JP4780571B2 - ポリペプチドとその用途 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なポリペプチド、それをコードするDNA、及び、それらの製造方法並びに用途に関する。
【0002】
【従来の技術】
インターロイキン1(以下、「IL−1」と言う。)は、有核細胞が産生するサイトカインであって、ほとんど全ての器官系或いは恒常性維持機構に関与する生体にとって重要なポリペプチドである。IL−1の生物学的活性を例示すると、ナチュラルキラー(NK)細胞の活性化、好中球の活性化、血管内皮細胞表面の性状の変化、骨及び軟骨の崩壊促進、造血促進、前駆B細胞の成熟誘導、成熟B細胞の増殖誘導、T細胞の活性化及びIL−2産生誘導、サイトカイン産生誘導、ある種の腫瘍細胞に対する細胞障害性/細胞制止性作用、繊維芽細胞の分裂促進、及び軟寒天中での腫瘍細胞の増殖促進作用等の活性を挙げることができる。これまで、IL−1には、IL−1αとIL−1βの二種類のIL−1が報告されている。これらIL−1α及びIL−1βは、何れも同じ細胞表面受容体に結合し、同等の生物学的性質を持っているが、これらIL−1αとIL−1βの塩基配列の相同性は約45%で、アミノ酸配列の相同性は約26%程度に過ぎないことが明らかにされている。又、IL−1関連物質としては、IL−1受容体アンタゴニスト(IL−1Ra)及びIL−1受容体β(IL−1Raβ)の存在が明らかにされている。斯かる状況下、IL−1α、IL−1β、IL−1Ra及びIL−1Raβなどの所謂、IL−1ファミリー以外に、他のIL−1類縁体が存在するのではないかとの指摘が為されているが、未だそのような報告はない。そのようなIL−1類縁体は、生体の免疫機構をより詳細に解明し、また、新たな医薬品を開発する上で有用であり、斯界に於いては、斯かる類縁体のスクリーニングとその確立が希求されていた。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の第一の課題は、従来公知のIL−1α、IL−1β、IL−1Ra及びIL−1Raβとは異なる、IL−1類縁体としての新規なポリペプチド(以下、「本発明のポリペプチド」と言う。)を提供することにある。
【0004】
本発明の第二の課題は、本発明のポリペプチドと結合する受容体蛋白質を提供することにある。
【0005】
本発明の第三の課題は、本発明のポリペプチドをコードするDNAを提供することにある。
【0006】
本発明の第四の課題は、前記DNAと自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な組換えDNAを提供することにある。
【0007】
本発明の第五の課題は、前記組換えDNAを適宜宿主に導入してなる形質転換体を提供することにある。
【0008】
本発明の第六の課題は、本発明のポリペプチドの製造方法を提供することにある。
【0009】
本発明の第七の課題は、本発明のポリペプチドと免疫学的に反応する抗体を提供することにある。
【0010】
本発明の第八の課題は、本発明のポリペプチドを有効成分とする医薬組成物を提供することにある。
【0011】
本発明の第九の課題は、本発明のポリペプチドと免疫学的に反応する抗体を含んでなる医薬組成物を提供することにある。
【0012】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記課題を解決するために、IL−1α、IL−1β及びIL−1RaのcDNAを用いて、培養株化された動物細胞由来のmRNAを広く検索した。その結果、培養株化されたヒトT細胞であるHPB−MLT細胞(FERM BP−2430)から、配列表における配列番号5に示すアミノ酸配列からなる本発明のポリペプチドを単離することに成功した。本発明のポリペプチドは、前述したように、IL−1α、IL−1β及びIL−1RaのcDNAに基づいて得られたものであるが、IL−1α、IL−1β及びIL−1Raとのアミノ酸配列の相同性は20%未満に過ぎず、IL−1ファミリーに属するも、従来公知のIL−1ファミリーとは異なる新規ポリペプチドであることが判明した。本発明はこの知見に基づいて為された発明である。
【0013】
すなわち、本発明の前記第一の課題は、培養株化されたヒトT細胞であるHPB−MLT細胞(FERM BP−2430)由来の新規ポリペプチドにより解決するものである。
【0014】
本発明の第二の課題は、本発明のポリペプチドと結合する受容体蛋白質により解決するものである。
【0015】
本発明の第三の課題は、本発明のポリペプチドをコードするDNAにより解決するものである。
【0016】
本発明の第四の課題は、当該DNAと自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な組換えDNAにより解決するものである。
【0017】
本発明の第五の課題は、当該組換えDNAを適宜宿主に導入してなる形質転換体により解決するものである。
【0018】
本発明の第六の課題は、本発明のポリペプチドの製造方法により解決するものである。
【0019】
本発明の第七の課題は、本発明のポリペプチドと免疫学的に反応する抗体により解決するものである。
【0020】
本発明の第八の課題は、本発明のポリペプチドを有効成分とする医薬組成物により解決するものである。
【0021】
本発明の第九の課題は、本発明のポリペプチドと免疫学的に反応する抗体を含んでなる医薬組成物により解決するものである。
【0022】
【発明の実施の形態】
本発明のポリペプチドは、配列表における配列番号5に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、更には、配列表における配列番号5に示すアミノ酸配列と少なくとも75%の相同性を有し、中間部分アミノ酸配列として配列表における配列番号7に示すアミノ酸配列を含んでなるアミノ酸配列からなるポリペプチドを意味する。より詳細には、本発明のポリペプチドは、配列表における配列番号5に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、更には、配列表における配列番号5に於けるアミノ酸配列中の1箇所又は2箇所以上に於いて、1個以上のアミノ酸が欠失、付加及び/又は置換したアミノ酸配列、即ち、配列表における配列番号5に於けるアミノ酸配列中、1乃至55個のアミノ酸が欠失、付加及び/又は置換したアミノ酸配列からなるポリペプチドが、本発明のポリペプチドとして好適に使用できる。斯かる本発明のポリペプチドは、特徴的な生物学的活性として、ナチュラルキラー(NK)活性を抑制する作用を有する。
【0023】
本発明のポリペプチドは、当該ポリペプチド産生能を有するヒト及びヒト以外の温血動物由来の細胞から得ることができると共に、遺伝子工学的手法を用いて得ることができる。好適には、本発明のポリペプチド産生能を有する培養株化されたヒトT細胞、殊に、HPB−MLT細胞(FERM BP−2430)を栄養培地中で培養することにより得ることができる。又、本発明のポリペプチド産生能を有する培養株化されたヒト細胞を、in vivo増殖法として、ヒト以外の温血動物の栄養分を含んだ体液(以下、「体液」と言う。)の供給を受けながら増殖させ、その培養液及び/又は増殖細胞から容易に得ることができる。前記ヒト以外の温血動物を用いる増殖方法は、マウス、ヌードマウス、ラット、ヌードラット、モルモット、ハムスターなどのげっ歯類の新生児を使用し、これら温血動物に、例えば、ウサギ由来の抗胸腺抗体などを注射して免疫反応を減弱させた後、本発明のポリペプチド産生能を有する培養株化されたヒト細胞を、動物1匹当たり約1×105乃至1×108個皮下又は腹腔内に注射して移植するか、あるいは、これら温血動物の成長個体の体外又は体内に設けられ、温血動物の体液が環流可能な拡散チャンバーなどの容器内に本発明のポリペプチド産生能を有する培養株化されたヒト細胞を収容し、その後、通常一般の方法により動物を約2乃至10週間飼育する。この飼育期間、移植したヒト細胞は温血動物の体液を利用しながら増殖させる。本発明のポリペプチドが増殖細胞中に含まれている場合、増殖細胞を細胞塊、腹水又は細胞浮遊液として採取し、必要に応じて、これを適宜分散溶媒を用いて分散・洗浄した後、増殖細胞を以下に述べる機械的破壊又は化学的破壊処理して、得られる破壊物から目的とする本発明のポリペプチドを採取する。in vivo増殖法は、栄養培地を用いる生体外の増殖方法と比較して、より低コストと低労力でより短時間に所望量の増殖細胞が得られるとの利点がある。なお、in vivo増殖方法は、例えば、特公昭56−54158号公報などに詳述されている。
【0024】
本発明のポリペプチドを前記細胞培養液から採取するには、増殖細胞を除去した培養上清から採取するか、又は、増殖細胞を分離又は分離せずに培養上清と共に超音波を印加して破砕したり、ホモゲナイズ、凍結融解、あるいは、低張媒体中に浸漬するなどして増殖細胞を破砕した後、得られる破砕物又は破砕物と培養上清との混合物から当該ポリペプチドを採取する。斯かる破砕物又は混合物から本発明のポリペプチドを採取するには、例えば、塩析、透析、濾過、濃縮、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ゲル電気泳動及び等電点電気泳動など、通常、蛋白質を分離、精製するために斯界に於いて使用される1種以上の方法を採用することができる。使用目的に応じて、採取した本発明のポリペプチド含有液を濃縮し、凍結乾燥して、本発明のポリペプチドを含有する液状又は固状物を得る。得られる本発明のポリペプチドの純度は、前記手法を組み合わせることにより、そのアミノ酸配列を正確に分析できる程度に、実質的に純粋なレベルまで精製することができる。
【0025】
又、本発明のポリペプチドは、当該ポリペプチドをコードするDNAに通常の遺伝子工学的手法を適用して得ることもできる。このようにして得られる組換え型ポリペプチであっても、配列表における配列番号5に示すアミノ酸配列、及び、当該アミノ酸配列と少なくとも75%の相同性を有し、N−末端側に、中間部分アミノ酸配列として配列表における配列番号7に示すアミノ酸配列を含んでなるアミノ酸配列からなるポリペプチドである限り、本発明のポリペプチドに包含される。また、本発明のポリペプチド断片とは、前記した本発明のポリペプチドを酵素、薬剤等により切断して得ることのできるポリペプチド断片を意味し、斯かるポリペプチド断片はポリペプチド合成することも可能である。
【0026】
本発明のポリペプチドをコードするDNAは、例えば、配列表における配列番号4に示す塩基配列、当該塩基配列と少なくとも75%の相同性を有し、その5´末端側に配列表における配列番号8に示す塩基配列からなる塩基配列を含んでなる塩基配列、又は、それら塩基配列に相補的な塩基配列を含んでなるDNAに基づいて、通常の化学合成を適用することによっても得ることができる。いずれにしても、本発明によるDNAは、一旦入手しさえすれば、PCR法や、自律複製可能なベクターを用いる方法などを適用することにより、所望のレベルにまで容易に増幅させて得ることができる。又、当該DNAを公知の方法により断片化して得られるDNA断片は、本発明のポリペプチドをコードするDNAをスクリーニングする場合に有用であると共に、本発明のポリペプチドに対する抗体を遺伝子組換え技術により調製する場合に有用である。遺伝子工学的手法による抗体を製造する手法自体は公知であり、この手法は大量にヒト由来の抗体(ヒト化抗体)を得るのに有用な手法である。
【0027】
本発明のポリペプチドをコードするDNAは、当該DNAが自律複製可能なベクターに挿入された、組換えDNAとしての形態のものも包含する。斯かる組換えDNAは、上述のように一旦目的とするDNAが入手できれば、通常一般の遺伝子工学的手法により比較的容易に調製することができる。本発明で用いるベクターは、適宜の宿主内で自律複製できるものであればよく、具体例には、例えば、大腸菌を宿主として用いるpUC18、pBluescript II SK(+)、pKK223−3及びλgt・λC等、枯草菌を宿主として用いる、pUB110、pTZ4、pC194、ρ11、φ1及びφ105等、2種以上の微生物を宿主として用いるpHY300PLK、pHV14、TRp7、YEp7及びpBS7等を挙げることができる。斯かるベクターに本発明のポリペプチドをコードするDNAを挿入するには、斯界において慣用の方法が用いられる。具体的には、上述のようにして得られる本発明のポリペプチドをコードするDNAと自律複製可能なベクターとを制限酵素及び/又は超音波により切断した後、本発明のポリペプチドをコードするDNA断片とベクター断片を連結する。DNAの切断に塩基配列に特異的に作用する制限酵素、とりわけ、KpnI、AccI、BamHI、BstXI、EcoRI、HindIII、NotI、PstI、SacI、SalI、SmaI、SpeI、XbaI、XhoIなどを用いれば、本発明のポリペプチドをコードするDNA断片とベクター断片を連結するのが容易となる。連結するには、必要に応じて、両者をアニーリングした後、生体内又は生体外でDNAリガーゼを作用させればよい。斯くして得られる組換えDNAは、適宜の宿主において無限に複製可能である。
【0028】
本発明のポリペプチドをコードするDNAは、更に、当該DNAが適宜の宿主に導入された、形質転換体としての形態のものも包含する。斯かる形質転換体は、通常、上述のようにして得られるDNA乃至は組換えDNAを適宜の宿主に導入して形質転換することにより容易に得ることができる。宿主としては、当該組換えDNAにおけるベクターに応じて選択される、斯界において慣用される微生物、植物、動物由来の種々の細胞を用いることができる。宿主微生物としては、例えば、大腸菌、枯草菌、アルスロバクター属の微生物をはじめとする細菌の他、放線菌、酵母、真菌などの何れも有利に用いることができる。宿主微生物に本発明によるDNAを導入するには、例えば、公知のコンピテントセル法やプロトプラスト法を適用すればよい。なお、本発明による形質転換体において、当該ポリペプチドをコードするDNAは、宿主の染色体から独立した状態にあっても、斯かる染色体に組み込まれた状態にあってもよい。宿主の染色体に組み込まれた当該DNAは、宿主内で安定して保持されるという特徴があり、組換え型の本発明のポリペプチドの製造に有利な場合がある。又、培養物自体を直接これらの菌体の破砕方法のいずれかを用いて処理し、上述の分離手段のいずれかを適用し、本発明のポリペプチドを含む菌体抽出液として得ることも有利に実施できる。このようにして得られる菌体抽出液から高純度の本発明のポリペプチドを採取する手法としては、公知の蛋白質の精製手段を適宜採用することにより達成できる。殊に、本発明のポリペプチドと免疫学的に反応する、本発明の抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーによれば、高純度の本発明ポリペプチドを工業的に容易に製造することができる。
【0029】
また、本発明のDNA断片とは、前記した本発明のポリペプチドをコードするDNAを酵素、薬剤等により切断して得ることのできるDNA断片を意味し、斯かるDNA断片は、化学合成することも可能である。
【0030】
本発明のポリペプチドと免疫学的に反応する抗体、殊に、モノクローナル抗体は、本発明のポリペプチド又はその抗原性フラグメントを抗原として用いることにより得ることができる。具体的には、例えば、斯かる抗原で免疫感作しておいた哺乳動物より採取した抗体産生細胞と無限増殖可能な哺乳類由来の細胞とのハイブリドーマを作製し、これより本発明のモノクローナル抗体を産生し得るハイブリドーマのクローンを選択し、これを生体内外で培養することにより得ることができる。斯かる抗原としては、配列表における配列番号5に示すアミノ酸配列又はそれと相同的なアミノ酸配列をコードするDNAを導入した形質転換体を培養することによって得ることができ、それらは、通常、完全精製又は部分精製した状態で使用される。抗原性フラグメントを得るには、これら完全精製品又は部分精製品を化学的又は酵素的に分解するか、配列表における配列番号5に示すアミノ酸配列に基づいてペプチド合成すればよい。また、本発明のポリペプチドと免疫学的に反応する抗体には、生体に本来的に存在し、生体から単離し、精製された、本発明のポリペプチドと免疫学的に反応する当該ポリペプチドの受容体蛋白質も包含される。
【0031】
免疫感作は慣用の方法によればよく、例えば、上記のごとき抗原を単独又は適宜アジュバントとともに、哺乳動物の静脈、皮内、皮下又は腹腔内に注射接種し、一定期間飼育する。哺乳動物は特に限定されることなく、所期の抗体産生細胞が得られる限り、その種類、大きさ、雌雄は問わない。通常はラット、マウス、ハムスターなどのげっ歯類が用いられ、後記無限増殖可能な哺乳類由来の細胞との適合性も勘案しながら、最適のものが選択される。用いる哺乳動物の種類や大きさにも依るが、抗原の接種量は、通常、総接種量を約5乃至500μg/匹とし、これを約1乃至2週間の間隔を置いて2乃至5回に分けて接種する。そして、最終接種から3乃至5日後に脾臓を摘出し、分散して抗体産生細胞としての脾細胞を得る。尚、この際、哺乳動物の血液から、本発明のポリペプチドと免疫学的に反応する抗体を含む血清(抗血清)を採取することも可能である。
【0032】
斯くして得られた抗体産生細胞と無限増殖可能な哺乳類由来の細胞とを融合させて、目的のハイブリドーマを含む細胞融合産物を得る。無限増殖可能な哺乳類由来の細胞には、通常、P3/NS1/1−Ag4−1(NS−1)細胞(ATCC TIB18)、P3X63Ag8細胞(ATCC TIB9)及びSp2/0−Ag14細胞(ATCC CRL1581)などのマウス骨髄腫由来の細胞株又はその変異株が用いられる。細胞融合は、例えば、ポリエチレングリコールやセンダイウイルスを始めとする融合促進剤や電気パルスによる慣用の方法が用いられる。一例を挙げると、融合促進剤を含む融合培地に、抗体産生細胞と無限増殖可能な哺乳類由来の細胞を、約1:1乃至1:10の割合で浮遊させ、この状態のまま、約30乃至40℃で約1乃至5分間インキュベートする。融合培地には、例えば、MEM培地、RPMI1640培地及びイスコフ改変ダルベッコ培地を始めとする通常一般のものを用いることができるが、血清は除いておくのが望ましい。
【0033】
目的のハイブリドーマを選択するには、まず、上記のようにして得た細胞融合産物をHAT培地などの選択用培地に移し、約30乃至40℃で約3日乃至3週間培養して、ハイブリドーマ以外の細胞を死滅させる。つぎに、ハイブリドーマを常法により培養し、培養物中に分泌された抗体を本発明のポリペプチドとの反応性を試験して検出する。試験には、エンザイムイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ及びバイオアッセイなどの抗体を検出するための慣用の方法が用いられる。例えば、富山朔二・安東民衛編『単クローン抗体実験マニュアル』、1992年、講談社サイエンティフィック社発行、105乃至152頁には、そのための方法が種々詳述されている。本発明のポリペプチドに特異的な抗体を産生するハイブリドーマは、限界希釈法などによりクローニングして、単一クローンを得ることができる。
【0034】
本発明のモノクローナル抗体は、斯かるハイブリドーマを生体内外で培養することにより得ることができる。培養には、哺乳類由来の細胞を培養するための慣用の方法が用いられ、例えば、生体外(in vitro)の培養培地で培養するときには、その培養物から、又、ヒト以外の温血動物に移植して生体内(invivo)で増殖させるときには、その腹水及び/又は血液からモノクローナル抗体を採取する。培養物又は腹水若しくは血液からモノクローナル抗体を採取するには、抗体一般を精製するための斯界における慣用の方法が用いられる。個々の方法としては、例えば、塩析、透析、濾過、濃縮、遠心分離、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ゲル電気泳動及び等電点電気泳動が挙げられ、これらは必要に応じて組合せて適用される。精製したモノクローナル抗体は、その後、濃縮・乾燥し、用途に応じて液状又は固状とする。
【0035】
本発明のモノクローナル抗体は、イムノアフィニティークロマトグラフィーによる本発明のポリペプチドの精製に極めて有用である。即ち、本発明のモノクローナル抗体を、本発明のポリペプチドとそれ以外の夾雑蛋白質を始めとする夾雑物質との混合物に接触させて、当該モノクローナル抗体に本発明のポリペプチドのみを吸着させる工程と、吸着した本発明のポリペプチドを当該モノクローナル抗体から脱着させる工程を含んでなる。これら両工程は、通常、水性媒体中で行なう。当該モノクローナル抗体は、通常、ゲル状の水不溶性担体に固定化した状態で用いられ、その水不溶性担体を円筒状のカラムに充填し、これに、例えば、形質転換体の培養液又はそれらの粗精製品を通液すると、実質的に本発明のポリペプチドのみが水不溶性担体に固定化した当該モノクローナル抗体に吸着する。吸着した本発明のポリペプチドは、当該モノクローナル抗体周囲の水素イオン濃度を変えることにより脱着させることができる。例えば、当該モノクローナル抗体がIgGのクラスに属する場合は、酸性側のpH、通常、pH2乃至3で、又、IgMのクラスに属する場合は、アルカリ側のpH、通常、pH10乃至11で脱着・溶出させる。本発明のモノクローナル抗体を用いる精製方法によるときには、本発明のポリペプチドを最少限の労力と時間で高度に精製できる。
【0036】
本発明のモノクローナル抗体は、本発明のポリペプチドの検出を必要とする諸分野にも広範な用途を有する。すなわち、本発明のモノクローナル抗体にラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイなどの標識イムノアッセイを適用するときには、被検試料中の本発明のポリペプチドの検出及び定量を迅速且つ正確に分析することができる。斯かる検出及び分析において、本発明のモノクローナル抗体は、例えば、放射性物質、酵素及び/又は蛍光物質により標識して用いられる。本発明のモノクローナル抗体は、本発明のポリペプチドに特異的に反応し、免疫学的に反応するので、斯かる免疫反応を前記標識物質を指標に検出すれば、被検試料中の極微量の本発明のポリペプチドを高精度で検出することができる。殊に、標識イムノアッセイは、バイオアッセイと比較して、一度に数多くの被検試料を分析できる上、分析に要する時間と労力が低減でき、しかも、分析が高精度であるという特徴がある。したがって、本発明による検出方法は、本発明のポリペプチドを製造する際の工程管理や、得られる製品の品質管理に極めて有用である。なお、本発明はモノクローナル抗体の標識や標識アッセイそのものに係わるものではないので詳細な説明は省くが、例えば、ピー・ティッセン著、石川栄治訳『エンザイムイムノアッセイ』、1989年、東京化学同人発行、196乃至348頁などには、モノクローナル抗体の標識や標識アッセイ方法について詳述されている。
【0037】
次に、本発明の医薬組成物について説明する。本発明のポリペプチドは、哺乳動物の免疫系に深く関与しているNK活性を抑制する作用を有していることから、それ単独、又は、公知のNK活性抑制剤、免疫調節剤、生理活性物質等と併用して、更には、必要に応じて、医薬的に許容される担体と併用して、NK活性抑制剤としての医薬組成物とすることができる。当該医薬組成物に配合する本発明のポリペプチドの投与量は、通常、ヒト成人1日当たり0.001〜100μg、好ましくは、0.01〜10μg、より好ましくは、0.1〜1μgの範囲から選択される。当該医薬組成物の剤形としては、液剤、粉剤、錠剤、顆粒剤、ペースト剤等の形態を例示でき、それらは、単位投与形態とするのが望ましい。又、本発明の抗体を含んでなる医薬組成物とは、当該抗体が本発明のポリペプチドと免疫学的に反応する形態にある組成物全般を意味する。
【0038】
ところで、本発明ポリペプチドをコードするDNAは、いわゆる、「遺伝子療法」にも適用することができる。すなわち、通常の遺伝子療法に於いて、本発明のDNAを、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスなどのウイルス由来のベクターに挿入するか、カチオニックポリマーや膜融合型リポソームなどのリポソームに包埋した状態で、NK活性を抑制する必要性のある疾患に罹患した患者に直接注入するか、あるいは、前記患者からリンパ球を採取し、採取したリンパ球に生体外で導入した後、その患者に自家移植することができる。又、養子免疫遺伝子療法に於いては、効果細胞に本発明のDNAを通常の遺伝子療法の場合と同様にして導入し、前記患者や免疫疾患等に罹患した患者を治療することも可能である。
【0039】
以下、本発明を実験に基づいてより詳細に説明する。
【0040】
【実験1】
<HPB−MLT細胞由来mRNAの取得>
ヒトT細胞であるHPB−MLT細胞(FERM BP−2430)を、RPMI1640培地を用いて培養して湿重量で1.1gの細胞を採取した。これを5Mグアニジンイソチオシアネート、10mM EDTA、50mMトリス塩酸緩衝液(pH7.0)、及び8%(w/v)β−メルカプトエタノールからなる混液(pH7.0)7.7mlに浸し、ホモゲナイザーで細胞を破砕し、4℃で15時間静置した。次に、常法に従って、35ml容遠心チューブに、5.7M塩化セシウムを含む100mM EDTA(pH7.5)を1ml注入し、その液面に前記細胞破砕物を10ml重層し、この状態で20℃、25,000rpmの条件で20時間超遠心分離してRNA画分を採取した。このRNA画分を15ml容遠心チューブにとり、等量のクロロホルム/イソブタノール混液(体積比で4:1)を加え、5分間振盪し、4℃、15,000rpmの条件で10分間遠心分離した後、水層部を採取し、これに2.5倍容のエタノールを加え、−20℃で2時間静置して全RNAを沈殿させた。この沈殿物を採取し、75%(v/v)エタノール水溶液で洗浄後、滅菌蒸留水0.5mlに溶解して全RNAを取得した。これをオリゴ結合ビーズ『Oligotex−dT30<super>』(日本合成ゴム株式会社製)を用いて精製して得られたHPB−MLT細胞由来mRNAを下記の実験に供した。
【0041】
【実験2】
<ポリペプチドのcDNAの取得>
【実験2−1】
<ポリペプチドの部分cDNAの取得>
上記で得たmRNA1μgを0.5ml容チューブに入れ、サーマルサイクラー(商品名『DNAサーマルサイクラー480』、パーキンエルマー社製)を用いて、70℃で5分間加熱した後、4℃に急冷した。次に10×PCR反応液を2μl、25mM塩化マグネシウムを2μl、100mMジチオトレイトールを2μl、2.5mM dNTPsを1μl、0.2μg/μlのランダムヘキサマーを1μl、35U/μlのリボヌクレアーゼインヒビター(商品名『RNasin』、プロメガ社製)を0.5μl、200U/μlの逆転写酵素(商品名『Avian Myeloblastosis Virus(AMV)由来逆転写酵素』、日本合成ゴム社製)を1μl加え、滅菌蒸留水で全量を20μlとした。この混合物を25℃で10分間、42℃で30分間、99℃で5分間インキュベートして逆転写酵素を反応させ、第1ストランドcDNAを含む水溶液を得た。次いで、ジェンバンク・データベースより、ヒトIL−1α(Accession No.E01146)、ヒトIL−1β(Accession No.E00619)およびヒトIL−1Ra(Accession No.M55646)のcDNA塩基配列を入手し、ホモロジー検索をコンピュータソフト(GENETYX−MAC Ver.9.0)を用いて行ない、三者に比較的保存された塩基配列領域について、センスプライマー1(s1;5′−(C/G)(T/A)CTACAG(C/T)TG(G/C/A/T)(A/C)(G/C)A−3′)とアンチセンスプライマー1(a1;5′−(G/T)(C/G)GGC(A/C)GAC(T/G)C(A/C)(A/T)(A/G)−3′)を設計し、PCR増幅させた。ストラタジーン社製の10×Pfu反応液5μl、2.5U/mlのPfuポリメラーゼ1μl、2.5mMdNTPs(100ng/μl)を4μl、s1プライマーを1μl、及び100ng/μlのa1プライマー1μl加え、滅菌蒸留水で全量を50μlとした。反応は、94℃で45秒間、42℃で45秒間、72℃で210秒間の一連の処理を30サイクル行った。得られたPCR産物を2.0%アガロースゲルにて電気泳動したところ、約100bp付近にバンドが検出された。この付近の増幅断片をゲルから切り出し、抽出用キット(『QIAEX II Gel Extraction Kit』、キアゲン社製)を用いて精製を行った。即ち、1.5ml容チューブに目的のゲル断片を入れた後、前記抽出用キットに付属されている『QX1』溶液を300μl加え、次いで前記抽出用キットに付属されているDNA吸着用ゲル『QIAEX II』を10μl加え、50℃にて10分間インキュベートした。13,000rpmで30秒間遠心分離した後、上清を除去し、沈殿物にQX1溶液を500μl加えて懸濁した後、13,000rpmの条件で30秒間遠心処理して沈殿を洗浄した。その後、得られた沈澱物にPE溶液を500μl加え、同様の遠心処理条件で2回洗浄した後、上清除去し、15分間室温にて乾燥した。最後に1mM EDTAを含む10mMトリス塩酸緩衝溶液(TE緩衝液、pH8.0)を20μl加え、室温で5分間静置してDNAを抽出した後、13,000rpmの条件で30秒間遠心処理して、目的のDNA断片を得た。
【0042】
次に、クローニングキット(商品名『pCR−Script SK(+) Cloning Kit』、ストラタジーン社製)を用いて、DNA断片−1のクローニングを行った。0.5ml容チューブに10ng/μlのpCR−Script SK(+)クローニングベクターを1μl、pCR−Script 10×反応溶液を1μl、10mM rATPを0.5μl、5U/μlのDNA断片−1を4μl、5U/μlのSrfI制限酵素を1μl、4U/μlのT4DNAリガーゼを1μl加え、更に滅菌蒸留水を加えて全量を10μlとした。これを室温にて1時間反応させてライゲーションを行った。次いで65℃にて10分間インキュベートして反応を停止させた後、4℃に冷却した。その後、常法に従い下記の方法で形質転換を行った。大腸菌株(商品名『EpicurianColi XL1−Blue MRF′ Kan supercompetent cells』、ストラタジーン社製)を予め氷冷しておいたファルコン2059ポリプロピレンチューブ(ファルコン社製)に40μl入れ、1.44Mβ−メルカプトエタノールを0.7μl加え、10分間氷中にて冷却した。これに前記ライゲーション産物を2μl加えて穏やかに撹拌した後、30分間氷中に静置した。次いで、42℃にて45秒間加熱後、SOC培地を450μl加え、37℃で1時間振盪培養した。その後、発色指示薬としてのX−gal(5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトピラノシド)0.4mg、100mMイソプロピルチオガラクトシドを40μl含むLB培地(1%塩化ナトリウム、1%トリプトン、0.5%酵母エキス、2%アガーを含む)にこの培養産物を植菌し、37℃にて16時間培養した。s1、a1プライマーを用いたコロニーPCRによって、目的とする100bpのバンドが出されたコロニーを、LB培地に接種し、37℃で16時間で振盪培養した。得られた菌体培養液2mlを用いて、常法に従って下記の方法でプラスミドを調製した。即ち、菌体を3,000rpmの条件で5分間遠心分離して回収した後、10ng/μlのリゾチウムを100μl入れ、室温にて5分間インキュベートし、0.2Mドデシル硫酸ナトリウム200μlを加えて混合し、5分間氷中で冷却した後、5M酢酸カリウムを150μl加え、5分間氷中にて冷却した。15,000rpmの条件で5分間遠心処理した後、上清400μlを1.5ml容チューブに取り、これに当量のフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(体積比で25:24:1)を加え、5分間激しく振盪した後、15,000rpmの条件で5分間遠心分離し、タンパク質を除去した。次いで、水層280μlを回収し、常法に従ってエタノール沈殿を行った。その後、RNase(40mg/ml)/TEを60μl加え、37℃にて1時間30分インキュベートした後、20%ポリエチレングリコールを30μl入れ、1.5時間氷中にて静置した。次いで、15,000rpmの条件で30分間遠心分離し、上清を除去した後、沈殿を75%(v/v)冷エタノール水溶液200μlで洗浄し、減圧下で10分間乾燥し、滅菌水に溶解させた。得られたプラスミドにつき、ジデオキシ法により、DNAシーケンサー(商品名『DNAシーケンサー373A』、アプライドバイオシステムズ社製)を用いて塩基配列を解析した結果、配列表における配列番号1に示す本発明のポリペプチドのcDNAの部分塩基配列を暫定的に決定した。その後、完全長の本発明のポリペプチドのcDNAのクローニングを目的として、5′及び3′末端のcDNA塩基配列の取得をRACEキット(商品名『5′/3′RACE Kit』、ロシュダイアグノスティックス社製)を用いて行った。
【0043】
【実験2−2】
<5′RACE法>
アンチセンスプライマー2(a2)として、配列表における配列番号1の塩基配列に於ける第103〜86番目に相当する5′−ATGTTCCAGGAGCCCACC−3′、アンチセンスプライマー3(a3)として、配列表における配列番号1の塩基配列の83〜65番目に相当する5′−AGCCCTATAAAAGATGAAG−3′、アンチセンスプライマー4(a4)として、配列表における配列番号1の塩基配列の61〜42番目に相当する5′−CGGCGTGCTGATTCCTTTTG−3′を作出した。先ず、5×cDNA合成溶液(250mMトリス塩酸(pH8.5)、40mM塩化マグネシウム、150mM塩化カリウム、5mMジチオトレイトール)を4μl、2.5mMdNTPsを2μl、a2プライマー(100ng/μl)を1μl、ヒトHPB−MLT細胞mRNAを240ng、AMV(Avian Myeloblastosis Virus)由来逆転写酵素(20U/μl)を1μl加え、DEPC処理水を入れ全量を20μlとした。これを55℃で1時間、65℃で10分間反応させてcDNAを得た。これをスピンカラムを用いて精製した。即ち、合成産物に100μlの反応溶液(3Mグアニジンチオシアネート、10mMトリス塩酸(pH6.6)、5%エタノール)を加え、スピンカラムに前記産物を入れ、15,000rpmで30秒間遠心処理した。次に洗浄溶液(20mM塩化ナトリウム、2mMトリス塩酸(pH7.5)/エタノール)を500μl加え、15,000rpmで30秒間遠心処理して洗浄し、再度同洗浄溶液200μlを加えて同様の操作を繰り返した。次いで、洗浄処理して得られた沈殿物に、10mMトリス塩酸(pH8.5)及び1mMEDTAを含む抽出溶液を50μl加え、15,000rpmで30秒間遠心分離してcDNA精製物を得た。精製物19μlに、100mMトリス塩酸(pH8.3)、15mM塩化マグネシウム、及び500mM塩化カリウムを含む10×反応液を2.5μl、2mMdATPを2.5μl加えて、全量を24μlとした。これを94℃で3分間加熱後、直ちに急冷し、ターミナルトランスフェラーゼ(10U/μl)を1μl加え、37℃で30分間、72℃で10分間保温した。次に合成産物5μl、37.5μM オリゴdT−アンカープライマー(5′−GACCACGCGTATCGATGTCGACTTTTTTTTTTTTTTTTV−3′、VはA、C又はGを示す)を1μl、a3プライマー(100ng/μl)を1μl、25mM dNTPsを1μl、Pfuポリメラーゼ(2.5U/ml)を1μl、10×Pfu反応液を5μl加えて滅菌蒸留水で50μlとし、94℃で45秒間、55℃で45秒間、72℃で2分間処理する一連の処理を35サイクル行って合成産物を増幅させた。更に増幅産物を1μl採取し、同様の条件で増幅を行った(但し、再増幅時には、12.5μM PCRアンカープライマー(5′−GACCACGCGTATCGATGTCGAC−3′)と90ng/μlのa4プライマーを使用)。PCR産物を1.2%アガロースゲルを用いて電気泳動を行ったところ、約550bpのバンドが検出された。その後、検出された断片を、前述と同様に抽出用キット(商品名『QIAEX II Gel Extraction Kit』、キアゲン社製)を用いて精製を行い、クローニングキット(『pCR−Script SK(+) Cloning Kit』、ストラタジーン社製)を用いてクローニングを行った。次いで、常法に従い大腸菌株(商品名『Epicurian Coli XL1−Blue MRF′ Kansupercompetent cells』、ストラタジーン社製)を用いて形質転換を行った。得られた形質転換体を栄養培地中で培養してコロニーを形成させ、コロニーPCRにより目的のバンドが検出されたコロニーを選択してLB−液体培地に植菌し、37℃で16時間で振盪培養した。菌体培養液2mlから、常法に従ってプラスミドを調製し、得られたプラスミド『pCRILL−5』をジデオキシ法により、DNAシーケンサーを用いて塩基配列解析を行った結果、配列表における配列番号2に示す5′末端側cDNA部分に約575bp相当の塩基配列が得られた。
【0044】
【実験2−3】
<3′RACE法>
センスプライマー2(s2)として、配列表における配列番号1の塩基配列の24〜42番目に相当する5′−CTGATGAAGCTGGCTGCC−3′を作出した。次いで、5×cDNA合成溶液を4μl、2.5mM dNTPsを2μl、37.5μMオリゴdT−アンカープライマーを1μl、HPB−MLT細胞mRNAを540ng、20U/μlのAMV由来逆転写酵素を1μl加え、DEPC処理水で全量を20μlとし、サーマルサイクラーを用いて55℃で60分間、65℃で10分間反応させてDNA産物を得、このDNA産物を1μl、12.5μM PCRアンカープライマー(5′−GACCACGCGTATCGATGTCGAC−3′)を1μl、s2プライマー(100ng/μl)を1μl、25mM dNTPsを1μl、2.5U/μlのPfuポリメラーゼを1μl、10×Pfu反応液5μlに、滅菌蒸留水を加えて全量を50μlとした。これを94℃で45秒間、55℃で45秒間、72℃で120秒間処理する一連の処理を35サイクル行って前記DNA産物を増幅させた。増幅産物を1.2%アガロースゲルを用いて電気泳動したところ、約320bpのバンドが検出された。その後、検出されたバンドを切除し、前述と同様に、抽出用キット(『QIAEX II Gel Extraction Kit』、キアゲン社製)を用いて精製し、続いて常法に従って、大腸菌株(『Epicurian Coli XL1−Blue MRF′ Kan supercompetent cells』、ストラタジーン社製)を用いて形質転換した。得られた形質転換体を栄養培地中で培養してコロニーを形成させ、コロニーPCRによって、目的のバンドが検出されたコロニーを選択してLB−液体培地に植菌し、37℃で16時間で振盪培養した。常法に従って得られたプラスミド『pCRILL−3』を、ジデオキシ法により塩基配列を解析した。その結果、本発明のポリペプチドの3′末端側cDNA部分の塩基配列として、配列表における配列番号3に示す248bpの塩基配列が得られた。
【0045】
【実験2−4】
<ポリペプチドのcDNAの取得>
実験2−2及び実験2−3で得られた塩基配列を基に、本発明のポリペプチドcDNAの5′末端側のセンスプライマーs4(5′−GAGAACTGAAGGCAAACAG−3′)及び3′末端側のアンチセンスプライマーa5(5′−AGTGAGCAGGTTTGGGGTT−3′)を作出し、本発明のポリペプチドの完全長塩基配列についてRT−PCR法にて増幅した。即ち、5×cDNA合成溶液を4μl、2.5mM dNTPsを2μl、37.5μMオリゴdT−アンカープライマーを1μl、HPB−MLT細胞mRNAを540ng、20U/μlのAMV由来逆転写酵素を1μl加えDEPC処理水で20μlとし、サーマルサイクラーを用いて55℃で60分間、65℃で10分間反応させた。得られたcDNA1μlに、100ng/μlの作出したセンスプライマーs4及びアンチセンスプライマーa5をそれぞれ1μl、25mM dNTPsを1μl、2.5U/μlのPfuポリメラーゼを1μl、10×Pfu反応液を5μl加え、更に、滅菌水を加えて50μlとした。これを94℃で45秒間、55℃で45秒間、72℃で120秒間処理する一連の処理を35サイクル行って前記cDNAを増幅させた。増幅産物を1.2%アガロースゲルを用いて電気泳動したところ、約850bpのバンドが検出された。次に、検出された断片を、前述と同様に抽出用キット(商品名『QIAEX II Gel Extraction Kit』、キアゲン社製)を用いて精製し、クローニングキット(商品名『pCR−Script SK(+) Cloning Kit』、ストラタジーン社製)を用いてクローニングし、続いて常法に従って大腸菌株(商品名『Epicurian Coli XL1−Blue MRF′ Kansupercompetent cells』、ストラタジーン社製)を形質転換した。得られた形質転換体を栄養培地中で培養してコロニーを形成させ、コロニーPCRによって、目的のバンドが検出されたコロニーを選択してLB−液体培地に植菌し、37℃で16時間振盪培養した。菌体培養液2mlから、常法に従ってプラスミドを調製し、得られたプラスミドをプラスミド『pCRILL−full』と命名した。このプラスミド『pCRILL−full』の塩基配列をジデオキシ法により、DNAシーケンサーを用いて解析し、配列表における配列番号4に示す本発明のポリペプチドcDNAを決定した。又、配列表における配列番号4に対応する本発明のポリペプチドのアミノ酸配列を配列表における配列番号5に示す。
【0046】
【実験3】
<生物活性>
常法に従って、健常人から末梢血を採取し、水溶性非イオン性ポリマー(商品名『ファイコール』、ファルマシア社製)を用いてNK細胞を含む末梢血リンパ球を採取した。採取したNK細胞を含む末梢血リンパ球を、0.1mM β−メルカプトエタノール及び10%牛胎児血清を含むRPMI1640培地を用いて2回洗浄し、5×106個/mlの細胞濃度となるように懸濁した。この細胞懸濁液を96ウェルマイクロプレートに各ウェル当たり100μlずつ分注し、各ウェルに、後述する実施例2で得た本発明のポリペプチド標品を所定濃度含有する溶液を50μl及び上記培地を50μlそれぞれ添加し、37℃で18時間インキュベートした。培養後のNK細胞を含む末梢血リンパ球を回収し、51Cr標識したK−562細胞(ATCC CCL243)と濃度比(NK細胞を含む末梢血リンパ球(エフェクター細胞(E))/K−562細胞(ターゲット細胞(T))(=E/T比)=6.25及び25の割合で混合した後、37℃で4時間培養した。培養後、96ウェルマイクロプレートを2,000rpmの条件で5分間遠心分離し、上清中の51Crのカウント数を測定することにより、本発明のポリペプチドがNK活性に及ぼす影響を調べた。その結果を図1に示す。
【0047】
図1の結果から明らかなように、本発明のポリペプチドが添加されたNK細胞を含む末梢血リンパ球は、本発明のポリペプチド無添加のNK細胞を含む末梢血リンパ球と比べ、上清中の51Crのカウント数が著しく低下し、このことは、本発明のポリペプチドが、NK細胞活性を抑制することを示すものである。
【0048】
【実施例1】
<組換えDNA及び形質転換体の調製>
本発明のポリペプチドとして、配列表における配列番号5に示す本発明のポリペプチドのcDNAがコードするアミノ酸配列の52番目のバリン残基からC−末端アミノ酸残基であるアスパラギン酸残基までの167個のアミノ酸配列からなるポリペプチドを大腸菌を用いる系で発現させる目的で、下記の組換えDNAを調製した。即ち、0.5ml容反応チューブに10×Pfu反応液(ストラタジーン社製)を10μl、Pfuポリメラーゼ(2.5U/ml)を1μl、25mM dNTPsを1μl、上記で得られたプラスミドpCRILL−fullを1ng、5′−ACTGCATATGGTGAAGAACTTAAACCCG−3′(無作為な4塩基に引き続き、NdeIサイト及び配列表における配列番号4に於ける274番目から291番目の塩基配列に相当)及び5′−ATGCGGATCCTTACTAATCGCTGACCTC−3′(無作為な4塩基に引き続き、BamHIサイトと終始コドン及び配列表における配列番号4に於ける777番目から763番目の塩基配列に相当)で表わされる塩基配列のセンスプライマー及びアンチセンスプライマーをそれぞれ適量加え、滅菌蒸留水で50μlとした。その後、常法により、得られた混合物を94℃で0.5分間、60℃で1分間、72℃で1分間、この順序でインキュベートする一連の処理を30サイクル繰り返してPCR反応させた。得られたPCR産物を、常法に従って、制限酵素NdeIおよびBamHIにて37℃で2時間消化後、70℃で15分間熱処理し、両制限酵素を失活させた。一方、プラスミド(商品名『pET−3a』、ノバジェン社製)も同様に制限酵素NdeIおよびBamHIにて37℃で2時間消化後、70℃で15分間熱処理を行なった。制限酵素消化後のベクター『pET−3a』100ngと同様の制限酵素処理後のPCR産物200ngとをライゲーションキット(商品名『DNA Ligation Kit Ver.2』、宝酒造株式会社製)を用いてライゲーション反応を行ない、発現用プラスミドpETILL−EXを構築した。pETILL−EXを常法に従って、ノバジェン製大腸菌『BL21(DE3)pLysS』を形質転換して形質転換体を得た。この形質転換体を形質転換体『ILL−EX−1』と命名した。尚、本実験で用いた、配列表における配列番号5に示す本発明のポリペプチドのcDNAがコードするアミノ酸配列の52番目のバリン残基からC−末端アミノ酸残基であるアスパラギン酸残基までの167個のアミノ酸配列は、IL−1α、IL−1β、IL−1Ra、及びIL−1Raβとの相同性は図2に示すように20%程度に過ぎなかった。図2中、アルファベットはアミノ酸の1文字略記号を示す。
【0049】
【実施例2】
<ポリペプチドの調製>
実施例1で得た形質転換体『ILL−EX−1』を、アンピシリン50μg/mlとクロラムフェニコール20μg/mlを含むLB培地(pH7.2)5mlに接種し、37℃で18時間培養した後、培養物から菌体液1mlを採取し、上記2種類の抗生物質を含むLB培地100mlに接種した。その後、37℃で4時間培養後、100mM IPTG(イソプロピル−β−D−ガラクトピラノシド)1mlを添加し、2時間培養した。培養後、10,000rpmで15分間遠心分離して大腸菌を回収した。このペースト状の大腸菌に、0.5M尿素、0.1%β−メルカプトエタノールを含む10mMリン酸緩衝液(pH6.8)10mlを添加し、室温で3時間攪拌した。攪拌後、10,000rpmの条件で20分間遠心し、菌体を回収した。この菌体に、8M尿素、0.1%β−メルカプトエタノールを含む10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.8)10mlを添加し、室温で18時間攪拌した。攪拌後、10,000rpmの条件で20分間遠心分離し、上清を回収した。回収した上清を0.5M尿素、0.1%β−メルカプトエタノールを含む10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.8)1Lに対して4℃にて18時間透析を行い、10,000rpmの条件で20分間遠心分離し、上清を回収した。この上清をクロマトグラフィー用ゲル(商品名『Superdex75』、ファルマシア社製)を用いるゲル濾過した。この際、0.1%β−メルカプトエタノールを含むPBSを溶出液として用い、分子量約20kDaの画分を回収することにより、精製した本発明のポリペプチド標品を得た。
【0050】
【実施例3】
〈ハイブリドーマ及びモノクローナル抗体の調製〉
【実施例3−1】
〈ハイブリドーマの調製〉
10週齢BALB/cマウスの腹腔内に実施例2の方法により得た精製した本発明のポリペプチドを完全フロイントアジュバントともに20μg/匹の割合で注射により接種した。この接種を2週間おきに2回、4週間に亘ってマウスに接種し、最後の接種から1週間後に更に接種し、その3日後に脾臓を摘出し、摘出した脾臓を生理食塩水中に分散して懸濁状の脾細胞を得た。
【0051】
この脾細胞とマウス骨髄腫由来のSP2/0−Ag14細胞(ATCC CRL1581)を、37℃に予温しておいた血清無含有のRPMI1640培地(pH7.2)にそれぞれ細胞密度3×104個/ml及び1×104個/mlになるように浮遊させ、遠心分離後、沈澱部を採取した。この沈澱に平均分子量1,500ダルトンの50%(w/v)ポリエチレングリコールを含む血清無含有のRPMI1640培地(pH7.2)1mlを1分間かけて滴々加え、37℃で1分間インキュベートした後、全量が50mlになるまで血清無含有のRPMI1640培地(pH7.2)を滴々加え、遠心分離後、沈澱部を採取した。この沈澱をHAT培地に浮遊させ、96ウェルマイクロプレートに200μl/ウェルずつ分注し、37℃で1週間インキュベートしてハイブリドーマを選択した。
【0052】
各ウェルにおける培養上清中に分泌された抗体につき、実施例2の方法により得た精製ポリペプチドとの反応性をエンザイムイムノアッセイにより調べ、前記精製ポリペプチドに反応性を示す抗体を産生するハイブリドーマを選別した。引続き、このハイブリドーマに常法にしたがって限界希釈を繰返し適用し、本発明のモノクローナル抗体を産生し得るハイブリドーマクローンを得た。
【0053】
【実施例3−2】
〈モノクローナル抗体の調製〉
実施例3−1で得た本発明のモノクローナル抗体を産生し得るハイブリドーマクローンを栄養培地中で培養し、培養物を精製したところ、BALB/cマウス1匹当たり、本発明のポリペプチドと免疫学的に反応するモノクローナル抗体約5mgを得た。
【0054】
【実施例4】
<エンザイムイムノアッセイによるポリペプチドの検出〉
常法にしたがって、実施例2の方法により得た本発明のポリペプチドでウサギを免疫感作した後、血液を採取し、本発明のポリペプチドと免疫学的に反応する抗体を精製し、単離した。当該抗体をPBSに20μg/mlになるように溶解し、96ウェルマイクロプレートに100μl/ウェルずつ分注した。マイクロプレートを室温下で3時間インキュベートした後、当該抗体溶液を除き、1%(w/v)ウシ血清アルブミンを含むPBSを200μl/ウェルずつ加え、4℃で一晩静置した。
【0055】
マイクロプレートからPBSを除き、0.05%(v/v)ツイーン20を含むPBSで洗浄後、実施例2の方法により得た本発明のポリペプチドを0.5%(w/v)ウシ血清アルブミンを含むPBSにより適宜濃度に希釈して100μl/ウェルずつ加え、振盪下、室温下で2時間反応させた。0.05%(v/v)ツイーン20を含むPBSで洗浄し、予めビオチン標識した本発明のポリペプチドと免疫学的に反応する抗体を100μl/ウェルずつ加え、振盪しながら室温下で2時間反応させ、0.05%(v/v)ツイーン20を含むPBSで洗浄した後、西洋ワサビパーオキシダーゼとストレプトアビジンとの複合体を100μl/ウェルずつ加え、振盪しながら室温下でさらに2時間反応させた。0.05%(v/v)ツイーン20を含むPBSで洗浄後、精製ポリペプチドに結合した西洋ワサビパーオキシダーゼの活性をo−フェニレンジアミンを基質に波長492nmにおける吸光度として測定した。本検出方法によれば、好感度で本発明のポリペプチドを精度良く検出し得る。
【0056】
【発明の効果】
上記したように、本発明は、配列表における配列番号5、又は、当該アミノ酸配列と少なくとも75%の相同性を有し、その中間部分アミノ酸配列として配列表における配列番号7に示すアミノ酸配列を含んでなるアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び、配列表における配列番号4に示す塩基配列、配列表における配列番号4に示す塩基配列と少なくとも75%の相同性を有する塩基配列を有し、その5´末端側に配列表における配列番号8に示す塩基配列を含んでなる塩基配列、又は、それら塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNA、更には、本発明のポリペプチドと免疫学的に反応する抗体、及び本発明のポリペプチドを検出する方法を提供する発明である。本発明によれば、哺乳動物の免疫系に関する研究、更には、NK活性抑制剤/調節剤としての医薬品開発にも貢献し得る発明である。
【0057】
本発明は、斯くも顕著な作用効果を発揮するものであり、斯界に貢献すること誠に多大な意義のある発明であると云える。
【0058】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明のポリペプチドがNK活性に及ぼす影響を示す図である。
【図2】本発明の実施例2のポリペプチド、IL−1α、IL−1β、IL−1Ra及びIL−1Raβとの相同性を示す図である。
Claims (1)
- 配列表における配列番号5に示すアミノ酸配列における52番目のバリン残基から218番目のアスパラギン酸残基までのアミノ酸配列からなるポリペプチドを有効成分とするNK活性抑制剤としての医薬組成物。
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