JP2001512002A - Ｔａｎｇｏ−７７関連蛋白質ファミリーの新規分子およびその使用 - Google Patents

Ｔａｎｇｏ−７７関連蛋白質ファミリーの新規分子およびその使用

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JP2001512002A JP2000505182A JP2000505182A JP2001512002A JP 2001512002 A JP2001512002 A JP 2001512002A JP 2000505182 A JP2000505182 A JP 2000505182A JP 2000505182 A JP2000505182 A JP 2000505182A JP 2001512002 A JP2001512002 A JP 2001512002A
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Abstract

(57)【要約】 新規Tango-77ポリペプチド、蛋白質、および核酸分子を開示する。単離された全長のTango-77蛋白質のほかに、本発明はさらに、単離されたTango-77融合蛋白質、抗原性ペプチド、および抗Tango-77抗体を提供する。本発明はまた、Tango-77核酸分子、本発明の核酸分子を含む組換え発現ベクター、その中に発現ベクターを導入する宿主細胞、およびその中にTango-77遺伝子が導入または破壊されているヒト以外のトランスジェニック動物も提供する。本発明の組成物を用いた診断法、スクリーニング法、および治療法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の背景 ポリペプチドサイトカインである、インターロイキン-1（IL-1）は、炎症およ
び免疫応答全体の重要なメディエータである。今日までIL-1ファミリーの３つの
メンバー、すなわちIL-1α、IL-1β、およびIL-1ra（インターロイキン-1受容体
アンタゴニスト）が単離されてクローニングされている。IL-1αおよびIL-1βは
、生物反応を誘発する前炎症性サイトカインであるのに対し、IL-1raはIL-1αお
よびIL-1β活性のアンタゴニストである。これらのリガンドに対しては、異なる
２つの細胞表面受容体、すなわちI型IL-1受容体（IL-1RtI）およびII型IL-1受容
体（IL-1RtII）が同定されている。最近の結果から、IL-1RtIがシグナル伝達お よび生物学的作用の発揮に関与する受容体であることが示唆されている。
【０００２】 上記のように、IL-1は宿主炎症反応の重要なメディエータである。炎症は重要
な恒常性メカニズムであるが、異常な炎症は宿主に損傷を与える可能性がある。
IL-1濃度の上昇は、多くの疾患、特に自己免疫疾患および炎症性障害に関連する
ことが知られている。
【０００３】 IL-1raは、IL-1の天然に存在する阻害剤であるため、IL-1raはIL-1の異常な、
そして有害となる可能性がある作用を制限するために用いることができる。実験
動物において、IL-1raによって前処置すると、リポ多糖類による敗血症が原因と
なる死亡を予防することが示されている。IL-1raが相対的に存在しないことから
、ヒト炎症性腸疾患において重要な役割を果たしていることが示唆されている。
【０００４】発明の概要 本発明は少なくとも部分的に、サイトカインスーパーファミリーのメンバーで
あると予想される分泌型蛋白質である、Tango-77をコードする遺伝子の発見に基
づく。下記のTango-77 cDNA（配列番号：１）は、可能性がある３つのオープン リーディングフレームを有する。予想される第一のオープンリーディングフレー
ムは、配列番号：１のヌクレオチド356位〜ヌクレオチド889位に及ぶヌクレオチ
ド534個（配列番号：３）を含み、アミノ酸178個の蛋白質（配列番号：２）をコ
ードする。この蛋白質は、アミノ酸約63個（配列番号：２のアミノ酸約１位〜ア
ミノ酸約63位（配列番号：４））の予想されるシグナル配列およびアミノ酸約11
5個（配列番号：２のアミノ酸約64位〜アミノ酸約178位（配列番号：５））の予
想される成熟蛋白質を含む可能性がある。
【０００５】 可能性がある第２のオープンリーディングフレームは、配列番号：１のヌクレ
オチド389位〜ヌクレオチド889位に及ぶヌクレオチド498個（配列番号：６）を 含み、アミノ酸167個の蛋白質（配列番号：７）をコードする。この蛋白質はア ミノ酸約52個（配列番号：７のアミノ酸約１位〜アミノ酸約52位（配列番号：８
））の予想されるシグナル配列およびアミノ酸約115個（配列番号：７のアミノ 酸約52位〜アミノ酸約167位（配列番号：９））の予想される成熟蛋白質を含む 可能性がある。
【０００６】 可能性がある第３のオープンリーディングフレームは、配列番号：１のヌクレ
オチド481位〜ヌクレオチド889位に及ぶヌクレオチド408個（配列番号：10）を 含み、アミノ酸136個の蛋白質（配列番号：11）をコードする。この蛋白質はア ミノ酸約21個（配列番号：11のアミノ酸約１位〜アミノ酸約21位（配列番号：12
））の予想されるシグナル配列およびアミノ酸約115個（配列番号：11のアミノ 酸約22位〜アミノ酸約136位（配列番号：13））の予想される成熟蛋白質を含む 可能性がある。
【０００７】 本明細書において用いられるように、用語「Tango-77」、「Tango-77蛋白質」
、「Tango-77ポリペプチド」等は、上記のTango-77遺伝子産物のいずれかまたは
全てを含む配列番号：１のcDNAによって産生されたポリペプチドを示すことがで
きる。
【０００８】 Tango-77は炎症を抑制して、分泌型IL-1raの役割と類似の機能的役割を果たす
と予想される。例えば、Tango-77はIL-1受容体に結合して、IL-1αおよびIL-1β
の受容体への結合を阻害することによって、受容体の活性化を遮断すると予想さ
れる。または、Tango-77はもう一つの経路を通じて、例えば新規受容体に結合す
ることによって炎症を抑制する可能性がある。したがって、Tango-77は急性およ
び慢性炎症、例えば、喘息、慢性骨髄性白血病、リウマチ性関節炎、乾癬および
炎症性腸疾患を含む多様な細胞プロセスを調節するために調節物質として有用と
なる可能性がある。
【０００９】 一つの局面において、本発明はTango-77またはその生物学的活性部分をコード
する単離された核酸分子と共に、Tango-77を検出するプライマーまたはハイブリ
ダイゼーションプローブとして適した核酸断片を提供する。
【００１０】 本発明は、Tango-77の発現を調節する（DNA、mRNAまたは蛋白質レベル、例え ばmRNAスプライシングを変化させることによって）化合物を投与することによっ
て、またはTango-77の活性を変化させることによって、異常なレベル（望ましく
ないほど高いまたは望ましくないほど低い）の炎症、IL-1受容体複合体の異常な
活性、またはIL-1の異常な活性に関連した障害を有する患者を診断および治療す
る方法を含む。そのような化合物の例には、小分子、アンチセンス核酸分子、リ
ボザイム、およびポリペプチドが含まれる。
【００１１】 本発明は配列番号：１、配列番号：３、配列番号：６、配列番号：10に示すヌ
クレオチド配列、アクセッション番号（「ATCC 98807のcDNA」）としてATCCに寄
託されたプラスミドのcDNA挿入断片のヌクレオチド配列、またはその相補鎖と少
なくとも45％（例えば、55％、65％、75％、85％、95％、または98％）同一であ
る核酸分子を特徴とする。
【００１２】 本発明は、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：６、配列番号：10に示す
ヌクレオチド配列、cDNA ATCC 98807のヌクレオチド配列、またはその相補鎖の ヌクレオチドの少なくとも100個（例えば、250、325、350、375、400、425、450
、500、550、600、650、700、800、900、または989個）の断片を含む核酸分子を
特徴とする。
【００１３】 本発明はまた、配列番号：２、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、
配列番号：11、配列番号：13のアミノ酸配列、またはATCC 98807のcDNAによって
コードされるアミノ酸配列と少なくとも45％（55％、65％、75％、85％、95％、
または98％）同一であるアミノ酸を有する蛋白質をコードしているヌクレオチド
配列を含む核酸分子を特徴とする。
【００１４】 好ましい態様において、Tabgo-77核酸分子は配列番号：１、配列番号：３、配
列番号：６、配列番号：10に示すヌクレオチド配列またはATCC 98807のcDNAのヌ
クレオチド配列を有する。
【００１５】 同様に、断片が配列番号：２、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：７、
配列番号：８、配列番号：９、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：13、ま
たはATCCアクセッション番号98807のcDNAによってコードされるポリペプチドの 連続したアミノ酸少なくとも15個（例えば、25、30、50、100、150、または178 個）を含む、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：７、配列
番号：８、配列番号：９、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：13のアミノ
酸配列を有するポリペプチドの断片をコードする核酸分子も本発明に含まれる。
【００１６】 本発明は、核酸分子がストリンジェントな条件下で配列番号：１、配列番号：
３、配列番号：６、配列番号：10またはその相補鎖を含む核酸分子とハイブリダ
イズする、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：７、配列番
号：８、配列番号：９、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：13のアミノ酸
配列、またはATCC アクセッション番号98807のcDNAによってコードされるアミノ
酸配列を含むポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子変種をコードする核酸分
子を含む。
【００１７】 配列番号：５、配列番号：９、もしくは配列番号：13（成熟ヒトTango-77）の
アミノ酸配列、または配列番号：２、配列番号：７、もしくは配列番号：11（未
成熟ヒトTango-77）のアミノ酸配列と少なくとも約45％、好ましくは65％、75％
、85％、95％、または98％同一であるアミノ酸配列を有する単離されたTango-77
蛋白質も本発明に含まれる。
【００１８】 配列番号：３、配列番号：６、配列番号：10またはATCC 98807のcDNAと少なく
とも約65％、好ましくは75％、85％、または95％同一であるヌクレオチド配列を
有する核酸分子によってコードされる単離されたTango-77蛋白質、および配列番
号：３、配列番号：６、配列番号：10のヌクレオチド配列、ATCC 98807のcDNAの
非コード鎖、またはその相補鎖を有する核酸分子と、ストリンジェントなハイブ
リダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する核酸分
子によってコードされる単離されたTango-77蛋白質も本明細書に含まれる。
【００１９】 ポリペプチドが配列番号：１、配列番号：３、配列番号：６、配列番号：10ま
たはその相補鎖を含む核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズす
る核酸分子によってコードされる、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：５
、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：11、配列番号：12、
配列番号：13のアミノ酸配列、またはアクセッション番号98807としてATCCに寄 託されているプラスミドのcDNA挿入断片によってコードされるアミノ酸配列を含
むポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子変種であるポリペプチドも本発明に
含まれる。
【００２０】 本発明のもう一つの態様は、サイトカインスーパーファミリーの他のメンバー
をコードする核酸分子と比較して、Tango-77核酸分子を特異的に検出するTango-
77核酸分子を特徴とする。例えば、一つの態様において、Tango-77核酸分子は、
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：６、配列番号：10、ATCC 98807のcDNA
、またはその相補鎖のヌクレオチド配列を含む核酸分子とストリンジェントな条
件下でハイブリダイズする。もう一つの態様において、Tango-77核酸分子は、長
さが少なくとも300（例えば、325、350、375、400、425、450、500、550、600、
650、700、800、900、または989個）ヌクレオチドであり、配列番号：１、配列 番号：３、配列番号：６、配列番号：10に示すヌクレオチド配列、cDNA ATCC 98
807、またはその相補鎖を含む核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリ ダイズする。さらにもう一つの態様において、本発明はTango-77核酸のコード鎖
とアンチセンスである単離された核酸分子を提供する。
【００２１】 本発明のもう一つの局面は、本発明のTango-77核酸分子を含むベクター、例え
ば組換え発現ベクターを提供する。もう一つの態様において、本発明はそのよう
なベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明はまた、適した培地において、Ta
ngo-77蛋白質が産生されるように組換え発現ベクターを含む発明の宿主細胞を培
養することによってTango-77蛋白質を産生する方法を提供する。
【００２２】 本発明のもう一つの局面は、単離されたまたは組換え型Tango-77蛋白質および
ポリペプチドを特徴とする。好ましいTango-77蛋白質およびポリペプチドは、天
然に存在するヒトTango-77が有する生物活性、例えば（i）Tango-77シグナル伝 達経路における蛋白質との相互作用能；（ii）Tango-77リガンドまたは受容体と
の相互作用能；または（iii）細胞内標的蛋白質との相互作用能、（iv）炎症に 関係する蛋白質との相互作用能、および（v）IL-1受容体の結合能、を少なくと も１個有する。別の活性は、ポリペプチドインターロイキン、サイトカイン、お
よび増殖因子を誘導および抑制することを含む。
【００２３】 本発明のTango-77蛋白質、またはその生物学的活性断片は、非Tango-77ポリペ
プチド（例えば、異種アミノ酸配列）と機能的に結合してTango-77融合蛋白質を
形成することができる。本発明はさらに、モノクローナル抗体またはポリクロー
ナル抗体のような、Tango-77蛋白質と特異的に結合する抗体を特徴とする。さら
に、Tango-77蛋白質またはその生物学的活性部分は、選択的に薬学的に許容され
る担体を含む、薬学的組成物に組み入れることができる。
【００２４】 もう一つの局面において、本発明は、Tango-77活性または発現の有無が生物試
料中において検出されるように、Tango-77活性または発現の指標を検出すること
ができる物質と生物試料を接触させることによって、生物試料中でのTango-77活
性または発現の有無を検出する方法を提供する。
【００２５】 もう一つの局面において、本発明は、細胞内でのTango-77活性または発現が調
節されるようにTango-77活性または発現を調節（阻害または刺激）する物質と細
胞を接触させることを含む、Tango-77活性を調節する方法を提供する。一つの態
様において、物質はTango-77蛋白質に特異的に結合する抗体である。もう一つの
態様において、物質はTango-77遺伝子の転写、Tango-77 mRNAのスプライシング 、またはTango-77 mRNAの翻訳を調節することによってTango-77の発現を調節す る。さらにもう一つの態様において、物質はTango-77 mRNAまたはTango-77遺伝 子のコード鎖とアンチセンスであるヌクレオチド配列を有する核酸分子である。
【００２６】 一つの態様において、本発明の方法は、Tango-77調節物質である物質を被験動
物に投与することによって、異常なTango-77蛋白質活性または核酸発現を特徴と
する障害を有する被験動物を治療するために用いられる。一つの態様において、
Tango-77調節物質はTango-77蛋白質である。もう一つの態様において、Tango-77
調節物質はTango-77核酸分子である。その他の態様において、Tango-77調節物質
はペプチド、ペプチド模倣体、または他の小分子である。好ましい態様において
、異常なTango-77蛋白質または核酸発現を特徴とする障害には、慢性および急性
炎症が含まれる。
【００２７】 本発明はまた、（i）Tango-77蛋白質をコードする遺伝子の異常な修飾または 変異；（ii）Tango-77蛋白質をコードする遺伝子の誤制御；および（iii）遺伝 子の野生型がTango-77活性を有する蛋白質をコードする、Tango-77蛋白質の異常
な翻訳後修飾、の少なくとも１つを特徴とする遺伝子病変または変異の有無を同
定する診断解析法を提供する。
【００２８】 もう一つの局面において、本発明は、Tango-77蛋白質に結合またはその活性を
調節する化合物を同定する方法を提供する。一般に、そのような方法は試験化合
物の存在下または非存在下においてTango-77蛋白質の生物活性を測定すること、
およびTango-77蛋白質の活性を変化させる化合物を同定することを含む。
【００２９】 本発明はまた、化合物の存在下および非存在下においてTango-77の発現を測定
することによってTango-77の発現を調節する化合物を同定する方法を特徴とする
。
【００３０】 本発明の他の特徴および利点は以下の詳細な説明および請求の範囲から明らか
となると思われる。
【００３１】発明の詳細な説明 本発明は、サイトカインスーパーファミリーに属するヒトTango-77をコードす
るcDNA分子の発見に基づいている。ヒトTango-77をコードするcDNA分子は可能性
がある３つのオープンリーディングフレームを有する。ヒトTango-77蛋白質に関
して可能性がある３つのヌクレオチドオープンリーディングフレームを図１に示
す（配列番号：３、配列番号：６および配列番号：10）。可能性がある３つのTa
ngo-77未成熟蛋白質に関して予想されるアミノ酸配列も同様に図１（配列番号：
２、配列番号：７、または配列番号：11）に示し、可能性がある３つの成熟蛋白
質も図１に示す（配列番号：５、配列番号：９、または配列番号：13）。
【００３２】 非翻訳領域を含む長さが約989ヌクレオチドである図１のTango-77 cDNA（配列
番号：１）は、分子量およそ19 kDa、18 kDa、または14.9 kDa（翻訳後修飾を除
く）である蛋白質アミノ酸をコードし、この蛋白質に関して可能性がある成熟型
の分子量は13 kDaである。ヒトTango-77をコードするcDNAを含むプラスミド（cD
NA挿入断片の名称はOf fthx077）は、1998年７月２日にバージニア州、マナッサ
スのユニバーシティブールバード、10801（郵便番号20110-2209）にあるアメリ カンタイプカルチャーコレクション（ATCC）に寄託され、アクセッション番号98
807を付与された。この寄託物は特許手続き上の微生物寄託の国際的承認に関す るブダペスト条約の要件の下で維持される。この寄託物は、当業者の便宜のため
に単に行われるのであって、寄託物が35 U.S.C. 112の下で必要とされる承認で はない。
【００３３】 ヒトTango-77は、特定の保存された構造的および機能的特徴を有する分子ファ
ミリー（「Tango-77ファミリー」）の一員である。「ファミリー」という用語は
、本発明の蛋白質および核酸分子を指す場合、共通の構造的ドメインおよび本明
細書に定義するように十分なアミノ酸もしくはヌクレオチド配列同一性を有する
蛋白質または核酸分子２個以上を意味すると解釈される。そのようなファミリー
メンバーは、天然に存在するものであってもよく、同じまたは異なる種のいずれ
かに由来してもよい。例えば、ファミリーは、ヒト起源の第一の蛋白質およびマ
ウス起源の蛋白質の相同体と共に、ヒト起源の第二の異なる蛋白質およびその蛋
白質のマウス相同体を含むことができる。ファミリーメンバーは同様に、共通す
る機能的特徴を有してもよい。
【００３４】 本明細書において互換的に用いられる「Tango-77活性」、「Tango-77の生物活
性」または「Tango-77の機能的活性」とは、標準的な技法に従ってインビボまた
はインビトロで測定した、Tango-77蛋白質、ポリペプチドまたは核酸分子によっ
て発揮されるTango-77反応性細胞に及ぼす活性を指す。Tango-77活性は、第二の
蛋白質との会合のように直接的な活性、またはTango-77蛋白質と第二の蛋白質と
の相互作用によって媒介される細胞シグナル伝達活性のような間接活性であって
もよい。好ましい態様において、Tango-77活性には、以下の活性の少なくとも１
つ以上が含まれる：（i）Tango-77シグナル伝達経路における蛋白質との相互作 用能；（ii）Tango-77リガンドもしくは受容体との相互作用能；または（iii） 細胞内標的蛋白質との相互作用能、（iv）炎症に関与する蛋白質との相互作用能
、および（v）IL-1受容体結合能。
【００３５】 したがって、本発明のもう一つの態様は、Tango-77活性を有する単離されたTa
ngo-77蛋白質およびポリペプチドを特徴とする。
【００３６】 本発明のさらにもう一つの態様は、シグナル配列を含むTango-77分子を特徴と
する。一般的にシグナル配列（またはシグナルペプチド）は、分泌型蛋白質の最
終N末端において起こるアミノ酸約21〜63個を含むペプチドである。本来のTango
-77シグナル配列（配列番号：４、配列番号：８、または配列番号：12）を除去 して、他の蛋白質からのシグナル配列に置換することができる。特定の宿主細胞
（例えば、哺乳類宿主細胞）では、異種シグナル配列を用いることによって、Ta
ngo-77の発現および／または分泌を増加させることができる。例えば、バキュロ
ウイルス包膜蛋白質のgp67分泌配列は、異種シグナル配列として用いることがで
きる。または、本来のTango-77シグナル配列を、発現系において、例えば関係す
る蛋白質の分泌を促進するために、それ自身異種シグナル配列として用いること
ができる。
【００３７】 本発明の様々な局面は以下の章にさらに詳細に記述する。
【００３８】I．単離核酸分子 本発明の一つの局面は、Tango-77蛋白質またはその生物活性部分をコードする
単離された核酸分子と共に、Tango-77コード核酸を特定するためのハイブリダイ
ゼーションプローブとして用いるために十分である核酸分子（例えば、Tango-77 mRNA）およびTang-77核酸分子の増幅または変異のためのPCRプライマーとして 用いられる断片に関する。本明細書において用いられるように、「核酸分子」と
いう用語は、DNA分子（例えば、cDNAまたはゲノムDNA）およびRNA分子（例えば 、mRNA）、ならびにヌクレオチド類似体を用いて生成されたDNAまたはRNAの類似
体を含むと解釈される。核酸分子は一本鎖、または二本鎖であってもよいが、好
ましくは二本鎖DNAである。
【００３９】 「単離された」核酸分子とは、核酸の天然材料に存在する他の核酸分子から分
離された分子である。好ましくは「単離された」核酸分子は、核酸が由来する生
体のゲノムDNAにおいて核酸に天然に隣接する（すなわち、核酸の5'および3'末 端に存在する配列）配列（好ましくは蛋白質コード配列）を含まない。例えば、
様々な態様において、単離されたTango-77核酸分子は、核酸が由来する細胞のゲ
ノムDNAにおいて核酸分子に天然に隣接するヌクレオチド配列の約５kb、４kb、 ３kb、２kb、１kb、0.5 kb、または0.1 kb未満を含むことができる。その上、cD
NA分子のような「単離された」核酸分子は、組換え技法によって生成される場合
には他の細胞材料もしくは培養培地を実質的に含まない、または化学合成される
場合には化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。
【００４０】 本発明の核酸分子、例えば配列番号：１、配列番号：３、配列番号：６、配列
番号：10、ATCC 98807のcDNAのヌクレオチド配列、またはこれらのヌクレオチド
配列のいずれかの相補鎖を有する核酸分子は、標準的な分子生物学技法および本
明細書に提供した配列情報を用いて単離することができる。ハイブリダイゼーシ
ョンプローブとして、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：６、配列番号：
10の核酸配列、ATCC 98807のcDNA、またはその相補鎖の全てまたは一部を用いる
ことによって、Tango-77核酸分子は、標準的なハイブリダイゼーションおよびク
ローニング技法（例えば、サムブルックら（Sambrook）編、「分子のクローニン
グ：実験マニュアル（Molecular Cloning：A Laboratory Manual）」第二版、コ
ールドスプリングハーバー研究所、コールドスプリングハーバー研究所出版、コ
ールドスプリングハーバー、ニューヨーク州、1989）を用いて単離することがで
きる。
【００４１】 本発明の核酸はcDNA、mRNAまたはゲノムDNAを鋳型として、および適当なオリ ゴヌクレオチドプライマーを用いて、標準的なPCR増幅技法に従って増幅するこ とができる。そのように増幅された核酸は適当なベクターにクローニングして、
DNA配列分析によって特徴付けを行うことができる。さらに、Tango-77ヌクレオ チド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技法、例えば、自動DN
Aシンセサイザーを用いて調製することができる。
【００４２】 もう一つの好ましい態様において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号
：１、配列番号：３、配列番号：６、配列番号：10に示すヌクレオチド配列、AT
CC 98807 cDNA、またはその一部の相補鎖である核酸分子を含む。所定のヌクレ オチド配列と相補的な核酸分子は、所定のヌクレオチド配列とハイブリダイズす
ることができ、それによって安定な二本鎖を形成する、所定のヌクレオチド配列
と十分に相補的である配列である。
【００４３】 その上、本発明の核酸分子は、Tango-77をコードする核酸配列の一部のみ、例
えばプローブもしくはプライマーとして用いることができる断片、またはTango-
77の生物活性部分をコードする断片を含むことができる。ヒトTango-77遺伝子の
クローニングから決定したヌクレオチド配列により、他の細胞タイプ、例えば他
の組織からのTango-77相同体の同定および／またはクローニングに用いるために
デザインされたプローブおよびプライマーの生成と共に、他の哺乳類からのTang
o-77相同体の生成が得られる。プローブ／プライマーは典型的に、実質的に純粋
なオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、典型的にストリンジェン
トな条件で、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：６、配列番号：10、また
はATCC98807のcDNAのセンスまたはアンチセンス配列の少なくとも約12、好まし くは約25、より好ましくは約50、75、100、125、150、175、200、250、300、350
または400連続ヌクレオチドとハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含 む。または、オリゴヌクレオチドは典型的に、ストリンジェントな条件下で配列
番号：１、配列番号：３、配列番号：６、配列番号：10の天然に存在する変異体
、またはATCC98807のcDNAのセンスもしくはアンチセンス配列のセンスもしくは アンチセンス配列の少なくとも約12、好ましくは約25、より好ましくは約50、75
、100、125、150、175、200、250、300、350または400連続ヌクレオチドとハイ ブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。
【００４４】 ヒトTango-77ヌクレオチド配列に基づくプローブは、同じまたは同一の蛋白質
をコードする転写物またはゲノム配列を検出するために用いることができる。プ
ローブは、それに結合する標識基、例えば放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、
または酵素共因子を含む。そのようなプローブは、被験動物の細胞試料中におけ
るTango-77コード核酸レベルを測定することによって、例えばTango-77 mRNAレ ベルを検出することによって、またはゲノムTango-77遺伝子が変異しているまた
は欠失しているか否かを決定することによって、Tango-77蛋白質を誤発現する細
胞または組織を同定する診断的試験キットの一部として用いることができる。
【００４５】 「Tango-77の生物学的に活性な部分」をコードする核酸断片は、Tango-77生物
活性を有するポリペプチドをコードする、配列番号：１、配列番号：３、配列番
号：６、配列番号：10の一部またはATCC 98807のcDNAのヌクレオチド配列を単離
して、Tango-77蛋白質のコードされた部分を発現し（例えば、インビトロでの組
換え型発現によって）、およびTango-77のコードされた部分の活性を評価するこ
とによって調製することができる。
【００４６】 本発明はさらに、遺伝コードの縮重のために配列番号：１、配列番号：３、配
列番号：６、配列番号：10のヌクレオチド配列またはATCC 98807のcDNAとは異な
り、このように配列番号：１、配列番号：３、配列番号：６、配列番号：10のヌ
クレオチド配列またはATCC 98807のcDNAによってコードされるものと同じTango-
77蛋白質をコードする核酸分子を含む。
【００４７】 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：６、配列番号：10に示すヒトTango-
77ヌクレオチド配列またはATCC 98807のcDNAのほかに、Tango-77のアミノ酸配列
の変化に至るDNA配列多形が集団（例えば、ヒト集団）に存在する可能性がある と当業者は認識するであろう。Tango-77遺伝子におけるそのような遺伝子多形は
、天然の対立遺伝子変種による集団内での個体に存在する可能性がある。対立遺
伝子は所定の遺伝子座で二者択一的に起こる遺伝子のグループの一つである。本
明細書において用いられるように、「対立遺伝子変種」という用語は、Tango-77
遺伝子座で起こるヌクレオチド配列、またはヌクレオチド配列によってコードさ
れるポリペプチドを指す。本明細書において用いられるように、「遺伝子」およ
び「組換え型遺伝子」という用語は、Tango-77蛋白質、好ましくは哺乳類のTang
o-77蛋白質をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子を指す。
そのような天然の対立遺伝子変種のため、典型的にTango-77遺伝子のヌクレオチ
ド配列に１〜５％の変動が起こる。もう一つの対立遺伝子は、異なる多数の個体
において関係する遺伝子をシークエンシングすることによって同定することがで
きる。これは、多様な個体における同じ遺伝子座を同定するためのハイブリダイ
ゼーションプローブを用いることによって容易に行うことができる。そのような
ヌクレオチド変種の全て、および天然の対立遺伝子変種の結果であり、しかもTa
ngo-77の機能的活性を変化させないTango-77において得られたアミノ酸多形また
は変種は、本発明の範囲内であると解釈される。
【００４８】 その上、ヒトTango-77のヌクレオチド配列とは異なるヌクレオチド配列を有す
る他の種からのTango-77蛋白質（Tango-77相同体）をコードする核酸分子も本発
明の範囲内であると解釈される。本発明のTango-77 cDNAの天然の対立遺伝子変 種および相同体に対応する核酸分子は、ヒトcDNAまたはその一部を、ストリンジ
ェントなハイブリダイゼーション条件下での標準的なハイブリダイゼーション技
法に従って、ハイブリダイゼーションプローブとして用いて、本明細書に開示の
ヒトTango-77核酸との同一性に基づいて単離することができる。
【００４９】 したがって、もう一つの態様において、本発明の単離された核酸分子は、長さ
が少なくとも300（325、350、375、400、425、450、500、550、600、650、700、
800、または989）ヌクレオチドであり、配列番号：１、配列番号：３、配列番号
：６、配列番号：10のヌクレオチド配列、好ましくはコード配列、またはATCC 9
8807のcDNAを含む核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。
【００５０】 本明細書において用いられるように、「ストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズする」という用語は、互いに少なくとも60％（65％、70％、好ましくは75
％）同一であるヌクレオチド配列が典型的に互いにハイブリダイズしたままであ
る、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を記述すると解釈される。そのよう
なストリンジェントな条件は当業者に既知であり、「分子生物学の現在のプロト
コール（Current Protocols in Molecular Biology）」、ジョンウィリー＆サン
ズ、ニューヨーク、（1989）、6.3.1〜6.3.6.に記述されている。ストリンジェ ントなハイブリダイゼーション条件の好ましい、非制限的な例は約45℃で６×塩
化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（SSC）でハイブリダイゼーションを行い、5
0〜65℃で0.2×SSC、0.1％SDSで１回以上洗浄することである。好ましくは、ス トリンジェントな条件で配列番号：１、配列番号：３、配列番号：６、配列番号
：10の配列またはATCC 98807のcDNAまたはその相補鎖とハイブリダイズする本発
明の単離された核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。本明細書で用
いるように、「天然に存在する」核酸分子とは、天然に存在する（例えば、天然
の蛋白質をコードする）ヌクレオチド配列を有するRNAまたはDNA分子を指す。
【００５１】 集団において存在する可能性があるTango-77配列の天然に存在する対立遺伝子
変種のほかに、当業者は配列番号：１、配列番号：３、配列番号：６、配列番号
：10のヌクレオチド配列またはATCC 98807のcDNAへの変異によって変化を導入し
、それによってTango-77蛋白質の生物活性を変化させることなく、コードされた
Tango-77蛋白質のアミノ酸配列を変化させることができることをさらに認識する
であろう。多様な種のTango-77において保存されていない、または単に半保存さ
れているに過ぎないアミノ酸残基は活性にとって必須ではなく、このため変化目
標となる可能性がある。または、「非必須」アミノ酸残基でのアミノ酸置換に至
るヌクレオチド置換を行うことができる。「非必須」アミノ酸残基は、生物活性
を変化させることなくTango-77の野生型配列（例えば、配列番号：２、配列番号
：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：11または配列番号：13）から変
化させることができる残基であるのに対し、「必須」アミノ酸残基は生物活性に
とって必要である。例えば、様々な種のTango-77蛋白質において保存されている
アミノ酸残基は、Tango-77活性を低下または変化させたい場合でなければ、活性
にとって必須であり、変化目標とはならない可能性がある。
【００５２】 したがって、本発明のもう一つの局面は、活性にとって必須でないアミノ酸残
基の変化を含むTango-77蛋白質をコードする核酸分子に関する。そのようなTang
o-77蛋白質は、配列番号：２、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配
列番号：11、または配列番号：13からのアミノ酸配列が異なるが、なお生物活性
を有する。一つの態様において、単離された核酸分子は、配列番号：２、配列番
号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：11、または配列番号：13のア
ミノ酸配列と少なくとも約45％同一であり、65％、75％、85％、95％、または98
％同一であるアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００５３】 配列番号：２、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：11、
もしくは配列番号：13の配列とは異なる配列を有するTango-77蛋白質をコードす
る単離核酸分子は、１個以上のアミノ酸置換、付加、もしくは欠失が、コードさ
れる蛋白質に導入されるように、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：６、
配列番号：10のヌクレオチド配列、またはATCC 98807のcDNAに１つ以上のヌクレ
オチド置換、負荷、または欠失を導入することによって作製することができる。
変異は、部位指向変異誘発およびPCRによる変異誘発のような標準的な技法を用 いて導入することができる。好ましくは、予想される非必須アミノ酸残基１個以
上に保存的アミノ酸置換を行う。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が
類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換される置換である。類似の側鎖を有する
アミノ酸残基のファミリーは当技術分野において既に定義されている。これらの
ファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸
性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、
グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システ
イン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プ
ロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例え
ば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン
、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれ
る。このように、Tango-77において予想される非必須アミノ酸残基は、好ましく
は同じ側鎖ファミリーからのもう一つのアミノ酸残基で置換される。または変異
は、例えば飽和変異誘発によって、Tango-77コード配列の全てまたは一部に無作
為に導入することができ、得られた変異体をTango-77生物活性に関してスクリー
ニングして活性を保持する変異体を同定することができる。変異誘発の後、コー
ドされた蛋白質を組換え発現させ、蛋白質の活性を決定することができる。
【００５４】 好ましい態様において、変異体Tango-77蛋白質は以下に対して解析することが
できる：（1）Tango-77シグナル伝達経路における蛋白質との蛋白質：蛋白質相 互作用形成能力；（2）Tango-77リガンドもしくは受容体結合能；または（3）細
胞内標的蛋白質との結合能、（4）炎症に関与する蛋白質との相互作用能、また は（5）IL-1受容体結合能。さらにもう一つの好ましい態様において、変異体Tan
go-77は炎症、喘息、自己免疫疾患および敗血症の調節能に関して解析すること ができる。
【００５５】 本発明は、アンチセンス核酸分子、すなわち蛋白質をコードするセンス核酸と
相補的である分子、例えば二本鎖cDNA分子のコード鎖と相補的である、またはmR
NA配列と相補的である分子を含む。したがって、アンチセンス核酸はセンス核酸
と水素結合することができる。アンチセンス核酸は全Tango-77コード鎖、または
そのごく一部、例えば蛋白質コード領域の全体または一部（またはオープンリー
ディングフレーム）と相補的となりうる。アンチセンス核酸分子はTango-77をコ
ードするヌクレオチド配列のコード鎖の非コード領域とアンチセンスとなりうる
。非コード領域（「5'および3'非翻訳領域」）は、コード領域に隣接し、アミノ
酸に翻訳されない5'および3'配列である。
【００５６】 本明細書に開示のTango-77をコードするコード鎖配列（例えば、配列番号：３
、配列番号：５、または配列番号：８）があれば、本発明のアンチセンス核酸は
、ワトソンとクリック（Watson and Crick）の塩基対形成規則に従ってデザイン
することができる。アンチセンス核酸分子は、Tango-77 mRNAの全コード領域と 相補的となりうるが、より好ましくはTango-77 mRNAのコードまたは非コード領 域のごく一部とアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチ
センスオリゴヌクレオチドは、Tango-77 mRNAの翻訳開始部位周辺の領域、例え ば配列5'-TGCAACTTTTACAGGAAACAC-3'（配列番号：19）または5'-CCTCACTTTTACCC
GAGACTC-3'（配列番号：20）、または5'-GACGGGTGGTACTTAAAACAA-3'（配列番号 ：21）を有するオリゴヌクレオチドと相補的となりうる。アンチセンスオリゴヌ
クレオチドは例えば、長さが約５、10、15、20、25、30、35、40、45または50ヌ
クレオチドとなりうる。本発明のアンチセンス核酸は、当技術分野で既知の技法
を用いた化学合成および酵素的ライゲーション反応を用いて構築することができ
る。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は
、天然に存在するヌクレオチド、または分子の生物学的安定性を増加させるよう
に、もしくはアンチセンスとセンス核酸の間に形成される二本鎖の物理的安定性
を増加させるようにデザインされた多様に修飾されたヌクレオチドを用いて化学
合成することができ、例えばホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌ
クレオチドを用いることができる。アンチセンス核酸を作製するために用いるこ
とができる修飾されたヌクレオチドの例には、5-フルオロウラシル、5-ブロモウ
ラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、
4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、5-カルボキシ
メチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシ ル、ジヒドロウラシル、β-D-ガラクトシルケオシン、イノシン、N6-イソペンテ
ニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、
2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、
N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシ アミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルケオシン、5'-メトキシカルボ キシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルア
デニン、ウラシル-5-オキシ酢酸（v）、ウィブトキソシン、シュードウラシル、
ケオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チ オウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラ シル-5-オキシ酢酸（v）、5-メチル-2-チオウラシル、3-(3-アミノ-3-N-2-カル ボキシプロピル)ウラシル（acp3）w、および2,6-ジアミノプリンが含まれる。ま
たは、アンチセンス核酸は、その中で核酸がアンチセンス方向にサブクローニン
グされる発現ベクターを用いて生物学的に産生することができる（すなわち、挿
入された核酸から転写されたRNAは以下の章に詳しく記述する、関係する標的核 酸とアンチセンス方向のRNAである）。
【００５７】 本発明のアンチセンス核酸分子は典型的に、それらがTango-77蛋白質をコード
する細胞のmRNAおよび／またはゲノムDNAとハイブリダイズもしくは結合し、そ れによって蛋白質の発現を阻害するように、例えば転写および／または翻訳を阻
害することによって、被験動物に投与される、またはインサイチューで産生され
る。ハイブリダイゼーションは、安定な二本鎖を形成するために従来のヌクレオ
チド相補性によって、または例えばDNA二本鎖に結合するアンチセンス核酸分子 の場合には、二重ヘリックスの大きい溝における特異的相互作用によって行うこ
とができる。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例には、組織部位での
直接インジェクションが含まれる。またはアンチセンス核酸分子は選択した細胞
を標的とするように改変して、全身投与することができる。例えば、全身投与の
場合、アンチセンス分子は、例えばアンチセンス核酸分子を細胞表面受容体また
は抗原と結合するペプチドまたは抗体と結合させることによって、選択した細胞
表面に発現された受容体または抗原にそれらが特異的に結合するように改変する
ことができる。アンチセンス核酸分子はまた、本明細書に記述のベクターを用い
て細胞に輸送することができる。アンチセンス分子が十分な細胞内濃度となるよ
うに、アンチセンス核酸分子が強いpol IIまたはpol IIIプロモーターの制御下 に置かれるベクター構築物が好ましい。
【００５８】 本発明のアンチセンス核酸分子はαアノマー核酸分子となりうる。α-アノマ ー核酸分子は通常のβユニットとは対照的に、その鎖が互いに平行である相補的
RNAと特異的二本鎖ハイブリッドを形成する（ゴールティエら（Gaultier）、（1
987）、Nucleic Acids Res. 15：6625〜6641）。アンチセンス核酸分子はまた、
2'-o-メチルリボヌクレオチド（イノウエら（Inoue）、（1987）、Nucleic Acid
s Res. 15：6131〜6148）またはキメラRNA-DNA類似体（イノウエ（Inoue）ら、 （1987）、FEBS Lett. 215：327〜330）を含むことができる。
【００５９】 本発明はまたリボザイムを含む。リボザイムは、mRNAのような、それに対して
それらが相補性領域を有する一本鎖核酸を開裂することができるリボヌクレアー
ゼ活性を有する触媒的RNA分子である。このように、リボザイム（例えば、ハン マーヘッドリボザイム（ハセルホフ＆ゲルラック（Haselhoff and Gerlach）、 （1988）、Nature 334：585〜591）を用いてTango-77 mRNA転写物を触媒的に開 裂し、それによってTango-77 mRNAの翻訳を阻害することができる。Tango-77コ ード核酸に対する特異性を有するリボザイムは、本明細書に開示のTango-77 cDN
Aのヌクレオチド配列（例えば、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：６、 配列番号：10）に基づいてデザインすることができる。例えば、活性部位のヌク
レオチド配列がTango-77コードmRNAにおいて開裂されるヌクレオチド配列と相補
的であるテトラヒメナ（Tetrahymena）L-19 IVS RNAの誘導体を構築することが できる。例えば、セックら（Cech）、米国特許第4,987,071号；およびセックら （Cech）、米国特許第5,116,742号を参照のこと。または、Tango-77 mRNAはRNA 分子のプールからの特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒RNAを選択するた めに用いることができる。例えば、バーテル＆スゾスタック（Bartel and Szost
ak）（1993）、Science 261：1411〜1418を参照のこと。
【００６０】 本発明はまた、三重らせん構造を形成する核酸分子を含む。例えば、Tango-77
遺伝子発現は、Tango-77の調節領域と相補的であるヌクレオチド配列（例えば、
Tango-77プロモーターおよび／またはエンハンサー）を標的にして標的細胞にお
いてTango-77遺伝子の転写を防止する三重らせん構造を形成することによって阻
害することができる。概して、へレン（Helene）（1991）、Anticancer Drug De
s. 6（6）：569〜84；ヘレン（Helene）（1992）、Ann. N. Y. Acad. Sci. 660 ：27〜36；およびマヘール（Maher）（1992）、Bioassays 14（12）：807〜15を
参照のこと。
【００６１】 好ましい態様において、本発明の核酸分子は例えば、分子の安定性、ハイブリ
ダイゼーション、または溶解性を改善するために、塩基部分、糖部分、またはリ
ン酸骨格を修飾することができる。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸骨格
は、ペプチド核酸を産生するように改変することができる（ヒルップら（Hyrup ）（1996）、Bioorganic & Medicinal Chemistry 4（1）：5〜23）。本明細書に
おいて用いられるように、「ペプチド核酸」または「PNA」という用語は、核酸 模倣体、例えばデオキシリボースリン酸骨格がシュードペプチド骨格に置換され
、保持されている天然のヌクレオベースは４個に過ぎないDNA模倣体を指す。中 性のPNA骨格は、低イオン強度の条件でDNAおよびRNAとの特異的ハイブリダイゼ ーションが起こることが示されている。PNAオリゴマーの合成は、ヒルップら（H
yrup）（1996）、上記；ペリー・オケーフェ（Perry-O'Keefe）ら（1996）、Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 93：14670〜675に記述のように標準的な固相ペプチド
合成プロトコールを用いて行うことができる。
【００６２】 Tango-77のPNAは治療的および診断的応用において用いることができる。例え ばPNAは、例えば、転写もしくは翻訳の停止を誘導する、または複製を阻害する ことによって、遺伝子発現を配列特異的に調節するためにアンチセンスまたは抗
遺伝子物質として用いることができる。Tango-77のPNAはまた、例えば遺伝子に おける単塩基対変異の分析において、例えばPNA指向PCRクランピングによって；
他の酵素、例えばS1ヌクレアーゼ（ヒルップら（Hyrup）（1996）、上記）と併 用して用いる場合には人工的な制限酵素として；またはDNA配列およびハイブリ ダイゼーションのためのプローブもしくはプライマーとして（ヒルップら（Hyru
p）（1996）、上記；ペリー・オケーフェ（Perry-O'Keefe）ら（1996）、Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 93：14670〜675）用いることができる。
【００６３】 もう一つの態様において、Tango-77のPNAは例えば、親油性または他のヘルパ ー基をPNAに接着させることによって、PNA-DNAキメラの形成によって、またはリ
ポソームもしくは当技術分野で既知の薬物輸送の他の技法を用いることによって
、その安定性または細胞の取り込みを増強するために改変することができる。例
えば、PNAおよびDNAの有利な特性を組み合わせてもよいTango-77のPNA-DNAキメ ラを作製することができる。そのようなキメラは、例えば、RNアーゼHおよびDNA
ポリメラーゼのようなDNA認識酵素がDNA部分と相互作用し、PNA部分は高い結合 親和性および特異性を提供する。PNA-DNAキメラは塩基のスタッキング、ヌクレ オベース間の結合数、および方向に関して選択される適当な長さのリンカーを用
いて結合させることができる（ヒルップ(Hyrup)(1996)、上記）。PNA-DNAキメラ
の合成はヒルップ（Hyrup）（1996）、上記およびフィンら（Fin）、（1996）Nu
cleic Acids Res. 24（17）：3357〜63に記述のように実施することができる。 例えば、DNA鎖は標準的なホスホロアミダイトカップリング化学および改変した ヌクレオシド類似体を用いて固相支持体上で合成することができる。5'-(4-メト
キシトリチル)アミノ-5'-デオキシ-チミジン・ホスホロアミダイトのような化合
物は、PNAとDNAの5'末端との結合として用いることができる（マグ（Mag）ら、 （1989）、Nucleic Acids Res. 24（17）：5973〜88）。PNAモノマーは5' PNA部
分および3' DNA部分を有するキメラ分子を産生するよう段階的にカップリングす
る（フィン（Fin）ら、（1996）Nucleic Acids Res. 24（17）：3357〜63）。ま
たはキメラ分子は5' DNA部分および3' PNA部分と共に合成することができる（ペ
ターサーら（Peterser）（1975）、Bioorganic Med. Chem. Lett. 5：1119〜111
24）。
【００６４】 他の態様において、オリゴヌクレオチドはペプチド（例えば、インビボで宿主
細胞受容体をターゲティングするため）、または細胞膜を通じての輸送を促進す
る物質（例えば、レッチンガーら（Letsinger）（1989）、Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 86：6553〜6556；レマイター（Lemaitre）ら（1987）、Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA 84：648〜652；PCT国際公開公報第88/09810号を参照のこと）、ま
たは血液脳関門（例えば、PCT国際公開公報第89/10134号を参照のこと）のよう な他の付属基を含んでもよい。さらに、オリゴヌクレオチドはハイブリダイゼー
ション誘発開裂物質（例えば、クロール（Krol）ら（1988）、Bio/Techniques 6
：958〜976を参照のこと）、またはインターカレート剤（例えばツォン（Zon） （1988）Pharm. Res. 5：539〜549を参照のこと）によって改変することができ る。このため、オリゴヌクレオチドは、もう一つの分子、例えばペプチド、ハイ
ブリダイゼーション誘発クロスリンク剤、輸送物質、ハイブリダイゼーション誘
発開裂物質等に結合してもよい。
【００６５】II．単離されたTango-77蛋白質および抗Tango-77抗体 本発明の一つの局面は、単離されたTango-77蛋白質およびその生物学的活性部
分と共に、抗Tango-77抗体を作製する免疫原として用いるのに適したポリペプチ
ド断片に関する。一つの態様において、本来のTango-77蛋白質は、標準的な蛋白
質精製技法を用いた適当な精製スキームによって細胞または組織源から単離する
ことができる。もう一つの態様において、Tango-77蛋白質は組換え型DNA技法に よって産生される。組換え型発現の代用として、Tango-77蛋白質またはポリペプ
チドは、標準的なペプチド合成技法を用いて化学合成することができる。
【００６６】 「単離された」もしくは「精製された」蛋白質またはその生物学的活性部分は
、Tango-77蛋白質が由来する細胞もしくは組織源からの細胞材料またはその他の
混入蛋白質を実質的に含まず、または化学合成の場合には化学前駆体もしくは他
の化学物質を実質的に含まない。「細胞材料を実質的に含まない」という表現は
、蛋白質が単離されている、または組換え的に産生される細胞の細胞成分とは分
離されているTango-77蛋白質の調製物を含む。このように、細胞材料を実質的に
含まないTango-77蛋白質には、非Tango-77蛋白質（本明細書において「混入蛋白
質」とも呼ぶ）約30％、20％、10％または５％（乾燥重量で）未満を含むTango-
77調製物が含まれる。Tango-77蛋白質またはその生物学的活性部分が組換え的に
産生される場合、それは培養培地を実質的に含まない、すなわち培養培地は蛋白
質調製物の容量の約20％、10％または５％未満であることが好ましい。Tango-77
蛋白質が化学合成によって産生される場合、それは好ましくは化学前駆体または
他の化学物質を実質的に含まない、すなわち蛋白質の合成に関係する化学前駆体
または他の化学物質とは分離されている。したがって、Tango-77蛋白質のそのよ
うな調製物は、化学前駆体または非Tnago-77化学物質を約30％、20％、10％、５
％（乾燥重量によって）未満有する。
【００６７】 Tango-77蛋白質の生物活性部分には、全長のTango-77蛋白質よりアミノ酸数個
少なく、およびTango-77蛋白質の活性少なくとも１つを示す、Tango-77蛋白質の
アミノ酸配列（例えば、配列番号：２、配列番号：５、配列番号：７、配列番号
：９、配列番号：11または配列番号：13に示すアミノ酸配列）と十分に同一であ
る、またはそれらに由来するアミノ酸配列を含むペプチドが含まれる。典型的に
、生物学的に活性な部分は、Tango-77蛋白質の活性少なくとも１つを有するドメ
インまたはモチーフを含む。Tango-77蛋白質の生物学的に活性な部分は、例えば
長さがアミノ酸10個、25個、50個、100個以上であるポリペプチドとなりうる。
【００６８】 その上、蛋白質の他の領域が欠失している他の生物学的活性部分は、組換え技
法によって調製することができ、本来のTango-77蛋白質の機能的活性１つ以上に
ついて評価することができる。
【００６９】 好ましいTango-77蛋白質は、配列番号：２、配列番号：５、配列番号：７、配
列番号：９、配列番号：11または配列番号：13に示すアミノ酸配列を有する。他
の有用なTango-77蛋白質は、配列番号：２、配列番号：５、配列番号：７、配列
番号：９、配列番号：11または配列番号：13と実質的に同一であり、配列番号：
２、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：11または配列番号
：13の蛋白質の機能的活性を保持するが、天然の対立遺伝子変種または変異誘発
によりアミノ酸配列が異なる。したがって、有用なTango-77蛋白質は、配列番号
：２、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：11または配列番
号：13のアミノ酸配列と少なくとも約45％、好ましくは55％、65％、75％、85％
、95％、または99％同一であるアミノ酸配列を含み、および配列番号：２、配列
番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：11または配列番号：13のTa
ngo-77蛋白質の機能的活性を保有する蛋白質である。好ましい態様において、Ta
ngo-77蛋白質は、配列番号：２、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、
配列番号：11または配列番号：13のTango-77蛋白質の機能的活性を保有する。
【００７０】 ２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列間の同一性の割合を決定するために
、配列は最適な比較目的のために配置する（例えば、第二のアミノ酸または核酸
配列との最適な配置を得るために第一のアミノ酸配列または核酸配列に空白を導
入することができる）。次に、対応するアミノ酸の位置またはヌクレオチドの位
置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第一の配列での位置が、第
二の配列での対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有
されている場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性の割合は
、配列が共有する同一位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一位置の
数／位置、例えば重なりの総数×100）。好ましくは、２つの配列は同じ長さで ある。
【００７１】 ２つの配列間の％相同性の決定は数学的アルゴリズムを用いて行うことができ
る。２つの配列の比較に用いられる数学的アルゴリズムの好ましい非制限的な実
施例は、カーリン＆アルツシュル（Karlin and Altschul）（1993）Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 90：5853〜5877において改変された、カーリン＆アルツシュル
（Karlin and Altschul）（1990）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87：2264〜2268
のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムはアルツシュル（Altschul）ら
（1990）、J. Mol. Biol. 215：403〜410のNBLASTおよびXBLASTプログラムに組 み込まれている。BLASTヌクレオチド探索は、本発明のTango-77核酸分子と相同 なヌクレオチド配列を得る場合にはスコア＝100、語長＝12のNBLASTプログラム によって実行することができる。BLAST蛋白質探索は、本発明のTango-77蛋白質 分子と相同なヌクレオチド配列を得る場合にはスコア＝50、語長＝３のXBLASTプ
ログラムによって実行することができる。比較目的のための空白のある配置を得
るために、空白のあるBLASTをアルツシュル（Altschul）ら（1997）、Nucleic A
cids Res. 25：3389〜3402に記述のように用いることができる。BLASTおよび空 白のあるBLASTプログラムを用いる際には、それぞれのプログラム（例えばXBALS
TおよびNBLAST）のデフォルトパラメータを用いることができる。http://www.nc
bi.nlm.nih.gov.を参照のこと。配列比較のために用いられる数学的アルゴリズ ムのもう一つの好ましい、非制限的な例は、メイヤーズ＆ミラー（Meyers and M
iller）CABIOS（1989）のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、GCG
配列配置ソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム（バージョン2.0
）に組み込まれている。アミノ酸配列の比較のためにALIGNプログラムを用いる 場合には、PAM120加重残基表、空白長のペナルティ12、および空白ペナルティ４
を用いることができる。
【００７２】 ２つの配列間の同一性の割合は、空白を認めるか否かによらず、上記の技法と
類似の技法を用いて決定することができる。同一性の割合を計算する場合には正
確なマッチのみを計数する。
【００７３】 本発明はまた、Tango-77キメラまたは融合蛋白質を提供する。本明細書におい
て用いられるように、Tango-77「キメラ蛋白質」または「融合蛋白質」は非Tang
o-77ポリペプチドと機能的に結合したTango-77ポリペプチドを含む。「Tango-77
ポリペプチド」とは、Tango-77ポリペプチドに対応するアミノ酸配列を有するポ
リペプチドを指すのに対し、「非Tango-77ポリペプチド」とは、Tango-77蛋白質
と実質的に同一でない蛋白質、例えばTango-77蛋白質とは異なり、および同じま
たは異なる生体に由来する蛋白質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチド
を指す。Tango-77融合蛋白質の中で、Tango-77ポリペプチドはTango-77蛋白質の
全てまたは一部、好ましくはTango-77蛋白質の少なくとも１つの生物活性部分に
対応することができる。融合蛋白質の中で、「機能的に結合した」という用語は
、Tango-77ポリペプチドおよび非Tango-77ポリペプチドが互いにインフレームで
融合することを示すと解釈される。非Tango-77ポリペプチドはTango-77ポリペプ
チドのN-末端またはC末端と融合することができる。
【００７４】 一つの有用な融合蛋白質は、Tango-77配列がGST配列のC末端と融合するGST-Ta
ngo-77融合蛋白質である。そのような融合蛋白質は、組換え型Tango-77の精製を
促進することができる。
【００７５】 もう一つの態様において、融合蛋白質はそのN末端において異種シグナル配列 を含むTango-77蛋白質である。例えば、本来のTango-77シグナル配列（すなわち
、配列番号：２のアミノ酸約１位〜63位；配列番号：４；または配列番号：７の
アミノ酸約１位〜52位；配列番号：８；または配列番号：11のアミノ酸１位〜21
位；配列番号：12）を除去してもう一つの蛋白質からのシグナル配列に置換する
ことができる。特定の宿主細胞（例えば、哺乳類の宿主細胞）においてTango-77
の発現および／または分泌は異種シグナル配列を用いることによって増加させる
ことができる。例えば、バキュロウイルス包膜蛋白質のgp67分泌配列は、異種シ
グナル配列として用いることができる（アウスユベールら（Ausubel）、上記） 。真核生物異種シグナル配列の他の例には、メリチンおよびヒト胎盤のアルカリ
フォスファターゼの分泌配列（ストラタジーン；ラホヤ、カリフォルニア州）が
含まれる。さらにもう一つの例において、有用な原核生物異種シグナル配列には
phoA分泌シグナル（サムブルック（Sambrook）ら、上記）、およびプロテインA 分泌シグナル（ファルマシア・バイオテック；ピスキャタウェイ、ニュージャー
ジー州）が含まれる。
【００７６】 さらにもう一つの態様において、融合蛋白質はその中でTango-77の全てまたは
一部が免疫グロブリン蛋白質ファミリーのメンバーに由来する配列と融合してい
るTango-77免疫グロブリン融合蛋白質である。本発明のTango-77免疫グロブリン
融合蛋白質は、薬学的組成物に組み入れて、細胞表面上のTango-77リガンドおよ
びTango-77受容体との相互作用を阻害し、それによってTango-77媒介シグナル伝
達をインビボで抑制するために被験動物に投与することができる。Tango-77免疫
グロブリン融合蛋白質を用いて、Tango-77の同種のリガンドの生物学的利用率に
影響を及ぼすことができる。Tango-77リガンド／Tango-77相互作用の阻害は、炎
症および自己免疫疾患の治療の双方に対して治療的に有用となる可能性がある。
その上、本発明のTango-77免疫グロブリン融合蛋白質は、被験動物において抗Ta
ngo-77抗体を産生し、Tango-77リガンドを精製するための免疫原として、および
Tango-77とTango-77受容体との相互作用を阻害する分子を同定するスクリーニン
グ解析において免疫原として用いることができる。
【００７７】 好ましくは、本発明のTango-77キメラまたは融合蛋白質は、標準的な組換え型
DNA技法によって産生される。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするDNA
断片は、従来の技法に従って、例えばライゲーションのための平滑末端またはス
タッガー末端、適当な末端を提供するための制限酵素消化、必要に応じた付着末
端の閉塞、望ましくない結合を防止するためのアルカリフォスファターゼ処置、
および酵素的ライゲーションを用いることによって、インフレームでライゲーシ
ョンされる。もう一つの態様において、融合遺伝子は自動DNAシンセサイザーを 含む従来の技法によって合成することができる。または遺伝子断片のPCR増幅は 、保存された２つの遺伝子断片間の相補的オーバーハングを生じるアンカープラ
イマーを用いて行うことができ、これをその後アニーリングして再増幅するとキ
メラ遺伝子配列が得られる（例えば、「分子生物学の現在のプロトコール（Curr
ent Protocols in Molecular Biology）」、アウスユベール（Ausubel）ら編、 ジョンウィリー＆サンズ：1992を参照のこと）。その上、既に融合部分をコード
している多くの発現ベクター（例えば、GSTポリペプチド）が市販されている。T
ango-77コード核酸は、融合部分がTango-77蛋白質にインフレームで結合するよ うに、発現ベクターにクローニングすることができる。
【００７８】 本発明は、Tango-77蛋白質の変種（すなわち、Tango-77アミノ酸配列の配列と
は異なる配列を有する蛋白質）にも関する。そのような変種はTango-77アゴニス
ト（模倣体）またはTango-77アンタゴニストのいずれかとして機能することがで
きる。Tango-77蛋白質の変種は変異誘発、例えば、Tango-77蛋白質の孤立性の点
突然変異、または切断によって作製することができる。Tango-77蛋白質のアゴニ
ストは、Tango-77蛋白質の天然に存在する型の生物活性の実質的に同じまたはサ
ブセットを保持することができる。Tango-77蛋白質のアンタゴニストは例えば、
Tango-77蛋白質を含む細胞シグナル伝達カスケードの下流または上流のメンバー
と競合的に結合することによってTango-77蛋白質の天然に存在する型の活性１つ
以上を阻害することができる。このように、特定の生物作用は限られた機能を有
する変種によって処置することによって誘発することができる。被験動物を蛋白
質の天然に存在する型の生物活性のサブセットを有する変種で処置すると、Tang
o-77蛋白質の天然に存在する型による処置と比較して被験動物における副作用が
より少なくなる。
【００７９】 Tango-77アゴニスト（模倣体）またはTango-77アンタゴニストのいずれかとし
て機能するTango-77蛋白質の変種は、変異体、例えば、Tango-77蛋白質の切断変
異体の組合せライブラリをTango-77蛋白質アゴニストまたはアンタゴニスト活性
に関してスクリーニングすることによって同定することができる。一つの態様に
おいて、Tango-77変種の多様なライブラリを核酸レベルでの組合せ変異誘発によ
って作製し、これは多様な遺伝子ライブラリによってコードされる。Tango-77変
種の多様なライブラリは、例えば可能性があるTango-77配列の一組の縮重が、個
々のポリペプチドとして、またはその中に一組のTango-77配列を含むより大きい
一組の融合ポリペプチド（例えば、ファージ表示のため）として、発現可能とな
るように遺伝子配列の中に合成オリゴヌクレオチドの混合物を酵素的にライゲー
ションすることによって産生することができる。縮重オリゴヌクレオチド配列か
らの可能性があるTango-77変種のライブラリを産生するために用いることができ
る多様な方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動DNAシンセサイザーに おいて行うことができ、次に合成遺伝子を適当な発現ベクターにライゲーション
する。遺伝子の一組の縮重を用いることによって、１つの混合物において、可能
性があるTango-77配列の望ましい組をコードする配列の全てを準備することがで
きる。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は当技術分野において既知である
（例えば、ナラン（Narang）（1983）、Tetrahedron 39：３；イタクラ（Itakur
a）ら（1984）、Annu. Rev. Biochem. 53：323；イタクラ（Itakura）ら（1984 ）、Science 198：1056；イケ（Ike）ら（1983）、Nucleic Acid Res. 11：447 を参照のこと）。
【００８０】 さらに、Tango-77蛋白質コード配列の断片のライブラリを用いて、Tango-77蛋
白質の変種をスクリーニングしてその後選択するためにTango-77断片の多様な集
団を作製することができる。一つの態様において、コード配列断片のライブラリ
はニッキングが１分子あたり約１回起こるに過ぎない条件下でヌクレアーゼによ
ってTango-77コード配列の二本鎖PCR断片を処理し、二本鎖DNAを変性させ、異な
るニック産物からのセンス／アンチセンス対を含むことができる二本鎖DNAを形 成するようにDNAを復元させ、S1ヌクレアーゼによる処置によって再形成された 二本鎖から一本鎖部分を除去し、および得られた断片ライブラリを発現ベクター
にライゲーションする。この方法によって、Tango-77蛋白質の様々な大きさのN-
末端および内部断片をコードする発現ライブラリを得ることができる。
【００８１】 点突然変異または切断によって作製された組合せライブラリの遺伝子産物のス
クリーニング、および選択された特性を有する遺伝子産物に対するcDNAライブラ
リのスクリーニングに関するいくつかの技術は当技術分野で既知である。そのよ
うな技術はTango-77蛋白質の組合せ変異誘発によって作製された遺伝子ライブラ
リの迅速なスクリーニングに適合させることができる。大きい遺伝子ライブラリ
のスクリーニングに関して、高処理能の分析を行うことができる最も広く用いら
れている技法は、典型的に、遺伝子ライブラリを複製可能な発現ベクターにクロ
ーニングし、得られたベクターのライブラリによって適当な細胞を形質転換し、
および望ましい活性の検出によってその産物が検出される遺伝子をコードするベ
クターの単離が促進されるような条件下で組合せ遺伝子を発現することが含まれ
る。ライブラリにおける機能的変異体の発生率を増強する技法である反復的集団
変異誘発（REM）は、Tango-77変種を同定するためのスクリーニング解析と併用 して用いることができる（アーキン＆ヨーバン（Arkin and Yourvan）（1992） 、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 ：7811〜7815；デルグレーブ（Delgrave）ら
（1993）、Protein Engineering 6(3)：327〜331）。
【００８２】 単離されたTango-77蛋白質、またはその一部もしくは断片は、ポリクローナル
抗体またはモノクローナル抗体調製の標準的な技法を用いてTango-77に結合する
抗体を産生するための免疫原として用いることができる。全長のTango-77蛋白質
を用いることができるが、または本発明は免疫原として用いられるTango-77の抗
原性ペプチド断片を提供する。Tango-77の抗原性ペプチドは、配列番号：２、配
列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：11または配列番号：13に
示すアミノ酸配列のアミノ酸残基少なくとも８個（好ましくは10、15、20、また
は30個）を含み、ペプチドに対して作製された抗体がTango-77と特異的免疫複合
体を形成するようにTango-77のエピトープを含む。
【００８３】 Tango-77免疫原は典型的に、適した被験動物（例えばウサギ、ヤギ、マウスま
たは他の哺乳類）を免疫原によって免役することによって抗体を作製するために
用いることができる。適当な免疫原調製物は、例えば組換え的に発現されたTang
o-77蛋白質または化学合成されたTango-77ポリペプチドを含むことができる。調
製物はさらに、フロイントの完全または不完全アジュバントのようなアジュバン
ト、または類似の免疫刺激剤を含むことができる。適した被験動物を免疫原性Ta
ngo-77調製物で免疫すると、ポリクローナル抗Tango-77抗体反応が誘導される。
【００８４】 したがって、本発明のもう一つの局面は抗Tango-77抗体に関する。本明細書に
おいて用いる「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリ
ン分子の免疫学的に活性な部分、すなわちTango-77のような抗原に特異的に結合
する抗原結合部位を含む分子を指す。Tango-77に特異的に結合する分子はTango-
77に結合するが、天然にTango-77を含む試料中、例えば生物試料中の他の分子に
は実質的に結合しない分子である。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分
の例には、ペプシンのような酵素によって抗体を処理することによって作製する
ことができるF(ab)およびF(ab')2断片が含まれる。本発明はTango-77に結合する
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を提供する。本明細書において用
いる「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は
、Tango-77の特定のエピトープと免疫反応することができる抗原結合部位の唯一
の種を含む抗体分子の集団を指す。このように、モノクローナル抗体組成物はそ
れが免疫反応する特定のTango-77蛋白質に対する単一の結合親和性を典型的に示
す。
【００８５】 ポリクローナル抗Tango-77抗体は適した被験動物をTango-77免疫原で免疫する
ことによって上記のように調製することができる。免疫した被験動物における抗
Tango-77抗体力価は、固定したTango-77を用いた酵素結合イムノソルベント解析
（ELISA）のような標準的な技法によって経時的にモニターすることができる。 望ましければ、Tango-77に対して作製した抗体分子は哺乳類（例えば血液から）
から単離することができ、プロテインAクロマトグラフィーのような周知の技法 によってさらに精製してIgG分画を得ることができる。免疫後の適当な時間に、 例えば抗Tango-77抗体力価が最高となる時間に、抗体産生細胞を被験動物から得
て、これを用いてコーラー＆ミルスタイン（Kohler and Milstein）（1975）、N
ature 256：495〜497によって最初に記述されたハイブリドーマ技法、ヒトB細胞
ハイブリドーマ技法（コズボー（Kozbor）ら（1983）、Immunology Today 4：72
）、EBVハイブリドーマ技法（コール（Cole）ら（1985）、「モノクローナル抗 体と癌治療（Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy）」、アランR. リス ・インク、77〜96頁）またはトリオーマ技法のような標準的な技法によってモノ
クローナル抗体を調製することができる。ハイブリドーマを作製する技術は周知
である（全般的に、「免疫学の現在のプロトコール（Current Protocols in Imm
unology）」（1994）、コリガン（Coligan）ら編、ジョンウィリー＆サンズ・イ
ンク、ニューヨーク、ニューヨーク州）。簡単に説明すると、不死化細胞株（典
型的に骨髄腫）を上記のようにTango-77免疫原で免役した哺乳類から得たリンパ
球（典型的に脾細胞）と融合させ、得られたハイブリドーマ細胞の培養上清をス
クリーニングして、Tango-77と結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマを特定する。
【００８６】 リンパ球と不死化細胞株との融合に用いられる多くの周知のプロトコールのい
ずれも、抗Tango-77モノクローナル抗体を産生する目的に応用することができる
（例えば、「免疫学の現在のプロトコール（Current Protocols in Immunology ）」、上記；ガルファー（Galfre）ら（1977）、Nature 266：55052；ケネス（R
. H. Kenneth）「モノクローナル抗体：新しい次元の生物学的分析（Monoclonal
Antibodies：A new Diemension In Biological Analyses）」、プレナム・パブ
リッシングコーポレーション、ニューヨーク、ニューヨーク州（1980）；および
ラーナー（Lerner）（1981）、Yale J. Biol. Med. 54：387〜402）を参照のこ と。その上、多くの当業者は同様に有用であるそのような方法の多くの変更が存
在することを認識するであろう。典型的に不死化細胞株（例えば、骨髄腫細胞株
）はリンパ球と同じ哺乳類種に由来する。例えば、マウスハイブリドーマは、本
発明の免疫原性調製物によって免役したマウスからのリンパ球を、不死化マウス
細胞株、例えばヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含む培養培
地（「HAT」培地）に感受性を示す骨髄腫細胞株と融合させることによって作製 することができる。例えばP3-NS1/1-Ag4-1、P3-x63-Ag8.653またはSp2/O-Ag14骨
髄腫株のような、多くの骨髄腫細胞株のいずれも標準的な技法に従って融合パー
トナーとして用いることができる。これらの骨髄腫株はATCCから入手可能である
。典型的に、ポリエチレングリコール（「PEG」）を用いてHAT感受性マウス骨髄
腫細胞をマウス脾細胞と融合させる。融合によって得られたハイブリドーマ細胞
は、未融合および非生産的に融合した骨髄腫細胞を死滅させる（未融合の脾細胞
は形質転換されていないために数日後に死滅する）HAT培地を用いて選択される 。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、例えば、標準
的なELISA解析を用いて、Tango-77に結合する抗体に関してハイブリドーマ培養 上清をスクリーニングすることによって検出される。
【００８７】 モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマを作製するもう一つの方法として、組
換え型組合せ免疫グロブリンライブラリ（例えば、抗体ファージディスプレイラ
イブラリ）をTango-77によってスクリーニングし、それによってTango-77に結合
する免疫グロブリンライブラリメンバーを単離することによってモノクローナル
抗Tango-77抗体を同定して単離することができる。ファージディスプレイライブ
ラリを作製およびスクリーニングするキットは市販されている（例えば、ファル
マシア社の組換えファージ抗体システム、カタログ番号27-9400-01；およびスト
ラタジーン社SurfZAP（登録商標）ファージディスプレイキット、カタログ番号2
40612）。さらに、抗体ディスプレイライブラリを作製およびスクリーニングす るために特に用いることができる方法および試薬の例は例えば、米国特許第5,22
3,409号；PCT国際公開公報第92/18619号；PCT国際公開公報第91/17271号；PCT国
際公開公報第92/20791号；PCT国際公開公報第92/15679号；PCT国際公開公報第93
/01288号；PCT国際公開公報第92/01047号；PCT国際公開公報第92/09690号；PCT 国際公開公報第90/02809号；フクス（Fuchs）ら（1991）Bio/Technology 9：137
0〜1372；ヘイ（Hay）ら（1992）、Hum. Antibod. Hybridomas 3：81〜85；ヒュ
ーズ（Huse）ら（1989）、Science 246：1275〜1281；グリフィス（Griffiths）
ら（1993）、EMBO J 12：725〜734に見ることができる。
【００８８】 さらに、ヒトおよびヒト以外の部分を含み、標準的な組換えDNA技法を用いて 作製することができる、キメラおよびヒト化したモノクローナル抗体のような組
換え型抗Tango-77抗体も本発明の範囲内である。そのようなキメラおよびヒト化
したモノクローナル抗体は当技術分野で既知の組換えDNA技法、例えばPCT国際公
開公報第87/02671号；欧州特許出願番号第184,187号；欧州特許出願番号第171,4
96号；欧州特許出願番号第173,494号；PCT国際公開公報第86/01533；米国特許第
4,816,567号；欧州特許出願番号第125,023号；ベター（Better）ら（1988）、Sc
ience 240：1041〜1043；リウ（LIu）ら（1987）、Proc. Natl Acad. Sci. USA
84：3439〜3443；リウ（Liu）ら、J. Immunol. 139：3521〜3526；サン（Sun） ら（1987）、Proc. Natl Acad. Sci. USA 84：214〜218；ニシムラ（Nishimura ）ら（1987）、Canc. Res. 47：999〜1005；ウッド（Wood）ら（1985）、Nature
314：446〜449；およびショウ（Shaw）ら（1988）、J. Natl. Cancer Inst. 80
：1553〜1559；モリソン（Morrison）（1985）、Science 229：1202〜1207；オ イ（Oi）ら（1986）、Bio/Techniques 4：214；米国特許第5,225,539号；ジョー
ンズ（Jones）ら（1986）、Nature 321：552〜525；ベルホーヤン（Verhoeyan）
ら（1988）、Science 239：1534；およびバイドラー（Beidler）ら（1988）、J.
Immunol. 141：4053〜4060に記述されている。
【００８９】 完全なヒト抗体はヒト患者の治療的治療のために特に望ましい。そのような抗
体は、内因性免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を発現することができないが
、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウス
を用いて産生することができる。トランスジェニックマウスを、選択した抗原、
例えばTango-77の全体または一部によって通常に免役する。抗原に対して産生さ
れたモノクローナル抗体は従来のハイブリドーマ技術を用いて得ることができる
。トランスジェニックマウスが保有するヒト免疫グロブリントランスジーンは、
B細胞分化の際に転位してその後クラススイッチを受けて体細胞変異を受ける。 このように、そのような技術を用いて、治療的に有用なIgG、IgAおよびIgE抗体 を産生することが可能である。ヒト抗体を産生するためのこの技術の総説に関し
ては、ロンベルグ＆ハスツァー（Lonberg and Huszer）（1995、Int. Rev. Immu
nol. 13：65〜93）を参照のこと。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産 生するこの技術ならびにそのような抗体を産生するプロトコールに関する詳細な
考察については、例えば、米国特許第5,625,126号；米国特許第5,633,425号；米
国特許第5,569,825号；米国特許第5,661,016号；および米国特許第5,545,806号 を参照のこと。さらに、アブジェニックス・インク（フリーモント、カリフォル
ニア州）のような企業は、上記と類似の技術を用いて選択された抗原に対して作
製されたヒト抗体を提供することに従事することができる。
【００９０】 選択したエピトープを認識する完全なヒト抗体は、「誘導型選択」と呼ばれる
技法を用いて作製することができる。このアプローチにおいて、選択されたヒト
以外のモノクローナル抗体、例えばマウス抗体を用いて同じエピトープを認識す
る完全なヒト抗体の選択が誘導される。
【００９１】 第一に、選択された抗原（エピトープ）に結合するヒト以外のモノクローナル
抗体、例えばTango-77活性を阻害する抗体を同定する。ヒト以外の抗体の重鎖お
よび軽鎖をクローニングして、これを用いてファージディスプレイFab断片を作 製する。例えば、重鎖遺伝子は、重鎖が細菌から分泌されることができるように
プラスミドベクターにクローニングすることができる。軽鎖遺伝子は軽鎖がファ
ージの表面上に発現されるようにファージコート蛋白質遺伝子にクローニングす
ることができる。ファージと融合するヒト軽鎖のレパートリー（ランダムコレク
ション）を用いてヒト以外の重鎖を発現する細菌を感染させる。得られた子孫の
ファージはハイブリッド抗体を示す（ヒト軽鎖／ヒト以外の重鎖）。選択した抗
原を厳しいスクリーニングにおいて用いて選択した抗原に結合するファージを選
択する。そのようなファージを同定するためには、何回かの選択が必要となる可
能性がある。これらの選択したヒト軽鎖遺伝子を次に用いてヒト重鎖遺伝子の選
択を以下のように誘導する。選択したヒト軽鎖遺伝子をベクターに挿入して細菌
によって発現させる。選択したヒト軽鎖を発現する細菌を、ファージと融合させ
たヒト重鎖のレパートリーに感染させる。得られた子孫ファージはヒト抗体を示
す（ヒト軽鎖／ヒト重鎖）。
【００９２】 次に、選択した抗原を厳しいスクリーニングにおいて用いて、選択した抗原に
結合するファージを選択する。この段階で選択したファージは、最初に選択した
ヒト以外のモノクローナル抗体によって認識される同じエピトープを認識する完
全なヒト抗体を示す。重鎖および軽鎖双方をコードする遺伝子を容易に単離し、
ヒト抗体を産生するためにさらに操作する。この技術はジェスパース（Jespers ）ら（1994、Bio/technology 12：899〜903）によって記述されている。
【００９３】 抗Tango-77抗体（例えば、モノクローナル抗体）は、アフィニティクロマトグ
ラフィーまたは免疫沈降のような標準的な技法によってTango-77を単離するため
に用いることができる。抗Tango-77抗体は細胞からの天然のTango-77、および宿
主細胞において発現された組換え的に産生されたTango-77の精製を促進する。そ
の上、抗Tango-77抗体は、Tango-77蛋白質の発現量およびパターンを評価するた
めに、Tango-77蛋白質を検出するために用いることができる（例えば、細胞溶解
物または細胞上清において）。抗Tango-77抗体は、臨床試験技法の一部として、
例えば、例えば所定の治療レジメの有効性を明らかにするために、組織中の蛋白
質レベルをモニターするために診断的に用いることができる。抗体を検出可能な
物質とカップリングさせることによって検出を促進することができる。検出可能
な物質の例には様々な酵素、補欠分子団、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、
および放射活性材料が含まれる。適した酵素の例には、ホースラディッシュ・ペ
ルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、またはア セチルコリンエステラーゼが含まれる；適した補欠分子団の例には、ストレプト
アビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが含まれる；適した蛍光材料の例
には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセイン・イソチオシアネー
ト、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン・フルオレセイン、塩化ダンシル
またはフィコエリスリンが含まれる；発光材料の例には、ルミノールが含まれる
；生物発光材料の例にはルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびアエコリンが含
まれ、および適した放射活性材料の例には125I、131I、35Sまたは3Hが含まれる 。
【００９４】III．組換え型発現ベクターおよび宿主細胞 本発明のもう一つの局面はベクター、好ましくはTango-77をコードする核酸分
子（またはその一部）を含む発現ベクターに関する。本明細書において用いるよ
うに、「ベクター」という用語はそれが結合しているもう一つの核酸を輸送する
ことができる核酸分子を指す。１つのタイプのベクターは「プラスミド」であり
、これは、その中にさらなるDNA部分をライゲーションすることができる環状の 二本鎖DNAループを指す。もう一つのタイプのベクターは、さらなるDNA部分がウ
イルスゲノムにライゲーションされるウイルスベクターである。特定のベクター
はそれらが導入される宿主細胞において自律的に複製することができる（例えば
、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター）。他
のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入に際
して宿主細胞のゲノムに組み入れられ、それによって宿主ゲノムと共に複製され
る。その上、特定のベクター、発現ベクターはそれらが機能的に結合している遺
伝子の発現を指向することができる。一般に、組換えDNA技法において利用され る発現ベクターはしばしばプラスミドの形である（ベクター）。しかし、本発明
は、同等の機能を提供するウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス
、アデノウイルス、およびアデノ関連ウイルス）のような発現ベクターの他の型
を含むと解釈される。
【００９５】 本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞において核酸の発現に適した形で本
発明の核酸を含み、そのことは組換え型発現ベクターが、発現のために用いられ
る宿主細胞に基づいて選択される、発現されるべき核酸配列と機能的に結合して
いる、１つ以上の調節配列を含むことを意味する。組換え型発現ベクターにおい
て、「機能的に結合した」とは、ヌクレオチド配列が発現されるように、関係す
るヌクレオチド配列が調節配列に結合していることを意味すると解釈される（例
えば、インビトロ転写／翻訳システムにおいて、またはベクターが宿主細胞に導
入される場合の宿主細胞において）。「調節配列」という用語はプロモーター、
エンハンサー、および他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナ
ル）を含むと解釈される。そのような調節配列は例えば、ゴーデル（Goeddel） ；「遺伝子発現技術（Gene Expression Technology）」、Methods in Enzymolog
y 185、アカデミックプレス、サンジエゴ、カリフォルニア州（1990）に記載さ れている。調節配列には、多くのタイプの宿主細胞においてヌクレオチド配列の
構成的発現を指向する配列、および特定の宿主細胞に限ってヌクレオチド配列の
発現を指向する配列（例えば、組織特異的調節配列）が含まれる。発現ベクター
のデザインは、形質転換すべき宿主細胞の選択、望ましい蛋白質の発現レベル等
の要因に依存することは当業者によって認識されるであろう。本発明の発現ベク
ターは宿主細胞に導入され、それによって本明細書に記述の核酸によってコード
される融合蛋白質またはペプチド（例えば、Tango-77蛋白質、Tango-77の変異型
、融合蛋白質等）を含む蛋白質またはペプチドを産生することができる。
【００９６】 本発明の組換え型発現ベクターは原核生物または真核生物、例えば大腸菌のよ
うな細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いて）、酵母細胞
または哺乳類細胞においてTango-77を発現するようにデザインすることができる
。適した宿主細胞は、ゴーデル（Goeddel）；「遺伝子発現技術（Gene Expressi
on Technology）」、Methods in Enzymology 185、アカデミックプレス、サンジ
エゴ、カリフォルニア州（1990）にさらに考察されている。または組換え型発現
ベクターは例えば、T7プロモーター調節配列およびT7ポリメラーゼを用いてイン
ビトロで転写および翻訳することができる。
【００９７】 原核細胞における蛋白質の発現は、融合または非融合蛋白質のいずれかの発現
を指向する構成的または誘導型プロモーターを含むベクターによって、大腸菌に
おいて最もしばしば実施されている。融合ベクターはそこにコードされている蛋
白質、通常組換え型蛋白質のアミノ末端に多くのアミノ酸を付加する。そのよう
な融合ベクターは典型的に３つの目的にかなっている：1) 組換え型蛋白質の発
現を増加させる；2) 組換え型蛋白質の溶解性を増加する、および3) アフィニ
ティ精製におけるリガンドとして作用することによって組換え型蛋白質の精製に
役立つ。しばしば、融合発現ベクターでは、蛋白質溶解開裂部位を融合部分の結
合部に導入して、融合部分からの組換え型蛋白質の分離を可能にし、その後融合
蛋白質を精製する。そのような酵素、およびその同種の認識配列は、第Xa因子、
トロンビンおよびエンテロキナーゼが含まれる。典型的な融合発現ベクターには
グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）、マルトースE結合蛋白質、または プロテインAをそれぞれ標的組換え型蛋白質に融合させるpGEX（ファルマシア・ バイオテック・インク；スミス＆ジョンソン（Smith and Johnson）（1988）、G
ene 67：31〜40）、pMAL（ニューイングランドバイオラブズ、ビバリー、マサチ
ューセッツ州）およびpRIT5（ファルマシア、ピスキャタウェイ、ニュージャー ジー州）が含まれる。
【００９８】 適した誘導型非融合大腸菌発現ベクターの例には、pTrc（アマン（Amann）ら （1988）、Gene 69：301〜315）およびpET 11d（スツディアら（Studier）、「 遺伝子発現技術（Gene Expression Technology）」：Methods in Enzymology 18
5、アカデミックプレス、サンジエゴ、カリフォルニア州（1990）、60〜89）が 含まれる。pTrcベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドtrp-lac融合プ ロモーターからの宿主RNAポリメラーゼ転写に依存する。pET 11dベクターからの
標的遺伝子発現は、共発現されたウイルスRNAポリメラーゼ（T7 gn1）によって 媒介されるT7 gn10-lac融合プロモーターからの転写に依存する。このウイルス ポリメラーゼは、宿主株BL21（DE3）またはHMS174（DE3）によって、lacUV 5プ ロモーターの転写制御下においてT7 gn1遺伝子を保有するレジデントλプロファ
ージから供給される。
【００９９】 大腸菌において組換え型蛋白質発現を最大限にする一つの戦略は、組換え型蛋
白質を蛋白質溶解的に開裂する能力が損なわれた宿主細菌において、蛋白質を発
現することである（ゴッテスマン（Gottesman）；「遺伝子発現技術（Gene Expr
ession Technology）」、Methods in Enzymology 185、アカデミックプレス、サ
ンジエゴ、カリフォルニア州（1990）119〜128）。もう一つの戦略は、それぞれ
のアミノ酸に対する個々のコドンが大腸菌において選択的に利用されるように、
発現ベクターに挿入すべき核酸の核酸配列を変化させることである（ワダ（Wada
）ら（1992）、Nucleic Acid Res. 20：2111〜2118）。本発明の核酸配列のその
ような変化は標準的なDNA合成技法によって実施することができる。
【０１００】 もう一つの態様において、Tango-77発現ベクターは酵母発現ベクターである。
酵母S.セリビザエ（S. cerivisae）において発現されるベクターの例にはpYepSe
c1（バルダリ（Baldari）ら（1987）、EMBO J. 6：229〜234）、pMFa（クルジャ
ン＆ヘルスコビッツ（Kurjan and Herskowitz）、Cell 30：933〜943）、pJRY88
（シュルツ（Schultz）ら（1987）、Gene 54：113〜123）、pYES2（インビトロ ゲン・コーポレーション、サンジエゴ、カリフォルニア州）、およびpicZ（イン
ビトロゲン・コーポレーション、サンジエゴ、カリフォルニア州）が含まれる。
【０１０１】 または、Tango-77はバキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞に発現す
ることができる。培養昆虫細胞（例えば、Sf 9細胞）において蛋白質の発現のた
めに利用できるバキュロウイルスベクターには、pAcシリーズ（スミス（Smith）
ら（1983）、Mol. Cell. Biol. 3：2156〜2165）およびpVLシリーズ（ラックロ ウ＆サマーズ（Lucklow and Summers）（1989）、Virology 170：31〜39）が含 まれる。
【０１０２】 さらにもう一つの態様において、本発明の核酸は哺乳類発現ベクターを用いて
哺乳類細胞に発現される。哺乳類発現ベクターの例にはpCDM8（シード（Seed） （1987）、Nature 329：840）およびpMT2PC（カウフマン（Kaufman）ら（1987）
、EMBO J. 6：187〜195）が含まれる。哺乳類細胞において用いる場合、発現ベ クターの制御機能はしばしばウイルス調節エレメントによって提供される。例え
ば、一般的に用いられるプロモーターはポリオーマ、アデノウイルス2、サイト メガロウイルスおよびシミアンウイルス40に由来する。原核細胞および真核細胞
の双方にとって適した他の発現システムに関しては、サムブルック（Sambrook、
上記）の第16章および第17章を参照のこと。
【０１０３】 もう一つの態様において、組換え型哺乳類発現ベクターは特定の細胞タイプ（
例えば、組織特異的調節エレメントを核酸を発現するために用いる）において選
択的に核酸の発現を指向することができる。組織特異的調節エレメントは当技術
分野において既知である。適した組織特異的プロモーターの非制限的な例には、
アルブミンプロモーター（肝臓特異的；ピンカート（Pinkert）ら（1987）、Gen
es Dev. 1：268〜277）、類リンパ特異的プロモーター（カラメ＆イートン（Cal
ame and Eaton）（1988）、Adv. Immunol. 43：235〜275）、特にT細胞受容体の
プロモーター（ウィノト＆バルチモア（Winoto and Baltimore）（1989）、EMBO
J. 8：729〜733）、および免疫グロブリン（バナージ（Banerji）ら（1983）、
Cell 33：729〜740；クィーン＆バルチモア（Queen and Baltimore）（1983）、
Cell 33：741〜748）、神経特異的プロモーター（例えば、神経フィラメントプ ロモーター；ビルネ＆ラドル（Byrne and Ruddle）（1989）、Proc. Natl Acad.
Sci. USA 86：5473〜5477）、膵臓特異的プロモーター（エドルンド（Edlund）
ら（1985）、Science 230：912〜916）、および哺乳類の腺特異的プロモーター （例えば、乳清プロモーター；米国特許第4,873,316号および欧州特許出願番号 第264,166号）。発生的に調節されるプロモーター、例えばマウスホックスプロ モーター（ケッセル＆グルス（Kessel and Gruss）（1990）、Science 249：374
〜379）およびαフェトプロテインプロモーター（カンペス＆チルグマン（Campe
s and Tilghman）（1989）、Genes Dev. 3：537〜546）も含まれる。
【０１０４】 本発明はさらに、アンチセンス方向に発現ベクターにクローニングされた本発
明のDNA分子を含む組換え型発現ベクターを提供する。すなわち、DNA分子はTang
o-77 mRNAとアンチセンスであるRNA分子が発現されるように（DNA分子の転写に よって）、調節配列と機能的に結合している。アンチセンス方向にクローニング
された核酸と機能的に結合した調節配列は、多様な細胞タイプにおいてアンチセ
ンスRNA分子の連続的な発現を指向するように選択することができ、例えばアン チセンスRNAの構成的、組織特異的、または細胞タイプ特異的発現を指向するウ イルスプロモーターおよび／またはエンハンサー、または調節配列を選択するこ
とができる。アンチセンス発現ベクターは、その中でアンチセンス核酸が効率の
高い調節領域の制御下で産生され、ベクターが導入される細胞タイプによってそ
の活性を決定することができる組換え型プラスミド、ファージミド、または弱毒
化ウイルスの形であってもよい。アンチセンス遺伝子を用いた遺伝子発現の調節
の考察に関しては、ワイントラウブ（Weintraub）ら（「レビュー−遺伝子学の トレンド（Reviews - Trends in Genetics）」第１巻(1)、1986）を参照のこと 。
【０１０５】 本発明のもう一つの局面は、その中で本発明の組換え型発現ベクターが導入さ
れる宿主細胞に関する。「宿主細胞」および「組換え型宿主細胞」という用語は
、本明細書において互換に用いられる。そのような用語は特定の被験動物の細胞
のみならず、そのような細胞の子孫または可能性がある子孫も指すと理解される
。変種または環境の影響のいずれかにより、特定の改変がその後の世代に起こる
可能性があるため、そのような子孫は親細胞とは実際に同一でないが、本明細書
において用いられる用語の範囲内に含まれる。
【０１０６】 宿主細胞は、いかなる原核細胞または真核細胞であってもよい。例えば、Tang
o-77蛋白質は大腸菌のような細菌細胞、昆虫細胞、酵母または哺乳類細胞（例え
ばチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（CHO）またはCOS細胞）に発現することが
できる。他の適した宿主細胞は当業者に既知である
【０１０７】 ベクターDNAは従来の形質転換またはトランスフェクション技法を通じて原核 細胞または真核細胞に導入することができる。本明細書に用いるように、「形質
転換」および「トランスフェクション」という用語は、リン酸カルシウムもしく
は塩化カルシウム共沈殿、DEAEデキストラン媒介トランスフェクション、リポフ
ェクション、または電気穿孔を含む、宿主細胞への異物核酸（例えば、DNA）の 導入に関して当技術分野において認められた多様な技法を指す。宿主細胞を形質
転換またはトランスフェクトするために適した方法は、サムブルック（Sambrook
）らおよび他の実験マニュアルに見ることができる。
【０１０８】 哺乳類細胞の安定なトランスフェクションのために、用いる発現ベクターおよ
びトランスフェクション技法に応じて、異物DNAをそのゲノムに組み入れるのは 細胞のごく小さい分画であってもよいことは既知である。これらの組み入れ体を
同定および選択するために、選択可能なマーカーをコードする遺伝子（例えば、
抗生物質に対する耐性）を一般に関係遺伝子と共に宿主細胞に導入する。好まし
い選択可能なマーカーには、G418、ヒグロマイシンおよびメトトレキサートのよ
うな薬剤に対する耐性を与えるマーカーが含まれる。選択可能なマーカーをコー
ドする核酸はTango-77をコードするベクターと同じベクター上で宿主細胞に導入
することができ、または異なるベクターに導入することができる。導入された核
酸分子によって安定にトランスフェクトした細胞は、薬剤選択に関して同定する
ことができる（例えば、選択可能なマーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生存する
が、他の細胞は死滅する）。
【０１０９】 培養における原核細胞または真核宿主細胞のような本発明の宿主細胞は、Tang
o-77蛋白質を産生するために（例えば発現するために）用いることができる。し
たがって、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を用いてTango-77蛋白質を産生す
る方法を提供する。一つの態様において、方法はTango-77蛋白質が産生されるよ
うに、適した培地において本発明の宿主細胞（その中にTango-77をコードする組
換え型発現ベクターが導入される）を培養することを含む。もう一つの態様にお
いて、方法はさらに、培地または宿主細胞からTango-77を単離することを含む。
【０１１０】 本発明の宿主細胞はまた、ヒト以外のトランスジェニック動物を産生するため
に用いることができる。例えば、一つの態様において、本発明の宿主細胞はその
中にTango-77コード配列が導入されている、受精卵母細胞または胚性幹細胞であ
る。次にそのような宿主細胞を用いて、外因性Tango-77配列がそのゲノムに導入
されているヒト以外のトランスジェニック動物、または内因性Tango-77配列が変
化している相同組換え動物を作製することができる。そのような動物はTango-77
の機能および／活性を研究するため、およびTango-77活性の調節物質を特定およ
び／または評価するために有用である。本明細書において用いるように、「トラ
ンスジェニック動物」とは、その中で動物の細胞の１つ以上がトランスジーンを
含む、ヒト以外の動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはラットまたはマウス
のような齧歯類である。トランスジェニック動物の他の例には、ヒト以外の霊長
類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類等が含まれる。トランスジー
ンは、そこからトランスジェニック動物が発生し、および成熟動物のゲノムにお
いて保持され、それによってトランスジェニック動物の１つ以上の細胞タイプま
たは組織においてコードされた遺伝子産物の発現を指向する、細胞のゲノムに組
み入れられる外因性DNAである。本明細書で用いるように、「相同組換え動物」 とは、内因性Tango-77遺伝子が、内因性遺伝子と動物の細胞、例えば動物の発生
前に動物の胎芽細胞内に導入された外因性DNA分子との相同組換えによって変化 している、ヒト以外の動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはマウスである。
【０１１１】 本発明のトランスジェニック動物は、例えば、マイクロインジェクション、レ
トロウイルス感染によって受精卵母細胞の雄性前核にTango-77コード核酸を導入
し、偽妊娠雌性里親動物において卵母細胞を生育させることによって作製するこ
とができる。Tango-77 cDNA配列、例えば（配列番号：１、配列番号：３、配列 番号：６、配列番号：10またはATCC 98807のcDNA）の配列は、ヒト以外の動物の
ゲノムにトランスジーンとして導入することができる。またはマウスTango-77遺
伝子のようなヒトTango-77遺伝子のヒト以外の相同体は、ヒトTango-77 cDNAと のハイブリダイゼーションに基づいて単離することができ、トランスジーンとし
て用いることができる。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルも、トラ
ンスジーンの発現効率を増加するためにトランスジーンに含まれる。組織特異的
調節配列は、特定の細胞に対してTango-77蛋白質の発現を指向するためにTango-
77トランスジーンに機能的に結合することができる。胎芽の操作およびマイクロ
インジェクションによってトランスジェニック動物、特にマウスのような動物を
産生する方法は、当技術分野では一般的となり、例えば米国特許第4,736,866号 および第4,870,009号、米国特許第4,873,191号およびホーガン（Hogan）の「マ ウス胎芽の操作（Manipulating the Mouse Embryo）」、（コールドスプリング ハーバー研究所出版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、1986）に記
述されている。他のトランスジェニック動物の作製に関しても同様の方法を用い
る。トランスジェニック第一代動物は、そのゲノムにおけるTango-77トランスジ
ーンの存在および／または動物の組織または細胞におけるTango-77 mRNAの発現 に基づいて同定することができる。次に、トランスジェニック第一代動物はトラ
ンスジーンを有するさらなる動物を育てるために用いることができる。その上、
Tango-77をコードするトランスジーンを有するトランスジェニック動物はさらに
、他のトランスジーンを有する他のトランスジェニック動物に育てることができ
る。
【０１１２】 相同組換え動物を作製するために、その中に欠失、付加、または置換が導入さ
れ、それによってTango-77遺伝子が変化する、例えば機能的に破壊されるTango-
77遺伝子の少なくとも一部（例えば、Tango-77遺伝子のヒトまたはヒト以外の相
同体、例えばマウスTango-77遺伝子）を含むベクターを調製する。好ましい態様
において、ベクターは相同組換えの際に内因性Tango-77遺伝子が機能的に破壊さ
れるように（すなわち、もはや機能的蛋白質をコードしない；「ノックアウト」
ベクターとも呼ぶ）デザインされる。またはベクターは相同組換えの際に、内因
性Tango-77遺伝子が変異している、またはそうでなければ変化しているがなお機
能的蛋白質をコードする（例えば、上流の調節領域が変化して、それによって内
因性Tango-77蛋白質の発現を変化させる）ようにデザインすることができる。相
同組換えベクターにおいて、Tango-77遺伝子の変化した部分は、その5'および3'
末端においてTango-77遺伝子のさらなる核酸に隣接して、ベクターによって保持
される外因性Tango-77遺伝子と胚性幹細胞における内因性Tango-77遺伝子の間に
相同組換えが起こるようにする。さらに隣接するTango-77核酸は内因性遺伝子と
の相同組換えが成功するように十分な長さの核酸である。典型的に、数キロベー
スの隣接DNA（5'および3'末端の双方で）がベクターに含まれる（例えば、相同 組換えベクターの記述に関しては）トーマス＆カペッチ（Thoman and Capecchi ）（1987）、Cell 51：503を参照のこと）。ベクターは胚性幹細胞株に導入する
ことができ（例えば電気穿孔によって）、およびその中に、導入されたTango-77
遺伝子が内因性Tango-77遺伝子と相同組換えされる細胞が選択される（例えば、
リら（Li）（1992）、Cell 69：915を参照のこと）。次に選択した細胞を動物（
例えば、マウス）の胚盤胞に注入して集合キメラを形成する（例えば、ブラッド
レー（Bradley）の「奇形癌および胚性幹細胞：実際のアプローチ（Teratocarci
nomas and Embryonic Stem Cells：A Practical Approach）」、ロバートソン（
Robertson）編、（IRL、オックスフォード、1987、113〜152頁を参照のこと）。
次にキメラ胎芽を適した偽妊娠雌性里親動物に移入して胎芽を満期まで発育させ
る。生殖系列細胞に相同組換えDNAを保有する子孫を用いて、動物の全ての細胞 がトランスジーンの生殖系列伝播によって相同組換えDNAを含む動物を育てるこ とができる。相同組換えベクターおよび相同組換え動物を構築する方法はブラッ
ドレー（Bradley）（1991）、Current Opnion in Bio/Technlogy 2：823〜829お
よびPCT国際公開公報第90/11354号、国際公開公報第91/01140号、国際公開公報 第92/0968号、および国際公開公報第93/04169号に記述されている。
【０１１３】 もう一つの態様において、トランスジーンの発現が調節されるように選択され
たシステムを含むヒト以外のトランスジェニック動物を作製することができる。
そのようなシステムの一例は、バクテリオファージP1のcre/loxPリコンビナーゼ
システムである。cre/loxPリコンビナーゼシステムに関する記述に関しては、例
えば、ラスコ（Lakso）ら（1992）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：6232〜62
36を参照のこと。リコンビナーゼシステムのもう一つの例は、サッカロミセス・
セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）のFLPリコンビナーゼシステム（オゴ ールマン（O'Gorman）ら（1991）、Science 251：1351〜1355）である。トラン スジーンの発現を調節するためにcre/loxPリコンビナーゼシステムを用いる場合
、cre/loxPリコンビナーゼおよび選択した蛋白質の双方をコードするトランスジ
ーンを含む動物を必要とする。そのような動物は例えば、２匹のトランスジェニ
ック動物、すなわち１匹は選択した蛋白質をコードするトランスジーンを有し、
もう１匹はリコンビナーゼをコードするトランスジーンを含む動物を交配するこ
とによって、「二重の」トランスジェニック動物の構築によって提供することが
できる。
【０１１４】 本明細書に記述のヒト以外のトランスジェニック動物のクローンはウィルムー
ト（Wilmut）ら（1997）、Nature 385：810〜813およびPCT国際公開公報第97/07
668号、および国際公開公報第97/07669号に記述されている方法に従って作製す ることができる。簡単に説明すると、トランスジェニック動物からの細胞、例え
ば体細胞を単離して、増殖周期を出てG0期に入るように誘導することができる。
次に、休止期の細胞を例えば電気的パルスを用いることによって、そこから休止
期細胞が単離された同じ種の動物から脱核した卵母細胞と融合させる。再構築し
た卵母細胞を、桑実胚または胚盤胞に発生するように培養して、偽妊娠雌性里親
動物に移入する。この雌性里親動物の子孫は、細胞、例えば体細胞が単離された
動物のクローンであろう。
【０１１５】IV．薬学的組成物 本発明のTango-77核酸分子、Tango-77蛋白質および抗Tango-77抗体（本明細書
では「活性化合物（active compound）」とも呼ばれる）は、投与のために適し た薬学的組成物（pharmaceutical composition）中に組み入れることができる。
このような組成物は典型的には、核酸分子、蛋白質または抗体、および薬学的に
許容しうる担体を含む。本明細書で用いる「薬学的に許容しうる担体」という言
葉は、薬学的投与に適合しうる任意およびすべての溶媒、分散媒、コーティング
剤、抗菌薬および抗真菌薬、等張化剤および吸収遅延剤などを含むものとする。
薬学的作用物質（pharmaceutically active substance）のためのこのような媒 体および薬剤は当技術分野では周知である。従来のあらゆる媒体または薬剤が有
効化合物に対して不適合性である場合を除き、組成物におけるその使用が考慮さ
れる。補足的な有効化合物を組成物に組み入れることも可能である。
【０１１６】 本発明の薬学的組成物は、想定される投与経路に適合しうるように製剤化され
る。投与経路の例には、非経口的（例、静脈内、皮内、皮下）（例、経口吸入）
、経皮的（局所的）、経粘膜的および直腸内投与が含まれる。非経口的、皮内ま
たは皮下適用のために用いられる溶液または懸濁液は以下の成分を含みうる：注
射用の水、食塩液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピ
レングリコールまたはその他の合成溶媒などの滅菌希釈液、ベンジルアルコール
またはメチルパラベンなどの抗菌薬、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウ
ムなどの抗酸化薬、エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤、酢酸塩、クエン
酸塩またはリン酸塩などの緩衝液、ならびに塩化ナトリウムおよびデキストロー
スなどの張性調整剤。pHは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基に
よって調整しうる。非経口的製剤は、ガラス製またはプラスチック製のアンプル
、使い捨てシリンジまたは多回投与用バイアルなどに封入しうる。
【０１１７】 注射のために適した薬学的組成物には、滅菌水性溶液（水溶性の場合）または
分散系、および無菌の注射用溶液または分散系を要時調製するための滅菌粉末が
含まれる。静脈内投与のために適した担体には、生理食塩水、滅菌精製水、クレ
モフォア（Cremophor）EL（登録商標）（BASF；Parsippany、NJ）またはリン酸 緩衝生理食塩水（PBS）が含まれる。すべての場合において、組成物は無菌でな ければならず、シリンジ注入が容易に行える程度に流動的である必要がある。そ
れは製造および保存条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生
物の混入作用から保護される必要がある。担体は、例えば水、エタノール、ポリ
オール（例えば、グリセリン、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレング
リコールなど）およびその適した混合物などを含む溶媒または分散媒でありうる
。適切な流動性は、例えばレシチンなどのコーティング剤の使用、必要な粒子径
の維持（分散液の場合）、および界面活性剤の使用によって維持しうる。微生物
の作用の防止は、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビ
ン酸、チメロサールなどの種々の抗菌薬および抗真菌薬によって達成しうる。多
くの場合には、例えば糖類、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコ−ル
、塩化ナトリウムなどの等張化剤を組成物中に含むことが好ましいと考えられる
。注射用組成物の持続的吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼ
ラチンなどの、吸収を遅延させる薬剤を組成物中に含めることによって達成しう
る。
【０１１８】 滅菌注射用溶液は、適切な溶媒中に、必要な量の活性化合物（例えば、Tango-
77蛋白質または抗Tango-77抗体）を、必要に応じて上記に列挙した成分の1つま たは組み合わせとともに組み入れ、続いて濾過滅菌を行うことによって調製しう
る。分散液は一般に、基本的な分散媒、および上記に列挙したものからの必要な
他の成分を含む滅菌媒体中に活性化合物を含めることによって調製される。滅菌
注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合には、好ましい調製の方法は、活性
成分の粉末に加えて、あらかじめ滅菌濾過された溶液から望ましい任意の付加的
な成分が得られるような真空乾燥および凍結乾燥である。
【０１１９】 経口用組成物は一般に、不活性希釈液または可食担体を含む。それらはゼラチ
ンカプセルに封入すること、または圧縮して錠剤にすることができる。経口的治
療投与の目的には、活性化合物を賦形剤とともに組み入れ、錠剤、トローチ剤ま
たはカプセル剤の形態で用いることができる。液体担体中の化合物が経口的に適
用され、咀嚼および喀出または嚥下される口内洗浄剤として用いるための液体担
体を用いて経口用組成物を調製することもできる。組成物の一部として、薬学的
に適合性のある結合剤および／または添加材料を含めることができる。錠剤、丸
剤、カプセル剤、トローチ剤などは以下の成分、または同様の性状をもつ化合物
の任意のものを含みうる：微結晶セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチン
などの結合剤、デンプンまたはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、プリモゲ
ル（Primogel）またはコーンスターチなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム
またはステローテス（Sterotes）などの潤滑剤、コロイド二酸化ケイ素などのグ
ライダント、ショ糖またはサッカリンなどの甘味料、またはペパーミント、サリ
チル酸メチルもしくはオレンジ香料などの着香料。
【０１２０】 吸入による投与のためには、化合物は、二酸化炭素などのガスなどの適した噴
霧剤を含む加圧容器もしくはディスペンサー、またはネブライザーからエアロゾ
ル噴霧の形態で送達される。
【０１２１】 経粘膜的または経皮的手段により、全身投与を行うこともできる。経粘膜的ま
たは経皮的投与のためには、透過させようとする障壁に適した浸透剤が製剤中に
用いられる。このような浸透剤は当技術分野で一般に知られており、例えば、経
粘膜的投与のためには界面活性剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が含まれる
。経粘膜的投与は鼻スプレーまたは坐薬の使用によって達成しうる。経皮的投与
のためには、活性化合物は、当技術分野で一般的に知られた軟膏、膏薬、ゲルま
たはクリーム剤として製剤化される。
【０１２２】 また、直腸内送達のための坐薬（例えば、カカオ脂およびその他のグリセリド
類などの従来の坐薬用基材）または停留浣腸の形態として化合物を調製すること
もできる。
【０１２３】 1つの態様において、活性化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル化 された送達系を含む放出制御型製剤などの、化合物を身体からの迅速排出から保
護すると思われる担体とともに調製される。エチレンビニルアセテート、重合無
水物（polyanhydride）、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステル およびポリ乳酸などの生分解性で生体適合性の重合体を用いることもできる。こ
のような製剤の調製のための方法は当技術分野では明らかであると思われる。ア
ルザ社（Alza Corporation）およびノバ・ファルマシューティカルズ（Nova Pha
rmaceuticals）社から材料を購入することもできる。リポソーム懸濁液（ウイル
ス抗原に対するモノクローン抗体を含む、感染細胞を標的とするリポソームを含
む）を薬学的に許容しうる担体として用いることも可能である。これらは、例え
ば米国特許第4,522,811号に記載されているような当業者に周知の方法に従って 調製しうる。
【０１２４】 投与を容易にし、投与量を均一化するためには、経口用または非経口用組成物
を単位式剤形（unit dosage form）として製剤化することが特に有利である。本
明細書で用いる単位式剤形とは、治療しようとする被験動物に対する単位投与量
として適した物理的に離散的な単位を意味し、各単位は必要な薬学的担体ととも
に望ましい治療的効果を生じるように計算された規定量の活性化合物を含む。本
発明の単位式剤形に関する仕様は、活性化合物の特有な特徴および達成しようと
する特定の治療効果、ならびに個体の治療のためのこのような活性化合物の調合
の技術分野に内在する制限によって規定されるとともに、それらに直接依存する
。
【０１２５】 本発明の核酸分子はベクター中に挿入し、遺伝子治療用ベクターとして用いる
ことができる。遺伝子治療用ベクターは、例えば静脈内注射、局所投与（米国特
許第5,328,470号を参照）または定位的注射（例えば、Chenら（1994）Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 91：3054〜3057を参照）によって被験動物に送達させうる。
遺伝子治療用ベクターの薬学的製剤は、許容しうる希釈剤中に遺伝子治療用ベク
ターを含むことができる、または遺伝子送達媒体が包埋された徐放性基質を含み
うる。または、レトロウイルスベクターのように、組換え細胞から完全な遺伝子
送達用ベクターを無傷で作製しうる場合には、薬学的製剤は遺伝子送達系を生じ
る1つまたは複数の細胞を含みうる。
【０１２６】 薬学的組成物は、投与に関する指示とともに、容器、包みまたはディスペンサ
ー中に含めることができる。
【０１２７】V．本発明の使用および方法 本明細書に記載される核酸分子、蛋白質、蛋白質相同体および抗体は、以下の
方法の1つまたは複数において用いうる：a）スクリーニング解析、b）検出解析 （例えば、染色体マッピング、組織型同定、法廷生物学）、c）予測医学（例え ば、診断解析、予後判定解析、臨床試験の観測および薬理ゲノム学（pharmacoge
nomics））およびd）治療方法（例えば、治療薬および予防薬）。Tango-77蛋白 質は他の細胞性蛋白質と相互作用し、このため炎症の調節のために用いうる。本
発明のポリペプチドは、生物活性を測定する解析法に用いることができる。例え
ば、それらを高スループットスクリーニング用の一連の蛋白質として用いうると
考えられる。
【０１２８】 本発明の単離された核酸分子は、Tango-77蛋白質の発現のため（例えば、遺伝
子治療の適用において宿主細胞内の組換え発現ベクターを介して）、Tango-77 m
RNA（例えば生物試料における）またはTango-77遺伝子における遺伝的欠損の検 出のため、およびTango-77活性の調節のために用いうる。さらに、Tango-77蛋白
質を、Tango-77の活性または発現を調節する作用物質または化合物のスクリーニ
ングのほか、Tango-77蛋白質の不十分なまたは過度の産生、または野生型Tango-
77蛋白質と比べて活性が低いまたは異常な形態のTango-77蛋白質の産生を特徴と
する障害の治療のために用いることもできる。さらに、本発明の抗Tango-77抗体
を、Tango-77蛋白質を単離し、Tango-77活性を調節するために用いることもでき
る。
【０１２９】 本発明はさらに、上記のスクリーニング解析によって同定される新規作用物質
、および本明細書に記載される治療のためのその使用に関する。
【０１３０】 A．スクリーニング解析 本発明は修飾因子（modulator）、すなわちTango-77蛋白質と結合するか、ま たは例えばTango-77の発現またはTango-77活性に対して刺激または抑制効果を及
ぼすような候補物質または被験化合物もしくは作用物質（例えば、ペプチド、ペ
プチド模倣物、小分子または他の薬物）を同定するための方法（本明細書では「
スクリーニング解析」とも呼ばれる）を提供する。
【０１３１】 分子ライブラリーを合成するための方法の例は、当技術分野において、例えば
デウィット（DeWitt）ら（1993）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90：6909、ア
ーブ（Erb）ら（1994）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91：11422、ツッカーマン （Zuckermann）ら（1994）J. Med. Chem 37：2678、チョウ（Cho）ら（1993）Sc
ience 261：1303、カレル（Carrell）ら（1994）Angew. Chem. Int. Ed. Engl.
33：2059、カレル（Carell）ら（1994）Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33：2061
およびギャロップ（Gallop）ら（1994）J. Med. Chem. 37：1233に見いだしうる
。
【０１３２】 化合物のライブラリーは、溶液中（例えば、Houghten（1992）Bio／Technique
s 13：412〜421）またはビーズ上（Lam（1991）Nature 354：82〜84）、チップ （Fodor（1993）Nature 364：555〜556）、細菌（米国特許第5,223,409号）、胞
子（特許第5,571,698号、第5,403,484号および第5,223,409号）、プラスミド（C
ullら（1992）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：1865〜1869）またはファージ上
（ScottおよびSmith（1990）Science 249：386〜390、Devlin（1990）Science 2
49：404〜406、Cwirlaら（1990）Proc. Natl. Acad. Sci. 87：6378〜6382およ びFelici（1991）J. Mol. Biol. 222：301〜310）に提供しうる。
【０１３３】 もう1つの態様では、解析は、例えばTango-77蛋白質がTango-77標的分子と結 合または相互作用する能力を測定することにより、被験化合物がTango-77蛋白質
またはその生物活性部分の活性を調節する能力を測定するために用いられる。本
明細書で用いる「標的分子」とは、自然な状態でTango-77蛋白質と結合または相
互作用する分子、例えば細胞の表面にある分子である。Tango-77標的分子は非Ta
ngo-77分子でもよく、本発明のTango-77蛋白質またはポリペプチドでもよい。1 つの態様において、Tango-77標的分子はシグナル伝達経路の構成要素であり、例
えばTango-77がIL-1受容体または別の受容体と結合し、それによって受容体を遮
断してその後のシグナル伝達を阻害してもよい。Tango-77蛋白質がTango-77標的
分子と結合または相互作用する能力の測定は、上記の方法の1つによって達成し うる。1つの好ましい態様において、Tango-77蛋白質がTango-77標的分子と結合 または相互作用する能力の測定は、標的分子の活性を測定することによって達成
しうる。例えば、標的分子の活性は、標的の細胞性第二メッセンジャー（例えば
細胞内Ca2＋、ジアシルグリセロール、IP3など）の誘導の検出、標的の適した基
質に対する触媒／酵素活性の検出、レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ
などの検出マーカーをコードする核酸と機能的に結合したTango-77反応性調節要
素）の誘導の検出、または炎症などの細胞反応の検出によって測定しうる。
【０１３４】 さらにもう1つの態様において、本発明の解析法は、Tango-77蛋白質またはそ の生物活性部分と被験化合物との接触、および被験化合物がTango-77蛋白質また
はその生物活性部分と結合する能力の測定を含む無細胞解析である。被験化合物
とTango-77蛋白質との結合は、上記のように直接的または間接的に測定しうる。
1つの好ましい態様において、本解析法は、Tango-77蛋白質またはその生物活性 部分とTango-77と結合して解析混合物を形成する既知の化合物との接触、解析混
合物と被験化合物との接触、および被験化合物がTango-77蛋白質と相互作用する
能力の測定であって、被験化合物がTango-77蛋白質と相互作用する能力の測定に
被験化合物がTango-77蛋白質またはその生物活性部分と優先的に結合する能力を
既知の化合物と対比して測定することが含まれるような測定を含む。
【０１３５】 もう1つの態様において、本解析法は、Tango-77蛋白質またはその生物活性部 分と被験化合物との接触、および被験化合物がTango-77蛋白質またはその生物活
性部分の機能を調節（例えば刺激または抑制）する能力の測定を含む無細胞解析
である。被験化合物がTango-77の活性を調節する能力の測定は、例えば、直接的
結合を測定するための上記の方法の1つにより、Tango-77蛋白質がTango-77標的 分子と結合または相互作用する能力を測定することによって達成しうる。1つの 代替的な態様において、被験化合物がTango-77の活性を調節する能力の測定は、
Tango-77蛋白質がTango-77標的分子をさらに調節する能力を測定することによっ
て達成しうる。例えば、適切な基質に対する標的分子の触媒／酵素活性を上記の
通りに測定することができる。
【０１３６】 さらにもう1つの態様において、無細胞解析は、Tango-77蛋白質またはその生 物活性部分とTango-77と結合して解析混合物を形成する既知の化合物との接触、
解析混合物と被験化合物との接触、および被験化合物がTango-77蛋白質と相互作
用する能力の測定であって、被験化合物がTango-77蛋白質と相互作用する能力の
測定に被験化合物がTango-77蛋白質またはその生物活性部分と優先的に結合する
能力を既知の化合物と測定することが含まれるような測定を含む。
【０１３７】 膜結合型のTango-77が存在することは考えられる。本発明の無細胞解析はいず
れの形態のTango-77にも適用しうる。膜結合型のTango-77を含む無細胞解析の場
合には、膜結合型のTango-77が溶液中に維持されるように溶解剤を用いることが
望ましいと考えられる。このような溶解剤の例には、n-オクチルグルコシド、n-
ドデシルグルコシド、n-ドデシルマルトシド、オクタノイル-N-メチルグルカミ ド、デカノイル-n-メチルグルカミド、トリトン（Triton）（登録商標）X-100、
トリトン（登録商標）X-114、テシット（Thesit）（登録商標）、イソトリデシ ポリ（エチレングリコールエーテル）n、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアン
モニオ]-1-プロパンスルホネート（CHAPS）、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチル
アンモニオ]-2-ヒドロキシ-l-プロパンスルホネート（CHAPSO）またはn-ドデシ ル=N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネートが含まれる。
【０１３８】 本発明の上記の解析法の複数の態様においては、非複合体型の一方または両方
の蛋白質からの複合型のものの分離が容易となるように、ならびに解析が自動化
に適応するように、Tango-77またはその標的分子のいずれかを固定することが望
ましい。候補化合物の存在下および非存在下における被験化合物とTango-77との
結合またはTango-77と標的分子の相互作用は、反応物を含めるのに適した任意の
容器内で行いうる。このような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験
管および遠心管が含まれる。1つの態様においては、一方または両方の蛋白質の 基質との結合が可能となるようなドメインを付加された融合蛋白質を提供しうる
。例えば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ／Tango-77融合蛋白質またはグ ルタチオン-S-トランスフェラーゼ／標的融合蛋白質を、グルタチオンセファロ ースビーズ（Sigma Chemical；St. Louis、MO）またはグルタチオン誘導体化マ イクロタイタープレートに吸着させ、次にこれを被験化合物、または被験化合物
および非吸着性標的蛋白質もしくはTango-77蛋白質のいずれか一方と混ぜ、複合
体形成をもたらす条件（例えば、塩およびpHに関する生理的条件）下で混合物を
インキュベートする。インキュベート後に、非結合型の成分を除去するためにビ
ーズまたはマイクロタイタープレートを洗い、例えば上記の通りに直接的または
間接的に複合体の測定を行う。または、複合体を基質から解離させ、標準的な技
法を用いてTango-77の結合または活性のレベルを測定することもできる。
【０１３９】 基質上に蛋白質を固定するためのその他の技術も、本発明のスクリーニング解
析において用いうる。例えば、ビオチンおよびストレプトアビジンとの結合を用
いてTango-77またはその標的分子を固定することができる。ビオチン化されたTa
ngo-77または標的分子は、当技術分野で知られた技法（例えばビオチン化キット
、Pierce Chemicals；Rockford、IL）を用いて、ビオチン-NHS（N-ヒドロキシ- サクシニミド）から調製し、ストレプトアビジンがコートされた96穴プレート（
Pierce Chemical）のウェル中に固定することができる。または、Tango-77また は標的分子とは反応するもののTango-77の標的分子との結合は妨げない抗体をプ
レートのウェルに対して誘導体化し、抗体結合によって非結合型の標的またはTa
ngo-77をウェル中に捕捉することもできる。このような複合体を検出するための
方法には、GST固定複合体に関する上記のものに加えて、Tango-77または標的分 子に反応する抗体を用いる複合体の免疫検出、さらにはTango-77または標的分子
に伴う酵素活性の検出に依拠する酵素結合解析が含まれる。
【０１４０】 もう1つの態様において、Tango-77発現の修飾因子は、細胞を候補化合物と接 触させ、細胞内でのTango-77のmRNAまたは蛋白質の発現を測定する方法において
同定される。候補化合物の存在下におけるTango-77のmRNAまたは蛋白質の発現レ
ベルを、候補化合物の非存在下におけるTango-77のmRNAまたは蛋白質の発現レベ
ルと比較する。この比較に基づいて、Tango-77発現の修飾因子として候補化合物
を同定しうる。例えば、候補化合物の存在下の方が非存在下よりもTango-77のmR
NAまたは蛋白質の発現が強い（統計的に有意に強い）場合には、候補化合物はTa
ngo-77のmRNAまたは蛋白質の発現の刺激因子として同定される。または、候補化
合物の存在下の方が非存在下よりもTango-77のmRNAまたは蛋白質の発現が弱い（
統計的に有意に弱い）場合には、候補化合物はTango-77のmRNAまたは蛋白質の発
現の抑制因子として同定される。細胞内でのTango-77のmRNAまたは蛋白質の発現
レベルは、本明細書に記載されたTango-77のmRNAまたは蛋白質を検出するための
方法によって測定しうる。
【０１４１】 本発明のさらにもう1つの局面では、Tango-77（「Tango-77結合蛋白質」また は「Tango-77-bp」）と結合または相互作用してTango-77活性を調節するその他 の蛋白質を同定するために、Tango-77蛋白質を「ベイト蛋白質（bait protein）
」としてツーハイブリッド解析またはスリーハイブリッド解析に用いることがで
きる（例えば、米国特許第5,283,317号、Zervosら（1993）Cell 72：223〜232；
Maduraら（1993）J. Biol. Chem. 268：12046〜12054、Bartelら（1993）Bio／T
echniques 14：920〜924、Iwabuchiら（1993）Oncogene 8：1693〜1696およびPC
T国際公開公報第94／10300号を参照のこと）。このようなTango-77結合蛋白質は
、例えばTango-77経路の上流または下流要素としてTango-77蛋白質によるシグナ
ルの伝播にも関与する可能性が高い。
【０１４２】 ツーハイブリッド系は、大部分の転写因子が、分離可能なDNA結合および活性 化ドメインからなるモジュール的性質をもつことに基づく。簡潔にいえば、本解
析では2つの異なるDNA構築物を利用する。一方の構築物では、Tango-77をコード
する遺伝子が、既知の転写因子（例えばGAL-4）のDNA結合ドメインをコードする
遺伝子と融合される。もう一方の構築物では、DNA配列のライブラリーから得た 同定されていない蛋白質（「プレイ（prey）」または「サンプル」）をコードす
るDNAが、既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子と融合される。 「ベイト」と「プレイ」蛋白質がインビボで相互作用してTango-77依存的複合体
を形成しうる場合には、転写因子のDNA結合および活性化ドメインは非常に接近 する。この接近により、転写因子に反応する転写調節部位と機能的に結合したレ
ポーター遺伝子（例えばlacZ）の転写が可能となる。レポーター遺伝子の発現は
検出可能であり、機能的転写因子を含む細胞コロニーを単離し、これを用いてTa
ngo-77と相互作用する蛋白質をコードするクローン化遺伝子を得ることができる
。
【０１４３】 本発明はさらに、上記のスクリーニング解析によって同定される新規作用物質
および本明細書に記載される治療のためのその使用にも関する。
【０１４４】 B．検出解析 本明細書で同定されるcDNA配列の一部または断片（および対応する完全遺伝子
配列）は、ポリヌクレオチド試薬として数多くの方式において用いることができ
る。例えば、これらの配列は以下のために用いうる：(i)それらの個々の遺伝子 の染色体上でのマッピング、およびそれによる遺伝病と関連した遺伝子領域の位
置の特定、(ii)微量の生物試料からの個体の識別（組織型同定）、ならびに(iii
)生物試料における法医学的鑑定における補助。これらの応用について以下のサ ブセクションで説明する。
【０１４５】 1．染色体マッピング いったん遺伝子の配列（または配列の一部）が単離されれば、この配列を用い
て遺伝子の染色体上の位置をマッピングすることができる。したがって、本明細
書に記載されるTango-77核酸分子またはその断片は、Tango-77遺伝子の染色体上
の位置をマッピングするために用いうる。Tango-77配列の染色体に対するマッピ
ングは、これらの配列と疾患に関連した遺伝子とを互いに関連づける上での最初
の重要な一歩である。
【０１４６】 簡潔にいえば、Tango-77配列からPCRプライマー（好ましくは長さ15〜25bp） を調製することにより、Tango-77遺伝子を染色体に対してマッピングすることが
できる。Tango-77配列のコンピュータ解析を用いると、ゲノムDNA中で1つのエク
ソンを上回る範囲に及んで増幅過程を複雑化させることのないプライマーを迅速
に選択することができる。これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細
胞ハイブリッド（somatic cell hybrid）のPCRスクリーニングのために用いうる
。増幅断片が得られるのは、Tango-77配列に対応するヒト遺伝子を含むハイブリ
ッドのみである。
【０１４７】 体細胞ハイブリッドは、異なる哺乳動物（例えばヒトおよびマウス細胞）に由
来する体細胞を融合させることによって調製される。ヒトおよびマウス細胞のハ
イブリッドが増殖および分裂するに従って、それらは徐々に順不同にヒト染色体
を失うが、マウス染色体は保持される。特定の酵素を欠くためにマウス細胞が増
殖しえないがヒト細胞は増殖できる培地を用いることにより、必要な酵素をコー
ドする遺伝子を含むヒト染色体が保持されると思われる。種々の培地を用いるこ
とにより、一連のハイブリッド細胞系を樹立することができる。この一連のそれ
ぞれの細胞系は単一のヒト染色体または少数のヒト染色体、およびマウス染色体
の全セットを含むため、個々の遺伝子を特定のヒト染色体に対してマッピングす
ることが容易になる（D'Eustachioら（1983）Science 220：919〜924）。転座お
よび欠失を有するヒト染色体を用いることにより、ヒト染色体の断片のみを含む
体細胞ハイブリッドを作製することもできる。
【０１４８】 体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、特定の配列を特定の染色体に指定す るための迅速な手順である。1つのサーマルサイクラーを用いると1日当たり3つ またはそれ以上の配列を指定することができる。Tango-77配列を用いてオリゴヌ
クレオチドプライマーを設計することにより、特定の染色体からの一連の断片を
用いてサブローカリゼーションを行うことができる。Tango-77配列を染色体にマ
ッピングするために同様に用いうるその他のマッピング手段には、インサイチュ
ーハイブリダイゼーション（Fanら（1990）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87：62
23〜27に記載されている）、標識されてフロー選別された（flow-sorted）染色 体によるプレスクリーニング、および染色体特異的cDNAライブラリーとのハイブ
リダイゼーションによる予備選択が含まれる。
【０１４９】 さらに、1つの段階で正確な染色体位置を得るために、分裂中期の染色体展開 物（chromosomal spread）に対するDNA配列の蛍光インサイチューハイブリダイ ゼーション（FISH）を用いることができる。染色体展開物は、紡錘体を破壊する
コルセミドなどの化学物質によって分裂が中期で阻止された細胞を用いて作製す
ることができる。染色体はトリプシンで短時間処理した後にギムザ染色を行うこ
とができる。各染色体には明暗のバンドが生じるため、染色体を個別に識別する
ことができる。FISH法は500または600塩基程度の短いDNAにも用いうる。しかし 、長さが1000塩基を超えるクローンの方が、容易に検出しうる十分な信号強度を
伴って特有の染色体位置と結合する可能性が高い。適度の時間で良好な結果を得
るためには好ましくは1000塩基、より好ましくは2000塩基で十分である。この技
法の総説については、バーマ（Verma）ら、ヒト染色体：基本技法のマニュアル （Human Chromosomes：A Manual of Basic Techniques）（Pergamon Press、New
York、1988）を参照されたい。
【０１５０】 単一の染色体もしくはその染色体上の単一の部位を標識するために染色体マッ
ピング用の試薬を個別に用いることもでき、または多数の部位および／または多
数の染色体を標識するために一連の試薬を用いることもできる。マッピングの目
的には、実際には遺伝子の非コード鎖に対応する試薬が好ましい。コード鎖は遺
伝子ファミリー内で保存されている可能性がより高く、このため染色体マッピン
グ中にクロスハイブリダイゼーションが生じる可能性が高まる。
【０１５１】 配列が正確な染色体位置にマッピングされれば、その配列の染色体上の物理的
位置を遺伝地図データと互いに関連づけることができる。（この種のデータは、
例えば、Johns Hopkins University Welch Medical Libraryからオンラインで入
手しうる、V. McKusick、ヒトにおけるメンデル遺伝（Mendelian Inheritance i
n Man）に見いだされる）。続いて、エジランド（Egeland）ら（1987）Nature、
325：783〜787などに記載された連鎖解析（物理的に隣接する遺伝子同士の共遺 伝）により、同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との関係を同定す
ることができる。
【０１５２】 さらに、Tango-77遺伝子と関連した疾患に罹患した、および罹患していない個
体間のDNA配列の差を明らかにすることができる。罹患した個体の一部またはす べてに変異が認められるが、罹患していない個体には全く認められない場合には
、その変異がその特定の疾患の原因である可能性が高いと思われる。罹患および
非罹患個体の比較には一般に、染色体展開物から視認可能な、またはそのDNA配 列に基づくPCRを用いて検出可能な欠失または転座などの構造的変化が染色体に あるかどうかをまず調べることが含まれる。究極的には、変異の存在を確認する
ため、および変異を多型から区別するために、いくつかの個体からの遺伝子の完
全塩基配列決定を行うことができる。
【０１５３】 2．組織型同定 本発明のTango-77配列は、微量の生物試料から個体を識別するために用いるこ
ともできる。例えば、米国軍では個人の識別のために制限酵素断片長多型（RFLP
）を用いることを検討している。この技法では、個体のゲノムDNAを1つまたは複
数の制限酵素で消化し、サザンブロット上での探索によって識別のための特有の
バンドを得る。この方法は、なくしたり交換したり盗まれたりする恐れがあり、
確実な識別を困難にしている「名札（dog tag）」に伴う現在の限界を免れる。 本発明の配列は、RFLPのための付加的なDNAマーカーとして有用である（米国特 許第5,272,057号に記載されている）。
【０１５４】 さらに、本発明の配列は、個体のゲノムの選択された部分の実際の1塩基毎のD
NA配列を決定する代替的な技法を提供するために用いることができる。このため
、本明細書に記載されるTango-77配列は、配列の5'および3'末端から2つのプラ イマーを調製するために用いうる。続いてこれらのプライマーを用いて個体のDN
Aを増幅し、その後に塩基配列を決定することができる。
【０１５５】 各個体は対立遺伝子の差のためにこのようなDNA配列の一意的なセットをもつ と考えられるため、この様式で調製された個体からの一連の対応するDNA配列か ら、一意的な個体識別がもたらされる。本発明の配列は、個体および組織からの
配列に関してこのような識別を得るために用いることができる。本発明のTango-
77配列はヒトゲノムの一部を一意的な様式で代表する。これらの配列のコード領
域には対立遺伝子変異がある程度起こり、非コード鎖ではその程度がより大きい
。個々のヒト間での対立遺伝子変異は500塩基毎に約1個の頻度で起こっていると
推定されている。本明細書に記載される各配列は、ある程度は、識別の目的で個
体からのDNAと比較しうる標準物質として用いることができる。非コード領域に はより数多くの多型が起こるため、個体を区別するために必要な配列はよりわず
かである。配列番号：1の非コード配列は、それぞれから100塩基の非コード増幅
配列が得られるおそらく10から1000個の一連のプライマーにより、確実な個体識
別を無理なく提供することが可能である。配列番号：3、配列番号：6または配列
番号：10におけるものなどの予想されるコード鎖が用いられる場合には、確実な
個体識別のためにより適したプライマーの数は500〜2,000個であると思われる。
【０１５６】 個体に関する一意的な識別データベースを作成するために、本明細書に記載さ
れるTango-77配列からの一連の試薬が用いられる場合には、後にその同じ試薬を
その個体からの組織の識別のために用いることができる。一意的な識別データベ
ースを用いると、その生死にかかわらず、極めてわずかな組織試料から個体の確
実な識別を行える。
【０１５７】 3．法生物学におけるTango-77部分配列の使用 DNAに基づく識別法を、法生物学において用いることもできる。法生物学は、 例えば犯罪の犯人などを確実に識別するための手段として、犯罪現場で発見され
た生物的証拠の遺伝子型同定を用いる科学分野である。このような鑑定を行うた
めには、犯罪現場で発見された毛髪もしくは皮膚、または血液、唾液もしくは精
液などの体液といった極めて微量の生物試料から採取したDNA配列を増幅するた めにPCR法が用いられる。増幅された配列は標準物質と比較することができ、そ れによって生物試料の由来を識別することが可能となる。
【０１５８】 本発明の配列は、例えばもう1つの「識別マーカー」（すなわち、特定の個体 に特有なもう1つのDNA配列）を提供することによって、DNAに基づく法医学的鑑 定の信頼性を高めうる、ヒトゲノム中の特定の遺伝子座を標的とするPCRプライ マーなどのポリヌクレオチド試薬を提供するために用いることができる。上記の
通り、制限酵素によって生じた断片により形成されるパターンに対する正確な選
択肢として、実際の塩基配列情報を識別のために用いることができる。非コード
領域ではより数多くの多型が生じ、この技法を用いた個体の区別がより容易とな
るため、この用途には配列番号：1の非コード領域を標的とする配列が特に適し ている。ポリヌクレオチド試薬の例には、Tango-77配列またはその一部、例えば
長さが少なくとも20または30塩基である配列番号：1の非コード領域に由来する 断片などが含まれる。
【０１５９】 本明細書に記載されるTango-77配列はさらに、例えば脳組織などの特定の組織
を同定するためのインサイチューハイブリダイゼーション法などに用いうる標識
されたまたは標識可能なプローブなどのポリヌクレオチド試薬を提供するために
用いることができる。これは、司法病理学者に由来不明の組織が提示された場合
に極めて有用なことがある。このような一連のTango-77プローブは、種および／
または臓器型別に組織を同定するために用いうる。
【０１６０】 同様の様式において、組織培養物を混入（すなわち、培養物における種々の種
類の細胞の混合物の存在）に関してスクリーニングするために、これらの試薬、
例えばTango-77プライマーまたはプローブを用いることができる。
【０１６１】 C．予測医学 本発明は、診断的解析、予測的解析、薬理ゲノム学および臨床試験の観測が個
体を予防的に治療するために予後判定的（予測的）な目的で用いられる、予測医
学の分野にも関する。したがって、本発明の1つの面は、生物試料（例えば、血 液、血清、細胞、組織）の文脈におけるTango-77蛋白質および／または核酸の発
現、さらにはTango-77活性を測定し、それによってある個体が疾患もしくは障害
に罹患しているか否か、またはTango-77の異常な発現もしくは活性に関連した障
害を発症するリスクがあるか否かを判定するための診断的解析に関する。また、
本発明は、個体がTango-77蛋白質、核酸の発現または活性に関連した障害を発症
するリスクがあるか否かを判定するための予後判定的（または予測的）解析も提
供する。例えば、生物試料においてTango-77遺伝子における変異を解析すること
ができる。このような解析は、Tango-77蛋白質、核酸の発現もしくは活性を特徴
とするか、またはそれに関連した障害の発症前に個体を予防的に治療するための
予後判定的または予測的な目的で用いることができる。
【０１６２】 本発明のもう1つの局面は、個体におけるTango-77蛋白質、核酸の発現もしく は発現、またはTango-77活性を明らかにすることにより、その個体に対して適切
な治療薬または予防薬を選択するための方法を提供する（本明細書では「薬理ゲ
ノム学」と呼ばれる）。薬理ゲノム学により、個体の遺伝子型（例えば、特定の
作用物質に個体が反応する能力を判定するために検討される個体の遺伝子型）に
基づいた個体の治療的または予防的治療のための作用物質（例えば薬物）の選択
が可能となる。
【０１６３】 本発明のさらにもう1つの局面は、臨床試験においてTango-77の発現または活 性に対する作用物質（例えば薬物またはその他の化合物）の影響を観測すること
に関する。
【０１６４】 上記およびその他の作用物質は以下の節でさらに詳細に記載される。
【０１６５】 1．診断解析 生物試料におけるTango-77の有無を検出するための例となる方法は、被験対象
からの生物試料の採取、および生物試料におけるTango-77の存在が検出されるよ
うな、その生物試料とTango-77蛋白質またはTango-77をコードする核酸（例えば
mRNA、ゲノムDNA）を検出しうる化合物または作用物質との接触を含む。Tango-7
7のmRNAまたはゲノムDNAを検出するための好ましい作用物質は、Tango-77のmRNA
またはゲノムDNAとハイブリダイズしうる標識された核酸プローブである。核酸 プローブは、例えば、配列番号：1、配列番号：3、配列番号：6、配列番号：10 の核酸などの完全長Tango-77核酸、または長さが少なくとも15、30、50、100、2
50または500ヌクレオチドであってTango-77のmRNAまたはゲノムDNAとストリンジ
ェントな条件下で十分に特異的にハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドなど
の、その一部である。本発明の診断的解析に用いるためのその他の適したプロー
ブは本明細書に記載されている。
【０１６６】 Tango-77蛋白質を検出するための好ましい作用物質の1つは、Tango-77蛋白質 と結合しうる抗体、好ましくは検出可能な標識を有する抗体である。抗体はポリ
クローン性でもよいが、より好ましくはモノクローン性である。完全な抗体また
はその断片（例えばFabまたはF(ab')2）を用いうる。プローブまたは抗体に関す
る「標識された」という用語は、検出可能な物質をプローブまたは抗体と結合（
すなわち物理的結合）させることによるプローブまたは抗体の直接的標識に加え
て、直接的に標識されたもう1つの試薬との反応によるプローブまたは抗体の間 接的標識を含むことを意図している。間接的標識の例には、蛍光標識された二次
抗体を用いての一次抗体の検出、および蛍光標識されたストレプトアビジンで検
出しうるようにするためのビオチンによるDNAプローブの末端標識が含まれる。 「生物試料」という用語には、被験動物から単離された組織、細胞および生物的
液体、さらには被験動物の内部に存在する組織、細胞および液体を含める意図が
ある。すなわち、本発明の検出法は、生物試料におけるTango-77のmRNA、蛋白質
またはゲノムDNAをインビトロならびにインビボで検出するために用いうる。例 えば、Tango-77 mRNAを検出するためのインビトロの方法には、ノーザンハイブ リダイゼーションおよびインサイチューハイブリダイゼーションが含まれる。Ta
ngo-77蛋白質を検出するためのインビトロ法には、固相酵素免疫測定法（ELISA ）、ウエスタンブロット法、免疫沈降法および免疫蛍光法が含まれる。Tango-77
蛋白質を検出するためのインビトロの方法には、サザンハイブリダイゼーション
が含まれる。さらにTango-77ゲノムDNAを検出するためのインビボの方法には、 標識された抗Tango-77抗体を被験動物に導入することが含まれる。例えば、被験
動物における存在および位置を標準的な撮像技術によって検出しうる放射性マー
カーによって抗体を標識することができる。
【０１６７】 1つの態様において、生物試料は被験対象からの蛋白質分子を含む。または、 生物試料は被験対象からのmRNA分子または被験対象からのゲノムDNA分子を含み うる。好ましい生物試料の1つは、従来の手段によって被験動物から単離された 末梢血白血球試料である。
【０１６８】 もう1つの態様において、本方法はさらに、対照被験動物からの対照生物試料 の採取、生物試料におけるTango-77蛋白質、mRNAまたはゲノムDNAの存在が検出 されるような、その対照試料とTango-77蛋白質、mRNAまたはゲノムDNAを検出し うる化合物または作用物質との接触、および対照試料におけるTango-77蛋白質、
mRNAまたはゲノムDNAの存在と被験試料におけるTango-77蛋白質、mRNAまたはゲ ノムDNAの存在との比較を含む。
【０１６９】 本発明は、生物試料（被験試料）におけるTango-77の存在を検出するためのキ
ットも含む。このようなキットは、被験動物がTango-77の異常発現に関連した障
害（例えば免疫障害）に罹患しているかどうか、またはその発症のリスクが高い
かどうかを判定するために用いることができる。例えば、本キットは、生物試料
におけるTango-77蛋白質またはmRNAを検出しうる標識された化合物または作用物
質、および試料中のTango-77の量を測定するための手段を含みうる（例えば、抗
Tango-77抗体、または配列番号：1もしくは配列番号：3もしくは配列番号：6も しくは配列番号：10などのTango-77をコードするDNAと結合するオリゴヌクレオ チドプローブ）。キットは、被験対象がTango-77の異常発現に関連した障害に罹
患していること、またはその発症のリスクが高いこと、またはTango-77蛋白質ま
たはmRNAの量が正常レベルの上または下であるかどうかを観察するための指示も
含みうる。
【０１７０】 抗体に基づくキットの場合、キットは例えば以下のものを含みうる：(1)Tango
-77蛋白質と結合する第1の抗体（例えば固体支持体に付着したもの）、および選
択的には(2)Tango-77蛋白質または第1の抗体と結合し、検出可能な作用物質が結
合している第2の異なる抗体。
【０１７１】 オリゴヌクレオチドに基づくキットの場合、キットは例えば以下のものを含み
うる：(1)Tango-77核酸配列とハイブリダイズする検出可能な標識を受けたオリ ゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチド、または(2)Tango-77核酸分子を増幅 するために有用な1対のプライマー。
【０１７２】 キットは、例えば緩衝剤、保存料または蛋白質安定化剤なども含みうる。キッ
トは検出可能な作用物質（例えば酵素または基質）を検出するために必要な成分
も含みうる。キットは、解析および含まれる被験試料との比較が可能な1つの対 照試料または一連の対照試料も含むことができる。キットの各構成要素は通常は
個々の容器内に封入されており、種々の容器はすべて、被験対象がTango-77の異
常発現に関連した障害に罹患しているか否か、またはその発症のリスクが高いか
否かを観察するための指示とともに単一の包装容器内におかれる。
【０１７３】 2．予後判定的解析 本明細書に記載される方法はさらに、被験動物がTango-77の異常な発現または
活性に関連した疾患または障害を有すること、またはそれを発症するリスクがあ
ることを同定するための診断的または予後判定的解析として用いることが可能で
ある。例えば、上記の診断的解析または以下の解析などの本明細書に記載される
解析は、被験動物が異常な発現または活性に関連した傷害を発症するリスクを有
することを同定するために使用することができる。このため、本発明は、被験動
物から被験試料が採取され、Tango-77蛋白質または核酸（例えばmRNA、ゲノムDN
A）が検出される方法であって、Tango-77蛋白質または核酸の存在によってその 被験動物がTango-77の異常な発現または活性に関連した疾患または障害を有する
か、またはその発症のリスクがあることが診断されるような方法を提供する。本
明細書で用いる「被験試料」とは、関心対象の被験動物から採取した生物試料を
意味する。例えば、被験試料は生物的液体（例えば精液）、細胞試料または組織
でありうる。
【０１７４】 さらに、本明細書に記載される予後判定解析は、Tango-77の異常な発現または
活性に関連した疾患または障害を治療するために、被験動物に対して作用物質（
例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、蛋白質、ペプチド、核
酸、小分子、またはその他の薬物候補物質）を投与しうるか否かを判定するため
に用いうる。例えば、このような方法は、被験動物を特定の作用物質または一群
の作用物質（例えばTango-77活性を低下させる種類の作用物質）によって効果的
に治療しうるか否かを判定するために用いうる。したがって、本発明は、被験試
料が採取されてTango-77蛋白質または核酸が検出されるような（例えば、Tango-
77蛋白質または核酸の存在によってTango-77の異常な発現または活性と関連した
障害を治療するための作用物質を投与しうる被験動物が診断されるような）、被
験動物をTango-77の異常な発現または活性に関連した障害に対する作用物質によ
って効果的に治療しうるか否かを判定するための方法を提供する。
【０１７５】 本発明の方法は、Tango-77遺伝子における遺伝的欠損または変異を検出し、そ
れによって欠損遺伝子を有する被験動物に異常な炎症を特徴とする障害に対する
リスクがあるかどうかを判定するために用いることもできる。好ましい態様にお
いて、本方法は、被験動物からの細胞試料における、Tango-77蛋白質をコードす
る遺伝子の完全性に影響を及ぼす変化またはTango-77遺伝子の誤発現のうち少な
くとも1つを特徴とする遺伝的欠損の有無を検出することが含まれる。例えば、 このような遺伝的欠損は、1）Tango-77遺伝子からの1つまたは複数のヌクレオチ
ドの欠失、2）Tango-77遺伝子に対する1つまたは複数のヌクレオチドの付加、3 ）Tango-77遺伝子の1つまたは複数のヌクレオチドの置換、4）Tango-77遺伝子の
染色体再配列、5）Tango-77遺伝子のメッセンジャーRNA転写物のレベルの変化、
6）ゲノムDNAのメチル化パターンなどの、Tango-77遺伝子の異常な修飾、7）Tan
go-77遺伝子のメッセンジャーRNA転写物での非野生型スプライシングパターンの
存在、8）非野生型レベルのTango-77蛋白質、9）Tango-77遺伝子の対立遺伝子の
消失、および10）Tango-77蛋白質の不適切な転写後修飾のうち少なくとも1つの 存在を確認することによって検出しうる。本明細書で説明した通り、Tango-77遺
伝子における欠損を検出するために用いうる当技術分野で知られた解析法は数多
く存在する。好ましい生物試料の1つは、被験動物から従来の手段によって単離 された末梢血白血球試料である。
【０１７６】 いくつかの態様において、欠損の検出には、アンカーPCRまたはRACE PCRなど のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）（例えば、米国特許第4,683,195号および第4,68
3,202号を参照）または連結連鎖反応（LCR）（例えば、Landegranら（1988）Sci
ence 241：1077〜1080およびNakazawaら（1994）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9
1：360〜364を参照）におけるプローブ／プライマーの使用が含まれ、このうち 後者はTango-77遺伝子の点変異の検出に特に有用なことがある（Abravayaら（19
95）Nucleic Acids Res. 23：675〜682を参照されたい）。この方法は、患者か らの細胞試料の採取、試料の細胞からの核酸（例えばゲノム性、mRNAまたはその
両方）の単離、核酸試料と、Tango-77遺伝子（存在すれば）のハイブリダイゼー
ションおよび増幅が起こるような条件下でTango-77遺伝子と特異的にハイブリダ
イズする1つまたは複数のプライマーとの接触、ならびに増幅産物の有無の検出 または増幅産物のサイズの検出および対照試料との長さの比較の段階を含みうる
。PCRおよび／またはLCRは、変異を検出するために用いられる本明細書に記載さ
れる任意の技法とともに予備的増幅段階として用いることが望ましいと考えられ
る。
【０１７７】 代替的な増幅法には、自続的配列複製（Guatelliら（1990）Proc. Nati. Acad
. Sci. USA 87：1874〜1878）、転写増幅系（Kwoh,ら（1989）Proc. Nati. Acad
. Sci. USA 86：1173〜1177）、Q-βレプリカーゼ（Lizardiら（1988）Bio／Tec
hnology 6：1197）またはその他の任意の核酸増幅法が含まれ、その後に当業者 に周知の技法を用いて増幅分子を検出する。これらの検出体系は、核酸分子が極
めて少数しか存在しない場合、このような分子の検出に特に有用である。
【０１７８】 1つの代替的な態様において、試料細胞からのTango-77遺伝子における変異は 、制限酵素切断パターンの変化によって同定しうる。例えば、試料および対照DN
Aを単離し、増幅し（選択的）、1つまたは複数の制限酵素で消化し、ゲル電気泳
動によって断片長のサイズを決定し、比較する。試料および対照DNAの間の断片 長サイズに差があれば、試料DNAにおける変異を意味する。さらに、配列特異的 リボザイム（例えば、米国特許第5,498,531号を参照）を用いて、リボザイム切 断部位の発生または消失によって特異的変異の存在を評価することもできる。
【０１７９】 その他の態様において、DNAまたはRNAなどの試料および対照核酸を数百または
数千のオリゴヌクレオチドプローブを含む高密度アレイとハイブリダイズさせる
ことにより、Tango-77における遺伝子変異を同定することができる（Croninら（
1996）Human Mutation 7：244〜255、Kozalら（1996）Nature Medicine 2：753 〜759）。例えば、Tango-77における遺伝子変異は、クローニン（Cronin）ら、 前記に記載されたような光発生（light-generated）DNAプローブを含む二次元ア
レイにおいて同定しうる。簡潔にいえば、プローブの第1のハイブリダイゼーシ ョンアレイは、連続的にオーバーラップするプローブの線状アレイを作成するこ
とによって配列間の塩基変化を同定する目的で、試料および対照における長いDN
A片を走査するために用いることができる。この段階で点変異の同定が可能とな る。この段階に続いて、検出されたすべての変異体または変異に対して相補的な
より小型で特化したプローブアレイを用いることにより、特定の変異の特徴を分
析しうる第2のハイブリダイゼーションアレイを用いる。それぞれの変異アレイ は、一方が野生型遺伝子に相補的であって他方が変異遺伝子に相補的である、対
応するプローブの組から構成される。
【０１８０】 さらにもう1つの態様では、当技術分野で知られた種々の配列決定反応のうち 任意のものを、Tango-77遺伝子の配列を直接決定し、試料Tango-77の配列と対応
する野生型（対照）配列との比較によって変異を検出するために用いることがで
きる。配列決定反応の例には、マクサム（Maxim）およびギルバート（Gilbert）
（（1977）Proc. Nati. Acad. Sci. USA 74：560）またはサンガー（Sanger）（
（1977）Proc. Nati. Acad. Sci. USA 74：5463）によって開発された技法に基 づくものが含まれる。診断的解析（（1995）Bio／Techniques 19：448）を実施 する際には、質量分析法による配列決定（例えば、PCT国際公開公報第94／16101
号、Cohenら（1996）Adv. Chromatogr. 36：127〜162およびGriffinら（1993）A
ppi. Biochem. Biotechnol. 38：147〜159）を含む、種々の自動的配列決定手順
の任意のものを用いうることも考慮される。
【０１８１】 Tango-77遺伝子における変異を検出するためのその他の方法には、RNA／RNAま
たはRNA／DNAヘテロ2本鎖におけるミスマッチ塩基を検出するために切断剤から の保護を用いる方法が含まれる（Myersら（1985）Science 230：1242）。一般に
「ミスマッチ切断」の技術的技法は、野生型Tango-77配列を含む（標識された）
RNAまたはDNAと、組織試料から得られた変異型の可能性のあるRNAまたはDNAをハ
イブリダイズさせることによって形成されたヘテロ2本鎖を提供することによっ て開始される。この2本鎖を、対照および試料鎖の間の塩基対ミスマッチのため に存在すると考えられるものなどの2本鎖の1本鎖領域を切断する作用物質によっ
て処理する。例えば、RNA／DNA 2本鎖をRNアーゼで処理し、DNA／DNAハイブリッ
ド体をS1ヌクレアーゼで処理することにより、ミスマッチ領域を酵素的に消化す
ることができる。その他の態様では、DNA／DNAまたはRNA／DNA 2本鎖をヒドロキ
シルアミンまたは四酸化オスミウム、およびピペリジンで処理してミスマッチ領
域を消化することができる。ミスマッチ領域の消化後に、変異の部位を決定する
ために、結果として得られた材料を変性ポリアクリルアミドゲルにかけてサイズ
別に分離する。例えば、コットン（Cotton）ら（1988）Proc. Nati Acad Sci US
A 85：4397、サレーバ（Saleeba）ら（1992）Methods Enzymol. 217：286〜295 を参照されたい。1つの好ましい態様において、対照DNAまたはRNAを検出のため に標識することができる。
【０１８２】 さらにもう1つの態様では、ミスマッチ切断反応に、細胞の試料から得られたT
ango-77 cDNAにおける点変異の検出およびマッピングのために規定系において2 本鎖DNAにおけるミスマッチ塩基対を認識する1つまたは複数の蛋白質（いわゆる
「DNAミスマッチ修復」酵素）を用いる。例えば、大腸菌のmutY酵素はG／Aミス マッチのAを切断し、ヒーラ（HeLa）細胞のチミジンDNAグリコシラーゼはG／Tミ
スマッチのTを切断する（Hsuら（1994）Carcinogenesis 15：1657〜1662）。例 となる態様によれば、野生型Tango-77配列などのTango-77配列に基づくプローブ
を被験細胞からのcDNAまたは他のDNA産物とハイブリダイズさせる。この2本鎖を
DNAミスマッチ修復酵素で処理し、切断産物が生じていれば、電気泳動手順など によって検出することができる。例えば、米国特許第5,459,039号を参照された い。
【０１８３】 その他の態様において、Tango-77遺伝子における変異を同定するために電気泳
動移動度の変化を用いうると考えられる。例えば、変異型および野生型核酸の間
の電気泳動移動度の差を検出するために、1本鎖高次構造多型（SSCP）を用いる ことができる（Oritaら（1989）Proc Natl. Acad. Sci USA：86：2766。Cotton （1993）Mutat. Res. 285：125〜144およびHayashi（1992）Genet Anal Tech Ap
pl 9：73〜79も参照のこと）。試料および対照Tango-77核酸の1本鎖DNA断片は変
性させ、再生させることができると考えられる。1本鎖核酸の二次構造は配列に よって異なるため、結果として生じた電気泳動移動度の変化から単一塩基の変化
すら検出することが可能となる。DNA断片を標識したり標識プローブによって検 出したりすることもできる。解析の感度は、配列の変化に対する二次構造の感受
性がより大きいRNA（DNAではなく）を用いることによって高めうる。1つの好ま しい態様において、本方法では、電気泳動移動度の変化に基づいて2本鎖ヘテロ2
本鎖分子を分離するためにヘテロ2本鎖分析を用いる（Keenら（1991）Trends Ge
net 7：5）。
【０１８４】 さらにもう1つの態様では、変性勾配ゲル電気泳動（DGGE）を用いて、変性剤 の勾配を含むポリアクリルアミドゲルにおける変異型または野生型断片の移動を
解析する（Myersら（1985）Nature 313：495）。DGGEを分析方法として用いる場
合には、例えばPCRによる約40bpの高融解性のGCに富むDNAのGCクランプ（GC cla
mp）を加えることにより、DNAが確実に完全には変性しないようにDNAは改変され
ると思われる。さらなる態様では、対照および試料DNAの移動度の差を同定する ために、変性勾配の代わりに温度勾配が用いられる（RosenbaumおよびReissner （1987）Biophys Chem 265：12753）。
【０１８５】 点変異を検出するためのその他の技術の例としては、選択的オリゴヌクレオチ
ドハイブリダイゼーション、選択的増幅または選択的プライマー伸長が非制限的
に含まれる。例えば、既知の変異が中心に配置され、続いて完全な一致が認めら
れた場合のみにハイブリダイゼーションを許容するような条件下で標的DNAとハ イブリダイズさせたオリゴヌクレオチドプライマーを調製しうる（Saikiら（198
6）Nature 324：163）、Saikiら（1989）Proc. Natl Acad. Sci USA 86：6230）
。このような対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドを
ハイブリダイゼーション膜に付着させ、標識された標的DNAとハイブリダイズさ せると、PCRで増幅された標的DNAまたは多数の異なる変異体とハイブリダイズす
る。
【０１８６】 または、選択的PCR増幅に依拠する対立遺伝子特異的増幅法を本発明とともに 用いることもできる。特異的増幅のためのプライマーとして用いられるオリゴヌ
クレオチドは、ミスマッチが防止されるか、またはポリメラーゼ伸長が軽減され
る適切な条件下で、分子の中心部（増幅が差分的ハイブリダイゼーションに依拠
するように）（Gibbsら（1989）Nucleic Acids Res. 17：2437〜2448）または一
方のプライマーの3'最末端に関心対象の変異を有すると思われる（Prossner（19
93）Tibtech 11：238）。さらに、切断に基づく検出部を作製するために変異領 域に新規制限部位を導入することが望ましいと思われる（Gaspariniら（1992）M
ol. Cell Probes 6：1）。いくつかの態様においては増幅用のTaqリガーゼを用 いた増幅も実施しうると考えられる（Barany（1991）Proc. Natl. Acad. Sci US
A 88：189）。このような場合には、3'および5'末端での完全な一致が存在する 場合のみに連結が起こると考えられ、増幅の有無を調べることによって特定の部
位での既知の変異の存在を検出することが可能となる。
【０１８７】 本明細書に記載される方法は、例えば、本明細書に記載される核酸または抗体
試薬の少なくとも1つを含むプレパッケージがなされた診断用キットを用いるこ とによって行うことができ、これは、Tango-77遺伝子が関与する疾患または疾病
の症状または家族歴がある患者を診断する臨床的状況などにおいて便利に用いう
ると考えられる。
【０１８８】 さらに、Tango-77が発現される任意の細胞種または組織、好ましくは末梢血白
血球を、本明細書に記載される予後判定的解析に用いることもできる。
【０１８９】 3．薬理ゲノム学 本明細書に記載されるスクリーニング解析によって同定されるような、Tango-
77活性（例えばTango-77遺伝子の発現）に対して刺激的または抑制的効果を有す
る作用物質または修飾因子を、Tango-77の異常な活性と関連した障害（例えば急
性または慢性の炎症または喘息）の治療（予防的または治療的）のために個体に
投与することができる。このような治療とともに、その個体の薬理ゲノム学（す
なわち、個体の遺伝子型とその個体の外来性化合物または薬物に対する反応との
間の関係に関する学問）を考慮することができる。治療薬の代謝の違いは、薬理
活性をもつ薬物の投与量と血中濃度との間の関係が変化することにより、重度の
毒性または治療の失敗につながりうる。このため、個体の薬理ゲノム学により、
その個体の遺伝子型の検討に基づいて予防的または治療的治療のための有効な作
用物質（例えば薬物）を選択することが可能になる。このような薬理ゲノム学は
さらに、適切な投与量および治療方式の決定に用いることができる。したがって
、個体におけるTango-77蛋白質の活性、Tango-77核酸の発現、またはTango-77遺
伝子の変異含有量を測定し、それによってその個人の治療的または予防的治療の
ために適した作用物質を選択することが可能である。
【０１９０】 薬理ゲノム学では、罹患者における薬物の生体内動態の変化および異常作用に
起因する、薬物に対する反応における臨床的に有意な遺伝的変動を取り扱う。例
えば、リンダー（Linder）（1997）Clin. Chem. 43（2）：254〜266を参照され たい。一般に、薬理ゲノム学的状態は2つのタイプに区別しうる。すなわち、薬 物が身体に作用する様式を変化させる単一因子として伝達される遺伝的状態（薬
物作用の変化）または身体が薬物に対して作用する様式を変化させる単一因子と
して伝達される遺伝的状態（薬物代謝の変化）である。これらの薬理ゲノム学的
状態は、稀な欠損症または多型のいずれかとして出現しうる。例えば、グルコー
ス-6-リン酸デヒドロゲナーゼ欠損症（G6PD）はよくみられる遺伝性酵素病であ り、その主な臨床的合併症はオキシダント類（抗マラリア薬、スルホンアミド、
鎮痛薬、ニトロフラン）の経口摂取後およびソラマメの摂食後に起こる溶血であ
る。
【０１９１】 1つの例となる態様として、薬物代謝酵素の活性は、薬物作用の強度および持 続時間の両方に関する主な決定要因である。薬物代謝酵素（例えば、N-アセチル
トランスフェラーゼ2（NAT2）ならびにシトクロムP450酵素CYP2D6およびCYP2Cl9
）の遺伝的多型の発見は、一部の患者で期待された薬物効果が得られなかったり
、または標準的で安全な用量の薬物を服用した後に薬物反応の悪化および重篤な
毒性が認められたりする理由の説明となった。これらの多型は集団において高代
謝能型（EM）および低代謝能型（PM）という2つの表現型として発現される。PM の出現率は集団によって異なる。例えば、CYP2D6をコードする遺伝子は多型性が
高く、PMにはいくつかの変異が同定されており、それらはいずれも機能的CYP2D6
の欠如をもたらす。CYP2D6およびCYP2Cl9に関して低代謝能型の人々は、標準的 用量を投与された際に薬物反応の悪化および副作用を経験する頻度が極めて高い
。代謝産物が有効治療成分である場合には、CYP2D6によって生じる代謝産物であ
るモルヒネを介したコデインの鎮痛効果に関して示されているように、PMは何ら
治療的反応を示さない。他方の極端な例は、標準的な投与量に反応しない、いわ
ゆる超迅速代謝能型（ultra-rapid metabolizer）である。。最近、超迅速代謝 にはCYP2D6遺伝子増幅という分子的基盤があることが同定された。
【０１９２】 このため、個体におけるTango-77蛋白質の活性、Tango-77核酸の発現、または
Tango-77遺伝子の変異含有量を測定し、それによってその個体の治療的または予
防的治療のために適した作用物質を選択することが可能である。さらに、薬理ゲ
ノム学的検討を、薬物代謝酵素をコードする多型対立遺伝子の遺伝子型同定を個
体の薬物反応に関する表現型の同定に適用することも可能である。この知見は、
投薬または薬物選択に適用された場合には、有害反応または治療の失敗を回避し
、それによって本明細書に記載された例示的なスクリーニング解析の1つによっ て同定された修飾因子などのTango-77修飾因子によって被験動物を治療する際の
治療的または予防的効果を高めうる。
【０１９３】 4．臨床試験時における効果の観測 Tango-77の発現または活性に対する作用物質（例えば薬物、化合物）の影響（
例えば異常な炎症を調節する能力）の観測を、基礎的な薬物スクリーニングにお
いてのみならず、臨床試験にも適用することができる。例えば、本明細書に記載
されたようなスクリーニング解析によってTango-77遺伝子の発現または蛋白質レ
ベルを増強させるか、またはTango-77活性をアップレギュレートすると判定され
た作用物質の有効性を、Tango-77の遺伝子発現または蛋白質レベルの低下、また
はTango-77活性のダウンレギュレーションを呈する被験動物の臨床試験において
観測することができる。または、スクリーニング解析によってTango-77遺伝子の
発現または蛋白質レベルを低下させるか、またはTango-77活性をダウンレギュレ
ートすると判定された作用物質の有効性を、Tango-77の遺伝子発現または蛋白質
レベルの増強、またはTango-77活性のアップレギュレーションを呈する被験動物
の臨床試験において観測することもできる。
【０１９４】 例えば、非制限的ではあるが、Tango-77活性を調節する（例えば、本明細書に
記載されたスクリーニング解析において同定される）作用物質（例えば化合物、
薬物または小分子）による治療によって細胞内で調節される、Tango-77を含む遺
伝子を同定することができる。したがって、例えば臨床試験において、細胞増殖
性疾患に対する作用物質の効果を検討するために、細胞を単離し、RNAを調製し て、Tango-77またはその障害に関与するとみられる他の遺伝子の発現レベルに関
して分析することができる。遺伝子発現レベル（すなわち、遺伝子発現パターン
）は、本明細書に記載されるノーザンブロット分析もしくはRT-PCRにより、また
はその代わりに本明細書に記載される方法の1つによって産生蛋白質の量を測定 することにより、またはTango-77またはその他の遺伝子の活性レベルを測定する
ことによって定量化しうる。このようにして、遺伝子発現パターンを、作用物質
に対する細胞の生理的反応の指標となるマーカーとして役立てることができる。
したがって、作用物質による被験動物の治療の前および実施中の種々の時点でこ
の反応状況を判定することができる。
【０１９５】 1つの好ましい態様において、本発明は、（i）作用物質を投与する前の被験動
物からの投与前試料の採取、（ii）投与前試料におけるTango-77蛋白質、mRNAま
たはゲノムDNAの発現レベルの検出、（iii）被験動物からの1つまたは複数の投 与後試料の採取、（iv）投与後試料におけるTango-77蛋白質、mRNAまたはゲノム
DNAの発現レベルの検出、（v）投与前試料におけるTango-77蛋白質、mRNAまたは
ゲノムDNAの発現レベルと、投与後試料におけるTango-77蛋白質、mRNAまたはゲ ノムDNAの発現レベルとの比較、および（vi）それに従っての被験動物への作用 物質の投与の変更の段階を含む、作用物質（例えば、例えば、アゴニスト、アン
タゴニスト、ペプチド模倣物、蛋白質、ペプチド、核酸、小分子、または本明細
書に記載されるスクリーニング解析によって同定されるその他の薬物候補物質）
による被験動物の治療の有効性を観測するための方法を提供する。例えば、Tang
o-77の発現または活性を検出されたレベルよりも高いレベルに増強させるため、
すなわち作用物質の有効性を高めるためには、作用物質の投与量を増やすことが
望ましいと思われる。または、Tango-77の発現または活性を検出されたレベルよ
りも低いレベルに低下させるため、すなわち作用物質の有効性を抑えるためには
、作用物質の投与量を減らすことが望ましいと思われる。
【０１９６】 C．治療方法 本発明は、Tango-77の異常な発現または活性と関連した障害のリスクがある（
または感受性がある）またはその障害を有する被験動物を治療する予防的および
治療的方法の両方を提供する。または、異常なIL-1産生と関連した障害をTango-
77によって治療することもできる。このような障害には、急性および慢性炎症、
喘息、いくつかの種類の関節炎、自己免疫性糖尿病、全身性エリテマトーデス、
ならびに炎症性腸疾患が含まれる。
【０１９７】 1．予防的方法 1つの局面において、本発明は、Tango-77発現または少なくとも1つのTango-77
活性を調節する作用物質を被験動物に投与することによって、被験動物における
Tango-77の異常な発現または活性（またはIL-1の異常な発現もしくは活性）と関
連した疾患または状態を予防するための方法を提供する。Tango-77の異常な発現
または活性に起因するまたはそれが一因である疾患に関するリスクがある被験動
物は、例えば、本明細書に記載された診断的または予後判定的解析の任意のもの
またはその組み合わせによって同定しうる。予防薬の投与は、疾患または障害が
予防されるように、またはその進行が遅くなるように、Tango-77の異常に特徴的
な症状が発現する前に行うことができる。例えば、Tango-77の異常の種類に応じ
て、被験動物を治療するために、Tango-77アゴニストまたはTango-77アンタゴニ
スト性作用物質を用いることができる。適切な作用物質は本明細書に記載される
スクリーニング解析に基づいて決定しうる。
【０１９８】 2．治療的方法 本発明のもう1つの局面は、治療を目的としてTango-77の発現または活性を調 節する方法に関する。本発明の調節方法は、細胞を、細胞に関連したTango-77蛋
白質活性のうち1つまたは複数の活性を調節する作用物質と接触させることを含 む。Tango-77蛋白質活性を調節する作用物質は、核酸もしくは蛋白質、Tango-77
蛋白質の天然にみられる同族リガンド、ペプチド、Tango-77ペプチド模倣物また
はその他の小分子などの、本明細書に記載される作用物質でありうる。1つの態 様において、作用物質はTango-77蛋白質の1つまたは複数の生物活性を刺激する 。このような刺激性物質の例には、活性Tango-77蛋白質および細胞内に導入され
たTango-77をコードする核酸分子が含まれる。もう1つの態様において、作用物 質はTango-77蛋白質の1つまたは複数の生物活性を抑制する。このような抑制性 物質の例には、アンチセンスTango-77核酸分子および抗Tango-77抗体が含まれる
。これらの調節方法はインビトロで行うこともでき（例えば、細胞を作用物質と
ともに培養することによる）、またはインビボで行うこともできる（例えば、被
験動物に作用物質を投与することによる）。本発明はそれ自体で、Tango-77蛋白
質または核酸分子の異常な発現または活性を特徴とする疾患または障害に罹患し
た個体を治療するための方法を提供する。1つの態様において、本方法は、Tango
-77の発現または活性を調節する（例えばアップレギュレートまたはダウンレギ ュレートする）作用物質（例えば本明細書に記載されたスクリーニング解析によ
って同定された作用物質）または作用物質の組み合わせを投与することを含む。
もう1つの態様において、本方法は、Tango-77の発現または活性の低下または異 常を代償するための治療法として、Tango-77蛋白質または核酸分子を投与するこ
とを含む。
【０１９９】 Tango-77が異常にダウンレギュレートされている状況、および／またはTango-
77活性の上昇に有益な効果があると考えられる状況では、Tango-77活性を刺激す
ることが望ましい。逆に、Tango-77が異常にアップレギュレートされている状況
、および／またはTango-77活性の低下に有益な効果があると考えられる状況では
、Tango-77活性を抑制することが望ましい。
【０２００】 本発明は、以下の実施例によってさらに例示されるが、これは制限的とみなさ
れるべきではない。本明細書の全体を通して引用されるすべての参考文献、特許
および刊行された特許出願の内容は本明細書に参照として組み入れられる。
【０２０１】 実施例 実施例1：ヒトTango-77 cDNAの単離および特徴分析 サイトカイン遺伝子IL-1α、IL-1βおよびIL-1raは2番染色体上に密にかたま って存在すること、すなわちIL-1α、IL-1βおよびIL-1raは互いに450kb以内に 位置することが明らかになっている。近位に存在する別の未知のサイトカイン遺
伝子を同定するために、IL-1αおよびIL-1βを含むBACクローンを用いた。これ を行うために、IL-1αおよびIL-1βに対して設計した特異的プライマーを用いて
、IL-1αおよびIL-1βを含むBACクローンをBACライブラリー（Research Genetic
s、Huntsville、Alabama）から選択した。BACからDNAを抽出し、ランダムに剪断
されたゲノムライブラリーの作製に用いた。このBACライブラリーから、配列決 定のために4000個のクローンを選択した。この結果得られたゲノム配列を集めて
コンティグとし、専有および公的データベースのスクリーニングに用いた。1つ のゲノムコンティグがIL-1raに類似する2つの配列区域を含むことが判明した。 これらの2つの区域はTango-77遺伝子のエクソンである可能性がある。
【０２０２】 エクソンの可能性のあるこの2つから2つのPCRプライマーを設計し、Tango-77
mRNAの発現のための一連のcDNAライブラリーのスクリーニングに用いた。TNF-α
で処理したヒト肺上皮由来のcDNAライブラリーで、予想されたサイズ（すなわち
、2つのエクソンがともにスプライシングを受けたとした場合のもの）の陽性バ ンドが認められた。そのPCR断片をプローブとして用いることにより、同じライ ブラリーから単一のcDNAクローンが単離された。このcDNAは989bpの挿入断片を 含む。このcDNAクローンが含むオープンリーディングフレームには3通りが考え られる。第1のオープンリーディングフレームは534ヌクレオチド（配列番号：1 のヌクレオチド356〜889；配列番号：3）を含み、178アミノ酸からなる蛋白質（
配列番号：2）をコードする。この蛋白質は、約63アミノ酸（配列番号：2のアミ
ノ酸1からほぼアミノ酸63まで（配列番号：4））からなる推定上のシグナル配列
、および約115アミノ酸（配列番号：2のほぼアミノ酸64からアミノ酸178まで（ 配列番号：5））からなる推定上の成熟蛋白質を含むと思われる。
【０２０３】 第2の推定されるヌクレオチドオープンリーディングフレームは498ヌクレオチ
ド（配列番号：1のヌクレオチド389〜889；配列番号：6）を含み、167アミノ酸 からなる蛋白質（配列番号：7）をコードする。この蛋白質は、約52アミノ酸（ 配列番号：7のアミノ酸1からほぼアミノ酸52まで（配列番号：8））からなる推 定上のシグナル配列、および約115アミノ酸（配列番号：7のほぼアミノ酸53から
アミノ酸167まで（配列番号：9））からなる推定上の成熟蛋白質を含むと思われ
る。
【０２０４】 第3のオープンリーディングフレームは408ヌクレオチド（配列番号：1のヌク レオチド372〜889；配列番号：10）を含み、136アミノ酸からなる蛋白質（配列 番号：11）をコードする。この蛋白質は、約21アミノ酸（配列番号：11のアミノ
酸1からほぼアミノ酸21まで（配列番号：12））からなる推定上のシグナル配列 、および約115アミノ酸（配列番号：11のほぼアミノ酸22からアミノ酸136まで（
配列番号：13））からなる推定上の成熟蛋白質を含むと思われる。
【０２０５】 Tango-77のヒトIL-1raとのアミノ酸レベルでの一致率は35％であると推定され
た。
【０２０６】実施例2：ヒト組織におけるTango-77 mRNAの発現 ノーザンブロットハイブリダイゼーションを用いてTango-77の発現を分析した
。プライム-イット（Prime-It）キット（Stratagene；La Jolla、CA）を供給者 の指示に従って用いることにより、PCRによって得た989bpのTango-77産物を３２ P-dCTPで放射標識した。ヒトmRNAを含むフィルター（MTNIおよびMTNII：Clontec
h；Palo Alto、CA）に対して、製造者の勧めに従い、高ストリンジェンシー条件
下でエクスプレスハイブ（ExpressHyb）ハイブリダイゼーション溶液（Clontech
）中でのプローブ探索および洗浄を行った。
【０２０７】 Tango-77 mRNAは、クローンテック（Clontech）ノーザンブロット上のいずれ の非刺激組織（脳、肝臓、脾臓、骨格筋、精巣、膵臓、心臓、腎臓および末梢血
白血球）mRNA中にも検出されなかった。
【０２０８】 続いて、96種を上回るcDNAライブラリーに対してTango-77の有無をPCR増幅を 用いて検討した。陽性シグナルが認められたのは3種のライブラリーのみであっ た。これらのライブラリーは、TNF-αで処理した気管支上皮、TNF-αで処理した
SSC細胞系、および抗CD3で処理したT細胞であった。
【０２０９】実施例3：Tango-77蛋白質の特徴分析 本実施例では、ヒトTango-77蛋白質の予想されるアミノ酸配列を、既知の蛋白
質であるIL-1raのアミノ酸配列と比較した。さらに、ヒトTango-77蛋白質の分子
量を予測した。
【０２１０】 上記のようにして単離されたヒトTango-77 cDNA（図1；配列番号：1）は、178
アミノ酸からなる蛋白質（図1；配列番号：2）または167アミノ酸からなる蛋白 質（図1；配列番号：7）または136アミノ酸からなる蛋白質（図1；配列番号：11
）をコードする。シグナルペプチド予測プログラムSIGNALP（Nielsenら（1997）
Protein Engineering 10：1〜6）により、Tango-77が、63アミノ酸からなるシグ
ナルペプチド（配列番号：2のアミノ酸1からほぼアミノ酸63まで（配列番号：4 ））を、115アミノ酸からなる成熟蛋白質の前、または115アミノ酸からなる成熟
蛋白質（配列番号：7のほぼアミノ酸52からアミノ酸167まで（配列番号：8）） の前、または115アミノ酸からなる成熟蛋白質（配列番号：11のほぼアミノ酸21 からアミノ酸136まで；配列番号：12）の前に含むことが予想された。
【０２１１】 図2に示されている通り、Tango-77はIL-1raと相同な領域を有する（配列番号 ：14）。
【０２１２】 翻訳後修飾を含めなければ、成熟型Tango-77の予想分子量は約13kDaであり、 未成熟型Tango-77の予想分子量は19.6kDa、18.5kDaまたは15.2kDaである。
【０２１３】実施例4：Tango-77蛋白質の調製 組換えTango-77は種々の発現システムにて産生させることができる。例えば、
成熟型Tango-77ペプチドを大腸菌内で組換えグルタチオン-S-トランスフェラー ゼ（GST）融合蛋白質として発現させ、融合蛋白質の単離および特徴分析を行う ことができる。具体的には、上記の通りにTango-77をGSTと融合させ、この融合 蛋白質を大腸菌株PEB199において発現させることができる。PEB199におけるGST-
Tango-77融合蛋白質の発現はIPTGによって誘導しうる。誘導を受けたPEB199株の
粗細菌可溶化物から、アフィニティクロマトグラフィーにより、グルタチオンビ
ーズ上に組換え融合蛋白質を精製することができる。
【０２１４】実施例5：選択的スプライシングを受けた形態のIL-1raおよびTango-77 コンピュータプログラムのプロクルーステス（Procrustes）（Gelfandら、199
6、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、93：9061〜9066）は、一続きのゲノムDNAにお
ける、関心対象の蛋白質に関する選択的スプライシングを受けたエクソンの有無
を予測する整列化アルゴリズムである。IL-1ra配列を用いることにより、プロク
ルーステスを用いて、2つのオーバーラップするBACゲノム配列における選択的ス
プライシングを受けた形態のIL-1raをコードする可能性のある付加的な配列の存
在を検索した（図3および図4参照）。IL-1raの変異体エクソンをコードすると思
われる複数の配列が同定された。エクソンと予想されるこれらのものは、IL-1ra
のN末端領域とは整列化により良好な対応が認められたが、Tango-77中には存在 しなかった。プロクルーステスによる結果は、さらにスプライシングを受けた形
態のIL-1raが存在することを予想させる。
【０２１５】 さらに、プロクルーステスにより、Tango-77の選択的スプライシングを受けた
エクソンをコードする付加的な配列がBAC1およびBAC2中にあることも予測された
（T77-プロクルーステス；図5）。予測されたこのスプライス変異型Tango-77で あるT77-プロクルーステスは、整列化によりTango-77（図6）ならびにIL-1raお よびIL-1β（図7）との対応が認められた。
【０２１６】 この配列内部のPCRプライマーは、標準的な技法を用いて一連のcDNAライブラ リーのスクリーニングに用いることができる。適したcDNAライブラリーには、TN
F-αで処理した気管支上皮、TNF-αで処理したSSC細胞系および抗CD3で処理した
T細胞から作製されるライブラリーが含まれる。この結果得られるcDNAクローン をライブラリーから単離して配列を決定することにより、付加的なTango-77 cDN
Aを同定することが可能である。
【０２１７】等価物 当業者は、定型的な範囲の実験により、本明細書に記載された特定の態様の等
価物を認識または確認しうると考えられる。このような等価物は本発明の範囲内
にあると考えられ、以下の請求の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、Tango-77のcDNA配列（配列番号：１）を示す。Tango-77
cDNAはヒトTango-77のアミノ酸配列（配列番号：２、配列番号：７、および配 列番号：11）のアミノ酸配列をコードする可能性がある３つのオープンリーディ
ングフレームを有する。配列番号：１について可能性がある３つのオープンリー
ディングフレームは：（1）ヌクレオチド356位〜ヌクレオチド889位（配列番号 ：３）；（2）ヌクレオチド389位〜ヌクレオチド889位（配列番号：６）；およ び（3）ヌクレオチド481位〜ヌクレオチド889位（配列番号：10）に及ぶ。
【図２】 図２は、Tango-77のアミノ酸配列（T77；配列番号：２）と共にI
L-1RA（配列番号：14）、およびIL-1β（配列番号：15）の配置を示す。
【図３】 図３は、BAC1のゲノム配列（配列番号：16）を示す。
【図４】 図４は、BAC2のゲノム配列（配列番号：17）を示す。
【図５】 図５は、プロクルーステース（Procrustes）によって予測された
（T77-プロクルーステース；配列番号：18）、Tango-77（配列番号：２）のもう
一つのスプライシング型のアミノ酸配列を示す。
【図６】 図６は、Tango-77のもう一つのスプライシング型（T77-プロクル
ーステース；配列番号：18）のアミノ酸配列の配置をTango-77（配列番号：２）
と共に示す。
【図７】 図７は、Tango-77のもう一つのスプライシング型（T77-プロクル
ーステース；配列番号：18）のアミノ酸配列の配置をIL-1ra（配列番号：14）、
およびIL-1β（配列番号：15）と共に示す。
【手続補正書】
【提出日】平成１２年８月１８日（２０００．８．１８）
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３（４４／５２）
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４（３１／６１）
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４（４２／６１）
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４（５７／６１）
【補正方法】変更
【補正内容】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ ４Ｃ０８４ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ ４Ｃ０８６ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 ４Ｈ０４５ 33/50 Ｄ 33/53 33/566 Ａ６１Ｋ 31/7088 33/566 Ａ６１Ｐ 3/10 // Ａ６１Ｋ 31/7088 11/06 38/00 19/02 Ａ６１Ｐ 3/10 29/00 11/06 37/02 19/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 29/00 15/00 ＺＮＡＡ 37/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，Ｊ Ｐ Ｆターム(参考） 2G045 AA29 AA34 AA35 BB14 BB51 CA18 CB01 CB17 FB01 FB02 FB03 FB08 4B024 AA01 AA11 CA01 CA09 CA12 DA02 DA03 GA11 HA08 HA11 HA14 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ42 QQ53 QQ79 QR32 QR48 QR51 QR56 QR62 QR80 QS25 QS34 4B064 AG02 CA10 CA19 CC24 DA01 4B065 AA90X AA93X AA93Y AB01 CA24 CA44 4C084 AA07 BA01 BA08 BA22 CA53 DA59 MA17 MA23 MA57 MA60 MA63 MA66 ZA592 ZA662 ZA892 ZA962 ZB012 ZB112 ZB152 ZC352 ZC422 4C086 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA59 ZA66 ZA89 ZA96 ZB01 ZB11 ZB15 ZC35 ZC42 4H045 AA10 AA30 BA10 CA40 DA02 EA20 FA72

Claims (22)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下からなる群より選択される単離核酸分子： a）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：６、配列番号：10のヌクレオチ ド配列、アクセッション番号98807としてATCCに寄託されたプラスミドのcDNA挿 入断片、またはその相補鎖と少なくとも45％同一であるヌクレオチド配列を含む
    核酸分子； b）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：６、配列番号：10のヌクレオチ ド配列、アクセッション番号98807としてATCCに寄託されたプラスミドのcDNA挿 入断片、またはその相補鎖の少なくとも300ヌクレオチドの断片を含む核酸分子 ； c）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：７、配列番号： ８、配列番号：９、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：13のアミノ酸配列
    、またはアクセッション番号98807としてATCCに寄託されたプラスミドのcDNA挿 入断片によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸
    分子； d）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：７、配列番号： ８、配列番号：９、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：13のアミノ酸配列
    を含むポリペプチドの断片をコードする核酸分子であって、該断片が、配列番号
    ：２、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：
    ９、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：13、またはアクセッション番号98
    807としてATCCに寄託されたプラスミドのcDNA挿入断片によってコードされるポ リペプチドの少なくとも15個の連続するアミノ酸を含む核酸分子； e）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：７、配列番号： ８、配列番号：９、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：13のアミノ酸配列
    、またはアクセッション番号98807としてATCCに寄託されたプラスミドのcDNA挿 入断片によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドの天然に存在する
    対立遺伝子変異体をコードする核酸分子であって、配列番号：１、配列番号：３
    、配列番号：６、配列番号：10またはその相補鎖を含む核酸分子とストリンジェ
    ントな条件下でハイブリダイズする核酸分子。
  2. 【請求項２】 以下からなる群より選択される、請求項１記載の単離核酸分
    子： a）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：６もしくは配列番号：10のヌク レオチド配列またはアクセッション番号98807としてATCCに寄託されたプラスミ ドのcDNA挿入断片を含む核酸分子、またはその相補鎖； b）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：７、配列番号： ８、配列番号：９、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：13のアミノ酸配列
    、またはアクセッション番号98807としてATCCに寄託されたプラスミドのcDNA挿 入断片によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸
    分子。
  3. 【請求項３】 ベクター核酸配列をさらに含む、請求項１記載の核酸分子。
  4. 【請求項４】 異種ポリペプチドをコードする核酸配列をさらに含む、請求
    項１記載の核酸分子。
  5. 【請求項５】 請求項１記載の核酸分子を含む宿主細胞。
  6. 【請求項６】 哺乳類宿主細胞である請求項５記載の宿主細胞。
  7. 【請求項７】 請求項１記載の核酸分子を含むヒト以外の哺乳類宿主細胞。
  8. 【請求項８】 以下からなる群より選択される単離ポリペプチド： a）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：７、配列番号： ８、配列番号：９、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：13のアミノ酸配列
    を含むポリペプチドの断片であって、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：
    ５、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：11、配列番号：12
    もしくは配列番号：13の少なくとも15個の連続するアミノ酸を含む断片； b）ポリペプチドが配列番号：１、配列番号：３、配列番号：６、配列番号：1
    0を含む核酸分子またはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイ ズする核酸分子によってコードされる、配列番号：２、配列番号：４、配列番号
    ：５、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：11、配列番号：
    12、配列番号：13のアミノ酸配列、またはアクセッション番号98807としてATCC に寄託されたプラスミドのcDNA挿入断片によってコードされるアミノ酸配列を含
    む、ポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子変種； c）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：６または配列番号：10のヌクレ オチド配列を含む核酸分子と少なくとも55％同一であるヌクレオチド配列を含む
    核酸分子によってコードされるポリペプチド。
  9. 【請求項９】 配列番号：２、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：７
    、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：13の
    アミノ酸配列、またはアクセッション番号98807としてATCCに寄託されたプラス ミドのcDNA挿入断片によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項８記載の
    単離ポリペプチド。
  10. 【請求項10】 異種アミノ酸配列をさらに含む、請求項８記載のポリペプチ
    ド。
  11. 【請求項11】 請求項８記載のポリペプチドと選択的に結合する抗体。
  12. 【請求項12】 核酸分子が発現される条件で請求項５記載の宿主細胞を培養
    することを含む、以下からなる群より選択されるポリペプチドの製造方法： a）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：７、配列番号： ８、配列番号：９、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：13のアミノ酸配列
    、またはアクセッション番号98807としてATCCに寄託されたプラスミドのcDNA挿 入断片によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド； b）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：７、配列番号： ８、配列番号：９、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：13のアミノ酸配列
    、またはアクセッション番号98807としてATCCに寄託されたプラスミドのcDNA挿 入断片によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドの断片であって、
    配列番号：２、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：８、配
    列番号：９、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：13のアミノ酸配列、また
    はアクセッション番号98807としてATCCに寄託されたプラスミドのcDNA挿入断片 によってコードされるアミノ酸配列の少なくとも15個の連続するアミノ酸を含む
    断片； c）ポリペプチドが配列番号：１、配列番号：３、配列番号：６、または配列 番号：10の核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子
    によってコードされる、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：５、配列番号
    ：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：
    13のアミノ酸配列、またはアクセッション番号98807としてATCCに寄託されたプ ラスミドのcDNA挿入断片によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド
    の天然に存在する対立遺伝子変異体。
  13. 【請求項13】 以下の段階を含む試料中における請求項８記載のポリペプチ
    ドの有無を検出する方法： a）請求項８記載のポリペプチドに選択的に結合する化合物と試料を接触させ る段階；および b）試料中で該化合物がポリペプチドに結合するか否かを判定する段階。
  14. 【請求項14】 ポリペプチドに結合する化合物が抗体である、請求項13記載
    の方法。
  15. 【請求項15】 請求項８記載のポリペプチドに選択的に結合する化合物と使
    用説明書とを含むキット。
  16. 【請求項16】 以下の段階を含む、試料中における請求項１記載の核酸分子
    の有無を検出する方法： a）核酸分子と選択的にハイブリダイズする核酸プローブまたはプライマーと 試料を接触させる段階；および b）核酸プローブまたはプライマーが試料中において核酸分子に結合するか否 かを判定する段階。
  17. 【請求項17】 試料がmRNA分子を含み、核酸プローブと接触させる、請求項
    16記載の方法。
  18. 【請求項18】 請求項１記載の核酸分子と選択的にハイブリダイズする化合
    物と使用説明書とを含むキット。
  19. 【請求項19】 以下の段階を含む、請求項８記載のポリペプチドに結合する
    化合物を同定する方法： a）ポリペプチドまたは請求項８記載のポリペプチドを発現する細胞を試験化 合物に接触させる段階；および b）ポリペプチドが試験化合物に結合するか否かを判定する段階。
  20. 【請求項20】 ポリペプチドに対する試験化合物の結合が以下からなる群よ
    り選択される方法によって検出される、請求項19記載の方法： a）試験化合物／ポリペプチド結合を直接検出することによる結合の検出； b）競合的結合解析を用いる結合の検出；および c）Tango-77媒介シグナル伝達に関する解析法を用いる結合の検出。
  21. 【請求項21】 ポリペプチドまたは請求項８記載のポリペプチドを発現する
    細胞を、ポリペプチドの活性を調節するために十分な濃度でポリペプチドと結合
    する化合物と接触させる段階を含む、請求項８記載のポリペプチドの活性を調節
    する方法。
  22. 【請求項22】 以下の段階を含む、請求項８記載のポリペプチドの活性を調
    節する化合物を同定する方法： a）請求項８記載のポリペプチドを試験化合物と接触させる段階；および b）ポリペプチドの活性に及ぼす試験化合物の作用を判定し、それによってポ リペプチドの活性を調節する化合物を同定する段階。
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