KR20100110298A - 안드로겐 수용체를 표적화하는 ｌｎａ 길항제 - Google Patents

안드로겐 수용체를 표적화하는 ｌｎａ 길항제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포 내 안드로겐 수용체 mRNA를 표적으로 하여, 안드로겐 수용체의 발현 감소를 유도하는 올리고머 화합물(올리고머)에 관한 것이다. 안드로겐 수용체 발현의 감소는 암과 같은, 과증식성 질환과 같은, 본 명세서에 언급된 질환 또는 의학적 장애와 같은 특정 의학적 장애의 치료에 유용하다.

Description

안드로겐 수용체를 표적화하는 ＬＮＡ 길항제{LNA antagonists targeting the androgen receptor}
본 발명은 안드로겐 수용체 발현의 조절을 위한 화합물, 조성물 및 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 세포 내 안드로겐 수용체 mRNA를 표적화하여 안드로겐 수용체의 발현 감소를 유도하는 올리고머 화합물(올리고머)에 관련된 것이다. 안드로겐 수용체 발현의 감소는 암, 특히 전립선 암 또는 유방 암과 같은 의학적 장애의 분야에 유용하다.
관련 사례
본 출원의 청구항은 2007년 11월 26일 출원된 미국 가출원 번호 60/990,125의 35 U.S.C.§119(e)에 기초하고, 상기 공개된 내용은 그 전체가 참조로서 본 문서에 삽입된다.
안드로겐 수용체(AR)는 남성 호르몬인 테스토스테론(testosterone) 또는 디하이드로테스토스테론(dihydrotestosterone) 중 하나와의 결합에 의해 활성화되는 핵 수용체의 한 형태이다. 안드로겐 수용체의 주요 기능은 유전자 발현을 조절하는 DNA 결합 전사 인자로 작용하는 것이다. 하지만, 안드로겐 수용체는 DNA 결합에 비의존적인 추가적 기능 또한 가진다. 안드로겐 수용체는 높은 농도에서 안드로겐 수용체를 저해할 수 있는 프로게스테론(progesterone) 수용체, 및 프로게스틴(progestins)과 대부분 밀접하게 연관되어 있다.
인간의 안드로겐 수용체 유전자는 하나의 카피(copy)이고, X-염색체(chromosome)의 Xq 11-12 위치에서 확인되는 반면, 그 수용체 자체는 두 개의 이성질체(iso-form, A 및 B)로 존재한다. 안드로겐 수용체-A는 최초 187개의 아미노산(N-말단 절단)이 부족한 87 KDa 단백질이다. 이성질체(isoform)인 안드로겐 수용체-B는 전체 길이 110 KDa 버전(version)이다.
안드로겐 수용체와 안드로겐의 결합은 수용체의 구조적 변화를 유도하고, 그결과, 열 충격 단백질(heat shcok protein)이 분열되고, 이량체화되고, 세포질 내에서 호르몬 반응 요소(hormone response elements)로 나타내어지는 특이적 DNA 서열에 결합하는 안드로겐 수용체 이량체가 있는 세포 핵으로 이동한다. 다른 핵 단백질과의 상호작용에 따라, 안드로겐 수용체는 인슐린 유사 성장 인자 1(insulin-like growth factor I,IGF-1)과 같은 특이적 유전자의 전사를 증가시키거나 또는 감소시켜, 유전자의 발현을 조절한다.
또한 안드로겐 수용체는 세포질 내에서 신호 전달 단백질에 의해 세포질내에서 활성을 가질 수 있다. 세포질내 안드로겐 수용체와 결합한 안드로겐은 예를 들면 이온 운반과 같은 유전자 전사에 비의존적인 세포 기능의 빠른 변화를 유도할 뿐 아니라, 예를 들면 다른 신호 전달 경로의 매개를 통해 유전자 전사에 간접적으로 영향을 주고, 그것에 의해 다른 전사 인자의 활성에 영향을 준다.
안드로겐 수용체의 과발현, 또는 돌연변이화된 안드로겐 수용체 유전자의 발현은 폴리글루타메이트(polyglutamate) 병(Monks et al., PNAS 11.2.2007, 온라인 공개), 탈모증, 전립선 비대증, 척수성 근 위축증 및 케네디 병과 같은 다양한 장애 뿐 아니라, 전립선 암 및 유방 암을 포함한 암과 같은 다양한 질병을 나타낸다.
국제특허 제97/11170호에는 안드로겐 수용체 mRNA에 선택적으로 하이브리드된 안티센스(antisense) 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)의 투여를 포함한 전립선 비대증 또는 전립선 암으로 진단된 환자에 대한 치료방법이 기재되어 있다. 27 - 29개 뉴클레오티드(nucleotide) 사이의 세 가지 안티센스(antisense) 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 서열이 밝혀졌다.
미국 특허 제6,733,776호 및 유럽 특허 제0 692 972호에는 안드로겐 수용체 유전자에 하이브리드된 안티센스(antisense) 핵산을 포함한 리포솜(liposome)의 적용에 의한 남성형 탈모증의 치료방법이 기재되어 있다. 특이적 서열을 가진 안티센스 분자 및 안드로겐 수용체의 표적화는 제공되어 있지 않다.
미국 특허 제2005/0164970호에는 안드로겐 수용체 mRNA를 표적화하는 siRNA 복합체를 사용한 전립선암의 치료방법이 기재되어 있다.
국제 특허 제2005/027833호에는 길이가 12-40 사이인 모포리노(morpholino) 써브-유닛(sub-unit)의 모포리노(morpholino) 올리고뉴클레오티드(oligonecleotide)를 환자에 투여하는 것으로 구성된 전립선암의 치료방법이 기재되어 있다.
국제 특허 제2001/083740호에는 인간 안드로겐 수용체를 표적화하는 18 에서 20개 사이의 연속된 유닛(unit)의 언차지된(uncharged) 모포리노(morpholino) 백본(backbone)을 포함하는 안티센스(antisense) 화합물이 기재되어 있다.
모포리노(morpholino) 안티센스(antisense) 화합물은 mRNA 스플라이싱(splicing) 또는 해석의 시작과 관여된 분자와 같은 다른 분자에 의해 mRNA에 접근을 막을 수 있는 핵산 표적과의 결합을 통해 작용한다.
미국 특허 제7,067,256호에는 안드로겐 수용체의 불활성화를 명백히 매개하는 리보자임(ribozyme)이 기재되어 있다. 안드로겐 수용체 mRNA에 상응하는 부분에 대해 안티센스한 19개의 뉴클레오티드(nucleotide) RNA 분자가 제공되어 있다.
하지만, siRNA, 모포리노(morpholino) 안티센스(antisense) 및 리보자임(ribozyme)에 대한 적용에도 불구하고, 상기 언급한 안드로겐 수용체의 저해제 중 어느 하나도 약학적으로 허용가능한 용량으로 생체 내(in vivo) 안드로겐 수용체를 효과적으로 하향-조절하는 것에서는 성공하지 못하였다.
바람직한 예에서, 본 발명은 LNA 화학 사용 및/또는 안드로겐 수용체 mRNA에 특히 효과적인 표적 싸이트(site)의 선별에 기초를 두고 선택되는 안드로겐 수용체 길항제의 새로운 분류를 제공한다.
도 1은 표 3에 기재되어 있는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)를 MCF7 세포에 형질전환한 후 24시간에 1, 4 및 16 nM의 농도에서 안드로겐 수용체 mRNA의 녹다운(knockdow)에 대한 올리고뉴클레오티드의 포텐셜(potential)을 실시간 중합효소연쇄반응을 이용하여 평가한 것이다. 모든 결과는 GAPDH에 의해 노말라이즈(normalise)하였고, 안드로겐 수용체 mRNA의 저해는 무처리 대조군과 비교한 퍼센트(percent)로 나타내었다. 결과는 세 번의 개별 실험 결과에 대한 평균으로 나타내었다.
도 2는 표 3에 나타낸 올리고뉴클레오티드(oligomucleotide)를 A549 세포에 형질전환한 후 24시간에 1, 4 및 16 nM의 농도에서 안드로겐 수용체 mRNA의 녹다운(knockdow)에 대한 올리고뉴클레오티드의 포텐셜(potential)을 실시간 중합효소연쇄반응을 이용하여 평가한 것이다. 모든 결과는 GAPDH에 의해 노말라이즈(normalise)하였고, 안드로겐 수용체 mRNA의 저해는 무처리 대조군과 비교한 퍼센트(percent)로 나타내었다. 결과는 세 번의 개별 실험 결과에 대한 평균으로 나타내었다.
도 3a 내지 3f는 인간 안드로겐 수용체 mRNA 서열(Genbank 등록 번호: NM_000044) 및 마우스 안드로겐 수용체 mRNA 서열(Genbank 등록 번호: NM_0134769)의 서열 정렬(Sequence alignment)을 나타낸 것이다.
도 4a 및 4b는 본 발명에 따른 올리고머에 의해 표적화되는 인간 안드로겐 수용체 mRNA(cDNA) 선호되는 표적 부위의 위치이다. 일부 실시태양에 있어서, 16 머(mer)의 표적 위치가 보여졌음에도 불구하고, 이러한 표적 부분은- 즉, 24개 이상의 연속된 뉴클레오티드의 표적 부위에서 보여지는 부분에 5' 또는 3'에 추가적으로 4개의 염기를 포함할 수 있다.
도 5는 서열번호: 1의 인간(Homo sapiens) 안드로겐 수용체(디하이드로테스토스테론(dihydrotestosterone) 수용체; 고환 여성화; 척수연수성 근위축증(Spinal and bulbar muscular atrophy); 케네디병)(AR), 형질전환 변이체 1, mRNA를 나타낸다(Genbank 등록 번호 NM_000044).
도 6은 서열번호 81의 마우스 안드로겐 수용체 mRNA 서열을 나타낸다.
도 7은 서열번호 82의 붉은털원숭이 안드로겐 수용체 mRNA 서열을 나타낸다.
도 8은 서열번호 83의 인간(Homo sapiens) 안드로겐 수용체 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 9는 서열번호 84의 마우스 안드로겐 수용체 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 10은 서열번호 85의 붉은털원숭이 안드로겐 수용체 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 11은 형질전환 후 24시간에 LNCaP에서 안드로겐 수용체 mRNA를 나타낸다.
도 12는 형질전환 후 24시간에 A549에서 안드로겐 수용체 mRNA를 나타낸다.
도 13은 A549 세포에 형질전환후 시간에 따른 세포 증식을 분석한 것이다.
도 14는 형질전환후 시간에 따른 세포 증식을 분석한 것이다.
도 15는 LNCap 세포에서, 형질전환 후 24, 48 또는 72시간에 카스페아제 3/7 활성을 나타낸 것이다.
도 16은 A549 세포에서, 형질전환 후 24, 48 또는 72시간에 카스페아제 3/7 활성을 나타낸 것이다.
도 17은 생체 내(in vivo) 올리고머 처리 후 혈장내 평균 PSA를 나타낸 것이다.
도 18은 암 성장에 대한 생체 내(in vivo) 저해를 나타낸 것이다.
발명의 요약
본 발명은 10 - 30개의 뉴클레오티드와 같은, 총 10 - 50 사이의 연속된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 10 - 30 뉴클레오티드 길이와 같은, 10 - 50 사이의 올리고머를 제공하고, 상기 연속된 뉴클레오티드 서열은 서열번호: 1 또는 이로부터 자연적으로 발생하는 변이체와 같은, 포유류 안드로겐 수용체 유전자와 같은 포유류 안드로겐 수용체를 암호화하는 핵산에 역상보적으로 상응하는 부분과 적어도 80%(예를 들면, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%) 상보적이다. 그러므로, 예를 들면, 상기 올리고머는 서열번호: 1의 (상응하는) 부분의 서열을 가진 단일 가닥 핵산 분자와 혼성화한다.
본 발명은 본 발명에 의한 올리고머를 포함하는 결합체, 및 상기 올리고머에 공유적으로 결합된 적어도 하나의 비-뉴클레오티드 또는 비-폴리뉴클레오티드 부분을 제공한다.
본 발명은 올리고머 또는 본 발명에 따른 결합체, 및 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 염 또는 보조제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 암과 같은, 과증식성 장애와 같은, 본 발명에 기재된 질병 또는 의학적 장애의 치료용과 같은 약제로서 사용되는 본 발명에 따른 올리고머 또는 결합체를 제공한다.
본 발명은 암과 같은, 과증식성 장애와 같은, 본 발명에 기재된 질병 또는 의학적 장애의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 올리고머 또는 결합체의 용도를 제공한다.
본 발명은 질병 또는 의학적 장애를 겪고 있는 환자, 또는 겪을 가능성이 있는 환자에 대한 본 발명에 따른 올리고머, 결합체 또는 약학적 조성물의 투여하는 것을 포함하는 암과 같은, 과증식성 장애와 같은, 본 발명에 따른 질병 또는 의학적 장애의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 상기 안드로겐 수용체를 발현하는 세포내 안드로겐 수용체의 저해 효과를 위해 상기 세포에 본 발명에 따른 올리고머, 또는 결합체를 투여하는 것을 포함하는 안드로겐 수용체를 발현하는 세포에서 안드로겐 수용체를 저해하는 방법을 제공한다.
본 발명은 총 10 ~ 50 뉴클레오염기 사이의 연속된 뉴클레오염기 서열을 포함하는 10 ~ 50 뉴클레오염기 사이의 길이인 올리고머를 제공하고, 상기 연속된 뉴클레오염기 서열은 포유류의 안드로겐 수용체를 암호화하는 핵산에 상응하는 부분과적어도 80% 상동적이다.
본 발명은 총 10 ~ 50 뉴클레오염기 사이의 연속된 뉴클레오염기 서열을 포함하는 10 ~ 50 뉴클레오염기 사이의 길이인 올리고머를 제공하고, 상기 연속된 뉴클레오염기 서열은 포유류 안드로겐 수용체를 암호화하는 핵산의 표적 부분에 역상보적으로 적어도 80% 동일하다.
또한 본 발명은 본 발명에 의한 올리고머를 포함하는 결합체를 제공하고, 올리고머의 뉴클레오염기 서열이 더해진 이러한 결합체는 본 발명의 올리고머에 공유적으로 결합된 적어도 하나의 비-뉴클레오티드 또는 비-폴리뉴클레오티드 부분("결합된 부분")이 포함된다.
본 발명은 올리고머 또는 본 발명에 따른 결합체, 및 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 염 또는 보조제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 약제로의 용도를 위한 본 발명에 의한 올리고머를 제공한다.
또한 본 발명은 유방암 또는 전립선암, 탈모증, 전립선 비대증, 척수성 근 위축증, 케네디 병 및 폴리글루타메이트(polyglutamate) 병과 같은 암으로 구성된 군으로부터 선택된 질병과 같은 본 발명에 기재된 하나 또는 그 이상의 질병에 대한 치료용 약제의 제조를 위한 본 발명의 올리고머의 용도를 제공한다.
또한 본 발명은 유방암 또는 전립선암, 탈모증, 전립선 비대증, 척수성 근 위축증, 케네디 병 및 폴리글루타메이트(polyglutamate) 병과 같은 암으로 구성된 군으로부터 선택된 질병과 같은 본 발명에 기재된 하나 또는 그 이상의 질병 치료를 위한 본 발명의 올리고머를 제공한다.
본 발명의 올리고머를 포함하는 약제 및 다른 조성물도 제공한다. 또한 시험관 내(in vitro) 또는 생체 내(in vivo)에서, 본 발명의 하나 또는 그 이상의 올리고머, 결합체 또는 조성물과 함께 상기 세포 또는 조직에 접촉하는 것을 포함하는 세포 또는 조직에서 안드로겐 수용체의 발현을 하향-조절하는 방법을 제공한다.
또한 안드로겐 수용체의 발현, 또는 과발현과 관련된 질환 또는 병을 갖거나 갖기 쉽다고(민감하다고) 의심되는 동물 또는 인간에게 치료적 또는 예방적으로 유효한 양의 본 발명의 하나 또는 그 이상의 올리고머, 결합체 또는 약학적 조성물을 투여함으로써 비-인간 동물 또는 인간을 치료하는 방법을 제공한다. 또한, 안드로겐 수용체의 발현 억제 및 안드로겐 수용체의 활성과 관련된 질환의 치료를 위한 올리고머 사용 방법을 제공한다.
본 발명은 유방암 또는 전립선암, 탈모증, 전립선 비대증, 척수성 근 위축증, 케네디 병 및 폴리글루타메이트(polyglutamate) 병과 같은 암으로 구성된 군으로부터 선택된 질병을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 발명에 의한 하나 또는 그 이상의 올리고머, 결합체, 또는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것(효과적인 양)을 포함한다.
본 발명은 하향-조절과 같은 세포 또는 조직에서 안드로겐 수용체의 발현을 억제 또는 감소시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 발명의 하나 또는 그 이상의 올리고머, 결합체 또는 약학적 조성물의 효과적인 양을 상기 세포 또는 조직에 접촉하는 단계를 포함하고, 그것으로부터 안드로겐 수용체의 발현을 억제 또는 감소시킨다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 10 내지 30개의 연속된 단량체로 구성되고, 인접한 단량체는 인산기(phosphate group) 또는 포스포티오에이트(phosphorothioate) 기에 의해 공유적으로 결합되어 있고, 상기 올리고머는 적어도 10개의 연속된 단량체의 첫번째 부분을 포함하고; 상기 첫번째 부분의 적어도 하나의 단량체는 뉴클레오시드 유사체이고; 상기 첫번째 부분의 서열은 포유류 안드로겐 수용체 유전자 또는 포유류 안드로겐 수용체 mRNA에 베트스-얼라인(best-aligne)된 표적 부분에 역상보적으로 적어도 80% 동일하다.
하나의 예로, 본 발명의 올리고머는
Figure pct00001
로 구성된 군으로부터 선택되어지고, 여기에서 대문자는 베타-D-옥시-LNA(beta-D-oxy-LNA) 단량체를 나타내고, 소문자는 DNA 단량체를 나타내며, 아래 기입되어있는 "s"는 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 연결을 나타내고, MeC는 5-메틸시토신(5-methylcytosine) 염기를 포함하는 베타-D-옥시-LNA 단량체를 나타낸다.
발명의 상세한 설명
올리고머
본 발명은 올리고머성 조성물(본 발명에서 올리고머로 기재됨)을, 서열번호 1로 나타낸 안드로겐 수용체 핵산과 같은, 포유류 안드로겐 수용체를 암호화하는 핵산 분자, 및 포유류 안드로겐 수용체를 암호화하는 핵산 분자에서 자연적으로 발생하는 변이체(variants)의 기능을 조절하는 용도로 사용한다. 본 발명에서 사용하는 용어 "올리고머(oligomer)"는, 둘 또는 그 이상의 뉴클레오티드(즉, 올리고뉴클레오티드)의 공유 결합에 의해 형성된 분자를 나타낸다. 본 발명에서, 본 발명의 올리고머로 나타내어지는 뉴클레오티드와 같은 각각의 단일 뉴클레오티드도 "모노머(monomer)" 또는 "유닛(unit)"으로 나타낼 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 올리고머는 길이에 있어서 10 ~ 30 뉴클레오티드 사이의 연속된 뉴클레오티드 서열을 구성 또는 포함한다(즉, 10 ~ 30개가 공유적으로 결합된 단량체를 포함 또는 구성).
다양한 실시태양에 있어서, 본 발명의 화합물은 RNA(유닛)를 포함하지 않는다. 다양한 실시태양에 있어서, 본 발명에 따른 화합물은 선형 분자이거나 또는 선형 분자로 합성되어진다. 이러한 실시태양에서, 상기 올리고머는 단일 가닥 분자이고, 형태학적으로 짧은 부분, 예를 들면, 같은 올리고머(즉, 듀플렉스(duplexes)) 내의 다른 부분과 상보적인, 적어도 3, 4 또는 5 개의 연속된 뉴클레오티드를 포함하지 않고, 이와 관련하여, 일부 실시태양에 있어서, 상기 올리고머는 (본질적으로) 이중 가닥이 아니다. 일부 실시태양에 있어서, 상기 올리고머는 siRNA가 아닌 것과 같이, 필수적으로 이중 가닥은 아니다. 다양한 실시태양에 있어서, 상기 본 발명의 올리고머는 연속된 뉴클레오티드 부분이 전체로 구성되어 있다. 따라서, 상기 올리고머는 대체로 자가-상보적이지 않다. siRNA는 일반적으로 각 말단에 2 번째 뉴클레오티드의 3'이 돌출되어 있는 21 및 23개 길이 사이의 뉴클레오티드와 같이, 2 개의 상보적으로 짧은 RNA(또는 동등한 뉴클레오염기 유닛) 서열로 구성된다. 생체 내(in vivo) 흡수를 강화하기 위해, siRNA는 콜레스테롤 군(일반적으로 가닥의 하나 또는 양쪽의 3' 또는 5' 말단)과 같은 스테롤과 결합되는 것과 같이, 결합될 수 있다.
또한, 본 발명은 안드로겐 수용체 mRNA 또는 유전자, 또는 서열번호 : 2 ~ 22에 특히 상응하는 이의 대립형질 변이체(alleic varient)의 표적 서열을 제공하고, 상기 표적 서열에 상응하는 안티센스(antisense) 올리고뉴클레오티드는 안드로겐 수용체를 하향-조절할 수 있다. 예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열인 서열번호: 2 ~ 22에 따른 표적 서열은 각각, 도 4에 나타내었다(굵은 글씨 및 밑줄로, 상응하는 올리고 서열번호를 위에 표시하였다). 예를 들어 변이체 서열은, 본 발명의 범위 안에도 있는 이러한 표적 서열의 대립형질 변이체(유전자 위치 Xq11-12에 존재하는 안드로겐 수용체(AR) 유전자와 같은)에 국한되지 않는다. 변이체 서열은 안드로겐 수용체의 표적 서열에 적어도 60% 상동 서열을 가지고, 더 바람직하게는 최소한 70%, 더 바람직하게는 최소한 80%, 더 바람직하게는 최소한 85%, 더 바람직하게는 최소한 90%, 더욱 바람직하게는 최소한 91%, 최소한 92%, 최소한 93%, 최소한 94%, 최소한 95% 상동 서열을 가지는 것이다. 일반적으로, 상기 변이체 서열에 따른 본 발명의 올리고머는 여전히 안드로겐 수용체를 하향-조절할 수 있다.
LNA 올리고뉴클레오티드의 특이적 디자인 또한, 예를 들면 서열번호 44 ~ 80에서 나타낸 바와 같이 공개되었다. 본 발명의 올리고머는 안드로겐 수용체 mRNA 및 단백질 발현의 강력한 저해제일 것으로 생각된다.
표적
포유류 안드로겐 수용체는 인간 또는 마우스의 안드로겐 수용체로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하고, 서열번호 1에서 타나내는 핵산에 의해 암호화되는 안드로겐 수용체와 같은 인간 안드로겐 수용체인 것이 더욱 바람직하다. 또한, 포유류 안드로겐 수용체 유전자(표적) 및 이에 상응하는 단백질은 하기의 표에서 나타낸 바와 같다;
Figure pct00002
인간의 안드로겐 수용체 유전자는 대립형질 변이체의 범위에서 보여지고, 일부 동질이상은 핵산을 cDNA 서열로 나타내고, 그 자체로 mRNA 서열로 나타내지 않는 상기-밝혀진 GenBank 등록 번호로 확인된다. 성숙한 mRNA 서열은 티민(thymine,T) 잔기가 우라실(uracil, U) 잔기로 교체된 상기 상응하는 cDNA 서열로부터 직접적으로 유래될 수 있다.
인간의 안드로겐 수용체 유전자는 대립형질 변이체의 범위에서 보여지고, 일부 동질이상은 질병 표현형과 연관되어져 있음이 알려져 있다(Mooney et al, NAR 15; 31(8) 2003). 예를 들면, CAG 반복 부분은 폴리글루타민(polyglutamine) 확장 장애와 연관되어있고, (GGC)n 트리뉴클레오티드 반복 및 R726L, T887A 및 L710H 단일 뉴클레오티드 동질이상을 포함한 다른 특징적인 대립형질 변이체가 확인되었으며, 상기 후자의 두 개는 다른 스테로이드 리간드(ligand)를 위한 안드로겐 수용체의 강화된 뒤섞임과 연관되어 있음이 보여지고 있다. 하나의 실시태양에서, n은 5에서 31 사이의 범위이다. 22 보다 적은 CAG 반복은 아프리카계 미국인 남성에서 전립선암이 증가된 위험과 관련되고, 따라서, 이는 우선적으로 대립형질 변이체일 수 있다.
일부 실시태양에 있어서, 표적 핵산은 R276L, T887A 및 L710H를 포함하는 하나 또는 그 이상의 단일 뉴클레오티드 동질이상을 포함하는 안드로겐 수용체의 대립형질 변이체이다.
따라서, 일부 실시태양에 있어서, 상기 표적은 (CAG)n 트리뉴클레오티드 반복, 또는 (GGC)n 트리뉴클레오티드 반복을 포함하는 안드로겐 수용체의 대립형질 변이체이다.
바람직한 실시태양에서, 포유류 안드로겐 수용체를 암호화하는 핵산은, 서열번호 1로 나타내어지는 인간 안드로겐 수용체 cDNA 서열 및/또는 서열번호 81로 나타내어지는 마우스 안드로겐 수용체 cDNA 서열, 또는 이에 따른 대립형질 변이체이다. 본 발명에 따른 올리고머는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.
따라서, 본 발명에 따른 올리고머의 '표적'은 안드로겐 수용체 mRNA이다. 상기 올리고머는 안드로겐 수용체 유전자를 발현하는 세포 내로 도입되었을 때, 그 결과 상기 안드로겐 수용체 mRNA 수준을 감소시키고, 세포내에서 상기 안드로겐 수용체의 발현 수준을 감소시킨다.
상기 안드로겐 수용체는 단백질 키나제 C 델타(Protein kinase C delta, PRKCD), 글루타치온 에스-트랜스퍼라제 쎄타 2(Glutathione S- transferase theta 2, GSTT2), 일시적인 수용체 잠재적인 양이온 채널 써브패밀리 V 멤버 3(transient receptor potential cation channel subfamily V member 3, TRPV3), 피롤린-5-카르복실화 환원효소 1(Pyrroline-5-carboxylate reductase 1, PYCR1) 또는 오르니틴아미노전환효소(ornithine aminotransferase, OAT)로 구성된 군으로부터 선택된 유전자와 같은, 일부 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다 - 이러한 유전자는 본 발명의 안드로겐 수용체 표적으로 기재되어 있고, 일부 실시태양에서, 본 발명에 따른 상기 올리고머는 상기 안드로겐 수용체 표적을 발현하거나, 또는 발현할 수 있는 세포의 내에서 하나 또는 그 이상의 안드로겐 수용체 표적의 발현을 조절(즉, 세포에서 안드로겐 수용체 표적의 저해(안드로겐 수용체의 의한)를 완화하는 경우)하는 데 사용될 수 있다.
상기 안드로겐 수용체 mRNA를 표적화하는 올리고머는 5' 비번역 리더(leader), 엑손(exon), 인트론(intron) 및 3' 비번역 테일(tail)과 같은 표적 mRNA 핵산을 따른 어떠한 부분에라도 혼성화될 수 있다. 그러나, 상기 안드로겐 수용체 mRNA를 표적화하는 올리고머는 표적 핵산을 형성하는 성숙한 mRNA와 혼성화되는 것이 바람직하다.
본 발명의 적절한 올리고머는 상기 안드로겐 수용체 유전자의 발현을 하향-조절할 수 있다. 이러한 점에서, 본 발명의 상기 올리고머는 일반적으로 인간 세포와 같은 표유류에서 안드로겐 수용체의 저해에 효과적일 수 있다. 일부 실시태양에 있어서, 본 발명의 올리고머는 표적 핵산에 결합하고, 정상 발현 수준과 비교하여 적어도 10% 또는 20%, 더욱 바람직하게는 정상 발현 수준과 비교하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%의 발현 억제에 영향을 준다(상기 올리고머의 투여 이전에 즉시와 같이). 일부 실시태양에 있어서, 1 및 25 nM 사이의 본 발명의 올리고머 또는 결합체를 사용할 경우에 이러한 조절이 나타난다. 동일한 또는 다른 실시태양에 있어서, 발현 억제는 70% 억제 이하와 같은, 80% 억제 이하, 90% 억제 이하, 95% 억제 이하, 98% 억제 이하와 같은, 100% 이하이다. 발현 수준의 조절은 예를 들면, 표적 단백질에 대해 만들어진 적절한 항체를 사용한 웨스턴 블랏팅(Western blotting)에 따른 SDS-PAGE와 같은 방법을 통한 단백질 수준 측정에 의해 결정될 수 있다. 또는, 발현 수준의 조절은 예를 들면, 노던 블랏팅(northern blotting) 또는 정량적 RT-PCR을 통한 mRNA의 수준 측정에 의해 결정될 수 있다. mRNA 수준을 통해 측정할 경우, 0.8 및 20nM 농도 사이와 같은, 0.04 및 25 nM과 같은, 적절한 투여량을 사용할 경우, 하향-조절의 수준은, 일부 실시태양에 있어서, 전형적으로 본 발명의 조성물의 부재하에서 정상 수준의 10 ~ 20% 사이의 수준이다.
따라서 본 발명은 안드로겐 수용체 단백질 및/또는 mRNA를 발현하는 세포에서 안드로겐 수용체 단백질 및/또는 mRNA의 발현의 하향-조절 또는 억제 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 세포에서 안드로겐 수용체 단백질 및/또는 mRNA의 발현을 하향-조절 및 억제하기 위해 본 발명에 따른 올리고머 또는 결합체(적절히 효과적인 양으로)를 상기 세포에 투여 또는 접촉하는 것을 포함한다. 적절하게 상기 세포는 인간 세포와 같은 포유류 세포이다. 상기 투여 또는 접촉은, 일부 실시태양에 있어서, 시험관 내(in vitro)에서 일어날 수 있다. 상기 투여 또는 접촉은, 일부 실시태양에 있어서, 생체 내(in vivo)에서 일어날 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "표적 핵산"은 서열번호: 1과 같은, 인간 안드로겐 수용체와 같은, 포유류 안드로겐 수용체 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 또는 RNA를 나타낸다. 안드로겐 수용체를 암호화하는 핵산 또는 자연적으로 발생하는 이의 변이체, 및 RNA 핵산은 이로부터 유래되었고, 비록 성숙한 mRNA가 바람직하나, 바람직하게는 pre-mRNA와 같은, mRNA이다. 일부 실시태양에 있어서, 예를 들어 연구 또는 진단에 사용할 경우, "표적 핵산"은 cDNA 또는 상기 DNA 또는 RNA 핵산 표적으로부터 유래된 합성 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명에 따른 올리고머는 바람직하게는 표적 핵산에 혼성화 할 수 있다. 서열번호: 1은 cDNA 서열이고, cDNA 서열에서 우라실(uracil)이 티미딘(thymidine)으로 교체되었음에도 불구하고, 상기 성숙한 mRNA 표적 서열에 상응하는 것으로 인지될 수 있다.
상기 용어 "자연적으로 발생하는 이의 변이체"는 마우스, 원숭이, 및 바람직하게는 인간과 같은, 포유류와 같은, 정의된 분류군에 자연적으로 존재하는 상기 안드로겐 수용체 핵산 서열의 변이체를 의미한다. 전형적으로는, 폴리뉴클레오티드의 "자연적으로 발생하는 변이체"라고 부를 때 그 용어는 염색체의 전좌 또는 복제에 의한 염색체 Chr X: 66.68 - 66.87 Mb에서 발견되는 안드로겐 수용체를 암호화하는 어떠한 대립형질 변이체, 및 이로부터 유래된 mRNA와 같은, RNA를 포함한다. "자연적으로 발생하는 변이체"는 또한 안드로겐 수용체 mRNA의 선택적 스플라이싱(alternative splicing)로부터 유래된 변이체를 포함할 수 있다. 특정 폴리펩티드 서열을 나타낼 경우, 예를 들면, 상기 용어는 신호 펩티드 절단, 단백질 가수분해의 절단, 당화 등과 같은, 공동 또는 번역후 변형에 의해 처리될 수 있는 단백질의 자연적으로 발생하는 형태도 포함한다.
올리고머 서열
상기 올리고머는 서열번호: 1로 표시되는 뉴클레오티드 서열에 역상보적으로 상응하는 연속된 뉴클레오티드 서열을 포함 또는 구성한다. 따라서, 상기 올리고머는 서열번호: 2 ~ 22 및 86 ~ 106으로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나 구성할 수 있고, 상기 올리고머(또는 이로부터 연속된 뉴클레오티드 부분)는 상기 선택된 서열에 대하여 선택적으로 하나, 둘, 또는 세개의 미스매치(mismatch)를 포함할 수 있다.
상기 올리고머는 포유류 안드로겐 수용체(예를들면, 서열번호: 1)를 암호화하는 핵산에 상당하는 부분으로 전체적으로 상보적인(완벽히 상보적인) 연속된 뉴클레오티드 서열을 포함 또는 구성할 수 있다. 따라서, 상기 올리고머는 안티센스 뉴클레오티드 서열을 포함 또는 구성할 수 있다.
그러나, 일부 실시태양에 있어서, 원하는 효과를 보기 위하여 표적 서열에 혼성화되고 표적에 아직 충분히 결합할 수 있을 때, 상기 올리고머는 1, 2, 3, 또는 4개(또는 그 이상)의 미스매치를 용인할 수 있다. 예를 들면, 미스매치는 뉴클레오티드 서열안에 존재하는 올리고머 뉴클레오티드 서열의 증가된 길이 및/또는 LNA와 같이, 뉴클레오티드 아날로그의 증가된 숫자에 의해 보완되어진다.
일부 실시태양에 있어서, 상기 연속적인 뉴클레오티드 서열은 포유류 안드로겐 수용체를 암호화하는 핵산에 상응하는 부분과 같은, 표적 서열에 혼성화 되었을 경우 2개의 미스매치 이상이 아닌 것과 같은, 3개 이상을 포함하지 않는다.
일부 실시태양에 있어서, 상기 연속적인 뉴클레오티드 서열은 포유류 안드로겐 수용체를 암호화하는 핵산에 상응하는 부분과 같은, 표적 서열에 혼성화 되었을 경우, 단지 하나의 미스매치를 포함한다.
본 발명의 상기 올리고머의 뉴클레오염기 서열 또는 연속된 뉴클레오염기 서열은 바람직하게는 서열번호: 2 - 22 및 86 - 106으로 구성된 군으로부터 선택되는 상응하는 서열에, 100% 상동적(동일)인 것과 같은, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96% 상동적인 것과 같은, 적어도 80% 상동적이다.
본 발명의 상기 올리고머의 뉴클레오티드 서열 또는 연속된 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 서열번호: 1로 나타내어지는 상응하는 서열의 역상보적에, 100% 상동적(동일한)인 것과 같은, 적어도 99% 상동적, 적어도 98% 상동적, 적어도 97% 상동적, 적어도 96% 상동적, 적어도 95%, 적어도 94%, 적어도 93%, 적어도 92%, 적어도 91%, 적어도 90%, 적어도 85%와 같은, 적어도 80% 상동적이다.
본 발명의 상기 올리고머의 뉴클레오티드 서열 또는 연속된 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 서열번호: 1에 존재하는 하위-서열에, 100% 상보적(완벽하게 상보적)인 것과 같은, 적어도 99% 상보적, 적어도 98% 상보적, 적어도 97% 상보적, 적어도 96% 상보적, 적어도 95%, 적어도 94%, 적어도 93%, 적어도 92%, 적어도 91%, 적어도 90%, 적어도 85%와 같은, 적어도 80% 상동적이다.
일부 실시태양에 있어서, 올리고머(또는 이의 연속된 뉴클레오티드 부분)는 서열번호: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 및 22로 구성된 군으로부터 선택되는 서열 중 하나 또는 이의 적어도 10개의 연속된 뉴클레오티드의 하위-서열로부터 선택되거나 구성되고, 상기 올리고머(또는 이의 연속된 뉴클레오티드 부분)는 상기 서열과 비교할 경우 하나, 2개, 또는 3개의 미스매치를 선택적으로 포함할 수 있다.
일부 실시태양에 있어서, 올리고머(또는 이의 연속된 뉴클레오티드 부분)는 서열번호: 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105 및 106으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열 중 하나 또는 이의 적어도 10개의 연속된 뉴클레오티드의 하위-서열로부터 선택되거나 구성되고, 상기 올리고머(또는 이의 연속된 뉴클레오티드 부분)는 상기 서열과 비교할 경우 하나, 2개, 또는 3개의 미스매치를 선택적으로 포함할 수 있다.
다른 바람직한 올리고머는 서열번호: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 및 22로 구성된 군의 서열로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 가지는 12, 13, 14, 15 또는 16개의 연속된 뉴클레오티드 길이의 서열과 같은 (연속된) 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 올리고머(또는 이의 연속된 뉴클레오티드 부분)는 상기 선택된 서열에 대하여 1, 2, 또는 3개의 미스매치를 선택적으로 포함할 수 있다.
일부 실시태양에 있어서 상기 하위-서열은 12 ~ 18 뉴클레오티드 사이와 같은, 12 ~ 22 사이와 같은, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 또는 29개의 연속된 뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 적절하게는, 일부 실시태양에 있어서, 상기 하위-서열은 본 발명의 올리고머의 연속된 뉴클레오티드 서열로서 같은 길이의 것이다.
그러나, 일부 실시태양에 있어서 상기 올리고머의 뉴클레오티드 서열은 독립적으로, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 추가적인 뉴클레오티드 5' 및/또는 3'과 같은, 5' 또는 3' 뉴클레오티드를 추가적으로 포함할 수 있다고 여겨지고, 이는 표적 서열에 비-상보적이다. 본 발명의 올리고머에 있어서, 일부 실시태양에 있어서, 추가적인 뉴클레오티드에 의해 5' 또는 3' 측면에 연속된 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에 있어서, 상기 추가적인 5' 또는 3' 뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA와 같은, 자연적으로 일어나는 뉴클레오티드이다. 일부 실시태양에 있어서, 상기 추가적인 5' 또는 3' 뉴클레오티드는 본 발명의 갭머(gapmer) 올리고머의 설명에 기재된 것에 따라 부분 D로 나타낼 수 있다.
일부 실시태양에 있어서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 44와 같은, 서열번호 2에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 연속된 뉴클레오티드와 같은, 이의 적어도 10개의 연속된 뉴클레오티드의 하위-서열을 구성 또는 포함한다.
일부 실시태양에 있어서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 45와 같은, 서열번호 3에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 연속된 뉴클레오티드와 같은, 이의 적어도 10개의 연속된 뉴클레오티드의 하위-서열을 구성 또는 포함한다.
일부 실시태양에 있어서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 46과 같은, 서열번호 4에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 연속된 뉴클레오티드와 같은, 이의 적어도 10개의 연속된 뉴클레오티드의 하위-서열을 구성 또는 포함한다.
일부 실시태양에 있어서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 47과 같은, 서열번호 5에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 연속된 뉴클레오티드와 같은, 이의 적어도 10개의 연속된 뉴클레오티드의 하위-서열을 구성 또는 포함한다.
일부 실시태양에 있어서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 48, 49 또는 50과 같은, 서열번호 6에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 연속된 뉴클레오티드와 같은, 이의 적어도 10개의 연속된 뉴클레오티드의 하위-서열을 구성 또는 포함한다.
일부 실시태양에 있어서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 51, 52 또는 53과 같은, 서열번호 7에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 연속된 뉴클레오티드와 같은, 이의 적어도 10개의 연속된 뉴클레오티드의 하위-서열을 구성 또는 포함한다.
일부 실시태양에 있어서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 54, 55 또는 56과 같은, 서열번호 8에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 연속된 뉴클레오티드와 같은, 이의 적어도 10개의 연속된 뉴클레오티드의 하위-서열을 구성 또는 포함한다.
일부 실시태양에 있어서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 57과 같은, 서열번호 9에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 연속된 뉴클레오티드와 같은, 이의 적어도 10개의 연속된 뉴클레오티드의 하위-서열을 구성 또는 포함한다.
일부 실시태양에 있어서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 58, 59 또는 60과 같은, 서열번호 10에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 연속된 뉴클레오티드와 같은, 이의 적어도 10개의 연속된 뉴클레오티드의 하위-서열을 구성 또는 포함한다.
일부 실시태양에 있어서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 61과 같은, 서열번호 11에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 연속된 뉴클레오티드와 같은, 이의 적어도 10개의 연속된 뉴클레오티드의 하위-서열을 구성 또는 포함한다.
일부 실시태양에 있어서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 62와 같은, 서열번호 12에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 연속된 뉴클레오티드와 같은, 이의 적어도 10개의 연속된 뉴클레오티드의 하위-서열을 구성 또는 포함한다.
일부 실시태양에 있어서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 63, 64또는 65와 같은, 서열번호 13에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 연속된 뉴클레오티드와 같은, 이의 적어도 10개의 연속된 뉴클레오티드의 하위-서열을 구성 또는 포함한다.
일부 실시태양에 있어서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 66과 같은, 서열번호 14에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 연속된 뉴클레오티드와 같은, 이의 적어도 10개의 연속된 뉴클레오티드의 하위-서열을 구성 또는 포함한다.
일부 실시태양에 있어서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 67과 같은, 서열번호 15에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 연속된 뉴클레오티드와 같은, 이의 적어도 10개의 연속된 뉴클레오티드의 하위-서열을 구성 또는 포함한다.
일부 실시태양에 있어서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 68과 같은, 서열번호 16에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 연속된 뉴클레오티드와 같은, 이의 적어도 10개의 연속된 뉴클레오티드의 하위-서열을 구성 또는 포함한다.
일부 실시태양에 있어서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 69, 70 또는 71과 같은, 서열번호 17에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 연속된 뉴클레오티드와 같은, 이의 적어도 10개의 연속된 뉴클레오티드의 하위-서열을 구성 또는 포함한다.
일부 실시태양에 있어서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 72와 같은, 서열번호 18에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 연속된 뉴클레오티드와 같은, 이의 적어도 10개의 연속된 뉴클레오티드의 하위-서열을 구성 또는 포함한다.
일부 실시태양에 있어서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 73, 74 또는 75와 같은, 서열번호 19에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 연속된 뉴클레오티드와 같은, 이의 적어도 10개의 연속된 뉴클레오티드의 하위-서열을 구성 또는 포함한다.
일부 실시태양에 있어서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 76과 같은, 서열번호 20에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 연속된 뉴클레오티드와 같은, 이의 적어도 10개의 연속된 뉴클레오티드의 하위-서열을 구성 또는 포함한다.
일부 실시태양에 있어서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 77, 78 또는 79와 같은, 서열번호 21에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 연속된 뉴클레오티드와 같은, 이의 적어도 10개의 연속된 뉴클레오티드의 하위-서열을 구성 또는 포함한다.
일부 실시태양에 있어서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 80과 같은, 서열번호 22에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 연속된 뉴클레오티드와 같은, 이의 적어도 10개의 연속된 뉴클레오티드의 하위-서열을 구성 또는 포함한다.
본 발명의 상기 올리고머(또는 연속된 뉴클레오티드 서열) 및 본 발명에 기재된 것과 같은, 포유류 안드로겐 수용체를 암호화하는 핵산 또는 이의 역상보적 서열 사이의 "상동성(homology)"을 결정할 경우, 상기 상동성의 결정은 본 발명의 조성물에 상응하는 뉴클레오티드 서열 및 포유류 안드로겐 수용체를 암호화하는 핵산에 상응하는 부위(또는 표적 핵산), 또는 이의 역상보적 서열로 간단한 정렬(alignment)을 통해 실시하고, 상기 상보성은 본 발명의 조성물에서 연속된 뉴클레오티드의 총 개수에 의해 정렬 및 나뉘는 염기의 개수를 측정하고 100을 곱하여 결정된다. 이러한 비교에 있어서, 만약 차이가 있으면, 이러한 차이는 본 발명의 뉴클레오티드 서열과 표적 핵산 사이의 차이에서의 뉴클레오티드의 개수가 있는 부분보다 단지 미스매치인 것이 바람직하다.
상기 용어 "상응하는"이란 상기 올리고머의 뉴클레오티드 서열 또는 연속된 뉴클레오티드 서열(첫 번째 서열) 및 i) 서열번호: 1과 같은, 안드로겐 수용체 단백질을 암호화하는 mRNA와 같은, 핵산 표적의 역 상보적인 하위-서열, 및/또는 ⅱ) 서열번호: 2 - 22 및 86 - 106으로 구성된 군과 같은 본 발명에서 제공되는 뉴클레오티드 서열 각각으로부터 선택된 추가 서열과 동일한 연속된 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 하위-서열 사이의 비교를 나타낸다. 뉴클레오티드 유사체(analogues)는 그와 동일하거나 상응하는 뉴클레오티드에 직접적으로 비교된다. i) 또는 ii)하에서 추가 서열에 상응하는 첫 번째 서열은 일반적으로 첫 번째 서열의 길이보다 긴 서열(상기 연속된 뉴클레오티드 서열과 같은)과 동일하고, 또는, 본 발명에서 기재한바와 같이, 일부 실시태양에 있어서, 상응하는 서열에 100% 상동적(동일)과 같은, 적어도 99% 상동적, 적어도 98% 상독적, 적어도 97% 상동적, 적어도 96% 상동적, 적어도 95%, 적어도 94%, 적어도 93%, 적어도 92%, 적어도 91%, 적어도 90%, 적어도 85%와 같은, 적어도 80% 상동적이다.
상기 용어 "상응하는 뉴클레오티드 유사체" 및 "상응하는 뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 유사체에서의 뉴클레오티드 및 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드가 동일한 것임을 표시하기 위한 것이다. 예를 들면, 뉴클레오티드의 2-디옥시리보스(2-deoxyribose) 유닛이 아데닌과 결합되어 있을 경우, 상기 "상응하는 뉴클레오티드 유사체"는 아데닌과 결합된 5탄당(pentose) 유닛(2-디옥시리보스와 다른)을 포함한다.
길이
올리고머는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 연속된 뉴클레오염기 서열의 길이 사이의 연속된 뉴클레오티드 서열을 포함 또는 구성한다.
다양한 실시태양에 있어서, 상기 올리고머는 13, 14, 15, 16개의 연속된 뉴클레오염기 길이와 같은, 13 ~ 17 또는 12 ~ 16과 같은, 12 ~ 18과 같은, 총 10 ~ 22 사이의 연속된 뉴클레오티드 서열을 포함 또는 구성한다.
다양한 실시태양에 있어서, 상기 올리고머는 총 10, 11, 12, 13 또는 14개의 연속된 뉴클레오티드 서열의 길이를 포함 또는 구성한다.
다양한 실시태양에 있어서, 본 발명에 따른 상기 올리고머는 15, 16 또는 17 뉴클레오티드와 같은, 18개 이하의 뉴클레오티드와 같은, 20개 이하의 뉴클레오티드와 같은, 22개 이하의 뉴클레오티드로 구성된다. 다양한 실시태양에 있어서 본 발명의 올리고머는 20개 이하의 뉴클레오염기를 포함한다.
뉴클레오티드 유사체
본 발명에서 사용하는 용어 "뉴클레오티드"는 당 부분(sugar moiety), 염기 부분(base moiety) 및 공유적으로 결합된 인산기(phosphate group) 및 DNA 또는 RNA와 같은, 두 개의 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드, 바람직하게는 DNA를 포함하는 배당체(glycoside)를 나타내고, 변형된 당 및/또는 염기 부분을 포함하는 비자연적으로 발생하는 뉴클레오티드는 본 발명에서 "뉴클레오티드 유사체"로서 기재된다.
비자연적으로 발생하는 뉴클레오티드는 2' 치환된 뉴클레오티드와 같은, 두 고리식(bicyclic)의 뉴클레오티드 또는 2' 변형된 뉴클레오티드와 같은, 변형된 당 부분을 가지는 뉴클레오티드를 포함한다.
"뉴클레오티드 유사체"는 당 및/또는 염기 부분에서의 변형에 의한 DNA 또는 RNA 뉴클레오티드와 같은, 자연적인 뉴클레오티드의 변이체(variants)이다. 유사체는 올리고뉴클레오티드에 있어서 자연적인 뉴클레오티드에 대해 원칙적으로 단지 "침묵(silent)" 또는 "동등(equivalent)"하고, 즉, 표적 유전자 발현 억제에 작용하는 올리고뉴클레오티드 방법에 대한 기능적 효과는 없다. 이러한 "동일한" 유사체는 만약, 예를 들어, 제조가 쉽고 저렴하거나, 또는 저장 또는 제조 상태가 더욱 안정적이거나, 또는, 꼬리표 또는 라벨을 나타낸다면, 역시 유용할 것이다. 그러나, 바람직하게는, 상기 유사체는 예를 들면, 표적에 대해 증가된 결합 친화성 및/또는 세포 내 뉴클레아제에 대해 증가된 저항성 및/또는 증가된 세포 내로의 운반의 용이함을 통하여 올리고머가 발현을 억제하는 작용 방법에 기능적 효과를 가질 수 있다. 뉴클레오시드 유사체의 특별한 예는 예를 들면, Freier & Altmann, Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443; Uhlmann, Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213, 및 하기 도식 1에 기재되어 있다:
Figure pct00003
도식 1
따라서 상기 올리고머는 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드의 단순한 서열을 포함 또는 구성하고 - 바람직하게는 2'-디옥시뉴클레오티드(본 발명에서는 일반적으로 "DNA"로서 기재)뿐만 아니라, 리보뉴클레오티드(본 발명에서는 일반적으로 "RNA"로서 기재), 또는 이러한 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드 및 하나 또는 그 이상의 비자연적으로 발생하는 뉴클레오티드의 조합, 즉 뉴클레오티드 유사체도 가능하다. 이러한 뉴클레오티드 유사체는 표적 서열에 대한 올리고머의 친화도를 적절하게 높일 수 있다.
적절하고 바람직한 뉴클레오티드 유사체의 예는 PCT/DK2006/000512에 기재되어 있거나 또는 본 문서에서 참조된다.
LNA 또는 2'-치환된 당과 같은, 올리고머에서 친화도가 높아진 뉴클레오티드 유사체의 결합은 특별하게 결합하는 올리고머의 크기를 감소시키고, 비특이적 또는 비정상적인 결합이 일어나기 전에 상기 올리고머의 크기에 대한 상한을 감소시킬 수도 있다.
일부 실시태양에 있어서 상기 올리고머는 적어도 2개의 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 실시태양에 있어서, 상기 올리고머는 예를 들면, 6 또는 7 뉴클레오티드 유사체와 같이, 3 ~ 8 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 바람직한 실시태양에 있어서, 상기 뉴클레오티드 유사체 중 적어도 하나는 잠금핵산(locked nucleic acid, LNA); 예를 들면 뉴클레오티드 유사체의 적어도 3 또는 적어도 4, 또는 적어도 5, 또는 적어도 6, 또는 적어도 7, 또는 8은 LNA일 수 있다. 일부 실시태양에 있어서 모든 뉴클레오티드 유사체는 LNA일 수 있다.
오직 뉴클레오티드로 구성되는, 바람직한 뉴클레오티드 서열 모티프(motif) 또는 뉴클레오티드 서열을 언급할 경우, 그 서열에 의해 정의되는 본 발명의 올리고머는 올리고머/표적 듀플렉스(duplex)의 듀플렉스 안정성/Tm을 높이는(즉, 친화도 향상 뉴클레오티드 유사체), LNA 유닛 또는 다른 뉴클레오티드 유사체와 같은, 상기 서열에 존재하는 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 대신에 상응하는 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다고 인식될 것이다.
일부 실시태양에 있어서, 올리고머의 뉴클레오티드 서열과 표적 서열 사이의 임의의 미스매치는 바람직하게는, 본 발명에 기재된 부분 B 내, 및/또는 본 발명에 기재된 부분 D 내, 및/또는 올리고뉴클레오티드에서 DNA 뉴클레오티드와 같은 비변형된 지점, 및/또는 연속된 뉴클레오티드 서열에서 5' 또는 3' 부분과 같은, 상기 친화도 향상 뉴클레오티드 유사체 외부에서 발견된다.
상기 뉴클레오티드의 이러한 변형의 예는 결합 친화도를 높이거나 증가된 뉴클레아제 저항성을 제공할 수 있는 2'-치환기를 제공하거나 또는 다리(잠금 핵산) 구조 제작을 통한 변형 당 부분을 포함한다.
바람직한 뉴클레오티드 유사체는 옥시(oxy)-LNA(베타-D-옥시-LNA, 및 알파-L-옥시-LNA과 같은), 및/또는 아미노(amino)-LNA(베타-D-아미노-LNA 및 알파-L-아미노-LNA과 같은) 및/또는 티오(thio)-LNA(베타-D-티오-LNA 및 알파-L-티오-LNA과 같은) 및/또는 ENA(베타-D-ENA 및 알파-L-ENA와 같은)와 같은, LNA이고, 가장 바람직하게는 베타-D-옥시-LNA이다.
일부 실시태양에 있어서 본 발명의 올리고머 내에 존재하는 뉴클레오티드 유사체(본 발명에 기재된 부분 A 및 C와 같은)는 예를 들면: 2'-O-알킬-RNA(2'-O-alkyl-RNA) 유닛, 2'-아미노-DNA(2'-amino-DNA) 유닛, 2'-플루오로-DNA(2'-fluoro-DNA) 유닛, LNA 유닛, 아라비노 핵산(arabino nucleic acid, ANA) 유닛, 2'-플루오로-ANA(2'-fluoro-ANA) 유닛, HNA 유닛, INA(intercalating nucleic acid -Christensen, 2002. Nucl. Acids. Res. 2002 30: 4918-4925는 참조로서 삽입)유닛 및 2'MOE 유닛으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 실시태양에 있어서 본 발명의 올리고머에 존재하는 뉴클레오티드 유사체의 상기 형태 중 오직 하나, 또는 이의 연속된 뉴클레오염기 서열이 있다.
일부 실시태양에 있어서 상기 뉴클레오티드 유사체는 2'-O-메톡시에틸-RNA{2'-O-methoxyethyl(2'MOE)-RNA}, 2'-플루오로-DNA(2'-fluoro-DNA) 단량체(monomer) 또는 LNA 뉴클레오티드 유사체이고, 이러한 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 이러한 유사체의 3가지 형태로부터 독립적으로 선택되는 뉴클레오티드 유사체를 포함하거나, 또는 상기 세 가지 형태로부터 선택되는 유사체의 오직 하나의 형태를 포함할 수 있다. 일부 실시태양에 있어서 상기 뉴클레오티드 유사체 중 적어도 하나는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 2'-MOE-RNA 뉴클레오티드 유닛과 같은, 2'-MOE-RNA이다. 일부 실시태양에 있어서 상기 뉴클레오티드 유사체 중 적어도 하나는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 2'-플루오로-DNA 뉴클레오티드 유닛과 같은, 2'-플루오로-DNA이다.
일부 실시태양에 있어서, 본 발명에 따른 올리고머는 3 ~ 7 또는 4 내지 8 사이의 LNA 유닛, 또는 3, 4, 5, 6 또는 7 LNA 유닛과 같은, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 LNA 유닛과 같은, 적어도 하나의 잠금핵산(Locked Nucleic Acid, LNA) 유닛을 포함한다. 다양한 실시태양에 있어서, 모든 뉴클레오티드 유사체는 LNA이다. 일부 실시태양에 있어서, 상기 올리고머는 베타-D-옥시-LNA, 및 하나 또는 그 이상의 하기 LNA 유닛: 베타-D 또는 알파-L의 구성 또는 이의 조합에서의 티오-LNA, 아미노-LNA, 옥시-LNA, 및/또는 ENA를 포함할 수 있다. 일부 실시태양에 있어서 모든 LNA 시토신 유닛은 5'메틸-시토신(5'methyl-Cytosine)이다. 본 발명의 일부 실시태양에 있어서, 상기 올리고머는 LNA 및 DNA 유닛 모두를 포함할 수 있다. 바람직하게는 LNA 및 DNA 유닛의 조합된 전체는 10 ~ 25이고, 바람직하게는 10 ~ 20이고, 더욱 바람직하게는 12 ~ 16이다. 본 발명의 일부 실시태양에 있어서, 적어도 하나의 LNA 및 나머지 뉴클레오티드 유닛으로 구성되는 연속된 뉴클레오티드 서열과 같은, 상기 올리고머의 뉴클레오티드 서열은 DNA 유닛이다. 일부 실시태양에 있어서 상기 올리고머는 오직 LNA 뉴클레오티드 유사체 및 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드(RNA 또는 DNA, 가장 바람직하게는 DNA 뉴클레오티드와 같은), 선택적으로는 포스포로티오에이트(phosphorothioate)와 같은 변형된 뉴클레이티드 사이의 연결을 포함한다.
상기 용어 "뉴클레오염기"는 뉴클레오티드의 염기 부분(base moiety)을 나타내고, 비자연적으로 발생하는 변이체뿐 아니라 자연적으로 발생하는 변이체를 포함한다. 따라서, "뉴클레오염기"는 잘 알려진 퓨린(purine) 및 피리미딘(pyrimidine) 이종고리(heterocycles)뿐만 아니라 이종고리의 유사체 및 이의 호변체(tautomeres)를 포함한다.
이러한 뉴클레오염기의 예는, 아데닌(adenine)에 한정하지 않고, 구아닌(guanine), 시토신(cytosine), 티미딘(thymidine), 우라실(uracil), 잔틴(xanthine), 하이포잔틴(hypoxanthine), 5-메틸시토신(5-methylcytosine), 이소시토신(isocytosine), 슈도이소시토신(pseudoisocytosine), 5-브로모우라실(5-bromouracil), 5-프로피닐우라실(5-propynyluracil), 6-아미노퓨린(6-aminopurine), 2-아미노퓨린(2-aminopurine), 이노신(inosine), 디아미노퓨린(diaminopurine), 및 2-클로로-6-아미노퓨린(2-chloro-6-aminopurine)을 포함한다.
일부 실시태양에 있어서, 올리고머에 존재하는 뉴클레오염기 중 적어도 하나는 5-메틸시토신(5-methylcytosine), 이소시토신(isocytosine), 슈도이소시토신(pseudoisocytosine), 5-브로모우라실(5-bromouracil), 5-프로피닐우라실(5-propynyluracil), 6-아미노퓨린(6-aminopurine), 2-아미노퓨린(2-aminopurine), 이노신(inosine), 디아미노퓨린(diaminopurine), 및 2-클로로-6-아미노퓨린(2-chloro-6-aminopurine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 변형된 뉴클레오염기이다.
LNA
상기 용어 "LNA"는 "잠금핵산(Locked Nucleic Acid)"으로 알려진, 두고리 뉴클레오티드 유사체를 나타낸다. LNA 단량체로 나타낼 수 있고, 또는, "LNA 올리고뉴클레오티드"로 문맥에 사용될 경우, 하나 또는 그 이상의 이러한 두고리 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 화합물에 사용되는 LNA는 바람직하게는 기본적으로 하기 화학식 Ⅰ의 구조를 갖는다
Figure pct00004
상기 X는 O-, S-, -N(RN*)-, -C(R6R6*)-으로부터 선택된다;
B는 수소(hydrogen), 선택적으로 치환된 C1-4 알콕시(alkoxy), 선택적으로 치환된 C1-4 알킬(alkyl), 선택적으로 치환된 C1-4 아실록시(acyloxy), 뉴클레오염기, DNA 삽입물질(intercalators), 광화학적 활성기, 열화학적 활성기, 킬레이팅기(chelating group), 리포터기(reporter group), 및 리간드(ligands)로부터 선택된다;
P는 다음의 단량체, 또는 인터뉴클레오시드(internucleotide) 결합 또는 치환된 R5를 선택적으로 포함하거나 치환된 R5*를 동일하게 사용가능한 5'-말단기와 같은, 5'-말단기에 대한 인터뉴클레오시드 결합을 위한 라디칼 위치를 나타낸다;
P*은 앞의 모노머, 또는 3'-말단기에 대한 인터뉴클레오시드 결합을 나타낸다;
R4* 및 R2*은 모두 C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -O-, -Si(Ra)2-, -S-, -SO2-, -N(Ra)-, 및 ＞C=Z로부터 선택되는 1 ~ 4 그룹/원자로 구성되는 이가라디칼(biradical)을 나타내고,
상기 Z는 각각 수소(hydrogen), 선택적으로 치환된 C1-12-알킬(alkyl), 선택적으로 치환된 C2-12-알케닐(alkenyl), 선택적으로 치환된 C2-12 알키닐(alkynyl), 하이드록시(hydroxy), C1-12-알콕시(alkoxy), C2-12-알콕시알킬(alkoxyalkyl), C2-12-알케닐록시(alkenyloxy), 카복시(carboxy), C1-12-알콕시카보닐(alkoxycarbonyl), C1-12-알킬카보닐(alkylcarbonyl), 포르밀(formyl), 아릴(aryl), 아릴옥시-카보닐(aryloxy-carbonyl), 아릴옥시(aryloxy), 아릴카보닐(arylcarbonyl), 헤테로아릴(heteroaryl), 헤테로아릴옥시-카보닐(heteroaryloxy-carbonyl), 헤테로아릴옥시(heteroaryloxy), 헤테로아릴카보닐(heteroarylcarbonyl), 아미노(amino), 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노{mono- 및 di(C1-6-alkyl)amino}, 카바모일(carbamoyl), 모노- 및 디(C1-6-알킬)-아미노-카보닐{mono- 및 di(C1-6-alkyl)-amino-carbonyl}, 아미노-C1-6-알킬-아미노카보닐{amino-C1-6-alkyl-aminocarbonyl}, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노-C1-6-알킬-아미노카보닐{mono- 및 di(C1-6-alkyl)amino-C1-6-alkyl-aminocarbonyl}, C1-6-알킬-카보닐아미노(C1-6-alkyl-carbonylamino), 카바미노(carbamido), C1-6-알카노일옥시(C1-6-alkanoyloxy), 설포노(sulphono), C1-6-알킬설포닐옥시(C1-6-alkylsulphonyloxy), 니트로(nitro), 아지도(azido), 설파닐(sulphanyl), C1-6-알킬티오(C1-6-alkylthio), 할로겐(halogen), DNA 삽입물질(intercalators), 광화학적 활성기, 열화학적 활성기, 킬레이팅기(chelating group), 리포터기(reporter group), 및 리간드(ligands)로부터 독립적으로 선택되는 -O-, -S-, 및 -N(Ra)-, 및 Ra 및 Rb로부터 선택되고, 상기 아릴(aryl) 및 헤테로아릴(heteroaryl)은 선택적으로 치환되고 두 이중의 치환기 Ra 및 Rb 는 모두 선택적으로 치환된 메틸렌(=CH2), 및 수소(hydrogen), 선택적으로 치환된 C1-12-알킬(alkyl), 선택적으로 치환된 C2-12-알케닐(alkenyl), 선택적으로 치환된 C2-12 알키닐(alkynyl), 하이드록시(hydroxy), C1-12-알콕시(alkoxy), C2-12-알콕시알킬(alkoxyalkyl), C2-12-알케닐록시(alkenyloxy), 카복시(carboxy), C1-12-(알콕시카보닐(alkoxycarbonyl), C1-12-알킬카보닐(alkylcarbonyl), 포르밀(formyl), 아릴(aryl), 아릴옥시-카보닐(aryloxy-carbonyl), 아릴옥시(aryloxy), 아릴카보닐(arylcarbonyl), 헤테로아릴(heteroaryl), 헤테로아릴옥시-카보닐(heteroaryloxy-carbonyl), 헤테로아릴옥시(heteroaryloxy), 헤테로아릴카보닐(heteroarylcarbonyl), 아미노(amino), 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노{mono- 및 di(C1-6-alkyl)amino}, 카바모일(carbamoyl), 모노- 및 디(C1-6-알킬)-아미노-카보닐{mono- 및 di(C1-6-alkyl)-amino-carbonyl}, 아미노-C1-6-알킬-아미노카보닐{amino-C1-6-alkyl-aminocarbonyl}, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노-C1-6-알킬-아미노카보닐{mono- 및 di(C1-6-alkyl)amino-C1-6-alkyl-aminocarbonyl}, C1-6-알킬-카보닐아미노(C1-6-alkyl-carbonylamino), 카바미노(carbamido), C1-6-알카노일옥시(C1-6-alkanoyloxy), 설포노(sulphono), C1-6-알킬설포닐옥시(C1-6-alkylsulphonyloxy), 니트로(nitro), 아지도(azido), 설파닐(sulphanyl), C1-6-알킬티오(C1-6-alkylthio), 할로겐(halogen), DNA 삽입물질(intercalators), 광화학적 활성기, 열화학적 활성기, 킬레이팅기(chelating group), 리포터기(reporter group), 및 리간드(ligands)로부터 독립적으로 선택되는, 각각의 치환기 R1*, R2, R3, R5, R5*, R6 및 R6*을 나타낼 수 있고, 상기 아릴(aryl) 및 헤테로아릴(heteroaryl)은 선택적으로 치환될 수 있고, 두 이중의 치환기 모두는 옥소(oxo), 치옥소(thioxo), 이미노(imino), 또는 선택적으로 치환된 메틸렌을 나타내고, 또는 모두는 하나 또는 그 이상의 헤테로원자/-O-, -S-, 및 -(NRN)-로부터 선택되는 군에 의해 선택적으로 중단 및/또는 종결된 1 ~ 5 탄소 원자 알킬렌 체인으로 구성되는 스피노 이중 라디칼로 형성될 수 있고, 두 연속된(비-이중의) 치환기는 이중 결합에 따르는 추가적인 결합을 나타낼 수 있고; 이중 라디칼에 존재하고 연관되지 않는 경우, RN*은 수소 및 C1-4 알킬(alkyl); 및 이의 염기성염(basic salts) 및 산부가염(acid addition salts)으로부터 선택된다;
일부 실시태양에 있어서 R5*는 H, -CH3, -CH2-CH3, -CH2-O-CH3, 및 -CH=CH2로부터 선택된다.
일부 실시태양에 있어서 R4* 및 R2*는 모두 -C(RaRb)-O-, -C(RaRb)-C(RcRd)-O-, -C(RaRb)-C(RcRd)-C(ReRf)-O-, -C(RaRb)-O-C(RcRd)-, -C(RaRb)-O-C(RcRd)-O-, -C(RaRb)-C(RcRd)-, -C(RaRb)-C(RcRd)-C(ReRf)-, -C(Ra)=C(Rb)-C(RcRd)-, -C(RaRb)-N(Rc)-, -C(RaRb)-C(RcRd)-N(Re)-, -C(RaRb)-N(Rc)-O-, 및 -C(RaRb)-S-, -C(RaRb)-C(RcRd)-S-로부터 선택되는 이중 라티칼을 나타낸다. 상기 각각의 Ra, Rb, Rc, Rd, Re, 및 Rf는 수소(hydrogen), 선택적으로 치환된 C1-12-알킬(alkyl), 선택적으로 치환된 C2-12-알케닐(alkenyl), 선택적으로 치환된 C2-12 알키닐(alkynyl), 하이드록시(hydroxy), C1-12-알콕시(alkoxy), C2-12-알콕시알킬(alkoxyalkyl), C2-12-알케닐록시(alkenyloxy), 카복시(carboxy), C1-12-(알콕시카보닐(alkoxycarbonyl), C1-12-알킬카보닐(alkylcarbonyl), 포르밀(formyl), 아릴(aryl), 아릴옥시-카보닐(aryloxy-carbonyl), 아릴옥시(aryloxy), 아릴카보닐(arylcarbonyl), 헤테로아릴(heteroaryl), 헤테로아릴옥시-카보닐(heteroaryloxy-carbonyl), 헤테로아릴옥시(heteroaryloxy), 헤테로아릴카보닐(heteroarylcarbonyl), 아미노(amino), 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노{mono- 및 di(C1-6-alkyl)amino}, 카바모일(carbamoyl), 모노- 및 디(C1-6-알킬)-아미노-카보닐{mono- 및 di(C1-6-alkyl)-amino-carbonyl}, 아미노-C1-6-알킬-아미노카보닐{amino-C1-6-alkyl-aminocarbonyl}, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노-C1-6-알킬-아미노카보닐{mono- 및 di(C1-6-alkyl)amino-C1-6-alkyl-aminocarbonyl}, C1-6-알킬-카보닐아미노(C1-6-alkyl-carbonylamino), 카바미노(carbamido), C1-6-알카노일록시(C1-6-alkanoyloxy), 설포노(sulphono), C1-6-알킬설포닐옥시(C1-6-alkylsulphonyloxy), 니트로(nitro), 아지도(azido), 설파닐(sulphanyl), C1-6-알킬티오(C1-6-alkylthio), 할로겐(halogen), DNA 삽입물질(intercalators), 광화학적 활성기, 열화학적 활성기, 킬레이팅기(chelating group), 리포터기(reporter group), 및 리간드(ligands)로부터 독립적으로 선택되고, 상기 아릴(aryl) 및 헤테로아릴(heteroaryl)은 선택적으로 치환되고, 두 이중의 치환기 Ra 및 Rb는 모두는 선택적으로 치환된 메틸렌(=CH2)을 나타낼 수 있다.
또 다른 실시태양에 있어서 R4* 및 R2*는 모두 -CH2-O-, -CH2-S-, -CH2-NH-, -CH2-N(CH3)-, -CH2-CH2-O-, -CH2-CH(CH3)-, -CH2-CH2-S-, -CH2-CH2-NH-, -CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-O-, -CH2-CH2-CH(CH3)-, -CH=CH-CH2-, -CH2-O-CH2-O-, -CH2-NH-O-, -CH2-N(CH3)-O-, -CH2-O-CH2-, -CH(CH3)-O-, -CH(CH2-O-CH3)-O-로부터 선택되는 이중 라디칼을 나타낸다.
모든 키랄 중심(chiral centers)을 위해, 비대칭기(asymmetric groups)는 R 또는 S 배향 중 어느 하나에 있을 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 올리고머에 사용되는 LNA는 임의의 하기 화학식에 따르는 적어도 하나의 LNA 유닛을 포함한다
상기 Y는 -O-, -O-CH2- ,-S-, -NH-, 또는 N(RH)이고; Z 및 Z*은 인터뉴클레오티드 결합, 말단기 또는 보호기 사이에서 독립적으로 선택되고; B는 자연적 또는 비자연적 뉴클레오티드 염기 부분으로 구성되고, RH는 수소 및 C1-4-알킬(C1-4-alkyl)로부터 선택된다.
특히 바람직한 LNA 유닛을 하기 도식 2에 나타낸다:
Figure pct00006
도식 2
상기 용어 "티오(thio)-LNA는 상기 일반 화학식에서 Y가 S 또는 -CH2-S-로부터 선택되는 잠금 뉴클레오티드를 포함한다. 티오-LNA는 베타-D 및 알파-L-배열 중에 있을 수 있다.
상기 용어 "아미노(amino)-LNA"는 상기 일반 화학식에서 Y가 -N(H)-, N(R)-, CH2-N(H)-, 및 -CH2-N(R)-로부터 선택되는 잠금 뉴클레오티드를 포함하고, 상기 R은 수소(hydrogen) 및 C1-4-알킬(alkyl)로부터 선택된다. 아미노-LNA는 베타-D 및 알파-L-배열 중에 있을 수 있다.
상기 용어 "옥시(oxy)-LNA는 상기 일반 화학식에서 Y가 -O- 또는 -CH2-O-를 나타내는 잠금 뉴클레오티드를 포함한다. 옥시-LNA는 베타-D 및 알파-L-배열 중에 있을 수 있다.
상기 용어 "ENA"는 상기 일반 화학식에서 Y가 -CH2-O-(-CH2-O-의 산소 원자는 염기 B에 관하여 2'-위치에 결합)인 잠금 뉴클레오티드를 나타낸다.
바람직한 실시태양에 있어서 LNA는 베타-D-옥시-LNA(beta-D-oxy-LNA), 알파-L-옥시-LNA(alpha-L-oxy-LNA), 베타-D-아미노-LNA(beta-D-amino-LNA) 및 베타-D-티오-LNA(beta-D-thio-LNA)로부터 선택되고, 바람직하게는 베타-D-옥시-LNA(beta-D-oxy-LNA)이다.
리보핵산분해효소 선별(RNAse recruitment)
올리고머성 화합물은 번역, 또는 다른 방법의 입체적 배치의 방해와 같은, 표적 mRNA의 비 리보핵산분해효소 매개 분해에 의해 작용할 수 있다고 여겨지지만, 본 발명의 바람직한 올리고머는 리보핵산분해효소 H(RNaseH)와 같은, 엔도리보핵산분해효소(RNase)의 선별을 할 수 있다.
상기 올리고머, 또는 연속된 뉴클레오염기 서열은 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 연속적인 뉴클레오티드 또는 뉴클레오염기를 포함하는, 적어도 8 또는 적어도 9개의 연속된 뉴클레오염기 유닛(잔기)과 같은, 적어도 7개의 연속된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오염기 유닛과 같은, 적어도 6개의 부분를 포함하는 것이 바람직하고, 상보적인 표적 RNA로 듀플렉스(duplex)를 형성할 경우, RNase를 선별할 수 있다. RNase를 선별할 수 있는 연속된 서열은 본 발명에 기재된 갭머(gapmer)에 나타낸 부분 B일 수 있다. 일부 실시태양에 있어서 부분 B와 같은, RNase를 선별할 수 있는 연속된 서열의 크기는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 뉴클레오티드 유닛과 같이, 더 높을 수 있다.
EP 1 222 309는 시험관 내(in vitro)에서 RNaseH의 활성을 측정하는 방법을 제공하고, RNaseH를 선별하는 능력을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 만약, 상보적인 RNA 표적이 제공될 경우, 상기 올리고머는 RNaseH를 선별할 수 있다고 여겨지고, 2' 치환기가 없고, 올리고뉴클레오티드에 있는 모든 뉴클레오티드 사이에 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 결합기(linkage groups)가 있는, 오직 뉴클레오티드 동일한 DNA의 적어도 10% 또는 20% 이하와 같은, 적어도 5%와 같은, 적어도 1%와 같은, EP 1 222 309의 실시태양 91 ~ 95에 의해 제공되는 방법을 사용하여, pmol/ℓ/min으로서 측정되는 초기 속도를 갖는다.
일부 실시태양에 있어서, 만약 상보적인 RNA 표적 및 RNaseH가 제공될 경우, 상기 올리고머는 RNaseH를 선별할 수 있다고 여겨지고, EP 1 222 309의 실시태양91 ~ 95에 의해 제공되는 방법을 사용하여, pmol/ℓ/min으로서 측정되는 RNaseH 초기 속도는 올리고뉴클레오티드에 있는 모든 뉴클레오티드 사이에 2' 치환기가 없고, 포르포로티오에이트(phosphorothioate) 결합기가 있는 오직 뉴클레오티드 동일한 DNA의 적어도 10% 이하 또는 20% 이하와 같은, 적어도 5% 이하와 같은, 적어도 1% 이하이다.
다른 실시태양에 있어서, 만약, 상보적인 RNA 표적 및 RNaseH가 제공될 경우, 상기 올리고머는 RNaseH를 선별할 수 있다고 여겨지고, EP 1 222 309의 실시태양 91 ~ 95에 의해 제공되는 방법을 사용하여, pmol/ℓ/min으로서 측정되는 RNaseH 초기 속도는 올리고뉴클레오티드에 있는 모든 뉴클레오티드 사이에 2' 치환기가 없고, 포르포로티오에이트(phosphorothioate) 결합기가 있는 오직 올리고뉴클레오티드 동일한 DNA를 사용하여 측정된 초기 속도의 적어도 80%와 같은, 적어도 60%와 같은, 적어도 40%와 같은, 적어도 20%이다.
상보적인 표적 RNA로 듀플렉스를 형성할 때, 연속된 뉴클레오티드 유닛을 형성하는 상기 올리고머의 부위는 전형적으로, RNA 표적에 의한 듀플렉스와 같은 DNA/RNA를 형성하는 뉴클레오티드 유닛으로 구성되는 RNase 선별을 할 수 있고 - 알파-L-배열에 있는 DNA 유닛 및 LNA 유닛을 포함하고, 알파-L-옥시-LNA인 것이 특히 바람직하다.
본 발명의 올리고머는 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체 모두를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고, 갭머(gapmer), 헤드머(headmer) 또는 믹스머(mixmer) 형태일 수 있다.
헤드머(headmer)는 3'-말단에 대한 RNAse에 의해 인식 및 절단되는 DNA 또는 변형된 뉴클레오티드 유닛의 연속된 신장(적어도 7개의 이러한 뉴클레오티드와 같은)이 따르는 5'-말단에서 비-RNase 선별 뉴클레오티드 유사체의 연속된 신장에 의해 정의되고, 테일머(tailmer)는 3'-말단에 대한 비-RNAse 선별 뉴클레오티드 유사체의 연속된 신장이 따르는 5'-말단에서 RNase에 의해 인식 및 전달되는 DNA의 연속된 신장 또는 변형된 뉴클레오티드(적어도 7개의 이러한 뉴클레오티드와 같은)에 의해 정의된다. 본 발명에 따른 다른 융합들(chemeras)은 RNase 및 비-RNase 선별 뉴클레오티드 유사체에 의해 인식 및 절단되는 DNA 또는 변형된 뉴클레오티드의 대체 조성물로 구성되는 믹스머(mixmer)라고 불린다. 또한, 일부 뉴클레오티드 유사체는 RNaseH 결합 및 절단을 매개할 수 있다. 알파-L-LNA가 어떤 확장에 대한 RNaseH 활성을 선별하기 때문에, 갭머(gapmer) 컨스트럭트(construct)에 대해 RNaseH에 의해 인식 및 절단되는 DNA 또는 변형된 뉴클레오티드의 작은 부위가 요구될 수 있고, 믹스머 컨스트럭션(construction)에 더욱 높은 유연성이 도입될 수 있다.
갭머 고안(gapmer design)
바람직하게는, 본 발명의 상기 올리고머는 갭머(gapmer)이다. 갭머 올리고머는 본 발명에 기재된 부분 B와 같은, 적어도 6 또는 7 DNA 뉴클레오티드 부위와 같은, RNaseH와 같은, RNase를 선별할 수 있는 뉴클레오티드의 연속된 신장을 포함하는 올리고머이고, 상기 부분 B는 RNAse를 선별할 수 있는 뉴클레오티드의 연속된 신장에서 1 ~ 6 사이의 뉴클레오티드 유사체 5 및 3'과 같은, 친화도 향상 뉴클레오티드 유사체 부분의 5' 및 3' 측면에 위치하고 - 이러한 부분들을 각각 부분 A 및 부분 C로 나타내었다.
바람직하게는 상기 갭머는 화학식(5' 에서 3'), A-B-C, 또는 선택적으로는 A-B-C-D 또는 D-A-B-C의 (폴리)뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 부분 A(5' 부분)는 LNA 유닛과 같은, 1 내지 6 사이의 뉴클레오티드 유사체와 같은, 적어도 하나의 LNA 유닛과 같은, 적어도 하나의 뉴클레오티드 유사체를 구성 또는 포함하고; 부분 B는 DNA 뉴클레오티드와 같은, RNAse(mRNA 표적과 같은, 상보적인 RNA 분자로 이루어진 듀플렉스에서 형성될 때)를 선별할 수 있는 적어도 5개의 연속된 뉴클레오티드를 구성 또는 포함하고; 부분 C(3' 부분)는 LNA 유닛과 같은, 1 내지 6 사이의 뉴클레오티드 유사체와 같은, 적어도 하나의 LNA 유닛과 같은, 적어도 하나의 뉴클레오티드 유사체를 구성 또는 포함하고; 존재할 경우, 부분 D는 DNA 뉴클레오티드와 같은, 1, 2 또는 3 뉴클레오티드 유닛을 구성 또는 포함한다.
일부 실시태양에 있어서, 부분 A는 3 또는 4 LNA 유닛과 같은, 3 또는 4 뉴클레오티드 유사체와 같은, LNA 유닛과 같은, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 뉴클레오티드 유사체로 구성; 및/또는 부분 C는 3 또는 4 LNA 유닛과 같은, 3 또는 4 뉴클레오티드 유사체와 같은, 2 ~ 5 LNA 유닛과 같은, 2 ~ 5 사이의 뉴클레오티드 유사체와 같은, LNA 유닛과 같은, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 뉴클레오티드 유사체로 구성된다.
일부 실시태양에 있어서 B는 RNAse를 선별할 수 있는 8개의 연속된 뉴클레오티드와 같은, RNAse를 선별할 수 있는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 연속된 뉴클레오티드, 또는 6 내지 10 사이, 또는 7 내지 9 사이를 구성 또는 포함한다. 일부 실시태양에 있어서 부분 B는 1 ~ 12 DNA 유닛과 같은, 적어도 하나의 DNA 뉴클레오티드 유닛을 구성 또는 포함하고, 바람직하게는 4 ~ 12 DNA 유닛이고, 더욱 바람직하게는 7 내지 10 사이의 DNA 유닛과 같은, 6 내지 10 사이의 DNA 유닛이고, 가장 바람직하게는 8, 9 또는 10 DNA 유닛이다.
일부 실시태양에 있어서 부분 A는 LNA와 같은, 3 또는 4 뉴클레오티드 유사체로 구성되고, 부분 B는 7, 8, 9 또는 10 DNA 유닛으로 구성되며, 부분 C는 LNA와 같은, 3 또는 4 뉴클레오티드 유사체로 구성된다. 이러한 고안은 (A-B-C) 3-10-3, 3-10-4, 4-10-3, 3-9-3, 3-9-4, 4-9-3, 3-8-3, 3-8-4, 4-8-3, 3-7-3, 3-7-4, 4-7-3을 포함하고, DNA 유닛과 같은, 하나 또는 2개의 뉴클레오티드 유닛을 가질 수 있는 부분 D를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 갭머 고안은 WO2004/046160에 기재되어 있고, 참조로서 본 발명에 통합된다.
본 발명에 참조로서 통합되는 US 가출원, 60/977409는 '쇼트머(shortmer)' 갭머 올리고머라 하며, 이는 일부 실시태양에 있어서 본 발명에 따른 갭머 올리고머일 수 있다.
일부 실시태양에 있어서 상기 올리고머는 총 10, 11, 12, 13 또는 14 뉴클레오티드 유닛의 연속된 뉴클레오티드 서열로 구성되고, 상기 연속된 뉴클레오티드 서열은 화학식(5' - 3'), A-B-C, 또는 선택적으로는 A-B-C-D 또는 D-A-B-C이고, 상기 부분 A(5' 부분)는 LNA 유닛과 같은, 1, 2 또는 3 뉴클레오티드 유사체로 구성되고; 부분 B는 상보적인 RNA 분자(mRNA 표적과 같은)로 이루어진 듀플렉스에서 형성될 때 RNAse를 선별할 수 있는 7, 8 또는 9개의 연속된 뉴클레오티드로 구성되고; 부분 C는 LNA 유닛과 같은, 1, 2 또는 3 뉴클레오티드 유사체로 구성된다. 존재할 경우, D 부분은 단일 DNA 유닛으로 구성된다.
일부 실시태양에 있어서 A는 1개의 LNA 유닛으로 구성된다. 일부 실시태양에 있어서 A는 2개의 LNA 유닛으로 구성된다. 일부 실시태양에 있어서 A는 3개의 LNA 유닛으로 구성된다. 일부 실시태양에 있어서 C는 1개의 LNA 유닛으로 구성된다. 일부 실시태양에 있어서 C는 2개의 LNA 유닛으로 구성된다. 일부 실시태양에 있어서 C는 3개의 LNA 유닛으로 구성된다. 일부 실시태양에 있어서 B는 7개의 뉴클레오티드 유닛으로 구성된다. 일부 실시태양에 있어서 B는 8개의 뉴클레오티드 유닛으로 구성된다. 일부 실시태양에 있어서 B는 9개의 뉴클레오티드 유닛으로 구성된다. 일부 실시태양에 있어서 B는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 DNA 유닛과 같은, 1 ~ 9 사이의 DNA 유닛으로 구성된다. 일부 실시태양에 있어서 B는 DNA 유닛으로 구성된다. 일부 실시태양에 있어서 B는 알파-L-배열에서 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개의 LNA 유닛과 같은, 알파-L-배열에 존재하는 적어도 하나의 LNA 유닛을 포함한다. 일부 실시태양에 있어서 B는 적어도 하나의 알파-L-옥시(oxy) LNA 유닛을 포함하거나 또는 상기 알파-L-배열에 존재하는 모든 LNA 유닛은 알파-L-옥시 LNA 유닛이다. 일부 실시태양에 있어서 A-B-C에 존재하는 뉴클레오티드의 개수는 (뉴클레오티드 유사체 유닛-부분 B-뉴클레오티드 유사체 유닛): 1-8-1. 1-8-2, 2-8-1, 2-8-2, 3-8-3, 2-8-3, 3-8-2, 4-8-1, 4-8-2, 1-8-4, 2-8-4, 또는; 1-9-1, 1-9-2, 2-9-1, 2-9-2, 2-9-3, 3-9-2, 1-9-3, 3-9-1, 4-9-1, 1-9-4, 또는; 1-10-1, 1-10-2, 2-10-1, 2-10-2, 1-10-3, 3-10-1로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시태양에 있어서 A-B-C의 뉴클레오티드의 개수는 2-7-1, 1-7-2, 2-7-2, 3-7-3, 2-7-3, 3-7-2, 3-7-4, 및 4-7-3으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시태양에 있어서 A 및 C는 모두 각각 두 LNA 유닛으로 구성되고, B는 8 또는 9 뉴클레오티드 유닛, 바람직하게는 DNA 유닛으로 구성된다.
인터뉴클레오티드 결합(internucleotide linkage)
상기 용어 "결합기(linkage group)" 또는 "인터뉴클레오티드 결합(internucleotide linkage)"은 두 뉴클레오티드, 두 뉴크레오티드 유사체, 및 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체 등을 서로 공유적으로 결합할 수 있는 그룹(group)을 나타낸다. 특히 바람직한 실시태양는 인산기(phosphate group) 및 포스포로티오에이트기(phosphorothioate group)를 포함한다.
본 발명의 상기 올리고머의 뉴클레오티드 또는 이의 연속된 뉴클레오티드 서열은 결합기를 통해 서로 연결되어 있다. 적절하게는 각 뉴클레오티드는 결합기를 통해 3' 인접 뉴클레오티드에 연결되어 있다.
적절한 인터뉴클레오티드 결합은 PCT/DK2006/000512에 기재된 것을 포함하고, 예를 들면, 상기 인터뉴클레오티드 결합는 PCT/DK2006/000512(본 문서에 참조로서 삽입)의 34쪽의 첫 번째 문단에 목록으로 기재되어 있다.
일부 실시태양에 있어서, 정상 포스포디에스터(phosphodiester)에서 RNaseH에 의해 절단되고, 또한 표적 유전자의 발현을 억제하는 안티센스 저해를 하는 포스포고티오에이트(phosphorothioate) 또는 보라노포스페이트(boranophosphate)와 같은, 뉴클레아제(nuclease) 공격에 더욱 저항성 있는 것으로 인터뉴클레오티드 결합을 변형하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 제공하는 것으로서 적절한 황(S)을 함유된 인터뉴클레오티드 결합인 것이 바람직하다. 특히 갭머의 부분 B 갭에 대하여 포스포로티오에이트 인터뉴클레오티드 결합인 것 또한 바람직하다. 포스포로티오에이트 결합은 측면 부분(적절하게는, A 및 C, 및 A 또는 C에서 D 연결을 위해, 부분 D 내)에 사용될 수 있다.
특히, 예를 들어 LNA 뉴클레오티드를 포함하는 A 및 C 부분과 같은 - 엔도-뉴클레아제 분해로부터 A 및 C 부분의 인터뉴클레오티드 결합을 보호하는 뉴클레오티드 유사체를 사용할 경우, 부분 A, B 및 C는 포스포디에스터 결합과 같은, 포스포로티오에이트 외의 인터뉴클레오티드 결합을 포함할 수 있다.
상기 올리고머에서 인터뉴클레오티드 결합은 표적 RNA의 RNase H 절단을 위한 포스포디에스터, 포스포로티오에이트 또는 보라노포스페이트일 수 있다. 뉴클레아제 저항성 향상 및 제조의 편이와 같은 다른 이유를 위해, 포스포로티오에이트가 바람직하다.
본 발명의 상기 올리고머의 하나의 실시태양에 있어서, 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체는 포스포로티오에이트기에 의해 서로 결합되어 있다.
특히 뉴클레오티드 유사체 유닛 사이 또는 연속된, 하나 또는 2개의 결합과 같은, 다른 포스포로티오에이트 올리고머 내로의 포스포디에스터 결합의 포함은 올리고머의 생물학적 이용가능성 및/또는 생물학적-분배를 변형할 수 있다- 본 문서에 참조로서 통합되는 WO2008/053314 참조.
일부 실시태양에 있어서, 적절하고 특별하지 않게 나타낸, 상기의 실시태양과 같은, 모든 존재하는 결합기는 포스포디에스터 또는 포스포로티오에이트, 또는 이의 혼합이다.
일부 실시태양에 있어서 모든 인터뉴클레오티드 결합기는 포스포로티오에이트이다.
본 발명에서 제공되는 것과 같은, 특별한 갭머 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낼 경우, 다양한 실시태양에 있어서, 결합이 본 발명에 기재된 것과 같은, 포스포로티오에이트 결합, 대안적인 결합일 경우, 예를 들면, 포스페이트(포스포디에스터) 결합이 쓰일 수 있고, 특별하게는 LNA 유닛과 같은, 뉴클레오티드 유사체 사이의 결합일 수 있다. 또한, 본 발명에서 제공되는 것과 같은, 특별한 갭머 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낼 경우, C 잔기가 5'메틸 변형된 시토신으로서 알려진 경우, 다양한 실시태양에 있어서, 올리고머에 존재하는 하나 또는 그 이상의 Cs는 변형되지 않은 C 잔기일 수 있다.
올리고머성 화합물(Oligomeric Compounds)
본 발명의 올리고머는 예를 들어, 22 ~ 42 및 44 내지 80으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
결합체(Conjugates)
본 공개의 문맥에서 사용되는 용어 "결합체"는 하나 또는 그 이상의 비-뉴클레오티드, 또는 비-폴리뉴클레오티드 부분으로 설명되는 올리고머의 공유 결합{"결합(conjugation)"}에 의해 형성되는 이형 분자를 나타낸다. 비-뉴클레오티드 또는 비-폴리뉴클레오티드 부분의 예는 단백질, 지방산 사슬, 당 잔기, 당단백질, 폴리머, 또는 이의 조합을 포함한다. 전형적인 단백질은 표적 단백질에 대한 항체일 수 있다. 전형적인 폴리머는 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol)일 수 있다.
그러므로, 다양한 실시태양에 있어서, 본 발명의 상기 올리고머는 전형적으로 뉴클레오티드의 연속된 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 부분 및 다른 비-뉴클레오티드 부분을 모두 포함할 수 있다. 연속된 뉴클레오티드 서열로 구성된 본 발명의 상기 올리고머를 나타낼 경우, 화합물은 결합 성분과 같은, 비-뉴클레오티드 성분을 포함할 수 있다.
본 발명의 다양한 실시태양에 있어서 올리고머성 화합물은 리간드/결합체에 결합될 수 있다. 이는 예를 들면, 올리고머성 화합물의 세포의 흡수 증가를 위해 사용될 수 있다. WO2007/031091은 적절한 리간드 및 결합체를 제공하고, 이는 참조로서 본 문서에 삽입된다.
본 발명은 본 발명에 기재된 본 발명에 따른 화합물을 포함하는 결합체, 및 상기 화합물에 공유적으로 결합된 적어도 하나의 비-뉴클레오티드 또는 비-폴리뉴클레오티드 부분을 제공한다. 그러므로, 다양한 실시태양에 있어서 본 발명의 화합물은 상기 핵산 또는 뉴클레오티드 서열로 구성되고, 본 발명에 기재된 것과 같이, 상기 화합물은 상기 화합물에 공유적으로 결합된 적어도 하나의 비-뉴클레오티드 또는 비-폴리뉴클레오티드 부분도 포함한다(예를 들면, 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체를 포함하지 않음).
결합(결합체 부분)은 본 발명의 올리고머의 활성, 세포의 분배 또는 세포의 흡수를 증가시킬 수 있다. 이러한 부분은 항체, 폴리펩티드, 콜레스테롤 부분, 담즙산, 티오에스터(thioester)와 같은 지질 부분, 예를 들면, 헥실-s-트리틸치올(Hexyl-s-tritylthiol), 티오콜레스테롤(thiocholesterol), 지방족 사슬(aliphatic chain), 예를 들면, 도데칸디올(dodecandiol) 또는 언데실 잔기(undecyl 잔기s), 인지질(phospholipids), 예를 들면, 디-헥사데실-랙-글리세롤(di-hexadecyl-rac-glycerol) 또는 트리에틸암모늄 1, 2-디-o-헥사데실-랙-글리세로-3-h-포스포네이트(triethylammonium 1,2-di-o-hexadecyl-rac-glycero-3-h-phosphonate), 폴리아민(polyamine) 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬(polyethylene glycol chain), 아다만탄 아세트산(adamantane acetic acid), 팔미틸 부분(palmityl moiety), 옥타데실아민(octadecylamine) 또는 헥실아미노-카보닐-옥시콜레스테롤 부분(hexylamino-carbonyl-oxycholesterol moiety)을 포함하나 이에 한정하지 아니다.
본 발명의 올리고머는 예를 들어, 아스피린, 이부프로펜, 설파제, 항당뇨제, 항박테리아 또는 항생제와 같은, 활성 약제 물질에 결합될 수 있다.
어떠한 실시태양에 있어서 결합된 부분은 콜레스테롤과 같은, 스테롤이다.
다양한 실시태양에 있어서, 상기 결합된 부분은 예를 들면, 길이에 있어서 3 ~ 10 아미노산 잔기와 같은, 2 ~ 20과 같은, 1 ~ 50 사이의 양전하 펩티드와 같은, 양전하 폴리머, 및/또는 폴리에틸글리콜(polyethylglycol, PEG) 또는 폴리프로필렌글리콜(polypropylene glycol)과 같은 폴리알킬렌옥사이드(polyalkylene oxide)를 포함 또는 구성하고 - WO 2008/034123 참고, 참조로서 본 문서에 삽입된다. 적절하게는 폴리알킬렌옥사이드와 같은, 양전하 폴리머는 WO 2008/034123에 기재된 방출가능한 링커(linker)와 같은 링커를 통해 본 발명의 올리고머에 결합될 수 있다.
실시태양의 방법에 따라, 하기 결합체 부분이 본 발명의 결합체로 사용될 수 있다:
Figure pct00007
활성화된 올리고머(Activated oligomers)
본 발명에서 사용되는 용어 "활성화된 올리고머(Activated oligomer)"는 올리고머를 하나 또는 그 이상의 결합된 부분에 공유 결합할 수 있게 하는, 즉, 자체는 핵산 또는 모노머가 아니며, 본 발명에 기재된 결합체를 형성하는 적어도 하나의 작용부(functional moiety)에 공유적으로 결합되는 본 발명의 올리고머를 나타낸다. 전형적으로는, 작용부는 예를 들면, 아데닌(adenine) 염기의 3'-하이드록실(hydroxyl)기 또는 엑소사이클릭(exocyclic) NH2기, 바람직하게는 친수성인 스페이서(spacer) 및 결합된 부분에 결합할 수 있는 말단기{예를 들면, 아미노(amino), 설피드릴(sulphydryl) 또는 하이드록실(hydroxyl)기}를 통해 올리고머에 공유적으로 결합할 수 있는 화학기(chemical group)로 구성될 것이다. 일부 실시태양에 있어서, 이러한 말단기는 보호되지 않고, 예를 들면, NH2기이다. 다른 실시태양에 있어서, 상기 말단기는 예를 들면, Theodora W Greene 및 Peter G M Wuts에 의한 "Protective Groups in Organic Synthesis" 3판(John Wiley & Sons, 1999)에 기재된 것과 같은 임의의 적절한 보호기에 의해 보호된다. 적절한 하이드록실 보호기의 예는 아세테이트에스터(acetate ester)와 같은 에스터, 벤질(benzyl)과 같은 아랄킬(aralkyl)기, 디페닐메틸(diphenylmethyl), 또는 트리페닐메틸(triphenylmethyl), 및 테트라하이드로피라닐(tetrahydropyranyl)을 포함한다. 적절한 아미노 보호기의 예는 벤질(benzyl), 알파-메틸벤질(alpha-methylbenzyl), 디페닐메틸(diphenylmethyl), 트리페닐메틸(triphenylmethyl), 벤질옥시카보닐(benzyloxycarbonyl), 터트- 부트옥시카모닐(tert-butoxycarbonyl), 및 트리콜로아세틸(trichloroacetyl) 또는 트리플루오로아세틸(trifluoroacetyl)과 같은 아실(acyl)기를 포함한다. 일부 실시태양에 있어서, 작용기는 자가절단(self-cleaving) 된다. 다른 실시태양에 있어서, 작용기는 생물 분해성이다. 예를 들면, 미국 특허 제 7,087,229호를 참고하고, 이는 그 전체에 있어서 본 문서에 참조로서 삽입된다.
일부 실시태양에 있어서, 본 발명의 올리고머는 올리고머의 5' 말단에 결합 부분의 공유 결합을 위해 5' 말단에서 작용화 된다. 다른 실시태양에 있어서, 본 발명의 올리고머는 3' 말단에서 작용화 될 수 있다. 또 다른 실시태양에 있어서, 본 발명의 올리고머는 백본(backbone)을 따라 또는 이종고리 염기 부분에서 작용화 될 수 있다. 다른 실시태양에 있어서, 본 발명의 올리고머는 상기 5' 말단, 상기 3' 말단, 상기 백본 및 염기로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 부분에서 작용화 될 수 있다.
일부 실시태양에 있어서, 본 발명의 활성화된 올리고머는 작용부에 공유적으로 결합하는 하나 또는 그 이상의 모노머가 합성되는 동안 통합됨으로써 합성된다. 다른 실시태양에 있어서, 본 발명의 활성화된 올리고머는 작용화 되지 않는 모노머로 합성되고, 상기 올리고머는 합성의 완결에 따라 작용화 된다. 일부 실시태양에 있어서, 올리고머는 아미노알킬(aminoalkyl) 링커를 포함하는 방해된 에스터로 작용화 되고, 상기 알킬 부분은 화학식 (CH2)w를 갖고, 상기 w는 1 내지 10 범위의 정수, 바람직하게는 약 6이고, 상기 알킬아미노기의 알킬 부분은 직쇄(straight chain) 또는 분지쇄(branched chain)일 수 있고, 상기 작용기는 에스터기(-O-C(O)-(CH2)wNH)를 통해 올리고머에 결합된다.
다른 실시태양에 있어서, 올리고머는 (CH2)w-설피드릴 (SH) 링커를 포함하는 방해된 에스터로 작용화 되고, 상기 w는 1 내지 10 범위의 정수, 바람직하게는 약 6이고, 상기 알킬아미노기의 알킬 부분은 직쇄(straight chain) 또는 분지쇄(branched chain)일 수 있고, 상기 작용기는 에스터기(-O-C(O)-(CH2)wSH)를 통해 올리고머에 결합된다.
일부 실시태양에 있어서, 설피드릴-활성화된 올리고뉴클레오티드는 폴리에틸렌글리콜 또는 펩티드(디설파이드 결합의 형성을 통해)와 같은 폴리머 부분으로 결합 된다.
상기 방해된 에스터를 포함하는 활성화된 올리고머는 당업계에 공지된 임의의 방법, 및 특히 PCT 출원 WO 2008/034122호 및 이의 실시태양에 기재된 방법에 의해 합성될 수 있고, 이는 그 전체에 있어서 본 발명에 참조로서 삽입된다.
다른 실시태양에 있어서, 본 발명의 상기 올리고머는 미국 특허 제 4,962,029호 및 4,914,210호에 기재된 것과 같이 작용화 시약(reagent)을 이용한 설피드릴, 아미노 또는 하이드록실기의 올리고머로의 도입을 통해 작용화 되고, 즉, 사실상 선형 시약은 보호된 또는 비보호된 설피드릴, 아미노 또는 하이드록실기를 포함하는 반대편 말단에 친수성 스페이서(spacer)를 통해 연결된 하나의 말단에 포스포라미다이트(phosphoramidite)를 갖는다. 이러한 시약은 일차적으로 상기 올리고머의 하이드록실기와 반응한다. 일부 실시태양에 있어서, 이러한 활성화된 올리고머는 상기 올리고머의 5'-하이드록실기에 결합하는 작용화 시약을 가진다. 다른 실시태양에 있어서, 상기 활성화된 올리고머는 3'-하이드록실기에 결합하는 작용화 시약을 가진다. 다른 실시태양에 있어서, 본 발명의 활성화된 올리고머는 올리고머의 백본에 있는 하이드록실기에 결합하는 작용화 시약을 가진다. 또 다른 실시태양에 있어서, 본 발명의 올리고머는 미국 특허 제 4,962,029호 및 4,914,210호에 기재된 것과 같은 하나 이상의 작용화 시약으로 작용화 되고, 이는 그 전체에 있어서 본 발명에 참조로서 삽입된다. 이러한 작용화 시약 및 이의 모노머 또는 올리고머로의 통합의 합성 방법은 미국 특허 제 4,962,029호 및 4,914,210호에 기재되어 있다.
일부 실시태양에 있어서, 고체상 결합 올리고머의 상기 5'-말단은 예를 들면, Diels-Alder Cycloaddition reaction을 통한 아미노산 또는 펩티드를 이용한 비보호된 올리고머의 결합에 의한, 디에닐포스포라미다이트(dienyl phosphoramidite) 유도체로 작용화 된다.
다양한 실시태양에 있어서, 2'-카바메이트(carbamate) 치환된 당 또는 2'-(O-펜틸-N-프탈리미도)-디옥시리보오스{2'-(O-pentyl-N-phthalimido)-deoxyribose}당과 같은, 2'-당 변이체를 포함하는 모노머의 올리고머로의 통합은 올리고머의 당에 결합된 부분의 공유 결합을 촉진한다. 다른 실시태양에 있어서, 하나 또는 그 이상의 올리고머의 2'-부분에 아미노-포함 링커로 된 올리고머는 예를 들면, 5'-디메톡시트리틸-2'-O-(e-프탈리미딜아미노펜틸)-2'-디옥시아데노신-3'-N,N-디이소프로필-시아노에톡시 포스포라미다이트{5'-dimethoxytrityl-2'-O-(e-phthalimidylaminopentyl)-2'-deoxyadenosine-3'--N,N-diisopropyl-cyanoethoxy phosphoramidite}와 같은, 시약을 사용하여 제조한다. 예를 들어, Manoharan, et al., Tetrahedron Letters, 1991, 34, 7171을 참고한다.
또 다른 실시태양에 있어서, 본 발명의 올리고머는 N6 퓨린 아미노기, 구아닌(guanine)의 엑소사이클릭 N2, 또는 시토신(cytosine)의 N4 또는 5 부분에 포함된, 뉴클레오염기에 아민(amine)-포함 작용부를 가질 수 있다. 다양한 실시태양에 있어서, 이러한 작용화는 이미 올리고머 합성에 작용화된 상업적인 시약을 사용하여 수득할 수 있다.
일부 작용부는 상업적으로 이용가능하고, 예를 들면, 헤테로이중작용성 및 모노이중작용성 결합 부분은 Pierce Co.(Rockford, IⅡ)로부터 구입할 수 있다. 다른 상업적으로 이용가능한 결합기는 5'-아미노-개질제(modifier) C6 및 3'-아미노-개질제 시약이고, 이들은 Glen Research Corporation(Sterling, Va.)으로부터 구입할 수 있다. 5'-아미노-개질제 C6은 또한 Aminolink-2로서 ABI(Applied Biosystems Inc., Foster City, Calif.)로부터 구입할 수 있고, 3'-아미노-개질제는 또한 Clontech Laboratories Inc.(Palo Alto, Calif.)로부터 구입할 수 있다.
조성물(Compositions)
본 발명의 올리고머는 약학적 제형 및 조성물에 사용될 수 있다. 적절하게는, 이러한 조성물을 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 염 또는 보조제를 포함한다. PCT/DK2006/000512는 적절하고 바람직한 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 및 보조제를 제공하고, 이는 참조로서 본 발명에 삽입된다. 적절한 용량, 제형, 투여 경로, 조성물, 투여 형태, 다른 치료적 조성물과의 조합, 전구약물(pro-drug) 제형은 또한 PCT/DK2006/000512에서 제공되고, 이는 또한 참조로서 본 발명에 삽입된다.
적용(Application)
본 발명의 상기 올리고머는 예를 들면, 진단, 치료 및 예방을 위한 연구 시약으로서 사용될 수 있다.
연구에 있어서, 이러한 올리고머는 특별히 세포 및 실험 동물에서 안드로겐 수용체 단백질의 합성(전형적으로 mRNA의 분해 또는 저해에 의해 단백질 형성을 방해) 저해에 사용될 수 있고 그로 인해 치료적 중재(therapeutic intervention)를 위한 표적으로서 표적의 기능적 분석 또는 그것의 유용성의 평가를 촉진한다.
진단에 있어서 상기 올리고머는 노던 블랏팅(northern blotting), 인사이츄 하이브리다이제이션(in-situ hybridization) 또는 비슷한 방법에 의해 세포 또는 조직에서 안드로겐 수용체 발현을 탐지 및 정량하는데 사용될 수 있다.
치료를 위해, 질병 또는 장애를 가진 것으로 의심되는 동물 또는 인간은 본 발명에 따른 유효한 양의 올리고머와 같은, 안티센스 화합물(또는 이의 결합체)을 적절히 유효한 양으로 처리하여 안드로겐 수용체의 발현을 조절함으로써 치료될 수 있다. 또한 본 발명의 치료적 또는 예방적으로 유효한 양의 하나 또는 그 이상의 본 발명의 상기 올리고머 또는 조성물의 투여에 의해 안드로겐 수용체의 발현과 관련된, 질환 또는 병을 가지거나 가지기 쉽다고 의심되는 사람을 치료하는 것과 같은, 포유류 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 약학전 조성물은 전립선암 또는 유방암과 같은 암과 같은, 안드로겐 수용체의 비정상적 수준과 관련된 질환의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 탈모증, 전립선 비대증, 척수성 근 위축증 및 케네디 병, 또는 폴리글루타메이트(polyglutamate) 병의 치료에 사용될 수 있다.
상기 언급한 치료는 예방일 수도 있다고 인정된다.
적절한 용량, 제형, 투여 경로, 조성물, 투여 형태, 다른 치료제와의 조합, 전구약물 제형은 또한 PCT/DK2006/000512에서 제공되고 - 이는 참조로서 본 발명에 삽입된다., 비록 PCT/DK2006/000512의 내용에서는 암의 치료에만 특이적으로 적용될 수 있음을 인정했지만, 본 발명의 치료적/약학적 조성물은 이에 한정되지 않는다.
또한 본 발명은 본 발명에 기재된 화합물 또는 결합체 또는 결합체, 및 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 보조제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. PCT/DK2006/000512는 적절하고 바람직한 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 보조제를 제공하고, 이것은 참조로서 본 발명에 삽입된다.
본 발명에 따른 올리고머, 결합체 또는 약학적 조성물은 일반적으로 유효한 양으로 투여되어진다.
또한, 본 발명은 본 발명에 언급한 질환의 치료를 위한 의약제의 제조, 또는 본 발명에 언급한 질환의 치료 방법에 이용되는 본 발명의 화합물 또는 결합체의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에서 나타낸 것과 같은 질환의 치료를 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 발명에 기재된 것과 같이 본 발명에 따른 화합물, 및/또는 본 발명에 따른 결합체, 및/또는 본 발명에 따른 약학적 조성물을 그것을 필요로 하는 환자에 대해 투여하는 것을 포함한다.
한 가지 이상의 유효 성분을 포함하는 약학적 조성물
본 발명에 따른 약학적 조성물은 전립선암 또는 유방암과 같은 암의 치료에 유용하다고 알려진 것, 특히 종래의 항안드로겐(antiandrogen) 요법(therapy)에 사용되는 약제를 포함한 다른 유효한 성분을 추가적으로 포함할 수 있다.
이러한 화합물의 종류의 하나는 수용체 부분에서 안드로겐의 결합을 저해하는 비스테로이드계 항안드로겐(NSAAs)이다.
황체 형성 호르몬 방출 호르몬 유사체(Luteinizing hormone-releasing hormone analogs, LHRH-As)는 안드로겐의 고환 생산을 거세 수준(castrate levels)으로 억제한다.
복합 안드로겐 차단 요법의 일환으로 LHRH-A를 사용할 때 CASODEX와 같은 NSSAs는, 전린선암 세포의 성장 저해를 돕는다. 하나의 실시태양에 있어서, 본 발명은 복합 안드로겐 차단 요법을 제공하고, 상기 요법은 본 발명에 따른 약학적 조성물, 및 본 발명의 약학적 조성물의 투여가 이루어지는 이전, 동안 또는 그 이후에 투여되는 NSAA 및/또는 LHRH-A 약제의 투여를 포함하는 치료법으로 특징지어 진다.
또한, 본 발명은 키트의 구성 요소를 제공하고, 상기 본 발명에 따른 상기 올리고머, 상기 결합체 및/또는 약학적 조성물로 구성되는 하나의 구성 요소 및 비스테로이드계 항안드로겐 및/또는 황체 형성 호르몬 방출 호르몬 유사체로 구성되는 또 다른 구성 요소로 이루어져 있다. 따라서, 상기 키트의 구성 요소는 상기 하나의 구성 요소 및 또 다른 구성 요소 모두를 동시에 또는 단계적으로 투여하는 것을 포함하는, 본 발명에서 언급한, 치료 방법에 사용될 수 있을 것으로 예상된다.
의학적 적응증(Medical Indications)
본 발명에 따른 올리고머 및 다른 조성물은 안드로겐 수용체의 과발현 또는 돌연변이 상태에서의 발현과 연관된 질환의 치료를 위해 사용될 수 있다. 약물적 중재(pharmaceutical intervention) 분야에서 선두 과학자들에 의해 안드로겐이 전립선암 또는 유방암에 대한 치료적 접근이 될 수 있음이 제시되었다.
유방암 또는 전립선암, 탈모증, 전립선 비대증, 척수성 근 위축증, 케네디 병 및 폴리글루타메이트(polyglutamate) 병과 같은 암으로 구성된 군으로부터 선택되는 질병을 포함한 안드로겐 수용체의 비정상적인 수준과 연관될수 있는 추가적인 질환은 본 발명에 따른 조성물, 결합체 및 화합물을 사용하여 치료될 수 있다.
하나의 실시태양에 있어서 유방암 또는 전립선암, 탈모증, 전립선 비대증, 척수성 근 위축증, 케네디 병 및 폴리글루타메이트(polyglutamate) 병과 같은 암으로 구성된 군으로부터 선택되는 질병을 포함한 안드로겐 수용체의 비정상적인 수준과 연관될수 있는 질환은 본 발명에 따른 조성물, 결합체 및 화합물을 사용하여 치료될 수 있다.
본 발명은 추가적으로 본 발명에 기재된 어떠한 및 모든 질환의 치료를 위한 의약제의 제조에 이용되는 본 발명의 화합물의 용도를 제공한다.
일반적으로 말해, 본 발명의 하나의 실시태양은 하나 또는 그 이상의 LNA 유닛으로 구성되는 안드로겐 수용체를 표적으로 하는 약학적으로 유효한 양의 올리고머를 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, 안드로겐 수용체의 비정상적 수준에 관련된 질환에 걸리거나 걸리기 쉬운 포유류에 대한 치료 방법을 나타낸다.
본 발명의 흥미로운 실시태양은 상기에 따른 질환의 치료를 위한 의약제의 준비를 위한 본 발명에서 정의된 올리고머(화합물) 또는 본 발명에서 정의된 결합체의 용도를 나타낸다.
본 발명의 방법은 바람직하게는 안드로겐 수용체의 비정상적 수준에 의해 발생하는 질환에 대한 치료 또는 예방을 위해 사용된다.
또한, 본 발명은 치료적으로 유효한 양의 안드로겐 수용체 변형 올리고머를 이러한 치료를 필요로 하는 인간에게 투여하는 것을 포함하는 질병 예방 및 치료 방법을 포함한다. 또한 본 발명은 안드로겐 수용체 변형 올리고뉴클레오티드 화합물의 단기간의 투여의 용도를 포함한다.
본 발명의 하나의 실시태양에 있어서 예를 들면, 올리고머의 세포 내 흡수를 증가시키기 위해, 올리고머(화합물)는 리간드 또는 결합체와 연결되어있다. 일부 실시태양에 있어서, 상기 결합체는 콜레스테롤(cholesterol)과 같은 스테롤(sterol)이다.
또한, 본 발명의 올리고머는 활성 약제 물질, 예를 들면, 아스피린(aspirin), 이부프로펜(ibuprofen), 설파제(sulfa drug), 항당뇨제(antidiabetic), 항박테리아제(antibacterial) 또는 항생제(antibiotic)에 결합될 수 있다.
양자택일적으로 말해서, 본 발명은 또한 안드로겐 수용체의 비정상적 수준에 대한 치료 방법을 나타내고, 상기 방법은 본 발명의 올리고머, 또는 본 발명의 결합체 또는 본 발명의 약학적 조성물을 그것을 필요로 하는 환자에게 투여 및 추가적으로 다른 화학요법 약제의 투여를 포함한다. 상기 추가적인 투여는 본 발명의 화합물에 결합하고, 약학적 조성물에 존재하며, 개별적인 제형으로 투여되는 추가적인 화학요법 약제의 투여일 수 있다.
또한 본 발명은 의약제로서의 사용을 위한 본 발명에서 정의된 올리고머, 조성물 또는 결합체와 관련된다.
또한 본 발명은 안드로겐 수용체의 비정상적 수준 또는 안드로겐 수용체의 돌연변이 형태의 발현(대립형질의 변이체와 같은, 본 발명에 나타낸 질환 중 하나와 관련된 것과 같은)의 치료를 위한 의약제의 제조를 위한 본 발명에서 정의된 화합물, 조성물, 또는 결합체의 용도와 관련된다.
또한, 본 발명은 유방암 또는 전립선암, 탈모증, 전립선 비대증, 척수성 근 위축증, 케네디 병 및 폴리글루타메이트(polyglutamate) 병과 같은 암으로부터 선택된 질환 또는 질병을 겪고 있는 개체에 대한 치료 방법과 관련되고, 상기 방법은 이를 필요로 하는 개체에 본 발명에서 정의된 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명은 단백질 키나제 C 델타(Protein kinase C delta, PRKCD), 글루타치온 에스-트랜스퍼라제 쎄타 2(Glutathione S- transferase theta 2, GSTT2), 일시적인 수용체 잠재적인 양이온 채널 써브패밀리 V 멤버 3(transient receptor potential cation channel subfamily V member 3, TRPV3), 피롤린-5-카르복실화 환원효소 1(Pyrroline-5-carboxylate reductase 1, PYCR1) 또는 오르니틴아미노전환효소(ornithine aminotransferase, OAT)로 구성된 군으로부터 선택된 유전자, mRNA 및/또는 단백질과 같은 안드로겐 수용체(즉, 안드로겐 수용체 표적들)에 의해 조절되는 유전자, 및 이들 각각의 mRNA 및 단백질 생산물을 조절하는 방법을 나타낸다. 안드로겐 수용체의 표적에 따라, 상기 조절은 안드로겐 수용체 표적의 증가된 발현 또는 활성, 또는 감소된 발현 또는 활성의 결과를 나타낼 수 있다.
실시태양
본 발명의 하기 실시태양은 본 발명에 기재된 다른 실시태양과 조합되어 사용될 수 있다.
1. 10 ~ 50 뉴클레오염기 사이의 길이인 올리고머는 총 10 ~ 50 뉴클레오염기 사이의 연속된 뉴클레오염기 서열을 포함하고, 상기 연속된 뉴클레오염기 서열은 포유류의 안드로겐 수용체를 암호화하는 핵산에 상응하는 부분과 적어도 80% 상동적이다.
2. 실시태양 1의 올리고머에 있어서, 상기 올리고머는 적어도 하나의 LNA 유닛(unit)을 포함한다.
3. 실시태양 1 또는 2의 올리고머에 있어서, 상기 연속된 뉴클레오염기 서열은 포유류의 안드로겐 수용체를 암호화하는 핵산에 상응하는 부분과 단 2개가 미스매치된 것과 같이, 3보다 많지 않은 미스매치를 포함한다.
4. 실시태양 3의 올리고머에 있어서, 상기 연속된 뉴클레오염기 서열은 포유류의 안드로겐 수용체를 암호화하는 핵산에 상응하는 부분과 오직 하나의 미스매치(mismatch)를 포함한다.
5. 실시태양 4의 올리고머에 있어서, 상기 연속된 뉴클레오염기 서열은 포유류의 안드로겐 수용체를 암호화하는 핵산에 상응하는 부분과 미스매치(즉, 상보적인)를 포함하지 않는다.
6. 실시태양 1 ~ 5 중 어느 하나의 올리고머에 있어서, 상기 올리고머의 뉴클레오염기 서열은 상기 연속된 뉴클레오염기 서열로 구성된다.
7. 실시태양 1 ~ 6 중 어느 하나의 올리고머에 있어서, 상기 포유류의 안드로겐 수용체를 암호화하는 핵산은 서열번호 1, 또는 이로부터 자연적으로 발생하는 대립형질 변이체와 같은 인간 안드로겐 수용체 뉴클레오티드 서열이다.
8. 실시태양 1 ~ 7 중 어느 하나의 올리고머에 있어서, 상기 연속된 뉴클레오염기 서열은 인간 안드로겐 수용체 핵산 서열 및 마우스 안드로겐 수용체 핵산 서열과 같은, 비-인간 포유류 안드로겐 수용체 핵산 서열 모두에서 상응하는 부분에 대해 상보적이다.
9. 실시태양 1 내지 8 중 어느 하나의 올리고머에 있어서, 상기 연속된 뉴클레오염기 서열은 적어도 7개의 연속된 서열을 포함하고, 뉴클레오염기 잔기는 상보적인 안드로겐 수용체 표적 RNA로 듀플렉스(duplex)를 형성할 경우, RNaseH를 선별할 수 있다.
10. 실시태양 9의 올리고머에 있어서, 상기 연속된 뉴클레오염기 서열은 적어도 8, 적어도 9 또는 적어도 10 개의 뉴클레오염기 잔기의 연속된 서열을 포함하고, 상보적인 안드로겐 수용체 표적 RNA로 듀플렉스(duplex)를 형성할 경우, RNaseH를 선별할 수 있다.
11. 실시태양 9 또는 10 중 어느 하나의 올리고머에 있어서, 상기 언급된 연속된 서열은 14, 15 또는 16 뉴클레오염기 잔기와 같은, 적어도 12 뉴클레오염기 또는 적어도 14 뉴클레오염기 길이와 같은, 적어도 9 또는 적어도 10 뉴클레오염기 길이이고, 상보적인 안드로겐 수용체 표적 RNA로 듀플렉스(duplex)를 형성할 경우, RNaseH를 선별할 수 있다.
12. 실시태양 1 ~ 11 중 어느 하나의 올리고머에 있어서, 상기 올리고머는 하나 또는 그 이상의 비-뉴클레오염기 화합물과 결합된다.
13. 실시태양 1 ~ 12 중 어느 하나의 올리고머에 있어서, 상기 올리고머는 10 ~ 22 뉴클레오염기 사이의 길이를 가진다.
14. 실시태양 1 ~ 13 중 어느 하나의 올리고머에 있어서, 상기 올리고머는 12 ~ 18 뉴클레오염기 사이의 길이를 가진다.
15. 실시태양 1 ~ 14 중 어느 하나의 올리고머에 있어서, 상기 올리고머는 14, 15 또는 16 뉴클레오염기의 길이를 가진다.
16. 실시태양 1 ~ 15 중 어느 하나의 올리고머에 있어서, 연속된 뉴클레오티드 서열에 상응하는 상기 연속된 뉴클레오염기 서열은 서열번호 86 ~ 106으로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열을 나타낸다.
17. 실시태양 1 ~ 16 중 어느 하나의 올리고머에 있어서, 상기 올리고머 또는 연속된 뉴클레오염기 서열은 서열번호 2 ~ 22로 구성되는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열로 나타내어지는 상응하는 뉴클레오염기 서열로부터 선택되거나, 또는 포함한다.
18. 실시태양 1 ~ 17 중 어느 하나의 올리고머에 있어서, 상기 연속된 뉴클레오염기 서열은 적어도 하나의 친화성이 강화된 뉴클레오티드 유사체를 포함한다.
19. 실시태양 18의 올리고머에 있어서, 상기 연속된 뉴클레오염기 서열은 5 및 8개 사이의 친화성이 강화된 뉴클레오티드 유사체와 같은, 총 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 친화성이 강화된 뉴클레오티드 유사체를 포함한다.
20. 적어도 하나의 친화성이 강화된 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 실시태양 1 ~ 19 중 어느 하나의 올리고머, 상기 남겨진 뉴클레오염기는 DNA 뉴클레오티드 및 RNA 뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 DNA 뉴클레오티드이다.
21. 실시태양 1 ~ 20 중 어느 하나의 올리고머에 있어서, 상기 올리고머는 5'에서 3' 방향에서, A-B-C, 및 선택적으로 A-B-C-D 공식으로, 뉴클레오염기 서열의 공식을 구성한다:
A 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 뉴클레오티드 유사체와 같은, 적어도 하나의 뉴클레오티드 유사체, 바람직하게는 2-5개 뉴클레오티드 유사체 사이, 바람직하게는 2, 3 또는 4개의 뉴클레오티드 유사체, 가장 바람직하게는 2, 3 또는 4개의 연속적인 뉴클레오티드 유사체로 구성 또는 포함 및;
B DNA 뉴클레오염기와 같은, RNAseH를 선별할 수 있는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 연속적인 뉴클레오염기와 같은, 또는 RNAseH를 선별할 수 있는 8개의 연속적인 뉴클레오염기와 같은, 6-10 사이, 또는 7-9 사이 RNAseH(상보적 RNA 모듈로 듀플렉스(duplex)를 형성할 경우, 안드로겐 수용체 mRNA 표적과 같은)를 선별할 수 있는 적어도 5개의 연속적인 뉴클레오염기로 구성 또는 포함, 및;
C 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 개의 뉴클레오티드 유사체와 같은, 적어도 하나의 뉴클레오티드 유사체, 바람직하게 2, 3, 또는 4개의 뉴클레오티드 유사체와 같은, 2-5 뉴클레오티드 유사체, 가장 바람직하게 1, 2, 3 또는 4 개의 뉴클레오티드 유사체를 구성 또는 포함, 및;
D 현재, 구성 또는 포함되었을 때, 1-3 또는 1-2 DNA 뉴클레오티드 사이와 같은, 하나 또는 그 이상의 DNA 뉴클레오티드를 구성하는 것이 바람직하다.
22. 실시태양 21의 올리고머에 있어서, 상기 A 부분은 2, 3 또는 4 개의 연속적인 뉴클레오티드 유사체를 구성 또는 포함한다.
23. 실시태양 21 ~ 22 중 어느 하나의 올리고머에 있어서, 상기 B 부분은 7, 8, 9 또는 10개의 연속적인 DNA 뉴클레오티드 또는 안드로겐 수용체 mRNA 표적과 같은, 상보적 RNA로 듀플렉스를 형성하였을 때 RNAseH를 선별할 수 있는 동등한 뉴클레오염기를 구성 또는 포함한다.
24. 실시태양 21 ~ 23 중 어느 하나의 올리고머에 있어서, 상기 C 부분은 2, 3, 또는 4개의 연속적인 뉴클레오티드 유사체를 구성 또는 포함한다.
25. 실시태양 21 ~ 24 중 어느 하나의 올리고머에 있어서, 상기 D 부분은 어디에 존재하든, 하나 또는 두개의 DNA 뉴클레오티드를 구성한다.
26. 실시태양 21 ~ 25 중 어느 하나의 올리고머에 있어서;
A 3 개의 연속된 뉴클레오티드 유사체를 구성 또는 포함하고;
B 7, 8, 9 또는 10 개의 연속된 DNA 뉴클레오티드 또는 안드로겐 수용체 mRNA 표적과 같은, 상보적 RNA로 듀플렉스를 형성하였을 때 RNAseH를 선별할 수 있는 동등한 뉴클레오염기를 구성 또는 포함하고;
C 3 개의 연속된 뉴클레오티드 유사체를 구성 또는 포함하고;
D 어디에 존재하든, 하나 또는 두개의 DNA 뉴클레오티드를 구성한다.
27. 실시태양 26의 올리고머에 있어서, 상기 연속된 뉴클레오염기 서열은 10, 11, 12, 13 또는 14 개의 뉴클레오염기를 구성하고, 및;
A 1, 2, 또는 3개의 연속된 뉴클레오티드 유사체를 구성하고;
B 7, 8, 또는 9 개의 연속적인 DNA 뉴클레오티드 또는 안드로겐 수용체 mRNA 표적과 같은, 상보적 RNA로 듀플렉스를 형성하였을 때 RNAseH를 선별할 수 있는 동등한 뉴클레오염기를 구성하고;
C 1, 2 또는 3 개의 연속된 뉴클레오티드 유사체를 구성하고;
D 어디에 존재하든, 하나의 DNA 뉴클레오티드를 구성한다.
28. 실시태양 21 ~ 27 중 어느 하나의 올리고머에 있어서, 상기 B 부분은 알파-L-옥시(alpha-L-oxy) LNA와 같은, 알파-L 구성이 있는 적어도 하나의 LNA 뉴클레오염기를 포함한다.
29. 실시태양 1~ 28 중 어느 하나에 의한 상기 올리고머에 있어서, 상기 뉴클레오티드 유사체는 잠금핵산(locked nucleic acid, LNA) 유닛; 2'-O-알킬-RNA(2'-O-alkyl-RNA) 유닛, 2'-OMe-RNA 유닛, 2'-아미노-DNA (2'-amino-DNA) 유닛, 2'-플루오로-DNA(2'-fluoro-DNA) 유닛, PNA 유닛, HNA 유닛, 및 INA 유닛으로부터 구성된 군으로부터 독립적 또는 전체적으로 선택된다.
30. 실시태양 29에 의한 상기 올리고머에 있어서, 상기 모든 뉴클레오티드 유사체는 LNA 유닛이다.
31. 2 내지 8개 사이의 뉴클레오티드 LNA 유닛과 같은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 LNA 유닛을 포함하는 실시태양 1 - 30 중 어느 하나에 의한 올리고머.
32. 실시태양 29 ~ 31 중 어느 하나에 의한 상기 올리고머에 있어서, 상기 LNA는 옥시(oxy)-LNA, 티오(thio)-LNA, 및 아미노(amino)-LNA, 베타(beta)-D 및 알파(alpha)-L 구성 중 하나 또는 그것의 조합으로부터 개별적으로 선택된다.
33. 실시태양 32에 의한 상기 올리고머에서, 상기 LNA는 모두 베타-D-옥시(beta-D-oxy)-LNA이다.
34. 실시태양 21-33 중 어느 하나에 의한 상기 올리고머에서, A 및 C 부분의 상기 뉴클레오티드 유사체 또는 뉴클레오염기는 베타-D-옥시(beta-D-oxy)-LNA이다.
35. 실시태양 1 - 34 중 어느 하나에 의한 상기 올리고머에 있어서, 상기 올리고머에 존재하는 뉴클레오염기의 적어도 하나는 5-메틸시토신(methylcytosine), 이소시토신(isocytosine), 슈도이소시토신(pseudoisocytosine), 5-브로모우라실(bromouracil), 5-프로피닐우라실(propynyluracil), 6-아미노퓨린(aminopurine), 2-아미노퓨린(aminopurine), 이노신(inosine), 다이아미노퓨린(diaminopurine), 및 2-클로로-6-아미노퓨린(2-chloro-6-aminopurine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 변형된 뉴클레오염기이다.
36. 실시태양 1 - 35 중 어느 하나에 의한 상기 올리고머에 있어서, 상기 올리고머는 포유류 안드로겐 수용체 mRNA와 상응하도록 적어도 50℃의 Tm에서 하이브리드하였다.
37. 실시태양 1 - 36 중 어느 하나에 의한 상기 올리고머에 있어서, 상기 올리고머는 포유류 안드로겐 수용체 mRNA와 상응하도록 80℃보다 높지 않은 Tm에서 하이브리드하였다.
38. 실시태양 1 - 37 중 어느 하나에 의한 상기 올리고머에 있어서, 상기 인터뉴클레오시드 결합은 포스포디에스터(phosphodiester), 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 및 보라노포스페이트(boranophosphate)로 구성된 군으로부터 개별적으로 선택된다.
39. 실시태양 38에 의한 상기 올리고머에 있어서, 상기 올리고머는 적어도 하나의 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 인터뉴클레오시드 결합을 포함한다.
40. 실시태양 39에 의한 상기 올리고머에 있어서, DNA 또는 RNA 유닛 사이, 또는 B 부분 내에 인접한 상기 인터뉴클레오시드 결합은 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 결합이다.
41. 실시태양 39 또는 40에 의한 상기 올리고머에 있어서, 연속적인 뉴클레오티드 유사체의 적어도 한 쌍 사이의 결합은 포스포디에스터(phosphodiester) 결합이다.
42. 실시태양 39 또는 40에 의한 상기 올리고머에 있어서, 연속적인 뉴클레오티드 유사체간 모든 결합은 포스포디에스터(phosphodiester) 결합이다.
43. 실시태양 42에 의한 상기 올리고머에 있어서, 모든 인터뉴클레오시드 결합은 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 결합이다.
44. 실시태양 1 - 42 중 어느 하나의 올리고머 및 상기 화합물에 공유적으로 결합된 적어도 하나의 비-뉴클레오티드 또는 비-폴리뉴클레오티드 부분을 포함하는 결합체.
45. 실시태양 1 - 43 중 어느 하나에 의한 올리고머 또는 실시태양 44에 의한 결합체, 및 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 염 또는 보조제를 포함한 약학적 조성물.
46. 45에 의한 약학적 조성물에 있어서, 상기 올리고머는 전구약물(pro-drug)로 구성된다.
47. 실시태양 45 또는 46에 의한 약학적 조성물에 있어서, 비-스테로이드계 항안드로겐 및 황체 형성 호르몬 방출 호르몬 유사체(Luteinizing hormone-releasing hormone analogs, LHRH-As)로 구성된 군으로부터 선택된 추가 치료제를 추가로 포함한다.
48. 유방암 또는 전립선암, 탈모증, 전립선 비대증, 척수성 근 위축증, 케네디 병 및 폴리글루타메이트(polyglutamate) 병과 같은 암으로 구성된 군으로부터 선택된 질병 또는 장애의 치료를 위한 의약제의 제조를 위한 실시태양 1 - 42 중 어느 하나에 의한 올리고머, 또는 실시태양 44에 의한 결합체의 용도.
49. 유방암 또는 전립선암, 탈모증, 전립선 비대증, 척수성 근 위축증, 케네디 병 및 폴리글루타메이트(polyglutamate) 병과 같은 암으로 구성된 군으로부터 선택된 질병 또는 장애의 치료 용도를 위한, 실시태양 1 - 43 중 어느 하나에 의한 올리고머, 또는 실시태양 44에 의한 결합체.
50. 유방암 또는 전립선암, 탈모증, 전립선 비대증, 척수성 근 위축증, 케네디 병 및 폴리글루타메이트(polyglutamate) 병과 같은 암으로 구성된 군으로부터 선택된 질병 또는 장애의 치료 방법, 상기 방법은 실시태양 1 - 43 중 어느 하나에 의한 올리고머, 또는 실시태양 44에 의한 결합체, 또는 실시태양 45 - 47 중 어느 하나에 의한 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에 투여하는 것을 포함한다.
51. 전립선암 또는 유방암과 같은 암의 치료 방법, 상기 방법은 실시태양 1 - 43 중 어느 하나에 의한 올리고머, 또는 실시태양 44에 의한 결합체, 또는 실시태양 45 - 47 중 어느 하나에 의한 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에 투여하는 것을 포함한다.
52. 세포 또는 조직 내에서 안드로겐 수용체의 발현을 감소 또는 저해하는 방법, 상기 방법은 실시태양 1 - 43 중 어느 하나에 의한 화합물, 또는 실시태양 44에 의한 결합체, 또는 실시태양 45 - 47 중 어느 하나에 의한 약학적 조성물을 상기 세포 또는 조직에 접촉하는 단계를 포함하고, 그것으로부터 안드로겐 수용체의 발현을 감소 또는 저해한다.
상기 유전자가 발현되는 세포 내에서 안드로겐 수용체에 의해 조절되는 유전자(즉, 안드로겐 수용체 표적)의 발현을 조절하는 방법, 상기 방법은 실시태양 1 - 43 중 어느 하나에 의한 화합물, 또는 실시태양 44에 의한 결합체, 또는 실시태양 45 - 47 중 어느 하나에 의한 약학적 조성물을 상기 세포 또는 조직에 접촉하는 단계를 포함하고, 그것으로부터 안드로겐 수용체 표적의 발현을 조절한다.
실시예
실시예 1: 단량체 합성
상기 LNA 단량체의 구조 재료(building block) 및 유도체는 하기 발표된 방법 및 이에 언급된 참조에 따라 제조되었고 - WO07/031081 및 이에 언급된 참조를 참고한다.
실시예 2: 올리고뉴클레오티드 합성
올리고뉴클레오티드는 WO07/031081에 기재된 방법에 따라 합성되었다. 표 1은 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열의 실시예를 나타낸다. 표 2 및 3은 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드(올리고)의 실시예를 나타낸다.
실시예 3: 올리고뉴클레오티드의 고안
본 발명에 따른, 일련의 다양한 올리고뉴클레오티드는 인간 안드로겐 수용체 mRNA(GenBank 등록번호 NM_000044, 서열번호: 1)와는 다른 부분을 표적으로 하여 고안되었다.
표 1 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열: 서열번호 2 ~ 22는 인간 안드로겐 수용체 mRNA를 표적으로 하여 고안된 올리고 서열이다.
서열번호 서열 (5'-3') 길이
(염기)		 표적 부분
NM_000044
서열번호: 2 GAGACCATCCTCACC 16 1389-1404
서열번호: 3 GGACCAGGTAGCCTGT 16 1428-1443
서열번호: 4 CCCCTGGACTCAGATG 16 1881-1896
서열번호: 5 GCACAAGGAGTGGGAC 16 1954-1969
서열번호: 6 GCTGTGAAGAGAGTGT 16 2422-2437
서열번호: 7 TTTGACACAAGTGGGA 16 2663-2678
서열번호: 8 GTGACACCCAGAAGCT 16 2813-2828
서열번호: 9 CATCCCTGCTTCATAA 16 2975-2990
서열번호: 10 ACCAAGTTTCTTCAGC 16 3008-3023
서열번호: 11 CTTGGCCCACTTGACC 16 3263-3278
서열번호: 12 TCCTGGAGTTGACATT 16 3384-3399
서열번호: 13 CACTGGCTGTACATCC 16 3454-3469
서열번호: 14 CATCCAAACTCTTGAG 16 3490-3505
서열번호: 15 GCTTTCATGCACAGGA 16 3529-3544
서열번호: 16 GAAGTTCATCAAAGAA 16 3594-3609
서열번호: 17 AGTTCCTTGATGTAGT 16 3616-3631
서열번호: 18 TTGCACAGAGATGATC 16 3809-3824
서열번호: 19 GATGGGCTTGACTTTC 16 3845-3860
서열번호: 20 CAGGCAGAAGACATCT 16 3924-3939
서열번호: 21 CCCAAGGCACTGCAGA 16 3960-3975
서열번호: 22 GCTGACATTCATAGCC 16 3114-3129
서열번호: 86 TGGGGAGAACCATCCTCACCCTGC 24 1385-1408
서열번호: 87 TCCAGGACCAGGTAGCCTGTGGGG 24 1424-1447
서열번호: 88 TGTTCCCCTGGACTCAGATGCTCC 24 1877-1990
서열번호: 89 TGGGGCACAAGGAGTGGGACGCAC 24 1950-1973
서열번호: 90 TTCGGCTGTGAAGAGAGTGTGCCA 24 2418-2441
서열번호: 91 CGCTTTTGACACAAGTGGGACTGG 24 2659-2682
서열번호: 92 CATAGTGACACCCAGAAGCTTCAT 24 2809-2832
서열번호: 93 GAGTCATCCCTGCTTCATAACATT 24 2971-2994
서열번호: 94 GATTACCAAGTTTCTTCAGCTTCC 24 3004-3027
서열번호: 95 AGGCCTTGGCCCACTTGACCACGT 24 3259-3282
서열번호: 96 AGCATCCTGGAGTTGACATTGGTG 24 3380-3403
서열번호: 97 GACACACTGGCTGTACATCCGGGA 24 3450-3473
서열번호: 98 GAGCCATCCAAACTCTTGAGAGAG 24 3486-3509
서열번호: 99 CAGTGCTTTCATGCACAGGAATTC 24 3525-3548
서열번호: 100 ATTCGAAGTTCATCAAAGAATTTT 24 3590-3613
서열번호: 101 ATCGAGTTCCTTGATGTAGTTCAT 24 3612-3635
서열번호: 102 GCACTTGCACAGAGATGATCTCTG 24 3805-3828
서열번호: 103 AATAGATGGGCTTGACTTTCCCAG 24 3841-3864
서열번호: 104 ATAACAGGCAGAAGACATCTGAAA 24 3920-3943
서열번호: 105 ATTCCCCAAGGCACTGCAGAGGAG 24 3956-3979
서열번호: 106 ATGGGCTGACATTCATAGCCTTCA 24 3110-3133
표 2: 본 발명의 올리고뉴클레오티드 고안- 서열번호- 23 ~ 43에서 대문자는 뉴클레오티드 아날로그 유닛을 가리키고, 첨자 "s"는 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 결합을 나타낸다. 소문자는 뉴클레오티드 유닛을 나타내고, "s"(어떤 경우에는)가 없는 것은 포스포디에스터(phosphodiester) 결합을 나타낸다.
Figure pct00008
실시예 4: 시험관 내(in vitro) 모델: 세포 배양
표적 핵산 발현에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 효과는 상기 표적 핵산이 적절한 수준으로 존재되어 제공되는 임의의 다양한 세포 형태에서 시험될 수 있다. 표적은 내생적으로 또는 상기 표적을 암호화하는 핵산의 일시적 또는 안정적인 형질전환에 의해 발현될 수 있다. 표적 핵산의 발현 수준은 일반적으로 예를 들면, 노던 블랏(Northern blot) 분석, 실시간 PCR(Real-Time PCR), 리보뉴클레아제 보호(Ribonuclease pretection) 분석을 사용하여 측정할 수 있다. 하기 세포 형태는 실례의 목적을 위해 제공되나, 상기 표적이 선택된 세포 형태에서 발현되어 제공되면, 다른 세포 형태도 일반적으로 사용될 수 있다.
세포는 하기에 기재된 적절한 배지에서 배양하였고 37℃에서 95 ~ 98% 습도 및 5% CO2 하에서 유지하였다. 세포는 1주일에 2 ~ 3회 계대배양하였다.
A549 인간 폐암 세포주 A549를 DMEM 배지(Sigma) + 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS) + 2 mM 글루타맥스(Glutamax) Ⅰ + 젠타마이신(gentamicin)(25 ug/ml)에서 배양하였다.
MCF7 인간 유방암 세포주 MCF7을 EagleMEM 배지(Sigma) + 2 mM 글루타맥스(Glutamax) Ⅰ + 1xNEAA + 젠타마이신(gentamicin)(25 ug/ml)에서 배양하였다.
실시예 5: 시험관 내(in vitro) 모델: 안티센스 올리고뉴클레오티드+ 를 이용한 처리
실시예 4에 나온 상기 세포주에 형질전환 운반체로서 양이온성 리포솜 제형 LipofectAMINE 2000(Gibco)을 사용하여 올리고뉴클레오티드를 처리하였다. 세포는 6-웰 세포 배양 플레이트(NUNC)에 분주하여 80 ~ 90% 밀도가 되었을 때 처리하였다. 올리고 농도는 최종 농도 1 nM 내지 16 nM 범위로 사용하였다. 올리고-지질 복합체의 제형은 혈청이 없는 OptiMEM(Gibco) 및 5 ㎍/㎖의 최종 지질 농도의 LipofectAMINE 2000을 사용하여 제조사에 의해 기재된 방법에 따라 수행되었다. 세포는 37℃에서 4시간 동안 배양하였고 올리고가 함유된 배양 배지를 제거하여 처리를 중지시켰다. 세포를 세척하고 혈청 함유 배지를 첨가하였다. 올리고 처리 후, 세포는 RNA 분석을 위해 수득하기 전에 20시간 동안 회복시켰다.
실시예 6: 시험관 내(in vitro) 모델: RNA 추출 및 cDNA 합성
총 RNA 분리 및 첫 번째 가닥 합성
제조사의 지침에 따라 Qiagen RNeasy kit(Qiagen cat. no. 74104)를 사용하여 상기 기재된 방법에 의해 형질전환된 세포로부터 총 RNA를 분리하였다. 첫 번째 가닥 합성은 Ambion으로부터 입수한 역전사효소(Reverse Transcriptase) 시약을 제조사의 지침에 따라 사용하여 실시하였다.
0.5 ㎍의 총 RNA의 각 시료는 RNase가 없는 H2O로 조절하였고(10.8 ㎕) 2 ㎕의 랜덤 데카머(random decamers)(50 μM) 및 4 ㎕의 dNTP 혼합물(각 dNTP는 2.5 mM)을 혼합하여 70℃에서 3분간 가열한 후 시료를 즉시 얼음에서 냉각하였다. 시료를 얼음에서 냉각한 후, 2 ㎕ 10×완충용액 RT, 1 ㎕ MMLV 역전사효소(100 U/㎕) 및 0.25 ㎕ RNase 저해제(inhibitor)(10 U/㎕)를 각 시료에 첨가하여 42℃에서 60분 동안 배양하였고, 95℃에서 10분 동안 효소를 열 불활성화하였고, 그런 다음 시료를 4℃에서 냉각하였다.
실시예 7: 시험관 내(in vitro) 모델: 실시간 PCR(Real-time PCR)에 의한 안드로겐 수용체 발현에 대한 올리고뉴클레오티드 저해의 분석
안드로겐 수용체 발현의 안티센스 조절은 당업계에 공지된 여러 가지 방법으로 분석할 수 있다. 예를 들면, 안드로겐 수용체 mRNA 농도는 예를 들면, 노던 블랏(Northern blot) 분석, 경쟁적 중합효소연쇄반응(competitive polymerase chain reactin, PCR), 또는 실시간 PCR(real-time PCR)을 통해 정량할 수 있다. 실시간 정량적 PCR이 현재 선호된다. RNA 분석은 총 세포의 RNA 또는 mRNA에서 수행될 수 있다.
RNA 분리 및 노던 블랏 분석과 같은 RNA 분석 방법은 당업계에서 일반적이고 예를 들면, Molecular biology, John Wiley 및 Sons에 현행하는 프로토콜에서 알 수 있다.
실시간 정량(PCR)은 상업적으로 이용가능한 Applied Biosystem으로부터 구입가능한 Multi-Color Real time PCR Detection System을 사용하여 편리하게 실시할 수 있다.
안드로겐 수용체 mRNA 농도에 대한 실시간 정량적 PCR 분석
인간 안드로겐 수용체 mRNA의 시료 조성은 제조사의 지침에 따라 인간 안드로겐 수용체 ABI Prism Pre-Developed TaqMan Assay Reagent(Applied Biosystems cat no. Hs00170025_m1)를 사용하여 정량하였다.
글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH) mRNA 정량은 시료 제조에서 어떠한 편차를 표준화하기 위한 내생적 대조군으로서 사용하였다.
인간 GAPDH mRNA의 시료 조성은 제조사의 지침에 따라 인간 GAPDH ABI Prism Pre-Developed TaqMan Assay Reagent(Applied Biosystems cat no. 4310884E)를 사용하여 정량하였다.
실시간 정량적 PCR은 당업계에 공지된 기술이고 예를 들면 Heid et al. Real time quantitative PCR, Genome Research (1996), 6:986-994에서 알 수 있다.
실시간 PCR: 실시예 6에 기재된 것에 의해 실시한 첫 번째 가닥 합성으로부터의 cDNA는 2 ~ 20배 희석하였고, Applied Biosystems의 Taqman 7500 FAST 또는 7900 FAST를 사용하여 실시간 정량적 PCR을 통해 분석하였다. 프라이머 및 탐침은 2×Taqman Fast Universal PCR master mix(2×)(Applied Biosystems Cat.# 4364103)로 혼합하였고 최종 부피 10 ㎕에 4 ㎕의 cDNA를 첨가하였다. 각 시료는 2회 분석하였다. cDNA의 2배 희석의 분석은 분석을 위해 제작된 표준곡선(standard curve)의 RNA를 발현하는 세포주로부터 정제된 물질로 제조되었다. 멸균 H20는 주형(template)이 없는 대조군을 위해 cDNA 대신에 사용하였다. PCR 프로그램은: 95℃에서 30초 동안 , 그런 다음 95℃에서 3초, 60℃에서 20 ~ 30 초가 40 사이클이었다. 표적 mRNA 서열의 상대적인 정량은 Applied Biosystems Fast System SDS Software Version 1.3.1.21. 또는 SDS Software Version 2.3.을 사용하여 산출된 임계 사이클(Thresold cycle)로부터 측정하였다.
실시예 8: 시험관 내(in vitro) 분석: 올리고뉴클레오티드 화합물에 의한 인간 안드로겐 수용체 발현의 안티센스 저해
표 3에서 나타낸 올리고뉴클레오티드는 1, 4 및 16 nM의 농도에서 안드로겐 수용체 mRNA 녹다운(knock down)에 대한 가능성을 위해 측정되었다(도 1 및 2).
표 3: 안티센스는 올리고뉴클레오티드에 의해 발현되는 인간 안드로겐 수용체 mRNA의 저해.
표 3에서 결과는 16 nM에서 모의(mock) 형질전환된 세포와 관련된 하향-조절 퍼센트로서 나타내었다. 소문자는 DNA 유닛을 나타내고, 굵은 대문자는 β-D-옥시-LNA(β-D-oxy-LNA) 유닛을 나타낸다. 모든 LNA C는 5'메틸 C이다. 아래에 기입한 "s"는 포스포로티오에이트 결합을 나타낸다.
Figure pct00009
표 3에 나타낸 바와 같이, 16 nM에서 서열번호: 48, 51, 54, 58, 63, 69, 73 및 77의 올리고뉴클레오티드는 본 발명에 있어서 A549 및 MCF7 세포에서 안드로겐 수용체 mRNA 발현을 90%이상 저해함을 증명하였고, 따라서, 바람직하다. 또한 바람직하게는 상기 이용된 안티센스 올리고 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드이고, 예를 들면 길이(더 짧거나 더 긴) 및/또는 뉴클레오염기 조성(예를 들면, 유사체 유닛의 형태 및/또는 비율)의 변화이고, 이는 또한 안드로겐 수용체 발현의 효과적인 저해를 제공한다.
실시예 9: 생체 내(In vivo) 분석: 올리고뉴클레오티드 화합물에 의해 마우스 간에서 발현되는 안드로겐 수용체 mRNA의 안티센스 저해
누드 마우스를 100 ㎎/㎏ 올리고뉴클레오티드로 3일 동안 총 4번(q3dx4) 정맥내 주사하였다(5마리 마우스의 그룹 크기). 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드(서열번호:48, 서열번호:51, 서열번호:58, 서열번호:63,서열번호:77)를 0.9% 인산염으로 완충한 생리식염수(phosphate buffered saline)에 용해하였다. 마지막 투여한 후 24시간 후 동물을 희생시키고 간 조직을 분리하여 RNA 추출 및 QPCR 분석을 할 때까지 RNA later에 보관하였다. 총 RNA를 추출하여 간 시료에서의 안드로겐 수용체 mRNA 발현을 mouse AR QPCR assay(cat. Mm01238475_m1, Applied Biosystems)를 사용하여 실시예 7에 기재된 qPCR을 통해 측정하였다. 결과는 마우스 GAPDH(cat. no. 4352339E, Applied Biosystems)로 표준화하였고 녹다운(Knockdown)은 식염수 처리된 대조군과 비교하여 정량하였다. 표 4에서 결과는 식염수 처리된 동물과 비교하여 하향-조절된 퍼센트를 나타낸다.
표 4
생체 내(In vivo) 안드로겐 수용체 MRNA 발현의 녹-다운(knock-down)
화합물 간 (% KD)
식염수 0
서열번호: 51 100 mg/kg 65.0+/-12.6
서열번호: 58 100 mg/kg 95.2+/-1.0
서열번호: 77 100 mg/kg 91.9+/-3.9
표 4에서 나타낸 바와 같이, 100 mg/kg에서 서열번호: 58 및 77의 올리고뉴클레오티드는 마우스 간 세포에서 안드로겐 수용체 mRNA 발현을 90%이상 저해함을 증명하였고, 따라서, 바람직하다.
실시예 10: 시험관 내(In vitro) 분석: 인간 안드로겐 수용체 mRNA의 안티센스 저해
증식하는 생존가능한 세포의 측정(MTS 분석)
형질전환하기 하루 전에 LNCaP 전립선암 및 A549 폐암 세포를 6 웰 플레이트에 웰 당 150,000 세포수의 밀도로 접종하였다. A549 세포는 DMEM 배지(Sigma) + 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS) + 2 mM 글루타맥스(Glutamax) I + 젠타마이신(gentamicin)(25 ug/ml)에서 배양하였고, LNCaP 세포는 RPMI 1640 배지(Sigma) + 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS) + 2 mM 글루타맥스(Glutamax) I + 젠타마이신(gentamicin)(25 ug/ml)에서 배양하였다. 다음날에 배지를 제거하였고 5 ㎍/㎖의 Lipofectamine2000(Invitrogen)이 함유된 1.2 ㎖ OptiMEM을 첨가하였다. 세포를 OptiMEM에 희석한 0.3 ㎖의 올리고뉴클레오티드를 첨가하기 전에 7분 동안 배양하였다. 최종 올리고뉴클레오티드의 농도는 4 및 16 nM이었다. 처리한 뒤 4시간 후, 배지를 제거하였고 세포를 트립신 처리하여 새 96 웰 플레이트(Scientific Orange no. 1472030100)의 웰 당 5000 세포의 밀도로 100 ㎕ 배지에서 배양하였다. 살아있는 세포를 테트라졸리움 화합물[3-(4,5-dimethyl-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt; MTS] 및 전자 커플링 시약(electron coupling reagent)(phenazine ethosulfate; PES) (CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega)을 첨가하여 지시한 시간에 측정하였다. 살아있는 세포는 490 ㎚에서 Powerwave(Biotek Instruments)로 측정하였다. OD490 ㎚는 시간/h에 대하여 작성하였다(도 13 및 14). 도 13 및 도 14에서 나타낸 바와 같이, 서열번호: 58 및 77의 올리고뉴클레오티드는 LNCap 전립선암 및 A549 폐암 세포 모두에서 성장을 저해하였고,따라서, 바람직하다.
실시예 11: 시험관 내(In vitro) 분석: 인간 안드로겐 수용체 mRNA의 안티센스 저해에 의한 카스페아제 3/7의 활성
형질전환하기 하루 전에 LNCaP 전립선암 및 A549 폐암 세포를 6 웰 플레이트에 웰 당 150,000 세포수의 밀도로 접종하였다. A549 세포는 DMEM 배지(Sigma) + 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS) + 2 mM 글루타맥스(Glutamax) I + 젠타마이신(gentamicin)(25 ug/ml)에서 배양하였고, LNCaP 세포는 RPMI 1640 배지(Sigma) + 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS) + 2 mM 글루타맥스(Glutamax) I + 젠타마이신(gentamicin)(25 ug/ml)에서 배양하였다. 다음날에 배지를 제거하였고 5 ㎍/㎖의 Lipofectamine2000(Invitrogen)이 함유된 1.2 ㎖ OptiMEM을 첨가하였다. 세포를 OptiMEM에 희석한 0.3 ㎖의 올리고뉴클레오티드를 첨가하기 전에 7분 동안 배양하였다. 최종 올리고뉴클레오티드의 농도는 4 및 16 nM이었다. 처리한 뒤 4시간 후, 배지를 제거하였고 세포를 트립신 처리하여 새 96 웰 플레이트(Scientific Orange no. 1472030100)의 웰 당 5000 세포의 밀도로 100 ㎕ 배지에서 배양하였다. 카스페아제(Caspase) 3/7 활성은 100ul Caspase-Glo 3/7 assay(promega) 첨가에 의해 지시된 시간에 측정되었다. 카스페아제(Caspase) 3/7 활성은 루미노미터(luminometer)를 사용하여 측정되었다. 상기 카스페아제(Caspase) 3/7 활성은 14h, 48h 및 72h의 세 가지 다른 시간 지점에 측정되었다(도 15 및 16). 도 15 및 도 16에서 나타낸 바와 같이, 서열번호: 58 및 77의 올리고뉴클레오티드는 LNCap 전립선암 및 A549 폐암 세포 모두에서 카스페아제 3/7의 활성을 유도하였고,따라서, 바람직하다.
실시예 12: 시험관 내(In vitro) 분석: 전립선암 세포 LNCaP 및 폐암 세포주 A549에서 올리고뉴클레오티드 화합물에 의한 인간 안드로겐 수용체 mRNA 발현의 안티센스 저해.
올리고뉴클레오티드는 0.5, 1, 2, 4, 8 및 16 nM의 농도에서 안드로겐 수용체 mRNA 녹다운(knock down)에 대한 가능성을 위해 측정되었다(도 11). 형질전환하기 하루 전에 LNCaP 전립선암 및 A549 폐암 세포를 6 웰 플레이트에 웰 당 150,000 세포수의 밀도로 접종하였다. A549 세포는 DMEM 배지(Sigma) + 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS) + 2 mM 글루타맥스(Glutamax) I + 젠타마이신(gentamicin)(25 ug/ml)에서 배양하였고, LNCaP 세포는 RPMI 1640 배지(Sigma) + 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS) + 2 mM 글루타맥스(Glutamax) I + 젠타마이신(gentamicin)(25 ug/ml)에서 배양하였다. 다음날에 배지를 제거하였고 5 ㎍/㎖의 Lipofectamine2000(Invitrogen)이 함유된 1.2 ㎖ OptiMEM을 첨가하였다. 세포를 OptiMEM에 희석한 0.3 ㎖의 올리고뉴클레오티드를 첨가하기 전에 7분 동안 배양하였다. 최종 올리고뉴클레오티드의 농도는 0.5, 1, 2, 4, 8 및 16 nM이었다. 세포는 세척하고 혈청이 포함된 배지를 첨가하였다. 올리고 처리 후 세포는 RNA 분석을 위해 수획하기 전에 20 시간동안 회복되도록 허락하였다. RNA 분리, cDNA 합성 및 qPCR을 위한 방법은 실시예 5, 6 및 7에서 나타낸바와 같다. 도 11 및 12에서 보는 바와 같이 서열번호: 58 및 77의 올리고뉴클레오티드는 폐암 세포주 A549 및 안드로겐 수용체-의존적(androgen receptor-dependent) 22RV1 전립선암 세포주 모두에서 안드로겐 수용체 mRNA 발현을 녹다운(knock-down)하는데 강력하다.
실시예 13: PSA에서 안티센스 올리고뉴클레오티드의 효과(도 17): 본 연구에서는 6 내지 7주령의 평균 몸무게 27.3±2.4g의 수컷 아티믹(athymic) 누드 마우스(Harlan Sprague Dawley)를 사용하였다. 22RV1(안드로겐-비의존적 전립선암세포주)세포 107 개를 PBS(Gibco#14190) 및 매트리겔(Matrigel, BD#356234)에 1:1의 비율로 현탁하고 각 마우스의 피하에 주사하였다. 암세포의 평균 크기가 150-200 mm3에 도달했을 때, 상기 마우스를 9개의 실험군으로 분리하였다. 암의 크기가 152.66±27.97mm3에 도달했을 때, 201개의 올리고를 정맥내로 주사하였다. 올리고는 매 3일 간격으로, 총 5회 주사하였다. 운반체 대조군을 올리고와 같은 양으로 주사하였다. 16일 째, 마우스를 희생시키고 EDTA가 들어있는 튜브에 혈액을 모으고, 5분 동안 가라앉혔다. 이후, 상기 상등액 50ul를 Salem(PSAHU-L01)에서 ALPCO Diagnostics의 ELISA kit를 사용하여 PSA 어쎄이(assay)를 수행하였다.
암의 성장에서 안티센스 올리고뉴클레오티드의 효과(도 18): 본 연구에서는 6 내지 7주령의 평균 몸무게 27.3±2.4g의 수컷 아티믹(athymic) 누드 마우스(Harlan Sprague Dawley)를 사용하였다. 22RV1(안드로겐-비의존적 전립선암세포주)세포 107 개를 PBS(Gibco#14190) 및 매트리겔(Matrigel, BD#356234)에 1:1의 비율로 현탁하고 각 마우스의 피하에 주사하였다. 암세포의 평균 크기가 150-200 mm3에 도달했을 때, 상기 마우스를 9개의 실험군으로 분리하였다. 암의 크기가 152.66±27.97mm3에 도달했을 때, 201개의 올리고를 정맥내로 주사하였다. 올리고는 매 3일 간격으로, 총 5회 주사하였다. 운반체 대조군을 올리고와 같은 양으로 주사하였다. 각 마우스의 암 크기는 캘리퍼스(calipers)로 두 치수를 측정하고, 하기 수식: 종양 크기=(길이 X 폭2)/2)를 사용하여 계산하였다.
실시예 14: 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol)과 올리고머의 결합체의 제조
서열번호: 48 또는 서열번호: 63로 나타내어지는 올리고머들은 5' 말단에 일반적인 포스포라미다이트 케미스트리(phosphoramidite chemistry)를 사용한 올리고머의 5' 인산기에 대한 Fmoc와 같은 보호기로 보호된 헥산-1(hexan-1) 아민 아미노알킬기의 결합에 의해 작용화 되고, 화학식 (IA) 및 (IB)를 각각 가지는 작용화된 올리고머를 수득하기 위해 결과적인 화합물 산화, 그것을 탈보호 및 정제한다:
Figure pct00010
상기 화학식에서 굵은 대문자는 뉴클레오시드 유사체 단량체를 나타내고, 소문자는 DNA 단량체를 나타내며, 상기 아래 기입한 "s"는 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 결합을 나타내고, MeC는 5-메틸시토신(5-methylcytosine)을 나타낸다.
화학식 (II)에 나타낸 것과 같은, 활성화된 PEG 용액:
Figure pct00011
상기 PEG 부분은 12,000의 평균 분자량을 가지고, PBS 완충용액에 있는 화학식 (IA) 및 (IB)의 화합물 각각은 분리된 용기에서 12시간 동안 상온에서 혼합되었다. 반응 용액을 메틸렌클로라이드(methylene chloride)로 3회 추출하였고 결합된 유기물층을 마그네슘설페이트(magnesium sulphate)로 건조시켜 여과하였고 감압하에서 용매를 증발시켰다. 상기 결과로 얻어진 잔류물을 이차 증류수에 녹여 음이온 교환 컬럼에 통과시켰다. 반응하지 않은 PEG 링커(linker)를 물로 용리하였고, 산물은 NH4HCO3 용액으로 용리하였다. 순수한 산물을 포함하는 분획물을 모으고, 화학식 (IIIA) 및 (IIIB)에서 나타낸 바와 같이 각각, 서열번호: 48 및 63으로 결합된 산물을 동결건조하였다:
Figure pct00012
상기 서열번호: 48 및 63의 올리고머 각각은 방출(releasable) 링커(linker)를 통해, 12,000의 평균 분자량을 가지는 PEG 중합체(polymer)와 연결되었다.
상기 언급한 과정을 이용하여, 서열번호: 51, 58 및 77로 나타내어지는 서열을 가진 올리고머로 만들 수 있는 PEG 중합체(polymer) 결합체의 화학적 구조는 각각 화학식 (IVA), (IVB) 및 (IVC)에서 나타낸 바와 같다:
Figure pct00013
상기 화학식에서 굵은 대문자는 베타-D-옥시-LNA(beta-D-oxy-LNA) 단량체를 나타내고, 소문자는 DNA 단량체를 나타내며, 상기 아래 기입한 "s"는 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 결합을 나타내고, MeC는 5-메틸시토신(5-methylcytosine)을 나타낸다.
화학식 (IVA), (IVB) 및 (IVC)로 나타내어지는 결합체를 각각 만들기 위해 상기 과정에 이용될 수 있는 활성화된 올리고머는 화학식 (VA), (VB) 및 (VC)로 나타내어지는 화학 구조를 가진다:
Figure pct00014
<110> Enzon Pharmaceuticals, Inc. Santaris Pharma A/S <120> LNA ANTAGONISTS TARGETING THE ANDROGEN RECEPTOR <130> 10fpi-05-02 <150> US 60/990125 <151> 2007-11-26 <150> PCT/DK2008/000147 <151> 2008-11-26 <160> 106 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4314 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 1 cgagatcccg gggagccagc ttgctgggag agcgggacgg tccggagcaa gcccagaggc 60 agaggaggcg acagagggaa aaagggccga gctagccgct ccagtgctgt acaggagccg 120 aagggacgca ccacgccagc cccagcccgg ctccagcgac agccaacgcc tcttgcagcg 180 cggcggcttc gaagccgccg cccggagctg ccctttcctc ttcggtgaag tttttaaaag 240 ctgctaaaga ctcggaggaa gcaaggaaag tgcctggtag gactgacggc tgcctttgtc 300 ctcctcctct ccaccccgcc tccccccacc ctgccttccc cccctccccc gtcttctctc 360 ccgcagctgc ctcagtcggc tactctcagc caacccccct caccaccctt ctccccaccc 420 gcccccccgc ccccgtcggc ccagcgctgc cagcccgagt ttgcagagag gtaactccct 480 ttggctgcga gcgggcgagc tagctgcaca ttgcaaagaa ggctcttagg agccaggcga 540 ctggggagcg gcttcagcac tgcagccacg acccgcctgg ttaggctgca cgcggagaga 600 accctctgtt ttcccccact ctctctccac ctcctcctgc cttccccacc ccgagtgcgg 660 agccagagat caaaagatga aaaggcagtc aggtcttcag tagccaaaaa acaaaacaaa 720 caaaaacaaa aaagccgaaa taaaagaaaa agataataac tcagttctta tttgcaccta 780 cttcagtgga cactgaattt ggaaggtgga ggattttgtt tttttctttt aagatctggg 840 catcttttga atctaccctt caagtattaa gagacagact gtgagcctag cagggcagat 900 cttgtccacc gtgtgtcttc ttctgcacga gactttgagg ctgtcagagc gctttttgcg 960 tggttgctcc cgcaagtttc cttctctgga gcttcccgca ggtgggcagc tagctgcagc 1020 gactaccgca tcatcacagc ctgttgaact cttctgagca agagaagggg aggcggggta 1080 agggaagtag gtggaagatt cagccaagct caaggatgga agtgcagtta gggctgggaa 1140 gggtctaccc tcggccgccg tccaagacct accgaggagc tttccagaat ctgttccaga 1200 gcgtgcgcga agtgatccag aacccgggcc ccaggcaccc agaggccgcg agcgcagcac 1260 ctcccggcgc cagtttgctg ctgctgcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc 1320 agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcaagagac tagccccagg cagcagcagc 1380 agcagcaggg tgaggatggt tctccccaag cccatcgtag aggccccaca ggctacctgg 1440 tcctggatga ggaacagcaa ccttcacagc cgcagtcggc cctggagtgc caccccgaga 1500 gaggttgcgt cccagagcct ggagccgccg tggccgccag caaggggctg ccgcagcagc 1560 tgccagcacc tccggacgag gatgactcag ctgccccatc cacgttgtcc ctgctgggcc 1620 ccactttccc cggcttaagc agctgctccg ctgaccttaa agacatcctg agcgaggcca 1680 gcaccatgca actccttcag caacagcagc aggaagcagt atccgaaggc agcagcagcg 1740 ggagagcgag ggaggcctcg ggggctccca cttcctccaa ggacaattac ttagggggca 1800 cttcgaccat ttctgacaac gccaaggagt tgtgtaaggc agtgtcggtg tccatgggcc 1860 tgggtgtgga ggcgttggag catctgagtc caggggaaca gcttcggggg gattgcatgt 1920 acgccccact tttgggagtt ccacccgctg tgcgtcccac tccttgtgcc ccattggccg 1980 aatgcaaagg ttctctgcta gacgacagcg caggcaagag cactgaagat actgctgagt 2040 attccccttt caagggaggt tacaccaaag ggctagaagg cgagagccta ggctgctctg 2100 gcagcgctgc agcagggagc tccgggacac ttgaactgcc gtctaccctg tctctctaca 2160 agtccggagc actggacgag gcagctgcgt accagagtcg cgactactac aactttccac 2220 tggctctggc cggaccgccg ccccctccgc cgcctcccca tccccacgct cgcatcaagc 2280 tggagaaccc gctggactac ggcagcgcct gggcggctgc 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motif <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> nucleotide or nucleotide analogues - optionally phosphorothioate <400> 8 gtgacaccca gaagct 16 <210> 9 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer Sequence/oligomer Sequence motif <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> nucleotide or nucleotide analogues - optionally phosphorothioate <400> 9 catccctgct tcataa 16 <210> 10 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer Sequence/oligomer Sequence motif <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> nucleotide or nucleotide analogues - optionally phosphorothioate <400> 10 accaagtttc ttcagc 16 <210> 11 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer Sequence/oligomer Sequence motif <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> nucleotide or nucleotide analogues - optionally phosphorothioate <400> 11 cttggcccac ttgacc 16 <210> 12 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer 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tgatgaactt cgaatgaact acatcaagga actcgatcgt atcattgcat 2880 gcaaaagaaa aaatcccaca tcctgctcaa ggcgtttcta ccagctcacc aagctcctgg 2940 actccgtgca gcctattgcg agagagctgc atcagttcac ttttgacctg ctaatcaagt 3000 cacacatggt gagcgtggac tttccggaaa tgatggcaga gatcatctct gtgcaagtgc 3060 ccaagatcct ttctgggaaa gtcaagccca tctatttcca cacccagtga agcattggaa 3120 atccctattt cctcacccca gctcatgccc cctttcagat gtcttctgcc tgtta 3175 <210> 83 <211> 920 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 83 Met Glu Val Gln Leu Gly Leu Gly Arg Val Tyr Pro Arg Pro Pro Ser 1 5 10 15 Lys Thr Tyr Arg Gly Ala Phe Gln Asn Leu Phe Gln Ser Val Arg Glu 20 25 30 Val Ile Gln Asn Pro Gly Pro Arg His Pro Glu Ala Ala Ser Ala Ala 35 40 45 Pro Pro Gly Ala Ser Leu Leu Leu Leu Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln 50 55 60 Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln 65 70 75 80 Glu Thr Ser Pro Arg Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gly Glu Asp Gly Ser 85 90 95 Pro Gln Ala His Arg Arg Gly Pro Thr Gly Tyr Leu Val Leu Asp Glu 100 105 110 Glu Gln Gln Pro 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Leu Gly Cys Ser Gly Ser Ala Ala Ala Gly Ser Ser 325 330 335 Gly Thr Leu Glu Leu Pro Ser Thr Leu Ser Leu Tyr Lys Ser Gly Ala 340 345 350 Leu Asp Glu Ala Ala Ala Tyr Gln Ser Arg Asp Tyr Tyr Asn Phe Pro 355 360 365 Leu Ala Leu Ala Gly Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Pro His 370 375 380 Ala Arg Ile Lys Leu Glu Asn Pro Leu Asp Tyr Gly Ser Ala Trp Ala 385 390 395 400 Ala Ala Ala Ala Gln Cys Arg Tyr Gly Asp Leu Ala Ser Leu His Gly 405 410 415 Ala Gly Ala Ala Gly Pro Gly Ser Gly Ser Pro Ser Ala Ala Ala Ser 420 425 430 Ser Ser Trp His Thr Leu Phe Thr Ala Glu Glu Gly Gln Leu Tyr Gly 435 440 445 Pro Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 450 455 460 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Ala Gly Ala Val Ala Pro 465 470 475 480 Tyr Gly Tyr Thr Arg Pro Pro Gln Gly Leu Ala Gly Gln Glu Ser Asp 485 490 495 Phe Thr Ala Pro Asp Val Trp Tyr Pro Gly Gly Met Val Ser Arg Val 500 505 510 Pro Tyr Pro Ser Pro Thr Cys Val Lys Ser Glu Met Gly Pro Trp Met 515 520 525 Asp Ser Tyr Ser Gly 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Asn Asp 565 570 575 Cys Thr Ile Asp Lys Phe Arg Arg Lys Asn Cys Pro Ser Cys Arg Leu 580 585 590 Arg Lys Cys Tyr Glu Ala Gly Met Thr Leu Gly Ala Arg Lys Leu Lys 595 600 605 Lys Leu Gly Asn Leu Lys Leu Gln Glu Glu Gly Glu Ala Ser Ser Thr 610 615 620 Thr Ser Pro Thr Glu Glu Thr Ala Gln Lys Leu Thr Val Ser His Ile 625 630 635 640 Glu Gly Tyr Glu Cys Gln Pro Ile Phe Leu Asn Val Leu Glu Ala Ile 645 650 655 Glu Pro Gly Val Val Cys Ala Gly His Asp Asn Asn Gln Pro Asp Ser 660 665 670 Phe Ala Ala Leu Leu Ser Ser Leu Asn Glu Leu Gly Glu Arg Gln Leu 675 680 685 Val His Val Val Lys Trp Ala Lys Ala Leu Pro Gly Phe Arg Asn Leu 690 695 700 His Val Asp Asp Gln Met Ala Val Ile Gln Tyr Ser Trp Met Gly Leu 705 710 715 720 Met Val Phe Ala Met Gly Trp Arg Ser Phe Thr Asn Val Asn Ser Arg 725 730 735 Met Leu Tyr Phe Ala Pro Asp Leu Val Phe Asn Glu Tyr Arg Met His 740 745 750 Lys Ser Arg Met Tyr Ser Gln Cys Val Arg Met Arg His Leu Ser Gln 755 760 765 Glu Phe Gly Trp Leu Gln Ile Thr Pro Gln Glu Phe Leu Cys Met Lys 770 775 780 Ala Leu Leu Leu Phe Ser Ile Ile Pro Val Asp Gly Leu Lys Asn Gln 785 790 795 800 Lys Phe Phe Asp Glu Leu Arg Met Asn Tyr Ile Lys Glu Leu Asp Arg 805 810 815 Ile Ile Ala Cys Lys Arg Lys Asn Pro Thr Ser Cys Ser Arg Arg Phe 820 825 830 Tyr Gln Leu Thr Lys Leu Leu Asp Ser Val Gln Pro Ile Ala Arg Glu 835 840 845 Leu His Gln Phe Thr Phe Asp Leu Leu Ile Lys Ser His Met Val Ser 850 855 860 Val Asp Phe Pro Glu Met Met Ala Glu Ile Ile Ser Val Gln Val Pro 865 870 875 880 Lys Ile Leu Ser Gly Lys Val Lys Pro Ile Tyr Phe His Thr Gln 885 890 895 <210> 86 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer Sequence/oligomer Sequence motif <220> <221> misc_feature <222> (1)..(24) <223> nucleotide or nucleotide analogues - optionally phosphorothioate <400> 86 tggggagaac catcctcacc ctgc 24 <210> 87 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer Sequence/oligomer Sequence motif <220> <221> misc_feature <222> (1)..(24) <223> nucleotide or nucleotide analogues - optionally phosphorothioate <400> 87 tccaggacca ggtagcctgt gggg 24 <210> 88 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer Sequence/oligomer Sequence motif <220> <221> misc_feature <222> (1)..(24) <223> nucleotide or nucleotide analogues - optionally phosphorothioate <400> 88 tgttcccctg gactcagatg ctcc 24 <210> 89 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer Sequence/oligomer Sequence motif <220> <221> misc_feature <222> (1)..(24) <223> nucleotide or nucleotide analogues - optionally phosphorothioate <400> 89 tggggcacaa ggagtgggac gcac 24 <210> 90 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer Sequence/oligomer Sequence motif <220> <221> misc_feature <222> (1)..(24) <223> nucleotide or nucleotide analogues - optionally phosphorothioate <400> 90 ttcggctgtg aagagagtgt gcca 24 <210> 91 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer Sequence/oligomer Sequence motif <220> <221> misc_feature <222> (1)..(24) <223> nucleotide or nucleotide analogues - optionally phosphorothioate <400> 91 cgcttttgac acaagtggga ctgg 24 <210> 92 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer Sequence/oligomer Sequence motif <220> <221> misc_feature <222> (1)..(24) <223> nucleotide or nucleotide analogues - optionally phosphorothioate <400> 92 catagtgaca cccagaagct tcat 24 <210> 93 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer Sequence/oligomer Sequence motif <220> <221> misc_feature <222> (1)..(24) <223> nucleotide or nucleotide analogues - optionally phosphorothioate <400> 93 gagtcatccc tgcttcataa catt 24 <210> 94 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer Sequence/oligomer Sequence motif <220> <221> misc_feature <222> (1)..(24) <223> nucleotide or nucleotide analogues - optionally phosphorothioate <400> 94 gattaccaag tttcttcagc ttcc 24 <210> 95 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer Sequence/oligomer Sequence motif <220> <221> misc_feature <222> (1)..(24) <223> nucleotide or nucleotide analogues - optionally phosphorothioate <400> 95 aggccttggc ccacttgacc acgt 24 <210> 96 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer Sequence/oligomer Sequence motif <220> <221> misc_feature <222> (1)..(24) <223> nucleotide or nucleotide analogues - optionally phosphorothioate <400> 96 agcatcctgg agttgacatt ggtg 24 <210> 97 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer Sequence/oligomer Sequence motif <220> <221> misc_feature <222> (1)..(24) <223> nucleotide or nucleotide analogues - optionally phosphorothioate <400> 97 gacacactgg ctgtacatcc ggga 24 <210> 98 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer Sequence/oligomer Sequence motif <220> <221> misc_feature <222> (1)..(24) <223> nucleotide or nucleotide analogues - optionally phosphorothioate <400> 98 gagccatcca aactcttgag agag 24 <210> 99 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer Sequence/oligomer Sequence motif <220> <221> misc_feature <222> (1)..(24) <223> nucleotide or nucleotide analogues - optionally phosphorothioate <400> 99 cagtgctttc atgcacagga attc 24 <210> 100 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer Sequence/oligomer Sequence motif <220> <221> misc_feature <222> (1)..(24) <223> nucleotide or nucleotide analogues - optionally phosphorothioate <400> 100 attcgaagtt catcaaagaa tttt 24 <210> 101 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer Sequence/oligomer Sequence motif <220> <221> misc_feature <222> (1)..(24) <223> nucleotide or nucleotide analogues - optionally phosphorothioate <400> 101 atcgagttcc ttgatgtagt tcat 24 <210> 102 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer Sequence/oligomer Sequence motif <220> <221> misc_feature <222> (1)..(24) <223> nucleotide or nucleotide analogues - optionally phosphorothioate <400> 102 gcacttgcac agagatgatc tctg 24 <210> 103 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer Sequence/oligomer Sequence motif <220> <221> misc_feature <222> (1)..(24) <223> nucleotide or nucleotide analogues - optionally phosphorothioate <400> 103 aatagatggg cttgactttc ccag 24 <210> 104 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer Sequence/oligomer Sequence motif <220> <221> misc_feature <222> (1)..(24) <223> nucleotide or nucleotide analogues - optionally phosphorothioate <400> 104 ataacaggca gaagacatct gaaa 24 <210> 105 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer Sequence/oligomer Sequence motif <220> <221> misc_feature <222> (1)..(24) <223> nucleotide or nucleotide analogues - optionally phosphorothioate <400> 105 attccccaag gcactgcaga ggag 24 <210> 106 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA oligomer Sequence/oligomer Sequence motif <220> <221> misc_feature <222> (1)..(24) <223> nucleotide or nucleotide analogues - optionally phosphorothioate <400> 106 atgggctgac attcatagcc ttca 24

Claims (17)

  1. 총 10 ~ 30 뉴클레오티드 사이의 연속된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 10 ~ 30 뉴클레오티드 사이의 길이이고, 상기 연속된 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1 또는 이의 자연적으로 발생하는 변이체와 같은, 포유류 안드로겐 수용체 유전자 또는 mRNA의 역상보적인 부분에 상응하는 부분과 적어도 80% 상동적이고, 적어도 하나의 LNA 유닛(unit)을 포함하는 올리고머.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 연속된 뉴클레오티드 서열은 i) 서열번호 94 또는 서열번호 58, ii) 서열번호 105 또는 서열번호 77 또는 iii) 서열번호: 2 - 22 및 86 - 106으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 서열에 상응하는 부분과 적어도 80% 상동적인 것을 특징으로 하는 올리고머.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 연속된 뉴클레오티드 서열은 제 1항에 상응하는 부분과 미스매치가 없거나 단지 1개 또는 2개의 미스매치를 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고머.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고머의 뉴클레오티드 서열은 상기 연속된 뉴클레오티드 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 올리고머.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연속된 뉴클레오티드 서열은 10 ~ 18 뉴클레오티드 사이의 길이인 것을 특징으로 하는 올리고머.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연속된 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 유사체(analogues)를 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고머.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 유사체는 잠금핵산(Locked Nucleic Acid, LNA) 유닛; 2'-O-알킬-RNA(2'-O-alkyl-RNA) 유닛, 2'-OME-RNA 유닛, 2'-아미노-DNA(2'-amino-DNA) 유닛, 및 2'-플루오로-DNA(2'-fluoro-DNA) 유닛으로 구성된 군으로부터 선택되는 당 변형된 뉴클레오티드와 같은, 당 변형된 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 올리고머.
  8. 제 6항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 유사체는 LNA인 것을 특징으로 하는 올리고머.
  9. 제 6항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 갭머(gapmer)인 것을 특징으로 하는 올리고머.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 안드로겐 수용체 유전자 또는 mRNA를 발현하는 세포에서 안드로겐 수용체 유전자 또는 mRNA의 발현을 저해하는 것을 특징으로 하는 올리고머.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고머는
    Figure pct00015

    {여기서, 상기 대문자는 베타-D-옥시-LNA(beta-D-oxy-LNA) 단량체를 표시하고, 소문자는 DNA 단량체를 표시하고, 아래 기입되어있는 "s"는 포스포로치오에이트(phosphorothioate)결합을 나타내며, MeC는 5-메틸시토신 염기(5-methylcytosine base)를 포함하는 베타-D-옥시-LNA(beta-D-oxy-LNA) 단량체를 나타냄}으로부터 선택된 연속된 뉴클레오티드 서열을 구성 또는 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고머.
  12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 상기 올리고머, 및 상기 올리고머에 공유적으로 결합된 적어도 하나의 비-뉴클레오티드 또는 비-폴리뉴클레오티드 부분을 포함하는 결합체.
  13. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 상기 올리고머, 또는 제 12항의 결합체, 및 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 염 또는 보조제를 포함하는 약학적 조성물.
  14. 암과 같은, 과증식성 질환과 같은, 본 명세서에 언급된 질환 또는 의학적 장애의 치료제와 같은, 약제로서 용도를 위한 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 올리고머, 또는 제 12항의 결합체.
  15. 암과 같은, 과증식성 질환과 같은, 본 명세서에 언급된 질환 또는 의학적 장애의 치료용 약제의 제조를 위한 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 올리고머 또는 제 12항에서 정의된 결합체의 용도.
  16. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 올리고머, 또는 제 12항의 결합체, 또는 제 13항의 약학적 조성물을 암과 같은, 과증식성 질환과 같은, 본 문서에 언급된 질환 또는 의학적 장애에 걸리거나, 또는 걸리기 쉬운 환자에게 효과적인 양으로 투여하는 것을 포함하는, 암과 같은, 과증식성 질환과 같은, 본 문서에 언급된 질환 또는 의학적 장애의 치료 방법.
  17. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 올리고머, 또는 제 12항의 결합체를 안드로겐 수용체를 발현하는 세포 내 안드로겐 수용체를 저해하기 위해 상기 세포 내로 투여하는 것을 포함하는 안드로겐 수용체를 발현하는 세포에서 안드로겐 수용체의 저해 방법.




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