【発明の詳細な説明】
メトトレキサートと組合せる耐性化を用いる自己免疫疾患の治療
発明の分野
本発明は、耐性化(tolerization)による自己免疫疾患の治療の分野に関する。
本発明はまた、メトトレキサートの投与による自己免疫疾患の治療の分野にも関
する。
発明の背景
自己免疫疾患は、自己の(自身の)通常の組織に対して向けられた異常な免疫応
答により特徴付けされる。
包含される免疫応答(又は免疫反応)の型に基づき、哺乳動物における自己免疫
疾患は、二つの異なるカテゴリーの一つ：細胞仲介(すなわち、Ｔ細胞仲介)又は
抗体仲介(すなわちβ細胞仲介)疾患、に一般に分類され得る。Ｔ細胞仲介自己免
疫疾患の非制限的な実例は、多発性硬化症(ＭＳ)、慢性関節リウマチ(ＲＡ)、糖
尿病の自己免疫段階(若年開始又はＩ型糖尿病)及び自己免疫性ぶどう膜網膜炎(a
utoimmune uveoretinitis)(ＡＵＲ)を含む。抗体仲介自己免疫疾患は、制限さ
れること無しに、重症筋無力症(ＭＧ)、自己免疫性甲状腺炎(ＡＴ)、及び全身性
エリテマトーデス（ＳＬＥ）を含む。
自己免疫疾患の両方のカテゴリーは、非特異的手法で全身的に免疫応答を抑制
する医薬、すなわち異常な免疫応答の選択的抑制化ができない医薬によって目下
のところ治療されている。そのような医薬の一つは、細胞の急速な成長を選択的
に阻害する生物学的応答変更剤、メトトレキサート(methotrexate)である。しか
しながら、メトトレキサートは、重大な毒性と他の副作用を有し、且つ治療して
いる対象者において「グローバルな」免疫抑制を結局は誘発する。換言すれば、
メトトレキサートの通常のコースによる延長した治療は、病原体に対する通常の
保護的な免疫応答をダウンレギュレートし、それによって感染のリスクが増大す
る。加えて、延長したグローバルな免疫抑制に罹った患者は、悪性の、肝、及び
腎不全のような、治療から危険な医療の合併症に進行する増大したリスクを有す
る。
自己免疫疾患を治療するため、メトトレキサートは、高い投薬量、例えば７．
５から２５ｍｇを週に一度通常的に投与される。そのような治療は、慢性関節リ
ウマチを治療するために慣習的に使用され、且つ多発性硬化症を治療するために
有効に用いられている(Goodkinら、Ann.Neurology.37:30,1995)。経口投与が最
も通例であるとしても、メトトレキサートはまた、その治療のため非経口投与用
にも商業的に利用される。
最近、新規の方法と製薬調製物が、自己免疫疾患(及び同種移植拒絶及びレト
ロウイルス関連死亡統計学的疾患のようなＴ細胞仲介炎症性疾患に関係した)を
治療するために有用とされることが見出されている。これらの治療は、自己抗原
耐性剤として、バイスタンダー抗原、又は自己抗原又はバイスタンダー抗原の疾
患抑制フラグメント又は類似物を用いて、経口的に又は粘膜に、例えば吸入によ
り耐性を誘発する。そのような治療は、1993年2月25日に提出したPCT特許出願PC
T/US93/01705、1991年3月4日に提出したPCT/US91/01466、1990年12月17日に提出
したPCT/US90/07455、1990年7月16日に提出したPCT/US90/03989、1991年10月10
日に提出したPCT/US91/07475、1993年8月17日に提出したPCT/US93/07786、1993
年9月24日に提出したPCT/US93/09113、1991年10月31日に提出したPCT/US91/0814
3、1991年3月29日に提出したPCT/US91/02218、1993年4月20日に提出したPCT/US9
3/03708、1993年4月9日に提出したPCT/US93/03369、及び1991年10月15日に提出
したPCT/US91/07542中に記載される。自己抗原及びバイスタンダー抗原は、以下
に定義される。
自己抗原(及びそれの分子の免疫優性エピトープ領域を含むそれのフラグメン
ト)の静脈内投与は、クローナルアネルギーと称されるメカニズムを経て免疫抑
制を誘発することが見出されている。クローナルアネルギーは、特有の抗原に対
するＴ細胞特異性のみの免疫攻撃の不活性化の原因となり、その結果、この抗原
に対する免疫応答を顕著に減じさせる。かくして、一度アネルギー化した、自己
抗原に対するＴ細胞特異性自己免疫応答促進化は、もはやその抗原への応答を増
殖しない。増殖におけるこの減少は、自己免疫疾患の徴候(ＭＳにおいて観測さ
れる神経組織の損傷のような)のために応答可能な免疫反応をも減じる。自己抗
原(又は免疫優性フラグメント)の単一投薬量及び「活性抑制」を誘発するそれよ
りも十分に大量での経口投与が、アネルギー(又はクローナル削除)を経て耐性を
も誘導し得る証拠もある。
治療方法は、活性抑制により起因することも開示されている。活性抑制はクロ
ーナルアネルギーのそれからの異なるメカニズムを経て機能化する。ＰＣＴ出願
PCT/US93/01705中に広範に論じられたこの方法は、自己免疫攻撃の下で、組織に
特異的な抗原の経口又は粘膜投与を含む。これらは「バイスタンダー(bystander)
抗原」と称され、且つ以下に定義される。この治療は、消化管結合リンパ組織(Ｇ
ＡＬＴ)、又は気管支結合リンパ組織(ＢＡＬＴ)、又は最も一般的な粘膜結合リ
ンパ組織(ＭＡＬＴ)(ＭＡＬＴはＧＡＬＴとＢＡＬＴを含む)において誘導される
べき調節(抑制)Ｔ細胞をもたらす。これらの調節細胞は、血液又はリンパ組織内
に放出され、次いで自己免疫疾患によってさいなまれた器官または組織に移動し
、且つそのさいなまれた器官又は組織の自己免疫攻撃を抑制する。バイスタンダ
ー抗原によって引き出されたＴ細胞(それを引き出すために用いたバイスタンダ
ー抗原の少なくとも一つの抗原決定基を認識する)は、それらが例えばトランス
フォーミング成長因子ベータ(ＴＧＦ-β)、インターロイキン-４(ＩＬ-４)、及
び／又はインターロイキン-１０(ＩＬ-１０)のようなある種の免疫調節因子及び
サイトカインの局部的な放出を仲介する場合には自己免疫攻撃の位置に標的化さ
れる。勿論、ＴＧＦ-βは、その攻撃を起こすその抗原に関係なくそれが免疫攻
撃を抑制することにおいて抗原非特異性免疫抑制因子である。（しかしながら、
バイスタンダー抗原による経口又は粘膜耐性化は自己免疫攻撃の近くでＴＧＦ-
βの放出のみを生じるために、全身的な免疫抑制を確保しない）ＩＬ-４とＩＬ-
１０はまた、抗原非特異性免疫調節サイトカインでもある。ＩＬ-４は特にＴｈ
２応答を増大し、すなわちＴ細胞前駆体の状態で作用し且つＴｈ１応答を犠牲に
してＴｈ２細胞内に差別的に分化するそれの原因となる。ＩＬ-４はまた、Ｔｈ
１増悪を間接的に阻害する。ＩＬ-１０は、Ｔｈ１応答の直接のインヒビターで
ある。バイスタンダー抗原によって自己免疫疾患にさいなまれた哺乳動物を経口
的に耐性化した後、ＴＧＦ-β、ＩＬ-４及びＩＬ-１０の増加したレベルが自己
免疫攻撃の位置で観測される。Chen,Y.ら、Science,265:1237-1240,1994。その
バイ
スタンダー抑制のメカニズムは、von Herrethら、J.Clin.Invest.,96:1324-1331
,1996年9月、によって確認されている。
Ｉ型インターフェロン、又はＩ型インターフェロン活性を有するポリペプチド
の経口又は非経口投与、自己抗原又はバイスタンダーの経口又は粘膜投与の一方
又は結合のいずれか一方は、自己免疫疾患の徴候の減少化に有益となることが開
示されている。Ｉ型(α又はβ)インターフェロンの最適以下の投与量は、自己抗
原及びバイスタンダー抗原の耐性化効果を高める。この働きは、04/07/95に提出
したＰＣＴ出願PCT/US95/04120中により詳細に記載してある。Ｉ型インターフェ
ロン、特にβ-ＩＦＮは、ある種の免疫調節特性、例えばγ-インターフェロン(
ＩＦＮ−γ)の活性の阻害などを有することが知られる。ＩＦＮ-γは、ＭＳを悪
化させることが示されており、且つＭＳ損傷の病因中に包含され得る。かくして
、ＩＦＮ-γは、Ｔ細胞によるＩＦＮ-γ発現を阻害するそれの能力の部分のため
に有益な効果を有することが明らかである。
04/07/95に提出したPCT/US95/04512は、自己抗原又はバイスタンダー抗原を用
いる経口的な耐性と共同したＴｈ-２増幅化サイトカインの使用を記載する。
これらの出願にない、しかしながらメトトレキサート治療と組合せる耐性化の
いずれかのフォームが記載される。また、本発明の前に、細胞分裂を阻害する、
メトトレキサートが、自己免疫疾患の治療において粘膜の耐性を仲介することに
含まれる細胞を阻害するかどうかは知られていない。
本発明の一の目的は、自己免疫疾患の治療において毒性の劣る量のメトトレキ
サートの投与を許すことである。
付加的な目的は、一度で投与される量を減じるためにより頻繁な投与において
メトトレキサートの投与を許すことである。
別の目的は、メトトレキサート単独の投与又は経口、又はより一般的には粘膜
の耐性化剤単独の投与のいずれか一方よりもより有効である自己免疫疾患のため
の治療を提供することである。
発明の概要
一つの実施態様において、本発明は自己免疫疾患を治療するための方法に関す
る。該方法は、バイスタンダー抗原を粘膜に投与することを含む。該方法はまた
、経口、経腸、又は非経口的にメトトレキサートを投与することをも含む。バイ
スタンダー抗原とメトトレキサートの量は、自己免疫疾患と結合した自己免疫応
答を抑制するための組み合わせにおける有効量とされる。
別の実施態様において、本発明は、自己免疫疾患を治療するための経口又は経
腸投与用の製薬組み合わせに関する。その組み合わせは、メトトレキサートとバ
イスタンダー抗原とを備え、そのバイスタンダー抗原とメトトレキサートの量は
、自己免疫疾患と結合した自己免疫応答を抑制するための組み合わせの有効量と
される。
別の実施態様において、本発明は、自己免疫疾患を治療するための方法に関す
る。該方法は、自己抗原を粘膜に投与することを含む。該方法はまた、経口、経
腸、又は非経口的にメトトレキサートを投与することをも含む。自己抗原とメト
トレキサートの量は、該疾患に結合した自己免疫応答を抑制するための組み合わ
せの有効量とされる。
別な実施態様において、本発明は、自己免疫疾患を治療するための経口又は経
腸投与用の製薬組み合わせに関する。その組み合わせはメトトレキサートと自己
抗原を備え、且つ自己抗原とメトトレキサートの量は、その自己免疫疾患と結合
した自己免疫応答を抑制するための組み合わせの有効量とされる。
図面の簡単な説明
図１は、メトトレキサートの最適及び最適以下の投薬量の投与のＥＡＥ臨床ス
コアに関する効果を示すグラフである。
図２は、メトトレキサートの最適投薬量又はＭＢＰの１ｍｇ投薬量のいずれか
の投与のＥＡＥ臨床スコアに関する効果を示すグラフである。
図３は、メトトレキサートの最適投薬量の投与との比較として、ＭＢＰととも
にメトトレキサートの最適投薬量の組み合わせのＥＡＥ臨床スコアに関する効果
を示すグラフである。
図４は、いずれかの単独の投与に比較した４０μｇメトトレキサートの最適以
下の投薬量とＭＢＰの１ｍｇ投薬量との組み合わせの投与のＥＡＥの効果を示す
グラフである。
図５は、いずれかの単独の投与に比較した２０μｇメトトレキサートの最適以
下の投薬量とＭＢＰの１ｍｇ投薬量との組み合わせの投与のＥＡＥの効果を示す
グラフである。
図６は、経口II型コラーゲンと経口メトトレキサート(中空ダイアモンド)の組
合わせ又は経口タイプIIコラーゲンのみ(中実ボックス)のいずれか一方が投与さ
れた、臨床実験の８週で開始時点である慢性関節リウマチ患者で測定した腫脹関
節カウント(swollen joint count)を示すグラフである。
図７は、経口II型コラーゲンと経口メトトレキサート(中空ダイアモンド)の組
合わせ又は経口タイプIIコラーゲンのみ(中実ボックス)のいずれか一方が投与さ
れた、臨床実験の８週で開始時点である慢性関節リウマチ患者で測定した圧痛関
節カウント(tender joint count)を示すグラフである。
図８は、II型コラーゲンとメトトレキサートの組合わせ、又はタイプIIコラー
ゲンのみのいずれか一方が投与されたそれの累積パウルス(Paulus)２０応答を達
成する患者のパーセントを示す。
発明の詳細な説明
メトトレキサートの経口又は非経口投与と共同しての、バイスタンダー抗原(
又は自己抗原)の経口、又はより一般的に粘膜投与が、それぞれの治療法の効果
に比較して、実質的に増大した自己免疫反応の抑制の結果となることが見出され
ている。
一つの実施態様において、本発明は、他に必要とされる(最適値以下の投与量)
であろうよりも自己免疫疾患の治療のために投与されるべきメトトレキサート量
を少なくすることを許す。これはメトトレキサートの高い毒性のため、より高い
有効性である。かくして、例えば、メトトレキサートとＭＢＰの組み合わせの投
与の抑制効果は、いずれかの単独の投与の効果よりもより効果的であることが見
出される。
メトトレキサートは、たとえメトトレキサートが細胞分裂を阻害すること、す
なわちそれが耐性化によって自己免疫疾患の治療を仲介する細胞に有害に作用し
ないとしても、粘膜耐性化によって治療を予防しないことが見出されている。さ
らに、耐性化剤の投与は、メトトレキサートの阻害性効果に干渉しないことが見
出されている。
さらに、メトトレキサート投与に結合した「リバウンド」効果を減少させ得る。
ＥＡＥラットにおいて及びヒトにおいてメトトレキサートの投与は、抑制に続き
(投与のコースが完結された後)疾患のリバウンドの結果を生じる。そのようなリ
バウンドは、経口、又は粘膜耐性化では観測されない。ＭＢＰとメトトレキサー
トは、リバウンド作用を生じない。かくして、メトトレキサート投与は、粘膜耐
性化のこの有益性に干渉しない。
加えて、メトトレキサートと耐性化剤の組み合わせは、投与当たりの低い投薬
量で頻繁に投与され得る。メトトレキサートが自己免疫疾患を治療するための高
い投薬量で週に一度通常的に投与される一方、本発明の組み合わせは、低い投薬
量で週に３回投与した場合、有効とされることが見出されている。上述した通り
、本発明に従いメトトレキサートの総合的に低い投薬量での投与は、毒性を減じ
るように作用する。週のインターバルの間でさらに小分割した形態において低い
投薬量の投与は、毒性を減じるようにさらに作用する。
かくして、例えば、もしメトトレキサートが自己免疫疾患を治療するために、
週当たり１０ｍｇの最適投薬量でそれ自身によって通常的に投与されるなら、耐
性化剤の有効量と共同して、週に三回、約３ｍｇの投与量でメトトレキサートを
投与することが、本発明の方法に従い可能となる。代替的に、耐性化剤の有効量
と結合した、最適以下の投薬量、例えば５ｍｇで週に一度、メトトレキサートを
投与することが可能である。代替的に、週に３回、２ｍｇの最適値以下の投薬量
が、耐性化剤の有効量とともに投与され得る。
本発明はメトトレキサートによる自己免疫状態の治療に関する改善として見な
し得る一方、経口(又は粘膜)耐性化による自己免疫疾患の治療に関する改善とし
てもまた見なし得る。
定義
この開示中で用いる場合、以下の用語は後述するそれらの持つ意味を有する：
「バイスタンダー抗原(bystander antigen)」又は「バイスタンダー」は、タ
ンパク質、タンパク質フラグメント、ペプチド、グリコプロテイン、又は、(i)
自己免疫攻撃の下で器官又は組織に特異的な成分又はそれから誘導される；及び
(ii)自己免疫破壊に寄与する細胞を攻撃する及びそれによる免疫攻撃を抑制する
下で器官又は組織で放出されるべき少なくとも１の抗原非特異性免疫抑制因子ま
たは免疫調節サイトカイン(ＴＧＦ-β、ＩＬ-４又はＩＬ-１０のような)を生じ
る調節(抑制)Ｔ細胞(ＣＤ４＋またはＣＤ８＋タイプとされ得る)を引き出す経口
又は経腸投与において、いずれかの他の免疫原性物質(すなわち、免疫応答の引
き出しができる物質)である。該用語は、自己免疫攻撃に含まれる自己抗原とそ
れのフラグメントを含むが、しかしそれに限定されない。加えて該用語は自己免
疫組織破壊の結果となる自己免疫攻撃の位置において露出されるようになる免疫
機構に通常的にさらされない抗原を含む。実例は、特有の組織が免疫機構との接
触から通常的に保護されるものに対して特異的でないとしても、熱ショックタン
パク質である。
「バイスタンダー抑制(bystander suppression)」は、自己免疫破壊に寄与す
る細胞の自己免疫攻撃の位置で抑制される；この抑制は、バイスタンダー抗原の
経口摂取(又は吸入)によって引き出されたサプレッサー細胞からの１又はそれ以
上の免疫抑制因子(Ｔｈ２-増大化サイトカイン及びＴｈ１-阻害化サイトカイン
を含む)の放出によって仲介され且つ免疫破壊に寄与する細胞が見出される場合
に該サイトに補充される。その結果は、抗原-非特異的であるが、組織破壊のた
めに応答可能な自己免疫応答のダウンレギュレーションが局部的に制限される。
「自己免疫疾患」は、哺乳動物及び／又は自己の物質内の異物的な免疫原性物
質との間を区別するのに失敗した該免疫機構において、ヒトを含む哺乳動物の免
疫機構の自然発生的な又は不調を誘導されるとして、且つ結果としてまるでそれ
がそれに対する免疫応答が異物的であり且つマウントされるようなに自己組織と
物質を治療するとしてここに定義される。該用語は、ヒト自己免疫疾患とそれの
動物モデルを含む。
「自己抗原」は、免疫機構による攻撃の最初の(又は第１の)標的となる、自己
免疫疾患における、哺乳動物内に通常的に見出されるいずれかの物質又はそれの
部分である。該用語はまた、哺乳動物に投与される際に、自己免疫疾患の特徴を
有する状態を誘導する抗原物質をも含む。加えて、該用語は、自己抗原の免疫優
性エピトープ又は免疫優性エピトープ領域から本質的になる消化性サブクラスを
含む。自己免疫状態を誘導する免疫優性エピトープ又は領域は、該疾患を誘導す
るような全体の自己抗原に代えて使用され得る自己抗原のフラグメントである。
自己免疫疾患に罹ったヒトにおいて、免疫優性エピトープ又は領域は、自己免疫
攻撃の下で組織または器官に特異的な抗原のフラグメントであり且つ自己免疫攻
撃Ｔ細胞の相当なパーセンテージ(例えば絶対多数が必要でないが多数の)によっ
て認識される。
「治療(treatment)」は、自己免疫疾患の開始を予防する又は遅らせるための
予防的治療(又は臨床的又は無症状の発現、例えば組織学的なそれの徴候)、同じ
く自己免疫攻撃を減衰すること及び自己免疫組織破壊を防止すること又は遅らせ
ることによって、自己免疫疾患の徴候の後の症状の抑制又は緩和の治療の両方を
含むことを意図する。自己免疫攻撃又は反応の「緩和」、「抑制」又は「減少」は
、その攻撃又は反応の１又はそれ以上の徴候の部分的な減少又は改良を包含する
。自己免疫反応の「実質的に」増加した抑制効果(又は改良又は減少)は、自己免
疫反応又は疾患の１又はそれ以上のマーカー又は組織学的又は臨床学的指標を有
意に減じることを意味する。非制限的実例は、手足(limb)スコアにおいて又は関
節炎スコアにおいて少なくとも１単位の減少、自己反応性Ｔ細胞の頻度における
有意な減少、及びインスリン炎スコアリング(例えば、Zhangら、PNAS，1991，88
:10252-10256中に記載されたように測定した)における少なくとも約０．５単位
の減少である。
「経口」投与は、経口、経腸又は胃内投与を含む。吸入による投与もまた自己
免疫疾患における耐性化効果を達成する。
「非経口」投与は、皮下、経皮、筋肉内、静脈内、腹腔内又は鞘内投与を含む
。
投与に「結合する」は、同時に又は連続的投与、同じく結合した又は分離した
形態での投与を包含する。
動物モデル
本明細書を通して、参考文献は、自己免疫疾患を実験するために開発されてい
る各種のモデル系とする。実験的自己免疫脳脊髄炎(ＥＡＥ)は、多発性硬化症(
ＭＳ)用のモデルとしてマウス及び他の齧歯動物種において実験されている。当
業者であれば、ＭＳのための多くの潜在的な免疫治療がこの動物モデル系におい
て最初に試験されることを認識する。その疾患は、ミエリン塩基性タンパク質(
ＭＢＰ)、ミエリンオリゴオリゴデンドロサイトタンパク質(ＭＯＧ)、又はプロ
テオリピドタンパク質(ＰＬＰ)及びアジュバント(完全フロイントアジュバント
、「ＣＦＡ」のような)による免疫化によって誘導される。その疾患の誘導のた
めに使用される抗原は、そのモデルにおいて自己抗原である。いずれかの抗原に
よるこの治療は、脱ミエリン化疾患の単相又は増悪／弛張性形態のいずれか一方
を誘導する(齧歯動物の型と種及び誘導の周知の詳細に基づく)。誘導された疾患
は、自己免疫疾患ＭＳの多くの特徴を有し且つそれの動物モデルとして奉仕する
。さらに、経口耐性化によるＥＡＥの成功した治療、及びヒトにおける疾患誘導
化細胞の頻度の減少化における相当の成功、及び多くのケースにおいて、ミエリ
ンの経口投与を用いる、ＭＳの徴候を改善することは、異なる経口耐性養生の成
功を予測するためのモデル系としてＥＡＥの使用を実証する。
マイコバクテリウム ツベルクロシス(Mycobacterium tuberculosis)による又
は感染しやすい哺乳動物の後根の尾内の油でのＣＦＡによる免疫化は、ヒト慢性
関節リウマチのためのモデルとして用いる疾患を誘導する。同様の手法において
、アジュバントと共にII型コラーゲンによる免疫化もまた、ヒト慢性関節リウマ
チのためのモデルとして奉仕する疾患(コラーゲン誘導化関節炎又は「ＣＩＡ」)
を誘導する。これらの動物モデルはまた、バイスタンダー抗原を用い成功した経
口耐性化の良好なプレディクターとして奉仕する。
Ｓ-抗原又はＩＲＢＰ抗原(インターフォトレセプター結合タンパク質)及びア
ジュバントによるルイスラットの免疫化は、自己免疫ぶどう膜網膜炎(uveroreti
nitis)を誘導する。最後に、Ｉ型糖尿病用のモデルは、ＮＯＤマウスにおいて自
然発生的に進展する。
上記したモデル系の１又はそれ以上は、本発明により提供される有効性及び改
善された治療を実証するために使用され得る。実際、その動物モデルは、正確に
はこの抑制メカニズムが抗原非特異性のために、バイスタンダー抑制を含む治療
を試験するために特に好適である。経口耐性化のケースにおいて、それ故に、該
モデルにおいて得られた徴候の抑制は、ヒトの自己免疫疾患とそれの動物モデル
の間に多くの実際の又は潜在的な相違とは関係がない。
上記動物モデルは、かくして本発明の成功した使用を実証するために使用され
得る。例えば、多発性硬化症自己抗原、ウシミエリンは、有意な患者の部分集合
に相当な有益性を与えた二重盲験においてヒトに経口的に投与される(Weiner,H
．ら、Science 259:1321-1324,1993)。加えて、関節圧痛、ＡＭ硬直、握力等の
ような慢性関節リウマチの徴候は、経口コラーゲン受容(一日0.1-0.5mgの単一投
薬量)のヒトにおいて首尾良く抑制された。(Trentham,D.ら、Science 261:1727,
1993)最後に、経口Ｓ-抗原による予備のヒトでの試行は、ぶどう膜網膜炎のため
に推奨される結果を示した。大規模なヒトの実験は、多発性硬化症、ぶどう膜網
膜炎、慢性関節リウマチ及び糖尿病のためにまもなく実施される。自己免疫疾患
の経口耐性化治療のための動物モデルの予測値は、これらのヒトの臨床的研究に
よって支持される。
バイスタンダー抑制の記述
クローナルアネルギーに対して、バイスタンダー抗原の粘膜投与によって仲介
される抑制は、トランスフォーミング増殖因子-ベータ(ＴＧＦ-β)のような１又
はそれ以上の免疫抑制因子；及び／又はインターロイキン４(ＩＬ-４)のような
Ｔｈ２-増加サイトカイン；及び／又は自己免疫攻撃の位置でインターロイキン
１０(ＩＬ-１０)を放出する標的化可能な免疫調節Ｔ細胞の引き出しによって生
じる。これらの調節Ｔ細胞は、高レベルのＩＬ-２又はγ-ＩＦＮを放出しない。
調節Ｔ細胞が引き出されるために、作動でのメカニズムは活性な抑制として関係
される。引き出された調節性細胞によって放出された免疫調節性サイトカインは
、たとえこれらの調節Ｔ細胞が、粘膜投与された抗原上の一つと同じ抗原決定基
により誘発される場合にのみ免疫調節性サイトカインを放出(又は放出を誘導)す
るとしても、抗原非特異性である。器官又は組織の自己免疫破壊に寄与する細胞
が
濃縮される動物の内部の位置への免疫調節Ｔ細胞の補充は、自己免疫攻撃の周囲
での免疫調節性物質の放出を与え、且つそのような攻撃に対応可能な全てのタイ
プの免疫機構を抑制する。
Ｔサプレッサー細胞が組織又は器官特異的抗原による粘膜耐性化への応答中で
引き出されているために、Ｔサプレッサー細胞のための標的は、その破壊細胞が
関係した特有な自己免疫疾患における免疫攻撃下の器官又は組織である。かくし
て、そのバイスタンダー抗原は、自己抗原又は自己抗原の免疫優性エピトープを
含むペプチドとされ得る。代替的に、バイスタンダー抗原は、自己抗原ではない
別の組織特異性抗原として良く；従って自己抗原(又は複数の自己抗原)は、同定
されることが必要でない治療される特有な疾患に包含される。
より詳細には、組織特異的(バイスタンダー)抗原のためのバイスタンダー抑制
の活性な抑制メカニズムの実例は、次の通りである：組織特異的(バイスタンダ
ー)抗原が経口的に(又は経腸的に、すなわち胃内に直接的に)投与された後、腸
管壁の下に配される非常に多数の免疫細胞のコレクションである、パイアー斑と
絨毛、それが接触が起こる場合に小腸管内を通過する。これらの細胞は、順に、
脾臓及びリンパ腺を含む免疫機構に伝えられる。その結果、サプレッサー(ＣＤ
８＋又はＣＤ４＋)Ｔ細胞が血液又はリンパの循環内に誘導され放出され、次い
で、哺乳動物自身の組織に対して向けられた活性化したヘルパーＴ細胞同じくＢ
細胞をダウンレギュレートするＴＧＦ-β及び／又は他の免疫調節性物質の放出
をそれらが生じる場合、自己免疫攻撃のエリアに補充される。Chen,Y.ら、Scien
ce,1994上掲。この手法で誘導した抑制は、抗原非特異性である。しかしながら
、得られる耐性は、特有の自己免疫疾患のために、すなわちバイスタンダー抗原
が、損害を受けている組織で又はその近傍で見出される免疫攻撃細胞を抑制する
バイスタンダー抗原の摂取によって攻撃及び抑制細胞が引き出された下での組織
のために特異的であるという事実によって、自己免疫攻撃下の特有な組織のため
に特異的である。
バイスタンダー抗原と自己抗原(同じくそれらのいずれかのフラグメント及び
類似物)は、天然ソース(それらが普通に発生する組織又は器官)から精製され得
るし、且つ当業者において周知の技術を用いて細菌、酵母、昆虫(例えばバキュ
ロウイルス)及び哺乳動物細胞中で、組換えＤＮＡ技術を用い得ることもできる
。多くの潜在的及び現実のバイスタンダー抗原のためのアミノ酸配列は、周知で
ある：例えば、Hunt,C.ら、PNAS（USA）82:6455-6459,1985(熱ショックタンパク
質ｈｓｐ７０)；Burkthardt,H.ら、Eur.J.Immunol.21:49-54,1991(抗原コラーゲ
ンIIエピトープ)；Tuohy,V.K.ら、J.Immunol.142:1523-1527,1989(マウス中のマ
ウスＰＬＰの脳炎誘発性決定)；Shinohara,T.ら、In Progress in Retinal Rese
arch,Osborne,N & Chader,J.Eds,Pergamon Press 1989,pp.51-55(S-抗原)；Dono
so,L.A.ら、J.Immunol.143:79-83,1989(ＩＲＢＰ)；Borst,D.E.ら、J.Biol.Chem
.264:115-1123,1989(ＩＲＢＰ)；Yamaki,K.ら、FEBS 234:39-43,1988(Ｓ-抗原)
；Donoso,L.A.ら、Eye Res.7:1087,1988(ＩＲＢＰ)；Wyborski,R.J.ら、Mol.Bra
in Res.8:193-198,1990(ＧＡＤ)を参照。
ウシ及びマウスＰＬＰ；ウシ、ヒト、チンパンジー、ラット、マウス、ブタ、
ウサギ、モルモットＭＢＰ；ヒトとウシコラーゲンアルファ-Ｉ(II)とウシコラ
ーゲンアルファ-Ｉ(I)；ニワトリコラーゲンII、及びヒトインスリンのためのア
ミノ酸配列は、周知であり且つ公表され且つこれらの抗原は当該分野で周知であ
るような組換え技術によって合成することができる。これらの抗原のフラグメン
トは化学的に合成でき且つ組換え技術によっても合成できる。
幾つかの組織特異性抗原は、商業的に利用可能である：例えばインスリン、グ
ルカゴン、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリン、コラーゲンＩ、コラーゲンII
、プロテオリピドタンパク質など。
バイスタンダー抗原は、ルーチン的に同定され得る。さいなまれた組織(affli
cted tissue)からのいずれかの抗原は、潜在的にバイスタンダー抗原である。そ
の潜在的なバイスタンダー抗原は、哺乳動物、及び同じ抗原によってインビトロ
で除去され且つ刺激され得るこれら哺乳動物からの、例えばＥＡＥ又はＭＳのケ
ースにおける血液又は脳脊髄液からの脾臓細胞又は循環性Ｔ細胞で培養され得る
。刺激により引き出されたＴ細胞は精製可能であり、且つ上清は、ＴＧＦ-β、
ＩＬ-４、ＩＬ-１０、又は他の免疫調節性物質のそれの含量を試験できる。特に
、ＴＧＦ-βは、好ましくは適当な商業的に利用し得るポリクローナルな又は最
も好ましくはＴＧＦ-βに対して生じたモノクローナルな抗体(例えば、Ｒ＆Ｄ S
ystems,
Minneapolis,MN；Celtrix Pharmaceuticals,Santa Clara,CA)を用いるＥＬＩＳ
Ａによって定量的に及び／又は定性的に測定され得る。Miller,A.ら、J.Immunol
.,148:1106,1992。代替的に、ＴＧＦ-β検出用の別な周知のアッセイが、商業的
に利用し得るミンク上皮細胞系を用い、後述の実施例において記載するように、
利用され得る。もしバイスタンダー抗原がＴＧＦ-βを放出しないＴサプレッサ
ー細胞を引き出すならば、そのＴ細胞は、ＩＬ-４又はＩＬ-１０の分泌を同様に
試験できる(ＩＬ-４とＩＬ-１０のための抗体は、例えばPharmigen,San Diego,C
Aから、商業的に利用され得る)。有効なバイスタンダー抗原でない組織特異性抗
原は、放出した免疫調節性サイトカインが抑制効果を発揮するには炎症の位置か
らは遙か遠くに移動されるように炎症位置(自己免疫攻撃の)から分離されるよう
なそれらである。
粘膜に誘導したバイスタンダーサプレッサーの有効性は、例えば：自己免疫攻
撃の標的である器官又は組織に対し向けられた多数の活性化Ｔ細胞クローンのよ
うな、一定の炎症マーカーの縮小；同じ位置でのＩＬ-２又はＩＦＮ-βレベルの
増加；さいなまれた器官又は組織の組織学的評価(例えば、バイオプシー又は磁
気共鳴イメージングによって)；又は自己免疫疾患に結合した臨床学的徴候の数
及び／又は程度における減少、を評価できる。
耐性化剤の使用-投薬量
本発明のバイスタンダー抗原により誘導した耐性は、経口(又は経腸)又は吸入
可能な投薬量の広い範囲にわたり、投薬量従属性である。しかしながら、有効な
投薬量の最小値と最大値がある。換言すれば、自己免疫疾患の臨床学的及び組織
学的な徴候の活性抑制は、特異的な投薬量の範囲内で起こり、しかしながら、疾
患から疾患、哺乳動物から哺乳動物、及びバイスタンダー抗原からバイスタンダ
ー抗原まで変化する。例えば、その疾患がマウスにおけるＰＬＰ-誘導化ＥＡＥ
である場合、ＭＢＰがバイスタンダー抗原として用いられる場合、抑制投薬量範
囲は、約０．１から約１ｍｇ／マウス／摂取(例えば一日おきに１０-１４-日ピ
リオドにわたり５−７摂取に関して生じる摂取によって)までである。最も好ま
しい投薬量は、０．２５ｍｇ／マウス／摂取である。ラットにおけるＭＢＰ誘導
疾患の抑制のため、約０．５から約２ｍｇ／マウス／摂取であり、最も好ましい
投薬量は、１ｍｇ／マウス／摂取である。ＭＢＰが経口耐性化剤として用いられ
る場合、ＭＳに罹ったヒトのための有効な投薬量の範囲は、一日当たり約１と約
１００の間、好ましくは約１と約２０ｍｇＭＢＰであり(数ヶ月から数年までの
範囲内の時間のピリオドの間、毎日又は一日おきに投与した)、最適値は一日当
たり約７と１０mgとされる。
慢性関節リウマチのために、Ｉ型コラーゲン又はIII型コラーゲンのいずれか
一方を受容しているヒトのための有効な投薬量の範囲は、一日当たり約０．００
５と約１ｍｇの間である。好ましい投薬量は、一日当たり約０．００５と約．５
ｍｇの間である。
患者のモニタリングは、投与の投薬量と頻度を最適化するために望ましくなさ
れ得る。患者への投与の正確な量と頻度は、段階、患者の疾患の徴候の頻度及び
程度及び患者の生理学的状態に基づいて、同じく当該分野で良く認識されるよう
に変更され得る。そのような最適化は、ケースバイケースにおいて好ましくは有
効とされる。免疫抑制に必要な投薬量の最適化は、ルーチンの実験よりも多くな
く含まれ、ここに開示したガイドラインを与える。
疾患の程度の評価は、疾患のタイプに基づいて周知の方法に従い達成され得る
。そのような方法は制限されること無しに含む：
ＭＳ： 時間のピリオドにわたる攻撃の程度と数；障害の進行累積(例
えば延長障害状態スケール(Expanded Disability Status Scal
e)において測定され得る)；脳内の病変の数と広さ(例えば磁気
共鳴イメージングによって明示される)；及び自己反応性Ｔ細
胞の頻度。
ＥＡＥ：次のようにスコアされ得る四肢の麻痺：０-疾患無し；１-増加
した活性、活性のない尾；２-軽度の麻痺、歩行不安定；３-中
度の麻痺、四肢扇形化発現；４-四肢麻痺；及び５-死亡。
ＲＡ： 関節腫脹、関節圧痛、早朝硬直化、握力、関節イメージング技
術
ＡＵＲ：視力；眼中Ｔ細胞数及び眼中の「混濁」。
Ｉ型糖尿病：膵臓Ｔ細胞機能(例えばＯＧＴＴグルコース耐性試験によ
って評価した)。
ＮＯＤモデル：インスリン及び糖尿病開始の遅延。
ＣＩＡ：関節炎スコアは４本の足のそれぞれで影響を受けた関節の数及
び次の１−４の任意のスコアに各等級化することに基づく：０
＝通常；１＝赤みのみ；２＝赤みプラス腫脹；３＝激しい腫脹
及び４＝関節変形。トータルの関節炎スコアは、全ての足のス
コアの総計である。最大の関節炎スコアは、該疾患のコースを
越える動物の最も高いスコアである。
この等級化法に従い可能性のある最も高い関節炎スコアは１６
である(４足Ｘ４足毎のスコア)。
コントロール患者又は実験動物は徴候の悪化している条件下での徴候の安定化
は、抑制治療の有効性の一つの指標である。改善の別の測定は、他の医薬、例え
ばステロイド又は他の抗炎症薬、及び生物学的応答修正剤を減らす又はやめるこ
との能力である。バイスタンダー抗原又は自己抗原の最適投薬量は、上述した通
り評価した最大の有益な効果を生じる一つである。有効な投薬量は、上述した通
りに治療されている疾患の少なくとも一つの特徴のマーカー、徴候又は組織学的
証拠の少なくとも統計学的に又は臨床学的な顕著な証明の根拠となる。（臨床的
に顕著な証明は、特有な自己免疫疾患の分野において熟練した臨床家によって観
測される一つである）
メトトレキサート治療と組み合わせる場合、バイスタンダー抗原(又は自己抗
原)の投薬量は、もしバイスタンダー抗原(又は自己抗原)が単独で投与され、自
己免疫反応を減じるのにより有効とされるその組合せを除いて、使用されている
であろうそれと等しくされ得る。
メトトレキサートの投薬量は、メトトレキサートが単独で使用されると同じく
高い場合、バイスタンダー抗原又は自己抗原との組合せは、増大した抑制効果を
与えることができる。代替的に、メトトレキサートの最適値以下の投薬量は、メ
トトレキサートの毒性作用を少なくするために投与され得る。このケースにおい
て、その組合せによって達成される増加した抑制は、例えばメトトレキサートの
最適投薬量により達成されたと同じく高くできる。
バイスタンダー抗原の最適量と同じく有効な投薬量の範囲の確定は、通常の方
法及び本出願の教示を用いて決定される。例えば、哺乳動物とヒトの投薬量は、
相対的に低い投薬量(例えば１ミリグラム)によって開始し、それを増進的に増加
し(例えば対数的)、且つＴＧＦ-ベータ(及び／又はＩＬ-４又はＩＬ-１０)分泌
細胞の数を測定すること及び／又は血液中の免疫攻撃Ｔ細胞の数と活性を評価す
ること(例えば、制限化希釈分析及び分化する能力によって)及び／又は上述した
通りの、疾患の重症度の評価によって決定され得る。最適投薬量は、血液中の抑
制サイトカインの最大値及び／又は疾患の徴候における最大の減少を原因を生成
する。有効な投薬量は、治療している疾患の少なくとも一つの徴候の特徴の少な
くとも統計学的又は臨床学的な有意の証明の原因となる。
バイスタンダー抗原の最大の有効投薬量は、動物における累進的により高い投
薬量で試験すること、次いでヒトへの推論によって確認され得る。例えば、齧歯
動物のために、上記で与えた投薬量に基づき、ヒトにおけるＭＢＰの最大有効投
薬量は、５０と１００ｍｇ／投与の間に見積もられている。同様に、ヒトのため
のコラーゲンII型の最大有効量は、約１ｍｇ／一日で見積もられている。
本発明は、自己免疫疾患リスクで感染しやすい個人での自己免疫疾患の開始を
予防するためにもまた、有効に使用され得る。例えば、Ｉ型糖尿病に進展するリ
スクのある患者の同定のための方法は、現存し、且つ信頼でき且つ米国糖尿病協
会(ＡＤＡ)によって実際に支持されている各種のアッセイ機構が、Ｉ型糖尿病に
対する感受性を評価する高い予測値を有して(特に組合せにおいて)開発されてい
る(Diabetes Care 13:762-775,1990)。一つの好ましいスクリーニング試験の詳
細は、当業者において利用可能である(Bonifacio,E.ら、The Lancet 335:147-14
9,1990)。
実用的な観点から、自己免疫疾患の開始の防止は、Ｉ型糖尿病において最も重
要である。他の自己免疫疾患(例えば、ＭＳ、ＲＡ、ＡＴ及びＡＵＲ)は、実際の
組織ダメージが起こる前に、組織破壊のより早期の段階で宣せられ；それ故に、
これら疾患の予防的治療は、Ｉ型糖尿病におけると同様に重要ではない。Ｉ型糖
尿病において、膵臓島細胞の実質的に全ての実際の破壊の前に有効な治療によっ
て収めることが最良である。島細胞が破壊された後、その治療は島細胞移植と結
合して用いない限り、有効とされ得ない。
自己免疫疾患と、経口又は吸入形態において投与した場合、これらの疾患の治
療において有効な組織-又は器官-特異的を確証した又は潜在的なバイスタンダー
抗原及び自己抗原の非制限的なリストが、後述の表１中に記載される。各個別の
疾患に記した抗原の組合せもまた投与され得る。
バイスタンダー抗原と自己抗原は、吸入によっても投与され得る。吸入される
ことが必要なバイスタンダーの量は、経口投与のためにそれらよりも一般的によ
り少ない。吸入治療のための有効な量は、上記に提供された同じ方法論を用い評
価され得る。 いずれかの自己免疫疾患のため、関連組織の抽出物、同様に特異的バイスタン
ダー抗原又はそれのフラグメントは、粘膜耐性化剤として使用され得る。換言す
れば、バイスタンダー抗原は、精製する必要がない。例えば、ＭＳ用に使用され
ているミエリン(異なる種から得ることができる)、Ｉ型糖尿病用に使用されてい
る膵臓細胞抽出物、同種移植拒絶(これは自己免疫現象ではない)を防止するため
に用いられている脾臓抽出物、及び筋炎を治療するために用いられる筋肉抽出物
。しかしながら、１またはそれ以上の個別の抗原又はフラグメントが好適である
。
かくして、本発明に従って、Ｉ型糖尿病を治療する場合、グルカゴンの有効量
(上述した通りに決定した)が、経口的に投与され得る。グルカゴンは、膵臓にお
いて特異的に存在する。しかしながら、グルカゴンは、Ｉ型糖尿病のコースにお
いて破壊された膵臓ベータ細胞においてそれが発現しないために、自己抗原でな
いことが明らかである(グルカゴンは、アルファ細胞、異なる細胞型中に排他的
に見出される)。かくして、グルカゴンは「純粋な」バイスタンダーである：そ
れは、いずれかの自己抗原活性を有することが明らかでない。（推定上、膵臓細
胞内環境においてそれの高い局部濃度の結果からして、グルカゴンのバイスタン
ダー活性は、アルファ細胞からのそれに分泌による。）
インスリンは、Ｉ型糖尿病のためのバイスタンダー活性を有する。たとえ抗イ
ンスリン自己抗体がＩ型患者において見出されたとしても、インスリンもまた自
己抗原であるかどうかは目下のところ知られていない。しかしながら、作用のメ
カニズムはどんなものでも、経口、経腸又は吸入可能なインスリン製剤は、膵臓
ベータ細胞の自己免疫破壊を防止することによってそれのためにＩ型糖尿病と動
物モデルの抑制において有効とされる。
多発性硬化症とそれに動物モデルのために、ＭＢＰのフラグメントを含む又は
含まない疾患の両方は、ＭＢＰ誘導化疾患のみでなくＰＬＰ誘導化疾患もまたバ
イスタンダー活性を有する。ラットにおいて、バイスタンダー抗原の摂取は、マ
ウスにおいてＣＤ８+サプレッサーとＣＤ４+調節細胞の両方が生成されるのに対
し、制限されたクラスＩであるＣＤ８+サプレッサー細胞を殆どすべて生成する(
その後者は制限されたクラスIIとされるであろうと思う)。Chen,Y.ら、Science,
1994,上掲。
慢性関節リウマチ及びそれの動物モデルのために、Ｉ型、II型及びIII型コラ
ーゲンは、粘膜耐性化剤として活性を有する。他のコラーゲンは、類似した活性
とされるように思われる。
ぶどう膜網膜炎とそれの動物モデルのために、Ｓ-抗原とＩＲＢＰ及びそれの
フラグメントがバイスタンダー活性を有する。
バイスタンダー抗原のフラグメントもまた利用され得る。有用なフラグメント
は、オーバーラッピングペプチド法を用いて同定でき、且つ摂取動物からのＴ細
胞は、ＴＧＦ-β、及び／又はＩＬ-４及び／又はＩＬ-１０の分泌を試験でき、
且つサブタイプにより同定することがさらにできる(ＣＤ８+及び／又はＣＤ４+)
。
粘膜投与したバイスタンダー抗原は、調節Ｔ細胞を引き出し且つそれによって
ＴＧＦ-β、及び／又はＩＬ-４及びＩＬ-１０の生産と放出を誘導する。そのよ
うなＴ細胞の一つは、ＣＤ４＋サプレッサーＴ細胞としてＥＡＥに対して経口的
に耐性化したマウスにおいて同定されており、且つＣＤ８＋サプレッサーＴ細胞
は、ラットにおいて同定されている。自己抗原、例えばＭＢＰの等しい免疫優性
エピトープは、そのような調節Ｔ細胞を含めることができる。付加的なそのよう
なエピトープは、哺乳動物にバイスタンダー抗原を与えること、及び抗原のフラ
グメント(及びかくして同定した抑制フラグメント)を認識する哺乳動物Ｔ細胞か
ら分離することによって、又は未実験の(摂取無し)動物に対する保護を選択的に
移すことができるバイスタンダー摂取動物からのＴ細胞を同定することによって
、同定することができる。
自己抗原投与は、1993年2月25日に提出したＰＣＴ出願PCT/US93/01705、1991
年3月4日に提出したPCT/US91/01466、1990年12月17日に提出したPCT/US90/07455
、1990年7月16日に提出したPCT/US90/03989、1991年10月10日に提出したPCT/US9
1/07475、1993年8月17日に提出したPCT/US93/07786、1993年9月24日に提出したP
CT/US93/09113、1991年10月31日に提出したPCT/US91/08143、1991年3月29日に提
出したPCT/US91/02218、1993年4月20日に提出したPCT/US93/03708、1993年4月9
日に提出したPCT/US93/03369、及び上述した1991年10月15日に提出したPCT/US91
/07542中に記載された通りに
実行される。
加えて、他のサイトカイン及び非サイトカイン相乗剤は、メトトレキサートと
共に経口耐性化の有効性を増加するために治療において結合させ得る。他のサイ
トカイン相乗剤(Ｉ型インターフェロン)の経口又は非経口的な使用は、04/07/95
に提出したPCT/US95/04120中に記載されている。Ｔｈ２増加サイトカインの投与
は、04/07/95提出のＰＣＴ出願番号PCT/US95/04512中に記載される。例えば、Ｉ
Ｌ-４とＩＬ-１０は、PCT/US95/04512中に記載された手法で投与され得る。本発
明において使用するための非サイトカイン相乗剤の非制限的な実例は、大腸菌と
サルモネラ菌の各種サブタイプのようなグラム陰性細菌の広いバラエティーから
の細菌リポポリサッカリド(ＬＰＳ、Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO;Difco,De
troit,MI;BIOMOL Res.Labs.,Plymouth,PA)、リピドＡ(Sigma Chemical Co.,St.L
ouis,MO;ICN Biochemicals,Cleveland,OH;Polysciences,Inc.,Warrington,PA)；
Deres,K.ら(Nature,342:561-564,1989)中に開示された通りに得ることができる
トリパルミトイル-Ｓ-グリカリルシステイニル-セリル-セリン(P3C55)に共有結
合したペプチドのような免疫調節リポプロテイン又はBraun,V.,Biochem.Biophys
.Acta 435:335-337,1976中に開示された通りに得ることができる大腸菌からの「
ブラウンズ」リポプロテイン；及びその相乗効果がSun,J-Bら1994 PNAS(USA)91,
1994年11月により記載されている(自己免疫反応の減少に関してでないが)コレラ
毒β鎖(ＣＴＢ)を含む。リピドＡは、それが完全なＬＰＳ分子よりも毒性が劣る
ことから本発明において使用するためにＬＰＳ以上に好適である。本発明におい
て使用するためのＬＰＳは、Galanesら(Eur.J.Biochem.9:245,1969)及びSkelly,
R.R.ら(Infect.Immun.23:287,1979)の方法を用い、グラム陰性細菌から抽出され
精製することができる。哺乳動物のための非サイトカイン相乗剤の有効な投薬量
範囲は、体重ｋｇ当たり約１５μｇから約１５ｍｇまで、好ましくは体重ｋｇ当
たり３００μｇ−１２ｍｇまでである。哺乳動物のための経口Ｉ型インターフェ
ロンの有効投薬量範囲は、認識されている最大有効投薬量でない1,000-150,000
単位である。
耐性化剤とメトトレキサートの両方の投与のための最適な摂取の確定は、ここ
に開示した情報と、バイスタンダー抗原、自己抗原及びメトトレキサートの投与
に関する周知の情報に照らして決定される。投薬量のルーチンのバリエーション
、組合せ及び治療の継続は、自己免疫反応の程度が測定され得る環境下で実行さ
れる。有用な投薬量と投与パラメーターは、多数の自己反応Ｔ細胞を、又は該疾
患の少なくとも１の臨床学的又は組織学的徴候の出現又は程度を減じることを含
む自己免疫反応の減少を結果として得るそれらである。
耐性化剤は、メトトレキサートの投与の２４時間以内に好ましくは投与される
。より好ましくは、それはメトトレキサートと同時に投与される。最も好ましく
は、両者は組み合わされた経口製剤で投与される。
本発明において使用するためのメトトレキサートは、経口又は非経口投薬形態
の両方において通常商業的に利用される。代替的に、メトトレキサートは、さら
に後述するようなキャリア及び他の剤を用い、経口又は非経口投薬を通常的に形
成する。
本発明に従う各経口(又は非経口)製剤は、当該分野で周知であるような、製薬
的に許容されるキャリア、希釈剤、フィラー、可溶化剤、または乳化剤、及び塩
を含む不活性成分を含み得る。例えば、錠剤は、当該分野で周知の固体キャリア
を用いる通常の方法に従って製剤化され得る。本発明において用いられるカプセ
ルは、ゼラチン又はセルロース誘導体のようないずれかの製薬的に許容される材
料から作製され得る。持続放出性経口デリバリーシステム及び／又は経口投与投
薬形態のための腸溶コーティングはまた、1987年11月3日発行の米国特許第4,704
,295号；1985年12月3日発行の米国特許第4,556,552号；1982年1月5日発行の米国
特許第4,309,404号；及び1982年1月5日発行の米国特許第4,309,406号中に記載さ
れるようなそれらも意図される。
固体キャリアの実例は、デンプン、糖、ベントナイト、シリカ、及び他の通例
使用されるキャリアを含む。本発明の製剤において使用され得るキャリアと希釈
剤との更なる非制限的な実例は、塩溶液、シロップ、デキストロース及び水を含
む。
吸入により投与される耐性化剤の実例は、12/17/90提出のPCT/US90/07455中に
提供される。本発明の吸入により投与するための製薬用製剤は、任意の成分とし
て、製薬的に許容されるキャリア、希釈剤、可溶化剤及び乳化剤、及び当該分
野において周知とされるタイプの塩を含有させ得る。そのような物質の実例は、
生理学的に緩衝化した塩溶液のような通常の塩溶液、及び水を含む。
本発明のこの相互の実施態様に従う耐性化剤の投与のルートは、エアゾル又は
吸入形態においてである。該抗原は、ドライパウダー粒子として又はキャリアガ
ス(例えば空気又はＮ2)中に懸濁した霧化水溶液として投与され得る。好ましい
エアゾル製薬製剤は、例えば、約１ｍｇと約３００ｍｇの間の抗原を含有する生
理学的に許容される緩衝化塩溶液を含有し得る。
液体中に溶解又は懸濁されない耐性化抗原の微細な分割された固体粒子の形態
のドライエアゾルもまた、本発明の実施において有用である。該耐性化抗原は、
ダスティングパウダーの形にでき、約１と５ミクロンの間、好ましくは２と３ミ
クロンの間の平均粒子サイズを有する微細な分割した粒子を含有する。徴細な分
割した粒子は、当該分野で周知の技法を用い粉砕及びスクリーン濾過によって調
製され得る。その粒子はパウダーの形とされ得る、微細に分割した材料の予め決
定した量の吸入によって投与され得る。
吸入による製薬製剤において使用されるキャリア及び／又は希釈剤の特有の非
制限的な実例は、水と、ｐＨ7.0-8.0リン酸緩衝化塩溶液のような生理学的に許
容される緩衝化溶液を含む。本発明の吸入による製薬製剤又は投薬形態において
使用するための適当なキャリア又は希釈剤の補足の非制限的実例は、1987年4月2
1日発行の米国特許第4,659,696号、1989年9月5日発行の4,863,720号及び1987年1
0月6日発行の4,698,332号中に開示される。
本発明の製薬製剤は、例えば、1986年11月25日発行の米国特許第4,624,251号
、1972年11月21日発行の3,703,173号、1971年2月9日発行の3,561,444号及び1971
年1月13日発行の4,635,627号中に開示されるそれらのようなネブライザーを用い
エアゾルスプレーの形で投与され得る。該エアゾル材料は治療すべき対象者によ
り吸入される。
Newman,S.P.Aerosols and the Lung中,Clarke,S.W.とDavia,D.eds.pp.197-224
,Butterworths,London,England,1984中に開示されるような加圧メーター測定投
薬吸入器(ＭＤＩ)及びドライパウダー吸入器のようなエアゾルデリバリーの他の
システムが、本発明を実施する場合使用され得る。
ここに開示したタイプのエアゾルデリバリーシステムは、Fisons Corporatio
n(Bedford,MA)，Schering Corp.(Kenilworth,NJ)及びAmerican Pharmoseal C
o.(Valencia,CA)を含む複数の販売元から利用される。
この明細書中に引用した全ての特許出願、特許及び学術文献は、それの全体に
おける参照によりそれにより併合される。矛盾のある場合、本開示の定義及び説
明を含む記述が優先する。
以下の実施例は、本発明の説明であり、それの範囲を制限することを意図しな
い。
実施例１：メトトレキサートと耐性化剤の最適投薬量の組合せによるラットにお
けるＥＡＥの抑制
後述の実験において以下の材料と方法を用いた。
動物． メスのルイスラットをHarlan-Sprague Dawley Inc.(Indianapolis,IN
)から得た。動物は、標準的な実験食と適宜に水とを維持した。動物は、Committ
ee on care of Laboratory Animals of the Laboratory Research Council(Pub.
#DHEW:NIH,85-23,1985改訂)のガイドラインに従い維持した。
抗原と試薬． モルモットＭＢＰは、Deiblerら(Prep.Biochem.2:139,1972)の
変法により脳組織から精製した。タンパク質含量と純度は、ゲル電気泳動及びア
ミノ酸分析によりモニターした。メトトレキサートは、Roxane Lab.Inc.(Columb
us,OH)から得た。メトトレキサート錠剤(２．５ｍｇ)は、メトトレキサート／緩
衝液ｍｌの濃度が得られるように緩衝液(Ｈ2Ｏ：ＰＢＳが１：１の比で)と混合
した。
耐性の誘導． 経口耐性のため、ラットは１８ゲージのステンレス鋼製動物摂
取ニードル(Thomas Scientific,Swedesboro，NJ)により胃内挿管によりＰＢＳ(
0.5X)中に溶かしたＭＢＰを摂取させた。動物は、免疫化の前に、７投与又は１
４投与のいずれか一方のため、月曜日、水曜日、及び金曜日の週３回("ＱＯＤ")
摂取させた。
ＥＡＥの誘導． 実際に誘導した疾患のために、ルイスラットは各エマルジョ
ンの５０μｌにより足肉趾において免疫化した。０．１ｍｌのエマルジョンは、
モルモットＭＢＰの２５μｇと完全フロイントアジュバント中マイコバクテリウ
ム ツベルクロシスの２００μｇを含有した。
臨床的評価． 動物は、ＥＡＥの証拠のために毎日盲験方式において評価した
。ＥＡＥの臨床的重症度は、次の通りスコア化した：０，疾患無し；１尾の活気
無し；２，後足麻痺；３，抑制できない後足麻痺；４，四肢麻痺；及び５死亡。
「ＭＭＣＳ」は、平均最大臨床スコアに関する。疾患の継続は、各動物の疾患の
開始から完全な回復(又は死亡)までのトータルの日数をカウントすることにより
計測した。
組織学的分析． 臨床スコアは、スコアサンプルのための２-テイルWilcoxon
ランク合計試験によって分析し、ｃｈｉスクエア分析はグループ間の発生率の比
較において用い、且つ平均の比較は、ステューデントのｔ-テストを用いて実行
した。ここの実験のために、５匹の動物をグループ当たり用いた。
以下の表は、ラットの各グループへの投与のためのプロトコルをを示す。「Ｑ
ＯＤｘ７」は、トータル７投与のため週３回の投与を示す。「ＱＯＤｘ１４」は
、トータル１４投与のため週３回の投与を示す。該プロトコルは、２度実施した
(実験＃１と実験＃２)。 この実験においてメトトレキサートの８０μｇは、それ自身、及びＧＰ-ＭＢ
Ｐ(モルモットＭＢＰ)の１ｍｇと組み合わせて投与した。週に３回の頻度で投与
したメトトレキサートの８０μｇは、重量を調整した場合、ヒトに投与したメト
トレキサートの最適投薬量に相当する。特に、６０Ｋｇ個人のために推奨される
投薬量は、週当たりメトトレキサートの１０ｍｇである。ラット投与のための７
の化学療法国立癌学会転換ファクターを用い、これは週当たり２３８μｇメトト
レキサートの２１２．２ｇラットへの投与、又は週当たり３回の８０μｇメトト
レキサートに相当する。
抗原１４回の投与を含む実験の結果を以下の表中に示した。これらの結果は、
メトトレキサートと組み合わせて投与した場合、ＭＢＰはメトトレキサートの作
用に干渉しないことを示した。それらはまた、最適な抑制がメトトレキサート単
独の８０μｇを用いて達成されたことをも立証した。 以下の表は、抗原７回の投与で得られた結果を示した。これらの結果は、メト
トレキサートとＭＢＰの組合せが、いずれかの化合物それ自身を投与したよりも
より大きな抑制を達成したことを示した。該組合せによって達成された抑制は、
いずれかの物質単独によるよりも実質的により一層大きかった。実施例２：メトトレキサートの最適以下の投薬量と耐性化剤の組合せによるラッ
トにおけるＥＡＥの抑制
実施例１において記載した手順を、以下に示したプロトコルについて続けた。
４０μｇ及び２０μｇの最適以下の投薬量を、１４日の期間にわたり、ＭＢＰの
１ｍｇとの組合せにおいて投与した。８０μｇの最適投薬量もまた投与した。この実験で得られた結果を以下の表中に示した。 図１−５は、完全フロイントアジュバント中のＭＢＰにより免疫化した２０日
後のこの実験からの臨床データを示す。
図１は、メトトレキサート単独の投与の結果を示す。メトトレキサートの最適
投薬量(８０μｇ)と最適以下の投薬量(４０μｇと２０μｇ)によるＥＡＥの抑制
は、投薬従属応答に従うと見ることができる。そのグラフは、１８日目で抑制の
最も高い度合に続いて、疾患の臨床徴候が再び現れる、メトトレキサート投与に
結合したリバウンド効果を示す。
図２は、ＭＢＰの最適投薬量と比較してメトトレキサートの最適投薬量の投与
の臨床スコアについての影響を示す。リバウンド効果は、メトトレキサートを投
与したラットについては２０日で見られたが、ＭＢＰを投与したラットでは無い
。
図３は、メトトレキサートの最適投薬量とＭＢＰの最適投薬量の組合せとの比
較として、メトトレキサートの最適投薬量の投与の臨床スコアについての効果を
示す。メトトレキサートの最適投薬量へのＭＢＰの添加は、メトトレキサートの
効果に干渉しない。２０日でのリバウンドを削除するＭＢＰの効果にメトトレキ
サートが干渉することもない。かくして、ＭＢＰとメトトレキサートの一様な最
適投薬量の組合せの投与で得られた効果は、いずれかの剤のそれ自身による投与
から見られるものに対して優るものである。
図４は、２つの組合せの投与との比較としてＭＢＰ単独とメトトレキサート単
独の４０μｇの最適以下の投与量の投与の結果を示す。その組合せは、いずれか
の単独で達成されるよりもより一層大きな抑制が達成され、且つメトトレキサー
ト単独で見られるリバウンド効果が回避される。抑制の度合は、メトトレキサー
ト単独の最適値投与で観測されたのと本質的に同じである。
図５は、２つの組合せの投与との比較としてＭＢＰ単独とメトトレキサート単
独の２０μｇの最適以下の投与量の投与の結果を示す。その組合せは、いずれか
の単独で達成されるよりもより一層大きな抑制が達成される。抑制の度合は、メ
トトレキサート単独の最適投与で観測されたのと類似している。
かくして、本発明に従い、メトトレキサートの最適値よりもより低い投薬量を
、ＭＢＰとの組合せることの結果として投与することができ、抑制効果はメトト
レキサート単独の最適投薬量のそれに類似したそれが達成される。加えて、その
組
合せは、メトトレキサート単独投与と結合したリバウンド効果を取り去る。
実施例３：メトトレキサートと耐性化剤の組合せによるコラーゲン誘導関節炎の
抑制
ＤＢＡ／Ｊ１マウスは、II型コラーゲン(０．２５ｍｌ中３００μｇ)、メトト
レキサート(０．２５ｍｌ中１０μｇ)、その二つの組合せによって、又は０．１
Ｎ酢酸(０．２５ｍｌ)のコントロール溶液によって連続５日間、一日一度経口的
に投薬した。そのII型コラーゲンは、ニワトリ胸骨II型コラーゲン(1.2mg/ml)(S
igma chemical Co.,St.Louis,MO)とした。メトトレキサートは、２．５ｍｇ錠剤
として得た(Roxane Lab.Inc.)。その錠剤は、２．５mg/ml溶液を形成するため、
０．１規定酢酸と混合した。投与したメトトレキサートの量は、マウス用の１２
の変換ファクター(Chemotherapy National Cancer Institute)を用い、且つマウ
ス当たり２６ｇの平均重量に基づいて、１０ｍｇ／週の６０Ｋｇヒトに対する最
適投薬量に基づいて決定した。
最終経口投与の３日後、各動物は、II型コラーゲンの１００μｇとマイコバク
テリウム ブチリクムの１００μｇを含むエマルジョンの０．１ｍｌによって、
それの毛を剃った背に皮内注射した。３週後、全てのマウスを０．１Ｎ酢酸中の
II型コラーゲンの１００μｇの腹腔内注射によってブーストした。動物は、６０
日間、関節炎の開始についてモニターした。開始日＋１０、動物は０から４のス
コアについて関節炎の徴候についてスコア付けした。各動物の関節炎スコアは、
４本の足のそれぞれのスコアの合計とした。
結果は以下の表６中に示した。 ＤＢＡ／１オスマウスにおけるコラーゲン誘導関節炎は、慢性関節炎リウマチ
よりも遙かに臨床的により激しく、ヒトにおけるメトトレキサートの１０ｍｇ投
薬量に基づいて計算したとしても、マウス中メトトレキサートの１０μｇは、コ
ラーゲン誘導関節炎を抑制するために十分に高い投薬量でないことは明白である
。実際に、その疾患の重症度は、コントロール緩衝液が投与された場合よりも悪
かった。これは、メトトレキサートの投与を免疫化の前に停止したことから、リ
バウンド効果の結果とされ得る。これらの結果は、しかしながらコラーゲン誘導
関節炎が、いずれかの材料単独を投与する場合よりも、II型コラーゲンとメトト
レキサートとを組み合わせた場合に実質的により大きいレベルにまで抑制された
ことを示した。
実施例４：ＴＧＦ-β誘導のためのアッセイ
血清フリー培養上清中のＴＧＦ-βの測定。
血清フリー培養上清は、試験動物からの細胞から捕集した。例えば、Kemri,ら
、J.Exp.Med.163:1037-1050,1986；及びWahl,ら、J.Immunol.145:2514-2419,199
0を参照。概略的には、モジュレーター細胞は、増殖培地中の抗原(５０μｌ／ｍ
ｌ)と共に８時間最初に培養される。その後で細胞は、３回洗浄し、血清フリー
培地中に再懸濁して残りの７２時間培養し、上清を捕集し、分析するまで凍結し
た。ＴＧＦ-β含量及び上清中イソ型の測定は、Danielpourら(Danielpour,D.ら
、J.Cell.Physiol.138:79-86,1989)に従い、ミンク肺上皮細胞系(American Type
Culture Collection,Bethesda,MD ＃CCL-64)を用いて実行し、且つ予め記載さ
れたようなサンドウイッチ酵素結合免疫ソルベントアッセイ(ＳＥＬＩＳＡ)アッ
セイによって確認した。活性ＴＧＦ-βのパーセントは、サンプルの酸活性化前
を除きアッセイにより測定した。
このアッセイは、バイスタンダー抑制のインデューサーとして使用するための
候補であるいずれかの抗原を試験するために適応させ得る。それらの抗原、抗原
フラグメント及び／又はこのアッセイによって測定したようなＴＧＦ-βの最も
高い濃度を誘導する抗原の量は、本発明の治療方法において使用するために適当
とされる。代替的に、後述したトランスウェル培養システムは、誘発されている
ＴＧＦ-βのレベルを示すために使用され得る。この培養システムは、細胞増殖
の抑制の機能としてＴＧＦ-βの作製を意味する。
抗原刺激化細胞の培養上清中のＩＬ-４及び／又はＩＬ-１０の出現は、その抗
原がバイスタンダー抑制のインデューサーとして使用するために好適である指標
としても奉仕させ得る。
ＩＬ-４、ＩＬ-１０(及びＴＧＦ-β)は、Chen,Y.ら、Schience,1994,上掲中に
記載した通りの各ポリペプチドに商業的に利用可能な抗体を用いるＥＬＩＳＡに
よって分析され得る。
トランスウェル培養． 直径が２４．５ｍｍで且つ０．４μｍのポアサイズを
持つ、半透膜ポリカーボネート膜によって分離された２つの区画からなる２重チ
ャンバートランスウェル培養システム(Costar,Cambridge,MA)が用いられる。そ
の２つのチャンバーは、１ｍｍ間隔とされ、直接細胞対細胞の接触なしに非常に
近接した共インキュベートされるべき細胞を与える。トランスウェル培養におい
て増殖応答のインビトロ抑制を測定するため、例えば、予め記載された通り(Ben
-Nun,A.ら、Eur.J.Immunol.11:195,1981)生起させ且つ維持した、５ｘ１０4抗原
特異的系細胞が、下方のウェル中で増殖培地の６００μｌ中、１０6の照射した(
2,500rad)胸腺細胞と共に培養される。経口耐性化した動物(例えばラット)又は
コントロール(ＢＳＡ摂取)からの脾臓細胞が、上方のウェルに加えられる(２０
０μｌ中、５ｘ１０5細胞)。脾臓は、最終の摂取後７−１４日で取り出され、単
細胞懸濁液が、ステンレス鋼メッシュを通して該脾臓をプレスすることによって
調製される。その抗原(５０ｍｇ／ｍｌ)は、２０μｌの容量で加えられる。モジ
ュレーター細胞が半透膜によってレスポンダー細胞から分離されるため、それら
は照射を要求されない。幾つかの実験において、インディケーター細胞は、レス
ポンダー細胞と一緒に下方のウェル中に添加され、且つこれらの場合においてモ
ジュレーター細胞は培養に配される直前に照射(1,250rad)される。増殖培地は、
２ｘ１０5Ｍ ２-メルカプトエタノールを補充したＲＰＭＩ１６４０(Gibco Labo
ratories,Grand Island,NY)、１％ピルビン酸ナトリウム、１％ペニシリン及び
ストレプトマイシン、１％グルタミン、１％ＨＥＰＥＳ緩衝液、１％非必須アミ
ノ酸、及び１％自己血清からなる。各トランスウェルは、４重で実施される。
そのトランスウェルは、湿った６％ＣＯ2と９４％空気雰囲気中、３７℃で７２
時間インキュベートされる。培養の５４時間後、それぞれの下方のウェルは、[3
Ｈ]チミジンの４μＣｉによりパルスされ、７２時間で破砕し、ファイバーグラ
スフィルター上に収穫するため丸底９６ウェルプレート(Costar)中の３つのウェ
ルに再シード化し、標準的な液体シンチレーション技術を用いてカウントする。
抑制パーセント＝１００ｘ(１−Δｃｐｍモジュレーターと培養したレスポンダ
ー／レスポンダーのΔｃｐｍ)。
実施例５： 慢性関節リウマチの治療
慢性関節リウマチにかかった患者は、メトトレキサート治療の突然の使用中止
の後の偽薬の投与と共に経口II型コラーゲンの投与と比較するために定義した臨
床実験の一部として、経口II型コラーゲン単独、又は経口II型コラーゲンと経口
メトトレキサートの組合せのいずれか一方を投与した。
この実験における患者は、週当たり２０ｍｇの最大投薬量においてメトトレキ
サートを全てが予め受けており、全てが機能クラスＩ、II及びIIIで型分けされ
る重症の慢性関節リウマチに罹っている。機能クラスIV中に分類した患者のみは
除外した。機能クラスIVは、日常のセルフケア、職業及び副業上の活動を実行す
るためのそれの能力において制限される患者を含む。全ての患者は、少なくとも
６の圧痛のある関節、及び少なくとも３の腫脹関節を示した。持続性ステロイド
、ＮＳＡＩＤＳ(非ステロイド抗炎症剤、及びある種の鎮痛薬がそれらの使用を
欲するそれらに投与した)。
２０３名の患者が該実験において登録した。実験の開始の直前に、メトトレキ
サート使用を完全に停止した。全ての患者は、その日の最初の食事の前に、オレ
ンジジュース中のII型コラーゲンの２０μｇ／日を経口的に投与した。
そのようなII型コラーゲンの調製方法は、ＷＯ 97/25435中に記載される。こ
の実験において用いたII型コラーゲンは、テロペプチドを取り除くため、酢酸中
で通常的にペプシン処理されている。II型コラーゲンの２０μｇを含む組成物、
そのような投薬量の投与方法、及びそのような投与の有益な結果は、ＷＯ 97/02
837中に記載される。
２４週で終えた実験の間、患者は、圧痛関節カウント及び腫脹関節カウントを
含む幾つかの測定によって評価した。累積パウルス２０応答は、慢性関節リウマ
チにおける改善の周知の尺度であり、効果を評価するために用いた。Paulusら、
Arthritis and Rheum.1990;33:477-484。
この実験の８週で、徴候が発赤した(「スパイクした」)それらの患者は、７．
５と１０ｍｇ／週の間の投薬量において商業的に利用可能なメトトレキサートに
よる経口治療を再開した。該実験を完結したトータル１０１名の患者の比較は、
II型コラーゲンとメトトレキサートを組み合わせ投与した４７名の患者と、II型
コラーゲンのみを投与した５４名の患者の間の応答を形成した。
その結果を図６-８中に示した。図６は、該実験の期間に測定した腫脹関節カ
ウントを示す。８週で悪化した徴候を持つ患者のグループは、その時点で増加し
た腫脹関節カウントを示した。II型コラーゲン治療と結合したメトトレキサート
治療を受けた後、患者のこのグループは、多数の腫脹関節の減少を示し、且つ組
合せ治療の８週後(図６中の１６週マークに相当する)、II型コラーゲンのみを受
けた患者よりも(それのベースライン数)腫脹関節のより大きな減少を示した。そ
の結果は、類似したパターンを示す圧痛関節カウントに関して図７中に示した。
図８中に示した累積パウルス２０応答を達成する患者のパーセントは、経口II
型コラーゲンのみを受けたそれらよりも、組合せ治療を受けた患者でより高かっ
た。共経口(colloral)メトトレキサート組合せを受けた患者のパウルス応答は、
メトトレキサートが８週でII型コラーゲンと組み合わされた時点から算出した。
かくして、経口のII型コラーゲンとメトトレキサートの組合せの使用は、経口II
型コラーゲン単独の使用と比較して疾患の抑制を増す結果が得られた。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｋ 38/51 Ａ６１Ｐ 29/00 １０１
39/00 37/06
Ａ６１Ｐ 3/10 Ｃ０７Ｄ 475/08
19/04 Ａ６１Ｋ 31:519）
27/02 37/02
29/00 １０１ 37/12
37/06 37/26
// Ｃ０７Ｄ 475/08 37/28
(Ａ６１Ｋ 38/00 37/56
31:519） 31:519）
(72)発明者 ネルソン，パトリシア エー
アメリカ合衆国 マサチューセッツ ベル
モント（番地なし)