CN107106704A - 用于治疗癌症的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本文描述的是涉及使用例如适体‑siRNA嵌合体分子治疗癌症(例如乳腺癌)的方法和组合物。

Description

用于治疗癌症的方法和组合物
相关申请的交叉引用
根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2014年8月29日提交的美国临时申请No.62/043,803的权益，以引用的方式将其内容整体并入本文。
政府支持
本发明是用由美国国防部(Department of Defense)授予的基金号W81XWH-09-1-0058的联邦基金完成的。美国政府对本发明享有一定的权利。
序列表
本申请包括序列表，所述序列表已经以ASCII格式通过电子提交，并在此以引用的方式将其整体并入。所述ASCII副本创建于2015年8月28日，命名为701039-082401-PCT_SL.txt，并且大小为8,984字节。
技术领域
本文所述的技术涉及包含EpCAM结合分子和抑制性核酸的嵌合分子，以及使用此类组合来治疗癌症(例如上皮癌)的方法。
背景技术
已经探索了RNA干扰(RNAi)在减少肝脏中的基因表达方面的医疗用途。然而，肝脏是唯一易于转染RNAi分子的。在其它组织中小RNA递送和产生的基因敲减(geneknockdown)连续低效，并最终失效。特别地，递送障碍是利用RNAi治疗癌症的主要障碍。
发明内容
如本文所述，本发明人已经开发了新的嵌合的适体-siRNA分子(AsiC)。这些AsiC靶向癌细胞标记物以将siRNA特异性地导向癌细胞，增加递送效力和治疗有效性，同时降低副作用的可能性。
在一个方面，本文描述的是包含结合癌症标记物的适体结构域和抑制性核酸结构域的嵌合分子。在一些实施方式中，癌症标记物是EpCAM或EphA2。在一些实施方式中，抑制性核酸特异性地结合至在癌细胞中上调的基因产物。在一些实施方式中，抑制性核酸抑制选自于由如下所组成的组中的基因的表达：Plk1、MCL1、EphA2、PsmA2、MSI1、BMI1、XBP1、PRPF8、PFPF38A、RBM22、USP39、RAN、NUP205和NDC80。在一些实施方式中，癌症标记物是EpCAM，并且抑制性核酸结构域抑制Plk1的表达。
在一些实施方式中，所述分子是适体-siRNA嵌合体(AsiC)。在一些实施方式中，结合癌症标记物的适体结构域包含SEQ ID NO：33的序列。在一些实施方式中，结合癌症标记物的适体结构域基本上由SEQ ID NO：33的序列组成。在一些实施方式中，抑制性核酸结构域包含SEQ ID NO：2的序列。在一些实施方式中，抑制性核酸结构域基本上由SEQ ID NO：2的序列组成。在一些实施方式中，所述分子包含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3中的一种的序列。在一些实施方式中，所述分子基本上由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3中的一种的序列组成。
在一些实施方式中，所述分子的3′端包含dTdT。在一些实施方式中，所述分子包含至少一个2′-F嘧啶。
在一个方面，本文描述的是包含如本文所述的嵌合分子和药学上可接受的载体的药物组合物。在一些实施方式中，该组合物包含至少两种如本文所述的嵌合分子，其中，所述嵌合分子具有不同的适体结构域和/或抑制性核酸结构域。在一些实施方式中，不同的适体或抑制性核酸结构域识别不同的靶标。在一些实施方式中，不同的适体或抑制性核酸结构域具有多种序列并识别相同的靶标。
在一个方面，本文描述的是对癌症进行治疗的方法，所述方法包括给予如本文所述的嵌合分子和/或组合物。在一些实施方式中，癌症是上皮癌或乳腺癌。在一些实施方式中，乳腺癌是三阴性乳腺癌。在一些实施方式中，所述给予是皮下给予。在一些实施方式中，进一步向受试者给予额外的癌症治疗。在一些实施方式中，癌症治疗是紫杉醇。
附图说明
图1A至图1H表明EpCAM适体特异性地靶向基底细胞A(Basal A)乳腺癌细胞。包含EpCAM适体和PLK1siRNA(作为SEQ ID NO：1公开的有义链和作为SEQ ID NO：2公开的反义链)的EpCAM-AsiC的设计(图1C)。相较于正常的乳腺上皮细胞系(BPE)，上皮乳腺癌细胞系(BPLER)过表达EpCAM蛋白(图1A至图1B)。靶向GFP的EpCAM-AsiC是在反义siRNA链的3′端标记Cy3或Alexa647并与BPLER和BPE细胞一起孵育。24小时后通过流式细胞术对摄取进行评估(图1D)。数据代表了3次独立实验。Cy3和Alexa647标记的EpCAM-AsiC分别被MB468和BPLER(EpCAM+细胞)摄取，而未被BPE(EpCAM-)摄取。示出了各峰的MFI。为了对基因沉默(gene silencing)进行测试，用靶向GFP的EpCAM-AsiC(4μM)对BPLER和BPE进行处理，并与使用Dharmafect和GFP-siRNA(100nM)的转染对照进行比较。在孵育72小时后通过流式细胞术对敲减进行评估。对照是mock且仅Dharmafect处理(脂质)(n＝4)(图1D)。靶向AKT1的EpCAM-AsiC选择性地敲减基底细胞A和luminal型乳腺癌细胞系中的AKT1mRNA(图1E)和蛋白质(图1F)的表达，而不敲减基底细胞B或人成纤维细胞(hFb)中的AKT1mRNA和蛋白质的表达。用靶向AKT1的siRNA进行的转染在所有细胞系中诱导了基因敲减，而用靶向GFP的EpCAM-AsiC进行的处理不会影响AKT1mRNA和蛋白质水平(*p＜0.05，p＜0.01)。相较于EpCAM-AsiC对siRNA转染的作用的AKT1蛋白质和基因敲减的图。EpCAM-AsiC诱导的敲减与EpCAM表达相关(图1E至图1H)。(n＝3，归一化至mock的平均值±SEM，*P＜0.05，**P＜0.01，双尾(2-tailed)t检验)。
图2A至图2E表明靶向PLK1的EpCAM-AsiC特异性抑制基底细胞A乳腺癌细胞中的细胞增殖。使用cell-titer-glo测定法(CTG)，针对代表基底细胞A、基底细胞B和luminal型细胞系的10种乳腺癌细胞系，测试靶向PLK1的EpCAM-AsiC对细胞增殖的影响。靶向PLK1的EpCAM-AsiC在基底细胞A和luminal细胞系中均降低了细胞增殖，而对基底细胞B细胞无影响(图2A、图2C)。在EpCAM表达水平和细胞活力之间观察到相关性(图2B)。将基底细胞A(EpCAM+GFP-)细胞与BPE(EpCAM-GFP+)细胞共培养，并用靶向PLK1的EpCAM-AsiC进行处理或不进行处理。不进行处理的共培养物显示出与如下相似的细胞比例：靶向PLK1的EpCAM-AsiC处理后，EpCAM+细胞减少并且EpCAM-细胞增加。代表性的流式细胞术图(图2D)，实验定量分析了4种不同细胞系中的GFP+/GFP-细胞的比例(图2E)。(n＝4，*p＜0.05，p＜0.01)。
图3A至图3D表明人TNBC组织特异性地摄取Cy3-EpCAM适体。实验设计，向乳腺癌和对照的外植体添加靶向GFP的Cy3-EpCAM-AsiC、Alexa647-siRNA-GFP或Alexa647-chol-siRNA-GFP(各2μM)，并孵育24小时，然后用胶原酶将组织消化成单细胞悬浮液并通过流式细胞术进行分析(图3A)。肿瘤活检物过表达EpCAM和细胞角蛋白、上皮细胞标记物(图3B)。来自三个独立实验之一的代表性直方图显示出siRNA和chol-siRNA以类似的效力穿透肿瘤和健康组织，而EpCAM-AsiC被肿瘤组织活检物选择性地摄取但不被健康的对照组织样品摄取(图3C)。在来自三位不同患者的肿瘤中重复摄取实验，对于各处理组，将各活检获得物(biopsy receive)进行3次测试。所有三位患者的概况(图3D)。(n＝3，mock，灰色EpCAM，红色，*P＜0.05，**P＜0.005，t-检验CD4-AsiC相对于mock处理)。
图4A至图4C表明靶向PLK1的EpCAM-AsiC特异性地抑制基底细胞A乳腺癌细胞中的肿瘤启动。乳腺癌细胞系的集落试验用靶向PLK1或GFP的EpCAM-AsiC(4μM)或者紫杉醇(100nM)处理24小时，并在无药物培养基中培养8天。用紫杉醇进行的处理减少了所有细胞系中的集落形成，而用靶向PLK1的EpCAM-AsiC进行的处理仅消除了luminal型(MCF7)和基底细胞A(HCC1954)细胞中的集落形成，用靶向GFP的EpCAM-AsiC进行的处理无作用(图4A)。在3个以上的细胞系中重复该试验，并且结果是可重复的(图4B)。乳腺球形成试验示出了类似的结果，靶向PLK1的EpCAM-AsiC仅在基底细胞A和luminal型细胞中减少细胞球数目，而对基底细胞B细胞无影响(图4C)。用靶向GFP或PLK1的EpCAM-AsiC对MB468-luc细胞处理24小时，并皮下注射至裸鼠的侧腹。每5天对小鼠成像，持续20天。未经处理的小鼠和用靶向GFP的EpCAM-AsiC处理的小鼠显示肿瘤启动的增加，而用靶向PLK1的EpCAM-AsiC预处理的细胞注射的小鼠无肿瘤启动。
图5A至图5C表明Alexa750-EpCAM-AsiC被选择性摄取至EpCAM+肿瘤中。图5A描绘了实验设置；用MB468-luc(左侧腹)和MB231-luc-mCherry(右侧腹)细胞注射裸鼠，注射后5天，将Alexa750标记的靶向GFP的EpCAM-AsiC(0.5mg/kg)经皮下注射至颈部。在注射后立即对小鼠成像，并且24小时、48小时和5天后再次成像。将Alexa750标记的靶向GFP的EpCAM-AsiC与MB468-luc肿瘤(EpCAM+)而不是MB231-luc-mCherry(EpCAM-)肿瘤中的荧光素酶肿瘤共定位。7只小鼠的分析证明在MB468(EpCAM+)肿瘤中的Alexa750显著增加(图5B)。图5C描绘了Alexa750摄取速率的曲线图。
图6A至图6B表明靶向PLK1的EpCAM-AsiC特异性地抑制基底细胞A乳腺癌细胞中的肿瘤生长。图6A描绘了实验设计。每72小时用5mg/Kg的靶向PLK1或GFP的EpCAM-AsiC对注射了MB231-luc-mCherry细胞(5×105)或MB468-luc细胞(5×106)的裸鼠进行处理，或不对其进行处理。图6B：用靶向PLK1的EpCAM-AsiC处理的MB468-luc肿瘤在早至处理后6天尺寸缩小，并且许多小鼠中在14天后完全消失。未经处理的EpCAM+和EpCAM-肿瘤在14天内尺寸增加。
图7表明EpCAM-AsiC在人和小鼠血清中是稳定的。将使用2′-氟-嘧啶合成的eGFPEpCAM-AsiC、化学上稳定的胆固醇缀合的eGFP siRNA(chol-siRNA)或未经修饰的eGFPsiRNA与等体积的人或小鼠血清一起孵育。每隔一段时间取出等分试样，重悬于加载缓冲液的凝胶中，并在变性PAGE凝胶上进行电泳之前在-80℃下储存。示出了染色后通过光密度法定量的2个独立实验的条带的平均强度(±S.E.M.)。
图8A至图8B表明注射EpCAM-AsiC不刺激小鼠中的先天免疫。对小鼠皮下注射eGFPEpCAM-AsiC(5mg/kg，n＝3)或腹腔注射聚(I：C)(5mg/kg或50mg/kg，n＝2/剂量)。图8A：通过多重免疫测定来评估在基线以及处理后6小时和16小时收集的血清样品的IFNβ、IL-6和IP-10进行评估。相较于基线，*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001。图8B：在处理后16小时收获的总的脾细胞中，通过qRT-PCR相对于gapdh对IFN诱导基因和细胞因子的mRNA表达进行评估。相较于未经处理的(NT，n＝3)，**p＜0.01。
图9描绘了序列的表格。(按出现的顺序分别为SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：2和SEQID NO：23至SEQ ID NO：32)。
图10A至图10B描绘了适体-siRNA嵌合体(AsiC)。图10A描绘了特异性地识别癌细胞表面受体的AsiC(共价地连接至siRNA的一条链的适体)的图，AsiC被内吞并随后释放到细胞溶质，其中，AsiC像内源性pre-miRNA一样被处理以敲减靶基因。条棒指出了两种递送障碍(hurdle)：在Dicer和RNA诱导的沉默复合物(RISC)定位处，细胞摄取并从内体释放至细胞溶质。图10B描绘了靶向PLK1的EpCAM-AsiC的设计。(作为SEQ ID NO：1公开的有义链和作为SEQ ID NO：2公开的反义链)。
图11A至图11D表明EpCAM-AsiC敲减和抗肿瘤作用与EpCAM水平相关，并抑制上皮乳腺肿瘤T-IC。图11A至图11B：代表性实验(图11A)以及脂质siRNA转染与EpCAM-AsiC相较的AKT1敲减(图11B)。图11C：仅在EpCAM+细胞系中EpCAM-AsiC敲减PLK1的抗增殖作用。图11D PLK1EpCAM-AsiC抑制luminal型MCF和基底细胞-A TNBCHCC1143中的集落形成，但不抑制间充质基底细胞-B MB231细胞中的集落形成。
图12A至图12B表明功能性EphA2适体的鉴定。图12A：EphA2+基底细胞-B MB231细胞与EphA2适体(EphA2apt)的孵育引起EphA2降解和活性Akt(pAkt)的瞬时减少。图12B：与EphA2apt(0至100nM)而非对照的非结合适体(ctl)孵育2小时的EphA2+乳腺癌细胞，显示出减少的EphA2。加入EphrinA用作EphA2降解的阳性对照。
图13A至图13C表明，仅在EpCAM+细胞系中、而非在永生化的乳腺上皮细胞系(BPE)或间充质的基底细胞B TNBC或人成纤维细胞中，EpCAM-AsiC敲减GFP蛋白(图13A)和AKT1mRNA(图13B至图13C)。经转染的siRNA在其敲减中是非特异性的。*P＜0.05。
图14，将来自相同受试者的正常乳腺组织和基底细胞-A TNBC肿瘤活检物与经Cy3-标记的EpCAM-AsiC孵育，3天后对单细胞悬浮液分析通过流式细胞术进行的摄取。裸siRNA均不被摄取，胆固醇缀合的siRNA被等同地摄取，但是EpCAM-AsiC被肿瘤特异性地摄取。左侧示出了代表性组织。
图15A至图15C。在T-IC功能的体外试验中，用PLK1EpCAM-AsiC对EpCAM+(而非EpCAM-)乳腺癌系进行处理抑制了集落(图15A、图15B)和乳腺球(图15C)功能。
图16表明用PLK1EpCAM-AsiC离体处理MB468细胞消除了它们在裸鼠中形成肿瘤的能力。在处理后的第二天植入等同数目的活细胞。
图17A至图17B表明EpCAM-AsiC被选择性地摄取至EpCAM+肿瘤，而非EpCAM-、TNBC肿瘤。图17A描绘了实验方案。图17B描绘了在处死时经切除的肿瘤中的EpCAM-AsiC的浓度。
图18A至图18B表明PLK1EpCAM-AsiC引起EpCAM+TNBC异种移植物的完全的肿瘤消退，但对EpCAM-基底细胞-B异种移植物无影响。图18A描绘了实验设计。在2周内序贯地进行左侧腹肿瘤和右侧腹肿瘤的荧光素酶活性成像。图18B描绘了荧光素酶活性表征的肿瘤大小的图。在用PLK1AsiC处理的小鼠中，所有的EpCAM+肿瘤快速消退，而其它肿瘤继续生长。
图19A至图19C表明基底细胞依赖性基因包括4个tri-snRNP剪接体复合基因(PFPF8、PRPF38A、RBM22、USP39)、2个核出口基因(nuclear export genes)(NUP205、RAN)和着丝粒基因(NDC80)。图19A描绘了在敲减3天后归一化至对照siRNA的细胞活力。图19B描绘了在敲减2天后通过接种活细胞评估的集落形成。图19C描绘了在敲减2天后的半胱天冬酶活化对MB468是特异性的，而不在BPE细胞中发生。
图20描绘了用于多聚化EpCAM-AsiC以改善胞吞作用的一些可能的设计。在这些设计中，有义链和反义链可互换，并且可以改变接头。
图2lA至图21D表明EpCAM适体特异性地靶向基底细胞A乳腺癌细胞。图21A描绘了含有EpCAM适体和PLK1siRNA(作为SEQ ID NO：1公开的有义链和作为SEQ ID NO：2公开的反义链)的EpCAM-AsiC的设计。图21B描绘了表明相较于正常的乳腺上皮细胞系(BPE)，上皮乳腺癌细胞系(BPLER)过表达EpCAM蛋白的图。靶向GFP的EpCAM-AsiC是在反义siRNA链的3′端标记的Alexa647或Cy3，并与BPLER和BPE细胞孵育。24小时后通过流式细胞术对摄取进行评估(图21C)。数据表示3个独立实验。Cy3和Alexa647标记的EpCAM-AsiC分别被MB468和BPLER(EpCAM+细胞)摄取，而未被BPE(EpCAM-)摄取。示出了各峰的MFI(mock，灰色)。图21D描绘了实验的图，其中，为了测定基因沉默，用靶向GFP的EpCAM-AsiC(4μM)对BPLER和BPE进行处理，并与使用Dharmafect和GFP-siRNA(100nM)的转染对照进行比较。在孵育后72小时通过流式细胞术对敲减进行评估。对照是mock且仅Dharmafect处理(脂质)。(n＝4)。
图22描绘了表明EpCAM适体不结合小鼠EpCAM的图。使用以mCD326抗体进行的流式细胞术对小鼠ESA(EpCAM)水平进行测定。4T1细胞(上皮小鼠乳腺癌细胞系)显示出高表达水平的EpCAM。RAW(小鼠单核细胞系)和MB468(人基底细胞A细胞系)均显示出EpCAM表达方面的增加，但比起4T1细胞小得多。小鼠间充质癌细胞系(67NR)显示出EpCAM表达方面的增加最小。摄取实验表明EpCAM-适体既不被4T1细胞摄取也不被67NR细胞摄取。
图23描绘了表明EpCAM在基底细胞A和luminal型乳腺癌细胞系中过表达，而不在基底细胞B乳腺癌细胞系中过表达的图。针对8种不同的乳腺癌细胞系的代表性FACS图，通过使用hEpCAM抗体的流式细胞术对EpCAM表达水平进行测试。EpCAM在所有的基底细胞A细胞系和luminal型细胞系中过表达，而在基底细胞B中细胞系未过表达(mock，阴影灰色，EpCAM，黑色)
图24A至图24F表明EpCAM AsiC特异性地在基底细胞A乳腺癌细胞中使基因表达沉默。靶向AKT1的EpCAM-AsiC在基底细胞A和luminal型乳腺癌细胞系中、而不在基底细胞B或人成纤维细胞(hFb)中选择性地敲减AKT1mRNA(图24A)和蛋白质(图24B、图24C)的表达。用靶向AKT1的siRNA进行的转染在所有的细胞系中诱导基因敲减，而用靶向GFP的EpCAM-AsiC进行的处理不会影响AKT1mRNA和蛋白质水平(*p＜0.05，p＜0.01)。比较了EpCAM-AsiC对siRNA转染的影响的AKT1蛋白质和基因敲减的图。EpCAM-AsiC诱导的敲减与EpCAM表达相关(图24D、图24E)。(n＝3，归一化至mock的平均值±SEM；*P＜0.05，**P＜0.01，双尾t检验)。图24F描绘了流式细胞术分析的结果。
图25A至图25E表明人TNBC组织特异性地摄取Cy3-EpCAM适体。图25A描绘了实验设计；向乳腺癌和对照外植体加入靶向GFP的Cy3-EpCAM-AsiC、Alexa647-siRNA-GFP或Alexa647-chol-siRNA-GFP(各2μM)，并孵育24小时，然后用胶原酶将组织消化成单细胞悬浮液并通过流式细胞术进行分析。图25B描绘了表明肿瘤活检物过表达EpCAM和细胞角蛋白(上皮细胞标记物)的图。图25C描绘了来自三个独立实验之一的代表性直方图，显示出siRNA和chol-siRNA均能穿透肿瘤和健康组织，具有相似的效力，而EpCAM-AsiC被肿瘤组织活检物选择性地摄取，而不被健康的对照组织样品摄取。在来自三位不同患者的肿瘤中重复摄取实验，各处理中对获得的各活检物测定3次。图25D描绘了代表性肿瘤。所有三位患者的概述在图25E中进行了描绘。(n＝3，*P＜0.05，**P＜0.005，t-检验CD4-AsiC相对于mock处理)。
图26描绘了表明EpCAM-AsiC被健康和结肠癌活检物摄取的图。向结肠癌和对照外植体加入靶向GFP的Cy3-EpCAM-AsiC、Alexa647-siRNA-GFP或Alexa647-chol-siRNA-GFP(各2μM)，并孵育24小时，然后用胶原酶将组织消化为单细胞悬浮液并通过流式细胞术进行分析。代表性直方图显示出EpCAM-AsiC、siRNA和chol-siRNA以相似的效力穿透肿瘤和健康组织。
图27A至图27D表明靶向PLK1的EpCAM AsiC特异性地抑制基底细胞A乳腺癌细胞中的细胞增殖。使用细胞滴度试验(CTG)，针对代表基底细胞A、基底细胞B和luminal型细胞系的10个乳腺癌细胞系测试靶向PLK1的EpCAM-AsiC对细胞增殖的影响。靶向PLK1的EpCAM-AsiC降低了基底细胞A和luminal型细胞系中的细胞增殖，而对基底细胞B细胞无影响(图27A)。在EpCAM表达水平和细胞活力之间观察到相关性(图27B)。将基底细胞A(EpCAM+GFP-)细胞与BPE(EpCAM-GFP+)细胞共培养，并用靶向PLK1的EpCAM-AsiC进行处理或不进行处理。在靶向PLK1的EpCAM-AsiC处理后，未经处理的共培养物显示出相似的细胞比例，EpCAM+细胞的比率减少且EpCAM-细胞的比率增加。图27C描述了代表性的流式细胞术图，图27D描绘了实验的定量图，其分析了4种不同细胞系中的GFP+/GFP-细胞的比率。(n＝4，*p＜0.05，p＜0.01)。
图28描绘了表明基底细胞A乳腺癌细胞系中的细胞活力的特异性降低是PLK1依赖的图。用靶向PLK1的EpCAM-AsiC或仅用EpCAM-适体对代表基底细胞A、基底细胞B和luminal型细胞的10种不同的乳腺癌细胞系进行处理，并与未经处理的对照进行比较。用EpCAM-适体处理的细胞系均未显示出细胞存活力的降低，而基底细胞A和luminal型细胞系在用靶向PLK1的EpCAM-AsiC处理后显示出细胞活力降低。
图29A至图29C表明靶向PLK1的EpCAM AsiC特异性地抑制基底细胞A乳腺癌细胞中的肿瘤启动。用靶向PLK1或GFP的EpCAM-AsiC(4μM)或紫杉醇(100nM)对乳腺癌细胞系的集落试验处理24小时，并在无药物培养基中培养8天。紫杉醇的处理减少了所有细胞系中的集落形成，而用靶向PLK1的EpCAM-AsiC的处理仅消除了luminal型细胞(MCF7)和基底细胞A(HCC1954)细胞中的集落形成，用靶向GFP的EpCAM-AsiC的处理无作用。图29A描绘了试验结果的图像。如图29B所描绘的图所示，在3个以上的细胞系中重复该试验，结果是可重复的。图29C描绘了表明细胞球形成试验显示出类似结果的图，靶向PLK1的EpCAM-AsiC仅在基底细胞A和luminal型细胞中减少细胞球的数量，而对基底细胞B细胞无影响。用靶向GFP或PLK1的EpCAM-AsiC对MB468-luc细胞处理24小时，并皮下注射至裸鼠的侧腹。每5天对小鼠进行成像，持续20天。未经处理的小鼠和用靶向GFP的EpCAM-AsiC处理的小鼠显示出肿瘤启动方面的增加，而用靶向PLK1的EpCAM-AsiC预处理的细胞注射小鼠无肿瘤启动。
图30A至图30B表明EpCAM AsiC在人和小鼠血清中稳定36小时。将各自处于100μlPBS的使用2′-氟-嘧啶合成的靶向GFP的EpCAM-AsiC、化学稳定的21聚体(21-mer)胆固醇缀合的GFP-siRNA(chol-siRNA)和未经修饰的21-mer GFP-siRNA加入至100μl的人或小鼠血清。每隔一段时间取出20μL，并重悬浮在凝胶载样缓冲液中，并在-80℃下冷冻，然后在变性PAGE凝胶上电泳。图30A描绘了代表性的PAGE凝胶，图30B描绘了通过光密度测定法分析的来自两个独立实验的条带的平均强度(±S.E.M.)的图。稳定化的胆固醇缀合的siRNA和EpCAM-AsiC在实验的36小时内均是稳定的。
图31A至图3lB表明Alexa750-EpCAM-AsiC被选择性地摄取至EpCAM+肿瘤中。图31A描绘了实验设置；向裸鼠注射MB468-luc(左侧腹)和MB231-luc-mCherry(右侧腹)细胞，注射后5天，将Alexa750标记的靶向GFP的EpCAM-AsiC(0.5mg/kg)经皮下注射至颈部。在注射后立即对小鼠成像，并在注射后24小时、48小时和5天后再次成像。将Alexa750标记的靶向GFP的EpCAM-AsiC与MB468-luc肿瘤(EpCAM+)而非MB231-luc-mCherry(EpCAM-)肿瘤中的荧光素酶肿瘤共定位。图31B描绘了7只小鼠的分析图，表明MB468(EpCAM+)肿瘤中的Alexa750显著增加。在第5天，除去肿瘤并将其可视化，以验证Alexa750标记的靶向GFP的EpCAM-AsiC确实进入了肿瘤。增加的Alexa750水平与mCherry水平呈负相关。(n＝8，*P＜0.05，t检验，EpCAM+相对于EpCAM-细胞)。
图32A至图32B表明靶向PLK1的EpCAM AsiC特异性地抑制基底细胞A乳腺癌细胞中的肿瘤生长。图32A描绘了实验设置，每72小时，用5mg/Kg的靶向PLK1或GFP的EpCAM-AsiC对注射了MB231-luc-mCherry细胞(5×105)或MB468-luc细胞(5×106)的裸鼠进行处理，或不对其进行处理。使用IVIS Spectra成像系统每72h对小鼠进行成像，进行14天。图32B描绘了如下的图，所述图表明用靶向PLK1的EpCAM-AsiC处理的MB468-luc肿瘤在早至处理后6天内尺寸缩小，并且许多小鼠中在14天后完全消失。未经处理的肿瘤EpCAM+和EpCAM-在14天内尺寸增加。
图33描绘了肿瘤生长的图，所述图表明MB468肿瘤仅在用PLK1EpCAM-AsiC处理后消退。当肿瘤变得可触诊时，用5mg/kg RNA 2x/wk开始对具有皮下的(sc)MB468肿瘤的小鼠进行处理。如所示的，对PLKlEpCAM-AsiC、GFP SpCAM-AsiC、EpCAM适体、PLK1siRNA和mock处理的样品进行分析。
图34表明在用PLK1EpCAM-AsiC处理的细胞中PLK1siRNA与Argonaute(AGO)相关。将用PLK1EPCAM-AsiC或siRNA处理2天的MB-468细胞裂解，并用泛-AGO抗体或IgG同种型对照对细胞裂解物进行免疫沉淀。通过Taqman qRT-PCR对免疫沉淀物中的PLK1siRNA的量进行定量，以相对于miR-16的log2具有SEM的平均值表示。通过Student′s t-检验，相较于siRNA处理的细胞，**P＜0.01。ND，不可检测。在用PLK1EpCAM-AsiCs处理后，在RISC中发现PLK1siRNA。然而，Ago免疫沉淀未显著耗尽来自上清液的PLK1siRNA。这可能是因为通过细胞摄取的大多数RNA不会从内体释放到细胞溶质(A.Wittrup等，Visualizing lipid-formulated siRNA release from endosomes and target gene knockdown.NatureBiotechnology 2015，在版)。
图35表明PLK EpCAM AsiC阻抑MCF10CA1a(CA1a)肿瘤生长。顶部图描绘了实验方案。在该实验中，将AsiC经皮下注射入肿瘤附近的侧腹中，但不注射入肿瘤中。底部图描绘了肿瘤的Log2总的发光光子通量的图(N＝4)，通过Student′st检验，*P＜0.05。
具体实施方式
本发明人已经证明了AsiC(适体-siRNA嵌合分子)在治疗癌症中的出乎预料的效力。本文所述的AsiC利用将嵌合分子特异性地靶向至癌细胞的适体，提供了通过siRNA靶向的基因的有效中靶阻抑。
特别地，本文所述的适体(例如靶向EpCAM和EphA2的适体)允许靶向肿瘤起始细胞(也称为癌症干细胞)的治疗。这些细胞不仅负责肿瘤起始、复发和转移，而且还相对地耐受常规细胞毒性治疗。因此，本文所述的组合物和方法允许以现有治疗未能实现的方式有效治疗基础病理。本文所述的AsiC的成功特别令人惊讶的是，先前已经对用抗体直接靶向EpCAM进行研究，并发现其缺乏有效性。
此外，本文所述的AsiC被证明在治疗上皮癌(如乳腺癌，例如三阴性乳腺癌(TNBC))中是出乎预料地有效的。目前尚未有针对TNBC的靶向治疗，并且可用的治疗通常在3年内引起转移，导致死亡。相较于健康细胞，本文所述的AsiC特异性地在luminal型和基底细胞-A TNBC细胞中表现出有效的基因敲减，在体外阻抑集落和乳腺球形成，并离体消除肿瘤启动。用AsiC进行的体外治疗引起治疗性靶向递送和快速肿瘤消退。
在一个方面，本文描述了包含结合癌症标记物的结构域和抑制性核酸结构域的嵌合分子。本文所使用的“结合癌症标记物的结构域”是指相较于相同类型的健康细胞，可以特异性地结合至癌细胞表面上更高表达的分子(癌症标记物)的结构域和/或分子。在一些实施方式中，癌症标记物可以是蛋白质和/或多肽。在一些实施方式中，癌症标记物可以选自EpCAM或EphA2。在一些实施方式中，结合癌症标记物的结构域可以是适体。
本文所使用的“EpCAM”或“上皮细胞粘附分子”是指介导上皮细胞中的Ca2+非依赖性同型细胞-细胞粘附的跨膜糖蛋白。对于多种物种而言，EpCAM的序列是已知的，例如人EpCAM(参见例如NCBI Gene ID：4072；蛋白质序列：NCBI Ref Seq：NP_002345.2)。
本文所使用的“EphA2”或“EPH受体A2”是指ephirin型蛋白-酪氨酸激酶受体。EphA2结合肝配蛋白-A(ephrin-A)配体，并允许Kaposi肉瘤相关的疱疹病毒进入宿主细胞。对于多种物种而言，EphA2的序列是已知的，例如人EphA2(参见例如NCBI Gene ID：1969；蛋白质序列：NCBI Ref Seq：NP_004422.2)。
本文所使用的“抑制性核酸结构域”是指包含抑制性核酸的结构域。在一些实施方式中，抑制性核酸可以是siRNA。
抑制性核酸结构域可以抑制(例如可以靶向)在癌细胞中上调的基因产物的表达和/或细胞生长和/或存活所需的基因的表达。在一些实施方式中，抑制性核酸结构域可以抑制选自如下的基因的表达：Plk1(例如“polo样激酶1”，NCBI Gene ID：5347)、MCL1(例如骨髓细胞白血病1，NCBI Gene ID：4170)、EphA2(NCBI Gene ID：1969)、PsmA2(例如蛋白酶体亚基α2，NCBI Gene ID：5683)、MSI1(例如musashi RNA结合蛋白1，NCBI Gene ID：4440)、BMI1(例如B淋巴瘤Mo-MLV插入物1，NCBI Gene ID：648)、XBP1(X-盒结合蛋白1，NCBI GeneID：7494)、PRPF8(例如mRNA前体处理因子8，NCBI Gene ID：10594)、PFPF38A(例如mRNA前体处理因子38A，NCBI Gene ID：84950)、RBM22(例如RNA结合模体蛋白22，NCBI Gene ID：55696)、USP39(例如泛素特异性肽酶39，NCBI Gene ID：10713)、RAN(例如ras相关核蛋白，NCBI Gene ID：5901)、NUP205(例如核孔蛋白205kDa，NCBI Gene ID：23165)和NDC80(例如NDC80着丝粒复合组分，NCBI Gene ID：10403)。这些基因的序列(例如人mRNA)易于从NCBI数据库获得，并且可由本领域技术人员用于设计抑制性核酸。此外，本文提供了示例性的抑制性核酸结构域，例如，具有SEQ ID NO：2的序列的核酸。
在一些实施方式中，本文所述的组合物可以包含含有适体的结合癌症标记物的结构域和含有siRNA的抑制性核酸结构域，例如，该组合物可以包含适体-siRNA嵌合体(AsiC)。
在一些实施方式中，本文所述的方法涉及用本文所述的组合物对患有或被诊断为患有癌症的受试者进行治疗。患有癌症的受试者可以通过医生使用当前的诊断癌症的方法来鉴定。表征这些病症和帮助诊断的癌症的症状和/或并发症是本领域众所周知的，包括但不限于例如在乳腺癌的情况下：乳腺组织中的团块或肿块(lump或mass)、整个乳房或乳房的部分肿胀、皮肤刺激、乳房凹陷、乳房或乳头疼痛、乳头内陷、发红、多鳞、或者乳房或乳头的刺激以及乳头溢液。可能有助于诊断例如乳腺癌的测试包括但不限于乳腺x光片、x射线、MRI、超声、乳腺导管造影摄片、活组织检查和导管灌洗。癌症的家族史或暴露至癌症的危险因素(例如烟雾、辐射、污染物、BRCA1突变等)也可以帮助确定受试者是否可能患有癌症或帮助进行癌症诊断。
本文所使用的术语“恶性肿瘤”、“恶性病症”、“癌症”或“肿瘤”是指干扰机体器官和系统的正常功能的细胞不受控生长。
本文所使用的术语“癌症”通常涉及其中的异常细胞不受控地分裂并可侵入附近组织的一类疾病或病症。癌细胞也可以通过血液和淋巴系统传播到机体的其它部分。
“癌细胞”或“肿瘤细胞”是指癌性生长的单个细胞或组织。肿瘤通常指通过细胞的异常生长形成的肿胀或损伤，其可以是良性的、恶变前的或恶性的。大多数癌细胞形成肿瘤，但是一些(例如白血病)不一定形成肿瘤。对于形成肿瘤的那些癌细胞而言，术语癌症(细胞)和肿瘤(细胞)可互换使用。
患有癌症或肿瘤的受试者是在受试者身体中存在客观上可测量的癌细胞的受试者。在该定义中包括恶性的、主动增殖性癌症，以及潜在的休眠肿瘤或微转移瘤。从其原始位置迁移并播种至其它重要器官的癌症可以通过受影响器官的功能退化最终导致受试者死亡。造血癌(例如白血病)能够与受试者中的正常造血区室竞争，从而导致造血失败(处于贫血、血小板减少症和中性粒细胞减少症的形式)，最终导致死亡。
癌症的实例包括但不限于恶性肿瘤(carcinoma)；淋巴瘤；胚细胞瘤；肉瘤；白血病；基底细胞恶性肿瘤；胆管癌；膀胱癌；骨癌；脑癌和CNS癌；乳腺癌；腹膜癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠癌和直肠癌；结缔组织癌；消化系统癌；子宫内膜癌；食管癌；眼癌；头颈癌；胃癌(包括胃肠癌)；胶质母细胞瘤(GBM)；肝恶性肿瘤(hepatic carcinoma)；肝细胞瘤(hepatoma)；上皮内瘤变；肾癌(kidney cancer或renal cancer)；喉癌；白血病；肝癌(liver cancer)；肺癌(例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)；淋巴瘤，包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤；黑素瘤；骨髓瘤；神经母细胞瘤；口腔癌(例如，唇、舌、口和咽)；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸系统癌症；唾液腺癌；肉瘤；皮肤癌；鳞状细胞癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫或子宫内膜癌；泌尿系统癌；外阴癌以及其它恶性肿瘤和肉瘤；以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞(SL)NHL、中级/滤泡NHL、中级弥漫性NHL、高级免疫母细胞性NHL、高级淋巴母细胞NHL、高级小无裂细胞NHL、肿块性疾病NHL、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤和华氏巨球蛋白血症)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；急性淋巴细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性髓细胞性白血病；以及移植后淋巴增生性紊乱(PTLD)；以及与瘢痣病、水肿(例如与脑肿瘤相关的水肿)和Meigs综合征相关的异常血管增生。在一些实施方式中，癌症可以是上皮癌。在一些实施方式中，癌症可以是乳腺癌。在一些实施方式中，癌症可以是三阴性乳腺癌。
“癌细胞”是体内、离体或在组织培养物中的癌性、癌前或转化的细胞，其具有不一定涉及摄取新遗传物质的自发或诱导的表型变化。尽管转化可以源自转化病毒的感染和新的基因组核酸的整合、或外源核酸的摄取，但是其也可以自发地发生或在暴露至致癌物质后发生，从而使内源基因突变。转化/癌症与以下有关：例如形态学改变、细胞永生化、异常生长控制、病灶形成、非贴壁依赖性、恶性肿瘤、接触抑制丧失和生长密度限制、生长因子或血清独立性、肿瘤特异性标记物、侵袭性或转移性、在合适的动物宿主(例如裸鼠)中的肿瘤生长。参见例如Freshney，CULTURE ANIMAL CELLS：MANUAL BASIC TECH。(第三版，1994)。
本文所述的组合物和方法可给予至患有或被诊断为患有癌症的受试者。在一些实施方式中，本文所述的方法包括向受试者给予有效量的本文所述的组合物以减轻癌症的症状。本文所使用的“减轻癌症的症状”是改善与癌症相关的任何病症或症状。相较于等同的未经处理的对照，此类减轻是通过任何标准技术测量减轻至少5％、10％、20％、40％、50％、60％、80％、90％、95％、99％以上。本领域技术人员已知用于将本文所述的组合物给予至受试者的多种手段。此类方法可以包括但不限于：口服给予、胃肠外给予、静脉内给予、肌内给予、皮下给予、经真皮给予、气道给予(气溶胶)、肺部给予、皮肤给予、局部给予、注射给予或瘤内给予。给予可以是局部的或全身性的。在一些实施方式中，给予是皮下给予。在一些实施方式中，本文所述的AsiC的给予是经皮下给予。
本文所使用的术语“有效量”是指缓解疾病或紊乱的至少一种或多种症状所需的组合物的量，并涉及足以提供期望效果的药物组合物的量。因此，术语“治疗有效量”是指当给予至典型受试者时，足以提供特定抗癌效果的量。在各种背景下，本文所使用的有效量也包括足以推迟疾病症状进展的量、足以改变疾病症状进程(例如但不限于延缓疾病症状的进展)的量、或足以逆转疾病症状的量。因此，指定确切的“有效量”通常是不实际的。然而，对于任何给定的情况，适当的“有效量”可以由本领域普通技术人员仅使用常规实验来确定。
有效量、毒性和治疗效果可以通过细胞培养物或实验动物中的标准药学程序来确定，例如用于确定LD50(使群体50％致死的剂量)和ED50(在群体50％中治疗有效的剂量)的药学程序。剂量可以根据所采用的剂型和所利用的给予途径而变化。毒性作用和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，并可表示为比例LD50/ED50。表现出大的治疗指数的组合物和方法是优选的。治疗有效剂量可以从细胞培养物检测初步估算。另外，剂量可在动物模型中制定以达到循环血浆浓度范围，所述循环血浆浓度范围包括在细胞培养物中或在合适的动物模型中确定的IC50(即，达到症状的半数最大抑制的组合物的浓度)。血浆中的水平可以通过例如高效液相色谱法进行测量。任何特定剂量的影响可以通过合适的生物测定法进行监测，例如用于其中包括肿瘤大小的测定法。所述剂量可以由医师来确定并在必要时进行调整，以适合所观察到的治疗效果。
在一些实施方式中，本文所述的技术涉及本文所述的药物组合物以及任选的药学上可接受的载体。药学上可接受的载体和稀释剂包括盐水、水性缓冲溶液、溶剂和/或分散媒介物。本领域公知此类载体和稀释剂的使用。可作为药学上可接受的载体的材料的一些非限制性实例包括：(1)糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素和醋酸纤维素；(4)黄蓍胶粉；(5)麦芽；(6)明胶；(7)润滑剂，例如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠和滑石；(8)赋形剂，例如可可脂和栓蜡；(9)油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇，例如丙二醇；(11)多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇(PEG)；(12)酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；(22)填充剂，例如多肽和氨基酸；(23)血清成分，例如血清白蛋白、HDL和LDL；(24)C2-C12醇，例如乙醇；以及(25)用于药物制剂中的其它无毒相容物质。润湿剂、着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、调味剂、芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可以存在于制剂中。术语例如“赋形剂”、“载体”、“药学上可接受的载体”等在本文中可互换使用。在一些实施方式中，例如如本文所述的，载体抑制活性试剂的降解。
在一些实施方式中，本文所述的药物组合物可以是胃肠外剂型。由于胃肠外剂型的给予通常绕开患者对污染物的天然防御，胃肠外剂型优选是无菌的或能够在给予患者之前灭菌。胃肠外剂型的实例包括但不限于：准备用于注射的溶液剂、待溶解或悬浮于用于注射的药学上可接受的载体中的干燥产品、准备用于注射的混悬剂、以及乳液。此外，可制备控释的胃肠外剂型用来给予患者，包括但不限于型剂型和剂量倾泻(dose-dumping)。
可以用来提供胃肠外剂型的公开的合适的载体对本领域技术人员来说是公知的。实例包括但不限于：无菌水；USP注射用水；盐水溶液；葡萄糖溶液；水性载体，例如但不限于氯化钠注射液、林格氏注射液、右旋糖注射液、右旋糖和氯化钠注射液、以及乳酸林格氏注射液；与水混溶的载体，例如但不限于乙醇、聚乙二醇和丙二醇；以及非水性载体，例如但不限于玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯和苯甲酸苄酯。改变或修饰本文所公开的组合物的药学上可接受的盐的溶解度的化合物也可以纳入本公开内容的胃肠外剂型中，包括常规和控释的胃肠外剂型。
药物组合物也可以配制成适合于口服给予，例如作为离散剂型，例如但不限于片剂(包括但不限于刻痕片剂或包衣片剂)、丸剂、囊片剂、胶囊剂、可咀嚼片剂、粉包剂(powder packets)、扁囊剂、含片、晶片、气溶胶喷雾剂；或液体剂，例如但不限于糖浆剂、酏剂、在水性液体中的溶液剂或混悬剂、非水性液体、水包油乳液或油包水乳液。此类组合物含有所公开的化合物的预定量的药学上可接受的盐，并可以使用本领域技术人员所熟知的药物学方法制备。通常参见，Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第21版，Lippincott，Williams和Wilkins，Philadelphia，PA(2005)。
常规剂型通常提供药物从制剂中的快速或立即释放。根据药物的药理学和药代动力学，使用常规剂型可使得患者的血液和其它组织中的药物浓度的大幅波动。这些波动可能影响许多参数，例如剂量频率、起效时间、疗效的持续时间、治疗性血液水平的维持、毒性、副作用等。有利的是，控释制剂可用于控制药物的起效时间、作用持续时间、治疗窗内的血浆水平以及峰值血液水平。特别是，控释或缓释(extended-release)剂型或制剂可用于确保实现药物的最大效果，同时使潜在的副作用和安全隐患最小化，副作用和安全隐患可能在药物的不足量给药(即，低于最低治疗水平)以及超过药物的毒性水平时出现。在一些实施方式中，组合物能够以持续释放(sustained release)制剂给予。
控释药物产品具有改进药物治疗高于通过它们的非控释对应物所实现的治疗的共同目标。理想的是，在医学治疗中使用优化设计的控释制剂的特性在于，使用最少的药物物质在最短时间内治愈或控制病情。控释制剂的优点包括：1)延长药物活性；2)降低剂量频率；3)提高患者依从性；4)使用较少的药物总量；5)减少局部或全身性副作用；6)使药物累积最小化；7)减少血液水平的波动；8)改善治疗功效；9)减少药物活性的增强作用或损失；以及10)改善疾病或病症的控制速度(Kim，Cherng-ju，Controlled Release Dosage FormDesign，2(Technomic Publishing，Lancaster，Pa.：2000))。
大多数控释制剂被设计为最初释放一定量的药物(有效成分)，以立即产生期望的治疗效果，并逐步且持续地释放另外量的药物以在一段长的时间内维持这一水平的治疗或预防作用。为了在体内维持药物的这一恒定水平，药物必须从剂型中以一定速度释放以置换药物从体内代谢和排出的量。活性成分的控释可以受到多种条件的刺激，包括但不限于：pH、离子强度、渗透压、温度、酶、水以及其它的生理病症或化合物。
各种已知的控释或缓释剂型、制剂和装置可适于用于本公开所述的盐和组合物。实例包括但不限于在以如下中描述的实例：美国专利号3,845,770、3,916,899、3,536,809、3,598,123、4,008,719、5,674,533、5,059,595、5,591,767、5,120,548、5,073,543、5,639,476、5,354,556、5,733,566以及6,365,185B1；以引用的方式将其各自并入本文。这些剂型可用于使用例如羟丙基甲基纤维素、其它聚合物基质、凝胶、可透膜、渗透系统(如(Alza Corporation，Mountain View，Calif.USA))或它们的组合提供一种或多种活性成分的缓慢释放或控释，从而提供期望的不同比例的释放曲线。
本文所述的方法可以进一步包括向受试者给予第二药剂和/或治疗，例如作为组合治疗的一部分。第二药剂和/或治疗的非限制性实例可包括放射疗法、手术、吉西他滨、顺铂(cisplastin)、紫杉醇、卡铂(carboplatin)、硼替佐米、AMG479、伏立诺他、利妥昔单抗、替莫唑胺、雷帕霉素、ABT-737、PI-103；烷化剂，例如噻替哌和环磷酰胺；烷基磺酸酯，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶，例如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌、meturedopa和uredopa；乙撑亚胺和甲基蜜胺(methylamelamines)，包括六甲蜜胺、三乙基三聚氰酰胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺；多聚乙酰(特别是布拉它辛和布拉它辛酮)；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康)；苔藓虫素；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；cryptophycins(特别是cryptophycin 1和cryptophycin 8)；多拉司他汀；duocarmycin(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；eleutherobin；pancratistatin；sarcodictyin；spongistatin；氮芥，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、盐酸氧氮芥、苯丙氨酸氮芥、新氮芥、苯芥胆甾醇(phenesterine)、松龙苯芥、氯乙环磷酰胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲(nitrosureas)，例如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，例如烯二炔抗生素(例如卡奇霉素，特别是卡奇霉素γ1I和卡奇霉素ωIl(参见例如Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.，33：183-186(1994))；dynemicin，包括dynemicin A；双膦酸盐，例如氯膦酸盐；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素发色团和相关的色素蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、carabicin、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌素、色霉素(chromomycinis)、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素(包括吗啉代阿霉素、氰基吗啉代阿霉素、2-吡咯啉并阿霉素和去氧阿霉素)、表柔比星、依索比星、去甲氧基柔红霉素、麻西罗霉素、丝裂霉素例如丝裂霉素C、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲佐菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物，例如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸、氨甲蝶呤、蝶罗呤、曲美沙特；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如环胞苷、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素，例如卡鲁睾酮、丙酸甲雄烷酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺，例如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，例如亚叶酸(frolinic acid)；乙酰葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛；地吖醌；elformithine；依利醋铵；埃博霉素；乙环氧啶；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明(lonidainine)；美登木素(maytansinoids)，例如美登素(maytansine)和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸乙肼；甲基苄肼；多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，Oreg.)；雷佐生；根霉素；西佐喃(sizofuran)；螺旋锗；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2’，2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯族毒素(特别是T-2毒素、疣孢菌素A(verracurinA)、杆孢菌素A和蛇形菌素)；氨基甲酸酯；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替哌；紫杉烷，例如紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)、Cremophor-free、紫杉醇的白蛋白工程化纳米颗粒制剂(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，I11.)和doxetaxel(Rhone-Poulenc Rorer，Antony，法国)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；吉西他滨；6-硫代鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；铂类似物，例如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；NAVELBINETM长春瑞滨；诺消灵；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊立替康(Camptosar，CPT-11)(包括伊立替康与5-FU和甲酰四氢叶酸的治疗方案)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇，例如视黄酸；卡培他滨；考布他汀；甲酰四氢叶酸(LV)；奥沙利铂，包括奥沙利铂治疗方案(FOLFOX)；拉帕替尼(TykerbTM)；减少细胞增殖的PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR(例如，厄洛替尼())和VEGF-A的抑制剂，以及任何上述物质的药学上可接受的盐、酸或者衍生物。
此外，治疗方法还可以包括使用放射或放射治疗。此外，治疗方法还可以包括使用手术治疗。
在本文所述的任何方面的一些实施方式中，本文所述的嵌合分子可以与紫杉烷(例如多西他赛或紫杉醇)组合给予。在本文所述的任何方面的一些实施方式中，本文所述的嵌合分子可与紫杉醇组合给予。在本文所述的任何方面的一些实施方式中，如本文所述的AsiC可以与紫杉烷组合给予。在本文所述的任何方面的一些实施方式中，如本文所述的AsiC可以与紫杉醇组合给予。
在某些实施方式中，本文所述的组合物的有效剂量可以一次给予患者。在某些实施方式中，组合物的有效剂量可以重复给予患者。对于全身给予，可以给予患者治疗量的组合物，包括例如0.1mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg、或更多。
在一些实施方式中，在初始治疗方案之后，可以在不太频繁的基础上给予治疗。例如，在每两周治疗进行三个月后，治疗可每月重复一次至六个月或一年或更长时间。根据本文所述的方法的治疗可以降低标志物的水平或病症的症状，例如降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％或更多。
本文所述的组合物的剂量可以由临床医师确定并在必要时进行调整，以适应观察到的治疗效果。至于治疗持续时间和治疗的频率，一般由熟练的临床医师监测受试者以确定何时治疗提供治疗效果，并确定是否增加或减少剂量、增加或降低给予频率、不继续治疗、恢复治疗或对治疗方案作出其它改变。给药计划可以每周一次至每天一次变化，这取决于许多临床因素，例如受试者对组分的敏感性。活性作用的期望的剂量或量可一次给予或分成亚剂量，例如2-4个亚剂量并在一段时间内(例如，以一天内的适当时间间隔或其它适当的计划)给予。在一些实施方式中，给予可以是长期的，例如在数周或数月的时间段内每天一次或多次给药和/或治疗。给药和/或治疗计划的实例是在1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月或更长的时间段内，每天给予、每天两次、每天三次或者每天四次或更多次给予。组合物可以在一段时间内给予，例如在5分钟、10分钟、15分钟、20分钟或25分钟内。
为了方便起见，在说明书、实施例和附加的权利要求书中使用的一些术语和短语的含义在如下提供。除非另有说明或从上下文中暗示得到，下列术语和短语包含下面所提供的含义。提供这些定义以帮助描述特定的实施方式，而并不打算限制所要求保护的发明，因为本发明的范围仅通过权利要求书加以限定。除非另有定义，本文所使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属技术领域中的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。如果在本领域中的术语的使用与本文所提供的定义之间存在明显的差异，则以本说明书中提供的定义为准。
为了方便起见，本文在说明书、实施例和附加的权利要求书中使用的一些术语汇集在此处。
本文所使用的术语“减少”、“降低的”、“降低”或“抑制”都是指降低统计学上显著的量。在一些实施方式中，“下降”、“降低”、“减少”或“抑制”通常是指与参照水平(例如，缺少给定的治疗)相比减少至少10％，并且可以包括例如减少至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％、或更多。如本文所使用的“降低”或“抑制”并未涵盖与参照水平相比的完全抑制或降低。“完全抑制”是与参照水平相比的100％的抑制。减少可以优选下降至在没有给定的紊乱的个体的正常范围内接受的水平。
本文所使用的术语“增加的/增高的”、“增加/增高”、“增强”或“激活/活化”都是指增加统计学上显著的量。在一些实施方式中，术语“增加的/增高的”、“增加/增高”、“增强”或“激活/活化”可意味着与参照水平相比增加至少10％，例如增加至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或上至并包括100％的增加、或与参照水平相比的10-100％之间的任意增加、或者至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍或至少约10倍的增加、或与参照水平相比的2倍至10倍之间的任意增加或更多。在标志物或症状的语境下，“增加/增高”是以此类水平的统计学上的显著增加/增高。
本文所使用的“受试者”是指人或动物。通常动物是脊椎动物，例如灵长类动物、啮齿类动物、家养动物或狩猎动物。灵长类动物包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴、以及猕猴例如恒河猴。啮齿类动物包括小鼠、大鼠、旱獭、雪貂、兔和仓鼠。家养动物和狩猎动物包括奶牛；马；猪；鹿；野牛；水牛；猫科动物，例如家猫；犬科动物，例如狗、狐狸、狼；鸟类，例如鸡、鸸鹋、鸵鸟；以及鱼类，例如鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼。在一些实施方式中，受试者是哺乳动物，例如灵长类动物，例如人。术语“个体”、“患者”和“受试者”在本文中可互换使用。
优选地，受试者是哺乳动物。所述哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或奶牛，但不限于这些实例。除了人之外的哺乳动物可以有利地用作代表癌症的动物模型的受试者。受试者可以是雄性或雌性。
受试者可以是先前已被诊断或确认为患有或具有需要治疗的病症(例如癌症)或者患有或具有与此类病症相关的一种或多种并发症的受试者，并且可选地已经接受对癌症的治疗或对与癌症相关的一种或多种并发症的治疗。或者，受试者也可以是先前没有被诊断为患有癌症或与癌症相关的一种或多种并发症的受试者。例如，受试者可以是显示出癌症的一个或多个风险因素或者显示出与癌症相关的一种或多种并发症的一个或多个风险因素的受试者、或未显示风险因素的受试者。
治疗特定病症的“有需要的受试者”可以是具有下述病症的受试者：诊断为具有该病症或诊断为具有发展出该病症的风险。
本文所使用的术语“蛋白”和“多肽”在本文中互换使用，以指定一连串的氨基酸残基，所述氨基酸残基通过在相邻残基的α-氨基基团和羧基基团之间的肽键相互连接。无论其大小或功能，术语“蛋白”和“多肽”是指氨基酸的聚合物，所述氨基酸包括经修饰的氨基酸(例如，磷酸化、糖化、糖基化等)和氨基酸类似物。“蛋白”和“多肽”通常用来指比较大的多肽，而术语“肽”通常用于指小的多肽，但是在本领域中这些术语的用法重叠。当指基因产物及其片段时，术语“蛋白”和“多肽”在本文中互换使用。因此，示例性的多肽或蛋白包括基因产物、天然存在的蛋白、同源物、直系同源物、旁系同源物、片段和上述物质的其它等同物、变型、片段和类似物。
本文所使用的术语“核酸”或“核酸序列”是指并入核糖核酸、脱氧核糖核酸或它们的类似物的单元的任何分子，优选聚合分子。核酸可以是单链或双链的。单链核酸可为变性的双链DNA的一条核酸链。或者，单链核酸可为并非衍生自任何双链DNA的单链核酸。在一个方面，核酸可以是DNA。在另一方面，核酸可以是RNA。合适的核酸分子是DNA、包括基因组DNA或cDNA。其它合适的核酸分子是RNA、包括mRNA。
给定基因的表达的抑制剂可为抑制性核酸或抑制性寡核苷酸。在一些实施方式中，抑制性核酸为抑制性RNA(iRNA)。在一些实施方式中，抑制性核酸为抑制性DNA(iDNA)。双链RNA分子(dsRNA)已显示出以称为RNA干扰(RNAi)的高度保守的调控机制阻断基因表达。本文所述的抑制性核酸可以包括具有长度为30个或更少的核苷酸(即，长度为8-30个核苷酸、长度通常为19-24个核苷酸)的区域的RNA链或DNA链(反义链)，该区域实质上与靶基因的转录物的前体或成熟形式的至少一部分互补。使用这些抑制性寡核苷酸使得可以靶向降解靶基因，引起靶基因的表达和/或活性降低。
本文所使用的术语“抑制性寡核苷酸”、“抑制性核酸”或“反义寡核苷酸”(ASO)是指含有寡核苷酸(例如介导RNA转录物靶向裂解的DNA或RNA分子)的试剂。在一个实施方式中，本文所述的抑制性寡核苷酸影响靶基因的表达和/或活性的抑制。在本发明方法和组合物中有用的抑制性核酸包括反义寡核苷酸、核酶、外源指导序列(EGS)寡核苷酸、siRNA化合物、单链或双链RNA干扰(RNAi)化合物(例如siRNA化合物)、经修饰的碱基/锁核酸(LNA)、antagomirs、肽核酸(PNA)以及与靶核酸的至少一部分杂交并调节其功能的其它寡聚化合物或寡核苷酸模拟物。在一些实施方式中，抑制性核酸包括反义RNA、反义DNA、嵌合反义寡核苷酸、包含经修饰的连接的反义寡核苷酸、干扰RNA(RNAi)、短干扰RNA(siRNA)；微干扰RNA(miRNA)；时序调节小RNA(stRNA)；或短发夹RNA(shRNA)；小RNA诱导的基因激活(RNAa)；小的活化RNA(saRNA)或它们的组合。关于抑制性核酸的进一步公开，请参见US2010/0317718(反义寡核苷酸)、US2010/0249052(双链核糖核酸(dsRNA))、US2009/0181914和US2010/0234451(LNA)、US2007/0191294(siRNA类似物)、US2008/0249039(经修饰的siRNA)、以及WO2010/129746和WO2010/040112(抑制性核酸)。
在某些实施方式中，用抑制剂(例如抑制性寡核苷酸)接触细胞，使得细胞中的靶mRNA水平降低为在不存在抑制性寡核苷酸的细胞中发现的靶mRNA水平的至少约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约99％、上至并包括100％。
本文所使用的术语“iRNA”是指含有本文所定义的术语RNA的试剂，并通过RNA诱导的沉默复合物(RISC)通路来介导RNA转录物的靶向切割。在一个实施方式中，本文所述的iRNA影响靶基因的表达和/或活性的抑制。在一个方面，RNA干扰剂包括与靶RNA序列相互作用以指导靶RNA切割的单链RNA。不希望受理论的束缚，引入植物和无脊椎动物细胞中的长的双链RNA通过称为Dicer的III型内切核酸酶分解成siRNA(Sharp等，Genes Dev.，2001，15：485)。Dicer(核糖核酸酶-III样酶)将dsRNA加工成具有特征性的两个碱基3′突出端(overhangs)的19-23个碱基对的短干扰RNA(Bernstein等，(2001)，Nature，409：363)。然后，将siRNA并入RNA诱导的沉默复合物(RISC)中，其中一个或多个解旋酶使siRNA双链体解旋，使得互补的反义链能够指导靶向识别(Nykanen等，(2001)，Cell，107：309)。在结合至适当的靶mRNA时，RISC内的一个或多个内切核酸酶对靶标进行切割，以诱导沉默(Elbashir等，(2001)Genes Dev.，15：188)。因此，一方面，RNA干扰剂涉及促进包含单链RNA的RISC复合物形成的双链RNA，所述单链RNA指导复合物在靶转录物的靶区域处切割以影响靶基因的沉默。
在一些实施方式中，抑制性寡核苷酸可以是双链核酸(例如dsRNA)。双链核酸包含两条核酸链，两条核酸链充分互补，以在使用双链核酸的情况下杂交形成双链体结构。双链核酸的一条链(反义链)包括互补区域，该区域与靶序列基本上互补、且通常完全互补。靶序列可以衍生自在靶基因的表达过程中形成的mRNA和/或成熟的miRNA的序列。另一条链(正义链)包含互补至反义链的区域，从而使得当在适当的条件下结合时，两条链杂交并形成双链体结构。通常，双链体结构的长度介于8至30个碱基对之间，包括端值；更通常在18至25个碱基对之间，包括端值；更通常在19至24个碱基对之间，包括端值；并且最通常在19至21个碱基对之间，包括端值。类似地，与靶序列互补的区域的长度介于8至30个核苷酸之间，包括端值；更通常在18至25个核苷酸之间，包括端值；更通常在19至24个核苷酸之间，包括端值；并且最通常在19至21个核苷酸之间，包括端值。在一些实施方式中，dsRNA的长度介于15至20个核苷酸之间，包括端值；并且在另外的实施方式中，dsRNA的长度介于25和30个核苷酸之间，包括端值。正如普通技术人员会认识到的，靶向用于切割的RNA的靶向区域最通常是较大的RNA分子(通常是mRNA分子)的一部分。相关地，mRNA和/或miRNA靶标的“部分”是具有足以成为用于反义导向的裂解(即，通过RISC通路裂解)的底物的长度的mRNA靶标的连续序列。在一些情况下，具有短至8个碱基对的双链体的双链核酸可以介导反义导向的的RNA裂解。最常见的靶标在长度上将是至少15个核苷酸、优选在长度上为15-30个核苷酸。
本领域技术人员还将认识到，双链体区域是双链抑制性核酸的主要功能部分，例如8至36个(例如15-30个)碱基对的双链体区域。因此，在一个实施方式中，在将其加工成例如15-30个碱基对的功能性双链体(靶向用于裂解的期望RNA)的程度上，抑制性核酸分子或具有超过30个碱基对的双链体区域的抑制性核酸分子的复合物是双链核酸。因此，普通技术人员将认识到，在一个实施方式中，miRNA是dsRNA。在另一实施方式中，dsRNA不是天然存在的miRNA。在另一实施方式中，在靶细胞中通过切割较大的双链核酸分子不产生用于靶向靶基因表达的抑制性核酸试剂。
虽然靶序列的长度通常为15-30个核苷酸，但是对于指导任何给定的靶RNA的切割而言，在该范围内的特定序列的适合性方面存在广泛的变化。当靶向miRNA时，靶序列可以短至8个核苷酸，包括“种子”区(例如核苷酸2-8))。本文提出的各种软件包和指南为任何给定基因靶标的最佳靶序列的鉴别提供了指引，但也可以采用经验方法，其中，将给定大小(非限制性实例如，21个核苷酸)的“窗口”或“掩码(mask)”在字面上或象征性地(包括例如在计算机上)放置在靶RNA序列上，以鉴别可用作靶序列的大小范围内的序列。通过将序列“窗口”逐渐移动到初始靶序列位置的上游或下游的一个核苷酸，可以鉴别下一个潜在靶序列，直到针对所选择的任何给定靶大小鉴别出可能序列的完整组。当用抑制性核酸试剂靶向时，这一过程与所鉴别序列的系统合成和测试(使用本文所述的测定或本领域已知的测定)一起以鉴别最佳表现的那些序列，当用抑制性核酸试剂靶向时，可以鉴别出介导靶基因表达的最佳抑制的那些RNA序列。
本文所述的双链抑制性核酸可以进一步包括一个或多个单链核苷酸突出端。双链抑制性核酸可以通过如下文进一步讨论的本领域已知的标准方法合成，例如通过使用例如可从Biosearch，Applied Biosystems，Inc商购获得的自动化DNA合成仪。在一个实施方式中，双链抑制性核酸的反义链在3′端和/或5′端具有1-10个核苷酸突出端。在一个实施方式中，双链抑制性核酸的有义链在3′端和/或5′端具有1-10个核苷酸突出端。在一个实施方式中，双链抑制性核酸的至少一个末端具有1至4个、通常1或2个核苷酸的单链核苷酸突出端。具有至少一个核苷酸突出端的双链抑制性核酸相对于其平端对应物具有出乎意料的优异的抑制性。
在另一实施方式中，突出端中的一个或多个核苷酸被核苷硫代磷酸酯取代。
本文所使用的术语“核苷酸突出端”是指从抑制性核酸(例如dsRNA)的双链体结构突出的至少一个未配对的核苷酸。例如，当双链抑制性核酸的一条链的3′-端延伸超过另一条链的5′-端时，存在核苷酸突出端，反之亦然。双链抑制性核酸可以包含至少一个核苷酸的突出端；或者，突出端可以包含至少两个核苷酸、至少三个核苷酸、至少四个核苷酸、至少五个核苷酸或更多。核苷酸突出端可以包含核苷酸/核苷类似物，或由核苷酸/核苷类似物组成，所述核苷酸/核苷类似物包括脱氧核苷酸/核苷。突出端可以在有义链、反义链或它们的任何组合上。此外，突出端的核苷酸可存在于双链抑制性核酸的反义链或有义链的5′端、3′端或两端。
关于双链抑制性核酸，本文所使用的术语“平端的(blunt)”或“平端”是指在dsRNA的给定末端没有未配对的核苷酸或核苷酸类似物，即没有核苷酸突出。双链抑制性核酸的一个或两个末端可以是平端的。当双链抑制性核酸的两端均是平端的时，该双链抑制性核酸被称为是平端的。将清楚的是，“平端”双链抑制性核酸是在两端均为平端的双链抑制性核酸，即在分子的任一端均没有核苷酸突出端。最常见的是，这种分子在其整个长度上是双链的。
在这一方面，两条链的一条与该两条链的另一条互补，其中一条链与靶基因前体或成熟miRNA的序列基本上互补。因此，在这方面，双链抑制性核酸将包括两种寡核苷酸，其中一种寡核苷酸被描述为有义链，并且第二种寡核苷酸被描述为有义链的相应的反义链。如本文其它地方所述的和本领域已知的，与在分离开的寡核苷酸上相反，双链抑制性核酸的互补序列也可以作为单个核酸分子的自身互补区而被含有。
技术人员将充分意识到的是，具有20至23个、特别是21个碱基对的双链体结构的抑制性核酸被认为在诱导反义介导的抑制中特别有效(Elbashir等，EMBO 2001，20：6877-6888)。然而，其他人已经发现，更短或更长的抑制性核酸也可能是有效的。
此外，在考虑之列的是，对于任何序列鉴定，可以通过系统地添加或移除核苷酸以产生更长或更短的序列并对那些序列以及通过将更长或更短尺寸的窗口从该点向上或向下移动靶标RNA而产生的序列进行测定，从而实现进一步的优化。此外，将产生新的候选靶标的这种方法偶联至本领域已知的或如本文所述的在抑制测定中基于那些靶序列的抑制性核酸的有效性的测试，可以使得抑制效力进一步提高。此外，可以通过例如引入如本文所述的或本领域已知的经修饰的核苷酸、添加或改变突出端、或本领域已知的和/或本文所讨论的其它修饰(例如增加血清稳定性或循环半衰期、增加热稳定性、增强跨膜递送、靶向至特定位置或细胞类型、增加与沉默途径酶的相互作用、增加从内体的释放等)来对这种经优化的序列进行调整，以进一步优化作为表达抑制剂的分子。
本文所述的抑制性核酸可以含有一个或多个与靶序列的错配。在一个实施方式中，本文所述的抑制性核酸含有不超过3个错配。如果抑制性核酸的反义链含有与靶序列的错配，则优选错配区域不位于互补区域的中心。如果抑制性核酸的反义链含有与靶序列的错配，则优选将错配限制在互补区域的5′端或3′端的最后5个核苷酸内。例如，对于与靶基因或其前体的区域互补的23个核苷酸的抑制性核酸试剂链，所述链通常在中心13个核苷酸内不含有任何错配。本文所述的方法或本领域已知的方法可用于确定含有与靶序列错配的抑制性核酸是否能有效抑制靶基因的表达。重要的是考虑具有错配的抑制性核酸在抑制靶基因表达中的效力，尤其是当已知靶基因中互补的特定区域具有在群体内的多态性序列变异时。
在另一实施方式中，抑制性核酸(例如dsRNA)的核酸在化学上修饰以增强稳定性或其它有益的特性。本发明中的特色的核酸可以通过本领域良好地建立的方法修饰和/或合成，例如描述于“Current protocols in nucleic acid chemistry”，Beaucage，S.L.等(编)，John Wiley&Sons，Inc.，New York，NY，USA中的方法，以引用的方式将其并入本文。修饰包括：例如(a)端修饰，例如5’端修饰(磷酸化、缀合、反向连接等)、3’端修饰(缀合、DNA核苷酸、反向连接等)；(b)碱基修饰，例如，用稳定碱基、不稳定碱基、或与扩大谱系的伴侣配对的碱基进行的置换，移除碱基(脱碱基核苷酸)，或缀合碱基；(c)糖修饰(例如，在2’位或4’位)或糖置换；以及(d)骨架修饰，包括磷酸二酯连接的修饰或置换。用于本文所述的实施方式中的核酸化合物的具体实例包括但不限于含有经修饰的骨架或非天然的核苷间连接的核酸。其中，具有经修饰的骨架的核酸包括在骨架中不具有磷原子的核酸。为了本说明书的目的，并且如本领域有时所引用的，在它们的核苷间的骨架中不具有磷原子的经修饰的核酸也可以被认为是寡核苷酸。在特定的实施方式中，经修饰的核酸将会在其核苷间的骨架中具有磷原子。
经修饰的骨架可以包括例如：具有正常的3’-5’连接的硼烷磷酸酯(boranophosphates)、磷硫酰、手性磷硫酰、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯(包括3’-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、亚膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3’-氨基磷酸氨基酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫羰氨基磷酸酯、硫羰烷基膦酸酯和硫羰烷基磷酸三酯；它们的2’-5’连接的类似物；以及具有反极性的物质(其中，相邻的核苷单元对以3’-5’至5’-3’或2’-5’至5’-2’连接)。各种盐、混合盐和游离酸形式也包括在内。
教导制备上述含磷连接的代表性的美国专利包括但不限于：美国专利No.3,687,808、4,469,863、4,476,301、5,023,243、5,177,195、5,188,897、5,264,423、5,276,019、5,278,302、5,286,717、5,321.131、5,399,676、5,405,939、5,453,496、5,455,233、5,466,677、5,476,925、5,519,126、5,536,821、5,541,316、5,550,111、5,563,253、5,571,799、5,587,361、5,625,050、6,028,188、6,124,445、6,160,109、6,169,170、6,172,209、6,239,265、6,277,603、6,326,199、6,346,614、6,444,423、6,531,590、6,534,639、6,608,035、6,683,167、6,858,715、6,867,294、6,878,805、7,015,315、7,041,816、7,273,933、7,321,029、和美国专利RE39464，以引用的方式将其各自并入本文。
在其中不包含磷原子的经修饰的骨架具有通过如下形成的骨架：短链烷基或环烷基核苷间连接、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间连接、或者一个或多个短链杂原子或杂环核苷间连接。这些骨架包括：具有吗啉代连接(部分由核苷的糖部分形成)的骨架；硅氧烷骨架；硫化物骨架、亚砜骨架或砜骨架；formacetyl骨架和thioformacetyl骨架；methylene formacetyl骨架和methylene thioformacetyl骨架；含烯烃骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚氨基骨架和亚甲基肼基骨架；磺酸酯骨架和磺胺骨架；酰胺骨架；以及其它的具有混合的N、O、S和CH2组成部分的骨架。
教导制备上述寡核苷酸的代表性的美国专利包括但不限于：美国专利Nos.5,034,506、5,166,315、5,185,444、5,214,134、5,216,141、5,235,033、5,64,562、5,264,564、5,405,938、5,434,257、5,466,677、5,470,967、5,489,677、5,541,307、5,561,225、5,596,086、5,602,240、5,608,046、5,610,289、5,618,704、5,623,070、5,663,312、5,633,360、5,677,437和5,677,439，以引用的方式将其各自并入本文。
适于或考虑用于抑制性核酸中的其它核酸模拟物中，核苷酸单元的糖和核苷间连接(即骨架)用新的基团所取代。碱基单元被维持用于与适当的核酸靶化合物杂交。一种此类寡聚化合物(已显示具有良好的杂交性质的核酸模拟物)被称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，核酸的糖骨架被含酰胺骨架(特别是氨基乙基甘氨酸骨架)取代。核碱基保留并且直接或间接地结合至骨架的酰胺部分的氮杂氮原子。教导制备PNA化合物的代表性的美国专利包括但不限于：美国专利Nos.5,539,082、5,714,331和5,719,262，以引用的方式将其各自并入本文。PNA化合物的进一步教导可以见于例如Nielsen等，Science，1991，254，1497-1500。
本发明中的一些特征的实施方式包括：具有磷硫酰骨架的核酸和具有杂原子骨架的寡核苷，并且特别是上述引用的美国专利No.5,489,677中的--CH2--NH--CH2--、--CH2--N(CH3)--O--CH2--[称为亚甲基(甲基亚氨基)骨架或MMI骨架]、--CH2--O--N(CH3)--CH2--、--CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2--和--N(CH3)--CH2--CH2--[其中，天然磷酸二酯骨架被表示为--O--P--O--CH2--]；以及上述引用的美国专利No.5,602,240中的酰胺骨架。在一些实施方式中，本文的特征的抑制性核酸具有上述引用的美国专利No.5,034,506的吗啉代骨架结构。
经修饰的核酸还可以包含一个或多个经取代的糖部分。本文的特征性的抑制性核酸在2’位置可以包含如下中的一种：OH；F；O-烷基、S-烷基或N-烷基；O-烯基、S-烯基或N-烯基；O-炔基、S-炔基或N-炔基；或者O-烷基-O-烷基，其中，烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C1-C10烷基或C2-C10烯基或C2-C10炔基。示例性的适当的修饰包括：O[(CH2)nO]mmCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中，n和m为从1至约10。在另外的实施方式中，dsRNA在2’位置包含如下中的一种：C1-C10低级烷基；取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基；SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2；杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、经取代的甲硅烷基、RNA裂解基团、报告子基团、嵌入剂、用于改善抑制性核酸的药代动力学性质的基团、或用于改善抑制性核酸的药效动力学性质的基团、以及具有类似性质的其它取代基。在一些实施方式中，修饰包括2’-甲氧基乙氧基(2’-O--CH2CH2OCH3，也称为2’-O-(2-甲氧基乙基)或2’-MOE)(Martin等，Helv.Chim.Acta，1995，78：486-504)，即烷氧基-烷氧基基团。另一示例性的修饰是如下文的实施例所述的2’-二甲基氨基氧基乙氧基，即O(CH2)2ON(CH3)2基团，又称为2’-DMAOE；以及如下文的实施例所述的2’-二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本领域也称为2’-O-二甲基氨基乙氧基乙基或2’-DMAEOE)，即2’-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2。
其它修饰包括2’-甲氧基(2’-OCH3)、2’-氨基丙氧基(2’-OCH2CH2CH2NH2)和2’-氟(2’-F)。类似的修饰也可以在修饰性核酸的核苷酸上的其它位置进行，特别是2’-5’连接的dsRNA中或3’末端核苷酸上的糖的3’位、以及5’末端核苷酸的5’位置。抑制性核酸也可以具有糖模拟物，例如取代戊呋喃糖的环丁基部分。教导制备此类经修饰的糖结构的代表性的美国专利包括但不限于：美国专利Nos.4,981,957、5,118,800、5,319,080、5,359,044、5,393,878、5,446,137、5,466,786、5,514,785、5,519,134、5,567,811、5,576,427、5,591,722、5,597,909、5,610,300、5,627,053、5,639,873、5,646,265、5,658,873、5,670,633和5,700,920，其中一些通常作为临时申请而拥有，并以引用的方式将其各自并入本文。
抑制性核酸还可包括核碱基(在本领域通常简称为“碱基”)修饰或置换。本文所使用的“未修饰的”或“天然的”核碱基包括：嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)；以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。经修饰的核碱基包括其它合成和天然的核碱基，例如：5-甲基胞嘧啶(5-me-C)；5-羟甲基胞嘧啶；黄嘌呤；次黄嘌呤；2-氨基腺嘌呤；腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基衍生物和其它烷基衍生物；腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基衍生物和其它烷基衍生物；2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶；5-卤素尿嘧啶和5-卤素胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶；6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶和6-偶氮胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫尿嘧啶；8-卤素、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其它的8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤；5-卤素(特别是5-溴)、5-三氟甲基和其它的5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶；7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤；8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤；7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。进一步的核碱基包括在如下公开的那些：美国专利No.3,687,808；Modified Nucleosides in Biochemistry，Biotechnology and Medicine，Herdewijn，P.编，Wiley-VCH，2008；The Concise Encyclopedia Of Polymer Science AndEngineering，858-859页，Kroschwitz，J.L编，John Wiley&Sons，1990；Englisch等，Angewandte Chemie，International Edition，1991，30，613；以及Sanghvi，YS.，dsRNAResearch and Applications，第15章，289-302页，Crooke，S.T.和Lebleu，B.编，CRCPress，1993。这些核碱基的一些对于增高本发明中的特征的寡聚化合物的结合亲和力是特别有用的。这些核碱基包括：5-取代的嘧啶；6-氮杂嘧啶；以及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已示出5-甲基胞嘧啶置换增高了核酸双链体稳定性0.6-1.2℃(Sanghvi，Y.S.，Crooke，S.T.和Lebleu，B.编，dsRNAResearch and Applications，CRC Press，Boca Raton，1993，276-278页)，并且是示例性的碱基置换，甚至更特别是当与2′-O-甲氧基乙基糖修饰组合时。
教导制备一些上述的经修饰的核碱基以及其它经修饰的核碱基的代表性的美国专利包括但不限于上面提到的美国专利No.3,687,808，及美国专利Nos.4,845,205、5,130,30、5,134,066、5,175,273、5,367,066、5,432,272、5,457,187、5,459,255、5,484,908、5,502,177、5,525,711、5,552,540、5,587,469、5,594,121、5,596,091、5,614,617、5,681,941、6,015,886、6,147,200、6,166,197、6,222,025、6,235,887、6,380,368、6,528,640、6,639,062、6,617,438、7,045,610、7,427,672和7,495,088，以引用的方式将其各自并入本文；以及美国专利No.5,750,692，以引用的方式将其也并入本文。
抑制性核酸的核酸也可以被修饰成包含一个或多个锁核酸(LNA)。锁核酸是具有经修饰的核糖部分的核苷酸，其中，所述核糖部分包含连接2’位和4’位碳的另外的桥。这一结构有效地将核糖“锁定”在3’-内向结构构象中。已经表明将锁核酸添加至siRNA增加了血清中的siRNA的稳定性，并降低了脱靶效应(Elmen，J.等，(2005)Nucleic AcidsResearch33(1)：439-447；Mook，OR.等，(2007)Mol Canc Ther 6(3)：833-843；Grunweller，A.等，(2003)Nucleic Acids Research 31(12)：3185-3193)。
教导制备锁核酸核苷酸的代表性的美国专利包括但不限于如下：美国专利Nos.6,268,490、6,670,461、6,794,499、6,998,484、7,053,207、7,084,125和7,399,845，以引用的方式将其各自整体并入本文。
本发明中的特征的抑制性核酸的核酸的另一修饰涉及将一个或多个配体、部分或缀合物在化学上连接至抑制性核酸，所述配体、部分或缀合物增强了抑制性核酸的细胞摄取、活性、细胞分布或药代动力学性质。此类部分包括但不限于：脂质部分如胆固醇部分(Letsinger等，Proc.Natl.Acid.Sci.USA，1989，86：6553-6556)；胆酸(Manoharan等，Biorg.Med.Chem.Let.，1994，4：1053-1060)；硫醚，例如beryl-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等，Ann.N.Y.Acad.Sci.，1992，660：306-309；Manoharan等，Biorg.Med.Chem.Let.，1993，3：2765-2770)；硫代胆固醇(Oberhauser等，Nucl.Acids Res.，1992，20：533-538)；脂肪链，例如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等，EMBO J，1991，10：1111-1118；Kabanov等，FEBS Lett.，1990，259：327-330；Svinarchuk等，Biochimie，1993，75：49-54)；磷脂，例如二-十六烷基-消旋-甘油或三乙基铵1，2-二-O-十六烷基-消旋-甘油-3-磷酸酯(Manoharan等，Tetrahedron Lett.，1995，36：3651-3654；Shea等，Nucl.Acids Res.，1990，18：3777-3783)；聚胺或聚乙二醇链(Manoharan等，Nucleosides&Nucleotides，1995，14：969-973)；或金刚烷乙酸(Manoharan等，Tetrahedron Lett.，1995，36：3651-3654)；棕榈酰部分(Mishra等，Biochim.Biophys.Acta，1995，1264：229-237)；或十八胺或己基氨基-羰基氧基胆固醇部分(Crooke等，J.Pharmacol.Exp.Ther.，1996，277：923-937)。
在一个实施方式中，配体改变了其被掺入的抑制性核酸试剂的分布、靶向或寿命。在优选的实施方式中，相较于不存在这样配体的物种而言，配体对所选的靶标(例如分子、细胞或细胞类型、区室(例如机体的细胞或器官区室)、组织、器官或区域)提供了增强的亲和力。优选的配体将不参与双链体核酸中的双链体配对。
配体可以包括天然存在的物质，例如蛋白质(例如人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)或球蛋白)；碳水化合物(例如右旋糖、支链淀粉、几丁质、壳聚糖、菊粉、环糊精或透明质酸)；或脂质。配体也可以是重组或合成的分子，例如合成的聚合物，例如合成的聚氨基酸。聚氨基酸的实例包括聚赖氨酸(PLL)、聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯-马来酸酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙二醇化)共聚物、二乙烯基醚-马来酸酐共聚物、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-异丙基丙烯酰胺聚合物或聚膦嗪。聚胺的实例包括：聚乙烯亚胺、聚赖氨酸(PLL)、精胺、亚精胺、聚胺、假肽-聚胺、肽模拟物聚胺、树枝物聚胺、精氨酸、脒、鱼精蛋白、阳离子脂质、阳离子卟啉、聚胺的季盐或α-螺旋肽。
配体还可以包括靶向基团，例如细胞或组织靶向剂，例如结合至特定的细胞类型(如肝细胞或巨噬细胞等)的凝集素、糖蛋白、脂质或蛋白质(例如抗体)。靶向基团可以是促甲状腺激素、促黑激素、凝集素、糖蛋白、表面活性蛋白A、粘蛋白碳水化合物、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基半乳糖胺、N-乙酰葡糖胺多价甘露糖(N-acetyl-gulucosaminemultivalent mannose)、多价岩藻糖、糖基化聚氨基酸、多价半乳糖、转铁蛋白、双膦酸盐、聚谷氨酸盐、聚天冬氨酸盐、脂质、胆固醇、类固醇、胆汁酸、叶酸、维生素B12、维生素A、生物素、或RGD肽或RGD肽模拟物。
配体的其它实例包括染料、插入剂(例如吖啶)、交联剂(例如补骨脂内酯(psoralene)、丝裂霉素C)、卟啉(TPPC4、texaphyrin、Sapphyrin)、多环芳香烃(例如吩嗪、二氢吩嗪)、人工核酸内切酶(例如EDTA)、亲脂性分子(例如胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1，3-双-O-(十六烷基)甘油、香叶草基氧基己基基团、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1，3-丙二醇、十七烷基基团、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪)以及肽缀合物(例如触足肽、Tat肽)、烷化剂、磷酸盐、氨基、巯基、PEG(例如PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚氨基、烷基、经取代的烷基、放射性标记的标记物、酶、半抗原(例如生物素)、运输/吸收促进剂(例如阿司匹林、维生素E、叶酸)、合成的核糖核酸酶(例如咪唑、双咪唑、组胺、咪唑簇(clusters)、吖啶-咪唑缀合物、四氮杂大环(tetraazamacrocycles)的Eu3+复合物)、二硝基苯基、HRP或AP。
配体可以是蛋白质，例如糖蛋白或肽，例如对共配体(co-ligand)具有特异性亲和力的分子，或者抗体(例如结合至指定的细胞类型(例如肝细胞或巨噬细胞)的抗体)。配体还可以包括激素和激素受体。它们还可以包括非肽类物质，例如脂质、凝集素、碳水化合物、维生素、辅因子、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基半乳糖胺、N-乙酰基葡萄糖胺多价甘露糖或多价岩藻糖。
配体可以是以下物质，例如，可以通过如破坏细胞的细胞骨架(例如通过破坏细胞的微管、微丝和/或中间丝)增加抑制性核酸试剂在细胞中的摄取的药物。该药物可以是例如分类群(taxon)、长春新碱、长春花碱、细胞松弛素、诺考达唑、japlakinolide、拉春库林A、鬼笔环肽、swinholide A、indanocine或myoservin。
在一些实施方式中，连接至如本文所述的抑制性核酸的配体充当了药代动力学(PK)调节剂。本文所使用的“PK调节剂”是指药代动力学调节剂。PK调节剂包括亲脂体(lipophiles)、胆汁酸、类固醇、磷脂类似物、肽、蛋白质结合剂、PEG、维生素等。PK调节剂的实例包括但不限于胆固醇、脂肪酸、胆酸、石胆酸、二烷基甘油酯、二酰基甘油酯磷脂、鞘脂、萘普生、布洛芬、维生素E、生物素等。还已知包含许多磷硫酰连接的寡核苷酸结合至血清蛋白，因此，在骨架中包含多个磷硫酰连接的短的寡核苷酸(例如约5个碱基、10个碱基、15个碱基或20个碱基的寡核苷酸)能够在本发明中作为配体(例如作为PK调节配体)。另外，结合血清组分(例如血清蛋白)的适体也适合用作本文所述实施方式中的PK调节配体。
对于不能容易地穿过双层膜的大分子药物和亲水性药物分子，细胞的内体/溶酶体区室中的截留被认为是有效地递送至其作用位点的最大障碍。已经设计出许多方法和策略来解决这个问题。对于脂质体制剂，融合脂质在制剂中的使用是最常见的方法(Singh，R.S.，Goncalves，C.等(2004)，On the Gene Delivery Efficacies of pH-SensitiveCationic Lipids via Endosomal Protonation.A Chemical Biology Investigation，Chem.Biol.，11，713-723)。通过质子化和/或pH诱导的构象变化表现出pH敏感性的内体裂解活性的其它组分包括带电荷的聚合物和肽。实例可以见于以下文献：Hoffman，A.S.，Stayton，P.S.等(2002)，Design of“smart”polymers that can direct intracellulardrug delivery.Polymers Adv.Technol.，13，992-999；Kakudo，Chaki，T.，S.等(2004)，Transferrin-Modified Liposomes Equipped with a pH-Sensitive FusogenicPeptide：An Artificial Viral-like Delivery System.Biochemistry 436，5618-5628；Yessine，M.A.和Leroux，J.C.(2004)，Membrane-destabilizing polyanions：interactionwith lipid bilayers and endosomal escape of biomacromolecules.，Adv.DrugDeliv.Rev.，56，999-1021；Oliveira，S.，van Rooy，I.等(2007)，Fusogenic peptidesenhance endosomal escape improving inhibitory nucleic acid-induced silencingof oncogenes.，Int.J.Pharm.，331，211-4。它们通常用于药物递送系统的上下文中，例如脂质体或脂质复合物(lipoplexes)。对于使用脂质体制剂的叶酸受体介导的递送，例如，pH敏感融合肽已经并入脂质体中，并且显示出通过在摄取过程期间改善药物的卸载来增强活性(Turk，M.J.，Reddy，J.A.等(2002)，Biochim.Biophys.Acta，1559，56-68中描述了Characterization of a novel pH-sensitive peptide that enhances drug releasefrom folate-targeted liposomes at endosomal pHs)。
在某些实施方式中，内体溶解组分(endosmolytic component)可以是显示pH依赖性膜活性和/或融合性的聚阴离子肽或肽模拟物。肽模拟物可以是被设计为模拟肽的小的蛋白质样链。肽模拟物可以产生自对现有肽的修饰，以改变分子的性质，或使用非天然氨基酸或其类似物合成肽样分子。在某些实施方式中，当与肽相比时，它们具有改善的稳定性和/或生物活性。在某些实施方式中，内体溶解组分在内体pH(例如，pH5-6)下呈现其活性构象。“活性”构象是其中内体溶解组分促进本发明的模块组合物(modular composition)或其任何组分(例如核酸)的内体裂解和/或从内体转运到细胞的胞质的构象。
示例性的内体溶解组分包括GALA肽(Subbarao等，Biochemistry，1987，26：2964-2972)、EALA肽(Vogel等，J.Am.Chem.Soc.，1996，118：1581-1586)及其衍生物(Turk等，Biochem.Biophys.Acta，2002，1559：56-68)。在某些实施方式中，内体溶解组分可以含有将响应于pH的变化而经历电荷变化或质子化作用的化学基团(例如，氨基酸)。内体溶解组分可以是直链或支链的。示例性的内体溶解组分的初级序列包括H2N-(AALEALAEALEALAEALEALAEAAAAGGC)-CO2H(SEQ ID NO：16)、H2N-(AALAEALAEALAEALAEALAEALAAAAGGC)-CO2H(SEQ ID NO：17)和H2N-(ALEALAEALEALAEA)-CONH2(SEQ ID NO：18)。
在某些实施方式中，可以将多于一种的内体溶解组分掺入本发明的抑制性核酸试剂中。在一些实施方式中，这需要将多于一种的相同的内体溶解组分掺入抑制性核酸试剂中。在其它实施方式中，这需要将两种以上的不同的内体溶解组分掺入抑制性核酸试剂中。
这些内体溶解组分可以通过例如改变内体pH下的构象来介导内体逃逸。在某些实施方式中，内体溶解组分可以在中性pH下以无规卷曲构象存在，并在内体pH下重排为两亲性螺旋。作为这种构象转变的结果，这些肽可能插入内体的脂质膜中，导致内体内容物泄漏到细胞质中。由于构象转变是pH依赖性的，内体溶解组分可以在血液(pH～7.4)中于循环时显示很少或没有融合活性(fusogenic activity)。本文使用的“融合活性”被定义为导致内体溶解组分破坏脂质膜的活性。融合活性的一个实例是内体溶解组分破坏内涵体膜，导致内体裂解或渗漏，以及将本发明的模块组合物的一种或多种组分(例如核酸)从内体转运到细胞质。
可由本领域技术人员对合适的内体溶解组分进行测试和鉴定。例如，可以通过常规方法、例如以细胞试验对化合物响应于例如根据pH环境改变电荷的能力进行测定。在某些实施方式中，将测试化合物与细胞组合或与细胞接触，并允许细胞例如通过内吞作用将测试化合物内化。然后，从该经接触的细胞制成内体制剂，并将该内体制剂与来自对照细胞的内体制剂相比较。相对于来自对照细胞的内体部分，来自经接触的细胞的内体部分的变化(例如降低)表明测试化合物可以作为融合剂起效。或者，可以例如通过显微镜(例如通过光学显微镜或电子显微镜)对经接触的细胞和对照细胞进行评估，以确定细胞中的内涵体群体的差异。可以对测试化合物和/或内体进行标记，例如以对内体泄漏进行定量。
在另一试验类型中，使用一种或多种测试或推定的融合剂构建本文所述的抑制性核酸试剂。可以对抑制性核酸试剂进行标记以便于观察。一旦抑制性核酸试剂被细胞摄取，可以例如通过制备内体制剂或通过显微技术(这使得细胞的细胞质中的经标记的抑制性核酸酸性剂可视化)来对内体溶解组分促进内涵体逃逸的能力进行评估。在某些其它实施方式中，基因表达的抑制或任何其它生理参数可用作内体逃逸的替代标记。
在其它实施方式中，圆二色光谱可用于鉴定显示pH依赖性结构转变的化合物。还可以进行两步测定法，其中，第一测定法对测试化合物单独响应于pH变化的能力进行评估，并且第二测定法对包含测试化合物的模块组合物响应于pH变化的能力进行评估。
在本文所述方面的一个实施方式中，配体或缀合物是脂质或基于脂质的分子。这种脂质或基于脂质的分子优选结合血清蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)。HSA结合配体允许缀合物分布到靶组织，例如机体的非肾靶组织。可以结合HSA的其它分子也可以用作配体。例如，可以使用neproxin或阿司匹林。脂质或基于脂质的配体可以(a)增加对缀合物降解的抗性、(b)增加靶向或转运到靶细胞或细胞膜、和/或(c)可用于调节与血清蛋白(例如HSA)的结合。
在另一方面，配体是细胞渗透剂，优选螺旋细胞渗透剂。优选地，这种试剂是两亲性的。示例性试剂是肽，例如tat或触足肽。如果试剂是肽，则其可以被修饰，包括肽模拟物、反向模拟物、非肽或假肽连接、以及D-氨基酸的使用。螺旋剂优选是α-螺旋剂，其优选具有亲脂相和疏脂相。
适用于本发明的肽可以是天然肽(例如tat或触足肽)、合成肽或肽模拟物。此外，肽可以是经修饰的肽，例如肽可以包含非肽或假肽连接以及D-氨基酸。肽模拟物(在本文中也称为寡肽模拟物)是能够折叠成类似于天然肽的限定的三维结构的分子。肽和肽模拟物附着至抑制性核酸试剂可以例如通过增强细胞识别和吸收来影响抑制性核酸的药代动力学分布。肽或肽模拟物部分的长度可以为约5-50个氨基酸，例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸。
肽或肽模拟物可以是例如细胞渗透肽、阳离子肽、两亲性肽或疏水性肽(例如，主要由Tyr、Trp或Phe组成)。肽部分可以是枝状物肽、约束肽(contrained peptide)或交联肽。在另一替代方案中，肽部分可以包括疏水膜易位序列(MTS)。示例性的含疏水MTS的肽是具有氨基酸序列AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO：19)的RFGF。含有疏水MTS的RFGF类似物(例如，氨基酸序列AALLPVLLAAP(SEQ ID NO：20))也可以是靶向部分。肽部分可以是“递送”肽，其可以携带包括肽、寡核苷酸和跨细胞膜蛋白质的大的极性分子。例如，已经发现来自HIVTat蛋白(GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO：21))和果蝇触足蛋白(RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ IDNO：22))的序列能够作为递送肽起效。肽或肽模拟物可以通过DNA的随机序列编码，例如从噬菌体展示库或“一珠一化合物”(OBOC)组合库鉴定的肽(Lam等，Nature，354：82-84，1991)。优选地，通过掺入的单体单元与dsRNA试剂连接的肽或肽模拟物是细胞靶向肽，例如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)-肽或RGD模拟物。肽部分的长度可以为约5个氨基酸至约40个氨基酸。肽部分可以具有结构修饰，例如以增加稳定性或直接构象性质。可以使用下面描述的任何结构修饰。
“细胞渗透肽”能够渗透细胞(例如，如细菌或真菌细胞的微生物细胞，或例如人细胞的哺乳动物细胞)。微生物细胞渗透性肽可以是例如α-螺旋线性肽(例如LL-37或CeropinP1)、含二硫键的肽(例如α-防御素、β-防御素或牛抗菌肽)、或仅含有一种或两种主导的氨基酸的肽(例如，PR-39或indolicidin)。细胞渗透肽还可以包括核定位信号(NLS)。例如，细胞渗透肽可以是双向两亲性肽，例如衍生自HIV-1gp41的融合肽结构域和SV40大T抗原的NLS的MPG(Simeoni等，Nucl.Acids Res，31：2717-2724，2003)。
在一些实施方式中，本文所述的抑制性核酸寡核苷酸还包含碳水化合物缀合物。碳水化合物缀合物有利于核酸的体内递送，以及适用于体内治疗用途的本文所述的组合物。本文所使用的“碳水化合物”是指如下的化合物：该化合物是本身由具有至少6个碳原子(其可以是直链、支链或环状的)的一个或多个单糖单元与键合至各碳原子的氧原子、氮原子或硫原子构成的碳水化合物，或者是具有由一个或多个单糖单元组成的碳水化合物部分作为其一部分的化合物，所述单糖单元各自具有至少六个碳原子(其可以是直链、支链或环状的)，其中氧原子、氮原子或硫原子键合至各碳原子。代表性的碳水化合物包括糖(单糖、二糖、三糖和含有约4-9个单糖单元的寡糖)和多糖(例如淀粉、糖原、纤维素和多糖树胶)。具体的单糖包括C5以上(优选C5-C8)的糖；二糖和三糖(包括具有两个或三个单糖单元(优选C5-C8)的糖)。在一些实施方式中，碳水化合物缀合物还包含其它配体，例如但不限于PK调节剂、内体溶解配体和细胞渗透肽。
在一些实施方式中，可以用可裂解或不可裂解的各种接头将本文所述的缀合物连接至抑制性核酸寡核苷酸。术语“接头”或“连接基团”是指连接化合物的两个部分的有机部分。接头通常包含直接键或原子(如氧或硫)、单元(如NR8、C(O)、C(O)NH、SO、SO2、SO2NH)或原子的链，原子的链例如但不限于取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、杂芳基烷基、杂芳基烯基、杂芳基炔基、杂环基烷基、杂环基烯基、杂环基炔基、芳基、杂芳基、杂环基、环基烷基、环基烯基、烷基芳基烷基、烷基芳基烯基、烷基芳基烯基、烯基芳基烷基、烯基芳基烯基、烯基芳基炔基、炔基芳基烷基、炔基芳基烯基、炔基芳基炔基、烷基杂芳基烷基、烷基杂芳基烯基、烷基杂芳基炔基、烯基杂芳基烷基、烯基杂芳基烯基、烯基杂芳基炔基、炔基杂芳基烷基、炔基杂芳基烯基、炔基杂芳基炔基、烷基杂环基烷基、烷基杂环基烯基、烷基杂环基炔基、烯基杂环基烷基、烯基杂环基烯基、烯基杂环基炔基、炔基杂环基烷基、炔基杂环基烯基、炔基杂环基炔基、烷基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基杂芳基、烯基杂芳基、炔基杂芳基，其中一个或多个亚甲基可以被O、S、S(O)、SO2、N(R8)、C(O)、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环基中断，其中R8是氢、酰基、脂肪族或取代的脂肪族。在一个实施方式中，接头为1-24个原子、优选4-24个原子、优选6-18个原子、更优选8-18个原子并且最优选8-16个原子。
可切割的连接基团是在细胞外部足够稳定，但在进入靶细胞后被切割以释放通过接头保持连在一起的两个部分的连接基团。在优选的实施方式中，可切割的连接基团在靶细胞中或在第一参考条件(其可以例如选择为模拟或代表细胞内的条件)下比在受试者的血液中或在第二参考条件下(其可以例如选择为模拟或代表见于血液或血清中的条件)的切割更快至少10倍以上、优选至少100倍。
可切割的连接基团对切割剂(例如pH、氧化还原电位或降解分子的存在)敏感。通常，切割剂在细胞内比起在血清或血液中更普遍或发现更高的水平或活性。这种降解剂的实例包括：选择用于特定底物或不具有底物特异性的氧化还原剂，包括例如存在于细胞中的氧化性或还原性酶或者还原剂(例如硫醇)，其可通过以下降解氧化还原可切割连接基团：还原；酯酶；内体或可产生酸性环境的试剂(例如导致pH在5以下的那些试剂)；可以通过作为一般的酸而水解或降解酸可切割的连接基团的酶、肽酶(其可以是底物特异性的)和磷酸酶。
可切割的连接基团(例如二硫键)可对pH敏感。人血清的pH为7.4，而平均细胞内pH略低，范围为约7.1-7.3。内体具有更加酸性的pH，范围为5.5-6.0，并且溶酶体具有甚至更加酸性的为约5.0左右的pH。一些接头将具有在优选的pH下被切割的可切割的连接基团，从而从细胞内的配体释放出阳离子脂质，或释放至细胞的期望区室中。
接头可以包含可被特定酶切割的可切割的连接基团。并入接头中的可切割的连接基团的类型可以取决于待靶向的细胞。可切割的连接基团的进一步的实例包括但不限于氧化还原可切割的连接基团(例如二硫键连接基团(-SS-))、基于磷酸盐的可切割的连接基团、基于酯的可切割的连接基团和基于肽的可切割连接基团。教导RNA缀合物的制备的代表性的美国专利包括但不限于美国专利Nos.4,828,979、4,948,882、5,218,105、5,525,465、5,541,313、5,545,730、5,552,538、5,578,717、5,580,731、5,591,584、5,109,124、5,118,802、5,138,045、5,414,077、5,486,603、5,512,439、5,578,718、5,608,046、4,587,044、4,605,735、4,667,025、4,762,779、4,789,737、4,824,941、4,835,263、4,876,335、4,904,582、4,958,013、5,082,830、5,112,963、5,214,136、5,082,830、5,112,963、5,214,136、5,245,022、5,254,469、5,258,506、5,262,536、5,272,250、5,292,873、5,317,098、5,371,241、5,391,723、5,416,203、5,451,463、5,510,475、5,512,667、5,514,785、5,565,552、5,567,810、5,574,142、5,585,481、5,587,371、5,595,726、5,597,696、5,599,923、5,599,928以及5,688,941、6,294,664、6,320,017、6,576,752、6,783,931、6,900,297、7,037,646，通过引用将其各自并入本文。
通常，候选的可切割的连接基团的适合性可以通过测试降解剂(或条件)切割候选的连接基团的能力来进行评估。还期望的是，还对候选的可切割的连接基团在血液中或当与其它非靶向组织接触时的抗切割的能力进行测试。因此，可以确定第一条件和第二条件之间的切割的相对易感性，其中，选择第一条件选择示出靶细胞中的切割，并选择第二条示出其它组织或生物流体(例如血液或血清)中的切割。评估可以在无细胞系统、细胞、细胞培养物、器官或组织培养物、或整个动物中进行。在无细胞条件下或培养条件下进行初步评估并通过在整个动物中的进一步评估进行确认可能是有用的。在优选的实施方式中，有用的候选化合物在细胞中(或在选择用于模拟细胞内条件的体外条件下)比在血液或血清(或在选择用于模拟细胞外条件下)中切割更快至少2倍、4倍、10倍或100倍。
在给定化合物中不必对所有位置进行统一修饰，事实上，可以在单一化合物中或甚至在抑制性核酸内的单个核苷中并入多于一种的上述修饰。本发明还包括作为嵌合化合物的抑制性核酸化合物。在本发明的上下文中，“嵌合”抑制性核酸化合物或“嵌合体”是抑制性核酸化合物，例如dsRNA，其含有两个以上的化学上不同的区域，各区域由至少一个单体单元(即，在dsRNA化合物情况下的核苷酸)组成。这些抑制性核酸通常含有至少一个区域，其中，所述核酸被修饰以赋予抑制性核酸增加的对核酸酶降解的抗性、增加的细胞摄取和/或增加的对靶核酸的结合亲和力。抑制性核酸的另外的区域可以用作能够切割RNA：DNA或RNA：RNA杂交体的酶的底物。例如，RNase H是切割RNA：DNA双链体的RNA链的细胞内切核酸酶。因此，RNase H的活化引起RNA靶标的切割，从而大大提高抑制性核酸抑制基因表达的效力。因此，相较于例如杂交至相同的靶区域的磷硫酰脱氧dsRNA，当使用嵌合的抑制性核酸时，通常使用较短的抑制性核酸即可获得相当的结果。可以通过凝胶电泳，如果必要的话通过本领域已知的相关的核酸杂交技术对RNA靶标的切割进行常规检测。
在某些情况下，抑制性核酸的核酸可以通过非配体基团修饰。许多非配体分子已经缀合至抑制性核酸以增强抑制性核酸的活性、细胞分布或细胞摄取，并且用于进行这种缀合的程序可在科学文献中获得。这种非配体部分包括脂质部分，如胆固醇(Kubo，T.等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，2007，365(1)：54-61；Letsinger等，Proc.Natl.Acid.Sci.USA，1989，86：6553)；胆酸(Manoharan等，Bioorg.Med.Chem.Lett.，1994，4：1053)；硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等，Ann.N.Y.Acad.Sci.，1992，660：306；Manoharan等，Bioorg.Med.Chem.Lett.，1993，3：2765)；硫代胆固醇(Oberhauser等，Nucl.Acids Res.，1992，20：533)；脂肪链，例如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等，EMBO J，1991，10：1111；Kabanov等，FEBS Lett.，1990，259：327；Svinarchuk等，Biochimie，1993，75：49)；磷脂，例如二-十六烷基-消旋-甘油或三乙基铵1，2-二-O-十六烷基-消旋-甘油-3-H-磷酸酯(Manoharan等，Tetrahedron Lett.，1995，36：3651；Shea等，Nucl.Acids Res.，1990，18：3777)；聚胺或聚乙二醇链(Manoharan等，Nucleosides&Nucleotides，1995，14：969)；或金刚烷乙酸(Manoharan等，Tetrahedron Lett.，1995，36：3651)；棕榈酰部分(Mishra等，Biochim.Biophys.Acta，1995，1264：229)；或十八胺或己基氨基-羰基氧基胆固醇部分(Crooke等，J.Pharmacol.Exp.Ther.，1996，277：923)。教导这种核酸缀合物的制备的代表性美国专利已经在上面列出。典型的缀合方案涉及在序列的一个或多个位置合成荷载氨基连接体的核酸。然后使用合适的偶联剂或活化剂使氨基与待缀合的分子反应。缀合反应可以用仍然结合至固体支持物上的核酸或在溶液相中的核酸切割后进行。通过HPLC纯化核酸缀合物通常提供纯的缀合物。
术语“适体”是指能够结合靶分子(例如多肽)的核酸分子。例如，本发明的适体可以特异性地结合至靶分子或结合至调节靶分子的表达和/或活性的信号传导途径中的分子。适体的产生和治疗用途在本领域中是公知的。参见例如，美国专利5,475,096。
本文所使用的术语“特异性结合”是指两个分子、化合物、细胞和/或颗粒之间的化学相互作用，其中，与第一实体结合至非靶标的第三实体相比，第一实体以更高的特异性和亲和力与第二靶实体结合。在一些实施方式中，特异性结合可以指与第一实体对第三非靶标实体的亲和力相比，第一实体对第二靶实体的亲和力为至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍、至少1000倍或者更高。对于给定靶标而言特异性的试剂是在所使用的测定条件下显示对该靶标的特异性结合的试剂。
本文所使用的术语“治疗(treat/treatment/treating)”或“减轻”是指治疗剂治疗，其中，目的是逆转、缓解、减轻、抑制、减缓或停止与疾病或紊乱(例如癌症)相关的的病症的进展或严重程度。术语“治疗”包括降低或缓解与癌症相关的病症、疾病或紊乱的至少一种不利影响或症状。如果一种或多种症状或临床标记物减少，则治疗通常是“有效”的。或者，如果疾病的进展减弱或停止，则治疗是“有效”的。也就是说，“治疗”不仅包括症状或标记物的改善，还包括与未进行治疗时所预期的情况相比症状的进展或恶化中止或至少减缓。有益或期望的临床结果(无论可测定或不可测定)包括但不限于：缓解一种或多种症状、减小疾病程度、稳定疾病(即，不恶化)状态、迟滞或减缓疾病进展、减轻或减缓疾病状态、缓和(部分或全部)、和/或减少死亡率。术语“治疗”疾病还包括提供疾病的症状或副作用的舒解(包括姑息治疗)。
本文所使用的术语“药物组合物”是指与药学上可接受的载体(例如在制药工业中常用的载体)组合的活性试剂。本文采用的短语“药学上可接受的”是指下述化合物、材料、组合物和/或剂型：在合理的医学判断范围内，适于与人类和动物的组织接触而无过度的毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的收益/风险比相匹配。
本文所使用的术语“给予”是指通过一定的方法或途径向受试者中投放本文所公开的化合物，使得至少将试剂部分递送至期望部位。含有本文所公开的化合物的药物组合物可以通过任何适当的途径给予，从而在受试者中产生有效的治疗。
术语“统计上显著”或“显著地”是指统计显著性，并且通常是指2个标准差(2SD)或更大的差异。
除了在操作实施例中或另有指示以外，本文所使用的表示成分的量或反应条件的所有数字均应理解为在所有情况下均由术语“约”加以修饰。术语“约”在与百分比连接使用时可以表示±1％。
本文所使用的术语“包含”或“包括”是指对于方法或组合物而言必不可少的组成、方法及其各自的成分，对于包含未指定的要素(无论是必要的要素或是非必要的要素)而言也是开放性的。
术语“由……组成”是指本文所述的组合物、方法及其各自的成分排除了在实施方式的描述中未列举的任何要素。
本文所使用的术语“基本上由……组成”是指对于给定的实施方式而言所需的要素。该术语允许存在实质上不会影响实施方式的基本和新颖的或功能性的特性的要素。
除非上下文另有明确指示，单数术语“一/该/所述(a/an/the)”包括复数的指示对象。类似地，除非上下文另有明确指示，词语“或”意在包括“和”。尽管与本文描述的相似或相当的方法和材料可用于本公开的实践或试验中，在下文中对合适的方法和材料进行了描述。缩写“例如(e.g.)”源自拉丁文的例如(exempli gratia)，并且在本文中用于表示非限制性的实例。因此，缩写“e.g.”与术语“例如(for example)”同义。
细胞生物学和分子生物学中的常用术语的定义可以在下述文献中找到：“TheMerck Manual of Diagnosis and Therapy”，第19版，Merck Research Laboratories出版，2006(ISBN 0-911910-19-0)；Robert S.Porter等(编)，The Encyclopedia ofMolecular Biology，Blackwell Science Ltd.出版，1994(ISBN 0-632-02182-9)；Benjamin Lewin，Genes X，Jones&Bartlett Publishing出版，2009(ISBN-10：0763766321)；Kendrew等(编)，Molecular Biology and Biotechnology：a ComprehensiveDesk Reference，VCH Publishers，Inc.出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)；以及CurrentProtocols in Protein Sciences 2009，Wiley Intersciences，Coligan等编。
除非另有说明，本发明采用在以下文献中描述的标准程序来实施，例如：Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第4版)，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，USA(2012)；Davis等，Basic Methods in MolecularBiology，Elsevier Science Publishing Inc.，New York，USA(1995)；或Methods inEnzymology：Guide to Molecular Cloning Techniques 152卷，S.L.Berger和A.R.Kimmel编，Academic Press Inc.，San Diego，USA(1987)；Current Protocols in ProteinScience(CPPS)(John E.Coligan等编，John Wiley and Sons，Inc.)；Current Protocolsin Cell Biology(CPCB)(Juan S.Bonifacino等编，John Wiley and Sons，Inc.)；以及Culture ofAnimal Cells：A Manual of Basic Technique，R.Ian Freshney著，Wiley-Liss出版，第5版(2005)；Animal Cell Culture Methods(Methods in Cell Biology，57卷，Jennie P.Mather和David Barnes编，Academic Press，第1版，1998)，以引用的方式将其整体并入本文。
本文在对本发明各个方面的描述中对其它术语进行定义。
出于描述和公开的目的，将本申请全文中引用的所有专利和其它出版物(包括文字出版物、发行的专利、公开的专利申请和同时待审的专利申请)以引用的方式明确地并入本文，例如，在此类出版物中描述的可与本文描述的技术关联使用的方法学。这些出版物仅由于它们的公开早于本申请的申请日而提供。在这一方面，不应当视作承认了本发明人没有权利借助于先前的发明或因为任何其它原因而将此类公开内容提前。所有关于这些文件的日期的声明或关于这些文件的内容的表述是基于申请人可获得的信息，并不构成关于这些文件的日期或内容的正确性的任何承认。
对本公开的实施方式的描述并非旨在进行穷举或将本公开限制为所公开的明确的形式。尽管本文中出于说明性目的描述了本公开的具体实施方式和实施例，然而正如相关领域的技术人员将了解的，可在本公开的范围内进行各种等同修改。例如，当在给定的顺序中给出了方法步骤或功能时，替代的实施方式能够以不同的顺序执行功能、或可以实质上同时执行功能。本文所提供的本公开的教导可以施用至其它适当的程序或方法。本文所述的各种实施方式可以组合以提供进一步的实施方式。如果需要的话，可对本公开的方面进行修改，以采用上述参考文献和应用的组合、功能和构思，从而提供本公开的进一步的实施方式。此外，由于生物功能对等性的考虑，可以在种类或数量上对蛋白结构进行不影响生物或化学作用的一些改变。根据详细的说明书的启示，可以对本公开作出这些改变和其它改变。所有这些修饰都旨在包含于所附的权利要求的范围之内。
可将任何上述实施方式中的特定要素与其它实施方式中的要素组合或置换。此外，尽管在这些实施方式的上下文中已经描述了与本公开的一些实施方式相关的优点，然而其它实施方式也可以表现出此类优点，并且，并非所有的实施方式都必须表现出这样的优点才能落入本公开的范围之内。
本文所描述的技术通过以下实例进行进一步说明，而不应被解释为进行了进一步的限定。
本文所述的技术的一些实施方式可以根据下列编号段落的任何一段进行定义：
1.一种嵌合分子，所述嵌合分子包含结合癌症标记物的适体结构域和抑制性核酸结构域。
2.如段落1所述的分子，其中，所述癌症标记物是EpCAM或EphA2。
3.如段落1-2中任一段所述的分子，其中，所述分子是适体-siRNA嵌合体(AsiC)。
4.如段落1-3中任一段所述的分子，其中，所述抑制性核酸特异性地结合至在癌细胞中上调的基因产物。
5.如段落1-4中任一段所述的分子，其中，所述抑制性核酸抑制选自于由以下所组成的组中的基因的表达：
Plk1、MCL1、EphA2、PsmA2、MSI1、BMI1、XBP1、PRPF8、PFPF38A、RBM22、USP39、RAN、NUP205和NDC80。
6.如段落1-5中任一段所述的分子，其中，所述癌症标记物是EpCAM，并且所述抑制性核酸结构域抑制Plk1的表达。
7.如段落1-6中任一段所述的分子，其中，所述结合癌症标记物的适体结构域包含SEQ ID NO：33的序列。
8.如段落1-6中任一段所述的分子，其中，所述结合癌症标记物的适体结构域基本上由SEQ ID NO：33的序列组成。
9.如段落1-8中任一段所述的分子，其中，所述抑制性核酸结构域包含SEQ ID NO：2的序列。
10.如段落1-8中任一段所述的分子，其中，所述抑制性核酸结构域基本上由SEQID NO：2的序列组成。
11.如段落1-10中任一段所述的分子，所述分子包含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3中的一种的序列。
12.如段落1-11中任一段所述的分子，所述分子基本上由SEQ ID NO：1至SEQ IDNO：3中的一种的序列组成。
13.如段落1-12中任一段所述的分子，其中，所述分子的3′端包含dTdT。
14.如段落1-13中任一段所述的分子，其中，所述分子包含至少一个2′-F嘧啶。
15.一种药物组合物，所述药物组合物包含段落1-14中任一段所述的分子和药学上可接受的载体。
16.如段落15所述的组合物，所述组合物包含至少两种段落1-14中任一段所述的嵌合分子，其中，所述嵌合分子具有不同的适体结构域或抑制性核酸结构域。
17.如段落16所述的组合物，其中，不同的适体或抑制性核酸结构域识别不同的靶标。
18.如段落16所述的组合物，其中，不同的适体或抑制性核酸结构域具有多种序列(sequences)并识别相同的靶标。
19.一种治疗癌症的方法，所述方法包括给予段落1-18中任一段所述的分子或组合物。
20.如段落19所述的方法，其中，所述癌症是上皮癌或乳腺癌。
21.如段落20所述的方法，其中，所述乳腺癌是三阴性乳腺癌。
22.如段落19-21中任一段所述的方法，其中，所述给予是皮下给予。
23.如段落19-22中任一段所述的方法，其中，向所述受试者进一步给予额外的癌症治疗。
24.如段落23所述的方法，其中，所述癌症治疗是紫杉醇。
实施例
实施例1：通过EpCAM适体-siRNA嵌合体进行的基因敲减抑制了基底细胞-样三阴性乳腺癌及其肿瘤起始细胞
需要用于体内siRNA递送以在肝脏外的细胞中敲减基因的有效治疗策略来利用RNA干扰对癌症进行治疗。EpCAM是在常见的上皮癌及其肿瘤起始细胞(T-IC，也称为癌干细胞)上高度表达的肿瘤相关抗原。本文证明了适体-siRNA嵌合体(AsiC，连接至siRNA有义链并与siRNA反义链退火的EpCAM适体)在人类癌症活检组织中和体外的EpCAM+癌细胞中被选择性地吸收并敲减基因表达。PLK1EpCAM-AsiC在裸鼠中抑制集落和乳腺球形成(体外T-IC测定)，以及通过EpCAM+luminal和基底细胞-A三阴性乳腺癌(TNBC)细胞系、而非EpCAM-间充质基底细胞-B TNBCs引起的肿瘤起始。皮下给予的EpCAM-AsiC在EpCAM+Her2+和TNBC肿瘤中集中并抑制其生长。因此，EpCAM-AsiC提供了有吸引力的治疗上皮癌的策略。
介绍
RNA干扰(RNAi)通过敲减致病基因提供了对疾病进行治疗的机会1。最近的早期阶段临床试验已经显示出使用脂质纳米粒子包封的siRNA或GalNAc缀合的siRNA在肝脏中对少数基因靶标实现有力的(75-95％)、持续的(持续数周或高达数月)且安全的敲减2-5。肝脏是机体的主要过滤器官，其捕获粒子并因此相对容易转染。然而，利用RNAi治疗大多数疾病的主要障碍(即，在肝脏以外的细胞中的基因敲减以及小RNA的有效递送)尚未解决。尤其是递送障碍是利用RNAi治疗癌症的主要障碍6。
三阴性乳腺癌(TNBC)是由缺乏雌激素、孕酮和Her2受体表达而定义的低分化癌症的异质组，其在任何乳腺癌亚型中的预后最差7-9。尽管相当可观的少数(sizableminority)是间充质的(基底细胞-B亚型)，但大多数TNBC具有上皮性质，并被分类为基底细胞-样或属于基底细胞-A亚型。TNBC影响着年轻女性，并且是与BRCA1基因突变相关的亚型。尚无靶向治疗可用。尽管大多数TNBC患者响应至化疗，但在3年内约三分之一发展转移并最终死亡。因此需要新的策略。
本文描述的是用于基因敲减和治疗基底细胞-样TNBC的灵活的靶标平台，其也可适用于治疗大多数常见的(上皮)癌症。我们通过将小干扰RNA(siRNA)连接至与EpCAM结合的RNA适体而将它们递送到上皮癌细胞中，EpCAM是首先描述的肿瘤抗原，在包括基底细胞-样TNBC的上皮癌中过表达的细胞表面受体。称为适体-siRNA嵌合体(AsiC)的适体连接的siRNA已被用于小动物模型中，以治疗前列腺癌并预防HIV感染10-18。我们选择用于靶向基底细胞-样TNBC的EpCAM，这是因为EpCAM在上皮癌中高度表达。预先鉴别了高亲和力的EpCAM适体。{Shigdar，2011#17903}EpCAM还对肿瘤起始细胞(T-IC，也称为癌症干细胞)进行标记20-27。这些细胞不仅被认为对起始肿瘤负责，而且还相对耐受传统的细胞毒性治疗，并且被认为对肿瘤复发和转移负责。设计用于消除T-IC的治疗是癌症研究的重要的但未满足的目标28。
在正常的上皮细胞中，EpCAM仅在可能无法接近药物的基底外侧间隙连接处微弱地表达29。在上皮癌中，其不仅更加丰富(以数量级计)，而且沿着细胞膜分布。EpCAM的结扎(ligation)促进了粘附，并增强了细胞增殖和侵袭力。EpCAM的蛋白水解性裂解释放出增加干细胞因子转录的细胞内片段30、31。EpCAM的致癌性质可能使肿瘤细胞难以通过下调EpCAM而产生抗性。在一项研究中，大约2/3的TNBC(估计大概是基底细胞-A亚型)强烈地对EpCAM而言染色25。EpCAM+循环细胞的数量与乳腺癌的预后差有关32-36。已经针对上皮癌对EpCAM抗体进行了临床评估，但其本身效力有限37-39。在FDA批准的用于监测转移性乳腺癌、结肠癌和前列腺癌治疗的方法中，EpCAM表达鉴定了循环肿瘤细胞32-36。此外，约97％的人乳腺癌和几乎100％的其它常见的上皮癌(包括肺癌、结肠癌、胰腺癌和前列腺癌)明亮地将EpCAM染色，表明本文开发的平台可适应于常见癌症的基于RNAi的治疗。
在本文中证明了，测试的所有上皮乳腺癌细胞系对EpCAM而言明亮地染色，而永生化的正常乳腺上皮细胞、成纤维细胞和间充质肿瘤细胞系则没有染色。EpCAM-AsiC在体外引起luminal型和基底细胞-ATNBC癌细胞以及人乳腺癌组织中的靶向基因敲减，但在正常的上皮细胞、间充质肿瘤细胞或正常的人乳腺组织中不会引起靶向基因敲减。敲减与EpCAM表达成正比。此外，EpCAM-AsiC介导的PLK1(有丝分裂所需的基因)的敲减，抑制了上皮乳腺癌细胞系的体外T-IC功能测定(集落和乳腺球形成)。离体治疗特异性地消除了肿瘤的起始。皮下注射的PLK1EpCAM-AsiC由不良预后的基底细胞-A和Her2乳腺癌的EpCAM+基底细胞-A三阴性乳腺癌(TNBC)原位异种移植物特异性地摄取，并引起快速的肿瘤消退。
EpCAM在上皮乳腺癌细胞系中高度表达
首先，在乳腺癌细胞系中对EpCAM表达进行检查。基于Cancer Cell LineEncyclopedia40中的基因表达数据，EpCAM mRNA在基底细胞-ATNBC和luminal型乳腺癌细胞系中高度表达，但在基底细胞-B(间充质)TNBC中表达较差(图1A)。通过流式细胞术评估的表面EpCAM染色在所有的测试的luminal型和基底细胞-样细胞系中有2-3条记录比起在用hTERT(BPE)41、成纤维细胞或间充质TNBC永生化的正常上皮细胞中更明亮(图1B)。因此，相较于正常细胞或间充质肿瘤，EpCAM在上皮乳腺癌细胞系中高度表达。
EpCAM-AsiC选择性地敲减EpCAM+乳腺癌细胞中的基因表达
通过SELEX鉴定了结合至亲和力为12nM的人EpCAM19的19个核苷酸(nt)适体42、43。它不结合至小鼠EpCAM(数据未显示)。设计少量的通过数个接头将siRNA的正义或反义链连接至适体的3′端的EpCAM-AsiC，并使用2′-氟嘧啶取代和3′-dTdT突出端进行合成，以提高体内稳定性，避免了具有相似序列的部分互补基因的脱靶敲减，并限制了先天的免疫受体刺激。为了测试RNA递送、基因敲减和抗肿瘤作用，将siRNA并入至敲减的eGFP(作为有用的标记基因)；AKT1(在所有的研究的细胞系中表达的内源基因，其敲减不是致命的)和PLK1(有丝分裂所需的激酶，其敲减是致死的)(图9)。在基因敲减的剂量应答研究中表现最好的AsiC通过U-U-U接头将19nt EpCAM适体连接到siRNA的有义(无活性)链(图1C)。通过将化学合成的约42～44nt长的链(19nt适体+接头+20～22nt siRNA有义链)退火至20-22nt的反义siRNA链来制备EpCAM-AsiC。用2′-氟嘧啶进行商业合成(Jackson，2003#11353；Scacheri，2004#11912；Jackson，2006#13758；Wheeler，2011#17906)，这些是RNase抗性的并且在人血清中非常稳定(T1/2＞＞36h，图7)，并且在体内注射到荷瘤小鼠中时不会触发先天免疫(图7)。
为了验证EpCAM+肿瘤细胞的选择性摄取，使用共聚焦荧光显微镜来比较EpCAM+MDA-MB-468TNBC细胞和BPE、EpEAMdim永生化的乳腺上皮细胞中的在5′-端用Cy3荧光标记的EpCAM适体的内化(数据未显示)。不希望受理论的束缚，由于AsiC只含有一种适体，它们不会与它们识别的受体交联。因此，细胞内化缓慢，因为它可能通过受体再循环发生，而不是更迅速的活化诱导的内吞作用过程。
只有MDA-MB-468细胞对适体进行摄取。在22小时清楚地检测到摄取，但在43小时后极大地增加。为了测试EpCAM-AsiC是否被EpCAM明亮细胞系特异性地摄取，对AsiC的反义链的3′端进行荧光标记。EpCAM+BPLER是通过用人TERT、SV40早期区域和H-RASV12进行转染而由BPE转化的基底细胞-A TNBC细胞系，在孵育24小时后进行分析时，EpCAM+BPLER摄取了Alexa-647EpCAM-AsiC，但是BPE细胞未摄取(图1D)。此前的研究表明，AsicC通过Dicer在细胞内被处理以从适体中释放siRNA(10、12、15)。为了验证释放的siRNA是否被RNA诱导的沉默复合物(RISC)摄取，当MDA-MB-468细胞与PLK1EpCAM-AsiC一起孵育时，使用qRT-PCR来扩增用Ago免疫沉淀的PLK1siRNA(图33)。当将相同的细胞用PLK1siRNA孵育时，无PLK1siRNA结合至Ago。
TNBC细胞摄取了Alexa-467EpCAM-AsiC，但在BPE细胞中未检测到摄取(图1E)。接下来评估基因敲减是否对EpCAM+肿瘤而言是特异性的，通过eGFP siRNA的脂质转染和eGFPEpCAM-AsiC，在这些相同的细胞系(稳定地表达eGFP)中对eGFP敲减进行比较(图1D)。虽然eGFP siRNA的转染在BPE和BPLER中等同地敲减了基因表达，但在没有任何转染脂质的情况下，EpCAM-AsiC的孵育选择性地仅在BPLER中敲减表达。AsiC敲减是均匀的，并与用脂质转染实现的敲减相当。接下来，相较于正常的人成纤维细胞，我们在6个乳腺癌细胞系中比较了由AKT1AsiC和转染的AKT1siRNA特异性敲减的内源性AKT1基因(图1E)。AKT1仅在EpCAMbright luminal和基底细胞-A TNBC中被靶向AKT1的EpCAM-AsiC选择性地敲减，但在间充质基底细胞-B TNBC、成纤维细胞或BPE中未敲减(数据未示出)。正如预期的那样，靶向eGFP的AsiC对AKT1水平无影响，并且AKT1siRNA的转染在所研究的所有细胞系中同等地敲减了表达。此外，AKT1的EpCAM-AsiC敲减与EpCAM表达强烈相关(图1G)。在经染色的转染细胞中通过流式细胞术分析AKT1蛋白时，获得了类似的结果(图1G、图1H)。因此，EpCAM-AsiC的体外敲减对EpCAMbright肿瘤细胞而言是有效的并且是特异性的。
PLK1EpCAM-AsiC在体外选择性地杀死EpCAMbright肿瘤细胞
为了探讨EpCAM-AsiC是否可以用作乳腺癌中的抗肿瘤剂，我们通过CellTiterGlo测定法检测了针对PLK1(有丝分裂所需的激酶)的AsiC对包括5个基底细胞-A TNBC、2个luminal型细胞系和3个基底细胞-BTNBC的10个乳腺癌细胞系的存活的影响。靶向PLK1的EpCAM-AsiC，而非针对eGFP的对照AsiC，降低了基底细胞-A和luminal型细胞系的细胞增殖，但不抑制基底细胞-B细胞(图2A)。PLK1siRNA的脂质转染抑制了所有细胞系的生长。抗增殖作用与EpCAM表达密切相关(图2B)。敲减后的活的EpCAM+细胞的减少归因于细胞凋亡的诱导，通过膜联蛋白V-碘化丙啶染色和半胱天冬酶活化进行评估(数据未示出)。为了确定EpCAM适体的结扎是否有助于EpCAM-AsiC的抗增殖作用，我们将用PLK1EpCAM-AsiC处理的细胞与用其本身上的适体处理的细胞的存活进行了比较(图2C)。本身的适体对任何乳腺癌细胞系的存活都没有可重复的影响，可能是因为作为单体试剂，其不与EpCAM受体交联而改变EpCAM信号传导。因此，PLK1EpCAM-AsiC通过基因敲减证实了其对EpCAM+乳腺癌细胞的特异性抗肿瘤作用。
为了确定当与EpCAMdim非转化上皮细胞混合时，EpCAM-AsiC是否特异性地靶向EpCAM+细胞，我们用PLK1EpCAM-AsiCs或培养基孵育了GFP-TNBC细胞和GFP+BPE细胞的共培养物，并在3天后通过流式细胞术使用GFP荧光对它们的相对存活率进行了测定(图2D、图2E)。靶向PLK1的EpCAM-AsiC大大降低了存活的EpCAM+基底细胞-A肿瘤细胞的比例，但对EpCAM-基底细胞-B细胞系的存活无影响。因此，当与正常细胞混合时，PLK1EpCAM-AsiC对EpCAM+肿瘤细胞具有选择性细胞毒性。
EpCAM-AsiC在EpCAM+乳腺肿瘤活检标本中集中
接下来检查了在完整组织内，相对于正常的乳腺样品，EpCAM-AsiC是否在人乳腺肿瘤中集中。将来自3名乳腺癌患者的配对的正常组织和乳腺肿瘤活检物切成具有约3mm边缘的立方体，并置于培养皿中。肿瘤样本细胞均为EpCAMbright，正常组织细胞为EpCAMdim(图3A)。将荧光标记的Alexa647-siRNA(预期不被正常组织或肿瘤摄取)、Alexa647-胆固醇缀合的siRNA(chol-siRNA，预期被两者摄取)或Cy3-EpCAM-AsiC添加到培养基中，并在收获前将组织孵育24小时。可以通过裸眼可视化的AsiC的Cy3信号仅集中在肿瘤标本中，并且在正常组织中未检测到(图3B)。为了对RNA摄取进行量化，对组织标本(代表性的肿瘤-正常组织对(图3C)，来自3个EpCAMbright配对的乳腺肿瘤-正常组织样品的三重复活检物的平均值±SD(图3D))的经漂洗的单细胞悬液进行流式细胞术分析。EpCAM-AsiC被肿瘤而非正常组织显著摄取，同时也不摄取未缀合的siRNA，并且两者在一定程度上摄取了chol-siRNA。因此，在完整组织中，相对于正常组织，EpCAM-AsiC被选择性地递送至EpCAMbright肿瘤。
PLK1EpCAM-AsiC抑制EpCAM+肿瘤的T-IC
选择EpCAM用于靶向的部分原因是EpCAM标记了T-IC和转移起始细胞(M-IC)20、22、26、27、31。为了研究EpCAM-AsiC是否抑制T-IC，我们比较了mock处理、用紫杉醇或EpCAM-AsiC对eGFP或PLK1处理后的集落形成和乳腺球形成(T-IC功能替代测定)。PLK1EpCAM-AsiC比紫杉醇更强烈地抑制了EpCAM+基底细胞-A TNBC和luminal型细胞系的集落和乳腺球形成，但对EpCAM-基底细胞-B TNBC无活性(图4A-图4C)。T-IC抑制是特异性的，因为eGFPAsiC无作用。用PLK1EpCAM-AsiC而非eGFPAsiC进行的孵育也降低了具有T-IC表型的细胞的比例，即在基底细胞-A和luminal型乳腺癌细胞系中特异性的CD44+CD24low/-和ALDH+细胞的数量(数据未示出)。为了评估EpCAM-AsiC对肿瘤起始的影响，将稳定表达荧光素酶的EpCAM+MB468细胞用培养基或PLK1或eGFP EpCAM-AsiC处理过夜，然后将相等数量的活细胞皮下植入裸鼠。通过体内肿瘤细胞发光进行评估，PLK1EpCAM-AsiC完全阻断了肿瘤形成(数据未示出)。相比之下，基底细胞-B MB436细胞的相似处理对肿瘤起始无影响(数据未示出)。因此，对于EpCAM+乳腺癌，PLK1EpCAM-AsiC选择性地抑制体外T-IC测定和肿瘤起始。
皮下给予的EpCAM-AsiC被远处的EpCAM+TNBC选择性摄取
为了在临床上有用，EpCAM-AsiC需要被播散的肿瘤细胞摄取。小鼠尾静脉中的荧光EpCAM-AsiC的静脉内注射不会引起植入裸鼠侧腹肿的皮下肿瘤内的AsiC显著积累(数据未示出)，可能是因为它们的大小(约25kDa)低于肾脏过滤的阈值，并且它们被迅速排泄。与聚乙二醇的连接大大增强了前列腺癌的小鼠异种移植模型中的PSMA-AsiC的循环半衰期、肿瘤积聚和抗肿瘤治疗效果11。然而，为了观察这种修饰是否可以被绕过，我们通过活动物落射荧光成像检查了Alexa750标记的eGFP EpCAM-AsiC在7只小鼠的颈背中的皮下注射是否引起在各侧腹中皮下植入的远处EpCAM+MB468和EpCAM-MB231TNBC中的积累(图5A、图5B)。在注射当天内，EpCAM-AsiC仅在EpCAM+肿瘤中集中，并持续至少4天。在第2天在注射部位周围检测到EpCAM-AsiC，但在第4天仅在EpCAM+肿瘤内发现EpCAM-AsiC。
PLK1EpCAM AsiC引起基底细胞-A TNBC和Her2乳腺癌异种移植物的消退
因为皮下注射的EpCAM-AsiC在远处的EpCAM+肿瘤中集中，我们接下来研究了PLK1EpCAM-AsiC的皮下注射是否可以选择性地抑制EpCAM+TNBC异种移植肿瘤的生长。将EpCAM+MB468-luc细胞植入裸鼠的一个侧腹的基质胶(Matrigel)中，并将EpCAM-MB231-luc-mCherry细胞植入相对着的侧腹。一旦两个肿瘤的荧光素酶信号超过背景被清楚地检测到，则每3天将5-6只小鼠的组进行mock处理或用5mg/kg的靶向PLK1或eGFP的EpCAM-AsiC皮下注射2周。肿瘤生长之后发光。所有的EpCAM+肿瘤仅在接受靶向PLK1的AsiC的小鼠中迅速完全退行(图6A、图6B)。用靶向eGFP的AsiC治疗的小鼠中的EpCAM+肿瘤和所有EpCAM肿瘤继续增长。该实验在注射PLK1AsiC后以相似的结果重复。除了仅用EpCAM适体或PLK1siRNA(数据未示出)处理的对照小鼠的组和携带Her2+MCF10A-CA1a的小鼠组外，肿瘤还继续生长而无显著变化(图34)。因此，皮下注射的PLK1EpCAM-AsiC显示出对基底细胞-A TNBC和EpCAM+人异种移植物的特异性抗肿瘤活性。
讨论
目前的靶向治疗依赖于使用肿瘤特异性抗体或致癌激酶抑制剂。之前无人证明非缀合的AsiC可具有有效的抗肿瘤作用，或者可以皮下给予AsiC。目前尚无用于TNBC或T-IC的靶向治疗。开发用于TNBC的靶向治疗和开发消除T-IC的方法是癌症研究的重要的未满足的目标。
本文证实，EpCAM-AsiC可以用于在上皮乳腺癌细胞及其干细胞中选择性地敲减基因，而保留正常的上皮细胞和基质，以引起肿瘤消退并抑制肿瘤起始。在一个非常具有侵略性的TNBC异种移植模型中，EpCAM-AsiC仅在3次注射后引起完全的肿瘤消退。这可能对于所有常见的上皮癌(均匀表达高水平的EpCAM)而言是有效的灵活的靶向治疗平台。
尽管本文使用了靶向PLK1的EpCAM-AsiC，但可以改变siRNA以敲减将被定制为单个患者肿瘤的分子特征或肿瘤亚型的任何肿瘤依赖性基因。靶向多于一种基因的AsiC混合物对于癌症治疗剂来说是理想的，以减少发展耐药性的机会。靶向癌症治疗迄今依赖于使用肿瘤特异性抗体或致癌激酶的小分子抑制剂。使用EpCAM作为AsiC配体并开发靶向癌症干细胞的RNAi治疗是新型的。之前无人证明非缀合的AsiC可以具有有效的抗肿瘤作用，或者可以皮下给予AsiC。此外，人源化小鼠中的皮下给予的CD4-AsiC的初步研究显示出在脾脏和远端淋巴结中的CD4细胞中强烈敲减，表明也可以皮下给予靶向定位于机体其它部位的细胞上的受体的AsiC。目前尚无TNBC或T-IC的靶向治疗。靶向递送具有减少剂量和减少对旁观者细胞的毒性的优点。
将RNAi用于癌症的主要障碍是将小RNA传递至散播的细胞中。本文描述的是使用AsiC来克服这个障碍。本文描述的是一类新的有效的抗癌药物。AsiC是能够靶向不同的细胞表面受体并敲减任何基因或基因组合的灵活的平台。{Burnett，2012#18447；Zhou，2011#18448；Thiel，2010#18445}。通过改变适体，AsiC平台可以解决阻碍了将基于RNAi的治疗应用至大多数疾病的递送障碍。这种方法对于个性化的癌症治疗是理想的，因为可以根据肿瘤的分子特征来调整靶基因的选择。此外，RNA混合物可以一次敲减多个基因来预测和克服耐药性。AsiC是肝脏外部的基因敲减最有吸引力的方法。它们优于递送RNA的复杂脂质体、纳米粒子或缀合方法(conjugated methods)，因为它们是在血液中稳定的单一化学实体、易于制造、非免疫原性、能够容易地穿透组织并且在过滤器官中不被捕获。
重要的癌症研究目标是消除T-IC(癌症干细胞)。T-IC相对地抵抗化疗，并被认为是造成肿瘤复发和转移的原因。{Federici，2011#19371}。本文所述的AsiC靶向高效力的(上皮)T-IC。因此，它们可以消除具有进行性疾病风险的肿瘤内的这种侵袭性亚群(参见图6A、图6B)。
本文使用的小尺寸的EpCAM适体对于AsiC药物是理想的，因为可以有效地合成RNA＜60nt。
除了它们的潜在治疗用途之外，EpCAM-AsiC也是用于鉴定T-IC和肿瘤的依赖性基因以定义新的药物靶标的强大的体内研究工具。原则上，适体嵌合体可以被设计成不仅可以传递siRNA，而且可以传递miRNA模拟物或antagomirs、通过RNAi以外的其它机制起作用的反义寡核苷酸、甚至更长的mRNA或非编码RNA(50、51)。它们也可以被设计以掺入多于一种的适体、多种siRNA、甚至毒素或小分子抗癌药物。
其小尺寸对于AsiC药物是理想的，因为可以有效地合成RNA≤60nt。不仅siRNA靶向至肿瘤，而且还可以通过敲减肿瘤依赖性基因来选择药物靶点来攻击肿瘤的Achilles’heel。这种灵活性可用于靶向个体患者癌症的分子脆弱性的个性化癌症治疗。
材料和方法
细胞培养。使人BPE和BPLER细胞在WIT培养基(Stemgent)中生长。用荧光素酶报告子转导MB468。除非另有说明，所有其它人细胞系均获自ATCC，并在均补充有10％FBS、1mML-谷氨酰胺和青霉素/链霉素(Gibco)的DMEM(MB231、BT549、MB436)、MEM(MCF7，BT474)、McCoy′s 5A(SKBR3)或RPMI1640(HCC1806、HCC1143、HCC1937、HCC1954，HCC1187、MB468、T47D)中生长。4T1小鼠乳腺癌细胞在10％FBS DMEM中生长。对于体内成像，使用稳定表达萤火虫荧光素酶(MB468-luc)的MB468细胞，并且在用pLV-Fluc-mCherry-Puro慢病毒(由哥伦比亚大学的Andrew Kung提供)感染后选择稳定表达萤火虫荧光素酶和mCherry(MB231-luc-mCherry)的MB231细胞。用嘌呤霉素选择MB231细胞。
为了摄取和沉默处理，将细胞以低密度(在96孔板中10,000个细胞/孔)接种并立即处理。所有的AsiC和siRNA处理在OptiMEM或WIT培养基中进行。通过CellTiter-Glo(Promega)或台盼蓝染色在96孔板中对细胞活力进行评估。
对于集落形成测定，将1，000个活细胞在圆底96孔板中处理6小时，然后转移到含有血清的培养基的10cm平板。每3天更换一次培养基。8-14天后，将细胞固定在甲醇(-20℃)中，并用结晶紫染色。对于乳腺球形成测定，将1，000个/ml活细胞在圆底96孔板中处理6小时，然后在补充有EGF(20ng/ml，BD Biosciences)、B27(1∶50，Invitrogen)、0.4％牛血清白蛋白(Sigma)和4μg/ml胰岛素(Sigma)的无血清DMEM/F12 1∶1(Invitrogen)中悬浮培养。1周或2周后对乳腺球进行计数。
siRNA转染。根据制造商的方案用Dharmafect I转染细胞。所有siRNA序列参见图9。
流式细胞术。对于流式细胞术，如前所述对细胞进行染色(Yu，F.等(2007)，let-7Regulates Self Renewal and Tumorigenicity of Breast Cancer Cells，Cell 131，1109-1123)，简要地说，在4℃下使用1∶50稀释的hAb对EpCAM和AKT1直接免疫染色30-60分钟(BioLegend/BD)。使细胞在含有0.5％FCS、1mM EDTA和25mM HEPES的PBS中染色。样品在相同的缓冲液中洗涤两次。采用FACS-Canto II(BD Biosciences)获得数据。进行三重复的分析，并对10,000个门控事件/样本进行计数。使用FlowJo(Treestar Inc.)进行所有数据分析。
RNA分析。如(Petrocca，F.等(2008)，E2F1-regulated microRNAs impairTGFbeta-dependent cell-cycle arrest and apoptosis in gastric cancer.，CancerCell 13，272-286)所述进行qRT-PCR分析。简要地说，根据制造商的SYBR Green MasterMix(Applied Biosystems)和BioRad C1000Thermal Cycler(Biorad)，用Trizol(Invitrogen)提取总RNA，并使用Thermoscript RT试剂盒(Invitrogen)从1000ng总RNA制备cDNA。将相对CT值归一化为GAPDH并转化为线性标度。
人乳腺组织的胶原酶消化。从UMASS组织库中接受新鲜乳房或结肠癌以及对照活组织检查，将样品切成3×3×3mm样品，并置于具有100μl RPMI的96孔板中。用Alexa647-siRNA-GFP、Alexa647-chol-siRNA-GFP或Cy3-AsiC-GFP对样品处理24小时。将样品拍照并消化。将来自各处理的三个样品合并，并放入含有1mg/ml胶原酶II(Sigma-Aldrich)的10mlRPMI中，在37℃下振荡30分钟。在胶原酶消化之前和之后，使用脾脏程序在37℃下将样品在温和的MACS解离器(Miltenyi)中破碎30分钟。使细胞悬浮液通过70μm细胞过滤器(BDFalcon)，用30ml RPMI洗涤，并染色移用于流式细胞术。
动物实验。所有的动物手术均由哈佛医学院和波士顿儿童医院动物护理和使用委员会批准进行。裸鼠购自Jackson实验室。
体内实验。对于肿瘤起始研究，对8周龄雌性Nu/J小鼠(Stock#002019，Jackson实验室)皮下注射用EpCAM-AsiC-GFP、EpCAM-AsiC-PLK1预处理24小时或未处理的MB468-luc(5×106)细胞。用Tryple Express(Invitrogen)对细胞进行胰蛋白酶消化，重悬于WIT培养基中并皮下注射入侧腹。腹膜内注射150mg/kg D-萤光素(Caliper Life Sciences)后，使用IVIS Spectra系统(Caliper Life Sciences)每5天拍摄全身发光照片，总共20天。
对于AsiC摄取实验，将用Tryple Express(Invitrogen)胰蛋白酶消化的MB468-luc(5×106)和MB231-luc-mCherry(5×105)细胞重悬于1∶1的WIT-基质胶溶液中并皮下注射入8周龄雌性Nu/J小鼠(Stock#002019，Jackson实验室)的侧腹中。使用IVIS Spectra系统(Caliper Life Sciences)每天对肿瘤大小进行分析。5天后，肿瘤清晰可见，并用Alexa750-EpCAM-AsiC-GFP(0.5mg/kg)皮下注射至小鼠颈部区域。每48小时对AsiC相对于肿瘤的定位进行测定，测定7天。
对于肿瘤抑制研究，将用Tryple Express(Invitrogen)胰蛋白酶消化的MB468-luc(5×106)和MB231-luc-mCherry(5×105)细胞重悬于1∶1的WIT-基质胶溶液中并皮下注射入8周龄雌性Nu/J小鼠(Stock#002019，Jackson实验室)。每天使用IVIS Spectra对肿瘤大小进行分析，5天后肿瘤清晰可见。将荷载类似大小的肿瘤的小鼠随机分为5组，并用5mg/kg的EpCAM-AsiC-PLK1、EpCAM-AsiC-GFP、EpCAM-适体、siRNA-PLK1进行处理或不进行处理。每72小时对小鼠进行处理，持续14天。
使用Living软件(Caliper Life Sciences)对所有图像进行分析。
统计分析。使用Microsoft Excel计算的学生t检验来对经处理样本与对照之间的显著性进行分析，其中，测试类型被设置为单尾分布和两样本等方差。为了对先天性免疫刺激进行评估，使用GraphPad Prizm 4软件(GraphPad Software，San Diego，CA)进行Bonferroni′s Multiple比较检验的单因素方差分析(ANOVA)。P＜0.05被认为是显著的。
先天免疫刺激的测量。用eGFP EpCAM-AsiCs(5mg/kg)皮下注射小鼠，或用聚(I：C)(5mg/kg或50mg/kg)腹膜内注射小鼠。将在基线处以及处理后6小时和16小时收集的血清样品储存在-80℃，然后使用ProcartaPlex Multiplex Immunoassay(Affymetrix/eBioscience，San Diego，CA)对IFNβ、IL-6和IP-10进行测量。在使用具有gentle MACS解离器(MACS Miltenyi Biotec，San Diego，CA)的TRIZOL(Invitrogen)提取RNA之前，将处理后16小时处死获得的脾脏储存在RNAlater(Qiagen)中。使用Superscript III和随机六聚体(Invitrogen)合成cDNA，并使用以下引物用SsoFast EvaGreen Supermix和Bio-Rad CFX96实时PCR系统(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)进行PCR。
Gapdh正向引物：5’-TTCACCACCATGGAGAAGGC-3’(SEQ ID NO：4)；
Gapdh反向引物：5’-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3’(SEQ ID NO：5)；
ifnb正向引物：5’-CTGGAGCAGCTGAATGGAAAG-3’(SEQ ID NO：6)；
ifnb反向引物：5’-CTTGAAGTCCGCCCTGTAGGT-3’(SEQ ID NO：7)；
il-6正向引物：5’-TGCCTTCATTTATCCCTTGAA-3’(SEQ ID NO：8)；
il-6反向引物：5’-TTACTACATTCAGCCAAAAAGCAC-3’(SEQ ID NO：9)；
ip-10正向引物：5’-GCTGCCGTCATTTTCTGC-3’(SEQ ID NO：10)；
ip-10反向引物：5’-TCTCACTGGCCCGTCATC-3’(SEQ ID NO：11)；
oas-1正向引物：5’-GGAGGTTGCAGTGCCAACGAAG-3’(SEQ ID NO：12)；
oas-1反向引物：5’-TGGAAGGGAGGCAGGGCATAAC-3’(SEQ ID NO：13)；
stat1正向引物：5’-TTTGCCCAGACTCGAGCTCCTG-3’(SEQ ID NO：14)；
statl反向引物：5’-GGGTGCAGGTTCGGGATTCAAC-3’(SEQ ID NO：15)。
EpCAM在基底细胞-A和luminal型乳腺癌细胞系中过表达，但不在基底细胞-B乳腺癌细胞系中过表达(数据未示出)。用8种不同的乳腺癌细胞系进行FACS，使用hEpCAM抗体通过流式细胞术对EpCAM表达水平进行检测。EpCAM在所有的基底细胞-A和luminal型细胞系中过表达，而不在基底细胞-细胞中过表达。
基底细胞-A乳腺癌细胞系中的细胞活力的特异性降低是PLK1依赖性的。用靶向PLK1的EpCAM-AsiC或仅用EpCAM适体对代表基底细胞-A、基底细胞-B和luminal型细胞的10种不同的乳腺癌细胞系进行处理，并与未处理的对照进行比较。用EpCAM-适体处理的细胞系均未显示细胞活力降低，而基底细胞-A和luminal型细胞系在用靶向PLK1的EpCAM-AsiC进行处理后显示出细胞活力降低(数据未示出)。
EpCAM-AsiC被健康和结肠癌活检物摄取。将靶向GFP的Cy3-EpCAM-AsiC、Alexa647-siRNA-GFP或Alexa647-chol-siRNA-GFP(各2μM)加入到结肠癌和对照外植体，并孵育24小时，然后用胶原酶将组织消化至单细胞悬液并通过流式细胞术进行分析。EpCAM-AsiC、siRNA和chol-siRNA以相似效力渗透了肿瘤和健康组织。在第5天，将肿瘤去除并可视化以证实Alexa750标记的靶向GFP的EpCAM-AsiC确实进入了肿瘤。Alexa750的升高的水平与mCherry水平呈负相关(n＝8，*P＜0.05，t检验EpCAM+相较于EpCAM-细胞)(数据未示出)。
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实施例2
本文描述了使用由结构化RNA(称为适体)构成的嵌合RNA的靶向siRNA递送(适体-siRNA嵌合体(AsiC))的开发，其被选择用于高亲和力结合至共价连接到siRNA的细胞表面蛋白。这些AsiC被表达受体的细胞摄取，适体识别该受体并将AsiC在细胞内进行处理以释放活性siRNA。这是灵活的平台，其可以通过靶向特定细胞表面受体而进行修饰以靶向不同的细胞，并且可进行设计以敲减任何基因或基因组合。
选择该适体用于高亲和力地结合至所有上皮细胞上表达的人EpCAM(CD326或ESA)，但在包括分化不良的乳腺癌如基底细胞-样TNBC中更高度表达。所有常见的癌症(肺、胰腺、前列腺、乳腺和结肠)具有高的EpCAM表达，并且可有效地被靶向。
本文证明了上皮乳腺癌细胞(而非间充质或正常的上皮细胞)选择性地摄取EpCAM-AsiC并在体外经历基因敲减。此外，敲减的程度与EpCAM水平密切相关。使用EpCAM-AsiC敲减有丝分裂所需的基因PLK1消除了癌细胞系生长和干细胞特性，包括异种移植物中的肿瘤起始以及集落和乳腺球形成。该平台可用于消除上皮肿瘤内的癌细胞和恶性癌干细胞。
EpCAM AsicC可以特异性地递送至基底细胞-样肿瘤并抑制肿瘤生长。这些AsiC也可以作为鉴定T细胞依赖的基因的强力研究工具，这可能是常规药物或基于RNAi的药物的良好靶标。
实施例3
用于调节基因表达的普遍存在的机制称为RNA干扰。它使用荷载短的互补序列的小RNA以阻断遗传信息转化成蛋白质。利用这种内生过程，通过敲减致病基因的表达来提供令人兴奋的治疗疾病的可能性。主要障碍是将小RNA传递到RNA干扰机构(machinery)所在的细胞中。在过去一年中，初步临床研究已经显示出非常有希望的结果，而通过肝脏中的异常基因表达引起的少数疾病中无显著的毒性。然而，向肝脏(捕获血液中的粒子的器官)递送比将药物递送至转移性肿瘤细胞更容易实现。本文描述的是将RNA靶向入上皮癌细胞中的策略，其特别适用于靶向最具侵袭性的乳腺癌、三阴性乳腺癌(TNBC)。此外，它还靶向大多数乳腺癌中的最恶性的亚群，称为癌症干细胞。这些细胞对化疗药物具有抗药性，并被认为是造成肿瘤复发和转移的原因。目前的癌症研究的重要目标是用对肿瘤具有选择活性、特别是针对肿瘤内的癌症干细胞具有选择活性的药剂取代对癌细胞和正常分裂细胞(如血液形成细胞和肠内细胞)均有毒的细胞毒性化疗药物。
用于一种类型的乳腺癌(Her2+)的靶向治疗已经极大地改变了治疗并显著改善了存活率。目前尚无用于TNBC或乳腺癌干细胞的靶向治疗。
本文描述的是证明将干扰RNA连接到识别细胞表面蛋白的结构化RNA(适体)的RNA可以敲减侵袭性乳腺癌细胞中的基因表达的数据。结合到在乳腺癌干细胞和大多数TNBC细胞上高度表达的蛋白质的适体可以在TNBC的最常见亚型中特异性地敲减癌细胞分裂或存活所需的蛋白质。这些RNA可以在组织培养物和TNBC的小鼠模型中进行测试。本文描述了利用基于RNA的药物来治疗不良预后的乳腺癌的平台，并在小鼠模型中证明了其效力。
治疗乳腺癌的最终适用性(哪些患者，它将如何帮助他们，临床应用/益处/风险，与患者相关的结果的预计时间)。该治疗可靶向的蛋白质在所有的上皮癌细胞上表达，但是在最小分化(并因此是最恶性的)的癌细胞上更强烈地表达。这种方法不仅可用于治疗大多数的上皮性乳腺癌(并且大多数乳腺癌细胞是上皮细胞)，而且还具有治疗常见癌症(包括结肠癌、肺癌、胰腺癌和前列腺癌)的潜力。我们的重点在于最具侵略性且最不良预后的乳腺癌，TNBC优先侵袭少数人群的年轻女性和女性。这种方法允许新的乳腺癌治疗平台。任何导致癌症或促进癌症的基因或基因组合都可能被敲减，使得该策略适合未来的个性化癌症治疗时代，其中，将根据他们的个体肿瘤的分子特征对每位患者的治疗进行定制。
此外，如果肿瘤无反应或变成抗性的，则可以灵活地对靶基因的混合物进行调整。因为正常的上皮细胞表达低水平的用于靶向的蛋白质，所以正常上皮细胞可能摄取一些并对正常上皮细胞有一些毒性，这在本文中进行了评估。然而，该平台是灵活的，使得可以选择治疗性siRNA物品(cargo)来杀死肿瘤细胞而对正常细胞的毒性最小。
本文描述的是能够引起肿瘤特异性基因敲减和肿瘤抑制的多种分子在小鼠TNBC模型中的设计和测试。
对于TNBC或乳腺癌中的高度恶性的肿瘤起始细胞亚群尚无靶向治疗。
三阴性乳腺癌(TNBC)具有最差的乳腺癌预后1-4。尚无靶向治疗，并且TNBC往往复发。本文描述的是在基底细胞-样(或基底细胞-A)TNBC中敲减肿瘤依赖性基因的基于小RNA的药物的开发。原则上可以利用RNA干扰(RNAi)来敲减致病基因来治疗任何疾病5-9。然而，将小RNA转化为药物是有挑战性的。最近的I期和II期临床试验已经显示出肝脏中的剧烈且持久的基因敲减(约80％-95％，单次注射后持续将近一个月)而无明显毒性10-16。然而，实现基因敲减以治疗癌症的潜力需要强大的方法来将RNA递送到弥漫性癌细胞中，肝脏靶向RNA无法做到这些7。理想的治疗方法可以选择性地敲减癌细胞中的基因，从而使正常细胞的毒性最小化17。
AsiC由共价连接到siRNA的RNA适体(对受体具有高亲和力的结构化RNA)18、19构成(图10A-图10B)。
本文描述的是在上皮癌中使用EpCAM适体来敲减基因的AsiC的用途37。EpCAM(首先描述的肿瘤抗原)在所有常见的上皮癌中高度表达38-45。在上皮乳腺癌上，EpCAM比正常乳腺组织上的丰度更多约400倍46。EpCAM39、45、47-53也在大多数上皮癌肿瘤起始细胞(T-IC，也称为癌干细胞)上高度表达39、45、47-53。
EpCAM适体具有高亲和力(12nM)并且是短的(19nt)，其对于AsiC药物是理想的，因为可以廉价且有效地合成RNA＜60nt。将由42～44nt的链构成的EpCAM-AsiC(19nt适体+3nt接头+20～22nt siRNA有义链)退火至20～22nt反义(活性)siRNA链(图10B)。它们用2′-氟嘧啶商业合成，从而提高血清稳定性(T1/2＞3d)并阻断先天免疫识别28、54-56。
相对于正常的上皮细胞，EpCAM靶向可引起基底细胞-样TNBC中的选择性基因敲减。选择性敲减会降低药物剂量和正常组织毒性。在正常的上皮细胞中，EpCAM仅在基底侧间隙连接处表达，其可能无法进入。在上皮癌中，它更丰富并且沿着整个细胞膜分布。EpCAM促进粘附，并因此增强增殖和侵袭力。EpCAM的蛋白水解切割释放增加干细胞因子转录的细胞内片段。EpCAM的致癌性质可能使肿瘤细胞难以通过下调EpCAM产生抗性。EpCAM+循环细胞的数量与乳腺癌中的不良预后有关。事实上，列举循环EpCAM+细胞是FDA批准的用于监测转移性乳腺癌、结肠癌和前列腺癌治疗的方法的基础。在我们的研究中，9个基底细胞-ATNBC和luminal型乳腺癌细胞系中有9个是强烈的EpCAM+，而正常的乳腺癌上皮细胞系和间充质TNBC接近背景水平(图1B)。因此，大多数基底细胞-样TNBC和luminal型乳腺癌将可能被EpCAM-AsiC靶向。在初始数据中，EpCAM-AsiC选择性地敲减EpCAM+乳腺癌和结肠癌细胞系中的表达，但在正常的上皮细胞或间充质肿瘤细胞中不表达；敲减是均匀的，并且与脂质转染相当，但脂质转染在所有的细胞系中均匀地敲减基因表达(图3A-图3C)。
通过针对PLK1(有丝分裂所需的激酶)的EpCAM-AsiC进行的AKT1敲减和细胞增殖抑制与EpCAM水平相关。当正常转化的上皮细胞(BPE)57与上皮TNBC细胞系混合时，EpCAM-AsiC仅在肿瘤细胞(而非BPE细胞)中引起PLK1敏感性细胞死亡(未示出)。此外，当将肿瘤活检物和正常组织活检物与荧光AsiC共孵育时，只有肿瘤摄取了AsiC并发荧光(未示出)。这些结果表明，相较于正常上皮细胞，EpCAM-AsiC对上皮肿瘤细胞是特异性的。
EpCAM还标记了T-IC40、45、58。癌症研究的重要目标是开发靶向T-IC的方法。虽然干细胞假说是有争议的，并且可能不适用于所有癌症，但有很好的证据表明，乳腺癌包括T-IC亚群59-82。T-IC相对地抵抗化疗并且也被认为是造成肿瘤复发和转移的原因。本文所述的AsiC被设计用于以高的效力靶向(上皮)T-IC。因此，它们可能适合消除具有复发风险的患者内的这种侵袭性亚群。为了研究EpCAM-AsiC是否抑制TNBCT-IC，我们比较了乳腺肿瘤细胞(对其进行mock处理或者用针对eGFP或PLK1的EpCAM-AsiC进行处理)的乳腺球和集落形成(T-IC功能的体外替代)。PLK1EpCAM-AsiC(而非对照GFP AsiC)消除了乳腺luminal型和基底细胞-样TNBC细胞系的乳腺球和集落形成(图11D)。PLK1EpCAM-AsiC还减少CD44+CD24low和Aldefluor+细胞(未示出)。重要的是，用PLK1EpCAM-AsiC进行的处理消除了基底细胞-样TNBC的肿瘤起始，但如预期的那样，对基底细胞-B TNBC肿瘤起始无影响(数据未示出)。在乳腺脂肪垫的原位植入之前，将表达荧光素酶的细胞系用AsiC处理过夜或进行mock处理。
在EGF受体信号传导中很重要的靶向EphA2的AsiC83-92也在本文考虑之内。EphA2在上皮和间充质(分别为基底细胞-A和基底细胞-B)TNBC细胞系(包括其T-IC)上表达，但小于EpCAM，并且仅在其它乳腺癌上较弱表达。抑制EphA2在多种癌症模型中减少了肿瘤生长和血管生成。此外，EphA2可以在癌细胞而非正常细胞上选择性地接近。
也在本文考虑之列的是小鼠-人交叉反应性AsiC，其对于未来的药物开发是有价值的，因为它们将使我们能够对自发性小鼠肿瘤模型中的毒性和有效性进行评估。
靶向EphA2的AsiC可以产生抑制EphA2信号传导和细胞增殖以及敲减基因的双重功能性RNA。
AsiC对个体化癌症治疗来说是理想的，因为可以将靶向敲减的基因调整为肿瘤的分子特征。此外，RNA的混合物可以组装以一次敲减多个基因，用于预期组合治疗并克服耐药性。AsiC不仅将药物靶向至肿瘤，还可以选择siRNA来攻击特异性的肿瘤的Achilles’heel。siRNA也提供了独特的机会来靶向“无药可靶向”的基因。敲减肿瘤依赖性基因(肿瘤需要，但正常细胞、存活不需要)的AsiC应该具有降低的毒性。为了鉴别我们可以敲减的基底细胞-样TNBC的遗传依赖性，我们进行了全基因组siRNA致死性筛选，比较了两种TNBC细胞系(在不同的培养基中用相同的致癌基因转化的人10种乳腺上皮细胞)：基底细胞-样BPLER和肌上皮HMLER细胞57、93。
尽管基本上是同基因的，但BPLER是高度恶性的并且富含T-IC，在裸鼠中仅50个细胞形成肿瘤，而HMLER需要＞105个细胞来起始肿瘤。筛选鉴别了依赖于BPLER而非HMLER的154个基因。蛋白酶体基因高度富集(P＜10-14)。BPLER依赖性基因表达与乳腺癌(而非肺癌或结肠癌)中的不良预后相关。因为TNBC是异质性的1、3、4、94，为了鉴别基底细胞-样TNBC中的共享的依赖性，我们进行了另一筛选以检测17个乳腺癌细胞系是否依赖于154个BPLER依赖性基因(未公开)。虽然许多BPLER依赖性只与基底细胞-样TNBC细胞系的亚组共享，但蛋白酶体、MCL1、一些剪接基因和一些其它的新的基因却很突出，因为几乎全部(9种中的至少8种)基底细胞-样TNBC细胞系依赖于这些基因，而正常细胞不依赖。如筛选所预测的，蛋白酶体抑制剂硼替佐米杀死基底细胞-ATNBC并且还阻断T-IC功能(通过集落和乳腺球形成来评估)，还在基底细胞-样TNBC中最具选择性。简单暴露至硼替佐米还抑制了小鼠上皮TNBC细胞系的集落形成和肿瘤抑制。硼替佐米强烈地抑制了Tp53+/-小鼠中自发产生的多种人类基底细胞-A系和原发性TNBC而非基底细胞-B或luminal型细胞系的肿瘤生长。硼替佐米还阻断了IV-注射的TNBC细胞的转移性肺定植(colonization)。然而，硼替佐米不能很好地渗透入实体瘤中。需要最大耐受剂量来抑制蛋白酶体活性并阻抑肿瘤。尽管可用蛋白酶体抑制剂在发育过程中改善肿瘤渗透，但蛋白酶体基因敲减可能提供更持久且更有效的蛋白酶体抑制。
EpCAM-和EphA2-AsiC可用于靶向基因敲减以治疗基底细胞-样TNBC癌症，保留正常细胞并消除其内的T-IC。在正常的上皮细胞中可能存在弱表达EpCAM或EphA2的一些摄取物，但是基因敲减将在适体配体高亮的肿瘤细胞中集中。
可以确定EpCAM-和EphA2-AsiC靶向何种乳腺癌亚型并确定适体配体水平如何影响基因沉默。也可以评估癌组织与正常上皮中的摄取/敲减。可以将EpCAM-AsiC引起基底细胞-样TNBC中的敲减的有效性与EphA2-AsiC进行比较。可以确定EpCAM-AsiC和EphA2-AsiC是否能够钯向T-IC以抑制肿瘤起始。
可以使用原位TNBC异种移植小鼠的活体动物成像进行EpCAM-和EphA2-AsiC的药代动力学(PK)/药效动力学(PD)研究。可以对处理的组织样品和动物进行毒性和先天免疫激活检测，并且如果需要改善PK/PD或降低毒性，将对AsiC进行化学修饰。作为原理的证明，将对PLK1敲减的抗肿瘤作用进行评估。根据本文所述的方法可以实现最近鉴定的基底细胞-A TNBC依赖性基因(例如MCL1和蛋白酶体基因)的阻抑。
在本文考虑之列的是：
识别EpCAM和EphA2并且被选择性地内化至基底细胞-A TNBC与正常上皮细胞中的跨物种反应性适体(cross-species reactive aptamers)；
验证乳腺癌细胞系与正常的上皮细胞中的靶向TNBC的AsiC的体外选择性摄取、基因沉默和细胞毒作用，确定它们转染的乳腺癌细胞系的亚型，并评估其转染和消除乳腺T-IC细胞的潜力；
评估体内全身递送和肿瘤浓度，定义PK和PD以及靶向TNBC的AsiC的最大耐受剂量，以及评估经优化的靶向TNBC的AsiC的抗肿瘤作用，靶向TNBC的AsiC在小鼠原发性和转移性癌的人TNBC细胞系模型中敲减PLK1和基底细胞-样TNBC依赖性基因。
靶向TNBC的适体的选择。通过称为SELEX(Systematic Evolution of Ligands byExponential enrichment)的过程，由具有广泛复杂性的组合核酸序列库(通常为1012-1014个不同序列)迭代筛选来鉴别结合至选定靶标的适体95、96。在经典方法中，将RNA库与蛋白质靶标一起孵育，将结合的RNA分离并扩增，以产生结合的RNA池(pool)。再次将这些应用于多个周期中以产生增多的富集的高亲和力RNA池。通过克隆和测序<100个个体序列来事先实现多轮SELEX后出现的序列的鉴定。
尽管这通常提供了足够数量的优势序列(winning sequence)来鉴别适体，但是与进化的寡核苷酸池的序列复杂度相比，经分析的序列的数量相当小。随着多次选择循环，未有效扩增的一些有效适体序列可能被耗尽和丢失。下一代深度测序方法和生物信息学可以允许评估早期循环的SELEX序列池中的更多序列，以在早期选择轮次中鉴别优势适体序列，从而减少完成高亲和力适体鉴定所需的时间和资源30、97-104。
用于并入AsiC的适体的重要性质是有效内化成细胞。细胞表面蛋白质的一些配体在结合其细胞表面蛋白质靶标后有效地内化，而其它配体则不能。另一策略(“切换SELEX(toggle SELEX)”)选择用于识别来自不同物种的相同配体的交叉反应性适体，这是临床前开发的有用特性。通过在直系同源蛋白质配体(例如小鼠和人形式)的选择之间的切换循环，可以富集跨物种反应性适体105。
这些SELEX技术可使得能够鉴别内化于人(和小鼠)基底细胞-样TNBC中但不进入正常的永生化的上皮细胞系中的EpCAM和EphA2的高亲和力的跨物种反应性适体。为了选择具有拮抗活性和/或交叉识别相应小鼠抗原的另外的EpCAM和EphA2适体(已公开的EpCAM适体不识别小鼠EpCAM(数据未示出))，我们可以在可商购的小鼠和人类纯化的重组靶蛋白质之间从含有2′-氟嘧啶的1012个RNA序列的库开始切换。长度为51nt的寡核苷酸的这一库被设计成具有20个核苷酸的随机区域，该区域两侧是在各选择轮次用于PCR扩增的已知序列的恒定区域。先前描述的方法将用于选择结合至固定的C-末端标签化蛋白的高亲和力RNA37(这使得N末端区域暴露，以助于选择识别细胞外结构域的适体)。可将标签化的对照蛋白用于对RNA适体库进行预清理，以除去非特异性结合物。可以进行7-10次迭代轮次的SELEX，以富集特定适体。每轮之后的集中可以通过表面等离子体共振来监测。可以使用高通量测序对显示出特异性结合的富集池进行测序。可以使用如所述的富集库序列的生物信息学分析来选择用于实验验证的序列97、98、106。
可以通过表面等离子体共振对来自高通量测序和生物信息学分析的前10-15个序列进行评估，以使用先前特征化的人适体进行比较来评估如99、106所述的相对的结合亲和力。
确认高亲和力交叉反应性适体的替代策略是细胞内化SELEX，在转染至表达人或小鼠EpCAM的293T细胞上积极选择并预先清除表达对照蛋白的细胞。如前所述37，5种最高亲和力的适体将被内化至EpCAM/EphA2+细胞中的能力将通过qRT-PCR和流式细胞术(使用荧光标签化的适体)与先前选择的适体进行比较。
也可以对这些适体的特异性地抑制肿瘤细胞系增殖的能力进行评估。具有该性质的适体可以是受体拮抗剂，将通过检查其对细胞信号传导的作用来进行验证。鉴于人和小鼠EphA2细胞外结构域之间的高同源性(＞90％同一性；＞90％的结构同源性)，鉴别与人和小鼠EphA2交叉反应的适体可以像测试用于针对小鼠的交叉反应的已选择适体一样简单。因此，可以首先评估现有组的20个人的EphA2适体结合小鼠EphA2的能力。或者，可以遵循上述策略。对于少数的最大适体(top aptamers)，可以合成截短序列(缺少一个或两个库衔接头(adapter)序列)，以限定结合所需的最小序列。
可以对各配体鉴别长度为约20-35nt的适体，其可被设计成可适用于化学合成的AsiC。
靶向TNBC的AsiC的体外评估及其针对T-IC的活性。可以定义何种乳腺癌亚型可用靶向TNBC的AsiC有效转染，并评估肿瘤敲减是否相对于正常组织细胞而言是特异性的，首先在细胞系中并随后在10个肿瘤标本中验证细胞系转化为10个组织的结果。我们还可以评估靶向TNBC的AsiC转染并靶向乳腺T-IC的效力。
AsiC设计和初始测试。可以通过连接至用于本文上述的初始的EpCAM-AsiC的靶向eGFP、AKT1和PLK1的siRNA(相对于对照扰乱的(scrambled)siRNA)，将上文鉴别的最有吸引力的适体(基于在不良预后癌症与正常细胞中的结合和表达的选择性、亲和力、截短到较短长度、肿瘤形成和干细胞行为中的配体的重要性、受体拮抗作用以及跨物种反应性的考虑进行优化)设计为AsiC。
预先使用慢病毒产生稳定表达不稳定的(d1)EGFP(蛋白质T1/2约1小时)的基底细胞-样NBC细胞系。可以通过流式和成像容易地将GFP表达定量，并且其敲减无生物学后果。短的T1/2允许快速灵敏地检测敲减。在所有细胞中表达的AKT1是用于研究的良好的内源性基因，因为其敲减对细胞活力无太大影响。
PLK1出于其抗肿瘤作用而使用，因为它的敲减对细胞分裂是细胞毒性的。本文描述的是用靶向这些基因中的各基因的EpCAM-AsiC进行的稳健且可重现的基因敲减。将用2′-氟嘧啶化学合成AsiC，以稳定和抑制先天免疫识别和处于它们的3′端的dT残基，以防止外切核酸酶消化。将2条链退火以产生最终的RNA(图10A-图10B)。可以对这些AsiC进行评估，并将其与原始的EpCAM-AsiC(作为阳性对照)和CD4-或PSMA-AsiC(作为阴性对照)在体外剂量应答实验中对AsiC摄取(使用例如缀合至短链3′端的不影响AsiC活性的荧光团(如AF-647))、基因敲减和降低的肿瘤细胞系生长和生存方面进行比较。可以分别通过流式细胞术、流式细胞术和qRT-PCR、以及Cell-TiterGlo和膜联蛋白-PI染色对几种人基底细胞-ATNBC细胞系(MB468、HCC1937、BPLER vs.永生化上皮细胞)中的选择性摄取、基因敲减和抗肿瘤作用进行定量。这些实验可以使得能够选择出识别EpCAM和EphA2的少数最佳表现的AsiC。
响应于靶向TNBC的AsiC的乳腺癌的类型。可以确定何种类型的乳腺癌可以用所选择的AsiC转染，以及相对于正常的上皮细胞在肿瘤中如何进行特异性法基因敲减。可以评估通过在代表常见的乳腺癌亚型的20个人乳腺癌细胞系但偏重于TNBC(14个TNBC细胞系，加上liminal和Her2+细胞系样品)中选择的AsiC进行的体外敲减93。可以将适体配体表达、荧光标记的AsiC的摄取和基因沉默与作为阴性对照的BPE57和成纤维细胞系进行比较。细胞系的这一大组(panel)可以允许评估细胞表面EpCAM和EphA2水平如何影响RNA摄取和基因沉默，以及是否存在有效敲减所需的表达阈值。剂量应答实验可以允许验证在AsiC中保留的适体的高亲和力。将通过使用酸洗来去除松散粘附的适体并且显示出结合被未标记的适体竞争和当细胞在处理前进行胰蛋白酶消化时被消除，从而验证摄取的特异性(相对于非特异性的“粘附”)。将AsiC介导的转染与作为阳性对照的脂质转染和作为阴性对照的裸siRNA进行比较。5天后通过流式细胞术和qRT-PCR对敲减进行评估，5天是AsiC介导的敲减的最佳时间。预期摄取和基因沉默将与适体配体水平相关。为了验证在配体+和liganddim/-未转化的乳腺上皮细胞的混合物中维持了肿瘤细胞的特异性，当PLK1是表达不同的适体配体水平的肿瘤细胞与不同数量的GFP+BPE细胞的混合物中的基因靶标时，我们可以比较荧光AsiC摄取、基因敲减和存活。
上皮原发性乳腺癌细胞是否优先摄取TNBC靶向AsiC，并显示相对于组织外植体中的正常的上皮细胞的敲减？为了评估原发性肿瘤摄取和敲减并预期对正常组织细胞的潜在毒性，我们接下来可以对在10个luminal、Her2+和TNBC乳腺癌以及周围正常组织的外植体中的原位转染和基因敲减进行评估。我们可以对来自约25个肿瘤的样本进行分析，以提供对常见的肿瘤亚型的全面了解。可以通过ER、PR、Her2和E-钙粘蛋白的组织学和免疫组织化学(IHC)染色证实肿瘤分型。如果适体识别小鼠配体，我们还可以使用小鼠肿瘤/正常组织来评估对正常上皮的潜在毒性。我们可以将没有大量的肿瘤细胞的竞争来源的正常组织与含有肿瘤细胞的组织进行比较。对于在治疗或手术后将AsiC给予具有低/不可检测的肿瘤负荷的患者的情况下，这对于预测毒性可能是非常重要的。这些实验还可以允许评估10种肿瘤的敲减是否与细胞系相匹配，组织构造是否影响肿瘤细胞中的摄取/敲减以及不同的肿瘤亚型如何转染。在本文考虑之列的是上皮乳腺癌将经历有效的基因敲减，但是正常的上皮细胞不会。
可以将切成约3×3×3mm3的片的活检物在微量滴定孔中进行转染，其应该在SQ或IV输注后模拟体内摄取。脂质体(lipofectamine)包封的siRNA和胆固醇缀合的siRNA在极化柱状(polarized columnar)和鳞状生殖道粘膜中的正常上皮细胞的基因敲减方面都是有效的108、109，而裸siRNA不被摄取。用正常的乳腺上皮组织中的这些对照预期类似的结果。我们可以平行地分析胶原酶消化的10个细胞的敲减，以将该敲减与组织和癌细胞系中实现的结果进行比较。我们可以首先使用siRNA靶向上皮基因来证实这些对照，我们之前已经敲减了这些基因(例如E-钙粘蛋白、细胞角蛋白(CK)-5(基底细胞的良好的标记物)和14、以及结合素-1)93、108、109，它们的表达可以容易地后随着IHC、荧光显微镜(FM)或分离细胞的流式细胞术。靶基因的染色可与表型标记物和荧光标记的siRNA的染色相关，以确定哪些细胞类型被靶向。泛-CK抗体可以区分上皮细胞(正常和肿瘤)与基质(stroma)。特别令人感兴趣的是在罕见的基底细胞组织干细胞中的递送和CK5敲减，因为EpCAM-AsiC可以靶向这些细胞并有效地引起正常组织干细胞的耗尽。将通过组织切片的H&E染色以及I型干扰素和炎性细胞因子(IL-1、IL-6、TNF-α)的qRT-PCR测定法来评估组织毒性和炎症。如果检测到，则还将引入RNA序列(除2′-氟嘧啶外)的另外的化学修饰以消除潜在的有害炎症。
靶向TNBC的AsiC可以靶向乳腺肿瘤起始细胞吗？我们选择EpCAM和EphA2作为适体靶标，部分因为它们转染T-IC的潜力。乳腺T-IC不是通过表型标记物唯一定义的(并且它们实际上可能是异质的93、110-113)，这使实验具有挑战性，因为T-IC通过其起始能够连续移植的处于小量的肿瘤的能力而被在功能上定义。在不同组合中的CD44、CD24、EpCAM、CD133、CD49f或ALDH1的染色富集了T-IC59、72、78、114-121。不同的方案定义了重叠但不相同的潜在的T-IC亚组。不希望受理论的束缚，在本文考虑之列的是EpCAM-和EphA2-AsiC将被T-IC摄取并在T-IC中引起基因沉默，并且可用于靶向治疗以消除或削弱肿瘤内的T-IC能力。
为了分析T-IC亚群中的AsiC摄取和基因沉默，可以将成组的乳腺癌细胞系(luminal、Her2+、基底细胞-A和基底细胞-B TNBC)中的EpCAM、EphA2、CD44和CD24的多色流式细胞术用于鉴别哪些乳腺细胞系具有推定的T-IC群体，该T-IC群体含有对EpCAM和/或EphA2而言明亮染色的细胞。我们还可以检测从这些细胞系产生的乳腺球和Aldefluor+细胞的EpCAM/EphA2染色112、123-125。我们可以在T-IC中选择约4-5条最亮/最均匀的EpCAM/EphA2表达作为最有吸引力的细胞系以在该亚目标中研究并且可以产生稳定的表达(d1)GFP的变体。这些细胞系以及它们的乳腺球和Aldefluor+亚群可以与携带GFP siRNA的AF647标记的AsiC(以及作为阴性对照的非靶向的PSMA-AsiC)一起孵育。通过AF-647荧光与EpCAM或EphA2、CD44和CD24以及Aldefluor染色一起来评估AsiC摄取。AsiC可以被EpCAM+或EphA2+CD44+CD24-/dimAldefluor+细胞摄取。为了评估T-IC表型细胞中的基因敲减，用eGFP或荷载对照siRNA的AsiC处理后，我们可以通过流式细胞术和qRT-PCR来监测T-IC群体中的GFP表达和剩余细胞。我们还可以评估内源性PLK1和AKT1的敲减。
这些实验可以表明不同亚型的乳腺癌中的T-IC是否被EpCAM/EphA2-AsiC靶向。在随后的实验中，我们将重点关注我们在T-IC富集群体中具有＞80％敲减的细胞系。如果敲减效力低下，我们可以修改转染条件(AsiC的量、细胞数、体积等)。接下来，我们可以评估AsiC是否抑制乳腺球和集落形成，减少表达CD44和ALDH1的亚群，以及侧群细胞的大小。除了敲减PLK1之外，我们可以设计和评估针对少数另外的基因的AsiC，乳腺T-IC的自我更新或维持多能性依赖于该少数基因。基底细胞-样TNBC T-IC对蛋白酶体抑制有选择性地敏感93。
因此，我们可以评估蛋白酶体成分(PSMA2)和潜在的其它选择性T-IC依赖性基因(例如MSI1(Musashi)，乳腺T-IC中的调节Wnt和Notch信号传导126-130或BMI1的RNA结合蛋白，干细胞自我更新所需的多梳成分131-134)的敲减。在验证这些基因于乳腺球细胞中被表达和敲减后，我们可以用靶向PLK1、MSI1、BMI1或PSMA2的AsiC或靶向eGFP的AsiC作为阴性对照来处理贴壁细胞和乳腺球，并通过用CD44、CD24、EpCAM、CD133、CD49f和ALDH1染色5-7天后对T-IC亚群的大小进行测量。我们还可以测量外流小分子染料(“侧群细胞”)的细胞比例。这些实验可以通过量化集落形成细胞和乳腺球的频率的功能测定来增补。连续重复(replating)可以评估连续增殖T-IC作为乳腺球的能力是否受到抑制。在本文考虑之列的是敲减PLK1、MSI1、BMI1或PSMA2可以降低来自一些细胞系的T-IC中的T-IC数目、增殖和功能，但不同的基因可能对不同的乳腺细胞系更有活性。例如，蛋白酶体抑制基底细胞-样TNBC中的T-IC的消除，但仅在3个间充质TNBC细胞系中的1个中抑制，而在更加分化的非TNBC肿瘤中不抑制93。
可以通过使用可获得的化学抑制剂(如硼替佐米)的实验或通过检查相同途径中的其它基因(对于MSI1而言，例如NOTCH1、β-连环蛋白或WNT1)的敲减是否也具有抗T-IC活性，进一步研究阻抑T-IC的敲减策略。接下来，使用在体外有希望的AsiC，我们可以确定将基底细胞-样TNBC细胞系短期离体暴露至AsiC是否抑制TNBC肿瘤起始，作为抑制T-IC能力的最终测量。对用所选择的AsiC(以及作为阴性对照的使用PSMA适体或含有eGFP siRNA的AsiC)过夜处理的细胞系进行存活力评估。在验证了短期siRNA暴露不影响存活力后，将离体处理的细胞以一定范围的细胞数原位注射入NOD/scid/"c-/-(NSG)小鼠(这些小鼠具有最高的肿瘤植入摄取)。可以将硼替佐米处理24小时(此时约40％的细胞仍然存活)作为阳性对照。
靶向TNBC的AsiC的体内评估
接下来可使用荷载适体配体+基底细胞-A TNBC细胞系(例如MB468或HCC1187)的乳腺脂肪垫异种移植物的裸鼠在体内对表现最佳的少数AsiC进行评估，一方面与配体-乳腺癌细胞系(例如基底细胞-B MB231)相比，另一方面约5-8只小鼠/gp以根据我们对这些模型的经验获得可重复的统计数据。对于体内成像而言，我们已经通过用表达mCherry和荧光素酶的慢病毒进行感染来产生稳定的发光/荧光细胞系。
肿瘤细胞中的全身性递送和敲减。因为未修饰的AsiC很小(约30kDa)，当IV或IP注射时，它们通过肾脏过滤而被快速消除。20kDa聚乙二醇(PEG)可以连接到siRNA的无活性链(过客链)的5′端21。IV注射的聚乙二醇化PSMA-AsiC集中在皮下肿瘤；聚乙二醇化将IP注射的AsiC的循环T1/2从＜35分钟延长至＞＞30小时，将基因沉默的耐久性提高至约5天，并将有效的肿瘤抑制剂量降低8倍至250pmol×5次注射。我们还发现(未示出)，SQ注射5mg/kg未修饰的CD4-AsiC引起人源化小鼠的脾以及近端和远端淋巴结中的CD4+细胞的全身特异性敲减。因此，通过使用AF-790偶联的AsiC和IVIS Spectrum的体内成像以及通过血液、尿液、肝脏和肿瘤样品中的活性链的Taqman测定，我们可以比较原始AsiC构建体和PEG-AsiC的IV和SQ给予后的AsiC水平。第一天频繁收集样品，样品可以在5天内进行分析。可以对组织切片的组织损伤进行评估，并可通过血细胞计数和血清化学对血液进行血液学、肝脏和肾脏毒性的分析。可以通过血清干扰素和炎性细胞因子的ELISA测定对与诱导先天免疫或炎症有关的毒性进行评估。可以计算循环T1/2和局限于EpCAM+肿瘤的注射药物的比例。基于我们用CD4-AsiC的SQ和IV给予的初步实验以及PSMA-AsiC9、21、25的体内经验，不希望受理论的束缚，在本文考虑之列的是未聚乙二醇化的AsiC将在IV给予后迅速排出，但是SQ EpCAM-AsiC和IV PEG-AsiC将更有利的定位于肿瘤异种移植物。
可以通过体内成像以及通过处理后4天、7天和12天收获的肿瘤样本的qRT-PCR、FM和流式细胞术对在浓度范围内的单次AsiC注射后的mCherry和PLK1的敲减进行评估。这些实验可以对峰值肿瘤基因敲减50％、75％和90％(ED50、ED75、ED90)所需的有效剂量以及肿瘤中的敲减的耐久性(定量为T-KD50＝肿瘤表达从峰值敲减中途返回至对照的时间)提供估计值。对各构建体可以确定这些参数。我们还可以确定PLK1构建体的最大耐受剂量(MTD)。不适当的PK/PD或先天免疫刺激的迹象将使得我们对化学修饰(向某些残基添加2′-OMe核糖)进行调整或添加更长的PEG聚合物，以使用简单的方法改善这些参数。
抗肿瘤作用。可以通过体内成像来测试最佳的靶向TNBC的AsiC如何针对在裸鼠中IV注射(作为转移模型)或植入乳腺脂肪垫的基底细胞-A肿瘤起效。我们可以通过靶向PLK1作为原理证明来起始21、107。可以使用基于PK/PD结果选择的给药方案，在荷载基底细胞-ATNBC脂肪垫肿瘤的8只小鼠的组(基于先前的实验而选择用于统计学显著性的组的大小)中SQ和/或IV注射PLK1-AsiC。一旦肿瘤变得可触诊，就可以对小鼠进行处理。将比较对代表性的配体+和配体-肿瘤的影响。可以用PBS或裸siRNA、携带扰乱的siRNA的AsiC以及PLK1PSMA-AsiC对对照小鼠进行处理。可以通过成像和卡尺对肿瘤大小进行量化。如果抗肿瘤作用不理想，可以将给药方案调整至最大耐受方案。
我们还可以比较它们自身给予和组合给予的PLK1敲减和标准保健的化疗的效果，以预期潜在的临床研究。如果有完全的肿瘤消退，我们可以对减少的剂量进行评估。也可以在植入少数其它基底细胞-A TNBC细胞系的小鼠中对有效方案进行评估，以证实抗肿瘤应答的普遍性。肿瘤细胞IV注射后，我们还可以对AsiC治疗进行评估，以确定针对远端转移的有效性。在处死时，可以对小鼠进行处死，并可以通过FM、H&E和IHC对乳腺脂肪垫的残留的微观或宏观肿瘤进行检查。还可以评估残留肿瘤细胞的EpCAM/EphA2表达，以确定肿瘤抗性是否可作为下调适体配体的结果而发展。还可以观察经处理小鼠的毒性的临床征象，并且可以通过血细胞计数以及肠、骨髓和脾脏的病理学检查仔细地检查在处死时的肠道毒性和骨髓毒性。设计有交叉反应适体的AsiC可用于对正常的上皮的毒性进行评估。使用我们最好的AsiC设计，接下来我们可以开始将PLK1敲减与单独或与PLK1组合测试的我们的siRNA筛选93中鉴别的TNBC依赖性基因(例如PSMA2或MCL1)的敲减进行比较。
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实施例4
RNA干扰(RNAi)通过敲减致病基因为治疗疾病提供了令人兴奋的机会。最近的早期临床试验已经在由肝中的异常基因表达引起的少数疾病中显示出有希望和持续的基因敲减和/或临床益处。利用RNAi进行癌症治疗的主要障碍是将小RNA传递给弥散性癌细胞。大多数上皮癌细胞和其中的肿瘤起始细胞(T-IC)高度表达EpCAM，这是首先描述的肿瘤抗原。我们测试的所有的上皮乳腺癌细胞系对EpCAM的明亮染色，而永生化的正常的乳腺上皮细胞和成纤维细胞则没有。可以使用由结构化RNA组成的嵌合RNA(称为适体)来实现体内的上皮癌细胞中的靶向基因敲减，该结构化RNA共价连接至siRNA，选择用于结合至高亲和力地结合至EpCAM。这些EpCAM适体-siRNA嵌合体(AsiC)被EpCAM+细胞摄取，并且选择性地引起上皮乳腺癌细胞而非正常的上皮细胞中的基因敲减。此外，在肿瘤起始潜力的体外测定和肿瘤起始中，用EpCAM-AsiC敲减PLK1阻抑了上皮乳腺癌细胞系的集落和乳腺球形成。
皮下注射的PLK1EpCAM-AsiC被EpCAM+基底细胞-A三阴性乳腺癌(TNBC)原位异种移植物特异性地摄取，并引起快速的肿瘤消退。在任意的乳腺癌中TNBC具有最差的预后，并且尚无用于TNBC的靶向疗法。本文具体考虑的是EpCAM-AsiC可用于靶向基因敲减，以对上皮(基底细胞-样)TNBC癌进行治疗而保留正常细胞，并消除其内部的T-IC。可以定义何种乳腺癌亚型可被EpCAM-AsiC靶向，并确定EpCAM水平如何影响摄取和基因沉默。可以在人乳腺癌组织外植体中对表达EpCAM的癌细胞和正常上皮细胞中的相对的摄取/敲减进行评估。还可以确定EpCAM-AsiC是否可以靶向乳腺T-IC来破坏肿瘤起始。
可以对EpCAM-AsiC的药物样特征进行优化。可以对EpCAM-AsiC的细胞摄取、内体释放、全身性递送和体内基因敲减进行优化。可以在TNBC细胞系异种移植模型中使用活体动物成像对EpCAM-AsiC摄取和基因沉默以及肿瘤阻抑的药代动力学(PK)和药效动力学(PD)进行评估。作为原理证明，可以对细胞增殖所需的PLK1的敲减的抗肿瘤作用进行评估。此外，在小鼠异种移植模型中对TNBC遗传依赖性的全基因组siRNA筛选中鉴别的新基因靶标的敲减进行评估。优化的EpCAM-AsiC及其PK、PD和可能毒性的认识可在用于进一步的毒性和其它临床前研究的实验中使用。
本文所述的是作为用于基底细胞-样三阴性乳腺癌和其它上皮癌及其内部的肿瘤起始细胞中的靶向基因敲减的方法的EpCAM适体-siRNA嵌合体的开发。目前尚无用于经常复发的三阴性乳腺癌或者用于乳腺癌中的高度恶性的肿瘤起始细胞亚群(这可能是导致某些情况的耐药性和复发的原因)的靶向治疗。这些RNA对基于RNA的药物提供了通用且灵活的平台，以用于治疗不良预后的乳腺癌。
实施例5
本文证明了：(1)EpCAM适体本身不会影响EpCAM+乳腺肿瘤细胞系的细胞生长或存活力(未示出)；(2)当正常的乳腺活检物与体外的EpCAM+TNBC人乳腺肿瘤组织混合时，荧光的EpCAM-AsiC仅集中在肿瘤中(图14)；(3)用PLK1EpCAM-AsiC处理EpCAM+luminal和基底细胞-ATNBC细胞而非间充质TNBC细胞阻断了肿瘤起始细胞(T-IC，集落和乳腺球形成)的体外测定和体内肿瘤起始(图15A-图15C和图16)；(4)皮下(sc)注射的EpCAM-AsiC集中在荷载EpCAM+和EpCAM-TNBC的小鼠的远离注射部位的两侧的EpCAM+肿瘤中(图17A-图18B)；以及(5)最重要的是，PLK1EpCAM-AsiC的皮下注射引起可触诊的基底细胞-A TNBC异种移植物的完全消退(图18A-图18B)。另外，(6)新的siRNA筛选鉴别出EpCAM-AsiC敲减的基底细胞-ATNBC的新型的共享的遗传依赖性(图19)。
不希望受理论的束缚，T-IC在上皮/间充质基因表达中是异质的和塑性的。尽管间充质特性可能有助于初始组织侵袭，但临床上显著转移的形成(定植)可能需要上皮性质。EpCAM介导的siRNA的递送有效阻断了肿瘤起始，但只能用于上皮(基底细胞-A TNBC，luminal)乳腺癌。
EpCAM适体的高亲和力和我们在均匀且混合的细胞群体中的摄取、基因敲减和增殖实验显示出特异性靶向至EpCAM+细胞。正常的上皮细胞和成纤维细胞不被靶向。显示EpCAM-AsiC不被正常的人体乳腺活检物摄取的新数据是令人信服的。
三阴性乳腺癌(TNBC)是不表达雌激素、孕酮和Her2受体的高度恶性癌症的多样化的组，具有最差的乳腺癌预后。尚无针对TNBC的靶向治疗，TNBC经常在细胞毒性治疗后复发。本文描述的是使用特异性靶向的RNA干扰(RNAi)用于基底细胞-样TNBC的基因敲减治疗的平台。RNAi可以选择性地敲减致病基因。然而，意识到用于治疗癌症的基因敲减的治疗潜力需要有效方法以将RNA递送至弥散性癌细胞中。存在两个瓶颈：使RNA跨越细胞膜，并从内体跨越至RNAi机构所在的靶细胞细胞质中。理想的治疗方法是选择性地敲减癌细胞中的基因，同时保留大多数正常细胞以将毒性最小化。
本文描述的是使用适体在具有嵌合RNA的基底细胞-样TNBC(大多数TNBC)中进行的基因敲减，所述适体是选择用于高亲和力地结合至针对EpCAM(也称为CD326或ESA)的靶分子的结构化核酸，首先描述了肿瘤抗原。EpCAM在上皮乳腺癌(包括基底细胞-样TNBC)上高度表达，平均比正常的乳腺组织高400倍。其也在其它上皮癌上高度表达并且是“癌干细胞”(也称为肿瘤起始细胞(T-IC))的标记物。适体-siRNA嵌合体(AsiC)将靶向适体共价连接至siRNA(图10B)。Dicer从内部细胞适体中切割siRNA。
上皮乳腺癌细胞而非间充质或正常的上皮细胞选择性地摄取EpCAM-AsiC并在体外经历基因敲减。此外，敲减与EpCAM水平密切相关。使用EpCAM-AsiC敲减有丝分裂所需基因的PLK1消除了集落和乳腺球形成(在与自我更新和肿瘤起始相关的体外测定中)以及体内肿瘤起始，表明EpCAM-AsiC可能用于靶向T-IC。皮下注射PLK1EpCAM-AsiC引起EpCAM+TNBC异种移植物完全消退，但对EpCAM-间充质TNBC无影响。
本文描述的是EpCAM-AsiC可用于靶向基因敲减，以治疗基底细胞-样TNBC癌症，而保留正常细胞，并消除其内的T-IC。除了选择性递送至靶细胞之外，相较于通过纳米颗粒、脂质体或RNA结合蛋白的RNA递送相比，AsiC对于癌症治疗而言具有重要的优点：(1)它们绕过肝和肺的捕获并集中在肿瘤中；(2)作为单个RNA分子，它们比起多组分药物更简单且更便宜地制造；(3)它们几乎没有毒性，并且不刺激先天免疫或炎症或产生显著的脱靶作用；(4)因为不引发抗体，可以重复使用；(5)它们在血清和其它体液中稳定。
可以定义何种乳腺癌亚型可被EpCAM-AsiC靶向，并确定EpCAM水平如何影响摄取和基因沉默。可以对癌组织相对于正常的上皮的相对摄取/敲减进行评估。也可以确定EpCAM-AsiC是否可以靶向乳腺T-IC以抑制肿瘤起始。优化EpCAM-AsiC的重要目标是摄取、内体释放、全身性递送和体内敲减。通过在TNBC原位异种移植物中的活体动物成像对EpCAM-AsiC摄取、基因沉默和肿瘤阻抑的药代动力学(PK)和药效动力学(PD)进行评估。作为原理证明，可以对细胞增殖所需的PLK1的抗肿瘤作用进行评估。可以对我们在全基因组RNAi筛选中作为基底细胞-样TNBC的遗传依赖性加以鉴别的其它基因的敲减进行评估。本文描述的是优化的EpCAM-AsiC的开发，及其PK、PD和可能的毒性的知识以及新的基底细胞样TNBC依赖性基因的靶向的鉴别。
本文描述的是：相较于正常的上皮，上皮乳腺癌中的选择性的EpCAM-AsiC活性的证实，并评估EpCAM-AsiC转染和消除乳腺T-IC(即癌症干细胞)的潜力；优化EpCAM-AsiC以转染和敲减体外的上皮TNBC细胞中的基因并用于体内的全身性递送和肿瘤集中，以及定义PK和PD及最大耐受剂量；评估靶向PLK1的经优化的EpCAM-AsiC和小鼠原发性和转移性癌症的人上皮TNBC模型中的基底细胞-样TNBC的新型依赖性基因的抗肿瘤作用。
虽然大多数TNBC患者响应于化疗，但在3年内约三分之一发展出转移并最终死亡。因此，我们需要新的策略。TNBC是异质性的、分化差的肿瘤，可能需要通过亚型或个体化治疗来进行处理1、3、4、72。多数TNBC是基底细胞-样的或属于基底细胞-A亚型。本文描述的是用于治疗适合于个性化治疗的基底细胞-样TNBC的灵活的靶向平台。药物不仅可以靶向至肿瘤，还可以通过敲减肿瘤依赖性基因而选择药物靶点以攻击肿瘤的Achilles’heel。这一策略通过将小干扰RNA(siRNA)连接到与EpCAM结合的RNA适体，将小干扰RNA(siRNA)递送至上皮癌细胞(图10B)，EpCAM是在上皮癌(包括基底细胞-样TNBC)上过表达的细胞表面受体。EpCAM在上皮癌及其T-IC上高度表达。
EpCAM靶向可引起基底细胞-样TNBC中而非正常的上皮细胞中的选择性基因敲减。选择性敲减既能降低药物剂量，又能降低组织毒性。
如本文所描述的，9个基底细胞-A TNBC和luminal乳腺癌细胞系中的9个是强烈的EpCAM+，而正常的乳腺上皮细胞系、成纤维细胞和间充质TNBC接近于背景EpCAM(图1B)。因此，几乎所有的基底细胞-样TNBC(可能是luminal乳腺癌)将被EpCAM-AsiC靶向。此外，由于约100％的上皮癌(包括肺癌、结肠癌、胰腺癌和前列腺癌)对EpCAM而言明亮地染色，这种平台也可以用于基于RNAi的常见癌症的治疗。
当RNAi在哺乳动物中被发现时，小RNA被誉为下一个新的药物类别。研究人员很快意识到得到RNAi来作为药物发挥作用并不简单。但是，在解决了RNA治疗的主要障碍(细胞摄取)之后，现在对于基于RNAi的药物来说是乐观的。最近的I/II期研究已经显示出由异常肝脏基因表达引起的高胆固醇血症、运甲状腺素蛋白相关的淀粉样变性、丙型肝炎、血友病和肝转移中的80％-95％基因敲减。然而，将RNAi应用于癌症治疗仍然是个梦想。将RNAi用于癌症的主要障碍是将小RNA递送至弥散细胞中。本文描述了克服该问题的方法和组合物(例如通过使用AsiC)。
AsiC是可以靶向不同的细胞表面受体并敲减任何基因或基因组合的灵活的平台。通过改变适体，AsiC平台可以解决阻碍将基于RNAi的治疗应用至大多数疾病的递送障碍。这种策略对于个性化的癌症治疗而言是理想的，因为可以根据肿瘤的分子特征来调整对靶基因的选择。此外，RNA混合物可以一次敲减多个基因来预测和克服耐药性。
本文描述了具有良好定义的PK/PD的优化的EpCAM-AsiC的开发。
重要的癌症研究目标是消除T-IC(癌症干细胞)。T-IC相对地抵抗化疗，并且被认为是造成肿瘤复发和转移的原因。本文所述的AsiC被设计成以高效率靶向(上皮)T-IC。因此，它们可以消除具有进行性疾病风险的肿瘤内的这种侵袭性亚群(参见图16)。
除了其潜在治疗用途之外，EpCAM-AsiC还可以是用于鉴别肿瘤和T-IC的依赖性基因以定义新的药物靶标的强大的体内研究工具。
本文描述了通过靶向EpCAM(在上皮癌及其T-IC中广泛过度表达的肿瘤抗原)而用于上皮癌和其中的T-IC的新型靶向治疗。目前的靶向治疗依赖于使用肿瘤特异性抗体或致癌激酶抑制剂。之前没有人证明非缀合AsiC可以具有有效的抗肿瘤作用，或者AsicC可以被皮下给予。目前尚无TNBC或T-IC的靶向治疗。开发用于TNBC的靶向治疗和开发消除T-IC的方法是癌症研究的重要的未满足的目标。
本文描述的方法以2种方式进行靶向-适体特异性地将治疗性RNA递送至肿瘤细胞，而可以基于靶向肿瘤的特异性分子依赖性来选择用于敲减的基因进行选择。通过测试体内敲减，可以证明基底细胞-样TNBC及其T-IC选择性地依赖于蛋白酶体、MCL1和U4/U6-U5tri-snRNP剪接复合物。这项工作可以鉴别一套新的适用于常规和基于RNAi的药物的药物靶标。
可以对转染细胞中的siRNA的运输进行检查，并且可系统地优化细胞中的RNA加工的各步骤以改善siRNA的药物特征。
CD4-AsiC可持久地敲减CD4+T淋巴细胞和巨噬细胞中的基因表达，并抑制HIV向人源化小鼠传递。CD4-AsiC特异性地阻抑极化的人宫颈阴道组织外植体和人源化小鼠雌性生殖道中的巨噬细胞和CD4+T细胞中的基因表达。因为它们是单体并且不与受体交联，所以CD4-AsiC不会激活靶细胞。它们也不会刺激先天免疫。向人源化小鼠仅阴道内给予80pmol的针对HIV基因和/或CCR5的CD4-AsiC即可完全阻断HIV性传播。RNAi介导的基因敲减在体内持续数周。通过在攻击(challenge)前2天给予的CCR5CD4-AsiC阻断传播。当暴露延迟4天或6天时，也发生显著但不完全的保护。靶向gag/vif的CD4-AsiC在暴露后给予时提供保护。因此，CD4-AsiC有望用于HIV杀微生物剂。
防止艾滋病毒传播的保护需要在生殖道中进行局部敲减。然而，全身性递送更具挑战性，并且是癌症所需要的。由于AsiC足够小至被肾脏过滤，所以它们被快速消除，并且不能有效地引起基因沉默。在一些实施方式中，可以将聚乙二醇(PEG)连接到siRNA的无活性(过客)链的5′-端。静脉内注射的PEG-AsiC集中在皮下肿瘤。PEG化将ip注射的AsiC的循环T1/2从＜35分钟延长至＞＞30小时，将基因沉默的耐久性提高至约5天，并将所需剂量降低8倍。未经修饰的CD4-AsiC的皮下注射在人源化小鼠的脾、近端和远端淋巴结中的CD4+细胞中特异性地引起约80％的基因敲减(未示出)。EpCAM-AsiC的皮下注射类似地引起EpCAM+肿瘤中的特异性集中/敲减(见下文)。
EpCAM-AsiC选择性地敲减EpCAM+癌细胞中的基因表达。EpCAM-AsiC具有退火至20-22nt的互补siRNA链的长约42-44nt的链(19nt适体+接头+20～22nt siRNA链)(图10B)。用2′-氟嘧啶进行商业合成，它们是RNase抗性的(血清中的T1/2＞3天，数据未示出)，并且不会引发先天免疫37、91-93。
表面EpCAM在测试的所有luminal和基底细胞-样细胞系中都很高，但是在用hTERT(BPE)94、成纤维细胞和间充质TNBC永生化的正常的上皮细胞中接近背景(图1B)。测试的若干设计中的多个(有义和反义链交换，以及数个接头)在EpCAM+细胞系中特异性地敲减基因表达，但最有效的设计如图10B所示。通过EpCAM-AsiC进行的eGFP和AKT1基因敲减对于EpCAM+细胞而言是均匀的和选择性的，并且与无选择性的siRNA脂质转染一样有效(图13A-图13C)。在8个乳腺癌细胞系中，通过PLK1EpCAM-AsiC进行的AKT1敲减和细胞增殖抑制与EpCAM水平密切相关(图11B-图11C)。EpCAM适体本身对细胞增殖无影响(未示出)。当EpCAM-BPE细胞与上皮TNBC细胞系混合时，EpCAM-AsiC仅在肿瘤细胞中而非正常的上皮细胞中敲减AKT1并引起PLK1敏感性细胞死亡(未示出)。3天后存活肿瘤细胞比例降低7倍。当我们向正常的乳腺和肿瘤活检样品中添加荧光AsiC、胆固醇缀合的siRNA(由正常上皮细胞摄取的chol-siRNA)或裸siRNA时，EpCAM-AsiC仅集中在肿瘤中(图14)。因此，EpCAM-AsiC对上皮肿瘤细胞而言是特异性的。
EpCAM-AsiC抑制EpCAM+肿瘤的T-IC。选择EpCAM用于部分靶向是因为EpCAM对T-IC和转移起始细胞(M-IC)进行标记。为了研究EpCAM-AsiC是否抑制T-IC，我们比较了mock处理、用紫杉醇或者针对eGFP或PLK1的EpCAM-AsiC进行处理后的集落和乳腺球形成(T-IC功能替代物)。PLK1EpCAM-AsiC比起紫杉醇更强烈地抑制了多个EpCAM+基底细胞-样TNBC和luminal细胞系的集落和乳腺球形成，但对EpCAM-基底细胞-B TNBC无活性(图15A-图15C)。为了评估EpCAM-AsiC对肿瘤起始的影响，将用培养基或PLK1或GFP EpCAM-AsiC处理过夜的存活的luc+EpCAM+MB468和EpCAM-MB231细胞皮下植入裸鼠中。PLK1EpCAM-AsiC阻断了肿瘤形成，但仅在EpCAM+肿瘤中(图16，数据未示出)。因此，EpCAM-AsiC抑制EpCAM+乳腺癌中的肿瘤起始。
EpCAM-AsiC被EpCAM+TNBC选择性地摄取并引起肿瘤消退。为了研究EpCAM-AsiC的潜在的临床有用性，我们首先检查了在两侧腹中荷载EpCAM+和EpCAM-TNBC的小鼠颈背中的皮下注射的Alexa750标记的EpCAM-AsiC(图17A-图17B)的递送。EpCAM-AsiC仅集中在EpCAM+肿瘤中。对荷载双侧肿瘤的小鼠进行mock处理或者用PLK1或GFP EpCAM-AsiC每两周注射一次，肿瘤生长并随后发光。EpCAM+肿瘤仅在接受靶向PLK1的AsiC的小鼠中迅速完全消退(图18A-图18B)。用另外的对照组(EpCAM适体本身或PLK1siRNA)重复该实验，两者均无任何抗肿瘤活性(数据未示出)。因此，皮下注射的EpCAM-AsiC对基底细胞-A TNBC显示出特异性抗肿瘤活性。
siRNA摄取、内体释放和基因沉默的活细胞成像。使用能够进行单分子检测的优化的旋转盘共聚焦显微镜用于对此前不可能释放的荧光RNA的弱的细胞溶质信号进行检测。每3秒对用Alexa647-siRNA脂质复合物孵育的HeLa细胞成像。含RNA的晚期内体释放出一小部分的cargo RNA，其迅速扩散以填充细胞溶质(数据未示出)。释放发生在短时间内，内吞后约15-20分钟。约104siRNA以典型事件释放。在稳定表达eGFP-d1的HeLa细胞中，GFPsiRNA在T1/2为约2.5小时的内体释放后引起GFP表达迅速降低。有效的基因沉默仅需要约1000个细胞溶质siRNA。释放引发自噬，其将含RNA内体隔离在双自噬膜内。之后无释放。
我们应用这种方法来研究Cy3标记的EpCAM-AsiC的摄取/释放，对EpCAM+MB468TNBC和EpCAM-BPE细胞进行比较。在BPE中的摄取和释放是微不足道的，但在MB468中明显减少。该成像方法和我们对siRNA转运的理解可用于优化EpCAM-AsiC设计，以改善内体释放和敲减。
基底细胞-样TNBC依赖性基因(BDG)的鉴定。为了鉴定EpCAM-AsiC可靶向的基底细胞-样TNBC的遗传依赖性，进行全基因组siRNA致死筛选比较用不同培养基中的相同致癌基因转化的人原发性乳腺上皮细胞、基底细胞-样BPLER和肌上皮HMLER细胞。虽然基本上是同基因的，但BPLER是高度恶性的并且富集T-IC，仅50个细胞即可在裸鼠中形成肿瘤，而HMLER需要＞105个细胞来起始肿瘤。筛选鉴别了BPLER而非HMLER所依赖的154个基因。蛋白酶体基因高度富集(P＜10-14)。BPLER依赖性基因的表达与乳腺癌而非肺癌或结肠癌中的不良预后相关。蛋白酶体抑制剂敏感性是基底细胞-A TNBC的共同特征，并与MCL1依赖性相关。正常的乳腺上皮细胞、luminal乳腺癌细胞系和间充质TNBC细胞系并不依赖于蛋白酶体或MCL1。蛋白酶体抑制不仅杀死了基底细胞-A TNBC，而且还通过集落和乳腺球测定阻断了T-IC功能，并且再次主要在基底细胞-样TNBC中是选择性的。简单暴露至硼替佐米也抑制了小鼠基底细胞样TNBC细胞系的肿瘤起始。
接下来，我们测试了蛋白酶体抑制是否抑制小鼠中的基底细胞-样TNBC肿瘤的生长。硼替佐米不能很好地渗透到实体瘤中，这限制了其临床应用。需要最大耐受静脉内剂量(MTD)以抑制皮下肿瘤中的蛋白酶体活性。MTD的治疗强烈地抑制了Tp53+/-小鼠中自发产生的3个人基底细胞-A TNBC细胞系和1个小鼠基底细胞-A TNBC细胞系以及10个TNBC的肿瘤生长，但对基底细胞-B或luminal细胞系无效。用卡非佐米(carfilzomib)得到类似的结果。硼替佐米还阻断了静脉内注射的小鼠TNBC细胞的肺定植。因此，上皮TNBC生长、肿瘤起始和转移选择性地需要蛋白酶体。虽然肿瘤穿透和PD可能随着更新的蛋白酶体抑制剂而改善，但蛋白酶体基因敲减可能提供更有效的蛋白酶体抑制。
因为TNBC是异质性的1、3、4、72，我们重新筛选了4个基底细胞-ATNBC和3个luminal人癌细胞系中的154个BPLER依赖性基因。我们的目标是鉴别作为潜在的EpCAM-AsiC靶标的基底细胞-样TNBC细胞系的额外的共享依赖性。154个BPLER依赖性基因中只有21个在测试的4个基底细胞-A细胞系中的3个中将活力降低了至少2倍。这些推定的BDG聚集在4个功能组-4个蛋白酶体基因和MCL1(先前验证)、参与RNA剪接的10个基因、参与有丝分裂的2个基因和核出口所需的2个基因。使用新的一组siRNA对21种BDG基因的20种进行重新测试，并重新确认了14种基因(另外的“命中”对脱靶效应可能是次要的，或者它们的敲减可能不足以引起致死性)。值得注意的是，10个剪接基因的9个重新确认。它们包括U4/U6-U5tri-snRNP复合物、PRPF8、PFPF38A、RBM22、USP39的4个成员。其它感兴趣的共享命中物(hit)是RAN核出口G蛋白和核孔蛋白NUP205，以及NDC80(将着丝粒锚定到有丝分裂纺锤体的着丝粒组分)。有丝分裂纺锤体检查点也需要USP39。
已知TNBC对抗有丝分裂剂特别敏感。USP39在乳腺癌细胞与正常的乳腺组织中过表达，并且USP39敲减抑制了luminal MCF7细胞的增殖和集落形成。此外，在斑马鱼中，USP39突变导致肿瘤抑制基因(如rb1和p21)的剪接缺陷。为了探讨抑制基底细胞-样TNBC中的剪接的治疗效果，我们在6个基底细胞样细胞系和luminal MCF7细胞中沉默4个剪接体tri-snRNP复合物BDG(PRPF8、PRPF38A、RBM22、USP39)(图19)。PRPF8、PRPF38A或RBM22而非MCF7的敲减激活半胱天冬酶-3，并将6个基底细胞-样细胞系的6个致死；USP39敲减杀死了6个基底细胞-样细胞系的3个。在所有亚型的乳腺癌细胞系中，剪接体蛋白经常被上调。所有6个基底细胞-样细胞系而非MCF7细胞的活力通过敲减有丝分裂着丝粒基因NDC80或者核出口基因RAN或NUP205而降低至少2倍。此外，在3个基底细胞-样TNBC细胞系的3个中，各tri-snRNP复合基因、RAN、NUP205或NDC80的敲减阻断了集落形成(潜力的T-IC替代物)。
EpCAM-AsiC可引起EpCAM+肿瘤及其内的T-IC的靶向基因敲减。尽管在弱表达EpCAM的正常的上皮细胞中可能有一些摄取，但是基因敲减将集中在EpCAMbright肿瘤细胞中，特别是在T-IC中。如本文所述，可为了有利的PK/PD而对EpCAM-AsiC进行优化，从而在小鼠模型中以可接受的毒性阻抑基底细胞-样TNBC的肿瘤生长和转移。
靶向eGFP、AKT1和PLK1的EpCAM-AsiC在本文中用作评估基因敲减和优化AsiC设计的模型。使用慢病毒可以产生稳定表达蛋白质T1/2为约1小时的不稳定(d1)EGFP的细胞系。可以通过流式和成像容易地对GFP表达进行定量，并且其敲减无生物学后果。短的T1/2允许快速灵敏地对敲减进行检测。在我们测试的所有细胞中表达的AKT1是很好的待研究的内源性基因，因为其在TNBC中的敲减不会影响细胞活力。PLK1被用作其抗肿瘤作用的原理证明，因为它的敲减对所有的分裂细胞均有细胞毒性。我们以前表明使用不同的递送策略的PLK1敲减显著地阻抑了小鼠中的Her2+乳腺癌。在最近的筛选中，PLK1在激酶基因中是独一无二的，因为它的敲减消除了乳腺T-IC。我们已经用靶向这些基因各自的EpCAM-AsiC实现了可靠且可重复的基因敲减。
可以购买EpCAM-AsiC，例如作为来自TriLink或NITTO Avecia的非GMP RNA。用2′-氟嘧啶合成EpCAM-AsiC的各链，对处于它们的3′-端的dT残基进行保护以防止外切核酸酶消化，然后退火以产生最终的RNA(图10B)。当我们优化AsiC时，可以取代并测试其它化学修饰，以确定它们是否赋予改进的活性。单独的适体和携带非靶向siRNA的AsiC可以作为对照。一些eGFP EpCAM-AsiC也可以退火至在3′端用荧光团修饰的反义链(不影响AsiC活性(未示出))，来对细胞内和体内的AsiC摄取和转运进行量化。
上皮乳腺癌和乳腺癌T-IC与正常的上皮细胞中的特异性EpCAM-AsiC敲减。可以确定用EpCAM-AsiC转染何种乳腺癌亚型，并评估肿瘤敲减是否对癌细胞而言是特异性的，首先在细胞系中，然后在10个肿瘤组织中，以证实细胞系原位转移到组织的结果。因为EpCAM-AsiC也可能转染正常的组织干细胞，所以在组织实验中评估了对这些罕见的基底细胞的敲减和毒性。我们还可以对EpCAM-AsiC转染和靶向乳腺T-IC的潜力进行评估。
响应于EpCAM-AsiC的乳腺癌的类型。我们首先需要知道何种类型的乳腺癌可以用EpCAM-AsiC转染，以及相对于正常上皮细胞，在肿瘤中的基因敲减有何特异性。我们通过对代表常见的乳腺癌亚型、但侧重于TNBC(14个TNBC细胞系，加上luminal和Her2+细胞系样品)95的一组20种人乳腺癌细胞系中体外敲减进行评估，延长了我们的初步研究(图13A-图13C和图11B-图11C)。可以将肿瘤细胞系中的EpCAM表达、Cy3标记的AsiC的摄取和基因沉默与BPE94和成纤维细胞进行比较。该大的肿瘤组将使我们能够评估细胞表面EpCAM水平如何影响基因沉默以及是否存在用于有效敲减的EpCAM表达阈值。我们还可以使用多种EpCAM+细胞系(所报道的EpCAM适体的高结合亲和力保留在AsiC中)在剂量应答实验中进行验证。可以通过使用酸洗来去除松散的粘附的适体并且显示出结合被未标记的适体竞争和当细胞在处理前进行胰蛋白酶消化时被消除，从而验证摄取的特异性(相对于非特异性的“粘附”)。可以将EpCAM-AsiC介导的转染与作为对照的脂质转染和裸siRNA进行比较。5天后通过流式细胞术和qRT-PCR对敲减进行评估，5天是AsiC介导的敲减的最佳时间。我们预期摄取和基因沉默与EpCAM水平相关。为了验证在EpCAM+和EpCAMdim未转染的乳腺上皮细胞的混合物中维持了对EpCAM+细胞的特异性，当PLK1为表达不同水平的EpCAM(MFI范围在100-1000之间)的肿瘤细胞与不同数量的GFP+BPE细胞的混合物中的基因靶标时，我们可以比较荧光EpCAM-AsiC摄取、基因敲减和存活力。
上皮乳腺癌细胞优先摄取EpCAM-AsiC并显示出相对于组织外植体中的正常的上皮细胞的敲减？为了评估原发性肿瘤敲减并预期对正常组织细胞的潜在毒性，我们接下来可以在来自乳房切除标本的周围正常组织以及10个luminal、Her2+和TNBC乳腺癌的外植体中对原位转染和基因敲减进行评估。可以对来自约25个肿瘤的样本进行分析，以提供肿瘤亚型的综合考虑。可以通过ER、PR、Her2和E-钙粘蛋白的组织学和IHC染色确认肿瘤分型。我们可以将没有EpCAM+细胞的大量竞争来源的正常组织与含有肿瘤细胞的组织进行比较。在将AsiC给予在治疗或手术后具有低/不可检测的肿瘤负荷的患者的情况下，这对于预测毒性可能是非常重要的。这些实验可以允许评估10种肿瘤的敲减是否与细胞系相匹配，组织结构是否影响肿瘤细胞中的摄取/敲减，以及不同的肿瘤亚型如何良好转染。
基于本文(例如图14)提供的数据，在本文考虑之列的是上皮乳腺癌而非正常的上皮细胞可以经历有效的基因敲减。可以在微量滴定孔中，将切成约3×3×3mm3样品的组织在Optimem溶液中进行转染。脂质复合的siRNA和chol-siRNA均在正常的柱状和鳞状生殖道上皮细胞中敲减基因，而裸siRNA不被摄取。我们首先可以使用siRNA来靶向我们已经预先敲减的上皮基因(例如E-钙粘蛋白、claudin3、细胞角蛋白(CK)-5(基底细胞的良好标记物)以及结合素-1)，对这些对照进行验证，其表达可以容易地通过IHC、荧光显微镜(FM)或分离细胞的流式细胞术处理。靶基因产物的染色可能与荧光siRNA和表型标记物的染色相关，以确定组织内的何种细胞类型被靶向。泛-CK抗体可用于区分上皮细胞(正常和肿瘤)与基质。我们还可以将胶原酶消化的10个细胞的敲减与组织敲减进行比较。不希望受理论的束缚，由于EpCAM-AsiC可能靶向这些细胞并潜在地导致毒性，可以对罕见的基底组织干细胞中的递送和CK5敲减进行评价。因为对GI肠道的毒性通常对癌症药物剂量限制，所以我们可以使用结肠肿瘤标本来重复这些研究，以确定结肠癌细胞、正常的肠上皮细胞和隐窝(crypt)干细胞是否被转染。这些实验可以提供关于临床毒性的有用数据和待敲减的基因的选择，即如果组织干细胞被有效转染，我们可能会敲减对正常的干细胞而言非必需的癌症依赖性基因。造血细胞不表达EpCAM，因此预期无血液毒性。
EpCAM-AsiC可以用于靶向乳腺肿瘤起始细胞吗？我们选择EpCAM作为适体靶标的一个原因是其转染T-IC(“癌症干细胞”)的潜力。T-IC具有耐药性，并认为响应于肿瘤的起始、复发和转移。乳腺T-IC不是由表型唯一定义的，这使得实验具有挑战性，因为T-IC通过其起始可以连续移植的肿瘤的能力而被在功能上进行定义。在不同组合中的CD44、CD24、EpCAM、CD133、CD49f或ALDH1的染色富集了T-IC49、61、67、107-111。
不同的方案定义了潜在的T-IC的重叠而不相同的子集。T-IC是异质的，并且在其上皮与间充质特性中显示出可塑性(并且实际上可能同时具有两种状态的某些特征)28、95、112-118。一些乳腺T-IC是间充质的，并且不表达EpCAM。然而，越来越多的证据表明，基底细胞-样TNBC够定植远处组织并形成宏观转移的能力(可以认为是T-IC在临床上最重要的功能)取决于上皮性质。此外，我们关于EpCAM-AsiC对T-IC功能和肿瘤起始的影响的新数据(图15A-图15C和图16)表明EpCAM-AsiC对基底细胞-A TNBC具有抗T-IC活性。我们推测EpCAM-AsiC被基底细胞-样TNBC T-IC摄取，并且可被用于靶向治疗以削弱其中的T-IC功能。
为了分析T-IC中的EpCAM-AsiC摄取和基因沉默，我们可以首先用EpCAM、CD44和CD24对一组乳腺癌细胞系进行染色，以鉴定其推测的T-IC群体含有对EpCAM而言明亮染色的细胞的乳腺细胞系。我们还可以检查由这些细胞系产生的乳腺球和Aldefluor+细胞111、123、124的EpCAM染色。我们可以在T-IC中选择约4-5条最均匀的EpCAM表达，作为该亚目标中研究的最有吸引力的细胞系(以及将其T-IC可能缺乏EpCAM染色的1-2个基底细胞-B细胞系作为对照)，并且可以产生稳定的表达eGFP的变体。可以将这些细胞系及其乳腺球和Aldefluor+亚群与荧光eGFP EpCAM-AsiC(以及作为对照的非靶向PSMA-AsiC)一起孵育。可以将AsiC摄取与EpCAM、CD44和CD24以及Aldefluor染色一起进行评估。AsiC应被EpCAM+CD44+CD24-/dim Aldefluor+细胞摄取。为了评估T-IC表型细胞中的基因敲减，我们可以通过流式细胞术和qRT-PCR(Aldefluor+或乳腺球群体)对T-IC群体中的GFP和剩余细胞进行监测。我们还可以对内源性PLK1和AKT1的敲减进行评估。这些实验可以告诉我们，乳腺癌不同亚型中的T-IC是否被EpCAM-AsiC靶向。接下来，我们评估AsiC是否抑制乳腺球和集落形成、减少表型T-IC亚群或侧群。
我们还可以设计和评估针对自我更新或多能性所需的另外的基因的AsiC。由于基底细胞-样TNBC T-IC对蛋白酶体抑制敏感，因此我们可以评估蛋白酶体成分(PSMA2)的敲减。我们将要评估的其它潜在的T-IC依赖性基因是MSI1(在调控Wnt和Notch信号传导的乳腺T-IC中高度表达的基因125-129)、BMI1(自我更新所需的多梳成分130-133)以及在我们最近的siRNA筛选中鉴别的可能的几种新型BDG(图19)。MSI1敲减减少了MCF7和T47D细胞中的乳腺球形成和干细胞标志物129。
在验证这些基因于乳腺球细胞中被表达和敲减后，我们可以用靶向这些基因或eGFP的AsiC作为阴性对照对贴壁细胞和乳腺球进行处理，并在5-7天后通过CD44、CD24、EpCAM、CD133、CD49f和ALDH1的染色来测量T-IC亚群的大小。我们还可以测量外流小分子染料的细胞(“侧群细胞”)的比例。这些实验可以通过量化集落形成细胞和乳腺球的功能测定来增补。连续重复可以研究T-IC作为乳腺球的传播是否受到抑制。
敲减PLK1、MSI1、BMI1或PSMA2可以降低一些乳腺癌亚型中的T-IC数量、增殖和功能，但不同的基因可能对不同的乳腺细胞系更有活性(即，蛋白酶体抑制消除了基底细胞-样TNBC中的T-IC，而在非TNBC肿瘤和三个基底细胞-B TNBC中的仅1个中不会消除95)。可以通过使用可获得的化学抑制剂的实验和/或通过以相同途径敲减其它基因(例如对于MSI1而言的NOTCH1、β-连环蛋白或WNT1)进一步对阻抑T-IC的敲减策略进行研究。可以将EpCAM-AsiC对T-IC的作用与EpCAM适体本身和EpCAM抗体(adecatumumab，Amgen)的作用进行比较。
接下来，我们确定基底细胞-样TNBC细胞系短期离体暴露至EpCAM-AsiC是否抑制肿瘤起始，作为T-IC抑制的最终测量。可以在体内对最有希望的AsiC进行测试。可对用AsiC(以及使用PSMA适体或含有eGFP siRNA的AsiC作为阴性对照)处理过夜的细胞系评估存活力。在验证短期siRNA暴露不影响生存力后，以一定范围的细胞数量将离体处理的细胞原位注射至NOD/scid/！c-/-(NSG)小鼠中(这些小鼠具有最高的肿瘤植入摄取量)。使用减少基底细胞-样TNBC中的肿瘤起始的硼替佐米进行预处理，或者将adecatumumab作为对照。
优化EpCAM-AsiC。为了改善EpCAM-AsiC药物特征，我们可以对体外基因敲减和体内递送的各步骤进行优化。我们还可以修改EpCAM-AsiC的化学成分(如果需要的话)，以尽量减少脱靶效应。
在初步研究和发表的工作中，体外最佳敲减所需的AsiC浓度为约1μM-4μM，比起用于脂质转染的约100nM(或更低)浓度高许多倍。对于敲减而言，EpCAM-AsiC遵循以下步骤：(1)细胞受体结合；(2)内吞作用；(3)内体释放；(4)Dicer加工；(5)掺入至RNA诱导的沉默复合物(RISC)；以及(6)靶mRNA裂解。我们可以系统地对各步骤进行优化，重点是步骤(2)和步骤(3)，我们期望我们可以获得最大的效力提升。AsiC设计变量是其亲和力影响步骤1和步骤2的EpCAM适体；控制步骤4的适体和siRNA之间的接头序列；控制步骤6的siRNA序列。此外，可以对用于由亚磷酰胺结构单元进行化学合成的各残基进行化学修饰，以减少核酸酶消化、部分互补序列的脱靶阻抑、先天免疫RNA传感器的结合和刺激、以及改善细胞摄取和体内PK。最常见的化学修饰是在磷酸酯骨架中用S代替O以产生RNase抵抗的硫代磷酸酯(PS)键，以及用2′-F、2′-O-甲基(2′OMe)或2′-O-甲氧基乙基(2′MOE)代替核糖中的2′-OH。PS、2′-F和2′-OMe修饰在临床试验中良好耐受，因此我们专注于它们。2′-OMe天然存在于rRNA和tRNA中，因此是安全的，并且2′-F也良好耐受；重度Ps修饰的核苷酸是粘性的(并且引起与血清蛋白的结合，这可以改善循环T1/2)并且可以引起不期望的副作用；轻度修饰的PS-RNA是无毒性的。化学修饰可以同时抑制和增强步骤5和6中的基因沉默。这可以是反复的过程；借鉴从以前的候选物获得的经验教训，在一个步骤中进行修改时，可以对其它步骤优化最有吸引力的修饰的候选物。我们可以验证选择用于进一步开发的经修饰的AsiC不会刺激先天免疫或产生细胞毒性。如果它们刺激先天免疫或产生细胞毒性，我们可以进一步修改我们的设计以避免这些问题。
优化体外敲减
(1)EpCAM结合。EpCAM适体具有12nM的亲和力。可以证实这种亲和力保留在EpCAM-AsiC中。如果AsiC具有比适体更低的亲和力，我们可以使用生物层干涉技术(OctetREDSystem，ICCB-Longwood Core)以重组EpCAM来比较适体和AsiC的亲和力。如果AsiC具有较低的结合亲和力，则它可能无法正确折叠。为了增强折叠成期望构象，我们可以尝试改变适体与AsiC有义链之间的接头类型和长度(即，我们可以掺入更多的3C接头或三乙烯或六甘醇间隔物)。
(2)内吞作用。单体AsiC通过组成型受体再循环缓慢摄取。该步骤可以通过受体交联进行优化，以引发活性内吞作用，这需要适体多聚化。适体(有或没有连接的siRNA)的多聚化可以(通过提高效价)增加结合亲合力或将不引起信号传导的适体转化为激动剂。可以通过如下将适体多聚化：使用链霉抗生物素蛋白(SA)结合生物素化(Bi)的适体和siRNA；用结合至含有通过柔性接头连接的多个互补序列的组织型寡核苷酸的衔接头将适体延伸；或用互补的衔接头序列延伸适体以产生二聚体。我们专注于不诱导抗体的全RNA设计。我们可以测试的一些设计如图20所示，我们也可以用有义链和反义链交换对构建体进行测试。
时间过程和剂量应答实验将对荧光标签化的多聚体构建体与单体AsiC进行比较，以通过流式细胞术和活细胞成像评估摄取和GFP敲减的程度和迅速度(数据未示出)。如果通过多聚化增强了内吞作用，但是敲减并没有改善，我们可以使用Northern印迹来跟随Dicer切割，并确定是否产生了预期的反义链(见下文)。如果没有，我们可以例如通过将双链体区域从21nt延长到27nt来改变接头的设计，因此多聚化AsiC是良好的Dicer底物(&)，并且验证了Dicer产物的5′端起源于预期的碱基。多聚化应降低多倍敲减所需的AsiC浓度。然而，多聚化可能导致不希望的EpCAM信号传导并促进肿瘤细胞增殖。我们可以证实这不是使用靶向eGFP的多聚化构建体的情况。多聚化的有吸引力的特征是它可以将多种不同的siRNA连接至单个RNA分子中，用于组合基因敲减以产生癌症“混合物”。
如果这些多聚体都不起作用，我们可以使用较少免疫刺激性的SA突变体来测试含有使RNA能够自组装成小纳米颗粒或SA-Bi策略的互补序列的单体AsiC。
(3)内体释放。尽管估计敲减所需要的胞质siRNA分子少于1000个(未示出)，但是在内吞的脂质体中只有少数siRNA被释放到细胞质中。可以通过活细胞成像来评估EpCAM-AsiC的内体释放，以测量内吞的AsiC的细胞溶质释放的效率。如果这表明少于期望的内体释放，则改善释放应该实质上降低药物剂量。可逆掩蔽的两亲性阳离子肽(mellitin)或聚合物(丁基乙烯基醚)的预孵育和内吞可以增强siRNA逃逸到细胞溶质中。掩蔽(masking)是指在中性pH下，肽或聚合物是不带电荷的并且不与质膜相互作用并使其损伤，但是在负的(negative)内体pH下，产生损害内体膜并释放辅助内吞的寡核苷酸的阳离子分子。在siRNA递送的2小时内静脉内注射这些掩蔽的聚合物通过chol-siRNA强化肝细胞敲减为小鼠和非人灵长类动物中的500倍。
我们可以首先通过活细胞电视显微术来确定先前转染的掩蔽的阳离子聚合物是否有利于EpCAM-AsiC(和脂质复合的siRNA)的细胞溶质递送和体外eGFP敲减。我们还可研究用碱性肽/聚合物孵育EpCAM-AsiC是否也可以确定使用巴伐洛霉素(bafilomycin)A或刀豆素(concanamycin)对内体酸化的抑制是否改变了EpCAM-AsiC细胞质释放和敲减，如质子海绵理论(proton sponge theory)所预测的。如果这些实验证实了质子海绵理论，我们可以对用于改变EpCAM-AsiC的策略进行研究。这些包括有义链或反义链与细胞穿透肽(包括不同大小的聚精氨酸、鱼精蛋白152、mellitin、转运素(transportan)或penetratin)的共价缀合(通过二硫键在细胞溶质的还原环境中自发逆转)，以及AsiC有义链与丁基和氨基乙烯基酯的缀合，或者有义链与不同长度的磷精胺(phosphospermines)的连接。我们可以验证这些修饰不会改变溶解性、导致细胞毒性或先天免疫刺激或干扰特定的EpCAM靶向。
Dicer加工、RISC并入、靶mRNA裂解。我们接下来获取前2-3个EpCAM-AsiC，以初始设计作为对照，并检查siRNA功能是否可以被优化。探测EpCAM-AsiC的有义、反义和适体部分的Northern印迹可以对细胞内的EpCAM-AsiC产物进行分析。可以将它们的迁移与合成的有义链和反义链、适体以及全长EpCAM-AsiC进行比较。如果Dicer按照预期的切割AsiC，我们可以回收RNA，该RNA像正义链和反义链(以及来自内体的未处理的EpCAM-AsiC和连接至其接头的适体的大小的条带)一样迁移。可以使用表达亚等位基因(hypomorphic)Dicer的HCT116细胞对Dicer依赖性进行验证。如果细胞内RNA不是预期的大小，我们可以克隆它们以确定Dicer切割的位置。如果条带未被切割或不在我们想要的位置，我们可以重新设计接头和双链区域以产生期望的切割。我们还可研究通过替代或者添加一个或多个3C接头或三乙烯或六甘醇间隔物来用替代接头或接头组合替代UUU接头，以增强对siRNA的细胞内处理。我们还可研究Dicer独立设计(其中，适体通过二硫键共价地连接至siRNA的正义或反义链)是否自发地在细胞溶质中减少，引起更有效的敲减。
一旦我们已经显示产生了合适的反义链，接下来我们可以将反义链掺入至RISC中。Northern印迹和Taqman PCR将定量泛-Ago抗体(2A8)降低的全细胞裂解物中的输入活性链(input active strand)的量。Ago结合、RISC中的siRNA的T1/2和靶基因敲减受到有义和反义链的化学修饰的影响。在专有位置和序列上布置的两条链上的特异性2′-F和2′-OMe化学修饰可以将敲减增加50倍，并且处于末端的PS连接大大增加了基因敲减持续时间。我们可以设计一小组携带有AsiC的siRNA部分的不同的共价修饰的AsiC，并分析它们对eGFP、AKT1和PLK1敲减的影响。
可以对我们在体内评估的靶向另外的基因的EpCAM-AsiC进行设计，使其具有最活跃的siRNA序列和最佳化学修饰。通过网络算法可以鉴定一小组用于测试敲减的siRNA序列(没有适体，通过转染)。可以使用也具有低的预测的熔融温度(Tm)的最有效的siRNA(pM活性)，因为它们被更好地处理。如果我们需要使用更高Tm的序列，我们可以在有义链的3′端添加错配，以促进siRNA展开并将活性链并入RISC。
消除脱靶效应和毒性。可以用原始和最优化的AsiC进行这些实验。可以通过AsiC孵育的TNBC细胞系的Cell Titer-Glo测定法，对编码eGFP siRNA(其敲减不应影响生存力)的各种AsiC的毒性的缺乏进行正式评估。基于以前的工作，我们不会预期显著降低存活力。脂质转染将用作细胞毒性RNA递送的对照。最后，我们可以通过在AsiC孵育后6h和24h进行的qRT-PCR来验证各AsiC不是免疫刺激的，以扩增一组炎症和先天免疫应答基因(IFNB、IFNG、IL1、IL8、IL10、OAS1、STAT1、IP10)。qRT-PCR是免疫刺激的最灵敏的测定法，并且我们选择捕获峰响应的次数。用聚(I：C)处理的细胞可以作为阳性对照，并且mock处理的细胞将成为阴性对照。如果任何AsiC是免疫刺激的(序列和浓度依赖性质)，我们可以评估减少先天免疫传感器结合的另外的化学修饰是否消除免疫刺激而不危及基因敲减。全AsiC或Dicer切割产物的第二残基的2′-F或2′-OMe修饰可以实现这一目的。
由于CD4-AsiC在我们的初步研究中不是免疫刺激的，并且优化的AsiC在大大降低的浓度下具有活性(并且脱靶效应是浓度依赖性的)，先天免疫刺激是不可能的，但如果检测到，则可以容易地被化学修饰阻抑。结合组织外植体研究，我们还可以仔细地对破坏上皮组织结构和细胞坏死的组织的组织学进行检查。
优化肿瘤浓度并定义PK/PD。接下来，我们评估并改善荷瘤小鼠中的全身性T1/2和肿瘤靶向。我们可以关注原始AsiC设计和一些体外优化的构建体(如它们被鉴定的)。我们可以使用qRT-PCR来测量循环T1/2和组织分布，荧光AsiC的体内成像用于观察肿瘤定位和肿瘤细胞mCherry的沉默(由于背景自发荧光而不使用GFP)，作为基因沉默的读数。可以通过我们最近的体内成像的经验促进EpCAM-AsiC PK/PD的研究(图16、图17A-图17B以及图18A-图18B，数据未示出)。这些实验可以使用携带荧光素酶-mCherry稳定转染子的乳腺脂肪垫异种移植物的裸鼠，相较于EpCAM-间充质基底细胞-B TNBC细胞系(例如MB231)，我们已经产生了EpCAM+基底细胞-A TNBC细胞系，如MB468或HCC1187。我们具有用于这些标签的表达质粒，并使用慢病毒感染来产生稳定的转染子。基于我们在这些模型中的初步研究的数据，将使用约5-8只小鼠/gp来获得统计学意义。我们可以首先比较原始的AsiC构建体的静脉内和皮下给予后的血液和肿瘤浓度，并对构建体进行优化以用于体外敲减。可以频繁地对小鼠的毒性的临床征象进行检查。可以用第一天频繁收集的样品(frequent samplecollection)在五天内对样品进行分析。在各时间点，可以收集血液和尿液并通过Taqman测定法分析反义链。可以在安乐死动物的较少时间点收集肿瘤和样品器官。可以通过血液计数和血清化学对血液进行血液学、肝脏和肾脏毒性分析。可以对循环T1/2和局限于EpCAM+肿瘤的注射药物的比例进行计算。不希望受理论的约束，基于我们用皮下和静脉内给予CD4-AsiC的初步实验和PSMA-AsiC的体内经验，我们预期这些EpCAM-AsiC中的大多数将在静脉内给予后迅速排泄，但是皮下注射的EpCAM-AsiC将集中在肿瘤异种移植物中。更大的多聚化构建体(图20)可以抵抗肾脏过滤，并且当静脉内给药时具有更好的肿瘤浓度。以一定浓度范围进行单次EpCAM-AsiC注射后，将皮下和静脉内PK结果与mCherry敲减进行比较；通过在处理后第4天、第7天和第12天收集的肿瘤标本的体内成像(使用IVIS Spectrum)和流式细胞术、FM和qRT-PCR对二者进行评估。这些实验可以为峰值肿瘤基因敲减50％、75％和90％(ED50、ED75、ED90)以及肿瘤中的敲减的耐久性(定量为T-KD50＝肿瘤表达从峰值敲减中途返回至对照的时间)所需的有效剂量提供估计值。可对各选定的构建体确定这些参数。
接下来，我们对改善循环T1/2的方法进行评估。这些包括增加AsiC的大小(即，通过PEG缀合来比较一些尺寸，例如10kD、20kD和30kD，避免已知有毒的聚合物，例如PEI)，以及增加与血清蛋白的结合以减少肾脏过滤(即，通过与结合至血清LDL158、159的胆固醇缀合，或通过添加二酰基尾以促进与血清白蛋白的结合)。我们避免产生颗粒或聚集体的策略，因为它们将具有较差的肿瘤渗透并且可能在肝脏中被捕获。将PEG连接至适体的5′端、无活性siRNA的3′端或活性链的3′端不应该干扰RNAi。可以使用未缀合的AsiC作为阳性对照(和基准)以及缀合的siRNA(无适体)作为阴性对照，如上进行体内PK/PD/毒性评估。使用PLK1EpCAM-AsiC对具有GFP的最低ED75或ED90和最长T-KD50的两个或三个构建体再次进行测试，以确定相应的PK/PD参数，从而帮助设计用于抗肿瘤效力实验的给药方案。我们还可以确定这些PLK1构建体的最大耐受剂量(MTD)。
EpCAM AsiC针对基底细胞-样TNBC的抗肿瘤作用。我们的最终目标是测试EpCAM-AsiC针对原位乳腺脂肪垫肿瘤和转移瘤的作用。除非肿瘤不生长或生长缓慢(在这种情况下我们将切换为NSG小鼠)，否则我们可以使用裸鼠。可以使用对多色荧光和生物发光敏感的IVIS光谱进行活体动物成像。这些实验可以评估所鉴别的2-3种最佳的EpCAM-AsiC。
针对原位异种移植物的PLK1EpCAM-AsiC的活性。我们可以通过靶向PLK1开始。可以使用基于以上的PK/PD结果选择的剂量和给药方案/注射途径，将如上所述优化的一些PLK1EpCAM-AsiC设计皮下和/或静脉内注射入5-8只小鼠的组(组的大小由基于先前实验的功率计算(power calculation)进行选择，其中，该组大小给出了统计学上显著的结果)。例如，如果ED90远低于MTD，则初始实验可能会研究每T-KD50/2d给予2ED90。一旦它们的肿瘤变得可触诊，就可以对小鼠进行初始治疗，但是在后续实验中，我们可以研究固定直径的较大肿瘤在多次给予后是否消退。对荷载代表性的EpCAM+基底细胞-A(MB468、HC1187、BPLER)和EpCAM-基底细胞-B(MB231)肿瘤的小鼠进行比较。对于一些实验，我们可以在各侧腹肿对荷载这些肿瘤的小鼠进行处理，但由于动物内肿瘤大小的变化，这些实验可能需要更多的小鼠。可以用PBS或裸siRNA、EpCAM适体本身、携带有扰乱的siRNA序列的EpCAM-AsiC和PLK1PSMA-AsiC处理对照小鼠。在一些实验中，我们可以将EpCAM-AsiC治疗与adecatumumab或紫杉醇进行比较。将通过发光和卡尺测量，每三天对肿瘤大小进行量化。也可以对治疗的小鼠进行称重并观察到毒性的临床征象，并且在处死时可以通过血细胞计数以及肠、骨髓和脾脏的病理学检查仔细检查肠和骨髓毒性。可以通过单因素方差分析(根据需要对多个比较进行修正)对组之间的差异进行评估。对于有效的AsiC，我们还可以检查治疗的即时效果，以评估抗肿瘤活性的机制，并证实AsiC不会激活先天性免疫应答。可以在单次治疗或对照注射后1-3天将荷瘤小鼠处死，并将肿瘤的活化的半胱天冬酶染色，通过细胞凋亡和H&E来寻找有丝分裂纺锤体而死亡，以追踪PLK1敲减的预期效果。可以通过多重ELISA对血清干扰素和促炎细胞因子进行评估，并通过qRT-PCR对脾脏和肿瘤细胞进行相应mRNA分析。如果无抗肿瘤作用或抗肿瘤作用不佳，可以将给药方案调整至MTD。如果抗肿瘤作用完成(完全肿瘤消退)，那么我们可以在治疗开始时对减少的剂量和/或更大的肿瘤进行评估。当对照小鼠由于未处理的肿瘤达到允许的大小而被处死时，可将经处理的小鼠处死，通过FM、H&E和IHC对乳腺脂肪垫进行残留的微观肿瘤或宏观肿瘤检查。还可以评估残留的肿瘤细胞的EpCAM表达，以确定肿瘤抵抗(如果出现抵抗)是否作为下调EpCAM的结果而发展。如果没有观察到残留的肿瘤细胞，我们可以进行额外的实验来确定肿瘤是否被根除-在荧光素酶测量已经恢复到背景水平后的1-2周对小鼠进行治疗并随后观察小鼠停止治疗1-2个月以观察肿瘤是否重生或出现转移。可以针对我们预期的EpCAM靶向的其它乳腺癌亚型(luminal、Her2+)评估基底细胞-A TNBC的最有效方案。
针对转移性肿瘤的PLK1EpCAM-AsiC活性。为了评估EpCAM-AsiC针对转移性癌细胞的有效性，我们可以评估NSG小鼠中的静脉内注射的针对基底细胞-A TNBC细胞系的PLK1EpCAM-AsiC，该PLK1EpCAM-AsiC具有最好的肿瘤摄取。在尾静脉注射基底细胞-A(或基底细胞-B作为对照)TNBC后，一旦肺成为荧光素酶+，我们可开始对小鼠进行处理。处理剂量可以使用上述确定的原发性肿瘤的有效方案和给予模式。可以每三天对小鼠成像。可以减少对照至mock处理组和用紫杉醇或含有非靶向siRNA的EpCAM-AsiC处理的组。当对照小鼠需要处死时，可以对所有组进行成像。可以对肺、肝和脑进行解剖、称重、成像，以量化肿瘤负荷，可以通过H&E和EpCAM染色对切片进行分析，并且通过qRT-PCR对来自各动物的一个肺分析人/小鼠Gapdh的相对表达以独立地将肿瘤负荷量化。如果PLK1EpCAM-AsiC处理的小鼠相对于对照组被完全保护而免于转移或显示出显著的优势，我们可以确定具有较大转移负担的小鼠是否也通过延迟处理的开始而得到保护，直到肿瘤负担更大。
我们还可以将上述鉴别用于治疗原位肿瘤的最有效的静脉内方案与最有效的皮下方案进行比较，因为转移位点的RNA递送/敲减可能不同于原发肿瘤位点。由于M-IC能力被认为与T-IC功能相关，因此，我们还可以使用这种转移模型来评估我们筛选的BDG基因以及本文上述鉴别的离体肿瘤起始所需的基因的体内敲减。
靶向BDF基因的EpCAM-AsiC的活性。接下来，我们可以将PLK1敲减与我们的siRNA筛选或文献中鉴定的TNBC依赖性基因(例如XBP1)的敲减相比较。对于所选择的各基因靶标而言，这些体内实验可以涉及(1)鉴别各基因的活性siRNA，并评估敲减对体外T-IC功能和细胞增殖的影响；(2)设计并在体外检测AsiC以敲减特异性基因；(3)评估基因敲减对各种乳腺癌细胞系中的体外增殖和T-IC功能的影响；以及(4)验证个体AsiC的脱靶免疫刺激的缺乏。可以使体外表现最佳的基因进行如上所述的针对PLK1的原位和转移模型的体内测试。在这些实验中，我们可以将未处理的小鼠与用靶向特定基因或PLK1的EpCAM-AsiC处理的小鼠进行比较。如果存在用于特定基因靶标的特异性抑制剂药物(即，用于蛋白酶体的硼替佐米/卡非佐米)，则也可以用该药物对一组对照小鼠进行处理，以用于比较。这些实验的示例性基因是蛋白酶体基因和MCL1、U4/U6-U5tri-snRNP复合基因96、97、XBP1以及着丝粒基因NDC80。也可以结合PLK1AsiC和彼此组合，对其本身具有最好的体内活性的AsiC进行评估。由于蛋白酶体抑制剂敏感性与体外MCL1依赖性密切相关(未示出)，我们假设蛋白酶体基因和MCL1敲减将是协同的。可以通过使用不同的RNA剂量组合或与相关的抑制剂药物的组合的等效线法对不同的AsiC和AsiC/药物组合的协同作用进行正式测试。特别地，我们将确定与护理药物标准物(如紫杉醇)结合的EpCAM-AsiC是否与原始构建体协同。
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实施例6
材料和方法
细胞培养
使人BPE和BPLER细胞在WIT培养基(Stemgent)中生长。用荧光素酶报告基因对MB468进行转导。除非另有说明，从ATCC获得所有的其它人细胞系，并在均补充有10％FBS、1mM L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素(Gibco)的MEM(MCF7、BT474)、McCoy′s 5A(SKBR3)、RPMI1640(HCC1806、HCC1143、HCC1937、HCC1954、HCC1187、MB468、T47D)或DMEM(MB231、BT549、MB436)中生长。使4T1小鼠乳腺癌细胞在10％FBS DMEM中生长。对于体内成像，使用稳定表达萤火虫荧光素酶(MB468-luc)的MB468细胞，并在用pLV-Fluc-mCherry-Puro慢病毒感染后选择稳定表达萤火虫荧光素酶和mCherry(MB231-luc-mCherry)的MB231细胞。用嘌呤霉素对MB231细胞进行选择。
对于摄取和沉默处理，将细胞以低密度(10,000个细胞/孔，处于96孔板中)接种并立即处理。在OptiMEM或WIT培养基中进行所有的AsiC和siRNA处理。通过CellTiter-Glo(Promega)或台盼蓝染色在96孔板中对细胞存活力进行评估。
对于集落形成测定，在圆底96孔板中对1,000个活细胞处理6小时，然后转移到含有血清的培养基的10-cm平板上。每三天更换一次培养基。8天至14天后，将细胞固定在甲醇(-20℃)中，用结晶紫染色。对于乳腺球形成测定，在圆底96孔板中对1,000/ml活细胞处理6小时，然后在补充有EGF(20ng/ml，BD Biosciences)、B27(1：50，Invitrogen)、0.4％牛血清白蛋白(Sigma)和4μg/ml胰岛素(Sigma)的无血清DMEM/F121∶1(Invitrogen)中悬浮培养。1周或2周后对乳腺球进行计数。
siRNA转染。根据制造商的方案，用Dharmafect I对细胞进行转染。所有的siRNA序列见下文。
流式细胞术。对于流式细胞术，如前所述对细胞进行染色(Yu，F等(2007)，let-7Regulates Self Renewal and Tumorigenicity of Breast Cancer Cells，Cell 131，1109-1123.)，简要地说，在4℃下使用1∶50稀释的hAb直接对EpCAM和AKT1免疫染色30-60分钟(BioLegend/BD)。在含有0.5％FCS、1mM EDTA和25mM HEPES的PBS中对细胞进行染色。将样品移相同的缓冲液洗涤两次。使用FACS-Canto II(BD Biosciences)采集数据。进行三重复的分析，并对10,000个门控事件/样本进行计数。使用FlowJo(Treestar Inc.)进行所有的数据分析。
RNA分析。如(Petrocca，F.等(2008)，E2F1-regulated microRNAs impairTGFbeta-dependent cell-cycle arrest and apoptosis in gastric cancer.CancerCell，13，272-286)所述的进行qRT-PCR分析。简要地说，根据制造商的SYBR Green MasterMix(Applied Biosystems)和BioRad C1000Thermal Cycler(Biorad)，用Trizol(Invitrogen)对总RNA进行提取，并用Thermoscript RT试剂盒(Invitrogen)从1000ng总RNA制备cDNA。将相对的CT值归一化为GAPDH并转化为线性标度。
人乳腺组织的胶原酶消化。从UMASS组织库收获新鲜乳腺或结肠癌和对照的活检物，将样品切成3×3×3mm样品，并置于具有100μl RPMI的96孔板中。用Alexa647-siRNA-GFP、Alexa647-chol-siRNA-GFP或Cy3-AsiC-GFP对样品处理24小时。将样品拍照并消化。合并来自各处理的三个样品，并在37℃下伴随振荡放入含有1mg/ml胶原酶II(Sigma-Aldrich)的10ml RPMI中30分钟。在胶原酶消化之前和之后，使用脾脏程序在37℃下将样品在温和的MACS解离器(Miltenyi)中破碎30分钟。使细胞悬浮液通过70μm细胞过滤器(BDFalcon)，用30ml RPMI洗涤，并染色用于流式细胞术。
动物实验。所有的动物程序均在哈佛医学院和波士顿儿童医院动物护理和使用委员会批准下进行。裸鼠购自Jackson实验室。
体内实验。对于肿瘤起始研究，向8周龄雌性Nu/J小鼠(Stock#002019，Jackson实验室)皮下注射用EpCAM-AsiC-GFP、EpCAM-AsiC-PLK1预处理24小时或未处理的MB468-luc(5×106)细胞。用Tryple Express(Invitrogen)将细胞进行胰蛋白酶消化，重悬于WIT培养基中并皮下注射入侧腹中。腹膜内注射150mg/kg D-萤光素(Caliper Life Sciences)，使用IVIS Spectra系统(Caliper Life Sciences)每5天拍摄全身的发光图像，总共20天。
对于AsiC摄取实验，将用Tryple Express(Invitrogen)进行胰蛋白酶消化的MB468-luc(5×106)和MB231-luc-mCherry(5×105)细胞重悬于1∶1的WIT-基质胶溶液中，并皮下注射入8周龄雌性Nu/J小鼠(Stock#002019，Jackson实验室)的侧腹中。使用IVISSpectra系统(Caliper Life Sciences)每天对肿瘤大小进行分析。5天后，肿瘤清晰可见，用Alexa750-EpCAM-AsiC-GFP(0.5mg/kg)皮下注射入小鼠颈部区域。每48小时测试AsiC相对于肿瘤的定位，测试7天。
对于肿瘤抑制研究，将用Tryple Express(Invitrogen)进行胰蛋白酶消化的MB468-luc(5×106)和MB231-luc-mCherry(5×105)细胞重悬于1∶1的WIT-基质胶溶液中，并皮下注射入8周龄雌性Nu/J小鼠(Stock#002019，Jackson实验室)的侧腹中。每天使用IVISSpectra对肿瘤大小进行分析，5天后肿瘤清晰可见。将荷载相当大小的肿瘤的小鼠随机分为5组，并用5mg/kg的EpCAM-AsiC-PLK1、EpCAM-AsiC-GFP、EpCAM-适体、siRNA-PLK1进行处理或未处理。每72小时对小鼠进行处理，处理14天。
使用Living软件(Caliper Life Sciences)对所有图像进行分析。
统计分析。使用Microsoft Excel计算的Student′s t检验来对经处理的样品与对照之间的显著性进行分析，其中，测试类型设置为单尾分布和双样本相等方差。
结果：
EpCAM-AsiC特异性靶向基底细胞A乳腺癌细胞
通过指数富集法(SELEX)进行的配体的系统进化来选择EpCAM适体，用于结合至人EpCAM。优化的适体的长度只有19个核苷酸(nt)，并以12nM的亲和力结合至人EpCAM(Shigdar S.等，RNA aptamer against a cancer stem cell marker epithelial celladhesion molecule affinity Cancer Cancer Sci。2011May；102(5)：991-8)。它并不结合至小鼠EpCAM(图22)。它的短长度对于AsiC药物而言是理想的，因为长度为约60nt或更短的RNA可以廉价且高效地化学合成。我们设计的EpCAM-AsiC由42-44nt的长链(19nt适体+3nt接头+20-22nt siRNA的有义(无活性)链)构成，其退火至20-22nt的反义(活性)siRNA链(图21A)。两种链均用2′-氟嘧啶取代来商业合成，其赋予血清和其它体液中提高的稳定性(T1/2＞＞3d)，并防止先天免疫RNA传感器的刺激。我们首先通过流式细胞术在一组人类乳腺细胞系中对EpCAM细胞表面水平进行评估(表2、图23)。EpCAM通过所有测试的基底细胞-A细胞和luminal癌细胞系高度表达，而并不通过基底细胞B细胞系高度表达。正常的人上皮细胞(BPE)的EpCAM染色接近背景，而其转化的衍生物BPLER具有明亮的EpCAM染色(图21B)。测试的一些设计中的多个(正义和反义链交换，以及多个接头)敲减了EpCAM+中而非EpCAM-细胞系的基因表达，但是在剂量应答实验中最有效的设计如图21A所示。为了测试EpCAM-AsiC是否会被EpCAM+细胞系特异性地吸收，我们用Alexa647对AsiC的反义链的3′端进行标记。BPLER基底细胞-A TNBC细胞系过表达EpCAM，而BPE(对照上皮性乳腺细胞系)不会过表达(图21B)。用靶向GFP的Alexa647-EpCAM-AsiC对BPLER和BPE细胞进行处理，只有BPLER显示出AsiC摄取(图21C)。我们通过用Cy3标记的EpCAM-适体(用Cy3在5′端标记19nt适体)对EpCAM+MDA-MB-468细胞和BPE对照进行处理，进一步验证了EpCAM-AsiC的选择性摄取。22小时和43小时后，我们清楚地看到EpCAM+细胞中的选择性的AsiC摄取(数据未示出)。为了了解EpCAM AsiC选择性地触发基因敲减的能力，我们选择了稳定过表达GFP的BPLER和BPE细胞系。用靶向GFP的EpCAM-AsiC对细胞进行处理或用GFP-siRNA转染细胞作为阳性对照(图21D)。虽然用GFP-siRNA进行的转染在BPE和BPLER中等同地敲减基因表达，但是EpCAM-AsiC选择性地在没有任何脂质的BPLER中敲减表达；敲减是均匀的，并与用脂质转染所达到的相当。
这些结果清楚地表明，EpCAM-AsiC被EpCAM+细胞选择性地摄取，并且可以在这些EpCAM+细胞中特异性地诱导基因敲减。我们还显示出，在不同位置(适体的5′端或反义链的3′端)使用不同的荧光团(Alexa647或Cy3)不影响特异性摄取。
针对8种不同的乳腺癌细胞系进一步对特异性mRNA和蛋白质敲减进行分析。本文中，我们示出了在用靶向AKT1的EpCAM-AsiC处理后，过表达EpCAM的基底细胞A和luminal细胞系显示减少的AKT1mRNA和蛋白质水平。用AKT1-siRNA进行的转染对所有细胞系具有相似的敲减作用，而使用靶向GFP的EpCAM-AsiC作为对照不影响任何细胞系(图24A、图24B)。在mRNA和蛋白质水平上，EpCAM表达水平与敲减效应之间存在明显的相关性(图24D、图24E)。
为了确定相较于健康人体组织，人上皮乳腺癌组织是否可以特异性摄取EpCAM-AsiC，我们对来自同一患者的人上皮乳腺癌活检物和健康对照组织进行了测试。用Alexa647-siRNA-GFP、Alexa647-chol-siRNA-GFP或Cy3-EpCAM-AsiC-GFP对样品处理24小时(图25A)。人肿瘤样品显示出更高的EpCAM水平以及更高的细胞角蛋白(上皮细胞标记物)水平(图25B)。标记的siRNA和chol-siRNA具有相似地穿透肿瘤和健康组织的效力，而EpCAM-AsiC被选择性地通过肿瘤组织而非健康对照组织样品摄取(图25C、图25D)。在来自三位不同患者的肿瘤中重复摄取实验，对于各处理，各活检物接受3次测试。所有三位患者的总结(图25E)。测试结肠癌活检物并与匹配的健康样品进行比较，健康和肿瘤结肠样品均能够摄取Cy3-EpCAM-AsiC-GFP(图26)。
靶向PLK1的EpCAM AsiC特异性地抑制基底细胞A乳腺癌细胞中的细胞增殖
为了了解EpCAM-AsiC是否可以特异性地靶向基底细胞-A和luminal型乳腺癌细胞并抑制增殖，我们设计了靶向PLK1的EpCAM-AsiC。PLK1是G2/M转换的已知触发器。针对代表基底细胞-A、基底细胞-B和luminal细胞系的10个乳腺癌细胞，测试了靶向PLK1的EpCAM-AsiC对细胞增殖的作用。靶向PLK1的EpCAM-AsiC在基底细胞A和luminal细胞系中均降低了细胞增殖，而对基底细胞B细胞无影响(图27A)。观察到EpCAM表达水平与细胞存活力之间的相关性(图27B)。为了了解EpCAM-AsiC是否特异性地靶向处于混合细胞群中的EpCAM+细胞，将HCC1937(EpCAM+GFP-)细胞与BPE(EpCAM-GFP+)细胞共培养，并用靶向PLK1的EpCAM-AsiC进行处理或不处理。未经处理的共培养物显示出类似的细胞比例(41％BPE和59％HCC1937)。在靶向PLK1的EpCAM-AsiC处理后，EpCAM+细胞比例降低至17％，而EpCAM-细胞增加至83％，表明EpCAM-AsiC特异性地抑制EpCAM+细胞的增殖。与其它的基底细胞A细胞系(MB468和HCC1143)重复共培养，得到类似的结果。当BPE细胞与基底细胞B细胞(MB231)共培养生长时，无论EpCAM-AsiC是否处理，BPE和MB231细胞之间的比例保持不变(在未处理的共培养物中为66％的BPE和33％的MB231；在EpCAM-AsiC处理后为61％的BPE和38％的MB231)(图27C、图27D)。
为了确定靶向PLK1的EpCAM-AsiC针对基底细胞A细胞的细胞存活力的阻抑作用是否通过结合至EpCAM受体的EpCAM-适体或通过沉默PLK1而触发，我们用EpCAM-适体对细胞进行处理，并与靶向PLK1的EpCAM-AsiC进行比较。靶向PLK1的EpCAM-AsiC在基底细胞A和luminal细胞系中阻抑了细胞存活力，而EpCAM-适体不会影响任何细胞系中的细胞存活力(图28)。
我们的目标之一是了解靶向PLK1的EpCAM-AsiC是否可用于靶向肿瘤内的T-IC。为了检查它是否可能不仅针对基底细胞-A和luminal细胞内的大部分细胞有活性，而且针对其内的T-IC也有活性，我们用靶向PLK1的EpCAM-AsiC对基底细胞-A、基底细胞-B和luminal细胞系处理24小时，并测试了其对体外集落和乳腺球形成的影响。当以克隆密度接种(HCC1937、HCC1954、HCC1806和MCF7)时，基底细胞A和luminal细胞系形成集落，而基底细胞-A和luminal细胞系在靶向PLK1的EpCAM-AsiC处理之后丧失形成集落的能力，而在紫杉醇处理后出现抗性克隆(图29A-图29B)。相反，暴露至靶向PLK1的EpCAM-AsiC不影响基底细胞-B(MB231和BT549)细胞的集落形成，而紫杉醇对基底细胞-A和luminal细胞具有相似的作用，降低了集落形成但仍然存在抗性克隆。同样地，在非贴壁条件下形成乳腺球的乳腺癌细胞系中，紫杉醇在所有的细胞系中减少了乳腺球的形成(图29C)，而靶向PLK1的EpCAM-AsiC特异性地抑制基底细胞-A和luminal中的乳腺球形成。为了检查靶向PLK1的EpCAM-AsiC的预处理是否会抑制或延缓体内肿瘤起始，我们用靶向PLK1、GFP的EpCAM-AsiC对MB-468-luc细胞处理24小时或未处理，并将细胞注射入裸鼠的侧腹中。使用IVIS光谱成像系统，我们每5天追踪肿瘤生长，持续20天。用靶向PLK1的EpCAM-AsiC预处理的细胞在20天后未显示出肿瘤的任何迹象，而未处理的细胞或用靶向GFP的EpCAM-AsiC预处理的细胞在5天后显示出肿瘤，并且在20天内肿瘤大小增长(图29D)。
靶向PLK1的EpCAM-AsiC特异性地抑制基底细胞A乳腺癌细胞中的肿瘤起始和生长
我们能够示出EpCAM-AsiC可以在体外特异性地靶向EpCAM+细胞，以了解这种能力是否在体内保留，我们首先测试了小鼠和人血清中的EpCAM-AsiC在一段时间内的稳定性。我们看到EpCAM-AsiC在小鼠和人血清中都稳定至少36h(图30A-图30B)。我们向裸鼠的相对着的侧腹注射MB468-luc和MB231-luc-mCherry细胞。5天后，当使用IVIS Spectra成像系统清楚可见肿瘤时，我们向小鼠皮下注射(在颈部区域，尽可能远离肿瘤细胞注射点)0.5mg/kg的Alexa750标记的靶向GFP的EpCAM-AsiC。在注射后立即对小鼠成像，并在24小时、48小时和5天后再次进行成像，以追踪AsiC定位。Alexa750标记的靶向GFP的EpCAM-AsiC清楚地定位于MB468-luc肿瘤(EpCAM+)而非MB231-luc-mCherry(EpCAM-)肿瘤(图31A)。7只小鼠的分析表明Alexa750在MB468(EpCAM+)肿瘤中显著增加(图31B)。在第5天，肿瘤被去除并可视化，以证实Alexa750标记的靶向GFP的EpCAM-AsiC确实进入了肿瘤。Alexa750的升高水平与mCherry水平呈负相关(数据未示出)。
我们的细胞存活力和肿瘤起始数据表明，靶向PLK1的EpCAM-AsiC特异性地抑制基底细胞A乳腺癌细胞中的肿瘤生长。为了测试这个假设，我们向裸鼠注射EpCAM-基底细胞B细胞(MB231-luc-mCherry细胞)或EpCAM+基底细胞A细胞(MB468-luc细胞)。一旦肿瘤通过IVIS成像系统清晰可见，每72小时用5mg/Kg的靶向PLK1或GFP的EpCAM AsiC对小鼠处理14天或不进行处理。使用IVIS Spectra成像系统每72小时对小鼠进行成像，持续14天。用靶向PLK1的EpCAM-AsiC处理的MB468-luc肿瘤早在处理后6天时尺寸收缩，并且在许多小鼠中于14天后完全消失，而MB231-luc-mCherry肿瘤保持不变。我们认为EpCAM-AsiC虽然是靶向GFP，但EpCAM-AsiC确实有一定的作用，因为用GFP AsiC处理的基底细胞A肿瘤的大小与对照的未处理的小鼠一样大。靶向GFP的EpCAM-Asic的处理阻抑了EpCAM+和EpCAM-肿瘤中的肿瘤生长，但并未消除肿瘤。EpCAM+和EpCAM-的未处理的肿瘤的尺寸在14天内均增加(图32A-图32B)。
表1：EpCAM-AsiC序列
表2：人乳腺细胞系的EpCAM平均荧光强度(MFI)
实施例7
三阴性乳腺癌在任何乳腺癌亚型中具有最差的预后，并且尚无靶向的TNBC治疗。TNBC具有与肿瘤起始细胞(T-IC)相关的表型，也称为癌症干细胞。T-IC抵抗化学疗法，并被认为是引起肿瘤复发和转移的原因。
EpCAM在正常的上皮细胞上以低水平在间隙连接处表达，但在几乎所有的上皮癌的整个膜中更加高度表达(更高100-1000倍)，并且是已知的TI-C标记。
本文描述的是用于基底细胞-样TNBC的基因敲减治疗的策略。如本文所述，适体-siRNA嵌合体(AsiC)平台适于转染上皮乳腺癌细胞，同时靶向乳腺肿瘤起始细胞(T-IC)。适体结合至EpCAM，在癌细胞和癌干细胞上高度表达。作为原理证明，siRNA针对所有细胞中的有丝分裂所需的激酶(PLK1)。
如本文所证明的，EpCAM-AsiC在人和小鼠中是稳定的。EpCAM AsiC可以在3′-端用2′-F嘧啶和dTdT进行化学合成，这使得它们对RNase具有抗性，并且不太可能刺激先天免疫。
用4mM EpCAM-AsiC将细胞处理5天，并通过流式细胞术检测由AKT1-AsiC进行的特异性的AKT1蛋白沉默(图24F)。
MB468肿瘤仅在用PLK1EpCAM-AsiC处理后消退。当肿瘤变得可触诊时，开始用5mg/kg RNA每周两次处理具有sc MB468肿瘤的小鼠。对PLK1EpCAM-AsiC、GFP SpCAM-AsiC、EpCAM适体、PLK1siRNA和mock处理样品进行分析(图33)。
序列表
<110> CHILDREN'S MEDICAL CENTER CORPORATION
<120> 用于治疗癌症的方法和组合物
<130> 701039-082401-PCT
<140>
<141>
<150> 62/043,803
<151> 2014-08-29
<160> 33
<170> PatentIn version 3.5
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Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Ala Ala Ala Gly Gly Cys
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<213> 人类免疫缺陷病毒
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<223> 人工序列的描述：合成肽
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<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
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<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
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<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 33
gcgacugguu acccggucgu uu 22

Claims (24)

1.一种嵌合分子，所述嵌合分子包含结合癌症标记物的适体结构域和抑制性核酸结构域。
2.如权利要求1所述的分子，其中，所述癌症标记物是EpCAM或EphA2。
3.如权利要求1-2中任一项所述的分子，其中，所述分子是适体-siRNA嵌合体(AsiC)。
4.如权利要求1-3中任一项所述的分子，其中，所述抑制性核酸特异性地结合至在癌细胞中上调的基因产物。
5.如权利要求1-4中任一项所述的分子，其中，所述抑制性核酸抑制选自于由以下所组成的组中的基因的表达：
Plk1、MCL1、EphA2、PsmA2、MSI1、BMI1、XBP1、PRPF8、PFPF38A、RBM22、USP39、RAN、NUP205和NDC80。
6.如权利要求1-5中任一项所述的分子，其中，所述癌症标记物是EpCAM，并且所述抑制性核酸结构域抑制Plk1的表达。
7.如权利要求1-6中任一项所述的分子，其中，所述结合癌症标记物的适体结构域包含SEQ ID NO：33的序列。
8.如权利要求1-6中任一项所述的分子，其中，所述结合癌症标记物的适体结构域基本上由SEQ ID NO：33的序列组成。
9.如权利要求1-8中任一项所述的分子，其中，所述抑制性核酸结构域包含SEQ ID NO：2的序列。
10.如权利要求1-8中任一项所述的分子，其中，所述抑制性核酸结构域基本上由SEQID NO：2的序列组成。
11.如权利要求1-10中任一项所述的分子，所述分子包含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3中的一种的序列。
12.如权利要求1-11中任一项所述的分子，所述分子基本上由SEQ ID NO：1至SEQ IDNO：3中的一种的序列组成。
13.如权利要求1-12中任一项所述的分子，其中，所述分子的3'端包含dTdT。
14.如权利要求1-13中任一项所述的分子，其中，所述分子包含至少一个2'-F嘧啶。
15.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-14中任一项所述的分子和药学上可接受的载体。
16.如权利要求15所述的组合物，所述组合物包含至少两种权利要求1-14中任一项所述的嵌合分子，其中，所述嵌合分子具有不同的适体结构域或抑制性核酸结构域。
17.如权利要求16所述的组合物，其中，不同的适体或抑制性核酸结构域识别不同的靶标。
18.如权利要求16所述的组合物，其中，不同的适体或抑制性核酸结构域具有多种序列并识别相同的靶标。
19.一种治疗癌症的方法，所述方法包括给予权利要求1-18中任一项所述的分子或组合物。
20.如权利要求19所述的方法，其中，所述癌症是上皮癌或乳腺癌。
21.如权利要求20所述的方法，其中，所述乳腺癌是三阴性乳腺癌。
22.如权利要求19-21中任一项所述的方法，其中，所述给予是皮下给予。
23.如权利要求19-22中任一项所述的方法，其中，向所述受试者进一步给予额外的癌症治疗。
24.如权利要求23所述的方法，其中，所述癌症治疗是紫杉醇。
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