JP2018524588A - 骨髄由来サプレッサー細胞中のテトラスパニン３３（Ｔｓｐａｎ３３）を標的化するがん療法 - Google Patents

骨髄由来サプレッサー細胞中のテトラスパニン３３（Ｔｓｐａｎ３３）を標的化するがん療法 Download PDF

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Abstract

Tspan33を発現する骨髄由来サプレッサー細胞を標的化することによって、例えば免疫療法のような抗がん療法と併用してがんを処置するための、及び候補治療剤を同定するための方法。

Description

優先権の主張
本出願は、2015年6月26日付けで出願された米国仮特許出願第62/185,358号;2015年6月26日付けで出願された第62/185,409号;及び2015年7月7日付けで出願された第62/189,587号の利益を主張する。前述のものの全内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
本発明は、Tspan33を標的化することによって、例えば他の抗がん療法と併用してがんを処置するための、及び候補治療剤を同定するための方法に関する。
腫瘍媒介免疫抑制は、有効ながん免疫療法を妨げる。がんの発達における免疫エフェクターへの許容性は、腫瘍環境に浸潤して転移性ニッチに移動するサプレッサー細胞集団の発達によって部分的に達成される。これまで、このような集団のなかで最も良く特徴付けられたものとしては、調節性T細胞(Treg)、骨髄由来サプレッサー細胞(MDSC)、及びM2極性化マクロファージが挙げられる。したがって、MDSCは、免疫監視を回避するのに腫瘍によって利用される主要な細胞型である。
WO2007135195 US8476246 US8795678 US8790655 米国特許第4,816,567号 米国特許第4,978,775号 米国特許第4,975,369号 米国特許第4,816,397号 米国特許第5,225,539号 米国特許第5,530,101号 米国特許第5,585,089号 米国特許第5,693,761号 米国特許第5,693,762号 米国特許第6,180,370号 WO90/07861 米国特許第5,208,020号 米国特許第5,475,092号 米国特許第5,585,499号 米国特許第5,846,545号 W084/03508 W085/03508 US2009/0010966 US20090041797 US5843711 US7585942 US7696338 US20080166375 US4,545,985 US4,892,827 US5,458,878 US7,314,632 WO2010040112 US2010/0317718 US2010/0249052 US2009/0181914 US2010/0234451 US2007/0191294 US2008/0249039 WO2010/129746 WO2010/040112 米国特許第5,013,830号 米国特許第5,149,797号 米国特許第5,220,007号 米国特許第5,256,775号 米国特許第5,366,878号 米国特許第5,403,711号 米国特許第5,491,133号 米国特許第5,565,350号 米国特許第5,623,065号 米国特許第5,652,355号 米国特許第5,652,356号 米国特許第5,700,922号 米国特許第5,034,506号 米国特許第3,687,808号 米国特許第4,469,863号 米国特許第4,476,301号 米国特許第5,023,243号 米国特許第5,177,196号 米国特許第5,188,897号 米国特許第5,264,423号 米国特許第5,276,019号 米国特許第5,278,302号 米国特許第5,286,717号 米国特許第5,321,131号 米国特許第5,399,676号 米国特許第5,405,939号 米国特許第5,453,496号 米国特許第5,455,233号 米国特許第5,466,677号 米国特許第5,476,925号 米国特許第5,519,126号 米国特許第5,536,821号 米国特許第5,541,306号 米国特許第5,550,111号 米国特許第5,563,253号 米国特許第5,571,799号 米国特許第5,587,361号 米国特許第5,625,050号 米国特許第5,166,315号 米国特許第5,185,444号 米国特許第5,214,134号 米国特許第5,216,141号 米国特許第5,235,033号 米国特許第5,264,562号 米国特許第5,264,564号 米国特許第5,405,938号 米国特許第5,434,257号 米国特許第5,470,967号 米国特許第5,489,677号 米国特許第5,541,307号 米国特許第5,561,225号 米国特許第5,596,086号 米国特許第5,602,240号 米国特許第5,610,289号 米国特許第5,608,046号 米国特許第5,618,704号 米国特許第5,623,070号 米国特許第5,663,312号 米国特許第5,633,360号 米国特許第5,677,437号 米国特許第5,677,439号 米国特許第5,539,082号 米国特許第5,714,331号 米国特許第5,719,262号 米国特許第4,845,205号 米国特許第5,130,302号 米国特許第5,134,066号 米国特許第5,175,273号 米国特許第5,367,066号 米国特許第5,432,272号 米国特許第5,457,187号 米国特許第5,459,255号 米国特許第5,484,908号 米国特許第5,502,177号 米国特許第5,525,711号 米国特許第5,552,540号 米国特許第5,587,469号 米国特許第5,596,091号 米国特許第5,614,617号 米国特許第5,750,692号 米国特許第5,681,941号 米国特許第4,828,979号 米国特許第4,948,882号 米国特許第5,218,105号 米国特許第5,525,465号 米国特許第5,541,313号 米国特許第5,545,730号 米国特許第5,552,538号 米国特許第5,578,717号 米国特許第5,580,731号 米国特許第5,591,584号 米国特許第5,109,124号 米国特許第5,118,802号 米国特許第5,138,045号 米国特許第5,414,077号 米国特許第5,486,603号 米国特許第5,512,439号 米国特許第5,578,718号 米国特許第4,587,044号 米国特許第4,605,735号 米国特許第4,667,025号 米国特許第4,762,779号 米国特許第4,789,737号 米国特許第4,824,941号 米国特許第4,835,263号 米国特許第4,876,335号 米国特許第4,904,582号 米国特許第4,958,013号 米国特許第5,082,830号 米国特許第5,112,963号 米国特許第5,214,136号 米国特許第5,245,022号 米国特許第5,254,469号 米国特許第5,258,506号 米国特許第5,262,536号 米国特許第5,272,250号 米国特許第5,292,873号 米国特許第5,317,098号 米国特許第5,371,241号 米国特許第5,391,723号 米国特許第5,416,203号 米国特許第5,451,463号 米国特許第5,510,475号 米国特許第5,512,667号 米国特許第5,514,785号 米国特許第5,565,552号 米国特許第5,567,810号 米国特許第5,574,142号 米国特許第5,585,481号 米国特許第5,587,371号 米国特許第5,595,726号 米国特許第5,597,696号 米国特許第5,599,923号 米国特許第5,599,928号 米国特許第5,688,941号 国際特許出願番号PCT/US92/09196号パンフレット 米国特許第6,287,860号 米国特許第6,268,490号 米国特許第6,734,291号 米国特許第6,770,748号 米国特許第6,794,499号 米国特許第7,034,133号 米国特許第7,053,207号 米国特許第7,060,809号 米国特許第7,084,125号 米国特許第7,572,582号 米国付与前出願番号第20100267018号 米国付与前出願番号第20100261175号 米国付与前出願番号第20100035968号 米国特許第5,582,981号 米国特許第4,458,066号 米国特許第20100004320号 米国特許第20090298916号 米国特許第20090143326号 米国特許第20040028670号 米国特許第6,063,400号 米国特許第6,007,839号
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マウスにおけるMDSCは広く特徴付けられているが、それらのヒト対応物はよくわかっておらず、マウスに存在する細胞マーカーが、必ずしもヒトでの使用に適しているとは限らない。MDSCは、免疫抑制能力を有する骨髄由来細胞のヘテロジニアスな集団と記述されている(5、9、40、41)。近年、ヒト腫瘍でのMDSC蓄積の役割に新たに関心が持たれるようになったことから、治療的介入のためにこれらの細胞を標的化するために、そのような細胞をよりいっそう定義する必要性が増加している。マウスにおけるMDSCを標的化する研究のほとんどが同定マーカーとしてCD11b+、Gr-1+を使用してきたが(9)、ヒトMDSCはそれほどよく定義されておらず、CD33+、CD11b+、Lin-及びHLA-DRlo細胞であるとして様々に特徴付けられてきた(28、30、42)。
本明細書に記載されるように、移植されたマウス膵臓腺癌から単離された脾臓のMDSCの遺伝子発現プロファイルを、腫瘍を有さない動物からのMDSCの遺伝子発現プロファイルと比較して、マウスとヒトの両方で免疫抑制性MDSC集団を認識する細胞表面抗原であるTspan33を同定した。本明細書に記載されるMDSCマーカーは、例えば、がんの発達、進行及び転移におけるMDSCの役割に関する臨床前研究を行うため、更に抗がん療法の効能をモニターするための、療法の標的として使用することができる。
したがって、第1の態様において、本発明は、対象におけるがんを処置する、又は処置のための対象を選択するための方法を提供する。本方法は、対象からの試料、例えば血液、血清、尿又はがん組織を含む試料中のTspan33+MDSCのレベルを検出する工程;試料中のTspan33+MDSCのレベルを、Tspan33+MDSCの参照レベルと比較する工程;及びMDSCを標的化する免疫療法での処置のために、参照レベルを超えるTspan33+MDSCのレベルを有する対象を選択する工程、及び任意選択でMDSCを標的化する免疫療法を対象に投与する工程;又はMDSCを標的化しない療法、例えばMDSCを標的化しない免疫療法又は非免疫療法の抗がん療法での処置のために、参照レベル又はそれ未満のTspan33+MDSCのレベルを有する対象を選択する工程;及び任意選択でMDSCを標的化しない療法を投与する工程を包含する。
別の態様において、本発明は、対象におけるがんを処置するための方法を提供する。本方法は、治療有効量のTspan33に特異的に結合して、対象におけるTspan33+骨髄由来サプレッサー細胞の数又は活性を低減させる抗体を投与することを包含する。MDSCの数は、例えば、末梢血液中のTspan33+細胞を測定することによって、又は外科手術後に患者からの外科的に除去した腫瘍組織試料中のTspan33+細胞を検出するためのIHCによって決定することができる。
一部の実施形態において、抗体は、ヒト、ヒト化、キメラ、又は二機能性の抗体である。一部の実施形態において、抗体は、細胞傷害性のペプチド若しくはタンパク質、放射線同位体、又は抗がん薬にカップリングされている。一部の実施形態において、本方法は、抗がん療法、例えば免疫療法を対象に投与するステップを包含する。
一部の実施形態において、抗がん療法は、Tspan33に特異的に結合する抗体の後に、例えば、Tspan33に特異的に結合する抗体の投与の少なくとも1週間後に対象に投与される。
一部の実施形態において、抗がん療法は、コールドインストルメント又はレーザーを用いた外科的切除、放射線療法、光線療法、生物学的療法(例えば、チロシンキナーゼ阻害剤を用いた)、高周波アブレーション(RFA)、放射線塞栓療法(radioembolisation)(例えば、90Y球体を用いた)、化学療法、及び免疫療法(例えば、がんワクチン、IL-2、シクロホスファミド、抗インターロイキン-2R免疫毒素、又はチェックポイント阻害剤又は他の免疫治療抗体の1つ又は複数を投与すること)からなる群から選択される。一部の実施形態において、抗がん療法は、チェックポイント阻害剤、例えば抗CD137、抗PD1、抗PDL1、若しくは抗CTLA-4抗体、及び/又はがんワクチン、例えば、放射線照射されたがん細胞、例えばICOS、GM-CSF(Gvax)又はFlt3-リガンド(Fvax)を発現する細胞でのワクチン接種の投与を含む。
一部の実施形態において、がんは、上皮由来の固形がんである。一部の実施形態において、がんは、白血病である。一部の実施形態において、がんは、がん組織におけるTspan33+骨髄由来サプレッサー細胞(MDSC)の存在を特徴とする。一部の実施形態において、がんは、前立腺がん、肺がん、又は肝臓がんである。
一部の実施形態において、本方法は、対象からの試料、例えば血液、尿、CSF、又はがん組織を含む試料を得る工程;試料中のTspan33+MDSCの存在を検出する工程;及びがん組織に存在するTspan33+MDSC、例えば参照レベルを超えるTspan33+MDSCのレベルを有する対象を選択し、次いで治療有効量の抗体を投与する工程を包含する。
さらなる態様において、本発明は、経時的な対象におけるがんに関する処置の効能をモニターするための方法を提供する。本方法は、対象中の、例えば対象からの第1の試料中の、例えば血液、尿、CSF、又はがん組織を含む試料中のTspan33+MDSCの第1のレベルを決定する工程;対象中の、例えば対象からの後続の試料中の、例えば血液又はがん組織を含む試料中のTspan33+MDSCの後続のレベルを決定する工程;Tspan33+MDSCの第1の及び後続のレベルを比較する工程、及びTspan33+MDSCの後続のレベルがTspan33+MDSCの第1のレベル未満である場合、処置を、有効であるとして同定する工程を包含する。
一部の実施形態において、処置は、対象においてTspan33+MDSCを特異的又は非特異的に枯渇させる。
一部の実施形態において、処置は、当業界で公知のような、又は本明細書に記載されるような、抗がん療法、例えば免疫療法である。一部の実施形態において、処置は、チェックポイント阻害剤、例えば、抗CD137、抗PD1、抗PDL1、又は抗CTLA-4抗体の投与を包含する。
別の態様において、本発明は、がんの処置のための候補化合物を同定するための方法を提供する。本方法は、Tspan33に結合する試験化合物を選択する工程;試験化合物を、Tspan33を発現する骨髄由来サプレッサー細胞(MDSC)を含む試料と接触させる工程;細胞に対する、例えばTspan33+MDSCの生存能、Tspan33+MDSCの寿命、Tspan33+MDSCの免疫抑制能力、又はTspan33+MDSCの増殖に対する試験化合物の作用を検出する工程;及び候補化合物として、MDSCの生存能、寿命、免疫抑制又は増殖を低減させる試験化合物を選択する工程を包含する。
一部の実施形態において、Tspan33に結合する試験化合物を選択する工程は、Tspan33、例えばTspan33を発現する細胞又は精製されたTspan33タンパク質を含む試料を提供する工程;試料を試験化合物と接触させる工程;試料中の試験化合物のTspan33への結合を検出する工程;及びTspan33に結合する試験化合物を選択する工程を含む。
一部の実施形態において、本方法は、障害のin vivoモデル、例えば動物腫瘍モデル、例えば、腫瘍異種移植モデルに、選択された候補化合物を投与する工程;障害のモデル、例えば障害の1つ又は複数の症状(例えば腫瘍又は脾臓におけるTspan33+MDSCの数、腫瘍の増殖又は転移)に対する作用を検出する工程;及び候補治療剤として、腫瘍又は脾臓中のTspan33+MDSCの数を低減させる、腫瘍増殖を低減させる、又は転移を低減させて、動物の生存を改善する候補化合物を選択する工程を包含する。
一部の実施形態において、障害のin vivoモデルは、動物腫瘍モデル、例えば腫瘍異種移植モデルである。
更に別の態様において、本発明は、経時的な対象におけるMDSCレベルに対する処置の作用を決定するための方法を提供する。本方法は、対象中の、例えば対象からの第1の試料中の、例えば血液、尿、CSF、又はがん組織を含む試料中のTspan33+MDSCの第1のレベルを決定する工程;対象中の、例えば対象からの後続の試料中の、例えば血液又はがん組織を含む試料中のTspan33+MDSCの後続のレベルを決定する工程;Tspan33+MDSCの第1の及び後続のレベルを比較する工程、及びTspan33+MDSCの後続のレベルがTspan33+MDSCの第1のレベルを超える場合、処置を、MDSCを増加させるとして同定する工程、又はTspan33+MDSCの後続のレベルがTspan33+MDSCの第1のレベル未満である場合、処置を、MDSCを減少させるとして同定する工程を包含する。
一部の実施形態において、処置は、がんのための処置である。
一部の実施形態において、処置は、対象においてTspan33+MDSCを特異的又は非特異的に枯渇させる。
追加の態様において、本発明は、対象におけるMDSCの存在又はレベルを決定するための方法を提供する。本方法は、任意選択で対象からの試料、例えば血液、尿、CSF、又はがん組織若しくは腫瘍溶解物を含む試料を得る工程;任意選択で、例えばフローサイトメトリーを使用して、初期骨髄性前駆細胞(例えば、HLA-DR lo、CD33+細胞)について試料を濃縮する工程;試料を、Tspan33に結合する抗体と接触させる工程;抗体の試料への結合を検出する工程;及び抗体の試料への結合に基づき、試料中のTspan33+MDSCのレベルを決定する工程を包含する。
本明細書に記載される方法において、一部の実施形態では、がんは、骨髄のがんではなく、例えば血液学的悪性腫瘍ではなく、例えば活性化B細胞に関連する血液学的悪性腫瘍ではなく、例えばB細胞リンパ腫ではない。
別段の指定がない限り、本明細書において使用される全ての専門用語や科学用語は、本発明が属する分野の当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。本発明で使用するための方法及び材料が本明細書に記載されているが、当業界において公知の他の好適な方法及び材料も使用することができる。材料、方法、及び実施例は単なる例示にすぎず、限定することを意図しない。本明細書で述べられた全ての公報、特許出願、特許、配列、データベースの登録、及び他の参考文献は、参照によりそれら全体が開示に組み入れられる。矛盾がある場合、定義を含め本明細書を優先させる。
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び図面から、並びに特許請求の範囲から明らかであると予想される。
Pan02腫瘍担持マウスの脾臓における遺伝子発現のマイクロアレイ分析を示す図である。膵腫瘍(Pan02);メラノーマ(B16)から単離したMDSC上及びGM-CSF/IL-6による変換後の骨髄由来MDSCからのTspan33の差次的発現変動を示す。 ヒト組織におけるTspan33の組織限定発現パターンを示す図である。 B16メラノーマ(上)、移植したE0771乳腺腫瘍(中央)、及びHer2トランスジェニックマウス乳腺腫瘍浸潤細胞(下)由来のMDSCにおけるTspan33の発現を示す6つのFACSグラフのセットである。左のパネル=Tspan33。右のパネル=CD11b+Gr1+細胞。 トランスジェニック誘導性HER2発現腫瘍の腫瘍浸潤及びHER2脱誘導後の退縮腫瘍におけるTspan33+MDSCの頻度の減少を実証するヒストグラムである。 Gr-1タンパク質標的化抗体の枯渇が、CD11b+Gr-1+(左)及びTspan33+MDSC(右)の頻度の減少と関連することを示す4つのFACSグラフのセットである。 GM-CSF/IL-6による変換後の骨髄由来MDSCにおけるTspan33発現を示すFACSグラフのセットである。 対照(正常組織)試料、腫瘍試料、並びに「規則正しく」シクロフォスファミド(CYC)及びセレコキシブ(CTX)で処置した腫瘍試料におけるTspan33+細胞の頻度を示す棒グラフである。Tspan33+MDSCは、シクロフォスファミド及びセレコキシブ処置を受けた動物において減少した。 FACS分析によって決定したように、健常ドナー(HD)及び前立腺がん患者(PD)から単離したPBMCにおけるTspan33陽性MDSCの頻度を示す棒グラフである。前立腺がんを有する患者由来のPBMCは、循環するCD33+HLA-DRlo Tspan33+MDSCを有する。前立腺がん患者(PC)及び健常ドナー(HD)から採取した血液由来のPBMCを単離し、HLA-DR、CD33、及びTspan33を染色し、FACSによって分析した。 E90771腫瘍を移植したC57BL/6マウスの腫瘍のサイズにおける、21日間の抗Gr1抗体処置の効果を示す画像である。画像の上の対は対照Igで処置した動物における代表的な腫瘍であり、画像の下の対は抗Gr1抗体で処置した動物における腫瘍である。 E90771腫瘍を移植したC57BL/6マウスにおける腫瘍体積を示す折れ線グラフである。動物は、対照Ig(ダイアモンド)又は抗Gr1抗体(四角)で処置した。腫瘍の増殖は抗体処置後著しく低減した。 E90771腫瘍を移植し、抗Gr1抗体で処置したC57BL/6マウスにおいて(白い棒)、対照Igで処置したもの(黒い棒)と比較して、MDSCの頻度が低減されたことを示す棒グラフである。 肺がん患者由来の正常(N)及び腫瘍(T)組織試料の対応対、並びに肝臓がん(肝細胞癌、陽性対照として使用)由来のHepG2細胞株におけるTSN33の発現を示すウェスタンブロットの画像である。
骨髄サプレッサー細胞は、25年以上前にがんにおいて記述されたが(1)、比較的わずかな注目しか受けなかった。しかしながら、少数の実験室での先駆的な仕事が、腫瘍の免疫監視からの回避に関与する免疫系のレギュレーターとしてのMDSCの重要性を強調してきた(2〜4)。MDSCは、がん患者の血液及び腫瘍を有するマウスにおいて劇的に増加する単球/マクロファージ、顆粒球及び樹状細胞で構成される、骨髄細胞のヘテロジニアスな集団である(5)。MDSCは、腫瘍部位に(又は前新生物の病変中に)、及び遺伝モデルにおいて末期がんが出現する前の脾臓中に、及び移植された同系マウスの腫瘍中に(6、7)存在する。MDSCはTregほどの注目を受けなかったが、それらへの関心は、近年公開された論文から明らかなように急速に増加している(8、9)。ヒトにおける彼らの研究の主な障害は、同定及び特異的な標的化に使用できる特異的な細胞表面マーカーの欠如であった(10)。マウスにおいて、MDSCは、一般的にCD11b+Gr-1+として特徴付けられている。更に、CD11bhi、Gr-1lo細胞は、単球と呼称されており、CD11blo、Gr-1hi細胞は、顆粒球MDSCと分類されている(11)。ヒトMDSCは、未成熟の表現型を有しており、初期には、肺がん、乳がん及び頭頸部がんにおけるHLA-DR-Lin-細胞と定義された(12)。近年それらは、腎臓がん及び黒色腫では、CD33+及びHLA-DR-Lin-細胞として(13、14);乳がんでは、HLA-DR-Lin-CD33+CD11b+細胞として(15);進行性の非小細胞肺がんでは、CD14-CD33+CD11b+CD15+として(16)、更に黒色腫、前立腺癌、腎臓癌及び肝細胞癌ではHLA-DR-CD14+細胞として(17〜19)記述されている。したがって、処置の転帰を比較するために、様々な腫瘍を有するがん患者に関連するMDSC集団をよりよく定義する必要がある。
更に、MDSCは、アルギナーゼ1の産生、iNOSを介した酸化窒素(NO)の産生、及び活性酸素種(ROS)の産生等のT細胞の機能を標的化する様々なメカニズムを採用する(20)。発達中の腫瘍は、血管内皮増殖因子(VEGF)、トランスフォーミング増殖因子-b(TGFb)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、IL-10、及びMDSCの蓄積を促進するプロスタグランジンE2等の多種多様の因子を分泌する(21、22)。近年の研究(23、24、25)及び本発明者らの未発表のデータから、腫瘍由来の乳酸塩も自然免疫機能に影響を与え、骨髄性前駆細胞からのAPC分化の停止を引き起こすという事実が裏付けられている。MDSCは、アルギニン代謝に関与する2つの酵素(ARG及びNOS)を包含する多数のメカニズムを利用することによって、またTGFb、プロスタグランジンE2(PGE2)産生、及びシステインの枯渇を介して免疫抑制を媒介する(5、26)。MDSCはまた、調節性T細胞の生成をモジュレートすることによって免疫エフェクター機能も抑制する(27〜29)。このため、免疫機能及び治療的標的化に関連するMDSCサブセットを同定すること、更に複数種間で適用できるマーカーを定義することはよりいっそう重要である。
注目すべき点は、がん処置のための抗GITRモノクローナル抗体(TRX518)の開発によりTreg特異的な療法が現実のものとなりつつあることであり(Schaerら、Curr Opin Investig Drugs. 2010年12月; 11(12): 1378〜86; Rosenzweigら、J Clin Oncol 28、2010(別冊; 抄録e13028))、現在、フェーズI試験(TRX518-001)中である。また、Treg活性を枯渇又は低減させる他の処置も公知であり、例えば、シクロホスファミド(規則正しい用量、例えば、通常毎日、通常経口的に、絶え間なく送達される)、三酸化ヒ素、パクリタキセル、スニチニブ、オキサリプラチン、PLX4720、アントラサイクリンベースの化学療法、及びVEGF-VEGFRシグナル伝達軸を選択的に標的化する薬剤、例えばVEGFをブロックする抗体(例えば、ベバシズマブ)、又はVEGFRチロシンキナーゼ活性の阻害剤(例えば、レンバチニブ)等である。MDSCは初期に出現し、Tregを誘導することができるため、抗MDSC療法は、がんにおける治療剤として有効な可能性がある。MDSC活性の阻害又はMDSCの数の枯渇は、動物移植モデルにおいて腫瘍増殖に打ち勝つことができ、これは、抗Gr-1抗体の使用によるMDSC枯渇;例えば5-FU、ドセタキセル、及びゲムシタビン等の非特異的な阻害剤を用いてMDSCの数を減少させること;MDSCの非抑制性骨髄細胞への変換を変更すること等の多数のメカニズムによって、又は例えばパクリタキセルを使用してMDSCの機能をモジュレートするによって達成することができる(30、31)。腫瘍を有するマウスにおいてMDSCを枯渇させるための抗Gr-1処置の使用は、腫瘍負荷量の減少及び寿命の増加をもたらした(32)。in vitroにおける腎臓がん患者から単離されたCD11b+、CD14-MDSCの枯渇は、アネルギーのT細胞の機能を回復させた(33)。しかしながら、例えばヒトにおける好中球枯渇及びMDSCにおけるGr-1+の欠如等の副作用が、これらの興味深い発見を診療施設に移すことを妨害してきた。腎臓がん患者におけるスニチニブ(34)又はオールトランス-レチノイン酸(ATRA)の使用を包含する薬物とそれに続くIL-2療法(13〜14)を用いた、MDSCを低減させるために行われたわずかな研究が、多少の効能を示した。これらの薬物の一部に関連する主要な問題は、それらの特異性の欠如であり、これらは、他の免疫区画において細胞に影響を与える(例えばATRAはTregを促進し、cox-2阻害剤はDC成熟を抑制する可能性があり、がん免疫療法の状況ではどちらも望ましくない結果である)。
マウスMDSCは更に、顆粒球CD11b+Gr-1hi(Ly6GhiLy6Clo/int)及び単球CD11b+Gr-1lo(Ly6G-Ly6Chi)MDSCと定義される。Greifenbergら(43)は、MDSCの5つの異なるサブタイプに更に細分するのにLPS及びIFNg誘導MDSCを使用したが、このようなより細かい特徴付けは、同定される新しいマーカーに基づき継続される可能性があると予想される(34、44)。多数の近年の論文から、(大部分がマウスの)MDSC集団の表現型を特徴付けるための新規のマーカーが報告されている。このような分類器としては、マウスにおいて免疫抑制性「単球」CD11b+CD49d+と「顆粒球」CD11+CD49d-MDSCとを区別するためのマーカーとしてのCD49dの使用が挙げられる(45)。また、CD80(46)、CD115(47、48)、CD124/IL-4Ra(48)等の抑制性MDSCのための多数の他のマーカーもマウスで報告されているが、近年、S100A9が報告されており、これは、ヒトMDSCとマウスMDSCの両方に存在すると報告されている(49)。S100A9は、CD14+HLA-DR-/lo骨髄細胞の発現アレイ分析に基づき、抑制性単球細胞に関連するMDSCマーカーとして同定された。マウスMDSCは、一酸化窒素合成酵素(NOS2)を発現するCD11b+Ly6GloLy6Chi単球MDSC(Mo-MDSC)、及びアルギナーゼ1(ARG1)を発現するCD11b+Ly6GhiLy6Clo顆粒球MDSC(G-MDSC)として更に特徴付けられている(9)。マウス腫瘍において、G-MDSCは、脾臓で収集される優勢な集団としてより一般的に特徴付けられており、Mo-MDSCが優勢なマウス腫瘍はより少数である(11)。しかしながら、G-MDSCの存在がより普及しているにもかかわらず、Mo-MDSCがより有効な免疫抑制薬とみなされている(50)。
20年にわたり、ヒトがん研究は、T細胞サプレッサー機能を有する骨髄細胞の存在を実証してきた(9、51〜53)。数年にわたる学術名の混乱の後、近年の許容できるヒトMDSCマーカーとしては、Lin-、HLA-DRlo、CD11b+、CD33+、CD14+細胞が挙げられる。さらなるサブセットの定義としては、Mo-MDSCについてはCD14+及びG-MDSCについてはCD15+の使用が挙げられてきた(9、54)。MDSCの可塑性の原因はこのMDSC集団における多様性にあったが、機能的分析と治療的標的化の両方が、マウスMDSCとヒトMDSCとのオーバーラップの欠如によって妨げられている。疾患及び後続の操作におけるMDSC生成に関する全ての動物データのほとんどはCD11b+Gr-1+MDSCを追跡することに基づいており、複数の表現型の特徴付けを有するヒトMDSCと関連づけられている。本発明の研究の目的は、マウス及びヒトMDSCを同定するだけでなく、これらの細胞の機能的な性質(すなわちNOベースのT細胞の抑制機能及びNK細胞の細胞傷害性)も同定するMDSCの共通のマーカーを発見することであった。ますます多くの臨床研究が、例えばがんワクチン又は養子T細胞療法等の標準的な化学療法又は免疫療法と併用するかしないかにかかわらず、抗腫瘍応答を改善するためにMDSCを阻害することの重要性を考慮しつつあることから(30、54)、それに続く適切なMDSC頻度のモニターを用いた臨床転帰が、重要になると予想される。
遺伝子発現のプロファイリング後、多数の異なる移植腫瘍モデルに加えて自然発生型膵臓がんモデルからのMDSCでTspan33発現を観察した(24)。本発明のデータから、CD11b+Gr-1+細胞は、Tspan33を発現すること、更に、異なる源から得られたTspan33+細胞は、それらの免疫抑制能力においても機能的に類似していることが示唆される。したがって、腫瘍を有するマウスの脾臓から、又は骨髄細胞由来MDSCから単離されたTspan33+細胞は、CD4増殖、抗原非依存性のCD8機能に加えてNK細胞の細胞傷害性を抑制することにおいて等しく有効であった。これらのTspan33+細胞は、一般的に記述されるマウス由来MDSCに類似してNOS2及びARG1を発現したことから、本発明者らは、Tspan33+細胞を免疫抑制性MDSCを表すと特徴付けた。更に、Tspan33+細胞は、GM-CSF及びIL-6との組合せの処理によってPBMCからも生成され(Lechnerら[39]によって実証された通り)、更にこれらの細胞(CD33を発現する)は、NOS2、TGFベータ、IL-6及びVEGFを発現することから、サイトカイン誘導MDSCはTspan33+細胞の集団によっても示されることが示唆され、それによりこの免疫抑制性集団におけるTspan33発現の役割が裏付けられる。
本発明者らは、脾臓及び複数のがん型の腫瘍浸潤細胞において観察できる骨髄細胞のヘテロジニアスな集団を特徴付け、これらの細胞はまた、それらの細胞表面におけるTspan33発現に基づき分類することもできることを示した。マウスBM細胞は、従来のCD11b、Gr-1マーカーを発現するMDSCに分化させることができ、本明細書で示した通り、CD11b+Gr-1hi(Ly6GhiLy6Clo/int)G-MDSC及びCD11b+Gr-1lo(Ly6G-Ly6Chi)Mo-MDSCは、Mo-MDSCであるTspan33+骨髄細胞に更に分類することができる。これらのTspan33+MDSCはNOS2を発現し、T細胞抑制性であり、NK細胞溶解活性を阻害する。重要なことに、Tspan33+骨髄細胞はまた、PBMCがGM-CSF及びIL-6で処理される場合、又はそれらが複数のがん細胞株由来のCMの存在下で培養される場合、in vitroでも生成される。これらの結果は、Tspan33+骨髄細胞が、マウスのがん及びin vitroで生成したヒトPBMC由来MDSC集団中に存在する真に免疫抑制性のMo-MDSCであることを裏付ける。
MDSCの枯渇又は阻害が、免疫プロファイルの改善を実証し、有効ながんワクチンを開発しようとする数々の近年の試みにおいて有益であることが証明された一方で(54、58)、全てのこれらの研究は、MDSCの頻度、機能を減少させるか又はそれらの分化を引き起こす複数の薬物を使用してきた。しかしながら、選択的な標的化されたMDSC枯渇は、それでもなお利用可能ではない。MDSCを枯渇させるのに抗Gr-1抗体が使用され、動物腫瘍モデルにおいて有効な転帰を示してきたが(例えば59、60)、単球及び樹状細胞の亜集団を包含する異なる細胞型におけるGr-1の発現(61)は、限定的な臨床的価値を有するMDSCのこのような抗体ベースの定義を利用する。また中和抗体を用いたGr-1+細胞の枯渇も抗腫瘍作用がないことが再度示され(62、63)、これは、他の細胞型での広範な作用に起因する可能性がある。ヒトMDSCはGr-1を発現しないが、動物におけるGr-1抗体媒介MDSC枯渇を用いた転帰の改善を実証する研究はここでも、標的化された抗MDSC療法への必要性を強調する。
Tspan33
Tspan33は、本明細書に記載される場合、GM-CSF及びIL-6又はがん細胞馴化培地により免疫抑制細胞に変換された、腫瘍を有するマウス由来の、マウス骨髄細胞由来の、及びヒトPBMC由来のMDSCを認識する新しい表面マーカーである。Tspan33+細胞は、マウスの乳腺癌及び膵管腺癌の遺伝モデルにおけるマウスの脾臓及び腫瘍浸潤に存在する。Tspan33は、マウスMDSC及びヒトPBMC由来免疫抑制細胞の機能的集団を同定するものであり、臨床的な応用に適している。
Tspan33はまた、Penumbraとしても公知であり、典型的には4つの膜貫通ドメインを有するテトラスパニンファミリーのメンバーをコードする。遺伝子は、7q32.1に配置されており、9つのエクソンを包含し、およそ25kbにわたり(Chenら、Cancer Genet. Cytogenet. 162: 95〜98、2005)、Tspan33における突然変異は、7qが欠失(Id.)した骨髄悪性腫瘍の7つの分析したケースのうち5つにおいて見出された。またPasquiniら、「Cloning and characterization of human Penumbra: a gene encoding a new erythroid membrane protein that modulates the proliferation and adhesion of proerythroblasts/erythroblasts.」Blood 102: 212a(抄録)、2003も参照されたい。
配列番号1は、例示的なヒトTspan33タンパク質配列である。
1 MARRPRAPAA SGEEFSFVSP LVKYLLFFFN MLFWVISMVM VAVGVYARLM KHAEAALACL
61 AVDPAILLIV VGVLMFLLTF CGCIGSLREN ICLLQTFSLC LTAVFLLQLA AGILGFVFSD
121 KARGKVSEII NNAIVHYRDD LDLQNLIDFG QKKFSCCGGI SYKDWSQNMY FNCSEDNPSR
181 ERCSVPYSCC LPTPDQAVIN TMCGQGMQAF DYLEASKVIY TNGCIDKLVN WIHSNLFLLG
241 GVALGLAIPQ LVGILLSQIL VNQIKDQIKL QLYNQQHRAD PWY(配列番号1)。
以下のTable A(表1)に、ヒト及び他の種における核酸及びアミノ酸のGenBank受託番号を示す。ゲノム配列は、NC_000007.14にある(範囲129144716〜129169694;参照GRCh38.p2一次アセンブリ)。
処置方法
本明細書で実証されたように、ヒト腫瘍におけるMDSCは、Tspan33の発現により、任意選択で例えばLin-、HLA-DRlo、CD11b+、CD33+、CD14+細胞等の他のマーカーの発現により、同定することができる。一部の実施形態において、Tspan33に加えてCD33、CD14の1つ又は複数の発現、及びHLA-DRの低発現が、MDSCを同定するのに使用される。したがって、本明細書に記載される方法は、がんの処置のための方法を包含する。一般的に、本方法は、治療有効量の、本明細書に記載されるようなTspan33を標的化する分子、例えば抗Tspan33抗体を、このような処置が必要な、又はこのような処置が必要であることが決定された対象に投与することを包含する。一部の実施形態において、本方法は、対象からの試料中(例えば、対象からの試料の腫瘍(例えば、原発性腫瘍、リンパ節、又は転移部位からの)又は末梢血液、CSF、尿、又は骨髄の試料中)の、Tspan33+細胞、すなわちTspan33+MDSCの存在を検出する工程(及び任意選択で、例えばLin-、HLA-DRlo、CD11b+、CD33+、CD14+細胞等の他のマーカーの存在に基づき;一部の実施形態において、Tspan33に加えてCD33、CD14の1つ又は複数の発現、及び/又はHLA-DRの低発現が、MDSCを同定するのに使用される)、及びTspan33+MDSCを枯渇させる療法での処置のために、対象の腫瘍又は血液中にTspan33+MDSCが存在する対象を選択する工程を包含する。
この文脈で使用されるように、「処置する」は、がんの少なくとも1つの臨床パラメーターを向上させることを意味する。一部の実施形態において、パラメーターは、腫瘍サイズ、腫瘍増殖速度、再発、又は転移であり、改善は、腫瘍サイズの低減又は通常急成長する腫瘍において変化がないこと;腫瘍増殖の低減又は中断;再発の低減、再発の遅延、若しくは再発がないこと、又は転移の低減、転移の遅延、若しくは転移がないことと予想される。本明細書に記載されるがんの処置のための治療有効量の化合物の投与は、腫瘍サイズの低減又は通常急成長する腫瘍において変化がないこと;腫瘍増殖の低減若しくは中断;又は転移の低減、転移の遅延、若しくは転移がないことの1つ又は複数をもたらすと予想される。一部の実施形態において、例えば、処置がなされると予想されるがんの再発を予防するように設計された処置は、局所的な腫瘍を例えば外科的に除去した後、又は例えば標準的な化学療法等の他の療法と併用して、又は併用しないで、放射線療法又は標的療法で処置した後に、行われる。理論に制限されることは望まないが、このような処置は、微小転移の休眠状態を維持することによって、例えばそれらの休眠状態が解除されないようにすることによって機能し得る。
用語「過剰増殖性」は、本明細書で使用される場合、細胞が自律的に成長する能力を有すること、すなわち急速に増殖する細胞成長を特徴とする異常な状況又は状態を指す。過剰増殖性の疾患の状況は、病理学的なものとして、すなわち、病状に特徴的であるか又は病状を構成するとして類別することができ、又は非病理学的な状況として、すなわち、正常から逸脱しているが病状に関連しないとして類別することができる。この用語は、組織病理学のタイプ又は侵入の段階に関わりなく、全てのタイプのがん性の成長又は腫瘍形成プロセス、転移性の組織又は悪性の形質転換細胞、組織、若しくは臓器を包含することを意味する。「腫瘍」は、過剰増殖性細胞の異常な成長である。「がん」は、例えば悪性腫瘍の成長を特徴とする病理学的な病状を指す。本明細書に記載される方法は、がん、例えば上皮由来の固形腫瘍を処置するのに使用することができ、これらのがんは、例えばICD-O(国際疾患分類腫瘍学)コード(改訂版3)、セクション(8010〜8790)で定義されている通りであり、例えば早期段階のがんであり、上皮がん細胞におけるサテライトリピートの転写及びプロセシングの増加に起因する相当レベルのサテライトの存在に関連する。したがって本方法は、腫瘍細胞、例えば上皮由来の固形腫瘍由来の細胞、例えば、膵臓がん、肺がん、乳がん、前立腺がん、腎臓がん、卵巣がん又は結腸/結腸直腸がんの細胞であることがわかっているか又はその疑いのある細胞を含む試料中のサテライトリピートへの干渉を包含し得る。
上皮由来のがんとしては、膵臓がん(例えば、膵臓腺癌)、肺がん(例えば、非小細胞肺癌又は小細胞肺癌)、肝臓がん(例えば、肝細胞癌)、前立腺がん、乳がん、腎臓がん、卵巣がん、又は結腸がんを挙げることができる。白血病としては、AML、CML又はCLLを挙げることができ、一部の実施形態において、がん性のMDSCを含む。本方法は、浸潤性がん発生を予防するための手段として初期の前新生物がんを処置するのにも使用することができる。
療法のための対象の選択
MDSCとしてのTspan33+細胞の同定は、MDSCを枯渇させるための療法(本明細書ではMDSC枯渇療法とも称される)によって利益を得る可能性が他者より高いと特定の患者を同定することを可能にする。したがって、例えば、本方法は、対象からの試料、例えばがん組織の生検試料、又は末梢血液試料、又は骨髄試料中の、Tspan33+MDSCのレベルを決定する工程、及びそのレベルを参照レベルと比較する工程を包含していてもよい。対象が、参照レベルを超えるTspan33+MDSCのレベルを有する場合、その対象は、MDSC枯渇療法によって利益を得る可能性がより高く、MDSC枯渇療法のために選択されると予想される(任意選択でそれが投与されてもよい)。一部の実施形態において、対象が、参照レベル未満のTspan33+MDSCのレベルを有する場合、その対象は、MDSC枯渇療法ではない療法、例えば免疫療法によって利益を得る可能性がより高く、特異的にMDSCを欠失させない療法のために選択されるべきである(任意選択でそれが投与されてもよい)。
好適な参照レベルは、対象の集団の慣例的な統計的分析を使用して決定してもよく、例えば、MDSC枯渇療法への応答及び免疫療法開始時のTspan33+MDSCレベルによって層別化した対象の集団におけるパーセンタイルごとのカットオフレベル、例えば、Tspan33+MDSCレベルによって層別化した対象の最も低い五分位数、四分位数、若しくは三分位数、又はそれを超えると対象が免疫療法に応答する可能性がそれほど高くなくなる他の閾値を表していてもよい。他の参照レベルも使用することができる。MDSC枯渇療法としては、本明細書に記載されるようにTspan33+MDSCを枯渇させるように具体的に標的化した療法、加えて免疫療法及び他の免疫枯渇療法を挙げることができる。
抗がん療法
一部の実施形態において、本方法は、対象に、例えば、本明細書に記載されるようなTspan33+MDSC枯渇療法(例えば、本明細書に記載されるようなTspan33を標的化する分子の投与)を使用して処置される対象に、又は本明細書に記載される方法を使用して選択される対象に、すなわち、Tspan33+細胞のレベルが閾値を超えるか閾値未満であるとして同定された対象に、抗がん療法を投与することを包含する。がん処置としては、当業界において公知のもの、例えば、コールドインストルメント又はレーザーを用いた外科的切除、放射線療法、光線療法、生物学的療法(例えば、チロシンキナーゼ阻害剤を用いた)、高周波アブレーション(RFA)、放射線塞栓療法(例えば、90Y球体を用いた)、化学療法、及び免疫療法が挙げられる。化学療法剤の非限定的な例としては、シクロホスファミド、メクロレタミン、クロラムブシル(chlorabucil)、メルファラン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、バルルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、エトポシド、テニポシド、タフルポシド(tafluposide)、アザシチジン、アザチオプリン(axathioprine)、カペシタビン、シタラビン、ドキシフルリジン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、メルカプトプリン、メトトレキセート、チオグアニン、ブレオマイシン、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、オールトランスレチノイン酸、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、及びベバシズマブ(又はそれらの抗原結合フラグメント)が挙げられる。抗がん処置のさらなる例は当業界において公知であり、例えばAmerican Society of Clinical Oncology(ASCO)、European Society for Medical Oncology(ESMO)、又はNational Comprehensive Cancer Network(NCCN)からの療法ガイドラインを参照されたい。
一部の実施形態において、本方法は、対象に、例えば、MDSC枯渇療法を使用して処置される対象に、又は本明細書に記載される方法を使用して選択される対象に、すなわち、Tspan33+細胞のレベルが閾値未満であるとして同定された対象に、免疫療法を投与することを包含する。免疫療法としては、腫瘍によって誘導された免疫抑制を標的化する療法が挙げられる;例えば、Stewart及びSmyth、Cancer Metastasis Rev. 2011年3月; 30(1): 125〜40を参照されたい。本明細書に記載される方法において有用な免疫療法としては、Tspan33+MDSCを特異的に枯渇させる療法、例えば、本明細書に記載されるようなTspan33を標的化する分子の投与を包含する療法;MDSCを非特異的に枯渇させる療法、例えば、Tspan33+MDSC集団を特異的に標的化しない可能性があるが、それでもなおTspan33+MDSC及び/又は他のMDSCの枯渇、局在化の変更、又は活性の低減を引き起こす可能性がある療法(本明細書では一般的に「非特異的MDSC枯渇免疫療法」と称される);及びMDSCを枯渇させない療法(本明細書では「非MDSC枯渇免疫療法」と称される)が挙げられる。一部の実施形態において、本方法は、Tspan33を標的化する分子の投与と同時に又はそれに続いて、免疫療法、例えば非特異的MDSC枯渇免疫療法又は非MDSC枯渇免疫療法を対象に共投与することを包含する。一部の実施形態において、本方法は、腫瘍又は対象(例えば、骨髄、脾臓、又は末梢血液)に存在するMDSCの数を、実質的に枯渇させるのに十分な時間、例えば処置前レベルの50%未満のレベルに、例えば処置前レベルの40%、30%、20%、又は10%未満にするのに十分な時間、例えば、少なくとも1週間、2週間、3週間、又は1カ月又はそれより長く、Tspan33を標的化する分子を投与すること、次いで免疫療法を投与することを包含し、Tspan33を標的化する分子は、免疫療法と共に投与し続けてもよいし、又は2つの処置様式を交互に行ってもよい。
非MDSC枯渇免疫療法
抗がん免疫性を促進するが特異的にMDSCを枯渇させない(又はMDSCを特異的に枯渇させることが公知ではないか若しくはそのように設計されていない)多数の免疫療法が当業界において公知である。一部の実施形態において、これらの療法は、例えば、免疫調節性の細胞型の数を低減させること、機能を変更すること、又は腫瘍局在化を予防することによって、例えば調節性T細胞(Treg)又はM2極性化マクロファージ等の他の免疫調節性の細胞型を主として標的化する可能性がある。例えば、Treg標的療法としては、抗GITRモノクローナル抗体(TRX518)、シクロホスファミド(例えば、規則正しい用量)、三酸化ヒ素、パクリタキセル、スニチニブ、オキサリプラチン、PLX4720、アントラサイクリンベースの化学療法、ダクリズマブ(抗CD25);免疫毒素、例えばオンタック(Ontak)(デニロイキンジフチトクス);リンパ除去(lymphoablation)(例えば、化学的又は放射線リンパ除去)及びVEGF-VEGFRシグナル伝達軸を選択的に標的化する薬剤、例えば、VEGFをブロックする抗体(例えば、ベバシズマブ)、又はVEGFRチロシンキナーゼ活性の阻害剤(例えば、レンバチニブ)若しくはATP加水分解の阻害剤(例えば、エクトヌクレオチダーゼ阻害剤、例えばARL67156(6-N,N-ジエチル-D-β,γ-ジブロモメチレンATP三ナトリウム塩)、8-(4-クロロフェニルチオ)cAMP(pCPT-cAMP)及び関連する環状ヌクレオチド類似体(8-[4-クロロフェニルチオ]cGMP;pCPT-cGMPを使用)、並びにWO2007135195に記載されているもの、同様にCD73又はCD39に対するmAb)が挙げられる。またドセタキセルも、M2マクロファージへの作用を有する。例えば、Zitvogelら、Immunity 39: 74〜88(2013)を参照されたい。別の例において、M2マクロファージ標的療法としては、クロドロネートリポソーム(Zeisbergerら、Br J Cancer. 95: 272〜281(2006))、DNAベースのワクチン(Luoら、J Clin Invest. 116(8): 2132〜2141(2006))、及びM2マクロファージ標的化アポトーシス促進性ペプチド(Cieslewiczら、PNAS. 110(40): 15919〜15924(2013))が挙げられる。ナチュラルキラーT(NKT)細胞を標的化する免疫療法も使用することができ、例えば、II型NKTよりもI型NKTを維持する免疫療法(例えば、CD1dのI型アゴニストリガンド)又はNKTの免疫抑制機能を阻害する、例えばTGF-ベータに拮抗するか又はCD1dを中和する免疫療法がある。
いくつかの有用な免疫療法は、免疫性の代謝プロセスを標的化するものであり、アデノシン受容体アンタゴニスト及び小分子阻害剤、例えばイストラデフィリン(KW-6002)及びSCH-58261;インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO)阻害剤、例えば、小分子阻害剤(例えば、1-メチル-トリプトファン(1MT)、1-メチル-d-トリプトファン(D1MT)、及びToho-1)若しくはIDO特異的siRNA、若しくは天然産物(例えば、ブラシニン又はエキシグアミン(exiguamine))(例えば、Munn、Front Biosci(Elite Ed). 2012年1月1日; 4: 734〜45を参照)、又はIDOの代謝産物を中和するモノクローナル抗体、例えばN-ホルミル-キヌレニンに対するmAbが挙げられる。
一部の実施形態において、免疫療法は、サイトカイン及びケモカイン、例えばIL-10、TGF-ベータ、IL-6、CCL2及びがんにおける免疫抑制に関連する他のもの等の作用に拮抗してもよい。例えば、TGF-ベータを中和する療法としては、抗TGF-ベータ抗体(例えばフレソリムマブ(fresolimumab)、インフリキシマブ、レルデリムマブ(Lerdelimumab)、GC-1008)、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド(例えば、トラベデルセン)、及びTGF-ベータの小分子阻害剤(例えばLY2157299)が挙げられる(Wojtowicz-Praga、Invest New Drugs. 21(1): 21〜32(2003))。免疫抑制サイトカインに拮抗する療法の別の例としては、抗IL-6抗体(例えばシルツキシマブ)(Guoら、Cancer Treat Rev. 38(7): 904〜910(2012))を挙げることができる。また、IL-10又はその受容体に対するmAb、例えば、Llorenteら、Arthritis & Rheumatism、43(8): 1790〜1800、2000(抗IL-10mAb)、又はNewtonら、Clin Exp Immunol. 2014年7月; 177(1): 261〜8(抗インターロイキン-10R1モノクローナル抗体)に記載されるもののヒト化バージョンも使用することができる。CCL2又はその受容体に対するmAbも使用することができる。一部の実施形態において、サイトカイン免疫療法は、US8476246に記載されるような一般的に使用される化学療法剤(例えば、ゲムシタビン、ドセタキセル、シスプラチン、タモキシフェン)と組み合わされる。
一部の実施形態において、免疫療法としては、がんに対する免疫応答を刺激する「危険」シグナル、例えば「PAMP」(病原体関連分子パターン)又は「DAMP」(傷害関連分子パターン)を惹起すると考えられる薬剤を挙げることができる。例えば、Pradeu及びCooper、Front Immunol. 2012、3: 287; Escamilla-Tilchら、Immunol Cell Biol. 2013年11月〜12月; 91(10): 601〜10を参照されたい。一部の実施形態において、免疫療法は、Toll様受容体(TLR)をアゴナイズして、免疫応答を刺激することができる。例えば、TLRアゴニストとしては、ワクチンアジュバント(例えば、3M-052)及び小分子(例えば、イミキモド、ムラミールジペプチド、CpG、及びミファムルチド(ムラミルトリペプチド))、加えて多糖類クレスチン及び内毒素が挙げられる。Galluziら、Oncoimmunol. 1(5): 699〜716(2012)、Luら、Clin Cancer Res. 2011年1月1日; 17(1): 67〜76、US8795678及びUS8790655を参照されたい。一部の実施形態において、免疫療法は、抗がん免疫応答を惹起するサイトカインの投与を含んでいてもよく、Lee及びMargolin、Cancers. 3: 3856〜3893(2011)を参照されたい。例えば、サイトカインIL-12が投与されてもよく(Portieljeら、Cancer Immunol Immunother. 52: 133〜144(2003))、又は遺伝子療法として投与されてもよい(Meleroら、Trends Immunol. 22(3): 113〜115(2001))。別の例において、インターフェロン(IFN)、例えばIFNガンマが、アジュバント療法として投与することができる(Dunnら、Nat Rev Immunol. 6: 836〜848(2006))。
一部の実施形態において、免疫療法は、抗がん免疫応答を強化するために細胞表面受容体に拮抗することができる。例えば、抗がん免疫応答をブーストするアンタゴニストのモノクローナル抗体としては、CTLA-4を標的化する抗体(イピリムマブ、Tarhini及びIqbal、Onco Targets Ther. 3: 15〜25(2010)及びUS7741345を参照、又はトレメリムマブ)又はPD-1を標的化する抗体(ニボルマブ、Topalianら、NEJM. 366(26): 2443〜2454(2012)及びWO2013/173223A1を参照、ペンブロリズマブ/MK-3475、ピディリズマブ(CT-011))を挙げることができる。
いくつかの免疫療法は、腫瘍部位へのT細胞動員を強化したり(例えば、エンドセリン受容体-A/B(ETRA/B)の例えばマシテンタンを用いた封鎖、又はETRA及びETRBアンタゴニストであるBQ123及びBQ788の組合せ等、Coffmanら、Cancer Biol Ther. 2013年2月; 14(2): 184〜92を参照)、又はCD8T細胞メモリー細胞形成を強化したりする(例えば、ラパマイシン及びメトホルミンを使用するもの、例えば、Pearceら、Nature. 2009年7月2日; 460(7251): 103〜7; Mineharuら、Mol Cancer Ther. 2014年9月25日.pii: molcanther. 0400. 2014;及びBerezhnoyら、Oncoimmunology. 2014年5月14日; 3: e28811を参照)。免疫療法はまた、アジュバントと共にエクスビボで拡張した自己又は同種の腫瘍反応性リンパ球、例えば、樹状細胞又はペプチドを移入することを含む養子細胞移入(ACT);がんワクチン、例えば、DNAベースのワクチン、サイトカイン(例えば、IL-2)、シクロホスファミド、抗インターロイキン-2R免疫毒素、プロスタグランジンE2阻害剤(例えば、SC-50を使用)及び/又はチェックポイント阻害剤、例えば抗CD137(BMS-663513)、抗PD1(例えば、ニボルマブ、ペンブロリズマブ/MK-3475、ピディリズマブ(CT-011))、抗PDL1(例えば、BMS-936559、MPDL3280A)、又は抗CTLA-4(例えば、イピリムマブ(ipilumimab))等の抗体等の1つ又は複数を投与することを包含していてもよい。例えば、Krugerら、「Immune based therapies in cancer」、Histol Histopathol. 2007年6月; 22(6): 687〜96; Eggermontら、「Anti-CTLA-4 antibody adjuvant therapy in melanoma」、Semin Oncol. 2010年10月; 37(5): 455〜9; Klinke DJ 2nd、「A multiscale systems perspective on cancer, immunotherapy, and Interleukin-12」、Mol Cancer. 2010年9月15日; 9: 242; Alexandrescuら、「Immunotherapy for melanoma: current status and perspectives」、J Immunother. 2010年7月〜8月; 33(6): 570〜90; Moschellaら、「Combination strategies for enhancing the efficacy of immunotherapy in cancer patients」、Ann N Y Acad Sci. 2010年4月; 1194: 169〜78; Ganesan及びBakhshi、「Systemic therapy for melanoma」、Natl Med J India. 2010年1月〜2月; 23(1): 21〜7; Golovina及びVonderheide、「Regulatory T cells: overcoming suppression of T-cell immunity」、Cancer J. 2010年7月〜8月; 16(4): 342〜7を参照されたい。一部の実施形態において、本方法は、例えば、WO2009/114547及びそこで引用された文献に記載されるような、腫瘍パルス樹状細胞を含む組成物を投与することを包含する。Shiaoら、Genes & Dev. 2011. 25: 2559〜2572も参照されたい。
MDSC枯渇療法
本明細書に記載される方法はまた、MDSCを枯渇させる、MDSC(任意選択でTspan33+MDSCを包含する)の局在化を変更する、又はMDSCの活性を低減する処置を投与することを包含していてもよい。一部の実施形態において、処置は、Tspan33+MDSCを特異的に標的化すると予想され、例えば、本明細書に記載されるようなTspan33を標的化する分子の投与を包含すると予想される。一部の実施形態において、処置は、Tspan33+MDSC集団を特異的に標的化しない場合があるが、それでもなおTspan33+MDSC及び/又はあらゆるTspan33+MDSCの枯渇、変更された局在化、又は低減された活性をもたらす(本明細書では一般的に「非特異的なMDSC枯渇免疫療法」と称する)。例えば、多数のがん処置がMDSCのレベルを減少させることが示されており、このような処置としては、ホスホジエステラーゼ-5(PDE-5)阻害剤、例えばシルデナフィル及びタダラフィル等;ニトロアスピリン(NO-アスピリン);合成トリテルペノイド、例えばバルドキソロンメチル(CDDO-Me)等、シクロオキシゲナーゼ2(COX2)阻害剤、例えばセレコキシブ及びロフェコキシブ等;アルギナーゼ阻害剤、例えばN-ヒドロキシ-L-アルギニン(NOHA)、nor-NOHA、ニトロアスピリン、又はN(G)-ニトロ-L-アルギニンメチルエステル(L-NAME)等;NF-κB阻害剤;一酸化窒素合成酵素の阻害剤、例えば1-NMMA、ニトロアスピリン;コロニー刺激因子及びその受容体の阻害剤、例えば、CSF-1Rをブロックするモノクローナル抗体(例えばIMC-CS4)、加えてCSF-1Rの小分子阻害剤(例えばPLX3397)又はcFMSキナーゼ(例えば、GW2580);ヒスタミン又はH2ブロッカー、例えばシメチジン等;IL-17;オールトランスレチノイン酸(ATRA);ビタミンD3又はビタミンA;TLR9リガンドアゴニスト、例えばCpGオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)等;ニトロ-ビスホスホネート(N-ビスホスホネート)、例えばゾレドロン酸等;STAT3活性化の阻害剤、例えばペプチドミメティクス、小分子阻害剤(例えば、クルクルミン(curcurmin)の誘導体、例えばククルビタシンB(CuB)等)、及び白金剤、例えばシスプラチン等;スニチニブ;ゲムシタビン;5-フルオロウラシル(5-FU);パクリタキセル;熱ショックタンパク質90(HSP90)阻害剤、例えば17-DMAG(17-ジメチルアミノエチルアミノ-17-デメトキシゲルダナマイシン)等;緑膿菌外毒素に連結されたIL-13(IL-13-PE);及び抗Gr1+抗体が挙げられる。例えば、Wesolowskiら、J Immunother Cancer. 1: 10(2013) doi: 10. 1186/2051-1426-1-10. eCollection 2013を参照されたい。
Tspan33+MDSCのレベルをモニターすること
対象におけるMDSCレベルをモニターする、例えば、療法(例えば、免疫療法、本明細書に記載されるようなMDSCを枯渇させることを意図した処置、又はMDSCレベルに影響を与えることがわかっているか又はその疑いがある可能性があるか若しくは可能性がない別のがん療法)の効能をモニターするのに使用できる方法が、本明細書に記載される。これらの実施形態において、Tspan33+細胞のレベルは、複数回検出され(例えば、例えば生検試料等の腫瘍からの試料中で、又は循環系、例えば血液試料中で)、Tspan33+細胞レベルの変化は、療法の効能を示す。例えば、腫瘍中のTspan33+細胞の減少は、免疫抑制の低減、例えば、MDSCの枯渇において療法が効果的であることを示す。これは特に、例えば本明細書に記載されるような免疫療法又はTspan33+MDSCを枯渇させることを意図した処置等の療法に関連するが、Tspan33+MDSCの減少はまた、他のタイプの療法が、MDSCの生成/移動を可能にする因子の除去等を含み得るメカニズムによってMDSCを枯渇させることも示す。加えて、対象においてTspan33+MDSCのレベルをモニターすることは、いつ療法を開始するかを決定するのに使用することができる。例えば、これらのモニター方法は、免疫療法が投与される前に、Tspan33+細胞を枯渇させるために処置される(例えば、本明細書に記載される方法を使用して)対象において免疫療法をいつ投与するかを決定するのに使用することができる。MDSCの枯渇が望ましくない条件について、例えば自己免疫疾患において、MDSCのレベルは、同様にモニターすることができ、これらのケースにおいて、MDSCの増加は、療法への改善された応答と相関する。
対象におけるMDSCレベルに対するがん療法の作用を決定又はモニターするのに使用できる方法も、本明細書に記載される。上述した方法に類似して、Tspan33+細胞のレベルは、複数回検出され(例えば、例えば生検試料等の腫瘍からの試料中で、又は循環系、例えば血液試料中で)、Tspan33+レベルの変化は、療法が、MDSCレベルに作用を有することを示す(すなわち、Tspan33+レベルの増加は、療法がMDSCレベルを増加させることを示し、Tspan33+レベルの減少は、療法がMDSCレベルを減少させることを示す)。一部の実施形態において、この情報は、追加の療法が使用されるべきかどうか、例えば、MDSCを標的化する追加の療法が最初の療法に追加されるべきかどうかを決定するのに使用することができる。したがって本方法は、複数の治療様式を選択するのに使用することができ、最初の療法の投与後にTspan33+MDSCの増加が検出される場合、本明細書に記載されるようなMDSCレベルを低減する追加の療法が選択される可能性がある(任意選択で投与される)。
加えて、療法の効能を予測するための方法が本明細書に記載される。腫瘍負荷量とMDSC頻度との直接の関係は、数種のマウスモデル(Younosら、Int. Immunopharmacol. 13: 245〜256(2012); Donkorら、Int. Immunopharmacol. 9: 937〜948(2009))及び膵臓がんのヒト臨床研究(Porembkaら、Cancer Immunol. Immunother. 61: 1373〜1385(2012));神経膠腫(Kohanbash及びOkada、Immunol Invest. 41(6〜7): 658〜79(2012));胃がん(Wangら、J. Immunol. 190、794〜804(2013));結腸直腸癌(Zhangら、PLoS One. 8(2): e57114(2013));乳がん(Markowitzら、Breast Cancer Res Treat. 140(1):13〜21(2013); Gabitassら、Cancer Immunol Immunother. 60(10): 1419〜30(2011));及び乳がん等の固形腫瘍(Diaz-Monteroら、Cancer Immunol. Immunother. 58: 49〜59(2009))で実証されている。したがって、MDSCレベルの低減(本明細書ではTspan33+レベルの減少によって決定される場合)は、腫瘍の縮小と相関し、MDSCのより高いレベル(Tspan33+レベルの増加によって、又は閾値を超える、例えば応答する可能性が高い対象におけるレベルを表す閾値を超えるTspan33+レベルの存在によって示される場合)は、療法への応答が不良であるか応答がないことを予測する。
モニター方法は、第1又はベースラインTspan33+細胞のレベルを決定すること、次いで経時的に、例えば、1つ又は複数の処置、例えばTspan33+細胞を枯渇させることを意図した処置又は免疫療法の投与の後又はその間に、1つ又は複数の後続のレベルを決定することを包含し得る。試料中のTspan33+細胞を検出する、任意選択でそれを定量するための、当業界において公知の方法を使用することができ、例えば、固体又は液体試料でのイムノアッセイ(例えば、検出可能な第1又は第2の抗体、例えば、蛍光標識した又は酵素的に検出可能な抗体);若しくはセルソーティング(例えば、流体試料中の蛍光活性化セルソーティング)を使用した、又はウェスタンブロット又はRNAベースの発現分析による方法がある。
ほとんどの実施形態においてTspan33タンパク質の検出が使用されると予想されるが、例えばRNAインサイチュハイブリダイゼーション又は当業界において公知の他の方法を使用したTspan33のmRNAの検出も、使用することができる。
MDSCの二次マーカー
一部の環境において、MDSCを同定するためにTspan33に加えて二次マーカーを使用することが望ましい場合がある。一例として、in vitroで拡張した細胞の場合、Tspan33単独を使用することができる。一部の実施形態において、例えば、試料中に造血細胞の混成集団が存在する場合、例えば、Tspan33が試料中の特定の他の細胞型で発現される可能性がある場合、二次マーカーの使用が望ましい可能性がある。これらのケースにおいて、CD33又はCD14の検出も使用が可能であり、すなわち、Tspan33+CD33+、Tspan33+CD14+、又はTspan33+CD33+CD14+細胞の検出は、本明細書に記載される方法のいずれにおいても使用することができる。代替として、又は加えて、二次マーカーは、非MDSCを排除するのにも使用することができ、例えばABO式血液型若しくはグリコホリンA陽性RBCの抗原、又はディエゴ抗原等のマーカーが、赤血球を排除するのに使用することができる。他の排除のための二次マーカーとしては、HLA-DR高(high)及びLin陽性集団を挙げることができる。
Tspan33を標的化する分子
また、Tspan33を標的化し、MDSC枯渇療法、予後予測、及び診断、並びにそのような分子を同定するための方法において有用な分子も本明細書に記載される。本明細書に記載される方法は、Tspan33を標的化することによってTspan33+MDSCを枯渇させる分子を投与することを包含し得る。このような分子としては、抗体又は他の治療化合物、例えば、小分子、ポリペプチド、ペプチド、又は阻害性核酸を挙げることができる。
抗Tspan33抗体
用語「抗体」は、本明細書で使用される場合、免疫グロブリン分子又はその抗原結合部位を指す。免疫グロブリン分子の抗原結合部位の例としては、抗原への結合能力を保持するF(ab)及びF(ab')2フラグメントが挙げられる。抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、組換え、キメラ、脱免疫化若しくはヒト化、完全ヒト、非ヒト(例えば、マウス)、又は単鎖抗体であり得る。一部の実施形態において、抗体は、エフェクター機能を有し、補体を固定することができる。一部の実施形態において、抗体は、Fc受容体に結合する能力が低減されているか、そのような能力がない。例えば、抗体は、Fc受容体への結合を支持しない、例えばFc受容体結合領域が変異誘発を受けているか又は欠失したアイソタイプ若しくはサブタイプ、フラグメント又は他の突然変異体であり得る。抗体及びそのフラグメントを作製するための方法は当業界において公知であり、例えば、Harlowら編、Antibodies: A Laboratory Manual(1988);Goding、Monoclonal Antibodies: Principles and Practice(N. Y. Academic Press 1983); Howard及びKaser、Making and Using Antibodies: A Practical Handbook(CRC Press;第1版、2006年12月13日); Kontermann及びDubel、Antibody Engineering 1巻(Springer Protocols)(Springer;第2版、2010年5月21日); Lo、Antibody Engineering: Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology)(Humana Press; 2010年11月10日);及びDubel、Handbook of Therapeutic Antibodies: Technologies, Emerging Developments and Approved Therapeutics(Wiley-VCH;第1版、2010年9月7日)を参照されたい。抗ICAM抗体を作製するのにこれらの方法のどれでも使用することができる。加えて、ヒトTspan33に結合する抗体は当業界において公知であり、例えば、Abbexa社;Abeam社;Abnova Corporation社;Acris Antibodies GmbH社;antibodies-online社;Atlas Antibodies社;Aviva Systems Biology社;Creative Diagnostics社;LifeSpan Biosciences社;Novus Biologicals社;R&D Systems社;Santa Cruz Biotechnology, Inc.社;St John's Laboratory社;及びUnited States Biological社から市販されている。
本明細書で使用される場合、用語「キメラ抗体」は、少なくとも1つのヒト定常領域を含むように操作された抗体を指す。例えば、マウス抗体(例えば、マウスモノクローナル抗体)の、軽鎖の可変領域の1つ若しくは全て(例えば、1つ、2つ、又は3つ)及び/又は重鎖の可変領域の1つ若しくは全て(例えば、1つ、2つ、又は3つ)がそれぞれ、ヒト定常領域、例えばこれに限定されないがIgG1ヒト定常領域に接続されていてもよい。キメラ抗体は、典型的には、非キメラ抗体に比べてヒトに対する免疫原性がより低いため、特定の状況において治療上の利益を提供する。当業者であれば、キメラ抗体について認識していると予想され、それらの生成に好適な技術も認識していると予想される。例えば、米国特許第4,816,567号;4,978,775号;4,975,369号;及び米国特許第4,816,397号を参照されたい。
「ヒト化抗体」は、この用語が本明細書で使用される場合、重鎖及び/又は軽鎖の非ヒト(例えば、マウス、ラット、又はハムスター)相補性決定領域(CDR)と共に、可変領域中に1つ又は複数のヒトフレームワーク領域を含むように操作された抗体を指す。一部の実施形態において、ヒト化抗体は、CDR領域を除いて全体的にヒトである配列を含む。ヒト化抗体は、典型的には、非ヒト化抗体に比べてヒトに対する免疫原性がより低いため、特定の状況において治療上の利益を提供する。ヒト化抗体は当業界において公知であり、ヒト化抗体を生成するための好適な技術も公知である。例えば、Hwangら、Methods 36: 35、2005; Queenら、Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86: 10029〜10033、1989; Jonesら、Nature 321: 522〜25、1986; Riechmannら、Nature 332: 323〜27、1988; Verhoeyenら、Science 239: 1534〜36、1988; Orlandiら、Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86: 3833〜3837、1989;米国特許第5,225,539号;5,530,101号;5,585,089号;5,693,761号;5,693,762号;及び6,180,370号;並びにWO90/07861を参照。
本明細書で使用される場合、用語「完全ヒト抗体」は、ヒト由来のアミノ酸配列のみを含有する抗体又は抗体の抗原結合フラグメントである。例えば、完全ヒト抗体は、ヒトB細胞又はヒトハイブリドーマ細胞から産生することができる。追加の実施形態において、抗体は、ヒト重鎖免疫グロブリン及びヒト軽鎖免疫グロブリンに関する遺伝子座を含有するか、又は特異的なヒト抗体の重鎖及び軽鎖をコードする核酸を含有するトランスジェニック動物から産生することができる。
「相補性決定領域」又は「CDR」は、この用語が本明細書で使用される場合、主として特異的な抗原認識の媒介に関与する重鎖及び軽鎖ポリペプチド両方の可変領域内の短いポリペプチド配列を指す。CDRは、Kabatら、J. Biol. Chem. 252、6609〜6616、1977; Chothiaら、J. Mol. Biol. 196: 901〜917、1987;及びMacCallumら、J. Mol. Biol. 262: 732〜745、1996により記述されている。各VL及び各VH内には、3つのCDR(CDR1、CDR2、及びCDR3と称される)がある。
「フラグメント」又は「抗体フラグメント」は、この用語が本明細書で使用される場合、全長抗体ポリペプチドを含まないが、それでもなお抗原に結合することができる全長抗体ポリペプチドの少なくとも一部を含む、抗体ポリペプチド分子(例えば、抗体重鎖及び/又は軽鎖ポリペプチド)由来のポリペプチドを指す。抗体フラグメントは、全長抗体ポリペプチドの切断された部分を含み得るが、この用語は、このような切断されたフラグメントに限定されない。抗体フラグメントとしては、例えば、Fabフラグメント、F(ab')2フラグメント、scFv(単鎖Fv)フラグメント、直鎖状抗体、単一特異性又は多重特異性抗体フラグメント、例えば、二重特異性、三重特異性、及び多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体)、ミニボディ、キレート化組換え抗体、トリボディ(tribody)又はバイボディ(bibody)、イントラボディ(intrabody)、ナノボディ、小モジュール免疫薬(SMIP)、結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質、ラクダ化抗体、及びVHH含有抗体等を挙げることができる。抗原結合抗体フラグメントのさらなる例は、当業界において公知である。
「フレームワーク領域」は、この用語が本明細書で使用される場合、CDR配列ではなく、主として抗原結合が許容されるようにCDR配列の正しい位置決めを維持することに関与する、重鎖及び軽鎖ポリペプチド両方の可変領域内のアミノ酸配列を指す。典型的にはフレームワーク領域それ自体は抗原結合に直接参加しないが、当業界において公知のように、特定の抗体のフレームワーク領域内の特定の残基は、抗原結合に直接参加することができるか、又はCDRにおける1つ又は複数のアミノ酸の抗原と相互作用する能力に影響を与えることができる。
一部の実施形態において、抗Tspan33抗体は、二重特異性抗体であり、例えば、結合アームにおいて二重特異性を有するため同時に2つの抗原に結合する抗体である。一部の実施形態において、二重特異性抗体は、同じ細胞上に存在する2つの抗原に結合し、例えば、MDSC上で、例えばTspan33とICAM4、CD33又はCD14との両方に結合する。一部の実施形態において、二重特異性抗体は、2つの異なる細胞(すなわち、2つのタイプの細胞)上に存在する抗原と結合し、例えば、MDSC上のTspan33に加えて、異なるタイプの細胞上に存在する可能性がある抗原、例えば、PD-1、PDL1、GITR、CTLA4、又はCD16Aと結合する。したがって、本方法は、Tspan33と、CD33、CD14、PDL1、PD1、GITR、CTLA4、又はCD16Aとに結合する二重特異性抗体の使用を包含していてもよい。二重特異性抗体を作製するための方法は、当業界において公知であり、例えば、Kuferら、TRENDS in Biotechnology 22(5): 238〜244(2004); Reuschら、mAbs 6(3): 727〜738 (2014); Kudoら、Tohuko J. Exp. Med. 188: 275〜288(1999); Das及びSuresh、Methods Mol Med. 109: 329〜46(2005); Nolan及びO'Kennedy、Biochim Biophys Acta. 1040(1): 1〜11 (1990); Compteら、Oncoimmunology. 2014年5月23日; 3: e28810. eCollection 2014; Jost及びPluckthun、Curr Opin Struct Biol. 27C: 102〜112 (2014);並びにByrneら、Trends Biotechnol. 31(11): 621〜32(2013)を参照されたい。
本明細書に記載されるような抗Tspan33抗体は、腫瘍細胞又はMDSCそれ自身を殺滅するために、様々な抗がん治療剤、例えば、放射線同位体;抗がん薬、例えばジェノトキシン等;又は他のあらゆる細胞傷害性成分、例えば植物、真菌若しくは細菌由来の分子、又は生物学的なタンパク質(例えば、タンパク質毒素)若しくは粒子(例えば、組換えウイルス粒子、例えばウイルスコートタンパク質を介して)、又はそれらの混合物を送達するのに使用することができる。治療剤は、細胞内で活性な薬物又は他の薬剤、例えば、本明細書に記載されるような、狭い範囲の放射線放出体、例えば狭い範囲の、高エネルギーのα-放出体等であり得る。一部の実施形態において、抗Tspan33抗体は、植物又は細菌由来の分子(又はそれらの誘導体)、例えば、メイタンシノイド(例えば、マイタンシノール又はDM1メイタンシノイド)にカップリングされていてもよい。DM1は、例えば標的細胞の内部に存在するときにDM1を放出するジスルフィドリンカーを介してペプチドに連結させることができるメイタンシンのスルフヒドリル含有誘導体である。ジスルフィドリンカーは、貯蔵中及び血清中で他のリンカーより大きい安定性を示す。メイタンシンは、微小管の形成及び既存の微小管の脱重合を防ぐことによって細胞殺滅をもたらす細胞傷害性物質である。これは、現在臨床で使用されているドキソルビシン、メトトレキセート、及びビンカアルカロイド等の抗がん剤より100から1000倍高い細胞傷害性である。代替として、本明細書に記載されるような抗Tspan33抗体は、タキサン、カリケアマイシン、プロテオソーム阻害剤、又はトポイソメラーゼ阻害剤にカップリングされていてもよい。[(1R)-3-メチル-1-[[(2S)-1-オキソ-3-フェニル-2-[(3-メルカプトアセチル)アミノ]プロピル]アミノ]ブチル]ボロン酸が、好適なプロテオソーム阻害剤である。N,N'-ビス[2-(9-メチルフェナジン-1-カルボキシアミド)エチル]-1,2-エタンジアミンが、好適なトポイソメラーゼ阻害剤である。
酵素的に活性な毒素及びそのフラグメントとしては、ジフテリア毒素Aフラグメント、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素A(緑膿菌由来)、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、α-サクリン(sacrin)、特定のシナアブラギリ(Aleurites fordii)タンパク質、特定のジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ(Phytolacca americana)タンパク質(PAP、PAPII及びPAP-S)、ニガウリ(Momordica charantia)阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ(Saponaria officinalis)阻害剤、ゲロニン、ミトギリン、レストリクトシン、フェノマイシン(phenomycin)、及びエノマイシン(enomycin)が例示される。一部の実施形態において、抗Tspan33抗体は、メイタンシノイド、例えばマイタンシノール(米国特許第5,208,020号を参照)、CC-1065(米国特許第5,475,092号、5,585,499号、5,846,545号を参照)にコンジュゲートされている。免疫毒素の酵素的に活性なポリペプチドを調製する手順は、参照により本明細書に組み入れられるW084/03508及びW085/03508に記載されている。抗体にコンジュゲートさせることができる細胞傷害性成分の例としては、アドリアマイシン、クロラムブシル、ダウノマイシン、メトトレキセート、ネオカルチノスタチン、及び白金が挙げられる。
がん細胞又はTspan33+MDSCを殺滅又は除去するために、抗Tspan33抗体は、プロドラッグ活性化剤とごく接近したときにのみ活性化されるプロドラッグとコンジュゲートさせてもよい。プロドラッグ活性化剤は、第2の抗Tspan33抗体、好ましくは同じ受容体(例えば、Tspan33)又は細胞(例えば、CD33)上の非競合部位に結合するものとコンジュゲートされる。2つの抗Tspan33抗体が競合又は非競合結合部位に結合するかどうかは、従来の競合結合アッセイによって決定することができる。使用に好適な薬物-プロドラッグ対は当業界において公知であり、例えば、Blakelyら、Cancer Research 56: 3287〜3292(1996)を参照されたい。
本明細書に記載されるような抗Tspan33抗体に付着した薬物はまた、宿主の生物学的プロセス由来であるか又はそれを有利にモジュレートする薬剤、例えば、インターフェロン、腫瘍増殖因子、腫瘍壊死因子、増殖因子、例えばGM-CSF及びG-CSF等、並びにインターロイキン、例えばインターロイキン-2、インターロイキン-6、インターロイキン-7及びインターロイキン-12、及び同種のものを包含していてもよい。本明細書に記載されるような抗Tspan33抗体に付着した薬物は、DNAを損傷する及び/又は細胞が増殖しないようにする薬剤、例えば遺伝毒性物質等を含んでいてもよい。ジェノトキシンとしては、これらに限定されないが、アルキル化剤、代謝拮抗物質、DNAカッター、DNA結合剤、トポイソメラーゼ毒及び紡錘体毒が挙げられる。アルキル化剤の例は、ロムスチン、カルムスチン、ストレプトゾシン、メクロレタミン、メルファラン、ウラシルナイトロジェンマスタード、クロラムブシル、シクロスファミド(cyclosphamide)、イホスファミド、シスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシン、チオテパ、ダカルバジン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、トリエチレンメラミン、ブスルファン、ピポブロマン、ミトタン及び他のプラチン(platine)誘導体である。
代替として、抗Tspan33抗体は、高エネルギーの放射線放出体、例えば131I、γ-放出体等の放射線同位体にカップリングされていてもよく、これは、腫瘍部位に位置するとき、細胞直径の数倍にわたり殺滅を引き起こす。例えば、Order、Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy、R. W. Baldwinら(編)中の「Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy」、303〜316頁(Academic Press 1985)を参照されたい。他の好適な放射性同位体としては、α-放出体、例えば212Bi、213Bi、及び211At等、並びにβ-放出体、例えば186Re及び90Y等が挙げられる。Lu117も、造影剤及び細胞傷害性物質の両方として使用が可能である。
131I、90Y、及び177Luで標識された抗Tspan33抗体を使用する放射線免疫療法(RIT)も、使用することができる。これらの3つの核種の物理特性には有意差があり、結果として、腫瘍に最大の放射線量を送達するためには、放射性核種の選択が重要になる場合がある。より高いベータエネルギーを有する90Y粒子が、嵩高な腫瘍にとって優れている可能性があるが、小さい腫瘍、特に骨への転移(例えば、前立腺がんに共通する転移)にとっては必ずしも必要ではない可能性がある。相対的に低いエネルギーの13lIのベータ粒子が理想的であるが、抗Tspan33抗体の内在化にとって、in vivoにおける放射性ヨウ素で標識した分子の脱ハロゲン化は主な不利益である。対照的に、177Luは、わずか0.2〜0.3mm範囲の低エネルギーのベータ粒子を有し、90Yと比較してかなり低い放射線量を骨髄に送達する。加えて、より長い物理的な半減期(90Yと比較して)のために、腫瘍での滞留時間はより長い。結果として、177Luで標識された薬剤のより高い活性(より多くのmCi量)を比較的少ない放射線量で髄質に投与することができる。様々ながんの処置における177Luで標識された抗体の使用を調査する数々の臨床研究がなされてきた(例えば、Mulliganら、Clin Cancer Res. 1: 1447〜1454(1995); Meredithら、J Nucl Med 37: 1491〜1496(1996); Alvarezら、Gynecologic Oncology 65: 94〜101(1997)を参照)。
抗Tspan33抗体はまた、ウイルス粒子上に存在するウイルス表面タンパク質にコンジュゲート又は融合させることもできる。例えば、抗Tspan33抗体は、ウイルス表面タンパク質に融合させることができる(例えば、融合タンパク質を形成するために)。代替として、抗Tspan33抗体は、ウイルス表面タンパク質に化学的にコンジュゲートさせることもできる(例えば、化学的リンカーを介して)。好ましくは、ウイルスが抗Tspan33抗体と共に内在化することによってTspan33+MDSCに入りそれを殺滅するように、ウイルスは、細胞内の膜と融合するウイルスであり、例えばインフルエンザウイルスである。ウイルスは、細胞毒素として遺伝子操作されてもよい。例えば、ウイルスは、細胞にとって毒性の遺伝子、例えば細胞死を促進する遺伝子を発現したり、又はそのような遺伝子の発現を誘導したりすることができる。好ましくは、このようなウイルスは、ウイルス複製できないと予想される。
細胞傷害性のペプチド又はタンパク質のさらなる例としては、イダルビシン;CRM9(例えば、FN18-CRM9、Knechtleら、Transplantation 1997; 63: 1〜6);又はヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質が挙げられる。一部の実施形態において、細胞傷害性のタンパク質は、細菌毒素であり、例えば、ジフテリア毒素(DT)又はそれらの部分若しくはバリアント、例えばMet1〜Thr387、例えば、Aulloら、EMBO J.11(2): 575〜83(1992); Abi-Habibら、Blood. 104(7): 2143〜2148(2004); Perentesisら、Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85: 8386〜8390(1988); Zettlemeisslら、Gene. 41(1): 103〜111(1986); US2009/0010966;US20090041797;US5843711;US7585942;US7696338;若しくはUS20080166375に記載されるようなもの;モノメチルオーリスタチンE;若しくは緑膿菌外毒素(PE)、又はそれらの部分若しくはバリアント、例えば、US4,545,985;4,892,827;5,458,878;7,314,632;Songら、Protein Expression and Purification 44(1): 52〜57(2005); Theuerら、J. Biol. Chem. 267(24): 16872〜16877(1992); Heimbrookら、Proc Natl Acad Sci USA. 87(12): 4697〜4701(1990); Debinskiら、Mol Cell Biol. 11(3): 1751〜1753(1991); Chaudharyら、Proc.Nadl. Acad. Sci. USA 87: 308〜312(1990)に記載されるようなものである。一部の実施形態において、細胞傷害性のタンパク質は、植物性毒素、例えば、植物のホロトキシン(例えば、クラスIIリボソーム不活性化タンパク質、例えば、リシン(例えば、脱グリコシル化リシンA鎖(dgA))、アブリン、ヤドリギレクチン、又はモデシン等)、又はヘミトキシン(hemitoxin)(クラスIリボソーム不活性化タンパク質、例えば、PAP、サポリン、ブリオジン(bryodin)1、ボウガニン(bouganin)、又はゲロニン)、又はそれらの細胞傷害活性を保持するフラグメント若しくはバリアントである。例えば、Nevilleら、J Contr Rel 1993; 24: 133〜141; Vallera、Blood 1994; 83: 309〜317; Vitettaら、Immunology Today 1993; 14: 252〜259; Kreitmanら、AAPS Journal. 2006; 8(3): E532〜E551を参照されたい。好適な配列は、当業界において公知である。
抗がん剤は、安定な連結を作り出すあらゆる公知の手段、例えば化学的又はペプチドリンカーを使用して抗体にカップリングされていてもよく、切断可能な(ジスルフィド、ヒドラゾン又はペプチド)又は切断不可能な(チオエーテル)リンカーを使用することができる。一部の実施形態において、ペプチドリンカー、例えばフレキシブルな又は硬いペプチドリンカーが使用される。一部の実施形態において、カテプシンで切断可能なリンカー(バリン-シトルリン)及び1つ又は複数のスペーサー、例えば、パラ-アミノベンジルカルバメートスペーサーが挙げられる。例えばスクシンイミジルトランス-4-(マレイミジルメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(SMCC)等の架橋試薬も使用することができる。
上記の例において、抗Tspan33抗体が細胞内で作用する治療剤に連結される場合(すなわち、抗体-薬物コンジュゲート)、MDSCに結合した後に内在化を受ける抗体を使用することが望ましい。一部の実施形態において、MDSCを活発に枯渇させるために、内在化されないが、結合を補って抗体依存性細胞傷害性の惹起を可能にする抗体を使用することができる。一部の実施形態において、例えば、Tspan33+MDSCレベルの検出及びモニターのため、又は血漿分離のためには、しっかりと結合して内在化されない抗体が好ましい。一部の実施形態において、また、Tspan33に結合して、例えば立体的阻害等の物理的なメカニズムによってその受容体への結合を防ぐ抗体も使用することができる。
抗Tspan33抗体も、例えば、Tspan33結合交換膜又は樹脂を用いた免疫吸着/血漿分離(又は治療的血漿交換)を使用して、対象からTspan33+MDSCを物理的に枯渇させるのに使用することができる。例えば、Reeves及びWinters、Br J Haematol. 2014年2月; 164(3): 342〜51を参照されたい。
一部の実施形態において、従来の免疫グロブリン又はモノクローナル抗体の代わりに、例えば、Petrenko及びSmith、Protein Eng. 13(8): 589〜92(2000)に記載されるようなファージボディ(phagebody)が使用される。
小分子
「小分子」は、本明細書で使用される場合、分子量が約3,000ダルトン未満の小さい有機又は無機分子を指す。一般的に、本発明に有用な小分子は、3,000ダルトン(Da)未満の分子量を有する。小分子は、例えば、少なくとも約100Daから約3,000Da(例えば、約100から約3,000Daの間、約100から約2500Daの間、約100から約2,000Daの間、約100から約1,750Daの間、約100から約1,500Daの間、約100から約1,250Daの間、約100から約1,000Daの間、約100から約750Daの間、約100から約500Daの間、約200から約1500の間、約500から約1000の間、約300から約1000Daの間、又は約100から約250Daの間)であり得る。Tspan33を標的化し、Tspan33+MDSCの数及び/又は活性を枯渇させ、本明細書に記載されるようながんの処置において有用である薬剤を同定するために、試験化合物、例えば小分子試験化合物をスクリーニングするための方法が、本明細書に包含される。本明細書で使用される場合、Tspan33+MDSCの活性としては、NOS2及びArg1の発現、T細胞の機能の抑制、例えばIFNg産生、並びにNK細胞溶解活性の阻害を挙げることができる。これらの活性のそれぞれのためのアッセイは、当業界において公知である。例えば、化合物、例えば抗体又は小分子が中和するかどうかを決定するために、化合物をTspan33+MDSCに添加し、T細胞を添加し、更にT細胞を、例えば抗CD3及び抗CD28抗体を使用して刺激して、T細胞の増殖又はIFNガンマの分泌を本明細書において示したように検出する。T細胞の増殖及びIFNgの分泌の増加は、その化合物がMDSCを中和したことを示す(図4を参照)。代替として、又は加えて、NK細胞溶解アッセイが使用されてもよく、Tspan33+MDSCが媒介するNK細胞溶解活性の抑制を阻害する化合物(例えば、小分子又は抗体)の能力、例えばK562細胞を溶解させる能力が、評価される。化合物の存在下におけるNK細胞溶解の増加は、その化合物がMDSC活性を阻害することを示す。
試験化合物は、例えば、天然産物又はコンビナトリアルケミストリーライブラリーのメンバーであってもよい。一連の多様な分子が、例えば電荷、芳香族性、水素結合、フレキシビリティー、サイズ、側鎖の長さ、疎水性、及び剛性等の様々な機能を網羅するために使用されるべきである。小分子合成に好適なコンビナトリアル技術は、当業界において公知であり、例えば、Obrecht及びVillalgordo、Solid-Supported Combinatorial and Parallel Synthesis of Small-Molecular-Weight Compound Libraries、Pergamon-Elsevier Science Limited(1998)で例示された通りであり、例えば「スプリットアンドプール(split and pool)」又は「パラレル」合成技術、固相及び液相技術、並びにコード化技術等が挙げられる(例えば、Czarnik、Curr. Opin. Chem. Bio. 1: 60〜6(1997)を参照)。加えて、多数の小分子ライブラリーが市販されている。多数の好適な小分子試験化合物が、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる米国特許第6,503,713号に列挙されている。
スクリーニングしようとするライブラリーは、様々なタイプの試験化合物を含んでいてもよい。所与のライブラリーは、一連の構造的に関連する又は関連のない試験化合物を含んでいてもよい。一部の実施形態において、試験化合物は、ペプチド又はペプチド模擬分子である。一部の実施形態において、試験化合物は、核酸である。
一部の実施形態において、試験化合物及びそれらのライブラリーは、第1の試験化合物、例えば、標的ポリペプチドの公知の天然結合パートナーに構造的に類似した第1の試験化合物、又は標的ポリペプチドと結合可能であると同定された第1の小分子の構造を、例えば当業界において公知の方法又は本明細書に記載される方法を使用して系統的に変更すること、及びその構造を得られた生物活性、例えば構造-活性相関研究に相関させることにより得ることができる。当業者であれば理解していると予想されるように、このような構造と活性との相関を得るための様々な標準的方法がある。したがって、一部の場合において、作業の大部分は観察に基づいてなされ得るが、一方で内因性ポリペプチド又はその部分の3次元構造は、小分子化合物又は化合物の合理的設計のための開始点として使用することができる。例えば、一実施形態において、小分子の汎用ライブラリーが、例えば本明細書に記載される方法を使用してスクリーニングされる。
一部の実施形態において、試験化合物が、試験試料、例えばがん細胞又は生きたがん組織若しくは臓器、例えば腫瘍外植片に適用され、試験化合物の1つ又は複数の作用が評価される。例えば培養細胞又は初代細胞において、Tspan33の発現、及び/又はTspan33+MDSCの数若しくは活性を低減させる試験化合物の能力を評価することができる。
一部の実施形態において、試験試料は、本明細書に記載されるような障害のin vivoモデルであるか、又はそれに由来する(例えば、それから採取された試料である)。例えば動物モデル、例えばラット又はマウス等のげっ歯類における異種移植モデルを使用することができ、Tspan33の発現、及び/又はTspan33+MDSCの数若しくは活性を阻害する試験化合物の能力を評価することができる。
これらの作用を評価するための方法は、当業界において公知である。例えば、タンパク質の発現をモジュレートする能力は、遺伝子又はタンパク質レベルで、例えば定量PCR又はイムノアッセイ法を使用して評価することができる。一部の実施形態において、当業界において公知のように、ハイスループット方法、例えばタンパク質又は遺伝子チップ(例えば、Griffithsら編、Modern genetic Analysis、1999、W. H. Freeman and Company中の第12章、Genomics; Ekins及びChu、Trends in Biotechnology、1999、17: 217〜218; MacBeath及びSchreiber、Science 2000、289(5485): 1760〜1763; Simpson、Proteins and Proteomics: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2002; Hardiman、Microarrays Methods and Applications: Nuts & Bolts、DNA Press、2003を参照)が、Tspan33の発現への作用を検出するのに使用することができる。
本明細書に記載される方法でスクリーニングされ、Tspan33の発現、及び/又はTspan33+MDSCの数若しくは活性を低減させると決定された試験化合物を、候補化合物とみなすことができる。例えば障害のin vivoモデル、例えば動物腫瘍モデル、例えば腫瘍異種移植モデルでスクリーニングされ、障害に対して、例えば障害の1つ又は複数の症状に対して(例えば腫瘍の増殖又は転移に対して)所望の作用を有すると決定された候補化合物を、候補治療剤とみなすことができる。候補治療剤は、臨床条件でスクリーニングされれば、治療剤である。候補化合物、候補治療剤、及び治療剤は、任意選択で最適化及び/又は誘導体化して、生理学的に許容できる賦形剤と共に製剤化して、医薬組成物を形成することができる。
したがって、第1のスクリーニングで「ヒット」と同定された試験化合物(例えば、Tspan33の発現、及び/又はTspan33+MDSCの数若しくは活性を低減させる試験化合物)を選択して、例えば結合親和性、結合活性、特異性、又は他のパラメーターを最適化するための合理的設計を使用して系統的に変更することができる。またこのような最適化は、本明細書に記載される方法の使用に関してもスクリーニングすることができる。したがって、一実施形態において、本発明は、当業界において公知の及び/又は本明細書に記載される方法を使用して、化合物の第1のライブラリーをスクリーニングすること、そのライブラリー中の1つ又は複数のヒットを同定すること、それらのヒットを系統的な構造変更に供してヒットに構造的に関連する化合物の第2のライブラリーを作り出すこと、及び本明細書に記載される方法を使用して第2のライブラリーをスクリーニングすることを包含する。
ヒットと同定された試験化合物は、本明細書に記載されるようながんの処置において有用な候補治療化合物とみなすことができる。「ヒット」の構造を決定するのに有用な様々な技術、例えば、MR、質量分析、電子捕獲型検出器を備えたガスクロマトグラフィー、蛍光及び吸収分光法が、本明細書に記載される方法で使用することができる。したがって、本発明はまた、本明細書に記載される方法により「ヒット」と同定された化合物、並びに本明細書に記載される障害の発症又は進行の処置、予防、又は遅延におけるそれらの投与及び使用のための方法も包含する。
候補治療化合物と同定された試験化合物は、がんの動物モデルへの投与によって更にスクリーニングすることができる。動物は、障害の変化について、例えば障害のパラメーター、例えば臨床転帰に関するパラメーターの改善についてモニターすることができる。一部の実施形態において、パラメーターは、腫瘍サイズ、腫瘍の増殖速度、再発、又は転移であり、改善は、腫瘍サイズの低減又は通常急成長する腫瘍において変化がないこと;腫瘍増殖の低減又は中断;再発の低減、再発の遅延、若しくは再発がないこと;又は転移の低減、転移の遅延、若しくは転移がないことと予想される。一部の実施形態において、パラメーターは、診断後の寿命、又は生存時間であり、改善は、診断後の寿命又は生存時間の増加と予想される。
小分子に関して上述した方法も、Tspan33を標的化し、Tspan33+MDSCの活性を阻害する、又はTspan33+MDSCの数を低減させるペプチド、ポリペプチド、又は核酸を同定するのに使用することができる。
阻害性核酸
本発明の方法及び組成物において有用な阻害性核酸としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、外部ガイド配列(EGS)オリゴヌクレオチド、siRNA化合物、一本鎖又は二本鎖RNA干渉(RNAi)化合物、例えばsiRNA化合物等、修飾塩基/ロックト核酸(LNA)、ペプチド核酸(PNA)、及び標的核酸の少なくとも一部にハイブリダイズしてその機能をモジュレートする他のオリゴマー化合物又はオリゴヌクレオチド模倣剤が挙げられる。一部の実施形態において、阻害性核酸としては、アンチセンスRNA、アンチセンスDNA、キメラアンチセンスオリゴヌクレオチド、修飾リンケージを含むアンチセンスオリゴヌクレオチド、干渉RNA(RNAi)、短鎖干渉RNA(siRNA);マイクロ干渉RNA(miRNA);小分子一過性RNA(stRNA);若しくは短鎖ヘアピンRNA(shRNA);小分子RNA誘導遺伝子活性化(RNAa);小分子活性化RNA(saRNA)、又はそれらの組合せが挙げられる。例えば、WO2010040112を参照されたい。
一部の実施形態において、阻害性核酸は、長さが10から50、10から20、10から25、13から50、又は13から30ヌクレオチドである。当業界において通常の技術を有する者であれば、これは、長さが、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、若しくは50ヌクレオチド、又はそれらの間のあらゆる範囲の相補部分を有する阻害性核酸を包含することを理解しているものと予想される。一部の実施形態において、阻害性核酸は、長さが15ヌクレオチドである。一部の実施形態において、阻害性核酸は、長さが12又は13から、20、25、又は30ヌクレオチドである。当業界において通常の技術を有する者であれば、これは、長さが、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29若しくは30ヌクレオチド、又はそれらの間のあらゆる範囲の相補部分を有する阻害性核酸を包含すること(相補部分は、標的配列に相補的な阻害性核酸の部分を指す)を理解しているものと予想される。
本発明の方法において有用な阻害性核酸は、標的RNAに十分相補的であり、すなわち十分よく、且つ十分な特異性でハイブリダイズして、所望の作用を達成することができる。「相補的」は、水素結合を介して、天然に存在する若しくは天然に存在しない塩基又はそれらの類似体を含む2つの配列間で対合する能力を指す。例えば、阻害性核酸のある位置の塩基が、RNAの対応する位置の塩基と水素結合できる場合、塩基は、その位置で互いに相補的であるとみなされる。100%の相補性は必要ではない。
Ablim3配列に十分な特異性で結合する阻害性核酸を設計するために、慣例的な方法を使用することができる。一部の実施形態において、本方法は、二次構造、例えば1つ、2つ、又はそれより多くのステム-ループ構造、又はシュードノットを有する領域を同定するために、当業界において公知のバイオインフォマティクス方法を使用すること、及び阻害性核酸で標的化するためにそのような領域を選択することを包含する。例えば、核酸の阻害活性を最適化するのに「ジーンウォーク(gene walk)」方法を使用することができる。例えば、標的RNAの長さにわたる10〜30ヌクレオチドの一連のオリゴヌクレオチドを調製し、続いて活性を試験することができる。任意選択で、合成され試験されるオリゴヌクレオチドの数を低減するために、例えば5〜10ヌクレオチド又はそれより長いギャップを標的配列間に残すことができる。GC含量は、好ましくは約30〜60%の間である。G又はCが3つ以上連続して並べられることは、できれば回避すべきである(例えば、非常に短い(例えば、約9〜10nt)オリゴヌクレオチドを用いた場合、不可能になる場合がある)。
一部の実施形態において、阻害性核酸分子は、RNA配列の特異的な領域を標的化するように設計することができる。例えば、特異的な機能的領域、例えば公知のRNA局在化モチーフを含む領域(すなわち、RNAが機能する標的核酸に相補的な領域)が、標的化されてもよい。代替として、又は加えて、高度に保存された領域、例えば、例えば霊長類(例えば、ヒト)とげっ歯類(例えば、マウス)等の異なる種からの配列を並べ、高度な同一性を有する領域を探すことによって同定された領域が、標的化されてもよい。パーセント同一性は、慣例的に、ベーシックローカルアライメントサーチツール(BLASTプログラム)(Altschulら、J. Mol. Biol.、1990、215、403〜410; Zhang及びMadden、Genome Res.、1997、7、649〜656)を例えばデフォルトパラメーターで使用して決定することができる。
例えば当業界において公知の又は本明細書で提供されるAblim3配列以内で1つ又は複数の標的領域、セグメント又は部位が同定されたら、標的に十分相補的であり、すなわち十分よく、且つ十分な特異性でハイブリダイズして(すなわち、他の非標的RNAに実質的に結合しない)、所望の作用を達成することができる阻害性核酸化合物が、選択される。
本発明の状況において、ハイブリダイゼーションは、相補的なヌクレオシド又はヌクレオチド塩基間のワトソン-クリック、フーグスティーン又は逆フーグスティーン水素結合であり得る水素結合を意味する。例えば、アデニンとチミンは、水素結合の形成を介して対合する相補的な核酸塩基である。相補的は、本明細書で使用される場合、2つのヌクレオチド間で正確に対合する能力を指す。例えば、オリゴヌクレオチドの特定の位置のヌクレオチドが、RNA分子の同じ位置でヌクレオチドと水素結合できる場合、阻害性核酸とRNAとは、その位置で互いに相補的であるとみなされる。各分子中の十分な数の対応する位置が、互いに水素結合できるヌクレオチドによって占められている場合、阻害性核酸とRNAとは、互いに相補的である。したがって、「特異的にハイブリダイズ可能な」及び「相補的」は、阻害性核酸とRNA標的との間で安定で特異的な結合が起こるような十分な程度の相補性又は正確な対合を示すのに使用される用語である。例えば、阻害性核酸のある位置の塩基が、RNAの対応する位置の塩基と水素結合できる場合、塩基は、その位置で互いに相補的であるとみなされる。100%の相補性は必要ではない。
相補的な核酸配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的核酸の配列に100%相補的でなくてもよいことは、当業界において理解されている。本発明の方法の目的のための相補的な核酸配列は、その配列が標的RNA分子に結合すると標的RNAの正常な機能に干渉して活性の損失を引き起こす場合、更に、特異的な結合が望ましい条件下で、例えば、in vivoのアッセイ又は治療的処置のケースにおいて生理学的条件下において、更にin vitroのアッセイのケースにおいて、アッセイが好適なストリンジェンシーの条件下で実行される条件下で、その配列が非標的RNA配列に非特異的結合することを回避するのに十分な程度の相補性がある場合、特異的にハイブリダイズ可能である。例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常は約750mM未満のNaCl及び75mM未満のクエン酸三ナトリウム、好ましくは約500mM未満のNaCl及び50mM未満のクエン酸三ナトリウム、より好ましくは約250mM未満のNaCl及び25mM未満のクエン酸三ナトリウムと予想される。低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、有機溶媒、例えばホルムアミドの非存在下で達成することができ、一方で高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、少なくとも約35%のホルムアミド、より好ましくは少なくとも約50%のホルムアミドの存在下で達成することができる。ストリンジェントな温度条件は、通常は少なくとも約30℃、より好ましくは少なくとも約37℃、最も好ましくは少なくとも約42℃の温度を包含すると予想される。様々な追加のパラメーター、例えばハイブリダイゼーション時間、洗浄剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム(SDS)の濃度、及び担体DNAの包含又は排除等は、当業者周知である。様々なレベルのストリンジェンシーが、これらの様々な条件を必要に応じて組み合わせることによって達成される。好ましい実施形態において、ハイブリダイゼーションは、750mMのNaCl、75mMのクエン酸三ナトリウム、及び1%SDS中、30℃で起こると予想される。より好ましい実施形態において、ハイブリダイゼーションは、500mMのNaCl、50mMのクエン酸三ナトリウム、1%SDS、35%ホルムアミド、及び100μg/mlの変性サケ精子DNA(ssDNA)中、37℃で起こると予想される。最も好ましい実施形態において、ハイブリダイゼーションは、250mMのNaCl、25mMのクエン酸三ナトリウム、1%SDS、50%ホルムアミド、及び200μg/mlのssDNA中、42℃で起こると予想される。これらの条件における有用なバリエーションは、当業者には容易に理解されるものと予想される。
ほとんどの適用に関して、ハイブリダイゼーション後の洗浄工程も、ストリンジェンシーの点で様々であると予想される。洗浄のストリンジェンシー条件は、塩濃度及び温度によって定義することができる。上記のように、洗浄のストリンジェンシーは、塩濃度を減少させたり又は温度を増加させたりすることによって増加させることができる。例えば、洗浄工程の場合のストリンジェントな塩濃度は、好ましくは約30mM未満のNaCl及び3mM未満のクエン酸三ナトリウム、最も好ましくは約15mM未満のNaCl及び1.5mM未満のクエン酸三ナトリウムと予想される。洗浄工程の場合のストリンジェントな温度条件は、通常は少なくとも約25℃、より好ましくは少なくとも約42℃、更により好ましくは少なくとも約68℃の温度を包含すると予想される。好ましい実施形態において、洗浄工程は、30mMのNaCl、3mMのクエン酸三ナトリウム、及び0.1%SDS中、25℃で起こると予想される。より好ましい実施形態において、洗浄工程は、15mMのNaCl、1.5mMのクエン酸三ナトリウム、及び0.1%SDS中、42℃で起こると予想される。より好ましい実施形態において、洗浄工程は、15mMのNaCl、1.5mMのクエン酸三ナトリウム、及び0.1%SDS中、68℃で起こると予想される。これらの条件の追加のバリエーションは、当業者には容易に理解されるものと予想される。ハイブリダイゼーション技術は当業者周知であり、例えば、Benton及びDavis(Science 196: 180、1977); Grunstein及びHogness(Proc. Natl. Acad. Sci.、USA 72: 3961、1975); Ausubelら(Current Protocols in Molecular Biology、Wiley Interscience、New York、2001); Berger及びKimmel(Guide to Molecular Cloning Techniques、1987、Academic Press、New York);及びSambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press、New Yorkに記載されている。
一般的に、本明細書に記載される方法において有用な阻害性核酸は、標的核酸内の標的領域に対して少なくとも80%の配列相補性、例えば、RNA内の標的領域に対して90%、95%、又は100%の配列相補性を有する。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドの20個の核酸塩基のうち18個が相補的であり、それゆえに標的領域に特異的にハイブリダイズすると予想されるアンチセンス化合物は、90パーセントの相補性を表すと予想される。標的核酸の領域内の阻害性核酸のパーセント相補性は、ベーシックローカルアライメントサーチツール(BLASTプログラム)(Altschulら、J. Mol. Biol.、1990、215、403〜410; Zhang及びMadden、Genome Res.、1997、7、649〜656)を使用して慣例的に決定することができる。RNAにハイブリダイズする阻害性核酸は、慣例的な実験を介して同定することができる。一般的に、阻害性核酸は、それらの標的への特異性を保持していなければならず、すなわち、意図された標的以外の転写物に直接結合したり、又は意図された標的以外の転写物の発現レベルに有意に直接影響を与えたりしてはならない。
阻害性核酸に関するさらなる開示に関しては、US2010/0317718(アンチセンスオリゴ);US2010/0249052(二本鎖リボ核酸(dsRNA));US2009/0181914及びUS2010/0234451(LNA);US2007/0191294(siRNA類似体);US2008/0249039(修飾siRNA);並びにWO2010/129746及びWO2010/040112(阻害性核酸)を参照されたい。
アンチセンス
一部の実施形態において、阻害性核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的には、標的に結合して、転写、翻訳又はスプライシングレベルで発現を中断させることによって、DNA又はRNA標的の発現をブロックするように設計される。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下でRNAにハイブリダイズするように設計された相補的な核酸配列である。したがって、標的に十分相補的であり、すなわち十分よく、且つ十分な特異性でハイブリダイズして、所望の作用を達成することができるオリゴヌクレオチドが、選択される。
siRNA/shRNA
一部の実施形態において、Ablim3のRNAに相補的な核酸配列は、干渉RNA、これらに限定されないが、短鎖干渉RNA(「siRNA」)又は小ヘアピンRNA(「shRNA」)等であってもよい。干渉RNAを構築するための方法は当業界において周知である。例えば、干渉RNAは、2つの別個のオリゴヌクレオチドから構築することができ、その場合、1つの鎖はセンス鎖であり、他方はアンチセンス鎖であり、アンチセンス及びセンス鎖は自己相補的であり(すなわち、各鎖が、他方の鎖のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、例えばアンチセンス鎖及びセンス鎖が二重鎖又は二本鎖構造を形成する);アンチセンス鎖は、標的核酸分子(すなわち、望ましくない遺伝子)又はその一部のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス鎖は、標的核酸配列又はその一部に対応するヌクレオチド配列を含む。代替として、干渉RNAは、単一のオリゴヌクレオチドから組み立てられ、その場合、自己相補的なセンス及びアンチセンス領域は、核酸ベース又は非核酸ベースのリンカーによって連結される。干渉RNAは、自己相補的なセンス及びアンチセンス領域を有する二重鎖、非対称二重鎖、ヘアピン又は非対称ヘアピン二次構造を有するポリヌクレオチドであってもよく、その場合、アンチセンス領域は、別個の標的核酸分子又はその一部中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は、標的核酸配列又はその一部に対応するヌクレオチド配列を有する。干渉は、自己相補的なセンス及びアンチセンス領域を含む2つ以上のループ構造及びステムを有する環状の一本鎖ポリヌクレオチドであってもよく、その場合、アンチセンス領域は、標的核酸分子又はその一部中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は、標的核酸配列又はその一部に対応するヌクレオチド配列を有し、更に環状のポリヌクレオチドをin vivo又はin vitroのいずれかでプロセシングして、RNA干渉の媒介が可能な活性なsiRNA分子を生成することもできる。
一部の実施形態において、干渉RNAコード領域は、センス領域、アンチセンス領域及びループ領域を有する自己相補的なRNA分子をコードする。このようなRNA分子は、望ましく発現される場合、「ヘアピン」構造を形成し、本明細書では「shRNA」と称される。ループ領域は、一般的に、長さが約2から約10ヌクレオチドの間である。一部の実施形態において、ループ領域は、長さが約6から約9ヌクレオチドである。一部の実施形態において、センス領域及びアンチセンス領域は、長さが約15から約20ヌクレオチドの間である。転写後プロセシングの後、小ヘアピンRNAは、RNアーゼIIIファミリーのメンバーである酵素ダイサーが媒介する切断事象によってsiRNAに変換される。次いでsiRNAは、それと相同性を有する遺伝子の発現を阻害することが可能である。詳細については、Brummelkampら、Science 296: 550〜553、(2002); Leeら、Nature Biotechnol.、20、500〜505、(2002); Miyagishi及びTaira、Nature Biotechnol 20: 497〜500、(2002); Paddisonら、Genes & Dev. 16: 948〜958、(2002); Paul、Nature Biotechnol、20、505〜508、(2002); Sui、Proc. Natl. Acad. Sd. USA、99(6)、5515〜5520、(2002); Yuら、Proc NatlAcadSci USA 99: 6047〜6052、(2002)を参照されたい。
siRNAによって誘導される標的RNA切断反応は、高度に配列特異的である。一般的に、siRNAが標的核酸の一部に同一なヌクレオチド配列を含有することが、阻害にとって好ましい。しかしながら、本発明を実施するのに、siRNAと標的遺伝子の100%の配列同一性は必ずしも必要ではない。したがって本発明は、遺伝子突然変異、株の多型性、又は進化的分岐に起因すると予測され得る配列バリエーションを許容できるという利点を有する。例えば、標的配列に比べて挿入、欠失、及び単一点突然変異を有するsiRNA配列も、阻害にとって有効であることが見出された。代替として、ヌクレオチド類似体の置換又は挿入を有するsiRNA配列が、阻害にとって有効であり得る。一般的にsiRNAは、それらの標的への特異性を保持していなければならず、すなわち、意図された標的以外の転写物に直接結合したり、又は意図された標的以外の転写物の発現レベルに有意に直接影響を与えたりしてはならない。
リボザイム
トランス型切断酵素的核酸分子を使用することもでき、それらはヒト疾患の治療剤として有望であることが示されている(Usman及びMcSwiggen、1995、Ann. Rep. Med. Chem. 30、285〜294; Christoffersen及びMarr、1995、J. Med. Chem. 38、2023〜2037)。酵素的核酸分子は、細胞内RNAバックグラウンド内の特異的なRNA標的を切断するように設計され得る。そのような切断事象は、RNAを非機能性にする。
一般に、RNA切断活性を有する酵素的核酸は、まず標的RNAに結合することよって作用する。そのような結合は、標的RNAを切断するように作用する分子の酵素的部分に近接して保持される酵素的核酸の標的結合部分を介して起こる。したがって、酵素的核酸はまず、相補的塩基対形成を介して標的RNAを認識、次いで結合し、正しい部位に結合すると、酵素的に作用し標的RNAを切断する。そのような標的RNAの戦略的切断は、コードされたタンパク質の合成を指示するその能力を破壊する。酵素的核酸はそのRNA標的に結合及び切断した後、そのRNAから離れ、別の標的を探し、新しい標的に繰り返し結合及び切断できる。
in vitro選択(進化)戦略(Orgel、1979、Proc. R. Soc. London、B 205、435)など、いくつかの手法が使用され、ホスホジエステル結合及びアミド結合の切断及びライゲーションなど、様々な反応を触媒することができる新しい核酸触媒を発展させてきた(Joyce、1989、Gene、82、83〜87; Beaudryら、1992、Science 257、635〜641; Joyce、1992、Scientific American 267、90〜97; Breakerら、1994、TIBTECH 12、268; Bartelら、1993、Science 261: 1411〜1418; Szostak、1993、TIBS 17、89〜93; Kumarら、1995、FASEB J.、9、1183; Breaker、1996、Curr. Op. Biotech.、1、442)。触媒活性に最適なリボザイムの開発は、遺伝子発現を制御する目的のためにRNA切断リボザイムを用いる任意の戦略に大きく貢献するであろう。ハンマーヘッド型リボザイムは、例えば飽和(10mM)濃度のMg2+補助因子の存在中で約1min-1の触媒反応速度(kcat)で作用する。人工の「RNAライゲース」リボザイムは、約100min-1の速度で相当する自己修飾反応を触媒することが示されている。更に、DNAで作製された基質結合アームを有する特定の修飾されたハンマーヘッド型リボザイムは、100min-1に及ぶ複数の代謝回転速度でRNA切断を触媒する。
阻害性核酸の修飾
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法で使用する阻害性核酸は修飾され、例えば、1つ又は複数の修飾された結合又は塩基を含む。多くの修飾された塩基は、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ペプチド核酸、又はロックド核酸(LNA)分子を含む。いくつかの阻害性核酸は完全に修飾されるが、他はキメラ型であり、それぞれ少なくとも1つのヌクレオチドからなる2つ以上の化学的に異なる領域を含有する。これらの阻害性核酸は、典型的には、1つ又は複数の有益な性質(例えば、ヌクレアーゼ耐性の増加、細胞への取り込みの増加、標的への結合親和性の増加など)を与える修飾されたヌクレオチドの少なくとも1つの領域、及びRNA:DNA又はRNA:RNAハイブリッドを切断することができる酵素の基質である領域を含有する。本発明のキメラ型阻害性核酸は、上述のように2つ以上のオリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、及び/又はオリゴヌクレオチド模倣体の複合構造として形成され得る。そのような化合物は、当技術分野では、ハイブリッド又はgapmerとも呼ばれる。そのようなハイブリッド構造の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、米国特許第5,013,830号;第5,149,797号;第5,220,007号;第5,256,775号;第5,366,878号;第5,403,711号;第5,491,133号;第5,565,350号;第5,623,065号;第5,652,355号;第5,652,356号;及び第5,700,922号が挙げられ、その各々は参照により本明細書に組込まれる。
いくつかの実施形態では、阻害性核酸は糖の2'位で修飾された少なくとも1つのヌクレオチド、最も好ましくは2'-O-アルキル、2'-O-アルキル-O-アルキル、又は2'-フルオロ修飾ヌクレオチドを含む。他の好ましい実施形態では、RNA修飾はRNAの3'端において、ピリミジン、無塩基残基、又は逆位の塩基のリボースに2'-フルオロ、2'-アミノ、及び2'-O-メチル修飾を含む。そのような修飾は通常はオリゴヌクレオチドに組込まれ、これらのオリゴヌクレオチドは、所与の標的に対する2'-デオキシオリゴヌクレオチドよりも高いTm(すなわち、高い標的結合親和性)を有することが示されている。
多くのヌクレオチド及びヌクレオシド修飾は、それらが組込まれるオリゴヌクレオチドを天然のオリゴデオキシヌクレオチドよりもヌクレアーゼ切断に耐性にすることが示されている。これらの修飾されたオリゴは未修飾オリゴヌクレオチドよりも長期間無傷で生き残る。修飾されたオリゴヌクレオチドの特定の例としては、修飾された骨格、例えばホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、短鎖アルキル若しくはシクロアルキル糖間結合又は短鎖ヘテロ原子若しくは複素環式糖間結合を含むものが挙げられる。最も好ましいものは、ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチド、及びヘテロ原子骨格、特にCH2-NH-O-CH2、CH、〜N(CH3)〜O〜CH2[メチレン(メチルイミノ)又はMMI骨格として公知である]、CH2--O--N(CH3)-CH2、CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2及びO-N(CH3)-CH2-CH2骨格(ここでは天然のホスホジエステル骨格がO-P--O-CHとして表される)、アミド骨格(De Mesmaekerら、Ace. Chem. Res. 1995、28:366〜374参照)、モルホリノ骨格構造(Summerton及びWeller、米国特許第5,034,506号参照)、ペプチド核酸(PNA)骨格(ここでは、オリゴヌクレオチドのホスホジエステル骨格がポリアミド骨格で置換され、ヌクレオチドはポリアミド骨格のアザ窒素原子に直接的に又は間接的に結合する。Nielsenら、Science 1991、254、1497参照)を有するオリゴヌクレオチドである。リン含有結合は、限定はされないが、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、3'-アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含むメチル及び他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、3'-アミノホスホロアミデート及びアミノアルキルホスホロアミデートを含むホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、及び正常な3'-5'結合を有するボラノホスホネート、2'-5'結合したこれらの類似体、及びヌクレオシドユニットの隣接する塩基対が5'-3'に対して3'-5'に又は5'-2'に対して2'-5'に結合する逆の極性を有するものを含む。米国特許第3,687,808号;第4,469,863号;第4,476,301号;第5,023,243号;第5,177,196号;第5,188,897号;第5,264,423号;第5,276,019号;第5,278,302号;第5,286,717号;第5,321,131号;第5,399,676号;第5,405,939号;第5,453,496号;第5,455,233号;第5,466,677号;第5,476,925号;第5,519,126号;第5,536,821号;第5,541,306号;第5,550,111号;第5,563,253号;第5,571,799号;第5,587,361号;及び第5,625,050号参照。
モルホリノベースのオリゴマー化合物は、Dwaine A. Braasch及びDavid R. Corey、Biochemistry、2002、41(14)、4503〜4510; Genesis、volume 30、issue 3、2001; Heasman, J.、Dev. Biol.、2002、243、209〜214; Naseviciusら、Nat. Genet、2000、26、216〜220; Lacerraら、Proc. Natl. Acad. Sci.、2000、97、9591〜9596;及び1991年7月23日に発行された米国特許第5,034,506号に記載される。
シクロへキセニル核酸オリゴヌクレオチド模倣体は、Wangら、J. Am. Chem. Soc、2000、122、8595〜8602に記載される。
リン原子を含まない修飾されたオリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子及びアルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、又は1つ若しくは複数の短鎖ヘテロ原子若しくは複素環式ヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらはモルホリノ結合(部分的にヌクレオシドの糖部分から形成される)、シロキサン骨格、硫化物、スルホキシド及びスルホン骨格、ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート骨格、メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格、スルホネート及びスルホンアミド骨格、アミド骨格、並びに混合N、O、S及びCH2構成要素部分を有する他のもの、を有するものを含む。その各々が参照により本明細書に組込まれる米国特許第5,034,506号;第5,166,315号;第5,185,444号;第5,214,134号;第5,216,141号;第5,235,033号;第5,264,562号;第5,264,564号;第5,405,938号;第5,434,257号;第5,466,677号;第5,470,967号;第5,489,677号;第5,541,307号;第5,561,225号;第5,596,086号;第5,602,240号;第5,610,289号;第5,602,240号;第5,608,046号;第5,610,289号;第5,618,704号;第5,623,070号;第5,663,312号;第5,633,360号;第5,677,437号;及び第5,677,439号参照。
1つ又は複数の糖置換部分も含むことができ、例えば2'位で以下のものの1つを含む: OH、SH、SCH3、F、OCN、OCH3OCH3、OCH3O(CH2)nCH3、O(CH2)nNH2又はO(CH2)nCH3、ここでnは1から約10であり、C1〜C10の低級アルキル、アルコキシアルコキシ、置換低級アルキル、アルカリル又はアラルキル、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、O-、S-、又はN-アルキル、O-、S-、又はN-アルケニル、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、RNA切断基、リポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を向上するための基、又はオリゴヌクレオチドの薬理特性を向上するための基、及び同様の特性を有する他の置換基。好ましい修飾は、2'-メトキシエトキシ[2'-O-CH2CH2OCH3、2'-O-(2-メトキシエチル)としても公知](Martinら、Helv. Chim. Acta、1995、78、486)が挙げられる。他の好ましい修飾としては、2'-メトキシ(2'-O-CH3)、2'-プロポキシ(2'-OCH2CH2CH3)及び2'-フルオロ(2'-F)が挙げられる。同様の修飾はまた、オリゴヌクレオチドのその他の位、特に3'末端ヌクレオチドの糖の3'位及び5'末端ヌクレオチドの5'位において作製することができる。オリゴヌクレオチドはペントフラノシル基の代わりにシクロブチルなどの糖模倣体を有する場合もある。
阻害性核酸はまた、加えて若しくは代わりに、核酸塩基(当技術分野では単に「塩基」と呼ばれることが多い)修飾又は置換も含み得る。本明細書で使用する場合、「非修飾」又は「天然」核酸塩基は、アデニン(A)、グアニン(G)、チミン(T)、シトシン(C)、及びウラシル(U)を含む。修飾された核酸塩基としては、天然核酸中にまれに又は一過的にのみ見出される核酸塩基、例えばヒポキサンチン、6-メチルアデニン、5-Meピリミジン、特に5-メチルシトシン(5-メチル-2'-デオキシシトシンとも呼ばれ、当技術分野では5-Me-Cと呼ばれることが多い)、5-ヒドロキシメチルシトシン(HMC)、グリコシルHMC及びゲントビオシルHMC、並びに合成の核酸塩基、例えば、2-アミノアデニン、2-(メチルアミノ)アデニン、2-(イミダゾリルアルキル)アデニン、2-(アミノアルキルアミノ)アデニン、又は他のヘテロ置換されたアルキルアデニン、2-チオウラシル、2-チオチミン、5-ブロモウラシル、5-ヒドロキシメチルウラシル、8-アザグアニン、7-デアザグアニン、N6(6-アミノヘキシル)アデニン及び2,6-ジアミノプリンが挙げられる。(Kornberg, A., DNA Replication、W. H. Freeman & Co., San Francisco、1980、75〜77; Gebeyehu, G.ら、Nucl. Acids Res. 1987、15:4513)。当技術分野で公知の「ユニバーサル」塩基、例えば、イノシンも含まれ得る。5-Me-C置換は、核酸二重らせんの安定性を0.6〜1.2℃増大することが示されており(Sanghvi, Y. S.、in Crooke, S. T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications、CRC Press、Boca Raton、1993、276〜278頁)、現時点では好ましい塩基置換である。
所与のオリゴヌクレオチドにおける全ての位置が均一に修飾されている必要はなく、事実上述の修飾の1つより多くを単一オリゴヌクレオチド内に又はオリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシド内に組込んでもよい。
いくつかの実施形態では、糖及びヌクレオシド間結合の両方、すなわちヌクレオチドユニットの骨格を新規の基で置換する。塩基ユニットは、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持する。そのようなオリゴマー化合物の1つ、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸(PNA)と呼ばれる。PNA化合物では、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格、例えば、アミノエチルグリシン骨格で置換されている。核酸塩基は保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子と直接又は間接的に結合している。PNA化合物の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、米国特許第5,539,082号;第5,714,331号;及び第5,719,262号が挙げられ、その各々は参照により本明細書に組込まれる。PNA化合物の更なる教示は、Nielsenら、Science、1991、254、1497〜1500に見出すことができる。
阻害性核酸はまた、1つ又は複数の核酸塩基(当技術分野では単に「塩基」と呼ばれることが多い)修飾又は置換も含み得る。本明細書で使用する場合、「非修飾」又は「天然」核酸塩基は、プリン塩基のアデニン(A)及びグアニン(G)、並びにピリミジン塩基のチミン(T)、シトシン(C)、及びウラシル(U)を含む。修飾された核酸塩基としては、他の合成及び天然核酸塩基、例えば、5-メチルシトシン(5-me-C)、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサン、2-アミノアデニン、アデニン及びグアニンの6-メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの2-プロピル及び他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミン及び2-チオシトシン、5-ハロウラシル及びシトシン、5-プロピニルウラシル及びシトシン、6-アゾウラシル、シトシン及びチミン、5-ウラシル(プソイド-ウラシル)、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシル、並びに他の8-置換アデニン及びグアニン、5-ハロ、特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチル及び他の5-置換ウラシル及びシトシン、7-メチルグアニン及び7-メチルアデニン、8-アザグアニン及び8-アザアデニン、7-デアザグアニン及び7-デアザアデニン、並びに3-デアザグアニン及び3-デアザアデニンを含む。
更に、核酸塩基は、米国特許第3,687,808号に開示されているもの、「The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering」、858〜859頁、Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons、1990に開示されているもの、Englischら、「Angewandle Chemie, International Edition」、1991、30、613頁に開示されているもの、並びにSanghvi, Y. S.、Chapter 15、「Antisense Research and Applications」、289〜302頁、Crooke, S.T.及びLebleu, B. ea., CRC Press、1993に開示されているものを含む。これらの核酸塩基の特定のものは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増大するのに特に有用である。これらには、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジン、並びにN-2、N-6及び0〜6置換プリンが挙げられ、これらは2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシル、並びに5-プロピニルシトシンを含む。5-メチルシトシン置換は、核酸二重らせんの安定性を0.6〜1.2℃増大することが示されており(Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. and Lebleu, B., eds、「Antisense Research and Applications」、CRC Press、Boca Raton、1993、276〜278頁)、現時点では好ましい塩基置換であり、特に、2'-O-メトキシエチル糖修飾と組合わせた場合、さらに好ましい。修飾された核酸塩基は、米国特許第3,687,808号、並びに第4,845,205号;第5,130,302号;第5,134,066号;第5,175,273号;第5,367,066号;第5,432,272号;第5,457,187号;第5,459,255号;第5,484,908号;第5,502,177号;第5,525,711号;第5,552,540号;第5,587,469号;第5,596,091号;第5,614,617号;第5,750,692号、及び第5,681,941号に記載されており、その各々は参照により本明細書に組込まれる。
いくつかの実施形態では、阻害性核酸は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、又は細胞の取り込みを増強する1つ又は複数の部分若しくはコンジュゲートに化学的に結合される。このような部分は、限定はされないが、コレステロール部分などの脂質部分(Letsingerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、1989、86、6553〜6556)、コール酸(Manoharanら、Bioorg. Med. Chem. Let.、1994、4、1053〜1060)、チオエーテル、例えばヘキシル-S-トリチルチオール(Manoharanら、Ann. N. Y. Acad. Sci.、1992、660、306〜309;Manoharanら、Bioorg. Med. Chem. Let.、1993、3、2765〜2770)、チオコレステロール(Oberhauserら、Nucl. Acids Res.、1992、20、533〜538)、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール又はウンデシル残基(Kabanovら、FEBS Lett.、1990、259、327〜330;Svinarchukら、Biochimie、1993、75、49〜54)、リン脂質、例えば、ジ-ヘキサデシル-rac-グリセロール又はトリエチルアンモニウム1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホネート(Manoharanら、Tetrahedron Lett.、1995、36、3651〜3654;Sheaら、Nucl. Acids Res.、1990、18、3777〜3783)、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖(Mancharanら、Nucleosides & Nucleotides、1995、14、969〜973)、又はアダマンタン酢酸(Manoharanら、Tetrahedron Lett.、1995、36、3651〜3654)、パルミチル部分(Mishraら、Biochim. Biophys. Acta、1995、1264、229〜237)、又はオクタデシルアミン若しくはヘキシルアミノ-カルボニル-tオキシコレステロール部分(Crookeら、J. Pharmacol. Exp. Ther.、1996、277、923〜937)を含む。その各々が参照により本明細書に組込まれる、米国特許第4,828,979号;第4,948,882号;第5,218,105号;第5,525,465号;第5,541,313号;第5,545,730号;第5,552,538号;第5,578,717号、第5,580,731号;第5,580,731号;第5,591,584号;第5,109,124号;第5,118,802号;第5,138,045号;第5,414,077号;第5,486,603号;第5,512,439号;第5,578,718号;第5,608,046号;第4,587,044号;第4,605,735号;第4,667,025号;第4,762,779号;第4,789,737号;第4,824,941号;第4,835,263号;第4,876,335号;第4,904,582号;第4,958,013号;第5,082,830号;第5,112,963号;第5,214,136号;第5,082,830号;第5,112,963号;第5,214,136号;第5,245,022号;第5,254,469号;第5,258,506号;第5,262,536号;第5,272,250号;第5,292,873号;第5,317,098号;第5,371,241号、第5,391,723号;第5,416,203号、第5,451,463号;第5,510,475号;第5,512,667号;第5,514,785号;第5,565,552号;第5,567,810号;第5,574,142号;第5,585,481号;第5,587,371号;第5,595,726号;第5,597,696号;第5,599,923号;第5,599,928号及び第5,688,941号も参照。
これらの部分又はコンジュゲートは、一次又は二次ヒドロキシル基などの官能基に共有結合したコンジュゲート基を含み得る。本発明のコンジュゲート基としては、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を増強する基、及びオリゴマーの薬物動態特性を増強する基が挙げられる。典型的なコンジュゲート基としては、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸塩、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン及び色素が挙げられる。本発明の文脈において、薬力学的特性を増強する基は、取込みを向上し、分解に対する耐性を増強し、及び/又は標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基を含む。本発明の文脈において、薬物動態学的特性を増強する基は、本発明の化合物の取込み、分布、代謝又は排出を向上する基を含む。代表的なコンジュゲート基は、1992年10月23日に出願された国際特許出願番号PCT/US92/09196号パンフレット、及び米国特許第6,287,860号に開示されており、これらは参照により本明細書に組込まれる。コンジュゲート部分としては、限定はされないが、コレステロール部分などの脂質部分、コール酸、チオエーテル、例えば、ヘキシル-5-トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール又はウンデシル残基、リン脂質、例えばジ-ヘキサデシル-rac-グリセロール又はトリエチルアンモニウム1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホネート、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖、又はアダマンタン酢酸、パルミチル部分、又はオクタデシルアミン若しくはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分が挙げられる。例えば、米国特許第4,828,979号;第4,948,882号;第5,218,105号;第5,525,465号;第5,541,313号;第5,545,730号;第5,552,538号;第5,578,717号、第5,580,731号;第5,580,731号;第5,591,584号;第5,109,124号;第5,118,802号;第5,138,045号;第5,414,077号;第5,486,603号;第5,512,439号;第5,578,718号;第5,608,046号;第4,587,044号;第4,605,735号;第4,667,025号;第4,762,779号;第4,789,737号;第4,824,941号;第4,835,263号;第4,876,335号;第4,904,582号;第4,958,013号;第5,082,830号;第5,112,963号;第5,214,136号;第5,082,830号;第5,112,963号;第5,214,136号;第5,245,022号;第5,254,469号;第5,258,506号;第5,262,536号;第5,272,250号;第5,292,873号;第5,317,098号;第5,371,241号、第5,391,723号;第5,416,203号、第5,451,463号;第5,510,475号;第5,512,667号;第5,514,785号;第5,565,552号;第5,567,810号;第5,574,142号;第5,585,481号;第5,587,371号;第5,595,726号;第5,597,696号;第5,599,923号;第5,599,928号及び第5,688,941号参照。
ロックド核酸(LNA)
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法で使用する修飾された阻害性核酸は、例えば、[アルファ]-L-LNAを含むロックド核酸(LNA)分子を含む。LNAは、リボース環が2'-酸素と4'-炭素の間のメチレン架橋によって「ロック」されているリボ核酸類似体-すなわち少なくとも1つのLNAモノマーを含有するオリゴヌクレオチド、つまり1つの2'-O、4'-C-メチレン-β-D-リボフラノシルヌクレオチドを含む。LNAの塩基は、標準的なワトソン-クリック塩基対を形成するが、ロックド構造は塩基対形成反応の速度及び安定性を増大する(Jepsenら、Oligonucleotides、14、130〜146(2004))。LNAはまた、DNAと比較して、RNAとの塩基対に対して親和性が増大する。これらの特性により、LNAはin situハイブリダイゼーション(FITC)及び比較ゲノムハイブリダイゼーションにおける蛍光のプローブとして、miRNAのノックダウンツールとして、及びmRNA又は他のRNA、例えば本明細書に記載のRNAを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドとして、特に有用である。
LNA分子は、各鎖中に10〜30、例えば12〜24、例えば12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、又は30ヌクレオチドを含み、鎖の1つが実質的に同一であり、例えば少なくとも80%(又はそれ超、例えば85%、90%、95%、又は100%)同一であり、例えばRNA中の標的領域に対する、3、2、1、又は0個のミスマッチヌクレオチドを有する分子を含み得る。LNA分子は当技術分野で公知の方法を使用して化学的に合成され得る。
LNA分子は、当技術分野で公知の任意の方法を使用して設計され得る;多くのアルゴリズムが公知であり、市販されている(インターネット上など、例えば、exiqon.com)。例えば、Youら、Nuc. Acids. Res. 34:e60 (2006); McTigueら、Biochemistry 43:5388〜405(2004);及びLevinら、Nuc. Acids. Res. 34:el42 (2006)参照。例えば、アンチセンスオリゴの設計に使用するものと類似の「遺伝子歩行」法は、LNAの阻害活性を最適化するために使用され得る。例えば、標的RNAの長さにわたる10〜30ヌクレオチドの一連のオリゴヌクレオチドを調製し、続いて活性を試験し得る。任意選択により、例えば5〜10ヌクレオチド又はそれ超のギャップをLNA間に残し、合成及び試験されるオリゴヌクレオチドの数を減らすことができる。GC含量は、好ましくは約30〜60%の間である。LNAを設計するための一般指針が当技術分野で公知であり、例えばLNA配列は他のLNA配列に非常に密接に結合するため、LNA内での著しい相補性は避けることが好ましい。4つより多くのLNA残基の連続は、可能な場合避けるべきである(例えば、非常に短い(例えば、約9〜10nt)オリゴヌクレオチドでは不可能な場合がある)。いくつかの実施形態では、LNAはキシロ-LNAである。
LNAに関する更なる情報は、米国特許第6,268,490号;第6,734,291号;第6,770,748号;第6,794,499号;第7,034,133号;第7,053,207号;第7,060,809号;第7,084,125号;及び第7,572,582号;並びに米国付与前出願番号第20100267018号;第20100261175号;及び第20100035968号; Koshkinら、Tetrahedron 54、3607〜3630(1998); Obikaら、Tetrahedron Lett. 39、5401〜5404(1998); Jepsenら、Oligonucleotides 14:130〜146(2004); Kauppinenら、Drug Disc. Today 2(3):287〜290(2005);及びPontingら、Cell 136(4): 629〜641(2009)、並びにこれらに記載の参考文献を参照。
アプタマー
アプタマーは、特異的な標的分子、例えばタンパク質に密接に体良く結合し得る短いオリゴヌクレオチド配列である。異なるアプタマー配列が、異なるタンパク質に特異的に結合できることが実証され、例えば配列GGNNGG、ここでN=グアノシン(G)、シトシン(C)、アデノシン(A)、又はチミジン(T)、はトロンビンに特異的に結合する(Bockら(1992) Nature 355: 564〜566及び米国特許第5,582,981号(1996) Tooleら)。
アプタマー種は、ランダムに生成したオリゴヌクレオチド配列を標的分子とインキュベートし、標的に結合する能力があるオリゴヌクレオチド配列を選択し、新しいプールを生成するために増幅し、望ましい表現型が観察されるまで及び/又は配列多様性が有意に最小化されるまで、この工程を繰り返すことによって生成できる(Tuerk及びGold、Science 249:505〜510(1990); Ellington及びSzostak、Nature 346:818〜822(1990)参照)。特異性は、オリゴヌクレオチド配列を非標的分子とインキュベートし、結合したオリゴヌクレオチドを残りの潜在的なアプタマーのプールから取り除く、ネガティブセレクション工程の導入によって増大できる(Yan及びLevy、RNA Bio. 6(3):316〜320(2009))。反復の選択工程後、最後に残った配列をクローン化及び配列決定し、アプタマーを特徴付けることができる。そのようなRNAアプタマーの選択及び調製方法は当技術分野で公知である(例えばFeigonら、Chem. Biol. 3: 611(1996); Kellyら、J. Mol. Biol. 256:417(1996); Famulok、Curr. Opin. Struct. Biol. 9:324(1999); Herman及びPatel、J. Science 287:820〜825(2000); Santosh及びYadava、Biomed Res Int. 2014:540451 (2014); Szeitnerら、J Pharm Biomed Anal, pii: S0731-7085(14)00209-X (2014); Kong及びByun、Biomol Ther (Seoul). 21(6):423〜34(2013)参照)。
阻害性核酸の作製及び使用
本明細書に記載の方法を実行するために使用する核酸配列は、RNA、cDNA、ゲノムDNA、ベクター、ウイルス、又はそれらのハイブリッドのいずれかが様々な供給源から単離され、遺伝子改変、増幅、及び/又は組換えで発現/生成され得る。組換え核酸配列は、個々に単離及びクローン化され、所望の活性を試験され得る。例えばin vitro、バクテリア、真菌、哺乳動物、イースト、昆虫、又は植物細胞発現系を含む任意の組換え発現系が使用され得る。
本発明の核酸配列は送達ベクターに挿入され、ベクター内の転写ユニットから発現され得る。組換えベクターは、DNAプラスミド又はウイルスベクターであってよい。ベクター構築物の生成は、限定はされないが、例えば、Sambrookら(Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (1989))、Coffinら(Retroviruses. (1997))及び「RNA Viruses: A Practical Approach」(Alan J. Cann, Ed., Oxford University Press、(2000))に記載のように、PCR、オリゴヌクレオチド合成、制限エンドヌクレアーゼ切断、ライゲーション、形質転換、プラスミド精製、及びDNAシークエンシングの基本的な技術を含む当技術分野で周知の任意の好適な遺伝子工学技術を使用して行われ得る。当業者には明らかであるように、本発明の核酸を細胞へ導入するために、様々な好適なベクターが利用可能である。核酸を送達する適切なベクターの選択及び選択した発現ベクターの細胞への挿入のための条件の最適化は、過度な実験を必要とすることなしに当業者の範囲内である。ウイルスベクターは、パッケージング細胞における組換えウイルスの産生ための配列を有するヌクレオチド配列を含む。本発明の核酸を発現するウイルスベクターは、限定はされないが、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルス、又はアルファウイルスを含むウイルス骨格を基に構築され得る。本発明の核酸を発現できる組換えベクターは本明細書に記載のように送達され、標的細胞で生き残ることができる(例えば、安定的形質転換体)。
本発明を実施するために使用する核酸配列は、例えば、Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440〜3444; Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19:373〜380; Blommers (1994) Biochemistry 33:7886〜7896; Narang (1979) Meth. Enzymol. 68:90; Brown (1979) Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22:1859;米国特許第4,458,066号に記載のように、周知の化学合成技術によってin vitroで合成され得る。
本発明の核酸配列は、修飾、例えばヌクレオチド修飾の取り込みによるなど、核酸分解に対して安定化され得る。例えば、本発明の核酸配列は、ヌクレオチド配列の5'又は3'末端にホスホロチオエートの、少なくとも第1、第2、又は第3ヌクレオチド間結合を含む。別の例として、核酸配列は、2'-修飾ヌクレオチド、例えば、2'-デオキシ、2'-デオキシ-2'-フルオロ、2'-O-メチル、2'-O-メトキシエチル(2'-O-MOE)、2'-O-アミノプロピル(2'-O-AP)、2'-O-ジメチルアミノエチル(2'-O-DMAOE)、2'-O-ジメチルアミノプロピル(2'-O-DMAP)、2'-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル(2'-O-DMAEOE)、又は2'-O--N-メチルアセトアミド(2'-O--NMA)を含んでよい。別の例として、核酸配列は、少なくとも1つの2'-O-メチル-修飾ヌクレオチドを含んでよく、いくつかの実施形態では、ヌクレオチドの全てが2'-O-メチル-修飾を含む。いくつかの実施形態では、核酸配列は「ロック」されている、すなわち、2'-O原子と4'-C原子とをつなぐメチレン架橋により、リボース環が「ロック」されている核酸類似体を含む(Kaupinnenら、Drug Disc. Today 2(3):287〜290(2005); Koshkinら、J. Am. Chem. Soc.、120(50):13252〜13253(1998)参照)。更なる修飾に関しては、米国特許第20100004320号、米国特許第20090298916号、及び米国特許第20090143326号を参照。
本発明を実行するために使用する核酸の操作のための技術、例えば、サブクローニング、標識プローブ(例えばKlenowポリメラーゼを使用するランダムプライマー標識、ニックトランスレーション、増幅)、シークエンシング、ハイブリダイゼーションなどは科学及び特許文献によく記載されている、例えばSambrookら、Molecular Cloning; A Laboratory Manual 3d ed. (2001); Current Protocols in Molecular Biology、Ausubelら、eds. (John Wiley & Sons, Inc.、New York 2010); Kriegler、Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993)参照。
医薬組成物
本明細書に記載の方法は、活性試薬としてTspan33を標的化する分子、例えば抗Tspan33抗体、小分子、又は本明細書に記載のようにTspan33を標的化する阻害性核酸を含む医薬組成物及び製剤の投与を含み得る。
いくつかの実施形態では、組成物は薬学的に許容される担体により製剤化される。医薬組成物及び製剤は、非経口的に、局所的に、経口的に、又はエアロゾル若しくは経皮的によるなど局所投与によって投与され得る。医薬組成物は任意の方法で製剤化され、状態又は疾患、及び病気の程度、各患者の全身の健康状態、結果として投与の好ましい方法等に応じて様々な単位剤形で投与され得る。医薬品の製剤化及び投与のための技術の詳細は科学及び特許文献によく記載されている。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy、21st ed.、2005参照。
活性化合物は、単独で又は医薬製剤(組成物)の構成要素として投与され得る。化合物は、ヒト又は獣医学で使用するための任意の便利な方法で、投与のために製剤化され得る。湿潤剤、乳化剤、並びにラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、並びに着色剤、剥離剤、コーティング剤、甘味料、香料及び芳香剤、防腐剤及び抗酸化剤も組成物中に存在し得る。
これらの組成物の製剤は、皮内、吸入、経口/点鼻、局所、非経口、直腸、及び/又は膣内投与に適したものを含み得る。製剤は、便利に単位剤形であってよく、薬学の分野で周知の任意の方法によって調製され得る。単一の剤形を製造する担体材料と組合され得る活性成分(例えば、本発明の核酸配列)の量は、処置される宿主、投与の特別な様式、例えば皮内又は吸入によって変わる。単一の剤形を製造する担体材料と組合され得る活性成分の量は、通常治療効果、例えば抗原特異的T細胞又は体液性応答をもたらす化合物の量である。
本発明の医薬製剤は、医薬品の製造に関して当技術分野で公知の任意の方法によって調製され得る。そのような薬物は、甘味料、香料、着色剤、及び防腐剤を含有し得る。製剤は、製造に適した非毒性の薬学的に許容される賦形剤と混合され得る。製剤は、1又は複数の希釈剤、乳化剤、防腐剤、緩衝剤、賦形剤等を含んでよく、液体、粉末、乳剤、凍結乾燥粉末、スプレー、クリーム、ローション、放出制御製剤、錠剤、ピル、ゲル、膏薬、移植等の形態で提供され得る。
経口投与のための医薬製剤は、適切な及び好適な投与量で当技術分野で周知の薬学的に許容される担体を使用して製剤化され得る。そのような担体は、医薬品を錠剤、ピル、粉末、糖衣錠、カプセル、液体、ロゼンジ、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等として単位剤形に製剤化することができ、患者による摂取に好適である。経口使用のための医薬製剤は、所望であれば、好適な更なる化合物を添加した後に、任意選択により生じた混合物を粉砕し、顆粒の混合物を処理して錠剤又は糖衣錠のコアを得ることにより、固体賦形剤として製剤化され得る。好適な固体賦形剤は、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、又はソルビトールを含む糖、トウモロコシ、小麦、米、ジャガイモ、又は他の植物由来のデンプン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、又はカルボキシ-メチルセルロースナトリウムなどのセルロース、アラビア及びトラガカントを含むゴム、並びにタンパク質、例えばゼラチン及びコラーゲンを含む炭水化物又はタンパク質充填剤である。架橋ポリビニルピロリドン、アガー、アルギン酸又はその塩、例えばアルギン酸ナトリウムなど、崩壊剤又は可溶化剤が添加され得る。プッシュフィットカプセルは、ラクトース又はデンプンなどの充填剤又は結合剤、タルク又はステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、及び任意選択により安定剤と混合した活性剤を含有し得る。軟カプセル中で、活性剤は、安定剤有り又は無しで、脂肪油、液体パラフィン、又は液体ポリエチレングリコールなどの好適な液体に溶解又は懸濁され得る。
水性懸濁液は、水性懸濁液の製造、例えば水性皮内注射に好適な賦形剤との混合物中に活性剤(例えば、本発明の核酸配列)を含有し得る。そのような賦形剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム及びアカシアゴムなどの懸濁剤、並びに天然起源のフォスファチド(例えばレシチン)、脂肪酸を有するアルキレンオキシドの縮合物(例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン)、長鎖脂肪族アルコールを有するエチレンオキシドの縮合物(例えばへプタデカエチレンオキシセタノール)、脂肪酸及びヘキシトール由来の部分エステルを有するエチレンオキシドの縮合物(例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレート)、又は脂肪酸及びヘキシトール無水物由来の部分エステルを有するエチレンオキシドの縮合物(例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート)などの分散剤又は湿潤剤を含む。水性懸濁液は、エチル又はn-プロピルp-ヒドロキシ安息香酸などの1つ又は複数の防腐剤、1つ又は複数の着色剤、1つ又は複数の香料、及び例えばスクロース、アスパルテーム、又はサッカリンなどの1つ又は複数の甘味料も含有し得る。製剤はモル浸透圧濃度を調製され得る。
いくつかの実施形態では、油性医薬品が本発明の核酸配列の投与に使用される。油性懸濁液は、落下性油、オリーブ油、ゴマ油若しくはココナッツ油などの植物油、又は液体パラフィンなどの鉱物油、又はこれらの混合物に活性剤を懸濁することによって製剤化され得る。生物学的利用能を増大し、経口投与した疎水性の医薬化合物の個体間における及び同一個体における可変性を低減する精油又は精油成分を使用することを記載している米国特許第5,716,928号参照(米国特許第5,858,401号も参照)。油懸濁液は、みつろう、固形パラフィン、又はセチルアルコールなどの増粘剤を含有し得る。グリセロール、ソルビトール、又はスクロースなどの甘味料は、味の良い経口製剤を提供するために添加され得る。これらの製剤は、アスコルビン酸などの抗酸化剤の添加によって保存され得る。注射可能な油ビヒクルの例としては、Minto (1997) J. Pharmacol. Exp. Ther. 281:93〜102を参照。
医薬製剤は、水中油型乳剤の形態であってもよい。油相は、上述のように、植物油若しくは鉱物油、又はこれらの混合物であってよい。好適な乳化剤は、アカシアゴム及びトラガカントゴムなど天然起源のゴム、大豆レシチンなどの天然起源のフォスファチド、ソルビタンモノオレートなど、脂肪酸及びヘキシトール無水物由来のエステル又は部分エステル、並びにポリオキシエチレンソルビタンモノオレートなど、これらの部分エステルとエチレンオキシドとの濃縮物を含む。シロップ及びエリキシル剤の製剤のように、乳剤は甘味料及び香料も含有し得る。そのような製剤は、粘滑剤、防腐剤、又は着色剤も含有し得る。他の実施形態では、これらの本発明の注射可能な水中油型乳剤は、パラフィン油、ソルビタンモノオレート、エトキシル化ソルビタンモノオレート、及び/又はエトキシル化ソルビタントリオレートを含む。
医薬化合物は、坐薬、吸入、粉末及びエアゾール製剤を含む鼻腔内、眼内、及び膣内経路によっても投与され得る(例えばステロイド吸入の、例えばRohatagi (1995) J. Clin. Pharmacol. 35:1187〜1193; Tjwa (1995) Ann. Allergy Asthma Immunol. 75:107〜111参照)。坐薬製剤は、薬物と、通常の温度では固体であるが体温では液体であり、したがって体内で溶けて薬物を放出する好適な非刺激性の賦形剤と混合することによって調製され得る。そのような材料はココアバター及びポリエチレングリコールである。
いくつかの実施形態では、医薬化合物は、局所経路によって経皮的に送達され、アプリケータースティック、溶液、懸濁液、乳剤、ゲル、クリーム、軟膏、ペースト、ゼリー、塗料、粉末、及びエアロゾルとして製剤化され得る。
いくつかの実施形態では、医薬化合物は、体内での徐放のためマイクロスフィアとしても送達され得る。例えば、マイクロスフィアは、皮下に徐放する薬物の皮内注射によって;Rao (1995) J. Biomater Sci. Polym. Ed. 7:623〜645参照;生分解性及び注射用ゲル製剤として、例えばGao (1995) Pharm. Res. 12:857-863(1995)参照;又は、経口投与のためのマイクロスフィアとして、例えばEyles (1997) J. Pharm. Pharmacol. 49:669〜674参照;投与され得る。
いくつかの実施形態では、医薬化合物は、静脈内(IV)投与又は臓器の体腔若しくはルーメンへの投与によるなど、非経口的に投与され得る。これらの製剤は、薬学的に許容される担体中に溶解された活性剤の溶液を含み得る。用いられ得る許容可能なビヒクル及び溶媒は、水及びリンガー液、等張食塩水である。更に、無菌の不揮発性油は、溶媒又は懸濁培地として用いられ得る。このため、合成モノ又はジグリセリドを含む、任意の無菌の不揮発性油が用いられ得る。更に、オレイン酸などの脂肪酸は同様に注射用の製剤に使用され得る。これらの溶液は無菌であり、通常望ましくない物を含まない。これらの製剤は、従来の、周知の殺菌技術によって殺菌され得る。製剤は、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等のpH調整剤及び緩衝剤、毒性調整剤など、生理的条件に近づけるために必要な薬学的に許容される補助剤を含有し得る。これらの製剤中の活性剤の濃度は大きく異なっていてよく、選択された投与の特定のモード及び患者の必要性に従って、主に液量、粘度、体重等に基づいて選択される。IV投与に関して、製剤は、無菌の注射用水性又は油性懸濁液などの無菌の注射用製剤であってよい。この懸濁液は、それらの好適な分散剤又は湿潤剤、及び懸濁剤を使用して製剤化され得る。無菌の注射用製剤は、非毒性の、非経口的に許容可能な、1,3-ブタンジオールの溶液などの希釈剤又は溶媒中にも懸濁され得る。投与は、ボーラス又は連続注入により得る(例えば、特定の期間、血管への実質的に途切れない導入)。
いくつかの実施形態では、医薬化合物及び製剤は凍結乾燥され得る。阻害性核酸を含む安定な凍結乾燥製剤は、本発明の医薬品及び充填剤、例えばマンニトール、トレハロース、ラフィノース、及びスクロース又はそれらの混合物を含む溶液を凍結乾燥することによって作製され得る。安定な凍結乾燥製剤を調製する方法は、タンパク質約2.5mg/mL、スクロース約15mg/mL、NaCl約19mg/mL、及び5.5より高いが6.5より低いpHを有するクエン酸ナトリウム緩衝液の溶液を凍結乾燥する工程を含み得る。例えば米国特許第20040028670号参照。
組成物及び製剤はリポソームの使用によって送達され得る。リポソームの使用によって、特にリポソーム表面が標的細胞に特異的なリガンドを担持する場合、又は他の方法で特定の臓器に優先的に向けられる場合、in vivoで活性剤の送達を標的細胞に集中できる。例えば、米国特許第6,063,400号;第6,007,839号; Al-Muhammed (1996) J. Microencapsul. 13:293〜306; Chonn (1995) Curr. Opin. Biotechnol. 6:698〜708; Ostro (1989) Am. J. Hosp. Pharm. 46:1576〜1587参照。本発明で使用されるように、用語「リポソーム」は、1つ又は複数の二重膜に配置された両親媒性脂質からなる小胞を意味する。リポソームは、送達される組成物を含有する親油性材料及び水性内部から形成される膜を有する単層又は多層小胞である。カチオン性リポソームは、負電荷を持つDNA分子と相互作用し安定な複合体を形成すると考えられる正電荷を持つリポソームである。pH感受性又は負電荷を持つリポソームは、それとの複合体よりもDNAを捕捉すると考えられる。カチオン性及び非カチオン性リポソームは両方とも、DNAを細胞に送達するために使用されている。
リポソームは、「立体安定化された」リポソーム、すなわち1つ又は複数の特殊化した脂質を含むリポソームも含み得る。リポソームに組込まれると、これらの特殊化した脂質は、そのような特殊化した脂質を欠くリポソームと比較して循環寿命が増大したリポソームをもたらす。立体安定化されたリポソームの例は、リポソームの小胞形成脂質部分の一部が1つ又は複数の糖脂質を含むもの、又はポリエチレングリコール(PEG)部分などの、1つ又は複数の親水性ポリマーで誘導体化されるものである。リポソーム及びそれらの使用は、米国特許第6,287,860号に更に記載される。
本発明の製剤は、予防及び/又は治療処置のために投与され得る。いくつかの実施形態では、治療用途のために、組成物は、トリグリセリドレベルを下げる必要がある又は本明細書に記載の障害のリスクがある若しくは障害を有する対象に、障害の臨床症状又はその合併症を治療する、緩和する、又は部分的に停止するために十分な量、これは治療有効量と呼ばれる、で投与される。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、対象のトリグリセリドの血清レベルを減少するのに十分な量で投与される。
これを達成するのに十分な医薬組成物の量は、治療有効用量である。この使用に有効な投与スケジュール及び量、すなわち投与レジメンは、疾患又は状態のステージ、疾患又は状態の重症度、患者の健康の全身状態、患者の全身状態、年齢等を含む様々な因子に依存する。患者の投与レジメンの算出において、投与の様式も考慮に入れる。
投与レジメンは、当技術分野で周知の薬物動態パラメーター、すなわち活性剤の吸収率、生物学的利用能、代謝、クリアランス等も考慮に入れる(例えば、Hidalgo- Aragones (1996) J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 58:611〜617; Groning (1996) Pharmazie 51:337〜341; Fotherby (1996) Contraception 54:59〜69; Johnson (1995) J. Pharm. Sci. 84:1144〜1146; Rohatagi (1995) Pharmazie 50:610〜613; Brophy (1983) Eur. J. Clin. Pharmacol. 24:103〜108; Remington: The Science and Practice of Pharmacy、21st ed.、2005参照)。最新の技術により、医師は、個々の患者それぞれの投与レジメン、活性剤、及び処置される疾患又は状態を決定できる。医薬品として使用される同様の組成物を規定したガイドラインは、投与レジメン、すなわち投与スケジュール及び投与レベルを決定するガイダンスとして使用され、本発明の方法が正しく及び適切に実行するように投与される。
単一の又は複数の製剤の投与は、例えば、患者によって必要とされる及び許容されるような用量及び頻度、各投与後に生じる治療効果の程度及び量(例えば、腫瘍サイズ又は増殖における効果)等に応じて与えられ得る。製剤は、状態、疾患、又は症状を効果的に処置、予防、又は改善する十分な量の活性剤を提供すべきである。
他の実施形態では、経口投与用の医薬製剤は、1日当たり、体重1kg当たり約1〜100mg又はそれ超の1日量である。経口投与とは対照的に、血流、体腔、又は臓器のルーメンへは少ない用量が使用され得る。局所又は経口投与、又は粉末、スプレー、若しくは吸入による投与においては実質的に高い用量が使用され得る。経口又は非経口投与可能な製剤を調製するための実際の方法は、当業者に公知又は明らかであり、Remington: The Science and Practice of Pharmacy、21st ed.、2005のような論文により詳細に記載されている。
様々な研究により、相補的な核酸配列を使用する有効な哺乳動物への投与が報告されている。例えば、Esau Cら、(2006) Cell Metabolism、3(2):87〜98は、正常マウスへの4週間、週2回、12.5〜75mg/kgの範囲のmiR-122アンチセンスオリゴヌクレオチドの腹腔内投与による投与を報告した。マウスは処置の終わりに、体重の減少又は食欲の低下がなく、健康及び正常に見えた。プラズマトランスアミナーゼレベルは、75mg/kg用量のmiR-122 ASOを除く全ての用量で正常範囲(AST 3/4 45、ALT 3/4 35)であり、ALT及びASTレベルの非常に緩やかな増加を示した。それらにより、50mg/kgが有効で、非毒性の用量であることが結論付けられた。Krutzfeldt J.ら、(2005) Nature 438, 685〜689による別の研究では、体重1kg当たり80、160、又は240mgの総用量を使用するアンタゴミルを注射してマウスにおいてmiR-122を発現停止した。最高用量は、miR-122シグナルの完全な欠損をもたらした。更に別の研究では、ロックド核酸(「LNA」)が霊長類に有効に適用され、miR-122を発現停止した。Elmen J.ら、(2008) Nature 452, 896〜899は、10mg kg-1 LNA-抗miRの3つの用量によって、miR-122の有効な発現停止が霊長類において達成され、これらの研究動物において、LNA関連毒性又は病理組織学的な変化のいずれの証拠もなしに、総血漿コレステロールの長期にわたる及び可逆的な減少をもたらしたことを報告している。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、他の薬物又は医薬品、例えばコレステロールの恒常性を提供する組成物との同時投与を含み得る。例えば、化合物は、本明細書に記載の疾患を処置する又は疾患のリスクを減らす、例えば他の免疫療法又は抗がん処置の薬物と同時投与され得る。
本発明は以下の実施例に更に記載され、特許請求の範囲に記載の本発明の範囲を限定しない。
材料及び方法
以下の材料及び方法を以下に記載の実施例において使用した。
マウス及びin vivo研究
C57BL/BL6マウスは、チャールズリバー社(Wilmington、MA)から購入し、BIDMCの動物施設で飼育した。およそ17mgの体重、6〜8週齢の雌のC57BL/6マウスを使用前1週間維持した。マウスは、平均室温20±1℃、湿度50%±10%、食物及び水に自由にアクセスできる、制限されたアクセス領域内でケージにつき5匹ずつ飼育した。全ての実験は、実験動物審査委員会によって許可された。マウスに、Pan02、E0771、RM-9又はB16細胞(マウスにつき1×106個の細胞)を皮下注射によって接種した。腫瘍体積は、先に記載のように測定した。
細胞の単離及び分析
腫瘍担持及び非腫瘍担持マウスから採取した脾臓を使用して、T細胞、NK細胞、及びMDSCを単離した。腫瘍浸潤リンパ球の単離のため、腫瘍標本をPBSで洗浄し、はさみで細かく切り、0.1%IV型コラゲナーゼ、0.2mg/mlV型ヒアルロニダーゼ、及び0.01%DNaseI(Sigma-Ardrich社製)により、37℃で30分間消化した。消化は、熱不活性化10%FCSを含有する過剰なRPMI1640培地の添加によって停止した。細胞懸濁液は、次いで順に100mm、70mm、及び40mmの細胞ストレーナー(BD Falcon社)に通し、10%FCSを含有するRPMI1640培地で3回洗浄した。リンパ球は密度勾配(Ficoll-Hypaque PLUS、GE Healthcare社)によって精製し、分析フローサイトメトリー、分取FACSソーティング、又は磁気ビーズでの単離のために染色した。細胞傷害性アッセイのため、腫瘍浸潤NK細胞は、CD3+細胞の枯渇によって磁気ビーズで単離し、続いてNK1.1+細胞を単離した。フローサイトメトリー分析によって測定された集団の純度は、およそ93%超であった。
骨髄由来サプレッサー細胞の単離
CD11b+Gr-1+細胞を精製するため、赤血球枯渇脾臓細胞はまず、製造業者(Miltenyi Biotec社、Auburn、CA)の指示に従って、抗CD19及び抗CD11cマイクロビーズ及びLDカラムを使用する磁気選別によりCD11bGr-1細胞を枯渇した。全MDSC集団又はMDSC亜分画の純度は典型的には90%より高い。
患者、MDSCの分析
先に承認されたIRBプロトコールに従って、前立腺がん患者から血液試料を採取した。Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare社、Uppsala、Sweden)密度勾配遠心分離によって、新鮮な採血からPBMCを単離し、凍結保存した。PBMCは37℃(1〜2分)でのインキュベーションにより溶かし、続いてRPMI1640中に再懸濁し、遠心分離した。細胞ペレットは、トリパンブルーで生存能を評価し、すぐに次の段落「モノクローナルAb及びフローサイトメトリー」に記載のように適切な抗体で染色後、マルチカラーフローサイトメトリーを使用して評価した。
モノクローナルAb及びフローサイトメトリー
蛍光色素コンジュゲート抗体による細胞表面染色及び細胞質内染色実験を以下の標準的な手順に従って実行した(35)。以下の抗体を使用した:PE、FITC、APCコンジュゲート抗Gr1及び抗CD11b、PEコンジュゲートCD4、CD8;PE、APC、PE-Cy5.5コンジュゲートLy6C及びLy6G;並びにFITCコンジュゲートNOS2。全て、BD Biosciences社(San Diego、CA)、又はBioLegend社(San Diego、CA)から購入した。Tspan33のPE、FITCコンジュゲーションを、Abeam社(Cambridge、MA)のウサギTspan33抗体(ab79130)又はAbnova社(Walnut、CA)のウサギポリクローナル抗体により行った。Tspan33抗体のFITC及びPE-結合は、Lightning-Link抗体標識キット(Novus社、Littleton、CO)により行った。前立腺がん患者を含む全ての研究は、R&D Systems社(Minneapolis、MN)のヒトTspan33モノクローナル抗体(MAB8405)により行った。製造業者によって記載されたように、CD33マイクロビーズ(Miltenyi社、Auburn、CA)を使用してヒトCD33+cellsを単離した。抗ヒトCD4、CD8、HLA-DR、CD14、CD33抗体は、BD Biosciences社及びeBioscience社(San Diego、CA)から購入した。細胞ソーティングはFACSAria II sorter (Becton Dickinson社、San Jose、CA)により行い、分析測定はBD FACSCantoフローサイトメーターにより行った。データ分析はFloJoソフトウェア(Tree Star社、Ashland、OR)を使用して実行した。
MDSC抑制アッセイ
T細胞のMDSC抑制は、腫瘍のないC57BL/6から単離した脾臓T細胞に対して行った。T細胞は、T細胞濃縮カラム(R&D Systems社)を使用して単離した。異なる比率で、単離したT細胞(2×104個)を、α-CD3/α-CD28で活性化し、照射したMDSC(5×104個)と培養した。CD4 T細胞増殖は、アラマーブルーを使用して、又はCFSE染色により分析した。ヒトT細胞増殖アッセイは、先に記載したように実施した(24)。
マイクロアレイ分析
脾臓細胞は、3週間後の皮下にPan02腫瘍を有するマウスから単離した。対照及び腫瘍担持動物の脾臓細胞から単離したMDSC(前の段落に記載したように)は、RNA単離(NucleoSpin RNA II、Machery-Nagel社、Duren、Germany)、続いて線形T7増幅及びAgilent社のWhole Mouse Genome Oligoマイクロアレイへのハイブリダイゼーションに使用した。スキャンしたアレイ画像は、品質管理分析及び正規化のために開発された、カスタマイズしたR言語スクリプトを使用して分析した。生のプローブレベルデータは、bioconductorの線形モデルマイクロアレイ分析ソフトウェアパッケージ(limma)の手順でLoess及びクオンタイル正規化を使用して正規化され、アレイ間での色素バイアス及び変動を調整した。異なって発現した遺伝子を同定するため、線形モデルはlimmaを使用して実行した(36)。Limmaは、線形モデルに合わせ、経験的ベイズの方法を使用することによって腫瘍と対照MDSCの間の差を評価し、各プローブセットからの発現値について評価したlog倍率変化の標準誤差を緩和した。差次的発現したプローブは、絶対倍率変化及びBenjamini and Hochberg補正P値に基づいて同定された(37)。
相互作用ネットワーク分析
遺伝子間の相互作用の解読のため、本発明者らは相互作用ネットワーク分析を実施した。相互作用ネットワークは、公知のタンパク質-タンパク質、タンパク質-DNA、共発現及びタンパク質-RNA相互作用を使用して生成された。相互作用情報は、文献検索及び公的に入手可能なデータベースを使用して得た。
細胞障害性アッセイ
NK細胞は、NK細胞単離キット(Miltenyi Biotec社、Auburn、CA)を使用して単離した。NK細胞傷害活性は先に記載のように測定した(24)。いくつかの実験では、NK細胞障害性は、CellaTox非放射性アッセイ(Cell Technology社、Mountain View、CA)を使用して測定し、製造業者の指示に従って、標的細胞の溶解を算出した。
in vitroサイトカイン誘導MDSC
ヒトPBMCを健常なボランティアから得た血液からFicoll密度勾配遠心分離(Sigma-Aldrich社、St. Louis、MO)によって単離した。PBMCは、GM-CSF (10ng/ml; R&D Systems社、Minneapolis、MN)及びIL-6 (R&D Systems社)を補足した、10% FCS、2mM L-グルタミン、100U/ペニシリン、及び100ug/mlストレプトマイシンを含有するRPMI培地中で培養した(5×105個の細胞/ml)。
共焦点顕微鏡
マウス由来の腫瘍を、適切な時間に採取し、クリオスタット切片のために固定及び調製した。組織切片(5um)を、Gr1、Tspan33に特異的なラット抗マウスmAbとインキュベートした。切片はAlexa Fluor 555抗ラット又はAlexa Fluor 488抗うさぎIgGで標識した。DAPI(Sigma社、St. Louis、MO)を核染色に使用した。共焦点顕微鏡はZeiss社のLSM510 Upright Confocal Systemで実施した。
統計分析
グループ間の差について、独立スチューデントのt検定を使用して統計分析を実施した。値は、p<0.05は統計的に有意であると考えた。
(実施例1)
Tspan33遺伝子発現はマウスMDSCと関連する
正常及び膵臓がん(Pan02)担持マウスの脾臓から単離したCD11b+Gr-1+細胞における遺伝子発現のマイクロアレイ分析により、多くの遺伝子の差次的発現が明らかになった。MDSCの単離/治療標的に使用され得る潜在的なMDSCマーカーを同定するため、本発明者らは(1)最大に差次的発現する、(2)細胞表面抗原をコードするようである(リーダー配列及び膜貫通領域の存在に基づく)、(3)マウスヒト相同分子種を有するようである、(4)発現が組織限定である、(5)2つの他の腫瘍モデルのMDSCにおいても差次的発現する、(6)in vitroで発生したMDSC培養物において発現する、及び(7)in vitroアッセイにおいて免疫抑制集団の指標となる遺伝子に注目した。この分析から、潜在的な新規の候補MDSCマーカーを表す遺伝子のセットの同定が明らかになった。
この分析に基づき、本発明者らは、腫瘍担持マウス由来、マウス骨髄細胞由来(図1)、並びにGM-CSF及びIL-6又はがん細胞条件培地によって免疫抑制細胞に変換されたヒトPBMC由来のMDSCを認識する新しいマーカーとしてTspan33を同定した。Tspan33は、高度に保存されたシステイン-システイン-グリシン(CCG)モチーフを含有するシステインリッチの長い細胞外ループ(LEL)を有する保存されたドメイン構造によって定義されるテトラスパニンスーパーファミリーに属する膜貫通タンパク質である(Maeckerら、FASEB J. 1997 May; 11(6):428〜42)。近年の報告ではTspan33は活性化B細胞に発現することが示されている(Luuら、Clin Immunol. 2013 Dec; 149(3):388〜399)。Tspan33は発現が組織限定であり(図2)、多様な同系同所性移植マウス腫瘍モデルにおける骨髄免疫抑制細胞の集団とも関連する(図3)。これらの細胞は、T細胞抑制に関連する遺伝子を発現し(Arg1、NOS2)、IL-6、VEGF、EP2、及びEP4も発現する。
(実施例2)
Tspan33タンパク質発現は多様なマウス腫瘍モデル由来のMDSCにおいて検出される
MDSCは、ヒト腫瘍及び様々な動物腫瘍モデルに蓄積することが示されている。E0771乳がん細胞を移植したマウス又は自然発症の乳房腫瘍を発症しているトランスジェニックマウスの腫瘍浸潤MDSCから単離したMDSCのフローサイトメトリー分析により(図3)、Tspan33陽性細胞の有意な集団が明らかになった。このことは、Tspan33が乳がんを有するマウスのMDSCのマーカーであるという事実を支持する。
MDSCは、脾臓、肝臓、及び腫瘍を含む、腫瘍担持動物の多様な部位で蓄積することが以前に報告されている。腫瘍(Pan02、E0771)は、注入の3週間後に切除し、コラゲナーゼ及びヒアルロニダーゼによる消化に供し、浸潤細胞を単離した。MDSC(CD11b+Gr-1+細胞の染色によって測定した)は、Pan02腫瘍における腫瘍浸潤物として存在することが見出された(51.2%)。CD11bhi細胞の別の亜集団がこの集団において観察されたが、これは、この集団が区別されにくい脾臓のMDSCとは対照的である。腫瘍浸潤MDSCの染色によりTspan33+細胞の別の集団が明らかになり(23.5%)、Tspan33が腫瘍浸潤MDSCのマーカーであることを示している。他の腫瘍モデルにおける腫瘍浸潤細胞の分析により、同様の頻度のCD11b+Gr-1+細胞が明らかになった。浸潤細胞の染色は、それらがTspan33+にも陽性であることを示した。腫瘍浸潤におけるTspan33+細胞の頻度は、B16メラノーマでは62%、E0771では55.3%、及びHer2トランスジェニックマウスでは68.6%であった(図3)。
(実施例3)
Tspan33+MDSCを担持する遺伝子改変マウスモデルにおける膵臓及び乳房腫瘍
本発明者らは、膵臓がんの遺伝的モデル(LSL-KrasG12D、Pdx-l-Creマウス)において単離した骨髄由来サプレッサー細胞におけるTspan33発現も調べた。このモデルにおいて、CD11b+Gr-1+陽性細胞は腫瘍を有する動物にみられる大きな、顆粒細胞の集団を構成し、これらのCD11b+Gr-1+細胞は、移植腫瘍モデルにおいて観察されたようにTspan33を発現する。
別の遺伝的モデルとして、本発明者らは、ドキシサイクリン依存的様式で哺乳動物特異的に活性化されたNeuを発現する二重トランスジェニックMMTV-rtTA/TetO-NeuNTマウスのコロニーを生成した。Neuの慢性誘導後、動物は2カ月以内にヒト乳がんに類似の浸潤性小結節癌を発生した。興味深いことに、dox中止時、腫瘍は急速に退縮し、小さい亜集団においてのみ、Nueの脱誘導にも関わらす再発が起こる。腫瘍は、慢性的にNeu誘導した動物において並びに72時間ドキシサイクリン中止を行い、退縮の兆候を示した動物の独立したセットから、それらが200mm2未満に達した時に回収した。腫瘍組織は記載したように酵素で消化し(24)、腫瘍浸潤リンパ球の様々なサブセットの頻度を適切な抗体による染色後に分析した。Neu誘導腫瘍は、Tspan33も染色されるCD11b+Gr1+細胞から構成される浸潤細胞の大きな集団を有することが観察された。興味深いことに、退縮している腫瘍から単離したTILは、MDSCにおいて68.6〜19.3%の劇的な減少を示した。免疫蛍光染色により、退縮している腫瘍におけるこの集団の減少傾向と共に腫瘍切片におけるTspan33+細胞の発現が明らかになった(図4)。
(実施例4)
MDSCの枯渇は腫瘍量を低下させ、Tspan33+MDSCの低頻度と関連する
in vivoでMDSCを枯渇するため、腫瘍の実際のサイズ(100〜125mm3)が明らかになった後、Her2/neu腫瘍担持マウスを、10mg/kgで腹腔内投与したmLy6Gモノクローナル抗体で処置した。
MDSC頻度の減少は、両方において減少した腫瘍量と関連することが見出された。更に、MDSC枯渇腫瘍から単離した腫瘍浸潤細胞は、Tspan33+細胞の頻度並びにCD11b+Gr-1+細胞の頻度の50%より多くの減少を示した(図5)。
(実施例5)
マウス骨髄からin vitroで生成したMDSCはTspan33を発現する
本発明者らは、マウス骨髄細胞がin vitroで免疫抑制細胞に変換され得ることを以前に示した。本発明者らは、そのようなMDSCをin vitroで生成した(BM-MDSCと呼称した):本発明者らはマウス骨髄細胞から開始し、それらをGM-CSF/IL-6で4日間インキュベートし、多くの方法でこれらの細胞を特徴付けた。BM-MDSCは、NOS2及びArg1の発現の増加を示し、抗CD3及び抗CD28で活性化されたCD4細胞の増殖を阻害するそれらの能力によって示されたように高度に免疫抑制性であり、CD8細胞においてIFNγ及びパーフォリン産生を阻害する。それらは、NK細胞毒性も阻害する。簡単に述べると、BM-MDSCは、異なる比率で抗CD3/CD28コートしたプレートにおいてCD4 T細胞と共培養した。増殖は、アラマーブルーによる細胞の染色後又はCFSE染色によって測定した。CD8細胞は、1:1の比率で24時間BM-MDSCと培養し、次いでIFNγ及びパーフォリンレベルを染色し、FACSによって分析した。
重要なことには、GM-CSF/IL-6中で4日間、BM細胞を培養することにより、CD11b+Gr-1+染色又はTspan33のいずれかによって定義され得るこれらの免疫抑制細胞の生成をもたらした(図6)。
(実施例6)
腫瘍増殖の薬理学的調整はMDSC頻度の減少と関連する
MDSCの除去は、抗腫瘍免疫及び全体的な疾患の転帰を緩和することが示されている。本発明者らのデータは、「規則正しい」低用量のシクロフォスファミド(毎日経口で送達)及びcox-2阻害剤(Tonguら、Cancer Immunol. Immunother. 62(2):383〜91(2013))による腫瘍担持マウスの処置が、少数のMDSC及びTregと関連して腫瘍増殖を遅くすることを示した。本発明者らはこの治療レジメン(CTX-30mg/kg/日;セレコキシブ-20mg/kg/日)を使用して、Pan02腫瘍担持動物に投与し、腫瘍サイズ並びに処置及び対照動物の脾臓におけるTspan33+MDSCレベルをモニターした。本発明者らは、この処置を受ける動物の脾臓におけるTspan33+細胞頻度によって測定されたように、腫瘍増殖の低減及び関連するMDSC数の減少を観察した。したがって、併用処置を受けた動物において、腫瘍体積を同時に低減する(131.2〜11.7mm3)と共にTspan33+細胞の頻度は37.8%〜11.6%に減少した(図7)。
(実施例7)
前立腺がん患者の循環するTspan33+MDSCの頻度
健常ドナー(HD)及び前立腺がん患者(PD)から単離したPBMCにおけるTspan33陽性MDSCの頻度は、以下のようにFACS分析によって測定した。血液は、健常ドナー(n=2)及び複数の前立腺がん患者(n=7)から採取した。PBMCは、材料及び方法に記載したように、差分密度勾配分離(Ficoll-Hypaque; Sigma-Aldrich社、St. Louis、MO)によって単離した。細胞はHLA-DR、CD33及びTspan33、又はアイソタイプ対照の蛍光色素コンジュゲート抗体によって標識した。Tspan33+細胞のパーセンテージを算出するため、Lin-、HLA-DRlo領域でゲートをかけ、アイソタイプ対照で測定したバックグラウンドの引き算後、陽性細胞をTspan33+細胞とみなした。スチューデントのt検定を行い、有意なレベルを測定した。
図8に示す結果は、健常ドナー(HD)と比較して、試験した全ての前立腺がん患者(PD)が有意に高い(P<0.01)レベルの循環するTspan33+MDSCを有したことを示す。
(実施例8)
MDSC標的化抗体は腫瘍増殖及びサイズを低減する
抗体を用いたMDSC枯渇の効果は、異種移植ヒト乳がんモデルにおいて評価した。in vivoでMDSCを枯渇するため、E0771移植腫瘍担持マウスをmLy6G(Gr-1)モノクローナル抗体で処置した;Gr-1は、マウスにおいてMDSCを標的化する本研究における同定マーカーとして使用されている(9)。
抗体は、10mg/kgで投与した(C57BL/6マウスの脇腹に1×106個のE0771細胞の注入後、腹腔内投与)。抗体注入は、腫瘍細胞注入後7日目、10日目、及び14日目の3回行った。脾臓及び腫瘍は、21日目に動物を安楽死させた後採取した。
最初の実験では、動物はAb処置による枯渇後2〜3日で屠殺し、脾臓は、抗体染色によってLy6G特異的細胞の存在を分析し、MDSCの枯渇をモニターした。
腫瘍増殖及び免疫回避におけるMDSCの役割の中心テーマの一部として、本発明者らは、抗Gr-1抗体処置を使用してE0771乳がん細胞移植動物のMDSCを枯渇した。MDSC頻度(CD11b+Gr-1+細胞の頻度)の低減は、腫瘍量の低減と関連することが見出された(図9A〜C)。これらの結果は、MDSC表面マーカーに対する抗体によるMDSC標的化が腫瘍増殖及びサイズの低減をもたらし得ることを示した。
(実施例9)
肝臓がんにおけるTspan33の発現
蛍光免疫組織化学法を行い、細胞におけるTspan33の発現をin situで更に検証した。Tspan33は、10μg/mLのモノクローナル抗体(カタログ# ab87543; abeam社、Cambridge、MA)を室温で3時間使用して、浸漬固定したHepG2細胞株で検出された。細胞を一次抗体(Alexa Fluor 647red/Alexa Fluor 488抗ウサギIgG 緑)で染色し、DAPI(青; Sigma社、St. Louis、MO)で対比染色した。共焦点顕微鏡はZeiss社のLSM510 Upright Confocal Systemで行った。
結果は、肝臓がん細胞株HepG2におけるTspan33の細胞質及び膜両方での発現を示した。
(実施例10)
肺がんにおけるTspan33の発現
Tspan33発現を、数人の患者からの正常及び肺がん試料において測定した。ウェスタンブロッティングによってTspan33発現を分析した、対応する正常なヒト及びがん組織試料は、Protein Biotechnologies社(Protein Biotechnologies社、CA)製のRIPA緩衝液中の溶解物として得た。大部分のヒト肺がん試料からの組織溶解物のウェスタンブロット分析により、ヒトTspan33に相当するタンパク質のバンドの存在が明らかであった(HepG2細胞溶解物で発現される同じサイズのバンドによって示されるように、最終レーン)。更に、Tspan33タンパク質は、正常組織(N)と比較して腫瘍(T)においてより豊富に発現した。このことは、肺がんを有する患者由来の腫瘍試料におけるTspan33+細胞の存在を示している。
その他の実施形態
本発明はその詳細な説明と併せて記載されるが、先の記載は例示を目的とし、本発明の範囲を制限するものではなく、添付の特許請求の範囲の範囲によって規定されるものであることが理解される。他の態様、利点、及び修飾は以下の特許請求の範囲の範囲内である。
[参考文献]

Claims (30)

  1. 対象におけるがんを処置する、又は処置のための対象を選択する方法であって、
    対象からの試料中のTspan33+MDSCのレベルを検出する工程であって、好ましくは、試料は、血液、血清、尿又はがん組織を含む、工程;
    試料中のTspan33+MDSCのレベルを、Tspan33+MDSCの参照レベルと比較する工程;並びに
    MDSCを標的化する免疫療法での処置のために、参照レベルを超えるTspan33+MDSCのレベルを有する対象を選択する工程、及び任意選択でMDSCを標的化する免疫療法を対象に投与する工程;又は
    MDSCを標的化しない療法、例えばMDSCを標的化しない免疫療法又は非免疫療法の抗がん療法での処置のために、参照レベル又はそれ未満のTspan33+MDSCのレベルを有する対象を選択する工程;及び任意選択でMDSCを標的化しない療法を投与する工程
    を含む方法。
  2. 治療有効量の、Tspan33に特異的に結合して、対象におけるTspan33+骨髄由来サプレッサー細胞の数又は活性を低減させる抗体を投与する工程を含む、対象におけるがんを処置する、又はMDSCの数を低減させる方法。
  3. 抗体が、ヒト、ヒト化、キメラ、二重特異性、又は二機能性の抗体である、請求項2に記載の方法。
  4. 抗体が、細胞傷害性のペプチド若しくはタンパク質、放射線同位体、又は抗がん薬にカップリングされている、請求項2に記載の方法。
  5. 対象に抗がん療法を投与する工程を更に含む、請求項2に記載の方法。
  6. 抗がん療法が、Tspan33に特異的に結合する抗体の後に対象に投与される、請求項1又は5に記載の方法。
  7. 抗がん療法が、本明細書に記載されるようなコールドインストルメント又はレーザーを用いた外科的切除、放射線療法、光線療法、生物学的療法、高周波アブレーション(RFA)、放射線塞栓療法、化学療法、及び免疫療法からなる群から選択される、請求項1又は5に記載の方法。
  8. 抗がん療法が、チェックポイント阻害剤及び/又はがんワクチンの投与を含む、請求項7に記載の方法。
  9. がんが、上皮由来の固形がんである、請求項1又は2に記載の方法。
  10. がんが、がん組織におけるTspan33+骨髄由来サプレッサー細胞(MDSC)の存在を特徴とする、請求項1又は2に記載の方法。
  11. 対象からの試料、好ましくは、血液、尿、CSF、又はがん組織を含む試料を得る工程;
    試料中のTspan33+MDSCの存在を検出する工程;及び
    がん組織に存在するTspan33+MDSCの参照レベルを超えるTspan33+MDSCのレベルを有する対象を選択し、次いで治療有効量の抗体を投与する工程
    を更に含む、請求項2に記載の方法。
  12. 経時的な対象におけるがんに対する処置の効能をモニターする方法であって、
    対象からの第1の試料、好ましくは、血液、尿、CSF、又はがん組織を含む試料中のTspan33+MDSCの第1のレベルを決定する工程;
    対象からの後続の試料、好ましくは、血液又はがん組織を含む試料中のTspan33+MDSCの後続のレベルを決定する工程;
    Tspan33+MDSCの第1の及び後続のレベルを比較する工程、及び
    Tspan33+MDSCの後続のレベルがTspan33+MDSCの第1のレベル未満である場合、処置を、有効であるとして同定する工程
    を含む方法。
  13. 処置が、対象においてTspan33+MDSCを特異的又は非特異的に枯渇させる、請求項12に記載の方法。
  14. 処置が、免疫療法である、請求項12に記載の方法。
  15. 処置が、チェックポイント阻害剤及び/又はTLRアゴニストの投与を含む、請求項14に記載の方法。
  16. がんの処置のための候補化合物を同定する方法であって、
    Tspan33に結合する試験化合物を選択する工程;
    試験化合物を、Tspan33を発現する骨髄由来サプレッサー細胞(MDSC)を含む試料と接触させる工程;
    細胞に対する試験化合物の作用を検出する工程であって、作用は、Tspan33+MDSCの生存能、Tspan33+MDSCの寿命、Tspan33+MDSCの免疫抑制能力、又はTspan33+MDSCの増殖から選択される、工程;及び
    候補化合物として、Tspan33+MDSCの生存能、寿命、免疫抑制又は増殖を低減させる試験化合物を選択する工程
    を含む方法。
  17. Tspan33に結合する試験化合物を選択する工程が、
    Tspan33を含む試料を提供する工程であって、任意選択で試料は、Tspan33を発現する細胞又は精製されたTspan33タンパク質を含む、工程;
    試料を試験化合物と接触させる工程;
    試料中の試験化合物のTspan33への結合を検出する工程;及び
    Tspan33に結合する試験化合物を選択する工程
    を含む、請求項16に記載の方法。
  18. 障害のin vivoモデルに、選択された候補化合物を投与する工程であって、好ましくは、モデルは動物腫瘍モデルである、工程;
    モデルにおける障害の1つ又は複数の症状、例えば腫瘍又は脾臓におけるTspan33+MDSCの数、腫瘍の増殖又は転移に対する作用を検出する工程;及び
    候補治療剤として、1つ又は複数の症状を改善する、例えば、腫瘍又は脾臓中のTspan33+MDSCの数を低減させる、腫瘍増殖を低減させる、又は転移を低減させる候補化合物を選択する工程
    を更に含む、請求項16に記載の方法。
  19. 障害の動物腫瘍モデルが、ヒト腫瘍異種移植モデルである、請求項18に記載の方法。
  20. 経時的な対象におけるMDSCレベルに対する処置の作用を決定する方法であって、
    対象からの第1の試料中のTspan33+MDSCの第1のレベルを決定する工程であって、好ましくは、試料は、血液、尿、CSF、又はがん組織を含む、工程;
    対象からの後続の試料中のTspan33+MDSCの後続のレベルを決定する工程;
    Tspan33+MDSCの第1の及び後続のレベルを比較する工程、及び
    Tspan33+MDSCの後続のレベルがTspan33+MDSCの第1のレベルを超える場合、処置を、MDSCを増加させるとして同定する工程、又は
    Tspan33+MDSCの後続のレベルがTspan33+MDSCの第1のレベル未満である場合、処置を、MDSCを減少させるとして同定する工程
    を含む方法。
  21. 処置が、がんのための処置である、請求項20に記載の方法。
  22. 処置が、対象においてTspan33+MDSCを特異的又は非特異的に枯渇させる、請求項20に記載の方法。
  23. 対象におけるMDSCの存在又はレベルを決定する方法であって、
    任意選択で対象からの試料を得る工程であって、好ましくは、試料は、血液、尿、CSF、又はがん組織若しくは腫瘍溶解産物を含む、工程;
    任意選択で、好ましくはフローサイトメトリーを使用して、骨髄細胞に関する試料を濃縮して、HLA-DRlo、CD33+細胞を選択する工程;
    試料を、Tspan33に結合する抗体と接触させる工程;
    抗体の試料への結合を検出する工程;及び
    抗体の試料への結合に基づき、試料中のMDSCのレベルを決定する工程
    を含む方法。
  24. がんが、骨髄のがんではなく、血液学的悪性腫瘍ではなく、活性化B細胞に関連する血液学的悪性腫瘍ではなく、又はB細胞リンパ腫ではない、請求項1から23のいずれか一項に記載の方法。
  25. 対象においてがんを処置するための、又はMDSCの数を低減させるための、Tspan33に特異的に結合してTspan33+骨髄由来サプレッサー細胞の数又は活性を低減させる抗体の使用。
  26. 抗体が、ヒト、ヒト化、キメラ、二重特異性、又は二機能性の抗体である、請求項25に記載の使用。
  27. 抗体が、細胞傷害性のペプチド若しくはタンパク質、放射線同位体、又は抗がん薬にカップリングされている、請求項25に記載の使用。
  28. がんが、上皮由来の固形がんである、請求項25に記載の使用。
  29. がんが、がん組織におけるTspan33+骨髄由来サプレッサー細胞(MDSC)の存在を特徴とする、請求項25に記載の使用。
  30. がんが、骨髄のがんではなく、血液学的悪性腫瘍ではなく、活性化B細胞に関連する血液学的悪性腫瘍ではなく、又はB細胞リンパ腫ではない、請求項25に記載の使用。
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