NO317049B1 - Undertrykkelse av T-celleproliferasjon ved anvendelse av fragmenter av myelinbasisk protein - Google Patents

Description

Oppfinnelsen angår preparater og sammensetninger inneholdende disse peptider for undertrykking av T-cellemediert eller T-celleavhengig autoimmunrespons. Mer spesifikt er oppfinnelsen rettet peptider henholdsvis sammensetninger som omfatter peptidfragmenter av myelin basisk protein (MBP) eller analoger derav, og anvendelse av slike peptider og sammensetninger for å fremstille et farmasøytisk preparat for behandling av multippel sklerose (MS).

Diskusjonen i dette avsnittet er ikke begrenset til diskusjonen rundt arbeidet som kvalifiserer som "kjent teknikk" mot foreliggende oppfinnelse. Det er således ingen adgang eller ingen deklarasjon mot foreliggende oppfinnelses interesser på bakgrunn av denne diskusjonen.

Multippel sklerose (MS) er en kronisk inflammatorisk sykdom av det hvite stoffet i menneskets sentralnervesystem og er antatt å være av autoimmun etiologi. Uavhengig av dens etiologi, blir MS ledsaget av autoimmunt angrep av nervevev. Sykdommen er f.eks. kjennetegnet ved dominerende T-celle og makrofaginfiltrater inn i nervevevet (dvs. hjerne, ryggrad, perifere nerver eller assosierte celletyper), demyelinering og neurologisk disfunksjon. Myelin basisk protein (MBP) har vært grundig studert av foreliggende oppfinnere, deres samarbeidspartnere og andre som et autoantigen i sykdommen på grunn av dens rolle som et induksjonsmiddel i hovedpattedyrmodellen av MS, eksperimentell allergisk encefalomyelitt (EAE) såvel som dens rolle i den human sykdommen post-viral encefalomyelitt. I tillegg har foreliggende oppfinnere og deres samarbeidspartnere studert MBP som et "tilskuerantigen" (serienr. 843,752, over).

En hovedhypotese som angår patogenese av MS er at T-celler reaktiv med myelin basisk protein i det hvite stoffet i CNS initierer den inflammatoriske prosessen. En annen hypotese er at T-celler reaktive med proteolipidprotein (PLP) initierer den inflammatoriske prosessen. Demonstrasjonen av at aktiverte T-celler som er spesifikk for myelin basisk protein (MBP) kan bli isolert fra MS pasienter (AUegretta, M., et al., Science: 247:778,1990) viser videre MBP-reaktive T-celler i patogenese av sykdom. Arbeidet i forbindelse med foreliggende oppfinnelse viser også at MBP-reaktive T-celler er involvert i patologi av sykdommen, etter initiering av den inflammatoriske prosessen. (Slik det vil bli beskrevet i mer detalj under, har foreliggende oppfinnelse vist at friske individer også ofte har MBP-spesifikke T-celler, men i motsetning til MS pasienter, blir MBP-spesifikke T-celler fra friske individer ikke aktivert).

Nåværende behandlinger for MS er ene og alene palliative og involverer administrering av medikamenter som virker på en ikke-spesifikk måte for å undertrykke immunresponsen i individet. Eksempler på slike medikamenter er cyklofosfanimid, Imuran (azatioprin) og cyklosporin A. Steroidkomponenter slik som prednison og metylpredninsolon ble også benyttet i mange tilfeller. Disse medikamentene har begrenset effekt mot MS. Anvendelse av slike medikamenter er begrenset av deres toksisitet og ved det faktum at det induserer "global" immunoundertrykking ved lengre anvendelse, dvs. de regulerer også ned den normale beskyttende immunresponsen til patogene mikroorganismer og øker dermed risiko for infeksjon. I tillegg løper pasienter som er globalt irnmunoundertrykket over lengre tidsperioder en øket risiko for å utvikle visse ondartete tilstander.

Flere detaljer på immunologiske prosesser som forekommer er kjente for eksperimentell allergisk encefalomyelitt (EAE), den primære dyremodellen for MS. EAE kan raskt bli indusert i små pattedyr ved immunisering med myelin basisk protein (MBP) i en passende adjuvant eller ved adoptiv overføring gjennom injeksjon av CD4<+>, MBP-reaktive T-celler (Alvord Jr., E.C., et al. eds. i Experimental Allergic Encephalomyelitis: A Useful Model for Multiple Sclerosis, A.R. Liss, N.Y., 1984; Makhtarian, D.E., et al. Nature 305:356,1984; Ben-Nun, A. et al. J. Immunol. 129:303, 1982). T-celler som induserer EAE i både mus og rotter, betegnet encafalitogenetiske celler, gjenkjenner spesifikt peptider som korresponderer til immunodominante regioner av MBP. Presentasjon av disse regionene til T-celler foregår på overflaten av antigen-presenterende celler (APCs) i forbindelse med unik hovedhistokompatibilitetskompleks (MHC) klasse II molekyler. Det skal undertrykkes at immunodominante regioner av MBP, som er den delen av proteinet som mest ofte blir gjenkjent av MBP reaktive T-celler av CD4<+->type, adskiller seg avhengig av art og vertspattedyr og kan også adskille seg avhengig av MBP art, til tross for det faktum at aminosyrefrekvensen av MBP utviser meget høy homologi mellom artene. Som f.eks. foreliggende oppfinnere og deres samarbeidspartnere har oppdaget, er en immunodominant epitop av human MBP i mennesker inneholdt i subsekvensen av human MBP molekyl som omfatter aminosyrer 84-102. En annen immunodominant epitop kan finnes i subsekvensen av human MS molekyl som omfatter aminosyrer 143-168. Dette er tydelig ved spesifisiteten av humane T-celler isolert fra individer som lider av MS (beslektet patentsøknad serienr. 502,559 og eksempel 1 under). Den immunodominante regionen av mus MBP er aminosyre 1-9 når den blir administrert til mus (Zamvil et al., Nature 324:258,1986) og den hos rotte MBP er aminosyrer 68-88 når den blir administrert til rotter (Burns et al., J. Exp. Med. 169:27,1989). På den annen side er immunodominant region av marsvin MBP i rotter lokalisert med residier

75-84 (Hashim, G. Myelin: Chemistry and Biology, Alan R. Liss, N.Y. 1980).

Basert på det arbeid som er gjort i EAE systemet, blir alternative terapier utviklet for behandling av autoimmune sykdommer generelt og spesielt MS. US-patentsøknad serienr. 65,794 inngitt 24. juni 1987 (nå avslått) og internasjonal patentsøknad PCT/US88/02139, inngitt 24. juni 1988 under behandling, nå i nasjonal fase som US-søknad serienr. 07/460,852 og continuation-in-part av denne søknad, US-søknad serienr. 07/596,936, beskriver at oral eller enteral administrering av hel myelin basisk protein såvel som sykdomsinduserende og ikke-induserende fragmenter og analoger derav er effekt i å undertrykke akutt monobasisk EAE og er nyttig i undertrykking av MS symptomer når det blir administrert samtidig.

Følgende patentsøknader som er under behandling er også av interesse: US-patentsøknad serienr. 454,806 inngitt 20. desember 1989 beskriver aerosoladministrering av autogener, sykdomsundertrykkende fragmenter av nevnte autoantigener og analoger derav som effektiv behandling for behandling av T-cellemedierte autoimmunsykdommer slik som MS.

US-søknad serienr. 07/487,732, inngitt 20. mars 1990 med tittel "Enhancement of the Down Regulation of Autoimmune Diseases by Oral Administration of Autoantigens" beskriver synergister (forøkere) for anvendelse med oral administrering av autogener, sykdomsundertrykkende fragmenter og analoger derav som effektive behandlinger av T-cellemedierte autoimmune sykdommer.

US-søknad serienr. 07/843,752 beskriver fremgangsmåter og sammensetninger for å behandle autoimmune sykdommer oralt eller ved inhalering ved administrering av tilskuerantigener. Tilskuerantigener er vevspesifikke antigener som er tilstede på lokus av autoimmunt angrep og som har evnen ved at de blir oralt administrert og genererer T-supressorceller som i sin tur undertrykker immunangrep i det påvirkede vevet. Tilskuerantigener er ikke nødvendigvis autoantigener og er ikke nødvendigvis selv målet for det immune angrep. (Det er faktisk evidens at immunoundertrykkende epitoper av et antigen er forskjellig fra immunodominante epitoper derav, selv om immunodominante epitoper som ikke utløser undertrykking ved oral administrering) kan virke som tilskuerantigener ved undertrykking av immunangrep rettet mot andre deler av samme antigen eller deler av andre antigener i det utløste vevet. Tilskuerantigener må (a) være spesifikk til det aktuelle vevet og (b) inneha mulighet til å utløse T-supressorceller ved oral administrering.

T-cellereseptorer består av to forskjellige kjeder av proteinmateriale. Visse T-cellereseptorer (TCR) består av V-beta (VB) kjeder og V-alfa (VA) kjeder, er kjent å gjenkjenne MBP. ISJL/PL mus vil encafalitogeniske (dvs. sykdomsinduserende når administrert til mus) T-celler som har disse reseptorene gjenkjenne et N-terminalt mus MBP peptid (residier 1-9) som presentert av et MHC molekyl (Zamvil, S.S. et al., Natura 324:258,1986) kodet av musegen H-2. Hoveddelen av T-cellereseptorene som gjenkjenner dette peptidet som er presentert i forbindelse med MHC kodes av mus TCR gener VB8.2 og VA2 eller VA4.1 Lewis rotter har TCR gensegmenter som er homologe med mus VB8.2 og TCR VA2 gener vært funnet i encefalitogeniske T-celler som gjenkjenner MBP residier 68-88 i sammenheng med Lewis rotte MHC (Burns, F.R. et al., J. Exp. Med. 169: 27,1989). Administrering av et VB8.2 spesifikt monoklonalt antistoff (dvs. et antistoff som gjenkjenner produktet VB8.2 uttrykt av tilsvarende gen) til mus har vist seg å være effektiv ved behandling av murin EAE. Immunisering med peptider som spesifikt tilsvarer TCR VB8.2 aminosyresekvensen lindrer EAE i Lewis rotte (Vanderbark, A.A., et al., Nature 341: 541-544,1989; Howell, M.D. et al., Science, 246: 668; 1989). Regioner av et autoantigen (slik som MBP) som oppfører seg som immunodominante regioner er artsspesifikke. Det har til nå ikke vært bestemt om vanlig V-genbruk i TCR V-gener eksisterer i mennesket blant T-cellegj enkj eimende immunodominante regioner av MBP eller om disse immunodominante regioner har blitt positivt identifisert i MS pasienter.

Man har nå funnet at oral administrering av multippel doser av små mengder hele antigener som inneholder encefalitogeniske immunodominante epitoper utløser denne type av aktiv undertrykking. På den annen side induserer i.v. administrering av helt autoantigen (eller av en eller flere encefalitogeniske immunodominante epitop-inneholdende fragmenter derav) også undertrykking men bare av immunangrep T-celler som gjenkjenner epitoper av autoantigen. Sistnevnte type undertrykking, som er antatt å foregå via mekanismen ved klonal anergi, observeres også ved oral administrering av enkle doser og store mengder antigener som innbefatter encefalitogene epitoper, spesifikke immunodominante epitoper, særlig når slike antigener er ledsaget av proteasehemmere.

For human MBP har et protein som antas å være et autoantigen for MS, omfattende studert av foreliggende oppfinnere, vist fragmenter av protein som inkorporerer epitoper som er gjenkjent av et stort antall MBP-spesifikt immunangrep (CD4<+>) T-celler isolert fra MS pasienter. Slike fragmenter som omfatter immunodominante epitoper, er sannsynligvis kandidater for administrering til pasienter som lider av MS, med det mål å undertrykke autoimmunresponsen, og særlig undertrykke funksjonen av MBP-reaktive T-celler som er ansvarlig for det autoimmune angrepet på nervøst vev. Foreliggende oppfinnelse innbefatter ikke bare oral administrering av slike peptidfragmenter til pattedyr som har behov for slik behandling, men også parenteral administrering av slike fragmenter.

Det er derfor et mål med foreliggende oppfinnelse å skaffe tilveie immunoundertrykkende midler, særlig fragmenter av human MBP, og anvendelse av disse fragmentene for å fremstille et preparat for behandling av MS.

Et annet mål ved foreliggende opprinnelse er å skaffe tilveie sammensetninger og farmasøytiske formuleringer som omfatter disse fragmentene av human MBP.

Et annet mål med oppfinnelsen er å skaffe tilveie som et reagens som kan bli anvendt for å bestemme spesifisitet av humane T-celler, et peptidfragment av MBP som inkorporerer en immunodominant epitop.

Et ytterligere mål er å skaffe tilveie forbindelser og sammensetninger som anergiserer MBP-reaktive T-celler eller sørge for aktiv undertrykking av slike T-celler, sistnevnte er åpenbart f.eks. ved undertrykking av proliferasjon av MBP-reaktive T-celler.

Således er det tilveiebrakt et peptid, kjennetegnet ved at aminosyresekvensen blir valgt fra gruppen som består av

i) aminosyreresidier av 86 - 102 av hMBP;

ii) aminosyreresidier av 87 - 102 av hMBP;

iii) aminosyreersidier av 84 -100 av hMBP;

iv) aminosyreresidier av 84 - 99 av hMBP;

v) aminosyreresidier av 85 - 99 av hMBP;

vi) aminosyreresidier av 84 - 98 av hMBP;

vii) aminosyreresidier av 86 - 99 av hMPB; og

viii) aminosyreresidier av 84 - 102 av hMBP der residie 102 har blitt erstattet med

tyrosin.

I peptidet ifølge oppfinnelsen er den foretrukne aminosyresekvensen

ENPVVHFFKNIVTPR, eller DENPVVHFFKNIVTPR.

Videre er det tilveiebrakt en anvendelse av peptidet ifølge oppfinnelsen for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av multippel sklerose (MS).

Dessuten innbefatter den foreliggende oppfinnelsen en farmasøytisk sammensetning, kjennetegnet ved at den omfatter en oral effektiv mengde av et peptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1-3 og fysiologisk akseptabel bærer eller fortynningsmiddel, hvor nevnte effektive mengde er fortrinnsvis i området fra ca. 10 ug til ca. 20 mg.

Foreliggende oppfinnelse innbefatter videre en farmasøytisk sammensetning, kjennetegnet ved at den omfatter en parenteral effektiv mengde av et peptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1-3 og en fysiologisk akseptabel bærer eller fortynningsmiddel, hvor nevnte effektive mengde er i området fra ca. 1 til ca. 200 mg. Figur 1 er en graf som viser frekvens av MBP reaktive T-celler isolert fra MS pasienter (venstre panel) og friske kontroller (høyre panel) som reagerer spesifikt med forskjellige human MBP peptidfragmenter. Figur 2A og 2B illustrerer grafisk undertrykking av EAE (indusert ved i.p. inokulering med MBP-spesifikke encefalitogene T-celler) ved overføring av miltceller fra dyr som er oralt tolerert med MBP. Figur 3 viser undertrykking av adoptivt overført EAE ved ko-overføring av CD4<+->uttømte eller CD8<+->uttømte T-celler fra MBP forede dyr. Figur 4 er en søylegraf av DTH responser som er forbundet med grad av beskyttelse (hvis noe) mot EAE induksjon ved ko-overføring sammen med CD4<+> T-celler av forskjellige T-celleundersett fra MBP forede dyr. Figur 5 er en søylegraf av kvantitativ histologisk analyse uttrykt i gjennomsnittlige tall av inflammatoriske foci isolert fra CNS (dvs. parenchyma og meninges) av mus injisert med forskjellige T-celleundermengder fra MBP-forede mus. Figur 6A viser undertrykking av aktivt indusert EAE ved intravenøs (IV) administrering av MBP; Figur 6B viser effekt av adoptivt overført EAE fra IV-administrering av MBP og manglende evne av miltceller av IV-tolererte mus for å konferere undertrykking når de blir ko-overført til native dyr sammen med en encefalitogen MBP linje. Figur 7 er en søylegraf som viser variasjon i undertrykking av EAE etter oral (A) eller IV (B) administrering av forskjellige MBP peptider. Figur 8 er en grafisk representasjon av evnen til forskjellige peptidkonstruksjoner basert på den immunodominante epitoperegionen av human MBP (human MBP aminosyrerester nr. 84-102) for å stimulere proliferasjon av humane MBP-reaktive T-cellekloner.

Panel A: effekt av utelatelse av en eller flere N-terminale aminosyrer;

Panel B: effekt av utelatelse av en eller flere C-terminale aminosyrer.

Figur 9 er en graf av evnen til en 15-mer (human MBP aminosyrerest nr. 85-99) til å stimulere proliferasjon av fire forskjellige humane T-cellekloner sammenlignet med evnen av MBP peptider 84-102 og 86-97 til å stimulere slik proliferasjon. Figur 10 er et kart som viser TCR/MHC kontakter for 8-89 og 88-104 human MBP peptider og foreslått motiv for denne interaksjonen. Figur 11 er et kart som viser induksjon av proliferasjon av T-cellekloner til human 85-99 MBP peptider av foreliggende oppfinnelse sammenlignet med proliferasjon indusert i disse kloner ved nativ MBP protein. Figur 12 er en autoradiograf som viser PCR amplifikasjon av cDNA fra 18 T-cellelinjer som blir generert fra fem MS pasienter og som var reaktive med MBP residier 84-102. Figur 13 er en autoradiograf av en Southern blot analyse for TCR VB og JB gen til bruk for MBP-reaktive T-cellelinjer generert fra perifert blod hos en MS pasient. Figur 14 er en serie av søylegrafer som viser reaktivitet av T-celler isolert fra MS pasienter og kontroller til forskjellige regioner av human MBP polypeptid i forhold om disse pasientene har visse MHC antigener. Figur 15. T-celler tidligere stimulert med fritt peptidantigen responderer ikke til antigenstimulering. T-celleklon Ob. I Al 2.8 ble stimulert enten direkte med MBP peptid 84-102 eller med en DR2+ B cellelinje (9010) eller L celletransfektant pulsert med 84-102 i 2 timer ved 37°C og analysert for proliferasjon. Endelig konsentrasjon av peptid i brønner med en stimulering er angitt. Slik man kan se i panel A resulterte alle tre stimuli i ekvivalent T-celleproliferasjon. Syv dager senere ble T-celler vasket og analysert på nytt for respons til 84-102 (5 ug/ml) eller B celler eller L celler pulsert med 84-102 (100 ug/ml). Slik det er vist i panel B, var T-celler som opprinnelig stimulert med høye konsentrasjoner av 84-102 ikke responsive til sekundær antigenstimulering. Figur 16. T-celle ikke-responsivitet kan ikke forventes ved tilsetning av B-celler. T-celleklonen Ob.l A12.8 ble dyrket i syv dager for primær stimulering enten alene eller i nærvær av 84-102 med tilsetning av enten MHC class II tilpasset (9010) eller ikke-tilpasset (9009) bestrålte transformerte B celler ved de tallene som er angitt, deretter vasket og analysert for proliferasjon til enten MBP 84-102 peptid (5 ug/ml) eller rIL-2 (10^ u/ml). T-celler dyrket i fravær av peptid (sirkler) hadde fullstendig evnen til å proliferere til sekundær antigen stimulering mens de som ble dyrket med peptid (kvadrater) var antigen ikke-responsive uavhengig av tilsetning av B-celler. Proliferasjon av IL-2 var ekvivalent i alle cellepopulasjoner. Figur 17. Kinetikk av T-celleanergi. T-celleklon Ob.l A12.8 ble dyrket i 0 til 168 timer i 5 ug/ml 84-102, vasket og analysert for proliferasjon til 84-102 eller IL-2. Feilsøyle representerer SEM av CPM fra tredoble kulturer. Data fra to sammenfallende men separate eksperimenter har blitt samlet for å representere alle tidspunkter. Figur 18. Anergiserte T-celler fortsetter å uttrykke CD3. T-celleklon Ob.l Al 2.8 ble dyrket i nærvær eller fravær av 5 ug/ml 84-102 i 4 dager, vasket og analysert for både celleoverflatefenotype og proliferativ respons. Celler ble farget med kontroll MAb Mslg-FITC eller OKT3 FITC (Coulter) i 30 minutter ved 4°C, vasket to ganger, deretter fiksert i 1% formalin og analysert ved strømcytometri. T-celler fra samme primære kultur ble analysert for proliferasjon til B celler (9010) pulsert med eller uten 84-102, eller rIL-2. Figur 19. Aktivering av anergiserte T-celler ved forskjellig stimuli. T-celleklon Ob.l A12.8 dyrket i nærvær eller fråvær av 84-102 i syv dager ble vasket og analysert for proliferasjon til logaritmiske titreringer av aCD3 + PMA, Tl I2 + Tl I3, PMA + iononmycin, og rIL-2. Endlig konsentrasjon eller ascitesfortynning av hvert reagens er uttrykt på x-aksen. PMA konsentrasjoner er opplistet under konsentrasjoner av aCD3 eller ionomycin. Figur 20. Anergiserte T-celler blir hemmet i deres evne til åfrigjøre [Ca<+2>]i til antigen stimulering. Ob.lA12.8 ble dyrket ± 5 ug/ml 84-102 i 7 dager, vasket og ladd med 1 ug/ml Indo-1 for analyse av [Ca<+2>]i. Sekundærstimulering av ionomycin (100 ug/ml),

ccCD3 (1/30 ase dil.), eller B celler (9010) pulsert + 100 ug/ml 84-102 ble tilsatt strømcytometri ved det tidspunktet som er angitt ved piler. For APC stimulering ble celler fjernet fra strømcytometer og sentrifugert i 1 minutt (representert ved hele søyler). Prosentrespons for hver prøve representerer prosent av celler over basislinje (etter-stimulus minus for-stimulus).

Figur 21. Cytokinproduksjon ved anergiserte T-celler A. T-celleklon Ob.l Al 2.8 ble dyrket med eller uten 84-102 i 2 dager, vasket, stimulert med eller uten 10 ng/ml PMA + 1 ug/ml ionomycin eller 5 ug/ml 84-102 ± 10 ng/ml PMA i 4 timer ved 37°C. Total cellulær RNA ble ekstrahert ved RNAzol B metoden for northern analyse. Parenteser betegner 2 forskjellige northern blot av identiske prøver hver hybridisert med en B-aktinkontrollprøve i tillegg til cytokinspesifikke prøver. Tilnærmet størrelser av mRNA bånd er opplistet. B. Ob.lA12.8 ble dyrket i 2 dager ± 84-102, vasket og stimulert med 84-102 eller rIL-2 som en positiv kontroll. Supernatanter ble samlet etter 20 timer av sekundær kultur og fortynnet 1:3 i kulturer i HT-2 celler. Proliferasjon av HT-2 celler representerer tilstedeværelse av IL-2 i supernatant av 84-102 stimulerte ikke-anergiserte T-celler og var maksimal med rIL-2 positiv kontroll.

Et trekk ved oppfinnelsen er rettet mot immunoundertrykkende midler som omfatter peptider som er fragmenter av human MBP. Utførelsesformer av oppfinnelsen innbefatter peptider og farmasøytiske sammensetninger som omfatter disse peptider.

Oppfinnelsen er også rettet mot anvendelse av de foregående peptidene til å undertrykke immunrespons mot myelin basisk protein og vev som inneholder det, og/eller å undertrykke T-celler som gjenkjenner en immunodominant epitop av human MBP. Disse anvendelser kan involvere oral og/eller parenteral administrering av en eller flere peptider ifølge oppfinnelsen, og resulterer i undertrykking av immunrespons mot protein og vev som inneholder det.

Som nevnt tidligere er foreliggende oppfinnelse rettet mot farmasøytiske sammensetninger som omfatter en eller flere av nevnte fragmenter av MBP.

Ytterligere omhandler oppfinnelsen anvendelse av fragmenter av human MBP ved undertrykking av human T-cellefunksjon, og identifikasjon av cD4<+> MBP-reaktive humane T-celler.

Alle patentsøknader, patenter og publikasjoner som siteres i beskrivelsen er med dette innbefattet med referanse i sin helhet. I det tilfelle det ikke er overensstemmelse, vil foreliggende beskrivelse inkludert definisjoner være dominerende.

Slik det blir brukt her innbefatter "undertrykking" en hver målbar reproduserbar reduksjon i T-celleproliferasjon som respons til faktorer som normalt stimulerer disse celler. Det skal imidlertid understrekes at foreliggende oppfinnelse bare angår undertrykking av proliferasjon av skadelige T-celler, dvs. proliferasjon av T-celler som fremmer autoimmunt angrep (CD4<+> T-celler spesifikt til et celle-antigen, f.eks. MBP). Et viktig trekk ved foreliggende oppfinnelse er evnen til å indusere undertrykking på en begrenset måte, der undertrykking av skadelige T-celler som er spesifikt til et celle-antigen er et resultat av valg av fragment eller fragmenter av MBP administrert og/eller fremgangsmåte ved administrering som diskutert under.

Undertrykking av skadelig T-celleproliferasjon kan også bli målt indirekte, dvs. slik man kan se ved reduksjon i symptomer fra en sykdom som er direkte eller indirekte forårsaket av immunangrepet T-celleproliferasjon, slik som skade på neuralt vev som observeres i MS, eller nedgang i antall eller alvorlighet av angrep som MS pasienter lider av. Skade på neuralt vev kan fastslås f.eks. ved magnetisk resonansavbilding (MRI) og måling av antall og alvorlighet av skader som der er synlig. Reduksjon i MS angrep eller alvorlighet kan fastslås f.eks. ved klinisk evaluering hos pasienter. Metoder for både MRI og klinisk evaluering er velkjent innenfor fagområdet.

Begrepet "autoantigen" er definert som en hver substans som normalt fins i et pattedyr, som i en unormal situasjon ikke lenger gjenkjennes som "seg selv" ved lymfocytter eller antistoffer i pattedyret, og blir angrepet av det immunoregulatoriske systemet som om det var en fremmed substans. Med andre ord er et autoantigen et antigen som er utsatt for et autoimmunt angrep. Tilstedeværelse av antistoffer eller til og med T-celler (av CD4<+> type) spesifikt til nativt antigen definerer den ikke som et autoantigen. MBP og PLP (proteolipid protein) er eksempler på autoantigener i MS.

"Immunodominant epitop" av et autoantigen (slik som MBP) menes en antigendeterminant som kan gjenkjennes av et vesentlig antall som inkluderer, men er ikke begrenset til, en hovedmengde (selv om ikke nødvendigvis ved et absolutt flertall) av T-celler i et sensitivt pattedyr til hvilken autoantigener slik som T-celler vil etablere eller hjelpe til å etablere en immunrespons hvis det sensitive pattedyret er et pattedyr som er rammet. (Det er åpenbart fra denne diskusjonen at et "sensitivt" pattedyr ikke trenger å være et pattedyr som er rammet).

"Immunodominante regioner" eller "immunodominante domener" av et autoantigen er referert her som de regioner av aminosyresekvensen av slikt autoantigen som inneholder en immunodominant epitop. Strukturer (og/eller lokalisering i MBP eller annet autoantigent molekyl) av immunodominerende epitoper (og regioner) av MBP eller andre autoantigener varierer avhengig av verten, og er derfor vertsspesifikk. Foreliggende oppfinnelse har faktisk funnet bevis for at årsaken til at immunodominante epitoper er vertsspesifikk er at de må omfatte et motiv (antas å være inneholdt i et peptid fragment på ca. 8 til ca. 15 aminosyrer i lengde) som binder til hovedhistokompatibilitetskomplekset av verten. Dette motivet varierer blant forskjellige arter (MHC varierer på samme måte) og kan også utvise polymorfisme blant medlemmer av samme art.

Begrepet "analog" av fragmenter av MBP innbefatter forbindelser som er så strukturelt beslektede med fragmentet av MBP at de innehar samme biologisk aktivitet som MBP fragmentet. Den biologiske aktiviteten som refereres til i denne definisjonen er evnen til å undertrykke en T-cellemediert eller T-celleavhengig autoimmunrespons ved administrering av MBP fragment, eller alternativt evnen til å undertrykke proliferasjon av T-celler som er ansvarlig for bidrag til autoimmunt angrep, eller evnen til å bli gjenkjent av T-celler som gjenkjenner immunodominant epitop av MBP. Et eksempel på en analog av fragmentet MBP 84-102 er fragmentet MBP 84-102tyr, der aminosyre 102 har blitt endret til tyrosin. Slik man kan se fra figur 8, har denne endringen liten eller ingen effekt på evnen av MBP fragmentet å stimulere proliferasjon av MBP-reaktiv T-cellelinje. Aminosyresubstitusjoner forventes ikke å ha noen effekt på oppløselighet eller farmakokinetikk av et fragment på grunn av den relativt lille størrelse av foreliggende fragmenter. Det skal anmerkes at en analog "ikke trenger å utvise samme aktivitet til samme grad, en "analog" trenger f.eks. ikke å være en så potent undertrykker som et virkelig fragment av det native antigenet.

Andre analoger av relevante humane MBP epitoper kan bli konstruert basert på evne til disse analoger å binde MHC og til å bli gjenkjent av relevant T-cellereseptor (begge av disse kan bli testet in vitro).

Slik de blir brukt her, blir "T-celler" eller "T-lymfocytter" definert som immunsystemceller, avledet fra stamceller lokalisert i hematopoietisk vev (dvs. bloddannende). Det er tre store kategorier av T-celler: hjelper, suppressor og cytotoksisk. T-celler uttrykker enten CD4 antigen (og blir deretter betegnet CD4<+> T-celler) eller CD8 antigen (i dette tilfellet betegnes de CD8<+> T-celler) på deres celleoverflate. Ekspresjon av CD4 eller CD8 antigener ved perifere (sirkulerende) T-celler korrelerer med funksjon og spesifisitet av T-celle. "Hjelper T-celler" som er CD4<+> gjenkjenner antigener og klasse II MHC molekyler og gjennomfører hjelper og regulatoriske funksjoner. "Cytotoksiske" og "suppressor" T-celler (som er CD8<+>) gjenkjenner antigener og klasse I MHC molekyler og gjennomfører cytotoksiske og undertrykkende funksjoner.

"Aktiv undertrykking" er undertrykking av immunfunksjonen der undertrykkingen er resultat av induksjon av ytterligere immunceller, spesifikt, regulatoriske (undertrykker) T-celler.

"Klonal anergj" er undertrykking av immunfunksjonen ved induksjon i humane celler særlig immunangrepet T-celler, av en tilstand av ikke-responsivitet og mer spesifikt ikke-responsivitet til presentasjon av antigenet til hvilken disse cellene normalt er spesifisert og til hvilken de normalt vil proliferere. La Salle, J. et al., J. Exp. Med., 176:177-186, juli 1992. Anergiserte T-celler synes å være normale i alle henseende med unntagelse av at de synes å være "slått av". De er ikke aktivert, og i fravær av tilsatt interleukin-2 (IL-2), prolifererer de ikke ved presentasjon av antigen som de gjenkjenner. Hvis IL-2 blir tilsatt, blir cellene anergisert og begynner å proliferere ved presentasjon av antigen.

Slik det blir brukt her, menes "behandling" å inkludere både profylaktisk behandling for å hindre en autoimmun sykdom som har symptomer av MS (eller bekreftelse på kliniske symptomer av denne) såvel som terapeutisk behandling, dvs. undertrykking eller en hvilken som helst målbar lindring av en eller flere symptomer etter påsetting av en sykdom som presenterer symptomer på MS.

"Reseptor-avledede peptider" blir her definert som peptider som har aminosyresekvenser med (eller innhold i) VB 17 og/eller VB12 av T-cellereseptoren eller analoger derav såvel som andre midler (slik som attenuert VB 17- eller VB12-inneholdende T-celler), som når den blir administrert til et pattedyr som lider av en sykdom og har symptomer på MS vil undertrykke en eller flere slike symptomer.

(Minimum sekvenslengde av aktive peptider i foreliggende oppfinnelse er ca. 20 aminosyrer. Det er ingen spesiell maksimumslengde så lenge som aktiviteten er beholdt. For eksempel kan hele TCR eller til og med hele T-celler bli anvendt).

"MHC" eller "hovedhistokompatibilitetskompleks" defineres som en kompleksserie av pattedyrcelleoverflateproteiner som er tilstede på overflaten av aktiverte T-celler, makrofager og andre immunsystemceller. MHC spiller en sentral rolle i mange trekk ved immunitet både ved presentering av histokompatibilitet (eller transplantasjon) antigener og ved regulering av immunrespons mot konvensjonelle (fremmede) antigener. Det er to typer MHC proteinmolekyler, klasse I og klasse II. Humane MHC gener er lokalisert på det humane kromosom og mus MHC gener er lokalisert i H-2 genetisk lokus på musekromosom 17.

"Klasse II MHC molekyler" er membranglykoproteiner som danner deler av MHC. Klasse II MHC molekyler fins hovedsakelig på celler av immunsystemet inkludert B-celler, makrofager, hjemeastrocytter, epidermiske Langerhan'ske celler, dendrittiske celler, tymisk epitelium og hjelper Tceller. Klasse II MHC molekyler er involvert i regulering av immunrespons under vevspodingsforkastelse, stimulering av antistoffproduksjon, graft-versus-vertsreaksjoner og i gjenkjenning av "seg selv" (eller autologe) antigener blant andre fenomener. I beskrivelsen under vil MHC bli anvendt om hverandre med "klasse II MHC". MHC genene vil bli referert til som "MHC gener". T-celler initierer en immunrespons når de møter antigen-presenterende celler (APC), slik som mononukleære fagocytter (makrofager, monocytter), Langerhan'ske celler eller folliculære dendrittiske celler, som til å begynne med tar opp, bearbeider (spalter) og presenterer antigeniske fragmenter av et protein på sin celleoverflate (i forbindelse med MHC). CD4<+> T-celler gjenkjenner antigenmolekyler eksklusivt når proteinet blir bearbeidet, og peptidfragmenter derav blir presentert, ved APC som uttrykker klasse II MHC molekyler.

"T-cellereseptor" eller "TCR" blir definert her som antigengjenkjenningsreseptor som er tilstede på overflaten av T-celler. TCR er derfor reseptoren som binder et molekyl som immunsystemet gjenkjenner - og presenterer - som et antigen (uavhengig av om molekylet er fremmed eller autolog, det sistnevnte er i det tilfellet med en autoimmun sykdom). En hoveddel av T-cellene uttrykker en TCR som består av et disulfidbundet heterodimerprotein inneholdende en alfa (A) og beta (B) kjede, mens en mindre del av T-cellene uttrykker to forskjellige kjeder (gamma og delta). TCR består av en A og en B kjede, hver av disse omfatter en variabel og konstant region. (Tilinghast, J.P. et al., Science 233: 879,1986; Concannon, P. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83:6589, 1986, Kimura et al., J. Exp. Med. 164: 739,1986; Toyonaga, B., et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82: 8624,1985). Den variable regionen i sin tur omfatter en "variabel", en "diversitet" og "sammenknyttende" segment. Forbindelsen mellom variabel, diversitet

og sammenknyttende segment er postulert å være sete for antigengjenkjenning av T-celler. Se også, Ho, H.Z., et al., Immunogenetics, 1982,15:509-517; Olerup, O. et al., Tissue Antigens, 1987, 30:135-138; Opelz, G., et al., Tissue Antigens, 1977,9:54-58; Danska, J.S. et al., J. Exp. Med., 1990,172:27-33; Kempkis, B., et al., J. Lnmunol., 1992,149:2323-2327.

T-cellegjenkjenning av et antigen reflekterer en trimolekylær interaksjon mellom T-cellereseptoren (TCR), MHC molekylet av APC og et peptid eller peptider som er bearbeidet av APC via en kløft eller lomme i den tredimensjonale strukturen i klasse II MHC molekylet. (Bjorkman, P.J., et al., 1987, Nature, 329:506 og 329:512). Den delen av proteinet som oftest presenteres på APC overflaten og gjenkjent av T-cellen er immunodominant epitop.

I dyremodell (EAE) omfatter T-cellereseptorene en del av den animalske VB8.2 sekvensen som har blitt anvendt for å behandle sykdommen og viser seg å virke ved å eliminere sykdomsinduserende T-celler. Særlig i dyremodellen, omfatter peptidene sekvensen Thr-Leu-Cys-Ala-Ser-Ser og Thr-Leu-Cys-Ala-Ser-Arg som kan tilsvarende eksponerte deler (overflate) av mus og rotte VB8.2 har blitt bestemt (i mus og rotte-modeller) å bekjempe autoimmunsykdomsmodellen ved å eliminere hjelper T-celler.

I undersøkelser har man identifisert to regioner av human MBP som inneholder immunodominante epitoper av human MBP i en menneskelig vert. Disse epitopene befinner seg i to adskilte deler av human MBP aminosyresekvens (residier hhv. nr. 82-104 og 143-168). Slik det er vist i eksempel 1 under, har foreliggende oppfinnelse identifisert human MBP aminosyreresidier nr. 84-102 som en immunodominant domene av human MBP som er gjenkjent av en hoveddel av perifere T-celler isolert fra pasienter som lider av MS. I tillegg har eksperimentering bestemt at den immunodominante epitopen i denne domenen videre er lokalisert i human MBP aminosyrer nr. 85-99. Disse data blir presentert i eksempel 3. (Det fremkommer ved interferens fra data i eksempel 3 at minimalt human MBP fragment hvori den foregående humane verts-immunodominante epitopen er fragment 87-98 for noen T-cellekloner. Men alle T-cellekloner reaktive med 84-102 gjenkjenner fragment 85-99). Et tilsvarende eksperiment med MBP fragment 143-168 kan raskt føre til identifikasjon av den nøyaktige lokus av den immunodominante epitopen.

Eksperimenter som involverer dyremodell av MS, EAE, har vist at proteinfragmenter som innbefatter tilsvarende immunodominante epitoper av marsvin MBP og bovin MBP i rotter, når de blir administrert oralt til dyr som lider av sykdommen, er effektive i å undertrykke symptomene fra sykdommen (beslektet patentsøknad serienr. 07/596,936 og eksempel 2 under) selv om noen ikke-induserende fragmenter er mer potente undertrykkere enn induseringsrfagmenter. Det har videre vist seg at denne oralt effektive undertrykking skyldes induksjon av CD8<+> suppressor T-celler (Lider et al., J. of Immunol. 142:748,1989). Noen eksperimenter har vært gjennomført av andre i dyr ved å anvende encefalitogene fragmenter av MBP: Se f.eks. Swierkosz, J.E., 1977, J. Immunol. 119:1501-1506; Su, X-M et al., 1991, J. Neuroimmunol. 34:181-190 (i.v. anvendelse av MBP fragmenter - bestemt å være encafalitogene i mus - koblet til miltceller for avtagende å bli adoptivt overført EAE i mus); Avrilionis, K. et al., 1991, J. Neuroimmunol. 35:201-210 (i.v. anvendelse av marsvin av liposombundet human MBP peptidfragment - vist seg å være encafalolitogen når den blir administrert til marsvin - for å undertrykke EAE indusert med samme fragment og i.p. og s.c. anvendelse av fritt peptid for samme formål).

Peptidene i foreliggende oppfinnelse kan fordelaktig bli anvendt i utforming av spesifikke immunoundertrykkende preparater inneholdende slike peptider som i sin tur er nyttig for undertrykking av skadelig T-celleproliferasjon. For eksempel har peptider som omfatter sekvenser av human MBP vist seg å indusere anergi i humane MBP-spesifikke CD4<+> T-celler eller å indusere T-suppressorceller spesifikt for demyelinering og kan bli konstruert og anvendt til dette formål. Se for eksempel eksemplene 1 og 2 under. Resultater som er rapportert i eksempel 2 indikerer videre at frem-gangsmåteprotokoll ved administrering av de tolererbare midlene påvirker mekanismen som medfører undertrykking av den nevnte immune reaksjon. Peptidfragmenter som således inkorporerer en immunodominant epitop av human MBP i mennesker er effektiv ved hemming av proliferasjon av MBP-reaktiv CD4<+> human T-celler in vitro og forventes å være effektiv av samme mekanisme når den blir administrert via i.v. veien i mennesket. Samme epitopiske peptider forventes å være effektive ved indusering av undertrykking av autoimmunt angrep av human neuralt vev når det blir administrert til mennesker oralt. Foreliggende oppfinnelse medfører også bevis på at hel MBP (som innbefatter de foregående to immunodominante epitoperegioner) kan indusere undertrykking via utløsing av suppressor T-celler (aktiv undertrykking) når MBP blir administrert oralt i små mengder i mange doser. Samme antigen, også administrert oralt, men i høye mengder og i en enkeldose vil indusere undertrykking via anergi. Det er videre evidens at begge mekanismer ved undertrykking kan bli utløst ved justering av oral administreringsprotokoll fra MBP mellom de to ekstremer som er identifisert over. Uten ønske om å være bundet til teorien, antas det at oral eller enteral administrering av immunodominante fragmenter av MBP kan sørge for at undertrykker T-celler blir utløst som i sin tur undertrykker T-celler som bidrar til autoimmunt angrep av neuralt vev (dvs. hjeme, ryggrad, perifere nerver eller assosierte celletyper). Nervevevskade som utgjør patologi som sees i pasienter som lider av MS antas å være et direkte resultat av et slikt autoimmunt angrep. I og med at denne tolererende mekanismen involverer aktiv induksjon av regulatoriske (suppressor) T-celler som ansvarlig for undertrykking av immunoreaktiviteten i celler i nærheten av vev under immunangrep, er det et eksempel på aktiv undertrykking.

Foreliggende oppfinnelse har akkumulert en stor samling av eksperimentelle bevis på at aktiv undertrykking foregår ved utløsing av tolereriserende-antigenspesifikke T-suppressorceller som er målrettet til lokus av legemet der antigenet som disse T-suppressorene er spesifikke kan bli funnet. Dette lokus inkluderer vev under autoimmunt angrep. Med en gang de møter dette antigenet, skiller T-suppressorene ut undertrykkende cytokiner slik som ikke-spesifikk immunosuppressiv faktor TGF-fl og interleukin-4 (IL-4) som undertrykker autoimmunresponser inkludert autoimmunt angrep. (Se beslektet patentsøknad serienr. 843,752).

1 motsetning er intravenøs administrering (eller subkutan eller intraperitoneal administrering) av MBD fragmenter som inkorporerer immunodominante epitoper antatt å medføre immunundertrykking gjennom en annen mekanisme som er kjent som klonal anergi. Klonal anergi eller T-celle ikke-responsivitet, har vært tilkjent antigenpresentasjon i fravær av passende ko-stimulatoriske faktorer. Jenkins, M.K. PNAS, 84:5409-5413,1987. Den nøyaktige identiteten til faktoren som er involvert er dårlig definert, men oppløselige cytokiner (f.eks. B-7, EDCI, og en passende intracellulær kalsiumkonsentrasjon) har vært implisert. Senere evidens antyder imidlertid at såkalt "negative signaler" i stedet for fravær av ko-stimulatoriske faktorer er ansvarlig for anergi. Disse signalene har imidlertid ikke vært definert. Se LaSalle J.M. et al., J. Exp. Med., 176:177-186, juni 1992. Heller enn indusering av T-cellekloner for å proliferere, forårsaker presentasjon av antigen ved APC uten ko-stimulatoriske faktorer (og/eller i nærvær av negative signaler) at T-celler blir ikke-responsive til etterfølgende antigenstimulering, mens det gjenværende responsive til IL-2 og er således beskrevet som anergisert (Jenkins et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 84:5409, 1987; Mueller et al., Ann. Rev. Immunol. 7:455,1989; Schwartz et al., Science 248:1349,1990). Autoimmunrespons-fremmende kloner spesifikt til et autoantigen slik som MBP, vil således ikke lenger proliferere i respons til det antigene, og reduserer immunangrepsreaksjonene som forårsaker vevsskade som er ansvarlig for autoimmunsykdomssymptomene, slik som neuralvevsskade som observeres i MS.

Undertrykking ved klonal anergi kan differensiert (og har blitt differensiert slik i eksperimentene under) fra aktiv undertrykking ved adoptive overføringseksperimenter som undersøke evne eller manglende evne til suppressor T-celler overført fra et tolerert dyr til et ikke-tolerert dyr for å sørge for undertrykking av immunfunksjonen i det sistnevnte dyret. T-celleoverføring medfører undertrykking hvis undertrykkingsmekanismen er aktiv, dvs. hvis den involverer utløsing av T-suppressorceller og forekommer ikke hvis suppressormekanismen er passiv, dvs. hvis klonal anergi er involvert. Resultatene som er rapportert i eksempel 2 illustrerer tilfeller der hver mekanisme av immunundetrrykking er involvert og viser at undertrykkingsmekanismen avhenger av en eller flere av følgende: (i) på substans som blir administrert for å indusere toleranse (f.eks. immunodominant epitopiske fragmenter av MBP induserer aktiv undertrykking via oral vei og energi via parenteral vei); (ii) på veien når det gjelder administrering av det tolererende antigen (f.eks. bare epitoper som blir gjenkjent av angrepne T-celler induserer anergi via i.v. vei); og (iii) på mengde og frekvens av administrering (f.eks. oralt administrert MBP induserer aktiv undertrykking når den blir gitt i mindre mengder og flere doser og passiv undertrykking når den blir gitt oralt i store mengder og en enkeldose).

Data viser at både encefalitogene og ikke-encafalitogene fragmenter av MBP kan utløse aktiv undertrykking når de blir administrert oralt, med de ikke-encefalitogene fragmenter som inkorporerer en immunosuppressiv epitope som arbeider via aktiv undertrykking og bare når den blir administrert via oral vei. Encefalitogene fragmenter (inkorporerer en immunodominant epitop) kan også utløse anergi via oral vei hvis den blir administrert i høye mengder og enkle doser. Disse resultatene har viktige forgreninger på utforming av tolererende midler og metoder basert på MBP som en tolererer. Avhengig av type immunsuppresjon som er ønsket, kan spesielle metoder når det gjelder administrering såvel som spesielle fragmenter bli anvendt. Det kan f.eks. være ønskelig å anvende en eller flere sykdoms-spredende epitopiske peptider via i.v. eller s.c. eller i.p. veien og (for tiden) en eller flere immunosuppressive epitopiske peptider via den orale veien.

Det er også antatt at tolererende metoder som involverer kombinasjoner av administreringsveier, og/eller protokoller, og/eller autoantigene fragmenter kan vise seg å være mest effektiv. Slik det er underforstått av personer med kunnskap innfor fagområdet, vil effektivitet av et fragment eller kombinasjon av fragmenter (eller en kombinasjon av et fragment og et helt antigen) og effektivitet ved en metode (eller kombinasjoner av metoder) når det gjelder administrering av MBP, være en funksjon av alder, kjønn, vekt, fysikalsk tilstand og sykdomstrinn og subjektet som skal bli behandlet, og den ledsagende anvendelse eller fravær av andre fragmenter eller behandlinger. Fragment(er) som blir anvendt og administreringsmetode må bli bestemt hovedsakelig delvis basert på disse faktorer, og trenger ikke å bli bestemt eksperimentelt på en sak til sak basis. Slik bestemmelse krever imidlertid ikke mer enn rutineeksperimentering, gitt ved eksempler og retningslinjer som er inneholdt her.

Peptider basert på sekvenser av human MBP for anvendelse i foreliggende oppfinnelse, som identifisert i eksempel 1, kan bli syntetisert ved å anvende velkjente fastfasemetoder (Merrifield, R.B., Fed. Proe. Soc. Ex. Biol., 21:412,1962 og J. Am. Chem. Soc. 85:2149,1963; R. Mitchel! A.R. et al., J. Am. Chem. Soc. 98:7357,1976; Tam, J. et al., J. Am. Chem. Soc. 105:6442,1983), fortrinnsvis ved anvendelse av en kommersielt tilgjengelig peptidsynteseappartur (slik som den som er laget av Applied Biosystems, Foster City, CA) og ved åfølge forhandlerens instruksjoner. Slike peptider kan alternativt bli syntetisert ved rekombinante DNA teknikker som er velkjent innenfor fagområdet, Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, NY, 1982, se sidene 51-54 og sidene 412-30). Disse peptidene kan f.eks. bli oppnådd som DNA ekspressjonsprodukter etter inkorporering av DNA sekvenser som koder for det ønskede fragment av MBP isolert fra de ønskede artene inn i ekspresjonsvektorer og innfører av slike vektorer i egnede eukaryotiske eller prokaryotiske verter som vil uttrykke de ønskede peptidene individuelt som en del av fusjonspeptider eller proteiner, fra hvilke de kan senere bli isolert ved å anvende velkjente teknikker.

Peptidanaloger kan bli utformet ved å anvende kjente aminosyresekvenser som er kodet av human MBP gen som beskrevet under, ved anvendelse av syntetiske eller rekombinante teknikker som beskrevet over og fremgangsmåter av f.eks. Eyler, E.B., i Advances in Experimental Medicine and Biology 21:259-281, 1978. Et peptid som har en sekvens basert på, men adskiller seg fra den eksakte aminosyresekvensen til det ønskede fragmentet av MBD, kan f.eks. bli kjemisk syntetisert ved å anvende de ovenfor beskrevne teknikkene. Et slikt peptid kan bli undersøkt for sin effekt på MBP-reaktive CD4<+> T-celler ved f.eks. å anvende fremgangsmåter som er beskrevet i eksempel 1 for identifisering av en mer nøyaktig lokalisering i aminosyrer 84-102 for denne spesielle immunodominante epitopen av en human MBP eller fremgangsmåte som beskrevet i eksempel 4 for testing av binding av T-cellereseptor og til MHC. Et MBP-basert peptid kan bli testet in vitro for effektivitet oralt i mennesker ved å eksponere samlede, isolerte perifere MBP-spesifikke suppressor T-celler fra individer til peptid for å bestemme om de prolifererer. I tillegg eller alternativt, kan disse isolerte suppressor T-cellene bli testet for å bestemme om de frigjør suppressive cytokiner slik som TGF-6 og/eller IL-4 ved eksponering til et MBP peptid. (Se f.eks. anvendelse av transwellsystemet i US-søknad serienr. 843,752 tilsvarer PCT US92/01705 med unntagelse av at anvendelse av miltceller som APC ikke er nødvendig; MBP peptid kan bli anvendt for å indusere cellene for å frigjøre TGF-B). MBP spesifikke T-suppressorceller kan bli isolert ved eksponering til MBP og bestemmelse av proliferering etterfulgt av bindingsstudier ved å anvende anti-CD8<+->antistoff.

Foreliggende oppfinnelse skaffer også tilveie farmasøytiske sammensetninger for oral eller parenteral anvendelse i undertrykking av autoimmun angrep T-cellefunksjoner hos mennesker, særlig de subjekter som lider av MS. Generelt inneholder slike sammensetninger en eller flere peptider ifølge oppfinnelsen som er fragmenter av human MBP og analoger derav, i en mengde som er effektiv i å undertrykke proliferasjon av immunangrepsceller. Undertrykking av funksjon som resulterer i en in vitro undertrykking av immunangrepsceller, slik som MBP-spesifikke CD4<+> T-celler og/eller attenuering av en eller flere symptomer av MS i en pasient som er blitt behandlet med det farmasøytiske preparatet ifølge oppfinnelsen. Se definisjonsseksjon over når det gjelder hva som utgjør undertrykking og symptomattenuering.

T-cellesuppressive peptider i foreliggende oppfinnelse kan også omfatte ytterligere ikke-MBP-avledede aminosyresekvenser som fører eller følger MBP-baserte sekvenser så lenge disse ytterligere sekvensene ikke overvinner den suppressive funksjonen til slike peptider. Testing av slike konstruksjoner for immunoundertrykkende aktivitet kan enkelt bli gjort ved f.eks. å anvende en eller flere av analysemetodene som her er beskrevet.

Farmasøytiske formuleringer i foreliggende oppfinnelse kan inkludere som eventuelle ingredienser, farmasøytisk aksepterbare bærermidler, bærere, fortynningsmidler, oppløsliggjørere eller emulgeringsmidler, og salter av den type som er velkjent innenfor fagområdet. Ikke-begrensende eksempler på slike substanser innbefatter 0,5N saltvann i destillert vann for parenteral anvendelse og laktose for oral anvendelse.

Fragmenter av human MBP kan bli administrert oralt ved bi-inhalering i forbindelse med synergister som kan øke effektiviteten av immunsuppresjon. Ucke-begrensende eksempler på synergister for anvendelse i foreliggende oppfinnelse inkluderer bakterielle lipopolysakkarider fra en lang rekke gramnegative bakterier slik som forskjellige subtyper av E. coli og Salmonella (LPS, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO; Difco, Detroit, Ml; BIOMOL Res. Labs., Plymouth, PA), Lipid A (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO; ICN Biochemicals, Cleveland, OH; Polysciences, Inc., Warrington, PA) og immunoregulatoriske lipoproteiner, slik som peptider som er kovalent bundet til tripalmitoyl-S-glycarylcysteinyl-seryl-serin (P3 C55) som kan bli oppnådd som beskrevet i Deres, K. et al., (Nature, 342:561-564,1989) eller "Braun's" lipoprotein fra E. coli som kan bli oppnådd som beskrevet i Braun, V., Biochim. Biophys. Acta 435:335-337,1976. LPS er foretrukket og Lipid A særlig foretrukket. Lipid A er særlig foretrukket ved anvendelse i foreliggende oppfinnelse fordi det er mindre toksisk enn hele LPS molekylet. LPS for anvendelse i foreliggende oppfinnelse kan bli ekstrahert fra gramnegative bakterier og renset ved å anvende fremgangsmåten til Galanes et al. (Eur. J. Biochem. 9:245, 1969) og Skelly, R.R., et al. (Jnfect. Immun. 23:287,1979).

Effektiv mengde av en synergist, f.eks. LPS eller Lipid A som skal bli administrert i forbindelse med MBP fragment er i området fra ca. 0,15 og 15 mg pr. kg kroppsvekt av nevnte pattedyr pr. dag og fortrinnsvis mellom 0,3 og 12 mg pr. kg kroppsvekt av nevnte pattedyr pr. dag.

Administreringsvei for suppressive midler i foreliggende oppfinnelse er i en oral eller parenteral form eller kombinasjoner av disse. Oral administrering innbefatter oral, enteral eller intragastrisk administrering og oral er foretrukket. Parenteral administrering innbefatter intraperitoneal, subkutan, intradermal og mest å foretrekke intravenøs administreirngsveier.

Som vist tidligere blir MBP basert peptid eller analog generelt administrert oralt til en menneskelig pasient i en mengde i området mellom ca. 10 ug og ca. 20 mg pr. administrering, fortrinnsvis mellom ca. 100 ug og 250 ug. Mengden blir pulsadministrert i en enkel doseringsform eller mange doseringsformer. For hel MBP å utløse aktiv undertrykking er en dosering på 1 mg 5 ganger daglig et eksempel på en effektiv mengde. For anergi, er 10-20 mg MBP parenteralt eksempler på en effektiv mengde. Overvåking av pasientene er ønskelig for å optimalisere dosering og frekvens når det gjelder administrering. Den eksakte mengde og frekvens av administrering til en pasient kan variere avhengig av tilstand, frekvens av manifestering og alvorlighet av pasientens sykdom og pasientens fysiske tilstand, slik det er velkjent innenfor fagområdet. Slik optimalisering blir fortrinnsvis gjennomført på en sak til sak basis. Optimalisering av doseringen som er nødvendig for immunundertrykking representerer ikke utilbørlig eksperimentering, gitt i retningslinjer som her er beskrevet.

I en alternativ utførelsesform av foreliggende oppfinnelse kan farmasøytiske orale formuleringer eller doseringsformer ifølge oppfinnelsen også bli administrert ved inhalering, fortrinnsvis i aerosolform. Inhaleringsmåten når det gjelder administrering er fortrinnsvis ikke gjennom nasalsystemet men gjennom bronkial eller pulmunær mukosa. MBP fragment og beslektede forbindelser i foreliggende oppfinnelse kan bli administrert til mennesker som tørre pulverpartikler eller som atomisert vandig oppløsning suspendert i en bærergass (f.eks. luft eller N2). Foretrukne aerosolfarmasøytiske formuleringer kan omfatte f.eks. en fysiologisk aksepterbar bufret saltoppløsning.

Metodene i foreliggende oppfinnelse kan involvere bi-inhaleringsadministrering av farmasøytiske formuleringer i form av en aerosolspray ved f.eks. å anvende en nebulisator slik som de som er beskrevet i US-patent nr. 4,624,251 inngitt 25. november 1986; 3,703,173 inngitt 21. november 1972; 3,561,444 inngitt 9. februar 1971 og 4,635,627 inngitt 13. januar 1971. Aerosolmaterialet blir inhalert av subjektet som blir behandlet.

Andre systemer for aerosolavlevering, slik som trykkpålagt doseinhallator (MDI) og tørrpulveirnhalator som beskrevet i Newman, S.P. i Aerosols and the Lung, Clarke, S.W. og Davia, D. eds. sidene 197-224, Butterworths, London, England, 1984, kan bli anvendt når man gjennomfører foreliggende oppfinnelse.

Aerosolavleveringssystemer av den type som her er beskrevet er tilgjengelig fra en lang rekke kommersielle kilder inkludert Fisons Corporation (Bedford, MA), Schering Corp.

(Kenilworth, NJ) og American Pharmoseal Co. (Valencia, CA).

Man forventer at lavere mengder av fragment av MBP i foreliggende oppfinnelse vil være nødvendig ved å anvende aerosoladministrering for behandling i og med at denne effekt har vært funnet når man behandler EAE med hel MBP og adj uvant artritt med kollagen som beskrevet i US-patentsøknad serienr. 454,486 inngitt 20. desember 1989. Det synes videre at immunsuppresjon indusert med inhalering av fragment av MBP foregår gjennom aktiv undertrykkingsmekanismer, tilsvarende oral administrering. Weiner, H.L. et al. FASEB 4(7):2101,1990. Mengder av fragment av MBP i foreliggende oppfinnelse som kan bli administrert i en aerosol doseringsform vil være mellom ca. 0,015 mg og ca. 1,5 mg pr. kg kroppsvekt på pattedyr pr. dag og kan eventuelt innbefatte en synergist i mengder i området mellom ca. 0,05 og ca. 15 mg pr. kg kroppsvekt av nevnte pattedyr pr. dag og kan bli administrert i en enkel doseringsform eller multiple doseringsformer. Eksakt mengde som skal bli administrert vil variere avhengig av tilstand og alvorlighet hos pasientens sykdom og den fysiske tilstanden hos pasienten.

Doseringsformer for parenteral administrering vil generelt inneholde fra ca. 1 til ca. 200 mg av et peptid ifølge oppfinnelsen pr. dose pr. person og fortrinnsvis ca. 10 mg til ca. 100 mg. Beskrivelsen av inerte eventuelle ingredienser og fin-avstemmende mengder og administreirngsskjema gitt over med hensyn på orale formuleringer angår bare parenterale formuleringer.

Det skal understrekes at enhetsinnholdet av aktiv ingrediens eller ingredienser inneholdt i en individuell oral eller parenteral dose av hver doseringsform trenger ikke selv utgjøre en effektiv mengde for behandling av MS siden den nødvendige effektive mengden kan bli oppnådd ved administrering av flere doseringsenheter.

Teknikker som er beskrevet under i eksempel 1-3 kan bli anvendt til å overvåke effektivitet av metoder i foreliggende oppfinnelse og optimalisere mengde og frekvens av administrering av sykdomsundertrykkende midler fra foreliggende oppfinnelse, såvel som fragmenter og metoder ved administrering som blir anvendt.

T-celler kan bli isolert fra en pasients perifere blod eller cerebrospinalfluid, amplifisert og klonet som beskrevet i eksempel 1-3 (før og/eller etter behandling ifølge foreliggende oppfinnelse). Antistoffer (enten polyklonale eller monoklonale) kan bli oppnådd direkte mot MBP peptider i foreliggende oppfinnelse (ved å anvende konvensjonelle teknikker som er velkjent og anvendt innenfor fagområdet) for å bestemme tilstedeværelse av MBP reaktive T-celler i en pasients periferiblod og mer spesifikk for tilstedeværelse av aktiverte MBP-reaktive CD4<+> T-celler før og/eller etter behandling ifølge oppfinnelsen. Peptidene i foreliggende oppfinnelse er også nyttige for å identifisere individer med T-celler reaktive med MBP, ved å anvende metoden i eksempel 1.

Foreliggende oppfinnelse blir beskrevet ytterligere under ved hjelp av spesifikke arbeidseksempler som har til hensikt å illustrere oppfinnelsen uten å begrense omfanget.

EKSEMPEL 1: Identifikasjon av hovedimmunodominant region av human MBP MBP ble ekstrahert med humant hjernevev og renset på en CM-52 kolonne (leverandør: Wattman Biosystems Ltd. Maidstone, Kent, U.K.) ved å anvende høyest molekylvektstopp (18kD) som beskrevet (Chou, F.C.-H. et al., J. Biol. Chem. 251:2671, 1976). MBP peptider ble syntetisert ved å anvende en faststoffasemetode eller ble oppnådd fra et kommersielt laboratorium (Biosearch Lab Inc., San Raphael, CA) og ble renset ved høytrykksvæskekromatografi som følger: Hvert peptid som inneholdt preparat ble opplagret i 0,1% trifluoreddiksyre (TFA) ved 1 mg/ml. Det ble deretter bearbeidet i en HPLC kolonne (Rainin reversfase C4 til Cl8) ved åanvende en 0-70% acetonitrilgradient inneholdende 0,1% TFA. Topper ble påvist ved 214 nm. MBP peptidfragrnenter anvendt er fremsatt i tabell 1 under. Sekvensen av human MBP er imidlertid publisert. Derfor er bare tallene som betegner aminosyreresidiene inneholdt i hvert peptid nødvendig.

En rask T-cellekloneteknikk ble anvendt for å undersøke om det var immunodominante epitoper på human MBP reaktiv med klasse II MHC fenotyper og frekvensen av slik reaktivitet. Totalt 15 824 kortleddede T-cellelinjer ble generert fra 51 humane subjekter ved å dyrke periferblod mononukleære celler (PMN) med renset MBP (100 ug) fulgt 3 dager senere, og deretter hver 3-4 dager, ved tilsetning av interleukin-2 (IL-2; fra ABI, Columbia, MD) og 2 enheter rekombinant interleukin-4 (IL-4; Genzyme, Boston, MA). På dag 13 av kulturen, ble en prøve fra hver linje testet for reaktivitet til MBP ved å anvende følgende proliferasjonsanalyse: T-cellekloner (1 x IO<5> celler/brønn) ble plettert i tre paralleller og dyrket med passende stimuli (dvs. 100 ug hel MBP eller 5% IL-2) i

72 timer ved 37°C, 90% fuktighet. 5% CO2 i 96 brønners flatbunnede mikrotiterplater (Costar). Celler ble pulsert med 2 uCi [<3>H]TdR (2 Ci/mmol, New England Nuclear, Boston, MA) i minst 18 timer av kulturen. APC ble fremstilt ved pulsering av human Epstein-Barr-virus transformerte humane B-celler (virus er kommersielt tilgjengelig fra ATCC) eller L-celler som er museceller transfektert med human DR2 (L-celler er kommersielt tilgjengelig fra ATCC under aksessjonsnr. ATCC-CCL1 og kan bli transfektert i henhold til metoden til Wilkinson, D. et al., J. Exp. Med., 1988,167:1442-1458 ved åanvende DNA som koder for DR2 som Wu, S. et al., J. Immunol., 1987, 138:2953). B-celler eller L-celler ble anvendt ved 1x10^ celler/brønn i komplett medium enten i nærvær eller fravær av 40 pM MBP eller fosfolipidprotein (PLP) i 2 timer ved 37°C, vasking to ganger med 4% Hanks (Whittaker), etterfulgt av bestråling med 5000 rad ved 4°C. For å stimulere T-celler uten ekstra APC, ble 2 uM MBP, PLP eller passende fragment tilsatt direkte til cellene under kulturens varighet: 48 timer, etterfulgt av pulsering av tymogen og deretter høsting. Titusen APC ble anvendt for 100 000 T-cellekloner. T-cellelinjer som viser seg å være reaktive til MBP eller PLP ble deretter undersøkt ved å anvende samme teknikk for reaktivitet for å overlappe oligopeptid 20-merer som innbefatter human MBP sekvens som vist i tabell 1 over. MBP og PLP reaktivitetsrfekvensanalyse ble gjennomført på pasienter med bestemt, gjentagende MS (som diagnostisert ved magnetisk resonansavbilding (MRI) og klinisk undersøkelse), så vel som på subjekter med andre neurologiske sykdommer og på normale subjekter (alle alder- og kjønnstilpasset MS pasientene). Resultatene er vist i tabell 2 under.

Pasienter med MS var kaukasiske og hadde velkarakterisert tilbakefallende gjentagende sykdom med minst to forverringer i løpet av de foregående 24 måneder og positive skader som man ser ved å anvende MRI på tidspunktet for blodprøvetaking. Subjekter med andre sentralnervesystemsykdommer hadde følgende diagnose: 1-3 uker etter enten cerebrovaskulær ulykke (n=4), hjemetrauma med CNS blødning (n=4), eller metastatisk hjernetumor (n=2). Totalt antall T-cellelinjer reaktiv med MBP eller PLP og totalt antall T-cellelinjer generert er vist i tabell 2 ("Ag" betyr "antigen"). I tillegg ble frekvens av MBP og PLP-reaktive linjer beregnet separat for hvert subjekt ved å dele tallet for MBP-reaktive linjer med totaltall av linjer generert og gjennomsnittsverdien +/-SEM er gitt. Samme konklusjon kan trekkes med hensyn på reaktivitet til PLP skjønt til en mindre grad enn reaktivitet til MBP eller dens fragmenter.

Selv om frekvens av linjer reaktiv til alle fragmenter av MBP var svakt høyere i subjekter med MS sammenlignet med andre subjekter, var denne økning ikke statistisk signifikant. Som imidlertid diskutert under, ble et signifikant større antall MBP reaktive cellelinjer fra MS pasienter reaktive med fragmenter som inkluderer aminosyrer 84-102 og 143-168, og identifiserer således disse peptidene og tilsvarende fragmenter av MBP som inneholder immunodominante epitoper av MBP aktiv i utvikling av MS.

Av totalt 302 cellelinjer fra pasienter med MS som kunne bli utviklet og bekreftet i å reagere med MBP ved gjentatt analyse, reagerte 140 (46,4%) med MBP residier 84-102; og tilnærmet 70-80% reagerte med enten MBP residier 84-102 eller 143-168.1 kontrollgruppene gjenkjente 11 av totalt 100 MBP reaktive T-cellelinjer (11,0%) 84-102 peptid og ca. 34% gjenkjente enten 84-102 eller 143-168 peptid. Den virkelige frekvens av T-celler avledet fra perifert blod som reagerte med hver MBP peptid for hvert individuelle subjekt ble beregnet. Gjennomsnittsverdier for pasienter med MS og kontrollsubjekter er vist i den høyre kolonne i tabell 2. Tilsvarende immunodominant peptid(er) av PLP kan bli identifisert ved samme metoder som beskrevet her for MBP peptider.

Frekvens av MBP peptid spesifikke cellelinjer fra normale subjekter og andre neurologiske sykdomskontroller var i virkeligheten identiske og således kombinert for analyse. Gjennomsnittsfrekvens av T-cellelinjer fra subjekter med MS som var selektivt reaktiv til MBP residier 84-102 var høyere sammenlignet med kontroller (figur 1). Signifikant, men mindre slående økninger i reaktivitet til MBP residier 61-82 og 124-142 ble også observert i MS pasienter, mens både MS og kontrollsubjekter viste høye frekvenser av T-cellelinjer reaktive med MBP residier 143-168. IL-2 ble anvendt til å selektere T-cellelinjer som var aktivert. Etter primærstimulering med IL-2 gjenkjente de således aktiverte cellelinjene MBP peptider.

Utvidelse av disse runnene i større populasjoner av MS pasienter ble gjort, ved å anvende teknikkene som er beskrevet over. Ytterligere 132 T-celler (63 fra MS pasienter og 88 fra normalkontroller) ble studert, med resultatene rapportert i tabell 3 under. Oppsummert støtter disse resultatene konklusjonen i peptidene som inneholder MBP aminosyreresidier 84-102 og 143-168 som immunodominante domener av MBP.

De foregående resultatene i tabell 4 viser at et dramatisk høyt antall ytterligere MPB reaktive T-cellekloner kan bli identifisert i MS pasienter (sammenlignet med kontroll) ved primærstimulering av MBP-spesifikk T-celler med IL-2. Dette indikerer at MBP-reaktive T-cellekloner kan bli deaktivert (sannsynligvis deanergisert) ved eksponering til IL-2, etter at de er blitt reaktive til MBP peptider.

EKSEMPEL 2: Mekanisme ved induksjon av immun toleranse Eksperimentene i dette eksemplet ble gjort for å sammenligne effektivitet av undertrykking av EAE ved å anvende forskjellige fragmenter av MBP, for å sammenligne oral og intravenøs administrering av proteinfragment, og for å sammenligne behandling av sykdomstilstand når den var indusert eller adoptivt-overført. Indusert EAE forekommer når MBP ble anvendt for å immunisere en vert og ble administrert intramuskulært i forbindelse med en adj uvant, mens adoptivt overført sykdom forekommer når en MBP-reaktiv cellelinje ble aktivert deretter injisert i dyret.

(Se induksjon av EAE-avsnitt under når det gjelder detaljer). I dette eksemplet ble følgende materialer og fremgangsmåter anvendt.

Dyr. Hunnlige Lewis rotter 6-8 uker gamle ble oppnådd fra Harlan-Sprague Dawley Inc.

(Indianapolis, IN). Dyrene ble holdt i Harvard Medical School Animal Care Facilities og holdt under standard laboratoriebetingelser og vann ad libitum. Dyrene ble holdt i overensstemmelse med retningslinjene for the Committee on Care of Laboratory Animals of the Laboratory Research Council (Pub. #DHEW:NIH, 85-23, revised 1985).

Antigener og reagenser. Marsvin MBP ble renset fra hjernevev ved den modifiserte metoden til Deibler et al. (Prep. Biochem. 2:139,1972). Proteininnhold og renhet ble undersøkt ved gelelektroforese og aminosyreanalyse. Concanavalin A og histon ble oppnådd fra Sigma (St. Louis, MO). Peptider ble syntetisert i peptidfacility i Center for Neurologic Disease, Brighan and Women's Hospital, og renset på HPLC. Aminosyresekvenser av peptider syntetisert er: 21-40, MDHARHGFLPRHRDTGILDS -

(immunosuppressiv epitoperegion når oralt administrert til rotte); 71-90,

Induksjon av toleranse. For oral toleranse eller aktiv suppresjon, ble rotter foret med 1 mg MBP oppløst i 1 ml PBS eller PBS alene, ved gastisk intubasjon med en 18-måls rustfri ståldyrfødenål (Thomas Scientific, Swedesboro, NJ). Dyrene ble foret fem ganger ved intervaller på 2-3 dager med siste foring to dager før immunisering. For intravenøs toleranse eller klonal anergi, ble rotter injisert med 0,1 mg MBP, MBP peptider eller histon oppløst i 0,1 ml PBS, eller PBS alene. Dyrene ble injisert via okkulærvene fem ganger ved intervaller på 2-3 dager med siste injeksjon 2 dager før immunisering.

Induksjon av EAE. For aktiv indusert sykdom, ble Lewis-rotter immunisert i venstre fotpute med 25 ug marsvin MBP i 50 ul PBS emulgert med et likt volum komplett Freund's adjuvans (CFA) inneholdende 4 mg/ml mycobacterium tuberculosis (Difco). For adoptivt overført EAE, ble en MBP aktiv T-cellelinje etablert fra rotter immunisert med MBP i CF A, reist og opprettholdt i henhold til metoden i Ben-Nun et al., (Euro. J. Immunol. 11:195,1982). Encefalitogene celler ble samlet etter aktivering ved kultur med Concanavalin A (ConA) (2 um/mi) ved å anvende bestrålte tymocytter fra immuniserte dyr som APC. Celler ble høstet fra kulturer via en fikol hypak gradient (Hypaque 1077, Sigma) og vasket to ganger i PBS før overføring. 5x10^ encafalitogene celler ble injisert intraperitonealt i 0,1 ml PBS inn i bestrålte (750 rad, 24 timer tidligere) motlagende rotter. Cellelevedyktighet hos både modulator og encafalitogene celler ble bestemt ved trypan blå ekskludering og var høyere enn 90%. I alle eksperimenter ble 5 dyr anvendt pr. eksperimentelle gruppe.

Rensing av T- celleundermengder for ado<p>tiv overføring av beskyttelse etter oral toleriserin<g>. Uttømming av lymfocyttundermengde ble gjennomført ved negativ seleksjon ved å anvende magnetiske perler i henhold til metoden til Cruikshank et al., (J. Immunol. 138:3817, 1987). Miltceller ble inkubert med en 1:10 fortynning av mus anti-rotte CD8 eller CD4 monoklonalt antistoff (henholdsvis kloner OX/8 eller W3/25, Serotec/Bioproducts, Indianapolis, IN), i 30 minutter på is, vasket to ganger og deretter tilsatt forhåndsvaskede magnetiske partikler, med en gjennomsnittlig diameter på 4,5 um (M-450) med geit anti-mus IgG kovalent festet (Dynal, Fort Lee, NJ). Mengden av magnetiske kuler som ble beregnet var 10 ganger den estimerte målcellepopulasjonen. Cellene ble inkubert med kuler i 0,5 ml RPMI1640 medium supplert med 10% fetalt kalveserum i en 10 ml rundbunnet testrør (Nunc) i 30 minutter på is med forsiktig risting hvert 5. minutt. Etter inkubering ble kuler/cellesuspensjonen vasket med 5 ml medium, og celle-mAb-kulekomplekset ble separert fra umerkede celler i et sterkt magnetisk felt ved å anvende en magnetisk partikkelkonsentrator (Dynal-MPC-1) i 2 minutter. Supematant ble fjernet og fremgangsmåten gjentatt to ganger for å oppnå ikke-festet fraksjon. Cellene i CD4<+> og CD8<+> uttømte populasjoner var

>95%CD4<+>CD8" eller CD4-CD8<+>, slik det ble demonstrert ved indirekte strømcytometri. Hele miltpopulasjoner fra MBP foret eller kontrolldyr ble dyrket (5 x 10^ celler i 1 ml proliferasjonsmedia), i nærvær av Con-A (2 ug/ml). Uttømte populasjoner ble dyrket ved en konsentrasjon på 2,5 x 10^ celler pr. ml. Resulterende undermengder ble anvendt som modulatorceller.

Klinisk evaluering. Dyr ble evaluert på en blindprøvemåte hver dag for evidens av EAE. Klinisk alvorlighet av EAE ble vurdert som følger: 0, ingen sykdom; 1 halt hale; 2, baklemparalyse; 3, baklemparaplegia, inkontinens; 4, tetraplegia; og 5, død. Varighet av sykdom ble målt ved å telle totalt antall dager fra sykdomsstart (vanligvis dag 10 eller 11 eller aktiv immunisering og 3-5 dager etter adoptiv overføring av sykdom) inntil fullstendig bedring for hvert dyr.

Forsinket type h<y>persensitivitet ( DTH) testing. DTH ble testet ved injisering av 25 ug MBP i PBS subkutant i øret. Tykkelsen ble målt ved en blindprøveobserverer, før og 48 timer etter utfordring, ved å anvende mikrometerkaliperer (Mitutoyo, Japan). Forskjell i øretykkelse før og etter utfordring ble registrert for hvert dyr, og resultatet ble uttrykt som gjennomsnitt for hver eksperimentelle gruppe ± SEM.

Histolo<g>i. Histologisk analyse av patologiske endringer ble gjennomført i rotter med adoptivt overført EAE. Ryggraden ble fjernet på dag 15 etter adoptiv overføring og fiksert med 10% nøytralbufret formalin. Parafinseksjoner ble fremstilt og farget med Luxol hurtig blå-hematoksylin og eosin, ved standardprosedyrer (Sobel et al., J. Immunol. 132:2393,1984). Ryggmargsvev ble prøvetatt på en identisk måte for hvert dyr og antall inflammatoriske foki pr. seksjon (klynger av >20 eller mer aggregerte inflammatoriske celler), i parenchyma og meninges ble vurdert på en blindprøvemåte (Sobel et al., supra).

Statistisk analyse. Kliniske skalaer ble analysert med en to-halet Wilcoxon rekkeviddesumtest for vurderingsprøver, chi kvadratanalyse ble anvendt til sammenligning av insidens av sykdom mellom grupper, og sammenligning av gjennomsnitt ble gjennomført ved å anvende Studenfs t-test. For individuelle eksperimenter ble 5 dyr anvendt pr. gruppe.

RESULTATER

Undertrykking av adoptiv overført EAE ved oral toleriserin<g> til MBP. For å evaluere effekt av tidligere oral administrering av MBP på adoptivt overført EAE, ble MBP-forede og kontrollrotter innokkulert intraperitonealt med 5x10^ MBP-spesifikke, Con-A stimulerte og encefalitogenlinjeceller. MBP reaktive celler ble overført to dager etter siste foring. Figur 2A viser de kliniske vurderingene av dyr som var oralt tolerisert til MBP og deretter innokkulert med MBP-spesifikke celler (svarte sirkler) og sammenligner dem med kliniske vurderinger av naive dyr som var innokkulert samtidig (åpne sirkler). Som det er vist i denne figuren, hadde oral administrering ingen effekt på adoptiv overført EAE. Foreliggende oppfinnelse foreslår at feil ved oral tolerisering for å undertrykke adoptiv overført EAE skyldes det faktum at transplanterte encefalogene T-celler blir aktivert og har evnen til å bevege seg til målorganer raskt der de starter immunangrep før tilstrekkelig antall suppressor T-celler: beveger seg til lymfonodus; og (iii) beveger seg til målorgan (hjerne). Forhold av regulatorisk til encefalotigene celler som er tilstede på målorganet og tidspunkt for inngang synes å være kritisk.

Adoptivt overført EAE ble imidlertid undertrykket når miltceller fra oralt toleriserte dyr ble ko-overført med encefalitogene celler til naive mottakere (figur 2B), indikerer at allerede-utløst suppressor T-celler med hell kan forhindre sykdom selv når de blir ko-administrert med immunangrepsceller.

Figur 2B viser kliniske vurderinger av dyr som ble ko-injisert med 5x10^ encafalitogene celler med 1,5x10^ miltceller fra dyr oralt tolerisert til MBP. For ko-overføring, ble celler fra oralt toleriserte dyr blandet med encefalitogene celler og injisert (svarte sirkler). Det ble også vist i figur 2B at tilsvarende beskyttelse ble observert når encefalitogene og modulatorceller ble injisert separat i høyre og venstre flanker (åpne sirkler), og dette indikerer at den beskyttende effekten ikke skyldes interaksjon mellom suppresjon T-celler og angreps T-celler. Kliniske vurderinger av positive kontrolldyr i figur 2B er indikert med svarte kvadrater.

Undertrykking av adoptivt overført EAE er avhengig av CD8+ T- celler fra oralt tolererte dyr. For å bestemme om undertrykking av adoptiv overført EAE var avhengig av en spesifikk T-celleundermengde, ble miltceller fra MBP forede dyr uttømt på CD4<+ >eller CD8<+> T-celleundermengder forut for adoptiv overføring og anvendt som modulatorer. Som vist i figur 3, ble adoptiv overføring av beskyttelse opphevet ved overføring av CD8<+> uttømte miltceller, men ikke ved overføring av CD4<+> uttømte miltceller (gjennomsnittlig maksimal skår = hhv. 2,3±0,2 vs. 0,7±0,2, p<0,01). Åpne kvadrater: uselektert miltcellepopulasjon, svarte sirkler CD4<+> uttømte miltceller; åpne sirkler CD8<+> uttømte miltceller.

Forsinket hypersensitivitet ( DTH) responser forbundet med adoptivt overført EAE. En korrelasjon mellom DTH responser og undertrykking av aktivitet indusert EAE etter oral tolerasjon har vært funnet (Miller et al., J. Exp. Med. 174:791,1991; Miller et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 89:421,1992). For åbestemme om en tilsvarende korrelasjon eksisterer i adoptivt overført EAE, ble DTH responser målt. Slik det er vist i figur 4 ble dominerende DTH responser utviklet i dyr som gjennomgår adoptiv overført EAE og DTH responser undertrykket ved ko-overføring av splenocyter fra dyr oralt tolerert til MBP. Undertrykket DTH responser ble opphevet ved uttømming av CD8<+>, men ikke CD4<+> T-celler forut for overføring (A øresvelling CD4<+> uttømt vs. CD8<+> uttømt = 0,6±0,1 vs. l,8±0,2,p<0,01).

Effekt av ko- overføring av celler fra MBP oralt tolererte dyr på CDS histologi i adoptivt overført EAE. Oral administrering av MBP undertrykker CNS inflammasjon i aktiv indusert EAE (Higgins et al., J. Immunol. 140:440,1988). Heke desto mindre undertrykket alle immunspesifikke immunomodulatoriske behandlinger av EAE kliniske sykdomspåvirket CNS inflammasjon (Offher et al., Science 251:430,1991). Som vist i figur 5, var det en minsket informasjon i både parenchyma og meninges når celler fra MBP-forede dyr ble overført og denne undertrykkingen ble observert når CD4<+> uttømte, men ikke CD8<+> uttømte modulator miltceller fra oralt toleriserte dyr ble overført. Antall CNS (parenchyma + meninges) inflammatoriske foki for spesifikke grupper var som følger: Kontroll = 76±8,2; MBP foret = 3,8±1,8; CD4<+> uttømt = 2,8±1,0; CD8<+> uttømt = 65±4; (p<0,01, MBP foret og CD4<+> uttømt vs. kontroll eller CD8<+> uttømt).

Undertrykking av aktiv indusert og adoptivt overført EAE etter IV administrering av MBP. Slik det er vist i figur 6A, undertrykket intravenøs (IV) injeksjon av MBP markert EAE aktivt indusert ved immunisering med MBP/CFA (gjennomsnittlig maksimal score = 0,5±0,2, vs. kontroll injisert histon = 3,0±0,3; p<0,01), i en analog måte til undertrykking ved oral tolerisering med MBP. I motsetning til oral tolerisering, som imidlertid ikke beskyttet mot adoptivt overført EAE (figur 2A), undertrykket IV injeksjon av MBP også adoptivt overført EAE (gjennomsnittlig maksimal score = 0,4±0,2, vs. kontroll = 3,2±0,2; p<0,01). (Figur 6B). I motsetning til oral tolerisering kunne imidlertid sykdomsbeskyttelse ikke bli adoptivt overført med miltceller fra PV toleriserte dyr når slike celler ble ko-overført med en MBP encefalitogen linje (gjennomsnittlig maksimal score = 2,8±0,2, vs. kontroll p = N.S. (figur 6B).

Undertrykking av EAE etter oral eller IV administrering av MBP peptider. For ytterligere å undersøke mekanismen ved oral vs. IV toleranse, ble MBP peptider som omfatter både encefalitogene og ikke-encefalitogene regioner av MBP administrert både oralt og intravenøst forut for immunisering for aktiv indusert sykdom. MBP peptid 71-90 fra marsvin MBP er encefalitogene i Lewis rotter (Swanborg et al., J. Immunol. 114:191,1975). Slik det er vist i figur 7, forekom undertrykking av EAE via IV tolerisering bare med hel MBP og encefalitogen peptid 71-90, men ikke med marsvin MBP peptid 21-40. Oral tolerisering med 21-40 var imidlertid effektiv i undertrykking av EAE. Marspeptid 21-40 ble valgt som eksperimenter som demonstrerer at det utløser TGF-B frigjort fra miltceller av rotter oralt tolerisert med hel MBP. Miller, A. et al., FASEB 6:1686,1992. Marsvin MBP peptid 131-150 undertrykket ikke når det var administrert enten oralt eller intravenøst. Det skal bemerkes at i tillegg til undertrykking via IV veien, undertrykket peptid 71-90 encefalitogen MBP når den var gitt oralt. Dette resultatet indikerer at peptider avledet fra immunodominant domene av en gitt MBP mot en gitt vert kan undertrykke T-cellefunksjon når de blir oralt eller intravenøst administrert, men gjør det ved forskjellige mekanismer avhengig av administreringsvei og administreringsprotokoll.

Resultatene fra disse eksperimentene viser at det er basisforskjeller i mekanisme når det gjelder undertrykking av EAE mellom oralt og parenteralt (f.eks. intravenøst) administrert MBP. Resultatene antyder at oralt administrert antigen virker hovedsakelig via generering av aktiv undertrykking, mens parenteralt administrert antigen virker via klonal anergi. Spesifikk støtte for denne konklusjonen er den dårlige evnen til miltceller fra IV toleriserte dyr å undertrykke adoptivt overført EAE. Forskjellige fragmenter av MBP var mer eller mindre effektiv i undertrykking med forskjellige administreringsveier. (Se f.eks. figur 7). Foreliggende funn kan bli anvendt til å dra fordel av at man kan utforme immunosuppressive metoder basert på anti-drevet toleranse, slik som metoden i foreliggende oppfinnelse.

EKSEMPEL 3

Fin- avstemt bestemmelse av immunodominant epitop av human MBP i mennesker ved å fastslå evne ved overlappende peptider å stimulere MBP spesifikke T- cellekloner

Ved å anvende celleproliferasjonsanalyse som er beskrevet i eksempel 1 over, ble evnen til et peptid som består av den immunodominante domenen av human MBP (dvs. sekvensen av aminosyrer 84-102) å stimulere T-celleproliferasjon bestemt og sammenlignet med den fra en serie av peptider som har aminosyresekvenser som representerer N-terminale og C-terminale progressive trunkeringer av den immunodominante domenen som ble bestemt. Slik det er vist i figur 8, (og tabell S under) prolifererer de testede T-cellelinjene med en N-terminal trunkering ned til aminosyre 85, etter dette var det en dramatisk nedgang i evnen til fragmentet å aktivere proliferasjon. Progressiv C-terminal trunkering påvirker raskt drastisk den stimulatoriske evnen, der bare trunkering til residie 99 ikke vesentlige påvirker epitopefunksjonen. I fravær av C-terminal trunkering, som vist i figur 8, synes tap av aminosyre 85 og 86 også å bli tolerert ved den testede klonen. I figur 9, ble fire forskjellige T-cellekloner eksponert til hel MBP 84-102 peptid og peptider 85-99 og 86-97 til test om forskjellige peptider forårsaket forskjeller i proliferasjon av de forskjellige kloner. Selv om individuelle kloner har iboende forskjellige evner til å proliferere i nærvær av et epitopisk peptid, ikke desto mindre er evnen til et spesielt peptid å forårsake at en klon prolifererer er kvalitativt tilsvarende fra klon til klon. Fra disse studier synes det at fragmentaminosyrer 85-99 vil omfatte et minimalt immunodominant fragment som har evnen til å stimulere T-celleaktivitet for alle T-cellekloner.

Tabell 5 under opplister evne til human MBP (84-102) spesifikke T-cellekloner å proliferere i nærvær av MBP (84-102) peptid og trunkerte eller modifiserte versjoner av dette peptid. Antall i matriks er peptidkonsentrasjoner (uttrykt i mikromolar) som gir 50% maksimal stimulering av T-cellekloner. Maksimal stimulering av T-cellekloner ble bestemt ved å eksponere dem til umodifisert utrunkert MBP (84-102) peptid. Betegnelsen med fete typer "50" og ">50" betyr en femganger eller mer enn femganger tap av stimulativ aktivitet sammenlignet med utrunkert umodifisert MBP peptid (84-102).

Peptidkonsentrasjoner (uM) som gir 50% maksimalt stimulering (referansepunkt: MBP (84-102) peptid) er gitt. <*> Mer enn femganger tap i aktivitet sammenlignet med MBP (84-102) peptid.

EKSEMPEL 4

T- cellegjenkjenning av alaninanalogpeptider av MBP 85- 99- reaktiv T- cellekloner

Figur 11 viser binding av hvert peptid til MHC (venstre kolonne) og til en T-celleklon (høyre panel). DRB1<*>1501 transfekterte L-celler presenterer immunodominant MBP

(84102) peptid til autoreaktive T-celler. APC ble pulsert med MPB (84-102) (100 ug/ml) for B-cellelinjer og 50 ug/ml for DR transfektanter, bestrålt med 5 000 rad og ko-dyrket med T-cellekloner i tre dager etterfulgt av en tymidinpuls. Resultatene (^H-tymidinopptak sammenlignet med nativt peptid) er uttrykt i svarte rektangler (90% av maksimal stimulering) grå med kryss (>50% av maksimal stimulering) lyse grå (>10% av maksimal stimulering) og hvite (ingen aktivitet). Resultatene viser at Val i posisjon 898 og Phe i posisjon 92 er involvert i MHC binding. Trunkeringsdata antyder at isoleucin i posisjon 95 også er involvert i MHC binding. T-cellereseptorkontaktpunkter inkluderer His ved 90, Phe ved 91 og Lys ved 93.

T-celleklon Hy.2El 1 vil tolerere en Arg substitusjon i stedet for Lys ved 93 men Ob T-cellekloner vil ikke. Foreslåtte bindingsmotiver for DRB1* 1501 ogDRB5<*>0101 er figur 10. Piler opp indikerer binding til DR reseptor og piler ned indikerer binding til MHC av APC.

En serie av analogpeptider vil bli syntetisert til både konservative og ikke-konservative aminosyresubstitusjoner i posisjoner 88-95 som vil bli anvendt. Negativ ladd asparaginsyre vil f.eks. bli substituert med en annen negativt ladd rest (glutominsyre), en aminosyre med samme bulk men uten ladning (asparagin), en aminosyre med motsatt ladning (lys), og til slutt en liten aminosyre slik som ala. Tilnærmet 60 peptider er nødvendig for å bli syntetisert.

Preliminære data antyder at 148-162 regionen av MBP er den minimale epitopen for dominant epitop 143-168. Når kjemeregionen av dette peptidet er definert ved å anvende metoder som er angitt i eksemplene 2 og 3, en tilsvarende analyse som angitt i dette eksempel 4 for MBP peptider 85-99.

Analoge peptider vil bli analysert forDR26-(DRBl<*>1501), DR2a-(DRB5<*>0101), DR4, DR7 og DQ1.1 binding. Denne analysen vil forklare videre hvilken aminosyrerest som er involvert i MHC binding. Analoge peptider som ikke har mindre enn 10 ganger bindingskapasitet av nativt peptid vil bli anvendt for å undersøke T-cellereseptorspesifisitet.

EKSEMPEL 5: Teknikker

MBP ble ekstrahert fra humant hjernevev og renset på en CM-52 kolonne ved å anvende høyeste molekylvekttopp (18 kD) som beskrevet (Chou, F.C.-H. et al. J. Biol. Chem. 251:2671, 1976). MBP peptider ble syntetisert ved å anvende en faststoffasemetode og ble oppnådd fra et kommersielt laboratorium (Biosearch Lab Inc., San Raphael, CA) og ble renset ved høytrykksvæskekromatografi. MBP peptidfragmenter som ble anvendt er framsatt i tabell 6 under.

T-cellereseptor TCR VB genanvendelse ble anvendt ved polymerasekjedereaksjon (PCR) amplifikasjon ved å anvende et panel av TCR VB primer etterfulgt av Southern blotting. T-cellelinjer ble etablert fra perifert blod mononukleære celler i to runders stimulering med MBP etterfulgt av stimulering med et immunodominant human MBP peptid (aminosyreresidier 84-102), immunodominansen av denne har blitt bestemt ved proliferasjonsanalyse (som beskrevet i eksempel 6) ved å anvende tabell 6 panel av 13 overlappende MBP peptider. Etter en tredje runde av stimulering av deres spesifikke MBP peptid, ble RNA ekstrahert med MBP-reaktive T-cellekulturpelleter (20 000-50 000 celler) ved ekstrahering med guanidinium-isotiocyanat/fenol-kloroform og isopropanolutfelling i nærvær av bærer tRNA. Enkelt-trådet cDNA ble syntetisert ved å anvende oligo-dT og AMV-reverstranskriptase (begge tilgjengelig kommersielt fira Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD). PCR (polymerasekjedereaksjon som beskrevet i US-patent nr. 4,800,159 inngitt 24. januar 1989; 4,683,195 inngitt 28. juli 1987; og 4,683,202 inngitt 28. juli 1987) amplifikasjon ble gjennomført ved å anvende et panel av 19 oligonukleotider (spesifikk for pulveriserte TCR VB familier - VB 1 -20, tabell 7) som tilsvarer CDR2 region av TCR B-kjede og en CB (konstantregion av B kjede) primer (tabell 7) (som beskrevet i Tilinghast, J.P. et al., Science 233:879,1986; Concannon, P. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 83:6598,1986; Kimura, N. et al., J. Exp. Med. 164:739, 1986; Toyonaga, B. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 82: 8624; 1985; Kimura, N. et al., Eur. J. Immunol. 17: 375,1987). Amplifikasjoner ble utført i 30 sykluser (94°C 1 minutt, 55°C 2 minutter, 72°C 3 minutter) ved å anvende 1 mikrogram av hver primer i 50 mikroliterreaksjoner. Amplifiserte produkter ble separert i 1% agarosegeler, overført til nitrocellulose og Southern blot ble redusert med en intern oligonukleotid TCR-CB probe (tabell 7). Prober ble merket med <32>P gamma-ATP og T4 polynukleotidkinase (Bethesda Research Labs.) til en spesifikk aktivitet på IO<8> cpm/ug og hybridisert i 6xSSC/5xDenhardt,s/0,05% pyrofosfat/lOOug/ml denaturert DNA/0,5% SDS i 18 timer ved 37°C. Blotene ble vasket med en sluttstrenghet på 6xSSC/70°C og autoradiografert i 2-18 timer. T-cellelinjer som var positive i mer enn to TV segmenter ble betraktet å ikke være avledet fra en enkel MBP reaktiv T-celle og derfor ekskludert fra analyse.

For sekvensering ble amplifikasjoner av cDNA gjennomført med en VB 17 primer (tabell 7) spesifikk for ledersegment inneholdende en indre Pst I restriksjonssete. Amplifisert DNA ble behandlet med proteinase K, fenol/kloroformekstrahert, etanolutfelt og spaltet med restriksjonsendonukleaser Bgl II og Pst I (kommersielt tilgjengelig f.eks. fra Bethesda Research Labs., over). Gelrenset DNA ble ligert inn i Ml3 mp 18 og enkel-trådet DNA ble sekvensert ved dideoksymetoden (Sanger, F., et al., 1977, Proe. Nati. Acad. Sei., 74:5463). Negative kontroller ble inkludert under prosedyren for åundersøke for mulig kontaminasjon av RNA prøver eller reagenser anvendt for cDNA syntese og amplifikasjon. VB, CB og JB2.1 primersekvenser som ble anvendt er fremsatt i tabell 7 under.

Amplifisert og ikke-amplifiserte prøver ble behandlet separat, reagenser ble prøvetatt og undersøkt for tilstedeværelse av amplifisert materiale og negative kontroller ble inkludert i forskjellige eksperimentelle trinn (RNA isolering, cDNA syntese, PCR amplifikasjon).

EKSEMPEL 6: Identifikasjon av VB eenbehandline i T- celler isolert fra MS

pasienter

To serier av eksperimenter ble gjennomført for å undersøke gyldighet av ovenfor beskrevne tilnærmelser. For det første ble det demonstrert at alle tabell 7 primere med unntagelse for VB20 hadde evne til å amplifisere cDNA fra perifere blod T-celler (figur 12). For det andre ble spesifisiteten av PCR amplifikasjoner undersøkt ved analyse av VB genbehandling i 69 uavhengige T-cellekloner tidligere etablert ved enkelcell-ekloning ved mitogen (slik som fytohemagglutin, - "PHA" - og interleukin-2). På grunn av høye oppnådde kloningseffekter, skaffet disse klonene tilveie en representativ analyse av VB genbehandling blant perifere blod T-celler. TCR VB genbehandling kunne bli bestemt for 65/69 (94,2%) av disse T-celleklonene og indikerer at en stor andel av TCR VB reportoaret ble dekket av VB primere. Mens 58 av disse kloner (84%) var positiv for en enkel VB, var 7 kloner (10,1%) dobbelt-positive, mulig på grunn av tilstedeværelse av to rearrangerte og uttrykte TCR VB gener.

TCR VB genbehandling ble deretter analysert i sekstifem MBP-spesifikke T-cellelinjer etablert fra fem pasienter med klinisk definert tilbakefall-gjentagende MS. Representative Southem blot fra MBP reaktive T-cellelinjer er vist i figur 12 og VB genbehandling for alle cellelinjer analysert er fremsatt i tabell 8 under. Femtien av disse linjene reagerte med MBP residier 84-102, mens fjorten T-cellelinjer var spesifisert for MBP residier 143-168. Trettien MBP T-cellelinjer reaktiv til MBP aminosyreresidier 84-102 ble analysert fra MS pasient Hy (pasient 1, tabell 8). Tjuetre av disse T-cellelinjene (74%) ble funnet å anvende VB17 gensegmentet, mens åtte andre cellelinjer ble begrenset av enten VB2, VB7 eller VB14 gensegementer. Disse resultater indikerer at VB 17 er hovedgjenkjenningselementet i T-cellelinjer fra denne MS pasient reaktiv med MBP residier 84-102. VB17 behandling ble også funnet blant 6/20 T-cellelinjer undersøkt fra fire andre pasienter (pasienter 2-5, tabell 8). Den andre TCR VB som ble anvendt av T-cellelinjer blant disse fire pasienter var VB 12 som ble funnet i 7/20 T-cellelinjer reaktive med MBP residier 84-102 (tabell 8, figur 12). Denne VB syntes å være homolog med mus VB8.2 som er dominerende TCR anvendt blant encefalitogene T-celler i mus og rotter (Burns, F.R. et al., J. Exp. Med. 169:27,1989).

MS pasient Cy uttrykker både DR2 og DRwl 1 antigener og hadde således T-celler som gjenkjente enten immunodominant MBP region (84-102 residier) eller MBP 143-168 residier. Dette skaffer tilveie mulighet for å sammenligne TCR VB behandling blant T-celler som reagerer med forskjellige MBP determinanter (figur 12). Av syv linjer som proliferer til MBP residier 84-102, uttrykte tre VB12 og en uttrykte VB17 (tabell 8). I motsetning ble 6/9 T-cellelinjer som gjenkjenner MBP residier 143-169 brukt VB 17 og bare en linje hver anvendte TCR VB12 og VB17 TCR gener (tabell 8). Southern blot av fem T-cellelinjer reaktive med MBP residier 84-102 (VB 12: Cy.2C2, Cy.3F6) eller MBP residier 143-168 (VB14: Cy.lE6, Cy.2B12, Cy.2E2) er vist i figur 12.

Selv om VB12/VB13 er relativt vanlig blant normalt perifert blod T-celler (tilnærmet 18%), er VB 17 betydelig mindre frekvent (tilnærmet 3%), slik det ble bestemt ved kvantitativ PCR. I motsetning, ble VB 17 funnet i 34/63 (53,9%) av T-cellelinjene reaktive med MBP residier 84-102, mens den bare var tilstede i 3/32 (9,4%) av TCR VB gener i tilfeldig mitogenavledet T-cellekloner oppnådd ved enkel-cellekloning fra normalt individ (Moretta, A. et al., J. Epp. Med. 157: 743,1983; Hafler, D.A., et al., J. Exp. Med. 167: 1313,1988). Disse data viser at VB17 TCR er selektiv involvert i gjenkjenning av immunodominant MBP 84-102 region.

For å vise at TCR gensegment identifisert med PCR var VB kodende gen anvendt for å gjenkjenne MBP peptid, ble to VB17 positive T-cellelinjer (Hy.2H9 og Hy.2G5) klonet ved begrenset fortynning (Moretta, over). 11/11 individuelle kloner etablert fra disse to cellelinjer, som var reaktive med både MBP og MBP residier 84-102, var VB17+. Tre av disse kloner ble videre analysert ved å anvende det komplette panel av VB primere og ble alle funnet å være negative for andre VB segmenter.

VB sekvensene av fire T-cellelinjer fra pasient Hy ble funnet å være 100% homologe til den publiserte VB 17 sekvensen (som beskrevet i Kimura, N., et al., Eur. J. Immunol. 17: 375, 1987). Denne sekvensanalysen bekrefter at spesifikke VB segmenter i virkeligheten ble amplifisert ved å anvende denne måte. Analyse av VDJ (diversitets-forbindelse) sekvensen indikerer at alle fire av disse T-cellene anvendte samme forbindelse JB2.1 segment og at 3/4 av disse hadde samme VDJ sekvens (Tabell 7). For å bestemme hvor ofte JB2.1 gensegmentet ble brukt av VB 17+ T-celler, ble DNA fra 20 cellelinjer fra MS pasient Hy amplifisert ved å anvende VB 17 primerkombinasjonen med en CB primer eller en JB2.1 primer (tabell 13). Alle disse linjer ble funnet å være positiv for VB17 såvel som JB2.1 gensegmenter, mens negative kontroller (RNA ekstrahert fra alle cellelinjer og ikke omdannet til cDNA, og reagenser anvendt for cDNA synteser og amplifikasjon) var negativ ved PCR og Southern blotting. Disse data viser en sterk seleksjon for VB17-JB2.1 sekvenselementer i MBP residier 84-102 reaktive T-cellelinjer avledet fira pasient Hy.

To andre T-cellelinjer som anvender VB 17 TCR identifisert ved PCR analyse og gjenkjennende MBP residier 84-102 fra MS pasienter Fn og Ns ble sekvensert og sammenlignet med sekvenser av TCR VB fra MS pasient Hy (tabell 8). Selv om VB17 gensegmentsekvensen var identisk blant T-celler reaktive MBP residier 84-102 fra tre pasienter, ble forskjellige JB sekvenselementer funnet. Tre resultater viser en delt VB genbruk i T-celler som gjenkjenner et immunodominant MBP peptid mellom forskjellige individer. I motsetning til dette, ble delt JB gensegmentbruk funnet blant T-celler avledet fra samme individ men ikke mellom forskjellige individer.

Fire av de fem studerte pasientene var positive for sykdomsassosiert DR2 allele, mens pasient Tw var HLA-DR3, DR4. Deke desto mindre, var tre VB12/VB17 begrenset cellelinjer tilstede blant fire linjer analysert fra denne MS pasient (tabell 8), indikerer at de delte MHC klasse II antigenene ikke kan være obligatorisk for delt TCR VB genbruk med hensyn på gjenkjenning av MBP peptid 84-102.

EKSEMPEL 7: Identifikasjon av hovedimmundominant region av human MBP

En rask T-cellekloningsteknikk ble anvendt for å undersøke om det var immunodominante epitoper på human MBP reaktiv med klasse II MHC fenotyper og frekvens av slik reaktivitet. Totalt 15 824 kortleddede T-cellelinjer ble generert fra 51 subjekter ved å dyrke perifere blodmononukleære celler (PMN) med renset MBP (oppnådd som i eksempel 5 over) fulgt tre dager senere, og deretter hver 3.-4. dag, ved tilsetning av interleukin-2 (IL-2) og interleukin-4 (IL-4) (Genzyme, Boston, MA). På dag 13 i dyrkingen, ble en prøve fra hver linje undersøkt for reaktivitet til MBP. Linjer reaktive til MBP ble deretter testet for reaktivitet til overlappende oligopeptid 20-merer som omfatter den humane MBP sekvensen som vist i tabell 6 over. For MHC restriksjonseksperimenter, ble linjer reaktive til et NBP peptid stimulert på nytt i to Ytterligere sykluser, først med MBP og deretter med det spesifikke MBP fragmentet som er gjenkjent av linjen. I en undergruppe av pasienter, ble frekvens av T-celler som gjenkjenner protelipid protein (PLP), en annen hovedencefalitogen sentralnervesystemantigen, undersøkt.

MBP og PLP frekvensanalyse ble gjennomført på pasienter med bestemt, tilbakefall MS (som diagnostisert ved magnetisk resonansavbildning - "MRI" - og klinisk undersøkelse), så vel som på subjekter med andre neurologiske sykdommer og normale subjekter (alle aldere og kjønn tilpasset MS pasienter). Resultatene er vist i tabell 8A under. Pasienter med MS var kaukasiere og hadde velkarakteriserte tilbakefallssykdom med minst to forverringer i løpet av tidligere 24 måneder og positive skader på magnetisk resonansavbilding (MRI) ved tidspunktet for blodprøvetaking. Subjekter med andre sentralnervesystemsykdommer hadde følgende diagnose: 1-3 uker etter enten cerebrovaskulær ulykke [4] eller hjernetrauma med CNS blødning [4]; metastatisk hjemetumor [2]. Total antall T-cellelinjer reaktive med enten MBP eller PLP og totalt antall T-cellelinjer generert er vist i tabell 8A ("Ag" betyr "antigen"). I tillegg, ble frekvenser av MBP- og PLP-reaktive linjer beregnet separert for hvert subjekt ved å dividere antall MBP reaktive linjer med totalt antall linjer generert og gjennomsnittsverdi ± SEM er gitt.

Selv om frekvens av MBP reaktive linjer var svakt høyere i subjekter med MS sammenlignet med andre subjekter, var dette ikke statistisk signifikant. Det var mer reaktivitet til PLP hos pasienter med MS sammenlignet med subjekter med andre neurologiske sykdommer, men oppnådde ikke statistisk signifikans.

Av totalt 302 cellelinjer fra pasienter med MS som kunne utvides å bekreftes å reagere med MBP ved gjentagende analyse, reagerte 140 (46,4%) med MBP residier 84-102.1 kontrollgruppene gjenkjente 11 av totalt 111 MBP reaktive T-cellelinjer (11,0%) dette MBP peptidet. Den virkelige frekvens av T-celler avledet fra perifert blod som reagerte med hvert MBP peptid for hvert individuelle subjekt ble beregnet. Gjennomsnittsverdier for pasienter med MS og kontrollsubjektet er vist i nest høyre kolonne i tabell 8A. 50 000 T-linjeceller ble plettert i tredoble paralleller med 50 000 bestrålte APC, NMC (mononukleære celler) (Hafler, D.A., et al., J. Exp. Med. 167: 1313,1988) i 72 timer i rundbunnede 96-brønners mikrotiterplater og brønner ble pulsert med [<3>H]-tymidin i minst 18 timers dyrking. APC MNC ble enten dyrket alene, pulsert med 100 ug/ml syntetisk MBP peptid 84-102, (bestemt å være optimal konsentrasjon av peptid for å indusere proliferasjon), eller pulsert med 100 ug/ml MBP. Gjennomsnittlige tellinger pr. minutt (CPM) verdier for tredoble brønner er vist i tabell 9. DR og DQw haplotyper er gitt og haplotyper felles med pasient (topplinje), som er positiv for DR2, DR7, DWwl, DWw3, er understreket.

Proliferasjon av T-cellelinjer ved å anvende et panel av forskjellige mononukleære celler (MNC) som antigenpresenterende celler (APC) er vist. Fem T-cellelinjer reaktive til MBP aminosyreresidier 84-102 fra subjekt Hy ble ekspandert ved gjentatte sykluser av stimulering med autologbestrålt MNC, pulsert med syntetisk MBP peptid 84-102 og

undersøkt for gjenkjenning av denne region av MBP.

For disse studier, ble panelet med fem T-cellelinjer reaktive med MBP residier 84-102 plettert med autolog APC MNC, som over, i nærvær av monoklonale antistoffer (mAbs)

(endelig konsentrasjon 1:100) som gjenkjenner forskjellige MHC klasse II genprodukter. (Nomenklatur som blir anvendt for antistoffer er tiende International Histocompatibility Workshop; spesifisitetene er også gitt). Resultatene er fremsatt i tabell 9 under.

Frekvens av peptidspesifikke cellelinjer fra normale subjekter og andre neurologiske sykdomskontroller var i virkeligheten identiske og således kombinert for analyse. Gjennomsnittsfrekvens av T-cellelinje fra subjekter med MS som var selektivt reaktiv til MBP residier 84-102 var høyere sammenlignet med kontroller (figur 1). Signifikant, men mindre slående økning i reaktivitet til MBP residier 61-82 og 124-142 ble også observert i MS pasienter, mens både MS og kontrollsubjekter viste høye frekvenser av T-cellelinjer reaktive med MBP residier 143-168. DR2, DQwl haplotype var meget inn-frekvent i kontrollsubjekter og mer vanlig i pasienter med MS (tabell 9). En assosiasjon ble observert mellom DR2 fenotype og både andelen eller frekvens av T-cellelinjer reaktiv til MBP residier 84-102 (figur 14).

For å bestemme om T-cellereaktivitet til MBP residier 84-102 var forbundet med DR2, ble DQwl ekspresjon i ikke-MS subjekter, ytterligere 6 normale subjekter med DR1, DQwl fenotype undersøkt. Resultatene er vist i figur 14.

En DR2 assosiasjon ble også observert blant kontroller på bakgrunn av andel av T-cellelinjer reaktiv med MBP residier 84-102 (DR2+ kontroller, 31,0±10-.8%; DR2-, 10,1±0,4%), selv om totalfrekvens av linjer reaktive med denne regionen av MBP var mindre enn den hos pasienter med MS (figur 14). Selv om DQwl er en bindingsdissosiasjon med DR2 såvel som med DR1 og DRwlO, viste uavhengig analyse av peptidreaktivitet ingen assosiasjon med DQwl fenotypeekspresjon.

DRwl 1 fenotype var mer vanlig i kontroller enn i subjekter med MS (tabell 8A). DRwl 1 var positivt assosiert med frekvens av linjer reaktiv til MBP residier 142-168 i pasienter med MS og kontroller, men ikke med frekvens av linjer reaktive med MBP residier 84-102 (figur 13). Reaktivitet til MBP residier 31-50, som ble observert som dominerende i kontrollsubjekter, var assosiert med DRwl 1. Andre MHC assosiasjoner ble ikke observert. MHC assosiasjon med residier av T-cellelinjer reaktive med en immunodominant MBP epitope ble bestemt. Resultatene er fremstilt i tabell 10 under. Mer spesifikt ble det bestemt at MHC haplotyper ble anvendt for å presentere antigen i T-cellelinjer reaktiv med en immunodominant MBP epitope. Monoklonalt antistoffblokkerende studier av fem T-cellelinjer reaktive med MBP residier 84-102 antyder at både DR og DQ molekyler kunne fungere som restriksjonselementer. Blant kloner blokkert med anti-DR mAb, prolifererte klon 2E11 i respons til MBP residier 84-102 med panelet av DR2+ APC mens 2C9 og 2H9 prolifererte bare med autolog APC (tabell 10). Gjenkjenning av peptid ved kloner 1A8 og 3A10, som var delvis blokkert med anti-DQ mAb ble begrenset til APC fra svareren og en av to APC donorsubjekter som uttrykker DQwl.

Å undersøke videre forhold mellom MHC ekspressjon og frekvens av T-cellereaktivitet til immunodominante MBP epitoper, ble en familie med en angjeldende slektning som uttrykker både DR2 og DRwl 1 fenotyper studert.

Familiemedlemmene til en MS pasient som uttrykker DR2, DRwl 1, DRw52, DQwl klasse II MHC haplotyper ble undersøkt for frekvens av T-cellelinjer reaktiv med MBP residier 84-102 og 143-168.

Totalt 1 728 individuelle T-cellelinjer ble generert fra både foreldre og fire avkom og antall linjer reaktive med enten MBP peptid 84-102 eller 143-168 ble bestemt.

2x10<$> MNC i hver av 288 brønner (tre 96 brønners rundbunnede plater) ble dyrket med MBP (10 ug/ml) som angitt over for hvert subjekt. På dag 16 ble hver T-cellelinje analysert for reaktivitet til syntetiske peptider som tilsvarer MBP residier 84-102 og 143-168. Antall av linjer reaktive med hvert peptid (stimuleringsindeks SI>3, delta CPM>500) generert pr. subjekt er vist. Virkelige stimuleringsindekser var generelt >20. Pl og P2 = foreldre; S1-S3 = avkom. Resultatene er fremsatt i tabell 11 under.

DR2+, DRwl 1+ pasient hadde en høy frekvens av T-cellelinjer reaktivt til både MBP residier 84-102 og 143-168. DRwl 1+ foreldre gjenkjente fortrinnsvis MBP+ residier 143-168, mens DR2+ foreldre gjenkjente fortrinnsvis MBP residier 84-102. Frekvens av MBP peptid reaktive linjer var imidlertid lavere enn det fra pasienten. Et avkom var DR2+ og fortrinnsvis gjenkjente MBP residier 84-102. Av to HLA identiske avkom med DR4, DQw3/DRw6, DQwl, reagerte en til MBP peptid 84-102 mens den andre gjorde det ikke. Selv om DQwl kan begrense gjenkjenning av MBP residier 84-102, kan andre faktorer slik som iboende TCR polymorfismer ha påvirket T-cellereaktivitet til MBP autoantigen i en av DR4, DQw3/DRw6, DQwl avkom. Denne familiebindingsanalysen antyer at optimal gjenkjenning av immunodominant MBP epitoper krever spesifikk klasse II MHC alleler både hos pasienter med MS og i kontroller. Totalt indikerer disse studiene at selv om kontrollsubjekter som uttrykker DR2 synes fortrinnsvis å gjenkjenne samme MBP determinant sammenlignet med DR2+ MS pasienter, er deres frekvens i blodet mindre enn den til pasienter med MS.

EKSEMPEL 7: Sekvensering av VB17 TCR

T-cellereseptor VB17+ PCR produkter fra seks klonede T-cellelinjer ble sekvensert ved dideoksymetoden som beskrevet reaktiv med MBP residier 84-102 (pasienter Hy, Fr og Ns) i eksempel 5. DNA ble amplifisert ved å anvende PCR primere for VB 17-ledersekvensen og TCR CB region som beskrevet over i eksempel 5. Amplifisert DNA ble klonet inn i Ml3 og sekvensert ved å anvende den velkjente dideoksymetoden (3 M13 plaque pr. T-cellelinje). Resultatene er fremsatt i tabell 12 under.

Det skal bemerkes at VB 17 sekvensen av alle fire T-cellelinjene etablert fra MS pasient Hy var 100% homologe til publisert VB 17 sekvens.

Følgende er en sammenheng mellom 3-bokstaver og 1-bokstavskoder for aminosyrer. Den er presentert av hensiktsmessige årsaker.

Asparaginsyre

(Asp, D)

Glutaminsyre

(Glu, E)

Lysin

(Lys, K)

Arginin

(Arg, R)

Histidin

(His, H)

Tyrosin

(Tyr, Y)

Cystein

(Cys,C)

Asparagin

(Asn, N)

Glutamin

(Gin, Q)

Serin

(Ser, S)

Treonin

(Thr,T)

Glycin

(Gly, G)

Alanin

(Ala, A)

Valin

(Val, V)

Leucin

(Leu, L)

Isoleucin

(He, I)

Metionin

(Met, M)

Prolin

(Pro, P)

Fenylalanin

(Phe, F)

Tryptofan

(Trp, W)

EKSEMPEL 8:1 eksemplet som presenteres under, ble følgende materialer og metoder anvendt: Generering av en MBP reaktive T- cellekloner. Myelinbasisk protein (MBP) reaktive T-cellelinjer og kloner ble generert som beskrevet tidligere (5). T-cellekloner ble generet fra MBP 84-102 reaktive T-cellelinjer ved begrenset fortynning (0,3 celler/brønn) i 96 brønners v-bunnet mikrotiterplater (Costar, Cambridge, MA) i nærvær av ug/ml PHA.P (Wellcome Diagnostics, Beckenham, UK) og 10^ bestrålt allogenetisk PBMC i medie bestående av RPMI1640 (Whittaker, Walkersville, MD), 10% opplagret human AB serum (PHS) (Biocell, Carson City, CA), 4 mM glutamin (GIBCO, Grand Island, NY), 10 mM HEPES (Whittaker), 100 u/ml penicillin/streptomycin (GIBCO), 5% IL-2 (Human T stim, Collaborative Research, Bedford, MA) og 1 u/ml rIL-4 (levert av Genetic Institute, Cambridge, MA). Kloner ble stimulert på nytt hver 8-12 dag ved lO^/brønn i 96 brønners rundbunnede mikrotiterplater (Costar) med alternerende runder av 40 uM 84-102 pulsert, bestrålt autolog PBMC og PHO/allogenisk PBMC. For eksperimentene som her er vist, ble T-cellekloner stimulert på nytt fra prøver av samme fryser for å forhindre drift fra langtidskulturen. T-celler ble frosset i 90% FCS/0,10% DMSO i flytende nitrogen.

MBP peptid 84-102. MBP peptid 84-102, aminosyresekvens

DENPVVHFFKNrVTPRTPP ble syntetisert ved faststoffasemetoden (Biosearch Lab, Inc., San Raphael, CA) og renset på HPLC som tidligere rapportert (5).

Cellelinjer. Tidligere etablert EBV transformert B cellelinjer 9010 (DR2w2, DQI) og 9009 (DR2w21, DQI) ble dyrket i 10% FCS komplett medium deretter frosset som beskrevet over og tint umiddelbart forut for antigenpuls. Musfibroblast L-cellelinje transfektert med DR2a (Idnd gave av R. Sekaly) ble dyrket i DMEM (Whittaker), 10% FCS (Whittaker), 1,6 mM xantin (Sigma Biochemicals, St. Louis, MO), 110 uM hypoxantin (Sigma), 18 uM mykofenolsyre (GIBCO) seleksjonsmedia, frosset som beskrevet over, og tint umiddelbart før antigenpuls. HT-2 murin IL-2 avhengig T-cellelinje (ATTC) ble dyrket i 10% FCS komplett medium med 5% IL-2 og anvendt for IL-2 bioanalyse to dager etter siste føding.

MAbs. MAbs anvendt i disse studier inkluderer CD3 spesifikk OKT3 og 2AD2, CD2 spesifikk Tl I2 og Tl I3 (gaver fra S. Schlossman), HLA-DR spesifikk L243, HLADQ spesifikk S3/4 (gaver fra F. Bach), HLA-DP spesifikk B7/21 (gaver fra N. Flomenberg), CD28 inaktiv 9,3 (gaver fra J. Ledbetter), CD45RA inaktiv 2H4 (Schlossman), CD45RO spesifikk UCHL-1 (Dakopatts, Glostrup, Danmark) LFA-3 og LFA-1 (gaver fra T. Springer), og CD25 Tac (gaver fra T. Waldman).

Proliferasjonsanalvse. T-celleklon (lO^/brønn) ble plettert i tredoble paralleller og kodyrket med passende stimuli som angitt i figurteksten i 72 timer ved 37°C, 90% fuktighet, 5% C02, i 96 brønners flatbunnede mikrotiterplater (Costar) pulsert med 2 uCi [<3>HjTdR (2 Ci/mmol, New England Nuclear Boston, MA) i de siste 18 dyrkingstimene. APC ble fremstilt ved pulsering av B celler eller L-celler ved 10^ celler/ml i komplett medium enten i nærvær eller fravær av 40um MBP 84-102 i 2 timer ved 37°C, vasking to ganger med 4% Hanks (Whittaker), fulgt av bestråling med 5000 rad ved 4°C. For åstimulere T-celler uten APC, ble 2 uM MBP peptid 84-102 eller IO<3 >u/ml rIL-2 (Hoffman LaRoche, Nutley, NJ) tilsatt direkte til cellene under kulturens varighet.

Strømcvtometrisk analyse av T- celler. En 1/100 fortynning av MAb ascites i PB S/2% PHS ble anvendt for å dekke T-celler ved 10<6>/ml i 30 minutter ved 4°C. Cellene ble vasket to ganger med 4°C fargemedia, farget med 1/60 FITC konjugert geite anti-mus lg (Tago, Burlinganie, CA) i 30 minutter ved 4°C. Celler ble vasket to ganger som over, deretter fiksert med 1% formaldehyd (J.T. Baker Chemical Co., Phillipsburg, NJ). Strømcytometrisk analyse ble gjennomført på en Epics C strømcytometer (Coulter Electronics, Hialeah, FL).

B7- transfeksjon. 50 ug Kpnl linearisert B7-pCDM8 konstruksjon ble kotransfektert med 5 ug Pvul linearisert POP.F inn i L-tk celler eller inn i DR2<+> L-tk"celler (tidligere transfektert med DR2) ved elektroporering ved anvendelse av BRL elektroporator ved innstilling på 250 V og 1600 mF. POP.F plasmidet inneholder herpes simplex virus tymidinkinasegenet under kontroll av SV40 promoter (23). DR2"B7<+> transfektanter ble selektert ved vekst i hypoxantin-aminopterin-tymidin (Sigma) inneholdende media og klonet. DR2<+>B7<+> transfektanter ble selektert og klonet i xangin/hypoxantin/mykofenolsyremedie inneholdende 150 ug/ml G418 sulfat (GIBCO). Kloner som uttrykker celleoverflate B7, som analysert ved indirekte immunofluorescens med anti-B7 mAb, ble klonet på nytt.

Måling av fCa- 2Hl. Som beskrevet tidligere (22), ble T-cellekloner (0,2-1,0x10 ml ladd med 2 ug/ml Indo-I (Sigma) i kulturmediet i 45 minutter ved 37°C. Indo-ladde celler ble fortynnet 1/10 med media og holdt ved 4°C inntil 1 minutt før FACS analyse. Stimulator APC ble pulsert med eller uten 40 um 84-102, vasket to ganger og suspendert på nytt i media ved 4°C. Ustimulerte Indo-ladde T-celler ble analysert i 30 sekunder før tilsetning av stimulus. I det tilfelle med cellulære stimulatorer, ble stimulator APC + ladd responderere analysert i 30 sekunder, deretter sentrifugert i 1 minutt ved 1 500 RPM for å etablere celle-cellekontakt, deretter suspendert på nytt og analysert for respons. Ionomycin (100 ug/ml) (Sigma) anvendt som en positiv kontroll forIndo-1 ladning.

Påvisning av cvtokin mRNA ved northern analyse. T-celleklon Ob.lA12.8 (lO^/brønn i 96-brønners rundbunnede mikrotiterplater i IL-2/IL-4 supplert medie) ble dyrket i nærvær eller fråvær 2 uM 84-102 i 48 timer. Celler ble vasket, og suspendert på nytt i komplett medium ved 2 x 10^/ml i nærvær eller fravær av enten 10 ng/ml PMA og 1 ug/ml ionomycin, 2 uM 84-102, eller 2 um 84-102 + 10 ng/ml PMA i 4 timer ved 37°C. Total cellulær RNA ble ekstrahert ved å anvende RNAzol B metode (TM Cinna Scientific, Friendswood, TX). 10 ug total cellulær RNA ble fraksjonert ved formaldehydgelelektroforese ved å anvende 1,2% SeaKem ME agarose (FM Bioproducts, Rockland, ME) og 2,2 M formaldehyd. Etter fraksjonering ble RNA blottet på Nytran membraner (Schleicher & Schuell, Keene, NH) med 10X SSC oppløsning ved kapillæraverføring over natten. Membraner ble bakt i en vakuumovn ved 80°C i 2 timer. For hybridisering av cytokinprober ble membraner forvasket i 0,5x SSC og 5% SDS ved 65°C i 2 timer, deretter forhybridisert i 50% formaldehyd, 5xSSC, 0,5% SDS, lx Denhardfs oppløsning, 10% dekstransulfat og 100 ug/ml laksesperm DNA (Sigma) ved 42°C i 1-2 timer. Prøver på IL-2, IL-4 og ylfh (beskrivet tidligere i ref. 24) ble merket til en spesifikk aktivitet på >10<8> cpm/ug ved tilfeldig primermerkingsmetode (Boehringer Mannheim, Mannheim, Tyskland) og tilsatt nylig hybridiseringsbuffer. Hybridiseringer ble gjennomført ved 42°C i 20 timer. Filtere ble vasket i 0,2x SSC/0,1% SDS to ganger i 10 minutter ved 24°C, deretter to ganger i 30 minutter ved 50°C. Autoradiografi ble gjennomført ved -70°C i 1-5 dager.

RESULTATER

T- celler tidligere stimulert med peptidanti<g>en er ikke responsive til antigen. Det er tidligere vist at MBP reaktive T-cellekloner prolifererer som respons til peptidantigen i fråvær av tradisjonell APC ved å presentere peptidantigen på sin egen MHC klasse II molekyler til autologe T-cellekloner (22). Det ble deretter undersøkt om T-cellepresentasjonen av antigen involverte forskjellige signalhendelser som svar på T-cellekloner sammenlignet med tradisjonell APC. Slik det er vist i figur 15, responderte T-celleklon Ob.l Al 2.8 til MBP peptidet 84-102 tilsatt direkte til kultur sammenlignet med peptid bundet til pulsert DR2<+> B-cellelinje eller DR2 transfekterte L-celler i primær proliferasjonsanalyse (figur 15 A). T-celler som opprinnelig var stimulert av fri MBP 84-102 peptidantigen var ikke-responsiv til antigenstimulering i noen form når den ble analysert en uke senere (figur 15B, åpne sirkler), mens T-celler stimulert i primære kulturer ved peptidpulserte B-celler eller DR2<+> L-celler responderte normalt til sekundær stimulering (figur 15B, lukkede symboler). Grad av ikke-responsivitet i sekundærstimulering var invers proporsjonal med antigenkonsentrasjon og proliferasjon indusert i primærstimulering.

Det er funnet at MBP peptid induserte ikke-responsivitet i 5 forskjellige T-cellekloner fra to forskjellige individer som er reaktive mot to forskjellige MBP peptidepitoper. Bare den spesifikke peptidepitopen induserer T-celle ikke-responsivitet (data ikke vist). Tilsetning av kostimulatoriske celler reverserer ikke ikke- responsivitet. Det ble som hypotese fremsatt at induksjon av anergi skyldes et negativt signal i steden for mangel på kostimulerende signal på T-celle APC siden L-celler (som antageligvis ikke har noen human kostimulatormolekyl) ikke induserte anergi. L-celler har imidlertid i det siste blitt funnet å uttrykke murin B7 (G. Freeman, manuskript under bearbeiding) og munn B7 har vært vist å kostimulere humane T-celler (25). For direkte å undersøke ko-stimulatoriske effekter av L-celler på induksjon av ikke-responsivitet, ble det tilsatt DR2 transfekterte L-celler til kulturen av T-celleklon med ubundet peptidantigen. For direkte å teste rollen til human B7 som et kostimulatormolekyl, ble det humane B7 genet transfektert i DR2<+> og DR2" L-celler. Slik det er vist i tabell 5, var T-celler dyrket i en uke i 84-102 i responsive for sekundær antigenstimulering selv når Lceller som uttrykker human B-7 eller kouttrykker B7 og DR2 ble tilsatt kulturen.

For å undersøke om ikke-responsivitet indusert ved peptidantigen var reversibel ved kostimulatormolekyler forskjellig fra B7, ble det tilsatt bestrålte B7<+>B celler som var enten passende (9010) eller ikke-passende (9009) HLA-DR for antigenpresentasjon til kulturen av T-celleklon med MBP 84-102. Figur 16 viser at ingen av B-cellelinjen hadde evnen til å forhindre induksjon av anergi forårsaket av T-celler som responderer til fritt peptid. Som imidlertid vist i figur 15, førte stimulering med MHC tilpasset B-cellelinjen 9010 som hadde blitt pulsert med peptidantigen og vasket forut for kultur, ikke til ikke-responsivitet av T-celleklonen. Selv om T-celleklone mistet antigenresponsivitet etter eksponering til peptidantigen, var respons til IL-2 uendret, og dette indikerer at ikke-responsivitet ikke skyldes celledød.

Kinetikk i anergiinduksjon. For å bestemme kinetikken i anergiinduksjon, ble sekundær T-cellerespons til MBP 84-102 peptid og IL-2 analysert etter en primærstimulering med peptid fra 2 til 168 timer. Mer enn 10 ganger reduksjon i respons til antigen ble indusert innenfor 24 timer av MBP 84-102 peptidkultur, og ved dette tidspunktet hadde bakgrunnsproliferasjon (alene) returnert til de i hvilende celler. Denne ikke-responsivitet ble videre øket til >100 ganger reduksjon av respons i løpet av 4 dager og ble opprettholdt under eksperimentets varighet, 7 dager (Figur 17).

Dcke- responsivite T- celler fortsetter å uttrykke CD3. Ikke-responsivitet av peptidanergisert T-cellekloner kunne ha vært sekundært til et tap av CD3/TcR celleoverflateekspresjon. Dette var ikke tilfelle, i og med at T-celler var ikke-responsive ved kultur med peptidantigen og hadde en ekvivalent CD3 overflateekspressjon sammenlignet med ikke-anergiserte T-cellekloner (figur 8).

Respons av aner<g>isert T- celleklon til ikke- antigen stimuli. For mer nøyaktig å definere hvilke aktiveringsveier som er defekte i anergisert T-cellekloner, ble T-celler anergisert med peptidkultur behandlet med reagenser som enten etterligner eller omgår celleoverflateantigenstimulering (figur 19). Anergiserte T-celler mislykkes i å proliferere som respons til enten kombinasjon av aCD3 og PMA eller CD2 mitogen MAbs Tll2 0gTll3.I motsetning, responderte anergiserte T-celler normalt til kombinasjon av PMA og ionomycin, som omgår behov for transmembransignalering (26), og til rIL-2 som stimulerer proliferasjon gjennom en separat vei (27).

Anergiserte T- celler er defekte i deres evne til å fri<g>jøre kalsium etter antigenstimulering. Slik det tidligere er vist, at MBP reaktive T-cellekloner frigjør intracellulær [CA<+2>] i som respons til peptidpresentering ved antigenpulserte T-celler eller B-celler (22), ble det undersøkt evnen av peptidanergiserte T-celler til å respondere i denne analysen. Anergiserte T-celler har en markert reduksjon i deres frigjøring av intracellulær [CA<+2>] i som respons til enten TCR tverrbinding med aCD3 eller peptidantigen presentert av B-celler (figur 20). I motsetning er respons til ionomycin i anergiserte T-cellekloner ekvivalent med den i ikke-anergiserte T-cellekloner.

Anergiserte T- celler mislykkes i å produsere cytokiner som respons til anti<g>en. T-cellekloner enten dyrket alene eller anergisert med MBP peptid 84-102 i 48 timer i en primærkultur ble stimulert i en sekundærkultur med enten peptid, peptid + PMA eller PMA + ionomycin. mRNA ble ekstrahert etter 4 timer og relativ mengde av IL-2, IL-4 og ylFN undersøkt ved norther blotting. Før induksjon av anergi, ble T-celleklon Ob.l A12.8 syntetisert IL-2, IL-4 og ylFN mRNA som respons til MBP 84-102 peptid eller til en kombinasjon av PMA + ionomycin eller peptid + PMA. I motsetning til dette mislyktes anergisert T-celleklon på å syntetisere IL-2, IL-4 og ylFN mRNA som respons til MBP 84-102 peptidet alene eller til peptid i kombinasjon med PMA, mens syntetiserte signifikante cytokin mRNA som respons til PMA + ionomycinstimulering (figur 21 A). Resultatene av northern analyse av IL-2 mRNA ble bekreftet ved en IL-2 bioanalyse ved å anvende HT-2 celler (figur 2IB). Anergiserte T-celler aktivert med peptidantigen i en sekundær stimulering sekrerte ikke IL-2, mens ikke-anergisert sekrerte IL-2, slik det ble målt ved proliferasjon av HT-2 celler.

Tradisjonell APC slik som makrofager, B-celler uttrykker MHC klasse I og har evnen til å bearbeide og presentere proteinantigen til CD4+ T-celler (28). Humane T-celler som uttrykker MHC klasse II etter aktivering har evnen til å presentere peptid eller degradert antigen, men prosesserer normalt helt antigen og antyder at de virker som "ikke-tradisjonell" APC (22,29-31). Selv om T-cellepresentasjonen av MBP 84-102 resulterer i en proliferasjonsanalyse, vises det her at T-celler stimulert med peptidantigen ikke er responsiv til sekundærstimulering ved enten antigen eller TcR/CD3 tverrbinding, men ingen IL-2. Langvarig antigen ikke-responsivitet ble indusert med ubundet peptid men ikke peptidpulserte B-celler eller DR2+L-celletransfektanter, dette antyder at ikke-responsivitet ikke skyldes en ikke-responsiv refraksjonsperiode etter forutgående stimulering slik det har vært foreslått som en mekanisme ved høy dosetoleranse (9). Det refereres til denne ikke-responsivitet som "anergi" fordi T-celler ikke er responsive til antigenstimulering, mens gjenværende IL-2 er responsive, som var det opprinnelige kriteriet som ble etablert ved å definere begrepet (8).

T-celletoleranse kan bli indusert in vitro ved kjemisk fiksert APC eller immobilisert aCD3 mAb der et signal blir avlevert gjennom TcR/CD3 uten et annet essensielt kostimulatorsignal (6-8). Det har blitt vist at CD28 molekylet på T-celler, reagerer med B7 på B-celler og aktiverte makrofager er en komponent i kostimulatorisk vei som er nødvendig for T-celleaktivering men postulert at fravær av B7 kostimulering kan føre til anergi (14-16). T-celleanergi indusert ved selv T-cellepresentasjon av MBP peptid synes å forekomme i nærvær av kostimulering på grunn av at tilsetning av enten B7 transfektanter eller EBV transformerte B-celler, som uttrykker høye nivåer av B7, ikke hadde evnen til å hindre induksjon av ikke-responsivitet. B-celler som videre hadde passende MHC og virket og ikke-toleragenisk APC i fravær av fritt antigen og som sansynligvis konkurrerer for presentasjon av peptidantigen med T-celler under kultur, har ikke evnen til å overvinne induksjon av ikke-responsivitet. Disse resultater antyder at induksjon av anergi av T-cellepresentasjon av peptidantigen resulterer i et negativt signal i steden for mangel på en positiv kostimulering. Disse resultatene har også praktiske implikasjoner for vekst av antigenspesifikk T-cellelinjer og kloner som bør bli stimulert på nytt i fravær av fritt peptidantigen for åhindre tap av antigenresponsivitet.

Mekanismen ved anergi indusert av T-cellepresentasjon av autoantigen ble undersøkt. Anergiserte T-celler har en markert nedgang når det gjelder deres evne til å frigjøre [Ca+<2>]i som respons på enten APC eller aCD3 mAb tverrbinding. I tillegg gjenopprettet behandling med kombinasjon med PMA og ionomycin fullstendig cytokinproduksjon og proliferasjon av anergiserte T-celler og antyder at signalhendelsene etter PKC aktivering og [Ca+<2>]j frigjøring er normalt. Tilstanden ved anergi som definert ved endringer i signaltransduksjon i vårt system er forskjellig fra studier på in vitro klonal anergi av Jenkins og Schwartz der det ikke ble observert noen signaleffekter i membranproksimale hendelser (32, 33). Mekanismen ved T-celleanergi indusert av T-cellepresentasjon av antigen synes lik med studier av transgene mus der autoreaktive T-celler som kommer inn i periferien mislykkes i å frigjøre [Ca+<2>]i som respons til TcR signaldannelse men har evnen til å proliferere som respons til kombinasjon av PMA og ionomycin (21). Det synes derfor å være minst to forskjellige tilstander av funksjonelt definert anergi. Akkurat som celletransformasjon kan foregå ved alternering av en eller mange forskjellige molekyler som regulerer en celles signaltransduksjonsvei, kan fenomenet med T-celleanergi bli oppnådd ved flere forskjellige mekanismer som påvirker forskjellige trinn i T-celleaktivering.

0'Hehir og medarbeidere har vist at T-celle ikke-responsivitet indusert ved peptid eller superantigen kan bli karakterisert ved en nedgang i overflateekspressjon av CD3 sammen med en økning i CD25 16 timer etter tilsetning av peptidantigen (34, 35). Det er også observert at en moderat nedgang i CD3/TCR ekspressjon og økning og CD25 ekspressjon på dette tidlige tidspunktet, sansynligvis på grunn av T-celleaktivering (data ikke vist). Det er imidlertid funnet at med 4 dagers anergiserte T-celler har likeverdig celleoverflatetetthet av CD3 som ikke-anergiserte T-celler (figur 18). Dette indikerer at anergi ikke bare kan forklares som reduksjon av celleoverflate CD3/TcR.

Slik man har sett med hovedmengden av humane T-cellekloner avledet fra perifert blod (24), synes T-celleklon Ob.l A12.8 å være en TjjO fenotype i sin evne til å produsere cytokiner av både Tjjl og Tjj2 undermengder som respons til mitogenstimulering (36). Anergiserte T-celler hadde ikke evnen til åsyntetisere IL-2, IL-4 eller ylFN mRNA eller sekrere målbar IL-2 som respons til antigenstimulering med eller uten PMA, mens tilsetning av både ionomycin og PMA genererte cytokinsyntese. Disse resultater er i overensstemmelse med både proliferasjon og CA+<2> data som antyder at blokkering i T-cellesignaler er i en hendelse som går forut for CA+<2> mobilisering. Negativt signal generert av T-celler som respons tit peptidantigen er ennå ikke definert, og heller ikke den virkelige biokjemiske signalhendelse som blir endret i disse anergiserte T-celler.

Et hovedspørsmål i immunologi angår hvordan aktivert autoantigen, reaktive T-celler blir regulert under en inflammatorisk respons. I tidligere arbeid er det vist at C-celler har evnen til å presentere peptidantigen og delvis nedbrutt nativ MBP, selv om det ikke har evnen til å bearbeide og presentere et renset MBP (22). Dette fører til at man spekulerer om aktiverte T-celler i et inflammatorisk sete (slik som et demyelineirngsplaque i hjernen) kan ha evnen til å presentere fragmenter av MBP til andre T-celler på stedet. Demonstrasjon av T-cellepresentasjon av peptidantigen fører til klonal ikke-responsivitet og antyder at denne mekanismen av toleranse kan ha vært utviklet for å hindre autoreaktive T-celler i et inflammatorisk sete fra klonisk ekspandering av skadet cellevev. En høy ekstracellulær konsentrasjon av nedbrutt protein vil være karakteristisk for et selvantigen, mens fremmed antigen etter initiell in situ immunrespons ville være tilstede ved en lavere konsentrasjon og bli internalisert inn i tradisjonell APC for bearbeiding og presentasjon. På denne måten kan ikke-passende antigenpresentasjon av T-celler som kan presenteres men ikke bearbeide antigenet føre til anergi i steden for aktivering av responderende T-celleklon på et inflammatorisk sete der degradert selvantigen er tilgjengelig.

Som konklusjon er det evidens for en mekanisme at man forklarer den initielle observasjon til Lamb og Feldman (10,11) at forbehandling av T-cellekloner med peptidantigen fører til antigen ikke-responsivitet. Anergi angår ekspresjon av MHC klasse I ved aktiverte humane T-celler har evnen til åpresentere peptidantigen til autologe T-celler. Selv om denne interaksjonen fører til en primærstimulering av T-celler, er de ikke responsive til etterfølgende stimulering i løpet av 24 timer av peptidforbehandling. Signaldefekten i anergiserte T-celler er membranproksimal fordi peptidbehandlet T-cellekloner er hemmet i deres evne til å frigjøre [Ca+<2>]j, produsere cytokiner, og proliferere til antigenstimuli, men utviser en normalrespons til behandling med PMA og ionomycin.

Tabell 13. Anergi forekommer i nærvær av B7 hjelpeceller. T-celleklon Ob.2F3. ble dyrket i 7 dager i nærvær av eller fravær av 5 ug/ml 84-102 med eller uten tilsetning av 10^/brønn L-celler (bestrålt ved 5 000 rad) med ekspressjon av DR2 og/eller B7 transfekterte molekyler. L-cellelinjer med og uten ekspressjon av DR2 ble transfektert med B7. Gjennomsnittlig fluorescensintensitet var 77,2 (mus Ig-PE) og 215 B7-PE) for DR2<+>B7<+> linje og 56,8 (mus Ig-PE) og 156 B7-PE) for DR2"B7<+> linje. Etter primærkulturen, ble T-cellene vasket og analysert for proliferasjon til 84-102.

Listen av referanser som er inkorporert med referanse i beskrivelsen i eksempel 8.

1. Kappler, J.W., U.D. Staerz, J. White og P.C. Marrack. 1988. Selv-toleranse eliminerer T-celler spesifikke for Mls-modifiserte produkter

av hovedhistokompatibilitetskompleks. Nature, 332:35.

2. MacDonald, H.R., R. Schneider, R.K. Lees, R.C. Howe, H. Acha-Orbea, H. Festenstein, R.M. Zinkernagel og H. Hengartner. 1988. T-cellereseptor VB anvendelse forutsier reaktivitet og toleranse til Mlsa-kodede antigener.

Nature, 332:40.

3. Kappler, J.W., N. Roehm, og P. Marrack. 1987. T-celletoleranse ved klonal eliminering i tymus. Cell, 49:273. 4. Kiesielow, P., H. Bluthman, U.D. Staerz, M. Steinmetz og H. von Boehmer. 1988. Toleranse i T-cellereseptortransgene mus involverer delesjon av ikke-matur CD4+8+ tymocyter. Nature, 333:742. 5. Ota, K., M. Matsui, E.L. Milford, G.A. Macklin, H.L. Weiner, og D.A. Hafler. 1990. T-cellegjenkjenning av en immunodominant myelinbasisk

proteinepitope i multippel sklerose. Nature, 346:183.

6. Jenkins, M.K., J.D. Ashwell, og R.H. Schwartz. 1988. Allogene ikke-T miltceller gjenoppretter responsivitet av normale T-cellekloner stimulert med antigen og kjemisk modifiserte antigenpresenterende celler. J.

Immunol. 140:3324.

7. Mueller, D.L., M.K. Jenkins og R.H. Schwartz. 1989. Klonal ekspansjon versus klonal inaktivering: En kostimulatorisk signalvei bestemmer følgen

av Tcelleantigenreseptorokkupering. Ann. Rev. Immunol. 7:445.

8. Jenkins, M.K., D.M. Pardoll, J. Mizuguchi, H. Quill og R.H. Schwartz. 1987. T-celle ikke-responsivitet in vivo og in vitro: Finspesifisitet av induksjon og molekylær karakterisering av ikke-responsiv tilstand.

Immunol. Rev. 95:113.

9. Suzuki, G., Y. Kawase, S. Koyasu, I. Yahara, Y. Kobayashi, og R.H. Schwartz. 1988. Antigen-indusert undertrykking av proliferativ respons av

T-cellekloner. J. Immunol. 140:1359.

10. Lamb, J.R., B.J. Skidmore, N. Green, J.M. Chiller, og M. Feldman. 1983. Induksjon av toleranse i influensavirusimmun T-Iymfocytkloner med syntetiske peptider av influensa hemagglutinin. J. Exp. Med. 157:1434. 11. Lamb, J.R. og M. Feldman. 1984. Essensielt krav for hovedhistokompatibilitetskompleksgjenkjenning i

T-celletoleranseinduksjon. Nature 308:72.

12. Kennedy, M.K., M.C. Dal Canto, J.L. Trotter og SJ. Miller. 1988. J.

Immunol. 141:2986.

13. Williams, I.F., og E.R. Unanue. 1990. Kostimulatoriske krav i murine Thl kloner. Rolle av hjelpecelle-avledede signaler som respons til anti-CD3

antistoff. J. Immunol. 145:85.

14. Gimmi, C.D., G.J. Freeman, J.G. Gribben, K. Sujgita, A.S. Freeman, C. Morimoto, og L.M. Nadler. 1991. B-celleoverflateantigen B7 skaffer tilveie et kostimulatorisk signal som induserer T-celler til åprolifere og sekrere

interleukin 2. Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 88:6575.

15. Linsley, P.S., W. Brady, L. Grosmaire, A. Aruffa, N.K. Damle og J.A. Ledbetter. 1991. Binding av B-celleaktiveringantigen B7 til CD28 kostimulert T-celleproliferasjon og interleukin 2 mRNA akkumulering. J.

Exp. Med. 173:721.

16. Freedman, A.S., G. Freeman, J.C. Horowitz, J. Daley og L.M. Nadler. 1987. B7, et B-cellebegrenset antigen som identifiserer for-aktiverte B-celler. J.

Immunol. 139:3260.

17. Burkly, L.C., D. Lo, O. Kanagawa, R.L. Brinster og R.A. Flavell, 1989. T-celletoleranse ved klonal energi i transgene mus med ikke-lymfoid

ekspressjon av MHC klasse II I-E. Nature, 342:564.

18. Lo, D., L.C. Burkly, G. Widera, C. Cowing, R.A. Flavell, R.D. Palmiter og R.L. Brinster. 1988. Diabetes og toleranse i transgene mus som uttrykker

klasse II MHC molekyler i bukspytt beta celler. Cell. 53:159.

19. Webb, S., C. Morris og J. Sprent. 1990. Ekstratymisk toleranse av modne T-celler: klonal eliminering som en konsekvens av immunitet. Cell. 63:1249. 20. Ramsdell, F., T. Lantz, og B.J. Fowlkes. 1989. En ikke-delesjonsmekanisme av tymisk selvtoleranse. Science 246:1038. 21. Blackman, M.A., T.H. Finkel, J. Kappler, J. Cambier og P. Marrack. 1991. Endret antigenreseptorsignaldannelse i anergene T-celler fra selv-tolerante

T-cellereseptor B-kjedetransgene mus. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88:6682. 22. LaSalle, J.M., K. Ota og D. A. Hafler. 1991. Presentasjon av autoantigen ved humane T-celler. J. Immunol. 147:774. 23. Grosveld, F.G., T. Lund, E.J. Murray, A.L. Mellor, H.H.M. Dahl og R.A. Flavell. Konstruksjon av kosmidbiblioteker som kan bli anvendt til å trans-formere eukaryotiske celler. Nucl. Acids Res. 10:6715. 24. Brod, S.A., D. Benjamin, og D.A. Hafler. 1991. Begrenset T-celleekspressjon av IL2/IFN-_ mRNA i human inflammatorisk sykdom. J.

Immunol. 147:810.

25. Freeman, G.J., G.S. Gray, CD. Gimmi, D.B. Lombard, L-J. Zhou, M. White, J.D. Fingeroth, J.G. Gribben og L.M. Nadler. 1991. Struktur, ekspressjon og T-celle kostimulatoirskaktivitet av murin homolog og human

B-lymfocytaktiverende antigen B7. J. Exp. Med. 174:625.

26. Altman, A.K.M. Coggeshall og T. Mustelin. 1990. Molekylære hendelser som formidler T-celleaktivering. Adv. Immunol. 48:227. 27. Bierer, B.E., P.S. Mattila, R.F. Standaert, L.A. Herzenberg, S.J. Burakoff, G. Crabtree og S.L. Schreiber. 1990. To forskjellige signaloverføringsveier blir hemmet av komplekser dannet mellom et immunofilin og enten FK506

eller rapamycin. Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 87:9231.

28. Unanue, E.R., og P.M. Allen. 1987. Basis for immunoregulatorisk rolle av makrofager og andre hjelpeceller. Science 236:551. 29. Hewitt, C.R.A., og M. Feldman. 1989. Human T-cellekloner presenterer antigen. J. Immunol. 142:1429. 30. Lanzavecchia, A., E. Roosnek, T. Gregory, P. Berman og S. Abrignani. 1988. T-celler kan presentere antigener slik som HIV gpl20 målrettet til sine

egne overflatemolekyler. Nature, 334:530.

31. Gerrard, T.L., D.J. Volkman, C.H. Jurgensen og A.S. Fauci. 1986. Aktiverte humane T-celler kan presentere denaturert antigen. Hum. Immunol. 17:416. 32. Mueller, D.L., M.K. Jenkins og R.H. Schwartz. 1989. Et hjelpe celle-avledet kostimulatorisk signal virker uavhengig av proteinkinase C-aktivering og tillater T-celleproliferasjon og forhindrer induksjon av

ikke-responsivitet. J. Immunol. 142:2617.

33. Mueller, D.M., M.K. Jenkins, L. Chiodetti, og R.H. Schwartz. 1990. En intracellulær kalsiumøkning og proteinkinase C aktivering mislykkes i å initiere T-celleproliferasjon i fravær av et kostimulatorisk signal. J.

Immunol. 144:3701.

34. 0'Hehir, R.E., H. Yssel, S. Verman, J.E. de Vries, H. Spits, og J.R. Lamb. 1991. Klonal analyse av forskjellig lymfokinproduksjon i peptid og super-antigenindusert T-celleanergi. Internat. Immunol. 3:819. 35. 0'Hehir, R.E., og J.R. Lamb. 1990. Induksjon av spesifikk klonal anergi i human T-lymfocytter ved Staphylococcus aureus enterotoksiner. Proe. Nati.

Acad. Sei. USA. 87:8884.

36. Street, N., J.H. Schumacher, T.A.T. Fong, H. Bass., D.F. Fiorentino, J.A.

Leverach, og T.R. Mossman. 1990. Heterogenitet i mushjelper T-celler: evidens fra bulkkulturer og begrensende fortynning av kloning for forløper Thl og Th2 celler. J. Immunol. 144:1629.

Foreliggende oppfinnelse har blitt illustrert med referanse til spesifikke eksempler. Det er åpenvart for de med kunnskap innenfor fagområdet at tilføringen, utelatelser og modifikasjoner er mulig uten å avvike fra oppfinnelsenstanken i de ledsagende kravene.

Claims (8)

1. Et peptid, karakterisert ved at aminosyresekvensen blir valgt fra gruppen som består av i) aminosyreresidier av 86 - 102 av hMBP; ii) aminosyreresidier av 87 - 102 av hMBP; iii) aminosyreersidier av 84 - 100 av hMBP; iv) aminosyreresidier av 84 - 99 av hMBP; v) aminosyreresidier av 85 - 99 av hMBP; vi) aminosyreresidier av 84 - 98 av hMBP; vii) aminosyreresidier av 86 - 99 av hMPB; og viii) aminosyreresidier av 84 - 102 av hMBP der residie 102 har blitt erstattet med tyrosin.

2. Peptid ifølge krav 1, karakterisert ved at aminosyresekvensen fortrinnsvis er ENPVVHFFKNIVTPR.

3. Peptid ifølge krav 1, karakterisert ved at aminosyresekvensen fortrinnsvis er DENPVVHFFKNIVTPR.

4. Anvendelse av et peptid ifølge krav 1, for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av multippel sklerose (MS).

5. Farmasøytisk sammensetning, karakterisert ved at den omfatter en oral effektiv mengde av et peptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1-3 og fysiologisk akseptabel bærer eller fortynningsmiddel.

6. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 5, karakterisert ved at nevnte effektive mengde er i området fra ca. 10 ug til ca. 20 mg.

7. Farmasøytisk sammensetning, karakterisert ved at den omfatter en parenteral effektiv mengde av et peptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1-3 og en fysiologisk akseptabel bærer eller fortynningsmiddel.

8. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 7, karakterisert v e d at nevnte effektive mengde er i området fra ca. 1 til ca. 200 mg.