SK51297A3

SK51297A3 - Compositions and treatment for multiple sclerosis

Info

Publication number: SK51297A3
Application number: SK512-97A
Authority: SK
Inventors: Dawn Smilek; Michael Samson; Malcolm Gefter; Di-Hwei Hsu; Jia-Dong Shi; Xavier Paliard; Brigitte Devaux; Jonathan Rothbard; Henry Franzen
Original assignee: Immulogic Pharma Corp
Priority date: 1994-10-25
Filing date: 1995-10-25
Publication date: 1998-03-04
Also published as: FI971750A; NO971900D0; NO971900L; AU4278296A; WO1996012737A2; CA2203629A1; EP0787147A1; IL115766A0; WO1996012737A3; CZ122697A3; HUT77047A; FI971750A0; SI9520118A; IS4466A; BR9509438A; PL324091A1; JPH10504039A

Description

Prípravky na liečenie sklerózy multiplex a ich použitie na prípravu liečiv

Súvisiace prihlášky

Táto prihláška je čiastočne pokračovacou prihláškou (continuation-in-part) prihlášky č. USSN 08/328224, podanej 25.10.1994. Je taktiež čiastočne pokračovacou prihláškou prihlášky č. USSN 08/300811, podanej 1.9.1994, ktorá je čiastočne pokračovacou prihláškou prihlášky č. USSN 08/116824, podanej 3.9.1993. Táto prihláška je taktiež čiastočne pokračovacou prihláškou prihlášky č. USSN 08/241246, podanej 10.5.1994. Uvedené prihlášky sú tu ako celok zahrnuté formou odkazu.

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka peptidov a prípravkov na báze peptwlov odvodených od myelínových autoantigénov vhodných na liečenie sklerózy multiplex a ich použitia na prípravu liečiv na liečenie, prevenciu nástupu a tlmenie príznakov sklerózy multiplex.

Doterajší stav techniky

Autoimunitné choroby sú významným zdravotným problémom človeka a sú relatívne málo preskúmané. Pretože neexistuje žiadny zjavný priamo zodpovedný mikrób alebo vírus, musí byť prevencia, liečba a diagnostika týchto chorôb založená na ich etiológii. Tá vždy zahrnuje komplexný rad reakcií endogénnych metabolických medziproduktov, štruktúrnych komponentov, buniek atď.

S charakterom autoimunitnej poruchy však vždy súvisí predstava, že pri vzniku i

sledu udalostí, ktoré vedú k príznakom, musí byť prítomný aspoň jeden autoantigén. Autoimunitné demyelinizujúce ochorenia, ako je skleróza multiplex (MS), nie sú výnimkou.

la

MS sa obvykle vyskytuje vo forme recidivujúcich záchvatov, odrážajúcich lézie v centrálnom nervovom systéme (CNS). Záchvaty sa vracajú, ustupujú a opäť vracajú po mnoho rokov zdanlivo náhodne. Frekvencia vzplanutia choroby je najväčšia počas prvých 3 až 4 rokov, ale po prvom záchvate, ktorý môže byť tak mierny, že unikne pozornosti lekára a ťažko sa naň možno rozpomenúť, nemusí ďalší nasledovať počas doby 10 až 20 rokov. Miera zotavenia po epizóde sa medzi pacientami výrazne líši. Remisia môže byť úplná, najmä po skorých záchva-

toch; často je však remisia neúplná a pretože nasleduje jeden záchvat za druhým, nasleduje stupňovitý postup smerom dole so zväčšujúcim sa trvalým deficitom. Klinický obraz MS je určovaný umiestnením ložisiek demyelinizácie v CNS. Klasické znaky zahrnujú zhoršené videnie, nystagmus, horšiu výslovnosť, znížené vnímanie vibrácií a polohový zmysel, ataxiu a chvenie končatiny pred dotykom, slabosť alebo paralýzu jednej alebo viac končatín, spasticitu a problémy s močovým mechúrom. Kritériá diagnózy klinicky určitej MS musia zahrnovať spoľahlivú históriu aspoň dvoch epizód neurologického deficitu a objektívne klinické známky lezie na viac ako jednom mieste CNS. Nie je známa účinná liečba MS. Súčasné terapeutické úsilie je zamerané na zlepšenie akútnych epizód a prevenciu relapsov alebo postupu choroby (Harrison’s Principles of Internal Medicíne, 12. vyd., zv. 2, str. 2038-2043, McGraw Hill, 1991).

Obvykle používaným zvieracím modelom pre ľudskú sklerózu multiplex je experimentálna alergická encenfalomyelitída (EAE), demyelinizujúce ochorenie centrálneho nervového systému, ktoré môže byť vyvolané u náchylných kmeňov myší imunizáciou myelínovým bázickým proteínom (MBP), proteolipidovým proteínom (PLP), myelínovým oligodendrocytovým proteínom (MOG) alebo syntetickými peptidmi založenými na sekvenciách týchto proteínov spojených s myelínom. MBP je jedným z predpokladaných autoantigénov pri skleróze multiplex (MS) a bol epitopovo mapovaný ako v ľudskom (Ota a d’., Náture, 346:183-187 (1990)), tak aj v hlodavčom (Zamvil a d’., Náture, 324:258-260 (1986)) systéme. Peptidy, o ktorých sa usudzuje, že obsahujú aspoň jeden epitop T buniek MBP (myelínového bázického proteínu), boli identifikované vo WO 93/21222, EP 0 304 279, WO 91/15225, Ota a ď., Letters to Náture, 346:183187 (1990), Wucherpfennig a d’., J. Exp. Med., 170:279-290 (1994). Ďalšie peptidy obsahujúce epitop T buniek MBP sú identifikované v prihláškach, ktoré sú tu ako celok zahrnuté odkazom na USSN 08/328224, podanú 25.10.1994, a USSN 08/241246, podanú 10.5.1994. Peptidy MOG s aktivitou T buniek sú identifikované v USSN 08/30081 1, zahrnutej tu ako odkaz.

Proteolipidový proteín (PLP) a myelín-asociovaný glykoproteín (MAG) sa taktiež považujú za možné autoantigény pri skleróze multiplex. Štúdie opisujúce patogenézu autoimunitnej odpovede na PLP pri skleróze multiplex boli publikované v Trotter a d’., J. Neuroimmunol. 33:55-62 (1991); epitopy T buniek PLP boli opísané v Pelfrey a ď., J. Neuroimmunol. 46:33-42 (1993). Štúdie opisujúce MAG ako potenciálny autoantigén pri skleróze multiplex sú publikované v Johnson a d’., J. Neuroimmunol. 13:99-108 (1986).

Experimentálna autoimunitná encefalomyelitída (EAE) je autoimunitná choroba sprostredkovaná CD4+ T bunkami, ktorá sa niektorými svojimi klinickými a histologickými znakmi podobá skleróze multiplex a slúži ako experimentálny model pre túto a iné autoimunitné choroby. EAE je zápalové ochorenie centrálneho nervového systému, ktoré vedie k paralýze a iným neurologickým abnormalitám. Typicky je vyvolávané čistenými myelínovými proteínmi a peptidmi. Model EAE sa napriek tomu intenzívne používa na skúmanie mechanizmov autoimunity a výskum potenciálnych terapeutík pre autoimunitné choroby.

Už v roku 1965 sa pozorovalo, že EAE je možné liečiť podávaním MBP v neencefalitogénnej forme, pravdepodobne vyvolaním imunologickej nereaktivity alebo tolerancie (Alvord, E.C. a ď., Ann. NY Acad. Sci., 1965, 122:333, Levine, S.E. a d’., Science, 1968, 161:1 155, Bernard, C.C.A., 1977 Clin. Exp. Immunol., 1977, 29:100). Tieto skoršie pozorovania boli v posledných niekoľkých rokoch doplnené mnohými výskumníkmi, ukazujúcimi, že podávanie MBP a peptidov MBP novorodencom alebo dospelým zamedzuje EAE (Bernard, C.C.A., 1977 Clin. Exp. Immunol., 1977, 29:100, Clayton, J.P. a d’., J. Exp. Med., 1989, 169:1681, Smilek, D.E. a d’., Proc. Naťl. Acad. Sci., 1991, 88:9633, Guar, A. a d’., Science 1992, 258:1491, Metzler, B. a d’., Int. Immunol. 1993, 5:1 159, Miller, A. a d’., J. Neuroimmunol. 1993, 46:73, Critchfield, J.M. a d’., Science, 1994, 263:1 139, Miller, A. a d’., Proc. Naťl. Acad. Sci. USA, 1992, 89:421). Tieto štúdie navrhujú rôzne cesty podávania, zahrnujúce subkutánnu, intraperitoneálnu, intranazálnu, intravenóznu a orálnu aplikáciu. Vyvolanie imunologickej nereaktivity u dospelých zvierat intravenóznou aplikáciou peptidov bolo demonštrované v rôznych systémoch antigénov. Z mnohých tu opisovaných dôvodov existujú obmedzenia klinickej použiteľnosti orálnej, enterálnej alebo aerosólovej aplikácie autoantigénov, ako je nemožnosť charakterizovať účinnú zložku terapeutického prípravku, akonáhle bola zavedená do žalúdka, v dôsledku následnej enzymatickej degradácie v žalúdku. S použitím týchto metód možno preto obťažne dosiahnuť predvídateľné a reprodukovateľné terapeutické účinky, nehovoriac o možnosti nepriaznivých vedľajších účinkov v dôsledku ďalšieho spracovania terapeutika organizmom, ktoré nemusí byť predvídateľné.

Mechanizmus prevencie choroby alebo vyvolania tolerancie bol vo väčšine týchto prípadov-pripísaný klonálnej anergii (Gaur a ď., viď vyššie), periferálnej delécii (Critchfield a ď., viď vyššie) alebo iným formám antigénovo špecifickej tolerancie. Zdá sa však, že ďalším mechanizmom, ktorým môžu orálne podávané MBP a MBP peptidy inhibovať EAE, je supresia, sprostredkovaná TGF-β (Miller a ď., viď vyššie v Proc. Naťl Acad. Sci.). MBP peptidy, rovnako ako substituované analógy MBP peptidov, boli skúmané ako alternatívne terapeutiká pre EAE u myší PLJ, B10.PL a (PLJ x SJL) Fl. Imunodominantným encefalitogénnym peptidom pre každý z týchto kmeňov je MBP Acl-11, ktorý je rozpoznávaný vo väzbe na Aa^uAp^u (Wraith, D.C. a ď., viď vyššie). MBP Acl-11 bol intenzívne študovaný substitučnou analýzou a boli stanovené jeho požiadavky na rozpoznávanie T buniek a na väzbu k hlavnému komplexu histokompatibility (major histocompatibility complex, MHC). Postranné reťazce zvyškov 3 a 6 prispievajú hlavne k rozpoznávaniu T buniek a postranné reťazce zvyškov 4 a 5 prevažne k väzbe na MHC. Väzba MBP Acl-11 na Αα“Αβ^υ môže byť dramaticky zlepšená rôznymi substitúciami aminokyselín na zvyšku 4, zahrnujúcimi alanín (Acl11 [4A]) a tyrozín (Acl-11[4Y]) (Wraith, D.C. a ď., viď vyššie, Fairchild, P.J. a ď., Int. Immunol., 1993, 5:1 151). Zdá sa, že substitúcie zvyšku 4, najmä tyrozínom, zlepšujú stabilitu komplexov peptid-MHC vzniknutých s týmito peptidmi. Acl-11[4A]) a Acl-11[4Y] si uchovávajú kontaktné zvyšky pre receptory T buniek (TCR), nutné pre antigenicitu, a sú účinnejšie ako MBP Acl-11 pri stimulácii MBP-špecifických T buniek in vitro. Acl-11[4Y] je encefalitogénny tiež in vivo (Acl-11[4A] je z neznámych dôvodov málo encefalitogénny). Ukázalo sa, že ako Acl-11[4A], tak Acl-11[4Y] zabraňujú EAE, a má sa za to, že pôsobia antigénovo špecifickými mechanizmami (Smilek a ď., viď vyššie, Wraith, D.C. a ď., viď vyššie).

V predchádzajúcich štúdiách bránili MBP peptidy alebo peptidové analógy, podávané v nekompletnom adjuvans tesne pred nástupom choroby, následnému vývoju EAE (Smilek a ď., viď vyššie, Gaur a ď., viď vyššie). Vo zvláštnej štúdii s použitím lymfocytov z MBP-špecifickej TCR transgénnej myši bolo zabránené adoptívne prenášanej EAE včasným a agresívnym podaním intravenózneho MBP pred nástupom klinických príznakov (Critchfield a ď., viď vyššie). Tieto štúdie naznačili, že by bolo možné zabraňovať EAE injekčnou aplikáciou MBP peptidov potom, čo boli aktivované encefalitogénne T bunky, ale nedotýkali sa otázky, či by s použitím tohto prístupu bolo možné zvrátiť postupujúcu paralýzu (a pravdepodobne aktívny zápal centrálneho nervového systému) alebo zabrániť relapsom po remisii. Okrem toho v niektorých ďalších skorších experimentoch boli na účinnú liečbu nutné extrémne vysoké dávky MBP alebo MBP peptidu. Pôvodcovia tohto vynálezu ako prví vo svojej skoršej prihláške USSN 08/328224, podanej 25.10.1994, v ktorej týmto pokračujú, opísali zvrat paralýzy a zabránenie relapsom po remisii. Od podania predchádzajúcej prihlášky pôvodcov tohto vynálezu zistili tiež mnohí ďalší pracovníci v odbore, že injekčným podaním určitých peptidových analógov odvodených od MBP je prekvapujúco možné zvrátiť postupujúcu paralýzu u EAE (Karin a ď., J. Exp. Med., 180:22272237 (december 1994).

Vynález odstraňuje vyššie uvedené nevýhody a poskytuje nové peptidy, prípravky a ich použitie na prípravu liečiva na liečenie sklerózy multiplex s použitím preparátov obsahujúcich aspoň jeden peptid so sekvenciou aminokyselinových zvyškov, ktorá zahrnuje aktivitu T buniek MBP. Ďalej sa vynález zaoberá doposiaľ nevyriešeným problémom, že ak má byť všeobecne použiteľná, musí byť liečba sklerózy multiplex s použitím peptidov alebo peptidových analógov účinná aj vtedy, keď je aplikovaná neskôr počas choroby alebo v jej pokročilom štádiu, buď počas remisii alebo počas relapsov za postupu nežiadúcej imunitnej odpovede.

Účelom vynálezu teda je nájsť peptidy a kombinácie peptidov, vhodné ako terapeutiká pre sklerózu multiplex účinné aj pri prevencii nástupu choroby. Ďalej je účelom vynálezu identifikovať profylaktický a terapeuticky účinné režimy dá6 vok a spôsoby aplikácie identifikovaných proteínov, peptidov a peptidových analógov na účinnú liečbu MS. Ďalej je účelom vynálezu identifikovať úspešnú liečbu pre neskoré štádium MS, na zabránenie relapsom, zastavenie choroby a/alebo zvrat postupu MS.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu sú izolované peptidy a kombinácie peptidov, odvodených od myelínových autoantigénov, ako je MBP, MOG, PLP a MAG, vhodné na liečbu sklerózy multiplex, včítane profylaktických a terapeutických prípravkov a ich použitie na prípravu liečiva na liečbu sklerózy multiplex. Výhodné prípravky podľa vynálezu zahrnujú aspoň jeden izolovaný čistený peptid, v podstate zbavený všetkých iných polypeptidov a nečistôt, zahrnujúci aminokyselinovú sekvenciu myelínového autoantigénu, ktorá má aktivitu T buniek. Terapeutický prípravok podľa vynálezu je schopný tlmiť autoantigénovo špecifickú imunitnú odpoveď na myelínový autoantigén v populácii ľudí trpiacich sklerózou multiplex alebo náchylných k nej tak, že príznaky choroby sú potlačené, odstránené alebo zvrátené a/alebo je zamedzený alebo spomalený nástup alebo postup príznakov choroby. Prípravky a ich použitie podľa vynálezu, ak sú aplikované v pokročilom štádiu choroby, zvrátia postupujúcu paralýzu alebo iné znaky choroby, ak sú aplikované počas akútnej fázy, alebo bránia relapsu, ak sú aplikované počas re» misie.

Znalosti, dostupné odborníkovi v odbore, tvorí tu uvádzaná patentová a odborná literatúra. Tu citované udelené patenty US, publikované prihlášky PCT a ďalšie publikácie sú tu zahrnuté ako odkaz.

Predmetom vynálezu sú izolované peptidy a ich kombinácie odvodené od myelínových autoantigénov, použiteľné na liečenie sklerózy multiplex, a taktiež terapeutické prípravky a ich použitie na prípravu liečiva na liečbu sklerózy multiplex. Tu používaný výraz „liečenie sklerózy multiplex“ alebo „liečba sklerózy multiplex“ zahrnuje profylaktické ošetrenie cicavcov náchylných k MS, liečbu pri počiatočnom nástupe MS a liečbu všetkých „pokročilých štádií“ MS včítane relapsujúcej-remitujúcej MS, chronickej progresívnej MS, primárnej progresívnej

MS a be6a

nignej MS. Terapeutické prípravky podľa vynálezu zahrnujú aspoň jeden čistený peptid, v podstate zbavený všetkých ostatných proteínov alebo nečistôt a zahrnujúci definovanú sekvenciu aminokyselinových zvyškov myelínového antigénu majúceho stimulačnú aktivitu T buniek, ktorým peptidom môže taktiež byť izolovaný peptid. Tu používaný výraz „izolovaný“ sa vzťahuje na peptid, ktorý je zbavený všetkých ostatných polypeptidov, nečistôt, východiskových látok alebo ďalších látok a ktorý nieje konjugovaný so žiadnou ďalšou molekulou.

Výraz „peptid“ sa podľa vynálezu vzťahuje na definovanú sekvenciu aminokyselinových zvyškov, ktorých je menej ako aminokyselín natívneho bielkovinového antigénu. Dĺžka peptidu podľa vynálezu prednostne činí aspoň približne sedem, výhodne aspoň asi 12 až 40 a najmä aspoň 13 až 30 aminokyselinových zvyškov, pričom tento peptid, keď je odvodený od bielkovinového antigénu, obsahuje menej aminokyselín ako celý bielkovinový antigén, výhodne nie viac ako 75 % aminokyselinových zvyškov celého bielkovinového antigénu. Peptidy používané podľa vynálezu majú aktivitu T buniek. Peptid majúci „aktivitu T buniek“ môže mať jednu alebo niekoľko týchto charakteristík: a) schopnosť vyvolať odpoveď T buniek, napríklad stimuláciu (tj. proliferáciu alebo sekréciu lymfokínu),

b) schopnosť vyvolať nereaktivitu alebo zníženú reaktivitu T buniek príslušných subpopulácií T buniek, takže sa tieto bunky nezúčastnia stimulácie imunitnej odpovede na útočiaci autoantigén (napríklad prostredníctvom anergie, tolerancie alebo apoptózy), c) schopnosť modifikovať profil sekrécie lymfokínu v porovnaní s vystavením prirodzene sa vyskytujúcemu autoantigénu, d) schopnosť vyvolať indukciu T supresorových buniek a e) je schopný vyvolať tlmenie príznakov autoimunitnej choroby akýmkoľvek mechanizmom alebo f) je odvodený od nezúčastneného antigénu a má schopnosť zistiť supresorové T bunky v mieste myelínového autoimunitného ataku, čo potom vedie k utlmeniu imunitných odpovedí v mieste myelínového autoimunitného ataku.

Peptidy zahrnujúce aspoň jeden epitop T buniek majú aktivitu T buniek a sú schopné vyvolať odpoveď T buniek, ako je stimulácia T buniek (tj. proliferácia T buniek alebo sekrécia lymfokínu) a/alebo sú schopné tlmiť autoantigénovo špecifickú odpoveď T buniek, čo môže viesť k autoantigénovo špecifickej nere8 aktivite T buniek alebo ku zníženej hladine autoantigénovo špecifickej reaktivity T buniek. Epitop T buniek je základný prvok alebo najmenšia jednotka rozpoznania receptorom T buniek, kde epitop zahrnuje aminokyseliny nevyhnutné na rozpoznanie receptora. Má sa za to, že epitopy T buniek sa zúčastňujú zahájenia a trvania imunitnej odpovede na antigén alebo autoantigén. Usudzuje sa, že tieto epitopy T buniek spúšťajú včasné prípady imunitnej odpovede na úrovni T pomocnej bunky väzbou na príslušnú molekulu HLA na povrchu bunky vykazujúcej antigén a stimuláciou relevantnej subpopulácie T buniek. Tieto prípady vedú k proliferácii T buniek, sekrécii lymfokínu, miestnym zápalovým reakciám, príchodu ďalších imunitných buniek na miesto a k aktivácii kaskády B buniek vedúcej k produkcii protilátok. V prípade autoimunitnej choroby sú produkovanými protilátkami protilátky proti autoantigénu, ako je MBP, čo vedie ku klinickým príznakom autoimunitnej choroby.

Peptidy s definovaným zložením aminokyselín, zahrnujúce epitopy T buniek, môžu byť identifikované pre ktorýkoľvek myelínový autoantigén včítane MBP. Jeden spôsob zahrnuje rozdelenie bielkovinového antigénu na neprekrývajúce alebo prekrývajúce sa peptidy s požadovanou dĺžkou a syntézu, Čistenie a testovanie týchto peptidov za účelom zistenia, či zahrnujú aspoň jeden epitop T buniek, rôznymi testami (napríklad testami proliferácie T buniek, testami sekrécie lymfokínu a štúdie nereaktivity T buniek). Pri inej metóde sa pomocou algoritmu odhadujú tie peptidy, ktoré pravdepodobne zahrnujú epitopy T buniek, a potom sa peptidy, odhadnuté pomocou algoritmu, syntetizujú, čistia a testujú v testoch T buniek alebo v štúdiách in vivo za účelom zistenia, Či tieto odhadnuté peptidy vyvolávajú proliferáciu T buniek alebo sekréciu lymfokínu alebo nereaktivitu T buniek, a budú teda pravdepodobne obsahovať epitopy T buniek. Ako je diskutované v mnohých vyššie citovaných dokumentoch, môže byť aktivita ľudských T buniek testovaná kultiváciou T buniek, získaných od jedinca, citlivého na autoantigén, ako je MBP, s peptidom odvodeným od tohto antigénu a stanovením, či ako reakcia na peptid prebieha proliferácia T buniek, meraná napríklad príjmom tritiovaného tymidínu bunkami. Stimulačné indexy pre odpoveď T buniek na peptidy je možné vypočítať ako maximálny počet za minútu (CPM) v reakcii na peptid, delený kontrolným CPM. Stimulačný index (S.I.) T buniek rovný alebo väčší ako dvojnásobok, prednostne trojnásobok úrovne pozadia sa považuje za „pozitívny“. Pozitívne výsledky sú použité v analýze potenciálnej terapeutickej účinnosti peptidov, diskutovanej ďalej a v príklade 1. Výhodné peptidy, používané podľa vynálezu, zahrnujú aspoň jeden epitop T buniek a prednostne aspoň dva alebo viac epitopov T buniek.

Jeden z algoritmov pre nachádzanie peptidov so stimulačnou aktivitou T buniek je opísaný v Rothbard, l^st Fórum in Virology, Annals of the Pasteur Inštitúte, str. 518-526 (december 1986), Rothbard a Taylor, Embo, 7:93-100 (1988), a EP 0 304 279. Tieto dokumenty opisujú definovanie všeobecnej schémy (algoritmu) pre väzbu peptidu na MHC triedy II, jej štatistický význam a koreláciu schémy so známymi epitopmi T buniek, rovnako ako jej úspešné použitie pri nachádzaní skôr neidentifikovaných epitopov T buniek rôznych bielkovinových antigénov a autoantigénov. Zdá sa, že všeobecná schéma pre peptid, o ktorom je známe, že sa viaže na MHC triedy II, ako je uvedené vo vyššie zmienených dokumentoch, obsahuje lineárnu Štruktúru, tvorenú aminokyselinou s nábojom alebo glycínom, za ktorým nasledujú dva hydrofóbne zvyšky. Po určení, či peptid zodpovedá všeobecnej schéme, môže byť testovaný na reaktivitu T buniek. Medzi ďalšie algoritmy, ktoré boli použité k nachádzaniu epitopov T buniek v skôr nedefinovaných bielkovinách, patrí algoritmus opísaný v práci Margalit a ď., J. Immunol. 138:2213-2229 (1987), ktorý je založený na modeli amfipatickej špirály.

Ďalej môžu byť stanovené peptidy zahrnujúce „kryptické epitopy T buniek“, ktoré sú taktiež použiteľné v spôsoboch a prípravkoch podľa vynálezu. Kryptické epitopy T buniek sú tie determinanty v bielkovinovom antigéne, ktoré v dôsledku spracovania a dodania natívneho bielkovinového antigénu do príslušnej molekuly MHC nie sú normálne odhalené imunitným systémom. Peptid zahrnujúci kryptický epitop T buniek je však schopný vyvolať nereaktivitu T buniek a keď je subjekt týmto peptidom primárne imunizovaný, T bunky získané zo subjektu proliferujú in vitro v reakcii na peptid alebo bielkovinový antigén, od ktorého je peptid odvodený. Peptidy, ktoré zahrnujú aspoň jeden kryptický epitop T buniek odvodený od bielkovinového antigénu, sa tu označujú ako „kryptické peptidy“. Na potvrdenie prítomnosti kryptických epitopov T buniek musí byť použitý test proliferácie T buniek, ako je v odbore známy, pri ktorom sa T bunky, senzibilizované antigénom, kultivujú in vitro v prítomnosti každého peptidu zvlášť na identifikáciu bunkových línií T buniek, reaktívnych s peptidom. Peptid sa pokladá za obsahujúci aspoň jeden kryptický epitop T buniek, keď je možné s daným peptidom identifikovať bunkovú líniu T buniek a T bunky sú pri expozícii peptidu a bielkovinovému antigénu, od ktorého je peptid odvodený, schopné proliferácie.

Naviac nie je nutné, aby peptid, používaný spôsobom podľa vynálezu, bol odvodený od sekvencie aminokyselín myelínového autoantigénu, ako je MBP. Spôsobom podľa vynálezu môže byť použitý ktorýkoľvek peptid, obsahujúci definovanú sekvenciu aminokyselinových zvyškov, ktorý je schopný tlmiť antigénovo špecifickú imunitnú odpoveď na myelínový autoantigén. Napríklad môžu byť syntetizované peptidy, zahrnujúce definovanú sekvenciu aminokyselín nezaloženú na sekvencii aminokyselín myelínového antigénu, ktoré sú napriek tomu schopné tlmiť antigénovo špecifickú imunitnú odpoveď, napríklad peptid simuluje epitop T buniek myelínového autoantigénu a spôsobuje tlmenie imunitnej odpovede na myelínový autoantigén, alebo spôsobuje tlmenie imunitnej odpovede z iných dôvodov, napríklad pretože je odvodený od nezúčastneného antigénu. Bez viazania sa na určitú teóriu sa má za to, že nezúčastnené antigény, ktoré sú taktiež tkanivovo špecifické (ale nie sú cieľom imunitného alebo autoimunitného ataku) môžu mať schopnosť iniciovať supresorové T bunky v mieste imunitného ataku, čo môže viesť ku tlmeniu imunitných odpovedí v mieste imunitného ataku (napríklad zasiahnutého „vlastného“ tkaniva v prípade autoimunitného ochorenia alebo nosnej sliznice, kože a pľúc v prípade alergie). Nezúčastnené antigény zahrnujú, bez toho, aby sa na ne obmedzovali, časti antigénu alebo autoantigénu, ktoré samé nie sú cieľom imunitného ataku a ktoré majú supresorovú aktivitu v mieste imunitného ataku. Tu používaný výraz „myelínový antigén“ alebo „myelínový autoantigén“ zahrnuje nezúčastnené antigény, ktoré môžu mať supresorovú aktivitu v mieste myelínového autoimunitného ataku.

Ďalej môže byť podľa vynálezu použitá ktorákoľvek zlúčenina, ktorá simuluje peptid schopný tlmiť antigénovo špecifickú imunitnú odpoveď na myelínový autoantigén (napríklad peptidomimetikum). Takáto zlúčenina nemusí byť tvorená celkom podjednotkami spojenými peptidickými väzbami, ale môže byť spojená aj inými väzbami (napríklad tioesterovými väzbami, redukovanými analógmi väzieb, izosterázami amidických väzieb), pokiaľ nepeptidická zlúčenina simuluje peptid schopný tlmiť antigénovo špecifickú imunitnú odpoveď na príslušný antigén, ako ukazuje účinné terapeutické/profylaktické ošetrenie príznakov. Peptidomimetiká môžu byť založené na ktoromkoľvek peptide podľa vynálezu, ale môžu zahrnovať napríklad analógy peptidickej väzby (napríklad Nmetylamidické väzby (NH-C_a2[-CO-NCH3-]C_ai) a redukované analógy väzby (NH-C_a2[-CH₂-NH-]C_ai)) namiesto jednej alebo niekoľkých normálnych peptidických väzieb.

Len čo boli identifikované peptidy obsahujúce epitop T buniek, je taktiež možné modifikovať štruktúru týchto peptidov na použitie podľa vynálezu na také účely, ako je zvýšenie rozpustnosti (žiadúce najmä, ak má byť prípravok aplikovaný injekčné), zvýšenie terapeutickej alebo preventívnej účinnosti (viď ďalej diskusiu peptidových analógov so zvýšenou väzbou MHC) alebo stability (napríklad životnosť ex vivo a odolnosť voči proteolytickej degradácii in vivo) alebo na uľahčenie syntézy peptidov. Môže byť získaný modifikovaný peptid alebo peptidový analóg, v ktorom bola sekvencia aminokyselín zmenená v porovnaní so sekvenciou natívnej bielkoviny, od ktorej je odvodený, alebo v porovnaní s nemodifikovaným peptidom, od ktorého sa odvodzuje modifikovaný peptid, napríklad substitúciou, deléciou alebo adíciou aminokyselín, za účelom modifikácie imunogenicity, zlepšenia rozpustnosti peptidu alebo zvýšenie ľahkosti syntézy peptidu (napríklad automatizovaná syntéza peptidov).

Peptid môže byť napríklad modifikovaný tak, že aspoň zachováva, pokiaľ nezlepšuje, schopnosť tlmiť autoimunitnú odpoveď pri MS (napríklad vyvolaním nereaktivity T buniek alebo znížením reaktivity T buniek) a súčasne si uchováva schopnosť viazať MHC proteíny. V tomto prípade je možné známymi metódami stanoviť kritické väzobné zvyšky pre receptor T buniek (napríklad substitúciou každého zvyšku a stanovením prítomnosti alebo absencie reaktivity T buniek). Zvyšky, ktoré sa ukázali ako nevyhnutné pre interakciu s receptorom T buniek, môžu byť modifikované náhradou nevyhnutnej aminokyseliny iným, prednostne podobným zvyškom aminokyseliny (konzervatívna substitúcia), ktorého prítomnosť sa prejavila ako zvyšujúca, znižujúca, avšak neeliminujúca, alebo neovplyvňujúca aktivitu T buniek. Ďalej môžu byť tie zvyšky aminokyselín, ktoré nie sú nevyhnutné pre interakciu s receptormi T buniek, modifikované náhradou inou aminokyselinou, ktorej zabudovanie môže zvýšiť, znížiť, avšak neeliminovať, alebo neovplyvňovať aktivitu T buniek, avšak neeliminuje väzbu na relevantný MHC. Ďalej môžu byť peptidy podľa vynálezu modifikované náhradou aminokyseliny, ktorá sa ukázala ako nevyhnutná pre interakciu s MHC proteínovým komplexom, iným, prednostne podobným zvyškom aminokyseliny (konzervatívna substitúcia), ktorého prítomnosť sa ukázala ako zvyšujúca, znižujúca, avšak neeliminujúca, alebo neovplyvňujúca aktivitu T buniek. Ďalej môžu byť zvyšky aminokyselín, ktoré nie sú nevyhnutné pre interakciu s MHC proteínovým komplexom, modifikované náhradou inou aminokyselinou, ktorej zabudovanie môže zvýšiť, neovplyvniť alebo znížiť, avšak neeliminovať reaktivitu T buniek. Ako neobmedzujúce príklady výhodných substitúcií aminokyselín za nie nevyhnutné aminokyseliny je možné uviesť náhrady alanínom, kyselinou glutámovou alebo metylaminokyselinou. Napríklad spis WO 94/06828 opisuje substituované peptidy, v ktorých môže byť v podstate každý zvyšok aminokyseliny substituovaný konzervatívnou aminokyselinou, aminokyselinou nenachádzajúcou sa v prírode alebo alanínom, a substituovaný peptid je napriek tomu schopný tlmiť antigéno.'7 vo špecifickú imunitnú odpoveď. Iným príkladom je práca Karin a ď., J. Exp.

/J

Med. 18,0:2227-2237 (1994), ktorá opisuje štúdie s použitím imunodominantné!

ho krysieho epitopu MBP so sekvenciou aminokyselín 87-99 (SEQ ID NO: 43), uvedenou na obr. 14. Tieto analógy predstavujú rad 13 substituovaných peptidov na báze sekvencie 87-99 (SEQ ID NO: 43), ktoré sa od pôvodného peptidu 8799 (SEQ ID NO: 43), líšia jedinou substitúciou alanínom v každej polohe peptidov 87-99 (SEQ ID NO: 43). Tieto štúdie boli uskutočňované za účelom zistenia predpokladaných miest interakcie imunodominantného peptidu s MHC a TCR u Lewisovej krysy, rovnako ako pre nájdenie modifikovaných peptidov so zlepše13 nými požadovanými charakteristikami na potenciálne terapeutické použitie. Tieto štúdie ukázali, že náhradou lyzínu (K) v polohe 91 peptidu 87-99 (SEQ ID NO: 43), alanínom (A) (viď 87-99[K>A] (SEQ ID NO: 36), na obr. 14) došlo k zamedzeniu a zvratu EAE u Lewisových krýs. Na základe tejto informácie by bolo možné očakávať, že zámenou lyzínu (K) za alanín (A) v mieste jediného lyzínu (K) prítomného v peptidoch, ktoré vo svojej sekvencii aminokyselín obsahujú sekvenciu 87-99 (SEQ ID NO: 43), tj. MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10), a MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), všetkých znázornených na obr. 2, by došlo taktiež ku zvýšeniu aktivity T buniek substituovaných peptidov. Napríklad MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), substituovaný alanínom (A) za lyzín (K) v polohe 10 peptidu MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), (t.j. DENPVVHFFANÍVTPRTPPPSQGK) (SEQ ID NO: 71), môže mať zvýšenú aktivitu T buniek, vedúcu ku zlepšeným terapeutickým vlastnostiam oproti „rodičovskému“ peptidu MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6).

Za účelom zvýšenia stability a/alebo reaktivity môžu byť peptidy taktiež modifikované tak, aby obsahovali v sekvencii aminokyselín bielkovinového antigénu jeden alebo viac polymorfizmov, vyplývajúcich z prirodzených alelických obmien. Na získanie modifikovanej bielkoviny alebo peptidu v rozsahu vynálezu môže byť tiež uskutočnená zámena alebo adícia D-aminokyselinou, neprirodzenou aminokyselinou alebo neaminokyselinovými analógmi. Peptidy podľa vynálezu môžu byť ďalej modifikované s použitím polyetylénglykolovej (PEG) metódy podľa A. Sehona a spolupracovníkov (Wie a ď., viď vyššie) za vzniku proteínu alebo peptidu, konjugovaného s PEG. PEG môže byť ďalej pridávaný počas chemickej syntézy proteínu alebo peptidu podľa vynálezu. Modifikácie peptidov alebo ich častí môžu zahrnovať tiež redukciu/alkyláciu (Tarr v Methods of Protein Microcharacterization, J E. Silver ed., Humana Press, Clifton, NJ, str. 155194 (1986), acyláciu (Tarr, viď vyššie), chemickú kondenzáciu s vhodným nosičom (Mishell a Shiigi, ed., Selected Methods in Cellular Immunology, WH Freeman, San Francisco, CA (1980), patent US 4,939.239, alebo mierne pôsobenie formalínom (Marsh, International Archives of Allergy and Applied Immunology,

41:199-215 (1971)).

/3a

Na uľahčenie čistenia a potenciálne zvýšenie rozpustnosti proteínov alebo peptidov podľa vynálezu je možné k reťazcu peptidu pridať reportérove skupiny. Napríklad môže byť k peptidu pridaný polyhistidín na čistenie peptidu afinitnou

chromatografiou na imobilizovanom kovovom ióne (Hochuli, E. a d., Bio/Technology, 6:1321-1325 (1988)). Okrem toho môžu byť, keď je to žiadúce, medzi reportérovu skupinu a aminokyselinové sekvencie peptidu zavedené špecifické miesta štiepenia endoproteázami na uľahčenie izolácie peptidov zbavených irelevantných sekvencií. Za účelom potenciálne napomôcť správnemu antigénovému spracovaniu epitopov T buniek v peptide môžu byť medzi oblasti rekombinačne alebo synteticky vložené kanonické miesta citlivé voči proteázam, obsahujúce vždy aspoň jeden epitop T buniek. Počas rekombinačnej konštrukcie peptidu môžu byť napríklad medzi oblasti v peptide vložené dvojice nabitých aminokyselín, ako je KK alebo RR. Vzniknutý peptid potom môže byť citlivý voči štiepeniu katepsínom a/alebo inými enzýmami typu trypsínu za vzniku častí peptidu obsahujúcich jeden alebo viac epitopov T buniek.

Ďalším príkladom modifikácie peptidov je substitúcia cysteínových zvyškov prednostne serínom, treonínom, leucínom alebo kyselinou glutámovou za účelom minimalizácie dimerizácie cez disulfídické väzby. Ďalej môžu byť peptidy modifikované za účelom zvýšenia rozpustnosti peptidu pre použitie v pufrovaných vodných roztokoch, ako sú farmaceutický prijateľné nosiče alebo riedidlá, pridaním funkčných skupín k peptidu, terminálnych Častí peptidu alebo nezahrnutím hydrofóbnych oblastí do peptidu. Napríklad na zvýšenie rozpustnosti môžu byť ku karboxyterminálnemu alebo aminoterminálnemu koncu alebo k obom pridané nabité aminokyseliny alebo dvojice alebo triplety nabitých aminokyselín. Ako príklady nabitých aminokyselín je možné uviesť arginín (R), lyzín (K), histidín (H), kyselinu glutámovú (E) a kyselinu asparágovú (D). Kvôli uľahčeniu peptidovej syntézy, napríklad pre automatizovanú syntézu peptidov, môže byť žiadúce vypustiť alebo nahradiť aminokyseliny, ktoré robia syntézu peptidu obťažnejšou alebo nákladnejšou. Napríklad keď je N-terminálna alebo Cterminálna aminokyselina peptidu schopná cyklizácie alebo môže podliehať degradácii buď počas syntézy peptidu alebo po nej, je možné takú aminokyselinu vypustiť alebo nahradiť, alebo alternatívne možno pridať jednu alebo viac ďalších aminokyselín na „blokovanie“ menej žiadúcej amino- alebo karboxyterminálnej aminokyseliny. Tieto pridávané aminokyseliny môžu byť odvodené od natívnej proteínovej sekvencie alebo sa môže jednať o nenatívne aminokyselinové zvyšky. Na zvýšenie vyššie definovanej aktivity T buniek peptidu môžu byť pridávané buď na aminoterminálny alebo na karboxyterminálny koniec peptidu alebo na oba ďalšie aminokyseliny. Tieto ďalšie aminokyseliny môžu byť odvodené od natívnej proteínovej sekvencie alebo sa môže jednať o nenatívne aminokyselinové zvyšky.

Peptidové prípravky, podávané podľa vynálezu, prednostne zahrnujú dostatočný percentuálny podiel epitopov T buniek myelínového autoantigénu (tj. aspoň asi 20, výhodne asi 30, prednostne asi 40 a najmä asi 60 % alebo viac) z celkovej reaktivity T buniek voči myelínovému autoantigénu v populácii jedincov, ktorí reagují na autoantigén a ktorí majú sklerózu multiplex (napríklad aspoň 10, výhodne aspoň 20 jedincov) a sú v prípravku obsiahnuté tak, že terapeutický režim podávania prípravku jedincovi s MS podľa vynálezu vedie k tlmeniu autoimunitnej odpovede MS. Na určenie, či peptid (do úvahy pripadajúci výhodný terapeutický peptid) alebo kombinácie do úvahy pripadajúcich peptidov budú obsahovať dostatočné percento celkovej reaktivity T buniek myelínového autoantigénu na tlmenie autoimunitnej odpovede MS v podstatnom percente populácie jedincov s MS, je možné použiť niekoľko analytických schém.

Podľa jednej analytickej schémy (s použitím MBP ako príkladu) sa peptidy obsahujúce epitopy T buniek roztriedia podľa počtu línií mikrotitrovej kultúry MBP reagujúcich na peptidy obsahujúce epitop a podľa počtu pacientov reagujúcich na ne. Pretože frekvencia MBP-špecifíckých T buniek v PBL pacientov s MS môže byť veľmi nízka, nie je často možné testovať všetky MBP peptidy na každom pacientovi s MS. Preto je vhodný nasledujúci postup na stanovenie najvhodnejších terapeutických peptidov, ktorý je ďalej opísaný v príklade 1. PBL sa izolujú z krvi a kultúry sú iniciované v 96jamkových mikrotitrových platniach. PBL sa čistí zo vzoriek čerstvej periférnej krvi (približne 75 ml) od pacientov s jednoznačnou MS pomocou Ficollovho gradientu hustoty. Mikrotitrové kultúry sa iniciujú 2xl0⁵ PBL na jamku a 10 μg/ml čisteného ľudského miechového MBP v kultivačnom médiu RPMI 1640, doplnenom 5 % ľudského séra AB, penicilínom - streptomycínom a L-glutamínom. Počínajúc dňom 6 až 7 sa kultúry doplnia 1L2 (20 jedn./ml) a IL4 (5 jedn./ml). Po 11 až 13 dňoch sa mikrotitrové kultúry premyjú, resuspendujú v čerstvom médiu a rozdelia do 12 čerstvých mikrotitrových jamiek. Ako bunky obsahujúce antigén sa pridajú autológne zmrazené PBL v množstve 5.10⁴ PBL na jamku. Screeningové antigény sa pridajú dvojmo ku 12 opakovaným jamkám z každej mikrotitrovej kultúry. Ako negatívna kontrola je vždy použité médium a ako pozitívna kontrola čistený ľudský rekombinačný MBP v množstve 10 úg/ml. Každý pacient je taktiež testovaný na reaktivitu s maximálne 4 MBP peptidmi, každým v koncentrácii 10 μΜ. Po 48 h sa uskutočňuje pulzácia s 0,75 pCi ³H-tymidínu a po 6 až 16 h pulzácie sa uskutoční odber. Kultúry sa označia ako pozitívne pre každý peptid podľa týchto kritérií: stimulačný index väčší ako 3,0, zmena CPM väčšia alebo rovná 500 a štandardná odchýlka od priemeru menšia ako zmena CPM. Na účely analýzy sa ďalej kultúry označia ako „peptid-pozitívne“ iba vtedy, keď reagovali súčasne na MBP a na peptid, a ak nereagovali na viac ako jeden neprekrývajúci sa peptid. S každým MBP peptidom sa prednostne testujú skupiny asi 10 až 50 pacientov a každá skupina pacientov sa testuje s maximálne štyrmi peptidmi. Peptidy sa potom roztriedia podľa týchto kritérií: 1) percento MBP pozitívnych mikrotitrových kultúr v každej skupine pacientov (celková reaktivita MBP), ktoré boli taktiež pozitívne na jeden z MBP peptidov, 2) percento jedincov reagujúcich na MBP v každej skupine s aspoň jednou mikrotitrovou kultúrou, ktorá bola pozitívna na jeden z MBP peptidov, kde jedinec reagujúci na MBP je definovaný ako pacient s aspoň jednou mikrotitrovou kultúrou, ktorá bola pozitívna na MBP. Jednotlivé do úvahy pripadajúce peptidy sa potom vyberú, pokiaľ 1) obsahujú aspoň 5, prednostne aspoň 10 a najmä aspoň 20 % celkovej reaktivity MBP a 2) reaktivita na ne sa nachádza u aspoň 20, prednostne aspoň 30, výhodne aspoň 40, zvlášť aspoň 50 a najmä aspoň 60 % jedincov reagujúcich na MBP. Poprípade možno uvažovať ďalšie kritériá na hodnotenie peptidov, ako je index pozitivity pre daný peptid. Index pozitivity reprezentuje ako intenzitu odpovede T buniek na peptid (S.I.), tak aj frekvenciu odpovede T buniek na peptid v populácii jedincov, ktorí reagujú na myelínový autoantigén. Napríklad ako je znázornené na obr. 15, index pozitivity 141-165 (MBP-4) (SEQ ID NO: 14) je približne 2500, vypočítané na základe dát uvedených v príklade 1. Stredná hodnota S.I. peptidu MBP-4 (SEQ ID NO: 14), na pacienta reagujúceho na MBP bola násot, 17 bená percentom jedincov reagujúcich na MBP-4 (SEQ ID NO: 14), v populácii pacientov reagujúcich na MBP.

Vysoko prečistené peptidy, v podstate prosté všetkých iných polypeptidov a nečistôt, s definovanou sekvenciou aminokyselinových zvyškov, zahrnujúcich aspoň jeden epitop T buniek, používané v terapeutických prípravkoch podľa vynálezu, môžu byť získané synteticky chemickou syntézou s použitím štandardných metód. V odbore sú známe rôzne metódy chemickej syntézy peptidov, ako je syntéza v pevnej fáze, ktorá je plne alebo poloautomatizovaná v rôznych komerčne dostupných syntetizátoroch peptidov. Synteticky vyrobené peptidy je potom možné čistiť, prednostne do homogenity, najmä do aspoň 90, výhodne aspoň 95 a zvlášť aspoň 97 % čistoty v podstate bez všetkých iných polypeptidov a nečistôt, ktoroukoľvek z mnohých metód, známych z literatúry na čistenie bielkovín.

Zvlášť žiadúce sú synteticky získané peptidy podľa vynálezu s dĺžkou až približne 45 a prednostne až približne 30 aminokyselinových zvyškov, pretože zväčšenie dĺžky môže viesť k ťažkostiam pri syntéze peptidu. Peptidy s väčšími dĺžkami môžu byť získavané ďalej diskutovanými metódami rekombinácie DNA.

Peptidy, použiteľné pre spôsob podľa vynálezu, môžu byť získavané taktiež metódami rekombinácie DNA v hostiteľskej bunke, transformovanej sekvenciou nukleovej kyseliny kódujúcej príslušný peptid. Ak sú získané rekombinačnými metódami, kultivujú sa hostiteľské bunky, transformované nukleovou kyselinou kódujúcou požadovaný peptid, v médiu vhodnom pre bunky a izolované peptidy môžu byť od kultivačného média alebo hostiteľských buniek alebo od obojeho čistené metódami, známymi v odbore na čistenie peptidov a bielkovín, zahrnujúcimi iónovýmennú chromatografiu, ultrafiltráciu, elektroforézu alebo imunopurifikáciu s protilátkami Špecifickými pre požadovaný peptid. Peptidy získané rekombinačne môžu byť izolované a čistené, prednostne do homogenity v podstate bez bunkového materiálu, iných polypeptidov alebo kultivačného média, na použitie spôsobmi vyššie opísanými pre synteticky získané peptidy.

1$

Za určitých obmedzených podmienok môžu byť peptidy získavané taktiež chemickým alebo enzymatickým štiepením vysoko čisteného úplného alebo natívneho proteínu, v ktorom boli vopred stanovené miesta chemického alebo enzymatického štiepenia a vzniknutý štiepny produkt je reprodukovateľný. Peptidy s definovanými sekvenciami aminokyselín môžu byť vysoko čistené a izolované do čistoty v podstate bez iných polypeptidov alebo nečistôt, prítomných v produkte enzymatického alebo chemického štiepenia, ktorýmkoľvek z postupov, vyššie opísaných pre vysoko čistené a izolované synteticky alebo rekombinačne získané peptidy.

Ďalej môžu byť peptidy podľa vynálezu používané v konjugátoch, aké sú opísané napríklad v patente US 5,130.297 (Sharma a d’.), kde sa pripravujú terapeutické prostriedky s použitím vzorca X—MHC—peptid alebo MHC—peptidX, kde X predstavuje funkčnú skupinu vybranú z toxínov a značiacich skupín, MHC je účinná časť MHC glykoproteínu, ktorý je disociovaný z bunkového povrchu, na ktorom normálne spočíva, a „peptid“ predstavuje ktorýkoľvek z tu uvedených peptidov, najmä MBP alebo MOG a zvlášť peptidy uvedené na obr. 2 a

14.

Ďalej zahrnujú výhodné peptidy podľa vynálezu aspoň jeden epitop T buniek úplného proteínu, najmä MBP alebo MOG. Peptidy môžu obsahovať tandemové repetície jedného epitopu a/alebo viac ako jedného epitopu.

V súlade s tu opísanými postupmi na identifikáciu peptidov obsahujúcich aktivitu T buniek MBP (viď diskusiu vyššie a ďalej v príklade 1) sú výhodnými peptidmi peptidy odvodené od MBP, pripadajúce do úvahy na terapeutické použitie, napríklad peptidy MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-2 (SEQ 1D NO. 5), MBP-3 (SEQ ID NO: 13), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) a MBP-5 (SEQ ID NO: 15), znázornené na obr. 2, alebo ktorákoľvek ich časť alebo modifikácia. Tieto peptidy boli testované na aktivitu T buniek spôsobom opísaným v príklade 1 a ukázalo sa, že obsahujú aspoň jeden epitop T buniek, ako ukazuje pomer MBP pozitívnych mikrotitrových kultúr, ktoré boli taktiež pozitívne na jeden z MBP peptidov (obr. 4a), a detegovateľná odpoveď na každý z výhodných peptidov vo významnom percente testovaných MBP pacientov (obr. 4b). Najreaktívnejší z týchto Štyroch peptidov je MBP-4 (141-165) (SEQ ID NO: 14), na ktorý pripadá 21 % celkovej odpovede MBP a je detegovateľný v 64 % testovaných pacientov, reagujúcich na MBP. MBP-4 (SEQ ID NO: 14) prekvapujúco vykazoval dramaticky väčšiu reaktivitu ako sú spojené reaktivity MBP 141-160 (SEQ ID NO: 28) a MBP 151-170 (SEQ ID NO: 29), ako je znázornené na obr. 3. Pôvodcovia tohto vynálezu ako prví identifikovali tento imunodominantný peptid, ktorý, ako sa zdá, obsahuje viacnásobné epitopy T buniek. Tento nový peptid je zvlášť vhodný na terapeutické použitie.

Ako vhodné peptidy, pripadajúce do úvahy na terapeutické použitie, sa ďalej javia MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-1.2 (SEQ ID NO: 4), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10), MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), a MBP-3.1 (SEQ ID NO: 13), znázornené na obr. 2. Tieto peptidy sú modifikovanými verziami MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-2 (SEQ ID NO: 5), resp. MBP3 (SEQ ID NO: 12), a očakáva sa, že budú mať podobnú aktivitu T buniek ako ich príslušné „rodičovské“ peptidy. Tieto peptidy boli modifikované vypustením a/alebo pridaním aminokyselín v súlade s vyššie opísanými metódami modifikácie peptidov, najmä za účelom uľahčenia syntézy.

Iné peptidy, ktoré sa ukázali ako imunodominantné (tj. majú aktivitu T buniek MBP) alebo boli odvodené od peptidov so známou aktivitou T buniek MBP, boli identifikované pôvodcami tohto vynálezu alebo inými pracovníkmi v tomto odbore (viď napríklad USSN 08/328224, dátum podania 25.10.1994, USSN 08/241246, dátum podania 10.5.1994, WO 93/21222, EP 0 304 279, WO 91/15225, Ota a ď., Letters to Náture, 346:183-187 (1990), Wucherpfenning a ď., J. Exp. Med., 170:279-290 (1994), Martin a ď., J. Immunol., (1990) 145:540-548), Karin a ď., J. Exp. Med. 180:2227-2237 (1994)). Takéto peptidy môžu byť taktiež vhodné na terapeutické použitie v prípravkoch a spôsoboch podľa vynálezu, najmä v kombinácii s vyššie opísanými výhodnými peptidmi Takéto peptidy zahrnujú, avšak neobmedzujú sa na ne, tieto celé peptidy alebo ich časti, kde čísla zvyškov zodpovedajú aminokyselinovým zvyškom ľudského MBP

119a proteínu, znázorneného na obr. 1 a majúceho jednotlivé sekvencie aminokyselín, znázornené na obr. 14: 13-25 (SEQ ID NO: 31), 31-50 (SEQ ID NO: 18), 6180 (SEQ ID NO: 21), 82-92 (SEQ ID NO: 32), 82-96 (SEQ ID NO: 33), 82-97 (SEQ ID NO: 34), 82-98 (SEQ ID NO. 35), 82-100 (SEQ ID NO. 30), 82100[P>Y] (SEQ ID NO: 46), 83-100 (SEQ ID NO: 37), 83-101 (SEQ ID NO:

38), 84-97 (SEQ ID NO: 39), 84-100 (SEQ ID NO: 40), 85-100 (SEQ ID NO: 41), 86-105 (SEQ ID NO: 42), 87-99 (SEQ ID NO: 43), 87-99[91K>A] (SEQ ID NO: 36), 88-100 (SEQ ID NO: 44), 88-99 (SEQ ID NO: 45), 111-135 (SEQ ID NO: 47), 122-140 (SEQ ID NO: 48), 139-170 (SEQ ID NO: 49),

141-160 (SEQ ID NO: 28), 142-166 (SEQ ID NO: 50), 142-168 (SEQ ID NO: 51), 146-160 (SEQ ID NO: 52), a 153-170 (SEQ ID NO: 53), výhodne 13-25 (SEQ ID NO: 31), 87-99 (SEQ ID NO: 43), 87-99[91K>A] (SEQ ID NO: 36), 82-100 (SEQ ID NO: 30), 82-100[100P>Y] (SEQ ID NO: 46), znázornené na obr. 14. Výhodné časti týchto peptidov alebo vý20 hodné modifikácie majú výhodne podobnú alebo väčšiu aktivitu T buniek v rovnakom alebo väčšom percente testovaných pacientov a/alebo majú podobnú alebo väčšiu terapeutickú účinnosť pri spôsoboch podľa vynálezu ako „rodičovský“ peptid, z ktorého bol modifikovaný peptid odvodený.

Predmetom vynálezu sú v jednom aspekte terapeutické prípravky zahrnujúce aspoň jeden peptid odvodený od myelínového antigénu s aktivitou T buniek alebo kombináciu peptidov odvodených od myelínového antigénu, z ktorých každý má aktivitu T buniek, a farmaceutický prijateľný nosič alebo riedidlo. Výhodné terapeutické prípravky zahrnujú dostatočné percento aktivity T buniek myelínového autoantigénu, takže ak sú podané MS pacientovi v terapeutickom režime, prednostne v neimunogénnej forme, sú schopné tlmiť imunitnú odpoveď špecifickú pre myelínový autoantigén v populácii ľudí náchylných k takejto antigénovo špecifickej imunitnej odpovedi. Tu používaný výraz „tlmenie“ zahrnuje, avšak neobmedzuje sa na ne, zamedzenie počiatočného nástupu príznakov choroby, obmedzenie príznakov sklerózy multiplex spôsobených antigénovo špecifickou imunitnou odpoveďou na MBP alebo iný myelínový autoantigén, najmä zníženie, obrat, nepostupovanie alebo zmiernenie príznakov. Nepostupovanie môže byť charakterizované, avšak bez toho, aby sa na ne obmedzovalo, ako (a) kratšie obdobie aktívnej choroby alebo exacerbácie, (b) menej vážne príznaky alebo postihnutie, (c) zdržanie postupu choroby, pri ktorom sa základný zdravotný stav nezhoršuje tak rýchlo, (d) predĺženie doby medzi obdobiami aktívnej choroby alebo exacerbácie (napríklad dlhšie obdobie remisií) (e) menej relapsov alebo exacerbácií a/alebo (f) spomalenie alebo zastavenie postupu zaťaženia léziami, detegovaného MRI. Ďalšie spôsoby hodnotenia, používané odborníkmi v príslušnom odbore, zahrnujú bodovacie systémy Expanded Disability Status Scale (EDSS), Neurological Rating Scale a iné metódy. Tu používaný výraz „pokročilé štádium“ označuje ktorýkoľvek okamžik po jasných klinických znakoch zjavnej choroby, či už sa jedná o relapsujúcu-remitujúcu MS, chronickú progresívnu MS, benignú MS alebo primárnu progresívnu MS. Okrem tejto definície môže „pokročilé štádium“ zahrnovať akútne fázy, remisie a exacerbácie. Tu používaný výraz „akútna fáza“ znamená nastupujúci záchvat, akútnu chorobu, aktívnu chorobu a exacerbáciu, ktoré výrazy sa používajú vzájomne zameniteľné.

Tieto tu používané výrazy sa všeobecne vzťahujú na stav, kedy subjekt trpiaci chorobou (či už diagnostikovanou alebo nie) vykazuje aktívne príznaky alebo znaky, obvykle považované odborníkmi za spojené so špecifickou imunitnou odpoveďou charakteristickou pre sklerózu multiplex. „Relaps“ znamená akútnu fázu, ktorá nasleduje po remisii. Výraz exacerbácia, keď je použitý v príslušnom kontexte, môže byť tiež interpretovaný ako nové a zhoršujúce sa príznaky alebo znaky. „Príznaky“ sú tie indície choroby, na ktoré si pacient sťažuje. „Znaky“ sú indície pozorované alebo namerané diagnostikom. Výrazy príznaky a znaky sa však tu používajú vzájomne zameniteľné, ak nie je uvedené inak.

Terapeutické prípravky podľa vynálezu prednostne zahrnujú aspoň jeden peptid alebo modifikovaný peptid alebo analóg peptidu, obsahujúci epitop T buniek, a farmaceutický prijateľný nosič alebo riedidlo. Tieto prípravky môžu prednostne obsahovať MBP peptid zvolený z tejto skupiny peptidov: MBP-1 (SEQ ID NO: 2). MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-1.2 (SEQ ID NO: 4), MBP2 (SEQ ID NO: 5), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO. 7),

MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO:

10), MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), MBP-3 (SEQ ID NO: 12), MBP-3.1 (SEQ ID NO: 13), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) a MBP-5 (SEQ ID NO: 15),, výhodne peptid zvolený zo skupiny zahrnujúcej MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-4 (SEQ ID NO: 14), a MBP-5 (SEQ ID NO 15), a najmä je MBP peptidom MBP-4 (SEQ ID NO: 14).

Prípravky podľa vynálezu môžu zahrnovať aspoň dva peptidy (napríklad fyzikálnu zmes aspoň dvoch peptidov), z ktorých každý má aktivitu T buniek a prednostne zahrnuje aspoň jeden epitop T buniek myelínového autoantigénu, ako je MBP. Tieto prípravky môžu byť podávané vo forme terapeutickej kompozície s farmaceutický prijateľným nosičom alebo riedidlom. Terapeuticky účinné množstvo jedného alebo viac týchto prípravkov môže byť jedincovi trpiacemu MS podávané súčasne alebo postupne. Výhodné prípravky zahrnujú aspoň jeden a prednostne aspoň dva peptidy vybrané zo skupiny zahrnujúcej MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-1.2 (SEQ ID NO: 4), MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO; 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO; 10),

MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), MBP-3 (SEQ ID NO: 12), MBP-3.1 (SEQ ID NO:

13) , MBP-4 (SEQ ID NO: 14) a MBP-5 (SEQ ID NO: 1 5),znázornené na obr.

2, výhodne zo skupiny zahrnujúcej MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-1.2 (SEQ

ID NO: 4), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2.(SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5(SEQ ID NO: 10),

MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), MBP-3.1 (SEQ ID NO: 13), MBP-4(SEQ ID NO:

14) , a MBP-5(SEQ ID NO: 15), a najmä zo skupiny zahrnujúcej MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-4(SEQ ID NO: 14) a MBP-5(SEQ ID NO: 15),. Ďalej môžu prípravky podľa vynálezu naviac obsahovať peptidy odvodené od MBP, obsahujúce zvyšky, ktorých čísla zodpovedajú aminokyselinovým zvyškom ľudského MBP proteínu, znázorneného na obr. 1, a obsahujúce jednotlivé sekvencie aminokyselín, uvedené na obr. 14: 13-25 (SEQ ID NO: 31), 31-50 (SEQ ID NO: 18), 61-80 (SEQ ID NO: 21), 82-92 (SEQ ID NO: 32), 8296 (SEQ ID NO: 33), 82-97 (SEQ ID NO: 34), 82-98 (SEQ ID NO: 35), 82-100 (SEQ ID NO: 30), 82-100[ 100P>Y] (SEQ ID NO: 46), 83-100 (SEQ ID NO: 37), 83-101 (SEQ ID NO: 38), 84-97 (SEQ ID NO: 39), 84-100 (SEQ ID NO: 40), 85-100 (SEQ ID NO: 41), 86-105 (SEQ ID NO: 42), 87-99 (SEQ ID NO: 43), 87-99[91K>A] (SEQ ID NO: 36), 88-100 (SEQ ID NO: 44), 88-99 (SEQ ID NO: 45), 1 1 1-135 (SEQ ID NO: 47), 122-140 (SEQ ID NO: 48), 139-170 (SEQ ID NO: 49), 141-160 (SEQ ID NO: 28), 142-166 (SEQ ID NO: 50), 142-168 (SEQ ID NO: 51), 146-160 (SEQ ID NO: 52) a 153-170 (SEQ ID NO: 53), a výhodne obsahujú tieto peptidy: 13-25 (SEQ ID NO: 3 1), 87-99 (SEQ ID NO: 43), 87-99[91K>A] (SEQ ID NO: 36), 82-100 (SEQ ID NO: 30), 82100[100P>Y] (SEQ ID NO: 46). Prednostne obsahujú prípravky podľa vynálezu aspoň dva peptidy, kde aspoň jeden peptid je MBP-4 (SEQ ID NO: 14) a aspoň jeden peptid je zvolený z tejto skupiny peptidov: MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-1.2 (SEQ ID NO: 4), MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10), MBP-2 6 (SEQ ID NO:

11), MBP-3 (SEQ ID NO: 13), MBP-3.1 (SEQ ID NO: 13) a MBP-5 (SEQ ID NO: 15), znázornených na obr. 2, a ďalej môžu zahrňovať aspoň jeden λ 23 z nasledujúcich peptidov, odvodených od MBP, znázornených na obr. 14: 13-25 (SEQ ID NO: 31), 31-50 (SEQ ID NO: 18), 61-80 (SEQ ID NO: 21), 82-92 (SEQ ID NO: 32), 82-96 (SEQ ID NO: 33), 82-97 (SEQ ID NO: 34), 82-98 (SEQ ID NO: 35), 82-100 (SEQ ID NO: 30), 82-100[ 100P>Y] (SEQ ID NO: 46), 83-100 (SEQ ID NO: 37), 83-101 (SEQ ID NO: 38), 84-97 (SEQ ID NO:

39), 84-100 (SEQ ID NO: 40), 85-100 (SEQ ID NO: 41), 86-105 (SEQ ID NO: 42), 87-99 (SEQ ID NO: 43), 87-99[91K>A] (SEQ ID NO: 36), 88-100 (SEQ ID NO: 44), 88-99 (SEQ ID NO: 45), 1 1 1-135 (SEQ ID NO: 47), 122-140 (SEQ ID NO: 48), 139-170 (SEQ ID NO: 49), 141-160 (SEQ ID NO: 28), 142-166 (SEQ ID NO: 50), 142-168 (SEQ ID NO. 51), 146-160 (SEQ ID NO: 52) a 153-170 (SEQ ID NO: 53), a najmä aspoň jeden z týchto peptidov: 13-25 (SEQ ID NO:

31), 87-99 (SEQ ID NO: 43), 87-99[91K>A] (SEQ ID NO: 36), 82-100 (SEQ ID NO: 30), 82-100[ 100P>Y] (SEQ ID NO: 46).

Výhodné prípravky podľa vynálezu zahrnujú tieto peptidy:

MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-3 (SEQ ID NO: 12), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) a MBP-5 (SEQ ID NO: 15);

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-3 (SEQ ID NO: 12), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) a MBP-5 (SEQ ID NO: 15);

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) a MBP-5 (SEQ ID NO: 15);

MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) a MBP-5 (SEQ ID NO: 15);

MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) a MBP-5 (SEQ ID NO: 15);

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2.1 (SEQ ID NO 6), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) a MBP-5 (SEQ ID NO: 15);

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6) a MBP-4 (SEQ ID NO: 14);

MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6) a MBP-4 (SEQ ID NO: 14);

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2 (SEQ ID NO: 5) a MBP-4 (SEQ ID NO: 14);

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6) a MBP-5 (SEQ ID NO:

15);

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6) a MBP-3 (SEQ ID NO:

12);

MBP-1 (SEQ ID NO: 2) a peptid vybraný zo skupiny zahrnujúcej MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10) alebo MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11);

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3) a peptid vybraný zo skupiny zahrnujúcej MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10) alebo MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11);

MBP-4 (SEQ ID NO: 14) a peptid vybraný zo skupiny zahrnujúcej MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10) alebo MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11);

MBP-4 (SEQ ID NO: 14) a peptid vybraný zo skupiny zahrnujúcej MBP-1 (SEQ ID NO: 2) alebo MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3);

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) a peptid vybraný zo skupiny zahrnujúcej 82-100 (SEQ ID NO: 30), 82-100[ 100P>Y] (SEQ ID NO: 46), 87-99 (SEQ ID NO: 43) a 87-99[91K>A] (SEQ ID NO: 36), znázornené na obr. 14;

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) a peptid vybraný zo skupiny zahrnujúcej MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10) alebo MBP-2 6 (SEQ ID NO: 11), znázornené na obr. 2;

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-5 (SEQ ID NO: 15), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) a peptid vybraný zo skupiny zahrnujúcej 82-100 (SEQ ID NO: 30), 82-100[ 100P>Y] (SEQ ID NO: 46), 87-99 (SEQ ID NO: 43) a 87-99[91K>A] (SEQ ID NO: 36), znázornené na obr. 14;

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-5 (SEQ ID NO: 15), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) a peptid vybraný zo skupiny zahrnujúcej MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10) alebo MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), znázornené na obr. 2;

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-5 (SEQ ID NO: 15), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) a peptid vybraný zo skupiny zahrnujúcej 82-100 (SEQ ID NO: 30), 82-100[100P>Y] (SEQ ID NO: 46), 87-99 (SEQ ID NO: 43) a 87-99[91K>A] (SEQ ID NO: 36), znázornené na obr. 14;

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-3 (SEQ ID NO: 12), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) a peptid vybraný zo skupiny zahrnujúcej MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10> alebo MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), znázornené na obr. 2.

Vynález taktiež zahrnuje použitie kombinácií terapeuticky účinných peptidov na prípravu liečiva k liečebnému režimu na liečenie sklerózy multiplex. Tieto kombinácie peptidov môžu byť podávané súčasne alebo postupne ako terapeutické prípravky zahrnujúce iba jeden peptid alebo niekoľko peptidov. Tento liečebný režim nemusí nutne zahrnovať fyzikálnu zmes viac ako jedného peptidu, ale zahrnuje kombináciu peptidov, podávaných súčasne alebo postupne ako jednorázová liečebná epizóda. Prednostné kombinácie peptidov (vo forme jedného alebo viac prípravkov, z ktorých každý zahrnuje jeden alebo viac peptidov), ktoré môžu byť podávané súčasne alebo postupne ako jednorázová liečebná epizóda, zahrnujú tieto kombinácie peptidov:

MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-2 (SEQ ID NO: 2), MBP-3 (SEQ ID NO: 12), MBP4 (SEQ ID NO: 14) a MBP-5 (SEQ ID NO: 15);

,ι 25a

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) a MBP-5 (SEQ ID NO: 15);

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6) a MBP-4 (SEQ ID NO:

14) ;

MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6) a MBP-4 (SEQ ID NO: 14); MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2 (SEQ ID NO: 5) a MBP-4 (SEQ ID NO. 14);

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6) a MBP-5 (SEQ ID NO:

15) ;

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2 1 (SEQ ID NO: 6) a MBP-3 (SEQ ID NO: 12);

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3) a peptid vybraný zo skupiny zahrnujúcej MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2 5 (SEQ ID NO: 10) alebo MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11);

MBP-4 (SEQ ID NO: 14) a peptid vybraný zo skupiny zahrnujúcej MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3

25b (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10) alebo

MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11);

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) a peptid vybraný zo skupiny zahrnujúcej MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10) alebo MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), znázornené na obr. 2;

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-5 (SEQ ID NO: 15), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) a peptid vybraný zo skupiny zahrnujúcej 82-100 (SEQ ID NO: 30), 82100[100P>Y] (SEQ ID NO: 46), 87-99 (SEQ ID NO: 43) a 87-99[91K>A] (SEQ ID NO: 36), znázornené na obr. 14,

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-5 (SEQ ID NO: 1), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) a peptid vybraný zo skupiny zahrnujúcej MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2 4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10) alebo MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), znázornené na obr. 2;

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-5 (SEQ ID NO: 15), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) a peptid vybraný zo skupiny zahrnujúcej 82-100 (SEQ ID NO: 30), 82100[ 100P>Y] (SEQ ID NO: 46), 87-99 (SEQ ID NO: 43) a 87-99[91K>A] (SEQ ID NO: 36), znázornené na obr. 14;

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-3 (SEQ ID NO: 12), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) a peptid vybraný zo skupiny zahrnujúcej MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10) alebo MBP-2.6 (SEQ ID NO: 1 I), znázornené na obr. 2.

;25c

Ďalej môžu výhodné prípravky a výhodné kombinácie MBP peptidov, ktoré môžu byť podávané súčasne a/alebo postupne, zahrnovať ktorýkoľvek z vyššie uvedených prípravkov a naviac môžu ďalej obsahovať peptid, obsahujúci aspoň jeden epitop T buniek, odvodený od myelínového oligodendrocytového proteínu (MOG), Čo je ďalší proteín, považovaný za jeden z autoantigénov zúčastňujúcich sa pri skleróze multiplex (viď Lebar a ď., J. Immunol. (1976) 1 16:1439-1446, Lebar a ď., J. Exp. Immunol. (1986) 66:423-443, Linington a Lassman, J. Neuroimmunol. (1987) 17:61-69, Lassman a ď., Acta Neuropathol. (Berl) (1988) 75:566-576, a Sun a ď., J. Immunol. (1991) 146:1490-1495). Peptidy, ktoré môžu zahrnovať epitopy T buniek odvodené od MOG, sú opísané v USSN

08/116824, dátum podania 3.9.1993, 1.9.1994 (tu zahrnuté ako odkaz) a je u pri liečbe sklerózy multiplex, keď sa f s vyššie uvedenými prípravkami a komb buniek T MBP podľa vynálezu, sú:

ľudský MOG 1-13 (SEQ ID NO: 54) ľudský MOG 103-115 (SEQ ID NO: 5) ľudský MOG 1-121 (SEQ ID NO: 56) a USSN 08/30081 1, dátum podania nich možné očakávať, že budú účinné »ripravujú a/alebo podávajú v spojení ináciami peptidov obsahujúcich epitop

GQFRVIGPRHPIR

HSYQEEAAMELKV

GQFRVIGPRHPIRALGDEV

ELPCRTSPGKNATGMEVGWY

RPPFSRVVHLYRNGKDQDGD

QAPEYRGRTELLKDAIGEGK

VTLRIRNVRFSDEGGFTCFF

RDHSYQEEAAMELKVEDPFYW

Ďalšie peptidy MOG s obsahom epitopov boli identifikované pôvodcami tohto vynálezu s použitím experimentálnej analýzy podobnej, aká je opísaná vyššie a v príklade 1 (dáta neuvedené) a zahrnujú ľudský MOG 1-20 (SEQ ID NO: 57) GQFRVIGPRHPIRALVGDEV, ľudský MOG 1 1-30 (SEQ ID NO: 58)

PIRALVGDEVELPCRISPGK, i25d ľudský MOG 21-40 (SEQ ID NO; 59) ľudský MOG 31-50 (SEQ ID NO: 60) ľudský MOG ľudský MOG ľudský MOG ľudský MOG

141-160 (SEQ ID NO 151-170 (SEQ ID NO

161-180 (SEQ ID NO

199-218 (SEQ ID NO

61)

62)

63)

64)

ELPCRISPGKNATGMEVGWY,

NATGMEVGWYRPPFSRVVHL,

TVGLVFLCLQYRLRGKLRAE,

YRLRGKLRAEIENLHRTFDP,

IENLHRTFDPHFLRVPCWKI a

YNWLHRRLAGQFLEELRNPF.

Vynález ďalej zahrnuje modifikácie alebo analógy (diskutované skoršie) vyššie uvedených MOG peptidov obsahujúcich epitop T buniek, ktoré si uchová26 vajú podobnú alebo väčšiu aktivitu T buniek ako rodičovský peptid, z ktorého je modifikácia alebo analóg odvodený.

Má sa za to, že prípravky zahrnujúce ako peptidy MOG, tak MBP, obsahujúce epitopy T buniek, ich modifikácie, ich analógy alebo peptidomimetiká na ich báze a kombinácie týchto peptidov, ktoré môžu byť podávané súčasne alebo postupne, majú výhodu maximalizácie tlmiaceho účinku na T bunky, špecifické ako pre MBP, tak MOG, zúčastňujúce sa na autoimunitnej odpovedi pri MS. Týmto spôsobom je možné zacieliť na rozmedzie T buniek, ktoré sa môžu zúčastniť na autoimunitnej odpovedi buď na MBP alebo MOG vedúcej ku klinickej manifestácii MS (demyelinizácii), pre utlmenie, a teda zvýšenie terapeutického účinku zlúčenín a prípravkov podľa vynálezu. Podobne môžu byť pre prípravky a ich použitie na prípravu liečiva podľa vynálezu vhodné peptidy, obsahujúce epitop T buniek, odvodené od iných myelínových antigénov, považovaných za autoantigény pri MS (napríklad proteolipidový proteín (PLP) a myelín-asociovaný glykoproteín (MAG).

Použitie prípravkov na prípravu liečiva k liečebnému režimu na liečenie sklerózy multiplex podľa vynálezu (ktorý vedie ku zvratu, prevencii alebo odloženiu nástupu príznakov choroby, vyvolaných útočiacim autoantigénom, alebo ku zníženiu, nepostupovaniu alebo zmierneniu príznakov vyvolaných útočiacim autoantigénom, t.j. k tlmeniu imunitnej odpovede, špecifickej pre autoantigén) zahrnuje podávanie terapeutického prípravku podľa vynálezu, zahrnujúceho aspoň jeden izolovaný peptid, odvodený od autoantigénu, zodpovedného za ošetrovaný chorobný stav (napríklad MBP, MOG, PLP, MAG), v neimunogénnej forme. Bez úmyslu viazať sa na nejakú teóriu sa má za to, že podávanie terapeutického prípravku podľa vynálezu môže a) vyvolať nereaktivitu T buniek príslušných subpopulácií T buniek, takže nereagujú na útočiaci antigén a nezúčastňujú sa na stimulácii imunitnej odpovede pri expozícii útočiacemu bielkovinovému antigénu (prostredníctvom anergie alebo apoptózy), b) modifikovať profil sekrécie lymfokínu v porovnaní s expozíciou útočiacemu autoantigénu, c) spôsobiť, že subpopulácie T buniek, ktoré sa normálne zúčastňujú na odpovedi na útočiaci antigén, sa stiahnu z miest normálnej expozice k miestam podania pri26a.

pravku (táto redistribúcia subpopulácií T buniek môže zlepšiť alebo znížiť schopnosť imunitného systému jedinca stimulovať obvyklú imunitnú odpo-

veď v mieste normálnej expozície útočiacemu antigénu, čo vedie ku zníženiu alebo zvratu príznakov), d) spôsobiť indukciu T supresorových buniek alebo e) spôsobiť indukciu supresorových buniek pomocou nezúčastneného antigénu.

Vysoko čistené a izolované peptidy, získané vyššie opísaným spôsobom, môžu byť formulované do terapeutických prípravkov podľa vynálezu, vhodných pre humánnu terapiu. Keď sa má terapeutický prípravok podľa vynálezu podávať injekčné (napríklad subkutánne, intravenózne), je výhodné, aby vysoko čistený peptid bol rozpustný vo vodnom roztoku pri farmaceutický prijateľnom pH (t.j. pri rozmedzí pH asi 4 až 9) tak, aby bol prípravok tekutý a ľahko aplikovateľný ihlou. Prípravok taktiež prednostne zahrnuje farmaceutický prijateľný nosič. Tu používaný výraz „farmaceutický prijateľný nosič“ zahrnuje akékoľvek a všetky vehikulá, rozpúšťadlá, disperzné prostredie, povlaky, antibakteriálne a protipliesňové prostriedky, prostriedky pre úpravu toxicity, pufrovacie prostriedky, prostriedky oneskorujúce alebo posilňujúce absorpciu, povrchovo aktívne látky a micelotvorné prostriedky, lipidy, lipozómy a prostriedky pre tvorbu kvapalných komplexov, stabilizátory a pod. Použitie týchto prostredí a prostriedkov pre farmaceutický účinné látky je v odbore známe. Pre použitie v terapeutických prípravkoch pripadajú do úvahy všetky bežné prostredia a prostriedky, pokiaľ nie sú inkompatibilné s účinnou zlúčeninou. V prípravkoch môžu byť zahrnuté ďalšie účinné zlúčeniny.

Ako je vyššie uvedené, terapeutické prípravky podľa vynálezu, vhodné na injekčné použitie, sú prednostne sterilné vodné roztoky, pripravené zabudovaním účinnej zlúčeniny (t.j. jedného alebo viac vyššie opísaných vysoko čistených a izolovaných peptidov) v požadovanom množstve do príslušného vehikulá s jednou alebo s kombináciou vyššie a ďalej uvedených zložiek podľa potreby s následnou sterilnou filtráciou. Medzi výhodné farmaceutický prijateľné nosiče patrí aspoň jedno vehikulum, ako je sterilná voda, fosforečnan sodný, manitol, sorbitol alebo chlorid sodný alebo akákoľvek ich kombinácia. Medzi ďalšie vhodné farmaceutický prijateľné nosiče patria rozpúšťadlá alebo disperzné prostredie, obsahujúce napríklad vodu, etanol, polyol (napríklad glycerol, propylénglykol a kvapalný polyetylénglykol a pod ), ich vhodné zmesi a rastlinné ole28 je. Správnu tekutosť je možné udržať napríklad použitím povlaku, ako je lecitín, dodržovaním požadovanej veľkosti častíc v prípade disperzií a použitím povrchovo aktívnych látok. Prevenciu proti pôsobeniu mikroorganizmov je možné dosiahnuť rôznymi antibakteriálnymi a protipliesňovými prostriedkami, ako sú napríklad parabeny, chlórbutanol, fenol, kyselina askorbová, thirmerosol a pod. Predĺženú absorpciu injekčných prípravkov možno dosiahnuť zahrnutím prostriedku, ktorý oneskoruje absorpciu, napríklad alumíniummonostearátu a želatíny.

Výhodné terapeutické prípravky podľa vynálezu by mali byť sterilné, stabilné za podmienok výroby, skladovania, distribúcie a použitia a mali by byť chránené pred kontaminujúcim pôsobením mikroorganizmov, ako sú baktérie a pliesne. Výhodný spôsob prípravy terapeutického prípravku, ktorý zachováva integritu prípravku (t.j. bráni kontaminácii, predlžuje skladovanie atď.) spočíva v príprave formulácie peptidu a farmaceutický prijateľného nosiča alebo nosičov, takže prípravok môže byť vo forme lyofilizovaného prášku, ktorý je tesne pred použitím rekonštituovaný vo farmaceutický prijateľnom nosiči, ako je sterilná voda. V prípade sterilných práškov na prípravu sterilných injekčných roztokov sú výhodnými metódami prípravy vákuové sušenie, vymrazovacie sušenie alebo spinové sušenie, ktoré poskytuje prášok účinnej zložky plus akejkoľvek ďalšej požadovanej zložky z ich vopred sterilné prefiltrovaného roztoku.

Ako je vyššie uvedené, terapeutický prípravok podľa vynálezu môže zahrnovať viac ako jeden izolovaný peptid. Pre podávanie niekoľkých aktívnych peptidov môže byť žiadúci terapeutický prípravok zahrnujúci multipeptidovú formuláciu vhodnú na farmaceutické podávanie ľuďom. Multipeptidová formulácia zahrnuje aspoň dva alebo viac izolovaných peptidov s definovanou sekvenciou aminokyselín a je schopná tlmiť antigénovo špecifickú imunitnú odpoveď. Ako multipeptidová formulácia môže byť vhodný ktorýkoľvek z vyššie opísaných prípravkov, ktoré zahrnujú aspoň dva peptidy. Ako je vyššie uvedené, vysoko výhodné peptidy, vhodné pre použitie v multipeptidovej formulácii, zahrnujú aspoň dva z týchto peptidov: MBP-1, MBP-1.1, MBP-1.2, MBP-2, MBP-2.1, MBP-2.2, MBP-2.3, MBP-2.4, MBO-2.5, MBP-2.6, MBP-3, MBP-3.1, MBP-4 a —a 29

MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 29), MBP-2 5 (SEQ ID NO: 10), MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), MBP-3 (SEQ ID NO: 12), MBP-3.1 (SEQ ID NO: 13), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) a MBP-5 (SEQ ID NO: 15). Zvláštne úvahy pri príprave multipeptidovej formulácie zahrnujú uchovanie rozpustnosti a stability všetkých peptidov vo formulácii vo vodnom roztoku pri fyziologicky prijateľnom pH. To vyžaduje voľbu jedného alebo viac farmaceutický prijateľných rozpúšťadiel a vehikulov, ktoré sú kompatibilné so všetkými peptidmi v multipeptidovej formulácii. Vhodné vehikulá napríklad zahrnujú sterilnú vodu, fosforečnan sodný, manitol alebo súčasne fosforečnan sodný a manitol. Ďalšia úvaha v prípade multipeptidovej formulácie zahrnuje prevenciu dimerizácie peptidov, keď je to nutné.

Podávanie vyššie opísaného terapeutického prípravku jedincovi v neimunogénnej forme možno uskutočňovať s použitím známych postupov v dávkach a počas doby účinnej na tlmenie imunitnej odpovede jedinca liečeného na MS, špecifickej pre antigén MBP. Tlmenie antigénovo špecifickej imunitnej odpovede na antigén súvisiaci s chorobným stavom u ľudí môže byť stanovené klinicky, keď je to možné, alebo subjektívne (t.j. pacient cíti, ako by sa zmiernili niektoré alebo všetky príznaky súvisiace s chorobným stavom).

Účinné množstvo terapeutických prípravkov podľa vynálezu sa môže líšiť podľa faktorov, ako je stupeň citlivosti jedinca na antigén, vek, pohlavie a hmotnosť jedinca a schopnosť peptidu vyvolávať tlmenie antigénovo špecifickej imunitnej odpovede u jedinca. Terapeutický prípravok podľa vynálezu môže byť podávaný v neimunogénnej forme vhodným spôsobom, napríklad injekčné (subkutánne, intravenózne a pod ), orálne, sublingválne, inhalačné, transdermáine, rektálne alebo ktoroukoľvek kombináciou aplikačných ciest za účelom zvýšenia terapeutickej účinnosti, alebo ktoroukoľvek inou aplikačnou cestou, známou pre podávanie terapeutických prípravkov. Môže byť žiadúce podávať jedincovi súčasne alebo postupne terapeuticky účinné množstvo jedného alebo viac terapeutických prípravkov podľa vynálezu. Každý z týchto prípravkov pre súčasné alebo postupné podávanie môže zahrnovať iba jeden peptid alebo vyššie opísanú multipeptidovú formuláciu.

Pre podávanie peptidu alebo peptidového prípravku inou ako parenterál nou cestou môže byť nutné peptid za účelom zamedzenia jeho inaktivácie po tiahnuť určitou látkou alebo ho s ňou podávať súčasne. Peptidový prípravok mô

29a

že byť napríklad podávaný súčasne s inhibítormi enzýmov alebo v lipozómoch. Inhibítory enzýmov zahrnujú inhibítor pankreatického trypsínu, diizopropylfluórofosfát (DEP) a trasylol. Lipozómy zahrnujú emulzie CGF voda v oleji vo vode, rovnako ako konvenčné lipozómy (Strejan a ď. (1984), J. Neuroimmunol. 7:27). Keď je peptid vhodne chránený, ako je opísané vyššie, môže byť podávaný orálne, napríklad s inertným riedidlom alebo s asimilovateľným jedlým nosičom. Peptidový prípravok a ďalšie zložky môžu byť taktiež uzatvorené v želatínovej kapsuli s tvrdým alebo mäkkým obalom, lisované na tablety alebo zabudované priamo do jedincovej diéty. Na orálne terapeutické podávanie môže byť účinná zlúčenina zabudovaná do vehikulov a používaná vo forme prehítateľných tabliet, bukálnych tabliet, pastiliek, kapsúl, elixírov, suspenzií, sirupov, oplátok a pod. Tieto kompozície a prípravky by mali obsahovať aspoň 1 % hmotnostné účinnej zlúčeniny. Percentuálny podiel kompozície alebo prípravku sa môže samozrejme meniť a výhodne môže činiť medzi asi 5 a 80 % hmotnosti jednotky. Množstvo účinnej zlúčeniny v týchto terapeuticky použiteľných prípravkoch je také, aby bolo dosiahnuté vhodné dávkovanie. Výhodné kompozície alebo prípravky podľa tohto vynálezu sa pripravujú tak, aby orálna dávková jednotka obsahovala medzi asi 10 pg a asi 200 mg účinnej zlúčeniny. Tablety, pastilky, pilulky, kapsuly a pod. môžu taktiež obsahovať: spojivo, ako je tragant, arabská guma, kukuričný škrob alebo želatína, vehikulá, ako je fosforečnan divápenatý, dezintegračný prostriedok, ako je kukuričný škrob, zemiakový škrob, kyselina algínová a pod., mazivo, ako je stearát horečnatý, a sladidlo, ako je sacharóza, laktóza alebo sacharín, alebo ochucovadlo, ako je pepermint, salicylan metylnatý alebo čerešňová príchuť. Keď je dávkovou jednotkou kapsula, môže okrem látok vyššie uvedeného typu obsahovať kvapalný nosič. Rôzne ďalšie látky môžu byť prítomné ako povlaky alebo môžu inak modifikovať fyzikálnu formu dávkovej jednotky. Napríklad tablety, pilulky alebo kapsuly môžu byť povlečené šelakom, cukrom alebo oboma. Sirup alebo elixír môže obsahovať účinnú zlúčeninu, sacharózu ako sladidlo, metyl- a propylparabény ako konzervačný prostriedok, farbivo a ochucovadlo, ako je čerešňová alebo pomarančová príchuť. Každá látka, použitá pri príprave všetkých jednotkových dávkových foriem, by samozrejme mala byť farmaceutický čistá a v použitom množstve v podstate netoxická. Účinná zlúče31 nina môže byť ďalej zabudovaná do prípravkov a formulácií s trvalým uvoľňovaním.

Pri injekčnej aplikácii (subkutánnej, i.v., im., intraperitoneálnej) jedného alebo viac prípravkov podľa vynálezu môže byť na jednotkovú dávku podávané prednostne asi 1 gg až 3 mg, výhodne asi 20 gg až 1,5 mg, najmä asi 50 až 750 gg a obzvlášť asi 75 až asi 750 gg každej účinnej zlúčeniny (peptidu). V závislosti od ďalej opísaného režimu môžu byť použité dávky až 1500 gg alebo viac. Zvlášť výhodné je formulovať do dávkových jednotiek parenterálne prípravky pre ľahkosť podávania a rovnomernosť dávkovania. „Jednotková dávka“ tu označuje fyzikálne diskrétne jednotky, vhodné ako jednorázové dávky pre ošetrované ľudské subjekty, pričom každá jednotka obsahuje vopred stanovené množstvo účinnej zlúčeniny, vypočítané tak, aby poskytlo požadovaný terapeutický účinok, v spojení s požadovaným farmaceutickým nosičom. Konkrétne požiadavky na nové dávkové formy podľa vynálezu sú určované a priamo závislé od (a) špecifických charakteristík účinnej zlúčeniny a od konkrétneho dosahovaného terapeutického účinku a (b) od obmedzení vyplývajúcich z metódy formulácie tejto účinnej zlúčeniny pre ošetrovanie ľudských subjektov.

Dávkový režim môže byť upravený na dosiahnutie optimálnej profylaktickej alebo terapeutickej odpovede. Môže byť napríklad v priebehu dní, týždňov, mesiacov alebo rokov podávaných niekoľko delených dávok alebo sa dávky môžu s každou ďalšou injekciou úmerne zvyšovať alebo znižovať podľa požiadaviek terapeutickej situácie. V jednom výhodnom terapeutickom režime sa subkutánne injekcie terapeutických prípravkov podávajú jeden raz denne počas akútnej fázy a jeden raz za dva dni počas remisie počas doby života jedinca trpiaceho chorobou. Ako alternatívy je možné injekcie podávať týždenne, mesačne alebo v iných periódach. Dávka môže zostávať pri každej injekcii konštantná alebo sa môže s každou ďalšou injekciou zvyšovať alebo znižovať. Optimálne môže byť trvalý liečebný program pre celú dobu života. Ako alternatíva je možné v intervaloch asi troch mesiacov až asi jedného roku po počiatočnej dobe liečby podávať posilňovaciu injekciu, ktorá môže byť jednorázová alebo môže zahrnovať ďalší rad injekcií podobne ako pri počiatočnej liečbe.

V dôsledku vysoko individuálnej odpovede imunitného systému jedincov trpiacich relapsujúcou remitujúcou MS, primárnou progresívnou MS, benígnou MS a chronickou progresívnou MS je nutné vyvíjať dôkladný a premenlivý dávkový režim. Najprv musí byť dokončené hodnotenie príjmu pacientom. Uskutoční sa kompletné vyšetrenie za účelom zistenia okrem iného zhoršeného videnia, nystagmu, chybnej výslovnosti, zníženého vnímania vibrácií a polohového zmyslu, ataxie a chvenia končatiny pred dotykom, slabosti alebo paralýzy jednej alebo viac končatín, spasticity a problémov s močovým mechúrom. Odborník stanoví pomocou zavedených metód, ako je EDSS, Neurological Rating Scale alebo iné podobné známe prostriedky, rovnako ako vyššie diskutovaných indícií chorobného stavu základnú hodnotu, voči ktorej bude možné merať akúkoľvek zmenu, zahrnujúcu postup, ale prednostne tlmenie invalidity. Aj keď neexistuje typická akútna alebo remitujúca fáza MS, objavili sa určité schémy, ktoré môžu byť vodítkom skúsenému praktikovi. Ako je vyššie uvedené, frekvencia recidív alebo akútnych stavov je najväčšia počas prvých 3 až 4 rokov choroby, ale po prvom záchvate nemusí nasledovať ďalší pozorovateľný záchvat počas doby 10 až 20 rokov (hoci zaťaženie léziami detegovateľné iba MRI môže poskytovať iný klinický obraz). Počas typických epizód sa príznaky zhoršujú počas doby niekoľkých dní až 2 až 3 týždňov a potom ustupujú. Zotavenie je obvykle rýchle počas týždňov, aj keď občas sa môže pretiahnuť aj vyše niekoľkých mesiacov.

MS je chronické ochorenie a predpokladá trvalú liečbu. V jej priebehu môže byť na zastavenie postupu choroby a invalidity najúčinnejšia dlhodobá liečba. Vhodný môže byť dávkový režim obdeň, aspoň jeden raz týždenne alebo jeden raz mesačne. Primerané modifikácie sú v rozsahu možností skúseného odborníka. Intervencia pri nástupe záchvatu sa považuje za významnú súčasť účinnej liečby.

U pacienta vykazujúceho akútne štádium musí byť zhodnotená sila záchvatu. Pri nástupe akútneho štádia môže byť podaná počiatočná injekcia. Zrejmým prínosom je zahájenie liečby čo najskôr počas akútnej fázy. Keď je to žiadúce, môže byť táto terapia kombinovaná so súčasnou liečbou β-interferónom, steroidmi a/alebo s inými terapiami, najmä určenými na znižovanie zápalov. Pacient t 33 by mal byť po prvom ošetrení, prednostne injekciou, denne pozorovaný. Počas akútnej fázy sa navrhuje aplikácia ďalšej liečby denne alebo aspoň každý tretí deň. Ako u každej medikácie by mal ošetrujúci lekár dávkovanie modifikovať na základe klinických zmien, ktoré indikujú potrebu modifikácie. Každá takáto úvaha je v rámci skúseností odborníka, riadiaceho sa navrhnutým dávkovým rozvrhom a podávaným množstvom. Rozsah dávok od asi 75 do asi 750 pg na dávku poskytuje ošetrujúcemu lekárovi dostatočnú šírku, ale nie neprimerané množstvo). Možnosti zahrnujú, avšak bez toho, aby sa na ňu obmedzovali, dennú liečbu počas akútnej fázy, po ktorej nasleduje vyššie opísaná liečba určená pre remisiu. To však nijako nevylučuje možnosť viac alebo menej častého dávkovania, keď stanoví ošetrujúci lekár, že je indikovaná intervencia.

Podľa vynálezu sa uvádza, že peptidy a prípravky podľa vynálezu môžu byť použité na liečenie a na prípravu liečiva na liečenie sklerózy multiplex v „pokročilom štádiu“. Na liečbu pokročilého štádia MS sú vhodné prípravky zahrnujúce aspoň jeden peptid s aktivitou T buniek, odvodený od myelínového autoantigénu. Na liečbu pokročilého štádia MS sú vhodné vyššie opísané prípravky MBP peptidov, MOG peptidov a ich kombinácie. Ako je vyššie uvedené, neobmedzujúcimi príkladmi týchto peptidov sú: MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-1.2 (SEQ ID NO: 4), MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10), MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), MBP-3 (SEQ ID NO: 12), MBP-3.1 (SEQ ID NO: 13), MBP-4 (SEQ ID NO: 14), MBP-5 (SEQ ID NO: 15), 13-25 (SEQ ID NO: 31), 31-50 (SEQ ID NO: 18), 61-80 (SEQ ID NO: 21), 82-92 (SEQ ID NO: 32), 82-96 (SEQ ID NO: 33), 82-97 (SEQ ID NO: 34), 82-98 (SEQ ID NO: 35), 82-100 (SEQ ID NO: 30), 82-100[100P>Y] (SEQ ID NO: 46), 83-100 (SEQ ID NO: 37), 83-101 (SEQ ID NO: 38), 84-97 (SEQ ID NO: 39), 84-100 (SEQ ID NO: 40), 85-100 (SEQ ID NO: 41), 86-105 (SEQ ID NO: 42), 87-99 (SEQ ID NO: 43), 87-99[91K>A] (SEQ ID NO: 36), 88-100 (SEQ ID NO: 44), 8899 (SEQ ID NO: 45), 1 11-135 (SEQ ID NO: 47), 122-140 (SEQ ID NO: 48), 139170 (SEQ ID NO: 49), 141-160 (SEQ ID NO: 28), 142-166 (SEQ ID NO: 50), 142166 (SEQ ID NO. 50), 142-168 (SEQ ID NO. 51), 146-160 (SEQ ID NO:

52) a 153-170 (SEQ ID NO: 53) a prednostne MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-4 (SEQ ID NO: 14), MBP-5 (SEQ ID NO: 15), 13-25 (SEQ ID NO: 31), 87-99 (SEQ ID NO: 43), 87-99[91K>A] (SEQ ID NO: 36), 82-100 (SEQ ID NO: 30), 82-100[100P>Y] (SEQ ID NO: 46), rovnako ako peptidy odvodené od ľudského MOG:

ľudský MOG 1-13 (SEQ ID NO: 54) ľudský MOG 103-115 (SEQ ID NO: 55) ľudský MOG 1-121 (SEQ ID NO: 56) ľudský MOG 1-20 (SEQ ID NO: 57) ľudský MOG 11-30 (SEQ ID NO: 58) ľudský MOG 21-40 (SEQ ID NO: 59) ľudský MOG 31-50 (SEQ ID NO: 60) ľudský MOG 141-160 (SEQ ID NO: 61) ľudský MOG 151-170 (SEQ ID NO. 62) ľudský MOG 161-180 (SEQ ID NO: 63) ľudský MOG 199-218 (SEQ ID NO: 64)

GQFRVIGPRHPIR

HSYQEEAAMELKV

GQFRVIGPRHPIRALGDEV

ELPCRTSPGKNATGMEVGWY

RPPFSRVVHLYRNGKDQDGD

QAPEYRGRTELLKDAIGEGK

VTLRIRNVRFSDEGGFTCFF

RDHSYQEEAAMELKVEDPFYW

GQFRVIGPRHPIRALVGDEV,

PIRALVGDEVELPCRISPGK,

ELPCRISPGKNATGMEVGWY,

NATGMEVGWYRPPFSRVVHL,

TVGLVFLCLQYRLRGKLRAE,

YRLRGKLRAEIENLHRTFDP,

IENLHRTFDPHFLRVPCWKI a

YNWLHRRLAGQFLEELRNPF

Pôvodcovia tohto vynálezu ako prví urobili prekvapujúci objav, že intervencia uprostred nastupujúceho záchvatu aktuálne zlepšuje stav subjektu, liečeného spôsobom podľa vynálezu. Prinajmenšom takáto intervencia nezhoršuje stav subjektu. Pôvodcovia ďalej preukázali, že intervencia počas remisie tlmí imunitnú odpoveď a v dôsledku takejto intervencie nedochádza k aktivácii stavu. Intervencia teda môže nielen spôsobiť zlepšenie, ale zdá sa, že keď je aplikovaná spôsobom podľa vynálezu, je úplne bezpečná. Na použití vyššie opísaného moλ 35 delu ΕΑΕ pôvodcovia demonštrovali, že opakované intravenózne podávanie imunodominantného MBP peptidu Acl-11 (SEQ ID NO: 65) úspešne lieči EAE, vyvolanú úplným MBP proteínom. Jedna úspešná liečba (indikujúca reaktivitu T buniek) sa preukázala u „natívneho peptidu“ (nesubstituovaný peptid odvodený od natívnej sekvencie postupom tu opísaným na identifikáciu peptidov obsahujúcich epitop T buniek, odvodených od bielkovinového autoantigénu); vhodné modifikované peptidy môžu byť identifikované porovnaním väzbových afinít modifikovaného peptidu s natívnym peptidom. Modifikovaný peptid, ktorý má väzbovú afinitu nižšiu ako natívny peptid, bude vhodným kandidátom ako peptid pre terapeutický prípravok podľa tohto vynálezu. Testy na stanovenie väzbovej afinity môžu byť identifikované z údajov v USSN 08/30081 1 s dátumom podania 1.9.1994, zahrnutom tu ako odkaz. Napríklad terapia s Acl-11 (SEQ ID NO: 65) sa ukázala ako úspešná. Terapia s Acl-11 (SEQ ID NO: 65) potom bola porovnaná s terapiou pomocou Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67), čo je analóg Acl11(SEQ ID NO: 65), ktorý sa viaže na A“A“ s vyššou afinitou a väčšiu stabilitou (Wraith, D.C. a d’., viď vyššie, a Fairchild, P.J. a ď., viď vyššie). Zaujímavé je zistenie pôvodcov, že Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) je účinný pri lOOnásobne nižšej dávke ako Acl-11 (SEQ ID NO: 65) a jeho terapeutický účinok je dlhodobejší, čo naznačuje, že pre terapeutický prípravok sú vhodné i vybrané modifikované peptidy. Prihlasovateľ ďalej preukazuje, že konkrétny testovaný peptid Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) tvorí u ošetrovanej myši in vivo stabilný komplex peptid-MHC. Z toho vyplýva, že modifikované peptidy, ktoré tvoria in vivo stabilné komplexy peptid-MHC, budou s vysokou pravdepodobnosťou vhodné na liečbu ľudí, pretože ich účinok sa môže veľmi zvýšiť pri konzervatívnych substitúciách aminokyselín (viď tiež Karin a ď., J. Exp. Med., 180:2227-2237 (1994)). Pôvodcovia tiež zistili, že analóg MBP peptidu Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) zvrátil nastupujúcu paralýzu, keď bol podávaný počas akútnej fázy EAE a bránil relapsom, ak bol podávaný počas remisie. To ukazuje, že vybrané modifikované peptidy a vybrané analógy peptidov môžu zvrátiť aktívne príznaky a zabrániť relapsom u ľudí trpiacich MS.

V ďalšom modeli priebehu ľudskej choroby zahájili pôvodcovia intravenózne peptidovú terapiu po nástupe EAE a počas akútnej fázy. Celkom prekvapujúco táto terapia, aplikovaná počas akútnej fázy, zvrátila nastupujúcu chorobu. Toto zistenie je prvé svojho druhu. V skorších experimentoch, uskutočňovaných aj inými pracovníkmi, bola peptidová terapia zahájená v dobe, kedy väčšina myší v ošetrovanej skupine ešte nevykazovala známky EAE, najneskôr pred imunizáciou alebo v blízkosti nástupu choroby. Napríklad v práci Gaura a ď., viď vyššie, bola skupina 13 myší vystavená režimu MBP provokujúcemu chorobu. Akonáhle vykazovala iba jedna z 13 myši minimálne známky choroby, t.j. jedna myš mala klinický záznam 1 (diskusia klinického hodnotenia myší viď príklad 2), bola siedmim myšiam intraperitoneálne injekčné aplikovaná zmes MBP peptidov. Zostávajúcich šesť myší, jednou z ktorých bola myš vykazujúca známky choroby, nedostalo žiadne ďalšie ošetrenie. V tomto prípade nie sú Gaur a ď. schopní pre myši bez klinických príznakov choroby vyvodiť z týchto údajov zmysluplný záver. Prítomnosť nízkeho klinického záznamu 1 u jednej myši nemôže byť interpretovaná tak, že indikuje aktívnu chorobu u ktorejkoľvek z ostatných myší. Preto Gaur a ď. opisujú liečbu pred nástupom choroby a rozhodne pred klinickými známkami choroby. Naproti tomu, aby bola použiteľná pri klinickom nasadení pri liečbe ľudí s MS, musela by terapia byť účinná, aj keby bola zahájená až po nástupe chorobného procesu. Ako model príslušnej ľudskej terapie podávali pôvodcovia peptidovú terapiu myšiam, pričom zahajovali s 250 nmól Acl11 [4Y] (SEQ ID NO: 67) po nástupe akútnej fázy EAE. Účinok tejto terapie je znázornený na obr. 5. Terapia bola zahájená individuálne u každej myši, akonáhle vykazovala počiatočné známky EAE. Keď myši vyvinuli EAE, boli zaradené do skupiny terapie s peptidom Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) a do každej z troch kontrolných skupín (bez ošetrenia, PBS alebo peptid OVA 323-337 (SEQ ID NO: 70) viažúci sa na A^UA“). Obr. 9 ukazuje, že terapia s Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) pri nástupe EAE vedie k dramatickému zlepšeniu charakteristík choroby, zjavnému do 48 h po počiatočnej injekcii peptidu. U týchto ošetrovaných myší EAE temer zmizla do štvrtého dňa po nástupe a účinok 18denného behu peptidovej terapie bol predĺžený.

.......57

Počas ďalšieho prekvapujúceho vývoja pôvodcovia zistili, že intravenózna peptidová terapia zahájená počas remisnej fázy EAE zabraňuje relapsom. Pri použití EAE ako modelu pre ľudské ochorenie, ako je vyššie uvedené, si opäť myši (PLJ x SJL)F1 vyvíjajú po imunizácii s MBP relapsujúcu EAE (Fritz, R.B. a ď., J. Immunol., 1983, 130:1024). EAE sa vyvinie obvykle medzi 9 a 16 dňami po imunizácii a akútna fáza choroby v tomto modeli trvá približne 3 až 20 dní. Počas akútnej fázy môže 20 % alebo viac myší uhynúť alebo sa stať moribundnými v závislosti od intenzity choroby pri experimente. Väčšina zvierat, ktoré prežili akútnu fázu potom vstupuje do krátkej remisnej fázy, vykazujúcej počas niekoľkých dní mierne alebo žiadne klinické známky choroby. V niektorých experimentoch môžu myši vstúpiť do remisnej fázy všetky približne v rovnakom čase (znázornené na obr. 5), ale vo väčšine prípadov je dĺžka akútnej fázy premenlivejšia. Po remisnej fáze nasleduje prvá relapsová fáza, ktorá má všeobecne rovnakú silu ako akútna fáza choroby. Následne si prežívajúce myši vyvíjajú reziduálnu chronickú paralýzu, ktorá pretrváva do ukončenia experimentu.

V myšom modeli predstavuje peptid Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) pozoruhodne účinnú terapiu, keď je zahájená počas remisnej fázy EAE. Za účelom vyšetrenia schopnosti Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) zabraňovať relapsom EAE boli myši sledované počas počiatočných epizód paralýzy, ktoré trvali 3 až 19 dní. Pretože prežívajúce myši vstupovali do remisnej periódy jednotlivo (definovanej ako zníženie klinického záznamu na 1 alebo 0 počas doby aspoň dvoch dní), boli striedavo zaraďované do dvoch skupín a bola zahájená intravenózna terapia s 25 nmól Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) alebo s kontrolným PBS. Myši boli liečené individuálne počínajúc druhým dňom remisie. Obr. 10 ukazuje, že intravenózna aplikácia Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67), zahájená počas remisnej fázy EAE, dramaticky znížila výskyt a silu relapsov, a naznačuje, že intravenózna peptidová terapia môže byť účinná, aj keď sa zahajuje neskoršie v priebehu choroby.

Mechanizmus intravenóznej peptidovej terapie doposiaľ nebol plne vysvetlený, aj keď už bolo u rôznych iných antigénových systémov naznačované, že podávanie antigénneho peptidu intravenózne pred imunizáciou vyvoláva antígéJ 138 novo špecifickú nereaktivitu imunitného systému. Ako ďalší dôkaz účinnosti terapeutika podávaného pacientom s MS podávali pôvodcovia i.v. encefalitogénny peptid alebo analóg peptidu a zistili, že znižuje in vitro proliferáciu lymfatických uzlín a produkciu IL2. Myšiam bolo desať a päť dní pred imunizáciou s MBP proteínom intravenózne aplikované 250 nmól MBP Acl-11(SEQ ID NO: 65). Obr. 11a ukazuje proliferatívnu odpoveď lymfatických uzlín týchto ošetrených myší, meranú na 10. deň po imunizácii. Predbežné intravenózne ošetrenie imunodominantným MBP peptidom Acl-11(SEQ ID NO: 65) bez vehikula pred imunizáciou znižuje následnú proliferatívnu odpoveď T buniek in vitro na MBP Acl-11(SEQ ID NO: 65). Podobné výsledky boli získané, keď boli myši vopred ošetrené intravenóznymi injekciami analógom MBP peptidu Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) (údaje neznázornené). Naviac bolo intravenóznym predbežným ošetrením s Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) zabránené produkcii IL2 lymfatickými uzlinami v reakcii na MBP Acl-11 (SEQ ID NO: 65) (obr. 11b). Tieto výsledky potvrdzujú, že intravenózne predbežné ošetrenie pomocou MBP Acl-11 (SEQ ID NO: 65) alebo Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) indukuje nereaktivitu T buniek na MBP Acl-11(SEQ ID NO: 65).

Pôvodcovia tak skúmali účinnosť intravenóznej terapie pomocou MBP peptidov a peptidových analógov pri liečbe relapsujúcej EAE a urobili rad jedinečných pozorovaní. Prvé a pravdepodobne najvýznamnejšie spočíva v tom, že liečba autoimunitného ochorenia jedným autoantigénnym peptidom môže byť účinná aj vtedy, keď je zahájená po nástupe príznakov ochorenia. Špecifické znaky ochorenia, používané na hodnotenie myší, sú diskutované v príkladoch uskutočnenia. Hodnotenie bodom 2 alebo viac na stupnici Mean Clinical Score bolo definované ako pokročilé štádium EAE. Výsledky naznačujú, že intravenózne MBP peptidy interferujú s encefalitogénnou aktivitou autoagresívnych imunizovaných buniek aj potom, čo bola prerušená mozgová krvná bariéra a došlo k lymfocytickej infiltrácii centrálneho nervového systému. V žiadnom časovom intervale nebolo pozorované, že by peptidy aspoň dočasne aktivovali, zhoršovali alebo exacerbovali nastupujúcu chorobu. EAE, ošetrená po nástupe akútnej fázy, bola zvrátená do niekoľkých dní po zahájení terapie, aj keď boli ošetrované myši pôvodne silne napadnuté. Histologické vyšetrenie potvrdilo, že klinická odpoveď na peptidovú terapiu korelovala s výrazným znížením lymfocytických infiltrátov do mozgu a miechy. Ako je tu diskutované, bola teda i.v. aplikácia MBP Acl11 [4Y] (SEQ ID NO: 67) účinná aj pri zahájení až 30 dní po imunizácii s MBP, v remisnej fáze EAE. Zahájenie liečby počas zdanlivo kľudovej fázy choroby teda opäť neviedlo k exacerbáciám a naviac úplne zamedzilo všetkým okrem najmiernejších relapsov. Tento výsledok je obzvlášť zaujímavý, pretože existuje dôkaz, že rozpoznávanie rôznych MBP epitopov prebieha neskôr počas imunitnej odpovede na MBP, a bolo naznačené, že tieto epitopy môžu prispievať k chorobe (Lehmann, P.V. a ď., Náture, 1992, 358:155). Tento vynález naznačuje, že podávanie peptidu veľmi skoro v priebehu choroby by mohlo zabraňovať vývoju neskoršej imunitnej odpovede na tieto epitopy. Je však pozoruhodné, že jeden analóg MBP peptidu účinne zabraňoval relapsom, ak bol podávaný po rozptýlení silnej akútnej fázy EAE, kedy imunitná odpoveď na MBP a poprípade na iné myelínové antigény už mohla pokročiť.

Pri praktickom uskutočňovaní tohto vynálezu sa preferuje voľba účinného terapeutika, ktorá je opísaná vyššie. Pôvodcovia vynálezu ďalej odvodili, že jedným kritériom pre optimálnych peptidických kandidátov by boli peptidy s reaktivitou T buniek a vyššou väzbovou afinitou MBP ako u natívneho peptidu, ktoré tvoria stabilné komplexy s MHC triedy II in vivo. Pôvodcovia konkrétne zistili, že peptidický analóg MBP, ktorý tvorí in vivo stabilné komplexy s MHC triedy II, je účinnejší pri liečbe EAE ako Acl-11(SEQ ID NO: 65). Už predtým sa preukázalo, že peptidický analóg MBP Acl-11 [4Y] (SEQ ID NO: 67) sa viaže na A“A^U s vyššou afinitou a že komplexy, tvorené in vitro medzi Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) a A^UA^U, sú stabilnejšie ako komplexy, vytvorené medzi Acl-11 (SEQ ID NO: 65) a A“A^U. Ukázalo sa tiež, že Acl-1 1 [4Y] (SEQ ID NO: 67) zabraňuje EAE, keď je inhalovaná veľká dávka pred imunizáciou (Metzler, B. a ď., viď vyššie). Tento vynález uvádza, že modifikovaný MBP peptidový analóg Acl11[4Y] (SEQ ID NO: 67) je aspoň lOOnásobne účinnejší ako terapeutický prostriedok než MBP Acl-11 (SEQ ID NO: 65) a vyžaduje aplikačnú schému s menšou frekvenciou dávok. Dôsledkom tejto zvýšenej účinnosti je terapeutikum,

139a ktoré je jednak praktickejšie a jednak účinnejšie. Pôvodcovia pozorovali, že intravenózna aplikácia Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67)(ale nie Acl-11 (SEQ ID NO. 65)) vedie ku tvorbe stabilných komplexov peptid-MHC in vivo. Má sa za to, že zlepšená účinnosť Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) súvisí s touto tvorbou stabilných komplexov peptid-MHC. Tieto komplexy sú detegovateľné na slezinových bunkách pomocou hybridómu špecifického pre MBP Acl-11 (SEQ ID NO: 65) počas doby až 10 h po injekcii. Má sa preto za to, že tvorba stabilných komplexov peptid-MHC môže byť jedným z charakteristických znakov takéhoto terapeuticky účinného peptidu. Terapeutický účinok Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) in vivo bol prekvapujúco prítomný dlho potom, čo sa komplexy peptid-MHC stali nedetegovateľnými na slezinových bunkách (viď obr. 6a a 9). Je pravdepodobné, že komplexy peptid-MHC tvoria antigénovo špecifické funkčné terapeutické jednotky, ktoré vykazujú dlhodobý účinok na encefalitogénne T bunky, pretrvávajúce aj potom, čo komplexy už nie sú detegovateľné in vivo. Nie je známe, či tieto komplexy vykazujú svoj účinok periférne alebo v centrálnom nervovom systéme. Ak operujú v centrálnom nervovom systéme, môžu tu komplexy vznikať alebo môžu bunky, nesúce tieto komplexy, migrovať cez bariéru krv-mozog.

Vynález ďalej poskytuje použitie aspoň jedného peptidu MBP majúceho aktivitu T buniek na prípravu liečiva k liečebnému režimu na liečenie sklerózy multiplex v kombinácii s pôsobením IFN-β v terapeuticky účinných množstvách.

Ako výsledok opísanej práce bolo objavené, že kombinácia aspoň jedného peptidu majúceho aktivitu T buniek, odvodeného od myelínových antigénov (napríklad MBP) a IFN-β, keď sa podáva v terapeutickom režime, má synergický účinok (obr. 12c), ktorý prekvapujúco znižuje klinické príznaky EAE u myši v ďaleko väčšom rozsahu ako je účinok každej zo zložiek na zmiernenie prizná40 kov EAE, ak sú podávané samostatne (obr. 12a až b), a ktorý je väčší, ako by bolo možné očakávať pre iba aditívny účinok peptidu plus IFN-β.

Pretože EAE slúži ako myší model ľudskej MS a je indukovaná rôznymi myelínovými antigénmi (napríklad PLP, MBP, MOG), očakáva sa, že podobný účinok bude pozorovaný i u ľudí. Vynález preto poskytuje použitie prípravku podľa vynálezu zahrnujúceho aspoň jeden peptid s aktivitou T buniek, odvodený od myelínového antigénu, prednostne v neimunogénnej forme, na prípravu liečiva na liečenie jedincov, ktorí majú sklerózu multiplex alebo sú náchylní k vyvinutiu sklerózy multiplex, v kombinácii s pôsobením IFN-β. Výhodné prípravky sú vyššie opísané prípravky podľa vynálezu, zahrnujúce MBP peptidy, rovnako ako MBP peptidy kombinované s MOG peptidmi, v kombinácii s pôsobením IFN-β súčasne alebo následne podávaným.

Podávanie prípravku podľa vynálezu, zahrnujúceho aspoň jeden peptid s aktivitou T buniek myelínového antigénu v terapeutickom režime, ktorý zahrnuje podávanie IFN-β, môže byť uskutočňované známymi postupmi pri ďávkach a počas doby dostatočnej k účinnej redukcii, eliminácii alebo prevencii príznakov spojených so sklerózou multiplex. Účinné množstvo ako peptidu, tak IFN-β, podávaných spoločne v terapeutickom režime, sa mení v závislosti od vyššie opísaných faktorov. Účinné zlúčeniny (napríklad MBP peptid alebo kompozícia obsahujúca ho spolu s IFN-β) môžu byť podávané vhodným vyššie uvedeným spôsobom, napríklad injekčné (subkutánne, intravenózne atď ), orálne, inhalačné, transdermálne alebo rektálne.

Injekčné môže byť napríklad podávané asi 1 μg až 3 mg a výhodne asi 20 až 500 μg peptidu, odvodeného od myelínového antigénu, na dávkovú jednotku. Prednostne sa injekčné môže podávať dávková jednotka 100 až 10 000 jednotiek IFN-β. Dávkový režim týchto dvoch zlúčenín môže byť upravený, aby poskytoval optimálnu terapeutickú odpoveď. Napríklad môže byť podávaný súčasne IFN-β a prípravok podľa vynálezu alebo prednostne môžu byť podávané s aspoň 6 hodinovým odstupom, výhodne aspoň 12 hodinovým odstupom alebo najmä aspoň s 24 hodinovým odstupom. Terapeutický režim podávania antigénneho pep41 tidu a IFN-β môže trvať počas doby niekoľkých dní alebo týždňov a môže byť skracovaný alebo predlžovaný podľa požiadaviek terapeutickej situácie, ako je opísané vyššie.

Vynález taktiež poskytuje nový prípravok, zahrnujúci fyzikálnu zmes peptidu s aktivitou T buniek, odvodeného od myelínového antigénu, ako je MBP alebo MOG, a IFN-β vo farmaceutický prijateľnom nosiči alebo riedidle. Tento prípravok môže byť používaný ako súčasť terapeutického režimu na liečbu alebo prevenciu sklerózy multiplex u jedinca.

Všeobecne sa uznáva, že výsledkom špecifickej odpovede na určitý autoantigén, sprostredkovanej T bunkami, sú aj iné autoimunitné ochorenia, ako je diabetes typu I a reumatoidná artritída. Rôzne prístupy k liečbe autoimunitných ochorení, sprostredkovaných T bunkami, zahrnujú podávanie celých autoantigénov alebo od nich odvodených peptidov obsahujúcich epitopy T buniek pacientovi za účelom tlmenia odpovede sprostredkovanej T bunkami, zodpovednej za nepriaznivé príznaky autoimunitného ochorenia.

Okrem myelínových autoantigénov, ktoré hrajú určitú úlohu pri MS, bol nájdený rad antigénov (tj. autoantigénov), ktoré vyvolávajú chorobné príznaky u iných autoimunitných ochorení, ako je diabetes, Gravesova choroba, myasténia gravis, syndróm good pasture, psoriáza, tyreoiditídä a reumatoidná artritída (t.j. autoantigény, ako je inzulín, rh faktor, acetylcholínové receptory, receptory buniek štítnej žľazy, proteíny základnej membrány, bielkoviny štítnej žľazy, ICA69 (PM-1), dekarboxyláza kyseliny glutámovej (64K alebo 65 K), proteolipid, kolagén (typ II), proteín teplotného šoku a karboxypeptidáza H). Má sa za to, že podobné prípravky a spôsoby, aké sú tu opisované, je možné používať pri liečbe autoimunitných ochorení, ako je reumatoidná artritída, diabetes, myasténia gravis, Gravesova choroba, syndróm good pasture, psoriáza a tyreoiditídä, kde antigénom zodpovedným za ochorenie je bielkovinový autoantigén.

Peptidy zahrnujúce definované sekvencie aminokyselinových zvyškov, majúce aktivitu T buniek a prednostne zahrnujúce aspoň jeden epitop T buniek a/alebo ktoré indukujú nereaktivitu T buniek alebo zníženú reaktivitu T buniek, boli identifikované a izolované pre mnohé z vyššie uvedených autoantigénov. Napríklad vo WO 94/07520 sú identifikované peptidy, ktoré sú údajne schopné tlmiť antigénovo špecifickú odpoveď na rozpustný kolagén typu II, čo je bielkovinový antigén, o ktorom sa usudzuje, že je autoantigénom pri reumatoidnej artritíde. WO 92/06704 opisuje spôsoby identifikácie peptidov inzulínu, ktoré údajne zahrnujú epitopy T buniek a ktoré môžu byť vhodné pre prípravky a spôsoby, analogické tomuto vynálezu, na liečbu diabetu typu I. Ďalej môžu byť ktorýmkoľvek z vyššie uvedených a v príkladoch definovaných spôsobov identifikácie peptidov bielkovinového autoantigénu, obsahujúcich epitop T buniek, identifíkované vhodné peptidy s obsahom epitopov T buniek pre antigén alebo autoantigén, o ktorom sa predpokladá, že je zodpovedný za ktorékoľvek z vyššie uvedených ochorení. Len čo sú také peptidy obsahujúce epitop T buniek identifikované pre cieľový autoantigén, môžu byť tieto peptidy používané v prípravkoch a spôsoboch analogických tým, aké tu boli opísané na liečbu sklerózy multiplex.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 znázorňuje úplnú dĺžku sekvencie aminokyselín ľudského MBP s označením čísiel aminokyselinových zvyškov, na ktoré sa tu odkazuje.

Obr. 2 znázorňuje aminokyselinové sekvencie výhodných peptidov, odvodených od MBP.

Obr. 3 znázorňuje aminokyselinové sekvencie prekrývajúcich sa peptidov a dlhších peptidov, použitých v príklade 1.

Obr. 4a predstavuje grafické znázornenie percentuálneho podielu celkovej odpovede MBP pre každý peptid uvedený na obr. 3. Reaktivita MBP bola vypočítaná na základe percenta MBP pozitívnych mikrotitrových kultúr v každej skupine individuálnych pacientov, ktorá taktiež reagovala pozitívne na jeden z MBP peptidov. Celkové MBP pozitívne mikrotitrové kultúry činili 89 až 184 v každej skupine 19 až 43 pacientov, testovaných na každý peptid.

Obr. 4b predstavuje grafické znázornenie percenta jedincov reagujúcich na MBP, ktorí rozpoznávajú každý peptid uvedený na obr. 3. Pacienti sa považujú za reagujúcich na MBP, ak aspoň jedna z ich mikrotitrových kultúr reaguje pozitívne na MBP. V každej skupine 19 až 43 pacientov, testovaných na každý peptid, bolo 12 až 3 1 pacientov reagujúcich na MBP. Reaktivita na peptid bola vypočítaná na základe percenta reagujúcich pacientov v každej skupine s aspoň jednou mikrotitrovou kultúrou pozitívnou na jeden z MBP peptidov.

Obr. 5a predstavuje graf stredných klinických hodnôt za dobu 0 až 40 dní po vyvolaní choroby u myší i.v. injekciou MBP Acl-11 (SEQ ID NO: 65) samotného v porovnaní s kontrolou.

Obr. 5b predstavuje graf stredných klinických hodnôt za dobu 0 až 40 dní po vyvolaní choroby u myší i.v. injekciou MBP Acl-ll (SEQ ID NO: 65) v kombinácii s MBP 31-47 (SEQ ID NO: 68) v porovnaní s kontrolou.

Obr. 5c predstavuje graf stredných klinických hodnôt za dobu 0 až 40 dní po vyvolaní choroby u myší i.v. injekciou OVA 323-339 (SEQ ID NO: 69) v porovnaní s kontrolou.

Obr. 6a predstavuje graf stredných klinických hodnôt za dobu 0 až aspoň 30 dní po vyvolaní choroby u subjektov injekciou buď 250 nmól Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) alebo Acl-11 (SEQ ID NO: 65) v porovnaní s kontrolou.

Obr. 6b predstavuje graf stredných klinických hodnôt za dobu 0 až aspoň 30 dní po vyvolaní choroby u myší ošetrených 2,5 nmól Acl-11 [4Y] (SEQ ID NO: 67) v porovnaní s kontrolou.

Obr. 6c predstavuje graf stredných klinických hodnôt za dobu 0 až aspoň 30 dní po vyvolaní choroby u myší ošetrených 2,5 nmól Acl-11 (SEQ ID NO: 65) v porovnaní s kontrolou.

Obr. 7 predstavuje úsečkový diagram znázorňujúci stredné histologické hodnoty u myší ošetrovaných peptidom oproti kontrolným myšiam, kde nižšia hodnota znamená znížený počet a vážnosť zápalových infiltrátov CNS.

. . .......- 44

Obr. 8 je úsečkový diagram znázorňujúci kapacitu slezinových buniek, ktoré boli podrobené pulzácii in vivo v uvedených časových intervaloch (1 až 10 h) pomocou 250 nmól Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) za účelom aktivácie hybridómovej bunkovej línie (hybridom 1934), odvodenej od MBP-špecifického klonu T buniek, in vitro.

Obr. 9 predstavuje graf, ukazujúci porovnanie ošetrenia myší s 250 nmól Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) oproti kontrole, PBS a OVA 323-337 (SEQ ID NO: 70).

Obr. 10 predstavuje graf, ukazujúci porovnanie ošetrenia zahájeného počas remisie s 25 nmól Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) oproti kontrole.

Obr. 11a predstavuje graf, znázorňujúci proliferáciu lymfatickej uzliny in vitro (indikovanú zabudovaním 3H-tymidínu) u myší, vopred ošetrených i.v. 250 nmól MBP Acl-11 (SEQ ID NO: 65), v porovnaní s kontrolou.

Obr. 11b je úsečkový diagram, znázorňujúci relatívnu produkciu lymfatickej uzliny IL2 v reakcii na MBP Acl-11 (SEQ ID NO: 65) u myší, vopred ošetrených s Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67), v porovnaní s kontrolou.

Obr. 12a predstavuje grafické znázornenie experimentu ukazujúceho účinok IFN-β na EAE u dvoch skupín po 10 dospelých myších samiciach (SJL x TLP)F1, u ktorých bola v deň 0 vyvolaná EAE morčacím MBP v kompletnom adjuvans s prídavkom toxínu dávivého kašľa a ktorým bolo buď podané iba nekompletné Freundovo adjuvans (kontrola) alebo ktoré boli v deň 9, 12, 16 a 20 (znázornené šípkami na osi x) ošetrované interperitoneálne (i.p.) 2 000 jednotkami IFN-β, pričom os y predstavuje strednú klinickú hodnotu (MCS) pre každú skupinu (0 - žiadne klinické znaky EAE, 1 - ochabnutý nereagujúci chvost, 2 čiastočná paralýza zadných končatín, 3 - úplná paralýza zadných končatín, 4 čiastočná až úplná paralýza predných končatín, 5 - moribundný stav).

Obr. 12b predstavuje grafické znázornenie experimentu ukazujúceho účinok MBP peptidu Ac 1-11 (SEQ ID NO: 65) u dvoch skupín po 10 dospelých myších samiciach (SJL x TLP)F1, u ktorých bola v deň 0 vyvolaná EAE morčacím MBP v kompletnom adjuvans s prídavkom toxínu dávivého kašľa a ktorým bolo buď podané PBS (kontrola) alebo ktoré boli v deň 10, 13, 17 a 21 (znázornené šípkami na osi x) ošetrované intravenózne s 250 nmól Ac 1-11(SEQ ID NO: 65), pričom os y predstavuje strednú klinickú hodnotu pre každú skupinu, ako je uvedené na obr. 12a.

Obr. 12c predstavuje grafické znázornenie experimentu ukazujúceho účinok MBP peptidu Ac 1-11 (SEQ ID NO. 65), podávaného v kombinácii s IFN-β na EAE u dvoch skupín po 10 dospelých myších samiciach (SJL x TLP)F1, u ktorých bola v deň 0 vyvolaná EAE v kompletnom adjuvans s prídavkom toxínu dávivého kašľa a ktorým bolo buď podané PBS (kontrola) alebo ktoré boli v deň 10, 13, 17 a 21 (znázornené otvorenými šípkami na osi x) ošetrované intravenózne s 250 nmól Ac 1-11 (SEQ ID NO: 65) a v deň 9, 12, 16 a 20 (znázornené uzatvorenými šípkami na osi x) ošetrované interperitoneálne s 2 000 jednotkami IFN-β, pričom os y predstavuje strednú klinickú hodnotu pre každú skupinu, ako je uvedené na obr. 12a.

Obr. 13 predstavuje grafické znázornenie experimentu, ukazujúceho účinok rôznych dávok IFN-β (10 000, resp. 2 000 jednotiek) na vyvolanú EAE u dvoch skupín po 10 dospelých myších samiciach (SJL x TLP)F1, u ktorých bola v deň 0 vyvolaná EAE pomocou morčacieho MBP s prídavkom toxínu dávivého kašľa a ktorým bolo buď podané PBS (kontrola) alebo ktoré boli v deň 9, 13 a 16 (znázornené uzatvorenými šípkami na osi x) ošetrované interperitoneálne (i.p.) s 10 000, resp. 2 000 jednotkami IFN-β, pričom os y predstavuje strednú klinickú hodnotu pre každú skupinu, ako je uvedené na obr. 12a.

Obr. 14 znázorňuje rôzne peptidy, odvodené od MBP, ktoré môžu byť vhodné pre prípravky a spôsoby podľa vynálezu.

Obr. 15 graficky znázorňuje index pozitivity (os y) (priemerný S.1./pacient reagujúci na MBP) násobený percentom jedincov reagujúcich na každý peptid (os x), ktorý je odvodený z rovnakých experimentálnych údajov, ktoré sú uvedené na obr. 4a a 4b a opísané v príklade 1.

Obr. 16 graficky znázorňuje stredné klinické hodnotenie vo vzťahu k zahájeniu terapie s použitím Acl-11 [4Y] (SEQ ID NO: 67) pre každého jedinca (deň 1 - nástup klinických znakov pre každú jednotlivú myš). Myši boli v deň 1, 3, 6, a 9 choroby ošetrované PBS (plné štvorčeky), i.v. 250 nmól Acl-11 [4Y] (SEQ ID NO: 67) (prázdne trojuholníčky) alebo s.c. 250 nmól Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) (prázdne krúžky). Tieto údaje naznačujú, že Acl-11 [4Y] (SEQ ID NO: 67) spôsobuje zvrátenie EAE, keď je podaný po nástupe paralýzy.

Obr. 17 graficky znázorňuje stredné klinické hodnotenie, keď je Acl11 [4Y] (SEQ ID NO: 67) podaný pred manifestáciou príznakov choroby. Dáta sú vynesené vo vzťahu k vyvolaniu choroby v deň 0 pomocou miechového homogenizátu gp (gpSCH) a ku dňom terapie. Skupiny prežívajúcich myší boli ošetrované v deň 8, 10, 13 a 17 pomocou 25 nmól Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) i.v. (prázdne trojuholníčky), 25 nmól Acl-1 1[4Y] (SEQ ID NO: 67) s.c. (plné krúžky) alebo boli bez ošetrenia (prázdne štvorčeky). Dáta ukazujú, že Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) zabraňuje nástupu EAE.

Obr. 18 graficky znázorňuje stredné klinické hodnotenie vo vzťahu k zahájeniu terapie s použitím Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67), podávaného intravenózne (prázdne trojuholníčky) alebo subkutánne (plné krúžky). Prázdne štvorčeky predstavujú kontrolu.

Obr. 19 graficky znázorňuje stredné klinické hodnotenie vo vzťahu ku dňu po vyvolaní choroby s použitím 75 pg gpMBP (plné štvorčeky), 100 pg huMOG (prázdne trojuholníčky) a kombinácie 75 pg gpMBP a 100 pg huMOG (plné štvorčeky). Ako je zrejmé, je choroba vyvolaná súčasne MOG a MBP oveľa silnejšia než každým z nich samotným.

Obr. 20 graficky znázorňuje stredné klinické hodnotenie vo vzťahu ku dňom terapie pomocou Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) (prázdne štvorčeky) v porovnaní s kontrolou PBS (plné štvorčeky). Choroba bola vyvolaná rovnako ako v príklade 10 pomocou huMOG +gpMBP. Tieto dáta ukazujú, že Acl11 [4 Y] (SEQ ID NO: 67) významne znižuje stredné klinické hodnotenie v porovnání s kontrolou.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Vynález je osvetlený na ďalej uvedených neobmedzujúcich príkladoch.

Príklad 1

Štúdia sklerózy multiplex ako imunitnej odpovede na myelínový bázický proteín v ľudskej populácii a peptidy a voľba MBP peptidov vhodných na terapeutické použitie

Syntéza peptidov:

Peptidy boli syntetizované s použitím štandardnej chémie Fmoc/Boc a čistené pomocou HPLC s reverznými fázami. Obr. 3 znázorňuje peptidy MBP použité v týchto štúdiách. Názvy peptidov alebo zvyšky aminokyselín sú v celom texte príkladov zhodné.

Protokol: Analýza ľudského PBL na reaktivitu s MBP a MBP peptidmi:

PBL boli čistené z čerstvých vzoriek periférnej krvi (približne 75 ml) od 222 pacientov s istou MS s použitím Ficollových gradientov hustoty. Mikrotitrové kultúry boli iniciované s 2 x 10⁵ PBL na jamku a 10 pg/ml čisteného ľudského miechového MBP v kultivačnom médiu RPMI 1640 doplnenom s 5 % ľudského séra AB, penicilínom-streptomycínom a L-glutamínom. Kultúry boli počínajúc dňom 6 až 7 doplnené s IL2 (20 jedn./ml) a s IL4 (5 jedn./ml). Po 1 1 až 13 dňoch boli mikrotitrové kultúry premyté, resuspendované v čerstvom médiu a rozdelené do 12 čerstvých mikrotitrových jamiek. Ako bunky obsahujúce antigén boli pridané autológne zmrazené PBL v množstve 5 x 10⁴ PBL na jamku.

Screeningové antigény boli dvojmo pridané do 12 zdvojených jamiek z každej mikrotitrovej kultúry. Ako negatívna kontrola bolo vždy použité médium a ako pozitívna kontrola čistený ľudský rekombinačný MBP v množstve 10 pg/ml. Každý pacient bol testovaný tiež na reaktivitu s maximálne 4 MBP peptidmi, každým v koncentrácii 10 μΜ. Po 48 h boli vzorky podrobené pulzácii s 0,75 pCi ³H-tymidínu a získavané po 6 až 16 h pulzácie.

Kultúry boli označené ako pozitívne pre každý peptid podľa týchto kritérií: stimulačný index väčší ako 3,0, zmena cpm väčšia alebo rovná 500 a štandardná odchýlka od priemeru menšia ako zmena cpm. Na účely analýzy boli kultúry ďalej označené ako „peptid-pozitívne“, len pokiaľ reagovali súčasne na MBP a peptid a pokiaľ nereagovali na viac ako jeden neprekrývajúci sa peptid. Reaktivita s každým z peptidov bola testovaná s použitím minimálne 19 a maximálne 43 pacientov.

Výsledky:

Priemerne 6 % mikrotitrových kultúr bolo zistených ako pozitívnych na MBP reaktivitu pre každého z pacientov (rozmedzie 0 až 37 MBP pozitívnych kultúr na pacienta). Aspoň jedna mikrotitrová kultúra bola pozitívna na MBP reaktivitu u 77 % pacientov a títo jedinci boli považovaní za „reagujúcich na MBP“. Status reagujúceho jedinca nekoreloval s pohlavím, kategóriou MS (RR vs. CP), typom HLA-DR, vekom alebo skutočnosťou, či pacient bral alebo nebral Betaseron.

Testované MBP peptidy zahrnovali panel 16 20mérov (obr. 3), prekrývajúcich sa o 10 aminokyselín a pokrývajúcich celú sekvenciu ľudského MBP (izoforma 18,5 kD). Boli testované ešte dva dlhšie peptidy (sekvencie MBP (MBP 83-105 (SEQ ID NO: 5) a MBP 141-165 (SEQ ID NO: 14), obr. 3). Reaktivita na MBP peptidy potom bola vypočítaná na základe podielu MBP pozitívnych mikrotitrových kultúr, ktoré boli pozitívne taktiež na jeden z MBP peptidov. Štyri z peptidov zodpovedali každý za aspoň 10 % celkovej reaktivity voči MBP (MBP 11-30 (SEQ ID NO: 2), MBP 81-100 (SEQ ID NO: 23), MBP 83a 49

105 (SEQ ID NO: 5) a MBP 141-165 (SEQ ID NO: 14)). Okrem toho bola reaktivita voči každému z týchto peptidov detegovaná u aspoň tretiny jednotlivých pacientov MS reagujúcich na MBP, u ktorých boli testované. Naviac vykazuje 77 % pacientov reagujúcich na MBP reaktivitu voči buď MBP 83-105 (SEQ ID NO:

5) alebo MBP 141-165 (SEQ ID NO: 14) alebo voči obom týmto peptidom.

Z týchto štyroch peptidov bol najreaktívnejší MBP 141-165 (SEQ ID NO: 14), zodpovedajúci za 21 % celkovej reaktivity voči MBP, ktorý bol detegovateľný u 64 % testovaných reagujúcich pacientov. MBP 141-165 (SEQ ID NO: 14) zrejme obsahuje epitopy T buniek ako z MBP 141-160 (SEQ ID NO: 28), tak MBP 151-170 (SEQ ID NO: 29) a prekvapujúco vykazoval dramaticky väčšiu reaktivitu ako dva 20mérové peptidy. MBP 81-100 (SEQ ID NO: 23) a MBP 83-105 (SEQ ID NO: 5) majú veľmi podobnú sekvenciu a pravdepodobne zahrnujú podobné, pokiaľ nie identické epitopy T buniek. Zodpovedajú oblasti, o ktorej sa predtým súdilo, že je spojená s haplotypom HLA-DR2. Naše výsledky naznačujú, že pacienti s MS ako s DR2, tak bez DR2 na tieto peptidy priaznivo reagujú. MBP 11-30 (SEQ ID NO: 2) je oblasť reaktivity peptidu, o ktorej sa pôvodne súdilo, že nie je u pacientov s MS často rozpoznávaná.

Každému z ostatných MBP peptidov prislúchalo menej ako 5 % celkovej reaktivity MBP a bol detegovaný u 20 % alebo menej testovaných reagujúcich pacientov (viď obr. 4a a 4b). Najväčšia reaktivita v tejto skupine peptidov bola zistená u MBP 111-130 (SEQ ID NO: 12), ktorému prislúchalo 4,5 % reaktivity MBP a bol nájdený u 19 % testovaných reagujúcich pacientov.

Voľba výhodných MBP peptidov

Výhodné MBP peptidy boli vyberané na základe dvoch kritérií:

1. Počet pacientov s MS, reagujúcich na peptidy pripadajúce do úvahy (aspoň 75 % testovaných pacientov, ktorí reagujú na bielkovinový antigén, rozpoznáva aspoň jeden z peptidov).

' Λ . :··.· i ·50

2. Intenzita odpovede T buniek na peptid pripadajúci do úvahy u pacientov s MS (odpoveď na peptidy pripadajúce do úvahy sa rovná 40 % celkovej odpovede na antigén).

Prvé kritérium splňuje MBP 83-105 (MBP-2 (SEQ ID NO: 5)) a MBP 141165 (MBP-4 (SEQ ID NO: 14)) (77 % reagujúcich pacientov rozpoznáva jeden z nich alebo oba, viď ďalej tabuľka 1). Spoločne týmto peptidom prislúcha 32 % reaktivity voči MBP (viď ďalej tabuľka 2).

Tabuľka 1. Reaktivita na MBP-2 (SEQ ID NO: 5) a MBP-4 (SEQ ID NO: 14): Analýza podľa jedincov

% jedincov reagujúcich na	MBP-2	MBP-4	MBP-2 a/alebo MBP-4
medzi reagujúcimi na MBP	11/3 1 [35,5 %]	20/31 [64,5 %]	24/31 [77,4 %]

Tabuľka 2. Reaktivita na MBP-2 (SEQ ID NO: 5) a MBP-4(SEQ ID NO: 14): Analýza podľa T bunkových línií

% MBP pozitívnych línií	MBP pozitívna a MBP-2	MBP pozitívna a MBP-4	MBP pozitívna a MBP-2 alebo MBP-4
medzi MBP pozitívnymi líniami	20/184 [10,95%]	39/184 [21,1 %]	59/184 [32,1 %]

Prídavok MBP 11-30 (MBP-1 (SEQ ID NO: 2)) tak splňuje druhé kritérium, pretože týmto trom peptidom spoločne prislúcha 42 % reaktivity voči

MBP. Ako výhodný peptid na terapeutické použitie by bol i MBP 11 1-130 (MBP-3 (SEQ ID NO 12)), najmä v kombinácii s MBP-1(SEQ ID NO. 2), MBP2 (SEQ ID NO: 5) a MBP-4 (SEQ ID NO: 14). MBP 81-100 (SEQ ID NO: 23) sa zdá byť ekvivalentný MBP 83-105 (SEQ ID NO: 5) a môže byť taktiež používaný v spojení s ostatnými vybranými výhodnými peptidmi.

Príklad 2

Podávanie peptidov cicavcom na liečbu EAE ako modelu pre sklerózu multiplex

Syntéza peptidov:

Peptidy boli pripravené automatizovanou syntézou peptidov (ABI 430A, Applied Biosciences, Foster City, CA) s použitím štandardnej 9-fluorenylmetoxykarbonylovej chémie. Peptidy boli čistené vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou a bolo potvrdené zloženie aminokyselín. Zvolené peptidické sekvencie boli MBP Acl-11 (SEQ ID NO: 65) ASQKRPSQRHG, MBP Acl11 [4 A] (SEQ ID NO: 66) ASQARPSQRHG, MBP Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) ASQYRPSQRHG, MBP 31-47 (SEQ ID NO: 68) RHRDTGILDSIGRFFSG, Ova 323-339 (SEQ ID NO: 69) ISQAVHAAHAEINEAGR a Ova 323-337 (SEQ ID NO: 70) ISQAVHAAHAEINEA.

Čistenie MBP

MBP bol pripravený z morčacích miech (Keystone Biologicals, Cleveland, OH) s použitím modifikácie metódy opísanej v Smith, M.E., J. Neurochem., 1969, 16:83. Stručne povedané bol MBP extrahovaný z izolovaných myelínových membrán pomocou chloroformu a metanolu, vyzrážaný citrátom draselným, extrahovaný kyselinou a lyofilizovaný. SDS-PAGE analýza tohto materiálu ukázala hlavný pás pri očakávanej molekulovej hmotnosti 18,5 kD.

»52

Indukcia EAE, hodnotenie a peptidová terapia

EAE bola indukovaná u myší (PJL x SJL) Fl, získaných od Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Keď myši dosiahli vek 8 až 14 týždňov, bola indukovaná EAE imunizáciou s 50 až 100 pg MBP, emulgovaného v kompletnom Freundovom adjuvans (Gibco Laboratories, Grand Island, NY), doplnenom ďalšími 400 pg na myš M. tuberculosis H37Ra (Difco Laboratories, Detroit, MI). V dobe imunizácie a po 48 h bolo intravenózne podané 200 ng toxínu dávivého kašľa (JRH Biosciences, Lenexa, KS). Myši boli hodnotené na základe klinických príznakov podľa tejto stupnice: 1 - paralýza chvostu, 2 - čiastočná paralýza zadných končatín, úplná paralýza zadných končatín, 4 - paralýza predných končatín, 5 - moribundná alebo mŕtva. Myši s hodnotou 5 boli usmrtené. Po smrti boli myši vyradené z ďalších výpočtov stredného klinického hodnotenia. Peptidy boli podávané intravenózne, ako je opísané ďalej v jednotlivých príkladoch.

Pre testy proliferácie lymfatických uzlín a produkcie IL2 boli z myší, imunizovaných vyššie opísaným spôsobom, pripravené za účelom indukcie EAE lymfocytové suspenzie slabinovej a paraaortálnej lymfatickej uzliny (na proliferačné experimenty nebol obsiahnutý toxín dávivého kašľa). Lymfocyty boli kultivované na mikrotitrových platniach s guľatým dnom v množstve 5.10⁵ na jamku s peptidmi MBP a RPMI 1640 doplneným 0,5 % čerstvého normálneho myšieho séra, penicilínom-streptomycínom, L-glutamínom a 5.10'^s M 2-merkaptoetanolu. Kultúry na testy proliferácie boli podrobené pulzom počas doby 16 h ³Htymidínom s nasledujúcou inkubáciou počas doby 72 h. Pre testy IL2 boli získané po 24 h supernatanty kultúr a boli testované na schopnosť podporovať rast bunkovej línie HT2, závislej na IL2. Na rozlíšenie produkcie IL2 od produkcie IL4 boli uskutočnené biologické skúšky HT2 v prítomnosti supernatantu 10% kultúry monoklonálnej protilátky 11.B. 11 (O’Hara, J. a ď., Náture, 1985, 3 1 5:333), ktorá inhibuje IL4-indukovanú proliferáciu buniek HT2.

Výsledky sú uvedené na obr. 9, ktorý ukazuje, že Acl-11[4Y] (SEQ ID NO. 67) zvráti priebeh EAE, keď je podávaný po nástupe paralýzy. EAE bola indukovaná v skupinách po 14 myšiach pomocou MBP. Terapia bola zahájená u ,· 13 každej myši jednotlivo, potom, čo sa u nej vyvinuli klinické znaky EAE. Dáta sú vynesené vo vzťahu k zahájeniu terapie pre každého jedinca (deň 1 - nástup klinických príznakov pre každú jednotlivú myš). Myši boli ošetrované intravenózne v deň 1, 4, 11 a 18 choroby pomocou PBS (prázdny krúžok), 250 nmól Acl11[4Y] (SEQ ID NO: 67)(plné štvorčeky) alebo 250 nmól Ova 323-337 (SEQ ID NO: 70)(plné krúžky). Ďalšia kontrolná skupina nedostávala žiadne ošetrenie (prázdne štvorčeky). Krížiky označujú jednotlivé myši, ktoré uhynuli alebo boli usmrtené v stupni 5 EAE. Hodnota MMS pre neošetrenú skupinu bola 4,6 a mortalita bola 64 %, Hodnota MMS pre skupinu ošetrenú s PBS bola 4,4 a mortalita 35 %. Hodnota MMS pre skupinu ošetrenú s Ova 323-337 (SEQ ID NO: 70) bola 4,2 a mortalita 21 %. Hodnota MMS pre skupinu ošetrenú s Acl11[4Y] (SEQ ID NO: 67) bola 3,2 a mortalita 7 %.

Obr. 10 ukazuje, že Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) zabraňuje relapsom EAE, keď sa podáva počas remisnej fázy choroby. EAE bola indukovaná pomocou MBP. Terapia bola zahájená u každej myši individuálne druhý deň remisie po počiatočnej epizóde EAE. Dáta sú vynesené vo vzťahu k zahájeniu terapie pre každého jedinca (deň 1 = druhý deň remisie). Skupiny 6 až 7 prežívajúcich myší boli ošetrované intravenózne v deň 1, 4, 7 a 18 po začiatku remisie buď pomocou PBS (prázdne krúžky) alebo 25 nmól Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67)(plné štvorčeky). Krížiky označujú jednotlivé myši, ktoré uhynuli alebo boli usmrtené v stupni 5 EAE. Počiatočné epizódy choroby pred remisiou trvali 3 až 18 dní (priemer 9 dní pre obe skupiny). Hodnota MMS počas počiatočnej epizódy bola podobná pre obe skupiny myší (3,0 pre skupinu ošetrenú s PBS a 3,9 pre skupinu ošetrenú s Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67)). Hodnota MMS po ošetrení pre skupinu PBS bola 4,1 a mortalita 33 %. Hodnota MMS po ošetrení pre skupinu ošetrovanú peptidom bola 0,3 a mortalita 0 %.

Obr. 11 znázorňuje, že intravenózne podávanie Acl-11 (SEQ ID NO: 65) alebo Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) vyvoláva nereaktivitu T buniek.

a) Skupiny po 3 až 4 myšiach boli 5 a 10 dní pred imunizáciou pomocou 150 pg MBP intravenózne ošetrené buď s PBS (plné krúžky) alebo s 250 nmól i 54

Acl-11 (SEQ ID NO: 65)(plné trojuholníky). Testy proliferácie lymfatických uzlín s MBP Acl-11 (SEQ ID NO: 65) boli uskutočnené v deň 9. Kontroly: Predbežné ošetrenie PBS PPD 108277/ médium 1855 a predbežné ošetrenie Acl11 (SEQ ID NO: 65) PPD 88499/médium 1335.

b) Skupiny po 4 myšiach boli 5 a 10 dní pred imunizáciou so 150 gg MBP intravenózne ošetrené buď s PBS alebo s 250 nmól Acl-11 [4Y] (SEQ ID NO: 67). Testy produkcie IL2 lymfatickými uzlinami so 150 gM Acl-11 (SEQ ID NO. 65) alebo so 17 gM Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) boli uskutočňované v deň 10.

Príklad 3

Podávanie peptidu v pokročilom štádiu

Po imunizácii s MBP sa vyvíja u myší (PJL x SJL) F1 relapsujúca EAE (Fritz, R.B., a ď., J. Immunol., 1983, 130:1024), čo tento model EAE robí ideálnym pre skúmanie terapeutickej intervencie. Hoci imunodominantným encefalitogénom u myší (PJL x SJL) F1 je MBP Acl-11(SEQ ID NO. 65), je u tohto kmeňa encefalitogénny tiež subdominantný epitop MBP 31-47(SEQ ID NO: 68). Za účelom zistenia, či na liečbu EAE, indukovanej MBP, je nutný jeden z týchto peptidov alebo oba, boli opakované jednotlivé kroky príkladu 2, avšak s tou výnimkou, že skupiny myší boli ošetrené v pokročilom štádiu choroby intravenóznymi injekciami súčasne MBP Acl-11 (SEQ ID NO: 65) a MBP 3 1-47 (SEQ ID NO: 68) alebo samotným Acl-11 (SEQ ID NO: 65). Skupiny kontrolných myší boli ošetrované intravenóznymi injekciami PBS alebo kontrolným peptidom Ova 323-339 (SEQ ID NO: 69), čo je peptid viažúci sa na A^UA“, nepríbuzný MBP a neimunogénny pre myši (PJL x SJL) Fl.

Obr. 5 znázorňuje, že opakované intravenózne injekcie MBP Acl-11 (SEQ ID NO: 65) buď samotného (obr. 5a) alebo v kombinácii s MBP 31-47 (SEQ ID NO. 68)(obr. 5b) znižujú výskyt, intenzitu a mortalitu EAE. Ošetrenie s oboma

155 peptidmi sa konzistentne s vyššie opísanými pozorovaniami iných pracovníkov javí ako o niečo účinnejšie ako ošetrenie s MBP Acl-11 (SEQ ID NO: 65) samotným. Myši boli ošetrené šiestimi intravenóznymi injekciami peptidu počas akútnej a prvej relapsovej fázy. Potom boli myši sledované až do dňa 125 v priebehu chronickej remitujúcej fázy so žiadnymi známkami neskorého ochorenia v skupinách ošetrených MBP peptidom (dáta neznázornené). Kontrolný peptid Ova 323-339 (SEQ ID NO: 69), podávaný intravenózne, nemal na ochorenie žiadny vplyv (obr. 5c). Vo zvláštnom experimente nebolo intravenózne podávanie MBP 3 1-47 (SEQ ID NO: 68) samotného účinné pri liečbe EAE (dáta neznázornené). Obr. 5a, b a c ukazujú účinnosť intravenózneho ošetrenia myší s EAE, indukovanou MBP. EAE bola indukovaná vyššie opísaným spôsobom pomocou MBP v skupinách po 11 až 16 myšiach. Myši boli ošetrované intravenózne injekciou 250 nmól každého peptidu počínajúc dňom 9, 12, 15, 21, 29 a 37. Krížiky, používané na všetkých obrázkoch, označujú jednotlivé myši, ktoré uhynuli alebo boli usmrtené v stupni 5 EAE. Kontrolná skupina, ošetrovaná PBS, je označená plnými krúžkami. Výsledky naznačujú, že imunodominantný encefalitogénny peptid MBP je jednak nevyhnutný a jednak dostačujúci k liečbe EAE indukovanej s MBP u myší (PJL x SJL) Fl, ako ukazuje zníženie intenzity a mortality EAE u ošetrených myší.

Príklad 4

Viacnásobné i.v. injekcie Acl-11 (SEQ ID NO: 65)

Po prípravných krokoch v príklade 2 boli pripravené viacnásobné injekcie Acl-11 (SEQ ID NO: 65). Jedna injekcia peptidu v deň 9 oneskorila ochorenie o dva dni a znížila mortalitu zo 100 % na 63 %, ale u všetkých ošetrených myší sa nakoniec vyvinula silná EAE (dáta neznázornené). Tri injekcie peptidu počas akútnej fázy EAE spočiatku liečili ochorenie účinne, avšak počas relapsovej fázy si ošetrovaná skupina myší vyvinula ochorenie s neskorým nástupom (dáta neznázornené). Tieto výsledky, uvažované spoločne, naznačujú, že na liečbu s MBP-indukovaného ochorenia u myší (PJL x SJL) Fl sú potrebné viacnásobné intravenózne injekcie MBP peptidov počas akútnej a prvej relapsovej fázy EAE. Pre dlhodobé zníženie intenzity ochorenia sú teda vyžadované viacnásobné injekcie Acl-11 (SEQ ID NO: 65). Obr. 6 ukazuje, že Acl-11 [4Y] (SEQ ID NO: 67) lieči EAE v nižšej dávke ako Acl-11 (SEQ ID NO: 65) a má na chorobu dlhšie trvajúci účinok. EAE bola indukovaná pomocou MBP u skupín po 8 až 10 myšiach. Obr. 6a znázorňuje myši ošetrované i.v. v dňoch 12 a 15 pomocou PBS (fosfátom pufrovaný salinický roztok; prázdne krúžky), 250 nmól Acl-11 (SEQ ID NO: 65)(plné štvorčeky) alebo 250 nmól Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67)(prázdne trojuholníčky). Hodnota MMS pre myši ošetrované s PBS bola 4,4 a mortalita 60 '%. Hodnota MMS pre myši ošetrované s Acl-11 (SEQ ID NO: 65) bola 3,9 a mortalita 37,5 %. Hodnota MMS pre myši ošetrované s Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) bola 2,1 a mortalita 0 %. Obr. 6b ukazuje myši ošetrované i.v. v dňoch 12, 15, 18, 21, 24 a 27 buď PBS (prázdne krúžky) alebo 2,5 nmól Acl11 (SEQ ID NO: 65)(plné krúžky). Hodnota MMS pre myši ošetrované s PBS bola 2,9 a mortalita 20 %. Hodnota MMS pre myši ošetrované peptidom bola 4,3 a mortalita 50 %.

Príklad 5

Ošetrenie analógom MBP peptidu, ktorý tvorí in vivo stabilné komplexy s MHC triedy II

Pretože komplexy peptid-MHC sú funkčné terapeutické jednotky, liečiace EAE, pôvodcovia odvodili, že Ac-1 1[4Y] (SEQ ID NO. 67) by mal byť účinnejší pri liečbe EAE, indukovanej aktívnym MBP, ako Acl-11 (SEQ ID NO: 65). Na otestovanie tejto hypotézy boli uskutočnené stupne príkladu 2 s výnimkou injekčnej schémy a bolo zmenené dávkovanie. Obr. 6a ukazuje, že iba dve injekcie Acl-11 [4Y] (SEQ ID NO: 67) skoro v priebehu choroby vyvolali dlhodobejší účinok ako dve injekcie Acl-11 (SEQ ID NO: 65). Obr. 6b ďalej ukazuje, že opakované intravenózne injekcie Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) sú vysoko účinné pri liečbe EAE v dávke 2,5 nmól (obr. 6c). Potom boli uskutočnené histologické skúšky. Boli pripravené histologické rezy EAE z mozgu a miechy a farbené he57 matoxylínom a eozínom (CVD, West Sacramento, CA). V rezoch boli pozorovateľom naslepo hodnotené zápalové infiltráty na stupnici 1 až 4. Účinnosť Acl11 [4Y] (SEQ ID NO: 67) bola potvrdená histologickými skúškami mozgových a miechových rezov z myší, ošetrovaných peptidom a PBS, ktoré vykazujú výrazne znížený počet a intenzitu zápalových infiltrátov centrálneho nervového systému u myší ošetrených peptidom (obr. 7). Obr. 7 demonštruje, že zápalové infiltráty sú redukované u myší, ošetrených Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67). Zlepšená účinnosť Acl-11 [4Y] (SEQ ID NO: 67) bola evidentná.

Vo vyššie uvedenom príklade bola evidentná zlepšená účinnosť Acl11[4Y] (SEQ ID NO: 67). Pôvodcovia odvodili, že in vivo vznikajú stabilné komplexy peptid-MHC medzi A“A“ a Acl-11 [4Y] (SEQ ID NO: 67), ktorý bol intravenózne injikovaný, a tak spôsobil pozorovanú zlepšenú účinnosť. Tieto komplexy, vznikajúce in vivo, sú detegovateľné pomocou hybridómu 1934, ktorý bol odvodený z encefalitogénneho MBP-špecifického klonu T buniek. Bolo postupované podľa stupňov príkladu 2 s výnimkou dôb a množstva injekcií a množstvá boli upravené, ako je uvedené ďalej. Hybridom T buniek 1934 je špecifický pre MBP Acl-11 (SEQ ID NO: 65) postupom podľa Wraitha, D.C., a ď., Celí 1989, 59:247. Stručne povedané boli hybridómové bunky inkubované v množstve 5.10⁴ na jamku v mikrotitrových platniach s plochým dnom s MBP peptidmi alebo peptidovými analógmi. Ako bunky obsahujúce antigén bolo pridané 5.10⁵ slezinových buniek (PJL x SJL) Fl, ožiarených 3 000 rad. Médium bolo rovnaké ako pri testoch proliferácie lymfatických uzlín s výnimkou toho, že doplnok séra tvorilo 10 % fetálneho teľacieho séra namiesto normálneho myšieho séra. Po 24 h boli odobrané supernatanty a bola skúmaná ich schopnosť podporovať rast buniek HT2. Potom boli z injikovaných myší v rôznych dobách po injekcii 250 nmól Acl-11 [4Y] (SEQ ID NO: 67) odobrané sleziny a splenocyty boli použité ako bunky obsahujúce antigén pre Ac 1 -1 1-špecifický hybridom 1934. Ku kultúram nebol pridávaný žiadny ďalší peptid. Obr. 8 ukazuje, že slezinové bunky, ktoré boli in vivo podrobené „pulzácii“ s Acl-1 1[4Y] (SEQ ID NO: 67), sú vysoko účinné pri aktivácii hybridómu 1934. Schopnosť aktivovať hybridom trvá maximálne 2 h po injekcii, potom začína klesať do štyroch až šiestich h po injek58 cii. Po 10 h po injekcii Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) je aktivácia minimálna a po 20 h nie je prítomná (dáta neznázornené). Ako je zrejmé z obr. 8, experimenty s Acl-11 (SEQ ID NO: 65) aktiváciu hybridómu slezinovými bunkami z injikovaných myší nevykazujú ani 1 h po injekcii (dáta neznázornené). Ako je podrobnejšie znázornené na obr. 8, komplexy peptid-MHC, vzniknuté in vivo, sú detegovateľné u myší injikovaných Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67). Skupinám po 2 myšiach bolo v rôznych časových okamžikoch pred vybratím slezín (1 až 10 h) intravenózne injikované 250 nmól Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67). Splenocyty z injikovaných myší boli vyšetrované na schopnosť aktivovať bunky hybridómu 1934 na produkciu IL2. Výsledky sú vyjadrené ako proliferácia HT2. Tieto výsledky podporujú hypotézu, že vznik stabilných komplexov peptid-MHC in vivo prispieva k účinnosti terapeutického analógu MBP peptidu.

Príklad 6

Syntéza myšieho MBP peptidu Acl-11(SEQ ID NO: 65)

Myší MBP peptid Acl-11 (SEQ ID NO: 65) bol syntetizovaný štandardnou syntézou Fmoc/tBoc a čistený pomocou HPLC. Sekvencia aminokyselín peptidu Acl-11 (SEQ ID NO: 65) je nasledujúca:

Indukcia EAE

EAE bola indukovaná u myších samíc (SJL x PL) F1 (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) vo veku 6 až 8 týždňov imunizáciou myší so 100 gg čisteného morčacieho MBP v CFA (GIBCO Lab., Grand Island, NY), obsahujúceho 400 gg kmeňa M. tuberculosis H37RA (DIFCO Lab., Detroit, MI), subkutánne pri koreni chvostu. V deň imunizácie a po 48 h bolo intravenózne dvakrát podané 200 ng toxínu dávivého kašľa (JHL BIOSCIENCE, Lenexa, Kansas). Myši boli denne monitorované na príznaky choroby a hodnotené podľa stupnice: 0 - žiadne klinické známky EAE, 1 - ochabnutý nereagujúci chvost, 2 - čiastočná paralýza zadných končatín, 3 - úplná paralýza zadných končatín, 4 - čiastočná až úplná <59 paralýza predných končatín, 5 - moribundná. Dáta sú vyjadrované ako priemer z hodnotenia intenzity choroby za každý deň zahrnujúci všetky zvieratá v skupine. Myši boli sledované počas doby 26 dní. Hneď keď myš uhynula na EAE, bolo do výpočtov pre všetky nasledujúce dni zahrnuté hodnotenie 5.

Účinok IFN-β na EAE

Bol uskutočnený titračný experiment na účely stanovenia účinkov rôzneho dávkovania IFN-β na EAE (obr. 13). Jedna skupina myši bola po indukcii EAE v deň 9, 13 a 16 ošetrovaná intraperitoneálne PBS (kontrola), jedna skupina myší bola v deň 9, 13 a 16 ošetrovaná 10 000 jedn. IFN-β (prázdny krúžok) a jedna skupina myší bola v deň 9, 13 a 16 ošetrovaná 2 000 jedn. IFN-β (plný krúžok). Ako je zrejmé z obr. 13, príznaky EAE sú v každom časovom bode pre obe dávky IFN-β podobné, čo naznačuje, že na experimenty s IFN-β by bola vhodná nižšia dávka, ktorá je preferovaná, pretože možnosť toxicity v dôsledku vyššej dávky IFN-β je menej pravdepodobná. V ostatných experimentoch, znázornených na obr. 12a až 12c, bolo použitých 2 000 jedn. IFN-β, pretože táto dávka vykázala zlepšenie klinického hodnotenia.

Ako je zrejmé z obr. 12a, bola ošetrovaná v deň 9, 12, 16 a 20 kontrolná skupina myší PBS a iná skupina myší 2 000 jedn. IFN-β. Ako je zrejmé z obr. 12a, skupina ošetrovaná IFN-β mala v priebehu času iba mierne slabšie príznaky ako kontrolná skupina.

Účinok myšieho MBP peptidu Acl-11 (SEQ ID NO: 65) na EAE

Bol zisťovaný účinok myšieho MBP peptidu Acl-11 (SEQ ID NO: 65) a výsledky sú zobrazené na obr. 12b. Jedna skupina myší bola v deň 10, 13, 17 a 21 po indukcii EAE ošetrovaná i.p. PBS (kontrola) a druhá skupina myší bola v deň 10, 13, 17 a 21 ošetrovaná i.v. 250 nmól peptidu Acl-11(SEQ ID NO:

65). Myši boli monitorované vyššie uvedeným spôsobom. Ako je znázornené na obr. 12b, myši ošetrované Acl-11 (SEQ ID NO: 65) mali slabšie príznaky ako kontrolná skupina.

Účinok ošetrenia kombináciou peptidu Acl-11 (SEQ ID NO: 65) a IFN-β na EAE

Účinky ošetrenia kombináciou peptidu Acl-11 (SEQ ID NO: 65) a IFN-β sú znázornené na obr. 12c. Jedna skupina myší bola po indukcii EAE ošetrovaná PBS (kontrola) a jedna skupina myší bola v deň 10, 13, 17 a 21 ošetrovaná i.v. 250 nmól peptidu Acl-11 (SEQ ID NO: 65)(otvorené šípky) a v deň 9, 12, 16 a 20 i.p. 2 000 jedn. IFN-β. Ako je znázornené na obr. 12c, skupina myši ošetrovaná kombináciou peptidu a IFN-β vykazovala výrazný pokles intenzity príznakov v porovnaní s kontrolnou skupinou aj v porovnaní s ošetrovaním samotným IFN-β alebo samotným peptidom, znázorneným na obr. 12a a 12b, čo ukazuje na synergický účinok tejto kombinácie. Liečebný režim, zahrnujúci kombináciu peptidu a IFN-β, teda poskytuje zvýšený účinok, vedúci ku zníženiu sily príznakov EAE.

Príklad 7

Podávanie peptidov cicavcom na liečbu EAE vyvolanej miechovým homogenizátom (SCH) ako modelu sklerózy multiplex

Syntéza peptidov

Peptidy boli pripravené automatizovanou syntézou peptidov (ABI 430A, Applied Biosciences, Foster City, CA) s použitím štandardnej 9-fluorenylmetoxykarbonylovej chémie. Peptidy boli čistené vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou a bolo potvrdené zloženie aminokyselín. Zvolené sekvencie peptidov boli MBP Acl-11 (SEQ ID NO: 65) ASQKRPSQRHG, MBP Acl61

11[4A] (SEQ ID NO: 66) ASQARPSQRHG, MBP Acl-11 [4Y] (SEQ ID NO: 67) ASQYRPSQRHG, MBP 31-47 (SEQ ID NO: 68) RHRDTGILDSIGRFFSG, Ova 323-339 (SEQ ID NO: 69) ISQAVHAAHAEINEAGR a Ova 323-337 (SEQ ID NO: 70) ISQAVHAAHAEINEA.

Čistenie MBP

SCH bol pripravený z morčacích miech (Keystone Biologicals, Cleveland, OH) s použitím modifikácie metódy podľa Smitha, M.E., J. Neurochem., 1969, 16:83. Zmes proteinov SCH bola lyofilizovaná a použitá podľa sušiny.

Indukcia EAE, hodnotenie a peptidová terapia

EAE bola indukovaná u myší (PJL x SJL) Fl, získaných od Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Keď myši dosiahli vek 8 až 14 týždňov, bola indukovaná EAE imunizáciou 500 až 1000 pg SCH, emulgovaného v kompletnom Freundovom adjuvans (Gibco Laboratories, Grand Island, NY), doplnenom ďalšími 400 pg na myš M. tuberculosis H37Ra (Difco Laboratories, Detroit, MI). V dobe imunizácie a o 48 h neskôr bolo podané 200 ng toxínu dávivého kašľu (JRH Biosciences, Lenexa, KS). Myši boli hodnotené na základe klinických príznakov podľa stupnice: 1. paralýza chvostu, 2. Čiastočná paralýza zadných končatín, 3. úplná paralýza zadných končatín, 4. paralýza predných končatín, 5. moribundná alebo mŕtva. Myši s hodnotením 5 boli usmrtené. Po smrti boli myši vyradené z ďalších výpočtov priemerného klinického hodnotenia. Intravenózne boli podávané peptidy, ako je uvedené ďalej v jednotlivých príkladoch.

Výsledky sú znázornené na obr. 16, ktorý ukazuje, že Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) zvráti priebeh EAE, keď je podaný po nástupe paralýzy. EAE bola indukovaná u skupín po 14 myšiach pomocou SCH. Terapia bola zahájená u každej myši individuálne potom, čo sa u nej vyvinuli klinické znaky EAE. Dáta sú vynesené vo vzťahu k zahájeniu terapie u každého jedinca (deň 1 - nástup klinic62 kých príznakov pre každú jednotlivú myš). Myši boli ošetrované v deň 1, 3, 6 a 9 choroby s PBS (plné štvorčeky), i.v. 250 nmól Acl-11 (4Y] (SEQ ID NO: 67)(prázdne trojuholníky) alebo 250 nmól Acl-11 [4 Y] (SEQ ID NO: 67)(prázdne krúžky). Hviezdička označuje jednotlivé myši, ktoré uhynuli alebo boli usmrtené v dôsledku stupňa 5 EAE.

Obr. 17 ukazuje, že Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) zabraňuje nástupu EAE, keď je podaný predtým, ako sa prejavia príznaky choroby. EAE bola indukovaná pomocou SCH. Terapia bola zahájená u každej myši individuálne na ôsmy deň po indukcii choroby pomocou gpSCH. Dáta sú vynesené vo vzťahu k zahájeniu terapie pre každého jedinca. Skupiny myší, ktoré prežili boli v deň 8, 10, 13 a 17 ošetrované i.v. 25 nmól Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67)(prázdne trojuholníky) alebo s.c. 25 nmól Acl-11 [4Y] (SEQ ID NO: 67)(plné krúžky). Jedna skupina nedostávala žiadne ošetrenie (prázdne štvorčeky).

Výsledky na obr. 16 a 17 ukazujú, že oba spôsoby podávania sú účinné pri prevencii nástupu príznakov.

Príklad 8

Bolo postupované rovnako ako v príklade 2, avšak neboli uskutočňované testy proliferácie lymfatických uzlín a produkcie IL2. EAE bola indukovaná v deň 0 pomocou gpMBP a potom bol 3 skupinám myší v deň 8, 10, 13 a 17 podávaný Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67). Výsledky sú graficky znázornené na obr. 18 ako intravenózne aplikácie (prázdne trojuholníky), subkutánne injekcie (plné krúžky) a kontrola (prázdne krúžky). Predbežné ošetrenie (napríklad ošetrenie pred prejavom príznakov) pomocou Acl-11 [4Y] (SEQ ID NO: 67) môže zamedziť vzniku EAE indukovanej pomocou gpMBP.

Príklad 9 cDNA kódujúca ľudský MOG proteín

V počiatočnom pokuse získať ľudskú DNA kódujúcu MOG proteín bola knižnica ľudskej cDNA podrobená polymerázovej reakcii (PCR) s použitím primérov 3’ a 5’, konštruovaných na základe publikovanej sekvencie kódujúcej krysí MOG podľa Gardiniera a ď. (viď vyššie). Sekvencia ľudského MOG nemohla byť týmto spôsobom získaná, pravdepodobne v dôsledku nedostatku homológie na konci 5’ a/alebo 3’ ľudskej a krysej sekvencie.

Preto boli konštruované štyri vnútorné krysie oligonukleotidy. Dva z nich boli homológne k hornému reťazcu génu (priméry 94-111 a 166-183) (SEQ ID NO: 74), báza 1 počínajúc ATG) a dva boli homológne so spodným reťazcom génu (priméry 538-555 (SEQ ID NO: 75) a 685-702). Kombinácia primérov 166183 (SEQ ID NO: 74) a 538-555 (SEQ ID NO: 75) bola úspešná pri uskutočňovaní amplifikácie fragmentu s očakávanou veľkosťou približne 400 bp z knižnice cDNA ľudského mozgu. Sekvencia týchto primérov bola:

a) 166-183: CAGAATCCGGGAAGAATGCCACGGGC (SEQ ID NO: 74) a

b) 538-555: CAGCGGCCGCACGGAGTTTTCCTCTCAG (SEQ ID NO: 75)

V priméri 166-183 (SEQ ID NO: 74) je prítomné miesto EcoRI a v priméri 538-555 (SEQ ID NO: 75) sa nachádza miesto Nôti.

Produkt PCR 400 bp bol klonovaný do expresného vektora pVL1393 štiepením pVL1393 (Pharmigen CA) pomocou EcoRI a Nôti, štiepením amplifikovaného produktu rovnakými enzýmami a ligáciou vzniknutých fragmentov. Inzert bol overený štiepením niekoľkých klonov odvodených z Iigovaných plazmidov pomocou EcoRI a Nôti a sekvenovaním vzniknutého 400 bp fragmentu ľudského MOG. Predpokladá sa, že vzniknutý inzert postráda 184 bp sekvencie 5’ a 201 bp sekvencie 3’, vztiahnuté na krysí otvorený čítací rámec s veľkosťou 738 bp.

Z horného a spodného reťazca inzertu 400 bp polôh 346-363 boli konštruované dva priméry:

5’-CAGAATTCTCAGGTTCTCAGATGAAGGA-3’ (SEQ ID NO: 76) a

5’-AAGCGGCCGCTATCCTTCATCTGAGAACCT-3’ (SEQ ID NO: 77) kde je v prvom reťazci prítomné miesto EcoRI a v druhom miesto Nôti. Podčiarknuté oblasti zodpovedajú sekvencii MOG.

Horný, resp. spodný primér ľudského MOG 346-363 (SEQ ID NO: 76 a 77) bol použitý v kombinácii s vyššie uvedeným krysím primérom 5’, resp. 3’ na amplifikáciu chýbajúcich koncov 5’ a 3’ génu z tej istej knižnice cDNA ľudského mozgu, ktorá bola použitá predtým. Bol získaný produkt PCR, zodpovedajúci 3’-konci génu, ale zodpovedajúci 5’-koniec nevznikol.

Získaný 3’-fragment ma, očekávanú veľkosť 400 bp a tento fragment bol klonovaný do pVL1393 a sekvenovaný.

Na získanie 5’-časti génu bola knižnica ľudskej mozgovej drene gtlO, získaná od Clotech, ktorá bola vopred amplifikovaná a mala titer 8.1O¹⁰ pfu/ml, podrobená screeningu postupom predpísaným výrobcom. Knižnica bola nanesená na 12 veľkých platní v množstve 30 000 plakov/platňu a plaky boli prenesené na nitrocelulózové filtre (2 opakované filtre/platňu). Dvanásť filtrov, získaných z 12 rôznych platní, potom bolo hybridizovaných s ³²P značenou sondou, zodpovedajúcou pôvodne klonovanému vnútornému 400 bp fragmentu ľudského MOG (polohy 184-534). Bolo získaných 22 silne pozitívnych. Pre každý pozitívny bola z pôvodných platní vyzdvihnutá zátka a inkubovaná cez noc pufrom s riedením λ za účelom vymytia fága z agaru. Skúmavka potom bola odstredená a supernatant prenesený.

Z každého poolu bola amplifikovaná DNA s použitím buď priameho priméru gtlO s miestom SstlI:

5’-CTTTTGAGCAAGTTCAGCCTGGTTAAG-3’ (SEQ ID NO: 78) alebo reverzného priméru gtlO s miestom Xhol:

5’-ACCTCGAGGAGGTGGCTTATGAGTATTTCTTCCAGGGTA-3’ (SEQ ID

NO: 79) rovnako ako horného alebo spodného reťazca vnútorného priméru ľudského MOG:

5’-GGTGCGGGAAAGGTGACTCTCAGGATCCGGAAT-3 ’ (SEQ ID NO: 80) alebo

5’-ATTCCGGATCCTGAGAGTCACCTTTCCCGCACC-3’ (SEQ ID NO: 81)

Posledné dva priméry (SEQ ID NO: 80 a 81) zahrnujú miesto BamHI (v sekvenciách podčiarknuté), prirodzene prítomné v sekvencií ľudského MOG.

Priméry boli použité v štyroch rôznych kombináciách: 1) priamy horný/spodný interného MOG, 2) reverzný spodný/spodný interného MOG, 3) horný interného MOG/reverzný spodný a 4) horný interného MOG/priamy horný.

Prvé dve kombinácie poskytli 5’-koniec génu (až po miesto BamHI) a posledné dve 3’-koniec génu. Obe časti 5’ a 3’ obsahujú nepreložené oblasti. Ktorý z oboch členov každej kombinácie skutočne vedie k požadovanému fragmentu, závisí na orientácii cDNA, klonovaných do gtlO.

Veľkosť získaných fragmentov sa v jednotlivých pooloch líšila. Päť najväčších fragmentov 5’ alebo 3’ bolo subklonovaných do miest SstlI a BamHI alebo BamHI a Xhol polylinkéru SK. Tri klony z každého poolu potom boli sekvenované, aby sa vylúčila prítomnosť chýb PCR. Tým sa získala úplná sekvencia oblasti kódujúcej gén, rovnako ako 174 bp nepreloženej sekvencie 5’.

Ľudský gén MOG kóduje preproteín s 248 aminokyselinami, ktorý má 87% homológiu s 246 aminokyselinami v krysom proteíne. Maturovaný proteín obsahuje 218 aminokyselín. Maturovaný proteín začína glycínom a je odvodený od preproteínu s 248 aminokyselinami štiepením z presekvencie siahajúcej od štar(,6 tovacieho kodónu MET k alanínovému zvyšku tesne predchádzajúcemu glycínu v polohe 1.

Príklad 9A

Expresia skráteného ľudského MOG v hmyzích bunkách SF-9 a E. coli

Expresia SF-9

Prenosový vektor PVL1393, obsahujúci cDNA skráteného ľudského MOG kódujúci aminokyseliny 1-121 ľudského MOG (prvých 121 aminokyselín SEQ ID NO: 48) bol kotransfikovaný do buniek SF-9 spolu s linearizovanou DNA Baculoviru Baculogold (Pharmingen, San Diego, CA). Po 4 dňoch bol odobraný supernatant kultúry, obsahujúci rekombinačné vírusy. Rekombinačný vírus bol vyčistený od plakov a podrobený trom cyklom amplifikácie na získanie zásobného vírusu s vyšším titrom. Bunky AF-9 potom boli infikované zásobným vírusom v množstve MOI 2,0. Supernatant z infikovaných buniek bol odobraný po 48 h po infekcii a nanesený na stĺpec agarózy NiNTA. Rekombinačný proteín MOG bol eluovaný za nedenaturujúcich podmienok s použitím 250 mM imidazolu, dialyzovaný proti 5% kyseline propiónovej a H₂O a následne lyofilizovaný. Koncentrácia proteínu bola odhadnutá pomocou BCA. Čistený proteín MOG bol vizualizovaný na 12,5% polyakrylamidovom géli, farbenom Coomassie blue.

Príklad 10

Podľa príkladov 9 a 9A bol pripravený skrátený ľudský MOG (huMOG). MBP (morča) bol pripravený opísaným spôsobom. Postupovalo sa podľa príkladu 2, avšak EAE bola indukovaná v troch oddelených skupinách myší s použitím 75 pg gpMBP a 100 pg huMOG (prázdne trojuholníky) a kombinácie 75 pg gp MBP a 100 pg huMOG (plné štvorčeky). Graf na obr. 19 ukazuje priebeh ochorenia pre každý prípad v tomto príklade. Ochorenie vyvolané súčasne MOG a

MBP je silnejšie ako v prípade každého z nich samotného. Výsledky naznačujú, že k ochoreniu prispieva MOG i MBP.

Príklad 11

Ochorenie bolo vyvolané rovnako ako v príklade 10 pomocou huMOG + gpMBP (deň 0 - vyvolanie ochorenia). Myši boli ošetrované pred nástupom príznakov s 250 nmól Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67) a kontrolou (PBS) v deň 6, 8, 1, 13, 17, 22 a 27 (šípky označujú ošetrenie). Ako ukazuje graf na obr. 20, ošetrenie Acl-11[4Y] (SEQ ID NO: 67)(prázdne štvorčeky) významne znížilo priemerný klinický záznam v porovnaní s kontrolami (plné štvorčeky).

Na základe tu opísaných konkrétnych postupov je odborník schopný nájsť, resp. pomocou iba rutinných experimentov vypracovať početné ekvivalenty, ktoré taktiež spadajú do rozsahu vynálezu a sú pokryté patentovými nárokmi.

ZOZNAM SEKVENCIÍ (1) VŠEOBECNÉ INFORMÁCIE:

(i) PÔVODCOVIA: Smilek, Dawn;

Samson, Michael F.; Gefter, Malcolm;

Hsu, Di-Hwei,

Shi, Jia-Dong;

Paliard, Xavier; Devaux, Brigitte; Rothbard, Jonathan; a Franzen, Henry M.

(ii) NÁZOV VYNÁLEZU: Prípravky a spôsoby liečenia sklerózy multiplex (iii) POČET SEKVENCIÍ: 81 (iv) KOREŠPONDENČNÁ ADRESA:

(A) ADRESÁT: LAHIVE & COCKFIELD (B) ULICA: 60 State Street, Suite 510 (C) MESTO: Boston (D) ŠTÁT: Massachusetts (E) KRAJINA: USA (F) ZIP: 02109-1875 (v) STROJOVO ČITATEĽNÁ FORMA:

(A) TYP MÉDIA: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC kompatibilný (C) OPERAČNÝ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Verše #1.25 (vi) ÚDAJE O TEJTO PRIHLÁŠKE:

(A) ČÍSLO PRIHLÁŠKY: PCT/US95/13682 (B) DÁTUM PODANIA: 25.10.1995 (vii) ÚDAJE O PRIORITNEJ PRIHLÁŠKE:

(A) ČÍSLO PRIHLÁŠKY: US 08/404,228 (B) DÁTUM PODANIA: 15.3.1995 (A) ČÍSLO PRIHLÁŠKY: US 08/328,224 (B) DÁTUM PODANIA: 25.10.1994 (A) ČÍSLO PRIHLÁŠKY: US 08/300,811 (B) DÁTUM PODANIA: 1.9.1994 (A) ČÍSLO PRIHLÁŠKY: US 08/241,246 (B) DÁTUM PODANIA: 10.5.1994 (A) ČÍSLO PRIHLÁŠKY: US 08/116,824 (B) DÁTUM PODANIA: 3.9.1993 (viii) INFORMÁCIE O ZÁSTUPCOVI:

(A) MENO: Amy E. Mandragouras (B) REGISTRAČNÉ ČÍSLO: Reg No. 36,207 (C) REFERENC1A/ČÍSLO SPISU: 094.2 PCT (IMI-052C2PC) (ix) TELEKOMUNIKAČNÉ INFORMÁCIE:

(A) TELEFÓN: (617) 227-7400 (B) TELEFAX: (617) 227-5941 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 170 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 1:

Ala 1

Ser

Gin

Lys

Arg 5

Pro

Ser

Gin

Arg

His 10

Gly

Ser

Lys

Tyr

Leu 15

Ala

Thr

Ala

Ser

Thr 20

Met

Asp

His

Ala

Arg 25

His

Gly

Phe

Leu

Pro 30

Arg

His

Arg

Asp

Thr 35

Gly

íle

Leu

Asp

Ser 40

íle

Gly

Arg

Phe

Phe 45

Gly

Asp

Arg

Gly 50

Ala

Pro

Lys

Arg

Gly 55

Ser

Gly

Lys

Asp

Ser 60

His

Pro

Ala

Arg 65

Thr

Ala

His

Tyr

Gly 70

Ser

Leu

Pro

Gin

Lys 75

Ser

His

Gly

Arg

Thr 80

Gin

Ásp

Glu

Asn

Pro 85

Val

His

Phe

Phe 90

Lys

Asn

íle

Val

Thr 95

Pro

Arg

Thr

Pro

Pro 100

Pro

Ser

Gin

Gly

Lys 105

Gly

Arg

Gly

Leu

Ser 110

Leu

Ser

Arg

Phe

Ser 115

Trp

Gly

Ala

Glu

Gly 120

Gin

Arg

Pro

Gly

Phe 125

Gly

Tyr

Gly

Arg 130

Ala

Ser

Asp

Tyr

Lys 135

Ser

Ala

His

Lys

Gly 140

Phe

Lys

Gly

Val

Asp 145

Ala

Gin

Gly

Thr

Leu 150

Ser

Lys

íle

Phe

Lys 155

Leu

Gly

Arg

Asp 160

Ser

Arg

Ser

Gly

Ser

Pro

Met

Ala

Arg

165 170 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA. 20 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:2:

Gly Ser Lys Tyr Leu Ala Thr Ala Ser Thr Met Asp His Ala Arg His 15 10 15

Gly Phe Leu Pro 20 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 19 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:3:

Gly Ser Lys Tyr Leu Ala Thr Ala Ser Thr Met Asp His Ala Arg His 15 10 15

Gly Phe Leu (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO.4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 21 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:4:

Gly Ser Lys Tyr Leu Ala Thr Ala Ser Thr Met Asp His Ala Arg His 15 10 15

Gly Phe Leu Pro Arg 20 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DĹŽKA: 23 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:5:

Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn íle Val Thr Pro Arg Thr 1 5 10 15

Pro Pro Pro Ser Gin Gly Lys 20 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 24 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID N0:6:

Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn íle Val Thr Pro Arg 1 5 10 15

Thr Pro Pro Pro Ser Gin Gly Lys 20 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 23 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:7:

Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn íle Val Thr Pro Arg 15 10 15

Thr Pro Pro Pro Ser Gin Gly 20 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 19 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:8:

Thr Gin Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn íle Val Thr

10 15

Pro Arg Thr (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 21 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:9:

Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn íle Val Thr Pro Arg 15 10 15

Thr Pro Pro Pro Ser 20 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 25 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 10:

Thr 1	Gin	Asp	Glu	Asn Pro Val 5	Val	His	Phe Phe Lys Asn íle 10	Val Thr 15
Pro	Arg	Thr	Pro	Pro	Pro	Ser	Gin	Gly
			20					25

(2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 23 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 11:

Thr Gin Asp Glu Asn Pro Val Vai His Phe Phe Lys Asn íle Val Thr 15 10 15

Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser 20 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE. SEQ ID NO. 12.

Leu Ser Arg Phe Ser Trp Gly Ala Glu Gly Gin Arg Pro Gly Phe Gly

10 15

Tyr Gly Gly Arg 20 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 19 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 13:

Leu Ser Arg Phe Ser Trp Gly Ala Glu Gly Gin Arg Pro Gly Phe Gly 15 10 15

Tyr Gly Gly (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 25 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA. lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný

(xi) OPIS SEK	VENCIE: SEQ ID NO: 14:
Phe Lys	Gly Val Asp Ala Gin	Gly	Thr Leu	Ser Lys íle Phe Lys Leu
1	5		10	15
Gly Gly	Arg Asp Ser Arg Ser	Gly	Ser
	. 20		25

(2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 25 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný

(xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 15: Pro Ser Gin Gly Lys Gly Arg	Gly Leu	Ser Leu 10	Ser Arg Phe Ser Trp 15
1	5
Gly Ala	Glu Gly	Gin Arg Pro	Gly	Phe
	20			25

(2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 16:

Ala Ser Gin Lys Arg Pro Ser Gin Arg His Gly Ser Lys Tyr Leu Ala

10 15

Thr Ala Ser Thr 20 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.

(A) DĹŽKA: 20 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 17:

Met Asp His Ala Arg His Gly Phe Leu Pro Arg His Arg Asp Thr Gly 15 10 15 íle Leu Asp Ser 20 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 18:

Arg His Arg Asp Thr Gly íle Leu Asp Ser íle Gly Arg Phe Phe Gly 15 10 15

Gly Asp Arg Gly 20 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 19:

íle Gly Arg Phe Phe Gly Gly Asp Arg Gly Ala Pro Lys Arg Gly Ser 15 10 15

Gly Lys Asp Ser 20 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO 20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:20:

Ala Pro Lys Arg Gly Ser Gly Lys Asp Ser His His Pro Ala Arg Thr 15 10 15

Ala His Tyr Gly 20 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:21:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:21:

His His Pro Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gin Lys Ser 15 10 15

His Gly Arg Thr 20 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:22:

Ser Leu Pro Gin Lys Ser His Gly Arg Thr Gin Asp Glu Asn Pro Val 1 5 10 15

Val His Phe Phe 20 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:23:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE. SEQ ID NO:23:

Gin Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn íle Val Thr Pro 15 10 15

Arg Thr Pro Pro 20 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO 24:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:24:

Lys Asn íle Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gin Gly Lys Gly 15 10 15

Arg Gly Leu Ser 20 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:25:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 aminokyselín (B) TYP. aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:25:

Pro Ser Gin Gly Lys Gly Arg Gly Leu Ser Leu Ser Arg Phe Ser Trp 15 10 15

Gly Ala Glu Gly 20 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO 26:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:26:

Gin Arg Pro Gly Phe Gly Tyr Gly Gly Arg Ala Ser Asp Tyr Lys Ser 15 10 15

Ala His Lys Gly 20 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:27:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:27:

Ala Ser Asp Tyr Lys Ser Ala His Lys Gly Phe Lys Gly Val Asp Ala 15 10 15

Gin Gly Thr Leu 20 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:28:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:28:

Phe Lys Gly Val Asp Ala Gin Gly Thr Leu Ser Lys íle Phe Lys Leu 15 10 15

Gly Gly Arg Asp ď 20 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:29:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA. lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:29:

Ser Lys íle Phe Lys Leu Gly Gly Arg Asp Ser Arg Ser Gly Ser Pro 15 10 15

Met Ala Arg Arg 20 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO 30:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 19 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:30:

Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn íle Val Thr Pro Arg 15 10 15

Thr Pro Pro (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:3 1.

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE: (A) DĹŽKA: 13 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:31:

Lys Tyr Leu Ala Thr Ala Ser Thr Met Asp His Ala Arg 1 5 10 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:32:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 11 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:32:

Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn 1 5 10 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:33:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 15 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:33:

Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn íle Val Thr Pro 1 5 10 15 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:34 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 16 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE. SEQ ID NO 34:

Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn íle Val Thr Pro Arg 15 10 15 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO 35:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 17 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ϋ) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU, interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO 35:

Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn íle Val Thr Pro Arg 15 10 15

Thr (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:36:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 13 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO 36:

Val His Phe Phe Ala Asn íle Val Thr Pro Arg Thr Pro 1 5 10 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:37:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 18 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO 37:

Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn íle Val Thr Pro Arg Thr 15 10 15

Pro Pro (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:38:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 19 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ED NO:38:

Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn íle Val Thr Pro Arg Thr 15 10 15

Pro Pro Pro (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO 39:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 14 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO 39:

Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn íle Val Thr Pro Arg 1 5 10 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO 40 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 17 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:40:

Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn íle Val Thr Pro Arg Thr Pro 15 10 15

Pro (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:41:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 16 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:41:

Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn íle Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro 15 10 15 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:42:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:42:

Val Val His Phe Phe Lys Asn íle Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro 15 10 ¹⁵

Ser Gin Gly Lys 20 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:43:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 13 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ED NO:43:

Val His Phe Phe Lys Asn íle Val Thr Pro Arg Thr Pro 1 5 10 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:44:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 13 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:44:

His Phe Phe Lys Asn íle Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro 1 5 10 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:45:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 12 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:45:

His Phe Phe Lys Asn íle Val Thr Pro Arg Thr Pro 1 5 10 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:46:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 19 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:46:

Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn íle Val Thr Pro Arg 15 10 15

Thr Pro Tyr (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:47:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 25 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:47:

Leu 1	Ser Arg Phe	Ser Trp Gly Ala Glu Gly Gin Arg Pro	Gly Phe Gly 15
5	10
Tyr	Gly	Gly	Arg	Ala	Ser	Asp	Tyr	Lys
			20					25

(2) INFORMÁCIE O SEQ Π) NO.48.

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 19 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:48:

Arg Pro Gly Phe Gly Tyr Gly Gly Arg Ala Ser Asp Tyr Lys Ser Ala 15 10 15

His Lys Gly (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:49:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 32 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:49:

Lys 1

Gly

Phe

Lys

Gly 5

Val

Asp

Ala

Gin

Gly 10

Thr

Leu

Ser

Lys

íle 15

Phe

Lys

Leu

Gly

Gly 20

Arg

Asp

Ser

Arg

Ser 25

Gly

Ser

Pro

Met

Ala 30

Arg

(2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:50:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 25 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:50:

Lys	Gly	Val	Asp	Ala	Gin	Gly	Thr	Leu	Ser Lys	íle Phe Lys Leu Gly
1				5					10	15
Gly	Arg	Asp	Ser	Arg	Ser	Gly	Ser	Pro
			20					25

(2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:51:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 27 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:51:

Lys	Gly	Val	Asp	Ala	Gin	Gly	Thr	Leu	Ser	Lys íle Phe Lys Leu Gly
1				5					10	15
Gly	Arg	Asp	Ser	Arg	Ser	Gly	Ser	Pro	Met	Ala
			20					25

(2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:52:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 15 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:52:

Ala Gin Gly Thr Leu Ser Lys íle Phe Lys Leu Gly Gly Arg Asp 15 10 15 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO53:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 18 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:53:

íle Phe Lys Leu Gly Gly Arg Asp Ser Arg Ser Gly Ser Pro Met Ala 1 5 10 15

Arg Arg (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:54:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 13 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:54:

Gly Gin Phe Arg Val íle Gly Pro Arg His Pro íle Arg 1 5 10 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:55:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 13 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO 55:

His Ser Tyr Gin Glu Glu Ala Ala Met Glu Leu Lys Val 1 5 10 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:56:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 121 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:56:

Gly 1	Gin Phe Arg	Val 5	íle	Gly Pro	Arg	His Pro íle Arg Ala Leu Val
10	15
Gly	Asp Glu Val	Glu	Leu	Pro Cys	Arg	Thr Ser	Pro Gly Lys Asn Ala
	20				25		30
Thr	Gly Met Glu	Val	Gly	Trp Tyr	Arg	Pro Pro	Phe Ser Arg Val Val
	35			40			45
His	Leu Tyr Arg	Asn	Gly	Lys Asp	Gin	Asp Gly	Asp Gin Ala Pro Glu
	50			55			60
Tyr	Arg Gly Arg	Thr	Glu	Leu Leu	Lys	Asp Ala	íle Gly Glu Gly Lys
65			70			75	80
Val	Thr Leu Arg	íle	Arg	Asn Val	Arg	Phe Ser	Asp Glu Gly Gly Phe
		85				90	95
Thr	Cys Phe Phe	Arg	Asp	His Ser	Tyr	Gin Glu	Glu Ala Ala Met Glu
	100				105		110
Leu	Lys Val Glu	Asp	Pro	Phe Tyr	Trp
	115			120

(2) INFORMÁCIE O SEQ CD NO:57:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO.57:

Gly Gin Phe Arg Val íle Gly Pro Arg His Pro íle Arg Ala Leu Val 15 10 15

Gly Asp Glu Val 20 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:58:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:58:

Pro íle Arg Ala Leu Val Gly Asp Glu Val Glu Leu Pro Cys Arg íle 15 10 15

Ser Pro Gly Lys 20 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:59:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:59:

Glu Leu Pro Cys Arg íle Ser Pro Gly Lys Asn Ala Thr Gly Met Glu 1 5 10 15

Val Gly Trp Tyr 20 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:60:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:60:

Asn Ala Thr Gly Met Glu Val Gly Trp Tyr Arg Pro Pro Phe Ser Arg 15 10 15

Val Val His Leu 20 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:61:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA. lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:61:

Thr Val Gly Leu Val Phe Leu Cys Leu Gin Tyr Arg Leu Arg Gly Lys 15 10 15

Leu Arg Ala Glu 20 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:62:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:62:

Tyr Arg Leu Arg Gly Lys Leu Arg Ala Glu íle Glu Asn Leu His Arg 15 10 15

Thr Phe Asp Pro 20 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:63:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DĹŽKA: 20 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA. lineárna

100 (ii) TYP MOLEKULY, peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:63:

íle Glu Asn Leu His /Arg Thr Phe Asp Pro His Phe Leu Arg Val Pro 1 5 10 15

Cys Trp Lys íle 20 (2) INFORMÁCIE O SEQ ED NO:64:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:64:

Tyr Asn Trp Leu His Arg Arg Leu Ala Gly Gin Phe Leu Glu Glu Leu 15 10 15

Arg Asn Pro Phe 20 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:65:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA. 11 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný

101 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:65:

Ala Ser Gin Lys Arg Pro Ser Gin 1 5

Arg His 10

Gly (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:66:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 11 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:66:

Ala Ser Gin Ala Arg Pro Ser Gin Arg His Gly 1 5 10 (2) INFORMÁCIE O SEQ ED NO:67:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 11 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ED NO 67:

Ala Ser Gin Tyr Arg Pro Ser 1 5

Gin Arg His Gly 10

102 (2) INFORMÁCIE O SEQ ED NO:68:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 17 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:68:

Arg His Arg Asp Thr Gly íle Leu Asp Ser íle 1 5 10

Gly (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:69:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 17 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:69:

íle Ser Gin Ala Val His Ala Ala His Ala Glu 1 5 10

Arg

Gly Arg Phe Phe Ser 15 íle Asn Glu Ala Gly 15 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:70:

103 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 15 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:70:

íle Ser Gin Ala Val His Ala Ala His Ala Glu íle Asn Glu Ala 15 10 15 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:71:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 24 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:71:

Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Ala Asn íle Val Thr Pro Arg 15 10 15

Thr Pro Pro Pro Ser Gin Gly Lys 20 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:72:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE: (A) DĹŽKA: 12 aminokyselín

104 (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interný (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO.72:

His Phe Phe Ala Asn íle Val Thr Pro Arg Thr Pro 1 5 10 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:73:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 18 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZEC: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:73:

GAAAGGCTCC ACACACCG 18 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:74:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 26 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZEC: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA

105 (xi) OPIS SEKVENCIE. SEQ ID NO:74:

CAGAATCCGG GAAGAATGCC ACGGGC 26 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:75:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 28 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZEC, jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:75:

CAGCGGCCGC ACGGAGTTTT CCTCTCAG 28 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:76:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 28 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZEC: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:76:

CAGAATTCTC AGGTTCTCAG ATGAAGGA

106 (2) INFORMÁCIE O SEQ Π) NO:77:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 30 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZEC: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:77:

AAGCGGCCGC TATCCTTCAT CTGAGAACCT 30 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:78:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 27 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZEC: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ Π) NO.78:

CTTTTGAGCA AGTTCAGCCT GGTTAAG 27 (2) INFORMÁCIE O SEQ ED NO:79:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE: (A) DĹŽKA: 39 párov báz

107 (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZEC: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:79:

ACCTCGAGGA GGTGGCTTAT GAGTATTTCT TCCAGGGTA (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO 80:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 33 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZEC: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:80:

GGTGCGGGAA AGGTGACTCT CAGGATCCGG AAT 3 3 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:81:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 33 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZEC: jednoduchý (D) TOPOLÓGIA: lineárna

108 (ii) TYP MOLEKULY: cDNA

OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:81:

ATTCCGGATC CTGAGAGTCA CCTTTCCCGC ACC

109

T’V 51iV

Claims

1. Prípravok na liečenie sklerózy multiplex u cicavca, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje aspoň jeden peptid, vybraný zo skupiny zahrnujúcej MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-1.2 (SEQ ID NO: 4), MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10), MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), MBP-3 (SEQ ID NO: 12), MBP-3.1 (SEQ ID NO: 13), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) a MBP-5 (SEQ ID NO: 15), znázornené na obr. 2, alebo ich modifikácie alebo analógy alebo peptidomimetiká.

2. Prípravok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že uvedený peptid je vybraný zo skupiny zahrnujúcej MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) a MBP-5 (SEQ ID NO: 15), znázornené na obr. 2.

3. Prípravok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že uvedeným peptidom je MBP-4 (SEQ ID NO: 14).

4. Prípravok na liečenie sklerózy multiplex u cicavca, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje aspoň jeden peptid odvodený od MBP, vybraný zo skupiny zahrnujúcej MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-1.2 (SEQ ID NO: 4),

MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7),

MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10),

MBP-2.6 (SEQ ID NO: 1 1), MBP-3 (SEQ ID NO: 12), MBP-3.1 (SEQ ID NO: 13),

MBP-4 (SEQ ID NO: 14) a MBP-5 (SEQ ID NO: 15), znázornené na obr. 2, pričom tento prípravok zahrnuje aspoň 40 % celkovej reaktivity T buniek voči MBP v populácii jedincov majúcich T bunky reagujúce na MBP.

110

5. Prípravok na liečenie sklerózy multiplex u cicavca, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje aspoň dva peptidy MBP, vybrané zo skupiny zahrnujúcej MBP-1 (SEQ ID

NO: 2), MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-2.1 (SEQ ID

NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID

NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10), MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), MBP-3 (SEQ ID

NO. 12), MBP-3.1 (SEQ ID NO: 13), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) a MBP-5 (SEQ ID NO: 15), znázornené na obr. 2.

6. Prípravok podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že uvedené peptidy sú vybrané zo skupiny zahrnujúcej MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) a MBP-5 (SEQ ID NO: 15), znázornené na obr. 2.

7. Prípravok podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že jeden z uvedených peptidov zahrnuje MBP-4.

8. Prípravok podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že ďalej zahrnuje aspoň jeden peptid, vybraný zo skupiny zahrnujúcej sekvencie aminokyselín 13-25 (SEQ ID NO: 31), 31-50 (SEQ ID NO: 18), 61-80 (SEQ ID NO: 21), 82-92 (SEQ ID NO:

32), 82-96 (SEQ ID NO: 33), 82-97 (SEQ ID NO: 34), 82-98 (SEQ ID NO: 35), 82-100 (SEQ ID NO: 30), 82-100[100P>Y] (SEQ ID NO: 46), 83-100 (SEQ ID NO: 37), 83-101 (SEQ ID NO. 38), 84-97 (SEQ ID NO. 39), 84-100 (SEQ ID NO.

40), 85-100 (SEQ ID NO: 41), 86-105 (SEQ ID NO: 42), 87-99 (SEQ ID NO: 43), 87-99[91K>A] (SEQ ID NO: 36), 88-100 (SEQ ID NO: 44), 88-99 (SEQ ID NO: 45), 1 1 1-135 (SEQ ID NO: 47), 122-140 (SEQ ID NO: 48), 139-170 (SEQ ID NO: 49), 141-160 (SEQ ID NO: 28), 142-166 (SEQ ID NO: 50), 142-168 (SEQ ID NO: 51), 146-160 (SEQ ID NO: 52) a 153-170 (SEQ ID NO: 53), znázornené na obr. 14.

9. Prípravok podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že ďalej zahrnuje aspoň jeden peptid, vybraný zo skupiny zahrnujúcej sekvencie aminokyselín 13-25 (SEQ ID

111

NO. 31), 87-99 (SEQ ID NO: 43), 87-99[91K>A] (SEQ ID NO. 36), 82-100 (SEQ ID NO: 30), 82-100[100P>Y] (SEQ ID NO: 46), znázornené na obr. 14.

10. Prípravok na liečenie sklerózy multiplex u cicavca, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje aspoň dva peptidy odvodené od MBP, pričom aspoň jedným peptidom je MBP-4 (SEQ ID NO: 14) a aspoň jeden peptid je vybraný zo skupiny zahrnujúcej

MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-1.2 (SEQ ID NO: 4),

MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7),

MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10),

MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), MBP-3 (SEQ ID NO: 12), MBP-3.1 (SEQ ID NO: 13), MBP-5 (SEQ ID NO: 15), 13-25 (SEQ ID NO: 31), 31-50 (SEQ ID NO: 18), 61-80 (SEQ ID NO. 21), 82-92 (SEQ ID NO: 32), 82-96 (SEQ ID NO: 33), 82-97 (SEQ ID NO: 34), 82-98 (SEQ ID NO: 355), 82-100 (SEQ ID NO: 30), 82-100[100P>Y] (SEQ ID NO. 46), 83-100 (SEQ ID NO: 37), 83-101 (SEQ ID NO: 38), 84-97 (SEQ ID NO: 39), 84-100 (SEQ ID NO: 40), 85-100 (SEQ ID NO: 41), 86-105 (SEQ ID NO: 42), 87-99 (SEQ ID NO: 43), 87-99[91K>A] (SEQ ID NO. 36), 88100 (SEQ ID NO: 44), 88-99 (SEQ ID NO: 45), 1 1 1-135 (SEQ ID NO: 47), 122140 (SEQ ID NO: 48), 139-170 (SEQ ID NO: 49), 141-160 (SEQ ID NO: 28), 142-166 (SEQ ID NO: 50), 142-168 (SEQ ID NO: 51), 146-160 (SEQ ID NO: 52) a 153-170 (SEQ ID NO: 53), znázornené na obr. 2 a 14.

11. Prípravok podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že aspoň jedným peptidom je MBP-4 (SEQ ID NO: 14) a aspoň jeden peptid je vybraný zo skupiny zahrnujúcej MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-1.2 (SEQ ID NO: 4),

MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7),

MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10),

MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), MBP-3 (SEQ ID NO: 12), MBP-3.1 (SEQ ID NO: 13),

MBP-5 (SEQ ID NO: 15), 13-25 (SEQ ID NO: 3 1), 87-99 (SEQ ID NO: 43), 8799[91K>A] (SEQ ID NO: 36), 82-100 (SEQ ID NO: 30), 82-100[ 100P>Y] (SEQ ID NO: 46).

112

12. Prípravok na liečenie sklerózy multiplex u cicavca, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje aspoň dva peptidy MBP, vybrané zo skupiny zahrnujúcej MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-1.2 (SEQ ID NO: 4), MBP-2 (SEQ ID

NO: 5), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID

NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10), MBP-2.6 (SEQ ID

NO: 11), MBP-3 (SEQ ID NO: 12), MBP-3.1 (SEQ ID NO: 13), MBP-4 (SEQ ID

NO: 14) a MBP-5 (SEQ ID NO: 15), znázornené na obr. 2, pričom tento prípravok zahrnuje aspoň 40 % celkovej reaktivity T buniek voči MBP v populácii jedincov majúcich T bunky reagujúce na MBP.

13. Prípravok podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje percentuálny podiel celkovej reaktivity T buniek voči MBP, dostatočný na to, aby podávanie prípravku jedincovi s MS viedlo k tlmeniu autoimunitnej odpovede MS.

14. Prípravok na liečenie sklerózy multiplex u cicavca, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje aspoň dva peptidy MBP, obsahujúce epitopy T buniek, pričom tento prípravok je vybraný zo skupiny zahrnujúcej prípravky pozostávajúce z:

MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-3 (SEQ ID NO: 12), MBP4 (SEQ ID NO: 14) a MBP-5 (SEQ ID NO: 15);

MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) a MBP-5 (SEQ ID NO. 15);

113

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6) a MBP-4 (SEQ ID NO: 14);

MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6) a MBP-4 (SEQ ID NO: 14);

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2 (SEQ ID NO: 5) a MBP-4 (SEQ ID NO: 14);

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6) a MBP-5 (SEQ ID NO: 15);

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6) a MBP-3 (SEQ ID NO: 12);

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) a peptid vybraný zo skupiny zahrnujúcej 82-100 (SEQ ID NO: 30), 82-100[100P>Y] (SEQ ID NO: 46), 87-99 (SEQ ID NO: 43) a 87-99[91K>A] (SEQ ID NO: 36), znázornené na obr. 14;

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-5 (SEQ ID NO: 15), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) a peptid vybraný zo skupiny zahrnujúcej 82-100 (SEQ ID NO: 30), 82-100[100P>Y]

114 (SEQ ID NO: 46), 87-99 (SEQ ID NO: 43) a 87-99[91K>A] (SEQ ID NO: 36), znázornené na obr. 14;

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-5 (SEQ ID NO: 15), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) a peptid vybraný zo skupiny zahrnujúcej 82-100 (SEQ ID NO: 30), 82-100[100P>Y] (SEQ ID NO: 46), 87-99 (SEQ ID NO. 43) a 87-99[91K>A] (SEQ ID NO: 36), znázornené na obr. 14;

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-3 (SEQ ID NO: 12), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) a peptid vybraný zo skupiny zahrnujúcej MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10) alebo MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), znázornené na obr. 2.

15. Prípravok podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že ďalej zahrnuje aspoň jeden peptid s aktivitou T buniek, odvodený od ľudského myelínového oligodendrocytového proteínu (MOG).

16. Prípravok podľa nároku 15, vyznačujúci sa tým, že uvedený peptid odvodený od MOG je vybraný zo skupiny zahrnujúcej ľudský MOG 1-13 (SEQ ID NO: 54) ľudský MOG 103-115 (SEQ ID NO: 55) ľudský MOG 1-121 (SEQ ID NO: 56)

GQFRVIGPRHPIR

HSYQEEAAMELKV

GQFRVIGPRHPIRALGDEV

ELPCRTSPGKNATGMEVGWY

RPPFSRVVHLYRNGKDQDGD

QAPEYRGRTELLKDAIGEGK

VTLRIRNVRFSDEGGFTCFF

RDHSYQEEAAMELKVEDPFYW

115 ľudský MOG 1-20 (SEQ ID NO: 57) ľudský MOG 11-30 (SEQ ID NO: 58) ľudský MOG 21-40 (SEQ ID NO: 59) ľudský MOG 31-50 (SEQ ID NO: 60) ľudský MOG 141-160 (SEQ ID NO: 61) ľudský MOG 151-170 (SEQ ID NO: 62) ľudský MOG 161-180 (SEQ ID NO: 63) ľudský MOG 199-218 (SEQ ID NO: 64)

GQFRVIGPRHPIRALVGDEV,

PIRALVGDEVELPCRISPGK,

ELPCRISPGKNATGMEVGWY,

NATGMEVGWYRPPFSRVVHL,

TVGLVFLCLQYRLRGKLRAE,

YRLRGKLRAEIENLHRTFDP,

IENLHRTFDPHFLRVPCWKI a

YNWLHRRLAGQFLEELRNPF.

17. Prípravok podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že ďalej zahrnuje aspoň jeden peptid s aktivitou T buniek, odvodený od MOG.

18. Izolovaný peptid, odvodený od MBP, vybraný zo skupiny zahrnujúcej MBP-1.1 (SEQ ID NO. 3), MBP-1.2 (SEQ ID NO: 4), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10), MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), MBP-3.1 (SEQ ID NO: 13), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) a MBP-5 (SEQ ID NO: 15), znázornené na obr. 2, alebo ich modifikácie alebo analógy.

19, Izolovaný peptid podľa nároku 18, ktorým je MBP-4 (SEQ ID NO: 14) alebo jeho modifikácia alebo analóg.

20. Analóg peptidu podľa nároku 18, kde aspoň jeden aminokyselinový zvyšok je nahradený alanínom, kyselinou glutámovou alebo metylaminokyselinou.

21. Peptid, vybraný zo skupiny zahrnujúcej MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4

116 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10), MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), znázornené na obr. 2, kde lyzin (K) je nahradený alanínom (A).

22. Peptidický analóg MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), kde lyzin (K) v polohe 10 je nahradený alanínom (A), pričom tento peptidický analóg má sekvenciu aminokyselín DENPVVHFFANIVTPRTPPPSQGK (SEQ ID NO: 71).

23. Peptidomimetikum peptidu vybraného zo skupiny zahrnujúcej MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-1.2 (SEQ ID NO: 4), MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10), MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), MBP-3 (SEQ ID NO. 12), MBP-3.1 (SEQ ID NO. 13), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) a MBP-5 (SEQ ID NO: 15), kde aspoň jedna normálna peptidická väzba je nahradená nepeptidickou väzbou, analógom peptidickej väzby alebo redukovaným analógom väzby.

24. Peptid, vybraný zo skupiny zahrnujúcej MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-1.2 (SEQ ID NO: 4), MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO. 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10), MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), MBP-3 (SEQ ID NO: 12), MBP-3.1 (SEQ ID NO: 13), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) a MBP-5 (SEQ ID NO: 15), ktorý bol modifikovaný adíciou aspoň jedného nabitého aminokyselinového zvyšku na aminoterminálny koniec, karboxyterminálny koniec alebo oba konce na zvýšenie rozpustnosti peptidu vo vodnom roztoku.

25. Peptid, vybraný zo skupiny zahrnujúcej MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-1.2 (SEQ ID NO: 4), MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO. 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO. 10), MBP-2.6 (SEQ ID NO. 11), MBP-3 (SEQ ID NO: 12), MBP-3.1 (SEQ ID NO: 13), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) a MBP-5

117 (SEQ ID NO: 15), ktorý bol modifikovaný adíciou aspoň jedného aminokyselinového zvyšku na aminoterminálny koniec, karboxyterminálny koniec alebo oba konce na zvýšenie aktivity T buniek, pričom uvedený aminokyselinový zvyšok je odvodený od sekvencie natívneho MBP proteínu.

26. Použitie prípravku podľa nároku 1 na prípravu liečiva na liečenie sklerózy mul típlex u cicavca tlmiaceho autoimunitnú odpoveď.

27. Použitie prípravku podľa nároku 1 na prípravu liečiva na prevenciu nástupu sklerózy multiplex u cicavca.

28. Použitie prípravku podľa nároku 5 na prípravu liečiva na liečenie sklerózy multiplex u cicavca tlmiaceho autoimunitnú odpoveď.

29. Použitie prípravku podľa nároku 10 na prípravu liečiva na liečenie sklerózy multiplex u cicavca tlmiaceho autoimunitnú odpoveď.

30. Použitie prípravku podľa nároku 14 na prípravu liečiva na liečenie sklerózy multiplex u cicavca tlmiaceho autoimunitnú odpoveď.

i

31. Použitie prípravku podľa nároku 15 na prípravu liečiva na liečenie sklerózy multiplex u cicavca tlmiaceho autoimunitnú odpoveď.

118

32. Použitie aspoň dvoch rôznych prípravkov podľa nároku 1 na prípravu liečiva na liečenie sklerózy multiplex u cicavca.

33. Použitie kombinácie peptidov odvodených od MBP, vybraných zo skupiny kombináciou peptidov zahrnujúcou

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) a MBP-5 (SEQ ID NO. 15);

MBP-1 (SEQ ID NO. 2), MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) a MBP-5 (SEQ ID NO: 15);

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6) a MBP-4 (SEQ ID NO: 14);

MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6) a MBP-4 (SEQ ID NO: 14);

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2 (SEQ ID NO: 5) a MBP-4 (SEQ ID NO: 14);

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6) a MBP-5 (SEQ ID NO: 15);

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6) a MBP-3 (SEQ ID NO: 12);

119

MBP-1.1 (SEQ ID NO; 3) a peptid vybraný zo skupiny zahrnujúcej MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10) alebo MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11);

MBP-4 (SEQ ID NO: 14) a peptid vybraný zo skupiny zahrnujúcej MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10) alebo MBP-2.6 (SEQ ID NO. 11);

MBP-1.1 (SEQ ID NO. 3), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) a peptid vybraný zo skupiny zahrnujúcej 82-100 (SEQ ID NO: 30), 82-100[100P>Y] (SEQ ID NO: 46), 87-99 (SEQ ID NO: 43) a 87-99[91K>A] (SEQ ID NO: 36), znázornené na obr. 14;

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) a peptid vybraný zo skupiny zahrnujúcej MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10) alebo MBP-2.6 (SEQ ID NO. 11), znázornené na obr. 2;

120

MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-3 (SEQ ID NO: 12), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) a peptid vybraný zo skupiny zahrnujúcej MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10) alebo MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), znázornené na obr. 2, na prípravu liečiva k liečebnému režimu na liečenie sklerózy multiplex u cicavca.

34. Multipeptidová formulácia na farmaceutické podávanie jedincom s MS, vyznačujúca sa tým, že zahrnuje aspoň dva peptidy MBP, pričom každý tento peptid je rozpustný a stabilný pri vopred stanovenom fyziologicky prijateľnom pH a tieto peptidy sú vybrané zo skupiny zahrnujúcej MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-1.2 (SEQ ID NO: 4), MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10), MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), MBP-3 (SEQ ID NO: 12), MBP-3.1 (SEQ ID NO: 13), MBP-4 (SEQ ID NO: 14) a MBP-5 (SEQ ID NO: 15).

35. Použitie terapeutického prípravku zahrnujúceho aspoň jeden peptid s aktivitou T buniek, odvodený od myelínového antigénu, alebo analóg tohto peptidu, na prípravu liečiva na liečenie pokročilého štádia sklerózy multiplex u cicavca tlmiaceho príznaky sklerózy multiplex.

36. Použitie podľa nároku 35, kde uvedený myelínový antigén je vybraný zo skupiny zahrnujúcej myelínový bázický proteín (MBP), myelínový oligodendrocytový proteín (MOG), proteolipidový proteín (PLP) a myelín-asociovaný glykoproteín (MAG).

37. Použitie podľa nároku 35, kde uvedený peptid zahrnuje peptidový analóg s väzbovou afinitou MHC, ktorá je vyššia ako väzbová afinita MHC peptidu, od ktorého je analóg odvodený.

121

38. Použitie terapeutického prípravku zahrnujúceho aspoň jeden MBP peptid, vybraný zo skupiny zahrnujúcej MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-1.2 (SEQ ID NO: 4), MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10), MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), MBP-3 (SEQ ID NO: 12), MBP-3.1 (SEQ ID NO: 13), MBP-4 (SEQ ID NO: 14), MBP-5 (SEQ ID NO: 15), 13-25 (SEQ ID NO: 31), 31-50 (SEQ ID NO: 18), 61-80 (SEQ ID NO: 21), 82-92 (SEQ ID NO. 32), 82-96 (SEQ ID NO: 33), 82-97 (SEQ ID NO: 34), 82-98 (SEQ ID NO: 35), 82-100 (SEQ ID NO: 30), 82-100[100P>Y] (SEQ ID NO: 46), 83-100 (SEQ ID NO: 37), 83-101 (SEQ ID NO: 38), 84-97 (SEQ ID NO: 39), 84-100 (SEQ ID NO: 40), 85-100 (SEQ ID NO: 41), 86-105 (SEQ ID NO: 42), 87-99 (SEQ ID NO: 43), 87-99[91K>A] (SEQ ID NO: 36), 88-100 (SEQ ID NO: 44), 8899 (SEQ ID NO: 45), 111-135 (SEQ ID NO: 47), 122-140 (SEQ ID NO: 48), 139170 (SEQ ID NO: 49), 141-160 (SEQ ID NO: 28), 142-166 (SEQ ID NO: 50), 142168 (SEQ ID NO: 51), 146-160 (SEQ ID NO: 52) a 153-170 (SEQ ID NO: 53), znázornené na obr. 2 a 14, alebo analóg tohoto peptidu na prípravu liečiva na liečenie pokročilého štádia sklerózy multiplex u cicavca tlmiaceho príznaky sklerózy multiplex.

39. Použitie podľa nároku 38, kde uvedený peptid je vybraný zo skupiny zahrnujúcej MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-1.2 (SEQ ID NO: 4), MBP-2 (SEQ ID NO. 5), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6), MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO. 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9), MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10), MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), MBP-3 (SEQ ID NO: 12), MBP-3.1 (SEQ ID NO: 13), MBP-5 (SEQ ID NO: 15), 13-25 (SEQ ID NO: 31), 87-99 (SEQ ID NO: 43), 8799[91K>A] (SEQ ID NO: 36), 82-100 (SEQ ID NO: 30), 82-100[100P>Y) (SEQ ID NO: 46) alebo ich analógy.

40. Použitie podľa nároku 35, kde uvedený peptid je odvodený od ľudského MOG a je vybraný zo skupiny zahrnujúcej

122

ľudský MOG 1-13 (SEQ ID NO: 54) GQFRVIGPRHPIR ľudský MOG 103-115 (SEQ ID NO: 55) HSYQEEAAMELKV ľudský MOG 1-121 (SEQ ID NO: 56) GQFRVIGPRHPIRALGDEV ELPCRT SPGKN ATGME VGW Y RPPFSRVVHLYRNGKDQDGD QAPEYRGRTELLKDAIGEGK VTLRIRNVRFSDEGGFTCFF RDHSYQEEAAMELKVEDPFYW ľudský MOG 1-20 (SEQ ID NO: 57) GQFRVIGPRHPIRALVGDEV, ľudský MOG 11-30 (SEQ ID NO. 58) PIRALVGDEVELPCRISPGK, ľudský MOG 21-40 (SEQ ID NO: 59) ELPCRISPGKNATGMEVGWY, ľudský MOG 31-50 (SEQ ID NO: 60) NATGMEVGWYRPPFSRVVHL, ľudský MOG 141-160 (SEQ ID NO: 61) TVGLVFLCLQYRLRGKLRAE, ľudský MOG 151-170 (SEQ ID NO: 62) YRLRGKLR AEIENLHRTFDP, ľudský MOG 161-180 (SEQ ID NO: 63) IENLHRTFDPHFLRVPCWKI a ľudský MOG 199-218 (SEQ ID NO: 64) YN WLHRRL AGQFLEELRNPF.

41. Použitie podľa nároku 38, kde uvedený prípravok ďalej zahrnuje aspoň jeden peptid ľudského MOG, vybraný zo skupiny zahrnujúcej ľudský MOG 1-13 (SEQ ID NO: 54) GQFRVIGPRHPIR

ľudský MOG 103-115 (SEQ ID NO: 55) HSYQEEAAMELKV ľudský MOG 1-121 (SEQ ID NO: 56) GQFRVIGPRHPIRALGDEV ELPCRTSPGKNATGMEVGWY RPPFSRVVHLYRNGKDQDGD QAPEYRGRTELLKDAIGEGK VTLRIRNVRFSDEGGFTCFF RDHSYQEEAAMELKVEDPFYW

123 ľudský MOG 1-20 (SEQ ID NO: 57) ľudský MOG 11-30 (SEQ ID NO: 58) ľudský MOG 21-40 (SEQ ID NO. 59) ľudský MOG 31-50 (SEQ ID NO: 60) ľudský MOG 141-160 (SEQ ID NO: 61) ľudský MOG 151-170 (SEQ ID NO: 62) ľudský MOG 161-180 (SEQ ID NO: 63) ľudský MOG 199-218 (SEQ ID NO: 64)

GQFRVIGPRHPIRALVGDEV,

PIRALVGDEVELPCRISPGK,

ELPCRISPGKNATGMEVGWY,

N ATGME VGW YRPPF SRV VHL,

TVGLVFLCLQYRLRGKLRAE,

YRLRGKLRAEIENLHRTFDP,

IENLHRTFDPHFLRVPCWKI a

YN WLHRRL AGQFLEELRNPF.

42. Použitie aspoň jedného terapeutického prípravku, zahrnujúceho aspoň jeden izolovaný a čistený peptid s definovanou dĺžkou, definovanou sekvenciou aminokyselinových zvyškov a zahrnujúci aktivitu T buniek, na prípravu liečiva na liečenie cicavca v pokročilom štádiu sklerózy multiplex, pričom je tento prípravok rozpustný vo vodnom roztoku a stabilný pri fyziologicky prijateľnom pH.

43. Použitie terapeutického prípravku podľa nároku 5, na prípravu liečiva na liečenie pokročilého štádia sklerózy multiplex u cicavca tlmiaceho príznaky sklerózy multiplex.

44. Použitie terapeutického prípravku podľa nároku 10, na prípravu liečiva na liečenie pokročilého štádia sklerózy multiplex u cicavca tlmiaceho príznaky sklerózy multiplex.

45. Použitie terapeutického prípravku podľa nároku 14, na prípravu liečiva na liečenie pokročilého štádia sklerózy multiplex u cicavca tlmiaceho príznaky sklerózy multiplex.

124

46. Použitie terapeutického prípravku podľa nároku 15, na prípravu liečiva na liečenie pokročilého štádia sklerózy multiplex u cicavca tlmiaceho príznaky sklerózy multiplex.

47. Použitie podľa nároku 35, kde pokročilým štádiom sklerózy multiplex je relapsujúca-remitujúca MS, chronická progresívna MS, primárna progresívna MS alebo benigná MS.

48. Použitie aspoň jedného peptidu myelínového autoantigénu, majúceho aktivitu T buniek, na prípravu liečiva na liečenie sklerózy multiplex u jedinca v kombinácii s pôsobením IFN-β.

49. Prípravok, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje terapeuticky účinné množstvo aspoň jedného peptidu majúceho aktivitu T buniek ľudského MBP a terapeuticky účinné množstvo IFN-β vo farmaceutický prijateľnom nosiči alebo riedidle.

50. Prípravok podľa nároku 49, vyznačujúci sa tým, že uvedený peptid je vybraný zo skupiny zahrnujúcej MBP-1 (SEQ ID NO: 2), MBP-1.1 (SEQ ID NO: 3), MBP-1.2 (SEQ ID NO: 4), MBP-2 (SEQ ID NO: 5), MBP-2.1 (SEQ ID NO: 6),

MBP-2.2 (SEQ ID NO: 7), MBP-2.3 (SEQ ID NO: 8), MBP-2.4 (SEQ ID NO: 9),

MBP-2.5 (SEQ ID NO: 10), MBP-2.6 (SEQ ID NO: 11), MBP-3 (SEQ ID NO: 12),

MBP-3.1 (SEQ ID NO: 13), MBP-4 (SEQ ID NO: 14), MBP-5 (SEQ ID NO: 15),

13-25 (SEQ ID NO: 31), 31-50 (SEQ ID NO: 18), 61-80 (SEQ ID NO: 21), 82-92 (SEQ ID NO: 32), 82-96 (SEQ ID NO: 33), 82-97 (SEQ ID NO: 34), 82-98 (SEQ ID NO: 35), 82-100 (SEQ ID NO: 30), 82-100[100P>Y] (SEQ ID NO: 46), 83-100 (SEQ ID NO: 37), 83-101 (SEQ ID NO: 38), 84-97 (SEQ ID NO: 39), 84-100 (SEQ ID NO: 40), 85-100 (SEQ ID NO: 41), 86-105 (SEQ ID NO: 42), 87-99

125 (SEQ ID NO: 43), 87-99[91K>A] (SEQ ID NO: 36), 88-100 (SEQ ID NO: 44), 8899 (SEQ ID NO: 45), 1 11-135 (SEQ ID NO: 47), 122-140 (SEQ ID NO: 48), 139170 (SEQ ID NO: 49), 141-160 (SEQ ID NO: 28), 142-166 (SEQ ID NO: 50), 142-168 (SEQ ID NO: 51), 146-160 (SEQ ID NO: 52) a 153-170 (SEQ ID NO: 53), znázornené na obr. 2 a 14.

51. Použitie aspoň jedného peptidu, majúceho aktivitu T buniek myelínového anti· génu, na prípravu liečiva na prevenciu nástupu sklerózy multiplex u jedinca náchyl neho na sklerózu multiplex, v kombinácii s pôsobením IFN-β.

52. Použitie aspoň jedného prípravku podľa nároku 1 na prípravu liečiva na prevenciu nástupu sklerózy multiplex u jedinca náchylného na sklerózu multiplex, v kombinácii s pôsobením IFN-β.

53. Použitie aspoň jedného prípravku podľa nároku 5 na prípravu liečiva na liečenie sklerózy multiplex u cicavca, v kombinácii s pôsobením IFN-β.

54. Použitie aspoň jedného prípravku podľa nároku 10 na prípravu liečiva na liečenie sklerózy multiplex u cicavca, v kombinácii s pôsobením IFN-β.

55. Použitie aspoň jedného prípravku podľa nároku 14 na prípravu liečiva na lieče nie sklerózy multiplex u cicavca, v kombinácii s pôsobením IFN-β.

56. Použitie aspoň jedného prípravku podľa nároku 15 na prípravu liečiva na lieče nie sklerózy multiplex u cicavca, v kombinácii s pôsobením IFN-β.

126

57. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje farmaceutický prijateľné vehikulum a peptidový komplex MHC triedy II, schopný viazať receptor T buniek a indukovať anergiu v T bunke nesúcej tento receptor, pričom tento komplex pozostáva v podstate zo:

zložky MHC triedy II, zahrnujúcej extracelulárne domény molekuly MHC triedy II, dostačujúce na vytvorenie väzbového vačku antigénu, pričom táto zložka je kódovaná alelou asociovanou s autoimunitnou chorobou a je rozpustná za fyziologických podmienok v neprítomnosti detergentu alebo lipidu, a autoantigénneho peptidu podľa nároku 1, ktorý je naviazaný na väzbový vačok antigénu.

58. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje farmaceutický prijateľné vehikulum a peptidový komplex MHC triedy II, schopný viazať receptor T buniek a indukovať anergiu v T bunke nesúcej tento receptor, pričom tento komplex pozostáva v podstate zo:

zložky MHC triedy II, zahrnujúcej extracelulárne domény molekuly MHC triedy II, dostačujúce na vytvorenie väzbového vačku antigénu, pričom táto zložka je kódovaná alelou asociovanou s autoimunitnou chorobou a je rozpustná za fyziologických podmienok v neprítomnosti detergentu alebo lipidu, a autoantigénneho peptidu podľa nároku 8, ktorý je naviazaný na väzbový vačok antigénu.

59. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje farmaceutický prijateľné vehikulum a peptidový komplex MHC triedy II, schopný viazať receptor T buniek a indukovať anergiu v T bunke nesúcej tento receptor, pričom tento komplex pozostáva v podstate zo:

127 zložky MHC triedy II, zahrnujúcej extracelulárne domény molekuly MHC triedy II, dostačujúce na vytvorenie väzbového vačku antigénu, pričom táto zložka je kódovaná alelou asociovanou s autoimunitnou chorobou a je rozpustná za fyziologických podmienok v neprítomnosti detergentu alebo lipidu, a autoantigénneho peptidu podľa nároku 16, ktorý je naviazaný na väzbový vačok antigénu.

60. Prípravok podľa nároku 57, vyznačujúci sa tým, že autoimunitnou chorobou je skleróza multiplex.

61. Prípravok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje tandemové kópie uvedeného peptidu.

62. Prípravok podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje tandemové kópie uvedeného peptidu.

63. Prípravok podľa nároku 16, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje tandemové kópie uvedeného peptidu.

1/21