KR20150064210A - 안드로겐 수용체 발현의 조절 - Google Patents
안드로겐 수용체 발현의 조절 Download PDFInfo
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Abstract
일부 실시양태는 세포에서 안드로겐 수용체(AR) 수준을 억제하기 위한 인간 안드로겐 수용체로 표적화되는 화합물 및 조성물에 관한 것으로서, 이 화합물 및 조성물은 암을 치료하고 암세포 성장 또는 증식을 억제하는 방법에 유용할 수 있다. 본원에서 제공된 일부 실시양태는 세포에서 안드로겐 수용체 수준을 억제하기 위한 화합물 및 조성물로서, 암을 치료하고 암세포, 예컨대, 전립선, 유방, 난소, 위 또는 방광의 암 또는 암세포의 증식 또는 성장을 억제하는 방법에 유용할 수 있는 화합물 및 조성물의 발견에 관한 것이다.
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일부 실시양태는 세포에서 안드로겐 수용체(AR) 수준을 억제하기 위한 인간 안드로겐 수용체에 표적화되는 화합물 및 조성물로서, 암을 치료하고 암세포 성장 또는 증식을 억제하는 방법에 유용할 수 있는 화합물 및 조성물에 관한 것이다.
안드로겐 수용체(AR)는 핵 수용체의 수퍼패밀리에 속하고 그의 호르몬 리간드인 안드로겐, 테스토스테론 또는 DHT와의 결합에 의해 활성화된다. 안드로겐 수용체는 세포질에서 호르몬 리간드에 결합하였을 때 핵으로 전위되고, 핵에서 DNA에 결합하고 다수의 표적 유전자들, 예컨대, 전립선 특이적 항원(PSA) 및 TMPRSS2의 발현을 조절하는 전사 인자로서 작용한다(Knudsen et al., Trends Endocrinol Metab 21: 315-24, 2010; Bennett et al., Int J Biochem Cell Biol. 42:813-827, 201).
안드로겐 수용체(AR) 신호전달은 전립선암 세포를 위한 중요한 생존 경로이고, "화학적 거세"로서도 공지되어 있는 안드로겐 고갈 치료법(ADT)은 순환하는 안드로겐 수준을 감소시켜 AR 활성을 억제하는, 호르몬 민감성 안드로겐 의존적 전립선암에 대한 제1차 치료 방법이다. 대다수의 환자들이 초기에 ADT에 반응하지만, 대다수는 거세 수준의 테스토스테론에도 불구하고 질환이 진행하는 거세 저항성을 궁극적으로 발생시킬 것이다. 이러한 유형의 암은 거세 저항성 전립선암(CRPC)으로서 공지되어 있다. 세포가 낮은 수준의 안드로겐에 민감하게 만들 수 있는 AR 단백질의 발현 증가; 트랜스활성화를 변경시킬 수 있거나 AR이 대안적 리간드에 민감하게 만들 수 있는 AR 돌연변이; 및 리간드 결합 도메인을 결여함에도 불구하고 리간드 자극의 부재 시 종양 성장을 촉진하는 작용을 할 수 있는 대안적으로 스플라이싱된 형태의 AR의 출현을 포함하는, 거세 저항성(거세-내성) 발생의 근원적인 다수의 기작들이 존재한다. 추가로, 전립선 종양은 그들 자신의 안드로겐을 합성함으로써 국소 종양내 테스토스테론 수준을 AR의 활성화에 이용될 수 있는 수준까지 증가시킬 수도 있다.
안드로겐 수용체(AR) 신호전달은 전립선암 세포를 위한 중요한 생존 경로이고, 안드로겐 고갈 치료법(ADT)은 국소적으로 진행된 전이성 질환을 갖는 환자를 위한 주요 치료로 남아있다. 대다수의 환자들이 초기에 ADT에 반응하지만, 대다수는 거세 수준의 테스토스테론에도 불구하고 질환이 진행하는 거세 저항성을 궁극적으로 발생시킬 것이다. 이 유형의 암은 거세 저항성 전립선암(CRPC)으로서 공지되어 있다(Karantos et al., Oncogene advance online: 1-13, 2013). 세포가 낮은 수준의 안드로겐에 민감하게 만들 수 있는 AR 단백질의 발현 증가(Gregory et al., Cancer Res 61: 2892-2898, 2001; Linja et al., Cancer Res 61: 3550-3555, 2001); 트랜스활성화를 변경시킬 수 있거나 AR이 대안적 리간드에 민감하게 만들 수 있는 AR 돌연변이(Scher et al., J Clin Oncol 23: 8253-8261, 2005); 및 리간드 결합 도메인을 결여함에도 불구하고 리간드 자극의 부재 시 종양 성장을 촉진하는 작용을 할 수 있는 대안적으로 스플라이싱된 형태의 AR의 출현(Yingming et al., Cancer Res 73:483-489, 2013)을 포함하는, 거세 저항성 발생의 근원적인 다수의 기작들이 존재한다. 추가로, 전립선 종양은 그들 자신의 안드로겐을 합성함으로써 국소 종양내 테스토스테론 수준을 AR의 활성화에 이용될 수 있는 수준까지 증가시킬 수도 있다(Attard et al., Cancer Cell 16:458-462, 2009).
안드로겐 수용체가 거세 저항성 전립선암에서 활성을 나타내는 상태로 남아있다는 사실은 안드로겐 리간드의 생성을 억제하거나 AR에 대한 이 리간드의 작용을 차단하는 신규 물질의 개발로 이어졌다. 이 신규 물질은 17-α-하이드록실라제(hydroxylase)/17,20-리아제(lyase)(CYP17) 활성을 억제하여, 부신 및 전립선 종양 그 자체에서 합성된 잔류 안드로겐을 감소시키는 아비라테론(abiraterone) 아세테이트(deBono et al., N Engl J Med 364: 1995-2006, 2011), 및 안드로겐 리간드가 AR에 결합하여 핵으로 전위하고 DNA에 결합하는 것을 방해하는 엔잘루타마이드(enzalutamide)(Scher et al., N Engl J Med 367: 1187-1197, 2012)를 포함한다. 다수의 다른 안드로겐 합성 억제제 또는 안드로겐 수용체 차단제가 임상전 또는 임상 단계에서 계발되고 있고, 예를 들면, ARN509, ODM201, TOK001 및 VT464를 포함한다.
CRPC에서 엔잘루타마이드 및 아비라테론과 같은 물질의 활성이 매우 고무적이지만, 이들 둘 다 모든 환자들에서 작용하지는 않고 전술된 기작에 의한 AR의 재활성화를 통한 추가 내성의 발생과 관련되어 있다(Yingming et al., Cancer Res 73:483-489, 2013). 따라서, CRPC의 치료를 위한 대안적 치료법, 특히 예를 들면, 야생형 AR, 돌연변이된 AR 및 스플라이스 변이체 AR를 포함하는 모든 형태의 AR의 활성을 제거할 수 있고/있거나 억제할 수 있는 대안적 치료법을 찾을 필요성이 계속 존재한다.
본 발명은 그의 디자인 및 작용 방식(AR RNA 표적과 염기쌍을 형성하고 DNA/RNA 이중체에서 RNA를 파괴하는 효소인 RNase H에 의한 그의 파괴를 매개함)을 통해 주요 형태의 AR을 억제하는 것을 목적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 제공한다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 AR mRNA의 적절한 영역을 표적화함으로써 주요 형태(전체 길이 형태, 스플라이스 변이체 형태 및 돌연변이된 형태)의 안드로겐 수용체 단백질들을 억제할 것이므로 CRPC를 갖는 환자의 치료에 적합할 것이다.
전립선암과 별도로, AR은 다른 종양, 예컨대, 유방암의 진행에서 한 인자로서 연루되어 있다. 유방암에서 AR은 ER 양성도 나타내는 종양의 70% 내지 80%에서 발현되고 삼중 음성(ER, PR 및 HER2의 발현 부재) 종양으로서 공지되어 있는 종양 사례의 12%에서 발현된다(Hickey et al., Molecular Endocrinology 26: 1252-1267, 2012). 임상전 연구에서, 안드로겐 수용체 길항제 비칼루타마이드(bicalutamide)는 시험관내 유방암 세포에서 항-증식 반응을 유도하고 이것은 Pi3K/mTOR 억제제의 첨가에 의해 증강된다(Ni et al., Cancer Cell 20: 119-131, 2011). 제2세대 항-안드로겐 엔잘루타마이드는 ER+/AR+ 유방암 세포에서 디하이드로테스토스테론(DHT) 매개된 증식을 억제하고 생체내 임상전 모델에서 에스트로겐-자극된 유방암 종양 성장을 억제하는 데 있어서 타목시펜만큼 효과적이다(Cochrane et al., Cancer Res 72(24 Supplement): P2-14-02, 2012). 엔잘루타마이드는 HER2+ 및 삼중 음성 유방암 세포에서 증식도 억제한다. 에스트로겐 작용이 감소되는 상황(예를 들면, 장기간 에스트로겐 고갈 또는 ER의 부재)에서 AR 수준은 증가하고 종양유발성을 띠게 될 수 있는 듯하다. 이것은 AR 길항제가 삼중 음성 또는 호르몬 내성 유방암 환경에서 최상으로 위치할 수 있다는 것을 암시할 것이다(Hickey et al., Molecular Endocrinology 26: 1252-1267, 2012). AR 표적화 치료법이 유방암에 대한 임상시험에서 현재 연구되고 있다(NCT00468715, NCT01597193, NCT01381874, NCT00755886).
AR은 방광, 난소, 위, 폐 및 간을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 다른 종양들에서도 발현된다. 임상전 데이터는 유방암에서의 역할과 유사한 역할, 즉 종양 세포 증식 생존을 촉진하는 역할을 뒷받침하므로; 이 종양들에서의 AR의 차단은 치료적 임상 이익을 가질 수 있다(Chang et al., Oncogene advance online: 1-10, 2013).
본원에서 제공된 여러 실시양태들은 세포에서 안드로겐 수용체 수준을 억제하기 위한 화합물 및 조성물로서, 암을 치료하고 암세포, 예컨대, 전립선, 유방, 난소, 위 또는 방광의 암 또는 암세포의 증식 또는 성장을 억제하는 방법에 유용할 수 있는 화합물 및 조성물의 발견에 관한 것이다.
상기 일반적인 설명 및 하기 상세한 설명은 청구된 본 발명을 예시하고 설명할 뿐이고 본 발명을 한정하지 않는다는 것을 이해해야 한다. 본원에서, 달리 구체적으로 언급되어 있지 않은 한, 단수형의 사용은 복수형을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 달리 언급되어 있지 않는 한, "또는"의 사용은 " 및/또는"을 의미한다. 나아가, 용어 "포함하는" 및 다른 형태, 예컨대, "포함한다" 및 "포함된다"의 사용은 한정하지 않는다. 또한, 달리 구체적으로 언급되어 있지 않은 한, 용어, 예컨대, "요소" 또는 "성분"은 한 유닛을 포함하는 요소 및 성분, 및 하나 초과의 서브유닛을 포함하는 요소 및 성분 둘 다를 포괄한다.
본원에서 사용된 단락 표제는 조직화 목적만을 위한 것이고 기재된 보호대상을 한정하는 것으로서 해석되어서는 안 된다. 특허, 특허출원, 논설, 교재 및 논문을 포함하나 이들로 한정되지 않는, 본원에서 인용된 모든 문헌들 또는 문헌의 일부는 본원에서 논의된 문헌의 일부 및 전체에 대해 본원에 명확히 참고로 도입된다.
정의
구체적인 정의가 제공되는 한, 본원에 기재된 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의약 및 약품 화학과 관련하여 이용된 명명법, 및 이들 분야의 절차 및 기법은 당분야에서 잘 공지되어 있고 통상적으로 사용되는 명명법, 및 절차 및 기법이다. 표준 기법은 화학적 합성 및 화학적 분석을 위해 이용될 수 있다. 허용되는 경우, 데이터베이스, 예컨대, 생물공학정보센터(NCBI)를 통해 입수될 수 있는 모든 특허들, 출원들, 공개된 출원들 및 다른 공개문헌, 진뱅크(GENBANK) 등록 번호 및 관련된 서열 정보, 및 본원의 개시내용 전체에서 언급된 다른 데이터는 본원에서 논의된 문헌의 일부 및 전체에 대해 참고로 도입된다.
달리 표시되어 있지 않은 한, 하기 용어들은 하기 의미를 갖는다:
"2'-O-메톡시에틸"(2'-MOE 및 2'-O(CH2)2-OCH3로서도 지칭됨)은 당 고리, 예컨대, 푸라노스 고리의 2' 위치에 있는 O-메톡시-에틸 변경을 지칭한다. 2'-O-메톡시에틸 변경된 당은 변경된 당이다.
"2'-MOE 뉴클레오사이드"(2'-O-메톡시에틸 뉴클레오사이드로서도 지칭됨)는 2'-MOE 변경된 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오사이드를 의미한다.
"2'-치환된 뉴클레오사이드"는 H 또는 OH 이외의 푸라노실 고리의 2' 위치에서 치환기를 포함하는 뉴클레오사이드를 의미한다. 일부 실시양태에서, 2'-치환된 뉴클레오사이드는 이환형 당 변경을 갖는 뉴클레오사이드를 포함한다.
"3' 표적 부위"는 특정 안티센스 화합물의 3'-최외각 뉴클레오타이드에 상보적인 표적 핵산의 뉴클레오타이드를 지칭한다.
"5' 표적 부위"는 특정 안티센스 화합물의 5'-최외각 뉴클레오타이드에 상보적인 표적 핵산의 뉴클레오타이드를 지칭한다.
"5-메틸사이토신"은 5' 위치에 부착된 메틸 기로 변경된 사이토신을 의미한다. 5-메틸사이토신은 변경된 핵염기이다.
"약"은 ±7% 이내의 값을 의미한다. 예를 들면, "화합물이 안드로겐 수용체의 약 70% 이상의 억제를 달성한다"가 언급되어 있는 경우, 안드로겐 수용체 수준이 63% 내지 77%의 범위 내에서 억제된다는 것을 내포한다.
"투여" 또는 "투여하는" 본원에서 제공된 안티센스 화합물을 그의 의도된 기능을 수행하도록 대상체에게 도입하는 경로를 지칭한다. 이용될 수 있는 투여 경로의 일례는 비경구 투여, 예컨대, 피하, 정맥내 또는 근육내 주사 또는 관주를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
유방암 또는 유방암 세포와 관련하여 "안드로겐-수용체 양성"은 안드로겐 수용체를 발현하는 유방암 또는 유방암 세포를 지칭한다.
"동물"은 마우스, 래트, 토끼, 개, 고양이, 돼지 및 비-인간 영장류(원숭이 및 침팬지를 포함하나 이들로 한정되지 않음)를 포함하나 이들로 한정되지 않는 인간 또는 비-인간 동물을 지칭한다.
"항안드로겐제"는 안드로겐 합성 억제제 또는 안드로겐 수용체 차단제인 치료 화합물 또는 약물을 지칭한다.
"안티센스 활성"은 안티센스 화합물과 그의 표적 핵산의 혼성화에 기인할 수 있는 임의의 검출가능한 또는 측정가능한 활성을 의미한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 활성은 표적 핵산, 또는 이러한 표적 핵산에 의해 코딩된 단백질의 양 또는 발현의 감소이다.
"안티센스 화합물"은 수소결합을 통해 표적 핵산에 혼성화할 수 있는 올리고머 화합물을 의미한다. 안티센스 화합물의 예로는 단일 가닥 화합물 및 이중 가닥 화합물, 예컨대, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, ssRNA, 및 점유-기초 화합물이 있다.
"안티센스 억제"는 표적 핵산에 상보적인 안티센스 화합물의 존재 하에서의 표적 핵산 수준이 안티센스 화합물의 부재 하에서의 표적 핵산 수준에 비해 감소되는 것을 의미한다.
"안티센스 기작"은 화합물과 표적 핵산의 혼성화를 수반하는 모든 기작들이고, 이때 혼성화의 결과 또는 효과는 예를 들면, 전사 또는 스플라이싱을 포함하는 세포 기구의 실속(stalling)을 수반하는 표적 분해 또는 표적 점유이다.
"안티센스 올리고뉴클레오타이드"는 표적 핵산의 상응하는 영역 또는 세그먼트와의 혼성화를 허용하는 핵염기 서열을 갖는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다.
"염기 상보성"은 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 핵염기와 표적 핵산 내의 상응하는 핵염기의 정확한 염기쌍 형성(즉, 혼성화)에 대한 성능을 지칭하고, 상응하는 핵염기들 사이의 왓슨-크릭, 후그스틴(Hoogsteen) 또는 역전된 후그스틴 수소결합에 의해 매개된다.
"이환형 당 모이어티(moiety)"는 4원 내지 7원 고리의 2개 원자들을 연결하여 제2 고리를 형성함으로써 이환형 구조를 발생시키는 가교를 포함하는 4원 내지 7원 고리(푸라노실을 포함하나 이것으로 한정되지 않음)를 포함하는 변경된 당 모이어티를 의미한다. 일부 실시양태에서, 4원 내지 7원 고리는 당 고리이다. 일부 실시양태에서, 4원 내지 7원 고리는 푸라노실이다. 이러한 일부 실시양태에서, 가교는 푸라노실의 2'-탄소와 4'-탄소를 연결한다.
리보실 당 고리의 2'-하이드록실 기가 당 고리의 4'-탄소 원자에 연결되어 메틸렌옥시(4'-CH2-O-2') 가교를 형성함으로써 이환형 당 모이어티를 형성하는 LNA가 본 발명에 따른 LNA의 정의 내에 포함된다. 가교는 2'-산소 원자와 4'-탄소 원자를 연결하는 메틸렌(-CH2-) 기일 수도 있고, 이러한 이유로 용어 메틸렌옥시(4'-CH2-O-2') LNA가 사용된다. 나아가, 이 위치에서 에틸렌 가교 기를 갖는 이환형 당 모이어티의 경우, 용어 "에틸렌옥시(4'-CH2CH2-O-2') LNA가 사용된다. 메틸렌옥시(4'-CH2-O-2') LNA의 이성질체인 α-L-메틸렌옥시(4'-CH2-O-2')도 본원에서 사용된 바와 같이 LNA의 정의 내에 포함된다.
"캡 구조" 또는 "말단 캡 모이어티"는 안티센스 화합물의 어느 한 말단에서 도입되어 있는 화학적 변경을 의미한다.
"거세 저항성 전립선암" 또는 "거세-내성 전립선암" 및 전립선암 세포는 안드로겐 고갈 치료법 또는 항안드로겐제에 대한 전립선암 및 전립선암 세포의 민감성의 감소를 지칭한다.
"cEt" 또는 "구속된 에틸"은 4'-탄소와 2'-탄소를 연결하는 가교를 포함하는 이환형 당 모이어티를 의미하고, 이때 상기 가교는 화학식 4'-CH(CH3)-O-2'를 갖는다.
"구속된 에틸 뉴클레오사이드"(cEt 뉴클레오사이드로서도 지칭됨)는 4'-CH(CH3)-O-2' 가교를 포함하는 이환형 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오사이드를 의미한다.
"화학적으로 구별되는 영역"은 동일한 안티센스 화합물의 또 다른 영역과 어떤 방식으로든 화학적으로 상이한 안티센스 화합물의 영역을 지칭한다. 예를 들면, 2'-O-메톡시에틸 뉴클레오타이드를 갖는 영역은 2'-O-메톡시에틸 변경을 갖지 않는 뉴클레오타이드를 갖는 영역과 화학적으로 구별된다.
"키메라 안티센스 화합물"은 2개 이상의 화학적으로 구별되는 영역을 갖는 안티센스 화합물을 의미하고, 이때 각각의 위치는 복수의 서브유닛을 갖는다.
"상보성"은 제1 핵산 및 제2 핵산의 핵염기들 사이의 쌍 형성에 대한 성능을 의미한다.
"포함한다", "포함하고" 및 "포함하는"은 언급된 단계 또는 요소, 또는 단계 또는 요소 군의 포함을 내포하되, 임의의 다른 단계 또는 요소, 또는 단계 또는 요소 군을 배제하지 않는 것으로 이해될 것이다.
"인접한 핵염기들"은 서로 바로 인접한 핵염기들을 의미한다.
"데옥시리보뉴클레오타이드"는 뉴클레오타이드의 당 위치의 2' 위치에서 수소를 갖는 뉴클레오타이드를 의미한다. 데옥시리보뉴클레오타이드는 다양한 치환기들 중 임의의 치환기로 변경될 수 있다.
"디자인하는" 또는 "디자인된"은 선택되는 핵산 분자와 특이적으로 혼성화하는 올리고머 화합물을 디자인하는 과정을 지칭한다.
"다운스트림"은 핵산의 3' 말단 또는 C-말단을 향하는 상대적인 방향을 지칭한다.
"효능"은 원하는 효과를 생성하는 능력을 의미한다.
유방암 또는 유방암 세포와 관련하여 "에스트로겐 수용체(ER) 양성"은 에스트로겐 수용체(ER)를 발현하는 유방암 또는 유방암 세포를 지칭한다.
유방암 또는 유방암 세포와 관련하여 "에스트로겐 수용체(ER) 음성"은 에스트로겐 수용체(ER)를 발현하지 않는 유방암 또는 유방암 세포를 지칭한다.
"발현"은 유전자에 의해 코딩된 정보가 세포 내에 존재하고 세포 내에서 작동하는 구조물로 전환되게 하는 모든 기능들을 포함한다. 이러한 구조물은 전사 및 번역의 생성물들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
"완전 상보성" 또는 "100% 상보성"은 제1 핵산의 각각의 핵염기가 제2 핵산에서 상보적 핵염기를 갖는다는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 제1 핵산은 안티센스 화합물이고, 표적 핵산은 제2 핵산이다.
"갭머(Gapmer)"는 RNase H 절단을 뒷받침하는 복수의 뉴클레오사이드를 갖는 내부 영역이 하나 이상의 뉴클레오사이드를 갖는 외부 영역들 사이에 위치하고 있는 키메라 안티센스 화합물을 의미하고, 이때 내부 영역을 구성하는 뉴클레오사이드는 외부 영역을 구성하는 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드들과 화학적으로 구별된다. 상기 내부 영역은 "갭(gap)"으로서 지칭될 수 있고, 상기 외부 영역은 "윙(wing)"으로서 지칭될 수 있다.
유방암 또는 유방암 세포와 관련하여 "Her2/neu 음성"은 Her2/neu를 발현하지 않는 유방암 또는 유방암 세포를 지칭한다.
"혼성화"는 상보적 핵산 분자들의 어닐링을 의미한다. 일부 실시양태에서, 상보적 핵산 분자들은 안티센스 화합물 및 핵산 표적을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 상보적 핵산 분자들은 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 핵산 표적을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
"바로 인접한"은 바로 인접한 요소들 사이에 개재 요소가 없음을 의미한다.
"개체"는 치료 또는 치료법을 위해 선택되는 인간 또는 비-인간 동물을 의미한다.
"유도한다", "억제한다", "증강시킨다", "상승시킨다", "증가시킨다", "감소시킨다", "상향조절한다", "하향조절한다" 등은 일반적으로 두 상태 사이의 정량적 차이를 의미한다.
"발현 또는 활성을 억제하는"은 발현 또는 활성의 감소 또는 차단을 지칭하고, 반드시 발현 또는 활성의 완전한 제거를 표시하지는 않는다.
"뉴클레오사이드 간 결합"은 뉴클레오사이드들 사이의 화학결합을 지칭한다.
"연장된" 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 본원에 개시된 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 비해 상대적으로 하나 이상의 추가 뉴클레오사이드를 갖는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다.
"연결된 데옥시뉴클레오사이드"는 뉴클레오타이드를 형성하기 위해 포스페이트 에스테르에 의해 연결된 데옥시리보스로 치환된 핵산 염기(A, G, C, T 및 U)를 의미한다.
"연결된 뉴클레오사이드"는 뉴클레오사이드 간 결합에 의해 함께 연결된 인접 뉴클레오사이드들을 의미한다.
"불일치" 또는 "비-상보적 핵염기"는 제1 핵산의 핵염기가 제2 또는 표적 핵산의 상응하는 핵염기와 염기쌍을 형성할 수 없는 경우를 지칭한다.
"변경된 뉴클레오사이드 간 결합"은 천연 발생 뉴클레오사이드간 결합(즉, 포스포디에스테르 뉴클레오사이드간 결합)으로부터의 치환 또는 임의의 변화를 지칭한다.
"변경된 핵염기"는 아데닌, 사이토신, 구아닌, 타이미딘 또는 우라실 이외의 임의의 핵염기를 의미한다. "비변경된 핵염기"는 푸린 염기 아데닌(A) 및 구아닌(G), 및 피리미딘 염기 타이민(T), 사이토신(C) 및 우라실(U)을 의미한다.
"변경된 뉴클레오사이드"는 독립적으로 변경된 당 모이어티 및/또는 변경된 핵염기를 갖는 뉴클레오사이드를 의미한다.
"변경된 뉴클레오타이드"는 독립적으로 변경된 당 모이어티, 변경된 뉴클레오사이드 간 결합 또는 변경된 핵염기를 갖는 뉴클레오타이드를 의미한다.
"변경된 올리고뉴클레오타이드"는 하나 이상의 변경된 뉴클레오사이드 간 결합, 변경된 당 및/또는 변경된 핵염기를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다.
"변경된 당"은 천연 당 모이어티로부터의 치환 및/또는 임의의 변화를 의미한다.
"단량체"는 올리고머의 단일 유닛을 지칭한다. 단량체는 천연 발생 또는 변경된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
"모티프"는 안티센스 화합물에서 비변경된 뉴클레오사이드 및 변경된 뉴클레오사이드의 패턴을 의미한다.
"천연 당 모이어티"는 DNA(2'-H) 또는 RNA(2'-OH)에서 발견된 당 모이어티를 의미한다.
"천연 발생 뉴클레오사이드 간 결합"은 3'에서 5'으로의 포스포디에스테르 결합을 의미한다.
"비-상보적 핵염기"는 서로 수소결합을 형성하지 않거나 다른 방식으로 혼성화를 뒷받침하지 않는 한 쌍의 핵염기들을 지칭한다.
"핵산"은 단량체 뉴클레오타이드로 구성되는 분자를 지칭한다. 핵산은 리보핵산(RNA), 데옥시리보핵산(DNA), 단일 가닥 핵산 및 이중 가닥 핵산을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
"핵염기"는 또 다른 핵산의 염기와 쌍을 형성할 수 있는 헤테로환형 모이어티를 의미한다.
"핵염기 상보성"은 또 다른 핵염기와 염기쌍을 형성할 수 있는 핵염기를 지칭한다. 예를 들면, DNA에서 아데닌(A)은 타이민(T)에 상보적이다. 예를 들면, RNA에서 아데닌(A)은 우라실(U)에 상보적이다. 일부 실시양태에서, 상보적 핵염기는 그의 표적 핵산의 핵염기와 염기쌍을 형성할 수 있는 안티센스 화합물의 핵염기를 지칭한다. 예를 들면, 안티센스 화합물의 특정 위치에 있는 핵염기가 표적 핵산의 특정 위치에 있는 핵염기와 수소결합할 수 있는 경우, 올리고뉴클레오타이드와 표적 핵산 사이의 수소결합의 위치는 그 핵염기쌍에서 상보적인 것으로 간주된다.
"핵염기 서열"은 임의의 당, 결합 및/또는 핵염기 변경과 무관한 인접 핵염기들의 순서를 의미한다.
"뉴클레오사이드"는 당에 연결된 핵염기를 의미한다.
"뉴클레오사이드 미메틱(mimetic)"은 올리고머 화합물의 하나 이상의 위치에서 당 또는 당 및 염기, 및 (반드시는 아니지만) 결합을 대체하는 데 사용되는 구조물, 예를 들면, 모르폴리노, 사이클로헥세닐, 사이클로헥실, 테트라하이드로피라닐, 비사이클로 또는 트리사이클로 당 미메틱, 예를 들면, 비-푸라노스 당 유닛을 갖는 뉴클레오사이드 미메틱을 포함한다. 뉴클레오타이드 미메틱은 올리고머 화합물의 하나 이상의 위치에서 뉴클레오사이드 및 결합을 대체하는 데 사용되는 구조물, 예를 들면, 펩티드 핵산 또는 모르폴리노(-N(H)-C(=O)-O- 또는 다른 비-포스포디에스테르 결합에 의해 연결된 모르폴리노)를 포함한다. 당 대용물은 약간 더 넓은 용어인 뉴클레오사이드 미메틱과 중첩되지만 당 유닛(푸라노스 고리)만의 대체를 표시하기 위한 것이다. 본원에서 제공된 테트라하이드로피라닐 고리는 푸라노스 당 기가 테트라하이드로피라닐 고리 시스템으로 대체되어 있는 당 대용물의 일례를 예시한다. "미메틱"은 당, 핵염기 및/또는 뉴클레오사이드 간 결합을 치환시키는 기를 지칭한다. 일반적으로, 미메틱은 당 또는 당-뉴클레오사이드 간 결합 조합 대신에 사용되고, 핵염기는 선택되는 표적과의 혼성화를 위해 유지된다.
"뉴클레오타이드"는 뉴클레오사이드의 당 부분에 공유연결된 포스페이트 기를 갖는 뉴클레오사이드를 의미한다.
"올리고머 화합물"은 핵산 분자의 하나 이상의 영역에 혼성화할 수 있는 연결된 단량체 서브유닛들의 중합체를 의미한다.
"올리고뉴클레오사이드"는 뉴클레오사이드 간 결합이 인 원자를 함유하지 않는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다.
"올리고뉴클레오타이드"는 서로 독립적으로 각각 변경될 수 있거나 변경되지 않을 수 있는 연결된 뉴클레오사이드들의 중합체를 의미한다.
"포스포로티오에이트 결합"은 비-가교 산소 원자들 중 하나가 황 원자로 대체됨으로써 포스포디에스테르 결합이 변경되어 있는 뉴클레오사이드들 사이의 결합을 의미한다.
"부분"은 핵산의 정의된 수의 인접(즉, 연결된) 핵염기들을 의미한다. 일부 실시양태에서, 부분은 표적 핵산의 정의된 수의 인접 핵염기들이다. 일부 실시양태에서, 부분은 안티센스 화합물의 정해진 수의 인접 핵염기들이다.
유방암 또는 유방암 세포와 관련하여 "프로게스테론 수용체(PR) 음성"은 프로게스테론 수용체(PR)를 발현하지 않는 유방암 또는 유방암 세포를 지칭한다.
"영역"은 하나 이상의 확인될 수 있는 구조, 기능 또는 특징을 갖는 표적 핵산의 부분으로서 정의된다.
"리보뉴클레오타이드"는 뉴클레오타이드의 당 부분의 2' 위치에서 하이드록시를 갖는 뉴클레오타이드를 의미한다. 리보뉴클레오타이드는 다양한 치환기들 중 임의의 치환기로 변경될 수 있다.
"세그먼트"는 표적 핵산 내의 영역의 보다 작은 또는 하위 부분으로서 정의된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "부위"는 표적 핵산 내의 독특한 핵염기 위치로서 정의된다.
"특이적으로 혼성화될 수 있는"은 특이적 결합이 요구되는 조건 하에서, 즉 생체내 분석 및 치유적 치료의 경우 생리학적 조건 하에서 비-표적 핵산에 대한 최소한의 효과를 나타내거나 효과를 나타내지 않으면서 원하는 효과를 유도하기 위해 안티센스 올리고뉴클레오타이드와 표적 핵산 사이에 충분한 상보성 정도를 갖는 안티센스 화합물을 지칭한다. "엄격한 혼성화 조건" 또는 "엄격한 조건"은 올리고머 화합물이 그의 표적 서열에 혼성화할 것이되 최소한의 수의 다른 서열에 혼성화할 조건을 지칭한다.
"대상체"는 치료 또는 치료법을 위해 선택되는 인간 또는 비-인간 동물을 의미한다.
"상승작용" 또는 "상승작용한다"는 각각의 성분 단독의 효과의 가산적 효과보다 더 큰 조합의 효과를 지칭한다.
"표적"은 조절하고자 하는 단백질을 지칭한다.
"표적 유전자"는 표적을 코딩하는 유전자를 지칭한다.
"표적화"는 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하여 원하는 효과를 유도할 안티센스 화합물의 디자인 및 선택 과정을 의미한다.
"표적 핵산", "표적 RNA", "표적 RNA 전사체" 및 "핵산 표적"은 모두 안티센스 화합물에 의해 표적화될 수 있는 핵산을 의미한다.
"표적 영역"은 하나 이상의 안티센스 화합물이 표적화되는 표적 핵산의 부분을 의미한다.
"표적 세그먼트"는 안티센스 화합물이 표적화되는 표적 핵산의 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. "5' 표적 부위"는 표적 세그먼트의 5'-최외각 뉴클레오타이드를 지칭한다. "3' 표적 부위"는 표적 세그먼트의 3'-최외각 뉴클레오타이드를 지칭한다.
"암을 치료하는"은 암 또는 이에 동반된 증상의 호전을 유발하는 조치를 수행하는 것을 지칭한다. 상기 조치의 조합도 용어 "치료"에 포함된다. 암의 호전은 대상체에서 암세포의 수를 감소시키거나 대상체에서 암세포의 수를 감소시키는 것을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 본원에서 사용된 바와 같이, 상기 치료는 암과 관련하여 건강의 전체 회복도 포함한다. 본원에서 제공된 실시양태에 따라 사용되는 치료는 치료되는 모든 대상체들에서 효과적이지 않을 수 있다는 것을 이해해야 한다. 그러나, 본원에서 언급된 암을 앓고 있는 대상체의 집단은 성공적으로 치료될 수 있다. 일부 실시양태에서, "암을 치료하는"은 암을 갖는 대상체에서 종양의 크기를 감소시키는 것, 암을 갖는 대상체에서 종양의 성장 또는 증식을 감소시키는 것, 전이를 예방하거나 전이의 정도를 감소시키는 것, 및/또는 대조군에 비해 암을 갖는 대상체의 생존을 연장시키는 것을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다수의 상이한 파라미터들에 의해 기술될 수 있다. 이 정의에서 언급된 암은 전립선암, 유방암, 난소암, 위암 및 방광암으로부터 선택되는 암을 포함하는 임의의 암일 수 있다.
"비변경된" 핵염기는 푸린 염기 아데닌(A) 및 구아닌(G), 및 피리미딘 염기 타이민(T), 사이토신(C) 및 우라실(U)을 의미한다.
"비변경된 뉴클레오타이드"는 천연 발생 핵염기, 당 모이어티 및 뉴클레오사이드 간 결합로 구성되는 뉴클레오타이드를 의미한다. 일부 실시양태에서, 비변경된 뉴클레오타이드는 RNA 뉴클레오타이드(즉, β-D-리보뉴클레오사이드) 또는 DNA 뉴클레오타이드(즉, β-D-데옥시리보뉴클레오사이드)이다.
"업스트림"은 핵산의 5' 말단 또는 N-말단을 향하는 상대적인 방향을 지칭한다.
일부 실시양태
일부 실시양태는 안드로겐 수용체(AR) mRNA 발현을 억제하는 방법, 화합물 및 조성물을 제공한다.
일부 실시양태는 안드로겐 수용체 핵산으로 표적화되는 안티센스 화합물 또는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체 핵산은 진뱅크 등록 번호 NT_011669.17_TRUNC_5079000_5270000(본원에서 서열 번호 1로서 도입됨), 진뱅크 등록 번호 NM_000044.3(본원에서 서열 번호 2로서 도입됨), 진뱅크 등록 번호 NM_001011645.2(본원에서 서열 번호 3으로서 도입됨), 진뱅크 등록 번호 FJ235916.1(본원에서 서열 번호 4로서 도입됨), 진뱅크 등록 번호 FJ235917.1(본원에서 서열 번호 5로서 도입됨), 진뱅크 등록 번호 FJ235918.1(본원에서 서열 번호 6으로서 도입됨), 진뱅크 등록 번호 FJ235919.1(본원에서 서열 번호 7로서 도입됨), 또는 진뱅크 등록 번호 FJ235920.1(본원에서 서열 번호 8로서 도입됨)에 기재된 서열이다.
일부 실시양태에서, 화합물 또는 조성물은 AR로 표적화되는 변경된 올리고뉴클레오타이드(길이에 있어서 10개 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드를 가짐)를 포함한다. AR 표적은 서열 번호 1 내지 8 중 어느 한 서열 번호에서 언급된 서열, 또는 이의 부분 또는 이의 변이체를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, AR 표적은 엑손 1 내지 3을 함유하되 엑손 4 내지 8을 결여하는 AR-V1, AR-V2, AR-V3, AR-V4, AR-V5, AR-V6 및 AR-V7(AR3으로서도 지칭됨)을 포함하나 이들로 한정되지 않는 공지된 AR 스플라이싱 변이체들의 서열을 가질 수 있다. AR-V1, AR-V2, AR-V3, AR-V4, AR-V5, AR-V6, AR-V7, 및 본원에서 제공된 화합물에 의해 표적화될 수 있는 추가 스플라이싱 변이체는 문헌(Hu et al., Cancer Res 2009; 69:16-22) 및 미국 특허출원 공보 제2010/0068802호(이들 각각은 전체적으로 본원에 참고로 도입됨)에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 화합물 또는 조성물은 10개 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되고 서열 번호 12 내지 179 중 임의의 서열 번호의 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개 이상의 인접 핵염기들을 포함하는 핵염기 서열을 갖는 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 윙 세그먼트에서 하나 이상의 변경된 뉴클레오사이드가 변경된 당을 갖는다. 일부 실시양태에서, 변경된 당은 이환형 당이다. 일부 실시양태에서, 변경된 뉴클레오사이드는 LNA 뉴클레오사이드이다. 일부 실시양태에서, 변경된 뉴클레오사이드는 2'-치환된 뉴클레오사이드이다. 일부 실시양태에서, 2'-치환된 뉴클레오사이드는 이환형 당 변경을 갖는 뉴클레오사이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변경된 뉴클레오사이드는 2'-MOE 뉴클레오사이드이다. 일부 실시양태에서, 변경된 뉴클레오사이드는 구속된 에틸(cEt) 뉴클레오사이드이다.
일부 실시양태에서, 화합물 또는 조성물은 10개 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되고 서열 번호 12 내지 179 중 임의의 서열 번호의 핵염기 서열로 구성되는 핵염기 서열을 갖는 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 윙 세그먼트에서 하나 이상의 변경된 뉴클레오사이드가 변경된 당을 갖는다. 일부 실시양태에서, 변경된 당은 이환형 당이다. 일부 실시양태에서, 변경된 뉴클레오사이드는 LNA 뉴클레오사이드이다. 일부 실시양태에서, 변경된 뉴클레오사이드는 2'-치환된 뉴클레오사이드이다. 일부 실시양태에서, 2'-치환된 뉴클레오사이드는 이환형 당 변경을 갖는 뉴클레오사이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변경된 뉴클레오사이드는 2'-MOE 뉴클레오사이드이다. 일부 실시양태에서, 변경된 뉴클레오사이드는 구속된 에틸(cEt) 뉴클레오사이드이다.
일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체로 표적화되는 화합물 또는 조성물은 서열 번호 35, 39, 43, 124, 150, 155, 169 또는 175의 서열로 구성되는 핵염기 서열을 갖는, 16개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 단일 가닥의 변경된 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 AR로 표적화되는 안티센스 화합물은 ISIS 560131, ISIS 569213, ISIS 569216, ISIS 569221, ISIS 569236, ISIS 579671, ISIS 586124, ISIS 583918, ISIS 584149, ISIS 584163, ISIS 584269 또는 ISIS 584468이다.
일부 실시양태에서, 변경된 올리고뉴클레오타이드는 a) 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트(gap segment); b) 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트(wing segment); 및 c) 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트를 포함한다. 갭 세그먼트는 5' 윙 세그먼트와 3' 윙 세그먼트 사이에 위치하고, 각각의 윙 세그먼트의 각각의 뉴클레오사이드는 변경된 당을 포함한다.
일부 실시양태에서, 변경된 올리고뉴클레오타이드는 20개의 연결된 뉴클레오사이드, 즉 10개의 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트, 5개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트 및 5개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트로 구성되고; 각각의 윙 세그먼트의 각각의 뉴클레오사이드는 2'-O-메톡시에틸 당을 포함하고; 각각의 뉴클레오사이드 간 결합은 포스포로티오에이트 결합이고; 각각의 사이토신은 5-메틸사이토신이다.
일부 실시양태에서, 변경된 올리고뉴클레오타이드는 16개의 연결된 뉴클레오사이드, 즉 10개의 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트, 3개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트 및 3개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트로 구성되고; 각각의 윙 세그먼트의 각각의 뉴클레오사이드는 구속된 에틸(cEt) 당을 포함하고; 각각의 뉴클레오사이드 간 결합은 포스포로티오에이트 결합이고; 각각의 사이토신은 5-메틸사이토신이다.
일부 실시양태에서, 변경된 올리고뉴클레오타이드는 16개의 연결된 뉴클레오사이드, 즉 9개의 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트, 3개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트 및 4개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트로 구성되고; 상기 5' 윙 세그먼트의 3개의 연결된 뉴클레오사이드는 각각 구속된 에틸(cEt) 당이고; 상기 3' 윙 세그먼트의 4개의 연결된 뉴클레오사이드는 5'에서 3' 방향으로 구속된 에틸(cEt) 당, 구속된 에틸(cEt) 당, 구속된 에틸(cEt) 당 및 2'-O-메톡시에틸 당이고; 각각의 뉴클레오사이드 간 결합은 포스포로티오에이트 결합이고; 각각의 사이토신은 5-메틸사이토신이다.
일부 실시양태에서, 변경된 올리고뉴클레오타이드는 16개의 연결된 뉴클레오사이드, 즉 8개의 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트, 5개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트 및 3개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트로 구성되고; 상기 5' 윙 세그먼트의 5개의 연결된 뉴클레오사이드는 각각 구속된 에틸(cEt) 당이고; 상기 3' 윙 세그먼트의 3개의 연결된 뉴클레오사이드는 각각 구속된 에틸(cEt) 당이고; 각각의 뉴클레오사이드 간 결합은 포스포로티오에이트 결합이고; 각각의 사이토신은 5-메틸사이토신이다.
일부 실시양태에서, 변경된 올리고뉴클레오타이드는 16개의 연결된 뉴클레오사이드, 즉 8개의 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트, 4개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트 및 4개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트로 구성되고; 상기 5' 윙 세그먼트의 4개의 연결된 뉴클레오사이드는 5'에서 3' 방향으로 2'-O-메톡시에틸 당, 구속된 에틸(cEt) 당, 구속된 에틸(cEt) 당 및 구속된 에틸(cEt) 당이고; 상기 3' 윙 세그먼트의 4개의 연결된 뉴클레오사이드는 5'에서 3' 방향으로 구속된 에틸(cEt) 당, 구속된 에틸(cEt) 당, 구속된 에틸(cEt) 당 및 2'-O-메톡시에틸 당이고; 각각의 뉴클레오사이드 간 결합은 포스포로티오에이트 결합이고; 각각의 사이토신은 5-메틸사이토신이다.
일부 실시양태에서, 변경된 올리고뉴클레오타이드는 16개의 연결된 뉴클레오사이드, 즉 8개의 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트, 5개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트 및 3개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트로 구성되고; 상기 5' 윙 세그먼트의 5개의 연결된 뉴클레오사이드는 5'에서 3' 방향으로 2'-O-메톡시에틸 당, 2'-O-메톡시에틸 당, 구속된 에틸(cEt) 당, 구속된 에틸(cEt) 당 및 구속된 에틸(cEt) 당이고; 상기 3' 윙 세그먼트의 3개의 연결된 뉴클레오사이드는 각각 구속된 에틸(cEt) 당이고; 각각의 뉴클레오사이드 간 결합은 포스포로티오에이트 결합이고; 각각의 사이토신은 5-메틸사이토신이다.
일부 실시양태에서, 변경된 올리고뉴클레오타이드는 16개의 연결된 뉴클레오사이드, 즉 7개의 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트, 7개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트 및 2개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트로 구성되고; 상기 5' 윙 세그먼트의 7개의 연결된 뉴클레오사이드는 5'에서 3' 방향으로 2'-O-메톡시에틸 당, 구속된 에틸(cEt) 당, 구속된 에틸(cEt) 당, 2'-O-메톡시에틸 당, 2'-O-메톡시에틸 당, 구속된 에틸(cEt) 당 및 구속된 에틸(cEt) 당이고; 상기 3' 윙 세그먼트의 2개의 연결된 뉴클레오사이드는 각각 구속된 에틸(cEt) 당이고; 각각의 뉴클레오사이드 간 결합은 포스포로티오에이트 결합이고; 각각의 사이토신은 5-메틸사이토신이다.
일부 실시양태에서, 변경된 올리고뉴클레오타이드는 16개의 연결된 뉴클레오사이드, 즉 7개의 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트, 6개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트 및 3개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트로 구성되고; 상기 5' 윙 세그먼트의 6개의 연결된 뉴클레오사이드는 5'에서 3' 방향으로 2'-O-메톡시에틸 당, 구속된 에틸(cEt) 당, 구속된 에틸(cEt) 당, 2'-O-메톡시에틸 당, 구속된 에틸(cEt) 당 및 구속된 에틸(cEt) 당이고; 상기 3' 윙 세그먼트의 3개의 연결된 뉴클레오사이드는 각각 구속된 에틸(cEt) 당이고; 각각의 뉴클레오사이드 간 결합은 포스포로티오에이트 결합이고; 각각의 사이토신은 5-메틸사이토신이다.
일부 실시양태에서, 변경된 올리고뉴클레오타이드는 16개의 연결된 뉴클레오사이드, 즉 7개의 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트, 5개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트 및 4개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트로 구성되고; 상기 5' 윙 세그먼트의 5개의 연결된 뉴클레오사이드는 5'에서 3' 방향으로 2'-O-메톡시에틸 당, 2'-O-메톡시에틸 당, 구속된 에틸(cEt) 당, 구속된 에틸(cEt) 당 및 구속된 에틸(cEt) 당이고; 상기 3' 윙 세그먼트의 4개의 연결된 뉴클레오사이드는 5'에서 3' 방향으로 구속된 에틸(cEt) 당, 구속된 에틸(cEt) 당, 구속된 에틸(cEt) 당 및 2'-O-메톡시에틸 당이고; 각각의 뉴클레오사이드 간 결합은 포스포로티오에이트 결합이고; 각각의 사이토신은 5-메틸사이토신이다.
일부 실시양태에서, 변경된 올리고뉴클레오타이드는 16개의 연결된 뉴클레오사이드, 즉 7개의 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트, 4개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트 및 5개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트로 구성되고; 상기 5' 윙 세그먼트의 4개의 연결된 뉴클레오사이드는 5'에서 3' 방향으로 2'-O-메톡시에틸 당, 구속된 에틸(cEt) 당, 구속된 에틸(cEt) 당 및 구속된 에틸(cEt) 당이고; 상기 3' 윙 세그먼트의 5개의 연결된 뉴클레오사이드는 5'에서 3' 방향으로 구속된 에틸(cEt) 당, 구속된 에틸(cEt) 당, 구속된 에틸(cEt) 당, 2'-O-메톡시에틸 당 및 2'-O-메톡시에틸 당이고; 각각의 뉴클레오사이드 간 결합은 포스포로티오에이트 결합이고; 각각의 사이토신은 5-메틸사이토신이다.
일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체로 표적화되는 화합물 또는 조성물은 서열 번호 35, 39, 43, 124, 150, 155, 169 또는 175의 서열로 구성되는 핵염기 서열을 갖는, 16개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 단일 가닥의 변경된 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하고, 이때 상기 변경된 올리고뉴클레오타이드는 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트; 5' 윙 세그먼트; 및 3' 윙 세그먼트를 포함하고, 이때 상기 갭 세그먼트는 상기 5' 윙 세그먼트와 상기 3' 윙 세그먼트 사이에 위치하고, 각각의 윙 세그먼트의 각각의 뉴클레오사이드는 변경된 당을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변경된 올리고뉴클레오타이드의 각각의 뉴클레오사이드 간 결합은 포스포로티오에이트 결합이다. 일부 실시양태에서, 변경된 올리고뉴클레오타이드의 각각의 사이토신은 5'-메틸사이토신이다.
일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체로 표적화되는 화합물은 서열 번호 35의 서열로 구성되는 핵염기 서열을 갖는, 16개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 단일 가닥의 변경된 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하고, 이때 상기 변경된 올리고뉴클레오타이드는 9개의 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트; 3개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트; 및 4개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트를 포함하고, 이때 상기 갭 세그먼트는 상기 5' 윙 세그먼트와 상기 3' 윙 세그먼트 사이에 위치하고; 상기 5' 윙 세그먼트의 3개의 연결된 뉴클레오사이드는 각각 구속된 에틸(constrained ethyl; cEt) 당이고; 상기 3' 윙 세그먼트의 4개의 연결된 뉴클레오사이드는 5'에서 3' 방향으로 구속된 에틸(cEt) 당, 구속된 에틸(cEt) 당, 구속된 에틸(cEt) 당 및 2'-O-메톡시에틸 당이고; 각각의 뉴클레오사이드 간 결합은 포스포로티오에이트 결합이고; 각각의 사이토신은 5'-메틸사이토신이다.
일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체로 표적화되는 화합물은 서열 번호 39의 서열로 구성되는 핵염기 서열을 갖는, 16개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 단일 가닥의 변경된 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하고, 이때 상기 변경된 올리고뉴클레오타이드는 9개의 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트; 3개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트; 및 4개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트를 포함하고, 이때 상기 갭 세그먼트는 상기 5' 윙 세그먼트와 상기 3' 윙 세그먼트 사이에 위치하고; 상기 5' 윙 세그먼트의 3개의 연결된 뉴클레오사이드는 각각 구속된 에틸(cEt) 당이고; 상기 3' 윙 세그먼트의 4개의 연결된 뉴클레오사이드는 5'에서 3' 방향으로 구속된 에틸(cEt) 당, 구속된 에틸(cEt) 당, 구속된 에틸(cEt) 당 및 2'-O-메톡시에틸 당이고; 각각의 뉴클레오사이드 간 결합은 포스포로티오에이트 결합이고; 각각의 사이토신은 5'-메틸사이토신이다.
일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체로 표적화되는 화합물은 서열 번호 39의 서열로 구성되는 핵염기 서열을 갖는, 16개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 단일 가닥의 변경된 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하고, 이때 상기 변경된 올리고뉴클레오타이드는 8개의 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트; 4개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트; 및 4개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트를 포함하고, 이때 상기 갭 세그먼트는 상기 5' 윙 세그먼트와 상기 3' 윙 세그먼트 사이에 위치하고; 상기 5' 윙 세그먼트의 4개의 연결된 뉴클레오사이드는 5'에서 3' 방향으로 2'-O-메톡시에틸 당, 구속된 에틸(cEt) 당, 구속된 에틸(cEt) 당 및 구속된 에틸(cEt) 당이고; 상기 3' 윙 세그먼트의 4개의 연결된 뉴클레오사이드는 5'에서 3' 방향으로 구속된 에틸(cEt) 당, 구속된 에틸(cEt) 당, 구속된 에틸(cEt) 당 및 2'-O-메톡시에틸 당이고; 각각의 뉴클레오사이드 간 결합은 포스포로티오에이트 결합이고; 각각의 사이토신은 5'-메틸사이토신이다.
일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체로 표적화되는 화합물은 서열 번호 39의 서열로 구성되는 핵염기 서열을 갖는, 16개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 단일 가닥의 변경된 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하고, 이때 상기 변경된 올리고뉴클레오타이드는 8개의 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트; 5개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트; 및 3개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트를 포함하고, 이때 상기 갭 세그먼트는 상기 5' 윙 세그먼트와 상기 3' 윙 세그먼트 사이에 위치하고; 상기 5' 윙 세그먼트의 5개의 연결된 뉴클레오사이드는 5'에서 3' 방향으로 2'-O-메톡시에틸 당, 2'-O-메톡시에틸 당, 구속된 에틸(cEt) 당, 구속된 에틸(cEt) 당 및 구속된 에틸(cEt) 당이고; 상기 3' 윙 세그먼트의 3개의 연결된 뉴클레오사이드는 각각 구속된 에틸(cEt) 당이고; 각각의 뉴클레오사이드 간 결합은 포스포로티오에이트 결합이고; 각각의 사이토신은 5'-메틸사이토신이다.
일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체로 표적화되는 화합물은 서열 번호 39의 서열로 구성되는 핵염기 서열을 갖는, 16개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 단일 가닥의 변경된 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하고, 이때 상기 변경된 올리고뉴클레오타이드는 7개의 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트; 4개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트; 및 5개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트를 포함하고, 이때 상기 갭 세그먼트는 상기 5' 윙 세그먼트와 상기 3' 윙 세그먼트 사이에 위치하고; 상기 5' 윙 세그먼트의 4개의 연결된 뉴클레오사이드는 5'에서 3' 방향으로 2'-O-메톡시에틸 당, 구속된 에틸(cEt) 당, 구속된 에틸(cEt) 당 및 구속된 에틸(cEt) 당이고; 상기 3' 윙 세그먼트의 5개의 연결된 뉴클레오사이드는 5'에서 3' 방향으로 구속된 에틸(cEt) 당, 구속된 에틸(cEt) 당, 구속된 에틸(cEt) 당, 2'-O-메톡시에틸 당 및 2'-O-메톡시에틸 당이고; 각각의 뉴클레오사이드 간 결합은 포스포로티오에이트 결합이고; 각각의 사이토신은 5'-메틸사이토신이다.
일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체로 표적화되는 화합물은 서열 번호 35의 서열로 구성되는 핵염기 서열을 갖는, 16개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 단일 가닥의 변경된 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하고, 이때 상기 변경된 올리고뉴클레오타이드는 7개의 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트; 6개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트; 및 3개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트를 포함하고, 이때 상기 갭 세그먼트는 상기 5' 윙 세그먼트와 상기 3' 윙 세그먼트 사이에 위치하고; 상기 5' 윙 세그먼트의 6개의 연결된 뉴클레오사이드는 5'에서 3' 방향으로 2'-O-메톡시에틸 당, 구속된 에틸(cEt) 당, 구속된 에틸(cEt) 당, 2'-O-메톡시에틸 당, 구속된 에틸(cEt) 당 및 구속된 에틸(cEt) 당이고; 상기 3' 윙 세그먼트의 3개의 연결된 뉴클레오사이드는 각각 구속된 에틸(cEt) 당이고; 각각의 뉴클레오사이드 간 결합은 포스포로티오에이트 결합이고; 각각의 사이토신은 5'-메틸사이토신이다.
일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체로 표적화되는 화합물은 서열 번호 43의 서열로 구성되는 핵염기 서열을 갖는, 16개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 단일 가닥의 변경된 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하고, 이때 상기 변경된 올리고뉴클레오타이드는 10개의 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트; 3개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트; 및 3개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트를 포함하고, 이때 상기 갭 세그먼트는 상기 5' 윙 세그먼트와 상기 3' 윙 세그먼트 사이에 위치하고; 각각의 윙 세그먼트의 각각의 뉴클레오사이드는 구속된 에틸(cEt) 당을 포함하고; 각각의 뉴클레오사이드 간 결합은 포스포로티오에이트 결합이고; 각각의 사이토신은 5'-메틸사이토신이다.
일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체로 표적화되는 화합물은 서열 번호 124의 서열로 구성되는 핵염기 서열을 갖는, 16개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 단일 가닥의 변경된 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하고, 이때 상기 변경된 올리고뉴클레오타이드는 10개의 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트; 3개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트; 및 3개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트를 포함하고, 이때 상기 갭 세그먼트는 상기 5' 윙 세그먼트와 상기 3' 윙 세그먼트 사이에 위치하고; 각각의 윙 세그먼트의 각각의 뉴클레오사이드는 구속된 에틸(cEt) 당을 포함하고; 각각의 뉴클레오사이드 간 결합은 포스포로티오에이트 결합이고; 각각의 사이토신은 5'-메틸사이토신이다.
일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체로 표적화되는 화합물은 서열 번호 150의 서열로 구성되는 핵염기 서열을 갖는, 16개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 단일 가닥의 변경된 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하고, 이때 상기 변경된 올리고뉴클레오타이드는 10개의 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트; 3개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트; 및 3개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트를 포함하고, 이때 상기 갭 세그먼트는 상기 5' 윙 세그먼트와 상기 3' 윙 세그먼트 사이에 위치하고; 각각의 윙 세그먼트의 각각의 뉴클레오사이드는 구속된 에틸(cEt) 당을 포함하고; 각각의 뉴클레오사이드 간 결합은 포스포로티오에이트 결합이고; 각각의 사이토신은 5'-메틸사이토신이다.
일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체로 표적화되는 화합물은 서열 번호 155의 서열로 구성되는 핵염기 서열을 갖는, 16개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 단일 가닥의 변경된 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하고, 이때 상기 변경된 올리고뉴클레오타이드는 10개의 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트; 3개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트; 및 3개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트를 포함하고, 이때 상기 갭 세그먼트는 상기 5' 윙 세그먼트와 상기 3' 윙 세그먼트 사이에 위치하고; 각각의 윙 세그먼트의 각각의 뉴클레오사이드는 구속된 에틸(cEt) 당을 포함하고; 각각의 뉴클레오사이드 간 결합은 포스포로티오에이트 결합이고; 각각의 사이토신은 5'-메틸사이토신이다.
일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체로 표적화되는 화합물은 서열 번호 169의 서열로 구성되는 핵염기 서열을 갖는, 16개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 단일 가닥의 변경된 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하고, 이때 상기 변경된 올리고뉴클레오타이드는 10개의 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트; 3개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트; 및 3개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트를 포함하고, 이때 상기 갭 세그먼트는 상기 5' 윙 세그먼트와 상기 3' 윙 세그먼트 사이에 위치하고; 각각의 윙 세그먼트의 각각의 뉴클레오사이드는 구속된 에틸(cEt) 당을 포함하고; 각각의 뉴클레오사이드 간 결합은 포스포로티오에이트 결합이고; 각각의 사이토신은 5'-메틸사이토신이다.
일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체로 표적화되는 화합물은 서열 번호 175의 서열로 구성되는 핵염기 서열을 갖는, 16개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 단일 가닥의 변경된 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하고, 이때 상기 변경된 올리고뉴클레오타이드는 10개의 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트; 3개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트; 및 3개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트를 포함하고, 이때 상기 갭 세그먼트는 상기 5' 윙 세그먼트와 상기 3' 윙 세그먼트 사이에 위치하고; 각각의 윙 세그먼트의 각각의 뉴클레오사이드는 구속된 에틸(cEt) 당을 포함하고; 각각의 뉴클레오사이드 간 결합은 포스포로티오에이트 결합이고; 각각의 사이토신은 5'-메틸사이토신이다.
일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체 핵산으로 표적화되는 안티센스 화합물 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 1의 하기 뉴클레오타이드 영역 내에서 상보적이다: 2957-2972, 3079-3094, 3099-3114, 3109-3124, 3113-3128, 3120-3135, 3133-3148, 3224-3239, 3226-3241, 3351-3366, 3353-3368, 3361-3376, 3388-3403, 3513-3528, 3517-3532, 3519-3534, 3641-3656, 3735-3750, 3764-3779, 3768-3783, 3798-3813, 3799-3814, 3851-3866, 3870-3885, 3874-3889, 3876-3891, 3878-3893, 3884-3899, 3886-3901, 3888-3903, 3901-3916, 3956-3971, 3962-3977, 3964-3979, 3967-3982, 4019-4034, 4038-4053, 4049-4064, 4056-4071, 4059-4074, 4062-4077, 4066-4081, 4070-4085, 4101-4116, 4103-4118, 4105-4120, 4109-4124, 4305-4320, 4405-4420, 4532-4547, 4534-4549, 4537-4552, 4539-4554, 4555-4570, 4571-4586, 4573-4588, 4578-4593, 4597-4612, 4632-4647, 4655-4670, 4656-4671, 4662-4677, 4699-4714, 4747-4762, 4750-4765, 4752-4767, 4754-4769, 4755-4770, 4769-4784, 4798-4813, 4804-4819, 4807-4822, 4833-4848, 4837-4852, 4839-4854, 4865-4880, 4868-4883, 4872-4887, 4874-4889, 4876-4891, 4887-4902, 4889-4904, 4916-4931, 4918-4933, 4938-4953, 4942-4957, 4944-4959, 4951-4966, 5050-5065, 5052-5067, 5054-5069, 5056-5071, 5060-5075, 5061-5076, 5062-5077, 5133-5148, 5141-5156, 5155-5170, 5265-5280, 5293-5308, 5308-5323, 5392-5407, 5448-5463, 5469-5484, 5481-5496, 5483-5498, 5486-5501, 5488-5503, 5494-5509, 5521-5536, 5666-5681, 6222-6237, 6701-6716, 7543-7558, 8471-8486, 8638-8653, 9464-9479, 10217-10232, 10250-10265, 10865-10880, 11197-11212, 11855-11870, 13189-13204, 13321-13336, 13346-13361, 16555-16570, 16793-16808, 16968-16983, 17206-17221, 18865-18880, 29329-29344, 32290-32305, 33315-33330, 39055-39070, 40615-40630, 42017-42032, 56050-56065, 58719-58734, 58720-58739, 58720-58735, 58721-58736, 58722-58737, 58723-58738, 58724-58739, 58724-58739, 58725-58740, 58725-58740, 58725-58740, 58750-58769, 58750-58765, 58751-58766, 58752-58767, 58753-58768, 58754-58769, 58755-58770, 60902-60917, 67454-67469, 102156-102171, 114874-114889, 115272-115287, 115365-115380, 134971-134986, 139682-139697, 139762-139777, 139782-139797, 144856-144871, 144938-144953, 148406-148421, 148443-148458, 148520-148535, 181695-181710, 182958-182973, 또는 183049-183064.
일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체 핵산으로 표적화되는 안티센스 화합물 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 1의 하기 뉴클레오타이드 영역을 표적화한다: 2957-2972, 3079-3094, 3099-3114, 3109-3124, 3113-3128, 3120-3135, 3133-3148, 3224-3239, 3226-3241, 3351-3366, 3353-3368, 3361-3376, 3388-3403, 3513-3528, 3517-3532, 3519-3534, 3641-3656, 3735-3750, 3764-3779, 3768-3783, 3798-3813, 3799-3814, 3851-3866, 3870-3885, 3874-3889, 3876-3891, 3878-3893, 3884-3899, 3886-3901, 3888-3903, 3901-3916, 3956-3971, 3962-3977, 3964-3979, 3967-3982, 4019-4034, 4038-4053, 4049-4064, 4056-4071, 4059-4074, 4062-4077, 4066-4081, 4070-4085, 4101-4116, 4103-4118, 4105-4120, 4109-4124, 4305-4320, 4405-4420, 4532-4547, 4534-4549, 4537-4552, 4539-4554, 4555-4570, 4571-4586, 4573-4588, 4578-4593, 4597-4612, 4632-4647, 4655-4670, 4656-4671, 4662-4677, 4699-4714, 4747-4762, 4750-4765, 4752-4767, 4754-4769, 4755-4770, 4769-4784, 4798-4813, 4804-4819, 4807-4822, 4833-4848, 4837-4852, 4839-4854, 4865-4880, 4868-4883, 4872-4887, 4874-4889, 4876-4891, 4887-4902, 4889-4904, 4916-4931, 4918-4933, 4938-4953, 4942-4957, 4944-4959, 4951-4966, 5050-5065, 5052-5067, 5054-5069, 5056-5071, 5060-5075, 5061-5076, 5062-5077, 5133-5148, 5141-5156, 5155-5170, 5265-5280, 5293-5308, 5308-5323, 5392-5407, 5448-5463, 5469-5484, 5481-5496, 5483-5498, 5486-5501, 5488-5503, 5494-5509, 5521-5536, 5666-5681, 6222-6237, 6701-6716, 7543-7558, 8471-8486, 8638-8653, 9464-9479, 10217-10232, 10250-10265, 10865-10880, 11197-11212, 11855-11870, 13189-13204, 13321-13336, 13346-13361, 16555-16570, 16793-16808, 16968-16983, 17206-17221, 18865-18880, 29329-29344, 32290-32305, 33315-33330, 39055-39070, 40615-40630, 42017-42032, 56050-56065, 58719-58734, 58720-58739, 58720-58735, 58721-58736, 58722-58737, 58723-58738, 58724-58739, 58724-58739, 58725-58740, 58725-58740, 58725-58740, 58750-58769, 58750-58765, 58751-58766, 58752-58767, 58753-58768, 58754-58769, 58755-58770, 60902-60917, 67454-67469, 102156-102171, 114874-114889, 115272-115287, 115365-115380, 134971-134986, 139682-139697, 139762-139777, 139782-139797, 144856-144871, 144938-144953, 148406-148421, 148443-148458, 148520-148535, 181695-181710, 182958-182973, 또는 183049-183064.
일부 실시양태에서, 안티센스 화합물 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 안드로겐 수용체 핵산의 영역을 표적화한다. 일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체 핵산의 영역으로 표적화되는 이러한 화합물 또는 올리고뉴클레오타이드는 이 영역의 동등한 길이 핵염기 부분에 상보적인 인접 핵염기 부분을 갖는다. 예를 들면, 상기 부분은 본원에서 언급된 영역의 동등한 길이 부분에 상보적인 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개 또는 16개 이상의 인접 핵염기 부분일 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 화합물 또는 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호 1의 하기 뉴클레오타이드 영역들을 표적화한다: 2957-2972, 3079-3094, 3099-3114, 3109-3124, 3113-3128, 3120-3135, 3133-3148, 3224-3239, 3226-3241, 3351-3366, 3353-3368, 3361-3376, 3388-3403, 3513-3528, 3517-3532, 3519-3534, 3641-3656, 3735-3750, 3764-3779, 3768-3783, 3798-3813, 3799-3814, 3851-3866, 3870-3885, 3874-3889, 3876-3891, 3878-3893, 3884-3899, 3886-3901, 3888-3903, 3901-3916, 3956-3971, 3962-3977, 3964-3979, 3967-3982, 4019-4034, 4038-4053, 4049-4064, 4056-4071, 4059-4074, 4062-4077, 4066-4081, 4070-4085, 4101-4116, 4103-4118, 4105-4120, 4109-4124, 4305-4320, 4405-4420, 4532-4547, 4534-4549, 4537-4552, 4539-4554, 4555-4570, 4571-4586, 4573-4588, 4578-4593, 4597-4612, 4632-4647, 4655-4670, 4656-4671, 4662-4677, 4699-4714, 4747-4762, 4750-4765, 4752-4767, 4754-4769, 4755-4770, 4769-4784, 4798-4813, 4804-4819, 4807-4822, 4833-4848, 4837-4852, 4839-4854, 4865-4880, 4868-4883, 4872-4887, 4874-4889, 4876-4891, 4887-4902, 4889-4904, 4916-4931, 4918-4933, 4938-4953, 4942-4957, 4944-4959, 4951-4966, 5050-5065, 5052-5067, 5054-5069, 5056-5071, 5060-5075, 5061-5076, 5062-5077, 5133-5148, 5141-5156, 5155-5170, 5265-5280, 5293-5308, 5308-5323, 5392-5407, 5448-5463, 5469-5484, 5481-5496, 5483-5498, 5486-5501, 5488-5503, 5494-5509, 5521-5536, 5666-5681, 6222-6237, 6701-6716, 7543-7558, 8471-8486, 8638-8653, 9464-9479, 10217-10232, 10250-10265, 10865-10880, 11197-11212, 11855-11870, 13189-13204, 13321-13336, 13346-13361, 16555-16570, 16793-16808, 16968-16983, 17206-17221, 18865-18880, 29329-29344, 32290-32305, 33315-33330, 39055-39070, 40615-40630, 42017-42032, 56050-56065, 58719-58734, 58720-58739, 58720-58735, 58721-58736, 58722-58737, 58723-58738, 58724-58739, 58724-58739, 58725-58740, 58725-58740, 58725-58740, 58750-58769, 58750-58765, 58751-58766, 58752-58767, 58753-58768, 58754-58769, 58755-58770, 60902-60917, 67454-67469, 102156-102171, 114874-114889, 115272-115287, 115365-115380, 134971-134986, 139682-139697, 139762-139777, 139782-139797, 144856-144871, 144938-144953, 148406-148421, 148443-148458, 148520-148535, 181695-181710, 182958-182973 또는 183049-183064.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 안티센스 화합물 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 엑손 1, 예를 들면, 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 영역 2863-5593(엑손 1) 또는 27672-27853(엑손 1B) 내에서 AR을 표적화한다. 일부 실시양태에서, AR의 엑손 1로 표적화된 본원에서 제공된 안티센스 화합물은 서열 번호 1의 하기 뉴클레오타이드 영역들 중 임의의 뉴클레오타이드 영역 내에서 상보적이다: 2957-2972, 3079-3094, 3099-3114, 3109-3124, 3113-3128, 3120-3135, 3133-3148, 3224-3239, 3226-3241, 3351-3366, 3353-3368, 3361-3376, 3388-3403, 3513-3528, 3517-3532, 3519-3534, 3641-3656, 3735-3750, 3764-3779, 3768-3783, 3798-3813, 3799-3814, 3851-3866, 3870-3885, 3874-3889, 3876-3891, 3878-3893, 3884-3899, 3886-3901, 3888-3903, 3901-3916, 3956-3971, 3962-3977, 3964-3979, 3967-3982, 4019-4034, 4038-4053, 4047-4062, 4049-4064, 4056-4071, 4059-4074, 4062-4077, 4066-4081, 4070-4085, 4101-4116, 4103-4118, 4105-4120, 4109-4124, 4305-4320, 4405-4420, 4532-4547, 4534-4549, 4537-4552, 4539-4554, 4555-4570, 4571-4586, 4573-4588, 4578-4593, 4597-4612, 4632-4647, 4655-4670, 4656-4671, 4662-4677, 4699-4714, 4747-4762, 4750-4765, 4752-4767, 4754-4769, 4755-4770, 4769-4784, 4798-4813, 4804-4819, 4807-4822, 4833-4848, 4837-4852, 4839-4854, 4865-4880, 4868-4883, 4872-4887, 4874-4889, 4876-4891, 4887-4902, 4889-4904, 4916-4931, 4918-4933, 4938-4953, 4942-4957, 4944-4959, 4951-4966, 5050-5065, 5052-5067, 5054-5069, 5056-5071, 5060-5075, 5061-5076, 5062-5077, 5133-5148, 5141-5156, 5155-5170, 5265-5280, 5293-5308, 5308-5323, 5392-5407, 5448-5463, 5469-5484, 5481-5496, 5483-5498, 5486-5501, 5488-5503, 5494-5509 또는 5521-5536.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 안티센스 화합물 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 엑손 2, 예를 들면, 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 영역 102087-102238(엑손 2) 또는 139551-139834(엑손 2c) 내에서 AR을 표적화한다. 일부 실시양태에서, AR의 엑손 2로 표적화되는 본원에서 제공된 안티센스 화합물은 서열 번호 1의 하기 뉴클레오타이드 영역들 중 임의의 뉴클레오타이드 영역 내에서 상보적이다: 102155-102170, 102156-102171, 139682-139697, 139762-139777 또는 139782-139797.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 안티센스 화합물 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 엑손 3, 예를 들면, 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 영역 144841-144957(엑손 3), 148380-148594(엑손 3b) 또는 153504-154908(엑손 3d) 내에서 AR을 표적화한다. 일부 실시양태에서, AR의 엑손 3으로 표적화되는 본원에서 제공된 안티센스 화합물은 서열 번호 1의 하기 뉴클레오타이드 영역들 중 임의의 뉴클레오타이드 영역 내에서 상보적이다: 144856-144871, 144938-144953, 148406-148421, 148443-148458 또는 148520-148535.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 안티센스 화합물 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 엑손 7, 예를 들면, 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 영역 181658-181815 내에서 AR을 표적화한다. 일부 실시양태에서, AR의 엑손 7로 표적화되는 본원에서 제공된 안티센스 화합물은 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 영역 181695-181710 내에서 상보적이다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 안티센스 화합물 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 엑손 8, 예를 들면, 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 영역 182517-189455 내에서 AR을 표적화한다. 일부 실시양태에서, AR의 엑손 8로 표적화되는 본원에서 제공된 안티센스 화합물은 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 영역 182958-182973 또는 183049-183064 내에서 상보적이다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 안티센스 화합물 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 인트론 1, 예를 들면, 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 영역 5594-27671 또는 27854-102086 내에서 AR을 표적화한다. 일부 실시양태에서, AR의 인트론 1로 표적화되는 본원에서 제공된 안티센스 화합물은 서열 번호 1의 하기 뉴클레오타이드 영역들 중 임의의 뉴클레오타이드 영역 내에서 상보적이다: 5666-5681, 6222-6237, 6701-6716, 7543-7558, 8471-8486, 8638-8653, 9464-9479, 10217-10232, 10250-10265, 10865-10880, 11197-11212, 11855-11870, 13189-13204, 13321-13336, 13346-13361, 16555-16570, 16793-16808, 16968-16983, 17206-17221, 18865-18880, 29329-29344, 32290-32305, 33315-33330, 39055-39070, 40615-40630, 42017-42032, 56050-56065, 58719-58734, 58720-58739, 58720-58735, 58721-58736, 58722-58737, 58723-58738, 58724-58739, 58724-58739, 58725-58740, 58725-58740, 58725-58740, 58750-58769, 58750-58765, 58751-58766, 58752-58767, 58753-58768, 58754-58769, 58755-58770, 60902-60917 또는 67454-67469.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 안티센스 화합물 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 인트론 2, 예를 들면, 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 영역 102239-139550 또는 139835-144840 내에서 AR을 표적화한다. 일부 실시양태에서, AR의 인트론 2로 표적화되는 본원에서 제공된 안티센스 화합물은 서열 번호 1의 하기 뉴클레오타이드 영역들 중 임의의 뉴클레오타이드 영역 내에서 상보적이다: 114874-114889, 115272-115287, 115365-115380 또는 134971-134986.
일부 실시양태에서, 안티센스 화합물 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의해 표적화될 때 서열 번호 1의 하기 뉴클레오타이드 영역들은 50% 이상의 억제를 나타낸다: 3099-3114, 3120-3135, 3351-3366, 3353-3368, 3361-3376, 3513-3528, 3519-3534, 3768-3783, 3799-3814, 3851-3866, 3888-3903, 4059-4074, 4534-4549, 4555-4570, 4571-4586, 4578-4593, 4655-4670, 4699-4714, 4750-4765, 4755-4770, 4865-4880, 5054-5069, 5060-5075, 5061-5076, 5062-5077, 5155-5170, 5265-5280, 5392-5407, 5448-5463, 5483-5498, 7543-7558, 8471-8486, 8638-8653, 9464-9479, 10217-10232, 10250-10265, 10865-10880, 11197-11212, 11855-11870, 13189-13204, 13321-13336, 13346-13361, 16555-16570, 16793-16808, 16968-16983, 17206-17221, 18865-18880, 29329-29344, 32290-32305, 33315-33330, 39055-39070, 40615-40630, 42017-42032, 56050-56065, 58719-58734, 58720-58735, 58720-58739, 58721-58736, 58722-58737, 58723-58738, 58724-58739, 58725-58740, 58750-58765, 58750-58769, 58751-58766, 58752-58767, 58753-58768, 58754-58769, 58755-58770, 60902-60917, 67454-67469, 102156-102171, 114874-114889, 114874-114889, 115272-115287, 115365-115380, 134971-134986, 144856-144871, 181695-181710, 182958-182973 및 183049-183064.
일부 실시양태에서, 안티센스 화합물 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의해 표적화될 때 서열 번호 1의 하기 뉴클레오타이드 영역들은 60% 이상의 억제를 나타낸다: 3799-3814, 3851-3866, 3888-3903, 4059-4074, 4534-4549, 4555-4570, 4571-4586, 4578-4593, 4655-4670, 4699-4714, 4755-4770, 4865-4880, 5060-5075, 5061-5076, 5062-5077, 5155-5170, 5265-5280, 5392-5407, 5448-5463, 5483-5498, 7543-7558, 8471-8486, 8638-8653, 9464-9479, 10217-10232, 10250-10265, 10865-10880, 11197-11212, 11855-11870, 13189-13204, 13321-13336, 13346-13361, 16555-16570, 16793-16808, 16968-16983, 17206-17221, 18865-18880, 29329-29344, 32290-32305, 33315-33330, 42017-42032, 56050-56065, 58719-58734, 58720-58735, 58720-58739, 58721-58736, 58722-58737, 58723-58738, 58724-58739, 58725-58740, 58750-58765, 58750-58769, 58751-58766, 58752-58767, 58753-58768, 58754-58769, 58755-58770, 67454-67469, 102156-102171, 115272-115287, 115365-115380, 144856-144871, 181695-181710, 182958-182973 및 183049-183064.
일부 실시양태에서, 안티센스 화합물 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의해 표적화될 때 서열 번호 1의 하기 뉴클레오타이드 영역들은 70% 이상의 억제를 나타낸다: 3799-3814, 3851-3866, 3888-3903, 4059-4074, 4534-4549, 4655-4670, 4699-4714, 4755-4770, 4865-4880, 5060-5075, 5062-5077, 5155-5170, 5265-5280, 5392-5407, 5448-5463, 5483-5498, 7543-7558, 8471-8486, 8638-8653, 9464-9479, 10865-10880, 11197-11212, 11855-11870, 13189-13204, 13321-13336, 13346-13361, 16555-16570, 16793-16808, 16968-16983, 17206-17221, 18865-18880, 33315-33330, 42017-42032, 58719-58734, 58720-58739, 58720-58735, 58721-58736, 58722-58737, 58723-58738, 58724-58739, 58725-58740, 58750-58769, 58750-58765, 58751-58766, 58752-58767, 58753-58768, 58754-58769, 58755-58770, 102156-102171, 115365-115380, 144856-144871, 181695-181710, 182958-182973 및 183049-183064.
일부 실시양태에서, 안티센스 화합물 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의해 표적화될 때 서열 번호 1의 하기 뉴클레오타이드 영역들은 80% 이상의 억제를 나타낸다: 3799-3814, 3851-3866, 3888-3903, 4059-4074, 4534-4549, 4655-4670, 4699-4714, 4755-4770, 4865-4880, 5060-5075, 5062-5077, 5155-5170, 5265-5280, 5392-5407, 5448-5463, 5483-5498, 8471-8486, 8638-8653, 9464-9479, 10865-10880, 11197-11212, 13189-13204, 16793-16808, 58719-58734, 58720-58735, 58721-58736, 58722-58737, 58723-58738, 58724-58739, 58725-58740, 58750-58765, 58751-58766, 58752-58767, 58753-58768, 58754-58769, 58755-58770, 102156-102171, 144856-144871, 181695-181710, 182958-182973 및 183049-183064.
일부 실시양태에서, 안티센스 화합물 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의해 표적화될 때 서열 번호 1의 하기 뉴클레오타이드 영역들은 90% 이상의 억제를 나타낸다: 4534-4549, 5060-5075, 5062-5077, 5155-5170, 5265-5280, 5448-5463, 58720-58735, 58721-58736, 58722-58737, 58723-58738, 58724-58739, 58725-58740, 58750-58765, 58751-58766, 58752-58767, 58753-58768, 58754-58769, 58755-58770, 182958-182973 및 183049-183064.
일부 실시양태에서, 하기 안티센스 화합물 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 안드로겐 수용체 핵산의 영역을 표적화하고 안드로겐 수용체 mRNA의 50% 이상의 억제를 달성한다: ISIS 번호 549332, 549334, 549338, 549347, 549358, 549360, 549361, 549362, 549366, 549371, 549372, 549374, 549377, 549379, 549380, 549381, 549387, 549390, 549414, 549432, 549434, 549457, 549458, 549459, 560071, 560098, 560099, 560100, 560131, 560132, 560133, 560137, 569213, 569215, 569216, 569220, 569222, 569223, 569227, 569228, 569229, 569236, 569238, 583559, 583567, 583608, 583609, 583613, 583635, 583638, 583662, 583795, 583796, 583799, 583834, 583919, 584145, 584148, 584149, 584152, 584157, 584158, 584162, 584163, 584165, 584166, 584167, 584168, 584179, 584180, 584183, 584184, 584192, 584233, 584242, 584245, 584263, 584269, 584274, 584312, 584329, 584361, 584465, 584465, 584468, 584469, 584469, 584495, 584495, 585233, 585259, 585262, 585263, 585264, 585265, 585268, 585269, 585271, 585274, 586124, 586224, 586224, 586225, 586225, 586227 및 586227.
일부 실시양태에서, 하기 안티센스 화합물 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 안드로겐 수용체 핵산의 영역을 표적화하고 안드로겐 수용체 mRNA의 50% 이상의 억제를 달성한다: 서열 번호 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 29, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 46, 49, 53, 54, 55, 57, 59, 63, 92, 93, 95, 101, 125, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176 및 177.
일부 실시양태에서, 하기 안티센스 화합물 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 안드로겐 수용체 핵산의 영역을 표적화하고 안드로겐 수용체 mRNA의 60% 이상의 억제를 달성한다: ISIS 번호 549332, 549334, 549338, 549347, 549358, 549360, 549361, 549362, 549366, 549371, 549372, 549374, 549377, 549379, 549380, 549381, 549387, 549390, 549414, 549432, 549434, 549457, 549458, 549459, 560071, 560098, 560099, 560100, 560131, 560137, 569213, 569216, 569222, 569228, 569236, 583795, 583796, 583799, 584145, 584148, 584149, 584152, 584157, 584158, 584162, 584163, 584165, 584166, 584167, 584168, 584179, 584180, 584183, 584184, 584192, 584233, 584242, 584245, 584274, 584312, 584361, 584468, 584469, 585233, 585259, 585262, 585263, 585264, 585265, 585268, 585269, 585274, 586124, 586224, 586225 및 586227.
일부 실시양태에서, 하기 안티센스 화합물 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 안드로겐 수용체 핵산의 영역을 표적화하고 안드로겐 수용체 mRNA의 60% 이상의 억제를 달성한다: 서열 번호 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 29, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 92, 93, 95, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 170, 171, 173, 175 및 176.
일부 실시양태에서, 하기 안티센스 화합물 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 안드로겐 수용체 핵산의 영역을 표적화하고 안드로겐 수용체 mRNA의 70% 이상의 억제를 달성한다: ISIS 번호 549332, 549334, 549338, 549347, 549358, 549360, 549361, 549362, 549366, 549371, 549372, 549374, 549377, 549379, 549380, 549381, 549387, 549390, 549414, 549432, 549434, 549457, 549458, 549459, 560071, 560098, 560099, 560100, 560131, 560137, 569222, 584145, 584148, 584149, 584152, 584162, 584163, 584165, 584166, 584167, 584168, 584179, 584180, 584183, 584184, 584192, 584245, 584274, 584469, 585259, 585262, 585268, 585269, 586124, 586224, 586225 및 586227.
일부 실시양태에서, 하기 안티센스 화합물 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 안드로겐 수용체 핵산의 영역을 표적화하고 안드로겐 수용체 mRNA의 70% 이상의 억제를 달성한다: 서열 번호 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 29, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 43, 148, 149, 150, 151, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 167, 170 및 176.
일부 실시양태에서, 하기 안티센스 화합물 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 안드로겐 수용체 핵산의 영역을 표적화하고 안드로겐 수용체 mRNA의 80% 이상의 억제를 달성한다: ISIS 번호 549332, 549334, 549338, 549347, 549358, 549360, 549361, 549362, 549366, 549371, 549372, 549374, 549377, 549379, 549380, 549381, 549387, 549390, 549414, 549432, 549434, 549457, 549458, 549459, 560098, 560099, 560100, 560137, 584148, 584149, 584152, 584162, 584163, 584166, 584180, 586124, 586224, 586225 및 586227.
일부 실시양태에서, 하기 안티센스 화합물 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 안드로겐 수용체 핵산의 영역을 표적화하고 안드로겐 수용체 mRNA의 80% 이상의 억제를 달성한다: 서열 번호 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 29, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 39, 40, 41, 43, 149, 150, 151, 154, 155, 157 및 161.
일부 실시양태에서, 하기 안티센스 화합물 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 안드로겐 수용체 핵산의 영역을 표적화하고 안드로겐 수용체 mRNA의 90% 이상의 억제를 달성한다: ISIS 번호 549358, 549371, 549372, 549374, 549377, 549380, 549432, 549434, 549457, 549458, 549459, 560098, 560099, 560100, 560137 및 586224.
일부 실시양태에서, 하기 안티센스 화합물 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 안드로겐 수용체 핵산의 영역을 표적화하고 안드로겐 수용체 mRNA의 90% 이상의 억제를 달성한다: 서열 번호 16, 21, 22, 23, 24, 26, 33, 34, 35, 36, 37, 39, 40 및 41.
안드로겐 수용체 mRNA의 % 억제는 당업자에게 공지되어 있는, 예컨대, 실시예 1에 기재되어 있는 표준 방법을 이용함으로써 측정될 수 있다.
본원에 함유된 예에서 각각의 서열 번호로 기재된 서열은 당 모이어티, 뉴클레오사이드 간 결합 또는 핵염기에 대한 임의의 변경과 무관하다는 것이 이해된다. 따라서, 서열 번호에 의해 정의된 안티센스 화합물은 독립적으로 당 모이어티, 뉴클레오사이드 간 결합 또는 핵염기에 대한 하나 이상의 변경을 포함할 수 있다. ISIS 번호(ISIS #)에 의해 기재된 안티센스 화합물은 핵염기 서열, 화학적 변경 및 모티프의 조합을 표시한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 화합물 또는 조성물은 HuVEC 세포에게 전달되었을 때 250 nM 미만, 200 nM 미만, 150 nM 미만, 100 nM 미만, 90 nM 미만, 80 nM 미만, 70 nM 미만, 65 nM 미만, 60 nM 미만, 55 nM 미만, 50 nM 미만, 45 nM 미만, 40 nM 미만, 35 nM 미만, 30 nM 미만, 25 nM 미만 또는 20 nM 미만의 시험관내 IC50 중 하나 이상을 가짐으로써 효능을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 억제는 본원에 기재된 바와 같이 프라이머 프로브 세트 RTS3559로 측정된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 화합물 또는 조성물은 식염수 처리된 동물에 비해 4배, 3배 또는 2배 이하의 ALT 또는 AST 값의 증가, 및 30%, 20%, 15%, 12%, 10%, 5% 또는 2% 이하의 간, 비장 또는 신장 중량의 증가 중 하나 이상을 가짐으로써 입증된 바와 같이 고도의 내약성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 화합물 또는 조성물은 식염수 처리된 동물에 비해 ALT 또는 AST의 증가를 갖지 않음으로써 입증된 바와 같이 고도의 내약성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 화합물 또는 조성물은 식염수 처리된 동물에 비해 간, 비장 또는 신장 중량의 증가를 갖지 않음으로써 입증된 바와 같이 고도의 내약성을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 안티센스 화합물은 N-말단 도메인을 코딩하는 엑손 1 및 DNA 결합 도메인을 코딩하는 엑손 2 및 3을 포함하되 짧은 힌지 영역을 코딩하는 엑손 4의 적어도 부분 또는 리간드 결합 도메인을 코딩하는 엑손 4 내지 8의 적어도 부분을 포함하지 않는 AR 스플라이싱 변이체를 표적화한다. 이러한 AR 스플라이싱 변이체의 일례로는 엑손 1 내지 3을 함유하되 엑손 4 내지 8을 결여하는 AR-V7이 있으나 이것으로 한정되지 않는다. 이러한 AR 스플라이싱 변이체의 추가 예로는 AR3, AR4, AR4b, AR5 및 AR6(각각 서열 번호 4 내지 8)이 있다. 일부 실시양태에서, 엑손 3의 3' 말단의 업스트림 및/또는 리간드 결합 도메인의 업스트림에서 AR로 표적화되는 안티센스 화합물은 리간드 결합 도메인으로 표적화되는 안티센스 화합물, 예컨대, 엑손 4로 표적화되고 미국 특허 제7,737,125호에 기재된 서열 번호 58에 상응하는 EZN-4176보다 더 큰 정도로 안드로겐 수용체 수준을 억제할 수 있다.
일부 실시양태에서, 안티센스 화합물은 기능성 DNA 결합 도메인을 갖되 기능성 리간드 결합 도메인을 갖지 않는 AR 스플라이싱 변이체를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 화합물이 N-말단 도메인을 코딩하는 엑손 1의 전체 또는 적어도 기능성 부분 및 DNA 결합 도메인을 코딩하는 엑손 2 및 3의 전체 또는 적어도 기능성 부분을 포함하되 짧은 힌지 영역을 코딩하는 엑손 4의 적어도 기능성 부분 또는 리간드 결합 도메인을 코딩하는 엑손 4 내지 8의 적어도 기능성 부분을 포함하지 않는 AR 스플라이싱 변이체를 표적화할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 실질적으로 엑손 1 내지 3으로 구성된, 본원에서 제공된 안티센스 화합물에 의해 표적화되는 특정 AR 스플라이싱 변이체는 게놈 영역 또는 엑손 4 내지 8로부터의 핵산 서열의 비-기능성 부분도 포함할 수 있다고 생각된다. 스플라이싱 과정은 DNA 결합 기능을 보유하되 리간드 결합 기능을 보유하지 않는 이러한 AR 스플라이싱 변이체를 발생시킬 수 있다고 생각된다. 일부 실시양태에서, 기능성 DNA 결합 도메인을 갖되 기능성 리간드 결합 도메인을 갖지 않는 AR 스플라이싱 변이체로 표적화되는 안티센스 화합물은 거세 저항성을 나타내는 전립선암 세포의 성장 또는 증식을 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 기능성 DNA 결합 도메인을 갖되 기능성 리간드 결합 도메인을 갖지 않는 AR 스플라이싱 변이체로 표적화되는 안티센스 화합물은 화학식 XI의 디아릴하이단토인 AR 억제제에 대한 내성이 있는 전립선암 세포의 성장 또는 증식을 리간드 결합 도메인으로 표적화되는 안티센스 화합물, 예컨대, 엑손 4로 표적화되고 미국 특허 제7,737,125호에 기재된 서열 번호 58에 상응하는 EZN-4176보다 더 큰 정도로 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 안티센스 화합물은 엑손 3의 3' 말단의 업스트림 및/또는 리간드 결합 도메인의 업스트림에 존재하는 엑손 1 내에서 AR을 표적화한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 안티센스 화합물은 엑손 3의 3' 말단의 업스트림 및/또는 리간드 결합 도메인의 업스트림에 존재하는 엑손 2 내에서 AR을 표적화한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 안티센스 화합물은 엑손 3의 3' 말단의 업스트림 및/또는 리간드 결합 도메인의 업스트림에 존재하는 인트론 1 내에서 AR을 표적화한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 안티센스 화합물은 전체 길이 AR; 및 N-말단 도메인을 코딩하는 엑손 1 및 DNA 결합 도메인을 코딩하는 엑손 2 및 3을 포함하되 짧은 힌지 영역을 코딩하는 엑손 4의 적어도 부분 또는 리간드 결합 도메인을 코딩하는 엑손 4 내지 8 중 어느 한 엑손의 적어도 부분을 포함하지 않는 AR 스플라이싱 변이체 둘 다의 발현을 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 안티센스 화합물은 리간드 결합 도메인의 업스트림에서 인간 안드로겐 수용체를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 이러한 안티센스 화합물은 엑손 3의 3' 말단의 업스트림에서 인간 안드로겐 수용체를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 안티센스 화합물은 엑손 3의 3' 말단의 업스트림 및/또는 리간드 결합 도메인의 업스트림에 존재하는 엑손 1 내에서 AR을 표적화한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 안티센스 화합물은 엑손 3의 3' 말단의 업스트림 및/또는 리간드 결합 도메인의 업스트림에 존재하는 엑손 2 내에서 AR을 표적화한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 안티센스 화합물은 엑손 3의 3' 말단의 업스트림 및/또는 리간드 결합 도메인의 업스트림에 존재하는 인트론 1 내에서 AR을 표적화한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 안티센스 화합물은 N-말단 도메인을 코딩하는 엑손 1 및 DNA 결합 도메인을 코딩하는 엑손 2 및 3을 포함하되 짧은 힌지 영역을 코딩하는 엑손 4의 적어도 부분 또는 리간드 결합 도메인을 코딩하는 엑손 4 내지 8의 적어도 부분을 포함하지 않는 AR 스플라이싱 변이체를 표적화한다. 이러한 AR 스플라이싱 변이체의 일례로는 엑손 1 내지 3을 함유하되 엑손 4 내지 8을 결여하는 AR-V7이 있으나 이것으로 한정되지 않는다.
일부 실시양태는 내성 전립선암 세포의 성장 또는 증식을 리간드 결합 도메인으로 표적화되는 안티센스 화합물, 예컨대, 엑손 4로 표적화되고 미국 특허 제7,737,125호에 기재된 서열 번호 58에 상응하는 EZN-4176보다 더 큰 정도로 억제할 수 있는, 리간드 결합 도메인의 업스트림에서 인간 안드로겐 수용체(AR)로 표적화되는 안티센스 화합물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 리간드 결합 도메인의 업스트림에서 인간 안드로겐 수용체(AR)로 표적화되는 안티센스 화합물은 엑손 3의 3' 말단의 업스트림에서 AR의 영역으로 표적화된다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 안티센스 화합물은 엑손 3의 3' 말단의 업스트림 및/또는 리간드 결합 도메인의 업스트림에 존재하는 엑손 1 내에서 AR을 표적화한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 안티센스 화합물은 엑손 3의 3' 말단의 업스트림 및/또는 리간드 결합 도메인의 업스트림에 존재하는 엑손 2 내에서 AR을 표적화한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 안티센스 화합물은 엑손 3의 3' 말단의 업스트림 및/또는 리간드 결합 도메인의 업스트림에 존재하는 인트론 1 내에서 AR을 표적화한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 변경된 올리고뉴클레오타이드의 핵염기 서열은 변경된 올리고뉴클레오타이드의 전체에 걸쳐 측정될 때 서열 번호 1 내지 8 중 어느 한 서열 번호에 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 이상 상보적이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 화합물은 12개 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변경된 올리고뉴클레오타이드이고 상기 변경된 올리고뉴클레오타이드의 전체에 걸쳐 측정될 때 서열 번호 1 내지 8 중 어느 한 서열 번호에 90% 이상 상보적인 핵염기 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 안티센스 화합물은 12개 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변경된 올리고뉴클레오타이드이고 상기 변경된 올리고뉴클레오타이드의 전체에 걸쳐 측정될 때 서열 번호 1 내지 8 중 어느 한 서열 번호에 100% 상보적인 핵염기 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 화합물 또는 변경된 올리고뉴클레오타이드는 단일 가닥이다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 변경된 올리고뉴클레오타이드는 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개 또는 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다. 일부 실시양태에서, 변경된 올리고뉴클레오타이드는 20개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다. 일부 실시양태에서, 변경된 올리고뉴클레오타이드는 16개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성된다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 변경된 올리고뉴클레오타이드의 하나 이상의 뉴클레오사이드 간 결합은 변경된 뉴클레오사이드 간 결합이다. 일부 실시양태에서, 각각의 뉴클레오사이드 간 결합은 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드 간 결합이다.
일부 실시양태에서, 변경된 올리고뉴클레오타이드의 하나 이상의 뉴클레오사이드는 변경된 당을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 변경된 당은 2'-O-메톡시에틸 기(2'-O(CH2)2-OCH3)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변경된 당은 2'-O-CH3 기를 포함한다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 변경된 당은 이환형 당이다. 일부 실시양태에서, 이환형 당은 4'-(CH2)n-O-2' 가교를 포함하고, 이때 n은 1 또는 2이다. 일부 실시양태에서, 이환형 당은 4'-CH2-O-2' 가교를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이환형 당은 4'-CH(CH3)-O-2' 가교를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 변경된 올리고뉴클레오타이드의 하나 이상의 뉴클레오사이드는 변경된 핵염기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변경된 핵염기는 5-메틸사이토신이다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 변경된 올리고뉴클레오타이드는 단일 가닥의 변경된 올리고뉴클레오타이드로 구성된다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 화합물 또는 조성물은 변경된 올리고뉴클레오타이드의 염을 포함한다.
약학 조성물을 제제화하기 위한 조성물 및 방법
안티센스 올리고뉴클레오타이드는 약학 조성물 또는 제제의 제조를 위해 약학적으로 허용가능한 활성 또는 불활성 물질과 혼합될 수 있다. 약학 조성물을 제제화하는 조성물 및 방법은 투여 경로, 질환의 정도 또는 투여되는 용량을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다수의 기준에 의존한다.
안드로겐 수용체 핵산으로 표적화되는 안티센스 화합물은 안티센스 화합물을 적합한 약학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체와 조합함으로써 약학 조성물로 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 약학적으로 허용가능한 희석제는 물, 예컨대, 주사에 적합한 멸균수이다. 따라서, 한 실시양태에서, 안드로겐 수용체 핵산으로 표적화되는 안티센스 화합물 및 약학적으로 허용가능한 희석제를 포함하는 약학 조성물이 본원에 기재된 방법에서 사용된다. 일부 실시양태에서, 약학적으로 허용가능한 희석제는 물이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 화합물은 본원에서 제공된 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다.
안티센스 화합물을 포함하는 약학 조성물은 인간을 포함하는 동물에게 투여되었을 때 생물학적 활성 대사물질 또는 이의 잔기를 (직접적으로 또는 간접적으로) 제공할 수 있는 임의의 약학적으로 허용가능한 염, 에스테르 또는 이러한 에스테르의 염, 또는 임의의 다른 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 따라서, 예를 들면, 본 개시내용은 안티센스 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 전구약물, 이러한 전구약물의 약학적으로 허용가능한 염, 및 다른 생체균등물에 관한 것이다. 적합한 약학적으로 허용가능한 염은 나트륨 염 및 칼륨 염을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
전구약물은 활성 안티센스 화합물을 형성하기 위해 신체 내에서 내생성 핵산분해효소에 의해 절단되는 추가 뉴클레오사이드가 안티센스 화합물의 한 말단 또는 양 말단에서 도입되어 있는 것을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 화합물 또는 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 추가로 포함한다.
일부 적응증
본 발명의 일부 양태는 본원에서 제공된 안드로겐 수용체로 표적화되는 안티센스 화합물을 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 암은 AR 양성 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 전립선암, 유방암, 난소암, 방광암 또는 위암이다. 일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체로 표적화되는 안티센스 화합물은 10개 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되고 서열 번호 12 내지 179 중 임의의 서열 번호의 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개 이상의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체로 표적화되는 안티센스 화합물은 10개 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되고 서열 번호 12 내지 179 중 임의의 서열 번호를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체로 표적화되는 안티센스 화합물은 서열 번호 12 내지 179 중 임의의 서열 번호의 핵염기 서열로 구성되는 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체로 표적화되는 안티센스 화합물은 16개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되고 서열 번호 35, 39, 43, 124, 150, 155, 169 또는 175로 구성되는 핵염기 서열을 갖는 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 화합물은 단일 가닥이다. 일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체로 표적화되는 안티센스 화합물은 ISIS 560131, ISIS 569213, ISIS 569216, ISIS 569221, ISIS 569236, ISIS 579671, ISIS 586124, ISIS 583918, ISIS 584149, ISIS 584163, ISIS 584269 또는 ISIS 584468이다.
일부 양태는 암의 치료에 사용되기 위한, 본원에서 제공된 안드로겐 수용체로 표적화되는 안티센스 화합물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 암은 AR 양성 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 전립선암, 유방암, 난소암, 방광암 또는 위암이다. 일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체로 표적화되는 안티센스 화합물은 10개 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되고 서열 번호 12 내지 179 중 임의의 서열 번호의 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개 이상의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체로 표적화되는 안티센스 화합물은 10개 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되고 서열 번호 12 내지 179 중 임의의 서열 번호를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체로 표적화되는 안티센스 화합물은 서열 번호 12 내지 179 중 임의의 서열 번호의 핵염기 서열로 구성되는 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체로 표적화되는 안티센스 화합물은 16개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되고 서열 번호 35, 39, 43, 124, 150, 155, 169 또는 175로 구성되는 핵염기 서열을 갖는 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 화합물은 단일 가닥이다. 일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체로 표적화되는 안티센스 화합물은 ISIS 560131, ISIS 569213, ISIS 569216, ISIS 569221, ISIS 569236, ISIS 579671, ISIS 586124, ISIS 583918, ISIS 584149, ISIS 584163, ISIS 584269 또는 ISIS 584468이다.
일부 양태는 암 치료용 약제의 제조를 위한, 본원에서 제공된 안드로겐 수용체로 표적화되는 안티센스 화합물의 용도에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 암은 AR 양성 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 전립선암, 유방암, 난소암, 방광암 또는 위암이다. 일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체로 표적화되는 안티센스 화합물은 10개 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되고 서열 번호 12 내지 179 중 임의의 서열 번호의 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개 이상의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체로 표적화되는 안티센스 화합물은 10개 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되고 서열 번호 12 내지 179 중 임의의 서열 번호를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체로 표적화되는 안티센스 화합물은 서열 번호 12 내지 179 중 임의의 서열 번호의 핵염기 서열로 구성되는 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체로 표적화되는 안티센스 화합물은 16개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되고 서열 번호 35, 39, 43, 124, 150, 155, 169 또는 175로 구성되는 핵염기 서열을 갖는 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 화합물은 단일 가닥이다. 일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체로 표적화되는 안티센스 화합물은 ISIS 560131, ISIS 569213, ISIS 569216, ISIS 569221, ISIS 569236, ISIS 579671, ISIS 586124, ISIS 583918, ISIS 584149, ISIS 584163, ISIS 584269 또는 ISIS 584468이다.
본 발명의 일부 양태는 항안드로겐제(예를 들면, 화합물 또는 약물)을 사용한 치료에 대한 내성을 나타내게 된 암을 갖는 암 환자의 치료를 위한, 본원에 기재된 인간 안드로겐 수용체(AR)로 표적화되는 안티센스 화합물의 용도에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 상기 암은 전립선암이다. 일부 실시양태에서, 상기 환자는 하기 물질들로부터 선택되는 물질을 사용한 치료에 대한 내성을 발생시킨 환자 또는 이러한 내성을 발생시킨 암을 갖는 환자이다: MDV3100, ARN-059, ODM-201, 아비라테론 아세테이트, TOK001, TAK700 및 VT464. 일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체로 표적화되는 안티센스 화합물은 10개 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되고 서열 번호 12 내지 179 중 임의의 서열 번호의 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개 이상의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체로 표적화되는 안티센스 화합물은 10개 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되고 서열 번호 12 내지 179 중 임의의 서열 번호를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체로 표적화되는 안티센스 화합물은 서열 번호 12 내지 179 중 임의의 서열 번호의 핵염기 서열로 구성되는 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체로 표적화되는 안티센스 화합물은 16개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되고 서열 번호 35, 39, 43, 124, 150, 155, 169 또는 175로 구성되는 핵염기 서열을 갖는 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 안티센스 화합물은 엑손 1, 예를 들면, 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 영역 2863-5593(엑손 1) 또는 27672-27853(엑손 1B) 내에서 AR을 표적화한다. 일부 실시양태에서, AR의 엑손 1로 표적화되는 본원에서 제공된 안티센스 화합물은 서열 번호 1의 하기 뉴클레오타이드 영역들 중 임의의 뉴클레오타이드 영역 내에서 상보적이다: 2957-2972, 3079-3094, 3099-3114, 3109-3124, 3113-3128, 3120-3135, 3133-3148, 3224-3239, 3226-3241, 3351-3366, 3353-3368, 3361-3376, 3388-3403, 3513-3528, 3517-3532, 3519-3534, 3641-3656, 3735-3750, 3764-3779, 3768-3783, 3798-3813, 3799-3814, 3851-3866, 3870-3885, 3874-3889, 3876-3891, 3878-3893, 3884-3899, 3886-3901, 3888-3903, 3901-3916, 3956-3971, 3962-3977, 3964-3979, 3967-3982, 4019-4034, 4038-4053, 4049-4064, 4056-4071, 4059-4074, 4062-4077, 4066-4081, 4070-4085, 4101-4116, 4103-4118, 4105-4120, 4109-4124, 4305-4320, 4405-4420, 4532-4547, 4534-4549, 4537-4552, 4539-4554, 4555-4570, 4571-4586, 4573-4588, 4578-4593, 4597-4612, 4632-4647, 4655-4670, 4656-4671, 4662-4677, 4699-4714, 4747-4762, 4750-4765, 4752-4767, 4754-4769, 4755-4770, 4769-4784, 4798-4813, 4804-4819, 4807-4822, 4833-4848, 4837-4852, 4839-4854, 4865-4880, 4868-4883, 4872-4887, 4874-4889, 4876-4891, 4887-4902, 4889-4904, 4916-4931, 4918-4933, 4938-4953, 4942-4957, 4944-4959, 4951-4966, 5050-5065, 5052-5067, 5054-5069, 5056-5071, 5060-5075, 5061-5076, 5062-5077, 5133-5148, 5141-5156, 5155-5170, 5265-5280, 5293-5308, 5308-5323, 5392-5407, 5448-5463, 5469-5484, 5481-5496, 5483-5498, 5486-5501, 5488-5503, 5494-5509 또는 5521-5536. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 안티센스 화합물은 엑손 2, 예를 들면, 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 영역 102087-102238(엑손 2) 또는 139551-139834(엑손 2c) 내에서 AR을 표적화한다. 일부 실시양태에서, AR의 엑손 2로 표적화되는 본원에서 제공된 안티센스 화합물은 서열 번호 1의 하기 뉴클레오타이드 영역들 중 임의의 뉴클레오타이드 영역 내에서 상보적이다: 102155-102170, 102156-102171, 139682-139697, 139762-139777 또는 139782-139797. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 안티센스 화합물은 엑손 3, 예를 들면, 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 영역 144841-144957(엑손 3), 148380-148594(엑손 3b) 또는 153504-154908(엑손 3d) 내에서 AR을 표적화한다. 일부 실시양태에서, AR의 엑손 3으로 표적화되는 본원에서 제공된 안티센스 화합물은 서열 번호 1의 하기 뉴클레오타이드 영역들 중 임의의 뉴클레오타이드 영역 내에서 상보적이다: 144856-144871, 144938-144953, 148406-148421, 148443-148458 또는 148520-148535. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 안티센스 화합물은 인트론 1, 예를 들면, 서열 번호 1의 5594-27671 또는 27854-102086 내에서 AR을 표적화한다. AR의 인트론 1로 표적화되는 본원에서 제공된 안티센스 화합물은 서열 번호 1의 하기 뉴클레오타이드 영역들 중 임의의 뉴클레오타이드 영역 내에서 상보적이다: 5666-5681, 6222-6237, 6701-6716, 7543-7558, 8471-8486, 8638-8653, 9464-9479, 10217-10232, 10250-10265, 10865-10880, 11197-11212, 11855-11870, 13189-13204, 13321-13336, 13346-13361, 16555-16570, 16793-16808, 16968-16983, 17206-17221, 18865-18880, 29329-29344, 32290-32305, 33315-33330, 39055-39070, 40615-40630, 42017-42032, 56050-56065, 58719-58734, 58720-58739, 58720-58735, 58721-58736, 58722-58737, 58723-58738, 58724-58739, 58724-58739, 58725-58740, 58725-58740, 58725-58740, 58750-58769, 58750-58765, 58751-58766, 58752-58767, 58753-58768, 58754-58769, 58755-58770, 60902-60917 또는 67454-67469. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 안티센스 화합물은 인트론 2, 예를 들면, 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 영역 102239-139550 또는 139835-144840 내에서 AR을 표적화한다. 일부 실시양태에서, AR의 인트론 2로 표적화되는 본원에서 제공된 안티센스 화합물은 서열 번호 1의 하기 뉴클레오타이드 영역들 중 임의의 뉴클레오타이드 영역 내에서 상보적이다: 114874-114889, 115272-115287, 115365-115380 또는 134971-134986. 일부 실시양태에서, 안티센스 화합물은 단일 가닥이다. 일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체로 표적화되는 안티센스 화합물은 ISIS 560131, ISIS 569213, ISIS 569216, ISIS 569221, ISIS 569236, ISIS 579671, ISIS 586124, ISIS 583918, ISIS 584149, ISIS 584163, ISIS 584269 또는 ISIS 584468이다.
특정 물질(예를 들면, 화합물 또는 약물)을 사용한 치료에 대한 내성은 상기 물질이 암의 성장 또는 퍼짐을 중단시키는 데 있어서 보다 덜 효과적이거나 더 이상 효과적이지 않으므로, 환자 또는 그의 암이 시간에 따라 상기 물질에 덜 반응하게 또는 민감하게 된다는 것을 의미한다. 전형적으로, 이러한 환자는 상기 물질에 대한 내성이 있는 환자로서 분류될 것이고, 이러한 물질로 더 이상 치료받지 않을 것이다. MDV3100, ARN-059, ODM-201, 아비라테론 아세테이트, TOK001, TAK700 및 VT464로부터 선택되는 물질에 대한 내성이 있는 전립선암을 갖는 대상체는 예를 들면, 상기 물질을 이전에 제공받았지만 그의 전립선암이 상기 물질에 덜 민감하게 또는 반응하게 된 환자를 포함할 수 있다. 예를 들면, MDV3100, ARN-059, ODM-201, 아비라테론 아세테이트, TOK001, TAK700 및 VT464로부터 선택되는 항안드로겐제에 대한 내성이 있는 전립선암은 상기 물질을 사용한 치료에도 불구하고 종양 부피, 전이 또는 진행 면에서 증가된 전립선암을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, MDV3100, ARN-059, ODM-201, 아비라테론 아세테이트, TOK001, TAK700 및 VT464로부터 선택되는 항안드로겐제에 대한 내성이 있는 전립선암은 상기 물질에 대한 불응성을 나타내고 치료에도 불구하고 종양 부피, 전이 또는 진행 면에서 감소하지 않는 전립선암을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태는 대상체에서 MDV3100, ARN-059, ODM-201, 아비라테론 아세테이트, TOK001, TAK700 및 VT464로부터 선택되는 항안드로겐제에 대한 내성이 있는 전립선암을 치료하는 방법으로서, 상기 물질에 대한 내성이 있는 전립선암을 갖는 대상체로서 상기 대상체를 확인하는 단계, 및 본원에 기재된 바와 같이 엑손 3의 3' 말단의 업스트림 및/또는 리간드 결합 도메인의 업스트림에서 인간 안드로겐 수용체(AR)로 표적화되는 안티센스 화합물을 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 몇몇 실시양태는 대상체에서 MDV3100, ARN-059, ODM-201, 아비라테론 아세테이트, TOK001, TAK700 및 VT464로부터 선택되는 항안드로겐제에 대한 내성이 있는 전립선암을 치료하는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같이 엑손 3의 3' 말단의 업스트림 및/또는 리간드 결합 도메인의 업스트림에서 인간 안드로겐 수용체(AR)로 표적화되는 안티센스 화합물을, 상기 항안드로겐제에 대한 내성이 있는 전립선암을 갖는 대상체로서 확인된 또는 진단된 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, MDV3100, ARN-059, ODM-201, 아비라테론 아세테이트, TOK001, TAK700 및 VT464로부터 선택되는 항안드로겐제에 대한 내성이 있는 전립선암은 전체 길이 AR에 비해 AR 스플라이싱 변이체를 우세하게 발현한다.
본 발명의 일부 양태는, 본원에 기재된 바와 같이 인간 안드로겐 수용체(AR)로 표적화되는 안티센스 화합물을 전립선암을 앓고 있는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자를 치료하는 방법에 관한 것으로서, 이때 상기 환자 또는 그의 암은 항안드로겐제(화합물 또는 약물)을 사용한 치료에 대한 내성을 발생시켰거나 나타내게 된다. 일부 실시양태에서, 상기 환자는 MDV3100, ARN-059, ODM-201, 아비라테론 아세테이트, TOK001, TAK700 및 VT464로부터 선택되는 물질을 사용한 치료에 대한 내성을 발생시킨 환자이다. 일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체로 표적화되는 안티센스 화합물은 10개 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되고 서열 번호 12 내지 179 중 임의의 서열 번호의 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개 이상의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체로 표적화되는 안티센스 화합물은 10개 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되고 서열 번호 12 내지 179 중 임의의 서열 번호를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체로 표적화되는 안티센스 화합물은 서열 번호 12 내지 179 중 임의의 서열 번호의 핵염기 서열로 구성되는 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체로 표적화되는 안티센스 화합물은 16개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되고 서열 번호 35, 39, 43, 124, 150, 155, 169 또는 175로 구성되는 핵염기 서열을 갖는 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 화합물은 단일 가닥이다. 일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체로 표적화되는 안티센스 화합물은 ISIS 560131, ISIS 569213, ISIS 569216, ISIS 569221, ISIS 569236, ISIS 579671, ISIS 586124, ISIS 583918, ISIS 584149, ISIS 584163, ISIS 584269 또는 ISIS 584468이다.
항안드로겐제를 사용한 치료에 대한 내성을 발생시켰거나 나타내게 된 전립선암은 거세 저항성 전립선암(CRPC)으로서 지칭된다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, 항안드로겐제, 예컨대, MDV3100에 대한 내성이 있는 전립선암 세포는 상기 억제제에 이전에 노출되었고 시간에 따라 상기 억제제에 덜 반응하게 또는 민감하게 되었다. 예를 들면, MDV3100은 환자에서 전립선암 세포 성장 또는 증식을 초기에 억제할 것이지만, 이러한 억제 효과는 상기 세포가 상기 억제제에 대한 내성을 나타내게 될 때 시간에 따라 감소될 수 있다.
본 발명의 일부 양태는 항안드로겐제(화합물 또는 약물)을 사용한 치료에 대한 내성을 나타내게 된 암을 갖는 환자에서 암을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한, 본원에서 제공된 안드로겐 수용체로 표적화되는 안티센스 화합물의 용도에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 암은 전립선암이다. 일부 실시양태에서, 상기 환자는 MDV3100, ARN-059, ODM-201, 아비라테론 아세테이트, TOK001, TAK700 및 VT464로부터 선택되는 물질을 사용한 치료에 대한 내성을 발생시킨 환자 또는 이러한 내성을 발생시킨 암을 갖는 환자이다. 일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체로 표적화되는 안티센스 화합물은 10개 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되고 서열 번호 12 내지 179 중 임의의 서열 번호의 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개 이상의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체로 표적화되는 안티센스 화합물은 10개 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되고 서열 번호 12 내지 179 중 임의의 서열 번호를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체로 표적화되는 안티센스 화합물은 서열 번호 12 내지 179 중 임의의 서열 번호의 핵염기 서열로 구성되는 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체로 표적화되는 안티센스 화합물은 16개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되고 서열 번호 35, 39, 43, 124, 150, 155, 169 또는 175로 구성되는 핵염기 서열을 갖는 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 화합물은 단일 가닥이다. 일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체로 표적화되는 안티센스 화합물은 ISIS 560131, ISIS 569213, ISIS 569216, ISIS 569221, ISIS 569236, ISIS 579671, ISIS 586124, ISIS 583918, ISIS 584149, ISIS 584163, ISIS 584269 또는 ISIS 584468이다.
엔잘루타마이드:
엔잘루타마이드(Xtandi™)로서도 공지되어 있고 IUPAC 명칭이 4-(3-(4-시아노-3-(트리플루오로메틸)페닐)-5,5-디메틸-4-옥소-2-티옥소이미다졸리딘-1-일)-2-플루오로-N-메틸벤즈아미드인 MDV3100은 화학식 XI로 표시되는 안드로겐 수용체 억제제의 디아릴하이단토인 클래스에 속하는 안드로겐 수용체 리간드 결합 억제제이다. MDV3100은 하기 화학식을 갖는다:
본원에서 제공된 일부 실시양태에서 사용되기에 적합한 MDV3100 및 추가 디아릴하이단토인 안드로겐 수용체 억제제는 전체적으로 본원에 참고로 도입되는 미국 특허 제7,709,517호, 미국 특허출원 공보 제20100172975호 및 미국 특허출원 공보 제20100210665호에 기재되어 있다.
ARN-509:
[화학식 XII]
ARN-509로서도 공지되어 있고 IUPAC 명칭이 4-(7-(6-시아노-5-(트리플루오로메틸)피리딘-3-일)-6,8-디옥소-5,7-디아자스피로[3.4]옥탄-5-일)-2-플루오로-N-메틸벤즈아미드인 화학식 XII의 화합물은 안드로겐 수용체 리간드 결합 억제제이다. 본원에서 제공된 일부 실시양태에서 사용되기에 적합한 ARN-509 및 추가 안드로겐 수용체 억제제는 전체적으로 본원에 참고로 도입되는 국제 특허출원 공보 제WO 2007126765호, 국제 특허출원 공보 제WO 2008119015호 및 미국 특허출원 공보 제2013/0116258호에 기재되어 있다.
아비라테론 아세테이트:
아비라테론 아세테이트 및 ZYTIGA®로서도 공지되어 있고 IUPAC 명칭이 [(3S,8R,9S,10R,13S,14S)-10,13-디메틸-17-(3-피리딜)-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15-데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]펜안쓰렌-3-일]아세테이트인 화학식 XIII의 화합물은 안드로겐 생합성 억제제이고 하기 화학식을 갖는다:
[화학식 XIII]
아비라테론 아세테이트의 구조 및 합성은 전체적으로 본원에 참고로 도입되는 문헌(Potter et al., Journal of Medicinal Chemistry, 38(13), 2463-71, 1995))에 기재되어 있다.
갈레테론:
TOK-001 및 갈레테론으로서도 공지되어 있고 IUPAC 명칭이 (3S,10R,13S)-17-(1H-벤조[d]이미다졸-1-일)-10,13-디메틸-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15-도데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]펜안쓰렌-3-올인 화학식 XIV의 화합물은 하기 화학식을 갖는다:
[화학식 XIV]
TOK-001의 구조 및 합성은 전체적으로 본원에 참고로 도입되는 문헌(Handratta et al., Journal of Medicinal Chemistry (2005), 48(8), 2972-84, 2005)에 기재되어 있다.
오르테로넬:
TAK-700 및 오르테로넬로서도 공지되어 공지되어 있고 IUPAC 명칭이 6-[7(S)-하이드록시-6,7-디하이드로-5H-피롤로[1,2-c]이미다졸-7-일]-N-메틸나프탈렌-2-카복스아미드인 화학식 XV의 화합물은 안드로겐 생합성 억제제이고 하기 화학식을 갖는다:
[화학식 XV]
TAK-700의 구조 및 합성은 문헌(Kaku et al., Bioorganic and Medicinal Chemistry, 19(21), 6383-99, 2011)에 기재되어 있다.
문헌(Yin et al., Int. J. Mol. Sci., 14(7): 13958-13978, 2013)은 거세 저항성 전립선암을 위한 다양한 약학 치료법(ODM-21, VT464, ARN509, TAK700 및 TOK-001을 포함함)을 이용한 최근의 진보를 논의한다.
특정 조합 및 조합 치료법
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 화합물을 포함하는 제1 물질이 하나 이상의 제2 물질과 병용 투여된다. 일부 실시양태에서, 이러한 제2 물질은 본원에 기재된 제1 물질과 동일한 질환, 장애 또는 상태를 치료하도록 디자인된다. 일부 실시양태에서, 이러한 제2 물질은 본원에 기재된 제1 물질과 상이한 질환, 장애 또는 상태를 치료하도록 디자인된다. 일부 실시양태에서, 제1 물질은 제2 물질의 원치 않는 부작용을 치료하도록 디자인된다. 일부 실시양태에서, 제2 물질은 제1 물질의 원치 않는 효과를 치료하기 위해 제1 물질과 병용 투여된다. 일부 실시양태에서, 이러한 제2 물질은 본원에 기재된 하나 이상의 약학 조성물의 원치 않는 부작용을 치료하도록 디자인된다. 일부 실시양태에서, 제2 물질은 조합 효과를 생성하기 위해 제1 물질과 병용 투여된다. 일부 실시양태에서, 제2 물질은 상승작용적 효과를 생성하기 위해 제1 물질과 병용 투여된다. 일부 실시양태에서, 제1 물질과 제2 물질의 병용 투여는 상기 물질들이 독립적인 치료법으로서 투여되는 경우 치료 또는 예방 효과를 달성하기 위해 요구될 용량보다 더 낮은 용량의 사용을 가능하게 한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 하나 이상의 화합물 또는 조성물은 하나 이상의 항안드로겐제와 병용 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 하나 이상의 화합물 또는 조성물 및 하나 이상의 항안드로겐제는 상이한 시간에서 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 하나 이상의 화합물 또는 조성물 및 하나 이상의 항안드로겐제는 단일 제제로 함께 제조된다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 하나 이상의 화합물 또는 조성물 및 하나 이상의 항안드로겐제는 별도로 제조된다. 일부 실시양태에서, 항안드로겐제는 MDV3100, ARN-059, ODM-201, 아비라테론, TOK001, TAK700 및 VT464로부터 선택된다.
본 발명의 일부 양태는 항안드로겐제와 조합되는, 본원에 기재된 인간 안드로겐 수용체(AR)로 표적화되는 안티센스 화합물의 용도에 관한 것이다. 구체적인 실시양태에서, 이러한 용도는 암을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법 또는 암을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의 용도이다. 일부 실시양태에서, 암은 전립선암, 유방암, 난소암, 방광암 및 위암으로부터 선택된다. 항안드로겐제의 구체적인 클래스는 제2 세대 항호르몬제, 예컨대, 엔잘루타마이드(MDV3100), ARN-059, ODM-201, 아비라테론 아세테이트, 갈레테론(TOK001), 오르테로넬(TAK700) 및 VT464(상기 문헌(Yin et al.) 참조)이다.
일부 양태는 본원에 기재된 인간 안드로겐 수용체(AR)로 표적화되는 안티센스 화합물과 항안드로겐제, 예컨대, MDV3100, ARN-059, ODM-201, 아비라테론, TOK001, TAK700 및 VT464로부터 선택되는 제2 세대 항호르몬제의 조합물에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 안드로겐 수용체(AR)로 표적화되는 안티센스 화합물과 항안드로겐제, 예컨대, MDV3100, ARN-059, ODM-201, 아비라테론, TOK001, TAK700 및 VT464로부터 선택되는 제2 세대 항호르몬제의 이러한 조합물은 암세포 성장 또는 증식의 억제 및/또는 암의 치료에 유용하다. 일부 실시양태에서, 암은 전립선암, 유방암, 난소암, 방광암 및 위암으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 암은 전립선암이다. 일부 실시양태에서, 암은 유방암이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 AR로 표적화되는 안티센스 화합물과 항안드로겐제, 예컨대, MDV3100, ARN-059, ODM-201, 아비라테론, TOK001, TAK700 및 VT464로부터 선택되는 제2 세대 항호르몬제는 암세포의 성장 또는 증식을 억제하도록 함께 상승작용한다. 몇몇 실시양태에서, 암세포는 거세 저항성을 나타내거나 나타내게 된 전립선암 세포가다. 다양한 실시양태에서, 암세포는 MDV3100, ARN-059, ODM-201, 아비라테론, TOK001, TAK700 및 VT464로부터 선택되는 제2 세대 항호르몬제에 대한 내성을 나타내거나 나타내게 된 전립선암 세포가다. 일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체로 표적화되는 안티센스 화합물은 10개 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되고 서열 번호 12 내지 179 중 임의의 서열 번호의 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개 이상의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체로 표적화되는 안티센스 화합물은 10개 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되고 서열 번호 12 내지 179 중 임의의 서열 번호를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체로 표적화되는 안티센스 화합물은 서열 번호 12 내지 179 중 임의의 서열 번호의 핵염기 서열로 구성되는 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체로 표적화되는 안티센스 화합물은 16개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되고 서열 번호 35, 39, 43, 124, 150, 155, 169 또는 175로 구성되는 핵염기 서열을 갖는 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체로 표적화되는 안티센스 화합물은 ISIS 560131, ISIS 569213, ISIS 569216, ISIS 569221, ISIS 569236, ISIS 579671, ISIS 586124, ISIS 583918, ISIS 584149, ISIS 584163, ISIS 584269 또는 ISIS 584468이다.
몇몇 실시양태는 인간 안드로겐 수용체(AR)로 표적화되는 안티센스 화합물과 화학식 XI의 디아릴하이단토인 AR 억제제, 예컨대, MDV3100의 조합물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 디아릴하이단토인 안드로겐 수용체(AR) 억제제는 하기 화학식 XVI의 화합물이다:
[화학식 XVI]
상기 식에서,
X는 트리플루오로메틸 및 요오도로 구성되는 군으로부터 선택되고, 이때 W는 O 및 NR5로 구성되는 군으로부터 선택되고, 이때 R5는 H, 메틸 및 하기 화학식의 기로 구성되는 군으로부터 선택되고:
[상기 식에서,
D는 S 또는 O이고, E는 N 또는 O이고, G는 알킬, 아릴, 치환된 알킬 또는 치환된 아릴이거나; D는 S 또는 O이고, E-G는 함께 C1-C4 저급 알킬임];
R1 및 R2는 함께 8개 이하의 탄소 원자를 포함하고, 알킬 및 치환된 알킬(할로알킬을 포함함)로 구성되는 군으로부터 선택되거나 이들이 연결된 탄소와 함께 사이클로알킬 또는 치환된 사이클로알킬 기를 형성하고;
R3은 수소, 할로겐, 메틸, C1-C4 알콕시, 포르밀, 할로아세톡시, 트리플루오로메틸, 시아노, 니트로, 하이드록실, 페닐, 아미노, 메틸카바모일, 메톡시카보닐, 아세트아미도, 메탄설폰아미노, 메탄설포닐, 4-메탄설포닐-1-피페라지닐, 피페라지닐, 및 하이드록실, 메톡시카보닐, 시아노, 아미노, 아미도, 니트로, 카바모일 또는 치환된 카바모일(메틸카바모일, 디메틸카바모일 및 하이드록시에틸카바모일을 포함함)로 임의적으로 치환된 C1-C6 알킬 또는 알케닐로 구성되는 군으로부터 선택되고;
R4는 수소, 할로겐, 알킬 및 할로알킬로 구성되는 군으로부터 선택되고, 이때 R3은 메틸아미노메틸 또는 디메틸아미노메틸이 아니다.
R5는 하기 화학식의 기일 수 있다:
일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체(AR)로 표적화되는 안티센스 화합물과 화학식 XVI의 디아릴하이단토인 AR 억제제, 예컨대, MDV3100의 이러한 조합물은 전립선암 세포 성장 또는 증식의 억제 및/또는 전립선암의 치료에 유용하다. 일부 실시양태에서, AR로 표적화되는 안티센스 화합물 및 화학식 XVI의 디아릴하이단토인 AR 억제제, 예컨대, MDV3100은 전립선암 세포의 성장 또는 증식을 억제하도록 함께 상승작용한다. 몇몇 실시양태에서, 전립선암 세포는 거세 저항성을 나타낸다. 다양한 실시양태에서, 전립선암 세포는 화학식 XVI의 디아릴하이단토인 AR 억제제, 예컨대, MDV3100에 대한 내성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 전립선암 세포 또는 거세 저항성 전립선암 세포는 전체 길이 AR에 비해 AR 스플라이싱 변이체를 우세하게 발현한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 AR로 표적화되는 안티센스 화합물 및 다른 항안드로겐제는 이 두 물질들을 동시에, 별도로 또는 순차적으로 투여함으로써 조합 치료에서 사용된다. 일부 실시양태에서, 상기 두 물질들은 고정된 용량 조합 생성물로서 제제화된다. 다른 실시양태에서, 상기 두 물질들은 동시에 또는 연속적으로(순차적으로) 복용될 수 있는 별도의 유닛으로서 환자에게 제공된다.
일부 실시양태에서, 또 다른 항안드로겐제, 예컨대, MDV3100, ARN-059, ODM-201, 아비라테론, TOK001, TAK700 및 VT464로부터 선택되는 제2 세대 항호르몬제와 함께 전립선암 세포 및/또는 거세 저항성 전립선암 세포 성장 또는 증식을 억제하는 데 유용한 안티센스 화합물은 엑손 3의 3' 말단의 업스트림 및/또는 리간드 결합 도메인의 업스트림에서 인간 안드로겐 수용체를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 안티센스 화합물은 본원에 기재된 바와 같이 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 인트론 1 또는 인트론 2 내에서 AR을 표적화한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 안티센스 화합물은 N-말단 도메인을 코딩하는 엑손 1, 및 DNA 결합 도메인을 코딩하는 엑손 2 및 3을 포함하되 짧은 힌지 영역을 코딩하는 엑손 4의 적어도 부분 또는 리간드 결합 도메인을 코딩하는 엑손 4 내지 8의 적어도 부분을 포함하지 않는 AR 스플라이싱 변이체를 표적화한다. 이러한 AR 스플라이싱 변이체의 일례로는 엑손 1 내지 3을 함유하되 엑손 4 내지 8을 결여하는 AR-V7이 있으나 이것으로 한정되지 않는다. 이러한 AR 스플라이싱 변이체의 추가 예로는 AR3, AR4, AR4b, AR5 및 AR6(각각 서열 번호 4 내지 8)이 있다. 일부 실시양태에서, 거세 저항성을 나타낼 수 있는 전립선암 세포는 전체 길이 AR에 비해 AR 스플라이싱 변이체를 우세하게 발현한다. 구체적인 실시양태에서, 전립선암 세포는 MDV3100, ARN-059, ODM-201, 아비라테론, TOK001, TAK700 및 VT464로부터 선택되는 항안드로겐제에 대한 거세 저항성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, MDV3100, ARN-059, ODM-201, 아비라테론, TOK001, TAK700 및 VT464로부터 선택되는 항안드로겐제와 함께 사용되는, 엑손 3의 3' 말단의 업스트림 및/또는 리간드 결합 도메인의 업스트림에서 AR로 표적화되는 안티센스 화합물은 MDV3100, ARN-059, ODM-201, 아비라테론, TOK001, TAK700 및 VT464로부터 선택되는 동일한 항안드로겐제와 함께 사용되는, 리간드 결합 도메인으로 표적화되는 안티센스 화합물, 예컨대, 엑손 4로 표적화되고 미국 특허 제7,737,125호에 기재된 서열 번호 58에 상응하는 EZN-4176보다 더 큰 정도로 거세 저항성 전립선암 세포를 포함하는 전립선암 세포의 성장 또는 증식을 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 안티센스 화합물과 MDV3100, ARN-059, ODM-201, 아비라테론, TOK001, TAK700 및 VT464로부터 선택되는 항안드로겐제의 조합물은 전립선암 세포, 예컨대, 거세 저항성 전립선암 세포의 성장 또는 증식을 억제하는 데 있어서 상기 안티센스 화합물 단독 또는 MDV3100, ARN-059, ODM-201, 아비라테론, TOK001, TAK700 및 VT464로부터 선택되는 항안드로겐제에 비해 상승작용적 효과(예를 들면, 가산적 효과보다 더 큰 효과)를 제공한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 함께 사용될 때 안티센스 화합물 및/또는 MDV3100, ARN-059, ODM-201, 아비라테론, TOK001, TAK700 및 VT464로부터 선택되는 항안드로겐제 중 어느 하나 또는 둘 다의 양은 동등한 수준의 전립선암 세포 성장 또는 증식 억제를 달성하는 데 필요한 안티센스 화합물 단독 또는 MDV3100, ARN-059, ODM-201, 아비라테론, TOK001, TAK700 및 VT464로부터 선택되는 항안드로겐제 단독의 상응하는 양보다 더 적을 수 있다.
일부 실시양태에서, MDV3100, ARN-059, ODM-201, 아비라테론, TOK001, TAK700 및 VT464로부터 선택되는 항안드로겐제와 함께 전립선암 세포 및/또는 거세 저항성 전립선암 세포 성장 또는 증식을 억제하는 데 유용한 본원에서 제공된 안티센스 화합물은 기능성 DNA 결합 도메인을 갖되 기능성 리간드 결합 도메인을 갖지 않는 AR 스플라이싱 변이체를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 화합물은 N-말단 도메인을 코딩하는 엑손 1의 전체 또는 적어도 기능성 부분, 및 DNA 결합 도메인을 코딩하는 엑손 2 및 3의 전체 또는 적어도 기능성 부분을 포함하되 짧은 힌지 영역을 코딩하는 엑손 4의 적어도 기능성 부분 또는 리간드 결합 도메인을 코딩하는 엑손 4 내지 8의 적어도 기능성 부분을 포함하지 않는 AR 스플라이싱 변이체를 표적화할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 실질적으로 엑손 1 내지 3으로 구성된, 본원에서 제공된 안티센스 화합물에 의해 표적화되는 일부 AR 스플라이싱 변이체는 게놈 영역 또는 엑손 4 내지 8로부터의 핵산 서열의 비-기능성 부분도 포함할 수 있다고 생각된다. 스플라이싱 과정은 DNA 결합 기능을 보유하되 리간드 결합 기능을 보유하지 않는 이러한 AR 스플라이싱 변이체를 발생시킬 수 있다고 생각된다. 일부 실시양태에서, 거세 저항성을 나타낼 수 있는 전립선암 세포는 전체 길이 AR에 비해 AR 스플라이싱 변이체를 우세하게 발현한다. 일부 실시양태에서, 전립선암 세포는 MDV3100, ARN-059, ODM-201, 아비라테론, TOK001, TAK700 및 VT464로부터 선택되는 항안드로겐제에 대한 거세 저항성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 안티센스 화합물은 엑손 3의 3' 말단의 업스트림 및/또는 리간드 결합 도메인의 업스트림에 존재하는 엑손 1 내에서 AR을 표적화한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 안티센스 화합물은 본원에 기재된 바와 같이 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 인트론 1 또는 인트론 2 내에서 AR을 표적화한다.
일부 실시양태에서, MDV3100, ARN-059, ODM-201, 아비라테론, TOK001, TAK700 및 VT464로부터 선택되는 항안드로겐제와 함께 사용되는, 기능성 DNA 결합 도메인을 갖되 기능성 리간드 결합 도메인을 갖지 않는 AR 스플라이싱 변이체로 표적화되는 안티센스 화합물은 MDV3100, ARN-059, ODM-201, 아비라테론, TOK001, TAK700 및 VT464로부터 선택되는 동일한 항안드로겐제와 함께 사용되는, 리간드 결합 도메인으로 표적화되는 안티센스 화합물, 예컨대, 엑손 4로 표적화되고 미국 특허 제7,737,125호에 기재된 서열 번호 58에 상응하는 EZN-4176보다 더 큰 정도로 거세 저항성 전립선암 세포를 포함하는 전립선암 세포의 성장 또는 증식을 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 안티센스 화합물과 MDV3100, ARN-059, ODM-201, 아비라테론, TOK001, TAK700 및 VT464로부터 선택되는 항안드로겐제의 조합물은 전립선암 세포, 예컨대, 거세 저항성 전립선암 세포의 성장 또는 증식을 억제하는 데 있어서 상기 안티센스 화합물 단독 또는 상기 항안드로겐제 단독에 비해 상승작용적 효과(예를 들면, 가산적 효과보다 더 큰 효과)를 제공한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 함께 사용될 때 안티센스 화합물 및/또는 MDV3100, ARN-059, ODM-201, 아비라테론, TOK001, TAK700 및 VT464로부터 선택되는 항안드로겐제 중 어느 하나 또는 둘 다의 양은 동등한 수준의 전립선암 세포 성장 또는 증식 억제를 달성하는 데 필요한 안티센스 화합물 단독 또는 상기 항안드로겐제 단독의 상응하는 양보다 더 적을 수 있다.
일부 실시양태에서, MDV3100, ARN-059, ODM-201, 아비라테론, TOK001, TAK700 및 VT464로부터 선택되는 항안드로겐제와 함께 전립선암 세포 및/또는 거세 저항성 전립선암 세포 성장 또는 증식을 억제하는 데 유용한 본원에서 제공된 안티센스 화합물은 전체 길이 AR; 및 N-말단 도메인을 코딩하는 엑손 1 및 DNA 결합 도메인을 코딩하는 엑손 2 및 3을 포함하되 짧은 힌지 영역을 코딩하는 엑손 4의 적어도 부분 또는 리간드 결합 도메인을 코딩하는 엑손 4 내지 8 중 어느 한 엑손의 적어도 부분을 포함하지 않는 AR 스플라이싱 변이체 둘 다의 발현을 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 안티센스 화합물은 리간드 결합 도메인의 업스트림에서 인간 안드로겐 수용체를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 이러한 안티센스 화합물은 엑손 3의 3' 말단의 업스트림에서 인간 안드로겐 수용체를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 안티센스 화합물은 엑손 3의 3' 말단의 업스트림 및/또는 리간드 결합 도메인의 업스트림에 존재하는 엑손 1 내에서 AR을 표적화한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 인간 안드로겐 수용체(AR)로 표적화되는 안티센스 화합물과 MDV3100, ARN-059, ODM-201, 아비라테론, TOK001, TAK700 및 VT464로부터 선택되는 항안드로겐제의 조합물이 제공되고, 이때 상기 안티센스 화합물은 10개 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되고 서열 번호 12 내지 179 중 임의의 서열 번호의 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개 이상의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 안드로겐 수용체(AR)로 표적화되는 안티센스 화합물과 MDV3100, ARN-059, ODM-201, 아비라테론, TOK001, TAK700 및 VT464로부터 선택되는 항안드로겐제의 조합물이 제공되고, 이때 상기 안티센스 화합물은 10개 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되고 서열 번호 12 내지 179 중 임의의 서열 번호를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 안드로겐 수용체(AR)로 표적화되는 안티센스 화합물과 MDV3100, ARN-059, ODM-201, 아비라테론, TOK001, TAK700 및 VT464로부터 선택되는 항안드로겐제의 조합물이 제공되고, 이때 상기 안티센스 화합물은 서열 번호 12 내지 179 중 임의의 서열 번호의 핵염기 서열로 구성되는 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 안드로겐 수용체(AR)로 표적화되는 안티센스 화합물과 화학식 XI의 디아릴하이단토인 AR 억제제, 예컨대, MDV3100의 조합물이 제공되고, 이때 상기 안티센스 화합물은 16개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되고 서열 번호 35, 39, 43, 124, 150, 155, 169 또는 175로 구성되는 핵염기 서열을 갖는 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 안드로겐 수용체(AR)로 표적화되는 안티센스 화합물과 화학식 XI의 디아릴하이단토인 AR 억제제, 예컨대, MDV3100의 조합물이 제공되고, 이때 안드로겐 수용체로 표적화되는 안티센스 화합물은 ISIS 560131, ISIS 569213, ISIS 569216, ISIS 569221, ISIS 569236, ISIS 579671, ISIS 586124, ISIS 583918, ISIS 584149, ISIS 584163, ISIS 584269 또는 ISIS 584468이다.
몇몇 실시양태는 전립선암 세포 성장 또는 증식을 억제하는 방법으로서, 전립선암 세포를 인간 안드로겐 수용체(AR)로 표적화되는 안티센스 화합물, 및 MDV3100, ARN-059, ODM-201, 아비라테론, TOK001, TAK700 및 VT464로부터 선택되는 항안드로겐제와 접촉시키는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 화합물, 및 MDV3100, ARN-059, ODM-201, 아비라테론, TOK001, TAK700 및 VT464로부터 선택되는 항안드로겐제는 전립선암 세포의 성장 또는 증식을 억제하기 위해 함께 상승작용한다. 몇몇 실시양태에서, 전립선암 세포는 거세 저항성을 나타낸다. 다양한 실시양태에서, 전립선암 세포는 MDV3100, ARN-059, ODM-201, 아비라테론, TOK001, TAK700 및 VT464로부터 선택되는 항안드로겐제에 대한 내성을 나타냄으로써 거세 저항성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 전립선암 세포 또는 거세 저항성 전립선암 세포는 전체 길이 AR에 비해 AR 스플라이싱 변이체를 우세하게 발현한다.
상기 실시양태들 중 임의의 실시양태의 일부 양태에서, 화학식 XVI의 디아릴하이단토인 AR 억제제, 예컨대, MDV3100과 함께 전립선암 세포의 성장 또는 증식을 억제하는 데 유용한 안티센스 화합물은 (i) 엑손 3의 3' 말단의 업스트림 및/또는 리간드 결합 도메인의 업스트림에서 인간 안드로겐 수용체, 또는 (ii) 기능성 DNA 결합 도메인을 갖되 기능성 리간드 결합 도메인을 갖지 않는 AR 스플라이싱 변이체를 표적화할 수 있고/있거나; (i) 전체 길이 AR, 및 N-말단 도메인을 코딩하는 엑손 1 및 DNA 결합 도메인을 코딩하는 엑손 2 및 3을 포함하되 짧은 힌지 영역을 코딩하는 엑손 4의 적어도 부분 또는 리간드 결합 도메인을 코딩하는 엑손 4 내지 8 중 어느 한 엑손의 적어도 부분을 포함하지 않는 AR 스플라이싱 변이체 둘 다의 발현을 감소시킬 수 있되; 단, 상기 안티센스 화합물은 하기 표 A에서 확인된 서열 번호 194 내지 215 중 임의의 서열 번호로 구성되는 핵염기 서열을 갖지 않는다.
[표 A]
상기 실시양태들 중 임의의 실시양태의 일부 양태에서, MDV3100, ARN-059, ODM-201, 아비라테론, TOK001, TAK700 및 VT464로부터 선택되는 항안드로겐제에 대한 내성이 있는 전립선암 세포의 성장 또는 증식을 억제하는 데 유용한 안티센스 화합물은 (i) 엑손 3의 3' 말단의 업스트림 및/또는 리간드 결합 도메인의 업스트림에서 인간 안드로겐 수용체, 또는 (ii) 기능성 DNA 결합 도메인을 갖되 기능성 리간드 결합 도메인을 갖지 않는 AR 스플라이싱 변이체를 표적화할 수 있고/있거나; (i) 전체 길이 AR, 및 N-말단 도메인을 코딩하는 엑손 1 및 DNA 결합 도메인을 코딩하는 엑손 2 및 3을 포함하되 짧은 힌지 영역을 코딩하는 엑손 4의 적어도 부분 또는 리간드 결합 도메인을 코딩하는 엑손 4 내지 8 중 어느 한 엑손의 적어도 부분을 포함하지 않는 AR 스플라이싱 변이체 둘 다의 발현을 감소시킬 수 있거나; (ii) 내성 전립선암 세포의 성장 또는 증식을 리간드 결합 도메인으로 표적화되는 안티센스 화합물, 예컨대, EZN-4176보다 더 큰 정도로 억제할 수 있되; 단, 상기 안티센스 화합물은 미국 특허 제7,737,125호(본원에 참고로 도입됨)에 서열 번호 2 내지 9, 49, 50, 52, 53, 55, 56, 및 86 내지 93으로서 기재되어 있고 표 A에서 확인된 서열 번호 194 내지 215 중 임의의 서열 번호로 구성되는 핵염기 서열을 갖지 않는다.
일부 양태는 본원에 기재된 바와 같이 인간 안드로겐 수용체(AR)로 표적화되는 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 유방암을 치료하는 방법 및 유방암 세포의 성장 또는 증식을 억제하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 유방암은 하기 특성들 중 하나 이상의 특성을 갖는다: 성장을 위해 안드로겐에 의존하는 안드로겐 수용체 양성, 성장을 위해 에스트로겐에 의존하지 않는 에스트로겐 수용체(ER) 음성, 성장을 위해 프로게스테론에 의존하지 않는 프로게스테론 수용체(PR) 음성, 또는 Her2/neu 음성. 일부 실시양태에서, 유방암 또는 유방암 세포는 아포크린이다.
일부 실시양태는 대상체에서 유방암을 치료하는 방법으로서, 인간 안드로겐 수용체(AR)로 표적화되는 안티센스 화합물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태는 대상체에서 유방암을 치료하는 방법으로서, 유방암을 갖는 대상체를 확인하는 단계, 및 인간 안드로겐 수용체(AR)로 표적화되는 안티센스 화합물을 상기 대상체에게 투여하여 상기 대상체의 유방암을 치료하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태는 유방암 세포의 성장 또는 증식을 억제하는 방법으로서, 유방암 세포를 인간 안드로겐 수용체(AR)로 표적화되는 안티센스 화합물과 접촉시키는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태는 유방암을 갖거나 가질 위험에 있는 대상체에서 AR 발현을 억제하는 방법으로서, 대상체 유방암을 확인하는 단계, 및 인간 AR로 표적화되는 안티센스 화합물을 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이고, 이때 상기 안티센스 화합물은 상기 대상체에서 AR 발현을 억제한다.
일부 실시양태에서, 유방암 또는 유방암 세포는 하기 특성들 중 하나 이상의 특성을 갖는다: 성장을 위해 안드로겐에 의존하는 안드로겐 수용체 양성, 성장을 위해 에스트로겐에 의존하지 않는 에스트로겐 수용체(ER) 음성, 성장을 위해 프로게스테론에 의존하지 않는 프로게스테론 수용체(PR) 음성, 또는 Her2/neu 음성. 일부 실시양태에서, 유방암 또는 유방암 세포는 ER, PR 및 HER2 삼중 음성 및 AR 양성(ER-, PR-, HER2-, AR+)을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 유방암 또는 유방암 세포는 ER 음성 및 AR 양성(ER-, AR+)을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 유방암 또는 유방암 세포는 ER 양성 및 AR 양성(ER+, AR+)을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 유방암 또는 유방암 세포는 아포크린이다. 아포크린 유방암은 세포가 ER, PR 또는 HER2 수용체를 발현하지 않고 통상적으로(그러나, 반드시는 아님) AR 양성을 나타낸다는 것을 의미하는 "삼중 음성"을 종종 나타낸다. 일부 실시양태에서, 아포크린 유방암 또는 유방암 세포는 ER, PR 및 HER2 삼중 음성 및 AR 양성(ER-, PR-, HER2-, AR+)을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 아포크린 유방암 또는 유방암 세포는 ER 음성 및 AR 양성(ER-, AR+)을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 아포크린 유방암 또는 유방암 세포는 유방의 땀샘으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 아포크린 유방암 또는 유방암 세포는 유방의 관내 암 또는 암세포이다. 일부 실시양태에서, 아포크린 유방암은 하기 특징들 중 어느 하나 이상의 특징을 가질 수 있다: 다량의 호산구성 과립 세포질, 뚜렷한 경계, 큰 소포성 핵, 약 1:2의 핵 대 세포질 비, 및/또는 첨단 돌출부로서 공지된 첨단 세포질 내의 분비된 과립의 축적.
일부 실시양태에서, 유방암 또는 유방암 세포는 ER 음성 및 AR 양성(ER-, AR+) 분자 아포크린 유방암 또는 유방암 세포가다. 일부 양태에서, ER 음성 및 AR 양성(ER-, AR+) 분자 아포크린 유방암 또는 유방암 세포는 PR 양성, PR 음성, HER2 음성 또는 HER2 양성을 나타낼 수도 있다.
유방암은 표준 조직학적 기법에 의해 호르몬 수용체, 예컨대, ER, PR 또는 HER2에 대한 양성 또는 음성 유방암으로서 확인될 수 있다. 예를 들면, 조직학적 유방암 샘플은 1% 미만의 세포가 에스트로겐 및 프로게스테론 수용체에 대한 핵 염색을 나타내고 HER2에 대한 면역조직화학적 염색이 관련 ASCO 및 CAP 지침에 따라 0배, 1배 또는 2배 양성 점수 및 1.8 미만의 FISH 비(HER2 유전자 신호 대 염색체 17 신호)를 보이는 경우 "삼중 음성"(ER-, PR-, HER2-) 샘플로서 분류될 수 있다(Meyer, P. et al., PLoS ONE 7(5): e38361 (2012)).
일부 실시양태에서, 유방암을 치료하거나 유방암 세포 표적의 성장 또는 증식을 억제하는 데 유용한 본원에서 제공된 안티센스 화합물은 엑손 3의 3' 말단의 업스트림 및/또는 리간드 결합 도메인의 업스트림에 존재하는 엑손 1 내에서 AR을 표적화한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 안티센스 화합물은 엑손 1, 예를 들면, 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 영역 2863-5593(엑손 1) 또는 27672-27853(엑손 1B) 내에서 AR을 표적화한다. 일부 실시양태에서, AR의 엑손 1로 표적화되는 본원에서 제공된 안티센스 화합물은 서열 번호 1의 하기 뉴클레오타이드 영역들 중 임의의 뉴클레오타이드 영역 내에서 상보적이다: 3353-3368, 3361-3376, 3519-3534, 3735-3750, 3768-3783, 3798-3813, 3799-3814, 3851-3866, 3870-3885, 3874-3889, 3888-3903, 4047-4062, 4062-4077, 4109-4124, 4534-4549, 4537-4552, 4555-4570, 4571-4586, 4573-4588, 4578-4593, 4655-4670, 4750-4765, 4752-4767, 4833-4848, 4837-4852, 4839-4854, 4865-4880, 4872-4887, 4874-4889, 4876-4891, 4916-4931, 4918-4933, 5052-5067, 5054-5069, 5060-5075, 5061-5076, 5061-5076, 5062-5077, 5155-5170, 5265-5280, 5293-5308, 5392-5407, 5448-5463, 5483-5498, 5486-5501 또는 5494-5509.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 안티센스 화합물은 엑손 3의 3' 말단의 업스트림 및/또는 리간드 결합 도메인의 업스트림에 존재하는 엑손 2 내에서 AR을 표적화한다. 일부 실시양태에서, 유방암을 치료하거나 유방암 세포 표적의 성장 또는 증식을 억제하는 데 유용한 본원에서 제공된 안티센스 화합물은 엑손 2, 예를 들면, 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 영역 102087-102238(엑손 2) 또는 139551-139834(엑손 2c) 내에서 AR을 표적화한다. 일부 실시양태에서, AR의 엑손 2로 표적화되는 본원에서 제공된 안티센스 화합물은 서열 번호 1의 하기 뉴클레오타이드 영역들 중 임의의 뉴클레오타이드 영역 내에서 상보적이다: 102155-102170 또는 102156-107171.
일부 양태에서, 유방암을 치료하거나 유방암 세포의 성장 또는 증식을 억제하는 데 유용한 본원에서 제공된 안티센스 화합물은 엑손 3의 3' 말단의 업스트림 및/또는 리간드 결합 도메인의 업스트림에 존재하는 인트론 1 내에서 AR을 표적화한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 안티센스 화합물은 인트론 1, 예를 들면, 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 영역 5594-27671 또는 27854-102086 내에서 AR을 표적화한다. 일부 양태에서, AR의 인트론 1로 표적화되는 본원에서 제공된 안티센스 화합물은 서열 번호 1의 하기 뉴클레오타이드 영역들 중 임의의 뉴클레오타이드 영역 내에서 상보적이다: 5666-5681, 6701-6716, 7543-7558, 8471-8486, 8638-8653, 9464-9479, 10865-10880, 11197-11212, 11855-11870, 13189-13204, 13321-13336, 13346-13361, 16793-16808, 16968-16983, 17206-17221, 18865-18880, 32290-32305, 33315-33330, 39055-39070, 40615-40630, 42017-42032, 56050-56065, 58719-58734, 58720-58735, 58721-58736, 58722-58737, 58723-58738, 58725-58740, 58750-58765, 58751-58766, 58752-58767, 58753-58768, 58754-58769 또는 58755-58770.
상기 실시양태들 중 임의의 실시양태의 일부 양태에서, 유방암을 치료하거나 유방암 세포의 생장 또는 증식을 억제하는 데 유용한 안티센스 화합물은 엑손 3의 3' 말단의 업스트림 및/또는 리간드 결합 도메인의 업스트림에서 인간 안드로겐 수용체를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 엑손 3의 3' 말단의 업스트림 및/또는 리간드 결합 도메인의 업스트림에서 인간 안드로겐 수용체를 표적화하는 안티센스 화합물들을 포함하나 이들로 한정되지 않는 본원에서 제공된 안티센스 화합물은 리간드 결합 도메인으로 표적화되는 안티센스 화합물, 예컨대, EZN-4176보다 더 큰 정도로 유방암을 치료할 수 있거나 유방암 세포의 성장 또는 증식을 억제할 수 있되; 단, 상기 안티센스 화합물은 미국 특허 제7,737,125호(본원에 참고로 도입됨)에 서열 번호 2 내지 9, 49, 50, 52, 53, 55, 56, 및 86 내지 93으로서 기재되어 있고 표 A에서 확인된 서열 번호 194 내지 215 중 임의의 서열 번호로 구성되는 핵염기 서열을 갖지 않는다.
안티센스 화합물
올리고머 화합물은 올리고뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오사이드, 올리고뉴클레오타이드 유사체, 올리고뉴클레오타이드 미메틱, 안티센스 화합물, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 siRNA를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 올리고머 화합물은 수소결합을 통해 표적 핵산에 혼성화할 수 있다는 의미에서 표적 핵산에 대한 "안티센스"일 수 있다.
일부 실시양태에서, 안티센스 화합물은 5'에서 3' 방향으로 기재될 때 그 자신에 의해 표적화되는 표적 핵산의 표적 세그먼트의 역방향 상보체를 포함하는 핵염기 서열을 갖는다. 이러한 일부 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 5'에서 3' 방향으로 기재될 때 그 자신에 의해 표적화되는 표적 핵산의 표적 세그먼트의 역방향 상보체를 포함하는 핵염기 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 안티센스 화합물은 길이에 있어서 10개 내지 30개의 서브유닛을 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 화합물은 길이에 있어서 12개 내지 30개의 서브유닛을 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 화합물은 길이에 있어서 12개 내지 22개의 서브유닛을 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 화합물은 길이에 있어서 14개 내지 30개의 서브유닛을 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 화합물은 길이에 있어서 14개 내지 20개의 서브유닛을 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 화합물은 길이에 있어서 15개 내지 30개의 서브유닛을 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 화합물은 길이에 있어서 15개 내지 20개의 서브유닛을 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 화합물은 길이에 있어서 16개 내지 30개의 서브유닛을 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 화합물은 길이에 있어서 16개 내지 20개의 서브유닛을 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 화합물은 길이에 있어서 17개 내지 30개의 서브유닛을 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 화합물은 길이에 있어서 17개 내지 20개의 서브유닛을 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 화합물은 길이에 있어서 18개 내지 30개의 서브유닛을 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 화합물은 길이에 있어서 18개 내지 21개의 서브유닛을 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 화합물은 길이에 있어서 18개 내지 20개의 서브유닛을 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 화합물은 길이에 있어서 20개 내지 30개의 서브유닛을 갖는다. 다시 말해, 이러한 안티센스 화합물들은 각각 12개 내지 30개의 연결된 서브유닛, 14개 내지 30개의 연결된 서브유닛, 14개 내지 20개의 서브유닛, 15개 내지 30개의 서브유닛, 15개 내지 20개의 서브유닛, 16개 내지 30개의 서브유닛, 16개 내지 20개의 서브유닛, 17개 내지 30개의 서브유닛, 17개 내지 20개의 서브유닛, 18개 내지 30개의 서브유닛, 18개 내지 20개의 서브유닛, 18개 내지 21개의 서브유닛, 20개 내지 30개의 서브유닛, 또는 12개 내지 22개의 연결된 서브유닛을 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 화합물은 길이에 있어서 14개의 서브유닛을 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 화합물은 길이에 있어서 16개의 서브유닛을 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 화합물은 길이에 있어서 17개의 서브유닛을 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 화합물은 길이에 있어서 18개의 서브유닛을 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 화합물은 길이에 있어서 20개의 서브유닛을 갖는다. 다른 실시양태에서, 안티센스 화합물은 8개 내지 80개, 12개 내지 50개, 13개 내지 30개, 13개 내지 50개, 14개 내지 30개, 14개 내지 50개, 15개 내지 30개, 15개 내지 50개, 16개 내지 30개, 16개 내지 50개, 17개 내지 30개, 17개 내지 50개, 18개 내지 22개, 18개 내지 24개, 18개 내지 30개, 18개 내지 50개, 19개 내지 22개, 19개 내지 30개, 19개 내지 50개 또는 20개 내지 30개의 연결된 서브유닛을 갖는다. 이러한 일부 실시양태에서, 안티센스 화합물은 길이에 있어서 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 50개, 51개, 52개, 53개, 54개, 55개, 56개, 57개, 58개, 59개, 60개, 61개, 62개, 63개, 64개, 65개, 66개, 67개, 68개, 69개, 70개, 71개, 72개, 73개, 74개, 75개, 76개, 77개, 78개, 79개 또는 80개의 연결된 서브유닛, 또는 상기 값들 중 임의의 두 값들에 의해 정의된 범위 내의 수의 서브유닛을 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 화합물은 안티센스 올리고뉴클레오타이드이고, 연결된 서브유닛은 뉴클레오타이드이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 단축될 수 있거나 절두될 수 있다. 예를 들면, 단일 서브유닛이 5' 말단으로부터 결실될 수 있거나(5' 절두), 대안적으로 3' 말단으로부터 결실될 수 있다(3' 절두). 안드로겐 수용체 핵산으로 표적화되는 단축된 또는 절두된 안티센스 화합물은 안티센스 화합물의 5' 말단으로부터 결실된 2개의 서브유닛을 가질 수 있거나, 대안적으로 안티센스 화합물의 3' 말단으로부터 결실된 2개의 서브유닛을 가질 수 있다. 대안적으로, 결실된 뉴클레오사이드는 안티센스 화합물 전체에 걸쳐 분산되어 있을 수 있다(예를 들면, 5' 말단으로부터 결실된 1개의 뉴클레오사이드 및 3' 말단으로부터 결실된 1개의 뉴클레오사이드를 갖는 안티센스 화합물).
단일 추가 서브유닛이 연장된 안티센스 화합물에 존재하는 경우, 상기 추가 서브유닛은 안티센스 화합물의 5' 말단 또는 3' 말단에 위치할 수 있다. 2개 이상의 추가 서브유닛들이 존재하는 경우, 추가된 서브유닛들은 서로 인접하여 존재할 수 있다(예를 들면, 안티센스 화합물의 5' 말단(5' 추가) 또는 대안적으로 3' 말단(3' 추가)에 추가된 2개의 서브유닛을 갖는 안티센스 화합물). 대안적으로, 추가된 서브유닛들은 안티센스 화합물 전체에 걸쳐 분산되어 있을 수 있다(예를 들면, 5' 말단에 추가된 1개의 서브유닛 및 3' 말단에 추가된 1개의 서브유닛을 갖는 안티센스 화합물).
활성을 제거하지 않으면서 안티센스 화합물, 예컨대, 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 길이를 증가시키거나 감소시키고/시키거나 불일치 염기를 도입하는 것이 가능하다. 예를 들면, 문헌(Woolf et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7305-7309, 1992)에서, 길이에 있어서 13개 내지 25개의 핵염기를 갖는 일련의 안티센스 올리고뉴클레오타이드들을 난모세포 주입 모델에서 표적 RNA의 절단을 도입하는 그들의 능력에 대해 시험하였다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 말단 근처에서 8개 또는 11개의 불일치 염기를 갖는 25개 핵염기 길이의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 비록 불일치를 함유하지 않는 안티센스 올리고뉴클레오타이드보다 더 낮은 정도이지만 표적 mRNA의 특이적 절단을 유도할 수 있었다. 유사하게, 1개 또는 3개의 불일치를 갖는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 13개 핵염기를 갖는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 표적 특이적 절단을 달성하였다.
문헌(Gautschi et al., J. Natl. Cancer Inst. 93:463-471, March 2001)은 bcl-2 mRNA에 대한 100% 상보성을 갖고 bcl-xL mRNA에 대한 3개의 불일치를 갖는 올리고뉴클레오타이드가 시험관내 및 생체내에서 bcl-2 및 bcl-xL 둘 다의 발현을 감소시키는 능력을 갖는다는 것을 입증하였다. 나아가, 이 올리고뉴클레오타이드는 생체내에서 강력한 항-종양 활성을 나타내었다.
문헌(Maher and Dolnick, Nuc. Acid. Res. 16:3341-3358, 1988)의 저자들은 일련의 직렬 14개 핵염기를 갖는 안티센스 올리고뉴클레오타이드; 및 각각 2개 또는 3개의 상기 직렬(tandem) 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 서열로 구성된, 28개 핵염기를 갖는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 42개 핵염기를 갖는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 토끼 망상적혈구세포 분석에서 인간 DHFR의 번역을 저지하는 그들의 능력에 대해 시험하였다. 14개 핵염기를 갖는 3개의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 각각은 비록 28개 또는 42개 핵염기를 갖는 안티센스 올리고뉴클레오타이드보다 더 약한 수준이지만 단독으로 번역을 억제할 수 있었다.
특정 안티센스 화합물 모티프 및 기작
일부 실시양태에서, 안티센스 화합물은 향상된 억제 활성, 표적 핵산에 대한 증가된 결합 친화성, 또는 생체내 핵산분해효소에 의한 분해에 대한 내성과 같은 성질을 안티센스 화합물에 부여하도록 패턴 또는 모티프로 정렬된 화학적으로 변경된 서브유닛을 갖는다.
키메라 안티센스 화합물은 전형적으로 핵산분해효소 분해에 대한 증가된 내성, 증가된 세포 섭취, 표적 핵산에 대한 증가된 결합 친화성, 및/또는 증가된 억제 활성을 부여하도록 변경된 하나 이상의 영역을 함유한다. 키메라 안티센스 화합물의 제2 영역은 또 다른 원하는 성질을 부여할 수 있는데, 예를 들면, RNA:DNA 이중체의 RNA 가닥을 절단하는 세포 핵산내부분해효소(endonuclease) RNase H에 대한 기질로서 작용할 수 있다.
안티센스 활성은 안티센스 화합물(예를 들면, 올리고뉴클레오타이드)과 표적 핵산의 혼성화를 수반하는 임의의 기작으로부터 발생될 수 있고, 이때 혼성화는 궁극적으로 생물학적 효과를 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산의 양 및/또는 활성은 조절된다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산의 양 및/또는 활성은 감소된다. 일부 실시양태에서, 안티센스 화합물과 표적 핵산의 혼성화는 궁극적으로 표적 핵산 분해를 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 안티센스 화합물과 표적 핵산의 혼성화는 표적 핵산 분해를 발생시키지 않는다. 이러한 일부 실시양태에서, 표적 핵산과 혼성화된 안티센스 화합물의 존재(점유)는 안티센스 활성의 조절을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 특정 화학적 모티프 또는 패턴의 화학적 변경을 갖는 안티센스 화합물은 하나 이상의 기작을 활용하기에 특히 적합하다. 일부 실시양태에서, 안티센스 화합물은 하나 초과의 기작을 통해 및/또는 밝혀지지 않은 기작을 통해 작용한다. 따라서, 본원에 기재된 안티센스 화합물은 특정 기작에 의해 한정되지 않는다.
안티센스 기작은 RNase H-매개된 안티센스; RISC 경로를 이용하고 siRNA, ssRNA 및 마이크로RNA 기작을 포함하나 이들로 한정되지 않는 RNAi 기작; 및 점유에 기초한 기작을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 일부 안티센스 화합물은 하나 초과의 이러한 기작을 통해 및/또는 추가 기작을 통해 작용할 수 있다.
RNase H-매개된 안티센스
일부 실시양태에서, 안티센스 활성은 적어도 부분적으로 RNase H에 의한 표적 RNA의 분해로부터 발생한다. RNase H는 RNA:DNA 이중체의 RNA 가닥을 절단하는 세포 핵산내부분해효소이다. "DNA-유사" 화합물인 단일 가닥 안티센스 화합물이 포유동물 세포에서 RNase H 활성을 이끌어낸다는 것은 당분야에서 공지되어 있다. 따라서, DNA 또는 DNA-유사 뉴클레오사이드의 적어도 부분을 포함하는 안티센스 화합물은 RNase H를 활성화시켜 표적 핵산의 절단을 발생시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, RNase H를 사용하는 안티센스 화합물은 하나 이상의 변경된 뉴클레오사이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 안티센스 화합물은 1개 내지 8개의 변경된 뉴클레오사이드로 구성되는 하나 이상의 블록을 포함한다. 이러한 일부 실시양태에서, 변경된 뉴클레오사이드는 RNase H 활성을 뒷받침하지 않는다. 일부 실시양태에서, 이러한 안티센스 화합물은 본원에 기재된 바와 같이 갭머(gapmer)이다. 이러한 일부 실시양태에서, 갭머의 갭은 DNA 뉴클레오사이드를 포함한다. 이러한 일부 실시양태에서, 갭머의 갭은 DNA-유사 뉴클레오사이드를 포함한다. 이러한 일부 실시양태에서, 갭머의 갭은 DNA 뉴클레오사이드 및 DNA-유사 뉴클레오사이드를 포함한다.
갭머 모티프를 갖는 일부 안티센스 화합물은 키메라 안티센스 화합물로서 간주된다. 갭머에서 RNase H 절단을 뒷받침하는 복수의 뉴클레오타이드를 갖는 내부 영역은 이 내부 영역의 뉴클레오사이드와 화학적으로 구별되는 복수의 뉴클레오타이드를 갖는 외부 영역들 사이에 위치한다. 갭머 모티프를 갖는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 경우, 갭 세그먼트는 일반적으로 핵산내부분해효소 절단에 대한 기질로서 작용하는 반면, 윙 세그먼트는 변경된 뉴클레오사이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 갭머의 영역은 각각의 상이한 영역을 포함하는 당 모이어티의 유형에 의해 구별된다. 일부 실시양태에서, 갭머의 영역을 구별하는 데 이용되는 당 모이어티의 유형은 β-D-리보뉴클레오사이드, β-D-데옥시리보뉴클레오사이드, 2'-변경된 뉴클레오사이드(이러한 2'-변경된 뉴클레오사이드는 특히 2'-MOE 및 2'-O-CH3을 포함할 수 있음), 및 이환형 당 변경된 뉴클레오사이드(이러한 이환형 당 변경된 뉴클레오사이드는 구속된 에틸을 갖는 이환형 당 변경된 뉴클레오사이드를 포함할 수 있음)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 윙의 뉴클레오사이드는 예를 들면, 2'-MOE를 포함하는 여러 변경된 당 모이어티 및 이환형 당 모이어티, 예컨대, 구속된 에틸 또는 LNA를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 윙은 여러 변경된 당 모이어티 및 비변경된 당 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 윙은 2'-MOE 뉴클레오사이드, 이환형 당 모이어티, 예컨대, 구속된 에틸 뉴클레오사이드 또는 LNA 뉴클레오사이드, 및 2'-데옥시뉴클레오사이드의 다양한 조합물들을 포함할 수 있다.
각각의 상이한 영역은 균일한 당 모이어티, 변이체 또는 교대로 존재하는 당 모이어티를 포함할 수 있다. 윙-갭-윙 모이어티는 종종 "X-Y-Z"로서 기재되고, 이때 "X"는 5'-윙의 길이를 나타내고, "Y"는 갭의 길이를 나타내고, "Z"는 3'-윙의 길이를 나타낸다. "X" 및 "Z"는 균일한, 변이체 또는 교대로 존재하는 당 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, "X" 및 "Y"는 하나 이상의 2'-데옥시뉴클레오사이드를 포함할 수 있다. "Y"는 2'-데옥시뉴클레오사이드를 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "X-Y-Z"로서 기재된 갭머는 갭이 5'-윙 및 3'-윙 각각에 바로 인접하여 위치하게 하는 배열을 갖는다. 따라서, 5'-윙와 갭 사이에, 또는 갭과 3'-윙 사이에 개재 뉴클레오타이드가 존재하지 않는다. 본원에 기재된 안티센스 화합물들 중 임의의 안티센스 화합물은 갭머 모티프를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, "X" 및 "Z"는 동일하고; 다른 실시양태에서, 이들은 상이하다. 일부 실시양태에서, "Y"는 8개 내지 15개의 뉴클레오사이드이다. X, Y 또는 Z는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 25개 또는 30개 이상의 뉴클레오사이드 중 임의의 뉴클레오사이드일 수 있다.
일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체 핵산으로 표적화되는 안티센스 화합물은 갭이 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개 또는 16개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되어 있는 갭머 모티프를 갖는다.
일부 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 하기 화학식 A로 기재된 당 모티프를 갖는다:
[화학식 A]
(J)m-(B)n-(J)p-(B)r-(A)t-(D)g-(A)v-(B)w-(J)x-(B)y-(J)z
상기 식에서,
A는 각각 독립적으로 2'-치환된 뉴클레오사이드이고;
B는 각각 독립적으로 이환형 뉴클레오사이드이고;
J는 각각 독립적으로 2'-치환된 뉴클레오사이드 또는 2'-데옥시뉴클레오사이드이고;
D는 각각 2'-데옥시뉴클레오사이드이고;
m은 0 내지 4이고;
n은 0 내지 2이고;
p는 0 내지 2이고;
r은 0 내지 2이고;
t는 0 내지 2이고;
v는 0 내지 2이고;
w는 0 내지 4이고;
x는 0 내지 2이고;
y는 0 내지 2이고;
z는 0 내지 4이고;
g는 6 내지 14이되;
단, m, n 및 r 중 하나 이상은 0이 아니고;
w 및 y 중 하나 이상은 0이 아니고;
m, n, p, r 및 t의 합계는 2 내지 5이고;
v, w, x, y 및 z의 합계는 2 내지 5이다.
RNAi 화합물
일부 실시양태에서, 안티센스 화합물은 이중 가닥 RNA 화합물(짧은 간섭 RNA 또는 siRNA로서도 지칭됨) 및 단일 가닥 RNAi 화합물(또는 ssRNA)을 포함하는 간섭 RNA 화합물(RNAi)이다. 이러한 화합물은 표적 핵산을 분해하고/하거나 격리시키기 위해 적어도 부분적으로 RISC 경로를 통해 작용한다(따라서, 마이크로RNA/마이크로RNA-유사 화합물을 포함함). 일부 실시양태에서, 안티센스 화합물은 이것이 이러한 기작에 특히 적합하게 만드는 변경을 포함한다.
i. ssRNA 화합물
일부 실시양태에서, 단일 가닥 RNAi 화합물(ssRNA)로서 사용되기에 특히 적합한 안티센스 화합물을 포함하는 안티센스 화합물은 변경된 5' 말단을 포함한다. 이러한 일부 실시양태에서, 5' 말단은 변경된 포스페이트 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 변경된 포스페이트는 안정화되어 있다(예를 들면, 비변경된 5'-포스페이트에 비해 분해/절단에 대한 내성을 나타낸다). 일부 실시양태에서, 이러한 5' 말단 뉴클레오사이드는 5'-인 모이어티를 안정화시킨다. 일부 변경된 5' 말단 뉴클레오사이드는 당분야, 예를 들면, 국제 특허출원 공보 제WO/2011/139702호에서 발견될 수 있다.
일부 실시양태에서, ssRNA 화합물의 5'-뉴클레오사이드는 하기 화학식 IIc를 갖는다:
[화학식 IIc]
상기 식에서,
T1은 임의적으로 보호된 인 모이어티이고;
T2는 화학식 IIc의 화합물을 올리고머 화합물에 연결하는 뉴클레오사이드 간 결합 기이고;
A는 하기 화학식들 중 하나를 갖고:
Q1 및 Q2는 각각 독립적으로 H, 할로겐, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, 치환된 C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 치환된 C2-C6 알키닐 또는 N(R3)(R4)이고;
Q3은 O, S, N(R5) 또는 C(R6)(R7)이고;
R3, R4, R5, R6 및 R7은 각각 독립적으로 H, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬 또는 C1-C6 알콕시이고;
M3은 O, S, NR14, C(R15)(R16), C(R15)(R16)C(R17)(R18), C(R15)=C(R17), OC(R15)(R16) 또는 OC(R15)(Bx2)이고;
R14는 H, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, 치환된 C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐 또는 치환된 C2-C6 알키닐이고;
R15, R16, R17 및 R18은 각각 독립적으로 H, 할로겐, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, 치환된 C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐 또는 치환된 C2-C6 알키닐이고;
Bx1은 헤테로환형 염기 모이어티이거나;
Bx2가 존재하는 경우, Bx2는 헤테로환형 염기 모이어티이고, Bx1은 H, 할로겐, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, 치환된 C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐 또는 치환된 C2-C6 알키닐이고;
J4, J5, J6 및 J7은 각각 독립적으로 H, 할로겐, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, 치환된 C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐 또는 치환된 C2-C6 알키닐이거나;
J4는 J5 및 J7 중 하나와 가교를 형성하고, 이때 상기 가교는 O, S, NR19, C(R20)(R21), C(R20)=C(R21), C[=C(R20)(R21)] 및 C(=O)로부터 선택되는 1개 내지 3개의 연결된 이라디칼 기를 포함하고, J5, J6 및 J7 중 나머지 둘은 각각 독립적으로 H, 할로겐, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, 치환된 C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐 또는 치환된 C2-C6 알키닐이고;
R19, R20 및 R21은 각각 독립적으로 H, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, 치환된 C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐 또는 치환된 C2-C6 알키닐이고;
G는 H, OH, 할로겐 또는 0-[C(R8)(R9)]n-[(C=0)m-Xl]j-Z이고;
R8 및 R9는 각각 독립적으로 H, 할로겐, C1-C6 알킬 또는 치환된 C1-C6 알킬이고;
Xl은 O, S 또는 N(El)이고;
Z는 H, 할로겐, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 치환된 C2-C6 알키닐 또는 N(E2)(E3)이고;
E1, E2 및 E3은 각각 독립적으로 H, C1-C6 알킬 또는 치환된 C1-C6 알킬이고;
n은 1 내지 약 6이고;
m은 0 또는 1이고;
j는 0 또는 1이고;
각각의 치환된 기는 할로겐, OJ1, N(J1)(J2), =NJ1, SJ1, N3, CN, OC(=X2)J1, OC(=X2)N(J1)(J2) 및 C(=X2)N(J1)(J2)로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 임의적으로 보호된 치환기를 포함하고;
X2는 O, S 또는 NJ3이고;
J1, J2 및 J3은 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고;
j가 1일 때, Z는 할로겐 또는 N(E2)(E3)가 아니고;
이때, 상기 올리고머 화합물은 8개 내지 40개의 단량체 서브유닛을 포함하고 표적 핵산의 적어도 부분에 혼성화될 수 있다.
일부 실시양태에서, M3은 O, CH=CH, OCH2 또는 OC(H)(Bx2)이다. 일부 실시양태에서, M3은 O이다.
일부 실시양태에서, J4, J5, J6 및 J7은 각각 H이다. 일부 실시양태에서, J4는 J5 및 J7 중 하나와 가교를 형성한다.
일부 실시양태에서, A는 하기 화학식들 중 하나를 갖는다:
상기 식에서,
Q1 및 Q2는 각각 독립적으로 H, 할로겐, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시 또는 치환된 C1-C6 알콕시이다. 일부 실시양태에서, Q1 및 Q2는 각각 H이다. 일부 실시양태에서, Q1 및 Q2는 각각 독립적으로 H 또는 할로겐이다. 일부 실시양태에서, Q1 및 Q2는 H이고, Q1 및 Q2는 중 나머지는 F, CH3 또는 OCH3이다.
일부 실시양태에서, T1은 하기 화학식을 갖는다:
상기 식에서,
Ra 및 Rc는 각각 독립적으로 보호된 하이드록실, 보호된 티올, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, 치환된 C1-C6 알콕시, 보호된 아미노 또는 치환된 아미노이고;
Rb는 O 또는 S이다. 일부 실시양태에서, Rb는 O이고, Ra 및 Rc는 각각 독립적으로 OCH3, OCH2CH3 또는 CH(CH3)2이다.
일부 실시양태에서, G는 할로겐, OCH3, OCH2F, OCHF2, OCF3, OCH2CH3, O(CH2)2F, OCH2CHF2, OCH2CF3, OCH2-CH=CH2, O(CH2)2-OCH3, O(CH2)2-SCH3, O(CH2)2-OCF3, O(CH2)3-N(R10)(R11), O(CH2)2-ON(R10)(R11), O(CH2)2-O(CH2)2-N(R10)(R11), OCH2C(=O)-N(R10)(R11), OCH2C(=O)-N(R12)-(CH2)2-N(R10)(R11) 또는 O(CH2)2-N(R12)-C(=NR13)[N(R10)(R11)]이고, 이때 R10, R11, R12 및 R13은 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이다. 일부 실시양태에서, G는 할로겐, OCH3, OCF3, OCH2CH3, OCH2CF3, OCH2-CH=CH2, O(CH2)2-OCH3, O(CH2)2-O(CH2)2-N(CH3)2, OCH2C(=O)-N(H)CH3, OCH2C(=O)-N(H)-(CH2)2-N(CH3)2 또는 OCH2-N(H)-C(=NH)NH2이다. 일부 실시양태에서, G는 F, OCH3 또는 O(CH2)2-OCH3이다. 일부 실시양태에서, G는 O(CH2)2-OCH3이다.
일부 실시양태에서, 5' 말단 뉴클레오사이드는 하기 화학식 IIe를 갖는다:
[화학식 IIe]
일부 실시양태에서, ssRNA에 특히 적합한 안티센스 화합물을 포함하는 안티센스 화합물은 정의된 패턴 또는 당 변경 모티프로 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 영역을 따라 정렬된 하나 초과의 유형의 변경된 당 모이어티 및/또는 천연 발생 당 모이어티를 포함한다. 이러한 모티프는 본원에서 논의된 당 변경 및/또는 다른 공지된 당 변경 중 임의의 당 변경을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오타이드는 균일한 당 변경을 갖는 영역을 포함하거나 이러한 영역으로 구성된다. 이러한 일부 실시양태에서, 상기 영역의 각각의 뉴클레오사이드는 동일한 RNA-유사 당 변경을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 영역의 각각의 뉴클레오사이드는 2'-F 뉴클레오사이드이다. 일부 실시양태에서, 상기 영역의 각각의 뉴클레오사이드는 2'-OMe 뉴클레오사이드이다. 일부 실시양태에서, 상기 영역의 각각의 뉴클레오사이드는 2'-MOE 뉴클레오사이드이다. 일부 실시양태에서, 상기 영역의 각각의 뉴클레오사이드는 cEt 뉴클레오사이드이다. 일부 실시양태에서, 상기 영역의 각각의 뉴클레오사이드는 LNA 뉴클레오사이드이다. 일부 실시양태에서, 균일한 영역은 올리고뉴클레오타이드의 전부 또는 본질적으로 전부를 구성한다. 일부 실시양태에서, 상기 영역은 1개 내지 4개의 말단 뉴클레오사이드를 제외한 전체 올리고뉴클레오타이드를 구성한다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오타이드는 교대로 존재하는 당 변경의 하나 이상의 영역을 포함하고, 이때 뉴클레오사이드는 제1 유형의 당 변경을 갖는 뉴클레오타이드와 제2 유형의 당 변경을 갖는 뉴클레오타이드 사이에 교대로 존재한다. 일부 실시양태에서, 상기 두 유형의 뉴클레오사이드는 RNA-유사 뉴클레오사이드이다. 일부 실시양태에서, 교대로 존재하는 뉴클레오사이드는 2'-OMe, 2'-F, 2'-MOE, LNA 및 cEt로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 교대로 존재하는 변경은 2'-F 및 2'-OMe이다. 이러한 영역들은 인접하여 존재할 수 있거나 상이하게 변경된 뉴클레오사이드 또는 접합된 뉴클레오사이드에 의해 단절될 수 있다.
일부 실시양태에서, 교대로 존재하는 변경의 교대로 존재하는 영역은 각각 단일 뉴클레오사이드로 구성된다(즉, 패턴이 (AB)xAy이고, 이때 A는 제1 유형의 당 변경을 갖는 뉴클레오사이드이고, B는 제2 유형의 당 변경을 갖는 뉴클레오사이드이고, x는 1 내지 20이고, y는 0 또는 1이다). 일부 실시양태에서, 교대로 존재하는 모티프에서 하나 이상의 교대로 존재하는 영역은 하나 초과의 유형의 단일 뉴클레오사이드를 포함한다. 예를 들면, 올리고뉴클레오타이드는 하기 뉴클레오사이드 모티프들 중 임의의 뉴클레오사이드 모티프의 하나 이상의 영역을 포함할 수 있다:
AABBAA;
ABBABB;
AABAAB;
ABBABAABB;
ABABAA;
AABABAB;
ABABAA;
ABBAABBABABAA;
BABBAABBABABAA; 또는
ABABBAABBABABAA
상기 모티프에서,
A는 제1 유형의 뉴클레오사이드이고, B는 제2 유형의 뉴클레오사이드이다. 일부 실시양태에서, A 및 B는 2'-F, 2'-OMe, BNA 및 MOE로부터 각각 선택된다.
일부 실시양태에서, 이러한 교대로 존재하는 모티프를 갖는 올리고뉴클레오타이드는 변경된 5' 말단 뉴클레오사이드, 예컨대, 화학식 IIc 또는 IIe의 변경된 5' 말단 뉴클레오사이드도 포함한다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오타이드는 2-2-3 모티프를 갖는 영역을 포함한다. 이러한 영역은 하기 모티프를 포함한다:
-(A)2-(B)x-(A)2-(C)y-(A)3-
상기 모티프에서,
A는 제1 유형의 변경된 뉴클레오사이드이고;
B 및 C는 A와 상이하게 변경된 뉴클레오사이드이지만, B 및 C는 서로 동일한 또는 상이한 변경을 가질 수 있고;
x 및 y는 1 내지 15이다.
일부 실시양태에서, A는 2'-OMe 변경된 뉴클레오사이드이다. 일부 실시양태에서, B 및 C는 둘 다 2'-F 변경된 뉴클레오사이드이다. 일부 실시양태에서, A는 2'-OMe 변경된 뉴클레오사이드이고, B 및 C는 둘 다 2'-F 변경된 뉴클레오사이드이다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오사이드는 하기 당 모티프를 갖는다:
5'-(Q)-(AB)xAy-(D)z
상기 모티프에서,
Q는 안정화된 포스페이트 모이어티를 포함하는 뉴클레오사이드이고(일부 실시양태에서, Q는 화학식 IIc 또는 IIe를 갖는 뉴클레오사이드이고);
A는 제1 유형의 변경된 뉴클레오사이드이고;
B는 제2 유형의 변경된 뉴클레오사이드이고;
D는 그와 인접한 뉴클레오사이드와 상이한 변경을 포함하는 변경된 뉴클레오사이드이고(따라서, y가 0인 경우 D는 B와 상이하게 변경되어야 하고, y가 1인 경우 D는 A와 상이하게 변경되어야 한다. 일부 실시양태에서, D는 A 및 B 둘 다와 상이하다.);
X는 5 내지 15이고;
Y는 0 또는 1이고;
Z는 0 내지 4이다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오사이드는 하기 당 모티프를 갖는다:
5'-(Q)-(A)x-(D)z
상기 모티프에서,
Q는 안정화된 포스페이트 모이어티를 포함하는 뉴클레오사이드이고(일부 실시양태에서, Q는 화학식 IIc 또는 IIe를 갖는 뉴클레오사이드이고);
A는 제1 유형의 변경된 뉴클레오사이드이고;
D는 A와 상이한 변경을 포함하는 변경된 뉴클레오사이드이고;
X는 11 내지 30이고;
Z는 0 내지 4이다.
일부 실시양태에서, 상기 모티프들에서 A, B, C 및 D는 2'-OMe, 2'-F, 2'-MOE, LNA 및 cEt로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, D는 말단 뉴클레오사이드를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 이러한 말단 뉴클레오사이드는 (비록 하나 이상이 우연히 혼성화할 것이지만) 표적 핵산에 혼성화하도록 디자인되지 않는다. 일부 실시양태에서, 각각의 D 뉴클레오사이드의 핵염기는 표적 핵산의 상응하는 위치에서 핵염기의 정체와 관계없이 아데닌이다. 일부 실시양태에서, 각각의 D 뉴클레오사이드의 핵염기는 타이민이다.
일부 실시양태에서, ssRNA로서 사용되기에 특히 적합한 안티센스 화합물을 포함하는 안티센스 화합물은 정의된 패턴 또는 변경된 뉴클레오사이드 간 결합 모티프로 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 영역을 따라 정렬된 변경된 뉴클레오사이드 간 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오타이드는 교대로 존재하는 뉴클레오사이드 간 결합 모티프를 갖는 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오타이드는 균일하게 변경된 뉴클레오사이드 간 결합의 영역을 포함한다. 이러한 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드 간 결합에 의해 균일하게 연결된 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드 간 결합에 의해 균일하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오타이드의 각각의 뉴클레오사이드 간 결합은 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오타이드의 각각의 뉴클레오사이드 간 결합은 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트로부터 선택되고, 하나 이상의 뉴클레오사이드 간 결합은 포스포로티오에이트이다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오타이드는 6개 이상의 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드 간 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오타이드는 8개 이상의 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드 간 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오타이드는 10개 이상의 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드 간 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오타이드는 6개 이상의 연속 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드 간 결합의 하나 이상의 블록을 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오타이드는 8개 이상의 연속 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드 간 결합의 하나 이상의 블록을 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오타이드는 10개 이상의 연속 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드 간 결합의 하나 이상의 블록을 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오타이드는 12개 이상의 연속 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드 간 결합의 하나 이상의 블록을 포함한다. 이러한 일부 실시양태에서, 이러한 하나 이상의 블록은 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단에 위치한다. 이러한 일부 실시양태에서, 이러한 하나 이상의 블록은 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단의 3개 뉴클레오사이드 내에 위치한다.
본원에 기재된 다양한 당 모티프들 중 임의의 당 모티프를 갖는 올리고뉴클레오타이드는 임의의 연결 모티프를 가질 수 있다. 예를 들면, 전술된 올리고뉴클레오타이드들을 포함하나 이들로 한정되지 않는 올리고뉴클레오타이드는 하기 비한정적 표로부터 선택되는 연결 모티프를 가질 수 있다:
ii. siRNA 화합물
일부 실시양태에서, 안티센스 화합물은 이중 가닥 RNAi 화합물(siRNA)이다. 이러한 실시양태에서, 한 가닥 또는 두 가닥이 ssRNA에 대해 전술된 임의의 변경 모티프를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, ssRNA 화합물은 비변경된 RNA일 수 있다. 일부 실시양태에서, siRNA 화합물은 비변경된 RNA 뉴클레오사이드를 포함할 수 있으나, 변경된 뉴클레오사이드 간 결합을 포함할 수 있다.
몇몇 실시양태는 이중 가닥 조성물에 관한 것으로서, 이때 각각의 가닥은 하나 이상의 변경된 또는 비변경된 뉴클레오사이드의 위치에 의해 정의된 모티프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 전체적으로 또는 적어도 부분적으로 혼성화되어 이중체 영역을 형성하는 제1 올리고머 화합물 및 제2 올리고머 화합물을 포함하고 핵산 표적에 상보적이고 혼성화하는 영역을 추가로 포함하는 조성물이 제공된다. 이러한 조성물은 핵산 표적에 대한 전체적 또는 부분적 상보성을 갖는 안티센스 가닥인 제1 올리고머 화합물, 및 제1 올리고머 화합물에 상보적인 하나 이상의 영역을 가져 하나 이상의 이중체 영역을 형성하는 센스 가닥인 제2 올리고머 화합물을 포함하는 것이 적합하다.
몇몇 실시양태의 조성물은 핵산 표적에 혼성화하여 그의 정상 기능을 상실시킴으로써 유전자 발현을 조절한다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산은 안드로겐 수용체이다. 일부 실시양태에서, 표적화된 안드로겐 수용체의 분해는 본 발명의 조성물로 형성되는 활성화된 RISC 복합체에 의해 용이해진다.
몇몇 실시양태는 이중 가닥 조성물에 관한 것으로서, 이때 가닥들 중 하나는 예를 들면, RISC(또는 절단) 복합체 내로의 반대 가닥의 우세한 적재에 영향을 미치는 데 유용하다. 상기 조성물은 선택되는 핵산 분자를 표적화하고 하나 이상의 유전자의 발현을 조절하는 데 유용하다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 표적 RNA의 부분에 혼성화하여 표적 RNA의 정상 기능을 상실시킨다.
일부 실시양태는 이중 가닥 조성물에 관한 것으로서, 이때 가닥들 둘 다가 헤미머(hemimer) 모티프, 전체적으로 변경된 모티프, 위치적으로 변경된 모티프 또는 교대로 존재하는 모티프를 포함한다. 본 발명의 조성물의 각각의 가닥은 예를 들면, siRNA 경로에서 특정 역할을 이행하도록 변경될 수 있다. 각각의 가닥에서 상이한 모티프를 사용하거나 각각의 가닥에서 상이한 화학적 변경을 갖는 동일한 모티프를 사용하는 것은 센스 가닥의 도입을 억제하면서 안티센스 가닥을 RISC 복합체에 대해 표적화하게 한다. 이 모델 내에서, 각각의 가닥은 그의 특정 역할을 위해 향상되도록 독립적으로 변경될 수 있다. 안티센스 가닥은 RISC의 한 영역에서 그의 역할을 향상시키도록 5' 말단에서 변경될 수 있는 반면, 3' 말단은 RISC의 상이한 영역에서 그의 역할을 향상시키도록 상이하게 변경될 수 있다.
이중 가닥 올리고뉴클레오타이드 분자는 자가-상보적 센스 영역 및 안티센스 영역을 포함하는 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드 분자일 수 있고, 이때 상기 안티센스 영역은 표적 핵산 분자 또는 이의 부분의 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 센스 영역은 표적 핵산 서열 또는 이의 부분에 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드 분자는 2개의 별도의 올리고뉴클레오타이드들로부터 조립될 수 있고, 이때 한 가닥은 센스 가닥이고, 나머지 가닥은 안티센스 가닥이고, 이때 상기 안티센스 가닥 및 상기 센스 가닥은 자가-상보적이다. 즉, 각각의 가닥은 다른 가닥의 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는데; 예컨대, 안티센스 가닥 및 센스 가닥이 이중체 또는 이중 가닥 구조물을 형성하는 경우(예를 들면, 이때 이중 가닥 영역은 약 15개 내지 약 30개, 예를 들면, 약 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개 또는 30개의 염기쌍을 가짐), 상기 안티센스 가닥은 표적 핵산 분자 또는 이의 부분의 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 센스 가닥은 표적 핵산 서열 또는 이의 부분에 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다(예를 들면, 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드 분자의 약 15개 내지 약 25개 이상의 뉴클레오타이드들이 표적 핵산 또는 이의 부분에 상보적이다). 대안적으로, 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드는 단일 올리고뉴클레오타이드로부터 조립되고, 이때 siRNA의 자가-상보적 센스 영역과 안티센스 영역은 핵산에 기초한 또는 비-핵산에 기초한 연결제(들)에 의해 연결된다.
이중 가닥 올리고뉴클레오타이드는 자가-상보적 센스 영역 및 안티센스 영역을 갖는, 이중체, 비대칭 이중체, 헤어핀 또는 비대칭 헤어핀 이차 구조를 갖는 폴리뉴클레오타이드일 수 있고, 이때 상기 안티센스 영역은 별도의 표적 핵산 분자 또는 이의 부분의 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 센스 영역은 표적 핵산 서열 또는 이의 부분에 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드는 2개 이상의 루프 구조, 및 자가-상보적 센스 영역 및 안티센스 영역을 포함하는 줄기를 갖는 원형 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드일 수 있고, 이때 상기 안티센스 영역은 표적 핵산 분자 또는 이의 부분의 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 센스 영역은 표적 핵산 서열 또는 이의 부분에 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 갖고, 상기 원형 폴리뉴클레오타이드는 생체내 또는 시험관내에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성 siRNA 분자를 발생시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드는 별도의 센스 서열 또는 영역 및 안티센스 서열 또는 영역을 포함하고, 이때 상기 센스 영역과 상기 안티센스 영역은 당분야에서 공지되어 있는 뉴클레오타이드 또는 비-뉴클레오타이드 연결제 분자에 의해 공유연결되거나, 대안적으로 이온성 상호작용, 수소결합, 반데르발스 상호작용, 소수성 상호작용 및/또는 적층 상호작용에 의해 비-공유연결된다. 일부 실시양태에서, 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드는 표적 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드는 표적 유전자의 발현의 억제를 야기하는 방식으로 표적 유전자의 뉴클레오타이드 서열과 상호작용한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드는 RNA만을 함유하는 분자로 한정될 필요는 없고, 화학적으로 변경된 뉴클레오타이드 및 비-뉴클레오타이드도 포함한다. 일부 실시양태에서, 짧은 간섭 핵산 분자는 2'-하이드록시(2'-OH) 함유 뉴클레오타이드를 결여한다. 특정 실시양태에서, 짧은 간섭 핵산은 임의적으로 임의의 리보뉴클레오타이드(예를 들면, 2'-OH 기를 갖는 뉴클레오타이드)를 포함하지 않는다. 그러나, RNAi를 뒷받침하기 위해 분자 내의 리보뉴클레오타이드의 존재를 요구하지 않는 이러한 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드는 2'-OH 기를 갖는 하나 이상의 뉴클레오타이드를 함유하는 부착된 연결제 또는 연결제들 또는 다른 부착된 또는 회합된 기, 모이어티, 또는 쇄를 가질 수 있다. 임의적으로, 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 위치의 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50%에서 리보뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 siRNA는 서열 특이적 RNAi를 매개할 수 있는 핵산 분자를 기재하는 데 사용된 다른 용어들, 예를 들면, 짧은 간섭 RNA(siRNA), 이중 가닥 RNA(dsRNA), 마이크로RNA(miRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 짧은 간섭 올리고뉴클레오타이드, 짧은 간섭 핵산, 짧은 간섭 변경된 올리고뉴클레오타이드, 화학적으로 변경된 siRNA, 후-전사 유전자 침묵 RNA(ptgsRNA) 등과 동등한 것으로 여겨진다. 추가로, 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 RNAi는 서열 특이적 RNA 간섭을 기재하는 데 사용된 다른 용어들, 예컨대, 후-전사 유전자 침묵, 번역 억제 또는 후생유전학(epigenetics)과 동등한 것으로 여겨진다. 예를 들면, 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드는 후-전사 수준 및 전-전사 수준 둘 다에서 유전자를 후생유전학적으로 침묵시키기 위해 사용될 수 있다. 비한정적 예에서, 비한정적 예에서, 본 발명의 siRNA 분자에 의한 유전자 발현의 후생유전학적 조절은 유전자 발현을 변경시키기 위한 염색질 구조 또는 메틸화 패턴의 siRNA-매개된 변경으로부터 발생될 수 있다(예를 들면, 문헌(Verdel et al., 2004, Science, 303, 672-676); 문헌(Pal-Bhadra et al., 2004, Science, 303, 669-672); 문헌(Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819); 문헌(Volpe et al., 2002, Science, 297, 1833-1837); 문헌(Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218); 및 문헌(Hall et al., 2002, Science, 297, 2232-2237) 참조).
본원에서 제공된 몇몇 실시양태의 화합물 및 조성물은 예를 들면, 자가-상보적 서열을 갖는 단일 RNA 가닥이 이중 가닥 입체구조를 취할 수 있는 "헤어핀" 또는 줄기-루프 이중 가닥 RNA 이펙터 분자, 또는 2개의 별도의 RNA 가닥을 포함하는 이중체 dsRNA 이펙터 분자를 포함하는 dsRNA-매개된 유전자 침묵 또는 RNAi 기작으로 안드로겐 수용체를 표적화할 수 있는 것으로 생각된다. 다양한 실시양태에서, dsRNA는 전적으로 리보뉴클레오타이드로 구성되거나 리보뉴클레오타이드와 데옥시뉴클레오타이드의 혼합물로 구성된다(예를 들면, 2000년 4월 19일자로 출원된 국제 특허출원 공보 제WO 00/63364호 또는 1999년 4월 21일자로 출원된 미국 특허출원 제60/130,377호에 개시된 RNA/DNA 혼성체). dsRNA 또는 dsRNA 이펙터 분자는 이 분자의 한 세그먼트 내의 뉴클레오타이드가 이 분자의 또 다른 세그먼트 내의 뉴클레오타이드와 염기쌍을 형성하도록 자가-상보적 영역을 갖는 단일 분자일 수 있다. 다양한 실시양태에서, 단일 분자로 구성되는 dsRNA는 전적으로 리보뉴클레오타이드로 구성되거나 데옥시리보뉴클레오타이드의 영역에 상보적인 리보뉴클레오타이드의 영역을 포함한다. 대안적으로, dsRNA는 서로 상보적인 영역을 갖는 2개의 상이한 가닥들을 포함할 수 있다.
다양한 실시양태에서, 두 가닥들은 전적으로 리보뉴클레오타이드로 구성되거나, 한 가닥은 전적으로 리보뉴클레오타이드로 구성되고 한 가닥은 전적으로 데옥시리보뉴클레오타이드로 구성되거나, 한 가닥 또는 두 가닥들은 리보뉴클레오타이드와 데옥시리보뉴클레오타이드의 혼합물을 함유한다. 일부 실시양태에서, 상보적 영역들은 서로에 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 이상 상보적일뿐만 아니라 표적 핵산 서열에도 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 이상 상보적이다. 일부 실시양태에서, 이중 가닥 입체구조로 존재하는 dsRNA의 영역은 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 50개, 75개, 100개, 200개, 500개, 1000개, 2000개 또는 5000개 이상의 뉴클레오타이드들을 포함하거나, cDNA 또는 dsRNA로 표시되는 다른 표적 핵산 서열의 모든 뉴클레오타이드들을 포함한다. 일부 실시양태에서, dsRNA는 임의의 단일 가닥 영역, 예컨대, 단일 가닥 말단을 함유하지 않거나, dsRNA는 헤어핀이다. 다른 실시양태에서, dsRNA는 하나 이상의 단일 가닥 영역 또는 오버행(overhang)을 갖는다. 일부 실시양태에서, RNA/DNA 혼성체는 안티센스 가닥 또는 영역인 DNA 가닥 또는 영역(예를 들면, 표적 핵산에 대한 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 이상의 상보성을 가짐) 및 센스 가닥 또는 영역인 RNA 가닥 또는 영역(예를 들면, 표적 핵산에 대한 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 이상의 동일성을 가짐)을 포함한다(반대 경우도 마찬가지임).
다양한 실시양태에서, RNA/DNA 혼성체는 효소적 또는 화학적 합성 방법, 예컨대, 본원에 기재된 방법 또는 2000년 4월 19일자로 출원된 국제 특허출원 공보 제WO 00/63364호 또는 1999년 4월 21일자로 출원된 미국 특허출원 제60/130,377호에 기재된 방법을 이용함으로써 시험관내에서 제조된다. 다른 실시양태에서, 시험관내에서 합성된 DNA 가닥은 세포 내로의 DNA 가닥의 형질전환 전에, 후에 또는 동시에 생체내 또는 시험관내에서 제조된 RNA 가닥과 복합체를 형성한다. 다른 실시양태에서, dsRNA는 센스 영역 및 안티센스 영역을 함유하는 단일 원형 핵산이거나, dsRNA는 원형 핵산 및 제2 원형 핵산 또는 선형 핵산을 포함한다(예를 들면, 2000년 4월 19일자로 출원된 국제 특허출원 공보 제WO 00/63364호 또는 1999년 4월 21일자로 출원된 미국 특허출원 제60/130,377호 참조). 예시적인 원형 핵산은 뉴클레오타이드의 자유 5' 포스포릴 기가 루프 백(loop back) 방식으로 또 다른 뉴클레오타이드의 2' 하이드록실 기에 연결되게 되는 올가미(lariat) 구조물을 포함한다.
다른 실시양태에서, dsRNA는 당의 2' 위치가 할로겐(예컨대, 불소 기)를 함유하거나 알콕시 기(예컨대, 메톡시 기)를 함유하는 하나 이상의 변경된 뉴클레오타이드를 포함하고, 이때 이러한 변경은 상응하는 2' 위치가 수소 또는 하이드록실 기를 함유하는 상응하는 dsRNA와 비교될 때 시험관내에서 또는 생체내에서 dsRNA의 반감기를 증가시킨다. 다른 실시양태에서, dsRNA는 인접 뉴클레오타이드들 사이에서 천연 발생 포스포디에스테르 결합 이외의 하나 이상의 결합을 포함한다. 이러한 연결의 예로는 포스포라미드, 포스포로티오에이트 및 포스포로디티오에이트 결합을 포함한다. dsRNA는 미국 특허 제6,673,661호에 교시된 바와 같이 화학적으로 변경된 핵산 분자일 수도 있다. 다른 실시양태에서, dsRNA는 예를 들면, 2000년 4월 19일자로 출원된 국제 특허출원 공보 제WO 00/63364호 또는 1999년 4월 21일자로 출원된 미국 특허출원 제60/130,377호에 개시된 바와 같이 1개 또는 2개의 캡핑된 가닥을 함유한다.
다른 실시양태에서, dsRNA는 국제 특허출원 공보 제WO 00/63364호에 개시된 적어도 부분적으로 dsRNA 분자들 중 임의의 분자일 수 있을 뿐만 아니라 미국 가특허출원 제60/399,998호, 미국 가특허출원 제60/419,532호 및 국제 특허출원 제PCT/US2003/033466호(이들의 교시는 본원에 참고로 도입됨)에 기재된 dsRNA 분자들 중 임의의 dsRNA 분자일 수도 있다. 상기 dsRNA들 중 임의의 dsRNA가 본원에 기재된 방법 또는 표준 방법, 예컨대, 국제 특허출원 공보 제WO 00/63364호에 기재된 방법을 이용함으로써 시험관내에서 또는 생체내에서 발현될 수 있다.
점유
일부 실시양태에서, 안티센스 화합물은 RNase H를 통해 표적 핵산의 절단을 발생시키거나 RISC 경로를 통해 절단 및 격리를 발생시킬 것으로 예상되지 않는다. 이러한 일부 실시양태에서, 안티센스 활성은 점유로부터 발생될 수 있고, 이때 혼성화된 안티센스 화합물의 존재는 표적 핵산의 활성을 파괴한다. 이러한 일부 실시양태에서, 안티센스 화합물은 균일하게 변경될 수 있거나 변경 및/또는 변경된 뉴클레오사이드와 비변경된 뉴클레오사이드의 혼합물을 포함할 수 있다.
표적 핵산, 표적 영역 및 뉴클레오타이드 서열
인간 안드로겐 수용체를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 하기 뉴클레오타이드 서열들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다: 진뱅크 등록 번호 NT_011669.17_TRUNC_5079000_5270000(본원에서 서열 번호 1로서 도입됨), 진뱅크 등록 번호 NM_000044.3(본원에서 서열 번호 2로서 도입됨), 진뱅크 등록 번호 NM_001011645.2(본원에서 서열 번호 3으로서 도입됨), 진뱅크 등록 번호 FJ235916.1(본원에서 서열 번호 4로서 도입됨), 진뱅크 등록 번호 FJ235917.1(본원에서 서열 번호 5로서 도입됨), 진뱅크 등록 번호 FJ235918.1(본원에서 서열 번호 6으로서 도입됨), 진뱅크 등록 번호 FJ235919.1(본원에서 서열 번호 7로서 도입됨), 및 진뱅크 등록 번호 FJ235920.1(본원에서 서열 번호 8로서 도입됨).
안드로겐 수용체 mRNA는 여러 기능성 도메인을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 전체 길이 안드로겐 수용체 mRNA는 N-말단 도메인을 코딩하는 엑손 1, DNA 결합 도메인을 코딩하는 엑손 2 및 3, 짧은 힌지 영역을 코딩하는 엑손 4, 및 리간드 결합 도메인을 코딩하는 엑손 4 내지 8을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 안티센스 화합물에 의해 표적화될 수 있는 안드로겐 수용체 스플라이싱 변이체는 N-말단 도메인을 코딩하는 엑손 1, 및 DNA 결합 도메인을 코딩하는 엑손 2 및 3, 또는 이들의 기능성 부분을 포함하나, 짧은 힌지 영역을 코딩하는 엑손 4의 적어도 부분 또는 리간드 결합 도메인을 코딩하는 엑손 4 내지 8의 적어도 부분을 포함하지 않는다. 이러한 AR 스플라이싱 변이체의 예로는 엑손 1 내지 3을 함유하되 엑손 4 내지 8을 결여하는 AR-V1, AR-V2, AR-V3, AR-V4, AR-V5, AR-V6 및 AR-V7(AR3으로서도 지칭됨)을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. AR-V1, AR-V2, AR-V3, AR-V4, AR-V5, AR-V6, AR-V7, 및 본원에서 제공된 안티센스 화합물에 의해 표적화될 수 있는 추가 스플라이싱 변이체는 문헌(Hu et al., Cancer Res 2009; 69:16-22) 및 미국 특허출원 공보 제2010/0068802호(이들 각각은 전체적으로 본원에 참고로 도입됨)에 기재되어 있다. 본원에서 제공된 안티센스 화합물에 의해 표적화될 수 있는 이러한 AR 스플라이싱 변이체의 추가 예로는 전체적으로 본원에 참고로 도입되는 문헌(Guo et al., Cancer Res. 2009; 69: 2305-13)에 기재된 AR3, AR4, AR4b, AR5 및 AR6(각각 서열 번호 4 내지 8)이 있으나 이들로 한정되지 않는다.
혼성화
일부 실시양태에서, 혼성화는 본원에 개시된 안티센스 화합물과 안드로겐 수용체 사이에서 일어난다. 혼성화의 가장 공통된 기작은 핵산 분자들의 상보적 핵염기들 사이의 수소결합(예를 들면, 왓슨-크릭, 후그스틴 또는 역전된 후그스틴 수소결합)을 수반한다.
혼성화는 다양한 조건들 하에서 일어날 수 있다. 엄격한 조건은 서열 의존적이고 혼성화될 핵산 분자들의 성질 및 조성에 의해 결정된다.
서열이 표적 핵산에 특이적으로 혼성화될 수 있는지를 결정하는 방법은 당분야에서 잘 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 안티센스 화합물은 안드로겐 수용체와 특이적으로 혼성화될 수 있다.
상보성
원하는 효과(예를 들면, 표적 핵산, 예컨대, 안드로겐 수용체 핵산의 안티센스 억제)가 일어날 정도로 안티센스 화합물의 충분한 수의 핵염기가 표적 핵산의 상응하는 핵염기와 수소결합할 수 있을 때 안티센스 화합물과 표적 핵산은 서로 상보적이다.
안티센스 화합물이 표적 핵산에 특이적으로 혼성화할 수 있는 상태로 남아있는 한, 안티센스 화합물과 안드로겐 수용체 핵산 사이의 비-상보적 핵염기가 허용될 수 있다. 더욱이, 안티센스 화합물은 개재 또는 인접 세그먼트가 혼성화 사건에 관여하지 않도록 안드로겐 수용체 핵산의 하나 이상의 세그먼트 상에서 혼성화할 수 있다(예를 들면, 루프 구조, 불일치 또는 헤어핀 구조).
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 안티센스 화합물은 또는 이의 특정된 부분은 안드로겐 수용체 핵산, 표적 영역, 표적 세그먼트 또는 이의 특정된 부분에 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상 상보적이다. 안티센스 화합물과 표적 핵산의 % 상보성은 관용적인 방법을 이용함으로써 측정될 수 있다.
예를 들면, 안티센스 화합물의 20개 핵염기들 중 18개 핵염기들이 표적 영역에 상보적이어서 특이적으로 혼성화할 안티센스 화합물은 90%의 상보성을 나타낼 것이다. 이 예에서, 남은 비-상보적 핵염기는 밀집되어 있을 수 있거나 상보적 핵염기에 의해 흩어져 있을 수 있고, 서로 인접하여 존재하거나 상보적 핵염기에 인접하여 존재할 필요가 없다. 따라서, 표적 핵산에 완전히 상보적인 2개의 영역들에 의해 플랭킹되어 있는 4개의 비-상보적 핵염기를 갖고 길이에 있어서 18개의 핵염기를 갖는 안티센스 화합물은 표적 핵산에 대한 77.8%의 총 상보성을 가질 것이므로 본 발명의 범위 내에 포함될 것이다. 표적 핵산의 영역에 대한 안티센스 화합물의 % 상보성은 당분야에서 공지되어 있는 BLAST 프로그램(기초 국소 정렬 검색 수단) 및 파워BLAST 프로그램을 사용함으로써 관용적으로 측정될 수 있다(Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656). % 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 예를 들면, 스미쓰(Smith) 및 워터만(Waterman)의 알고리즘을 사용하는, 디폴트 셋팅을 사용한 Gap 프로그램(위스콘신 서열 분석 팩키지, 유닉스를 위한 버전 8, 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group), 미국 위스콘신주 매디슨 유니버시티 리서치 파크 소재)에 의해 측정될 수 있다(Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489).
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 안티센스 화합물 또는 이의 특정된 부분은 표적 핵산 또는 이의 특정된 부분에 완전히 상보적이다(즉, 100%의 상보성). 예를 들면, 안티센스 화합물은 안드로겐 수용체 핵산, 또는 이의 표적 영역, 표적 세그먼트 또는 표적 서열에 완전히 상보적일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "완전히 상보적인"은 안티센스 화합물의 각각의 핵염기가 표적 핵산의 상응하는 핵염기와 정확한 염기쌍을 형성할 수 있다는 것을 의미한다. 예를 들면, 20개 핵염기를 갖는 안티센스 화합물은, 이 안티센스 화합물에 완전히 상보적인 표적 핵산의 상응하는 20개 핵염기를 갖는 부분이 존재하는 한, 길이에 있어서 400개 핵염기를 갖는 표적 핵산에 완전히 상보적이다. "완전히 상보적인"은 제1 핵산 및/또는 제2 핵산의 특정된 부분의 언급에서 사용될 수도 있다. 예를 들면, 30개 핵염기를 갖는 안티센스 화합물의 20개 핵염기를 갖는 부분은 길이에 있어서 400개 핵염기를 갖는 표적 서열에 "완전히 상보적"일 수 있다. 30개 핵염기를 갖는 올리고뉴클레오타이드의 20개 핵염기를 갖는 부분은 표적 서열이 상응하는 20개 핵염기를 갖는 부분을 갖는 경우 표적 서열에 완전히 상보적이고, 이때 각각의 핵염기는 안티센스 화합물의 20개 핵염기를 갖는 부분에 상보적이다. 동시에, 전체 30개 핵염기를 갖는 안티센스 화합물은 이 안티센스 화합물의 남은 10개의 핵염기도 표적 서열에 상보적인지에 따라 상기 표적 서열에 완전히 상보적일 수 있거나 완전히 상보적이지 않을 수 있다.
비-상보적 핵염기의 위치는 안티센스 화합물의 5' 말단 또는 3' 말단에 존재할 수 있다. 대안적으로, 비-상보적 핵염기 또는 핵염기들은 안티센스 화합물의 내부 위치에 존재할 수 있다. 2개 이상의 비-상보적 핵염기들이 존재하는 경우, 이들은 인접하여 존재할 수 있거나(즉, 연결될 수 있거나) 비-인접하여 존재할 수 있다. 한 실시양태에서, 비-상보적 핵염기는 갭머 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 윙 세그먼트에 위치한다.
일부 실시양태에서, 길이에 있어서 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개 이하의 핵염기를 갖는 안티센스 화합물은 표적 핵산, 예컨대, 안드로겐 수용체 핵산 또는 이의 특정된 부분에 비해 상대적으로 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하 또는 1개 이하의 비-상보적 핵염기(들)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 길이에 있어서 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개 또는 30개 이하의 핵염기를 갖는 안티센스 화합물은 표적 핵산, 예컨대, 안드로겐 수용체 핵산 또는 이의 특정된 부분에 비해 상대적으로 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하 또는 1개 이하의 비-상보적 핵염기(들)를 포함한다.
제공된 안티센스 화합물은 표적 핵산의 부분에 상보적인 안티센스 화합물도 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "부분"은 표적 핵산의 영역 또는 세그먼트 내의 정의된 수의 인접(즉, 연결된) 핵염기를 지칭한다. "부분"은 안티센스 화합물의 정의된 수의 인접 핵염기를 지칭할 수도 있다. 일부 실시양태에서, 안티센스 화합물은 표적 세그먼트의 8개 이상의 핵염기를 갖는 부분에 상보적이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 화합물은 표적 세그먼트의 9개 이상의 핵염기를 갖는 부분에 상보적이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 화합물은 표적 세그먼트의 10개 이상의 핵염기를 갖는 부분에 상보적이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 화합물은 표적 세그먼트의 11개 이상의 핵염기를 갖는 부분에 상보적이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 화합물은 표적 세그먼트의 12개 이상의 핵염기를 갖는 부분에 상보적이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 화합물은 표적 세그먼트의 13개 이상의 핵염기를 갖는 부분에 상보적이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 화합물은 표적 세그먼트의 14개 이상의 핵염기를 갖는 부분에 상보적이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 화합물은 표적 세그먼트의 15개 이상의 핵염기를 갖는 부분에 상보적이다. 표적 세그먼트의 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개 이상의 핵염기를 갖는 부분, 또는 이들 값들 중 임의의 두 값들에 의해 정의된 범위 내의 수의 핵염기를 갖는 부분에 상보적인 안티센스 화합물도 고려된다.
동일성
본원에서 제공된 안티센스 화합물은 특정 뉴클레오타이드 서열, 서열 번호, 또는 특정 ISIS 번호로 표시된 화합물, 또는 이들의 부분에 대한 정의된 % 동일성을 가질 수도 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 안티센스 화합물은 동일한 핵염기쌍 형성 능력을 갖는 경우 본원에 개시된 서열과 동일하다. 예를 들면, 개시된 DNA 서열에서 타이미딘 대신에 우라실을 함유하는 RNA는 우라실 및 타이미딘 둘 다가 아데닌과 쌍을 형성하기 때문에 상기 DNA 서열과 동일한 것으로 간주될 것이다. 본원에 기재된 안티센스 화합물의 단축된 버전 및 연장된 버전뿐만 아니라 본원에서 제공된 안티센스 화합물에 비해 상대적으로 동일하지 않은 염기를 갖는 화합물도 고려된다. 동일하지 않은 염기들은 서로 인접하여 존재할 수 있거나 안티센스 화합물 전체에 걸쳐 분산되어 있을 수 있다. 안티센스 화합물의 % 동일성은 그와 비교되는 서열에 비해 상대적으로 동일한 염기쌍 형성을 갖는 염기의 수에 따라 계산된다.
일부 실시양태에서, 안티센스 화합물 또는 이의 부분은 본원에 개시된 안티센스 화합물들 또는 서열 번호들 중 하나 이상, 또는 이의 부분에 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상 동일하다.
일부 실시양태에서, 안티센스 화합물의 부분이 표적 핵산의 동등한 길이 부분과 비교된다. 일부 실시양태에서, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개 또는 25개 핵염기를 갖는 부분이 표적 핵산의 동등한 길이 부분과 비교된다.
일부 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 부분은 표적 핵산의 동등한 길이 부분과 비교된다. 일부 실시양태에서, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개 또는 25개 핵염기를 갖는 부분은 표적 핵산의 동등한 길이 부분과 비교된다.
변경
뉴클레오사이드는 염기-당 조합물이다. 뉴클레오사이드의 핵염기(염기로서도 공지되어 있음) 부분은 정상적으로 헤테로환형 염기 모이어티이다. 뉴클레오타이드는 뉴클레오사이드의 당 부분에 공유연결된 포스페이트 기를 추가로 포함하는 뉴클레오사이드이다. 펜토푸라노실 당을 포함하는 뉴클레오사이드의 경우, 포스페이트 기는 당의 2', 3' 또는 5' 하이드록실 모이어티에 연결될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 인접 뉴클레오사이드들이 서로 공유연결되어 선형 중합체 올리고뉴클레오타이드를 형성함으로써 형성된다. 올리고뉴클레오타이드 구조 내에서, 포스페이트 기는 통상적으로 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오사이드 간 결합을 형성하는 것으로서 지칭된다.
안티센스 화합물에 대한 변경은 뉴클레오사이드 간 결합, 당 모이어티 또는 핵염기에 대한 치환 또는 변화를 포함한다. 변경된 안티센스 화합물은 바람직한 성질, 예를 들면, 향상된 세포 섭취, 핵산 표적에 대한 향상된 친화성, 핵산분해효소의 존재 하에서의 증가된 안정성 또는 증가된 억제 활성 때문에 천연 형태에 비해 종종 바람직하다.
화학적으로 변경된 뉴클레오사이드는 그의 표적 핵산에 대한 단축된 또는 절두된 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 결합 친화성을 증가시키기 위해 사용될 수도 있다. 결과적으로, 필적할만한 결과가 이러한 화학적으로 변경된 뉴클레오사이드를 갖는 보다 짧은 안티센스 화합물을 사용할 때 종종 수득될 수 있다.
변경된 뉴클레오사이드 간 결합
RNA 및 DNA의 천연 발생 뉴클레오사이드 간 결합은 3'에서 5'으로의 포스포디에스테르 결합이다. 하나 이상의 변경된, 즉 비-천연 발생 뉴클레오사이드 간 결합을 갖는 안티센스 화합물은 바람직한 성질, 예를 들면, 향상된 세포 섭취, 표적 핵산에 대한 향상된 친화성, 및 핵산분해효소의 존재 하에서의 증가된 안정성 때문에 천연 발생 뉴클레오사이드 간 결합을 갖는 안티센스 화합물에 비해 종종 선택된다.
변경된 뉴클레오사이드 간 결합을 갖는 올리고뉴클레오타이드는 인 원자를 보유하는 뉴클레오사이드 간 결합뿐만 아니라 인 원자를 갖지 않는 뉴클레오사이드 간 결합도 포함한다. 대표적인 인 함유 뉴클레오사이드 간 결합은 포스포디에스테르, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 포스포라미데이트 및 포스포로티오에이트를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 인을 함유하는 연결 및 인을 함유하지 않는 연결의 제조 방법은 잘 공지되어 있다.
일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체 핵산으로 표적화되는 안티센스 화합물은 하나 이상의 변경된 뉴클레오사이드 간 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변경된 뉴클레오사이드 간 결합은 포스포로티오에이트 결합이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 화합물의 각각의 뉴클레오사이드 간 결합은 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드 간 결합이다.
변경된 당 모이어티
안티센스 화합물은 임의적으로 하나 이상의 뉴클레오사이드를 함유할 수 있고, 이때 당 기는 변경되어 있다. 이러한 당 변경된 뉴클레오사이드는 향상된 핵산분해효소 안정성, 증가된 결합 친화성 또는 일부 다른 유리한 생물학적 성질을 안티센스 화합물에 부여할 수 있다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오사이드는 화학적으로 변경된 리보푸라노스 고리 모이어티를 포함한다. 화학적으로 변경된 리보푸라노스 고리의 예로는 치환기(5' 치환기 및 2' 치환기를 포함함)의 추가, 이환형 핵산(BNA)을 형성하기 위한 비-같은자리(geminal) 고리 원자들의 가교형성, S, N(R) 또는 C(R1)(R2)(R, R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, C1-C12 알킬 또는 보호기임)에 의한 리보실 고리 산소 원자의 교체 및 이들의 조합이 있으나 이들로 한정되지 않는다. 화학적으로 변경된 당의 예로는 2'-F-5'-메틸 치환된 뉴클레오사이드(다른 개시된 5',2'-비스 치환된 뉴클레오사이드에 대하여 2008년 8월 21일자로 공개된 PCT 국제 특허출원 공보 제WO 2008/101157호 참조), 또는 2' 위치에서 추가 치환과 함께 S에 의한 리보실 고리 산소 원자의 교체(2005년 6월 16일자로 공개된 미국 특허출원 공보 제2005-0130923호 참조) 또는 대안적으로 BNA의 5'-치환(2007년 11월 22일자로 공개된 PCT 국제 특허출원 공보 제WO 2007/134181호 참조, 이때 4'-(CH2)-O-2'(LNA)는 예를 들면, 5'-메틸 또는 5'-비닐 기로 치환됨)이 있다.
변경된 당 모이어티를 갖는 뉴클레오사이드의 예로는 5'-비닐, 5'-메틸(R 또는 S), 4'-S, 2'-F, 2'-OCH3, 2'-OCH2CH3, 2'-OCH2CH2F 및 2'-O(CH2)2OCH3 치환기를 포함하는 뉴클레오사이드들이 있으나 이들로 한정되지 않는다. 2' 위치에서의 치환기는 알릴, 아미노, 아지도, 티오, O-알릴, O-C1-C10 알킬, OCF3, OCH2F, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn) 및 O-CH2-C(=O)-N(Rl)-(CH2)2-N(Rm)(Rn)(이때, Rl, Rm 및 Rn은 각각 독립적으로 H, 또는 치환된 또는 비치환된 C1-C10 알킬임)로부터 선택될 수도 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "이환형 뉴클레오사이드"는 이환형 당 모이어티를 포함하는 변경된 뉴클레오사이드를 지칭한다. 이환형 뉴클레오사이드의 예로는 4' 리보실 고리 원자와 2' 리보실 고리 원자 사이의 가교를 포함하는 뉴클레오사이드들이 있으나 이들로 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 안티센스 화합물은 4'에서 2'으로의 가교를 포함하는 하나 이상의 이환형 뉴클레오사이드를 포함한다. 이러한 4'에서 2'으로 가교된 이환형 뉴클레오사이드의 예로는 하기 화학식들 중 하나가 있으나 이것으로 한정되지 않는다: 4'-(CH2)-O-2'(LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2'(ENA); 4'-CH(CH3)-O-2'(구속된 에틸 또는 cEt로서도 지칭됨) 및 4'-CH(CH2OCH3)-O-2'(및 이의 유사체(2008년 7월 15일자로 발행된 미국 특허 제7,399,845호 참조)); 4'-C(CH3)(CH3)-O-2'(및 이의 유사체(2009년 1월 8일자로 공개된 국제 특허출원 공보 제WO/2009/006478호 참조)); 4'-CH2-N(OCH3)-2'(및 이의 유사체(2008년 12월 11일자로 공개된 국제 특허출원 공보 제WO/2008/150729호 참조)); 4'-CH2-O-N(CH3)-2'(2004년 9월 2일자로 공개된 미국 특허출원 공보 제2004-0171570호 참조); 4'-CH2-N(R)-O-2'(이때, R은 H, C1-C12 알킬 또는 보호기임)(2008년 9월 23일자로 발행된 미국 특허 제7,427,672호 참조); 4'-CH2-C-(H)(CH3)-2'(문헌(Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134) 참조); 및 4'-CH2-C(=CH2)-2'(및 이의 유사체(2008년 12월 8일자로 공개된 국제 특허출원 공보 제WO/2008/154401호 참조)).
이환형 뉴클레오사이드와 관련된 추가 보고는 공개된 문헌들에서 발견될 수도 있다(예를 들면, 문헌(Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456); 문헌(Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630); 문헌(Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 5633-5638); 문헌(Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222); 문헌(Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039); 문헌(Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26) 8362-8379); 문헌(Elayadi et al., Curr. Opinion Invest. Drugs, 2001, 2, 558-561); 문헌(Braasch et al., Chem. Biol, 2001, 8, 1-7); 문헌(Oram et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243); 미국 특허 제6,268,490호; 미국 특허 제6,525,191호; 미국 특허 제6,670,461호; 미국 특허 제6,770,748호; 미국 특허 제6,794,499호; 미국 특허 제7,034,133호; 미국 특허 제7,053,207호; 미국 특허 제7,399,845호; 미국 특허 제7,547,684호; 미국 특허 제7,696,345호; 미국 특허출원 공보 제2008-0039618호; 미국 특허출원 공보 제2009-0012281호; 미국 특허출원 제60/989,574호; 미국 특허출원 제61/026,995호; 미국 특허출원 제61/026,998호; 미국 특허출원 제61/056,564호; 미국 특허출원 제61/086,231호; 미국 특허출원 제61/097,787호; 미국 특허출원 제61/099,844호; PCT 국제 특허출원 공보 제WO 1994/014226호; PCT 국제 특허출원 공보 제WO 2004/106356호; PCT 국제 특허출원 공보 제WO 2005/021570호; PCT 국제 특허출원 공보 제WO 2007/134181호; PCT 국제 특허출원 공보 제WO 2008/150729호; PCT 국제 특허출원 공보 제WO 2008/154401호; 및 PCT 국제 특허출원 공보 제WO 2009/006478호 참조). 상기 이환형 뉴클레오사이드들 각각은 예를 들면, α-L-리보푸라노스 및 β-D-리보푸라노스를 포함하는 하나 이상의 입체화학적 당 배열을 갖도록 제조될 수 있다(1999년 3월 25일자로 공보 제WO 99/14226호로서 공개된 PCT 국제 특허출원 제PCT/DK98/00393호 참조).
일부 실시양태에서, BNA 뉴클레오사이드의 이환형 당 모이어티는 펜토푸라노실 당 모이어티의 4' 위치와 2' 위치 사이에 하나 이상의 가교를 갖는 화합물들을 포함하나 이들로 한정되지 않고, 이때 이러한 가교는 -[C(Ra)(Rb)]n-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -C(=O)-, -C(=NRa)-, -C(=S)-, -O-, -Si(Ra)2-, -S(=0)x- 및 -N(Ra)-로부터 독립적으로 선택되는 1개 또는 2개 내지 4개의 연결된 기를 독립적으로 포함하고; 이때,
x는 0, 1 또는 2이고;
n은 1, 2, 3 또는 4이고;
Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 H, 보호기, 하이드록실, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, 치환된 C2-C12 알키닐, C5-C20 아릴, 치환된 C5-C20 아릴, 헤테로환 라디칼, 치환된 헤테로환 라디칼, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, C5-C7 지환족 라디칼, 치환된 C5-C7 지환족 라디칼, 할로겐, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, 아실(C(=O)-H), 치환된 아실, CN, 설포닐(S(=0)2-J1) 또는 설폭실(S(=O)-J1)이고;
J1 및 J2는 각각 독립적으로 H, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, 치환된 C2-C12 알키닐, C5-C20 아릴, 치환된 C5-C20 아릴, 아실(C(=O)-H), 치환된 아실, 헤테로환 라디칼, 치환된 헤테로환 라디칼, C1-C12 아미노알킬, 치환된 C1-C12 아미노알킬 또는 보호기이다.
일부 실시양태에서, 이환형 당 모이어티의 가교는 -[C(Ra)(Rb)]n-, -[C(Ra)(Rb)]n-O-, -C(RaRb)-N(R)-O- 또는 -C(RaRb)-O-N(R)-이다. 일부 실시양태에서, 상기 가교는 4'-CH2-2', 4'-(CH2)2-2', 4,-(CH2)3-2', 4'-CH2-O-2', 4'-(CH2)2-O-2', 4'-CH2-O-N(R)-2' 또는 4'-CH2-N(R)-O-2'-이고, 이때 R은 각각 독립적으로 H, 보호기 또는 C1-C12 알킬이다.
일부 실시양태에서, 이환형 뉴클레오사이드는 이성질체 배열에 의해 더 정의된다. 예를 들면, 4'-2' 메틸렌-옥시 가교를 포함하는 뉴클레오사이드는 α-L 배열 또는 β-D 배열로 존재할 수 있다. 종래, α-L-메틸렌옥시(4'-CH2-O-2') BNA는 안티센스 활성을 보인 안티센스 올리고뉴클레오타이드 내로 도입되었다(Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 27, 6365-6372).
일부 실시양태에서, 이환형 뉴클레오사이드는 하기 표시된 (A) α-L-메틸렌옥시(4'-CH2-O-2') BNA, (B) β-D-메틸렌옥시(4'-CH2-O-2') BNA, (C) 에틸렌옥시(4'-(CH2)2-O-2') BNA, (D) 아미노옥시(4'-CH2-O-N(R)-2') BNA, (E) 옥시아미노(4'-CH2-N(R)-O-2') BNA, (F) 메틸(메틸렌옥시)(4'-CH(CH3)-O-2') BNA, (G) 메틸렌-티오(4'-CH2-S-2') BNA, (H) 메틸렌-아미노(4'-CH2-N(R)-2') BNA, (I) 메틸 탄소환형(4'-CH2-CH(CH3)-2') BNA, (J) 프로필렌 탄소환형(4'-(CH2)3-2') BNA 및 (K) 비닐 BNA를 포함하나 이들로 한정되지 않는다:
상기 식에서,
Bx는 염기 모이어티이고, R은 독립적으로 H, 보호기, C1-C12 알킬 또는 C1-C12 알콕시이다.
일부 실시양태에서, 하기 화학식 I를 갖는 이환형 뉴클레오사이드가 제공된다:
[화학식 I]
상기 식에서,
Bx는 헤테로환형 염기 모이어티이고;
-Qa-Qb-Qc-는 -CH2-N(Rc)-CH2-, -C(=O)-N(Rc)-CH2-, -CH2-O-N(Rc)-, -CH2-N(Rc)-O- 또는 -N(Rc)-O-CH2이고;
Rc는 C1-C12 알킬 또는 아미노 보호기이고;
Ta 및 Tb는 각각 독립적으로 H, 하이드록실 보호기, 컨쥬게이트 기, 반응성 인 기, 인 모이어티, 또는 지지체 매질에의 공유부착이다.
일부 실시양태에서, 하기 화학식 II를 갖는 이환형 뉴클레오사이드가 제공된다:
[화학식 II]
상기 식에서,
Bx는 헤테로환형 염기 모이어티이고;
Ta 및 Tb는 각각 독립적으로 H, 하이드록실 보호기, 컨쥬게이트 기, 반응성 인 기, 인 모이어티, 또는 지지체 매질에의 공유부착이고;
Za는 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 치환된 C1-C6 알킬, 치환된 C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알키닐, 아실, 치환된 아실, 치환된 아미드, 티올 또는 치환된 티올이다.
한 실시양태에서, 치환기는 각각 독립적으로 할로겐, 옥소, 하이드록실, OJc, NJcJd, SJc, N3, OC(=X)Jc 및 NJeC(=X)NJcJd로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 단일 또는 다중 치환되고, 이때 Jc, Jd 및 Je는 각각 독립적으로 H, C1-C6 알킬 또는 치환된 C1-C6 알킬이고, X는 O 또는 NJc이다.
일부 실시양태에서, 하기 화학식 III을 갖는 이환형 뉴클레오사이드가 제공된다:
[화학식 III]
상기 식에서,
Bx는 헤테로환형 염기 모이어티이고;
Ta 및 Tb는 각각 독립적으로 H, 하이드록실 보호기, 컨쥬게이트 기, 반응성 인 기, 인 모이어티, 또는 지지체 매질에의 공유부착이고;
Zb는 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 치환된 C1-C6 알킬, 치환된 C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알키닐 또는 치환된 아실(C(=O)-)이다.
일부 실시양태에서, 하기 화학식 IV를 갖는 이환형 뉴클레오사이드가 제공된다:
[화학식 IV]
상기 식에서,
Bx는 헤테로환형 염기 모이어티이고;
Ta 및 Tb는 각각 독립적으로 H, 하이드록실 보호기, 컨쥬게이트 기, 반응성 인 기, 인 모이어티, 또는 지지체 매질에의 공유부착이고;
Rd는 C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐 또는 치환된 C2-C6 알키닐이고;
qa, qb, qc 및 qd는 각각 독립적으로 H, 할로겐, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐 또는 치환된 C2-C6 알키닐, C1-C6 알콕실, 치환된 C1-C6 알콕실, 아실, 치환된 아실, C1-C6 아미노알킬 또는 치환된 C1-C6 아미노알킬이다.
일부 실시양태에서, 하기 화학식 V를 갖는 이환형 뉴클레오사이드가 제공된다:
[화학식 V]
상기 식에서,
Bx는 헤테로환형 염기 모이어티이고;
Ta 및 Tb는 각각 독립적으로 H, 하이드록실 보호기, 컨쥬게이트 기, 반응성 인 기, 인 모이어티, 또는 지지체 매질에의 공유부착이고;
qa, qb, qe 및 qf는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, 치환된 C2-C12 알키닐, C1-C12 알콕시, 치환된 C1-C12 알콕시, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, O-C(=O)-NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk 또는 N(H)C(=S)NJjJk이거나;
qe 및 qf는 함께 =C(qg)(qh)이고;
qg 및 qh는 각각 독립적으로 H, 할로겐, C1-C12 알킬 또는 치환된 C1-C12 알킬이다.
메틸렌옥시(4'-CH2-O-2') BNA 단량체 아데닌, 사이토신, 구아닌, 5-메틸-사이토신, 타이민 및 우라실의 합성 및 제조, 및 핵산 인식 성질이 그들의 올리고머화와 함께 기재되어 있다(Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). 이환형 핵산(BNA) 및 이의 제조도 국제 특허출원 공보 제WO 98/39352호 및 국제 특허출원 공보 제WO 99/14226호에 기재되어 있다.
메틸렌옥시(4'-CH2-O-2') BNA 및 2'-티오-BNA의 유사체도 제조되었다(Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222). 핵산 중합효소에 대한 기질로서 잠겨진 뉴클레오사이드 유사체 포함 올리고데옥시리보뉴클레오타이드 이중체의 제조도 기재되어 있다(Wengel et al., 국제 특허출원 공보 제WO 99/14226호). 나아가, 신규 입체구조적으로 제한된 고친화성 올리고뉴클레오타이드 유사체인 2'-아미노-BNA의 합성은 문헌(Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039)에 기재되어 있다. 추가로, 2'-아미노-BNA 및 2'-메틸아미노-BNA가 제조되었고, 상보적 RNA 및 DNA 가닥을 갖는 이들의 이중체의 열안정성이 이전에 보고되었다.
일부 실시양태에서, 하기 화학식 VI을 갖는 이환형 뉴클레오사이드가 제공된다:
[화학식 VI]
상기 식에서,
Bx는 헤테로환형 염기 모이어티이고;
Ta 및 Tb는 각각 독립적으로 H, 하이드록실 보호기, 컨쥬게이트 기, 반응성 인 기, 인 모이어티, 또는 지지체 매질에의 공유부착이고;
qi, qj, qk 및 ql은 각각 독립적으로 H, 할로겐, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, 치환된 C2-C12 알키닐, C1-C12 알콕실, 치환된 C1-C12 알콕실, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, O-C(=O)-NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk 또는 N(H)C(=S)NJjJk이고;
qi 및 qj 또는 ql 및 qk는 함께 =C(qg)(qh)이고, 이때 qg 및 qh는 각각 독립적으로 H, 할로겐, C1-C12 알킬 또는 치환된 C1-C12 알킬이다.
4'-(CH2)3-2' 가교 및 알케닐 유사체 가교 4'-CH=CH-CH2-2'를 갖는 한 탄소환형 이환형 뉴클레오사이드가 기재되어 있다(Freier et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443 and Albaek et al., J. Org. Chem., 2006, 77, 7731-7740). 탄소환형 이환형 뉴클레오사이드들의 합성 및 제조도 그들의 올리고머화 및 생화학적 연구와 함께 기재되어 있다(Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc, 2007, 129(26), 8362-8379).
본원에서 사용된 바와 같이, "4'-2' 이환형 뉴클레오사이드" 또는 "4'에서 2'으로의 이환형 뉴클레오사이드"는 당 고리의 2' 탄소 원자와 4' 탄소 원자를 연결하는, 푸라노스 고리의 2개의 탄소 원자들을 연결하는 가교를 포함하는 푸라노스 고리를 포함하는 이환형 뉴클레오사이드를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "단환형 뉴클레오사이드"는 이환형 당 모이어티가 아닌 변경된 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오사이드를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오사이드의 당 모이어티 또는 당 모이어티 유사체는 임의의 위치에서 변경될 수 있거나 치환될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "2'-변경된 당"은 2' 위치에서 변경된 푸라노실 당을 의미한다. 일부 실시양태에서, 이러한 변경은 할로겐화물; 치환된 알콕시 및 비치환된 알콕시; 치환된 티오알킬 및 비치환된 티오알킬; 치환된 아미노알킬 및 비치환된 아미노알킬; 치환된 알킬 및 비치환된 알킬; 치환된 알릴 및 비치환된 알릴; 및 치환된 알키닐 및 비치환된 알키닐을 포함하나 이들로 한정되지 않는 치환기들로부터 선택되는 치환기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 2' 변경은 O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nF, O(CH2)nONH2, OCH2C(=O)N(H)CH3 및 O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2를 포함하나 이들로 한정되지 않는 치환기들로부터 선택되고, 이때 n 및 m은 1 내지 약 10이다. 다른 2'-치환기는 C1-C12 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 알크아릴, 아르알킬, O-알크아릴 또는 O-아르알킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, F, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알크아릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단 기, 레포터 기, 인터칼레이터(intercalator), 약동학적 성질을 개선하기 위한 기 또는 안티센스 화합물의 약력학적 성질을 개선하기 위한 기, 및 유사한 성질을 갖는 다른 치환기로부터 선택될 수도 있다. 일부 실시양태에서, 변경된 뉴클레오사이드는 2'-MOE 측쇄를 포함한다(Baker et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 11944-12000). 이러한 2'-MOE 치환은 비변경된 뉴클레오사이드 및 다른 변경된 뉴클레오사이드, 예컨대, 2'-O-메틸, O-프로필 및 O-아미노프로필에 비해 개선된 결합 친화성을 갖는 것으로서 기재되어 있다. 2'-MOE 치환기를 갖는 올리고뉴클레오타이드는 생체내 사용을 위한 기대되는 특징을 갖는 유전자 발현의 안티센스 억제제인 것으로 밝혀져 있기도 하다(Martin, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504; Altmann et al., Chimia, 1996, 50, 168-176; Altmann et al., Biochem. Soc. Trans., 1996, 24, 630-637; and Altmann et al., Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917-926).
본원에서 사용된 바와 같이, "변경된 테트라하이드로피란 뉴클레오사이드" 또는 "변경된 THP 뉴클레오사이드"는 일반 뉴클레오사이드에서 펜토푸라노실 잔기 대신에 치환된 6원 테트라하이드로피란 "당"(당 대용물)을 갖는 뉴클레오사이드를 의미한다. 변경된 THP 뉴클레오사이드는 당분야에서 하기 예시된 테트라하이드로피란 고리 시스템을 갖는 헥시톨 핵산(HNA), 아니톨 핵산(ANA), 만니톨 핵산(MNA)(문헌(Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854) 참조) 또는 플루오로 HNA(F-HNA)로서 지칭되는 것들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다:
일부 실시양태에서, 하기 화학식 VII을 갖는 당 대용물이 선택된다:
[화학식 VII]
상기 식에서, 화학식 VII의 상기 하나 이상의 테트라하이드로피란 뉴클레오사이드 유사체 각각에 대하여 독립적으로
Bx는 헤테로환형 염기 모이어티이고;
Ta 및 Tb는 각각 독립적으로 테트라하이드로피란 뉴클레오사이드 유사체를 안티센스 화합물에 연결하는 뉴클레오사이드 간 결합 기이거나, Ta 및 Tb 중 하나는 테트라하이드로피란 뉴클레오사이드 유사체를 안티센스 화합물에 연결하는 뉴클레오사이드 간 결합 기이고 Ta 및 Tb 중 나머지 하나는 H, 하이드록실 보호기, 연결된 컨쥬게이트 기 또는 5' 또는 3' 말단 기이고;
q1, q2, q3, q4, q5, q6 및 q7은 각각 독립적으로 H, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐 또는 치환된 C2-C6 알키닐이고; R1 및 R2는 수소, 하이드록실, 할로겐, 치환된 또는 비치환된 알콕시, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=X)NJ1J2 및 CN으로부터 각각 선택되고, 이때 X는 O, S 또는 NJ1이고, J1, J2 및 J3은 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이다.
일부 실시양태에서, q1, q2, q3, q4, q5, q6 및 q7이 각각 H인 화학식 VII의 변경된 THP 뉴클레오사이드가 제공된다. 일부 실시양태에서, q1, q2, q3, q4, q5, q6 및 q7 중 하나 이상은 H가 아니다. 일부 실시양태에서, q1, q2, q3, q4, q5, q6 및 q7 중 하나 이상은 메틸이다. 일부 실시양태에서, R1 및 R2 중 하나가 플루오로인 화학식 VII의 THP 뉴클레오사이드가 제공된다. 일부 실시양태에서, R1은 플루오로이고 R2는 H이고; R1은 메톡시이고 R2는 H이고; R1은 메톡시에톡시이고 R2는 H이다.
일부 실시양태에서, 당 대용물은 5개 초과의 원자 및 1개 초과의 헤테로원자를 갖는 고리를 포함한다. 예를 들면, 모르폴리노 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오사이드 및 올리고머 화합물에서의 그들의 사용이 보고되어 있다(예를 들면, 문헌(Braasch et al., Biochemistry, 2002, 41, 4503-4510); 미국 특허 제5,698,685호; 미국 특허 제5,166,315호; 미국 특허 제5,185,444호; 및 미국 특허 제5,034,506호 참조). 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "모르폴리노"는 하기 화학식을 갖는 당 대용물을 의미한다:
일부 실시양태에서, 모르폴리노는 예를 들면, 상기 모르폴리노 구조로부터의 다양한 치환기를 추가하거나 변경시킴으로써 변경될 수 있다. 이러한 당 대용물은 본원에서 "변경된 모르폴리노"로서 지칭된다.
변경의 조합, 예컨대, 2'-F-5'-메틸 치환된 뉴클레오사이드(다른 개시된 5',2'-비스 치환된 뉴클레오사이드에 대해서는 2008년 8월 21일자로 공개된 PCT 국제 특허출원 공보 제WO 2008/101157호 참조), 및 S에 의한 리보실 고리 산소 원자의 교체 및 2' 위치에서의 추가 치환(2005년 6월 16일자로 공개된 미국 특허출원 공보 제2005-0130923호 참조) 또는 대안적으로 이환형 핵산의 5'-치환(2007년 11월 22일자로 공개된 PCT 국제 특허출원 공보 제WO 2007/134181호 참조, 이때 4'-CH2-O-2' 이환형 뉴클레오사이드는 5' 위치에서 5'-메틸 또는 5'-비닐 기로 더 치환됨)도 제공되나, 이들로 한정되지 않는다. 탄소환형 이환형 뉴클레오사이드들의 합성 및 제조도 그들의 올리고머화 및 생화학적 연구와 함께 기재되어 있다(예를 들면, 문헌(Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc. 2007, 129(26), 8362-8379) 참조).
일부 실시양태에서, 안티센스 화합물은 천연 발생 뉴클레오사이드의 펜토푸라노실 잔기 대신에 6원 사이클로헥세닐을 갖는 뉴클레오사이드인 하나 이상의 변경된 사이클로헥세닐 뉴클레오사이드를 포함한다. 변경된 사이클로헥세닐 뉴클레오사이드는 당분야에서 기재된 변경된 사이클로헥세닐 뉴클레오사이드들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다(예를 들면, 2010년 4월 10일자로 공개된 PCT 국제 특허출원 공보 제WO 2010/036696호(공유); 문헌(Robeyns et al., J. Am. Chem. Soc., 2008, 130(6), 1979-1984); 문헌(Horvath et al., Tetrahedron Letters, 2007, 48, 3621-3623); 문헌(Nauwelaerts et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(30), 9340-9348); 문헌(Gu et al., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2005, 24(5-7), 993-998); 문헌(Nauwelaerts et al., Nucleic Acids Research, 2005, 33(8), 2452-2463); 문헌(Robeyns et al., Acta Crystallographica, Section F: Structural Biology and Crystallization Communications, 2005, F61(6), 585-586); 문헌(Gu et al., Tetrahedron, 2004, 60(9), 2111-2123); 문헌(Gu et al., Oligonucleotides, 2003, 13(6), 479-489); 문헌(Wang et al., J. Org. Chem., 2003, 68, 4499-4505); 문헌(Verbeure et al., Nucleic Acids Research, 2001, 29(24), 4941-4947); 문헌(Wang et al., J. Org. Chem., 2001, 66, 8478-82); 문헌(Wang et al., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2001, 20(4-7), 785-788); 문헌(Wang et al., J. Am. Chem., 2000, 122, 8595-8602); 공개된 PCT 국제 특허출원 공보 제WO 06/047842호; 및 공개된 PCT 국제 특허출원 공보 제WO 01/049687호 참조; 이들 각각의 내용은 전체적으로 본원에 참고로 도입됨). 일부 변경된 사이클로헥세닐 뉴클레오사이드는 하기 화학식 X를 갖는다:
[화학식 X]
상기 식에서, 화학식 X의 상기 하나 이상의 사이클로헥세닐 뉴클레오사이드 유사체 각각에 대해 독립적으로
Bx는 헤테로환형 염기 모이어티이고;
T3 및 T4는 각각 독립적으로 사이클로헥세닐 뉴클레오사이드 유사체를 안티센스 화합물에 연결하는 뉴클레오사이드 간 결합 기이거나, T3 및 T4 중 하나는 테트라하이드로피란 뉴클레오사이드 유사체를 안티센스 화합물에 연결하는 뉴클레오사이드 간 결합 기이고 T3 및 T4 중 나머지 하나는 H, 하이드록실 보호기, 연결된 컨쥬게이트 기, 또는 5' 또는 3' 말단 기이고;
q1, q2, q3, q4, q5, q6, q7, q8 및 q9는 각각 독립적으로 H, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 치환된 C2-C6 알키닐이고 또는 다른 당 치환기이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "2'-변경된" 또는 "2'-치환된"은 2' 위치에서 H 또는 OH 이외의 치환기를 포함하는 당을 포함하는 뉴클레오사이드를 지칭한다. 2'-변경된 뉴클레오사이드는 당 고리의 2개의 탄소 원자들을 연결하는 가교가 당 고리의 2' 탄소와 또 다른 탄소를 연결하는 이환형 뉴클레오사이드; 및 비-가교 2' 치환기, 예컨대, 알릴, 아미노, 아지도, 티오, O-알릴, O-C1-C10 알킬, -OCF3, 0-(CH2)2-O-CH3, 2'-O(CH2)2SCH3, 0-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn) 또는 O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn)을 갖는 뉴클레오사이드를 포함하나 이들로 한정되지 않고, 이때 Rm 및 Rn은 각각 독립적으로 H, 또는 치환된 또는 비치환된 C1-C10 알킬이다. 2'-변경된 뉴클레오사이드는 예를 들면, 당의 다른 위치 및/또는 핵염기에서 다른 변경을 추가로 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "2'-F"는 당 고리의 2' 위치에서 플루오로 기를 포함하는 당을 포함하는 뉴클레오사이드를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "2'-OMe", "2'-OCH3" 또는 "2'-O-메틸"은 각각 당 고리의 2' 위치에서 -OCH3 기를 포함하는 당을 포함하는 뉴클레오사이드를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "올리고뉴클레오타이드"는 복수의 연결된 뉴클레오사이드들을 포함하는 화합물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 상기 복수의 뉴클레오사이드들 중 하나 이상의 뉴클레오사이드가 변경된다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 리보뉴클레오사이드(RNA) 및/또는 데옥시리보뉴클레오사이드(DNA)를 포함한다.
안티센스 화합물 내로 도입될 뉴클레오사이드를 변경시키기 위해 사용될 수 있는 많은 다른 비사이클로 및 트리사이클로 당 대용물 고리 시스템도 당분야에서 공지되어 있다(예를 들면, 문헌(Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854) 참조). 이러한 고리 시스템은 활성을 향상시키기 위해 다양한 추가 치환을 받을 수 있다.
변경된 당의 제조 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 이러한 변경된 당의 제조를 교시하는 일부 대표적인 미국 특허들은 하기 미국 특허들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다: 미국 특허 제4,981,957호; 미국 특허 제5,118,800호; 미국 특허 제5,319,080호; 미국 특허 제5,359,044호; 미국 특허 제5,393,878호; 미국 특허 제5,446,137호; 미국 특허 제5,466,786호; 미국 특허 제5,514,785호; 미국 특허 제5,519,134호; 미국 특허 제5,567,811호; 미국 특허 제5,576,427호; 미국 특허 제5,591,722호; 미국 특허 제5,597,909호; 미국 특허 제5,610,300호; 미국 특허 제5,627,053호; 미국 특허 제5,639,873호; 미국 특허 제5,646,265호; 미국 특허 제5,670,633호; 미국 특허 제5,700,920호; 미국 특허 제5,792,847호; 미국 특허 제6,600,032호; 및 2005년 6월 2일자로 출원되었고 2005년 12월 22일자로 공보 제WO 2005/121371호로서 공개된 국제 특허출원 제PCT/US2005/019219호(이들 각각은 전체적으로 본원에 참고로 도입됨).
변경된 당 모이어티를 갖는 뉴클레오타이드에서, 핵염기 모이어티(천연 핵염기 모이어티, 변경된 핵염기 모이어티 또는 이들의 조합물)는 적절한 핵산 표적과의 혼성화를 위해 유지된다.
일부 실시양태에서, 안티센스 화합물은 변경된 당 모이어티를 갖는 하나 이상의 뉴클레오사이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변경된 당 모이어티는 2'-MOE이다. 일부 실시양태에서, 2'-MOE 변경된 뉴클레오사이드들은 갭머 모티프로 정렬된다. 일부 실시양태에서, 변경된 당 모이어티는 (4'-CH(CH3)-O-2') 가교 기를 갖는 이환형 뉴클레오사이드이다. 일부 실시양태에서, (4'-CH(CH3)-O-2') 변경된 뉴클레오사이드들은 갭머 모티프의 윙 전체에 걸쳐 정렬되어 있다.
변경된 핵염기
핵염기(또는 염기) 변경 또는 치환은 천연 발생 또는 합성 비변경된 핵염기와 구조적으로 구별될 수 있지만 기능적으로 상호교환될 수 있다. 천연 핵염기 및 변경된 핵염기 둘 다가 수소결합에 참여할 수 있다. 이러한 핵염기 변경은 핵산분해효소 안전성, 결합 친화성 또는 일부 다른 유리한 생물학적 성질을 안티센스 화합물에 부여할 수 있다. 변경된 핵염기는 합성 핵염기 및 천연 핵염기, 예를 들면, 5-메틸사이토신(5-me-C)을 포함한다. 5-메틸사이토신 치환을 포함하는 일부 핵염기 치환은 표적 핵산에 대한 안티센스 화합물의 결합 친화성을 증가시키는 데 특히 유용하다. 예를 들면, 5-메틸사이토신 치환은 핵산 이중체 안정성을 0.6℃ 내지 1.2℃까지 증가시키는 것으로 밝혀져 있다(Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278).
추가 변경된 핵염기는 5-하이드록시메틸 사이토신, 잔틴, 하이포잔틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 다른 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오타이민 및 2-티오사이토신, 5-할로우라실 및 사이토신, 5-프로피닐(-C≡C-CH3) 우라실 및 사이토신, 및 피리미딘 염기의 다른 알키닐 유도체, 6-아조 우라실, 사이토신 및 타이민, 5-우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 다른 5-치환된 우라실 및 사이토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 2-F-아데닌, 2-아미노-아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌, 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 포함한다.
헤테로환형 염기 모이어티는 푸린 또는 피리미딘 염기가 다른 헤테로환, 예를 들면, 7-데아자-아데닌, 7-데아자구아노신, 2-아미노피리딘 및 2-피리돈으로 교체되어 있는 헤테로환형 염기 모이어티도 포함할 수 있다. 안티센스 화합물의 결합 친화성을 증가시키는 데 특히 유용한 핵염기는 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘, 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 푸린(2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐사이토신을 포함함)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체 핵산으로 표적화되는 안티센스 화합물은 하나 이상의 변경된 핵염기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안드로겐 수용체 핵산으로 표적화되는 단축된 또는 갭-확장된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 변경된 핵염기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변경된 핵염기는 5-메틸사이토신이다. 일부 실시양태에서, 각각의 사이토신은 5-메틸사이토신이다.
접합된 안티센스 화합물
안티센스 화합물은 발생된 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 활성, 세포 분포 또는 세포 섭취를 향상시키는 하나 이상의 모이어티 또는 접합체에 공유연결될 수 있다. 전형적인 컨쥬게이트 기는 콜레스테롤 모이어티 및 지질 모이어티를 포함한다. 추가 컨쥬게이트 기는 탄수화물, 인지질, 바이오틴, 펜아진, 폴레이트, 펜안쓰리딘, 안쓰라퀴논, 아크리딘, 플루오레세인, 로다민, 쿠마린 및 염료를 포함한다.
안티센스 화합물은 성질, 예를 들면, 핵산분해효소 안정성을 향상시키기 위해 안티센스 화합물의 한 말단 또는 양 말단에 일반적으로 부착되는 하나 이상의 안정화 기를 갖도록 변경될 수도 있다. 캡 구조물이 안정화 기에 포함된다. 이 말단 변경은 핵산외부분해효소(exonuclease) 분해로부터 말단 핵산을 갖는 안티센스 화합물을 보호하고, 세포 내로의 전달 및/또는 세포 내에서의 위치선정에 도움을 줄 수 있다. 상기 캡은 5' 말단(5'-캡) 또는 3' 말단(3'-캡)에 존재할 수 있거나, 양 말단에 존재할 수 있다. 캡 구조물은 당분야에서 잘 공지되어 있고, 예를 들면, 역립된(inverted) 데옥시 탈염기 캡을 포함한다. 핵산분해효소 안정성을 부여하기 위해 안티센스 화합물의 한 말단 또는 양 말단을 캡핑하는 데 사용될 수 있는 추가 3'-안정화 기 및 5'-안정화 기는 2003년 1월 16일자로 공개된 국제 특허출원 공보 제WO 03/004602호에 개시된 3'-안정화 기 및 5'-안정화 기를 포함한다.
일부 실시양태에서, ssRNA로서 사용되기에 특히 적합한 안티센스 화합물들을 포함하나 이들로 한정되지 않는 안티센스 화합물은 하나 이상의 컨쥬게이트 기의 부착에 의해 변경된다. 일반적으로, 컨쥬게이트 기는 약력학적 성질, 약동학적 성질, 안정성, 결합, 흡수, 세포 분포, 세포 섭취, 전하 및 제거를 포함하나 이들로 한정되지 않는, 부착된 올리고뉴클레오타이드의 하나 이상의 성질을 변경시킨다. 컨쥬게이트 기는 화학 분야에서 관용적으로 사용되고, 모 화합물, 예컨대, 올리고뉴클레오타이드에 직접적으로 연결되거나 임의적 접합체 연결 모이어티 또는 접합체 연결 기를 통해 연결된다. 컨쥬게이트 기는 인터칼레이터, 레포터 분자, 폴리아민, 폴리아미드, 폴리에틸렌 글리콜, 티오에테르, 폴리에테르, 콜레스테롤, 티오콜레스테롤, 콜산 모이어티, 폴레이트, 지질, 인지질, 바이오틴, 펜아진, 펜안쓰리딘, 안쓰라퀴논, 아다만탄, 아크리딘, 플루오레세인, 로다민, 쿠마린 및 염료를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 일부 컨쥬게이트 기, 예를 들면, 하기 컨쥬게이트 기들은 이미 기재되어 있다: 콜레스테롤 모이어티(Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556), 콜산(Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060), 티오에테르, 예를 들면, 헥실-S-트리틸티올(Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), 티오콜레스테롤(Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538), 지방족 쇄, 예를 들면, 도데칸디올 또는 운데실 잔기(Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54), 인지질, 예를 들면, 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸-암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스페이트(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 쇄(Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973), 또는 아다만탄 아세트산(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), 팔미틸 모이어티(Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카보닐-옥시콜레스테롤 모이어티(Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937).
ssRNA에 유용한 접합체를 포함하는 추가 접합체 및 안티센스 화합물 내에서의 이들의 배치에 대해서는 예를 들면, PCT 국제 특허출원 공보 제WO 2013/033230호를 참조한다.
약학 조성물을 제제화하는 조성물 및 방법
안티센스 올리고뉴클레오타이드는 약학 조성물 또는 제제의 제조를 위해 약학적으로 허용가능한 활성 또는 불활성 물질과 혼합될 수 있다. 약학 조성물을 제제화하는 조성물 및 방법은 투여 경로, 질환의 정도 또는 투여되는 용량을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다수의 기준에 의존한다.
안드로겐 수용체 핵산으로 표적화되는 안티센스 화합물은 안티센스 화합물을 적합한 약학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체와 조합함으로써 약학 조성물로 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 약학적으로 허용가능한 희석제는 물, 예컨대, 주사에 적합한 멸균수이다. 따라서, 한 실시양태에서, 안드로겐 수용체 핵산으로 표적화되는 안티센스 화합물 및 약학적으로 허용가능한 희석제를 포함하는 약학 조성물이 본원에 기재된 방법에서 사용된다. 일부 실시양태에서, 약학적으로 허용가능한 희석제는 물이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 화합물은 본원에서 제공된 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다.
안티센스 화합물을 포함하는 약학 조성물은 인간을 포함하는 동물에게 투여되었을 때 생물학적 활성 대사물질 또는 이의 잔기를 (직접적으로 또는 간접적으로) 제공할 수 있는 임의의 약학적으로 허용가능한 염, 에스테르 또는 이러한 에스테르의 염, 또는 임의의 다른 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 따라서, 예를 들면, 본 개시내용은 안티센스 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 전구약물, 이러한 전구약물의 약학적으로 허용가능한 염, 및 다른 생체균등물에 관한 것이다. 적합한 약학적으로 허용가능한 염은 나트륨 염 및 칼륨 염을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
전구약물은 활성 안티센스 화합물을 형성하기 위해 신체 내에서 내생성 핵산분해효소에 의해 절단되는 추가 뉴클레오사이드가 안티센스 화합물의 한 말단 또는 양 말단에서 도입되어 있는 것을 포함할 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드의 시험관내 시험
다른 안티센스 화합물을 사용한 처리를 위해 적절하게 변경될 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 사용한 세포의 처리 방법이 본원에 기재되어 있다.
세포는 배양물에서 대략 60% 내지 80% 전면생장률(confluency)에 도달할 때 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 처리될 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드를 배양된 세포 내로 도입하기 위해 통상적으로 사용되는 한 시약은 양이온성 지질 형질감염 시약 리포펙틴(LIPOFECTIN)(인비트로겐(Invitrogen), 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)을 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 원하는 최종 농도 및 100 nM 안티센스 올리고뉴클레오타이드 당 2 내지 12 ㎍/㎖일 수 있는 리포펙틴 농도를 달성하기 위해 OPTI-MEM 1(인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 리포펙틴과 혼합할 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드를 배양된 세포 내로 도입하는 데 사용된 또 다른 시약은 리포펙타민(LIPOFECTAMINE)(인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)을 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 원하는 농도 및 100 nM 안티센스 올리고뉴클레오타이드 당 2 내지 12 ㎍/㎖일 수 있는 리포펙타민 농도를 달성하기 위해 OPTI-MEM 1 감소된 혈청 배지(인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 리포펙타민과 혼합한다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드를 배양된 세포 내로 도입하기 위해 이용되는 또 다른 기법은 전기천공을 포함한다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드를 배양된 세포 내로 도입하기 위해 이용되는 또 다른 기법은 세포에 의한 올리고뉴클레오타이드의 자유 섭취를 포함한다.
세포를 관용적인 방법으로 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 처리한다. 표적 핵산의 RNA 또는 단백질 수준이 당분야에서 공지되어 있고 본원에 기재되어 있는 방법에 의해 측정되는 시간인, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리 후 16시간 내지 24시간에서 세포를 회수할 수 있다. 일반적으로, 처리가 다회 반복하여 수행될 때, 데이터는 반복 처리의 평균으로서 제시된다.
사용된 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 농도는 세포주마다 상이하다. 특정 세포주에 대한 최적 안티센스 올리고뉴클레오타이드 농도를 측정하는 방법은 당분야에서 잘 공지되어 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 리포펙타민으로 형질감염될 때 전형적으로 1 nM 내지 300 nM의 농도로 사용된다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 전기천공의 이용을 통해 형질감염될 때 625 nM 내지 20,000 nM의 보다 높은 농도로 사용된다.
RNA 단리
총 세포 RNA 또는 폴리(A)+ mRNA에 대한 RNA 분석을 수행할 수 있다. RNA 단리 방법은 당분야에서 잘 공지되어 있다. 당분야에서 잘 공지되어 있는 방법, 예를 들면, 트리졸(TRIZOL) 시약(인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)을 제조자의 권장된 프로토콜에 따라 사용하여 RNA를 준비한다.
실시양태 :
E1. 10개 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되고 서열 번호 12 내지 179의 핵염기 서열들 중 임의의 핵염기 서열의 8개 이상의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물.
E2. 16개 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되고 서열 번호 12 내지 179 중 어느 한 서열 번호의 핵염기 서열을 포함하는 핵염기 서열을 갖는 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물.
E3. 서열 번호 12 내지 179 중 어느 한 서열 번호의 핵염기 서열로 구성되는 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물.
E4. 10개 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되고 서열 번호 35, 39, 43, 124, 150, 155, 169 또는 175의 핵염기 서열들 중 임의의 핵염기 서열의 8개 이상의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물.
E5. 16개 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되고 서열 번호 35, 39, 43, 124, 150, 155, 169 또는 175의 핵염기 서열을 포함하는 핵염기 서열을 갖는 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물.
E6. 16개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되고 서열 번호 35, 39, 43, 124, 150, 155, 169 또는 175의 핵염기 서열로 구성되는 핵염기 서열을 갖는 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물.
E7. 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 2957-2972, 3079-3094, 3099-3114, 3109-3124, 3113-3128, 3120-3135, 3133-3148, 3224-3239, 3226-3241, 3351-3366, 3353-3368, 3361-3376, 3388-3403, 3513-3528, 3517-3532, 3519-3534, 3641-3656, 3735-3750, 3764-3779, 3768-3783, 3798-3813, 3799-3814, 3851-3866, 3870-3885, 3874-3889, 3876-3891, 3878-3893, 3884-3899, 3886-3901, 3888-3903, 3901-3916, 3956-3971, 3962-3977, 3964-3979, 3967-3982, 4019-4034, 4038-4053, 4049-4064, 4056-4071, 4059-4074, 4062-4077, 4066-4081, 4070-4085, 4101-4116, 4103-4118, 4105-4120, 4109-4124, 4305-4320, 4405-4420, 4532-4547, 4534-4549, 4537-4552, 4539-4554, 4555-4570, 4571-4586, 4573-4588, 4578-4593, 4597-4612, 4632-4647, 4655-4670, 4656-4671, 4662-4677, 4699-4714, 4747-4762, 4750-4765, 4752-4767, 4754-4769, 4755-4770, 4769-4784, 4798-4813, 4804-4819, 4807-4822, 4833-4848, 4837-4852, 4839-4854, 4865-4880, 4868-4883, 4872-4887, 4874-4889, 4876-4891, 4887-4902, 4889-4904, 4916-4931, 4918-4933, 4938-4953, 4942-4957, 4944-4959, 4951-4966, 5050-5065, 5052-5067, 5054-5069, 5056-5071, 5060-5075, 5061-5076, 5062-5077, 5133-5148, 5141-5156, 5155-5170, 5265-5280, 5293-5308, 5308-5323, 5392-5407, 5448-5463, 5469-5484, 5481-5496, 5483-5498, 5486-5501, 5488-5503, 5494-5509, 5521-5536, 5666-5681, 6222-6237, 6701-6716, 7543-7558, 8471-8486, 8638-8653, 9464-9479, 10217-10232, 10250-10265, 10865-10880, 11197-11212, 11855-11870, 13189-13204, 13321-13336, 13346-13361, 16555-16570, 16793-16808, 16968-16983, 17206-17221, 18865-18880, 29329-29344, 32290-32305, 33315-33330, 39055-39070, 40615-40630, 42017-42032, 56050-56065, 58719-58734, 58720-58739, 58721-58736, 58722-58737, 58723-58738, 58724-58739, 58725-58740, 58750-58769, 58751-58766, 58752-58767, 58753-58768, 58754-58769, 58755-58770, 60902-60917, 67454-67469, 114874-114889, 115272-115287, 115365-115380, 134971-134986, 102156-102171, 139682-139697, 139762-139777, 139782-139797, 144856-144871, 144938-144953, 148406-148421, 148443-148458, 148520-148535, 181695-181710, 182958-182973 또는 183049-183064 내에서 상보적인 10개 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물로서, 이때 상기 변경된 올리고뉴클레오타이드가 서열 번호 1에 90% 이상 상보적인 것인 화합물.
E8. 서열 번호 1의 핵염기 2957-2972, 3079-3094, 3099-3114, 3109-3124, 3113-3128, 3120-3135, 3133-3148, 3224-3239, 3226-3241, 3351-3366, 3353-3368, 3361-3376, 3388-3403, 3513-3528, 3517-3532, 3519-3534, 3641-3656, 3735-3750, 3764-3779, 3768-3783, 3798-3813, 3799-3814, 3851-3866, 3870-3885, 3874-3889, 3876-3891, 3878-3893, 3884-3899, 3886-3901, 3888-3903, 3901-3916, 3956-3971, 3962-3977, 3964-3979, 3967-3982, 4019-4034, 4038-4053, 4049-4064, 4056-4071, 4059-4074, 4062-4077, 4066-4081, 4070-4085, 4101-4116, 4103-4118, 4105-4120, 4109-4124, 4305-4320, 4405-4420, 4532-4547, 4534-4549, 4537-4552, 4539-4554, 4555-4570, 4571-4586, 4573-4588, 4578-4593, 4597-4612, 4632-4647, 4655-4670, 4656-4671, 4662-4677, 4699-4714, 4747-4762, 4750-4765, 4752-4767, 4754-4769, 4755-4770, 4769-4784, 4798-4813, 4804-4819, 4807-4822, 4833-4848, 4837-4852, 4839-4854, 4865-4880, 4868-4883, 4872-4887, 4874-4889, 4876-4891, 4887-4902, 4889-4904, 4916-4931, 4918-4933, 4938-4953, 4942-4957, 4944-4959, 4951-4966, 5050-5065, 5052-5067, 5054-5069, 5056-5071, 5060-5075, 5061-5076, 5062-5077, 5133-5148, 5141-5156, 5155-5170, 5265-5280, 5293-5308, 5308-5323, 5392-5407, 5448-5463, 5469-5484, 5481-5496, 5483-5498, 5486-5501, 5488-5503, 5494-5509, 5521-5536, 5666-5681, 6222-6237, 6701-6716, 7543-7558, 8471-8486, 8638-8653, 9464-9479, 10217-10232, 10250-10265, 10865-10880, 11197-11212, 11855-11870, 13189-13204, 13321-13336, 13346-13361, 16555-16570, 16793-16808, 16968-16983, 17206-17221, 18865-18880, 29329-29344, 32290-32305, 33315-33330, 39055-39070, 40615-40630, 42017-42032, 56050-56065, 58719-58734, 58720-58739, 58721-58736, 58722-58737, 58723-58738, 58724-58739, 58725-58740, 58750-58769, 58751-58766, 58752-58767, 58753-58768, 58754-58769, 58755-58770, 60902-60917, 67454-67469, 114874-114889, 115272-115287, 115365-115380, 134971-134986, 102156-102171, 139682-139697, 139762-139777, 139782-139797, 144856-144871, 144938-144953, 148406-148421, 148443-148458, 148520-148535, 181695-181710, 182958-182973 또는 183049-183064의 동등한 길이 부분에 100% 상보적인 8개 이상의 인접 핵염기의 부분을 포함하는 핵염기 서열을 갖는, 10개 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물로서, 이때 상기 변경된 올리고뉴클레오타이드의 핵염기 서열이 서열 번호 1에 상보적인 것인 화합물.
E9. E1, E7 및 E8 중 어느 한 실시양태에 있어서, 서열 번호 1의 엑손 1 뉴클레오타이드 2957-2972, 3079-3094, 3099-3114, 3109-3124, 3113-3128, 3120-3135, 3133-3148, 3224-3239, 3226-3241, 3351-3366, 3353-3368, 3361-3376, 3388-3403, 3513-3528, 3517-3532, 3519-3534, 3641-3656, 3735-3750, 3764-3779, 3768-3783, 3798-3813, 3799-3814, 3851-3866, 3870-3885, 3874-3889, 3876-3891, 3878-3893, 3884-3899, 3886-3901, 3888-3903, 3901-3916, 3956-3971, 3962-3977, 3964-3979, 3967-3982, 4019-4034, 4038-4053, 4049-4064, 4056-4071, 4059-4074, 4062-4077, 4066-4081, 4070-4085, 4101-4116, 4103-4118, 4105-4120, 4109-4124, 4305-4320, 4405-4420, 4532-4547, 4534-4549, 4537-4552, 4539-4554, 4555-4570, 4571-4586, 4573-4588, 4578-4593, 4597-4612, 4632-4647, 4655-4670, 4656-4671, 4662-4677, 4699-4714, 4747-4762, 4750-4765, 4752-4767, 4754-4769, 4755-4770, 4769-4784, 4798-4813, 4804-4819, 4807-4822, 4833-4848, 4837-4852, 4839-4854, 4865-4880, 4868-4883, 4872-4887, 4874-4889, 4876-4891, 4887-4902, 4889-4904, 4916-4931, 4918-4933, 4938-4953, 4942-4957, 4944-4959, 4951-4966, 5050-5065, 5052-5067, 5054-5069, 5056-5071, 5060-5075, 5061-5076, 5062-5077, 5133-5148, 5141-5156, 5155-5170, 5265-5280, 5293-5308, 5308-5323, 5392-5407, 5448-5463, 5469-5484, 5481-5496, 5483-5498, 5486-5501, 5488-5503, 5494-5509 또는 5521-5536 내에서 상보적인 10개 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물.
E10. E9에 있어서, 서열 번호 1의 엑손 1 뉴클레오타이드 5052-5067 내에서 상보적인 10개 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물.
E11. E1, E7 및 E8 중 어느 한 실시양태에 있어서, 서열 번호 1의 인트론 1 뉴클레오타이드 5666-5681, 6222-6237, 6701-6716, 7543-7558, 8471-8486, 8638-8653, 9464-9479, 10217-10232, 10250-10265, 10865-10880, 11197-11212, 11855-11870, 13189-13204, 13321-13336, 13346-13361, 16555-16570, 16793-16808, 16968-16983, 17206-17221, 18865-18880, 29329-29344, 32290-32305, 33315-33330, 39055-39070, 40615-40630, 42017-42032, 56050-56065, 58719-58734, 58720-58739, 58721-58736, 58722-58737, 58723-58738, 58724-58739, 58725-58740, 58750-58769, 58751-58766, 58752-58767, 58753-58768, 58754-58769, 58755-58770, 60902-60917, 67454-67469, 114874-114889, 115272-115287, 115365-115380 또는 134971-134986 내에서 상보적인 10개 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물.
E12. E11에 있어서, 서열 번호 1의 인트론 1 뉴클레오타이드 8638-8653, 11197-11212, 40615-40630, 58719-58734, 58720-58735 또는 58721-58736 내에서 상보적인 10개 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물.
E13. E1 내지 E12 중 어느 한 실시양태에 있어서, 변경된 올리고뉴클레오타이드가 하나 이상의 변경된 당을 포함하는 것인 화합물.
E14. E13에 있어서, 하나 이상의 변경된 당이 2'-O-메톡시에틸 기를 포함하는 것인 화합물.
E15. E13에 있어서, 하나 이상의 변경된 당이 이환형 당인 화합물.
E16. E15에 있어서, 이환형 당이 4'-CH(CH3)-O-2' 기를 포함하는 것인 화합물.
E17. E15에 있어서, 이환형 당이 4'-CH2-O-2' 또는 4'-(CH2)2-O-2' 기를 포함하는 것인 화합물.
E18. E1 내지 E17 중 어느 한 실시양태에 있어서, 변경된 올리고뉴클레오타이드가 하나 이상의 변경된 뉴클레오사이드 간 결합을 포함하는 것인 화합물.
E19. E18에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 각각의 뉴클레오사이드 간 결합이 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드 간 결합인 화합물.
E20. E1 내지 E19 중 어느 한 실시양태에 있어서, 변경된 올리고뉴클레오타이드가 하나 이상의 변경된 핵염기를 포함하는 것인 화합물.
E21. E20에 있어서, 변경된 핵염기가 5-메틸사이토신인 화합물.
E22. E1 내지 E21 중 어느 한 실시양태에 있어서, 변경된 올리고뉴클레오타이드가 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트; 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트; 및 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트를 포함하고; 이때 상기 갭 세그먼트가 상기 5' 윙 세그먼트와 상기 3' 윙 세그먼트 사이에 위치하고, 각각의 윙 세그먼트의 각각의 뉴클레오사이드가 변경된 당을 포함하는 것인 화합물.
E23. E22에 있어서, 변경된 올리고뉴클레오타이드가 10개의 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트; 3개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트; 및 3개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트를 포함하고; 이때 상기 갭 세그먼트가 상기 5' 윙 세그먼트와 상기 3' 윙 세그먼트 사이에 위치하고, 각각의 윙 세그먼트의 각각의 뉴클레오사이드가 2'-O-메톡시에틸 당 또는 구속된 에틸 당을 포함하고, 각각의 뉴클레오사이드 간 결합이 포스포로티오에이트 결합인 화합물.
E24. 서열 번호 35의 서열로 구성되는 핵염기 서열을 갖는, 16개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 단일 가닥의 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로서, 이때 상기 변경된 올리고뉴클레오타이드가 9개의 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트; 3개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트; 및 4개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트를 포함하고; 이때 상기 갭 세그먼트가 상기 5' 윙 세그먼트와 상기 3' 윙 세그먼트 사이에 위치하고; 상기 5' 윙 세그먼트의 3개의 연결된 뉴클레오사이드가 각각 구속된 에틸(cEt) 당이고; 상기 3' 윙 세그먼트의 4개의 연결된 뉴클레오사이드가 5'에서 3' 방향으로 구속된 에틸(cEt) 당, 구속된 에틸(cEt) 당, 구속된 에틸(cEt) 당 및 2'-O-메톡시에틸 당이고; 각각의 뉴클레오사이드 간 결합이 포스포로티오에이트 결합이고; 각각의 사이토신이 5-메틸사이토신인 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
E25. 서열 번호 39의 서열로 구성되는 핵염기 서열을 갖는, 16개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 단일 가닥의 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로서, 이때 상기 변경된 올리고뉴클레오타이드가 9개의 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트; 3개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트; 및 4개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트를 포함하고; 이때 상기 갭 세그먼트가 상기 5' 윙 세그먼트와 상기 3' 윙 세그먼트 사이에 위치하고; 상기 5' 윙 세그먼트의 3개의 연결된 뉴클레오사이드가 각각 구속된 에틸(cEt) 당이고; 상기 3' 윙 세그먼트의 4개의 연결된 뉴클레오사이드가 5'에서 3' 방향으로 구속된 에틸(cEt) 당, 구속된 에틸(cEt) 당, 구속된 에틸(cEt) 당 및 2'-O-메톡시에틸 당이고; 각각의 뉴클레오사이드 간 결합이 포스포로티오에이트 결합이고; 각각의 사이토신이 5-메틸사이토신인 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
E26. 서열 번호 39의 서열로 구성되는 핵염기 서열을 갖는, 16개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 단일 가닥의 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로서, 이때 상기 변경된 올리고뉴클레오타이드가 8개의 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트; 4개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트; 및 4개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트를 포함하고; 이때 상기 갭 세그먼트가 상기 5' 윙 세그먼트와 상기 3' 윙 세그먼트 사이에 위치하고; 상기 5' 윙 세그먼트의 4개의 연결된 뉴클레오사이드가 5'에서 3' 방향으로 2'-O-메톡시에틸 당, 구속된 에틸(cEt) 당, 구속된 에틸(cEt) 당 및 구속된 에틸(cEt) 당이고; 상기 3' 윙 세그먼트의 4개의 연결된 뉴클레오사이드가 5'에서 3' 방향으로 구속된 에틸(cEt) 당, 구속된 에틸(cEt) 당, 구속된 에틸(cEt) 당 및 2'-O-메톡시에틸 당이고; 각각의 뉴클레오사이드 간 결합이 포스포로티오에이트 결합이고; 각각의 사이토신이 5-메틸사이토신인 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
E27. 서열 번호 39의 서열로 구성되는 핵염기 서열을 갖는, 16개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 단일 가닥의 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로서, 이때 상기 변경된 올리고뉴클레오타이드가 8개의 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트; 5개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트; 및 3개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트를 포함하고; 이때 상기 갭 세그먼트가 상기 5' 윙 세그먼트와 상기 3' 윙 세그먼트 사이에 위치하고; 상기 5' 윙 세그먼트의 5개의 연결된 뉴클레오사이드가 5'에서 3' 방향으로 2'-O-메톡시에틸 당, 2'-O-메톡시에틸 당, 구속된 에틸(cEt) 당, 구속된 에틸(cEt) 당 및 구속된 에틸(cEt) 당이고; 상기 3' 윙 세그먼트의 3개의 연결된 뉴클레오사이드가 각각 구속된 에틸(cEt) 당이고; 각각의 뉴클레오사이드 간 결합이 포스포로티오에이트 결합이고; 각각의 사이토신이 5-메틸사이토신인 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
E28. 서열 번호 39의 서열로 구성되는 핵염기 서열을 갖는, 16개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 단일 가닥의 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로서, 이때 상기 변경된 올리고뉴클레오타이드가 7개의 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트; 4개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트; 및 5개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트를 포함하고; 이때 상기 갭 세그먼트가 상기 5' 윙 세그먼트와 상기 3' 윙 세그먼트 사이에 위치하고; 상기 5' 윙 세그먼트의 4개의 연결된 뉴클레오사이드가 5'에서 3' 방향으로 2'-O-메톡시에틸 당, 구속된 에틸(cEt) 당, 구속된 에틸(cEt) 당 및 구속된 에틸(cEt) 당이고; 상기 3' 윙 세그먼트의 5개의 연결된 뉴클레오사이드가 5'에서 3' 방향으로 구속된 에틸(cEt) 당, 구속된 에틸(cEt) 당, 구속된 에틸(cEt) 당, 2'-O-메톡시에틸 당 및 2'-O-메톡시에틸 당이고; 각각의 뉴클레오사이드 간 결합이 포스포로티오에이트 결합이고; 각각의 사이토신이 5-메틸사이토신인 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
E29. 서열 번호 35의 서열로 구성되는 핵염기 서열을 갖는, 16개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 단일 가닥의 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로서, 이때 상기 변경된 올리고뉴클레오타이드가 7개의 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트; 6개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트; 및 3개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트를 포함하고; 이때 상기 갭 세그먼트가 상기 5' 윙 세그먼트와 상기 3' 윙 세그먼트 사이에 위치하고; 상기 5' 윙 세그먼트의 6개의 연결된 뉴클레오사이드가 5'에서 3' 방향으로 2'-O-메톡시에틸 당, 구속된 에틸(cEt) 당, 구속된 에틸(cEt) 당, 2'-O-메톡시에틸 당, 구속된 에틸(cEt) 당 및 구속된 에틸(cEt) 당이고; 상기 3' 윙 세그먼트의 3개의 연결된 뉴클레오사이드가 각각 구속된 에틸(cEt) 당이고; 각각의 뉴클레오사이드 간 결합이 포스포로티오에이트 결합이고; 각각의 사이토신이 5-메틸사이토신인 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
E30. 서열 번호 43의 서열로 구성되는 핵염기 서열을 갖는, 16개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 단일 가닥의 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로서, 이때 상기 변경된 올리고뉴클레오타이드가 10개의 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트; 3개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트; 및 3개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트를 포함하고; 이때 상기 갭 세그먼트가 상기 5' 윙 세그먼트와 상기 3' 윙 세그먼트 사이에 위치하고; 각각의 윙 세그먼트의 각각의 뉴클레오사이드가 구속된 에틸(cEt) 당을 포함하고; 각각의 뉴클레오사이드 간 결합이 포스포로티오에이트 결합이고; 각각의 사이토신이 5-메틸사이토신인 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
E31. 서열 번호 124의 서열로 구성되는 핵염기 서열을 갖는, 16개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 단일 가닥의 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로서, 이때 상기 변경된 올리고뉴클레오타이드가 10개의 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트; 3개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트; 및 3개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트를 포함하고; 이때 상기 갭 세그먼트가 상기 5' 윙 세그먼트와 상기 3' 윙 세그먼트 사이에 위치하고; 각각의 윙 세그먼트의 각각의 뉴클레오사이드가 구속된 에틸(cEt) 당을 포함하고; 각각의 뉴클레오사이드 간 결합이 포스포로티오에이트 결합이고; 각각의 사이토신이 5-메틸사이토신인 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
E32. 서열 번호 150의 서열로 구성되는 핵염기 서열을 갖는, 16개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 단일 가닥의 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로서, 이때 상기 변경된 올리고뉴클레오타이드가 10개의 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트; 3개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트; 및 3개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트를 포함하고; 이때 상기 갭 세그먼트가 상기 5' 윙 세그먼트와 상기 3' 윙 세그먼트 사이에 위치하고; 각각의 윙 세그먼트의 각각의 뉴클레오사이드가 구속된 에틸(cEt) 당을 포함하고; 각각의 뉴클레오사이드 간 결합이 포스포로티오에이트 결합이고; 각각의 사이토신이 5-메틸사이토신인 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
E33. 서열 번호 155의 서열로 구성되는 핵염기 서열을 갖는, 16개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 단일 가닥의 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로서, 이때 상기 변경된 올리고뉴클레오타이드가 10개의 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트; 3개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트; 및 3개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트를 포함하고; 이때 상기 갭 세그먼트가 상기 5' 윙 세그먼트와 상기 3' 윙 세그먼트 사이에 위치하고; 각각의 윙 세그먼트의 각각의 뉴클레오사이드가 구속된 에틸(cEt) 당을 포함하고; 각각의 뉴클레오사이드 간 결합이 포스포로티오에이트 결합이고; 각각의 사이토신이 5-메틸사이토신인 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
E34. 서열 번호 169의 서열로 구성되는 핵염기 서열을 갖는, 16개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 단일 가닥의 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로서, 이때 상기 변경된 올리고뉴클레오타이드가 10개의 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트; 3개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트; 및 3개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트를 포함하고; 이때 상기 갭 세그먼트가 상기 5' 윙 세그먼트와 상기 3' 윙 세그먼트 사이에 위치하고; 각각의 윙 세그먼트의 각각의 뉴클레오사이드가 구속된 에틸(cEt) 당을 포함하고; 각각의 뉴클레오사이드 간 결합이 포스포로티오에이트 결합이고; 각각의 사이토신이 5-메틸사이토신인 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
E35. 서열 번호 175의 서열로 구성되는 핵염기 서열을 갖는, 16개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 단일 가닥의 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로서, 이때 상기 변경된 올리고뉴클레오타이드가 10개의 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트; 3개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트; 및 3개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트를 포함하고; 이때 상기 갭 세그먼트가 상기 5' 윙 세그먼트와 상기 3' 윙 세그먼트 사이에 위치하고; 각각의 윙 세그먼트의 각각의 뉴클레오사이드가 구속된 에틸(cEt) 당을 포함하고; 각각의 뉴클레오사이드 간 결합이 포스포로티오에이트 결합이고; 각각의 사이토신이 5-메틸사이토신인 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
E36. E1 내지 E35 중 어느 한 실시양태에 있어서, 변경된 올리고뉴클레오타이드가 안드로겐 수용체를 코딩하는 핵산에 90% 이상 상보적인 것인 화합물.
E37. E1 내지 E36 중 어느 한 실시양태에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 안드로겐 수용체를 코딩하는 핵산에 100% 상보적인 것인 화합물.
E38. E37에 있어서, 안드로겐 수용체를 코딩하는 핵산이 서열 번호 1 내지 8 중 어느 한 서열 번호의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인 화합물.
E39. E1 내지 E38 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 약학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 포함하는 조성물.
E40. E1 내지 E38 중 어느 한 실시양태의 화합물 및 하기 화학식 XVI의 디아릴하이단토인 안드로겐 수용체(AR) 억제제를 포함하는 조성물:
[화학식 XVI]
상기 식에서,
X는 트리플루오로메틸 및 요오도로 구성되는 군으로부터 선택되고, 이때 W는 O 및 NR5로 구성되는 군으로부터 선택되고, 이때 R5는 H, 메틸 및 하기 화학식의 기로 구성되는 군으로부터 선택되고:
[상기 식에서,
D는 S 또는 O이고, E는 N 또는 O이고, G는 알킬, 아릴, 치환된 알킬 또는 치환된 아릴이거나; D는 S 또는 O이고, E-G는 함께 C1-C4 저급 알킬임];
R1 및 R2는 함께 8개 이하의 탄소 원자를 포함하고, 알킬 및 치환된 알킬(할로알킬을 포함함)로 구성되는 군으로부터 선택되거나 이들이 연결된 탄소와 함께 사이클로알킬 또는 치환된 사이클로알킬 기를 형성하고;
R3은 수소, 할로겐, 메틸, C1-C4 알콕시, 포르밀, 할로아세톡시, 트리플루오로메틸, 시아노, 니트로, 하이드록실, 페닐, 아미노, 메틸카바모일, 메톡시카보닐, 아세트아미도, 메탄설폰아미노, 메탄설포닐, 4-메탄설포닐-1-피페라지닐, 피페라지닐, 및 하이드록실, 메톡시카보닐, 시아노, 아미노, 아미도, 니트로, 카바모일 또는 치환된 카바모일(메틸카바모일, 디메틸카바모일 및 하이드록시에틸카바모일을 포함함)로 임의적으로 치환된 C1-C6 알킬 또는 알케닐로 구성되는 군으로부터 선택되고;
R4는 수소, 할로겐, 알킬 및 할로알킬로 구성되는 군으로부터 선택되고, 이때 R3은 메틸아미노메틸 또는 디메틸아미노메틸이 아니고;
R5는 하기 화학식의 기일 수 있다:
E41. E40에 있어서, 디아릴하이단토인 안드로겐 수용체(AR) 억제제가 MDV3100인 조성물.
E42. E1 내지 E38 중 어느 한 실시양태의 화합물, 및 MDV3100, ARN-059, ODM-201, 아비라테론, TOK001, TAK700 및 VT464로부터 선택되는 항안드로겐제를 포함하는 조성물.
E43. E1 내지 E38 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 E39 내지 E42 중 어느 한 실시양태의 조성물을, 암을 갖는 대상체에게 투여하여 상기 대상체에서 암을 치료하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
E44. 암을 치료하는 데 사용되기 위한 E1 내지 E38 중 어느 한 실시양태의 안티센스 화합물 또는 E39 내지 E42 중 어느 한 실시양태의 조성물.
E45. E44에 있어서, 암이 전립선암, 유방암, 난소암, 위암 또는 방광암인 화합물 또는 조성물.
E46. E45에 있어서, 암이 거세 저항성 전립선암인 화합물 또는 조성물.
E47. E46에 있어서, 거세 저항성 전립선암이 MDV3100, ARN-059, ODM-201, 아비라테론, TOK001, TAK700 및 VT464로부터 선택되는 항안드로겐제에 대한 내성이 있는 것인 화합물 또는 조성물.
E48. E43에 있어서, 암이 립선암, 유방암, 난소암, 위암 또는 방광암인 방법.
E49. E48에 있어서, 암이 거세 저항성 전립선암인 방법.
E50. E49에 있어서, 거세 저항성 전립선암이 MDV3100, ARN-059, ODM-201, 아비라테론, TOK001, TAK700 및 VT464로부터 선택되는 항안드로겐제에 대한 내성이 있는 것인 방법.
E51. E44 내지 E47, E49 및 E50 중 어느 한 실시양태에 있어서, 안티센스 화합물이 AR 스플라이싱 변이체를 표적화하는 것인 화합물 또는 방법.
E52. E51에 있어서, AR 스플라이싱 변이체가 기능성 리간드 결합 도메인을 결여하는 것인 화합물 또는 방법.
E53. E44 내지 E47 및 E49 내지 E52 중 어느 한 실시양태에 있어서, 안티센스 화합물이 전체 길이 AR, 및 엑손 4 내지 8 중 어느 한 엑손을 결여하는 AR 스플라이싱 변이체의 발현을 감소시킬 수 있는 것인 화합물 또는 방법.
E54. E51에 있어서, AR 스플라이싱 변이체가 엑손 1 내지 3으로 구성되는 것인 화합물 또는 방법.
E55. E44 내지 E47 및 E49 내지 E52 중 어느 한 실시양태에 있어서, 안티센스 화합물이 엑손 3의 3' 말단의 업스트림에서 AR로 표적화되고, 엑손 3의 3' 말단의 다운스트림에서 AR의 영역으로 표적화되는 안티센스 화합물보다 더 큰 정도로 전립선암 세포의 성장 또는 증식을 억제할 수 있는 것인 화합물 또는 방법.
E56. E55에 있어서, 엑손 3의 3' 말단의 다운스트림에서 AR의 영역으로 표적화되는 안티센스 화합물이 전체 길이 AR의 수준을 감소시킬 수 있으나 엑손 1 내지 3으로 구성되는 AR 스플라이싱 변이체의 수준을 감소시킬 수 없는 것인 화합물 또는 방법.
E57. E56에 있어서, 엑손 3의 3' 말단의 다운스트림에 있는 영역이 엑손 4를 포함하는 것인 화합물 또는 방법.
E58. E44 내지 E47 및 E49 내지 E52 중 어느 한 실시양태에 있어서, 전립선암 세포가 전체 길이 AR에 비해 AR 스플라이싱 변이체를 우세하게 발현하는 것인 화합물 또는 방법.
E59. E58에 있어서, AR 스플라이싱 변이체가 기능성 리간드 결합 도메인을 결여하는 것인 화합물 또는 방법.
E60. 대상체에서 MDV3100, ARN-059, ODM-201, 아비라테론, TOK001, TAK700 및 VT464로부터 선택되는 항안드로겐제에 대한 내성이 있는 전립선암을 치료하는 방법으로서, 엑손 3의 3' 말단의 업스트림에서 인간 안드로겐 수용체(AR)로 표적화되는 안티센스 화합물을 상기 대상체에게 투여하여 상기 전립선암을 치료하는 것을 포함하는 방법.
E61. E60에 있어서, 대상체가 MDV3100, ARN-059, ODM-201, 아비라테론, TOK001, TAK700 및 VT464로부터 선택되는 항안드로겐제에 대한 내성이 있는 전립선암을 갖는 대상체로서 진단된 것인 방법.
E62. E60 또는 E61에 있어서, 안티센스 화합물이 AR 스플라이싱 변이체를 표적화하는 것인 방법.
E63. E62에 있어서, AR 스플라이싱 변이체가 기능성 리간드 결합 도메인을 결여하는 것인 방법.
E64. E60 내지 E63 중 어느 한 실시양태에 있어서, 안티센스 화합물이 전체 길이 AR, 및 엑손 4 내지 8 중 어느 한 엑손을 결여하는 AR 스플라이싱 변이체의 발현을 감소시킬 수 있는 것인 방법.
E65. E64에 있어서, AR 스플라이싱 변이체가 엑손 1 내지 3으로 구성되는 것인 방법.
E66. E60 내지 E65 중 어느 한 실시양태에 있어서, 안티센스 화합물이 엑손 3의 3' 말단의 업스트림에서 AR로 표적화되고, 엑손 3의 3' 말단의 다운스트림에서 AR의 영역으로 표적화되는 안티센스 화합물보다 더 큰 정도로 디아릴하이단토인 안드로겐 수용체(AR) 억제제에 대한 내성이 있는 전립선암 세포의 성장 또는 증식을 억제할 수 있는 것인 방법.
E67. E66의 방법에 있어서, 엑손 3의 3' 말단의 다운스트림에서 AR의 영역으로 표적화되는 안티센스 화합물이 전체 길이 AR의 수준을 감소시킬 수 있으나 엑손 4 내지 8 중 어느 한 엑손을 결여하는 AR 스플라이싱 변이체의 수준을 감소시킬 수 없는 것인 방법.
E68. E67에 있어서, AR 스플라이싱 변이체가 엑손 1 내지 3으로 구성되는 것인 방법.
E69. E68에 있어서, 엑손 3의 3' 말단의 다운스트림에 있는 영역이 엑손 4를 포함하는 것인 방법.
E70. E60 내지 E69 중 어느 한 실시양태에 있어서, 전립선암이 거세 저항성을 나타내는 것인 방법.
E71. E60 내지 E70 중 어느 한 실시양태에 있어서, 전립선암이 전체 길이 AR에 비해 AR 스플라이싱 변이체를 우세하게 발현하는 세포를 포함하는 것인 방법.
E72. E71에 있어서, AR 스플라이싱 변이체가 엑손 4 내지 8 중 어느 한 엑손을 결여하는 것인 방법.
E73. E72에 있어서, AR 스플라이싱 변이체가 엑손 1 내지 3으로 구성되는 것인 방법.
E74. E72에 있어서, AR 스플라이싱 변이체가 기능성 리간드 결합 도메인을 결여하는 것인 방법.
E75. 전립선암 세포를 인간 안드로겐 수용체(AR)로 표적화되는 안티센스 화합물, 및 MDV3100, ARN-059, ODM-201, 아비라테론, TOK001, TAK700 및 VT464로부터 선택되는 항안드로겐제와 접촉시키는 것을 포함하는, 전립선암 세포 성장 또는 증식을 억제하는 방법으로서, 이때 상기 안티센스 화합물 및 상기 항안드로겐제가 함께 상승작용하여 전립선암 세포의 성장 또는 증식을 억제하는 것인 방법.
E76. E75에 있어서, 안티센스 화합물이 엑손 3의 3' 말단의 업스트림에서 AR로 표적화되는 것인 방법.
E77. E75 또는 E76에 있어서, 전립선암 세포가 이 전립선암 세포의 성장 또는 증식을 억제하는 데 효과적인 안티센스 화합물 또는 항안드로겐제 단독의 양보다 조합 사용 시 각각 또는 둘 다 더 적은 양의 안티센스 화합물 및 항안드로겐제와 접촉되는 것인 방법.
E78. E75 내지 E77 중 어느 한 실시양태에 있어서, 안티센스 화합물 및 항안드로겐제가 상기 전립선암 세포의 성장 또는 증식을 억제하는 데 있어서 안티센스 화합물 단독 또는 항안드로겐제 단독에 비해 가산적 효과보다 더 큰 효과를 제공하는 것인 방법.
E79. E75 내지 E78 중 어느 한 실시양태에 있어서, 안티센스 화합물이 AR 스플라이싱 변이체를 표적화하는 것인 방법.
E80. E79에 있어서, AR 스플라이싱 변이체가 기능성 리간드 결합 도메인을 결여하는 것인 방법.
E81. E75 내지 E80 중 어느 한 실시양태에 있어서, 안티센스 화합물이 전체 길이 AR, 및 엑손 1 내지 3으로 구성되는 AR 스플라이싱 변이체의 발현을 감소시킬 수 있는 것인 방법.
E82. 유방암 세포를 인간 안드로겐 수용체(AR)로 표적화되는 안티센스 화합물과 접촉시키는 것을 포함하는, 안드로겐 수용체(AR) 양성 유방암 세포의 성장 또는 증식을 억제하는 방법으로서, 이때 상기 유방암 세포의 성장 또는 증식이 억제되는 것인 방법.
E83. 안드로겐 수용체(AR) 양성 유방암을 갖거나 가질 위험에 있는 대상체를 확인하는 단계; 및
인간 AR로 표적화되는 안티센스 화합물을 상기 대상체에게 투여하는 단계
를 포함하는, AR 양성 유방암을 갖거나 가질 위험에 있는 대상체에서 AR 발현을 억제하는 방법으로서, 이때 상기 안티센스 화합물이 상기 대상체에서 AR 발현을 억제하는 것인 방법.
E84. 인간 안드로겐 수용체(AR)로 표적화되는 안티센스 화합물을 대상체에게 투여하여 상기 대상체에서 유방암을 치료하는 것을 포함하는, 대상체에서 AR 양성 유방암을 치료하는 방법.
E85. E82 내지 E84 중 어느 한 실시양태에 있어서, AR 양성 유방암 또는 유방암 세포가 성장을 위해 안드로겐 발현에 의존하는 것인 방법.
E86. E82 내지 E85 중 어느 한 실시양태에 있어서, 유방암 또는 유방암 세포가 에스트로겐 수용체(ER) 음성, 프로게스테론 수용체(PR) 음성 또는 Her2/neu 음성을 나타내는 것인 방법.
E87. E82 내지 E85 중 어느 한 실시양태에 있어서, 유방암 또는 유방암 세포가 ER 양성 및 AR 양성을 나타내는 것인 방법.
E88. E82 내지 E85 중 어느 한 실시양태에 있어서, 유방암 또는 유방암 세포가 ER 음성 및 AR 양성을 나타내는 것인 방법.
E89. E82 내지 E88 중 어느 한 실시양태에 있어서, 유방암 또는 유방암 세포가 아포크린 유방암 또는 유방암 세포인 방법.
E90. E60 내지 E88 중 어느 한 실시양태에 있어서, 안티센스 화합물이 E1 내지 E38 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인 방법.
E91. E60 내지 E88 중 어느 한 실시양태에 있어서, 안티센스 화합물이 E24 내지 E35 중 어느 한 실시양태의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인 방법.
실시예
비한정적 개시 및 참고도입
본원에 기재된 일부 화합물, 조성물 및 방법이 일부 실시양태에 따라 구체적으로 기재되어 있지만, 하기 실시예들은 본원에 기재된 화합물을 예시하는 데에만 기여할 뿐이고 이 화합물을 한정하기 위한 것이 아니다. 본원에서 인용된 참고문헌들 각각은 전체적으로 본원에 참고로 도입된다.
실시예 1: HuVEC 세포에서 인간 AR의 안티센스 억제
AR 핵산을 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드들을 디자인하고 시험관내에서 AR mRNA에 대한 그들의 효과에 대해 시험하였다. 유사한 배양 조건을 갖는 일련의 실험들에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드들을 시험하였다. 각각의 실험에 대한 결과는 하기 제시된 별도의 표들에서 제공되어 있다. 웰당 20,000개 세포의 밀도로 배양된 HuVEC 세포를, 500 nM 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 전기천공으로 형질감염시켰다. 대략 24시간의 처리 시간 후, RNA를 세포로부터 단리하고 AR mRNA 수준을 정량 실시간 PCR로 측정하였다. 인간 프라이머 프로브 세트 RTS3559(본원에서 서열 번호 9로서 표기된 정방향 서열 TCCTTCACCAATGTCAACTCC; 본원에서 서열 번호 10으로서 표기된 역방향 서열 GAGCCATCCAAACTCTTGAGA; 본원에서 서열 번호 11로서 표기된 프로브 서열 AGTACCGCATGCACAAGTCCCG)를 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. AR mRNA 수준을 리보그린(RIBOGREEN)®에 의해 측정된 총 RNA 함량에 따라 조절하였다. 결과는 비처리된 대조군 세포에 비해 상대적인 AR의 % 억제로서 제공되어 있다. 총 155개의 올리고뉴클레오타이드들을 시험하였다. 추가 연구를 위해 선택되는 올리고뉴클레오타이드들만이 표 1 및 2에 제시되어 있다.
표 1 및 2에서 새로 디자인된 키메라 안티센스 올리고뉴클레오타이드들은 3-10-3 (S)-cEt 갭머로서 디자인되었다. 상기 갭머는 길이에 있어서 16개의 뉴클레오사이드를 갖고, 이때 중심 갭 세그먼트는 10개의 2'-데옥시뉴클레오사이드로 구성되고 5' 방향 및 3' 방향 둘 다에서 3개의 뉴클레오사이드를 포함하는 윙 세그먼트에 의해 플랭킹되어 있다. 5' 윙 세그먼트에서의 각각의 뉴클레오사이드 및 3' 윙 세그먼트에서의 각각의 뉴클레오사이드는 (S)-cEt 변경을 갖는다. 각각의 갭머 전체에 걸쳐 뉴클레오사이드 간 결합은 포스포로티오에이트 결합이다. 각각의 갭머 전체에 걸쳐 모든 사이토신 잔기들은 5-메틸사이토신이다. "시작 부위"는 갭머가 인간 유전자 서열에서 표적화되는 5'-최외각 뉴클레오사이드를 표시한다. "정지 부위"는 갭머가 인간 유전자 서열에서 표적화되는 3'-최외각 뉴클레오사이드를 표시한다. 표 1 및 2에 나열된 각각의 갭머는 본원에서 서열 번호 1로서 표기된 인간 AR 게놈 서열(뉴클레오타이드 5079000부터 5270000까지 절두된 진뱅크 등록 번호 NT_011669.17) 또는 본원에서 서열 번호 2로서 표기된 인간 AR mRNA 서열(진뱅크 등록 번호 NM_000044.3), 또는 이들 둘 다로 표적화된다. 'n/a'는 올리고뉴클레오타이드가 그 특정 유전자 서열을 표적화하지 않는다는 것을 표시한다.
실시예 2: HuVEC 세포에서 인간 AR의 용량 의존적 안티센스 억제
AR mRNA의 유의한 시험관내 억제를 나타내는 갭머를 전술된 연구로부터 선택하여 HuVEC 세포에서 다양한 용량으로 시험하였다. 세포를 웰당 20,000개 세포의 밀도로 플레이팅하고 표 3 및 4에 특정된 18.5 nM, 55.6 nM, 166.7 nM, 500.0 nM 및 1500.0 nM 농도의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 전기천공으로 형질감염시켰다. 대략 16시간의 처리 시간 후, RNA를 세포로부터 단리하고 AR mRNA 수준을 정량 실시간 PCR로 측정하였다. 인간 AR 프라이머 프로브 세트 RTS3559를 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. AR mRNA 수준을 리보그린®에 의해 측정된 총 RNA 함량에 따라 조절하였다. 결과는 비처리된 대조군 세포에 비해 상대적인 AR의 % 억제로서 제공되어 있다. 유사한 배양 조건을 갖는 일련의 실험에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드들을 시험하였다. 각각의 실험에 대한 결과는 하기 제시된 별도의 표들에서 제공되어 있다.
각각의 올리고뉴클레오타이드의 절반 최대 억제 농도(IC50)도 표 3 및 4에서 제공되어 있다. 예증된 바와 같이, AR mRNA 수준은 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 처리된 세포에서 용량 의존적 방식으로 감소되었다.
실시예 3: HuVEC 세포에서 인간 AR의 안티센스 억제
AR 핵산을 표적화하는 추가 안티센스 올리고뉴클레오타이드들을 디자인하고 시험관내에서 AR mRNA에 대한 그들의 효과에 대해 시험하였다. 웰당 20,000개 세포의 밀도로 배양된 HuVEC 세포를, 500 nM 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 전기천공으로 형질감염시켰다. 대략 24시간의 처리 시간 후, RNA를 세포로부터 단리하고 AR mRNA 수준을 정량 실시간 PCR로 측정하였다. 인간 프라이머 프로브 세트 RTS3559를 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. AR mRNA 수준을 리보그린®에 의해 측정된 총 RNA 함량에 따라 조절하였다. 결과는 비처리된 대조군 세포에 비해 상대적인 AR의 % 억제로서 제공되어 있다. 총 82개의 올리고뉴클레오타이드들을 시험하였다. 추가 연구를 위해 선택되는 올리고뉴클레오타이드들만이 표 5에 제시되어 있다.
표 5에서 새로 디자인된 키메라 안티센스 올리고뉴클레오타이드들은 3-10-3 (S)-cEt 갭머 또는 5-10-5 MOE 갭머로서 디자인되었다. 3-10-3 (S)-cEt 갭머는 길이에 있어서 16개의 뉴클레오사이드를 갖고, 이때 중심 갭 세그먼트는 10개의 2'-데옥시뉴클레오사이드로 구성되고 5' 방향 및 3' 방향 둘 다에서 3개의 뉴클레오사이드를 포함하는 윙 세그먼트에 의해 플랭킹되어 있다. 5' 윙 세그먼트에서의 각각의 뉴클레오사이드 및 3' 윙 세그먼트에서의 각각의 뉴클레오사이드는 (S)-cEt 변경을 갖는다. 5-10-5 MOE 갭머는 길이에 있어서 20개의 뉴클레오사이드를 갖고, 이때 중심 갭 세그먼트는 10개의 2'-데옥시뉴클레오사이드로 구성되고 5' 방향 및 3' 방향 둘 다에서 5개의 뉴클레오사이드를 포함하는 윙 세그먼트에 의해 플랭킹되어 있다. 5' 윙 세그먼트에서의 각각의 뉴클레오사이드 및 3' 윙 세그먼트에서의 각각의 뉴클레오사이드는 2'-MOE 변경을 갖는다. 각각의 갭머 전체에 걸쳐 뉴클레오사이드 간 결합은 포스포로티오에이트 결합이다. 각각의 갭머 전체에 걸쳐 모든 사이토신 잔기들은 5-메틸사이토신이다. "시작 부위"는 갭머가 인간 유전자 서열에서 표적화되는 5'-최외각 뉴클레오사이드를 표시한다. "정지 부위"는 갭머가 인간 유전자 서열에서 표적화되는 3'-최외각 뉴클레오사이드를 표시한다. 표 5에 나열된 각각의 갭머는 본원에서 서열 번호 1로서 표기된 인간 AR 게놈 서열(뉴클레오타이드 5079000부터 5270000까지 절두된 진뱅크 등록 번호 NT_011669.17)로 표적화된다.
실시예 4: HuVEC 세포에서 인간 AR의 용량 의존적 안티센스 억제
AR mRNA의 유의한 시험관내 억제를 나타내는 갭머를 전술된 연구로부터 선택하여 HuVEC 세포에서 다양한 용량으로 시험하였다. 세포를 웰당 20,000개 세포의 밀도로 플레이팅하고 표 6에 특정된 31.3 nM, 62.5 nM, 125.0 nM, 250.0 nM, 500.0 nM 및 1000.0 nM 농도의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 전기천공으로 형질감염시켰다. 대략 16시간의 처리 시간 후, RNA를 세포로부터 단리하고 AR mRNA 수준을 정량 실시간 PCR로 측정하였다. 인간 AR 프라이머 프로브 세트 RTS3559를 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. AR mRNA 수준을 리보그린®에 의해 측정된 총 RNA 함량에 따라 조절하였다. 결과는 비처리된 대조군 세포에 비해 상대적인 AR의 % 억제로서 제공되어 있다. 유사한 배양 조건을 갖는 일련의 실험에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드들을 시험하였다. 각각의 실험에 대한 결과는 하기 제시된 별도의 표들에서 제공되어 있다.
각각의 올리고뉴클레오타이드의 절반 최대 억제 농도(IC50)도 표 6에서 제공되어 있다. 예증된 바와 같이, AR mRNA 수준은 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 처리된 세포에서 용량 의존적 방식으로 감소되었다.
실시예 5: HuVEC 세포에서 인간 AR의 안티센스 억제
AR 핵산을 표적화하는 추가 안티센스 올리고뉴클레오타이드들을 디자인하고 시험관내에서 AR mRNA에 대한 그들의 효과에 대해 시험하였다. 웰당 20,000개 세포의 밀도로 배양된 HuVEC 세포를, 250 nM 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 전기천공으로 형질감염시켰다. 대략 24시간의 처리 시간 후, RNA를 세포로부터 단리하고 AR mRNA 수준을 정량 실시간 PCR로 측정하였다. 인간 프라이머 프로브 세트 RTS3559를 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. AR mRNA 수준을 리보그린®에 의해 측정된 총 RNA 함량에 따라 조절하였다. 결과는 비처리된 대조군 세포에 비해 상대적인 AR의 % 억제로서 제공되어 있다. 총 40개의 올리고뉴클레오타이드들을 시험하였다. 추가 연구를 위해 선택되는 올리고뉴클레오타이드들만이 표 7에 제시되어 있다.
표 7에서 새로 디자인된 키메라 안티센스 올리고뉴클레오타이드들은 3-10-3 (S)-cEt 갭머 또는 데옥시, MOE 및 (S)-cEt 올리고뉴클레오타이드로서 디자인되었다. 3-10-3 (S)-cEt 갭머는 길이에 있어서 16개의 뉴클레오사이드를 갖고, 이때 중심 갭 세그먼트는 10개의 2'-데옥시뉴클레오사이드로 구성되고 5' 방향 및 3' 방향 둘 다에서 3개의 뉴클레오사이드를 포함하는 윙 세그먼트에 의해 플랭킹되어 있다. 5' 윙 세그먼트에서의 각각의 뉴클레오사이드 및 3' 윙 세그먼트에서의 각각의 뉴클레오사이드는 (S)-cEt 변경을 갖는다. 데옥시, MOE 및 (S)-cEt 올리고뉴클레오타이드는 길이에 있어서 16개의 뉴클레오사이드를 갖고, 이때 뉴클레오사이드는 MOE 당 변경, (S)-cEt 당 변경 또는 데옥시 변경을 갖는다. '화학구조' 칸은 각각의 올리고뉴클레오타이드의 당 변경을 기술하고, 'k'는 (S)-cEt 당 변경을 표시하고, 숫자는 데옥시뉴클레오사이드의 수를 표시하고, 'e'는 MOE 변경을 표시한다. 각각의 갭머 전체에 걸쳐 뉴클레오사이드 간 결합은 포스포로티오에이트 결합이다. 각각의 갭머 전체에 걸쳐 모든 사이토신 잔기들은 5-메틸사이토신이다. 표에 나열된 서열 번호는 올리고뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. "시작 부위"는 갭머가 인간 유전자 서열에서 표적화되는 5'-최외각 뉴클레오사이드를 표시한다. "정지 부위"는 갭머가 인간 유전자 서열에서 표적화되는 3'-최외각 뉴클레오사이드를 표시한다. 표 7에 나열된 각각의 갭머는 본원에서 서열 번호 1로서 표기된 인간 AR 게놈 서열(뉴클레오타이드 5079000부터 5270000까지 절두된 진뱅크 등록 번호 NT_011669.17)로 표적화된다.
실시예 6: HuVEC 세포에서 인간 AR의 용량 의존적 안티센스 억제
AR mRNA의 유의한 시험관내 억제를 나타내는 갭머를 전술된 연구로부터 선택하여 HuVEC 세포에서 다양한 용량으로 시험하였다. 세포를 웰당 20,000개 세포의 밀도로 플레이팅하고 표 8에 특정된 31.3 nM, 62.5 nM, 125.0 nM, 250.0 nM, 500.0 nM 및 1000.0 nM 농도의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 전기천공으로 형질감염시켰다. 대략 16시간의 처리 시간 후, RNA를 세포로부터 단리하고 AR mRNA 수준을 정량 실시간 PCR로 측정하였다. 인간 AR 프라이머 프로브 세트 RTS3559를 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. AR mRNA 수준을 리보그린®에 의해 측정된 총 RNA 함량에 따라 조절하였다. 결과는 비처리된 대조군 세포에 비해 상대적인 AR의 % 억제로서 제공되어 있다. 유사한 배양 조건을 갖는 일련의 실험에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드들을 시험하였다. 각각의 실험에 대한 결과는 하기 제시된 별도의 표들에서 제공되어 있다.
각각의 올리고뉴클레오타이드의 절반 최대 억제 농도(IC50)도 표 8에서 제공되어 있다. 예증된 바와 같이, AR mRNA 수준은 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 처리된 세포에서 용량 의존적 방식으로 감소되었다.
실시예 7: HuVEC 세포에서 인간 AR의 용량 의존적 안티센스 억제
AR 유전자 서열을 표적화하는 데옥시, MOE 및 (S)-cEt 올리고뉴클레오타이드로서 추가 안티센스 올리고뉴클레오타이드들을 디자인하고 HuVEC 세포에서 다양한 용량으로 시험하였다. 상기 올리고뉴클레오타이드들은 길이에 있어서 16개의 뉴클레오사이드를 갖고, 이때 뉴클레오사이드는 MOE 당 변경, (S)-cEt 당 변경 또는 데옥시 변경을 갖는다. '화학구조' 칸은 각각의 올리고뉴클레오타이드의 당 변경을 기술하고, 'k'는 (S)-cEt 당 변경을 표시하고, 숫자는 데옥시뉴클레오사이드의 수를 표시하고, 'd'는 데옥시리보스를 표시하고, 'e'는 MOE 변경을 표시한다. 각각의 갭머 전체에 걸쳐 뉴클레오사이드 간 결합은 포스포로티오에이트 결합이다. 각각의 갭머 전체에 걸쳐 모든 사이토신 잔기들은 5-메틸사이토신이다. 표에 나열된 서열 번호는 올리고뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. "시작 부위"는 갭머가 인간 유전자 서열에서 표적화되는 5'-최외각 뉴클레오사이드를 표시한다. "정지 부위"는 갭머가 인간 유전자 서열에서 표적화되는 3'-최외각 뉴클레오사이드를 표시한다. 표 9에 나열된 각각의 갭머는 본원에서 서열 번호 1로서 표기된 인간 AR 게놈 서열(뉴클레오타이드 5079000부터 5270000까지 절두된 진뱅크 등록 번호 NT_011669.17)로 표적화된다.
세포를 웰당 20,000개 세포의 밀도로 플레이팅하고 표 10 내지 12에 특정된 62.5 nM, 125.0 nM, 250.0 nM, 500.0 nM 및 1000.0 nM 농도의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 전기천공으로 형질감염시켰다. 대략 16시간의 처리 시간 후, RNA를 세포로부터 단리하고 AR mRNA 수준을 정량 실시간 PCR로 측정하였다. 인간 AR 프라이머 프로브 세트 RTS3559를 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. AR mRNA 수준을 리보그린®에 의해 측정된 총 RNA 함량에 따라 조절하였다. 결과는 비처리된 대조군 세포에 비해 상대적인 AR의 % 억제로서 제공되어 있다. 유사한 배양 조건을 갖는 일련의 실험에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드들을 시험하였다. 각각의 실험에 대한 결과는 하기 제시된 별도의 표들에서 제공되어 있다.
각각의 올리고뉴클레오타이드의 절반 최대 억제 농도(IC50)도 표 10 내지 12에서 제공되어 있다. 예증된 바와 같이, AR mRNA 수준은 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 처리된 세포들 중 일부에서 용량 의존적 방식으로 감소되었다.
실시예 8: HuVEC 세포에서 인간 AR의 안티센스 억제
AR 핵산을 표적화하는 추가 안티센스 올리고뉴클레오타이드들을 디자인하고 시험관내에서 AR mRNA에 대한 그들의 효과에 대해 시험하였다. 웰당 20,000개 세포의 밀도로 배양된 HuVEC 세포를 1,000 nM 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 전기천공으로 형질감염시켰다. 대략 24시간의 처리 시간 후, RNA를 세포로부터 단리하고 AR mRNA 수준을 정량 실시간 PCR로 측정하였다. 인간 프라이머 프로브 세트 RTS3559를 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. AR mRNA 수준을 리보그린®에 의해 측정된 총 RNA 함량에 따라 조절하였다. 결과는 비처리된 대조군 세포에 비해 상대적인 AR의 % 억제로서 제공되어 있다. 총 75개의 올리고뉴클레오타이드들을 시험하였다. 추가 연구를 위해 선택되는 올리고뉴클레오타이드들만이 표 13에 제시되어 있다.
표 13에서 새로 디자인된 키메라 안티센스 올리고뉴클레오타이드들은 3-10-3 (S)-cEt 갭머, 3-9-4 (S)-cEt 갭머, 4-8-4 (S)-cEt 갭머, 4-9-3 (S)-cEt 갭머, 5-7-4 (S)-cEt 갭머, 5-8-3 (S)-cEt 갭머, 6-7-3 (S)-cEt 갭머, 또는 데옥시, MOE 및 (S)-cEt 올리고뉴클레오타이드로서 디자인되었다. 3-10-3 (S)-cEt 갭머는 길이에 있어서 16개의 뉴클레오사이드를 갖고, 이때 중심 갭 세그먼트는 10개의 2'-데옥시뉴클레오사이드로 구성되고 5' 방향 및 3' 방향 둘 다에서 3개의 뉴클레오사이드를 포함하는 윙 세그먼트에 의해 플랭킹되어 있다. 3-9-4 (S)-cEt 갭머는 길이에 있어서 16개의 뉴클레오사이드를 갖고, 이때 중심 갭 세그먼트는 9개의 2'-데옥시뉴클레오사이드로 구성되고 5' 방향에서 3개의 뉴클레오타이드를 포함하고 3' 방향에서 4개의 뉴클레오사이드를 포함하는 윙 세그먼트에 의해 플랭킹되어 있다. 4-8-4 (S)-cEt 갭머는 길이에 있어서 16개의 뉴클레오사이드를 갖고, 이때 중심 갭 세그먼트는 8개의 2'-데옥시뉴클레오사이드로 구성되고 5' 방향 및 3' 방향 둘 다에서 4개의 뉴클레오사이드를 포함하는 윙 세그먼트에 의해 플랭킹되어 있다. 4-9-3 (S)-cEt 갭머는 길이에 있어서 16개의 뉴클레오사이드를 갖고, 이때 중심 갭 세그먼트는 9개의 2'-데옥시뉴클레오사이드로 구성되고 5' 방향에서 4개의 뉴클레오타이드를 포함하고 3' 방향에서 3개의 뉴클레오사이드를 포함하는 윙 세그먼트에 의해 플랭킹되어 있다. 5-7-4 (S)-cEt 갭머는 길이에 있어서 16개의 뉴클레오사이드를 갖고, 이때 중심 갭 세그먼트는 7개의 2'-데옥시뉴클레오사이드로 구성되고 5' 방향에서 5개의 뉴클레오타이드를 포함하고 3' 방향에서 4개의 뉴클레오사이드를 포함하는 윙 세그먼트에 의해 플랭킹되어 있다. 5-8-3 (S)-cEt 갭머는 길이에 있어서 16개의 뉴클레오사이드를 갖고, 이때 중심 갭 세그먼트는 8개의 2'-데옥시뉴클레오사이드로 구성되고 5' 방향에서 5개의 뉴클레오타이드를 포함하고 3' 방향에서 3개의 뉴클레오사이드를 포함하는 윙 세그먼트에 의해 플랭킹되어 있다. 6-7-3 (S)-cEt 갭머는 길이에 있어서 16개의 뉴클레오사이드를 갖고, 이때 중심 갭 세그먼트는 7개의 2'-데옥시뉴클레오사이드로 구성되고 5' 방향에서 6개의 뉴클레오타이드를 포함하고 3' 방향에서 3개의 뉴클레오사이드를 포함하는 윙 세그먼트에 의해 플랭킹되어 있다. 5' 윙 세그먼트에서의 각각의 뉴클레오사이드 및 3' 윙 세그먼트에서의 각각의 뉴클레오사이드는 (S)-cEt 변경을 갖는다. 데옥시, MOE 및 (S)-cEt 올리고뉴클레오타이드는 길이에 있어서 16개의 뉴클레오사이드를 갖고, 이때 뉴클레오사이드는 MOE 당 변경, (S)-cEt 당 변경 또는 데옥시 변경을 갖는다. '화학구조' 칸은 각각의 올리고뉴클레오타이드의 당 변경을 기술하고, 'k'는 (S)-cEt 당 변경을 표시하고, 숫자는 데옥시뉴클레오사이드의 수를 표시하고, 'd'는 데옥시리보스를 포시하고, 'e'는 MOE 변경을 표시한다. 각각의 갭머 전체에 걸쳐 뉴클레오사이드 간 결합은 포스포로티오에이트 결합이다. 각각의 갭머 전체에 걸쳐 모든 사이토신 잔기들은 5-메틸사이토신이다.
표에 나열된 서열 번호는 올리고뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. "시작 부위"는 갭머가 인간 유전자 서열에서 표적화되는 5'-최외각 뉴클레오사이드를 표시한다. "정지 부위"는 갭머가 인간 유전자 서열에서 표적화되는 3'-최외각 뉴클레오사이드를 표시한다. 표 13에 나열된 각각의 갭머는 본원에서 서열 번호 1로서 표기된 인간 AR 게놈 서열(뉴클레오타이드 5079000부터 5270000까지 절두된 진뱅크 등록 번호 NT_011669.17)로 표적화된다.
실시예 9: HuVEC 세포에서 인간 AR의 용량 의존적 안티센스 억제
AR mRNA의 유의한 시험관내 억제를 나타내는 갭머를 전술된 연구로부터 선택하여 HuVEC 세포에서 다양한 용량으로 시험하였다. 세포를 웰당 20,000개 세포의 밀도로 플레이팅하고 표 14에 특정된 31.25 nM, 62.5 nM, 125.0 nM, 250.0 nM, 500.0 nM 및 1000.0 nM 농도의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 전기천공으로 형질감염시켰다. 대략 16시간의 처리 시간 후, RNA를 세포로부터 단리하고 AR mRNA 수준을 정량 실시간 PCR로 측정하였다. 인간 AR 프라이머 프로브 세트 RTS3559를 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. AR mRNA 수준을 리보그린®에 의해 측정된 총 RNA 함량에 따라 조절하였다. 결과는 비처리된 대조군 세포에 비해 상대적인 AR의 % 억제로서 제공되어 있다. 유사한 배양 조건을 갖는 일련의 실험에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드들을 시험하였다. 각각의 실험에 대한 결과는 하기 제시된 별도의 표들에서 제공되어 있다.
각각의 올리고뉴클레오타이드의 절반 최대 억제 농도(IC50)도 표 14에서 제공되어 있다. 예증된 바와 같이, AR mRNA 수준은 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 처리된 세포에서 용량 의존적 방식으로 감소되었다.
실시예 10: HuVEC 세포에서 인간 AR의 용량 의존적 안티센스 억제
AR mRNA의 유의한 시험관내 억제를 나타내는 갭머를 실시예 8로부터 선택하여 HuVEC 세포에서 다양한 용량으로 시험하였다. 세포를 웰당 20,000개 세포의 밀도로 플레이팅하고 표 15에 특정된 46.9 nM, 187.5 nM, 750.0 nM 및 3000.0 nM 농도의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 전기천공으로 형질감염시켰다. 대략 16시간의 처리 시간 후, RNA를 세포로부터 단리하고 AR mRNA 수준을 정량 실시간 PCR로 측정하였다. 인간 AR 프라이머 프로브 세트 RTS3559를 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. AR mRNA 수준을 리보그린®에 의해 측정된 총 RNA 함량에 따라 조절하였다. 결과는 비처리된 대조군 세포에 비해 상대적인 AR의 % 억제로서 제공되어 있다.
각각의 올리고뉴클레오타이드의 절반 최대 억제 농도(IC50)도 표 15에서 제공되어 있다. 예증된 바와 같이, AR mRNA 수준은 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 처리된 세포에서 용량 의존적 방식으로 감소되었다.
실시예 11: HuVEC 세포에서 인간 AR의 안티센스 억제
AR 핵산을 표적화하는 추가 안티센스 올리고뉴클레오타이드들을 디자인하고 시험관내에서 AR mRNA에 대한 그들의 효과에 대해 시험하였다. 웰당 20,000개 세포의 밀도로 배양된 HuVEC 세포를, 500 nM 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 전기천공으로 형질감염시켰다. 대략 24시간의 처리 시간 후, RNA를 세포로부터 단리하고 AR mRNA 수준을 정량 실시간 PCR로 측정하였다. 인간 프라이머 프로브 세트 RTS3559를 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. AR mRNA 수준을 리보그린®에 의해 측정된 총 RNA 함량에 따라 조절하였다. 결과는 비처리된 대조군 세포에 비해 상대적인 AR의 % 억제로서 제공되어 있다. 총 616개의 올리고뉴클레오타이드들을 시험하였다. 추가 연구를 위해 선택되는 올리고뉴클레오타이드들만이 표 16 내지 23에 제시되어 있다.
표 16 내지 23에서 새로 디자인된 키메라 안티센스 올리고뉴클레오타이드들은 3-10-3 (S)-cEt 갭머로서 디자인되었다. 상기 갭머는 길이에 있어서 16개의 뉴클레오사이드를 갖고, 이때 중심 갭 세그먼트는 10개의 2'-데옥시뉴클레오사이드로 구성되고 5' 방향 및 3' 방향 둘 다에서 3개의 뉴클레오사이드를 포함하는 윙 세그먼트에 의해 플랭킹되어 있다. 5' 윙 세그먼트에서의 각각의 뉴클레오사이드 및 3' 윙 세그먼트에서의 각각의 뉴클레오사이드는 (S)-cEt 변경을 갖는다. 각각의 갭머 전체에 걸쳐 뉴클레오사이드 간 결합은 포스포로티오에이트 결합이다. 각각의 갭머 전체에 걸쳐 모든 사이토신 잔기들은 5-메틸사이토신이다.
표에 나열된 서열 번호는 올리고뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. "시작 부위"는 갭머가 인간 유전자 서열에서 표적화되는 5'-최외각 뉴클레오사이드를 표시한다. "정지 부위"는 갭머가 인간 유전자 서열에서 표적화되는 3'-최외각 뉴클레오사이드를 표시한다. 표 16 내지 23에 나열된 각각의 갭머는 본원에서 서열 번호 1로서 표기된 인간 AR 게놈 서열(뉴클레오타이드 5079000부터 5270000까지 절두된 진뱅크 등록 번호 NT_011669.17) 또는 본원에서 서열 번호 2로서 표기된 인간 AR mRNA 서열(진뱅크 등록 번호 NM_000044.3), 또는 이들 둘 다로 표적화된다. 'n/a'는 올리고뉴클레오타이드가 그 특정 유전자 서열을 표적화하지 않는다는 것을 표시한다.
실시예 12: HuVEC 세포에서 인간 AR의 안티센스 억제
AR 핵산을 표적화하는 추가 안티센스 올리고뉴클레오타이드들을 디자인하고 시험관내에서 AR mRNA에 대한 그들의 효과에 대해 시험하였다. 웰당 20,000개 세포의 밀도로 배양된 HuVEC 세포를, 1,000 nM 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 전기천공으로 형질감염시켰다. 대략 24시간의 처리 시간 후, RNA를 세포로부터 단리하고 AR mRNA 수준을 정량 실시간 PCR로 측정하였다. 인간 프라이머 프로브 세트 RTS3559를 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. AR mRNA 수준을 리보그린®에 의해 측정된 총 RNA 함량에 따라 조절하였다. 결과는 비처리된 대조군 세포에 비해 상대적인 AR의 % 억제로서 제공되어 있다. 총 385개의 올리고뉴클레오타이드들을 시험하였다. 추가 연구를 위해 선택되는 올리고뉴클레오타이드들만이 표 24 내지 28에 제시되어 있다.
표 24 내지 28에서 새로 디자인된 키메라 안티센스 올리고뉴클레오타이드들은 3-10-3 (S)-cEt 갭머로서 디자인되었다. 상기 갭머는 길이에 있어서 16개의 뉴클레오사이드를 갖고, 이때 중심 갭 세그먼트는 10개의 2'-데옥시뉴클레오사이드로 구성되고 5' 방향 및 3' 방향 둘 다에서 3개의 뉴클레오사이드를 포함하는 윙 세그먼트에 의해 플랭킹되어 있다. 5' 윙 세그먼트에서의 각각의 뉴클레오사이드 및 3' 윙 세그먼트에서의 각각의 뉴클레오사이드는 (S)-cEt 변경을 갖는다. 각각의 갭머 전체에 걸쳐 뉴클레오사이드 간 결합은 포스포로티오에이트 결합이다. 각각의 갭머 전체에 걸쳐 모든 사이토신 잔기들은 5-메틸사이토신이다.
표에 나열된 서열 번호는 올리고뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. "시작 부위"는 갭머가 인간 유전자 서열에서 표적화되는 5'-최외각 뉴클레오사이드를 표시한다. "정지 부위"는 갭머가 인간 유전자 서열에서 표적화되는 3'-최외각 뉴클레오사이드를 표시한다. 표 24 내지 28에 나열된 각각의 갭머는 본원에서 서열 번호 1로서 표기된 인간 AR 게놈 서열(뉴클레오타이드 5079000부터 5270000까지 절두된 진뱅크 등록 번호 NT_011669.17)로 표적화된다.
실시예 13: HuVEC 세포에서 인간 AR의 용량 의존적 안티센스 억제
AR mRNA의 유의한 시험관내 억제를 나타내는 갭머를 전술된 연구로부터 선택하여 HuVEC 세포에서 다양한 용량으로 시험하였다. 세포를 웰당 20,000개 세포의 밀도로 플레이팅하고 표 29 내지 37에 특정된 46.9 nM, 187.5 nM, 750.0 nM 및 3000.0 nM 농도의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 전기천공으로 형질감염시켰다. 대략 16시간의 처리 시간 후, RNA를 세포로부터 단리하고 AR mRNA 수준을 정량 실시간 PCR로 측정하였다. 인간 AR 프라이머 프로브 세트 RTS3559를 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. AR mRNA 수준을 리보그린®에 의해 측정된 총 RNA 함량에 따라 조절하였다. 결과는 비처리된 대조군 세포에 비해 상대적인 AR의 % 억제로서 제공되어 있다.
각각의 올리고뉴클레오타이드의 절반 최대 억제 농도(IC50)도 표 29 내지 37에서 제공되어 있다. 예증된 바와 같이, AR mRNA 수준은 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 처리된 세포들 중 일부에서 용량 의존적 방식으로 감소되었다.
실시예 14: 전립선암 세포주를 사용한 분석을 위한 인간 안드로겐 수용체(AR) mRNA를 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 선택
인간 AR 게놈 서열의 상이한 영역들을 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를, 전립선암 세포주에서의 추가 연구를 위해 상기 연구에서 제공된 안티센스 올리고뉴클레오타이드들로부터 선택하였다. AR-V7 및 AR-V567es는 문헌(Hornberg, E. et al., PLoS One 2011. Vol. 6)에 기재된 바와 같이 암 환자에서 검출된 주요 AR 스플라이스 변이체이다.
추가 연구를 위해 하기 ISIS 올리고뉴클레오타이드들을 선택하였다: 엑손 1에서 인간 AR 게놈 서열을 표적화하는 ISIS 549372; AR의 정지 코돈을 넘어서 엑손 8의 3' 말단에서 인간 AR 게놈 서열을 표적화하는 ISIS 549434; 인트론 1에서 인간 AR 게놈 서열을 표적화하는 ISIS 560131; 및 인트론 1에서 인간 AR 게놈 서열을 표적화하는 ISIS 569236. 또 다른 안티센스 올리고뉴클레오타이드인 ISIS 554221(ACCAAGTTTCTTCAGC, 본원에서 서열 번호 178로서 표기됨)은 벤치마크로서 사용되기 위해 미국 특허 제7,737,125호의 서열 번호 58로서 표기된 안티센스 올리고뉴클레오타이드와 동일한 AR의 엑손 4(즉, 리간드 결합 도메인)로 표적화되는, 포스포로티오에이트 골격을 갖는 3-10-3 LNA 갭머로서 디자인되었다.
실시예 15: MDV3100 내성 C4-2B 세포에서 안드로겐 수용체 단백질 수준에 대한 인간 안드로겐 수용체(AR) mRNA의 안티센스 억제의 효과
C4-2B 세포는 종양학 분야에서 통상적으로 사용되는 안드로겐 비의존적 인간 전립선 선암종 세포이고 임상적으로 관련된 배양 세포로서 확립되었다(Thalmann，G.N. et al., Cancer Res. 1994. 54: 2577). MDV3100 또는 엔잘루타마이드는 거세 저항성 전립선암의 치료를 위해 메디베이션(Medivation)에 의해 개발된 실험 안드로겐 수용체 길항제 약물이다. ISIS 549372, ISIS 554221 및 ISIS 549434를 MDV3100 내성(MR) C4-2B 세포에서 시험하였다.
세포를 2개월의 기간에 걸쳐 5 μM 농도의 MDV3100의 존재 하에서 배양하여 MDV3100 내성을 유도하였다. 세포에 의한 자유 섭취를 위해 1 μM의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 농도의 ISIS 549372, ISIS 549434 및 ISIS 554221을 1 μM 농도에서 배양 배지에 각각 첨가하였다. 2일의 처리 시간 후, 단백질분해효소 억제제를 함유하는 RIPA 완충제로 세포를 회수하였다. 전체 길이 AR에 대한 밴드의 존재뿐만 아니라 변이체 형태인 AR-V7에 대한 밴드의 존재도 AR 항체(N-20, 산타 크루즈(Santa Cruz))를 사용한 웨스턴 블롯으로 검출하였다. ISIS 549372를 사용한 세포의 처리는 ISIS 554221 또는 ISIS 549434를 사용한 처리보다 더 광범위하게 전체 길이 AR 및 AR-V7을 감소시켰다.
실시예 16: MDV3100 내성 C4-2B 세포에서 안드로겐 수용체(AR)-표적 유전자에 대한 인간 AR mRNA의 안티센스 억제의 효과
AR 표적 유전자에 대한 AR의 안티센스 억제의 효과를 분석하였다. ISIS 549372, ISIS 549458, ISIS 554221 및 ISIS 549434를 C4-2B MR 세포에서 시험하였다.
세포를 96웰 플레이트에서 웰당 40,000개 세포의 밀도로 플레이팅하고 10% 태아 소혈청을 함유하는 RPMI1640 배지에서 배양하였다. 세포를 2개월의 기간에 걸쳐 5 μM 농도의 MDV3100의 존재 하에서 배양하여 MDV3100 내성을 유도하였다. 세포에 의한 자유 섭취를 위해 ISIS 549372, ISIS 549458, ISIS 549434 및 ISIS 554221을 배양 배지에 0.04 μM, 0.20 μM, 1.00 μM 및 5.00 μM 안티센스 올리고뉴클레오타이드 농도로 각각 첨가하였다. 인간 유전자 서열에서 공지된 표적 영역을 갖지 않는 대조군 올리고뉴클레오타이드인 ISIS 347526(서열 TCTTATGTTTCCGAACCGTT(서열 번호 179) 5-10-5 MOE 갭머)을 음성 대조군으로서 포함시켰다. 24시간의 처리 시간 후, 총 AR mRNA 수준을 프라이머 프로브 세트 RTS3559를 사용한 정량 실시간 PCR로 측정하였다. 인간 AR 프라이머 프로브 세트 hAR_LTS00943(본원에서 서열 번호 180으로서 표기된 정방향 서열 GCCCCTGGATGGATAGCTACT; 본원에서 서열 번호 181로서 표기된 역방향 서열 CCACAGATCAGGCAGGTCTTC; 본원에서 서열 번호 182로서 표기된 프로브 서열 ACTGCCAGGGACCATGTTTTGCCC)을 사용하여 AR-V7 mRNA 수준을 측정하였다. AR mRNA 수준을 인간 액틴 mRNA 수준으로 조절하였다. 결과는 비처리된 대조군 세포에 비해 상대적인 총 AR의 % 억제로서 표 38에서 제공되어 있다. ISIS 549372, ISIS 549458 및 ISIS 549434를 사용한 세포의 처리는 ISIS 554221을 사용한 처리보다 더 광범위하게 용량 의존적 방식으로 총 AR 전사체 수준을 감소시켰다.
전체 길이 AR의 웨스턴 분석뿐만 아니라 AR-V7 변이체의 웨스턴 분석도 전술된 분석과 유사한 방식으로 수행하였다. 분석은 ISIS 549372 및 ISIS 549458을 사용한 처리가 전체 길이 AR 및 AR-V7의 수준을 감소시켰다는 것을 입증하였다. ISIS 549434를 사용한 처리는 전체 길이 AR의 수준을 감소시켰지만 AR-V7의 수준을 감소시키지는 않았다. ISIS 554221을 사용한 처리는 ISIS 549372에 비해 덜 광범위하게 전체 길이 AR의 수준을 감소시켰고, AR-V7의 수준을 감소시키지 않았다. 대조군 올리고뉴클레오타이드 ISIS 347526은 예상된 바와 같이 단백질 수준을 감소시키지 않았다.
프라이머 프로브 세트 hKLK2_LTSO0963(본원에서 서열 번호 183으로서 표기된 정방향 서열 CTTGCGCCCCAGGAGTCT; 본원에서 서열 번호 184로서 표기된 역방향 서열 CTCAGAGTAAGCTCTAGCACACATGTC; 본원에서 서열 번호 185로서 표기된 프로브 서열 AGTGTGTGAGCCTCCATCTCCTGTCCAA)을 사용하여 AR 표적 유전자인 KLK2의 mRNA 수준을 측정하였다. 프라이머 프로브 세트 RTS1072(본원에서 서열 번호 186으로서 표기된 정방향 서열 GCCAAGGAGGGAGGGTCTT; 본원에서 서열 번호 187로서 표기된 역방향 서열 CCCCCCATAGTGAATCAGCTT; 본원에서 서열 번호 188로서 표기된 프로브 서열 ATGAAGTAAGGAGAGGGACTGGACCCCC)를 사용하여 AR 표적 유전자인 KLK3의 mRNA 수준을 측정하였다. 표 39 및 40에서 제공된 바와 같이, ISIS 549372, ISIS 549458 및 ISIS 549434를 사용한 처리는 ISIS 554221을 사용한 처리보다 더 광범위하게 용량 의존적 방식으로 표적 유전자 수준을 감소시켰다.
실시예 17: MDV3100 내성 C4-2B 세포의 증식 능력에 대한 인간 안드로겐 수용체(AR) mRNA의 안티센스 억제의 효과
암세포의 증식 능력에 대한 AR의 안티센스 억제의 효과를 분석하였다. ISIS 549372, ISIS 549458, ISIS 554221 및 ISIS 549434를 C4-2B MR 세포에서 시험하였다.
ISIS 549372, ISIS 549434, ISIS 549458 및 ISIS 554221을 0.04 μM，0.20 μM，1.00 μM 및 5.00 μM의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 농도로 배양 배지에 각각 첨가하였다. ISIS 347526을 음성 대조군으로서 포함시켰다. 6일의 처리 기간 후, 셀타이터(CellTiter) 96® 에이퀴어스 원 솔루션 세포 증식(AQueous One Solution Cell Proliferation) 키트(프로메가(Promega))를 제조자의 설명서에 따라 사용하여 암세포의 증식 능력을 측정하였다. 결과는 비처리된 세포에 비해 상대적인 % 증식 억제로서 표 41에서 제공되어 있다. ISIS 549372, ISIS 549434 및 ISIS 549458을 사용한 세포의 처리는 ISIS 554221을 사용한 처리보다 더 광범위하게 용량 의존적 방식으로 세포의 증식을 감소시켰다.
실시예 18: MDV3100 내성 LMR20 세포에 대한 인간 안드로겐 수용체(AR) mRNA의 안티센스 억제의 효과
LMR20으로서 표기된 MDV3100 내성 세포주를 생성하였다. LMR20 세포의 증식 능력 및 AR mRNA 수준에 대한 AR의 안티센스 억제의 효과를 분석하였다. ISIS 560131，ISIS 549458 및 ISIS 569236을 LNA 갭머 ISIS 554221과 함께 시험하였다.
LnCaP 세포를 대략 6개월 동안 증가하는 농도의 MDV3100과 함께 항온처리하였다. 20 μM의 MDV3100의 존재 하에서 광범위한 배양 후 단일 클론을 선택하였다. 클론 LMR20은 LnCaP 모세포에 비해 MDV3100으로 처리되었을 때 IC50의 대략 10배 증가를 나타내면서 지질 매개된 형질감염 없이 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 자유로운 섭취를 가능하게 하는 능력을 유지하였다.
연구 1
배지로부터 임의의 안드로겐을 제거하기 위해 차콜-스트립핑된 태아 소혈청(CSS)을 함유하는 페놀 레드 무함유 배지(라이프 테크놀로지스(Life Technologies))에서 LMR20 세포를 웰당 1,500개 세포의 밀도로 플레이팅하였다. ISIS 560131，ISIS 549458, ISIS 569236 및 ISIS 554221을 0.04 μM，0.2 μM，1.0 μM 또는 5.0 μM 농도로 배양 배지에 개별적으로 첨가하였다. 공지된 인간 표적 서열을 갖지 않는 ISIS 549148을 대조군으로서 포함시켰다. 합성 안드로겐 작용제인 R1881(Takeda，A.N. et al., Mol. Pharmacol. 2007. 71: 473-82)을 각각의 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 처리된 세포 세트에 1 nM 용량으로 1일째 날에 첨가하였다. DHT를 각각의 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 처리된 또 다른 세포 세트에 10 nM의 용량으로 1일째 날에 첨가하였다. MDV3100을 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 처리되지 않은 또 다른 세포 세트에 10 nM의 용량으로 1일째 날에 첨가하였고, 이것은 대조군으로서 사용되었다. 5일의 처리 기간 후, 암세포의 증식 능력을 표준 MTT 분석으로 측정하였다. 결과는 비처리된 세포에 비해 상대적인 % 증식 억제로서 표 42에서 제공되어 있다.
표 42에서 제공된 바와 같이, 안드로겐 작용제 R1881 또는 DHT의 존재 하에서, ISIS 560131，ISIS 549458 및 ISIS 569236은 ISIS 554221보다 더 광범위하게 용량 의존적 방식으로 MDV3100 내성 전립선암 세포 증식을 유의하게 억제하였다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드들에 의한 증식의 억제도 MDV3100을 사용한 처리에 필적할만하거나 이러한 처리보다 더 강력하였다.
연구 2
CSS를 함유하는 페놀 레드 무함유 배지에서 LMR20 세포를 웰당 1,500개 세포의 밀도로 플레이팅하였다. ISIS 560131，ISIS 549458, ISIS 569236 및 LNA 갭머 ISIS 554221을 0.04 μM, 0.2 μM, 1.0 μM 또는 5.0 μM 농도로 배양 배지에 개별적으로 첨가하였다. 공지된 인간 표적 서열을 갖지 않는 ISIS 549148을 대조군으로서 포함시켰다. MDV3100을 세포의 한 세트에 10 nM의 용량으로 1일째 날에 첨가하고, 대조군으로서 사용하였다. DHT를 각각의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 MDV3100으로 처리된 세포의 한 세트에 72시간 동안 10 nM의 용량으로 1일째 날에 첨가하였다. R1881을 각각의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 MDV3100으로 처리된 또 다른 세포 세트에 72시간 동안 10 nM의 용량으로 1일째 날에 첨가하였다. AR, 전립선 특이적 항원(PSA) 및 TMPRSS2(안드로겐-조절된 유전자)(Lin, B.，et al., Cancer Res. 1999. 59: 4180)의 mRNA 수준을 측정하였다. 결과는 기준 값의 백분율로서 표현된 mRNA 수준으로서 표 43 내지 45에서 제공되어 있다. mRNA 수준은 처리 후 하강될 수 있거나 증가될 수 있다.
표 43 내지 45에서 제공된 바와 같이, ISIS 560131，ISIS 549458 및 ISIS 569236은 AR 작용제로 처리되었거나 처리되지 않은 LMR20 세포에서 기준에 비해 상대적으로 용량 의존적 방식으로 AR mRNA 수준을 감소시켰다. LNA 갭머 ISIS 554221을 사용한 처리는 AR mRNA 수준을 변경시키지 않았다. ISIS 560131，ISIS 549458 및 ISIS 569236은 LNA 갭머 ISIS 554221 또는 MDV3100보다 더 광범위하게 PSA 수준 및 TMPRSS2를 감소시켰다. MDV3100을 사용한 처리는 AR 작용제로 처리된 세포에서 AR mRNA의 수준을 증가시켰고 PSA 또는 TMPRSS2 mRNA 수준을 감소시키지 않았다.
실시예 19: C4-2B 세포의 증식 능력에 대한 MDV3100과 조합된 인간 안드로겐 수용체(AR) mRNA의 안티센스 억제의 효과
암세포의 증식 능력에 대한 상이한 용량의 MDV3100과 조합된 AR의 안티센스 억제의 효과를 분석하였다. ISIS 549372，ISIS 549434，ISIS 549458 및 ISIS 554221을 C4-2B 세포에서 시험하였다.
C4-2B 세포를 웰당 1,500개 세포의 밀도로 플레이팅하였다. ISIS 549372, ISIS 549434, ISIS 549458 또는 ISIS 554221을 0.1 μM 농도로 배양 배지에 개별적으로 첨가하였다. ISIS 347526을 음성 대조군으로서 포함시켰다. MDV3100도 0.25 μM 또는 1.00 μM의 용량으로 1일째 날에 첨가하였다. 6일의 처리 기간 후, 셀타이터 96® 에이퀴어스 원 솔루션 세포 증식 키트(프로메가)를 제조자의 설명서에 따라 사용하여 암세포의 증식 능력을 측정하였다. 결과는 비처리된 세포에 비해 상대적인 % 증식 억제로서 표 46에서 제공되어 있다. ISIS 549372 또는 ISIS 549458을 사용한 세포의 처리는 ISIS 554221을 사용한 처리보다 더 광범위하게 세포의 증식을 감소시켰다. 예를 들면, 표 46에서 제공된 바와 같이, ISIS 549372만을 사용한 처리는 59%까지 세포 증식을 감소시켰고, ISIS 549458을 사용한 처리는 23%까지 세포 증식을 감소시킨 ISIS 554221 단독에 비해 74%까지 세포 증식을 감소시켰다.
표 46 및 47에서 제공된 바와 같이, MDV3100과 조합된 ISIS 549372 또는 ISIS 549458은 MDV3100과 조합된 동등한 몰 농도의 ISIS 554221보다 더 큰 정도로 전립선암 세포 증식을 억제하였다.
ISIS 549372 또는 ISIS 549458을 사용한 세포의 처리가 MDV3100과 상승작용하는지를 확인하기 위해, 상기 분석을 0.1 μM ASO에서 반복하였다. 표 46에서 제공된 바와 같이, ISIS 549372 또는 ISIS 549458을 사용한 처리는 MDV3100과 상승작용하였다. 예를 들면, 0.25 μM의 MDV3100 단독은 4%까지 증식을 억제하였고; 0.1 μM의 ISIS 549372 단독은 23%까지 세포 증식을 억제하였고; 조합 사용 시, 세포 증식은 66%까지 억제되었다. 유사하게, 0.1 μM의 ISIS 549458 단독은 39%까지 세포 증식을 억제하였고; 조합 사용 시 세포 증식은 75%까지 억제되었다. 따라서, ISIS 549372 또는 ISIS 549458과 MDV3100의 조합은 전립선암 세포 증식의 억제 면에서 상승작용적이다(즉, 가산적 효과보다 더 큰 효과).
실시예 20: LNCaP 세포의 증식 능력에 대한 MDV3100과 조합된 인간 안드로겐 수용체(AR) mRNA의 안티센스 억제의 효과
암세포의 증식 능력에 대한 상이한 용량의 MDV3100과 조합된 AR의 안티센스 억제의 효과를 분석하였다. ISIS 560131 및 ISIS 569236을 LNCaP 세포에서 시험하였다.
LNCaP 세포를 웰당 1,000개 세포의 밀도로 플레이팅하였다. ISIS 560131 또는 ISIS 569236을 0.08 μM, 0.04 μM, 0.2 μM 또는 1.0 μM 농도로 배양 배지에 개별적으로 첨가하였다. ISIS 549148을 음성 대조군으로서 포함시켰다. 2일째 날에 0.016 μM, 0.08 μM, 0.4 μM 또는 2.0 μM의 용량으로 MDV3100을 ISIS 올리고뉴클레오타이드로 처리된 세포에 첨가하였다. 5일의 처리 기간 후, 셀타이터 96® 에이퀴어스 원 또는 셀타이터-글로(CellTiter-Glo)® 솔루션 세포 증식 키트(프로메가)를 제조자의 설명서에 따라 사용하여 암세포의 증식 능력을 측정하였다. 결과는 비처리된 세포에 비해 상대적인 % 증식 억제로서 표 48 내지 52에서 제공되어 있다.
표들에서 제공되어 있는 바와 같이, ISIS 560131 또는 ISIS 569236을 사용한 처리는 MDV3100과 상승작용하였다. 예를 들면, 대조군 올리고뉴클레오타이드인 ISIS 549148과 함께 MDV3100은 0.08 μM에서 평균 7%까지 증식을 억제하였고; ISIS 560131 단독은 0.04 μM에서 24%까지 세포 증식을 억제하였고; 조합 사용 시, 세포 증식은 41%까지 억제되었다. 유사하게, ISIS 569236 단독은 0.04 μM에서 9%까지 세포 증식을 억제하였고; 조합 사용 시, 세포 증식은 26%까지 억제되었다. 따라서, ISIS 560131 또는 ISIS 569236과 MDV3100의 조합은 전립선암 세포 증식의 억제 면에서 상승작용적이다(즉, 가산적 효과보다 더 큰 효과).
실시예 21: C4-2B 세포의 증식 능력에 대한 MDV3100과 조합된 인간 안드로겐 수용체(AR) mRNA의 안티센스 억제의 효과
암세포의 증식 능력에 대한 상이한 용량의 MDV3100과 조합된 AR의 안티센스 억제의 효과를 분석하였다. ISIS 560131 및 ISIS 569236을 C4-2B 세포에서 시험하였다.
C4-2B 세포를 웰당 1,000개 세포의 밀도로 플레이팅하였다. ISIS 560131 또는 ISIS 569236을 0.08 μM, 0.04 μM, 0.2 μM 또는 1.0 μM 농도로 배양 배지에 개별적으로 첨가하였다. ISIS 549148을 음성 대조군으로서 포함시켰다. 2일째 날에 0.016 μM, 0.08 μM, 0.4 μM 또는 2.0 μM의 용량으로 MDV3100을 ISIS 올리고뉴클레오타이드로 처리된 세포에 첨가하였다. 5일의 처리 기간 후, 셀타이터 96® 에이퀴어스 원 솔루션 세포 증식 키트(프로메가)를 제조자의 설명서에 따라 사용하여 암세포의 증식 능력을 측정하였다. 결과는 비처리된 세포에 비해 상대적인 % 증식 억제로서 표 53 내지 57에서 제공되어 있다.
표들에서 제공되어 있는 바와 같이, ISIS 560131 또는 ISIS 569236을 사용한 처리는 MDV3100과 상승작용하였다. 예를 들면, 대조군 올리고뉴클레오타이드인 ISIS 549148과 함께 MDV3100은 0.4 μM에서 평균 6%까지 증식을 억제하였고; ISIS 560131 단독은 0.08 μM에서 16%까지 세포 증식을 억제하였고; 조합 사용 시, 세포 증식은 31%까지 억제되었다. 유사하게, 대조군 올리고뉴클레오타이드인 ISIS 549148과 함께 MDV3100은 0.08 μM에서 증식을 억제하지 않았고(0%); ISIS 569236 단독은 0.2 μM에서 37%까지 세포 증식을 억제하였고; 조합 사용 시, 세포 증식은 52%까지 억제되었다. 따라서, ISIS 560131 또는 ISIS 569236과 MDV3100의 조합은 전립선암 세포 증식의 억제 면에서 상승작용적이다(즉, 가산적 효과보다 더 큰 효과).
실시예 22: 22RV1 세포의 증식 능력에 대한 MDV3100과 조합된 인간 안드로겐 수용체(AR) mRNA의 안티센스 억제의 효과
암세포의 증식 능력에 대한 상이한 용량의 MDV3100과 조합된 AR의 안티센스 억제의 효과를 분석하였다. ISIS 560131 및 ISIS 569236을 22RV1 세포에서 시험하였다.
22RV1 세포를 48시간 동안 5% CSS 배지에서 웰당 2,000개 세포의 밀도로 플레이팅하였다. 0.4 nM, 1.34 nM, 4 nM 또는 13.4 nM 농도의 ISIS 560131 또는 ISIS 569236을 함유하는 RNAiMAX 시약을 사용하여 세포를 형질감염시켰다. ISIS 549148을 음성 대조군으로서 포함시켰다. 1 nM의 DHT 및 0.04 μM, 0.2 μM, 1.0 μM 또는 5.0 μM 용량의 MDV3100을 4시간 후 첨가하였다. 3일의 처리 기간 후, 셀타이터 96® 에이퀴어스 원 솔루션 세포 증식 키트(프로메가)를 제조자의 설명서에 따라 사용하여 암세포의 증식 능력을 측정하였다. 결과는 비처리된 세포에 비해 상대적인 % 증식 억제로서 표 58 내지 62에서 제공되어 있다.
표들에서 제공되어 있는 바와 같이, ISIS 560131 또는 ISIS 569236을 사용한 처리는 MDV3100과 상승작용하였다. 예를 들면, 대조군 올리고뉴클레오타이드인 ISIS 549148과 함께 MDV3100은 1.0 μM에서 평균 5%까지 증식을 억제하였고; ISIS 560131 단독은 1.34 nM에서 3%까지 세포 증식을 억제하였고; 조합 사용 시, 세포 증식은 23%까지 억제되었다. 유사하게, 대조군 올리고뉴클레오타이드인 ISIS 549148과 함께 MDV3100은 1.0 μM에서 5%까지 증식을 억제하였고; ISIS 569236 단독은 1.0 μM에서 17%까지 세포 증식을 억제하였고; 조합 사용 시, 세포 증식은 30%까지 억제되었다. 따라서, ISIS 560131 또는 ISIS 569236과 MDV3100의 조합은 전립선암 세포 증식의 억제 면에서 상승작용적이다(즉, 가산적 효과보다 더 큰 효과).
실시예 23: CWR22-RV1 세포에 대한 인간 안드로겐 수용체(AR) mRNA의 안티센스 억제의 효과
암세포의 증식 능력에 대한 AR의 안티센스 억제의 효과를 분석하였다. ISIS 549372, ISIS 549434, ISIS 549458 및 ISIS 554221을 CWR22-RV1 세포에서 시험하였다.
CWR22-RV1 세포를 플레이팅하고 1.7 nM, 5.0 nM, 16.7 nM 또는 50 nM 농도의 ISIS 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 RNAiMAX 시약(라이프 테크놀로지스)을 사용하여 형질감염시켰다. ISIS 347526을 음성 대조군으로 포함시켰다. 6일의 처리 기간 후, 암세포의 표적 감소 및 증식 능력을 측정하였다.
AR 전체 길이 mRNA의 안티센스 억제를 RTS3559 프라이머 프로브 세트로 측정하였다. 결과는 비처리된 세포에 비해 상대적인 % 억제로서 표 63에서 제공되어 있다. AR mRNA의 V7 스플라이스 변이체의 감소도 SYBR 그린 염색(Hu, R. et al., Cancer Res. 2009, 69: 16-22)을 사용하여 RT-PCR로 측정하였다. 결과는 비처리된 세포에 비해 상대적인 % 감소로서 표 64에서 제공되어 있다. 셀타이터 96® 에이퀴어스 원 솔루션 세포 증식 키트(프로메가)를 제조자의 설명서에 따라 사용하여 세포 증식을 측정하였다. 결과는 비처리된 세포에 비해 상대적인 % 증식 억제로서 표 65에서 제공되어 있다.
실시예 24: C4-2B 세포에 의한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 자유 섭취에 의한 인간 안드로겐 수용체(AR) mRNA의 안티센스 억제의 효과
AR mRNA 수준에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 자유 섭취의 효과를 조사하였다. ISIS 549372, ISIS 549434, ISIS 549458 및 ISIS 554221을 시험하였다.
세포 증식을 측정하기 위해 세포를 96웰 플레이트에서 1,000개 세포/웰의 농도로 플레이팅하고 표적 감소를 측정하기 위해 세포를 4,000개 세포/웰의 농도로 플레이팅하였다. ISIS 549458, ISIS 549372, ISIS 549434 및 ISIS 554221을 0.04 μM, 0.20 μM, 1.00 μM 또는 5.00 μM의 농도로 개별적으로 첨가하였다. 24시간의 항온처리 시간 후, hAR_LTS00943을 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. 데이터는 표 66에서 제공되어 있다. 결과는 ISIS 549458, ISIS 549372 및 ISIS 549434가 ISIS 554221보다 더 강력하게 AR mRNA 발현을 억제하였다는 것을 표시한다.
6일째 날, 증식을 측정하기 위해 플레이팅된 세포를 발색될 때까지 MTT 시약과 함께 항온처리하였다. 490 nm에서 분광계를 이용하여 색채 강도를 측정하였다. 데이터는 표 67에서 제공되어 있다.
실시예 25: LnCaP 세포에 의한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 자유 섭취에 의한 인간 안드로겐 수용체(AR) mRNA의 안티센스 억제의 효과
AR mRNA 수준에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 자유 섭취의 효과를 조사하였다.
세포를 96웰 플레이트에서 4,000개 세포/웰의 농도로 플레이팅하였다. 표 68에 특정된 ISIS 올리고뉴클레오타이드들을 0.02 μM，0.10 μM，0.50 μM，2.50 μM 또는 10.00 μM의 농도로 개별적으로 첨가하였다. 24시간의 항온처리 시간 후, 프라이머 프로브 세트 hAR_LTS00943을 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. 데이터는 표 68에서 제공되어 있다. 결과는 대다수의 ISIS 올리고뉴클레오타이드들이 각각의 농도에서 ISIS 554221보다 더 강력하게 AR mRNA 발현을 억제하였다는 것을 표시한다.
실시예 26: DHT의 존재 하에서 22RV1 세포의 증식 능력에 대한 인간 안드로겐 수용체(AR) mRNA의 안티센스 억제의 효과
디하이드로테스토스테론(DHT)은 안드로겐 호르몬이고 AR 활성화제이다. DHT로 처리된 암세포의 증식 능력에 대한 AR의 안티센스 억제의 효과를 분석하였다. ISIS 560131 및 ISIS 569236을 인간 전립선암 세포주 22RV1에서 시험하였다.
22RV1 세포를 웰당 1,500개 세포의 밀도로 플레이팅하였다. RNAiMAX™ 시약(라이프 테크놀로지스)을 사용하여 ISIS 560131 및 ISIS 569236을 1.34 nM，4.00 nM，13.4 nM 또는 40.0 nM 농도로 세포 내로 개별적으로 형질감염시켰다. 공지된 인간 표적 서열을 갖지 않는 ISIS 549148을 대조군으로서 포함시켰다. 각각의 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 처리된 별도의 세포 세트를 1 nM의 최종 농도로 1일째 날에 첨가된 DHT로 처리하였다. 5일의 처리 기간 후, 표준 MTT 분석을 이용하여 암세포의 증식 능력을 측정하였다. 결과는 비처리된 세포에 비해 상대적인 % 증식 억제로서 표 69에서 제공되어 있다.
표 69에서 제공되어 있는 바와 같이, ISIS 560131 및 ISIS 569236 둘 다가 대조군과 비교될 때 AR 활성화제인 DHT의 존재 하에서 조차도 전립선암 세포 증식을 유의하게 억제하였다. 대조군 올리고뉴클레오타이드는 예상된 바와 같이 증식에 대한 어떠한 영향도 보이지 않았다.
실시예 27: AR을 표적화하는 ISIS 올리고뉴클레오타이드를 사용한 C4-2B 세포 처리의 시간-경과 연구
C4-2B 암세포의 유전자 발현에 대한 안티센스 억제의 효과를 분석하였다. ISIS 560131 및 ISIS 569236을 시험하였다.
AR mRNA 분석
C4-2B 세포를 완전 배지에서 웰당 1,000개 세포의 밀도로 플레이팅하였다. 형질감염 시약을 사용하지 않으면서 ISIS 560131 또는 ISIS 569236을 0.04 μM, 0.2 μM, 1.0 μM 또는 5.0 μM의 최종 농도로 배양 배지에 개별적으로 첨가하였다. ISIS 549148을 음성 대조군으로서 포함시켰다. MDV3100을 별도의 세포 세트에서 0.04 μM, 0.2 μM, 1.0 μM 또는 5.0 μM의 용량으로 첨가하였다. 8시간, 24시간 및 48시간의 처리 시간 후, AR 발현을 프라이머 프로브 세트 hAR-LTS00943로 측정하였다. 결과는 비처리된 세포에 비해 상대적인 AR의 % 발현으로서 표 70 내지 72에서 제공되어 있다. ISIS 560131 또는 ISIS 569236을 사용한 세포의 처리는 대조군 세트에 비해 상대적으로 세포에서 AR 발현을 감소시켰다. MDV-3100을 사용한 처리는 48시간 시점에서 AR 발현을 증가시켰다.
AR 단백질 분석
세포에서 단백질 수준도 분석하였다. 세포를 단백질분해효소 억제제 함유 RIPA 완충제로 회수하였다. 전체 길이 AR에 대한 밴드의 존재를 AR 항체(N-20, SC-816, 산타 크루즈 바이오테크놀로지)를 사용한 웨스턴 블롯으로 검출하였다. 전체 길이 AR은 하우스 킵핑 유전자인 GAPDH의 수준으로 표준화되었을 때 24시간 및 48시간 동안 ISIS 560131 또는 ISIS 569236으로 처리된 세포에서 유의하게 감소되었다.
다운스트림 유전자의 mRNA 발현 분석
전립선 특이적 항원(PSA) 및 TMPRSS2의 발현도 분석하였다. 결과는 비처리된 세포에 비해 상대적인 % PSA 발현 억제로서 표 73 내지 75에서 제공되어 있고 비처리된 세포에 비해 상대적인 % TMPRSS2 발현 억제로서 표 76 내지 78에서 제공되어 있다. ISIS 560131 또는 ISIS 569236을 사용한 세포의 처리는 24시간 및 48시간 시점에서 대조군 세트에 비해 상대적으로 세포에서 PSA 및 TMPRSS2 발현을 감소시켰다. MDV-3100을 사용한 처리도 다운스트림 유전자 발현을 감소시켰으나, 상기 ISIS 올리고뉴클레오타이드들만큼 강력하게 감소시키지는 않았다.
실시예 28: 완전 배지 및 CSS 배지에서 배양된 LNCaP 세포에서 AR mRNA의 안티센스 억제
완전 배지 및 DHT를 함유하는 CSS 배지에서 배양된 LNCaP 세포에서 AR의 안티센스 억제의 효과를 조사하였다.
완전 배지에서의 유전자 발현
세포를 웰당 1,000개 세포의 밀도로 플레이팅하였다. ISIS 560131 또는 ISIS 569236을 0.04 μM，0.2 μM，1.0 μM 또는 5.0 μM의 농도로 개별적으로 첨가하였다. ISIS 549148을 음성 대조군으로서 포함시켰다. MDV3100을 별도의 세포 세트에 0.04 μM, 0.2 μM, 1.0 μM 또는 5.0 μM의 용량으로 첨가하였다. 48시간의 항온처리 시간 후, AR, PSA 및 TMPRSS2의 RNA 수준을 측정하였다. 데이터는 표 79 내지 81에서 제공되어 있다.
전체 길이 AR의 단백질 분석도 하우스 킵핑 유전자인 GAPDH의 수준으로 표준화된 발현의 용량 의존적 감소를 입증하였다.
CSS 배지 및 CSS+DHT 배지에서의 유전자 발현
세포를 웰당 2,000개 세포의 밀도로 플레이팅하고, 5% 차콜 스트립핑된 혈청(깁코) 배지로 보충된 페놀 레드 무함유 RPMI에서 16시간 동안 배양하였다. ISIS 560131 또는 ISIS 569236을 각각의 세포 세트에 0.04 μM, 0.2 μM, 1.0 μM 또는 5.0 μM로 개별적으로 첨가하였다. ISIS 549148을 음성 대조군으로서 포함시켰다. MDV3100을 별도의 세포 세트에 0.04 μM, 0.2 μM, 1.0 μM 또는 5.0 μM로 첨가하였다. 4시간의 항온처리 시간 후, DHT를 표시된 바와 같이 1 nM의 최종 농도까지 배지에 첨가하였다. 48시간 후 RNA를 채취하고 AR, PSA 및 TMPRSS2의 수준을 측정하였다. 데이터는 표 82 내지 85에서 제공되어 있다. DHT의 부재 하에서, 비처리된 대조군과 비교될 때 LNCaP 세포에서의 AR 발현은 95%였고 PSA 발현은 7%였고 TMPRSS2 발현은 24%였다.
CSS 배지 및 CSS+DHT 배지에서의 증식에 대한 효과
완전 배지 또는 CSS+1 nM DHT 배지에서 5일 동안 처리한 후, 셀타이터 96® 에이퀴어스 원 솔루션 또는 셀타이터-글로® 솔루션 세포 증식 키트(프로메가)를 제조자의 설명서에 따라 사용하여 암세포의 증식 능력을 측정하였다. 결과는 비처리된 세포에 비해 상대적인 % 증식 억제로서 표 86 및 87에서 제공되어 있다. ISIS 560131，ISIS 569236 및 MDV-3100을 사용한 세포의 처리는 대조군에 비해 용량 의존적 방식으로 세포의 증식을 감소시켰다. CSS+DHT 배지에서 ISIS 올리고뉴클레오타이드를 사용한 처리는 MVD-3100을 사용한 처리보다 더 큰 정도로 증식 능력을 감소시켰다. DHT를 함유하지 않는 CSS 배지에서 배양된 세포의 증식 능력은 비처리된 대조군 수준의 17%이다.
실시예 29: 완전 배지 및 CSS 배지에서 배양된 C4-2 세포에서 AR mRNA의 안티센스 억제
완전 배지 및 DHT 함유 CSS 배지에서 배양된 C4-2 세포에서 AR mRNA 수준의 안티센스 억제의 효과를 조사하였다.
완전 배지에서의 유전자 발현
세포를 웰당 1,000개 세포의 밀도로 플레이팅하였다. ISIS 560131 또는 ISIS 569236을 0.04 μM，0.2 μM，1.0 μM 또는 5.0 μM의 농도로 개별적으로 첨가하였다. ISIS 549148을 음성 대조군으로서 포함시켰다. MDV3100을 별도의 세포 세트에 0.04 μM, 0.2 μM, 1.0 μM 또는 5.0 μM의 농도로 첨가하였다. 48시간의 항온처리 시간 후, AR, PSA 및 TMPRSS2의 RNA 수준을 측정하였다. 데이터는 표 88 내지 90에서 제공되어 있다. ISIS 올리고뉴클레오타이드를 사용한 처리는 AR 발현을 억제한 반면, MDV-3100을 사용한 처리는 세포에서 AR 발현을 증가시켰다.
전체 길이 AR 및 PSA의 단백질 분석도 하우스 킵핑 유전자인 GAPDH의 수준으로 표준화된 발현의 용량 의존적 감소를 입증하였다.
CSS+DHT 배지에서의 유전자 발현
세포를 웰당 2,000개 세포의 밀도로 플레이팅하고, 1 nM DHT를 함유하는 CSS 배지에서 배양하였다. ISIS 560131 또는 ISIS 569236을 각각의 세포 세트에 0.04 μM, 0.2 μM, 1.0 μM 또는 5.0 μM의 농도로 개별적으로 첨가하였다. ISIS 549148을 음성 대조군으로서 포함시켰다. MDV3100을 별도의 세포 세트에 0.04 μM, 0.2 μM, 1.0 μM 또는 5.0 μM의 농도로 첨가하였다. 48시간의 항온처리 시간 후, AR, PSA 및 TMPRSS2의 RNA 수준을 측정하였다. 데이터는 표 91 내지 93에서 제공되어 있다. DHT의 부재 하에서, 비처리된 대조군과 비교될 때 C4-2 세포에서 AR 발현은 153%였고 PSA 발현은 42%였고 TMPRSS2 발현은 23%였다.
CSS 배지 및 CSS+DHT 배지에서의 증식에 대한 효과
완전 배지 또는 CSS+1 nM DHT 배지에서 5일 동안 처리한 후, 셀타이터 96® 에이퀴어스 원 솔루션 또는 셀타이터-글로® 세포 증식 키트(프로메가)를 제조자의 설명서에 따라 사용하여 암세포의 증식 능력을 측정하였다. 결과는 비처리된 세포에 비해 상대적인 % 증식 억제로서 표 94 및 95에서 제공되어 있다. ISIS 560131，ISIS 569236 및 MDV-3100을 사용한 세포의 처리는 대조군에 비해 용량 의존적 방식으로 세포의 증식을 감소시켰다. DHT를 함유하지 않는 CSS 배지에서 배양된 세포의 증식 능력은 비처리된 대조군 수준의 17%이다.
실시예 30: 완전 배지 및 CSS 배지에서 배양된 C4-2B 세포에서 AR mRNA의 안티센스 억제
완전 배지 및 DHT 함유 CSS 배지에서 배양된 C4-2B 세포에서 AR mRNA 수준의 안티센스 억제의 효과를 조사하였다.
완전 배지에서의 유전자 발현
세포를 웰당 1,000개 세포의 밀도로 플레이팅하였다. ISIS 560131 또는 ISIS 569236을 0.04 μM，0.2 μM，1.0 μM 또는 5.0 μM의 농도로 개별적으로 첨가하였다. ISIS 549148을 음성 대조군으로서 포함시켰다. MDV3100을 별도의 세포 세트에 0.04 μM, 0.2 μM, 1.0 μM 또는 5.0 μM의 농도로 첨가하였다. 48시간의 항온처리 시간 후, AR, PSA 및 TMPRSS2의 RNA 수준을 측정하였다. 데이터는 표 96 내지 98에서 제공되어 있다. ISIS 올리고뉴클레오타이드를 사용한 처리는 AR 발현을 억제한 반면, MDV-3100을 사용한 처리는 세포에서 AR 발현을 증가시켰다.
전체 길이 AR의 단백질 분석도 하우스 킵핑 유전자인 GAPDH의 수준으로 표준화된 발현의 용량 의존적 감소를 입증하였다.
CSS+DHT 배지에서의 유전자 발현
세포를 웰당 2,000개 세포의 밀도로 플레이팅하고, 1 nM DHT를 함유하는 CSS 배지에서 배양하였다. ISIS 560131 또는 ISIS 569236을 각각의 세포 세트에 0.04 μM, 0.2 μM, 1.0 μM 또는 5.0 μM의 농도로 개별적으로 첨가하였다. ISIS 549148을 음성 대조군으로서 포함시켰다. MDV3100을 별도의 세포 세트에 0.04 μM, 0.2 μM, 1.0 μM 또는 5.0 μM의 농도로 첨가하였다. 48시간의 항온처리 시간 후, AR, PSA 및 TMPRSS2의 RNA 수준을 측정하였다. 데이터는 표 99 내지 101에서 제공되어 있다. DHT의 부재 하에서, 비처리된 대조군과 비교될 때 C4-2 세포에서 AR 발현은 188%였고 PSA 발현은 43%였고 TMPRSS2 발현은 27%였다. ISIS 올리고뉴클레오타이드를 사용한 처리는 AR 발현을 억제한 반면, MDV-3100을 사용한 처리는 세포에서 AR 발현을 증가시켰다.
CSS 배지 및 CSS+DHT 배지에서의 증식에 대한 효과
완전 배지 또는 CSS+1 nM DHT 배지에서 5일 동안 처리한 후, 셀타이터 96® 에이퀴어스 원 또는 셀타이터-글로® 솔루션 세포 증식 키트(프로메가)를 제조자의 설명서에 따라 사용하여 암세포의 증식 능력을 측정하였다. 결과는 비처리된 세포에 비해 상대적인 % 증식 억제로서 표 102 및 103에서 제공되어 있다. ISIS 560131，ISIS 569236 및 MDV-3100을 사용한 세포의 처리는 대조군에 비해 용량 의존적 방식으로 세포의 증식을 감소시켰다. CSS+DHT 배지에서 ISIS 올리고뉴클레오타이드를 사용한 처리는 MVD-3100을 사용한 처리보다 더 큰 정도로 증식 능력을 감소시켰다. DHT를 함유하지 않는 CSS 배지에서 배양된 세포의 증식 능력은 비처리된 대조군 수준의 12%이다.
실시예 31: 완전 배지 및 CSS 배지에서 배양된 VCaP 세포에서 AR mRNA의 안티센스 억제
완전 배지 및 DHT 함유 CSS 배지에서 배양된 VCaP 전립선암 세포(Korenchuk, S. et al., In Vivo. 2001. 15: 163-168)에서 AR의 안티센스 억제의 효과를 조사하였다. VCaP 세포는 전체 길이 AR 및 V7 변이체 둘 다를 발현한다.
완전 배지에서의 유전자 발현
세포를 웰당 10,000개 세포의 밀도로 플레이팅하였다. RNAiMAX 형질감염 시약을 사용하여 ISIS 560131 또는 ISIS 569236을 1.34 nM, 4 nM, 13.4 nM 또는 40 nM의 농도로 개별적으로 첨가하였다. ISIS 549148을 음성 대조군으로서 포함시켰다. 48시간의 항온처리 시간 후, 전체 길이 AR, V7 변이체, PSA 및 TMPRSS2의 RNA 수준을 측정하였다. 데이터는 표 104 내지 107에서 제공되어 있다.
전체 길이 AR 및 V7 변이체의 단백질 분석도 하우스 킵핑 유전자인 GAPDH의 수준에 비해 둘 다의 발현의 용량 의존적 감소를 입증하였다.
별도의 세포 세트를 0.04 μM, 0.2 μM, 1.0 μM 또는 5.0 μM의 MDV-3100으로 처리하였다. 48시간의 항온처리 시간 후, 전체 길이 AR, V7 변이체, PSA 및 TMPRSS2의 RNA 수준을 측정하였다. 데이터는 비처리된 대조군에 비해 유전자 발현의 % 발현으로서 표현되어 표 108에서 제공되어 있다.
CSS+DHT 배지에서의 유전자 발현
세포를 웰당 15,000개 세포의 밀도로 플레이팅하고, CSS 배지에서 16시간 동안 배양하였다. 그 다음, 각각의 세포 세트에 대해 1.34 nM, 4 nM, 13.4 nM 또는 40 nM의 ISIS 560131 또는 ISIS 569236과 함께 RNAiMAX 시약을 사용하여 세포를 형질감염시켰다. ISIS 549148을 음성 대조군으로서 포함시켰다. 4시간 후, 1 nM DHT를 첨가하였다. MDV3100을 0.04 μM, 0.2 μM, 1.0 μM 또는 5.0 μM의 용량으로 별도의 세포 세트에 첨가하였다. 48시간의 항온처리 시간 후, AR, PSA 및 TMPRSS2의 RNA 수준을 측정하였다. 데이터는 표 109 내지 113에서 제공되어 있다. DHT의 부재 하에서, 비처리된 대조군과 비교될 때 VCaP 세포에서 AR 발현은 555%였고 V7 변이체 발현은 656%였고 PSA 발현은 11%였고 TMPRSS2 발현은 22%였다.
증식에 대한 효과
완전 배지 또는 CSS+1 nM DHT 배지에서 5일 동안 처리한 후, 셀타이터 96® 에이퀴어스 원 또는 셀타이터-글로® 솔루션 세포 증식 키트(프로메가)를 제조자의 설명서에 따라 사용하여 암세포의 증식 능력을 측정하였다. 결과는 비처리된 세포에 비해 상대적인 % 증식 억제로서 표 114 내지 116에서 제공되어 있다. ISIS 560131，ISIS 569236 및 MDV-3100을 사용한 세포의 처리는 대조군에 비해 용량 의존적 방식으로 세포의 증식을 감소시켰다. CSS+DHT 배지에서 ISIS 올리고뉴클레오타이드를 사용한 처리는 MVD-3100을 사용한 처리보다 더 큰 정도로 증식 능력을 감소시켰다. DHT를 함유하지 않는 CSS 배지에서 배양된 세포의 증식 능력은 비처리된 대조군 수준의 12%이다.
아폽토시스에 대한 효과
완전 배지에서 72시간 동안 처리한 후, 암세포의 아폽토시스를 캐스파제-글로(Caspase-Glo) 3/7 분석(프로메가)으로 측정하였다. 결과는 비처리된 세포에 비해 상대적인 세포의 % 아폽토시스로서 표 117 및 118에서 제공되어 있다. ISIS 560131，ISIS 569236 및 MDV-3100을 사용한 세포의 처리는 대조군에 비해 용량 의존적으로 세포의 아폽토시스를 증가시켰다.
ISIS 560131，ISIS 569236 및 MDV-3100으로 처리된 세포에서 용량 의존적 방식으로 증가되는 것으로 확인된 절단된 PARP 수준의 단백질 웨스턴 블롯 분석으로도 아폽토시스를 측정하였다.
실시예 32: 완전 배지 및 CSS 배지에서 배양된 22RV1 세포에서 AR mRNA의 안티센스 억제
완전 배지 및 DHT 함유 CSS 배지에서 배양된 22RV1 세포에서 AR의 안티센스 억제의 효과를 조사하였다.
완전 배지에서의 유전자 발현
세포를 웰당 1,000개 세포의 밀도로 플레이팅하였다. RNAiMAX 형질감염 시약을 사용하여 ISIS 560131 또는 ISIS 569236을 1.34 nM, 4 nM, 13.4 nM 또는 40 nM의 농도로 개별적으로 첨가하였다. ISIS 549148을 음성 대조군으로서 포함시켰다. 48시간의 항온처리 시간 후, 전체 길이 AR, V7 변이체, PSA 및 TMPRSS2의 RNA 수준을 측정하였다. 데이터는 표 119 내지 122에서 제공되어 있다.
전체 길이 AR 및 V7 변이체의 단백질 분석도 하우스-킵핑 유전자인 GAPDH의 수준에 비해 발현의 용량 의존적 감소를 입증하였다.
별도의 세포 세트를 0.04 μM, 0.2 μM, 1.0 μM 또는 5.0 μM의 MDV-3100으로 처리하였다. 48시간의 항온처리 시간 후, 전체 길이 AR, V7 변이체, PSA 및 TMPRSS2의 RNA 수준을 측정하였다. 데이터는 비처리된 대조군에 비해 유전자 수준의 % 발현으로서 표현되어 표 123에서 제공되어 있다.
CSS+DHT 배지에서의 유전자 발현
세포를 웰당 2,000개 세포의 밀도로 플레이팅하고, CSS 배지에서 16시간 동안 배양하였다. 각각의 세포 세트에 대해 1.34 nM, 4 nM 또는 13.4 nM의 ISIS 560131 또는 ISIS 569236과 함께 RNAiMAX 시약을 사용하여 세포를 형질감염시켰다. ISIS 549148을 음성 대조군으로서 포함시켰다. 4시간 후, 1 nM DHT를 첨가하였다. MDV3100을 0.04 μM, 0.2 μM, 1.0 μM 또는 5.0 μM의 농도로 별도의 세포 세트에 첨가하였다. 48시간의 항온처리 시간 후, AR, AR V7 변이체, PSA 및 TMPRSS2의 RNA 수준을 측정하였다. 데이터는 표 124 내지 128에서 제공되어 있다. DHT의 부재 하에서, 비처리된 대조군과 비교될 때 VCaP 세포에서 AR 발현은 555%였고 V7 변이체 발현은 656%였고 PSA 발현은 11%였고 TMPRSS2 발현은 22%였다.
ISIS 올리고뉴클레오타이드를 사용한 처리는 전체 길이 AR 및 V7 변이체뿐만 아니라 다운스트림 유전자 발현도 유의하게 억제하였다. ISIS 올리고뉴클레오타이드를 사용한 처리는 MVD-3100을 사용한 처리보다 더 큰 정도로 유전자 발현을 억제하였다.
증식에 대한 효과
완전 배지에서 5일 동안 처리한 후, 셀타이터 96® 에이퀴어스 원 또는 셀타이터-글로® 솔루션 세포 증식 키트(프로메가)를 제조자의 설명서에 따라 사용하여 암세포의 증식 능력을 측정하였다. 결과는 비처리된 세포에 비해 상대적인 % 증식 억제로서 표 129 및 130에서 제공되어 있다. ISIS 560131，ISIS 569236 및 MDV-3100을 사용한 세포의 처리는 대조군에 비해 용량 의존적 방식으로 세포의 증식을 감소시켰다. CSS+DHT 배지에서 ISIS 올리고뉴클레오타이드를 사용한 처리는 MVD-3100을 사용한 처리보다 더 큰 정도로 증식 능력을 감소시켰다. DHT를 함유하지 않는 CSS 배지에서 배양된 세포의 증식 능력은 비처리된 대조군 수준의 12%이다.
아폽토시스에 대한 효과
완전 배지 또는 CSS+DHT 배지에서 72시간 동안 처리한 후, 암세포의 아폽토시스를 캐스파제-글로 3/7 분석 키트(프로메가)로 측정하였다. 결과는 비처리된 세포에 비해 상대적인 세포의 % 아폽토시스로서 표 131 및 132에서 제공되어 있다. ISIS 560131 및 ISIS 569236을 사용한 세포의 처리는 대조군에 비해 용량 의존적으로 세포의 아폽토시스를 증가시켰다.
실시예 33: 사이노몰구스 원숭이에서 인간 안드로겐 수용체를 표적화하는 ISIS 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 효과
사이노몰구스 원숭이를 전술된 연구로부터 선택되는 ISIS 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 치료하였다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드 효능 및 내약성을 평가하였다. 시험된 인간 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 레서스(rhesus) 게놈 서열(뉴클레오타이드 134001부터 308000까지 절두되고 본원에서 서열 번호 189로서 표기된 진뱅크 등록 번호 NW_001218131.1)과 교차반응한다. 서열 번호 189에 대한 각각의 올리고뉴클레오타이드의 표적 시작 부위 및 표적 영역뿐만 아니라, 그들의 화학구조 및 서열의 세부사항은 표 133에서 제공되어 있다.
치료
연구 전, 원숭이들을 30일 동안 격리하였고, 이 기간 동안 동물들을 일반적인 건강에 대해 매일 관찰하였다. 원숭이들의 연령은 2세 내지 4세이었고 체중은 2 kg 내지 4 kg이었다. ISIS 올리고뉴클레오타이드 또는 PBS를 각각 4마리의 무작위 배정된 수컷 사이노몰구스 원숭이들의 13개 군에게 피하 주사하였다. 연구의 제1주(1일째 날, 3일째 날, 5일째 날 및 7일째 날) 4회 용량으로 구성되는 적재 요법에 이어서 14일째 날부터 시작하는 매주 1회 (2주부터 6주까지) 투여로 구성되는 유지 요법을 이용하여 PBS 용액 또는 ISIS 올리고뉴클레오타이드를 40 mg/kg의 용량으로 투여하였다. 피하 주사를 등 위의 4개 부위(용량 당 1개 부위)에서 시계방향 회전으로 수행하였다. 케타민을 사용하여 진정시키면서 문신으로 주사 부위를 표시하고 최소 3 cm의 간격으로 분리하였다.
연구 기간 동안, 질병 또는 고통의 징후에 대해 원숭이들을 최소한 매일 1회 관찰하였다. 본 실시예에 기재된 프로토콜은 동물실험 윤리위원회(IACUC)에 의해 승인받았다.
표적 감소
RNA 분석
프라이머 프로브 세트 RTS3559를 사용한 AR의 실시간 PCR 분석을 위해 간, 심장, 골격근, 신장 및 전립선 조직으로부터 RNA를 추출하였다. 결과를 리보그린®으로 표준화하였다. 결과는 PBS 대조군에 비해 상대적인 AR mRNA의 % 억제로서 제공되어 있다. 표 134에 나타낸 바와 같이, ISIS 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 사용한 처리는 PBS 대조군에 비해 상대적으로 AR mRNA를 유의하게 감소시켰다. 'n/a'는 mRNA 수준이 그 장기에서 측정되지 않았다는 것을 표시한다.
단백질 분석
ELISA 키트(엔조 라이프 사이언시스(Enzo Life Sciences))를 제조자의 설명서에 따라 사용하여 혈청 테스토스테론 단백질 수준을 혈장에서 측정하였다. 결과는 ng/㎖로 표현되어 표 135에서 제공되어 있다. 결과는 ISIS 올리고뉴클레오타이드들 중 일부가 테스토스테론 단백질 수준을 감소시켰다는 것을 표시한다.
내약성 연구
체중 및 장기 중량 측정
동물의 전체 건강에 대한 ISIS 올리고뉴클레오타이드의 효과를 평가하기 위해, 체중 및 장기 중량을 측정하였다. 체중은 42일째 날에 측정되었고 표 136에서 제공되어 있다. 장기 중량은 안락사 시에 측정되었고, 데이터도 표 136에서 제공되어 있다. 구체적으로, ISIS 560131을 사용한 치료는 원숭이들의 체중 및 장기 중량의 관점에서 충분히 용인되었다.
간 기능
간 기능에 대한 ISIS 올리고뉴클레오타이드의 효과를 평가하기 위해, 원숭이들을 밤새 금식시켰다. 모든 연구군들로부터 대략 1.5 ㎖의 혈액 샘플을 44일째 날에 채취하였다. 혈청 분리를 위해 항응고제를 갖지 않은 튜브 내에 혈액을 채취하였다. 상기 튜브를 최소한 90분 동안 실온에서 보관한 후, 10분 동안 3,000 rpm에서 원심분리하였다. 도시바(Toshiba) 120FR NEO 화학 분석기(도시바 코포레이션(Toshiba Co.), 일본 소재)를 이용하여 다양한 간 기능 마커들의 수준을 측정하였다. 결과는 표 137에서 제공되어 있다. 구체적으로, ISIS 560131을 사용한 치료는 간 기능 마커의 관점에서 충분히 용인되었다.
혈액학
사이노몰구스 원숭이들에서 혈액학적 파라미터에 대한 ISIS 올리고뉴클레오타이드의 임의의 효과를 평가하기 위해, 이용가능한 연구 동물 각각으로부터 대략 0.5 ㎖ 혈액의 혈액 샘플을 44일째 날에 K2-EDTA 함유 튜브 내에 채취하였다. ADVIA2120i 혈액학 분석기(지멘스(SIEMENS), 미국 소재)를 이용하여 샘플을 적혈구 세포(RBC) 수, 백혈구 세포(WBC) 수, 혈소판 수, 헤모글로빈 함량 및 혈구용적률(hematocrit)에 대해 분석하였다. 데이터는 표 138에서 제공되어 있다.
데이터는 대다수의 올리고뉴클레오타이드들을 사용한 치료가 이 용량에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 대한 예상된 범위를 벗어난 혈액학적 파라미터의 임의의 변화를 야기하지 않았다는 것을 표시한다. 구체적으로 ISIS 560131을 사용한 치료는 원숭이의 혈액학 관점에서 충분히 용인되었다.
신장 기능
신장 기능에 대한 ISIS 올리고뉴클레오타이드의 효과를 평가하기 위해, 원숭이들을 밤새 금식시켰다. 모든 연구군들로부터 대략 1.5 ㎖의 혈액 샘플을 44일째 날에 채취하였다. 혈청 분리를 위해 항응고제를 갖지 않은 튜브 내에 혈액을 채취하였다. 상기 튜브를 최소한 90분 동안 실온에서 보관한 후, 10분 동안 3,000 rpm에서 원심분리하였다. 도시바 120FR NEO 화학 분석기(도시바 코포레이션, 일본 소재)를 이용하여 BUN 및 크레아티닌의 수준을 측정하였다. 결과는 mg/㎗로 표현되어 표 139에서 제공되어 있다. 혈장 화학 데이터는 대다수의 ISIS 올리고뉴클레오타이드들이 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 대한 예상된 범위를 벗어난 임의의 효과를 신장 기능에 미치지 않았다는 것을 표시한다. 구체적으로, ISIS 560131을 사용한 치료는 원숭이의 신장 기능의 관점에서 충분히 용인되었다.
신장 기능을 소변검사로도 평가하였다. 젖은 얼음 상의 깨끗한 우리 팬(cage pan)을 이용하여 모든 동물들로부터 새로운 소변을 44일째 날에 채취하였다. 새로운 소변 채취를 수행하기 전날 밤새 음식물을 공급하지 않았지만, 물을 공급하였다. 120FR NEO 자동 화학 분석기(도시바 코포레이션, 일본 소재)를 이용하여 총 단백질 및 크레아티닌 수준을 측정하였고, 단백질 대 크레아티닌 비를 계산하였다. 결과는 표 140에서 제공되어 있다.
C-반응 단백질 수준 분석
사이노몰구스 원숭이들에서 ISIS 올리고뉴클레오타이드의 임의의 염증 효과를 평가하기 위해, 상기 원숭이들을 밤새 금식시켰다. 모든 연구군들로부터 대략 1.5 ㎖의 혈액 샘플을 44일째 날에 채취하였다. 혈청 분리를 위해 항응고제를 갖지 않은 튜브 내에 혈액을 채취하였다. 상기 튜브를 최소한 90분 동안 실온에서 보관한 후, 10분 동안 3,000 rpm에서 원심분리하였다. 도시바 120FR NEO 화학 분석기(도시바 코포레이션, 일본 소재)를 이용하여, 간에서 합성되고 염증의 마커로서 작용하는 C-반응성 단백질(CRP)을 43일째 날에 측정하였다. 보체 C3도 유사하게 측정하였고, 데이터는 기준 값의 백분율로서 제공되어 있다. 결과는 표 141에서 제공되어 있고, 대다수의 ISIS 올리고뉴클레오타이드들을 사용한 치료가 원숭이에서 임의의 염증을 야기하지 않았다는 것을 표시한다.
약동학 연구
선택되는 치료군의 신장 및 간에서 전체 길이 올리고뉴클레오타이드의 농도를 측정하였다. 이용된 방법은 페놀-클로로포름(액체-액체) 추출에 이어서 고체상 추출로 구성되는 종래 공개된 방법(Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999)의 변경된 방법이다. 내부 표준물(ISIS 355868, 27-머 2'-O-메톡시에틸 변경된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드, GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT，본원에서 서열 번호 190으로서 표기됨)을 추출 전에 첨가하였다. 대략 1.14 ㎍/g의 정량 하한(LLOQ)을 갖는 보정 곡선을 이용하여 조직 샘플 농도를 계산하였다.
결과는 조직 g 당 ㎍으로서 표현되어 표 142에서 제공되어 있다. 신장 대 간 비도 계산되었고 표 142에서 제공되어 있다.
실시예 34: 안드로겐 수용체 의존성 유방암 정위 모델에 대한 안드로겐 수용체(AR)의 안티센스 억제의 효과
MDA-MB-453 세포는 에스트로겐 수용체 및 프로게스테론 수용체의 부재 하에서 AR을 발현한다(Hall, R.E. et al., Eur. J. Cancer 1994, 30: 484-490). 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의한 AR mRNA 발현의 억제의 효과를 MDA-MB-453 종양 보유 마우스에서 조사하였다.
연구 1
분석에서 시험된 안티센스 올리고뉴클레오타이드인 ISIS 569216(TGATTTAATGGTTGCA; 서열 번호 39)은 데옥시, MOE 및 (S)-cEt 올리고뉴클레오타이드로서 디자인되었고 길이에 있어서 16개의 뉴클레오사이드를 갖는다. 이 올리고뉴클레오타이드의 화학구조는 5' - Te Gk Ak Tk Td Td Ad Ad Td Gd Gd Td Tk Gk Ck A이고, 이때 'e'는 2'-O-메톡시에틸 리보스를 표시하고; 'k'는 (S)-cEt를 표시하고, 'd'는 2'-데옥시리보스를 표시한다. 상기 올리고뉴클레오타이드 전체에 걸쳐 뉴클레오사이드 간 결합은 포스포로티오에이트(P=S) 결합이다. 상기 올리고뉴클레오타이드 전체에 걸쳐 모든 사이토신은 5-메틸사이토신이다. ISIS 569216은 인간 AR 게놈 서열(뉴클레오사이드 5079000부터 5270000까지 절두된 진뱅크 등록 번호 NT_011669.17, 서열 번호 1) 상에 2개 표적 시작 부위 58720 및 58750을 갖는다.
치료
50% 매트리겔과 혼합된 MDA-MB-453 유방 암종세포(5 x 106개)를 10마리 암컷 NSG 마우스들의 유선 지방 패드 내로 주사하였다. 주요 순환 안드로겐인 테스토스테론의 활성 형태인 디하이드로테스토스테론(DHT) 펠렛을 동시에 피하 이식하였다. 일단 종양이 100 mm3의 크기에 도달하면, 마우스들을 2개의 치료군으로 무작위로 나누었다. 제1 치료군은 4주 동안 매주 5회 50 mg/kg의 용량으로 피하 주사에 의해 투여된 ISIS 569216을 주사로 제공받았다. 제2 치료군은 4주 동안 매주 5회 피하 주사에 의해 투여된 비히클만을 주사로 제공받았고 대조군으로서 작용하였다. 종양 성장을 매주 1회 모니터링하였고, 치료 후 32일째 날에 마우스를 희생시켰다. 종양 조직 및 TB-계면 샘플을 채취하고 추가 분석을 위해 프로세싱하였다.
RNA 분석
종양을 절개하고 조직을 RNA 추출 및 qPCR 분석을 위해 프로세싱하였다. AR mRNA 발현을 TB-계면에서 평가하고 액틴 mRNA 발현으로 표준화하였다. ISIS 569216으로 치료된 마우스에서 AR mRNA는 대조군에 비해 48%까지 억제되었다.
종양 부피의 측정
버니어 칼리퍼(Vernier caliper)를 이용하여 연구 기간 전체에 걸쳐 정기적으로 종양 부피를 측정하였다. 표 143에 나타낸 바와 같이, 종양 부피는 대조군에 비해 ISIS 569216으로 치료된 마우스에서 유의하게 감소되었다.
연구 2
치료
ATCC로부터 입수된 MDA-MB-453 세포를 10% FBS 함유 레이보비츠(Leibovitz's) L-15 배지에서 유지하였다. 성장인자-감소된 매트리겔 중의 5 x 106개 종양 세포(1:1)를 암컷 NSG 마우스들(잭슨 라보라토리스(Jackson Laboratories))의 유선 지방 패드 내에 이식하였다. DHT 펠렛도 마우스들의 견갑골 사이에 동시에 이식하였다.
20일 후, 마우스들을 치료군으로 무작위로 나누었다. 마우스 군들은 2주 동안 매주 5일 피하 투여된 50 mg/kg의 ISIS 569236 또는 ISIS 560131을 주사로 제공받았다. 마우스 군을 대조군 올리고뉴클레오타이드 ISIS 549148(공지된 인간 서열을 갖지 않는, 본원에서 서열 번호 193으로서 표기된 서열 GGCTACTACGCCGTCA를 갖는 3-10-3 (S)-cEt 갭머)로 유사하게 치료하였다. 또 다른 마우스 대조군을 PBS로 유사하게 치료하였다.
종양 성장의 측정
버니어 칼리퍼를 이용하여 연구 기간 전체에 걸쳐 정기적으로 종양 부피를 측정하였다. 표 144에 나타낸 바와 같이, 종양 부피는 AR을 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 치료된 마우스에서 대조군에 비해 감소되었다.
RNA 분석
퀴아젠(Qiagen)으로부터 구입된 RNA 추출 키트를 사용하여 RNA 추출을 수행하였다. 프라이머 프로브 세트 LTS00943을 사용하여 AR RNA 발현을 측정하였고 인간 액틴 mRNA 발현으로 표준화하였다. 인간 AR RNA 발현을 종양 조직에서 평가하였다. ISIS 560131로 치료된 마우스에서 AR RNA 발현은 대조군에 비해 35%까지 억제되었고, ISIS 569236으로 치료된 마우스에서 AR 발현은 대조군에 비해 19%까지 억제되었다.
SEQUENCE LISTING
<110> Isis Pharmaceuticals, Inc.
Susan M. Freier
Punit P. Seth
Eric E. Swayze
Brett P. Monia
<120> MODULATION OF ANDROGEN RECEPTOR
EXPRESSION
<130> BIOL0212WO
<150> 61/712,780
<151> 2012-10-11
<150> 61/712,756
<151> 2012-10-11
<150> 61/723,701
<151> 2012-11-07
<150> 61/777,851
<151> 2013-03-12
<150> 61/777,813
<151> 2013-03-12
<150> 61-777,895
<151> 2013-03-12
<160> 215
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 191001
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
ctgacagaaa gcagatcatt ggttgcctga ggaggaggag tataggagag gtggagggaa 60
aatgtacaaa gtggcacaat aaaaactttt ggaatcatag atatattcac tatcttgatt 120
gagtgatgat ttcatgagtg cacgcgtgtg tcaaaaatga tcaatttatg caactttaaa 180
tatgtgcagt ttattgtata tatcaattat acctcagtac ggctattaaa aagaaaccct 240
ctggctgcac aatgcagaac tgattctagg aaagagtgga gggaggatga ccatttacag 300
tgctccaggt ggaagagaac ggtgccttct ggaagtgaac taggttggca acaacagaga 360
tgaaataaat gggcagatgt gtgagatact taggaaataa aacccgatgg tcaccatttt 420
ccaaaggtca gctcatcctg gctttccaga gcaaagagct agggaagact ttattaataa 480
atccctcttg aagttgcaga ggaagcttat agcagaaact tactctcaac ctgactaatc 540
tgagagaaca cctctggttc catttgatta ctaaaaaact gcaaagaaca ggaggagaaa 600
gaagaagaaa gctggtacaa acagtgaact tatataatat taatcaataa ttgtctcttg 660
ttcttaaaag caatgggaag aaaatgagat ttgagctgga agatcagagt tcaaaatcca 720
aataaagtat atggccctaa tatgcttata gtagttaacc tttcctgata atgatataat 780
tgttgacagc accatcttta aaaataaaaa taacatagta atccttcaga tttgtagaat 840
gctttcctgt ttacaagttt gttctataca cattatgtct tttaaatgac acactagcct 900
tctgagggta acttatattg gcaacagttt tcagatgtgg aaactgtgaa gacaatgttg 960
gtgatgtgga agcaacataa actttggagt ctttcagacc caggtttgaa tgtcagactg 1020
ctttttattc agagtaactt cagagcatta tttctcacct taattttttt tcaggcctct 1080
ttgtgtctat gtgtcctctt cactcctgtc cattgttcat tcagtgattt ttgcaccttc 1140
cttcactgtt agtgtgtaga cacatagttc tcctggctct gagacctatg ttaattccat 1200
tctaccatcc tgccagccca ctcaattcct attgagcaat gctagttgaa agttgtggtg 1260
ggattaaatg ttgcaatgag tattcaaatg aggttgaagt atctacgcat tctacttaca 1320
tatggtgagg tatattcaag gaaggctgta gccattaaaa tctcaggaaa taatttttca 1380
cctcctcagg tgaaagggtc ttcaggcctt tgtgttctgg aaggttcatt tatagccatt 1440
tcccaaatga caatgcgatt gatgagtcta gagtctagct caaatagcaa tggactggaa 1500
gactagttta ggttttacta atgtggaaca tagaacaaat tatgtccttg tttcagcctg 1560
ttcatctgtg aaatagagcc tatcatatcc agtcttcctt gcctttaggt ttgagttacc 1620
ttctttggtc aaggtaagta aatgcctatg atgtttggct gtgcacaaga taaagctaca 1680
acaaagctac aacccatctt ttctctgtag aagactgcaa aaagcaaaag agacccaggc 1740
aaaaatctcg gaatgacttt tggaacagag agcctcccca gaatcagaag tcaaaggaat 1800
ttaaaacata gggaggccca gggtctctac tgacataaag gaaagatgtt ttccttatag 1860
gtttacgttt acattttctc tctctttcca ttcccacttg catctccacc tttacacagg 1920
gcttatggga cctcctccac aaaagagcag ttgcagtaac ccacatcatc ctctacgcct 1980
ggctgtccat caagaggcga aaagcagccc tatataggtt ctatccttgg atagttccag 2040
ttgtaaagtt taaaatatgc gaaggcaact tggaaaagca agcggctgca tacaaagcaa 2100
acgtttacag agctctggac aaaattgagc gcctatgtgt acatggcaag tgtttttagt 2160
gtttgtgtgt ttacctgctt gtctgggtga ttttgccttt gagagtctgg atgagaaatg 2220
catggttaaa ggcaattcca gacaggaaga aaggcagaga agagggtaga aatgacctct 2280
gattcttggg gctgagggtt cctagagcaa atggcacaat gccacgaggc ccgatctatc 2340
cctatgacgg aatctaaggt ttcagcaagt atctgctggc ttggtcatgg cttgctcctc 2400
agtttgtagg agactctccc actctcccat ctgcgcgctc ttatcagtcc tgaaaagaac 2460
ccctggcagc caggagcagg tattcctatc gtccttttcc tccctccctc gcctccaccc 2520
tgttggtttt ttagattggg ctttggaacc aaatttggtg agtgctggcc tccaggaaat 2580
ctggagccct ggcgcctaaa ccttggttta ggaaagcagg agctattcag gaagcagggg 2640
tcctccaggg ctagagctag cctctcctgc cctcgcccac gctgcgccag cacttgtttc 2700
tccaaagcca ctaggcaggc gttagcgcgc ggtgagggga ggggagaaaa ggaaagggga 2760
ggggagggaa aaggaggtgg gaaggcaagg aggccggccc ggtgggggcg ggacccgact 2820
cgcaaactgt tgcatttgct ctccacctcc cagcgccccc tccgagatcc cggggagcca 2880
gcttgctggg agagcgggac ggtccggagc aagcccagag gcagaggagg cgacagaggg 2940
aaaaagggcc gagctagccg ctccagtgct gtacaggagc cgaagggacg caccacgcca 3000
gccccagccc ggctccagcg acagccaacg cctcttgcag cgcggcggct tcgaagccgc 3060
cgcccggagc tgccctttcc tcttcggtga agtttttaaa agctgctaaa gactcggagg 3120
aagcaaggaa agtgcctggt aggactgacg gctgcctttg tcctcctcct ctccaccccg 3180
cctcccccca ccctgccttc cccccctccc ccgtcttctc tcccgcagct gcctcagtcg 3240
gctactctca gccaaccccc ctcaccaccc ttctccccac ccgccccccc gcccccgtcg 3300
gcccagcgct gccagcccga gtttgcagag aggtaactcc ctttggctgc gagcgggcga 3360
gctagctgca cattgcaaag aaggctctta ggagccaggc gactggggag cggcttcagc 3420
actgcagcca cgacccgcct ggttaggctg cacgcggaga gaaccctctg ttttccccca 3480
ctctctctcc acctcctcct gccttcccca ccccgagtgc ggagccagag atcaaaagat 3540
gaaaaggcag tcaggtcttc agtagccaaa aaacaaaaca aacaaaaaca aaaaagccga 3600
aataaaagaa aaagataata actcagttct tatttgcacc tacttcagtg gacactgaat 3660
ttggaaggtg gaggattttg tttttttctt ttaagatctg ggcatctttt gaatctaccc 3720
ttcaagtatt aagagacaga ctgtgagcct agcagggcag atcttgtcca ccgtgtgtct 3780
tcttctgcac gagactttga ggctgtcaga gcgctttttg cgtggttgct cccgcaagtt 3840
tccttctctg gagcttcccg caggtgggca gctagctgca gcgactaccg catcatcaca 3900
gcctgttgaa ctcttctgag caagagaagg ggaggcgggg taagggaagt aggtggaaga 3960
ttcagccaag ctcaaggatg gaagtgcagt tagggctggg aagggtctac cctcggccgc 4020
cgtccaagac ctaccgagga gctttccaga atctgttcca gagcgtgcgc gaagtgatcc 4080
agaacccggg ccccaggcac ccagaggccg cgagcgcagc acctcccggc gccagtttgc 4140
tgctgctgca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc 4200
agcagcagca gcagcaagag actagcccca ggcagcagca gcagcagcag ggtgaggatg 4260
gttctcccca agcccatcgt agaggcccca caggctacct ggtcctggat gaggaacagc 4320
aaccttcaca gccgcagtcg gccctggagt gccaccccga gagaggttgc gtcccagagc 4380
ctggagccgc cgtggccgcc agcaaggggc tgccgcagca gctgccagca cctccggacg 4440
aggatgactc agctgcccca tccacgttgt ccctgctggg ccccactttc cccggcttaa 4500
gcagctgctc cgctgacctt aaagacatcc tgagcgaggc cagcaccatg caactccttc 4560
agcaacagca gcaggaagca gtatccgaag gcagcagcag cgggagagcg agggaggcct 4620
cgggggctcc cacttcctcc aaggacaatt acttaggggg cacttcgacc atttctgaca 4680
acgccaagga gttgtgtaag gcagtgtcgg tgtccatggg cctgggtgtg gaggcgttgg 4740
agcatctgag tccaggggaa cagcttcggg gggattgcat gtacgcccca cttttgggag 4800
ttccacccgc tgtgcgtccc actccttgtg ccccattggc cgaatgcaaa ggttctctgc 4860
tagacgacag cgcaggcaag agcactgaag atactgctga gtattcccct ttcaagggag 4920
gttacaccaa agggctagaa ggcgagagcc taggctgctc tggcagcgct gcagcaggga 4980
gctccgggac acttgaactg ccgtctaccc tgtctctcta caagtccgga gcactggacg 5040
aggcagctgc gtaccagagt cgcgactact acaactttcc actggctctg gccggaccgc 5100
cgccccctcc gccgcctccc catccccacg ctcgcatcaa gctggagaac ccgctggact 5160
acggcagcgc ctgggcggct gcggcggcgc agtgccgcta tggggacctg gcgagcctgc 5220
atggcgcggg tgcagcggga cccggttctg ggtcaccctc agccgccgct tcctcatcct 5280
ggcacactct cttcacagcc gaagaaggcc agttgtatgg accgtgtggt ggtggtgggg 5340
gtggtggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcgagg 5400
cgggagctgt agccccctac ggctacactc ggccccctca ggggctggcg ggccaggaaa 5460
gcgacttcac cgcacctgat gtgtggtacc ctggcggcat ggtgagcaga gtgccctatc 5520
ccagtcccac ttgtgtcaaa agcgaaatgg gcccctggat ggatagctac tccggacctt 5580
acggggacat gcggtaagtt tttccttcca gaaatgtcgc ctttcggccc agggcagagt 5640
cactctgtgt tctggggtat ctagcggctc ctacctgcgc gaacactcag attgcccctg 5700
ggagagctca gcagggtaaa cctagagctc tcccgtggac tcccggcctg ccagaggttt 5760
aacctgagct ctcctaattt ctgctgcgtg ccctgggtgc tgattcctgc cctcccagat 5820
tcttcaactc ccccaaccgc cccaaattct cactacctcc tggtactcga ggtcccaaac 5880
agaaatccta ttgcacgggc caccttcaga gataaagctc ccaagccctc cactcttcct 5940
ttcctcctgt cctcaaagtc tgagaacctc aacaggaatt tgggcaattt ctcctcttca 6000
ggtctgttag gatttcactt tcagcctgcg cagattagag tcaaaaagac cggcccaata 6060
gcttctcagc gggtatcctc cagagaggta aagtgaaatt ctcggttagg gaaagaaagt 6120
ggtctctggg tgctgaggtc tgctgtgtga aagggtgaac ttctttctcc tgaagcaact 6180
ggggacttgc tccagggctg gaggtcagta gagataatcc aaaccgtcat gtttagagta 6240
ggcagagggg caactttctt ggtaaagact tcacaggatt tgcactcaca gtttctcaac 6300
gttggttgac tatgttgaaa gtagttgctt gggtcggttt tctcttgtaa agtgtttatt 6360
ttctctgtgg attataacag atccacagcc ccctacttca ggtttgcatc agatctataa 6420
agaggagaat attcttttaa tgtacaattt aattaggctt gactctgact tacaaaactg 6480
ttggaaaaca tttttttgta aagcatttcc tgctatttca gtgtgctcca aaatctccac 6540
tggggagggt ggagtgaggt tttttattat attcctttat ttttaggaca tgtttgcatt 6600
ttagaatatg tgcagttagc tctaacaaat tgagtaagaa ctcttaatga cctatgagcc 6660
gtaatcttac cccaaagttt taattagcat atgagaaaag tggcaggcaa ttgcatcgtg 6720
cttattaaaa attattcctc accgcagttg ttgagcttct tggagaccat gctgaagatt 6780
ttctccccca gcaaattaag atattagttt atctgctgag ggaggacaga ctgaattggg 6840
gaattaactc ctcaggtagg ccaggtgctg atgtccctgt ggacttttgt cttattcttt 6900
gtttctatgg ctgttttctt ttacctgtga cttctccgaa atttctttgt tagccttaac 6960
atctttgttt ggggacttaa atccagcaat ttgccttctt tcactgatgc tttccttctt 7020
acaaggtaga tagcacagtg ttagtaaaga aagaaagagg agggtaggat ttcatattat 7080
ttcgtgggct gttgaagaaa cagcttctta ccaggcttta cattccatta ggtttttaat 7140
gtttgactta caagattttc agagggttca tttgatattg tcaaagtctt ttccagttaa 7200
tttagactct tcatttttgt aatgggttta tgctatggga caaaaaaagt attcttcatt 7260
ttataagaac aaatttactt ggtagggtta attttttttc tagggctgtc actagacggt 7320
ggagcccctc ttctactgta aacttttctt gggggaaaat gtctaaggtg cattttgacc 7380
tgccatgata ctaaacccag acactggaac cttccatctt ctgcatgcct cccccacaac 7440
ttacttactt aacagggaaa aaactgatgg ttccacatat ttgctaaaaa atgtgtgcct 7500
tcaaagacaa aaccaaaatt tttagggaat aactatagag agcaaaagtt actcccatca 7560
agtagacaac gagcttggtg attttatttc aggtcttaat gaaaaaagct tctttatgag 7620
gaaggttatc atatcttggt gcctccttga cagtccgctt aaattaatga cataaactaa 7680
tgagaattta gcagttcctg cagaaagtac aagtttattt tttttttctg gtttgtgatt 7740
gctgcactga atatgaggag tctagttaaa gggacaactg gtgttcctgt cttgtgagtt 7800
gacgaagact ttccatttct aggatataga aaatccttaa gccggtttat tgaaaattaa 7860
tcaatttaat cagaatgcaa tcaattccaa tacaaaagtt agtattttct ttctttttat 7920
tgaaaattaa tttaatcaga atacaatcaa ttccaatcca aaagttgata ttttcttact 7980
ttctcttttt ttccctcatt ttgtagggat acaatttggt gaaaggcaag agatttctta 8040
agccaaagca agagtgtctt ccctctctgt gttgcatgca ttatgtgcca tgtttgagct 8100
aaaaatctca aaattgggca ggcttccaat gacctgttgg gtccctccct ttaccattca 8160
tgtgtgtgtt tatgtacata attttgtgga ggggtttttt taaaccttag taacatctgc 8220
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gtggtctctt ttacttaatt tagcatgtgg tttgaacaga aggaaaaata aaaagtgatg 8340
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gagtgcatgc cagaattaga gtttggggtt tagagaaatt atccagatgc caaaagaaca 8580
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ctttgatatt gacaagtctt gctccctttc tctattagat ttttcaaaat aaggcatttt 8700
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gttgaccgat gttcaggaat aggctttggc atctgacaga ttttgtttta aatactggct 22140
ctgggtctta ctagcttcca gttctgggct gcttcacctc tcttgagttt cagtttcttc 22200
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aacatccttg ataaatagca aaatgctaga caaatatggg ggcttaatat gacattgagg 147300
tcactagtaa tttagctgga aagtctgtaa cacagcactt cccgatggct tttaccctaa 147360
gtaacttggt atgccatata atatgtaaca gcaccaacag gcagagaatc gccagaaaac 147420
actcttgatt acctcaaacg aaaaagtacc accaggatcc tgttcagaag ctaattttag 147480
taattaaggg aatcatatgc tatgttcaaa taccatgcca gtaaaaaccc aattgtttac 147540
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cgttccctgc cctactgaca caaccccctc ccaagtttat tgttaactta cacattcaat 147660
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aggtagggtg tttttctttg attaagagat tgacacttct gttgcctagg acctcccaac 188160
tcaaccattt ctaggtgaag gcagaaaaat ccacattagt tactcctctt cagacatttc 188220
agctgagata acaaatcttt tggaattttt tcacccatag aaagagtggt agatatttga 188280
atttagcagg tggagtttca tagtaaaaac agcttttgac tcagctttga tttatcctca 188340
tttgatttgg ccagaaagta ggtaatatgc attgattggc ttctgattcc aattcagtat 188400
agcaaggtgc taggtttttt cctttcccca cctgtctctt agcctgggga attaaatgag 188460
aagccttaga atgggtggcc cttgtgacct gaaacacttc ccacataagc tacttaacaa 188520
gattgtcatg gagctgcaga ttccattgcc caccaaagac tagaacacac acatatccat 188580
acaccaaagg aaagacaatt ctgaaatgct gtttctctgg tggttccctc tctggctgct 188640
gcctcacagt atgggaacct gtactctgca gaggtgacag gccagatttg cattatctca 188700
caaccttagc ccttggtgct aactgtccta cagtgaagtg cctggggggt tgtcctatcc 188760
cataagccac ttggatgctg acagcagcca ccatcagaat gacccacgca aaaaaaagaa 188820
aaaaaaaatt aaaaagtccc ctcacaaccc agtgacacct ttctgctttc ctctagactg 188880
gaacattgat tagggagtgc ctcagacatg acattcttgt gctgtccttg gaattaatct 188940
ggcagcagga gggagcagac tatgtaaaca gagataaaaa ttaattttca atattgaagg 189000
aaaaaagaaa taagaagaga gagagaaaga aagcatcaca caaagatttt cttaaaagaa 189060
acaattttgc ttgaaatctc tttagatggg gctcatttct cacggtggca cttggcctcc 189120
actgggcagc aggaccagct ccaagcgcta gtgttctgtt ctctttttgt aatcttggaa 189180
tcttttgttg ctctaaatac aattaaaaat ggcagaaact tgtttgttgg actacatgtg 189240
tgactttggg tctgtctctg cctctgcttt cagaaatgtc atccattgtg taaaatattg 189300
gcttactggt ctgccagcta aaacttggcc acatcccctg ttatggctgc aggatcgagt 189360
tattgttaac aaagagaccc aagaaaagct gctaatgtcc tcttatcatt gttgttaatt 189420
tgttaaaaca taaagaaatc taaaatttca gatgaatgtc atcagagttc ttttaattag 189480
ctctttttat tggctgtttt tattgaagtc aagagttggt atcatgcccg gttgcgtttt 189540
atgctatttt gattttcata tatttttaaa agtctttgca caagggttac aaatttgccc 189600
tgtggtggcc ttagcataag ctgacctggg accaccaaaa taacaaggaa tttgggctag 189660
aaagcacaga tggacactgg tgacccatca caacttctct tgaaaaaccc caaacttgtc 189720
agctggggaa aagccacaca aagcccagct gcccaccttc acatccttat ccttgtagga 189780
gcataaaatg gtgtcatcac tgcccagttc taaccaagct tcagttaaag aatgggtacc 189840
ttcacatctt cactattttt caggggcctt accgtccttg accacccaag taaaatctaa 189900
atcagccttc ttttgggttc ttcagttcaa gcaaggcctc ttcttgtggc ctctcagtat 189960
taatatttat gaggttgcag attgaatttt tgggcctgag atacaagcca tcaatgaggt 190020
gtgacaaagc atgtcaatga ataataagaa aattatctat tcttccatat cctcccctgt 190080
aataagggtt gtcagaatgc cttctttctg ggctgggttg aggattcagt gagaacatat 190140
gtgacacagc tggtgggcta ttaagctctg gctttgctcc ctgttaaaat gccagaaccc 190200
ttgagaggga tcccacattg agccatgttt atcactgacc accttagaat ggatggattt 190260
ctcagatttt tcctgagatc aatgcttgat ggagaggaga ggagaacaat agattcttgg 190320
gatgtgtgtt atgcatgtgt ttaagtaaga gacagagagt atgtttattt gcaggttgtg 190380
tgtgtaaagt cagagcctgc ctccagagga tcttctctaa ccaccattgc ttaggtcctg 190440
ttcgtttgca tctacagcga atgaccttac agccatctga cttggcttca ctcaccactc 190500
agctcctgcc taaacagacg aggtggttag catccaccat aagttttcca aggagtagca 190560
aagcacaaag gacacctatt gggttgaaaa gagcctagag gcatgagtcc tgtgtgtgac 190620
ttgttcatag tcatgcagct agtgtatagc taggattctc ccctgctgat ttactatgtg 190680
acactaggca gcaatctgcc cttgctggac ctcggttttc taatctgtaa aatgtgtgga 190740
gtaaaactac atgagatggg aagtcccttc tagtgcagat gccatggtta ttgaaaactg 190800
cagcaacatc tttcttaatc gtaaggggaa agaaaaagac catttactac tcctagaaca 190860
gttttggagc tagaatattc acatttgcac tcaataatta tttacaaaac aactagtgtg 190920
gagagggtca aaacaacagc tgagtcctgt gtaatagata ttgtcaaccc cttgatggat 190980
gaggaagggg ctcaaaggga a 191001
<210> 2
<211> 10661
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1116)...(3878)
<400> 2
cgagatcccg gggagccagc ttgctgggag agcgggacgg tccggagcaa gcccagaggc 60
agaggaggcg acagagggaa aaagggccga gctagccgct ccagtgctgt acaggagccg 120
aagggacgca ccacgccagc cccagcccgg ctccagcgac agccaacgcc tcttgcagcg 180
cggcggcttc gaagccgccg cccggagctg ccctttcctc ttcggtgaag tttttaaaag 240
ctgctaaaga ctcggaggaa gcaaggaaag tgcctggtag gactgacggc tgcctttgtc 300
ctcctcctct ccaccccgcc tccccccacc ctgccttccc cccctccccc gtcttctctc 360
ccgcagctgc ctcagtcggc tactctcagc caacccccct caccaccctt ctccccaccc 420
gcccccccgc ccccgtcggc ccagcgctgc cagcccgagt ttgcagagag gtaactccct 480
ttggctgcga gcgggcgagc tagctgcaca ttgcaaagaa ggctcttagg agccaggcga 540
ctggggagcg gcttcagcac tgcagccacg acccgcctgg ttaggctgca cgcggagaga 600
accctctgtt ttcccccact ctctctccac ctcctcctgc cttccccacc ccgagtgcgg 660
agccagagat caaaagatga aaaggcagtc aggtcttcag tagccaaaaa acaaaacaaa 720
caaaaacaaa aaagccgaaa taaaagaaaa agataataac tcagttctta tttgcaccta 780
cttcagtgga cactgaattt ggaaggtgga ggattttgtt tttttctttt aagatctggg 840
catcttttga atctaccctt caagtattaa gagacagact gtgagcctag cagggcagat 900
cttgtccacc gtgtgtcttc ttctgcacga gactttgagg ctgtcagagc gctttttgcg 960
tggttgctcc cgcaagtttc cttctctgga gcttcccgca ggtgggcagc tagctgcagc 1020
gactaccgca tcatcacagc ctgttgaact cttctgagca agagaagggg aggcggggta 1080
agggaagtag gtggaagatt cagccaagct caagg atg gaa gtg cag tta ggg 1133
Met Glu Val Gln Leu Gly
1 5
ctg gga agg gtc tac cct cgg ccg ccg tcc aag acc tac cga gga gct 1181
Leu Gly Arg Val Tyr Pro Arg Pro Pro Ser Lys Thr Tyr Arg Gly Ala
10 15 20
ttc cag aat ctg ttc cag agc gtg cgc gaa gtg atc cag aac ccg ggc 1229
Phe Gln Asn Leu Phe Gln Ser Val Arg Glu Val Ile Gln Asn Pro Gly
25 30 35
ccc agg cac cca gag gcc gcg agc gca gca cct ccc ggc gcc agt ttg 1277
Pro Arg His Pro Glu Ala Ala Ser Ala Ala Pro Pro Gly Ala Ser Leu
40 45 50
ctg ctg ctg cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag 1325
Leu Leu Leu Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
55 60 65 70
cag cag cag cag cag cag cag cag cag caa gag act agc ccc agg cag 1373
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Glu Thr Ser Pro Arg Gln
75 80 85
cag cag cag cag cag ggt gag gat ggt tct ccc caa gcc cat cgt aga 1421
Gln Gln Gln Gln Gln Gly Glu Asp Gly Ser Pro Gln Ala His Arg Arg
90 95 100
ggc ccc aca ggc tac ctg gtc ctg gat gag gaa cag caa cct tca cag 1469
Gly Pro Thr Gly Tyr Leu Val Leu Asp Glu Glu Gln Gln Pro Ser Gln
105 110 115
ccg cag tcg gcc ctg gag tgc cac ccc gag aga ggt tgc gtc cca gag 1517
Pro Gln Ser Ala Leu Glu Cys His Pro Glu Arg Gly Cys Val Pro Glu
120 125 130
cct gga gcc gcc gtg gcc gcc agc aag ggg ctg ccg cag cag ctg cca 1565
Pro Gly Ala Ala Val Ala Ala Ser Lys Gly Leu Pro Gln Gln Leu Pro
135 140 145 150
gca cct ccg gac gag gat gac tca gct gcc cca tcc acg ttg tcc ctg 1613
Ala Pro Pro Asp Glu Asp Asp Ser Ala Ala Pro Ser Thr Leu Ser Leu
155 160 165
ctg ggc ccc act ttc ccc ggc tta agc agc tgc tcc gct gac ctt aaa 1661
Leu Gly Pro Thr Phe Pro Gly Leu Ser Ser Cys Ser Ala Asp Leu Lys
170 175 180
gac atc ctg agc gag gcc agc acc atg caa ctc ctt cag caa cag cag 1709
Asp Ile Leu Ser Glu Ala Ser Thr Met Gln Leu Leu Gln Gln Gln Gln
185 190 195
cag gaa gca gta tcc gaa ggc agc agc agc ggg aga gcg agg gag gcc 1757
Gln Glu Ala Val Ser Glu Gly Ser Ser Ser Gly Arg Ala Arg Glu Ala
200 205 210
tcg ggg gct ccc act tcc tcc aag gac aat tac tta ggg ggc act tcg 1805
Ser Gly Ala Pro Thr Ser Ser Lys Asp Asn Tyr Leu Gly Gly Thr Ser
215 220 225 230
acc att tct gac aac gcc aag gag ttg tgt aag gca gtg tcg gtg tcc 1853
Thr Ile Ser Asp Asn Ala Lys Glu Leu Cys Lys Ala Val Ser Val Ser
235 240 245
atg ggc ctg ggt gtg gag gcg ttg gag cat ctg agt cca ggg gaa cag 1901
Met Gly Leu Gly Val Glu Ala Leu Glu His Leu Ser Pro Gly Glu Gln
250 255 260
ctt cgg ggg gat tgc atg tac gcc cca ctt ttg gga gtt cca ccc gct 1949
Leu Arg Gly Asp Cys Met Tyr Ala Pro Leu Leu Gly Val Pro Pro Ala
265 270 275
gtg cgt ccc act cct tgt gcc cca ttg gcc gaa tgc aaa ggt tct ctg 1997
Val Arg Pro Thr Pro Cys Ala Pro Leu Ala Glu Cys Lys Gly Ser Leu
280 285 290
cta gac gac agc gca ggc aag agc act gaa gat act gct gag tat tcc 2045
Leu Asp Asp Ser Ala Gly Lys Ser Thr Glu Asp Thr Ala Glu Tyr Ser
295 300 305 310
cct ttc aag gga ggt tac acc aaa ggg cta gaa ggc gag agc cta ggc 2093
Pro Phe Lys Gly Gly Tyr Thr Lys Gly Leu Glu Gly Glu Ser Leu Gly
315 320 325
tgc tct ggc agc gct gca gca ggg agc tcc ggg aca ctt gaa ctg ccg 2141
Cys Ser Gly Ser Ala Ala Ala Gly Ser Ser Gly Thr Leu Glu Leu Pro
330 335 340
tct acc ctg tct ctc tac aag tcc gga gca ctg gac gag gca gct gcg 2189
Ser Thr Leu Ser Leu Tyr Lys Ser Gly Ala Leu Asp Glu Ala Ala Ala
345 350 355
tac cag agt cgc gac tac tac aac ttt cca ctg gct ctg gcc gga ccg 2237
Tyr Gln Ser Arg Asp Tyr Tyr Asn Phe Pro Leu Ala Leu Ala Gly Pro
360 365 370
ccg ccc cct ccg ccg cct ccc cat ccc cac gct cgc atc aag ctg gag 2285
Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Pro His Ala Arg Ile Lys Leu Glu
375 380 385 390
aac ccg ctg gac tac ggc agc gcc tgg gcg gct gcg gcg gcg cag tgc 2333
Asn Pro Leu Asp Tyr Gly Ser Ala Trp Ala Ala Ala Ala Ala Gln Cys
395 400 405
cgc tat ggg gac ctg gcg agc ctg cat ggc gcg ggt gca gcg gga ccc 2381
Arg Tyr Gly Asp Leu Ala Ser Leu His Gly Ala Gly Ala Ala Gly Pro
410 415 420
ggt tct ggg tca ccc tca gcc gcc gct tcc tca tcc tgg cac act ctc 2429
Gly Ser Gly Ser Pro Ser Ala Ala Ala Ser Ser Ser Trp His Thr Leu
425 430 435
ttc aca gcc gaa gaa ggc cag ttg tat gga ccg tgt ggt ggt ggt ggg 2477
Phe Thr Ala Glu Glu Gly Gln Leu Tyr Gly Pro Cys Gly Gly Gly Gly
440 445 450
ggt ggt ggc ggc ggc ggc ggc ggc ggc ggc ggc ggc ggc ggc ggc ggc 2525
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
455 460 465 470
ggc ggc ggc gag gcg gga gct gta gcc ccc tac ggc tac act cgg ccc 2573
Gly Gly Gly Glu Ala Gly Ala Val Ala Pro Tyr Gly Tyr Thr Arg Pro
475 480 485
cct cag ggg ctg gcg ggc cag gaa agc gac ttc acc gca cct gat gtg 2621
Pro Gln Gly Leu Ala Gly Gln Glu Ser Asp Phe Thr Ala Pro Asp Val
490 495 500
tgg tac cct ggc ggc atg gtg agc aga gtg ccc tat ccc agt ccc act 2669
Trp Tyr Pro Gly Gly Met Val Ser Arg Val Pro Tyr Pro Ser Pro Thr
505 510 515
tgt gtc aaa agc gaa atg ggc ccc tgg atg gat agc tac tcc gga cct 2717
Cys Val Lys Ser Glu Met Gly Pro Trp Met Asp Ser Tyr Ser Gly Pro
520 525 530
tac ggg gac atg cgt ttg gag act gcc agg gac cat gtt ttg ccc att 2765
Tyr Gly Asp Met Arg Leu Glu Thr Ala Arg Asp His Val Leu Pro Ile
535 540 545 550
gac tat tac ttt cca ccc cag aag acc tgc ctg atc tgt gga gat gaa 2813
Asp Tyr Tyr Phe Pro Pro Gln Lys Thr Cys Leu Ile Cys Gly Asp Glu
555 560 565
gct tct ggg tgt cac tat gga gct ctc aca tgt gga agc tgc aag gtc 2861
Ala Ser Gly Cys His Tyr Gly Ala Leu Thr Cys Gly Ser Cys Lys Val
570 575 580
ttc ttc aaa aga gcc gct gaa ggg aaa cag aag tac ctg tgc gcc agc 2909
Phe Phe Lys Arg Ala Ala Glu Gly Lys Gln Lys Tyr Leu Cys Ala Ser
585 590 595
aga aat gat tgc act att gat aaa ttc cga agg aaa aat tgt cca tct 2957
Arg Asn Asp Cys Thr Ile Asp Lys Phe Arg Arg Lys Asn Cys Pro Ser
600 605 610
tgt cgt ctt cgg aaa tgt tat gaa gca ggg atg act ctg gga gcc cgg 3005
Cys Arg Leu Arg Lys Cys Tyr Glu Ala Gly Met Thr Leu Gly Ala Arg
615 620 625 630
aag ctg aag aaa ctt ggt aat ctg aaa cta cag gag gaa gga gag gct 3053
Lys Leu Lys Lys Leu Gly Asn Leu Lys Leu Gln Glu Glu Gly Glu Ala
635 640 645
tcc agc acc acc agc ccc act gag gag aca acc cag aag ctg aca gtg 3101
Ser Ser Thr Thr Ser Pro Thr Glu Glu Thr Thr Gln Lys Leu Thr Val
650 655 660
tca cac att gaa ggc tat gaa tgt cag ccc atc ttt ctg aat gtc ctg 3149
Ser His Ile Glu Gly Tyr Glu Cys Gln Pro Ile Phe Leu Asn Val Leu
665 670 675
gaa gcc att gag cca ggt gta gtg tgt gct gga cac gac aac aac cag 3197
Glu Ala Ile Glu Pro Gly Val Val Cys Ala Gly His Asp Asn Asn Gln
680 685 690
ccc gac tcc ttt gca gcc ttg ctc tct agc ctc aat gaa ctg gga gag 3245
Pro Asp Ser Phe Ala Ala Leu Leu Ser Ser Leu Asn Glu Leu Gly Glu
695 700 705 710
aga cag ctt gta cac gtg gtc aag tgg gcc aag gcc ttg cct ggc ttc 3293
Arg Gln Leu Val His Val Val Lys Trp Ala Lys Ala Leu Pro Gly Phe
715 720 725
cgc aac tta cac gtg gac gac cag atg gct gtc att cag tac tcc tgg 3341
Arg Asn Leu His Val Asp Asp Gln Met Ala Val Ile Gln Tyr Ser Trp
730 735 740
atg ggg ctc atg gtg ttt gcc atg ggc tgg cga tcc ttc acc aat gtc 3389
Met Gly Leu Met Val Phe Ala Met Gly Trp Arg Ser Phe Thr Asn Val
745 750 755
aac tcc agg atg ctc tac ttc gcc cct gat ctg gtt ttc aat gag tac 3437
Asn Ser Arg Met Leu Tyr Phe Ala Pro Asp Leu Val Phe Asn Glu Tyr
760 765 770
cgc atg cac aag tcc cgg atg tac agc cag tgt gtc cga atg agg cac 3485
Arg Met His Lys Ser Arg Met Tyr Ser Gln Cys Val Arg Met Arg His
775 780 785 790
ctc tct caa gag ttt gga tgg ctc caa atc acc ccc cag gaa ttc ctg 3533
Leu Ser Gln Glu Phe Gly Trp Leu Gln Ile Thr Pro Gln Glu Phe Leu
795 800 805
tgc atg aaa gca ctg cta ctc ttc agc att att cca gtg gat ggg ctg 3581
Cys Met Lys Ala Leu Leu Leu Phe Ser Ile Ile Pro Val Asp Gly Leu
810 815 820
aaa aat caa aaa ttc ttt gat gaa ctt cga atg aac tac atc aag gaa 3629
Lys Asn Gln Lys Phe Phe Asp Glu Leu Arg Met Asn Tyr Ile Lys Glu
825 830 835
ctc gat cgt atc att gca tgc aaa aga aaa aat ccc aca tcc tgc tca 3677
Leu Asp Arg Ile Ile Ala Cys Lys Arg Lys Asn Pro Thr Ser Cys Ser
840 845 850
aga cgc ttc tac cag ctc acc aag ctc ctg gac tcc gtg cag cct att 3725
Arg Arg Phe Tyr Gln Leu Thr Lys Leu Leu Asp Ser Val Gln Pro Ile
855 860 865 870
gcg aga gag ctg cat cag ttc act ttt gac ctg cta atc aag tca cac 3773
Ala Arg Glu Leu His Gln Phe Thr Phe Asp Leu Leu Ile Lys Ser His
875 880 885
atg gtg agc gtg gac ttt ccg gaa atg atg gca gag atc atc tct gtg 3821
Met Val Ser Val Asp Phe Pro Glu Met Met Ala Glu Ile Ile Ser Val
890 895 900
caa gtg ccc aag atc ctt tct ggg aaa gtc aag ccc atc tat ttc cac 3869
Gln Val Pro Lys Ile Leu Ser Gly Lys Val Lys Pro Ile Tyr Phe His
905 910 915
acc cag tga agcattggaa accctatttc cccaccccag ctcatgcccc 3918
Thr Gln
920
ctttcagatg tcttctgcct gttataactc tgcactactc ctctgcagtg ccttggggaa 3978
tttcctctat tgatgtacag tctgtcatga acatgttcct gaattctatt tgctgggctt 4038
tttttttctc tttctctcct ttctttttct tcttccctcc ctatctaacc ctcccatggc 4098
accttcagac tttgcttccc attgtggctc ctatctgtgt tttgaatggt gttgtatgcc 4158
tttaaatctg tgatgatcct catatggccc agtgtcaagt tgtgcttgtt tacagcacta 4218
ctctgtgcca gccacacaaa cgtttactta tcttatgcca cgggaagttt agagagctaa 4278
gattatctgg ggaaatcaaa acaaaaacaa gcaaacaaaa aaaaaaagca aaaacaaaac 4338
aaaaaataag ccaaaaaacc ttgctagtgt tttttcctca aaaataaata aataaataaa 4398
taaatacgta catacataca cacatacata caaacatata gaaatcccca aagaggccaa 4458
tagtgacgag aaggtgaaaa ttgcaggccc atggggagtt actgattttt tcatctcctc 4518
cctccacggg agactttatt ttctgccaat ggctattgcc attagagggc agagtgaccc 4578
cagagctgag ttgggcaggg gggtggacag agaggagagg acaaggaggg caatggagca 4638
tcagtacctg cccacagcct tggtccctgg gggctagact gctcaactgt ggagcaattc 4698
attatactga aaatgtgctt gttgttgaaa atttgtctgc atgttaatgc ctcaccccca 4758
aacccttttc tctctcactc tctgcctcca acttcagatt gactttcaat agtttttcta 4818
agacctttga actgaatgtt ctcttcagcc aaaacttggc gacttccaca gaaaagtctg 4878
accactgaga agaaggagag cagagattta accctttgta aggccccatt tggatccagg 4938
tctgctttct catgtgtgag tcagggagga gctggagcca gaggagaaga aaatgatagc 4998
ttggctgttc tcctgcttag gacactgact gaatagttaa actctcactg ccactacctt 5058
ttccccacct ttaaaagacc tgaatgaagt tttctgccaa actccgtgaa gccacaagca 5118
ccttatgtcc tcccttcagt gttttgtggg cctgaatttc atcacactgc atttcagcca 5178
tggtcatcaa gcctgtttgc ttcttttggg catgttcaca gattctctgt taagagcccc 5238
caccaccaag aaggttagca ggccaacagc tctgacatct atctgtagat gccagtagtc 5298
acaaagattt cttaccaact ctcagatcgc tggagccctt agacaaactg gaaagaaggc 5358
atcaaaggga tcaggcaagc tgggcgtctt gcccttgtcc cccagagatg ataccctccc 5418
agcaagtgga gaagttctca cttccttctt tagagcagct aaaggggcta cccagatcag 5478
ggttgaagag aaaactcaat taccagggtg ggaagaatga aggcactaga accagaaacc 5538
ctgcaaatgc tcttcttgtc acccagcata tccacctgca gaagtcatga gaagagagaa 5598
ggaacaaaga ggagactctg actactgaat taaaatcttc agcggcaaag cctaaagcca 5658
gatggacacc atctggtgag tttactcatc atcctcctct gctgctgatt ctgggctctg 5718
acattgccca tactcactca gattccccac ctttgttgct gcctcttagt cagagggagg 5778
ccaaaccatt gagactttct acagaaccat ggcttctttc ggaaaggtct ggttggtgtg 5838
gctccaatac tttgccaccc atgaactcag ggtgtgccct gggacactgg ttttatatag 5898
tcttttggca cacctgtgtt ctgttgactt cgttcttcaa gcccaagtgc aagggaaaat 5958
gtccacctac tttctcatct tggcctctgc ctccttactt agctcttaat ctcatctgtt 6018
gaactcaaga aatcaagggc cagtcatcaa gctgcccatt ttaattgatt cactctgttt 6078
gttgagagga tagtttctga gtgacatgat atgatccaca agggtttcct tccctgattt 6138
ctgcattgat attaatagcc aaacgaactt caaaacagct ttaaataaca agggagaggg 6198
gaacctaaga tgagtaatat gccaatccaa gactgctgga gaaaactaaa gctgacaggt 6258
tccctttttg gggtgggata gacatgttct ggttttcttt attattacac aatctggctc 6318
atgtacagga tcacttttag ctgttttaaa cagaaaaaaa tatccaccac tcttttcagt 6378
tacactaggt tacattttaa taggtccttt acatctgttt tggaatgatt ttcatctttt 6438
gtgatacaca gattgaatta tatcattttc atatctctcc ttgtaaatac tagaagctct 6498
cctttacatt tctctatcaa atttttcatc tttatgggtt tcccaattgt gactcttgtc 6558
ttcatgaata tatgtttttc atttgcaaaa gccaaaaatc agtgaaacag cagtgtaatt 6618
aaaagcaaca actggattac tccaaatttc caaatgacaa aactagggaa aaatagccta 6678
cacaagcctt taggcctact ctttctgtgc ttgggtttga gtgaacaaag gagattttag 6738
cttggctctg ttctcccatg gatgaaagga ggaggatttt ttttttcttt tggccattga 6798
tgttctagcc aatgtaattg acagaagtct cattttgcat gcgctctgct ctacaaacag 6858
agttggtatg gttggtatac tgtactcacc tgtgagggac tggccactca gacccactta 6918
gctggtgagc tagaagatga ggatcactca ctggaaaagt cacaaggacc atctccaaac 6978
aagttggcag tgctcgatgt ggacgaagag tgaggaagag aaaaagaagg agcaccaggg 7038
agaaggctcc gtctgtgctg ggcagcagac agctgccagg atcacgaact ctgtagtcaa 7098
agaaaagagt cgtgtggcag tttcagctct cgttcattgg gcagctcgcc taggcccagc 7158
ctctgagctg acatgggagt tgttggattc tttgtttcat agctttttct atgccatagg 7218
caatattgtt gttcttggaa agtttattat ttttttaact cccttactct gagaaaggga 7278
tattttgaag gactgtcata tatctttgaa aaaagaaaat ctgtaataca tatattttta 7338
tgtatgttca ctggcactaa aaaatataga gagcttcatt ctgtcctttg ggtagttgct 7398
gaggtaattg tccaggttga aaaataatgt gctgatgcta gagtccctct ctgtccatac 7458
tctacttcta aatacatata ggcatacata gcaagtttta tttgacttgt actttaagag 7518
aaaatatgtc caccatccac atgatgcaca aatgagctaa cattgagctt caagtagctt 7578
ctaagtgttt gtttcattag gcacagcaca gatgtggcct ttcccccctt ctctcccttg 7638
atatctggca gggcataaag gcccaggcca cttcctctgc cccttcccag ccctgcacca 7698
aagctgcatt tcaggagact ctctccagac agcccagtaa ctacccgagc atggcccctg 7758
catagccctg gaaaaataag aggctgactg tctacgaatt atcttgtgcc agttgcccag 7818
gtgagagggc actgggccaa gggagtggtt ttcatgtttg acccactaca aggggtcatg 7878
ggaatcagga atgccaaagc accagatcaa atccaaaact taaagtcaaa ataagccatt 7938
cagcatgttc agtttcttgg aaaaggaagt ttctacccct gatgcctttg taggcagatc 7998
tgttctcacc attaatcttt ttgaaaatct tttaaagcag tttttaaaaa gagagatgaa 8058
agcatcacat tatataacca aagattacat tgtacctgct aagataccaa aattcataag 8118
ggcagggggg gagcaagcat tagtgcctct ttgataagct gtccaaagac agactaaagg 8178
actctgctgg tgactgactt ataagagctt tgtgggtttt tttttcccta ataatataca 8238
tgtttagaag aattgaaaat aatttcggga aaatgggatt atgggtcctt cactaagtga 8298
ttttataagc agaactggct ttccttttct ctagtagttg ctgagcaaat tgttgaagct 8358
ccatcattgc atggttggaa atggagctgt tcttagccac tgtgtttgct agtgcccatg 8418
ttagcttatc tgaagatgtg aaacccttgc tgataaggga gcatttaaag tactagattt 8478
tgcactagag ggacagcagg cagaaatcct tatttctgcc cactttggat ggcacaaaaa 8538
gttatctgca gttgaaggca gaaagttgaa atacattgta aatgaatatt tgtatccatg 8598
tttcaaaatt gaaatatata tatatatata tatatatata tatatatata tatagtgtgt 8658
gtgtgtgttc tgatagcttt aactttctct gcatctttat atttggttcc agatcacacc 8718
tgatgccatg tacttgtgag agaggatgca gttttgtttt ggaagctctc tcagaacaaa 8778
caagacacct ggattgatca gttaactaaa agttttctcc cctattgggt ttgacccaca 8838
ggtcctgtga aggagcagag ggataaaaag agtagaggac atgatacatt gtactttact 8898
agttcaagac agatgaatgt ggaaagcata aaaactcaat ggaactgact gagatttacc 8958
acagggaagg cccaaacttg gggccaaaag cctacccaag tgattgacca gtggccccct 9018
aatgggacct gagctgttgg aagaagagaa ctgttccttg gtcttcacca tccttgtgag 9078
agaagggcag tttcctgcat tggaacctgg agcaagcgct ctatctttca cacaaattcc 9138
ctcacctgag attgaggtgc tcttgttact gggtgtctgt gtgctgtaat tctggttttg 9198
gatatgttct gtaaagattt tgacaaatga aaatgtgttt ttctctgtta aaacttgtca 9258
gagtactaga agttgtatct ctgtaggtgc aggtccattt ctgcccacag gtagggtgtt 9318
tttctttgat taagagattg acacttctgt tgcctaggac ctcccaactc aaccatttct 9378
aggtgaaggc agaaaaatcc acattagtta ctcctcttca gacatttcag ctgagataac 9438
aaatcttttg gaattttttc acccatagaa agagtggtag atatttgaat ttagcaggtg 9498
gagtttcata gtaaaaacag cttttgactc agctttgatt tatcctcatt tgatttggcc 9558
agaaagtagg taatatgcat tgattggctt ctgattccaa ttcagtatag caaggtgcta 9618
ggttttttcc tttccccacc tgtctcttag cctggggaat taaatgagaa gccttagaat 9678
gggtggccct tgtgacctga aacacttccc acataagcta cttaacaaga ttgtcatgga 9738
gctgcagatt ccattgccca ccaaagacta gaacacacac atatccatac accaaaggaa 9798
agacaattct gaaatgctgt ttctctggtg gttccctctc tggctgctgc ctcacagtat 9858
gggaacctgt actctgcaga ggtgacaggc cagatttgca ttatctcaca accttagccc 9918
ttggtgctaa ctgtcctaca gtgaagtgcc tggggggttg tcctatccca taagccactt 9978
ggatgctgac agcagccacc atcagaatga cccacgcaaa aaaaagaaaa aaaaaattaa 10038
aaagtcccct cacaacccag tgacaccttt ctgctttcct ctagactgga acattgatta 10098
gggagtgcct cagacatgac attcttgtgc tgtccttgga attaatctgg cagcaggagg 10158
gagcagacta tgtaaacaga gataaaaatt aattttcaat attgaaggaa aaaagaaata 10218
agaagagaga gagaaagaaa gcatcacaca aagattttct taaaagaaac aattttgctt 10278
gaaatctctt tagatggggc tcatttctca cggtggcact tggcctccac tgggcagcag 10338
gaccagctcc aagcgctagt gttctgttct ctttttgtaa tcttggaatc ttttgttgct 10398
ctaaatacaa ttaaaaatgg cagaaacttg tttgttggac tacatgtgtg actttgggtc 10458
tgtctctgcc tctgctttca gaaatgtcat ccattgtgta aaatattggc ttactggtct 10518
gccagctaaa acttggccac atcccctgtt atggctgcag gatcgagtta ttgttaacaa 10578
agagacccaa gaaaagctgc taatgtcctc ttatcattgt tgttaatttg ttaaaacata 10638
aagaaatcta aaatttcaaa aaa 10661
<210> 3
<211> 8112
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (163)...(1329)
<400> 3
gctgcgagca gagagggatt cctcggaggt catctgttcc atcttcttgc ctatgcaaat 60
gcctgcctga agctgctgga ggctggcttt gtaccggact ttgtacaggg aaccagggaa 120
acgaatgcag agtgctcctg acattgcctg tcactttttc cc atg ata ctc tgg 174
Met Ile Leu Trp
1
ctt cac agt ttg gag act gcc agg gac cat gtt ttg ccc att gac tat 222
Leu His Ser Leu Glu Thr Ala Arg Asp His Val Leu Pro Ile Asp Tyr
5 10 15 20
tac ttt cca ccc cag aag acc tgc ctg atc tgt gga gat gaa gct tct 270
Tyr Phe Pro Pro Gln Lys Thr Cys Leu Ile Cys Gly Asp Glu Ala Ser
25 30 35
ggg tgt cac tat gga gct ctc aca tgt gga agc tgc aag gtc ttc ttc 318
Gly Cys His Tyr Gly Ala Leu Thr Cys Gly Ser Cys Lys Val Phe Phe
40 45 50
aaa aga gcc gct gaa ggg aaa cag aag tac ctg tgc gcc agc aga aat 366
Lys Arg Ala Ala Glu Gly Lys Gln Lys Tyr Leu Cys Ala Ser Arg Asn
55 60 65
gat tgc act att gat aaa ttc cga agg aaa aat tgt cca tct tgt cgt 414
Asp Cys Thr Ile Asp Lys Phe Arg Arg Lys Asn Cys Pro Ser Cys Arg
70 75 80
ctt cgg aaa tgt tat gaa gca ggg atg act ctg gga gcc cgg aag ctg 462
Leu Arg Lys Cys Tyr Glu Ala Gly Met Thr Leu Gly Ala Arg Lys Leu
85 90 95 100
aag aaa ctt ggt aat ctg aaa cta cag gag gaa gga gag gct tcc agc 510
Lys Lys Leu Gly Asn Leu Lys Leu Gln Glu Glu Gly Glu Ala Ser Ser
105 110 115
acc acc agc ccc act gag gag aca acc cag aag ctg aca gtg tca cac 558
Thr Thr Ser Pro Thr Glu Glu Thr Thr Gln Lys Leu Thr Val Ser His
120 125 130
att gaa ggc tat gaa tgt cag ccc atc ttt ctg aat gtc ctg gaa gcc 606
Ile Glu Gly Tyr Glu Cys Gln Pro Ile Phe Leu Asn Val Leu Glu Ala
135 140 145
att gag cca ggt gta gtg tgt gct gga cac gac aac aac cag ccc gac 654
Ile Glu Pro Gly Val Val Cys Ala Gly His Asp Asn Asn Gln Pro Asp
150 155 160
tcc ttt gca gcc ttg ctc tct agc ctc aat gaa ctg gga gag aga cag 702
Ser Phe Ala Ala Leu Leu Ser Ser Leu Asn Glu Leu Gly Glu Arg Gln
165 170 175 180
ctt gta cac gtg gtc aag tgg gcc aag gcc ttg cct ggc ttc cgc aac 750
Leu Val His Val Val Lys Trp Ala Lys Ala Leu Pro Gly Phe Arg Asn
185 190 195
tta cac gtg gac gac cag atg gct gtc att cag tac tcc tgg atg ggg 798
Leu His Val Asp Asp Gln Met Ala Val Ile Gln Tyr Ser Trp Met Gly
200 205 210
ctc atg gtg ttt gcc atg ggc tgg cga tcc ttc acc aat gtc aac tcc 846
Leu Met Val Phe Ala Met Gly Trp Arg Ser Phe Thr Asn Val Asn Ser
215 220 225
agg atg ctc tac ttc gcc cct gat ctg gtt ttc aat gag tac cgc atg 894
Arg Met Leu Tyr Phe Ala Pro Asp Leu Val Phe Asn Glu Tyr Arg Met
230 235 240
cac aag tcc cgg atg tac agc cag tgt gtc cga atg agg cac ctc tct 942
His Lys Ser Arg Met Tyr Ser Gln Cys Val Arg Met Arg His Leu Ser
245 250 255 260
caa gag ttt gga tgg ctc caa atc acc ccc cag gaa ttc ctg tgc atg 990
Gln Glu Phe Gly Trp Leu Gln Ile Thr Pro Gln Glu Phe Leu Cys Met
265 270 275
aaa gca ctg cta ctc ttc agc att att cca gtg gat ggg ctg aaa aat 1038
Lys Ala Leu Leu Leu Phe Ser Ile Ile Pro Val Asp Gly Leu Lys Asn
280 285 290
caa aaa ttc ttt gat gaa ctt cga atg aac tac atc aag gaa ctc gat 1086
Gln Lys Phe Phe Asp Glu Leu Arg Met Asn Tyr Ile Lys Glu Leu Asp
295 300 305
cgt atc att gca tgc aaa aga aaa aat ccc aca tcc tgc tca aga cgc 1134
Arg Ile Ile Ala Cys Lys Arg Lys Asn Pro Thr Ser Cys Ser Arg Arg
310 315 320
ttc tac cag ctc acc aag ctc ctg gac tcc gtg cag cct att gcg aga 1182
Phe Tyr Gln Leu Thr Lys Leu Leu Asp Ser Val Gln Pro Ile Ala Arg
325 330 335 340
gag ctg cat cag ttc act ttt gac ctg cta atc aag tca cac atg gtg 1230
Glu Leu His Gln Phe Thr Phe Asp Leu Leu Ile Lys Ser His Met Val
345 350 355
agc gtg gac ttt ccg gaa atg atg gca gag atc atc tct gtg caa gtg 1278
Ser Val Asp Phe Pro Glu Met Met Ala Glu Ile Ile Ser Val Gln Val
360 365 370
ccc aag atc ctt tct ggg aaa gtc aag ccc atc tat ttc cac acc cag 1326
Pro Lys Ile Leu Ser Gly Lys Val Lys Pro Ile Tyr Phe His Thr Gln
375 380 385
tga agcattggaa accctatttc cccaccccag ctcatgcccc ctttcagatg 1379
tcttctgcct gttataactc tgcactactc ctctgcagtg ccttggggaa tttcctctat 1439
tgatgtacag tctgtcatga acatgttcct gaattctatt tgctgggctt tttttttctc 1499
tttctctcct ttctttttct tcttccctcc ctatctaacc ctcccatggc accttcagac 1559
tttgcttccc attgtggctc ctatctgtgt tttgaatggt gttgtatgcc tttaaatctg 1619
tgatgatcct catatggccc agtgtcaagt tgtgcttgtt tacagcacta ctctgtgcca 1679
gccacacaaa cgtttactta tcttatgcca cgggaagttt agagagctaa gattatctgg 1739
ggaaatcaaa acaaaaacaa gcaaacaaaa aaaaaaagca aaaacaaaac aaaaaataag 1799
ccaaaaaacc ttgctagtgt tttttcctca aaaataaata aataaataaa taaatacgta 1859
catacataca cacatacata caaacatata gaaatcccca aagaggccaa tagtgacgag 1919
aaggtgaaaa ttgcaggccc atggggagtt actgattttt tcatctcctc cctccacggg 1979
agactttatt ttctgccaat ggctattgcc attagagggc agagtgaccc cagagctgag 2039
ttgggcaggg gggtggacag agaggagagg acaaggaggg caatggagca tcagtacctg 2099
cccacagcct tggtccctgg gggctagact gctcaactgt ggagcaattc attatactga 2159
aaatgtgctt gttgttgaaa atttgtctgc atgttaatgc ctcaccccca aacccttttc 2219
tctctcactc tctgcctcca acttcagatt gactttcaat agtttttcta agacctttga 2279
actgaatgtt ctcttcagcc aaaacttggc gacttccaca gaaaagtctg accactgaga 2339
agaaggagag cagagattta accctttgta aggccccatt tggatccagg tctgctttct 2399
catgtgtgag tcagggagga gctggagcca gaggagaaga aaatgatagc ttggctgttc 2459
tcctgcttag gacactgact gaatagttaa actctcactg ccactacctt ttccccacct 2519
ttaaaagacc tgaatgaagt tttctgccaa actccgtgaa gccacaagca ccttatgtcc 2579
tcccttcagt gttttgtggg cctgaatttc atcacactgc atttcagcca tggtcatcaa 2639
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aaggttagca ggccaacagc tctgacatct atctgtagat gccagtagtc acaaagattt 2759
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tcaggcaagc tgggcgtctt gcccttgtcc cccagagatg ataccctccc agcaagtgga 2879
gaagttctca cttccttctt tagagcagct aaaggggcta cccagatcag ggttgaagag 2939
aaaactcaat taccagggtg ggaagaatga aggcactaga accagaaacc ctgcaaatgc 2999
tcttcttgtc acccagcata tccacctgca gaagtcatga gaagagagaa ggaacaaaga 3059
ggagactctg actactgaat taaaatcttc agcggcaaag cctaaagcca gatggacacc 3119
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gagactttct acagaaccat ggcttctttc ggaaaggtct ggttggtgtg gctccaatac 3299
tttgccaccc atgaactcag ggtgtgccct gggacactgg ttttatatag tcttttggca 3359
cacctgtgtt ctgttgactt cgttcttcaa gcccaagtgc aagggaaaat gtccacctac 3419
tttctcatct tggcctctgc ctccttactt agctcttaat ctcatctgtt gaactcaaga 3479
aatcaagggc cagtcatcaa gctgcccatt ttaattgatt cactctgttt gttgagagga 3539
tagtttctga gtgacatgat atgatccaca agggtttcct tccctgattt ctgcattgat 3599
attaatagcc aaacgaactt caaaacagct ttaaataaca agggagaggg gaacctaaga 3659
tgagtaatat gccaatccaa gactgctgga gaaaactaaa gctgacaggt tccctttttg 3719
gggtgggata gacatgttct ggttttcttt attattacac aatctggctc atgtacagga 3779
tcacttttag ctgttttaaa cagaaaaaaa tatccaccac tcttttcagt tacactaggt 3839
tacattttaa taggtccttt acatctgttt tggaatgatt ttcatctttt gtgatacaca 3899
gattgaatta tatcattttc atatctctcc ttgtaaatac tagaagctct cctttacatt 3959
tctctatcaa atttttcatc tttatgggtt tcccaattgt gactcttgtc ttcatgaata 4019
tatgtttttc atttgcaaaa gccaaaaatc agtgaaacag cagtgtaatt aaaagcaaca 4079
actggattac tccaaatttc caaatgacaa aactagggaa aaatagccta cacaagcctt 4139
taggcctact ctttctgtgc ttgggtttga gtgaacaaag gagattttag cttggctctg 4199
ttctcccatg gatgaaagga ggaggatttt ttttttcttt tggccattga tgttctagcc 4259
aatgtaattg acagaagtct cattttgcat gcgctctgct ctacaaacag agttggtatg 4319
gttggtatac tgtactcacc tgtgagggac tggccactca gacccactta gctggtgagc 4379
tagaagatga ggatcactca ctggaaaagt cacaaggacc atctccaaac aagttggcag 4439
tgctcgatgt ggacgaagag tgaggaagag aaaaagaagg agcaccaggg agaaggctcc 4499
gtctgtgctg ggcagcagac agctgccagg atcacgaact ctgtagtcaa agaaaagagt 4559
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acatgggagt tgttggattc tttgtttcat agctttttct atgccatagg caatattgtt 4679
gttcttggaa agtttattat ttttttaact cccttactct gagaaaggga tattttgaag 4739
gactgtcata tatctttgaa aaaagaaaat ctgtaataca tatattttta tgtatgttca 4799
ctggcactaa aaaatataga gagcttcatt ctgtcctttg ggtagttgct gaggtaattg 4859
tccaggttga aaaataatgt gctgatgcta gagtccctct ctgtccatac tctacttcta 4919
aatacatata ggcatacata gcaagtttta tttgacttgt actttaagag aaaatatgtc 4979
caccatccac atgatgcaca aatgagctaa cattgagctt caagtagctt ctaagtgttt 5039
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atgccaaagc accagatcaa atccaaaact taaagtcaaa ataagccatt cagcatgttc 5399
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attaatcttt ttgaaaatct tttaaagcag tttttaaaaa gagagatgaa agcatcacat 5519
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gagcaagcat tagtgcctct ttgataagct gtccaaagac agactaaagg actctgctgg 5639
tgactgactt ataagagctt tgtgggtttt tttttcccta ataatataca tgtttagaag 5699
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tgaagatgtg aaacccttgc tgataaggga gcatttaaag tactagattt tgcactagag 5939
ggacagcagg cagaaatcct tatttctgcc cactttggat ggcacaaaaa gttatctgca 5999
gttgaaggca gaaagttgaa atacattgta aatgaatatt tgtatccatg tttcaaaatt 6059
gaaatatata tatatatata tatatatata tatatatata tatagtgtgt gtgtgtgttc 6119
tgatagcttt aactttctct gcatctttat atttggttcc agatcacacc tgatgccatg 6179
tacttgtgag agaggatgca gttttgtttt ggaagctctc tcagaacaaa caagacacct 6239
ggattgatca gttaactaaa agttttctcc cctattgggt ttgacccaca ggtcctgtga 6299
aggagcagag ggataaaaag agtagaggac atgatacatt gtactttact agttcaagac 6359
agatgaatgt ggaaagcata aaaactcaat ggaactgact gagatttacc acagggaagg 6419
cccaaacttg gggccaaaag cctacccaag tgattgacca gtggccccct aatgggacct 6479
gagctgttgg aagaagagaa ctgttccttg gtcttcacca tccttgtgag agaagggcag 6539
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tgtgacctga aacacttccc acataagcta cttaacaaga ttgtcatgga gctgcagatt 7199
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actctgcaga ggtgacaggc cagatttgca ttatctcaca accttagccc ttggtgctaa 7379
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tgtaaacaga gataaaaatt aattttcaat attgaaggaa aaaagaaata agaagagaga 7679
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tagatggggc tcatttctca cggtggcact tggcctccac tgggcagcag gaccagctcc 7799
aagcgctagt gttctgttct ctttttgtaa tcttggaatc ttttgttgct ctaaatacaa 7859
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<211> 3641
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (328)...(2265)
<400> 4
gacactgaat ttggaaggtg gaggattttg tttttttctt ttaagatctg ggcatctttt 60
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cccgcaagtt tccttctctg gagcttcccg caggtgggca gctagctgca gcgactaccg 240
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aggtggaaga ttcagccaag ctcaagg atg gaa gtg cag tta ggg ctg gga agg 354
Met Glu Val Gln Leu Gly Leu Gly Arg
1 5
gtc tac cct cgg ccg ccg tcc aag acc tac cga gga gct ttc cag aat 402
Val Tyr Pro Arg Pro Pro Ser Lys Thr Tyr Arg Gly Ala Phe Gln Asn
10 15 20 25
ctg ttc cag agc gtg cgc gaa gtg atc cag aac ccg ggc ccc agg cac 450
Leu Phe Gln Ser Val Arg Glu Val Ile Gln Asn Pro Gly Pro Arg His
30 35 40
cca gag gcc gcg agc gca gca cct ccc ggc gcc agt ttg ctg ctg cag 498
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cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag 546
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
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cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag caa gag act agc ccc 594
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Glu Thr Ser Pro
75 80 85
agg cag cag cag cag cag cag ggt gag gat ggt tct ccc caa gcc cat 642
Arg Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gly Glu Asp Gly Ser Pro Gln Ala His
90 95 100 105
cgt aga ggc ccc aca ggc tac ctg gtc ctg gat gag gaa cag caa cct 690
Arg Arg Gly Pro Thr Gly Tyr Leu Val Leu Asp Glu Glu Gln Gln Pro
110 115 120
tca cag ccg cag tcg gcc ctg gag tgc cac ccc gag aga ggt tgc gtc 738
Ser Gln Pro Gln Ser Ala Leu Glu Cys His Pro Glu Arg Gly Cys Val
125 130 135
cca gag cct gga gcc gcc gtg gcc gcc agc aag ggg ctg ccg cag cag 786
Pro Glu Pro Gly Ala Ala Val Ala Ala Ser Lys Gly Leu Pro Gln Gln
140 145 150
ctg cca gca cct ccg gac gag gat gac tca gct gcc cca tcc acg ttg 834
Leu Pro Ala Pro Pro Asp Glu Asp Asp Ser Ala Ala Pro Ser Thr Leu
155 160 165
tcc ctg ctg ggc ccc act ttc ccc ggc tta agc agc tgc tcc gct gac 882
Ser Leu Leu Gly Pro Thr Phe Pro Gly Leu Ser Ser Cys Ser Ala Asp
170 175 180 185
ctt aaa gac atc ctg agc gag gcc agc acc atg caa ctc ctt cag caa 930
Leu Lys Asp Ile Leu Ser Glu Ala Ser Thr Met Gln Leu Leu Gln Gln
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cag cag cag gaa gca gta tcc gaa ggc agc agc agc ggg aga gcg agg 978
Gln Gln Gln Glu Ala Val Ser Glu Gly Ser Ser Ser Gly Arg Ala Arg
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gag gcc tcg ggg gct ccc act tcc tcc aag gac aat tac tta ggg ggc 1026
Glu Ala Ser Gly Ala Pro Thr Ser Ser Lys Asp Asn Tyr Leu Gly Gly
220 225 230
act tcg acc att tct gac aac gcc aag gag ttg tgt aag gca gtg tcg 1074
Thr Ser Thr Ile Ser Asp Asn Ala Lys Glu Leu Cys Lys Ala Val Ser
235 240 245
gtg tcc atg ggc ctg ggt gtg gag gcg ttg gag cat ctg agt cca ggg 1122
Val Ser Met Gly Leu Gly Val Glu Ala Leu Glu His Leu Ser Pro Gly
250 255 260 265
gaa cag ctt cgg ggg gat tgc atg tac gcc cca ctt ttg gga gtt cca 1170
Glu Gln Leu Arg Gly Asp Cys Met Tyr Ala Pro Leu Leu Gly Val Pro
270 275 280
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Pro Ala Val Arg Pro Thr Pro Cys Ala Pro Leu Ala Glu Cys Lys Gly
285 290 295
tct ctg cta gac gac agc gca ggc aag agc act gaa gat act gct gag 1266
Ser Leu Leu Asp Asp Ser Ala Gly Lys Ser Thr Glu Asp Thr Ala Glu
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tat tcc cct ttc aag gga ggt tac acc aaa ggg cta gaa ggc gag agc 1314
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Leu Gly Cys Ser Gly Ser Ala Ala Ala Gly Ser Ser Gly Thr Leu Glu
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gtgtattagg caattcgtat ttccccctta ggttctagcc ttctggatcc cagccagtga 2815
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ctg gcg ggc cag gaa agc gac ttc acc gca cct gat gtg tgg tac cct 1842
Leu Ala Gly Gln Glu Ser Asp Phe Thr Ala Pro Asp Val Trp Tyr Pro
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ggc ggc atg gtg agc aga gtg ccc tat ccc agt ccc act tgt gtc aaa 1890
Gly Gly Met Val Ser Arg Val Pro Tyr Pro Ser Pro Thr Cys Val Lys
510 515 520
agc gaa atg ggc ccc tgg atg gat agc tac tcc gga cct tac ggg gac 1938
Ser Glu Met Gly Pro Trp Met Asp Ser Tyr Ser Gly Pro Tyr Gly Asp
525 530 535
atg cgt ttg gag act gcc agg gac cat gtt ttg ccc att gac tat tac 1986
Met Arg Leu Glu Thr Ala Arg Asp His Val Leu Pro Ile Asp Tyr Tyr
540 545 550
ttt cca ccc cag aag acc tgc ctg atc tgt gga gat gaa gct tct ggg 2034
Phe Pro Pro Gln Lys Thr Cys Leu Ile Cys Gly Asp Glu Ala Ser Gly
555 560 565
tgt cac tat gga gct ctc aca tgt gga agc tgc aag gtc ttc ttc aaa 2082
Cys His Tyr Gly Ala Leu Thr Cys Gly Ser Cys Lys Val Phe Phe Lys
570 575 580 585
aga gcc gct gaa ggg aaa cag aag tac ctg tgc gcc agc aga aat gat 2130
Arg Ala Ala Glu Gly Lys Gln Lys Tyr Leu Cys Ala Ser Arg Asn Asp
590 595 600
tgc act att gat aaa ttc cga agg aaa aat tgt cca tct tgt cgt ctt 2178
Cys Thr Ile Asp Lys Phe Arg Arg Lys Asn Cys Pro Ser Cys Arg Leu
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cgg aaa tgt tat gaa gca ggg att ctg gga gca gct gtt gtt gtt tct 2226
Arg Lys Cys Tyr Glu Ala Gly Ile Leu Gly Ala Ala Val Val Val Ser
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Glu Arg Ile Leu Arg Val Phe Gly Val Ser Glu Trp Leu Pro
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1 5
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cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag 546
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
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cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag caa gag act agc ccc 594
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Glu Thr Ser Pro
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Arg Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gly Glu Asp Gly Ser Pro Gln Ala His
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cgt aga ggc ccc aca ggc tac ctg gtc ctg gat gag gaa cag caa cct 690
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Ser Tyr Arg Glu Thr Asn Leu Lys Ala Val Ser Trp Pro Leu Asn His
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Thr
gacagtcaag aatttcagag ccagctggca tgcagtggac ctcatgccag cccattttat 2486
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taatgtggct tggcattggc aaagtgcttt ttgattgttc ttgatcacat atgatggggg 2879
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gtcactgagc tgaaggtagt agctgatcca cagaagttca gtaaacaagg accagatttc 3179
tgcttctcca ggagaagaag ccagccaacc cctctcttca aacacactga gagactacag 3239
tccgactttc cctcttacat ctagccttac tgtagccaca ctccttgatt gctctctcac 3299
atcacatgct tctcttcatc agttgtaagc ctctcattct tctcccaagc cagactcaaa 3359
tattgtattg atgtcaaaga agaatcactt agagtttgga atatcttgtt ctctctctgc 3419
tccatagctt ccatattgac accagtttct ttctagtgga gaagtggagt ctgtgaagcc 3479
agggaaacac acatgtgaga gtcagaagga ctctccctga cttgcctggg gcctgtcttt 3539
cccaccttct ccagtctgtc taaacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca 3599
cacacacgct ctctctctct ctcccccccc aacacacaca cactctctct ctcacacaca 3659
cacacataca cacacacttc tttctctttc ccctgactca gcaacattct ggagaaaagc 3719
caaggaagga cttcaggagg ggagtttccc ccttctcagg gcagaatttt aatctccaga 3779
ccaacaagaa gttccctaat gtggattgaa aggctaatga ggtttatttt taactacttt 3839
ctatttgttt gaatgttgca tatttctact agtgaaattt tcccttaata aagccattaa 3899
tacacccaaa aaaaaaaaaa aaa 3922
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 9
tccttcacca atgtcaactc c 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 10
gagccatcca aactcttgag a 21
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 11
agtaccgcat gcacaagtcc cg 22
<210> 12
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 12
gcgctctgac agcctc 16
<210> 13
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 13
cacctgcggg aagctc 16
<210> 14
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 14
ggctgtgatg atgcgg 16
<210> 15
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 15
cttcgcgcac gctctg 16
<210> 16
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 16
atggtgctgg cctcgc 16
<210> 17
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 17
ggtcgaagtg ccccct 16
<210> 18
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 18
gacaccgaca ctgcct 16
<210> 19
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 19
cccgaagctg ttcccc 16
<210> 20
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 20
cttgcctgcg ctgtcg 16
<210> 21
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 21
gttgtagtag tcgcga 16
<210> 22
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 22
aagttgtagt agtcgc 16
<210> 23
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 23
gcgctgccgt agtcca 16
<210> 24
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 24
aggatgagga agcggc 16
<210> 25
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 25
gctcccgcct cgccgc 16
<210> 26
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 26
cgctttcctg gcccgc 16
<210> 27
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 27
gccgccaggg taccac 16
<210> 28
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 28
ccaaacgcat gtcccc 16
<210> 29
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 29
agcttcatct ccacag 16
<210> 30
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 30
tcccttcagc ggctct 16
<210> 31
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 31
tttctgctgg cgcaca 16
<210> 32
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 32
gttcattcga agttca 16
<210> 33
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 33
gaggatcatc acagat 16
<210> 34
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 34
ctaaacttcc cgtggc 16
<210> 35
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 35
ttgatttaat ggttgc 16
<210> 36
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 36
gttgatttaa tggttg 16
<210> 37
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 37
atggttgatt taatgg 16
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 38
tggttgattt aatggttgca 20
<210> 39
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 39
tgatttaatg gttgca 16
<210> 40
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 40
ggttgattta atggtt 16
<210> 41
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 41
tggttgattt aatggt 16
<210> 42
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 42
agttgtagta gtcgcg 16
<210> 43
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 43
gatttaatgg ttgcaa 16
<210> 44
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 44
acagcactgg agcggc 16
<210> 45
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 45
aacttcaccg aagagg 16
<210> 46
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 46
agtctttagc agcttt 16
<210> 47
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 47
gcttcctccg agtctt 16
<210> 48
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 48
ccttgcttcc tccgag 16
<210> 49
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 49
gcactttcct tgcttc 16
<210> 50
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 50
tcagtcctac caggca 16
<210> 51
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 51
gactgaggca gctgcg 16
<210> 52
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 52
ccgactgagg cagctg 16
<210> 53
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 53
gctagctcgc ccgctc 16
<210> 54
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 54
cagctagctc gcccgc 16
<210> 55
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 55
gcaatgtgca gctagc 16
<210> 56
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 56
gtcgcctggc tcctaa 16
<210> 57
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 57
ctggctccgc actcgg 16
<210> 58
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 58
atctctggct ccgcac 16
<210> 59
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 59
tgatctctgg ctccgc 16
<210> 60
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 60
agtgtccact gaagta 16
<210> 61
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 61
aggctcacag tctgtc 16
<210> 62
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 62
gacacacggt ggacaa 16
<210> 63
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 63
agaagacaca cggtgg 16
<210> 64
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 64
cgctctgaca gcctca 16
<210> 65
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 65
gtcgctgcag ctagct 16
<210> 66
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 66
ggtagtcgct gcagct 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 67
gcggtagtcg ctgcag 16
<210> 68
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 68
atgcggtagt cgctgc 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 69
gtgatgatgc ggtagt 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 70
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<210> 71
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 71
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<210> 72
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 72
gcttggctga atcttc 16
<210> 73
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 73
ccttgagctt ggctga 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 74
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 75
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<210> 76
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 76
gtaggtcttg gacggc 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 77
gattctggaa agctcc 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 78
gctctggaac agattc 16
<210> 79
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 79
cgcgcacgct ctggaa 16
<210> 80
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 80
tcacttcgcg cacgct 16
<210> 81
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 81
tggatcactt cgcgca 16
<210> 82
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 82
gttctggatc acttcg 16
<210> 83
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 83
cgctcgcggc ctctgg 16
<210> 84
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 84
tgcgctcgcg gcctct 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 85
gctgcgctcg cggcct 16
<210> 86
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 86
aggtgctgcg ctcgcg 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 87
gctgttcctc atccag 16
<210> 88
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 88
tgctgcggca gcccct 16
<210> 89
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 89
ggtgctggcc tcgctc 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 90
tgcatggtgc tggcct 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 91
gttgcatggt gctggc 16
<210> 92
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 92
tgctgttgct gaagga 16
<210> 93
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 93
ggatactgct tcctgc 16
<210> 94
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 94
tcggatactg cttcct 16
<210> 95
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 95
tgccttcgga tactgc 16
<210> 96
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 96
ctcgctctcc cgctgc 16
<210> 97
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 97
tgtccttgga ggaagt 16
<210> 98
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 98
tggtcgaagt gccccc 16
<210> 99
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 99
cagaaatggt cgaagt 16
<210> 100
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 100
tgttcccctg gactca 16
<210> 101
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 101
agctgttccc ctggac 16
<210> 102
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 102
gaagctgttc ccctgg 16
<210> 103
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 103
ccgaagctgt tcccct 16
<210> 104
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 104
gtacatgcaa tccccc 16
<210> 105
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 105
acagcgggtg gaactc 16
<210> 106
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 106
ggacgcacag cgggtg 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 107
gtgggacgca cagcgg 16
<210> 108
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 108
tgcattcggc caatgg 16
<210> 109
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 109
cctttgcatt cggcca 16
<210> 110
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 110
aacctttgca ttcggc 16
<210> 111
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 111
gctcttgcct gcgctg 16
<210> 112
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 112
cagtgctctt gcctgc 16
<210> 113
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 113
ttcagtgctc ttgcct 16
<210> 114
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 114
tcttcagtgc tcttgc 16
<210> 115
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 115
actcagcagt atcttc 16
<210> 116
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 116
atactcagca gtatct 16
<210> 117
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 117
tttggtgtaa cctccc 16
<210> 118
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 118
cctttggtgt aacctc 16
<210> 119
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 119
ctaggctctc gccttc 16
<210> 120
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 120
cagcctaggc tctcgc 16
<210> 121
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 121
agcagcctag gctctc 16
<210> 122
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 122
ctgccagagc agccta 16
<210> 123
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 123
tcgcgactct ggtacg 16
<210> 124
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 124
agtcgcgact ctggta 16
<210> 125
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 125
gtagtcgcga ctctgg 16
<210> 126
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 126
tagtagtcgc gactct 16
<210> 127
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 127
tctccagctt gatgcg 16
<210> 128
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 128
cagcgggttc tccagc 16
<210> 129
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 129
ccttcttcgg ctgtga 16
<210> 130
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 130
ggtccataca actggc 16
<210> 131
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 131
acacatcagg tgcggt 16
<210> 132
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 132
cgccagggta ccacac 16
<210> 133
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 133
catgccgcca gggtac 16
<210> 134
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 134
accatgccgc cagggt 16
<210> 135
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 135
ctgctcacca tgccgc 16
<210> 136
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 136
acacaagtgg gactgg 16
<210> 137
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 137
cccttcagcg gctctt 16
<210> 138
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 138
cagagtcatc cctgct 16
<210> 139
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 139
caccctcaag attctt 16
<210> 140
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 140
aaggtagtct ttaagg 16
<210> 141
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 141
gttttcaaat gcagcc 16
<210> 142
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 142
gccatgagac agcttt 16
<210> 143
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 143
attcttgact gtctga 16
<210> 144
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 144
gcatgccagc tggctc 16
<210> 145
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 145
cgcgcaggta ggagcc 16
<210> 146
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 146
tctaaacatg acggtt 16
<210> 147
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 147
atgcaattgc ctgcca 16
<210> 148
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 148
atgggagtaa cttttg 16
<210> 149
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 149
catattattg tgctgc 16
<210> 150
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 150
gtcaatatca aagcac 16
<210> 151
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 151
gagttgtgat ttcagg 16
<210> 152
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 152
ttgatggaat gctgat 16
<210> 153
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 153
ggttaacttt ctctga 16
<210> 154
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 154
tggattgtaa attacg 16
<210> 155
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 155
gaacattatt aggcta 16
<210> 156
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 156
tcaatctaga taccat 16
<210> 157
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 157
cacatcagaa ggagta 16
<210> 158
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 158
gagtgttaat gaagac 16
<210> 159
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 159
ctgattagct atgacc 16
<210> 160
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 160
atgagtcctc agaatc 16
<210> 161
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 161
gtagattcta gctttg 16
<210> 162
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 162
acaggctctg actagg 16
<210> 163
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 163
tgtgtgaccc ttggac 16
<210> 164
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 164
aagtatgagc atggtt 16
<210> 165
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 165
ggattctcta cacaca 16
<210> 166
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 166
ccatttgtgc caaacc 16
<210> 167
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 167
aggttaggga gtaggc 16
<210> 168
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 168
tagggtttgg tcagaa 16
<210> 169
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 169
ccttatggat gctgct 16
<210> 170
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 170
gttatcttac tctccc 16
<210> 171
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 171
gattgtgtat agctgc 16
<210> 172
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 172
ggttatggtt ctgtct 16
<210> 173
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 173
cttcattgca ggtctg 16
<210> 174
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 174
tagccaactt tcttta 16
<210> 175
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 175
cattgtacta tgccag 16
<210> 176
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 176
tttggtaaca ttaggc 16
<210> 177
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 177
atggttgtcc tgtaca 16
<210> 178
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 178
accaagtttc ttcagc 16
<210> 179
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 179
tcttatgttt ccgaaccgtt 20
<210> 180
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 180
gcccctggat ggatagctac t 21
<210> 181
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 181
ccacagatca ggcaggtctt c 21
<210> 182
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 182
actgccaggg accatgtttt gccc 24
<210> 183
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 183
cttgcgcccc aggagtct 18
<210> 184
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 184
ctcagagtaa gctctagcac acatgtc 27
<210> 185
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 185
agtgtgtgag cctccatctc ctgtccaa 28
<210> 186
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 186
gccaaggagg gagggtctt 19
<210> 187
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 187
ccccccatag tgaatcagct t 21
<210> 188
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 188
atgaagtaag gagagggact ggaccccc 28
<210> 189
<211> 174000
<212> DNA
<213> Macaca mulatta
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(174000)
<223> n = A,T,C or G
<400> 189
aagttgtggt gggattaaat gttgcaatga gtattcaaat aaggttgaag tatctatgca 60
ttctacttac atatggttga ggtatattca aggaagcctg tagccattaa aatctcaggg 120
aacaattttt cacctcctca ggtgaaaggg tcttcaggcc tttgtgttct ggaaggttca 180
tttatagcca tttcccaaat aacattgaga cggatgagtc tagagtctag ctcaaatggc 240
aatgggctgg aagactagtt tagtttttac taatgtggaa catagaacaa aattatgtcc 300
ttgtttcagc ctgctcatct gtgaagtaga gcctatcata tccagtctcc cttgccttta 360
ggtttgagtt accttctttg gtcaaggtaa gtaaatgcct atgatgtttt gctgtgcaca 420
agataaagct acaacaaagc tacaacctgt cttttctctg tagaagacgg caaaaagcaa 480
aagagaccca ggcaaaaatc tcggaatgac ttttgaaaca gacagcctcc ctagaatcag 540
aagtcaaagg aatttaaaac atagggaggc ccagggtctc tactgacata aaagaaagct 600
gttttcgtta taggtttact tttacatttt ctctctcttt ccattcccac ctgcctctcc 660
acctttacac agggcttatg ggacctcctc cacaaaagag cagttgcaat aacccacatc 720
atcctccacg cctggctgtc catcaagagg cgaaaagcag ccctatatag gttctatcct 780
tggatagttc cggttggaaa gtttaaaata tgcaaaggca acttggaaaa gcaagcggct 840
gcatacaaca caaacctttg caaagctctg cacaaaattg agggcctatg cgtacatggc 900
aagtgttttt agtgtttgcg tgtttacctg cttgtctggg tggttttgcc tttgcaagtc 960
tggatgagaa atgcatggtt aaaggcaatt ccagacagga agaaaggcag agaagagggt 1020
agaaatgacc tctgattctt ggggctgagg gttcctagag caaatggcac aatgccagga 1080
ggcccgatct atccctatga cggaatctaa ggtttcagct agtatctgct ggcttggtca 1140
tggcttgctc ctcagtttgt aggagactct cccgtctgca cgctcttatc agtcctgaaa 1200
agaacccctg gcagccatta ggagcaggta ctcctatcgt ccttttcctc cctcctcctc 1260
tacaccccgt tggtttttta gattgggctt tggaaccaaa tttggtgagt gctggcctcc 1320
aggaaatctg gatctctggc gcttaaagct tggtttagca aagcaggagc tattcaggaa 1380
gcaggggtcc tccagggcta cagctagcct ctcctgccct cgcccacgct gcgccagcac 1440
ttgtttctcc aaagccacta ggcaggcgtt agcgcgcgat gaggggaggg gagaaaaaga 1500
aaggggaggg gagggaaaag gaggtgggaa ggcaaggagg ccggcccggc gggggcggga 1560
cccgactcgc aaactgttgc atttgctctc cacctcccag cgccccctcc gagatcccgg 1620
ggagccagct tgctgggaga gcgggacggt ccggagcaag cccagaggca gaggaggcga 1680
cagagggaaa aacggccgag ctagccgctc cagtgctgta caggagccga agggacgcac 1740
cacgacagcc ccagcccggc tccagcgaca gccaacgcct tttgcagcgc ggcgacttcg 1800
aagccgccgc cccggagctg ccctttcctc ttcggtgaag tttttaaaag ctgctaaaga 1860
ctcggaggaa gcaaggaaag tgcctggtag gactgacggc tgcctttgtc ctcctcctct 1920
ccaccccgcc tccccccacc ctgctccccc ccccgccccg cgtcttctct cccgcagctg 1980
cctcagtcgg ctactctccg ccaacccccc ttactgcccc tctccccacc ctccctcccc 2040
cgtcggccca gcgctgccag cccgagtttg cagagaggta actccctttg gctgcgagcg 2100
ggcgagctag ctgcacattg caaagaaggc tcttaggagc caggcgactg gggagcggct 2160
tcagcactgc agccacgacc tgcctggtta ggctgcacgc ggagagaacc ctccgtttcc 2220
ccccactctc tctctacttc ctcctgcttt ccccaccccg agtgcggagc cagagatcaa 2280
aagatgaaaa gacagtcagg gcttcagtag ccaaaaaata aaacaaacaa aaacaaaaca 2340
aaacaaaaaa acgaaataaa agaaaaagat aataactcag ttcttatttg cacctacttc 2400
agtggacact gaatttggaa ggtggaggat tttgtttttt cttttaagat tcgggcatct 2460
tttgaatcta cccttcaagt gttaagagac agactgtgag cctagcaggg cagatcttgt 2520
ccaccgtgtg tcttcttctg caggagactt tgaggctgtc agagcgcttt ttgcgtggtt 2580
gctcccgcaa gtttccttct ctggagcttc ccgcaggtgg gcagctagct gcagcgacta 2640
ccgcatcatc acagcctgtt gaactcttct gagcaagaga aggggaggcg gggtaaggga 2700
agtaggtgga agattcagcc aagctcaagg atggaggtgc agttagggct ggggagggtc 2760
taccctcggc cgccgtccaa gacctaccga ggagctttcc agaatctgtt ccagagcgtg 2820
cgcgaagtga tccagaaccc gggccccagg cacccagagg ccgcgagcgc agcacctccc 2880
ggcgccagtt tgcagcagca gcagcagcag cagcaagaaa ctagcccccg gcaacagcag 2940
cagcagcagc agggtgagga tggttctccc caagcccatc gtagaggccc cacaggctac 3000
ctggtcctgg atgaggaaca gcagccttca cagcctcagt cagccccgga gtgccacccc 3060
gagagaggtt gcgtcccaga gcctggagcc gccgtggccg ccggcaaggg gctgccgcag 3120
cagctgccag cacctccgga cgaggatgac tcagctgccc catccacgtt gtctctgctg 3180
ggccccactt tccccggctt aagcagctgc tccgccgacc ttaaagacat cctgagcgag 3240
gccagcacca tgcaactcct tcagcaacag cagcaggaag cagtatccga aggcagcagc 3300
agcgggagag cgagggaggc ctcgggggct cccacttcct ccaaggacaa ttacttaggg 3360
ggcacttcga ccatttctga cagcgccaag gagctgtgta aggcagtgtc ggtgtccatg 3420
ggcttgggtg tggaggcgtt ggagcatctg agtccagggg aacagcttcg gggggattgc 3480
atgtacgccc cagttttggg agttccaccc gctgtgcgtc ccactccgtg tgccccattg 3540
gccgaatgca aaggttctct gctagacgac agcgcaggca agagcactga agatactgct 3600
gagtattccc ctttcaaggg aggttacacc aaagggctag aaggcgagag cctaggctgc 3660
tctggcagcg ctgcagcagg gagctccggg acacttgaac tgccgtccac cctgtctctc 3720
tacaagtccg gagcactgga cgaggcagct gcgtaccaga gtcgcgacta ctacaacttt 3780
ccactggctc tggccgggcc gccgccccct ccaccgcctc cccatcccca cgctcgcatc 3840
aagctggaga acccgctgga ctatggcagc gcctgggcgg ctgcggcggc gcagtgccgc 3900
tatggggacc tggcgagcct gcatggcgcg ggtgcagcgg gacccggctc tgggtcaccc 3960
tcagcggccg cttcctcatc ctggcacact ctcttcacag ccgaagaagg ccagttgtat 4020
ggaccgtgtg gtggtggggg cggcggcggt ggcggcggcg gcggcggcgc aggcgaggcg 4080
ggagctgtag ccccctacgg ctacactcgg ccacctcagg ggctggcggg ccaggaaggc 4140
gacttcaccg cacctgatgt gtggtaccct ggcggcatgg tgagcagagt gccctatccc 4200
agtcccactt gtgtcaaaag cgagatgggc ccctggatgg atagctactc cggaccttac 4260
ggggacatgc ggtaagtttc tccttccaga aatgtcgcct ttcggcccag ggcacagagt 4320
cgctctgcat tctggggtgt ctagtggctc ctacctgcgc gaacactcag actgcccctg 4380
ggagagctca gcagggtaaa cctagagctc tccccgtgga ctcccggcct gccagaggtt 4440
taacctgagc tctcctaatt tctgctgcgt gtcctgggtg ctgattcctg ccctcccaga 4500
ttcttcaact cccccaacgg ccccaaattc tcgctacctc ctggtacccg agtcccaaac 4560
ttaaatccta ttgtacgggc caccttcaga gacaaagctc ataagccctc cactcttcct 4620
tttctcctgt cctcgaagtc tgagaacctc aatcagaaat ttgggcaatt tcttctcttc 4680
gggtctgtta ggacttccct ttcagcctgt gcagattaga gtcaaaaaga ctggcccaag 4740
agcttctcag cggatctcct ccaaagaggt aaaatgaaat tctcggttag ggaaagaaag 4800
tggtctctgg gtgctgaggt ctgctatgtg aaggagtgaa cttctttccc ggaagcaact 4860
ggggacttgc tccagggctg gaggtcagta gagataatct gaaccgtcat gtttagagta 4920
ggcagagggg caactttctt ggtaaagact ccacaggatt tgcattcaca gtttctcaac 4980
gttggttgac tatgttgaaa gtagttgctt gggtcggttt tctcttataa agtgtttatt 5040
ttctctgtgg attttaacag atccacaacc ccctacttca ggtttgcatc agatctataa 5100
agaggagaat attcttttaa tgtacaattt aattaggctt cagtctgact tacaaaagtg 5160
ttggaaaaca tatttttgtg aaacatttcc tgctatttca gtgtgcccca aaatctccac 5220
tggggaggga ggagtgaggt ttttcttatt atattccttc atttttagga catgttggca 5280
ttttagaata catgctgtta gctctaacaa attgagtaag aactcttagt gacctatgag 5340
ccataatctt accccagagt tttaattagc atatgagaaa agtggcaggc aattgcatcg 5400
tgcttattaa aaattattcc tcaccgcaat tgttgagctt cttggagacc atgctgaaga 5460
ttttctcccc cagcaaatta agatattagt ttatctagtg agggaggaca tactgaattg 5520
gggaattcac tcctcaggta gaccaggtgc tgatgtccct gtggacttat gtcttattct 5580
ttgtttctat ggctgttttc ttttatctgt gacttctccg aaatttcttt gttagcctta 5640
acatcttcgt ttggggactt aaatccagca atttgccttc tttcactgat gctttccttg 5700
ttacaaggta gagatagcac gctattagtg aagaaagaaa gaggagggta ggatttcata 5760
ttattttgtg ggctgttgaa gaaacagctt cttaccaggc tttacattcc attaggtttt 5820
taatgtttgg cttacaagat tttgaaaggg ttcatttgat atcgtcaaag tattttccag 5880
ttaatttaga ctctttattt ttgtaatggg tttatcctat gggacaaaaa aagtattctt 5940
cattttataa gaataaattt tcttggcagg gttaattttt tttctaagcc tgtcactaga 6000
cggtggagcc cttcttctac tgtaaacttt tcttgtggga aaatgtctaa ggtgcatttt 6060
gacctgccat gatactaaac ccagactctg gaaccttcca tcttctgcat gcctccccca 6120
caacttactt acttagcagg gaaaaaactg atggttccac atatttctta aaaaatgtgt 6180
gccttcaaag gcaaaaccaa aatttttagg gaataactat agagagcaaa agttactccc 6240
atcaggtaga caatgagctt ggtgatttta tttcaggtct taatgaaaaa agcttcttta 6300
tgaggaagat tatcatatct tggtgcctcc ttgacagtct gcttaaatta atgacataaa 6360
ctaatgagaa tttagcagtt cctgcagaaa gtacaagatt tttttttctg gtttttgatt 6420
gctgcactga ttatgaggag tctagttaaa aggaaaactg gtgttcctgt ctcgtaagtt 6480
gacgaagact ttccatttct aggatagaga aaatccttaa gtcagtttat tgaaaattaa 6540
tcaatttaat cagaatgcaa tcaattccaa tccaaaagtt gatattttct tactttctct 6600
ttttttcccc tcactttgta ggggtgcaat ttggtgaaag gcaagagatt tcttaagcca 6660
aatcaagagt gtcttccctt tctgtattgc atgcattatg tgccattttt tagctaaaaa 6720
tctcaaaatt gtgcaggctt ccagtgacct gttgggttcc tctcttttcc attcatgtgt 6780
gtgtttatgc acattagtta attttgtgaa gggatttttt taaaccttag taacatctgc 6840
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gtggtctctt ttacttaatt tagcatgtga tttaaacaga aggaaaaata aaaagtgatg 6960
ggacttgtgt gcaaccctga tgatattttg tggagttgtc tgtcttctct ctgagatcaa 7020
acaggactac aactttgtta attgaccact ggctcccttg gcagaggtag ggcttcttag 7080
attccagcag gcagcacaat aatatgacaa aaatttattc ttgggagttg ggttctaaga 7140
gagtctgcat gccagaatta gagtttgggg tttagagaaa ttatccagat gcaaaaagaa 7200
cattttaatt tttctcttgg taatttgttc tggtctccat agtaggtagt actttagcag 7260
tgctttgata ttgacaagtc ttgttccctt tttctattag attttacaaa ataaggcatt 7320
ttattaattc ctctttcctt ctcctctctc ctctcagtta ccaagcattt ttatgactat 7380
cttacaaggg acagtttgtc ttgtaaagca gaattttcct ttgaaaccaa gacagactat 7440
ttctccccat aggcttcaag aaccaatatt ttggcaagaa gcatcttttc cttgtggtca 7500
gcaaataggt agtgagttct gtctggattc caacaatcaa cacctgagga ccaaatagcc 7560
acactgggtg gcaccccatc tggaagtata cacaggatgt agccctcttt cttgtccaca 7620
gctcaagtca gccaaagatt aacactggtg agagatattt tcgaagaagt ttgcaggctt 7680
ccaattgcag ggtcgttttg gggtgctttc ttgcctgtgc taattttatc tcatcaggct 7740
tccattcttt gagctgtaaa ctttgaaata atatattaga ttcgctggta cgtttaattt 7800
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taaaacaaaa aattctttgg tctcctttcg cgtacatgca ctgtggcttg tacgtgtgca 7920
agccacttgg tgggattatg tgaattgggg ttagaaatgt ggacaatttt attatgatta 7980
tttttaatgg tgatatcaag atcaccagtt tcattcagaa ccttgcataa gcagggagca 8040
gaatgtggac tgggtgtggc aaagcaaggg cttattttat agccaaacct gaaatcacaa 8100
ctctgaaata taaaaaaaaa agcaaacaaa aaaatcaagt tttgtgagct tggtcagaga 8160
aggaaaagaa aatctctccc caccccccac ctccaccatt ttctctttgt ctgcagcttc 8220
ctcaagtgct gcctgtcccc gattttcttt tattccactc ctttcatgtt tttgacattg 8280
aaatacagac tcttctttcc acttctcagg gcatttttct cattacacct gtggcatgct 8340
cctaaataat ttcttaaaaa aaaaaaatct gtaaagtagc cgattagatc aaccccagca 8400
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taccttgagg ttaaagcctg gttcaacagt tgctgaggga gttaactaga tggcttgagg 8520
acttggcaat ttcataaagt attttgtctt atgctgtcgc tgtctctgtc tctgtcttga 8580
tctctgtctc tctctgtgta ctgtaatgtt ggccaccttc tctcagaacc tgagagagag 8640
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acataaaaat taatcatatg aaaacaaaga aagatattaa agaaattatt ctacctccga 8820
cttctcatat cagcattcca tcaagttctg ggatgttaaa ttcagagaaa gttaacctca 8880
tcttaaacac aaagttgact tttaaacaaa attgcttata aagttccgta cagttaccag 8940
cattggttgc cctttgtcat acggaagaga attatgaaat ctcatattta catagcattc 9000
ttaaaaaaaa aaaaaagaca cagtgttttc cagtttattc actgcattca tgttagtttg 9060
agtaggccag gaggggtgct tagtgattac ccttttgcta ggtaaagaag tagaaagata 9120
gattttctat gatgtttgtt taccatgtag gggaatctct ttagagcaac actcccaggc 9180
tttttcttct tgaaatttcc cacctgacaa atactttaga ttgttactcc taaggacttc 9240
tctcagtagc tgctacatag agacgatagt ctatgaatta ttgcttgcac actcatgggt 9300
gatgccacac gctctctctc ctggcagttc ttgctgccaa cctgcaggcc acaccaggac 9360
tgaaggcagc tcatctagat aagtttatag cattaaagtg ctgggtcact tgagaatgtt 9420
gtcaatttag gttacttagt acctaagtgt tattttttaa ataatagctt tattgagacg 9480
taatttacaa tccatacaat tcactcttct aaagtgtaca gttccatgct tttcagtata 9540
ttcagagttg tgcaaccatt attgcaatca attttagaac attttaatca cccccaaagg 9600
aaacgctatg cacctttttg ttcaatgcct tatgttccct cagtccttag caaccaataa 9660
tctacttcta tctatggatg tgcttattct aatattttgt atgaatgaaa tcatgtaata 9720
tgtggtcttt tgtgactagc ttctttcaca cagaatatgt tttcaaggtc atccatgctg 9780
aagcacgtat cagtacttcg ctatttttta tagcctaata atgttccact gtatgactat 9840
acaacatttt atctatccgt ttatcaggag atgagcatta gggttgtttc caccttttga 9900
ctattatgaa taatactgct gtgaacattc atgtacaagt ttattgtgga catattcagt 9960
ccacatattg tggacatttt caattctttt ggatacatac ataggattga aatctctgag 10020
tcatatggta cctctatgtt tatcctttga agaactgtca aactgttttc gaaagtgtct 10080
gcactgtttt acaatcccat cagcaacgta tgaggggtcc atttcttcca catccttgca 10140
aacacttgta attctctttt ttattacagc tatattagtg ggtgtgaagt ggtacctcat 10200
tgtggttttt atttctattt ccctaataac gaataatgtt cagtatctat tcatgttctt 10260
attggccatt tgtatatctt cttttttgag aaatatctat ttggattctt tgcccatttt 10320
ttagttgggt tttttattat tgagttttaa gagttttaaa aaatatattc tggatgcatg 10380
tcctttaata gattgtgatt tgtggatatt ttttcacatt ctgtgggttg tcttttttac 10440
tttccttttt tttctttttg tgttcttaat ggtatctaga ttgaagcaca aaaaaagttt 10500
ttaagtttga tgaagtccaa ttcatctgtt tttttttttc tgttttggcg tatgattttg 10560
gcatcatatc taagaaggct ttgcctaatc caagattaca aagatttaca catatgtttc 10620
cttctaagag ttttatagtt ttcgctgttt acacttaggt ctttcatcag ttttgatgta 10680
atgtttatat atgattgagg taggggtccg acttcattct tttacacata gatactcatt 10740
tcttacaata ttcttgttga atttttcctc acttaactgt cttggcaccc tttgtgtaaa 10800
atcagttgac tgtaaatgtg agggtttatt tgtggactct caactgtatt cagttgatct 10860
atatgtttat tcctatgcca gtaccacatt atcttgatta ttgtaggttt ttagtgagtt 10920
ttgaaattag gaattttgtg ctctttgact ttggtcttgt ttttcaaggt tgttttggct 10980
cttgtgggtc ccttgagttt tcatatgaat tgggataagt ttgtcaattt ctacaaagaa 11040
gtcagctggg attctcacag gaactatatt acatctgtaa atcaatttgg ggagcattgc 11100
catctcaaca acgttaagtt ttttcatcca taaatatgag atgtcttccc atttatttag 11160
atcttccttt tgtcaacaat tttttattgt tttcagatga taagttttgc agttcttttt 11220
aaaatttagt cttaagtgat ttattttttg atactattat aaattgaact gttttgttga 11280
ttttcttttc agattattca ctgccaatgt atgaaaacat aattgttttg tgtattgatc 11340
ttgcatcctg caaccttgct gaaaatacct gagttttgaa tacttctggg acttatgggg 11400
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tttttataag cagctaaaat cataattttg tgtttttatc tcttgtcctt tggacagagt 11820
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tctatgtaga gattgaactt tgtcttcatt aacactctag gctaaaggtc atagctaatc 12000
agctacaact gtcatgtcct gataattgtg agttaactgc aggccaccca gcaaaaggtt 12060
tagttataat ctgatagctg tctgtagaga ttaccctaat aaagggaatt ttttaaaaaa 12120
gaatctggca ggggatagta gctcactcct gtaatcccag cactttggga ggccgaggtg 12180
ggcggatcat ctgaggtcag gagttcaaga ccagcctggc caacatggtg aaaccccatg 12240
tctactaaaa atacaaaaat tatccaggcg ttttggtggg cacccataat cccagctact 12300
tgggaggctg aggcaggagg atcacttgag cctaggaggc agatgttgca gcgagccgag 12360
atcatgccac tgcactccag gatccgtcaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 12420
aaaagactct atcaatcaac cacttttcat taagcacctg ctatgtgtcc agcatgtact 12480
aggaagagat aagataaaag gggacacaat tcagacagaa tcttcttgag gtaattgctt 12540
acaaggagct tatagccact gaaaacaaaa acaaacaaaa acaaataacc aaaacccaaa 12600
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atctttttaa atgtagatat ttaaaaaaaa aaaaaaagag agagagagag agagaaatga 12720
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agtaagtagg agcatgtcta aactcaagca atagattaaa gatcctgatg tatattttaa 12840
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ggaggcggag cttgcagtga gccgagatcg cgccactgca ctccagcctg ggcgacacag 13380
cgagactccg tctcaaaaaa aaaaaaaaaa gagttgtttt tctgccttct aagtttccat 13440
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tataagagct ttgctgtaat agacaacgta acattctgaa acggcctacc acctaacatg 13560
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ttccattatt gcatttcatt cttgtttcta ccctgtacaa gtaactagag tttggagtat 13980
tataatagta ttcatactat tacaatactt ttattcccat tataaaaatt atgctaagag 14040
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tagcagcgaa cagaacacac aaaaatatct gaatggagct gacagtttaa tgagaggaga 14460
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ggtagagtgc ctgaggcacc gagatggaaa gggacttggc taagctcata cagcaagcta 15960
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gtctatattg gaaaaatgaa aattctttgt tccatactga gaacaaagaa ttatatataa 16080
tcatatataa taataatgat agcacttact gaatgtttgc tgtgtaaact tccgcacctt 16140
gcatgaactg attcatttaa ttctcatgtc aactttagga agcaggccta gagacgttaa 16200
ataacttgtc caagggtcac acagctagga agtagcagaa cttgtgtgca ctcccaggaa 16260
gtctggcttc taaccacaag gttctaacta ctgtgcaata tcagcagctt ctcagattac 16320
tcttcacctt caccatccca aaagactggc gacataggtg acttcattat gcactgcccc 16380
tattatagtc cactgatcct caccaaatag ctgggtggcc tagaggttaa agtaggggca 16440
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tagaatctag gtgattcagc tccacaactt atgttatttt ccaatacatt tatggaacga 16860
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acaagattgg acagagaatt gggggagtga gcagagtcca tttccttcca gagactggac 17220
aaaaggaaca aaatgttggg aaaaaagtca gcatgtggat tttgtgggat ttacactaaa 17280
taagaacgga cacttgccag gactgacaag atgctacctc aatccctcta ggccccaatg 17340
tgttatgcag gatcccataa gaagtcatga atgtagttgt cagataatct ttttgttact 17400
gtggaaatgg aagcaggata ctgcaaaaat ctgtctctcc aggttttctt ttaaagaagg 17460
tacagtcttg ctaaatgata actgtttgga catttatttg aaaatgggca gtgcaggaga 17520
gaaagaattt ttccaagctt gtcacattgg gccatctctc tgaagcattg tccaacctct 17580
aattagatga ggagactgca ttaaccaaga gttgagagta aagatggaaa cacttgatgt 17640
ttggtgtttg ggtgcagaaa ggattccaaa acatgttctg agtttcttta ctctgcccat 17700
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atttaaatca catttgaatt ttggcaatta acaaggcagt aattggcatc aggaaggtat 26400
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ctcgtaagat tattacagta ataaccattt attaagcact gtgtcagcaa tggtgtggga 87960
ccacaacttc actgaatcct cattgcaatc ttgtggggtc tgtatttctt tgcctgtttt 88020
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acccgcctcc ccaactttac atgctgcttc ctatgttaga ggacttggct taggcatctg 142860
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tttcatatta gaaaaattcc gggttggcaa ttacaagcat ctcaaaatga ccagaacctg 142980
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aacctggagt ctgaggctta ggagcttagg tttttgctcc tcaacacaga ctttgacgtt 143100
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nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 148920
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 148980
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 149040
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ngggtcctgg 149100
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attctatttt taatttttta atgttgtaat taatttaatt ttttaaaagt tttgctttct 149700
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tataggcata cataataagt tttattcgac ttgtacttta agagaaaata tgtccaccat 169920
ccacatgata ctgacacaaa tgagctaaca ttgagcttca agtagcttct aagtgttcat 169980
ttcactaggc acagcacaga tgtggccttt ccccccttct ctcccttgat atctggcagg 170040
gcataaaggc ccaggccact tcctctgccc cttcccagcc ctgcaccaaa gctgcatttc 170100
aggagactct ctcgagacag tccagtaact accggagcat ggcccctgca tagccctgga 170160
aaaataagag gctggctgtc tacgaatcat cttgtgccag ttgcccaggt gagagggcac 170220
tgggccaagg gagtggtttt catgtttgac ccactacaag gggtcatggg aatcaggaat 170280
gccaaagtac cagatcaaat ccaaaactta aagtcaaaat aagccattca gcatgttcag 170340
tttcttggaa aaggaagttt ctacccctga tgcctttgta ggcagatctg ttctcaccat 170400
taatcttttt gaaaatcttt taaagcagtt tttaaaaaga aagatgaaag catcacatta 170460
tgtaaccaaa gattacattg tatctgctaa gataccaaaa ttcacaaggg cagggaggga 170520
gcaagcatta gtgcctcttt gataagctgt ccaaagacag actaaaggac tttgctggtg 170580
actgacttat aagagttttg tggggttttt tttccctaat aatatacatg tttggaagag 170640
ttgaaaataa ttttgggaaa atgggtttat gggtccttca ctaagtgatt ttataagtag 170700
aactggcttt ccttttcttt agtagttgct gagcaaattc ttgaagctcc atcattgcat 170760
ggttggaaat ggagctattc ttagccactg tgtttgctag tgcccatgtt agcttatctg 170820
aagatgtgaa acccttgctg ataaggaatc atttaaagta ctagattttg cactagaggg 170880
acagcaggca gaaatcctta tttctgccca ctttggatgg cacaagaagt tatctgcagt 170940
tgaaggcaga aagttgaaat atattgtaaa tgaatatttg tattcatgtt tcaaaattga 171000
aatatatata tatatatttt atatatatat atatacacac acacacatat atagtgtgtg 171060
tgtgtgtgtg tgcgcgcgcg cgcgcgtgtg tgtgttctga tagctttacc tttctctgga 171120
tctttatact tggttccaga tcacacctga tgccatgtac ttgtgagaga ggatgcagtt 171180
atgttatgga agctctctca gaacagacaa gacatgtaga ttaatcagat aactgaaagt 171240
tttctcccct attgggtctg acccacaggt cctgtgaagg agcagagggg taaaaagagt 171300
agaggacatg atacattgta ctttactagt tcaagacaga tgaatgtgga aagtgtaaaa 171360
actcaatgga actgattgag atttaccaca gggaaggccc aaacttgggg ccaaaagcct 171420
actcaagtga ttgaccagtg gcgccctaat gggacctgag ctattgggag aagagaactg 171480
ttctttggtc ttcaccatcc ttgtgagaga aggacagttt cctgcattgg aacctggagc 171540
aagcgctcca tctttcacac aaattccctc acctgagatt gaggtgctcc tgttaatggg 171600
tgtctgtgtg ctgtaattct ggttttggat atgttctgta aagattttga caaatgaaaa 171660
tatgttttta tctgttaaaa cttgtcagag tactagaagt tgtatctctg taggtgcagg 171720
tccatttctg cccacgggta gggtgttttt ctttgactaa gagattgaca ccgggatctg 171780
ttgcccaggg cctcccaact caaccatttc taggtgaagg cagaaaaatc cacattagtc 171840
actcctcttc agacatttca gctgagataa caaatcattt ggaatttctt cacccataga 171900
aagagtggta gatatttgaa tttagtaggt ggagttttat agaaaaaaca gcttttgcct 171960
cagttttgat ttatcctcat ttgatttggc cagaacgtag gtaatatgca tcgattggct 172020
tctgattcca attcagtata gcagggtgct gggttttttc ttttccccac ccgtctctta 172080
gcctagggaa ttaaataaga agccttagaa tgggtggccc ttgtgacctg aaacacttcc 172140
tacataagct acttaacaag attgtcatgt agctgcagat tcctttgccc accaaagact 172200
agaacacacg catatccata aaccaaagga aagacaactc tgaaatgctg tttctctggt 172260
ggttccctct ctggctgttg cttcacagta tgggaacctg tactctgcat aggtgacagg 172320
ccagatttgc attctcttac aaccttagcc cttggtgtta actgtcctac agtgaagtgc 172380
ctgtggagtt gtcctatccc agaagccact tggatgctga gagcagccac catcagaacg 172440
acccacgcga aaaaaaaaaa attaaaaagt cccctcacaa cccagtgaca cctttctgct 172500
ttcctctaga ctggaacatt gattagggag tgcctcagac atgacattct tgtgctgtcc 172560
ttggaattaa tctgacagca ggagggcgca gactatgtaa acagagataa gaattaattt 172620
tcaaagttga aggggaaaaa aagaaagaaa aaagaagaga gagagaaaga aagcatcgta 172680
caaagatttt cttaaaaaaa acaattttgc ttgaaatttc tttagatggg gctcagttgt 172740
cacagtggca cttggcctcc actgggcagc aggaccagct ccaagcgcta gtgttctgtt 172800
ctctttttgt aatcttggaa tcttttgttg ctctaaatac aattaaaaat ggtagaaact 172860
tgtttgttgg actaaatgtg tgactttggg tctgtctctg cctctgcttt cagaaatgtc 172920
atccattgtg taaaatattg gcttgctggt ctgccagcta aaacttggcc acatcccctg 172980
ttgtggctgc aggatcgagt tattgttaac aaagagaccc aagaaaagct gctaatgtcc 173040
tcttatcatt gttgttaatt tgttaaaaca taaagaaatc taaaatttca gatgaatgtc 173100
atcagagttc ttttaattag ctctttttat tggctgtttt tattgaagtc aagagttggt 173160
atcatgccca gttgtgtttt atgctatttt gattttcata tatttttaaa agtctttgca 173220
caaggcttac aaatttgccc tgtggtggcc ttagcataag ctgacctggg accaccaaaa 173280
taacaaggaa tttgggctag aaagcacaga tggacactgg cggcccatca caacttctct 173340
tgaaaaacac caaacttgtc agctggggaa aagccacaca aagcccagtt gcctactttc 173400
acaaccttat ccatgtggga gcataaaatg gtggcatcac tgcccagttc taaccaagct 173460
tcagttaaag aatgggtacc ttcacatcct cactattttt caggggcctt accatcctca 173520
accacccaag taaaatctaa atcagccttc ttttgggttc ttcagttcaa gtaaggcctc 173580
ttcttgtggc ctctcagtgt gaatacttac gaggttccag attgaatttt tgggcctgag 173640
atacaaggca tcaatgaggt gtgacaaaac atgtcaacga ataataagaa aattctctat 173700
tcttccatat cctcccctgt aataagggtt gtcagaatgc cttctttctc ggctgagttg 173760
aagattcagt gagaacatat gtgacacagc tggtgggcta ttaagctctg gctttgctcc 173820
ctgttaaaat gccagaaccc ttgagaggga tcccacattc agccatgttt atcattgacc 173880
accttagaat ggatggattt ctcagatttt tcctgagatc agtgcttgat ggagaggaga 173940
ggagaacaat agattcttgg gatgtgtgct ttgcatgtgt ttaagtaaga gacagagagt 174000
<210> 190
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 190
gcgtttgctc ttcttcttgc gtttttt 27
<210> 191
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 191
tctggaacag attctg 16
<210> 192
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 192
gcttcatctc cacaga 16
<210> 193
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 193
ggctactacg ccgtca 16
<210> 194
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 194
gagaaccatc ctcacc 16
<210> 195
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 195
ggaccaggta gcctgt 16
<210> 196
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 196
cccctggact cagatg 16
<210> 197
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 197
gcacaaggag tgggac 16
<210> 198
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 198
gctgtgaaga gagtgt 16
<210> 199
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 199
tttgacacaa gtggga 16
<210> 200
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 200
gtgacaccca gaagct 16
<210> 201
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 201
catccctgct tcataa 16
<210> 202
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 202
tggggagaac catcctcacc ctgc 24
<210> 203
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 203
tccaggacca ggtagcctgt gggg 24
<210> 204
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 204
tgttcccctg gactcagatg ctcc 24
<210> 205
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 205
tggggcacaa ggagtgggac gcac 24
<210> 206
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 206
ttcggctgtg aagagagtgt gcca 24
<210> 207
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 207
cgcttttgac acaagtggga ctgg 24
<210> 208
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 208
catagtgaca cccagaagct tcat 24
<210> 209
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 209
gagtcatccc tgcttcataa catt 24
<210> 210
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 210
ctgtgaagag agtg 14
<210> 211
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 211
tgtgaagaga gt 12
<210> 212
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 212
ttgacacaag tggg 14
<210> 213
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 213
tgacacaagt gg 12
<210> 214
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 214
tgacacccag aagc 14
<210> 215
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 215
gacacccaga ag 12
Claims (40)
10개 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되고 서열 번호 12 내지 179의 핵염기 서열들 중 임의의 핵염기 서열의 8개 이상의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물.
10개 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되고 서열 번호 35, 39, 43, 124, 150, 155, 169 또는 175의 핵염기 서열들 중 임의의 핵염기 서열의 8개 이상의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물.
서열 번호 1의 뉴클레오타이드 2957-2972, 3079-3094, 3099-3114, 3109-3124, 3113-3128, 3120-3135, 3133-3148, 3224-3239, 3226-3241, 3351-3366, 3353-3368, 3361-3376, 3388-3403, 3513-3528, 3517-3532, 3519-3534, 3641-3656, 3735-3750, 3764-3779, 3768-3783, 3798-3813, 3799-3814, 3851-3866, 3870-3885, 3874-3889, 3876-3891, 3878-3893, 3884-3899, 3886-3901, 3888-3903, 3901-3916, 3956-3971, 3962-3977, 3964-3979, 3967-3982, 4019-4034, 4038-4053, 4049-4064, 4056-4071, 4059-4074, 4062-4077, 4066-4081, 4070-4085, 4101-4116, 4103-4118, 4105-4120, 4109-4124, 4305-4320, 4405-4420, 4532-4547, 4534-4549, 4537-4552, 4539-4554, 4555-4570, 4571-4586, 4573-4588, 4578-4593, 4597-4612, 4632-4647, 4655-4670, 4656-4671, 4662-4677, 4699-4714, 4747-4762, 4750-4765, 4752-4767, 4754-4769, 4755-4770, 4769-4784, 4798-4813, 4804-4819, 4807-4822, 4833-4848, 4837-4852, 4839-4854, 4865-4880, 4868-4883, 4872-4887, 4874-4889, 4876-4891, 4887-4902, 4889-4904, 4916-4931, 4918-4933, 4938-4953, 4942-4957, 4944-4959, 4951-4966, 5050-5065, 5052-5067, 5054-5069, 5056-5071, 5060-5075, 5061-5076, 5062-5077, 5133-5148, 5141-5156, 5155-5170, 5265-5280, 5293-5308, 5308-5323, 5392-5407, 5448-5463, 5469-5484, 5481-5496, 5483-5498, 5486-5501, 5488-5503, 5494-5509, 5521-5536, 5666-5681, 6222-6237, 6701-6716, 7543-7558, 8471-8486, 8638-8653, 9464-9479, 10217-10232, 10250-10265, 10865-10880, 11197-11212, 11855-11870, 13189-13204, 13321-13336, 13346-13361, 16555-16570, 16793-16808, 16968-16983, 17206-17221, 18865-18880, 29329-29344, 32290-32305, 33315-33330, 39055-39070, 40615-40630, 42017-42032, 56050-56065, 58719-58734, 58720-58739, 58721-58736, 58722-58737, 58723-58738, 58724-58739, 58725-58740, 58750-58769, 58751-58766, 58752-58767, 58753-58768, 58754-58769, 58755-58770, 60902-60917, 67454-67469, 114874-114889, 115272-115287, 115365-115380, 134971-134986, 102156-102171, 139682-139697, 139762-139777, 139782-139797, 144856-144871, 144938-144953, 148406-148421, 148443-148458, 148520-148535, 181695-181710, 182958-182973 또는 183049-183064 내에서 상보적인 10개 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 갖는 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물로서, 이때 상기 변경된 올리고뉴클레오타이드가 서열 번호 1에 90% 이상 상보적인 것인 화합물.
서열 번호 1의 인트론 1 뉴클레오타이드 5666-5681, 6222-6237, 6701-6716, 7543-7558, 8471-8486, 8638-8653, 9464-9479, 10217-10232, 10250-10265, 10865-10880, 11197-11212, 11855-11870, 13189-13204, 13321-13336, 13346-13361, 16555-16570, 16793-16808, 16968-16983, 17206-17221, 18865-18880, 29329-29344, 32290-32305, 33315-33330, 39055-39070, 40615-40630, 42017-42032, 56050-56065, 58719-58734, 58720-58739, 58721-58736, 58722-58737, 58723-58738, 58724-58739, 58725-58740, 58750-58769, 58751-58766, 58752-58767, 58753-58768, 58754-58769, 58755-58770, 60902-60917, 67454-67469, 114874-114889, 115272-115287, 115365-115380 또는 134971-134986 내에서 상보적인 10개 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물.
제4항에 있어서, 서열 번호 1의 인트론 1 뉴클레오타이드 8638-8653, 11197-11212, 40615-40630, 58719-58734, 58720-58735 또는 58721-58736 내에서 상보적인 10개 내지 30개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 변경된 올리고뉴클레오타이드가 하나 이상의 변경된 당을 포함하는 것인 화합물.
제6항에 있어서, 하나 이상의 변경된 당이 2'-O-메톡시에틸 기를 포함하는 것인 화합물.
제6항에 있어서, 하나 이상의 변경된 당이 이환형 당인 화합물.
제8항에 있어서, 이환형 당이 4'-CH(CH3)-O-2', 4'-CH2-O-2' 및 4'-(CH2)2-O-2'로부터 선택되는 기를 포함하는 것인 화합물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 변경된 올리고뉴클레오타이드가 하나 이상의 변경된 뉴클레오사이드 간 결합을 포함하는 것인 화합물.
제10항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 각각의 뉴클레오사이드 간 결합이 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드 간 결합인 화합물.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 변경된 올리고뉴클레오타이드가 하나 이상의 변경된 핵염기를 포함하는 것인 화합물.
제12항에 있어서, 변경된 핵염기가 5-메틸사이토신인 화합물.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 변경된 올리고뉴클레오타이드가
연결된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트(gap segment);
연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트(wing segment); 및
연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트
를 포함하고; 이때, 상기 갭 세그먼트가 상기 5' 윙 세그먼트와 상기 3' 윙 세그먼트 사이에 위치하고, 각각의 윙 세그먼트의 각각의 뉴클레오사이드가 변경된 당을 포함하는 것인 화합물.
연결된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트(gap segment);
연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트(wing segment); 및
연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트
를 포함하고; 이때, 상기 갭 세그먼트가 상기 5' 윙 세그먼트와 상기 3' 윙 세그먼트 사이에 위치하고, 각각의 윙 세그먼트의 각각의 뉴클레오사이드가 변경된 당을 포함하는 것인 화합물.
서열 번호 35의 서열로 구성되는 핵염기 서열을 갖는, 16개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 단일 가닥의 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로서, 이때 상기 변경된 올리고뉴클레오타이드가
9개의 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트;
3개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트; 및
4개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트
를 포함하고; 이때, 상기 갭 세그먼트가 상기 5' 윙 세그먼트와 상기 3' 윙 세그먼트 사이에 위치하고; 상기 5' 윙 세그먼트의 3개의 연결된 뉴클레오사이드가 각각 구속된 에틸(constrained ethyl; cEt) 당이고; 상기 3' 윙 세그먼트의 4개의 연결된 뉴클레오사이드가 5'에서 3' 방향으로 구속된 에틸(cEt) 당, 구속된 에틸(cEt) 당, 구속된 에틸(cEt) 당 및 2'-O-메톡시에틸 당이고; 각각의 뉴클레오사이드 간 결합이 포스포로티오에이트 결합이며; 각각의 사이토신이 5-메틸사이토신인 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
9개의 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트;
3개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트; 및
4개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트
를 포함하고; 이때, 상기 갭 세그먼트가 상기 5' 윙 세그먼트와 상기 3' 윙 세그먼트 사이에 위치하고; 상기 5' 윙 세그먼트의 3개의 연결된 뉴클레오사이드가 각각 구속된 에틸(constrained ethyl; cEt) 당이고; 상기 3' 윙 세그먼트의 4개의 연결된 뉴클레오사이드가 5'에서 3' 방향으로 구속된 에틸(cEt) 당, 구속된 에틸(cEt) 당, 구속된 에틸(cEt) 당 및 2'-O-메톡시에틸 당이고; 각각의 뉴클레오사이드 간 결합이 포스포로티오에이트 결합이며; 각각의 사이토신이 5-메틸사이토신인 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
서열 번호 39의 서열로 구성되는 핵염기 서열을 갖는, 16개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 단일 가닥의 변경된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로서, 이때 상기 변경된 올리고뉴클레오타이드가
7개의 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트;
4개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트; 및
5개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트
를 포함하고; 이때, 상기 갭 세그먼트가 상기 5' 윙 세그먼트와 상기 3' 윙 세그먼트 사이에 위치하고; 상기 5' 윙 세그먼트의 4개의 연결된 뉴클레오사이드가 5'에서 3' 방향으로 2'-O-메톡시에틸 당, 구속된 에틸(cEt) 당, 구속된 에틸(cEt) 당 및 구속된 에틸(cEt) 당이고; 상기 3' 윙 세그먼트의 5개의 연결된 뉴클레오사이드가 5'에서 3' 방향으로 구속된 에틸(cEt) 당, 구속된 에틸(cEt) 당, 구속된 에틸(cEt) 당, 2'-O-메톡시에틸 당 및 2'-O-메톡시에틸 당이고; 각각의 뉴클레오사이드 간 결합이 포스포로티오에이트 결합이며; 각각의 사이토신이 5-메틸사이토신인 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
7개의 연결된 데옥시뉴클레오사이드로 구성되는 갭 세그먼트;
4개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 5' 윙 세그먼트; 및
5개의 연결된 뉴클레오사이드로 구성되는 3' 윙 세그먼트
를 포함하고; 이때, 상기 갭 세그먼트가 상기 5' 윙 세그먼트와 상기 3' 윙 세그먼트 사이에 위치하고; 상기 5' 윙 세그먼트의 4개의 연결된 뉴클레오사이드가 5'에서 3' 방향으로 2'-O-메톡시에틸 당, 구속된 에틸(cEt) 당, 구속된 에틸(cEt) 당 및 구속된 에틸(cEt) 당이고; 상기 3' 윙 세그먼트의 5개의 연결된 뉴클레오사이드가 5'에서 3' 방향으로 구속된 에틸(cEt) 당, 구속된 에틸(cEt) 당, 구속된 에틸(cEt) 당, 2'-O-메톡시에틸 당 및 2'-O-메톡시에틸 당이고; 각각의 뉴클레오사이드 간 결합이 포스포로티오에이트 결합이며; 각각의 사이토신이 5-메틸사이토신인 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 변경된 올리고뉴클레오타이드가 안드로겐 수용체를 코딩하는 핵산에 90% 이상 상보적인 것인 화합물.
제17항에 있어서, 안드로겐 수용체를 코딩하는 핵산이 서열 번호 1 내지 8 중 어느 한 서열 번호의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인 화합물.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 약학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 포함하는 조성물.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 화합물, 및 MDV3100, ARN-059, ODM-201, 아비라테론(abiraterone), TOK001, TAK700 및 VT464로부터 선택되는 항안드로겐제를 포함하는 조성물.
제20항에 있어서, 항안드로겐제가 MDV3100인 조성물.
암을 갖는 대상체에게, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 화합물 또는 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하여 상기 대상체에서 암을 치료하는 것을 포함하는 암 치료 방법.
제22항에 있어서, 암이 전립선암, 유방암, 난소암, 위암 또는 방광암인 방법.
제22항에 있어서, 암이 거세 저항성 전립선암인 방법.
제24항에 있어서, 거세 저항성 전립선암이 MDV3100, ARN-059, ODM-201, 아비라테론, TOK001, TAK700 및 VT464로부터 선택되는 항안드로겐제에 대한 내성이 있는 것인 방법.
암 치료에 사용하기 위한 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 안티센스 화합물 또는 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항의 조성물.
제26항에 있어서, 암이 전립선암, 유방암, 난소암, 위암 또는 방광암인 화합물 또는 조성물.
제27항에 있어서, 암이 거세 저항성 전립선암인 화합물 또는 조성물.
제28항에 있어서, 거세 저항성 전립선암이 MDV3100, ARN-059, ODM-201, 아비라테론, TOK001, TAK700 및 VT464로부터 선택되는 항안드로겐제에 대한 내성이 있는 것인 화합물 또는 조성물.
MDV3100, ARN-059, ODM-201, 아비라테론, TOK001, TAK700 및 VT464로부터 선택되는 항안드로겐제에 대한 내성이 있는 전립선암 세포의 성장 또는 증식을 억제하는 방법으로서, 전립선암 세포를 엑손 3의 3' 말단의 업스트림에서 인간 안드로겐 수용체(AR)로 표적화되는 안티센스 화합물과 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
제30에 있어서, 항안드로겐제가 MDV3100인 방법.
대상체에서 MDV3100, ARN-059, ODM-201, 아비라테론, TOK001, TAK700 및 VT464로부터 선택되는 항안드로겐제에 대한 내성이 있는 전립선암을 치료하는 방법으로서, 엑손 3의 3' 말단의 업스트림에서 인간 안드로겐 수용체(AR)로 표적화되는 안티센스 화합물을 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
제32항에 있어서, 대상체가 MDV3100, ARN-059, ODM-201, 아비라테론, TOK001, TAK700 및 VT464로부터 선택되는 항안드로겐제에 대한 내성이 있는 전립선암을 갖는 것으로서 진단되는 것인 방법.
전립선암의 치료를 필요로 하는 환자에서 전립선암을 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 안티센스 화합물 또는 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항의 조성물 및 항안드로겐제를 상기 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
제34항에 있어서, 항안드로겐제가 MDV3100, ARN-059, ODM-201, 아비라테론, TOK001, TAK700 및 VT464로부터 선택되는 것인 방법.
제34항 또는 제35항에 있어서, 안티센스 화합물 및 항안드로겐제가 함께 상승작용하여 전립선암 세포의 성장 또는 증식을 억제하는 것인 방법.
제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 전립선암 세포를, 상기 전립선암 세포의 성장 또는 증식을 억제하는 데 효과적인 단독의 안티센스 화합물 또는 항안드로겐제의 양보다 조합 시 각각 또는 둘 다 더 적은 양의 안티센스 화합물 및 항안드로겐제와 접촉시키는 것인 방법.
유방암 세포를 인간 안드로겐 수용체(AR)로 표적화되는 안티센스 화합물과 접촉시키는 것을 포함하는, 안드로겐 수용체(AR) 양성 유방암 세포의 성장 또는 증식을 억제하는 방법으로서, 이때 상기 유방암 세포의 성장 또는 증식이 억제되는 것인 방법.
제30항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 화합물이 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인 방법.
제30항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 화합물이 제15항 또는 제16항의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인 방법.
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