JPH11511650A - 改変されたミエリンタンパク質分子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 多発性硬化症の臨床的評価、診断および治療のための組成物および方法を提供する。本発明の組成物は、ヒトプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）および／またはヒトミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）に関連する分子であり、核酸およびポリペプチドを包含する。本発明の核酸分子は、改変されたＰＬＰポリペプチドおよび改変されたＭＢＰポリペプチドの生産に有用であり、このようなポリペプチドは、ＰＬＰおよびＭＢＰエピトープに対する応答性についてＴ細胞をアッセイすることにおいて有用である。本発明のポリペプチドは、多発性硬化症を治療する手段としてアネルギーおよびアポトーシスを含むＴ細胞応答を誘導することにより作用する治療剤としても有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 改変されたミエリンタンパク質分子 発明の分野 本発明は、自己免疫疾患の治療に関する。特に、本発明は、多発性硬化症（Ｍ Ｓ）の診断および治療を容易にする組成物および方法を提供する。さらに具体的 には、工学処理されたヒトミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）分子、すなわち ＭＢＰポリペプチド、およびＭＢＰポリペプチドをコードする核酸分子、ならび にプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）分子、すなわちＰＬＰ配列を含むポリペ プチド、およびそのようなポリペプチドをコードする核酸分子を提供し、また、 多発性硬化症の診断、臨床的評価および治療的処置のためのこのようなポリペプ チドの使用方法も提供する。 本発明の背景 このセクションにおける論述は、本発明に対して「従来技術」となる資格を有 する対象に限らない。したがって、この論述において特定の対象物が包含されて いるという理由により、このような従来技術の水準の認容が解釈され、または引 用されるものではなく、そのような包含の理由により、本発明者らの興味に対す る宣言が解釈されるものではない。 自己免疫疾患 自己免疫疾患は、ある種の自己抗原に対する寛容性の喪失によりもたらされ、 これらの抗原に対する免疫系による不適切な攻撃を生じる。免疫系の抗体媒介性 （体液性）および細胞性の側面の両方において、免疫自己寛容性を維持するため に、多数の機構が通常は機能している。自己免疫疾患が起こるのは、これらの機 構が誤って働く場合である。 このような誤って指示された免疫系の活性により生じる疾患には、米国におい てだけでも一千万人を超える患者が罹っている。これらの疾患の症状ではなく原 因を治療する治療法が長い間求められてきた。自己免疫活性の有益な減少を提供 する薬剤が見出されている一方で、このような治療は、一般に、正常な免疫機能 をも低めるという危険な望ましくない影響を有するので、最適なものとは考えら れていない。 多発性硬化症 多発性硬化症（ＭＳ）は、進行性の神経退行性自己免疫障害であり、約３５万 人の米国人が罹患している（例えばＨauser，1994を参照されたい）。女性はこ の疾患を発病する可能性が男性の２倍である。ＭＳは、通常、年齢１５〜５０歳 の患者、最も一般的には２０〜４０歳の若い女性が罹る。ＭＳの名前は、罹患し た個体の中枢神経系（ＣＮＳ）の肉眼（macroscopic）検査で見られる複数の傷 ついた（硬化した）退行領域に由来する。多発性硬化症に付随するこの退行は、 脱髄、慢性的炎症、および脳、視神経および脊髄の罹患領域のグリオーシス（瘢 痕）を含む。 ＭＳは、疾患の進行の異なるタイプおよび段階により特徴づけられる。悪化と 寛解の期間を示す場合、患者は再発寛解（relapsing and remitting）ＭＳを有 すると診断される。急速進行性または慢性的進行性ＭＳは、疾患の進行のペース に応じて診断される。これらの段階は、通常、個々の発作からの回復の程度が減 少し、悪化の期間のあいだに臨床的に安定な期間がある、疾患の経過の後期に起 こる。不活性ＭＳは、典型的には疾患の進行の後期に起こり、種々の程度の固定 した神経学的欠陥を特徴とする。 ＭＳは、常に患者を衰弱させ、しばしば麻痺および死亡に至らせる。ＭＳの当 初の発病の引き金となる因子は未知のままであるが、ＭＳの病理学はミエリン鞘 に対する異常な免疫応答により生じるという証拠は説得力がある。この免疫応答 は、ある種の白血球の自己免疫作用に関与する。神経抗原特異的Ｔ細胞はこの点 において特に重要であると信じられている。 病理学的には、ＭＳは、慢性的な炎症、脱髄、および白質のグリオーシスを特 徴とする。ＭＳの古典的な病巣は、プラークと呼ばれ、周囲の白質から容易に区 別されるはっきり画定された灰色またはピンクの領域である。（白質の着色は、 この組織におけるミエリンの高濃度によるものである。）急性ＭＳ病巣は、単核 球、主にＴ細胞（ヘルパーおよび細胞傷害性の両方）およびマクロファージによ る組織浸潤を伴う脱髄を特徴とし、Ｂ細胞および形質細胞は稀にしか存在しない 。これらの炎症性浸潤物は、この疾患に特徴的な脱髄を媒介するように見える。 活性化されたＴ細胞はマクロファージの浸潤および活性化を促進するサイトカイ ンを放出するため、Ｔ細胞はＭＳにおける病理的自己免疫発作の一次媒介因子と 考 えられる。Ｔ細胞およびミエリンのより詳細な論述は、「Ｔ細胞生理学」、「Ｔ 細胞および自己免疫病因論」および「ＭＳにおけるＴ細胞標的特定自己抗原」と 題して後記する。 現在のＭＳの治療はさまざまである。疾患の重症度および処置に対する応答に 応じて、薬物療法の多様な選択枝が利用可能である。ＭＳの治療に用いられる薬 物としては、プレドニゾンおよびメチルプレドニゾンのようなステロイド、副腎 皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）のようなホルモン、アザチオプリンのような代謝 拮抗物質、シクロホスファミドのようなアルキル化剤、およびシクロスポリンの ようなＴ細胞阻害剤が挙げられる。これらの薬剤はすべて典型的にいくらかのレ ベルの全身的免疫抑制を生じ、患者を感染しやすい状態に置くので、これらのい ずれの薬剤の投与も危険である。患者は、このような薬剤による処置を受けると 、吐き気、脱毛、高血圧および腎不全などの副作用を経験する可能性もある。さ らに、これらの薬剤のいくつかは発ガン性である。 ＭＳを治療する新規なアプローチとしては、インターフェロンβ療法が挙げら れ、これは、ＭＳ発作の頻度を低めることができ、疾患の進行を遅らせる可能性 もある。別の新規なアプローチとしては、以下に述べるようなＭＳ自己免疫応答 に関与する抗原の投与が挙げられる。 ＭＳの診断 ＭＳは、典型的には診療歴および物理的検査に基づいて診断される。ＭＳに特 有の臨床的徴候または診断試験はない。再発および寛解疾患の症状はＭＳの診断 の可能性を上昇させるものではあるが、ＭＳに一般に付随する単一の初期症状を 有する患者の診断は、断定的であり得ない。各々が２４時間もしくは少なくとも １ヵ月離れた２以上の悪化の症状、または少なくとも６ヵ月にわたる持続する徴 候および症状の遅い段階的な進行は、ＭＳを強く示唆するものと考えられる。Ｃ ＮＳ白質の２以上の領域における関与を示すＭＲＩによる知見および全身的疾患 の証拠もまた、ＭＳの表示である。 現在、この疾患の診断を確認し、その進行を評価するために種々の実験室試験 が行われている。このような試験としては、ＭＳ病理学の化学的および細胞の徴 候についてのヒト脳脊髄液（ＣＳＦ）および血液の分析が挙げられる。 ＭＳに付随するＣＳＦ異常は、単核球細胞増加および自己反応性（典型的には ミエリン反応性）Ｔ細胞の存在、総Ｉｇレベルの上昇、およびオリゴクローナル Ｉｇの存在（典型的には２以上のオリゴクローナルバンドとして見られる）から なる。約８０％の患者において、ＣＳＦのＩｇＧ含量は、正常濃度の総タンパク 質の存在下で増加する。これは、ＣＮＳにおけるＩｇＧの選択的産生によって生 じる。 ＣＳＦ ＩｇＧのオリゴクローナルバンド形成は、アガロースゲル電気泳動技 術によって検出される。ＭＳ患者の７５〜９０％において２以上のオリゴクロー ナルバンドが見出される。オリゴクローナルバンド形成の存在は、ＭＳにおける 総ＩｇＧレベルの上昇と相関する。ＭＳのＣＳＦにおける他のＩｇ異常としては 、遊離のカッパまたはラムダ軽鎖、およびＩｇＡを含む他のＩｇアイソタイプの レベルの上昇が挙げられる。 ミエリンの崩壊に由来する代謝産物もまたＣＳＦ中に検出される。ＰＬＰまた はそのフラグメントの上昇したレベルは、例えばラジオイムノアッセイにより、 ＭＳ患者および他の神経疾患を有するいくらかの患者の両方において検出されう る。 ＣＳＦについて上述した病理学的徴候の多くに加えて、ＭＳ患者の血液は、Ｉ ｇＧ合成の上昇したレベル、多核白血球、減少した血清Ｂ₁₂レベル、上昇した赤 血球沈降率、および自己抗体または自己反応性Ｔ細胞の存在を示しうる。後述す るように、「反応性Ｔ細胞インデックス」はＭＳの臨床的経過を監視するための 特に有用な細胞の知見である。 ＭＳ疾患のこれらの種々の指標は臨床的に有用である一方、（ＭＲＩのような 高価な画像（イメージ）技術に対して）血液または脳脊髄液試験のような、比較 的低価格で容易に定量可能な試験を用いた、ＭＳ患者における自己免疫活性の経 過および程度を追跡する他の手段が必要とされている。 Ｔ細胞、抗原提示細胞、およびＴ細胞エピトープ 上述したように、ＭＳ病因論は白血球、最も重要にはＴ細胞の不適切な作用に より媒介されると信じられている。Ｔ細胞は、多くの必須の免疫機能を提供する 単核白血球である。ヒトの自己免疫疾患におけるＴ細胞の重要性は過去１０年間 の間にますます認識されてきている。全身的な免疫抑制をもたらす処理を用いる 研究により、ＣＤ４⁺またはヘルパーＴ細胞として知られるＴ細胞のサブセット について、タンパク質またはペプチド抗原に対するすべての免疫応答（細胞性お よび体液性の両方）の一次調節因子としての臨床的な役割が定義された。 Ｔ細胞は、直接的および間接的な手段により組織損傷を媒介する。ＣＤ８⁺（ 細胞傷害性）およびＣＤ４⁺（ヘルパー）サブセットの両方のＴ細胞は、種々の 他のタイプの白血球を活性化することにより間接的に組織を損傷させうる多様な 炎症性サイトカインを分泌する。このようなＴ細胞効果の例としては、抗体分泌 Ｂ細胞の活性化（体液性免疫活性の刺激）およびマクロファージの活性化が挙げ られ、これらは加水分解酵素、反応性酸素種およびさらなる前炎症性サイトカイ ンを放出することにより急性の組織損傷および炎症を引き起こしうる。これらの Ｔ細胞活性の間接的な効果に加えて、標的抗原を提示する細胞を攻撃するＣＤ８⁺ 細胞傷害性Ｔ細胞により、直接的な組織損傷が媒介されうる。 Ｔ細胞の生理学の１つの独特の側面は、その細胞表面上のＴ細胞レセプター（ ＴＣＲ）と呼ばれる膜結合性の抗体様結合構造の存在である。抗体のように、Ｔ ＣＲは特定の抗原に高い特異性で結合する。非常に多くの細胞クローンとして発 生し、各クローンが独特の特異性を有する抗体を産生する抗体産生細胞のように 、Ｔ細胞は、広大な数の異なるクローンとして発生し、あらゆる特定のＴ細胞ク ローンも、一定の結合特異性を有するＴＣＲの単一のタイプを発現する。自己抗 原に特異的に結合するＴＣＲを有するＴ細胞クローンは、自己免疫疾患の発症に 関与する。 可溶性分子であるのではなく細胞表面に存在することに加えて、ＴＣＲは、抗 原を認識する方法において抗体と異なる。抗体は種々の状況における抗原（例え ばネイティブの、変性した、可溶性の、または膜に結合した抗原）に結合するが 、ＴＣＲは、ほとんどの抗原と、それらの抗原が抗原提示細胞（ＡＰＣ）として 知られるある種の細胞により分解（処理、プロセッシング）され、生じるペプチ ドが主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）のクラスＩまたはクラスIIタンパク質と関 連してＡＰＣの細胞表面に展示（提示、ディスプレイ）された後にのみ、結合す る。ヒトの集団においては、異なる個体は、非常に異なるこれらのクラスのＭＨ Ｃ分 子を現しうる。したがって、多くの異なるエピトープが、このような個体におい て優先的に提示されうる。 ＡＰＣにより抗原のプロセッシングが行われる機構の詳細については、よくわ かっていない。したがって、ある一定の抗原を特定のペプチドが産生され展示さ れるような方法でプロセッシングするＡＰＣの能力に関しては、その抗原が既に その点に関して特徴づけされているのでない限り、かなりの不確実性がある。 抗原がＴ細胞をそのＴＣＲを介して刺激するためには、ＡＰＣが抗原をプロセ ッシングして提示するという要件についての１つの例外は、小さいペプチド抗原 の場合である。このようなペプチドは、ＡＰＣによりプロセッシングされること なく、細胞表面上のＭＨＣクラスＩ分子に直接結合することができ、次いで、特 異的ＴＣＲにより「認識」され、結合されて、それによりＴ細胞を刺激しうる。 抗体およびＴＣＲとその特異的抗原との相互作用の研究により、特定のポリペ プチド抗原が、典型的には、エピトープとして知られる多数のサブ分子的特徴を 含み、それらの各々が特定の抗体または（ＡＰＣによるポリペプチドのプロセッ シングおよびＴ細胞エピトープを含む派生ペプチドのＭＨＣによる展示の後に） 特定のＴＣＲのための異なる結合部位として役立つことが示された。 したがって、ＴＣＲと抗体とは、各々ポリペプチド抗原の小さい部分を認識す るのみであることにおいて同様である。それらは、抗体が典型的にはその特異的 エピトープをインタクトなポリペプチドの状況において認識し、一方、ＴＣＲは ＡＰＣの表面上のプロセッシングされたポリペプチドのＭＨＣクラスIIまたはク ラスＩ結合ペプチドフラグメントとして特異的エピトープを認識するのみである ことにおいて異なる。重要なことには、このＴＣＲエピトープ認識過程は、ＡＰ Ｃが、適切なペプチドを生成し展示するように、ポリペプチド抗原をプロセッシ ングすることができる場合のみ起こりうる。したがって、特異的ＴＣＲによって 認識されるペプチドが特定のポリペプチド抗原中に存在しうるとしても、その特 異的ＴＣＲを発現するＴ細胞を刺激することができるペプチドがインビボでその ポリペプチド抗原かが誘導されるかどうかは不確実である。これは、ＡＰＣがそ の特定のポリペプチド抗原をプロセッシングすることによって特異的ＴＣＲによ り認識されるペプチドを生成できるかどうかが不確実であるためである。 この、特定のポリペプチド抗原のＡＰＣによるプロセッシングの結果について の確実性の欠如は、いくつかの要因に起因している。ＡＰＣが特定のポリペプチ ド抗原をそのポリペプチドに含まれる特異的ペプチドエピトープを展示するよう にプロセッシングしない可能性がある１つの理由は、ＡＰＣはエピトープ内の部 位でポリペプチドを効率的に切断し、そのためそれを破壊することである。第二 の理由は、ポリペプチドのプロセッシングに関与するＡＰＣの細胞内区画にその ポリペプチドが入れない、またはそれにより有効に分解されないことである。 一次構造（直線状のアミノ酸配列）、二次構造（直線状のアミノ酸配列におい て互いに近接するアミノ酸残基の相互作用により生じる三次元構造）、または三 次構造（直線状のアミノ酸配列においては互いに離れているが、ポリペプチド鎖 の折りたたみ（フォールディング）の結果として互いに近傍にくるアミノ酸残基 の相互作用により生じる三次元構造）のある側面は、ＡＰＣのプロセッシングに 影響を与えうる。ポリペプチドのアミノ酸配列は、特異的Ｔ細胞を刺激するよう にＡＰＣによりプロセッシングされ展示されるその潜在能を決定することにおい て、明らかに最も重要な要因である。特異的Ｔ細胞のＴＣＲにより認識されるペ プチドは、ポリペプチドのアミノ酸配列内に含まれていなければならない。アミ ノ酸配列は、ポリペプチドの潜在的二次および三次構造（すなわちフォールディ ング）をも決定する。 ポリペプチドのフォールディングは、ＡＰＣのプロセッシングにも重大な影響 を与えうる。特定のポリペプチドに由来する特異的エピトープのＡＰＣによる展 示の不確実性についての上述した第一および第二の理由の両方が、ポリペプチド がフォールディングされる方法によりもたらされうる。ＡＰＣ内でのプロセッシ ング中の加水分解による切断は、フォールディングによる切断部位のマスキング または露出により影響されうる。細胞内区画へのポリペプチドの進入は、ポリペ プチドの三次元構造により影響されることがよく知られているが、この三次元構 造はフォールディングの作用による。 Ｔ細胞および自己免疫疾患 自己免疫疾患においては、少数の自己抗原の種々のエピトープと反応性である 限られた数のＴ細胞クローンのみが活性化され、病因論に関与する。疾患原因の 自己反応性Ｔ細胞のこの病理的活性化において、種々の機構が役割を果たすと仮 定されている。感染または局所的炎症による抗原提示細胞（ＡＰＣ）の一次的活 性化は、そのような機構の１つと解されている。このようにして活性化されたＡ ＰＣは、それまでのところ非反応性であるＴ細胞に対する強力な共刺激を提供す ることができる。 他の提案された機構は、細菌の毒素のようなスーパー抗原による従来鎮静期の 自己反応性Ｔ細胞のポリクローナル活性化；または外来および自己抗原の間の偶 然の分子ミミクリー（molecular mimicry）を包含する（Ａbbas et al.,1994） 。この最後の場合においては、宿主の免疫系は、宿主タンパク質上の相同エピト ープに似た、ウイルスのような病原因子により発現されるタンパク質上のエピト ープに対する応答を装備する。自己免疫攻撃は、次いで後で起こる交差反応性免 疫応答によってもたらされる。 外部的要因に加えて、すべてのＴ細胞媒介性自己免疫疾患の出現の根底にある のは、複数遺伝性因子により決定される遺伝性の感受性の複雑なパターンである 。これらの種々の要因についてのさらなる論述については、Ｓteinman，1995 に おいて自己免疫の現在の諸説が論評されている。 ＭＳ（次に「ＭＳにおけるＴ細胞標的特定自己抗原」と題して詳述する）を含 むいくつかの自己免疫疾患においては、異常な免疫応答により標的とされる自己 抗原のいくつかまたはすべてが同定されている。ＭＳのような自己免疫障害にお いて自己反応性Ｔ細胞により標的とされるこれらの自己抗原およびこれらの抗原 中の特異的エピトープの知見は、「抗原の投与によるＭＳの治療」および「アポ トーシスの治療的誘導」と題して以下に詳述するように、治療法へのアプローチ を提供する。 ＭＳにおけるＴ細胞標的特定自己抗原 上述したように、ＭＳの正確な原因学は不明のままであるが、自己免疫攻撃は 明らかに中枢神経系（ＣＮＳ）ミエリンの破壊に関連があり、これがこの疾患の 証明である。ミエリンはある種のニューロンの軸索を取り囲むミエリン鞘の特徴 的な成分であり、電気的絶縁体として作用するものであり、これらのニューロン の適正な信号伝達機能に必須である。したがって、ＭＳに付随する脱髄は、ニュ ーロンの信号授受を破壊し、感覚機能の重度の障害および麻痺をもたらして、罹 患したニューロンにおける機能の喪失を引き起こす。 ミエリン鞘は、（中枢神経系の）オリゴデンドロサイト（乏突起神経膠細胞） および（末梢神経系の）シュワン細胞により作られる。ミエリンは、規則的に交 互になった脂質（例えばコレステロール、リン脂質およびスフィンゴ脂質）およ びタンパク質の層から構成される。 ミエリンの４つの主要なタンパク質成分、すなわちミエリン塩基性タンパク質 （ＭＢＰ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、ミエリン関連糖タンパク質 （ＭＡＧ）およびミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質（ＭＯＧ）は、ＭＳ 患者から単離された自己反応性Ｔリンパ球により認識される（Ｅndoh,et al.,19 86;Ｍartin,et al.,1992;Ｋerlero de Ｒosbo et al.,1993;Ａmor et al.,1994; Ｊohns et al.,1995）。 ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）およびプロテオリピドタンパク質（ＰＬ Ｐ）は、ミエリンの主要タンパク質成分であり、それぞれミエリン鞘の総タンパ ク質含量の約３０％および５０％を構成する。ＭＢＰおよびＰＬＰは、ＭＳにお ける主要な標的自己抗原であることが示されており、ＭＢＰおよびＰＬＰと反応 性のＴ細胞はその病因論において重要な役割を果たす（例えば、Ｓchwartz，199 3;Ｂrown and ＭcＦarlin,1981,Ｌab.Ｉnvest.45,pp.278-284;Ａllegretta et a l.,1990;Ｌehmann et al.,1992;Ｍartin et al.,1992;Ｓprent,1994; Ｓu and Ｓriram,1991,Ｊ.of Ｎeuroimmunol. 34,pp.181-190;およびＷeimbs and Ｓtoff el,1992を参照されたい）。 ＭＢＰ特異的およびＰＬＰ特異的Ｔリンパ球は、ＭＳ患者の血液中に見出され ている。これらはしばしば健康な個体の血液中に見出されうるが、典型的にはＭ Ｓ患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）中に存在する。重要なことには、このようなＴ細胞 は健康な個体からのＣＳＦ中には見出されない（Ｋerlero de Ｒosbo et al.,19 93;Ｚhang et al.,1994）。 ＭＢＰおよびＰＬＰに対するＭＳ患者の免疫応答は、健康な個体のそれとは明 らかに異なる。ＭＳ患者においては活性化のマーカー（例えばＩＬ−２レセプタ ー）を発現するＭＢＰ特異的およびＰＬＰ特異的Ｔ細胞の頻度が上昇するという 観察により証明されるように、ＭＢＰおよびＰＬＰ反応性Ｔ細胞は、ＭＳ患者に おいて優先的に活性化される（例えば、Ｚhang,et al.,1994を参照されたい）。 遺伝子突然変異頻度解析も、ＭＢＰ反応性Ｔリンパ球がＭＳ患者において特異 的に活性化されるという証拠を提供する。遺伝子突然変異は、休息中のＴ細胞よ りも分裂中のＴ細胞において高頻度であるため、特定の特異性のＴ細胞における 上昇した突然変異頻度は、インビボにおけるこれらの細胞の特異的活性化の指標 を提供する（Ａllegretta et al.,1990）。 ＭＳ患者からのＴリンパ球は、チオグアニン中で培養され、このプリンアナロ グに対して細胞を抵抗性にするｈｐｒｔ遺伝子中の突然変異の頻度が試験された 。正常個体からのＴ細胞の頻度の１０倍にのぼる高頻度のチオグアニン抵抗性Ｔ 細胞クローンがＭＳ患者において見出され、意図的に脳ＭＢＰに暴露されたこと は全くなかったが、これらの突然変異体クローンのかなりの割合がこの抗原に応 答して増殖した。これに対し、正常被検者から得られた抵抗性クローンは全くＭ ＢＰを認識しなかった。 ＭＢＰ、ＰＬＰおよびＭＯＧは、動物において実験的アレルギー性脳脊髄炎（ ＥＡＥ）を誘導するその能力のため、ＭＳ患者における一次自己抗原であるとも 考えられている。ＥＡＥは、ＭＳによく似た実験的に誘導された状態であり、Ｍ Ｓのベンチマーク動物モデルである。さらに、ＥＡＥ（またはＭＳ）を患う個体 から健康な動物へのＴ細胞の移入は、受容者においてＥＡＥを起こすことができ 、これは、「養子移入（adoptive transfer）」と呼ばれる疾患誘導方法である 。例えば、ヒトから動物への移入実験において、ＭＳ患者からのＣＳＦ単核細胞 （Ｔ細胞を含む）は、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスの脳室中のＣＳＦに 注入した場合、麻痺、運動失調、および炎症性脳病巣を引き起こした(Saeki et al.,1992)。また、ＭＢＰおよび／またはＰＬＰおよび／またはＭＯＧでの動物 の免疫は、ＣＮＳ炎症、麻痺およびＥＡＥのその他の徴候および症状を誘起する ことができる（例えば、Ａlvord et al.,1984;Ａbbas et al.,1994;Ａmor et al .,1994;およびＪohns et al.,1995を参照されたい）。 ＭＢＰ、ＰＬＰおよびＭＯＧがＭＳにおける異常な免疫応答により標的とされ る一次抗原であることは明らかであるが、研究により、Ｔ細胞増殖応答を誘導し うるＭＢＰおよびＰＬＰエピトープの顕著な異質性が解明されている。これらの 研究は、ＭＳ患者の反応性Ｔ細胞により正常な健康個体のそれよりも高頻度で認 識される単一のエピトープを一致して解明していない（Ｃhou et al.,1989;Ｒic hert et al.,1989;Ｍartin et al.,1990;Ｏta et al.,1990;Ｐette et al.,1990 ;Ｍartin et al.,1992;Ｍeinl et al.,1993）。抗原の標的化におけるこの異質 性は、一部には、ヒト集団において異なる個体により発現されるＭＨＣ分子およ びＴＣＲの多様性の作用である可能性がある。 ＭＢＰの異なる分子形態（アイソフォーム）は、ＭＢＰ ｈｎＲＮＡの差次的 （differential）スプライシングにより生成され、単一のＭＢＰ遺伝子の７つの エクソンのいくつかまたはすべてのコードされるタンパク質の存在をもたらす。 健康な成人においては、ＭＢＰは、ほとんど排他的に、ＭＢＰ遺伝子のエクソン ２以外のすべてのエクソンを含むmＲＮＡから生成される１８．５kＤa 分子とし て見出される（Ｋamholtz et al.,1988）。ＭＢＰの他の形態としては、全長（ ７つすべてのエクソン）の２１．５kＤa アイソフォーム、および別の２つの少 量のアイソフォーム（１７．２および２０．２kＤa）が挙げられる。２つのエク ソン２含有アイソフォーム（２１．５および２０．２kＤa）の発現は、初期胚発 生中および損傷組織の再有髄化中の両方において、ミエリンの形成とともに増加 するように見える（Ｋamholtz et al.,1988;Ｒoth et al.,1987）。これらの２ つのアイソフォームは、損傷した成人組織の再有髄化においても見出されるが、 当業界において、そして本明細書において、「胎児性」アイソフォームと呼ばれ る。 ＭＳプラークは、再有髄化の領域を含み、したがって、健康な成人ＣＮＳ組織 に見出されるよりも高レベルのＭＢＰの２１．５アイソフォームを含有するはず であり、エクソン２によりコードされるＭＢＰの２つの胎児性アイソフォーム（ これらの領域は「Ｘ２ＭＢＰ」または単に「Ｘ２」と呼ばれる）の各々の共通す る２６アミノ酸の領域（配列番号１のアミノ酸残基６０〜アミノ酸残基８５にわ たる配列に相当する）内のエピトープに対する免疫応答は、確立した疾患の経過 を悪化させうることを示唆している（Ｐrineas et al.,1993;Ｒaine and Ｗu,19 93;Ｂruck et al.,1994）。 再有髄化は、ＭＳの経過において周期的に起こりうるので、再有髄化の各サイ クルは、理論的にはＣＮＳにおける休止中のＸ２ＭＢＰ特異的Ｔ細胞を活性化す ることにより進行中の免疫応答を駆り立てるのに役立つことができる。この仮説 を支持するものとして、いくつかの証拠が、ＭＳ病因論におけるＭＢＰ遺伝子の エクソン２によりコードされたエピトープ（すなわちＸ２ＭＢＰ内のエピトープ ）の関与を示唆している。 ＭＳにおけるＭＢＰの代替的アイソフォームの役割の研究は、その免疫学的特 性を評価するためには精製された大量のミエリン抗原が利用可能であることを必 要とする。したがって、このような研究は、一般に、合成的に誘導したペプチド 、例えばＸ２ＭＢＰを含むペプチドを用いることに限られていた。最近、ヒトＭ ＢＰのエクソン２にコードされた配列を含むペプチドと反応性のＣＤ４⁺ＭＨＣ クラスII制限Ｔ細胞が、ＭＳ患者および正常な健康対照者の両方の末梢血から単 離された（Ｖoskuhl et al.,1993a;Ｖoskuhl et al.,1994）。ＭＳに罹患した家 族において、Ｘ２包含ペプチドに特異的なＴリンパ球の頻度は、Ｘ２を含まない ＭＢＰの１８．５kＤa アイソフォーム内のエピトープに特異的なＴ細胞の頻度 よりも高かった（Ｖoskuhl et al.,1993b）。ヒト被検者からのこのデータに加 えて、最近、マウスのＸ２包含ペプチドがＳＪＬ／Ｊマウスにおいて免疫原性で あることが見出され、エクソン２ペプチド感作リンパ球の養子移入により重度の ＥＡＥが誘導された（Ｓegal et al.,1994;Ｆritz and Ｚhao,1994）。 総合すると、これらのヒトおよび動物での知見は、ミエリン由来抗原ＭＢＰに 対するインビボでの細胞性免疫応答は、多発性硬化症に付随した病因論の少なく ともいくつかを引き起こすことを明らかにしている。しかし、Ｘ２エピトープに 関するこれらの研究の全てが抗原として合成ペプチドを使用しており、これらの 研究のどれひとつとして全長ＭＢＰ２１．５タンパク質を用いていないことは留 意されるべきである。ＡＰＣによる試験されていないタンパク質の特定のエピト ープのプロセッシングおよび展示に関する不確実性に照らして、これらの結果が インビボでのＭＳ病因論に真に関連するかどうかは、当業界において疑問とされ た。 ＰＬＰは、非常に疎水性の内在性ミエリン膜タンパク質であり、その物理的お よび化学的特性により単離、研究または患者への投与が困難である（例えば、So bel et al.,1994;Ｔuohy,1994;Ｖan der Ｖenn et al.,1989;Ｖan der Ｖenn et al. ,1990;Ｖan der Ｖenn et al.,1992;van Noort et al.,1994を参照されたい）。 ＰＬＰの一次アミノ酸配列は種間でよく保存されている。典型的には、成熟ＰＬ Ｐポリペプチドは、ＰＬＰ遺伝子によりコードされる開始メチオニンを含まない 。このアミノ酸は、哺乳類細胞において翻訳後プロセッシングにより除去される ようである。したがって、本明細書において用いる場合、ヒトＰＬＰのアミノ酸 番号は配列番号２２に示すものであり、グリシン残基をアミノ酸番号１として番 号を開始してある。 ２７６アミノ酸のＰＬＰポリペプチドは、約５０％の疎水性残基を含み、５つ の親水性ドメインおよび４つの非常に疎水性の高いドメインに分けられると記載 されており、これらはタンパク質のアミノ末端から開始して１から４までの番号 が付されている。タンパク質のドメインは、ドメインの境界を定義するのに使用 する基準によって、異なる範囲を有するように定義されうる。したがって、最も 厳密な基準によると、ヒトＰＬＰ分子の疎水性ドメインは、ヒトＰＬＰのアミノ 酸配列（配列番号２２）のアミノ酸残基１０〜３６（疎水性ドメイン１）、５９ 〜８７（疎水性ドメイン２）、１５１〜１７８（疎水性ドメイン３）、および２ ３８〜２６７（疎水性ドメイン４）にわたる。これより厳密性の低い基準もこれ らのドメインを定義するのに用いられ、代わりに、疎水性ドメインは、ヒトＰＬ Ｐのアミノ酸配列（配列番号２２）のアミノ酸残基１０〜１８（疎水性ドメイン １）、７０〜８０（疎水性ドメイン２）、１６２〜１７０（疎水性ドメイン３） 、および２５０〜２５８（疎水性ドメイン４）にわたるということができる。 したがって、ＰＬＰの親水性ドメインは、ヒトＰＬＰのアミノ酸配列（配列番 号２２）のアミノ酸残基１〜９（親水性ドメイン１）、３７〜５８（親水性ドメ イン２）、８８〜１５０（親水性ドメイン３）、１７９〜２３７（親水性ドメイ ン４）、および２６７〜２７６（親水性ドメイン５）と定義することができる。 ＰＬＰ反応性Ｔ細胞株は、ＰＬＰペプチドに対して強く反応する。ＰＬＰ配列 に基づく配列を有する合成ペプチドは、マウスおよびヒト脳炎誘発性エピトープ を同定するために用いられてきた。例えば、Ｆritz et al.,1983,Ｊ.Ｉmmunol. 130,pp.191-194;Ｅndoh et al.,1986;Ｇreer et al.,1992;Ｋuchroo et al.,199 2;Ｋuchroo et al.,1994;ＭcＲae et al.,1992;Ｐelfrey et al.,1993;Ｐelfrey et al.,199 4;Ｓobel et al.,1992;Ｔuohy et al.,1988;Ｔuohy et al.,1989;Ｔuohy et al. ,1992;Ｗhitham et al.,1991,Ｊ.Ｉmmunol. 147,pp.101-107;Ｗhitham et al.,1 991,Ｊ.Ｉmmunol.,147pp.3803-3808; およびＣorreale et al，1995を参照され たい。これらのヒトペプチドにより定義されたエピトープを表１に示す。 ＰＬＰの最近提案された構造に従えば（Ｗeimbs and Ｓtoffel，1992）、これ らの脳炎誘発性エピトープは、ＰＬＰの膜内ドメインおよび膜外ドメインの両方 に見出される。 ＰＬＰペプチドは、脳炎誘発性であることが示されており、ウサギ、ラット、 モルモット、および種々のマウス系統において疾患を誘発することができる（例 えば、Ｔrotter et al.,1987を参照されたい）。マウスＰＬＰは、配列において ヒトＰＬＰ（配列番号２２）と同一である。マウスのモデルにおける脳炎誘発性 エピトープとしては、表２に示すものが挙げられる。少なくともいくつかのマウ ス系統において、ＰＬＰは、ＣＮＳ内の主要な脳炎誘発物質を表す（Ｋennedy e t al.1990）。種々のげっ歯類モデルにおいて、ＭＢＰ誘導性疾患に比較して、 ＰＬＰ誘導性ＥＡＥについて有意に多い脱髄が観察された（Ｔabira,1988）。臨 床的研究においては、ＭＳ患者対正常健康対照個体においてＰＬＰペプチド反応 性Ｔ細胞の数の有意な差が報告されている（Ｓun et al.,1991;Ｔrotter et al. ,1991;Ｃhou et al.,1992;Ｚhang et al.,1994）。 これらの観察に加えて、ＭＳ病因論におけるＰＬＰの重要性は、ＰＬＰが、Ｍ ＢＰとは違って、ＣＮＳにおいてのみ見出され、末梢神経系には見出されず、そ こではＭＳにおいて損傷が相対的にほとんど起こらない、という観察によって示 唆されている（Ｌees and Ｍackin,1988）。 抗原の投与によるＭＳの治療 あらゆる疾患の理想的な治療的処置は、正常な生理学に影響を与えずに病因論 を遮断するものである。自己免疫疾患の場合には、このような理想的療法へのア プローチは、外来抗原に対する免疫応答に影響を与えずに自己免疫疾患関連自己 抗原に対する免疫寛容性を特異的に誘発する処置である。免疫機能の他のすべて の側面を変えないまま、特異的な自己抗原に対する寛容性を誘発しうる新規な治 療剤および治療戦略が模索されている。 特異的自己反応性リンパ球、特にＴ細胞を抑制するために抗原を投与すること を介してＴ細胞応答を治療的に改変し、それにより疾患関連自己抗原に対する寛 容性を誘起する試みが行われてきた。このような抗原特異的療法の顕著な利点は 、それが、自己抗原と反応することにより病理生成に関与するＴ細胞のみの活性 の治療的調節を達成しうることである。この特異性は、他の抗原と反応性のＴ細 胞の重要な免疫活性を変えずに、治療的利益を提供する。 自己反応性Ｔ細胞を抑制する療法は神経組織の脱髄および生じる症状を有意に 軽減する可能性があるため、ＭＳ抗原は、ＭＳ／ＥＡＥの治療のための寛容性誘 導剤として研究されてきた（例えば、Ａdronni et al.,1993;Ｃritchfield et a l.,1994;Ｍiller and Ｋarpus,1994;Ｒacke et al.,1995を参照されたい）。こ れらの研究において、多数の治療プロトコールおよび抗原が用いられており、ヒ ト形態の抗原よりも動物の抗原が主に使用された。例えば、Ｗeiner et al.,199 3はウシミエリンから精製したＭＢＰを用い、Ｍiller et al.,1992はモルモット 、ラットおよびマウスのＭＢＰを用いた。ヒトＭＢＰ抗原を用いた研究において は、ＭＢＰは死体のヒト脳から精製された（例えば、Ｚhang et al.,1994を参照 されたい）。 経口寛容性は、ＴＧＦ―βを含むサイトカインの分泌を通じてインビトロおよ びインビボの両方で免疫応答を抑制する調節ＣＤ８⁺Ｔ細胞に関与する（Ｃhen e t al.,1994,Ｓcience,265:1237-1240）。この機構により媒介されるＴ細胞の活 性のダウンレギュレーションは、特定のＴ細胞クローンに特異的ではなく、抗原 特異的免疫抑制に関与しないが、抑制性Ｔ細胞の分泌したサイトカインにより影 響を受けるのに十分なほどそれらの細胞の近傍にあるあらゆるＴ細胞に作用する 。この現象は、「傍観者抑制（bystander suppression）」と呼ばれてきた。 最近の研究においては、ＭＳ患者に対するウシミエリンの経口投与の寛容誘導 効果が調べられてきた（Ｗeiner et al.,1993,Ｓcience,259:1321-1324;Ｙoon e t al.,1993）。プラセボで処理した患者よりも少数の経口ミエリン処理患者がそ のＭＳ症状の悪化を生じたが、患者が適正に無作為化されていなかったため、こ の研究の結果は、確定的ではなかった。実際、著者らは、「この研究はＭＳの治 療における経口ミエリンの有効性を証明するものではないことは強く強調されな ければ ならない」ということを注意していた。したがって、経口寛容誘導の研究はＭＳ の治療のための免疫調節剤としてのミエリンタンパク質の有用性を支持する一方 、新規なより有効な抗原、およびＭＳの免疫調節治療のためのこのような抗原の 代替的な投与モードは模索されつづけている。 明らかに、ヒト疾患の治療のためには、ヒト由来の抗原の方が、ヒト疾患にお いて自己免疫攻撃のために標的とされる実際の自己抗原であり、疾患の抑制は相 同タンパク質が投与された場合に最も有効であるはずであるため、動物由来抗原 よりも有利である（Ｍiller et al.,1992）。これは、ヒトタンパク質は同じＭ ＨＣ結合特異性を有し、自己免疫応答により標的とされる内在性タンパク質と同 じ抗原プロセッシングを受けるであろうからである。 実際、重要なＭＳ自己抗原の免疫優性エピトープ（すなわち、ＣＤ４⁺自己反 応性Ｔ細胞により最もしばしば認識されるタンパク質の抗原性領域）は、多くの ミエリン抗原がアミノ酸配列レベルで高い種間相同性を呈するとはいえ、抗原が 由来する動物種によって異なる。例えば、ＭＳ患者から得られるＴ細胞の解析に よって決定されたように、ヒトＭＢＰの免疫優性エピトープはアミノ酸８４〜１ ０２にわたる領域に含まれ、別の１つはアミノ酸１４３〜１６８にわたる領域に 見出される。これに対し、マウスＭＢＰの主要免疫優性エピトープはアミノ酸１ 〜９にわたる領域に見出され（Ｚamvil et al.,Ｎature,324:258,1986）、ラッ トＭＢＰの主要免疫優性エピトープはアミノ酸６８〜８８にわたる領域に見出さ れる（Ｂurns,et al.,Ｊ.Ｅx.Ｍed.169:27,1989）。 しかし、治療剤としてのヒトＣＮＳ組織から単離された抗原の使用は、望まし くない。これは、一般にＣＮＳ組織から抗原を精製することに伴う問題およびヒ ト原材料の入手の困難性によるだけでなく、より重要なことには、病原因子の汚 染の可能性の排除の問題による。ＣＮＳ由来タンパク質の精製における潜在的な 汚染物質の一例は、海綿状脳障害であるクロイツフェルト・ヤコブ病およびクー ルー病を伝播するプリオン粒子である。プリオン粒子は、精製すべきタンパク質 を破壊しないようなあらゆる公知の滅菌手段に対して耐性であるため、特に手に おえない問題を呈する。 これらの問題を回避するヒト抗原の入手の有用なアプローチは、組換えＤＮＡ 技術を用いるタンパク質抗原の生産であり、これは、典型的には抗原をコードす るＤＮＡ分子を調製し、そのＤＮＡを用いて非ヒト宿主細胞において抗原の発現 を駆動することによって行う。Ｏettinger et al.(1993)は、ヒトＭＢＰの１８ ．５kＤa形態をコードする未改変のヒト配列を含む組換えＤＮＡ分子を調製し、 このＤＮＡを用いて Ｅscherichia coli において組換えヒト１８．５kＤa ＭＢ Ｐを発現させた。しかし、Ｅ.coli におけるＰＬＰポリペプチドの発現は、少な くともいくつかのＰＬＰ配列は細菌に有害な効果を有するようであるため、現在 に至るまで手におえない問題であることがわかっていた。 実際、ＰＬＰの疎水性は、水溶性を厳密に制限し（Tuohy，1994）、あらゆる 供給源からのネイティブなＰＬＰ形態を、調製および静脈投与が困難なものとし ている。 Ｔ細胞削除 Ｔ細胞レパートリーの変更は、天然にはＴ細胞発生の間に起こる。胸腺細胞（ 未成熟Ｔ細胞）のわずかな一部のみが胸腺におけるこの発生および選択事象を生 き延び、末梢循環への発生中のＴ細胞の移住をもたらされ、ここでＴ細胞は成熟 を完了する（von Ｂoehmer,1988;Ｍarrack and Ｋappler，1987）。実験的証拠 は、胸腺中には自己抗原のレセプターを担持する多数の胸腺細胞が当初は存在す ることを強く示唆する。胸腺中でのＴ細胞発生の間に、これらの自己抗原と反応 性の細胞は、正常な発生経路の一部として削除される（殺される）。この胸腺内 寛容誘導過程は「胸腺寛容性（thymic tolerance）」と呼ばれる。 発生中のＴ細胞は胸腺中では一定の自己抗原に出会わないが、成熟末梢Ｔ細胞 としてこれらに遭遇しうる。例えば、神経抗原は胸腺中ではまったく提示される ことがない可能性がある。このような自己抗原に対する寛容性は、通常は胸腺の 外で形成され、「末梢寛容性（peripheral tolerance）」と呼ばれる。末梢寛容 性は少なくとも２つの機構により起こることができ、その１つは、胸腺寛容性と 同様であるが異なる過程であり、以前遭遇していない自己抗原と特異的に反応性 の成熟末梢Ｔ細胞の削除をもたらすものである。さらに、ある種の特異的反応性 を有するＴ細胞は、不活性（アネルギー）になるように誘導されうる。末梢削除 およびアネルギーの誘導は、「末梢寛容性」の発生をもたらす生理学的な機構で あ る。胸腺および末梢寛容誘導の結果として、成熟Ｔ細胞は、通常、ほとんどの自 己抗原に対して寛容であるが、自己反応性Ｔ細胞は、その抗原が必要な共刺激と ともに提示されないため、または免疫学的に特典的な部位に見出されるため、存 続しうる。 Ｔ細胞削除を介して寛容誘導が生成される機構は、ある種の定義された条件下 での抗原に対する反復的な暴露に依存することが最近示された。したがって、特 異的Ｔ細胞削除は、関連エピトープを含む外来性化合物の適切な投与によって誘 導することができる。個々の自己免疫疾患の病因論にはいずれも限られた数の自 己抗原のみ（ずっと多数のエピトープを含む）が関与するので、それらが知られ ている場合には、疾患において標的とされる自己エピトープを、病因論に関与す るエピトープを含む１以上の単離された自己抗原由来化合物の形態で患者に投与 することが可能である。最適な臨床的効果を得るためには、ＭＢＰおよびＰＬＰ の総合的な混合物（おそらくはＭＯＧエピトープとともに）を有することが必要 でありうる。これは、ヒトＭＨＣおよびＴＣＲ多型の程度の大きさのためであり 、また、新規なエピトープ反応性が自己免疫疾患進行中に出現しうるためである （ＭcＣarron et al.,1990;Ｌehmann et al.,1992;Ｋaufman et al.,1993）。 アポトーシス 自己反応性Ｔ細胞の削除は、多くの生物系の調節における重要な過程を表すプ ログラムされた細胞死の例である（Ｓinger et al.,1994）。プログラムされた 細胞死は、アポトーシスと呼ばれる機構により起こる。アポトーシスにおいては 、細胞は、一定の刺激に対して、細胞の自殺を効果的に構成する予め決められた 事象の特定の連続を行うことにより応答する。アポトーシスは、明らかにＴ細胞 レパートリーの形成および維持において大きな役割を果たし、自己反応性ＴＣＲ を発現する細胞を積極的に排除することにより自己寛容性の確立に貢献する。 最近、Ｔ細胞がその一生において複数の地点で多様な刺激により誘導されるア ポトーシスによる細胞死に感受性であることが発見された(例えば、Ｌenardo,199 1;Ｂoehmer and Ｌenardo,1993;Ｃritchfield et al.,1994を参照されたい)。正 の選択因子も、特異的Ｔ細胞クローンの生存を調節することにおいて役割を果た すと信じられている。これらの、または他の機構による、生物中の特定のクロー ンの 個々のＴ細胞の数の減少または増大は、特定の抗原に対するその生物の免疫系の 応答性を調節することに役立つ。いくつかの自己免疫疾患モデルにおいて、なら びにある種のウイルス感染において、アポトーシスを、成熟末梢抗原特異的Ｔリ ンパ球および未成熟胸腺細胞に（一定の定義された条件下で抗原に対して暴露さ れた際に）誘導することができることが現在確立されている。 アポトーシスは多くの生物系において起こる（例えば、Ｋerr et al.,1991;Ｌ ockshin and Ｚakeri,1991;Ｃohen et al.,1992;Ｄuvall and Ｗyllie,1986;Ｃo tter et al.,1990を参照されたい）。アポトーシスを行っている細胞は、特定の 事象のプログラム、すなわち活性な代謝に依存し、細胞の自己破壊に寄与する細 胞および生化学的過程を行う。アポトーシスのＴ細胞においては、核が縮み、ク ロマチンが凝縮し、遺伝物質（ＤＮＡ）が漸進的に小さいフラグメント（ヌクレ オソームのリピートのサイズ）に分解し、細胞質の簡潔化が起こり、細胞膜は気 泡を形成し、最終的には細胞が崩壊する（Ｋawabe and Ｏchi,1991;Ｓmith et a l.,1989）。細胞はアポトーシスから回復することはできず、アポトーシスは不 可逆的な細胞死をもたらす（Ｋawabe and Ｏchi,1991;Ｓmith et al.,1989）。 最近の報告によると、Ｔ細胞におけるアポトーシスの誘導において、ＦＡＳリ ガンドとして知られるＴＮＦ関連サイトカインおよびそのレセプターであるＣＤ ９５（ＦＡＳレセプター）が役割を有することが示されている（Ｃrispe et al. ,1994;Ｎagata and Ｓuda,1995;Ｓtrasser,1995;Ｄhein et al.,1995;Ｂrunner et al.,1995;およびＪu et al.,1995）。 アポトーシスを行わないが、活性化されたＴ細胞は、細胞溶解を引き起こすこ とにより、またはＢ細胞応答または他の免疫作用を起こすリンホカインを分泌す ることにより、その「エフェクター」機能を実施する（Ｐaul，1989）。これら のエフェクター機能は、自己免疫および他の疾患における組織損傷の原因である 。 アポトーシスの治療的誘導 自己免疫疾患を回避または治療する１つの強力なアプローチは、アポトーシス により自己免疫応答に関与するリンパ球を永久に排除することである。例えば、 ほとんどのＴ細胞レパートリーを無傷のままにしながら、治療対象の特定の自己 免疫疾患において標的とされる自己抗原と反応性であるＴ細胞のみを排除するこ とにより、治療効果を達成することができる。インビボ研究により、ミエリン抗 原と反応性のＴ細胞のアポトーシスを誘導するのに有効な用量および間隔でミエ リン抗原を投与することによりＥＡＥを治療しうることが明らかになった（例え ば、Ｃritchfield,et al.,1994を参照されたい）。 このアプローチは、「自己免疫疾患、アレルギー性障害および移植片拒絶の治 療のためのインターロイキン２刺激Ｔリンパ球細胞死」と題され、Ｍichael Ｊ. Ｌenardo の名前で出願された係属中の米国特許出願０７／７５１，０９０号、 および「自己免疫疾患、アレルギー性障害および移植片拒絶の治療のためのイン ターロイキン４刺激Ｔリンパ球細胞死」と題され、Ｍichael Ｊ.Ｌenardo の名 前で出願された係属中の米国特許出願０７／９２６，２９０号に記載されている 。 添付の図面は、本明細書中に取り込まれ、その一部を構成するものであり、本 発明のある側面を説明し、記載とともに、本発明の原理を説明するのに役立つも のである。もちろん、これらの図面および記載の両方が説明のためだけのもので あり、本発明を限定するものではないことは理解されるべきである。 図面の簡単な説明 図１： ＣＦＡアジュバント中で投与したオブアルブミン（図１Ａ−ＯＶＡ） 、ＰＬＰペプチド１３９−１５１（図１Ｂ−配列番号２２のアミノ酸残基１３９ 〜１５１に相当するアミノ酸配列を有するペプチド）、ΔＰＬＰ４（図１Ｃ−Ｐ ＬＰ４）、またはＭＰ４（図１Ｄ）で処理した４匹の個別のＳＪＬ／Ｊマウスの 活動性（抗原誘発）ＥＡＥの臨床経過。疾患は、０＝異常無し、１＝弱々しい尾 、２＝弱々しい尾および反転された際に直ちに回復できない、３＝弱い後脚また は一方の後脚を引きずる、４＝両後脚の麻痺、５＝瀕死の状態、および６＝死亡 、として採点した。臨床スコアは白丸、重量（g）は黒丸で示す。 図２： 静脈内ΔＰＬＰ４投与による養子ＥＡＥの予防・治療。ΔＰＬＰ４／ ＣＦＡで免疫したマウスからのＰＬＰ特異的リンパ節細胞を、インビトロでＰＬ Ｐペプチド１３９−１５１（図１について上述したもの）で刺激した。これらの 動物からのＴ細胞を、０日目にマウス１匹当たり１０⁷細胞でナイーブ受容者に 静脈注射することにより移入した。処理群の５匹のマウス（ＰＬＰ４；２、４、 ６日）には、移入後２、４、６日に１２５μｇのΔＰＬＰ４の２回の注射（６〜 ８時間間 隔）を与えた。非処理群の５匹のマウス（対照動物）には、等量（１００μl） の滅菌水を与えた。マウスは毎日監視し、各群の平均臨床スコアを決定した（図 １におけるように採点した）。 図３： Ｘ軸上に示すようにナイーブマウス（ＳＪＬ／Ｊ）およびＰＬＰペプ チド１３９−１５１（図１について上述したもの）（「ペプチド」）またはΔＰ ＬＰ４（ＰＬＰ４）で免疫したマウスからのＴ細胞濃縮リンパ節細胞の、示した 濃度の合成ＰＬＰペプチド（１３９−１５１、または１７８−１９１、すなわち 配列番号２２のアミノ酸残基１７８〜１９１に相当するアミノ酸配列を有するペ プチド）またはインタクトなΔＰＬＰ４（「ＰＬＰ４」）によるインビトロ刺激 に応答しての増殖応答。Ｔ細胞は、培地単独中または抗原とともに７２時間イン キュベートした。増殖は、１８時間パルス後の³Ｈ−チミジンの取り込みにより 測定した。すべてのアッセイは、３連の培養で複製した。 図４： 静脈内ΔＰＬＰ４投与によるΔＰＬＰ４誘発活動性ＥＡＥの予防・治 療。 ＥＡＥは、ＳＪＬ／Ｊマウスに、０日および３日に１００μｇのＣＦＡ中のΔ ＰＬＰ４を皮下注射し、続いて３００ng の百日咳毒素を注射することにより誘 発した。５匹の実験マウスには、免疫後５、７および９日に１２５μｇのΔＰＬ Ｐ４の２回の静脈注射（６〜８時間間隔）を与えた（ＰＬＰ４；５、７、９日、 黒丸）。非処理群の５匹のマウス（対照動物、白丸）には、等量（１００μl） の滅菌水を同じスケジュールで与えた。マウスは毎日監視し、各群の平均臨床ス コアを各群について決定した（図１におけるように採点した）。 図５： ＰＬＰ処理はＰＬＰおよびＭＢＰ抗原に対する応答におけるＴ細胞増 殖を排除する。Ｔ細胞増殖アッセイは、ＥＡＥを誘発するために免疫し、ΔＰＬ Ｐ４で処理したマウスから得たリンパ節細胞について実施した。誘導および処理 は、図４について記載したとおりであった。５０μg/ml でインビトロＴ細胞増 殖アッセイに用いた抗原は、示したようにΔＰＬＰ４（ＰＬＰ４）またはＭＰ４ であった。 図６： 組換えＭＰ４による刺激に応答してのヒトＭＢＰ特異的Ｔ細胞株の増 殖。ＭＰ４は、１０μg/ml の濃度で用いた。ヒトＴ細胞株２Ａ２（ＭＢＰペプ チド３１−５０と反応性）、３Ｈ５（ＭＢＰペプチド８７−１０６と反応性）お よび５ Ｂ２（ＭＢＰペプチド１５１−１７０と反応性）は、当初、健康な個人から入手 した。これらの細胞株は、かっこ内に示す成人脳（１８．５kＤa）ＭＢＰ（配列 番号４）の相当するアミノ酸位置により示されるＭＢＰエピトープに特異的であ る。 図７： ＭＰ４はＰＬＰによる疾患誘発後のマウスＴ細胞を刺激し、ＰＬＰ処 理はＭＰ４抗原に応答するＴ細胞増殖を排除する。Ｔ細胞増殖アッセイは、ＥＡ Ｅを誘発するためにΔＰＬＰ４で免疫し、ΔＰＬＰ４で処理したマウスから得た リンパ節細胞について実施した。ＭＰ４は、５０μg/ml でインビトロＴ細胞増 殖アッセイに用いた。 図８： ＰＬＰペプチド１３９−１５１（図１について上述したもの）で免疫 したＳＪＬ／ＪマウスからのＴ細胞濃縮リンパ節細胞の、１０μg/ml の合成Ｐ ＬＰペプチド（１３９−１５１、４３−６４（すなわち配列番号２２のアミノ酸 残基４３〜６４に相当するアミノ酸配列を有するペプチド）または２１５−２３ ２（すなわち配列番号２２のアミノ酸残基２１５〜２３２に相当するアミノ酸配 列を有するペプチド））またはインタクトなΔＰＬＰ４（「ＰＬＰ４」）による インビトロ刺激に応答しての増殖応答。Ｔ細胞は、培地単独中または抗原ととも に７２時間インキュベートした。増殖は、１８時間パルス後の³Ｈ−チミジンの 取り込みにより測定した。すべてのアッセイは、３連の培養で複製した。 図９： ＰＬＰペプチド１０３−１１６で免疫したＳＷＲマウスからのＴ細胞 濃縮リンパ節細胞の、１０μg/mlの合成ＰＬＰペプチド（１７８−１９１（上述 ）、１３９−１５１（上述）、または１０３−１１６（すなわち配列番号２２の アミノ酸残基１０３〜１１６に相当するアミノ酸配列を有するペプチド））また はインタクトなΔＰＬＰ４（「ＰＬＰ４」）によるインビトロ刺激に応答しての 増殖応答。Ｔ細胞は、培地単独中または抗原とともに７２時間インキュベートし た。増殖は、１８時間パルス後の³Ｈ−チミジンの取り込みにより測定した。す べてのアッセイは、３連の培養で複製した。 図１０： ＰＬＰペプチド４３−６４で免疫したＰＬ／ＪマウスからのＴ細胞 濃縮リンパ節細胞の、１０μg/ml の上述の合成ＰＬＰペプチド（１３９−１５ １、４３−６４または１７８−１９１）またはインタクトなΔＰＬＰ４（「ＰＬ Ｐ４」） によるインビトロ刺激に応答しての増殖応答。Ｔ細胞は、培地単独中または抗原 とともに７２時間インキュベートした。増殖は、１８時間パルス後の³Ｈ−チミ ジンの取り込みにより測定した。すべてのアッセイは、３連の培養で複製した。 図１１： モルモットＭＢＰで活性化した３０，０００，０００個のＴ細胞の 移入により誘発したＥＡＥの治療。処理は、示したとおり、２００μg ＭＰ４； ２００μg モルモットＭＢＰ（ＧＰ−ＭＢＰ）；４００μg モルモットＭＢＰ； または４００μg オブアルブミン（ＯＶＡ、対照）であった。これらの処理は、 脳炎誘発性Ｔ細胞の養子移入の後、６、８および１０日に静脈内に１日２回（６ 時間間隔で）投与した。各処理群は、３〜５匹の動物で構成した。 図１２： 図１について上述した１００μg のＰＬＰペプチド１３９−１５１ でのＳＪＬマウスの免疫により誘発したＥＡＥの治療。処理は、示したように、 ２５０μg のＭＰ４または２５０μg のハトシトクロームｃ（対照）を用いて行 った。これらの処理は、免疫後、５、７および９日に静脈内に１日２回（６時間 間隔で）投与した。各処理群は、３匹の動物で構成した。 図１３： 合成ＭＢＰ２１．５遺伝子（ｃＤＮＡ）の構築のためのＰＣＲ戦略 。かっこＡで示すのは、ＭＢＰ＋Ｘ２^Cys81/Bact.遺伝子の構築に用いた重複す るオリゴヌクレオチド１から６（配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番 号８、配列番号９および配列番号１０）の整列図である。この遺伝子の３つのサ ブドメイン（Ｉ、IIおよびIII、かっこＢで示す図により表す）を最初に合成し た。より大きいドメイン（Ｉ＋II、II＋III）は、かっこＣにより示す図で表す ように適切な外側のオリゴヌクレオチド（それぞれオリゴヌクレオチド１および ４、および３および６）を用いる重複ＰＣＲにより形成した。全長分子は、外側 オリゴヌクレオチド１および６を用いてドメインＩ＋IIおよびII＋IIIの重複Ｐ ＣＲにより完成した。最終生成物のマップを、かっこＤで示す図に表す。この図 において、全長分子のこのマップ中の斜線領域はエクソン２の位置を示し、アミ ノ酸残基８１のシステイン（Ｃｙｓ⁸¹）はセリン（Ｓｅｒ⁸¹）に変更されたもの として示されている。遺伝子の３′末端（図の右手側）の黒四角は、精製を容易 にするために付加されたヒスチジンタッグをコードする配列を表す。 図１４： 細菌細胞における組換えＭＢＰ発現および細胞内局在（未分画全細 胞 溶解物）。細胞溶解物は、付加的なインサート（挿入片）を含まない対照ｐＥＴ ２２ｂベクター（「１」）、ｐＥＴ２２ｂ／ＭＢＰ１８．５^hum.（「２」）、ま たはｐＥＴ２２ｂ／ＭＢＰ＋Ｘ２^Cys81/Bact.（「３」）で形質転換したＢＬ２ １（ＤＥ３）細胞の誘導した培養から調製した。全細胞溶解物は、還元条件下で １６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し（これらの条件下では２量体は見られない ことに注意されたい）、次いでクマシー染色（「クマシー」）、あるいはヒト脳 ＭＢＰのカルボキシ末端エピトープ（「Ｃ−ｔｅｒｍ Ａｂ」）またはアミノ末 端エピトープ（「Ｎ−ｔｅｒｍ Ａｂ」）を認識するモノクローナル抗体を用い てイムノブロットを行った。星印は、「Ｎ−ｔｅｒｍ Ａｂ」モノクローナル抗 体によってのみ認識されるＭＢＰ＋Ｘ２^Cys81の２つのフラグメントの位置を明 らかにする。キロダルトンで表す分子量（マーカータンパク質の電気泳動により 決定した）は、左にある。白および黒の矢印は、それぞれＭＢＰ＋Ｘ２^Cys81お よびＭＢＰ１８．５の位置を表す。 図１５： 細菌細胞における組換えＭＢＰ発現および細胞内局在（可溶性画分 対不溶性画分）。細胞溶解物は、インサートを含まない対照ｐＥＴ２２ｂベクタ ー（「１」）、ｐＥＴ２２ｂ／ＭＢＰ１８．５^hum.（「２」）、またはｐＥＴ２ ２ｂ／ＭＢＰ＋Ｘ２^Cys81/Bact.（「３」）で形質転換したＢＬ２１（ＤＥ３） 細胞の誘導した培養から調製した。細菌溶解物は、上述したように中性緩衝液（ 「トリス」）または０．１Ｎ塩酸（「酸」）条件のいずれかを用いて、可溶性（ 「Ｓ」）または不溶性ペレット（「Ｐ」）画分に分画した。還元条件下で細胞画 分のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより得られたクマシー染色ゲルを示す（これらの条件下 では２量体は見られないことに注意されたい）。白および黒の矢印は、それぞれ ＭＢＰ＋Ｘ２^Cys81およびＭＢＰ１８．５の位置を表す。酸抽出（中性抽出では なく）により可溶性画分中へのＭＢＰ＋Ｘ２^Cys81およびＭＢＰ１８．５ポリペ プチドの回収が可能になったことに注意されたい。 図１６： 細菌細胞からの組換えＭＢＰの大量酸抽出。還元条件下で行った、 クマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す（これらの条件下では２量体は見 られないことに注意されたい）。３つのレーンの各群は、同時の酸抽出および機 械的破壊により得られた全細胞溶解物（「溶解物」）ならびに不溶性（「不溶」 ） および可溶性（「可溶」）画分を示す。細胞溶解物は、付加的なインサートを含 まない対照ｐＥＴ２２ｂベクター（「１」）、ｐＥＴ２２ｂ／ＭＢＰ１８．５^{hu m.} （「２」）、またはｐＥＴ２２ｂ／ＭＢＰ＋Ｘ２^Cys81/Bact.（「３」）で形 質転換したＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の誘導した培養から回収した。ＭＢＰ＋Ｘ２^Cys81 （白矢印）およびＭＢＰ１８．５^hum.（黒矢印）の位置を示す。この大量 酸抽出により、ほとんどすべてのＭＢＰ＋Ｘ２^Cys81およびＭＢＰ１８．５ポリ ペプチドの可溶性画分中への回収が可能になったことに注意されたい。 図１７： 酸抽出ＭＢＰ＋Ｘ２^Cys81の逆相クロマトグラフィによる単離を示す クロマトグラフ。図１６に示す実験により回収された可溶性画分（「可溶」レー ン「３」）を、ＶＹＤＡＣ Ｃ４逆相カラム上でクロマトグラフィを行い、２５ 〜５０％（ＣＨ₃ＣＮ）／０．１％ＴＦＡ勾配により溶出した。ＭＢＰ＋Ｘ２^{Cys 81} は、１７分と２０分の間に溶出する大きいピークに相当するプール画分中に見 出される。ＭＢＰ１８．５についても同様のクロマトグラフが得られた。 図１８： 細菌細胞の酸抽出物の金属キレートクロマトグラフィによるＭＢＰ ＋Ｘ２^Cys81（上のパネル）およびＭＢＰ１８．５（下のパネル）の精製。アフ ィニティ精製中に回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけたタンパク質画分のクマシー 染色ゲルを示す。ＭＢＰ＋Ｘ２^Cys81（白矢印）およびＭＢＰ１８．５（黒矢印 ）の位置を示す。レーンは、「ロード」（カラムに注入した溶解物）、「未結合 」（カラムのフロースルー（素通り）物）、「洗浄１」、「洗浄２」および「洗 浄３」（各洗浄からのカラム溶出物）、「溶出１」、「溶出２」および「溶出３ 」（各溶出工程からのカラム溶出物）、および樹脂（最終溶出の後に採取し、試 料緩衝液中で煮沸し、ゲルにかけたカラム樹脂の試料）と標識してある。 図１９： 示すとおりに、核酸配列ＭＢＰ１８．５^hum.（配列番号４）、ＭＢ Ｐ＋Ｘ２^Cys81/hum.（配列番号１）、ＭＢＰ＋Ｘ２^Ser81/bact.（配列番号３） およびＭＢＰ＋Ｘ２^Cys81/bact.（配列番号２）を含む核酸ベクターで形質転換 した細菌における細菌発現ＭＢＰポリペプチドの収率。 図２０： ＭＢＰ抗原は成人脳由来ＭＢＰに特異的なヒトＴ細胞クローンの増 殖応答を誘起する。成人脳ＭＢＰ１８．５に特異的なＴ細胞株を、培地のみ（「 対照」）、または１０mg の精製成人脳ＭＢＰ（「脳ＭＢＰ」）、細菌により産 生さ せたＭＢＰ１８．５（「ＭＢＰ１８．５」）もしくは細菌により産生させたＭＢ Ｐ＋Ｘ２^Cys81（「ＭＢＰ＋Ｘ２^Cys81」）を含有する培地で刺激した。実施例に おいて記載したように３連で行った単一の代表的な増殖アッセイからの総³Ｈ取 り込み cpm を報告してある。「２Ａ２」および「３Ｈ５」は実施例に記載した ように正常個体から得たヒトＴ細胞株である。 図２１： ＭＢＰ抗原に対するエクソン２特異的ヒトＴ細胞株の増殖応答。ヒ トＴ細胞株１Ｈ７および１Ｇ１を、培地のみ（「対照」）、または１０μg の精 製成人脳ＭＢＰ（「脳ＭＢＰ」）、細菌により産生させたＭＢＰ１８．５（「Ｍ ＢＰ１８．５」）、細菌により産生させたＭＢＰ＋Ｘ２^Cys81（「ＭＢＰ＋Ｘ２^{C ys81} 」）もしくは配列番号１のアミノ酸５９〜８４に相当するエクソン２にコー ドされるペプチド（「Ｘ２ペプチド」）を含有する培地で刺激した。実施例にお いて記載したように３連で行った増殖アッセイ中に取り込まれた総³Ｈ（cpm）を 示す。１Ｈ７および１Ｇ１は、ＭＢＰのエクソン２にコードされた領域に特異的 なヒトＴ細胞株であり、以下に図２２について説明する実験において用いた３Ａ １１株と同じＭＳ患者から得たものである。実施例において記載したように３連 で行った増殖アッセイ中に取り込まれた総³Ｈ（cpm）を示す。 図２２： ＭＢＰ＋Ｘ２^Cys81およびＭＢＰ＋Ｘ２^Ser81に対するエクソン２特 異的ヒトＴ細胞株の増殖応答。ヒトＴ細胞株３Ａ１１を、種々の用量のエクソン ２ペプチド（「Ａ」）、ＭＢＰ＋Ｘ２^Cys81（「Ｂ」）、ＭＢＰ＋Ｘ２^Ser81（「 Ｃ」）または培地のみ（「Ｄ」）で刺激した。３Ａ１１は、ＭＢＰのエクソン２ にコードされた領域に特異的なヒトＴ細胞株であり、図２１について説明する実 験において用いた１Ｈ７および１Ｇ１と同じＭＳ患者から得たものである。実施 例において記載したように３連で行った増殖アッセイ中に取り込まれた総³Ｈ（c pm）を示す。 図２３： 組換えヒトＭＢＰ＋Ｘ２^Cys81/bact.（胎児形態、「ｆ」、配列番号 １）の、成人脳由来ヒトＭＢＰ（成人形態、「ａ」、配列番号４）の配列との配 列比較。成人脳由来ヒトＭＢＰ配列（ＧenＢank 受託番号＃Ｍ１３５７７）は、 ＭＢＰ＋Ｘ２^Cys81/bact.のＥ．coli優先コドン配列と不一致の位置においての み記載してある。開始（ＡＴＧ）および停止（ＴＡＡ）コドンは両方の遺伝子に つい て示す。成人脳由来ヒトＭＢＰ配列におけるダッシュは、エクソン２（bp１７７ 〜２５５）およびＭＢＰ＋Ｘ^2Cys81/bact.のこのバージョンに付加されたヒスチ ジンタッグ（bp５９５〜６１２）（すなわち、６個のカルボキシ末端ヒスチジン 残基を有するＭＢＰ＋Ｘ２^Cys81/bact.、これもまたヒスチジンタッグと呼ばれ る）の位置を示す。ＭＢＰ＋Ｘ２^Cys81/bact.遺伝子の構築に用いた合成オリゴ ヌクレオチド間の重複領域に下線を付してある。意図的なＭＢＰ＋Ｘ２^{Cys81/ba ct.} 遺伝子配列のＣからＴへの塩基対突然変異は、位置４６２、５２８および５ ３２の上の星印によって記してある。これらの変化は、ＭＢＰ＋Ｘ２^Cys81アミ ノ酸配列を保存する。センスオリゴヌクレオチド１（配列番号５）は、ＮｄｅＩ クローニング部位の５′側に位置するＧＧＡＡＴＴＣＣＧＴＡＡＧＧＡＧＧＴＡ ＴＡＧ（この図に示していない）を含み、塩基１０８まで広がる。オリゴヌクレ オチド６（bp５１６〜６２２、配列番号１０）は、示した配列に対するアンチセ ンスオリゴヌクレオチドであり、ＨｉｎｄIII部位の３′側に位置するテトラヌ クレオチドＣＣＣＣ（この図に示していない）を含む。用いた他の４つのオリゴ ヌクレオチドは、センスオリゴヌクレオチド３（配列番号７）および５（配列番 号９）ならびにアンチセンスオリゴヌクレオチド２（配列番号６）および４（配 列番号８）を含む。アミノ酸８１のシステインは太字で記してある。 図２４： 組換えヒトＭＢＰ２１．５（「ｒｈＭＢＰ２１．５」）のＭＢＰエ ピトープの位置の図。数字は、試験したＴ細胞株の既知のエピトープ特異性（数 字の命名または「Ｇimer」により示す）に相当する配列番号１のアミノ酸残基を 示す。示した各々のＴ細胞株は、本発明の精製ｒｈＭＢＰ２１．５分子に対して 陽性のＴ細胞応答を与えた。 図２５： 試験した特異的分子の詳細および図２４に示す各Ｔ細胞株について 得られた結果。 発明の概要 したがって、ヒト患者におけるＭＳの診断、臨床的評価および治療のための、 ならびにそのような治療に対するＭＳ患者の潜在的応答性の評価のための、組成 物および方法を提供することは、本発明の１つの目的である。 本発明は、新規な組換えヒトＰＬＰポリペプチドを含む組成物を提供する。本 明細書および請求の範囲において用いる場合、「ＰＬＰポリペプチド」は、上述 のように、ヒトＰＬＰの少なくとも１つの親水性ドメインに相当する少なくとも １つの配列を含むポリペプチドをいう。本発明に従えば、このようなＰＬＰポリ ペプチドは、ＭＢＰ、ＭＯＧ、および／またはＭＡＧポリペプチド配列、ならび に他の関連ポリペプチド配列をさらに含んでいてもよい。また、ＰＬＰポリペプ チドをコードし、細菌細胞からのこのような分子の産生および単離を最適化する ように工学処理されているＤＮＡ構築体も提供する。 より具体的には、本発明の分子は、ネイティブなＰＬＰポリペプチドから少な くとも１つの疎水性ペプチド領域を除いた配列、好ましくは少なくとも２つの疎 水性ペプチド領域を除いた配列を含むアミノ酸の配列を含むＰＬＰムテイン（mu teins）を含む免疫反応性ポリペプチドを包含する。より好ましくは、アミノ酸 の配列は、ネイティブなＰＬＰポリペプチドから少なくとも３つの疎水性ペプチ ド領域を除いた配列を含む。最も好ましいのは、ネイティブなＰＬＰポリペプチ ドからＰＬＰの４つの疎水性ドメインすべての各々を構成する少なくともいくつ かのアミノ酸残基を除いた配列を含むアミノ酸の配列を含むＰＬＰムテインを含 む免疫反応性ポリペプチドである。 本発明のポリペプチドおよび核酸分子は、さらにＭＢＰ配列、すなわち配列番 号１または配列番号３の少なくとも１０個の連続するアミノ酸残基の任意のスパ ン（範囲）に相当する配列を含む。本明細書および請求の範囲において用いる場 合、「ＭＢＰポリペプチド」は、このようなＭＢＰ配列を含むポリペプチドをい い、「ヒトＭＢＰ遺伝子のエクソン２の少なくとも一部によりコードされるアミ ノ酸配列」は、配列番号１のアミノ酸６０〜８５にわたる領域からの少なくとも １０個の連続するアミノ酸に相当する少なくとも１０個の連続するアミノ酸の配 列をいう。 本発明は、新規な組換えヒトＭＢＰ２１．５ポリペプチド（すなわち、ヒトＭ ＢＰ遺伝子のエクソン２の少なくとも一部によりコードされるアミノ酸配列を含 むＭＢＰポリペプチド）を含む組成物を提供する。好ましくは、これらのＭＢＰ ポリペプチドは、ヒトＭＢＰ遺伝子の７つすべてのエクソンによりコードされる アミノ酸配列を含有する。ある好ましい態様においては、エクソン２によりコー ドされる配列は、ポリペプチドの大量産生および精製を容易にするために改変さ れている。また、ＭＢＰ２１．５ポリペプチドをコードし、細菌細胞からのこの ような分子の産生および単離を最適化するように工学処理されているＤＮＡ構築 体も提供する。 本発明の方法は、ＭＳの診断および臨床的評価、ならびにＭＳの治療およびこ のような治療に対するＭＳ患者の潜在的応答性の評価における本発明の組成物の 使用を含む。 好ましい態様の説明 上述のように、本発明は、ＭＳの治療、診断および臨床的評価における使用の ためのＭＢＰおよびＰＬＰポリペプチド（タンパク質）、およびＭＢＰおよびＰ ＬＰポリペプチドの産生に有用な核酸分子に関する。 Ｉ．ＭＢＰポリペプチド 本明細書および請求の範囲において用いる場合、「ＭＢＰ２１．５ポリペプチ ド」は、以下のポリペプチドの１つまたはそれ以上のものをいう ：配列番号１ のポリペプチド（ヒト２１．５kＤaＭＢＰ、「ＭＢＰ＋Ｘ２」）、アミノ酸８１ が任意の標準アミノ酸である配列番号１のポリペプチド（「ＭＢＰ＋Ｘ２^Xxx81 」）、システイン８１が他の任意の標準アミノ酸で置換された配列番号１のポリ ペプチド（「ＭＢＰ＋Ｘ２^Xaa81」）、システイン８１が無電荷のアミノ酸（す なわち、pＨ６〜７の間で荷電していないアミノ酸）により置換された、約１５ ９未満の分子量を有する配列番号１のポリペプチド（「ＭＢＰ＋Ｘ２^Xaa81<150 」）、およびシステイン８１がセリンで置換された配列番号１のポリペプチド（ 「ＭＢＰ＋Ｘ２^Ser81」）。 「ＭＢＰ２１．５ポリペプチド」は、その配列がヒトＭＢＰ遺伝子のエクソン ２によりコードされるアミノ酸の配列の少なくともいくらかを含み続けること、 さらに、そのポリペプチドがＭＳ患者から単離されたＭＢＰ反応性Ｔ細胞の集団 において「Ｔ細胞応答」を誘導しうることを条件として、前述の４つの配列の変 異体をも含む。「Ｔ細胞応答」という用語については以下に述べる。 本発明の１つの好ましいＭＢＰ２１．５ポリペプチドは、ヒトＭＢＰのエクソ ン２によりコードされるアミノ酸を含有し、約２１．５kＤa の分子量を有し、 Ｃ ｙｓ８１が別の標準アミノ酸で置換されている、細菌により発現されたヒト組換 えＭＢＰ（このポリペプチドは、本明細書において「ＭＢＰ＋Ｘ２^Xaa81」と呼 び、それをコードする核酸分子は、「ＭＢＰ＋Ｘ２^Xaa81/hum.」または「ＭＢＰ ＋Ｘ２^Xaa81/bact.」と呼ぶ。ここで、右肩の「hum.」または「bact.」は後述の ように核酸分子のコード領域におけるコドン利用度を示す）である。当業界にお いて用いるように、「標準」アミノ酸は、タンパク質に一般的に見出される２０ 種のアミノ酸の１つである。 本明細書において用いる場合、エクソン２によりコードされるアミノ酸配列は 、Ｘ２ＭＢＰまたは単にＸ２と呼ぶこととなる。本発明に従えば、Ｘ２ＭＢＰ配 列は、ネイティブなエクソン２によりコードされる配列の天然の位置（配列番号 １、配列番号２および配列番号３により示すもの）が好ましいが、ＭＢＰ＋Ｘ２^Xxx81 ポリペプチド中のいかなる位置にあってもよい。Ｘ２ＭＢＰ配列を含む他 のポリペプチドは、以下に記載する。 好ましくは、置換アミノ酸は、エピトープ変換を起こさない、すなわち、Ｘ２ ＭＢＰの免疫優性エピトープ（１つまたは複数）のＴ細胞認識は、特定の置換ア ミノ酸でのＣｙｓ８１の置換により実質的に変化しない。本発明以前には、別の 標準アミノ酸によるアミノ酸残基８１の置換がこのようなエピトープ変換を起こ すであろうかどうか（すなわち、このような変更がエピトープ中性であるか否か ）は未知であった。 任意の標準アミノ酸の置換によるエピトープ変換の欠如は、Ｘ２ＭＢＰと特異 的に反応性であるＴ細胞（例えばＴ細胞株）（Ｘ２ＭＢＰ特異的Ｔ細胞）の、Ｍ ＢＰ＋Ｘ２^Xaa81に対する、または、好ましくは以下に詳述するようにＭＢＰ＋ Ｘ２^Xaa81のエクソン２にコードされる領域を含む試験ペプチド（Ｘ２^Xaa81ペプ チド）に対する応答を試験することにより、本発明に従って決定することができ る。試験ペプチドは、好ましくはＣｙｓ８１が他の標準アミノ酸で置換されてい る配列番号１のアミノ酸残基５９〜８４に相当する配列を有する２６アミノ酸の ペプチド（「Ｘ２^Xaa81２６mer」）である。 Ｘ２ＭＢＰ特異的Ｔ細胞は、エクソン２にコードされるアミノ酸配列を含有す るペプチド（以下、「Ｘ２ＭＢＰペプチド」と呼ぶ）を用いて従来の方法により Ｔ細胞株として得ることができる。例えば、Ｖoskuhl et al.,1993aに記載され た方法を用いてもよい。Ｖoskuhl et al.,1993b;Ｓegal et al.,1994;Ｖoskuhl et al.,1994;およびＦritz and Ｚhao,1994も参照されたい。 好ましくは、ヒトＴ細胞株は、ちょうどエクソン２によりコードされる２６ア ミノ酸を有するＸ２ＭＢＰペプチド、すなわち配列番号１のアミノ酸残基５９〜 ８４に相当する配列のＸ２ＭＢＰペプチド（「Ｘ２ ２６mer」）を用いた刺激に 続いてこのような標準的方法により得る。特に、Ｘ２ ２６merでの刺激は、Ｖos kuhl et al.,1993a文献に記載された４０アミノ酸のＸ２ＭＢＰペプチドまたは ＭＢＰの１８．５kＤaアイソフォームでの刺激より好ましい。 本発明に従えば、このようにして得られたＸ２ＭＢＰ特異的Ｔ細胞株は、中で も、位置８１での特定のアミノ酸置換のエピトープ中性度を決定するために用い る。これは、Ｘ２^Xaa81ペプチドに対するＸ２ＭＢＰ特異的ヒトＴ細胞株の細胞 の反応を評価することにより達成される。（ＭＢＰ＋Ｘ２^Xaa81もエピトープ中 性度を試験するために使用することができるが、好ましさは劣る。）Ｘ２ＭＢＰ 特異的T細胞がＶoskuhl et al.,1993aにより規定されたＸ２ＭＢＰ特異性につい ての基準を満足する程度に、特定のアミノ酸置換を含有するＸ２^Xaa81ペプチド に応答する場合、すなわち、その特定のＸ２^Xaa81ペプチドが培地のみの対照と 比較して２を超える刺激インデックスを示す場合、特定の置換アミノ酸のエピト ープ中性度が確認される。好ましくは、刺激インデックスは３を超える。 本発明に従えば、このようなエピトープ中性置換は、一般的に、好ましくは強 疎水性ではない、分子量約１５０未満の荷電していないアミノ酸を用いて、達成 することができる。 これらの要件を満たすアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ 、およびＳｅｒである。最も好ましくは、置換はＳｅｒであり、Ｃｙｓ８１がＳ ｅｒ８１に変化しているエクソン２コード領域を含むＭＢＰ２１．５ポリペプチ ドがもたらされる（以下、このポリペプチドを「ＭＢＰ＋Ｘ２^Ser81」と呼び、 それをコードする核酸分子は、「ＭＢＰ＋Ｘ２^Ser81/hum.」または「ＭＢＰ＋Ｘ ２^Ser81/bact.」と呼ぶ。ここで、右肩の「hum.」または「bact.」は後述のよう に核酸分子のコード領域におけるコドン利用度を示す）である。 本発明以前には、Ｔ細胞が、細菌により発現されたＭＢＰ＋Ｘ２ポリペプチド を哺乳類により発現されたＭＢＰポリペプチド（例えば、ヒト由来ＭＢＰ−Ｘ２ ）と同程度まで認識し、それに対して応答するであろうかどうかは未知であった 。この不確実性は、中でも、細菌または哺乳類細胞におけるタンパク質発現中の タンパク質の折りたたみ（フォールディング）の差異による。細菌により発現さ れたポリペプチドは、典型的には哺乳類細胞により発現されたタンパク質のネイ ティブなコンフォメーションには折りたたまれない。上で「Ｔ細胞、抗原提示細 胞およびＴ細胞エピトープ」と題して発明の背景のセクションで論述したように 、タンパフォールディングは、特異的エピトープがＡＰＣにより適切にプロセッ シングされるかどうかを決定しうる。この理由のため、細菌により発現されたタ ンパク質は、ネイティブなタンパク質と同じようにＡＰＣによりプロセッシング され提示されない可能性があり、したがって、Ｔ細胞により認識されない可能性 がある。 ＭＢＰ＋Ｘ２^Cys81のエクソン２配列は、このような配列が合成ペプチド（こ れらは、ＴＣＲにより認識されＴ細胞により応答されるために、ＡＰＣによりプ ロセッシングされる必要がない）としてＴ細胞に加えられた場合にＴ細胞を刺激 することが示されていたにすぎないため、さらなる不確実性の原因であった。本 発明以前には、（供給源を問わず）ＭＢＰの２１．５kＤa アイソフォームが脳 炎誘発性Ｔ細胞を刺激するようにＡＰＣによって正しくプロセッシングされうる こと、（ＭＳ病因論におけるＸ２エピトープの役割に関する特別に興味深い疑問 である）は示されたことがなかった。本発明は、従来報告されたＸ２ＭＢＰペプ チドの研究の臨床的関連性を明らかにし、これが事実であることの証明を可能に した。 II ．ＰＬＰポリペプチド 本発明の好ましいＰＬＰペプチドは、親水性ドメイン２、３および４を含む細 菌により発現されたヒト組換えＰＬＰである。このようなＰＬＰポリペプチドは 、１つまたはそれ以上の疎水性ドメインを含んでいてもよい。より好ましくは、 ＰＬＰポリペプチドは、表１に示すＭＳ関連ＰＬＰエピトープを含む。このよう な好ましいＰＬＰポリペプチドとしては、ΔＰＬＰ３（配列番号２３）およびΔ Ｐ ＬＰ４（配列番号２４）が挙げられる。本発明の特に好ましい分子は、配列番号 ２３もしくは配列番号２４、または好ましくは配列番号２５、配列番号２６（好 ましくは配列番号２６のアミノ酸残基１〜３６８、１および３６８を含む）、配 列番号２７（好ましくは配列番号２７のアミノ酸残基６〜３７４、６と３７４を 含む）もしくは配列番号２８（好ましくは配列番号２８のアミノ酸残基１〜４８ ７、１と４８７を含む）に相当するアミノ酸配列を含むＰＬＰムテインである。 特に好ましい態様の１つにおいては、免疫反応性ポリペプチドは、少なくとも １０個の連続するアミノ酸（すなわち、エピトープを含むのに十分なサイズのア ミノ酸の直鎖状ポリマー）を含み、そのうち１つの標的アミノ酸残基を除いてす べてが配列番号１のアミノ酸残基８１を含むヒトＭＢＰの２１．５kＤa アイソ フォーム（配列番号１）の領域に相当する。この態様においては、標的アミノ酸 残基は、配列番号１のアミノ酸残基８１の位置に相当するＭＢＰアミノ酸配列内 の位置にあり、標的アミノ酸残基はシステイン以外の任意の標準アミノ酸である 。 本発明のある好ましい免疫反応性ポリペプチドは、ヒトミエリンオリゴデンド ロサイト糖タンパク質（配列番号２８のアミノ酸残基１９９〜３１９、１９９と ３１９を含む）のアミノ酸配列の少なくとも１０個の連続するアミノ酸に相当す るミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質アミノ酸配列を、さらに含む。 好ましくは、本発明の免疫反応性ポリペプチドは、ネイティブなＰＬＰポリペ プチドよりも高いレベルで細菌中において発現され、および／または水性溶液中 でネイティブなＰＬＰポリペプチドよりも可溶性である。 ＰＬＰ特異的Ｔ細胞は、ＰＬＰアミノ酸配列を含むペプチドを用いて従来の方 法によりＴ細胞株として得ることができる。例えば、Ｖoskuhl et al.,1993a に より記載された方法を用いることができる。Ｖoskuhl et al.,1993b;Ｓegal et al.,1994;Ｖoskuhl et al.,1994;Ｆritz and Ｚhao,1994;Ｐelfrey et al.,1993 ;Ｐelfrey et al.,1994;およびＣorreale et al.,1995も参照されたい。 本発明以前には、細菌により発現されたＰＬＰポリペプチドがそれを治療剤と して使用することが可能なようにＴ細胞により認識され応答されるであろうかど うかは未知であった。この不確実性は、中でも、細菌または哺乳類細胞における タンパク質発現中のタンパク質フォールディングの差異による。細菌により発現 されたタンパク質は、典型的には哺乳類細胞により発現されたタンパク質のネイ ティブなコンフォメーションには折りたたまれない。上で「Ｔ細胞、抗原提示細 胞およびＴ細胞エピトープ」と題して発明の背景のセクションで論述したように 、タンパク質フォールディングは、特異的エピトープがＡＰＣにより適切にプロ セッシングされるかどうかを決定しうる。この理由のため、細菌により発現され たタンパク質は、ネイティブなタンパク質と同じようにＡＰＣによりプロセッシ ングされ提示されない可能性がある。したがって、このような細菌により発現さ れたタンパク質のいくつかまたはすべてのエピトープがＴ細胞により認識されな い可能性がある。 III ．ＭＢＰおよびＰＬＰポリペプチドをコードする核酸分子 本発明の実施において有用な核酸分子は、当業界で現在公知のあるいは後に開 発される種々の技術を用いて調製することができる。例えば、当業界で周知の技 術を用いて、これらをクローン化された遺伝子を用いて製造することができる。 本明細書において用いる場合、遺伝子（単数または複数）という用語は、イント ロンを包含する配列を有するまたはイントロンを有さない、発現される（例えば タンパク質をコードする）核酸分子、例えばｃＤＮＡにわたる。クローン化され た遺伝子は、従来の技術、例えばＭＢＰもしくはＰＬＰポリペプチドの部分をコ ードする制限フラグメントを生成するための核酸分子の制限消化および／または ＰＣＲ増幅により操作される。これらのフラグメントは、例えばＰＣＲ融合（重 複ＰＣＲ）または制限消化生成物の酵素的連結を用いて組み立てることができる 。組み立てられた構築体またはそのフラグメントは、オリゴヌクレオチドを介す る位置特異的突然変異誘発のような突然変異誘発技術により改変することができ る。 これらの従来技術を教示する多数の刊行物が利用可能であり、Ｓambrook,et a l.,1989;Ｈo et al.,Ｇene 1989;Ｆarrell,1993; Ａusubel et al.,1994;Ｇriff in and Ｇriffin,1994;Ｍullis et al.,1994;Ｈarwood,1994;およびＤavis et a l.,1994が挙げられる。あるいは、本発明の実施に用いられるＭＢＰまたはＰＬ Ｐポリペプチドをコードする核酸分子またはこのような核酸分子を組み立てるの に用いられる核酸フラグメントのいずれかもしくはすべては、化学的手段により 合成することができる（例えば、Ｔalib et al.,1991 およびＡusubel et al.,1 994 を参照さ れたい）。 本発明に従えば、本発明のＭＢＰおよびＰＬＰポリペプチドの種々のアミノ酸 についてのコドンは、細菌中でのタンパク質産生を強化するために「細菌化」し てもよい。当業界で公知のように、細菌は、特定のアミノ酸についてのある一定 のコドンを、同じアミノ酸をコードする他の可能なコドンよりも優先して用いる 傾向がある。したがって、細菌のタンパク質合成装置（マシナリー）は好まれる コドンを処理する場合により有効に働きうると信じられている。ミエリンタンパ ク質をコードするコドンの細菌化およびその他の変更は、本発明のＭＢＰ分子を 具体的に引用して例示し、以下に詳述する。 配列番号１は、ネイティブなＭＢＰのヒト２１．５kＤa 胎児性アイソフォー ムについてのアミノ酸およびヌクレオチド配列を規定する。ＭＢＰ＋Ｘ２^Xaa81 をコードする核酸分子は、配列番号１のヌクレオチド２４１から２４３（すなわ ちコドン８１）の少なくとも１つのヌクレオチドを、そのコドンが所望の置換ア ミノ酸に相当するように改変することにより、製造することができる。このよう な改変は、上述したオリゴヌクレオチド媒介位置特異的突然変異誘発、ＰＣＲ突 然変異誘発、または所望のポリヌクレオチドのデノボ合成のような従来の組換え ＤＮＡ技術を含め、当業界で現在公知のまたは今後開発される種々の核酸操作技 術を用いて達成することができる。 ＭＢＰ＋Ｘ２^Ser81については、ネイティブなＴＧＣコドンは、ＡＧＣ、ＡＧ Ｔ、ＴＣＡ、ＴＣＣ、ＴＣＧおよびＴＣＴのいずれかに変更することができる。 一般に、この変更は、好ましくはＴＣＧへのものである。これは、この変更がそ の位置に新しいＴＣＧＡ制限部位を創設する結果となるからである。この位置で の新しい制限部位の創設は、ＭＢＰ＋Ｘ２^Ser81をコードする核酸分子のような ＭＢＰ＋Ｘ２^Xaa81をコードする核酸分子の製造の全体的過程における中間工程 として典型的に得られる改変および未改変核酸分子の混合物からの、所望の改変 を有する核酸分子の同定および単離を容易にする。タンパク質産生の最適化の配 慮が核酸操作の容易さの配慮に優先する場合、およびＭＢＰ＋Ｘ２^Ser81が細菌 （例えばＥ.coli）中で産生されるべき場合（この場合、ＴＣＧは細菌に好まれ るコドンではない）、ＴＣＣ、ＴＣＴまたはＡＧＣが細菌中で好まれるコドンで あるから、この 変更は、好ましくはＴＣＣ、ＴＣＴまたはＡＧＣへのものである。 配列番号２は、ＭＢＰのネイティブなヒト２１．５kＤa 胎児性アイソフォー ムについてのアミノ酸配列、およびこのタンパク質をコードする改変されたヌク レオチド配列（ここでは細菌中でのタンパク質の産生を強化するために種々のア ミノ酸についてのコドンが「細菌化」されている）を規定する。当業界で公知の ように、細菌は、特定のアミノ酸についてのある一定のコドンを、同じアミノ酸 をコードする他の可能なコドンよりも優先して用いる傾向がある。したがって、 細菌のタンパク質合成装置は好まれるコドンを処理する場合により有効に働きう ると信じられている。しかし、これも当業界で公知のように、好まれないコドン を好まれるコドンで置き換えることが実際に細菌中での特定のタンパク質の産生 の実質的な強化をもたらすかどうかは予測ができない。以下に実施例において詳 細に述べるように、配列番号２の細菌化は、Ｅ.coli 中におけるＭＢＰの産生を 少なくとも５０％増加させた。 配列番号２においては、細菌化は、既に細菌により好まれるコドン（基準１） に相当していないネイティブなヒトコドンを細菌により好まれるコドンで置換す ることにより行った。どのコドンを変更するかを選択するに際し、次の７つのア ミノ酸に特に注意を払った：Ａｒｇ（２１個のうち１７個のコドンを変更した） ；Ｇｌｙ（２８個のうち１３個のコドンを変更した）；Ｐｒｏ（１７個のうち１ ０個のコドンを変更した）；Ｌｙｓ（１４個のうち１２個のコドンを変更した） ；Ｌｅｕ（１１個のうち３個のコドンを変更した）；Ｔｈｒ（８個のうち６個の コドンを変更した）；およびＶａｌ（５個のうち３個のコドンを変更した）。こ れらのアミノ酸は、Ｅ.coli 中におけるその重複コドンの一定のものの使用につ いての強い偏向（Ｗada et al.,1992）のため、強調した。これらの７種のうち 、Ａｒｇ、ＰｒｏおよびＬｙｓは、これらがＭＢＰ２１．５中のアミノ酸残基の ２６％を構成するので、最も重要と考えられた。代替的な基準として、いくつか のコドンは、高度に発現される細菌遺伝子において優先的に用いられるコドンに 変更した（基準２、Ｇrosjean and Ｆiers,1982を参照されたい）。配列番号３ に相当する核酸分子に取り入れられたコドン変更の完全なリスト（配列番号３に 見出されるアミノ酸番号８１についてのＳｅｒコドンの代わりに、この比較にお いてはネイ ティブなシステイン８１が維持されていることを除く）を表４に示す。ここでは 、ネイティブな（胎児性）ヒトＭＢＰ２１．５配列データは「ｈｕＭＢＰ２１． ５」として示し、細菌化した組換えＭＢＰ配列データ（ＭＢＰ＋Ｘ２^{Cys81/bact .} ）は「ｒｅｃＭＢＰ２１．５」として示す。 本明細書および請求の範囲において用いる場合、「細菌により好まれるコドン 」という表現は、上記の２つの基準のいずれかに基づいて選択されるコドンをい い、右肩に付した(１)「hum.」および(２)「bact.」は、(１)ネイティブなヒトコ ドンおよび(２)ネイティブなヒトコドンから細菌により好まれるコドンへ変更さ れている少なくともいくつかのコドン、を有するＭＢＰコード核酸配列を表す。 望ましい場合には、所望のレベルの産生の増加が達成されるかどうかを基準と し、多かれ少なかれ細菌化を行うことができる。また、ＭＢＰに関しては、細菌 化された配列は、ＭＢＰ＋Ｘ２^Xaa81/bact.または好ましくはＭＢＰ＋Ｘ２^{Ser81 /bact.} を産生するようにさらに変更することができる。細菌化および付加的なコ ドン８１の変更は、上述および実施例に記載する核酸操作技術を用いて行うこと ができる。 上述のように、配列番号３は、ＭＢＰ＋Ｘ２^Ser81をコードし、さらにコード されるポリペプチドのカルボキシ末端の６個のヒスチジン残基をコードする３′ 末端の付加的な１８ヌクレオチド配列（終止コドンの直前、すなわち配列番号３ のヌクレオチド５９２〜６０９）（このような少なくとも４残基の複数のヒスチ ジン添加をヒスチジンタッグと呼ぶ）を含む細菌化ヌクレオチド配列を示す。こ のヒスチジンタッグは、ネイティブなＭＢＰ＋Ｘ２^Cys81/hum.タンパク質には見 出されず、このＭＢＰ＋Ｘ２^Ser81/bact.遺伝子の発現のポリペプチド産物の精 製を容易にするために付加された。 ヒスチジンタッグは、金属キレート剤として作用する少なくとも５個の連続す るヒスチジン残基の群であり、金属キレートクロマトグラフィまたは同様のもの を使用してこのようなタッグを含むポリペプチドをタンパク質の混合物から迅速 かつ効率よく精製することを可能にする。本発明に従えば、本発明のポリペプチ ドの容易な精製を可能にするように、このようなヒスチジンタッグは、本発明の いずれのポリペプチドに付加してもよく、あるいはこのようなタッグをコードす る配列を本発明のいずれの核酸分子に付加してもよい。 本発明の好ましい核酸分子は、好適な宿主において発現された場合に本発明の ＭＢＰおよび／またはＰＬＰポリペプチドの発現を指示するヌクレオチド配列（ および／またはそれに相補的なヌクレオチド配列）を含む単離された核酸分子で ある。 本発明のタンパク質コード核酸分子は、適切な発現ベクター、すなわち挿入さ れたタンパク質コード配列の転写および翻訳に必要な要素を含むベクター中に挿 入することができ、ＭＢＰおよび／またはＰＬＰポリペプチドの産生に用いるこ とができる。タンパク質コード配列を発現させるために、多様な宿主ベクター系 を利用することができる。それらのものとしては、ワクシニアウイルス、アデノ ウイルス、レトロウイルス等のようなウイルスにより感染される哺乳類細胞系； プラスミドでトランスフェクションされる哺乳類細胞系；バキュロウイルスのよ うなウイルスにより感染される昆虫細胞系；酵母発現ベクターを含む酵母または バクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡもしくは同様の ものにより形質転換される細菌のような微生物が挙げられるが、これらに限定さ れない。 細菌の使用に有用な発現ベクターは、周知のクローニングベクターｐＢＲ３２ ２の遺伝要素（Ａmerican Ｔype Ｃulture Ｃollection, 12301 Ｐarklawn Ｄri ve，Ｒockville, Ｍaryland 20852，ＵＳＡ；ＡＴＣＣ受託番号３７０１７）を 含むものなどの市販のプラスミド由来の選択マーカーおよび細菌複製起点を含む ことができる。これらのｐＢＲ３２２「骨格セクション」または機能的に等価な 配列は、適切なプロモーターおよび発現すべき構造遺伝子と組み合わせる。 好ましい細菌発現ベクターとしては、ファージＴ７プロモータープラスミドｐ ＥＴ１４ｂ、およびｐＥＴ２２ｂ（Ｎovagen,Ｍadison,ＷＩ）が挙げられるが、 これらに限定されない。これらのベクターは、好ましくはＥ.coliＢＬ２１（Ｄ Ｅ３）（Ｎovagen,Ｍadison,ＷＩ）において発現させる。この菌株は、Ｔ７ポリ メラーゼ遺伝子をＥ.coliｌａｃＵＶ５プロモーターのうしろに含む組換えバク テリオファージＤＥ３溶原（Ｓtudier et al.,1990）について溶原性である。他 の好ましい細菌発現ベクターは、ｐＥＴＴｒｃ ＳＯ５／ＮＩベクター（配列番 号２１）、ｐＴ ｒｃ ９９Ａベクター(Ｐharmacia)およびｐＳＥベクター(Ｉnvitrogen,Ｓan Ｄi ego,ＣＡ）を含むＴｒｃベクターである。 組換え微生物発現ベクターにおいて一般に用いられる他のプロモーターとして は、ラクトースプロモーター系（Ｃhang,et al.,1978）、トリプトファン（ｔｒ ｐ）プロモーター（Ｇoeddel,et al.,1980）およびｔａｃプロモーター、または ｔｒｃプロモーターと呼ばれるｔａｃプロモーターとｔｒｐプロモーターとの融 合物（Ｓambrook,et al.,1989、およびＭaniatis et al,1982、特に412頁を参照 されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。特に好ましいプロモーター は、バクテリオファージプロモーター、例えば上述のＴ７プロモーターであり、 これは、宿主細胞中において対応するバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ、 例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼの発現とともに用いることができる。 組換えＭＢＰおよびＰＬＰポリペプチドは、菌類宿主、好ましくはＳ.cerevis iae のような Ｓaccharomyces 属の酵母においても発現させることができる。Ａs pergillus 、Ｐicha または Ｋluyveromyces のような他の属の菌類もまた、用い てもよい。菌類ベクターは、一般的に酵母２μm プラスミドまたは別の自律複製 配列（ＡＲＳ）由来の複製起点、プロモーター、ＭＢＰおよび／またはＰＬＰを コードするＤＮＡ、ポリアデニル化および転写終結を指示する配列、および選択 マーカー遺伝子を含む。好ましくは、菌類ベクターは、Ｅ.coli および菌類の両 方の形質転換を可能にする複製起点および選択マーカーを含む。 菌類における好適なプロモーター系としては、メタロチオネイン、３−ホスホ グリセリン酸キナーゼ、またはエノラーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸キナー ゼおよびグルコキナーゼのような他の解糖酵素のプロモーター、ならびにグルコ ース抑制アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（ＡＤＨ２）、アルコールデ ヒドロゲナーゼ遺伝子ＡＤＨ１由来の構成的プロモーターなどが挙げられる。例 えば、Ｓchena,et al.,1991を参照されたい。酵母α因子または酵母インベルタ ーゼの分泌を指示するもののような分泌シグナルは、菌類ベクターに取り入れて 、菌類生育培地中へのＭＢＰおよび／またはＰＬＰポリペプチドの分泌を促進す ることができる。Ｍoir,et al.,1991を参照されたい。 好ましい菌類発現ベクターは、細菌中においての選択および複製についてｐＢ Ｒ３２２からのＤＮＡ配列、および菌類ＤＮＡ配列（ベクターｐＡＡＨ５に見出 されるようなＡＤＨ１プロモーターおよびアルコールデヒドロゲナーゼＡＤＨ１ 終結配列を含む（Ａmmerer,1983））を用いて構築することができる。 種々の哺乳類または昆虫細胞培養系を用いて本発明の組換えＭＢＰおよび／ま たはＰＬＰポリペプチドを発現させることができる。昆虫細胞における非相同タ ンパク質の産生のための好適なバキュロウイルス系は、Ｌuckow,et al.,1988に より論評されている。好適な哺乳類宿主細胞株の例としては、サル腎臓起源のＣ ＯＳ細胞、マウスＣ１２７乳上皮細胞、マウスＢＡＬＢ／ｃ−３Ｔ３細胞、マウ スＭＯＰ８細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ヒト２９３Ｔ細 胞、ＨｅＬａ、ミエローマ、およびベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞が挙げ られる。哺乳類発現ベクターは、複製起点、発現されるべきＭＢＰおよび／また はＰＬＰコード配列にリンクしたエンハンサーおよび好適なプロモーター、およ びリボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、スプライスドナーおよびアクセプ ター部位および転写終結配列などの他の５′もしくは３′隣接（フランキング） 配列のような非翻訳要素を含んでいてもよい。 脊椎動物細胞の形質転換に用いるべき哺乳類発現ベクター系中の転写および翻 訳制御配列は、ウイルス起源のものであってもよい。例えば、一般的に用いられ るプロモーターおよびエンハンサーは、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、 シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、ワクシニアウイルス、およびヒトサイトメ ガロウイルス由来であり、サイトメガロウイルス immediate-early 遺伝子１プ ロモーターおよびエンハンサーが含まれる。 組換えＭＢＰおよび／またはＰＬＰポリペプチドの発現のための特に好ましい 真核細胞ベクターは、ｐＡＰＥＸ−１（配列番号１１）であり、より好ましくは ｐＡＰＥＸ−３ｐ（配列番号１２）である。ベクターｐＡＰＥＸ−１は、タンパ ク質発現レベルを増加するように改変されたベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉ nvitrogen）の誘導体である。第一に、３′非翻訳ＳＶ４０スモールｔ抗原イン トロンを、６０１塩基対のＸｂａＩ／ＨｐａＩフラグメントの欠失により除去し た。これは、このイントロンが上流コード領域への異常なスプライシングを受け やすいためである（Ｅvans and Ｓcarpulla,1989;huang and Ｇorman,1990）。 第二に、４８４塩基対のＮｄｅＩ−ＮｏｔＩフラグメントをベクターｐＲｃ／Ｃ ＭＶ７ＳＢ由来（Ｓato et al.,1994,Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.269:17267、以下参照）の 対応する８４５塩基対のＮｄｅＩ−ＮｏｔＩフラグメントで置き換えることによ り、アデノウイルス／免疫グロブリンキメラハイブリッドイントロンを５′非翻 訳領域に導入した。最後に、Ｅ.coli からのプラスミドＤＮＡ収率を上げるため に、得られたＣＭＶプロモーター発現カセットをベクターｐＧＥＭ−４Ｚ（Ｐro mega Ｃorp.Ｍadison,ＷＩ）にシャトル化した。 ベクターｐＡＰＥＸ−３は、ＥＢＮＡ遺伝子が最初に２．４kbＣｌａＩ／Ａｃ ｃＩフラグメントの欠失により除去されているベクターｐＤＲ２（Ｃlontech Ｌ aboratories,Ｉnc.Ｐalo Ａlto,ＣＡ）の誘導体である。次いで、ＲＳＶプロモ ーターがＣＭＶプロモーターで置き換えられ、アデノウイルス／免疫グロブリン キメライントロンが、ｐＤＲ２からの４５０bp のＭｌｕｌ／ＢａｍＨＩフラグ メントをベクターｐＡＰＥＸ−１からの１．０kb のＭｌｕＩ／ＢａｍＨＩフラ グメントと交換することにより置き換えられている。ｐＡＰＥＸ−３Ｐの構築の ためには、ＨＳＶ ｔｋプロモーターおよびハイグロマイシンホスホトランスフ ェラーゼ（ｈｙｇ）遺伝子を含む１．７kb のＢｓｔＩ／ＳｗａＩフラグメント をｐＡＰＥＸ−３から除去し、ＳＶ４０初期プロモーターおよびピューロマイシ ンアセチルトランスフェラーゼ（ｐａｃ）遺伝子を含む１．１kb のＳｎａＢＩ ／ＮｈｅＩフラグメント（Ｍorgenstern and Ｌand,1990,Ｎucleic Ａcids Ｒes .18:3587-3596）およびベクターｐＡＰＥＸ−１からのＳＶ４０ポリアデニル化 シグナルを含む１３７bpのＸｂａＩ／ＣｌａＩフラグメントで置き換えた。 ｐＡＰＥＸベクター中の組換えＭＢＰおよび／またはＰＬＰをコードするイン サートの発現のための特に好ましい宿主細胞は、ヒト２９３ＥＢＮＡ細胞株（Ｉ nvitorgen,Ｓan Ｄiego,ＣＡ）である。 組換えＭＢＰおよび／またはＰＬＰの発現のための別の好ましい真核細胞ベク ターは、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉnvitrogen Ｃorporation,Ｓan Ｄiego,ＣＡ ）である。ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ発現ベクターは、ヒトサイトメガロウイルス最 初期（immediate-early）遺伝子Ｉプロモーターおよびエンハンサー要素、シミ アンウイルス４０（ＳＶ４０）コンセンサスイントロンドナーおよびアクセプタ ースプ ライシング配列、およびＳＶ４０コンセンサスポリアデニル化シグナルを含む。 このベクターは、ＳＶ４０ラージＴ抗原により形質転換された細胞（例えばＣＯ Ｓ細胞、ＭＯＰ８細胞など）中でのエピゾーム性増幅を可能にするＳＶ４０複製 起点、および細菌宿主における増殖および選択のためのアンピシリン耐性遺伝子 をも含む。 III ．本発明のポリペプチドの調製 精製組換えＭＢＰおよびＰＬＰは、好適な宿主／ベクター系（好ましくは細菌 系）を培養して本発明の核酸分子の組換えＭＢＰおよび／またはＰＬＰ翻訳生成 物を発現させ、次いでこれを宿主系、例えば細菌、昆虫細胞、菌類または哺乳類 細胞の培地または細胞抽出物から精製することにより調製する。したがって、本 発明は、宿主により本発明の核酸分子が発現されるように本発明の核酸分子を含 有する組換え宿主を生育させること、および発現されたポリペプチドを単離する ことを特徴とするＭＢＰおよびＰＬＰポリペプチドの生産方法を提供する。 分泌産物として１つ以上のヒスチジンタッグ配列（少なくとも５個のヒスチジ ン残基のストレッチを含む配列）を含有する組換えＭＢＰおよび／またはＰＬＰ タンパク質を発現する細胞の発酵は、精製を大幅に簡素化する。このようなヒス チジンタッグ配列は、特異的条件下でニッケルのような金属への、したがって精 製用ニッケル（または他の金属）カラムへの結合を可能にする。 一般的に言って、精製は、好適なセットの濃縮および分画（例えばクロマトグ ラフィ）工程を用いて行う。ＭＢＰポリペプチドの精製のためには、特に好まし い精製工程は、「ＭＢＰポリペプチドの精製および特徴づけ」と題して以下に実 施例に記載するように、酸抽出を包含する。 本発明の精製されたＭＢＰおよびＰＬＰポリペプチドは、どのようにして調製 されたものであっても、いくらかの不純物の存在を特徴とする。これらの不純物 は、用いた産生および精製過程に依存する量および特徴のタンパク質、炭水化物 、脂質、または他の分子を含んでいる可能性がある。これらの成分は、通常、ウ イルス、原核細胞、真核細胞または合成起源であり、好ましくは非発熱性であっ て約１重量％未満の桁の特に害のない夾雑物の量で存在する。 IV ．臨床的適用 上述のように、本発明のＭＢＰおよび／またはＰＬＰ核酸分子によりコードさ れるＭＢＰおよびＰＬＰポリペプチドは、ＭＳの診断、臨床的評価および治療の ため、およびＰＬＰポリペプチドの投与に関与する治療的処置に対するＭＳ患者 の潜在的応答性の評価のために用いることができる。このような診断および評価 の手順は、本明細書で論述するＭＢＰおよびＰＬＰポリペプチドの１つまたはそ れ以上の存在下および非存在下におけるＴ細胞の複製（レプリカ）培養物のイン キュベーション、およびその１つまたはそれ以上のポリペプチドの存在下でのイ ンキュベーションの結果もたらされるが、非存在下でのインキュベーションによ ってはもたらされないＴ細胞活性化および／またはＴ細胞アポトーシス（この明 細書においておよび請求の範囲において「Ｔ細胞応答」と呼ぶ）の検出を必要と するアッセイを含む。 より具体的には、このようなアッセイは、好ましくは患者からＴ細胞を単離し 部分的に精製すること、単離されたＴ細胞を、配列番号１のポリペプチド、シス テイン８１が他の任意の標準アミノ酸で置き換えられている配列番号１のポリペ プチド、システイン８１が分子量約１５０未満の荷電していないアミノ酸で置き 換えられている配列番号１のポリペプチド、およびシステイン８１がセリンで置 き換えられている配列番号１のポリペプチドよりなる群から選択されるポリペプ チドのようなＰＬＰおよび／またはＭＢＰポリペプチド；および／または配列番 号２３のポリペプチド、配列番号２４のポリペプチド、配列番号２６のポリペプ チド、配列番号２７のポリペプチド、配列番号２８のポリペプチド、または上述 のその他の好ましいＭＢＰまたはＰＬＰポリペプチドと一緒にすること、および 上記ポリペプチドにより誘導されたＴ細胞応答のレベルを測定することを含む。 Ｔ細胞応答の測定方法は、以下に「Ｔ細胞応答の検出」の小見出しの下に記載す る。 本発明に従えば、このようなアッセイは、単離されたＰＬＰまたはＭＢＰ２１ ．５ポリペプチドを、以下に「Ｔ細胞応答の検出」の小見出しの下に記載する要 素の任意のもののようなＴ細胞応答の検出に使用するための要素の近傍におよび ／または密封して（in close confinement）含む、ＭＢＰまたはＰＬＰ反応性Ｔ 細胞の検出のためのキットとして提供してもよい。このようなキットの１つの好 まし い態様においては、キットは、そのキットが多発性硬化症の診断および／または 臨床的評価における使用のためのものであることを示すラベルをも含む。 患者のＣＳＦ中のＴ細胞がこのようにしてＰＬＰまたはＭＢＰ２１．５ポリペ プチドとともにインキュベーションされた場合にＴ細胞応答を呈するという発見 は、その患者がＭＳを患っているという表示として受け取られる。ＭＳ患者のＣ ＳＦおよび／または血液中のこのようなＭＢＰまたはＰＬＰ応答性Ｔ細胞の発見 は、その患者がＭＢＰおよび／またはＰＬＰポリペプチドによる治療の適切な候 補者であることの表示である。血液またはＣＳＦ中のこのようなＴ細胞のレベル は、疾患の進行および治療に対する応答の表示として監視してもよい。 患者の血液および／またはＣＳＦ中のこのような反応性Ｔ細胞の数（「前駆体 頻度」または「反応性Ｔ細胞インデックス」）は、経時的に監視することができ 、増加する数は悪化を示し、減少する数は改善を示すものとして、疾患の臨床的 進行の指標として用いることができる。反応性Ｔ細胞インデックスは、いつ治療 的処置が適切であるかを予言するものとしても役立つ。例えば、インデックスの 突然の増加は、治療的介入を開始または強化すべきであることを示唆する。イン デックスが治療の経過中監視される場合、その治療がＭＢＰおよび／またはＰＬ Ｐポリペプチドの投与を包含するか否かにかかわらず、反応性Ｔ細胞インデック スの有意な減少は、治療の成功の表示であり、一方、インデックスの有意な上昇 は治療の失敗を示し、治療法を調整すべきであることを示唆する。 したがって、本発明は、患者からのＴ細胞を単離し部分的に精製すること、単 離されたＴ細胞を免疫反応性ＭＢＰ２１．５ポリペプチドまたはＰＬＰポリペプ チド（ＰＬＰポリペプチドはネイティブなＰＬＰポリペプチドから少なくとも１ つまたは２つの疎水性ペプチド領域を除いたもの、好ましくは少なくとも３つの 疎水性ペプチド領域を除いたものであるアミノ酸配列を有するＰＬＰムテインア ミノ酸配列を含む）と一緒にすること、および上記ポリペプチドにより誘導され たＴ細胞応答のレベルを測定することを特徴とするアッセイを提供する。 本発明は、免疫反応性ＰＬＰポリペプチド（ネイティブなＰＬＰポリペプチド から少なくとも１つまたは２つの疎水性ペプチド領域を除いたもの、好ましくは 少なくとも３つの疎水性ペプチド領域を除いたものであるアミノ酸配列を有する ＰＬＰムテインアミノ酸配列を含む）を、Ｔ細胞応答の検出に用いる薬剤と密接 に制限および／または近傍に含むＭＢＰ反応性Ｔ細胞の検出のためのキットをさ らに提供する。本発明に従えば、このようなキットは、そのキットが多発性硬化 症の臨床的評価における使用のためのものであることを示すラベルをさらに含ん でいてもよい。 Ａ．Ｔ細胞応答の検出 Ｔ細胞活性化およびアポトーシスのアッセイは、当業者には周知である。この ようなアッセイの詳細な論述およびプロトコールは、Ｗier,1978;Ｋlaus,1987; Ｖoskuhl et al.,1993;およびＯrmerod,1994を含む多数の刊行物に見出すことが できる。このようなアッセイは、Ｔ細胞活性化および／またはアポトーシスのあ る種の重要な指標の変化を測定する。 Ｔ細胞活性化については、これらの指標は、一般的にＴ細胞増殖、サイトカイ ン放出、およびサイトカインレセプターおよび他の活性化関連細胞表面マーカー の発現の検出のための試薬を含む。アポトーシスについては、これらの指標は、 一般的に核の収縮および／または細胞死の観察／検出のための色素、染色、およ び他の試薬；アポトーシス性の細胞死を阻害しうる代謝阻害剤；染色、酵素、標 識核酸前駆体、およびＤＮＡ分解の他の指標を含む。 Ｔ細胞活性化およびアポトーシスのすべてのアッセイは、細胞培養（組織培養 ）の供給品（典型的にはマルチウェルプレート、シャーレおよびフラスコのよう な培養容器、ならびに試験管および遠心管、ピペット、ドロッパーおよびドロッ パー瓶のような液体測定具、細胞培養培地、および緩衝溶液）の使用を包含する 。これらのアッセイの多くは、標識抗体（しばしは測定対象の指標に特異的に結 合する非標識一次抗体に対する二次抗体である）の読み出しをも包含する。さら に、これらのアッセイは、以下および実施例において述べるように多数の他の試 薬および機器にも関与する。本明細書および請求の範囲において用いる場合、「 Ｔ細胞応答の検出における使用のための要素」は、このような検出のために使用 しうる、本明細書において論述する試薬（抗体を含む）、供給品、培地、および 機器の任意のものをいう。 Ｔ細胞に特異的な試薬を指標として用いるのでない限り、Ｔ細胞応答の測定は 、 一般的に白血球の調製物からのＴ細胞（これらは典型的にはそれらが単離されて いる体液（例えば脳脊髄液または非凝集血）の遠心および／またはろ過により得 られる（すなわち部分的に精製される））の標識および／またはさらなる精製に 関与する。以下の本明細書および請求の範囲において用いる場合、「単離された Ｔ細胞」は、生体から除去されたＴ細胞であって、しかし必ずしも（例えば体液 から白血球を除去するための遠心により、または他の血液細胞からのＴ細胞の分 離により）さらに精製されていないものをいう。Ｔ細胞の単離は、したがって、 ランセット、注射針、注射筒、真空血液採取管、および他の血液および／または ＣＳＦ採取供給品に関与し、さらにろ過および遠心供給品にも関与しうる。 Ｔ細胞を特異的に標識するための方法は、典型的には、Ｔ細胞特異的マーカー （これらは一般的にはＴ細胞レセプター、そのサブユニット、およびＣＤ３のよ うな関連分子である）に対する抗体を包含する従来の免疫組織化学および／また はＦＡＣＳ技術に関与する。このような抗体は、多数の供給源から市販されてい る。 Ｔ細胞を少なくとも部分的に精製する方法は、上述の抗体を用いるＦＡＣＳに よる細胞ソーティング、グラスビーズおよび／またはナイロンウールの通過を含 む種々のアフィニティ精製法、白血球細胞の混合物からＴ細胞以外の細胞を除去 するための他の白血球細胞タイプマーカーに対する抗体の使用、および差次的遠 心分離（例えば、ポリスクロース（ＦＩＣＯＬＬ）、アルブミン、コロイド状シ リカなどの密度勾配媒体を用いる密度勾配遠心および／または遠心エルトリエー ション）を含む。 Ｔ細胞増殖の検出は、上述のようなＴ細胞の標識または部分的精製、および一 般的に細胞増殖を検出するために用いられる方法の適用により達成することがで きる。このような方法の１つは、生細胞により発生期のＤＮＡ中に取り込まれう る検出可能な核酸前駆体分子の存在下でＴ細胞を培養することにより新規に合成 されるＤＮＡを標識することを包含する。このような前駆体としては、³Ｈ−チ ミジンおよび他の放射性標識前駆体、ならびにＢｒｄＵおよび他の好都合に検出 可能な非放射性前駆体が挙げられる。放射性標識前駆体を用いる場合、取り込ま れなかった前駆体は洗浄除去し、取り込まれた前駆体を、オートラジオグラフィ 、 シンチレーション計測、または他の従来の放射能定量法により測定する。 ＢｒｄＵなどを用いる場合、取り込まれなかった前駆体は洗浄除去し、前駆体 に特異的に結合することができる抗体または他の試薬を用いて、核ＤＮＡ中に取 り込まれた前駆体を検出する。さらに、代謝的に活性な細胞を標識する試薬を用 いて、細胞数の増加を追跡することができる。このような試薬としては、ＭＴＴ 、ＸＴＴ、ＭＴＳおよびＷＳＴ−１が挙げられる。これらは、ミトコンドリアの 酵素で切断されて、分光光度計測により容易に検出および測定しうる生成物を生 じ、このようにして測定される切断生成物のレベルは試験対象の試料中の代謝的 に活性な細胞の数に比例する。このような試薬は、多数の供給源から市販されて いる。 Ｔ細胞活性化の多数の細胞表面マーカーが当業界で知られており、一般的に従 来の免疫組織化学および／またはＦＡＣＳ技術を用いて抗体（多数の供給源から 市販されている）により検出される。これらのマーカーとしては、ＣＤ２５（Ｉ Ｌ−２レセプター）、ＣＤ２６、ＣＤ３０、ＣＤ６９、およびCＤ７１（トラン スフェリンレセプター）が挙げられる。 Ｔ細胞活性化は、培地中へのサイトカインの放出を測定することによっても検 出することができる（例えば、Ｃorreale et al.,1995を参照さたい）。不活性 Ｔ細胞はサイトカインを放出しないが、一方、少なくともいくらかの活性Ｔ細胞 はＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−Ｉ０、ＩＬ−１１、ＩＬ− １２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、γ−インターフェロン、ＴＮＦ−α、およびＦ ＡＳリガンドとして知られるＴＮＦ関連サイトカインを放出する。さらに、Ｔ細 胞活性化は、ＣＤ９５（ＦＡＳレセプター）を含む活性化特異的マーカーのＴ細 胞表面発現により検出してもよい。これらのサイトカインおよびマーカーの各々 を検出するための抗体は、当業界で周知であり、市販されている。（例えば培地 中の）サイトカインを測定するためのこのような抗体を用いるアッセイも、当業 界で周知であり、商品化されている。 Ｔ細胞活性化についての特に感度のよいアッセイは、最近開発された酵素結合 免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイであり、これは、典型的にはＴ細胞を 培養した抗体コーティング基質上のスポットとして単一のＴ細胞によるサイトカ イン放出を検出する。このようなアッセイは、Ｔaguchi et al.,1990およびＳun et al., 1991 に記載されている。好ましくは、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いてγ−イ ンターフェロンの分泌を検出する。 細胞の死が進行中のアポトーシスの結果であるか否かを決定するための材料お よび方法も、当業者には周知である。アポトーシス関連の超微細構造の変化の検 出を可能にする従来の組織化学的染色に加えて、アッセイおよび染色技術を含む アポトーシス検出手順は、何年もの間、当業界で使用されている。これらの手順 は、典型的には、細胞死が活性代謝（例えばタンパク質合成）に依存するかどう か、または死んでいく細胞がＤＮＡ分解（断片化）を呈するかどうかを決定する 。 前者のタイプの手順は、代謝阻害剤（例えばシクロヘキシミドのようなタンパ ク質合成阻害剤、アクチノマイシンＤのようなＲＮＡ合成阻害剤、またはシクロ スポリンのような免疫特異的阻害剤）の存在下または非存在下で死んでいく細胞 を含有するレプリカ培養を生育させること、およびこのような阻害が細胞死を遅 延させるかどうかを決定することを包含する。遅延する場合には、ほぼ確実にア ポトーシスが関与する。例えば、細胞死を色素ヨウ化プロピジウムが細胞に進入 する能力として検出しているＤhein et al.,1995を参照されたい。 ＤＮＡ断片化の検出のための手順は、典型的にはフェノール抽出およびゲル電 気泳動による、ＤＮＡの単離およびサイズ分離を包含しうる。より新しい技術は 、酵素ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（「ＴｄＴ」また は「ターミナルトランスフェラーゼ」）、適切な緩衝液（例えば、コバルト塩、 およびＤＴＴ、ＤＴＥまたはＢＭＥのような還元剤を含有するカコジル酸緩衝液 ）および標識デオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）またはその標 識誘導体もしくはアナログ（例えば、ＢｒｄＵＴＰ、ビオチニル化ｄＮＴＰ、ジ ゴキシゲン標識ｄＮＴＰ、または放射性標識ｄＮＴＰ、集合的に「標識ＸＴＰ」 と呼ぶ）の使用を包含する。 ＴｄＴは、標識ＸＴＰｓをＤＮＡ分子の遊離末端に取り込む。アポトーシスに 付随するＤＮＡ分解は、健康な細胞におけるずっと少数のものと比較して、はる かに多数の遊離末端の生成を包含するので、健康な細胞と比較して高いレベルの 標識ＸＴＰｓの取り込みは、進行中のアポトーシスを示す。したがって、アポト ーシスを検出するためのＴｄＴ法は、オートラジオグラフィまたは免疫組織化学 （例えば標識ＸＴＰに対する抗体を、蛍光または酵素タッグを付した抗体として 、またはタッグを付した二次抗体とともに、使用するもの）のような従来の技術 を典型的には用いる取り込まれた標識ＸＴＰの検出（通常は細胞を洗浄して取り 込まれなかった標識ＸＴＰを除去した後）を包含する。この方法の実施のための 市販キットは、ＯＮＣＯＲ,Ｉnc.,Ｇaithersburg,ＭＤより「ＡＰＯＰＴＡＧ」 キットとして入手可能である。 別の最近開発された技術は、抗ヒストン捕獲抗体および抗ＤＮＡ検出抗体を用 いるＥＬＩＳＡを包含する。このアッセイは、断片化したクロマチンからのイン タクトなクロマチンの従来の分離に依拠し、このような分離した断片化したクロ マチンのレベルは上述のＥＬＩＳＡにより測定する。この方法の実施のための市 販のキットは、Ｂoehringer Ｍannheim Ｃorporation,Ｉndianapolis,ＩＮより 「細胞死検出キット」として入手可能である。 Ｂ．処理 本発明のＭＢＰポリペプチドを用いる処理について、本発明のＭＢＰ２１．５ ポリペプチド（例えばＭＢＰ＋Ｘ２^Ser81）は、ＭＳ患者において抗原寛容誘導 を得るための以前のアプローチにおいて用いられる非ヒト由来ＭＢＰ抗原と比較 して種々の利点を有することは留意されるべきである。このような利点としては 、ＭＢＰ免疫優性領域の全範囲の包含、および結果としてのこれらのポリペプチ ドがこのようなＭＢＰ免疫優性領域のいずれかと反応性のＴ細胞に寛容性を誘導 する能力が挙げられる。 自己反応性の抗原内および抗原間の拡散は、自己免疫疾患に付随する関連した 現象であり、抗原中の付加的なエピトープまたは標的組織中の付加的な抗原が疾 患の進行中に自己免疫性Ｔ細胞により標的にされるようになる。このような抗原 拡散は、実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）およびインスリン依存性糖尿病 のマウスモデルにおける炎症性自己免疫過程の経過中に観察されていた（Ｌehma nn et al.,1992;ＭcＣarron et al.,1990;Ｋaufman et al.,1993;Ｔisch et al. ,1993）。 抗原拡散のこれらの知見は、ＭＳ患者におけるＭＢＰ反応性活性化Ｔ細胞によ り認識される免疫優性エピトープの可変性の証明とともに、有効なＭＢＰ特異的 療法はＭＢＰ特異的自己反応性Ｔ細胞の不均質集団を標的とする必要があるであ ろうことを示す。したがって、ＭＢＰの非経口投与がＭＳ治療において最大に効 果的であるためには、その免疫優性エピトープの完全なレパートリーがＴリンパ 球に提示されなければならない。 本発明のある側面に従えば、多発性硬化症を患う患者の治療方法は、患者にＭ ＢＰ２１．５ポリペプチドを投与することを特徴とする。好ましくは、ＭＢＰ２ １．５ポリペプチドは、ＭＢＰ免疫優性エピトープの完全なレパートリーを包含 する。ＭＢＰ２１．５ポリペプチドは、患者の体の関連区画（すなわち体液また は組織区画）、例えば患者の血液、脳脊髄液、リンパ、細網内皮系、肝臓、リン パ節、脾臓、胸腺などにおいて、ＭＢＰ反応性Ｔ細胞のアポトーシスを誘導する のに十分なポリペプチド濃度を達成するのに十分な量で投与される。好ましくは 、このポリペプチドは、少なくとも１２時間であって４日を超えない間隔で、少 なくとも２回、患者に投与される。 本発明のある側面に従えば、多発性硬化症を患う患者の治療方法は、患者にＰ ＬＰポリペプチド（例えば、ΔＰＬＰ３、ΔＰＬＰ４、ＭＰ３、ＭＰ４、ＰＭ４ 、ＭＭＯＧＰ４）を投与することを特徴とする。好ましくは、ＰＬＰポリペプチ ドは、既知のヒトＰＬＰ免疫優性エピトープの完全なレパートリーを包含する。 ＰＬＰポリペプチドは、患者の体の関連区画（すなわち体液または組織区画）、 例えば患者の血液、脳脊髄液、リンパ、細網内皮系、肝臓、リンパ節、脾臓、胸 腺などにおいて、ＰＬＰ反応性Ｔ細胞のアポトーシスを誘導するのに十分なポリ ペプチド濃度を達成するのに十分な量で投与される。好ましくは、このポリペプ チドは、投与間が少なくとも１２時間であって４日を超えない間隔で、反復的に 患者に投与される。このポリペプチドは、疾患の悪化でなく寛容性がもらたされ るように、好ましくは付随するアジュバント投与なしに投与される。 本発明に従えば、ＭＢＰおよび／またはＰＬＰ反応性Ｔ細胞のアポトーシスを 誘導するのに十分な、患者の体液または組織区画におけるＭＢＰおよび／または ＰＬＰポリペプチドの濃度は、「臨床的適用」および「Ｔ細胞応答の検出」と題 して上述した材料、方法およびアッセイを用いて決定される。濃度は、関連のな いポリペプチド（例えばアルブミン）を用いて行った対照アッセイと比較して、 ＭＢＰまたはＰＬＰエピトープに対する応答を示す末梢血からのＴ細胞の数の実 質的な減少（「前駆体頻度」または「反応性Ｔ細胞インデックス」）が、このポ リペプチドに応答して（処理前に採取した血液試料からのＴ細胞と比較して）処 理の後に見られた場合に、ＭＢＰまたはＰＬＰ反応性Ｔ細胞のアポトーシスを誘 導するのに十分と考えられる。反応性Ｔ細胞インデックスの少なくとも２５％の 減少は、一般に、「実質的な減少」を構成する。より小さい減少も、統計的に有 意な減少、すなわちスチューデントＴ試験のような標準的統計的試験により解析 した場合に確立値ｐが０．０５以下、好ましくは０．０１５以下であるとき、「 実質的」と考えられる。 あるいは、ＭＢＰまたはＰＬＰ反応性Ｔ細胞のアポトーシスを誘導するのに十 分な患者血液および／または脳脊髄液中のポリペプチド濃度は、ＥＡＥまたはＭ Ｓの臨床的経過を安定化するまたは臨床的症状を改善するのに必要な量としてル ーチンのインビボ実験により決定してもよい。 本発明に従えば、ＰＬＰおよび／またはＭＢＰ２１．５ポリペプチドは、アポ トーシスを誘発せずに寛容性を誘導するよう設計されたスケジュールでの投与に より（例えばＴ細胞アネルギーを誘発することにより）、ＭＳ患者においてＰＬ Ｐおよび／またはＭＢＰ反応性Ｔ細胞の寛容性を誘導するために用いてもよい。 このようなスケジュールは、典型的には患者をアレルゲンに対して寛容誘導する ために用いられ、一般的には毎週、隔週または毎月ベースの寛容誘導剤（この場 合、ＭＢＰ２１．５調製物）の少量の用量（典型的には数マイクログラムから数 百マイクログラムの範囲）の投与を包含する。 患者の体液または組織区画中のポリペプチドの所望の濃度を達成するのに十分 な投与ポリペプチドの量は、当業者に周知の標準的な薬物動態学的計算を用いて ルーチンのヒトおよび動物の研究データから容易に決定することができる。当初 のインビボ研究はＥＡＥを誘発するように処理されたマウスで行う。好ましくは 、ポリペプチドの用量は、続いて霊長類、例えばヒト患者またはマーモセット（ 末梢血中にＭＢＰ反応性Ｔ細胞を有することが知られているサル）において決定 する。好ましくは、用量は、ＭＢＰまたはＰＬＰエピトープに対する応答を示す 末梢血からのＴ細胞の数の実質的な減少または臨床的改善（好ましくは動物にお け る）を達成するように調整する。 用量は、投与の方式、治療される患者の具体的な症状、患者の全体的な健康、 状態、サイズおよび年齢、および処方する医師の判断によっても変化する。 医師の判断によるが、典型的な治療処理は、通常は疾患の臨床的重症度および 反応性Ｔ細胞インデックスの監視と同時に投与される一連の用量を含む。ポリペ プチドの投与は、一般に静脈ルート、例えば注射による静脈内注入によって行う 。他の投与ルート（例えば皮下注射、皮内注射、筋内注射、エアロゾル吸入、経 口、鼻、膣、直腸など）も、医師により決定されるように所望であれば用いても よい。 注射に好適な製剤は、Ｒemington's Ｐharmaceutical Ｓciences,Ｍack Ｐubl ishing Ｃompany,Ｐhiladelphia,ＰＡ,17th ed.(1985)に見出される。このよう な製剤は、無菌的で、非発熱性でなければならず、一般には、生理食塩水、緩衝 （例えばリン酸緩衝）生理食塩水、ハンクス液、リンゲル液、デキストロース／ 生理食塩水、グルコース溶液などのような医薬的に有効な担体を含有する。製剤 は、必要に応じて医薬的に許容されうる補助物質、例えば浸透圧調整剤、湿潤剤 、殺菌剤、保存剤、安定剤などを含有してもよい。 本発明の製剤は、包装材およびポリペプチドを含む製造物として頒布すること ができる。包装材は、この製剤は神経疾患の治療における使用のためのものであ ることを示し、具体的に多発性硬化症に言及してもよいラベルを含む。 本発明を、いかなる方式においても制限する意図ではなく、以下の実施例にお いてより十分に説明する。 実施例 ＭＢＰ２１．５ポリペプチドおよびネイティブＭＢＰ１８．５の発現を指示す る細菌ベクターの構築 ヒトＭＢＰの１８．５kＤa アイソフォームをコードする全長ｃＤＮＡは、Ａ ＴＣＣから入手した（＃５７４８；ＡＴＣＣ,Ｒockville,ＭＤ）。プラスミドｐ ＨＢＰ−１を、ＡmpliＴaq（Ｐerkin-Ｅlmer、Ｎorwalk,ＣＴ）を用いる、９４ ℃で１分間の変性、５２℃で１分間のアニーリングおよび７２℃で１分間の伸長 を含む３０サイクルの標準的ＰＣＲ反応において、鋳型として用いた。センスオ リゴヌクレオチドプライマー（５′-ＣＡＴＡＴＧＧＣＧＴ ＣＡＣＡＧＡＡＧＡ Ｇ ＡＣ-３′、配列番号１３） は、ｈＭＢＰ１８．５のＮ末端（ＭＡＳＱＫＲ）をコードし、ＮｄｅＩクローニ ング部位を含む。一方、アンチセンスプライマー（５′-ＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧ ＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡ ＴＧＧＧＴＧ-３′、配列番号１４）はＣ末端残基（ＰＭ ＡＲＲ）をコードし、ＢａｍＨＩクローニング部位を含む。７２℃で１０分間の 付加的な伸長の後、得られる５２６塩基対（bp）のフラグメントを、製造者の記 載にしたがってｐＣＲII（Ｉnvitrogen,Ｓan Ｄiego,ＣＡ）中にサブクローニン グした。カナマイシン耐性Ｅ.coliＤＨ１０Ｂ（Ｇibco/ＢＲＬ,Ｇaithersburg, ＭＤ）形質転換体を選択し、インサートを、制限酵素解析によって同定し、ジデ オキシ配列解析によって確認した。ＭＢＰコード領域を、ファージＴ７プロモー タープラスミドｐＥＴ１４ｂ（Ｎovagen,Ｍadison,ＷＩ）のＮｄｅＩおよびＸｈ ｏＩ部位にサブクローニングし、後にｐＥＴ２２ｂ（Ｎovagen,Ｍadison,ＷＩ） 中に再クローニングした。得られた組換えＭＢＰ１８．５遺伝子は、ネイティブ なヒトＭＢＰ１８．５タンパク質には見出されない、このＭＢＰ１８．５^hum.遺 伝子産物の精製を容易にするために付加された３′末端のヒスチジンタッグをコ ードする付加的な１８ヌクレオチドの配列（終止コドンの直前）を除き、改変さ れていないネイティブなコドンのみを含む。得られた組換えベクター（ｐＥＴ２ ２ｂ／ＭＢＰ１８．５^hum.）を、ＤＥ３溶原がＥ.coliｌａｃＵＶ５プロモータ ー（Ｓtudier et al.,1990）の後ろにＴ７ポリメラーゼ遺伝子を含むＥ.coliＢ Ｌ２１（ＤＥ３）(Ｎovagen,Ｍadison,ＷＩ)中に形質転換により導入した。 ヒトＭＢＰの２１．５kＤa アイソフォームをコードする合成組換え遺伝子は 、３ラウンドの重複ＰＣＲ（Ｈo et al.,1989）において構築した（図１３を参 照されたい）。３つの遺伝子サブドメインの各々を、５pmol のＨＰＬＣ精製オ リゴヌクレオチドの適切な対の各々および０．５単位のＴａｑポリメラーゼ（Ｐ erkin-Ｅlmer）を用いて１００μｌ反応物において合成した。９５℃で１分間の 変性、５０℃で１分間のアニーリングおよび７２℃で１分間の３０サイクルを行 った。次いで、精製ＰＣＲフラグメントの各々の５％を、第二ラウンドＰＣＲに おいて鋳型として用いた。ここで、２つのサブドメインをフランキングオリゴヌ クレオチドを用いて結合した。これらのＤＮＡフラグメントの精製および第三ラ ウンドＰＣＲにより、６４８bp 生成物の増幅がもたらされた。このＰＣＲ産物 をＥｃｏＲ ＩおよびＨｉｎｄIIIで消化し、ｐＢＳ(−)中にサブクローニングし、Ｅ.coliＸ Ｌ−１Ｂlue（Ｓtratagene,Ｌa Ｊolla,ＣＡ）中に形質転換により導入した。ア ンピシリン耐性形質転換体を選択し、目的の構築体を制限酵素解析および配列解 析により同定した。いくつかの独立したクローンからの制限フラグメントを一緒 にして、ＰＣＲクローニング中に起こった望ましくない突然変異を除去し、得ら れたＭＢＰ＋Ｘ２^Cys81/Bact.遺伝子をｐＥＴ２２ｂのＮｄｅＩおよびＨｉｎｄI II部位にクローニングした。 ヒトＭＢＰの２１．５kＤa アイソフォームのアミノ酸残基８１のシステイン からセリンへの置換をコードする変更された遺伝子は、以下の工程により構築し た。中間ＭＢＰフラグメントのＰＣＲ増幅は、ｐＥＴ２２ｂ／ＭＢｐ２１．５^{hu m.} を鋳型とし、突然変異導入アンチセンスプライマー（５′-ＧＴＣＴＴＴＧＴ ＡＣＡＴＧＴＴＣＧＡＣＡ ＧＧＣＣＣＧＧＣＴＧ ＧＣＴＡＣＧ−３′、配列番 号１５、Ｓｅｒ⁸¹コドンに下線を付した；ＮｓｐＩ部位は斜字体で示す）とセン スオリゴヌクレオチドプライマー（５′-ＣＡＧＣＡＣＣＡＴＧ ＧＡＣＣ-３′ 、配列番号１６、ＮｃｏＩ部位は斜字体で示す）とともに用いて行った。次いで 、ＭＢＰ＋Ｘ２^Cys81/Bact.のＮｓｐＩ−ＮｃｏＩ制限フラグメントを、突然変 異を導入したフラグメントと交換し、ＭＢＰ＋Ｘ２^Ser81/Bact.を作成した。 重複ＰＣＲにおいてＭＢＰ１８．５^hum.遺伝子を鋳型として用いて、ネイティ ブなヒトコドンを用いてＭＢＰ＋Ｘ２^Cys81の１バージョンを作成した。ヒトエ クソン２配列を含むＰＣＲフラグメントは、センスオリゴヌクレオチド（配列番 号１７）： ５′-ＧＧＴＧＣＧＣＣＡＡ ＡＧＣＧＧＧＧＣＴＣ ＴＧＧＣＡＡＧＧＴＡ Ｃ ＣＣＴＧＧＣＴＡＡ ＡＧＣＣＧＧＧＣＣＧ ＧＡＧＣＣＣＴＣＴＧ ＣＣＣＴＣ ＴＣＡＴＧ ＣＣＣＧＣＡＧＣＣＡ ＧＣＣＴＧＧＧＣＴＧ ＴＧＣＡＡＣＡＴＧ Ｔ ＡＣＡＡＧＧＡＣＴＣ ＡＣＡＣＣＡＣＣＣＧ ＧＣＡＡＧＡＡＣ−３′ をプラスミドｐＥＴ２２ｂのＴ７ターミネーターにハイブリダイズするアンチセ ンスオリゴヌクレオチド（配列番号１８）と組み合わせて用いて、ｐＥＴ２２ｂ ／ｒｈＭＢＰ１８．５から作成した。第二のＰＣＲフラグメントは、同じ鋳型を 用い、Ｔ７プロモーターオリゴヌクレオチド（配列番号１９）をエクソン２の５ ′末端にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチド（５′-ＧＧＣＴ ＴＴＡＧＣＣ ＡＧＧＧＴＡＣＣＴＴ ＧＣＣＡＧＡＧＣＣＣ ＣＧＣＴＴＴＧＧＣ-３′、配列 番号２０）と組み合わせて用いて作成した。第二ラウンドＰＣＲにおけるＴ７プ ロモーターおよびターミネーターオリゴヌクレオチドを用いる増幅による両ＰＣ Ｒ産物の融合により、ＭＢＰ＋Ｘ２^Cys81/hum.遺伝子を含むＰＣＲ産物の構築を 完成した。このＰＣＲ産物から得られる制限フラグメントを、次いでＮｄｅＩお よびＨｉｎｄIII部位でｐＥＴ２２ｂ中にサブクローニングし、目的のクローン の選択は、配列解析により確認した。組換えＭＢＰの細菌による発現および同定 組換えＭＢＰポリペプチドの発現のために、Ｅ.coliＢＬ２１（ＤＥ３）株を 発現プラスミドで形質転換し、アンピシリン耐性コロニーを選択してテリフィッ クブロス（ＴＢ）培地（Ｓambrook et al.,1989）でＯＤ₆₀₀が０．６になるまで 生育させた。タンパク質発現は、１mＭイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴ Ｇ）で４時間誘導した。組換えにより発現されたＭＢＰポリペプチドの分析的特 徴づけは、ＯＤ₆₀₀が１．５のとき誘導した細胞の １ml を採取して行った。細 胞ペレットを１００μl の２０mＭトリス−塩酸、ｐＨ７．５中で煮沸して溶解 し、１０％の溶解物を１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｎovex,Ｓan Ｄiego,ＣＡ）に より解析した。組換えにより発現されたＭＢＰポリペプチドは、クマシーＲ−２ ５０染色またはＭＢＰエクソン１に相当するヒトＭＢＰアミノ末端残基３６〜５ ０（ＭＣＡ408,ＳeroＴec,Ｉndianapolis,ＩＮ）もしくはＭＢＰエクソン６に相 当するカルボキシ末端残基１２９〜１３８（ＭＣＡ 70，ＳeroＴec，Ｉndianapo hs，ＩＮ）のいずれかに特異的なラットモノクローナル抗体を用いる免疫ブロッ ティングにより同定した。 可溶性および不溶性画分へのＥ.coli 細胞の分画のためには、誘導した培養の 各々の２mlからの細胞ペレットを、ＯＤ₆₀₀が１．５のとき回収し、４００mlの ２０mＭ トリス−塩酸、pＨ８．０中に再懸濁した。全細胞溶解物を調製するた め、懸濁液を１００mg/mlリゾチームおよび １mＭフェニルメチルスルホニルフ ルオリドに調整し、次いで３０℃で１５分間インキュベートした。この後、１０ mＭ ＭｇＣｌ₂および２００mg/mlのＤＮａｓｅＩ（Ｓigma，Ｓt.Ｌouis，ＭＯ） を添加し、室温で２０分間インキュベートした。細胞溶解物を２つに分け、一方 の 半分にはさらにトリス緩衝液を加え、他方の半分は０．１Ｎ塩酸とし、室温で３ ０分間抽出した。遠心後、可溶性上清を不溶性ペレットから採取し、各画分をＳ ＤＳ含有ローディング色素中で５分間煮沸した。各画分の２０％のＳＤＳ−ＰＡ ＧＥゲルを、上述のように組換えにより発現されたＭＢＰポリペプチドについて 解析した。 組換えＭＢＰの精製および特徴づけ 組換えにより発現されたポリペプチドの精製のために、誘導した細胞の１ｌ培 養物を、遠心して回収し、ペレットを、ＴＥＫＭＡＲホモジナイザー（Ｔhe Ｔe kmarＣo.,Ｃincinnati,ＯＨ）を用いて１０ml/g（1０％w/v）の０．１Ｎ塩酸中 でホモジナイズした。細胞は、マイクロフルイダイザーＭＩＣＲＯＦＬＵＩＤＩ ＺＥＲ（Ｍodel Ｍ110-Ｔ,Ｍicrofluidics Ｃorp.,Ｎewton,ＭＡ）を３回通過さ せて機械的に破壊した。すべての操作は氷上で行った。組換えにより発現された ＭＢＰを含有する可溶性画分は、Ｂeckman ＪＡ-10 ローター中で１０，０００ ×ｇで４℃、３０分間の細胞溶解物の遠心後、上清として回収した。上清は、Ｗ ＨＡＴＭＡＮ ＰＯＬＹＣＡＰ ＴＦ膜（０．４５μm）（Ｗhatman ＬabＳales, Ｈillsboro,ＯＲ）を通してろ過し、ＡＭＩＣＯＮ stir cell装置（Ａmicon,Ｂe verly,ＭＡ）においてＰＭ-１０膜を用いて５〜１０倍濃縮した。濃縮した画分 から、ＭＩＬＬＥＸ ＧＶ（０．２mm）シリンジフィルター(Ｍillipore Ｃorpor ation,Ｂedford,ＭＡ)を通過させて粒状物を除去し、ろ過した試料をＶＹＤＡＣ Ｃ４逆相カラム（直径１．０cm／長さ２５cm、ＶＹＤＡＣ,Ｈesperia,ＣＡ）に ４．１ml／分で注入した。タンパク質は、３０分間の直線状２５〜４０％アセト ニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）勾配を用いて溶出し、次いで凍 結乾燥した。 組換えにより発現されたＭＢＰポリペプチドの精製のため、凍結乾燥した物質 を、結合緩衝液（８Ｍ尿素、１０mＭ β-メルカプトエタノール、０．１Ｍ Ｎａ Ｈ₂ＰＯ₄、０．０１Ｍトリス−塩酸、pＨ８．０）中に再懸濁し、製造者の指示 に従ってＮｉ−ＮＴＡ樹脂に結合させた（Ｑiagen Ｉnc.，Ｃhadsworth，ＣＡ） 。カラムは、同じ結合緩衝液で２回洗浄し、混在する Ｅ.coli タンパク質を p Ｈ６．３に調整した同じ結合緩衝液で除去した（洗浄３）。ｒｈＭＢＰは、pＨ ５．９（溶出１）および pＨ４．５（溶出２）の結合緩衝液、および最後に ６ Ｍ 塩酸グア ニジン、０．２Ｍ酢酸（溶出３）を含む段階的勾配で溶出した。すべての画分お よびカラムの一部を、還元剤の存在下で１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した 。 ＭＢＰポリペプチドを、迅速分析逆相ＨＰＬＣアッセイにより定量した。４． ６×５０mmのＣ１８カラム（Ｃ18ＨＹＴＡＣＨ,Ｇlycotech,Ｂranford,ＣＴ）を 用い、アッセイは、Ｋalghatgi and Ｈorvath,1987により記載されたＨＰＬＣと 同様にして８０℃で行った。組換えにより発現されたＭＢＰポリペプチドは、破 壊した細胞から０．１Ｎ塩酸を用いて抽出し、１分間の直線状１０〜３０％アセ トニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）勾配を用いてＣ18 ＨＹＴＡ ＣＨ 逆相カラム上で分画した。直線状のアッセイ範囲において、ＭＢＰポリペ プチドのピーク高の測定値は、ＭＢＰポリペプチドの量に正比例する。ＭＢＰ＋ Ｘ２^Cys81標準の濃度は、アミノ酸組成により決定した。ＭＢＰ＋Ｘ２^Cys81の分 子量は、質量分析により２２，１８８ダルトンと決定された。精製ＭＢＰ＋Ｘ２^Cys81 タンパク質のＮ末端配列決定の結果は、アミノ酸配列ＡｌａＳｅｒＧｌｎ ＬｙｓＡｒｇＰｒｏＳｅｒＧｌｎＡｒｇＨｉｓＧｌｙＳｅｒＬｙｓＴｙｒＬｅｕ ＡｌａＴｈｒＡｌａＳｅｒＴｈｒＭｅｔＡｓｐＨｉｓＡｌａＡｒｇであり、ＭＢ Ｐ＋Ｘ２^Cys81/hum.のヌクレオチド配列（配列番号１）から予測される最初の２ ５アミノ酸に相当した。 ＭＢＰ１８．５およびエクソン２特異的Ｔ細胞株の樹立および増殖アッセイ ネイティブなヒトＭＢＰを、以前記載されたとおりに調製した（Ｖoskuhl et al.,1993a）。ＭＢＰエクソン２にコードされる合成ペプチドは、Ｓynthecell Ｃorp.（Ｒockville,ＭＤ）から購入したものであり、ＨＰＬＣ解析で９５％を 超える純度であった。末梢血リンパ球は、白血球除去血輸血およびＦＩＣＯＬＬ 勾配上での分離により単離した。次いで、細胞を、１０％ＤＭＳＯを含むＲＰＭ Ｉ１６４０（Ｗhittaker Ｂioproducts,Ｗalkersville,ＭＤ）中で低温保存し、 使用時まで液体窒素中で保存した。Ｔ細胞株は、以前記載したとおりに限界細胞 濃度法を用いて生成した（Ｖoskuhl et al.，1993a）。２Ａ２および３Ｈ５は、 正常個体から得られたヒトＴ細胞株である。１Ｈ７、１Ｇ１および３Ａ１１は、 ＭＳ患者から得られたＴ細胞株であり、ＭＢＰのエクソン２にコードされる領域 に特異的である。 Ｔ細胞株は、最後の再刺激後１０日間休ませ、その後２×１０⁵細胞/ml の濃度 でレスポンダー（応答者）として使用した。自己の照射（３０００rad）末梢血 リンパ球（ＰＢＬ）をスティミュレーター（刺激者）として１×１０⁶細胞/ml の濃度で用いた。応答者細胞および刺激者細胞の両方の５０μlずつを、１００ μlの特定のＭＢＰ抗原または培地のみを含む丸底９６ウェルマイクロタイター プレート（Ｎunc,Ｒoskilde,Ｄenmark）の各ウェル中で混合した。組換えＭＢＰ については、逆相ＨＰＬＣ精製からの凍結乾燥調製物を８〜１０mg/ml の濃度に ＰＢＳ中で再懸濁し、次いで使用直前に培地で希釈した。アッセイは、３連で、 １０％ヒトプール血清（４〜７人の正常ＡＢ型ＮＩＨ血液銀行供血者から入手し た；使用前に熱非働化しろ過滅菌したもの）を添加した、２mＭＬ−グルタミン 、１００Ｕ/mlペニシリンおよび１００mg/ml ストレプトマイシン（すべて Ｗh ittaker Ｂioproducts,Ｗalkersville,ＭＤ）を含有するイスコフ改変ダルベッ コ培地（ＩＭＤＭ、Ｇibco,Ｇrand Ｉsland,ＮＹ）中で行った。培養は、５％Ｃ Ｏ₂の存在下、３７℃で７２時間インキュベートした。培養の最後の１８時間の 間、細胞を１ウェル当たり１mＣiの³[Ｈ]-チミジンでパルスし、グラスファイバ ーフィルター上に回収し、チミジンの取り込みをシンチレーション計測により測 定した。 組換えヒトＭＢＰ遺伝子の構築および細菌による発現 成人ヒトＭＢＰの胎児型アイソフォームをコードするように合成遺伝子を構築 した（２１．５kＤa アイソフォーム、ＭＢＰ＋Ｘ２^Cys81）（図１および２を参 照されたい）。他者は典型的には特定のコード領域の完全センス鎖およびアンチ センス鎖にわたる多数のオリゴヌクレオチドを連結することにより合成遺伝子を 構築していたが（Ｊayarman et al.,1991; Ｗilliams et al.,1988; Ｈernan et al.,1992; Ｗosnick et al.,1987）、ここではたった６つのオリゴヌクレオチ ド（配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列 番号１０）を用いて組換えヒトＭＢＰ＋Ｘ２^Cys81をコードする ６４４bp の遺 伝子を合成した。これらのＨＰＬC精製したオリゴヌクレオチドは、１１０〜１ ３０bp の範囲のサイズであり、２０〜２５bp の重複領域が３ラウンドのＰＣＲ 中のセンス鎖およびアンチセンス鎖のハイブリダイゼーションのために設計され ていた（図１３）。組換えＭＢＰ遺伝子の最適な細菌による発現のために、ヒト コドンの多 くを、すべての既知の（Ｗada et al.,1992）または高度発現される（Ｇrosjean and Ｆiers,1982）Ｅ.coli 遺伝子について作成されたコドン傾向表に基づいて 、好まれる細菌コドンに変換した。かなりのコドン変更を、特にアルギニン、プ ロリンおよびリジン（ＭＢＰ２１．５中のアミノ酸残基の２６％を包含する）を コードするものについて行った。 いくつかの独立のクローンを配列決定したところ、各々が細菌クローニング菌 株による合成ＤＮＡの拒絶またはＰＣＲに基づく誤りのいずれかに帰すことがで きる複数のヌクレオチド置換または欠失を有していた。これらの誤りのすべては 、ヌクレオチド位置４６２、５２８および５３２に同定されたシトシンからチミ ンへの置換を除き、修正した。これらの変更は、コードされるＭＢＰ＋Ｘ２^{Cys8 1} のアミノ酸配列を保存しており、細菌コドン偏向に対して有害ではないため(Ｗ ada et al.,1992)、修正しなかった。ＭＢＰの成人脳由来（１８．５kＤa）アイ ソフォームの組換えによる発現については、このアイソフォームをコードするネ イティブなヒトコドンを有するｃＤＮＡクローン（ＭＢＰ^18.5/hum.、ＭＢＰ１ ８．５をコードする）を、同じ発現ベクターへのクローニングのための適切な制 限部位を含むようにＰＣＲにより改変した。 細菌における組換えＭＢＰポリペプチドの発現は、当初は栄養豊富なＴＢ培地 中で生育させた小規模振とうフラスコ培養を用いて特徴づけした。１０ml 培養 をＩＰＴＧで誘導した後、ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞中で高レベルでＭＢＰの両組 換え形態が発現された。ＭＢＰ１８．５およびＭＢＰ＋Ｘ２^Cys81は、ＳＤＳ− ＰＡＧＥにより分離した全細菌タンパク質のクマシー色素染色により同定される 主要なタンパク質であり（図１４、「クマシー」）、ヒトＭＢＰのカルボキシ末 端（図１４、「Ｃ末端Ａｂ」）またはアミノ末端（図１４、「Ｎ末端Ａｂ」）に 対する抗体により特異的に認識された。２つのより小さいＭＢＰ免疫反応性ポリ ペプチド（６〜１６kＤa）がＭＢＰ＋Ｘ２^Cys81溶解物において同定しうるが、 Ｎ末端抗体を用いるイムノブロット解析によってのみであり、タンパク質分解で はなく、カルボキシ末端付近での未熟な翻訳終結がこの存在に関与することが示 唆される。このことは、これらの小さいポリペプチドが実験の経過中安定である ことを示したパルス−チェイス標識実験において確認された。 封入体は、振とうフラスコ実験において顕著ではなかったが、組換えＭＢＰは 溶解した細菌細胞の不溶性画分に観察された（図１５、「トリス」）。従来、ウ シ脊髄から精製された相同タンパク質は脳炎誘発活性を持ち、pＨ２〜３で可溶 性であることが示された（Ｅinstein et al.,1962）。この脳炎誘発性タンパク 質は、後にＭＢＰとして同定されたものであり、ほとんど完全に１８．５kＤa アイソフォームからなっている（Ｄeibler et al.,1972）。ＭＢＰは酸可溶性で あるので、本発明者らは、細菌溶解物の直接酸抽出による精製を合理化すること が可能であろうと理由づけた。したがって、本発明者らは、ｒｈＭＢＰを酸性条 件下で可溶化することを試みた。０．１Ｎ塩酸による全細胞溶解物の処理（図１ ５、「酸」）により、可溶性画分（Ｓ）へのｒｈＭＢＰのほとんどの放出が得ら れた。不溶性ペレット画分（Ｐ）からｒｈＭＢＰの全部を抽出できないのは、こ の特定の試料調製中の細胞の不完全な溶解による可能性がある。 ＭＢＰポリペプチドの精製および特徴づけ 組換えにより発現されたＭＢＰポリペプチドの精製のために、１ｌの振とうフ ラスコ培養からの細胞を、上述の酸性条件下で機械的に破壊した。同時の細胞破 壊および酸抽出の後、組換えにより発現されたＭＢＰポリペプチドのすべては、 可溶性画分中に見出された（図１６、「可溶」）。可溶性酸画分を、直接ＶＹＤ ＡＣＣ４逆相カラムにかけ、２５〜４０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ勾配 を用いて１７〜２０分で単一の鋭いピークとしてｒｈＭＢＰを溶出した（図１７ ）。このピーク画分のＮ末端の配列決定により、上述のとおりのＭＢＰポリペプ チドについての正しいアミノ末端配列を確認した。付加的なカルボキシ末端のヒ スチジンタッグを有するＭＢＰ＋Ｘ２^Cys81の予測された分子量は、このピーク 画分の質量分析により得られた質量２２，１８５ダルトンと一致した。プールし たピーク画分のクマシー染色ゲルにより、組換えＭＢＰポリペプチドが同定され たが、全長ＭＢＰポリペプチドの限られた酸加水分解により生成されたとみられ る短縮型ＭＢＰフラグメントの不均質な混合物もまた示された（図１８、「注入 物」）。Ｃ末端のヒスチジンタッグを用いることにより、変性条件および酸性p Ｈ溶出を用いる金属キレートクロマトグラフィにより全長ＭＢＰ物質を得た（図 １８）。全長ＭＢＰポリペプチドの大部分は、溶出２（８Ｍ尿素、１０mＭβ− メルカプト エタノール、０．１ＭＮａＨ₂ＰＯ₄、０．０１Ｍトリス、pＨ４．５）または溶 出３（６Ｍ塩酸グアニジン、０．２Ｍ酢酸）を用いて溶出されたが、混在するＥ .coli タンパク質はよりストリンジェントでない第二の溶出からの溶出物中に観 察された（図１８、「溶出２」）。 ＭＢＰ＋Ｘ２^Cys81/bact.の発現をＭＢＰ１８．５^/hum.のそれと定量的に比較 するために、３セットの１ｌ細菌培養から可溶性酸溶解物を調製し、上述の迅速 分析逆相ＨＰＬＣアッセイを用いて解析した。アミノ酸解析により決定したとお りの、標準量のＭＢＰ＋Ｘ２^Cys81を用い、ピーク高をタンパク質濃度と関連づ けて、本発明者らは、ＭＢＰ１８．５^/hum.遺伝子からの発現と比較して１．５ 〜２．０倍多いＭＢＰ２１．５ポリペプチドが合成ＭＢＰ＋Ｘ２^Cys81/bact.遺 伝子から発現されることを観察した。細菌コドンを有するＭＢＰ遺伝子からの組 換えタンパク質の平均発現レベルは、ヒトコドンを有する遺伝子からの３０mg/l と比較して、５０mg/l であった。ＭＢＰ＋Ｘ２^Cys81/hum.遺伝子を発現した菌 株はＭＢＰ１８．５^/hum.を発現する菌株と同様の量のＭＢＰポリペプチドを生 成したので、これは、細菌コドン偏向を反映し、エクソン２関連配列の効果では ない（図１９および表５を参照されたい）。 生理学的条件下で、ＭＢＰ１８．５ではなく、ＭＢＰ＋Ｘ２^Cys81の一部は、 非還元試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でのクマシー染色およびウェスタンブロッ ティングにより同定される見かけ上の２量体分子を形成した。２量体は、還元試 料については同様の条件下では観察されなかった。ＭＢＰ２量体は、ウシＣＮＳ からのミエリンタンパク質の逆相ＨＰＬＣ分画後にも観察された（van Ｎoort e t al.,1994）。 このような２量体は、医薬的投与のために処方されるべきタンパク質調製物に おいては特に望ましくない。これは、このような用途のためには、このようなタ ンパク質は一般に単一の分子量を含む定義された特徴を有する単一の分子の実体 であるのが好ましいからである。したがって、単一の単量体形態のＭＢＰ２１． ５ポリペプチドを好都合に効率よく調製しうる手段を考案することが重要である 。ＭＢＰ＋Ｘ２^Cys81の２量体形成がエクソン２の位置８１の単一のシステイン 残基（Ｃｙｓ⁸¹）を通じて媒介されたかどうかを試験するために、このシステイ ン（Ｃ ｙｓ⁸¹）を位置特異的突然変異誘発によりセリン（Ｓｅｒ⁸¹）に変換した。 逆相ＨＰＬＣにより、ＭＢＰ＋Ｘ２^Ser81がＭＢＰ＋Ｘ２^Cys81と同様のレベル で細菌中で発現され（平均５０mg/ml、図１９を参照されたい）、還元剤なしで 生理的溶液中で単量体のままでいることが示された。２量体形成の効果的な排除 のためのこのようなアミノ酸置換を試験する代替的な方法として、Ｘ２ＭＢＰペ プチドを調製し、還元剤なしで生理的溶液中で２量体形成について試験してもよ い。 ＭＢＰ１８．５およびＭＢＰエクソン２特異的Ｔ細胞は組換えヒト（ｒｈ）Ｍ ＢＰを認識する ＭＢＰの組換え形態の生物活性を評価するために、本発明者らは、組換えタン パク質を抗原投与した場合の、ヒトＭＢＰ特異的Ｔ細胞株のインビトロ増殖応答 を試験した。脳由来ヒトＭＢＰ１８．５または合成エクソン２ペプチド（ＭＢＰ ２１．５のアミノ酸残基６０〜８５、配列番号１）に応答するＴ細胞株を生成し た。２つのＭＢＰ１８．５特異的株、２Ａ２（残基３１〜５０を認識する）およ び３Ｈ５（残基８７〜１０６を認識する）を、ＭＢＰ１８．５またはＭＢＰ＋Ｘ ポリペプチドのいずれかとのインキュベーションによりインビトロで７２時間刺 激した。このインキュベーションの最後の１８時間の間に、細胞を³Ｈ−チミジ ンでパルスし、細胞増殖の測定を可能にした。図２０に示すように、両Ｔ細胞株 は、ヒト脳から精製したか細菌から精製したかにかかわらず、ＭＢＰ＋Ｘ２^{Cys8 1} およびＭＢＰ１８．５に等しく良好に応答した。本発明者らは、当業界で記載 されたＭＢＰエピトープに応答するさらなるヒトＴ細胞株の抗原認識をも解析し た。当業界で命名されているように、そして本明細書において記載するように、 これらのＭＢＰ１８．５エピトープは、ＭＢＰ１８．５の残基１０６〜１２５、 １３６〜１５５、１４１〜１７０および１５１〜１７０内に含まれている。ここ で、番号付けは当業界で用いられているものであり、ブタＭＢＰ分子のアミノ酸 配列に基づくものである。それぞれの場合において、ネイティブなＭＢＰ１８． ５および組換えＭＢＰ＋Ｘ２^Cys81に応答して有意なT細胞増殖が観察された。 エクソン２にコードされるペプチド配列を含むようにＭＢＰ＋Ｘ２分子を工作 した。Ｘ２を含む治療剤を調製する手段を提供することに加えて、これらの分子 は、ＡＰＣが全長ＭＢＰ２１．５由来のエクソン２エピトープをＴ細胞による認 識が可能なように提示しうるかどうかの決定を可能にした。これは、エクソン２ 中の単一のシステイン残基がＴ細胞認識に必須であるかどうかが未知であったた め、ＭＢＰ＋Ｘ２^Ser81ポリペプチドについても重要であった。 ２つの独立のエクソン２ペプチド特異的ヒトＴ細胞株を用いた増殖アッセイは 、合成エクソン２ペプチド、ＭＢＰ＋Ｘ２^Cys81（図２１）およびＭＢｐ＋Ｘ２^{S er81} （図２２）のみがＴ細胞応答を誘起しうることを明らかに証明した。さらに 、用量効果アッセイ（図２２）により、ＭＢＰ＋Ｘ２^Cys81およびＭＢＰ＋Ｘ２^{S er81} の両方が効率的にインビトロでＴ細胞に提示されることが解明された。この ことは、Ｃｙｓ⁸¹は試験したクローンにより認識されるエクソン２にコードされ るエピトープの提示のために重要ではないことを示す。Ｔ細胞増殖データは、図 ２４および図２５にも示す。 これらの結果は、ヒトＴ細胞は全長ＭＢＰ２１．５分子に由来するプロセッシ ングされたＸ２エピトープに応答することができること、およびＭＢＰ１８．５ 、ＭＢＰ＋Ｘ２^Cy181およびＭＢＰ＋Ｘ２^Ser81を含む細菌により発現されたＭＢ Ｐの組換え形態はネイティブなＭＢＰ１８．５タンパク質と同様に脳炎誘発性Ｔ 細胞を刺激することにおいて有効でありうることを明らかにする。 ΔＰＬＰ４および他のＰＬＰムテインの合成、発現および精製 プラスミドｐＵＣ８(ＡＴＣＣ＃５７４６６)中にクローニングされた全長ヒト ＰＬＰ標的配列を含む１．５kb フラグメントからなるＤＮＡ鋳型を、広範に改 変して、ΔＰＬＰ４を作成した。各々親水性ドメイン２、３および４を含むペプ チドをコードする３つのポリヌクレオチドを、ＰＣＲにより個別に合成し、続い て重複ＰＣＲにより融合した。ΔＰＬＰ４のオープンリーディングフレーム全体 を含むＤＮＡの配列の完全性は、ジデオキシ配列解析により確認した。ΔＰＬＰ ４コード領域をＮｄｅＩ／ＨｉｎｄIIIフラグメントとしてプラスミドｐＥＴ２ ２ｂ（Ｎovagen）にサブクローニングした。ΔＰＬＰ４タンパク質は、Ｎ末端に 融合した５つの付加的なアミノ酸（Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ） およびＣ末端ヒスチジンに融合した５つの付加的なヒスチジン（ヒスチジンタッ グ）を含む。 プラスミドΔＰＬＰ４を、λＤＥ３溶原を含むＥ．coli 菌株Ｗ３１１０（Ｄ Ｅ３）（Ｓtudier et al.,1990）に形質転換により導入し、形質転換した細菌に より産生されたΔＰＬＰ４ポリペプチドを、クマシーブルー染色により、そして ウェスタンブロットにヒトＰＬＰの合成ペプチド（アミノ酸１１８〜１３０）に 対するウサギポリクローナル血清（Ｓerotec,ＡＨＰ２６１）をプローブとして 用い、続いて西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギ抗体および増強化学 発光（ＥＣＬ）検出系（Ａmersham）を用いて検出することにより同定した。１m ＭＩＰＴＧによる誘導の後、ΔＰＬＰ４は、全細胞タンパク質の約５０％を構成 し、封入体のみに局在するようであった。封入体の選択的抽出は、６Ｍ塩酸グア ニジン、または好ましくは５Ｍ塩酸グアニジン、２０mＭクエン酸ナトリウム、p Ｈ５．０、を含有する緩衝液を用いて行う。このような抽出は、ＳＤＳ−ＰＡＧ Ｅおよび分析逆相ＨＰＬＣによる判定で９０％にのぼる純度の調製物をもたらし た。Ｎ末端アミノ酸配列決定により、この単離されたポリペプチドの配列がΔＰ ＬＰ４の予測されたアミノ末端残基を含むことを確認した。 同様の従来技術を用いて、他のＰＬＰムテインポリペプチドをコードする核酸 分子を構築し、Ｗ３１１０（ＤＥ３）において発現させた。これらとしては、疎 水性ドメイン１、３および４が欠如したΔＰＬＰ３（配列番号２３）、および疎 水性ドメイン１および４のみを欠くＰＬＰムテインをコードする同様の構築体（ ΔＰＬＰ２、配列番号２９）が挙げられる。ΔＰＬＰ２は、アミノ末端に付した ヒスチジンタッグをも含み、これは、トロンビン切断部位を含むリンカー（配列 番号２９のアミノ酸残基１４〜１９）により、ＰＬＰの第二の親水性ドメインの アミノ末端に連結し、それとは分離されている。コードされるＰＬＰムテインの 発現により、ΔＰＬＰ３は上記のΔＰＬＰ４に匹敵するレベルで発現されたこと 、一方、ΔＰＬＰ２はパルス−チェイス放射標識分析によって検出されうるにす ぎない非常に低いレベルで発現されたことが解明された。同じ発現系で試験した ネイティブなＰＬＰ構築体は、パルス−チェイス放射標識によって分析した場合 でさえ、検出可能なＰＬＰポリペプチドをまったく生じなかった。 ＭＰ４および他のキメラＰＬＰ分子の構築、発現および精製 ＭＢＰ２１．５−ΔＰＬＰ４融合タンパク質であるＭＰ４を、以下のようにし て構築した。ＭＢＰ２１．５（配列番号１）をコードする合成ＤＮＡフラグメン トを上述の発現ベクターｐＥＴ２２ｂ中のＴ７プロモーターの制御下においた。 次に、適切に間隔をおいたリボソーム結合部位およびΔＰＬＰ４遺伝子を含むＤ ＮＡフラグメントをＭＢＰ２１．５遺伝子の下流に連結し、ＭＢＰ２１．５およ びΔＰＬＰ４の独立の発現のためのジシストロン性オペロンを作成した。このジ シストロン性構築体をＡａｔII−ＸｈｏＩで消化し、合成ＡａｔII−ＸｈｏＩリ ンカー／アダプター（配列番号２６のヌクレオチド５８８〜６０５にわたる配列 に相当する）に連結して、ＭＰ４と名付けたＭＢＰ２１．５／ΔＰＬＰ４キメラ タンパク質をコードする遺伝子融合体（配列番号２６）を作成した。得られたＭ Ｐ４融合タンパク質のための発現構築体の配列の完全性を確認し、ＭＰ４をコー ドするプラスミドを用いて上述のバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼの 溶原性染色体コピーを担持するＥ．coliＷ３１１０（ＤＥ３）を形質転換した。 同様の従来技術を用いて、他のキメラＰＬＰポリペプチドをコードする核酸分 子を構築し、Ｗ３１１０（ＤＥ３）において発現させた。これらとしては、ＭＰ ３（配列番号２５）、ＰＭ４（配列番号２７）、およびＭＭＯＧＰ４（配列番号 ２８）が挙げられる。ＭＰ３は、ＰＬＰムテイン部分が配列番号２３のΔＰＬＰ ３キメラであること以外はＭＰ４と同様のキメラであった。ＰＭ４は、ＭＰ４に おけるのと異なる向きにＭＢＰ２１．５とΔＰＬＰ４とを連結するために重複Ｐ ＣＲ手順において異なるリンカー（配列番号２７のヌクレオチド５０８〜５１９ にわたる配列に相当する）を用いたこと以外は、ＭＰ４と同様であった。ＭＭＯ ＧＰ４は、ヒトミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（Ｐham-Ｄinh et a l,Ｊ.Ｎeurochem.1994,63:2353、以下参照）の細胞外ドメインをコードする配列 をＭＢＰとＰＬＰ由来配列との間に挿入することにより構築した。これらのコー ドされたキメラＰＬＰポリペプチドの発現により、これらが以下に述べるように ＭＰ４のレベルと匹敵するレベルで発現されたことが解明された。 ＭＰ４合成は、１mＭＩＰＴＧの添加によりＭＰ４プラスミドを担持するＥ.co li Ｗ３１１０（ＤＥ３）において誘導した。このタンパク質は、不溶性画分のみ に局在するようであり、全細胞タンパク質の約２０％を構成した。ＭＰ４は以下 のようにして単離した。２０１のＩＰＴＧ誘導発酵物からのＥ．coliペーストを 、１ ０倍容（１０ml/g湿潤重量）の溶解緩衝液（２０mＭクエン酸ナトリウム、１mＭ ＥＤＴＡ、pＨ５．０）中に再懸濁した。このペーストを、氷上で ＵltraＴurra xＴ５０ホモジナイザーを用いて均一に懸濁した。pＨ５．０まで塩酸を添加し、 氷上で Ｍicrofluidizer モデルＭ−１１０Ｔホモジナイザーを相互作用チャン バーで１５，０００〜２０，０００psi の圧力で用いて細胞を溶解した。得られ た溶解物を約１０，０００×g で遠心して、可溶性および不溶性画分を分離した 。可溶性画分を捨て、不溶性画分を、ホモジナイザー（Ｔekmar ＴＰ 18/1051） を用いて１０倍容（１０ml/g湿潤重量）の抽出緩衝液（６Ｍグアニジン塩酸、０ ．５Ｍ塩化ナトリウム、２０mＭ リン酸ナトリウム、pＨ５．０）中に再懸濁し た。抽出物を、２〜８℃で６０分間攪拌しながらインキュベートした。次いで、 抽出物を、１０，０００×gで３０分、遠心した。遠心後の上清を、Ｂranson Ｓ onifier 450を用いて氷上で５分間超音波処理して混在する核酸をせん断し、０ ．４５μフィルター（Ｗhatman 75ＡＳ Ｐolycap）を通してろ過し、ろ過上清を 得た。 カラムクロマトグラフィを２工程で行った。第一工程においては、以下のよう にして金属キレートクロマトグラフィを用いた。キレート ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ Ｆast Ｆlow（Ｐharmacia Ｂiotech）を含む直径５cm×長さ２０cmの大きさのカ ラムを脱イオン水中で充填した。カラムのおよそ上３分の２を、樹脂７．８ml当 たり１mlの０．１Ｍ ＮｉＣｌ₂を注入することによりＮｉ⁺⁺で荷電させた。次い で、カラムを ５ＣＶ の脱イオン水で洗浄した。カラムを、２ＣＶ の緩衝液Ａ （６Ｍグアニジン塩酸、０．５Ｍ塩化ナトリウム、２０mＭリン酸ナトリウム、 １mＭ２−メルカプトエタノール、pＨ７．２）で平衡化し、２８０nm でベース ラインの光学密度を測定した。ろ過した上清をＮａＯＨでpＨ７．２に調整し、 最終濃度１mＭになるように２−メルカプトエタノールを添加した。この還元試 料を室温に暖めた。還元試料を流速５０ml/分で注入した。次いで流速を１００m l/分に調整し、カラムを、カラム流出物が２８０nmでベースラインの光学密度に 達するまで緩衝液Ａで洗浄した。次いで、最初はpＨ７．２、次にpＨ６．３、そ して最後にpＨ５．５の６Ｍ尿素、０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．０２Ｍリン酸 ナトリウムを用いて、カラムを連続的に３回洗浄した。各洗浄は光学密度がベー スラインに戻るまで行った。 ＭＰ４は、６Ｍ尿素、０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．０２Ｍリン酸ナトリウム 、pＨ３．５を用いて、２８０nm で光学密度を監視しながらカラムから溶出した 。タンパク質含有画分をプールし、ＭＰ４を、以下のようにしてさらに精製した 。約３５mg のＭＰ４を含む（分析ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより概算 した）プール画分のアリコートを、ジチオスレイトールを最終濃度５０mＭ およ び塩酸グアニジンを最終濃度６Ｍになるよう添加し、pＨを８．０に調整するこ とにより、十分に還元した。次いで、試料を、３７℃で０．５時間インキュベー トした。得られた還元および変性した調製物を、次いで０．４５μフィルターを 通してろ過し、５５％ソルベントＡ（５０％ギ酸／５０％Ｈ₂Ｏ）および４５％ ソルベントＢ(５０％アセトニトリル／５０％ギ酸)で平衡化した直径１cm×長さ ２５cmの Ｃ４ ＶＹＤＡＣ（Ｈesperia，ＣＡ）逆相ＨＰＬＣカラムに室温で適 用した。（２８０nm でのベースライン光学密度の読み取りは、試料をカラムに 注入する前に行った。）注入後、カラム流出液を、読み取り値がベースラインに 戻るまで監視した。次いで、カラムを、５５％ソルベントＡ、４５％ソルベント Ｂから０％ソルベントＡ、１００％ソルベントＢまでソルベントＢが増加する直 線状勾配を用いて溶出した。 プールしたタンパク質含有画分を、約２〜３mg/mlの濃度になるまで、Ｒotava p濃縮機（Ｂuchi Ｃorp.）中で濃縮した。次いで、脱イオン水をフラスコに添加 して、試料をおよそもとの容量にし、再び試料を濃縮して残存するギ酸を除去し た。この過程は、もとの容量の約５〜１０倍の水を添加し除去するまで繰り返し た。次いで、試料を、１０，０００ダルトンカットオフＰＭ−１０膜を備えた攪 拌細胞濃縮器（Ａmicon）に移した。全部で１２透析容量（diavolumes）の脱イ オン水が試料を通過するまで３回脱イオン水を添加して、４℃で透析ろ過（diaf iltration）を行った。（試料の最終のpＨは３．５であった。） 得られた濃縮物質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび分析逆相ＨＰＬＣによる判定で ９０％にのぼるＭＰ４の純度を有していた。Ｎ末端アミノ酸配列決定により、単 離されたポリペプチドは配列番号２６の予測されたアミノ末端残基を含むことが 確認された。 ＭＰ４のさらなる精製が望まれる可能性がある。さらなる精製工程としては、 ゲルろ過クロマトグラフィおよびイオン交換クロマトグラフィ（好ましくはカチ オン交換クロマトグラフィ）が挙げられる。これらの工程は、０．１％〜１．０ ％の濃度の非イオン性界面活性剤（好ましくはＴＷＥＥＮ 20）の添加により容 易になる。非イオン性界面活性剤は、金属キレートクロマトグラフィに干渉しな いので、細胞溶解後の精製のいずれの時点で添加してもよい。 細菌由来のあらゆる医薬調製物についてのように、ＭＰ４調製物は、ヒトへの 投与の前に動物における毒性について試験され、有毒な調製物はいずれもさらに 精製されるか、廃棄される。このような毒性試験は、好ましくはマウスを用いて 、最も好ましくは後述するようにＥＡＥを誘発したマウスを用いて、脳炎誘発性 タンパク質の注射により、または好ましくはＥＡＥを患う動物からのＴ細胞の養 子移入により、行う。このような方式の試験は、処置の有効性が動物モデル系に おいて評価されるのを可能にするという付加的な利点を有する。このような試験 のためには、細菌により産生されたポリペプチドの３００μg用量を、好ましく は「ＥＡＥを有するマウスの治療」の小見出しの下に後述する適切な治療スケジ ュールにしたがって投与する。 本発明のＰＬＰポリペプチドにより誘発されるＴ細胞応答 本発明のΔＰＬＰ４およびＭＰ４ポリペプチドを、Ｔ細胞応答を刺激し、ＥＡ Ｅ／ＭＳを予防および治療するその能力について、インビトロおよびインビボ系 において試験した。これらの研究の結果を図１〜１２および表３に示す。これら の結果は、本発明のＰＬＰポリペプチドがＴ細胞応答を誘発することができ、種 々のＭＢＰおよびＰＬＰエピトープに対するＴ細胞反応性に影響を与えることが でき、そして、ＥＡＥを誘発し、予防し、治療することができることを明らかに する。 能動免疫によるＥＡＥの誘発 雌のＳＪＬ／Ｊマウスは、Ｊackson Ｌaboratories（Ｂar Ｈarbor,ＭＥ）か ら購入した。すべてのマウスは、８週齢から１２週齢の間で用いた。すべてのマ ウスは、無制限の標準的な実験室飼料および水で維持した。食餌は、麻痺した動 物が飼料および水に容易に近づけることを確実にするよう調整した。 雌のＳＪＬ／Ｊマウスを、１５０μg の結核菌Ｈ３７Ｒａ（Ｄifco；完全フロ イ ントアジュバント）および抗原を含有する１５０μl の不完全フロイントアジュ バント乳剤を用いて皮下注射により免疫した。抗原は、１００μg のオブアルブ ミン、１００μg の組換えΔＰＬＰ４、３００μg のＭＰ４または１５０μg の ＰＬＰペプチドＩＣＳ（位置１４０のシステインがセリンで置換されている配列 番号２２のアミノ酸残基１３９〜１５１）を含有していた。各１５０μl の注射 は、背側側面の３ヶ所に分配した。 予備的試験において百日咳毒素を同時投与した場合により高い発病率が得られ たので、０日目および３日目にすべてのマウスに、続いて３００ng の百日咳毒 素（Ｌist Ｂiologicals，Ｃampbell，ＣＡ）の注射も与えた。その正確な作用 モードは知られていないが、ＥＡＥ誘発における百日咳毒素の免疫調節効果は周 知である。百日咳毒素は、血液脳関門透過性を生成し、したがってＣＮＳへの脳 炎誘発性細胞の進入を容易にすると信じられている血管作用物質である。 疾患の当初の臨床的徴候は、通常、免疫後１２日と１６日の間に観察された。 マウスは毎日監視し、平均臨床スコアを各群に与えた。発病の平均日数は、臨床 的徴候の最初の出現に基づいて算出した。 ＥＡＥの養子移入 供与者ＳＪＬ／Ｊマウスは、上述のように１００μg のΔＰＬＰ４を用いて皮 下経路で免疫した。９〜１１日後、疲弊しているリンパ節細胞を収穫し、同系Ｓ ＪＬ／Ｊ抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下で２５μg/ml のＰＬＰペプチド１Ｃ Ｓで４日間刺激した。ペプチドで活性化したＴ細胞（０．１mlのＰＢＳ中、１． ６×１０⁷個）を収穫し、２回洗浄し、同系のナイーブ受容者に静脈経路で注射 した。 ＥＡＥを有するマウスの治療 マウスを、非処理マウス、および１２５μｇのΔＰＬＰ４またはハトシトクロ ームｃ（対照として）のいずれかの静脈注射を、養子移入実験においては２、４ および６日に、能動免疫実験においては５、７および９日に、１日２回（６〜８ 時間間隔）受けるマウスを含む処置群に分けた。 本明細書を通じて、種々の刊行物および特許の開示を引用している。これらの 教示および開示は、その全体が、本発明が属する分野の技術水準をより十分に説 明するために、参照により本明細書に取り込まれる。 本明細書において本発明の好ましいおよびその他の態様を記載したが、当業者 は、以下の請求の範囲に定義するとおりの本発明の範囲を逸脱することなく、さ らなる態様を企図し、実施することができる。 ＰＬＰペプチド名（左欄）中、ＰＬＰの文字に続く数字は、そのペプチドの配 列が配列番号２２のそれらの数字（両端を含む）のアミノ酸残基にわたり、それ らに相当することを示す。 ペプチド配列の最後の右肩の小文字は、そのペプチドを論述する参考文献を、 以下のように示す： 左欄（「ＰＬＰペプチド」）中の数字は、そのペプチドの配列が配列番号２２ のそれらの数字（両端を含む）のアミノ酸残基にわたり、それらに相当すること を示す。 ^*免疫は、ＣＦＡ（１５０μｇＨ３７Ｒａ）を用いて０日目に行った。用いた抗 原は、１００μｇオブアルブミン（Ｓigma）、１００μｇΔＰＬＰ４、１５０μ ｇＰＬＰペプチド１３９−１５１、または３００μｇＭＰ４であった。すべての 群に、０日目および３日目に３００ng百日咳毒素を静脈内注射により与えた。^† 免疫と最初のＥＡＥの徴候との間の平均日数を各群の動物について示す（範囲 をかっこ内に示す）。^‡ 疾患の重症度が最高のときの平均臨床等級を示す（範囲をかっこ内に示す）。 ^*recＭＢＰ２１．５は、Ｃ末端に６個の付加的なヒスチジンを含む。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/564 Ｚ 33/564 Ａ６１Ｋ 37/02 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (31)優先権主張番号 ０８／４８２，１１４ (32)優先日 1995年６月７日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ， ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ， ＶＮ (71)出願人 ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリ カ、リプレゼンテッド・バイ・ザ・セクレ タリー・デパートメント・オブ・ヘルス・ アンド・ヒューマン・サービシーズ アメリカ合衆国、メリーランド州 20852、 ロックビル、エグゼキューティブ・ブール バード 6011、スイート 325、オフィ ス・オブ・テクノロジー・トランスファ ー、ディレクター、ナショナル・インステ ィテュート・オブ・ヘルス (72)発明者 ミラー、ジョン・ピー アメリカ合衆国、コネチカット州 06512、 イースト・ヘイブン、シルバー・サンズ・ ロード 30、ユニット・19 エフ (72)発明者 レナード、マイケル・ジェイ アメリカ合衆国、メリーランド州 20854、 ポトマック、フォールズ・チャペル・ウェ イ 9117 (72)発明者 マクファーランド、ヘンリー・エフ アメリカ合衆国、メリーランド州 20879、 ゲイザーズ バーグ、ブリンク・ロード 1902 (72)発明者 マティス、ルイス アメリカ合衆国、コネチカット州 06490、 サウスポート、フリントロック・ロード 775 (72)発明者 ミラー、アイリーン・エリオット アメリカ合衆国、コネチカット州 06512、 イースト・ヘイブン、シルバー・サンズ・ ロード 30、ユニット・19 エフ (72)発明者 ナイ、スティーブン・エイチ アメリカ合衆国、ウィスコンシン州 53092、メコン、ウェスト・ウォーナキ ー・サークル 6906 (72)発明者 ペルフレイ、クララ・エム アメリカ合衆国、メリーランド州 20879、 ゲイザーズ バーグ、ブリングズ・コート 19803 (72)発明者 スクウィント、スティーブン・ピー アメリカ合衆国、コネチカット州 06524、 ベサニー、コーチマンズ・レーン 16 (72)発明者 ウィルキンズ、ジェイムズ・エイ アメリカ合衆国、コネチカット州 06525、 ウッドブリッジ、クラーク・ロード 21

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．アミノ酸８１が任意の標準アミノ酸であってよいことを除き配列番号１に規 定するアミノ酸配列を含む単離された免疫反応性ポリペプチド。 ２．標準アミノ酸がシステインではない、請求項１記載のポリペプチド。 ３．標準アミノ酸が、約１５０未満の分子量を有する荷電していないアミノ酸で ある、請求項１記載のポリペプチド。 ４．他の標準アミノ酸がセリンである、請求項３記載のポリペプチド。 ５．以下のもの： （a）好適な宿主において発現された場合、請求項１記載のポリペプチドの発現 を指示するヌクレオチド配列；または （b）（a）に相補的な配列；または （c）（a）および（b）の両方 を含む単離された核酸分子。 ６．以下のもの： （a）好適な宿主において発現された場合、アミノ酸８１が任意の標準アミノ酸 であってよいことを除き配列番号１に規定するアミノ酸配列を含むポリペプチド の発現を指示するヌクレオチド配列；または （b）（a）に相補的な配列；または （c）（a）および（b）の両方、 を含む単離された核酸分子であって、上記ヌクレオチド配列は、変更されたコド ンのセットを定義し、上記変更されたコドンのセットは、アミノ酸８１について のコドン以外の、少なくとも１つの変更されたコドンのセットのコドンが、ネイ ティブなコドンのセットを有する核酸分子が細菌において発現された場合よりも 変更されたコドンのセットを有する核酸分子が細菌で発現された場合に高いレベ ルのポリペプチドが産生されるように細菌により好まれるコドンであることにお いて、配列番号１に定義されたネイティブなコドンのセットと異なる、核酸分子 。 ７．位置８１のアミノ酸がシステインではない、請求項６記載の単離された核酸 分子。 ８．位置８１のアミノ酸がセリンである、請求項７記載の単離された核酸分子。 ９．変更されたコドンのセットを有する核酸分子が細菌において発現された場合 に産生されるポリペプチドのレベルが、ネイティブなコドンのセットを有する核 酸分子が細菌において発現された場合に産生されるポリペプチドのレベルの少な くとも１．５倍である、請求項６記載の単離された核酸分子。 １０．以下の工程： （１）上記核酸分子が宿主により発現されるように請求項５、６、７または８記 載の核酸分子を含む組換え宿主を生育させる工程；および （２）発現されたポリペプチドを単離する工程 を含む、ミエリン塩基性タンパク質ポリペプチドの製造方法。 １１．宿主が細菌宿主である、請求項１０記載の方法。 １２．発現されたポリペプチドの単離を、宿主を破壊して破壊物を生成した後、 上記破壊物を分画し、上記分画が破壊物の酸抽出を包含する工程を含むことを特 徴とする方法により達成する、請求項１０記載の方法。 １３．多発性硬化症患者を処置する方法であって、上記患者に、ヒトＭＢＰ遺伝 子のエクソン２の少なくとも一部によりコードされるアミノ酸配列を含むミエリ ン塩基性タンパク質アミノ酸配列を含む単離された免疫反応性ポリペプチドを、 ＭＢＰ反応性Ｔ細胞の寛容性を誘導するのに十分な患者の身体区画における上記 ポリペプチドの濃度を達成するのに十分な量で投与することを特徴とする方法。 １４．上記区画が患者の脳脊髄液である、請求項１３記載の方法。 １５．上記区画が患者の血液である、請求項１３記載の方法。 １６．上記区画がリンパ節である、請求項１３記載の方法。 １７．上記ポリペプチドを、少なくとも１２時間であって４日を超えない間隔で 少なくとも２回患者にポリペプチドを投与することを含む養生法にしたがって、 患者に投与する、請求項１３記載の方法。 １８．方法が、Ｔ細胞分裂を刺激するのに十分な患者の血液または脳脊髄液中の インターロイキン−２濃度を達成するのに十分な量でインターロイキン−２を患 者に投与することをさらに含む、請求項１３記載の方法。 １９．精製されたミエリン塩基性タンパク質ポリペプチドおよび医薬的に許容さ れうる担体を含む寛容性誘導組成物であって、上記ミエリン塩基性タンパク質ポ リペ プチドが、ヒトＭＢＰ遺伝子のエクソン２の少なくとも一部によりコードされる アミノ酸配列を含み、上記組成物が、ヒト患者に対する投与に好適である、組成 物。 ２０．上記ミエリン塩基性タンパク質ポリペプチドが、配列番号１のポリペプチ ドである、請求項１８記載の組成物。 ２１．上記ミエリン塩基性タンパク質ポリペプチドが、請求項４記載のポリペプ チドである、請求項１８記載の組成物。 ２２．包装材および上記包装材に含有される医薬製剤を含む製造物であって、 （a）上記医薬製剤が、精製されたミエリン塩基性タンパク質ポリペプチドおよ び医薬的に許容されうる担体を含み、上記ミエリン塩基性タンパク質ポリペプチ ドが、ヒトＭＢＰ遺伝子のエクソン２の少なくとも一部によりコードされるアミ ノ酸配列を含むこと； （b）上記製剤が、ヒト患者に対する投与に好適であること；および （c）上記包装材が、上記製剤は多発性硬化症の処置における使用のためのもの であることを示すラベルを含むこと を特徴とする製造物。 ２３．患者からＴ細胞を単離し部分的に精製すること、単離されたＴ細胞をヒト ＭＢＰ遺伝子のエクソン２の少なくとも一部によりコードされるアミノ酸配列を 含むミエリン塩基性タンパク質ポリペプチドを含む精製された免疫反応性ポリペ プチドと一緒にすること、および上記ポリペプチドにより誘導されたＴ細胞応答 のレベルを測定することを特徴とするアッセイ。 ２４．ヒトＭＢＰ遺伝子のエクソン２の少なくとも一部によりコードされるアミ ノ酸配列を含む約２１．５kＤ の質量を有する精製されたミエリン塩基性タンパ ク質ポリペプチドを、Ｔ細胞応答の検出における使用のための要素の近傍におよ び／または密封して含む、ＭＢＰ反応性Ｔ細胞の検出のためのキット。 ２５．上記キットが、そのキットは多発性硬化症の臨床的評価における使用のた めのものであることを示すラベルをさらに含む、請求項２４記載のキット。 ２６．ＰＬＰムテインを含む免疫反応性ポリペプチドであって、上記ムテインが アミノ酸配列を含み、上記配列がネイティブなＰＬＰポリペプチドから少なくと も３つの疎水性ペプチド領域を除いたものの配列を含む、ポリペプチド。 ２７．上記ＰＬＰムテインが、配列番号２３のアミノ酸残基６〜１８６（６およ び１８６を含む）にわたるアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を含む、請求項 ２６記載の免疫反応性ポリペプチド。 ２８．上記ＰＬＰムテインが、ネイティブなＰＬＰポリペプチドよりも高いレベ ルで細菌中で発現される、請求項２６記載の免疫反応性ポリペプチド。 ２９．上記ＰＬＰムテインが、ネイティブなＰＬＰポリペプチドよりも水性溶液 中において可溶性が高い、請求項２６記載の免疫反応性ポリペプチド。 ３０．上記ＰＬＰムテインが、配列番号２４のアミノ酸残基６〜１６９（６およ び１６９を含む）にわたるアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を含む、請求項 ２６記載の免疫反応性ポリペプチド。 ３１．配列番号１のミエリン塩基性タンパク質の少なくとも１０個の連続するア ミノ酸を含むＭＢＰアミノ酸配列をさらに含む、請求項２６記載の免疫反応性ポ リペプチド。 ３２．１つの標的アミノ酸残基以外のすべてが配列番号１のアミノ酸残基８１を 含む配列番号１の領域に相当する少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含むＭ ＢＰアミノ酸配列をさらに含む請求項２６記載の免疫反応性ポリペプチドであっ て、上記標的アミノ酸残基が配列番号１のアミノ酸残基８１の位置に相当するＭ ＢＰアミノ酸配列内の位置に存在し、上記標的アミノ酸残基が、配列番号１のア ミノ酸残基８１であるシステイン以外の任意の標準アミノ酸である、ポリペプチ ド。 ３３．配列番号２５に規定するアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を含む、請 求項２６記載のＰＬＰムテイン。 ３４．配列番号２６のアミノ酸残基１〜３６８（１および３６８を含む）にわた るアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を含む、請求項２６記載のＰＬＰムテイ ン。 ３５．配列番号２７のアミノ酸残基６〜３７４（６および３７４を含む）にわた るアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を含む、請求項２６記載のＰＬＰムテイ ン。 ３６．配列番号２８のアミノ酸残基１〜４８７（１および４８７を含む）にわた るアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を含む、請求項２６記載のＰＬＰムテイ ン。 ３７．ヒトミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質のアミノ酸配列の少なく とも１０個の連続するアミノ酸に相当するミエリンオリゴデンドロサイト糖タン パ ク質アミノ酸配列をさらに含む請求項２６記載のポリペプチドであって、上記ヒ トミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２８ のアミノ酸残基１９９〜３１９（１９９および３１９を含む）にわたるアミノ酸 配列に相当する、ポリペプチド。 ３８．以下のもの： （a）好適な宿主中で発現された場合、請求項２６記載のポリペプチドの発現を 指示するヌクレオチド配列；または （b）（a）に相補的な配列；または （c）（a）および（b）の両方 を含む単離された核酸分子。 ３９．以下のもの： （a）好適な宿主中で発現された場合、請求項２７記載のポリペプチドの発現を 指示するヌクレオチド配列；または （b）（a）に相補的な配列；または （c）（a）および（b）の両方 を含む単離された核酸分子。 ４０．以下のもの： （a）好適な宿主中で発現された場合、請求項２９記載のポリペプチドの発現を 指示するヌクレオチド配列；または （b）（a）に相補的な配列；または （c）（a）および（b）の両方 を含む単離された核酸分子。 ４１．以下のもの： （a）好適な宿主中で発現された場合、請求項３０記載のポリペプチドの発現を 指示するヌクレオチド配列；または （b）（a）に相補的な配列；または （c）（a）および（b）の両方 を含む単離された核酸分子。 ４２．以下のもの： （a）好適な宿主中で発現された場合、請求項２５記載のポリペプチドの発現を 指示するヌクレオチド配列；または （b）（a）に相補的な配列；または （c）（a）および（b）の両方 を含む単離された核酸分子。 ４３．以下のもの： （a）好適な宿主中で発現された場合、請求項３１記載のポリペプチドの発現を 指示するヌクレオチド配列；または （b）（a）に相補的な配列；または （c）（a）および（b）の両方 を含む単離された核酸分子。 ４４．以下のもの： （a）好適な宿主中で発現された場合、請求項３２記載のポリペプチドの発現を 指示するヌクレオチド配列；または （b）（a）に相補的な配列；または （c）（a）および（b）の両方 を含む単離された核酸分子。 ４５．以下のもの： （a）好適な宿主中で発現された場合、請求項３３記載のポリペプチドの発現を 指示するヌクレオチド配列；または （b）（a）に相補的な配列；または （c）（a）および（b）の両方 を含む単離された核酸分子。 ４６．以下のもの： （a）好適な宿主中で発現された場合、請求項３４記載のポリペプチドの発現を 指示するヌクレオチド配列；または （b）（a）に相補的な配列；または （c）（a）および（b）の両方 を含む単離された核酸分子。 ４７．以下のもの： （a）好適な宿主中で発現された場合、請求項３５記載のポリペプチドの発現を 指示するヌクレオチド配列；または （b）（a）に相補的な配列；または （c）（a）および（b）の両方 を含む単離された核酸分子。 ４８．以下のもの： （a）好適な宿主中で発現された場合、請求項３６記載のポリペプチドの発現を 指示するヌクレオチド配列；または （b）（a）に相補的な配列；または （c）（a）および（b）の両方 を含む単離された核酸分子。 ４９．以下のもの： （a）好適な宿主中で発現された場合、請求項３７記載のポリペプチドの発現を 指示するヌクレオチド配列；または （b）（a）に相補的な配列；または （c）（a）および（b）の両方 を含む単離された核酸分子。 ５０．請求項２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、 ３８または３９記載の核酸分子を含む組換え宿主を宿主により上記核酸分子が発 現されるように生育させること、および発現されたポリペプチドを単離すること を特徴とするＰＬＰポリペプチドの製造方法。 ５１．上記宿主が細菌宿主である、請求項５０記載の方法。 ５２．多発性硬化症患者を処置する方法であって、上記患者に、単離された免疫 反応性ポリペプチドを、ＰＬＰ反応性Ｔ細胞の寛容性を誘導するのに十分な患者 身体の区画における上記ポリペプチドの濃度を達成するのに十分な量で投与する ことを含み、上記ポリペプチドが、ネイティブなＰＬＰポリペプチドから少なく とも３つの疎水性ペプチド領域を除いたもののアミノ酸配列を含むアミノ酸配列 を有するＰＬＰムテインを含む、方法。 ５３．上記区画が患者の脳脊髄液である、請求項５２記載の方法。 ５４．上記区画が患者の血液である、請求項５２記載の方法。 ５５．上記区画がリンパ節である、請求項５２記載の方法。 ５６．上記ポリペプチドを、投与間が少なくとも１２時間であって４日を超えな い間隔で少なくとも２回患者に上記ポリペプチドを反復的に投与することを含む 養生法にしたがって、患者に投与する、請求項５２記載の方法。 ５７．方法が、Ｔ細胞分裂を刺激するのに十分な患者の血液または脳脊髄液中の インターロイキン−２濃度を達成するのに十分な量でインターロイキン−２を患 者に投与することをさらに含む、請求項５２記載の方法。 ５８．以下のもの： （１）ネイティブなＰＬＰポリペプチドから少なくとも３つの疎水性ペプチド領 域を除いたもののアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有するＰＬＰムテインを含 む、精製されたＰＬＰポリペプチド；および （２）医薬的に許容されうる担体 を含む組成物であって、ヒト患者に対する投与に好適である組成物。 ５９．上記ＰＬＰムテインが、配列番号２３のアミノ酸配列に相当するアミノ酸 配列を含む、請求項５８記載の組成物。 ６０．上記ＰＬＰムテインが、配列番号２４のアミノ酸配列に相当するアミノ酸 配列を含む、請求項５８記載の組成物。 ６１．以下のものを含むアミノ酸配列を有するＰＬＰムテイン： （１）上記ＰＬＰムテインがネイティブなＰＬＰポリペプチドよりも高いレベル で細菌中で発現されるようにネイティブなＰＬＰポリペプチドから少なくとも３ つの疎水性ペプチド領域を除いたもののアミノ酸配列；および （２）医薬的に許容されうる担体 を含む寛容性誘導組成物であって、ヒト患者に対する投与に好適である組成物。 ６２．包装材および上記包装材に含有される医薬製剤を含む製造物であって、 （a）上記医薬製剤が、ネイティブなＰＬＰポリペプチドから少なくとも３つの 疎水性ペプチド領域を除いたもののアミノ酸配列を有するＰＬＰムテインアミノ 酸配列を含むＰＬＰポリペプチド、および医薬的に許容されうる担体を含むこと ； （b）上記製剤が、ヒト患者に対する投与に好適であること；および （c）上記包装材が、上記製剤は多発性硬化症の処置における使用のためのもの であることを示すラベルを含むこと を特徴とする製造物。 ６３．患者からＴ細胞を単離し部分的に精製すること、単離されたＴ細胞をネイ ティブなＰＬＰポリペプチドから少なくとも３つの疎水性ペプチド領域を除いた もののアミノ酸配列を有するＰＬＰムテインアミノ酸配列を含む免疫反応性ポリ ペプチドと一緒にすること、および上記ポリペプチドにより誘導されたＴ細胞応 答のレベルを測定することを特徴とするアッセイ。 ６４．ネイティブなＰＬＰポリペプチドから少なくとも３つの疎水性ペプチド領 域を除いたもののアミノ酸配列を有するＰＬＰムテインアミノ酸配列を含むＰＬ Ｐポリペプチドを、Ｔ細胞応答の検出における使用のための要素の近傍におよび ／または密封して含む、ＰＬＰ反応性Ｔ細胞の検出のためのキット。 ６５．上記キットが、そのキットは多発性硬化症の臨床的評価における使用のた めのものであることを示すラベルをさらに含む、請求項６４記載のキット。