HU220357B - Eljárás és készítmények autoimmun betegségek kezelésére bystander antigén alkalmazásával - Google Patents

Abstract

A találmány tárgyát autoimmun betegségekben szenvedő emlősökkezelésére alkalmas hatóanyagok alkalmazása képezi. A betegségkezelése céljából valamely bystander antigén hatékony mennyiségétszájon át vagy belégzés útján beadják, és a beadott antigén ?-TGF-(béta-transzformáló növekedési faktor) felszabadulást okoz a szervezetegy olyan helyén, ahol az autoimmun válaszban részt vevő T-sejtektalálhatók, ily módon gátolva ezeket. A bystander antigén olyanbystander antigén, amely a megtámadott szövetre vagy szervre jellemző,és a szupresszor T-sejteket az autoimmun válasz helyére irányítja. Atalálmány szerinti, bystander antigént tartalmazó készítményeketorális vagy inhalációs adagolásra alkalmasan formulázzák. A találmánytárgyát képező eljárások alkalmazásával, a találmány szerintikészítmények adagolása útján emlősökben az autoimmun betegségekkialakulása gátolható vagy enyhíthető, illetve a már kialakultbetegség teljesen gyógyítható. ŕ

Description

A találmány tárgyát autoimmun betegségekben szenvedő emlősök kezelésére alkalmas hatóanyagok alkalmazása képezi. A betegség kezelése céljából valamely bystander antigén hatékony mennyiségét szájon át vagy belégzés útján beadjuk, és a beadott antigén β-TGF(béta-transzformáló növekedési faktor) felszabadulást okoz a szervezet egy olyan helyén, ahol az autoimmun válaszban részt vevő T-sejtek találhatók, ily módon gátolva ezeket. A bystander antigén előnyösen olyan bystander antigén, amely a megtámadott szövetre vagy szervre jellemző, és a szupresszor T-sejteket az autoimmun válasz helyére irányítja.

A találmány szerinti, bystander antigént tartalmazó készítményeket orális vagy inhalációs adagolásra alkalmasan formulázzuk. A találmány tárgyát képező eljárások alkalmazásával, a találmány szerinti készítmények adagolása útján emlősökben az autoimmun betegségek kialakulása gátolható vagy enyhíthető, illetve a már kialakult betegség teljesen gyógyítható.

Az autoimmun betegségeket normális autológ (saját) szövetek ellen adott abnormális immunválasszal jellemezhetjük.

Az emlősök autoimmun betegségeit a normálisnál erősebb immunválasz típusa szerint általánosságban két csoportba lehet besorolni: sejtközvetített (azaz T-sejtközvetített) és ellenanyag-közvetített elváltozások. A sejtközvetített autoimmun betegségek közé tartoznak például, többek között a sclerosis multiplex (SM), a reumatoid arthritis (RA, reumás ízületi gyulladás), az autoimmun thyroiditis (AT, autoimmun pajzsmirigygyulladás), a diabetes mellitus (cukorbetegség, fiatalkori vagy 1-es típusú) és az autoimmun uveoretinitis (AUR, autoimmun szemgyulladás). Az ellenanyag-közvetített autoimmun betegségek közé tartoznak a myasthenia gravis (MG), és a szisztémás lupus erythematosus (SLE).

Az autoimmun megbetegedések mindkét csoportját jelenleg olyan gyógyszerekkel kezelik, amelyek az immunválaszt nem specifikus módon nyomják el, azaz olyan gyógyszerekkel, amelyek nem képesek az abnormális immunválaszt szelektíven elnyomni. Ilyenek többek között például a methotrexát, ciklofoszfamid, Imuran (azatioprin) és a ciklosporin A. Szteroidvegyületeket, mint a prednizon és a metilprednizolon (nem specifikus immunszuppresszánsok) szintén használnak számos esetben. Mindezek a jelenleg alkalmazott gyógyszerek csak korlátozottan hatásosak mind a sejtközvetített, mind az ellenanyag-közvetített autoimmun betegségek ellen. Ráadásul az ilyen gyógyszereknek jelentős toxikus és egyéb mellékhatásuk van, sőt, ami még fontosabb, idővel „globális” immunszuppressziót váltanak ki a kezelt betegekben. Másképpen kifejezve, az ilyen gyógyszerekkel végzett huzamos kezelés csökkenti a normális védekező immunválaszt a kórokozókkal szemben, és a fertőzések esélyét növeli. Emellett a hosszan tartó általános immunszuppressziónak kitett betegekben nagyobb eséllyel lépnek fel súlyos orvosi, a kezelés okozta szövődmények, mint rosszindulatú elváltozások, veseelégtelenség és cukorbetegség.

Az autoimmun betegségek hagyományos kezelése ezen hátrányainak kiküszöbölése céljából a jelen feltalálók és munkatársaik olyan eljárásokat és gyógyszerkészítményeket dolgoztak ki, amelyek az autoimmun betegségek kezelésében használhatóak és a szájon át (orálisan) vagy belélegzés útján (inhalálással) végzett tolerizálás (válaszképtelenség előidézése) elvén alapulnak; tolerogénként autoantigéneket, vagy autoantigének analógjainak a betegséget elnyomó fragmenseit használnak önmagukban vagy úgynevezett „szinergistákkal”, azaz olyan vegyületekkel együtt, melyek az autoantigének tolerogén hatását növelik.

Az autoantigének olyan antigének, melyek valamely szervben vagy szövetben, amelyiket az autoimmun folyamat megtámad, normális esetben is megtalálhatók és arra specifikusak, és amelyek az autoimmun válasz elsődleges célpontjai.

Habár a fenti eljárások és gyógyszerkészítmények jelentős javulást eredményeznek az autoimmun betegségek kezelésében, gyógyászati felhasználásukat nehezíti, hogy a specifikus autoantigéneket, amelyek a kóros állapot előidézésében és fenntartásában szerepet játszanak, minden egyes esetben azonosítani kell; vagyis ismernünk kell a specifikus anyagokat, melyek az immunrendszer támadásának célpontjai. Ez az azonosítás sok esetben nehéz és időigényes, amint azt a témában járatos szakemberek tudják. így például egy adott időpontban egynél több autoantigén is lehet az autoimmun válasz célpontja, és az autoantigének változhatnak, ahogyan a betegség fokozatosan több és több szövetet érint.

Ennek megfelelően a szakirodalom alapján nagy igény mutatkozik olyan, az eddigieknél jobb hatóanyagokra, eljárásokra és készítményekre, melyek az autoimmun betegségekben szenvedő egyének kezelésére szolgálnak, és a gyógyászatban könnyebben hozzáférhetőek, például nem igénylik az autoantigének előzetes azonosítását. Szintén igény van az autoimmun betegségek kezelésére szolgáló további eljárásokra és készítményekre, mely eljárásokat és készítményeket az autoantigének mellett vagy helyett lehet használni.

Igény mutatkozik továbbá azon mechanizmusok felderítésére, melyekkel az autoimmun betegségek ellen fel lehet venni a harcot, továbbá ezen újonnan megszerzett tudás alapján olyan új eljárások és készítmények kidolgozására, melyekkel az autoimmun betegségek ellen harcba lehet szállni.

Éppen ezért a találmány tárgyát javított eljárások és készítmények képezik, melyek autoimmun megbetegedésekben szenvedő emlősök kezelésére szolgálnak, és amely eljárásokat és készítményeket önállóan vagy esetenként egy vagy több autoantigénnel, szinergistával vagy más immunválasz-regulátorral kombinációban kell alkalmazni.

A találmány tárgyát képezik közelebbről olyan eljárások és készítmények, melyek autoimmun megbetegedésekben szenvedő emlősök kezelésére szolgálnak, hatékonyan használhatók az ilyen betegségek kezelésére, a tünetek enyhítésére vagy a betegség megelőzésére, és nem igénylik a betegség előidézésében vagy fenntartásában szerepet játszó autoantigének előzetes azonosítását.

A találmány tárgyát képezik továbbá eljárások és készítmények, melyek autoimmun megbetegedésekben

HU 220 357 Β szenvedő vagy azokra fogékony emlősök kezelésére szolgálnak, nem toxikus hatóanyagokat tartalmaznak, amely hatóanyagok előnyösen betegségspecifikusak.

Jelen találmány azon a váratlan és meglepő felfedezésen alapul, miszerint bizonyos antigének (úgynevezett bystander antigének) szájon át vagy a bélrendszeren keresztül (vagy belélegzés útján) való beadása olyan Tsejtek megjelenéséhez vezet, melyek az autoimmun betegségben szerepet játszó szövetek vagy szervek károsításában részt vevő sejteket gátolják. A bystander antigén által aktivált T-sejtek β-TGF (transforming growth factor béta: béta-transzformáló növekedési faktor) felszabadulását okozzák, mely anyag gátolja az immunválaszban részt vevő azon sejteket, melyek a közelben találhatók.

Ezen szuppresszív mechanizmus működéséhez nem szükséges, hogy a β-TGF-et termelő T-sejtek felismerjék a betegség létrejöttéért felelős sejteket. Csak annyi szükséges, hogy a kétféle sejt közel legyen egymáshoz, amikor a β-TGF felszabadul. Ennek elérésének egyik módja, hogy olyan antigént használunk bystander antigénként, amelyik (a) β-TGF termelésének előidézésére képes T-sejteket aktivál és (b) ő maga a megtámadott szervre vagy szövetre specifikus, úgyhogy a szupresszor T-sejtek, amelyek a β-TGF termelődéséért felelősek (és a bystander antigén orális beadásának hatására aktiválódtak) ugyanabban a szervben vagy szövetben fognak koncentrálódni, amelyben a betegségokozó sejtek is koncentrálódnak.

A jelen találmány érdekes vonása, hogy egy bizonyos bystander antigén szájon át alkalmazva kivédhet egy másik antigénre vagy antigénffagmensre specifikus sejtek által okozott szövetkárosodást. Ez utóbbi antigén vagy antigénffagmens azonosítása nem szükséges.

Éppen ezért a jelen találmány tárgya valamely autoimmun megbetegedésben szenvedő emlős kezelésére szolgáló eljárás, amelyre jellemző, hogy az adott emlősnek az adott betegség kezelése céljából valamely bystander antigén hatékony mennyiségét beadva, az antigén β-TGF-felszabadulást okoz a szervezetben egy olyan helyen, ahol az autoimmun válaszban részt vevő T-sejtek találhatók, ily módon gátolva ezeket az immunválaszban részt vevő T-sejteket.

Más vonatkozásban a jelen találmány tárgyát képezik olyan készítmények és gyógyszerkeverékek, amelyek valamely bystander antigénnek valamely autoimmun betegség kezelésére elegendő mennyiségét tartalmazzák.

Megint más vonatkozásban a jelen találmány tárgya olyan belélegezhető formában előállított gyógyszerkészítmény, mely valamely emlős valamely autoimmun megbetegedésének kezelésére szolgál, amely készítmény valamely bystander antigén hatékony mennyiségét tartalmazza, mely antigén beadás után az antigén βTGF-felszabadulást okoz a szervezetben egy olyan helyen, ahol az autoimmun válaszban részt vevő T-sejtek találhatók, ily módon gátolva ezeket az immunválaszban részt vevő T-sejteket; és a készítmény gyógyszerkészítmények előállításánál szokásosan alkalmazott hordozó és/vagy egyéb segédanyagokat is tartalmaz.

A következőkben a találmány szemléltetését szolgáló ábrák rövid leírását közöljük.

Az 1. ábra oszlopdiagram formájában mutatja szájon át tolerizált állatokból izolált nyiroksejtek vagy nyiroksejtfajták felülúszóinak sejtszaporodást okozó hatásának in vitro gátlását.

A 2. ábra oszlopdiagram formájában mutatja a fenti in vitro gátlás felfüggesztését β-TGF elleni ellenanyag alkalmazása esetén.

A 3. ábra oszlopdiagram formájában mutatja szájon át tolerizált állatokból izolált szupresszor T-sejtek savómentes felülúszójának β-TGF-aktivitását.

A 4. ábra (A-D) β-TGF elleni ellenanyagok és kontrolisavók hatását mutatja szájon át tolerizált (MBP-vel etetett) illetve nem etetett állatokban kiváltott kísérleti allergiás agyvelőgyulladásra (experimental allergic encephalomyelitis, EAE).

Az 5. ábra (A-D) β-TGF elleni ellenanyagok hatását mutatja szájon át tolerizált és kontrollállatokban kiváltott késői típusú túlérzékenységi reakcióra (delayed type hypersensitivity, DTH).

A 6. ábra (A-C) bystander antigén szájon át történő beadásával és lényegében egyidejű MBP-immunizálással, majd bizonyos antigének beadásával kapcsolatban mutatja autoimmun betegségek gátlását.

A 7. ábra az ilyen bystander-szuppresszióval kapcsolatos késői típusú túlérzékenységei reakciót (DTH) mutatja.

A 8. ábra azt mutatja, hogy az EAE bystander-szuppressziója kialakul-e marha-szérumalbuminnal (BSA), tojásalbuminnal (ÓVA) vagy mielin bázikus fehérjével (myelin basic protein, MBP) etetett és MBP-vel immunizált, a táplálékban is adott antigénnel injekciózott állatokban.

A 9. ábra oszlopdiagram formájában mutatja, hogy a bystander-szuppresszió adaptív átvitele a CD8+ szupresszor T-sejtekkel kapcsolatos.

A 10. ábra oszlopdiagram formájában mutatja tengerimalacok BMP-stimulált nyirokcsomóiból kivett nyiroksejtek szaporodását BMP-peptidek hatására.

All. ábra oszlopdiagram formájában mutatja különböző BMP-peptidek azon képességét, hogy BMPvel etetett állatok lépsejtjeit OVA-aktivált lépsejtek elnyomására késztessék in vitro, a hatóanyagokat átengedő, de a sejteket visszatartó fallal kettéosztott edényben (transwell).

A 12. ábra (A) autoantigén (PLP) vagy bystander antigén (BMP) etetésének hatását mutatja PLP-peptid által előidézett EAE-re SJL/J egerekben. A (B) oszlopdiagram az (A) adatait foglalja össze.

A 13. ábra (A) egy autoantigén (PLP) vagy agy bystander antigén (MBP) intravénás beadásának tolerizáló hatását mutatja SJL/J egerekben PLP-peptidekkel kiváltott EAE esetében. A (B) oszlopdiagram az (A) adatait foglalja össze.

A 14. ábra oszlopdiagram formájában mutatja az MBP 71-90 peptid által kiváltott EAE elnyomását különböző tengerimalac-MBP-peptidek etetésének hatására önmagukban vagy szójatripszin inhibitorral (STI) együtt.

HU 220 357 B

A 15. ábra (A-D) oszlopdiagram-sorozat formájában mutatja EAE-re teljes MBP-vel vagy az MBP 71-90 peptiddel immunizált, teljes MBP-vel vagy különféle MBP-peptidekkel (önmagukban vagy STI-vel együtt) etetett állatok DTH-válaszait.

A 16. ábra oszlopdiagram formájában mutatja az MBP-vel, valamint annak betegségokozó és nem okozó fragmenseivel végzett intravénás tolerizálás hatását a kiváltott EAE-re SJL/J egerekben.

A leírásban idézett valamennyi szabadalmi leírást és egyéb irodalmi hivatkozást teljes teijedelmében a kitanításhoz tartozónak kell tekinteni.

Jelen találmány vonatkozásában a következő kifejezéseket az itt megadott meghatározások értelmében fogjuk használni. Amennyiben a hivatkozott szabadalmi bejelentésekben, szabadalmakban és szakirodalmi hivatkozásokban valamely kifejezést azt itt megadottaktól eltérő értelemben használnak, a jelen leírás szerinti értelmezés az irányadó.

(a) Bystander antigén az olyan fehérje, fehérjefragmens, peptid, glikoproteid, vagy bármely egyéb immunogén (azaz immunválaszt kiváltani képes) anyag, amely szájon vagy a bélrendszeren át (vagy belélegzés útján) történő beadás esetén szupresszor T-sejteket aktivál, melyek β-TGF felszabadulását okozzák, és így gátolják azokat a sejteket, melyek valamely autoimmun betegség folyamán a szövetek károsodását okozzák, még akkor is, ha ezek a károsító sejtek valamely más immunogén anyagra specifikusak. Előnyösen a bystander antigén által aktivált szupresszor T-sejtek ugyanazon szövetek felé vándorolnak, amely szövetet az autoimmun válasz támad. A kifejezés magában foglalja azon antigéneket, de nem korlátozódik azon antigénekre, melyek β-TGF felszabadulását okozzák, és jellemzőek az autoimmun válasz által megtámadott szervre vagy szövetre. Ilyeténképpen a bystander fogalma nem azonos az autoantigén fogalmával, ahogyan az utóbbit a jelen találmány vonatkozásában használjuk. Valamely autoantigén nem szükségképpen bystander is egyben, hacsak belélegzés vagy lenyelés útján nem gátol valamely autoimmun választ T-szupresszorok aktiválása és β-TGF felszabadítása révén, amint azt fentebb leírtuk.

(b) Bystander-szuppresszió az autoimmun károsításban részt vevő sejtek gátlása az immunszuppresszív βTGF felszabadítása révén, mely felszabadítás olyan szupresszor T-sejtek hatására megy végbe, melyeket a bystander antigén lenyelése vagy belélegzése aktivált, és melyek az autoimmun károsítást végző sejtek tartózkodási helyéhez vándorolnak.

(c) Emlős a jelen találmány vonatkozásában bármely élőlény, amelyiknek immunrendszere van, és autoimmun betegségre fogékony.

(d) Autoimmun betegség a jelen találmány vonatkozásában az emlősök, beleértve az embert is, immunrendszerének hibás működése, melynek során az immunrendszer nem tesz különbséget az idegen anyagok és a szervezet bizonyos saját szövetei és anyagai között, ezeket a szöveteket és anyagokat idegenként ismeri fel és ennek következtében immunválaszt mutat a szervezet normális, autológ (saját) szövete(i) ellen.

(e) Autoantigén bármely anyag, vagy annak része, mely normálisan előfordul valamely emlősben, és amelyet adott esetben az immunrendszer ellenanyagai és nyiroksejtjei idegenként, azaz nem a szervezethez tartozóként ismer fel, és ezáltal az immunrendszer támadásának elsődleges célpontjává válik, mintha idegen anyag lenne. A fogalom magában foglalja azokat az anyagokat is, melyek bár nem részei az adott emlős szervezetének, mégis az autoimmun betegségek jellemzőit mutató állapotokat idéznek elő, ha valamely emlősnek beadják őket.

(f) Kezelés alatt értjük mind az autoimmun megbetegedés (vagy annak klinikai és szubklinikai, azaz szövettani tüneteinek megjelenése) megelőzésére irányuló megelőző kezelést, mind a tünetek enyhítését vagy megszüntetését célzó gyógyító jellegű kezelést az autoimmun betegség jelentkezése után.

(g) Szinergisták a jelen találmány vonatkozásában az olyan anyagok, amelyek az autoimmun betegségek klinikai vagy szövettani megjelenésének elnyomását segítik vagy növelik, ha a valamely bystander antigénnel vagy autoantigénnel együtt adjuk szájon át vagy belélegeztetés útján. Az előző mondatban található együtt kifejezés magában foglalja az autoantigének vagy bystander antigének beadása előtt, lényegében egyidejűleg, vagy utána történő beadást. Természetesen az együtt adott anyag beadása nem előzheti meg vagy követheti a másik anyag beadását olyan hosszú időtartammal, hogy az először beadott anyag hatása elenyésszen a második anyag beadásának időpontjára. Következésképpen a szinergistákat körülbelül 24 órával az autoantigének vagy bystander antigének beadása előtt vagy után, előnyösen egy órán belül kell beadni.

(h) Szájon át vagy orális alkalmazás magában foglalja a szájon, gyomron vagy beleken keresztül a szervezetbe juttatást.

(i) Valamely autoimmun betegség jellemzőivel vagy tüneteivel rendelkező betegség olyan spontán vagy kiváltott betegséget jelöl, amelyik ugyanazon szerv(ek) vagy szövet(ek) gyulladásával jár, mint az adott autoimmun betegség. Példaképpen egy kiváltott állapot az EAE, ami a sclerosis multiplex modellje. A spontán kialakuló állapotra példa a NŐD egerekben kifejlődő cukorbaj (diabétesz).

Mint azt váratlanul felfedeztük, bystander antigének szájon át vagy belélegeztetés útján történő beadása hatékony kezelése az autoimmun betegségeknek. Legalábbis a sejtközvetített autoimmun betegségeket kezelni lehet a jelen találmány tárgyát képező eljárások és gyógyszerkészítmények felhasználásával.

A bystander antigének szájon át való beadása következtében létrejövő gátlás olyan szupresszor T-sejtek aktiválásán keresztül hat, melyek egy immunválaszt gátló anyagot, a transzformáló növekedési faktor β-változatát (β-TGF) termelik. A β-TGF nem specifikus az őt termelő sejtet ingerlő antigénre, habár ezek a szupresszor T-sejtek csak a szájon át (vagy belélegzéssel) a szervezetbe került antigén hatására termelnek β-TGF-et. A szupresszor T-sejtek összegyűjtése valamely emlős szervezetének azon részébe, ahol valamely szerv vagy

HU 220 357 Β szövet károsítását végző sejtek koncentrálódnak, lehetővé teszi a β-TGF felszabadulását a betegségokozó sejtek közelében; a β-TGF azután legátolja ezeket a sejteket. A β-TGF azon képessége, hogy ezeket a károsító sejteket gátolja, független azon antigén(ek)től, melyekre a károsító sejtek specifikusak.

A károsító sejtek gátlását előnyösen úgy érjük el, hogy az emlős szájon át történő kezelésére olyan antigént választunk, amelyik nemcsak hogy β-TGF termelésére képes szupresszor T-sejtek aktiválására alkalmas, hanem ezen szupresszor T-sejteket az emlős szervezetének azon részébe képes irányítani, ahol a károsító sejtek nagy számban vannak jelen. A szupresszor T-sejtek számára a legelőnyösebb és leghatékonyabb célpont a kérdéses autoimmun betegség során megtámadott szerv vagy szövet, mert a károsító sejtek ezen szerv vagy szövet közelében koncentrálódnak. Következésképpen előnyös, ha a bystander antigén (melyre a szupresszor Tsejtek specifikusak) jellemző a megtámadott szervre vagy szövetre, így a bystander antigén lehet valamely autoantigén, vagy előnyösen valamely autoantigénnek egy betegséget nem okozó fragmense vagy analóg vegyülete. Mint az a 6. példából látható, valamely autóantigén azon részei vagy epitópjai, amelyek valamely szerv vagy szövet károsításában szerepet játszanak, nem azonosak a bystander-szuppresszióban részt vevőkkel. Még előnyösebben a bystander antigén lehet valamely antigén, amely maga nem autoantigén; ilyeténképpen a betegségben szerepet játszó autoantigén(ek)et nem kell ismernünk.

Valamely szövetspecifikus bystander antigén bystander-szuppressziót előidéző hatásának mechanizmusa a jelen találmány szerint részletesebben a következő: Miután valamely bystander antigént szájon át vagy enterálisan (azaz közvetlenül a gyomorba), vagy belélegeztetés útján a szervezetbe juttatunk, a vékonybélbe jut, ahol az úgynevezett Peyer-féle plakkokkal lép kapcsolatba; ezek a bélfalban található immunsejttelepek. Ezek a sejtek kapcsolatban állnak az immunrendszerrel, ezen belül a léppel és a nyirokcsomókkal. Ennek eredményeképpen CD8+ szupresszor T-sejtek aktiválódnak, és vonzódnak az autoimmun támadás területére, ahol β-TGF felszabadulását okozzák, ami nem specifikus módon gátolja a B-sejteket, valamint az aktivált CD4+ T-sejteket, amelyek az emlős saját szövetei ellen irányulnak. A β-TGF nem specifikus természete ellenére a bekövetkező tolerancia az autoimmun betegségre specifikus annak következtében, hogy a bystander antigén specifikus a megtámadott szövetre, és a károsodást szenvedő szövet közelében található immunsejteket gátolja.

A jelen találmány tárgyán belül a bystander-szuppresszió egy másik esetében olyan antigént adunk szájon át, amelyik nem autoantigén, és nem is specifikus a megtámadott szervre vagy szövetre. A bystander-szuppresszió aktiválása céljából ugyanezen antigénből injekció formájában is juttatunk a szervezetbe. A lenyelt vagy belélegzett antigén szupresszor T-sejtek képződését indukálja, melyek abba a mikrokömyezetbe vagy gyulladt szövetbe vándorolnak, ahol az injektált antigén található, és ott β-TGF-et szabadítanak fel. A felszabadított β-TGF minden immunsejtet legátol, köztük a károsító sejteket is.

A β-TGF az immunrendszer sejtjeit (például a T- és B-sejteket) gátolja, és ily módon befolyásolja a gyulladásos reakciókat. T-limfociták (nyiroksejtek) és más sejtek termelnek β-TGF-et, az immunválasz eseményei sorában viszonylag későn (a T-sejtek aktiválódása után). A β-TGF erősen gátolja a T- és B-sejtek szaporodását. Számos egészséges szövet képes β-TGF-et termelni. Ezek közé tartoznak az emberi vérlemezkék, a méhlepény, a marhavese, a csontszövet, NK-sejtek, Bsejtek, CD4+ és CD8+ T-sejtek és aktivált makrofágok. A β-TGF izolálása és tulajdonságairól szóló ismeretek a következő kiadványban találhatók: Transforming Growth Factor^s Chemistry, Biology and Therapeutics, szerkesztette Piez, K. A. és mások, Ann. N. Y. Acad. Sci. 593: 1-217,1990.

Bár a β-TGF-et eredetileg mint növekedési faktort írták le, hamarosan világossá vált, hogy számos és fontos immunológiai szabályozó tulajdonsága van, melyek közé tartozik a B- és T-sejtek gátlása (a CD4+ sejtek gátlása inkább, mint a CD8+ sejteké) mind rágcsálókban, mind emberben. A β-TGF-ről szintén ismert, hogy a gyulladást elősegítő citokinekkel, mint a tumomekrózis-faktor (TNF) és a γ-interferon (γ-IFN) ellentétes hatást fejt ki, a sejtölő nyiroksejtek működését akadályozza, továbbá az interleukin-l-(IL-l) és interleukin-2- (IL—2) receptorok megjelenését is gátolja, amivel a sejteket válaszképtelenné teszi ezen citokinekkel szemben. A β-TGF egy 25 kD molekulatömegű fehérje, két azonos, 12,5 kD tömegű alegységből áll, melyeket számos láncközti diszulfidhíd tart össze. A β-TGFnek legalább két: aktív és nyugvó formája létezik. Az aktív β-TGF-nek rövid a féléletideje és kicsi a térfogati megoszlása, az inaktív β-TGF-nek hosszabb a féléletideje és nagyobb a térfogati megoszlása. A β-TGF-nek két izoformája létezik, a βΙ-TGF és a βΙ-TGF. Azt gondoljuk, hogy a β2-TGF-nek van szerepe a bystander-szuppresszióban.

Ezen bejelentésben különféle modellrendszerekre hivatkozunk, amelyeket autoimmun betegségek tanulmányozására fejlesztettek ki. A kísérleti autoimmun agyvelőgyulladást (experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE) egerekben és más emlősökben tanulmányozták, mint a sclerosis multiplex (SM) modelljét. A témában átlagosan járatos szakember tudja, hogy gyakorlatilag valamennyi, az SM kezelésére szánt potenciális immunterápiai eljárást először ebben az állatkísérlett rendszerben próbálnak ki. A betegséget a mielin bázikus fehérje (myelin basic protein, MBP) vagy a proteolipid-fehérje (PLP) és valamely adjuváns, segédanyag (mint például a Freund-féle teljes adjuváns, Freund’s complete adjuvant, FCA) parenterális (az emésztőrendszert elkerülő) beadásával váltják ki. Ez a kezelés, bármelyik antigénnel a kettő közül, a betegség monofázisos vagy exacerbáló-remittáló formáját váltja ki, az állatfajtól és a beadás részleteitől függően. Ez a kiváltott betegség az SM autoimmun megbetegedés számos jellemzőjét mutatja.

HU 220 357 Β

A Mycobacterium tuberculosis parenterális beadása a Freund-féle teljes adjuvánssal együtt, olajban, fogékony emlősök faroktövébe olyan betegséget okoz, amelyik az emberi reumatoid arthritis jellemzőivel bír. Hasonlóképpen, a ΙΙ-es típusú kollagén parenterális beadása adjuvánssal szintén az emberi reumatoid arthritis jellemzőivel bíró betegséget okoz.

Lewis-patkányoknak S-antigént vagy IRBP-antigént adva adjuvánssal autoimmun uveoretinitist okozunk, míg a cukorbetegség spontán fejlődik ki NŐD egerekben és BB patkányokban.

A fent ismertetett állatkísérletes modellek bármelyike alkalmazható a jelen találmány tárgyát képező javított kezelés hatékonyságának igazolására. Valóban, az állatkísérletes modellek különösen alkalmasak a bystander-szuppressziót felhasználó kezelések tesztelésére pontosan azért, mert ez a mechanizmus képes valamennyi immunsejt gátlására, függetlenül az antigéntől, melyekre a sejtek specifikusak, így nem érzékeny az emberi betegség és az állatkísérletes modell valós vagy potenciális különbségeinek nagy részére.

A fenti állatkísérletes modellek felhasználhatóak a jelen találmány hasznosságának megítélésére, így például a jelen feltalálók szájon át adtak egy sclerosis multiplex-autoantigént, nevezetesen marhamielint, embereknek egy kettős vak kísérlet során és azt találták, hogy a betegek egy bizonyos részének jelentős előnye származott a kezelésből. Emellett olyan emberekben, akik szájon át kaptak kollagént (0,1-1,0 mg naponta egyszer), a reumatoid arthritis tünetei (ízületi gyengeség stb.) enyhültek. Végül orális S-antigénnel igen biztató eredményeket értek el uveoretinitis esetében, így az állatkísérletes modellekből levonható következtetéseket klinikai kísérletekben is sikerült kiterjeszteni.

Olyan bystander antigéneket, amelyek nem specifikusak az autoimmun betegség során megtámadott szövetre, nem toxikus antigének között lehet találni, az ÓVA esetében például az 1. példában használt tesztrendszer segítségével.

Valamely szervre vagy szövetre specifikus bystander antigéneket oly módon lehet azonosítani, hogy a szóba jövő antigének β-TGF-felszabadító képességét méqük, így például valamely autoimmun támadás célpontját képező szervből vagy szövetből, általánosan ismert antigéntisztítási eljárások segítségével tisztíthatunk egy vagy akár több szövetspecifikus bystander antigént.

Bystander antigéneket és autoantigéneket (úgyszintén ffagmenseiket és analóg vegyületeiket) rekombináns DNS-technológiával is elő lehet állítani, baktériumokban, élesztőben, rovarsejtekben és emlőssejtekben, olyan eljárásokkal, melyek a témában jártas szakemberek számára jól ismertek. Számos igazolt és feltételezett bystander antigén aminosavsorrendje ismert (a betegségokozó ffagmenseket előnyösen kizárva), például az alábbi közleményekből: Hunt, C. és munkatársai., PNAS (USA), 82: 6455-6459, 1985 (a hsp70 hősokk-fehéije); Burkhardt, H. és munkatársai., Eur. J. Immunoi. 27; 49-54, 1991 (a kollagén II immunogén epitópjai); Tuohy, V. K. és munkatársai., J. Immunoi.

142: 1523-1527, 1989 (az egér PLP agyvelőgyulladást okozó antigéndeterminánsai); Shinohara, T. és munkatársai., in Progress in Retinái Research, Osbome, N. és Chader, J. (szerk.), Pergamon Press 1989, 51-55 old. (S-antigén); Donoso, L. A. és munkatársai., J. Immunoi. 143: 79-83, 1989 (IRBP); Borst, D. E. és munkatársai., J. Bioi. Chem. 264: 1115-1123, 1989 (IRBP); Yamaki, K. és munkatársai., FEBS 234: 39-43, 1988 (S-antigén); Donoso, L. A. és munkatársai, Eye Rés. 7; 1087, 1988 (IRBP); Wyborsky, R. J. és munkatársai., Mól. Brain Rés. 8: 193-198, 1990 (GAD).

A marha-PLP; a marha-, emberi, csimpánz-, patkány-, egér-, nyúl-, tengerimalac-MBP; az emberi és marha-a-l-(II)-kollagén és a marha-a-l-(I)-kollagén; valamint az emberi inzulin aminosavsorrendje szakirodalmi forrásokból idézve a leírás végén, az igénypontok előtt megtalálható.

Továbbá számos szövetspecifikus antigén kapható a kereskedelemben: például inzulin, glukagon, mielin bázikus fehérje, I és II típusú kollagén stb.

A potenciális bystander antigént emlősökkel etetve, az emlősök lépsejtjeit vagy keringő T-sejtjeit például a vérből vagy az EAE, illetve SM esetében a gerincvelői folyadékból kinyerve, in vitro ugyanazon antigénnel ingerelhetjük. Az ingerlés hatására aktiválódott T-sejteket tisztíthatjuk, és a felülúszóikat a β-TGF jelenlétére mennyiségi vagy minőségi elemző módszerekkel tesztelhetjük, például megfelelő kereskedelmi, a β-TGF ellen termelt poliklonális vagy előnyösen monoklonális ellenanyaggal, vagy más ismert β-TGF mérési módszerrel, mint például az 1. példában ismertetett, kereskedelmi forgalomban lévő vidramenyét-tüdóhámsejtvonallal. Ilyen β-TGF mérőmódszereket az alábbi példákban ismertetünk részletesen. Autoantigénekből származó peptidek bystander-potenciáljának mérésére szolgáló módszereket szintén a példák között ismertetünk.

A jelen találmányban ismertetett bystander antigénekkel kiváltott tolerancia a szájon át (vagy enterálisan), illetve belélegzés útján a szervezetbe juttatott adagok széles skáláján dózis-hatás összefüggést mutatnak. Mindazonáltal létezik legkisebb és legnagyobb hatásos dózis. Azaz valamely autoimmun betegség klinikai és szövettani tüneteinek mérséklése egy meghatározott dózistartományban tapasztalható, mely dózistartomány betegségről betegségre, emlősről emlősre és bystander antigénről bystander antigénre változik. Például ha a betegség PLP- vagy MBP-kiváltott EAE egérben, a gátló dózistartomány MBP bystander antigén esetében körülbelül 0,1 és 1 mg/egér/etetés (körülbelül minden második napon etetve, például 5-7-szer 10-14 napon belül). Előnyösebben a dózis 0,25 mg/egér/etetés. Ugyanazon betegség gátlására patkányban az MBP dózistartománya körülbelül 0,5-től 5 mg/patkány/etetés-ig terjed, a legelőnyösebb adagolás 1 mg/patkány/etetés. SM-ben szenvedő emberek esetén a hatásos dózistartomány MBP használatakor körülbelül 1-körülbelül 100, előnyösen körülbelül 1-körülbelül 50 mg MBP naponta (minden nap vagy minden második napon adva), az optimum körülbelül 30 mg/nap.

HU 220 357 B

Reumatoid arthritis esetén az emberek hatásos adagja I-es vagy Π-es típusú kollagénből körülbelül 0,1-körülbelül 1 mg/nap. Egereknél adjuváns okozta arthritis kezelésére a hatásos kollagéndózis körülbelül 3-körülbelül 30 pg/etetés, az EAE-re fentebb ismertetett etetési rend szerint.

A hatásos dózistartomány és az optimum meghatározása a szakmai gyakorlat része, így például emberek és állatok hatásos dózisainak meghatározása történhet úgy, hogy viszonylag alacsony dózissal kezdünk (például 1 pg), majd fokozatosan (például logaritmusosan) emeljük a dózist és mérjük a β-TGF-et a vérben, vagy a betegség súlyosságát valamely általánosan elfogadott fokozati skála szerint (például 1-től 5-ig, vagy a hirtelen rosszabbodások számát alapul véve, vagy az ízületek duzzadását, a merevséget, a látás jellemzőit stb. mérve, a betegség természetétől függően). Az optimális dózis az lesz, amelyik a vérben a legtöbb βTGF-et szabadítja fel, vagy amelyik a betegség tüneteinek legnagyobb mérvű enyhülését okozza. Hatásos dózis az, amelyik a kezelt betegség legalább egy jellegzetes tünetének statisztikailag szignifikáns csökkenését okozza.

A jelen találmány szintén előnyösen felhasználható autoimmun betegségekre fogékony, fokozott kockázatú csoportba tartozó egyének/egyedeknél az autoimmun betegség kitörésének megakadályozására, így például az I-es típusú diabéteszre nézve fokozott kockázatú egyének azonosítására széles körben ismert, megbízható módszerek állnak rendelkezésre, melyeket az Amerikai Diabetes Társaság (Amerikán Diabetes Association, ADA) a közelmúltban hitelesített. Különféle tesztrendszereket fejlesztettek ki, amelyek (különösen kombinálva) jó prediktiv értéket mutatnak az I-es típusú diabéteszre való fogékonyság kimutatása tekintetében (Diabetes Care 13, 762-775, 1990). Egy előnyös szűrőmódszer részletei szakember számára hozzáférhetőek (Bonifacio, E. és munkatársai., The Láncét 355: 147-149,1990).

Gyakorlati szempontból a legtöbb autoimmun betegség kitörésének megelőzése kevésbé fontos, mint a diabétesz esetében. Az SM, RA, AT és az AUR korán felismerhetők, amikor még nem történt lényeges szövetkárosodás; következésképpen ezen betegségek megelőzése kevésbé fontos, mint a diabétesz esetében.

Az alább található 1. táblázat az autoimmun betegségek és az igazolt vagy potenciális bystander antigének nem teljes listája, mely utóbbiak hatásosak ezen betegségek kezelésében, ha szájon át vagy belélegeztetve adjuk őket. Az egyes betegségeknél felsorolt antigének kombinációi szintén várhatóan hatásosak lesznek az adott betegség kezelésében.

1. táblázat

Autoimmun betegség	Bystander antigén
1-es típusú diabétesz (megtartott βsejt-működéssel)	Glukagon, inzulin, GAD (γ-amino-dekarboxiláz), hősokk-fehétje

Autoimmun betegség	Bystander antigén
Sclerosis multiplex	MBP, MBP-peptidek (különösen a betegséget nem indukálok), PLP, PLP-peptidek (különösen a nem indukálok)
Reumatoid arthritis	Kollagén, kollagénpeptidek (különösen a nem indukálok), hősokkfehétje
Uveoretinitis	S-antigén, S-antigén-peptidek (különösen a nem indukálok), IRBP (Interfotoreceptor Retinoid-kötő Fehétje) és peptidjei (különösen a nem indukálok)

Bármely autoimmun betegség esetén használhatunk szövetkivonatokat csakúgy, mint specifikus bystander antigéneket. Például SM-ben mielint, 1-es típusú diabéteszben hasnyálmirigy-kivonatot használtak. Mindazonáltal egy vagy több egyedi, tisztított antigén használata előnyösebb.

így a jelen találmány szerint az 1-es típusú diabétesz kezelésére a glukagon valamely hatásos adagját (amelyet a fent leírtak szerint határoztunk meg) adjuk szájon át vagy belélegeztetve. A glukagon jellemzően a hasnyálmirigyben található. A glukagon azonban nem autoantigén, mert az 1-es típusú diabétesz folyamán a hasnyálmirigy β-sejtjei károsodnak, míg a glukagon egy másik sejtféleségben, az α-sejtekben található. Ilyen értelemben a glukagon tisztán bystander antigén: semmilyen autoantigén-aktivitása nincs.

Az inzulinnak határozott bystander-aktivitása van az 1-es típusú diabéteszben. Nem ismeretes jelenleg, hogy az inzulin autoantigénként is szerepel-e ebben a betegségben. Mindenesetre, a hatásmechanizmustól függetlenül, szájon át, enterálisan vagy belélegeztetve adott inzulinkészítmények hatásosak az 1-es típusú diabéteszjellemzőit mutató kórképekben, mint azt az amerikai egyesült államokbeli 595,468. számú szabadalmi bejelentésünkben leírtuk.

A sclerosis multiplex jellegzetességeit mutató betegségekben az MBP nem indukáló fragmenseit, például a tengerimalac-MBP 21-40. aminosavjait tartalmazó peptidet használhatjuk bystanderként, nemcsak MBP által kiváltott betegségben (azaz ahol az MBP az immunrendszer támadásának elsődleges célpontja), hanem PLP-kiváltott betegségben is (ahol a PLP az immunrendszer támadásának elsődleges célpontja).

Reumatoid arthritisben és állatkísérletes modelljeiben az I-es és ΙΙ-es típusú kollagénnek van bystanderaktivitása.

Uveoretinitis jellegű betegségekben az S-antigén mutat bystander-aktivitást.

Azoknak a bystander antigéneknek, amelyek maguk is autoantigének, előnyösen a betegséget nem indukáló fragmenseit használjuk. Ilyen ffagmenseket az átfedő peptidek módszerével találhatunk, ahogyan az a 3. példában szerepel. Ez a technika általánosan alkalmazható, bár a 3. példában kifejezetten az MBP nem indukáló fragmenseinek azonosítására használtuk.

HU 220 357 Β

A jelen feltalálók felfedezték azt is, hogy a szájon át adott autoantigének és bystander antigének olyan epitópokkal rendelkeznek, amelyek specifikusan a βTGF termelését és/vagy felszabadulását okozzák. Már korábban leírták például a MBP immunológiailag jelentős (immundomináns) epitópjait, vagyis azokat az epitópokat, amelyeket a betegek CD4+ T-sejtjeinek többsége felismer és jelenlétükben szaporodásnak indul. Ezzel szemben immunszuppresszív epitópokat, azaz olyanokat, amelyek a β-TGF termelését és/vagy felszabadulását okozzák, a jelen bejelentés előtt mások nem hoztak nyilvánosságra, és nem is javasoltak. Ilyen epitópokat tartalmazó peptidek szájon át vagy belélegezve történő beadása várhatóan specifikusabb módon vezet bystander-szuppresszióhoz, mint az egész antigénmolekula beadása anélkül, hogy az állatot kitennénk az autoantigén molekula betegségindukáló vagy betegségelősegítő részeinek. Az immunszuppresszív epitópokat a 3. példában az MBP 21-40 peptid azonosítására leírt módszer szerint találhatjuk meg a molekulán belül (úgyszintén lásd a 14. ábrát).

A bystander-antigéneket autoantigénekkel együtt is lehet adni az autoimmun betegségek kezelésére vagy megelőzésére. Az autoantigén beadását az amerikai egyesült államokbeli 460,852, 596,936, 454,486, 551,632, 502,559, 607,826 és a fent említett 595,468. számú szabadalmi bejelentések alapján végezhetjük. Várhatóan a specifikus autoantigének (és előnyösen az autoantigének nem indukáló fragmenseinek) beadása más bystander antigénekkel együtt az autoimmun betegség hatékony kezelését eredményezi.

Emellett szinergistákat is be lehet vonni a kezelésbe, hogy a fentiek hatékonyságát javítsuk. A jelen találmány vonatkozásában szóbajövő szinergisták példaképpen, többek között a Gram-negatív baktériumok széles skálájából, például az E. coli és a Salmonella különféle altípusai által termelt lipopoliszacharidok (LPS, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo, USA; Difco, Detroit, USA; BIOMOL Rés. Labs., Plymouth, PA), lipid A (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo, USA; ICN Biochemicals, Cleveland, OH, USA; Polysciences, Inc., Warrington, PA, USA) és immunológiai szabályozó lipoproteidek, mint például a tripalmitoil-S-glicarilciszteinil-szeril-szerinhez (P3 C55) kovalensen kötött peptidek, melyeket a Deres, K. és munkatársai által a Natúré 342: 561-564,1989-ben leírtak szerint nyerhetünk; vagy az E. coli „Braun” lipoproteidje, amelyet a Braun, V.: Biochim. Biophys. Acta 435: 335-337, 1976 közleményben leírtak szerint nyerhetünk. Előnyösen LPS-t, különösen előnyösen Lipid A-t használunk. A Lipid A különösen előnyös a jelen találmány szempontjából, mert kevésbé toxikus, mint az LPS. Az LPS-t a jelen találmány céljaira Gram-negatív baktériumokból nyerhetjük ki, és a Galanes és munkatársai, Eur. J. Biochem. 9: 245, 1969, valamint a Skelly, R. R. és munkatársai, Infect. Immun. 23: 287, 1979 által leírt módszerekkel tisztíthatjuk.

Más szempontból a jelen találmány tárgyát képezik olyan, autoimmun betegségben szenvedő emlősök kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmények, amelyek valamely bystander antigént tartalmaznak az autoimmun betegségek tüneteinek csökkentése szempontjából hatásos mennyiségben. Ezekben a készítményekben, ahogyan azt az Amerikai Egyesült Államokban 1990. március 2-án benyújtott 487.732 számú szabadalmi bejelentésünkben leírtuk, tetszés szerint alkalmazhatunk szinergistákat az autoimmun betegség klinikai tüneteinek kezelésére hatásos mennyiségben, a jelen találmány tárgyát képező bystander antigénnel együtt. A szinergisták, ha bystander antigénnel együtt adjuk őket, a PGE (prosztaglandin E) és IL-4 (interleukin-4) citokinek szintjének növekedését okozzák a célszerv közelében.

A jelen leírásban úgy tekintjük, hogy valamely autoimmun betegség akár egyetlen tünetének a kezelés hatására bekövetkező, statisztikailag szignifikáns enyhülése a jelen találmány körébe esik.

Minden egyes szájon át (vagy enterálisan) alkalmazott, a jelen találmány tárgyát képező készítmény tartalmazhat inaktív, inért alkotórészeket, mint gyógyszertanilag elfogadható hordozókat, oldószereket, kitöltőanyagokat, oldatba vivő vagy emulgeálószereket, sókat, amint az a szakmában közismert. Például tablettákat készíthetünk a szakmában jól ismert eljárásoknak megfelelően. A jelen találmány szerint alkalmazott kapszulákat bármely gyógyszertanilag elfogadott anyagból lehet készíteni, mint például a zselatin, vagy a cellulózszármazékok. Késleltetett hatású, szájon át alkalmazott készítmények, vagy a bélfal belső bevonatai szintén alkalmazhatók, például a következő amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban ismertetettek (a közölt dátumok a megadás dátumai): 4,704,295 (1987. november 3); 4,556,552 (1985. december 3); 4,309,404 (1982. január 5) és 4,309,406 (1982. január 5).

Alkalmazható szilárd hordozók például a keményítő, cukor, bentonit, szilika, vagy bármely általánosan használt hordozó. További példák a jelen találmány szerinti készítményekben használható hordozókra és oldószerekre a sóoldat, cukorszirup, dextróz és a víz.

Nyilvánvaló, hogy valamely készítmény egységnyi adagja nem szükségszerűen tartalmazza a hatóanyag(ok) hatásos mennyiségét, minthogy a szükséges hatásos dózist az egységnyi adag (például tabletta, kapszula vagy ezek kombinációi) többszöri beadásával is biztosítani lehet.

A jelen találmány tárgyát képező bystander antigének előnyös beadási módja a szájon át vagy az enterális (közvetlenül a gyomor-bél traktusba történő). Az előnyös orális vagy enterális gyógyszerkészítmények állhatnak például egy tablettából vagy kapszulából, amelyek a jelen találmány tárgyát képező bystander antigének) hatásos mennyiségét tartalmazzák valamely szinergista hatásos mennyiségével vagy anélkül.

Általánosságban, orális vagy enterális alkalmazás esetén a bystander antigént egyetlen dózisban vagy többszöri dozírozásban lehet adni.

A bystander antigénekkel együtt adott szinergisták, például az LPS vagy a Lipid A hatásos mennyiségei széles határok között változhatnak, az adott emlős testsúlykilogrammjára vonatkoztatva naponta 0,15 és 15 mg között, előnyösen 0,3 és 12 mg/kg testsúly/nap között.

HU 220 357 Β

A jelen találmány egy másik előnyös megvalósítása szerint az autoimmun betegségben szenvedő állatnak a gyógyszerkészítmény beadható belélegeztetés (inhalálás) útján is, előnyösen aeroszol formájában. Előnyösen a szervezetbe való bejuttatás nem az orrjáratokon, hanem a hörgők és a tüdő felszínén történik. Várhatóan a jelen találmány tárgyát képező bystander antigének kisebb mennyisége is elegendő lesz az autoimmun betegség kezelésére, amint azt a kísérletes autoimmun agy velőgyulladás (EAE) mielin bázikus fehérjével (MBP) történő kezelésénél találtuk, az 1989. december 20-án az Amerikai Egyesült Államokban benyújtott 454.486 számú szabadalmi bejelentésünkben leírtak szerint. A jelen találmány tárgyát képező bystander antigének aeroszol formájában a szervezetbe juttatható mennyisége körülbelül 0,1 és körülbelül 15 mg/kg testsúly/nap között lehet, és tetszés szerint magában foglalhat valamely szinergistát körülbelül 0,1 és körülbelül 15 mg/kg testsúly/nap közötti mennyiségben, egyszeri vagy többszöri adagban. A pontos beadandó adag függ a betegség súlyosságától és a beteg fizikai állapotától.

A jelen találmány tárgyát képező aeroszolos készítmény tartalmazhat tetszés szerint további alkotórészeket, mint gyógyszertanilag elfogadható hordozókat, oldószereket, oldatba vivő vagy emulgeálószereket, sókat, amint az a szakmában közismert. Ilyenekre példa többek között a normál élettani sóoldat, mint például az élettanilag pufferolt sóoldatok, és a víz.

A jelen találmány ezen megvalósításában a bystander antigének bejuttatása aeroszolként vagy belélegzés útján történik. A jelen találmány tárgyát képező bystander antigének és rokon anyagok bejuttatása történhet szilárd porrészecskék formájában, vagy valamely hordozógázban (például levegő vagy nitrogén) eloszlatott vizes oldatként. Előnyös aeroszolos gyógyszerkészítmények állhatnak például valamely élettanilag elfogadható pufferolt sóoldatból, amely a jelen találmány tárgyát képező bystander antigén(eke)t 1 mg és 300 mg közötti mennyiségben tartalmazzák.

A jelen találmány megvalósítása szempontjából úgyszintén használhatóak a száraz aeroszolok, amelyek a bystander antigének nem folyadékban oldott, szilárd finom részecskéiből állnak. A bystander antigének füstölgő porok formájában szerepelhetnek, amelyek átlagos részecskemérete körülbelül 1 és 5 pm között van, előnyösen 2 és 3 pm között. Finoman eloszlatott részecskéket a szakmában jól ismert technikákkal, porrá töréssel és szitálással lehet előállítani. A részecskéket a por valamely meghatározott mennyiségének belélegzésével lehet a szervezetbe juttatni.

A jelen találmány tárgyát képező aeroszolos gyógyszerkészítményekben használható hordozók és hígító-, illetve oldószerek közé tartoznak többek között a víz, valamint az élettanilag elfogadható módon pufferolt sóoldatok, mint például a foszfáttal pH 7,0-8,0 közé pufferolt sóoldat. A jelen találmány tárgyát képező aeroszolos gyógyszerkészítményekben használható hordozók és hígító-, illetve oldószerekre további példák az amerikai egyesült államokbeli, 1987. április 17-én megadott, US 4,659, 596. számú, továbbá az 1989. szeptember 5-én megadott, 4,863,720. számú, és az 1987. október 6-án megadott, 4,698,332. számú szabadalmakban találhatók.

A jelen találmány tárgyát képező aeroszolos gyógyszerkészítmény példának okáért olyan aeroszolos spray (permet) formájában kerülhet beadásra, amelyet az amerikai egyesült államokbeli, 1986. november 25-én megadott, 4,624,251. számú, továbbá az 1972. november 21-én megadott 3,703,173. számú, valamint az 1971. február 9-én megadott, 3,561,444. számú és az 1971. január 13-án megadott, 4,635,627. számú szabadalmakban leírt ködképző szerkezetek valamelyikével állítottak elő. Az aeroszolt a kezelt személy vagy állat belélegzi.

A jelen találmány megvalósításakor használhatók még más aeroszolos adagoló rendszerek is, mint például a nyomás alatt működő adagoló inhalálókészülék (pressurized metered dose inhaler, MDI), vagy a száraz port belélegeztető készülék, amelyek leírása a következő könyvfejezetben található: Newman, S. P.: in Aerosols and the Lung, szerkesztette Clarké, S. W. és Davia, D., 197-224. oldal, Butterworths, London, England, 1984.

Ilyen típusú aeroszoladagoló rendszereket kereskedelmi forgalomban is lehet kapni, például a Fisons Corporation (Bedford, MA, USA), a Schering Corp. (Kenilworth, NJ) és az American Pharmoseal Co. (Valencia, CA) cégektől.

Amint azt a témában járatos szakemberek látni fogják, a jelen találmány tárgyát képező bystander antigének pontos adagja és a beadás gyakorisága (orális vagy aeroszolos készítményként) függ a bystander antigén aktivitásától, továbbá a kezelt személy korától, nemétől, testsúlyától és fizikai állapotától, valamint más kezelések egyidejű alkalmazásától vagy nem alkalmazásától. Következésképpen a használt dózisokat és kezelési sémákat ezen tényezők alapján kell megállapítani, és adott esetben kísérletekkel meghatározni. Ez a fajta kísérleti meghatározás azonban pusztán rutinkísérleteket igényel, az itt leírt alapelveknek megfelelően.

A találmány szerinti megoldást az alábbiakban példákkal szemléltetjük részletesebben, anélkül azonban, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk.

Az 1. példa azt mutatja be, hogy a bl-TGF aktív formája a MBP-specifikus CD4+ T-sejtek gátlását okozza, és hogy MBP etetésével állatokban CD8+ sejteket indukálunk, melyek β-TGF felszabadulását okozzák, valamint hogy maga a β-TGF felelős a gátlásért. Ugyanezen példa azt is demonstrálja, hogy olyan antigének, amelyek nem autoantigének, sőt nem is specifikusak a megtámadott szervre vagy szövetre, T-szupresszor sejteket aktiválnak, melyek β-TGF felszabadulását okozzák. Ezt az ovalbumin (tojásalbumin) szájon át történő beadásával mutatjuk be. Az ovalbuminnal az a probléma, hogy miután nem specifikus az autoimmun reakció által érintett szövetre, önmagában nem képes a szupresszor T-sejteket arra a helyre irányítani, ahol az autoimmun reakcióban részt vevő sejtek találhatók. Ezzel a problémával a 2. példában foglalkozunk. Az 1. példa azt is bemutatja, hogy nem minden szájon át adott anti9

HU 220 357 Β gén okoz bystander-típusú szuppressziót: a marhaalbumin nem okoz.

Végül az 1. példa bemutatja azt is, hogy ugyanezen mechanizmus (a bystander-szuppresszió) működik, amikor az EAE-t MBP szájon át történő adásával kezeljük.

A 2. példa azt mutatja be, hogy valamely antigén, amelyik bysander-szuppresszióra képes, szájon át történő beadáskor β-TGF-felszabadulást okoz, továbbá hogy amennyiben az ezen antigén által aktivált szupresszor T-sejteket sikerül arra a helyre irányítani, ahol az autoimmun válaszban részt vevő sejtek találhatóak, ez utóbbi sejtek gátlás alá kerülnek. A 2. példa továbbá egy eljárást mutat be a szupresszor sejteknek a megfelelő helyre irányítására, mely eljárás abban az esetben is használható, ha az antigén nem specifikus az autoimmun reakció által megtámadott szövetre. Végül a 2. példa azt is bemutatja, hogy a szupresszor T-sejtek, amelyek a β-TGF felszabadulását okozzák, nem feltétlenül kell hogy közvetlen érintkezésbejussanak a gátolni kívánt sejtekkel annak érdekében, hogy a gátlás létrejöjjön.

Az eljárás, melynek segítségével a bystander antigén hatékonnyá tehető (azaz arra kényszeríthető, hogy a β-TGF-et a betegségokozó sejtek közelében szabadítsa fel) abban áll, hogy ugyanazon antigénből lényegében egyidejűleg (a bystander szájon át való beadásától számított 24 órán belül, előtte vagy utána) injekcióval is juttatunk a szervezetbe. Például, amikor OVA-t etetünk az állatokkal, majd MBP/CFA-val immunizáljuk őket EAE kiváltása céljából, egy OVA-injekció elnyomja az EAE-t. Ennek oka, hogy mind az EAEokozó sejtek (amelyeket az OVA-aktivált szupresszor sejtek nem ismernek fel), mind az OVA-specifikus Tsejtek (melyek az OVA-ra specifikusak, csakúgy, mint az OVA-aktivált szupresszor sejtek) a nyirokcsomókban gyűlnek össze. Ennek jelentősége a terápiában az, hogy nem specifikus bystander antigéneket is használhatunk az autoimmun betegségek elleni küzdelemben, ha a nekik megfelelő szupresszor T-sejteket oda tudjuk irányítani, ahol a betegségokozó sejteket gátolni fogják. Habár az ilyen nem specifikus bystander antigének használata elsődlegesen a specifikus bystander-kezelés kiegészítőjének tekinthető, mindenképpen a jelen találmány tárgyát képezi.

A 3. példa a betegséget nem indukáló fragmensek, továbbá elsősorban immunszuppresszív fragmensek azonosítására szolgáló módszert mutat be egy olyan bystander, az MBP esetében, amelyik egyben autoantigén is. Mindazonáltal a technika általánosan használható bármely antigén esetében, amelynek az aminosavsorrendje ismert (ld. a 10., 11. és 14. ábrákat is).

A 3. példa továbbá azt is bemutatja, hogy az autoantigéneknek vannak olyan fragmenseik (például a tengerimalac-MBP immundomináns epitópja, az MBP 71-90, amelyik EAE-t vált ki), amelyek nem vesznek részt a β-TGF felszabadításában, és a bystander-szuppresszióban sem. így a 3. példa azt is illusztrálja, hogy az előnyös megoldás a tisztán bystander-szuppresszió, legalábbis az autoantigén immundomináns, betegségokozó fragmenseit nem szabad használni, hanem helyettük olyan származékokat kell használni, amelyekből a betegségokozó epitópokat kihagyjuk, míg az immunszuppresszív epitópokat nem. A 3. példa azt is bemutatja, hogy a bystander-szuppresszióra képes antigénekben vannak immunszuppresszív epitópok, és hogy az autoantigének esetében az immunszuppresszív epitópok nem azonosak az autoimmun válaszért felelős epitópokkal.

A 4. példa bemutatja, hogy az autoimmun válaszban részt vevő sejtek és citokinek valóban jelen vannak az MBP/CFA-val immunizált állatok agykérgében és kisagyában, de hiányoznak a kontroll- (egészséges) állatok megfelelő szerveiből, míg a szuppresszióban részt vevő sejtek és citokinek megtalálhatók az immunizált, és MBP-vel vagy MBP-vel és LPS-sel etetett állatokban.

Az 5. példa bemutatja az inzulin A-lánc, az inzulin B-lánc, négy inzulin B-lánc-fragmens, valamint a glukagon hatékonyságát az 1-es típusú diabétesz-szel járó hasnyálmirigy-gyulladás (NŐD egérmodell) bystanderkezelésében. Ez a fajta hasnyálmirigy-gyulladás (insulitis) a szigetsejteket érinti, és az 1-es típusú diabétesz kezelésének jó indikátora, minthogy (a) ugyanazon mechanizmus váltja ki, mint az 1-es típusú diabéteszt, (b) csak addig áll fenn, amíg az autoimmun károsítás folyik, azaz ameddig az alany még mutat valamelyes szigetsejt-működést.

A 6. példa azt mutatja be, hogy valamely autoantigén szerepelhet bystander antigénként valamely másik autoantigén esetében. A példában az MBP szerepel a PLP bytsander antigénjeként. (A PLP-nek is megvan az a képessége, hogy az MBP-indukált betegséget elnyomja, azaz a PLP is bystandere az MBP-nek.)

A 6. példa bemutatja továbbá, hogy a bystanderszuppressziótól eltérően az intravénás tolerizáláshoz ugyanaz az antigén kell, amelyik az autoimmun támadás célpontja (vagy amellyel valamely állatkísérletes modellben a betegséget előidéztük).

1. példa

Orális tolerizálással aktivált, mielin bázikus fehérjére specifikus szupresszor T-sejtek $-TGF felszabadítása révén elnyomják az antigénspecifikus immunválaszt in vitro és in vivő.

Az alább ismertetett kísérletekben a következő anyagokat és módszereket használjuk:

Állatok. 6-8 hetes nőstény Lewis-patkányokat a Harlan-Sprague Dawley Inc. (Indianapolis, IN, USA) cégtől veszünk, majd szokásos, korlátlan mennyiségű laboratóriumi takarmányon és vizen tartjuk őket.

Antigének. Tengerimalac mielin bázikus fehérjét agyszövetből tisztítunk Deibler és munkatársai, Prep. Biochem. 2: 139, 1972 módszere szerint, az amerikai egyesült államokbeli, 1990. március 2-án benyújtott, 07/484,732 számú szabadalmi bejelentésben leírt módosításokkal. A fehéijetartalmat és a tisztaságot gélelektroforézissel és aminosavelemzéssel ellenőrizzük.

Vegyszerek. A kereskedelemből beszerzett vegyszerek a következők: patkány-y-interferont semlegesítő monoklonális egérellenanyag (Amgen Biologicals, Thousand Oaks, CA, USA); egér α+β-TNF ellen ter10

HU 220 357 B melt hörcsög monoklonális ellenanyag (Genzyme, Boston, MA, USA); βΙ+2-TGF ellen termelt nyúl poliklonális ellenanyag (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA); és indometacin (Sigma, St. Louis, MO, USA). A β-TGF 1. típusú izoformája ellen pulykában termelünk ellenszérumot, Danielpour, D. és munkatársai, J. Cell. Physiol. 138: 79-86, 1989 módszere szerint.

Orális tolerancia előidézése. Patkányokat 1 ml PBSben feloldott 1 mg MBP-vel, vagy csak PBS-sel etetünk közvetlenül a gyomorba, 18-as rozsdamentes állatetető tű segítségével (Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA). Az állatokat 2-3 naponként, összesen öt alkalommal etetjük, az utolsó etetés az immunizálás előtt két nappal történik. Ennek célja tolerancia kiváltása.

Sejtszaporodási válaszok in vitro gátlása felülúszókkal. Az utolsó etetés után 7-14 nappal a lépsejteket eltávolítjuk, és egysejtes szuszpenziót készítünk a lépet rozsdamentes acélszitán keresztülpréselve. A felülúszók készítéséhez a lépsejteket 5 χ 10⁶ sejt/ml töménységben in vitro stimuláljuk MBP-vel (50 pg/ml) 10 ml sejttenyésztő közegben. A sejttenyésztő közeg RPMI 1640 (GIBCO, Grand Island, NY, USA), amihez 2x10 ⁵ mol/liter 2-merkaptoetanolt, 1% nátrium-piruvátot, 1% penicillint és strepromicint, 1% glutamint, 1% HEPES puffért, 1% nem esszenciális aminosavkeveréket és 1% autológ szérumot adunk. A felülúszókat 24 óra után levesszük, és 1,0 ml-t adunk 2,5 xlO⁴ MBP-specifikus T-sejthez, amelyeket Ben-Nun, A. és munkatársai, Eur. J. Immunoi. 11: 195-199, 1981 módszere szerint tenyésztünk 5χ 10⁵ db, 2500 rad-dal besugárzott timocitával együtt, 0,1 ml sejttenyésztő közegben. MBP-t (50 pl/ml) adunk a tenyészethez 20 pl térfogatban. A kísérleteket három párhuzamos beállításban végezzük, gömbölyű aljú tálcákon (Costar, Cambridge, MA, USA). A sejteket 72 óráig tenyésztjük 37 °C-on, nedvesített inkubátorban, 6% CO₂ és 94% levegő keverékében, majd 1 pCi ³H-timidint adunk minden egyes mérőhelybe legalább 18 óra időtartamra. A tenyészeteket üvegszálas szűrőpapírra visszük át egy multihar vés terel, és szokásos folyadékszcintillációs technikákkal mérjük a sejtekbe beépült ³H-timidin mennyiségét.

Ennek a célja az orális tolerizálás oldható faktorai mérési módszerének beállítása.

T-sejt alcsoportok tisztítása. Nyiroksejtalcsoportok szelektív eltávolítását Cruikshank módosított módszerével végezzük (J. Immunoi. 138: 3817-3823, 1987), mágneses részecskék segítségével. A lépsejteket egérben termelt antipatkány-CD8, CD4 vagy B-sejt-specifikus monoklonális ellenanyagokkal (1:10 hígítás, OX/8, W3/25 és OX/33 jelű kiónok, kereskedelmi forgalomba hozza a Serotec/Bioproducts, Indianapolis, IN, USA) inkubáljuk 30 percig jégfiirdőben, kétszer mossuk, majd előre mosott mágneses részecskékhez adjuk, amelyek átlagos átmérője 4,5 pm (M-450), amelyekhez előzőleg kecske-antiegér IgG-t kötöttek (Dynal Inc., Fort Lee, NJ). A használt mágneses részecskemennyiséget úgy adjuk meg, hogy az eltávolítani kívánt sejtek mindegyikére körülbelül 10 mágneses részecske jusson. A sejteket a mágneses részecskékkel 0,5 ml 10% fetális borjúsavót tartalmazó RPMI 1640ben inkubáljuk egy 10 ml-es gömbölyű aljú csőben (Nunc), 30 percig jégen, 5 percenként gyengéden megrázva a csövet. Inkubáció után a sejtmágneses részecskeszuszpenziót 5 ml tápfolyadékkal mossuk, és a sejtrészecskekomplexeket a szabad sejtektől erős mágneses térben, mágneses részecskekoncentrátorral (DynalMPC-1) 2 perc alatt elválasztjuk. A felülúszót eltávolítjuk, és az eljárást kétszer megismételjük. Az adott ellenanyaggal mentesített Τ-sejt-, illetve B-sejt-készítmény 95%-nál több CD4+CD8-, vagy CD4-CD8 + , vagy CD4+CD8+, illetve CD4+CD8+OX/33- sejtet tartalmaz, áramlásos citometriával mérve. MBP-vel etetett és kontrollállatok lépsejtjeit (5xl0⁶ sejt) 50 pg/ml MBP jelenlétében tartjuk 1 ml szérummentes tápfolyadékban. Az adott sejtektől mentesített sejtkeverékeket 2,5xl0⁶/ml töménységben tartjuk. A felülúszókat 24 óra után begyűjtjük, és 0,1 ml-t adunk a szaporodó sejtekhez, amint azt fentebb leírtuk.

Ennek célja specifikus T-sejt alcsoportok izolálása annak meghatározására, hogy mely T-sejtek játszanak szerepet a bystander-szuppresszióban.

A felülúszók kezelése citokinellenes ellenanyagokkal. MBP-vel etetett és kontrollállatokból kivett lépsejteket (5 χ 10⁶/ml tápfolyadékban) 50 pg/ml MBP jelenlétében tartunk, és γ-interferont, β-TGF-et, a- és β-TNF-et (tumor necrosis factor) semlegesítő ellenanyagot vagy indometacint adunk hozzájuk. Az ellenanyagokat többféle hígításban (1:250, 1:500, 1:1000) adjuk, az indometacint 0,5-1 pg/ml koncentrációban. 24 óra elteltével a felülúszókat begyújtjuk, a szabad ellenanyagot és az ellenanyag-citokin komplexeket antiIgG-vel borított mágneses részecskék (Dyanbeads, Dynal, Inc., Fort Lee, NJ, USA) segítségével eltávolítjuk úgy, hogy milliliterenként 4xl0⁷ részecskét inkubálunk a felülúszóban 30 percig, majd eltávolítjuk a részecskéket Liabakk és munkatársai, Scand. J. Immunoi. 30: 641, 1989 leírása szerint, egy Dynal Magnetic Partiele Concentrator (Dynal MPC-1) eszköz segítségével. Az eljárást kétszer végezzük minden egyes felülúszó esetében.

Ennek a kísérletnek az a célja, hogy az orális tolerizálás során termelődő citokineket vizsgáljuk.

Β-TGF mérése szérummentes felülúszókban. A szérummentes felülúszókat a következő leírt eljárások szerint gyűjtjük: Kehri és munkatársai, J. Exp. Med. 163: 1037-1050,1986 és Wahl, és munkatársai, J. Immunoi. 145: 2514-2419, 1990. Röviden: a sejteket először 8 óráig 50 pg/ml MBP jelenlétében tartjuk savótartalmú tápfolyadékban. Ezután a sejteket háromszor mossuk, és szérummentes tápfolyadékban további 72 óráig tartjuk, a felülúszókat összegyűjtjük, és lefagyasztva tároljuk. A felülúszók β-TGF-tartalmát egy vidramenyét-tüdősejtvonal (American Type Culture Collection, Bethesda, MD, USA, katalógusszám CCL-64) segítségével határozzuk meg, a fent említett, Danelpur és munkatársai által írt közlemény alapján, és szendvicsenzimkötött immunoassay (ELISA) használatával ellenőrizzük (Dianielpour és munkatársai, Growth Factors 2: 61-71, 1989.)

HU 220 357 Β

Az aktív β-TGF arányát savas előkezelés nélkül végzett meghatározással adjuk meg.

Ennek a kísérletnek a célja az orálisan tolerizált állatokból kinyert T-sejtek által termelt β-TGF a mérése és izoformájának meghatározása.

Állatok immunizálása. Jelentős EAE-betegség kiváltása céljából Lewis-patkányokat immunizálunk 25 pg MBP-t adva a bal talpba. Az MBP-oldat 50 μΐ-ét előzetesen 50 pl Freund-féle teljes adjuvánssal, mely 4 mg/ml Mycobacterium tuberculosis-t tartalmaz (Difco), emulzióvá keverjük.

Anti-fi-TGF immunsavó és kontrollsavók in vivő alkalmazása. Az in vivő kísérletekben pulykában termelt, a β-TGF 1-es izoformájára specifikus immunsavót alkalmazunk, amint azt Danielpur és munkatársai leírják (lásd fent). A savót 56 °C-on 30 percig inaktiváljuk injektálás előtt. Csoportonként 5 állatot injekciózunk intraperitoneálisan (ip.) a pulyka immunsavó, illetve kontrollpulykasavó különböző hígításaival (12,5; 25 vagy 50 pl-t 100 pl-re hígítva PBS-sel) naponta ötször az MBP/CFA immunizáláshoz képest a -2., 0., +2., +4., +6. napon. Az immunsavó 1 pl-e általában 4 mg/ml ^l25J izotóppal jelzett βΙ-TGF kötődését akadályozza meg A549 sejtekhez (Danielpour és munkatársai, 1990, lásd fent). így kezeljük mind az orálisan tolerizált, mind a nem tolerizált állatokat, mely utóbbiakban EAE fog kifejlődni.

Ezen kísérletek célja, hogy az anti^-TGF immunsavó hatását vizsgáljuk in vivő az orális tolerancia kialakulására, és megfigyeljük, hogy a β-TGF-aktivitást az immunsavó megszünteti-e.

Klinikai értékelés. Az in vitro kísérletek és a klinikai betegség közötti összefüggések vizsgálata céljából az állatokat mindennap vizsgáljuk az EAE tüneteinek meglétére anélkül, hogy a vizsgálatot végző személy tudná, melyik állat milyen kezelést kapott. Az EAE klinikai súlyosságát a következőképpen értékeljük: 0, nincs betegség; 1, petyhüdt farok; 2, egyik hátsó comb bénulása; 3, mindkét hátsó comb bénulása; 4, mind a négy végtag bénulása; 5, halál. A betegség időtartamát a betegség első jelentkezésétől (általában az immunizálás után 10-11 nap) az állat haláláig vagy teljes gyógyulásáig adjuk meg.

Késői típusú túlérzékenység (delayed type hypersensitivity, DTH) tesztelése. A DTH tesztelésére 25 pg PBS-ben oldott MBP-t injektálunk a fülbe. Ez előtt és 48 órával később mikrométer-tolómérővel (Mitutoyo, Japán) mérjük a fül vastagságát anélkül, hogy a vizsgálatot végző személy tudná, melyik állat milyen kezelést kapott. A változást kezelési csoportonként, mint átlagokat és az átlagok hibáját adjuk meg.

A DTH-választ azért mérjük, mert ugyanúgy a CD4+ T-sejtek közvetítik, mint az EAE-t.

Statisztikai elemzés. Az átlagokat egyoldali Student-féle t-próbával hasonlítjuk össze, míg a betegség előfordulását a különféle csoportokban chi-négyzetelemzéssel vizsgáljuk, amint az a témában átlagosan járatos szakember számára nyilvánvaló.

Kísérleteket hajtunk végre annak eldöntésére, hogy az orálisan MBP-vel tolerizált patkányokból származó lépsejtekből bizonyos sejtféleségeket eltávolítva, a megmaradó sejtek felülúszója MBP-ingerlés után képes-e egy MBP-re szaporodó sejtvonal gátlására. Mint azt az 1. ábra mutatja, az orálisan MBP-vel tolerizált patkányokból származó lépsejtekből a B-sejteket és a CD4+ sejteket lehet eltávolítani úgy, hogy a megmaradó sejtek felülúszója MBP-ingerlés után gátolja az MBP-re szaporodó sejtvonalat. A BSA-val etetett állatok lépsejtjeinek és az MBP-vel etetett állatok CD8+-sejtektől mentesített lépsejteknek a felülúszója nem gátol. Ezek szerint a gátlás az etetett antigénre specifikus, és CD8+ szupresszor sejteket igényel.

Annak megállapítására, hogy melyik ismert citokin felelős a gátlásért, a feltételezetten szerepet játszó citokinek ellen termelt, a citokinek hatását semlegesítő ellenanyagokat adunk a felülúszókhoz, hogy a citokinek aktivitását megszüntessük. Amint azt a 2. ábra mutatja, nyúlban termelt, β-TGF elleni ellenanyag dózisfüggő módon megszünteti a felülúszók gátló hatását. A γ-IFN- és α+β-TNF-elleni ellenanyagok, valamint indometacin nevű prosztaglandin-blokkoló anyag hozzáadásakor a gátlás felfüggesztését nem tapasztaljuk. Maga a gátlás nem alakul ki, ha anti^-TGF ellenanyagokat adunk közvetlenül az MBP-specifikus T-sejtvonalhoz (az adatokat itt nem mutatjuk be). Mindez arra utal, hogy a β-TGF felelős az 1. ábrán megfigyelhető gátlásért, és hogy a gátlást oldható hatóanyag közvetíti.

Annak érdekében, hogy az MBP-vel etetett állatokból származó és in vitro stimulált lépsejtek felülúszójában a β-TGF jelenlétét közvetlenül kimutassuk, a felülúszókat savómentesen állítjuk elő, és közvetlenül βTGF-et mérünk belőlük, ahogyan azt fentebb ismertettük. Amint azt a 3. ábra mutatja, az MBP-vel etetett állatokból származó és in vitro MBP-vel stimulált lépsejtek MBP jelenlétében bocsátanak ki β-TGF-et, MPB nélkül nem. Továbbá akkor is tapasztalunk β-TGF-felszabadítást, ha OVA-val (ovalbuminnal) etetett állatok lépsejtjeit in vitro OVA-val stimuláljuk. Egy, a βΙ-TGF-et és a β2-ΤΟΕ-εΙ blokkoló ellenanyagokat használó ELISA segítségével kimutathatjuk, hogy a β-TGF a βΐizotípusba tartozik. Továbbá a felszabadult β-TGF az aktív, nem a latens formába tartozik. Az MBP-vel etetett állatokból származó és in vitro MBP-vel stimulált lépsejtek általában 6,8 ±1,7 ng/ml β-TGF-et termelnek, amiből 68 ±9% az aktív forma. MBP-vel etetett állatokból származó és in vitro a T-sejteket nem specifikusan szaporodásra késztető anyaggal, Concanavalin A-val (Con A) stimulált lépsejtek felülúszójában nem találunk β-TGF-et, habár a latens β-TGF kis mennyiségeit (tipikusan például 2,1 ±0,45 ng/ml) igen.

Annak megállapítására, hogy a β-TGF-nek van-e szerepe az EAE elnyomásában MBP-etetett állatoknál, pulyka anti^-TGF ellenszérumot adunk in vivő. Mint azt a 4. ábra mutatja, a PBS-sel vagy kontrollpulykaszérummal kezelt állatokban 2,5-3,5 súlyossága, bénulással járó EAE fejlődik ki körülbelül a 13. napra. MBP-vel végzett orális tolerizáció jelentősen csökkentette az EAE súlyosságát (4. ábra C) a PBS-sel vagy kontrollpulykaszérummal kezelt állatokban. Az 5 alkalommal 50 μΐ kontrollszérummal kezelt állatokban a be12

HU 220 357 Β tegség súlyossága rendszerint 3,2±0,2, míg az orálisan tolerizált, 5 alkalommal 50 μΐ kontrollszérummal kezeitekben 1,0 ±0,2 (p< 0,001). Amint azt a 4D. ábra mutatja, az anti-p-TGF antiszérummal végzett in vivő kezelés dózisfüggő módon megszünteti az MBP orális adásával elért tolerizációt; az orálisan tolerizált, 5 alkalommal 50 μΐ anti-P-TGF ellenszérummal kezelt állatokban a betegség maximális súlyossága tipikusan 3,7±0,2, szemben a fenti l,0±0,2-vel (p<0,001, a D csoport a C-vel szemben). Érdemes megjegyezni, hogy a 4B. ábra szerint az orálisan nem tolerizált, anti-βTGF antiszérummal kezelt állatokban a betegség dózisfüggő súlyosbodása tapasztalható. A betegség jelentkezése korábban történik, a gyógyulás elhúzódik, a betegség súlyosabb (4,5±0,2 szemben a 3,2±0,2-vel, a B szemben az A-val, p< 0,01).

A késői típusú túlérzékenységi (DTH) válasz az EAE klinikai lefolyásával korrelál, és az MBP-vei szembeni in vivő sejtes immunitás mértékéül szolgál (Brod, S. A. és munkatársai, Ann. Neurol. 29: 615-622, 1991; Khoury, S. J. és munkatársai, Cell. Immunoi. 131: 302-310, 1990). A 4. ábránál leírt csoportok DTH-válaszait PBSben oldott 25 pg MBP-nek a fülbőr alá adásával váltjuk ki. A fül vastagságát a beadás előtt és utána 48 órával méijük. A két mérés eredményének különbségét a csoport átlagaként±az átlag hibájaként adjuk meg.

Amint azt az 5. ábra (A-D.) mutatja, az EAE-ben szenvedő állatokban kifejezett DTH-reakció jelentkezik, amelyet MBP szájon át adásával meg lehet szüntetni. A DTH megszüntetése felfüggeszthető in vivő adott anti^-TGF antiszérummal, dózisfüggően (l,5±0,5, szemben a O,5±O,3-mal, p<0,0001; 5 alkalommal 50 μΐ anti^-TGF ellenszérummal kezelt állatok szemben az 5 alkalommal 50 μΐ kontrollszérummal kezelt állatokkal). Továbbá ugyanezen in vivő kezelés eredményeképpen az MBP-re adott DTH-válaszok erősödnek az orálisan tolerizált, az EAE-ből felgyógyuló állatok esetében (2,1 ±0,3 szemben az l,4±0,3-mal, p<0,01; 5 alkalommal 50 μΐ anti-p-TGF ellenszérummal kezelt állatok szemben az 5 alkalommal 50 μΐ kontrollszérummal kezelt állatokkal).

A fent bemutatott eredmények bizonyítékot szolgáltatnak arra, hogy az endogén βΙ-TGF immunregulációs szerepet játszik az EAE-ből történő spontán gyógyulás folyamatában és a szájon át adott MBP tolerizáló hatásában. Annak fényében, hogy a β-TGF tulajdonságai az evolúció során nagymértékben megőrződtek, várható, hogy a β-TGF-nek a kísérleti állatokban tapasztalt immunszuppresszív hatásai az emberben is hasonlóak lesznek.

2. példa

Orálisan adott antigének által kiváltott bystanderszuppresszió

Az alább ismertetett kísérletekben a következő anyagokat és módszereket használjuk:

Állatok. 6-8 hetes nőstény Lewis-patkányokat a Harlan-Sprague Dawley Inc. (Indianapolis, IN, USA) cégtől veszünk, majd szokásos, korlátlan mennyiségű laboratóriumi takarmányon és vizen tartjuk őket.

Antigének. Tengerimalac mielin bázikus fehérjét agyszövetből tisztítunk Deibler és munkatársai, Prep. Biochem. 2: 139, 1972. módszere szerint, az amerikai egyesült államokbeli, 1990. március 2-án benyújtott, 07/484,732 számú szabadalmi bejelentésben leírt módosításokkal. A fehérjetartalmat és a tisztaságot gélelektroforézissel ellenőrizzük. Ovalbumint (ÓVA) és BSA-t a Sigma Chemical Co.-tól (St. Louis, MO, USA) veszünk, keyhole limpet (kagyló) hemocianint (KLH) pedig a Calbiochem Behring Corp.-tól (La Jolla, CA, USA).

Állatok immunizálása. Jelentős EAE-betegség kiváltása céljából a patkányoknak 25 pg MBP-t adunk a bal talpba; az MBP-oldat 50 μΐ-ét előzetesen 50 pl Freundféle teljes adjuvánssal, mely 4 mg/ml Mycobacterium tuberculosis-t tartalmaz (Difco), emulzióvá keverjük. Az in vivő bystander-szuppresszió kiváltását célzó kísérletekben az ÓVA, BSA vagy KLH másodlagos antigének 50-300 pg-ját 100 pl PBS-ben oldva, ugyanazon talpba injektáljuk az MBP-CFA-val történt elsődleges immunizálás után 8 órával.

Klinikai értékelés. Az alább ismertetett in vitro kísérletek és a bystander-szuppresszió klinikai megnyilvánulásai közötti összefüggések vizsgálata céljából az állatokat mindennap vizsgáljuk az EAE tüneteinek meglétére anélkül, hogy a vizsgálatot végző személy tudná, melyik állat milyen kezelést kapott. Az EAE klinikai súlyosságát a következőképpen értékeljük: 0, nincs betegség; 1, petyhüdt farok; 2, egyik hátsó comb bénulása; 3, mindkét hátsó comb bénulása, 4, mind a négy végtag bénulása 5, halál. A betegség időtartamát a betegség első jelentkezésétől (általában az immunizálás után ΙΟΙ 1 nap) az állat haláláig vagy teljes gyógyulásáig adjuk meg. Az átlagokat egyoldali Student-féle t-próbával hasonlítjuk össze, míg a betegség előfordulását a különféle csoportokban chi-négyzet-elemzéssel vizsgáljuk.

Orális tolerancia előidézése. Patkányokat 1 ml PBS-ben feloldott 1 mg MBP, ÓVA, BSA vagy KLH antigénekkel vagy csak PBS-sel etetünk közvetlenül a gyomorba, 18-as rozsdamentes állatetető tű segítségével (Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA). Az állatokat 2-3 naponként, összesen öt alkalommal etetjük, az utolsó etetés az immunizálás előtt két nappal történik.

Késői típusú túlérzékenység (delayed type hypersensitivity, DTH) tesztelése. A DTH tesztelésére 50 pg PBS-ben oldott MBP-t injektálunk a fülbe. Ez előtt és 48 órával később mikrométer-tolómércével (Mitutoyo, Japán) mérjük a fül vastagságát anélkül, hogy a vizsgálatot végző személy tudná, melyik állat milyen kezelést kapott. A változást kezelési csoportonként, mint átlagokat és az átlagok hibáját adjuk meg. Minden kezelési csoport 5 állatból áll.

Transwell-tenyészet. Kétkamrás tenyészedényt a Costar cégtől (Cambridge, MA, USA) veszünk. Ezek átmérője 24,5 mm és két kamrából állnak, melyeket egy félig áteresztő polikarbonáthártya választ el; ennek pórusmérete 0,4 pm. A két kamra egymástól 1 mm-re van, így a sejteket anélkül lehet együtt tenyészteni, hogy közvetlen sejt-sejt kapcsolatot hozhatnának létre. A szaporodási reakciók in vitro gátlásának mérésére az alsó kamrákba őxlO⁴ MBP- vagy OVA-specifikus sejtet (Ben13

HU 220 357 Β

Nun és munkatársai, Eur. J. Immunoi. 11: 195, 1981 módszere szerint készítve és fenntartva) teszünk 10⁶ db, 2500 rad-dal besugárzott timocitával, 0,6 ml tápfolyadékban. A felső kamrába 0,2 ml-ben 5 χ 10³ lépsejtet teszünk, melyeket orálisan tolerizált patkányokból vagy 5 kontroll- (BSA-val etetett) patkányokból veszünk ki.

A lépsejteket az utolsó etetést követő 7-14. napon vesszük ki, és egysejtes szuszpenziót készítünk a lépeket rozsdamentes acélszitán történő átpréselésével. Minthogy a válaszoló- (szaporodó) sejtek és a szabályozósej- 10 tek el vannak választva, az utóbbiakat nem kell besugározni. Egyes kísérletekben a szabályozó- (modulátor) sejteket az alsó kamrába adjuk a válaszolósejtekkel együtt, ez esetben az előbbieket be kell sugározni (1250 raddal), mielőtt a tenyészetbe tesszük őket. A szaporító kő- 15 zeg összetétele: RPMI 1640 (Gibco Laboratories, Grand Island, NY, USA), amihez 2x10-⁵ mol/liter 2merkaptoetanolt, 1% nátrium-piruvátot, 1% penicillint és strepromicint, 1% glutamint, 1% HEPES-puffert, 1% nem esszenciális aminosavkeveréket és 1% autológ szé- 20 rumot adunk. Minden kísérletet 4 kamrapárban végzünk párhuzamosan. A kamrákat (transwell) 72 óráig tartjuk 37 °C-on, nedvesített inkubátorban, 6% CO₂ és 94% levegő keverékében. 54 óra elteltével 4 pCi ³H-timidint adunk minden egyes alsó kamrába. A 72 óra elteltével az aló kamrák tartalmát három részre osztjuk, és egy Costar gömbölyű aljú, 96 mérőhelyű tálca három mérőhelyébe tesszük. A tenyészeteket üvegszálas szűrőpapírra visszük át egy multiharvesterrel, és szokásos folyadékszcintillációs technikákkal mérjük a sejtekbe beépült 30 ³H-timidin mennyiségét. Az eredményeket mint százalékos gátlást (gátlási százalék) fejezzük ki: 100x(l - a modulátorsejtekkel tenyészett válaszolósejtek Δ cpmje/a magukban tenyésztett válaszolók Δ cpm-je). (A Δ cpm a percenkénti beütésszámok különbsége az MBP- 35 vei kezelt és nem kezelt MBP-specifikus sejtek között. MBP nélkül a sejtvonal 1 000-2 000 közötti cpmet ad.)

A transwell-rendszert arra használjuk, hogy a bystander-szuppreszió során termelt oldható faktorokat 40 vizsgáljuk, és hogy a gátlás átvitelét kövessük.

T-sejt alcsoportok tisztítása. Nyiroksejtalcsoportok szelektív eltávolítását Cruikshank módosított módszerével végezzük (J. Immunoi. 138: 3817-3823, 1987), mágneses részecskék segítségével. A lépsejteket egérben termelt antipatkány-CD8, vagy CD4-specifikus monoklonális ellenanyagokkal (1:10 hígításban, OX/8, W3/25 jelű kiónok, kereskedelmi forgalomba hozza a Serotec/Bíoproducts, Indianapolis, IN, USA) inkubáljuk 30 percig jégfiirdőben, kétszer mossuk, majd előre mosott mágneses részecskékhez adjuk, amelyek átlagos átmérője 4,5 pm (M-450), amelyekhez előzőleg kecske-antiegér IgG-t kötöttek (Dynal Inc., Fort Lee, NJ). A használt mágneses részecskemennyiséget úgy adjuk meg, hogy az eltávolítani kívánt sejtek mindegyikére körülbelül 10 mágneses részecske jusson. A sejteket a mágneses részecskékkel 0,5 ml 10% fötális borjúsavót tartalmazó RPMI 1640-ben inkubáljuk egy 10 ml-es gömbölyű aljú csőben (Nunc), 30 percig jégen, 5 percenként gyengéden megrázva a csövet. Inkubáció után a sejtmágneses részecskeszuszpenziót 5 ml tápfolyadékkal mossuk, és a sejtrészecskekomplexeket a szabad sejtektől erős mágneses térben, mágneses részecskekoncentrátorral (Dynal-MPC-1) 2 perc alatt elválasztjuk. A felülúszót eltávolítjuk, és az eljárást kétszer megismételjük. Az adott ellenanyaggal mentesített T-sejt-készítmény 95%-nál több CD4+CD8-, vagy CD4-CD8+ sejtet tartalmaz, áramlásos citometriával 25 mérve.

A betegség gátlásának adaptív transzferé. A bystander-szuppresszió folyamán létrejövő betegséggátlás adoptív transzferének követésére a donorpatkányokat 1 mg MBP-vei, OVA-val vagy KLH-val etetjük naponta ötször minden másnap, és az utolsó etetést követő 7-14. napon leöljük. A lépsejteket kivesszük, és in vitro a homológ antigénnel (50 pg/ml) tartjuk a szaporító közegben 72 óráig. A sejteket ezután intraperitoneálisan (ip.) injektáljuk: a teljes lépsejttömegből 10⁸ sejtet, a CD8-, illetve CD4-mentesített sejtekből 56xl0⁷-et. A recipiens állatokat az adoptív transzfer előtt 250 rad-dal besugározzuk, az adoptív transzfer után 6 órával MBP/CFA-val immunizáljuk, és újabb 8 óra elteltével 50 pg OVA-t adunk nekik.

Annak megállapítására, hogy az in vitro szuppresszióhoz közvetlen sejt-sejt kontaktus szükséges-e, a fent leírt kétkamrás transwell-rendszert használjuk. A tipikus eredményeket az alábbi, 2. táblázat szemlélteti.

2. táblázat

MBP-specifikus T-sejtvonal szaporodásának gátlása MBP-vel etetett patkányok lépsejtjei által a transweil-rendszerben

	Felső kamra	Alsó kamra	Δ cpm	Gátlás (%)
1.		MBP-vonal	37 809+3 326
2.		MBP-vonal+MBP-etetett állatból kivett modulátorok	18 412+1 867	51
3.		MBP-vonal+PBS-etetett állatból kivett modulátorok	34 631+3 994	8
4.	MBP-vel etetett állatból kivett modulátorok	MBP-vonal	15 620+2 294	59
5.	PBS-sel etetett állatból kivett modulátorok	MBP-vonal	34 043+3 731	10

HU 220 357 B

5χ10⁴ MBP-specifikus T-sejtet teszünk az alsó kamrába, 10⁶ besugárzott (2 500 rád) timocitával mint antigénprezentáló sejttel (APC) és 50 pg/ml MBP-vel. MBP- vagy PBS-etetett állatok modulátorsejtjeit (5xl0⁵) adjuk a felső vagy az alsó kamrába. Az alsó kamrába adott modulátorsejteket besugározzuk

250 rad-dal. Az MBP-specifikus sejtvonal háttérbeütésszáma MBP, illetve ÓVA nélkül 1 000 és

000 cpm között lesz.

Mint a 2. táblázatból látható, ha MBP-vel etetett állatokból származó besugárzott lépsejteket egy MBPspecifikus sejtvonallal együtt tenyésztünk az alsó kamrában, a sejtvonal szaporodása gátlást szenved (2. csoport). Ezzel szemben nem tapasztalható gátlás a PBSsel etetett állatok lépsejtjeivel (3. csoport). Gyakorlatilag ugyanolyan gátlást tapasztalható, ha a válaszolósejteket a modulátorsejtektől félig áteresztő hártyával választjuk el (4. és 5. csoport). Ennek alapján úgy tűnik, hogy a gátlást valamilyen oldható anyag közvetíti, amelyik a hártyán áthatol.

Annak megállapítására, hogy a transwell-rendszerben megfigyelt in vitro szuppresszióhoz a modulátorés válaszoló- (responder-) sejtek azonos antigénspecificitása szükséges-e, az alsó kamrába egy OVA-vonalat teszünk. A tipikus eredményeket a 3. táblázat tartalmazza.

Amint azt a 3. táblázat mutatja, ha a felső kamrába MBP-vel etetett állatokból származó modulátorsejteket teszünk, ezek MBP jelenlétében elnyomják az alsó kam10 rában lévő ÓVA-vonal szaporodását, de MBP nélkül nem (2. és 3. csoport). PBS-sel etetett állatokból származó modulátorsejtek a felső kamrában, MBP jelenlétében nem befolyásolják az alsó kamrában lévő OVA-vonal szaporodását (4. csoport). Ezzel szemben OVA-etetett állatokból származó modulátorsejtek a felső kamrában, ÓVA jelenlétében elnyomják az alsó kamrában lévő OVA-vonal szaporodását (7. csoport). Érdemes megjegyezni, hogy a transwell-rendszerbe adott oldható antigén áthatol a két kamrát elválasztó hártyán, és mindkét kamrában jelen van, amint az in vivő is történne.

3. táblázat

ÓVA- vagy MBP-specifikus T-sejt-vonal szaporodásának gátlása MBP- vagy OVA-etetett patkányok lépsejtjei által transwell-rendszerben

	Modulátor (felső)	Válaszoló (alsó)	Acpm	Gátlás (%)
		OVA-vonal+ÓVA	62 761+3 881
	MBP-etetett	OVA-vonal+ÓVA	65 868+3 989	-5
	MBP-etetett+MBP	OVA-vonal+OVA	30 974+3 450	51
	PBS-etetett+MBP	OVA-vonal+ÓVA	61 132+2 967	<1
		MBP-vonal+MBP	71 503+4 581
	OVA-etetett	MBP-vonal+MBP	67 075+2 904	6
	OVA-etetett+OVA	MBP-vonal+MBP	37 778+3 780	47
	PBS-etetett+OVA	MBP-vonal+MBP	68 104+4 832	5

5xl0⁴ MBP- vagy OVA-specifikus T-sejtet teszünk az alsó kamrába, 106 besugárzott (2 500 rád) timocitával, mint antigén-prezentáló sejttel (APC). MBP-, ÓVA- vagy PBS-etetett állatok modulátorsejtjeit (5 χ 10⁵) adjuk a felső kamrába. Az MBP- vagy OVA-specifikus sejtvonal háttér-beütésszáma MBP, illetve ÓVA nélkül 1 000 és 2 000 cpm között lesz.

A fenti in vitro bystander-szuppresszió és az in vivő helyzet közötti összefüggés tisztázására egy sor kísérletet végezhetünk az EAE-modellben. Patkányokat OVAval etetünk (1 mg/ml, 10 nap alatt 5 alkalommal), majd MBP-CFA-val immunizáljuk őket (talpba), ezután 8 órával ugyanazon talpba adunk OVA-t. Mint azt a 6A. ábra mutatja, a 8 órával az MBP-CFA-immunizálás után beadott ÓVA nincs hatással az EAE-re, amint az várható is. A betegség maximális súlyosságának értéke 3,8+0,1, ha OVA-t adunk bőr alá (se.). Ezzel szemben az MBPCFA-immunizálás előtt OVA-val etetett, immunizálás után pedig OVA-val talpba injektált állatokban a MBPetetéshez hasonlóan (6B. ábra) az EAE súlyossága csökken; az OVA-etetett, OVA-val injekciózott állatokban tipikusan 0,9+0,2; az MBP-etetettekben 1,1+0,1; míg az

OVA-etetett, KLH-val injekciózott kontrollokban 3,9+0,1 (p<0,001; az 0VA-, illetve MBP-etetettek a kontrolokkal szemben). Eszerint az MBP/CFA immunizálástól aktiválódott CD4+ T-sejteket a bystander antigén, jelen esetben az ÓVA orális adásával indukált CD8+ T-sejtek által termelt β-TGF gátolja. Azokban az OVA-etetett állatokban, amelyeknek az MBP/CFA immunizálás és OVA-injekció után KLH-t adunk szájon át, az EAE nem gátlódik (6C. ábra), a betegség súlyossága 3,7+0,1 (a kontroliokban 3,8+0,1). Ezen kísérletek szerint az in vivő hatások hasonlóak az in vitro transwell-rendszerben tapasztaltakkal, mégpedig valamely antigénnel való orális tolerizálás kialakuló modulátorsejtek képesek valamely másik antigénre specifikus sejteket elnyomni, ha a tolerizáló antigén jelen van.

Annak megállapítására, hogy vajon létrejön-e szenzitizálás, érzékenyítés a bystander-hatással összefüggésben, mérjük a DTH-válaszokat. Mind az MBP-vel etetett, mind az OVA-val etetett, majd MBP/CFA-val és OVA-val immunizált állatokban a DTH-válaszok gátlását tapasztaljuk (7. ábra). Más antigének, mint a BSA vagy a KLH adása nem befolyásolja ezen állatok MBP15

HU 220 357 Β re adott DTH-válaszait. Az ÓVA etetése után MBP/ /CFA-val együtt injekcióban adott ÓVA nem vált ki OVA-ellenes, DTH-ban megnyilvánuló immunválaszt.

Annak kizárására, hogy az ÓVA valamilyen különleges tulajdonsága felelős a megfigyelt in vivő bystander-szuppresszióért, hasonló kísérleteket végzünk, amelyekben BSA-t etetünk és adunk bőr alá az MBP/CFA immunizálás után. Amint azt a 8. ábra mutatja, az MBP/CFA immunizálás előtt etetett, után injektált BSA elnyomta az EAE-t az OVA-hoz hasonlóan. Érdemes megjegyezni, hogy a BSA csak 300 pg-os dózisban tudja meggátolni az EAE-t, míg az OVA-ból már 50 pg is elegendő.

A 9. ábra szerint az MBP-vel vagy OVA-val etetett állatokból adoptív transzferrel MBP/CFA-val immunizált, OVA-injektált recipiensekbe juttatott lépsejtek átviszik a betegség elleni védelmet. Ezt az adoptív módon átvitt védelmet a CD8+ (szupresszor) T-sejtek eltávolítása megszünteti, míg a CD4+ T-sejtek eltávolítása nem. KLH-val etetett állatokból kivett lépsejtek nem védik meg MBP/CFA-val immunizált, OVA-injektált recipienseket a betegségtől.

3. példa

A tengerimalac-MBP immunszuppreszív epitópjainak azonosítása

A fenti 2. példában ismertetett transwell-rendszert felhasználjuk a tengerimalac-MBP azon immunszuppreszív epitópjainak azonosítására, amelyek hatására szupresszor T-sejtekből β-TGF szabadul fel.

Először erősítsük meg a szakirodalomban található nézeteket az MBP betegségokozó fragmenseiről (autoimmun-válasz epitópjairól) a következőképpen: a tengerimalac-MBP-nek a 10. ábrán részletezett átfedő peptidjeit kereskedelmi fonásokból szerezzük be, vagy szintetizáljuk jól ismert technikák segítségével, előnyösen valamely kereskedelmi peptidszintetizáló készülékkel (például Applied Biosystems), a gyártó utasításait követve. Ezután patkányokat etetünk teljes MBP-vel, és az így orálisan tolerizált a lépsejteket kivéve, azokat MBP-peptidekkel ingereljük. Az ingerelt T-sejteknek sejtölő (killer) T-sejteket indukáló képességét azután mennyiségileg mérjük egy szaporodási tesztben, ahogyan azt az 1. és 2. példában leírtuk, valamint mérjük a szaporodó sejtek betegségátvivő képességét is.

Amint azt a 10. ábra mutatja, a tengerimalacMBP-nek a 71-90. aminosavakat magába foglaló peptidje messze a leghatékonyabb killer T-sejt-indukáló peptid, következésképpen az MBP legpotensebb betegségfokozó fragmense. A tengerimalac-MBP-nek ez a fragmense tehát a fehérje immundomináns epitópjának felel meg.

Az MBP-vel etetett és MBP/CFA-val immunizált állatokból kivett lépsejteket (ahogyan azt a fenti 1. és 2.

példában leírtuk) a transwell-rendszerben OVA-val etetett állatokból kivett lépsejtekkel tenyésztjük együtt. A tengerimalac MBP-jének a 21-40, 51-70 és 101-120. aminosavakat magában foglaló peptidjeit adva a modulátorsejteket tartalmazó kamrába, ezek mind elnyomják az OVA-specifikus sejtvonal szaporodását. A tipikus eredményeket all. ábra mutatja. Érdemes megjegyezni, hogy a tengerimalac-MBP-nek a 10. és 11. ábrán azonosított immundomináns epitópja a (71-90. aminosavakat tartalmazó peptid) nem képes gátlást kiváltani a transwell-rendszerben. A tengerimalac-MBP-nek a 151-170., és 161-178. aminosavakat tartalmazó peptidjei gátolják az OVA-specifikus vonal szaporodását, de ez a hatás nem specifikus és ezen peptidek in vitro toxicitásának tulajdonítható, minthogy ugyanezen peptidek akkor is gátolják az OVA-val etetett állatokból kivett lépsejtek szaporodását, ha azokat nem MBP-vel etetett (kontroll) modulátorsejtekkel tenyésztjük együtt (az adatokat nem mutatjuk be). Ezek a kísérletek továbbá azt demonstrálják, hogy a bystander szuppresszióhoz olyan antigének etetése szükséges, amelyek β-TGF felszabadulását vátlják ki. Ezek a kísérletek még azt is megmutatják, hogy valamely autoantigén azon fragmensei, melyek a bystander szuppresszióban részt vesznek, nem azonosak az autoimmunválasz kiváltásában részt vevő fragmensekkel.

4. példa

Sejtek, citokinek és aktivációs markerek normál, EAE-ben szenvedő és MBP-vel etetett patkányok agyából készült metszeteken

EAE-indukált patkányokat MBP-vel etetve, az etetés hatását az agyban található sejtek és faktorok szempontjából elemezzük. Lewis-patkányoknak öt alkalommal adunk MBP-t szájon át, majd MBP/CFA-val immunizáljuk őket, és az agyukat 14 nap után (amikor a betegség a tetőfokára hág) immunszövettani módszerekkel vizsgáljuk, immunizált, MBP-vel nem etetett patkányok és normál patkányok agyával összehasonlítva.

Az agykéregből és a kisagyból készült fagyasztott metszeteket paraformaldehid-lizin-perj odát-oldatban rögzítjük a sejtek és az aktivációs antigének vizsgálata céljából, vagy acetonban a citokinek jelölésére, és peroxidáz-antiperoxidáz módszerrel festjük (Hancock, W.W. el al., J. Immunoi. 138: 164, 1987). A citokinek és endotélsejtek jelenlétét 20 látótérben vizsgáljuk, és a következőképpen jelöljük: (-), ha nem találunk ilyeneket; (+/-), ha metszetenként 10 sejtnél kevesebbet látunk, vagy nyomokban tapasztalunk jelölődést; (+), ha kevés kicsi foltot látunk; (2+), ha több foltot látunk, és (3+), ha sok nagy perivaszkuláris (érkömyéki) sejtcsoportosulást, valamint az agyhártya alatt diffúz festődést észlelünk.

Az eredményeket a 4. táblázat foglalja össze.

HU 220 357 Β

4. táblázat

Sejtek, citokinek és aktivációs markerek patkányagyban (n=3/csoport)

Marker	Normál	AE	MBP-etetett	MBP/LPS etetett
Fehérvérsejtek, CD4+sejtek	+/-	+	1 +	1 +
IL-2R(p55), PCNA	-	+	+/-	-
IL-1, IL-2, IL-6, γ-IFN, TNF	+/-	+	1 +	-
IL-4	-	-	-	2+
β-TGF	-	-	2+	2 +
PGE	-	/-	-	2+
la, ICAM-1	+/-	+	1 +	1 +

Az MBP-vel etetett csoportban a sejtes gyulladásos 20 reakció és a TNF, az la, valamint az ICAM-1 kifejeződésének gátlására találunk bizonyítékot, míg a β-TGF szintje emelkedett (4. táblázat).

Korábban már felfedeztük, hogy a lipopoliszacharid (LPS) növeli az EAE-nek az MBP orális beadásával el- 25 ért gátlását. Amikor az MBP+LPS-sel etetett állatok agyát vizsgáljuk a betegség csúcsidőszakában, a csak MBP-vel etetett állatokhoz képest még az IL-4 és a PGE-szintek növekedését is meg lehet figyelni. Ebből úgy tűnik, hogy a β-TGF mellett bizonyos körűimé- 30 nyék között az IL-4 és más szabályozócitokinek is részt vesznek az immunválasz gátlásában.

Ha csak a szinergistát adjuk szájon át (bystander vagy autoantigén nélkül), az nem eredményezi az IL-4 vagy a PGE szintjének emelkedését (az adatokat nem 35 mutatjuk be).

Összefoglalva, amint az a 4. táblázat adataiból a fentiek szerint megállapítható, a normál patkányagyban nincsenek gyulladásra utaló sejtek, citokinek vagy aktivációs markerek, míg az EAE-ben szenvedő patká- 40 nyok agyában számos gyulladással kapcsolatos sejt és citokin (például IL-1, IL-2, IL-6, γ-IFN és TNF) található. Ezzel szemben az olyan EAE-indukált patkányoknál, amelyeknek MBP+LPS-t (egy szinergistát) adtunk szájon át, a gyulladásos sejtek száma és a gyulla- 45 dásra jellemző citokinek mennyisége csökken, továbbá CD8+ szupresszor T-sejtek, IL-4, β-TGF és prosztaglandin E (PGE) jelennek meg, amelyek mind a CD4+ sejtek és a gyulladásra jellemző citokinek ellen hatnak.

5. példa

Az insulitis elnyomása NŐD egerekben inzulinpeptidek és glukagon szájon át történő adásával

A következőkben az inzulin elválasztott A- és B- 55 lánca, valamint az inzulin B-láncából származó szintetikus peptidek és a glukagon etetésének hatását tanulmányozzuk a NŐD egerekben kifejlődő insulitisre.

NŐD egereket (Taconic Labs) 1 mg glukagonnal, vagy 1 mg disznóinzulinnal (mindkettő kereskedelmi 60 eredetű), avagy az inzulin A-lánc, B-lánc, illetve Blánc-peptidek (valamennyi peptid szintetikus) molárisán azonos mennyiségével etetünk hetente kétszer öt hétig, és tízhetes korukban leöljük őket.

A kontrollállatokat egy nem hasnyálmirigy-eredetű peptiddel, a GAP-pal etetjük. Az insulitist Zhang, Z. J., PNAS (USA,), 88: 10 252-10 256, 1991 módszere szerint értékeljük, szemikvantitatív inzulitis-pontok alapján.

Az inzulin B-lánc-peptidek az 1-12., 10-22., 11-30. és 23-30. aminosavaknak felelnek meg (B,_₁₂, B₎₀-₂₂, Bji_₃o és B₂₃_₃₀) Az állatokat 10 alkalommal etetjük, három hét alatt.

Az eredményeket az 5. táblázat mutatja.

5. táblázat

Csoport	Mennyiség (mg)	Insulitis- pontszám
Kontroll- (PBS-etetett)		2,66
A-lánccal etetett	0,4	1,88
B-lánccal etetett	0,6	1,32
B,12-etetett	0,24	1,76
B10 22-etetett	0,27	1,71
B, 13 „-etetett	0,40	1,44
B23.3O-etetett	0,17	2,22
MBP-etetett	1	2,14
GAP-etetett	0,24	2,47
Glukagon-etetett	1	1,81

Amint az 5. táblázatban bemutatott eredményekből látható, az inzulin A- és B-láncának etetése elnyomja az insulitist, a B-lánc erősebben. A Bj_₁₂, B₁₀_₂₂ és a Bn_3o peptidek szintén gátolják az insulitist, míg a B₂₃_3o nem. Az MBP-vel vagy GAP-pal kezelt állatokban a betegség enyhülése nem tapasztalható. Továbbá a glukagon, egy bystander antigén adása is az insulitis ellen hat.

HU 220 357 Β

6. példa

A marha-PLP vagy az egér-MBP szájon át adása tolerogén, intravénás adása nem

A szájon át, illetve vénába történő beadás tolerizáló hatásának összehasonlítása végett, továbbá a bystander-szuppresszió további demonstrálására 7 hetes nőstény SJL/J egerek (Jackson Labs, Bar Harbor, ME, USA) 5-6-os csoportjait a PLP 140-160. peptidjével immunizáljuk a 0. és a 7. napon, és a következő kezeléseket alkalmazzuk:

1. Hisztonnal etetünk (0,25 mg)

2. Egér-MBP-vei etetünk (0,25 mg)

3. Marha-PLP-vei etetünk (0,25 mg)

4. Hisztonnal injekciózunk iv. (0,25 mg)

5. MBP-vei injekciózunk iv. (0,25 mg)

6. PLP-vel injekciózunk iv. (0,25 mg)

Mindegyik csoportot másnaponként kezeljük 7 napig. Az intravénás (iv.) csoportban az anyagot a szemfonadékba (plexus) injekciózzuk. A marha-PLP 140-160. peptidjét használjuk. A peptid aminosavsorrendje 20 COOH-PLAYTIGVFKDPHGLWKGLCNH₂.

Amint az a 12. ábrán látható, mind az egér-MBP, mind a marha-PLP egyenlően hatékony a PLP-peptid okozta EAE gátlásában, ha szájon át adjuk. Egy nem specifikus fehérje, a hiszton, viszont nem hatásos az 25 EAE gátlásában, ha szájon át adjuk. Tehát egy bystander antigén, ez esetben az egér-MBP, szájon át adva hatékonyan elnyomja a marha-PLP-okozta EAE-t.

Ezzel szemben, ha intravénásán adjuk, csak a betegség kiváltására használt antigén, ez esetben a marha- 30 PLP nyomja el hatékonyan az EAE-t. Az eredményeket a 13. ábra mutatja.

Továbbá tanulmányozzuk különböző peptidek etetésének hatását a tengerimalac-MBP 71-90. aminosavjait tartalmazó peptid (ez a tengerimalac-MBP domináns epitópja, amint azt a 3. példában fent megmutattuk) által EAE-ben megbetegített Lewis-patkányok esetében.

A tengerimalac-MBP 71 -90. aminosavjait tartalmazó pepiidből 0,25 mg-ot adunk Freund-féle teljes adjuvánsban a betegség előidézése céljából, és a különböző tengerimalac-MBP peptidek etetésének az EAE-re gyakorolt hatását tanulmányozzuk.

Amint azt a 14. ábra mutatja, a teljes tengerimalac5 MBP és annak 21-40. peptidje ugyanolyan hatásos a tengerimalac-MBP 71-90. által kiváltott EAE kezelésében, mint maga a tengerimalac-MBP 71-90. peptid. Ez esetben a tengerimalac-MBP 131-150. nem hatásos. A peptideket STI-vel együtt is etetjük, hogy megakadá10 lyozzuk a gyomomedv általi lebontásukat és növeljük biológiai hatásukat. A teljes MBP-re adott DTHválaszokat MBP vagy az MBP 21-40., illetve az MBP 71-90. bármelyikének etetése megszünteti. Ezzel szemben a tengerimalac-MBP 71-90. peptidjére adott 15 DTH-választ csak a teljes tengerimalac-MBP és annak 71-90. peptidje nyomja el szájon át adva, a tengerimalac-MBP 21-40. nem (15. ábra). Ez összhangban van azzal a következtetéssel, hogy az MBP 71-90. peptidje nem vesz részt a bystander-szuppresszióban.

Végül vizsgáljuk az EAE gátlását iv. a betegség kitörése előtt (az immunizálást követő 8. és 9. napon) adott MBP-vel és MBP-peptidekkel történő tolerizálással.

Amint azt a 16. ábra mutatja, azokban az állatokban, amelyekben EAE-t indukálunk teljes tengerimalacMBP-vel, csak a teljes tengerimalac-MBP és a tengerimalac-MBP 71-90. peptidje hatásos az EAE gátlásában, ha iv. adjuk. Az MBP 21-40., amelyik szájon át adva hatásos a betegség gátlásában, iv. adva nem hatásos, összhangban azzal, hogy bystander-szuppressziót nem lehet intravénásán előidézni. A 131-150. aminosavakat tartalmazó peptid és a hiszton szintén nem hatásosak az EAE elnyomásában, összhangban azzal a ténynyel, hogy ezen antigének egyike sem felelős az autoim35 mun reakcióért.

A következőkben ismertetett, publikus szakirodalmi forrásból idézett aminosavszekvenciák a találmány szerinti megoldás bizonyos aspektusainak megvilágításához nyújtanak segítséget.

A marha-PLP aminosavsorrendje

20 Gly-Leu-Leu-Glu-Cys-Cys-Ala-Arg-Cys-Leu-Val-Gly-Ala-Pro-Phe-Ala-Ser-Leu-Val-Ala30 40

Thr-Gly-Leu-Cys-Phe-Phe-Gly-Val-Ala-Leu-Phe-Cys-Gly-Cys-Gly-His-GIu-Ala-Leu-Thr50 60

Gly-Thr-Glu-Lys-Leu-Ile-Glu-Thr-Tyr-Phe-Ser-Lys-Asa-Tyr-Gla-Asp-Tyr-Glu-Tyr-Leu70 80

I le-Asa-Val- 1le-Hi s-Ala-Phe-Gln-Tyr-Va1 - Ile-Tyr-Gly-Thr-Ala-Ser-Phe-Phe-Phe-Leu18

HU 220 357 Β

100

Tyr-Gly-Ala-Leu-Leu-Leu-Ala-Tyr-Gly-Phe-Tyr-Thr-Thr-Gly-Ala-Val-Arg-Cla-Ile-Phe110 120 Gly-Asp-Tyr-Lys-Thr-Thr-Ile-Cys-Gly-Lys-Gly-Leu-Ser-Ala-Thr-Val-Thr-Gly-Gly-Glns2........................................

130 140

Lys-Gly-Arg-Gly-Ser-Arg-Gly-Gln-His-Gln-Ala-His-Ser-Leu-Glu-Arg-Val-Cys-His-Cys150 160

Leu-Gly-Lys-Trp-Leu-Gly-Hi s-Pro-Asp-Lys-Phe-Val-Gly-Ile-Thr-Tyr-Ala-Leu-Thr-Va1 ........ x .....................................................................

170 180

Val-Trp-Leu-Leu-Val-Phe-Ala-Cys-Ser-Ala-Val-Pro-Val-Tyr-Ile-Tyr-Phe-Asp-Thr-Trp190 200

Thr-Thr-Cys-Gln-Ser-Ile-Ala-Ala-Pro-Ser-Lys-Thr-Ser-Ala-Ser-Ile-Gly-Thr-Leu-Cys--Phe - x - Ser .................................... x ............................ Ser ........

210 220 Ala-Asp-Ala-Arg -Me t-Tyr-Gly-Val-Leu-Pro-Trp-Asn-Ala-Phe-Pro-Gly-Lys-Val-Cys-Gly230 240

Ser-Asp-Leu-Leu-Ser-Ile-Cys-Lys-Thr-Ala-Glu-Phe-Clp-Va1-Thr-Phe-Hi s-Leu-Phe-Ile-Va 1 -Asn 250 260

Ala-Ala-Phe-Val-Gly-Ala-Ala-Ala-Thr-Leu-Val-Ser-Leu-Val-Thr-Phe-Me t-Ile-Ala-Ala-( )270

Thr-Tyr-Asn-Phe-Ala-Val-Leu-Lys-Leu-Me t-Gly-Arg-Gly-Thr-Lys-Phe

Inzulinfragmensek

10-18

1-21

Al) H-GIVEQCCTSICSLYQLENYCN-OH (A21)

B1) H-FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT-OH (B3C 1-30 _1 -12 23 - 30

10-22

11-30

HU 220 357 Β

2 3

0 0

Hűm ASQKRPSQRHGSKYLATASTMDHARHGFLPRHRDT Bov AAQKRPSQR— SKYLASASIMDHARHGFLPRHRDT Rab ASQKRP SQRHGSKYLATASIMDHARHGFL PRHRDT Gpig ASQKRP SQRHQSKYLATAS IMDHARHGFL PRHRDT Ra t s ASQKRPSQRHGSKYLATASTMDHARHGFLPRHRDT Ch i c ASQKRSSFRHGSK-MASATSTDHARHGS-PRHRDS

5 6 7

0 0 0

Hűm GILDSIGRFFGGDRGAPKRGSGKDSHHPARTAHYG Bov GILDS LGRF FGSDRGAPKRGSGKDGHHAARTTHYG Rab GILDSIGRF F S SDRGAPKRGSGKD—HAARTTHYG Gpig GI LDS I GRF FGSDRAAPKRGSGKDSHHAARTTHYG Ra t s GI LDS IGRFFSGDRGAPKRGSGKDSH—TRTTHYG Ch i c GLLDSLGRFFGGDR-VPRRGFGKD AARASHVG

9 1

0 0

Hűm SLPQKS-HGRTQDENPWHFFKNIVTPRTPPPSQG Bov S L PQKAQHGRPQ D E N P WHF FKNI VT PRT P P P S QG Rab S L PQKS -HGRPQ D E N PWHF FKN I VT PRT P P P SQG Gpig SLPQKSQ—RSQDENPWHFFLNIVTPRTPPPSQG Ra t s S L PQKSQ—RTQ D E N PWHF FKN I VT PRT P P P SQG C h i c Sí PQRSQH-R P(HD,G,N)P WHF FKN IVS PRT P P PMQA

1111 12 3 4

0 0 0

Hűm KGRGLSLSRFSUGAEGQRPGFGYGGRASDYKSAHK Bov KGRGLSLSRFSWGAEGQKPGFGYGGRASDYKSAHK Rab KGRGTVLSRFSW3AEGQKPGFGYGGRAADYKSAHK Gp i g KGRGLSLSRFSW3AEGQKPGFGYGGRA- DYKS—K

Ra t s KGRGLSLSRFSW----------------------Ch i c KGRGLSLTRFSWGGEGHKPGSGYGSKFYEHSAHK

1 1

6 7

0 0

Hűm GFKG-V-DAQ G TLSKIFKLGGR----DS R SGS PMARR

Bov GLKG- -HDA Q G TL SKI FKLGGR----DSRSGS PMARR

Rab GLKG A-DAQGTLSRLFKLGGR----DSRSGSPMARR

Gp i g GFKG-AHDAQGTLSKI FKLGGR----DSRSGSPMARR

Rats GGR----DSRSGSPMARR

Ch i c GHKGZSHQ(G,K,G)TLSKI FKLGGR P(SXES,D,S)R SGS P VARR

Az ember (Hűm), marha (Bov), nyúl (Rab), tengerimalac (GPig), patkány (Rats) és tyúk (Chic) központi 50 idegrendszeréből származó mielin bázikus fehérjék aminosavsorrendje. A patkány-BP a 14 kD-os úgynevezett kis fehéije, amelynek a 118-159-es aminosavjai, melyeket a BP-gén 6. exonja kódol, hiányoznak. Az emberi 18,5 és 7,2 kD molekulatömegű formákat használ- 55 tűk az összehasonlításhoz. Az utóbbiból a 107-117-es fragmens (aláhúzva) hiányzik; ezt a fragmenst a BPgén 5. exonja kódolja. A sorrendeket oly módon helyeztük el, hogy az azonos pozícióban lévő aminosavak egymás alá esnek, így könnyű őket összevetni. Ez a rendszer a deléciókat (kiesett fragmenseket) és a betoldásokat is kezeli, így összesen 177 pozícióval dolgozik. A zárójelbe tett aminosavak pontos sorrendje még nem ismert.

Különböző kollagének aminosavsorrendjeinek összehasonlítása

HU 220 357 Β

105

Emb eri-αΐ (II)	Ma r h a - a	(II)		Ma rha-αΐ (I)
gly	pro	me t	I gly	VAL	me t	|	gly	pro	me t
gly	pro	me t	gly	pro	me t		gly	pro	SER
gly	pro	arg	giy	pro	arg		gly	pro	arg
gly	pro	pro	gly	pro	pro*		gly	LEU	pro*
gly	pro	a 1 a	gly	pro	a 1 a		gly	pro	PRO*
gly	a 1 a	pro	gly	a 1 a	pro*		gly	a 1 a	pro*
gly	pro	gin	giy	pro	gin		gly	pro	gin
giy	phe	gin	giy	phe	gin		f giy	phe	gin
giy	asn	pro	gly	asn	pro		giy	PRO	pro
gly	glu	pro	gly	glu	pro*		gly	glu	pro*
gly	glu	pro	giy	glu	pro*		gly	glu	pro*
gly	va 1	ser	gly	va 1	ser		gly	ALA	ser
gly	pro	me t	gly	pro	me t		gly	pro	me t
gly	pro	arg	gly	pro	arg		gly	pro	arg
gly	pro	pro	gly	pro	pro*		gly	pro	pro*
gly	pro	pro	gly	pro	pro*		giy	pro	pro*
gly	1 y s	pro	gly	lys	pro*		gly	lys	ASN
gly	asp	asp	gly	asp	asp		gly	asp	asp
gly	glu	a 1 a	gly	glu	a 1 a		gly	glu	a 1 a
giy	1 y s	pro	gly	1 y s	pro*		giy	1 y s	pro*
gly	1 y s	a 1 a	1 gly	lys	SER	1	gly	ARG	PRO*
gly	glu	arg	gly	glu	arg		giy	glu	arg
gly	pro	pro	giy	pro	pro*		gly	pro	pro*
gly	pro	gin	gly	pro	gin		gly	pro	gin
giy	a 1 a	arg	giy	a 1 a	arg		gly	a 1 a	arg
gly	phe	pro	gly	phe	pro*		gly	LEU	pro*
gly	t h r	pro	gly	thr	pro*		gly	thr	ALA
gly	1 eu	pro	gly	1 eu	pro*		giy	1 eu	pro*
giy	va 1	1 y s	gly	va 1	lys*-	glc-gla	gly	MET	lys*-	glc-gla
gly	h i s	arg	gly	h i s	arg		gly	h i s	arg
gly	tyr	pro	gly	tyr	pro*		gly	PHE	SER
gly	1 eu	asp	gly	1 eu	asp		gly	1 eu	asp
gly	a 1 a	1 y s	giy	a 1 a	lys*-	glc-gla	gly	a 1 a	lys*-	glc-gla
gly	glu	a 1 a	gly	glu	a 1 a		gly	ASP	a 1 a
gly	a 1 a	pro	gly	a 1 a	pro*		gly	PRO	ALA
gly	va 1	1 y s	gly	va 1	lys		gly	PRO	1 y s
gly	glu	ser	gly	g 1 u	ser		gly	glu	PRO*
gly	ser	pro	gly	ser	pro*		gly	ser	pro*
gly	g 1 u	asn	gly	glu	asn		gly	glu	asn
gly	ser	pro	giy	ser	pro*		gly	ALA	pro*
gly	pro	me t	gly	pro	me t		gly	GLN	me t
gly	pro	arg	gly	pro	arg		giy	pro	arg
giy	1 eu	pro	gly	1 eu	pro*		gly	1 e u	pro*
giy	g 1 u	arg	gly	glu	arg		gly	g lu	arg
gly	arg	thr	gly	arg	thr		gly	arg	PRO*
gly	pro	a 1 a	gly	pro	a 1 a		gly	pro	PRO*
gly	a 1 a	a 1 a	gly	a 1 a	a 1 a		gly	SER	a 1 a
gly	a 1 a	arg	gly	a 1 a	arg		gly	a 1 a	arg
gly	asn	asp	gly	asn	asp		gly	ASP	asp
gly	g 1 n	pro	gly	gin	pro*		gly	ALA	VAL
gly	pro	a 1 a	gly	pro	a 1 a		gly	ALA	a 1 a
gly	pro	pro	gly	pro	pro*		giy	pro	pro*
gly	pro	va 1	gly	pro	va 1		gly	pro	THR	1
gly	pro	a 1 a	giy	pro	a 1 a		gly	pro	a 1 a
gly	giy	pro	gly	gly	pro*		gly	PRO	pro*	|
gly	phe	pro	giy	phe	pro*		gly	phe	pro*
gly	a 1 a	pro	giy	a 1 a	pro*		giy	a 1 a	VAL	1
giy	a 1 a	1 y s	gly	a 1 a	lys*-	glc-gla	gly	a 1 a	lys*-	glc-gla

132

162

192

222

252

HU 220 357 Β

282

gly	glu	a 1 a	gly	glu	a 1 a	giy	glu	GLY
gly	pro	thr	gly	pro	thr	gly	pro	thr
gly	a 1 a	arg	gly	a 1 a	arg	gly	PRO	arg
gly	pro	glu	gly	pro	glu	gly	SER	glu
giy	a 1 a	gin	gly	a 1 a	g 1 n	giy	PRO	gin
giy	pro	arg	gly	pro	arg	gly	VAL	arg
gly	glu	pro	gly	glu	pro*	gly	glu	pro*
gly	thr	pro	giy	thr	pro*	gly	PRO	pro*
giy	ser	pro	gly	ALA	pro* |	gly	PRO	ALA
gly	pro	a 1 a	gly	pro	a 1 a	gly	ALA	a 1 a
gly	a 1 a	ser	gly	a 1 a	ALA |	gly	PRO	ALA
gly	asn	pro	gly	asn	pro*	gly	asn	pro*
giy	thr	asp	gly	ALA	asp |	gly	ALA	asp
gly	i 1 e	pro	gly	i 1 e	pro*	qiy	GLU	pro*
gly	a 1 a	1 y s	gly	a 1 a	lys*	gly	a 1 a	lys*
gly	ser	a 1 a	gly	ser	a 1 a	gly	ALA	ASN
gly	a 1 a	pro	gly	a 1 a	pro*	gly	a 1 a	pro*
gly	i 1 e	a 1 a	gly	i e	a 1 a	gly	i e	a 1 a
gly	a 1 a	pro	gly	a 1 a	pro*	gly	a 1 a	pro*
gly	phe	pro	gly	phe	pro*	giy	phe	pro*
gly	pro	arg	gly	ALA	arg |	gly	ALA	arg
gly	pro	pro	gly	pro	pro*	gly	pro	SER
asp	pro	gin	GLY	PRO	THR	GLY	PRO	GLN
gly	a 1 a	thr	gly	a 1 a	SER	gly	a 1 a	PRO
gly	pro	1 eu	gly	pro	1 eu	gly	pro	PRO*
gly	pro	1 y s	giy	pro	lys*	giy	pro	lys*
gly	gin	thr	gly	gin	thr	giy	ASN	SER
giy	1 y s	pro	gly	lys	pro	gly	lys	pro
gly	i 1 e	a 1 a	giy	i 1 e	a 1 a	gly	ALA	PRO*
giy	phe	1 y s	gly	phe	lys*	giy	ASN	lys*
gly	glu	g 1 n	gly	glu	g 1 n	gly	ASP	THR
gly	pro	1 y s	gly	pro	lys*	gly	ALA	lys*
gly	glu	pro	gly	glu	pro*	giy	g lu	pro*
gly	pro	a 1 a	gly	pro	a 1 a	gly	pro	THR
gly	pro	gin	gly	VAL	gin |	gly	ILE	gin
gly	a 1 a	pro	gly	a 1 a	pro*	gly	PRO	pro*
gly	pro	a 1 a	gly	pro	a 1 a	gly	pro	a 1 a
gly	glu	glu	gly	glu	glu	gly	glu	glu
giy	lys	arg	gly	1 y s	arg	gly	1 y s	arg
gly	a 1 a	arg	gly	a 1 a	arg	gly	a 1 a	arg
gly	glu	pro	giy	a 1 u	pro*	gly	glu	pro*
gly	giy	va 1	gly	giy	ALA	giy	PRO	THR
giy	pro	i 1 e	gly	pro	ALA	giy	LEU	PRO*
gly	pro	pro	gly	pro	pro*	gly	pro	pro*
giy	glu	arg	gly	glu	arg	gly	glu	arg
gly	a 1 a	pro	gly	a 1 a	pro*	gly	GLY	pro*
gly	asn	arg	giy	SER	arg |	gly	SER	arg
gly	phe	pro	gly	phe	pro*	gly	phe	pro*
gly	gin	asp	gly	gin	asp	gly	ALA	asp
giy	1 eu	a 1 a	gly	1 eu	a 1 a	gly	VAL	a 1 a
gly	pro	1 y s	gly	pro	lys*	gly	pro	lys*
gly	a 1 a	pro	gly	PRO	pro* |	gly	PRO	ALA |
gly	glu	arg	gly	glu	arg	gly	glu	arg
gly	pro	ser	giy	SER	PRO*	gly	ALA	PRO*
giy	1 eu	a 1 a	gly	ALA	VAL	gly	PRO	ALA
gly	pro	1 y s	gly	pro	lys*	gly	pro	lys*
gly	a 1 a	asn	gly	SER	PRO*	gly	SER	PRO*
gly	asp	pro	giy	GLU	ALA	giy	GLU	ALA
giy	arg	pro	gly	arg	pro*	gly	arg	pro*
gly	g 1 u	pro	giy	glu	ΆΕΑ |	giy	g lu	ALA |

312

342

372

402

432

HU 220 357 Β

462

gly	leu	pro	gly	1 eu	pro*	gly	1 eu	pro*
gly	a 1 a	arg	1 giy	a 1 a	LYS* |	gly	a 1 a	LYS*
gly	1 eu	thr	gly	1 eu	thr	gly	1 eu	thr
gly	arg	pro	gly	arg	pro*	gly	SER	pro*
gly	asp	a 1 a	giy	asp	a 1 a	gly	SER	PRO*
giy	pro	gin	gly	pro	gin	gly	pro	ASP
gly	1 y s	va 1	gly	lys	va 1	gly	1 y s	THR
gly	pro	ser	gly	pro	ser	gly	pro	PRO*
gly	a 1 a	pro	gly	a 1 a	pro*	gly	PRO	ALA
gly	g 1 u	asp	gly	glu	asp	gly	GLN	ASN
gly	arg	pro	gly	arg	pro*	gly	arg	pro*
gly	pro	pro	gly	pro	pro*	gly	pro	pro*
gly	pro	gin	gly	pro	gin	gly	pro	PRO*
gly	a 1 a	arg	gly	a 1 a	arg	gly	a 1 a	arg
gly	gin	pro	gly	gin	pro*	gly	gin	ALA
gly	va 1	me t	gly	va 1	me t	gly	va 1	me t
gly	phe	pro	giy	phe	pro*	gly	phe	pro*
gly	pro	lys	giy	pro	lys*	gly	pro	LYS
gly	a 1 a	asn	gly	a 1 a	asn	gly	a 1 a	ALA
gly	glu	pro	giy	glu	pro*	gly	glu	pro*
giy	1 y s	a 1 a	gly	lys	a 1 a	gly	1 y s	a 1 a
gly	g 1 u	1 y s	gly	glu	lys*	gly	glu	ARG
gly	1 eu	pro	gly	1 eu	pro*	gly	VAL	pro*
gly	a 1 a	pro	gly	a 1 a	pro*	gly	PRO	pro*

492

522 gly leu arg gly leu pro gly lys asp gly glu thr gly a 1 a glu gly pro pro gly pro a 1 a gly pro a 1 a gly glu arg gly glu gin gly a 1 a pro gly pro ser gly phe gin gly leu pro gly pro pro gly pro pro gly glu a 1 a gly lys pro gly asp gin gly val pro gly glu a 1 a gly a 1 a pro gly leu val gly pro arg gly glu arg g1y phe pro gly glu arg gly ser pro gly ala gin gly leu gin gly pro arg gly leu pro gly thr pro

552

582

612

HU 220 357 B

642

gly	thr	asp	gly	thr	asp	gly	ASN	asp
gly	pro	1 y s	gly	pro	lys*	gly	ALA	lys*
gly	a 1 a	ser	1 gly	a 1 a	ALA |	gly	ASP	ALA
gly	pro	a 1 a	gly	pro	a 1 a	gly	ALA	PRO*
gly	pro	pro
gly	a 1 a	gin
gly	pro	pro
giy	1 eu	gin
giy	me t	pro
gly	g 1 u	arg
gly	a 1 a	a 1 a
gly	i 1 e	a 1 a	giy	i 1 e	a 1 a	gly	LEU	PRO*
gly	pro	1 y s	gly	pro	lys*	gly	pro	LYS
gly	asp	arg	gly	asp	arg	gly	asp	arg
gly	asp	va 1	gly	asp	va 1	gly	asp	ALA
gly	glu	1 y s	gly	glu	1 y s	gly	PRO	1 y s
gly	pro	g 1 u	gly	pro	glu	gly	ALA	ASP
gly	a 1 a	pro	gly	a 1 a	pro	gly	a 1 a	pro
gly	lys	asp
giy	a 1 a	arg
gly	1 eu	thr
gly	pro	i 1 e
gly	pro	pro
gly	pro	a 1 a
gly	a 1 a	asn	1 gly	ASP	VAL |	gly	ALA	PRO*
gly	glu	1 y s	gly	glu	lys*	gly	ASP	LYS
giy	g 1 u	va 1	giy	glu	va 1	gly	glu	ALA
gly	pro	pro	gly	pro	pro*	gly	pro	SER
gly	pro	a 1 a
gly	ser	a 1 a
gly	a 1 a	arg
gly	a 1 a	pro
gly	glu	arg
gly	glu	thr
gly	pro	pro
gly	pro	a 1 a
gly	phe	a 1 a
gly	pro	pro
gly	a 1 a	asp
gly	gin	pro	gly	gin	pro	gly	gin	PRO*
gly	a 1 a	1 y s	gly	a 1 a	lys*	gly	a 1 a	LYS
gly	glu	gin	1 gly	GLY	gin |	gly	GLU	PRO*
giy	glu	a 1 a	giy	glu	a 1 a	gly	ASP	a 1 a
gly	g 1 n	1 y s	gly	gin	lys*	giy	ALA	lys*
giy	asp	a 1 a	gly	asp	a 1 a	gly	asp	a 1 a
gly	a 1 a	pro	gly	a 1 a	pro*	gly	a 1 a	pro*
gly	pro	gin
giy	pro	ser
gly	a 1 a	pro
gly	pro	gin
gly	pro	thr
gly	va 1	thr
gly	pro	1 y s
gly	a 1 a	arg
gly	a 1 a	gin
gly	pro	pro
gly	a 1 a	t h r
gly	phe	pro
gly	a 1 a	a 1 a
gly	arg	va 1

672

702

732

762

792

HU 220 357 Β gly gly gly gly gly gly gly gly gly gly gly gly gly gly gly gly gly gly gly giy gly gly gly gly gly gly giy gly giy gly gly gly gly gly gly giy gly giy gly gly gly gly gly gly gly gly gly gly gly gly gly giy gly gly giy gly gly giy gly giy pro ser asn pro pro pro 1 y s pro a 1 a asp pro arg glu 1 eu pro pro glu glu asp pro a 1 a pro pro 1 eu gin i 1 e 1 eu g 1 n glu phe 1 eu pro g 1 u gin a 1 a a 1 a asp pro pro pro 1 eu pro g 1 u arg ser a 1 a pro arg a 1 a va 1 asp glu a 1 a a 1 a a 1 a pro ser pro pro 1 y s pro asn pro pro pro ser asp 1 y s arg ser pro a 1 a pro gin a 1 a pro lys pro asp ser g 1 u pro gin a 1 a arg va 1 pro arg arg pro pro ser pro gin pro ser arg pro va 1 pro thr a 1 a pro glu pro asp pro asp a 1 a 1 y s arg thr va 1 pro pro pro pro a 1 a thr gin

822

852

882

912

942

972

HU 220 357 Β

1002

g	ly	asp	a	rg
g	iy	glu	a	1 a
g	ly	a 1 a	g	1 n
g	ly	pro	m	le t
g	iy	pro	s	e r
g	ly	pro	a	1 a
g	ly	a 1 a	a	rg
g	ly	i 1 e	g	1 n
g	iy	pro	g	In
g	iy	pro	a	rg
g	ly	asp	1	ys
g	iy	glu	a	1 a
g	ly	glu	P	r o
g	iy	glu	a	rg
g	ly	1 eu	1	ys
g	ly	h i s	a	rg
g	iy	phe	t	hr
g	iy	1 eu	g	In
g	ly	1 eu	P	ro
g	iy	pro	P	r o
g	ly	pro	s	e r
g	iy	asp	g	In
g	ly	a 1 a	s	e r
g	iy	pro	a	1 a
g	ly	pro	s	e r
g	iy	pro	a	rg
g	iy	pro	P	r o
g	iy	pro	V	a 1
g	ly	pro	s	e r
g	ly	1 y s	a	sp
g	iy	a 1 a	a	sn
g	ly	i 1 e	P	r o
g	iy	pro	i	1 e
g	ly	pro	P	r o
g	iy	pro	a	rg
g	iy	arg	s	e r
g	iy	glu	t	hr
g	ly	pro	a	1 a
g	iy	pro	P	r o
g	ly	asn	P	r o
g	iy	pro	P	r o
g	ly	pro	P	r o
g	iy	pro	P	r o
g	iy	pro	g	ly

1032

1062

1092

Claims (23)

1. Autoimmun betegség során immuntámadást szén- 50 védő szervre vagy szövetre specifikus, autoantigéntől, annak fragmensétől vagy származékától eltérő, bétatranszformáló növekedési faktor (β-TGF) felszabadulását kiváltó bystander antigén alkalmazása, autoimmun betegség kezelésére alkalmas gyógyászati készítmény előállítására.

2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint bystander antigénként glukagont alkalmazunk.

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti alkalmazás, orálisan beadható gyógyászati készítmény előállítására.

4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti alkalmazás, inhalációsan beadható gyógyászati készítmény előállítására.

5. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti alkalmazás, sclerosis multiplex vagy állatgyógyászati megfelelője kezelésére alkalmas gyógyászati készítmény előállítására.

6. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti alkalmazás, reumatoid arthritis vagy állatgyógyászati megfelelője

55 kezelésére alkalmas gyógyászati készítmény előállítására.

7. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti alkalmazás, I. típusú diabétesz vagy állatgyógyászati megfelelője kezelésére alkalmas gyógyászati készítmény előállí60 tására.

HU 220 357 Β

8. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti alkalmazás, uveoretinitis vagy állatgyógyászati megfelelője kezelésére alkalmas gyógyászati készítmény előállítására.

9. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti alkalmazás, autoimmun betegség kezelésére alkalmas, kombinációban szinergistát is tartalmazó gyógyászati készítmény előállítására.

10. Eljárás hatóanyagként autoimmun betegség során immuntámadást szenvedő szervre vagy szövetre specifikus, autoantigéntől, annak fragmensétől vagy származékától eltérő, β-TGF-felszabadulást kiváltó bystander antigént tartalmazó, emlős autoimmun betegségének kezelésére szolgáló orális gyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy a bystander antigénnek az autoimmun betegség kezelésében hatásos mennyiségét gyógyászati készítmények előállításánál szokásosan alkalmazott hordozó és/vagy egyéb segédanyagokkal elegyítjük.

11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy bystander antigénként glukagont alkalmazunk.

12. A 10. vagy 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sclerosis multiplex vagy állatgyógyászati megfelelője kezelésére alkalmas gyógyászati készítményt állítunk elő.

13. A 10. vagy 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy reumatoid arthritis vagy állatgyógyászati megfelelője kezelésére alkalmas gyógyászati készítményt állítunk elő.

14. A 10. vagy 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az I. típusú diabétesz vagy állatgyógyászati megfelelője kezelésére alkalmas gyógyászati készítményt állítunk elő.

15. A 10. vagy 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy uveoretinitis vagy állatgyógyászati megfelelője kezelésére alkalmas gyógyászati készítményt állítunk elő.

16. A 10. vagy 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy további hatóanyagként egy szinergista olyan mennyiségét is alkalmazzuk, ami a bystander antigénnel kombinálva az autoimmun betegség kezelésében hatásos.

17. Eljárás hatóanyagként autoimmun betegség során immuntámadást szenvedő szervre vagy szövetre specifikus, autoantigéntől, annak fragmensétől vagy származékától eltérő, β-TGF-felszabadulást kiváltó bystander antigént tartalmazó, emlős autoimmun betegségének kezelésére szolgáló inhalációs gyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy a bystander antigénnek az autoimmun betegség kezelésére alkalmas mennyiségét, gyógyászati készítmények előállításánál szokásosan alkalmazott hordozó- és/vagy egyéb segédanyagokkal elegyítjük.

18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy bystander antigénként glukagont alkalmazunk.

19. A 17. vagy 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy sclerosis multiplex vagy állatgyógyászati megfelelője kezelésére alkalmas gyógyászati készítményt állítunk elő.

20. A 17. vagy 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy reumatoid arthritis vagy állatgyógyászati megfelelője kezelésére alkalmas gyógyászati készítményt állítunk elő.

21. A 17. vagy 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy I. típusú diabétesz vagy állatgyógyászati megfelelője kezelésére alkalmas gyógyászati készítményt állítunk elő.

22. A 17. vagy 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy uveoretinitis vagy állatgyógyászati megfelelője kezelésére alkalmas gyógyászati készítményt állítunk elő.

23. A 17. vagy 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy további hatóanyagként egy szinergista olyan mennyiségét is alkalmazzuk, ami a bystander antigénnel kombinálva az autoimmun betegség kezelésében hatásos.