EA020026B1 - Lna-антагонисты андрогенного рецептора - Google Patents

Lna-антагонисты андрогенного рецептора Download PDF

Info

Publication number
EA020026B1
EA020026B1 EA201070660A EA201070660A EA020026B1 EA 020026 B1 EA020026 B1 EA 020026B1 EA 201070660 A EA201070660 A EA 201070660A EA 201070660 A EA201070660 A EA 201070660A EA 020026 B1 EA020026 B1 EA 020026B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
oligomer
androgen receptor
nucleotide
nucleotides
sequence
Prior art date
Application number
EA201070660A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201070660A1 (ru
Inventor
Йеспер Ворм
Original Assignee
Сантарис Фарма А/С
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Сантарис Фарма А/С filed Critical Сантарис Фарма А/С
Publication of EA201070660A1 publication Critical patent/EA201070660A1/ru
Publication of EA020026B1 publication Critical patent/EA020026B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/24—Drugs for disorders of the endocrine system of the sex hormones
    • A61P5/26—Androgens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/24—Drugs for disorders of the endocrine system of the sex hormones
    • A61P5/28—Antiandrogens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3231—Chemical structure of the sugar modified ring structure having an additional ring, e.g. LNA, ENA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/334—Modified C
    • C12N2310/3341—5-Methylcytosine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/341—Gapmers, i.e. of the type ===---===
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Изобретение относится к олигомерным соединениям (олигомерам), которые избирательно связываются с мРНК андрогенного рецептора в клетке, что приводит к пониженной экспрессии андрогенного рецептора. Снижение экспрессии андрогенного рецептора полезно для лечения определенных медицинских расстройств, например заболевания или медицинского расстройства, которое описано в настоящем документе, например гиперпролиферативного расстройства, такого как рак.

Description

Настоящее изобретение относится к соединениям, композициям и способам модулирования экспрессии андрогенного рецептора. В частности, данное изобретение относится к олигомерным соединениям (олигомерам), которые избирательно связываются с мРНК андрогенного рецептора в клетке, что приводит к снижению экспрессии андрогенного рецептора. Снижение экспрессии андрогенного рецептора полезно при ряде медицинских расстройств, таких как рак, в особенности рак предстательной железы или рак молочной железы.
Связанные заявки
По данной заявке испрашивается приоритет согласно 35 И.8.С. § 119 (е) по предварительной заявке на патент США № 60/990125, которая подана 26 ноября 2007 года и описание которой включено в настоящий документ в виде ссылки в полном объеме.
Предпосылки изобретения
Андрогенный рецептор (АР) относится к типу ядерных рецепторов, которые активируются посредством связывания с любым из таких андрогенных гормонов, как тестостерон или дигидротестостерон. В отношении своей основной функции андрогенный рецептор представляет собой фактор транскрипции, связывающийся с ДНК, который регулирует экспрессию генов. Однако андрогенный рецептор также выполняет дополнительные функции, не относящиеся к связыванию с ДНК. Ближайшим гомологом андрогенного рецептора является рецептор прогестерона, и прогестины в высоких дозировках могут блокировать андрогенный рецептор.
В то время как у человека существует единственная копия гена АР, которая найдена на X хромосоме в положении Хс.| 11-12, рецептор как таковой существует в двух изоформах (А и В). АР-А представляет собой белок массой 87 кДа, у которого отсутствуют первые 187 аминокислот (усечен с Ν-конца). Изоформа АР-В представляет собой полноразмерную форму массой 110 кДа.
Связывание андрогена с андрогенным рецептором вызывает конформационные изменения рецептора, которые приводят к диссоциации белков теплового шока, димеризации и транспортировке из цитозоля в ядро клетки, где димеры андрогенного рецептора связываются с определенными последовательностями ДНК, обозначаемыми как элементы гормонального ответа. В зависимости от взаимодействия с другими ядерными белками АР контролирует экспрессию генов, усиливая или ослабляя транскрипцию определенных генов, таких как инсулиноподобный фактор роста 1 (ΙΟΡ-1).
Андрогенные рецепторы также могут обладать цитоплазматической активностью, которая, однако, опосредована белками-переносчиками сигнала в цитоплазме. Связывание андрогена с цитоплазматическими андрогенными рецепторами может вызвать быстрые изменения в работе клетки независимо от транскрипции генов, например, в ионном транспорте, а также косвенно влиять на транскрипцию генов, например, посредством других путей передачи сигнала и таким образом влиять на активность других факторов транскрипции.
При некоторых заболеваниях была выявлена чрезмерная экспрессия андрогенного рецептора или экспрессия мутировавших генов андрогенного рецептора, например, при раке, включая рак предстательной железы и рак молочной железы, а также при других расстройствах, таких как полиглутаминовые заболевания (Мопкк с1 а1., ΡΝΑ8, ШгстЬсг. 2, 2007, публикация в Интернете), алопеция, доброкачественная гиперплазия предстательной железы, спинальная и мышечная атрофия и болезнь Кеннеди.
В \УО 97/11170 сообщается о способе лечения пациентов с диагностированной доброкачественной гиперплазией предстательной железы или раком предстательной железы, который включает введение антисмыслового олигонуклеотида, который избирательно гибридизуется с мРНК андрогенного рецептора. Раскрыты три антисмысловых олигонуклеотидных последовательности длиной 27-29 нуклеотидов.
В И8 6733776 и ЕР 0692972 сообщается о способе лечения андрогенной алопеции с помощью липосом, содержащих антисмысловую нуклеиновую кислоту, которая гибридизуется с геном андрогенного рецептора. Антисмысловые молекулы с конкретными последовательностями, нацеленными на андрогенный рецептор, не предоставлены.
В ϋδ 2005/0164970 сообщается о способе лечения рака предстательной железы с использованием комплексов миРНК, которые избирательно связываются с мРНК андрогенного рецептора.
В \УО 2005/027833 сообщается о способе лечения рака предстательной железы, который включает введение пациенту морфолино-олигонуклеотида длиной 12-40 морфолино-звеньев.
В \УО 2001/083740 сообщается об антисмысловом соединении, которое обладает незаряженным морфолино-остовом длиной от 18 до 20 смежных звеньев, которые нацелены на андрогенный рецептор человека.
Антисмысловые морфолино-соединения действуют посредством связывания с целевой нуклеиновой кислотой для того, чтобы блокировать доступ других молекул к мРНК, например молекул, которые участвуют в сплайсинге мРНК или инициации трансляции.
В υδ 7067256 сообщается о рибозиме, который, по всей видимости, опосредует инактивацию андрогенного рецептора. Предоставлена антисмысловая молекула РНК из 19 нуклеотидов для соответствующей области мРНК андрогенного рецептора.
Однако несмотря на применение миРНК, антисмысловых морфолино-соединений и рибозимов, ни
- 1 020026 один из вышеупомянутых ингибиторов андрогенного рецептора не позволяет успешно ингибировать андрогенный рецептор ίη νίνο и в фармакологически приемлемых дозировках.
К примеру, настоящее изобретение относится к новому классу антагонистов андрогенного рецептора, которые были отобраны на основе присутствия ΕΝΆ в их химическом составе и/или посредством отбора особенно эффективных сайтов-мишеней в мРНК андрогенного рецептора.
Сущность изобретения
Изобретение относится к олигомеру длиной 10-50, например длиной 10-30 нуклеотидов, который содержит непрерывную нуклеотидную последовательность общей длиной 10-50, например 10-30 нуклеотидов, где указанная непрерывная нуклеотидная последовательность по меньшей мере на 80% (например, на 85, 90, 95, 98 или 99%) гомологична области, которая соответствует обратной комплементарной последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует андрогенный рецептор млекопитающего, например гена андрогенного рецептора млекопитающего или мРНК, например 8ЕО ГО № 1, или его вариантов, встречающихся в природе. Таким образом, например, олигомер гибридизуется с одноцепочечной молекулой нуклеиновой кислоты, которая обладает последовательностью (соответствующей) части 8ЕС ГО № 1.
Изобретение относится к конъюгату, который содержит олигомер по изобретению и по меньшей мере один ненуклеотидный или неполинуклеотидный фрагмент, ковалентно связанный с указанным олигомером.
Изобретение относится к фармацевтической композиции, которая содержит олигомер или конъюгат по изобретению и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель, соль или адъювант.
Изобретение относится к олигомеру или конъюгату по изобретению для применения в качестве лекарственного средства, например, для лечения заболевания или медицинского расстройства, которое описано в настоящем документе, например гиперпролиферативного расстройства, такого как рак.
Изобретение относится к применению олигомера или конъюгата по изобретению в производстве лекарственного средства для лечения заболевания или медицинского расстройства, которое описано в настоящем документе, например гиперпролиферативного расстройства, такого как рак.
Изобретение относится к способу лечения заболевания или медицинского расстройства, которое описано в настоящем документе, например гиперпролиферативного расстройства, такого как рак, указанный способ включает введение олигомера, конъюгата или фармацевтической композиции по изобретению пациенту, страдающему или подверженного риску указанного заболевания или медицинского расстройства.
Изобретение относится к способу ингибирования андрогенного рецептора в клетке, которая экспрессирует андрогенный рецептор, указанный способ включает введение олигомера или конъюгата по изобретению в указанную клетку для того, чтобы вызвать ингибирование андрогенного рецептора в указанной клетке.
Изобретение относится к олигомеру длиной 10-50 нуклеиновых оснований, который содержит непрерывную последовательность нуклеиновых оснований общей длиной 10-50 нуклеиновых оснований, где указанная непрерывная последовательность нуклеиновых оснований по меньшей мере на 80% гомологична соответствующей области нуклеиновой кислоты, которая кодирует андрогенный рецептор млекопитающего.
Изобретение относится к олигомеру длиной 10-50 нуклеиновых оснований, который содержит непрерывную последовательность нуклеиновых оснований общей длиной 10-50 нуклеиновых оснований, где указанная непрерывная последовательность нуклеиновых оснований по меньшей мере на 80% идентична обратной комплементарной последовательности целевой области нуклеиновой кислоты, которая кодирует андрогенный рецептор млекопитающего.
Изобретение дополнительно относится к конъюгату, который содержит олигомер по изобретению, например к конъюгату, который содержит, в дополнение к последовательности нуклеиновых оснований олигомера, по меньшей мере один ненуклеотидный или неполинуклеотидный фрагмент (конъюгированный фрагмент), который ковалентно связан с олигомером по изобретению.
Изобретение относится к фармацевтическим композициям, которые содержат олигомер или конъюгат по изобретению и фармацевтически приемлемые разбавитель, носитель, соль или адъювант.
Изобретение дополнительно относится к олигомеру по изобретению для применения в медицине.
Изобретение дополнительно относится к применению олигомера по изобретению в производстве лекарственного средства для лечения одного или нескольких заболеваний, упомянутых в настоящем документе, например заболеваний, выбранных из группы, состоящей из рака, например рака молочной железы или рака предстательной железы, алопеции, доброкачественной гиперплазии предстательной железы, спинальной и мышечной атрофии, болезни Кеннеди и полиглутаминовых заболеваний.
Изобретение дополнительно относится к олигомеру по изобретению для применения в лечении одного или нескольких заболеваний, упомянутых в настоящем документе, например заболеваний, выбранных из группы, состоящей из рака, такого как рак молочной железы или рак предстательной железы, алопеции, доброкачественной гиперплазии предстательной железы, спинальной и мышечной атрофии, болезни Кеннеди и полиглутаминовых заболеваний.
- 2 020026
Также предоставлены фармацевтические и другие композиции, содержащие олигомер по изобретению. Также предоставлены способы подавления экспрессии АР в клетках или тканях, которые включают приведение указанных клеток или тканей, ίη νίΐτο или ίη νίνο, в контакт с одним или несколькими олигомерами, конъюгатами или композициями по изобретению.
Также раскрыты способы лечения животного, не являющегося человеком, или человека с подозрением на наличие или склонность (восприимчивость) к заболеванию или состоянию, связанному с экспрессией или чрезмерной экспрессией АР, посредством введения указанному животному или человеку терапевтически или профилактически эффективного количества одного или нескольких олигомеров, конъюгатов или фармацевтических композиций по изобретению. Также предоставлены способы использования олигомеров для ингибирования экспрессии АР и для лечения заболеваний, связанных с активностью АР.
Изобретение относится к способу лечения заболевания, выбранного из группы, состоящей из рака, такого как рак молочной железы или рак предстательной железы, алопеции, доброкачественной гиперплазии предстательной железы, спинальной и мышечной атрофии, болезни Кеннеди и полиглутаминовых заболеваний, способ включает введение (эффективного количества) одного или нескольких олигомеров по изобретению, их конъюгатов или фармацевтических композиций по изобретению пациенту, нуждающемуся в этом.
Изобретение относится к способу ингибирования или снижения экспрессии андрогенного рецептора в клетке или ткани, например, посредством понижающей регуляции, который включает стадию приведения указанной клетки или ткани в контакт с эффективным количеством одного или нескольких олигомеров по изобретению, их конъюгатов или фармацевтических композиций для того, чтобы ингибировать или понизить экспрессию андрогенного рецептора.
В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к олигомеру, состоящему из 10-30 смежных мономеров, где смежные мономеры ковалентно связаны с помощью фосфатной группы или фосфоротиоатной группы, где указанный олигомер содержит первую область по меньшей мере из 10 смежных мономеров, где по меньшей мере один мономер из указанной первой области является аналогом нуклеозида, где последовательность указанной первой области по меньшей мере на 80% идентична наилучшим образом выровненной обратной комплементарной последовательности целевой области гена андрогенного рецептора млекопитающего или мРНК андрогенного рецептора млекопитающего.
В одном из аспектов олигомер по изобретению выбран из группы, состоящей из 5'-А3 МеС3м’С5а3а3д31131:3С3с3Ь3::3с3А3С3 неС-3' (5Е<2 Ю Ν' 58) и
5'-МеС3МеС3МеС3а3а5д3д3с3а3с3Ъ3д3с3А563А-3 1 (2Еф Ю № 77) где заглавные буквы обозначают мономеры бета-Э-окси-ΤΝΑ и строчные буквы обозначают мономеры ДНК, нижний индекс δ обозначает фосфоротиоатную связь и МеС обозначает мономер бета-Όокси-ΤΝΑ, содержащий основание 5-метилцитозин.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 - олигонуклеотиды, представленные в табл. 3, оценивали по их способности к нокдауну мРНК андрогенного рецептора в концентрациях 1, 4 и 16 нМ в клетках МСР7 через 24 ч после трансфекции с использованием ПЦР в реальном времени. Все результаты нормализованы к ΟΑΡΌΗ и ингибирование мРНК АР показано в виде процентной доли от необработанного контроля. Приведенные результаты представляют собой среднее значение результатов трех независимых экспериментов.
Фиг. 2 - олигонуклеотиды, представленные в табл. 3, оценивали по их способности к нокдауну мРНК андрогенного рецептора в концентрациях 1, 4 и 16 нМ в клетках А549 через 24 ч после трансфекции с использованием ПЦР в реальном времени. Все результаты нормализованы к ΟΑΡΌΗ и ингибирование мРНК АР показано в виде процентной доли от необработанного контроля. Приведенные результаты представляют собой среднее значение результатов трех независимых экспериментов.
Фиг. 3 - выравнивание последовательности мРНК андрогенного рецептора человека (инвентарный номер ОепЬапк ΝΜ_000044) и последовательности мРНК андрогенного рецептора мыши (инвентарный номер ОепЬапк ΝΜ_0134769).
Фиг. 4 - расположение предпочтительных целевых областей в мРНК АР (кДНК) человека, с которыми избирательно связываются олигомеры по изобретению. Несмотря на то что показаны 16-членные целевые сайты, в некоторых вариантах осуществления эти целевые области могут содержать дополнительные 4 основания с 5'- или 3'-конца показанных областей, т.е. представлять собой целевые области длиной до 24 смежных нуклеотидов.
Фиг. 5 - 8ЕЦ ГО № 1: андрогенный рецептор Ното 8ар1еп8 (дигидротестостероновый рецептор; тестикулярная феминизация; спинальная и бульбарная мышечная атрофия; болезнь Кеннеди) (АР), транскрипционный вариант 1, мРНК (инвентарный номер ОепЬапк ΝΜ_000044).
Фиг. 6 - 8ЕЦ ГО № 81: последовательность мРНК андрогенного рецептора мыши.
Фиг. 7 - 8ЕЦ ГО № 82: последовательность мРНК андрогенного рецептора макака резуса.
Фиг. 8 - 8ЕЦ ГО № 83: аминокислотная последовательность белка андрогенного рецептора Ното 8ар1епв.
- 3 020026
Фиг. 9 - 8ЕО Ш № 84: аминокислотная последовательность белка андрогенного рецептора мыши.
Фиг. 10 - 8Е0 Ш № 85: аминокислотная последовательность белка андрогенного рецептора макака резуса.
Фиг. 11 - мРНК АР в ЬЫСаР через 24 ч после трансфекции.
Фиг. 12 - мРНК АР в А549 через 24 ч после трансфекции.
Фиг. 13 - тест на клеточную пролиферацию - А549, зависимость от времени после трансфекции.
Фиг. 14 - тест на клеточную пролиферацию - зависимость от времени после трансфекции.
Фиг. 15 - активность каспазы 3/7 в клетках ЬЫСаР через 24, 48 или 72 ч после трансфекции. Фиг. 16 - активность каспазы 3/7 в клетках А549 через 24, 48 или 72 ч после трансфекции. Фиг. 17 - среднее Р8А в плазме после лечения олигомером ίη νίνο.
Фиг. 18 - ингибирование роста опухоли ίη νίνο.
Подробное описание изобретения
Олигомеры.
В настоящем изобретении применяются олигомерные соединения (именуемые в настоящем документе олигомерами) для модулирования функции молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует андрогенный рецептор млекопитающего, например нуклеиновой кислоты андрогенного рецептора, приведенной в 8ЕО Ш № 1, и встречающихся в природе вариантов таких молекул нуклеиновой кислоты, кодирующей андрогенный рецептор млекопитающего. Термин олигомер в контексте настоящего изобретения относится к молекуле, образованной посредством ковалентной связи между двумя или более нуклеотидами (т.е. к олигонуклеотиду). В настоящем документе каждый отдельный нуклеотид, например нуклеотиды, присутствующие в олигомере по изобретению, также могут обозначаться как мономер или звено. В некоторых вариантах осуществления олигомер содержит непрерывную нуклеотидную последовательность длиной 10-30 нуклеотидов или состоит из нее (т.е. содержит 10-30 ковалентно связанных мономеров или состоит из них).
В различных вариантах осуществления соединения по изобретению не содержат РНК (звенья). В различных вариантах осуществления соединения по изобретению представляют собой линейные молекулы или синтезированы в форме линейной молекулы. В таких вариантах осуществления олигомер представляет собой одноцепочечную молекулу и в основном не содержит короткие области, например по меньшей мере из 3, 4 или 5 смежных нуклеотидов, которые комплементарны другой области в этом же олигомере (т.е. дуплексы) - в этом отношении, в некоторых вариантах осуществления олигомер (по существу) не является двухцепочечным. В некоторых вариантах осуществления олигомер является, по существу, не двухцепочечным, например не представляет собой миРНК. В различных вариантах осуществления олигомер по изобретению может полностью состоять из непрерывной нуклеотидной области. Таким образом, олигомер, по существу, не является самокомплементарным. миРНК состоит из 2 комплементарных коротких последовательностей РНК (или эквивалентных нуклеотидных звеньев), например, длиной от 21 до 23 нуклеотидов, в основном с 2 нуклеотидами на 3'-конце, выступающими с обоих концов. Для того чтобы увеличить захват ίη νίνο, миРНК может быть конъюгирована, например, со стерином, например с холестериновой группой (в основном 3'- или 5'-концом одной или обеих цепей).
Изобретение дополнительно относится к целевой последовательности в мРНК или гене АР или ее аллельному варианту, в частности к последовательностям, соответствующим 8ЕО Ш №№ 2-22, где антисмысловые олигонуклеотиды, соответствующие указанным целевым последовательностям, способны осуществлять понижающую регуляцию АР. Например, целевые последовательности, которые соответствуют антисмысловым олигонуклеотидным последовательностям 8ЕО Ш №№ 2-22, соответственно приведены на фиг. 4 (выделены жирным начертанием с подчеркиванием, над которыми указаны соответствующие 8ЕО Ш №№). Последовательности вариантов, например, но не ограничиваясь, аллельные варианты (например, гена (АР), представленного в генном локусе Хс.| 11-12) таких целевых последовательностей также включены в объем изобретения. Последовательность варианта может быть по меньшей мере на 60%, более предпочтительно по меньшей мере на 70%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95% гомологична целевой последовательности в АР. В основном олигомер по изобретению, соответствующий указанной последовательности варианта, сохраняет способность к понижающей регуляции АР.
Также раскрыты конкретные конструкции ΤΝΑ-олигонуклеотидов, например, приведенные в 8ЕО ГО №№ 44-80. Олигомеры по изобретению рассматриваются как возможные ингибиторы мРНК андрогенного рецептора и экспрессии белка.
- 4 020026
Мишени.
Андрогенный рецептор млекопитающего предпочтительно выбран из группы, состоящей из андрогенных рецепторов человека или мыши. Предпочтительно андрогенный рецептор млекопитающего представляет собой андрогенный рецептор человека, например андрогенный рецептор, который кодируется нуклеиновой кислотой, которая показана в 8ЕО ΙΌ № 1. Дополнительные гены андрогенных рецепторов млекопитающих (мишени) и их соответствующие белки приведены в следующей таблице:
Инвентарный номер СепЬапк - нуклеиновая кислота (последовательность мРНК/кДНК) Инвентарный номер СепЬапк - полипептид (предсказанная последовательность)
Человек ΝΜ_000044 ΝΡ_000035
Мышь ΝΜ_013476 ΝΡ_038504
Макак резус ΝΜ_001032911 ΝΡ—001028083
Следует признать, что у человека ген андрогенного рецептора проявляет некоторую степень изменчивости аллеля и что в некоторых случаях полиморфизма вышеупомянутые инвентарные номера СепЬаик для нуклеиновых кислот относятся к последовательностям кДНК, а не к последовательностям мРНК как таковым. Последовательность зрелой мРНК можно получить непосредственно из соответствующей последовательности кДНК при замене основания тимин (Т) на урацил (И).
Следует признать, что у человека ген андрогенного рецептора проявляет некоторую степень изменчивости аллеля и в некоторых случаях полиморфизм связан с патологическими фенотипами (Моопеу е1 а1., ΝΑΡ, 15; 31(8) 2003). Например, экспансия САС повторов связана с заболеваниями, отличающимися полиглутаминовой экспансией, а другие идентифицированные описанные аллельные варианты включают тринуклеотидный повтор (ССС)п и однонуклеотидные замены К726Ь, Т887А и Ь710Н, и было показано, что последние два коррелируют с уменьшением избирательности АР-рецептора в отношении других стероидных лигандов. В одном из вариантов осуществления п может находиться в диапазоне от 5 до 31. Повторы САС менее 22 раз связаны с увеличением риска рака предстательной железы у афроамериканцев мужского пола, и поэтому могут представлять собой предпочтительный аллельный вариант.
В некоторых вариантах осуществления целевая нуклеиновая кислота представляет собой аллельный вариант АР, который содержит одну или несколько однонуклеотидных замен, включая К726Ь, Т887А и Ь710Н.
Следовательно, в некоторых вариантах осуществления мишенью является аллельный вариант АР, который содержит тринуклеотидный повтор (САС)п или тринуклеотидный повтор (ССС)п.
В предпочтительном варианте осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая андрогенный рецептор млекопитающего, представляет собой последовательность кДНК андрогенного рецептора человека, приведенную в 8ЕО ΙΌ № 1, и/или последовательность кДНК андрогенного рецептора мыши, приведенную в 8ЕО ΙΌ № 81, или их аллельные варианты. Олигомер по изобретению представляет собой антисмысловой олигонуклеотид.
Следовательно, мишень олигомера по изобретению представляет собой мРНК андрогенного рецептора. Введение олигомера в клетку, которая экспрессирует ген андрогенного рецептора, приводит к снижению уровня мРНК андрогенного рецептора, что приводит к снижению уровня экспрессии андрогенного рецептора в клетке.
Известно, что андрогенный рецептор регулирует экспрессию нескольких генов, например генов, выбранных из группы, состоящей из протеинкиназы С-дельта (РРКСП). глутатион 8-трансферазы тета 2 (С8ТТ2), 3 члена V подсемейства потенциальных катионных каналов временных рецепторов (ТКРУЗ), пирролин-5-карбоксилатредуктазы 1 (РУСР1) или орнитинаминотрансферазы (ОАТ), - такие гены в настоящем документе обозначают как мишени андрогенного рецептора, и, по существу, в некоторых вариантах осуществления олигомеры по изобретению можно использовать для модулирования экспрессии одной или нескольких мишеней андрогенного рецептора в клетке, которая экспрессирует или способна экспрессировать (т.е. в случае ослабления репрессии (с помощью АР) мишени андрогенного рецептора в клетке) указанную мишень андрогенного рецептора.
Олигомеры, избирательно связывающиеся с мРНК андрогенного рецептора, могут гибридизоваться с любым сайтом вдоль всей нуклеиновой кислоты мРНК-мишени, например с 5'-концевой нетранслируемой лидерной последовательностью, экзонами, интронами и 3'-концевым нетранслируемым хвостом. Однако предпочтительно, чтобы олигомеры, нацеленные на мРНК андрогенного рецептора, гибридизовались со зрелой мРНК-формой целевой нуклеиновой кислоты.
Пригодный олигомер по изобретению обладает способностью к понижающей регуляции экспрессии гена андрогенного рецептора. В этом отношении олигомер по изобретению может вызывать ингибирование андрогенного рецептора в основном у млекопитающего, например в клетках человека. В некоторых вариантах осуществления олигомеры по изобретению связываются с целевой нуклеиновой кислотой и вызывают ингибирование экспрессии по меньшей мере на 10 или 20% по сравнению с нормальным
- 5 020026 уровнем экспрессии, более предпочтительно ингибирование по меньшей мере на 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 95% по сравнению с нормальным уровнем экспрессии (например, непосредственно перед введением дозы олигомера). В некоторых вариантах осуществления такое модулирование можно наблюдать при использовании соединения по изобретению в концентрации от 0,04 до 25 нМ, например от 0,8 до 20 нМ. В том же или другом варианте осуществления ингибирование экспрессии составляет менее 100%, например ингибирование составляет менее 98%, ингибирование составляет менее 95%, ингибирование составляет менее 90%, ингибирование составляет менее 80%, например ингибирование составляет менее 70%. Модулирование уровня экспрессии можно определить при измерении концентрации белка, например, таким способами, как 8Ό8-ΡΑΟΕ с последующим вестерн-блоттингом с использованием соответствующих антител, индуцированных против целевого белка. Альтернативно, модулирование уровней экспрессии можно определить при измерении уровней мРНК, например, с помощью нозерн-блоттинга или количественной ОТ-ПЦР. При измерении модулирования посредством измерения уровней мРНК степень понижающей регуляции при использовании подходящей дозировки, например, в концентрации от 0,04 до 25 нМ, такой как от 0,8 до 20 нМ, в некоторых вариантах осуществления в основном соответствует уровню 10-20% от нормальных уровней в отсутствие соединения по изобретению.
Следовательно, изобретение относится к способу понижающего регулирования или ингибирования экспрессии белка андрогенного рецептора и/или мРНК в клетке, которая экспрессирует белок андрогенного рецептора и/или мРНК, указанный способ включает введение или приведение олигомера или конъюгата по изобретению (соответственно в эффективном количестве) в контакт с указанной клеткой для понижающего регулирования или ингибирования экспрессии белка андрогенного рецептора и/или мРНК в указанной клетке. Соответственно клетка представляет собой клетку млекопитающего, например клетку человека. В некоторых вариантах осуществления введение или приведение в контакт может происходить ίη νίΐτο. В некоторых вариантах осуществления введение или приведение в контакт может происходить ίη νίνο.
Термин целевая нуклеиновая кислота, как применяют в настоящем документе, относится к ДНК или РНК, которая кодирует полипептид андрогенного рецептора млекопитающего, например андрогенного рецептора человека, например, к 8ΕΟ ГО № 1. Андрогенный рецептор кодируется нуклеиновыми кислотами или их встречающимися в природе вариантами и рибонуклеиновыми кислотами, полученными из них, предпочтительно мРНК, например пре-мРНК, хотя предпочтительно зрелой мРНК. В некоторых вариантах осуществления, например, при использовании в исследованиях или в диагностике целевая нуклеиновая кислота может представлять собой кДНК или синтетический олигонуклеотид, полученный из вышеупомянутых целевых дезоксирибонуклеиновых или рибонуклеиновых кислот. Олигомер по изобретению предпочтительно способен гибридизоваться с целевой нуклеиновой кислотой. Следует признать, что 8ΕΟ ГО № 1 представляет собой кДНК последовательность и, по существу, соответствует последовательности зрелой целевой мРНК несмотря на то, что в последовательности кДНК урацил замещен на тимидин.
Термин встречающийся в природе вариант относится к вариантам нуклеотидной последовательности полипептида андрогенного рецептора, который существует в природе в рамках определенной таксономической группы, такой как млекопитающие, например мышь, обезьяна и предпочтительно человек. В основном при использовании встречающихся в природе вариантов полинуклеотида термин также может включать любые аллельные варианты андрогенного рецептора, кодируемые геномной ДНК, которая найдена в X хромосоме: 66,68-66,87 Мб (миллионов оснований) посредством хромосомной перестройки или дупликации, и РНК, такой как мРНК, полученной из нее. Встречающиеся в природе варианты также могут включать в себя варианты, полученные в результате альтернативного сплайсинга мРНК андрогенного рецептора. При упоминании о конкретной полипептидной последовательности термин также включает, например, встречающиеся в природе формы белка, которые, таким образом, могут подвергаться процессингу, например, посредством ко- или посттрансляционных модификаций, таких как отщепление сигнального пептида, протеолитическое расщепление, гликозилирование и т.д.
Последовательности олигомеров.
Олигомеры состоят из непрерывной нуклеотидной последовательности, которая соответствует обратной комплементарной последовательности нуклеотидной последовательности, представленной в 8ΕΟ ГО № 1, или содержат ее. Таким образом, олигомер может содержать последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ΕΟ ГО №№ 2-22 и 86-106, или состоять из нее, где указанный олигомер (или его непрерывная нуклеотидная часть) необязательно может содержать одно, два или три несоответствия относительно указанной выбранной последовательности.
Олигомер может содержать непрерывную нуклеотидную последовательность, которая полностью комплементарна (абсолютно комплементарна) соответствующей области нуклеиновой кислоты, которая кодирует андрогенный рецептор млекопитающего (например, 8ΕΟ ГО № 1), или состоять из нее. Таким образом, олигомер может содержать антисмысловую нуклеотидную последовательность или состоять из нее.
Однако в некоторых вариантах осуществления олигомер, в котором может быть допущено 1, 2, 3 или 4 (или более) несоответствия, гибридизуется с целевой последовательностью и сохраняет силу свя
- 6 020026 зывания с мишенью, достаточную для проявления понижающего эффекта, т.е. понижающей регуляции мишени. Несоответствия можно компенсировать, например, увеличением длины нуклеотидной последовательности олигомера и/или увеличением числа аналогов нуклеотидов, таких как ΕΝΆ, представленных в нуклеотидной последовательности.
В некоторых вариантах осуществления непрерывная нуклеотидная последовательность содержит не более чем 3, например не более чем 2, несоответствия, при гибридизации с целевой последовательностью, например с соответствующей областью нуклеиновой кислоты, которая кодирует андрогенный рецептор млекопитающего.
В некоторых вариантах осуществления непрерывная нуклеотидная последовательность содержит не более чем одно несоответствие при гибридизации с целевой последовательностью, например с соответствующей областью нуклеиновой кислоты, которая кодирует андрогенный рецептор млекопитающего.
Нуклеотидные последовательности олигомеров по изобретению или непрерывная нуклеотидная последовательность предпочтительно по меньшей мере на 80% гомологичны соответствующей последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8ЕО Ш №№ 2-22 и 86-106, например, гомологичны по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, например гомологичны на 100% (идентичны).
Нуклеотидные последовательности олигомеров по изобретению или непрерывная нуклеотидная последовательность предпочтительно по меньшей мере на 80% гомологичны обратной комплементарной последовательности соответствующей последовательности, представленной в 8ЕО Ш № 1, например, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, гомологичны по меньшей мере на 96%, гомологичны по меньшей мере на 97%, гомологичны по меньшей мере на 98%, гомологичны по меньшей мере на 99%, например гомологичны на 100% (идентичны).
Нуклеотидные последовательности олигомеров по изобретению или непрерывная нуклеотидная последовательность предпочтительно по меньшей мере на 80% комплементарны подпоследовательности, представленной в 8ЕО Ш № 1, например, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, комплементарны по меньшей мере на 96%, комплементарны по меньшей мере на 97%, комплементарны по меньшей мере на 98%, комплементарны по меньшей мере на 99%, например комплементарны на 100% (абсолютно комплементарны).
В некоторых вариантах осуществления олигомер (или его непрерывная нуклеотидная часть) выбран из последовательностей, выбранных из группы, состоящей из 8ЕО Ш №№ 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 и 22, или их непрерывной подпоследовательности по меньшей мере из 10 нуклеотидов, или содержит одну из них, где указанный олигомер (или его непрерывная нуклеотидная часть) может необязательно содержать одно, два или три несоответствия относительно данной последовательности.
В некоторых вариантах осуществления олигомер (или его непрерывная нуклеотидная часть) выбран из последовательностей, выбранных из группы, состоящей из 8ЕО Ш №№ 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105 и 106, или их непрерывной подпоследовательности по меньшей мере из 10 нуклеотидов, или содержит одну из них, где указанный олигомер (или его непрерывная нуклеотидная часть) может необязательно содержать одно, два или три несоответствия по сравнению с данной последовательностью.
Другие предпочтительные олигомеры содержат (непрерывную) нуклеотидную последовательность, например непрерывную последовательность длиной 12, 13, 14, 15 или 16 нуклеотидов, которая содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы последовательностей, состоящей из 8ЕО Ш № 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 и 22, где указанный олигомер (или его непрерывная нуклеотидная часть) может необязательно содержать одно, два или три несоответствия по сравнению с указанной выбранной последовательностью.
В некоторых вариантах осуществления подпоследовательность может состоять из 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 или 29 последовательных нуклеотидов, например 12-22 нуклеотидов, например 12-18 нуклеотидов. Соответственно в некоторых вариантах осуществления подпоследовательность обладает той же длиной, что и непрерывная нуклеотидная последовательность олигомера по изобретению.
Однако следует признать, что в некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность олигомера может содержать дополнительные нуклеотиды на 5'- или 3'-конце, например независимо 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных нуклеотидов на 5'- и/или 3'-конце, которые не комплементарны целевой последовательности. В этом отношении в некоторых вариантах осуществления олигомер по изобретению может содержать непрерывную нуклеотидную последовательность, которая фланкирована дополнительными 5'- и/или 3'-концевыми нуклеотидами. В некоторых вариантах осуществления дополнительные 5'или 3'-концевые нуклеотиды представляют собой встречающиеся в природе нуклеотиды, такие как дезоксирибонуклеотиды или рибонуклеотиды. В некоторых вариантах осуществления дополнительные 5'
- 7 020026 или З'-концевые нуклеотиды могут представлять собой Ό-область, которая упоминается в настоящем документе в отношении олигомеров с пропусками.
В некоторых вариантах осуществления олигомер по изобретению содержит нуклеотидную последовательность согласно 8ЕО ГО № 2, например 8ЕО ГО № 44, или непрерывную подпоследовательность по меньшей мере из ее 10 нуклеотидов, например из ее 11, 12, 13, 14, 15 или 16 нуклеотидов, или состоит из нее.
В некоторых вариантах осуществления олигомер по изобретению содержит нуклеотидную последовательность согласно 8ЕО ГО № 3, например 8ЕО ГО № 45, или непрерывную подпоследовательность по меньшей мере из ее 10 нуклеотидов, например из ее 11, 12, 13, 14, 15 или 16 нуклеотидов, или состоит из нее.
В некоторых вариантах осуществления олигомер по изобретению содержит нуклеотидную последовательность согласно 8ЕО ГО № 4, например 8ЕО ГО № 46, или непрерывную подпоследовательность по меньшей мере из ее 10 нуклеотидов, например из ее 11, 12, 13, 14, 15 или 16 нуклеотидов, или состоит из нее.
В некоторых вариантах осуществления олигомер по изобретению содержит нуклеотидную последовательность согласно 8ЕО ГО №5, например 8ЕО ГО № 47, или непрерывную подпоследовательность по меньшей мере из ее 10 нуклеотидов, например из ее 11, 12, 13, 14, 15 или 16 нуклеотидов, или состоит из нее.
В некоторых вариантах осуществления олигомер по изобретению содержит нуклеотидную последовательность согласно 8ЕО ГО № 6, например 8ЕО ГО №№ 48, 49 или 50, или непрерывную подпоследовательность по меньшей мере из ее 10 нуклеотидов, например из ее 11, 12, 13, 14, 15 или 16 нуклеотидов, или состоит из нее.
В некоторых вариантах осуществления олигомер по изобретению содержит нуклеотидную последовательность согласно 8ЕО ГО № 7, например 8ЕО ГО №№ 51, 52 или 53, или непрерывную подпоследовательность по меньшей мере из ее 10 нуклеотидов, например из ее 11, 12, 13, 14, 15 или 16 нуклеотидов, или состоит из нее.
В некоторых вариантах осуществления олигомер по изобретению содержит нуклеотидную последовательность согласно 8ЕО ГО № 8, например 8ЕО ГО №№ 54, 55 или 56, или непрерывную подпоследовательность по меньшей мере из ее 10 нуклеотидов, например из ее 11, 12, 13, 14, 15 или 16 нуклеотидов, или состоит из нее.
В некоторых вариантах осуществления олигомер по изобретению содержит нуклеотидную последовательность согласно 8ЕО ГО № 9, например 8ЕО ГО № 57, или непрерывную подпоследовательность по меньшей мере из ее 10 нуклеотидов, например из ее 11, 12, 13, 14, 15 или 16 нуклеотидов, или состоит из нее.
В некоторых вариантах осуществления олигомер по изобретению содержит нуклеотидную последовательность согласно 8ЕО ГО № 10, например 8ЕО ГО №№ 58, 59 или 60, или непрерывную подпоследовательность по меньшей мере из ее 10 нуклеотидов, например из ее 11, 12, 13, 14, 15 или 16 нуклеотидов, или состоит из нее.
В некоторых вариантах осуществления олигомер по изобретению содержит нуклеотидную последовательность согласно 8ЕО ГО № 11, например 8ЕО ГО № 61, или непрерывную подпоследовательность по меньшей мере из ее 10 нуклеотидов, например из ее 11, 12, 13, 14, 15 или 16 нуклеотидов, или состоит из нее.
В некоторых вариантах осуществления олигомер по изобретению содержит нуклеотидную последовательность согласно 8ЕО ГО № 12, например 8ЕО ГО № 62, или непрерывную подпоследовательность по меньшей мере из ее 10 нуклеотидов, например из ее 11, 12, 13, 14, 15 или 16 нуклеотидов, или состоит из нее.
В некоторых вариантах осуществления олигомер по изобретению содержит нуклеотидную последовательность согласно 8ЕО ГО № 13, например 8ЕО ГО №№ 63, 64 или 65 или непрерывную подпоследовательность по меньшей мере из ее 10 нуклеотидов, например из ее 11, 12, 13, 14, 15 или 16 нуклеотидов, или состоит из нее.
В некоторых вариантах осуществления олигомер по изобретению содержит нуклеотидную последовательность согласно 8ЕО ГО № 14, например 8ЕО ГО № 66, или непрерывную подпоследовательность по меньшей мере из ее 10 нуклеотидов, например из ее 11, 12, 13, 14, 15 или 16 нуклеотидов, или состоит из нее.
В некоторых вариантах осуществления олигомер по изобретению содержит нуклеотидную последовательность согласно 8ЕО ГО № 15, например 8ЕО ГО № 67, или непрерывную подпоследовательность по меньшей мере из ее 10 нуклеотидов, например из ее 11, 12, 13, 14, 15 или 16 нуклеотидов, или состоит из нее.
В некоторых вариантах осуществления олигомер по изобретению содержит нуклеотидную последовательность согласно 8ЕО ГО № 16, например 8ЕО ГО № 68, или непрерывную подпоследовательность по меньшей мере из ее 10 нуклеотидов, например из ее 11, 12, 13, 14, 15 или 16 нуклеотидов, или состоит из нее.
- 8 020026
В некоторых вариантах осуществления олигомер по изобретению содержит нуклеотидную последовательность согласно 8ЕО Ш № 17, например 8ЕО Ш №№ 69, 70 или 71, или непрерывную подпоследовательность по меньшей мере из ее 10 нуклеотидов, например из ее 11, 12, 13, 14, 15 или 16 нуклеотидов, или состоит из нее.
В некоторых вариантах осуществления олигомер по изобретению содержит нуклеотидную последовательность согласно 8ЕО Ш № 18, например 8ЕО Ш № 72, или непрерывную подпоследовательность по меньшей мере из ее 10 нуклеотидов, например из ее 11, 12, 13, 14, 15 или 16 нуклеотидов, или состоит из нее.
В некоторых вариантах осуществления олигомер по изобретению содержит нуклеотидную последовательность согласно 8ЕО Ш № 19, например 8ЕО Ш №№ 73, 74 или 75, или непрерывную подпоследовательность по меньшей мере из ее 10 нуклеотидов, например из ее 11, 12, 13, 14, 15 или 16 нуклеотидов, или состоит из нее.
В некоторых вариантах осуществления олигомер по изобретению содержит нуклеотидную последовательность согласно 8ЕО Ш № 20, например 8ЕО Ш № 76, или непрерывную подпоследовательность по меньшей мере из ее 10 нуклеотидов, например из ее 11, 12, 13, 14, 15 или 16 нуклеотидов, или состоит из нее.
В некоторых вариантах осуществления олигомер по изобретению содержит нуклеотидную последовательность согласно 8ЕО Ш № 21, например 8ЕО Ш №№ 77, 78 или 79, или непрерывную подпоследовательность по меньшей мере из ее 10 нуклеотидов, например из ее 11, 12, 13, 14, 15 или 16 нуклеотидов, или состоит из нее.
В некоторых вариантах осуществления олигомер по изобретению содержит нуклеотидную последовательность согласно 8ЕО Ш № 22, например 8ЕО Ш № 80, или непрерывную подпоследовательность по меньшей мере из ее 10 нуклеотидов, например из ее 11, 12, 13, 14, 15 или 16 нуклеотидов, или состоит из нее.
При определении гомологии между олигомерами по изобретению (или непрерывной нуклеотидной последовательностью) и нуклеиновой кислотой, которая кодирует андрогенный рецептор млекопитающего, или ее обратной комплементарной последовательностью, например, описываемой в настоящем документе, определение гомологии можно осуществить посредством простого выравнивания соответствующей нуклеотидной последовательности соединения по изобретению с соответствующей областью нуклеиновой кислоты, которая кодирует андрогенный рецептор млекопитающего (или целевой нуклеиновой кислотой), или ее обратной комплементарной последовательностью, и гомологию определяют при подсчете числа выровненных оснований, деленного на общее число смежных нуклеотидов в соединении по изобретению и умноженного на 100. При таком сравнении, если пропуски существуют, предпочтительно, чтобы такие пропуски представляли собой только несоответствия, а не области, в которых несколько нуклеотидов в области пропуска различаются в нуклеотидной последовательности по изобретению и целевой нуклеиновой кислоте.
Термины соответствующий и соответствует относятся к сравнению нуклеотидной последовательности олигомера или непрерывной нуклеотидной последовательности (первой последовательности) и соответствующей непрерывной нуклеотидной последовательности из добавочной последовательности, выбранной из любого пункта: ί) подпоследовательность обратной последовательности, комплементарной целевой нуклеиновой кислоте, такой как мРНК, которая кодирует белок андрогенного рецептора, например 8ЕО Ш № 1, и/или ίί) последовательность нуклеотидов, предоставленная в настоящем документе, например, в группе, состоящей из 8ЕО Ш №№ 2-22 и 86-106 или их подпоследовательностей. Нуклеотидные аналоги сравнивают непосредственно с эквивалентными или соответствующими им нуклеотидами. Первая последовательность, которая соответствует добавочной последовательности по п.1) или и), в основном идентична этой последовательности, превышающей по длине первую последовательность (например, непрерывную нуклеотидную последовательность), или, как описано в настоящем документе, в некоторых вариантах осуществления может быть по меньшей мере на 80% гомологична соответствующей последовательности, например, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, гомологична по меньшей мере на 96%, гомологична по меньшей мере на 97%, гомологична по меньшей мере на 98%, гомологична по меньшей мере на 99%, например гомологична на 100% (идентична).
Термины соответствующий нуклеотидный аналог и соответствующий нуклеотид предназначены для обозначения того, что нуклеотид в нуклеотидном аналоге и встречающийся в природе нуклеотид идентичны. Например, когда в нуклеотиде 2-дезоксирибоза соединена с аденином, соответствующий нуклеотидный аналог содержит пентозу (отличается от 2-дезоксирибозы), соединенную с аденином.
Длина.
Олигомеры содержат непрерывную нуклеотидную последовательность общей длиной 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 смежных нуклеотидов или состоят из нее.
В некоторых вариантах осуществления олигомеры содержат непрерывную нуклеотидную последовательность общей длиной 10-22, например 12-18, например 13-17 или 12-16, например 13, 14, 15, 16
- 9 020026 смежных нуклеотидов, или состоят из нее.
В некоторых вариантах осуществления олигомеры содержат непрерывную нуклеотидную последовательность общей длиной 10, 11, 12, 13 или 14 смежных нуклеотидов или состоят из нее.
В некоторых вариантах осуществления олигомер по изобретению состоит не более чем из 22 нуклеотидов, например не более чем из 20 нуклеотидов, например не более чем из 18 нуклеотидов, например из 15, 16 или 17 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления олигомер по изобретению содержит менее чем 20 нуклеотидов.
Нуклеотидные аналоги.
Термин нуклеотид, как применяют в настоящем документе, относится к гликозиду, содержащему остаток сахара, остаток основания и ковалентно связанную фосфатную группу, и включает как встречающиеся в природе нуклеотиды, такие как дезоксирибонуклеотиды или рибонуклеотиды, предпочтительно дезоксирибонуклеотиды, так и не встречающиеся в природе нуклеотиды, содержащие остатки модифицированных сахаров и/или оснований, которые в настоящем документе также обозначаются как нуклеотидные аналоги.
Не встречающиеся в природе нуклеотиды включают нуклеотиды, которые содержат остатки модифицированных сахаров, например бициклические нуклеотиды или 2'-модифицированные нуклеотиды, например 2'-замещенные нуклеотиды.
Нуклеотидные аналоги представляют собой варианты природных нуклеотидов, таких как дезоксирибонуклеотиды или рибонуклеотиды, полученные посредством модификации остатков сахара и/или основания. В принципе, аналоги могут являться просто молчащими или эквивалентными по отношению к природным нуклеотидам в отношении олигонуклеотида, т.е. не обладать функциональным влиянием на действие олигонуклеотида и на ингибирование экспрессии гена-мишени. Тем не менее, такие эквивалентные аналоги можно использовать, например, если они проще или дешевле в производстве, или более стабильны в условиях хранения или производства, или являются тэгом или меткой. Однако предпочтительно аналоги обладают функциональным влиянием на действие олигомера и на ингибирование экспрессии, например, обеспечивая увеличенную аффинность связывания с мишенью и/или увеличенную устойчивость к внутриклеточным нуклеазам и/или упрощенную доставку в клетку. Конкретные примеры аналогов нуклеозидов описаны, например, авторами Рте1ет & ЛИшаии; Νιιοί. Λοίά Век., 1997, 25, 4429-4443 и ИЫшапп; Сигг. Ορίηίοη ίη Эгид Эеуе1ортеп1. 2000, 3(2), 293-213 и на схеме 1.
Схема 1
Фосфоротиоат 2‘-О*ме™л 2-МОБ 2-фтор
2'-АР НКА СеМА ΡΝΛ
?-(3-гидрокси)поопил
О-1 в
Ο-Ϊ-ΒΗ,· боранофосфаты
Таким образом, олигомер может содержать простую последовательность встречающихся в природе нуклеотидов, предпочтительно 2'-дезоксинуклеотидов (как правило, упоминаются в настоящем документе как ДНК), но также, возможно, рибонуклеотидов (как правило, упоминаются в настоящем документе как РНК), или сочетание таких встречающихся в природе нуклеотидов и одного или нескольких не встречающихся в природе нуклеотидов, т.е. нуклеотидных аналогов, или состоять из этой последовательности. Соответственно такие нуклеотидные аналоги могут увеличивать аффинность олигомера к целевой последовательности.
Примеры подходящих и предпочтительных нуклеотидных аналогов предоставлены в РСТ/0К2006/000512 или упоминаются в настоящем документе.
Встраивание в олигомер таких увеличивающих аффинность нуклеотидных аналогов, как ΤΝΆ или 2'-замещенные сахара, может сделать возможным уменьшение размера избирательно связывающегося олигомера, а также может уменьшить верхний предел размера олигомера, ниже которого возникает неизбирательное или неправильное связывание.
- 10 020026
В некоторых вариантах осуществления олигомер содержит по меньшей мере 2 нуклеотидных аналога. В некоторых вариантах осуществления олигомер содержит 3-8 нуклеотидных аналогов, например 6 или 7 нуклеотидных аналогов. Во много более предпочтительных вариантах осуществления по меньшей мере один из указанных нуклеотидных аналогов представляет собой замкнутую нуклеиновую кислоту (ΕΝΑ); например по меньшей мере 3, или по меньшей мере 4, или по меньшей мере 5, или по меньшей мере 6, или по меньшей мере 7 или 8 нуклеотидных аналогов могут представлять собой ΕΝΑ. В некоторых вариантах осуществления все нуклеотидные аналоги могут представлять собой ΕΝΑ.
Следует признать, что при упоминании о предпочтительном мотиве нуклеотидной последовательности или нуклеотидной последовательности, которая состоит только из нуклеотидов, олигомеры по изобретению, которые определяются этой последовательностью, могут содержать соответствующий нуклеотидный аналог вместо одного или нескольких нуклеотидов, представленных в указанной последовательности, например звенья ΕΝΆ или другие нуклеотидные аналоги, которые повышают стабильность дуплекса/Тт олигомера/целевого дуплекса (т.е. нуклеотидные аналоги, увеличивающие аффинность).
В некоторых вариантах осуществления любое несоответствие между нуклеотидной последовательностью олигомера и целевой последовательностью предпочтительно находится в областях олигонуклеотида, которые расположены за пределами нуклеотидных аналогов, увеличивающих аффинность, например в В-области, упомянутой в настоящем документе, и/или в Ό-области, упомянутой в настоящем документе, и/или в областях немодифицированных нуклеотидов, таких как ДНК, и/или в областях, которые расположены с 5'- или З'-конца непрерывной нуклеотидной последовательности.
Примеры такой модификации нуклеотида включают модификацию остатка сахара для того, чтобы предоставить 2'-замещающую группу или получить мостиковую (замкнутая нуклеиновая кислота) структуру, которая увеличивает аффинность, а также может обеспечивать повышенную устойчивость к нуклеазам.
Предпочтительным нуклеотидным аналогом является ΕΝΆ, например окси-ΕΝΆ (например, бета-Оокси-ΕΝΆ и альфа-Е-окси-ΕΝΆ), и/или амино-ΕΝΆ (например, бета-О-амино-ΕΝΑ и альфа-Б-аминоΕΝΑ), и/или тио-ΕΝΑ (например, бета-О-тио-ΕΝΑ и альфа-Б-тио-ΕΝΑ), и/или ΕΝΑ (например, бета-ОΕΝΑ и альфа-Б-ΕΝΑ). Наиболее предпочтительным является бета-О-окси-ΕΝΑ.
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидные аналоги, присутствующие в олигомере по изобретению (например, в А- и С-областях, упомянутых в настоящем документе), независимо выбраны, например, из звеньев 2'-О-алкил-РНК, звеньев 2'-амино-ДНК, звеньев 2'-фтор-ДНК, звеньев ΕΝΑ, звеньев арабинонуклеиновой кислоты (ΑΝΑ), звеньев 2'-фтор-ΑNΑ, звеньев ΗΝΑ, звеньев ΙΝΑ (интеркалирующая нуклеиновая кислота, см. статью СйгМсщсп. 2002, Νυοί. Αείάκ. Век., 2002, 30: 4918-4925, которая, таким образом, включена в качестве ссылки) и звеньев 2'-МОЕ. В некоторых вариантах осуществления в олигомере по изобретению или его непрерывной нуклеотидной последовательности присутствует только один из вышеупомянутых типов нуклеотидных аналогов.
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидные аналоги представляют собой 2'-Ометоксиэтил-РНК (2'-МОЕ), мономеры 2'-фтор-ДНК или нуклеотидные аналоги ΕΝΑ и, по существу, олигонуклеотид по изобретению может содержать нуклеотидные аналоги, которые независимо выбраны из этих трех типов аналогов, или он может содержать только один тип аналога, выбранный из этих трех типов. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из указанных нуклеотидных аналогов представляет собой 2'-МОЕ-РНК, например 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидных звеньев представляют собой 2'-МОЕ-РНК. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из указанных нуклеотидных аналогов представляет собой 2'-фтор ДНК, например 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидных звеньев представляют собой 2'-фтор-ДНК.
В некоторых вариантах осуществления олигомер по изобретению содержит по меньшей мере одно звено замкнутой нуклеиновой кислоты (ΕΝΑ), например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 звеньев ΕΝΑ, например 37 или от 4 до 8 звеньев ΕΝΑ или 3, 4, 5, 6 или 7 звеньев ΕΝΑ. В некоторых вариантах осуществления все нуклеотидные аналоги представляют собой ΕΝΑ. В некоторых вариантах осуществления олигомер может содержать как бета-О-окси-ΕΝΑ, так и одно или несколько следующих звеньев ΕΝΑ: тио-ΕΝΑ, амино-ΕΝΑ, окси-ΕΝΑ и/или ΕΝΑ, в бета-Э- или альфа-Б-конфигурации, или их сочетания. В некоторых вариантах осуществления все звенья цитозиновой ΕΝΑ представляют собой 5'-метилцитозин. В некоторых вариантах осуществления изобретения олигомер может содержать как звенья ΕΝΑ, так и звенья ДНК. Предпочтительно олигомер состоит всего из 10-25 звеньев ΕΝΑ и ДНК, предпочтительно из 10-20, даже более предпочтительно из 12-16. В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеотидная последовательность олигомера, например непрерывная нуклеотидная последовательность, содержит по меньшей мере одно звено ΕΝΑ, а в качестве остальных нуклеотидов она содержит звенья ДНК. В некоторых вариантах осуществления олигомер содержит только нуклеотидные аналоги в виде ΕΝΑ и встречающиеся в природе нуклеотиды (такие как рибонуклеотиды или дезоксирибонуклеотиды, наиболее предпочтительно дезоксирибонуклеотиды), необязательно с модифицированными межнуклеотидными связями, например с фосфоротиоатом.
Термин нуклеиновое основание относится к остатку основания нуклеотида и включает как встречающиеся в природе, так и не встречающиеся в природе варианты. Таким образом, нуклеиновое осно
- 11 020026 вание включает не только известные пуриновые и пиримидиновые гетероциклы, но также их гетероциклические аналоги и таутомеры.
Примеры нуклеиновых оснований включают в качестве неограничивающих примеров аденин, гуанин, цитозин, тимидин, урацил, ксантин, гипоксантин, 5-метилцитозин, изоцитозин, псевдоизоцитозин, 5-бромурацил, 5-пропинилурацил, 6-аминопурин, 2-аминопурин, инозин, диаминопурин и 2-хлор-6аминопурин.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно из нуклеиновых оснований, присутствующих в олигомере, является модифицированным нуклеиновым основанием, которое выбрано из группы, состоящей из 5-метилцитозина, изоцитозина, псевдоизоцитозина, 5-бромурацила, 5пропинилурацила, 6-аминопурина, 2-аминопурина, инозина, диаминопурина и 2-хлор-6-аминопурина.
ΕΝΆ.
Термин 'ΈΝΆ относится к бициклическому нуклеотидному аналогу, известному как замкнутая нуклеиновая кислота. Он может относиться к мономеру ΕΝΆ или при использовании в отношении ΕΝΆ-олигонуклеотида к олигонуклеотиду, содержащему один или несколько таких бициклических нуклеотидных аналогов.
ΕΝΆ, используемые в соединениях олигонуклеотидов по изобретению, предпочтительно обладают структурой согласно общей формуле I
К3 где X выбран из -0-, -8-, -Ν (ΚΝ), -С(К6К6*)-;
В выбран из водорода, необязательно замещенного С1-4-алкокси, необязательно замещенного С1-4алкила, необязательно замещенного С1-4-ацилокси, нуклеиновых оснований, ДНК-интеркаляторов, фотохимически активных групп, термохимически активных групп, хелатирующих групп, репортерных групп и лигандов;
Р обозначает положение радикала для межнуклеозидной связи со следующим мономером или 5'концевую группу, такая межнуклеозидная связь или 5'-концевая группа необязательно содержит заместитель К5 или эквивалентно применимый заместитель К5*;
Р* обозначает межнуклеозидную связь с предыдущим мономером или З'-концевую группу;
К4* и К2* вместе обозначают бирадикал, состоящий из 1-4 групп/атомов, выбранных из -С(КаКь)-, -С(Ка)=С(Кь)-, -С(Ка)=№, -0-, -81(Ка)2-, -8-, -802-, -Ν(Κα)- и >Τ=Ζ, где Ζ выбран из -0-, -8- и -Ν(Κα)-, и Ка и Кь, каждый независимо, выбран из водорода, необязательно замещенного С1-12-алкила, необязательно замещенного С2-12-алкенила, необязательно замещенного С2-12-алкинила, гидрокси, С1-12-алкокси, С2-12алкоксиалкила, С2-12-алкенилокси, карбокси, С1-12-алкоксикарбонила, С1-12-алкилкарбонила, формила, арила, арилоксикарбонила, арилокси, арилкарбонила, гетероарила, гетероарилоксикарбонила, гетероарилокси, гетероарилкарбонила, амино, моно- и ди(С1-6-алкил)амино, карбамоила, моно- и ди(С1-6алкил)аминокарбонила, амино-С1-6-алкиламинокарбонила, моно- и ди(С1-6-алкил)амино-С1-6алкиламинокарбонила, С1-6-алкилкарбониламино, карбамидо, С1-6-алканоилокси, сульфоно, С1-6алкилсульфонилокси, нитро, азидо, сульфанила, С1-6-алкилтио, галогена, ДНК-интеркаляторов, фотохи мически активных групп, термохимически активных групп, хелатирующих групп, репортерных групп и лигандов, где арил и гетероарил могут быть необязательно замещенными и где два геминальных заместителя Ка и Кь вместе могут обозначать необязательно замещенный метилен (=СН2), и каждый из присутствующих заместителей К1*, К2, К3, К5, К5*, К6 и К6* независимо выбран из водорода, необязательно замещенного С1-12-алкила, необязательно замещенного С2-12-алкенила, необязательно замещенного С2-12алкинила, гидрокси, С1-12-алкокси, С2-12-алкоксиалкила, С2-12-алкенилокси, карбокси, С1-12алкоксикарбонила, С1-12-алкилкарбонила, формила, арила, арилоксикарбонила, арилокси, арилкарбонила, гетероарила, гетероарилоксикарбонила, гетероарилокси, гетероарилкарбонила, амино, моно- и ди(С1-6алкил)амино, карбамоила, моно- и ди(С1-6-алкил)аминокарбонила, амино-С1-6-алкиламинокарбонила, моно- и ди(С1-6-алкил)амино-С1-6-алкиламинокарбонила, С1-6-алкилкарбониламино, карбамидо, С1-6алканоилокси, сульфоно, С1-6-алкилсульфонилокси, нитро, азидо, сульфанила, С1-6-алкилтио, галогена, ДНК-интеркаляторов, фотохимически активных групп, термохимически активных групп, хелатирующих групп, репортерных групп и лигандов, где арил и гетероарил могут быть необязательно замещены и где два геминальных заместителя вместе могут обозначать оксо, тиоксо, имино, или необязательно замещенный метилен, или вместе могут образовывать спиро-бирадикал, состоящий из цепи алкилена из 1-5 атомов углерода, которая необязательно прерывается и/или заканчивается одним или несколькими гетероатомами/группами, выбранными из -0-, -8- и -(ΝΕ2)-. где Β.Ν выбран из водорода и С1-4-алкила и где два соседних (негеминальных) заместителя могут обозначать дополнительную связь, образуют двойную связь; и К.х*, когда он присутствует в молекуле и не является частью бирадикала, выбран из водорода и
- 12 020026
С1_4-алкила; и их основных солей и кислотно-аддитивных солей.
В некоторых вариантах осуществления В5* выбран из Н, -СН3, -СН2-СН3,- СН2-О-СН3 и -СН=СН2.
В некоторых вариантах осуществления В4* и В2* вместе обозначают бирадикал, выбранный из -С(ВаВь)-О-, -С(ВаВь)-С(ВСВ4)-О-, -С(ВаВь)-С(ВСВ4)-С(ВеВг)-О-, -С(ВаВь)-О-С (ВСВ4)-, -С(ВаВь)-О-С(ВСВ4)О-, -С(ВаВь)-С(ВСВ4)-, -С(ВаВь)-С(ВСВ4)-С(ВеВг)-, С(Ва)=С(Вь)-С(ВСВ4)-, -С(ВаВь)-Ы(ВС)-, -С(ВаВь)С(ВСВ0)-Ы(Ве)-, -С(ВаВь)-Ы(ВС)-О-, и -С(ВаВь)-8-, -С(ВаВь)-С(ВСВ4)-8-, где каждый из Ва, Вь, ВС, В4, Ве и Вг независимо выбран из водорода, необязательно замещенного С1-12-алкила, необязательно замещенного С2-12-алкенила, необязательно замещенного С2-12-алкинила, гидрокси, С1-12-алкокси, С2-12-алкоксиалкила, С2-12-алкенилокси, карбокси, С1-12-алкоксикарбонила, С1-12-алкилкарбонила, формила, арила, арилоксикарбонила, арилокси, арилкарбонила, гетероарила, гетероарилоксикарбонила, гетероарилокси, гетероарилкарбонила, амино, моно- и ди(С1-6-алкил)амино, карбамоила, моно- и ди(С1-6-алкил)аминокарбонила, амино-С1-6-алкиламинокарбонила, моно- и ди(С1-6-алкил)амино-С1-6-алкиламинокарбонила, С1-6алкилкарбониламино, карбамидо, С1-6-алканоилокси, сульфоно, С1-6-алкилсульфонилокси, нитро, азидо, сульфанила, С1-6-алкилтио, галогена, ДНК-интеркаляторов, фотохимически активных групп, термохими чески активных групп, хелатирующих групп, репортерных групп и лигандов, где арил и гетероарил могут быть необязательно замещены и где два геминальных заместителя Ва и Вь вместе могут обозначать необязательно замещенный метилен (=СН2).
В дополнительном варианте осуществления В4* и В2* вместе обозначают бирадикал (двухвалентную группу), выбранную из -СН2-О-, -СН2-8-, -ί.Ή;-ΝΗ-. -СН2-Ы(СН3)-, -СН2-СН2-О-, -СН2-СН (СН3)-, -СН2-СН2-8-, -СН2-СН2-№-, -СН2-СН2-СН2-, -СН2-СН2-СН2-О-, -СН2-СН2-СЩСН3)-, -СН=СН-СН2-, -СН2-О-СН2-О-, -С^ЯН-О-, -С^КСОДО-О-, -СН2-О-СН2-, -СН(СНэ)-О-, -СН(СН2-О-СН3)-О-.
Для всех хиральных центров асимметричные группы могут находиться или в В-, или в 8ориентации.
Предпочтительно ΕΝΆ, использованная в олигомере по изобретению, содержит по меньшей мере одно звено ΕΝΆ согласно любой из формул
где Υ представляет собой -О-, -О-СН2-, -8-, -ΝΠ- или МВ11); Ζ и Ζ* независимо выбраны из межнуклеотидной связи, концевой группы или защитной группы; В обозначает остаток природного или неприродного нуклеотидного основания и ВН выбран из водорода и С1-4-алкила.
Особенно предпочтительные звенья ΕΝΆ приведены на схеме 2.
Термин тио-ΕΝΆ включает замкнутый нуклеотид, в котором Υ в вышеприведенной общей формуле выбран из 8 или -СН2-8-. Тио-ΕΝΆ может находиться в бета-Э- или альфа-Б-конфигурации.
Термин амино-ΕΝΆ относится к замкнутому нуклеотиду, в котором Υ в вышеприведенной общей формуле выбран из -МН)-, МВ)-, СН2-МН)- и -СН2-МВ)-, где В выбран из водорода и С1-4-алкила. Амино-ΕΝΆ может находиться в бета-0- или в альфа-Ь-конфигурации.
Термин окси-ΕΝΆ относится к замкнутому нуклеотиду, в котором Υ в вышеприведенной общей формуле обозначает -О- или -СН2-О-. Окси-ΕΝΆ может находиться в бета-0- или альфа-Бконфигурации.
- 13 020026
Термин ΕΝΑ относится к замкнутому нуклеотиду, в котором Υ в вышеприведенной общей формуле представляет собой -СН2-О- (где атом кислорода в группе -СН2-О- присоединен к 2'-положению относительно основания В).
В предпочтительном варианте осуществления ΕΝΑ выбрана из бета-Э-окси-ΕΝΑ, альфа-Ь-оксиΕΝΑ, бета-П-амино-ΕΝΑ и бета-О-тио-ΕΝΑ. в частности представляет собой бета-Э-окси-ΕΝΑ.
Вовлечение РНКазы.
Следует признать, что олигомерное соединение может функционировать посредством не опосредованной РНКазами деградации целевой мРНК, а, например, посредством стерического препятствия транслированию или другими способами, однако предпочтительные олигомеры по изобретению способны вовлекать эндорибонуклеазы (РНКазы), такие как РНКаза Н.
Предпочтительно, чтобы в олигомере или непрерывной нуклеотидной последовательности содержалась область по меньшей мере из 6, например по меньшей мере 7, последовательных нуклеотидных звеньев, например по меньшей мере из 8 или по меньшей мере из 9 последовательных нуклеотидных звеньев (остатков), включая 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 последовательных нуклеотидов, которые при образовании дуплекса с комплементарной целевой РНК способны вовлекать РНКазы. Непрерывной последовательностью, которая обладает способностью вовлекать РНКазы, может быть В-область, которая упоминается в отношении олигомера с пропусками, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления размер непрерывной последовательности, которая обладает способностью вовлекать РНКазы, например В-область, может быть длиннее, например состоять из 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 нуклеотидных звеньев.
В ЕР 1222309 предоставлены способы определения активности РНКазы Н ίη νίΐτο, которые можно использовать для определения способности вовлекать РНКазу Н. Олигомер считают способным вовлекать РНКазу Н, если в присутствии комплементарной целевой РНК, РНКаза Н обладает начальной скоростью, измеренной в пмоль/л/мин, равной по меньшей мере 1%, например по меньшей мере 5%, например по меньшей мере 10% или менее чем 20% от начальной скорости, установленной с использованием эквивалентного олигонуклеотида, состоящего только из дезоксирибонуклеотидов, без 2'-заместителей, с фосфоротиоатными связывающими группами между всеми нуклеотидами в олигонуклеотиде, с использованием способа, предоставленного в примерах 91-95 из ЕР 1222309.
В некоторых вариантах осуществления олигомер считают, по существу, неспособным вовлекать РНКазу Н, если в присутствии комплементарной целевой РНК и РНКазы Н начальная скорость РНКазы Н, измеренная в пмоль/л/мин, составляет менее чем 1%, например менее чем 5%, например менее чем 10 или менее чем 20%, от начальной скорости, установленной с использованием эквивалентного олигонуклеотида, состоящего только из дезоксирибонуклеотидов, без 2'-заместителей, с фосфоротиоатными связывающими группами между всеми нуклеотидами в олигонуклеотиде, с использованием способа, предоставленного в примерах 91-95 из ЕР 1222309.
В других вариантах осуществления олигомер считают способным вовлекать РНКазу Н, если в присутствии комплементарной целевой РНК и РНКазы Н начальная скорость РНКазы Н, измеренная в пмоль/л/мин, составляет по меньшей мере 20%, например, по меньшей мере 40%, например, по меньшей мере 60%, например, по меньшей мере 80% от начальной скорости, установленной с использованием эквивалентного олигонуклеотида, состоящего только из дезоксирибонуклеотидов, без 2'-заместителей, с фосфоротиоатными связывающими группами между всеми нуклеотидами в олигонуклеотиде, с использованием способа, предоставленного в примерах 91-95 из ЕР 1222309.
В основном при образовании дуплекса из комплементарной целевой РНК и олигомера, способного вовлекать РНКазу, определенная область олигомера образована последовательными нуклеотидными звеньями, которые образуют ДНК/РНК-подобный дуплекс с целевой РНК и включают как дезоксирибонуклеотидные звенья, так и звенья ΕΝΑ, которые находятся в альфа-Ь-конфигурации, особенно предпочтительно в виде альфа-Ь-окси ΕΝΑ.
Олигомер по изобретению может содержать нуклеотидную последовательность, которая содержит как нуклеотиды, так и нуклеотидные аналоги, и может быть в форме олигомера с пропусками, олигомера с головной конфигурацией или смешанного олигомера.
Олигомер с головной конфигурацией определяется непрерывным фрагментом секвенирования не вовлекающих РНКазу нуклеотидных аналогов на 5'-конце, за которым следует непрерывный фрагмент секвенирования из дезоксирибонуклеотидов или модифицированных нуклеотидных звеньев, распознаваемых и расщепляемых РНКазами по направлению к 3'-концу (например, по меньшей мере 7 таких нуклеотидов), и олигомер с хвостовой конфигурацией определяется непрерывным фрагментом секвенирования из дезоксирибонуклеотидов или модифицированных нуклеотидов, распознаваемых и расщепляемых РНКазой на 5'-конце (например, по меньшей мере из 7 таких нуклеотидов), за которым следует непрерывный фрагмент секвенирования не вовлекающих РНКазу нуклеотидных аналогов по направлению к 3'концу. Другие химеры по изобретению, называемые смешанными олигомерами, состоят из последовательности чередующихся дезоксирибонуклеотидов или модифицированных нуклеотидов, распознаваемых и расщепляемых РНКазой и не вовлекающих РНКазу нуклеотидных аналогов. Некоторые нуклеотидные аналоги также могут обладать способностью опосредовать связывание и расщепление РНКазой
- 14 020026
H. Поскольку α-Ь-ΕΝΑ в известной мере вовлекает активность РНКазы Н, могут потребоваться меньшие пропуски дезоксирибонуклеотидов или модифицированных нуклеотидов, распознаваемых и расщепляемых РНКазой Н в конструкции олигомера с пропусками, а в конструкцию смешанного олигомера может быть введена большая гибкость.
Конструкция олигомера с пропусками.
Предпочтительно олигомер по изобретению представляет собой олигомер с пропусками (дартег). Олигомер с пропусками представляет собой олигомер, в котором содержится непрерывный фрагмент секвенирования из нуклеотидов, способных вовлекать РНКазу (например, РНКазу Н), например фрагмент по меньшей мере из 6 или 7 дезоксирибонуклеотидов, упомянутый в настоящем документе как Вобласть, где В-область фланкирована с 5'- и 3'-конца областями увеличивающих аффинность нуклеотидных аналогов, например из 1-6 нуклеотидных аналогов, расположенных на 5'- и 3'-конце непрерывного фрагмента секвенирования из нуклеотидов, которые обладают способностью вовлекать РНКазу, и эти области обозначают как А- и С-область соответственно.
Предпочтительно олигомер с пропусками содержит (поли)нуклеотидную последовательность формулы (от 5'-конца к 3'-концу) А-В-С или необязательно Α-Β-Ο-Ό или Ό-Α-Β-С, где А-область (5'-область) содержит (или состоит из) по меньшей мере один нуклеотидный аналог, например по меньшей мере одно звено ΕΝΑ, например 1-6 нуклеотидных аналогов, таких как звенья ΕΝΑ, и В-область содержит (или состоит из) по меньшей мере пять смежных нуклеотидов, которые обладают способностью вовлекать РНКазу (при образовании дуплекса с комплементарной молекулой РНК, например, с целевой мРНК), таких как дезоксирибонуклеотиды, и С-область (3'-область) содержит (или состоит из) по меньшей мере один нуклеотидный аналог, например по меньшей мере одно звено ΕΝΑ, например 1-6 нуклеотидных аналогов, таких как звенья ΕΝΑ, и Ό-область, если она присутствует, состоит из или содержит 1, 2 или 3 нуклеотидных звена, таких как дезоксирибонуклеотиды.
В некоторых вариантах осуществления А-область состоит из 1, 2, 3, 4, 5 или 6 нуклеотидных аналогов, таких как звенья ΕΝΑ, например из 2-5 нуклеотидных аналогов, например из 2-5 звеньев ΕΝΑ, например из 3 или 4 нуклеотидных аналогов, например из 3 или 4 звеньев ΕΝΑ; и/или С-область состоит из
I, 2, 3, 4, 5 или 6 нуклеотидных аналогов, таких как звенья ΕΝΑ, например из 2-5 нуклеотидных аналогов, например из 2-5 звеньев ΕΝΑ, например из 3 или 4 нуклеотидных аналогов, например из 3 или 4 звеньев ΕΝΑ.
В некоторых вариантах осуществления В-область содержит (или состоит из) 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 смежных нуклеотидов, которые обладают способностью вовлекать РНКазу, или из 6-10, или из 7-9, например из 8 смежных нуклеотидов, которые обладают способностью вовлекать РНКазу. В некоторых вариантах осуществления В-область содержит (или состоит из) по меньшей мере одно дезоксирибонуклеотидное звено, например 1-12 дезоксирибонуклеотидных звеньев, предпочтительно 4-12 дезоксирибонуклеотидных звеньев, более предпочтительно 6-10 дезоксирибонуклеотидных звеньев, например 7-10 дезоксирибонуклеотидных звеньев, наиболее предпочтительно 8, 9 или 10 дезоксирибонуклеотидных звеньев.
В некоторых вариантах осуществления А-область состоит из 3 или 4 нуклеотидных аналогов, таких как ΕΝΑ, В-область состоит из 7, 8, 9 или 10 дезоксирибонуклеотидных звеньев и С-область состоит из 3 или 4 нуклеотидных аналогов, таких как ΕΝΑ. Такая конструкция включает (А-В-С) 3-10-3, 3-10-4, 4-103, 3-9-3, 3-9-4, 4-9-3, 3-8-3, 3-8-4, 4-8-3, 3-7-3, 3-7-4, 4-7-3 и может дополнительно содержать Ό-область, в которой может содержаться 1 или 2 нуклеотидных звена, например дезоксирибонуклеотидных звена.
Дополнительные конструкции олигомеров с пропусками раскрыты в \УО 2004/046160 и, таким образом, включены в качестве ссылки.
Предварительная заявка США 60/977409, включенная таким образом в качестве ссылки, относится к коротким олигомерам с пропусками, которые в некоторых вариантах осуществления могут представлять собой олигомеры с пропусками по настоящему изобретению.
В некоторых вариантах осуществления олигомер состоит из непрерывной нуклеотидной последовательности общей длиной 10, 11, 12, 13 или 14 нуклеотидных звеньев, где непрерывная нуклеотидная последовательность описывается формулой (в направлении 5'-3') А-В-С или необязательно Α-Β-С-О или ΌΑ-Β-С, где А состоит из 1, 2 или 3 звеньев нуклеотидных аналогов, таких как звенья ΌΝΑ; В состоит из 7, 8 или 9 смежных нуклеотидных звеньев, которые обладают способностью вовлекать РНКазу при образовании дуплекса с комплементарной молекулой РНК (например, с целевой мРНК), и С состоит из 1, 2 или 3 звеньев нуклеотидных аналогов, таких как звенья ΌΝΑ. В случае наличия Ό состоит из одного дезоксирибонуклеотидного звена.
В некоторых вариантах осуществления А состоит из 1 звена ΌΝΑ. В некоторых вариантах осуществления А состоит из 2 звеньев ΌΝΑ. В некоторых вариантах осуществления А состоит из 3 звеньев ΌΝΑ. В некоторых вариантах осуществления С состоит из 1 звена ΌΝΑ. В некоторых вариантах осуществления С состоит из 2 звеньев ΌΝΑ. В некоторых вариантах осуществления С состоит из 3 звеньев ΌΝΑ. В некоторых вариантах осуществления В состоит из 7 нуклеотидных звеньев. В некоторых вариантах осуществления В состоит из 8 нуклеотидных звеньев. В некоторых вариантах осуществления В состоит из 9 нуклеотидных звеньев. В некоторых вариантах осуществления В состоит из 1-9 дезоксирибонуклеотидных
- 15 020026 звеньев, например из 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 дезоксирибонуклеотидных звеньев. В некоторых вариантах осуществления В состоит из дезоксирибонуклеотидных звеньев. В некоторых вариантах осуществления В содержит по меньшей мере одно звено ΕΝΆ, которое находится в альфа-Ь-конфигурации, например 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 звеньев ΕΝΆ в альфа-Ь-конфигурации. В некоторых вариантах осуществления В содержит по меньшей мере одно звено альфа-Ь-окси ΕΝΆ или в них все звенья ΕΝΆ, находящиеся в альфаЬ-конфигурации, представляют собой звенья альфа-Ь-окси Б-ΝΑ. В некоторых вариантах осуществления число нуклеотидов, представленных в А-В-С выбрано из группы, состоящей из (звенья нуклеотидных аналогов - В-область - звенья нуклеотидных аналогов): 1-8-1, 1-8-2, 2-8-1, 2-8-2, 3-8-3, 2-8-3, 3-8-2, 4-8-1, 4-8-2, 1-8-4, 2-8-4 или 1-9-1, 1-9-2, 2-9-1, 2-9-2, 2-9-3, 3-9-2, 1-9-3, 3-9-1, 4-9-1, 1-9-4 или 1-10-1, 1-10-2, 210-1, 2-10-2, 1-10-3, 3-10-1. В некоторых вариантах осуществления число нуклеотидов в А-В-С выбрано из группы, состоящей из 2-7-1, 1-7-2, 2-7-2, 3-7-3, 2-7-3, 3-7-2, 3-7-4 и 4-7-3. В некоторых вариантах осуществления каждая из А и С состоит из двух звеньев ΕΝΑ и В состоит из 8 или 9 нуклеотидных звеньев, предпочтительно дезоксирибонуклеотидных звеньев.
Межнуклеотидные связи.
Термины связывающая группа или межнуклеотидная связь предназначены для обозначения группы, которая способна ковалентно связывать вместе два нуклеотида, два нуклеотидных аналога и нуклеотид и нуклеотидный аналог и т.д. Конкретные и предпочтительные примеры включают фосфатные группы и фосфоротиоатные группы.
Нуклеотиды олигомера по изобретению или их непрерывные нуклеотидные последовательности соединены вместе с помощью связывающих групп. Соответственно каждый нуклеотид соединен с 3'смежным нуклеотидом через связывающую группу.
Пригодные межнуклеотидные связи включают те, что перечислены в РСТ/ЬК2006/000512, например межнуклеотидные связи, перечисленные в первом параграфе страницы 34 в РСТ/0К2006/000512 (который включен таким образом в качестве ссылки).
В некоторых вариантах осуществления предпочтительно превратить обычный фосфодиэфир межнуклеотидной связи в форму, более устойчивую к действию нуклеаз, например в фосфоротиоат или боранофосфат; эти два типа связи расщепляются РНКазой Н, а также делают возможным снижение экспрессии целевого гена посредством ингибирования антисмысловыми олигонуклеотидами.
Могут быть предпочтительны предоставленные в настоящем документе подходящие межнуклеотидные связи, содержащие серу (8). Фосфоротиоатные межнуклеотидные связи также предпочтительны, в особенности для области пропуска (В) в олигомерах с пропусками. Фосфоротиоатные связи также могут быть использованы для фланкирующих областей (А и С, и для соединения А или С с Ό, и в Όобласти, в случае необходимости).
Однако области А, В и С могут содержать межнуклеотидные связи, отличающиеся от фосфоротиоатных, например фосфодиэфирные связи, в особенности, например, при защите межнуклеотидных связей в областях А и С от расщепления эндонуклеазами с помощью нуклеотидных аналогов, например, когда области А и С содержат Ь-ΝΑ нуклеотиды.
Межнуклеотидные связи в олигомере могут быть фосфодиэфирными, фосфоротиоатными или боранофосфатными для того, чтобы сделать возможным расщепление целевой РНК РНКазой Н. Фосфоротиоатная связь предпочтительна в силу улучшенной устойчивости к нуклеазам и других причин, таких как простота производства.
В одном из аспектов олигомера по изобретению нуклеотиды и/или нуклеотидные аналоги соединены друг с другом посредством фосфоротиоатных групп.
Признано, что включение фосфодиэфирных связей, например одной или двух таких связей, в олигомер, содержащий только фосфоротиоатные связи, в особенности между или рядом со звеньями нуклеотидных аналогов (в основном в А- и/или С-области) может изменить биодоступность и/или биораспределение олигомера - см. \УО 2008/053314, который включен таким образом в качестве ссылки.
В некоторых вариантах осуществления, например в указанных выше вариантах осуществления, все подходящие и конкретно не указанные оставшиеся связывающие группы представляют собой фосфодиэфирные или фосфоротиоатные группы или их смесь.
В некоторых вариантах осуществления все межнуклеотидные связывающие группы представляют собой фосфоротиоатные группы. В отношении конкретных олигонуклеотидных последовательностей олигомеров с пропусками, например, представленных в настоящем документе, следует понимать, что в различных вариантах осуществления, когда связи представляют собой фосфоротиоатные связи, можно использовать альтернативные связи, например связи, описываемые в настоящем документе, такие как фосфатные (фосфодиэфирные) связи, в особенности для соединения звеньев нуклеотидных аналогов, таких как ΕΝΑ. Подобным образом, в отношении конкретных олигонуклеотидных последовательностей олигомеров с пропусками, например, предоставленных в настоящем документе, когда остатки С помечены как 5'-метилированный цитозин, в различных вариантах осуществления один или несколько С8, присутствующих в олигомере, могут являться не модифицированными остатками С.
Олигомерные соединения.
Олигомеры по изобретению могут быть выбраны, например, из группы, состоящей из 8ЕО ΙΌ №№
- 16 020026
22-43 и 44-80.
Конъюгаты.
В контексте настоящего раскрытия термин конъюгат обозначает гетерогенную молекулу, образованную посредством ковалентного присоединения (конъюгирования) олигомера, который описан в настоящем документе, с одной или несколькими ненуклеотидными или неполинуклеотидными молекулами. Примеры ненуклеотидных или неполинуклеотидных молекул включают макромолекулярные вещества, такие как белки, цепи жирных кислот, остатки сахаров, гликопротеины, полимеры или их сочетания. В основном белки могут представлять собой антитела против целевого белка. К типичным полимерам относится полиэтиленгликоль.
Следовательно, в различных вариантах осуществления олигомер по изобретению может содержать как полинуклеотидную область, которая в основном состоит из непрерывной последовательности нуклеотидов, так и дополнительную ненуклеотидную область. В отношении олигомера по изобретению, состоящего из непрерывной нуклеотидной последовательности, соединение может содержать ненуклеотидные компоненты, например конъюгируемый компонент.
В различных вариантах осуществления изобретения олигомерное соединение соединено с лигандами/конъюгатами, которые можно использовать, например, для увеличения захвата олигомерных соединений клетками. В νΟ 2007/031091 предоставлены подходящие лиганды и конъюгаты, которые включены, таким образом, в качестве ссылки.
Изобретение также относится к конъюгату, содержащему соединение по изобретению, которое описано в настоящем документе, и по меньшей мере один ненуклеотидный или неполинуклеотидный фрагмент, ковалентно связанный с указанным соединением. Следовательно, в различных вариантах осуществления, в которых соединение по изобретению состоит из конкретной нуклеиновой кислоты или нуклеотидной последовательности, которые раскрыты в настоящем документе, соединение также может содержать по меньшей мере один ненуклеотидный или неполинуклеотидный фрагмент (например, не содержащий один или несколько нуклеотидов или нуклеотидных аналогов), ковалентно связанный с указанным соединением.
Конъюгирование (с конъюгируемой молекулой) может увеличить активность, распределение в клетке или захват олигомера по изобретению клеткой. Такие молекулы включают в качестве неограничивающих примеров антитела, полипептиды, молекулы липидов, например молекулы холестерина, холевую кислоту, тиоэфиры, например, гексил-8-тритилтиол, тиохолестерин, алифатические цепи, например, додекандиоловые или ундециловые остатки, фосфолипиды, например, ди-гексадецил-рац-глицерин или триэтиламмоний 1,2-ди-о-гексадецил-рац-глицеро-3-Ь-фосфонат, полиаминную или полиэтиленгликолевую цепь, адамантан-уксусную кислоту, пальмитиловую молекулу, октадециламиновую или гексиламинокарбонил-оксихолестериновую молекулу.
Олигомеры по изобретению также могут быть конъюгированы, чтобы активировать лекарственное вещество, например аспирин, ибупрофен, сульфамидное лекарственное средство, противодиабетическое средство, антибактериальное средство или антибиотик.
В определенных вариантах осуществления конъюгированный фрагмент представляет собой стерин, например холестерин.
В различных вариантах осуществления конъюгированный фрагмент содержит (или состоит) положительно заряженный полимер, например положительно заряженный пептид, длиной, например, 1-50, например 2-20, например 3-10 аминокислотных остатков, и/или полиалкиленоксид, такой как полиэтиленгликоль (РЕО) или полипропиленгликоль - см. νθ 2008/034123, включенный, таким образом, в качестве ссылки. Соответственно положительно заряженный полимер, такой как полиалкиленоксид, можно присоединить к олигомеру по изобретению через линкер, такой как высвобождаемый линкер, описанный νθ 2008/034123.
В качестве примера следующие конъюгируемые молекулы можно использовать в конъюгатах по изобретению:
5'-олигомер-з' ,0_Л—о. 5'-олигомер-з’
Термин активированный олигомер, как применяют в настоящем документе, относится к олигомеру по изобретению, который ковалентно связан (т.е. функционализирован) по меньшей мере с одним функциональным фрагментом, который позволяет ковалентно связать олигомер с одним или несколькими конъюгированными фрагментами, т.е. с молекулами, которые сами по себе не являются нуклеиновыми кислотами или мономерами, для получения конъюгатов, описанных в настоящем документе. В основном функциональный фрагмент будет содержать химическую группу, которая способна ковалентно связываться с олигомером, например, через 3'-гидроксильную группу или внециклическую NΗ2-группу
- 17 020026 аденинового основания, спейсер, который предпочтительно является гидрофильным, и концевую группу, которая способна связываться с конъюгированным фрагментом (например, амино-, сульфгидрильной или гидроксильной группой). В некоторых вариантах осуществления эта концевая группа не защищена, например представляет собой ΝΉ^-группу. В других вариантах осуществления концевая группа защищена, например, с помощью любой подходящей защитной группы, например, описанной в Рго1ееНуе Сгоирк ίη Огдашс 8упШек1к авторами ТНеобога Сгеепе и Ре1ег С.М. ХУШк, 3-е изд. (ίοΐιη \УПеу & 8опк. 1999). Примеры подходящих гидроксильных защитных групп включают эфиры, такие как ацетатный эфир, аралкильные группы, такие как бензил, дифенилметил или трифенилметил и тертрагидропиранил. Примеры подходящих аминных защитных групп включают бензил, альфа-метилбензил, дифенилметил, трифенилметил, бензилоксикарбонил, трет-бутоксикарбонил и ацильные группы, такие как трихлорацетил или трифторацетил. В некоторых вариантах осуществления функциональный фрагмент является самоотщепляющимся. В других вариантах осуществления функциональный фрагмент является биоразрушаемым; см., например, патент США № 7087229, который в полном объеме включен в настоящий документ в качестве ссылки.
В некоторых вариантах осуществления олигомеры по изобретению функционализированы по 5'концу для того, чтобы сделать возможным ковалентное присоединение конъюгированного фрагмента к 5'-концу олигомера. В других вариантах осуществления олигомеры по изобретению могут быть функционализированы по 3'-концу. В других вариантах осуществления олигомеры по изобретению могут быть функционализированы на протяжении остова или по гетероциклическому остатку основания. В других вариантах осуществления олигомеры по изобретению могут быть функционализированы более чем по одному положению, которые независимо выбраны из 5'-конца, 3'-конца, остова и основания.
В некоторых вариантах осуществления активированные олигомеры по изобретению синтезированы посредством встраивания в процессе синтеза одного или нескольких мономеров, которые ковалентно соединены с функциональным фрагментом. В других вариантах осуществления активированные олигомеры по изобретению синтезированы из нефункционализированных мономеров и олигомер функционализируют после завершения синтеза. В некоторых вариантах осуществления олигомеры функционализированы пространственно-затрудненным сложным эфиром, содержащим аминоалкильный линкер, где алкильная часть имеет формулу (СН2)„, где ν представляет собой целое число в диапазоне от 1 до 10, предпочтительно приблизительной 6, где алкильная часть алкиламинной группы может представлять собой разветвленную или неразветвленную цепь и где функциональная группа присоединена к олигомеру через сложноэфирную группу (-О-С(О)-(СН2)„8Н).
В других вариантах осуществления олигомеры функционализированы пространственнозатрудненным сложным эфиром, содержащим (СН2)„-сульфгидрильный (8Н) линкер, где ν представляет собой целое число в диапазоне от 1 до 10, предпочтительно приблизительно 6, где алкильная часть алкиламинной группы может представлять собой разветвленную или неразветвленную цепь и где функциональная группа присоединена к олигомеру через эфирную группу (-О-С(О)-(СН2)„8Н).
В некоторых вариантах осуществления активированные сульфгидрильной группой олигонуклеотиды конъюгированы с полимерными фрагментами, такими как полиэтиленгликоль или пептиды (посредством образования дисульфидной связи).
Активированные олигомеры, содержащие пространственно-затрудненные сложные эфиры, как описано выше, можно синтезировать любым известным в данной области способом и, в частности, способами, раскрытыми в публикации РСТ \УО 2008/034122 и в ее примерах, и эта публикация включена в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме.
В других вариантах осуществления олигомеры по изобретению функционализированы посредством введения сульфгидрильных, аминных или гидроксильных групп в олигомер с помощью функционализирующего реактива, по существу, как описано в патентах США №№ 4962029 и 4914210, т.е. с помощью, по существу, линейного реактива, содержащего фосфорамидитную группу на одном конце, соединенную через гидрофильную спейсерную цепь с противоположным концом, который содержит защищенную или незащищенную сульфгидрильную, аминную или гидроксильную группу. Такие реактивы сначала реагируют с гидроксильными группами в олигомере. В некоторых вариантах осуществления такие активированные олигомеры содержат функционализирующий реактив, соединенный с 5'-гидроксильной группой олигомера. В других вариантах осуществления активированные олигомеры содержат функционализирующий реактив, соединенный с 3'-гидроксильной группой. В других вариантах осуществления активированные олигомеры по изобретению содержат функционализирующий реактив, соединенный с гидроксильной группой на остове олигомера. В дополнительных вариантах осуществления олигомер по изобретению функционализирован более чем одним функционализирующим реактивом, как описано в патентах США №№ 4962029 и 4914210, которые включены в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме. Способы синтеза таких функционализирующих реактивов и встраивания их в мономеры или олигомеры раскрыты в патентах США №№ 4962029 и 4914210.
В некоторых вариантах осуществления 5'-конец связанного с твердой фазой олигомера функционализирован диенильным фосфорамидитным производным с последующим конъюгированием олигомера со снятой защитой, например, с аминокислотой или пептидом посредством реакции циклоприсоединения
- 18 020026
Дильса-Альдера. В различных вариантах осуществления встраивание в олигомер мономеров, содержащих 2'-модифицированные сахара, например 2'-замещенные карбаматом сахара или сахар 2'-(О-пентил№фталимидо)дезоксирибозу, облегчает ковалентное присоединение конъюгированных фрагментов к сахарам олигомера. В других вариантах осуществления олигомер с аминосодержащим линкером в 2'положении одного или нескольких мономеров получают с использованием такого реактива, например, как 5'-диметокситритил-2'-О-(е-фталимидиламинопентил)-2'-дезоксиаденозин-3'-^№диизопропилцианоэтоксифосфорамидит; см., например, МапоНагап, с1 а1., Тс1гаНсбгоп Ьейегз, 1991, 34, 7171.
В дополнительных вариантах осуществления олигомеры по изобретению могут содержать аминосодержащие функциональные фрагменты на нуклеиновом основании, в том числе на Ν6 пуриновых аминогруппах, на внециклических Ν2 гуанина или на Ν в 4 или 5 положении в цитозине. В различных вариантах осуществления такая функционализация может достигаться при использовании коммерческого реактива, который уже функционализирован в синтезе олигомера.
Коммерчески доступны некоторые функциональные фрагменты, например гетеробифункциональные и гомобифункциональные связывающие фрагменты доступны в Р1егсе Со. (ЯоскГогй, III).
Другие коммерчески доступные связывающие группы представляют собой 5'-аминомодификаторы С6 и 3'-аминомодифицирующие реактивы, которые доступны в 61еп Кекеагсй Согрогайоп (§1ег1тд, Уа.). 5'-аминомодификатор С6 также доступен в ΑΒΙ (Аррйеб Вю8у81ет8 1пс., Ройег Сйу, Са11Г.) под названием Аш1по11пк-2, а 3'-аминомодификатор также доступен в С1оп1ес11 ЬаЬога1опе8 1пс. (Ра1о Ако, Са11Г.).
Композиции.
Олигомер по изобретению можно использовать в фармацевтических составах и композициях. Соответственно такие композиции содержат фармацевтически приемлемые разбавитель, носитель, соль или адъювант. В РСТ/0К2006/000512 предоставлены подходящие и предпочтительные фармацевтически приемлемые разбавитель, носитель и адъюванты, которые включены, таким образом, в виде ссылки. Подходящие дозировки, составы, пути введения, композиции, лекарственные формы, комбинации с другими терапевтическими средствами, составы с пролекарственными средствами также предоставлены в РСТ/0К2006/000512, которые также включены, таким образом, в виде ссылки.
Применения.
Олигомеры по изобретению можно использовать в качестве реактивов для исследований, например для диагностики, терапии и профилактики.
В исследованиях такие олигомеры можно использовать для того, чтобы избирательно ингибировать синтез белка андрогенного рецептора (в основном посредством разрушения или ингибирования мРНК, предотвращая, таким образом, образование белка) в клетках и у экспериментальных животных, таким образом облегчая функциональный анализ мишени или оценку ее пригодности в качестве мишени для терапевтического воздействия.
В диагностике олигомеры можно использовать для обнаружения и количественного определения экспрессии андрогенного рецептора в клетках и тканях с помощью нозерн-блоттинга, гибридизации ш 811и или сходных способов.
При терапии животное или человека с подозрением на заболевание или расстройство, которое можно лечить модулированием экспрессии андрогенного рецептора, лечат введением антисмысловых соединений в соответствии с данным изобретением в соответствующем эффективном количестве. Дополнительно предоставлены способы лечения млекопитающего, например лечение человека с подозрением или со склонностью к заболеванию или состоянию, связанному с экспрессией андрогенного рецептора, посредством введения терапевтически или профилактически эффективного количества одного или нескольких олигомеров или композиций по изобретению.
Фармацевтическую композицию по изобретению можно использовать для лечения состояний, связанных с аномальными уровнями андрогенного рецептора, например рака, такого как рак предстательной железы или молочной железы.
Фармацевтическую композицию по изобретению можно использовать для лечения алопеции, доброкачественной гиперплазии предстательной железы, спинальной и мышечной атрофии и болезни Кеннеди или полиглутаминового заболевания.
Следует признать, что упомянутое в настоящем документе лечение может быть профилактическим.
Подходящие дозировки, составы, пути введения, композиции, лекарственные формы, комбинации с другим терапевтическими средствами, составы с пролекарственными средствами также предоставлены в РСТ/0К2006/000512 и включены, таким образом, в виде ссылки, хотя следует признать, что те аспекты из РСТ/0К2006/000512, которые избирательно применимы только к лечению рака, могут не соответствовать терапевтическим/фармацевтическим композициям и способам по настоящему изобретению.
Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей соединение или конъюгат, описанный в настоящем документе, или конъюгат и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель или адъювант. В РСТ/0К2006/000512 предоставлены подходящие и предпочтительные фармацевтически приемлемые разбавитель, носитель и адъюванты, которые включены, таким образом, в виде ссылки.
Олигомер, конъюгат или фармацевтическую композицию по изобретению в основном вводят в эф- 19 020026 фективном количестве.
Изобретение также относится к использованию описанного соединения или конъюгата по изобретению для производства лекарственного средства для лечения расстройства, упомянутого в настоящем документе, или в способе лечения расстройства, упомянутого в настоящем документе.
Изобретение также относится к способу лечения расстройства, упомянутого в настоящем документе, указанный способ включает введение соединения по изобретению, описанного в настоящем документе, и/или конъюгата по изобретению, и/или фармацевтической композиции по изобретению нуждающемуся в этом пациенту.
Фармацевтические композиции, содержащие более чем один активный ингредиент.
Фармацевтическая композиция по изобретению может дополнительно содержать другие активные ингредиенты, включая те, для которых указано, что их можно использовать для лечения рака, например рака предстательной железы или рака молочной железы, в особенности средства, используемые в традиционной антиандрогенной терапии.
Одним из таких классов соединений являются нестероидные антиандрогены (НСАА), которые блокируют связывание андрогенов с активным центром рецептора.
Аналоги релизинг-гормона лютеинизирующего гормона (АРГЛГ) подавляют образование андрогенов в тестикулах до уровней кастратов.
НСАА, такие как Касодекс, при использовании с АРГЛГ в виде части комбинированной андрогенблокирующей терапии помогают ингибировать рост злокачественных клеток в простате. В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к комбинированной андроген-блокирующей терапии, которая отличается тем, что эта терапия включает введение фармацевтической композиции по изобретению и средства из класса НСАА и/или АРГЛГ, которое можно вводить до, во время или после введения фармацевтической композиции по изобретению.
Изобретение также относится к набору из нескольких частей, где одна часть содержит олигомер, конъюгат и/или фармацевтическую композицию по изобретению, а другая часть содержит нестероидный антиандроген и/или аналог релизинг-гормона лютеинизирующего гормона. Поэтому предусмотрено, что набор из нескольких частей можно использовать в способе лечения, упомянутом в настоящем документе, где способ включает в себя введение как одной части, так и другой части, или одновременно или по очереди.
Медицинские показания.
Олигомеры и другие композиции по изобретению можно использовать для лечения состояний, связанных с чрезмерной экспрессией или экспрессией мутантной версии АР. Ведущие исследователи в данной области предполагают, что фармацевтическое вмешательство в АР приведет к дополнительным возможностям лечения рака предстательной железы или рака молочной железы.
Дополнительные состояния, которые могут быть связаны с аномальными уровнями андрогенного рецептора и которые, следовательно, можно лечить с помощью композиций, конъюгатов и соединений по изобретению, включают расстройства, выбранные из группы, состоящей из рака, например рака молочной железы или рака предстательной железы, алопеции, доброкачественной гиперплазии предстательной железы, спинальной и мышечной атрофии, болезни Кеннеди и полиглутаминового заболевания.
В одном из вариантов осуществления состояния, которые могут быть связаны с аномальными уровнями андрогенного рецептора и которые, следовательно, можно лечить с помощью композиций, конъюгатов и соединений по изобретению, включают расстройства, выбранные из группы, состоящей из рака, например рака молочной железы или рака предстательной железы.
Изобретение дополнительно относится к использованию соединения по изобретению в производстве лекарственного средства для лечения любых или всех состояний, описываемых в настоящем документе.
В общем случае установлено, что один аспект по изобретению относится к способу лечения млекопитающего, которое страдает от или восприимчиво к состояниям, связанным с аномальными уровнями андрогенного рецептора, который включает введение млекопитающему терапевтически эффективного количества олигомера, нацеленного на АР и содержащего одно или несколько звеньев ΕΝΑ.
Представляющий интерес аспект по изобретению относится к использованию олигомера в виде соединения, как определено в настоящем документе, или олигомера в виде конъюгата, как определено в настоящем документе, для получения лекарственного средства для лечения состояния согласно вышеуказанному.
Способы по изобретению предпочтительно применяют для лечения или профилактики заболеваний, вызванных аномальными уровнями андрогенного рецептора.
Кроме того, изобретение, описываемое в настоящем документе, относится к способу предупреждения или лечения заболевания, который включает введение терапевтически эффективного количества олигомера, модулирующего андрогенный рецептор, человеку, нуждающемуся в таком лечении. Изобретение дополнительно относится к применению кратковременного введения олигонуклеотидного соединения, модулирующего андрогенный рецептор.
В одном из вариантов осуществления изобретения олигомер (соединение) соединен с лигандом или
- 20 020026 конъюгатом. Например, для того чтобы увеличить захват олигомера клетками, в некоторых вариантах осуществления конъюгатом является стерин, например холестерин.
Олигомеры по изобретению также могут быть конъюгированы для того, чтобы активировать лекарственные вещества, например аспирин, ибупрофен, сульфаниламидные лекарственные средства, противодиабетические, антибактериальные средства или антибиотики.
Альтернативно установлено, что, кроме того, изобретение относится к способу лечения аномальных уровней андрогенного рецептора, указанный способ включает введение олигомера по изобретению или конъюгата по изобретению либо фармацевтической композиции по изобретению нуждающемуся в этом пациенту и дополнительно включает введение дополнительного химиотерапевтического средства. Указанное дополнительное введение может представлять собой такое введение, при котором дополнительное химиотерапевтическое средство, конъюгированное с соединением по изобретению, представлено в фармацевтической композиции или вводится в виде отдельного состава.
Изобретение также относится к олигомеру, композиции или конъюгату, как определено в настоящем документе, для применения в качестве лекарственного средства.
Изобретение дополнительно относится к применению соединения, композиции или конъюгата, как определено в настоящем документе, в производстве лекарственного средства для лечения аномальных уровней андрогенного рецептора или экспрессии мутантных форм АР (например, аллельных вариантов, таких как те, которые связаны с одним из заболеваний, упомянутых в настоящем документе).
Кроме того, изобретение относится к способу лечения субъекта, страдающего от заболевания или состояния, выбранного из рака, например рака молочной железы или рака предстательной железы, алопеции, доброкачественной гиперплазии предстательной железы, спинальной и мышечной атрофии, болезни Кеннеди и полиглутаминового заболевания, способ включает стадию введения фармацевтической композиции, как определено в настоящем документе, нуждающемуся в этом субъекту.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способам регулирования генов и соответствующих им мРНК и белковых продуктов, которые модулируются посредством андрогенного рецептора (т.е. мишеней андрогенного рецептора), например генов, мРНК и/или белков, выбранных из группы, состоящей из протеинкиназы С-дельта (РККСЭ), глутатион 8-трансферазы тета 2 (С8ТТ2), 3 члена V подсемейства потенциальных катионных каналов временных рецепторов (ΤΚΡν3), пирролин-5-карбоксилатредуктазы 1 (РУСЫ) или орнитинаминотрансферазы (ОАТ). В зависимости от мишени андрогенного рецептора модулирование может приводить к увеличению экспрессии или активности мишени андрогенного рецептора или снижению экспрессии или активности.
Варианты осуществления
Следующие варианты осуществления настоящего изобретения можно использовать в сочетании с другими вариантами осуществления, описываемыми в настоящем документе.
1. Олигомер длиной 10-50 нуклеиновых оснований, который содержит непрерывную последовательность нуклеиновых оснований общей длиной 10-50 нуклеиновых оснований, где указанная непрерывная последовательность нуклеиновых оснований по меньшей мере на 80% гомологична соответствующей области нуклеиновой кислоты, которая кодирует андрогенный рецептор млекопитающего.
2. Олигомер согласно варианту осуществления 1, где указанный олигомер содержит по меньшей мере одно звено ΕΝΆ.
3. Олигомер согласно варианту осуществления 1 или 2, где непрерывная последовательность нуклеиновых оснований содержит не более чем 3, например не более чем 2, несоответствия относительно соответствующей области нуклеиновой кислоты, которая кодирует андрогенный рецептор млекопитающего.
4. Олигомер согласно варианту осуществления 3, где указанная непрерывная последовательность нуклеиновых оснований содержит не более чем одно несоответствие относительно соответствующей области нуклеиновой кислоты, кодирующей андрогенный рецептор млекопитающего.
5. Олигомер согласно варианту осуществления 4, где указанная непрерывная последовательность нуклеиновых оснований не содержит несоответствий (т.е. комплементарна) относительно соответствующей области нуклеиновой кислоты, кодирующей андрогенный рецептор млекопитающего.
6. Олигомер согласно любому варианту осуществления 1-5, где последовательность нуклеиновых оснований олигомера состоит из непрерывной последовательности нуклеиновых оснований.
7. Олигомер согласно любому варианту осуществления 1-6, где нуклеиновая кислота, которая кодирует андрогенный рецептор млекопитающего, представляет собой нуклеотидную последовательность андрогенного рецептора человека, например 8ΕΟ ΙΌ № 1, или ее встречающиеся в природе аллельные варианты.
8. Олигомер согласно любому варианту осуществления 1-7, где непрерывная последовательность нуклеиновых оснований комплементарна соответствующей области как последовательности нуклеиновой кислоты андрогенного рецептора человека, так и последовательности нуклеиновой кислоты андрогенного рецептора млекопитающего, не являющегося человеком, например последовательности нуклеиновой кислоты андрогенного рецептора мыши.
9. Олигомер согласно любому варианту осуществления 1-8, где непрерывная последовательность
- 21 020026 нуклеиновых оснований содержит непрерывную подпоследовательность по меньшей мере из 7 остатков нуклеиновых оснований, которая при образовании дуплекса с комплементарной целевой РНК андрогенного рецептора обладает способностью вовлекать РНКазу Н.
10. Олигомер согласно варианту осуществления 9, где непрерывная последовательность нуклеиновых оснований содержит непрерывную подпоследовательность по меньшей мере из 8, по меньшей мере из 9 или по меньшей мере из 10 остатков нуклеиновых оснований, которая при образовании дуплекса с комплементарной целевой РНК андрогенного рецептора обладает способностью вовлекать РНКазу Н.
11. Олигомер согласно любому варианту осуществления 9 или 10, где указанная непрерывная подпоследовательность длиной по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 нуклеиновых оснований, например длиной по меньшей мере 12 нуклеиновых оснований или по меньшей мере 14 нуклеиновых оснований, например 14, 15 или 16 остатков нуклеиновых оснований, при образовании дуплекса с комплементарной целевой РНК андрогенного рецептора обладает способностью вовлекать РНКазу Н.
12. Олигомер согласно любому варианту осуществления 1-11, где указанный олигомер конъюгирован с одним или несколькими соединениями, которые не являются нуклеиновыми основаниями.
13. Олигомер согласно любому варианту осуществления 1-12, где указанный олигомер имеет длину от 10 до 22 нуклеиновых оснований.
14. Олигомер согласно любому варианту осуществления 1-13, где указанный олигомер имеет длину от 12 до 18 нуклеиновых оснований.
15. Олигомер согласно любому варианту осуществления 1-14, где указанный олигомер имеет длину 14, 15 или 16 нуклеиновых оснований.
16. Олигомер согласно любому варианту осуществления 1-15, где указанная непрерывная последовательность нуклеиновых оснований соответствует непрерывной нуклеотидной последовательности, представленной в последовательности нуклеиновой кислоты, которая выбрана из группы, состоящей из 8ЕО ГО № 86-106.
17. Олигомер согласно любому варианту осуществления 1-16, где олигомер или непрерывная последовательность нуклеиновых оснований содержит (или выбрана из) соответствующую последовательность нуклеиновых оснований, представленную в нуклеотидной последовательности, которая выбрана из группы, состоящей из 8ЕО ГО № 2-22.
18. Олигомер согласно любому варианту осуществления 1-17, где указанная непрерывная последовательность нуклеиновых оснований содержит по меньшей мере один нуклеотидный аналог, увеличивающий аффинность.
19. Олигомер согласно варианту осуществления 18, где указанная непрерывная последовательность нуклеиновых оснований содержит всего 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидных аналогов, увеличивающих аффинность, например от 5 до 8 нуклеотидных аналогов, увеличивающих аффинность.
20. Олигомер согласно любому варианту осуществления 1-19, который содержит по меньшей мере один нуклеотидный аналог, увеличивающий аффинность, где остальные нуклеиновые основания выбраны из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотидов и рибонуклеотидов, и предпочтительно представляют собой дезоксирибонуклеотиды.
21. Олигомер согласно любому варианту осуществления 1-20, где олигомер содержит последовательность нуклеиновых оснований формулы в направлении 5'-3', А-В-С и необязательно формулы А-ВС-Э. где
А состоит из или содержит по меньшей мере один нуклеотидный аналог, например 1, 2, 3, 4, 5 или 6 нуклеотидных аналогов, предпочтительно 2-5 нуклеотидных аналогов, предпочтительно 2, 3 или 4 нуклеотидных аналога, наиболее предпочтительно 2, 3 или 4 последовательных нуклеотидных аналога;
В состоит или содержит по меньшей мере пять последовательных нуклеиновых оснований, которые обладают способностью вовлекать РНКазу Н (при образовании дуплекса с комплементарной молекулой РНК, например, с целевой мРНК АР), например, дезоксирибонуклеиновых оснований, например, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 последовательных нуклеиновых оснований, которые обладают способностью вовлекать РНКазу Н, или 6-10, или 7-9, например 8, последовательных нуклеиновый оснований, которые обладают способностью вовлекать РНКазу Н;
С состоит из или содержит по меньшей мере один нуклеотидный аналог, например 1, 2, 3, 4, 5 или 6 нуклеотидных аналогов, предпочтительно 2-5 нуклеотидных аналогов, например 2, 3 или 4 нуклеотидных аналога, наиболее предпочтительно 2, 3 или 4 последовательных нуклеотидных аналога;
Ό, если присутствует, то состоит из или содержит, предпочтительно состоит из одного или нескольких дезоксирибонуклеотидов, например из 1-3 или 1-2 дезоксирибонуклеотидов.
22. Олигомер согласно варианту осуществления 21, где А-область состоит из или содержит 2, 3 или 4 последовательных нуклеотидных аналога.
23. Олигомер согласно любому варианту осуществления 21, 22, где В-область состоит из или содержит 7, 8, 9 или 10 последовательных дезоксирибонуклеотидов или эквивалентных нуклеиновых оснований, которые обладают способностью вовлекать РНКазу Н при образовании дуплекса с комплементарной РНК, например с целевой мРНК андрогенного рецептора.
24. Олигомер согласно любому варианту осуществления 21-23, где С-область состоит из или со
- 22 020026 держит 2, 3 или 4 последовательных нуклеотидных аналога.
25. Олигомер согласно любому варианту осуществления 21-24, где О-область. в случае присутствия, состоит из одного или двух дезоксирибонуклеотидов.
26. Олигомер согласно любому варианту осуществления 21-25, где
А состоит из или содержит 3 смежных нуклеотидных аналога;
В состоит из или содержит 7, 8, 9 или 10 смежных дезоксирибонуклеотидов или эквивалентных нуклеиновых оснований, которые обладают способностью вовлекать РНКазу Н при образовании дуплекса с комплементарной РНК, например с целевой мРНК андрогенного рецептора;
С состоит из или содержит 3 смежных нуклеотидных аналога;
Ό, в случае присутствия, состоит из одного или двух дезоксирибонуклеотидов.
27. Олигомер согласно варианту осуществления 26, где непрерывная последовательность нуклеиновых оснований состоит из 10, 11, 12, 13 или 14 нуклеиновых оснований и где
А состоит из 1, 2 или 3 смежных нуклеотидных аналогов;
В состоит из 7, 8 или 9 смежных дезоксирибонуклеотидов или эквивалентных нуклеиновых оснований, которые обладают способностью вовлекать РНКазу Н при образовании дуплекса с комплементарной РНК, например с целевой мРНК андрогенного рецептора;
С состоит из 1, 2 или 3 смежных нуклеотидных аналогов;
Ό, в случае присутствия, состоит из одного дезоксирибонуклеотида.
28. Олигомер согласно любому из вариантов осуществления 21-27, где В содержит по меньшей мере одно нуклеиновое основание ΕΝΑ, которое находится в альфа-Ь-конфигурации, например альфа-Ьокси ΕΝΑ.
29. Олигомер согласно любому варианту осуществления 1-28, где нуклеотидные аналоги независимо или совместно выбраны из группы, состоящей из звеньев замкнутой нуклеиновой кислоты (ΕΝΑ); звеньев 2'-О-алкил-РНК, звеньев 2'-ОМе-РНК, 2'-аминодезоксирибонуклеотидных звеньев, 2'фтордезоксирибонуклеотидных звеньев, звеньев ΡΝΑ, звеньев ΗΝΑ и звеньев ΙΝΑ.
30. Олигомер согласно варианту осуществления 29, где все нуклеотидные аналоги представляют собой звенья ΕΝΑ.
31. Олигомер согласно любому варианту осуществления 1-30, который содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 звеньев ΕΝΑ, например от 2 до 8 нуклеотидных звеньев ΕΝΑ.
32. Олигомер согласно любому варианту осуществления 29-31, где ΕΝΑ независимо выбраны из окси-ΕΝΑ, тио-ΕΝΑ и амино-ΕΝΑ, в бета-Ό- или в альфа-Ь-конфигурации, или в сочетании.
33. Олигомер согласно варианту осуществления 32, где все ΕΝΑ представляют собой бета-О-оксиΕΝΑ.
34. Олигомер согласно любому варианту осуществления 21-33, где нуклеотидные аналоги или нуклеиновые основания областей А и С представляют собой бета-О-окси-ΕΝΑ.
35. Олигомер согласно любому варианту осуществления 1-34, где по меньшей мере одно из нуклеиновых оснований, представленных в олигомере, представляет собой модифицированное нуклеиновое основание, выбранное из группы, состоящей из 5-метилцитозина, изоцитозина, псевдоизоцитозина, 5бромурацила, 5-пропинилурацила, 6-аминопурина, 2-аминопурина, инозина, диаминопурина и 2-хлор-6аминопурина.
36. Олигомер согласно любому варианту осуществления 1-35, где указанный олигомер гибридизуется с соответствующей мРНК андрогенного рецептора млекопитающего при Тт по меньшей мере 50°С.
37. Олигомер согласно любому варианту осуществления 1-36, где указанный олигомер гибридизуется с соответствующей мРНК андрогенного рецептора млекопитающего при Тт более чем 80°С.
38. Олигомер согласно любому варианту осуществления 1-37, где межнуклеозидные связи независимо выбраны из группы, состоящей из фосфодиэфирной, фосфоротиоатной и боранфосфатной связи.
39. Олигомер согласно варианту осуществления 38, где олигомер содержит по меньшей мере одну фосфоротиоатную межнуклеозидную связь.
40. Олигомер согласно варианту осуществления 39, где межнуклеотидные связи, расположенные рядом с или между звеньями ДНК или РНК или в В-области, представляют собой фосфоротиоатные связи.
41. Олигомер согласно варианту осуществления 39 или 40, где связи между по меньшей мере одной парой последовательных нуклеотидных аналогов представляют собой фосфодиэфирную связь.
42. Олигомер согласно варианту осуществления 39 или 40, где все связи между последовательными нуклеотидными аналогами представляют собой фосфодиэфирные связи.
43. Олигомер согласно варианту осуществления 42, где все межнуклеозидные связи представляют собой фосфоротиоатные связи.
44. Конъюгат, содержащий олигомер согласно любому варианту осуществления 1-43 и по меньшей мере один ненуклеотидный или неполинуклеотидный фрагмент, ковалентно связанный с указанным соединением.
45. Фармацевтическая композиция, содержащая олигомер, который определен в любом из вариантов осуществления 1-43, или конъюгат, который определен в варианте осуществления 44, и фармацевти
- 23 020026 чески приемлемые разбавитель, носитель, соль или адъювант.
46. Фармацевтическая композиция согласно варианту осуществления 45, в которую олигомер введен в качестве пролекарственного средства.
47. Фармацевтическая композиция согласно варианту осуществления 45 или 46, которая дополнительно содержит дополнительное терапевтическое средство, выбранное из группы, состоящей из нестероидных антиандрогенов и аналогов релизинг-гормона лютеинизирующего гормона.
48. Применение олигомера, который определен в любом из вариантов осуществления 1-43, или конъюгата, который определен в варианте осуществления 44, в производстве лекарственного средства для лечения заболевания или расстройства, выбранного из группы, состоящей из рака, такого как рак молочной железы или рак предстательной железы, алопеции, доброкачественной гиперплазии предстательной железы, спинальной и мышечной атрофии, болезни Кеннеди и полиглутаминового заболевания.
49. Олигомер, который определен в любом из вариантов осуществления 1-43, или конъюгат, который определен в варианте осуществления 44, для применения в лечении заболевания или расстройства, выбранного из группы, состоящей из рака, такого как рак молочной железы или рак предстательной железы, алопеции, доброкачественной гиперплазии предстательной железы, спинальной и мышечной атрофии, болезни Кеннеди и полиглутаминового заболевания.
50. Способ лечения заболевания или расстройства, выбранного из группы, состоящей из рака, такого как рак молочной железы или рак предстательной железы, алопеции, доброкачественной гиперплазии предстательной железы, спинальной и мышечной атрофии, болезни Кеннеди и полиглутаминового заболевания, указанный способ включает введение олигомера, который определен в любом из вариантов осуществления 1-43, или конъюгата, который определен в варианте осуществления 44, или фармацевтической композиции, которая определена в любом из вариантов осуществления 45-47, нуждающемуся в этом пациенту.
51. Способ лечения рака, такого как рак предстательной железы или рак молочной железы, указанный способ включает введение олигомера, который определен в одном из вариантов осуществления 1-43, или конъюгата, который определен в варианте осуществления 44, или фармацевтической композиции, которая определена в любом из вариантов осуществления 45-47, нуждающемуся в этом пациенту.
52. Способ снижения или ингибирования экспрессии андрогенного рецептора в клетке или в ткани, способ содержит стадию приведения указанной клетки или ткани в контакт с соединением, которое определено в любом из вариантов осуществления 1-43, или с конъюгатом, который определен в варианте осуществления 44, или с фармацевтической композицией, которая определена в любом из вариантов осуществления 45-47, для того, чтобы снизить или ингибировать экспрессию андрогенного рецептора.
Способ модулирования экспрессии гена, который регулируется андрогенным рецептором (т.е. мишени андрогенного рецептора) в клетке, которая экспрессирует указанный ген, указанный способ содержит стадию приведения указанной клетки или ткани в контакт с соединением, которое определено в любом из вариантов осуществления 1-43, или с конъюгатом, который определен в варианте осуществления 44, или с фармацевтической композицией, которая определена в любом из вариантов осуществления 4547, для того, чтобы модулировать экспрессию мишени андрогенного рецептора.
Примеры
Пример 1. Синтез мономеров.
Мономерные строительные блоки и производные ΕΝΆ получали согласно опубликованным процедурам и цитируемым в них ссылкам; см. \У0 07/031081 и цитируемые в нем ссылки.
Пример 2. Синтез олигонуклеотидов.
Олигонуклеотиды синтезировали согласно способу, описанному в \У0 07/031081. В табл. 1 приведены примеры антисмысловых олигонуклеотидных последовательностей по изобретению. В табл. 2 и 3 приведены примеры антисмысловых олигонуклеотидов (олиго) по изобретению.
Пример 3. Конструирование олигонуклеотидов.
В соответствии с настоящим изобретением был разработан ряд различных олигонуклеотидов для избирательного связывания с различными областями мРНК андрогенного рецептора человека (инвентарный номер СеиЬаик ΝΜ_000044, 8ЕО ΙΌ № 1).
Антисмысловые олигонуклеотидные последовательности по изобретению 8ЕО ΙΌ №№ 2-22 представляют собой олигонуклеотидные последовательности, сконструированные для избирательного связывания с мРНК андрогенного рецептора человека.
- 24 020026
Таблица 1
ЗЕО 10 N0 Последовательность (5’-3’) Длина (основания) Сайт мишени ΝΜ_000044
ЗЕО © ΝΟ: 2 ОАВААССАТССТСАСС 16 1389-1404
ЗЕО Ю N0: 3 63АССА6ВТА0ССТЗТ 16 1428-1443
ЗЕО Ю N0: 4 ССССТЗЗАСТСАСАТ6 16 1881-1896
ЗЕО Ю N0: 5 ЗСАСААвЗАВТвВвАС 16 1954-1969
ЗЕО © N0: 6 ЗСТСТЗААЗАСАСТСТ 16 2422-2437
ЗЕО 10 ΝΟ: 7 ТТТбАСАСААЗТЗЗСА 16 2663-2678
ЗЕО 10 ΝΟ: 8 ЗТСАСАСССАЗААЗСТ 16 2813-2828
ЗЕО © ΝΟ: 9 САТСССТССТТСАТАА 16 2975-2990
ЗЕОЮЫО: 10 АССААЗТТТСТТСАОС 16 3008-3023
ЗЕО Ю ΝΟ: 11 СТТСССССАСТТЗАСС 16 3263-3278
ЗЕО ©Ν0: 12 ТССТеЗАбТТСАСАТТ 16 3384-3399
ЗЕО © N0: 13 САСТ6ССТЗТАСАТСС 16 3454-3469
ЗЕОЮЫО: 14 САТССАААСТСТТСАО 16 3490-3505
3Ε0Ι0Ν0:15 ССТТТСАТЗСАСАЗЗА 16 3529-3544
ЗЕО ©N0:16 заазттсатсааазаа 16 3594-3609
ЗЕО© N0:17 АЗТГССТТСАТСТАВТ 16 3616-3631
ЗЕО© N0:18 ттссасазазатзатс 16 3809-3824
ЗЕО© N0:19 0АТС66СТТСАСТТТС 16 3845-3860
ЗЕО © N0: 20 САСЗСАСААЗАСАТСТ 16 3924-3939
5ЕО (0 ΝΟ: 21 СССААЗССАСТССАОА 16 3960-3975
ЗЕО © N0: 22 ОСТОАСАТТСАТАОСС 16 3114-3129
ЗЕО Ю N0:86 ТЗвЗЗАЗААССАТССТСАСССТеС 24 1385-1408
ЗЕО Ю N0:87 ТССАЗСАССАСЗТАСССТЗТСВее 24 1424-1447
5Е0 Ю N0: 88 ТвТТССССТВЗАСТСАЗАТвСТСС 24 1877-1990
ЗЕО Ю N0: 89 ТЗЗЗЗСАСААЗЗАЗТЗЗЗАСЗСАС 24 1950-1973
ЗЕО ГО N0:90 ТТСЗЗСТЗТЗААСАЗАЗТЗТЗССА 24 2418-2441
ЗЕО © N0: 91 СеСТПТЗАСАСААЗТЗеЗАСТЗб 24 2659-2682
ЗЕО © N0: 92 САТАОТОАСАСССАОААССТТСАТ 24 2809-2832
ЗЕО ГО N0: 93 ЗАЗТСАТСССТЗСТТСАТААСАТТ 24 2971-2994
ЗЕО Ю N0: 94 ОАТТАССААСТТТСТТСАССТТСС 24 3004-3027
ЗЕО © N0:95 АСЗССТТЗЗСССАСПЗАССАСЗТ 24 3259-3282
ЗЕО © N0:96 АЗСАТССТЗбАЗТТЗАСАТТСЗТЗ 24 3380-3403
ЗЕО © N0: 97 0АСАСАСТ63СТЗТАСАТСС363А 24 3450-3473
ЗЕО ГО N0: 98 САСССАТССАААСТСТТ0А6АСА6 24 3486-3509
ЗЕО ГО N0: 99 САЗТССТТТСАТЗСАСАЗеААТТС 24 3525-3548
8Е0 Ю N0:100 АТГСОААЗТТСАТСАААЗААТПТ 24 3590-3613
ЗЕО Ю N0:101 АТС6А6ТГССТТЗАТСТАСТТСАТ 24 3612-3635
ЗЕО © N0:102 ЗСАСТГЗСАСАЗАЗАТЗАТСТСТЗ 24 3805-3828
ЗЕО © N0:103 ААТАЗАТЗЗЗСТТЗАСТТТСССАЗ 24 3841-3864
ЗЕО © N0:104 АТААСАЗЗСАЗААЗАСАТСТЗААА 24 3920-3943
ЗЕО © N0:105 АТТССССААЗЗСАСТЗСАЗАЗЗАЗ 24 3956-3979
ЗЕО © ΝΟ: 106 АТССОСТЗАСАТТСАТАОССТТСА 24 3110-3133
Конструкции олигонуклеотидов по изобретению - в 8ЕО ΙΌ №№ 23-43 заглавные буквы обозначают звенья нуклеотидных аналогов и нижний индекс к обозначает фосфоротиоатную связь. Строчные буквы обозначают нуклеотидные звенья. При отсутствии к подразумевается фосфодиэфирная связь.
- 25 020026
Таблица 2
ЗЕО ГО ΝΟ Последовательность (5'-3')
ЗЕО ГО ΝΟ: 23
ЗЕО ГО ΝΟ: 24
ЗЕО ГО ΝΟ: 25 5’-С3С8СдС3Т3д3д5а3с31дС3а5д3А3Т36-3'
ЗЕО ГО ΝΟ: 26 б’-ОзСвАзСда-да-дд-^а-дд-^дзд-дС^А^С-З·
ЗЕО ГО ΝΟ: 27
ЗЕО ГО ΝΟ: 28 5’-Т^Т3Т8д3а3с8а3а8а8а3д3Т3д308С3А-3'
ЗЕО ГО ΝΟ: 29 5’-е8Т868а8д3а3с3с3с8а3д3а3азе8С8Т-3'
ЗЕО ГО ΝΟ: 30 ^^5^5^5^5^5^5^595^5^5^5^5^5^5^5^-^
ЗЕО ГО N0: 31
ЗЕО ГО ΝΟ: 32 б’-С^-ГдддддСдС^дадд^ддАдС^С-З'
ЗЕО ГО ΝΟ: 33 ^ТдСдСд^сГддда'дд’дУ^д'даГдСдАд Та Т-3'
ЗЕО ГО ΝΟ: 34 5 Сд^^Сд1^д‘д9'дСд^дд'д1’дадСда*дТдСдС-3
ЗЕО ГО ΝΟ: 35
ЗЕО ГО ΝΟ: 36 5 ОдОдА-3
ЗЕО ГО ΝΟ: 37
ЗЕО ГОЫО: 38 З'-А^бдТд^СдСдУдддадЦд'дЦА^бдТ-З'
ЗЕО ГО ΝΟ: 39 5’-Т8 Т8б8с8а^с3а3д3а8д8а3^д3А^Т3С-3'
ЗЕО ГО ΝΟ: 40 б^вАдТдддддддСд^^ддадСдТдТдТ^С-З'
ЗЕО ГО ΝΟ: 41
ЗЕО ГО N0: 42 5‘-С3С3С-5а3а3д3д3с5а3с51$д3с3А3О3А-3'
ЗЕО ГО ΝΟ: 43 5'“ Сд Тд дз Эд Сд Эд 1д ΐ§ Сд Эд (д Эд Сд Сд С ’З’
Пример 4. Модель ίη νίίΓο: культура клеток.
Действие антисмысловых олигонуклеотидов на экспрессию целевых нуклеиновых кислот можно тестировать на любом из множества типов клеток при условии, что целевая нуклеиновая кислота присутствует в измеримых концентрациях. Мишень может экспрессироваться эндогенно или посредством временной или постоянной трансфекции нуклеиновой кислотой, кодирующей указанную мишень. Уровень экспрессии целевой нуклеиновой кислоты можно определить обычным путем с использованием, например, анализа нозерн-блоттинга, ПЦР в реальном времени, тестов на устойчивость к рибонуклеазам. Следующие типы клеток предоставлены для иллюстративных целей, но другие типы клеток можно использовать обычным путем при условии, что мишень экспрессируется в выбранном типе клеток.
Клетки культивировали в подходящей среде, как описано ниже, и поддерживали при 37°С и 95-98% влажности и 5% СО2. Клетки пересевали обычным путем 2-3 раза в неделю.
А549 Клеточную линию рака легких человека А5439 культивировали в ΌΜΕΜ (81дта) + 10% эмбриональной телячьей сыворотки (РВ8) + 2 мМ С1и1атах I + гентамицин (25 мкг/мл).
МСР7 Клеточную линию рака молочной железы человека МСР7 культивировали в Еад1еМЕМ (81дта) + 10% эмбриональной телячьей сыворотки (РВ8) + 2 мМ С1и1атах I + 1 х ЯЕАА + гентамицин (25 мкг/мл).
Пример 5. Модель ίη νίίτο: обработка антисмысловым олигонуклеотидом+.
Клеточные линии, перечисленные в примере 4, обрабатывали олигонуклеотидом с использованием состава с катионными липосомами ЫроГеЦАМГПЕ 2000 (С1Ьсо) в качестве носителя для трансфекции. Клетки высевали в 6-луночные планшеты для культивирования клеток (ИиПС) и обрабатывали при 8090% конфлюэнтности. Конечные концентрации использованных олигонуклеотидов варьировали от 1 до 16 нМ. Состав с олигонуклеотидно-липидными комплексами получали, по существу, как описано производителем с использованием бессывороточной ОрйМЕМ (С1Ьсо), и конечная концентрация липидов Ь1роГес1АМШЕ 2000 составляла 5 мкг/мл. Клетки инкубировали при 37°С в течение 4 ч и обработку останавливали посредством удаления среды для культивирования, содержащей олигонуклеотиды. Клетки промывали и добавляли среду, содержащую сыворотку. После обработки олигонуклеотидами клеткам позволяли восстановиться в течение 20 ч перед тем, как собрать их для анализа РНК.
Пример 6. Модель ίη νίίτο: выделение РНК и синтез кДНК. Выделение общей РНК и синтез первой цепи.
Общую РНК выделяли из клеток, трансфицированных, как описано выше, с использованием О|адеп КЫеазу кН (О|адеп. номер по каталогу 74104) по инструкциям производителя. Синтез первой цепи осу
- 26 020026 ществляли с использованием реактивов Кеуегзе Тгапзспр1азе из Αιηόίοη по инструкциям производителя.
0,5 мкг общей РНК каждого образца разбавляли до объема 10,8 мкл водой, не содержащей РНКазу, смешивали с 2 мкл случайных декамеров (50 мкМ) и 4 мкл смеси 6ΝΤΡ (по 2,5 мМ каждого 6ΝΤΡ) и нагревали до 70°С в течение 3 мин, после чего образцы быстро охлаждали на льду. После охлаждения образцов на льду в каждый образец добавляли по 2 мкл 10 х Вийсг КТ, 1 мкл ММЬУ Кеуегзе ТгапзспрШзе (100 Ед/мкл) и 0,25 мкл ингибитора РНКазы (10 Ед/мкл), а затем инкубировали при 42°С в течение 60 мин, инактивировали фермент нагреванием при 95°С в течение 10 мин и затем образец охлаждали до 4°С.
Пример 7. Модель ίη νίίτο: анализ ингибирования экспрессии андрогенного рецептора с помощью олигонуклеотидов посредством ПЦР в реальном времени.
Модулирование экспрессии андрогенного рецептора антисмысловыми олигонуклеотидами можно оценить множеством способов, известных в данной области. Например, уровни мРНК андрогенного рецептора можно определить количественно, например с помощью анализа нозерн-блоттинга, конкурентной полимеразной цепной реакции (ПЦР) или ПЦР в реальном времени. В настоящее время количественная ПЦР в реальном времени является предпочтительной. Анализ РНК можно осуществлять при использовании общей клеточной РНК или мРНК.
Способы выделения и анализа РНК, такие как нозерн-блоттинг, являются обычными в данной области и изложены, например, в Сштей Рго1осо1з ίη Мо1еси1аг Вю1оду, ίοΐιη ^11еу апб 8опз.
Количественную ПЦР в реальном времени можно удобно осуществлять с использованием коммерчески доступной Ми1Б-Со1от Кеа1 Т1те РСК ОеЮсбоп 8уз1ет, которая доступна в Αρρ^6 Вюзуз1ет.
Анализ уровней мРНК андрогенного рецептора с помощью количественной ПЦР в реальном времени.
Содержание мРНК андрогенного рецептора человека в образце определяли количественно с использованием реактивов для анализа андрогенного рецептора человека Тас.|Мап, разработанных в ΑΒΙ Рпзт (АррНеб Вюзуз1етз, номер по каталогу Нз00171172_т1) по инструкциям производителя. Количество мРНК глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ΟΑΡΌΗ) использовали в качестве эндогенного контроля для нормализации каких-либо различий в подготовке образцов. Содержание мРНК ΟΑΡΌΗ человека в образце оценивали количественно с использованием реактивов для анализа ΟΑΡΌΗ человека Тас.|Мап, разработанных в ΑΒΙ Ρι^ιη (Аррбеб Вюзуз1етз, номер по каталогу 4310884Е) по инструкциям производителя.
Количественная ПЦР в реальном времени представляет собой способ, хорошо известный в данной области и изложенный, например, авторами Не1б еί а1. Веа1 бте с.|иапШа1Ае ΡΟΡ, Сепоте ВезеагсБ (1996), 6: 986-994. ПЦР в реальном времени: кДНК, полученную при синтезе первой цепи, который выполняли, как описано в примере 6, разбавляли в 2-20 раз и анализировали посредством количественной ПЦР в реальном времени с использованием Тас.|тап 7500 ΡΑ^ или 7900 ΡΑ^ из Жрр11еб Вюзуз1етз. Праймеры и зонд смешивали с 2х Тацтап Ρазί ипАегза1 ΡΟΡ Маз1ег М1х (2х) (АррНеб Вюзуз1етз, номер по каталогу 4364103) и добавляли к 4 мкл кДНК до конечного объема 10 мкл. Каждый образец анализировали дважды. Калибровочные кривые для анализа создавали на основе 2-кратных разведений кДНК, которые получали из материала, выделенного из клеточной линии, экспрессирующей требуемую РНК.
В контроле без матрицы вместо кДНК использовали стерильную Н2О. Программа ПЦР: 95°С в течение 30 с, затем 40 циклов по 95°С, 3 с, 60°С, 20-30 с. Относительные количества последовательности целевой мРНК определяли по вычисленному пороговому циклу с использованием программного обеспечения Лрр11еб Вюзуз1етз Ρазί 8узίет 8Ό8, версия 1.3.1.21, или программного обеспечения 8Ό8, версия 2.3.
Пример 8. Анализ т νίίτο: ингибирование экспрессии мРНК андрогенного рецептора человека соединениями антисмысловых олигонуклеотидов.
Оценивали способность олигонуклеотидов, представленных в табл. 3, к нокдауну мРНК андрогенного рецептора в концентрации 1, 4 и 16 нМ (см. фиг. 1 и 2).
В табл. 3 представлены данные о понижающей регуляции в виде процентной доли относительно клеток, подвергшихся имитации трансфекции при 16 нМ. Строчные буквы обозначают дезоксирибонуклеотидные звенья, строчные буквы в жирном начертании обозначают звенья в-О-окси-ΕΝΑ. Все ΕΝΑ С представляют собой 5'-метил С. Нижний индекс з обозначает фосфоротиоатную связь.
- 27 020026
Таблица 3
Ингибирование экспрессии мРНК андрогенного рецептора человека антисмысловыми олигонуклеотидами
Тестируемое вещество Последовательность (5*-3') Процент 1нгибировани! андрогенного рецептора МСР7 Процент ингибирования андрогенного рецептораА549
ЗЕО ГО N0: 44 5*-С№вза-5а-5с5с5а8^с5с3Т5с8^С-5е-3’ 80,1 63.8
5Е0 ГО N0: 45 5*-(э8С5А8с'8с8а8д'8д'81^адд8с8с8Т8С8Т-3 89.0 88.2
ЗЕО ГО N0: 46 б'-С^С’дС’дСд^д'дд’да'дСд^СдадддА^Тзб-З 89.4 82.8
ЗЕО ГО N0: 47 5’-С-зСзАзС8а8а8д8д8аддд^д8д-8О-5^е-3’ 83.1 77.7
ЗЕО ГО N0: 48 5'-ОдСдТддд^д8а8адд8адд8адд8ТдОдТ-3' 93.8 96.7
ЗЕО ГО N0: 49 5'--СдТдСд1:8дда8аддда8д8а8ддТд©-3 пЛ. пЛ.
ЗЕО Ю ΝΟ: 50 5,-т3С51дд5а5а 5д5а5д5а5с5Тд-3 пЛ. пЛ.
ЗЕО Ю N0: 51 5,_ТдТдТдд8адС8а8с8а'да5д81^д8вдОдА-3 96.9 95.5
ЗЕО ГО N0: 52 ^ТзТзОда8Сза8с8ада8д8Т5дд<эз6-3 п.а. пЛ.
ЗЕО ГО N0: 53 5'-Тд(Зда8сдадс8ада8дд^6-з6-3· пЛ. пЛ.
ЗЕО ГО N0: 54 5,-б8Г8<3-8аз^^^а8д8^адС'8С8Т-3’ 95.4 98.3
ЗЕО Ю N0: 55 5'-Τ·5θ8Α·5σ535σ5σ5σ5θ5933535α80-3· пЛ. пЛ.
ЗЕО ГО N0: 56 5'- СИ5^а8с5с5с5а8д5а5А86-3· пЛ. пЛ.
ЗЕО ГО N0: 57 5 'СдА8ТдС‘дСдС7д(^ддС'д|'д1^С*да*дТ8А^А“3 89.5 88.9
ЗЕО ГО N0: 58 5ЧкзО8Сзададд8у8Т8сду^Аз0зе-3· 95.6 98.9
ЗЕО ГО N0: 59 ^СзСзАдаздд^^^Сд^^СдАдС-З' пЛ. пЛ.
ЗЕО ГО N0: 60 ^''СдА^а'зддУ^дСдУдСдА-З' пЛ. пЛ.
ЗЕО Ιϋ N0: 61 86.7 93.3
ЗЕО Ю N0: 62 5 ТзСвСд^ддддадддУ'дддадСдА^Тд’Г-З 81.3 93.0
ЗЕО ГО N0: 63 б’-Св^С-зедддддСд^дд^адСдадТдСдС-З’ 90.9 98.4
ЗЕО ГО N0: 64 б-АвСз^ддддСд^ддГдазазад-Где-З· пЛ. пЛ.
ЗЕО ГО N0: 65 5,-С‘зТддэддсд1,ддд1'8а8с^А^Т-3' пл. пЛ.
ЗЕО ГО N0: 66 5 -СдАдТдСдс‘да8а8а5сд1’8сд^18(ЗзАд6-3 79.8 95.3
ЗЕО ГО N0: 67 ^^дСдТдЬд^Сдад^ддСда’дСдадОдСдА-З 83.5 97.0
ЗЕО ГО N0: 68 5_®*5А8Аз9дУ8сза дТ8с^а8а8а8(ЭдА^А“3 88.2 85.6
ЗЕО ГО N0; 69 92.7 94.0
ЗЕО ГО N0: 70 ^^5Т8ТдС,дс8(,81^ддад(, 8ддТдАд©--3' п.а. пЛ.
ЗЕО ГО ΝΟ: 71 ^-3'&Г8с5с'51'д1‘5д5а'51'5д5ТдА-3' лЛ. пЛ.
ЗЕО Ю N0: 72 5 _ТзТдСд0,да8с,да5д, 8адддад('зддА^Т^С-3 79.2 90.4
ЗЕО ΙΟ ΝΟ: 73 ^’ФзА^ТдддддддСд^д^дддадС’д^ТдТдС-З 91.1 97.3
ЗЕО ГО ΝΟ: 74 5** ^ТзОдЗ'зОзСзУдЗ'дадСд^дТдТ-З пЛ. пЛ.
ЗЕО ГО N0: 75 5'-Тз68ддддСзУддва‘дС8Т^Т-3' пЛ. пЛ.
ЗЕО Ю N0: 76 5 'СдАд6ддд с8а'8д5ада‘ддда*3Сда‘3Т'8С^Т-3 85.9 94.3
ЗЕО ГО N0: 77 5 -С8С^С^а8а3д'3д8с8а8с8^ддС5А^6дА-3 93.0 98,5
ЗЕО ГО ΝΟ: 78 5,-С-3СдА^а8д8ддс8адС81-дддС5^6-3' ПЛ. ПЛ.
ЗЕО ГО ΝΟ: 79 5'-СзА^а8д3д3с5аесд^ддСзА-3’ пЛ. пЛ.
ЗЕО ГО N0: 80 5 - Од Сд Тд д8 а8 с8 а818 (5 с8 а81д а8 6д СдС-3’ ПЛ. пЛ.
Как показано в табл. 3, в этих экспериментах олигонуклеотиды 8Ερ Ιϋ №№ 48, 51, 54, 58, 63, 69, 73
- 28 020026 и 77 при 16 нМ показали более чем 90% ингибирование экспрессии мРНК андрогенного рецептора в клетках А549 и МСЕ7 и, следовательно, являются предпочтительными. Также предпочтительны олигонуклеотиды, основанные на показанных антисмысловых олигонуклеотидных последовательностях, например отличающиеся длиной (длиннее или короче) и/или составом нуклеиновых оснований (например, типом и/или долей звеньев аналогов), которые также обеспечивают хорошее ингибирование экспрессии андрогенного рецептора.
Пример 9. Анализ ίη νίνο: ингибирование экспрессии мРНК андрогенного рецептора печени мыши соединениями антисмысловых олигонуклеотидов.
Голые мыши внутривенно получали дозы олигонуклеотидов с.|3б/4 из расчета 100 мг/кг (размер группы - 5 мышей). Антисмысловые олигонуклеотиды (8ΕΟ ΙΌ № 48, 8ΕΟ ΙΌ № 51, 8ΕΟ ΙΌ № 58, 8ΕΟ ΙΌ № 63, 8ΕΟ ΙΌ № 77) растворяли в 0,9% фосфатно-солевом буфере. Животных забивали через 24 ч после введения последней дозы, брали образцы ткани печени и хранили до выделения РНК и КПЦР анализа. Выделяли общую РНК и экспрессию мРНК АР в образцах печени измеряли с помощью КПЦР, как описано в примере 7, с использованием КПЦР теста на АР мыши (Αρρίίβά В1О8у81ет8, номер по каталогу Мт01238475_т1). Результаты нормализовали по 6ΑΡΌΗ мыши (АррКеб В1О8уз1ет8, номер по каталогу 4352339Е) и проводили количественный анализ нокдауна по отношению к контролям, обработанным физиологическим раствором. Данные в табл. 4 представлены в виде процентной доли понижающей регуляции относительно животных, обработанных физиологическим раствором.
Таблица 4
Нокдаун экспрессии мРНК АР ίη νίνο
Соединение Печень (% нокдауна)
Физиологический раствор 0
5Е<2 Ю № 51 100 мкг/мл 65,0+12,6
ЗЕС Ιϋ Ν· 58 100 мкг/мл 95,2±1,0
£Е<2 Ю № 77 100 мкг/мл 91,9 + 3,9
Как показано в табл. 4, в этих экспериментах олигонуклеотиды 8ΕΟ ΙΌ №№ 58 и 77 при концентрации 100 мг/кг показали более чем 90% ингибирование экспрессии мРНК андрогенного рецептора в клетках печени мыши и, следовательно, являются предпочтительными.
Пример 10. Анализ ίη νίίτο: ингибирование мРНК андрогенного рецептора человека антисмысловыми олигонуклеотидами.
Измерение пролиферирующих жизнеспособных клеток (тест МТ8).
Рак предстательной железы ΕΝΟαΡ и клетки рака легких А549 высевали при плотности 150000 клеток на лунку в 6-луночные планшеты за день до трансфекции. Клети А549 культивировали в ΌΜΕΜ (81дта) + 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЕВ8) + 2 мМ С1и1атах Ι + гентамицин (25 мкг/мл), тогда как клетки ΕΝΟαΡ культивировали в среде ΚΡΜΙ 1640 (81дта) + 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ГВ8) + 2 мМ С1и1атах Ι + гентамицин (25 мкг/мл). На следующий день среду удаляли, а затем добавляли 1,2 мл ΟρίίΜΕΜ, содержащей 5 мкг/мл ΕίροίεοίΑΜΙΝΕ 2000 (ΙηνίίΓο^η). Клетки инкубировали в течение 7 мин перед добавлением 0,3 мл олигонуклеотидов, разведенных в ΟρίίΜΕΜ. Конечные концентрации олигонуклеотидов составляли 4 и 16 нМ. После обработки в течение 4 ч среду удаляли и клетки трипсинизировали и высевали при плотности 5000 клеток на лунку в прозрачный 96-луночный планшет (8^ηίίίίο Оганде, № 1472030100) в 100 мкл среды. Жизнеспособные клетки измеряли в моменты времени, обозначенные добавлением 10 мкл соединения тетразола [3-(4,5-диметил-2-ил)-5-(3карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2Н-тетразол, внутренняя соль; ΜΤ8] и электроносвязывающего реактива (феназин этосульфат; РЕ8) (Се11Тйег 96® ΑΟικοι.^ Ове 8ο1υίίοη Се11 Ρτο1ίίοπιΙίοη Аззау, Ргошеда). Жизнеспособные клетки измеряли при 490 нм в Ρο\\ΌΓ\ν;·ι\Ό (Вю1ек ΙιΜτιιπκηΝ). Строили график зависимости оптической плотности при 490 нм от времени (ч) (см. фиг. 13 и 14). Как показано на фиг. 13 и 14, олигонуклеотиды 8ЕО ΙΌ №№ 58 и 77 ингибировали рост как рака предстательной железы ЕЫСаР, так и клетки рака легких А549, и, следовательно, являются предпочтительными.
Пример 11. Анализ ίη νίίτο: активность каспазы 3/7 при ингибировании мРНК андрогенного рецептора человека антисмысловыми олигонуклеотидами.
Рак предстательной железы ΕΝΟηΡ и клетки рака легких А549 высевали при плотности 150000 клеток на лунку в 6-луночный планшет за день до трансфекции. Клетки А549 культивировали в ΌΜΕΜ (81дта) + 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЕВ8) + 2 мМ 61иίатаx Ι + гентамицин (25 мкг/мл), тогда как клетки ΕΝΟηΡ культивировали в среде ΚΡΜΙ 1640 (81дта) + 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ГВ8) + 2 мМ С1и1атах Ι + гентамицин (25 мкг/мл). На следующий день среду удаляли, а затем добавляли 1,2 мл ΟρίίΜΕΜ, содержащей 5 мкг/мл ΕίροίεοίΑΜΙΝΕ 2000 (Iην^ί^οдеη). Клетки инкубировали в течение 7 мин перед добавлением 0,3 мл олигонуклеотидов, разведенных в ΟρίίΜΕΜ. Конечные концентрации олигонуклеотидов составляли 4 и 16 нМ. После обработки в течение 4 ч среду удаляли, клетки трипсинизировали и высевали при плотности 5000 клеток на лунку в белый 96-луночный планшет (Νιιηο) в 100 мкл среды. Активность каспазы 3/7 измеряли в моменты времени, отмеченные добавлением 100 мкл Сазρазе-61ο 3/7 аззау (Рготеда). Активность каспазы 3/7 измеряли с использованием люмено
- 29 020026 метра. Активности каспазы 3/7 измеряли в три различных момента времени - 14, 48 и 72 ч (см. фиг. 15 и 16). Как показано на фиг. 15 и 16, олигонуклеотиды 8ЕО ΙΌ №№ 58 и 77 индуцировали активность каспазы 3/7 как в клетках рака предстательной железы ΕΝΟαΡ, так и в клетках рака легких А549, и, следовательно, являются предпочтительными.
Пример 12. Анализ ίη νίίτο: ингибирование экспрессии мРНК андрогенного рецептора человека соединениями антисмысловых олигонуклеотидов в клетках рака предстательной железы ЬМОаР и в клеточной линии рака легких А549.
Оценивали способность олигонуклеотидов к нокдауну мРНК андрогенного рецептора при концентрациях, равных 0,5, 1, 2, 4, 8 и 16 нМ (см. фиг. 11). Клетки рака предстательной железы ЬМОаР и клетки рака легких А549 высевали при плотности 150000 клеток на лунку в 6-луночный планшет за день до трансфекции. Клетки А549 культивировали в ΌΜΕΜ (81дта) + 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ΕΒ8) + 2 мМ С1и1атах I + гентамицин (25 мкг/мл), тогда как клетки ΕΝΟαΡ культивировали в среде ΚΡΜΙ 1640 (81дта) + 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ΕΒ8) + 2 мМ 61и1атах I + гентамицин (25 мкг/мл). На следующий день среду удаляли, а затем добавляли 1,2 мл ОрЕМЕМ, содержащей 5 мкг/мл □ρο^οίΑΜΙΝΕ 2000 (ЗптПгодеп). Клетки инкубировали в течение 7 мин перед добавлением 0,3 мл олигонуклеотидов, разведенных в ОрЕМЕМ. Конечные концентрации олигонуклеотидов составляли 0,5, 1, 2, 4, 8 и 16 нМ. Клетки промывали и добавляли среду, содержащую сыворотку. После обработки олигонуклеотидами клеткам давали возможность восстановиться в течение 20 ч перед тем, как их собирали для анализа РНК. Процедуры выделения РНК, синтеза кДНК и КПЦР описаны в примерах 5, 6 и 7. Как показано на фиг. 11 и 12, олигонуклеотиды 8ЕО ΙΌ №№ 58 и 77 обладали способностью к нокдауну экспрессии мРНК АР как в клеточной линии рака легких А549, так и в зависящей от андрогенного рецептора клеточной линии рака предстательной железы 22КУ1.
Пример 13. Действие антисмыслового олигонуклеотида на ΡδΑ (фиг. 17).
В исследовании использовали самцов бестимусных мышей пи/пи в возрасте от шести до семи недель (Наг1ап Зргадие Эа\\!еу) со средним весом 27,3±2,4 г. Десять миллионов клеток 22КУ1 (не зависящая от андрогенов линия клеток рака предстательной железы) суспендировали в ΡΒδ (С1Ьсо#14190) и Ма1пде1 (ΒΌ#356234) в соотношении 1:1 и инъецировали подкожно каждой мыши. Когда опухоли достигали среднего объема 150-200 мм3, мышей делили на девять экспериментальных групп. 200 мкл олигонуклеотидов инъецировали внутривенно, когда средний размер опухоли достигал 152,66±27,97 мм3. Олигонуклеотиды давали каждые 3 дня, в целом всего 5 раз. Контроль с носителем давали по такой же схеме, что и олигонуклеотиды. На 16 день мышей забивали, собирали кровь в пробирки с ЭДТА и центрифугировали в течение 5 мин. Затем по 50 мкл супернатантов подвергали тесту на ΡδΑ с использованием набора для ΕΟδΑ из ΑΕΡ0Ό П1адпокЕс5 в 8а1ет (Ρ8ΑΗυ-Ε01).
Действие антисмыслового олигонуклеотида на рост опухоли (фиг. 18): в этом исследовании использовали самцов бестимусных мышей пи/пи в возрасте от шести до семи недель (Наг1ап Зргадие Эа\\'1еу) со средним весом 27,3±2,4 г. Десять миллионов клеток 22КУ1 (не зависящая от андрогенов линия клеток рака предстательной железы) суспендировали в ΡΒδ (61Ьсо#14190) и Ма1пде1 (ΒΌ#356234) в соотношении 1:1 и инъецировали подкожно каждой мыши. Когда опухоли достигали среднего размера 150-200 мм3, мышей делили на девять экспериментальных групп. 200 мкл олигонуклеотидов инъецировали внутривенно, когда средний размер опухоли достигал 152,66±27,97 мм3. Олигонуклеотиды давали каждые 3 дня, в целом всего 5 раз. Контроль с носителем давали по такой же схеме, что и олигонуклеотиды. Объемы опухолей у каждой мыши определяли при помощи измерения линейных размеров штангенциркулем и вычисляли по формуле: объем опухоли = (длинах ширина2)/2).
Пример 14. Получение конъюгатов олигомеров с использованием полиэтиленгликоля.
Олигомеры, обладающие последовательностями, приведенными в 8ЕО ΙΌ № 48 или 63, функционализировали по 5'-концу посредством присоединения аминоалкильной группы, например гексан-1-амина, блокированного блокирующей группой, такой как Етос к 5'-фосфатным группам олигомеров с использованием обычной фосфорамидитной реакции, окисления полученных соединений, снятия защитной группы с них и очистки их для получения функционализированных олигомеров, соответственно обладающих формулами (ΙΑ) и (ΙΒ) и
*.О^—Р---О----В,ц*С.Т^«и11д1а3*|д1а|1д1А|^|Т’1'О1Т—ОН Η1Ν (1А)
Л—5——он (1В>
где заглавные буквы в жирном начертании обозначают мономеры аналогов нуклеозидов, строчные буквы обозначают мономеры ДНК, нижний индекс к обозначает фосфоротиоатную связь и МеС обозначает 5-метилцитозин.
- 30 020026
Раствор активированного РЕО, например, показанного формулой (II)
где фрагмент РЕО обладает средней молекулярной массой 12000, каждое из соединений формул (ΙΑ) и (ΙΒ) в буфере ΡΒ8 встряхивали в отдельном сосуде при комнатной температуре в течение 12 ч. Реакционные растворы экстрагировали три раза метиленхлорицом и объединенных органические слои сушили над сульфатом магния и фильтровали, а растворитель испаряли при пониженном давлении. Полученный остаток растворяли в дважды дистиллированной воде и загружали на анионообменную колонку. Непрореагировавший РЕО-линкер элюировали водой, а продукты элюировали раствором ΝΗ·|ΗίΌ3. Фракции, содержащие чистые продукты, объединяли и липофилизировали, чтобы получить конъюгаты 8ЕЦ ΙΌ №№ 48 и 63, соответственно показанные формулами (ΙΙΙΑ) и (ΙΙΙΒ)
где каждый из олигомеров 8ЕЦ ΙΌ №№ 48 и 63 присоединен к полимеру РЕО, обладающему средней молекулярной массой 12000, через высвобождаемый линкер.
Химические структуры конъюгатов с полимером РЕО, которые можно получить из олигомеров, обладающих последовательностями, приведенными в 8ЕЦ ΙΌ №№ 51, 58 и 77, с использованием вышеописанных процессов, соответственно показаны формулами (ΙΥΆ), (ΙΥΒ) и (1УС)
где заглавные буквы в жирном начертании обозначают мономеры бета-Э-окси-ΕΝΑ, строчные буквы обозначают мономеры ДНК, нижний индекс δ обозначает фосфоротиоатную связь и МеС обозначает 5-метилцитозин.
Активированные олигомеры, которые можно использовать в этом процессе, соответственно для получения конъюгатов, показанных формулами (ΙνΑ), (ΙνΒ) и (ГУС), обладают химическими структурами, которые показаны формулами (ΎΑ), (УБ) и (УС)

Claims (17)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Олигомер, имеющий непрерывную нуклеотидную последовательность общей длиной 10-30 нуклеотидов, где указанная непрерывная нуклеотидная последовательность по меньшей мере на 80% гомологична обратной комплементарной последовательности соответствующей области гена андрогенного рецептора млекопитающего или мРНК, где указанный олигомер содержит по меньшей мере одно звено ΕΝΆ и где непрерывная нуклеотидная последовательность содержит по меньшей мере 10 последовательных нуклеотидов, которые на 100% идентичны соответствующей области 8ЕО ГО NО: 94 или 8ЕО ГО ΝΘ: 58.
  2. 2. Олигомер по п.1, где непрерывная нуклеотидная последовательность содержит 8ЕО ГО NО: 94 или 8ЕО ГО ΝΘ: 58.
  3. 3. Олигомер по п.1 или 2, где непрерывная нуклеотидная последовательность содержит другие нуклеотидные аналоги.
  4. 4. Олигомер по п.3, где нуклеотидные аналоги представляют собой нуклеотиды с модифицированными сахарами.
  5. 5. Олигомер по п.3, где нуклеотидные аналоги представляют собой ΕΝΆ.
  6. 6. Олигомер по любому из пп.1-5, который состоит из 5 '(зв<2 и> ио 58), где заглавные буквы обозначают мономеры бета-И-оксиΕΝΆ и строчные буквы обозначают мономеры ДНК, нижний индекс δ обозначает фосфоротиоатную связь и МеС обозначает мономер бета-И-окси-ΕΝΆ, содержащий основание 5-метилцитозин.
  7. 7. Конъюгат, содержащий олигомер по любому из пп.1-6 и по меньшей мере один ненуклеотидный или неполинуклеотидный фрагмент, ковалентно связанный с указанным олигомером.
  8. 8. Конъюгат по п.7, где указанный ненуклеотидный или неполинуклеотидный фрагмент представляет собой белок, цепь жирной кислоты, остаток сахара, гликопротеин, полимер или их сочетания.
  9. 9. Конъюгат по п.7, где указанный ненуклеотидный или неполинуклеотидный фрагмент представляет собой стерин, холестерин, антитело, полиэтиленгликоль, лиганд, молекулу липида, холевую кислоту, тиоэфир, гексил-8-тритилтиол, тиохолестерин, алифатическую цепь, додекандиоловый остаток, ундециловые остатки, фосфолипид, дигексадецил-рац-глицерин, триэтиламмоний 1,2-ди-о-гексадецил-рацглицеро-3-Б-фосфонат, полиаминную гликолевую цепь, полиэтиленгликолевую цепь, адамантануксусную кислоту, пальмитиловую молекулу, октадециламиновую, гексиламинокарбонилоксихолестериновую молекулу, активное лекарственное вещество, ибупрофен, сульфамидное лекарственное средство, противодиабетическое средство, антибактериальное средство, антибиотик, положительно заряженный полимер, положительно заряженный пептид или полиалкиленоксид.
  10. 10. Конъюгат по п.7, где указанный ненуклеотидный или неполинуклеотидный фрагмент представляет собой стерин.
  11. 11. Фармацевтическая композиция, содержащая олигомер по любому из пп.1-6 и фармацевтически приемлемые разбавитель, носитель, соль или адъювант, где указанная фармацевтическая композиция представляет собой антагонист андрогенного рецептора.
  12. 12. Применение олигомера по любому из пп.1-6 в качестве лекарственного средства.
  13. 13. Применение по п.12, где указанное лекарственное средство предназначено для лечения заболевания или медицинского расстройства.
  14. 14. Применение олигомера по любому из пп.1-6 для производства лекарственного средства для лечения заболевания или медицинского расстройства.
  15. 15. Способ ίη νίΐΓΟ ингибирования андрогенного рецептора в клетке, которая экспрессирует андрогенный рецептор, включающий введение олигомера по любому из пп.1-6 в указанную клетку для того, чтобы ингибировать андрогенный рецептор в указанной клетке.
  16. 16. Фармацевтическая композиция, содержащая конъюгат по любому из пп.7-10 и фармацевтически приемлемые разбавитель, носитель, соль или адъювант, где указанная фармацевтическая композиция представляет собой антагонист андрогенного рецептора.
  17. 17. Применение конъюгата по любому из пп.7-10 для производства лекарственного средства для лечения заболевания или медицинского расстройства.
EA201070660A 2007-11-26 2008-11-26 Lna-антагонисты андрогенного рецептора EA020026B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US99012507P 2007-11-26 2007-11-26
PCT/DK2008/000417 WO2009068033A2 (en) 2007-11-26 2008-11-26 Lna antagonists targeting the androgen receptor

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201070660A1 EA201070660A1 (ru) 2010-12-30
EA020026B1 true EA020026B1 (ru) 2014-08-29

Family

ID=40379703

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201070660A EA020026B1 (ru) 2007-11-26 2008-11-26 Lna-антагонисты андрогенного рецептора

Country Status (17)

Country Link
US (3) US7737125B2 (ru)
EP (1) EP2225377B1 (ru)
JP (2) JP5872162B2 (ru)
KR (1) KR20100110298A (ru)
CN (1) CN101932709B (ru)
AU (1) AU2008329327B2 (ru)
BR (1) BRPI0820508A2 (ru)
CA (1) CA2705714A1 (ru)
DK (1) DK2225377T3 (ru)
EA (1) EA020026B1 (ru)
ES (1) ES2456990T3 (ru)
IL (2) IL205944A (ru)
MX (1) MX2010005703A (ru)
NZ (1) NZ585327A (ru)
TW (1) TW200930382A (ru)
UA (1) UA100253C2 (ru)
WO (1) WO2009068033A2 (ru)

Families Citing this family (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1572902B1 (en) 2002-02-01 2014-06-11 Life Technologies Corporation HIGH POTENCY siRNAS FOR REDUCING THE EXPRESSION OF TARGET GENES
US20040014956A1 (en) 2002-02-01 2004-01-22 Sequitur, Inc. Double-stranded oligonucleotides
US20060009409A1 (en) 2002-02-01 2006-01-12 Woolf Tod M Double-stranded oligonucleotides
WO2009039173A2 (en) * 2007-09-19 2009-03-26 Applied Biosystems Inc. SiRNA SEQUENCE-INDEPENDENT MODIFICATION FORMATS FOR REDUCING OFF-TARGET PHENOTYPIC EFFECTS IN RNAi, AND STABILIZED FORMS THEREOF
US8450290B2 (en) * 2007-11-26 2013-05-28 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating androgen receptor dependent disorders including cancers
ES2743600T3 (es) 2010-03-12 2020-02-20 Brigham & Womens Hospital Inc Métodos de tratamiento de los trastornos inflamatorios vasculares
EP2606130B1 (en) * 2010-08-16 2019-03-13 Duke University Camkk-beta as a marker in prostate cancer
CN103517990A (zh) 2010-10-07 2014-01-15 通用医疗公司 癌症生物标志物
EP3702460A1 (en) 2010-11-12 2020-09-02 The General Hospital Corporation Polycomb-associated non-coding rnas
WO2012065051A1 (en) * 2010-11-12 2012-05-18 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating androgen receptor dependent disorders including cancers
EP2663323B1 (en) 2011-01-14 2017-08-16 The General Hospital Corporation Methods targeting mir-128 for regulating cholesterol/lipid metabolism
DK2717883T3 (en) 2011-05-02 2017-04-24 Stichting Vumc PROTECTION AGAINST ENDOTELIAL BARRIER DYSFUNCTION BY INHIBITION OF THE TYROSINKINASE ABL RELATED GENES (ARG)
JP6234370B2 (ja) 2011-10-11 2017-11-22 ザ ブリガム アンド ウィメンズ ホスピタル インコーポレイテッドＴｈｅ Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， Ｉｎｃ． 神経変性障害におけるマイクロｒｎａ
WO2013184209A1 (en) 2012-06-04 2013-12-12 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. Mif for use in methods of treating subjects with a neurodegenerative disorder
EA029563B1 (ru) * 2012-07-27 2018-04-30 Арагон Фармасьютикалз, Инк. Способы и композиции для определения резистентности к терапии, направленной на андрогенный рецептор
US9725721B2 (en) 2012-09-26 2017-08-08 Mirrx Therapeutics Oligomers with improved off-target profile
WO2014059364A1 (en) * 2012-10-11 2014-04-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating kennedy's disease
US9175291B2 (en) * 2012-10-11 2015-11-03 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of androgen receptor expression
EP2920304B1 (en) 2012-11-15 2019-03-06 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotide conjugates
EP2951305B1 (en) * 2013-01-30 2018-08-15 F.Hoffmann-La Roche Ag Lna oligonucleotide carbohydrate conjugates
EP2774997A1 (en) * 2013-03-05 2014-09-10 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Detection of Androgen Receptor (AR) mutations in circulating tumor DNA from plasma samples of castration-resistant prostate cancer patients using locked nucleic acid-clamp PCR
WO2014171826A1 (en) 2013-04-17 2014-10-23 Stichting Vu-Vumc Treatment of cognitive impairment in depressive disorders
AU2014259954B2 (en) 2013-05-01 2019-11-07 Regulus Therapeutics Inc. MicroRNA compounds and methods for modulating miR-122
CN105164261B (zh) 2013-05-01 2022-03-18 莱古路斯治疗法股份有限公司 用于增强的细胞摄取的化合物和方法
MX2016002044A (es) * 2013-08-16 2016-08-17 Rana Therapeutics Inc Composiciones y metodos para modular el acido ribonucleico.
EP3760208B1 (en) 2014-06-25 2024-05-29 The General Hospital Corporation Targeting human satellite ii (hsatii)
EP4043567B1 (en) 2014-08-29 2024-05-08 The Children's Medical Center Corporation Methods and compositions for the treatment of cancer
WO2016114655A1 (en) 2015-01-12 2016-07-21 Ry Pharma B.V. Treating neuromuscular or neurologic disease through reducing gabaergic and/or glycinergic inhibitory neurotransmitter overstimulation
EP3256591A4 (en) 2015-02-13 2018-08-08 Translate Bio Ma, Inc. Hybrid oligonucleotides and uses thereof
WO2016164463A1 (en) 2015-04-07 2016-10-13 The General Hospital Corporation Methods for reactivating genes on the inactive x chromosome
AU2016282986A1 (en) 2015-06-26 2018-02-01 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Cancer therapy targeting tetraspanin 33 (tspan33) in myeloid derived suppressor cells
WO2017065602A1 (en) 2015-10-13 2017-04-20 Ry Pharma B.V. Treating neuromuscular or neurologic disease through reducing gabaergic and/or glycinergic inhibitory neurotransmitter overstimulation
WO2017066712A2 (en) 2015-10-16 2017-04-20 The Children's Medical Center Corporation Modulators of telomere disease
WO2017066796A2 (en) 2015-10-16 2017-04-20 The Children's Medical Center Corporation Modulators of telomere disease
AU2016355178B9 (en) 2015-11-19 2019-05-30 Massachusetts Institute Of Technology Lymphocyte antigen CD5-like (CD5L)-interleukin 12B (p40) heterodimers in immunity
WO2017147087A1 (en) 2016-02-25 2017-08-31 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Treatment methods for fibrosis targeting smoc2
US11525140B2 (en) 2016-03-24 2022-12-13 Universiteit Leiden Methods for transfecting plants and for reducing random integration events
CN109477090B (zh) * 2016-04-14 2022-03-22 e-NA生物科技公司 微小rna-143衍生物
AU2017309347B2 (en) * 2016-08-08 2020-11-19 Olipass Corporation Androgen receptor antisense oligonucleotides
US11459568B2 (en) 2016-10-31 2022-10-04 University Of Massachusetts Targeting microRNA-101-3p in cancer therapy
US11643655B2 (en) * 2016-11-15 2023-05-09 City Of Hope Methods for intracellular delivery and enhanced gene targeting
WO2018111099A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Stichting Vumc Biomarkers and treatments for cerebral amyloid angiopathy (caa)
WO2018195486A1 (en) 2017-04-21 2018-10-25 The Broad Institute, Inc. Targeted delivery to beta cells
US11821003B2 (en) 2017-08-14 2023-11-21 Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute Cardiogenic mesoderm formation regulators
WO2019089216A1 (en) 2017-11-01 2019-05-09 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods of treating cancers
EP3502259A1 (en) 2017-12-19 2019-06-26 Universiteit Leiden A combinational strategy for reducing random integration events when transfecting plants
US12005120B2 (en) 2018-05-08 2024-06-11 Regulus Therapeutics Inc. Galnac conjugated modified oligonucleotides as miR-122 inhibitor having HCV antiviral activity with reduced hyperbilirubinemia side-effect
CA3110661A1 (en) 2018-08-29 2020-03-05 University Of Massachusetts Inhibition of protein kinases to treat friedreich ataxia
WO2020067887A1 (en) 2018-09-24 2020-04-02 Erasmus University Medical Center Rotterdam Specific inhibition of janus kinase 3 (jak3) for modulating anti-tumor immune responses
GB201817990D0 (en) * 2018-11-02 2018-12-19 Univ Of Essex Enterprise Limited Enzymatic nucleic acid molecules
KR102473989B1 (ko) 2018-11-28 2022-12-07 (주)바이오니아 안드로젠 수용체 특이적 서열을 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체, 및 이를 포함하는 탈모 예방 및 발모용 조성물
WO2020148400A1 (en) * 2019-01-16 2020-07-23 Stichting Katholieke Universiteit Antisense oligonucleotides for use in the treatment of crpc
WO2020171889A1 (en) 2019-02-19 2020-08-27 University Of Rochester Blocking lipid accumulation or inflammation in thyroid eye disease

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005027833A2 (en) * 2003-09-12 2005-03-31 Avi Biopharma, Inc. Compound and method for treating androgen-independent prostate cancer
US20050159376A1 (en) * 2002-02-20 2005-07-21 Slrna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition 5-alpha reductase and androgen receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4914210A (en) 1987-10-02 1990-04-03 Cetus Corporation Oligonucleotide functionalizing reagents
US4962029A (en) 1987-10-02 1990-10-09 Cetus Corporation Covalent oligonucleotide-horseradish peroxidase conjugate
US6733776B1 (en) 1992-04-02 2004-05-11 Anticancer, Inc. Method for promoting hair growth
DE69429337T3 (de) 1993-04-02 2012-08-30 Anticancer Inc. Verfahren zur verabreichung von förderlichen zusammensetzungen auf die haarfollikel
AU7366296A (en) 1995-09-20 1997-04-09 Worcester Foundation For Biomedical Research, Inc. Antisense oligonucleotide chemotherapy for benign hyperplasia or cancer of the prostate
US6489163B1 (en) 1996-05-08 2002-12-03 Board Of Regents, The University Of Texas System Ribozyme mediated inactivation of the androgen receptor
US6784291B2 (en) 2000-05-04 2004-08-31 Avi Biopharma, Inc. Splice-region antisense composition and method
HUE037352T2 (hu) * 2002-04-05 2018-08-28 Roche Innovation Ct Copenhagen As A HIF-1alfa expresszálódását módosító oligomer vegyületek
US7087229B2 (en) 2003-05-30 2006-08-08 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Releasable polymeric conjugates based on aliphatic biodegradable linkers
DK2284269T3 (en) 2002-11-18 2017-10-23 Roche Innovation Ct Copenhagen As Antisense design
CA2512337A1 (en) * 2003-01-03 2004-07-29 Gencia Corporation Sirna mediated post-transcriptional gene silencing of genes involved in alopecia
WO2004069992A2 (en) * 2003-02-10 2004-08-19 Santaris Pharma A/S Oligomeric compounds for the modulation of ras expression
JP2006518999A (ja) * 2003-02-10 2006-08-24 サンタリス・ファルマ・アクティーゼルスカブ チオレドキシン発現の改変のためのオリゴマー化合物
KR20060015505A (ko) 2003-04-13 2006-02-17 엔존 파마슈티컬즈, 인코포레이티드 올리고뉴클레오타이드 전구약물
US20050164970A1 (en) 2003-12-22 2005-07-28 University Of Kansas Medical Center Method for treating prostate cancer using siRNA duplex for androgen receptor
RU2377301C2 (ru) * 2003-12-23 2009-12-27 Сантарис Фарма А/С ОЛИГОМЕРНОЕ СОЕДИНЕНИЕ, ПОНИЖАЮЩЕЕ ЭКСПРЕССИЮ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ГЕНА Bcl-2, КОНЪЮГАТ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ ОЛИГОМЕРНОГО СОЕДИНЕНИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА
WO2007031091A2 (en) 2005-09-15 2007-03-22 Santaris Pharma A/S Rna antagonist compounds for the modulation of p21 ras expression
KR20080068019A (ko) 2005-09-15 2008-07-22 산타리스 팔마 에이/에스 아포지단백질-ｂ100 발현 억제용 ｒｎａ 길항제 화합물
WO2007041497A2 (en) * 2005-09-30 2007-04-12 Cleveland Biolabs, Inc. Modulation of androgen receptor
EP2024503A2 (en) * 2006-05-01 2009-02-18 Aarhus Universitet An animal model and a method for producing an animal model
AU2007257094B2 (en) 2006-05-05 2012-10-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating expression of SGLT2
CA2662520A1 (en) 2006-09-15 2008-03-20 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Polymeric conjugates containing positively-charged moieties
WO2008034122A2 (en) 2006-09-15 2008-03-20 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Hindered ester-based biodegradable linkers for oligonucleotide delivery
WO2008053314A2 (en) 2006-10-30 2008-05-08 Nokia Corporation Method, apparatus and system providing operator controlled mobility for user equipment
JP5168944B2 (ja) 2007-02-28 2013-03-27 三浦工業株式会社 羽根車式流量計

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050159376A1 (en) * 2002-02-20 2005-07-21 Slrna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition 5-alpha reductase and androgen receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
WO2005027833A2 (en) * 2003-09-12 2005-03-31 Avi Biopharma, Inc. Compound and method for treating androgen-independent prostate cancer

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BEANE R.L. ET AL.: "Inhibiting gene expression with locked nucleic acids (LNAs) that target chromosomal DNA", BIOCHEMISTRY 20070626 AMERICAN CHEMICAL SOCIETY US, vol. 46, no. 25, 26 June 2007 (2007-06-26), pages 7572-7580, XP002517552, page 7 *
EDER I.E. ET AL.: "Inhibition of LNCaP prostate cancer cells by means of androgen receptor antisense oligonucleotides", CANCER GENE THERAPY, NORWALK, CT, US, vol. 7, no. 7, 1 January 2000 (2000-01-01), pages 997-1007, XP002313666, ISSN: 0929-1903, the whole document *
KURRECK J. ET AL.: "Design of antisense oligonucleotides stabilized by locked nucleic acids", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, OXFORD UNIVERSITY PRESS, SURREY, GB, vol. 30, no. 9, 1 May 2002 (2002-05-01), pages 1911-1918, XP002281375, ISSN: 0305-1048, page 1913-1915 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2225377B1 (en) 2014-01-08
IL205944A0 (en) 2010-11-30
JP2016105703A (ja) 2016-06-16
IL222397A (en) 2015-10-29
KR20100110298A (ko) 2010-10-12
WO2009068033A3 (en) 2009-07-23
ES2456990T3 (es) 2014-04-24
BRPI0820508A2 (pt) 2017-05-23
AU2008329327A1 (en) 2009-06-04
EP2225377A2 (en) 2010-09-08
US7737125B2 (en) 2010-06-15
CA2705714A1 (en) 2009-06-04
DK2225377T3 (da) 2014-04-07
IL205944A (en) 2015-11-30
US20110319471A1 (en) 2011-12-29
US20100234451A1 (en) 2010-09-16
CN101932709A (zh) 2010-12-29
CN101932709B (zh) 2014-09-10
AU2008329327B2 (en) 2015-07-16
US20090181916A1 (en) 2009-07-16
JP5872162B2 (ja) 2016-03-01
MX2010005703A (es) 2010-06-11
NZ585327A (en) 2012-10-26
EA201070660A1 (ru) 2010-12-30
UA100253C2 (ru) 2012-12-10
WO2009068033A2 (en) 2009-06-04
TW200930382A (en) 2009-07-16
JP2011504362A (ja) 2011-02-10
US7989429B2 (en) 2011-08-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA020026B1 (ru) Lna-антагонисты андрогенного рецептора
EP2149605B1 (en) Short RNA antagonist compounds for the modulation of target mRNA
JP6463687B2 (ja) Ｆｇｆｒ３の発現の調節のための組成物及び方法
EP2152879B1 (en) Rna antagonist compounds for the modulation of beta-catenin
US8450290B2 (en) Methods for treating androgen receptor dependent disorders including cancers
US20100216864A1 (en) RNA Antagonist Compounds for the Modulation of PCSK9
WO2008113832A2 (en) SHORT RNA ANTAGONIST COMPOUNDS FOR THE MODULATION OF TARGET mRNA
US20120295955A1 (en) Rna antagonist compounds for the modulation of her3
EP2225376B1 (en) Rna antagonist compounds for the modulation of pik3ca expression
AU2011326034A1 (en) Compositions and methods for treating androgen receptor dependent disorders including cancers
US8440809B2 (en) RNA antagonists targeting Hsp27

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU