发明概述
总的来说,本发明涉及用于诱导细胞中程序性细胞死亡的方法和试剂。本发明的方法和试剂对治疗癌症和其它增殖性疾病有效。
本发明涉及核碱基寡聚物,特别是寡核苷酸,用于调解编码IAP的多核苷酸的功能。这些寡聚物减少产生的IAP的数量,此数量允许通常表达IAP的细胞产生程序性细胞死亡。这一点通过提供核碱基寡聚物来实现,所述核碱基寡聚物特异性的与编码IAP的一种或多种多核苷酸杂交。核碱基寡聚物与IAP多核苷酸(如RNA,DNA)的特异性杂交作用干扰IAP多核苷酸的正常功能,减少IAP蛋白质的产生数量。这种通过特异性杂交到靶位的化合物对靶核酸的功能的调解通常被称为“反义”。
一方面,本发明涉及长度多达30个核碱基的核碱基寡聚物,寡聚物包括选自SEQ ID NO:1-99,143,147,151,163-260,287,289和300-460序列的至少八个连续的核碱基。所要达到的是将寡聚物给予细胞时能够抑制IAP的表达。
在某些实施方案中,核碱基寡聚物包括选自SEQ ID NO:1-99,143,147,151,163-260,287,289和300-460的序列。令人期望的是核碱基寡聚物由(或基本上由)一种或多种上述的SEQ ID NOs组成。例如,核碱基寡聚物可以是包括选自SEQ ID NOs:97,98,99,143,147,151,287和289序列的XIAP反义核酸,包括选自SEQ ID NOs:300-389序列的HIAP1反义核酸,或者包括选自SEQ ID NOs:390-460序列的HI AP2反义核酸。在一个特别理想的实施方案中,本发明涉及具有11个DNA残基的核碱基寡聚物,所述DNA残基的每一侧连接有4个2’-O-甲基RNA残基并由下列序列中的一种组成:
5’-AUUGGTTCCAATGTGUUCU-3’(SEQ ID NO:155);5’-ACACGACCGCTAAGAAACA-3’(SEQID NO:16);5’-ACAGGACTACCACTTGGAA-3’(SEQ ID NO:157);5’-UGCCAGTGTTGATGCUGAA-3’(SEQ ID NO:27);5’-GCUGAGTCTCCATATUGCC-3’(SEQ IDNO:141);5’-UCGGGTATATGGTGTCUGA-3’(SEQ ID NO:41);5’-AAGCACTGCACTTGGUCAC-3’(SEQ ID NO:47);5’-CCGGCCCAAAACAA AGAAG-3’(SEQ IDNO:51);5’-ACCCTGGATACCATTUAGC-3’(SEQ ID NO:63);5’-UGUCAGTACATGTTGGCUC-3’(SEQ ID NO:161);和5’-UGCACCCTGGATA CCAUUU-3’(SEQID NO:151)。
本发明的核碱基寡聚物可以包括至少一个经修饰的键(如硫代磷酸酯,甲基膦酸酯,磷酸三酯,二硫代磷酸酯,或者磷酸硒酸酯键),经修饰的核碱基(如,5-甲基胞嘧啶),和/或经修饰的糖部分(如,2’-O-甲氧乙基基团或2’-O-甲基基团)。在一个实施方案中,寡聚物是嵌合的寡聚物(如,一种寡核苷酸包括由硫代磷酸酯或磷酸二酯键连接的DNA残基,每一侧带有至少一、二、三或四个由硫代磷酸酯键连接的2’-O-甲基RNA残基)。
另一方面,本发明涉及一种增强细胞中程序性细胞死亡的方法。该方法包括给予细胞本发明的核碱基寡聚物以便IAP(如,XIAP,HIAP1,或HIAP2)的表达被抑制的步骤。核碱基寡聚物可以是,例如,反义化合物、双链RNA或核酶的组成部分。这一给药步骤可以单独进行或者与第二步(如给予化疗剂,生物反应调节剂,和/或化学致敏剂)结合。细胞可以是体外或体内的。在一个实施方案中,细胞是癌细胞(如人类癌细胞)或源于淋巴或骨髓的细胞。
在一个相关方面,本发明涉及通过给予动物有效量的本发明的核碱基寡聚物来治疗动物具有增生性疾病(如,癌症,淋巴增生性障碍或骨髓增生异常综合征)或预防这样疾病发生的方法。
癌症可以是例如急性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性原粒细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、急性骨髓单核细胞白血病、急性单核细胞白血病、急性红白血病、慢性白血病、慢性骨髓细胞白血病、骨髓增生异常综合征、慢性淋巴细胞白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤、何杰金氏病、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯瘤、颈癌、子宫癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜细胞瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤或视网膜母细胞瘤。治疗癌症时,优选还给予一种或多种化疗剂、生物反应调节剂、和/或化学致敏剂。优选的,给予一种或多种这些药剂是在给予核碱基寡聚物五天之内。典型的化疗剂是阿霉素(多柔比星)、长春烯碱、依托泊苷、紫杉醇和顺铂。可以应用任意一种能够在靶位形成有效量的给药方式,特别优选的给药方式是通过静脉内和瘤内给药。
另一方面,本发明涉及包括本发明的核碱基寡聚物和药学上可接受的载体的药物组合物。如果需要,药物组合物中还可以包括其他组分(如胶体分散体系或化疗剂)。
本发明还涉及一种能够切割XIAP,HIAP1或HIAP2mRNA的催化性RNA分子。在优选的实施方案中,催化性RNA分子的结合臂上包括相应于本发明的核碱基寡聚物的至少8个连续的核碱基(如表1、2、6和7中任意一个的核碱基序列)。RNA分子优选锤头状基序,但也可以是发夹结构,丁型肝炎病毒,组1内含子,VS RNA或RNA酶P RNA基序。
本发明还涉及表达载体,其包括编码一种或多种催化性RNA分子并且位置适当的核酸,用于在哺乳动物细胞中表达。
本发明还涉及一种通过给予动物有效量的上述催化性RNA分子或编码催化性RNA分子的表达载体来治疗患有癌症或淋巴组织增生性疾病的动物的方法。
在另外一方面,本发明涉及具有21至29个核碱基的双链RNA分子,其中至少八个连续的核碱基相应于表1、2、6和7中的任意序列。
一个相关的方面,本发明还涉及具有50至70个核碱基的双链RNA分子,所述的RNA分子包含21至29个核碱基的第一结构域,这些核碱基包括对应于表1,2,6和7中任一序列的至少8个连续的核碱基;与所述的第一结构域互补的第二结构域,以及位于所述第一和第二结构域之间的环形结构域,以便所述第一结构域和所述第二结构域能够复合形成双链发夹式RNA分子。本发明还以一种编码这种双链RNA的表达载体(如:腺病毒载体或逆转录病毒载体)为特征。
本发明还以一种通过给予动物有效量的上述双链RNA分子治疗患有癌症或淋巴增生性障碍的动物的方法为特征。
这里的“核碱基寡聚物”是指一种包括至少八个通过连接基团连接在一起的核碱基化合物。经过修饰和未经修饰的天然和非天然的寡核苷酸,以及寡核苷酸模拟物如蛋白质核酸(Protein Nucleic Acids),锁核苷酸和阿拉伯糖核酸包括在该定义中。很多核碱基或连接基团用于本发明的核碱基寡聚物之中,包括那些下文在标题为“寡核苷酸和其它核碱基寡聚物”部分中详细描述的核碱基寡聚物。
“蛋白质”或“多肽”或“多肽片段”是指构成一种天然存在的多肽或肽的全部或部分,或者构成一种非天然存在的多肽或肽的两个氨基酸以上的任意链,不管翻译后修饰(如糖基化或磷酸化)。
“程序性细胞死亡”是指细胞死亡的程序,其中死亡细胞显示一系列具有明显特征的生化标志包括细胞膜起泡,细胞体皱缩,染色体凝聚和DNA梯形。通过编程性死亡的细胞包括神经元(如在神经变性疾病例如中风,帕金森氏病和阿尔默海茨病的过程中),心肌症(在心肌梗塞后或充血性心力衰竭过程中),和癌症细胞(如暴露于放射性或化疗剂后)。未减轻环境压力(如缺氧负荷)可以引起细胞进入程序性细胞死亡程序的早期,这一程序是可逆的(即在程序性细胞死亡程序早期的细胞可能被救活)。在细胞编程性死亡的晚期(定型期),细胞不能被救活,结果将导致死亡。
已知的刺激和抑制不同种细胞程序性细胞死亡的蛋白质和化合物均是本领域公知的。例如,半胱天冬酶(ICE)家族的细胞内表达和激活诱导或活化程序性细胞死亡,然而IAP的表达或一些Bc1-2家族的成员抑制程序性细胞死亡。另外,在一些特别的细胞类型中有抑制细胞死亡的存活因子。例如,神经营养因子,如NGF抑制神经元的程序性细胞死亡。
这里的“IAP基因”是指编码具有至少一种BIR域的多肽,并且当以其它细胞内或细胞外递送方式提供时能够调节(抑制或增强)细胞或组织内程序性细胞死亡(如见US专利No.5,919,912)的基因。在优选的实施方案中,IAP基因是一种与至少一种人或小鼠XIAP、HIAP1或HIAP2(任何一种在US专利No.6,156,535中描述)具有大约50%或更多(如至少85%、90%或95%)同一性的基因。优选的测定同一性的序列的区域是编码至少一种BIR域和环锌指结构域的区域。哺乳动物IAP基因包括从任意的哺乳动物中分离的核苷酸序列。优选的哺乳动物是人类。
这里“IAP蛋白质”或“IAP多肽”是指一种由IAP基因编码的多肽或其片段。
这里的“IAP生物活性”是指已知在体内或体外通过IAP多肽引起的任何活性。
这里的”增强的程序性细胞死亡”是指增加那些在给定细胞群中(如癌症细胞、淋巴细胞、成纤维细胞或任何其它细胞)的程序性细胞死亡的细胞的数量。可以理解在特定试验中由一种提高程序性细胞死亡的化合物所引起的程序性细胞死亡提高的程度是不同的,但是本领域技术人员能够确定程序性细胞死亡的水平的统计学显著差异由此鉴定提高程序性细胞死亡的核碱基寡聚物,其中程序性细胞死亡受IAP抑制。优选的“提高程序性细胞死亡”是指与没有给予本发明的核碱基寡聚物但是接受了基本上类似的治疗的细胞相比,进行程序性细胞死亡的细胞的增加量至少是10%,优选25%甚至是50%;最优选的是增加至少一倍。优选的检测样本是正常的进行非充分的程序性细胞死亡的细胞(即,癌细胞)的样本。这里将描述在程序性细胞死亡的水平上检测变化的方法。
所述的“抑制目标基因的表达”的核碱基寡聚物是指相对于未经处理的对照组而言,能够减少至少5%,更优选至少大约10%,25%,甚至50%目标mRNA的数量,或者由这种mRNA编码的蛋白质的数量的核碱基寡聚物。测定mRNA和蛋白质水平的方法是本领域公知的;这里描述一些示例方法。
“杂交”是指互补核碱基之间的氢连接,可以是沃森-克里克,Hoogsteen或反式Hoogsteen氢连接。例如,腺嘌呤和胸腺嘧啶是通过氢连接形成的互补核碱基对。
所述的“增生性疾病”是指由于不适当的高水平的细胞分化,不适当的低水平的程序性细胞死亡,或二者兼备所引起的疾病,或者能够导致这种不适当的高水平的细胞分化,不适当的低水平的程序性细胞死亡,或二者兼备的疾病。例如,癌症是增生性疾病的一个例子。癌症的例子包括,但不限于,白血球过多症(如,急性白血病,急性淋巴细胞性白血病,急性髓细胞性白血病,急性原粒细胞性白血病,急性早幼粒细胞性白血病,急性骨髓单核细胞性白血病,急性单核细胞性白血病,急性红白血病,慢性白血病,慢性髓细胞性白血病,慢性淋巴细胞性白血病)红细胞增多症,淋巴瘤(何杰金氏病,非何杰金氏病),特发性巨球蛋白血症,重链病,和实体瘤,如肉瘤和癌(例如,纤维肉瘤,粘液肉瘤脂肪肉瘤,软骨肉瘤,骨肉瘤,脊索瘤,血管肉瘤,内皮肉瘤,淋巴管肉瘤,淋巴管内皮肉瘤,滑膜瘤;间皮瘤,尤因氏瘤,平滑肌肉瘤,横纹肌肉瘤,结肠癌,胰腺癌,乳腺癌,卵巢癌,前列腺癌,鳞状细胞癌,基底细胞癌,腺癌,汗腺癌,皮脂腺癌,乳头状癌,乳头腺癌,囊腺癌,骨髓癌,支气管癌,肾细胞癌,肝癌,尼罗导管癌,绒毛膜癌,精原细胞癌,胚胎性癌,维尔姆斯瘤(Wilims),宫颈癌,子宫癌,睾丸癌,肺癌,小细胞肺癌,膀胱癌,上皮癌,神经胶质瘤,星形细胞瘤,成神经管细胞瘤,颅咽管瘤,室管膜瘤,松果体瘤,成血管细胞瘤,听神经瘤,少突神经胶质瘤,神经鞘瘤,脑脊膜瘤,黑素瘤,神经母细胞瘤,和视网膜母细胞瘤)。淋巴组织增生性疾病也被认为是增生性疾病。
优选的,本发明的核碱基寡聚物在不能正常的进行充分的程序性细胞死亡的细胞中能够增强程序性细胞死亡和/或减少IAP mRNA或蛋白质水平。相对于对照组而言,优选的增加至少10%,更优选增加25%,最优选增加1倍或更多。优选的本发明的核碱基寡聚物包括大约8至30个核碱基,其中至少八个连续核碱基是选自SEQ ID NO:1-99,143,147,151,163-260,287,289和300-460的序列。本发明的核碱基寡聚物还可以包括,例如,附加的20,40,60,85,120或更多的与IAP多核苷酸互补的连续的核碱基。核碱基寡聚物(或其中一部分)可以包括一个经修饰的骨架。硫代磷酸酯,二硫代磷酸酯和其它经修饰的骨架是本领域公知的。核碱基寡聚物可以包括一或多个非天然连接。
所述的“化疗剂”是指用来杀死癌症细胞或减缓其生长的药剂。相应的,认为细胞毒性剂和细胞生长抑制剂都是化学治疗剂。
所述的“生物反应调节剂”是指刺激或恢复免疫系统抵抗疾病能力的药剂。一些,但不是全部,生物反应调节剂可以减缓癌症细胞生长,因此也被认为是化学治疗剂。生物反应调节剂的例子是干扰素(α,β,γ),白细胞介素-2,美罗华(rituximab)和曲妥单抗(transtuzumab)。
所述的“化学致敏剂“是指能够使肿瘤细胞对化学治疗作用更加敏感的药剂。
所述的“治疗有效量“是指与未经治疗的患者相比能够改善疾病症状,抑制靶细胞生长,减小肿瘤的大小和数量,抑制IAP表达或增强靶细胞的程序性细胞死亡的化合物(例如,一种核碱基寡聚物)的量。本发明用来治疗异常增生(即,癌症)的活性化合物的有效量依赖给药方式,年龄,体重和受试者整体健康状况的不同而不同。最终,主治医师或兽医决定适当的量和剂量方案。这个量被认为是一个“有效的”量。
所述的“淋巴组织增生性疾病”是指淋巴系统的细胞(例如,T-细胞和B-细胞)异常增生的疾病,包括多发性硬化症,克罗恩病,红斑狼疮,类风湿性关节炎和骨关节炎。
所述的“核酶”是指具有酶活性,对于靶RNA分子具有特异性位点和分裂能力的RNA。核酶可以用于减少多肽的表达。应用核酶减少多肽表达的方法在如Turner等(Adv.Exp.Med.Biol.465:303-318,2000)和Norris等(Adv.Exp.Med.Biol.465:293-301,2000)中有所描述。
所述的“报告基因”是指编码一种其表达可被测定的多肽的基因;这样的多肽包括,但不局限于,葡萄糖醛酸酶(GUS),荧光素酶,氯霉素转乙酰基酶(CAT)和β-半乳糖苷酶。
所述的“启动子”是指足以引导转录的多核苷酸。
所述的“可操作性连接”是指第一多核苷酸位于第二多核苷酸的邻近位置,该第二多核苷酸在有适当的分子(如,转录激活因子蛋白质)与其结合时能够引导第一多核苷酸的转录。
本发明的其它特征和优点将以下面的优选实施方案的说明和权利要求进一步加以明确。
附图简述
图1A-1L表示相对于总蛋白质而言,反义XIAP寡核苷酸对XIAP蛋白质表达的效果图。
图1B,1D,1F,1H,1J和1L是与模拟试验的转染结果相比,每一个寡核苷酸转染的总蛋白质浓度,模拟转染用来使上述的XIAP蛋白质结果标准化。
图2A-2C表示多种反义XIAP寡核苷酸,单独或结合起来,作用于XIAP RNA(图2A)和蛋白质(图2B)的效果图。图2C是与模拟转染结果相比较每一个寡核苷酸转染的总蛋白质浓度值,模拟转染用来使图2B中表示的XIAP蛋白质结果标准化。
图3和图4表示31nM(图3)或63nM(图4)的4×4混合骨架(MBO)FG8或E12寡核苷酸的效果图。H460肺癌细胞用125nM MBO和Lipofectamine 2000在一天两天或连续三天中转染18小时。在指示时间采集用于蛋白质印迹法(western)分析的样本。进行光密度扫描法,XIAP蛋白质水平以GAPDH为标准,与定位至100%的模拟对照试验相比较。标明的百分数表示XIAP蛋白质对特异的无序(Scrambled)对照组的百分数。
图5A-5D表示反义XIAP寡核苷酸对细胞活力的效果图(图5A,5C和5D),以及阿霉素存在时的化学致敏作用(图5B)。
图6表示在体外H460细胞中寡核苷酸介导的特异的XIAP mRNA的下降。描述在H460细胞内用单独的Lipofectamine 2000(LFA)处理,或用1.2□M的寡核苷酸F3、G4、C5、AB6、DE4或D7和Lipofectamine 2000处理,或用分别的反极性(RP)或无序(SC)寡核苷酸对照品处理的XIAP mRNA图。进行转染6个小时的XIAP mRNA相对量的实时RT-PCR定量。所有的数据都以代表性试验中的三个数据的平均值±标准偏差(SD)表示。同等实验条件下未处理细胞(对照组)中的XIAP mRNA的水平指定为1。
图7表示用不同的PS-XIAP寡核苷酸转染后H460细胞的XIAP RNA的水平。H460人类肺癌细胞用1uM PS-寡核苷酸和Lipofectamine 2000转染6个小时。然后采集细胞做Taqman分析。
图8表示用4×4MBO转染9小时后H460细胞中的XIAP RNA的水平图。H460细胞用62.5nM至1uM的4×4MBO和Lipofectamine 2000转染9个小时。然后采集细胞做Taqman分析。
图9表示用4×4MBO转染24小时后H460细胞中的XIAP蛋白质降低(knockdown)。H460细胞用1uM的4×4MBO和Lipofectamine 2000转染24个小时。然后采集细胞做蛋白质印迹分析。进行光密度扫描法测定,XIAP蛋白质水平用肌动蛋白校正,与被设置为100%的特定无序(sm,rm)的对照组相比较。
图10A和10B是表示体外H460细胞中的XIAP蛋白质的反义介导的特异性下调的示意图。描述单独用Lipodectamine 2000(LFA)处理,或用LFA加上1.2uM XIAP寡核苷酸F3、G4或C5处理,或用它们各自的寡核苷酸对照(RP,SC)处理的H460细胞中的XIAP蛋白质水平。XIAP蛋白质水平用蛋白质印迹法分析(图10A),蛋白质的量用光密度法来定量(图10B)。XIAP水平用细胞肌动蛋白水平校正,与未经处理的对照组(CNT)水平相比。
图i1A和11B是表示XIAP寡核苷酸介导的对半胱天冬酶的作用的示意图。表示与对照组相比在转染的H460细胞中,1.2uM的XIAP寡核苷酸F3、G4或C5或它们各自的RP和SC ODN对照对前-半胱天冬酶-3,PARP(全长(116kDa)和经处理的(85kDa))(图10A)和Bc1-2和Bax蛋白水平(图10B)表达的影响。用蛋白质印迹法分析蛋白质的表达。Bc1-2和Bax蛋白质水平以细胞肌动蛋白水平为标准,用光密度法定量。Bc1-2和Bax的比率以两个或三个独立的实验的平均值表示,对照组(CNT)的比率设为1。
图12A和12B是表示XIAP特异寡核苷酸诱导程序性细胞死亡的图解。在用1.2uM XIAP G4 AS寡核苷酸,G4 SC寡核苷酸处理的或未经处理的对照组(CNT)的H460细胞中测定程序性细胞死亡的诱导。图12A表示具有亚-G0/G1 DNA含量(细胞凋亡的)的细胞的百分数,用碘化丙锭(PI)染色和流式细胞仪测量。图12B表示用DAPI染色的寡核苷酸处理的H460细胞的核形态学。箭头表示具有核DNA皱缩或剪切的特征性细胞凋亡形态学的细胞。
图13A是XIAP G4AS寡核苷酸治疗对H460细胞活力影响的效果图。细胞用浓度递增的单独的LFA或LFA与G4AS寡核苷酸或G4SC寡核苷酸复合的LFA-寡核苷酸复合物处理,处理24小时后通过MTT分析测定细胞活力。数据以三个独立实验的平均值±SD表示。
图13B表示在有或没有阿霉素(DOX)、紫杉醇、长春烯碱(VNB)或依托泊苷(Etop)存在时,在0.4uM剂量下,用单独的LFA或LFA与G4 AS寡核苷酸或G4 SC寡核苷酸复合的LFA-寡核苷酸复合物处理后死亡H460细胞的百分数,以MTT分析测定。数据以三个独立的实验的平均值±SD表示。
图14表示用XIAP AS 2×2 MBOs和长春烯碱处理的小鼠的相对H460肿瘤生长。寡核苷酸以50ug/g瘤质量瘤内注射于皮下移植H460细胞异种移植物的SCID-RAG2小鼠。这种治疗与给予长春烯碱相结合。
图15是表示用XIAP AS PS-寡核苷酸系统治疗的小鼠的平均H460细胞肿瘤大小的图。将XIAP AS PS-寡核苷酸系统给药(腹膜内注射)于皮下植入H460细胞异种移植物的SCID-RAG2小鼠,与对照组相比减小了肿瘤的体积。
图16是表示用XIAP AS PS-寡核苷酸系统治疗的小鼠中MDA-MB-435/LCC6乳腺癌细胞肿瘤大小的图。将XIAP AS PS-寡核苷酸系统给药于在乳房脂肪垫中植入LCC6细胞异种移植物的雌性SCID-RAG2小鼠,与对照组相比减小了肿瘤的体积。
图17是表明在体内G4寡核苷酸对肿瘤生长和肿瘤XIAP蛋白质水平的效果的示意图。全身给予裸XIAP G4 AS寡核苷酸或G4 SC寡核苷酸对雄性SCID-RAG2小鼠皮下H460细胞异种移植物生长的抗肿瘤效力。所有的数据以平均值±SEM表示(n=6只小鼠/组)。
图18A和18B是描述单独用G4 AS寡核苷酸、G4SC寡核苷酸或赋形剂(对照)治疗21天后SCID-RAG2小鼠中植入的H460肿瘤异种移植物中的XIAP的蛋白质表达水平,用蛋白质印迹法分析,用光密度法定量。XIAP的水平用细胞的肌动蛋白校正。所有的数据以平均值±SD表示(n=3)。
图19A和19B表示用15mg/kg系统给药XIAP G4 AS寡核苷酸或G4SC寡核苷酸超过21天后,G4寡核苷酸对植入SCID-RAG2小鼠的H460肿瘤的组织病理学体内影响的显微照片。图19A描述用苏木精和伊红染色的肿瘤切片。图19B表示肿瘤切片中泛素表达的免疫组织化学。展示了典型的肿瘤显微照片。内部的刻度标记等于100μm。
图20A和20B表示长春烯碱(VNB)与XIAP寡核苷酸联合使用体内效力增加的图。测定SCID-RAG2小鼠中VNB联合或不联合XIAP G4AS寡核苷酸或G4SC寡核苷酸的抗H460肿瘤异种移植物的效力。图20A描述单个药剂的抗肿瘤活性,而图20B描述VNB和G4寡核苷酸联合使用的抗肿瘤活性。所有的数据以平均值±SEM表示(n=6只小鼠/组)。
图21是表示HIAP1寡核苷酸对HIAP1 RNA水平影响的图。
图22A和22B是表示蛋白质印迹的光密度扫描的示意图,该蛋白质印迹法显示HIAP1寡核苷酸对细胞阻断放线菌酮诱导的HIAP1蛋白质上调的能力的作用。
图23是表示通过总蛋白质测量HIAP1表明寡核苷酸对细胞毒性的影响图。
图24是表示对HIAP1寡核苷酸APO 2序列特异性的验证的图。
图25表示HIAP1寡核苷酸对抗药SF295成胶质细胞瘤化学致敏作用的影响。
发明详述
本发明提供抑制IAP表达的核碱基寡聚物和将其用于细胞中诱导程序性细胞死亡的方法。本发明的核碱基寡聚物也可以用于形成药物组合物。本发明还涉及提高细胞内程序性细胞死亡的方法,该方法是将本发明的寡核苷酸与化疗剂,如细胞毒性剂、细胞生长抑制剂或生物反应调节剂(如,阿霉素、长春烯碱、依托泊苷、紫杉醇、顺铂、干扰素、白细胞介素2、单克隆抗体)联合给药。化学治疗剂可以是,例如,如果需要,也可以给予化学致敏剂(即一种使增殖的细胞对化学治疗更加敏感的药剂)。上述药剂的任意结合可以构成药物组合物。这些药物组合物用来治疗增生性疾病,如,癌症或淋巴增生性障碍,或增生性疾病的症状。本发明的核碱基寡聚物也可以与放射疗法结合用来治疗癌症或其它增生性疾病。
癌症细胞中程序性细胞死亡的激活作用提供了新的强效改善患者对常规的化学治疗或放射治疗的响应的方法。就直接抑制半胱天冬酶和抑制程序性细胞死亡的能力而言,XIAP是IAP基因家族中最有效的成员。我们研究过在体内和体外XIAP通过反义(AS)寡核苷酸的下调对人类非小细胞肺癌(NIH-H460)生长的作用。经实时RT-PCT和蛋白质印迹法测定,在培养的H460人类肺癌细胞中,寡核苷酸G4AS被鉴定为最有效的化合物,分别有效地下调XIAP mRNA55%,下调蛋白质水平高达60%,在1.2uM浓度时诱导60%的细胞死亡。相反的,无序对照组G4寡核苷酸仅引起很少的XIAP损失和小于10%的细胞死亡。由前-半胱天冬酶-3和PARP蛋白质的降解显示,用G4AS的治疗诱导程序性细胞死亡,在1.2uM浓度时伴随显著的核DNA浓缩和剪切。而且,XIAP AS寡核苷酸使H460细胞对阿霉素,紫杉醇,长春烯碱和依托泊苷的细胞毒性效应敏感。在动物模型中,我们证明在系统的腹膜内给药的SCID/RAG2-免疫缺陷小鼠的异种移植物模型中15mg/kg的G4AS对人类H460肿瘤具有显著的序列特异性的生长抑制作用。系统的AS ODN给药与肿瘤异种移植XIAP蛋白质下调85%有关。15mg/kg的G4AS和5mg/kg的长春烯碱联合应用明显的抑制肿瘤的生长,比它们分别单独使用效果明显。这些研究表明XIAP的下调是肺癌细胞死亡的一个明显信号,并且能够在体外诱导程序性细胞死亡,在体内抑制肿瘤生长。这些研究支持IAP是人类非小细胞肺癌和其它实体瘤的癌症治疗的适当靶位的论点。
治疗
治疗可以用在癌症治疗之处:家中,医师诊室,诊所,医院的门诊部,或住院部进行。治疗通常由住院开始,以便于医生可以近距离的观察治疗效果和做出所需的调整。治疗的持续时间取决于被治疗的癌症的种类,患者的年龄和状况,所患疾病的阶段和类型,患者机体对治疗的响应情况。给药应有不同的间隔(如,每天一次,每周一次,或每月一次)。治疗应按照启动和停止循环进行,这种循环包括修整期以便于患者的机体有机会构造新的健康的细胞并且恢复机体的抵抗力。
根据癌症的种类和其所处的阶段,治疗可以用来减缓癌症的扩散,减慢癌症的生长,杀死或捕获可能从原始的肿瘤扩散到身体其它部位的癌症细胞,减轻由癌症引起的症状,避免癌症的首次发生。
这里所用的术语“癌症”或“新生物”或肿瘤细胞“是指以异常方式增长的细胞的集合。癌症生长是不受控制的和递增的,在不激发情况下发生,或者将使正常细胞的增生停止。
本发明的核碱基寡聚物或其它IAP抗细胞凋亡的路径的负调节物可以在药学可接受的稀释剂,载体或赋形剂中以单位药剂的形式给药。采用常规的药学方法制备合适的药剂或组合物,通过这些药剂或组合物将化合物给予患有由过度细胞增生引起的疾病的患者。给药可以在患者具有症状之前。任何适当的给药途径都可以采用,例如,肠胃道外给药,静脉内,动脉内,皮下,瘤内,肌内,颅内,眶内,眼睛,心室内,肝内,囊内,鞘膜内,脑池内,腹膜内,鼻内,气雾剂,栓剂,或口服给药。例如,治疗药剂可以是液体溶液或混悬液的形式;对于口服给药,制剂可以是片剂或胶囊;鼻内给药制剂是粉末剂,滴鼻剂或气雾剂。
本领域技术人员公知的制备药剂的方法在,例如″Remington:TheScience and Practice of Pharmacy″Ed.A.R.Gennaro,LippincourtWilliams & Wilkins,Philadelphia,PA,2000中公开。例如肠胃道外给药的制剂可以包括赋形剂,无菌水,或盐,聚二醇,如聚乙二醇,植物油,或氢化萘。生物相容的,生物可降解的丙交酯聚合物,丙交酯/乙交酯共聚物,或聚氧乙烯-聚丙乙烯共聚物可以用来控制化合物的释放。其它的可用作IAP调节化合物的有用的肠胃道外递药系统包括乙烯-酯酸乙烯酯共聚物颗粒,渗透泵,可植入的灌注系统和脂质体。可吸入的药剂可以包括赋形剂,例如,乳糖,或者可以是水溶液包括,例如,聚氧乙烯-9-月桂基醚,甘氨胆酸盐,和脱氧胆酸盐,或以滴鼻剂或凝胶形式给药的油溶液。
药剂以治疗有效量(如,预防、消除或减轻病理状态的量)给予患者,提供对疾病或病症的治疗。本发明的核碱基寡聚物的优选的剂量可能依赖于疾病的类型和程度,特定患者的整体健康状况,复方赋形剂的组成和给药途径的变化。
如上所述,如果需要,本发明的核碱基寡聚物的治疗可以与治疗增生性疾病的其它疗法(如放射性疗法,外科手术或化学疗法)联合使用。
对于上述的任何一种方法,本发明的核碱基寡聚物优选以静脉内给药或施用于需要发生程序性细胞死亡的位点(例如,注射)。
寡核苷酸和其它核碱基寡聚物
至少两种寡核苷酸通过RNA酶H诱导RNA的剪切:具有磷酸二酯(PO)或硫代磷酸酯(PS)连接的多聚脱氧核苷酸。虽然2′-OMe-RNA序列表现出对RNA靶位的高亲合力,但是这些序列不是RNA酶H的作用底物。一种理想的寡核苷酸是基于2’-修饰的寡核苷酸,该寡核苷酸包含寡聚脱氧核苷酸缺口其中一些或所有核酸间连接键修饰成硫代磷酸酯以抵抗核酸酶。甲基膦酸酯修饰的存在提高了寡核苷酸与它的靶位RNA的亲和力,由此降低了IC50。这种修饰也增加了修饰的寡核苷酸对核酸酶的抵抗。可以理解本发明的方法和制剂可以与任何其它先进的方法结合使用,包括共价闭合的多重反义(CMAS)寡核苷酸(Moon等,Biochem J.346:295-303,2000;PCT公开号No.WO 00/61595),带状反义(RiAS)寡核苷酸(Moon等,J.Biol.Chem.275:4647-4653,2000;PCT公开号WO 00/61595)和大环反义寡核苷酸(美国专利申请公开号US 2002/0168631 A1)。
如本领域公知的,核苷是核碱基-糖的结合体。核苷的碱基部分通常是一个杂环的碱基。这种杂环的碱基中最常见的两类是嘌呤和嘧啶。核苷酸是糖部分与磷酸基共价连接的核苷。对于那些包括戊呋喃糖的核苷来说,磷酸基可以与糖的2’,3’或5’位的任意羟基部分连接。在形成寡核苷酸中磷酸基共价链接邻近的核苷形成线性的多聚体化合物。依次的,这个线性的多聚体结构的尾端进一步链接形成环状结构;开放的直线形结构通常是优选的。在寡核苷酸结构中,磷酸基通常被认为形成寡核苷酸的骨架。RNA和DNA的通常的连接或骨架是3’和5’磷酸二酯连接。
用于本发明的优选的核碱基寡聚物的特例包括含有经修饰的骨架或非天然的核苷间链接的寡核苷酸。如说明书中定义的,具有经修饰的骨架的核碱基寡聚物包括在骨架中保留磷原子的及骨架中没有磷原子的。根据本说明书的目的,那些核苷间的骨架没有磷原子的经修饰的寡核苷酸也被视为核碱基寡聚物。
具有经修饰的寡核苷酸骨架的核碱基寡聚物包括,例如,硫代磷酸酯,手性硫代磷酸酯,二硫代磷酸酯,磷酸三酯,氨基烷基-磷酸三酯,甲基或其它烷基磷酸酯包括3’-烯基磷酸酯和手性磷酸酯,次膦酸盐,氨基磷酸酯包括3’-氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯,硫代氨基磷酸酯,硫代烷基磷酸酯,硫代烷基磷酸三酯,具有正常的3′-5′连接的硼烷磷酸酯,这些化合物2′-5′连接的类似物,和那些具有反向极性的化合物,其中核碱基单元的邻近配对是3′-5′连接至5′-3′或2′-5′链接至5′-2′。也包括各种盐,混合盐和游离酸的形式。教导上述含磷链接的制备方法的典型美国专利包括,但不限于,美国专利号No.3,687,808;4,469,863;4,476,301;5,023,243;5,177,196;5,188,897;5,264,423;5,276,019;5,278,302;5,286,717;5,321,131;5,399,676;5,405,939;5,453,496;5,455,233;5,466,677;5,476,925;5,519,126;5,536,821;5,541,306;5,550,111;5,563,253;5,571,799;5,587,361和5,625,050,全部引入这里作为参考。
具有不含磷原子的经修饰的寡核苷酸骨架的核碱基寡聚物具有由短链烷基或环烷基核苷间连接,混合杂原子和烷基或环烷基核苷间链接,或一种或多种短链杂原子或杂环的核苷间连接构成的骨架。包括那些具有吗啉代连接(部分的由核苷的糖部分形成);硅氧烷骨架;硫化物,亚砜和砜的骨架;甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基骨架;亚甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基骨架;包含烯烃的骨架;氨基磺酸酯骨架;亚甲基亚胺基和亚甲基肼基骨架;磺酸酯和氨苯磺胺骨架;酰胺骨架;和其它具有混合的N,O,S和CH2构成部分。教导上述寡核苷酸制备的典型的美国专利包括,但不限于,美国专利No.5,034,506;5,166,315;5,185,444;5,214,134;5,216,141;5,235,033;5,264,562;5,264,564;5,405,938;5,434,257;5,466,677;5,470,967;5,489,677;5,541,307;5,561,225;5,596,086;5,602,240;5,610,289;5,602,240;5,608,046;5,610,289;5,618,704;5,623,070;5,663,312;5,633,360;5,677,437;和5,677,439,这些都全文引入作为参考。
在其它核碱基寡聚物中,糖和核苷间连接,即骨架,被一些新的基团取代。核碱基单元保留与IAP杂交。这样的核碱基寡聚物被认为是肽核酸(PNA)。在PNA化合物中,寡核苷酸的糖骨架被含有酰胺的骨架取代,特别是氨基乙基甘氨酸骨架。核碱基被直接或间接的固定或束缚到骨架的酰胺部分的氮杂氮原子上。制备或应用这些核碱基寡聚物的方法记述在如″Peptide Nucleic Acids:Protocols andApplications″Ed.P.E.Nielsen,Horizon Press,Norfo1k,UnitedKingdom,1999中。教导制备PNA的典型的美国专利包括,但不局限于,美国专利号No.5,539,082;5,714,331;和5,719,262,每一篇都引入这里作为参考。关于PNA的进一步教导见Nielsen等,Science,1991,254,1497-1500。
在本发明的特别的实施例中,核碱基寡聚物具有硫代磷酸酯骨架和带有杂原子骨架的核苷,特别是-CH2-NH-O-CH2-,-CH2-N(CH3)-O-CH2-(已知的亚甲基(甲基亚氨基)或MMI骨架),-CH2-O-N(CH3)-CH2-,-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-,和-O-N(CH3)-CH2-CH2-。在其它的实施例中,寡核苷酸具有美国专利No.5,034,506描述的吗啉代骨架结构。
核碱基寡聚物还可以包含一或多个取代的糖部分。核碱基寡聚物在2’位含有下列基团:OH;F;O-,S-,或N-烷基;O-,S-,或N-烯基;O-,S-或N-炔基;或O-烷基-O-烷基,其中烷基、烯基、炔基可以是取代或未取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。特别优选的是O[(CH2)nO]mCH3,O(CH2)nOCH3,O(CH2)nNH2,O(CH2)nCH3,O(CH2)nONH2和O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2,其中n和m是从1至大约10。其它优选的核碱基寡聚物包括在2’位是下列基团之一:C1至C10低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基团、报道基团、嵌入剂、改善核碱基寡聚物药物代谢动力学性质的基团、或改善核碱基寡聚物药效学性质的基团、和具有相似性质的其它取代基。优选的修饰是2′-O-甲基和2′-甲氧基乙氧基(2′-O-CH2CH2OCH3,还公知为2′-O-(2-甲氧基乙基)或2′-MOE)。其它理想的修饰是2’-二甲基氨基氧乙氧基(即O(CH2)2ON(CH3)2,还公知为2’-DMAOE。其它的修饰包括,2’-氨基丙氧基(2′-OCH2CH2CH2NH2)和2’-氟(2′-F)。相似的修饰还可以是在寡核苷酸或其它核碱基寡聚物的其它位置,特别是在3’端核苷酸或2′-5′连接的寡核苷酸上的糖的3’位和5’端核苷酸的5’位。核碱基寡聚物还可以有糖的模拟物如环丁基部分来取代戊呋喃糖。教导这种经修饰的糖结构的制备的典型美国专利包括,但不局限于,美国专利No.4,981,957;5,118,800;5,319,080;5,359,044;5,393,878;5,446,137;5,466,786;5,514,785;5,519,134;5,567,811;5,576,427;5,591,722;5,597,909;5,610,300;5,627,053;5,639,873;5,646,265;5,658,873;5,670,633;和5,700,920,每一篇都全文引入作为参考。
核碱基寡聚物还可以包括核碱基修饰或取代。这里所使用的“未修饰”或“天然的”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G),及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T),胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修饰的核碱基包括其它合成和天然的核碱基,例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、6-甲基和其它腺嘌呤和鸟嘌呤的烷基衍生物;腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基或其它烷基衍生物;2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶;5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶;5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶;6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶;5-尿嘧啶(假尿嘧啶);4-硫尿嘧啶;8-卤代、8-氨基、8-巯基、8-硫烷基、8-羟基、和其它8-取代腺嘌呤和鸟嘌呤;5-卤代(如,5-溴代)、5-三氟甲基和其它5-取代尿嘧啶和胞嘧啶;7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤;8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤;7-去氮杂鸟嘌呤和7-去氮杂腺嘌呤;3-去氮杂鸟嘌呤和3-去氮杂腺嘌呤。更多的核碱基包括那些公开于美国专利No.3,687,808,The Concise Encyclopedia OfPolymer Science And Engineering,858-859页,Kroschwitz,J.I.,ed.John Wiley & Sons,1990,Englisch等,Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613,Sanghvi,Y.S.,Chapter 15,Antisense Research and Applications,289-302页,Crooke,S.T.和Lebleu,B.,ed.,CRC Press,1993中的核碱基。这些核碱基中的某些对于增强本发明的反义寡核苷酸的结合亲和力特别有用。包括5-取代的嘧啶,6-氮杂嘧啶,N-2、N-6、和O-6取代的嘌呤,包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代物显示出增强核苷酸双链稳定性0.6-1.2度。C.(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.and Lebleu,B.,eds.,Antisense Research andApplications,CRC Press,Boca Raton,1993,pp.276-278),是理想的碱基取代,当与2’-O-甲氧基乙基或2’-甲基糖基修饰结合时更是如此。教导上述经修饰的核碱基的某种及其它经修饰的核碱基的制备的典型的美国专利包括No.4,845,205;5,130,302;5,134,066;5,175,273;5,367,066;5,432,272;5,457,187;5,459,255;5,484,908;5,502,177;5,525,711;5,552,540;5,587,469;5,594,121;5,596,091;5,614,617;5,681,941;和5,750,692,每一篇都结合在此作为参考。
本发明的其它核碱基寡聚物的修饰包括向核碱基寡聚物上化学连接一个或多个能够增强寡核苷酸活性、细胞分配或细胞摄取的部分或共轭物。这样的部分包括但不局限于,脂质部分如胆固醇部分(Letsinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:6553-6556,1989),胆酸(Manoharan等,Bioorg.Med.Chem.Let,4:1053-1060,1994),硫醚,如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等,Ann.N.Y.Acad.Sci.,660:306-309,1992;Manoharan等,Bioorg.Med.Chem.Let.,3:2765-2770,1993),巯基胆固醇(0berhauser等,Nucl.Acids Res.,20:533-538:1992),脂肪族链,如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等,EMBO J.,10:1111-1118,1991;Kabanov等,FEBS Lett.,259:327-330,1990;Svinarchuk等,Biochimie,75:49-54,1993),磷脂,如二-十六烷基-rac-甘油或三乙铵1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-H-磷酸酯(Manoharan等,TetrahedronLett.,36:3651-3654,1995;Shea等,Nucl.Acids Res.,18:3777-3783,1990),聚胺或聚乙二醇链(Manoharan等,Nucleosides & Nucleotides,14:969-973,1995),或金刚烷乙酸(Manoharan等,Tetrahedron Lett.,36:3651-3654,1995),十六烷基部分(Mishra等,Biochim.Biophys.Acta,1264:229-237,1995),或十八氨基或己氨基-羰基-羟胆固醇部分(Crooke等,J.Pharmacol.Exp.Ther.,277:923-937,1996)。教导这些核碱基寡聚物共轭物制备的典型的美国专利包括No.4,587,263;4,605,735;4,667,025;4,762,779;4,789,737;4,824,941;4,818,979;4,835,263;4,876,335;4,904,582;4,948,882;4,958,013;5,082,830;5,109,124;5,112,963;5,118,802;5,138,045;5,214,136;5,218,105;5,245,022;5,254,469;5,258,506;5,262,536;5,272,250;5,292,873;5,317,098;5,371,241;5,391,723;5,414,077;5,416,203;5,151,463;5,486,603;5,510,475;5,512,439;5,512,667;5,514,785;5,525,465;5,541,313;5,545,730;5,552,538;5,565,552;5,567,810;5,574,142;5,578,718;5,580,731;5,585,481;5,587,371;5,591,584;5,595,726;5,597,696;5,599,923;5,599,928;5,608,046;和5,688,941,每一篇都全文引入作为参考。
本发明还包括嵌合化合物的核碱基寡聚物。“嵌合”核碱基寡聚物是包含两个或多个化学独立区域的核碱基寡聚物特别是寡核苷酸,每一个化学独立的区域都由至少一个单体单位组成,即,寡核苷酸中的核苷酸。这些核碱基寡聚物典型的具有至少一个区域,在该区域中核苷酸寡聚物被修饰,与核碱基寡聚物相比,经修饰的核苷酸寡聚物增强了对核酸酶降解作用的抵抗力,增加了细胞摄取,和/或增强了对靶核苷酸的结合亲和力。核碱基寡聚物的另外的区域用作能够裂解RNA:DNA或RNA:RNA杂交体的酶作用底物。例如,RNA酶H是细胞核酸内切酶,能够裂解RNA:DNA双链的RNA链。因此,激活RNA酶H导致靶RNA的剪切,由此大大的增强了核碱基寡聚物抑制基因表达的作用。因而,与杂交到相同靶区域的硫代磷酸酯脱氧寡核苷酸相比,使用嵌合核碱基寡聚物时产生相同结果的核碱基寡聚物更短。
本发明的嵌合核碱基寡聚物可以形成上述两种或多种核碱基寡聚物的复合结构。如果是寡核苷酸,这样的核碱基寡聚物在本领域称作杂交体或gapmer。教导这种杂交体结构的制备方法的典型的美国专利包括No.5,013,830;5,149,797;5,220,007;5,256,775;5,366,878;5,403,711;5,491,133;5,565,350;5,623,065;5,652,355;5,652,356;和5,700,922,每一篇都全文引入此处作为参考。
按照本发明应用的核碱基寡聚物可以通过公知的固相合成技术便利的常规的制备。这种合成所用的设备由如Applied Biosystems(Foster City,Calif.)等销售。其它的本领域公知的合成方法也可以使用。使用相似的技术制备寡核苷酸如硫代磷酸酯和烷基化衍生物是众所周知的。
本发明的核碱基寡聚物也可以与其它分子,分子结构或化合物的混合物混合,被包裹,共轭或与其他分子、分子结构或化合物的混合物联合,例如脂质体,受体靶向分子,口服,直肠,局部或其它制剂,以辅助摄取,分布和/或吸收。教导制备这种摄取、分布和/或吸收辅助药剂的方法的典型的美国专利包括No.5,108,921;5,354,844;5,416,016;5,459,127;5,521,291;5,543,158;5,547,932;5,583,020;5,591,721;4,426,330;4,534,899;5,013,556;5,108,921;5,213,804;5,227,170;5,264,221;5,356,633;5,395,619;5,416,016;5,417,978;5,462,854;5,469,854;5,512,295;5,527,528;5,534,259;5,543,152;5,556,948;5,580,575;和5,595,756,每一篇都全文引入作为参考。
本发明的核碱基寡聚物包括任何药学可接受的盐、酯、或这种酯的盐,或其它任何给予动物后能够提供(直接的或间接的)生物学活性的代谢物或其残余部分的化合物。相应的,例如,本发明的公开也涉及本发明化合物的前药和药学上可接受的盐,该前药的药学可接受的盐和其它生物等效物。
术语“前药”指以非活性形式制备,在内源性酶或其它化学试剂和/或条件的作用下在体内或其细胞中转化成活性形式(即,药物)的治疗剂。特别的,按照PCT公开号WO93/24510或WO94/26764公开的方法制备本发明的寡核苷酸前药模型SATE[(S-乙酰基-2-巯基乙基)磷酸盐]衍生物。
术语“药学可接受的盐”是指保留母体化合物的需要得到的生物学活性并且不传递不期望的毒物学作用的盐。药学可接受的碱加成盐是与金属或胺,如碱金属和碱土金属或有机胺类形成的。作为金属阳离子使用的例子是钠、钾、镁、钙等等。适当的胺类的例子是N,N′-二苄乙烯二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、二聚环戊二烯、二乙胺茶碱、N-甲基葡萄糖胺和普鲁卡因(例如,见Berge等,J.PharmaSci.,66:1-19,1977)。酸性化合物的碱加成盐以常规方式的通过游离酸与足够量的期望的碱接触生成盐而制备。以常规的方式使盐的形式接触酸并且分离游离酸可以使游离酸的形式再生。游离酸的形式与其盐的形式在一些物理性质如极性溶液中的溶解度上存在一定的差别,但是在其它方面,出于本发明的目的,盐等同于它们的游离酸。这里所使用的“药学上的加成盐”包括本发明的组合物的一种组分的酸形式的药学可接受的盐。包括胺类的有机或无机酸盐。优选的酸盐是盐酸盐、酯酸盐、水杨酸盐、硝酸盐和磷酸盐。其它的适当的药学可接受的盐是本领域技术人员公知的,包括多种无机和有机酸的碱性盐,无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸或磷酸;有机羧酸、磺酸、磺基或磷酸基的酸或N-取代的氨基磺酸,例如,酯酸、丙酸、羟乙酸、琥珀酸、马来酸、羟基马来酸、甲基马来酸、反丁烯二酸、苹果酸、酒石酸、乳酸、草酸、葡萄糖酸、葡萄糖二酸、葡糖醛酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、苯乙醇酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、2-苯氧苯甲酸、2-乙酰氧基苯甲酸、双羟萘酸、烟酸或异烟腙;及氨基酸例如自然界中参与蛋白质合成的20种α氨基酸,如谷氨酸或天门冬氨酸,还有苯乙酸、甲磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、乙烷-1,2-二磺酸、苯磺酸、4-甲苯磺酸、萘-2-磺酸、萘-1,5-二磺酸、2-或3-磷酸甘油酸、葡萄糖-6-磷酸盐、N-环己基氨基磺酸(形成环己氨基磺酸盐),或其它酸有机化合物,如抗坏血酸。化合物的药学可接受的盐可以用药学可接受的阳离子制备。适当的药学可接受的阳离子是本领域技术人员公知的,包括碱金属、碱土金属、铵和季铵的阳离子。碳酸盐和碳酸氢盐也可以。
对于寡核苷酸和其它核碱基寡聚物而言,适当的药学可接受的盐包括(i)与阳离子如钠、钾、铵、镁、钙、多胺如精胺和精脒等形成的盐;(ii)与无机酸,如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等形成的酸加成盐;(iii)与有机酸如醋酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、葡糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、鞣酸、棕榈酸、海藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、萘二磺酸、多聚半乳糖醛酸等等形成的盐;和(iv)由元素阴离子如氯、溴和碘得到的盐。
本发明还包括包含本发明的核碱基寡聚物的药物组合物和药剂。本发明的药物组合物可以以很多途径给药,取决于期望局部治疗还是全身疗法以及被治疗的面积。可以局部给药(包括眼部的和粘膜的包括阴道和直肠给药),肺的,如,通过吸入或吹入粉末剂或气雾剂,包括通过喷雾器;气管内,鼻内,表皮和透皮),口服或肠胃道外给药。肠胃道外给药包括静脉内,动脉内,皮下,腹膜内,或肌肉内注射或输注;或颅内,如,鞘膜内或心室内给药。
锁核苷酸(Locked nucleic acids)
锁核苷酸(LNAs)是可以用在本发明的核碱基寡聚物。LNAs包括一个能够限制核苷酸类似物的呋喃核糖环的灵活性并将其锁定在刚性的双环N-型构象的2’O,4’-C亚甲基桥。LNAs表现出对特定核酸外切酶和核酸内切酶的增强的耐受性并激活RNA酶H,几乎能够整合到任何核碱基寡聚物。而且,包含LNA的核碱基寡聚物可以用标准的亚磷酰胺合成实验设计制备。其它关于LNAs的详细内容见PCT申请WO99/14226和美国专利申请公开US2002/0094555A1,每一篇都合并在此作为参考。
阿拉伯糖核酸
阿拉伯糖核酸(ANAs)也可以用作本发明的方法和制剂中。ANAs是基于用D-阿拉伯糖代替天然的D-2’-去氧核糖的核碱基寡聚物。非衍生的ANA类似物与RNA的结合亲和力与硫代磷酸酯与RNA的结合亲和力相似。阿拉伯糖用氟衍生(2’F-ANA),将导致结合亲和力增强,并有效的选择性的水解所得到的ANA/RNA和F-ANA/RNA双链中的结合RNA。这些类似物的末端用简单的L糖衍生而使其在细胞介质中稳定。ANAs在治疗中的用途在如Damha等,Nucleosides Nucleotides&Nucleic Acids 20:429-440,2001中讨论。
核碱基寡聚物的传递
我们在此证明裸寡核苷酸能够进入肿瘤细胞并且抑制IAP表达。但是,也许期望使用一种制剂以辅助寡核苷酸或其它核碱基寡聚物传递入细胞(如,见美国专利No.5,656,611,5,753,613,5,785,992,6,120,798,6,221,959,6,346,613,和6,353,055,每一篇都结合在此作为参考。)。
核酶
包括本发明的反义IAP序列的催化性RNA分子或核酶在体内可以用于抑制IAP聚核苷酸的表达。反义RNAs中包含核酶序列赋予RNA裂解活性,因此增强了构建体的活性。这种目标RNA特异性核酶的设计和应用在Haseloff等,Nature 334:585-591。1988,and美国专利No.2003/0003469 A1中有所描述,每一篇都结合在此作为参考。
相应的,本申请涉及一种催化性RNA分子,其结合臂上包括一个具有8-19个连续核碱基的反义RNA,这些核碱基对应于表1,2,6和7中任意一个序列。在本发明的优选的实施例中,催化的核苷酸分子构成锤头型或发夹结构,也可以形成肝炎δ病毒的基序,组I内含子或RNA酶P RNA(与RNA引导序列联合)或链孢霉属VS RNA。这种锤头基序的例子在Rossi等,Aids Research and Human Retroviruses,8:183,1992中有所描述。发夹结构基序的例子在Hampel等,″RNACatalyst for Cleaving Specific RNA Sequences,″filed Sep.20,1989中有所描述,该文献是U.S.Ser.No.07/247,100filed Sept.20,1988,Hampel和Tritz,Biochemistry,28:4929,1989及Hampel等,Nucleic Acids Research,18:299,1990的连续。肝炎δ病毒基序的例子在Perrotta和Been,Biochemistry,31:16,1992中有所描述。链孢霉属VS核酶基序在Collins等的(Saville和Collins,Cell 61:685-696,1990;Saville and Collins,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:8826-8830,1991;Collins和Olive,Biochemistry 32:2795-2799,1993)中有所描述。这些特殊的基序不是对本发明的限制,本领域技术人员公知重要的是本发明中的酶核酸分子具有与一或多个靶基因RNA区域互被的特异的底物结合位点,并且具有赋予分子RNA裂解活性的位于底物结合位点中或环绕底物结合位点的核苷酸序列。
RNA干扰
本发明的核碱基寡聚物可以用于双链RNA中用于RNA干扰(RNAi)-介导的IAP表达的减少(knockdown)。RNAi是一种降低感兴趣的特定蛋白质细胞表达的方法(综述Tuschl,Chembiochem 2:239-245,2001;Sharp,Genes & Devel.15:485-490,2000;Hutvagner和Zamore,Curr.Opin.Genet.Devel.12:225-2322002;Hannon,Nature 418:244-251,2002)。在RNAi中,基因沉默通常由于细胞中双链RNA(dsRNA)的存在而在转录后激发。这些双链RNA被细胞内处理为被称作小干扰RNA(siRNA)的短链片段。通过dsRNA转染或通过使用基于质粒表达系统的siRNA表达而使siRNA进入细胞逐渐的用来在哺乳动物细胞中产生功能丧失表型。
本发明的一个实施方案中,制成包括八个至十九个连续的核碱基的本发明的核碱基寡聚物的双链RNA(dsRNA)分子。dsRNA可以是形成双链的两个不同RNA链或自身形成双链的单RNA链(小发夹结构(sh)RNA)。典型的,dsRNA是大约21或22个碱基对,如果需要可以更短或更长(直到大约29个碱基对)。dsRNA可由标准的技术制备(如,化学合成或体外转录)。例如可从Ambion(Austin,TX)和Epicentre(Madison,WI)得到试剂盒。哺乳动物细胞中的dsRNA表达的方法在Brummelkamp等Science 296:550-553,2002;Paddison等Genes & Devel.16:948-958,2002.Paul等Natufe Biotechnol.20:505-508,2002;Sui等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99:5515-5520,2002;Yu等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99:6047-6052,2002;Miyagishi等Nature Biotechnol.20:497-500,2002;Lee等Nature Biotechnol.20:500-505 2002中有所描述,这些都合并在此作为参考。
小发夹结构的RNA由一个具有可选的3’UU-突出的茎环结构组成。虽然存在差异,茎的范围是21至31bp(优选25至29bp),环的范围是4至30bp(优选4至23bp)。对于细胞内shRNA的表达,可使用包含多聚酶IIIH1-RNA或U6启动子、茎环结构插入的克隆位点,和4-5-脱氧胸腺嘧啶苷转录终止信号的质粒载体。多聚酶III启动因子通常具有界限清楚的起始和终止位点,它们的转录物缺少聚(A)尾部。这些启动子的终止信号被定义为聚脱氧胸腺嘧啶苷束,转录物典型的在第二尿嘧啶核苷后裂开。在这个位置的剪切产生一个在表达的shRNA中的3’UU突出,与合成的siRNA的3’突出相似。其它的在哺乳动物细胞中表达shRNA的方法在上面引用的参考文献中有所描述。
下面的例子用来解释本发明。但这不意味本发明仅限于此。