SI9520118A

SI9520118A - Sestavki in zdravljenje multiple skleroze

Info

Publication number: SI9520118A
Application number: SI9520118A
Authority: SI
Inventors: Dawn Smilek; Michael Samson; Malcolm Gefter; Di-Hwei Hsu; Jia-Dong Shi; Xavier Paliard; Brigitte Devaux; Jonathan Rothbard; Henry Franzen
Original assignee: Immulogic Pharmaceutical Corporation
Priority date: 1994-10-25
Filing date: 1995-10-25
Publication date: 1998-08-31
Also published as: IS4466A; WO1996012737A2; CA2203629A1; WO1996012737A3; FI971750A0; CZ122697A3; NO971900L; JPH10504039A; FI971750A; BR9509438A; HUT77047A; SK51297A3; NO971900D0; PL324091A1; AU4278296A; IL115766A0; EP0787147A1

Abstract

Predloženi izum zagotavlja izolirane peptide in kombinacije peptidov, ki so izvedeni iz mielinskih avtoantigenov, kot so MBP, MOG, PLP in MAG, primerne za zdravljenje multiple skleroze, vključno s profilaktičnimi in terapevtskimi sestavki in metodami za preprečevanje ali zdravljenje multiple skleroze. Prednostni sestavki v smislu izuma obsegajo vsaj en izoliran očiščen peptid, ki je brez vseh drugih polipeptidov ali kontaminantov, pri čemer peptid obsega aminokislinsko sekvenco, mielinski avtoantigen, ki ima T celično aktivnost. Terapevtski sestavek v smislu izuma je sposoben zniževalne regulacije avtoantigenskega specifičnega imunskega odziva na mielinski avtoantigen pri populaciji ljudi, ki bolehajo za multiplo sklerozo ali so zanjo dovzetni, tako da reduciramo, eliminiramo ali preprečimo bolezenske simptome in/ali preprečimo ali upočasnimo nastop ali progresijo bolezenskih simptomov. Dodatno sestavki in postopki predloženega izuma, kadar jih damo v napredovanem stadiju bolezni, izničijo paralizo, ki je v teku ali druge znake bolezni, kadar jih dajemo med akutno fazo bolezni, ali preprečujejo povratek bolezni, kadar jih dajemo med remisijo.ŕ

Description

Pripravki in zdravljenje multiple skleroze

Sorodne prijave

Ta prijava je delna nadaljevalna prijava USSN 08/328,224, vložene 25. oktobra 1994. Ta prijava je tudi delna nadaljevalna prijava USSN 08/300,811, vložene 1. septembra 1994, ki je delna nadaljevalna prijava USSN 08/116,824, vložene 3. septembra 1993. Ta prijava je tudi delna nadaljevalna prijava USSN 08/241,246, vložene 10. maja 1994. Gornje prijave so tu v celoti vključene kot reference.

Ozadje izuma

Avtoimunske bolezni so pomemben človeški zdravstveni problem in jih razmeroma slabo razumemo. Ker ni noben mikrobni ali virusni povzročitelj očitno neposredno odgovoren, mora preprečevanje, zdravljenje in diagnoza takšnih bolezni temeljiti na etiologiji bolezni. To vedno vključuje kompleksne serije reakcij endogenih metabolnih intermediatov, strukturnih komponent, celic itd. Vendar pa obstaja glede narave avtoimunskega stanja mnenje, da mora biti v ustvarjanje sekvence dogodkov, ki rezultira v simpotome, vpleten vsaj en avtoantigen. Avtoimunske demielinacijske bolezni, kot je multipla skleroza, niso nobena izjema.

MS se običajno izraža v obliki ponavljajočih napadov, ki se odražajo v lezijah znotraj centralnega živčnega sistema (CNS=Central Nervous System). Napadi se navidezno naključno tekom mnogo let ponavljajo, popuščajo in ponavljajo. Pogostost vzplamenitev je največja med prvimi 3 do 4 leti bolezni, toda prvemu napadu, ki je bil lahko tako blag , da je ušel zdravniški pozornosti in ki se ga da komajda spomniti, lahko ponoven napad ne sledi 10 do 20 let. Obseg okrevanja po epizodnem dogodku med pacienti zelo variira. Remisija je lahko popolna, še zlasti po zgodnjih napadih, pogosto pa je nepopolna in ko en napad sledi drugemu, sledi postopna navzdoljšnja progresija z naraščajočim permanentnim primanjkljajem. Klinično sliko MS določimo z lociranjem žarišč demielinacije znotraj CNS. Klasične značilnosti vključujejo oslabljen vid, nistagamus, disartrijo, zmanjšano perecepcijo vibracije in zmanjšanje občutka za položaj, ataksijo in intencijski tremor, slabotnost ali paralizo enega ali več udov, spastičnost in težave z mehurjem. Kriteriji za diagnozo klinično dokončne MS morajo vključevati zanesljivo zgodovino vsaj 2 epizodnih dogodkov nevrološkega primanjkljaja in objektiven klinični znak lezije na več kot enem mestu znotraj CNS. Za MS ni znano nobeno učinkovito zdravljenje.Trenutni terapevtski napori so usmerjeni k izboljšanju akutnega dogodka in k preprečevanju povratka ali napredovanja bolezni (Harrison’s Principles of Internal Medicine, 12th Edition, Vol. 2, str. 2038-2043, McGravv Hill, 1991).

Običajno uporabljan živalski model za humano multiplo sklerozo je eksperimentalni alergijski encefalomielitis (EAE), demielinacijska bolezen centralnega živčnega sistema, ki jo lahko induciramo v občutljivih sevih miši z imunizacijo z mielinskim bazičnim proteinom (MBP), proteolipidnim proteinom (PLP), mielinskim oligodendrocitnim proteinom (MOG), ali s sintetičnimi peptidi, ki temeljijo na sekvencah teh peptidov, povezanih z mielinom. MBP je eden izmed predvidenih avtoantigenov v multipli sklerozi (MS) in je bil epitopno kartiran tako v človeškem (Ota et al., Nature, 346:183-187 (1990)), kot v glodalskem sistemu (Zamvil et al. Nature 324:258-260 (1986)). Peptidi, za katere mislimo, da obsegajo vsaj en T celični epitop MBP (mielinskega bazičnega proteina = myelin basic protein) so bili indentificirani v ΛΥΟ 93/21222, EP 0 304 279, WO 91/15225, Ota et al. Letters to Nature, 346:183-187 (1990), Wucherpfennig et al., J. Exp. Med., 170:279-290 (1994). Drugi peptidi MBP, ki vsebujejo T celični epitop, so bili identificirani v prijavah, ki so tu v celoti vključene za referenco, v U.S.S.N. 08/328,224, vloženi 25. oktobra 1994 in v U.S.S.N. 08/241,246, vloženi 10. maja 1994. Peptidi MOG, ki imajo T celično aktivnost, so bili identificirani v USSN 08/300,811, ki je tu vključena za referenco.

Kot možna avtoantigena v multipli sklerozi sta bila vključena tudi proteolipidni protein (PLP) in glikoprotein, povezan z mielinom (MAG). Študije, ki opisujejo patogenezo avtoimunskega odziva na PLP pri multipli sklerozi, so bile opisane v Trotter et al., J. Neuroimmunol., 33:55-62 (1991); T celični epitopi PLP so bili opisani v Pelfrey et al., J. Neuroimmunol., 46:33-42 (1993). Študije, ki opisujejo MAG kot potencialni avtoantigen pri multipli sklerozi, so opisane v Johnson et al., J. Neuroimmunol., 13:99-108 (1986).

Eksperimentalni avtoimunski encefalomielitis (EAE) je avtoimunska bolezen, posredovana s celicami T CD4+, ki je v nekaterih svojih kliničnih in histoloških značilnostih podobna multipli sklerozi in ki služi kot eksperimentalni model za to in druge avtoimunske bolezni. EAE je vnetna bolezen centralnega živčnega sistema, ki ima za posledico paralizo in druge nevrološke nepravilnosti. Značilno jo induciramo s prečiščenimi mielinskimi proteini in peptidi. Model EAE se na široko uporablja pri preiskovanju mehanizmov avtoimunosti in za raziskovanje možnih terapevtikov za avtoimunsko bolezen.

Že 1965 so opazili, da bi lahko EAE zdravili z dajanjem MBP v ne-encefalitogenski obliki, predvidoma z indukcijo imunološke neodzivnosti ali tolerance. (Alvord, E.C., et al., Ann. NY Acad Sci., 1965,122:333, Levine, S.E., et al. Science, 1968, 161:1155, Bernard C.C. A., 1977 Ciin. Exp. Immunol., 1977, 29:100). To zgodnje opažanje je bilo v preteklih nekaj letih razširjeno s številnimi raziskavami, ki kažejo, da neonatalno dajanje MBP ali peptidov MBP ali dajanje le-teh odraslim, preprečuje EAE (Bernard, C.C.A., 1977 Ciin. Exp. Immunol;, 1977, 29:100, Clayton, J.P., et al., J. Exp. Med. 1989, 169:1681, Smilek, D.E., et al., Proč. Nat’l, Acad. Sci., 1991, 88:9633, Guar, A., et al., Science, 1992, 258:1491, Metzler, B. et al., Int. Immunol, 1993, 5:1159, Miller, A., et al., J. Neuroimmunol, 1993, 46:73, Critchfield, J.M. et al., Science, 1994, 263:1139, Miller, A., et al., Proč. Nat’l, Acad, Sci., USA, 1992, 89:421). Te študije so predlagale različne poti dajanja, ki vključujejo subkutano, intraperitonealno, intranazalno, intravenozno in oralno dajanje. Indukcija imunološke neodzivnosti pri odraslih živalih z intravenoznimi peptidi je bila ponazorjena v množici antigenskih sistemov. Zaradi mnogih tukaj opisanih razlogov, obstajajo meje za klinično uporabnost oralnega, enteralnega ali aerosolnega dajanja avtoantigenov, kot je nesposobnost za karakterizacijo aktivne komponente terapevtskega sestavka, ko je le-ta enkrat uveden v želodec, zaradi naknadne encimatske razgradnje v želodcu. Tako je lahko z uporabo teh metod težko doseči predvidljive in ponovljive terapevtske učinke, da ne omenjamo potenciala za škodljive stranske učinke, kot rezultatov nadaljnje telesne predelave zdravila, ki so lahko prav tako nepredvidljivi.

Mehanizem preprečevanja bolezni ali indukcije tolerance smo v večini teh primerov pripisovali klonalni anergiji (Gaur et al., zgoraj), periferalni deleciji (Critchfield, et al. zgoraj), ali drugim oblikam antigensko specifične tolerance. Vendar pa se zdi, da je s TGF-)3-posredovana sosednja (bystander) supresija dodatni mehanizem, s katerim lahko oralno dani MBP in peptidi MBP inhibirajo EAE (Miller et al., zgoraj v Proč. Nat’1 Acad. Sci.). Peptide MBP, kot tudi substituirane peptidne analoge MBP, so preiskovali kot alternativne terapevtike za EAE v PU, B10.PL in (PLJ x SJL)F1 miših. MBP Acl-11 je imunodominanten encefalitogenski peptid za vsakega od teh sevov in se prepoznano veže na Aa^uA/3^u (Wraith, D.C., et al., zgoraj). MBP Acl-11 so temeljito preučevali s substitucijsko analizo in dobro so določili njegove zahteve za identifikacijo celic T in vezavo poglavitnega histokompatibilnostnega kompleksa (MHC). Stranske verige ostankov 3 in 6 v glavnem prispevajo k identifikaciji celic T, medtem ko stranske verige ostankov 4 in 5 v glavnem prispevajo k vezavi MHC. Vezavo MBP Acl-11 na Aa^uA/3^u lahko izredno izboljšamo z množico substitucij aminokislin na ostanku 4, vključno z alaninom (Acl-11[4A]) in tirozinom (Acl11[4Y]) (Wraith, D.C. et al., zgoraj Fairchild, P.J. et al., Int. Immunol, 1993, 5:1151). Izgleda, da substitucije ostanka 4, zlasti s tirozinom, izboljšajo stabilnost kompleksov peptid-MHC, ki se tvorijo s temi peptidi. Acl-11[4A] in Acl-11[4Y] obdržita T celične receptorske (TCR) kontaktne ostanke, ki so potrebni za antigenost, in sta močnejša kot MBP Acl-11 v stimulaciji MBP-specifičnih celic T in vitro. Acl-11[4Y] je encefalitogenski tudi in vivo (Acl-ll[4Aj je slabo encefalitogenski .iz neznanih razlogov). Znano je, da tako Acl-11[4A], kot Acl11[4Y], preprečujeta EAE in misli se, da delujeta z antigensko specifičnimi mehanizmi (Smilek, et al., zgoraj, Wraith, D.C. et al., zgoraj).

V predhodnih študijah so peptidi ali peptidni analogi MBP, ki so jih dajali v nekompletnem adjuvansu tik pred nastopom bolezni, preprečili naknaden razvoj EAE (Smilek et al., zgoraj, Gaur et al., zgoraj). V ločeni študiji, ker so uporabili limfocite iz MBP-specifične TCR transgenske miši, so adoptivno prenešen EAE preprečili z zgodnjim in agresivnim dajanjem intravenoznega MBP pred nastopom kliničnih znakov (Critchfield, et al., zgoraj). Te študije so nakazale, da je možno preprečili EAE z injiciranjem peptidov MBP po tem, ko so bile aktivirane encefalitogenske celice T, niso pa se ukvarjale s vprašanjem, ali bi lahko izničili paralizo, ki je v teku, (in verjetno aktivno vnetje centralnega živčnega sistema) oziroma ali bi lahko z uporabo tega pristopa preprečili povratke bolezni, ki sledijo remisiji. Poleg tega je bilo v nekaterih izmed predhodno opravljenih poizkusov za učinkovito zdravljenje potrebno pogosto dajanje izredno velikih doz MBP ali peptidov MBP. Tukajšnji izumitelji so bili prvi, ki so opisali izničenje paralize, kakor tudi preprečevanje povratkov bolezni, ki sledijo remisiji, in sicer v svojem predhodnem predmetu USSN 08/328,224, vloženi 25. oktobra 1994, ki se tu nadaljuje. Odkar so tukajšnji izumitelji vložili predhodni predmet, so bili tudi ostali, ki delajo na tem področju, presenečeni ob ugotovitvi, da bi lahko injekcija določenih peptidnih analogov, izvedenih iz MBP, pri EAE izničila paralizo, ki je v teku (Karin et al., J. Exp. Med., 180:2227-2237 (Dec. 1994)).

Predloženi izum premaguje zgoraj opisane pomanjkljivosti in zagotavlja nove peptide, sestavke in postopke za zdravljenje multiple skleroze z uporabo pripravkov, ki obsegajo vsaj en peptid, ki ima sekvenco aminokislinskih ostankov, ki vsebuje T celično aktivnost MBP. Nadalje je predloženi izum usmerjen k še nerešenemu problemu, in sicer, da morajo biti zdravljenja multiple skleroze z uporabo peptidov ali peptidnih analogov, da bi bila splošno uporabna, učinkovita tudi kadar jih dajemo pozno v teku bolezni ali v napredovanem stadiju bolezni ali med remisijami ali med povratki bolezni, medtem ko poteka neželen imunski odziv.

Potemtakem je predmet predloženega izuma zagotoviti peptide in kombinacije peptidov, ki so ustrezni kot terapevtik za multiplo sklerozo, vključno s preprečevanjem nastopa bolezni. Še en predmet predloženega izuma je dognati profilaktično in terapevtsko učinkovite dozirne režime in načine dajanja identificiranih proteinov, peptidov in peptidnih analogov za učinkovito zdravljenje MS. Še en predmet predloženega izuma je določiti zdravljenje, ki uspešno zdravi pozen stadij MS, preprečuje povratke bolezni, ustavi bolezen in/ali izniči napredovanje MS.

Povzetek izuma

Predloženi izum zagotavlja izolirane peptide in kombinacije peptidov, ki so izvedeni iz mielinskih avtoantigenov, kot so MBP, MOG, PLP in MAG, primerne za zdravljenje multiple skleroze, vključno s profilaktičnimi in terapevtskimi sestavki in postopke za preprečevanje ali zdravljenje multiple skleroze. Prednostni sestavki v smislu izuma obsegajo vsaj en izoliran očiščen peptid, ki je v bistvu brez vseh drugih polipeptidov ali kontaminantov, pri čemer peptid obsega aminokislinsko sekvenco mielinskega avtoantigena, ki ima T celično aktivnost. Terapevtski sestavek v smislu izuma je sposoben zniževalno regulirati avtoantigensko specifičen imunski odziv na mielinski avtoantigen pri populaciji ljudi, ki bolehajo za multiplo sklerozo ali ki so dovzetni za multiplo sklerozo, tako da bolezenske simptome zmanjšamo, eliminiramo ali preprečimo in/ali preprečimo ali upočasnimo nastop ali napredovanje bolezenskih simptomov.

Poleg tega sestavki in postopki v smislu predloženega izuma, kadar jih dajemo v napredovanem stadiju bolezni, izničijo paralizo, ki je v teku, ali druge znake bolezni, kadar jih dajemo med akutno fazo bolezni ali preprečujejo povratek bolezni, kadar jih dajemo med remisijo.

Kratek opis risb

Sl. 1 kaže celotno dolžino aminokislinske sekvence humanega MBP, pri čemer kaže tudi številčenje aminokislinskih ostankov, na katere se sklicujemo tukaj.

Sl. 2 kaže aminokislinsko sekvenco prednostnih peptidov, izvedenih iz MBP.

Sl. 3 kaže aminokislinsko sekvenco prekrivajočih se peptidov, kakor tudi daljše peptide, uporabljene v primeru 1.

Sl. 4a je grafični prikaz odstotka celokupnega odziva MBP za vsak peptid, ki je prikazan na sl. 3. Reaktivnost MBP smo izračunali na osnovi odstotka MBP pozitivnih mikrotitetrskih skupin v vsaki skupini posameznih pacientov, ki so dali pozitiven rezultat tudi za enega od peptidov MBP. Celokupne MBP pozitivne mikrotitrske kulture so segale od 89-184 v vsaki skupini 19-43 pacientov, ki smo jih testirali na vsak peptid.

Sl. 4b je grančni prikaz odstotka MBP odzivnikov, ki prepoznajo vsak peptid prikazan na sl. 3. Smatrali smo, da so pacienti MBP odzivniki, če je imela vsaj ena izmed njihovih mikrotitrskih kultur pozitiven rezultat za reaktivnost MBP. V vsaki skupini 19-43 pacientov, ki so bili testirani na vsak peptid, je bilo 1231 MBP odzivnih pacientov. Reaktivnost peptida smo izračunali na osnovi odstotka MBP odzivnih pacientov v vsaki skupini z vsaj eno mikrotitrsko kulturo, ki je dala pozitiven rezultat za enega od peptidov MBP.

Sl. 5a je graf srednjih kliničnih rezultatov v obdobju 0-40 dni po indukciji bolezni pri miših, ki smo jih obdelali z i.p. injekcijami samo MBP Acl-11 (SEQ ID NO: 65), v primerjavi s kontrolo.

Sl. 5b je graf srednjih kliničnih rezultatov v obdobju 0-40 dni po indukciji bolezni pri miših, ki smo jih obdelali z i.v. injekcijami MBP Acl-11 (SEQ ID NO: 65) združenega z MBP 31-47 (SEO ID NO: 68), v primerjavi s kontrolo.

Sl. 5c je graf srednjih kliničnih rezultatov v območju 0-40 dni po indukciji bolezni pri miših, ki smo jih obdelali z i.v. injekcijami OVA 323-339 (SEQ ID NO: 69), v primerjavi s kontrolo.

SL 6a je graf srednjih kliničnih rezultatov v obdobju 0 do vsaj 30 dni po indukciji bolezni pri osebkih, ki smo jih obdelali ali z 250 nmolarno injekcijo Acl11[4Y] (SEQ ID NO: 67), ali z Acl-11 (SEO ID NO: 65), v primerjavi s kontrolo.

Sl. 6b je graf srednjih kliničnih rezultatov v obdobju 0 do vsaj 30 dni po indukciji bolezni pri miših, ki smo jih obdelali z 2,5 nmoloma Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67), v primerjavi s kontrolo.

Sl. 6c je graf srednjih kliničnih rezultatov v obdobju 0 do vsaj 30 dni po indukciji bolezni pri miših, ki smo jih obdelali z 2,5 nmoloma Acl-11 (SEQ ID NO: 65), v primerjavi s kontrolo.

Sl. 7 je stolpčni graf, ki prikazuje srednje histološke rezultate miši, ki so bile obdelane s peptidom, proti mišim, ki so bile obdelane s kontrolo, pri čemer nižji rezultat pomeni znižano število in resnost inflamatornih infiltratov CNS.

Sl. 8 je stolpčni graf, ki prikazuje kapaciteto vraničnih celic, ki smo jih in vivo za določene časovne intervale (1-10 ur) vzpostavili v stik z 250 nmoli Acl11[4Y] (SEQ ID NO: 67), da smo aktivirali in vitro hibridomno celično linijo (hibridom 1934), izvedeno iz MBP- specifičnega T celičnega klona.

Sl. 9 je graf, ki prikazuje primerjavo obdelave miši z 250 nmoli Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) proti kontroli, PBS in OVA 323-337 (SEQ ID NO: 70).

Sl. 10 je graf, ki prikazuje primerjavo obdelav s 25 nmoli Acl-11[4YJ (SEQ ID NO: 67), s katerimi smo začeli med remisijo, proti kontroli.

Sl. Ila je graf, ki prikazuje in vitro proliferacijo limfnega vozla (kot jo kaže vključitev 3H-timidina) miši, ki so dobile predhodno i.v. obdelavo z 250 nmoli MBP Acl-11 (SEQ ID NO: 65), v primerjavi s kontrolami.

SL 1 lb je stolpčni graf, ki prikazuje relativno produkcijo IL-2 limfnega vozla v odzivu na MBP Acl-11 (SEQ ID NO: 65) pri miših, ki so bile predhodno obdelane z

Acl-11 [4Yj (SEQ ID NO: 67), v primerjavi s kontrolo.

Sl. 12a je grafični opis poizkusa, ki prikazuje učinke IFN-/3 na EAE v dveh skupinah po 10 (SJL x TLP) Fj odraslih mišjih samic, pri katerih smo EAE inducirali z MBP gvinejske svinje v kompletnem adjuvansu plus pertusisni toksin na dan 0 in katerim smo dali ali samo nekompleten Freundov adjuvans (kontrola), ali pa smo jih obdelali intraperitonealno (i.p.) z 2000 enotami IFN-/3 9, 12, 16 in 20 dan (označeno na x osi s puščicami), Y os predstavlja srednji klinični rezultat (MCS=mean clinical score) za vsako skupino, 0=ni kliničnih znakov EAE, 1=šibak, neodziven rep, 2=delna paraliza zadnje okončine, 3=popolna paraliza zadnje okončine, 4=delna do popolna paraliza prednje okončine in 5=umirajoča.

Sl. 12bje grafični opis poizkusa, ki prikazuje učinke peptida MBP Acl-11 (SEQ ID NO: 65) v dveh skupinah po 10 (SJL x TLP) Fj odraslih mišjih samic, pri katerih smo EAE inducirali z uporabo MBP gvinejske svinje v kompletnem adjuvansu plus pertusisni toksin na dan 0, in katerim smo dali ali PBS (kontrola), ali pa smo jih obdelali z 250 nmoli Acl-11 (SEQ ID NO: 65) intravenozno 10, 13, 17 in 21 dan (označeno s puščicami na x osi), Y os predstavlja povprečni srednji klinični rezultat za vsako skupino, kot je opisan za sl. 12a.

Sl. 12c je grafični opis poizkusa, ki prikazuje učinke peptida MBP Acl-11 (SEQ ID NO: 65), ki smo ga dajali v kombinaciji z IFN-/3, na EAE, v dveh skupinah po 10 (SJL x TLP) Fj odraslih mišjih samic, katerim smo inducirali EAE v kompletnem adjuvansu plus pertusisni toksin na dan 0 in katerim smo dali ali PBS (kontrolo), ali ki smo jih obdelali intravenozno z 250 nmoli Acl-11 (SEQ ID NO: 65) 10, 13, 17 in 21 dan (označeno s praznimi puščicami na x osi) in katere smo 9, 12, 16 in 20 dan (označeno s polnimi puščicami na x osi) obdelali intraperitonealno (i.p.) z 2000 enotami IFN-/3, Y os prikazuje srednji klinični rezultat, kot je obravnavan za sl. 12a.

Sl. 13 je grafični opis poizkusa, ki prikazuje učinke različnih doz IFN-/3 (10000 enot oz. 2000 enot) na induciran EAE pri dveh skupinah po 10 (SJL x TLP) Fj odraslih mišjih samic, katerim smo EAE inducirali z uporabo MBP gvinejske svinje plus pertusisni toksin na dan 0 in katerim smo dali ali PBS (kontrolo), ali katere smo obdelali z 10000 enotami oz. 2000 enotami IFN-/3 intraperitonealno(i.p.) 9, 13, 16 dan (označeno s polnimi puščicami na x osi), Y os pa označuje srednji klinični rezulat, kot je obravnavan za sl. 12a.

Sl. 14 prikazuje različne peptide, izvedene z MBP, ki so lahko primerni v sestavkih in postopkih v smislu izuma.

Sl. 15 je grafični prikaz pozitivnostnega indeksa (y os) (povprečni S.I./MBP odzivni pacient), pomnoženega z odstotkom posameznikov, ki se odzivajo na vsak peptid (x-os), kateri je izveden iz enakih eksperimentalnih podatkov, prikazanih na sl. 4a in 4b, in ki so opisani v primeru 1.

Sl. 16 je grafični prikaz srednjega kliničnega rezultata glede na začetek terapije z uporabo Acl-ll[4Yj (SEQ ID NO: 67) za vsako posameznico (dan 1 = nastop kliničnih znakov za vsako posamezno miš). Miši smo 1, 3, 6 in 9 dan bolezni obdelali s PBS (polni kvadratki), 250 nmoli Acl-11[4Y] i.v., (SEQ ID NO: 67) prazni trikotniki, ali 250 nmoli Acl-11[4Y] s.c. (SEQ ID NO: 67) (prazni krožci). Ti podatki kažejo, da Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) zavre EAE, kadar ga dajemo po nastopu paralize.

Sl. 17 je grafični prikaz srednjega kliničnega rezultata, kadar dajemo Acl-11[4Y] predno se pojavijo simptomi bolezni. Podatki so izrisani glede na bolezen, inducirano z gp homogenatom hrbtnega mozga (gpSCH) na dan 0 in dneve po terapiji. Skupine preživelih miši smo obdelali 8, 10, 13, in 17 dan s 25 nmoli Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) i.v. (prazni trikotniki), 25 nmoli Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) s.c. (polni krožci), ali pa jih nismo obdelali (prazni kvadratki). Ti podatki kažejo, da Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) prepreči nastop EAE.

S1.18 je grafični prikaz srednjega kliničnega rezultata glede na začetek terapije z uporabo Acl-ll[4Yj (SEQ ID NO: 67), ki smo ga dajali intravenozno (prazni trikotniki), ali subkutano (polni krožci). Prazni kvadratki prikazujejo kontrolo.

Sl. 19 je grafični prikaz srednjega kliničnega rezultata glede na dan bolezni, inducirane z uporabo 75 /zg gpMBP (polni krožci), 100 /zg huMOG (prazni trikotniki) in kombinacije 75 /zg gpMBP in 100 /zg huMOG (polni kvadratki). Kot je prikazano, je bolezen, inducirana z obema, MOG in MBP, veliko resnejša kot bolezen inducirana z vsakim posamezno.

Sl. 20 je grafična predstavitev srednjega kliničnega rezulata glede na dneve terapije ob uporabi Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) (prazni kvadratki) v primerjavi s PBS kontrolami (polni kvadratki). Bolezen smo inducirali kot v primeru 10, z uporabo huMOG + gpMBP. Ti podatki kažejo, da je Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) izredno znižal srednji klinični rezultat v primerjavi s kontrolami.

Natančen opis izuma

Patentna in znanstvena literatura, na katero se sklicujemo tukaj, podaja znanje, ki je na voljo strokovnjakom. Tu citirani podeljeni U.S. patenti, PCT objave in druge objave so vključeni kot referenca.

Predloženi izum zagotavlja izolirane peptide in njihove kombinacije, izvedene iz mielinskih avtoantigenov, ki so uporabni za zdravljenje multiple skleroze, kakor tudi terapevtske sestavke in postopke za zdravljenje multiple skleroze. Kot uporabljamo tukaj, izraz zdravljenje multiple skleroze vključuje: profilaktično zdravljenje tistih sesalcev, ki so dovzetni za MS; zdravljenje samega nastopa MS; in zdravljenje vseh napredovanih stadijev MS, vključno z vračajočo-popuščajočo MS, kronično progresivno MS, primarno progresivno MS in benigno MS. Terapevtski sestavki v smislu izuma obsegajo vsaj en očiščen peptid, ki je v bistvu brez vseh drugih proteinov ali kontaminantov, in ki obsega definirano sekvenco aminokislinskih ostankov mielinskega antigena, ki ima T celice- stimulirajočo aktivnost, pri čemer je lahko peptid tudi izolirani peptid. Kot uporabljamo tukaj, se izraz izoliran nanaša na peptid, ki je brez vseh drugih polipeptidov, kontaminantov, izhodnih reagentov ali drugih materialov, in ki ni konjugiran na kakršnokoli drugo molekulo.

Skladno s predloženim izumom se peptid nanaša na določeno sekvenco aminokislinskih ostankov, ki je manjša od aminokislin nativnega proteinskega antigena. Peptid v smislu izuma prednostno obsega v dolžino vsaj približno 7 aminokislinskih ostankov in prednostno vsaj okoli 12-40 aminokislinskih ostankov in bolj prednostno vsaj 13-30 aminokislinskih ostankov, in vsebuje, kadar je izveden iz proteinskega antigena, manj aminokislin, kot jih ima cel proteinski antigen in prednostno ne več kot okoli 75 % aminokislinskih ostankov celega proteinskega antigena. Peptidi, ki jih uporabljamo v smislu izuma, imajo T celično aktivnost. Peptid, ki ima T celično aktivnost, ima lahko katerokoli, eno ali več, izmed naslednjih značilnosti: a) sposobnost, da izzove T celični odziv, kot je stimulacija (t.j. proliferacija ali sekrecija limfokina): b) sposobnost, da povzroči T celično neodzivnost ali zmanjšano T celično odzivnost ustreznih podpopulacij celic T, tako da ne sodelujejo v stimulaciji imunskega odziva na povzročiteljski avtoantigen (npr. preko anergije, tolerance ali apoptoze); c) sposobnost, da modificira profil sekrecije limfokina v primerjavi z izpostavitvijo avtoantigenu, ki se pojavlja v naravi; d) sposobnost, da povzroči indukcijo supresorskih celic T; in e) sposobnost, da povzroči zniževalno regulacijo simpotomov avtoimunske bolezni s katerimkoli mehanizmom; ali f) je izveden iz sosednjega (bystander) an11 tigena in ima sposobnost, da izzove supresorske celice T na mestu mielinskega avtoimunskega napada, kar ima za rezultat zniževalno regulacijo imunskih odzivov na prizorišču mielinskega avtoimunskega napada.

Peptidi, ki obsegajo vsaj en T celični epitop, imajo T celično aktivnost in so sposobni izzvati T celični odziv, kot je stimulacija celic T (t.j. proliferacija celic T ali sekrecija limfokina) in/ali so sposobni zniževalne regulacije avtoantigensko specifičnega odziva celic T, ki ima lahko za rezultat avtoantigensko specifično T celično neodzivnost, ali ki zniža nivo avtoantigenske specifične T celične odzivnosti. T celični epitop je osnovni element ali najmanjša enota, ki jo prepoznava T celični receptor, pri čemer epitop obsega aminokisline, ki so bistvene za receptorsko prepoznavanje. Mislimo, .da so T.celični epitopi vpleteni v iniciacijo in trajanje imunskega odziva na antigen ali avtoantigen. Menimo, da ti T celični epitopi sprožijo dogodke zgodnjega imunskega odziva na nivoju pomožne celice T z vezavo na ustrezno molekulo HLA na površini celice, ki predstavlja antigen, in s stimulacijo pomembne podpopulacije celic T. Ti dogodki vodijo do proliferacije celic T, sekrecije limfokina, lokalnih inflamatornih reakcij, okrepitve dodatnih imunskih celic na mestu in aktivacije kaskade celic B, ki vodi do proizvodnje protiteles. V primeru avtoimunske bolezni so protitelesa, ki se proizvajajo, avtoprotitelesa proti avtoantigenu, kot je MBP, kar ima za posledico klinične simptome avtoimunske bolezni.

Peptide. .ki imajo definirane aminokislinske sestave in ki obsegajo T celične epitope, lahko identificiramo za katerikoli mielinski avtoantigen, vključno z MBP. En postopek vključuje razdelitev proteinskega antigena v ne-prekrivajoče ali prekrivajoče se peptide želenih dolžin in sintetiziranje, čiščenje in testiranje teh peptidov z uporabo kakršnegakoli števila testov (t.j. testa proliferacije celic T, testa sekrecije limfokina in študije T celične neodzivnosti), da določimo, ali peptidi obsegajo vsaj en T celični epitop MBP. V drugem postopku uporabimo algoritem za napovedovanje tistih peptidov, za katere je verjetno, da obsegajo T celične epitope in nato sintetiziramo, očistimo in testiramo peptide, ki smo jih napovedali z algoritmom v testih celic T ali in vivo študijah, da določimo, ali takšni napovedani peptidi povzročijo proliferacijo celic T ali sekrecijo limfokina ali T celično neodzivnost, in za katere je potemtakem verjetno, da vsebujejo T celične epitope. Kot je obravnavano v mnogih zgoraj citiranih dokumentih, lahko humano T celično aktivnost testiramo z gojenjem celic T, ki jih dobimo iz posameznika, ki je občutljiv na avtoantigen kot je MBP, s peptidom, izvedenim iz antigena, in z določevanjem, ali se pojavi proliferacija celic T v odzivu na peptid, kot jo izmerimo, npr. s celičnim navzemom timidina, zazamovanega s tritijem. Stimulacijske indekse za odzive celic T na peptide lahko izračunamo kot maksimalne udarce na minuto (CPM=counts per minute, udarci na minuto) v odzivu na peptid, deljene s kontrolnimi CPM. Stimulacijski indeks (S.I.) celic T, kije enak ali dvakrat in prednostno trikrat večji od nivoja ozadja, smatramo kot pozitivnega. Pozitivne rezultate uporabljamo v analizi potencialne terapevtske učinkovitosti peptidov, kot jo obravnavamo tu kasneje in v primeru 1. Prednostni peptidi, ki so uporabni v smislu predloženega izuma, obsegajo vsaj en T celični epitop in prednostno vsaj dva ali več T celičnih epitopov.

En aigontem za napovedovanje peptidov, ki imajo T celično stimulacijsko aktivnost, je opisan v Rothbard, lst Forum in Virology, Annals of the Pasteur Institute, str. 518-526 (december, 1986), Rothbard in Taylor, Embo, 7:93-100 (1988), in EP 0 304 279. Ti dokumenti opisujejo določanje splošnega vzorca (algoritma) za vezavo peptida na MHC razreda II, njegov statistični pomen in korelacijo vzorca z znanimi T celičnimi epitopi, kakor tudi njegovo uspešno uporabo v napovedovanju predhodno neidentificiranih T celičnih epitopov različnih proteinskih antigenov in avtoantigenov. Kot je navedeno v zgoraj omenjenih dokumentih, se zdi, da splošni vzorec za peptid, za katerega je znano, da dobro veže MHC razreda II, vsebuje linearni vzorec, ki je sestavljen iz nabitega aminokislinskega ostanka ali glicina, kateremu sledita dva iTiarotobiia ostanka. Po določitvi, ali je peptid v skladu s splošnim vzorcem, lahko peptid nato testiramo na T celično reaktivnost. Drugi algoritmi, ki se uporabljajo za napovedovanje T celičnih epitopov predhodno nedefiniranih proteinov, vključujejo algoritem, ki so ga opisali Margalit et al., J. Immunol. 138:2213-2229 (1987), ki temelji na modelu amfipatične spirale.

Dodatno lahko določimo peptide, ki vsebujejo prikrite T celične epitope in ki so uporabni tudi v postopkih in sestavkih v smislu izuma. Prikriti T celični epitopi so tiste determinante v proteinskem antigenu, ki jih, zaradi tvorbe in uvedbe nativnega proteinskega antigena na ustrezno molekulo MHC, v imunskem sistemu običajno ne odkrijemo. Vendar pa je peptid, ki vsebuje prikrit T celični epitop, sposoben povzročiti, da postanejo celice T nedovzetne in kadar subjekt iniciiramo s peptidom, bodo celice T, ki jih pridobimo iz subjekta, proliferirale in vitro v odgovoru na peptid ali proteinski antigen, iz katerega je izveden peptid. Peptidi, ki obsegajo vsaj en prikrit T celični epitop, izveden iz proteinskega antigena, so tu navedeni kot prikriti peptidi. Za potrditev prisotnosti prikritih T celičnih epitopov lahko uporabimo analizo proliferacije celic T, kot je znana v stroki, pri kateri z antigenom primirane celice T kultiviramo in vitro v prisotnosti vsakega peptida posebej, da dokažemo peptidno-reaktivne T celične linije. Smatramo, da vsebuje peptid vsaj en prikrit T celični epitop, če lahko z danim peptidom dokažemo T celično linijo in če so celice T sposobne proliferacije po izzivu s peptidom in proteinskim antigenom, iz katerega je izveden peptid.

Poleg tega ni nujno, da je peptid, ki ga uporabimo po postopku v smislu izuma, izveden iz aminokislinske sekvence mielinskega antigena, kot je MBP. Skladno s postopkom v smislu izuma lahko uporabimo katerikoli peptid, ki vsebuje definirano sekvenco aminokislinskih ostankov in ki je sposoben zniževalne regulacije antigensko specifičnega imunskega odziva na mielinski avtoantigen. Npr., sintetiziramo lahko peptide, ki vsebujejo definirano aminokislinsko sekvenco, ki ne temelji na aminokislinski sekvenci mielinskega antigena, ki pa so sposobni zniževalne regulacije antigensko specifičnega imunskega odziva, npr. peptid posnema T celični epitop mielinskega avtoantigena in povzroči zniževalno regulacijo imunskega odziva na mielinski avtoantigen ali povzroči zniževalno regulacijo imunskega odziva zaradi drugega razloga, kot je ta. da je izveden iz sosednjega (bystander) .antigena. Brez omejitve na katerokoli teorijo mislimo, da imajo lahko sosednji antigeni, ki so tudi tkivno specifični (toda niso tarče imunskega ali avtoimunskega napada), sposobnost, da izzovejo supresorske celice T na mestu imunskega napada, kar ima lahko nato za posledico zniževalno regulacijo imunskih odzivov na prizorišču imunskega napada (npr. prizadeto lastno tkivo v primeru avtoimunske bolezni, ali nosna sluznica, koža in pljuča v primeru alergije). Sosednji antigeni vključujejo, toda nanje niso omejeni, dele antigena ali avtoantigena, ki sami niso tarča imunskega napada in ki imajo supresivno aktivnost na mestu imunskega napada. Kot ju uporabljamo tukaj, vključujeta izraza mielinski antigen ali mielinski avtoantigen sosednje antigene, ki imajo lahko supresivno aktivnost na mestu mielinskega avtoimunskega napada.

Poleg tega lahko v smislu izuma uporabimo katerokoli spojino, ki posnema peptid, ki je sposoben zniževalne regulacije antigensko specifičnega imunskega odziva na mielinski avtoantigen (npr. peptidomimetik). Takšna spojina ni nujno v celoti sestavljena iz podenot, ki so združene s peptidnimi vezmi, ampak so le-te lahko združene z drugimi spojitvami (kot so npr. tiolestrske vezi, analogi reducirane vezi, izosteraze amidne vezi), pod pogojem, da ne-peptidna spojina posnema peptid, ki je sposoben zniževalne regulacije antigensko specifičnega imunskega odziva na zadevni antigen, kot se kaže z učinkovitim terapevtskim/profilaktičnim zdravljenjem simptomov. Peptidomimetiki lahko temeljijo na kateremkoli od peptidov v smislu izuma, toda namesto ene ali več normalnih peptidnih vezi, lahko vključujejo npr.

analoge peptidne vezi (npr. N-metilamidne vezi NH C_a2[-CO-NH3-]C_a]) in analoge reducirane vezi (NH-C_a2[-CH₂-NH-]C_al)).

Ko peptide, ki vsebujejo T celični epitop, enkrat identificiramo, je tudi možno, da strukturo takšnih peptidov modificiramo za uporabo v smislu predloženega izuma za takšne namene, kot je povečanje topnosti (zlasti želeno, če naj bo sestavek injiciran), pospeševanje terapevtske ali preventivne učinkovitosti (glej razpravo o peptidnih analogih, ki imajo pospešeno vezavo MHC, spodaj), ali stabilnosti (npr. rok trajanja ex vivo in odpornost na proteolitsko degradacijo in vivo ali za olajšanje sinteze peptidov. Modificiran peptid ali peptidni analog, v katerem je bila aminokislinska sekvenca spremenjena v primerjavi z nativno proteinsko sekvenco, iz katere je izvedena, ali v primerjavi z nemodificiranim peptidom, iz katerega naj bo modificirani peptid •izveden Jahko.proizvedemo z aminokislinsko substitucijo, delecijo ali adicijo, tako da modificiramo imunogenost, izboljšamo topnost peptida ali olajšamo sintezo peptidov (npr. avtomatizirana sinteza peptidov).

Peptid lahko modificiramo npr. tako, da vsaj zadrži, če že ne izboljša sposobnost, da zniževalno regulira avtoimunski odziv pri MS (npr. z induciranjem T celične neodzivnosti ali z zmanjšano T celično odzivnostjo) in še vedno ohrani sposobnost, da veže proteine MHC. V tem primeru lahko kritične vezivne ostanke za T celični receptor določimo z uporabo znanih tehnik (npr. substitucija vsakega ostanka in določitev prisotnosti ali odsotnosti T celične reaktivnosti). Tiste ostanke, ki so se pokazali kot eseadalni^ajnterakcijo T celičnega receptorja, lahko modificiramo z nadomestitvijo esencialne aminokisline z drugo aminokislino, prednostno s podobnim aminokislinskim ostankom (konzervativna substitucija), prisotnost katerega je pokazala, da poveča, zmanjša toda ne eliminira, ali ne prizadane T celične aktivnosti. Poleg tega lahko tiste aminokislinske ostanke, ki niso nujni za interakcijo T celičega receptorja, modificiramo tako, da jih nadomestimo z drugo aminokislino, vključitev katere lahko poveča, zmanjša toda ne eliminira, ali ne vpliva na T celično aktivnost, toda ne eliminira vezave na pomemben MHC.

Poleg tega lahko peptide v smislu izuma modificiramo z nadomestitvijo aminokisline, ki se ;e pokazala kot esencialna za interakcijo s kompleksom protein-MHC, z drugo aminokilslino, prednostno s podobnim aminokislinskim ostankom (konzervativna substitucija), prisotnost katerega kaže, da poveča, zmanjša, toda ne eliminira, ali ne prizadane T celične aktivnosti. Poleg tega lahko aminokislinske ostanke, ki niso nujni za interakcijo s proteinskim kompleksom MHC, toda ki še vedno vežejo proteinski kompleks MHC, modificiramo tako, da jih nadomestimo z drugo aminokislino, vključitev katere lahko poveča, ne prizadane, ali zmanjša, toda ne eliminira T celično reaktivnost. Prednostne aminokislinske substitucije ne-esencialnih aminokislin vključujejo, toda nanje niso omejene, substitucije z alaninom, glutaminsko kislino ali metilamino kislino. WO 94/06828 v enem primeru opisuje substituirane peptide, v katerih je lahko v bistvu vsak aminokislinski ostanek substituiran s konzervativno aminokislino, aminokislino, ki se ne nahaja v naravi, ali z alaninom, pa je substituirani peptid še vedno sposoben zniževalne regulacije antigensko specifičnega imunskega odziva. V drugem primeru Karin et al., J. Exp. Med. 180:2227-2237 (1994) opisujejo študije, v katerih so uporabili analoge imunodominantnega podganjega epitopa MBP, ki ima aminokislinsko sekvenco 87-99 (SEQ ID NO: 43), kot je prikazana na sl. 14. Analogi so bili iz serije 13 substituiranih peptidov, ki temeljijo na sekvenci 87-99 (SEQ ID NO: 43), ki seje razlikovala od originalnega peptida 87-99 v eni sami substituciji alanina na vsakem položaju vzdolž peptidov 87-99 (SEQ ID NO: 43). Te študije so bile oblikovane tako, da bi pokazale domnevna mesta, kjer imunodominantni peptid reagira z MHC in TCR v Lewisovi podgani, kakor tudi, da bi pojasnile modificirane peptide, ki imajo izboljšane želene značilnosti za potencialno terapevtsko uporabo. Te študije so pokazale, da je substituiranje lizina (K) na položaju 91 peptida 87-99 (SEQ ID NO: 43) z alaninom (A) (glej 87-99[K>A] (SEQ ID NO: 3b) na sl. 14) preprečilo in izničilo EAE v Lewisovih podganah. Na osnovi te informacije bi pričakovali, da bo imela substitucija alanina (A) z lizinom (K) pri edinem lizinu (K), ki je prisoten v peptidih, ki vsebujejo sekvenco 87-99 (SEQ ID NO: 43) znotraj svojih aminokislinskih sekvenc, t.j. MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEO ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10) in MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), vsi kot so prikazani na sl. 2, za rezultat tudi povečano T celično aktivnost substituiranih peptidov. Npr. MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), ki ima z analinom (A) substituiran lizin (K) na položaju 10 peptida MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6) (t.j. DENPVVHFFANIVTPRTPPPSOGK) (SEQ ID NO: 71) bi lahko povečal T ceiicno aktivnost, kar bi imelo za rezultat povečane terapevtske lastnosti v primerjavi z roditeljskim MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6) peptidom.

Za povečanje stabilnosti in/ali reaktivnosti lahko peptide modificiramo tudi tako, da enega ali več polimorfizmov vključimo v aminokislinsko sekvenco proteinskega antigena, ki izhaja iz naravne alelne variacije. Za proizvodnjo modificiranega proteina ali peptida znotraj obsega predloženega izuma, lahko dodatno dodamo ali substituiramo D-aminokisline, ne-naravne aminokisline in ne-aminokislinske analoge.

Nadalje lahko za proizvodnjo proteina ali peptida, konjugiranega s PEG, peptide v smislu predloženega izuma modificiramo z uporabo polietilenglikolne (PEG) metode A. Sehon-a in sodelavcev (Wie et al. zgoraj). Poleg tega lahko PEG dodamo med kemijsko sintezo proteina ali peptida v smislu izuma. Modifikacije peptidov ali njihovih delov lahko vključujejo tudi redukcijo / alkilacijo (Tarr v: Methods of Protein Microcharacterization, J.E. Silver ed. Humana Press, Clifton, NJ, str. 155-194 (1986)); acilacijo (Tarr. zgoraj), kemijsko sklopitev na ustrezen nosilec (Mishell in Shiigi, eds., Selected Methods in Cellular Immunology, WH Freeman, San Francisco, CA a(1980); U.S. patent 4,939,239; ali blago obdelavo s formalinom (Marsh International Archives of Allergy and Applied Immunology, 41:199-215 (1971)).

Za olajšanje čiščenja in potencialno povečanje topnosti proteinov ali peptidov v smislu izuma, je možno, da k peptidnemu ogrodju dodamo reportersko(e) skupino(e). Npr., za čiščenje peptida na imobilizirani kovinsko ionski afinitetni kromatografiji, (Hochuli, E. et al., Bio/Technology, 6:1321-1325 (1988)) lahko peptkiudxadam«.-pialihistidin. Poleg tega lahko, Če je želeno, med reportersko skupino in aminokislinske sekvence peptida uvedemo specifična endoproteazna cepilna mesta zato, da olajšamo izolacijo peptidov brez nepomembnih sekvenc. K pravilni tvorbi antigena T celičnih epitopov znotraj peptida lahko zelo pripomoremo tako, da med regijami rekobinantno ali sintetično načrtujemo standardna proteazno občutljiva mesta, pri čemer vsebuje vsako mesto vsaj en T celični epitop. Npr., med rekombinantno konstrukcijo peptida lahko med regije znotraj peptida uvedemo nabite aminokislinske pare, kot je KK ali RR. Nastali peptid lahko napravimo občutljiv na cepitev s katepsinom in/ali drugimi encimi, ki so podobni tripsinu, da tvorimo porcije peptida, ki vsebujejo en ali več T celičnih epitopov.

Še en primer modifikacije peptidov je substitucija cisteinskih ostankov, prednostno s serinom, treoninom, levcinom ali glutaminsko kislino zato, da minimiziramo dimerizacijo preko disulfidnih vezi. Poleg tega lahko za uporabo v pufranih vodnih raztopinah, kot so farmacevtsko sprejemljivi nosilci ali razredčila, peptide modificiramo z namenom povečanja topnosti peptida tako, da k peptidu dodamo funkcionalne skupine, terminalne dele peptida ali tako, da v peptide ne vključimo hidrofobnih regij. Za povečanje topnosti lahko npr. h karboksiterminalnemu koncu ali aminoterminalnemu koncu peptida ali k obema dodamo nabite aminokisline ali nabite aminokislinske pare ali triplete. Primeri nabitih aminokislin vključujejo arginin (R). lizin (K), histidin (H), glutaminsko kislino (E) in aspartinsko kislino (D). Za olajšanje sinteze peptidov, kot je avtomatizirana sinteza peptidov, je lahko želeno, da odstranimo ali nadomestimo aminokisline, ki bi lahko otežkočile sintezo peptidov ali ki bi jo lahko podražile. Npr., če je N-terminalna ali C-terminalna aminokislina peptida sposobna ciklizacije, ali če je lahko predmet degradacije ali med peptidno sintezo ali po njej, lahko takšne aminokisline odstranimo ali nadomestimo, ali pa lahko, alternativno, dodamo eno ali več dodatnih aminokislin, da blokiramo manj želene amino- ali karboksi-terminalne aminokisline. Takšne dodane aminokisline so lahko ali izvedene iz nativne proteinske sekvence, ali pa so lahko ne-nativni aminokislinski ostanek. Da povečamo peptidno T celično aktivnost, kot je definirana zgoraj, lahko dodatne aminokisline dodamo ali k amino-terminalnemu koncu peptida, h karboksiterminalnemu koncu peptida ali k obema. Takšne dodatne aminokisline so lahko izvedene iz nativne proteinske sekvence ali pa so ne-nativni aminokislinski ostanki.

Peptidni sestavki, ki jih dajemo v smislu predloženega izuma, prednostno vsebujejo dovoljšen odstotek T celičnih epitopov mielinskega avtoantigena (t.j. vsaj okoli 20 %, bolj prednostno okoli 30 %, bolj prednostno okoli 40 % in še bolj prednostno okoli 60 % ali več) s skupno T celično reaktivnostjo na mielinski avtoantigen pri populaciji posameznikov, ki se odzivajo na avtoantigen, in ki imajo multiplo sklerozo (npr. vsaj 10 posameznikov in bolj prednostno vsaj 20 posameznikov) in le-ti so v sestavek vključeni tako, da ima terapevtski režim dajanja sestavka posamezniku z MS v smislu predloženega izuma za rezultat zniževalno regulacijo avtoimunskega odziva MS. Za določitev, ali je verjetno, da peptid (prednostno peptid, kandidat za terapevtik) ali kombinacija kandidacijskih peptidov vsebuje dovoljšen odstotek skupne T celične reaktivnosti mielinskega avtoantigena, da zniževalno regulira avtoimunski odziv MS v znatnem odstotku populacije posameznikov z MS, lahko uporabimo več analitskih shem.

Po eni analitski shemi (ki uporablja kot primer MBP), so peptidi, ki vsebujejo T celični epitop, razvrščeni po številu MBP mikrotitrskih gojitvenih linij, ki se odzivajo na peptide, ki vsebujejo epitop, in glede na število pacientov z MS, ki se nanje odzivajo. Ker je MBP-specifična T celična frekvenca v PBL pri pacientih z MS lahko zelo nizka, pogosto ni možno testirati vseh peptidov MBP na vsakem posameznem pacientu z MS. Zaradi tega je naslednji način ustrezen za določevanje najbolj uporabnih terapevtskih peptidov in je nadalje opisan v primeru 1. PBL izoliramo iz krvi in kulture uvedemo v mikrotitrske plošče s 96 jamicami. PBL-je prečistimo iz vzorcev sveže periferne krvi (približno 75 cm³) pacientov z dokončno MS z uporabo gradienta gostote po Ficollu. Mikrotitrske kulture uvedemo z 2 χ 10⁵ PBL na jamico in K) Mg/ml MBP prečiščenega človeškega hrbtnega mozga v gojitvenem mediju ta

RPMI 1640 dopolnimo s 5 % človeškim AB serumom, penicilinom-streptomicinom in L-glutaminom. S pričetkom na 6-7 dan kulture dopolnimo z IL2 (20 enot/ml) in z IL4 (5 enot/ml). Po 11-13 dneh mikrotitrske kulture speremo, resuspendiramo v svežem mediju in razdelimo v 12 svežih mikrotitrskih jamic. Dodamo avtologne zamrznjene PBL-je kot celice, ki predstavljajo antigen, v količini 5 χ 10⁴ PBL na jamico. K 12 replikacijskim jamicam iz vsake mikrotitrske kulture dodamo v dvojniku selekcionirane (skrining) antigene. Kot negativno kontrolo vedno uporabimo medij, kot pozitivno kontrolo pa uporabimo prečiščen humani rekombinantni MBP z 10 ^g/ml. Vsakega pacienta testiramo tudi na reaktivnost na maksimalno 4 MBP peptide, vsakega v koncentraciji 10 μΜ. Po 48 urah analize vzpostavimo v stik z

27,75 kBq ³H-timidina in jih po 6-16 urah stika zberemo. Kulture ovrednotimo kot pozitivne za vsak peptid po naslednjih kriterijih: stimulacijski indeks večji od 3,0, sprememba v CPM večja ali enaka 500 in standardna napaka srednje vrednosti manjša kot je sprememba v CPM. Poleg tega za analitske namene kulture ovrednotimo kot peptidno-pozitivne le, če se odzovejo tako na MBP, kot na peptid, in če se ne odzovejo na več kot en ne-prekrivajoč peptid. Skupine okoli 10 - 50 pacientov prednostno testiramo z vsakim od peptidov MBP in vsako skupino pacientov testiramo z največ 4 peptidi. Peptide nato razvrstimo po naslednjih kriterijih: 1) odstotek MBP pozitivnih mikrotitrskih kultur v vsaki skupini pacientov (skupna MBP reaktivnost), ki dajo pozitiven rezultat tudi za enega od peptidov MBP; 2) odstotek na MBP odzivnih posameznikov v vsaki skupini z vsaj eno mikrotitrsko kulturo, ki je dala pozitiven rezultat za enega od peptidov MBP, pri čemer je MBP odzivni posameznik definiran kot pacient z vsaj eno mikrotitrsko kulturo, ki je dala pozitiven rezultat za MBP. Posamezne kandidacijske peptide nato izberemo le, če 1) vsebujejo vsaj 5 %, bolj prednostno vsaj 10 % in najbolj prednostno vsaj 20 % skupne MBP reaktivnosti in 2) je ugotovljena reaktivnost nanje pri vsaj 20 %, bolj prednostno pri vsaj 30 %, bolj prednostno pri vsaj 40 %, bolj prednostno pri vsaj 50 % in najbolj prednostno pri 60 % MBP odzivnih posameznikov. Po želji lahko kot dodatni kriterij za razvrstitev peptidov smatramo tudi pozitivnostni indeks za dani peptid. Pozitivnostni indeks predstavlja tako jakost T celičnega odziva na peptid (S.I.), kot frekvenco T celičnega odziva na peptid v populaciji posameznikov, ki se odzivajo na mielinski avtoantigen. Na primer, kot je prikazano na sl. 15, pozitivnostni indeks 141-165 (MBP-4) (SEQ ID NO: 14) je približno 2500, kar smo izračunali z uporabo podatkov, ki so tukaj opisani v primeru 1. Srednji S.I. peptida MBP-4 (SEQ ID NO: 14) na MBP odzivnega pacienta pomnožimo z odstotkom posameznikov, ki se odzivajo na MBP-4 (SEQ ID NO: 14) v populaciji pacientov, ki se odzivajo na MBP.

Visoko očiščene peptide, v bistvu brez vseh drugih polipeptidov in kontaminantov, ki imajo definirano sekvenco aminokislinskih ostankov, ki obsegajo vsaj en T celični epitop, ki jih uporabimo v terapevtskih sestavkih v smislu izuma, lahko proizvedemo sintetično s kemijsko sintezo ob uporabi standardnih tehnik. V stroki so znane različne metode kemijskega sintetiziranja peptidov, kot je sinteza v trdni fazi na tržno i azpoložljivih peptidnih sintetizatorjih, ki je popolnoma ali polavtomatizirana. Sintetično proizvedene peptide lahko nato z uporabo kakršnegakoli števila tehnik, ki so znane v literaturi za čiščenje proteinov, očistimo, prednostno do homogenosti, bolj značilno do vsaj 90 %, bolj prednostno do vsaj 95 % in še bolj prednostno do vsaj 97 % čistote, v bistvu brez vseh drugih polipeptidov in kontaminatov.

Sintetično proizvedeni peptidi v smislu izuma, ki obsegajo v dolžino do približno 45 aminokislinskih ostankov in najbolj prednostno do približno 30 aminokislinskih ostankov, so še zlasti želeni, saj imajo lahko povečanja dolžine za rezultat težavnost peptidne sinteze. Peptide večje dolžine lahko proizvedemo z rekombinantnimi DNA tehnikami, kotje razloženo spodaj.

Peptide, ki so uporabni v postopkih v smislu predloženega izuma, lahko proizvedemo tudi z uporabo rekombinantnih DNA tehnik v gostiteljski celici, ki je transformirana s sekvenco nukleinske kisline, ki kodira za takšen peptid. Kadar proizvajamo z rekombinantnimi tehnikami, gojimo gostiteljske celice, ki so transformirane z nukleinsko kislino, ki kodira želeni peptid v za celice ustreznem mediju in izolirane peptide lahko očistimo iz celičnega gojitvenega medija, gostiteljskih celic ali iz obojih z uporabo tehnik, ki so znane v stroki za čiščenje peptidov in proteinov, vključno z ionsko izmenjevalno kromatografijo, ultrafiltracijo, elektroforezo ali imunskim čiščenjem » protitelesi, ki so specifična za želeni peptid. Za uporabo v skladu s postopki, ki so opisani zgoraj za sintetično proizvedene peptide, lahko rekombinantno proizvedene peptide izoliramo in očistimo, prednostno do homogenosti, tako da so v bistvu brez celičnega materiala, drugih polipeptidov ali gojitvenega medija.

V določenih omejenih okoliščinah lahko peptide proizvedemo tudi s kemijsko ali encimatsko cepitvijo visoko očiščenega proteina s polno dolžino ali naravnega proteina, kateremu so bila predhodno določena mesta kemijske presnove ali encimatske cepitve in katerega izloček, ki nastane, se da reproducirati. Peptide, ki imajo definirane aminokislinske sekvence, lahko dobro očistimo in izoliramo v bistvu brez kakršnihkoli drugih polipeptidov ali kontaminantov, ki bi bili prisotni v encimatskem ali kemijskem izločku, s katerimkoli izmed postopkov, ki so opisani zgoraj za visoko očiščene in izolirane sintetično ali rekombinantno proizvedene peptide.

Poleg tega lahko peptide v smislu predloženega izuma uporabimo v konjugatih, kot je opisano npr. v U.S. patentu 5,130,297 (Sharma et al.), kjer so terapevtska sredstva pripravili z uporabo formule X-MHC-peptid ali MHC--peptid-X, v kateri X predstavlja funkcionalni del, izbran izmed toksina in markirne skupine; MHC je učinkoviti del glikoproteina MHC, pri čemer je omenjeni glikoprotein disociiran iz celične površine, na kateri se običajno nahaja; in peptid predstavlja kateregakoli od peptidov, ki so navedeni tukaj, natančneje MBP ali MOG, in natančneje predstavlja peptide, ki so prikazani na sl. 2 in 14.

Še nadalje obsegajo prednostni peptidi v smislu izuma vsaj en T-celični epitop proteina ?polnt ΐ1ο1ζίη6, bolj natančno MBP ali MOG. Peptidi lahko vsebujejo tandemske ponovitve posameznega epitopa in/ali več kot en epitop.

Skladno s tu opisanimi postopki za identifikacijo peptidov, ki obsegajo T celično aktivnost MBP (glej razpravo zgoraj, kakor tudi primer 1 spodaj) prednostni peptidi, ki so izvedeni iz MBP, in ki so kandidati za terapevtsko uporabo, obsegajo naslednje peptide: MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-3 (SEQ ID NO: 12), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in MBP-5 (SEQ ID NO: 15), vsi kot so prikazani na sl. 2, ali kakršenkoli njihov del ali kakršnokoli njihovo modifikacijo. Te peptide smo testirali na T celično aktivnost, kot je opisano v primeru 1, in pokazalo se je, da obsegajo vsajen TsceliČni epiiop, kot je razvidno iz razmerja MBP pozitivnih rmkrotitrskih kultur, ki dajo pozitiven rezultat tudi za enega izmed peptidov MBP (sl. 4a) in zaznaven odziv za vsakega izmed prednostnih peptidov v signifikantnem odstotku MBP pacientov, kijih testiramo (sl. 4b). MBP-4 (141-165) (SEQ ID NO: 14) je med štirimi peptidi najbolj reaktiven, pripisujemo mu 21 % celokupnega MBP odziva in ga lahko detektiramo v 64 % MBP odzivnih pacientov, ki jih testiramo. Med štirimi peptidi je pokazal MBP-4 (SEQ ID NO: 14) presenetljivo veliko več reaktivnosti, kot sta združeni reaktivnosti MBP 141-160 (SEQ ID NO: 28) in MBP 151-170 (SEQ ID NO: 29). kot sta prikazana na sl. 3. Tukajšnji izumitelji so prvi identificirali ta imunodominantni peptid, za katerega se zdi, da obsega mnogovrstne T celične epitope. Ta novi peptid je še zlasti prednosten za terapevtsko uporabo.

Poleg tega mislimo, da so MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-1.2 (SEQ ID NO: 4), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10), MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11) in MBP-3.1 (SEQ ID NO: 13), kot so prikazani na sl. 2, primerni kandidacijski peptidi za terapevtsko uporabo. Ti peptidi so modificirane verzije MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-2 (SEQ ID NO: 5) oz. MBP-3 (SEQ ID NO: 12), in pričakujemo, da imajo podobno T celično aktivnost, kot je tista, ki jo imajo njihovi zadevni roditeljski peptidi. Te peptide smo modificirali z aminokislinsko delecijo, adicijo ali z obema, skladno s peptidnimi modifikacijskimi tehnikami, kot so opisane zgoraj, v glavnem z namenom, da olajšamo sintezo peptidov.

Ostale peptide, ki so se pokazali kot imunodominantni (t.j. imajo T celično aktivnost MBP), ali ki so bili izvedeni iz peptidov, za katere je znano, da imajo T celično aktivnost MBP, so identificirali tukajšnji izumitelji ali drugi, ki delajo na tem področju (glej npr. U.S.S.N. 08/328.224 vložena 25. oktobra 1994; U.S.S.N. 08/241.246 vložena

10. maja 1994; WO 93/21222; EP 0 304 279, WO 91/15225; Ota et al. Letters to Nature, 346:183-187 (1990); Wucherpfennig et al., J. Exp. Med. 170:279-290 (1994); Martin et al., J. Immunol., (1990) 145:540-548); Karin et al., J. Exp. Med. 180:22272237 (1994)). Takšni peptidi so lahko prav tako primerni za terapevtsko uporabo v sestavkih in postopkih v smislu izuma, še zlasti kadar jih združimo s prednostnimi kandidacijskimi peptidi, ki so opisani zgoraj. Takšni peptidi vključujejo, toda nanje niso omejeni, vse ali del naslednjih peptidov, ki imajo številke ostankov, ki ustrezajo aminokislinskim ostankom humanega proteina MBP, ki je prikazan na sl. 1, in ki imajo posamezne aminokislinske sekvence, ki so prikazane na sl. 14: 13-25 (SEQ ID NO: 31), 31-50 (SEQ ID NO: 18), 61-80 (SEQ ID NO: 21), 82-92 (SEQ ID NO: 32),

82- 96 (SEQ ID NO: 33), 82-97 (SEQ ID NO: 34), 82-98 (SEQ ID NO: 35), 82-100 (SEQ ID NO: 30), 82-100[100P>Yj (SEQ ID NO: 46), 83-100 (SEQ ID NO: 37),

83- 101 (SEQ ID NO: 38), 84-97 (SEQ ID NO: 39), 84-100 (SEQ ID NO: 40), 84-100 (SEQ ID NO: 40), 85-100 (SEQ ID NO: 41), 86-105 (SEQ ID NO: 42), 87-99 (SEQ ID NO: 43), 87-99[91K>A] (SEQ ID NO: 36), 88-100 (SEQ ID NO: 44), 88-99 (SEQ ID NO: 45), 111-135 (SEQ ID NO: 47), 122-140 (SEQ ID NO: 48), 139-170 (SEQ ID NO: 49), 141-160 (SEQ ID NO: 28), 142-166 (SEQ ID NO: 50), 142-168 (SEQ ID NO: 51), 146-160 (SEQ ID NO: 52) in 153-170 (SEQ ID NO: 53), še bolj prednostno pa obsegajo naslednje peptide: 13-25 (SEQ ID NO: 31), 87-99 (SEQ ID

NO: 43), 87-99[91K>A] (SEQ ID NO: 36), 82-100 (SEQ ID NO: 30), 821 ()()[] OOP >Y] (SEQ ID NO: 46), vsi kot so prikazani na sl. 14. Prednostni deli teh peptidov ali prednostne modifikacije naj bi prednostno imele podobno ali večjo T celično aktivnost v enakem ali večjem odstotku pacientov, kijih testiramo in/ali imajo podobno ali večjo terapevtsko učinkovitost v postopkih v smislu izuma, kot je tista, ki jo ima roditeljski peptid, iz katerega je izveden modificirani peptid.

En vidik predloženega izuma zagotavlja terapevtske sestavke, ki obsegajo vsaj en peptid, izveden iz mielinskega antigena, ki ima T celično aktivnost, ali kombinacijo peptidov, izvedenih iz mielinskega antigena, pri čemer ima vsak peptid T celično aktivnost, in farmacevtsko sprejemljiv nosilec ali razredčilo. Prednostni terapevtski sestavki obsegajo dovoljšen odstotek T celične aktivnosti mielinskega avtoantigena, tako da so, kadar jih dajemo pacientu z MS v terapevtskem režimu prednostno v neimunogeni obliki, sposobni zniževalne regulacije specifičnega imunskega odziva na mielinski avtoantigen pri populaciji ljudi, ki imajo takšen antigenski specifičen odziv. Kot uporabljamo tukaj, vključuje zniževalna regulacija, toda nanje ni omejena, preprečevanje prvotnega nastopa bolezenskih simptomov, reduciranje bolezenskih simptomov multiple skleroze, povzročenih z antigensko specifičnim imunskim odzivom na MBP ali drug mielinski avtoantigen, še natančneje vključuje redukcijo, izničenje, ne-napredovanje ali blaženje simpotomov. Ne-napredovanje lahko označimo, toda nanje ni omejeno, z (a) krajšimi obdobji aktivne bolezni ali eksacerbaciie. (b)_manj resnimi simptomi ali nezmožnostjo, (c) zakasnitvijo v napredovanju bolezni, pri čemer osnovno zdravstveno stanje ne gre navzdol tako hitro (d), povečanje ali podaljšanje časa med obdobji aktivne bolezni ali eksacerbacije (npr. daljša obdobja remisije), (e) z manj povratki bolezni ali eksacerbacijami in/ali (f) upočasnitvijo ali ustavitvijo napredovanja obsega poškodb, ki jih zaznamo z MRL Drugi orodji za določevanje, ki ju strokovnjaki uporabljajo v stroki, sta sistema vrednotenja Expanded Disability Status Scale (EDSS) in Neurological Rating Scale. Kot uporabljamo tukaj, je napredovan stadij kakršnakoli točka nad čistimi kliničnimi znaki očitne bolezni, bodisi da je bolezen vračajoča-popuščajoča MS, kronična progresivna MS, benigna MS ali primarna progresivna MS. Dodatno k tej definiciji lahko napredovan stadij obsega akutno(e) fazo(e), remisijo(e) in eksacerbacijo(e). Kot ga uporabljamo tukaj, lahko izraz akutna faza pomeni napad, ki je v teku, akutno bolezen, aktivno bolezen in eksacerbacijo in le-te uporabljamo izmenično. Kot jih uporabljamo tukaj, se ti izrazi splošno nanašajo na stanje, v katerem kaže oseba z boleznijo (bodisi diagnosticirano ali ne) aktivne simptome ali znake, ki jih strokovnjaki običajno razumejo v povezavi s specifičnim imunskim odzivom, ki je značilen za multiplo sklerozo. Razumemo, da povratek bolezni pomeni akutno fazo, ki sledi remisiji. Izraz eksacerbacija, če ga uporabljamo v ustreznem kontekstu, lahko interpretiramo tudi tako, da pomeni nove in slabšajoče simptome ali znake. Simptomi so tisti indici bolezni, zaradi katerih se pacient pritožuje. Znaki so tisti indici, ki jih opazi ali izmeri diagnostik. Seveda pa lahko, če ni navedeno drugače, izraze simptomi in znaki uporabljamo izmenično.

Terapevtski sestavki v smislu izuma prednostno obsegajo vsaj en T celični epitop vsebujoč peptid ali modificiran peptid ali peptidni analog in farmacevtsko sprejemljiv nosilec ali razredčilo. Takšni sestavki lahko prednostno obsegajo peptid MBP, izbran iz naslednje skupine peptidov: MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-1.2 (SEQ ID NO: 4), MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10), MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), MBP-3 (SEQ ID NO: 12), MBP-3.1 (SEQ ID NO: 13), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in MBP-5 (SEQ ID NO: 15), bolj prednostno je peptid MBP izbran izmed MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in MBP-5 (SEQ ID NO: 15) in še bolj prednostno je peptid MBP MBP-4 (SEQ ID NO: 14).

Sestavki v smislu izuma lahko obsegajo vsaj dva peptida (npr. fizikalno zmes vsaj dveh peptidov), pri čemer ima vsak peptid T celično aktivnost in prednostno obsega vsaj en T celični epitop mielinskega avtoantigena, kot je MBP. Takšne sestavke lahko dajemo v obliki terapevtskega sestavka s farmacevtsko sprejemljivim nosilcem ali razredčilom. Terapevtsko učinkovito količino enega ali več takšnih sestavkov lahko dajemo posamezniku, ki boleha za MS, simultano ali zaporedno. Prednostni sestavki obsegajo vsaj en peptid, in prednostno vsaj dva peptida, izbrana iz naslednje skupine peptidov: MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-1.2 (SEQ ID NO: 4), MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7).MBP 2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10), MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), MBP-3 (SEQ ID NO: 12), MBP-3.1 (SEQ ID NO:

13), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in MBP-5 (SEQ ID NO: 15) vsi kot so prikazani na sl. 2 in še bolj prednostno, izbrana iz naslednje skupine peptidov: MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-1.2 (SEQ ID NO: 4), MBP-2.1 (SEO ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10), MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), MBP-3.1 (SEQ ID NO: 13), MBP-4 (SEQ ID NO: 14), in MBP-5 (SEQ ID NO: 15) in najbolj prednostno izbrana iz naslednje skupine peptidov: MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-4 (SEO ID NO: 14) in MBP-5 (SEQ ID NO: 15). Dodatno lahko sestavki v smislu izuma nadalje obsegajo peptide, izvedene iz MBP, ki imajo številke ostankov, ki ustrezajo aminokislinskim ostankom humanega proteina MBP, ki je prikazan na sl. 1 in ki imajo posamezne aminokislinske sekvence, kot so prikazane na sl. 14: 13-25 (SEQ ID NO: 31), 31-50 (SEQ ID NO: 18), 61-80 (SEO ID NO: 21), 82-92 (SEO ID NO: 32), 82-96 (SEO ID NO: 33), 82-97 (SEO ID NO: 34j, 82-98 (SEO ID NO: 35),

82-100 (SEQ ID NO: 30), 82-100[100P>Y] (SEQ ID NO: 46), 83-100 (SEO ID NO: 37), 83-101 (SEQ ID NO: 38), 84-97 (SEQ ID NO: 39), 84-100 (SEQ ID NO:40), 85-100 (SEQ ID NO: 41), 86-105 (SEQ ID NO: 42), 87-99 (SEQ ID NO:43), 87-99[91K>A] (SEQ ID NO: 36), 88-100 (SEQ ID NO: 44), 88-99 (SEQ ID NO: 45), 111-135 (SEQ ID NO: 47), 122-140 (SEQ ID NO: 48), 139-170 (SEQ ID NO: 49), 141-160 (SEQ ID NO: 28), 142-166 (SEQ ID NO: 50), 142-168 (SEQ ID NO: 51), 146-160 (SEQ ID NO: 52) in 153-170 (SEQ ID NO: 53) in še bolj prednostno obsegajo naslednje peptide: 13-25 (SEQ ID NO: 31), 87-99 (SEQ ID NO: 43), 8799[91K>Aj (SEQ ID NO: 36), 82-100 (SEQ ID NO: 30), 82-100[100P>Y] (SEQ ID NO:46). Prednostno obsegajo sestavki v smislu izuma vsaj dva peptida, pri čemer je vsaj en peptid MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in je vsaj en peptid izbran iz naslednje skupine peptidov: MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-1.2 (SEQ ID NO: 4), MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEO ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10), MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), MBP-3 (SEQ ID NO: 12), MBP-3.1 (SEQ ID NO: 13) in MBP-5 (SEQ ID NO: 15), vsi kot so prikazani sl. 2 in nadalje lahko obsegajo vsaj enega od naslednjih peptidov, ki so izvedeni iz MBP, kot so prikazani na sl. 14:13-25 (SEQ ID NO: 31), 31-50 (SEQ ID NO: 18), 61-80 (SEQ ID NO: 21), 82-92 (SEQ ID NO: 32), 82-96 (SEO ID NO: 33), 82-97 (SEQ ID NO: 34), 82-98 (SEO ID NO: 35), 82-100 (SEO ID NO: 30), 82-100[100P>Y] (SEQ ID NO:46), 83-100 (SEQ ID NO: 37), 83-101 (SEQ ID NO: 38), 84-97 (SEQ ID NO: 39), 84-100 (SEQ ID NO: 40), 85-100 (SEQ ID NO: 41), 86-105 (SEQ ID NO: 42), 87-99 (SEQ ID NO: 43), 87-99[91K>A] (SEQ ID NO: 36), 88-100 (SEQ ID NO: 44), 88-99 (SEQ ID NO: 45), 111-135 (SEQ ID NO: 47), 122-140 (SEQ ID NO: 48), 139-170 (SEQ ID NO: 49), 141-160 (SEQ ID NO: 28), 142-166 (SEQ ID NO: 50), 142-168 (SEQ ID NO: 51), 146-160 (SEQ ID NO: 52) in 153-170 (SEQ ID NO: 53) in še bolj prednostno obsegajo vsaj enega izmed naslednjih peptidov: 13-25 (SEQ ID NO: 31), 87-99 (SEQ ID NO: 43), 87-99[91K>A] (SEQ ID NO: 36), 82-100 (SEQ ID NO: 30), 82-100[100P> Υ] (SEQ ID NO: 46).

Prednostni sestavki v smislu izuma obsegajo naslednje peptide:

MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-2 (SEO ID NO: 5), MBP-3 (SEQ ID NO: 12) in MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in MBP-5 (SEQ ID NO: 15);

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-3 (SEQ ID NO: 12),

MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in MBP-5 (SEQ ID NO: 15):

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2 (SEO ID NO: 5), MBP-4 (SEO ID NO: 14) in

MBP-5 (SEQ ID NO: 15);

MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in MBP-5 (SEQ ID NO: 15);

MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in MBP-5 (SEQ ID NO: 15);

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in MBP-5 (SEQ ID NO: 15);

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6) in MBP-4 (SEQ ID NO: 14); MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6) in MBP-4 (SEQ ID NO: 14); MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2 (SEQ ID NO: 5) in MBP-4 (SEQ ID NO: 14); MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6) in MBP-5 (SEQ ID NO: 15); MBP-1.1 (SEO ID NO: 3), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6) in MBP-3 (SEQ ID NO: 12); MBP-1 (SEQ ID NO: 2) in peptid, izbran iz skupine, ki sestoji iz: MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10) ali MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11);

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3) in peptid, izbran iz skupine, ki sestoji iz: MBP-2 (SEQ ID NO: 5). MBP-2.1 (SEO ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10) ali MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11);

MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in peptid, izbran iz skupine, ki sestoji iz: MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10) ali MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11);

MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in peptid, izbran iz skupine, ki sestoji iz: MBP-1 (SEQ ID NO: 2) ali MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3);

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in peptid, izbran iz skupine, ki sestoji iz: 82-100 (SEQ ID NO; 30), 82-100[100P>Y] (SEQ ID NO: 46), 87-99 (SEQ ID NO: 43) in 87-99[91K>A] (SEQ ID NO: 36), vsi kot so prikazani na sl. 14; MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3) in MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in peptid, izbran iz skupine, ki sestoji iz: MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10) ali MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), vsi kot so prikazani na sl. 2;

MBP-1.1 (SEO ID NO: 3), MBP-5 (SEQ ID NO: 15), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in peptid, izbran iz skupine, ki sestoji iz: 82-100 (SEQ ID NO: 30), 82-100[100P>Y] (SEQ ID NO:46), 87-99 (SEQ ID NO:43), in 87-99[91K>A] (SEQ ID NO: 36), vsi kot so prikazani na sl. 14;

MBP-1.1 (SEO ID NO: 3), MBP-5 (SEO ID NO: 15), MBP-4 (SEO ID NO: 14) in peptid, izbran iz skupine, ki sestoji iz MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10) ali MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), vsi kot so prikazani na sl. 2;

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-5 (SEQ ID NO: 15), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in peptid, izbran iz skupine, ki sestoji iz: 82-100 (SEQ ID NO: 30), 82-100[100P>Y] (SEO ID NO:46), 87-99 (SEQ ID NO:43) in 87-99[91K>A] (SEQ ID NO: 36), vsi kot so prikazani na sl. 14;

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-3 (SEQ ID NO: 12), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in peptid, izbran iz skupine, ki sestoji iz:

MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10) ali MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), vsi kot so prikazani na sl.

Predloženi izum opisuje tudi režim zdravljenja, ki obsega dajanje kombinacij terapevtsko učinkovitih peptidov kot posamezen dogodek zdravljenja. Takšne kombinacije peptidov lahko dajemo simultano ali zaporedno, kot terapevtske sestavke, ki obsegajo le en peptid ali ki obsegajo več peptidov. Takšen režim zdravljenja ni nujno fizikalna zmes več kot enega peptida, toda obsega kombinacijo peptidov, ki jih dajemo simultano ali zaporedno kot posamezen dogodek zdravljenja. Prednostne kombinacije peptidov (v obliki enega ali več sestavkov, pri čemer vsak obsega enega ali več peptidov), ki jih lahko dajemo simultano ali zaporedno kot posamezen dogodek zdravljenja, vključujejo naslednje kombinacije peptidov:

MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-3 (SEQ ID NO: 12) in MBP-4 (SEO ID NO: 14) in MBP-5 (SEQ ID NO: 15);

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2.1 (SEO ID NO: 6), MBP-3 (SEQ ID NO: 12), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in MBP-5 (SEQ ID NO: 15);

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in MBP-5 (SEQ ID NO: 15);

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in

MBP-5 (SEQ ID NO: 15);

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6) in MBP-4 (SEO ID NO: 14);

MBP-1 (SEO ID NO: 2), MBP-2.1 (SEO ID NO: 6) in MBP-4 (SEO ID NO: 14);

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2 (SEQ ID NO: 5) in MBP-4 (SEO ID NO: 14);

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6) in MBP-5 (SEQ ID NO: 15); MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6) in MBP-3 (SEQ ID NO: 12); MBP-1 (SEQ ID NO: 2) in peptid, izbran iz skupine, ki sestoji iz: MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10) ali MBP-2-6 (SEQ ID NO: 11);

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3) in peptid, izbran iz skupine, ki sestoji iz: MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10) ali MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11);

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in peptid, izbran iz skupine, ki sestoji iz: 82-100 (SEQ ID NO: 30), 82-100[100P>Y] (SEQ ID NO:46), 87-99 (SEQ ID NO:43) in 87-99[91K>A] (SEQ ID NO: 36), vsi kot so prikazani na sl. 14;

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3) in MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in peptid, izbran iz skupine, ki sestoji iz: MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10) ali MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), vsi kot so prikazani na sl. 2;

MBP-1.1 (SEO ID NO: 3), MBP-5 (SEQ ID NO: 15), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in peptid, izbran iz skupine, ki sestoji iz: 82-100 (SEQ ID NO: 30), 82-100[100P>Yj (SEQ ID NO:46), 87-99 (SEQ ID NO:43) in 87-99[91K>Aj (SEQ ID NO: 36), vsi kot prikazani na sl. 14;

MBP-1.1 (SEO ID NO: 3), MBP-5 (SEQ ID NO: 15), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in peptid, izbran iz skupine, ki sestoji iz: MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10) ali MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), vsi kot so prikazani na sl. 2;

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-5 (SEQ ID NO: 15), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in peptid, izbran iz skupine, ki sestoji iz: 82-100 (SEQ ID NO: 30), 82-100[100P>Y] (SEQ ID NO: 46), 87-99 (SEQ ID NO: 43) in 87-99[91K>A] (SEQ ID NO: 36), vsi kot so prikazani na sl. 14;

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-3 (SEQ ID NO: 12), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in peptid, izbran iz skupine, ki sestoji iz: MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEO ID

NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10) ali MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), vsi kot so prikazani na sl. 2.

Poleg tega lahko prednostni sestavki in prednostne kombinacije peptidov MBP, ki jih lahko dajemo simultano in/ali zaporedno, vključujejo kateregakoli od gornjih sestavkov in kombinacij, poleg tega pa lahko obsegajo vsaj en T celični epitop-vsebujoč peptid, izveden iz mielinskega oligodentrocitnega proteina (MOG), še en protein, za katerega mislimo, daje eden izmed avtoantigenov, ki so vključeni v multiplo sklerozo (glej Lebar, et al., J. Immunol. (1976) 116:1439-1446; Lebar et al., J.Exp. Immunol (1986) 66:423-443; Linington and Lassman, J. Neuroimmunol. /1987) 17:61-69; Lassman et al., Acta Neuorpathol. (Beri) (1988) 75:566-576; in Sun et al., J. Immunol. (1991) 146:1490-1495). Peptidi, ki lahko obsegajo T celične epitope izvedene iz MOG, so opisani v USSN 08/116,824 vloženi 3. septembra 1993 in USSN 08/300,811 vloženi 1. septembra 1994 (tu vključeni za referenco) in za katere pričakujemo, da so učinkoviti v zdravljenju multiple skleroze, kadar jih pripravimo in/ali dajemo v povezavi z zgoraj opisanimi sestavki, in kombinacije T celični epitopvsebujočih peptidov MBP v smislu predloženega izuma so:

Humani MOG 1-13 (SEQ ID NO: 54) Humani MOG 103-115 (SEQ ID NO: 55) Humani MOG 1-121 (SEQ ID NO: 56)

G Q F R V I G P R H P I R

H S Y Q E E A A M E L K. V

GQFRVIGPRHPIRALVGDEV

ELPCRTSPGKNATGMEVGWY

RPPFSRVVHLYRNGKDQDGD

QAPEYRGRTELLKDAIGEGK

VTLRIRNVRFSDEGGFTCFF

RDHSYQEEAAMELKVEDPFYW

Dodatne peptide MOG, ki vsebujejo epitop, so izumitelji identificirali z uporabo eksperimentalne analize, ki je podobna tisti, ki je opisana zgoraj in v primeru 1 (podatki niso prikazani). Taki peptidi vključujejo:

HumaniMOG 1-20 (SEQ ID NO: 57) Humani MOG 11-30 (SEQ ID NO: 58) HumaniMOG 21-40 (SEQ ID NO: 59) HumaniMOG 31-50 (SEQ ID NO: 60) HumaniMOG 141-160 (SEQIDNO:61) HumaniMOG 151-170 (SEQIDNO:62) HumaniMOG I6I-I80 (SEQ ID NO: 63) HumaniMOG 199-218 (SEQIDNO:64)

GQFRVIGPRHPIRALVGDEV;

PIRALVGDEVELPCR1SPGK;

ELPCRISPGKNATGMEVGWY;

NATGMEVGWYRPPFSRVVHL;

TVGLVFLCLQYRLRGKLRAE;

YRLRGKLRAEIENLHRTFDP;

IENLHRTFDPHFLRVPC WKI; in ynwlhrrlagqfleelrnpf.

Predloženi izum nadalje obravnava modifikacije ali analoge (obravnavane predhodno) gornjih peptidov MOG, ki vsebujejo T celični epitop, ki ohranijo podobno ali večjo T celično aktivnost, kot jo ima roditeljski peptid, iz katerega je izvedena modifikacija ali analog.

Mislimo, da imajo sestavki, ki obsegajo T celični epitop-vsebujoče peptide tako MOG kot MBP, njihove modifikacije, njihove analoge ali peptidomimetike, ki na njih temeljijo, in kombinacije takšnih peptidov, katere lahko dajemo simultano ali zaporedno, to prednost, da maksimirajo zniževalno-regulacijski učinek tako na MBP, kot MOG specifične celice T, ki sodelujejo v avtoimunskem odzivu v MS. Na ta način lahko ciljamo niz celic T, ki lahko sodelujejo v avtoimunskem odzivu ali na MBP ali MOG, kar ima za posledico klinične manifestacije MS (demielacija) z namenom, da le-te .zniževalno reguliramo, s čimer pospešimo terapevtski učinek spojin in sestavkov v smislu izuma. Podobno so lahko v sestavkih in postopkih v smislu izuma prav tako primerni T celični epitop vsebujoči peptidi, ki so izvedeni iz drugih mielinskih antigenov za katere mislimo, da so avtoantigeni v MS (npr. proteolipidni protein (PLP) in glikoprotein, povezan z mielinom (MAG)).

Režim terapevtskega/profilaktičnega zdravljenja v smislu predloženega izuma (ki ima za posledico izničenje, preprečevanje ali zakasnitev nastopa bolezenskih simptomov, povzročenih s povzročiteljskim avtoantigenom, ali ki ima za posledico redukcijo, ne-napredovanje ali blažitev simptomov, povzročenih s povzročiteljskim avtoantigenom t.j.-zniževalna regulacija avtoantigensko specifičnega, imunskega odziva) obsega dajanje terapevtskega sestavka v smislu izuma v ne-imunogeni obliki, ki obsega vsaj en izoliran peptid, izveden iz avtoantigena, ki je odgovoren za bolezensko stanje, ki ga zdravimo (npr. MBP, MOG, PLP, MAG). Čeprav se nimamo namena omejiti na kakršnokoli teorijo, mislimo, da lahko dajanje terapevtskega sestavka v smislu izuma: a) povzroči T celično neodzivnost ustreznih T celičnih podpopulacij, tako da postanejo ne-dovzetne za povzročiteljski antigen in ne sodelujejo v stimuliranju imunskega odziva po izpostavitvi povzročiteljskemu proteinskemu antigenu (npr. preko anergije ali apoptoze); b) modificirajo profil sekrecije limfokina v primerjavi z izpostavitvijo povzročiteljskemu avtoantigenu; c) povzročno, da se T celične podpopulacije, ki normalno sodelujejo v odzivu na povzročiteljski antigen, umaknejo iz mest normalne izpostavitve proti mestom dajanja sestavka (ta redistribucija T celičnih podpopulacij lahko izboljša ali zniža sposobnost posameznikovega imunskega sistema, da stimulira običajni imunski odziv na mestu normalne izpostavitve povzročiteljskemu antigenu, kar ima za rezultat zmanjšanje ali izničenje simptomov); d) povzročijo indukcijo supresorskih celic T ali

e) povzročijo indukcijo supresorskih celic T preko sosednjega (bystander) antigena.

Visoko očiščene in izolirane peptide, proizvedene kot je opisano zgoraj, lahko formuliramo v terapevtske sestavke v smislu izuma, ki so primerni za humano terapijo. Če naj terapevtski sestavek v smislu izuma dajemo z injekcijo (npr. subkutano injekcijo, intravenozno injekcijo), potem je prednostno, da je visoko očiščeni peptid topen v vodni raztopini pri farmacevtsko sprejemljivem pH (t.j. pH območje okoli 4-9), tako da je sestavek tekoč in je zlahka injektibilen. Sestavek prednostno vključuje tudi farmacevtsko sprejemljiv nosilec. Kot uporabljamo tukaj, vključuje farmacevtsko sprejemljiv nosilec kakršnekoli in vse ekscipiente, topila, disperzijske medije, prevleke, antibakterijska in antifungicidna sredstva, toksična sredstva, pufre, sredstva za zadrževanje ali pospeševanje absorpcije, površinsko aktivne snovi in sredstva za tvorbo micelov, lipide, lipozome in sredstva za tvorbo tekočih kompleksov, stabilizirna sredstva in podobne. Uporaba takšnih medijev in sredstev za farmacevtsko aktivno snov je znana v stroki. Mišljena je njihova uporaba v terapevtskih sestavkih, razen v kolikor kakršenkoli konvencionalni medij ali sredstvo ni kompatibilno z aktivno spojino. V sestavke lahko vključimo tudi dodatne aktivne spojine.

Kot smo opisali Zgoraj, so terapevtski sestavki v smislu izuma, ki so primerni za injekcijsko uporabo, prednostno sterilne vodne suspenzije, pripravljene z združitvijo aktivne spojine (t.j. enega ali več visoko očiščenih in izoliranih peptidov, kot so opisani zgoraj) v zahtevani količini v ustreznem vehiklu, z eno sestavino ali kombinacijo sestavin naštetih zgoraj in spodaj, kot je potrebno, čemur sledi filtrirna sterilizacija. Prednostni farmacevtsko sprejemljivi nosilci vključujejo vsaj en ekscipient, kot je sterilna voda, natrijev fosfat, manitol, sorbitol ali natrijev klorid, ali kakršnokoli njihovo kombinacijo. Drugi farmacevtsko sprejemljivi nosilci, ki so lahko primerni, vključujejo topila ali disperzijski medij, ki vsebuje npr. vodo, etanol, poliol (npr. glicerol, propilenglikol in tekoč polietilenglikol in podobne), ustrezne njihove zmesi in rastlinska olja. Ustrezno tekočnost lahko vzdržujemo npr. z uporabo prevleke, kot je lecitin, v primeru disperzij z vzdrževanjem zahtevane velikosti delcev in z uporabo površinsko aktivnih snovi. Preprečevanje delovanja mikroorganizmov lahko dosežemo z različnimi antibakterijskimi in antifungicidnimi sredstvi, npr. parabeni, klorobutanolom, fenolom, askorbinsko kislino, tirmerozolom in podobnimi. Podaljšano absorpcijo sestavkov, ki se jih da injicirati, lahko dosežemo tako, da v sestavek vključimo sredstvo, ki zadrži absorpcijo, npr. aluminijev monostearat in želatino.

Prednostni terapevtski sestavki v smislu izuma morajo biti sterilni, stabilni pod pogoji izdelave, skladiščenja, distribucije in uporabe, in jih moramo varovati proti kontaminacijskim delovanjem mikroorganizmov, kot so bakterije in glive. Prednosten način izdelave terapevtskega sestavka, ki ohrani integriteto sestavka, (t.j. prepreči kontaminacijo, podaljša skladiščenje itd.) je, da pripravimo formulacijo peptida in farmacevtsko sprejemljivega nosilca(ev) tako, da je lahko sestavek v obliki liofiliziranega praška, katerega tik pred uporabo rekonstituiramo v farmacevtsko sprejemljivem nosilcu, kot je sterilna voda. V primeru sterilnih praškov za pripravo sterilnih injekcijskih raztopin so prednostni postopki priprave vakuumsko sušenje, liofiliziranje ali sušenje z vrtenjem (spin drying), ki dajo prašek aktivne sestavine plus katerokoli želeno sestavino iz njene predhodno sterilno filtrirane raztopine.

Kot smo opisali že zgoraj, lahko terapevtski sestavek v smislu izuma obsega več kot en izoliran peptid. Terapevtski sestavek, ki obsega multipeptidno formulacijo primerno za farmacevtsko dajanje ljudem, je lahko želen za dajanje večih nktivnih peptidov. Multipeptidna formulacija vključuje vsaj dva ali več izoliranih peptidov, ki imajo definirano aminokislinsko sekvenco, in je sposobna zniževalne regulacije antigensko specifičnega imunskega odziva. Kot multipeptidna formulacija so lahko primerni katerikoli izmed predhodno opisanih sestavkov, ki obsegajo vsaj dva peptida. Kot smo opisali predhodno, vključujejo zelo želeni peptidi, ki so primerni za uporabo v multipeptidni formulaciji, vsaj dva izmed naslednjih peptidov:

MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-1.2 (SEQ ID NO:4), MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEO ID NO: 10), MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), MBP-3 (SEQ ID NO: 12), MBP-3.1 (SEQ ID NO: 13), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in MBP-5 (SEQ ID NO: 15). Pri pripravi multipeptidne formulacije moramo posebno paziti na vzdrževanje topnosti in stabilnosti vseh peptidov v formulaciji v vodni raztopini pri fiziološko sprejemljivem pH. To zahteva izbiro enega ali več farmacevtsko sprejemljivih topil in ekscipientov, ki so kompatibilni z vsemi peptidi v multipeptidni formulaciji. Primerni ekscipienti vključujejo npr. sterilno vodo, natrijev fosfat, manitol ali oba, tako natrijev fosfat in manitol. Dodatno moramo, če je potrebno, v multipeptidni formulaciji paziti na to da preprečimo dimerizacijo peptidov.

Dajanje terapevtskih sestavkov, kot so opisani zgoraj, v ne-imunogeni obliki, lahko pri posamezniku izvedemo z uporabo znanih postopkov, v dozah in v obdobjih, ki so učinkovita, da povzročijo zniževalno regulacijo MBP antigensko specifičnega imunskega odziva posameznika, ki ga zdravimo za MS. Zniževalno regulacijo antigensko specifičnega imunskega odziva na antigen, ki je povezan z bolezenskim stanjem pri ljudeh, lahko, kadar je možno, določimo klinično, ali pa ga lahko določimo subjektivno (t.j. pacient čuti, če so bili ublaženi nekateri ali vsi simptomi, ki so povezani z bolezenskim stanjem, katerega zdravimo).

Učinkovite količine terapevtskih sestavkov v smislu izuma lahko variirajo glede na faktorje, kot je stopnja občutljivosti posameznika na antigen, starost, spol in masa posameznika, in sposobnost peptida, da povzroči zniževalno regulacijo antigensko specifičnega imunskega odziva v posamezniku. Terapevtski sestavek v smislu izuma lahko dajemo v ne-imunogeni obliki na primeren način, kot z injekcijo (subkutano, intravenozno itd.), z oralnim dajanjem, sublingualno, z inhalacijo, s transdermalno aplikacijo, z rektalnim dajanjem ali s katerokoli kombinacijo poti dajanja, za katere velja, da pospešijo terapevtsko učinkovitost, ali katerokoli drugo potjo dajanja, ki je v stroki znana za dajanje terapevtskih sredstev. Želeno je lahko, da terapevtsko učinkovito količino enega ali več terapevtskih sestavkov v smislu izuma dajemo posamezniku simultano ali zaporedno. Vsak izmed takšnih sestavkov za simultano ali zaporedno dajanje lahko obsega le en peptid, ali pa lahko obsega multipeptidno formulacijo, kot je opisana zgoraj.

Za dajanje peptida ali peptidnega sestavka drugače, kot s parenteralnim dajanjem, je lahko potrebno, da peptid prevlečemo z materialom za preprečevanje njegove inaklivacije, ali da dajemo ta material hkrati s peptidom. Npr., peptidni sestavek lahko dajemo hkrati z encimskimi inhibitorji ali v lipozomih. Encimski inhibitorji vključujejo pankreazni tripsinski inhibitor, diizopropilfluorofosfat (DEP) in trazilol. Lipozomi vključujejo voda-v-olju-v-vodi CGF emulzije, kakor tudi konvencionalne lipozome (Strejan et al., (1984) J. Neuroimmunol. 7:27). Kadar je peptid ustrezno zaščiten kot je opisano zgoraj, ga lahko dajemo oralno, npr., z inertnim razredčilom ali z asimilacije sposobnim jedilnim nosilcem. Peptidni sestavek in druge sestavine so lahko vključeni tudi v trde ali mehke želatinske kapsule, stisnjeni v tablete ali vključeni neposredno v posameznikovo dieto. Za oralno terapevtsko dajanje je lahko aktivna spojina združena z ekscipienti in uporabljena v obliki prebavljivih tablet, bukalnih tablet, pastil, kapsul, eliksirjev, suspenzij, sirupov, oblatov in podobno. Takšni sestavki in pripravki morajo vsebovati vsaj 1 mas.% aktivne spojine. Odstotek sestavka in pripravkov lahko seveda variira in je lahko primerno med okoli 5 do 80 mas.% enote. Količina aktivne spojine v takšnih terapevtsko uporabnih sestavkih je takšna, da dobimo primerno dozo. Prednostni sestavki ali pripravki v smislu izuma so pripravljeni tako, da oralna dozirna enota vsebuje med okoli 10 /zg do okoli 200 mg aktivne spojine. Tablete, pastile, pilule, kapsule in podobne lahko vsebujejo tudi naslednje: vezivo, kot je gumitragakant, akacijo, koruzni škrob ali želatino; ekscipiente, kot je dikalcijev fosfat; dezintegracijska sredstva, kot je koruzni škrob, krompirjev škrob, algininsko kislino in podobne; mazivo, kot je magnezijev stearat; in sladilno sredstvo, kot je saharoza, laktoza ali saharin ali aromatizirno sredstvo, kot je pepermint, olje zelenke ali češnjeva aroma. Kadar je dozirna enotska oblika kapsula, lahko le-ta poleg materialov gornjega tipa, vsebuje še tekoči nosilec. Kot prevleke, ali za kakršnokoli drugačno modificiranje fizikalne oblike dozirne enote, so lahko prisotni št različni drugi materiali. Npr., tablete, pilule ali kapsule so lahko prevleče s šelakom, sladkorjem ali z obema. Sirup ali eliksir lahko vsebuje aktivno spojino, saharozo kot sladilno sredstvo, metil- in propilparabene kot konzervans, barvilo in aromo, kot je češnjeva ali pomarančna aroma. Seveda mora biti katerikoli material, ki ga uporabimo pri pripravi katerekoli dozirne enotske oblike, farmacevtsko čist in v uporabljenih količinah v bistvu ne-toksičen. Poleg tega je lahko aktivna spojina vključena v pripravke in formulacije z zadrževanim sproščanjem.

Za injekcijo (subkutano I.V., I.M., intraperitonealno) lahko dajemo en ali več terapevtskih sestavkov v smislu izuma, prednostno okoli 1 /zg-3 mg in bolj prednostno od okoli 20 ^g-l,5 mg in še bolj prednostno okoli 50 /zg-750 /zg in še bolj prednostno okoli 75 /zg do okoli 750 gg vsake aktivne komponente (peptida) na dozirno enoto. V odvisnosti od režima, kot je opisan spodaj, lahko uporabimo doze v višini 1500 /zg ali več. Za olajšanje dajanja in enotnost doze je še zlasti koristno, da parenteralne sestavke formuliramo v enotski dozirni obliki. Enotska dozirna oblika, kot jo uporabljamo tukaj, se nanaša na fizikalne diskretne enote, ki so primerne kot enotne doze za ljudi, ki jih želimo zdraviti, pri čemer vsebuje vsaka enota predhodno določeno količino aktivne spojine, preračunano tako, da proizvede želen terapevtski učinek v povezavi z želenim farmacevtskim nosilcem. Specifikacija za nove enotske dozirne oblike v smislu izuma je narekovana in neposredno odvisna od (a) edinstvenih lastnosti aktivne spojine in določenega terapevtskega učinka, ki ga želimo doseči in (b) omejitev, ki so prisotne v načinu priprave takšne aktivne spojine za zdravljenje ljudi.

Dozirni režim lahko naravnamo tako, da zagotovimo optimalni profilaktični ali terapevtski odziv. Npr., dajemo lahko več deljenih doz tekom dni, tednov, mesecev ali let, ali pa lahko z vsako naknadno injekcijo dozo proporcionalno povečujemo ali zmanjšujemo, kot to nakazujejo zahteve terapevtske situacije. V prednostnem terapevtskem režimu dajemo subkutane injekcije terapevtskih sestavkov enkrat dnevno med akutno fazo in enkrat vsak drugi dan med remisijo v doživljenjskem obdobju posameznika, ki boleha za boleznijo. Alternative bi vključevale tedenske, mesečne ali druge periodične injekcije. Doza lahko ostane konstantna za vsako injekcijo, ali pa se lahko z vsako naknadno injekcijo povečuje ali znižuje. Kontinuirni, doživljenski program zdravljenja je lahko najbolj želen. Alternativno lahko dajemo ojačitveno injekcijo v intervalih od okoli treh mesecev do okoli 1 leta po obdobju prvotnega zdravljenja in vključuje lahko le eno injekcijo, lahko pa vključuje še eno serijo injekcij, ki so podobne tistim v prvotnem zdravljenju.

Zaradi zelo individualnega odziva imunskega sistema posameznikov, ki bolehajo ali za popuščajočo vračajo MS, primarno progresivno MS, benigno MS ali kronično progresivno MS, je potrebno razviti previdne in različne dozirne režime. Najprej moramo narediti oceno navzema zadevnega pacienta. Izvedemo popoln preizkus, pri katerem med drugim iščemo poslabšan vid, nistagamus, disartrijo, poslabšano percppciio vihraciic in poslabšan občutek za lego, ataksijo in intencijski tremor, oslabelost ali paralizo enega ali več udov, spastičnost in probleme z mehurjem. Strokovnjaki bodo uporabili sprejeta orodja, kot je EDSS, skalo nevrološke razvrstitve in druga, v stroki znana podobna orodja, kakor tudi predhodno obravnavane indice bolezenskega stanja, da bodo določili osnovno linijo, od katere se lahko merijo kakršnekoli spremembe, vključno s progresijo nezmožnosti, toda prednostno zniževalno regulacijo. Čeprav ne obstaja tipična akutna ali popuščajoča faza MS, so se pojavili določeni vzorci, ki bodo vodili izkušenega zdravnika. Kot je omenjeno zgoraj, je frekvenca vzplamenitev ali akutnih stanj največja med prvimi 3 do 4 leti bolezni, toda prvi napad, kateremu ne sledi nujno še en opažen napad 10 do 20 let (čeprav lahko pokaže kopičenje lezij, ki ga lahko detektiramo le z MRI, drugačno klinično sliko). Med tipičnimi epizodnimi dogodki se simptomi v obdobju od nekaj dni, pa do 2 do 3 tednov slabšajo in nato ponehajo. Okrevanje je običajno hitro, v teku nekaj tednov, čeprav se lahko včasih raztegne na nekaj mesecev.

MS je kronična bolezen in potrebna je kontinuirna terapija. Neprekinjeno, dolgotrajno zdravljenje je lahko najbolj učinkovito zdravljenje za ustavitev napredovanja bolezni in nesposobnosti. Primeren je lahko dozirni režim vsak drugi dan, vsaj enkrat tedensko ali enkrat mesečno. Smiselne modifikacije so znotraj sposobnosti strokovnjaka. Intervencijo ob nastopu napada smatramo kot pomembno komponento učinkovitega zdravljenja.

Za pacienta, ki je v akutnem stadiju, moramo oceniti resnost napada. Začetno injekcijo lahko damo na začetku akutnega stadija. Očitno bi bilo koristno začeti zdravljenje kolikor možno zgodaj v akutni fazi. Če je želeno, lahko to zdravljenje združimo s simultanim zdravljenjem z /3-interferonom, steroidi in/ali drugimi terapijami, zlasti s tistimi, ki so oblikovane tako, da zmanjšajo vnetje. Pacienta opazujemo dnevno po prvi obdelavi, prednostno z injekcijo. Predlagamo, da damo dodatne obdelave vsak dan ali vsaj vsak tretji dan med akutno fazo. Kakor pri vsaki medikaciji, mora lečeči zdravnik modificirati dozo glede na klinične spremembe, ki kažejo potrebo po modifikaciji. Kakršnakoli takšna diskrecija je znotraj obsega strokovnjakov, ki uporabljajo predlagan dozirni program in količine kot napotke. Dozirno območje od okoli 75 do okoli 750 /zg na dozo daje Iečečemu zdravniku veliko svobode (in ni nesmiselna količina). Opisi vključujejo, toda nanje niso omejeni, dnevna zdravljenja med akutno fazo, katerim sledi potek zdravljenja remisije, naveden zgoraj. To na noben način ne izključuje možnosti bolj ali manj pogostega doziranja, če lečeči zdravnik določi, da je potrebna intervencija.

Predloženi izum opisuje, da lahko napredovan stadij multiple skleroze zdravimo skladno s sestavki in postopki v smislu izuma. Sestavki, ki obsegajo vsaj en peptid, ki ima T celično aktivnost in ki je izveden iz mielinskega antigena, so primerni za zdravljenje napredovanega stadija MS. Sestavki peptidov MBP, peptidov MOG in njihovih zgoraj opisanih kombinacij so primerni za zdravljenje napredovanega stadija MS. Kotje opisano zgoraj, vključujejo ti peptidi, toda nanje niso omejeni:

MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-1.2 (SEQ ID NO: 4), MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-2.1(SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10), MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), MBP-3 (SEQ ID NO: 12), MBP-3.1 (SEQ ID NO: 13), MBP-4 (SEQ ID NO: 14), MBP-5 (SEQ ID NO: 15), 13-25 (SEQ ID NO: 31), 31-50 (SEQ ID NO: 18), 61-80 (SEQ ID NO: 21), 82-92 (SEQ ID NO: 32), 82-96 (SEQ ID NO: 33), 82-97 (SEQ ID NO: 34), 82-98 (SEQ ID NO: 35), 82-100 (SEQ ID NO: 30), 82-100 [100P>Yj (SEQ ID NO: 46), 83-100 (SEQ ID NO: 37), 83-101 (SEQ ID NO: 38), 84-97 (SEQ ID NO: 39), 84-100 (SEQ ID NO: 40), 85-100 (SEQ ID NO: 41), 86-105 (SEQ ID NO: 42), 87-99 (SEQ ID NO: 43), 87-99 [91 K>Aj (SEQ ID NO: 36), 88-100 (SEQ ID NO: 44), 88-99 (SEQ ID NO: 45), 111,-135 (SEQ ID NO: 47), 122-140 (SEQ ID NO: 48), 139-170 (SEQ ID NO: 49), 141-160 (SEQ ID NO: 28), 142-166 (SEQ ID NO: 50), 142-168 (SEQ ID NO: 51), 146-160 (SEQ ID NO: 52) in 153-170 (SEQ ID NO: 53) in in prednostno MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3),

MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-4 (SEQ ID NO: 14), MBP-5 (SEQ ID NO: 15), 13-25 (SEQ ID NO: 31), 87-99 (SEQ ID NO: 43), 87-99 [91 K>AJ (SEQ ID NO: 36), 82-100 (SEQ ID NO: 30), 82-100 [ 100P>Y] (SEQ ID NO: 46} kakor tudi peptide, izvedene iz humanega MOG:

Humani MOG 1-13 (SEQ ID NO: 54) Humani MOG 103-115 (SEQ ID NO: 55) Humani MOG 1 -121 (SEQ ID NO: 56)

Humani MOG 1-20 (SEQ ID NO: 57) Humani MOG 11-30 (SEQ ID NO: 58) Humani MOG 21-40 (SEQ ID NO: 59) Humani MOG 31-50 (SEQ ID NO: 60) Humani MOG 141-160 (SEQ ID NO: 61) Humani MOG 151-170 (SEQ ID NO: 62) Humani MOG 161-180 (SEQ ID NO: 63) Humani MOG 199-218 (SEQ ID NO: 64)

GQFR VIGPRHPIR

HSYQEEAAMELKV

GQFRVIGPRHPIRALVGDEV

ELPCRTSPGKNATGMEVGWY

RPPFSRVVHLYRNGKDQDGD

Q A P EYRGRTELLKDAIGEGK

V T L R I R N V R F S D E G G F TC F F

RDHSYQEEAAMELKVEDPFYW

GQFRVIGPRHPIRALVGDEV;

PIRALVGDEVELPCRISPGK;

ELPCR1SPGKNATGMEVGWY;

NATGMEVGWYRPPFSRVVHL;

TVGLVFLCLQYRLRGKLRAE;

YRLRGKLRAEIENLHRTFDP;

IENLHRTFDPHFLRVPCVVKI; in

YNWLHRRLAGQFLEELRNPF.

Tukajšnji izumitelji so bili prvi, ki so prišli do presenetljivega odkritja, da intervencija sredi napada, ki je v teku, dejansko izboljša stanje osebe, ki jo zdravimo v skladu s postopkom v smislu izuma. Na minimumu takšna intervencija ne poslabša stanja osebe. Nadalje prijavitelji prikazujejo, da intervencija med remisijo zniževalno regulira imunski odziv in da se, kot rezultat kakršnekoli takšne intervencije, stanje ne aktivira. Tako lahko intervencija ne povzroči samo izboljšanja, ampak se zdi, da je povsem varna, kadar jo uporabimo v smislu postopka predloženega izuma. Z uporabo zgoraj opisanega modela EAE prijavitelji ponazarjajo, da ponavljajoče intravenozno dajanje imunodominantnega peptida MBP Acl-11 (SEQ ID NO: 65) uspešno zdravi EAE, induciran s celotnim proteinom MBP. Svojčas uspešno zdravljenje (indikativ T celične reaktivnosti) je prikazano z nativnim peptidom (nesubstituiran peptid, izveden iz nativne sekvence v skladu s postopki, ki so tu Opis.mi za identifikacijo T celični epitop vsebujočih peptidov, izvedenih iz proteinskega avtoantigena), ustrezno modificirane peptide pa lahko identificiramo s primerjavo vezivnih afinitet modificiranega peptida z nativnim peptidom. Modificirani peptid, ki ima vezivno afiniteto nižjo kot nativni peptid, bi bil ustrezen kandidacijski peptid za terapevtski sestavek v smislu predloženega izuma. Analize za določevanje vezivnih afinitet lahko doženemo iz navedb v U.S.S.N. 08/300,811 vloženi 1. septembra 1994, kije tu vključena kot referenca. Npr., ugotovili smo, daje Acl-11 (SEQ ID NO: 65) terapija uspešna. Terapijo z Acl-11 (SEQ ID NO: 65) smo nato primerjali s terapijo z Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67), analogom Acl-11 (SEQ ID NO: 65), ki se veže na A^UA^U z višjo afiniteto in večjo stabilnostjo (Wraith, D.C. et al., zgoraj in Fairchild. P.J. et al. zgoraj). Zanimivo, prijavitelji so ugotovili, da je Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) učinkovit v 100-krat nižji dozi kot Acl-11 (SEQ ID NO: 65) in da njegov terapevtski učinek traja dlje, kar kaže na to, da bi bili izbrani modificirani peptidi primerni tudi v terapevtskem sestavku. Nadalje prijavitelji prikazujejeo, da določen testiran peptid Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) v obdelanih miših tvori stabilne komplekse peptid-MHC in vivo. To nakazuje, da je zelo verjetno, da so modificirani peptidi, ki tvorijo stabilne komplekse peptid-MHC in vivo, primerni peptidi za zdravljenje ljudi, saj se lahko njihova jakost zelo poveča s konzervativnimi aminokislinskimi substitucijami (glej tudi Karin et al., J. Exp. Med., 180:2227-2237 (1994)). Prijavitelji so tudi odkrili, da je peptidni analog MBP Acl11[4Y] (SEQ ID NO: 67) izničil paralizo v teku, kadar smo ga dali med akutno fazo EAE, in da je preprečil povratke bolezni, kadar smo ga dali med remisijo. To kaže na to, da lahko modificirani peptidi in analogi izbranih peptidov izničijo aktivne simptome in preprečijo povratke bolezni pri ljudeh, ki bolehajo za MS.

Prijavitelji so v še enem modelu poteka človeške bolezni začeli intravenozno peptidno terapijo po začetku EAE in med akutno fazo. Precej presenetljivo je ta terapija izničila bolezen v teku, kadar smo jo dajali med akutno fazo. Ta ugotovitev je prva te vrste. V preteklih poizkusih, ki so jih naredili drugi, so s peptidno terapijo začeli takrat, ko večina miši v obdelovani skupini še ni kazala znakov EAE, pred imunizacijo ali najkasneje blizu nastopa bolezni. Na primer, v Gaur et al. zgoraj, je bila skupina 13 miši izpostavljena režimu MBP, ki povzroči bolezen. Ko je le ena od 13 miši pokazala minimalne znake bolezni t.j. ena miš je imela klinični rezultat 1 (glej primer 2 za diskusijo kliničnega vrednotenja pri miših), so sedmim mišim intraperitonealno injicirali zmes peptidov MBP. Preostalih šest miši, ena izmed njih je bila žival, ki je kazala znake bolezni, niso dodatno obdelali. V tem primeru so bili Gaur et al. za miši, ki so brez kliničnih simptomov bolezni, nesposobni potegniti kakršenkoli smiselen zaključek o svojih podatkih. Prisotnosti nizkega kliničnega rezultata 1 pri eni miši ne moremo interpretirati tako, kot da kaže na aktivno bolezen pri katerikoli izmed drugih miši. Gaur et al. torej opisujejo zdravljenje pred nastopom bolezni in najbolj natančno, pred kliničnimi znaki bolezni. Za razliko, pa bi morala biti terapija, da bi bila uporabna v klinični postavitvi zdravljenja ljudi z MS, učinkovita tudi v primeru, če bi z njo začeli veliko po nastopu bolezenskega procesa. Kot model ustrezne humane terapije so prijavitelji mišim dajali peptidno terapijo z 250 nmol Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67), s katero so pričeli po nastopu akutne faze EAE. Sl.

prikazuje učinek te terapije. S terapijo smo začeli pri vsaki miši posamezno, potem ko je pokazala začetne znake EAE. Miši smo označili, kot da so razvile EAE na Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) peptidno terapevtsko skupino in na vsako od treh kontrolnih skupin (brez obdelave, PBS ali A^uA^u-vezivni peptid OVA 323-337) (SEO ID NO: 70). Slika 9 kaže, da zdravljenje EAE, ki je v teku, z Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) vodi do izrednega izboljšanja bolezenskih rezultatov, ki je vidno v 48 urah po začetni injekciji peptida. Pri teh obdelanih miših se EAE skoraj popolnoma odstrani do četrtega dne po nastopu in učinek 18-dnevnega poteka peptidne terapije je podaljšan.

V še enem presenetljivem razvoju so prijavitelji odkrili, da intravenozna peptidna terapija, s katero pričnemo med fazo remisije EAE, prepreči povratke bolezni. Z uporabo EAE, kot modela za človeško bolezen, kot je omenjeno zgoraj, se pri (PLJ x SJL)F1 miših razvije povratek bolezni EAE po imunizaciji z MBP (Fritz, R.B. et al., J. Immunol, 1983, 130:1024). EAE se običajno razvije med 9 in 16 dnevom po imunizaciji in v tem modelu traja akutna faza bolezni od okoli 3 do 20 dni. 20 % ali več miši lahko med aktuno fazo pogine ali umira, odvisno od resnosti bolezni v poizkusu. Največ preživelih v akutni fazi nato vstopi v kratko fazo remisije, pri čemer nekaj dni izražajo blage ali nikakršne klinične znake bolezni. V nekaterih poizkusih vstopijo v fazo remisije vse miši približno istočasno (ponazorjeno na sliki 5), toda v največ primerih je dolžina akutne faze bolezni bolj variabilna. Fazi remisije sledi faza prvega povratka bolezni, ki je splošno glede resnosti enaka akutni fazi bolezni. Naknadno preživele miši razvijejo rezidualno kronično paralizo, ki se ohrani do konca poizkusa.

V mišjem modelu je peptid Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) izredno učinkovita terapija takrat, kadar ga dajemo med fazo remisije EAE. Za raziskavo kapacitete Acl-11[4Y} (SEO ID NO: 67), ki prepreči povratke EAE, smo miši zasledovali v teku njihovih začetnih dogodkov paralize, ki so trajali od 3 do 19 dni. Preživele miši so posamično vstopale v obdobje remisije (definirano kot zmanjšanje v kliničnem rezultatu na 1 ali 0 za vsaj dva dni), alternativno smo jih razvrstili v dve skupini in začeli z intravenozno terapijo s 25 nmoli Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) ali s kontrolno PBS. Miši smo obdelali posamezno, s pričetkom na njihov drugi dan remisije. Slika 10 kaže, da je intravenozna obdelava z Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) s pričetkom med fazo remisije EAE, izredno zmanjšala pogostost in resnost povratka bolezni in kaže, da je lahko intravenozna peptidna terapija učinkovita tudi takrat, kadar z njo začnemo pozno v teku bolezni.

Mehanizem intravenozne peptidne terapije še ni povsem pojasnjen, čeprav je bilo v številnih drugih antigenskih sistemih predhodno že nakazano, da intravenozno dajanje antigenskega peptida pred imunizacijo inducira antigensko specifično neodzivnost imunskega sistema. Kot nadaljnjo indikacijo viabilnosti terapevtika, ki se ga daje pacientom z MS, so prijavitelji I.V. dajali encefalitogenski peptid ali peptidni analog in ugotovili, da je reduciral in vitro proliferacijo limfnega vozla in produkcijo IL2. Mišim smo intravenozno injicirali 250 nmolov MBP Acl-11 (SEQ ID NO: 65) 10 in 5 dni pred imunizacijo s proteinom MBP. Slika Ila kaže proliferativni odziv limfnega vozla pri teh obdelanih miših izmerjen 10 dan po imunizaciji. Predhodna intravenozna obdelava z imunodominantnim peptidom MBP Acl-11 (SEQ ID NO: 65) brez adjuvansa pred imunizacijo, zniža naknadni in vitro proliferativni T celični odziv na MBP Acl-11 (SEQ ID NO: 65). Podobne rezultate smo dobili, kadar smo miši predhodno obdelali z intravenoznimi injekcijami peptidnega analoga MBP, Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) (podatki niso prikazani). Poleg tega smo produkcijo IL2 limfnega vozla, kot odziv na MBP Acl-11 (SEQ ID NO: 65), preprečili z intravenozno obdelavo z Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) (slika Ilb). Rezultati potrjujejo, da predhodna intravenozna obdelava z MBP Acl-11 (SEQ ID NO: 65) ali Acl-ll[4Yj (SEQ ID NO: 67) inducira T celično neodzivnost na MBP Acl-11 (SEO'ID NO: 65).

Prijavitelji smo torej raziskovali učinkovitost terapije z intravenoznimi peptidi in peptidnimi analogi MBP pri zdravljenju vračanja bolezni EAE in prišli do številnih enkratnih opažanj. Prvič in verjetno najbolj pomembno, zdravljenje avtoimunske bolezni s posameznim avtoantigenskim peptidom je lahko učinkovito tudi takrat, kadar s terapijo začnemo po nastopu bolezenskih znakov. Specifični bolezenski znaki, uporabljeni za ovrednotenje miši, so obravnavani v tukajšnjih primerih. Srednji klinični rezultati nivoja 2 ah višjega, so bili definirani kot napredovan stadij EAE. Rezultati kažejo, da intravenozni peptidi MBP ovirajo encefalitogensko aktivnost avtoagresivno miciiranih celic tudi potem, ko je bila krvna možganska bariera odstranjena in seje pojavila limfocitna infiltracija centralnega živčnega sistema. Nikoli nismo opazili, da bi peptidi vsaj začasno aktivirali, poslabšali ali povzročili eksacerbacijo bolezni, ki je v teku. EAE, ki ga zdravimo po nastopu akutne faze, se izniči v nekaj dneh po začetku terapije, čeprav so bile prvotno obdelane miši močno prizadete. Histološka preiskava je potrdila, da je klinični odziv na peptidno terapijo koreliral z opaženo redukcijo v limfocitnih infiltratih možgan in hrbtnega mozga. Kot je obravnavano tukaj, je bilo tudi I.V. dajanje MBP Acl-11 [4Υ] (SEO ID NO: 67) učinkovito celo takrat, kadar smo z njim pričeli tako pozno, kot je 30 dni po imunizaciji z MBP, v fazi remisije EAE. Torej začetek zdravljenja med navidezno mirno fazo bolezni ni vodilo ponovno do eksacerbacij, poleg tega pa je popolnoma preprečilo vse, razen najbolj blagih povratkov bolezni. Ta rezultat je še zlasti zanimiv zato, ker ne obstaja dokaz, da se prepoznavanje množice epitopov MBP pojavi pozno v imunskem odzivu na MBP in obstajalo je mnenje, da bi lahko ti epitopi prispevali k bolezni (Lehmann, P.V., et al., Nature, 1992, 358:155). Predloženi izum predlaga, da bi lahko dajanje peptida zelo zgodaj v teku bolezni preprečilo razvoj poznega imunskega odziva na takšne epitope. Seveda je opazno, da je posamezen peptidni analog MBP učinkovito preprečil povratke bolezni, kadar smo ga dali po resoluciji resne akutne faze EAE, ko je lahko imunski odziv na MBP in verjetno na druge mielinske antigene, že napredoval.

V izvedbi predloženega izuma je prednostna izbira učinkovitega terapevtika in je opisana tu dalje. Dodatno so tukajšnji izumitelji postavili teorijo, da bi bil lahko en kriterij za najboljše kandidacijske peptide ta, da so to tisti s T celično reaktivnostjo in z višjo MHC vezivno afiniteto, kot jo ima nativni peptid, ki tvori stabilne komplekse z MHC razreda II in vivo. Še zlasti so prijavitelji preučevali peptidni analog MBP, ki tvori stabilne komplekse z MHC razreda II in vivo, ki je pri zdravljenju EAE bolj učinkovit, kot Acl-11 (SEQ ID NO: 65). Že prej je bilo pokazano, da se peptidni analog MBP Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) veže na A^UA^U z višjo afiniteto in da so kompleksi, ki se tvorijo in vitro med Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) in A^UA^U bolj stabilni kot tisti, ki se tvorijo med Acl-11 (SEQ ID NO: 65) in A^UA^U. Pokazano je bilo tudi, da Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) prepreči EAE, kadar se pred imunizacijo inhalirajo velike doze (Metzler, B. et al., zgoraj). Predloženi izum opisuje, da je modificirani peptidni analog MBP Acl-11 [4Υ] (SEQ ID NO: 67) kot terapevtsko sredstvo vsaj 100-krat bolj učinkovit kot MBP Acl-11 (SEQ ID NO: 65) in da zahteva manj pogost urnik doziranja. Ta povečana učinkovitost ima za rezultat terapevtik, ki je tako bolj praktičen, kot tudi bolj učinkovit. Prijavitelji so opazili, da ima intravenozno dajanje Acl-ll[4Yj (SEQ ID NO: 67) (toda ne Acl-11 (SEQ ID NO: 65)) za posledico tvorbo stabilnih kompleksov peptid-MHC in vivo. Mislimo, da je izboljšana učinkovitost Acl-ll[4Yj (SEQ ID NO: 67) povezana s tvorbo stabilnih kompleksov peptid-MHC. Te komplekse lahko detektiramo na vraničnih celicah z uporabo MBP Acl-11 (SEQ ID NO: 65)-specifičnega hibridoma do 10 ur po injekciji. Prav tako mislimo, da je lahko tvorba stabilnih kompleksov peptid-MHC ena od značilnosti takšnega učinkovitega terapevtskega peptida. Presenetljivo je bil in vivo terapevtski učinek Acl-11[4Y] (SEO ID NO: 67) prisoten še dolgo po tem, ko se kompleksov peptid-MHC na vraničnih celicah ni dalo več detektirati (glej sliko 6a in sliko 9). Možno je, da kompleksi peptid-MHC tvorijo antigensko specifične funckionalne terapevtske enote, ki izražajo dolgotrajen učinek na encefalitogenske celice T, ki traja tudi še potem, ko kompleksov in vivo ne moremo več detektirati. Ni znano, ali takšni kompleksi izražajo svojo učinkovitost periferno ali v centralnem živčnem sistemu. Če delujejo v centralnem živčnem sistemu, se lahko kompleksi tvorijo tam, ali pa lahko celice, ki nosijo komplekse, migrirajo preko krvne možganske bariere.

Predloženi izum nadalje zagotavlja postopke za zdravljenje multiple skleroze, ki obsegajo dajanje terapevtsko učinkovite količine vsaj enega peptida MBP, ki ima T celično aktivnost, v režimu zdravljenja, ki vključuje terapevtsko učinkovito količino IFN-jS.

Kot rezultat tu opisanega dela smo odkrili, da ima kombinacija vsaj enega peptida, ki ima T celično aktivnost, izvedenega iz mielinskih antigenov (npr. MBP) in IFN-/3, kadar jo dajemo v terapevtskem režimu, sinergistični učinek (slika 12c), ki presenetljivo zmanjša klinične simptome EAE pri miših do veliko večjega obsega, kot je učinek vsakega na blaženje simptomov EAE, kadar ju dajemo posamično (slika 12a-b) in kije večji od tistega, ki bi ga pričakovali za predvsem aditivni učinek peptid + IFN-/3.

Ker služi EAE kot mišji model humane MS in ker ga inducirajo različni mielinski antigeni, (npr. PLP, MBP, MOG), pričakujemo, da bomo podoben učinek videli tudi pri ljudeh. Zaradi tega predloženi izum zagotavlja postopek zdravljenja posameznikov, ki imajo multiplo sklerozo, ali ki so dovzetni za razvoj multiple skleroze, ki obsega dajanje učinkovite količine sestavka v smislu izuma, kateri obsega vsaj en peptid, ki ima T celično aktivnost, izveden iz mielinskega antigena, prednostno v neimunogeni obliki, v terapevtskem režimu, ki vključuje tudi dajanje IFN-/3. Prednostni sestavki vključujejo tiste sestavke v smislu izuma, ki so opisani predhodno, ki obsegajo peptide MBP, kakor tudi peptide MBP združene s peptidi MOG, v povezavi s simultano ali zaporedno dajanim IFN-/3.

Dajanje sestavka v smislu izuma, ki obsega vsaj en peptid, ki ima T celično aktivnost mielinskega antigena, v terapevtskem režimu, ki vključuje dajanje IFN-β, lahko izvedemo z uporabo znanih postopkov z dozami in za obdobja, ki učinkovito zmanjšajo, eliminirajo ali preprečijo simptome, ki so povezani z multiplo sklerozo.

Učinkovite količine tako peptida, kot IFN-β, kadar ju dajemo v terapevtskem režimu skupaj, variirajo glede na faktorje, ki so obravnavani zgoraj. Aktivne spojine (npr. peptid MBP ali njegov sestavek in IFN-β) lahko dajemo na primeren način, kot z injekcijo (subkutano, intravenozno itd.), z oralnim dajanjem, inhalacijo, s transdermalno aplikacijo ali z rektalnim dajanjem, kot je opisano zgoraj.

Z injekcijo lahko dajemo npr. prednostno okoli 1 /xg-3 mg in bolj prednostno okoli 20-500 μ-g peptida, izvedenega iz mielinskega antigena, na dozirno enoto. Prednostno lahko z injekcijo dajemo dozirno enoto 100-10000 enot IFN-β. Dozirni režim teh dveh spojin lahko naravnamo tako, da zagotovimo optimalni terapevtski odziv. Npr., IFN-β in sestavek v smislu izuma lahko dajemo simultano, ali pa ju prednostno lahko dajemo vsaj 6 ur narazen, prednostno vsaj 12 ur narazen ali bolj prednostno vsaj 24 ur narazen. Terapevtski režim dajanja, tako antigenskega peptida, kot IFN-β, lahko nadaljujemo v obdobju večih dni ali tednov in ga lahko skrajšamo ali podaljšamo kot to narekuje nujnost terapevtske situacije, kot je obravnavano zgoraj.

Predloženi izum zagotavlja tudi nov sestavek, ki obsega fizikalno zmes peptida, ki ima T celično aktivnost, izvedenega iz mielinskega antigena, kot je MBP ali MOG, in IFN-β v farmacevtsko sprejemljivem nosilcu ali razredčilu. Ta sestavek lahko uporabimo kot del terapevtskega režima za zdravljenje ali preprečevanje multiple skleroze pri posamezniku.

Druge avtoimunske bolezni, kot je diabetes tipa I in revmatoidni artritis, so splošno sprejete, kot da so rezultat s celicami T posredovanega antigensko specifičnega odziva proti avtoantigenu. Različni pristopi za zdravljenje avtoimunskih bolezni, posredovanih s celicami T, vključujejo dajanje celih avtoantigenov ali iz njih izvedenih peptidov, ki vsebujejo T celične epitope, pacientu z namenom, da zniževalno reguliramo s T celicami posredovan odziv, ki je odgovoren za škodljive simptome avtoimunske bolezni.

Ugotovljeno je bilo, da poleg mielinskih avtoantigenov, ki igrajo vlogo v MS, povzročajo bolezenske simptome v drugih avtoimunskih boleznih, kot je diabetes, Gravesova bolezen, miastenia gravis, Good Pasturejev sindrom, psoriaza, tiroiditis in revmatoidni artritis, številni antigeni (npr. avtoantigeni, kot so izolin; rh faktor; acetilholinski receptorji; receptorji tiroidnih celic, temeljni membranski proteini; tiroidni proteini; ICA-69 (PM-1); dekarboksilaze glutaminske kisline (64K ali 65K); proteolipid, kolagen (tipa II), protein toplotnega šoka in karboksipeptidaza H). Mis43 limo, da lahko za zdravljenje avtoimunskih bolezni, kot je revmatoidni artritis, diabetes, miastenia gravis, Gravesova bolezen, Good Pasturejev sindrom, psoriaza in tiroiditis, kjer je antigen, ki je odgovoren za bolezen, proteinski avtoantigen, uporabimo sestavke in metode podobne tistim, ki so opisani tukaj.

Peptidi, ki obsegajo definirane sekvence aminokislinskih ostankov, ki imajo T celično aktivnost in ki prednostno vsebujejo vsaj en T celični epitop in/ali ki inducirajo T celično neodzivnost ali zmanjšano T celično odzivnost, so bili identificirani in izolirani za številne izmed zgoraj imenovanih avtogenov. Npr. peptidi, za katere mislimo, da so sposobni zniževalno regulirati antigensko specifičen odziv na topen kolagen tipa II, proteinski antigen, za katerega mislimo, da je avtoantigen v revmatoidnem artritisu, so bili identificirani v WO 94/07520. WO 92/06704 opisuje postopke za identifikacijo peptidov insulina za katere se misli, da vsebujejo T celične epitope in ki bi bili lahko uporabni v sestavkih in postopkih, ki so analogni tistim iz predloženega izuma, za zdravljenje diabetesa I. Poleg tega lahko ustrezne peptide, ki vsebujejo T celični epitop, identificiramo za antigen ali avtoantigen, za katerega predvidevamo, da je odgovoren za katerokoli od zgoraj imenovanih bolezni, s katerimkoli od postokov, ki so opisani zgoraj in v primerih, za identifikacijo T celični epitop-vsebujočih peptidov proteinskega avtoantigena. Potem, ko so peptidi, ki vsebujejo takšen T celični epitop, identificirani za tarčni avtoantigen, lahko takšne peptide uporabimo v sestavkih in postopkih, ki so analogni tistim, ki so tu opisani za zdravljenje multiple skleroze.

Predloženi izum ponazarjamo z naslednjimi neomejujočimi primeri.

PRIMER 1

Študija imunskega odziva multiple skleroze pri človeški populaciji na mielinski bazični protein in peptidi in selekcija peptidov MBP, ki so primerni za terapevtsko uporabo

Sinteza peptidov

Peptide smo sintetizirali z uporabo standardne Fmoc/tBoc kemije in jih očistili s HPLC z reverzno fazo. Slika 3 prikazuje peptide MBP, ki smo jih uporabili v teh študijah. Imena peptidov ali aminokislinski ostanki so vseskozi konsistentni.

Protokol: Analiza humanega PBL na reaktivnost z MBP in peptidi MBP:

PBL-je smo prečistili iz svežih vzorcev periferne krvi (približno 75 cm³) 222 pacientov z dokončno MS z uporabo gradienta gostote po Ficollu. Mikrotitrske kulture smo vložili z 2 χ 10⁵ PBL na jamico in 10 Mg/ml prečiščenega MBP človeškega hrbtnega mozga v gojitvenem mediju RPMI 1640 dopolnili s 5 % humanim AB serumom, penicilinom-streptomicinom in L-glutaminom. S pričetkom na dan 6-7 smo kulture dopolnili z IL2 (20 enot/ml) in IL4 (5 enot/ml). Po 11-13 dneh smo mikrotitrske kulture sprali, resuspendirali v svežem mediju in razdelili v 12 svežih mikrotitrskih jamic. Dodali smo avtologno zamrznjene PBL-je, z 5 χ 10⁴ PBL na jamico, kot celice, ki predstavljajo anitgen.

K 12 replikacijskim jamicam iz vsake mikrotitrske kulture smo v dvojniku dodali skrining antigene. Kot negativno kontrolo smo vedno uporabili medij, kot pozitivno kontrolo pa smo uporabili prečiščen humani rekombinantni MBP z 10 Mg/ml. Vsakega pacienta smo testirali tudi na reaktivnost z največ 4 peptidi MBP, z vsakim v koncentraciji 10 mM. Po 48 urah smo analize vzpostavili v stik z 27,75 kBq ³Htimidina in jih po 6-16 urnem stiku zbrali.

Kulture smo ocenili kot pozitivne na vsakega od peptidov po naslednjih kriterijih: stimulacijski indeks večji od 3,0, sprememba v CPM večja od ali enaka 500 in standardna napaka srednje vrednosti manjša od spremembe v CPM. Poleg tega smo za namene analize kulture ocenili kot peptidno-pozitivne le, če so se odzvale tako na MBP, kot na peptid, in če se niso odzvale na več kot en neprekrivajoč peptid. Reaktivnost z vsakim od peptidov smo testirali z uporabo najmanj 19 in največ 43 pacientov.

Rezultati:

Povprečje 6 % mikrotitrskih kultur je dalo pozitiven rezultat na MBP reaktivnost pri vsakem pacientu (območje 0-37 MBP pozitivnih kultur na pacienta). Vsaj ena mikrotitrska kultura je dala pozitiven rezultat za MBP reaktivnost pri 77 % pacientov in smatrali smo, da so ti posamezniki MBP odzivniki. MBP odzivni status ni koreliral s spolom, kategorijo MS (VP proti KP), tipom HLA-DR, starostjo ali s tem, ali je pacient jemal betaseron ali ne.

Testirani peptidi MBP so vključevali ploščo s 16 20-meri (slika 3), ki se prekrivajo z 10 aminokislinami in ki prekrivajo celotno sekvenco humanega MBP (18,5 kD izooblika). Testirali smo tudi dva dodatna daljša peptida (sekvence MBP (MBP 83-105 (SEQ ID NO: 5) in MBP 141-165 (SEQ ID NO: 14), slika 3). Nato smo na osnovi deleža MBP pozitivnih mikrotitrskih kultur, ki so dale pozitiven rezultat tudi za enega od peptidov MBP, izračunali reaktivnost peptidov MBP. Vsak izmed štirih peptidov je prispeval vsaj 10 % celokupne MBP reaktivnosti (MBP 11-30 (SEQ ID NO: 2), MBP 81-100 (SEQ ID NO: 23), MBP 83-105 (SEQ ID NO: 5) in MBP 141165 (SEQ ID NO: 14)). Poleg tega smo detektirali reaktivnost na vsakega od teh peptidov pri vsaj eni tretjini posameznih MBP-odzivnih pacientih z MS, pri katerih smo te peptide testirali. Nadalje je 77 % MBP-odzivnih pacientov pokazalo reaktivnost tako na MBP 83-105 (SEQ ID NO: 5), kot na MBP 141-165 (SEQ ID NO: 14), ali na oba peptida.

Med štirimi peptidi je najbolj reaktiven MBP 141-165 (SEQ ID NO: 14), ki prispeva 21 % celotnega odziva MBP in ga lahko določimo pri 64 % testiranih MBP-odzivnih pacientih. Zdi se, da MBP 141-165 (SEQ ID NO: 14) vključuje T-celične epitope tako iz MBP 141-160 (SEQ ID NO: 28), kot iz MBP 151-170 (SEQ ID NO: 29) in presenetljivo je pokazal izredno več reaktivnosti, kot oba 20-merna peptida. MBP 81-100 (SEQ ID NO: 23) in MBP 83-105 (SEQ ID NO: 5) sta si v sekvenci zelo podobna in verjetno je, da vključujeta podobne, če ne celo identične T celične epitope. Ustrezata regiji, za katero so nekoč mislili, da je povezana s haplotipom HLA-DR2. Naši rezultati kažejo, da imajo tako DR2, kot ne-DR2 pacienti z MS dobro reaktivnost na te peptide. MBP 11-30 (SEQ ID NO: 2) je področje reaktivnosti peptida, za katero prej niso mislili, da je pri pacientih z MS pogosto prepoznavno.

Vsak od ostalih peptidov MBP je prispeval manj kot 5 % celokupne MBP reaktiv46 nosti in zaznali smo ga pri 20 % ali manj MBP odzivnih pacientih, ki smo jih testirali (glej slike 4a in 4b). Največ reaktivnosti med to podskupino peptidov smo ugotovili z MBP 111-130 (SEQ ID NO: 12), kije prispeval 4,5 % MBP reaktivnosti in ki smo ga našli pri 19 % testiranih MBP odzivnikov.

Izbor prednostih peptidov MBP

Prednostne peptide MBP smo izbrali na temelju dveh kriterijev:

1. Število pacientov z MS, ki se odzovejo na kandidacijske peptide (vsaj 75 % testiranih pacientov se odzove na proteinski antigen, ki ga prepozna vsaj eden od peptidov).

2. Magnituda T celičnega odziva na kandidacijaki peptid pri pacientih z MS (odziv na kandidacijske peptide je enak 40 % celokupnega odziva na antigen).

MBP 83-105 (MBP-2 (SEQ ID NO: 5)) in MBP 141-165 (MBP-4 (SEQ ID NO: 14)) izpolnjujeta prvi kriterij (77 % MBP odzivnikov prepozna enega ali oba). Glej tabelo 1 spodaj. Ta dva peptida skupaj prispevata 32 % MBP reaktivnosti (glej tabelo 2 spodaj).

TABELA 1

Odzivnost za MBP-2 (SEQ ID NO: 5) in MBP-4 (SEO ID NO: 14): Analiza po posameznikih % posazmeznikov, ki se odzovejo na MBP-2 MBP-4

MBP-2 in/ali MBP-4 med MBP odzivniki

11/31 [35,5 %] 20/30 [64,5 %] 24/31 [77,4 %]

TABELA 2

Odzivnost na MBP-2 (SEQ ID NO: 5) in MBP-4 (SEQ ID NO: 14): Analiza s T celičnimi linijami

% MBP pozitivnih linij	MBP pozitivni in MBP-2	MBP pozitivni in 141-165	MBP pozitivni in MBP-2 ali MBP-4
med MBP	20/184	39/184 [21,1 %]	59/184 [32,1 %]
pozitivnih	[10,95 %]
linij

Dodajanje MBP 11-30 (MBP-1 (SEQ ID NO: 2)) tako izpolnjuje drugi kriterij, saj trije peptidi skupaj prispevajo 42 % MBP reaktivnosti. MBP 111-130 (MBP-3 (SEQ ID NO: 12)) bi bil primeren tudi kot prednostni peptid za terapevtsko uporabo, zlasti v kombinaciji z MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-2 (SEQ ID NO: 5) in MBP-4 (SEQ ID NO: 14). MBP 81-100 (SEQ ID NO: 23) se zdi ekvivalenten MBP 83-105 (SEQ ID NO: 5) in ga lahko uporabimo tudi v povezavi z drugimi peptidi, izbranimi kot prednostnimi.

PRIMER 2

Dajanje peptidov sesalcem za zdravljenje EAE kot modela za multiplo sklerozo

Sinteza peptidov

Peptide smo pripravili z avtomatizirano sintezo peptidov (ABI 430A, Applied Biosciences. Foster City, CA) z uporabo standardne 9-tluorenilmetoksikarbonilne kemije. Peptide smo očistili z visokotlačno tekočinsko kromatografijo in potrdili aminokislinsko sestavo. Izbrane peptidne sekvence so bile MBP Acl-11 (SEQ ID NO: 65) ASQKRPSQRHG; MBP Ac 1-11 [4Α] (SEQ ID NO: 66) ASQARPSQRHG; MBP Acl-11 [4Υ] (SEQ ID NO: 67) ASQYRPSQRHG; MBP 31-47 (SEQ ID NO: 68) RHRDTGILDSIGRFFSG; Ova 323-339 (SEQ ID NO: 69) ISQAVHAAHAEINEAGR;

in Ova 323-337 (SEQ ID NO: 70) ISQAVHAAHAEINEA.

Čiščenje MBP

Iz hrbtnega mozga gvinejske svinje (Keystone Biologicals, Cleveland, OH) smo z uporabo modifikacije metode po Smithu, M.E. J. Neurochem., 1969,16:83, pripravili MBP. Če povzamemo, iz izoliranih mielinskih membran smo z uporabo kloroforma in metanola ekstrahirali MBP, oborili s kalijevim citratom, kislo ekstrahirali in liofilizirali. SDS-PAGE analiza tega materiala je pokazala glavni pas pri pričakovani molekulski masi 18,5 Kd.

Indukcija EAE, vrednotenje in peptidna terapija

EAE smo inducirali v (PLJ x SJL) Fl miših, ki smo jih dobili pri Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Ko so miši dosegle starost 8-14 tednov, smo inducirali EAE z imunizacijo s 50-100 MBP, emulgiranem v kompletnem Freundovem adjuvansu (Gibco Laboratories, Grand Island, NY), dopolnjenim z dodatnimi 400 μg na miš M. tuberculosis H37Ra (Difco Laboratories, Detroit, MI). Ob imunizaciji in 48 ur kasneje smo jim intravenozno dali 200 ng pertusisnega toksina (JRH Biosciences, Lenexa,-‘J<Sj.'Na'osnovi kliničnih znakov smo miši ovrednotili po naslednji skali: 1, paraliza repa; 2, delna paraliza zadnje okončine; 3, popolna paraliza zadnje okončine; 4, paraliza prednje okončine; 5, umirajoča ali mrtva. Miši pete stopnje smo evtanazirali. Po smrti smo miši izločili iz naknadnih računov srednjega kliničnega rezultata. Peptide smo dajali intravenozno, kot je opisano v posameznih primerih spodaj.

Za teste proliferacije limfnega vozla in produkcije IL2 smo pripravili suspenzije limfocitov ingvenalnega in paraaortnega limfnega vozla iz miši, ki so bile imunizirane, kot je opisano zgoraj za indukcijo EAE (za poizkuse proliferacije pertusisni toksin ni bil vključen). Limfocite smo kultivirali v mikrotitrskih ploščah z okroglim dnom z 5 x 10⁵ na jamico s peptidi MBP in RPMI 1640 dopolnili z 0,5 % svežim normalnim mišjim serumom, penicilinom-streptomicinom, L-glutaminom in 5 χ IO'⁵ M

2-merkaptoetanoIom. Kulture za test proliferacije smo za 16 ur vzpostavili v stik s ³H-timidinom, čemur je sledila 72-urna inkubacija. Za IL2 test smo supernatante kultur po 24 urah zbrali in preiskali njihovo sposobnost, da podprejo rast IL2-odvisne celične linije HT2. Da bi razlikovali produkcijo IL2 od produkcije IL4, smo izvedli bioteste HT2 v prisotnosti 10 % supernatanta kulture monoklonalnega protitelesa ll.B.ll (O’Hara, J., et al., Nature, 1985, 315:333), ki inhibira z IL4-inducirano proliferacijo celic HT2.

Rezultati so prikazani na sliki 9, ki kaže, da Acl-11[4Y] (SEO ID NO: 67) izniči EAE, kadar ga dajemo po nastopu paralize. EAE smo inducirali z MBP v skupinah s no 14 miši. Pri vsaki miši posamezno smo s terapijo začeli potem, ko je razvila klinične znake EAE. Podatki so izrisani glede na začetek terapije za vsako miš posamezno (dan 1 je nastop kliničnih znakov pri vsaki posamezni miši). Miši smo intravenozno obdelali 1, 4, 11 in 18 dan bolezni s PBS (prazni krožci), 250 nmoli Acl-11 [4Υ] (SEQ ID NO: 67) (polni kvadratki) ali z 250 nmoli Ova 323-337 (SEO ID NO: 70) (polni krožci). Dodatne kontrolne skupine nismo obdelali (prazni kvadratki). Majhni križci kažejo posamezne miši, ki so poginile, ali ki smo jih usmrtili pri EAE stopnje 5. MMS za neobdelano kontrolno skupino je 4,6 in mortaliteta je 64 %. MMS za skupino, obdelano s PBS, je 4,4 in mortaliteta je 35 %. MMS za skupino, obdelano z Ova 323-337 (SEQ ID NO: 70) je 4,2 in mortaliteta je 21 %. MMS za skupino,-obdelan o z Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67), je 3,2 in mortliteta je 7 %.

Slika 10 kaže, da Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) preprečuje povratke EAE, kadar ga dajemo med remisijsko fazo bolezni. EAE induciramo z MBP. S terapijo smo začeli pri vsaki miši posamezno drugi dan po remisiji, po začetnem epizodnem dogodku EAE. Podatki so izrisani glede na začetek terapije pri vsaki miši posamezno (dan 1 = drugi dan remisije). Skupine s po 6-7 preživelimi mišimi 1, 4, 7 in 18 dan po začetku remisije obdelamo intravenozno s PBS (prazni krožci) ali s 25 nmoli Acl11 [4 Υ] (SEQ ID NO: 67) (polni kvadratki). Majhni križci kažejo posamezne miši, ki so poginile, ali ki smo jih usmrtili pri EAE stopnje 5. Začetni epizodni dogodki pred remisije so trajali od 3 do 18 dni (v povprečju 9 dni za obe skupini). MMS med začetnim dogodkom je bil podoben za obe skupini miši (3,0 za skupino, obdelano s PBS in 3,9 za skupino, obdelano z Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67)). Za skupino, obdelano s PBS, je MMS po obdelavi 4,1 in mortaliteta je 33 %. Za skupino, obdelano s peptidom, je MMS po obdelavi 0,3 in mortaliteta je 0 %.

Slika 11 kaže, da intravenozno dajanje Acl-11 (SEQ ID NO: 65) ali Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) inducira T celično neodzivnost.

a. Skupine po 3-4 miši smo deset in pet dni pred imunizacijo s 150 /xg MBP predhodno intravenozno obdelali ali s PBS (polni krožci) ali z 250 nmoli Acl11 (SEQ ID NO: 65) (polni trikotniki). Deveti dan smo izvedli teste proliferacije limfnega vozla z MBP Acl-11 (SEO ID NO: 65). Kontrole so bile, kot sledi: PBS predobdelava PPD 108277/medij 1855 in Acl-11 (SEO ID

NO: 65) predobdelava PPD 88499/medij 1335.

b. Skupine po 4 miši smo deset in pet dni pred imunizacijo s 150 jtxg MBP predhodno intravenozno obdelali ali s PBS ali z 250 nmoli Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67). Deseti dan smo izvedli teste produkcije IL2 limfnega vozla s 150 μΜ Acl-11 (SEQ ID NO: 65) ali 17 μΜ Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67).

PRIMER 3

Daianie peptida v napredovanem stadiju

Po imunizaciji z MBP se pri (PLJxSJL)Fl miših razvije povratek EAE (Fritz, R.B., et al., J. Immunol., 1983,130:1024), kar napravi ta model EAE idealen za raziskovanje terapevtske intervencije. Čeprav je MBP Acl-11 (SEQ ID NO: 65) imunodominanten encefalitogen v (PLJ x SJL)F1 miših, je v tem sevu encefalitogenski tudi subdominantni epitop MBP 31-47 (SEQ ID NO: 68). Za določitev, ali je za zdravljenje EAE, induciranega z MBP, potreben eden ali obadva encefalitogenska peptida, smo sledili korakom primera 2, z razliko, da smo skupine miši v napredovanem stadiju bolezni obdelali z intravenoznimi injekcijami MBP Acl-11 (SEQ ID NO: 65) in MBP 31-47 (SEQ ID NO: 68) skupaj, ali samo z Acl-11 (SEQ ID NO: 65). Skupine kontrolnih miši smo obdelali z intravenoznimi injekcijami PBS ali s kontrolnim peptidom Ova 323-339 (SEQ ID NO: 69), A^UA^U vezivnim peptidom, ki ni soroden MBP in kije neimunogenski v (PLJxSJL)Fl miših.

Slika 5 kaže, da ponavljajoče intravenozne injekcije samega MBP Acl-11 (SEQ ID NO: 65), (slika 5a) ali v kombinaciji z MBP 31-37 (SEQ ID NO: 68) (slika 5b) zmanjšajo pojav, resnost in mortaliteto EAE. Zdi se, da je obdelava z obema peptidoma nekako bolj učinkovita, kot obdelava samo z MBP Acl-11 (SEQ ID NO: 65), kar se ujema z opažanji drugih, kot je omenjeno zgoraj. Miši smo v teku akutne faze in faze prvega povratka bolezni obdelali s šestimi intravenoznimi injekcijami peptida. Miši smo nato zasledovali do 125 dneva, med kronično, popuščajočo fazo, brez dokaza pozne bolezni v skupinah, ki so bile obdelane s peptidom MBP (podatki niso prikazani). Kontrolni peptid Ova 323-339 (SEQ ID NO: 69) ni imel učinka na bolezen, kadar smo ga dali po intravenozni poti (slika 5c). V ločenem poizkusu intravenozno dajanje samega MBP 31-47 (SEQ ID NO: 68) pri zdravljenju EAE ni bilo učinkovito (podatki niso prikazani). Slike 5(a), (b) in (c) kažejo učinkovitost intravenozne obdelave miši z EAE, induciranim z MBP. V skupinah s po 11-16 miši smo inducirali EAE z MBP, kot je podano zgoraj. Miši smo obdelali z intravenozno injekcijo 250 nmolov vsakega peptida s pričetkom 9,12,15, 21, 29 in 37 dan. Na vseh risbah so uporabljeni majhni križci, ki kažejo posamezne miši, ki so poginile, ali katere smo usmrtili pri EAE stopnje 5. Kontrolno skupino smo obdelali s PBS (polni krožci). Rezultati kažejo, da je imunodominantni encefalitogenski peptid MBP tako nujen, kot zadosten za zdravljenje EAE, induciranega z MBP pri (PLJxSJL)Fl miših, kar se kaže z zmanjšanjem resnosti in mortalitete EAE pri obdelanih miših.

PRIMER 4

Večkratne I.V. injekcije Acl-11 (SEQ ID NO: 65)

Sledeč korakom priprave v primeru 2 smo pripravili večkratne injekcije Acl-11 (SEQ ID NO: 65). Ena injekcija peptida deveti dan je zakasnila bolezen za dva dni in znižala mortaliteto od 100 % na 63 %, toda vse izmed obdelanih miši so na koncu razvile resen EAE (podatki niso prikazani). Tri injekcije peptida med akutno fazo EAE so najprej učinkovito zdravile bolezen, toda med fazo povratka bolezni je obdelana skupina miši razvila pozen nastop bolezni (podatki niso prikazani). Če povzamemo, rezultati kažejo, da so za zdravljenje z MBP inducirane bolezni pri (PLJ x SJL)F1 miših potrebne večkratne intravenozne injekcije peptidov MBP med akutno fazo in fazo prvega povratka EAE. Tako so za podaljšano zmanjšanje resnosti bolezni potrebne večkratne injekcije Acl-11 (SEQ ID NO: 65). Slika 6 kaže, da Acl11[4Y] (SEQ ID NO: 67) zdravi EAE v nižji dozi kot Acl-11 (SEQ ID NO: 65) in da ima dlje trajajoč učinek na bolezen. V skupine 8-10 miši induciramo EAE z MBP. Slika 6a kaže miši obdelane I.V. 12 in 15 dan s PBS (fosfatno pufrana slanica) (prazni krožci), z 250 nmoli Acl-11 (SEQ ID NO: 65) (polni kvadratki) ali z 250 nmoli Acl-ll[4Yj (SEQ ID NO: 67) (prazni trikotniki). MMS za miši, obdelane s PBS, je 4,4 in mortaliteta je 60 %. MMS za miši, obdelane z Acl-11 (SEQ ID NO: 65), je 3,9 in mortaliteta je 37,5 %. MMS za miši, obdelane z Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67), je 2,1 in mortaliteta je 0 %. Slika 6b kaže miši obdelane I.V. 12, 15, 18, 21, 24 in 27 dan ali s PBS (prazni krožci) ali z 2,5 nmoloma Acl-11 (SEQ ID NO: 65) (polni krožci). MMS za miši, obdelane s PBS, je 2,9 in mortaliteta je 20 %. MMS za miši, obdelane s peptidom, je 4,3 in mortaliteta je 50 %.

PRIMER 5

Obdelava s peptidnim analogom MBP, ki tvori stabilne komplekse z MHC razreda II in vivo

Ker so kompleksi peptid-MHC funkcionalne terapevtske enote, ki zdravijo EAE, imajo prijavitelji teorijo, da bi bil Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) učinkovitejši pri zdravljenju aktivnega EAE, induciranega z MBP, kot Acl-11 (SEQ ID NO: 65). Da bi preizkusili to hipotezo, smo izvedli korake primera 2, z razliko, da smo spremenili urnik injekcij in doziranj. Slika 6a kaže, da le dve injekciji Acl-U[4Y] (SEQ ID NO: 67) zgodaj v teku bolezni proizvedeta daljši učinek, kot dve injekciji Acl-11 (SEQ ID NO: 65). Poleg tega slika 6b kaže, da so ponavljane intravenozne injekcije Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) zelo učinkovite pri zdravljenju EAE v dozi 2,5 nmolov (slika 6c). Nato smo izvedli histološke teste. Pripravili smo histološke sekcije iz EAE možgan in hrbtnega mozga in jih obarvali s hematoksilinom in eozinom (CVD, Inc., West Sacramento, CA). Sekcije smo z opazovalnikom z zaslonko ovrednotili z ozirom na inflamatorne infiltrate na skali od 1 do 4. Učinkovitost Acl11[4Y] (SEQ ID NO: 67) smo potrdili s histološko preiskavo sekcij možgan in hrbtnega mozga miši, obdelanih s peptidom, in miši, obdelanih s PBS, ki pokaže izrazito znižano število in resnost inflamatornih infiltratov centralnega živčnega sistema pri miših, obdelanih s peptidom (slika 7). Slika 7 ponazarja, da so inflamatorni infiltrati zmanjšani pri miših, ki so obdelane z Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67). Izboljšana učinkovitost Acl-11 [4Υ] (SEQ ID NO: 67) je očitna.

V primeru zgoraj je bila izboljšana učinkovitost Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) očitna. Prijavitelji imamo teorijo, da se stabilni kompleksi peptid-MHC tvorijo in vivo med A^UA^U in Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67), katerega smo injicirali intravenozno, s čimer smo povzročili opaženo izboljšano učinkovitost. Te in vivo tvorjene komplekse lahko detektiramo z uporabo hibridoma 1934, katerega smo izvedli iz encefalitogensko MBP-specifičnega T celičnega klona. Sledili smo korakom v zgornjem primeru 2, s to razliko, da smo število injekcij in količine naravnali tako, kot je opisano spodaj. T celični hibridom 1934 je specifičen za MBP Acl-11 (SEQ ID NO: 65), pri čemer sledimo postopku, kije opisan v Wraith, D.C., et al., Celi 1989, 59:247. Če povzamemo, v mikrotitrske plošče z ravnim dnom smo inkubirali hibridomne celice pri 5 χ 10⁴ na jamico s peptidi ali peptidnimi analogi MBP. Kot celice, ki predstavljajo antigen, smo dodali 5 χ 10⁵ (PU x SJL)F1 vraničnih celic, obsevanih s 3000 radi. Medij je bil enak kot za analize proliferacije limfnega vozla, razen da je serumsko dopolnilo, namesto normalnega mišjega seruma, 10 % fetalni telečji serum. Po 24 urah smo supernatante zbrali in raziskali njihovo sposobnost, da podprejo rast celic HT2. Nato smo ob različnih časih po injekciji 250 nmolov Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) iz injiciranih miši odstranili vranice in splenocite uporabili kot celice, ki predstavljajo antigen za Acl-ll-specifični hibridom 1934. Kulturam nismo dodali nobenega dodatnega peptida. Slika 8 kaže, da so vranične celice, katere smo vzpostavili v stik (pulzirali) in vivo z Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67), zelo učinkovite pri aktiviranju hibridoma 1934. Kapaciteta za aktivacijo hibridoma je bila največja 2 uri po injekciji, nato pa je 4 do 6 ur po injekciji začela pojenjati. Aktivacija je bila najmanjša 10 ur po injekciji Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67), po 20 urah pa ni bila več prisotna (podatki niso prikazani). Kot lahko vidimo iz slike 8, poizkusi z Acl-11 (SEQ ID NO: 65) ne kažejo aktiviacije hibridoma z vraničnimi celicami iz injiciranih miši niti 1 uro po injekciji (podatki niso prikazani). Kot je natančneje prikazano na sliki 8, je možno komplekse peptid-MHC, ki se tvorijo in vivo, detektirati v miših, injiciranih z Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67). Skupinam s po dvema mišima smo intravenozno injicirali 250 nmolov Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) pri različnih časovnih točkah pred odstranitvijo vranice (1-10 ur). Splenocite iz injiciranih miši smo preiskali na njihovo kapaciteto, da aktivirajo celice hibridoma 1934, da proizvajajo IL2. Rezultati so izraženi kot proliferacija HT2. Rezultati podpirajo hipotezo, da tvorba stabilnih kompleksov peptid-MHC in vivo prispeva k učinkovitosti terapevtskega peptidnega analoga MBP.

PRIMER 6

Sinteza mišjega peptida MBP Ac-1-11 fSEQ ID NO: 651

Mišji peptid MBP, Acl-11 (SEQ ID NO: 65), smo sintetizirali z uporabo standardne Fmoc/tBoc sinteze in ga očistili s HPLC. Aminokislinska sekvenca za peptid Acl-11 (SEQ ID NO: 65) je kot sledi:

Indukcija EAE

V 6 do 8 tednov stare samice (SJLxPL)Fl miši (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) smo inducirali EAE z imunizacijo miši s 100 μ-g prečiščenega MBP gvinejske svinje v CFA (GIBCO Lab., Grand Island, NY), ki vsebuje 400 pg H37RA sev M. tuberculosis (DIFCO Lab., Detroit, MI), subkutano v bazo repa. Na dan imunizacije in tudi 48 ur kasneje smo jim dali dvakrat intravenozno (i.v.) 200 ng pertusisnega toksina (JHL BIOSCIENCE, Lenexa, Kansas). Miši smo dnevno opazovali na bolezenske simptome in resnost bolezni smo ovrednotili po naslednji skali 0=ni kliničnih znakov EAE, 1= šibak, neodziven rep, 2=delna paraliza zadnje okončine, 3=popolna paraliza zadnje okončine in 4=delna do popolna paraliza prednje okončine, in 5=umirajoča. Podatki so izraženi kot srednja vrednost rezultatov resnosti bolezni vsak dan, pri čemer vključujejo vse živali v skupini. Miši smo zasledovali 26 dni. Ko je miš poginila za EAE, smo rezultat 5 vključili v izračune za vse naslednje dni.

Učinek IFN-ff na EAE v titracijskem poskusu za določitev učinkov različnih doz IFN-/3 na EAE (slika 13). 9, 3 in 16 dan po indukciji EAE smo eno skupino miši obdelali intraperitonealno s PBS (kontrola), eno skupino miši smo 9, 13 in 16 dan obdelali z 10000 enotami IFN-/3 (prazni krožci) in eno skupino miši 9, 13 in 16 dan z 2000 IFN-/3 (polni krožci). Kot je prikazano na sliki 13, so si simptomi EAE pri posamezni časovni točki za obe dozi IFN-/3 podobni, kar kaže na to, da bi bila nižja doza ustrezna za poizkuse z IFN-jS in da je to prednostna doza, saj so možnosti toksičnosti zaradi višje doze IFN-β, manj verjetne. V preostalih poizkusih, ki so prikazani na slikah 12a - 12c, smo uporabili 2000 enot IFN-/3, saj je ta doza pokazala izboljšanje kliničnega rezultata.

Kot je prikazano v sliki 12a, smo 9,12, 16 in 20 dan kontrolno skupino miši obdelali s PBS, drugo skupino miši pa z 2000 enotami IFN-/3 i.p. Kot je prikazano na sliki 12a, je imela skupina, obdelana z IFN-β, tekom časa le rahlo manj resne simptome kot miši iz kontrolne skupine.

Učinek mišjega peptida MBP Acl-11 (SEQ ID NO: 65) na EAE

Določili smo učinek mišjega peptida MBP Acl-11 (SEO ID NO: 65) in rezultati so prikazani na sliki 12b. 10, 13, 17 in 21 dan po indukciji EAE smo eno skupino miši obdelali i.p. s PBS (kontrola), drugo skupino miši pa smo 10, 13, 17 in 21 dan obdelali i.v. z 250 nmoli peptida Acl-11 (SEQ ID NO: 65). Miši smo opazovali, kot je opisano zgoraj. Kot je prikazano na sliki 12b, so imele miši, ki so bile obdelane z Acl-11 (SEQ ID NO: 65), manj resne simptome, kakor tiste iz kontrolne skupine.

Učinek zdravljenja s kombinacijo peptida Acl-11 (SEQ ID NO: 65) in IFN-ff na

EAE

Učinki obdelave s kombinacijo peptida Acl-11 (SEQ ID NO: 65) in IFN-β so prikazani na sliki 12c. Po indukciji EAE smo eno skupino miši obdelali i.p. s PBS (kontrola), eno skupino miši pa smo 10, 13, 17 in 21 dan obdelali i.v. z 250 nmoli peptida Acl-11 (SEQ ID NO: 65) (prazne puščice) in 9, 12, 16 in 20 dan i.p. z 2000 enotami IFN-β. Kot je prikazano na sliki 12c, je skupina miši, ki so bile obdelane s kombinacijo peptida in IFN-β, pokazala izredno znižanje resnosti simptomov v primerjavi s kontrolno skupino, kakor tudi v primerjavi z zdravljenjem samo z IFN-β ali samo s peptidom, kot je prikazano na slikah 12a in 12b, kar kaže na sinergistični učinek kombinacije. Potemtakem režim zdravljenja, ki vključuje kombinacijo peptida in IFN-β, zagotavlja povečan učinek na zmanjšanje resnosti simptomov EAE.

PRIMER 7

Dajanje peptidov sesalcem za zdravljenje EAE, induciranega s homogenatom hrbtnega mozga (SCH= Spinal Cord Homogenate), kot modela za multiplo sklerozo

Sinteza peptidov

Peptide smo pripravili z avtomatizirano sintezo peptidov (ABI 430A, Applied Biosciences, Foster City, CA) z uporabo standardne 9-fluorenilmetoksikarbonilne kemije. Peptide smo očistili z visokotlačno tekočinsko kromatografijo in potrdili aminokislinsko sestavo. Izbrane peptidne sekvence so bile: MBP Acl-11 (SEQ ID NO: 65) ASQKRPSQRHG; MBP Acl-11 [4Α] (SEQ ID NO: 66) ASQARPSQRHG; MBP Acl-11 [4Υ] (SEQ ID NO: 67) ASQYRPSQRHG; MBP 31-47 (SEQ ID NO: 68) RHRDTGILDSIGRFFSG; Ova 323-339 (SEQ ID NO: 69) ISQAVHAAHAEINEAGR;

in Ova 323-337 (SEQ ID NO: 70) ISQAVHAAHAEINEA.

Čiščenje MBP

Z uporabo modifikacije metode po Smithu, M.E., J. Neurochem., 1969, 16:83, smo pripravili SCH iz hrbtnega mozga gvinejske svinje (Keystone Biologicals, Cleveland, OH). Zmes proteinov SCH smo liofilizirali in uporabili glede na suho maso.

Indukcija EAE, vrednotenje in peptidna terapija

EAE smo inducirali v (PLJ x SJL)F1 miših, ki smo jih dobili pri Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Ko so miši dosegle starost 8-14 tednov, smo inducirali EAE z imunizacijo s 500-1000 /ig SCH, emulgiranega v kompletnem Freundovem adjuvansu (Gibco Laboratories, Grand Island, NY) dopolnjenem z dodatnimi 400 /zg na miš M. tuberculosis H37Ra (Difco Laboratories, Detroit, MI). Ob imunizaciji in 48 ur kasneje, smo jim intravenozno dali 200 ng pertusisnega toksina (JRH Biosciences, Lenexa, KS). Na osnovi kliničnih znakov smo miši ovrednotili po naslednji skali:

1, paraliza repa; 2, delna paraliza zadnje okončine; 3, popolna paraliza zadnje okončine; 4, paraliza prednje okončine; 5, umirajoča ali mrtva. Miši z vrednostjo 5 smo evtanazirali. Po smrti smo miši izločili iz naknadnih izračunov srednjega kliničnega rezultata. Peptide smo dajali intravenozno, kot je opisano v posameznih primerih spodaj.

Rezultati so prikazani na sliki 16, ki kaže, da Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) prepreči EAE, kadar ga dajemo po nastopu paralize. EAE induciramo s SCH v skupinah s po 14 miši. S terapijo smo začneli pri vsaki miši posamezno, potem ko je razvila klinične znake EAE. Podatki so izrisani glede na začetek terapije pri vsakem posamezniku (dan 1= nastop kliničnih znakov za vsako posamezno miš. Miši obdelamo 1, 3, 6 in 9 dan bolezni s PBS (polni kvadratki), 250 nmoli Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) i.v. (prazni trikotniki), ali z 250 nmoli Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) (prazni krožci). Majhna zvezdica kaže posamezne miši, ki so mrtve ali katere smo usmrtili pri EAE stopnje 5.

Slika 17 kaže, da Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) prepreči nastop EAE, kadar ga dajemo še predno nastopijo simptomi bolezni. EAE smo inducirali s SCH. S terapijo smo začeli pri vsaki miši posamezno 8 dan po indukciji bolezni z gpSCH. Podatki so izrisani glede na začetek terapije pri vsaki miši posamezno. Skupine preživelih miši smo 8,10,13 in 17 dan obdelali i.v. s 25 nmol Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) (prazni trikotniki) ali s.c. s 25 nmoli Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) (polni krožci). Ene skupine nismo obdelali (prazni kvadratki).

Rezultati, prikazani na slikah 16 in 17 kažejo, da je pri preprečevanju nastopa simptomov učinkovit katerikoli način dajanja.

PRIMER 8

Sledili smo enakemu postopku, kot v primeru 2, s to razliko, da nismo izvedli analize proliferacije limfnega vozla in produkcije IL2. EAE smo inducirali na dan 0 z uporabo gpMBP, nakar smo 8, 10, 13 in 17 dan trem skupinam miši dali Acl11 [4Υ] (SEQ ID NO: 67). Rezultati za intravenozno dajanje (prazni trikotniki), subkutano injekcijo (polni krožci) in kontrolo (prazni krožci) so grafično predstavljeni na sliki 18. Pred- obdelava (npr. obdelava pred pojavom simtpomov) z Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) lahko prepreči z gpMBP inducirano bolezen EAE.

PRIMER 9 cDNA, ki kodira humani protein MOG

Da bi pridobili humano DNA, ki kodira protein MOG, smo v začetnem poizkusu humano cDNA knjižnico izpostavili polimerazni verižni rekaciji (PCR) z uporabo 3’ in 5’ primerjev, oblikovanih iz sekvence, ki kodira podganji MOG, katero so objavili Gardinier et al. (zgoraj). Sekvence humanega MOG na ta način nismo mogli dobiti, domnevno zaradi nedovoljšnje homolognosti na 5’ in/ali 3’ koncih humanih in podganjih sekvenc.

Zaradi tega smo oblikovali štiri podganje notranje oligonukleotide. Dva izmed njih sta bila homologna z vrhnjo verigo gena (primerja 94-111 in 166-183 (SEQ ID NO: 74) baze 1, z začetkom pri ATG), dva pa sta bila homologna s spodnjo verigo gena (primerja 538-555 (SEQ ID NO: 75) in 685-702). Kombinacija primerjev 166-183 (SEO ID NO: 74) in 538-555 (SEQ ID NO: 75) je bila uspešna pri izvedbi pomnoževanja fragmenta s pričakovano velikostjo približno 400 bp iz knjižnice humane možganske cDNA. Sekvenca teh primerjev je bila:

a) 166-183: CAGAATCCGGGAAGAATGCCACGGGC_(SEQ ID NO:

74); in

b) 538-555: CAGCGGCCGCACGGAGTTTTCCTCTCAG (SEQ ID

NO: 75).

EcoRI mesto je prisotno v primerju 166-183 (SEQ ID NO: 74); Noti mesto je prisotno v primerju 538-555 (SEQ ID NO: 75).

400 bp produkt PCR smo klonirali v ekspresijski vektor pVL1393 z razgradnjo pVL1393 (Pharmingen CA) z EcoRI in Noti, z razgradnjo pomnoženega produkta z istimi encimi in ligiranjem nastalih fragmentov. Vključek smo preverili z razgradnjo večih klonov, izvedenih iz ligiranih plazmidov z EcoRI in Noti, in s sekvenciranjem nastalega 400 bp fragmenta humanega MOG. Na osnovi 738 bp podganjega odprtega bralnega okvira nastali vključek domnevno nima 184 bp 5’ sekvence in 201 bp 3’ sekvence.

Iz 400 bp vključka smo iz položajev 346-363 vrhnje in spodnje verige oblikovali dva primerja, kot sledi:

5'-CAGAATTCTCAGGTTCTCAGATGAAGGA-3' (SEQ ID NO: 76); in

5’-AAGCGGCCGCTATCCTTCATCTGAGAACCT-3' (SEQ ID NO:

77).

pri čemer je EcoRI mesto prisotno v prvi verigi in je Noti mesto prisotno v drugi verigi. Podčrtane regije ustrezajo sekvenci MOG.

Humane MOG 346-363 vrhnje in spodnje primerje (SEQ ID NOS: 76 in 77) smo uporabili v kombinaciji z zgoraj omenjenimi 5’ oz. 3’ podganjimi primerji, da smo pomnožili 5’ in 3’ manjkajoče konce gena iz iste knjižnice humane možganske cDNA, kot smo jo uporabili predhodno. Dobili smo produkt PCR, ki ustreza 3’ koncu gena, nismo pa dobili ustreznega 5’ konca.

t

Dobljeni 3’ fragment je imel pričakovano velikost 400 bp in ta fragment smo klonirali v pVL1393 in sekvencirali.

Da bi dobili 5’ del gena, smo knjižnico gtlO humane možganske medule, nabavljeno pri Clontechu, katero smo predhodno pomnožili in je imela titer 8xlO¹⁰ pfu/ml, selekcionirali po protokolu, ki ga je opisal proizvajalec. Knjižnico smo zasadili na 12 velikih plošč s 30000 plaki/ploščo in plake dvignili na nitrocelulozne filtre (2 replikacijska filtra/ploščo). Nato smo 12 filtrov, ki smo jih dvignili iz 12 različnih plošč, hibridizirali na ³²P markiran vzorec, ki ustreza prvotno kloniranemu notranjemu 400 bp fragmentu humanega MOG (položaji 184-534). Dobili smo 22 močnih pozitivi. 7a vsak pozitiv smo plak dvignili iz originalnih plošč in ga inkubirali preko noči z razredčitvenim pufrom, da smo eluirali fag iz agarja. Cevko smo nato centrifugirali in prenesli supernatant.

Iz vsakega posameznega poola smo pomnožili DNA z uporabo ali gt 10 sprednjega primerja s Sstll mestom:

5'-CTTTTGAGCAAGTTCAGCCTGGTTAAG-3' (SEQ ID NO: 78) ali z gtlO reverznega primerja z Xhol mestom:

5-. ACCTCGAGGAGGTGGCTTATGAGTATTTCTTCCAGGGTA-3' (SEQ ID NO: 79) kakor tudi z notranjim primerjem humanega MOG spodnje ali gornje verige: 5-GGTGCGGGAAAGGTGACTCTCAGGATCCGGAAT-3' (SEQ ID NO: 80) ali

5'-ATTCCGGATCCTGAGAGTCACCTTTCCCGCACC-3' (SEQ ID NO: 81).

Zadnja dva primerja (SEQ ID NOS: 80 in 81) vključujeta BamHl mesto (podčrtano v sekvencah), ki je naravno prisotno v sekvenci humanega MOG.

Primerje smo uporabili v štirih različnih kombinacijah: 1) sprednji zgoraj/notranji MOG spodaj; 2) reverzni spodaj/notranji MOG spodaj; 3) notranji MOG zgoraj/reverzni spodaj; in 4) notranji MOG zgoraj/sprednji zgoraj.

Prvi dve kombinaciji sta zagotovili 5’ konec gena (do mesta BamHl) in zadnji dve 3’ konec gena. Oba deleža 5’ in 3’ vključujeta neprevedene regije. Kateri od dveh članov vsake kombinacije je dejansko rezultiral v želeni fragment, je odvisno od orientacije cDNA, kloniranih v gtlO.

Velikost dobljenih fragmentov je od enega do drugega poola variirala. Pet največjih 5’ fragmentov ali 3’ fragmentov smo subklonirali v Sstll in BamHl ali BamHl in Xhol mesta polilinkerja SK. Tri klone iz vsakega poola smo nato sekvencirali, da smo izločili prisotnost napak pri PCR. To je zagotovilo popolno sekvenco regije, ki kodira gen, kakor tudi 174 bp 5’ neprevedene sekvence.

Gen humanega MOG kodira predprotein z 248 aminokislinami, ki ima 87 %-no homolognost z 246 aminokislinami v podganjem proteinu. Zreli protein vsebuje 218 aminokislin. Zreli protein se začne pri glicinskem ostanku in je izveden iz 248 aminokislinskega predproteina s cepitvijo iz predsekvence, ki se razteza od MET začetnega kodona do alaninskega ostanka, kije tik pred glicinom v položaju 1.

PRIMER 9A

Ekspresija skrajšanega humanega MOG v celicah SF-9 insektov in E.coli

Ekspresija SF-9

Prenosni vektor PVL1393, ki vsebuje skrajšano cDNA humanega MOG, ki kodira aminokisline 1-121 humanega MOG (prvih 121 aminokislin s SEQ ID NO: 48), smo kotransfektirali v celice SF-9 skupaj z DNA Baculovirusa, linearizirano po Baculogoldu (Pharmingen, San Diego, CA). Supernatant kulture, ki vsebuje rekombinantne viruse, smo po 4 dneh zbrali. Rekombinantni virus smo očistili, da je bil brez plakov in izpostavili 3-kratnemu pomnoževanju, da smo dobili virusno zalogo z visokim titrom. Celice AF-9 smo nato inficirali z virusno zalogo pri MOI 2,0. Supernatant iz inficiranih celic smo 48 ur po infekciji zbrali in nanesli na NiNTA agarozno kolono. Rekombinantni protein MOG smo eluirali pod ne-denaturacijskimi pogoji z uporabo 250 mM imidazola, dializirali proti 5 % propionski kislini in H₂O, in nato liofilizirali. Koncentracijo proteina smo ocenili z BCA. Očiščeni protein MOG smo vizualizirali na 12,5 % poliakrilamidnem gelu, obarvanem z Coomassie modrim.

PRIMER 10

Skrajšan humani MOG (huMOG) smo pripravili tako, kot je opisano v primerih 9 in 9a. MBP (gvinejske svinje) smo pripravili tako, kot je opisano. Sledili smo postopkom predhodnega primera 2, z razliko, da smo EAE inducirali v treh ločenih skupinah miši z uporabo 75 pg gpMBP in 100 pg huMOG (prazni trikotniki) in kombinacijo 75 pg gpMBP in 100 pg huMOG (polni kvadratki). Graf na sliki 19 kaže potek bolezni za vsakega od teh primerov. Bolezen, inducirana tako z MOG, kot z MBP, je veliko resnejša, kot bolezen, ki je bila inducirana z vsakim posamezno. Rezultati kažejo, da oba, tako MOG kot MBP, prispevata k bolezni.

PRIMER 11

Z uporabo huMOG+gpMBP (dan 0 = indukcija bolezni) smo inducirali bolezen kot v primeru 10. Pred nastopom simptomov smo miši obdelali z 250 nmoli Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) in kontrolo (PBS) 6, 8, 10, 13, 17, 22 in 27 dan (puščice kažejo obdelavo). Kot kaže graf na sliki 20, obdelava z Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) (prazni prostori), izredno zniža srednji klinični rezultat v primerjavi s kontrolami (polni kvadratki).

Ekvivalenti

Strokovnjaki bodo prepoznali oz. bodo sposobni z uporabo ne več kot enega rutinskega eksperimentiranja dognati številne ekvivalente specifičnim postopkom, ki so opisani tukaj. Smatramo, da so takšni ekvivalenti znotraj obsega predloženega izuma in da so pokriti z zahtevki, ki sledijo.

Za

Immulogic Pharmaceutical Corporation:

SEZNAM SEKVENC (1) GENERAL INFORMATION:

(i) APPLICANT: Smilek, Dawn;

Samson, Michael F.;

Gefter, Malcolm,Hsu, Di-Hwei;

Shi, Jia-Dong;

Paliard, Xavier,Devaux, Brigitte;

Rothbard, Jonathan; and Franzen, Henry M.

(ii) TITLE OF INVENTION: Compositions and Treatment for Multiple Sclerosis (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 81 (iv) CORRESPONDENCE ADDRESS:

(A) ADDRESSEE: LAHIVE & COCKFIELD (B) STREET: 60 State Street, Suite 510 (C) CITY: Boston (D) STATE: Massachusetts (E) COUNTRY: USA (F) ZIP: 02109-1875 (v) COMPUTER READABLE FORM:

(A) MEDIUM ΤΥΡΕ: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible (C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTNARE: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (vi) CURRENT APPLICATION DATA:

(A) APPLICATION NUMBER: PCT/US95/13682 (B) FILING DATE: 25-October-1995 (vii) PRIOR APPLICATION DATA:

(A) APPLICATION NUMBER: US 08/404,228 (B) FILING DATE: 15-March-1995 (A) APPLICATION NUMBER: US 08/328,224 (B) FILING DATE: 25-October-1994 (A) APPLICATION NUMBER: US 08/300,811 (B) FILING DATE: 1-September-1994 (A) APPLICATION NUMBER: US 08/241,246 (B) FILING DATE: 10-May-1994 (A) APPLICATION NUMBER: US 08/116,824 (B) FILING DATE: 3-September-1993 (vili) ATTORNEY/AGENT INFORMATION:

(A) NAME: Amy E. Mandragouras (B) REGISTRATION NUMBER: Reg. No. 36,207 (C) REFERENCE/DOCKET NUMBER: 094.2 PCT (IMI-052C2PC) (ix) TELECOMMUNICATION INFORMATION:

(A) TELEPHONE: (617) 227-7400 (B) TELEFAX: (617) 227-5941 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:1:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 170 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPGLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEOUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:1:

Ala

Ser

Gin

Lys

Arg

Pro

Ser

Gin

Arg

His

Gly

Ser

Lys

Tyr

Leu

Ala

1

5

10

15

Thr

Ala

Ser

Thr

Met

Asp

His

Ala

Arg

His

Gly

Phe

Leu

Pro

Arg

His

20

25

30

Arg

Asp

Thr

Gly

lle

Leu

Asp

Ser

lle

Gly

Arg

Phe

Gly

Asp

35

40

45

Arg

Gly

Ala

Pro

Lys

Arg

Gly

Ser

Gly

Lys

Asp

Ser

His

Pro

Ala

50

55

60

Arg

Thr

Ala

His

Tyr

Gly

Ser

Leu

Pro

Gin

Lys

Ser

His

Gly

Arg

Thr

65

70

75

80

Gin

Asp

Glu

Asn

Pro

Val

His

Phe

Lys

Asn

lle

Val

Thr

Pro

85

90

95

Arg

Thr

Pro

Ser

Gin

Gly

Lys

Gly

Arg

Gly

Leu

Ser

Leu

Ser

100

105

110

Arg

Phe

Ser

Trp

Gly

Ala

Glu

Gly

Gin

Arg

Pro

Gly

Phe

Gly

Tyr

Gly

115

120

125

Gly

Arg

Ala

Ser

Asp

Tyr

Lys

Ser

Ala

His

Lys

Gly

Phe

Lys

Gly

Val

130

135

140

Asp

Ala

Gin

Gly

Thr

Leu

Ser

Lys

lle

Phe

Lys

Leu

Gly

Arg

Asp

145

150

155

160

Ser

Arg

Ser

Gly

Ser

Pro

Met

Ala

Arg

165 170 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:2:

(i) SEOUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 20 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEOUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:2:

Gly 1	Ser Lys Tyr Leu Ala Thr Ala 5	Ser	Thr 10	Met	Asp	His	Ala	Arg 15	His
Gly	Phe Leu Pro 20
INFORMATION FOR SEQ ID NO:3:
(i)	SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 19 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear
(ii)	MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide
(V)	FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal
(xi)	SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO	:3 :
Gly	Ser Lys Tyr Leu Ala Thr Ala	Ser	Thr	Met	Asp	His	Ala	Arg	His

10 15

Gly Phe Leu (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:4:

(i) SEOUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 21 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEOUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:4:

Gly Ser Lys Tyr Leu Ala Thr Ala Ser Thr Met Asp His Ala Arg His 15 10 15

Gly Phe Leu Pro Arg 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:5:

(i) SEOUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 23 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal

(xi)	SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:	:5:
Glu	Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys	Asn	Ile Val Thr Pro Arg Thr
1	5	10	15

Pro Pro Pro Ser Gin Gly Lys 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:6:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 24 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:6:

Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg 15 10 15

Thr Pro Pro Pro Ser Gin Gly Lys 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:7:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 23 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:7:

Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg 15 10 15

Thr Pro Pro Pro Ser Gin Gly (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:8:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 19 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:8:

Thr Gin Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr 15 10 15

Pro Arg Thr (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:9:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 21 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:9:

Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg 15 10 15

Thr Pro Pro Pro Ser 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:10:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 25 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (Xi) SECUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:10:

Thr Gin Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr 15 10 15

Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gin Gly 20 25 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:11:

(i) SEOUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 23 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:11:

Thr Gin Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr 15 10 15

Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:12:

(i) SEOUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 20 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEOUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:12:

Leu Ser Arg Phe Ser Trp Gly Ala Glu Gly Gin Arg Pro Gly Phe Gly 15 10 15

Tyr Gly Gly Arg 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:13:

(i) SEOUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 19 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:13:

Leu Ser Arg Phe Ser Trp Gly Ala Glu Gly Gin Arg Pro Gly Phe Gly 15 10 15

Tyr Gly Gly (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO-.14:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 25 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGV: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:14:

Phe Lys Gly Val Asp Ala Gin Gly Thr Leu Ser Lys Ile Phe Lys Leu 15 10 15

Gly Gly Arg Asp Ser Arg Ser Gly Ser 20 25 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 15:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 25 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:15:

Pro Ser Gin Gly Lys Gly Arg Gly Leu Ser Leu Ser Arg Phe Ser Trp 15 10 15

Gly Ala Glu Gly Gin Arg Pro Gly Phe 20 25 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:16:

(i) SEOUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 20 amino acids (Β) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:16:

Ala Ser Gin Lys Arg Pro Ser Gin Arg His Gly Ser Lys Tyr Leu Ala 15 10 15

Thr Ala Ser Thr 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:17:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 20 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (XX) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:17:

Met Asp His Ala Arg His Gly Phe Leu Pro Arg His Arg Asp Thr Gly 15 10 15

Ile Leu Asp Ser 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:18:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 20 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:18:

Arg His Arg Asp Thr Gly Ile Leu Asp Ser Ile Gly Arg Phe Phe Gly 15 10 15

Gly Asp Arg Gly 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 19:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 20 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:19:

Ile Gly Arg Phe Phe Gly Gly Asp Arg Gly Ala Pro Lys Arg Gly Ser 15 10 15

Gly Lys Asp Ser 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:20:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 20 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:20:

Ala Pro Lys Arg Gly Ser Gly Lys Asp Ser His His Pro Ala Arg Thr 15 10 15

Ala His Tyr Gly 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:21:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 20 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:21:

His His Pro Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gin Lys Ser 15 10 15

His Gly Arg Thr 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:22:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 20 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:22:

Ser Leu Pro Gin Lys Ser His Gly Arg Thr Gin Asp Glu Asn Pro Val 15 10 15

Val His Phe Phe 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:23:

(i)	SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid
(D) TOPOLOGY	: linear
(ii)	MOLECULE ΤΥΡΕ	: peptide
(v)	FRAGMENT ΤΥΡΕ	: internal

(xi)	SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:	:23 :
Gin	Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe	Phe Lys Asn	lle Val Thr Pro
1	5	10	15

Arg Thr Pro Pro 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:24:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 20 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:24:

Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gin Gly Lys Gly 15 10 15

Arg Gly Leu Ser 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:25:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 20 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGV: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:25:

Pro Ser Gin Gly Lys Gly Arg Gly Leu Ser Leu Ser Arg Phe Ser Trp 15 10 15

Gly Ala Glu Gly 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:26:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 20 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:26:

Gin Arg Pro Gly Phe Gly Tyr Gly Gly Arg Ala Ser Asp Tyr Lys Ser 15 10 15

Ala His Lys Gly 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:27:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 20 amino acids (Β) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:27:

Ala Ser Asp Tyr Lys Ser Ala His Lys Gly Phe Lys Gly Val Asp Ala 15 10 15

Gin Gly Thr Leu 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:28:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 20 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:28:

Phe Lys Gly Val Asp Ala Gin Gly Thr Leu Ser Lys Ile Phe Lys Leu 15 10 15

Gly Gly Arg Asp 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NOr29:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 20 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:29:

Ser Lys Ile Phe Lys Leu Gly Gly Arg Asp Ser Arg Ser Gly Ser Pro 15 10 15

Met Ala Arg Arg 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:30:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 19 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:30:

Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn lle Val Thr Pro Arg 15 10 15

Thr Pro Pro (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:31:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 13 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:31:

Lys Tyr Leu Ala Thr Ala Ser Thr Met Asp His Ala Arg 15 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:32:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 11 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEOUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:32:

Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn 1 5 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:33:

(i) SEOUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 15 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEOUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:33:

Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro 15 10 15 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:34:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 16 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:34:

Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg 15 10 15 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:35:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 17 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal

Thr (xi) SEOUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:35:

Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg

10 15

2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:36:

(i) SEOUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 13 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEOUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:36:

Val His Phe Phe Ala Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr Pro 15 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:37:

(i) SEOUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 18 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEOUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:37:

Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr 15 10 15

Pro Pro (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:38:

(i) SEOUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 19 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (Xi) SEOUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:38:

Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr 15 10 15

Pro Pro Pro

ΊΊ (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:39:

(i) SEOUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 14 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEOUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:39:

Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg 15 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:40:

(i) SEOUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 17 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEOUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:40:

Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr Pro 15 10 15

Pro (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:41:

(i) SEOUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 16 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (Xi) SEOUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:41:

Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:42:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 20 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:42:

Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val-Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro 15 10 15

Ser Gin Gly Lys 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:43:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 13 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:43:

Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr Pro 15 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:44:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 13 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:44:

His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro 15 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:45:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 12 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:45:

His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr Pro 15 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:46:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 19 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:46:

Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg 15 10 15

Thr Pro Tyr (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:47:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 25 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:47:

Leu Ser Arg Phe Ser Trp Gly Ala Glu Gly Gin Arg Pro Gly Phe Gly

10 15

Tyr Gly Gly Arg Ala Ser Asp Tyr Lys 20 25 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:48:

(i) SEOUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 19 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEOUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:48:

Arg Pro Gly Phe Gly Tyr Gly Gly Arg Ala Ser Asp Tyr Lys Ser Ala 15 10 15

His Lys Gly (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:49:

(i) SEOUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 32 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEOUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:49:

Lys Gly Phe Lys Gly Val Asp Ala Gin Gly Thr Leu Ser Lys Ile Phe 15 10 15

Lys Leu Gly Gly Arg Asp Ser Arg Ser Gly Ser Pro Met Ala Arg Arg 20 25 30 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:50:

(i) SEOUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 25 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:50:

Lys Gly Val Asp Ala Gin Gly Thr Leu Ser Lys Ile Phe Lys Leu Gly 15 10 15

Gly Arg Asp Ser Arg Ser Gly Ser Pro 20 25 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:51:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 27 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:51:

Lys Gly Val Asp Ala Gin Gly Thr Leu Ser Lys Ile Phe Lys Leu Gly 15 10 15

Gly Arg Asp Ser Arg Ser Gly Ser Pro Met Ala 20 25 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:52:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 15 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:52:

Ala Gin Gly Thr Leu Ser Lys Ile Phe Lys Leu Gly Gly Arg Asp 15 10 15 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:53:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 18 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:53:

lle Phe Lys Leu Gly Gly Arg Asp Ser Arg Ser Gly Ser Pro Met Ala 15 10 15

Arg Arg (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:54:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 13 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:54:

Gly Gin Phe Arg Val lle Gly Pro Arg His Pro lle Arg 15 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:55:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 13 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:55:

His Ser Tyr Gin Glu Glu Ala Ala Met Glu Leu Lys Val 15 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:56:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 121 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEOUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:56:

Gly 1	Gin Phe Arg	Val 5	Ile	Gly Pro Arg	His 10	Pro	Ile Arg Ala	Leu Val 15
Gly	Asp Glu Val	Glu	Leu	Pro Cys Arg	Thr	Ser	Pro Gly Lys	Asn Ala
	20			25			30
Thr	Gly Met Glu	Val	Gly	Trp Tyr Arg	Pro	Pro	Phe Ser Arg	Val Val
	35			40			45
His	Leu Tyr Arg	Asn	Gly	Lys Asp Gin	Asp	Gly	Asp Gin Ala	Pro Glu
	50			55			60
Tyr	Arg Gly Arg	Thr	Glu	Leu Leu Lys	Asp	Ala	Ile Gly Glu	Gly Lys
65			70			75		80
Val	Thr Leu Arg	Ile	Arg	Asn Val Arg	Phe	Ser	Asp Glu Gly	Gly Phe
		85			90			95
Thr	Cys Phe Phe	Arg	Asp	His Ser Tyr	Gin	Glu	Glu Ala Ala	Met Glu
	100			105			110
Leu	Lys Val Glu	Asp	Pro	Phe Tyr Trp
	115			120
INFORMATION FOR SEQ	ID NO:57:
(i)	SEOUENCE CHARACTERISTICS:
	(A) LENGTH	: 20	amino acids
	(B) ΤΥΡΕ: amino acid
	(D) TOPOLOGY:	linear
(ii)	MOLECULE ΤΥΡΕ: ;	peptide
(v)	FRAGMENT ΤΥΡΕ:	internal

(xi)	SEOUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:	;57:
Gly	Gin Phe Arg Val Ile Gly Pro Arg	His	Pro Ile Arg Ala Leu Val
1	5	10	15

Gly Asp Glu Val 20 (2) INFORMATION FOR SEO ID NO;58:

(i) SEOUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 20 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOG'/: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEOUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:58:

Pro lle Arg Ala Leu Val Gly Asp Glu Val Glu Leu Pro Cys Arg lle 1 5 10 15

Ser Pro Gly Lys 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:59:

(i) SEOUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 20 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEOUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:59:

Glu Leu Pro Cys Arg lle Ser Pro Gly Lys Asn Ala Thr Gly Met Glu 15 10 15

Val Gly Trp Tyr 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:60:

(i) SEOUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 20 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEOUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:60:

Asn Ala Thr Gly Met Glu Val Gly Trp Tyr Arg Pro Pro Phe Ser Arg

10 15

Val Val His Leu 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:61:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 20 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:61:

Thr Val Gly Leu Val Phe Leu Cys Leu Gin Tyr Arg Leu Arg Gly Lys 15 10 15

Leu Arg Ala Glu 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:62:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 20 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO-.62:

Tyr Arg Leu Arg Gly Lys Leu Arg Ala Glu Ile Glu Asn Leu His Arg 15 10 15

Thr Phe Asp Pro 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:63:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 20 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEOUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:63:

Ile Glu Asn Leu His Arg Thr Phe Asp Pro His Phe Leu Arg Val Pro

10 15

Cys Trp Lys Ile 20

2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:64:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 20 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:64:

Tyr Asn Trp Leu His Arg Arg Leu Ala Gly Gin Phe Leu Glu Glu Leu 15 10 15

Arg Asn Pro Phe 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:65:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 11 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:65:

Ala Ser Gin Lys Arg Pro Ser Gin Arg His Gly 15 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:66:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 11 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:66:

Ala Ser Gin Ala Arg Pro Ser Gin Arg His Gly 15 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:67:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 11 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:67:

Ala Ser Gin Tyr Arg Pro Ser Gin Arg His Gly 15 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:68:

(i) SEOUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 17 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEOUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:68:

Arg His Arg Asp Thr Gly lle Leu Asp Ser lle Gly Arg Phe Phe Ser 15 10 15

Gly (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:69:

(i) SEOUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 17 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEOUENCE DESCRIPTION: SEO ID NO:69:

Ile Ser Gin Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly 15 10 15

Arg (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:70:

(i) SEOUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 15 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEOUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:70:

Ile Ser Gin Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala 15 10 15 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:71:

(i) SEOUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 24 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEOUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:71:

Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Ala Asn Ile Val Thr Pro Arg 15 10 15

Thr Pro Pro Pro Ser Gin Gly Lys 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:72:

(i) SEOUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 12 amino acids (B) ΤΥΡΕ: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: peptide (v) FRAGMENT ΤΥΡΕ: internal (xi) SEOUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:72:

His Phe Phe Ala Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr Pro 15 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:73:

(i) SEOUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 18 base pairs (B) ΤΥΡΕ: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: cDNA (xi) SEOUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:73:

GAAAGGCTCC ACACACCG 18 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:74:

(i) SEOUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 26 base pairs (B) ΤΥΡΕ: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: cDNA (xi) SEOUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:74:

CAGAATCCGG GAAGAATGCC ACGGGC 26 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:75:

(i) SEOUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 28 base pairs (B) ΤΥΡΕ: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: cDNA (xi) SEOUENCE DESCRIPTION: SEO ID NO:75:

CAGCGGCCGC ACGGAGTTTT CCTCTCAG 28 (2) INFORMATION FOR SEO ID NO:76:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 28 base pairs (B) ΤΥΡΕ: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: cDNA (xi) SEOUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:76:

CAGAATTCTC AGGTTCTCAG ATGAAGGA 28 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:77:

(i) SEOUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 30 base pairs (B) ΤΥΡΕ: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: cDNA (xi) SEOUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:77:

AAGCGGCCGC TATCCTTCAT CTGAGAACCT 30 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:78:

(i) SEOUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 27 base pairs (B) ΤΥΡΕ: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: CDNA (xi) SEOUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:78:

CTTTTGAGCA AGTTCAGCCT GGTTAAG 27 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:79:

(i) SEOUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 39 base pairs (B) ΤΥΡΕ: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: cDNA (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:79

ACCTCGAGGA GGTGGCTTAT GAGTATTTCT TCCAGGGTA (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:80:

(i) SEOUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 33 base pairs (B) ΤΥΡΕ: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: cDNA (xi) SEOUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:80:

GGTGCGGGAA AGGTGACTCT CAGGATCCGG AAT 33 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:81:

(i) SEOUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 33 base pairs (B) ΤΥΡΕ: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: cDNA (xi) SEOUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:81:

ATTCCGGATC CTGAGAGTCA CCTTTCCCGC ACC 33

Claims

PATENTNI ZAHTEVKI

1. Sestavek za zdravljenje multiple skleroze pri sesalcu, označen s tem, da obsega vsaj en peptid, pri čemer je navedeni peptid izbran iz naslednje skupine peptidov: MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-1.2 (SEQ ID NO: 4), MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10), MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), MBP-3 (SEQ ID NO: 12), MBP-3.1 (SEQ ID NO: 13), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in MBP-5 (SEQ ID NO: 15), vsi kot so prikazani na sliki 2, ali njegove modifikacije ali analoge ali peptidomimetike.
2. Sestavek po zahtevku 1, označen s tem, da je navedeni vsaj en peptid izbran iz skupine, ki sestoji iz MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-4 (SEO ID NO: 14) in MBP-5 (SEQ ID NO: 15), vsi, kot so prikazani na sliki 2.
3. Sestavek po zahtevku 1, označen s tem, daje navedeni vsaj en peptid MBP-4 (SEQ ID NO: 14).
4. Sestavek za zdravljenje multiple skleroze pri sesalcu, označen s tem, da obsega vsaj en peptid, izveden iz MBP, ki je izbran iz skupine, ki sestoji iz: MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-1.2 (SEQ ID NO: 4), MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10), MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), MBP-3 (SEQ ID NO: 12), MBP-3.1 (SEQ ID NO: 13), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in MBP-5 (SEQ ID NO: 15), vsi, kot so prikazani na sliki 2, pri čemer omenjeni sestavek obsega vsaj 40 % skupne T celične reaktivnosti na MBP v populaciji posameznikov, ki imajo T celice, katere se odzivajo na MBP.
5. Sestavek za zdravljenje multiple skleroze pri sesalcu, označen s tem, da obsega vsaj dva peptida MBP, izbrana iz skupine, ki sestoji iz: MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEO ID NO: 10), MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), MBP-3 (SEQ ID NO: 12), MBP-3.1 (SEO ID NO: 13), MBP-4 (SEO ID NO: 14) in MBP-5 (SEQ ID NO: 15), vsi kot so prikazani na sliki 2.
6. Sestavek po zahtevku 5, označen s tem, da sta navedena vsaj dva peptida izbrana iz skupine, ki sestoji iz MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in MBP-5 (SEQ ID NO: 15), vsi kot so prikazani na sliki 2.
7. Sestavek po zahtevku 5, označen s tem, da eden od navedenih vsaj dveh peptidov obsega MBP-4.
8. Sestavek po zahtevku 5, označen s tem, da nadalje obsega vsaj en peptid, izbran iz skupine, ki sestoji iz aminokislinskih sekvenc: 13-25 (SEQ ID NO: 31), 31-50 (SEQ ID NO: 18), 61-80 (SEQ ID NO: 21), 82-92 (SEQ ID NO: 32), 82-96 (SEQ ID NO: 33), 8297 (SEQ ID NO: 34), 82-98 (SEQ ID NO: 35), 82-100 (SEQ ID NO: 30), 82-100 [100 P>Y] (SEQ ID NO: 46), 83-100 (SEQ ID NO: 37), 83-101 (SEQ ID NO: 38), 84-97 (SEQ ID NO: 39), 84-100 (SEQ ID NO: 40), 85-100 (SEQ ID NO: 41), 86-105 (SEQ ID NO: 42), 87-99 (SEQ ID NO: 43), 87-99 [91K>A] (SEQ ID NO: 36), 88-100 (SEQ ID NO: 44), 88-99 (SEQ ID NO: 45), 111-135 (SEQ ID NO: 47), 122-140 (SEQ ID NO: 48), 139-170 (SEQ ID NO: 49), 141-160 (SEQ ID NO: 28), 142-166 (SEQ ID NO: 50), 142-168 (SEQ ID NO: 51), 146-160 (SEQ ID NO: 52) in 153-170 (SEQ ID NO: 53), vsi kot so prikazani na sliki 14.
9. Sestavek po zahtevku 5, označen s tem, da nadalje obsega vsaj en peptid izbran iz skupine, ki sestoji iz aminokislinskih sekvenc: 13-25 (SEQ ID NO: 31), 87-99 (SEQ ID NO: 43), 87-99 [91K>A] (SEQ ID NO: 36), 82-100 (SEQ ID NO: 30), 82-100 [100P> Υ] (SEQ ID NO: 46), vsi kot so prikazani na sliki 14.
10. Sestavek za zdravljenje multiple skleroze pri sesalcu, označen s tem, da obsega vsaj dva peptida, izvedena iz MBP, pri čemer je vsaj en peptid MBP-4 (SEQ ID NO:

14) in je vsaj en peptid izbran iz skupine, ki sestoji iz: MBP-1 (SEQ ID NO: 2) MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-1.2 (SEQ ID NO: 4), MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10), MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), MBP-3 (SEQ ID NO: 12), MBP-3.1 (SEQ ID NO: 13), MBP-5 (SEQIDNO: 15), 13-25 (SEQ ID NO: 31), 31-50 (SEQ ID NO: 18), 61-80 (SEQ ID NO: 21), 82-92 (SEQ ID NO: 32), 82-96 (SEQ ID NO: 33), 82-97 (SEQ ID NO: 34), 82-98 (SEQ ID NO: 35), 82-100 (SEQ ID NO: 30), 82-100 [100 P>Y] (SEQ ID NO: 46), 83-100 (SEQ ID NO: 37), 83101 (SEQ ID NO: 38), 84-97 (SEQ ID NO: 39), 84-100 (SEQ ID NO: 40), 85-100 (SEQ

ID NO: 41), 86-105 (SEQ ID NO: 42), 87-99 (SEQ ID NO: 43), 87-99 [91K>A] (SEQ ID NO: 36), 88-100 (SEQ ID NO: 44), 88-99 (SEQ ID NO: 45), 111-135 (SEQ ID NO: 47), 122-140 (SEQ ID NO: 48), 139-170 (SEQ ID NO: 49), 141-160 (SEQ ID NO: 28), 142-166 (SEQ ID NO: 50), 142-168 (SEQ ID NO: 51), 146-160 (SEQ ID NO: 52) in 153-170 (SEQ ID NO: 53), vsi kot so prikazani na slikah 2 in 14.
11. Sestavek po zahtevku 10, označen s tem, da je vsaj en peptid MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in je vsaj en peptid izbran iz skupine, ki sestoji iz: MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-1.2 (SEQ ID NO: 4), MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10), MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), MBP-3 (SEQ ID NO: 12), MBP-3.1 (SEQ ID NO: 13), MBP-5 (SEQ ID NO: 15), 13-25 (SEQ ID NO: 31), 87-99 (SEQ ID NO: 43), 87-99[91K>A] (SEQ ID NO: 36), 82-100 (SEQ ID NO: 30), 82-100[100P>Y] (SEQ ID NO:46).
12. Sestavek za zdravljenje multiple skleroze pri sesalcu, označen s tem, da obsega vsaj dva peptida MBP, izbrana iz naslednje skupine peptidov: MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-1.2 (SEQ ID NO: 4), MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10), MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), MBP-3 (SEQ ID NO: 12), MBP-3.1 (SEQ ID NO: 13), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in MBP-5 (SEQ ID NO: 15), vsi kot so prikazani na sliki 2, pri čemer omenjeni sestavek obsega vsaj 40 % skupne T celične reaktivnosti na MBP v populaciji posameznikov, ki imajo T celice, katere se odzivajo na MBP.
13. Sestavek po zahtevku 5, označen s tem, da obsega dovoljšen odstotek skupne T celične reaktivnosti na MBP, tako da ima dajanje sestavka posamezniku z MS za posledico zniževalno regulacijo avtoimunskega odziva MS.
14. Sestavek za zdravljenje multiple skleroze pri sesalcu, označen s tem, da obsega vsaj dva peptida MBP, ki vsebujeta T celični epitop, pri čemer je omenjeni sestavek izbran iz skupine sestavkov, ki sestojijo iz:

MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-3 (SEQ ID NO: 12) in

MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in MBP-5 (SEQ ID NO: 15);

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-3 (SEQ ID NO: 12),

MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in MBP-5 (SEQ ID NO: 15);

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in

MBP-5 (SEQ ID NO: 15);

MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-4 (SEO ID NO: 14) in MBP-5 (SEQ ID NO: 15);

MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in MBP-5 (SEQ ID NO: 15);

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in MBP-5 (SEQ ID NO: 15);

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6) in MBP-4 (SEQ ID NO: 14); MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6) in MBP-4 (SEQ ID NO: 14); MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2 (SEQ ID NO: 5) in MBP-4 (SEQ ID NO: 14); MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6) in MBP-5 (SEQ ID NO: 15); MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6) in MBP-3 (SEQ ID NO: 12); MBP-1 (SEQ ID NO: 2) in peptid, izbran iz skupine, ki sestoji iz: MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10) ali MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11);

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3) in peptid, izbran iz skupine, ki sestoji iz: MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10) ali MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11);

MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in peptid, izbran iz skupine, ki sestoji iz: MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10) ali MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11);

MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in peptid, izbran iz skupine, ki sestoji iz: MBP-1 (SEQ ID NO: 2) ali MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3);

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in peptid, izbran iz skupine, ki sestoji iz: 82-100 (SEQ ID NO: 30), 82-100[100P>Yj (SEQ ID NO: 46), 87-99 (SEQ ID NO: 43) in 87-99[91K>A] (SEQ ID NO: 36), vsi kot so prikazani na sl. 14; MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3) in MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in peptid, izbran iz skupine, ki sestoji iz: MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10) ali MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), vsi kot so prikazani na sl. 2;

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-5 (SEQ ID NO: 15), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in peptid, izbran iz skupine, ki sestoji iz: 82-100 (SEO ID NO: 30), 82-100[100P>Y] (SEO ID NO:46), 87-99 (SEQ ID NO:43), in 87-99[91K>A] (SEQ ID NO: 36), vsi kot so prikazani na sl. 14;

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-5 (SEQ ID NO: 15), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in peptid, izbran iz skupine, ki sestoji iz MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10) ali MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), vsi kot so prikazani na sl. 2;

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-5 (SEQ ID NO: 15), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in peptid, izbran iz skupine, ki sestoji iz: 82-100 (SEQ ID NO: 30), 82-100[100P>Yj (SEQ ID NO:46), 87-99 (SEQ ID NO:43) in 87-99[91K>A] (SEQ ID NO: 36), vsi kot so prikazani na sl. 14;

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-3 (SEQ ID NO: 12), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in peptid, izbran iz skupine, ki sestoji iz:

MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10) ali MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), vsi kot so prikazani na sl. 2.
15. Sestavek po zahtevku 5, označen s tem, da nadalje obsega vsaj en peptid, ki ima T celično aktivnost, izveden iz humanega mielinskega oligodendrocitnega proteina (MOG).
16. Sestavek po zahtevku 15, označen s tem, daje navedeni peptid, izveden iz MOG, izbran iz skupine, v kateri so:

Humani MOG 1-13 (SEQ ID NO: 54) Humani MOG 103-115 (SEQ ID NO: 55) Humani MOG 1-121 (SEQ ID NO: 56)

Humani MOG 1-20 (SEQ ID NO: 57) Humani MOG 11-30 (SEQ ID NO: 58) Humani MOG 21 -40 (SEQ ID NO: 59) Humani MOG 31-50 (SEQ ID NO: 60) Human. MOG 141-160 (SEQ ID NO: 61) Humani MOG 151-170 (SEQIDNO: 62) Humani MOG 161-180 (SEQ ID NO: 63) Humani MOG 199-218 (SEQ ID NO: 64)

G Q F R V I G P R H P I R

HSYQEEAAMELKV

GQFRVIGPRHPIRALVGDEV

ELPCRTSPGKNATGMEVGWY

RPPFSRVVHLYRNGKDQDGD

QAPEYRGRTELLKDAIGEGK

VTLRIRNVRFSDEGGFTCFF

RDHSYQEEAAMELKVEDPFYW

GQFRVIGPRHPIRALVGDEV;

PIRALVGDEVELPCRISPGK;

ELPCR1SPGKNATGMEVGWY;

NATGMEVGWYRPPFSRVVHL;

TVGLVFLCLQYRLRGKLRAE;

YRLRGKLRAEIENLHRTFDP;

I EN LH RT F DPH FL R VPC W K I; in YNWLHRRLAGQFLEELRNPF.
17. Sestavek po zahtevku 14, označen s tem, da nadalje obsega vsaj en peptid, ki ima T celično aktivnost, izveden iz MOG.
18. Izoliran peptid, izveden iz MBP, označen s tem, da je navedeni peptid izbran iz skupine, ki sestoji iz: MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-1.2 (SEQ ID NO: 4), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6); MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEO ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10), MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), MBP-3.1 (SEQ ID NO: 13), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in MBP-5 (SEQ ID NO: 15), vsi kot so prikazani na sliki 2, ali je njegova modifikacija ali analog.
19. Izoliran peptid po zahtevku 18, označen s tem, da je navedeni peptid MBP-4 (SEQ ID NO: 14) ali je njegova modifikacija ali analog.
20. Analog peptida po zahtevku 18, označen s tem, da je vsaj en aminokislinski ostanek navedenega peptida substituiran z alaninom, glutaminsko kislino ali metilamino kislino.
21. Peptid izbran iz skupine, ki sestoji iz MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10), MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), vsi kot so prikazani na sliki 2, označen s tem, da je lizin (K) substituiran z alaninom (A).
22. Peptidni analog MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), označen s tem, da je lizin(K) na položaju 10 substituiran z alaninom (A), pri čemer ima omenjeni peptidni analog aminokislinsko sekvenco DENPVVHFFANIVTPRTPPPSQGK (SEQ ID NO: 71).
23. Peptidomimetik peptida, ki je izbran iz skupine, ki sestoji iz: MBP-1 (SEO ID NO: 2), MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-1.2 (SEQ ID NO: 4), MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10), MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), MBP-3 (SEQ ID NO: 12), MBP-3.1 (SEQ ID NO: 13), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in MBP-5 (SEQ ID NO: 15), označen s tem, da je vsaj ena normalna peptidna vez substituirana z nepeptidno vezjo, analogom peptidne vezi ali analogom reducirane vezi.
24. Peptid izbran iz skupine, ki sestoji iz: MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-1.2 (SEQ ID NO: 4), MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEO ID NO: 9), MBP-2.5 (SEO ID NO: 10), MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), MBP-3 (SEQ ID NO: 12), MBP-3.1 (SEO ID NO: 13), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in MBP-5 (SEQ ID NO: 15), označen s tem, da je bil modificiran z adicijo vsaj enega nabitega aminokislinskega ostanka na amino terminalni konec, karboksi terminalni konec, ali na oba terminalna konca omenjenega peptida, da povečamo topnost omenjenega peptida v vodni raztopini.
25. Peptid, izbran iz skupine, ki sestoji iz: MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-1.2 (SEQ ID NO: 4), MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10), MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), MBP-3 (SEO ID NO: 12), MBP-3.1 (SEQ ID NO: 13), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in MBP-5 (SEQ ID NO: 15), označen s tem, da je bil modificiran z adicijo vsaj enega aminokislinskega ostanka na amino terminalni konec, karboksi terminalni konec, ali na oba terminalna konca omenjenega peptida, da se poveča T celična aktivnost omenjenega peptida, pri čemer je vsaj en aminokislinski ostanek izveden iz proteinske sekvence nativnega MBP.
26. Uporaba sestavka po zahtevku 1 za izdelavo zdravila za zdravljenje multiple skleroze ali preprečevanje njenega nastopa.
27. Uporaba po zahtevku 26, označena s tem, da je navedeno zdravilo prilagojeno za vsaj eno izmed naslednjih poti dajanja: i.v. injekcija v ne-imunogenski obliki, subkutana injekcija v ne-imunogenski obliki, oralno dajanje, inhalacijsko dajanje, sublingualno dajanje, transdermalno dajanje, rektalno dajanje ali katerakoli njihova kombinacija.
28. Uporaba po zahtevku 26, označena s tem, daje navedeno zdravilo prilagojeno za subkutano dajanje v ne-imunogenski obliki.
29. Uporaba sestavka pa zahtevku 5, 10, 14 ali 15 za izdelavo zdravila za zdravljenje multiple skleroze.
30. Uporaba vsaj dveh različnih sestavkov po zahtevku 1 za izdelavo zdravila za zdravljenje multiple skleroze.
31. Uporaba kombinacije peptidov, izvedenih iz MBP, ki so izbrani iz skupine kombinacij peptidov, v kateri so:

MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-3 (SEQ ID NO: 12) in MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in MBP-5 (SEQ ID NO: 15);

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-3 (SEQ ID NO: 12), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in MBP-5 (SEQ ID NO: 15);

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in MBP-5 (SEQ ID NO: 15);

MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in MBP-5 (SEQ ID NO: 15);

MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in MBP-5 (SEQ ID NO: 15);

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in MBP-5 (SEQ ID NO: 15);

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6) in MBP-4 (SEQ ID NO: 14); MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6) in MBP-4 (SEQ ID NO: 14); MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2 (SEQ ID NO: 5) in MBP-4 (SEQ ID NO: 14); MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6) in MBP-5 (SEQ ID NO: 15); MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6) in MBP-3 (SEO ID NO: 12); MBP-1 (SEQ ID NO: 2) in peptid, izbran iz skupine, ki sestoji iz: MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10) ali MBP-2-6 (SEQ ID NO: 11);

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3) in peptid, izbran iz skupine, ki sestoji iz: MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10) ali MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11);

MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in peptid, izbran iz skupine, ki sestoji iz: MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10) ali MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11);

MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in peptid, izbran iz skupine, ki sestoji iz: MBP-1 (SEO ID NO: 2) ali MBP-1.1 (SEO ID NO: 3);

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in peptid, izbran iz skupine, ki sestoji iz: 82-100 (SEO ID NO: 30), 82-100[100P>Y] (SEQ ID NO:46), 87-99 (SEQ

ID NO:43) in 87-99[91K>A] (SEQ ID NO: 36), vsi kot so prikazani na sl. 14;

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3) in MBP-4 (SEO ID NO: 14) in peptid, izbran iz skupine,

100 ki sestoji iz: MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10) ali MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), vsi kot so prikazani na sl. 2;

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-5 (SEQ ID NO: 15), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in peptid, izbran iz skupine, ki sestoji iz: 82-100 (SEQ ID NO: 30), 82-100[100P>Yj (SEQ ID NO:46), 87-99 (SEQ ID NO:43) in 87-99[91K>A] (SEQ ID NO: 36), vsi kot prikazani na sl. 14;

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-5 (SEQ ID NO: 15), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in peptid, izbran iz skupine, ki sestoji iz: MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10) ali MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), vsi kot so prikazani na sl. 2;

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-5 (SEQ ID NO: 15), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in peptid, izbran iz skupine, ki sestoji iz: 82-100 (SEQ ID NO: 30), 82-100[100P>Y] (SEQ ID NO: 46), 87-99 (SEQ ID NO: 43) in 87-99[91K>A] (SEQ ID NO: 36), vsi kot so prikazani na sl. 14;

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-3 (SEQ ID NO: 12), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in peptid, izbran iz skupine, ki sestoji iz: MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10) ali MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), vsi kot so prikazani na sl. 2, za izdelavo zdravila za zdravljenje multiple skleroze pri sesalcu.
32. Multipeptidna formulacija za farmacevtsko dajanje posameznikom z MS, označena s tem, da obsega vsaj dva peptida MBP, pri čemer je vsak peptid topen in stabilen pri fiziološko sprejemljivem, predhodno določenem pH, pri čemer so navedeni peptidi izbrani iz skupine, ki sestoji iz: MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-1.2 (SEQ ID NO: 4), MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEO ID NO: 10), MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), MBP-3 (SEQ ID NO: 12), MBP-3.1 (SEQ ID NO: 13), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) in MBP-5 (SEQ ID NO: 15).
33. Uporaba terapevtskega sestavka, ki obsega vsaj en peptid, ki ima T celično aktivnost, izveden iz mielinskega antigena ali analog navedenega peptida, v količini, ki je učinkovita, da zniževalno regulira simptome multiple skleroze, za izdelovanje zdravila za zdravljenje napredovanega stanja multiple skleroze pri sesalcu.

101
34. Uporaba po zahtevku 33, označena s tem, da je mielinski antigen izbran iz skupine, ki sestoji iz mielinskega bazičnega proteina (MBP), mielinskega oligodendrocitnega proteina (MOG), proteolipidnega proteina (PLP) in glikoproteina, povezanega z mielinom (MAG).
35. Uporaba po zahtevku 33, označena s tem, da navedeni peptid obsega peptidni analog, ki ima MHC vezivno afiniteto, ki je večja od MHC vezivne afinitete peptida, iz katerega je izveden analog.
36. Uporaba terapevtskega sestavka, ki obsega vsaj en peptid MBP, pri čemer je navedeni peptid izbran iz skupine, ki sestoji iz: MBP-1 (SEQ ID NO: 2)

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-1.2 (SEQ ID NO: 4), MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10), MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), MBP-3 (SEQ ID NO: 12), MBP-3.1 (SEQ ID NO: 13), MBP-4 (SEQ ID NO: 14). MBP-5 (SEQ ID NO: 15), 13-25 (SEQ ID NO: 31), 31-50 (SEQ ID NO: 18), 61-80 (SEQ ID NO: 21), 8292 (SEQ ID NO: 32), 82-96 (SEQ ID NO: 33), 82-97 (SEQ ID NO: 34), 82-98 (SEQ ID NO: 35), 82-100 (SEQ ID NO: 30), 82-100 [100 P>Y] (SEQ ID NO: 46), 83-100 (SEQ ID NO: 37), 83-101 (SEQ ID NO: 38), 84-97 (SEQ ID NO: 39), 84-100 (SEQ ID NO: 40), 85-100 (SEQ ID NO: 41), 86-105 (SEQ ID NO: 42), 87-99 (SEQ ID NO: 43), 8799 [91K>A] (SEQ ID NO: 36), 88-100 (SEQ ID NO: 44), 88-99 (SEQ ID NO: 45), 111135 (SEQ ID NO: 47), 122-140 (SEQ ID NO: 48), 139-170 (SEQ ID NO: 49), 141-160 (SEQ ID NO: 28), 142-166 (SEQ ID NO: 50), 142-168 (SEQ ID NO: 51), 146-160 (SEQ ID NO: 52), in 153-170 (SEQ ID NO: 53), vsi kot so prikazani na slikah 2 in 14, ali analog omenjenega peptida, za izdelavo zdravila za zdravljenje napredovanega stanja multiple skleroze pri sesalcu.
37. Uporaba po zahtevku 36, označena s tem, da je navedeni vsaj en peptid izbran iz skupine, v kateri so: MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP -1.2 (SEQ ID NO: 4), MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10), MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), MBP-3 (SEQ ID NO: 12), MBP-3.1 (SEO ID NO: 13), MBP-5 (SEQ ID NO: 15), 13-25 (SEQ ID NO: 31), 87-99 (SEO ID NO: 43), 87-99[91K>A] (SEQ ID NO: 36), 82-100 (SEO ID NO: 30), 82100[100P>Y] (SEQ ID NO: 46) ali je njegov analog.

102
38. Uporaba po zahtevku 33, označena s tem, da je navedeni vsaj en peptid izveden iz humanega MOG in je izbran iz skupine, v kateri so:

HumaniMOG 1-13 (SEQ ID NO: 54) Human.MOG 103-115 (SEQ ID NO: 55) HumaniMOG 1-121 (SEQIDNO: 56)

HumaniMOG 1-20 (SEQ ID NO: 57) HumaniMOG 11-30 (SEQ ID NO: 58) HumaniMOG 21-40 (SEQ ID NO: 59) Humar» MOG 31-50 (SEQ ID NO: 60) HumaniMOG 141-160 (SEQ ID NO: 61) Humani MOG 151-170 (SEQ ID NO: 62) HumaniMOG 161-180 (SEQ ID NO: 63) HumaniMOG 199-218 (SEQ ID NO: 64)

G Q F R V I G P R H P I R

H S YQEEAAMELKV

GQFRV IG PRH P I R A LVGDE V

ELPCRTSPGKNATGMEVGWY

RPPFSRVVHLYRNGKDQDGD

QAPEYRGRTELLKDAIGEGK

VTLRIRNVRFSDEGGFTCFF

RDHSYQEEAAMEIKVEDPFYW

GQFRVIGPRHPIRALVGDEV;

PIRALVGDEVELPCRISPGK;

ELPCRISPGKNATGMEVGWY.

NATGMEVGWYRPPFSRVVHL;

TVGLVFLCLQYRLRGKLRAE;

YRLRGKLRAEIENLHRTFDP;

I E N L H R T F D P H F L R V P C W K I; in YNWLHRRLAGQFLEELRNPF.
39. Uporaba po zahtevku 36, označena s tem, da navedeno zdravilo nadalje obsega vsaj en peptid humanega MOG, izbran iz skupine, v kateri so:

Human MOG 1-13 (SEQ ID NO: 54) HumaniMOG 103-115 (SEQ ID NO: 55) HumaniMOG 1-121 (SEQ ID NO: 56)

Human MOG 1-20 (SEQ ID NO: 57) Human MOG 11-30 (SEQ ID NO: 58) Human MOG 21-40 (SEQ ID NO: 59) Human MOG 31-50 (SEQ ID NO: 60) HumaniMOG 141-160 (SEQ ID NO: 61) Human MOG 151-170 (SEQ ID NO: 62) HumaniMOG 161-180 (SEQ ID NO: 63) HumaniMOG 199-218 (SEQ ID NO: 64)

G Q F R V I G P R H P I R

HSYQEEAAM ELKV

GQFRVIGPRHPIRALVGDEV

ELPCRTSPGKNATGMEVGWY

RPPFSRVVHLYRNGKDQDGD

QAPEYRGRTELLKDAIGEGK

VTLRIRNVRFSDEGGFTCFF

RDHSYQEEAAMELKVEDPFYW

GQFRVIGPRHP1RALVGDEV;

PIRALVGDEVELPCRISPGK;

ELPCRISPGKNATGMEVGWY;

NATCMEVGWYRPPFSRVVHL;

TVGLVFLCLQYRLRGKLRAE;

YRLRGKLRAEIENLHRTFDP;

I EN L H RT F D P H F L R V PC W K I; in YNWLHRRLAGQFLEELRNPF.
40. Uporaba po zahtevku 33, označena s tem, da je navedeno zdravilo prilagojeno za tako pot dajanja, ki obsega subkutano ali intravensko injekcijo omenjenega peptida.
41. Uporaba vsaj enega terapevtskega sestavka, ki obsega vsaj en izoliran in očiščen peptid, pri čemer ima navedeni peptid definirano dolžino, definirano sekvenco aminokislinskih ostankov in ima T celično aktivnost, pri čemer je omenjeni sestavek sposoben zniževalno regulirati simptome multiple skleroze pri populaciji sesalcev z napredovanim stadijem multiple skleroze, kadar ga dajemo v ne-imunogenski obliki,

103 in pri čemer je omenjeni sestavek topen v vodni raztopini in je stabilen pri fiziološko sprejemljivem pH, za izdelavo zdravila za zdravljenje sesalca v napredovanjem stanju multiple skleroze.
42. Uporaba po zahtevku 41, označena s tem, da dajanje obsega simultano ali zaporedno dajanje vsaj dveh izmed navedenih terapevtskih sestavkov.
43. Uporaba terapevtskega sestavka po zahtevku 5, 10, 14 ali 15 v količini, ki je učinkovita, da zniževalno regulira simptome multiple skleroze, za izdelavo zdravila za zdravljenje napredovanega stanja multiple skleroze pri sesalcu.
44. Uporaba po zahtevku 33, označena s tem, da je napredovan stadij multiple skleroze vračajoča-popuščajoča MS, kronična progresivna MS, primarna progresivna MS ali benigna MS.
45. Uporaba po zahevku 33, označena s tem, da je navedeno zdravilo prilagojeno za dajanje v kombinaciji z /3-interferonom
46. Uporaba vsaj enega peptida mielinskega avtoantigena, ki ima T celično aktivnost, za izdelavo zdravila za zdravljenje multiple skleroze pri posamezniku, označena s tem, da je navedeno zdravilo prilagojeno za dajanje v kombinaciji s terapevstko učinkovito količino IFN-/3.
47. Uporaba po zahtevku 46, označena s tem, da je navedeno zdravilo prilagojeno za simultano dajanje navedenega peptida in navedenega IFN-/3.
48. Sestavek, označen s tem, da obsega terapevtsko učinkovito količino vsaj enega peptida, ki ima T celično aktivnost humanega MBP in terapevtsko učinkovito količino IFN-/3 v farmacevtsko sprejemljivem nosilcu ali razredčilu.
49. Sestavek po zahtevku 48, označen s tem, da je navedeni vsaj en peptid izbran iz skupine, ki sestoji iz: MBP-1 (SEQ ID NO: 2) MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-1.2 (SEQ ID NO: 4), MBP-2 (SEQ ID NO: 5). MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEO

ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID

NO: 10), MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), MBP-3 (SEQ ID NO: 12), MBP-3.1 (SEQ ID NO:

13), MBP-4 (SEQ ID NO: 14), MBP-5 (SEQ ID NO: 15). 13-25 (SEQ ID NO: 31),3150 (SEQ ID NO: 18), 61-80 (SEQ ID NO: 21), 82-92 (SEQ ID NO: 32), 82-96 (SEQ ID

104

NO: 33), 82-97 (SEQ ID NO: 34), 82-98 (SEQ ID NO: 35), 82-100 (SEQ ID NO: 30), 82-100 [100 P>Y] (SEQ ID NO: 46), 83-100 (SEQ ID NO: 37), 83-101 (SEQ ID NO: 38), 84-97 (SEQ ID NO: 39), 84-100 (SEQ ID NO: 40), 85-100 (SEQ ID NO: 41), 86105 (SEQ ID NO: 42), 87-99 (SEQ ID NO: 43), 87-99 [91K>A] (SEQ ID NO: 36), 88100 (SEQ ID NO: 44), 88-99 (SEQ ID NO: 45), 111-135 (SEQ ID NO: 47), 122-140 (SEQ ID NO: 48), 139-170 (SEQ ID NO: 49), 141-160 (SEQ ID NO: 28), 142-166 (SEQ ID NO: 50), 142-168 (SEQ ID NO: 51), 146-160 (SEQ ID NO: 52) in 153-170 (SEQ ID NO: 53), vsi kot so prikazani na slikah 2 in 14.
50. Uporaba vsaj enega peptida, ki ima T celično aktivnost, za izdelavo zdravila za preprečevanje nastopa multiple skleroze pri posamezniku, ki je zanjo dovzeten, označena s tem, da je navedeno zdravilo prilagojeno za dajanje v kombinaciji z IFN-β.
51. Uporaba vsaj enega sestavka po zahtevku 1 za izdelavo zdravila za preprečevanje nastopa multiple skleroze pri posamezniku, ki je zanjo dovzeten, označena s tem, da je navedeno zdravilo prilagojeno za dajanje v kombinaciji z IFN-β.
52. Uporaba vsaj enega sestavka po zahtevku 5, 10, 14 ali 15 za izdelavo zdravila za zdravljenje multiple skleroze pri sesalcu, označena s tem, da je navedeno zdravilo prilagojeno za dajnje v kombinaciji z IFN-β.
53. Farmacevtski sestavek, označen s tem, da obsega farmacevtsko sprejemljiv ekscipient in peptidni kompleks MHC razreda II, ki je sposoben vezave T celičnega receptorja in induciranja anergije v celici T, ki nosi receptor, pri čemer kompleks v bistvu sestoji iz:

komponente MHC razred II, ki obsega ekstracelularna področja molekule MHC razreda II, ki so zadostna, da tvorijo žep, ki veže antigen, pri čemer je omenjena komponenta kodirana z alelom, povezanim z avtoimunsko boleznijo, pri čemer je komponenta topna pod fiziološkimi pogoji v odsotnosti detergenta ali lipida; in avtoantigenskega peptida po zahtevku 1, pri čemer je avtoantigenski peptid vezan na žep, ki veže antigen.
54. Farmacevtski sestavek, označen s tem, da obsega farmacevtsko sprejemljiv ekscipient in peptidni kompleks MHC razreda II, ki je sposoben vezave T celičnega receptorja in induciranja anergije v T celici, ki nosi receptor, pri čemer kompleks v bistvu sestoji iz:

105 komponente MHC razred II, ki obsega ekstracelularna področja molekule MHC razreda II, ki.so zadostna, da tvorijo žep, ki veže antigen, pri čemer je omenjena komponenta kodirana z alelom, povezanim z avtoimunsko boleznijo, pri čemer je komponenta topna pod fiziološkimi pogoji v odsotnosti detergenta ali lipida; in avtoantigenskega peptida po zahtevku 8, pri čemer je avtoantigenski peptid vezan na žep, ki veže antigen.
55. Farmacevtski sestavek, označen s tem, da obsega farmacevtsko sprejemljiv ekscipient in peptidni kompleks MHC razreda II, ki je sposoben vezave T celičnega receptorja in induciranja anergije v T celici, ki nosi receptor, pri čemer kompleks sestoji v bistvu iz:

komponente MHC razred II, ki obsega ekstracelularna področja molekule MHC razred II, ki so zadostna, da tvorijo žep, ki veže antigen, pri čemer je omenjena komponenta kodirana z alelom, ki je povezan z avtoimunsko boleznijo, pri čemer je komponenta topna pod fiziološkimi pogoji v odsotnosti detergenta ali lipida; in avtoantigenskega peptida po zahtevku 16, pri čemer je avtoantigenski peptid vezan na žep, ki veže antigen.
56. Sestavek po zahtevku 53, označen s tem, da je avtoimunska bolezen multipla skleroza.
57. Sestavek po zahtevku 1, označen s tem, da obsega tandemske kopije omenjenega peptida.
58. Sestavek po zahtevku 8, označen s tem, da obsega tandemske kopije omenjenega peptida.
59. Sestavek po zahtevku 16, označen s tem, da obsega tandemske kopije omenjenega peptida.

Za

Immulogic Pharmaceutical Corporation:

25833-VJI-97/LŽ

106

IZVLEČEK

Sestavki in zdravljenje multiple skleroze

Predloženi izum zagotavlja izolirane peptide in kombinacije peptidov, ki so izvedeni iz mielinskih avtoantigenov, kot so MBP, MOG, PLP in MAG, primerene za zdravljenje multiple skleroze, vključno s profilaktičnimi in terapevtskimi sestavki in metodami za preprečevanje ali zdravljenje multiple skleroze. Prednostni sestavki v smislu izuma obsegajo vsaj en izoliran očiščen peptid, ki je brez vseh drugih polipeptidov ali kontaminantov, pri čemer peptid obsega aminokislinsko sekvenco, mielinski avtoantigen, ki ima T celično aktivnost. Terapevtski sestavek v smislu izuma je sposoben zniževalne regulacije avtoantigenskega specifičnega imunskega odziva na mielinski avtoantigen pri populaciji ljudi, ki bolehajo za multiplo sklerozo ali so zanjo dovzetni, tako da reduciramo, eliminiramo ali preprečimo bolezenske simptome in/ali preprečimo ali upočasnimo nastop ali progresijo bolezenskih simpotomov. Dodatno sestavki in postopki predloženega izuma, kadar jih damo v napredovanem stadiju bolezni, izničijo paralizo, ki je v teku ali druge znake bolezni, kadar jih dajemo med akutno fazo bolezni, ali preprečujejo povratek bolezni, kadar jih dajemo med remisijo.