JP2002532094A

JP2002532094A - ＩＬ−１ゼータ、ＩＬ−１ゼータスプライス変異体およびＸｒｅｃ２のＤＮＡおよびポリペプチド

Info

Publication number: JP2002532094A
Application number: JP2000588357A
Authority: JP
Inventors: シムズ，ジョン・イー; スミス，ダーク・イー; ボーン，テレサ・エル
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 1998-12-14
Filing date: 1999-12-14
Publication date: 2002-10-02
Anticipated expiration: 2019-12-14
Also published as: CA2353483C; IL143361A; PT1141298E; CY1105405T1; ES2325165T3; DE69940750D1; AU2004218668B2; AU2178800A; AU2004218668A1; DE69932259T2; ES2267311T3; CA2353483A1; AU775128B2; JP5081277B2; CA2642146C; NZ512749A; EP1141298A2; WO2000036108A2; DK1141298T3; JP4562287B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、新規な精製および単離したＩＬ−１ゼータ、ＩＬ−１ゼータスプライス変異体およびＸｒｅｃ２ポリペプチド、ならびにそのフラグメント、それらのポリペプチドをコードする核酸、組換え形のそれらのポリペプチドの製造方法、これらのポリペプチドに対して産生された抗体、これらのポリペプチドに由来するフラグメント化ペプチド、ならびにその使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】関連出願の引照本出願は、米国仮特許出願Ｓ．Ｎ．６０／１１２，１６３（１９９８年１２月
１４日出願）およびＳ．Ｎ．６０／１６４，６７５（１９９９年１１月１０日出
願）の優先権を主張する。それらの開示内容全体をよりどころとし、参考として
援用する。

【０００２】発明の背景発明の分野本発明は、新規な精製および単離したＩＬ−１ゼータ、ＩＬ−１ゼータスプラ
イス変異体およびＸｒｅｃ２ポリペプチド、ならびにそのフラグメント、それら
のポリペプチドをコードする核酸、組換え型のそれらのポリペプチドの製造方法
、これらのポリペプチドに対して産生された抗体、これらのポリペプチドに由来
するフラグメント化ペプチド、ならびにその使用に関する。

【０００３】関連技術の説明インターロイキン−１（ＩＬ−１）は大きなサイトカイン群のメンバーであり
、その主な機能は免疫応答および炎症反応を仲介することである。５つの既知Ｉ
Ｌ−１ファミリーメンバーがあり、それにはＩＬ−１アルファ（ＩＬ−１α）、
ＩＬ−１ベータ（ＩＬ−１β）、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ
）、ＩＬ−１デルタ（ＩＬ−１δ、ＷＯ９９／３５２６８に開示）、およびＩＬ
−１８（以前は、ＩＧＩＦ、時にはＩＬ−１ガンマとして知られていた）が含ま
れる。マクロファージが分泌するＩＬ−１は、実際には大部分のＩＬ−１βと少
量のＩＬ−１αの混合物である（Ａｂｂａｓｅｔａｌ．，１９９４）。ＩＬ
−１αおよびＩＬ−１βはまずシグナル配列を欠如する３３ｋＤの前駆体として
産生され、さらにタンパク質分解開裂によりプロセシングされて、それぞれ約１
７ｋＤの分泌される活性形を生成する。さらに、ＩＬ−１αのこの３３ｋＤ前駆
体も活性である。両方の形のＩＬ−１は、第２染色体上に位置する２つの異なる
遺伝子の産物である。これら２つの形は互いに３０％未満の相同性であるが、そ
れらは両方とも同じ受容体に結合し、かつ類似の活性をもつ。

【０００４】ＩＬ−１ファミリーのリガンドは、リガンド結合鎖であるＩ型ＩＬ−１受容体
（ＩＬ−１ＲＩ）および必要なシグナリング成分であるＩＬ−１Ｒアクセサリー
タンパク質（ＡｃＰ）からなる共通の受容体に結合する（Ｓｉｍｓｅｔａｌ
．，１９８８；Ｇｒｅｅｎｆｅｄｅｒｅｔａｌ．，１９９５；Ｃｕｌｌｉｎ
ａｎｅｔａｌ．，１９８８）。ＩＩ型ＩＬ−１受容体（ＩＬ−１ＲＩＩ）は
アゴニストＩＬ−１（特にＩＬ−１β）を結合して隔離するが、それ自身ではシ
グナリング応答を誘導することはない（ＭｃＭａｈａｎｅｔａｌ．，１９９
１；Ｓｉｍｓｅｔａｌ．，１９９３；Ｃｏｌｏｔｔａｅｔａｌ．，１９
９３；Ｃｏｌｏｔｔａｅｔａｌ．，１９９４）。ＩＬ−１リガンドはＩＬ−
１ＲＩＩの可溶性タンパク質分解フラグメント（ｓＩＬ−１ＲＩＩ）にも結合で
きる（Ｃｏｌｏｔｔａｅｔａｌ．，１９９３）。

【０００５】生物学的に不活性な形のＩＬ−１であるＩＬ−１ｒａは、構造的にはＩＬ−１
と相同である。ＩＬ−１ｒａは、細胞外領域への効率的な分泌を可能にするシグ
ナル配列をもつ状態で産生される（Ａｂｂａｓｅｔａｌ．，１９９４）。さ
らに、ＩＬ−１ｒａはＩ型ＩＬ−１受容体に結合するが、その後のＡｃＰとの相
互作用をもたらすことができない。したがってＩＬ−１ｒａはＩＬ−１Ｒ１を遮
断し、アゴニストＩＬ−１の作用を阻止する（Ｈａｎｎｕｍｅｔａｌ．，１
９９０；Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇｅｔａｌ．，１９９０）。

【０００６】主なＩＬ−１供給源は活性化したマクロファージまたは単核食細胞である。Ｉ
Ｌ−１を産生する他の細胞には、上皮細胞および内皮細胞が含まれる（Ａｂｂａ
ｓｅｔａｌ．，１９９４）。マクロファージからのＩＬ−１分泌は、マクロ
ファージがグラム陰性細菌に遭遇してそれらを取り込んだ後に起きる。そのよう
な細菌はリポ多糖類（ＬＰＳ）分子（内毒素としても知られる）を細菌細胞壁に
含有する。ＬＰＳ分子は、マクロファージを刺激して腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）お
よびＩＬ−１を産生させる活性成分である。この場合、ＩＬ−１はＬＰＳおよび
ＴＮＦの産生に応答して産生される。ＬＰＳは低濃度ではマクロファージを刺激
し、Ｂ細胞を活性化し、かつ細胞感染を排除するのに必要な他の宿主応答を生じ
る；しかし高濃度では、ＬＰＳは著しい組織損傷、ショック、さらには死をも引
き起こす可能性がある。

【０００７】ＩＬ−１の生物学的機能には、血管内皮細胞およびリンパ球の活性化、局所組
織破壊および発熱が含まれる（Ｊａｎｅｗａｙｅｔａｌ．，１９９６）。Ｉ
Ｌ−１は、低濃度ではマクロファージおよび血管内皮細胞を刺激してＩＬ−６を
産生させ、血管内皮細胞表面にある分子をアップレギュレートして白血球付着を
増加させ、そして単核食細胞その他の細胞を刺激して炎症性白血球を活性化する
ある種のケモカインを産生させることによって間接的に炎症性白血球を活性化す
る。さらに、ＩＬ−１は他の炎症応答、たとえばプロスタグランジン、酸化窒素
合成酵素およびメタロプロテイナーゼの誘導に関与する。ＩＬ−１の機能は低レ
ベルの微生物感染症に際しては重要である。しかし微生物感染症がエスカレート
すると、ＩＬ−１は発熱を誘発し、単核食細胞を刺激してＩＬ−１およびＩＬ−
６を産生させ、肝細胞からの血清タンパク質産生を増大させ、かつ凝固系を活性
化することにより、全身的に作用する。さらに、ＩＬ−１は腫瘍の出血性壊死を
起こさず、骨髄幹細胞分裂を抑制し、またＩＬ−１は高濃度ではヒトにとって致
死的である。

【０００８】ＩＬ−１の重要な機能からみて、ＩＬ−１リガンドファミリーおよびＩＬ−１
受容体ファミリーの他のメンバーを同定する必要がある。さらに、依然としてタ
ンパク質研究および免疫系に関心がもたれていることからみて、新規タンパク質
およびそれらの阻害薬の知見、同定および役割が、近代の分子生物学および生化
学の最前線である。多量の知見が得られつつあるにもかかわらず、当技術分野で
は依然として細胞応答および免疫応答に関与するタンパク質のアイデンティティ
ーおよび機能を見出すことが求められている。

【０００９】他の観点において、未知タンパク質の一次構造または配列の同定は、努力を要
する実験プロセスの頂点である。未知タンパク質を同定するために、研究者は当
業者既知のさまざまな技術を用いて未知タンパク質を既知ペプチドと比較するこ
とに依存できる。たとえば電気泳動、沈降法、クロマトグラフィー、配列決定法
および質量分析などの方法でタンパク質がルーティンに分析される。

【００１０】特に、タンパク質の個々のアミノ酸成分に関連したタンパク質組成の独特な性
質のため、そのタンパク質内に独特な開裂部位が配置される。化学的または酵素
的な開裂によりタンパク質を特異的にフラグメント化すると、独特の”ペプチド
フィンガープリント”が得られる（Ｄ．Ｗ．Ｃｌｅｖｅｌａｎｄｅｔａｌ．
，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５２：１１０２−１１０６，１９７７；Ｍ．Ｂ
ｒｏｗｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，５０：３０９−３１６，
１９８０）。その結果、特定部位での開裂により、そのタンパク質が再現性をも
って厳密な分子量のペプチドにフラグメント化される。さらに、これらのペプチ
ドは、ペプチドの等電ｐＨを決定する独特な電荷特性をもつ。これらの独特な特
性をさまざまな電気泳動その他の方法で利用できる（Ｂｒｏｃｋｅｔａｌ．
，ＢｉｏｌｏｇｙｏｆＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，ｐｐ．７６−７７，
ＰｒｅｎｔｉｃｅＨａｌｌ，第６版，１９９１）。

【００１１】タンパク質のフラグメント化は、アミノ酸組成分析およびタンパク質配列決定
（Ｐ．Ｍａｔｓｕｄｉａｒａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２：１００３５
−１００３８，１９８７；Ｃ．Ｅｃｋｅｒｓｋｏｒｎｅｔａｌ．，Ｅｌｅｃ
ｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，９：８３０−８３８，１９８８）、特に”遮断した”
Ｎ−末端をもつタンパク質からのフラグメントの生成に利用される。さらに、フ
ラグメント化タンパク質は、免疫化、アフィニティー選択（Ｒ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ
，ＵＳＰ５，１５１，４１２）、修飾部位（たとえばリン酸化）の決定、活性な
生物学的化合物の生成（Ｂｒｏｃｋｅｔａｌ．，ＢｉｏｌｏｇｙｏｆＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，ｐｐ．３００−３０１，ＰｒｅｎｔｉｃｅＨａ
ｌｌ，第６版，１９９１）、および相同タンパク質の識別（Ｍ．Ｂｒｏｗｎｅ
ｔａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，５０：３０９−３１６，１９８０）に
使用できる。

【００１２】さらに未知タンパク質のペプチドフィンガープリントが得られる場合、それを
既知タンパク質のデータベースと比較して、質量分析による未知タンパク質の同
定の補助とすることができる（Ｗ．Ｊ．Ｈｅｎｚｅｌｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５０１１−５０１５，１９９
３；Ｄ．Ｆｅｎｙｏｅｔａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１９：
９９８−１００５，１９９８）。これらの比較を容易にするためのさまざまなコ
ンピューターソフトウェアプログラムにインターネットを通じてアクセスできる
：たとえばＰｒｏｔｅｉｎＰｒｏｓｐｅｃｔｏｒ（インターネットサイト：ｐ
ｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｓｃｆ．ｅｄｕ）、ＭｕｌｔｉＩｄｅｎｔ（インターネ
ットサイト：ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｓｐｒｏｔ／ｍｕｌｔｉｉｄｅｎｔ
．ｈｔｍｌ）、ＰｅｐｔｉｄｅＳｅａｒｃｈ（インターネットサイト：ｗｗｗ．
ｍａｎｎ．ｅｍｂｌ−ｈｅｉｅｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ．．．ｄｅＳｅａｒｃｈ／
ＦＲ＿ＰｅｐｔｉｄｅＳｅａｒｃｈＦｏｒｍ．ｈｔｍｌ）、およびＰｒｏＦｏｕ
ｎｄ（インターネットサイト：ｗｗｗ．ｃｈａｉｔ−ｓｇｉ．ｒｏｃｋｅｆｅｌ
ｌｅｒ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｔｉｄ−ｆｒａｇ．ｈｔｍｌ）。これ
らのプログラムにより、ユーザーは表示された許容度内で開裂剤およびフラグメ
ント化ペプチドの分子量を特定することができる。これらのプログラムは、これ
らの分子量をデータベースに蓄積された情報と比較して未知タンパク質のアイデ
ンティティーを決定する補助となる。正確な同定のためには、フラグメント化ペ
プチドの個数およびそれらのペプチドの厳密な分子量に関する厳密な情報が必要
である。したがって、フラグメント化ペプチドの個数およびそれらの分子量を決
定する際の精度を高めると、未知タンパク質同定の成功の可能性が高まる。

【００１３】さらに、未知タンパク質のペプチド消化物をタンデム型質量分析（ＭＳ／ＭＳ
）により配列決定し、得られた配列をデータベースと対比して検索することがで
きる（Ｊ．Ｋ．Ｅｎｇｅｔａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．ＭａｓｓＳｐｅｃ
．，５：９７６−９８９，１９９４；Ｍ．Ｍａｎｎｅｔａｌ．，Ａｎａｌ．
Ｃｈｅｍ．，６６：４３９０−４３９９，１９９４；Ｊ．Ａ．Ｔａｙｌｏｒｅ
ｔａｌ．，ＲａｐｉｄＣｏｍｍ．ＭａｓｓＳｐｅｃ．，１１：１０６７−
１０７５，１９９７）。この方法に利用できる検索プログラムがインターネット
にある：たとえばＬｕｔｅｆｉｓｋ９７（インターネットサイト：ｗｗｗ．ｌｓ
ｂｃ．ｃｏｍ．７０／Ｌｕｔｅｆｉｓｋ９７．ｈｔｍｌ）、ならびに前記のＰｒ
ｏｔｅｉｎＰｒｏｓｐｅｃｔｏｒ、ＰｅｐｔｉｄｅＳｅａｒｃｈおよびＰｒｏ
Ｆｏｕｎｄプログラム。したがって、遺伝子およびその推定タンパク質配列なら
びにペプチドフラグメントの配列を配列データベースに加えると、タンデム型質
量分析による未知タンパク質の同定を補助することができる。

【００１４】したがって当技術分野では、ペプチドフラグメント化研究用、分子量測定用、
およびタンデム型質量分析によるタンパク質配列決定用に適したポリペプチドも
求められている。

【００１５】発明の概要本発明は、”ＩＬ−１ゼータ”と呼ばれるＩＬ−１ファミリーリガンド、なら
びにＴＤＺ．１、ＴＤＺ．２およびＴＤＺ．３と呼ばれるＩＬ−１ゼータの３つ
のスプライス変異体に対する単離核酸、ならびにそれらの核酸によりコードされ
るポリペプチドを提供する。本発明は、”Ｘｒｅｃ２”と呼ばれるＩＬ−１ファ
ミリー受容体に対する単離核酸分子、ならびにそれらの核酸分子によりコードさ
れるポリペプチドをも提供する。したがって、１つの側面において本発明は、そ
れぞれ配列番号：１、配列番号：５、配列番号：６、または配列番号：７のＤＮ
Ａ配列を含む、ＩＬ−１ゼータ、ＴＤＺ．１、ＴＤＺ．２およびＴＤＺ．３の単
離核酸分子、ならびに配列番号：１、５、６および７に相補的な核酸分子に関す
る。同様に本発明は、配列番号：２の核酸分子および配列番号：２に相補的な核
酸分子を含むＸｒｅｃ２の単離核酸分子に関する。他の側面において本発明は、
それぞれ配列番号：３、配列番号：８、配列番号：９、または配列番号：１０の
アミノ酸配列をもつ、単離したＩＬ−１ゼータ、ＴＤＺ．１、ＴＤＺ．２および
ＴＤＺ．３ポリペプチド、ならびに配列番号：３、８、９および１０のポリペプ
チドをコードする核酸分子に関する。さらに本発明には、配列番号：４のアミノ
酸配列を含む単離Ｘｒｅｃ２ポリペプチド、および配列番号：４のポリペプチド
をコードする核酸分子が包含される。

【００１６】一本鎖および二本鎖両方のＲＮＡおよびＤＮＡ核酸分子、ならびに配列番号：
１、２、５、６および７の全部または一部を含む変性二本鎖ＤＮＡ、および／ま
たは配列番号：３、４、８、９および１０に示したアミノ酸配列をコードするＤ
ＮＡにハイブリダイズする核酸分子が本発明に包含される。配列番号：１、２、
５、６および７の配列を含む核酸分子のインビトロ変異誘発により誘導される単
離核酸分子、配列番号：１、２、５、６および７の配列を含む核酸分子から縮重
した単離核酸分子、並びに本発明ＤＮＡの対立遺伝子変異体である単離核酸分子
も包含される。本発明は、これらの核酸分子の発現を指令する組換えベクター、
およびこれらのベクターで形質転換またはトランスフェクションした宿主細胞を
も包含する。

【００１７】さらに本発明は、ＩＬ−１ファミリーのリガンドおよび受容体に関連する活性
をもつタンパク質をコードする核酸を同定するために前記核酸を使用する方法を
包含する。たとえば、ＩＬ−１ゼータ核酸分子を用いてＩＬ−１ゼータ受容体を
同定することができ、一方、Ｘｒｅｃ２核酸分子を用いてＸｒｅｃ２リガンドを
同定することができる。

【００１８】さらにこれらの核酸を用いて、これらの核酸が関連するヒト染色体を同定でき
る。たとえばＩＬ−１ゼータ、ＴＤＺ．１、ＴＤＺ．２およびＴＤＺ．３核酸を
用いてヒト第２染色体を同定でき、一方、Ｘｒｅｃ２核酸を用いてヒトＸ染色体
を同定できる。したがって、これらの核酸を用いて、それぞれヒト第２およびＸ
染色体上の遺伝子地図を作製し；それぞれヒト第２およびＸ染色体に関連する特
定の疾病、症状、またはヒトの他の状態に関連する遺伝子を同定し；また細胞の
信号伝達および免疫系を研究することができる。

【００１９】本発明は、配列番号：１、２、５、６および７の核酸に由来するセンスまたは
アンチセンスオリゴヌクレオチドを、本発明の遺伝子がコードする各ポリヌクレ
オチドの発現阻害に使用することをも包含する。

【００２０】本発明はこれらの核酸分子によりコードされるＩＬ−１ゼータおよびＸｒｅｃ
２の単離ポリペプチドおよびフラグメントをも包含し、これにはそれぞれ配列番
号：３、４、８、９および１０の可溶性ポリペプチド部分が含まれる。本発明は
さらに、これらのポリペプチドの製造方法であって、発現を促進する条件下で宿
主細胞を培養し、そして培地からポリペプチドを回収することを含む方法を包含
する。特に細菌、酵母、植物、昆虫および動物細胞におけるこれらのポリペプチ
ドの発現が本発明に包含される。

【００２１】一般に本発明のポリペプチドは、免疫調節、細胞増殖、細胞死、細胞移動、細
胞間相互作用および炎症応答などの細胞プロセスを研究するために使用できる。
さらに、これらのポリペプチドを用いて、ＩＬ−１ゼータ、ＴＤＺ．１、ＴＤＺ
．２およびＴＤＺ．３リガンド、ならびにＸｒｅｃ２受容体に関連するタンパク
質を同定できる。

【００２２】さらに本発明は、これらのポリペプチドを用いてポリペプチド対向構造（ｃｏ
ｕｎｔｅｒ−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）分子関連活性の有効な阻害薬をスクリーニン
グするためのアッセイ法、およびこれらのポリペプチドをポリペプチド対向構造
分子により仲介される疾病の処置のための療法薬として使用する方法を包含する
。さらに、これらのポリペプチドをその阻害薬（たとえば阻害薬として作用する
工学的に作製した受容体）の設計に使用する方法も本発明の１側面である。

【００２３】さらに本発明には、試料核酸および／またはタンパク質の同定を補助するため
の電子データベース検索における、ＩＬ−１ゼータおよびＸｒｅｃ２の核酸配列
、ポリペプチドまたはそのフラグメントの推定アミノ酸配列、あるいはポリペプ
チドおよびそのフラグメントの推定アミノ酸配列の組合わせの使用が包含される
。本発明はさらに、本明細書に開示するポリペプチドをタンパク質フラグメント
化度の立証のための対照として使用する方法を提供する。

【００２４】これらのポリペプチドに結合する単離したポリクローナル抗体またはモノクロ
ーナル抗体、さらに本発明ポリペプチドの精製を補助するためのこれらの抗体の
使用も本発明に包含される。

【００２５】発明の詳細な記述本発明に包含される核酸分子には、下記の核酸配列が含まれる：

【００２６】

【化１】

【００２７】

【化２】

【００２８】

【化３】

【００２９】

【化４】

【００３０】

【化５】

【００３１】本発明の核酸配列によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は以下の
ものを含む：

【００３２】

【化６】

【００３３】

【化７】

【００３４】

【化８】

【００３５】

【化９】

【００３６】

【化１０】

【００３７】本発明のＩＬ−１ゼータ、ＩＬ−１ゼータスプライス変異体（ＴＤＺ．１、Ｔ
ＤＺ．２およびＴＤＺ．３）およびＸｒｅｃ２核酸が見出されたことにより、各
ポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクター、およびこれらの発現ベクタ
ーでトランスフェクションまたは形質転換した宿主細胞を構築できる。本発明に
より、生物学的に活性なＩＬ−１ゼータ、ＩＬ−１ゼータスプライス変異体およ
びＸｒｅｃ２ポリペプチドならびにそのフラグメントの単離および精製も可能に
なる。さらに他の態様においては、これらの核酸またはそのオリゴヌクレオチド
をプローブとして用いて、関連活性をもつタンパク質をコードする核酸を同定す
ることができる。たとえばＩＬ−１ゼータおよびＩＬ−１ゼータスプライス変異
体を用いてＩＬ−１ファミリーリガンドに関連する活性を同定でき、Ｘｒｅｃ２
を用いてＩＬ−１ファミリー受容体に関連する活性を同定できる。さらに、ＩＬ
−１ゼータ、ＴＤＺ．１、ＴＤＺ．２およびＴＤＺ．３の核酸またはオリゴヌク
レオチドを用いてヒト第２染色体を同定でき、一方、Ｘｒｅｃ２を用いてヒトＸ
染色体を同定できる。同様に、これらの核酸またはそのオリゴヌクレオチドを用
いて、それぞれヒト第２およびＸ染色体の遺伝子地図を作製し、またヒト第２お
よびＸ染色体に関連する特定の疾病、症状、またはヒトの他の状態に関連する遺
伝子を同定することができる。たとえば、ＩＬ−１ゼータ、ＴＤＺ．１、ＴＤＺ
．２およびＴＤＺ．３の核酸またはオリゴヌクレオチドを用いて、緑内障、外胚
葉性異形成症、インスリン依存性糖尿病、しわ皮膚（ｗｒｉｎｋｌｙｓｋｉｎ
）症候群、Ｔ細胞性白血病／リンパ腫、および頚骨筋ジストロフィー症を同定で
き、一方、Ｘｒｅｃ２の核酸またはオリゴヌクレオチドを用いて、網膜分離症、
脳回欠損、皮質下層状ヘテロピア（ｓｕｂｃｏｒｔｉｃａｌｌａｍｉｎａｌｈ
ｅｔｅｒｏｐｉａ）、精神発達遅滞、ｃｏｗｃｈｏｃｋ症候群、ｂａｚｅｘ症候
群、多毛症、リンパ滲出性症候群、免疫不全症、ランガー中割球異形成症および
白血病を同定できる。最後に、これらの核酸に由来する一本鎖センスまたはアン
チセンスオリゴヌクレオチドを用いて、それぞれＩＬ−１ゼータおよびＸｒｅｃ
２遺伝子がコードする各ポリヌクレオチドの発現を阻害することができる。

【００３８】さらに、ＩＬ−１ゼータ、ＴＤＺ．１、ＴＤＺ．２、ＴＤＺ．３およびＸｒｅ
ｃ２ポリペプチドならびにその可溶性フラグメントを用いて、血管内皮細胞およ
びリンパ球を活性化し、および／または活性化を阻害し、ならびに／あるいは局
所組織破壊および発熱を誘発および／または阻害し（Ｊａｎｅｗａｙｅｔａ
ｌ．，１９９６）、マクロファージおよび血管内皮細胞がＩＬ−６を産生するの
を阻害および／または刺激し、プロスタグランジン、（一）酸化窒素合成酵素お
よびメタロプロテイナーゼの誘導を誘発および／または阻害し、並びに、血管内
皮細胞表面にある分子をアップレギュレートし、および／またはアップレギュレ
ーションを阻害することができる。さらに、これらのポリペプチドおよびフラグ
メント化ペプチドを用いて、炎症仲介物質、たとえば転写因子ＮＦ−κＢおよび
ＡＰ−１、ＭＡＰキナーゼＪＮＫおよびｐ３８、ＣＯＸ−２、ｉＮＯＳの誘導、
ならびにこれらの分子により刺激されるすべての活性を、誘発および／または阻
害することもできる。

【００３９】さらに、これらのポリペプチドおよびフラグメント化ペプチドを、ペプチドフ
ラグメント化の対照として使用できる。最後に、これらのポリペプチドおよびそ
のフラグメントを用いて抗体を産生させることができ、本発明はＩＬ−１ゼータ
およびＸｒｅｃ２ポリペプチドの精製のためのそのような抗体の使用を包含する
。

【００４０】核酸分子具体的な態様において、本発明は内因性汚染物質を含まない特定の単離ヌクレ
オチド配列に関する。”ヌクレオチド配列”とは、分離したフラグメントの形の
、またはより大きな核酸構築体の成分としての、ポリヌクレオチド分子を表す。
核酸分子は、少なくとも１回は純粋な形で、かつ標準的な生化学的方法（たとえ
ばＳａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２版，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨ
ａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ニューヨーク州コールド・スプリング・ハ
ーバー，１９８９）によりその成分ヌクレオチド配列を同定、操作および回収で
きる量または濃度で単離された、ＤＮＡまたはＲＮＡに由来するものである。そ
のような配列は、真核細胞遺伝子中に一般に存在する内部非翻訳配列（すなわち
イントロン）により中断されないオープンリーディングフレームの形で提供およ
び／または構築されることが好ましい。非翻訳ＤＮＡの配列が、オープンリーデ
ィングフレームの５’側または３’側に存在してもよい。ここではこれらはコー
ド領域の操作または発現を妨害しないからである。

【００４１】本発明の核酸分子には、一本鎖および二本鎖の両方の形のＤＮＡ、ならびにそ
のＲＮＡ相補体が含まれる。ＤＮＡには、たとえばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化
学合成したＤＮＡ、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ、およびそれらの組合わせ
が含まれる。ゲノムＤＮＡは、常法により、たとえば配列番号：１、２、５、６
、７のｃＤＮＡまたはその適切なフラグメントをプローブとして用いて単離でき
る。

【００４２】本発明のＤＮＡ分子には、全長遺伝子ならびにそのポリヌクレオチドおよびフ
ラグメントが含まれる。全長遺伝子は、Ｎ−末端シグナルペプチドを含んでもよ
い。他の態様には、可溶性形をコードするＤＮＡ、たとえばタンパク質の細胞外
ドメインをコードするものであって、シグナルペプチドを含むもの、または含ま
ないものが含まれる。

【００４３】本発明の核酸は優先的にヒト供給源に由来するが、本発明は非ヒト種に由来す
るものをも包含する。

【００４４】好ましい配列本発明の特に好ましい核酸分子は、ＩＬ−１ゼータ、ＴＤＺ．１、ＴＤＺ．２
およびＴＤＺ．３についてはそれぞれ配列番号：１、５、６、７に、Ｘｒｅｃ２
については配列番号：２に示したものである。配列番号：１および２の核酸配列
をもつｃＤＮＡクローンは、実施例１の記載に従って単離された。配列番号：１
および２のＤＮＡによりコードされるＩＬ−１ゼータおよびＸｒｅｃ２のアミノ
酸配列を、それぞれ配列番号：３および４に示す。配列番号：５、６および７の
核酸配列をもつｃＤＮＡクローンは、実施例８の記載に従って単離された。配列
番号：５、６および７のＤＮＡによりコードされるＴＤＺ．１、ＴＤＺ．２およ
びＴＤＺ．３のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号：８、９および１０に示す。

【００４５】配列番号：１〜４は、配列番号：３のＩＬ−１ゼータをＩＬ−１ファミリーの
メンバーと同定し、配列番号：４のＸｒｅｃ２をＩＬ−１受容体ファミリーのメ
ンバーと同定する。これの基礎となる相同性を表１に示す。

【００４６】

【表１】

【００４７】ＩＬ−１ゼータスプライス変異体は、ゲノムＤＮＡ配列のストレッチ中に見出
された（Ｘ２２３０４．ｇｂｎ）。このゲノム配列は、異なるＩＬ−１ゼータエ
キソンおよびＴａｎｇｏ−７７として知られる他のスプライス変異体（ＷＯ９９
／０６４２６）をも含む。クローン化したＩＬ−１ゼータ、ＴＤＺ．１、ＴＤＺ
．２、ＴＤＺ．３およびＴａｎｇｏ−７７のｃＤＮＡ配列とゲノム配列を比較す
ると、スプライシング事象の発生について洞察できる。図１は、ＩＬ−１ゼータ
遺伝子座のゲノム構造およびオータナティブスプライシングにより生成した（複
数の）ｃＤＮＡを示す。番号をつけたボックスは、個々のエキソン１〜６を示し
、介在イントロンのおおまかなサイズを上に示す。星印（^*）は、終止コドンが
コード配列の末尾（エキソン６）に、または読み枠内（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）終止
コドンとして（エキソン３）存在することを示す。”Ｍ”は、エキソン１または
エキソン３に由来する潜在的開始メチオニンを示す。Ｔａｎｇｏ−７７はＷＯ９
９／０６４２６に開示されたｃＤＮＡ構造である。ＩＬ−１ゼータおよびそのス
プライス変異体の著しい特色は、エキソン４の存在または不存在である。エキソ
ン４はＩＬ−１ゼータ、ＴＤＺ．１およびＴＤＺ．２には存在するが、Ｔａｎｇ
ｏ−７７またはＴＤＺ．３には存在しない。エキソン４によりコードされるアミ
ノ酸配列は、成熟ペプチドの数個のベータ鎖において、ＩＬ−１ファミリーの他
のメンバーのアミノ酸配列と良好にアラインする。これに対し、Ｔａｎｇｏ−７
７のエキソン１および２、ならびにＴＤＺ．３ｃＤＮＡのエキソン１によりコ
ードされるアミノ酸配列（これらはＩＬ−１ゼータ、ＴＤＺ．１およびＴＤＺ．
２のエキソン４を補足するのではなく、置換する）は、この同じ領域において、
ＩＬ−１ファミリーの他のメンバーと良好にアラインしない。ＩＬ−１ゼータ、
Ｔａｎｇｏ−７７、ＴＤＺ．１、ＴＤＺ．２およびＴＤＺ．３はすべて、成熟ペ
プチドのＣ−末端２／３（これらのスプライス−イソ形すべてに共通のエキソン
５および６によりコードされる領域）において、ＩＬ−１ファミリーの他のメン
バーのアミノ酸配列と良好にアラインする。したがって、ＩＬ−１ゼータ、ＴＤ
Ｚ．１およびＴＤＺ．２のＤＮＡによりコードされる”成熟ペプチド”は、機能
性ＩＬ−１様の分子であると思われる。これは、機能性ＩＬ−１様の分子である
可能性の少ないＴａｎｇｏ−７７またはＴＤＺ．３のＤＮＡによりコードされる
ポリペプチドと対照的である。

【００４８】ＴＤＺ．３以外のすべてのスプライス−イソ形は、ｃＤＮＡがＮ−末端方向に
成熟ＩＬ−１のＮ−末端をはるかに越えて伸びているので、ＩＬ−１様サイトカ
インのプロ形をコードする可能性がある。この所見から、ＩＬ−１ゼータ、ＴＤ
Ｚ．１およびＴＤＺ．２は同一の成熟ペプチドをコードすると推定される。この
所見に関連して、ＩＬ−１ゼータ、ＴＤＺ．１およびＴＤＺ．２間で異なるのは
プロドメイン（５’ＵＴＲのほかに）である。

【００４９】ＩＬ−１ゼータ、ＴＤＺ．１、ＴＤＺ．２、ＴＤＺ．３およびＴａｎｇｏ−７
７の組織分布を詳述した表ＩＩＩは、Ｔａｎｇｏ−７７の発現がＩＬ−１ゼータ
の発現より広範囲であることを示す。表ＩＩＩは、ＴＤＺ．１の発現がＴａｎｇ
ｏ−７７の発現に匹敵し、ほぼ完全にオーバーラップすることも示す。この組織
分布データを図１のアラインメント情報と合わせると、ＴＤＺ．１は、ＩＬ−１
ファミリーの他のメンバーと良好にアラインし、かつその発現が広範囲である唯
一のスプライス変異体メンバーであることが分かる。これらの所見は、ＴＤＺ．
１が生物学的応答に関して最も重要なスプライス変異体である可能性を示唆する
。

【００５０】さらなる配列１より多いコドンが同一アミノ酸をコードすることができるという既知の遺伝
子コドン縮重のため、ＤＮＡ配列が配列番号：１、２、５、６、７に示すものと
異なってもなお、それぞれ配列番号：３、４、８、９および１０のアミノ酸をも
つポリペプチドをコードすることができる。そのような変異ＤＮＡ配列は、意図
的でない変異（たとえばＰＣＲ増幅中に起きるもの）により生じる可能性があり
、あるいは天然配列の意図的な変異誘発の生成物である可能性がある。

【００５１】したがって本発明は、本発明のポリペプチドをコードする単離ＤＮＡ配列であ
って、下記より選択される配列を提供する：（ａ）配列番号：１、２、５、６、
７のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ；（ｂ）配列番号：３、４、８、９および１
０のポリペプチドをコードするＤＮＡ；（ｃ）中等度ストリンジェンシー条件下
で（ａ）または（ｂ）のＤＮＡにハイブリダイズでき、かつ本発明のポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ；（ｄ）高ストリンジェンシー条件下で（ａ）または（ｂ
）のＤＮＡにハイブリダイズでき、かつ本発明のポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ；ならびに（ｅ）遺伝暗号の結果として（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）
に定めたＤＮＡに対して縮重しており、かつ本発明のポリペプチドをコードする
ＤＮＡ。もちろん、そのようなＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドは本
発明に包含される。

【００５２】本明細書中で用いる中等度ストリンジェンシー条件は、たとえばＤＮＡの長さ
に基づいて当業者が容易に判定できる。基本的条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔ
ａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２版，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１．１０１−１０４，ＣｏｌｄＳ
ｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８９に述
べられており、下記の採用が含まれる：ニトロセルロースフィルターの予備洗浄
溶液：５×ＳＳＣ，０．５％ＳＤＳ，１．０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、ハ
イブリダイゼーション条件：約５０％ホルムアミド、６×ＳＳＣ、４２℃（また
は他の同様なハイブリダイゼーション溶液、たとえばＳｔａｒｋ溶液、約５０％
ホルムアミド中、約４２℃）、および洗浄条件：約６０℃，０．５×ＳＳＣ，０
．１％ＳＤＳ。高ストリンジェンシー条件も、たとえばＤＮＡの長さに基づいて
当業者が容易に判定できる。一般にそのような条件は上記と同様なハイブリダイ
ゼーション条件下で、かつ約６８℃，０．２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳの洗浄条
件を用いる。温度および洗浄溶液の塩濃度をプローブの長さなどの要因に従って
必要に応じて調整しうることは、当業者に認識されるであろう。

【００５３】同様に本発明の態様に包含されるのは、後記のように、不活性化Ｎ−グリコシ
ル化部位（１以上）、不活性化プロテアーゼプロセシング部位（１以上）または
保存アミノ酸置換（１以上）を含むポリペプチドフラグメントおよびポリペプチ
ドをコードするＤＮＡである。

【００５４】他の態様において、本発明の核酸分子は天然配列に少なくとも８０％同一であ
るヌクレオチド配列をも含む。核酸分子が天然配列に少なくとも９０％同一である、少なくとも９５％同一で
ある、少なくとも９８％同一である、少なくとも９９％同一である、または少な
くとも９９．９％同一である配列を含む態様も包含される。

【００５５】同一性パーセントは視覚調査および数学的計算により判定できる。あるいは、
２つの核酸配列の同一性パーセントは、Ｄｅｖｅｒｅｕｘｅｔａｌ．，Ｎｕ
ｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１２：３８７，１９８４に記載される、ウィスコ
ンシン遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）から入手できるＧＡＰコン
ピュータープログラム、バージョン６．０を用いて配列情報を比較することによ
り判定できる。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには下記の
ものが含まれる：（１）ヌクレオチドに関する単項比較マトリックス（同一につ
いては１、非同一については０の数値を含む）、およびＳｃｈｗａｒｔｚａｎ
ｄＤａｙｈｏｆｆ編，ＡｔｌａｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅａｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｐｐ．３５３−３５８，ＮａｔｉｏｎａｌＢ
ｉｏｍｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ，１９７９に記
載されたような、ＧｒｉｂｓｋｏｖａｎｄＢｕｒｇｅｓｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃ
ｉｄｓＲｅｓ．，１４：６７４５，１９８６の重み付き比較マトリックス；（
２）各ギャップにつき３．０のペナルティ、さらに各ギャップ中の各記号につき
０．１０のペナルティ；ならびに（３）末端ギャップについてはペナルティなし
。配列比較の分野の専門家が用いる他のプログラムも使用できる。

【００５６】本発明は、ポリペプチドの製造に有用な単離核酸を提供する。そのようなポリ
ペプチドは、多数の常法により製造できる。本発明のポリペプチドまたはその目
的フラグメントをコードするＤＮＡ配列を、そのポリペプチドまたはフラグメン
トの産生のために発現ベクターにサブクローニングすることができる。ＤＮＡ配
列を、有利には適切なリーダーペプチドまたはシグナルペプチドをコードする配
列に融合させる。あるいは、目的フラグメントを既知の方法で化学的に合成でき
る。ＤＮＡフラグメントは、全長クローン化ＤＮＡ配列の制限エンドヌクレアー
ゼ消化により調製し、アガロースゲル上での電気泳動により単離することもでき
る。必要ならば、５’または３’末端を目的点まで再構成するオリゴヌクレオチ
ドを、制限酵素消化により作製したＤＮＡフラグメントにライゲートさせること
ができる。そのようなオリゴヌクレオチドはさらに、目的とするコード配列の上
流に制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を含むことができ、コード配列のＮ−末端
に開始コドン（ＡＴＧ）を配置することができる。

【００５７】目的とするタンパク質フラグメントをコードするＤＮＡ配列を単離および増幅
するために、周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法も採用できる。ＤＮＡフ
ラグメントの目的とする末端を定めるオリゴヌクレオチドを、５’および３’プ
ライマーとして用いる。これらのオリゴヌクレオチドはさらに、発現ベクターへ
の増幅ＤＮＡフラグメントの挿入を容易にするために、制限エンドヌクレアーゼ
認識部位を含んでもよい。ＰＣＲ法は、Ｓａｉｋｉｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ，２３９：４８７，１９８８；Ｗｕｅｔａｌ．編，ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＤＮＡＭｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ，ｐｐ．１８９−１９６，Ａｃａｄｅｍ
ｉｃＰｒｅｓｓ社，サンディエゴ，１９８９；およびＩｎｎｉｓｅｔａｌ
．編，ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：ＡＧｕｉｄｅｔｏＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ社，１９９
０に記載されている。

【００５８】ポリペプチドおよびそのフラグメント本発明は、天然由来のもの、または組換えＤＮＡ技術を伴う方法などの各種技
術により製造されたものを含めた、種々の形のポリペプチドおよびそのフラグメ
ントを包含する。そのような形には誘導体、変異体およびオリゴマー、ならびに
その融合タンパク質またはフラグメントが含まれるが、これらに限定されない。

【００５９】本発明のポリペプチドには、前記核酸配列によりコードされる全長タンパク質
が含まれる。特に好ましいＩＬ−１ゼータ、ＴＤＺ．１、ＴＤＺ．２、ＴＤＺ．
３およびＸｒｅｃ２のポリペプチドは、それぞれ配列番号：３、４、８、９およ
び１０のアミノ酸配列を含む。ＩＬ−１ゼータ、ＴＤＺ．１、ＴＤＺ．２、およ
びＴＤＺ．３について、Ｎ−末端が古典的なシグナルペプチドではなく、ＩＬ−
１ファミリーの他のメンバーの成熟形に対比して余分な長さをコードすることは
、これらのＮ−末端がプロドメインとして作用する可能性を示唆する。推定開裂
部位は、タンパク質の保存構造部分が始まる点である。構造モデリングデータに
よりこの推定が支持される。ＩＬ−１ゼータ、ＴＤＺ．１、およびＴＤＺ．２に
ついては、この部位はエキソン４によりコードされるアミノ酸配列のＮ−末端付
近のいずれかにある。たとえば配列番号：３に示すＩＬ−１のポリペプチドは、
アミノ酸１からｘにまで及ぶ推定プロドメインを含み、ここでｘは２０〜５０の
整数である。同様に、配列番号：８のＴＤＺ．１は、アミノ酸１からｘ’にまで
及ぶ推定プロドメインを含み、ここでｘ’は４０〜６０の整数であり、最も好ま
しくはｘ’は約５２である。配列番号：９のＴＤＺ．２は、アミノ酸１からｘ”
にまで及ぶ推定プロドメインを含み、ここでｘ”は２０〜４０の整数であり、最
も好ましくはｘ”は３１である。

【００６０】ＩＬ−１ゼータおよびそのスプライス変異体と異なり、配列番号：４に示すＸ
ｒｅｃ２のポリペプチドはシグナルペプチドとして機能するＮ−末端疎水性領域
を含み、アミノ酸１９〜３５９を含む細胞外ドメイン、アミノ酸３６０〜３７８
を含む膜貫通領域、およびアミノ酸３７９〜６９６を含むＣ−末端細胞質ドメイ
ンがそれに続く。コンピューター分析により、シグナルペプチドは配列番号：４
の残基１〜１９に相当すると推定される（ただし次に最も可能性のあるコンピュ
ーター推定シグナルペプチド開裂部位は、配列番号：４のアミノ酸２０および１
６（順位が低下する）の後にある）。したがって、シグナルペプチドの開裂によ
り配列番号：４のアミノ酸１９〜６９６を含む成熟タンパク質が得られる。

【００６１】このようなポリペプチド領域の上記境界はおおまかであることは当業者に認識
されるであろう。たとえば膜貫通領域の境界（これはその目的に利用できるコン
ピュータープログラムを用いて推定できる）が上記と異なる可能性がある。

【００６２】本発明のポリペプチドは膜結合であってもよく、あるいは分泌され、したがっ
て可溶性であってもよい。可溶性ポリペプチドはそれらが発現した細胞から分泌
されうる。一般に可溶性ポリペプチドは、目的ポリペプチドを発現する無傷の細
胞を、たとえば遠心分離により培養培地から分離し、そして培地（上清）を目的
ポリペプチドの存在についてアッセイすることにより同定できる（そして、不溶
性の膜結合した同等物と区別できる）。培地中にポリペプチドが存在することは
、そのポリペプチドが細胞から分泌され、したがって可溶性形タンパク質である
ことを示す。

【００６３】１態様において、可溶性ポリペプチドおよびそのフラグメントは細胞外ドメイ
ンの全部または一部を含み、ただしポリペプチドを細胞膜上に保持させる膜貫通
領域を欠如する。可溶性ポリペプチドは、そのポリペプチドが産生された細胞か
ら分泌される限り、細胞質ドメインまたはその部分を含んでもよい。

【００６４】一般に、ある種の適用には可溶性形の使用が有利である。可溶性ポリペプチド
は細胞から分泌されるので、組換え宿主細胞からのポリペプチドの精製は容易に
なる。さらに、可溶性ポリペプチドの方が一般に静脈内投与に適する。

【００６５】本発明は、目的とする生物学的活性を保持する細胞外ドメインのポリペプチド
およびフラグメントをも提供する。具体的態様は、天然のコグネイト、基質また
は対向構造体（”結合パートナー”）を結合する能力を保持する配列番号：３、
４、８、９および１０のポリペプチドフラグメントを目的とする。そのようなフ
ラグメントは前記のように可溶性ポリペプチドであってもよい。他の態様におい
て、ポリペプチドおよびフラグメントは、有利には前記のようにＩＬ−１リガン
ドおよびＩＬ−１受容体ファミリーにおいて保存されている領域を含む。

【００６６】本発明においては、配列番号：３、４、８、９および１０の配列のうち少なく
とも２０、または少なくとも３０の連続アミノ酸を含むポリペプチドフラグメン
トも提供される。１つの側面において、配列番号：４のＸｒｅｃ２の細胞質ドメ
インに由来するフラグメントは、シグナル伝達の研究、および生物シグナルの伝
達に関連する細胞プロセスの調節に利用される。ポリペプチドフラグメントを、
抗体の産生に際して免疫源としても利用できる。

【００６７】変異体本発明においては、前記ポリペプチドおよびフラグメントの天然変異体および
誘導変異体を提供する。

【００６８】変異体は少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を示すものであってよい。
ポリペプチドまたはフラグメントが、好ましいポリペプチドまたはそのフラグメ
ントに少なくとも９０％同一である、少なくとも９５％同一である、少なくとも
９８％同一である、少なくとも９９％同一である、または少なくとも９９．９％
同一であるアミノ酸配列を含む態様も包含される。同一性パーセントは視覚調査
および数学的計算により判定できる。あるいは、２つのタンパク質配列の同一性
パーセントは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎａｎｄＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏ．，４８：４４３，１９７０）のアルゴリズムに基づく、ウィスコンシン遺伝
学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）から入手できるＧＡＰコンピューター
プログラムを用いて配列情報を比較することにより判定できる。ＧＡＰプログラ
ムの好ましいデフォルトパラメーターには下記のものが含まれる：（１）スコア
リングマトリックス、ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｈｅｎｉｋｏｆｆｅｔａｌ．，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８９：１０９１５，１９９
２に記載；（２）ギャップ重み１２；（３）ギャップ長さ重み４；ならびに（４
）末端ギャップについてはペナルティなし。配列比較の分野の専門家が用いる他
のプログラムも使用できる。

【００６９】本発明の変異体には、たとえばオータナティブｍＲＮＡスプライシング事象ま
たはタンパク質分解開裂により生じるものが含まれる。ｍＲＮＡのオータナティ
ブスプライシングにより、トランケートした、ただし生物学的活性をもつタンパ
ク質、たとえば天然の可溶性形タンパク質が得られる可能性がある。タンパク質
分解に起因する変異には、たとえば異なるタイプの宿主細胞において発現した際
に１またはそれ以上の末端アミノ酸がタンパク質から除かれる（一般に１〜５個
の末端アミノ酸）ことによるＮ−末端またはＣ−末端の相異が含まれる。アミノ
酸配列の相異が遺伝子多型（そのタンパク質を産生する個体間の対立遺伝子の相
異）に起因するタンパク質も、本発明に包含される。

【００７０】本発明の範囲に包含される他の変異体には、他の化合物部分、たとえばグリコ
シル基、脂質、リン酸基、アセチル基などとの共有結合体または凝集結合体を形
成することにより修飾してその誘導体を形成しうるポリペプチドが含まれる。共
有結合誘導体は、化合物部分をポリペプチドのアミノ酸側鎖またはＮ−末端もし
くはＣ−末端の官能基に結合させることにより製造できる。後記に詳述するよう
に、それに結合した診断薬（検出薬）または療法薬を含む結合体が本発明に包含
される。

【００７１】他の誘導体には、本発明のポリペプチドと他のタンパク質またはポリペプチド
との共有結合体または凝集結合体、たとえば組換え培養における合成によりＮ−
末端またはＣ−末端融合体として得られるものが含まれる。融合タンパク質の例
については、オリゴマーに関連して後記に述べる。さらに、融合タンパク質は精
製および同定を容易にするために付加されるペプチドを含むことができる。その
ようなペプチドには、たとえばポリ−Ｈｉｓまたは抗原性の同定用ペプチドが含
まれる：ＵＳＰ５，０１１，９１２およびＨｏｐｐｅｔａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１２０４，１９８８に記載。そのようなペプチドの１
つはＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドＡｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−
Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号：１１）であり、これは抗原性が高く、特異
的モノクローナル抗体が可逆的に結合するエピトープを供給し、発現した組換え
タンパク質を迅速にアッセイし、かつ容易に精製することができる。４Ｅ１１と
表示されるネズミハイブリドーマは、特定の二価金属カチオンの存在下でＦＬＡ
Ｇ（登録商標）ペプチドを結合するモノクローナル抗体を産生する：ＵＳＰ５，
０１１，９１２に記載：参考として本明細書に援用する。４Ｅ１１ハイブリドー
マ細胞系はＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎに寄託ｎｏ．ＨＢ９２５９で寄託されている。ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチド
を結合するモノクローナル抗体は、ＥａｓｔｍａｎＫｏｄａｋ社、Ｓｃｉｅｎ
ｔｉｆｉｃＩｍａｇｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓＤｉｖｉｓｉｏｎ，コネチカッ
ト州ニュー・ヘブンから入手できる。

【００７２】本発明により提供される変異体ポリペプチドには、天然の生物学的活性または
それと実質的に同等活性を保持する、天然ポリペプチドの変異体が含まれる。一
例は、天然形の場合と本質的に同じ結合アフィニティーで結合する変異体である
。結合アフィニティーは、常法により、たとえばＵＳＰ５，５１２，４５７に記
載される後記の方法により測定できる。

【００７３】変異体には、実質的に天然形に相同であるが、１以上の欠失、挿入または置換
のため天然形のものと異なるアミノ酸配列をもつポリペプチドが含まれる。具体
的態様には、天然配列と比較したとき１〜１０個のアミノ酸残基の欠失、挿入ま
たは置換を含むポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。

【００７４】あるアミノ酸を類似の生理学的特性をもつ残基で交換してもよい。そのような
保存置換の例には、１つの脂肪族残基相互、たとえばＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕま
たはＡｌａ相互の置換；１つの極性残基相互、たとえばＬｙｓとＡｒｇ、Ｇｌｕ
とＡｓｐ、またはＧｌｎとＡｓｎ間の置換；あるいは１つの芳香族残基相互、た
とえばＰｈｅ、ＴｒｐまたはＴｙｒ相互の置換が含まれる。他の保存置換、たと
えば類似の疎水性をもつ領域全体の置換を伴うものは周知である。

【００７５】同様に、本発明のＤＮＡには、１またはそれ以上の欠失、挿入または置換のた
め天然ＤＮＡ配列と異なるが、生物学的に活性であるポリペプチドをコードする
変異体が含まれる。

【００７６】本発明はさらに、天然様式のグリコシル化を伴うか、または伴わない本発明の
ポリペプチドを包含する。酵母または哺乳動物発現系（たとえばＣＯＳ−１また
はＣＯＳ−７細胞）で発現したポリペプチドは、発現系の選択に応じて分子量お
よびグリコシル化パターンが天然ペプチドと類似するか、または有意に異なる可
能性がある。本発明のポリペプチドを細菌性発現系、たとえば大腸菌（Ｅｃｏ
ｌｉ）で発現させると、グリコシル化されていない分子が得られる。さらに、あ
る調製物が異なる状態にグリコシル化された多数のタンパク質種を含有すること
がある。グリコシル基は常法により、特にグリコペプチダーゼを用いる方法で除
去できる。一般に本発明のグリコシル化ポリペプチドを過剰モルのグリコペプチ
ダーゼ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｈｅｉｍ）と共にインキュベートしても
よい。

【００７７】これに対応して、アミノ酸残基もしくは配列の種々の付加体もしくは置換体、
または末端もしくは内部の残基もしくは配列の欠失体をコードする類似のＤＮＡ
構築体が本発明に包含される。たとえばポリペプチド細胞外ドメイン中のＮ−グ
リコシル化部位を修飾してグリコシル化を妨げ、これにより哺乳動物および酵母
発現系において炭水化物を減少させた類似体を発現させることができる。真核細
胞ポリペプチドのＮ−グリコシル化部位は、アミノ酸トリプレットＡｓｎ−Ｘ−
Ｙにより表され、ここでＸはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸、ＹはＳｅｒまたはＴ
ｈｒである。これらのトリプレットをコードする核酸配列に対する適宜な置換、
付加または欠失により、Ａｓｎ側鎖における炭水化物残基の結合が阻止されるで
あろう。たとえばＡｓｎが異なるアミノ酸で交換されるように選択した１ヌクレ
オチド変更で、Ｎ−グリコシル化部位を不活性化するのに十分である。あるいは
、ＳｅｒまたはＴｈｒを他のアミノ酸、たとえばＡｌａで交換することができる
。タンパク質中のＮ−グリコシル化部位を不活性化するための既知方法は、ＵＳ
Ｐ５，０７１，９７２およびＥＰ２７６，８４６に記載されており、これらを本
明細書に参考として援用する。

【００７８】変異体の他の例においては、生物学的活性にとって必須でないＣｙｓ残基をコ
ードする配列を、Ｃｙｓ残基を欠失させるか、または他のアミノ酸と交換して、
折りたたみまたは再生に際しての不適正な分子内ジスルフィド橋の形成を阻止す
ることができる。

【００７９】他の変異体は、隣接する二塩基性アミノ酸残基を修飾して、ＫＥＸ２プロテア
ーゼが存在する酵母系における発現を高めることにより作製される。ＥＰ２１２
，９１４には、タンパク質中のＫＥＸ２プロテアーゼプロセシング部位を不活性
化するために部位特異的変異誘発を用いることが開示されている。ＫＥＸ２プロ
テアーゼプロセシング部位は、残基の欠失、付加または置換によりＡｒｇ−Ａｒ
ｇ、Ａｒｇ−Ｌｙｓ、およびＬｙｓ−Ａｒｇ対を変化させてこれらの隣接塩基性
残基の発生を排除することにより、不活性化される。Ｌｙｓ−Ｌｙｓ対はＫＥＸ
２開裂に対する感受性がかなり低いと考えられ、Ａｒｇ−ＬｙｓまたはＬｙｓ−
ＡｒｇからＬｙｓ−Ｌｙｓへの変換は、ＫＥＸ２部位を不活性化するための保存
的な好ましい方法である。

【００８０】オリゴマー本発明には、ＩＬ−１ゼータ、ＴＤＺ．１、ＴＤＺ．２、ＴＤＺ．３またはＸ
ｒｅｃ２ポリペプチドを含むオリゴマーまたは融合タンパク質が包含される。本
発明のポリペプチドがＩ型膜タンパク質、たとえばＸｒｅｃ２である場合、融合
パートナーはこのＩ型膜タンパク質のＣ−末端に結合する。そのようなオリゴマ
ーは共有結合または非共有結合多量体の形であってよく、二量体、三量体、また
はより高次のオリゴマーが含まれる。前記のように、好ましいポリペプチドは可
溶性であり、したがってこれらのオリゴマーは可溶性ポリペプチドを含むことが
できる。本発明の１側面において、オリゴマーはポリペプチド成分の結合能を維
持し、したがって二価、三価などの結合部位を備えている。

【００８１】本発明の１態様は、ポリペプチドに融合したペプチド部分間の共有結合または
非共有結合相互作用により結合した複数のポリペプチドを含むオリゴマーに関す
る。そのようなペプチドは、ペプチドリンカー（スペーサー）、またはオリゴマ
ー化を促進する特性をもつペプチドであってよい。ロイシンジッパー、および抗
体由来のある種のポリペプチドは、後記に詳述するように、それに結合したポリ
ペプチドのオリゴマー化を促進しうるペプチドに含まれる。

【００８２】免疫グロブリンベースのオリゴマー１つの別法として、免疫グロブリン由来のポリペプチドを用いてオリゴマーを
調製する。抗体由来のポリペプチドの種々の部分（Ｆｃドメインが含まれる）に
融合したある種の異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の調製は、たとえばＡ
ｓｈｋｅｎａｚｉｅｔａｌ．，ＰＮＡＳＵＳＡ，８８：１０５３５，１９
９１；Ｂｙｒｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４４：６７７，１９９９；お
よびＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈａｎｄＡｒｕｆｆｏ，”免疫グロブリン融合タ
ンパク質の構築”，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌ．４，ｐｐ．１０．１９．１−１０．１９．１１，１９９
２に記載されている。

【００８３】本発明の１態様は、本発明のポリペプチドを抗体由来のＦｃポリペプチドに融
合させることにより作製された２つの融合タンパク質を含む二量体に関する。ポ
リペプチド／Ｆｃ融合タンパク質をコードする遺伝子融合体を適宜な発現ベクタ
ーに挿入する。この組換え発現ベクターで形質転換した宿主細胞においてポリペ
プチド／Ｆｃ融合タンパク質が発現し、抗体にかなり類似するものが組み立てら
れ、その際Ｆｃ部分間にジスルフィド結合が形成されて、二価分子が得られる。

【００８４】本明細書中で用いる”Ｆｃポリペプチド”という用語には、Ｆｃ領域のＣＨド
メインのいずれか、または全部を含む、抗体のＦｃ領域からなる天然形およびム
テイン（変異タンパク質、ｍｕｔｅｉｎ）形のポリペプチドが含まれる。二量体
化を促進するヒンジ部を含む、そのようなポリペプチドの短縮型（ｔｒｕｎｃａ
ｔｅｄｆｏｒｍ）も含まれる。好ましいポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１抗体由
来のＦｃポリペプチドを含む。

【００８５】ＷＯ９３／１０１５１（本明細書に参考として援用する）に記載される適切な
あるポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域のＮ−末端ヒンジ部から天然
Ｃ−末端にまで及ぶ一本鎖ポリペプチドである。他の有用なＦｃポリペプチドは
、ＵＳＰ５，４５７，０３５およびＢａｕｍｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ．，
１３：３９９２−４００１，１９９４（本明細書に参考として援用する）に記載
されるＦｃムテインである。このムテインのアミノ酸配列は、ＷＯ９３／１０１
５１に提示された天然Ｆｃ配列のものと、アミノ酸１９がＬｅｕからＡｌａへ、
アミノ酸２０がＬｅｕからＧｌｕへ、かつアミノ酸２２がＧｌｙからＡｌａへ変
化した以外は同一である。このムテインはＦｃ受容体に対するアフィニティー低
下を示す。

【００８６】Ｆｃ部分を含む上記の融合タンパク質（およびそれから形成したオリゴマー）
は、プロテインＡまたはプロテインＧカラム上でのアフィニティークロマトグラ
フィーによって容易に精製できるという利点をもつ。

【００８７】他の態様において本発明のポリペプチドは、抗体のＨ鎖またはＬ鎖の可変部の
代わりに使用できる。融合タンパク質が抗体のＨ鎖またはＬ鎖の両方をもつ場合
、４つものポリペプチド細胞外領域をもつオリゴマーを形成することができる。

【００８８】ペプチドリンカーベースのオリゴマーあるいは、オリゴマーはペプチドリンカー（スペーサーペプチド）をもつか、
またはもたない、複数のポリペプチドを含む融合タンパク質である。適切なペプ
チドリンカーには、ＵＳＰ４，７５１，１８０および４，９３５，２３３（これ
らを本明細書に参考として援用する）に記載されるものが含まれる。目的とする
ペプチドリンカーをコードするＤＮＡ配列を、いずれか適切な常法により、本発
明のＤＮＡ配列と同じ読み枠内に挿入することができる。たとえばリンカーをコ
ードする化学合成オリゴヌクレオチドを配列間にライゲートさせることができる
。具体的態様において融合タンパク質は、ペプチドリンカーで分離された２〜４
つの可溶性ポリペプチドからなる。

【００８９】ロイシンジッパー本発明のオリゴマーを製造するための他の方法は、ロイシンジッパーを用いる
ものである。ロイシンジッパードメインは、それらを含むタンパク質のオリゴマ
ー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは最初は幾つかのＤＮＡ結合
性タンパク質中に同定され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ，２４０：１７５９，１９８８）、それ以来さまざまなタンパク質中に見出
されるようになった。既知のロイシンジッパーには、二量体化または三量体化す
る天然ペプチドおよびその誘導体がある。

【００９０】ジッパードメイン（本明細書中ではオリゴマー化ドメイン、又はオリゴマー形
成ドメインとも呼ぶ）は、しばしば他のアミノ酸が介在する４または５個のロイ
シン残基をもつ反復性７残基反復を含む。ジッパードメインの例は、酵母転写因
子ＧＣＮ４中にみられるもの、およびラット肝中にみられる熱安定ＤＮＡ結合性
タンパク質（Ｃ／ＥＢＰ；Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２４３：１６８１，１９８９）である。２つの核形質転換タンパク質ｆｏｓ
およびｊｕｎもジッパードメインを示し、ネズミ原癌遺伝子の遺伝子産物ｃ−ｍ
ｙｃも同様である（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２
４０：１７５９，１９８８）。核癌遺伝子ｆｏｓおよびｊｕｎは、優先的にヘテ
ロ二量体を形成するジッパードメインを含む（Ｏ’Ｓｈｅａｅｔａｌ．，Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ，２４５：６４６，１９８９；Ｔｕｒｎｅｒｅｔａｌ．，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ，２４３：１６８９，１９８９）。これらのタンパク質において、ジ
ッパードメインは生物学的活性（ＤＮＡ結合）にとって必要である。

【００９１】パラミクソウイルス、コロナウイルス、麻疹ウイルスおよび多くのレトロウイ
ルスを含めた幾つかの異なるウイルスの融合誘導タンパク質（ｆｕｓｏｇｅｎｉ
ｃｐｒｏｔｅｉｎ）もジッパードメインをもつ（Ｂｕｃｋｌａｎｄｅｔａ
ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３８：５４７，１９８９；Ｂｒｉｔｔｏｎ，Ｎａｔｕｒ
ｅ，３５３：３９４，１９９１；ＤｅｌｗａｒｔａｎｄＭｏｓｉａｌｏｓ，
ＡＩＤＳＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＨｕｍａｎＲｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ
，６：７０３，１９９０）。これらの融合誘導ウイルスタンパク質中のジッパー
ドメインは、それらのタンパク質の膜貫通領域付近にある；ジッパードメインは
融合誘導タンパク質のオリゴマー構造に寄与する可能性が示唆されている。融合
誘導ウイルスタンパク質のオリゴマー化は融合ポア形成に関与する（Ｓｐｒｕｃ
ｅｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：３
５２３，１９９１）。ジッパードメインが熱ショック転写因子のオリゴマー化に
おいて役割を果たすことも最近報告された（Ｒａｂｉｎｄｒａｎｅｔａｌ．
，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９：２３０，１９９３）。

【００９２】ジッパードメインは、短い平行コイルドコイルとして折りたたまれる（Ｏ’Ｓ
ｈｅａｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：５３９，１９９１）。この平
行コイルドコイルの一般構造は十分に解明されており、１９５３年にＣｒｉｃｋ
により提唱された”ノブから穴へ（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）”充填
をもつ（Ｃｒｉｃｋ，ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，６：６８９，１９
５３）。ジッパードメインにより形成される二量体は７残基反復により安定化さ
れ、これはＭｃＬａｃｈｌａｎａｎｄＳｔｅｗａｒｔ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，９８：２９３，１９７５の表記法に従って（ａｂｃｄｅｆｇ）_nと表示さ
れる。ここで残基ａおよびｄは一般に疎水性残基であり、ｄはロイシンであって
、ヘリックスの同一面に並ぶ。一般に逆に荷電した残基が位置ｇおよびｅに生じ
る。こうして、２つのヘリックス状ジッパードメインから形成される平行コイル
ドコイルにおいて、第１ヘリックスの疎水性側鎖により形成される”ノブ”が第
２ヘリックスの側鎖間に形成される”穴”内へ充填される。

【００９３】位置ｄの残基（しばしばロイシン）は大きな疎水性安定化エネルギーをもたら
し、オリゴマー形成に重要である（Ｋｒｙｓｔｅｋｅｔａｌ．，Ｊ．Ｐｅｐ
ｔｉｄｅＲｅｓ．，３８，：２２９，１９９１）。最近、Ｌｏｖｅｊｏｙｅ
ｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９：１２８８，１９９３は、ヘリックスがｕ
ｐ−ｕｐ−ｄｏｗｎに走行している三本鎖α−ヘリックス束の合成を報告した。
彼らの研究で、疎水性安定化エネルギーはヘリックスモノマーからコイルドコイ
ルが形成される主駆動力を与えることが確認された。これらの研究は、静電相互
作用がコイルドコイルの化学量論および幾何学に関与することも示された。ロイ
シンジッパーの構造についての考察は、さらにＨａｒｂｕｒｙｅｔａｌ．，
Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６２：１４０１，１９９３にみられる。

【００９４】可溶性オリゴマータンパク質を製造するのに適したロイシンジッパードメイン
の例はＷＯ９４／１０３０８に記載され、肺界面活性タンパク質Ｄ（ＳＰＤ）由
来のロイシンジッパーはＨｏｐｐｅｅｔａｌ．，ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ
，３４４：１９１，１９９４に記載されており、これらを本明細書に参考として
援用する。それに融合した異種タンパク質の安定な三量体形成を可能にする修飾
ロイシンジッパーの使用が、Ｆａｎｓｌｏｗｅｔａｌ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．，６：２６７−２７８，１９９４に記載されている。ロイシンジッ
パーペプチドに融合した可溶性ポリペプチドを含む組換え融合タンパク質が適切
な宿主細胞において発現し、形成される可溶性オリゴマーを培養上清から回収す
る。

【００９５】ある種のロイシンジッパー部分は優先的に三量体を形成する。一例は、肺界面
活性タンパク質Ｄ（ＳＰＤ）由来のロイシンジッパーである：Ｈｏｐｐｅｅｔ
ａｌ．，ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ，３４４：１９１，１９９４およびＵＳＰ
５，７１６，８０５に記載：それらの全体を本明細書に参考として援用する。こ
の肺ＳＰＤ由来ロイシンジッパーペプチドは、アミノ酸配列ＰｒｏＡｓｐＶ
ａｌＡｌａＳｅｒＬｅｕＡｒｇＧｌｎＧｌｎＶａｌＧｌｕＡ
ｌａＬｅｕＧｌｎＧｌｙＧｌｎＶａｌＧｌｎＨｉｓＬｅｕＧ
ｌｎＡｌａＡｌａＰｈｅＳｅｒＧｌｎＴｙｒ（配列番号：１２）を
もつ。

【００９６】三量体形成を促進する他のロイシンジッパーの例は、アミノ酸配列ＡｒｇＭ
ｅｔＬｙｓＧｌｎＩｌｅＧｌｕＡｓｐＬｙｓＩｌｅＧｌｕＧ
ｌｕＩｌｅＬｅｕＳｅｒＬｙｓＩｌｅＴｙｒＨｉｓＩｌｅＧ
ｌｕＡｓｎＧｌｕＩｌｅＡｌａＡｒｇＩｌｅＬｙｓＬｙｓＬ
ｅｕＩｌｅＧｌｙＧｌｕＡｒｇ（配列番号：１３）である：ＵＳＰ５，
７１６，８０５に記載。他の１態様においては、Ｎ−末端Ａｓｐ残基が付加され
る；他の態様では、このペプチドがＮ−末端Ａｒｇ残基を欠如する。

【００９７】オリゴマー化促進特性を保持する、前記ジッパーペプチドのフラグメントも使
用できる。そのようなフラグメントの例には、前記アミノ酸配列中に存在するＮ
−末端またはＣ−末端残基１または２個を欠如するペプチドが含まれるが、これ
らに限定されない。ロイシンジッパーは、天然ロイシンジッパーペプチドから、
たとえば天然アミノ酸配列における保存置換により誘導でき、その際ペプチドが
オリゴマー化を促進する能力は保持される。

【００９８】天然の三量体タンパク質に由来する他のペプチドを三量体オリゴマーの調製に
使用できる。あるいは、オリゴマー化を促進する合成ペプチドを使用できる。具
体的態様においては、ロイシンジッパー部分のロイシン残基をイソロイシン残基
で交換する。イソロイシンを含むそのようなペプチドをイソロイシンジッパーと
呼ぶことはできるが、本明細書中で用いる”ロイシンジッパー”という用語に包
含する。

【００９９】ポリペプチドおよびそのフラグメントの調製本発明のポリペプチドおよびそのフラグメントの発現、単離および精製は任意
の適切な方法で実施でき、それには下記のものが含まれるが、これらに限定され
ない：

【０１００】発現系本発明は、ＤＮＡを含む組換えクローニングおよび発現ベクター、ならびにそ
れらの発現ベクターを含む宿主細胞も提供する。ＤＮＡを含む発現ベクターは、
そのＤＮＡがコードする本発明のポリペプチドまたはフラグメントを調製するの
に使用できる。ポリペプチドの調製方法は、そのポリペプチドをコードする組換
え発現ベクターで形質転換した宿主細胞をそのポリペプチドの発現が促進される
条件下で培養し、次いで発現したポリペプチドを培養物から回収することを含む
。発現したポリペプチドを精製するための方法が、用いる宿主細胞のタイプ、お
よびそのポリペプチドが膜結合形または宿主細胞から分泌される可溶性形のいず
れであるかなどの要因に従って異なることは、当業者に認識されるであろう。

【０１０１】任意の適切な発現系を使用できる。ベクターは本発明のポリペプチドまたはフ
ラグメントをコードするＤＮＡを含み、これは適切な転写または翻訳調節ヌクレ
オチド配列、たとえば哺乳動物、微生物、ウイルスまたは昆虫遺伝子に由来する
配列に、機能可能な状態で結合している。調節配列の例には、転写プロモーター
、オペレーターまたはエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、ならびに転
写および翻訳の開始および終止を制御する適宜な配列が含まれる。調節配列がＤ
ＮＡ配列に対して機能的に関係している場合、ヌクレオチド配列は機能可能な状
態で結合している。たとえば、プロモーターヌクレオチド配列がＤＮＡ配列の転
写を制御するならば、そのプロモーターヌクレオチド配列はＤＮＡ配列に機能可
能な状態で結合している。目的とする宿主細胞において複製する能力を与える複
製起点、および形質転換体を同定する選択遺伝子が、一般に発現ベクターに組み
込まれる。

【０１０２】さらに、適切なシグナルペプチドをコードする配列（天然または異種）を発現
ベクターに組み込むことができる。シグナルペプチド（分泌リーダー）のための
ＤＮＡ配列を本発明の核酸配列と読み枠が一致するように融合させることができ
、これによりそのＤＮＡがまず転写され、そしてｍＲＮＡがシグナルペプチドを
含む融合タンパク質に翻訳される。目的とする宿主細胞において機能性であるシ
グナルペプチドは、ポリペプチドの細胞外分泌を促進する。シグナルペプチドは
、ポリペプチドが細胞から分泌されるとポリペプチドから開裂する。

【０１０３】シグナルペプチドの開裂部位（１以上）がコンピュータープログラムにより推
定したものと異なる可能性があり、また組換えポリペプチドの発現に用いた宿主
細胞のタイプなどの要因に従って変動する可能性があることも、当業者に認識さ
れるであろう。タンパク質調製物はシグナルペプチドが１より多い部位で開裂し
たことにより生じる異なるＮ−末端アミノ酸をもつタンパク質分子の混合物を含
むことがある。本発明により得られる成熟タンパク質の具体的態様には、この残
基を配列番号：３の位置６、２３、２５、２６、３９、４１または４８に、およ
び配列番号：４の位置または１９にＮ−末端アミノ酸としてもつタンパク質が含
まれるが、これらに限定されない。

【０１０４】ポリペプチドの発現に適した宿主細胞には、原核細胞、酵母または高等な真核
細胞が含まれる。哺乳動物または昆虫の細胞が宿主細胞として用いるのに一般に
好ましい。細菌、真菌、酵母および哺乳動物細胞性宿主に用いるのに適したクロ
ーニングベクターおよび発現ベクターは、たとえばＰｏｕｗｅｌｓｅｔａｌ
．，ＣｌｏｎｉｎｇＶｅｃｔｏｒ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ニューヨーク，１９８５に記載されている。本明細書に開
示するＤＮＡ構築体に由来するＲＮＡを用いてポリペプチドを調製するために、
無細胞翻訳系も使用できる。

【０１０５】原核細胞系原核細胞には、グラム陰性またはグラム陽性生物が含まれる。形質転換に適し
た原核宿主細胞には、たとえば大腸菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ，
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、ならびにＰｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属に属す
る他のさまざまな種が含まれる。大腸菌などの原核宿主細胞では、ポリペプチド
は真核宿主細胞において組換えポリペプチドの発現を促進するためにＮ−末端メ
チオニン残基を含むことができる。このＮ−末端メチオニンは発現した組換えポ
リペプチドから開裂させることができる。

【０１０６】原核宿主細胞に用いる発現ベクターは、一般に１又はそれ以上の表現型選択性
マーカー遺伝子を含む。表現型選択性マーカー遺伝子は、たとえば抗生物質耐性
を与えるタンパク質、または独立栄養要求性を付与するタンパク質をコードする
遺伝子である。原核宿主細胞に有用な発現ベクターの例には、市販プラスミド、
たとえばクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）に由来する
ものが含まれる。ｐＢＲ３２２はアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性遺伝
子を含み、したがって形質転換細胞を同定するための簡単な手段を提供する。適
切なプロモーターおよびＤＮＡ配列をｐＢＲ３２２ベクターに挿入する。他の市
販ベクターには、たとえばｐＫＫ２２３−３（ＰｈａｒｍａｃｉａＦｉｎｅ
Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，スウェーデン国ウプサラ）およびｐＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅ
ｇａＢｉｏｔｅｃ，米国ワイオミング州マディソン）が含まれる。

【０１０７】組換え原核宿主細胞発現ベクターに一般に用いられるプロモーター配列には、
β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇ
ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７５：６１５，１９７８；およびＧｏｅｄｄ
ｅｌｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２８１：５４４，１９７９）、トリプトフ
ァン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａ
ｃｉｄｓＲｅｓ．，８：４０５７，１９８０；およびＥＰ−Ａ−３６７７６）
、およびｔａｃプロモーター（Ｍａｎｉａｔｉｓ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ｐ．４１２，Ｃｏｌｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８２）が含まれる。
特に有用な原核宿主細胞発現系は、ファージλＰ_LプロモーターおよびｃＩ８５
７ｔｓ熱不安定リプレッサー配列を用いる。λＰ_Lプロモーターの誘導体を組み
込んだ、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
から入手できるプラスミドベクターには、プラスミドｐＨＵＢ２（大腸菌ＪＭＢ
９株中に常在、ＡＴＣＣ３７０９２）およびｐＰＬｃ２８（大腸菌ＲＲ１中に常
在、ＡＴＣＣ５３０８２）が含まれる。

【０１０８】酵母系あるいは、ポリペプチドを酵母宿主細胞、好ましくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ属（たとえばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から発現させることができる。他
の属の酵母、たとえばＰｉｃｈｉａまたはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓも使用で
きる。酵母ベクターは、しばしば２μ酵母プラスミド由来の複製起点配列、自己
複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終
止のための配列、および選択性マーカー遺伝子を含む。酵母ベクターに適したプ
ロモーター配列には、特に下記に対するプロモーターが含まれる：メタロチオネ
イン、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎｅｔａｌ．，Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５５：２０７３，１９８０）または他の解糖酵素（
Ｈｅｓｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ａｄｖ．ＥｎｚｙｍｅＲｅｇ．，７：１４９，
１９６８；およびＨｏｌｌａｎｄｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７：４
９００，１９７８）、たとえばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デ
ヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフル
クトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸
ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホ−グル
コースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼ。酵母発現系に用いるための他の適
切なベクターおよびプロモーターについては、さらにＨｉｔｚｅｍａｎ、ＥＰ−
Ａ−７３，６５７に記載されている。他の例は、Ｒｕｓｓｅｌｌｅｔａｌ．
，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５８：２６７４，１９８２；およびＢｅｉｅｒ
ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３００：７２４，１９８２に記載されるグルコ
ース抑制性ＡＤＨ２プロモーターである。酵母と大腸菌の両方において複製可能
なシャトルベクターは、大腸菌における選択および複製のためのｐＢＲ３２２由
来のＤＮＡ配列（Ａｍｐ^r遺伝子および複製起点）を前記の酵母ベクターに挿入
することにより構築できる。

【０１０９】酵母α−因子リーダー配列を用いてポリペプチドの分泌を指令することができ
る。α−因子リーダー配列は、しばしばプロモーター配列と構造遺伝子配列の間
に挿入される（Ｋｕｒｊａｎｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ，３０：９３３，１９８
２；およびＢｉｔｔｅｒｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．，ＵＳＡ，８１：５３３０，１９８４）。酵母宿主からの組換えポリペプチ
ドの分泌を容易にするのに適した他のリーダー配列は当業者に既知である。リー
ダー配列をその３’末端付近で修飾して、１又はそれ以上の制限部位を含ませて
もよい。これは構造遺伝子へのリーダー配列の融合を容易にするであろう。

【０１１０】酵母の形質転換プロトコルは当業者に既知である。そのようなプロトコルの１
つがＨｉｎｎｅｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．，
ＵＳＡ，７５：１９２９，１９７８に記載されている。Ｈｉｎｎｅｎらのプロト
コルは、Ｔｒｐ⁺形質転換体を選択培地中で選択する。その際、選択培地は０．
６７％の酵母窒素塩基、０．５％のカザミノ酸、２％のグルコース、１０ｍｇ／
ｍｌのアデニン、および２０ｍｇ／ｍｌのウラシルを含む。

【０１１１】ＡＤＨ２プロモーター配列を含むベクターで形質転換した酵母宿主細胞を、発
現誘発のために”富化”培地中で増殖させてもよい。富化培地の例は、１％の酵
母エキス、２％のペプトンおよび１％のグルコースを含み、８０ｍｇ／ｍｌのア
デニンおよび８０ｍｇ／ｍｌのウラシルを補充したものである。グルコースが培
地から枯渇すると、ＡＤＨ２プロモーターの抑制解除が起きる。

【０１１２】哺乳動物系または昆虫系哺乳動物または昆虫宿主細胞培養系も組換えポリペプチドの発現に使用できる
。昆虫細胞における、異種タンパク質産生のためのバキュロウイルス系が、Ｌｕ
ｃｋｏｗｅｔａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：４７，１９８８
により概説されている。哺乳動物源の樹立細胞系も使用できる。適切な哺乳動物
宿主細胞系の例には、下記のものが含まれる：サル腎細胞のＣＯＳ−７系（ＡＴ
ＣＣＣＲＬ１６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ，２３：
１７５，１９８１）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ
１６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、および
ＢＨＫ（ＡＴＣＣＣＲＬ１０）細胞系、ならびにアフリカミドリザル腎細胞
系ＣＶ１由来のＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞系（ＡＴＣＣＣＣＬ７０）：ＭｃＭａ
ｈａｎｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ．，１０：２８２１，１９９１に記載。

【０１１３】ＤＮＡを哺乳動物細胞に導入するための確立された方法が、Ｋａｕｆｍａｎ，
Ｒ．Ｊ．，ＬａｒｇｅＳｃａｌｅＭａｍｍａｌｉａｎＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ，ｐｐ．１５−６９，１９９０により記載されている。市販試薬、たとえ
ばＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ脂質試薬（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）またはＬｉｐｏ
ｆｅｃｔａｍｉｎｅ−Ｐｌｕｓ脂質試薬を用いる他のプロトコルを用いて、細胞
をトランスフェクションすることができる（Ｆｅｌｇｎｅｒｅｔａｌ．，Ｐ
ｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８４：７４１３−７４１７，
１９８７）。さらにエレクトロポレーションを用いて常法により、たとえばＳａ
ｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２版，Ｖｏｌ−３．１，ＣｏｌｄＳｐｒ
ｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８９に記載の
方法で、哺乳動物細胞をトランスフェクションすることができる。安定な形質転
換体の選択は、当技術分野で既知の方法、たとえば細胞毒性薬物に対する耐性に
より実施できる。Ｋａｕｆｍａｎｅｔａｌ．，Ｍｅｔｈ．ｉｎＥｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ，１８５：４８７−５１１，１９９０に、幾つかの選択方式、たとえ
ばジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）耐性が記載されている。ＤＨＦＲ選択
に適した宿主系統は、ＤＨＦＲを欠失するＣＨＯのＤＸ−Ｂ１１系統である（Ｕ
ｒｌａｕｂｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ
，７７：４２１６−４２２０，１９８０）。ＤＨＦＲｃＤＮＡを発現するプラ
スミドをＤＸ−Ｂ１１系統に導入すると、このプラスミドを含む細胞のみが適切
な選択培地中で増殖できる。発現ベクターに組み込むことができる選択性マーカ
ーの他の例には、抗生物質、たとえばＧ４１８およびハイグロマイシンＢに対す
る耐性を付与するｃＤＮＡが含まれる。ベクターを宿した細胞を、これらの化合
物に対する耐性に基づいて選択できる。

【０１１４】哺乳動物宿主細胞発現ベクターのための転写および翻訳制御配列を、ウイルス
ゲノムから切り取ることができる。慣用されるプロモーター配列およびエンハン
サー配列は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０（
ＳＶ４０）およびヒトサイトメガロウイルスに由来する。ＳＶ４０ウイルスゲ
ノム由来のＤＮＡ配列、たとえばＳＶ４０起点、初期および後期プロモーター、
エンハンサー、スプライスおよびポリアデニル化部位を用いて、哺乳動物宿主細
胞における構造遺伝子配列の発現のための他の遺伝子要素を得ることができる。
ウイルス初期および後期プロモーターは特に有用である。これは、両者ともウイ
ルスゲノムからフラグメントとして容易に得られ、そしてウイルス複製起点も含
みうるからである（Ｆｉｅｒｓｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７３：１１３
，１９７８；およびＫａｕｆｍａｎ，Ｍｅｔｈ．ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，
１９９０）。これより小さな、または大きなＳＶ４０フラグメントも、ＳＶ４０
複製起点に位置するＨｉｎｄＩＩＩ部位からＢｇｌＩ部位へ向かって伸びる約２
５０ｂｐの配列が含まれるならば使用できる。

【０１１５】哺乳動物発現ベクターからの異種遺伝子の発現を改善することが示された他の
制御配列には、ＣＨＯ細胞由来の発現増大配列要素（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａ
ｕｇｍｅｎｔｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅｅｌｅｍｅｎｔ，ＥＡＳＥ）（Ｍｏｒ
ｒｉｓｅｔａｌ．，ＡｎｉｍａｌＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｐｐ
．５２９−５３４，１９９７；およびＷＯ９７／２５４２０）、およびアデノウ
イルス２由来の三部分リーダー（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅｌｅａｄｅｒ，ＴＲＰ
）およびＶＡ遺伝子ＲＮＡ（Ｇｉｎｇｅｒａｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．，２５７：１３４７５−１３４９１，１９８２）が含まれる。ウイル
ス由来の内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）配列は、ジシストロン性（
ｄｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）ｍＲＮＡを効率的に翻訳させる（Ｏｈｅｔａｌ．
，ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＤｅｖ
ｅｌｏｐｍｅｎｔ，３：２９５−３００，１９９３；およびＲａｍｅｓｈｅｔ
ａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，２４：２６９７−
２７００，１９９６）。異種ｃＤＮＡをジシストロン性ｍＲＮＡの一部として発
現させ、次いで選択性マーカー（たとえばＤＨＦＲ）の遺伝子を発現させると、
宿主のトランスフェクション性および異種ｃＤＮＡの発現が改善されることが示
された（Ｋａｕｆｍａｎ，Ｍｅｔｈ．ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９９０）
。ジシストロン性ｍＲＮＡを用いる発現ベクターの例は、Ｍｏｓｓｅｒｅｔ
ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２２：１５０−１６１，１９９７により
記載されるｐＴＲ−ＤＣ／ＧＦＰ、およびＭｏｒｒｉｓｅｔａｌ．，Ａｎｉ
ｍａｌＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｐｐ．５２９−５３４，１９９７に
より記載されるｐ２Ａ５Ｉである。

【０１１６】有用な高発現ベクターｐＣＡＶＮＯＴが、Ｍｏｓｌｅｙｅｔａｌ．，Ｃｅ
ｌｌ，５９：３３５−３４８，１９８９により記載されている。哺乳動物宿主細
胞に用いるための他の発現ベクターは、Ｏｋａｙａｍａｅｔａｌ．（Ｍｏｌ
．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，３：２８０，１９８３）による開示に従って構築でき
る。Ｃ１２７ネズミ乳上皮細胞における安定な高レベルの哺乳動物ｃＤＮＡ発現
に有用な系は、実質的にＣｏｓｍａｎｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．，２３：９３５，１９８６の記載に従って構築できる。Ｃｏｓｍａｎｅｔ
ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１２：７６８，１９８４に記載された有用な高発現ベ
クターＰＭＬＳＶＮ１／Ｎ４は、ＡＴＣＣ３９８９０として寄託されている。
他の有用な哺乳動物発現ベクターは、ＥＰ−Ａ−０３６７５６６およびＷＯ９１
／１８９８２に記載されており、これらを本明細書に参考として援用する。さら
に他の別法では、ベクターはレトロウイルス由来であってもよい。

【０１１７】他の有用な発現ベクターｐＦＬＡＧ（登録商標）を使用できる。ＦＬＡＧ（登
録商標）法は、低分子量（１ｋＤ）の親水性ＦＬＡＧ（登録商標）マーカーペプ
チドをｐＦＬＡＧ（登録商標）発現ベクターにより発現する組換えタンパク質の
Ｎ−末端に融合させることを中心とする。ｐＤＣ３１１はＣＨＯ細胞においてタ
ンパク質を発現させるのに用いる他の特殊なベクターである。ｐＤＣ３１１は、
目的遺伝子およびジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子を、ＤＨＦＲ翻
訳のための内部リボソーム結合部位、発現増大配列要素（ＥＡＳＥ）、ヒトＣＭ
Ｖプロモーター、三部分リーダー配列、およびポリアデニル化部分と共に含む、
ニシストロン配列を特色とする。

【０１１８】使用できるシグナルペプチドに関して、天然シグナルペプチドを所望により異
種のシグナルペプチドまたはリーダー配列で交換してもよい。シグナルペプチド
またはリーダーの選択は、組換えポリペプチドを産生させる宿主細胞のタイプな
どの要因に依存するであろう。たとえば哺乳動物宿主細胞において機能する異種
シグナルペプチドの例には、ＵＳＰ４，９６５，１９５に記載されるインターロ
イキン−７（ＩＬ−７）のシグナル配列；Ｃｏｓｍａｎｅｔａｌ．，Ｎａｔ
ｕｒｅ，３１２：７６８，１９８４に記載されるインターロイキン−２受容体の
シグナル配列；ＥＰ３６７，５６６に記載されるインターロイキン−４受容体シ
グナルペプチド；ＵＳＰ４，９６８，６０７に記載されるＩ型インターロイキン
−１受容体シグナルペプチド；およびＥＰ４６０，８４６に記載されるＩＩ型イ
ンターロイキン−１受容体シグナルペプチドが含まれる。

【０１１９】精製本発明は、ポリペプチドおよびそのフラグメントの単離および精製方法をも包
含する。

【０１２０】単離および精製本発明に包含される”単離した”ポリペプチドおよびそのフラグメントは、そ
れまたはそれらが自然界でみられる環境と等しい環境にないポリペプチドまたは
そのフラグメントである。本発明に包含される”精製した”ポリペプチドおよび
そのフラグメントは、他のタンパク質またはポリペプチドを本質的に含まないも
の、たとえば前記のような組換え発現系の精製物、あるいは天然の細胞および／
または組織などの非組換え源に由来する精製物である。

【０１２１】好ましい１態様において、組換えポリペプチドまたはフラグメントの精製は、
本発明のポリペプチドまたはフラグメントの精製を補助するために、他のポリペ
プチドへの本発明のポリペプチドまたはフラグメントの融合体を用いて達成でき
る。そのような融合パートナーには、前記のポリ−Ｈｉｓまたは他の抗原性同定
ペプチド、ならびに従来記載されているＦｃ部分を含めることができる。

【０１２２】いかなるタイプの宿主細胞についても、当業者に既知のように、組換えポリペ
プチドまたはフラグメントの精製方法は、用いる宿主細胞のタイプ、並びに組換
えポリペプチドまたはフラグメントが培地中へ分泌されるか否かなどの要因に従
って異なるであろう。

【０１２３】一般に組換えポリペプチドまたはフラグメントは、分泌されない場合は宿主細
胞から、または可溶性でありかつ分泌される場合は培地もしくは上清から単離し
、次いで１又はそれ以上の濃縮、塩析、イオン交換、疎水性相互作用、アフィニ
ティー精製、またはサイズ排除クロマトグラフィーの工程により単離できる。こ
れらの工程を達成するための具体的方法については、市販のタンパク質濃縮フィ
ルター、たとえばＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅＰｅｌｌｉｃｏｎ限
外濾過ユニットを用いて培養培地をまず濃縮できる。濃縮工程後、濃縮物を精製
マトリックス、たとえばゲル濾過媒体に適用することができる。あるいは、アニ
オン交換樹脂、たとえばペンダントジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基をもつ
マトリックスまたは支持体を使用できる。マトリックスは、アクリルアミド、ア
ガロース、デキストラン、セルロース、またはタンパク質精製に慣用される他の
タイプのものであってよい。あるいは、カチオン交換工程を使用できる。適切な
カチオン交換体には、スルホプロピル基またはカルボキシメチル基を含む各種の
不溶性マトリックスが含まれる。さらに、クロマトフォーカシング工程を使用で
きる。あるいは、疎水性相互作用クロマトグラフィー工程を使用できる。適切な
マトリックスは樹脂に結合したフェニルまたはオクチル部分であろう。さらに、
組換えタンパク質を選択的に結合するマトリックスを用いるアフィニティークロ
マトグラフィーを使用できる。用いられるそのような樹脂の例は、レクチンカラ
ム、色素カラム、および金属キレートカラムである。最後に、ポリペプチドをさ
らに精製するために、疎水性の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬ
Ｃ）媒体（たとえばシリカゲル、またはペンダントメチル、オクチル、オクチル
デシルその他の脂肪族基をもつポリマー樹脂）を用いる１以上のＲＰ−ＨＰＬＣ
工程を採用できる。さまざまに組み合わせた上記精製工程のうち幾つかまたは全
部は周知であり、単離および精製した組換えタンパク質を得るのに採用できる。

【０１２４】本発明のポリペプチド結合性タンパク質、たとえば本発明のポリペプチドに対
して形成されたモノクローナル抗体を含むアフィニティーカラムを用いて、発現
ポリペプチドをアフィニティー精製することもできる。これらのポリペプチドは
常法により、たとえば高塩類の溶離緩衝液により、アフィニティーカラムから分
離し、次いで用いる低塩類緩衝液中へ透析するか、あるいは用いるアフィニティ
ーマトリックスに応じてｐＨその他の成分を変化させることにより、あるいはア
フィニティー部分の天然基質、たとえば本発明によるポリペプチドを用いて競合
分離することができる。

【０１２５】本発明のこの側面においては、ポリペプチド結合性タンパク質、たとえば本発
明の抗ポリペプチド抗体、または本発明のポリペプチドと相互作用しうる他のタ
ンパク質を、固相支持体、たとえばカラムクロマトグラフィーマトリックスまた
はこれに類する基質であって、表面に本発明のポリペプチドを発現する細胞の同
定、分離もしくは精製に適したものに結合させることができる。本発明のポリペ
プチドを結合するタンパク質は、任意の手段で固相接触表面に付着させることが
できる。たとえば磁性マイクロスフェアをこれらのポリペプチド結合性タンパク
質でコーティングし、そして磁界によりインキュベーション容器内に保持する。
細胞混合物の懸濁液を、そのようなポリペプチド結合性タンパク質をもつ固相と
接触させる。それらの表面に本発明のポリペプチドをもつ細胞はこの固定したポ
リペプチド結合性タンパク質に結合し、次いで結合していない細胞を洗い去る。
このアフィニティー結合法は、そのようなポリペプチド発現細胞を溶液から精製
、スクリーニングまたは分離するのに有用である。陽性選択された細胞を固相か
ら離脱させる方法は当技術分野で既知であり、たとえば酵素の使用が含まれる。
そのような酵素は好ましくは細胞に対して無毒性かつ無害であり、好ましくは細
胞表面結合性パートナーを開裂させる特性をもつ。

【０１２６】あるいは、本発明のポリペプチド発現細胞を含有する疑いのある細胞混合物を
まず本発明のビオチニル化ポリペプチド結合性タンパク質と共にインキュベート
することができる。インキュベーション期間は、本発明のポリペプチドに確実に
十分に結合させるために、典型的には少なくとも１時間である。次いで得られた
混合物をアビジンコーテッドビーズ充填カラムに導通すると、アビジンに対する
ビオチンの高アフィニティーによりポリペプチド結合性細胞がビーズに結合する
。アビジンコーテッドビーズは当技術分野で既知である（Ｂｅｒｅｎｓｏｎｅ
ｔａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０Ｄ：２３９，１９８６）。
結合していない物質の洗浄および結合細胞の放出は、常法により実施される。

【０１２７】目的純度は意図するタンパク質の用途に依存する。たとえばタンパク質をイン
ビボ投与する場合は比較的高い純度が望ましい。そのような場合、ＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に際して他のタンパク質に相
当するタンパク質バンドが検出されないほどポリペプチドを精製する。差別グリ
コシル化、翻訳後差別プロセシングなどに起因するポリペプチドに対応する多数
のバンドをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより視覚化しうることは、当業者に認識されるで
あろう。最も好ましくは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析における単一タンパク質
バンドに示されるように実質的に均質になるまで、本発明のポリペプチドを精製
する。タンパク質バンドは、銀染色、クーマシーブルー染色、または（タンパク
質が放射性標識されている場合）オートラジオグラフィーにより視覚化できる。

【０１２８】アッセイ法精製した本発明のポリペプチド（タンパク質、ポリペプチド、フラグメント、
変異体、オリゴマー、および他の形を含む）が結合パートナーを結合する能力を
、任意の適切なアッセイ法、たとえば一般的な結合アッセイ法により試験するこ
とができる。たとえばポリペプチドを検出可能な試薬（たとえば放射性核種、発
色団、比色反応または蛍光反応を触媒する酵素など）で標識することができる。
結合パートナーを発現する細胞と標識ポリペプチドを接触させる。次いで細胞を
洗浄して結合していない標識ポリペプチドを除去し、その標識の性質に従って選
択した適切な方法で細胞結合標識の存在を測定する。

【０１２９】結合アッセイ法の一例は下記のとおりである。結合パートナーｃＤＮＡを含む
組換え発現ベクターを当技術分野で周知の方法により構築する。１０ｃｍ²の皿
中のＣＶ１−ＥＢＮＡ−１細胞を、この組換え発現ベクターでトランスフェクシ
ョンする。ＣＶ１−／ＥＢＮＡ−１細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１０４７８）は、
ＣＭＶ極初期エンハンサー／プロモーター駆動によりＥＢＶ核抗原−１を構成的
に発現する。ＣＶ１−ＥＢＮＡ−１はアフリカミドリザル腎細胞系ＣＶ−１（Ａ
ＴＣＣＣＣＬ７０）に由来する：ＭｃＭａｈａｎｅｔａｌ．（ＥＭＢＯＪ．，１０：２８２１，１９９１）により記載。

【０１３０】トランスフェクションした細胞を２４時間培養し、次いで各皿の細胞を２４ウ
ェルプレートに分ける。さらに４８時間培養した後、トランスフェクションした
細胞（約４×１０⁴個／ウェル）をＢＭ−ＮＦＤＭ、すなわち５０ｍｇ／ｍｌの
脱脂粉乳を添加した結合用媒質（ＲＰＭＩ１６４０；２５ｍｇ／ｍｌのウシ血
清アルブミン、２ｍｇ／ｍｌのナトリウムアジド、２０ｍＭのＨｅｐｅｓを含有
、ｐＨ７．２）で洗浄する。次いで細胞を３７℃で１時間、種々の濃度の、たと
えば前記に従って調製した可溶性ポリペプチド／Ｆｃ融合タンパク質と共にイン
キュベートする。次いで細胞を洗浄し、結合用媒質中、定常飽和濃度の¹²⁵Ｉ−
マウス抗ヒトＩｇＧと共に３７℃で１時間、穏やかに撹拌しながらインキュベー
トする。十分な洗浄後、細胞をトリプシン処理により離脱させる。

【０１３１】上記で用いたマウス抗ヒトＩｇＧはヒトＩｇＧのＦｃ領域に対して形成された
ものであり、ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ社（ペンシルベニア州ウェスト・グローブ）から入手できる。この抗
体を標準クロラミン−Ｔ法により放射性ヨウ素化する。この抗体は細胞に結合し
ている任意のポリペプチド／Ｆｃ融合タンパク質のＦｃ部分に結合するであろう
。すべてのアッセイにおいて、¹²⁵Ｉ−抗体の非特異的結合を、融合タンパク質
／Ｆｃの不存在下、ならびにＦｃ融合タンパク質および２００倍モル過剰の非標
識マウス抗ヒトＩｇＧ抗体の存在下でアッセイする。

【０１３２】細胞結合¹²⁵Ｉ−抗体をＰａｃｋａｒｄＡｕｔｏｇａｍｍａ計数器で定量す
る。アフィニティー計算値（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．，５１：６６０，１９４９）を、Ｍｉｃｒｏｖａｘコンピューターで行
うＲＳ／Ｉ（ＢＢＮＳｏｆｔｗａｒｅ，マサチュセッツ州ボストン）により求
める。

【０１３３】他のタイプの適切な結合アッセイは競合結合アッセイである。たとえば、変異
体の生物学的活性は、結合パートナーへの結合に対して変異体が天然タンパク質
と競合する能力をアッセイすることにより判定される。

【０１３４】競合結合アッセイは常法により行うことができる。競合結合アッセイに使用で
きる試薬には、本発明の放射性標識ポリペプチド、および結合パートナー（内因
性のものまたは組換え体）を発現する無傷の細胞が含まれる。たとえば放射性標
識した可溶性ＩＬ−１ゼータフラグメントを、細胞表面ＩＬ−１ゼータ受容体へ
の結合に対して可溶性ＩＬ−１ゼータ変異体との競合に使用できる。無傷の細胞
の代わりに、プロテインＡまたはプロテインＧ（固相上）とＦｃ部分の相互作用
により固相に結合した可溶性結合パートナー／Ｆｃ融合タンパク質を使用できる
。プロテインＡまたはプロテインＧを含むクロマトグラフィーカラムには、Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ社（ニュージャージー州ピスカッタウェイ）か
ら入手できるものが含まれる。

【０１３５】他のタイプの競合結合アッセイは、放射性標識した可溶性結合パートナー、た
とえば可溶性ＩＬ−１ゼータ受容体／Ｆｃ融合体、またはＸｒｅｃ２リガンド／
Ｆｃ融合タンパク質、および結合パートナーを発現する無傷の細胞を用いる。定
性的結果は競合オートラジオグラフィープレート結合アッセイにより得ることが
でき、一方、定量的結果を求めるにはＳｃａｔｃｈａｒｄプロット（Ｓｃａｔｃ
ｈａｒｄ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，５１：６６０，１９４９）を
利用してもよい。

【０１３６】ＩＬ−１ゼータ、ＴＤＺ．１、ＴＤＺ．２、ＴＤＺ．３およびＸｒｅｃ２核酸またはオリゴヌクレオチドの使用ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、およびそのオリゴヌクレオチドを含めた本発明の
核酸は、前記のポリペプチド発現のほかに下記に使用できる： − ＩＬ−１リガンドおよび受容体ファミリーのタンパク質をコードする核酸
を同定するためのプローブとして； − ヒト第２およびＸ染色体を同定するために； − ヒト第２およびＸ染色体上の遺伝子地図を作製するために； − ヒト第２およびＸ染色体に関連する特定の疾病、症状その他の状態に関連
する遺伝子を同定するために； − ＩＬ−１ゼータ、ＴＤＺ．１、ＴＤＺ．２、ＴＤＺ．３およびＸｒｅｃ２
遺伝子によりコードされるポリペプチドの発現を阻害するための一本鎖センスま
たはアンチセンスオリゴヌクレオチドとして； − 個体において欠陥遺伝子の検出を補助するために；ならびに − 遺伝子治療のために。

【０１３７】プローブ本発明の核酸の使用には、プローブまたはプライマーとしてのフラグメントの
使用が含まれる。そのようなフラグメントは一般にＤＮＡ配列の少なくとも約１
７の連続ヌクレオチドを含む。他の態様においては、ＤＮＡフラグメントはＤＮ
Ａ配列の少なくとも３０、または少なくとも６０の連続ヌクレオチドを含む。

【０１３８】他の哺乳動物種に由来する配列番号：１、２、５、６および７の相同体も本発
明において企図されるので、配列番号：１、２、５、６および７のヒトＤＮＡに
基づくプローブを用いて、他の哺乳動物種に由来するｃＤＮＡライブラリーを一
般的な種間ハイブリダイゼーション法によりスクリーニングできる。

【０１３９】遺伝暗号の知識を前記のアミノ酸配列と組み合わせて用いて、縮重オリゴヌク
レオチドの組を調製できる。そのようなオリゴヌクレオチドは、たとえばポリメ
ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においてプライマーとして有用であり、これによりＤ
ＮＡフラグメントを単離および増幅する。

【０１４０】染色体地図作成配列番号：１のＩＬ−１ゼータ、または配列番号：５、６および７のＩＬ−１
ゼータスプライス変異体の核酸の全部または一部（オリゴヌクレオチドを含む）
を当業者に周知の方法で用いて、ヒト第２染色体、およびＩＬ−１リガンドファ
ミリーメンバーのＤＮＡを含むその特定の遺伝子座を同定できる。さらに、配列
番号：２のＸｒｅｃ２の核酸の全部または一部（オリゴヌクレオチドを含む）を
用いて、ヒトＸ染色体、およびＩＬ−１受容体ファミリーメンバーのＤＮＡを含
むその特定の遺伝子座を同定できる。有用な方法には、上記配列またはその部分
（オリゴヌクレオチドを含む）を種々の周知の方法、たとえば放射線ハイブリッ
ドマッピング（高分解能）、染色体スプレッドへのｉｎｓｉｔｕハイブリダイ
ゼーション（中等度分解能）、および個々のヒト染色体を含むハイブリッド細胞
系に対するサザンブロットハイブリダイゼーション（低分解能）におけるプロー
ブとしての使用が含まれるが、これらに限定されない。

【０１４１】たとえば放射線ハイブリダイゼーションにより染色体地図を作製できる。Ｗｈ
ｉｔｅｔｅｈｅａｄＩｎｓｔｉｔｕｔｅ／ＭＩＴＣｅｎｔｅｒｆｏｒＧ
ｅｎｏｍｅＲｅｓｅａｒｃｈの９３放射線ハイブリッドのＧｅｎｅｂｒｉｄｇ
ｅ４パネルを用いてＰＣＲを行う（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｏｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｆｔｐ／ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ／ｈｕｍａｎ＿ＳＴＳ＿
ｒｅｌｅａｓｅｓ／ｊｕｌｙ９７／ｒｈｍａｐ／ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅ４．ｈｔ
ｍｌ）。目的遺伝子の推定エキソン内にあって、ヒトゲノムＤＮＡ由来の生成物
を増幅するが、ハムスターゲノムＤＮＡを増幅しないプライマーを用いる。ＰＣ
Ｒの結果をインターネット（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｓｅｑ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅ
ｄｕ）上のＷｈｉｔｅｔｅｈｅａｄ／ＭＩＴＲａｄｉａｔｉｏｎＭａｐｐｉ
ｎｇサイトに提示するデータベクターに変換する。データの得点を求め、放射線
ハイブリッド地図上の既知のＳｅｑｕｅｎｃｅＴａｇＳｉｔｅ（ＳＴＳ）マ
ーカーに対比して染色体帰属および配置を提供する。以下のウェブサイトで放射
線ハイブリッドマッピングについての情報がさらに得られる：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｏｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｆｔｐ／ｄｉｓ
ｔｒｉｂｕｔｉｏｎ／ｈｕｍａｎ＿ＳＴＳ＿ｒｅｌｅａｓｅｓ／ｊｕｌｙ９７／
０７−９７．ＩＮＴＲＯ．ｈｔｍｌ

【０１４２】関連疾病の同定後記のように、配列番号：１のＩＬ−１ゼータ、ならびに配列番号：５、６お
よび７のＩＬ−１ゼータスプライス変異体の核酸は、放射線ハイブリダイゼーシ
ョンおよびハイスループット−ショットガン配列決定法により、ヒト第２染色体
の２ｑ１１−１２領域にマッピングされた。ヒト第２染色体は、緑内障、外胚葉
性異形成症、インスリン依存性糖尿病、しわ皮膚症候群、Ｔ細胞性白血病／リン
パ腫、および頚骨筋ジストロフィー症を含めた特定の疾病（これらに限定されな
い）に関連する。配列番号：２のＸｒｅｃ２の核酸は、放射線ハイブリダイゼー
ションおよびハイスループット−ショットガン配列決定法によりヒトＸ染色体の
Ｘｐ２２領域にマッピングされた。ヒトＸ染色体は、網膜分離症、脳回欠損、皮
質下層状ヘテロピア、精神発達遅滞、ｃｏｗｃｈｏｃｋ症候群、ｂａｚｅｘ症候
群、多毛症、リンパ滲出性症候群、免疫不全症、ランガー中割球異形成症、およ
び白血病に関連する。したがって当業者は、配列番号：１、５、６、７および２
の核酸またはそのフラグメントを周知の方法で用いて、第２およびＸ染色体にマ
ッピングされる遺伝子に関連する異常を分析できる。これにより、このマーカー
が再配列または欠失した状態を識別できる。さらに、配列番号：１、２、５、６
および７の核酸分子またはそのフラグメントを、位置が分かっていない他の遺伝
子をマッピングするためのポジショナルマーカーとして使用できる。

【０１４３】このＤＮＡは、本発明の核酸に対応する遺伝子の欠陥または量の不足により仲
介される（直接的または間接的に）障害の治療方法の開発に使用できる。本明細
書に開示した天然ヌクレオチド配列により欠陥遺伝子を検出し、正常な遺伝子と
交換することができる。欠陥遺伝子は、インビトロ診断アッセイ法において、ま
た本明細書に開示した天然ヌクレオチド配列とこの遺伝子をもつ疑いのある者か
らの遺伝子のヌクレオチド配列を比較することにより検出できる。

【０１４４】センス−アンチセンス本発明の核酸の他の有用なフラグメントには、ターゲットｍＲＮＡ（センス）
またはＤＮＡ（アンチセンス）配列に結合しうる一本鎖核酸配列（ＲＮＡまたは
ＤＮＡ）を含むセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。本発
明によるアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ（配列番号：
１、２、５、６および７）のフラグメントを含む。そのようなフラグメントは一
般に、少なくとも約１４ヌクレオチド、好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチド
を含む。あるタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づいてアンチセンスまた
はセンスオリゴヌクレオチドを誘導できることは、たとえばＳｔｅｉｎｅｔ
ａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，４８：２６５９，１９８８；およびｖａｎ
ｄｅｒＫｒｏｌｅｔａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６：９５８，
１９８８に記載されている。

【０１４５】アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドがターゲット核酸配列に結合す
ると二本鎖が形成され、これがＲＮＡｓｅＨによるｍＲＮＡの分解増大、スプラ
イシングの阻害、転写または翻訳の早期終止を含めた幾つかの手段の１つにより
、あるいは他の手段により、タンパク質発現を遮断または阻害する。したがって
アンチセンスオリゴヌクレオチドをタンパク質発現の遮断に使用できる。アンチ
センスまたはセンスオリゴヌクレオチドはさらに、修飾した糖−ホスホジエステ
ル主鎖（または他の糖結合、たとえばＷＯ９１／０６６２９に記載されたもの）
をもつオリゴヌクレオチドを含み、そのような糖結合は内因性エンドヌクレアー
ゼに耐性である。耐性糖結合をもつこのようなオリゴヌクレオチドはインビボで
安定である（すなわち酵素分解に耐えうる）が、ターゲットヌクレオチド配列に
結合しうる特異性を保持する。

【０１４６】センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例には、たとえばＷＯ９
０／１０４４８に記載された有機部分、あるいは、ターゲット核酸配列に対する
オリゴヌクレオチドのアフィニティーを高めるその他の有機部分、たとえばポリ
−（Ｌ−リシン）、に共有結合したオリゴヌクレオチドが含まれる。さらにまた
、インターカレーション剤、たとえばエリプチシン、およびアルキル化剤または
金属錯体をセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させて、ターゲ
ットヌクレオチド配列に対するアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドの
結合特異性を改変することができる。

【０１４７】アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、たとえばリポフェクション
、ＣａＰＯ₄仲介によるＤＮＡトランスフェクション、エレクトロポレーション
を含めた任意の遺伝子伝達法により、またはエプスタインバーウイルスなどの遺
伝子伝達ベクターを用いて、ターゲット核酸配列を含む細胞に導入できる。

【０１４８】センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＯ９１／０４７５３に記
載されるように、リガンド結合性分子との結合体の形成により、ターゲット核酸
配列を含む細胞に導入することもできる。適切なリガンド結合性分子には、細胞
表面受容体、成長因子、他のサイトカイン、または細胞表面受容体に結合する他
のリガンドが含まれるが、これらに限定されない。好ましくはリガンド結合性分
子の結合は、実質的にリガンド結合性分子がそれの対応分子または受容体に結合
するのを妨害せず、あるいはセンスもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドま
たはそれの結合形が細胞に進入するのを実質的に遮断しない。

【０１４９】あるいはセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＯ９０／１０４
４８に記載されるように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成により、ター
ゲット核酸配列を含む細胞に導入できる。センスまたはアンチセンスオリゴヌク
レオチド複合体は、好ましくは細胞内で内因性リパーゼにより解離する。

【０１５０】ＩＬ−１ゼータ、ＴＤＺ．１、ＴＤＺ．２、ＴＤＺ．３およびＸｒｅｃ２ポリペプチドおよびフラグメント化ポリペプチドの使用用途には下記のものが含まれるが、これらに限定されない： − タンパク質の精製およびその活性測定 − 運搬剤 − 療法薬および研究用試薬 − ペプチドフラグメント化の対照 − 未知タンパク質の同定 − 抗体の産生精製試薬本発明のポリペプチドはそれぞれタンパク質精製試薬として使用できる。これ
らのポリペプチドを固体支持体材料に結合させ、アフィニティークロマトグラフ
ィーによりパートナータンパク質を精製するのに使用できる。具体的な態様にお
いては、ポリペプチド（本明細書に記載した、結合パートナーを結合しうる任意
の形のもの）を、常法により固体支持体に結合させる。一例として、タンパク質
のアミノ酸側鎖上の官能基と反応する官能基を含むクロマトグラフィーカラムを
利用できる（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ社、ニュージャージー州ピス
カッタウェイ）。別法では、ポリペプチド／Ｆｃタンパク質（前記）をプロテイ
ンＡ−またはプロテインＧ−含有クロマトグラフィーカラムにＦｃ部分との相互
作用により結合させる。

【０１５１】本発明のポリペプチドは、細胞表面に結合パートナーを発現する細胞を精製ま
たは同定するのにも使用できる。ポリペプチドを固相、たとえばカラムクロマト
グラフィーマトリックスまたは同様な適切な支持体に結合させる。たとえば磁性
マイクロスフェアをこれらのポリペプチドでコーティングし、そして磁界により
インキュベーション容器内に保持することができる。結合パートナー発現細胞を
含有する細胞混合物の懸濁液を、上記ポリペプチドを保有する固相と接触させる
。細胞表面に結合パートナーを発現する細胞はこの固定したポリペプチドに結合
し、次いで結合していない細胞を洗い去る。

【０１５２】あるいは、前記ポリペプチドを検出可能部分に結合させ、次いで結合パートナ
ー発現について検査すべき細胞と共にインキュベートすることができる。インキ
ュベーション後、結合していない標識物質を除去し、細胞上に検出可能部分が存
在するか否かを判定する。

【０１５３】さらに他の態様においては、結合パートナー発現細胞を含有する疑いのある細
胞混合物をビオチニル化ポリペプチドと共にインキュベートする。インキュベー
ション期間は、確実に十分に結合させるために一般に少なくとも１時間である。
次いで得られた混合物をアビジンコーテッドビーズ充填カラムに導通すると、ア
ビジンに対するビオチンの高アフィニティーにより目的細胞がビーズに結合する
。アビジンコーテッドビーズの使用方法は既知である（Ｂｅｒｅｎｓｏｎｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０Ｄ：２３９，１９８６）。結
合していない物質の洗浄および結合細胞の離脱は、常法により実施される。

【０１５４】活性測定ポリペプチドは、結合パートナータンパク質の結合アフィニティーに関してそ
れらの生物学的活性を測定するのにも使用できる。たとえば、前記ポリペプチド
は”品質確認”試験を実施する者が、たとえば種々の条件下でのタンパク質の貯
蔵寿命および安定性を監視するために使用できる。たとえば、前記ポリペプチド
は、種々の温度で貯蔵した、または種々の細胞タイプにおいて産生した結合パー
トナータンパク質の生物学的活性を測定するための結合アフィニティー試験に使
用できる。これらのタンパク質は、結合パートナータンパク質の修飾（たとえば
化学修飾、トランケーション、変異など）後に生物学的活性が保持されているか
どうかを判定するためにも使用できる。修飾した結合パートナータンパク質の結
合アフィニティーを、修飾していない結合パートナータンパク質のものと比較し
、修飾が結合パートナーの生物学的活性に及ぼす不都合な作用を検出する。こう
して結合パートナータンパク質をたとえば試験研究に用いる前にその生物学的活
性を確認できる。

【０１５５】運搬剤前記ポリペプチドは、それに結合した薬剤を結合パートナー保有細胞へ運搬す
るためのキャリヤーとしても使用できる。たとえば、前記ポリペプチドはインビ
トロまたはインビボ法でそのような細胞（または細胞表面に結合パートナーを発
現することが認められた他の細胞タイプ）へ診断薬または療法薬を運搬するため
に使用できる。

【０１５６】ポリペプチドに結合させうる検出薬（診断薬）または療法薬には、毒素、他の
細胞毒性物質、薬物、放射性核種、発色団、比色反応または蛍光反応を触媒する
酵素などが含まれるが、これらに限定されない。個々の薬剤は意図する用途に従
って選択される。毒素には、リシン（ｒｉｃｉｎ）、アブリン、ジフテリア毒素
、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ外毒素Ａ、リボソーム不活性
化タンパク質、マイコトキシン、たとえばトリコテセン類、ならびにその誘導体
およびフラグメント（たとえば一本鎖）が含まれる。診断用として適した放射性
核種、たとえば¹²³Ｉ、¹³¹Ｉ、^99mＴｃ、¹¹¹Ｉｎ、および⁷⁶Ｂｒが含まれるが、
これらに限定されない。療法診断用として適した放射性核種の例は、¹³¹Ｉ、²¹¹ Ａｔ、⁷⁷Ｂｒ、¹⁸⁶Ｒｅ、¹⁸⁸Ｒｅ、²¹²Ｐｂ、²¹²Ｂｉ、¹⁰⁹Ｐｄ、⁶⁴Ｃｕ、およ
び⁶⁷Ｃｕである。

【０１５７】そのような薬剤を、任意の適切な常法により前記ポリペプチドに結合させるこ
とができる。ポリペプチドは、たとえば目的薬剤上の官能基と反応して共有結合
を形成しうる官能基をアミノ酸側鎖上に含む。あるいは、前記のタンパク質また
は薬剤を誘導体化して、目的とする反応性官能基を生成または結合させることが
できる。誘導体化は、タンパク質に種々の分子を結合させるのに使用できる二官
能型結合性試薬のひとつを結合させることを伴うものであってもよい（Ｐｉｅｒ
ｃｅＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ，イリノイ州ロックフォード）。タン
パク質を放射性標識するための多数の方法が知られている。放射性核種金属を、
たとえば適切な二官能性キレート化剤の使用によりポリペプチドに結合させても
よい。

【０１５８】こうして、ポリペプチド、および適切な診断薬または療法薬を含む結合体（好
ましくは共有結合）が調製される。これらの結合体を、個々の用途に適切な量で
投与し、または他の方法で使用できる。

【０１５９】療法薬本発明のポリペプチドは、これらのポリペプチドの欠陥または量の不足により
仲介される（直接的または間接的に）障害の治療方法の開発に使用できる。これ
らのポリペプチドは、そのような障害を伴う哺乳動物に投与できる。

【０１６０】これらのポリペプチドは、インビトロまたはインビボ法で結合パートナーの生
物学的活性を阻害するのにも使用できる。たとえば精製Ｘｒｅｃ２受容体ポリペ
プチドを用いて、内因性の細胞表面Ｘｒｅｃ２受容体にＸｒｅｃ２リガンドが結
合するのを阻害できる。あるいは、精製ＩＬ−１ゼータポリペプチドまたはその
いずれかのスプライス変異体を用いて、内因性ＩＬ−１ゼータポリペプチドまた
はそのスプライス変異体が細胞表面受容体に結合するのを阻害できる。内因性Ｘ
ｒｅｃ２受容体に対するＸｒｅｃ２リガンドの結合により生じる生物学的効果が
こうして阻害される。

【０１６１】本発明のポリペプチドは、結合パートナー仲介による障害を処置するために哺
乳動物に投与できる。そのような結合パートナー仲介による障害には、結合パー
トナーにより引き起こされる（直接的または間接的に）か、または悪化する状態
が含まれる。

【０１６２】本発明の組成物は、本明細書に記載する任意の形のポリペプチド、たとえば天
然タンパク質、変異体、誘導体、オリゴマー、および生物学的活性フラグメント
を含有することができる。具体的な態様においては、組成物は可溶性ポリペプチ
ド、または本発明の可溶性ポリペプチドを含むオリゴマーを含む。

【０１６３】ＩＬ−１ゼータポリペプチドの特に重要な領域は、分子の二次構造を表す図２
に示した分子モデルから誘導できる。このモデルはＩＬ−１βおよびＩＬ−１ｒ
ａの結晶構造に基づく。図中、β−鎖を黄色で示し、それらの方向を矢印で示す
。β−ターーンを青色で、コイルを緑で示す。このモデルは、分子のひずみを生
じることなく、ＩＬ−１ゼータ構造をＩＬ−１βおよびＩＬ−１ｒａ構造に重ね
うることを証明する。この分子の信頼度は高いので、ＩＬ−１ゼータに由来する
療法分子を作製するための合理的な薬物設計に使用できる。

【０１６４】有効量の本発明ポリペプチドを他の成分、たとえば生理学的に許容できる希釈
剤、キャリヤーまたは賦形剤と組み合わせたものを含む組成物が本発明において
提供される。これらのポリペプチドを医薬的に有用な組成物の調製に用いる既知
方法に従って配合できる。それらを唯一の有効物質として、またはその適応症に
適した他の既知有効物質と共に、医薬的に許容できる希釈剤（たとえば食塩水、
トリス−ＨＣｌ、アセテート、およびリン酸緩衝溶液）、保存剤（たとえばチメ
ロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、乳化剤、可溶化剤、アジュバント
および／またはキャリヤーと混和することができる。医薬組成物に適した配合物
には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ，ペンシル
ベニア州イーストン，１９８０に記載のものが含まれる。

【０１６５】さらに、そのような組成物をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、金属イオン
と複合体形成するか、あるいは高分子化合物、たとえばポリ酢酸、ポリグリコー
ル酸、ヒドロゲル、デキストランなどに取り込ませるか、あるいはリポソーム、
マイクロエマルション、ミセル、単膜もしくは多重膜ベシクル、赤血球ゴースト
またはスフェロプラストに取り込ませることができる。そのような組成物は物理
的状態、溶解度、安定性、インビボ放出速度、およびインビボクリアランス速度
に影響を及ぼすので、意図する用途に従って選択できる。

【０１６６】本発明の組成物は任意の適切な様式で、たとえば局所的に、非経口的に、また
は吸入により投与できる。”非経口”という用語には、注射、たとえば皮下、静
脈内または筋肉内経路によるものが含まれ、局所投与、たとえば疾病または損傷
の部位における投与も含まれる。インプラントからの持続放出も企図される。適
切な投与量が処置すべき障害の性質、患者の体重、年齢および全般的状態、なら
びに投与経路に応じて異なることは、当業者に認識されるであろう。

【０１６７】動物試験に従って予め投与量を判定でき、ヒト投与のためのスケーリングは技
術分野で受け入れられている方法に従って行われる。生理学的に許容できる配合物中に核酸を含む組成物も考慮される。ＤＮＡをた
とえば注射用に配合できる。

【０１６８】研究用試薬本発明ポリペプチドの他の用途は、ＩＬ−１ゼータまたはそのスプライス変異
体とそれの結合パートナーとの相互作用、およびＸｒｅｃ２とそれの結合パート
ナーとの相互作用により生じる、あるいはこれらの相互作用を阻害することによ
り生じる生物学的効果を種々の細胞において調べるための研究道具としてである
。ポリペプチドは、ＩＬ−１ゼータ、Ｘｒｅｃ２、それぞれの結合パートナーま
たはその相互作用を検出するためのインビトロアッセイにも使用できる。

【０１６９】本発明の他の態様は、細胞のシグナル伝達を調べるための本発明ポリペプチド
の使用に関する。ＩＬ−１ファミリーのリガンドおよび受容体は、感染症および
免疫性炎症応答に対する保護において中心的役割を果たす。これには、細胞のシ
グナル伝達、血管内皮細胞およびリンパ球の活性化、炎症性サイトカイン、急性
期タンパク質、造血、発熱、骨再吸収、フロスタグランジン、メタロプロテイナ
ーゼおよび接着分子の誘導が含まれる。既知ＩＬ−１ファミリーメンバー数が連
続的に増加していることに関して、適切な分類方式はポリペプチドの構造および
機能（活性化および調節特性）の比較に基づくものである。たとえば、ＩＬ−１
ゼータ、ＴＤＺ．１、ＴＤＺ．２およびＴＤＺ．３は他のＩＬ−１ファミリーリ
ガンド（ＩＬ−１α、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１８）と同様に、そしてＸｒｅｃ
２は他のＩＬ−１ファミリー受容体（ＩＬ−１ＲＩ、ＩＬ−１ＲＩＩ、ＩＬ−１
Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬ）と同様に、前記の多数の機能に関与し、かつ炎症応答
を促進し、したがっておそらく炎症性および／または自己免疫性疾患、たとえば
慢性間接リウマチ、炎症性腸疾患および乾癬の原因および持続に関与すると思わ
れる。したがって、本発明ポリペプチドの発現の変更および／または活性化は、
細胞特異性応答および増殖の活性化または阻害を含めた（これらに限定されない
）多数の細胞プロセスに著しい効果をもつ可能性がある。クローン化したＩＬ−
１ゼータ、ＴＤＺ．１、ＴＤＺ．２、ＴＤＺ．３、Ｘｒｅｃ２、またはその機能
不活性変異体の発現を利用して、そのタンパク質が特定の信号伝達事象の仲介に
おいて果たす役割を確認することができる。

【０１７０】細胞のシグナル伝達はしばしば分子活性化カスケードを伴い、その間に受容体
がターゲット基質をリン酸化する細胞内キナーゼを特異的に活性化することによ
り、リガンド−受容体仲介によるシグナルを伝搬する。これらの基質は、それ自
体がリン酸化に伴って活性化されるキナーゼであってもよい。あるいは、それら
はリン酸化に伴うタンパク質−タンパク質相互作用によって下流の信号伝達を促
進するアダプター分子であってもよい。基質分子（１またはそれ以上）の性質に
関係なく、発現した機能活性形のＸｒｅｃ２、ＩＬ−１ゼータ、ＩＬ−１ゼータ
スプライス変異体、およびそれらの結合パートナーを用いて、本発明のポリペプ
チドにより認識および活性化された基質（１またはそれ以上）が何であるかを同
定できる。したがってこれらの新規ポリペプチドは、信号伝達経路に関与する新
規分子を同定するための試薬として使用できる。

【０１７１】未知タンパク質の同定質量分析による未知タンパク質の同定を補助するために、ポリペプチドまたは
ペプチドフィンガープリントを既知タンパク質のデータベースに挿入し、または
それと比較することができる（Ｗ．Ｊ．Ｈｅｎｚｅｌｅｔａｌ．，Ｐｒｏ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５０１１−５０１５，１９９３；
Ｆｅｎｙｏｅｔａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１９：９９８−
１００５，１９９８）。これらの比較を容易にする多様なソフトウェアプログラ
ムにインターネットによりアクセスできる：たとえばＰｒｏｔｅｉｎＰｒｏｓ
ｐｅｃｔｏｒ（インターネットサイト：ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｓｃｆ．ｅｄ
ｕ）、Ｍｕｌｔｉｌｄｅｎｔ（インターネットサイト：ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．
ｃｈ／ｓｐｒｏｔ／ｍｕｌｔｉｉｄｅｎｔ．ｈｔｍｌ）、ＰｅｐｔｉｄｅＳｅａ
ｒｃｈ（インターネットサイト：ｗｗｗ．ｍａｎｎ．ｅｍｂｌ−ｈｅｉｅｄｅｌ
ｂｅｒｇ．ｄｅ．．．ｄｅＳｅａｒｃｈ／ＦＲ＿ＰｅｐｔｉｄｅＳｅａｒｃｈ
Ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ）、およびＰｒｏＦｏｕｎｄ（インターネットサイト：ｗｗ
ｗ．ｃｈａｉｔ−ｓｇｉ．ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／
ｐｒｏｔ−ｉｄ−ｆｒａｇ．ｈｔｍｌ）。これらのプログラムによりユーザーは
開裂試薬およびフラグメント化ペプチドの分子量を、表示された許容度内で特定
できる。これらのプログラムは、観察した分子量を配列データベースから誘導し
た推定ペプチド分子量と比較して、未知タンパク質のアイデンティティーを判定
するのを補助する。

【０１７２】さらに、ポリペプチドまたはペプチド消化物をタンデム型質量分析（ＭＳ／Ｍ
Ｓ）により配列決定し、得られた配列をデータベースに対比して検索する（Ｅｎ
ｇｅｔａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｓｐｅｃ．，５：９７６−９８９，１９
９４；Ｍ．Ｍａｎｎｅｔａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６６：４３９０−
４３９９，１９９４；およびＪ．Ａ．Ｔａｙｌｏｒｅｔａｌ．，Ｒａｐｉｄ
Ｃｏｍｍ．Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃ．，１１：１０６７−１０７５，１９９７）。
この方法に使用できる検索プログラムは、Ｌｕｔｅｆｉｓｋ９７（インターネッ
トサイト：ｗｗｗ．ｌｓｂｃ．ｃｏｍ：７０／Ｌｕｔｅｆｉｓｋ９７．ｈｔｍｌ
）などのインターネット、および前記のＰｒｏｓｐｅｃｔｏｒ、Ｐｅｐｔｉｄｅ
ＳｅａｒｃｈおよびＰｒｏＦｏｕｎｄプログラムにある。

【０１７３】したがって、遺伝子ならびにその推定タンパク質配列およびペプチドフラグメ
ントの配列を配列データベースに加えることにより、質量分析法を用いる未知タ
ンパク質同定を補助できる。

【０１７４】抗体本発明のポリペプチドと免疫反応性である抗体が本発明により提供される。そ
のような抗体は、抗体の抗原結合部位を介して本発明のポリペプチドに特異的に
結合する（非特異的結合ではなく）。したがって前記のポリペプチド、フラグメ
ント、変異体、融合タンパク質などを、それと免疫反応性である抗体の産生に際
して”免疫原”として使用できる。より詳細には、前記のポリペプチド、フラグ
メント、変異体、融合タンパク質などは、抗体形成を誘発する抗原決定基または
エピトープを含む。

【０１７５】これらの抗原決定基またはエピトープは、線状またはコンホメーショナル（不
連続）のいずれであってもよい。線状エピトープはポリペプチドの１つのアミノ
酸セクションからなり、一方、コンホメーショナルまたは不連続エピトープはタ
ンパク質が折りたたまれた際に近接するポリペプチド鎖の異なる領域からの複数
のアミノ酸セクションからなる（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ，Ｊｒ．ａｎｄＰ．
Ｔｒａｖｅｒｓ，ＩｍｍｕｎｏＢｉｏｌｏｇｙ，３：９，ＧａｒｌａｎｄＰ
ｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社，第２版，１９９６）。折りたたまれたタンパク質は複雑
な表面をもつので、利用可能なエピトープの数はきわめて多い；しかしタンパク
質のコンホメーションおよび立体障害のため、実際にエピトープに結合する抗体
の数は利用可能なエピトープの数より少ない（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ，Ｊｒ．
ａｎｄＰ．Ｔｒａｖｅｒｓ，ＩｍｍｕｎｏＢｉｏｌｏｇｙ，３：９，Ｇａｒ
ｌａｎｄＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社，第２版，１９９６）。エピトープは当技術
分野で既知の任意の方法で同定できる。

【０１７６】したがって本発明の１態様は、本発明のポリペプチドの抗原性エピトープに関
する。そのようなエピトープは、後記に詳述するように、抗体、特にモノクロー
ナル抗体の産生に有用である。さらに本発明のポリペプチドに由来するエピトー
プを、探索試薬として、アッセイに、およびポリクローナル血清または培養ハイ
ブリドーマからの上清などの物質から特異的結合抗体を精製するために使用でき
る。そのようなエピトープまたはその変異体は、当技術分野で周知の方法、たと
えば固相合成、化学的もしくは酵素によるポリペプチド開裂、または組換えＤＮ
Ａ技術を用いて調製できる。

【０１７７】本発明のポリペプチドのエピトープにより誘発しうる抗体については、エピト
ープが単離されたものであっても、ポリペプチドの一部のままであっても、ポリ
クローナルおよびモノクローナル抗体のいずれも、常法により調製できる。たと
えばＫｅｎｎｅｔｅｔａｌ．（編），ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：ＡＮｅｗＤｉｍｅｎｓｉｏｎｉｎＢｉｏｌｏｇｃａｌＡｎａｌｙｓｅｓ，ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ，ニューヨー
ク，１９８０；およびＨａｒｌｏｗａｎｄＬａｎｄ（編），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，コールド・スプリング・ハ
ーバー、ニューヨーク，１９８８参照。

【０１７８】本発明のポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マ細胞系も本発明において企図される。そのようなハイブリドーマは常法により
作製および同定できる。そのようなハイブリドーマ細胞系を作製するための１方
法は、動物をポリペプチドで免疫化し；免疫化した動物から脾細胞を採取し；そ
れらの脾細胞を骨髄腫細胞系に融合させて、これによりハイブリドーマ細胞を作
製し；そして前記ポリペプチドを結合するモノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマ細胞系を同定する。モノクローナル抗体は常法により回収できる。

【０１７９】本発明のモノクローナル抗体には、キメラ抗体、たとえばヒト化形ネズミモノ
クローナル抗体が含まれる。そのようなヒト化抗体は既知の技術で調製でき、抗
体をヒトに投与した際に免疫原性が低いという利点をもつ。１態様において、ヒ
ト化モノクローナル抗体はネズミ抗体の可変部（またはその抗原結合部位のみ）
およびヒト抗体由来の定常部を含む。あるいは、ヒト化抗体フラグメントはネズ
ミモノクローナル抗体の抗原結合部位およびヒト抗体由来の可変部（抗原結合部
位を欠如）を含む。キメラ抗体および他の工学的に作製したモノクローナル抗体
の調製方法には、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：
３２３，１９８８；Ｌｉｕｅｔａｌ．，ＰＮＡＳ，８４：３４３９，１９８
７；Ｌａｒｒｉｃｋｅｔａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７：９３
４，１９８９；およびＷｉｎｔｅｒｅｔａｌ．，ＴＩＰＳ，１４：１３９，
１９９３に記載される方法が含まれる。抗体をトランスジェニックに産生する方
法は、ＧＢ２，２７２，４４０、ＵＳＰ５，５６９，８２５および５，５４５，
８０６、ならびにそれらに基づく優先権を主張する関連特許にみられる。これら
のすべてを本明細書に参考として援用する。

【０１８０】常法により調製しうる、抗体の抗原結合性フラグメントも本発明に包含される
。そのようなフラグメントの例には、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）₂フラグメント
が含まれるが、それらに限定されない。遺伝子工学的方法で調製した抗体フラグ
メントおよびその誘導体も提供される。

【０１８１】１態様において、抗体は本発明のポリペプチドに特異的であり、他のタンパク
質と交差反応しない。そのような抗体を同定するスクリーニング法は周知であり
、たとえば免疫アフィニティークロマトグラフィーを用いることができる。

【０１８２】その使用本発明の抗体は、本発明のポリペプチドまたはフラグメントをインビトロまた
はインビボで検出するアッセイに使用できる。これらの抗体は、本発明のポリペ
プチドまたはフラグメントを免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製
するのにも使用できる。

【０１８３】さらに本発明のポリペプチドが結合パートナーに結合するのを遮断しうる抗体
は、そのような結合により生じる生物学的活性を阻害するために使用できる。そ
のような遮断抗体は、任意の適切なアッセイ法により、たとえばＩＬ−１ゼータ
受容体を発現する特定の細胞へのＩＬ−１ゼータ、ＴＤＺ．１、ＴＤＺ．２また
はＴＤＺ．３の結合を抗体が阻害する能力を調べることにより同定できる。ある
いは遮断抗体は、本発明のポリペプチドがターゲット細胞上のそれらの結合パー
トナーに結合することにより生じる生物学的作用を阻害する能力を調べるアッセ
イ法において同定できる。たとえば、抗体がＩＬ−１ゼータ仲介、Ｘｒｅｃ２仲
介、または結合パートナー仲介による細胞溶解を阻害する能力をアッセイするこ
とができる。

【０１８４】抗体を産生する事象により仲介される生物学的活性を阻害するために、そのよ
うな抗体をインビトロ法に使用し、あるいはインビボ投与することができる。し
たがって、本発明のポリペプチドと結合パートナーの相互作用により引き起こさ
れるか、または悪化する（直接的または間接的に）障害を処置できる。療法は、
結合パートナー仲介による生物学的活性の阻害に有効な量の遮断抗体を哺乳動物
にインビボ投与することを伴う。そのような療法に使用するにはモノクローナル
抗体が一般に好ましい。１態様においては、抗原結合性抗体フラグメントを用い
る。

【０１８５】抗体をアゴニスト（すなわちリガンド模倣）特性についてスクリーニングでき
る。そのような抗体は、細胞表面受容体に結合すると、ＩＬ−１が細胞表面ＩＬ
−１受容体に結合した場合に誘導されるのと類似の生物学的作用（たとえば生物
学的シグナルの伝達）を誘導する。アゴニスト性抗体は、血管内皮細胞およびリ
ンパ球を活性化し、局所的な組織破壊および発熱を誘導し（Ｊａｎｅｗａｙｅ
ｔａｌ．，１９９６）、マクロファージおよび血管内皮細胞を刺激してＩＬ−
６を産生させ、血管内皮細胞表面にある分子をアップレギュレートするのに使用
できる。

【０１８６】本発明のポリペプチドに対して形成された抗体、および生理学的に許容できる
希釈剤、賦形剤またはキャリヤーを含む組成物が本発明において提供される。そ
のような組成物の適切な成分は、本発明のポリペプチドを含有する組成物に関し
て前記に述べたものである。

【０１８７】本発明においては、抗体に結合した検出薬（たとえば診断薬）または療法薬を
含む結合体も提供される。そのような薬剤の例を前記に提示した。これらの結合
体はインビボ法またはインビトロ法に使用できる。

【０１８８】以下の例は本発明の具体的な態様をさらに説明するために提示され、本発明の
範囲を限定するものと解すべきでない。

【０１８９】実施例１：ＩＬ−１ゼータおよびＸｒｅｃ２核酸の単離ヒトＩＬ−１ゼータ核酸配列は、部分オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ
）をコードするＥＳＴＩＭＡＧＥクローン１６２８７６１、寄託＃ＡＩ０１４
５４８の配列決定により求められた。多数のｃＤＮＡライブラリーを内部プライ
マーでスクリーニングして、このポリペプチドの発現パターンを決定した。ヒト
ＩＬ−１ゼータ配列の２つの内部プライマーを用いてＰＣＲを実施した後、ＩＬ
−１ゼータ配列について下記のｃＤＮＡライブラリーが陽性であった：骨髄スト
ローマ、ヒト脾臓腫瘍、およびＲａｊｉ（Ｂ細胞系）。ＩＬ−１ゼータクローン
をヒトゲノムＤＮＡ配列、骨髄ストローマおよびヒト膵腫瘍ライブラリーから単
離し、配列決定した。

【０１９０】ヒトＸｒｅｃ２配列は、ハイスループット配列決定法、ＰＣＲおよび５’ＲＡ
ＣＥ反応により得られた。染色体領域Ｘｐ１１のハイスループットショットガン
配列決定法により、Ｘｒｅｃ２のエキソン４〜６の配列が得られた（ＧｅｎＢａ
ｎｋ寄託番号ＡＬ０３１４６６およびＡＬ０３１５７５）。同様に、染色体領域
Ｘｐ２２−１６４〜１６６（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＣ００５７４８）の配列
により、Ｘｒｅｃ２のエキソン１０〜１２の配列が得られた。

【０１９１】エキソン５および１１内のプライマー（１０ピコモル／反応）ならびにＨｏｔ
ｓｔａｒＴａｑポリメラーゼ（Ｑｕｉａｇｅｎ，カリフォルニア州バレンシア
）を用い、ヒト脳第１鎖ｃＤＮＡについてＰＣＲ（４０サイクル）を実施して、
エキソン７〜９の配列を得た。次いで、精巣ｃＤＮＡ、およびエキソン４内の入
れ子型プライマーを用いて５’ＲＡＣＥ反応を実施し、推定イニシエーターメチ
オニンを含むエキソン３配列を得た。ＰＣＲおよび５’ＲＡＣＥの両反応とも、
標準プロトコルにより実施した。

【０１９２】実施例２：精製ＩＬ−１ゼータおよびＸｒｅｃ２ポリペプチドの使用ポリペプチド特異的ＥＬＩＳＡ：ＩＬ−１ゼータまたはＸｒｅｃ２を含有する試料の系列希釈液（５０ｍＭＮ
ａＨＣＯ₃中、ＮａＯＨでｐＨ９に調整）を、Ｌｉｎｂｒｏ／Ｔｉｔｅｒｔｅｋ
９６ウェル平底Ｅ．Ｉ．Ａ．マイクロタイトレーションプレート（ＩＣＮＢ
ｉｏｍｅｄｉｃａｌ社、オハイオ州オーローラ）に塗布する（１００：１／ウェ
ル）。４℃で１６時間のインキュベーション後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を
含有する２００：１ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）でウェルを６回洗浄する。
次いで、５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有するＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中１ｍｇ／
ｍｌのＦＬＡＧ（登録商標）結合パートナーと共に、ウェルを９０分間インキュ
ベートする（１００：１／ウェル）。次いで５％ＦＣＳを含有するＰＢＳ−Ｔｗ
ｅｅｎ中１ｍｇ／ｍｌの抗−ＦＬＡＧ（登録商標、モノクローナル抗体Ｍ２）と
共に各ウェルを９０分間インキュベートし（１００：１／ウェル）、次いで前記
に従って洗浄する。続いてウェルをポリクローナルヤギ抗−ｍＩｇＧ１特異性西
洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗体（５％ＦＣＳを含有するＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ
中の市販原液１：５０００希釈液）と共に、ウェルを９０分間インキュベートす
る（１００：１／ウェル）。ＨＲＰ結合抗体はＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ社（アラバマ州バーミンガム）から得ら
れる。ウェルを前記に従って６回洗浄する。

【０１９３】ＥＬＩＳＡを実施するために、基質ミックス［１００：１／ウェルのＴＭＢ
ペルオキシダーゼ基質とペルオキシダーゼ溶液Ｂ（ＫｉｒｋｅｇａａｒｄＰｅ
ｒｒｙＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、メリーランド州ガイザースバーグ）の１：
１プレミックス］をウェルに添加する。十分な発色反応の後、２ＮＨ₂ＳＯ₄（
５０：１／ウェル）の添加により酵素反応を停止する。色濃度（リガンド受容体
結合を指示する）を、ＶＭａｘプレートリーダー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅ
ｖｉｃｅｓ、カリフォルニア州サニーベール）で４５０ｎｍにおける吸光を測定
することにより判定する。

【０１９４】実施例３：アミノ酸配列ＩＬ−１ゼータおよびＸｒｅｃ２のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号：１お
よび２の完全ヌクレオチド配列の翻訳により決定した。

【０１９５】実施例４：ＤＮＡ配列およびアミノ酸配列ＩＬ−１ゼータおよびＸｒｅｃ２の核酸配列を、ＥＳＴＩＭＡＧＥクローン
（寄託＃ＡＩ０１４５４８（ＩＬ−１ゼータ）ならびに＃ＡＬ０３１５７５およ
び＃ＡＬ００５７４８（Ｘｒｅｃ２））の複合配列、ならびにＰＣＲおよび５’
ＲＡＣＥ反応により得た他の配列の標準二本鎖配列決定法により決定した。

【０１９６】単離したＩＬ−１ゼータおよびＸｒｅｃ２ＤＮＡのヌクレオチド配列、なら
びにそれによりコードされるアミノ酸配列を、配列番号：１〜４に示す。ＰＣＲ
により単離したＩＬ−１ゼータＤＮＡフラグメントの配列は配列番号：１のヌ
クレオチド１〜５７９に対応し、これは配列番号：３のアミノ酸１〜１９２をコ
ードする；同様にＰＣＲにより単離したＸｒｅｃ２ＤＮＡフラグメントの配列
は配列番号：２のヌクレオチド１〜２０８８に対応し、これは配列番号：４のア
ミノ酸１〜６９８をコードする。

【０１９７】アミノ酸配列：３および４は、それぞれ他の既知ＩＬ−１リガンドおよび受容
体ファミリーのメンバーと著しい相同性をもつ。

【０１９８】実施例５：本発明のポリペプチドを結合するモノクローナル抗体この例は、ＩＬ−１ゼータポリペプチドを結合するモノクローナル抗体の調製
方法を具体的に示す。Ｘｒｅｃ２を結合するモノクローナル抗体の調製にも同じ
プロトコルを使用できる。そのような抗体の形成に使用できる適切な免疫原には
、精製ＩＬ−１ゼータポリペプチド、もしくはその免疫原フラグメント、たとえ
ば細胞外ドメイン、またはＩＬ−１ゼータを含有する融合タンパク質（たとえば
可溶性ＩＬ−１ゼータ／Ｆｃ融合タンパク質）が含まれるが、これらに限定され
ない。

【０１９９】精製ＩＬ−１ゼータポリペプチドを用いて、常法により、たとえばＵＳＰ４，
４１１，９９３に記載の方法により、それと免疫反応性であるモノクローナル抗
体を形成することができる。要約すると、ＩＬ−１ゼータ免疫原を完全フロイン
トアジュバントに乳化して１０〜１００μｇの量で皮下または腹腔内注射するこ
とにより、マウスを免疫化する。１０〜１２日後、不完全フロイントアジュバン
トに乳化した追加ＩＬ−１ゼータで免疫化動物を追加免疫化する。次いで毎週ま
たは隔週の免疫化計画で、マウスを定期的に追加免疫化する。眼窩後放血または
尾先端切除により定期的に血清を採取して、ドットブロットアッセイ、ＥＬＩＳ
Ａ（酵素結合イムノソルベントアッセイ）またはＩＬ−１ゼータ受容体結合の阻
害によりＩＬ−１ゼータ抗体を検査する。適切な抗体力価の検出後、陽性動物に
最後の１回の食塩水中ＩＬ−１ゼータの静脈内注射を行う。３〜４日後、動物を
殺し、脾細胞を採取し、そして脾細胞をネズミ骨髄腫細胞系、たとえばＮＳ１ま
たは好ましくはＰ３×６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣＣＲＬ１５８０）と融
合させる。融合によりハイブリドーマ細胞が形成され、これを多数のマイクロタ
イタープレートにおいて、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッドおよび脾細胞ハイブ
リッドの増殖を阻害するためにＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよび
チミジン）選択培地に接種する。

【０２００】ハイブリドーマ細胞を精製ＩＬ−１ゼータに対する反応性についてＥＬＩＳＡ
により、Ｅｎｇｖａｌｌｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．，８：８７１
，１９７１およびＵＳＰ４，７０３，００４に開示された方法を応用してスクリ
ーニングする。好ましいスクリーニング方法は、Ｂｅｃｋｍａｎｎｅｔａｌ
．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４４：４２１２，１９９０に記載の抗体捕獲法で
ある。陽性ハイブリドーマ細胞を同系ＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内注射して、高
濃度の抗ＩＬ−１ゼータモノクローナル抗体を含有する腹水を生成させることが
できる。あるいは、ハイブリドーマ細胞をインビトロでフラスコまたはローラー
ボトル内において種々の方法で増殖させることができる。マウス腹水中に産生さ
れたモノクローナル抗体を、硫酸アンモニウム沈殿、次いでゲル排除クロマトグ
ラフィーにより精製することができる。あるいは、プロテインＡまたはプロテイ
ンＧに対する抗体の結合に基づくアフィニティークロマトグラフィーを、ＩＬ−
１ゼータへの結合に基づくアフィニティークロマトグラフィーと同様に採用でき
る。

【０２０１】実施例６：Ｘｒｅｃ２ｍＲＮＡの組織分布Ｘｒｅｃ２ｍＲＮＡの組織分布を、下記に従ってノーザンブロット分析によ
り調べた。アリコートのＸｒｅｃ２リボプローブを２つの異なる多重ヒト組織ノ
ーザンブロットに添加した（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州パロ・アルト
；Ｂｉｏｃｈａｉｎ、カリフォルニア州パロ・アルト）。ブロットを１０×デン
ハート液、５０ｍＭトリス，ｐＨ７．５、９００ｍＭＮａＣｌ，０．１％ピロ
リン酸Ｎａ，１％ＳＤＳ，２００μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ中でハイブリダイズ
させた。ハイブリダイゼーションを６３℃で一夜、５０％ホルムアミド中におい
て、先の記載に従って実施した（Ｍａｒｃｈｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３
１５：６４１−６４７，１９８５）。次いでブロットを２×ＳＳＣ，０．１％Ｓ
ＤＳにより６８℃で３０分間洗浄した。β−アクチン特異性プローブを用いる対
照プロービングとの比較により、最高レベルのＸｒｅｃ２ｍＲＮＡを含む細胞
および組織を判定した。

【０２０２】Ｘｒｅｃ２はヒト脳および心臓組織に検出され、より低い程度で卵巣に検出さ
れた。これらの組織に２つのＸｒｅｃ２ｍＲＮＡが検出された：１つは７．５
ｋｂ転写体、１つは１０．０ｋｂ転写体。８．０ｋｂＸｒｅｃ２転写体が骨格
筋に検出された。ヒトｃＤＮＡ組織パネルのＰＣＲ分析により、Ｘｒｅｃ２ｍ
ＲＮＡが心臓、脳および卵巣に検出され、より低い程度で扁桃腺、胎児肝臓、前
立腺、精巣、小腸および結腸に検出されたが、脾臓、リンパ節、胸腺、骨髄、白
血球、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓または膵臓には検出されなかった。

【０２０３】前記方法に従って、腫瘍細胞から単離したＲＮＡのノーザンブロットをＸｒｅ
ｃ２で調べた。このプローブに弱くハイブリダイズする８．０ｋｂの転写体が、
結腸直腸腺癌細胞系ＳＷ４８０に検出された。Ｘｒｅｃ２転写体は、ＨＬ−６０
（前骨髄球性白血病）、Ｓ３（ＨｅＬａ細胞）、Ｋ−５６２（慢性骨髄性白血病
）、ＭＯＬＴ−４（リンパ芽球性白血病）、Ｒａｊｉ（バーキットリンパ腫）、
Ａ５４９（肺癌）、またはＧ３６１（黒色腫）細胞には検出されなかった。

【０２０４】実施例７：ＩＬ−１ゼータに対する結合アッセイ全長ＩＬ−１ゼータを発現させ、ＩＬ−１ゼータ受容体を結合する能力を調べ
ることができる。この結合アッセイは下記に従って実施できる：可溶性ＩＬ−１ゼータポリペプチドのＮ−末端に融合したロイシンジッパーペ
プチドを含む融合タンパク質（ＬＺ−ＩＬ−１ゼータ）をこのアッセイに用いる
。本質的に、ＦＬＡＧ（登録商標）（ＩＬ−１ゼータ）発現構築体の作製につい
てＷｉｌｅｙｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３：６７３−６８２，１９９
５（本明細書に参考として援用する）に記載されたものに従って発現構築体を作
製する。ただしＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドをコードするＤＮＡの代わりに、
三量体化可能な修飾ロイシンジッパーをコードする配列を用いる。発現ベクター
ｐＤＣ４０９におけるこの構築体は、ヒトサイトメガロウイルス由来のリーダー
配列、続いて可溶性ＩＬ−１ゼータポリペプチドのＮ−末端に融合したロイシン
ジッパー部分をコードする。ＬＺ−ＩＬ−１ゼータをＣＨＯ細胞において発現さ
せ、培養上清から精製する。

【０２０５】ｐＤＣ４０９と表示される発現ベクターは、ＭｃＭａｈａｎｅｔａｌ．，
ＥＭＢＯＪ．，１０：２８２１−２８３２，１９９１（本明細書に参考として
援用する）に記載されたｐＤＣ４０６ベクターに由来する哺乳動物発現ベクター
である。ｐＤＣ４０９に付加される特色（ｐＤＣ４０６と比較して）には、多重
クローニング部位（ｍｃｓ）内の追加のユニーク制限部位；ｍｃｓの下流にある
３つの終止コドン（各読み枠内に１つ）；およびｍｃｓの下流にあり、ｍｃｓに
挿入されたＤＮＡの配列決定を容易にするＴ７ポリメラーゼプロモーターが含ま
れる。

【０２０６】全長ＩＬ−１ゼータタンパク質の発現のために、全コード領域（すなわち配列
番号：１に示すＤＮＡ配列）をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅させ
る。ＰＣＲに用いる鋳型は、実施例１に記載した（膵臓腫瘍）ｃＤＮＡライブラ
リーから単離されたｃＤＮＡクローンである。単離および増幅したＤＮＡを発現
ベクターｐＤＣ４０９に挿入すると、ｐＤＣ４０９−ＩＬ−１ゼータと表示する
構築体が得られる。

【０２０７】ＬＺ−ＩＬ−１ゼータポリペプチドを用いて、前記の組換えまたは内因性ＩＬ
−１ゼータ受容体を発現する宿主細胞に結合する能力を調べる。ＩＬ−１ゼータ
受容体を発現する細胞を、１０％ウシ胎仔血清、ペニシリン、ストレプトマイシ
ンおよびグルタミンを補充したＤＭＥＭ中で培養する。細胞をＬＺ−ＩＬ−１ゼ
ータ（５ｍｇ／ｍｌ）と共に約１時間インキュベートする。インキュベーション
後、細胞を洗浄して結合していないＬＺ−ＩＬ−１ゼータを除去し、ビオチニル
化抗−ＬＺモノクローナル抗体（５ｍｇ／ｍｌ）およびフィコエリトリン結合ス
トレプトアビジン（１：４００）と共にインキュベートした後、蛍光活性化細胞
走査（ＦＡＣＳ）により分析する。ＦＡＣｓｃａｎ（ＢｅｃｋｔｏｎＤｉｃｋ
ｉｎｓｏｎ，カリフォルニア州サンホゼ）により細胞分析を行う。

【０２０８】ＩＬ−１ゼータ受容体を発現する細胞は、ＩＬ−１ゼータ受容体を発現しない
細胞と比較して有意に高いＩＬ−１ゼータ結合を示す。

【０２０９】実施例８：ＩＬ−１ゼータならびにそのスプライス変異体ＴＤＺ．１、ＴＤＺ．２およびＴＤＺ．３の同定ならびに組織分布種々のヒト組織におけるＩＬ−１ゼータの発現を、ＩＬ−１ゼータ特異性プラ
イマーを用いるＲＴＰＣＲ、または実施例１に記載したＩＬ−１ゼータＥＳＴ
由来の放射性標識ＤＮＡプローブを用いるｃＤＮＡライブラリーのスクリーニン
グにより調べた。結果を表ＩＩに示す。

【０２１０】表ＩＩにおいて”−”は、これらの実験で、分析したその組織または細胞中に
ＩＬ−１ゼータｍＲＮＡが検出されなかったことを示す。採用したアッセイ法の
限界を考慮すると、”−”はそのＩＬ−１ゼータがその実験においてその組織中
に検出されなかったことを示すにすぎず、そのＩＬ−１ゼータがその組織におい
て決して発現しないことを示すのではないことは認められるであろう。さらに、
発現パターンが変動するのは、ｃＤＮＡ組織パネルの作製に種々のロットのＲＮ
Ａ源材料を用いたことにより説明できる。

【０２１１】陽性結果は下記により得られた：”ａ”，第１鎖ｃＤＮＡのパネル（Ｃｌｏｎ
ｔｅｃｈ）からのＰＣＲ分析による；”ｂ”，ｃＤＮＡライブラリースクリーニ
ングによる；”ｃ”，ＥＳＴの存在による；および”ｄ”，各ＲＮＡのＰＣＲ分
析による。”ｅ”は、細胞へのＬＰＳ添加により遺伝子の発現が増大したことを
示す。組織源の欄で、”プール”は胎児肺、精巣およびＢ細胞の混合物であった
。ヒト細胞系の欄で、”マクロファージ−１”はＴＨＰ−１、”マクロファージ
−２”はＵ９３７であり；”ＢＭストローマ”はＩｍｍｕｎｅｘにおいて誘導し
た未発表の骨髄ストローマ細胞系ＩＭＴＬＨであり；”初期ｈｅｍａｔ．”は造
血前駆細胞系ＨＬ６０であり；”膵臓腫瘍”はＨＰＴ−４であった。

【０２１２】この表に示すように、ＩＬ−１ゼータはヒトのリンパ節、胸腺、骨髄ストロー
マ、肺、精巣および胎盤に検出された。さらに、ＩＬ−１ゼータｍＲＮＡはヒト
のマクロファージ細胞系ＴＨＰ−１およびＵ９３７、造血前駆細胞系ＨＬ６０、
ならびに膵臓腫瘍細胞系ＨＰＴ−４に検出された。

【０２１３】

【表２】

【０２１４】ＩＬ−１ゼータの組織分布を、ＲＴＰＣＲにより、ＩＬ−１の別のスプライ
ス形であるＴａｎｇｏ−７７（ＷＯ９９／０６４２６）の組織分布とも比較した
。ＲＴＰＣＲに用いたプライマーは、Ｔａｎｇｏ−７７の第１エキソン（図１
のエキソン（１））またはＩＬ−１ゼータの第１エキソン（図１のエキソン（３
））に特異的な５’プライマーを共通の末端エキソン（図１のエキソン（６））
に由来する共通の３’プライマーと組み合わせたものであった。Ｃｌｏｎｔｅｃ
ｈ（カリフォルニア州サンホゼ）から購入した多数のヒト組織源からの第１鎖ｃ
ＤＮＡを用いてＰＣＲ反応を行った。推定サイズのＰＣＲ生成物および異なるサ
イズの他の数種類のＰＣＲ生成物を検出した。推定サイズと異なる３つのＰＣＲ
生成物を単離し、多数の組織ｃＤＮＡからの配列情報を得るのに用いた。これら
のＰＣＲ生成物の単離および特性解明により、３つの新規ＩＬ−１ゼータスプラ
イス変異体が明らかになった。これらのスプライス変異体の核酸配列を配列番号
５、６および７に示す。これらはそれぞれ配列番号８、９および１０により示さ
れるアミノ酸配列をコードする。これらのスプライス変異体の構成および関係を
図１に示す。

【０２１５】これらのスプライス変異体はそれぞれ精巣で発現するので、ＴＤＺ．１、ＴＤ
Ｚ．２およびＴＤＺ．３（精巣由来のゼータ変異体、Ｔｅｓｔｉｓ−Ｄｅｒｉｖ
ｅｄＺｅｔａｖａｒｉａｎｔ）と表示された。精巣は共通の発現組織である
が、それが唯一の発現組織ではない。表ＩＩＩは、ＩＬ−１ゼータ、Ｔａｎｇｏ
−７７、ＴＤＺ．１、ＴＤＺ．２およびＴＤＺ．３についての組織発現調査の結
果を示す。ＴＤＺ．１およびＴＤＺ．２は図１に示すエキソン４、５および６を
含む。これらはＩＬ−１ゼータの最後の３つのエキソンに相当し、その分子の保
存構造ドメインに相当する。ＩＬ−１ファミリーの他のメンバーとアラインさせ
ると、エキソン４、５および６は保存構造モチーフ内の多数の保存残基を含むこ
とが分かる。

【０２１６】図１のエキソン（２）中におけるＴａｎｇｏ−７７の多型性が注目される。単
離したｃＤＮＡにおいて、エキソン（２）の第３残基のグリシンの代わりにバリ
ンがある。Ｔａｎｇｏ−７７配列においては、アミノ酸配列はＰＡＧＳＰＬＥＰ
（配列番号：１４）である。多型の場合、この配列はＰＡＶＳＰＬＥＰ（配列番
号：１５）である。

【０２１７】

【表３】

【０２１８】実施例９：Ｘｒｅｃ２のシグナル伝達活性全長Ｘｒｅｃ２を発現ベクターｐＤＣ３０４中へクローニングした。得られた
ベクターおよびＮＦκＢ−駆動ルシフェラーゼレポータープラスミドを用いて、
先にＢｏｒｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：２９４４５
−２９４５０，１９９８（本明細書に参考として援用する）に記載されたＤＥＡ
Ｅ−デキストラン法により、ＣＯＳ７細胞をトランスフェクションした。トラン
スフェクションした細胞をＩＬ−１α（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１β（１０ｎ
ｇ／ｍｌ）またはｈＩＬ−１８（４０ｎｇ／ｍｌ）で４時間刺激した際、ルシフ
ェラーゼ活性は検出されなかった。

【０２１９】ＩＬ−１Ｒファミリーの既知メンバー数種類は、それについて既知のコグネイ
トリガンドがまだ同定されていないオーファン受容体である。そのようなオーフ
ァン受容体の例には、ＩＬ−１Ｒｒｐ２、Ｔ１／ＳＴ２およびＳＩＧＩＲＲが含
まれる。しかしこれらのオーファン受容体のうちの幾つかは、そのオーファン受
容体の細胞質ドメインに融合したＩＬ−１Ｒ細胞外ドメインおよび膜貫通ドメイ
ン（ＩＬ−１Ｒｅｘｔｍ）を含むキメラ分子として発現した場合、ＩＬ−１に応
答して転写活性化を仲介することができる。たとえばＴ１／ＳＴ２の細胞質ドメ
インを含むＩＬ−１Ｒｅｘｔｍキメラは、ＩＬ−１刺激に応答して転写活性化を
仲介することができる；Ｍｉｔｃｈａｍｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２７１：５７７７−５７８３，１９９６に概説：本明細書に参考として援
用する。

【０２２０】Ｘｒｅｃ２がＩＬ−１に応答して転写活性化を仲介する能力を調べるために、
Ｘｒｅｃ２の細胞質ドメイン（Ｘｒｅｃ２ｃｙｔｏ）（配列番号：４のアミノ酸
３８２〜６９６）をＩＬ−１Ｒｅｘｔｍとのキメラ分子として発現させた。この
キメラＩＬ−１Ｒｅｘｔｍ−Ｘｒｅｃ２ｃｙｔｏを、ＣＯＳ７細胞において前記
に従ってＮＦκＢ−駆動ルシフェラーゼレポータープラスミドと共に過剰発現さ
せた。これらの細胞のＩＬ−１刺激後、ルシフェラーゼ活性は検出されなかった
。対照として全長ＩＬ−１をＣＯＳ７細胞において過剰発現させ、これらの細胞
においてＩＬ−１刺激に応答した転写活性化の誘導を観察した。

【０２２１】トランケートした細胞質テイル（配列番号：４のアミノ酸３８２〜５７３）を
もつＩＬ−１Ｒｅｘｔｍ−Ｘｒｅｃ２ｃｙｔｏキメラ受容体を用いて、実験を繰
り返した。この場合も、キメラ受容体はこれらのアッセイにおいてＩＬ−１に対
して不応答性であった。これは、ＩＬ−１Ｒファミリーの他の幾つかのメンバー
と異なり、Ｘｒｅｃ２の細胞質ドメインはＮＦκＢによるシグナル伝達を仲介し
ないことを示す。

【０２２２】ＩＬ−１受容体ファミリーの他のメンバーは、Ｉ型ＩＬ−１Ｒのシグナル伝達
必須成分であるＩＬ−１ＲＡｃＰと同様にアクセサリーサブユニットとして機
能する。Ｘｒｅｃ２がＩＬ−１受容体のアクセサリーサブユニットとして機能す
るか否かを評価するために、一連のキメラ受容体を作製した。同定された始原型
ＩＬ−１Ｒファミリーの各メンバーの細胞質ドメインをＩＬ−１ＲおよびＡｃＰ
の両者の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインに融合させると、７つのＩＬ−１
Ｒキメラおよび７つのＩＡｃＰキメラのパネルが得られた。これらのＩＬ−１Ｒ
およびＩＡｃＰキメラを、ＮＦκＢ−駆動ルシフェラーゼレポータープラスミド
と共に、ネズミＴ細胞リンパ腫細胞系（Ｓ４９．１）においてエレクトロポレー
ションにより、あらゆる可能な組合わせで同時発現させた。エレクトロポレーシ
ョンの２日後、細胞をＩＬ−１α（１０ｎｇ／ｍｌ）またはＩＬ−１β（１０ｎ
ｇ／ｍｌ）で４時間刺激し、先にＢｏｒｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．，２７３：２９４４５−２９４５０，１９９８に記載されたようにルシフ
ェラーゼ活性を評価した。普通はＳ４９．１細胞はＩＬ−１に不応答性である。
しかしＩＬ−１ＲおよびＡｃＰの両方を一過性過剰発現させると、Ｓ４９．１細
胞はＩＬ−１応答性になる。他のＡｃＰ様分子はこの系において他のＩＬ−１Ｒ
様分子と共同作動してＳ４９．１細胞にＩＬ−１応答性を与えるが、Ｘｒｅｃ２
はＩＬ−１ＲキメラまたはＡｃＰキメラのいずれでも応答しなかった。

【０２２３】本明細書に引用したすべての刊行物の全体を参考として援用する。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】ＩＬ−１ゼータ遺伝子座のゲノム構造を示す。

【図２】ＩＬ−１ゼータポリペプチドの二次構造を表す分子モデルを示す。図中、β−
鎖を黄色で示し、それらの方向を矢印で示す；β−ターンを青色で示す；コイル
を緑で示す。ＩＬ−１ゼータ構造を２つの異なる図で提示する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 21/08 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ボーン，テレサ・エルアメリカ合衆国ワシントン州98028，ケンモア，ノースイースト・ワンハンドレッドアンドナインティエイトス・ストリート 6458 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA26 BA63 CA04 DA01 DA02 DA05 DA11 DA12 EA04 GA11 4B064 AG04 AG20 AG27 CA02 CA05 CA06 CA10 CA11 CA19 CA20 CC01 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA58X AA72X AA87X AA93Y AB01 AC14 BA02 BA16 CA24 CA44 CA46 4H045 AA10 AA11 AA20 BA10 CA40 DA03 DA50 DA75 DA76 EA20 EA50 FA71 FA72 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記よりなる群から選択される単離核酸分子：（ａ）配列番号：１、配列番号：５、配列番号：６、または配列番号：７のＤ
ＮＡ配列；（ｂ）配列番号：３、配列番号：８、配列番号：９、または配列番号：１０の
配列を含むアミノ酸配列をコードする単離核酸分子；（ｃ）（ａ）または（ｂ）の核酸配列を含む変性二本鎖ＤＮＡのいずれかの鎖
に、５０％ホルムアミドおよび６×ＳＳＣ中、４２℃の中等度ストリンジェンシ
ー条件、６０℃、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの洗浄条件下でハイブリダイ
ズする単離核酸分子；（ｄ）配列番号：１、配列番号：５、配列番号：６、または配列番号：７から
インビトロ変異誘発により誘導した単離核酸分子；（ｅ）遺伝暗号の結果、配列番号：１、配列番号：５、配列番号：６、または
配列番号：７から縮重した単離核酸分子；（ｆ）ヒトＩＬ−１ゼータＤＮＡ、マウスＩＬ−１ゼータＤＮＡ、ヒトＩＬ−
１ゼータＤＮＡの対立遺伝子変異体、マウスＩＬ−１ゼータＤＮＡの対立遺伝子
変異体、およびＩＬ−１ゼータＤＮＡの種相同体よりなる群から選択される単離
核酸分子；ならびに（ｇ）ヒトＩＬ−１ゼータスプライス変異体、マウスＩＬ−１ゼータスプライ
ス変異体、ヒトＩＬ−１ゼータスプライス変異体の対立遺伝子変異体、マウスＩ
Ｌ−１ゼータスプライス変異体の対立遺伝子変異体、およびＩＬ−１ゼータスプ
ライス変異体の種相同体よりなる群から選択される単離核酸分子。
【請求項２】請求項１に記載の核酸分子の発現を指令する組換えベクター。
【請求項３】請求項１に記載の核酸分子によりコードされる単離ポリペプチ
ド。
【請求項４】非グリコシル化形の、請求項３に記載の単離ポリペプチド。
【請求項５】請求項３に記載のポリペプチドに結合する単離抗体。
【請求項６】抗体がモノクローナル抗体である、請求項５に記載の単離抗体
。
【請求項７】請求項２に記載のベクターでトランスフェクションまたはトラ
ンスダクションした宿主細胞。
【請求項８】ＩＬ−１ゼータポリペプチドの製造方法であって、請求項７に
記載の宿主細胞を発現が促進される条件下で培養し、そして培養培地から該ポリ
ペプチドを回収することを含む方法。
【請求項９】宿主細胞が細菌細胞、酵母細胞、植物細胞および動物細胞より
なる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】配列番号：３、配列番号：８、配列番号：９、または配列番
号：１０の配列よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む精製ＩＬ−１ゼー
タポリペプチド。
【請求項１１】請求項３に記載のポリペプチドを含むオリゴマー。
【請求項１２】下記よりなる群から選択される単離核酸分子：（ａ）配列番号：２のＤＮＡ配列；（ｂ）配列番号：４の配列を含むアミノ酸配列をコードする単離核酸分子；（ｃ）（ａ）または（ｂ）の核酸配列を含む変性二本鎖ＤＮＡのいずれかの鎖
に、５０％ホルムアミドおよび６×ＳＳＣ中、４２℃の中等度ストリンジェンシ
ー条件、６０℃、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの洗浄条件下でハイブリダイ
ズする単離核酸分子；（ｄ）配列番号：２からインビトロ変異誘発により誘導した単離核酸分子；（ｅ）遺伝暗号の結果、配列番号：２から縮重した単離核酸分子；ならびに（ｆ）ヒトＸｒｅｃ２ＤＮＡ、マウスＸｒｅｃ２ＤＮＡ、ヒトＸｒｅｃ２ＤＮＡの対立遺伝子変異体、マウスＸｒｅｃ２ＤＮＡの対立遺伝子変異体、
およびＸｒｅｃ２ＤＮＡの種相同体よりなる群から選択される単離核酸分子。
【請求項１３】請求項１２に記載の核酸分子の発現を指令する組換えベクタ
ー。
【請求項１４】請求項１２に記載の核酸分子によりコードされる単離ポリペ
プチド。
【請求項１５】非グリコシル化形の、請求項１４に記載の単離ポリペプチド
。
【請求項１６】請求項１４に記載のポリペプチドに結合する単離抗体。
【請求項１７】抗体がモノクローナル抗体である、請求項１６に記載の単離
抗体。
【請求項１８】請求項１３に記載のベクターでトランスフェクションまたは
トランスダクションした宿主細胞。
【請求項１９】Ｘｒｅｃ２ポリペプチドの製造方法であって、請求項１８に
記載の宿主細胞を発現が促進される条件下で培養し、そして培養培地から該ポリ
ペプチドを回収することを含む方法。
【請求項２０】宿主細胞が細菌細胞、酵母細胞、植物細胞および動物細胞よ
りなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】下記よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む精製ＩＬ
−１ゼータポリペプチド：（ａ）配列番号：４のアミノ酸配列；および（ｂ）配列番号：４のアミノ酸１９〜６９６。
【請求項２２】請求項１４に記載のポリペプチドを含むオリゴマー。