NO319062B1

NO319062B1 - Bystander suppresjon av autoimmune sykdommer

Info

Publication number: NO319062B1
Application number: NO19943151A
Authority: NO
Inventors: David Allen Hafler; Zhengyi Zhang; Howard Weiner; Ariel Miller; Ahmad Al-Sabbagh
Original assignee: Autoimmune Inc
Priority date: 1992-02-28
Filing date: 1994-08-25
Publication date: 2005-06-13
Also published as: AU3754297A; ES2190784T3; HUT74832A; HU220357B; DK0627933T3; JPH08504745A; EP0627933A4; IL104880A0; DE69332518D1; PT627933E; JP3712260B2; HU9402468D0; DE69332518T2; IL104880A; EP0627933A1; CA2117492A1; BR9306042A; KR950700082A; AU720695B2; NO943151L

Abstract

En fremgangsmåte for behandling av autoimmune sykdommer i pattedyr som omfatter administrering til pattedyr en effektiv mengde for behandling av sykdommene med et tilstedeværende antigen, idet antigenet som utløser frigjøringen av transformerende vekstfaktor beta (TGF-P) ved et locus i kroppen til pattedyrene hvor T-cellene som bidrar til autoimmun respons undertrykker. T-cellenes bidrag til sykdommen. Sammensetninger omfattende tilstedeværende antigener nyttige for behandling av autoimmune sykdommer i pattedyr og farmasøytiske formuleringer derav er også beskrevet.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en forbedring ved behandling av autoimmune sykdommer. Oppfinnelsen er rettet mot anvendelse av bystander antigener (dvs. antigener som undertrykker celler involvert i den autoimmune prosessen) for behandling av autoimmune sykdommer og bruk av glucagon, spesielt for behandling av type 1 diabetes.

Autoimmune sykdommer er kjennetegnet ved en unormal immunrespons rettet mot normale autologe (selv) vev.

Basert på typen av supranormalimmunrespons som er involvert kan autoimmune sykdommer i pattedyr generelt bli klassifisert i en av to forskjellige kategorier: celle-mediert (dvs. T celle-mediert) eller antistoff-medierte forstyrrelser. Ikke-begrensende eksempler på celle-medierte autoimmune sykdommer innbefatter multippel sklerose (MS) reumatoid artritis (RA), autoimmun tyroiditis (AT), diabetes mellitus (begynnende hos barn eller type 1 diabetes) og autoimmun uveoretinitis (AUR). Antistoff-medierte autoimmune sykdommer innbefatter myasthenia gravis (MG) og systemisk lupus erythematosus (SLE).

Begge kategorier av autoimmunsykdommer blir for tiden behandlet med medikamenter som undertrykker immunresponsene på en uspesifikk måte, dvs. medikamenter som kan undertrykke selektivt den unormale immunresponsen. Ikke-begrensende eksempler på slike medikamenter innbefatter methotreksat, cyklofosfamid, Imuran (asatioprin) og cyklosporin A. Stereoidforbindelser så som prednison og metylprednisolon (også uspesifikke immunundertrykkende midler) blir også anvendt i mange tilfeller. Alle disse for tiden anvendte medikamentene har begrensende effektivitet både overfor celle- og antistoff-medierte autoimmunsykdommer. Slike medikamenter har videre signifikant toksisitet og andre bivirkninger og induserer til slutt "global" immunsuppresjon i individer som blir behandlet. Forlenget behandling med medikamentene nedregulerer derfor den normale beskyttende immunresponsen overfor patogener og øker derfor risikoen for infeksjoner. Pasienter utsatt for forlenget global immunsuppresjon har i tillegg øket risiko for å utvikle alvorlige medisinske komplikasjoner etter behandlingen, så som malignheter, nyresvikt og diabetes.

Patentpublikasjonen NO 920127 (WO 9101222) beskriver en fremgangsmåte for behandling eller forhindring av autoimmun ovioretinitis i pattedyr. Foreliggende oppfinnelse viser oral administrering av S-Ag som et retinalt autoantigen. S-AG er imidlertid et autoantigen i S-Ag EAU-modellen og er derfor intet bystander antigen som vist i den foreliggende oppfinnelsen. Den foreliggende oppfinnelsen anvender bystander antigen som ikke er autoantigener og derfor er den foreliggende oppfinnelse ny og skiller seg vesentlig fra nevnte publikasjon.

Miller et al., PNAS 1992,89; 421-425, Miller et al., J Exp Med 1991,174; 791-798 og Karpus et al., J. Immun 1991, 146; 1163-1168 beskriver TGF-pl avhengig suppresjon av MBP-indusert EAE ved anvendelse av administrering av MBP (oralt eller parenteralt) til Lewis-rotter. Også i dette tilfellet kan det nevnes at MBP er et autoantigen i den MBP-induserte EAE-modellen og intet bystander antigen som vist i den foreliggende oppfinnelsen. I foreliggende oppfinnelse er det en forutsetning at det forede antigenet ikke er det samme som antigenet som anvendes for å indusere en sykdom. Nevnte publikasjoner (spesielt Miller et al., i Exp Med 1991,174; 791-798) viser den orale administreringen av OVA og BS A. Imidlertid er disse bystander antigener ikke organ- eller vevsspesifikke, og er således forskjellig fra bystander antigenene som anvendes i forbindelse med den foreliggende oppfinnelsen. Karpus et al. omhandler på ingen måte oralt indusert bystander suppresjon, fordi dyrene som anvendes i forsøkene ikke fores med et hvilket som helst antigen. Således er det helt tydelig at foreliggende oppfinnelse er ny og skiller seg vesentlig fra den kjente teknikken.

I et forsøk på å løse ulempene ved konvensjonelle behandlinger for autoimmun sykdom har oppfinnerne og medarbeiderne tilveiebrakt fremgangsmåter og farmasøytiske formuleringer som er nyttige for behandling av autoimmune sykdommer basert på konseptet med oral tolerering (eller tolerering ved inhalering) ved anvendelse som tolereringsmidler autoantigener, eller sykdomssuppresive fragmenter eller analoger av autoantigener alene eller i kombinasjon med såkalte "synergister", dvs. forbindelser som forsterker tolereringseffekten til autoantigenene.

Autoantigener er antigener som normalt finnes innenfor og som er spesifikke for et organ eller vev under autoimmunt angrep som i seg selv er primære mål for autoimmun respons.

Til tross for at ovennevnte fremgangsmåter og farmasøytiske formuleringer representerer en vesentlig forbedring ved behandling av autoimmune sykdommer er deres terapeutiske tilgjengelighet forsinket på grunn av at i hvert tilfelle må de spesifikke autoantigenene som er involvert i å utløse og opprettholde sykdomstilstanden bli identifisert. De spesifikke forbindelsene som er utsatt for angrep fra immunsystemet må derfor bli bestemt. I mange tilfeller er dette både vanskelig og tidkrevende. Mere enn ett autoantigen kan f.eks. bli utsatt for autoimmunt angrep ved et visst tidspunkt og identifisering av autoantigenet(ene) kan forandres når sykdommen progressivt ødelegger mer og mer av vevet som er involvert.

Det som er nødvendig innenfor dette fagområdet er derfor forbedrede midler, fremgangsmåter og sammensetninger for behandling av individer som lider av autoimmune sykdommer som vil være letter tilgjengelige for terapeutiske anvendelser, f.eks. som ikke på forhånd vil kreve identifikasjon er av autoantigenene. Det er også et behov innenfor fagområdet for ytterligere fremgangsmåter og sammensetninger for behandling av autoimmun sykdom, hvor fremgangsmåtene og sammensetningene kan bli anvendt i tillegg til eller i stedet for autoantigenene.

Det er videre et behov for å utlede mekanismene hvori gjennom autoimmune sykdommer kan bli bekjempet og for identifisering av nye fremgangsmåter og sammensetninger i lys av disse nye kunnskapene som kan bli anvendt for å bekjempe autoimmune sykdommer.

En hensikt ifølge, og fokus av, foreliggende oppfinnelse er å anvende et bystander antigen for fremstilling av et oralt eller inhalerbart legemiddel for behandling av eller forebygging av en autoimmun sykdom hos et individ, hvor det nevnte bystander antigen er spesifikt til et organ eller vev som er rammet av immunangrep i løpet av nevnte sykdom og hvori nevnte bystander antigen ikke er det primære angrepsmålet av det immunregulatoriske systemet i løpet av nevnte sykdom hos nevnte individ.

Foretrukne trekk ved anvendelsen ifølge oppfinnelsen fremgår av medfølgende krav 2 - 6 og er nærmere definert nedenfor i beskrivelsen.

Videre er det tilveiebrakt en anvendelse av glukagon for fremstilling av et oralt eller inhalerbart legemiddel for behandling av type 1 diabetes hos pattedyr.

Foretrukne trekk ved anvendelsen ifølge oppfinnelsen fremgår av medfølgende krav 8 - 12.

Foreliggende oppfinnelse er basert på den uventede og overraskende oppdagelsen av at oral eller enteral administrering (eller administrering ved inhalering) av visse antigener (betegnet "bystander antigener" og definert nedenfor) forårsaker at T-cellene blir utløst som igjen undertrykker celler som bidrar til immunt angrep på organet eller vevet som er involvert i en autoimmun sykdom. T-celler som blir utløst av bystander antigen formidler frigjøringen av transformerende vekstfaktor beta (TGF-B) som undertrykker cellene som bidrar til immunangrepet som finnes i nærheten.

For at denne typen av suppresjonsmekanisme skal kunne virke er det ikke nødvendig at de TGF-B frigjørende T-cellene gjenkjenner de sykdomsbidragende cellene. Det som er nødvendig er at begge typer av celler finnes i samme nærhet når TGF-J3 blir frigjort. En måte å oppnå dette på er å anvende som bystander antigen et antigen som (a) har evnen til å utløse T-celler som forårsaker frigjøring av TGF-B og (b) er selv spesifikk for vevet eller organet som blir angrepet slik at suppressor T-cellene som forårsaker frigjøring av TGF-6 (og som blir utløst før oral administrering av bystander antigen) vil være rettet mot samme organ eller vev som også er en beliggenhet hvor de sykdomsfremmende cellene er konsentrert.

Bystander antigener kan være autoantigener, dvs. de behøver ikke å være de samme antigenene som blir angrepet av de sykdomsinduserende cellene. Det er et interessant trekk ifølge foreliggende oppfinnelse at oral administrering av et bystander antigen kan avverge vevskade utført av celler spesifikke for et annet antigen eller antigenfragment. Dette andre antigenet (eller fragmentet) behøver ikke å ha blitt identifisert. Figur 1 er en kolonnegrafisk fremstilling som viser in vitro suppresjon av proliferative responser formidlet av supernatantene til lymfocytter eller lymfocyttundergrupper isolert fra oralt tolererte dyr. Figur 2 er en kolonnegrafisk fremstilling som viser inhibisjon av in vitro suppresjon til antitransformerende vektstfaktor-B (TGF-B) antistoff. Figur 3 er en kolonnegrafisk fremstilling som viser TGF-Baktivitet i serumfrie kultursupernatanter til suppressor T-celler isolert fra oralt tolererte dyr. Figur 4 (A-D) angir en serie grafiske fremstillinger som viser virkningene av anti-TGF-B antistoffer og kontrollsera på eksperimentell allergisk encefalomyelitis (EAE) i oralt tolererte (MBP-tilførte) og ikke-MBP-tilførte dyr. Figur 5 (A-D) angir en serie kolonnegrafiske fremstillinger som viser virkningen av anti-TGF-B antistoffer på forsinket type hypersensitivitet (DTH) responser i oralt toleriserte og kontrolldyr. Figur 6 (A-C) angir en serie grafiske fremstillinger som viser suppresjon av autoimmunsykdom assosiert med oral administrering av et bystander antigen og vesentlig samtidig immunisering med MBP etterfulgt av injeksjon av valgte antigener. Figur 7 er kolonnegrafisk fremstilling som viser forsinket type hypersensitivitet (DTH) responser assosiert med slike bystander suppresjon. Figur 8 er en kolonnegrafisk fremstilling som viser om in vivo bystander suppresjon av EAE er assosiert med bovint serumalbumin (BSA), ovalbumin (OVA) og myleinbasisk protein (MBP) tilført til dyrene immunisert med MBP og injisert med samme antigen som ble tilført. Figur 9 er en kolonnegrafisk fremstilling som viser at den adaptive overføring av bystander suppresjon er assosiert med CD8<+> suppressor T-celler. Figur 10 er en kolonnegrafisk fremstilling som viser proliferasjon av T-cellene (av den typen som formidler EAE) i respons til syntetiske overlappende marsvin MBP peptider ved MBP-primede lymfoide celler. Figur 11 er en kolonnegrafisk fremstilling som viser evnen som forskjellige MBP peptider har til å utaktivere miltcellene fra MBP-tilførte dyr overfor suppresjon OVA-

i

primede miltceller i et in vitro transbrønnsystem.

Figur 12 (A) er en grafisk fremstilling som angir virkningen av å tilføre et autoantigen (PLP) eller et bystander antigen (MBP) på EAE indusert SJL/J mus med PLP-peptid;

(B) er en kolonnegrafisk fremstilling som oppsummerer dataene ifølge (A).

Figur 13 (A) er en grafisk fremstilling som angir den toleriserende virkningen ved

intravenøs administrering av et autoantigen (PLP) eller et bystander antigen (MBP) på EAE indusert i SJL/J mus med PLP-peptid; (B) er en kolonnegrafisk fremstilling som oppsummerer dataene i (A).

Figur 14 er en kolonnegrafisk fremstilling som viser suppresjon av EAE (indusert med

MBP-peptid 71-90) ved tilførsel av forskjellige marsvin MBP peptider alene eller i kombinasjon med soyabønnetrypsininhibitor (STI). Figur 15 (A-D) er en serie kolonnegrafiske fremstillinger som viser DTH responser i dyr immunisert for EAE med enten total MBP eller MBP peptid 71-90 og tilført enten total MBP eller forskjellige MBP peptider (alene eller i kombinasjon med STI). Figur 16 er en kolonnegrafisk fremstilling som viser virkningen av intravenøs tolerisering med MBP og sykdoms induserende og ikke-induserende fragmenter derav på indusert EAE ekspresjon i SJL/J mus.

Alle patentsøknader, patenter og litteraturreferanser som er sitert i denne beskrivelsen er inkorporert heri som referanse.

Definisjoner

Følgende betegnelser som blir anvendt i beskrivelsen har følgende betydninger:

(a) "Bystander antigen" eller "bystander" er et protein, proteinfragment, peptid, glykoprotein eller en hvilken som helst annen immunogen forbindelse (dvs. en forbindelse som kan utløse en immunorespons) som (i) ved oral eller enteral administrering (eller administrering ved inhalering) utløser suppressor T-celler som forårsaker at TGF-B blir frigjort og derved undertrykker cellene som bidrar til ødeleggelse av vevet i løpet av en autoimmun sykdom og selv når de ødeleggende cellene er spesifikke for en annen immunogen forbindelse. Suppressor T-cellene utløst av den bystander vil bli målsøkt til samme vev som blir angrepet i løpet av en autoimmun sykdom. Betegnelsen omfatter derfor, men er ikke begrenset til, antigener som kan forårsake ovennevnte frigjøring av TGF-B og er spesifikk for vevet eller organet som blir angrepet i nevnte autoimmune sykdom. Betegnelsen omfatter autoantigener og fragmenter eller analoger derav som har evnen til å utløse slike T-celle suppressorer ved oral eller enteral administrering eller ved inhalering. "Bystander" er ikke tilsvarende "autoantigen" som sistnevnte er definert heri. Et "autoantigen" er ikke også en "bystander" unntatt at når det ved inntak eller inhalering undertrykker den autoimmune responsen vis utløsning av T-suppressorer som forårsaker frigjøring av TGF-B som beskrevet ovenfor. (b) "Bystander suppresjon" er suppresjon av celler som bidrar til autoimmun destruksjon ved frigjøring av den immunsuppresive TGF-B og denne frigjøringen blir igjen formidlet av suppressor T-celler utløst ved inntak eller inhalasjon av et bystander antigen og rekruttert til setet hvor cellene som bidrar til autoimmun destruksjon finnes. Resultatet er nedregulering av den spesifikke autoimmune responsen. (c) "Pattedyr" er definert heri som en hvilken som helst organisme som har et immunsystem og som er mottakelig for en autoimmun sykdom. (d) "Autoimmun sykdom" er definert heri som en feilfunksjon i immunsystemet til pattedyrene, inkludert mennesker, hvor immunsystemet ikke skjelner mellom fremmede forbindelser i pattedyret og/eller autologe vev eller forbindelser og, som et resultat, behandler autologe vev og forbindelser som om de var fremmede og danner en immunrespons mot disse. (e) "Autoantigen" er en hvilken som helst forbindelse eller en del derav som normalt finnes i et pattedyr som, i en unormal situasjon, ikke lenger gjenkjennes som en del av selve pattedyret av lymfocyttene eller antistoffene til pattedyret, og er derfor det primære målet for angrep fra det immunregulatoriske systemet som om det var en fremmed forbindelse. Betegnelsen innbefatter også antigene forbindelser som induserer tilstander med karaktertrekkene til en autoimmun sykdom når administrert til pattedyrene. (f) "Behandling" skal innbefatte både profylaktisk behandling for å forhindre en autoimmun sykdom (eller å forhindre manifestasjon av kliniske eller subkliniske, f.eks. histologiske symptomer derav), samt terapeutisk suppresjon eller lindring av symptomer etter begynnelsen av en slik autoimmun sykdom. (g) "Synergister" er definert heri som forbindelser som supplerer eller forsterker suppresjonen av den kliniske (og/eller histologiske) manifestasjonen av autoimmune sykdommer når administrert oralt eller ved inhalering i sammenheng med administrering av et tilsted værende antigen og/eller et autoantigen. Som anvendt i foregående setning, og andre steder i denne beskrivelsen, "i sammenheng med" (også referert til heri som i assosiasjon med) betyr før, vesentlig samtidig med eller etter oral eller aerosol administrering av autoantigener og/eller bystander antigener. Administrering av den forente forbindelsen bør ikke følge etter administrering av autoantigen eller bystander antigen med så lang tidsintervall at de relevante virkningene av forbindelsen

som er blitt administrert først er blitt oppbrukt. Synergister bør derfor bli administrert i løpet av omtrent 24 timer før eller etter at autoantigenet eller det bystander antigenet, og fortrinnsvis i løpet av omtrent 1 time. (h) "Oral" administrering innbefatter oral, enteral eller intragastrisk administrering. (i) En sykdom med "karaktertrekk" eller "symptomer" på en bestemt autoimmun sykdom referer til en spontan eller indusert sykdomstilstand som fremkommer med spesifikk betennelse av det samme organet eller vevet som det som er påvirket i den autoimmune sykdommen. Et eksempel på en indusert tilstand er EAE som er en modell for multippel sklerose. Et eksempel på en spontan tilstand er diabetes utviklet av NOD mus.

Beskrivelse av bystander suppresjon

Det er nå uventet blitt oppdaget at oral eller ved -inhalasjonsadministrering av tilstedeværende antigener er en effektiv behandling for en autoimmun sykdom. I det minste celleformidlete autoimmune sykdommer kan bli behandlet ved anvendelse av fremgangsmåter og farmasøytiske formuleringer ifølge foreliggende oppfinnelse.

Suppresjon formidlet ved oral administrering av bystander antigener oppnås ved å utløse suppressor T-celler som frigjør en immun suppressiv faktor, transformerende vekstfaktor-beta (TGF-B).

TGF-B er ikke spesifikk for antigenet som utløser suppressorcellene som frigjør det, til tross for at disse suppressor T-cellene frigjør TGF-B bare når utløst av det oralt administrerte (eller inhalerte) antigenet. Rekruttering av suppressor T-celler til et lokus innenfor et pattedyr hvor cellene som bidrar til den autoimmune destruksjonen av et organ eller vev er konsentrert muliggjør frigjøring av TGF-B i nærheten av de sykdomsforårsakende cellene og undertrykker (dvs., inaktiverer) disse cellene. Evnen som TGF-B har til å undertrykke disse "destruktive" cellene er uavhengig av antigenet som de destruktive cellene kan være spesifikke for.

Den foretrukne måten å oppnå suppresjon av destruktive celler på er å selektere for oral administrering til pattedyret antigen som ikke bare har evnen til å utløse suppressor T-celler som kan frigjøre TGF-B, men som kan målsøke disse suppressor T-cellene til en beliggenhet innenfor pattedyrets kropp hvor destruktive celler finnes i høy konsentrasjon. Det foretrukne og mest effektive målet for suppressor T-celler er organet eller vevet består under immunt angrep i den bestemte autoimmune sykdommen som er involvert på grunn av at de destruktive cellene vil bli konsentrert i nærheten av det organet eller vevet.

Det er dermed foretrukket at det bystander antigenet (som suppressor T-cellene er spesifikke overfor) er selv et antigen som er spesifikt for vevet eller organet som blir angrepet. Det bystander antigenet kan derfor være et autoantigen eller fortrinnsvis et ikke-sykdomsinduserende fragment eller en analog av et autoantigen (det er mye som tyder på at delene eller epitopene til autoantigenet som er involvert i indusering av sykdom eller i vevsdestruksjon ikke er de samme som de som er involvert ved bystander suppresjon, se eksempel 6 nedenfor). Bystanderen kan derimot være et annet antigen som ikke er et autoantigen, dermed behøver autoantigenet (eller autoantigenene) som er involvert ikke bli identifisert.

Mekanismen for bystander suppresjon ifølge foreliggende oppfinnelse for et vevsspesifikt bystander antigen er som følger: etter at et vevsspesifikt bystander antigen er administrert oralt (eller enteralt, dvs. direkte inn i maven) eller ved inhalering, passerer det inn i tynntarmen hvor det kommer i kontakt med de såkalte Peyers Patches, som er samlinger av immunocytter beliggende under tarmveggen. Disse cellene kommuniserer igjen med immunsystemet, inkludert milt og lymfeknuter. Resultatet er at suppressor (CD8+) T-cellene blir indusert og rekruttert til området med autoimmunt angrep, hvor de forårsaker frigjøring av TGF-13, som kan uspesifikt nedregulere B-cellene samt aktiverte CD4+ T-celler direkte mot pattedyrets egne vev. Til tross for den uspesifkke naturen til aktiviteten av TGF-B er den resulterende toleransen spesifikk for den autoimmune sykdommen på grunn av at det bystander antigenet er spesifikt for vevet som blir angrepet og som undertrykker immuncellene som finnes ved eller nære ved vevet som blir skadet.

Et annet tilfelle av bystander suppresjon som hører innunder rammen av oppfinnelsen innbefatter oral administrering av et antigen som er verken et autoantigent eller spesifikt for et vev eller organ som blir angrepet. For å aktivere bystander suppresjon må injeksjon med det samme antigenet foregå. Det inntatte eller inhalerte antigenet utløser dannelsen av suppressor T-celler som blir målsøkt til mikromiljøet, reaksjonsveien eller betent vev (avhengig av hvor det injiserte antigenet lokaliseres) hvor de forårsaker frigjøring av TGF-B. TGF-B undertrykker alle immunoangrepcellene, inkludert de vevsødeleggende cellene.

TGF- B

TGF-8 påvirker cellene til immunsystemet (f.eks. T og B lymfocytter) for derved å påvirke inflammatoriske responser. T-lymfocytter (og andre celler) produserer TGF-B. Det blir frigjort relativt sent i kaskaden til immunsystemresponshendelsene (etter T-celleaktivering) og er sterkt suppresivt for både T- og B-celleproliferasjon. Mange normale vev har evnen til å produsere TGF-B. Disse innbefatter humane blodplater, placenta, bovin nyre, ben, NK celler, B-celler, samt CD4+ og CD8+ T-celler og aktiverte makrofager. Isolerings- og biologiske egenskaper til TGF-B er blitt beskrevet i Transforming Growth Factor-Bs Chemistry, Biology and Therapeutics, Piez, K.A et al Eds, Ann. N.Y. Acad. Sei. 593:1-217,1990.

Til tross for at TGF-B opprinnelig ble identifisert som en vekstfaktor ble det fort klart at det var en forbindelse med mange og viktige immunregulatoriske egenskaper inkludert inhibisjon av B- og T-celler og inhibisjon av aktiviteten til CD4+ celler mer enn CD8+ celler, både i gnagere og mennesker. TGF-B er også kjent for å antagonisere inflammatoriske cytokiner såsom tumornekrosefaktor (TNF) og gammainterferon (IFN-y), blokkere cytotoksisk lymfocyttaktivitet og inhibere induksjonen av reseptorer for interlaukin-1 (IL-1) interlaukin-2 (IL-2) for derved å gjøre cellene ureagerende overfor disse cytokinene. TGF-B er et protein som har en molekylvekt på 25 kD og består av to identiske 12,5 kD subenheter som blir holdt sammen av et antall interkjede disulfmbindinger. Minst to former av TGF-B eksisterer: aktiv og latent. Aktiv TGF-B har en kort halveringstid og en liten volumfordeling, mens latent TGF-B har en utvidet halveringstid og en større volumfordeling. To isoformer av TGF-B eksisterer, TGF-B1 og TGF-B2. Det antas at TGF-B1 er involvert i bystander suppresjon.

Dyremodeller

I foreliggende beskrivelse er det blitt referert til forskjellige modellsystemer som er blitt utviklet for studering av autoimmune sykdommer. Eksperimentell autoimmun encefalomyelitis (EAE) er blitt studert i mus og andre pattedyrarter som en modell for multippel sklerose (MS). Fagfolk innenfor dette området vet at nesten alle potensielle immunterapier for MS først blir testet i dette dyremodellsystemet. Sykdom blir indusert ved parenteral administrering av myelinbasisk protein (MBP) eller proteolipidprotein (PLP) og en adjuvant (såsom Freunds fullstendige adjuvant, FCA). Denne behandlingen med et av antigenene, induserer begge en monofasisk og en

forverrende/tilbakevendende form av det myelinerende sykdom (avhengig av artene og

detaljene ved administrering). Denne induserte sykdommen har samme karaktertrekk som den autoimmune sykdommen MS.

Parenteral administrering av mycobacterium tuberculosis med Freunds fullstendige adjuvant i olje inn i den dorsale rothalen til mottakelige pattedyr induserer en sykdom med karaktertrekk som human reumatoid artritis. På samme måte vil parenteral administrering av type II kollagen med en adjuvant også indusere en sykdom med karaktertrekken til human reumatoid artritis.

Administrering til Lewisrotter av S-antigen eller IRBP-antigen med en adjuvant induserer autoimmun uevoretinitis, mens diabetes utvikles spontant i NOD mus og BB rotte.

En eller flere av de ovenfor beskrevne modellsystemene kan bli anvendt for å demonstrere effektiviteten og den forbedrete behandlingen som blir gitt ifølge foreliggende oppfinnelse. Dyremodellene er spesielt egnede for testing av terapier som involverer bystander suppresjon nøyaktig på grunn av at denne mekanismen innbefatter suppresjon av alle immunangrepscellene uansett antigenet som de er spesifikke overfor og er derfor upåvirket av mange aktuelle eller potensielle forskjeller mellom en human autoimmunforstyrrelse og en dyremodell derav.

Ovennevnte dyremodeller kan bli anvendt for å etablere anvendbarheten av foreliggende oppfinnelse i pattedyr (inkludert mennesker). Oppfinnerne administrerte oralt et multippel sklerose autoantigen, bovint myelin, til mennesker i en dobbelt-blindstudie og oppdaget at en viss pasientundergruppe fikk en betraktelig fordel fra denne behandlingen. Reumatoid artritis symptomer, så som leddømhet, AM stivhet, gripestyrke osv. ble vellykket undertrykket i mennesker som mottok oral kollagen (0,1-1,0 mg enkeltdose daglig). Humane forsøk med oral S-antigen viste meget lovende resultater for uveoretinitits. Alle disse humane forsøkene ble forsøkt basert på data fra dyr ved anvendelse av den hensiktsmessige dyremodellen. Den antatte verdien av dyremodellene for terapeutisk behandling av autoimmune sykdommer er dermed blitt vesentlig bedret.

i

Bystander antigener

Bystander antigener som ikke er spesifikke for vevet som blir angrepet i løpet av den autoimmune sykdommen kan bli identifisert blant ikke-toksiske antigene forbindelser ved anvendelse av det samme analysesystemet som ble anvendt for OVA i f.eks. eksempel 1.

Bystander antigener er spesifikke for et vev eller et organ kan lett bli identifisert ved å teste evnen som slike spesifikke antigener har til å forårsake frigjøring av TGF-13, som kan bli detektert. En eller flere potensielle vevspesifikke bystander antigener kan f.eks. bli renset ved anvendelse av velkjente antigenrensingsteknikker fra et organ eller vev som er målet for det autoimmune angrepet.

Bystander antigener og autoantigener (samt fragmenter og analoger av disse) kan også bli oppnådd ved anvendelse av rekombinant DNA teknologi, i bakterielle, gjær, insekt (f.eks. psacalan virus) og pattedyrceller ved anvendelse av teknikker som er velkjente for fagfolk innenfor dette området. Aminosyresekvenser for mange potensielle og aktuelle bystander antigener er kjente (sykdomsinduserende epitoper bør fortrinnsvis ikke bli anvendt): se f.eks. Hunt, C et al PNAS (USA), 82:6455-6459,1985 (varmesjokkprotein hsp70); Burkhardt, H et al, Eur. J. Immunol. 21:49-54 1991 (antigenkollagen II epitope); Tuohy, V.K. et al, J. Immunol. 142:1523-1527,1989 (encefalitogenisk determinant til muse PLP); Shinohara, T et al, i Progress in Retinal Research, Osbome, N. & Chader J. Eds, Pergamon Press 1989, s. 51-55 (S-antigen); Donoso, L.A. et al, J. Immunol. 143:79-83,1989 (IRBP); Yamaki, K et al, FEBS 234:39-43,1988 (S-antigen); Donoso, L.A. et al, Eye Res. 7:1087,1988 (IRBP); Wyborski, R.J. et al, Mol. Brain Res. 8:193-198 (GAD).

Aminosyresekvensene for bovin PLP; bovin, human, sjimpanse, rotte, mus, gris, kanin, marsvin MBP, human og bovin kollagen alfa-1(11) og bovin kollagen alfa-1(1); og humant insulin selv om det blir tatt fra publiserte kilder, er oppført i appendiks A.

I tillegg er noen vevspesifikke antigener kommersielt tilgjengelige, f.eks. insulin, glukagon, myelinbasisk protein, kollagen I, kollagen II osv.

Potensielle bystandere kan deretter bli matet til dyrene og miltcellene eller sirkulerende T-celler fra f.eks. blod eller cerebrospinalfluidet når det gjelder EAE eller MS, fra disse pattedyrene kan bli fjernet, og stimulert in vitro med samme antigen. T-celler utløst ved stimulering kan bli renset og supernatantene kan bli testet for TGF-13 innholdet kvantitativt og/eller kvalitativt ved anvendelse av f.eks. et egnet kommersielt tilgjengelig polyklonalt eller fortrinnsvis monoklonalt antistoff dannet mot TGF-B eller en annen kjent analyse for TGF-B deteksjon som beskrevet i eksempel 1 nedenfor ved anvendelse av en kommersielt tilgjengelig minklunge epitelialcellelinje. Slike fremgangsmåter for testing for TGF-B er beskrevet i detalj i eksemplene nedenfor. Fremgangsmåter for bekreftelse på bystander potensiale til peptidene avledes fra autoantigenene er også illustrert i eksemplene.

Anvendelse av bystander antigener - doseringer

Toleransen indusert av bystander antigener ifølge oppfinnelsen er doseavhengig over et bredt område av oral (eller enteral) eller inhalerbare doseringer. Det er derimot minimale og maksimale effektive doseringer. Suppresjon av de kliniske og histologiske symptomene til en autoimmun sykdom oppstår dermed innenfor et spesifikt doseringsområde som varierer fra sykdom til sykdom, pattedyr til pattedyr og bystander antigen til bystander antigen. Når sykdommen f.eks. er PLP- eller MBP-indusert EAE i mus er det suppressive doseringsområdet når MBP blir anvendt som bystander fra omtrent 0,1 til omtrent 1 mg/mus/foring (idet foringene foregår omtrent annenhver dag f.eks. 5-7 foringer over en 10-14 dagers periode). Den mest foretrukne dosering er 0,25 mg/mus/f5ring. For suppresjon av den samme sykdommen i rotter er MBP suppressiv doseringsområde fra omtrent 0,5 til omtrent 5 mg/rotte/foring og den mest foretrukne doseringen er 1 mg/rotte/foring. Det effektive doseringsområdet for mennesker med MS, når MBP blir anvendt, er på mellom omtrent 1 og omtrent 100, fortrinnsvis mellom omtrent 1 og omtrent 50 mg MBP pr dag (administrert hver dag eller annenhver dag) idet det optimale er omtrent 30 mg/dag.

For reumatoid artritis er det effektive doseringsområdet for mennesker som mottar enten type I eller type II kollagen omtrent 0,1 til omtrent 1 mg/dag. For adjuvantindusert artritis i mus er det effektive kollagendoseringsområdet omtrent 3 til omtrent 30 mikrogram/foring med samme ioringsskjema som for EAE.

Bestemmelse av effektivt doseringsområde samt optimal mengde er kjent for fagfolk innenfor dette området. Doseringer for pattedyr og humane doseringer kan f.eks. bli bestemt ved å begynne med en relativt lav dose (f.eks. 1 mikrogram) progressivt å øke denne (f.eks. logaritmisk) og måling av mengden TGF-B i blodet og/eller registrering av alvorligheten til sykdommen, ifølge velkjente registreringsmetoder (f.eks. på en skala fra 1 til 5, eller ved å måle antall angrep, eller ved å måle svelling av ledd, gripestyrken, stivhet, syn osv. avhengig av sykdomstypen). Optimal dosering er den som danner den maksimale mengden av TGF-B i blodet og/eller forårsaker størst reduksjon i sykdomssymptomene. Et effektivt doseringsområde er det som forårsaker minst en statistisk signifikant attenuering av minst et symptom karakteristisk for sykdommen som blir behandlet.

Foreliggende oppfinnelse kan også med fordel bli anvendt for å forhindre forløpet av en autoimmun sykdom i mottakelige individer som risikerer en autoimmun sykdom. Fremgangsmåte for identifikasjon av pasienter som risikerer å utvikle type 1 diabetes eksisterer og er pålitelige og er nylig blitt støttet av den amerikanske diabetes foreningen (ADA). Forskjellige analysesystemer er blitt utviklet som (spesielt i kombinasjon) har en høy forutsigbar verdi med mottakelighet for type 1 diabetes (Diabetes Care 13: 762-775,1990). Detaljer angående foretrukket screeningstest er tilgjengelig for fagfolk innenfor området (Bonifacio, E et al, The Lancet 335:147-149, 1990).

Fra et praktisk standpunkt er forhindring av forløpet av de fleste autoimmune sykdommene ikke et like viktig mål som når det gjelder diabetes. MS, RA, AT og AUR blir fastslått ved et tidlig standpunkt, før vesentlig vevsskade har foregått, derfor er preventiv behandling av disse sykdommene ikke like viktige som når det gjelder diabetes.

En ikke-begrensende liste av autoimmune sykdommer og vevs- eller organspesifikke bekreftede eller potensielle bystander antigener effektive for behandling av disse sykdommene når administrert i en oral eller inhalerbar er angitt i tabell 1 nedenfor. Administrering av kombinasjoner av antigener oppført for hver individuelle sykdom er også ventet å være effektive for behandling av sykdommen.

For en hvilken som helst autoimmun sykdom kan vevsekstrakter bli anvendt samt spesifikke bystander antigener. Myelin er f.eks. blitt anvendt for MS og bukspyttkjertelekstrakter er blitt anvendt for type 1 diabetes. Administrering av en eller flere individuelle antigener er derimot foretrukket.

Ifølge foreliggende oppfinnelse ved behandling av type 1 diabetes kan en effektiv mengde (bestemt som beskrevet ovenfor) glukagon bli administrert oralt eller ved inhalering. Glukagon er spesielt tilstede i bukspyttkjertelen.

Glukagon er derimot ikke et autoantigen på grunn av at det er bukspyttkjertel betaceller som ødelegger forløpet av type 1 diabetes, mens glukagon bare finnes i alfaceller som er en annen celletype. Glukagon er derfor en "ren" bystander: det har ikke noen autoantigen aktivitet.

Insulin har definitivt bystander aktivitet for type 1 diabetes. Det for tiden ikke kjent om insulin også er et autoantigen. Uansett virkningsmekanisme så er oral, enteral og inhalerbare insulinpreparater effektive når det gjelder å undertrykke sykdommer med karaktertrekkene til type 1 diabetes som i inngitt patentsøknad serial nr 595.468.

For sykdommer som har karaktertrekkene til multippel sklerose virker de ikke-induserende fragmentene til MBP, f.eks. et peptid omfattende marsvin MBP aminosyrene 21-40 som bystander ikke bare for MBP-induserte sykdommer (dvs. når MBP er det primære målet for autoimmunt angrep), men også for PLP-indusert sykdom (når PLP er det primære målet for det autoimmune angrepet).

For reumatoid artritis og dyremodeller derav har type-I og type-II kollagen bystander aktivitet.

For sykdommer med karaktertrekk til uveoretinitis har S-antigen bystander aktivitet.

Ikke-induserende fragmenter av bystander antigener som også er autoantigener er foretrukket. Slike fragmenter kan bli bestemt ved anvendelse av den overlappende peptidmetoden ifølge eksempel 3 (som er en generell teknikk til tross for at den i eksempel 3 er beskrevet spesifikt med hensyn på identifikasjon av ikke-induserende fragmenter av MBP).

De foreliggende oppfinnere har også oppdaget at oralt administrerte autoantigener og bystander antigener begge har epitoper som spesifikt induserer produksjon og/eller frigjør TGF-B. Til tross for at immundominant epitoper av f.eks. MBP tidligere er blitt beskrevet, dvs. epitoper som en stor del av pasientens CD4+ T-lymfocytter gjenkjenner og prolifererer i respons til, eller som en stor del av pasientens antistoffer gjenkjenner, immunsuppressive epitoper, dvs. de som utløser produksjon og/eller frigjøring av TGF-B er ikke tidligere blitt beskrevet eller foreslått. Oral eller bi-inhalasjonsadministrering av peptider som omfatter disse epitopene antas å være mer spesifikke når det gjelder å utløse bystander suppresjon enn administrering av hele antigenet uten risiko for å sensibilisere dyret for sykdomsinduserende eller sykdomspropagerende deler av et autoantigen. De immunsuppressive epitopene kan bli identifisert ved anvendelse av fremgangsmåtene beskrevet i eksempel 3 for identifikasjon av MBP-peptid 21-40 (se også fig. 14).

Bystander antigener kan bli administrert sammen med autoantigener (kombinasjon er effektivt) for å behandle eller forhindre autoimmune sykdommer. Autoantigen administrering blir utført som beskrevet i US patentsøknad serie nr 460.852, 596.936, 454.486, 551.632, 502.559, 607.826 og 595.468 nevnt ovenfor. Koadministrering av spesifikke autoantigene (og fortrinnsvis ikke-induserende fragmenter av autoantigener) med andre bystander antigener vil tilveiebringe effektiv suppresjon av de autoimmune sykdommene.

Synergister kan i tillegg også bli gitt ved behandlingen for å forsterke effektiviteten av ovennevnte. Ikke begrensende eksempler på synergister for anvendelse i foreliggende oppfinnelse innbefatter bakterielle lipopolysakkarider fra mange forskjellige gram negative bakterier så som forskjellige undergrupper av E.coli og Salmonella (LPS, Sigma Chemical Co. St. Louis, MO; Difco, Detroit, MI; BIOMOL res. Labs. Plymouth, PA), Lipid A (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO; ICN Biochemicals, Cleveland, OH; Polysciences, Inc, Warrington, PA) og immunregulatoriske lipoproteiner, så som peptider kovalentlig koblet til tripalmitoyl-S-glykarylcysteinyl-seryl-serin (P3 C55) som kan bli oppnådd som beskrevet i Deres, K. et al (Nature, 342:561-564,1989) eller "Brauns" lipoproteiner fra E.coli som kan bli oppnådd som beskrevet i Braun, V. Biochim. Biophys. Acta 435:335-337,1976. LPS er foretrukket og lipid A er spesielt foretrukket. Lipid A er spesielt foretrukket for anvendelse i foreliggende oppfinnelse på grunn av at det er mindre toksisk enn hele LPS molekylet. LPS for anvendelse i foreliggende oppfinnelse kan bli ekstrahert fra gram-negative bakterier og renset ved anvendelse av fremgangsmåten til Galanes et al (Eur. J. Biochem. 9:245, 1969) og Skelly, R.R. et al (Infect. Immun. 23:287, 1979).

Formuleringer

I et annet aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse også en anvendelse av et bystander antigen for å fremstille orale farmasøytiske formuleringer for behandling av pattedyr som lider av autoimmune sykdommer omfattende en mengde av et bystander antigen (som beskrevet nedenfor) som effektivt undertrykker den autoimmune sykdommen. Formuleringene omfatter videre i tillegg en synergist som beskrevet i inngitt US patentsøknad serie nr 487.732, inngitt mars 1,1990 i en mengde effektiv (sammen med bystander antigen ifølge foreliggende oppfinnelse) til å behandle de kliniske symptomene på spesifikke autoimmunsykdommer. Synergister, når administrert sammen med bystander antigener, forårsaker en økning av cytokinene PGE (prostaglandin-E) og IL-4 (interlaukin-4) i nærheten av målorganet.

I beskrivelsen er det underforstått at en hvilken som helst statistisk signifikant attenuering av selv et symptom på en autoimmun sykdom før anvendelse ifølge foreliggende oppfinnelse hører inn under rammen av oppfinnelsen.

Hver oral (eller enteral) formulering kan i tillegg omfatte inerte bestanddeler inkludert farmasøytiske akseptable bærere, fortynningsmidler, fyllstoffer, oppløsnings- eller emulgeringsmidler, og salter, som er velkjente innenfor fagområdet. Tabletter kan f.eks. bli formulert i henhold til konvensjonelle prosedyrer som anvender faste bærere som er velkjente innenfor fagområdet. Kapsler anvendt i foreliggende oppfinnelse kan bli dannet fra et hvilket som helst farmasøytisk akseptabelt materiale, så som gelatin, eller cellulosederivater. Orale leveringssystemer med vedvarende frigjøring og/eller enteriske belegg for oralt administrerte doseringsformer kommer også i betraktning, som de som er beskrevet i US patent nr 4.704.295, utstedt 3. november, 1987; US patent nr 4.556.552 utstedt 3. desember, 1985; US patent nr 4.309.404, utstedt 5. januar, 1982; og US patent nr 5.309.406, utstedt 5. januar, 1982.

Eksempler på faste bærere innbefatter stivelse, sukker, bentonitt, silika og andre vanlig anvendte bærere. Ytterligere ikke begrensende eksempler på bærere og fortynningsmidler som kan bli anvendt i formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter saltvann, sirup, dekstrose og vann.

Det er å bemerke at enhetsinnholdet av det aktive ingredienser eller ingrediensene innbefattet i en individuell dose av hver doseringsform behøver i seg selv ikke utgjøre en effektiv mengde, på grunn av at den nødvendige effektive mengden kan bli nådd ved administrering av en mengde doseringsenheter (så som kapsler eller tabletter eller kombinasjoner derav).

Administreirngsveien til de bystander antigenene ifølge foreliggende oppfinnelse er fortrinnsvis oralt eller enteralt. Foretrukne orale eller enterale farmasøytiske formuleringer kan f.eks. omfatte en pille eller kapsel inneholdende en effektiv mengde av en eller flere bystander antigener ifølge foreliggende oppfinnelse med eller uten en effektiv mengde av en synergist.

Når administrert oralt eller enteralt, kan det bystander antigenet bli administrert i enkeltdoseringsform eller flerdoserings former.

Den effektive mengden av en synergist, f.eks. LPS eller lipid A, som skal bli administrert sammen med bystanderen varierer mellom omtrent 0,15 og 15 mg pr kg kroppsvekt til nevnte pattedyr pr dag og fortrinnsvis mellom omtrent 0,3 og 12 mg pr kg kroppsvekt til nevnte pattedyr pr dag.

I en alternativ foretrukket utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse kan farmasøytiske formuleringer eller doseringsformer ifølge foreliggende oppfinnelse også bli administrert til pattedyr som lider av autoimmune sykdommer ved inhalering, fortrinnsvis i aerosol form. Inhaleringsmåten for administrering er fortrinnsvis ikke gjennom den nasale veien, men gjennom bronki og lungeslimhinner. Det er ventet at mindre mengder av bystander antigener ifølge foreliggende oppfinnelse vil være nødvendig ved anvendelse av aerosol administrering for behandling av en autoimmun sykdom som oppdaget ved behandling av eksperimentell autoimmun encefalomyelitis (EAE) med myelinbasisprotein (MBP) og adjuvant artitis med kollagen som beskrevet i inngitte US patentsøknad serie nr 454.486 inngitt desember 20, 1989. Mengdene av bystander antigener ifølge foreliggende oppfinnelse som kan bli administrert i en aerosol doseringsform er omtrent 0,1 mg og omtrent 15 mg pr kg kroppsvekt av et pattedyr pr dag og kan eventuelt innbefatte en synergist i mengder varierende mellom omtrent 0,1 og omtrent 15 mg pr kg kroppsvekt til nevnte pattedyr pr dag og kan bli administrert i enkeltdoseringsform eller flerdoseringsformer. Den nøyaktige mengden som skal bli administrert vil variere avhengig av tilstanden og alvorligheten til pasientens sykdom og fysiske tilstand til pasienten.

Aerosolfarmasøytiske formuleringer kan innbefatte, som eventuelle ingredienser, farmasøytiske akseptable bærere, fortynningsmidler, oppløsningsmidler og emulgeringsmidler, salter av den typen som er velkjent innenfor fagområdet. Eksempler på slike forbindelser innbefatter normale saltvannsoppløsninger, så som fysiologiske bufrede saltvannsoppløsninger, og vann.

Administreirngsveien til bystander antigenene ifølge denne alternative utførelsesformen av foreliggende oppfinnelse er i en aerosol eller inhalert form. Bystander antigenene og beslektede forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli administrert som tørrpulverpartikler eller som en automatisert vandig oppløsning suspendert i en bærergass (f.eks. luft eller N2). Foretrukne aerosolfarmasøytiske formuleringer kan f.eks. omfatte en fysiologisk akseptabel bufret saltvannsoppløsning inneholdende mellom omtrent 1 mg og 300 mg av bystander antigener ifølge foreliggende oppfinnelse.

Tørr aerosol i form av finfordelte faste partikler av bystander antigener som ikke er oppløst eller suspendert i en væske er også nyttige ved utførelser av foreliggende oppfinnelse. Bystander antigener kan være i form av støvpulvere og omfatte finfordelte partikler som har en gjennomsnittlig partikkelstørrelse på mellom omtrent 1 og 5 mikron, fortrinnsvis mellom 2 og 3 mikron. Finfordelte partikler kan bli fremstilt ved pulverisering og siktfiltrering ved anvendelse av velkjente teknikker. Partiklene kan bli administrert ved inhalering av en forutbestemt mengde av det finfordelte materialet som

kan være i form av et pulver.

Spesifikke ikke-begrensende eksempler på bærere og/eller fortynningsmidler som er nyttige i aerosolfarmasøytiske formuleringer ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter vann og fysiologisk-akseptable bufrede saltvannsoppløsninger så som fosfatbufret saltvannsoppløsning, pH 7,0-8,0. Ytterligere ikke-begrensende eksempler på egnede bærere eller fortynningsmidler for anvendelse i aerosolfarmasøytiske formuleringer eller doseringsformer ifølge foreliggende oppfinnelse er beskrevet i US patent nr 4.659.696 utstedt 21. april, 1987,4.863.720 utstedt 5. september, 1989 og 4.698.332 utstedt 6. oktober, 1987.

Farmasøytiske formuleringer kan bli administrert i form av en aerosolspray ved anvendelse av f.eks. en forstøver som de som er beskrevet i US patent nr 4.624.351 utstedt 25. november, 1986; 3.703.173 utstedt 21. november, 1972; 3.561.444 utstedt 9. februar, 1971 og 4.635.627 utstedt 31. januar, 1971. Aerosolmaterialet blir inhalert av individet som skal bli behandlet.

Andre systemer for aerosollevering, så som trykkbelastede bestemte doseinhaleringsinnretmnger (MDI) og tørrpulverinhaleringer som beskrevet i Newman, S.P. i Aerosols and the Lung, Clarke, S.W. og Davia, D. eds. side 197-224. Butter-worths, London, England, 1984 kan bli anvendt ved utførelse av foreliggende oppfinnelse.

Aerosolleveringssystemer av den typen som er beskrevet heri er tilgjengelig fra mange kommersielle kilder inkludert Fisons Corporation (Bedford, MA), Schering Corp.

(Kenilworth, NJ) og American Pharmoseal CO. (Valencia, CA).

Som kjent for fagfolk innenfor dette området er den nøyaktige doseringen og frekvensen av administrering av bystander antigener ifølge foreliggende oppfinnelse (i oral eller aerosol form) en funksjon av aktiviteten til det bystander antigenet, samt alder, kjønn, vekt og fysisk tilstand til individet som skal bli behandlet, og samtidig administrering eller fravær av andre behandlinger. Justering av doseringer som blir anvendt og administreringsskjemaer må bli bestemt basert på disse faktorene og kan være nødvendig å bestemme eksperimentelt. Slik bestemmelse krever derimot ikke mer enn rutinemessig eksperimentering ifølge retningslinjene angitt heri.

Eksperimentelt

I eksemplene nedenfor som skal illustrere foreliggende oppfinnelse uten å begrense rammen er følgende demonstrert: Eksempel 1 viser at den aktive formen av TGF-B 1 isotypen formidler suppresjon av CD4+ T-celler spesifikke for MBP og at CD8+ T-cellene indusert ved tilførsel av MBP til dyr forårsaker frigjøring av TGF-B og det er TGF-B som er ansvarlig for suppresjon. Det samme eksemplet demonstrerer også at antigener som ikke er autoantigener og som til og med ikke er spesifikke for vevene eller organene under autoimmunt angrep kan utløse dannelse av T-suppressorceller som forårsaker frigjøring av TGF-B. Dette kan illustreres ved oral administrering av ovalbumin. Problemet med ovalbumin er derimot at på grunn av at det ikke er spesifikk for det autoimmunt påvirkede vevet, så kan det i seg selv ikke målsøke T-suppressorcellene til et sete hvor cellene som bidrar til det autoimmune angrepet finnes. (Dette problemet er beskrevet i eksempel 2). Eksempel 1 illustrerer også at ikke hvert oralt administrert antigen forårsaker bystander type suppresjon: bovint serumalbumin gjør det ikke.

Eksempel 1 demonstrerer også at den samme mekanismen (bystander suppresjon) virker i suppresjon av EAE ved oral administrering av MBP.

Eksempel 2 viser at et antigen med evne for bystander suppresjon vil ved oral administrering forårsake frigjøring av TGF-B og at dersom suppressor T-cellene utløst av dette antigenet kan bli rekruttert til en beliggenhet hvor cellene bidrar til et immunt angrep kan bli funnet, så vil de sykdomsfremmende cellene bli undertrykt. Eksempel 2 tilveiebringer videre en måte for å oppnå slik rekruttering selv når antigenet ikke er spesifikt for vevet under autoimmunt angrep. Eksempel 2 viser at suppressor T-cellene som muliggjør frigjøring av TGF-B ikke må møte suppresserte celler for at suppresjon skal foregå.

Måten som et ikke-spesifikt bystander antigen kan bli gjort til en effektiv bystander (dvs. "tvunget" til å forårsake at TGF-B blir frigjort i nærheten av de sykdomsfremmende cellene) er ved vesentlig samtidig injeksjon med et samme antigenet (i løpet av 24 timer før eller etter bystander oral administrasjon). For eksempel når OVA ble tilført til dyrene og deretter ble disse dyrene immunisert med MBP/CFA for å indusere EAE, og det ble oppdaget at en injeksjon med OVA undertrykker EAE. Dette er forårsaket av konsentrasjonen til både EAE fremmende celler (som de OVA-utløsende suppressor T-cellene ikke gjenkjenner) og celler spesifikke for OVA (som er spesifikke for OVA, akkurat som OVA-utløste suppressor T-celler) i lymfeknutene til dyret. Implikasjonen for terapi er at de uspesifikke bystander antigenene også kan bli anvendt for å bekjempe den autoimmune sykdommen dersom deres suppressor T-celler kan bli målsøkt til et sete hvor de vil undertrykke de sykdomsfremmende cellene. Til tross for at anvendelse av slike ikke-spesifikke bystander antigener blir betraktet hovedsakelig som en adjuvant for spesifikk bystander terapi er det klart innenfor rammen av oppfinnelsen.

Eksempel 3 illustrerer en teknikk for identifisering av ikke-induserende fragmenter og immunsuppressive epitoper for en bystander som også er et autoantigen:MBP. Teknikken er generell og kan bli anvendt på et hvilket som helst bystander antigen dersom aminosyresekvensen derav er kjent. (Se også figurene 10,11 og 14).

Eksempel 3 indikerer også at det er deler av autoantigenet (f.eks. immundominante epitoper til marsvin MBP, MBP 71-90, som er et EAE-induserende fragment) som ikke deltar i utløsningen av TGF-fl frigjøringen, og som ikke deltar i bystander suppresjon. Eksempel 3 illustrerer dermed at "ren" bystander suppresjon er ønskelig, i det minste de immundominante (sykdomsinduserende) delene av et autoantigen bør ikke bli anvendt og at konstruksjoner bør bli utført som inkluderer immunsuppressive epitoper og som ekskluderer de sykdomsfremmende epitopene. Eksempel 3 viser også at det er immunsuppressive epitoper i antigener med evne for bystander suppresjon og at når det gjelder autoantigener er de immunsuppressive epitopene forskjellige fra de som er ansvarlige for autoimmun respons.

Eksempel 4 demonstrerer at typer av celler av cytokiner som er involvert i autoimmun respons og suppresjon derav er tilstede (eller fraværende) i barkene og lillehjernene til kontrolldyr eller de som er immunisert med MBP/CFA og/eller tilført MBP eller tilført MBP og synergisten LPS.

Eksempel 5 illustrerer effektiviteten til insulin A-kjede, insulin B-kjede og hver av de fire insulin, B-kjedefragmenter samt glucagon i bystander suppresjon av insulitis assosiert med type 1 diabetes (NOD modell). Insulitis som er en inflammatorisk respons observert i øycellene gir en god markør for å bestemme effektiviteten av type 1 diabetes autoimmun suppresjon på grunn av at insulitis (a) blir utløst ved samme mekanisme som type 1 diabetes og (b) vedvarer bare mens den autoimmune destruksjonen fortsatt

foregår, dvs. mens individet opprettholder minst en viss øyecellefunksjon.

Eksempel 6 demonstrerer at et autoantigen kan bare virke som en bystander for et annet autoantigen. MBP ble dermed demonstrert å være en bystander for PLP. (PLP har også evnen til å undertrykke MBP-indusert sykdom og derfor er PLP en bystander for MBP).

Eksempel 6 viser også at til forskjell fra bystander suppresjon, krever LV. tolerisering at det samme antigenet blir administrert som det som er målet for autoimmunt angrep (eller som induserer sykdommen, i en dyremodell).

EKSEMPEL 1: Suppressor T-celler dannet ved oral tolerisasjon overfor my lein basisk protein suppreserer både in vitro og in vivo immunresponsene ved frigjøring av TGF-fl etter antigenspesifikk utløsning

I eksperimentene beskrevet nedenfor ble følgende materialer og fremgangsmåter anvendt.

Dyr. Hunn Lewis rotte 6-8 uker gamle ble oppnådd fra Harlan-Sprague Dawley Inc.

(Indianapolis, IN). Dyrene ble opprettholdt på standard laboratorisk mat og vann etter behov.

Antigener. Marsvin myelinbasisprotein (MBP) ble renset fra hjernevev ved den modifiserte metoden til Diebler et al (Prep. Biochem. 2:139,1972) som beskrevet i US patentsøknad serie nr 07/487.732 inngitt 2 mars, 1990. Proteininnholdet og renheten ble undersøkt ved gelelektroforese og aminosyreanalyse.

Rea<g>enser. Kommersielle reagenser som ble anvendt var som følger: monoklonale muse anti-rotte IFNy nøytraliserende antistoff (Amgen Biologicals, Thousand Oaks, CA); monoklonalt hamster anti-murint TNFa+fl antistoff (Genzyme, Boston, MA); polyklonalt kanin anti-TGF-61+2 nøytraliserende antistoff (R & D Systems, Inc. Minneapolis, MN) og indomethacin (Sigma, St. Louis, MO). Kalkun antiserum spesifikt for type 1 isoformen av TGF-B ble dannet som tidligere beskrevet (Danielpour, D. et al. J. Cell. Physiol. 138: 79-86,1989).

Induksjon av oral toleranse. Rottene ble foret 1 mg MBP løst opp i 1 ml PBS, eller PBS alene. Ved gastrisk intubasjon ved anvendelse av en 18 gauge rustfri stålnål for foring av dyr (Thomas Scientific, Swedesboro, NJ). Dyrene ble foret fem ganger ved intervaller på 2-3 dager med siste foring 2 dager før immunisering. Hensikten med dette var å indusere toleranse.

In vitro suppresjon av proliferative responser til su<p>ernatanter. Miltcellene ble fjernet 7-14 dager etter siste foring og en enkelt cellesuspensjon fremstilt ved å presse miltene gjennom en rustfri stålmesh. For preparering av supernatantene ble miltceller i en konsentrasjon på 5 x 10^ celle/ml stimulert in vitro med MBP (50 ug/ml) i 10 ml prolifereirngsmedium. Prolifereringsmediet besto av RPMI1640 (GOBCO, Grand Island, NY) supplementert med 2 x 10"^ M 2-merkatoetanol, 1 % natriumpyruvat, 1 % penicillin og streptomycin, 1 % glutamin, 1 % HEPES, 1 % uessensiell aminosyrer og 1 % autologt serum. Supernatantene ble høstet ved 24 timer og 100 ul ble tilsatt til 2,5 x IO<4> MBP spesifikke T-celler, dannet og opprettholdt som tidligere beskrevet (Ben-Nun, A. et al. Eur. J. Immunol. 11:195-199,1981), dyrket med 5 x 10<5> bestrålte (2500 rad) tymocytter, i 100 ul prolifereirngsmedium. MBP (50 ul/ml) ble tilsatt til kulturen i et volum på 20 ul. Eksperimentene ble utført i triplikat i rundbunnede 96-brønnplater (Costar, Cambridge, MA). Cellene ble dyrket i 72 timer ved 37°C i en inkubator med fuktighet på 6 % CO2 og 94 % luftatmosfære, og hver brønn ble pulset med 1 uCi <3>H thymidin i de siste 18 dyrkningstimene. Kulturene ble høstet på fiberglassfiltre ved anvendelse av en multihøster og telt ved anvendelse av standard væskescintillasjonsteknikker.

Hensikten med dette var å sette opp et analysesystem for oppløselige faktorer produsert ved oral tolerering.

Rensing av T- celleundergrupper. Tapping av lymfocyttundergrupper ble utført ved negativ seleksjon ved anvendelse av magnetiske kuler ifølge en modifisert metode til Cruikshank (J. Immunol. 138: 3817-3823,1987). Miltcellene ble inkubert med en 1:10 fortynning av museanti-rotte CD8, CD4 eller B-cellemonoklonale antistoffer (mAbs)

(klonene OX/8, W3/25 eller OX/33 kommersielt tilgjengelig fra Serotec/Bioproducts, Indianapolis, IN) i 30 minutter på is, vasket to ganger og deretter tilsatt til forvaskede magnetiske partikler med en gjennomsnittlig diameter på 4,5 um (M-450) med geite anti-muse IgG kovalentlig koblet (Dynal Inc., Fort Lee, NJ). Mengden av magnetiske kuler som ble anvendt ble beregnet å være 10 ganger den vurderte målcellepopulasjon. Cellene ble inkubert med kulene i 0,5 ml RPMI 1640 supplementert med 10 % føtalt kalveserum (FCS) i et 10 ml rundbunnet reagensrør (Nunc) i 10 minutter på is med forsiktig risting hvert 5. minutt. Etter inkubasjon ble kule/cellesuspensjonen vasket med 5 ml medium og celle-mAb-kulekompleksene ble separert fra umerkede celler i et sterkt magnetisk område ved anvendelse av en magnetisk-partikkelkonsentrator (Dynal-MPC-1) i 2 minutter. Supernatanten ble fjernet og prosedyren gjentatt to ganger for å oppnå ikke-adherert fraksjon. Cellene i T-celle og B-celle tappede populasjoner var <95 % CD4<+>CD8", CD4-CD8<+> eller CD4<+>CD8<+> eller CD4<+>CD8<+>OX/33" (B-celletappet) som demonstrert ved indirekte flow cytometri. Hele miltpopulasjoner (5 x 10^ celler) fra MBP matede eller kontrollmatede dyr ble dyrket i nærvær av MBP (50 ug/ml) i 1 ml serumfritt proliferasjonsmedium. Tappede populasjoner ble dyrket ved en konsentrasjon på 2,5 x 10^ celler/ml. Supernatantene ble samlet ved 24 timer og 100 ul ble tilsatt til responderceller som beskrevet ovenfor.

Hensikten med dette var å isolere spesifikke undergrupper av T-celler for å bestemme hvilke T-celler som var involvert i bystander suppresjon.

Behandling av supernatanter med anti- cvtokinantistoffer. Miltceller (5 x 10^/ml i proliferasjonsmedium) fra MBP-forede og kontrolldyr ble inkubert i nærvræ av MBP (50 ug/ml) pluss nøytraliserende antistoffer mot interferongamma (INF ), TGF-B, Tumor Necrosis Factor (TNF)_+B eller med indomethacin i 72 timer. Antistoffene ble testet i et område av konsentrasjoner på (1:250, 1:500,1:1000) og indomethacin testet ved konsentrasjoner på 0,5-1 ug/ml. Ved 24 timer ble supernatantene samlet og fritt antistoff eller antistoff-cytokinkomplekser ble fjernet ved anvendelse av magnetiserbare polymerkuler (Dynabeads, Dynal, Inc., Fort Lee, NJ). Kulene koblet med anti-immunoglobulinantistoffer ble inkubert i en konsentrasjon på 4 x 10^ kuler/ml i 30 minutter (utført to ganger for hver prøve) og fjernet ifølge en modifisert metode til Liabakk et al (Scand. J. Immunol. 30:641,1989) ved anvendelse av en Dynal Magnetic Particle Concentrator (Dynal, MPC-1).

Hensikten med disse eksperimentene var å undersøke de oppløselige cytokinene produsert ved oral tolerisasjon.

Måling av TGF- B aktiviteten i serumfrie kultursu<p>ernatanter. Serumfrie kultursupematanter ble samlet som tidligere beskrevet (Kehri et al, J. Exp. Med. 163: 1037-1050,1986; Wahl et al, J. Immunol. 145: 2514-2419,1990). Modulatorceller ble først dyrket i 8 timer med MBP (50 ul/ml) i proliferasjonsmediet. Deretter ble cellene vasket tre ganger og resuspendert i serumfritt medium i de gjenværende 72 timene av dyrkningen, samlet og deretter frosset helt til de skulle bli analysert. Bestemmelse av TGF-B innholdet og isoformtypen i supernatantene ble utført ved anvendelse av en minklungeepitelcellelinje (American Type Culture Collection, Bethesda, MD #CCL-64) ifølge Danielpour et al (supra), og bekreftet ved en sandwich enzymbundet immunosurbentanalyse (SELISA) analyse som tidligere beskrevet (Danielpour et al, Growth Factors 2: 61-71,1989). Prosent aktiv TGF-13 ble bestemt ved analyse uten tidligere syreaktivering av prøvene. Hensikten med disse eksperimentene var å måle og bestemme isoformen til TGF-B produsert T-celler oppnådd fra oralt toleriserte dyr.

Immunisering av dyr. For å indusere en vesentlig EAE sykdomstilstand ble Lewisrotter immunisert med 25 ug MBP i 50 ul i det venstre fotbladet, emulgert i et likt volum av fullstendig Freunds adjuvant inneholdende 4 mg/ml Mycobacterium tuberculosis (Difco).

In vivo administrering av anti- TGF- fl antiserum og kontrollsera. Kalkun anti-TGF-B antiserum spesifikk for type 1 isoform ble anvendt for in vivo eksperimenter og var tidligere blitt dannet og karakterisert (Danielpour et al, 1990, supra). Serum ble varmeinaktivert ved 56°C i 30 min før injeksjon. Dyrene (5 pr gruppe) ble injisert intraperetonealt (LP.) med anti-TGF-B antiserum eller kontroll kalkunserum ved forskjellige konsentrasjoner (12,5,25 eller 50 ul fortynnet i PBS til et endelig volum på 100 ul), 5 ganger ved dagene -2, 0, +2, +4, +6 i forhold til MBP/CFA immunisering. 1 ul av antiserumet blokkerte 4 mg/ml bindingsaktivitet på 125 I-TGF-fll til A549 cellene (Danielpour et al, 1990, supra). In vivo behandling ble gitt både til oralt toleriserte dyr og til dyr for å utvikle EAE uten oral tolerisering.

Disse eksperimentene ble utført for å undersøke virkningen av anti TGF-B antiserum eller oral toleranse induksjon in vivo og for å se om TGF-B aktiviteten ble opphevet.

Klinisk vurdering. For å undersøke korrelasjonen mellom in vitro analyser og klinisk sykdom ble dyrene vurdert blindt hver dag for bevis for EAE. Hvor alvorlig EAE var klinisk ble registrert som følger: 0, ingen sykdom; 1, hengende hale; 2, bakbensparalyse; 3, bakbensparaplegia, inkontinens; 4, tetraplegia; 5, død. Varigheten av sykdommen ble målt ved å telle det totale antall dager fra sykdom begynte (vanligvis 10 dager eller 11 dager etter immunisering) frem til fullstendig helbredelse eller død for hvert dyr.

Forsinket type hvpersensitivitets ( DTH) testing. DTH ble testet ved injisering av 25 ug MBP i PBS subkutant i øret. Tykkelsen ble målt før og 48 timer etter eksponering av en blindet observatør ved anvendelse av mikrometerpinsetter (Mitutoyo, Japan). Forandring i øretykkelsen før og etter eksponeringen ble registrert for hvert dyr og resultatet ble uttrykt som gjennomsnitt for hver eksperimentell gruppe ±SEM.

DTH responsene ble registrert på grunn av at de blir formidlet av CD4+ T-celler som er

EAE.

Statistisk analyse. Sammenligninger av midlene ble utført ved anvendelse av en "one-tailed" student-test og chi square analyse (som er kjent for fagfolk innenfor dette området) ble anvendt for sammenligning av sykdomsforekomsten mellom gruppene.

Eksperimenter ble utført for å bestemme om supernatantene samlet fra splenocytter tappet for T-celle undergrupper eller B-celler fra rotter oralt tolerisert overfor MBP og stimulert in vitro med MBP kunne undertrykke en MBP linje. Som vist i figur 1 oppstår en reduksjon i proliferasjonen til MBP linjen ved tilsetning av supernatanter fra B-celletappede eller CD4 tappede splenocytter fra dyr tilført MBP og stimulert in vitro med MBP. Ingen suppresjon oppsto i supernatanter fra celler til bovint serumalbumin (BSA)-f6rede dyr eller CD8 tappede splenocytter fra MBP-f6rede dyr. Dette indikerte at suppresjonen var spesifikk for tilført antigen og krevde suppressor T-celler.

For å bestemme om et kjent cytokin var ansvarlig for å formidle suppresjonen ble nøytraliserende antistoffer til cytokiner postulert å ha suppressoraktivitet tilsatt til supernatantene i et forsøk for å oppheve suppresjonen. Som vist i figur 2 opphevet kanin anti-TGF-B antistoffet suppresjonen formidlet av supernatanter på en doseavhengig måte. Ingen virkning på suppresjonen fremkom med nøytraliserende antistoffer til INFy, THFa+fl eller når indomethacin, et prostaglandinblokkerende middel, ble tilsatt. Ingen suppresjon oppsto når anti-TGF-B antistoffet ble tilsatt direkte til MBP spesifikk responder T-cellelinje (data ikke vist). Dette indikerer at TGF-B er ansvarlig for suppresjon observert i fig 1 og var forårsaket av en oppløselig faktor.

For å direkte demonstrere tilstedeværelse av TGF-fl i supernatantene til miltcellene fra dyr tilført MBP og stimulert in vitro med MBP ble supernatantet samlet under serumfrie betingelser og analysert direkte for TGF-B som beskrevet ovenfor. Som vist i figur 3 ble TGF-B utskilt av miltcelle fra MBP forede dyr simulert in vitro i nærvær, men ikke i fravær av MBP. TGF-B ble også utskilt når splenocytter fra ovalbumin (OVA) forede dyr ble stimulert in vitro med OVA. Ved anvendelse av en spesifikk SELISA analyse med blokkerende antistoffer spesifikke for enten TGF-B l eller TGF-B2 ble det videre demonstrert at TGF-B var av TGF-1 isotype. I tillegg ble TGF-B utskilt i aktiv i stedet for latent form. Mengden TGF-fi i gruppen forede og stimulert in vitro med MBP var 6,8 ± 1,7 ng/ml med 68 ± 9 % i aktiv form. I OVA gruppen var mengden TGF-B 6,1 1,0 ng/ml med 65 ± 9 % i aktiv form. Det ble ikke observert aktiv TGF-B i supernatantene fra miltcellene til dyrene foret med MBP og stimulert med en uspesifikk induser av T-celleproliferasjonen, concanavalin-A (Con-A), til tross for at små mengder (2,1 ± 0,45 ng/ml) av latent TGF-B ble observert.

For å bestemme om TGF-B 1 også spilte en rolle i suppresjon av EAE ved oral tolerisasjon for MBP ble kalkun anti TGF-B 1 antiserum administrert in vivo. Som vist i figur 4A ble paralytis EAE utviklet i kontroUdyr med en maksimal alvorlighet i sykdommen på mellom 3,2-3,5 på dag 13 hvor dyrene ble injisert med PBS eler kontrollkalkunserum. Oral tolerisasjon med MBP reduserte alvorligheten av EAE (figur 4C) i dyrene injisert med PBS eller kontrollkalkunserum. Maksimal alvorlig sykdom i dyr behandlet fem ganger med 50 ul kontrollserum var 3,2 ± 0,2 og i oralt toleriserte dyr behandlet fem ganger med 50 ul kontrollserum var 1,0 ± 0,2 (p < 0,001). Som vist i figur 4D førte in vivo behandling med anti-TGF-Bl antiserum til opphevet beskyttelse indusert ved oral administrering av MBP på en doseavhengig måte; maksimal alvorlig sykdom i oralt toleriserte dyr behandlet fem ganger med 50 ul anti-TGF-Bl antiserum var 3,7 ± 0,2 vs. 1,0 ± 0,2 (p < 0,001, gruppe D vs. C). Som vist i figur 4B var det en doseavhengig forsterkning av sykdommen i dyr behandlet med anti-TGF-Bl antiserum som ikke var oralt tolerisert overfor MBP. Opprinnelsen på sykdommen var tidligere, helbredelsen ble forsinket og alvorligheten av sykdommen var større enn (4,5 ± 0,2 vs. 3,2 ± 0,2, grupper B vs. A p < 0,01).

Forsinket-type hypersensitivitet (DTH) responser korrelerte med det kliniske forløpet av EAE og virker som et mål på in vivo cellulær immunitet overfor MBP (Brod, S.A. et al (Ann. Neurol. 29:615-622,1991; Khoury, S.J. et al Cell. Immunol. 131:302-310,1990). DTH responsene ble testet i samme gruppe beskrevet i figur 4 ved injisering av 25 ug MBP i PBS subkutant i øret. Tykkelsen ble målt før og 48 timer etter utsettingen. Forandringen i øretykkelse før og etter administrering ble registrert for hvert dyr og resultatene uttrykt som gjennomsnittet for hver eksperimentell gruppe ±SEM.

Som vist i figur 5 (A-D) ble det utviklet betydelige DTH responser i dyr som gjennomgikk EAE og DTH responser som ble undertrykket ved oral administrering av MBP. Undertrykkede DTH responser ble opphevet ved in vivo anti-TGF-Bl behandling på en doseavhengig måte (1,5 ± 0,5 vs. 0,5 ± 0,3; p < 0,001 i dyr injisert fem ganger med 50 ul anti-TGF-B vs. kontrollserum. Ifølge den samme in vivo behandlingen var det forsterkning av DTH responsene overfor MBP i dyr som ble helbredet fra EAE som var oralt toleriserte (2,1 ± 0,3 vs. 1,4 ± 0,3; p < 0,01 i dyr injisert fem ganger med 50 ul anti-TGF-B vs. kontrollserum).

Resultatene presentert ovenfor tyder på en immunregulatorisk rolle utspilt av endogent TGF-B 1 i den spontant oppståtte helbredelse fira EAE og i suppresjon av EAE indusert ved oral tolerisasjon overfor MBP. I lys av det faktum at TGF-B trekkene blir sterkt konservert i evolusjonen blir det hevdet at de immunsuppressive virkningene til TGF-B i eksperimentelle dyr er lik effektene i mennesker.

EKSEMPEL 2: Antigen-drevet bystander suppresjon etter oral administrering

av antigener

Dyr. Hunn Lewisrotter 6-8 uker gamle ble oppnådd fra Harlan-Sprague Dawley Inc.

(Indianapolis, IN). Dyrene ble opprettholdt på standard laboratoriemat og vann etter behov.

Antigener. Marsvin MBP ble renset fra hjernevev ifølge en metode modifisert fra Deibler et al (supra) som beskrevet i eksempel 1 ovenfor og renheten ble undersøkt ved gelelektroforese. Ovalbumin (OVA) og BSA ble oppnådd fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) og keyhole limpet hemocyanin (KLH) fra Calbiochem Behring Corp. (La Jolla, CA).

Immunisering av dyr. Dyrene ble immunisert med 25 ug MBP i fotbladene, emulgert i et likt volum CFA inneholdende 4 mg/ml Myobacterium tuberculosis (Difco Labs, Detroit, MI) for å indusere en vesentlig EAE sykdomstilstand. For in vivo bystander suppresjonseksperimenter ble 50-300 fig av det sekundære antigenene OVA, BSA eller KLH injisert subkutant i samme fotblad i 100 fil PBS 8 timer etter primær immunisering med MBP CFA.

Klinisk vurdering. Dyrene ble vurdert på en blindet måte hver dag for tilsynekomst av EAE for å korrelere de kliniske manifestasjonene til bystander suppresjon med in vitro analysene beskrevet nedenfor. Grad av klinisk alvor av EAE ble registrert som følger: 0, ingen sykdom; 1, hengende hale; 2, bakben paralyse; 3, bakben paraplegia, inkontinens;

4, tetraplegia; 5, død. Gjennomsnittlig maksimal klinisk alvorlighet ble beregnet som tidligere beskrevet for hver eksperimentell gruppe (7). Statistisk analyse ble utført ved anvendelse av en one-tailed students t test og en chi square analyse for sammenligning av hendelser mellom gruppene.

Induksjon av oral toleranse. Dyrene ble tilført 1 mg MBP, OVA, BSA eller KLH oppløst i 1 ml PBS eller PBS alene, ved gastrisk intubasjon ved anvendelse av en 18-gauge rustfri stålnål for foring av dyr (Thomas Scientific, Swedesboro, NJ). Dyrene ble foret fem ganger (totaldose 5 mg), ved intervaller på 2-3 dager med siste foring 2 dager før immunisering.

Forsinket tvpe h<yp>ersensitivitet ( DTH) testing. DTH ble testet ved injisering av 50 jig MBP eller OVA i PBS, subkutant inn i øret. MBP ble injisert i venstre øre og OVA i det høyre øret i samme dyr. Tykkelse, i enheter på 0,025 cm ble målt i blindprøve, før og 48 timer etter eksponering ved anvendelse av mikrometerpassere (Mitutoyo, Utsunomia, Japan). Forandring i øretykkelsen før og etter eksponering ble registrert for hvert dyr og resultatene ble uttrykt som gjennomsnittet for hver eksperimentelle gruppe ± SEM; hver gruppe besto av fem dyr.

Transwell kulturer. Et dobbeltrom transwell kultursystem (Costar Cambrdige, MA) som er 24,5 mm i diameter og består av to rom separert av en semi-permeabel polykarbonatmembran, med en porestørrelse på 0,4 u.m ble anvendt. De to rommene er en 1 mm fra hverandre og muliggjør at cellene blir inkubert sammen i nærheten av hverandre uten direkte celle-til-celle kontakt. For å måle in vitro suppresjonen av proliferative responser i transwell kulturene ble 5 x IO<4> MBP- eller OVA-spesifikke cellelinjer, oppnådd og opprettholdt som tidligere beskrevet (Ben-Nun, A. et al, Eur. J. Immunol. 11:195,1981) dyrket med IO<6> bestrålte (2.500 rad) tymocytter, i 600 ul proliferasjonsmedium i den nederste brønnen. Miltcellene fra oralt toleriserte rotter eller kontroller (foret BSA) ble tilsatt til den øvre brønnen (5 x 10<5> celler i 200 ul). Miltcellene ble fjernet 7-14 dager etter den siste foringen og en enkeltcelle suspesjon ble dannet ved å presse miltene gjennom en rustfri stålmesh. MBP og OVA (50 ug/ml) ble tilsatt i et volum på 20 ul På grunn av at modulatorceller er separert fra responderceller med en semi-permeabel membran krever de ikke bestråling. I noen eksperimenter ble modulatorceller tilsatt i den lavere brønnen sammen med responderceller, og i disse tilfellene ble modulatorcellene bestrålt (1.250 rad) rett før de blir plassert i kultur. Proliferasjonsmedia besto av RPMI 1640 (Gibco Laboratories, Grand Island, NY) supplementert med 2 x 10^ M 2-merkatpetanol, 1 % natriumpyruvat, 1 % penicillin og streptomycin og 1 % glutamin, 1 % HEPES buffer, 1 % ikke-essensielle aminosyrer og 1 % autologt serum. Hver transwell ble utført i kvadruplikat. Transwellene ble inkubert ved 37°C i en fuktighet på 6 % CO2 og 94 % luftatmosfære i 72 timer. Etter 54 timers dyrkning ble hver lavere brønn pulset med 4 uCi [^H] tymidin og ved 72 timer splittet og på ny sådd i tre brønner i en rundbunnet 96-brønnplate (Costar) for høsting på fiberglassfiltre og telling ved anvendelse av standard væske scintillasjonsteknikker. Prosent suppresjon = 100 x (l - A cpm-respondere dyrket med modulatorer/A cpm av respondere).

Transwellsystemet ble anvendt for å undersøke de oppløselige faktorene produsert i løpet av bystander suppresjon og å registrere målføring av suppresjon i løpet av prosessen.

Rensin<g> av T- celle undergrupper. Tapping av T-celleundergrupper ble utført ved negativ seleksjon ved anvendelse av magnetiske kuler ifølge den modifiserte metoden til Cruikshank et al, supra. Miltcellene ble inkubert med 1:100 fortynning av museanti-rotte CD8, eller CD4, mAbs (klonene OX/8 eller W3/25 Serotec/Bioproducts, Indianapolis, IN) i 30 minutter på is, vasket to ganger og deretter tilsatt til forvaskede magnetiske partikler, med en gjennomsnittlig diameter på 450 mikron (M-450) med geite anti-muse iGg kovalentlig koblet (Dynal Inc. Fort Lee, NJ). Mengden av magnetiske kuler som ble anvendt ble beregnet å være 10 ganger i forhold til den vurderte målcellepopulasjon. Cellene ble inkubert med kuler i 0,5 ml RPMI 1640 supplementert med 10 % FCS i et 10 ml rundbunnet reagensrør (Nunc, Roskilde, Danmark) i 30 minutter på is med forsiktig risting hvert 5. minutt. Etter inkubasjon ble kule/cellesuspensjonen vasket med 5 ml medium og celle-mAb-kulekompleksene ble separert fra umerkede celler i et sterkt magnetisk felt ved anvendelse av en magnetisk-partikkelkonsentrator (Dynal-MPC-1) i 2 minutter. Supernatanten ble fjernet og prosedyren ble <g>jentatt to ganger for å oppnå den ikke-adherente fraksjonen. T-cellene i den tappede populasjonen var 95 % CD4<+>CD8" eller CD8<+>CD4~ som demonstrert ved indirekte flow cytometri.

Adoptiv overføring av svkdomssuppresjon. For å registrere den adoptive overføringen av sykdomssuppresjon som oppstår i løpet av bystander suppresjon mottok donorrottene enten 1 mg MBP, OVA eller KLH, fem ganger med intervaller på 2 dager og ble drept 7-14 dager etter den siste tilførselen. Miltcellene ble høstet og inkubert in vitro med det homologe aintigenet (50 fig/ml) i proliferasjonsmedium i 72 timer. Cellene ble injisert intraperetoneal: 10* celler for hele miltpopulasjoner eller 5-6 x 10<?> celler for CD8- eller CD4tappede populasjoner. Mottakerdyrene ble bestrålt (250 rad) før adoptiv overføring, immunisert med MBP/CFA 6 timer etter den adoptive overføringen og administrert 8 timer senere med 50 ug OVA. ;For å bestemme om celle-til-cellekontakten var nødvendig for in vitro suppresjon ble et transwellsystem (beskrevet ovenfor) anvendt. Resultatene er angitt i tabell 2 nedenfor. ;Som vist i tabell 2 var det når bestrålte splenocytter fra MBP-forede dyr ble inkubert sammen med en MBP linje i den nedre brønnen, suppresjon av proliferasjon (linje 2), mens ingen suppresjon ble observert med splenocytter fra PBS forede dyr (linje 3). Omtrent identisk suppresjon ble observert når modulatorceller ble separert fra respondercellene med semipermeabel membran (linjene 4 og 5). Suppresjonen så ut til å være formidlet av en oppløselig faktor eller faktorer som diffunderer gjennom transwellmembranen. Bystander suppresjon ser ut til å være operativ ved induksjon av den orale toleransen i EAE. 5 x IO<4> MBP linjeceller + MBP (50 ng/ml) ble plassert i den lavere brønnen med 10^ bestrålte (2.500 rad) tymocytter som antigenpresenterende celler (APC). Miltmodulatorceller (5 x 10^) fra MBP- eller PBS-forede dyr ble tilsatt til enten den øvre eller nedre brønnen. Modulatorcellene tilsatt til den nedre brønnen ble bestrålt (1.250 rad). Bakgrunnstellingene til MBP linjen uten tilsatt MBP var mellom 1.000 og 2.000 cpm. ;For å bestemme om den in vitro suppresjonen observert i transwellsystemet krevde identisk antigen spesifisitet mellom modulator og respondercellene ble en OVA linje plassert i den nedre brønnen. Resultatene er angitt i tabell 3 nedenfor. ;Som vist i tabell 3 kunne modulatorceller fra MBP-forede dyr plassert i den øvre brønnen undertrykke en OVA linje i den nedre brønnen, i nærvær, men ikke i fravær, av MBP (linjene 2 og 3). MBP tilsatt til modulatorcellene fra dyrene tilført PBS undertrykte ikke OVA linjen (linje 4). Suppresjon av en MBP linje fremkom med modulatorcellene fra OVA-tilførte dyr i nærvær av OVA (linje 7). Oppløselig antigen tilsatt til transwell i en av brønnene diffunderte over membranen og var dermed tilstede i begge brønnene som tilfellet var in vivo. 5 x IO<4> MBP eller OVA linjecellene ble plassert i den nedre brønnen med 10^ bestrålte (2.500 rad) tymocytt som APC. Modulatorcellene (5 x IO<5>) fra MBP-, OVA- eller PBS-forede dyr ble tilsatt til den øvre brønnen. Bakgrunnstellingene til MBP og OVA linjene uten MBP eller OVA tilsatt var på mellom 1.000 og 2.000 cpm. ;For å bestemme forholdet mellom ovennevnte in vitro bystander suppresjon og in vivo situasjonen ble en serie eksperimenter utført i EAE modellen. Rottene ble foret med OVA (1 mg, 5 ganger over en 10 dagers periode), deretter immunisert med MBP/CFA i fotbladet og gitt OVA 8 timer senere i samme fotblad. Som vist i figur 6A hadde injisering av OVA i fotbladet 8 timer etter immunisering med MBP/CFA ingen virkning på EAE som ventet. Gjennomsnittlig maksimal alvorlig klinisk sykdom var 3,9 ± 0,2 for MBP/CFA immunisert og 3,8 ±0,1 med OVA gitt subkutant. I dyr foret med OVA før immunisering med MBP/CFA men etter OVA ble gitt subkutant i fotbladet oppsto suppresjon av EAE på en analog måte som foring av MBP (figur 6B); alvorligheten til sykdommen i OVA foret pluss OVA gitt subkutant var 0,9 ± 0,2 i MBP foret var det 1,1 ± 0,1 og i OVA foret og KLH gitt subkutant (kontrollgruppe) 3,9 ± 0,1 (p < 0,001, OVA og MBP foret vs. kontroll). CD4+ T-celler indusert ved immunisering med MBP/CFA ble nedregulert av TGF-B frigjort av CD8+ T-celler indusert ved oral administrering av et bystander antigen, i dette tilfellet OVA. Ingen suppresjon av EAE ble observert i dyr foret med OVA hvor KLH ble gitt etter MBP/CFA pluss OVA subkutant (figur 6C), sykdomsalvorligheten var 3,7 ± 0,1 og 3,8 ± 0,2. Disse eksperimentene demonstrerer en in vivo virkning som ligner den som sees in vitro i transwellsystemet. Modulatorceller dannet ved oral tolerisasjon overfor et antigen undertrykker cellene til en annen antigen-spesifisitet når det toleriserte antigenet er tilstede. ;For å bestemme om en korrelasjon eksisterer i det in vivo bystander systemet og å bestemme grad av sensitibilisering som oppstår i assosiasjon med den bystander virkningen, ble DTH responsene målt. Undertrykte DTH responser overfor MBP ble observert både i dyr foret med MBP og de som ble foret med OVA som deretter ble immunisert med MBP/CFA pluss OVA (figur 7). Oral administrering av andre antigener, såsom KLH eller BSA hadde ingen virkning på DTH responsene overfor MBP i disse dyrene. Tilførsel av OVA etterfulgt av injeksjon av OVA subkutant i assosiasjon med MBP/CFA dannet ikke noen immunrespons overfor OVA målt ifølge ;DTH. ;For å utelukke muligheten av at noe unikt overfor OVA var ansvarlig overfor den observerte in vivo bystander suppresjonen ble lignende eksperimenter utført hvor BSA ble tilført og deretter gitt subkutant etter MBP/CFA immuniseringen. Som vist figur 8 hørte oral administrering av BSA før immunisering med MBP/CFA etterfulgt av BSA (bystander antigen) gitt subkutant til undertrykket EAE på en analog måte som ved OVA. Suppresjon av EAE assosiert med BSA ble bare observert når det sekundære antigenet ble gitt subkutant i en dose på 300 ug, mens med OVA oppsto suppresjon ved ;en dose på SO ug. ;Som vist i figur 9, miltceller fra MBP- eller OVA-forede dyr overførte beskyttelse til naive mottakere, som ble immunisert med MBP/CFA og gitt OVA subkutant. Adoptivt overført suppresjon ble opphevet ved tapping av CD8<+> (suppressor T-celler), men ikke ved tapping av CD4<+> celler. Ingen beskyttelse ble observert med adoptiv overføring av miltceller fra KLH-fSrede dyr til dyr immunisert med MBP/CFA pluss OVA. ;Eksempel 3: Identifikasjon av immunsuppressive epitoper til marsvin MBP ;Transwellsystemet ifølge eksempel 2 ovenfor ble anvendt for å identifisere epitopene tilstede på marsvin MBP som induserer frigjøring av TGF-0 fra suppressor T-celler. ;Sykdomsinduserende fragmenter (autoimmun responsepitoper) til MBP ble først bekreftet som følger: overlappende peptider som vist i figur 10, til marsvin MBP ble oppnådd fra kommersielle kilder eller syntetisert i henhold til velkjente teknikker, spesifikt ved anvendelse av en kommersiell peptidsynteseapparatur (fra Applied Biosystems) og ved å følge forhandlerens instruksjoner. Total MBP ble deretter foret til rotter og lymfeknuteceller fra oralt toleriserte dyr ble utløst med MBP-peptidene. Evnen som aktiverte celler har til å indusere dreper T-celler ble deretter kvantitativt bestemt ved en proliferasjonsanalyse også som beskrevet i eksemplene 1 og 2 og ved testing av evnen som de prolifererende cellene har til å overføre sykdommen. ;Som vist i figur 10 var et peptid som dekker residiene 71-90 til marsvin MBP den mest effektive induseren til å drepe T-celler og derfor det mest potente sykdomsfremmende fragmentet til MBP. Denne regionen av marsvin MBP tilsvarer derfor den immundominante epitopen til proteinet. ;Når miltcellene oppnådd fra dyr foret med MBP og immunisert med MBP/CFA (som beskrevet ovenfor i eksemplene 1 og 2) ble dyrket sammen i transwellsystemet med miltceller isolert fra OVA-forede dyr kunne peptider tilsvarende marsvin MBP aminosyreresidiene 21-40,51-70 og 101-120 tilsatt til modulatorbrønnen alle utløse suppresjon av proliferasjonen av den OVA-forede linjen. Resultatene er vist i figur 11. Den immundominante epitopen til marsvin MBP, identifisert i figur 10 og 11 (tilsvarende aminosyreresidiene nr 71-90) var ineffektive når det gjelder å utløse suppresjon i transwellsystemet. Peptider tilsvarende marsvin MBP residie nr 151-170 og 161-178 inhiberer proliferasjonen av OVA (responder) linjen, men denne virkningen var uspesifikk og kan ha vært forårsaket av toksisiteten indusert in vitro til disse peptidene, idet disse peptidene inhiberer proliferasjonen av miltceller isolerte OVA-forede dyr når dyrket sammen med kontroll (ikke-MBP-f6rede) modulatorceller (data ikke vist). Disse eksperimentene demonstrerer videre at foring av antigener som utløser TGF-B til dyr er nødvendig for bystander suppresjon. Disse eksperimentene demonstrerer også at de delene av et autoantigen som er involvert i bystander suppresjon er forskjellige fra de som er involvert i autoimmun respons. ;EKSEMPEL 4. Celler, cytokiner og aktiveringsmarkerer i deler av rottehjernen ;oppnådd fra normale EAE-induserte og MBP-forede rotter ;Virkningen av oral administrering av MBP i rotter indusert for EAE ble analysert med hensyn på celler og faktorer tilstede i hjernene til forede og kontrollrotter. Lewisrotter ble foret med MBP fem ganger og deretter immunisert med MBP/CFA og hjernene ble undersøkt immunhistologisk på dag 14 (sykdomstoppen) og sammenlignet med hjerner fra immuniserte kontrollforede dyr høstet på samme tid, og til hjerner fra naive dyr. Cryostatseksjoner av bark ob cerebellum ble blandet i paraformaldehyd-lysin-periodat for å bestemme leukocytter og aktiveringsantigener, eller i aceton for merking av cytokiner, og farvet ifølge en peroksydase-antiperoksydasemetode (Hancock, W.W. et al, J. Immunol. 138:164,1987). Resultater av cytokin og endotelmerking i 20 påfølgende områder ble vurdert som (-) uten merking, (+/-) <10 celler/del eller spormerking, (+) få små foci, (2+) multiple foci og (3+) multiple store perivaskulære samlinger og diffus submeningial farving. ;Resultatene er oppsummert i tabell 4. ;;I den MBP-forede gruppen var det tegn på nedregulering av cellulær inflammatorisk immunrespons og TNF, Ia og ICAM-1 ekspresjon, mens det var oppregulering av TGF-fl ekspresjon (tabell 4). ;Det er tidligere blitt oppdaget at liposakkarid (LPS) forsterker suppresjonen av EAE oppnådd ved oral administrering av MBP. Hjernene til MBP+LPS forede dyr ved sykdomstoppen ble også undersøkt og i tillegg til forandringene observert med bare MBP foring var det ingen oppregulering av IL-4 og PGE ekspresjon. Under visse betingelser deltar IL-4 eller regulatoriske cytokiner med TGF-6 i nedregulering av immunresponsen. ;Foring av bare synergist (uten bystander eller autoantigen) resulterer ikke i oppregulering av IL-4 eller PGE (data ikke vist). ;Som vist ut i fra resultatene angitt i tabell 4 ovenfor inneholder normale rottehjemer ikke celler, cytokiner og aktiveringsmarkører, mens EAE-induserte rotter har forskjellige inflammatoriske celler og inflammatoriske cytokiner (dvs. IL-1, IL-2, IL-6, IFNy og TNF) tilstede. EAE-induserte rotter som ble foret med MBP pluss LPS (en synergist) har i kontrast til dette en reduksjon av celler og inflammatoriske cytokiner og inneholder i tillegg suppressor T-celler (CD8+ undergruppe), IL-4, TGF-fl og prostaglandin E(PGE), som alle motvirker virkningene til CD4+MNC og inflammatoriske cytokiner. ;EKSEMPEL 5: Suppresjon av insultits i NOD mus ved oral administrering av ;insulinpeptider og glukagon ;Virkning av foring av separerte insulin A- eller B-kjeder og forskjellige syntetiske peptider avledet fra insulin B-kjedeproteinmolekylet og glukagon på insulitis i NOD mus ble undersøkt. ;NOD mus (Taconic Labs) ble foret 1 mg glukagon, eller 1 mg griseinsulin (begge oppnådd kommersielt) eller like molare mengder insulin A-kjede, B-kjede og B-kjedepeptidet beskrevet nedenfor (alle insulinfragmentene er blitt syntetisert) to ganger ukentlig i 5 uker og ofret i en alder på 10 uker. ;Kontrolldyrene ble foret et ikke-bukspyttkjertel (dvs. urelatert) peptid, GAP. Insulitis ble målt som et semikvantitativt insulitismål ifølge fremgangsmåten beskrevet i Zhang, Z.J. PNAS(USA), 88:10252-10256,1991. ;Insulin B-kjede peptidene tilsvarte aminosyreresidiene 1-12 ( B\_\ 2) > 10-22 (Bjq-22)» 11-30 (Bj i_3o) og 23-30 (823.30)- Alle dyrene ble foret ti ganger i løpet av tre uker. ;Resultatene er angitt i tabell 5 nedenfor. ;;Det fremgår fra resultatene i tabell 5 at insulina-kjede eller B-kjede undertrykte insulitis, i B-kjedeforingen viste en høyere grad av suppresjon. Peptidene Bl_i2> Bi q_22 °S ^11-30 undertrykte også insulitis, mens B23.30 ikke gjorde det. Ingen suppresjon ble observert i dyr foret med MBP eller GAP. I tillegg var glukagon, et bystander antigen, også effektiv når det gjelder undertrykking av insulitis. ;EKSEMPEL 6: Oral toleranse vs. IV administrering av bovin-PLP eller muse ;MBP ;For å sammenligne virkningen av tolerisasjon via oral eller intravenøs (IV) vei for administrering og videre å demonstrere bystander suppresjon ble grupper på 5-6 hunnkjønn, 7 uker gamle, SJL/J mus (Jackson Labs, Bar Harbour, ME) immunisert med PLP peptid 140-160 på dagene 0-7 og mottok følgende behandlinger: ;Grupper ;1. Foret histon (0,25 mg) ;2. F6ret muse MBP (0,25 mg) ;3. Foret bovin PLP (0,25 mg) ;4. Injisert LV. histon (0,25 mg) ;5. Injisert LV. MBP (0,25 mg) ;6. Injisert LV. PLP (0,25 mg) ;Hver gruppe ble behandlet annenhver dag i 7 dager. I den intravenøse gruppen ble materialet injisert inn i øyenettet. PLP peptidet som ble anvendt var det sykdomsinduserende fragmentet 140-160 til bovin PLP. Dette peptidet hadde aminosyresekvensen COOH-PLAYTIGVFKDPHGLWKGLCNH2, som representerer de foregående aminosyreresidiene. ;Som vist i figur 12 var muse MBP og bovin PLP like effektive i nedregulering av PLP-peptid-indusert EAE når administrert oralt. Et uspesifikt protein, histon, var ineffektivt til å undertrykke EAE når administrert oralt. Et bystander antigen, når det gjelder muse MBP, undertrykte effektivt EAE når administrert oralt til dyr indusert for EAE med bovint PLP. ;Når administrert intravenøst, ble bare antigenet anvendt for å indusere sykdommen, i dette tilfellet bovint PLP, effektivt undertrykke EAE. Resultatene er vist i figur 13. ;Virkningene av foring av forskjellige peptider til Lewis rotter indusert for EAE av marsvin MBP residie nr 71-90 (hovedimmundominante epitopen til marsvin MBP som vist i eksempel 3 ovenfor) ble også studert. ;EAE ble indusert ved immunisering med 0,25 mg marsvin MBP aminosyreresidiene nr 71-90 i Freuds fullstendige adjuvant og virkningen av foring av forskjellige marsvin MBP peptider på EAE ble undersøkt. Som vist i figur 14 var total marsvin MBP og et 21-40 marsvinpeptid like effektive i nedregulering av EAE indusert av marsvin MBP 71-90 som 71-90. Marsvin MBP peptid 131-150 var ineffektiv i dette tilfellet. Peptidene ble også foret med STI som forhindrer nedbrytningen av mavesafter og forsterke deres biologiske virkning. DTH responsene overfor total MBP ble undertrykt ved foring av MBP eller hvilke som helst av MBP-peptidene 21-40 eller 71-90. DTH responsene overfor marsvin MBP pepitd 71-90 ble bare undertrykt ved foring av enten total MBP eller marsvin peptid 71-90 og ble ikke oppnådd av marsvin MBP peptid 21-40 (figur 15). Dette er i samsvar med konklusjonen som innbefatter at MBP fragmentet 71-90 ikke deltar i bystander suppresjon. ;Suppresjon av EAE ved LV. tolerisasjon med MBP og MBP peptider før sykdomsekspresjon (på dagene 8 og 9 etter immunisering) ble undersøkt. ;Som vist i figur 16, i dyr indusert for EAE med total marsvin MBP var bare total marsvin MBP og marsvin MBP peptider tilsvarende aminosyreresidiene 71-90 effektive når det gjelder å undertrykke EAE når administrert via LV. veien. Peptider tilsvarende marsvin NBP aminosyreresidiene nr 21-40, som er effektive i nedregulering av EAE når administrert oralt, var ineffektive når det gjelder å undertrykke EAE når administrert intravenøst, i samsvar den manglende evnen av LV. administrering for å utløse bystander suppresjon. Et peptid tilsvarende aminsyreresidie nr 131-150 og histon var også ineffektive når det gjelder å undertrykke EAE når administrert intravenøst, i samsvar med det faktum at ingen av disse antigenene er ansvarlig for autoimmun respons. *

Claims

1. Anvendelse av et bystander antigen for fremstilling av et oralt eller inhalerbart legemiddel for behandling av eller forebygging av en autoimmun sykdom hos et individ, hvor det nevnte bystander antigen er spesifikt til et organ eller vev som er rammet av immunangrep i løpet av nevnte sykdom og hvori nevnte bystander antigen ikke er det primære angrepsmålet av det immunregulatoriske systemet i løpet av nevnte sykdom hos nevnte individ.

2. Anvendelse ifølge krav 1, hvori nevnte legemiddel administreres oralt til nevnte individ.

3. Anvendelse ifølge krav 1, hvori nevnte legemiddel administreres til nevnte individ ved hjelp av inhalering.

4. Anvendelse ifølge krav 1, hvori den ytterligere innbefatter en synergist som er virksom i kombinasjon med nevnte bystander antigen for å behandle nevnte sykdom.

5. Anvendelse ifølge krav 1 som ytterligere innbefatter administrering til nevnte individ i et separat trinn av en mengde av en synergist som er virksom i kombinasjon med nevnte bystander antigen for å behandle nevnte sykdom.

6. Anvendelse ifølge krav 1, hvori nevnte bystander antigen er et peptid som innbefatter et immunosuppressivt epitop.

7. Anvendelse ifølge krav 1, hvor nevnte bystander antigen er glukagon og nevnte autoimmunsykdom er type 1 diabetes.

8. Anvendelse ifølge krav 7, hvori nevnte legemiddel administreres oralt.

9. Anvendelse ifølge krav 7, hvori nevnte legemiddel administreres ved hjelp av inhalering.

10. Anvendelse ifølge krav 1, hvor nevnte bystander antigen er glutaminsyre og nevnte immunsykdom er type 1 diabetes.

11. Anvendelse i følge krav 10, hvori nevnte legemiddel administreres oralt.

12. Anvendelse ifølge krav 10, hvori nevnte legemiddel administreres ved inhalering.