JP3434510B2 - ミエリン塩基性タンパク質のペプチドフラグメントを用いたｔ‐細胞増殖の抑制 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、米国に係属中の一部継続出願であり、以下
の対応PCT出願を適用可能である： （ａ）1990年３月30日に出願された出願番号07/502,559
の係属中の米国出願の一部継続出願である1992年４月９
日に出願された出願番号07/885,318号 （ｂ）1992年２月28日に出願された出願番号07/843,752
号。

発明の分野 本発明は、Ｔ−細胞に媒介された、またはＴ−細胞依
存性の自己免疫応答の抑制のための組成物及び方法に関
する。より詳しくは、本発明はミエリン塩基性タンパク
質（MBP）のペプチドフラグメント及びその類似体から
なる組成物、及び、ミエリン塩基性タンパク質に特異的
なヒトＴ−細胞の増殖をアネルギー化または停止させ
る、または、そのようなＴ−細胞の活性抑制を引き起こ
すために、そのペプチド及び組成物を用いる方法に関す
る。本発明のペプチドは、ミエリン塩基性タンパク質反
応性のCD4⁺T−細胞の同定にも有用である。

発明の背景 本節における議論は、本発明に対する「従来技術」と
される著者の議論に限られない。従って、本発明者の利
害関係に対するいかなる承認や宣誓も、この議論を理由
として含まれることはない。

多発性硬化症（MS）は、ヒト中枢神経系の白質の臨床
的炎症性疾患であり、自己免疫性の病因であると考えら
れている。その病因にかかわらず、MSは、神経組織の自
己免疫攻撃に結び付いている。例えば、その疾患は、プ
ロミネント（prominent）Ｔ−細胞及びマクロファージ
が、神経組織（例えば、脳、末梢神経、または関連した
細胞タイプ）中への浸潤、脱髄及び神経病理学的機能障
害によって特徴づけられる。ミエリン塩基性タンパク質
（MBP）は、MSの大多数の動物モデル、実験的アレルギ
ー性脳脊髄炎（EAE）における誘発試薬としての役割、
と同様にヒト疾患のポスト−バイラル（post−viral）
脳脊髄炎におけるその役割のために、本発明者とその共
同研究者及び他の者によって、疾患の自己抗原として広
く研究されている。さらに、本発明者およびその共同研
究者らは、“バイスタンダー（bystander）抗原”とし
てのMBPを研究した（上述の、出願番号843,752号）。

MSの病原に関する主要な仮説では、CNSの白質中のミ
エリン塩基性タンパク質と反応性のＴ−細胞が炎症性過
程を開始する。他の仮説では、プロテオリピドタンパク
質（PLP）と反応性のＴ−細胞が炎症性過程を開始す
る。ミエリン塩基性タンパク質（MBP）に特異的な活性
化されたＴ−細胞が、MS患者から単離されるという証明
（Allegretta,M.et al.,Science,247:778,1990）は、さ
らに、その疾患の病原に、MBP−反応性Ｔ−細胞が含ま
れることを暗示する。本発明者らの研究は、炎症過程の
開始に引き続く、その疾患の病理にも、MBP−反応性Ｔ
−細胞が含まれることを示した。（以下でさらに詳細に
述べるように、本発明者らは、健康人もまた、しばしば
MBP−特異的Ｔ−細胞を有しているが、MS患者と異な
り、健康人からのMBP−特異的Ｔ−細胞は活性化されて
いないということを証明した。） MSの現在の治療は、単に緩和するだけであり、患者の
免疫応答を抑制するために非−特異的形態で作用する薬
剤の投与を含んでいる。そのような薬剤の例は、シクロ
ホスファミド、イムラン（アザチオプリン）、シクロス
ポリンＡである。プレドニソン及びメチルプレドニソン
のようなステロイド化合物もまた多くの例で採用され
る。これらの薬剤は、MSに対して限られた効力しが持た
ない。そのような薬剤は、それらの毒性により、また、
長期的な使用において“全身の（global）”免疫抑制を
誘発する、即ち、それらが、病原微生物に対する通常の
保護的免疫応答をダウンレギュレート（downregurate）
し、それにより、感染の危険性を増すという事実によっ
て使用を制限される。さらに、長期間に渡って全身の免
疫抑制された患者は、ある悪性の発展の危険性が増大す
る。

生起している免疫過程のさらに詳細は、実験的アレル
ギー性脳脊髄炎症（EAE）、MSの第１の動物モデルにつ
いて知られている。EAEは、適当なアジュバント中のミ
エリン塩基性タンパク質（MBP）での免疫化によって、
またはCD4⁺、MBP−反応性Ｔ−細胞の注入を通した獲得
転移によって、小型哺乳類に容易に誘発されうる。（Al
vord Jr,E.C.らeds.in Experimental Allergic Encepha
lomyeritis:Auseful model for Multiple Sclerosis,A.
R.Liss,N.Y.,1984;Makhtarian,D.E.らNature 305:356,1
984;Ben−Nun,A.らJ.Immunol.129:303,1982）。マウス
及びラットの両方においてEAEを誘発するＴ−細胞は、
起脳炎細胞と名付けるが、MBPの免疫優性（immunodomin
ant）領域に対応するペプチドを特異的に確認する。こ
れらの領域のＴ−細胞に対する提示（presentation）
は、抗原−提示細胞（APCs）の表面で、独自の主要組織
適合性抗原系（MHC）クラスII分子を伴って生ずる。MBP
の免疫優性領域、即ちCD4⁺タイプのＴ−細胞反応性のMB
Pによって最も頻繁に認識されるタンパク質の一部は、
宿主哺乳類の種及び、MBPのアミノ酸配列が非常に高い
種間相同性を示すという事実にもかかわらず、MBPの種
類によっても異なる。例えば、本発明者及び共同研究者
が発見したように、ヒトにおけるヒトMBPの免疫優性エ
ピトープ（epitope）は、アミノ酸84−102からなるヒト
MBP分子のサブ配列に含まれる。他の免疫優性エピトー
プが、アミノ酸143−168からなるヒトMS分子のサブ配列
に見いだせる。これは、MSに感染した個人から単離した
ヒトＴ−細胞の特異性によって証明される（関連特許出
願、出願番号502,559及び後述の実施例１）。マウスMBP
の免疫優性領域は、マウスに投与したときアミノ酸１−
９であり（ZamvilらNature 324:258,1986）、ラットの
免疫優性領域は、ラットに投与したときアミノ酸66−68
である（BurnsらJ.Exp.Med.169:27,1989）。一方、ラッ
トにおけるモルモットMBPのイムノドミナント領域は、
残基75−84に位置している（Hashim,G.Myerin:化学と生
物学,Alan R.Liss,N.Y.1980）。

EAE系においてなされた研究に基づいて、一般的な自
己免疫性疾患、特にMSの治療に対して、他の治療法が発
達した。1987年６月24日に出願された米国特許出願、出
願番号65,794（現在は取り下げられた）、及び1988年６
月24日に出願された同時係属の国際特許出願PCT/US88/0
2139であって、現在は各国段階の米国出願番号07/460,8
52、及びその一部継続出願である米国出願番号07/596,9
36とは、全ミエリン塩基性タンパク質の経口または経腸
投与によれば、疾患−誘発性及び非誘発性フラグメント
及びそれらの類似体と同様に、急性の単相性EAEの抑制
において有効であり、同様に投与したとき、MS徴候を抑
制するのに有効である。

以下の、同時係属の共同で譲渡した特許出願もまた興
味深い:1989年12月20日に出願された米国特許出願第45
4,806号は、自己抗原、前記自己抗原の疾患−誘発性フ
ラグメントおよびそれらの類似体のエアロゾル（aeroso
l）投与が、MSのようなＴ−細胞媒介自己抗原疾患を治
療するために有効な治療法であることを開示している。

“自己抗原の経口投与による自己免疫性疾患のダウン
レギュレーションの促進”という名称で、1990年３月20
日に出願された米国特許出願第07/487,732号は、自己抗
原、疾患−誘発性フラグメント及びそれらの類似体の経
口投与とともに相乗剤（促進剤）を使用することが、Ｔ
−細胞媒介自己免疫性疾患の治療に効果的であることを
開示している。

米国特許出願第07/843,752号は、経口または吸入によ
るバイスタンダー抗原の投与により、自己免疫疾患を治
療するための方法及び組成物を開示している。バイスタ
ンダー抗原は、組織−特異的抗原であり、免疫攻撃の場
所に存在し、経口投与されたとき、攻撃を受けている組
織において逆に免疫攻撃を抑制するＴ−サプレッサー細
胞を生成する。バイスタンザー抗原は、自己抗原である
必要はなく、それ自体が免疫攻撃の標的である必要はな
い。（実際、（経口投与で抑制を引き起こす）免疫優性
エピトープは、攻撃を受けている組織における同じ抗原
の他の部分または他の抗原の部分に対して向けられた免
疫攻撃の抑制においてバイスタンダー抗原として振る舞
うが、自己抗原の免疫抑制エピトープは、それらの免疫
優性エピトープとは異なるという証拠がある。）しか
し、バイスタンダー抗原は、（ａ）攻撃を受けている組
織に特異的であり、（ｂ）経口投与でＴ−サプレッサー
細胞の引き出し能力を持たねばならない。

Ｔ−細胞レセプターは、２本の異なったタンパク質物
質の鎖からなる。あるＴ−細胞レセプター（TCRs）は、
Ｖ−ベータ（VB）鎖とＶ−アルファ（VA）鎖からなり、
MBPを認識することが知られている。SJL/PLマウスにお
いて、これらのレセプターを有する起脳炎（即ち、マウ
スに投与したとき疾患を誘発する）Ｔ−細胞は、MHC分
子から提示され（Zamvil,S.S.ら,Nature 324:258,198
6）、マウス遺伝子Ｈ−２でエンコードされたＮ−末端
マウスMBPペプチド（残基１−９）を認識する。MHCに関
連して提示されるこのペプチドを認識するＴ−細胞レセ
プターの大多数は、マウスTCR遺伝子VB8.2及びVA2また
はVA4によりエンコードされる。ルイスラット（Lewis R
at）において、マウスVB8.2及びTCRVA2遺伝子と相同なT
CR遺伝子セグメント（segment）が、ルイスラットMHCを
背景とするMBP残基68−88を認識する起脳炎Ｔ−細胞に
見いだされた（BUrns,F.R.ら,J.Exp.Med.169:27,198
9）。VB8.2−特異性モノクローナル抗体（即ち、対応遺
伝子により発現される生成物VB8.2を認識する抗体）の
マウスへの投与は、ネズミのEAEの治療に効果的である
ことが示された。特にTCRVB8.2アミノ酸配列に対応する
ペプチドによる免疫化は、ルイスラットのEAEを改善す
る（Vanderbark,A.A.ら,Nature 341:541−544,1989;How
ell,M.D.ら,Science:246.668;1989）。しかし、免疫優
性領域のように振る舞う（MBPのような）自己抗原の領
域は、種特異的である。これまでのところ、ヒトにおい
て、MBPの免疫優性領域を認識するＴ−細胞間での、TCR
V−遺伝子におけるコモン（common）Ｖ−遺伝子の利用
法が存在するか、また、これらの免疫優性領域がMS患者
において積極的に同定されるかどうかは決定されていな
い。

現在、多重投与量及び少量の、起脳炎免疫優性エピト
ープを含む全抗原の経口投与がこのタイプの活性抑制を
引き起こすことが見いだされている。一方、全自己抗原
（または起脳炎免疫優性エピトープを含むそれらのフラ
グメントのひとつまたはそれ以上）のi.v.投与もまた、
自己抗原のエピトープを認識する免疫攻撃Ｔ−細胞以外
の抑制を引き起こす。後者のタイプの抑制は、クローナ
ル・アネルギーの機構を通して進行すると考えられてい
るが、１回の投与及び、起脳炎エピトープ、特に免疫優
性エピトープを含む多量の抗原を、特にプロテアーゼ阻
害剤とともに経口投与したときにも観察される。

MSに対する自己抗原であると考えられるタンパク質で
あるヒトMBPについて、本発明者らは広範に試験し、MS
患者から単離された多くのMBP−特異的免疫攻撃（CD
4⁺）Ｔ−細胞によって認識されるエピトープを含むタン
パク質のフラグメントを明らかにした。免疫優性エピト
ープからなるそのようなフラグメントは、MSにかかった
患者への投与の候補者のようであり、自己免疫応答の抑
制、特に神経組織への自己免疫攻撃に応答性するMBP−
反応性Ｔ−細胞の機能の抑制を終点とする。その最後
に、本発明は、そのような治療を必要とする哺乳類に対
するペプチドフラグメントの経口投与のみならず、その
ようなフラグメントの経腸投与も考慮する。

従って、本発明の目的は、免疫抑制試薬、特にヒトMB
Pのフラグメント、そして、これらのフラグメントをヒ
トＴ−細胞機能の抑制に使用する方法を提供することに
ある。

本発明の他の目的は、ヒトへの経口及び／またはi.v.
投与に有効なヒトMBPのこれらのフラグメントからなる
組成物及び製薬製剤、そして、そのような製剤の使用方
法を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、ヒトＴ−細胞の特異性を
決定するのに使用できる試薬として、免疫優性エピトー
プを含むMBPのペプチドフラグメントを提供することに
ある。

本発明のさらなる目的は、MBP−反応性Ｔ−細胞をア
ネルギー化したり、そのようなＴ−細胞の活性抑制を起
こす化合物及び組成物を提供することにあり、後者は、
MBP−反応性Ｔ−細胞の増殖の抑制という例示で証明さ
れる。

本発明の、これら及び他の目的は、当業者にとって、
本明細書、図面、請求の範囲に照らして明らかになる。

図面の簡単な説明 図１は、MS患者（左側パネル）及び健康な対照（右側
パネル）から単離した、異なるヒトMBPペプチドフラグ
メントと特異的に反応するMBP反応性Ｔ−細胞の頻度を
示す棒グラフである。

図2A及び2Bは、MBPで経口トラライズ（tolerize）さ
れた動物からの脾臓細胞の転移による（MBP−特異的起
脳炎Ｔ−細胞のi.p.接種によって誘発された）EAEの抑
制のグラフ的表示である。

図３は、MBP給餌動物からのCD4⁺−欠如またはCD8⁺−
欠如のＴ−細胞の同時転移により獲得転移されたEAEの
抑制を示す。

図４は、MBP給餌動物からの種々のＴ−細胞サブセッ
トのCD4⁺T−細胞を伴う同時転移によるEAE誘発（もしあ
ったら）に対する保護の程度に関連したDHT応答の棒グ
ラフである。

図５は、MBP−給餌マウスからの種々のＴ−細胞サブ
セットを注入されたマウスのCNS（即ち、実質及び髄
膜）から単離された炎症性のフォシ（foci）の平均数を
表現する定性的組織学分析の棒グラフである。

図6Aは、MBPの静脈内（IV）投与によって積極的に誘
発されたEAEの抑制を示す。図6Bは、MBPのIV投与の獲得
転移されたEAEに対する影響、及び、それらを起脳炎MBP
列を伴う無垢の動物への同時投与したとき、IV−トララ
イズされた動物の脾臓が抑制を与えない可能性を示す。

図７は、異なるMBPペプチドの経口（Ａ）またはIV
（Ｂ）投与に引き続くEAE抑制の変化を表す棒グラフで
ある。

図８は、ヒトMBPの免疫優性エピトープ領域（ヒトMBP
アミノ酸残基番号84−102）に基づいて構成された種々
のペプチドの、ヒトMBP−反応性Ｔ−細胞クローンの増
殖を刺激する能力のグラフ的表現である。

パネルA:ひとつまたはそれ以上のＮ−末端アミノ酸のオ
ミッティング（omitting）効果。

パネルB:ひとつまたはそれ以上のＣ−末端アミノ酸のオ
ミッティング効果。

図９は、15−メル（mer）（ヒトMBPアミノ酸残基番号
85−99）の、４つの異なるヒトＴ−細胞クローンの増殖
を刺激する能力を、MBPペプチド84−102及び86−97の、
そのような増殖を刺激する能力との比較において示すグ
ラフである。

図10は、85−99及び88−104ヒトMBPペプチドに接触し
たTCR/MHCを示すチャート（chart）、及び、この相互作
用に対して提出されたモチーフ（motif）である。

図11は、本発明のヒト85−99MBPペプチドによるＴ−
細胞クローンの増殖の誘発を、元のままのMBPタンパク
質によるこれらのクローンにおいて誘発された増殖との
比較において示すチャートである。

図12は、５人のMS患者から生成され、MBP残基84−102
反応性の、18T−細胞列からのcDNAのPCR増幅を示すオー
トラジオグラフである。

図13は、TCRVB及びJB遺伝子のMBP−反応性Ｔ−細胞列
の、MS患者の末梢血液から生成されたMBP−反応性Ｔ−
細胞列に対する使用のサザンブロット分析のオートラジ
オグラフである。

図14は、MS患者及び対照から単離されたＴ−細胞の、
これらの患者があるMCH抗原を持っているかどうかに関
連したヒトMBPポリペプチドの異なる領域に対する反応
性を示す一連の棒グラフである。

図15.事前にフリーペプチド抗原で刺激したＴ−細胞
は、抗原性刺激に対して非応答性である。Ｔ−細胞クロ
ーンOb.1A12.8は、MBPペプチド84−102で、または84−1
02でパルスされたDR2＋Ｂ細胞列（9010）もしくはＬ細
胞トランスフェクタントで、37℃で２時間直接刺激さ
れ、増殖を検定された。１回の刺激のウェル（well）中
のペプチドの最終濃度を示した。パネルＡに見られるよ
うに、３つ全ての刺激物は、等価なＴ−細胞増殖をもた
らした。７日後、Ｔ−細胞は洗浄され、84−102（５μg
/ml）または84−102でパルスされたＢ細胞もしくはＬ細
胞（100μg/ml）に対する応答が再検定された。パネル
Ｂに示したように、最初に高濃度の84−102で刺激され
たＴ−細胞は、いかなる第２の抗原性刺激に対しても非
応答性であった。

図16.T−細胞の非応答性は、Ｂ細胞の添加では防ぐこ
とができない。Ｔ−細胞クローンOb.1A12.8は、第１の
刺激として、単独、またはMHCクラスII適合性（9010）
または非適合性（9009）の照射され形質転換された表示
した数のＢ細胞を添加した84−102の存在下のいずれか
で、７日間第１の刺激の培養をされた。次に、洗浄さ
れ、MBP84−102ペプチド（５μg/ml）またはrIL−２（1
0³u/ml）のいずれかの増殖が検定された。ペプチドなし
で成長したＴ−細胞（丸印）は、第２の抗原性刺激に対
して十分に増殖することができるが、ペプチドとともに
成長したもの（四角印）は、Ｂ細胞添加に関わらず非応
答性であった。IL−２の増殖は、すべての細胞集団にお
いて等価であった。

図17.T−細胞アネルギーの反応速度論。Ｔ−細胞クロ
ーンOb.1A12.8は、５μg/mlの84−102中で０から168時
間培養され、洗浄され、84−102またはIL−２の増殖が
検定された。誤差表示は、３倍培地からのCPMの標準誤
差を表している。２つの一致するが分離された実験から
のデータが、全ての時間に対してプールされた。

図18.アネルギー化されたＴ−細胞は、CD3の発現を継
続する。Ｔ−細胞クローンOb.1A12.8は、５μg/mlの84
−102存在下または非存在下で４日間培養され、洗浄さ
れ、細胞表面表現型及び増殖的応答の両方が検定され
た。細胞は、標準MAbMsIg−FITCまたはOKT3FITCの30分
間（コールター（coulter））で30分着色した。４℃で
２回洗浄し、１％ホルマリン中で固定し、フローサイト
メトリーで検定した。同じ第１の培地からのＴ−細胞
は、84−102またはrIL−２存在または非存在でパルスさ
れたＢ細胞（9010）の増殖に対して検定された。

図19.種々の刺激物によるアネルギー化されたＴ−細
胞の活性化。84−102存在下または非存在下で７日間培
養されたＴ−細胞クローンOb1A12.8は、洗浄され、αCD
3＋PMA、Tll₂＋Tll₃、PMA＋イオノンマイシン（iononmy
sin）、及びrIL−２の対数滴定に対する増殖が検定され
た。各試薬の最終濃度または腹水希釈液をｘ−軸に取っ
た。PMA濃度は、αCD3またはイオノンマイシンの濃度の
下に挙げた。

図20.アネルギー化されたＴ−細胞は、抗原性刺激に
対して［Ca⁺²］ｉを放出する能力を阻害された。Ob.1A1
2.8は、±５μg/ml84−102で７日間培養され、洗浄さ
れ、［Ca⁺²］ｉの分析のために２μg/mlのIndo−１で負
荷された。＋100μg/mlの84−102でパルスされたイオノ
マイシン（100μg/ml）、αCD3（1/30腹水希釈液）、ま
たはＢ細胞（9010）による第２の刺激が、矢印で示した
時点でフローサイトメーターに添加された。APC刺激の
ために、細胞はフローサイトメーターから取り出され、
１分間遠心分離された。（実線で示した）。各試料のパ
ーセント応答は、ベースラインより上の細胞の％を表し
ている（刺激後引く刺激前）。

図21.アネルギー化されたＴ−細胞によるシトキンの
生成。

A. T−細胞クローンOb.1A12.8は、84−102存在下または
非存在下で、２日間培養され、10ng/mlのPMA＋１μg/ml
のイオノマイシン、または５μg/mlの84−102±10ng/ml
のPMAの存在下または非存在下で、37℃で４時間刺激さ
れた。全細胞RNAは、ノザン分析のRNAゾル（RNAzol）Ｂ
法により抽出された。括弧は、それぞれがシトキン特異
的プローブに加えて、β−アクチン制御プローブでハイ
ブリッド化された同一の試料の２つの異なるノザンブロ
ットを表している。mRNA結合のおよその寸法が挙げられ
ている。

B. Ob1A12.8は、±84−102で２日間培養され、洗浄さ
れ、84−102または、ポジティブな対照としてrIL−２で
刺激された。第２の培養後20時間に上澄み液が回収さ
れ、HT−２細胞の培地で1:3に希釈された。HT−２細胞
の増殖は、84−102で刺激されたアネルギー化されてい
ないＴ−細胞の上澄み液にIL−２が存在し、それはrIL
−２のポジティブな対照で最大であることを示してい
る。

発明の概要 ひとつの態様において、本発明は、ヒトMBPのフラグ
メントであるペプチドからなる免疫抑制試薬に向けられ
ている。本発明の実施態様は、ペプチド及びそれらのペ
プチドからなる製薬組成物を含んでいる。

本発明は、前記ペプチドを、ミエリン塩基性タンパク
質及びそれを含む組織に対する免疫応答の抑制のため、
及び／または、ヒトMBPの免疫優性エピトープを認識す
るＴ−細胞の抑制のために使用する方法にも向けられて
いる。これらの方法は、本発明によるペプチドのひとつ
またはそれ以上の経口および／または経腸投与を含み、
タンパク質及びそれを含む組織に対する免疫応答の抑制
をもたらす。

本発明には、アミノ酸配列ENPVVHFFKNIVTPRからなる
ヒトMBPのフラグメントも含まれる。

さらなる態様にあっては、本発明は、MBPの前記フラ
グメントのひとつまたはそれ以上からなる製薬組成物に
向けられている。

本発明のさらなる態様は、ヒトＴ−細胞機能の抑制、
及びCD4⁺MBP−反応性ヒトＴ−細胞の同定におけるヒトM
BPのフラグメントの使用方法を含む。

発明の詳細な説明 本明細書で挙げられている特許出願、特許、及び出版
物は、その全体が参考文献としてこの明細書に取り入れ
られている。不一致がある場合は、定義を含めたこの開
示が優先する。

ここで用いられる“抑制（suppression）”は、その
細胞を通常刺激する因子に対する応答におけるＴ−細胞
の増殖の、計測可能で再現性のある減少を含む。しか
し、本発明は、有害なＴ−細胞の増殖、即ち自己免疫攻
撃を促進するＴ−細胞（自己抗原に特異的なCD4⁺T−細
胞、例えばMBP）の増殖の抑制にのみ関することを強調
すべきである。確かに、本発明の重要な態様は、限られ
た方法によって抑制を引き起こす能力であり、以下で論
議するように、自己抗原に特異的な有害なＴ−細胞の抑
制は、投与されたMBPのフラグメント及び／または投与
方法の選択の結果である。

有害なＴ−細胞の増殖の抑制は、間接的にも測定でき
る。即ち、MSに見られる神経組織に対する損傷のよう
な、免疫攻撃Ｔ−細胞増殖が直接的あるいは間接的に引
き起こす疾患の徴候の緩和、またはMS患者が被るMSの攻
撃の数や厳しさの減少を通して見られる。神経組織に対
する損傷は、例えば、磁気共鳴イメージング（magnetic
resonance imaging）（MRI）によって検査でき、損傷
の数及び厳しさの測定を、それらの中に見ることができ
る。MS攻撃数または厳しさの減少は、例えば患者の臨床
評価によって検査することができる。MRI及び臨床評価
は、この分野ではよく知られている。

“自己抗原（autoantigen）”という用語は、異常な
状態にある哺乳類に通常見いだされる物質であり、その
哺乳類のリンパ球または抗体によって、けっして“自
己”とは認識されず、免疫調節系によって外来物質であ
るとして攻撃される物質と定義する。即ち、自己抗原と
は、自己免疫破壊を受ける抗原である。元の抗原に特異
的な抗体または（CD4⁺タイプの）同等（even）Ｔ−細胞
が単に存在するだけでは、それは自己抗原として確立さ
れない。MBP及びPLP（プロテオリピドタンパク質）は、
MSにおける自己抗原の例である。

（MBPのような）自己抗原の“免疫優性エピトープ”
は、感応性哺乳類のＴ−細胞の大多数（絶対多数である
必要はない）を含むがそれに限られない十分な数のＴ−
細胞によって認識される抗原決定因子を意味し、その感
応性哺乳類が病気の哺乳類でもあるとき、抗原に対して
そのようなＴ−細胞が、免疫応答を開始または開始を助
ける。（この議論から、“感応性の”哺乳類が病気にな
った哺乳類である必要がないということは明らかであ
る。） 自己抗原の“免疫優性領域”または“免疫優性ドメイ
ン”は、免疫優性エピトープを含む自己抗原のアミノ酸
配列の領域と定義する。MBPまたは他の自己抗原の免疫
優性エピトープ（及び領域）の構造（及び／またはMBP
または他の自己抗原分子の配置）は、宿主に依存して変
化する、よって宿主特異的である。本発明者らは、免疫
優性エピトープが宿主特異的である理由は、それらが
（約８から約15のアミノ酸の長さのペプチド断片に含ま
れると考えられる）モチーフからなり、それが宿主の主
要な主要組織適合抗原系に結合することであるという証
拠を挙げた。このモチーフは異なる種間で変化し（MHC
も同様に変化し）、同じ種の要員の間でも多形態性を示
す。

MBPのフラグメントの“類似体（analog）”という用
語は、MBPのフラグメントに構造的に関連し、MBPフラグ
メントと同様の生物学的活性を有する化合物を含む。こ
の定義でいう生物学的活性は、MBPフラグメントを投与
した際のＴ−細胞媒介またはＴ−細胞依存性の自己免疫
応答を抑制する能力、または自己免疫攻撃の原因となる
か、あるいはそれに貢献するＴ−細胞の増殖を抑制する
能力、もしくは、MBPの免疫優性エピトープを認識する
Ｔ−細胞によって認識される能力をいう。フラグメント
MBP84−102の類似体の例は、フラグメントMBP84−102ty
rであり、アミノ酸102がチロシンに変わっている。図８
からわかるように、この変化はMBPフラグメントのMBP−
反応性Ｔ−細胞列の増殖を刺激する能力に、全くあるい
はわずかにしか影響を与えない。さらに、アミノ酸配列
は、本フラグメントは比較的小さな寸法であるので、フ
ラグメントの溶解性または薬理反応速度に影響を与えな
いと予想される。“類似体”は、同程度に同じ活性を発
揮する必要はないことは特記すべきである。即ち、“類
似体”は、元の抗原の実際のフラグメントと同様に有効
な抑制剤である必要はない。

関連したヒトMBPエピトープの他の類似体が、これら
の類似体の、MHCと結合したり、関連するＴ−細胞レセ
プターによって認識されたりする能力（両者はインビト
ロで試験できる）に基づいて構成される。

ここで用いる“Ｔ−細胞”または“Ｔ−リンパ球”
は、造血（即ち血液を造る）組織に位置したステム細胞
から導かれた免疫系細胞と定義する。Ｔ−細胞には３つ
の広いカテゴリー：ヘルパー、サプレッサー、及び細胞
毒がある。Ｔ−細胞は、CD4抗原（そのときCD4⁺T−細胞
と称される）またはCD8抗原（この場合CD8⁺T−細胞と称
される）のどちらかを、その細胞表面で発現させる。周
辺（circulating）Ｔ−細胞によるCD4またはCD8の発現
は、そのＴ−細胞の機能及び特異性に相関している。CD
4⁺である“ヘルパーＴ−細胞”は、抗原及びクラスII M
HC分子を認識し、ヘルパーまたは調節機能を果たす。
“細胞毒”及び“サプレッサー"T−細胞（CD8⁺である）
は、抗原及びクラスI MHC分子を認識し、細胞毒及び抑
制機能を果たす。

“積極的な抑制（active suppression）”は免疫機能
の抑制であり、その抑制が、免疫細胞、特に調節（サプ
レッサー）Ｔ−細胞の付加による誘発の結果である。
“クローナルアネルギー（clonal anergy）”は、非応
答性及びさらに特別には、これらの細胞が通常は特異的
で、通常は増殖するような抗原の提示に対する非応答性
の状態にある免疫細胞、特に免疫攻撃Ｔ−細胞における
誘発による免疫機能の抑制である。La Salle,J.ら,J.Ex
p.Med.,176:177−186,1992年７月。アネルギー化された
Ｔ−細胞は、それらが“ターン・オフ（turn off）”さ
れたと見られるものを除いた全ての点において平常であ
ることを示す。それらは、インターロイキン−２（IL−
２）の添加なしでは活性化されず、それらが認識する抗
原の提示に際して増殖しない。IL−２が加えられると、
細胞は脱アネルギー化（de−anergized）となり、抗原
の提示に際して増殖を始める。

ここで用いる“治療（treatment）”は、MSの徴候を
持つ自己免疫疾患（またはそれらの臨床的徴候の発現）
を防御する予防治療と、治癒的治療、即ち、MSの徴候を
呈する疾患のオンセット（onset）後の、ひとつまたは
それ以上の徴候の抑制あるいは測定可能な緩和とを含む
ことを意味する。

“レセプター誘導ペプチド（receputor−derived pep
tide）”は、ここで、Ｔ−細胞レセプターまたはその類
似体のVB17及び／またはVB12と同様に（弱毒化されたVB
17−またはVB12−を含むＴ−細胞のような）他の試薬の
アミノ酸配列を有する（または含まれる）ペプチドであ
って、それがMSの徴候を有する疾患に罹った哺乳類に投
与されたとき、そのような徴候のひとつまたはそれ以上
を抑制するものと定義する。（本発明の活性ペプチドの
最短配列長さは、約20アミノ酸である。活性が保持され
ている限り、特に長さの最大値はない。例えば、TCRま
たは同等全Ｔ−細胞が使用できる。） “MHC"または“主要組織適合抗原系”は、活性化され
たＴ−細胞、マクロファージ及び他の免疫系細胞の表面
に存在する哺乳類細胞表面タンパク質の一連の複合体と
定義する。MHCは、組織適合性（または移植）抗原の提
示において、及び従来の（外来の）抗原に対する免疫応
答の調節において、多くの免疫性の態様における中心的
役割を演ずる。MHCタンパク質分子には、クラスＩ及び
クラスIIの２つのタイプが存在する。ヒトMHC遺伝子
は、ヒト染色体６に位置し、マウスMHC遺伝子は、マウ
ス染色体17上のＨ−２遺伝子座に位置する。

“クラスII MHC分子”は、MHCの一部を形成する膜糖
タンパク質である。クラスII MHC分子は、Ｂ−細胞、マ
クロファージ、脳アストログリア、表皮ランゲルハンス
細胞、樹木状細胞、胸腺上皮及びヘルパーＴ−細胞を含
む免疫系の細胞に主に見いだされる。クラスII MHC分子
は、組織移植片拒絶、抗体生成移植片対宿主反応の刺激
の間の免疫応答の調節、及び他の現象の間での“自己”
（または自己由来）の認識に含まれる。以下の明細書で
は、MHCは“クラスII MHC"と交換可能に用いられる。そ
のMHC遺伝子は、“MHC遺伝子”と称される。Ｔ−細胞
は、それが単核食細胞（マクロファージ、単球）、ラン
ゲルハンス細胞またはろ胞樹木状細胞のような、当初は
処理（消化物）を吸収し、それらの細胞表面に（それら
のMHCに応じて）タンパク質の抗原フラグメントを提示
する抗体提示細胞（APCs）に出会ったときに免疫応答を
開始する。CD4⁺T−細胞は、クラスII MHC分子を発現す
るAPCsによってタンパク質が処理され、そのペプチドフ
ラグメントが提示されたとき、抗原分子を排他的に認識
する。“Ｔ−細胞レセプター（Ｔ−cell receptor）”
または“TCR"は、ここで、Ｔ−細胞表面に存在する抗原
認識レセプターと定義する、従って、TCRは、免疫系を
抗原として認識、そして提示、する分子に結合するレセ
プターである（その分子は外来または自己由来で、後者
である場合は自己免疫疾患である）。Ｔ−細胞の大多数
は、１本のアルファ（Ａ）と１本のベータ（Ｂ）鎖を含
むジスルフィド結合したヘテロダイマータンパク質から
なるTCRを発現するが、Ｔ−細胞の少数は、２本の異な
る鎖（ガンマ及びデルタ）を発現する。TCRは、ＡとＢ
鎖からなり、その各々は、可変または不変の領域からな
る。（Tilinghast,J.P.ら,Science 233:879,1986;Conca
nnon,P.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:6589,1986;Kimur
a,N.ら,J.Exp.Med.164:739,1986:Toyonaga,B.ら,Proc.N
atl.Acad.Sci.USA 82:8624,1985.）。その可変領域は、
“可変”、“相違”、及び“結合”セグメントからな
る。それら可変、相違、及び結合セグメント間の接合点
は、Ｔ−細胞による抗原認識の部位であると仮定され
る。Ho,H.Z.ら,Immunogenetics,1982,15:509−517;Oler
up,O.ら,Tissue Antigens,1987,30:135−138;Opelz,G.
ら,Tissue Antigens,1977,9:54−58;Danska,J.S.ら,J.E
xp.Med.1990,172:27−33;Kempkis,B.ら,J.Immunol.,199
1,147:2467−2473;Sellins,K.S.ら,J.Immunol.,1992,14
9:2323−2327を参照。

Ｔ−細胞の抗原の認識は、Ｔ−細胞レセプター（TC
R）、APCのMHC分子、及びAPCによってクラスII MHC分子
の３次元構造の裂け目またはポケットを通して処理され
たペプチドの間の３分子間相互作用を反映している。
（Bjorkman,P.J.ら,1987,Nature,329:506と329:512）。
APC表面に最も頻繁に提示され、Ｔ−細胞によって認識
されるタンパク質の部分は、免疫優性エピトープであ
る。

動物モデル（EAE）において、動物VB8.2配列の部分か
らなるＴ−細胞レセプターは、疾患の治療に使用され、
疾患−誘発性Ｔ−細胞を除去することにより作用すると
見られる。特に、動物モデルにおいて、マウス及びラッ
トのVD8.2の露出した（表面）部分に相当するThr−Leu
−Cys−Ala−Ser−Ser及びThr−Leu−Cys−Ala−Ser−A
rgという配列からなるペプチドは、（マウス及びラット
において）ヘルパーＴ−細胞を除去することにより自己
免疫疾患と戦うことが確認された。

本発明者らは、ヒト宿主においてヒトMBPの免疫優性
エピトープを含むヒトMBPの２つの領域を同定した。こ
れらの領域は、ヒトMBPアミノ酸配列の２つの異なる部
分に固有のものである（各々残基番号82−104及び143−
168）。後述の実施例１に示したように、本発明者ら
は、ヒトMBPアミノ酸残基番号84−102を、MSに罹った患
者から単離した周辺Ｔ−細胞の大多数により認識される
ヒトMBPのひとつの免疫優性ドメインと同定した。さら
なる実験は、このドメインの免疫優性エピトープは、さ
らにヒトMBPアミノ酸番号85−99に位置していることを
決定した。これらのデータは、実施例３で提供した。
（実施例３のデータからの推論により、前述のヒト宿主
免疫優性エピトープが存在する動物ヒトMBPフラグメン
トは、いくつかのＴ−細胞クローンでフラグメント87−
98であることがわかる。しかし、84−102と反応性の全
てのＴ−細胞クローンは、フラグメント85−99を認識す
る）。MBPフラグメント143−168の同様の実験は、その
免疫優性エピトープの正確な位置の決定を容易に導く。

MS、EAEの動物モデルを含む実験は、ラットにおける
モルモットMBP及びウシMBPの対応する免疫優性エピトー
プを含むタンパク質フラグメントは、疾患にかかった動
物に経口投与されたとき、疾患の症候の抑制に有効であ
ることを示した（関連特許出願番号07/596,936及び後述
の実施例２）、しかし、いくつかの非誘発性フラグメン
トは、誘発性フラグメントより強力な抑制剤である。さ
らに、この経口による抑制は、CD8⁺サプレッサーＴ−細
胞の誘発に依存していることが示された（Linderら,J.o
f Immunol.142:748,1989）。動物においてMBPの起脳炎
フラグメントを用いたいくつかの実験が、他者によって
行われた。例えば以下を参照:Swierkosz,J.E.,1977,J.I
mmunol.119:1501−1506;Su,X−Ｍら,1991,J.Neuroimmun
ol.34:181−190（i.v.マウスにおいて起脳炎であると決
定されたMBPフラグメントは、脾臓細胞と結合し、獲得
転移されたEAEを緩和する）、Avrilionis,K.ら,1991,J.
Neuroimmunol.,35:201−210（i.v.モルモットに投与さ
れたとき起脳炎であることが示されているリポソーム結
合したヒトMBPペプチドフラグメントのモルモットにお
ける、同じフラグメントで誘発されたEAEの抑制のため
の使用、及び、フリーペプチドの同じ目的でのi.p.及び
s.c.の使用））。

従って、本発明のペプチドは、そのようなペプチドを
含む特異的な免疫抑制の合成の設計において有益に使用
され、翻って、それは有害なＴ−細胞の増殖の抑制に有
効である。例えば、ヒトMBP−特異的CD4⁺T−細胞におい
てアネルギーを誘発するか、または脱髄に特異的なＴ−
サプレッサー細胞を誘発することが示されているヒトMB
Pの配列からなるペプチドは、そのような目的で構成
し、使用することができる。例えば、後述の実施例１及
び２を参照。さらに、実施例２で報告された結果は、ト
ラライジング試薬の投与の方法及び計画は、自己免疫反
応の抑制をもたらす機構に影響を与えることを示してい
る。従って、ヒトにおいてヒトMBPの免疫優性エピトー
プを取り入れたペプチドフラグメントは、インビトロで
のMBP−反応性CD4⁺ヒトＴ−細胞の増殖の阻害に有効で
あり、ヒトにおいてi.v.経路を通して投与されたとき、
同じ機構によって有効であると予想される。同じエピト
ープペプチドは、ヒトに経口投与されたとき、ヒト神経
組織の免疫攻撃の抑制を有効に誘発すると予想される。
本発明者らは、（前述の２つの免疫優性エピトープ領域
を含む）全MBPは、MBPが少量および複数回投与により経
口投与されたとき、サプレッサーＴ−細胞を引き出すこ
とを通した抑制（積極的な抑制）を誘発することを示す
証拠を有している。同じ抗原が経口投与されても、大量
で１回の投与であれば、アネルギーを通した抑制を誘発
するだろう。最後に、抑制の両方の機構は、上で同定し
た２つの極端な例の間のMBPからの経口投与計画を調整
することにより誘起される。

理論的に裏付けされていないが、MBPの免疫優性フラ
グメントの経口または経腸投与により、サプレッサーＴ
−細胞が、翻って、神経組織（即ち、脳、脊髄、末梢神
経、または関連した細胞タイプ）の免疫攻撃に寄与する
Ｔ−細胞の抑制を引き出されるようになると考えられ
る。MSに罹った患者において見られる疾患を構成する神
経組織の損傷は、そのような自己免疫攻撃の直接の結果
と考えられる。このトラライズ機構は、免疫攻撃下の組
織近傍におけるＴ−細胞の免疫反応性の抑制を起こす調
整（サプレッサー）Ｔ−細胞の積極的な誘発を含んでい
るので、それは、積極的な抑制の一例である。

本発明者らは、これらのサプレッサーＴが特異的であ
るような抗原が見られる身体の箇所を標的としている寛
容抗原特異的サプレッサーＴ−細胞の誘引によって、活
性の抑制が起きるという多数の実験証拠を蓄積してき
た。この箇所は、自己免疫攻撃を受けている組織を含
む。ひとたびこれらがこの抗原に遭遇すると、サプレッ
サーＴは、非特異的免疫抑制因子TGF−βおよびインタ
ーロイキン−４（IL−４）のような、自己免疫攻撃を含
む自己免疫反応を抑制する抑制シトキニンを分泌する。
（第843752号の関連特許参照） 対照的に、免疫優性エピトープを取込むMBPフラグメ
ントの静脈投与（あるいは皮下、あるいは腹腔内投与）
は、クローンアネルギーとして知られる別の機構を経て
免疫抑制を引起こすと信じられている。クローンアネル
ギー、あるいはＴ−細胞の非反応性の原因は、適切な相
互促進因子がない状態で、抗体が生じることである。Je
nkins,M.K.PNAS,84:5409−5413,1987.含まれる因子が厳
密に同等かは、明記されていないが、可溶性シトキニン
（例えば、Ｂ−７、EDCI、および適切な細胞内のカルシ
ウム濃度）には触れている。しかし、より最近の証拠
は、相互促進因子がないことよりはむしろ、いわゆる
“負のシグナル”が、アネルギーの原因であることを示
唆している。しかし、これらのシグナルは、未だその性
質を明らかにされていない。ラサール，ジェー．エム．
（LaSalle J.M.）他,J.Exp.Med.,176:177−186,6月号,1
992参照。Ｔ−細胞クローンを誘導して増殖させるより
はむしろ、相互促進因子のないAPCsによる抗原の発生
（および／または負のシグナルの存在下で）によって、
Ｔ−細胞はIL−２の原因でありつづける一方で、サブ配
列抗原促進の因子ではなくなり、したがってアネルギー
化されたと評される（Jenkinsら,Proc.Natl.Acad.Sci.8
4:5409,1987;Muellerら,Ann.Rev.Immunol.７:455,1989;
Schwartzら,Science 248:1349,1990）。したがって、MB
Pのような、ある自己抗原に対して特異的な自己免疫反
応促進クローンは、もはやその抗原に反応して増殖せ
ず、自己免疫疾患症状の原因である組織損害を引起こす
免疫攻撃反応を減少するが、このような神経組織損害
が、MS中で観測された。

クローンアネルギーによる抑制は、寛容化された動物
から寛容化されていない動物に、後者の動物において免
疫機能の抑制を引起こすために転移されたサプレッサー
Ｔ−細胞の能力の有無を試験する養子移入実験によっ
て、活性の抑制と区別することができる（以下の実験に
おいてそのように区別された）。Ｔ−細胞転移は、抑制
機構が活性であれば、すなわち、サプレッサーＴ−細胞
の誘引を含んでいれば抑制を引起こし、抑制機構が非活
性であれば、すなわちクローンアネルギーが含まれてい
れば起こらない。実験例２において報告された結果は、
免疫抑制の各機構が含まれる例を図示し、また、抑制機
構は以下の一つまたはそれ以上によることを示してい
る：（ｉ）寛容誘導するために投与されるサブスタンス
（例えば、MBPの免疫優性エピトープ的フラグメント
は、経口的経路を経る活性抑制および非経口的経路を経
るエネルギーを誘導する）；（ii）寛容抗原の投与の経
路（例えば、攻撃Ｔ−細胞によって認識されるエピトー
プのみがi.v.経路を経てアネルギーを誘導する）；（ii
i）投与の量と頻度（例えば、経口的に投与されたMBP
は、少量を多様な容量にて与えられた際には、活性の抑
制を、経口的に多量を単一の容量にて与えられた際に
は、非活性の抑制を誘引する）。

データは、MBPの起脳炎性および非起脳炎性フラグメ
ントのいずれもが、経口的に投与された際に活性の抑制
を誘発することができるが、これらの非起脳炎性フラグ
メントは、活性の抑制を経てのみ、また、経口の経路を
経て投与された場合にのみはたらく免疫抑制エピトープ
を取込むものである。起脳炎性フラグメント（免疫優性
エピトープを取込む）もまた、単一の用量にて大量に投
与されれば、経口の経路を経てアネルギーを誘発するこ
とができる。

これらの結果は、寛容化作因および寛容化剤としての
MBPに基づく方法の設計に、重要な区分を有する。した
がって、望ましい免疫抑制の種類によって、特定のフラ
グメントと同様に特定の投与方法を用いることができ
る。例えば、一つかそれ以上の疾患繁殖エピトープ的ペ
プチドを、i.v.あるいはs.c.あるいはi.p.経路を経て用
いることが望ましく、同時に一つかそれ以上の免疫抑制
エピトープ的ペプチドを、経口の経路を経て用いること
が望ましい。

投与経路の組み合わせを含む寛容化方法および／また
はプロトコールおよび／または自己抗原フラグメントが
最も効果的であると判明することも予想される。当業者
には理解されるであろうが、フラグメントおよびフラグ
メントの組み合わせ（あるいはフラグメントと全抗原と
の組み合わせ）の有効性およびMBPフラグメントの投与
方法（あるいは方法の組み合わせ）の有効性は、治療を
受ける被験者の年齢、性別、体重、体調および疾患状況
と、他のフラグメントあるいは治療が同時に使用される
か否かによって異なる。その結果、用いられたフラグメ
ントおよび投与方法は、相当にこれらの因子に基づいて
決定されなければならず、実験によって一件毎の根拠に
基づいて決定される必要がある。しかし、このような決
定には、定例の実験以上のことは必要でなく、実施例お
よび指針をここに包含した。

実施例１にて同定されたように、本発明に用いるヒト
MBPの配列に基づくペプチドは、よく知られた固相法を
用いて合成することができる（Merrifield,R.B.）Fed.P
roc.Soc.Ex.Biol.,21:412,1962およびJ.Am.Chem.Soc.8
5:2149,1963;R.Mitchell A.R.ら,J.Am.Chem.Soc.98:735
7,1976;Tam,J.ら,J.Am.Chem.Soc.105:6442,1983）が、
好ましくは市販のペプチド合成装置を用い（Applied Bi
osystem社製），フォスターシティー,CA製造のものな
ど）、製造業社の使用説明書に従う。あるいはまた、こ
のようなペプチドは、現在では当業界で広く知られると
ころの、DNA組替え技術によっても合成することができ
る（Maniatisら，分子クローニング：実験の手引,Cold
Spring Harbor研究所,NY,1982,pp.51−54およびpp.412
−30参照）例えば、これらのペプチドは、望ましい種よ
り分離されたMBPの望ましいフラグメントを暗号化するD
NA配列の、発現ベクトルへの取込みおよび、個別に望ま
しいペプチドを発現するであろう適当な真核または原核
の宿主へのこのようなベクトルの導入の後に、DNA発現
の産物として得られるか、あるいは融合ペプチドまたは
蛋白質の部分として得られ、このものから広く知られた
技術を用いて分離することができる。

ペプチド類似体は、以下に開示される通り、上述の合
成あるいは組替え技術および例えばEyler,E.B.,実験的
医学および生物学の進歩21:259−281,1978.の方法によ
って、ヒトのMBP遺伝子により暗号化された既知のアミ
ノ酸配列を用いて設計することができる。例えば、MBP
の望ましいフラグメントの、厳密なアミノ酸配列に基づ
いてはいるが異なる配列を有するペプチドは、上述の技
術を用いて化学的に合成することができる。このような
ペプチドは、例えば実施例１にて述べられている、この
特定のヒトMBPの免疫優性エピトープのアミノ酸87−102
中のより精密な位置を同定するための操作あるいは、例
４にて述べられている、Ｔ細胞レセプターおよびMHCに
対する効果を、試験することができる。個体より収集さ
れ、分離された末梢MBP特異的サプレッサーＴ−細胞を
ペプチドにさらし、それらが増加するか否かを測定する
ことによって、MBP基盤ペプチドの内服による人体での
有効性をインビトロに試験することができる。その上
に、あるいはまた、これらの分離されたサプレッサーＴ
−細胞は、MBPペプチドにさらした際にTGF−βおよび／
またはIL−４のような抑制シトキンを遊離するか否かを
試験し、測定することができる。（例えば、APS'sとし
ての脾臓細胞の使用が必要でないこと以外は、PCT US9
2/01705に対応する、同時係属の米国特許出願第843752
号におけるトランスウェル（transwell）システムの利
用を参照;MBPペプチドは、細胞を誘導するために用いら
れ、TGF−βを遊離させることができる。）MBP特異的Ｔ
−サプレッサー細胞は、MBPにさらされることによって
分離され、増殖評価に引続いてアンチCD8⁺抗体を用いた
結合研究を行なった。

本発明は、ヒト、とりわけMSに苦しむ被験者の自己免
疫攻撃Ｔ−細胞の機能を抑制するための経口的または非
経的使用について薬剤の製剤および投薬量形式をも提供
するものである。ヒトMBPおよび類似体のフラグメント
であり、その一定量が免疫攻撃細胞の増殖抑制に効果的
である発明によれば、一般的にこのような投薬量形式は
一つまたはそれ以上のペプチドを含んでいる。例えば、
本発明の方法に準じて治療を受けてきた患者におけるMB
P特異的CD4⁺T細胞および／またはMSの１つまたはより多
くの兆候の減衰のような、免疫攻撃細胞のインビトロな
抑制となる機能の抑制は、本発明の範疇であるとみなさ
れる。何が抑制および兆候の減衰を構成しているかは、
これまでの章を参照のこと。

本発明のＴ−細胞抑制ペプチドは、これらの添加配列
が、このようなペプチドの抑制機能をうち負かさない限
りにおいては、MBP基盤配列を導く、あるいはこれに続
く、添加的非MBP誘導アミノ酸配列をも包囲する。免疫
抑制行動に対するこのような構造の試験は、例えばここ
に述べるされたアッセイ法の一つまたはそれ以上を用い
て簡単に行なうことができる。

本発明の調剤組成物は、任意の成分として、当業界で
広く知られる種類の薬用の媒体、担体、希釈剤、可溶化
剤あるいは乳化剤および塩を含むものであってよい。こ
のような基質の非限定例は、蒸留水中0.5Nの食塩水を非
経口的に用い、乳糖を経口的に用いることを含む。

ヒトMBPのフラグメントは、免疫抑制の有効性を増大
させる相乗剤とともに、経口にあるいは吸入によって投
与することができる。本発明に用いる相乗剤の非限定例
は、例えば大腸菌（E.coli）の様々なサブタイプ、およ
びサルモネラ菌（Salmonella）（LPS,Sigma Chemical C
o.），セントルイス,MO;Difco,デトロイト,MI;バイオモ
ルBIOMOL調査研究所，プリマス,PA）、脂質Ａ（Sigma C
hemical Co.,セントルイス,MO;ICN Biochemicals,クリ
ーブランド,OH;Polysciences,Inc.,ウォーリントン,P
A）、およびDeres,K.）らにより開示されたように（Nat
ure,342:561−564,1989）して得られるトリパーミトイ
ル−Ｓ−グリカリルシステイニル−セリル−セリン（P₃
C55）と共有結合で結合したペプチド、あるいはBraun,
V.,Biochim.Biophys.Acta 435:335−337,1976に開示さ
れたようにしてE.coliより得られる、“ブラウンの”リ
ポ蛋白のような免疫調節リポ蛋白、などのようなグラム
陰性の細菌の多様な品種の中の細菌リポ多糖類を含む。
LPSが望ましく、脂質Ａが特に望ましい。脂質Ａは、全L
PS分子よりも毒性が弱いために、本発明での使用には特
に望ましい。本発明にLPSを用いるには、グラム陰性の
細菌から抽出し、Galanesら（Eur.J.Biochem.９:245,19
69）およびSkelly,R.R.ら（Infect.Immun.Biochem.23:2
87,1979）の方法を用いて精製することができる。

効果的な量の相乗剤、例えばLPSあるいは脂質Ａは、
前記哺乳類の体重1kg毎に、毎日0.15〜15mg程度、望ま
しくは前記哺乳類の体重1kg毎に、毎日0.3〜12mgの広範
囲に及ぶMBPフラグメントとともに投与される。

本発明の抑制剤の投与の方法は、経口の形式あるいは
非経口の形式あるいはこれらを組み合わせたものであ
る。経口の投与とは、経口、経腸あるいは胃内の投与を
含むが、経口が望ましい。非経口の投与とは、腹腔内、
皮下、皮膚内、および最も望ましい静脈内投与を含む。

一般的に、MBP基盤ペプチドあるいは類似体は、ヒト
の患者に対し、各投与ごとに約10μｇ〜20mg、好ましく
は約100μｇ〜250μｇの範囲で、経口にて投与される。
この量は、一つの投与量形式あるいは多数の投与量形式
において、パルス投与される。活性抑制を引起こすため
には、全てのMBPについて、毎日５回ずつ1mgの投与量形
式が効果的な量の一例である。アネルギーのためには、
非経口的な10〜20mgが効果的な量の例である。投与の投
薬量および頻度を最適化するために、患者の監視が望ま
しい。患者への投与の厳密な量および頻度は、当業界で
は充分認識されているように、発現の時期と頻度および
患者の疾患の深刻度および患者の体調によって多様とな
るであろう。このような最適化は、一件毎の根拠に基づ
いて行なわれることが望ましい。ここに指針を開示され
た免疫抑制に必要な投薬量の最適化は、不要な実験では
ない。

本発明の別の好ましい具体化における薬剤の経口製剤
または投薬量形式は、本発明によれば、吸入によっても
投与することができ、望ましくはエアロゾルの形態で用
いる。投与の吸入法は、好ましくは鼻腔を経るものでな
く、気管支および肺粘膜を経るものである。本発明のMB
Pフラグメントおよび関連化合物は、乾燥粉末粒子とし
てあるいは微粒子化してキャリアーガス（例えば空気ま
たはN₂）中に漂わせた水溶液としてヒトに投与すること
ができる。好ましいエアロゾル薬剤の製剤は、例えば、
生理的に受容される緩衝塩溶液を包含する。

本発明の方法は、薬剤の製剤の吸入による投与で、例
えば米国特許第4624251号,1986年11月25日発行；第3703
173号,1972年11月21日発行；第3561444号,1971年２月９
日発行および第4635627号,1971年１月13日発行に述べた
もののような噴霧器を用いるエアロゾルスプレーの方式
によるものが含まれている。エアロゾル物質は治療を受
ける被験者により吸入される。

本発明を実行する際には、Newman,S.P.のAerosols an
d the Lung,Clarke,S.W.およびDavia,D.編.pp.197−22
4,バターワース，ロンドン，イングランド,1984.に開示
されている気圧保持の測定用量吸入器（MDI）および乾
燥粉末吸入器のような、エアロゾル移送の他の方式を用
いることができる。

ここに開示された種類のエアロゾル移送方式は、フィ
ソンズ（Fisons）コーポレーション（ベッドフォード,M
A）、シェーリング（Schering）コープ（ケニルワース,
NJ）およびアメリカンファーモシール（American Phhar
moseal）コー（バレンシア,CA）など多数の販売元より
入手することができる。

治療にエアロゾル投与を用いた場合、1989年12月20日
出願の同時係属中の米国特許出願第454486号に開示され
ているように、全MBPを用いてEAEの処理を行なった際お
よびコラーゲンを用いてアジュバント関節炎の処理を行
なった際にこの効果が見出されたことから、本発明のMB
Pのフラグメントは、少量を必要とされるのみであるこ
とが期待される。さらには、MBPのフラグメントの吸入
により誘引される免疫抑制は、経口投与に類似した活性
の抑制機構を経て起こる。Weiner,H.L.らFASEB ４
（７）:2102、1990.本発明のMBPのフラグメントの、エ
アロゾル投薬量形式によって投与される量は、哺乳類の
体重1kg毎に、毎日約0.015〜約1.5mgであり、哺乳類の
体重1kg毎に、毎日約0.05〜約15mgの範囲の相乗剤を任
意に含むことができ、単一の投薬量形式あるいは多数の
投薬量形式によって投与することができる。投与される
厳密な量は、患者の疾患の状態と深刻さおよび、患者の
体調によって様々である。

本発明によれば、非経口的な投与に対する投薬量形式
は、一人毎、用量毎に、一般的に約１〜200mgのペプチ
ドを含有し、望ましくは、約10mg〜約100mgを含有す
る。経口の製剤に関して上の表に記述した、上記の不活
性な任意成分および正確な量の調製および投与計画は、
非経口の製剤のみに付属する。

必要有効量は投薬量単位の複数の投与によって達成さ
れ得ることから、各投薬量形式の、個別の経口的または
非経口的用量に含まれる活性成分の単位含有量は、それ
自体でMSの治療に効果的な量を構成する必要はないこと
が認識されるであろう。

実施例１−３において述べた技術を用いて、本発明の
方法の有効性を監視し、本発明の投与に用いられたフラ
グメントと方法と同様に疾患抑制剤の投与の量と頻度と
を最適化することができる。

Ｔ細胞は、実施例１−３に述べたように、患者の末梢
血液あるいは脳脊髄液より分離され、増殖、クローン化
される（本発明による治療の前および／または後）。抗
体（多クローン性または単クローン性）は、本発明のMB
Pペプチドに向けて得られ（当業界でよく知られ、用い
られている従来法によって）、本発明による治療の前お
よび／または後に、患者の末梢血液中にMBP反応性Ｔ−
細胞の兆候を求めて、またより特異的には活性化MBP反
応性CD4⁺T−細胞の兆候を求めて検定される。本発明の
ペプチドは、実施例１の方法を用いてMBPに対して反応
性のＴ−細胞をもつ個体を同定するにも有用である。

本発明は、これより後に、範囲を限定することなく本
発明を説明しようと意図した特定の実施例について叙述
される。

実施例1:ヒトMBPの主要自己免疫領域の同定 MBPは、ヒトの脳組織から抽出され、叙述のように（C
hou,F.C.H.,J.Biol.Chem.251:2671,1976）最大分子量ピ
ーク（18kD）を用いて、CM−52カラム（製造元:Wattman
Biosystems Ltd）メイズトン，ケント,U.K.）上で精製
された。MBPペプチドは、固相法を用いて合成され、あ
るいは商業研究所（Biosearch Lab Inc.,サンラファエ
ル,CA）より入手され、以下のように高圧液相クロマト
グラフィーによって精製された：調製品を含む各ペプチ
ドは、0.1％のトリフルオロ酢酸（TFA）中にて1mg/mlに
調製された。その後HPLCカラム（レイニン（Rainin）逆
相C4あるいはC18）中で、0.1％TAFを含有する０〜70％
アセトニトリル勾配を用いて処理された。ピークは214n
mにて検出された。使用されたMBPペプチドフラグメント
は、以下の表１中に列記した。しかし、ヒトMBPの配列
は公表されている。それゆえ各ペプチドに含まれるアミ
ノ酸残基を設計する数のみが必要である。

クラスII MHC表現型に対して反応性のヒトのMBPに免
疫優性のエピトープがあるか否か、およびこのような反
応性の頻度を試験するために、迅速Ｔ−細胞クローン化
技術が用いられた。総計15824の短期間Ｔ−細胞列系
が、51人のヒトの被験者由来の末梢血液分子細胞（PM
N）を精製済MBP（100μｇ）で培養し、３日後に、また
その後は３〜４日毎に、インターロイキン−２（IL2;AB
I社、メリーランド州コロンビア）および２単位の組替
えインターロイキン４（IL−4;ジェンザイム（Genzym
e）社、マサチューセッツ州ボストン）を添加した。培
養13日目に各系列からのアリコートは、MBPに対する反
応性について以下の増殖検定法を用いて試験された:T−
細胞クローン（１×10⁵細胞／ウェル）が、３つ用意さ
れ、適当な刺激物（例えば100μｇの全MBPあるいは５％
のIL−２）で、96ウェル平底顕微滴定培地（Coster社）
中、37℃、72時間、湿度90％、CO₂5％にて同時培養され
た。細胞は、２μCi［³H］TdR（2Ci/mmol、ニューイン
グランド ニュークリア社、マサチューセッツ州ボスト
ン）によって培養の終盤の18時間にパルス標識された。
APCsは、ヒトのＢ細胞が転移したヒトのエプスタインバ
ールウィルス（細菌はATCCより購入可能）あるいは、ヒ
トのDR₂を移入したマウス細胞であるＬ細胞（Ｌ細胞は
補助No.ATCC−CCL1の下にATCCより購入可能であり、Wu,
S.ら,J.Immunol.,1987,138:2953によってDNAを暗号化す
るDR2を用いて、Wilkinson,D.ら,J.Exp.Med.,1988,167:
1442−1458の方法によって移入することができる。）を
パルス標識することによって調製された。Ｂ細胞または
Ｌ細胞は、40pMのMBPあるいはリン脂質蛋白質（PLP）の
存在下と、非存在下のいずれかの完全培地において、１
×10⁶細胞／ウェルとして37℃にて２時間用いられ、続
いて４℃にて5000rad.の照射を受けた。補助APCsなしに
Ｔ−細胞を刺激するためには、２μＭのMBP、PLP、ある
いは適当なフラグメントが、培養の期間に細胞に対して
直接加えられた:48時間、続いてチモーゲン（thymoge
n）によるパルス標識、その後収集が行なわれた。一万
のAPC'sが、100000のＴ細胞クローンに用いられた。

MBPあるいはPLPに対して反応性であると示されたＴ細
胞系列は、その後同様の技術を用いて上の表１に示され
たようにヒトMBP配列を包囲する重なりオリゴペプチド2
0−mersに対する反応性を試験された。MBPおよびPLP反
応性頻度分析は、他の神経疾患の被験者および正常な被
験者（全ての年齢および性別はMS患者と一致）と同様
に、限定された、再発−緩和性のMSの患者（磁気共鳴画
像診断（MRI）および臨床検査によって診断された通
り）に対して行なわれた。結果は以下の表２に示された
通りである。

MSの患者は白人種であり、非常に特徴的な再発−緩和
性の疾患をもち、24ヵ月以内に少なくとも２度の悪化
と、血液引出しの際にはMRIを用いて見られたように良
性の腫瘍を呈した。他の中枢神経型の疾患の被験者は、
以下の診断を受けた：大脳血管性の事故（ｎ＝４）、CN
S出血を伴う脳の外傷（ｎ＝４）、転移性（metastati
c）脳腫瘍（ｎ＝２）の、いずれかの１−３週間後。MBP
あるいはPLPに対して反応性であるＴ−細胞系列の総数
および生じたＴ−細胞系列の総数が、表２に示されてい
る（“Ag"は“抗原”を意味する）。加えて、MBPおよび
PLP反応性の系列の頻度は、各被験者について、MBP反応
性系列の数を生じた系列の総数で割ることにより計算さ
れ、平均散＋／−SEMが与えられた。MBPとそのフラグメ
ントに対する反応性よりも低い程度ではあるが、PLPに
対する反応性に関しては同様の結果が得られた。

他の被験者と比較して、MBPの全てのフラグメントに
対して反応性である系列の頻度が、MSの被験者において
はわずかに高いのではあるが、この増分は、統計的に注
目に値するものではない。しかし、以下に議論するよう
に、MS患者由来のMBP反応性細胞系列の、著しく多数
が、それぞれアミノ酸84−102および143−168を含むフ
ラグメントに対して反応性であり、したがってこれらの
ペプチドおよび対応するMBPのフラグメントが、MSの発
達においてMBP活性の免疫優性エピトープを含んでいる
と確認される。

MSの患者由来の総計302の細胞系列は、反復した分析
では、拡張して確実にMBPと反応することができ、140
（46.4％）がMBP残基84−102と反応し；ほぼ70−80％が
MBP残基84−102あるいは143−168のいずれかと反応し
た。コントロール群では、総計100のMBP反応性Ｔ−細胞
系列の内11（11.0％）が、84−102ペプチドを認識し、
約34％が54−102または143−168ペプチドのいずれかを
認識した。各個別の被験者について、各々のMBPペプチ
ドと反応した、末梢の血液から得たＴ−細胞の実際の頻
度を計算した。MSの患者およびコントロール被験者に対
する平均値は、表２の最右列に示されている。PLPの対
応する免疫優性ペプチドは、ここにMBPペプチドについ
て述べたと同様の方法にて確認することができる。

正常な被験者および他の神経疾患のコントロール由来
のMBPペプチド特異細胞系列の頻度は、事実上全く同様
であり、したがって分析に際しては併合された。選択的
にMBP残基84−102に対して反応性である、MSの被験者由
来のＴ−細胞系列の平均頻度は、コントロールと比較す
るとより高かった（図１）。MSおよびコントロールの被
験者が、MBP残基143−168に対して反応性であるＴ細胞
系列の高い頻度を示した一方で、MBP残基61−82および1
24−142に対する反応性における、注目に値するものの
それほど強烈でない増分もまた、MS患者において観測さ
れた。活性化されたＴ−細胞系列を選択するために、IL
−２が用いられた。IL−２による第１の刺激の後、この
ように活性化された細胞系列はMBPペプチドを認識し
た。

上述の技術を用いて、これらの発見をより数多くのMS
患者に拡張することがなされた。付加的な132のＴ−細
胞系列（MS患者由来のもの63および正常なコントロール
由来のもの88）が研究され、結果は下記の表３に示され
た。要約すれば、これらの結果はMBPアミノ酸残基84−1
02および143−168を含むペプチドをMBPの免疫優性領域
とする結論を支持するものである。

前述の表４の結果は、IL−２を用いたMBP特異Ｔ−細
胞の一次刺激作用において、付加的なMBP特異Ｔ−細胞
クローンが、（コントロールと比較して）MS患者には、
劇的に高い数値で確認されることを証明している。この
ことは、MBP反応性Ｔ−細胞クローンは、IL−２にさら
されることによって非活性化され（おそらくは非アネル
ギー化され）、続いて、MBPペプチドに対して反応性と
なるであろうことを示唆している。

実施例2:免疫寛容の誘導の機構 本例の実験は、誘導あるいは養子移入された際に、MB
Pの異なるフラグメントを用いてEAEの抑制の有効性を比
較し、蛋白質フラグメントの経口のおよび静脈内の投与
とを比較し、疾患の状態の治療を比較するために行なわ
れた。EAEの誘導は、MBPが、宿主を免疫するために用い
られ、アジュバントとともに筋肉内に投与される際に起
こり、その一方で、養子移入された疾患は、MBP反応性
細胞系列が活性化され、その後動物に注射されるさいに
生じる（詳しくは以下のEAEの誘導の章を参照）。本例
では以下の物質および方法を用いた。

動物 ６〜８週齢の雌のルイスラットを、Harlan−Spra
gue Dawley Inc.（インディアナポリス,IN）より入手し
た。動物は、ハーバード大学医学部動物保護施設に収容
され、標準的な実験室の餌および水にリブリュームを加
えて飼育された。動物は実験研究審議会の実験動物の保
護に関する委員会の指針（Pub.＃DHEW:NIH、85−25、19
85年改定版）に従って飼育した。

抗原および試薬 脳の組織由来のモルモットのMBPは、D
eiblerらの修飾法により精製した（Prep.Biochem.２:13
9,1972）。蛋白質含有量および純度は、ゲル電気泳動お
よびアミノ酸分析によって検査した。コンカナバリンＡ
およびヒストンは、シグマ（Sigma）（セントルイス,M
O）より入手した。ペプチドは、神経疾患のためのセン
ターであるブリガムアンドウィメンズ（Brigham and Wo
men's）病院内のペプチド施設にて合成し、HPLCによっ
て精製した。合成されたペプチドのアミノ酸配列は、21
−40,MDHARHGFLPRHRDTGILDS（ラットに経口にて投与し
た際の免疫抑制エピトープ領域）;71−90、SLPQKSQRSQD
ENPVVHF（ラットにおける免疫優性の起脳炎領域）;151
−170,GTLSKIFKLGGRDSRSである。

寛容の誘導 経口の寛容あるいは活性の抑制のために、
ラットは1mlのPBSに溶解した1mgのMBP、あるいはPBSの
みを、ゲージ18のステンレス剛動物飼育針（Thomas Sci
entific,スウェーデスボロ,NJ）を用いた胃の挿管治療
によって与えた。動物は、２、３日間隔で５回、免疫化
の２日前を最後として餌を与えた。静脈内寛容あるいは
クローンアネルギーのためには、ラットは、0.1mlのPBS
に溶解した0.1mgのMBPあるいはMBPペプチドあるいはヒ
ストンか、またはPBSのみを注射した。動物は、目の静
脈から２、３日間隔で５回、免疫化の２日前を最後とし
て注射した。

EAEの誘導 活発に誘導された疾患のためには、ルイス
ラットは、左足の肉趾から、50μｌのPBS中の25μｍの
モルモットのMBPを、4mg/mlの結核ミコバクテリア（デ
ィフコ（Difco）製）を含有する同体積の完全フロイン
トのアジュバンド（CFA）中に乳化したものにより免疫
化した。EAEの養子移入のためには、MBP活性細胞系列
は、Ben−Nunらの方法（Euro.J.Immunol.11:195、198
2）によって飼育し、CFA中のMBPにより免疫化されたラ
ットから樹立した。起脳炎細胞は、APSsとして免疫化し
た動物からとり、放射線を照射した胸腺細胞を用い、コ
ンカナバリンＡ（ConA）（２μm/ml）を加えた培養によ
る活性化の後に採集した。細胞は、フィコールハイパー
ク（ficol hypaque）勾配（Hypaque1077、シグマ社製）
を経て収穫し、移入に先立ち二度洗浄した。５×10⁶の
起脳性細胞は、0.1mlPBS中として、放射線照射した（75
0rad、24時間、earlier）受容体ラットに、腹腔内から
注入した。モジュレーターおよび起脳性細胞双方の細胞
生存可能性は、トリパンブルーによって試験し、90％以
上であった。全ての実験において、各実験グループから
５体の動物を用いた。

経口の寛容に引続く保護の養子移入のためのＴ細胞サブ
セットの精製 リンパ球サブセットの減少は、Cruiksha
nkらの修飾方法（J.Immunol.138:3817,1987）により、
磁気ビーズを用いた負の選択によって果された。ひ臓細
胞は、マウスの抗ラットCD8あるいはCD4単クローン抗体
（OX/8あるいはW3/25はそれぞれセロテック／バイオプ
ロダクツ（Serotec/Bioproducts），インディアナポリ
ス,IN）の1:10希薄溶液とともに温置し、30分間氷冷
し、二回洗浄し、その後平均直径4.5μｍ（Ｍ−450）で
あり、共有結合的にヤギの抗マウスIgGが付着している
（ダイナル（Dynal），フォートリー,NJ）、未洗浄の磁
気粒子に加えた。使用した磁気ビーズの量は、標的細胞
の数を見積もったものの10倍であると推定された。細胞
は、ビーズとともに、10％の子牛の胎児の血清を10mlの
丸底試験官（Nunc）に追加した、0.5mlのRPMI1640培地
にて30分間温置した。５分毎に静かに振とうしながら氷
冷した。温置した後、ビーズ／細胞懸濁は5mlの培養液
で洗浄し、磁気粒子濃縮機（ダイナル−MPC−１）を２
分間用いて強い磁場において、細胞−mAb−ビーズ錯体
は未標識の細胞から分離した。上清を取除き、この操作
を２回繰返して非粘性のフラクションを得た。CD4⁺およ
びCD8⁺において数が減少した細胞は、indirect flow cy
tometoryに証明されたように、＞95％CD4⁺CD8^-あるいは
CD4^-CD8⁺である。MBP飼育の動物およびコントロールの
動物由来の脾臓全体の数は、Con−Ａ（２μg/ml）の存
在化で培養した（1mlの増殖培地中、細胞５×10⁶）。減
少した数は、1mlあたり細胞2.5×10⁶の濃度にて培養し
た。得られたサブセットはモジュレーター細胞として用
いられる。

臨床評価 動物は、EAEの形跡を求めて、目隠し法にて
毎日評価された。EAEの臨床の厳しさは、以下のように
記録された:0、疾患なし;1、尾に生気なし;2、後脚の麻
痺;3、後脚の対麻痺、自制の不能;4、四肢の麻痺;5、死
亡。疾患の持続時間は、疾患の発症（通常は活性免疫化
の後10日か11日、また、疾患の養子移入の後３〜５日）
からの、各動物の完全な回復までの総日数を数えること
によって測定した。

遅延性過敏症（DTH）検査 DTHは、PBSに溶解した25μ
ｇのMBPを耳に皮下注射することによって検査した。目
隠しされた観察者によって、challengeの前と48時間後
に、カリパス測微計（ミツトヨ製，日本）を用いて、厚
さを測定した。実施前と後との耳の厚さの差異は、各動
物に対して記録され、その結果は各実験グループ±SEM
について平均値として表現した。

微細構造 病理変化の微細構造的分析は、ラットにおい
て養子移入EAEを用いて行なった。養子移入の後15日で
脊髄が取除かれ、10％の中性の緩衝ホルマリン中に固定
した。パラフィン切片を調製し、ラクソール（Luxol）
ファーストブルーヘマトキシリンおよびエオジンを用
い、標準的操作によって染色した（Sobelら,J.Immunol.
132:2393,1984）。脊髄組織は、各動物と柔組織および
ミニンジス（meninges）中の切片（20ci以上のより凝集
した炎症細胞のクラスター）毎の数多くの炎症中心につ
いて同一の方法で標本抽出し、目隠し法（Sobelら,supr
a）にて記録した。

統計的分析 臨床のスケールは、記録標本について二末
端の（two−tailed）ウィルコクソン ランク サム
テスト（Wilcoxon rank sum test）により分析し、カイ
二乗解析（chi square analysis）を用いてグループ間
で疾患の発生率の比率を行い、方法の比較はスチューデ
ントｔ−検定によって行なった。個々の実験には、グル
ープごとに動物５体を用いた。

結 果 MBPへの経口の寛容による、養子移入されたEAEの抑制
養子移入EAEに対する、先のMBPの経口投与の効果を評価
するために、MBP飼育のラットおよびコントロールのラ
ットは、５×10⁶のMBP特異的でCon−Ａにより促進され
た起脳炎性系列細胞を、腹腔内から接種した。最後の餌
を与えて２日後にMBP反応性の細胞を移入した。図2Aの
グラフは、MBPに対して経口にて寛容化され、その後MBP
特異細胞（黒丸）を接種された動物の臨床記録と、これ
に相応する同様に接種を受けた未治療の動物の臨床記録
である。この表に示されるように、MBPの経口投与は養
子移入されたEAEに対して何の効果も及ぼさなかった。
本発明者らは、養子移入されたEAEを抑制しようとの経
口の寛容化が失敗に終ったことは、移植された起脳炎性
Ｔ細胞が活性化され、敏速に標的器官に移動することが
でき、その器官において充分な数の抑制Ｔ−細胞に先立
って免疫攻撃を開始することによると提唱している：リ
ンパ節に移動し；さらに（iii）は、標的器官（脳）に
移動する。したがって、起脳炎性細胞に対する調節の割
合は標的器官に表れ、これらが侵入するタイミングはき
わどいようである。しかし、経口にて寛容化された動物
由来の脾臓細胞が起脳炎性細胞とともに未治療の受容体
に同時転移した際、養子移入されたEAEは抑制され（図2
B）、既誘引の抑制Ｔ細胞は、たとえこれらが免疫攻撃
細胞と同時投与された場合でもうまく疾患を避け得るこ
とを示唆している。

図2Bは、起脳炎性細胞５×10⁶と、MBPに対して経口に
て寛容化された動物由来の脾臓細胞1.5×10⁶を同時に注
射した動物の臨床記録を示している。同時転移のために
は、経口にて寛容化された動物由来の細胞は、起脳炎性
細胞と混合して、注射した（黒丸）。同じく図2Bに示し
たように、起脳炎性細胞およびモジュレーター細胞が別
々に左右の隣接領域に注射した際に類似の保護が観察さ
れ、このことは、保護効果が抑制Ｔ−細胞と攻撃Ｔ−細
胞との相互作用によるものではないことを示唆してい
る。正のコントロール動物の臨床記録は、図2B中に黒四
角により示されている。

養子移入されたEAEの抑制は、経口にて寛容化された動
物由来のCD8⁺T細胞に依存している。 養子移入されたE
AEの抑制が、特異Ｔ−細胞サブセットに依存しているか
否かを決定するために、養子移入に先立ってMBP給餌動
物由来の脾臓細胞がCD4⁺あるいはCD8⁺T細胞サブセット
において消耗され、モジュレーターとして用いられた。
図４に示されるように、保護の養子移入は、CD4⁺を消耗
した脾臓細胞の転移によってではなく、CD8⁺を消耗した
脾臓細胞の転移によって撤廃された（平均最大記録＝2.
3±0.2vs.0.7±0.2、各々ｐ＜0.01）。白四角：非選択
的脾臓細胞数、黒丸CD4⁺を消耗した脾臓細胞、白丸CD8⁺
を消耗した脾臓細胞。

養子移入されたEAEに関連する遅延性過敏症（DTH）反応
DTH反応および、経口的な寛容化に続き、活性に誘導
されたEAE抑制の相関関係が見出された（Millerら,J.Ex
p.Med.174:791,1991;ミラー他,Proc.Natl.Acad.Sci.89:
421,1992）。養子移入されたEAE中に類似の相関関係が
存在するか否かを決定するために、DTH反応を測定し
た。図４に示すように、傑出したDTH反応は、養子移入
されたEAEに苦しむ動物中で発生し、DTH反応は、MBPに
対して経口に寛容化された動物由来のスプレノサイトの
同時移入によって抑制された。抑制されたDTH反応は、
転移に先立って、CD4⁺T細胞ではなくCD8⁺の消耗によっ
て撤廃された（耳の腫脹率 CD4⁺消耗vs. CD8⁺消耗＝
0.6±0.1 vs. 1.8±0.2、ｐ＜0.01）。

養子移入されたEAE中のCNS微細構造における、経口にて
寛容化された動物のMBP由来の細胞の同時転移の効果 M
BPの経口投与は、活性に誘導されたEAEにおけるCNSの炎
症を抑制する（Higginsら,J.Immunol.140:440,1988）。
それにもかかわらず、臨床疾患を抑制するEAEの免疫特
異的免疫モジュレーター治療が、すべてCNSの炎症に影
響を与えるわけではない（Offnerら,Science 251:450,1
991）。図５に示されたように、柔組織とミニンジスと
のいずれにおいても、MBP給餌の動物由来の細胞が転移
された際に炎症の減少が見られ、経口にて寛容化された
動物由来の、CD8⁺を消耗したモジュレーターひ臓細胞が
転移された場合ではなく、CD4⁺を消耗したものである場
合に、このような抑制が観察された。特異グループにつ
いてのCNS（柔組織およびミニンジス）炎症中心の数値
は、以下の通りである：コントロール＝76±8.2;MBP給
餌＝3.8±1.8;CD4⁺消耗＝2.8±1.0;CD8⁺消耗＝65±4;
（ｐ＜0.01、MBP給餌およびCD4⁺消耗vs.コントロールあ
るいはCD8⁺消耗） MBPのIV投与の結果としての、活性に誘導され、養子移
入されたEAEの抑制 図6Aに示されるように、MBPの（I
V）静脈内注射は、MBPを用いた経口の寛容化による抑制
と類似の方法でのMBP/CFAを用いた免疫化によって（平
均最大記録＝0.5±0.2、vs.ヒストンを注射されたコン
トロール＝3.0±0.3;p＜0.01）、明らかに活性に誘導さ
れたEAEを抑制した。しかし、養子移入されたEAEに対し
て保護をしなかった（図2A）経口の寛容化とは対照的
に、MBPのIV注射は、養子移入されたEAEをも抑制した
（平均最大記録＝0.4±0.2、vs.コントロール＝3.2±0.
2;p＜0.01）（図6B）。しかし、経口の寛容化とは異な
り、このような細胞が、MBP起脳炎性細胞系列によって
同時転移される場合でも、疾患保護はIV寛容化動物由来
の脾臓細胞によって養子移入され得ない（平均最大記録
＝2.8±0.2、vs.コントロールｐ＝N.S.（図6B）。

MBPペプチドの経口あるいはIV投与の結果としてのEAEの
抑制 経口のvs. IV寛容の機構をさらに研究するた
め、MBPの起脳炎性および非起脳炎性のいずれの領域を
も取囲むMBPペプチドを、活性に誘導された疾患に対す
る免疫化に先立って経口的および静脈内に投与した。モ
ルモットMBPのMBPペプチド71−90は、ルイスラットにお
いて起脳炎性であった（Swanborgら,J.Immunol.114:19
1,1975）。図７に示されたように、IV寛容化を経るEAE
の抑制は、モルモットMBPペプチド21−40によってでは
なく、全MBPおよび起脳炎性のペプチド71−90によって
のみ起こった。しかし、21−40による経口の寛容化はEA
Eの抑制に効果的であった。全MBPに対して経口的に寛容
化されたラットのひ臓細胞からTGF−βを遊離すると実
験で証明されたことから、モルモットペプチド21−40が
選択された。Miller,A.ら,FASEB ６:1686,1992。コント
ロールのモルモットMBPペプチド131−150は、投与され
た際、経口でも静脈内でも抑制しなかった。記録では、
IV経路を経る抑制に加えて、経口で与えられた際には起
脳炎性MBPペプチド71−90もまた抑制する。この結果
は、与えられたMBPの、与えられた宿主に対する免疫優
性領域から誘導されたペプチドは、経口的あるいは静脈
内投与された際にＴ−細胞機能を抑制し得るが、投与の
経路およびプロトコールによって異なる機構によって行
なうべきである。これらの実験の結果は、経口的と非経
口的（例えば静脈内の）なMBP投与との間には、EAの抑
制機構に根本的な相違があることを示している。結果
は、経口投与された抗原が、活性抑制の世代を経て優勢
に作用し、これに反して非経口投与された抗原は、クロ
ーンアネルギーを経て作用ことを示唆している。具体的
にこの結論を支持するのは、IV寛容化された動物由来の
脾臓細胞が、養子移入されたEAEを抑制できないことで
ある。加えて、投与の経路が別々な抑制において、別々
のMBPのフラグメントが多かれ少なかれ効果的であった
（例えば、図７参照）。本発見は、本発明の方法のよう
に抗原制御寛容に基づく免疫抑制法の計画において利用
することができる。

実施例 3:MBP特異的Ｔ−細胞クローンを刺激する重複
ペプチドの能力を評価することによる、ヒトにおけるヒ
トMBPの免疫支配的なエピトープの決定のファインチュ
ーニング 上記の実施例１で示された細胞増殖活性測定を用い
て、ヒトMBP（すなわち、アミノ酸84−102の配列）の免
疫優性領域を有するペプチドにおけるＴ−細胞の増殖を
刺激する能力を評価し、免疫優性領域のＮ末端とＣ末端
が少しずつ進んで切断されたアミノ酸配列を有する一連
のペプチドの能力と比較した。図８に示すように、（お
よび以下の表５に示すように）試験されたＴ−細胞の系
列は、アミノ酸85位までＮ末端が切断されたものを用い
たときに増殖し、その後、増殖を活性化する断片の能力
において急激な減少があった。

少しずつ進んだＣ末端の切断は速く急激に刺激能力に
影響を与え、そこでは、わずか99残基までの切断のみ
が、エピトープの機能に実質的な影響を与えない。Ｃ末
端の切断がない場合、図８に示すように、アミノ酸85お
よび86の欠如もまた、試験されたクローンによって寛容
されると思われる。図９において、異なるペプチドが異
なるクローンの増殖に差異を生じるかどうか調べるため
に、４つの異なるＴ−細胞のクローンが、全体のMBP84
−102ペプチドと、85−99および86−97のペプチドとに
さらされた。各々のクローンは、本来、エピトピックペ
プチドの存在下で増殖するための異なる能力を持ってい
るが、それにもかかわらず、クローンに増殖を引き起こ
す特有のペプチドの能力は、質的にはどのクローンでも
似通っていた。これらの研究から、アミノ酸85−99の断
片は、全てのＴ−細胞クローンにとって、Ｔ−細胞の活
性を刺激することができる最小の免疫支配的な断片を成
すと思われる。

以下の表５は、MBP（84−102）ペプチド、およびこの
ペプチドの切断または修飾されたものの存在下で、ヒト
MBP（84−102）特異的Ｔ−細胞クローンが増殖するため
の能力を示している。表中における数字は、Ｔ−細胞ク
ローンの最高刺激の50％を与えるペプチドの濃度（マイ
クロモルで表示）である。Ｔ−細胞クローンの最高刺激
は、修飾および切断されていないMBP（84−102）ペプチ
ドにさらして評価されたものである。太字は、“50"お
よび“＞50"が、修飾および切断されていないMBP（84−
102）ペプチドと比較して、刺激による活性が５倍また
は５倍以上低下したことを意味することを示している。

最高刺激（参照点:MBP（84−102）ペプチド）の50％
を与えるペプチドの濃度（μＭ）が与えられている。MB
P（84−102）ペプチドと比較して活性における５倍以上
の低下。

実施例 4:MBP 85−99に反応するＴ細胞クローンのア
ラニンアナログペプチドのＴ細胞認識 図11は、各々のペプチドの、MHC（左の列）およびＴ
細胞クローン（右のパネル）への結合を示している。DR
B1＊1501が導入されたＬ細胞が、オートリアクティブ
（autoreactive）Ｔ−細胞に、免疫支配的なMBP（84−1
02）ペプチドを与える。

APCは、Ｂ細胞株に対してMBP（84−102）ペプチド（1
00μg/ml）で、DR導入体に対して50μg/mlを用いてパル
スされ、5000radで放射線を照射し、３日間Ｔ−細胞ク
ローンとともに培養し、さらにチミジンパルスを行っ
た。

その結果（固有のペプチドと比較した³H−チミジンの
取り込み（uptake））は、黒い長方形（最高刺激の90
％）、斜線付きの灰色（＞最高刺激の50％）、明るい灰
色（＞最高刺激の10％）、および白（活性なし）で表さ
れている。その結果は、898位のValと92位のPheとが、M
HCの結合に関与することを示している。切断されたペプ
チドのデータは、95位のイソロイシンもまたMHCの結合
に関与することを示唆する。Ｔ−細胞受容体の接合部
は、90位のHis、91位のPhe、および93位のLysが含まれ
ている。

Ｔ細胞クローンHy.2Ellは、93位のLysの位置にArgを
置換することに対して寛容であるが、Ob T細胞クローン
はそうではない。

DRB1 1501とDRB5 0101とに対して提案された結合配列
が、図10に示されている。

上向きの矢印はDR受容体への結合を示し、下向きの矢
印はACPのMHCへの結合を示している。

一連のアナログペプチドは、使用される88−95位で、
保守的および反保守的なアミノ酸の置換体に合成され
る。

たとえは、マイナス電荷を有するアスパラギン酸は、
他のマイナス電荷を有する残基（グルトミックアシッド
（glutomic acid））で置換され、あるアミノ酸は電荷
を持たない同じ体積のもの（アスパラギニン（asparagi
nine））で、あるアミノ酸は逆の電荷を有するもの（Ly
s）で、そして最後にalaのような小さいアミノ酸で置換
されたものである。直前には、60のペプチドが合成され
る必要がある。

予備のデータは、MBPの148−162領域が、支配的なエ
ピトープ143−168に対する最小のエピトープであること
を示唆している。このペプチドの中核の領域が、実施例
２および３で概説された方法、MBPペプチド85−99に対
するこの実施例４で概説されたものと類似する解析を使
用して決定される。

アナログペプチドは、DR26−（DRB1 1501）、DR2a−
（DRB5 0101）、DR4、DR7、およびDQ1.1の結合に対して
解析される。この解析は、どのアミノ酸残基がMHCの結
合に関与するか、さらに深く解明するものである。自然
のペプチドの10倍ほどの結合能を有するアナログペプチ
ドは、Ｔ−細胞レセプターの特異性を調べるために使用
される。

実施例 5:方法 MBPは、（Chou,F.C.−H.et al J.Biol.Chem.251:267
1,1976）に示されている通り、ヒトの脳組織から抽出さ
れ、最大の分子量のピーク（18kD）を用いたCM−52カラ
ムで精製された。MBPペプチドは、固相法で合成され、
商業的研究所（Biosearch Lab Inc.,San Raphael,CA）
から得て、高圧液体クロマトグラフィーによって精製さ
れた。使用されたMBPペプチド断片は、以下の表６に示
されている。

Ｔ細胞受容体TCR VB遺伝子のユーセイジは、TCR VBプ
ライマーのパネルを用いた複製連鎖反応（PCR）増幅、
それに続くサザンブロッティングによって決定された。
Ｔ−細胞株は、MBPを用いた二次刺激によって末梢の血
液の単核細胞から確立され、次いで免疫支配的なヒトMB
Pペプチド（アミノ酸残基84−102）で刺激され、その免
疫支配性は、13の重複するMBPペプチドの表６のパネル
を使用して、（実施例６に示すような）増殖活性の測定
によって決定された。それらの特定のMBPペプチドを用
いた三次刺激に続いて、RNAが、MBP反応性Ｔ−細胞培養
ペレット（20、000−50,000個体の細胞）から、グアニ
ジウム−イソチオシアネート／フェノール−クロロホル
ムを用いた抽出、およびキャリアーtRNAの存在下でイソ
プロパノール沈降により抽出された。一本鎖cDNAは、オ
リゴdTとAMV逆転写酵素（双方ともBathesda Research L
aboratories,Gaithersburg,MDから商業的に入手）とを
用いて合成された。PCR（1989年１月24日に発行された
米国特許第4,800,159号;1987年７月28日に発行された第
4,683195号；および1987年７月28日に発行された第4,68
3,202号に開示された複製連鎖反応）増幅は、TCR B鎖の
CDR2領域およびCB（Ｂ鎖の不変領域）プライマー（表
７）に一致する19のオリゴヌクレオチドのパネル（公表
されたTCR VBファミリー−−VB1−20、表７に対して特
異的な）を用いて行われた（以下に示されているものに
従っている、Tilinghast,J.P.ら,Science 223:879,198
6;Concannon,P.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.83:6598,1986;K
imura,ら,J.Exp.Med.164:739,1986;Toyonaga,B.ら,Pro
c.Natl.Acad.Sci.82:8624,1985;Kimura,N.ら,Eur.J.Imm
unol.17:375,1987）。増幅は、50μｌの反応に各々のプ
ライマー１μｇを用いて、30サイクル（94℃で１分、55
℃で２分、72℃で３分）行った。増幅産物は、１％アガ
ロースゲルで分離し、ニトロセルロースに転写し、内部
のオリゴヌクレオチドTCR−CBプローブでサザンブロッ
トを行った（表７）。プローブは、³²PガンマATPとT4ポ
リヌクレオチドキナーゼ（Bethesda Research Labs.）
とを用いて、その比活性が10⁸cpm/ugになるように標識
し、6xSSC/5x Denhardt's/0.05％ピロリン酸/100ug/ml
の変性したDNA/0.5％SDSに18時間37℃の条件下でハイブ
リッド形成した。ブロット（blots）は、6xSSC/70℃の
最終的に厳重に洗浄し、２−18時間オートラジオグラフ
ィーを行った。二つ以上のVB断片に陽性なＴ−細胞株
は、単一のMBPに反応するＴ−細胞から導かれたもので
はないとみなされ、解析から除外した。

配列決定に際して、cDNAの増幅は、内部にPst I制限
部位を有するリーダー断片に特異なVB17プライマー（表
７）を用いて行った。増幅されたDNAは、プロテイナー
ゼＫで処理し、フェノール／クロロホルム抽出し、エタ
ノール沈降し、制限エンドヌクレアーゼBgl IIおよびPs
t I（商業的に入手される、例えば、Bethesda Research
Lab.,supraから）で切断した。ゲルで精製したDNAは、
M13 mp18に連結し、一本鎖DNAは、ジデオキシ法（Sang
er,F.,ら,1977,Proc.Nat'l.Acad.Sci.,74:5463）によっ
て配列決定した。ネガティブコントロール（Nagative c
ontrols）は、RNAの試料またはcDNAの合成および増幅に
使用される試薬に起こり得る不純物の混入を調べる手段
に含まれる。使用したVB、CB、およびJB2.1プライマー
の配列は、以下の表７に示す。

増幅および増幅されていない試料は分けて扱われ、試
薬は分注されて、増幅された物質の存在が調べられ、ネ
ガティブコントロールは異なる実験段階（RNAの単離、c
DNAの合成、PCR増幅）として含まれた。

実施例 6:MS患者から単離されたＴ−細胞のVB遺伝子の
同定 上述の言及の妥当性を調べるために、二種類の実験が
行われた。第一に、VB20を除く表７の全てのプライマー
が、末梢血液のＴ−細胞からのcDNAを増幅することがで
きた（図12）。第二に、PCR増幅の特異性が、マイトジ
ェン（例えば、フィトヘマグルチニン−−“PHA"−−お
よびインターロイキン−２）を用いた単一細胞のクロー
ニングによって前もって確立された69の独立したＴ−細
胞クローンにおけるVB遺伝子のユーセイジの解析により
調べられた。得られた高度のクローニング効果のため
に、これらのクローンは、末梢血液のＴ−細胞の間でVB
遺伝子のユーセイジの典型的な解析を与えた。これらの
Ｔ−細胞クローンの65/69（94.2％）が、TCR VBのレパ
ートリーのかなりの割合がVB9プライマーによって覆わ
れていることを示していると、TCR VB遺伝子ユーセイジ
は決定され得る。これらのうち58のクローン（84％）
が、単独のVBに陽性であり、７つのクローン（10.1％）
が、おそらく二つの転移および発現されたTCR VB遺伝子
の存在のために重複した陽性を示した。

TCR VB遺伝子のユーセイジは、さらに、臨床的に再発
性レミティングMSと診断された５人の患者から確立され
た65のMBP特異的Ｔ細胞株で解析された。MBP反応性Ｔ−
細胞株からの典型的なサザンブロットが図12に示され、
解析された全ての細胞株に対するVB遺伝子のユーセイジ
が以下の表８に示されている。

これらのうち51の株は、MBP残基84−102と反応し、一
方14のＴ−細胞株がMBP残基143−168に特異的であっ
た。MBPアミノ酸残基84−102と反応する31のMBP T−細
胞株が、MS患者Hy（患者１、表８）から解析された。こ
れらのうち23のＴ−細胞株（74％）は、VB17遺伝子断片
を使用することが明らかになり、一方で、他の８つの細
胞株はVB2、VB7、もしくはVB14遺伝子断片によって制限
された。これらの結果は、VB17が、MBP残基84−102と反
応するこのMS患者のＴ−細胞株における一般的な認識要
素であることを支持している。VB17のユーセイジは、他
の４人の患者（患者２−５、表８）から調べられた6/20
T−細胞株の間でもまた発見された。これらの４人の患
者の間のＴ−細胞株によって使用された第二のTCR VB
は、MBP残基84−102と反応する7/20T−細胞株に見られ
たVB12であった（表８、図12）。このVBは、マウスやラ
ットで起脳炎Ｔ−細胞の間で使用される支配的なTCRで
あるマウスVB8.20に、たまたま相同性がある（Burns,F.
R.et al.,J.EXP.Med.169:27,1989）。

MS患者Cyは、DR2およびDRw11抗原の両方を提示し、そ
のため、免疫支配的なMBP領域（84−102残基）またはMB
P143−168残基を認識するＴ−細胞を有していた。この
ことは、異なるMBP決定因子と反応するＴ−細胞の間
で、TCR VBのユーセイジを比較するための機会を与えた
（図12）。MBP残基84−102に対して増殖する７つの株の
うち、３つはVB12を発現し、一つはVB17を発現した（表
８）。対照的に、MBP残基143−168を認識する6/9T−細
胞株は、VB14を使用した。たった一つの株のみがTCR VB
12とVB17TCR遺伝子を使用した（表８）。MBP残基84−10
2（VB12:Cy.2C2、Cy.3F6）またはMBP残基143−168（VB1
4:Cy.1E6、Cy.2B12、Cy.2E2）と反応する５つのＴ−細
胞株のサザンブロット解析は、図12に示されている。

VB12/VB13は、定量的なPCRによる算定によれば、正常
な末梢血液Ｔ−細胞の間で相対的に共通であり（約18
％）、VB17はかなり少ない頻度（約３％）である。これ
と対照的に、VB17は、MBP残基84−102に反応するＴ−細
胞株の34/63（53.9％）に見られ、一方、それは、正常
な個体の単一細胞のクローニングによって得られた、不
規則なマイトジェンによって引き起こされたＴ−細胞ク
ローンにおけるTCR VB遺伝子の3/32（9.4％）に現れる
だけであった（Moretta,A.ら,J.Epp.Med.157:743,1983;
Hafler,D.A.ら,J.Exp.Med.167:1313,1988）。これらの
データは、VB17 TCRが、免疫優性MBP84−102領域の認
識に選択的に関与することを示している。

PCRによって同定されたTCR遺伝子断片が、MBPペプチ
ドの認識に使用されるVBをコードする遺伝子であること
を示すために、二つのVB17陽性Ｔ−細胞株（Hy.2H9とH
y.2G5）が限界希釈法によってクローンされた（Morett
a,supra.）。MBPおよびMBP残基84−102の両方に反応す
る、これら二つの細胞株から確立された11/11の個々の
クローンは、VB17＋であった。これらのクローンの３つ
は、VBプライマーの完全なパネルを用いてさらに解析さ
れ、他のVB断片には全てが陰性であることがかった。

患者Hyから得られた４つのＴ−細胞株のVB配列は、公
開されたVB17配列に100％相同するものであることがわ
かった（Kimura,N.ら,Eur.J.Immunol.17:375,1987に明
かされた）。この配列解析は、特異的なVB断片が確かに
このアプローチを使用して増幅されることを確証する。
VDJ（多様的結合（diversity−junctional））配列の解
析は、これらの４つ全てのＴ−細胞が同じ結合JB2.1断
片を使用し、それらの3/4が同じDVJ配列を有することを
示した（表７）。どのくらいの頻度でJB2.1遺伝子断片
がVB17＋Ｔ細胞に使用されるかを決定するために、MS患
者Hyから得られた20細胞株のDNAが、CBプライマーまた
はJB2.1プライマーと組み合わせたVB17プライマー結合
体を用いて増幅した（図13）。これらの株の全ては、JB
2.1遺伝子断片はもちろんVB17にも陽性であることがわ
かった。一方、陰性コントロール（全ての細胞株から抽
出され、cDNAに変換されていないRNA、および、cDNAの
合成と増幅とに使用された試薬）は、PCRおよびサザン
ブロッティングによって陰性であった。これらのデータ
は、患者Hyから得られた、MBP残基84−102反応性Ｔ−細
胞株における、VB17−JB2.1配列因子に対する強力な選
択性を示している。

PCR解析によって同定されたVB17 TCRを使用し、か
つ、MS患者FnおよびNsから得られたMBP残基84−102を認
識する他の二つのＴ−細胞株が、配列決定され、MS患者
Hyから得られたTCR VBの配列と比較された（表８）。V
B17遺伝子断片配列は、３人の患者から得られたMBP残基
84−102に反応するＴ−細胞の間で同様であるが、異な
るJB配列因子が発見された。３つの結果は、異なる個体
間で免疫支配的なMBPペプチドを認識するＴ細胞におけ
る共有されたVB遺伝子ユーセイジを示している。これと
は対照的に、共有されたJB遺伝子断片ユーセイジは、異
なる個体間からではなく、同一の個体から得られたＴ−
細胞の間で見つかった。

研究した５人の患者のうちの４人が、病気と関係のあ
るDR2対立遺伝子に陽性であったが、患者TwはHLA−DR
3、DR4であった。それにも係わらず、３つのVB12/VB17
制限された細胞株は、このMS患者から解析された４つの
株の間に存在し（表８）、共有されたMHCクラスII抗原
が、MBPペプチド84−102を認識することに関して、共有
されたTCR VB遺伝子ユーセイジに対して命令とならな
い可能性があることを示している。

実施例 7:ヒトMBPの主要な免疫支配的領域の同定 急速なＴ−細胞クローニング技術は、クラスII MHC表
現型と反応するヒトMBPにおける免疫支配的エピトー
プ、および、そのような反応の頻度があるかどうかを確
かめるために使用された。15、824の短期培養されたＴ
−細胞株の全体が、精製されたMBP（上述の実施例５に
示すようにして得られた）を用いた末梢血液単核細胞
（PMN）の培養、および３日後、そしてさらに３−４日
ごとにインターロイキン−２（IL−２）とインターロイ
キン−４（IL−４）（Genzyme,Boston,MA）を添加する
ことによって、51の被験者からもたらされた。培養の13
日に、個々の株の一定量でMBPに対する反応について調
べた。MBPに反応する株は、さらに、上記表６に示され
たようなヒトMBP配列を含む重複するオリゴペプチド20
マーに対する反応性を調べた。MHCの制限の実験のため
に、MBPペプチドと反応する株は、最初はMBPによって、
次はその株によって確認される特異的なMBP断片によっ
て、２回以上のサイクルで刺激した。患者のサブグルー
プにおいて、プロテオリピドタンパク質（PLP）、他の
主要な起脳炎中枢神経系抗原、を認識するＴ−細胞の頻
度を調べた。

MBPおよびPLPの頻度の解析が、他の神経的な疾患を有
する被験者および正常な被験者（全ての年齢および性別
はMS患者に対応したものである）はもちろん、明確な再
発性レミティングMS（磁気共鳴像−−“MRI"−−および
臨床試験によって診断された）を保有する患者で実施し
た。この結果を以下の表8Aに示す。

MSを有する患者は、白人で、過去24ケ月以内に少なく
とも２度の悪化症状があり、よく特徴付けられた再発性
レミティング症状を有し、磁気共鳴像（MRI）で採血す
る際の積極的な傷を有していた。他の中枢神経系疾患を
有する患者は、次の症状を有していた：セレブロバスキ
ュラー アクシデント（cerebrovascular accident）
［４］またはCNSヘモルヘイジ（hemorrhage）を伴った
脳トラウマ（trauma）［４］から１−３週間後；メタス
タティック（metastatic）脳腫瘍［２］。MBPまたはPLP
と反応するＴ−細胞株の総数、およびもたらされたＴ−
細胞株の総数は、表8Aに示されている（“Ag"は“抗
原”を意味する）。加えて、MBP−およびPLP−反応性株
の頻度が、もたらされた株の総数に対してMBP反応性株
の数を分けることにより、個々の被験者ごとに個別に算
定され、中間値±SEMが与えられた。

MBP反応性株の頻度は、他の患者と比較して、MSを有
する患者でわずかに高くなっているが、このことは統計
的に重要ではない。他の神経的な疾患を有する患者と比
較して、MSを有する患者ではPLPに対してより反応性が
高かったが、このこともまた統計的に重要であるほどの
ものではない。

発展させられ、繰り返し行われた解析でMBPと反応す
ることが確信された、MSを有する患者から得られた総数
302の細胞株のうち、140（46.4％）がMBP残基84−102に
反応した。対照の組では、総数100のMBP反応性Ｔ−細胞
株の11（11.％）が、このMBPペプチドを認識した。個々
の被験者に対する、個々のMBPペプチドと反応する末梢
血液から得られたＴ−細胞の実際の頻度が算定された。
MSを有する患者および対照の被験者の平均値が、表8Aの
右から２番目の列に示されている。

50,000のＴ−細胞株は、50,000のＸ線照射されたAP
C、MNC（単核細胞）（Hafler,D.A.ら,J.Exp.Med.167:13
13,1988）とともに３通に、96ウェルのミクロタイター
プレートの丸い底に72時間の間入れ、培養の最後の18時
間にウェルを［³H］−チミジンでパルスした。APC MNC
は、単独で培養、または、合成MBPペプチド84−102の10
0μg/ml（増殖を促進するペプチドの最適の濃度である
ことが決定された）とともにパルス、または、100μg/m
lのMBPとともにパルスした。３通のウェルに対する係数
効率（counts per minute）（CPM）の平均値を表９に示
す。DRおよびDQwハプロタイプが与えられ、DR2、DR7、D
Qw1、DQw3に陽性である患者（最上の行）に共通のハプ
ロタイプには、下線を付した。

抗原提供細胞（APC）として、異なる単核細胞（MNC）
のパネルを使用するＴ−細胞株の増殖が示されている。
被験者Hyから得られたMBPアミノ酸残基84−102に反応す
る５つのＴ−細胞株が、オートロガスＸ線照射されたMN
Cを用いた刺激の周期的な繰り返しによって発育せら
れ、合成MBPペプチド84−102でパルスし、MBPのこの領
域の認識に対する調査を行った。

これらの研究のために、MBP残基84−102と反応する５
つのＴ−細胞株のパネルが、オートオートロガス（auto
autologous）APC MNCとともに、上述のように、異なる
MHCクラスII遺伝子の産物を認識するモノクローナル抗
体（mAbs）（1:100の終濃度）の存在下でまかれた。
（抗体に使用されている専門語は、Tenth Internationa
l Histocompatibility Workshop;それらの特異性もまた
与えられている。）結果は、以下の表10に示されてい
る。

正常な被験者と他の神経的な疾患のある対照とから得
られたペプチド特異的細胞株の頻度は、ほとんど同一で
あり、従って解析に組み合わせられた。MBP残基84−102
に選択的に反応するMSを有する被験者から得られたＴ−
細胞株の頻度の平均は、対照と比較してより高いもので
あった（図１）。MBP残基61−82および124−142に対す
る反応において、かなり著しい増加は、MS患者において
も観察されたが、一方で、MSと対照の被験者の両方が、
MBP残基143−168と反応するＴ−細胞株の高度な頻度を
示した。DR2、DQw1ハプロタイプは、対照の被験者では
非常に稀で、MSを有する患者ではより共通性がある（表
９）。DR2の表現型と、MBP残基84−102に反応するＴ−
細胞株の割合または頻度の双方との間の結合が観察され
た（図14）。

MBP残基84−102に対するＴ−細胞の反応性は、MSを有
していない被験者におけるDR2、DQw1の発現と関連する
かどうかを決定するため、DR2、DQw1の表現型を有する
付加的な６人の正常な被験者を調査した。この結果を図
14に示す。

MBP残基84−102と反応するＴ−細胞株の割合の見地か
ら、DR2の結合もまた、対照の間で観察されたが（DR2＋
対照、31.0±10−.8％;DR2−、10.1±0.4％）、MBPのこ
の領域と反応する株の全体の頻度は、MSを有する患者の
ものより少なかった（図14）。DQw1は、DR1およびDQw10
とはもちろん、DR2と結合が解離した状態にあるが、ペ
プチドとの反応における個々の解析では、DQw1表現型と
の結合は全く示されなかった。

DRw11表現型は、MSを有する被験者より、対照におい
てより一層共通性がある（表8A）。DRw11は、MBP残基84
−102と反応する株の頻度とではなく、MSを有する患者
および対照におけるMBP残基142−168に反応する株の頻
度と積極的に結合される（図13）。MBP残基31−50に対
する反応、対照の被験者で予め観察されていたこと、
は、DRw11と関連付られた。他のMHCの結合は観察されな
かった。

免疫優性MBPエピトープと反応するＴ−細胞株の残基
に結合するMHCを決定された。その結果は、以下に表10
に示されている。より明確に、MHCハプロタイプが、免
疫優性エピトープと反応するＴ−細胞系内の抗原を提供
するために使用されるかどうかを決定した。

MBP残基84〜102と反応する５つのＴ細胞系のモノクロ
ーナル抗体阻止の研究は、DR分子およびDQ分子の両方が
制限要素として作用しうることを示唆した。抗DR mAb
によって阻止されたクローンの中で、クローン2E11は、
MBP残基84〜102に反応して、DR2＋APCのパネルで増殖
し、一方、2C9および2H9は、自己由来のAPCでのみ増殖
した（表10）。クローン1A8および3A10によるペプチド
の認定は、これらのクローンは抗DQ mAbによって部分
的に阻止されており、DQw1を発現する２つのAPC供与体
患者のうちのいずれか１つおよび反応体からのAPCに制
限された。

MHC発現と、免疫優性MBPエピトープに対するＴ−細胞
反応の頻度との関係をさらに調査するために、DR2およ
びDRw11表現型の両方を発現する症状に苦しむ同胞種を
有するファミリーが研究された。

DR2、DQw1;DQw11、DRw52、DQw1クラスII MHCハプロタ
イプを発現するMS患者のファミリーメンバーを、MBP残
基84〜102および143〜168と反応するＴ−細胞の頻度に
ついて試験した。

1,728個体のＴ−細胞株の総計は、両方の親および４
つの同胞種から生じ、MBPペプチド84〜102または143〜1
68のいずれかと反応する株（lines）の数を定量した。

288ウェル（96ウェル丸底プレート３枚）それぞれの
中の、２×10⁵MNCを、それぞれの試料について上記で概
説したように、MBP（10μg/ml）とともに培養した。16
日目、それぞれのＴ−細胞株を、MBP残基84〜102および
143〜168に相当する合成ペプチドとの反応性について分
析した。試料毎に生じた、それぞれのペプチド（作用イ
ンデックス SI＞３、デルタ CPM＞500）と反応する株
の数を示す。実際の作用インデックスは、およそ＞20で
あった。P1およびP2＝両親;S1〜S3＝同胞種である。結
果を下記の表11に示す。

DR2＋、DRw11＋患者は、MBP残基84〜102および143〜1
68の両方と反応するＴ−細胞株の頻度が高かった。DRw1
1＋親は、選択的にMBP残基143〜168を認識し、一方DR2
＋親は選択的にMBP残基84〜102を認識した。しかしなが
ら、MBPペプチド反応性株の頻度は、患者のそれよりも
低いものであった。１つの同胞種はDR2＋であり、選択
的にMBP残基84〜102を認識した。DR4、DQw3/DRw6、DQw1
を有する、２つのHLA同一同胞種のうち、１つはMBPペプ
チド84〜102に反応したのに対して、他方は反応しなか
った。DQw1はMBP残基84〜102の認識を制限しうるが、引
き継がれたTCR多型性のような他のファクターは、DR4、
DQw3/DRw6、DQw1同胞種の１つにおける、MBP自己抗原に
対するＴ−細胞反応性に影響しうる。このファミリー連
鎖分析によって、免疫優性MBPエピトープの最適な認識
は、MSを有する患者においても、またその照射において
も、特異的なクラスII MHC対立因子を要求することが示
唆された。全体的に、これらの研究は、DR2を発現する
対照試料が、DR2＋ MS患者と比べて同じMBP決定基を選
択的に認識するようにみえるが、それらの血液中におけ
る頻度は、MSを有する患者のそれに比べて少ないことを
示している。

実施例 7A:VB17 TCRの配列決定 ６つのクローン化されたＴ−細胞株からの、Ｔ−細胞
レセプターVB17＋PCR生成物は、上述のようにジデオキ
シ法によって配列決定し、実施例５で、MBP残基84〜102
（患者Hy、Fr、およびNs）と反応した。DNAを、上記実
施例５に記載したように、VB17リーダー配列およびTCR
CB領域について、PCRプライマーを用いて増幅した。
その増幅されたDNAを、M13にクローン化し、周知のジデ
オキシ法（Ｔ−細胞株毎に、３ M13プラーク）を用い
て配列決定した。その結果を、下記表12に示す。

上記において、MS患者Hyから樹立された４つのＴ−細
胞株すべてのVB17配列は、公開されているVB17配列と10
0％相同であった、ということが注意されるべきであ
る。

以下は、アミノ酸に対する３文字コードと１文字コー
ドの一致を示したものである。便宜上示す。

アスパラギン酸 （Asp,D） グルタミン酸 （Glu,E） リジン （Lys,K） アルギニン （Arg,R） ヒスチジン （His,H） チロシン （Tyr,Y） システイン （Cys,C） アスパラギン （Asn,N） グルタミン （Gln,Q） セリン （Ser,S） スレオニン （Thr,T） グリシン （Gly,G） アラニン （Ala,A） バリン （Val,A） ロイシン （Leu,L） イソロイシン （Ile,I） メチオニン （Met,M） プロリン （Pro,P） フェニルアラニン （Phe,F） トリプトファン （Trp,W） 実施例8:以下に示す実施例において、次の材料および方
法を用いた： MBP反応性Ｔ−細胞クローンの生成。 ミエリン塩基性
タンパク質（MBP）反応性Ｔ−細胞およびクローンは前
述のように生成した（５）。Ｔ−細胞クローンはMBP84
〜102反応性Ｔ−細胞株から、96ウェルＶ底マイクロタ
イタープレート（Costar,Cambrige,MA）で、μm/ml PH
A.P（Wellcome Diagnostics,Beckenham,UK）および10⁵
照射された異系PBMCの存在下、RPMI 1640（Whittaker,
Walkersville,MD）、10％のプール化されたヒトのAB血
清（PHS）（Biocell,Carson City,CA）、4mMのグルタミ
ン（GIBCO,Grand Island,NY）、10mMのHEPES（Whittake
r）、100μ/mlのペニシリン／ストレプトマイシン（GIB
CO）、５％のIL−２（ヒトT stim,Collaborative,Resea
ch,Bedford,MA）、および１μ/mlのrIL−４（Genetics
Institute,Combrige,MA謹呈）からなる培地で、希釈
（0.3細胞／ウェル）を限定することによって生成し
た。クローンを８〜12日毎に、96ウェル丸底マイウロタ
イタープレート（Costar）内で10⁴/ウェルの状態で、40
μＭパルスし、照射された自己由来の84〜102PBMCとPHA
/異系PBMCとを交互に連続して用いて、再度刺激した。
ここに示されている実験のために、Ｔ−細胞クローン
を、長時間の培養からドリフトを予防するために冷凍さ
れた同じアリコートによって再度刺激した。90％FCS/.1
0％DMS中のＴ−細胞を液体窒素中で凍結した。

MBPペプチド84〜102。 MBPペプチド84〜102は、アミノ
酸配列DENPVVHFFKNIVTPRTPPを、固相法（Bioseach Lab,
Inc.,San Raphael,CA）によって合成し、前述のようにH
PLCにより精製した（５）。

細胞株。 前もって樹立されたEBV形質転換Ｂ細胞株901
0（DR2w2、DQ I）および9009（DR2w2、DQ1）を、10FCS
完全培地で生育し、上記のように凍結し、抗原パルスの
前に直ちに解凍した。DR2a（Idnd gift of R.Sekaly）
で移入された、マウスの線維芽細胞Ｌ細胞株を、DMEM
（Whittaker）、10％FCS（Whittaker）1.6mMキサンチン
（Sigma Biochemicals,St.Louis,MO）、110μＭヒポキ
サンチン（Sigma）、18μＭマイコフェノール酸（GIBC
O）選択培地中で培養し、上述のように凍結し、抗原パ
ルスの前に直ちに解凍した。HT−２ムリンIL−２依存Ｔ
−細胞株（ATTC）を、５％ IL−２を有する10％ FCS
完全培地中で生育し、最後の食餌の後２日間のIL−２バ
イオアッセイに用いた。

MAbs。 これらの研究に用いられるMAbsは、CD3特異性O
KT3および2AD2、CD2特異性T11₂およびT11₃（S.Schlossm
an謹呈）、HLA−DR特異性L243、HLADQ特異性S3/4（F.Ba
ch謹呈）、HLA−DP特異性B7/21（N.Flomenberg謹呈）、
CD28不活性9.3（J.ledbetter謹呈）、CD45RA不活性2H4
（Schlossman）、CD45RO特異性UCHL−１（Dakopatts,Gl
ostrup,Denmark）LFA−３およびLFA−１（T.Springer謹
呈）、およびCD25タック（T.Waldman謹呈）を含む。

増殖検定。 Ｔ−細胞クローン（10⁵/ウェル）を三重に
塗布し、図の凡例された適切な刺激とともに、72時間、
37℃、湿度90％、５％ CO₂で、96ウェル平底マイクロ
タイタープレート（Costar）中で相互培養し、培養の最
後の18時間の間、２μCi［³H］Tdr（２ Ci/mmole、New
England Nuclear Boston,MA）でパルスした。APCは、
Ｂ細胞またはＬ細胞を、10⁶細胞/mlで、完全培地中、40
μＭのMBP84〜102の存在下でまたは存在しない状態で、
２時間、37℃でパルスし、４℃のハンクス（Whittake
r）で２回洗浄した後、４℃で、5000radの照射を行って
調製した。補助APCなしで、Ｔ−細胞を刺激するため
に、２μＭのMBPペプチド84〜102、または10³μ/mlのrI
L−２（Hoffman LaRoche,Nutley,NJ）を培養の継続中に
細胞に直接加えた。

Ｔ細胞の流体細胞計測分析。 MAb腹水をPBS/2％PHS中
で1/100に希釈した希釈液を、Ｔ−細胞を10⁶/ml、４℃
で30分間コートするのに用いた。細胞を４℃の染色培地
で２回洗浄し、1/60FITC複合やぎ抗マウスIg（Tago,Bur
limgamie,CA）を用いて、30分間、４℃で染色した。細
胞を上記のようにして２回洗浄した後、１％のホルムア
ルデヒド（J.T.BAker Chemical NJ）を用いて固定化し
た。液体細胞計測分析は、エピックス シー（Epics
Ｃ）流体細胞計測（Coulter Electronics,Hialeah,FL）
で行った。

B7−移入。 50μｇのKpn I線形化B7−pCDM8構造体を、
５μｇのPvu I線形化POP.Fとともに、Ｌ−tk^-細胞、ま
たはDR2⁺ Ｌ−tk^-細胞（前もってDR2とともに移入され
た）に、BRLエレクトロポレーターを250Vおよび1600mF
にセットして用い、エレクトロポレートによって共移入
した。POP.fプラスミドは、SV40プロモーターのコント
ロール下で、ヘルペス単一ウィルスチミジンキナーゼ遺
伝子を含む（23）。DR2^-B7⁺トランスフェクタントを、
培地を含むヒポキサンチン−アミノプロテイン−チミジ
ン（Sigma）における生育によって選択し、クローン化
した。DR2⁺B7⁺トランスフェクタントを、150μg/mlのG4
18硫酸塩（GIBCO）を含む、キサンチン／ヒポキサンチ
ン／マイコフェノール酸培地で、選択し、クローン化し
た。クローン発現細胞表面B7を、抗−B7 mAbを用いて
非直接的な蛍光免疫検定法によって定量されるように、
再クローン化した。

［Ca＋２］ｉの測定。 前記（22）で述べたように、Ｔ
細胞クローン（0.2〜1.0×10⁷/ml）を、２μg/mlのIndo
−１（Sigma）とともに、培養培地に、45分間、37℃で
負荷した。Indo−負荷細胞を、培地で1/10に希釈し、FA
CS分析の１分前まで４℃に保った。刺激剤APCを、40μ
Ｍの84〜102の存在下、あるいはこれが存在しない状態
で、パルスし、２回洗浄し、培地中で、４℃で再度懸濁
した。刺激されていないIndo−負荷Ｔ−細胞を、刺激を
加える前の30秒間に分析した。細胞刺激剤の場合には、
刺激剤APC＋負荷応答体を、30秒間分析し、それから150
0r.p.m.で１分間遠心分離して、細胞−細胞接触を樹立
し、それから再度懸濁し、反応について分析した。イオ
ノマイシン（100μg/ml）（Sigma）を、Indo−１負荷に
対する正の対照として用いた。

ノーザン分析法によるシトキンmRNAの検出。 Ｔ−細胞
クローン Ob.1A12.8（10⁵/ウェル 96ウェル丸底マイ
クロタイタープレート Il−2/IL−４補充培地）を、２
μＭの84〜102の存在下あるいは存在しない状態で、４
時間培養した。細胞を洗浄し、完全培地中、２×10⁶/ml
で、10ng/mlのPMAおよび１μg/mlのイオノマイシン、２
μＭの84〜102、または２μｍの84〜102＋10ng/mlのPMA
のいずれかの存在下であるは存在しない状態で、37℃
で、４時間、再度懸濁した。全細胞RNAを、RNAzol Ｂ
法（TM Cinnna Scientific,Friebdswood,TX）を用いて
抽出した。10μｇの全細胞RNAを、1.2％SeaKem ME ア
ガロース（FMC Bioproducts,Rockland,ME）および2.2M
ホルムアルデヒドを用いたホルムアルデヒドゲル電気泳
動によって分画した。分画の後、RNAを、10X SSC溶液
を用い、一晩の毛管輸送によってNytran膜（Schleicher
＆ Schuell,Keene,NH）にブロットした。膜を減圧オー
ブン内で、80℃で２時間ベイクした。シトキンプローブ
のハイブリッド形成のために、膜を0.5x SSCおよび５
％SDS中で、65℃で２時間、予備洗浄し、それから50％
ホルムアルデヒド、5xSSC、0.5％ SDS、1xデンハード
溶液、10％デキストラン硫酸塩、および100μg/mlの鮭
精子DNA（Sigma）中で、42℃で１〜２時間予備ハイブリ
ッド形成した。IL−２、IL−４、およびγIfn（前記参
照文24に記載）のためのプローブを、ランダムプライマ
ーラベリング法（Boehringer Mannheim,Mannheim,W.Ger
many）によって、＞10⁸cpm/μｇの特異活性に標識し、
新鮮なハイブリッド形成バッファーに加えた。ハイブリ
ッド形成は、42℃、20時間で行った。フィルターを、0.
2xSSC/0.1％SDS中で、10分間、24℃で２回洗浄し、30秒
間、50℃で２回洗浄した。オートラジオグラフィーを、
−70℃で、１〜５日間行った。

結果 ペプチド抗原を用いて予め刺激されたＴ−細胞は抗原に
反応しない。 我々は、MBP反応Ｔ細胞クローンは、伝
統的なAPCが存在しない状態で、自己由来のＴ細胞クロ
ーン自身のクラスII MHC分子に、ペプチド抗原を存在さ
せることによって、ペプチド抗原に反応して増殖すると
いうことを以前に示している（22）。そして我々は、抗
原のＴ−細胞の提示が、伝統的なAPCに比べて、反応す
るＴ細胞クローンにおける、異なるシグナリングを含む
かどうか調べた。図15に示されるように、第１の増殖定
量において、Ｔ−細胞クローン Ob.1A12.8は、パルス
されたDR2⁺ Ｂ細胞株またはDR2移入Ｌ細胞と結合した
ペプチドに比べて、培養に直接加えられたMBPペプチド8
4〜102に対して同様に反応した（図15A）。しかしなが
ら、遊離のMBP84〜102ペプチド抗原によって、もともと
刺激を受けたＴ−細胞は、１週間後に定量された際にい
かなる形態であっても、抗原刺激に反応しなかった（図
15B、白丸）のに対して、第１の培養において、ペプチ
ドパルスされたＢ細胞あるいはDR2⁺L細胞によって刺激
されたＴ−細胞は、第２の刺激に正常に反応した（図15
B、黒記号）。第２の刺激における無反応の程度は、抗
原の濃度、および第１の刺激で引き起こされる増殖に反
比例した。

我々はMBPペプチドが、２つの異なるMBPペプチドエピ
トープに対して反応する２つの異なる個体からの、５つ
の異なるＴ−細胞クローンにおける不反応を引き起こす
ことを確認した。その特異ペプチドエピトープのみが、
Ｔ−細胞の不反応を引き起こす（データ示さず）。

相互作用細胞の添加は不反応を逆転させない。 我々
は、Ｌ細胞（仮定上、ヒトの相互作用分子を有さない）
が、アネルギーを誘発しないことから、アネルギーの誘
発は、Ｔ−細胞APCにおける相互作用シグナルの欠除よ
りも、負のシグナルのせいであるとされるべきだと仮定
した。しかしながら、最近、Ｌ細胞がムリンB7（G.Free
man,manuscript in preparation）を発現することが見
いだされ、ムリンB7がヒトのＴ細胞に相互作用すること
が示されている（25）。不反応の誘発における、Ｌ細胞
の相互作用効果を直接テストするために、我々はDR2移
入Ｌ細胞を、Ｔ−細胞クローンの培養へ、結合されてい
ないペプチド抗原とともに添加した。ヒトB7の相互作用
分子としての役割を直接テストするために、ヒトB7の遺
伝子をDR2⁺およびDR2^-L細胞へ移入した。表５に示すよ
うに、84〜102中で一週間培養されたＴ−細胞は、ヒトB
7を発現するまたはB7およびDR2を共発現するＬ細胞がそ
の培養に加えられた時にも、第２の抗原刺激に反応しな
かった。

ペプチド抗原によって誘発される不反応が、B7以外の
相互作用分子によって逆転しうるかどうかをテストする
ために、我々は、抗原の存在化に適切な（9010）または
不適切な（9009）HLA−DRのいずれかである、照射され
たB7⁺B細胞を、MBP84〜102とともにＴ−細胞クローンの
培養に加えた。図16は、どちらのＢ細胞株も、遊離のペ
プチドに対するＴ−細胞の反応によって引き起こされる
アネルギーの誘発を妨げることはできないということを
示している。しかしながら、図15に示されるように、ペ
プチド抗原とともにパルスされ、培養の前に洗浄された
Ｂ細胞ライン9010にマッチしたMHCを用いた刺激は、Ｔ
−細胞クローンの不反応を導かなかった。Ｔ細胞クロー
ンはペプチド抗原へ照射を行った後の抗原反応性を失う
が、IL−２への反応は未変化であり、そのことは、不反
応性が細胞の死滅に基づくものにされるべきではないこ
とを示唆している。

アネルギー誘発の反応速度論。 アネルギー誘発の反応
速度を定量するために、MBP84〜102ペプチドおよびIL−
２に対する、第２のＴ−細胞反応を、ペプチドを用いた
２〜168時間の第１の刺激の後に検定した。抗原に対す
る反応における10倍より大きい減退が、MBP84〜102ペプ
チド培養の24時間以内に引き起こされた。そして、その
時までに、バックグラウンドの増殖は（単独で）静止細
胞のバックグラウンドに戻った。この不反応性はさらに
増強されて、４日間で、＞100倍の反応の減退にまでな
り、不反応性は実験の期間中、すなわち７日間維持され
た（図17）。

不反応性Ｔ−細胞はCD3の発現へ続く。 ペプチドアネ
ルギー化Ｔ−細胞クローンの不反応性は、CD3/TcR細胞
表面発現のロスに次ぐものでありうる。これは、ペプチ
ド抗原を伴う培養によって不反応性となったＴ−細胞
が、アネルギー化されていないＴ−細胞クローンと比べ
て、同様のCD3表面発現を有するというケースではなか
った（図８）。

アネルギー化Ｔ−細胞クローンの非抗原性刺激に対する
反応 アネルギー化Ｔ−細胞クローンの中でどの活性化
経路が欠損しているかをさらに明確化するために、ペプ
チド培養によりアネルギー化されたＴ−細胞を、細胞表
面抗原性刺激に似たまたはバイパスする試薬で処理した
（図19）。アネルギー化Ｔ細胞はαCD3とPMAまたはCD2
分裂促進（mitogenic）MAbs T11₂とT11₃の組み合わせ
に対する反応で増殖しなかった。これに対して、アネル
ギー化Ｔ細胞は、膜貫通伝達（26）の必要性をバイパス
するPMAとイオノマイシン（ionomycin）の組み合わせに
は通常に反応し、また別の経路により（27）増殖を刺激
するrIL−２にも通常に反応した。

アネルギー化Ｔ細胞は抗原性刺激後のカルシウムの放出
能力が欠損している。 以前MBP反応性Ｔ−細胞クロー
ンが抗原パルス化Ｔ−細胞またはＢ細胞により提供され
たペプチドに反応して細胞内の［CA⁺²］ｉを放出するこ
とを示したように、ペプチドアネルギー化Ｔ−細胞の反
応能力をこのアッセイでテストした。アネルギー化Ｔ−
細胞は、αCD3とクロスリンクするTCRあるいはＢ細胞で
提供されたペプチド抗原に反応して細胞内［CA⁺²］ｉを
放出を著しく減少させた（図20）。これに対して、アネ
ルギー化Ｔ−細胞クローンでのイオノマイシンに対する
反応は、非アネルギー化Ｔ−細胞クローンと同等であっ
た。

アネルギーＴ細胞は抗原反応においてサイトカインを生
産することができない。 単独で培養された、あるいは
１次培養でMBPペプチド84−102で48時間アネルギー化さ
れたＴ−細胞クローンを、ペプチド、ペプチド＋PMA、
またはPMA＋イオノマイシンとの２次培養で刺激した。
４時間後にmRNAを抽出し、ノザンブロッティングによ
り、IL−2,IL−４、とγIFNの比含量を調べた。アネル
ギー導入の前に、MBP84−102ペプチドあるいはPMA＋イ
オノマイシンまたはペプチド＋PMAの組み合わせに反応
して、Ｔ−細胞クローンOb.1A12.8はIL−2,IL−４、お
よびγIFNのmRNAを合成した。これに対してアネルギー
化Ｔ−細胞クローンは、MBP84−102ペプチド単独あるい
はPMAとペプチドの組み合わせに対する反応において、I
L−2,IL−４、とγIFNのmRNAを合成できなかったが、PM
A＋イオノマイシンの刺激に反応して大量のサイトカイ
ンmRNAを合成した（図21A）。IL−2mRNAのノザン解析の
結果は、HT−２細胞を用いたIL−２バイオアッセイによ
り確認された（図21B）。２次刺激でペプチド抗原で活
性化されたアネルギー化Ｔ細胞はIL−２を分泌しなかっ
たが、HT−２細胞の増殖でみられたように、非アネルギ
ー化細胞はIL−２を分泌した。

マクロファージ、Ｂ細胞、樹状突起細胞のような従来
のAPCは構成的に、MHCクラスIIを発現し、CD⁴⁺T細胞の
タンパク質抗原をプロセスし、提供することができる
（28）。活性化後にMHCクラスIIを発現するヒトＴ細胞
は、ペプチドや分解された抗原を提供することができる
が、通常“非従来的"APCとしてふるまうことを示唆して
いる抗原全部をプロセスする（22,29−31）。

MBP84−102のＴ細胞提供は、増殖アッセイをもたらす
が、ここで我々はペプチド抗原に刺激されたＴ細胞が抗
原によってもTcR/CD3クロスリンキングによっても二次
刺激で反応しないが、IL−２ではそうでもないことを示
す。さらに長期間継続する抗原非反応性（unresponsive
ness）は、非結合型ペプチドで誘導されるが、Ｂ細胞パ
ルス化ペプチドやDR2＋Ｌ細胞トランスフェクション体
では誘導されなかった。このことは、その非反応性は、
単に、高用量寛容（high dose tolerance）のメカニズ
ムで示唆されたような、先の刺激の後の非反応性抵抗性
（refractory）時期によるものではないことを示唆して
いる（９）。我々は、この非反応性を“アネルギー”と
いう。なぜならそのＴ細胞は抗原刺激に非反応性である
が、残りのIL−２は反応性で、その用語を定義するため
に確立されたオリジナルの基準であったからである
（８）。

TcR/CD3複合体を通じて２次必須共刺激シグナル（a s
econd essential costimulator signal）なしでシグナ
ルが伝達される、化学的に結合されたAPCあるいは固定
化αCD3 mAbにより、Ｔ細胞寛容がインビトロで誘導さ
れることができる（６−８）。Ｂ細胞のB7と活性化され
たマクロファージと相互作用しているＴ細胞のCD28分子
は、Ｔ細胞活性化に必要な共刺激経路の１つの構成成分
であることを示し、B7共刺激の欠如はアネルギーを起こ
すかもしれないことを仮定する（14−16）。しかしなが
ら、MBPペプチドの自己Ｔ細胞提供で誘導されるＴ細胞
アネルギーは、共刺激の存在において起こるかもしれな
い。なぜならB7トランスフェクション体あるいはEBV形
質転換Ｂ細胞の添加は、高レベルのB7を発現し、非反応
性の誘導を防ぐことができなかったからである。さらに
適当なMHCと振る舞いとフリーの抗原の非存在下で非寛
容性APCとを有し、おそらく培養時にＴ細胞を有するペ
プチドの提供のために競合するＢ細胞は、この非反応性
の誘導を克服することができない。これらの結果は、ペ
プチド抗原のＴ細胞提供によるアネルギーの誘導が肯定
的共刺激の欠如というよりも、否定的シグナルであるこ
とを示唆している。これらの結果は、また、抗原非反応
性のロスを防ぐために、フリーペプチド抗原の非存在下
において、再刺激化されるべき抗原特異的Ｔ細胞ライン
とクローンの生育のための実用的な示唆を有している。

自己抗原のＴ細胞提供により誘導されるアネルギーの
メカニズムを調べた。アネルギー化Ｔ細胞は、APCまた
はαCD3 mAbクロスリンキングに反応して著しく［Ca＋
^２］ｉの放出能力を減少させた。さらにPMAとイオノマ
イシンの組み合わせでの処理は、サイトキン生産とアネ
ルギー化Ｔ細胞の増殖を回復させ、PKC活性化と［Ca＋
^２］ｉ放出後の情報伝達は正常であることを示唆してい
る。したがって我々のシステムの情報伝達において交互
に定義されるアネルギー状態は、膜近接で情報伝達欠損
が観察されなかったJenkinsとSchwartzによるインビト
ロクローンアネルギーに関する研究とは異なる（32,3
3）。抗原のＴ細胞提供により誘導されるＴ細胞アネル
ギーのメカニズムは、周囲に逃げる自己反応性Ｔ細胞
が、TcRに反応して、［Ca＋^２］を放出できないが、PMA
とイオノマイシンとの組み合わせに反応して増殖するこ
とができるトランスジェニックマウスの研究に似ている
ように見える（21）。したがって、少なくとも２つの異
なる機能的に定義されたアネルギーが存在するようであ
る。細胞の情報伝達の経路を制御する多くの異なる分子
の１つの変化により、細胞の形質転換が起こり得るよう
に、Ｔ細胞のアネルギーの現象は、Ｔ細胞活性化の異な
る段階に影響するいくつかの異なるメカニズムにより達
成されるかもしれない。

O'Hehirと共同研究者は、ペプチドまたは超抗原によ
り誘導されるＴ細胞非反応性は、ペプチド抗原の添加16
時間後、CD25の増加に伴い、CD3の表面の発現の減少に
より特徴づけられ得ることを示した（34,35）。我々は
さらに、この初期時点において、緩やかなCD3/TCR発現
の減少とCD25発現の増加を観察している。これはおそら
くＴ細胞活性化によるものであろう（データは示してい
ない）。しかしながら、我々は４日までにアネルギー化
Ｔ細胞は非アネルギー化Ｔ細胞と同等のCD3の表層細胞
濃度を示すことを発見した（図18）。このことはアネル
ギーは単に細胞表面のCD3/TcRとして説明することがで
きないことを示している。

末梢血液から由来するヒトＴ細胞クローンの大半でみ
たように（24）、Ｔ細胞クローンOb.1A12.8は、分裂促
進剤の刺激に反応して、T_H1とT_H2の両方のサブセットの
サイトキンを生産する能力において、T_HOフェノタイプ
を示すようである（36）。アネルギー化Ｔ細胞は、PMA
の有無に関わらず、抗原刺激に対する反応として、IL−
２、IL−４、またはγIFN mRNAまたは分泌された定量
可能なIL−２を合成することができなかったが、イオノ
マイシンとPMAの両方の添加は、サイトキン合成を起こ
す。これらの結果は、Ｔ細胞の情報のブロックが、Ca＋
^２移動の前におこることを示唆する増殖とCA＋^２フラッ
クスデータの両方に一致する。ペプチド抗原に反応し
て、Ｔ細胞によって起こされる否定的シグナルは、これ
らのアネルギーＴ細胞で変化する実際の生化学的シグナ
ルのように、まだ定義されているところである。

免疫学上重要な問題は、活性化された自己抗原、反応
性Ｔ細胞が炎症反応の間どのように制御されているかに
関するものである。以前の仕事において、我々はＴ細胞
が高度に精製されたMBPをプロセスしたり、提供するこ
とはできないが、ペプチド抗原と部分的に分解されたネ
イティブMBPを提供することができることを示した（2
2）。このことは、炎症部位（例えば脳の脱髄プラー
ク）で活性化されたＴ細胞は、その部位の他のＴ細胞に
MBPフラグメントを提供できるかもしれないことを推察
させる。ペプチド抗原のＴ細胞提供が、クローンの非反
応性を引き起こすということは、この寛容のメカニズム
が、炎症部位の自己反応性Ｔ細胞が、破壊された自己組
織へクローン拡大するのを防ぐことを発展させたかもし
れないことを示唆する。分解されたタンパク質の細胞外
高濃度は、自己抗原の性質であろうが、初期の生体内現
位置の（in situ）免疫反応の後の外来抗原は、低濃度
で提供され、従来のAPCにプロセスまたは提供のために
取り込まれるであろう。このようにして、抗原を提供し
得るが、プロセスしないＴ細胞による不適当な抗原の提
供は、分解された自己抗原が利用される炎症部位で反応
するＴ細胞クローンを活性化せずに、アネルギーを起こ
す。

結論として、我々は、ペプチド抗原でＴ細胞クローン
を前処理することが抗原非反応性をもたらすというLamb
とFeldman（10,11）の初期の観察を説明するメカニズム
の証拠を提供する。アネルギーは、自己由来Ｔ細胞にペ
プチド抗原を提供することができるヒトＴ細胞で活性化
されたMHCクラスIIの発現に関連づけられる。この相互
作用はＴ細胞の初期刺激を引き起こすが、これらのＴ細
胞はペプチド前処理の24時間以内に、後の刺激に非反応
性にされる。このアネルギー化Ｔ細胞の情報伝達欠損
は、膜近位である。なぜならペプチド処理されたＴ細胞
クローンは、［Ca＋^２］の放出、サイトキンの生産、抗
原刺激に対する増殖の能力を阻害されるが、PMAとイオ
ノマイシンの処理に対して、正常な反応を示すからであ
る。

表13 アネルギーはB7修飾細胞の存在化でおこる。Ｔ−
細胞クローンOb.2F3は、５μg/mlの84−102の存在下あ
るいは非存在下、10⁴/ウェルDR2および／またはB7感染
分子を発現するＬ細胞（5000ラドで照射）添加または非
添加で、７日間培養した。DR2の発現および非発現Ｌ細
胞株はB7でトランスフェクションした。平均蛍光強度は
DR2⁺B⁺ラインで77,2（マウスIg−PE）と215.6（B7−P
E）、DR2^-B7⁺ラインで56.8（マウスIg−PE）と158.6（B
7−PE）であった。１次培養の後、Ｔ−細胞を洗浄し、8
4−102に対する増殖のアッセイをおこなった。

明細書実施例８において引用された引用文献リスト Kappler,J.W.,U.D.Staerz,J.White,及びP.C.Marrack.19
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ors Th1 and Th2 cells.J.Immunol.144:1629. 以上本発明を、明細書の実施例の参照により説明し
た。しかしながら、当業者にとって、クレームされた発
明の思想あるいは態様から離れることなしに多くの添
加、削除、および変更が可能であることは明白であろ
う。

フロントページの続き (72)発明者 ミラー，アリエール イスラエル国 ハイファ 34 750 ア フザ シミキン ストリート 24 (72)発明者 アル‐サバー，アーマッド アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02062 ノーウッド ヴィレッジ ロー ド ウェスト 3403 (56)参考文献 ＴＨＥ ＦＡＳＥＢ ＪＯＵＲＮＡ Ｌ，Ｖｏｌ．４，Ｎｏ．７（1990）, ｐ．Ａ1857，Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ. 956 Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．346（1990）, ｐ．183−187 Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．248 （1990），ｐ．1016−1019 Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ, Ｖｏｌ．12，Ｎｏ．８（1991），ｐ. 277−282 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 7/00 - 7/08 A61K 38/00 - 38/02 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】アミノ酸配列が、 ｉ）ヒトミエリン塩基性タンパク質（hMBP）のアミノ酸
   残基85−102; ii）hMBPのアミノ酸残基84−100; iii）hMBPのアミノ酸残基84−99; iv）hMBPのアミノ酸残基85−99; ｖ）hMBPのアミノ酸残基84−98; vi）hMBPのアミノ酸残基148−162; よりなる群から選択されるペプチド。
2. 【請求項２】ENPVVHFFKNIVTPRのアミノ酸配列からなる
   ペプチド。
3. 【請求項３】多発性硬化症に罹患したヒトにおいて活性
   化MBP反応性Ｔ−細胞の免疫機能を抑制するための薬剤
   組成物であって、非経口的に効果的な量のペプチドと、
   薬理学的に許容される担体または希釈液を含み、上記ペ
   プチドが： ｉ）ヒトミエリン塩基性タンパク質（hMBP）のアミノ酸
   残基84−102; ii）hMBPのアミノ酸残基85−102; iii）hMBPのアミノ酸残基86−102; iv）hMBPのアミノ酸残基84−100; ｖ）hMBPのアミノ酸残基84−99; vi）hMBPのアミノ酸残基85−99; vii）hMBPのアミノ酸残基84−98; viii）残基102がチロシンに置換されているhMBPのアミ
   ノ酸残基84−102; ix）hMBPのアミノ酸残基143−168; ｘ）hMBPのアミノ酸残基148−162; よりなる群から選択される組成物。
4. 【請求項４】上記効果的な量が１μｇから約200mgの範
   囲である請求の範囲第３項の組成物。
5. 【請求項５】哺乳類における多発性硬化症で観察される
   タイプの自己免疫反応を抑制するための薬剤組成物であ
   って、経口的に効果的な量のペプチドと、薬理学的に許
   容される担体または希釈液を含み、上記ペプチドが： ｉ）ヒトミエリン塩基性タンパク質（hMBP）のアミノ酸
   残基84−102; ii）hMBPのアミノ酸残基85−102; iii）hMBPのアミノ酸残基86−102; iv）hMBPのアミノ酸残基84−100; ｖ）hMBPのアミノ酸残基84−99; vi）hMBPのアミノ酸残基85−99; vii）hMBPのアミノ酸残基84−98; viii）残基102がチロシンに置換されているhMBPのアミ
   ノ酸残基84−102; ix）hMBPのアミノ酸残基143−168; ｘ）hMBPのアミノ酸残基148−162; よりなる群から選択され、上記ペプチドの上記効果的な
   量が上記自己免疫反応を抑制する組成物。
6. 【請求項６】上記効果的な量が10μｇから約20mgの範囲
   である請求の範囲第５項の組成物。