KR100682350B1 - 변형된미엘린단백질분자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 다발성 경화증의 임상적 평가, 진단 및 치료용 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명의 조성물은 인간 프로테오리피드 단백질(PLP) 및/또는 인간 미엘린 염기성 단백질(MBP)과 관련된 분자이며, 핵산과 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 핵산 분자는 변형된 PLP 폴리펩티드 및 변형된 MBP 폴리펩티드의 제조에 유용하며,이러한 폴리펩티드는 PLP 및 MBP 에티토프에 대한 반응성에 대해 T 세포를 분석하는데 유용하다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드는 다발성 경화증의 치료 수단으로서 면역성 결여 및 세포소멸을 포함하는 T 세포 반응을 유도하므로써 작용하는 치료제로서 유용하다.

Description

변형된 미엘린 단백질 분자{MODIFIED MYELIN PROTEIN MOLECULES}

본 발명은 자가면역 질병의 치료에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 다발성 경화증(MS)의 진단 및 치료를 수행하는 조성물을 제공한다. 더 구체적으로, 본 발명은 조작된 인간 미엘린 염기성 단백질(MBP) 분자, 즉 MBP 폴리펩티드 및 MBP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자, 및 프로테오리피드 단백질(PLP) 분자, 즉 PLP 서열을 포함하는 폴리펩티드 및 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자 뿐만 아니라 다발성 경화증의 진단, 임상적 평가 및 치료를 위해 상기 폴리펩티드를 사용하는 방법을 제공한다.

본 명세서에서의 논의는 본 발명에 대한 "종래 기술"로서 부여되는 주제에 제한되지 않는다. 따라서, 이러한 종래 기술의 어떤 인정도 본 논의에서 특정 주제의 내포를 이유로 추론되거나 암시되지 않을 것이며, 본 발명자의 관심에 대한 어떠한 발표도 이러한 내포를 이유로 암시되지 않을 것이다.

자가면역 질환

특정 자가 항원에 대한 관용성의 상실에 기인하는 자가면역 질환은 이들 항원에 대한 면역 체계의 부적절한 공격을 유발한다. 여러 가지 메카니즘이 정상적으로 작용하여 면역 체계의 항체-매개된(체액성) 국면 및 세포성 국면 둘 다에서 면역 자가-관용성을 유지하고 있다. 이들 메카니즘이 정상적으로 기능하지 못하는 경우 자가면역 질환이 발생한다.

이러한 잘못 유도된 면역 체계 활성에 기인한 질병은 미국의 경우에만 일천만명 이상의 환자에게 영향을 미치고 있다. 이들 질병의 징후 보다는 원인을 치료하기 위한 치료법을 찾기 위한 노력이 오랫동안 수행되어 왔다. 어떤 제제가 자가면역 활성의 이로운 감소를 제공하는 것으로 확인되었지만, 일반적으로 이러한 치료는 바람직하지 않으며, 정상적인 면역 기능에 유해한 영향을 끼칠수 있기 때문에 최적의 치료법은 될 수 없었다.

다발성 경화증

다발성 경화증(MS)은 진행성의 신경퇴행성 자가면역 질환으로서, 약 350,000명의 미국인이 고통받고 있다[참조: Hauser (1994)]. 남성에 비해 2배 이상의 여성이 질병을 앓고 있다. 보통 다발성 경화증은 15세 내지 50세의 환자, 특히 20 내지 40세의 젊은 여성 환자들에게 나타난다. 다발성 경화증은 이 질병을 앓고 있는 개체의 중추신경계(CNS)의 육안 식별에서 볼 수 있는 손상된(경화성) 다수의 퇴화 부분으로 인해 다발성 경화증으로 명명되었다. 다발성 경화증과 관련된 퇴화는 수초탈락, 만성 염증, 및 뇌, 시신경 및 척수의 영향받은 부분의 신경교증(손상)을 포함한다.

다발성 경화증은 질병 진행의 상이한 유형 및 단계에 의해 특징지워 진다. 환자가 악화 및 완화 기간을 경험하는 경우, 그 환자는 재발성 다발성 경화증 및 완화성 다발성 경화증을 보유하는 것으로 진단된다. 신속하게 진행하는 다발성 경화증 또는 만성적으로 진행하는 다발성 경화증은 질병 진행의 정도에 따라 진단된다. 이들 단계는 보통 개별적인 공격으로부터 회복의 정도가 감소되는 경우, 상기 질병의 진행 이후에 발생하며, 악화 단계들 사이에 임상적으로 안정한 기간이 존재한다. 불활성 다발성 경화증은 전형적으로 질병 진행 이후에 발생하며, 가변적인 크기의 정해진 신경학적 결함을 특징으로 한다.

다발성 경화증은 항상 쇠약을 동반하며, 때로는 마비와 죽음에 이르기도 한다. 다발성 경화증을 최초 촉발시키는 인자는 아직 알려지지 않고 있지만, 다발성 경화증의 질병 상태가 미엘린 초(sheath)에 대한 비정상적인 면역 반응에 기인한다라는 설득력있는 증거가 확인된 바 있다. 이러한 면역 반응에는 임의 백혁구의 자가면역 작용이 연루되어 있다. 상기 관점에서 신경항원-특이성 T 세포가 특히 중요한 것으로 생각된다.

병리학적으로, 다발성 경화증은 백질의 만성 염증, 수초탈락 및 신경교증을 특징으로 한다. 플라크라고 불리우는 다발성 경화증의 고전적인 병변은 주위의 백질과 용이하게 식별되는 한계가 명확한 회색 또는 분홍색 부분이다. (백질의 착색은 이 조직내에 있는 고농도의 미엘린에 기인한다.) 급성 다발성 경화증 병변은 단핵 세포, 주로 T 세포(헬퍼 T 세포 및 세포 독성 T 세포 둘 다) 및 마크로파지에 의한 조직 침윤과 관련된 수초탈락, 거의 존재하지 않는 B 세포 및 혈장 세포와 관련된 수초탈락을 특징으로 한다. 이들 염증성 침윤물은 상기 질병의 특징인 수초탈락을 매개하는 것으로 보인다. 활성화된 T 세포는 마크로파지 침윤 및 활성화를 촉진하는 시토킨을 방출하기 때문에, T 세포는 다발성 경화증에서 병원성 자가면역 공격의 주 매개자인 것으로 생각된다. T 세포 및 미엘린에 대한 더 상세한 논의는 후술하는 "T 세포 생리학", "T 세포 및 자가면역 발병학", 및 "다발성 경화증에서 T 세포 표적 한정된 자가항원"에서 확인할 수 있다.

다발성 경화증에 대한 현재의 치료 방법은 다양하다. 질병의 심각성 및 치료에 대한 반응에 따라 여러 가지 선택할 수 있는 약물 치료법을 사용할 수 있다. 다발성 경화증 치료에 사용된 약물로는 프레드니손과 메틸프레드니솔론과 같은 스테로이드; 뇌하수체 호르몬(ACTH)과 같은 호르몬; 아자티오프린과 같은 항대사물질; 시클로포스파미드와 같은 알킬화제; 및 시클로스포린과 같은 T-세포 억제제를 들 수 있다. 이들중 임의 약물의 투여는 위험한데, 이들 모든 약물은 전형적으로 일정 수준의 일반화된 면역억제를 나타내며, 환자가 더 쉽게 감염되는 경향이 있기 때문이다. 또한, 상기 약물로 환자를 치료하는 경우, 환자는 욕지기, 탈모, 고혈압 및 신장 장애와 같은 부작용을 경험할 수도 있다. 또한, 이들 약물중 몇몇은 발암성이다.

다발성 경화증을 치료하기 위한 새로운 접근법으로는 인터페론-베타 치료법을 들 수 있는데, 이 치료법은 다발성 경화증 공격의 빈도를 감소시킬 수 있으며, 질병의 진행 속도를 느리게할 수 있다. 다른 새로운 치료법으로는 후술하는 바와 같이 다발성 경화증 자가면역 반응에 연루된 항원을 투여하는 방법을 들 수 있다.

다발성 경화증의 진단

다발성 경화증은 전형적으로 의학적 이력 및 물리적 조사에 기초하여 진단된다. 다발성 경화증에 독특한 임상적 징후 또는 진단 시험은 없다. 다발성 경화증에 공통적으로 관련된 단일 초기 징후를 이용한 환자의 진단은, 재발성 질병 및 완화성 질병의 징후가 다발성 경화증의 진단 가능성을 증가시킴에도 불구하고, 정확한 방법은 아니다. 24시간 지속되거나, 1개월 이상의 간격으로 발생하거나, 6개월 이상에 걸쳐 사인과 징후가 서서히 진행하는 2개 이상의 악화되는 증상은 다발성 경화증의 유력한 지표로 생각된다. 중추신경계 백질의 2개 이상의 부위내의 연루를 유추할 수 있는 MRI 진단 및 전신성 질병의 증거 또한 다발성 경화증의 지표가 된다.

현재, 여러 가지 실험실적 테스트를 수행하여 상기 질병 진행의 진단 및 평가를 확인하고 있다. 이러한 테스트로는 다발성 경화증 병인의 화학적 및 세포성 징후에 대한 인간 뇌척수액(CSF) 및 혈액의 분석을 들 수 있다.

다발성 경화증과 관련된 CSF 비이상성은 단핵 세포 수액세포증다증 및 자가반응성(전형적으로 미엘린 반응성) T 세포의 존재, 전체 Ig의 수준 증가 및 전형적으로 2개 이상의 올리고클로날 밴드에 의해 확인된 올리고클로날 Ig의 존재로 이루어진다. 약 80％의 환자에서, IgG의 CSF 함량은 전체 단백질이 정상적인 농도로 존재하는 경우 증가된다. 이는 중추신경계 내에서 IgS의 선택적인 생성의 결과이다.

CSF IgG의 올리고클로날 밴드 형성은 아가로즈 겔 전기영동법으로 검출된다. 2개 이상의 올리고클로날 밴드는 다발성 환자의 75 내지 90％에서 확인된다. 올리고클로날 밴드의 존재는 다발성 경화증에서 상승된 전체 IgG 수준과 관련되어 있다. 다발성 경화증 CSF에서 다른 Ig 비이상성으로는 유리 카파 또는 람다 경쇄 및 IgA를 포함하는 기타 Ig 이소타입의 상승된 수준을 포함한다.

또한, 미엘린 분해로부터 유래하는 대사물질은 CSF 내에서 검출할 수 있다. PLP 또는 그의 단편의 상승된 수준은 다발성 경화증 환자 및 기타 신경학적 질병을 앓고 있는 환자에서 예를 들어 방사성 면역 분석법으로 검출할 수 있다.

CSF에 대한 상기한 다수의 병리학적 징후 이외에, 다발성 경화증 환자의 혈액은 IgG 합성의 증가된 수준, 다형핵 백혈구, 감소된 혈청 B₁₂ 수준, 증가된 적혈구 침강 속도 및 자가항체 또는 자가반응성 T 세포의 존재를 나타낼 수 있다. 후술하는 바와 같이, "반응성 T 세포 지수"는 다발성 경화증의 임상적 과정을 검색하기 위해 특히 유용항 세포성 발견이다.

다발성 경화증에 대한 이들 여러 가지 지표는 임상적으로 유용하지만, 혈액 또는 뇌척수액 테스트와 같은 상대적으로 저가(MRI와 같은 고가의 상형성 기법에 비해)이며, 용이하게 정량할 수 있는 테스트를 이용하여 다발성 경화증 환자의 자가면역 활성의 과정과 정도를 테스트할 수 있는 다른 수단이 요구되고 있다.

T 세포, 항원 제시 세포 및 T 세포 에피토프

상기한 바와 같이, 다발성 경화증 병인은 백혈 세포(백혈구), 가장 중요한 T 세포의 부적절한 작용에 의해 매개되는 것으로 생각된다. T 세포는 다수의 필수적인 면역 기능을 수행하는 단핵 백혈 세포이다. 인간 자가면역 질병에서 T 세포의 중요성에 대한 관심은 과거 십연년간 증가되어 왔다. 일반화된 면역 억제를 일으키는 처리를 이용하는 연구는 단백질 또는 펩티드 항원에 대한 모든 면역 반응(세포성 및 체액성 둘 다)의 주 조절자로서 CD4⁺ 또는 헬퍼 T 세포로 공지된 T 세포의 아군을 위한 결정적인 역할로 한정되어 왔다.

T 세포는 직접적인 수단 또는 간접적인 수단에 의해 조직 손상을 매개한다. CD8⁺(세포 독성) 및 CD4⁺(헬퍼) 아군의 T 세포는 여러 가지 형태의 백혈구를 활성화시키므로써 간접적으로 조직을 손상시킬 수 있는 여러 가지 염증성 시토킨을 분비한다. 이러한 T 세포 효과의 예로는 항체 분비 B 세포의 활성화(체액성 면역반응의 자극) 및 마크로파지의 활성화를 들 수 있는데, 이는 가수분해성 효소, 반응성 산소종 및 추가 예비-염증성 시토킨의 방출에 의한 급성 조직 손상 및 염증의 원인이 될 수 있다. 이러한 T 세포 활성의 간접적인 효과이외에도, 직접적인 조직손상이 표적 항원을 나타내는 세포를 공격하는 CD8⁺ 세포독성 T 세포에 의해 매개될 수 있다.

T 세포 생리학의 한 독특한 관점은 그들의 세포 표면 상에서 T 세포 수용체(TCR)라 칭하는 막 결합된 항체-유사 결합 구조의 존재이다. 항체와 같이, TCR은 높은 특이성으로 특정 항원에 결합한다. 세포의 다수 클론으로서 성장하고, 각각의 클론이 독특한 특이성을 가진 항체를 생성하는 항체-생성 세포와 같이, T 세포는 다수의 구별되는 클론으로 성장하며, 임의의 특정 T 세포 클론은 한정된 결합특이성을 갖는 단일 형태의 TCR을 발현한다. 자가 항원이 특이적으로 결합하는 TCR을 가진 T 세포 클론은 자가면역 질병의 진전에 일익을 담당한다.

가용성 분자라기 보다는 세포 표면에 존재하는 사실 이외에, 그들이 항원을 인식하는 방법에서 TCR은 항체와 상이하다. 항체는 여러 가지 구조의 항원과 결합하지만(예를 들어, 천연 항원, 변성된 항원, 가용성 항원 또는 막 결합된 항원), TCR은 단지 항원이 항원 제시 세포(APC)로 공지된 특정 세포에 의해 분해(처리)된 후에 대부분의 항원에 결합하고, 생성된 펩티드는 주요한 조직적합성 복합체(MHC)의 부류 II 또는 부류 I 단백질과 결합하여 APC의 세포 표면상에 나타난다(제시된다). 인간 군집에서, 상이한 개체는 이들 부류의 매우 상이한 MHC 분자를 나타낼 수 있다. 따라서, 다수의 상이한 에피토프는 이러한 개체 내에서 우선적으로 제시될 수 있다.

항원 처리가 APC에 의해 수행되는 상세한 메카니즘에 대한 이해는 불충분하다. 결과적으로 항원이 이미 이러한 관점에서 특정화되지 않았다면, 주어진 항원을 상기한 방식으로 처리하여 특정 펩티드를 생성하고, 나타낼 수 있는 APC의 능력에는 상당한 불확실성이 존재한다.

항원으로 하여금 TCR에 의해 T 세포를 자극하도록 하기 위해 APC가 항원을 처리하고, 제시하는 요구조건에 대한 한 예외는 작은 펩티드 항원의 경우이다. 이러한 펩티드는 APC에 의해 처리되지 않고, 세포 표면 상에서 MHC 부류 I 분자에 직접 결합할 수 있으며, 이어서 특정 TCR에 의해 "인식" 및 결합되므로써 T 세포를 자극할 수 있다.

항체 및 TCR과 그들의 특정 항원과의 상호작용에 대한 연구 결과, 특정 폴리펩티드 항원은 전형적으로 에피토프로 공지된 다수의 아분자 특성을 포함하는데, 이들 각각은 특정 항체 또는 (폴리펩티드의 APC 처리 및 T 세포 에피토프를 포함하는 유도된 펩티드의 MHC 표시 이후) 특정 TCR을 위한 구별된 결합 위치로서 작용할 수 있다.

따라서, TCR 및 항체는, 각각 폴리펩티드 항원의 작은 부분을 인식한다라는 점에서 유사하다. 이들은, 항체가 전형적으로 손상되지 않은 폴리펩티드의 구조 내의 그의 특이성 에피토프를 인식하는 반면, TCR은 단지 APC의 세포 표면 상에서 처리된 폴리펩티드의 MHC 부류 II 또는 부류 I 결합된 펩티드 단편으로서 특이성 에피토프만을 인식한다라는 점에서 상이하다. 중요한 점은, 상기 TCR 에피토프 인식 과정이 단지 APC가 적합한 펩티드를 생성하고, 나타내기 위해 폴리펩티드 항원을 보유할 수 있는 경우에만 나타난다는 것이다. 따라서, 특이성 TCR에 의해 인식되는 펩티드가 특정 폴리펩티드 항원 내에 존재함에도 불구하고, 특이성 TCR을 발현하는 T 세포를 자극할 수 있는 펩티드가 생체 내에서 상기 폴리펩티드 항원으로부터 유래될 것인가에는 의문의 여지가 있다. 왜냐하면, APC가 특정 폴리펩티드 항원을 처리하므로써 특이성 TCR에 의해 인식되는 펩티드를 생성하느냐하는 점이 불확실하기 때문이다.

이는 몇가지 요인으로 인해 특정 폴리펩티드 항원의 APC 처리 결과에 대한 확실성을 저하시킨다. 상기 폴리펩티드 내에 함유된 특이성 펩티드 에피토프를 나타내기 위한 특정 폴리펩티드 항원의 처리를 APC가 수행할 수 없는 한가지 이유는 APC가 에피토프 내에 있는 임의 위치에서 상기 폴리펩티드를 효과적으로 절단하므로써 상기 폴리펩티드를 파괴시키기 때문이다. 두 번째 이유는 상기 폴리펩티드가 폴리펩티드 처리에 일익을 담당하는 APC의 아세포성 구획 내로 진입할 수 없거나, 상기 구획에 의해 효과적으로 분해되지 않기 때문이다.

일차구조(선형 아미노산 서열), 이차구조(선형 아미노산 서열에서 서로 인접한 아미노산 잔기의 상호작용에 기인한 3차원 구조), 또는 삼차구조(선형 아미노산 서열에서는 서로 떨어져 있지만, 폴리펩티드 쇄의 접힘(foldiing)으로 인해 서로 인접하게 되는 아미노산 잔기들의 상호작용에 기인한 3차원 구조)의 특정 관점은 APC 처리에 영향을 미칠 수 있다. 폴리펩티드의 아미노산 서열은 APC에 의해 처리 및 나타나게 되어 특이성 T 세포를 자극하기 위한 그의 가능성 결정에서 명백히 매우 중요한 요인이다. 특이성 T 세포의 TCR에 의해 인식되는 펩티드는 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 내에 포함되어야만 한다. 또한, 상기 아미노산 서열은 상기 폴리펩티드의 가능한 이차 및 삼차구조(즉, 접힘)를 결정한다.

또한, 폴리펩티드의 접힘은 APC 처리에 현저한 영향을 미칠 수 있다. 특정 폴리펩티드로부터 유래하는 특이성 에피토프의 APC에 의한 표시의 불확실성에 대해 이미 기술한 첫 번째 및 두 번째 이유 둘 다 상기 폴리펩티드가 접혀지는 방식에 기인할 수 있다. 처리중에 APC 내의 단백질 분해성 절단은 접힘에 기인한 절단 위치의 노출 또는 가림에 의해 영향받을 수 있다. 아세포성 구획내로 폴리펩티드의 진입은 상기 폴리펩티드의 3차원 구조에 의해 영향받는 것으로 널리 알려져 있으며, 상기 3차원 구조는 접힘의 작용이다.

T 세포 및 자가면역 질병

자가면역 질병에서, 소수의 자가항원의 여러 가지 에피토프와 반응성인 단지 제한된 수의 T 세포 클론은 활성화되며, 병인에 관련되어 있다. 질병을 일으키는 자가반응성 T 세포의 상기 병원성 활성화에 역할을 수행하는 여러 가지 메카니즘이 가정되었다. 감염 또는 국소 염증에 의한 항원 제시 세포(APC)의 일차 활성화는 이러한 메카니즘에 연루되어 있다. 이러한 방식으로 활성화된 APC는 비반응성인 T 세포를 위한 강력한 동시자극을 제공할 수 있다.

기타 제안된 메카니즘은 이전의 진정기의 자가반응성 T 세포의 박테리아 독소와 같은 초항원에 의한 다중클론 활성화; 또는 외래 항원과 자가항원 사이의 동시 발생하는 분자 의태(molecular mimicry)를 포함한다[참조: Abbas 등, (1994)]. 상기 마지막 경우에서, 숙주 면역 체계는 숙주 단백질 상의 상동성 에피토프와 유사한 비루스와 같은 병원체에 의해 발현되는 단백질 상의 에피토프에 반응한다. 자가면역 공격은 후속하여 발생하는 교차 반응성 면역 반응에 기인한다.

외부 인자 이외에 모든 T 세포 매개된 자가면역 질병의 근원적인 출현은 다 유전자성 인자에 의해 결정되는 유전된 민감성의 복잡한 패턴이다. 이들 여러 가지 인자에 대한 추가의 논의는 문헌[참조: Steinman, reviews current theories of autoimmunity (1995)]에 기술되어 있다.

다발성 경화증(바로 후술하는 바와 같이 "다발성 경화증에서 T 세포 표적 한정된 자가항원")을 포함하는 몇몇 자가면역 질병에서, 비정상적인 면역 반응에 의해 표적화된 자가항원의 일부 또는 전부는 동정되었다. 이들 자가 항원 및 다발성 경화증과 같은 자가면역 질환에서 자가반응성 T 세포에 의해 표적화된 이들 자가항원 내의 특이성 에피토프에 대한 지식은 치료에 대한 접근법을 제공한다. 이러한 내용은 후술하는 "항원 투여에 의한 다발성 경화증의 치료" 및 "세포소멸의 치료적 유도"에 기재되어 있다.

다발성 경화증에서 T 세포 표적 한정된 자가항원

상기한 바와 같이, 다발성 경화증의 정확한 병인은 알려지지 않았지만, 자가면역 공격은 상기 질병의 증거인 중추신경계 미엘린의 파괴에 명백히 일익을 담당한다. 미엘린은 특정 뉴우론의 축삭을 둘러싸고 있는 미엘린 초의 특징적인 성분이며, 이들 뉴우론의 적절한 신호 전달 기능을 위해 필수적인 성분이다. 따라서, 다발성 경화증과 관련된 수초탈락은 영향받은 뉴우론의 기능 상실을 야기시키고, 뉴우론 신호전달을 파괴하고, 마비에 이르게하며, 감각 기능의 심각한 손상을 초래하게 된다.

미엘린 초는 올리고덴드로사이트(중추신경계 내) 및 슈완 세포(말초신경계 내)로 이루어진다. 미엘린은 지질(예를 들어, 콜레스테롤, 인지질 및 스핑고리피드) 및 단백질로 이루어진 규칙적인 교호층으로 구성되어 있다.

미엘린의 4개의 주 단백질, 즉 미엘린 염기성 단백질(MBP), 프로테오리피드 단백질(PLP), 미엘린 관련된 당단백질(MAG) 및 미엘린 올리고덴드로사이트 단백질(MOG)은 다발성 경화증 환자로부터 분리된 자가반응성 T 임파구에 의해 인식된다[참조: Endoh 등, (1986); Martin 등, (1992); kerlero de Rosbo 등, (1993); Amor 등, (1994); Johns 등, (1995)].

미엘린 염기성 단백질(MBP) 및 프로테오리피드 단백질(PLP)은 미엘린의 주 단백질 성분이며, 각각 미엘린 초의 전체 단백질 성분의 약 30％ 및 50％를 포함한다. MBP 및 PLP는 다발성 경화증에서 주요한 표적 자가항원으로 나타나며, MBP 및 PLP와 반응성인 T 세포는 다발성 경화증의 병인에서 중요한 역할을 수행한다[참조: Schwaetz (1993); Brown 및 McFarlin (1981) Lab Invest 45, pp. 278-284; Allegretta 등 (1990); Lehmann 등 (1992); Matin 등 (1992); Sprent (1994); Su 및 Sriram (1991) J of Neuroimmunol 34, pp. 181-190; 및 Weimbs 및 Stoffel (1992)].

MBP-특이성 및 PLP-특이성 T 임파구는 다발성 경화증 환자의 혈액에서 확인되었다. 이들은 가끔 건강한 개체의 혈액에서도 발견할 수 있지만, 이들은 전형적으로 다발성 경화증 환자의 뇌척수 유체(CSF) 내에 존재한다. 중요한 것은 이러한 T 세포는 건강한 개체로부터 취한 CSF에서는 발견되지 않는다는 점이다[참조: Kerlero de Rosbo 등, (1993); Zhang 등, (1994)].

MBP 및 PLP에 대한 다발성 경화증 환자의 면역 반응은 건강한 개체의 그것과는 명백히 상이하다. T 세포와 반응성인 MBP 및 PLP는 다발성 경화증 환자에서 선택적으로 활성화되며, 이는 활성화의 MBP-특이성 및 PLP-특이성 T 세포 발현 마커(예를 들어, IL-2 수용체)의 빈도가 다발성 경화증 환자에서 증가한다는 사실로부터 입증된다[참조: Zhang 등, (1994)].

또한, 유전자 돌연변이 빈도 분석은 MBP 반응성 T 임파구가 다발성 경화증 환자에서 특이적으로 활성화된다는 증거를 제공한다. 유전자 돌연변이는 휴지 상태의 T 세포 보다는 분열하는 T 세포에서 더 빈번하기 때문에, 특정한 특이성의 T 세포에서 증가된 돌연변이 빈도는 생체 내에서 이들 세포의 특이적 활성화를 암시하는 것이다[참조: Allegretta 등, (1990)].

다발성 경화증 환자로부터 취한 T 임파구는 티오구아닌 내에서 배양하여 상기 퓨린 유사체에 대한 내성을 상기 T 임파구에 부여하는 hprt 유전자 내에서 돌연변이의 빈도를 테스트하였다. 티오구아닌 내성 T 세포 클론의 높은 빈도, 즉 정상적인 개체로부터 취한 T 세포의 빈도의 10배에 달하는 빈도는 다발성 경화증 환자에서 발견되었으며, 이들을 의도적으로 상기 항원에 결코 노출시키지 않음에도 불구하고, 증식된 이들 돌연변이 클론의 상당량이 뇌 MBP에 대해 반응한다. 대조적으로, MBP를 인식하는, 정상적인 개체로부터 취한 내성 클론은 없었다.

또한, MBP, PLP 및 MOG는 다발성 경화증에서 주요한 자가항원인 것으로 생각된다. 왜냐하면, 동물에서 실험적인 알레르기성 뇌척수염(EAE)을 유도할 수 있는 그들의 능력 때문이다. EAE는 다발성 경화증과 매우 유사한 실험적으로 유도된 질환이며, 다발성 경화증의 기준 동물 모델이다. 또한, EAE(또는 다발성 경화증)를 앓고 있는 개체로부터 건강한 동물로의 T 세포의 전달은 수용체에서 EAE를 발생시킬 수 있다. 이리한 질병 유도 방법은 "입양 전달(adoptive transfer)"로 칭한다. 예를 들어, 인간 대 동물 전달 연구에서, 다발성 경화증 환자로부터 취한 CSF 단핵 세포(T 세포를 포함함)를 중증 복합 면역 결핍(SCID) 생쥐의 CSF에 주입하는 경우, 발작, 운동실조 및 염증성 뇌 병변을 야기시킬 수 있다[참조: Saeki 등 (1992)]. 또한, MBP 및/또는 PLP 및/또는 MOG를 이용하는 동물의 면역화는 중추신경계 염증, 발작, 및 기타 EAE의 징후를 유도할 수 있다[참조: 예를 들어, Alvord 등 (1984); Abbas 등 (1994); Amor 등 (1994); 및 Johns 등 (1995)].

MBP, PLP 및 MOG가 다발성 경화증에서 비정상적인 면역 반응에 의해 표적화된 주 항원인 것은 명백하지만, 연구 결과 T 세포 증식성 반응을 유도할 수 있는 MBP 및 PLP 에피토프의 현저한 이종성을 확인하였다. 이들 연구는 정상적인 건강한 개체의 빈도 보다 더 높은 빈도로 다발성 경화증 환자의 반응성 T 세포에 의해 인식되는 단일 에피토프를 지속적으로 밝혀내지는 못했다[참조: Chou 등 (1989); Richert 등 (1989); Martin 등 (1990); Ota 등 (1990); Pette 등 (1990); Martin 등 (1992); Meinl 등 (1993)]. 항원 표적화에서 상기 이종성은 부분적으로 인간 군집에서 상이한 개체에 의해 발현된 여러 가지 MHC 분자 및 TCR 분자의 기능일 수 있다.

MBP의 상이한 분자 형태(이소형태)는 MBP hnRNA의 차등(differential) 결찰에 의해 생성되며, 이는 단일 MBP 유전자의 7개의 엑손중 일부 또는 모두의 암호화된 단백질의 존재를 초래한다. 건강한 성인에서, MBP는 거의 전적으로 엑손 2를 제외한 MBP 유전자의 모든 엑손을 포함하는 mRNA로부터 생성된 18.5 kDa 분자로서 발견된다[참조: Kamholtz 등 (1988)]. MBP의 다른 형태는 전장(모두 7개의 엑손) 21.5 kDa 이소형태 및 두 개의 다른 부 이소형태(17.2 및 20.0 kDa)를 포함한다. 이소형태(21.5 kDa 및 20.2 kDa)를 함유하는 2개의 엑손 2의 발현은 초기 태아 발육 및 손상된 조직의 수초재형성 과정중에 미엘린 형성과 함께 증가된다[참조: Kamholtz 등 (1988); Roth 등 (1987)]. 이들 두 개의 이소형태는 당업계에서 언급되고 있으며, 본 명세서에서는 이들이 손상된 성인 조직의 수초 재형성에서 발견되지만 "태아" 이소형태로 칭하기로 한다.

다발성 경화증 플라크는 수초재형성 부위를 함유한다. 따라서, 건강한 성인의 중추신경계 조직에서 발견되는 것 보다 더 높은 수준으로 MBP의 21.5 이소형태를 함유하여야 하며, 이는 엑손 2에 의해 암호화된 MBP의 2개의 태아 이소형태 각각에 공통적인 26 아미노산 영역(서열 번호 1의 아미노산 잔기 60부터 아미노산 잔기 85까지 걸치는 서열에 상응한다)(이 영역은 "X2MBP" 또는 간단히 "X2"라 칭한다) 내의 에피토프에 대한 면역 반응성은 발생한 질병의 임상적 과정을 악화시킬 수 있다[참조: Prineas 등 (1993); Raine 및 Wu (1993); Bruck 등 (1994)].

수초재형성은 다발성 경화증의 진행중에 주기적으로 발생할 수 있기 때문에, 수초재형성의 각 사이클은 이론적으로 증추신경계 내의 휴지 상태의 X2MBP 특이성 T 세포를 활성화시키므로써 개시되는 면역 반응의 가속화에 기여할 수 있다. 이 가설을 지지하기 위한 몇가지 증거는 MBP 유전자(즉, X2MBP 내의 에피토프)의 엑손 2에 의해 암호화되는 에피토프의 개입을 제안하고 있다.

다발성 경화증에서 MBP의 대체 이소형태의 역할에 대한 연구는 그들의 면역학적 특성을 평가하기 위해 정제된 미엘린 항원의 양에 대한 사용가능성을 필요로한다. 따라서, 이러한 연구는 일반적으로 합성적으로 유도된 펩티드, 예를 들어 X2MBP를 포함하는 펩티드를 이용하는 것으로 제한된다. 최근에, 인간 MBP의 엑손 2 암호화된 서열을 함유하는 펩티등와 반응성인 CD4⁺ MHC 부류 II-제한된 T 세포는 다발성 경화증 환자 및 정상적인 건강한 대조용 개체 둘 다의 말초 혈액으로부터 분리하였다[참조: Voskuhl 등 (1993a); Voskuhl 등 (1994)]. 다발성 경화증으로 고통받고 있는 한 가족에서, 펩티드를 포함하는 X2에 특이적인 T 임파구의 빈도는 X2를 함유하지 않는 MBP의 18.5 kDa 이소형태 내의 에피토프에 특이적인 T 세포의 빈도 보다 더 크다[참조: Voskuhl 등 (1993b)]. 인간 개체로부터 얻은 상기 자료이외에 펩티드를 포함하는 쥐 X2는 SJL/J 생쥐에서 면역원성인 것으로 최근에 확인되었으며, 중증 EAE는 엑손 2 펩티드 감작된 임파구의 입양 전달에 의해 유도된다[참조: Segal 등 (1994); Fritz 및 Zhao (1994)].

상기한 인간 및 동물에 대한 발견으로부터, 생체내에서 미엘린 유도된 항원 MBP에 대한 면역 반응은 다발성 경화증과 관련된 병인의 적어도 일부를 구성한다. 그러나, 주목해야 할 점은 X2 에피토프에 관련된 모든 연구는 항원으로서 합성 펩티드를 사용하였으며, 전장 MBP 21.5 단백질을 사용하는 것은 아무것도 없다는 점이다. APC에 의해 테스트하지 않은 단백질의 특정 에피토프의 처리 및 표시와 관련된 불확실한 견지에서, 이들 결과가 생체내에서 다발성 경화증 병인에 실제로 관련된 것인가에는 의문의 여지가 있다.

PLP는 매우 소수성인 내재성 미엘린 막 단백질이며, 그의 물리적 및 화학적 특성으로 인해 PLP의 분리, 연구 또는 환자에의 투여에 어려움이 따른다[참조: 예를 들어, Sobel 등 (1994); Tuohy (1994); Van der Venn 등 (1989); Van der Venn 등 (1990); Van der Venn 등 (1992); van Noort 등 (1994)]. PLP의 일차 아미노산 서열은 종 사이에서 매우 보존적이다. 전형적으로, 성숙한 PLP 폴리펩티드는 PLP 유전자에 의해 암호화되는 개시자 메티오닌을 포함하지 않으며; 이 아미노산은 해독후 처리 과정에 의해 포유류 세포 내에서 제거되는 것으로 생각된다. 따라서, 본 명세서에서 사용한 바와 같이 인간 PLP의 아미노산 번호 부여는 서열 번호 22에 도시한 것이며, 글리신 잔기를 1번 아미노산으로 하여 번호를 부여하였다.

276 아미노산 PLP 폴리펩티드는 약 50％의 소수성 잔기를 함유하고 있으며, 5개의 친수성 도메인 및 4개의 극히 소수성인 도메인으로 이루어지며, 이들 극히 소수성인 도메인은 상기 단백질의 아미노 말단에서 출발하여 1 내지 4의 번호를 부여하였다. 단백질 도메인은 도메인 경계를 지정하기 위해 사용한 기준에 따라 상이한 정도를 갖는 것으로 정의할 수 있다. 따라서, 가장 엄한 기준에 의하면, 인간 PLP 분자는 인간 PLP의 아미노산 서열(서열 번호 22)의 아미노산 잔기 10 내지 36(소수성 도메인 1), 59 내지 87(소수성 도메인 2), 151 내지 178(소수성 도메인 3) 및 238 내지 267(소수성 도메인 4)에 걸친다. 또한, 이들 도메인을 한정하기 위해 덜 엄한 기준을 사용하는 경우, 소수성 도메인은 인간 PLP의 아미노산 서열(서열 번호 22)의 아미노산 잔기 10 내지 18(소수성 도메인 1), 70 내지 80(소수성 도메인 2), 162 내지 170(소수성 도메인 3) 및 250 내지 258(소수성 도메인 4)에 걸친다.

따라서, PLP의 친수성 도메인은 인간 PLP의 아미노산 서열(서열 번호 22)의 아미노산 잔기 1 내지 9(친수성 도메인 1), 37 내지 58(친수성 도메인 2), 88 내지 150(친수성 도메인 3) 및 267 내지 276(친수성 도메인 4)으로 한정할 수 있다.

PLP-반응성 T 세포주는 PLP 펩티드에 강하게 반응한다. PLP 서열에 기초한 서열을 보유하는 합성 펩티드는 쥐 및 인간 뇌척수염의 원인이 되는 에피토프를 동정하기 위해 사용한다[참조: 예를 들어, Fritz 등 (1983), J. Immunol. 130, pp 191-194; Endoh 등 (1986); Greer 등 (1992); Kuchroo 등 (1992); Kuchroo 등 (1994); McRae 등 (1992); Tuohy 등 (1988); Tuohy 등 (1989); Tuohy 등 (1992); Whitham 등 (1991) J. Immunol. 147, pp 101-107; Whitham 등 (1991) J. Immunol. 147, pp 3803-3808; 및 Correale 등 (1995)]. 인간 펩티드 한정된 에피토프는 하기 표 1에 나타냈다.

최근에 제안된 PLP의 구조에 따라[참조: Weimbs 및 Stoffel (1992)], 이들 뇌척수염 발생 에피토프는 PLP의 내막 및 외막 도메인 둘 다에서 확인되었다.

PLP 펩티드는 뇌척수염을 발생시키는 것으로 확인되었으며, 토끼, 쥐, 기니피그 및 여러 가지 생쥐 종에서 질병을 유도하였다[참조: 예를 들어, Trotter 등 (1987)]. 쥐 PLP의 서열은 인간 PLP의 서열(서열 번호 22)과 동일하다. 생쥐 모델에서 뇌척수염 발생 에피토프는 하기 표 2에 나타낸 것들을 포함한다. 적어도 몇몇 생쥐 종에서, PLP는 중추신경계 내에서 뇌척수염의 주요한 발병원인 것으로 나타났다[참조: Kennedy 등 (1990)]. 여러 가지 설치류 모델에서, MBP-유도된 질병과 비교시 PLP-유도된 EAE에서 더 현저한 수초탈락이 관찰되었다[참조: Tabira (1988)]. 임상적 연구에서, 다발성 경화증 환자 대 정상적인 건강한 대조용 개체의 PLP-펩티드 반응성 T 세포의 수에서 현저한 차이가 보고되었다[참조: Sun 등 (1991); Trotter 등 (1991); Chou 등 (1992); Zhang 등 (1994)].

이들 관찰 이외에, 다발성 경화증 병인에서 PLP의 중요성은 MBP와는 달리 PLP는 중추신경계 내에서 단독으로 발견되며, 다발성 경화증에서 거의 손상이 나타나지 않는 말초 신경계에서는 발견되지 않는다는 관할에 의해 제안되었다[참조: Lees 및 Mackin (1988)].

항원 투여에 의한 다발성 경화증의 치료

어떤 질병의 이상직인 치료는 정상적인 생리에 영향을 미치지 않고 병인을 특이적으로 차단하는 것이다. 자가면역 질병의 경우, 이러한 이상적인 치료법에 대한 한 접근법은 외래 항원에 대한 면역 반응에 영향을 미치지 않고 자가면역 질병 관련된 자가 항원에 대한 면역 관용성을 특이적으로 유도하는 것이다. 면역 기능의 기타 모든 국면을 변경시키지 않으면서 특이적인 자가 항원에 대한 관용성을 유도하기 위한 신규한 치료제 및 치료 기법을 개발하고 있다.

특이적인 자가반응성 임파구, 구체적으로 T 세포를 억제하기 위한 항원을 투여하여 T 세포 반응을 치료적으로 변형시키므로써 질병-관련된 자가 항원에 대한 관용성을 도출해내기 위한 시도가 행해져 왔다. 이와 같은 항원-특이성 치료법의 구별되는 잇점은 상기 치료법이 자가 항원과의 반응을 통해 병의 진전에 관여하는 이들 T 세포만의 활성의 치료적 조절을 수행할 수 있다는데 있다. 이러한 특이성은 기타 항원과 반응성인 T 세포의 중요한 면역 활성을 변경시키지 않는 치료적 잇점을 제공한다.

다발성 경화증 항원은 다발성 경화증/뇌척수염의 치료를 위한 관용화 유도제로서 연구되었는데, 그 이유는 자가반응성 T 세포를 억제하는 치료법이 신경 조직 수초탈락 및 이에 의한 징후를 현저히 경감시킬 수 있기 때문이다[참조: 예를 들어, Adronni 등 (1993); Critchfield 등 (1994); Miller 및 Karpus (1994); Racke 등 (1995)]. 다수의 치료 프포토콜 및 항원이 이들 연구에 이용되었으며, 항원은 주로 사용되는 형태인 인간 항원 보다는 동물 항원을 이용하였다. 예를 들어, Weiner 등(1993)은 소 미엘린으로부터 MBP를 정제하였으며, Miller 등 (1992)은 기니 피그, 돼지, 쥐 및 생쥐 MBP를 사용하였다. 인간 MBP 항원을 사용하는 연구에서, MBP는 해부용 시체의 뇌로로부터 정제하였다[참조: 예를 들어, Zhang 등 (1994)].

경구 관용은 시험관내 및 생체내에서 TGF-베타를 포함하는 시토킨의 분비를 통해 면역 반응을 억제하는 조절성 CD8⁺ T 세포를 포함한다[참조: Chen 등 (1994) Science 265: 1237-1240]. 상기 메카니즘에 의해 매개된 T 세포 활성의 하향 조절은 특정 T 세포 클론에 특이적이지 않으며, 항원-특이성 면역억제에 연루되지 않으나, 그들의 분비된 시토킨에 의해 영향받기에 충분할 정도로 억제성 T 세포에 인접되어 있어서 임의의 T 세포에 작용한다. 이러한 현상은 "방관자 억제(bystander suppression)"라 칭한다.

최근의 연구는 다발성 경화증 환자에 대한 소 미엘린 경구 투여의 관용화 효과를 조사하였다[참조: Weiner 등, (1993) Science 259: 1321-1324; Yoon 등 (1993)]. 경구용 미엘린으로 치료한 환자중에서 플라시보로 치료한 환자 보다 그들의 다발성 경화증 징후가 악화된 환자는 거의 없었다. 그러나, 이 연구의 결과는 확정적이지 못한데, 그 이유는 상기 환자들은 적절히 무작위화되지 않았기 때문이다. 실제로, 상기 연구를 수행한 저자들도 "본 연구가 다발성 경화증 치료에서 경구용 미엘린의 효능을 입증하지는 못한다는 것을 특히 강조한다"라고 자평하고 있다. 따라서, 경구 관용화 연구가 다발성 경화증의 치료를 위한 면역 조절제로서 미엘린 단백질의 유용성을 지지하지만, 다발성 경화증을 치료하기 위한 신규의 더 효율적인 항원 및 상기 항원의 대체 투여 형태의 개발은 계속 이루어져야 한다.

인간 질병의 치료를 위해, 인간에서 유래한 항원이 동물에서 유래한 항원보다 잇점을 가지고 있음은 명백하다. 왜냐하면, 이들은 인간 질병에서 자가면역 공격을 위해 표적화된 실질적인 자가 항원이며, 질병의 억제는 상동 단백질이 투여되는 경우에 가장 효과적이기 때문이다[참조: Miller 등 (1992)]. 이는 인간 단백질이 동일한 MHC 결합 특이성을 보유하며, 자가 면역 반응에 의해 표적화된 내인성 단백질로서 동일한 항원 처리를 수행하는 것도 한 원인이 된다.

실제로, 아미노산 서열 수준에서 다수의 미엘린 항원이 높은 종간 상동성을 나타내고 있음에도 불구하고, 중요한 다발성 경화증 자가 항원의 면역우성 에피토프(즉, CD4⁺ 자가반응성 T 세포에 의해 가장 빈번히 인식되는 단백질의 항원성 영역)는 항원이 유래하는 종에 따라 상이하다. 예를 들어, 다발성 경화증 환자로부터 획득한 T 세포의 분석에 의해 결정되는 바와 같이, 인간 MBP의 면역우성 에피토프는 아미노산 84 내지 102에 걸치는 영역을 함유하며, 다른 에피토프는 아미노산 143 내지 168에 걸치는 영역에서 발견된다. 대조적으로, 쥐과 동물 MBP의 주 면역우성 에피토프는 아미노산 1 내지 9에 걸치는 영역에서 발견되며[참조: Zamvil 등, Nature 324: 258 (1986)], 쥐 MBP의 주 면역우성 에피토프는 아미노산 68 내지 99에 걸치는 영역에서 발견된다[참조: Burns 등, J. Ex. Med. 169:27 (1989)].

그러나, 인간 중추신경계 조직으로부터 분리한 항원을 치료제로서 사용하는 것은 바람직하지 않다. 이는 중추신경계 조직으로부터 항원을 정제하는데에 따른 문제점 및 인체 생 물질 수득의 어려움 뿐만 아니라, 더 중요한 것으로 병원체 오염 가능성의 제거에 관련된 문제점에 기인한다. 중추신경계에서 유래한 단백질의 정제에서 가능한 오염원의 한 예로는 스폰지 형태의 뇌질환 크레우츠펠트-쟈콥병 및 쿠루를 전이시키는 프라이온 입자를 들 수 있다. 프라이온 입자는 특히 처리하기 어려운 문제점을 야기시키는데, 그 이유는 이들이 정제하려는 단백질을 파괴하지 않는 공지된 멸균 수단에 대한 내성이 있기 때문이다.

이들 문제점을 기피하는 인간 항원을 수득하려는 유용한 접근법은 재조합 DNA 기법, 전형적으로 항원을 암호화하는 DNA 분자를 제조하고, 상기 DNA를 이용하여 비인간 숙주 세포 내에서 상기 상원의 발현을 유도하므로써 단백질 항원을 제조하는 방법이다. Oettinger 등 (1993)은 인간 MBP의 18.5 kDa 형태를 암호화하는 변형되지 않은 인간 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 제조하고, 이 DNA를 이용하여 이. 콜리 내에서 재조합 인간 18.5 kDa MBP를 발현시켰다. 그러나, 이. 콜리 내에서 PLP 폴리펩티드의 발현은 지금까지 처리하기 어려운 문제점이 있는 것으로 밝혀졌는데, 그 이유는 적어도 몇몇 PLP 서열이 박테리아에 대한 독성 효과를 갖기 때문인 것으로 보인다.

실제로, PLP의 소수성은 수 용해도를 극도로 제한시키며[참조: Tuohy (1994)], 임의 기원으로부터 유래한 천연 PLP는 제조 및 정맥내 투여에 어려움이 있다.

T 세포 결실

T 세포 레파토리 내의 변경은 T 세포 발육 중에 자연적으로 발생한다. 흉선 세포(미성숙 T 세포)의 단지 일부만이 그들의 성숙이 완결되는 말초 순환에의 발생 중의 T 세포의 이동을 일으키는 흉선 내의 발육 및 선택 사상에서 살아남는다[참조: von Boehmer (1988); Marrack 및 Kappler (1987)]. 실험적 증거는 자가 항원에 대한 수용체를 보유하는 다수의 흉선 세포가 흉선 내에 초기에 존재함을 제안하고 있다. 흉선 내에서 T 세포 발육 중에, 자가 항원과 반응성인 이들 세포는 정상적인 발육 경로의 일부로서 결실(사멸)된다. 이러한 흉선내 관용화 과정은 "흉선 관용성"이라 칭한다.

발생중의 T 세포는 흉선 내에서 특정 자가항원과 조우하지 않으나, 성숙한 말초 T 세포로서는 자가항원과 조우할 수 있다. 예를 들어, 신경 항원은 흉선 내에 결코 존재할 수 없을 것이다. 이러한 자가항원에 대한 관용은 정상적으로 흉선 외에서 생성되며, 이는 "말초 관용성"이라 칭한다. 말초 관용성은 2개 이상의 메카니즘으로 발생하는데, 한 메카니즘은 유사하나, 다른 메카니즘은 이전에 조우하지 않은 자가항원과 특이적으로 반응하는 성숙한 말초 T 세포의 결실을 일으키는 흉선 관용과는 구별되는 과정이다. 또한, 임의의 특이 반응성을 보유하는 T 세포를 유도하여 불활성(무력성)으로 만들 수 있다. 말초 결실 및 무력성의 유도는 "말초 관용성"의 발생을 일으키는 생리적인 메카니즘이다. 흉선 관용화 및 말초 관용화의 결과, 성숙한 T 세포는 대부분의 자가항원에 대한 정상적인 관용성을 갖는다. 그러나, 자가반응성 T 세포는 저항할 수 있는데, 그 이유는 그들의 항원이 필요한 동시자극으로 제시되지 않거나, 면역학적으로 특전적인 부위 내에서 발견되기 때문이다.

T 세포 결실에 의해 관용성이 생성되는 메카니즘은 최근에 임의의 한정된 조건 하에서 항원에 대한 반복된 노출에 의존하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 특이성 T 세포 결실은 관련된 에피토프를 포함하는 외인성 화합물의 적합한 투여에 의해 유도할 수 있다. 단지 제한된 수의 자가항원(특히, 다수의 에피토프를 포함하는 자가항원)이 임의 개체의 자가면역 질병의 병인에 연루되기 때문에, 이들이 공지된 경우, 병인에 연루된 에피토프를 함유하는 하나 이상의 분리된 자가항원-유래의 화합물 형태로 어떤 질병에서 표적화된 자가 에피토프를 환자에게 투여하는 것이 가능하다. 최적의 임상 효과를 획득하기 위해, 아마도 MOG 에피토프와 함께 MBP 및 PLP 에피토프의 종합 혼합물을 보유하는 것이 필요할 수도 있는데, 그 이유는 인간 MHC 및 TCR 다형성의 정도가 크기 때문이며, 신규한 에피토프 반응성이 자가면역 질병 진행 과정중에 나타날 수 있기 때문이다[참조: McCarron 등 (1990); Lehmann 등 (1992); Kaufman 등 (1993)].

세포소멸(apoptosis)

자가반응성 T 세포의 결실은 프로그램된 세포 사멸의 한 예이며, 이는 많은 생물학적 시스템의 조절에서 중요한 과정이다[참조: Singer 등 (1994)]. 프로그램된 세포 사멸은 세포소멸이라 칭하는 메카니즘에 의해 일어나는데, 세포는 세포 사멸을 효율적으로 구성하는 미리 예정된 현상의 특성 순서를 수행하므로써 특정 자극에 반응한다. 세포소멸은 명백히 T 세포 레파토리를 형성하고, 유지하는데 큰 역할을 수행하며, 자가반응성 TCR을 발현하는 세포를 활성적으로 제거하므로써 자가관용의 확립에 기여한다.

최근에, T 세포가 그들의 수명동안 다수의 지점에서 여러 가지 자극에 의해 유도된 세포소멸성 세포 사멸에 민감하다는 것이 밝혀졌다[참조: Lenardo (1991); Boehme 및 Lenardo (1993); Critchfield 등 (1984)]. 또한, 양성 선택 인자는 특이성 T 세포 클론의 생존을 조절하는데 일정 역할을 수행하는 것으로 생각된다. 유기체 내에서 이들 메카니즘 및 기타 메카니즘에 의한 특정 클론의 개개의 T 세포 수의 감소 또는 팽창은 특정 항원에 대한 상기 유기체의 면역 체계의 반응성을 조절하는데 기여한다. 세포소멸이 성숙한 말초 항원-특이성 T 임파구 뿐만 아니라 미성숙 흉선 세포 내에서 유도될 수 있음은(임의의 한정된 조건하에서 항원에 대한 노출시) 현재 몇몇 자가면역 질병 모델 뿐만 아니라 임의의 비루스 감염에서 확고히 확립되었다.

세포소멸은 다수의 생물학적 시스템 내에서 발생한다[참조: 예를 들어, Kerr 등 (1991); Lockshin 및 Zakeri (1991); Cohen 등 (1992); Devall 및 Wyllie (1986); Cotter 등 (1990)]. 세포소멸을 수행하는 세포는 활성 대사에 의존하는 세포성 및 생화학적 과정인 특정 프로그램을 수행하며, 세포의 자가 파괴에 기여한다. 세포소멸성 T 세포에서, 핵 수축, 크로마틴 응축, 유전 물질(DNA)은 점진적으로 작은 단편(뉴클레오솜 반복 크기)으로 분해되고, 세포질 압축이 존재하고, 세포막은 수포를 형성하고, 세포는 실질적으로 붕괘된다[참조: Kawabe 및 Ochi (1991); Smith 등 (1989)]. 세포는 세포소멸로부터 회복할 수 없으며, 이는 결국 비가역적인 세포 사멸로 귀착된다[참조: Kawabe 및 Ochi (1991); Smith 등 (1989)].

최근의 보고에 따르면, T 세포의 세포소멸의 유도[참조: Crispe 등 (1994); Nagata 및 Suda (1995); Stasser (1995); Dhein 등 (1995); Brunner 등 (1995); 및 Ju 등 (1995)]에서, FAS 리간드로 공지된 TNF-관련 시토킨 및 그의 수용체, CD95(FAS 수용체)에 대한 역할이 제시되었다.

세포소멸을 수행하지 않으나, 활성화되는 T 세포는 세포용해를 초래하거나 B 세포 반응 또는 기타 면역 효과를 야기시키는 임포카인을 분비하므로써 그들의 "효과기" 작용을 수행할 것이다[참조: Paul (1989)]. 이들 효과기 작용은 자가면역 질병 및 기타 질병에서 조직 손상의 원인이다.

세포소멸의 치료적 유도

자가면역 질병을 기피하거나 치료하기 위한 강력한 접근법은 세포소멸에 의해 자가면역 질병에 관련된 임파구를 영원히 제거하는 것이다. 예를 들어, 치료 효과는 대다수의 T 세포 레파토리를 손상되지 않은 상태로 유지하면서 치료하려는 특정 자가면역 질병에서 표적화된 자가항원과 반응성인 이들 T 세포만을 제거하므로써 획득할 수 있다. 생체내 연구 결과, EAE는 상기 항원과 반응성인 T 세포의 세포소멸을 유도하기에 효과적인 양과 간격으로 미엘린 항원을 투여하므로써 치료할 수 있는 것으로 입증되었다[참조: 예를 들어, Critchfield 등 (1994)].

이러한 접근법은 자가면역 질병, 알레르기성 반응 및 이식거부반응의 치료를 위한 인터루킨-2 자극된 T 임파구 세포 사멸이라는 제하의 미국 특허 출원 제07/751,090호(마이클 제이. 르나르도)(이는 미국 특허 제6,083,503호로 등록된 미국 특허 출원 제08/122,345호의 계속을 위하여 포기되었음) 및 알레르기성 질환의 치료를 위한 인터루킨-4 자극된 T 임파구 세포 사멸이란 제하의 미국 특허 출원 제07/926,290호(마이클 제이. 르나르도)(이는 미국 특허 제5,935,575호로 등록된 미국 특허 출원 제08/348,286호의 계속을 위하여 포기되었음)에 기재되어 있다.

본 명세서의 일부를 구성하는 첨부 도면은 본 발명의 특정 관점을 예시하는 것이며, 본 명세서와 함께 본 발명의 본질을 설명하는데 기여한다. 물론, 본 명세서 및 도면은 본 발명을 설명하고자 하는 것이며, 본 발명의 범위가 이것으로 제한되는 것은 아니다.

도 1은 CFA 보조제 중으로 투여한 난알부민(도 1A-OVA), PLP 펩티드 139-151(도 1B-서열 번호 22의 아미노산 잔기 139-151에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 펩티드), ΔPLP4(도 1C-PLP4) 또는 MP4(도 1D)로 처리한 4마리 개개의 SJL/J 생쥐에서 활성(항원-유도된) EAE의 임상적 과정을 나타내는 도면이다. 질병은 0(비정상성 없음); 1(꼬리가 움직이지 않음); 2(우측으로 회전할 수 없는 움직이지 않는 꼬리); 3(뒷다리가 약해지거나, 한쪽 뒷다리를 끔); 4(양쪽 뒷다리 마비); 5(거의 죽음); 및 6(죽음)으로 등급을 부여하였다. 임상적 수치는 ○, 중량(g)은 ●으로 나타냈다.

도 2는 정맥내 ΔPLF4 투여에 의한 입양 EAE의 예방/치료를 나타내는 도면이다. ΔPLP4/CEA 면역화된 생리로부터 취한 PLP-특이성 림프 결절 세포는 시험관 내에서 PLP-펩티드 139-151(도 1과 동일함)로 자극하였다. 이들 동물로부터 취한 T 세포는 정맥내 주입으로 0일에 10⁷ 세포/생쥐로 새로운 수용체에 이전하였다. 상기 처리된 군(PLP4 2일, 4일, 6일)의 생쥐 5 마리는 전이후 2일, 4일, 6일째에 ΔPLP4 125 ㎍을 2회의 정맥내 주입으로 주입하였다. 5마리의 미처리된 생쥐(대조용 동물)에게는 동일한 부피(100 ㎕)의 멸균수를 주입하였다. 생쥐는 날마다 검사하였으며, 각각의 군에 대한 평균 임상 수치를 측정하였다(도 1과 동일하게 수치를 측정함).

도 3은 X 축에 나타낸 바와 같이, 시험관 내에서 제시된 농도의 합성 PLP 펩티드(139-151 또는 178-191--서열 번호 22의 아미노산 잔기 178-191에 상응하는 아미노산 서열) 또는 손상되지 않은 ΔPLP4(PLP4)를 이용한 자극에 대한 순전한 생쥐(SJL/J) 및 도 1에서 기술한 PLP 펩티드 139-151(펩티드) 또는 ΔPLP4(PLP4)로 면역화한 생쥐로부터 취한 T 세포 풍부한 임파절의 증식성 반응을 나타내는 도면이다. T 세포는 배지 단독 또는 항원과 함께 72 시간 동안 항온처리 하였다. 증식은 18시간 동안 펄스를 가한후 ³H-티미딘 혼입에 의해 측정하였다. 모든 분석은 3개의 배양물에 대해 2회 실시하였다.

도 4는 정맥내 ΔPLP4 투여에 의해 ΔPLP4-유도된 활성 EAE의 예방/치료를 나타내는 도면이다. EAE는 0일 및 3일째에 CFA중의 ΔPLP4 100 ㎍, 이어서 백일해 독소 300 ng을 피하 주입하여 SJL/J 생쥐 내에서 유도하였다. 5마리의 실험용 생쥐에게는 2회의 정맥내 주입에 의해 면역화하고 5, 7 및 9일이 경과한 후 ΔPLP4 125 ㎍을 주입하였다(PLP4 5일, 7일, 9일, ●). 5마리의 미처리 생쥐(대조용 동물, ○)에게는 동일한 부피(100 ㎕)의 멸균수를 동일한 일정으로 주입하였다. 생쥐는 매일 검사하였으며, 평균 임상 수치(도 1과 동일하게 결정함)를 각각의 군에 대해 할당하였다.

도 5는 PLP 치료가 PLP 및 MBP 항원에 대한 T 세포 증식을 제거하는 것을 나타내는 도면이다. T 세포 증식 분석은 면역화한 생쥐로부터 수득한 임파절 세포에 대해 수행하여 EAE를 유도하고, ΔPLP4로 치료하였다. 유도 및 치료는 도 4와 동일하게 수행하였다. 시험관내 T 세포 증식 분석에서 50 ㎍/㎖로 사용된 항원은 이미 기술한 바와 같이 ΔPLP4(PLP4) 또는 MP4였다.

도 6은 재조합 MP4를 이용하는 자극에 대한 인간 MBP-특이성 T 세포주의 증식을 나타내는 도면이다. MP4는 10 ㎍/㎖로 사용하였다. 인간 T 세포주 2A2(MBP 펩티드 31-50과 반응성임), 3H5(MBP 펩티드 87-106과 반응성임) 및 5B2(MBP 펩티드 151-170과 반응성임)는 최초 건강한 개체로부터 수득하였다. 이들 세포주는 괄호로 나타낸 성인 인간 뇌(18.5 kDa) MBP(서열 번호 4)의 상응하는 아미노산 부위에 의해 제시된 MBP 에피토프에 특이적이다.

도 7은 PLP를 이용한 질병 유도후, MP4는 쥐과 동물의 T 세포를 자극하며, PLP 처리는 MP4 항원에 대한 T 세포 증식을 제거하는 것을 나타내는 도면이다. T 세포 증식 분석은 ΔPLP4로 면역화된 생쥐로부터 수득한 림프 결절 세포에서 수행하여 EAE를 유도하고, ΔPLP4로 치료하였다. MP4는 시험관내 T 세포 증식 분석에서 50 ㎍/㎖로 사용하였다.

도 8은 합성 PLP 펩티드(139-151, 43-64 ; 서열 번호 22의 아미노산 잔기 43-64에 상응하는 아미노산 서열을 가진 펩티드 또는 215-232 ; 서열 번호 22의 아미노산 잔기 215-232에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 펩티드) 또는 10 ㎍/㎖의 손상되지 않은 ΔPLP4(PLP4)를 이용하는 시험관내 자극에 대한 PLP 펩티드 139-151(도 1에 기술함)로 면역화된 SJL/J 생쥐로부터 취한 T 세포 풍부한 임파절 세포의 증식성 반응을 나타내는 도면이다. T 세포는 배지 단독 또는 항원과 함께 72 시간 동안 항온처리하였다. 증식은 18 시간 동안 펄스를 가한후 ³H-티미딘 혼입에 의해 측정하였다. 모든 분석은 3개의 배양물에 대해 2회 수행하였다.

도 9는 합성 PLP 펩티드(178-191; 상기함, 139-151; 상기함, 또는 103-116; 서열 번호 22의 아미노산 잔기 103-116에 상응하는 아미노산 서열을 가진 펩티드) 또는 10 ㎍/㎖의 손상되지 않은 ΔPLP4(PLP4)를 이용하는 시험관내 자극에 대한 PLP 펩티드 103-116으로 면역화된 SWR 생쥐로부터 취한 T 세포 풍부한 임파절 세포의 증식성 반응을 나타내는 도면이다. T 세포는 배지 단독 또는 항원과 함께 72 시간 동안 배양하였다. 증식은 18 시간 동안 펄스를 가한후 ³H-티미딘 혼합에 의해 측정하였다. 모든 분석은 3개의 배양물에 대해 2회 수행하였다.

도 10은 합성 PLP 펩티드(139-151, 43-64 또는 178-191; 상기함) 또는 10 ㎍/㎖의 손상되지 않은 ΔPLP4(PLP4)를 이용하는 시험관내 자극에 대한 PLP 펩티드 43-64로 면역화된 PL/J 생쥐로부터 취한 T 세포 풍부한 임파절 세포의 증식성 반응을 나타내는 도면이다. T 세포는 배지 단독 또는 항원과 함께 72 시간 동안 항온처리하였다. 증식은 18 시간 동안 펄스를 가한 후 ³H-티미딘 혼입에 의해 측정하였다. 모든 분석은 3개의 배양물에 대해 2회 수행하였다.

도 11은 기니 피그 MBP로 활성화된 30,000,000개의 T 세포의 전달에 의해 유도된 EAE의 치료를 나타내는 도면이다. 치료는 MP4 200 ㎍; 기니 피그 MBP(GP-MBP) 200 ㎍; 기니 피그 MBP 400 ㎍; 또는 난알부민 400 ㎍(OVA, 대조용)으로 제시한 바와 같이 수행하였다. 이들 치료는 뇌척수염 발생 T 세포의 입양 전달후 6, 8 및 10일째에 1일 2회 정맥내 투여하여 수행하였다. 각각의 치료군은 3 내지 5마리의 동물로 구성하였다.

도 12는 도 1에 기술한 PLP 펩티드 139-151 100 ㎍을 이용하는 SJL 생쥐의 면역화에 의해 유도된 EAE의 치료를 나타내는 도면이다. 재료는 MP4 250 ㎍ 또는 비둘기 시토크롬 c(대조용) 250 ㎍을 이용하여 수행하였다. 이들 치료는 면역화후 5, 7 및 9일째에 정맥내로 1일 2회(6시간 간격) 투여하였다. 각각의 치료군은 3마리의 동물로 구성하였다.

도 13은 합성 MBP21.5 유전자(cDNA)의 구성을 위한 PCR 기법을 나타내는 도면이다. 괄호 A는 MBP+X2^Cys81/Bact. 유전자를 구성하기 위해 사용된 중첩하는 올리고뉴클레오티드 1 내지 6(서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9 및 서열 번호 10)의 배열이다. 상기 유전자의 3개의 하부도메인(I, II 및 III, 괄호 B로 나타냄)은 초기에 합성하였다. 더 큰 도메인(I+II, II十III)은 괄호 C로 나타낸 바와 같은 적합한 외부 올리고뉴클레오티드(각각 올리고뉴클레오티드 1 및 4와 올리고뉴클레오티드 3 및 6)를 이용하는 중첩 PCR로 형성하였다. 전장 분자는 외부 올리고뉴클레오티드 1 및 6을 이용하는 도메인 I+II 및 II+III의 중첩-PCR로 완료하였다. 최종 생성물 지도는 괄호 D로 나타냈다. 괄호 D에서 전장 분자의 빗금친 부분은 세린으로 변경된 것으로 나타낸(Ser⁸¹) 아미노산 잔기 81의 시스테인(Cys⁸¹)을 보유하는 엑손 2의 위치를 나타낸다. 상기 유전자의 3' 말단의 검게 칠한 부분(본 다이아그램의 우측)은 정제를 용이하게 하기 위해 첨가된 히스티딘 태그를 암호화하는 서열의 첨가를 의미한다.

도 14는 박테리아 세포, 즉 미분획된 전체 세포 용해물에서 재조합 MBP 발현 및 아세포성 정위를 나타내는 도면이다. 세포 용해물은 삽입물("1"), pET22b/MBP18.5^hum.("2") 또는 pET22b/MBP+X2^Cys81/Bact.("3")을 첨가하지 않고, 대조용 벡터 pET22b로 형질전환시킨 BL21(DE3) 세포의 유도된 배양물로부터 제조하였다. 전체 세포 용해물은 환원 조건(주: 이들 조건하에서 관찰된 이량체는 없었음) 하에서 16％ SDS-PAGE로 분리한후, 쿠마지 염색(Coom)하거나, 인간 뇌 MBP의 카르복시-말단 에피토프("C-term Ab") 또는 아미노-말단 에피토프("N-term Ab")중 하나를 인식하는 단일클론 항체를 이용하여 면역블로트하였다. * 는 단지 "N-term Ab" mAb에 의해 인식되는 MBP+X2^Cys81의 두 개의 단편 부분을 나타낸다. kDa으로 나타낸 분자량(전기영동 마커 단백질에 의해 측정함)은 좌측에 나타냈다. 백색 화살표 및 흑색 화살표는 각각 MBP+X2^Cys81 및 MBP18.5 를 나타낸다.

도 15는 박테리아 세포 내에서 MBP 발현 및 아세포성 정위를 나타내는 도면이다(가용성 대 불용성). 세포 용해물은 삽입물("1"), pET22b/MBP18.5^hum.("2") 또는 pET22b/MBP+X2^Cys81/Bact ("3")을 첨가하지 않고, 대조용 벡터 pET22b로 형질전환시킨 BL21(DE3) 세포의 유도된 배양물로부터 제조하였다. 박테리아 용해물은 상기한 바와 같이 중성 완충액("트리스") 또는 0.1N HCl("산") 조건을 이용하여 가용성("S") 또는 불용성 펠릿("P") 분획으로 분획화하였다. 본 도면은 환원 조건 하에서(주: 이들 조건하에서 이량체는 관찰되지 않음) 상기 세포 분획의 SDS-PAGE에 의해 수득한 쿠마지 염색된 겔을 나타낸다. 백색 화살표 및 흑색 화살표는 각각 MBP+X2^Cys81 및 MBP18.5 를 나타낸다. 주: 산 추출(중성 추출은 아님)은 가용성 분획 내에서 MBP+X2^Cys81 및 MBP18.5 폴리펩티드의 회수를 가능하게 한다.

도 16은 박테리아 세포로부터 재조합 MBP의 대량 산 추출을 나타내는 도면이다. 본 도면은 환원 조건하에서(주: 이들 환원 조건 하에서 이량체는 검출되지 않음) 수행된 쿠마지 염색된 SDS-PAGE 겔을 나타낸다. 3개 레인의 각각의 군은 동시 산 추출 및 기계적인 분쇄에 의해 동시에 수득한 전체 세포 용해물("용해물") 및 불용성("불용성") 및 가용성("가용성") 분획을 나타낸다. 세포는 삽입물("1"), pET22b/MBP18.5^hum.("2") 또는 pET22b/MBP+X2^Cys81/Bact.("3")을 첨가하지 않고, 대조용 벡터 pET22b로 형질전환시킨 BL21(DE3) 세포의 유도된 배양물로부터 수집하였다. MBP+X2^Cys81(백색 화살표) 및 MBP18.5^hum.(흑색 화살표)의 위치를 나타냈다. 주: 이와 같은 대량 산 추출은 가용성 분획 내의 거의 모든 MBP+X2^Cys81 및 MBP18.5 폴리펩티드의 회수를 가능하게 한다.

도 17은 산 추출된 MBP+X2^Cys81 의 역상 크로마토그래피 분리를 나타내는 크로마토그래프이다. 도 16에 도시한 실험에서 회수된 가용성 분획("가용성" 레인 "3")은 VYDAC C4 역상 칼럼을 통해 크로마토그래피하였으며, 25-50％(CH₃CN)/0.1％ TFA 구배에 의해 용출하였다. MBP+X2^Cys81 은 17 내지 20분 사이에서 용출되는 큰 피크와 상응하는 수집된 분획 내에서 발견되었다. 유사한 크로마토그래프가 MBP18.5 에 대해서도 획득되었다.

도 18은 박테리아 세포의 산 추출물의 금속 킬레이트화 크로마토그래피에 의한 MBP+X2^Cys81 (상부 패널) 및 MBP18.5(하부 패널)의 정제를 나타내는 도면이다. 본 도면은 친화성 정제 및 SDS-PAGE를 수행하는 중에 수집된 단백질 분획의 쿠마지 염색한 겔을 나타낸다. MBP+X2^Cys81 (백색 화살표) 및 MBP18.5 (흑색 화살표)의 위치를 나타냈다. 레인은 "로드"(컬럼에 로딩된 용해물), "미결합" (컬럼 통과), "세척 1", "세척 2" 및 "세척 3"(각각의 세척으로부터의 칼럼 용출물), "용출 1", "용출 2", 및 "용출 3"(각각의 용출 단계로부터의 칼럼 용출물), 수지(최종 용출 후에 취한 칼럼 수지의 샘플, 샘플 완충액 내에서 가열하고, 겔에 로딩함)로 표지하였다.

도 19는 핵산 서열 MBP18.5^hum.(서열 번호 4), MBP+X2^Cys81/hum.(서열 번호 1), MBP+X2^Ser/bact.(서열 번호 3) 및 MBP+X2^Cys81/bact. (서열 번호 2)를 포함하는 핵산 벡터로 형질감염시킨 박테리아에서 박테리아에 의해 발현된 MBP 폴리펩티드의 수득량을 나타내는 도면이다.

도 20은 MBP 항원이 성인 뇌-유도된 MBP에 특이적인 인간 T 세포 클론으로부터 증식성 반응을 도출하는 것을 나타내는 도면이다. 성인 뇌 MBO81.5에 특이적인 T 세포주는 배지 단독("대조용") 또는 정제된 성인 뇌 MBP("뇌 MBP"), 박테리아에 의해 생성된 MBP18.5("MBP18.5") 또는 MBP+X2^Cys81("MBP+X2^Cys81") 10 mg을 함유하는 배지를 이용하여 자극하였다. 이미 상기 실시예에서 기술한 바와 같이, 3회 수행한 대표적인 하나의 증식 분석으로부터 전체 혼입된 ³H-CPM을 측정하였다. "2A2" 및 "3H5"는 상기 실시예에서 기술한 바와 같이, 정상적인 개체로부터 수득한 인간 T 세포주이다.

도 21은 MBP 항원에 대한 엑손 2 특이성 인간 T 세포의 증식성 반응을 나타내는 도면이다. 인간 T 세포주 1H7 및 1G1은 배지 단독("대조용") 또는 정제된 성인 뇌 MBP("뇌 MBP"), 박테리아에 의해 생성된 MBP18.5("MBP18.5"), MBP+X2^Cys81("MBP+X2^Cys81") 또는 서열 번호 1의 아미노산 59 내지 84에 상응하는 엑손 2-암호화된 펩티드("X2 펩티드") 10 ㎍을 함유하는 배지를 이용하여 자극하였다. 이미 상기 실시예에서 기술한 바와 같이, 3회 수행한 대표적인 하나의 증식 분석으로부터 전체 혼입된 ³H-CPM을 측정하였다. 1H1 및 1G1은 MBP의 엑손 2 암호화된 부위에 특이적인 인간 T 세포주이며, 후술하는 도 22의 실험에서 사용된 3A11주와 같이 동일한 다발성 경화증 환자로부터 수득하였다. 이미 상기 실시예에서 기술한 바와 같이, 3회 수행한 대표적인 하나의 증식 분석으로부터 전체 혼입된 ³H-CPM을 측정하였다.

도 22는 MBP+X2^Cys81 및 MBP+^Ser81에 대한 엑손 2 특이성 인간 T 세포주의 증식성 반응을 나타내는 도면이다. 인간 T 세포주 3A11은 가변적인 양의 엑손 2 펩티드("A"), MBP+X2^Cys81 ("B") 및 MBP+X2^Cys81("C") 또는 배지 단독("D")으로 자극하였다. 3A11은 MBP의 엑손 2 암호화된 부위에 특이적인 인간 T 세포주이며, 도 21에 기술된 실험에서 사용된 1H7 및 1G1과 동일한 다발성 경화증 환자로부터 수득하였다. 이미 상기 실시예에서 기술한 바와 같이, 3회 수행한 대표적인 하나의 증식 분석으로부터 전체 혼입된 ³H-CPM을 측정하였다.

도 23은 재조합 인간 MBP+X2^Cys81/bact.(태아형, "f", 서열 번호 1)과 성인 뇌 유도된 인간 MBP(성인형 "a", 서열 번호 1)의 서열 비교를 나타내는 도면이다. 성인 뇌 유도된 인간 MBP 서열(진뱅크 수탁 번호 M13577)은 MBP+X2^Cys81/bact.의 이. 콜리 지정 코돈 서열을 벗어나는 위치에만 표시하였다. 개시자(ATG) 및 종결 코돈(TAA)은 상기 두 개의 유전자에 대해 제시하였다. 성인 뇌 유도된 인간 MBP 서열 내의 대쉬(--)는 엑손 2(bp 177-255) 및 상기 MBP+X2^Cys81/bact. 버전에 대한 히스티딘 태그(bp 595-612)(즉, 6개의 카르복시 말단 히스티딘 잔기를 보유하는 MBP+X2^Cys81/bact. , 히스티딘 태그라고도 칭한다) 첨가 위치를 나타낸다. MBP+X2^Cys81/bact., 유전자의 구성을 위해 사용된 합성 올리고뉴클레오티드 사이의 중첩 영역은 밑줄로 나타냈다. 의도한 MBP+X2^Cys81/bact. 유전자 서열로부터 C 대 T bp 돌연변이는 462, 528 및 532 위치에서 ^* 로 나타냈다. 이들 변화는 MBP+X2^Cys81 아미노산 서열을 보존시킨다. 센스 올리고뉴클레오티드 1(서열 번호 5)는 5' 에서 NdeI 클로닝 위치까지 위치된 서열 GGAATTCCGTAAGGAGGTAT AG(도면에는 도시하지 않음)을 포함하며, 염기 108을 통해 연장된다. 올리고뉴크레오티드 6(bp 516-622, 서열 번호 10)은 도시한 서열의 안티센스 올리고뉴클레오티드이며, 3' 에서 HindIII 위치까지 테트라뉴클레오티드 CCCC(도면에 도시하지 않음)를 포함한다. 사용된 4개의 기타 올리고뉴클레오티드는 센스 올리고뉴클레오티드 3(서열 번호 7) 및 5(서열 번호 9) 및 안티센스 올리고뉴클레오티드 2(서열 번호 6) 및 4(서열 번호 8). 아미노산 81의 시스테인은 굵은 서체로 표시하였다.

도 24는 재조합 인간 MBP 21.5("rhMBP21.5")의 MBP 에피토프의 위치를 도식적으로 나타낸 도면이다. 숫자는 테스트한 T 세포주의 공지된 에피토프 특이성(숫자 문자 숫자 또는 "Gimer" 로 나타냄)에 상응하는 서열 번호 1의 아미노산 잔기를 나타낸다. T 세포주 각각은 본 발명의 정제된 rhMBP21.5 분자에 대해 양성 T 세포 반응을 나타냈다.

도 25는 테스트한 특이성 분자의 상세한 설명과 도 24에 나타낸 T 세포주를 이용하여 수득한 결과를 나타내는 도면이다.

발명의 개요

본 발명의 목적은 인간 환자의 다발성 경화증을 진단하고, 임상적으로 평가하고, 치료하고, 이러한 치료에 대한 다발성 경화증 환자의 잠재적인 반응성을 평가하기 위한 조성물 및 방법을 제공하는데 있다.

본 발명은 신규의 재조합 인간 PLP 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 명세서 및 특허청구의 범위에서 사용한 용어 "PLP 폴리펩티드"는 이미 기술한 바와 같이 인간 PLP의 하나 이상의 소수성 도메인에 상응하는 하나 이상의 서열을 함유하는 폴리펩티드를 의미한다. 본 발명에 따라, 상기 PLP 폴리펩티드는 MBP, MOG, 및/또는 MAG 폴리펩티드 서열 뿐만 아니라 기타 관련된 폴리펩티드 서열을 추가로 포함할 수 있다. 또한, PLP 폴리펩티드를 암호화하며, 박테리아 세포로부터 이러한 분자의 생성 및 분리를 최적화하기 위해 조작된 DNA 구성물도 제공된다.

구체적으로, 본 발명의 분자는 하나 이상의 소수성 펩티드 영역, 바람직하게는 2개 이상의 소수성 펩티드 영역을 제거한 천연 PLP 폴리펩티드의 서열을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 PLP 뮤테인을 포함하는 면역반응성 폴리펩티드를 포함한다. 상기 아미노산 서열은 3개 이상의 소수성 펩티드 영역을 제거한 천연 PLP 폴리펩티드 서열을 포함하는 것이 더 바람직하다. 가장 바람직한 면역반응성 폴리펩티드는 각각 모두 PLP의 4개의 소수성 도메인을 구성하는 아미노산 잔기의 적어도 일부가 없는 천연 PLP 폴리펩티드 서열을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 면역반응성 폴리펩티드이다.

본 발명의 폴리펩티드 및 핵산 분자는 MBP 서열, 즉 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 10개 이상의 연속하는 아미노산 서열의 임의의 걸침(범위)에 상응하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 본 명세서 및 특허청구의 범위에서 사용한 용어 "MBP 폴리펩티드"는 이러한 MBP 서열을 포함하는 폴리펩티드이며, "인간 MBP 유전자의 엑손 2의 적어도 일부분에 의해 암호화된 아미노산 서열"은 서열 번호 1의 아미노산 60-85에 걸치는 영역으로부터 10개 이상의 접촉성 아미노산에 상응하는 10개 이상의 접촉성 아미노산의 서열이다.

본 발명은 신규한 재조합 인간 MBP 21.5 폴리펩티드(즉, 인간 MBP 유전자의 엑손 2의 적어도 일부분에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 MBP 폴리펩티드)를 포함하는 조성물을 제공한다. 이들 MBP 폴리펩티드는 인간 MBP 유전자의 모두 7개의 엑손에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 임의의 바람직한 구체예에서, 엑손 2에 의해 암호화된 서열은 변형되어 상기 폴리펩티드의 대량 생산 및 정제를 용이하게 한다. 또한, MBP 21.5 폴리펩티드를 암호화하고, 박테리아 세포로부터 이러한 분자의 제조 및 분리를 최적화하기 위해 조작된 DNA 구성물이 제공된다.

본 발명의 방법은 다발성 경화증의 진단 및 임상적 평가 뿐만 아니라 다발성 경화증의 치료 및 이러한 치료에 대한 다발성 경화증 환자의 잠재적인 반응성의 평가에 본 발명의 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.

바람직한 구체예의 설명

상기한 바와 같이, 본 발명은 다발성 경화증의 치료, 진단 및 임상적 평가에 이용하기 위한 MBP 및 PLP 폴리펩티드와 MBP 및 PLP 폴리펩티드를 생성하는데 유용한 핵산 분자에 관한 것이다.

I. MBP 폴리펩티드

본 명세서 및 특허청구의 범위에서 사용한 용어 "MBP 21.5 폴리펩티드"는 하기하는 폴리펩티드중 하나 이상의 폴리펩티드를 의미한다: 서열 번호 1의 폴리펩티드(인간 21.5 kDa MBP, "MBP+X2"), 임의의 표준 아미노산으로서 아미노산 81을 보유하는 서열 번호 1의 폴리펩티드("MBP+X2^Xxx81"), 시스테인 81이 임의의 기타 표준 아미노산으로 대체된 서열 번호 1의 폴리펩티드("MBP+X2^Xxx81"), 시스테인 81이 분자량이 약 150 미만인 하전되지 않은 아미노산(즉, pH 6-7에서 하전되지 않은 아미노산)으로 대체된 서열 번호 1의 폴리펩티드("MBP+X2^Xxx81＜150") 및 시스테인 81이 세린으로 대체된 서열 번호 1의 폴리펩티드("MBP+X2^Scr81 ").

또한, "MBP 21.5 폴리펩티드"는 상기한 4가지 서열의 변형된 형태를 포함하는데, 이때 상기 변형된 형태의 서열이 인간 MBP 유전자의 엑손 2에 의해 암호화된 아미노산 서열의 적어도 일부분을 계속 포함하며, 이 폴리펩티드는 다발성 경화증 환자로부터 분리된 MBP 반응성 T 세포의 군집에서 "T 세포 반응"을 유도할 수 있어야 한다. 용어 "T 세포 반응"은 후술한다.

본 발명의 바람직한 MBP 21.5 폴리펩티드는 인간 MBP 유전자의 엑손 2에 의해 암호화된 아미노산을 함유하고, 분자량이 약 21.5 kDa이고, 시스테인 81이 다른 표준 아미노산으로 대체된 박테리아에 의해 발현된 인간 재조합 MBP이다.(이 폴리펩티드는 "MBP+X2^Xaa81 "로 칭하며, 이를 암호화하는 핵산 분자는 "MBP+X2^Xaa81/hum. " 또는 "MBP+X2^Xaa81/bact. "라 칭하며, 첨자 hum. 또는 bact.는 후술하는 바와 같이 핵산 분자의 암호화 영역내의 코돈 용법을 나타내는 것이다.) 당업계에서 사용되고 있는 바와 같이, "표준" 아미노산은 단백질에서 공통적으로 발견되는 20개의 아미노산중 하나를 의미한다.

본 명세서에서 사용한 엑손 2에 의해 암호화된 아미노산 서열은 X2MBP 또는 단순히 X2라 칭할 것이다. 본 발명에 따라, X2MBP는, 천연 엑손 2 암호화된 서열(서열 번호 1, 서열 번호 2 및 서열 번호 3)의 자연적으로 발생하는 위치가 바람직함에도 불구하고, MBP+X^Xxx81 폴리펩티드에서 임의의 위치에 위치할 수 있다.

대체 아미노산은 에피토프 전환을 야기시키지 않는 것이 바람직하다. 즉, X2MBP의 면역우성 에피토프 또는 에피토프의 T 세포 인식은 시스테인 81을 특정 대체 아미노산으로 대체하므로써 실질적으로 변화되지 않는 것이 바람직하다. 본 발명 이전에는 아미노산 81의 다른 표준 아미노산으로의 대체가 이러한 에피토프 전환을 야기시키는지의 여부(즉, 이러한 변경이 에피토프 중성인지의 여부)는 미확인 상태였다.

임의의 표준 아미노산의 치환에 의한 에피토프 전환의 결핍은 본 발명에 따라 MBP+X2^Xaa81 또는 바람직하게는 후술하는 바와 같이 MBP+X2^Xaa81의 엑손 2 암호화된 영역을 포함하는 테스트 펩티드(X2^Xaa81 펩티드)에 대해 X2MBP(X2MBP-특이성 T 세포)와 특이적으로 반응성인 T 세포(예를 들어, T 세포주)의 반응을 테스트하므로써 측정할 수 있다. 상기 테스트 펩티드는 시스테인 81이 기타 표준 아미노산으로 대체된 서열 번호 1의 아미노산 잔기 59 내지 84에 상응하는 서열을 보유하는 26 아미노산 펩티드("X2^Xaa81 26량체)인 것이 바람직하다.

X2MBP-특이성 T 세포는 엑손 2에 의해 암호화된 아미노산 서열을 함유하는 펩티드(이하, "X2MBP 펩티드"로 약칭함)를 이용하는 통상적인 방법으로 T 세포주로서 획득할 수 있다. 예를 들어, 문헌[참조: Voskuhl 등 (1993a)]에 기재된 방법을 사용할 수 있다. 또한, 문헌[참조: Voskuhl 등 (1993b); Segal 등 (1994); Voskuhl 등 (1994); 및 Fritz 및 Zhao (1994)]을 참조할 것.

인간 T 세포주는 엑손 2에 의해 암호화된 26 아미노산, 즉 서열 번호 1의 아미노산 잔기 59 내지 84에 상응하는 서열을 가진 X2MBP 펩티드("X2 26량체")를 이용하는 자극에 이어서 이러한 표준 방법으로 수득할 수 있다. 특히, X2 26량체를 이용하는 자극은 40 아미노산 X2MBP 펩티드 또는 Voskuhl 등 (1993a)의 문헌에 기술된 MBP의 18.5 kDa 이소형태를 이용하는 자극 보다 바람직하다.

본 발명에 따라, 상기한 바와 같이 제조된 X2MBP-특이성 T 세포주를 이용하여 특히 81 위치에서 특정 아미노산 치환의 에피토프 중성을 결정한다. 이는 X2^Xaa81 펩티드에 대한 X2MBP-특이성 인간 T 세포주의 세포 반응을 평가하므로써 수행할 수 있다. (또한, MBP+X2^Xaa81 도 에피토프 중성을 테스트하기 위해 사용할 수 있으나, 덜 바람직하다.) X2MBP-특이성 T 세포가 Voskuhl 등 (1993a)에 의해 기술된 X2MBP-특이성을 위한 조건을 만족하는 정도로 특정 아미노산 치환을 함유하는 X2^Xaa81 펩티드에 반응하는 경우, 즉 특정 X2^Xaa81 펩티드가 배지 단독인 대조용과 비교시 2 이상의 자극 지수를 나타내는 경우, 특정 대체 아미노산의 에피토프 중성이 확인된다. 상기 자극 지수는 3 이상이 바람직하다.

본 발명에 따라, 이러한 에피토프 중성 대체는 일반적으로 분자량이 약 150 미만이고, 바람직하게는 강한 소수성이 아닌 하전되지 않은 아미노산을 이용하여 획득할 수 있다.

이들 요구조건을 만족시키는 아미노산은 알라닌, 아스파라긴, 글리신, 프롤린, 트레오닌 및 세린을 포함한다. 상기 대체 아미노산으로 가장 바람직한 것은 세린이며, 이는 시스테인 81이 세린 81로 변화된 엑손 2 암호화된 영역을 포함하는 MBP 21.5 폴리펩티드를 생성한다(이하, 이 폴리펩티드는 "MBP+X2^Ser81 "로 약칭하며, 이를 암호화하는 핵산 분자는 "MBP+X2^Ser81/hum. " 또는 "MBP+X2^Ser81/bact. "이라 칭하고, 이때 첨자 hum. 또는 bact.는 후술하는 바와 같이 상기 핵산 분자의 암호화 영역에서 코돈 용법을 나타낸다).

본 발명 이전에, 박테리아에서 발현된 MBP+X2 폴리펩티드가 포유동물에서 발현된 MBP 폴리펩티드(예를 들어, 인간 유도된 MBP-X2)와 동일한 정도로 T 세포에 의해 인식되고, 반응하는지의 여부는 아직 확인되지 않고 있다. 이 불확실성은 특히 박테리아 또는 포유류 세포 내에서 단백질의 발현중에 단백질 접힘의 차이에 기인한다. 박테리아에서 발현된 단백질은 전형적으로 포유류 세포에서 발현된 단백질의 천연 형태로 접혀지지 않는다. 상기 배경기술의 "T 세포, 항원 제시 세포 및 T 세포 에피토프" 부분에서 기술한 바와 같이, 단백질 접힘은 특이성 에피토프가 APC에 의해 적절히 처리되는지의 여부를 확인할 수 있다. 이러한 이유로 박테리아에서 발현된 단백질은 천연 단백질과 동일한 방식으로 APC에 의해 처리 및 제시되지 않을 수 있으며, 따라서 T 세포에 의해 인식되지 않을 수 있다.

MBP+X2^Cys81의 엑손2 서열은 또 다른 불확실성의 원인이 되는데, 그 이유는 이러한 서열이 합성 펩티드로서 T 세포에 첨가되는 경우 T 세포를 자극하는 것으로 보여지기 때문이다(TCR에 의해 인식되고, T 세포에 의해 반응하기 위해서 APC에 의해 처리될 필요는 없다). 본 발명 이전에, MBP의 21.5 kDa 이소형태(기원에 관계없이)는 다발성 경화증 병인에서 X2 에피토프의 역할에 대한 특별한 관심의 대상인 뇌척수염 발생 T 세포를 자극하도록 APC에 의해 정확히 처리되는 것임이 밝혀지지 않았었다. 본 발명은 이것이 이전에 보고된 X2MBP 펩티드 작용의 임상적인 관련성을 예시하는 케이스에 해당함을 입증하였다.

II. PLP 폴리펩티드

본 발명의 바람직한 PLP 폴리펩티드는 친수성 도메인 2, 3 및 4를 함유하는 박테리아에서 발현된 인간 재조합 PLP이다. 이러한 PLP 폴리펩티드는 하나 이상의 소수성 도메인을 포함할 수 있다. PLP 폴리펩티드는 하기 표 1에 나타낸 다발성 경화증과 관련된 PLP 에피토프를 포함하는 것이 더 바람직하다. 상기 바람직한 PLP 폴리펩티드는 ΔPLP3(서열 번호 23) 및 ΔPLP4(서열 번호 24)를 포함한다. 본 발명의 특히 바람직한 분자는 서열 번호 23 또는 서열 번호 24에 기술된 아미노산 서열또는 바람직하게는 서열 번호 25, 서열 번호 26(바람직하게는 서열번호 26의 아미노산 잔기 1 내지 368을 포함함), 서열 번호 27(바람직하게는 서열번호 27의 아미노산 잔기 6 내지 374를 포함함) 또는 서열 번호 28(바람직하게는 서열 번호 28의 아미노산 잔기 1 내지 487을 포함함)에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 PLP 뮤테인이다.

특히 바람직한 구체예에서, 면역반응성 폴리펩티드는 10개 이상의 연속하는 아미노산(즉, 에피토프를 포함하기 위해 크기가 충분한 아미노산의 선형 중합체)을 포함하는데, 하나를 제외한 모든 표적 아미노산 잔기는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 81을 포함하는 인간 MBP(서열 번호 1)의 21.5 kDa 이소형태의 한 영역에 상응한다. 본 구체예에서, 상기 표적 아미노산 잔기는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 81의 위치에 상응하는 MBP 아미노산 서열 내의 임의 위치에 위치하며, 상기 표적 아미노산 잔기는 시스테인 이외의 임의의 표준 아미노산이다.

본 발명의 임의의 바람직한 면역반응성 폴리펩티드는 인간 미엘린 올리고덴드로사이트 당단백질의 아미노산 서열의 10개 이상의 인접한 아미노산(서열 번호 28의 아미노산 잔기 199 내지 319를 포함함)에 상응하는 미엘린 올리고덴드로사이트 당단백질 아미노산 서열을 추가로 포함한다.

본 발명의 면역반응성 폴리펩티드는 천연 PLP 폴리펩티드 보다 더 높은 수준으로 박테리아에서 발현되고/되거나 천연 PLP 폴리펩티드 보다 수용액에서 더 가용성이다.

PLP-특이성 T 세포는 PLP 아미노산 서열을 함유하는 펩티드를 이용하여 통상적인 방법으로 T 세포주로서 획득할 수 있다. 예를 들어, 문헌[참조: Voskuhl 등 (1993a)]에 기재된 방법을 사용할 수 있다. 또한, 문헌[참조: Voskuhl 등 (1993b); Segal 등 (1994); Voskuhl 등 (1994); Fritz 및 Zhao (1994); Pelfrey 등 (1993); Pelfery 등 (1994); 및 Correale 등 (1995)]을 참조할 것.

본 발명 이전에, 박테리아에서 발현된 PLP 폴리펩티드가 치료제로서 그들을 사용할 수 있도록 하는 방식으로 T 세포에 의해 인식되고, 반응하는지의 여부는 아직 확인되지 않고 있다. 이 불확실성은 특히 박테리아 또는 포유류 세포 내에서 단백질의 발현중에 단백질 접힘의 차이에 기인한다. 박테리아에서 발현된 단백질은 전형적으로 포유류 세포에서 발현된 단백질의 천연 형태로 접혀지지 않는다. 상기 배경기술의 "T 세포, 항원 제시 세포 및 T 세포 에피토프" 부분에서 기술한 바와 같이, 단백질 접힘은 특이성 에피토프가 APC에 의해 적절히 처리되는지의 여부를 확인할 수 있다. 이러한 이유로 박테리아에서 발현된 단백질은 천연 단백질과 같이 APC에 의해 처리 및 제시되지 않을 수 있으며, 따라서 T 세포에 의해 인식되지 않을 수 있다.

III. MBP 및 PLP 폴리펩티드를 암호화하는 헥산 분자

본 발명의 실시에 유용한 핵산 분자는 당업계에 공지되어 있고, 후속적으로 개발된 여러 가지 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 당업계에 공지된 기법을 이용하므로써 이들은 클로닝된 유전자를 이용하여 제조할 수 있다. 본 명세서에서 사용한 용어 "유전자(들)"는 발현된(예를 들어, 단백질-암호화) 핵산 분자를 포함하며, 이들은 인트론 함유 서열일 수 있으며, cDNA와 같이 인트론을 함유하지 않은 서열일 수 있다. 클로닝된 유전자는 통상직인 기법, 예를 들어 핵산 분자의 PCR 증폭 및/또는 MEP 또는 PLP 폴리펩티드의 부분을 암호화하는 제한 단편을 생성하기 위한 제한 분해를 이용하여 제작할 수 있다. 이들 단편은 예를 들어 PCR 융합(중첩 PCR) 또는 제한 분해 생성물의 효소적 결찰을 이용하여 조립할 수 있다. 조립된 구성물 또는 이의 단편은 올리고뉴클레오티드 매개된 위치-지정된 돌연변이와 같은 돌연변이 생성 기법으로 변형시킬 수 있다.

이들 통상적인 방법은 여러 가지 문헌[참조: Sambrook 등 (1989); Ho 등, Gene (1989); Farrell (1993); Ausubel 등 (1994); Griffin 및 Griffin (1994); Mullis 등 (1994); Harwood (1994); 및 Davis 등 (1994)]에 상세히 기재되어 있다. 대안으로, 본 발명의 MBP 또는 PLP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자 또는 이러한 핵산 분자를 조립하기 위해 사용한 핵산 단편중 임의 단편 또는 모든 단편은 화학적인 수단으로 합성할 수 있다[참조: 예를 들어, Talib 등 (1994) 및 Ausubel 등 (1994)].

본 발명에 따라, 본 발명의 MBP 및 PLP 폴리펩티드의 여러 가지 아미노산에대한 코돈은 "박테리아화(bacterialyzed)"하여 박테리아 내에서 상기 단백질의 생성을 증강시킬 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 박테리아는 동일한 아미노산을 암호화하는 기타 가능한 코돈에 우선하여 특정 아미노산을 위한 특정 코돈을 이용하는 경향이 있다. 따라서, 박테리아의 단백질 합성 기구는 지정 코돈을 처리하는 경우 더 효과적으로 작용할 수 있다. 박테리아화 및 미엘린 단백질 암호화 코돈의 기타 변경은 본 발명의 MBP 분자에 대한 특정 참고문헌에 상세히 예시되어 있다.

서열 번호 1은 MBP의 천연 인간 21.5 kDa 태아 이소형태에 대한 아미노산 및 핵산 서열을 도시한다. MBP+X2^Xaa81을 암호화하는 핵산 분자는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 241 내지 243중 하나 이상(즉, 코돈 81)을 변형하여 제조하므로써 상기 코돈을 바람직한 대체 아미노산에 상응하게 한다. 이러한 변형 기법은 당업계에 현재 공지된 또는 후속 개발된 여러 가지 핵산 조작 기법을 이용하여 수행할 수 있다. 이러한 기법의 예로는 상기한 바와 같이 올리고뉴클레오티드 매개된 위치-지정 돌연변이발생, PCR 돌연변이 발생 또는 원하는 폴리뉴클레오티드의 드 노보합성과 같은 통상적인 재조합 DNA 기법을 들 수 있다.

MBP+X2^Ser81 에 있어서, 천연 TGC 코돈은 AGC, AGT, TCA, TCC, TCG 및 TCT중 임의의 코돈으로 변형시킬 수 있다. 일반적으로, 상기 변형은 TCG가 바람직한데, 그 이유는 상기 변형이 이 위치에서 새로운 TCGA 제한 위치를 생성시키기 때문이다. 상기 위치에서 새로운 제한 위치의 생성은 MBP+X2^Ser81을 암호화하는 핵산 분자와 같은 MBP+X2^Xaa81을 암호화하는 핵산 분자를 생성하는 전체적인 과정의 중간 단계로서 전형적으로 수득되는 변형된 핵산 분자 및 변형되지 않은 핵산 분자의 혼합물로부터 바람직한 변형을 포함하는 핵산 분자의 동정 및 분리를 용이하게 한다. 단백질 생성의 최적화의 고려가 각 핵산 조작의 용이성의 고려에 우선하는 경우 및 MBP+X2^Ser81를 박테리아, 예를 들어 이. 콜리 내에서 생성하려는 경우(TCG 코돈은 박테리아에서의 지정 코돈이 아닌 경우), 상기 변형은 TCC, TCT 또는 AGC가 바람직한데, 그 이유는 이들 코돈이 박테리아에서 바람직하게 때문이다.

서열 번호 2는 MBP의 천연 인간 21.5 kDa 태아 이소형태에 대한 아미노산 서열 및 이 단백질을 암호화하는 변형된 뉴클레오티드 서열을 나타내는데, 이때 여러 가지 아미노산에 대한 코돈은 박테리아화하여 박테리아 내에서 상기 단백질의 생성을 증강시킨다. 당업계에 공지된 바와 같이, 박테리아는 동일한 아미노산을 암호화하는 기타 가능한 코돈에 우선하여 특정 아미노산을 위한 특정 코돈을 이용하는 경향이 있다. 따라서, 박테리아의 단백질 합성 기구는 선호하는 코돈을 처리하는 경우 더 효과적으로 작용할 수 있다. 그러나, 당업계에 공지된 바와 같이, 선호하지 않는 코돈의 선호하는 코돈으로의 치환이 실제로 박테리아 내에서 특정 단백질의 생성을 실질적으로 증가시킬 수 있느냐 하는 것은 예측할 수 없다. 실시예에 상세히 기술하는 바와 같이, 서열 번호 2의 박테리아화는 이. 콜리 내에서 MBP 생성을 50％ 이상 증가시킨다.

서열 번호 2에서, 박테리아화는 박테리아가 선호하는 코돈에 상응하지 않는 천연 인간 코돈을 박테리아가 선호하는 코돈으로 치환하므로써 수행한다(조건 1). 변화시키려는 코돈의 선택에서, 하기하는 7개의 아미노산에 특히 주위를 기울여야 한다: 아르기닌(21개 코돈중 17개가 변화됨); 글리신(28개 코돈중 13개가 변화됨); 프롤린(17개 코돈중 10개가 변화됨); 라이신(14개 코돈중 12개가 변화됨); 루신(11개 코돈중 3개가 변화됨); 트레오닌(8개 코돈중 6개가 변화됨); 및 발린(5개 코돈중 3개가 변화됨). 이들 아미노산이 강조되는 이유는 이. 콜리 내에서 그들의 특정 잉여 코돈의 사용에 대한 강한 성향 때문이다[참조: Wada 등 (1992)]. 이들 7개의 아미노산 중에서, 아르기닌, 프롤린 및 라이신이 가장 중요한 것으로 생각되는데, 그 이유는 이들이 MBP 21.5 내의 아미노산 잔기의 26％를 구성하기 때문이다. 대체 기준으로서, 몇몇 코돈은 고 발현된 박테리아 유전자 내에서 우선적으로 사용되는 코돈으로 변화된다(기준 2, Grosjean 및 Fiers (1982)). 서열 번호 3에 상응하는 핵산 분자 내에 혼입된 코돈 변화의 완전한 목록(서열 번호 3에서 발견되는 81번 아미노산에 대한 Ser 코돈을 대신하여 상기 비교 내에 유지된 천연 시스테인 코돈 81은 제외함)은 하기 표 4에 나타냈으며, 이때 천연(태아) 인간 MBP 21.5 서열 자료는 "huMBP 21.5"로 나타냈으며, 박테리아화된 재조합 MBP(MBP+X2^Cys81/bact.) 서열 자료는 "recMBP 21.5"로 나타냈다.

본 명세서 및 특허청구의 범위에서 사용된 표현 "박테리아가 선호하는 코돈(bacterially preferred codon)"은 상기 두가지 기준에 근거하여 선택된 코돈을 의미하며, 첨자 (1) "hum." 및 (2) "bact."는 (1) 천연 인간 코돈 및 (2) 천연 인간 코돈으로부터 박테리아가 선호하는 코돈으로 변화된 적어도 몇 종류의 코돈을 보유하는 MBP-암호화 핵산 서열을 나타낸다.

약간의 박테리아화는 필요에 따라 수행할 수 있으며, 소망하는 수준의 생성 증가를 획득될 수 있느냐가 기준이 된다. 또한, MBP와 관련하여 박테리아화된 서열은 추가로 변경되어 MBP+X2^Xaa81/bact. 또는 바람직하게는 MBP+X2^Ser81/bact. 를 생성할 수 있다. 박테리아화 및 코돈 81에서 추가의 변경은 전술한 내용 및 실시예에서 기술한 핵산 조작 기법을 이용하여 수행할 수 있다.

상기한 바와 같이, 서열 번호 3은 MBP+X2^Ser81 을 암호화하는 박테리아화된 뉴클레오티드 서열을 나타내고, 상기 암호화된 폴리펩티드의 카르복시 말단에서 6개의 히스티딘 잔기를 암호화하는 3' 단부에서 추가의 18 뉴클레오티드 서열(종결 코돈 직전에 존재하는 서열, 즉 서열 번호 3의 뉴클레오티드 592-609)을 추가로 포함한다(이러한 4개 잔기 이상의 다수의 히tm티딘의 첨가는 히스티딘 태그라 칭한다). 이 히스티딘 태그는 천연 MBP+X2^Cys81/hum. 단백질 내에서는 발견되지 않으며, 이들을 첨가하여 상기 MBP+X2^Ser81/bact. 유전자 발현의 폴리펩티드 생성물의 정제를 용이하게 한다.

히스티딘 태그는 금속 킬레이터로서 작용하는 5개 이상의 구성 히스티딘 잔기로 이루어진 군이며, 금속 킬레이트화 크로마토그래피 등을 이용하여 단백질의 혼합물로부터 상기 태그를 함유하는 폴리펩티드를 신속하고, 효율적으로 정제할 수 있다. 본 발명에 따라, 상기 히스티딘 태그는 본 발명의 임의의 폴리펩티드에 첨가하거나, 상기 태그를 암호화하는 서열은 본 발명의 임의의 핵산 서열에 첨가하므로써 본 발명의 폴리펩티드의 신속한 정제가 가능하게 된다.

본 발명의 바람직한 핵산 분자는, 적합한 숙주 내에서 발현되는 경우, 본 발명의 MBP 및/또는 PLP 폴리펩티드의 발현을 유도하는 뉴클레오티드 서열(및/또는 이 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열)을 포함하는 분리된 핵산 분자이다.

본 발명의 단백질-암호화 핵산 분자는 적합한 발현 벡터, 즉 삽입된 단백질 암호화 서열의 전사 및 해독을 위해 필요한 요소를 함유하는 벡터에 삽입하고, 이어서 MBP 및/또는 PLP 폴리펩티드를 생성하는데 사용할 수 있다. 여러 가지 숙주 벡터 시스템을 사용하여 단백질 암호화 서열을 발현할 수 있다. 이들의 예로는 백시니아 비루스, 아데노비루스, 레트로비루스등과 같은 비루스로 감염된 포유류 세포 시스템; 플라즈미드로 형질감염된 포유류 세포 시스템; 바쿨로비루스와 같은 비루스로 감염된 곤충 세포 시스템; 효모 발현 벡터를 함유하는 효모와 같은 미생물 또는 박테리오파지 DNA, 플라즈미드 DNA, 코스미드 DNA 등으로 형질전환된 박테리아를 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

박테리아 용으로 유용한 발현 벡터는 널리 알려진 클로닝 벡터 pBR322(미국 메릴랜드 20852, 록빌, 파크론 드라이브 12301에 소재하는 미국 모식균 배양 수집소; ATCC 수학번호 37017)의 유전 요소를 포함하는 것들을 포함하는 시판되는 플라즈미드로부터 유도되는 박테리아 복제 원점을 포함할 수 있다. 이들 pBR322 "백본부" 또는 기능적으로 등가인 서열은 적합한 프로모터 및 발현하려는 구조 유전자와 조합된다.

바람직한 박테리아 발현 벡터로는 파지 T7 프로모터 플라즈미드 pET14b, 및 pET22b(미국, 위스콘신, 메디슨에 소재하는 노바겐)을 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 이들 벡터는 이. 콜리 BL21(DE3)(미국, 위스콘신, 메디슨에 소재하는 노바겐) 내에서 발현되는 것이 바람직하다. 상기 균주는 이. 콜리 lacUV5 프로모터 뒤의 T7 폴리머라제를 위한 유전자를 함유하는 박테리오파지 DE3 라이소젠에 대해 용원성이다[참조: Studier 등 (1990)]. 기타 바람직한 박테리아 발현 벡터는 pET Trc SO5/NI 벡터(서열 번호 21), pTrc 99A 벡터(파마시아) 및 pSE 벡터(미국, 캘리포니아, 샌디에고에 소재하는 인비트로겐)을 포함하는 Trc 벡터이다.

재조합 미생물 발현 벡터 내에 공통적으로 사용되는 기타 프로모터로는 락토즈 프로모터 시스템[참조: Chang 등 (1978)], 트립토판(trp) 프로모터[참조: Goeddel 등 (1980)] 및 tac 프로모터 또는 trc 프로모터라 칭하는 tac 프로모터와 trp 프로모터와의 융합 프로모터[참조: Sambrook 등 (1989) 및 Maniqatis 등 (1982), 특히 412 페이지]를 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 특히 바람직한 프로모터는 박테리오파지 프로모터, 예를 들어 T7 프로모터인데, 이 프로모터는 숙주 세포 내에서 상응하는 박테리오파지 RNA 폴리머라제, 예를 들어 T7 RNA 폴리머라제의 발현과 병용할 수 있다.

또한, 재조합 MBP 및 PLP 폴리펩티드는 진균류 숙주, 바람직하게는 사카로마이세스 세레비재 속의 효모 내에서 발현할 수 있다. 또한, 진균 또는 아스퍼길러스, 피치아 또는 클루이베로마이세스와 같은 기타 속을 사용할 수도 있다. 진균 벡터는 일반적으로 2 ㎛ 효모 플라즈미드 또는 다른 자가 복제 서열(ARS)로부터 취한 복제 원점, 프로모터, MBP 및/또는 PLP 폴리펩티드를 암호화하는 DNA, 폴리아데닐화를 유도하는 서열 및 전사 종결 및 선택성 마커 유전자를 함유한다. 진균 벡터는 이. 콜리 및 진균의 형질전환을 가능하게 하는 복제 원점 및 선택성 마커를 함유하는 것이 바람직하다.

진규류 내의 적합한 프로모터 시스템은 메탈로티오네인, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 에놀라제, 헥소키나제, 피루베이트 키나제 및 글루코키나제와 같은 기타 당분해성 효소용 프로모터 뿐만 아니라 글루코즈-억제성 알코을 디하이드로게나아제 프로모터(ADH2), 알콜 디하이드로게나아제 ADH1 유전자로부터 취한 프로모터 등을 들 수 있다[참조: 예를 들어, Schena 등 (1991)]. 효모 알파-인자 또는 효모 인버타아제의 분비를 유도하는 신호와 같은 분비 신호는 진균류 벡터 내에 혼입되어 진균류 성장 배지 내로 MBP 및/또는 PLP 폴리펩티드의 분비를 촉진한다[참조: Moir 등 (1991)].

바람직한 진균류 발현 벡터는 박테리아 내에서 분비 및 복제를 위해 pBR322로부터 취한 DNA 서열 및 벡터 pAAH5에서 확인할 수 있는 바와 같이, ADH1 프로모터 및 알코올 디하이드로게나아제 ADH1 종결 서열을 포함하는 진균류 DNA 서열을 이용하여 구성할 수 있다.

여러 가지 포유류 또는 곤충 세포 배양 시스템을 이용하여 본 발명의 재조합 MBP 및/또는 PLP 폴리펩티드를 발현할 수 있다. 곤충 세포 내에서 이종 단백질을 생성하기 위해 적합한 바쿨로비루스 시스템은 문헌[참조: Luckow 등 (1988)]에 기재되어 있다. 적합한 포유류 숙주 세포주의 예로는 원숭이 신장 기원의 COS 세포, 생쥐 C127 유방 상피 세포, 생쥐 BALB/c-3T3 세포, 생쥐 MOP8 세포, 중국 햄스터 난소 세포(CHO), 인간 293T 세포, 헤라, 흑색종 및 신생 햄스터 신장(BHK) 세포를 들 수 있다. 포유류 발현 벡터는 복제 원점, 발현하려는 MBP 및/또는 PLP 암호화 서열에 연결된 적합한 프로모터 및 인헨서 및 기타 5' 또는 3' 전후 서열, 예를 들어 리보좀 결합 위치, 폴리아데닐화 위치, 결찰 공여체 및 수용체 위치 및 전사 종결 서열을 포함한다.

척추 동물 세포의 형질전환에 사용되는 포유류 발현 벡터 시스템 내의 전사 및 해독 조절 서열은 비루스로부터 제공될 수 있다. 예를 들어, 통상적으로 사용되는 프로모터 및 인헨서는 폴리오마 비루스, 아데노비루스, 시미안 비루스40(SV40), 백시니아 및 인간 거식세포 비루스(CMV)로부터 유도되는데, 거식세포 초기(immediately early) 유전자 1 프로모터 및 인핸서를 포함한다.

재조합 MBP 및/또는 PLP 폴리펩티드의 발현을 위해 특히 바람직한 진핵 세포 벡터는 pAPEX-1(서열 번호 11 및 더 바람직하게는 pAPEX-3p, 서열 번호 12)이다. pAPEX-1 벡터는 단백질 발현 수준을 증가시키기 위해 변형시킨 pcDNAI/Amp(인비트로겐)의 유도체이다. 첫째, 3'-미해독된 SV40 작은-t 항원 인트론은 601 염기쌍의 XbaI/HPaI 단편의 결실에 의해 제거되는데, 그 이유는 상기 인트론이 상류 암호화 영역 내로의 비정상 결찰에 민감하기 때문이다[참조: Evans 및 Scarpulla (1989); Huang 및 Gormab (1990)]. 둘째로, 키메라 아데노비루스-면역글로블린 하이브리드 인트론은 벡터 pRc/CMV7SB[참조: Sato 등 (1994), J. Biol. Chem. 269: 17267]로부터 취한 상응하는 845 염기쌍 NdeI-NotI 단편을 이용하여 484 염기쌍 NdeI-NotI 단편을 대체하므로써 5'-미해독된 영역으로 투입한다. 최종적으로, 이. 콜리로부터 플라즈미드 DNA 수율을 증가시키기 위해, 생성된 CMV 프로모터 발현 카세트를 벡터 pGEM-4Z(미국, 위스콘신, 메디슨에 소재하는 프로메가 코오포레이숀)내로 이동시킨다.

벡터 pAPEX-3은 먼저 EBNA 유전자가 2.4 kb ClaI/AccI 단편의 결실로 인해 제거된 벡터 pDR2(미국, 캘리포니아, 팔로 알토에 소재하는 클론테크 래보래토리즈 인코오포레이티드)의 유도체이다. 이어서, RSV 프로모터는 벡터 pAPEX-1으로부터의 1.0 kb MluI/BamHI 단편과 pDR2로부터 취한 450 염기쌍 MluI/BamHI 단편을 교환하므로써 CMV 프로모터와 아데노비루스/면역글로불린키메라 인트론으로 대체한다. pAPEX-3P의 구성을 위해서, HSV tk 프로모터 및 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제(hyg)를 함유하는 1.7 kb BstI/SwaI 단편을 pAPEX-3으로부터 제거하였으며, SV40 초기 프로모터 및 푸로마이신 아세틸트랜스퍼라아제(pac) 유전자[Morgenstern 및 Land (1990), Nucleic Acids Res. 18: 3587-3596] + 벡터 pAPEX-1으로부터 취한 SV4O 폴리아데닐화 신호를 함유하는 137 염기쌍 XbaI/ClaI 단편을 함유하는 1.1 kb SnaBI/NheI 단편으로 대체하였다.

pAPEX 벡터내의 재조합 MBP- 및/또는 PLP-암호화 삽입물의 발현을 위해 특히 바람직한 숙주 세포는 인간 293 EBNA 세포주(미국, 캘리포니아, 산디에고에 소재하는 인비트로겐)이다.

재조합 MBP 및/또는 PLP의 발현용으로 바람직한 다른 진핵세포 벡터는 pcDNAI/Amp(인비트로겐)이다. 상기 pcDNAI/Amp 발현 벡터는 인간 거식세포비루스 초기 유전자 I 프로모터 및 인핸서 요소, SV40 컨센서스 인트론 공여체 및 수용체 결찰 서열 및 SV40 컨센서스 폴리아데닐화 신호를 함유한다. 또한, 상기 벡터는 SV 40 복제 원점을 함유하고 있어 SV40 큰 T 항원으로 형질전환된 세포(예를 들어, COS 세포, MOP8 세포등)에서 에피좀 증폭을 가능하게 하며, 박테리아 세포 내에서 증식 및 선택용 앰피실린 내성 유전자를 함유하고 있다.

III. 본 발명의 폴리펩티드의 제조

정제된 재조합 MBP 및 PLP는 본 발명의 핵산 분자의 재조합 MBP 및/또는 PLP 해독 생성물을 발현하기 위해 적합한 숙주/벡터 시스템을 배양하고, 이어서 상기 숙주 시스템, 예를 들어 박테리아, 곤충 세포, 진균류 또는 포유류 세포의 배양 배지 또는 세포 추출물을 정제하므로써 제조하였다. 따라서, 본 발명은 MBP 및 PLP 폴리펩티드를 생성하기 위한 방법을 제공하는데, 상기 방법은 본 발명의 핵산 분자를 함유하는 재조합 숙주를 성장시키는 단계; 상기 핵산 분자가 상기 숙주에 의해 발현되는 단계; 및 발현된 폴리펩티드를 분리하는 단계를 포함한다.

분비된 생성물로서 하나 이상의 히스티딘 태그 서열(5개 이상의 히스티딘 잔기의 신장을 포함하는 서열)을 함유하는 재조합 MBP 및/또는 PLP 단백질을 발현하는 세포를 배양함으로써 정제를 매우 단순화시킬 수 있다. 이러한 히스티틴 태그 서열은 특정 조건 하에서 니켈과 같은 금속에 결합하므로써 정제를 위해 니켈(또는 다른 금속) 칼럼을 이용할 수 있다.

일반적으로 정제는 적합한 세트의 농도 및 분획화 단계(예를 들어, 크로마토그래피)를 이용하여 수행된다. MBP 폴리펩티드의 정제를 위해 특히 바람직한 정제 단계는 하기 실시예의 "MBP 폴리펩티드의 정제 및 특정화"란에서 기술되는 바와 같은 산 추출이다.

그러나, 본 발명의 정제된 MBP 및 PLP 폴리펩티드는 일반적으로 몇몇 불순물의 존재 하에서 특정화될 것이다. 이들 불순물은 단백질, 탄수화물, 지질 또는 기타 분자를 들 수 있으며, 이들의 특성은 사용된 생성 및 정제 방법에 따라 다르다. 이들 성분들은 보통 비루스, 원핵세포, 진핵세포로부터 기인한 것 또는 합성된 것이며, 발열원이 아닌 것이 바람직하며, 약 1 중량％ 미만의 무해한 오염량으로 존재하는 것이 바람직하다.

IV. 임상적 적용

상기한 바와 같이, 본 발명의 MBP 및/또는 PLP 핵산 분자에 의해 암호화된 MBP 및 PLP 폴리펩티드는 다발성 경화증의 진단, 임상적 평가 및 치료에 사용할 수 있으며, PLP 폴리펩티드의 투여를 포함하는 치료에 대한 다발성 경화증 환자의 잠재적인 반응성을 평가하기 위해서도 사용할 수 있다. 이러한 진단 및 평가 방법은 본원에 기재한 하나 이상의 MBP 및 PLP의 존재 또는 부재 하에서 T 세포의 이중 배양물의 배양 및 하나 이상의 폴리펩티드의 존재(부재가 아님)하에서 배양하여 T 세포 활성화 및/또는 T 세포 세포소멸(본 명세서 및 특허 청구의 범위에서는 "T 세포 반응"이라 칭함)의 검출을 수반하는 분석법을 포함한다.

구체적으로, 이러한 분석법은 환자로부터 T 세포의 분리 및 부분적인 정제, 서열 번호 1의 폴리펩티드, 임의의 기타 표준 아미노산으로 시스테인 81이 대체된 서열 번호 1의 폴리펩티드, 분자량이 약 150 미만인 하전되지 않은 아미노산으로 시스테인 81이 대체된 서열 번호 1의 폴리펩티드 및 세린으로 시스테인 81이 대체된 서열 번호 1의 폴리펩티드; 또는 서열 번호 23의 폴리펩티드, 서열 번호 24의 폴리펩티드, 서열 번호 26의 폴리펩티드, 서열 번호 27의 폴리펩티드, 서열 번호 28의 폴리펩티드 또는 상기한 기타 바람직한 MBP 또는 PLP 폴리펩티드로 구성되는 군으로부터 선택된 폴리펩티드과 같은 PLP 및/또는 MBP 폴리펩티드와 분리된 T 세포와의 조합, 상기 폴리펩티드에 의해 유도된 T 세포 반응의 수준 측정을 포함하는 것이 바람직하다. T 세포 반응의 측정 방법은 후술하는 "T 세포 반응의 검출"란에 상세히 기술한다.

본 발명에 따라, 상기 분석법은 MBP 또는 PLP 반응성 T 세포의 검출용 키트로서 제공될 수 있는데, 상기 키트는 폐쇄 구획내 및/또는 후술하는 "T 세포 반응의 검출"란에 기술된 제제중 하나와 같은 T 세포 반응 검출용으로 사용되는 제제의 근방에 및/또는 제한된 상태로 분리된 PLP 또는 MBP 21.5 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 키트의 바람직한 구체예에서, 상기 키트는 상기 키트가 다발성 경화증의 진단 및/또는 임상적 평가를 위해 사용하는 키트임을 나타내는 표지를 추가로 포함한다.

이와 같은 방식으로 PLP 또는 MBP 21.5 폴리펩티드와 함께 배양하는 경우 T 세포 반응을 나타내는 환자 CSF 내에서의 T 세포의 발견은 환자가 다발성 경화증을 앓고 있는 지표로 고려한다. 다발성 경화증 환자의 CSF 및/또는 혈액 내에서 상기 MBP 또는 PLP 반응성 T 세포의 발견은 환자가 MBP 및/또는 PLP 폴리펩티드로 치료해야할 적합한 후보임을 입증하는 것이다. 혈액 또는 CSF 내에서 상기 T 세포의 수준은 치료할 질병 진행 및 반응의 지표로서 검사할 수 있다.

환자의 혈액 및/또는 CSF 내의 상기한 바와 같은 반응성 T 세포의 수("전구물질 빈도" 또는 "반응성 T 세포 지수")는 시간에 따라 검사할 수 있으며, 질병의 악화를 나타내는 수치의 증가 및 질병의 호전을 나타내는 수치의 감소를 이용하여 질병질병 진행의 지표로 사용할 수 있다. 또한, 반응성 T 세포 지수는 치료가 적합한 경우, 예를 들어 지수의 갑작스러운 증가의 경우 예지자로서 기여하는데, 이는 치료적 개입을 개시하여야 하거나 증강시켜야 함을 의미하는 것이다. 상기 치료가 MBP 및/또는 PLP 폴리펩티드의 투여를 포함하건, 포함하지 않건 상기 지수가 치료 과정 동안 검사되는 경우, 반응성 T 세포 지수의 현저한 감소는 치료의 성공을 의미하는 것인 반면, 상기 지수의 현저한 증가는 치료의 실패를 의미하는 것이며, 이는 치료 방법을 조정해야 함을 의미한다.

따라서, 본 발명은 환자로부터 T 세포를 부분적으로 분리 및 정제하는 단계, 분리된 T 세포와 면역 반응성 MBP 21.5 폴리펩티드 또는 PLP 폴리펩티드(하나 또는 두 개 이상의 소수성 펩티드 영역, 바람직하게는 3개 이상의 소수성 펩티드 영역을 제거한 천연 PLP 폴리펩티드의 아미노산 서열을 보유하는 PLP 뮤테인 아미노산을 포함하는 PLP 폴리펩티드)를 조합하는 단계, 상기 폴리펩티드에 의해 유도된 T 세포 반응의 수준을 검사하는 단계를 포함하는 분석법을 제공한다.

본 발명은 폐쇄 구획내 및/또는 T 세포 반응 검출용으로 사용되는 제제와 인접한 상태로 면역반응성 PLP 폴리펩티드(하나 또는 두 개 이상의 소수성 펩티드 영역, 바람직하게는 3개 이상의 소수성 펩티드 영역을 제거한 천연 PLP 폴리펩티드의 아미노산 서열을 보유하는 PLP 뮤테인 아미노산을 포함하는 PLP 폴리펩티드)를 포함하는 MBP 반응성 T 세포의 검출용 키트를 추가로 제공한다. 본 발명에 따라, 상기 키트는 상기 키트가 다발성 경화증의 진단 및/또는 임상적 평가를 위해 사용하는 키트임을 나타내는 표지를 추가로 포함한다.

A. T 세포 반응의 검출

T 세포 활성화 및 세포소멸의 분석법은 당업계에 널리 알려져 있다. 이에 대한 설명은 문헌[참조: Wier (1978): Klaus (1987); Voskuh] 등 (1993); 및 Ormerod (1994)]에 상세히 기재되어 있다. 이러한 분석법은 T 세포 활성화 및/또는 세포소멸의 임의의 중요한 지표의 변화를 측정하는 것이다.

T 세포 활성화에 있어서, 이들 지표는 일반적으로 T 세포 증식, 시토킨 방출 및 시토킨 수용체의 발현의 검출을 위한 시약 및 기타 활성화 관련된 세포 표면 마커를 포함한다. 세포소멸에 있어서, 이들 지표는 일반적으로 염료, 염색약 및 기타 핵 수축 및/또는 세포 사멸의 관찰/검출을 위한 시약; 세포소멸성 세포 사멸을 억제할 수 있는 대사 억제제; 염색약, 효소, 표지된 핵산 전구물질 및 기타 DNA 분해 지표를 포함한다.

T 세포 활성화 및 세포소멸의 모든 분석법은 전형적으로 다중 웰 평판, 접시 및 플라스크 뿐만 아니라 시험관 및 원심분리 튜브, 액체 계량 장치, 예를 들어 피펫, 적하기 및 적하병, 세포 배양 배지 및 완충용액을 포함하는 세포 배양(조직 배양) 기구를 사용한다. 또한 이들 다수의 분석법은 표지된 항체, 종종 1차 항체에 대한 2차 항체, 측정하려는 지표에 특이적으로 결합하는 비표지된 항체의 판독을 포함한다. 또한, 이들 분석법은 상기한 내용 및 실시예에 기술하는 수많은 시약 및 기구를 사용한다. 본 명세서 및 특허청구의 범위에서 사용한 용어 "T 세포 반응의 검출용으로 사용되는 제제"는 임의의 시약(항체 포함), 공급품, 배지 및 상기 검출을 위해 사용할 수 있는 기구를 의미한다.

T 세포에 특이적인 시약이 지표로 사용되지 않는 경우, T 세포 반응의 측정은 일반적으로 표지화 및/또는 백혈구의 제조물로부터 T 세포의 추가 정제를 포함하는데, 이는 전형적으로 백혈구가 분리된 체액(예를 들어, 뇌척수액 또는 응집되지 않은 혈액)의 원심분리 및/또는 여과에 의해 수득된다(즉, 부분적으로 정제된다). 후술하는 바와 같이, 특허청구의 범위에서 사용한 용어 "분리된 T 세포"는 필요적으로 추가 정제(예를 들어, 체액으로부터 백혈구를 제거하기 위한 원심분리 또는 기타 혈액 세포의 분리에 의한 정제)하지 않은, 생체로부터 제거된 T 세포를 의미한다. 따라서, T 세포의 분리는 란세트, 바늘, 주사기, 진공 혈액 수집 튜브 및 기타 혈액 및/또는 CSF 수집기를 사용하며, 추가로 여과 및 원심분리기를 사용한다.

T 세포를 특이적으로 표지하는 방법은 전형적으로 통상적인 면역조직화학 기법 및/또는 FACS 기법을 포함하는데, 이들 기법들은 일반적으로 T 세포 수용체, 이의 서브유니트인 T 세포 특이성 마커에 대한 항체 및 CD3과 같은 관련 분자이다. 이러한 항체는 다수의 공급처에서 시판되고 있다.

T 세포를 적어도 부분적으로 정제하는 방법은 상기한 항체를 이용하는 FACS에 의한 세포 분류, 유리구 및/또는 나일론 울에 통과시키는 것을 포함하는 여러 가지 친화성 정제법, 백혈구 혼합물로부터 T 세포 이외의 세포를 제거하기 위해 다른 백혈구를 위한 마커에 대한 항체 및 차등 원심분리, 예를 들어 원심분리 세정 및/또는 폴리수크로즈(FICOLL), 알부민, 콜로이드성 실리칸 등과 같은 밀도 구배 매체를 이용하는 밀도 구매 원심분리를 포함한다.

T 세포 증식의 검출은 상기한 바와 같은 T 세포를 표지화 또는 부분 정제하고, 일반적으로 세포 증식을 검출하기 위해 사용하는 방법을 적용한다. 이러한 방법 중 하나는 살아있는 세포에 의해 초기 DNA 내로 혼입될 수 있는 검출가능한 핵산 전구물질 분자의 존재하에서 상기 T 세포를 배양하므로써 새로이 합성된 DNA를 표지하는 단계를 포함한다. 이러한 전구물질은 ³H 티미딘 및 기타 방사능으로 표지된 전구물질, 및 BrdU 및 기타 편리하게 검출할 수 있는 비방사능 표지된 전구물질을 포함한다. 방사능 표지된 표지를 사용하는 경우, 혼입되지 않은 전구물질은 세척하여 제거하고, 혼입된 전구물질의 수준은 자동방사능사진법, 섬광 계수법 또는 기타 방사능 정량에 사용하는 방법으로 측정한다.

BrdU 등을 사용하는 경우, 혼입되지 않은 전구물질은 세척하여 분리하고, 항체 또는 상기 전구물질에 특이적으로 결합할 수 있는 기타 시약을 이용하여 핵DNA 내에 혼입된 전구물질을 검출한다. 또한, 활성 세포를 대사적으로 표지할 수 있는 시약을 사용하여 세포 수의 증가를 추적한다. 이러한 시약의 예로는 MTT, XTT, MTS 및 WST-1을 들 수 있으며, 이들은 미토콘드리아 효소에 의해 절단되어 분광측정법으로 용이하게 검출 및 측정할 수 있는 생성물을 산출하는데, 절단된 생성물의 수준은 테스트하려는 샘플 내의 대사적으로 활성인 세포의 수에 비례하여 측정된다. 이러한 시약은 다수의 공급처에서 시판되고 있다.

T 세포 활성화의 다수의 세포 표면 마커는 당업계에 공지되어 있으며, 통상적인 면역조직화학 기법 및/또는 FACS 기법을 이용하므로써 항체(다수의 공급처에서 시판됨)에 의해 일반적으로 검출된다. 이들 마커의 예로는 CD25(IL-2 수용체), CD26, CD30, CD69 및 CD71(트랜스페린 수용체)를 들 수 있다.

또한, T 세포 활성화는 배양 배지 내로의 시토킨 방출을 측정하므로써 검출할 수 있다[참조: 예를 들어, Correale 등 (1995)]. 불활성 T 세포는 시토킨을 방출하지 않지만, 적어도 일부의 활성 T 세포는 IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, 감마 인터페론, TNF-알파 및 TNF 관련 시토킨(FAS 리간드로 공지됨)을 방출한다. 또한, T 세포 활성화는 CD95(FAS 수용체)를 포함하는 활성화-특이성 마커의 T 세포 표면 발현에 의해 검출할 수 있다. 이들 각각의 시토킨 및 마커를 검출하기 위한 항체는 당업계에 공지되어 있고, 시판되고 있으며; 예를 들어, 배양 배지 내에서 시토킨을 측정하기 위해 상기 항체를 사용하는 분석법도 당업계에 공지 및 시판되고 있다.

T 세포 활성화를 검출하기 위한 특히 민감한 분석법은 최근에 개발된 효소 결합 면역스포트(ELISPOT) 분석법인데, 이는 전형적으로 T 세포가 배양된 항체 피복된 기질 상에서 스포트로서 단일 T 세포에 의한 시토킨 방출을 검출한다. 이러한 분석법은 문헌[참조: Taguchi 등 (1990) 및 Sun 등 (1991)]에 기재되어 있다. ELISPOT 분석법은 감마 인터페론의 분비를 검출하는데 사용하는 것이 바람직하다.

세포성 질병 상태가 진행되고 있는 세포소멸 과정의 결과에 비롯되는 것인지의 여부를 결정하기 위한 재료 및 방법도 당업자에게 공지되어 있다. 또한, 통상적인 조직학적 염색, 즉 세포소멸과 관련된 초미세구조의 변화의 검출을 가능하게 하는 염색이외에 분석 및 염색 기법을 포함하는 세포소멸 검출 방법이 오랜기간 사용되어 왔다. 이들 방법은 전형적으로 세포 사멸이 할성 메카기즘(예를 들어, 단백질 합성)에 좌우되는지의 여부 또는 사멸하고 있는 세포가 DNA 분해(단편화)를 나타내는지의 여부를 결정하는 것이다.

상기한 전자의 방법은 대사 억제제, 예를 들어 시클로헥시미드와 같은 단백질 합성 억제제, 악티노마이신 D와 같은 RNA 합성 억제제 또는 시클로스포린과 같은 면역-특이성 억제제의 존재 또는 부재 하에서 사멸하고 있는 세포를 함유하는 복제 배양물을 성장시키고, 이러한 억제가 세포 사멸을 지연시키는지의 여부를 결정하는 것을 포함한다. 세포사멸이 지연되는 경우, 세포소멸이 거의 확실히 관련되어 있다. 예를 들어, 세포 사멸은 염료인 프로피듐 요오다이드를 상기 세포내로 진입시킬 수 있는 능력으로 측정한다[참조: 예를 들어, Dhein 등 (1995)].

DNA 단편화를 검출하는 방법은 전형적으로 페놀 추출 및 겔 전기영동에 의해 수행되는 DNA의 분리 및 크기 분리를 포함할 수 있다. 더 새로운 기법은 효소 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라아제("TdT"또는 "말단 트랜스퍼라아제"), 적합한 완충액(예를 들어, 코발트염과 DTT, DTE 또는 BME와 같은 환원제를 함유하는 카코딜레이트 완충액) 및 표지된 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTP) 또는 표지된 유도체 또는 이의 유사체(예를 들어, BrdUTP, 비오티닐화된 dNTP, 디곡시게닌 표지된 dNTP, 방사능표지된 dNTP, 이들은 전체적으로 "표지된 XTP"라 칭한다)의 이용을 포함한다.

TdT는 표지된 XTP를 DNA 분자의 유리 말단에 혼입한다. 세포소멸과 관련된 DNA 분해는 건강한 세포의 소수의 유리 말단에 비해 다수의 유리 말단을 생성하기 때문에, 건강한 세포에 비해 높은 수준의 XTP의 혼입은 세포소멸이 진행되고 있음을 나타내는 것이다. 따라서, 세포소멸을 검출하기 위한 TdT 법은 자동방사능사진법 또는 면역조직화학법(예를 들어, 표지된 XTP에 대한 항체의 이용: 표지된, 예를 들어 형광물질로 표지되거나 효소적으로 표지된 항체 또는 표지된 제 2 항체의 병용)과 같은 통상적인 기법을 전형적으로 이용하는 혼입된 표지된 XTP의 검출을 포함한다(상기 분석은 미혼입된 표지된 XTP를 세척 제거하는 단계를 수반한다). 상기 방법을 실시하기 위한 키트는 미국, 메릴랜드, 게티스버그에 소재하는 온코르 인코오포레이티드에서 "아포프태그(APOPTAG)" 키트로 시판되고 있다.

최근에 개발된 다른 분석법은 항-히스톤 포획 항체 및 항-DNA 검출 항체를 이용하는 ELISA 를 포함한다. 이 분석법은 단편화된 크로마틴으로부터 손상되지 않은 크로마틴의 분리, 이렇게 분리된 단편화된 크로마틴의 수준을 상기 ELISA를 이용하여 측정하는 것을 포함한다. 이러한 키트는 미국, 인디아나, 인디아나폴리스에 소재하는 뵈링거 만하임 코오포레이숀에서 "세포 사멸 검출" 키트로 시판된다.

B.치료

본 발명의 MBP 폴리펩티드를 이용하는 치료에 있어서 주목해야 하는 점은, 본 발명의 MBP 21.5 폴리펩티드(예를 들어, MBP+X2^Ser81)가 다발성 경화증 환자에서 항원 관용화를 획득하기 위한 종래의 접근법에 사용된 비인간 유도된 MBP 항원에 비해 많은 잇점을 가지고 있다는 점이다. 이러한 잇점으로는 MBP 면역우성 영역의 전범위의 포함 및 임의의 상기 MBP 면역우성 영역에 반응성인 T 세포 내에서 관용성을 유도할 수 있는 이들 폴리펩티드의 필연적인 능력을 들 수 있다.

자동방사능의 항원내 및 항원간 확산은 표적 조직내의 항원 또는 추가 항원 내의 추가 에피토프가 질병 진행 중에 자가반응성 T 세포에 의해 표적화되는 자가면역 질병과 관련된 현상이다. 이러한 항원 확산은 실험적 알레르기성 뇌척수염(EAE) 및 인슐린 의존성 당뇨병의 쥐과 동물 모델에서 염증성 자가면역 질병의 과정 중에 관찰되어 왔다[참조: Lehmann 등 (1992); McCarron 등 (1990); Kaufman 등 (1993); Tisch 등 (1993)].

항원 확산에 대한 이들 발견 및 다발성 경화증 환자에서 MBP 반응성의 활성화된 T 세포에 의해 인식되는 면역우성 에피토프 내에서의 가변성의 입증은 효과적인 MBP 특이성 치료법이 MBP 특이성 자가반응성 T 세포의 이종 군집을 표적화할 필요가 있음을 의미하는 것이다. 따라서, 비경구 MBP 투여가 다발성 경화증의 치료에서 최대 효과를 얻으려면, 그의 면역우성 에피토프의 완전한 레파토리기 T 임파구에 기여되어야만 한다.

본 발명의 특정 관점에 따라, 다발성 경화증 환자에게 MBP 21.5 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하는, 다발성 경화증 환자를 치료하는 방법이 제공된다. 상기 MBP 21.5 폴리펩티드는 MBP 면역우성 에피토프의 완전한 레파토리를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 MBP 21.5 폴리펩티드는 환자 신체, 예를 들어 환자의 혈액, 뇌척수액, 림프, 세망내피계, 간, 림프 결절, 비장, 흉선등의 관련 구획(즉, 체액 또는 조직 구획) 내에서 상기 폴리펩티드의 농도를 획득하고, MBP 반응성 T 세포의 세포소멸을 유도하기에 충분한 양으로 투여된다. 상기 폴리펩티드는 12 시간 이상 및 4일 이하의 간격으로 2회 이상 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 특정 관점에 따라, 다발성 경화증 환자에게 PLP 폴리펩티드(예를 들어, ΔPLP3, ΔPLP4, MP3, MP4, PM4, MMOGP4)를 투여하는 단계를 포함하는 다발성 경화증 환자를 치료하는 방법이 제공된다. 상기 PLP 폴리펩티드 는 공지된 인간 PLP 면역우성 에피토프의 완전한 레파토리를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 PLP 폴리펩티드는 환자 신체, 예를 들어 환자의 혈액, 뇌척수액, 림프, 세망내피계, 간, 림프 결절, 비장, 흉선등의 관련 구획(즉, 체액 또는 조직 구획) 내에서 상기 폴리펩티드의 농도를 획득하고, PLP 반응성 T 세포의 세포소멸을 유도하기에 충분한 양으로 투여된다. 상기 폴리펩티드는 12 시간 이상 및 4일 이하의 간격으로 2회 이상 투여하는 것이 바람직하다. 상기 폴리펩티드는 보조제를 동시에 투여하지 않는 것이 바람직하며, 질병의 악화가 아니라 관용성을 유도할 것이다.

본 발명에 따라, MBP 및/또는 PLP 반응성 T 세포의 세포소멸을 유도하기에 충분한, 환자의 체액 또는 조직 구획 내의 MBP 및/또는 PLP 폴리펩티드의 농도는 이미 "임상적 적용" 및 "T 세포 반응의 검출"에서 기술한 재료, 방법 및 분석법을 이용하여 측정하였다. MBP 또는 PLP 에피토프에 대한 반응을 나타내는 말초 혈액으로부터 T 세포 수의 실질직인 감소("전구물질 빈도" 또는 "반응성 T 세포 지수")가, 관련되지 않은 폴리펩티드를 이용하여 수행하는 대조용 방법과 비교하여, 상기 폴리펩티드에 대한 치료(치료전에 혈액 샘플로부터 취한 T 세포와 비교하여)에서 나타나는 경우, MBP 또는 PLP 반응성 T 세포의 세포소멸을 유도하기에 충분한 농도인 것으로 생각된다. 일반적으로, 반응성 T 세포 지수가 25％ 이상 감소하는 경우, "실질적인 감소"일 것이다. 또한, 더 적은 양의 감소는 이들이 통계학적으로 중요한 감소, 즉 학생 T 테스트와 같은 표준 통계학적 테스트에 의해 분석하는 경우 가능성을 나타내는 수치 p가 0.05 이하, 바람직하게는 0.015 이하인 감소는 "실질적인" 것으로 생각된다.

또한, MBP 또는 PLP 반응성 T 세포의 세포소멸을 유도하기에 충분한 환자 혈액 및/또는 뇌척수액 내에서의 폴리펩티드의 농도는 EAE 또는 다발성 경화증의 임상적 과정을 안정화하거나, 이들의 징후를 개선시키기 위해 필요한 양으로서 통상적인 생체내 실험에 의해 결정할 수 있다.

본 발명에 따라, MBP 21.5 및/또는 PLP 폴리펩티드는 세포소멸을 유도하지 않고(예를 들어, T 세포 무용을 유도하므로써) 관용화를 유도하도록 계획된 투여에 의해 다발성 경화증 환자 내에서 MBP 및/또는 PLP 반응성 T 세포의 관용화를 유도하는데 사용할 수 있다. 이러한 계획은 전형적으로 알레르겐에 대해 환자를 관용화하는데 사용되며, 일반적으로 더 적은 양(전형적으로 ㎍ 내지 수백 ㎍)의 관용화제(이 경우 MBP 21.5 제제)를 1주일, 2주일 또는 1개월 단위로 투여하는 것을 포함한다.

환자의 체액 또는 조직 구획 내에서 상기 폴리펩티드의 바람직한 농도를 획득하기에 충분하도록 투여된 폴리펩티드의 양은 당업계에 공지된 표준 약리역학적 계산을 이용하여 통상적인 인간 및 동물 연구 자료로부터 용이하게 측정할 수 있다. 생체내 초기 연구는 EAE를 유도하기 위해 처리된 생쥐 내에서 수행하였다. 바람직한 폴리펩티드의 투여량은 연속하여 영장류, 예를 들어 인간 환자 또는 마모셋(말초 혈액 내에 MBP 반응성 T 세포를 보유하는 것으로 공지된 원숭이)에 대해 결정되었다. 바람직한 투여량은 임상적 호전(바람직하게는 동물에서) 또는 MBP 또는 PLP 에피토프에 대한 반응을 나타내는 말초 혈액으로부터 T 세포 수의 실질적인 감소를 획득하기 위해 조정된다.

자한, 상기 투여량은 투여 방법, 치료하려는 환자의 특정 징후, 환자의 전체적인 건강 상태, 조건, 신장 및 연령 및 담당 의사의 판단에 따라 변경된다.

담당 의사의 판단에 따라, 전형적인 치료는 질병의 임상적 심각성 및 반응성 T 세포 지수를 검사하면서 수행하는 일련의 투여를 포함한다. 상기 폴리펩티드의 투여는 일반적으로 혈관내, 예를 들어 주사액에 의한 정맥내 주입에 의해 수행할 수 있다. 기타 투여 경로(예를 들어, 피하주입, 피내주입, 근육내 주입, 흡입 에어러졸, 경구투여, 비강투여, 질내투여, 직장내투여등)을 의사의 판단에 따라 이용할 수 있다.

주사용으로 적합한 제제는 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, 미국, 펜실베니아, 필라델피아에 소재하는 Mack 출판사 (1985)]에 기재되어 있다. 이러한 제제는 멸균되어야 하고, 비발열원이어야 하며, 일반적으로 약학적으로 효과적인 담체, 예를 들어 염수, 완충처리된 염수(예를 들어, 인산염 완충 처리된 염수), 행크 용액, 링거 용액, 덱스트로즈/생리 식염수, 글루코즈 용액 등을 포함한다. 상기 제제는 필요에 따라 약학적으로 허용가능한 보조제, 예를 들어 등장 조절제, 습윤제, 살균제, 보존제, 안정화제 등을 함유할 수 있다.

본 발명의 제제는 포장 재료 및 상기 폴리펩티드를 포함하는 제품으로 보급할 수 있다. 상기 포장 재료는 상기 제제가 신경학적 질병, 특히 다발성 경화증의 치료용으로 사용할 수 있음을 나타내는 표지를 포함할 것이다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 단지 충분히 예시될 뿐이며, 이로 제한되지 않는다.

MBP 21.5 폴리펩티드 및 천연 MBP18.5의 발현을 유도하는 박테리아 벡터의 구성

인간 MBP의 18.5 kDa 이소형태를 암호화하는 전장 cDNA는 ATCC(＃5748; 미국, 메릴랜드, 록빌에 소재하는 ATCC)로부터 수득하였다. 플라즈미드 pHBP-1은 30 사이클 동안 AmpliTaq(미국, 코네티컷, 노르웍에 소재하는 퍼킨 엘머)를 이용하는 표준 PCR 반응에서 주형으로 사용하였으며, 상기 PCR 반응에서는 94℃에서 1분 동안 변성, 52℃에서 1분 동안 어닐링 및 72℃에서 1분 동안 신장하였다. 센스 올리고뉴클레오티드 프라이머(5'-CATATGGCGTCACAGAAGAG AC-3' 서열 번호 13)은 hMBP18.5(MASQKR)의 N-말단을 암호화하고, NdeI 클로닝 위치를 함유하는 반면, 안티센스 프라이머(5'-GGATCCTTAG CGTCTAGCCA TGGGTG-3', 서열 번호 14)는 C-말단 잔기(PMARR)를 암호화하며, BamHI 클로닝 위치를 함유하였다. 72℃에서 10분동안 추가 신장한후, 생성되는 526 염기쌍 단편은 공급자에 의해 기술된 바와 같이 pCRII(인비트로겐) 내로 서브클로닝하였다. 카나마이신 내성 이. 콜리 DH10B(미국, 메릴랜드에 소재하는 지브코/비알엘) 형질전환체를 선택하였으며, 상기 삽입물을 제한 분석으로 동정하였으며, 디데옥시 서열 분석법으로 입증하였다. 상기 MBP 암호화 영역은 파지 T7 프로모터 플라즈미드 pET14b(미국, 위스콘신, 메디슨에 소재하는 노바겐)의 NdeI 및 XhoI 위치 내로 서브클로닝하고, 이어서 pET22b(노바겐) 내로 재클로닝하였다. 생성된 재조합 MEP18.5 유전자는 천연 인간 MBP18.5 단백질 내에서 발견되지 않는 3' 단부(종결 코돈 직전)의 히스티딘 태그를 암호화하며, 상기 MBP18.5^hum. 유전자의 생성물의 정제를 용이하게 하는 추가의 18 뉴클레오티드 서열을 제외하고, 변형되지 않은 천연 코돈만을 함유하였다. 생성된 재조합 벡터(pE722b/MBP18.5^hum.)은 DE3 라이소젠이 이. 콜리 lacUV5 프로모터 뒤의 T7 폴리머라제를 위한 유전자를 함유하는 이. 콜리 BL21(DE3)(노바겐) 내로 형질전환하였다[참조: Studier 등 (1990)].

인간 MBP의 21.5 kDa 이소형태를 암호화하는 합성 재조합 유전자는 3회의 중첩 PCR에서 구성하였다[참조: Ho 등 (1989), 도 13]. 3개의 유전자 서브도 메인 각각은 각각의 적합한 쌍의 HPLC 정제된 올리고뉴클레오티드 5 pmole 및 Taq 폴리머라제(퍼킨 엘머) 0.5 유니트를 이용하여 100 ㎕의 반응물 내에서 합성하였다. 95℃에서 1분 동안 30회의 변성, 50℃에서 1분 동안 어닐링 및 72℃에서 1분 동안 DNA 쇄 신장을 수행하였다. 이어서, 각각의 정제된 PCR 단편 5％를 제 2 라운드 PCR의 주형으로 사용하였으며, 이때 두 개의 서브도메인은 연속하는 올리고뉴클레오티드를 이용하여 조합하였다. 이들 DNA 단편의 정제 및 제 3 라운드의 PCR은 648 bp 생성물의 증폭으로 귀착되었다. 상기 PCR 생성물을 EcoRI 및 HindIII로 분해하고, pBS(-) 내로 서브클로닝하고, 이. 콜리 XL-1 블루(미국, 캘리포니아, 라졸라에 소재하는 스트라타젠)내로 형질전환하였다. 앰피실린-내성 형질전환체를 선택하고, 목적하는 구성물을 제한 분석 및 서열 분석으로 확인하였다. 몇개의 개별적인 클론으로부터 취한 제한 단편을 조합하여 PCR 중에 일어난 바람직하지 않은 돌연변이를 제거하였으며, 생성된 MBP+X2^Cys81/Bact. 유전자는 NdeI 및 HindIII 위치에서 pET22b 내로 클로닝하였다.

인간 MBP의 21.5 kDa 이소형태의 아미노산 잔기 81에서 세린 치환에 대해 시스테인을 암호화하는 변경된 유전자는 하기 단계를 이용하여 구성하였다. 내부 MBP 단편의 PCR 증폭은 돌연변이 유발성 안티센스 프라이머(5'-GTCTTTGTACATGTTCGACA GGCCCGGCTG GCTACG-3', 서열 번호 15, Ser⁸¹ 코돈은 밑줄로 나타냈고, NsPI 위치는 이택릭체로 나타냄)과 센프 올리고뉴클레오티드 프라이머(5'-CAGCACCATG GACC-3', 서열 번호 16, NcoI 위치는 이탤릭체로 나타냄)를 함께 주형으로 pET22b/MBP21.5^hum.을 이용하여 수행하였다. MBP+X2^Cys81/Bact.내의 NspI-NcoI 제한 단편은 돌연변이된 단편으로 교환하여 MBP+X2^Ser81/Bact. 를 생성하였다.

중첩 PCR에서 MBP18.5^hum. 를 주형으로 이용하고, 천연 인간 코돈을 이용하여 임의 버전의 MBP+X2^Cys81 를 생성하였다. 인간 엑손 2 서열을 포함하는 PCR 단편은 플라즈미드 pET22b의 T7 종결자에 하이브리드화되는 센스 올리고뉴클레오티드 5'-GGTGCGCCAA AGCGGGGCTC TGGCAAGGTA CCCTGGCTAA AGCCGGGCCG GAGCCCTCTG CCCTCTCATG CCCGCAGCCA GCCTGGGCTG TGCAACATGT ACAAGGACTC ACACCACCCG GCAAGAAC-3', 서열 번호 17과 안티센스 올리고뉴클레오티드(서열 번호 18)를 병용하므로써 pET22b/rhMBP18.5로부터 생성하였다. 제 2 PCR 단편은 동일한 주형을 이용하나, 엑손 2의 5' 단부에 하이브리드화하는 T7 올리고뉴클레오티드(서열 번호 19)와 안티센스 올리고뉴클레오티드(5'-GGCTTTAGCC AGGGTACCTT GCCAGAGCCC CGCTTTGGC-3', 서열 번호 20)를 병용하여 생성하였다. PCR의 제 2 라운드에서 T7 프로모터 및 종결자 올리고뉴클레오티드를 이용하는 증폭에 의한 상기 PCR 생성물들의 융합으로 MBP+X2^Cys81/hum. 을 함유하는 PCR 생성물의 구성을 완료하였다. 상기 PCR 생성물에서 수득된 제한 단편은 NdeI 및 HindIII 위치에서 pET22b 내로 서브클로닝하였으며, 바람직한 클론의 선택은 서열 분석으로 확인하였다.

재조합 MBP의 박테리아 발현 및 동정

재조합 MBP 폴리펩티드의 발현을 위해, 이. 콜리 균주 EL21(DE3)을 발현 플라즈미드 및 선택된 앰피실린 내성 콜로니로 형질전환하고, 테리픽 브로스(TB) 배지[참조: Sambrook 등 (1989)]에서 OD₆₀₀ 이 0.6이 될 때까지 성장시켰다. 단백질 발현은 4 시간 동안 1 mM의 이소프로필티오갈락토시드(IPTG)를 이용하여 유도하였다. 재조합 발현된 MBP 폴리펩티드의 이론적인 특정화는 OD₆₀₀ 1.5에서 유도된 세포 1 ㎖를 제거하여 수행하였다. 세포 펠릿은 20 mM 트리스-HCl(PH 7.5) 100 ㎕ 내에서 비등시켜 용해하였으며, 상기 용해물 10％를 16％ SDS-PAGE(미국, 캘리포니아, 산디에고에 소재하는 노벡스)로 분석하였다. 재조합 발현된 MBP 폴리펩티드는 쿠마지 R-250 염색 또는 MBP 엑손 1에 상응하는 인간 MBP 아미노-말단 잔기 36-50(미국, 인디아나, 인디아나폴리스에 소재하는 세로테크의 MCA 408) 또는 MBP 엑손 6에 상응하는 카르복시-말단 잔기 129-138(세로테크의 MCA 70)에 특이적인 쥐 단일클론 항체를 이용하는 면역블로팅으로 확인하였다.

이. 콜리 세포를 가용성 및 불용성 분획으로 분획화하기 위해, 각각의 유도된 배양물 2 ㎖로부터 취한 세포 펠릿을 OD₆₀₀ 1.5에서 수집하였으며, pH 8.0의 20 mM 트리스-HCl 400 ㎖ 내에서 재현탁하였다. 전체적인 세포 용해물을 제조하기 위해, 상기 현탁액을 라이소자임 및 1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드와 함께 100 mg/㎖로 만들고, 30℃에서 15분 동안 항온처리하였다. 10 mM 염화마그네슘 및 DNsae I(미국, 미주리, 세인트루이스에 소재하는 시그마) 200 mg/㎖를 첨가한 후, 실온에서 20분 동안 항온처리하였다. 상기 세포 용해물을 나누고, 1/2은 추가의 트리스 완충액으로, 다른 1/2은 0.1N HCl을 수용시키고, 실온에서 30분 동안 추출하였다. 원심분리후, 가용성 상청액을 불용성 펠릿으로부터 제거하고, 각 분획을 SDS-함유 로딩 염료 내에서 5분 동안 비등시켰다. 각 분획의 20％ SDS-PAGE 겔은 상기한 바와 같이 재조합 발현된 MBP 폴리펩티드에 대해 분석하였다.

재조합 MBP의 정제 및 특정화

재조합 발현된 MBP 폴리펩티드의 정제를 위해, 유도된 세포 배양물 1 ℓ를 원심분리로 수거하고, 펠릿은 테크마(TEKMAR) 균질화기(미국, 오하이오, 신시네티에 소재하는 더 테크마 컴퍼니)를 이용하여 0.1 N HCl 10 ㎖/g(10％ w/v) 내에서 균질화하였다. 세포는 미세유동화기(모델 M110-T, 미국, 메사추세츠, 뉴톤에 소재하는 마이크로플루이딕스 코오포레이숀)를 이용하여 기계적으로 3회 분쇄하였다. 모든 조작은 얼음 위에서 수행하였다. 재조합 발현된 MBP 폴리펩티드를 함유하는 가용성 분획은 상기 세포 용해물을 베크만 JA-10 로터를 이용하여 10,000xg, 4℃에서 30분 동안 원심분리한 후, 상청액으로 수거하였다. 상청액은 와트만 폴리캅 TF(0.45 ㎛) 막(미국, 오리건, 힐스보로에 소재하는 와트만 랩세일즈)을 통해 여과하고, 아미콘 교반 세포 장치(미국, 메사추세츠, 비벌리에 소재하는 아미콘) 내에서 PM-10 막을 이용하여 5 내지 10배 농축하였다. 농축된 분획으로 부터 입자는 밀렉스 GV(0.2 mm) 시린지 여과기(미국, 메사추세츠, 베트포드에 소재하는 밀리포어 코어포레이숀)를 통해 통과시켜 제거하였으며, 여과된 샘플은 VYDAC C4 역상 컬럼(미국, 캘리포니아, 헤스페리아에 소재하는 1.0cm 직경/25cm 길이의 VYDAC)에 4.1 ㎖/분의 속도로 로딩하였다. 단백질은 선형 25-40％ 아세토니트릴/0.1％ 트리플루오로아세트산(TFA) 구배를 이용하여 30분 동안 용출시킨후, 동결건조하였다.

재조합 발현된 MBP 폴리펩티드의 정제를 위해, 동결건조된 재료는 결합 완충액(8M 요소, 10 mM 베타머캅토에탄올, 0.1M NaH₂PO₄, PH 8.0의 0.01M 트리스-HCl) 내에 재현탁하고, 제조자(미국, 캘리포니아 카드스워드에 소재하는 퀴아젠 인코오포레이티드)의 지시에 따라 Ni-NTA 수지에 결합시켰다. 상기 칼럼은 동일한 결합 완충액으로 2회 세척하고, 오염성 이. 콜리 단백질은 pH 6.3 으로 조정한 결합 완충액을 이용하여 제거하였다(3회 세척). rhMBP 는 PH 5.9의 결합 완충액(용출 1) 및 pH 4.5(용출 2) 및 최종적으로 6M 구아니딘 히드로클로라이드, 0.2M 아세트산(용출 3)을 포함하는 단계 구배로 용출하였다. 모든 분획 및 칼럼 수지의 일부는 환원제의 존재하에서 16％ SDS-PAGE로 분석하였다.

MBP 폴리펩티드는 신속하고 분석적인 역상 HPLC 분석법으로 정량하였다. 4.6x50mm C18 칼럼(미국, 코네티컷, 브랜포드에 소재하는 글리코테크의 C18 HYTACH)을 사용하였으며, 분석은 80℃에세 문헌[참조: Kalghatgi 및 Horvath (1987)]에 기술된 HPLC와 유사한 방법으로 수행하였다. 재조합 발현된 MBP 폴리펩티드는 분쇄된 세포로부터 0.1N HCl를 이동하여 추출하였으며, 10-30％ 아세토니트릴/0.1％ 트리플루오로아세트산(TFA) 선형 구배를 이용하여 1분 동안 C18HYTACH 역상 칼럼에서 분획화하였다. 상기 선형 분석 범위에서, MBP 폴리펩티드 피크 높이는 MBP 폴리펩티드의 양과 직접적으로 비례하였다. MBP+X2^Cys81 표준물의 농도는 아미노산 조성으로 측정하였다. MBP+X2^Cys81의 분자량은 질량 분광광도법으로 측정하였으며, 측정 결과는 22,188 Da 였다. 정제된 MBP+X2^Cys81 단백질의 N-말단 서열은 아미노산 서열, 즉 알라닌 세린, 글루타민 라이신 아르기닌 프롤린 세린 글루타민 아르기닌 히스티딘 글리신 세린 라이신 티로신 루신 알라닌 트레오닌 알라닌 세린 트레오닌 메티오닌 아스파라긴 히스티딘 알라닌 아르기닌이었으며, 이는 MBP+X2^Cys81/hum.의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 1)로부터 예상되는 최초 25개의 아미노산 서열에 상응하였다.

MBP18.5- 및 엑손 2-특이성 T 세포주의 확립 및 증식 분석

천연 인간 MBP는 이미 기술한 바와 같이 제조하였다[참조: Voskuhl 등(1993a)]. MBP 엑손 2-암호화된 합성 펩티드는 신테틱 코오포레이숀(미국, 메릴랜드, 록빌)으로부터 구입하였으며, HPLC 분석으로 확인한 순도는 95％ 이상이었다. 말초 혈액 임파구는 백혈구분리반출법으로 분리하였으며, FICOLL 구배상에서 분리하였다. 그후, 세포는 10％ DMSO를 포함하는 RPMI 1640(미국, 메릴랜드, 워커스빌에 소재하는 휘태커 바이오프로덕츠) 내에서 냉동보존하였으며, 사용할 때까지 액체 질소 중에서 저장하였다. T 세포주는 이미 기술한 바와 이 제한 세포 농도를 이용하여 생성하였다[참조: Voskuhl 등 (1993a)]. 2A2 및 3H5는 정상적인 개체로부터 수득한 인간 T 세포주였다. 1H7, 1G1 및 3A11은 다발성 경화증 환자로부터 수득한 인간 T 세포주였으며, MBP의 엑손 2-암호화된 영역에 특이적이었다. T 세포주는 마지막 재자극이후에 10일 동안 휴지상태로 유지하였으며, 이어서 2x10⁵ 세포/㎖의 농도로 반응자(responders)로서 사용하였다. 자가 방사선 조사(3000 rad)된 말초 혈액 임파구(PBL)는 1x10⁶/㎖,의 농도로 자극자(stimulatots)로서 사용하였다. 상기 반응자 및 자극자 세포 각각 50 ㎕를 100㎕의 특정 항원 또는 배지만을 함유하고 있는 둥근 바닥 96-웰 미량역가 평판(덴마크, 로스킬드에 소재하는 눈크)의 각각의 웰에서 혼합하였다. 재조합 MBP에 있어서, 역상 HPLC 정제 결과 생성된 동결건조된 제조물은 PBS 내에 8-10 mg/㎖의 농도로 재현탁하고, 이어서 사용하기 직전에 배지로 희석하였다. 분석은 3회 수행하였으며, 2 mM L-글루타민, 100유니트/㎖ 페니실린 및 100 mg/㎖ 스트렙토마이신(모두 미국, 메릴랜드, 워커스빌에 소재하는 휘태커 바이오프로덕츠)을 함유하고, 10％ 수집된 인간 혈청(4 내지 7명의 정상적인 AB NIH 혈액 은행의 공여자, 사용하기 전에 열 불활성화하고, 멸균 여과함)으로 보충된 이스코브의 변형된 둘베코배지(IMDM, 미국, 뉴욕, 그랜드 아일랜드에 소재하는 지브코)에서 수행하였다. 배양물은 5％ 이산화탄소 내에서 37℃에서 72 시간 동안 배양하였다. 배양의 최종 18 시간 동안 세포는 1 mCi/웰 ³[H]-티미딘으로 펄스를 가하고, 유리 섬유 필터상에서 수거하고, 섬광 계수법으로 티미틴 혼입을 측정하였다.

재조합 인간 MBP유전자의 구성 및 박테리아 발현

성인 인간 MBP(21.5 kDa 이소형태, MBP+X2^Cys81)의 태아 이소형태를 암호화하기 위한 합성 유전자를 구성하였다[참조: 도 1 및 2]. 기타 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 특정 암호화 영역의 완전한 센스 및 안티센스 스트랜드[참조: Jayarman 등 (1991): Williams 등 (1988): Hernan 등 (1992); Wosnick 등 (1987)]를 포함하는 다수의 올리고뉴클레오티드를 연결하므로써 구성된 합성 유전자를 보유하지만, 단지 6개의 을리고뉴클레오티드(서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9 및 서열 번호 10)를 이용하여 재조합 인간 MBP+X2^Cys81을 암호화하는 644 염기쌍 유전자를 합성하였다. HPLC-정제된 올리고뉴클레오티드의 크기는 110 내지 130 염기쌍이며, PCR의 제 3 라운드중에 센스 및 안티센스 스트랜드의 하이브리드화를 위해 설계된 20 내지 25 염기쌍의 중첩 영역을 보유하고 있다(참조: 도 13), 재조합 MBP 유전자의 최적 박테리아 발현을 위해, 다수의 인간 코돈을 모두 공지된[참조: Wada 등 (1992)] 또는 고 발현된 [참조: Grosjean 및 Fiers (1982)] 이. 콜리 유전자에 대해 생성된 코돈 성향표에 기초하여 박테리아가 선호하는 코돈으로 전환시켰다. 상당한 코돈 변경은, 특히 아르기닌, 프롤린 및 라이신을 암호화하는 것에 대해 수행하였으며, 이들은 MBP 21.5 내의 아미노산 잔기의 26％를 포함하였다.

몇몇 독립 클론은 서열결정하였으며, 각각은 박테리아 클로닝 균주에 의한 합성 DNA의 거부 또는 PCR 기초한 오차중 어느 것인가에 기여하는 다수의 뉴클레오티드 치환 또는 결실을 보유하였다. 이들 오차 모두는 뉴클레오티드 위치 462, 528 및 532에서 확인되는 키토신에서 티민으로의 치환을 제외하고 수정하였다. 상기 변화는 수정하지 않았는데, 그 이유는 이들이 암호화된 MBP+X2^Cys81 아미노산 서열을 보존하며, 박테리아 코돈 선호성에 유해한 영향을 미치지 않기 때문이다[참조: Wada 등 (1992)]. 상기 MBP의 성인 인간 뇌 유래한(18.5 kDa) 이소형태의 재조합 발현을 위해서, 상기 이소형태(MBP18.5^/hum., HBP18.5를 암호화함)를 암호화하는 천연 인간 코돈을 보유하는 cDNA 클론은 PCR로 변형하여 동일한 발현 벡터 내에 클로닝을 위한 적합한 제한 단편을 포함하도록 하였다.

박테리아에서 재조합 MBP 폴리펩티드의 발현은 풍부한 TB 배지 내에서 성장시킨 소규모의 진탕 플라스크 배양물을 이용하여 초기에 특정화하였다. IPTG를 이용한 배양물 10 ㎖의 유도후, MBP의 두가지 재조합 형태는 BL21(DE3) 세포 내에서 고 수준으로 발현하였다. MBP18.5 및 MBP+X2^Cys81 은 SDS-PAGE에 의해 분리한 전체 박테리아 단백질의 쿠마지 염료로 염색하여 동정한 주 단백질이었으며(참조: 도 14 "Coom"), 인간 MBP의 카르복시 말단(도 144의 "C-term Ab") 또는 아미노 말단(도 14의 "N-term Ab")에 유도된 항체에 특이적으로 인식되었다. 두 개의 더 작은 MBP-면역반응성 폴리펩티드(6 내지 16 kDa)는 N-말단 항체를 이용하는 면역블로트 분석에 의해서만 MBP+X2^Cys81 용해물 내에서 동정되었으며, 이는 카르복시 말단 근처에서 일어나는 해독의 미성숙 종결이 단백질 분해라기 보다는 그들의 존재에 기인하는 것을 의미하는 것이다. 이는 펄스 추적 표지화 실험에서 확인할 수 있으며, 상기 실험의 과정 동안 더 작은 폴리펩티드는 안정하였다.

봉입체는 진탕 플라스크 실험에서 분명하지 않았음에도 불구하고, 재조합 MBP는 용해된 박테리아 세포의 불용성 분획 내에서 관찰되었다(도 15, "트리스"). 이전에 소 척수로부터 정제된 균질한 단백질은 뇌척수염 발생 활성을 보유하는 것으로 확인되었으며, pH 2-3에서 가용성이었다[참조: Einstein 등 (1962)]. 연속하여 상기 뇌척수염 발생 단백질은 MBP로서 후속 동정하였으며, 거의 전적으로 18.5 kDa으로 구성되어 있었다[참조: Diebler 등 (1972)], MBP는 산 가용성이기 때문에, 본 발명자들은 이를 박테리아 용해물의 직접적인 산 추출에 의한 정제할 수 있을 것으로 생각하였다. 따라서, 본 발명자들은 산성 조건 하에서 rhMBP를 용해하려고 시도하였다. 0.1N HCl을 이용한 전체적인 세포성 용해물의 처리는 대부분의 rhMBP를 가용성 분획(들) 내로 방출하였다. 불용성 펠릿 분획(P)으로부터 모든 rhMBP를 추출할 수 없는 것은 상기 특정 샘플 제조중에 세포의 불완전한 용해에 기인할 수 있다.

MBP폴리켑티드의 정제 및 특정화

재조합 발현된 MBP 폴리펩티드의 정제를 위해서, 진탕 플라스크 배양물 1ℓ로부터 취한 세포는 상기한 바와 같이 산성 조건 하에서 기계적으로 분쇄하였다. 동시 세포 분쇄 및 산 추출후, 모든 재조합 발현된 MBP 폴리펩티드는 가용성 분획(도 16의 "가용성")에서 발견되었다. 상기 가용성 산 분획은 직접 VYDAC C4 역상 칼럼에 적용하였으며, 25 내지 40％ 아세토니트릴/0.1％ TFA 구배를 이용하는 용출에서 rhMBP는 17 내지 20분에서 급한 단일 피크로 용출되었다(도 17), 상기 피크 분획의 N-말단 서열결정 결과, 상기한 바와 같이 MBP 폴리펩티드에 대한 정확한 아미노-말단 서열로 입증되었다. 추가의 카르복시 말단 히스티딘 태그를 보유하는 MBP+X2^Cys81의 예상 분자량은 피크 분획의 질량 분광광도법으로 분석한 결과 22.185 Da와 일치하였다. 수집된 피크 분획의 쿠마지 염색된 겔은 재조합 MBP 폴리펩티드로 확인되었지만, 명백하게 전장 MBP 폴리펩티드의 제한된 산 가수분해에 의해 생성된 잘려진 MBP 단편의 이종 혼합물로 나타났다(도 18 "로드"). C-말단 히스티딘 태그를 조사하기 위해, 전장 MBP 재료를 변성 조건 및 산성 pH 용출을 이용하는 금속 킬레이트화 크로마토그래피로 수득하였다(도 18). 대부분의 전장 MBP 폴리펩티드는 오염성 이. 콜리 단백질이 덜 엄한 제 2 용출로부터의 용출액에서 관찰됨에도 불구하고, 용출 2(8 M 요소, 10 mM 베타-메르캅토에탄올, 0.1M NaH₂PO₄, 0.01M 트리스(PH 4.5) 또는 용출 3(6M 구아니딘 히드로클로라이드, 0.2M 아세트산)에서 용출되었다(도 18 "용출 2").

MBP+X2^Cys81/bact.의 발현과 MBP81.5^/hum. 의 발현을 정량적으로 비교하기 위해, 가용성 산 용해물은 박테리아 배양물 1 ℓ로 이루어진 3개의 세트로부터 제조하고, 상기한 신속한 분석적인 역상 HPLC를 이용하여 분석하였다. 아미노산 분석에 의해 측정된 바와 같이 MBP+X2^Cys81의 표준량을 이용하고, 단백질 농도와 피크 높이를 관련지으므로써 MBP18.5^/hum. 유전자로부터의 발현에서 보다 1.5 내지 2.0 배 더 MBP 21.5 폴리펩티드를 MBP+X2^Cys81/bact. 유전자로부터 발현됨을 확인하였다. MBP 유전자로부터 박테리아 코돈을 이용한 재조합 단백질의 평균 발현 수준은 인간 코돈을 이용한 유전자로부터의 발현량 30 mg/ℓ에 비해 50 mg/ℓ였다. 이는 박테리아 코돈 성향을 반영하는 것이며, 엑손 2-관련된 서열의 효과를 반영하는 것은 아니다. 그 이유는 MBP+X2^Cys81/hum. 유전자를 발현하는 균주는 MBP18.5^/hum.을 발현하는 균주와 유사한 양의 MBP 폴리펩티드를 생성하기 때문이다(도 19 및 표 5).

생리적인 조건 하에서, MBP18.5가 아닌 MBP+X2^Cys81 의 분획은 비환원된 샘플의 쿠마지 블루 및 SDS-PAGE 겔 상에서의 웨스턴 블로팅에 의해 확인되는 명백한 이량체 분자를 형성하였다. 이량체는 환원된 샘플을 이용하여 유사한 조건하에서 관찰하였다. 또한, MBP 이량체는 소 중추신경계로부터 취한 미엘린 단백질의 역상 HPLC 분획화후 관찰되었다[참조: van Noort 등 (1994)].

이러한 이량체는 약학적 투여를 위해 제제화하려는 단백질 제조물에서 특히 바람직하지 않은데, 상기 용도를 위해서 이러한 단백질은한정된 특성과 독특한 분자량을 가진 단일 분자가 바람직하기 때문이다. 따라서, MBP 21.5 폴리펩티드의 단일, 단량체 형태를 편리하고, 효율적으로 제조하는 수단을 마련하는 것이 중요하다. MBP十X2^Cys81의 이량체 형성이 엑손 2의 위치 81에서 단일 시스테인 잔기(Cys⁸¹)를 통해 매개되는지의 여부를 테스트하기 위해, 상기 시스테인(Cys⁸¹)은 위치-지정된 돌연변이 발생에 의해 세린(Ser⁸¹)로 전환하였다.

역상 HPLC로 확인한 결과, MBP+X2^Ser81은 박테리아에서 MBP+X2^Cys81과 유사한 수준으로 발현되며(평균적으로 50 mg/ℓ, 도 19), 환원제 없이 생리적 용액 내에서 단량체성으로 존재하였다. 이량체 형성의 효과적인 제거를 위한 상기 아미노산 치환의 다른 방법으로서, X2MPB 펩티드를 제조할 수 있으며, 환원제 없이 생리적 용액 내에서 이량체 형성에 대해 테스트할 수 있다.

MBP18.5- 및 MBP 엑손 2-특이성 T 세포는 재조합 인간(rh) MBP를 인식한다.

MBP의 재조합 형태의 생물학적 활성을 평가하기 위해, 본 발명자들은 재조합 단백질을 이용하여 항원투여하는 경우의 인간 MBP-특이성 T 세포주의 시험관 내에서의 증식 반응을 평가하였다. 뇌 유도된 인간 MBP18.5 또는 합성 엑손 2 펩티드(MBP21.5의 아미노산 잔기 60 내지 85, 서열 번호 1)에 대해 반응하는 T 세포주를 생성하였다. 두 개의 MBP18.5-특이성 세포주인 2A2(잔기 31-50을 인식함) 및 3H5(잔기 87 내지 106을 인식함)은 MBP18.5 또는 MBP+X2 폴리펩티드중 하나를 이용하여 시험관 내에서 72 시간 동안 배양하여 자극하였다. 상기 배양의 최종 18 시간 동안 세포는 ³H-티미딘으로 펄스를 가하여 세포 증식의 측정이 가능하도록 하였다. 도 20에서 확인할 수 있는 바와 같이, 인간 뇌로부터 정제된 것이든, 박테리아로부터 정제된 것이든 상기 T 세포주 둘 다는 동일하게 MBP+X2^Cys81 및 MBP18.5에 잘 반응하였다. 또한, 본 발명자들은 관련 문헌에 기술된 바와 같이 MBP 에피토프에 대해 반응하는 추가의 인간 T 세포주의 항원인식을 분석하였다. 관련 문헌 및 본 명세서에 기술한 바와 같이, 이들 MBP18.5 에피토프는 MBP18.5의 잔기 106-125, 136-155, 141-170 및 151-170 내에 포함되었다. 상기 번호는 돼지 MBP 분자의 아미노산 서열에 기초하여 부여한 것이다. 각각의 경우에서, 현저한 T 세포 증식이 천연 MBP18.55 및 재조합 MBP+X2^Cys81에 대해 관찰되었다.

MBP+X2 분자는 엑손 2-암호화된 펩티드 서열을 포함하도록 조작하였다. X2를 함유하는 치료제를 제조하는 수단을 제공하는 것 이외에, 상기 분자는 APC가 T 세포에 의한 인식을 가능하게 하는 방식으로 전장 MBP 21.5 로부터 엑손 2 에피토프를 나타낼 수 있는지 여부의 결정을 가능하게 하였다. 또한, 이는 MBP十X2^Ser81을 위해 중요한데, 그 이유는 엑손 2 내의 단일 시스테인 잔기가 T 세포 증식에 필수적인 지의 여부가 아직 알여지지 않았기 때문이다.

2개의 독립 엑손 2-펩티드-특이성 인간 T 세포주를 이용하는 증식 분석으로 명백히 단지 합성 엑손 2 펩티드, MBP+X2^Cys81(도 21) 및 MBP+X2^Ser81(도 22)만이 T 세포 반응을 도출해낼 수 있음을 입증하였다. 또한, 투여량 반응 분석(도 22)은 MBP+X2^Cys81 및 MBP+X2^Ser81 둘 다 시험관 내에서 T 세포에 대해 효율적으로 표시됨을 나타냈다. 이는 시스테인 81이 테스트한 클론에 의해 인식되는 엑손 2-암호화된 에피토프의 기여를 위해 없어도 되는 것임을 의미하는 것이다. 또한, T 세포 증식 자료는 도 24 및 도 25에 나타냈다.

이들 결과로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 인간 T 세포는 전장 MBP21.5 분자로부터 유도된 처리된 X2 에피토프에 대해 반응할 수 있으며, MBP18.5, MBP+X2^Cys81 및 MBP+X2^Ser81 을 포함하는 MBP의 박테리아에서 발현된 재조합 형태는 천연 MBP18.5 단백질과 같이 뇌척수염 발생 T 세포를 자극하는데 효과적일 수 있다.

PLP4 및 기타 PLP 뮤테인의 합성, 발현 및 정제

플라즈미드 pUC8(ATCC #57466)에서 클로닝된 전장 인간 PLP 표적 서열을 함유하는 1.5 kb 단편으로 이루어진 DNA 주형을 광범위하게 변형하여

PLP4를 제조하였다. 각각 친수성 도메인 2, 3 및 4를 포함하는 펩티드를 암호화하는 3개의 폴리뉴클레오티드를 PCR을 이용하여 개별적으로 합성하고, 연속하여 중첩 PCR로 융합하였다. 전체

PLP4 오픈 리딩 프레임을 함유하는 DNA의 서열 완전성은 디데옥시 서열 분석법으로 입증하였다. 상기

PLP4 암호화 영역은 NdeI/HindIII 단편으로서 플라즈미드 pET22b(노바겐)내로 서브클로닝하였다.

PLP4 단백질은 N 말단에 융합된 5개의 추가 아미노산(메티오닌-루신-글루타메이트-아스파테이트-프롤린) 및 C 말단 히스티딘에 융합된 5개의 추가 히스티딘(히스티딘 태그)를 함유하였다.

플라즈미드 p

PLP4는 람다 DE3 라이소젠을 함유하는 이. 콜리 균주W3110(DE3)[참조: Studier 등 (1990)] 내로 형질전환하였으며, 상기 형질전환된 박테리아에 의해 생성된

PLP4 폴리펩티드는 쿠마지 블루 염색 및 인간 PLP(세로테크, AHP261)의 합성 펩티드(아미노산 서열 118-130)에 대해 발생된 토끼 다중클론 혈청을 이용하는 웨스턴 블로트를 탐색하고, 호스래디쉬 퍼옥시다아제 표지된 염소 항-토끼 항체 및 증강된 화학발광(ECL) 검출 시스템(아메르샴)을 이용하는 검출에 의해 확인하였다. 1 mM IPTG를 이용하는 유도후에,

PLP4는 전체 세포 단백질의 약 50％로 계산되었으며, 전적으로 봉입체 내에 위치하는 것으로 생각되었다. 봉입체의 선택적인 추출은 6M 구아니딘 HCl 또는 바람직하게는 5 M 구이니딘 HCl, 2OmM 시트르산 나트륨(pH 5.0)을 함유하는 완충액을 이용하여 수행하였다. 이러한 추출은 SDS-PAGE와 역상 HPLC로 판단한 결과, 순도가 90％ 이하인 제조물로 확인되었다. N 말단 아미노산 서열 결정을 통해 분리된 폴리펩티드의 서열이 예상된

PLP4의 아미노 말단 잔기를 함유하고 있는 것을 확인하였다.

유사한 통상적인 기법을 이용하여, 기타 PLP 뮤테인 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 구성하고, W3110(DE3) 내에서 발현시켰다. 이들은

PLP3(서열 번호 23)을 포함하였는데, 소수성 도메인 1, 3 및 4는 없었으며, 단지 소수성 도메인 1 및 4만이 없는 PLP 뮤테인을 암호화하는 유사한 구성물(

PLP2, 서열 번호 29)을 포함하였다. 또한,

PLP2는 그의 아미노 말단에 부착된 히스티딘 태그 서열을 포함하였으며, 이는 트롬빈 절단 위치(서열 번호 29의 아미노산 잔기 14 내지 19)를 함유하는 링커에 의해 PLP의 제 2 소수성 도메인의 아미노 말단으로부터 분리된 것이었다. 암호화된 PLP 뮤테인의 발현은

PLP3이

PLP4와 필적할 만한 수준으로 발현하지만,

PLP2는 낮은 수준으로 발현하여 이들은 펄스 추적 방사능 표지 분석에 의해서만 검출할 수 있었다. 동일한 발현 시스템 내에서 테스트한 천연 PLP 구성물은 펄스 추적 방사성 표지 분석법으로 분석한 경우에도 임의의 검출가능한 PLP 폴리펩티드를 생성시키지 않았다.

MP4 및 기타 키메라 PLP 분자의 구성, 발현 및 정제

MBP21.5 -

PLP4 융합 단백질인 MP4는 다음과 같이 구성하였다. MBP21.5(서열 번호 1)를 암호화하는 합성 DNA 단편은 상기한 바와 같은 발현 벡터 pET22b 내의 T7 프로모터의 조절 하에 위치시켰다. 이어서, 적절히 위치된 리보좀 결합 위치 및

PLP4 유전자를 함유하는 DNA 단편은 MBP21.5 유전자의 하류에 연결시키고, MBP21.5 및

PLP4의 독립적인 발현을 위해 디시스트론성 오페론을 생성시켰다. 상기 디시스트론성 구성물은 AatII-XhoI로 분해하고, 합성 AatII-XhoI 링커/어댑터(서열 번호 26의 뉴클레오티드 잔기 588 내지 605에 걸치는 서열에 상응함)에 연결하이 MBP21.5/

PLP4 키메라 단백질(MP4로 칭함, 서열 번호 26)을 암호화하는 유전자 융합을 수행하였다. 생성된 MP4 융합 단백질에 대한 발현 구성물의 서열 완전성을 확인하고, MP4-암호화 플라즈미드를 사용하여 이미 박테리오파지 T7 RNA 폴리머라제의 용원성 염색체 사본을 유지하는 것으로 언급한 이. 콜리 W3110(DE3)을 형질전환시켰다.

유사한 통상의 기법을 이용하여, 기타 키메라 PLP 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 구성하고, W3110(DE3) 내에서 발현시켰다. 이들은 MP3(서열 번호 25), PM4(서열 번호 27) 및 MMOGP4(서열 번호 28)을 포함하였다. MP3은 MP4와 유사한 키메라였는데, PLP 뮤테인 부분이 서열 번호 23의

PLP3 키메라인것만 달랐다. PM4는 MP4와 유사하였는데, 중첩 PCR에서 상이한 링커(서열 번호 27의 뉴클레오티드 508 내지 519에 걸치는 서열에 상응함)를 사용하여 MP4 내에서의 방향과는 반대 방향으로 MBP21.5 및

PLP4를 연결하였다. MMOGP4는 인간 미엘린 올리고덴드로사이트 당단백질의 외세포성 도메인을 암호화하는 서열[참조: Pham-Dinh 등, J Neurochem 1994 63: 2353)을 MBP와 PLP 유도된 서열 사이의 MP4내에 삽입하므로써 구성하였다. 암호화된 키메라 PLP 폴리펩티드의 발현을 통해 확인한 결과, 이들은 후술하는 바와 같이 MP4와 필적할 만한 수준으로 발현되었다.

MP4 합성은 1 mM IPTC의 첨가에 의해 MP4 플라즈미드를 보유하는 이. 콜리 W3110(DE3) 내에서 유도하였으며, 상기 단백질은 전적으로 불용성 분획 내에 위치하였으며, 전체 세포 단백질의 약 20％를 구성하였다. MP4 는 다음과 같이 분리하였다. IPTG 유도된 발효액 20 ℓ로부터 취한 이. 콜리 페이스트를 용해 완충액(20 mM 시트레이트, 1 mM EDTA, pH 5.0) 10 부피(10 ㎖/g 습윤 중량)내에 재현탁하였다. 상기 페이스트는 얼음상에서 울트라터랙스 T 50 균질화기를 이용하여 균일하게 현탁하였다. HCl을 첨가하여 pH를 5 0으로 만들고, 세포를 얼음 상에서 미세유동화기 모델 M-110T 균질화기를 이용하여 용해하였다. 상기 균질화기는 반응 챔버에서 15,000 내지 20,000 psi의 압력으로 조작하였다. 생성된 용해물은 약 10,000xg로 원심분리하여 가용성 분획과 불용성 분획을 분리하였다. 가용성 분획은 폐기하고, 불용성 분획은 추출 완충액(6M 구아니딘-HCl, 0.5M 염화나트륨, 20mM 인산 나트륨 pH 5.0) 10 부피(10 ㎖/g 습윤 중량) 내에서 균질화기(테크마 TP 18/1051)를 이용하여 재현탁하였다. 추출물은 2 내지 8℃에서 60분동안 교반하면서 배양하였다. 이어서, 상기 추출물은 10,000xg에서 30분 동안 원심분리하였다. 원심분리후 상청액은 얼음 상에서 브란손 초음파발생기 450을 이용하여 5분 동안 초음파 처리하여 오염성 핵산을 제거하고, 0.45 미크론 필터(와트만75AS 폴리캅)을 통해 여과하여 여과된 상청액을 수득하였다.

칼럼 크로마토그래피는 2단계로 수행하였다. 제 1 단계에서는, 금속 킬레이트 크로마토그래피를 다음과 같이 수행하였다. 직경이 5 cm 이고, 길이가 20 cm 이며, 킬레이트화 세파로즈 패스트 플로우(파마시아 바이오테크)를 함유하는 칼럼을 탈이온수로 충진하였다. 칼럼의 상부 약 2/3은 수지 7.8 ㎖ 당 0.1M 염화니켈을 로딩하여 Ni⁺⁺로 하전시켰다. 이어서, 상기 칼럼은 탈이온수 5 CV로 세척하였다. 상기 칼럼을 완충액 A(6M 구이니딘-HC1, 0.5％ 염화나트륨, 20mM 인산나트륨, 1mK 2-머캅토에탄을 pH 7.2) 2 CV로 평형처리하고, 280 nm에서 기준 광학 밀도를 측정하였다. 수산화나트륨을 이용하여 여과된 상청액의 pH를 7.2로 조정하고, 최종 농도를 1 mM로 2-머캅토에탄올을 첨가하였다. 이와 같이 환원된 샘플은 실온으로 가온하였다. 상기 환원된 샘플은 50 ㎖/분의 유속으로 로딩하였다. 이어서 유속을 100 ㎖/분으로 조정하고, 상기 칼럼 유출액이 280 nm에서 측정한 광학 밀도에 이를 때까지 완충액 A로 계속 세척하였다. 이어서, 상기 칼럼을 6M 요소, 0.5M 염화나트륨, 0.02M 인산 나트륨으로 최초 pH 7.2, 그 다음 PH 6.3 및 최종적으로 PH 5.5 로 세척하였으며, 각각의 세척은 기준 광학 밀도에 이를 때 까지 수행하였다.

MP4는 6M 요소, 0.5M 염화나트륨, 0.02M 인산 나트륨, pH 3.5를 이용하여 칼럼으로부터 용출하였으며, 용출중에는 280 nm에서 광학 밀도를 검사하였다. 분획을 함유하는 단백질은 수집하였으며, MP4는 다음과 같이 추가 정제하였다: 약 35g의 MP4를 함유하는(분석적인 HPLC 및 SDS-PAGE로 산정된 바와 같음) 소량의 수집된 분획은 디티오트레이톨(최종 농도 50 mM), 구아니딘 HCl(최종 농도 6M)을 첨가하고, pH를 8.0으로 조정하여 완전히 환원시켰다. 이어서, 샘플을 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 생성되는 환원된 및 변성된 제조물을 0.45 미크론 필터를 통해 여과하고, 실온에서 55％ 용액 A(50％ 포름산/50％ 물)및 45％ 용액 B(50％ 아세토니트릴/50％ 포름산)으로 평형처리한 직경 1 cm, 길이 25 cm인 C4 VYDAC(미국, 캘리포니아, 헤스페리아) 역상 HPLC 칼럼에 적용하였다.(상기 칼럼에 샘플을 적용하기 전에 280 nm에서 광학 밀도를 측정하여 기준으로 삼았다) 로딩후, 칼럼 용출액은 280 nm에서 판독치가 기준에 이를때까지 검사하였다. 이어서 상기 칼럼을 55％ 용액 A, 45％ 용액 B에서 0％ 용액 A, 100％ 용액 B로 증가하는 선형 구배를 이용하여 용출하였다.

분획을 함유하는 수집된 단백질은 약 2 내지 3 mg/㎖의 농도까지 로타뱁농축기(부치 코오포레이숀)로 농축하였다. 이어서, 탈이온수를 플라스크에 첨가하고, 샘플의 부피를 그의 최초 부피로 만들었으며, 상기 샘플을 다시 농축하여 잔류 포름산을 제거하였다. 상기 최초 부피로 물을 첨가하고, 이를 제거하는 과정을 5 내지 10회 반복하였다. 이어서, 상기 샘플을 10,000 Da 차단 PM-10 막을 장착한 교반된 세포 농축기(아미콘)로 이전하였다. 탈이온수를 3회 첨가하여 4℃에서 여과(diafiltration)하였으며, 이는 탈이온수의 총 12 부피가 샘플을 통과할 때 까지 수행하였다(상기 샘플의 최정 pH는 3.5 였다)

생성된 농축 물질의 순도를 SDS-PAGE 및 분석적인 역상 HPLC로 판단한 결과 90％ 이하였다. N-말단 아미노산 서열 결정 결과, 분리된 폴리펩티드의 서열은 서열 번호 26의 예상된 아미노 말단 잔기를 함유하는 것으로 확인되었다.

MP4의 추가 정제가 필요할 수도 있다. 추가 정제 단계는 겔 여과 크로마토그래피 및 이온(바람직하게는 양이온) 교환 크로마토그래피를 포함한다. 이들 단계는 비이온성 세정제(바람직하게는 트윈 20)를 0.1 내지 1.0％ 농도로 첨가하므로써 용이하게 수행할 수 있다. 세포 용해에 이은 정제의 임의의 시점에서 상기 비이온성 세정제를 첨가할 수 있는데, 이는 상기 세정제가 금속 킬레이트 크로마토그래피를 방해하지 않기 때문이다.

임의의 약학적 제제가 박테리아로부터 유도되는 바와 같이, MP4 제제는 인간에게 투여하기 전에 동물내에서 독성에 대해 테스트를 수행하여 임의의 독성 제제는 추가로 정제하거나 폐기한다. 이러한 독성 테스트는 생쥐, 가장 바람직하게는 후술하는 바와 같이 EAE가 유도된 생쥐를 이용하여 EAE를 앓고 있는 동물로부터 T 세포의 입양 전달에 의해 수행하는 것이 바람직하다. 이러한 방식으로 수행되는 테스트는 동물 모델 시스템에서 치료의 효능을 평가할 수 있다는 잇점을 제공한다. 이러한 테스트에 있어서, 박테리아에서 생성된 플리펩티드 300 ㎍을 하기 "EAE를 앓고 있는 생쥐의 치료"란에서 기술된 적합한 치료 계획에 따라 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 PLP 폴리펩티드에 의해 유도된 T 세포 반응

본 발명의

PLP4 및 MP4 폴리펩티드는 T 세포 반응을 자극할 수 있는 그들의 능력 및 EAE/다발성 경화증을 예방 및 또는 치료할 수 있는 그들의 능력에 대해 시험관내 및 생체내 시스템 내에서 테스트하였다. 이들 연구의 결과는 도 1 내지 12 및 표 3에 요약하였다. 이들 결과로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 PLP 폴리펩티드는 T 세포 반응을 유도하고, 여러 가지 MBP 및 PLP 에피토프에 대한 반응성에 영향을 주며, EAE를 예방 및 치료할 수 있다.

활성 면역화에 의한 EAE의 유도

SJL/J 암 생쥐는 더 잭슨 레보래토리즈(미국, 메인, 바 하버)로부터 입수하였다. 모든 생쥐는 생후 8 내지 12주된 것을 사용하였다. 모든 생쥐는 표준 실험실 사료와 물로 사육하였다. 공급을 조절하여 마비된 동물이 사료와 물에 용이하게 접근하도록 하였다.

SJL/J 암 생쥐는 미코박테리움 투베르쿨로시스 H37Ra(디프코; 프레운트 완전 보조제) 150 ㎍ 및 항원을 함유하는 프레운트 불완전 보조제 에멀젼 150 ㎕를 피하 주입하여 면역화하였다. 항원은 난알부민 100 ㎍, 재조합

PLP4 100 ㎍, MP4 300 ㎍ 또는 PLP 펩티드 1CS(140 위치의 시스테인을 세린으로 치환환 서열 번호 22의 아미노산 잔기 139 내지 151) 150 ㎍를 포함하였다. 각각의 주사액 150 ㎕를 등 주변의 3개소에 분포시켰다.

또한, 모든 생쥐는 0일과 3일에 백일해 독소(미국, 캘리포니아, 캠프벨에 소재하는 리스트 바이오로지칼스) 300 ng을 피하 주입하였는데, 그 이유는 예비 테스트에서 백일해 독소를 동시 투여하는 경우 더 높은 발병률이 수득되기 때문이다. 작용의 정확한 모드가 불명확함에도 불구하고, EAE 유도에 대한 백일해의 면역 조절 효과는 널리 알려져 있다. 백일해 독소는 혈액-뇌 장벽 투과성을 생성시키며, 따라서 뇌척수염 발생 세포의 중추신경계 내로의 진입을 용이하게 하는 것으로 생각되는 혈관활성 물질이다.

질병의 초기 임상 징후는 보통 면역화후 12일 내지 16일이 경과된후에 관찰된다. 생쥐는 매일 검사하였으며, 각각의 군에 대해 평균 임상 치수를 할당하였다.

개시의 평균일은 임상 징후의 최초 출현에 기초하여 계산하였다.

EAE의 입양 전달

공여자 SJL/J 생쥐는 상기한 바와 같이

PLP4 100 ㎍을 피하투여하여 면역화하였다. 9 내지 11일이 경과한 후, 배출되는 림프 결절 세포를 수거하고, 공통 유전성 SJL/J 항원 기여 세포(APC)의 존재하에서 4일 동안 PLP 펩티드 1CS 25 ㎍/㎖를 이용하여 자극하였다. 펩티드 활성화된 T 세포(0.1 ㎖ PBS 내의 1.6x10⁷)을 수거하였으며, 2회 세척하고, 공통 유전자의 순전한 수용체 내로 정맥내 주입하였다.

EAE를 앓고 있는 생쥐의 치료

생쥐는 치료하지 않은 생쥐와 입양 전달 실험에서 2일, 4일 및 6일 또는 활성 면역화 실험에서 5일, 7일 및 9일에 1일 2회

PLP4 125 ㎍ 또는 비둘기 시토크롬 c(대조용)를 정맥내 주입한 생쥐로 구분하였다.

지금까지 본 발명을 기술하면서 여러 가치 문헌 및 특허를 언급하였다. 상기 문헌에 제시된 내용은 본 발명의 내용을 더 완전하게 기술하기 위해서 본 명세서에 참고로 인용한 것이다.

본 명세서에 본 발명의 바람직한 기타 구체예를 기술하였지만, 후술하는 특허청구의 범위에 기재된 발명의 범위를 벗어나지 않는 한도내에서 당업자에 의한 본 발명의 변형 실시가 가능할 것이다.

[표 1a]

다발성 경화증 환자에서 자가면역성 인간 PLP 펩티드

[표 1b]

[표 2]

동종번식 생쥐 가계에서 PLP의 뇌척수염 발생 에피토프

[표 3]

SJL/J 생쥐에서 EAE의 유도

[표 4a]

[표 4b]

[표 5]

Claims (25)

1. 포장 재료 및 상기 포장 재료 내에 함유된 다발성 경화증 치료용 약학 제제를 포함하는 제품으로서,

   (a) 상기 약학 제제는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 59 내지 84를 포함하되 위치 81의 아미노산 잔기가 시스테인이 아닌 것인 분리된 폴리펩티드를 포함하고;

   (b) 상기 약학 제제는 인간의 다발성 경화증 치료용이며; 또한

   (c) 상기 포장 재료는 상기 약학 제제가 다발성 경화증의 치료에 사용되는 것임을 나타내는 표지를 포함하는 것인 제품.
2. (a) 프로테오리피드 단백질 뮤테인을 포함하는 분리된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로서, 상기 뮤테인은 서열번호 23의 아미노산 잔기 6 내지 186을 포함하는 서열 및 서열번호 24의 아미노산 잔기 6 내지 169를 포함하는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 뉴클레오티드 서열; 또는

   (b) 상기 (a)에 상보적인 서열; 또는

   (c) 상기 (a) 및 (b) 둘다

   를 포함하는 분리된 핵산 분자.
3. 제2항에 있어서, 폴리펩티드가 서열번호 1의 미엘린 염기성 단백질의 10개 이상의 연속하는 아미노산을 포함하는 미엘린 염기성 단백질 아미노산 서열을 추가로 포함하는 것인 분리된 핵산 분자.
4. 제2항에 있어서, 폴리펩티드가 서열번호 1의 아미노산 잔기 81을 포함하는 서열 번호 1의 10개 이상의 연속하는 아미노산을 포함하는 미엘린 염기성 단백질 아미노산 서열을 추가로 포함하며, 상기 서열 번호 1의 위치 81의 아미노산 잔기가 시스테인이 아닌 것인 분리된 핵산 분자.
5. 제2항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 것인 분리된 핵산 분자.
6. 제2항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열 번호 26의 아미노산 잔기 1 내지 368을 포함하여 걸치는 아미노산 서열을 포함하는 것인 분리된 핵산 분자.
7. 제2항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열 번호 27의 아미노산 잔기 6 내지 374를 포함하여 걸치는 아미노산 서열을 포함하는 것인 분리된 핵산 분자.
8. 제2항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열번호 28의 아미노산 잔기 1 내지 487을 포함하여 걸치는 아미노산 서열을 포함하는 것인 분리된 핵산 분자.
9. (1) 프로테오리피드 단백질 뮤테인을 포함하는 프로테오리피드 단백질 폴리펩티드로서, 상기 뮤테인은 서열번호 23의 아미노산 잔기 6 내지 186을 포함하는 서열 및 서열번호 24의 아미노산 잔기 6 내지 169를 포함하는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 프로테오리피드 단백질 폴리펩티드; 및

   (2) 약학적 허용 담체

   를 포함하는, 인간의 다발성 경화증 치료용 조성물.
10. 포장 재료 및 상기 포장 재료 내에 함유된 다발성 경화증 치료용 약학 제제를 포함하는 제품으로서,

    (a) 상기 약학 제제는, 서열번호 23의 아미노산 잔기 6 내지 186을 포함하는 서열 및 서열번호 24의 아미노산 잔기 6 내지 169를 포함하는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로테오리피드 단백질 뮤테인 아미노산 서열을 포함하는 프로테오리피드 단백질 폴리펩티드 및 약학적 허용 담체를 포함하고;

    (b) 상기 약학 제제는 인간의 다발성 경화증 치료용이며; 또한

    (c) 상기 포장 재료는 상기 약학 제제가 다발성 경화증의 치료에 사용되는 것임을 나타내는 표지를 포함하는 것인 제품.
11. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드가, 위치 81의 아미노산 잔기가 시스테인이 아닌 것인 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것인 제품.
12. 제1항에 있어서, 상기 위치 81의 아미노산 잔기가 표준 아미노산인 것인 제품.
13. 제1항에 있어서, 상기 위치 81의 아미노산이 알라닌, 아스파라긴, 글리신, 프롤린, 트레오닌 및 세린으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 제품.
14. 제9항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열번호 1의 미엘린 염기성 단백질의 10개 이상의 연속하는 아미노산을 포함하는 미엘린 염기성 단백질 아미노산 서열을 추가로 포함하는 것인 조성물.
15. 제9항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열번호 1의 아미노산 잔기 81을 포함하는 서열 번호 1의 10개 이상의 연속하는 아미노산을 포함하는 미엘린 염기성 단백질 아미노산 서열을 추가로 포함하며, 상기 서열 번호 1의 위치 81의 아미노산 잔기가 시스테인이 아닌 것인 조성물.
16. 제9항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열번호 25의 아미노산을 포함하는 것인 조성물.
17. 제9항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열 번호 26의 아미노산 잔기 1 내지 368을 포함하여 걸치는 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
18. 제9항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열 번호 27의 아미노산 잔기 6 내지 374를 포함하여 걸치는 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
19. 제9항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열번호 28의 아미노산 잔기 1 내지 487을 포함하여 걸치는 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
20. 제10항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열번호 1의 미엘린 염기성 단백질의10개 이상의 연속하는 아미노산을 포함하는 미엘린 염기성 단백질 아미노산 서열을 추가로 포함하는 것인 제품.
21. 제10항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열번호 1의 아미노산 잔기 81을 포함하는 서열 번호 1의 10개 이상의 연속하는 아미노산을 포함하는 미엘린 염기성 단백질 아미노산 서열을 추가로 포함하며, 상기 서열 번호 1의 위치 81의 아미노산 잔기가 시스테인이 아닌 것인 제품.
22. 제10항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열번호 25의 아미노산을 포함하는 것인 제품.
23. 제10항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열 번호 26의 아미노산 잔기 1 내지 368을 포함하여 걸치는 아미노산 서열을 포함하는 것인 제품.
24. 제10항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열 번호 27의 아미노산 잔기 6 내지 374를 포함하여 걸치는 아미노산 서열을 포함하는 것인 제품.
25. 제10항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열번호 28의 아미노산 잔기 1 내지 487을 포함하여 걸치는 아미노산 서열을 포함하는 것인 제품.

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