JP6463687B2 - Fgfr3の発現の調節のための組成物及び方法 - Google Patents
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Description
本出願は、線維芽細胞増殖因子受容体3型(FGFR3)をコードする核酸を標的化しかつハイブリダイズするオリゴヌクレオチド及び関連する医薬組成物、並びに、該オリゴヌクレオチドを使用してFGFR3の発現を調節する方法に関する。特に、特定の実施態様は、FGFR3をコードするmRNAなどの核酸とハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチド、及び、このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてFGFR3の発現を調節するための方法に関する。FGFR3の発現の低減は、軟骨無形成症などの一連の内科的疾患にとって有益である。
線維芽細胞増殖因子受容体(FGFR)は、線維芽細胞増殖因子に対する高親和性の受容体である。これらの因子は、細胞増殖、分化、及び他の生物学的プロセスにおいて多様な役割を有し、その正確な機能は、標的細胞及び発達段階に依存する。FGFR遺伝子の突然変異は、多種多様な疾患を引き起こすことが判明した。例えば、FGFR1及びFGFR2の突然変異は頭蓋縫合早期癒合症において起こり、FGFR3の突然変異は骨格形成異常、例えば軟骨無形成症、軟骨低形成症、及び致死性骨異形成症(I型及びII型)に関与している。
本出願は、FGFR3の異常発現に関連した疾病(例えば、形成異常、例えば軟骨無形成症)の処置に有用な、新規なオリゴヌクレオチド、特にロックド核酸(LNA)アンチセンスオリゴヌクレオチド、及び治療的介入を提供する。本明細書において開示された本発明は、FGFR3を異常発現している細胞又は組織を、本発明のオリゴヌクレオチドと接触させることは、FGFR3(特に、FGFR3の突然変異した又は天然の変異体)の発現を調節するという発見に関する。特定の実施態様において、FGFR3の発現の調節は、例えば、正常な軟骨細胞の機能を回復する。本発明のオリゴヌクレオチド及びこのようなオリゴヌクレオチドを使用してFGFR3の異常発現を調節する方法は、例えば軟骨無形成症などのFGFR3の異常発現に関連した生存率及び罹患率を改善する、又はさらには治癒する手段を提供する。
本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、FGFR3の発現を調節することのできる特異的な治療ツールを提供する。いくつかの実施態様において、本明細書に記載の短い(例えば、通常、およそ50、40、30、20、18、17、16、15、14、13、12、10、8またはそれ以下のヌクレオチド長)一本鎖の合成オリゴヌクレオチドは、FGFR3RNA標的配列(例えばプレmRNA又はmRNA)に対して相補的である塩基配列を有し、水素結合による塩基対形成によってハイブリッド二本鎖を形成する。例えば、いくつかの実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、FGFR3をコードする核酸(例えばFGFR3をコードするmRNA)又はそのフラグメント(例えば配列番号5又は6)に標的化し得るか又はそれに対して相補的であり得、これにより、FGFR3の発現を調節し得る。他の実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、一般的に、切断作用機序、又は、プレmRNAのプロセシング若しくはmRNAの翻訳に関与する酵素を立体的に遮断することによって作用し得る。このハイブリダイゼーションは、発現(すなわち、標的mRNAコードを、そのタンパク質産物へと翻訳)を妨げると予想され得、従って、その後のタンパク質産物の作用を妨げる。従って、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド及び方法を使用して、FGFR3の異常発現に関連した1つ以上の容態(例えば疾病又は症候群)、例えば癌、例えば膀胱癌、骨格形成異常、例えば軟骨無形成症、軟骨低形成症、及び致死性骨異形成症(I型及びII型)を寛解又は処置することができる。
いくつかの実施態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、異常に発現したFGFR3をコードする核酸(例えば、配列番号4に提供されるようなFGFR3をコードするmRNA並びに/又は配列番号5及び配列番号6に提供されるようなそのフラグメント)及びこのような核酸の天然の変異体に標的化し、これにより、FGFR3の発現を調節する。本明細書において使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、2つ以上のヌクレオチドの共有結合によって形成される分子を指す。オリゴヌクレオチドという用語は、一般的に、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオチド模倣体、及びこれらのキメラ組合せを含む。本発明の脈絡において、単一のヌクレオチド単位はまた、モノマー又は単位とも称され得る。いくつかの実施態様において、「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」、「単位」及び「モノマー」という用語は互換的に使用される。ヌクレオチド又はモノマーの配列を言及する場合、言及されるのは塩基配列、例えばA、T(又はU)、G又はCであると認識される。
特定の実施態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、FGFR3の発現を調節することができるか、又はいくつかの実施態様においてダウンレギュレート(例えば低減又は消失)させることができる(例えば、mRNAレベルで異常発現したFGFR3をダウンレギュレート)。これに関して、本発明のオリゴヌクレオチドは、典型的には哺乳動物細胞、例えばヒト細胞(例えばA549細胞、HeLa細胞、膀胱細胞又は軟骨細胞)において、FGFR3の阻害を及ぼすことができる。いくつかの実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、標的核酸(例えば突然変異した又は異常発現したFGFR3mRNA)にハイブリダイズし、正常な発現レベル(例えば、該オリゴヌクレオチド又はコンジュゲートの非存在下における発現レベルなど)と比較して少なくとも10%又は20%の発現の阻害又は低減を及ぼす。例えば、本明細書において開示されたオリゴヌクレオチドは、FGFR3突然変異対立遺伝子を有する個体に見られるFGFR3の正常な発現レベルと比較して、FGFR3の発現の少なくとも約30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97.5%、98%、99%又は100%の低減又は阻害を及ぼし得る。いくつかの実施態様において、このような調節は、約0.04nM〜25nMの濃度(例えば約0.8nM〜20nMの濃度)の本発明の化合物に標的細胞又は組織を曝すと明白である。同じ又は異なる実施態様において、標的核酸(例えば突然変異したFGFR3をコードするmRNA)の発現阻害は、100%未満である(例えば、約98%未満の阻害、約95%未満の阻害、約90%未満の阻害、約80%未満の阻害、又は約70%未満の阻害)。いくつかの実施態様において、本明細書において開示されたオリゴヌクレオチドは、mRNAレベルでFGFR3の発現を(例えば、突然変異した又は異常発現したFGFR3をコードするmRNAに標的化及びハイブリダイズすることによって)調節することができる。発現の調節(例えばmRNAレベルでの)は、タンパク質のレベル又は濃度を測定することによって(例えば、SDS−PAGE、続いて標的タンパク質に対して生じた適切な抗体を使用してのウェスタンブロットによって)決定され得る。あるいは、発現の調節(例えばmRNAレベルでの)は、mRNAのレベル又は濃度を測定することによって(例えば、ノザンブロット又は定量RT−PCRによって)決定され得る。mRNAのレベル又は濃度の評価を介して発現を測定する場合、適切な用量又は濃度のオリゴヌクレオチド(例えば、約0.04nM〜25nM、又は約0.8nM〜20nM)を使用した場合のダウンレギュレーションの程度は、本発明のオリゴヌクレオチド、コンジュゲート又は組成物の非存在下で観察された正常なレベル又は濃度と比較して、約10%超、約10〜20%、約20%超、約25%超、又は約30%超であり得る。
いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、配列番号1若しくは配列番号4のヌクレオチド配列、又は配列番号1若しくは配列番号4のフラグメントの逆相補体に相当する、連続ヌクレオチド配列を含む又はからなる。従って、該オリゴヌクレオチドは、配列番号9、10、11、12、13又は14からなる群より選択された配列を含む又はからなり得、該オリゴヌクレオチド(又はその連続ヌクレオチド部分)は、場合により、選択された標的配列に対して1つ、2つ又は3つのミスマッチを有し得る。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、G380R突然変異を含むFGFR3配列領域をコードするヌクレオチド配列、及びこのような突然変異の周囲のヌクレオチドの逆相補体に相当する、連続ヌクレオチド配列を含む又はからなり得る。例えば、いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、表1において同定された配列を含み得る(すなわち、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13又は配列番号14)。該オリゴヌクレオチドは、G380R突然変異を含むFGFR3をコードする核酸(例えばmRNA)の領域(例えば、G380R突然変異から約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20又はそれ以上のヌクレオチドだけ上流及び/又は下流にある領域)、例えば表1において同定された標的配列に対して相補的であり得る。例えば、いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、表1において同定されたmRNA標的配列(例えば、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、又は配列番号20)に対して相補的であり得る。いくつかの実施態様において、このような相補的オリゴヌクレオチドは、FGFR3の遺伝子産物(すなわちFGFR3mRNA)に、特に、G380R突然変異をコードするFGFR3の遺伝子産物にハイブリダイズすることができる。
該オリゴヌクレオチドは、全部で5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29又は30連続ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む又はからなり得る。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、全部で約8〜25、例えば約10〜22、例えば約12〜18、例えば約13〜17、又は12〜16、例えば約13、14、15、16連続ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む又はからなる。いくつかの実施態様において、該オリゴヌクレオチドは、全部で8、9、10、11、12、13、又は14連続ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む又はからなる。いくつかの実施態様において、本発明によるオリゴヌクレオチドは、22個以下のヌクレオチド、例えば20個以下のヌクレオチド、例えば18個以下のヌクレオチド、例えば15、16、又は17個のヌクレオチドからなる。いくつかの実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、20個未満のヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列長についての範囲が示される場合、それは、例えば10〜30(又はその間)(10及び30の両方を含む)の範囲で与えられる上限及び下限の長さを含むことが理解されるべきである。
ヌクレオチド類似体
本明細書において使用される「ヌクレオチド」という用語は、糖部分、塩基部分、及び共有結合で連結された基(例えばリン酸基又はホスホロチオエートヌクレオチド間連結基)を含むグリコシドを指し、DNA又はRNAなどの天然のヌクレオチド、並びに、修飾された糖及び/又は塩基部分を含む非天然ヌクレオチド(これはまた本明細書において「ヌクレオチド類似体」とも称される)の両方を網羅する。本明細書において、単一のヌクレオチド(単位)はまた、モノマー又は核酸単位とも称され得る。
「LNA」という用語は、C2*−C4*ビラジカル(橋)を含み、「ロックド核酸」又は「BNA」(二環式核酸(Bicyclic Nucleic Acid)又は「架橋核酸(Bridged Nucleic Acid)」)としても知られる、二環式ヌクレオシド類似体を指す。それはLNAモノマーを指し得るか、又は「LNAオリゴヌクレオチド」の脈絡で使用される場合には、LNAは、1つ以上のこのような二環式ヌクレオチド類似体を含有するオリゴヌクレオチドを指す。いくつかの態様において、二環式ヌクレオシド類似体はLNAヌクレオチドであり、それ故、これらの用語は互換的に使用され得、このような実施態様において、どちらも、リボース糖環のC2’とC4’との間のリンカー基(例えば橋)の存在によって特徴付けられる。
(式中、Yは、−O−、−CH2O−、−S−、−NH−、N(Re)及び/又は−CH2−からなる群より選択され;Z及びZ*は、独立して、ヌクレオチド間連結、RH、末端基、又は保護基から選択され;Bは、天然又は非天然ヌクレオチド塩基部分(核酸塩基)を構成し、RHは、水素及びC1−4−アルキルから選択され;Ra、Rb、Rc、Rd及びReは、場合により独立して、水素、場合により置換されているC1−12−アルキル、場合により置換されているC2−12−アルケニル、場合により置換されているC2−12−アルキニル、ヒドロキシ、C1−12−アルコキシ、C2−12−アルコキシアルキル、C2−12−アルケニルオキシ、カルボキシ、C1−12−アルコキシカルボニル、C1−12−アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ−カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ−カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ及びジ(C1−6−アルキル)アミノ、カルバモイル、モノ及びジ(C1−6−アルキル)−アミノ−カルボニル、アミノ−C1−6−アルキルアミノカルボニル、モノ及びジ(C1−6−アルキル)アミノ−C1−6−アルキル−アミノカルボニル、C1−6−アルキルカルボニルアミノ、カルバミド、C1−6−アルカノイルオキシ、スルホノ、C1−6−アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1−6−アルキルチオ、ハロゲン、DNAインターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、レポーター基、及びリガンドからなる群より選択され、アリール及びヘテロアリールは、場合により置換されていてもよく、2つのジェミナルな置換基Ra及びRbは一緒に、場合により置換されているメチレン(=CH2)を示し得;RHは、水素及びC1−4−アルキルから選択される)
で示される構造を有する。いくつかの実施態様において、Ra、Rb、Rc、Rd及びReは、場合により独立して、水素及びC1−6−アルキル、例えばメチルからなる群より選択される。全ての不斉中心について、非対称の基はR又はSのいずれかの配向で見られ得、例えば、2つの例示的な立体化学的異性体はβ−D及びα−Lアイソフォームを含み、これは、以下のように示され得る;
(式中、
Bxはヘテロ環塩基部分であり;
−Qa−Qb−Qc−は−CH2−N(Rc)−CH2−、−C(=O)−N(Rc)−CH2−、−CH2−O−N(Rc)−、−CH2−N(Rc)−O−、又は−N(Rc)−O−CH2であり;
Rcは、C1−C12アルキル又はアミノ保護基であり;
Ta及びTbは、各々独立して、H、ヒドロキシル保護基、コンジュゲート基、反応性リン基、リン部分、又は支持媒体への共有結合的付着である)
を有する。
(式中、
Bxはヘテロ環塩基部分であり;
Ta及びTbは、各々独立して、H、ヒドロキシル保護基、コンジュゲート基、反応性リン基、リン部分、又は支持媒体への共有結合的付着であり;Zaは、C1−C6アルキル、C2−C6アルケニル、C2−C6アルキニル、置換C1−C6アルキル、置換C2−C6アルケニル、置換C2−C6アルキニル、アシル、置換アシル、置換アミド、チオール、又は置換チオである)
を有する。
(式中、
Bxはヘテロ環塩基部分であり;
Ta及びTbは、各々独立して、H、ヒドロキシル保護基、コンジュゲート基、反応性リン基、リン部分、又は支持媒体への共有結合的付着であり;
Z b は、C1−C6アルキル、C2−C6アルケニル、C2−C6アルキニル、置換C1−C6アルキル、置換C2−C6アルケニル、置換C2−C6アルキニル、又は置換アシル(C(=O)−)である)
を有する。
(式中、
Bxはヘテロ環塩基部分であり;
Ta及びTbは、各々独立して、H、ヒドロキシル保護基、コンジュゲート基、反応性リン基、リン部分、又は支持媒体への共有結合的付着であり;
Rdは、C1−C6アルキル、置換C1−C6アルキル、C2−C6アルケニル、置換C2−C6アルケニル、C2−C6アルキニル、置換C2−C6アルキニルであり;各qb、qc及びqdは、独立して、H、ハロゲン、C1−C6アルキル、置換C1−C6アルキル、C2−Ceアルケニル、置換C2−C6アルケニル、C2−C6アルキニル、又は置換C2−C6アルキニル、C1−C6アルコキシ、置換Q−C6アルコキシ、アシル、置換アシル、C1−C6アミノアルキル、又は置換C1−C6アミノアルキルである)
を有する。
(式中、
Bxはヘテロ環塩基部分であり;
Ta及びTbは、各々独立して、H、ヒドロキシル保護基、コンジュゲート基、反応性リン基、リン部分、又は支持媒体への共有結合的付着であり;qa、qb、qc及びqfは各々独立して、水素、ハロゲン、C1−C12アルキル、置換C1−C12アルキル、C2−C12アルケニル、置換C2−C12アルケニル、C2−C12アルキニル、置換C2−C12アルキニル、C1−C12アルコキシ、置換C1−C12アルコキシ、OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、NJjJk、N3、CN、C(=O)OJj、C(=O)NJjJk、C(=O)Jj、O−C(=O)NJjJk、N(H)C(=NH)NJjJk、N(H)C(=O)NJjJk又はN(H)C(=S)NJjJkであるか;又は、qe及びqf一緒に、=C(qg)(qh)であり;qg及びqhは、各々独立して、H、ハロゲン、C1−C12アルキル、又は置換C1−C12アルキルである)
を有する。
(式中、
Bxはヘテロ環塩基部分であり;
Ta及びTbは、各々独立して、H、ヒドロキシル保護基、コンジュゲート基、反応性リン基、リン部分、又は支持媒体への共有結合的付着であり;各々qi、qj、qk及びqlは各々独立して、H、ハロゲン、C1−C12アルキル、置換C1−C12アルキル、C2−C12アルケニル、置換C2−C12アルケニル、C2−C12アルキニル、置換C2−C12アルキニル、C1−C12アルコキシ、置換C2−C12アルコキシ、OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、NJjJk、N3、CN、C(=O)OJj、C(=O)NJjJk、C(=O)Jj、O−C(=O)NJjJk、N(H)C(=NH)NJjJk、N(H)C(=O)NJjJk又は(H)C(=S)NJjJkであり;qi及びqj又はql及びqkは一緒に=C(qg)(qh)であり;qg及びqhは、各々独立して、H、ハロゲン、C1−C12アルキル、又は置換C1−C6アルキルである)
を有する。
(式中、式Xの各々の少なくとも1つの該テトラヒドロピランヌクレオシド類似体とは独立して、
Bxはヘテロ環塩基部分であり;
T3及びT4は、各々独立して、テトラヒドロピランヌクレオシド類似体をアンチセンス化合物に連結しているヌクレオシド間連結基であるか、又はT3及びT4の一方は、テトラヒドロピランヌクレオシド類似体をアンチセンス化合物に連結しているヌクレオシド間連結基であり、T3及びT4の他方はH、ヒドロキシル保護基、連結されたコンジュゲート基、又は5’若しくは3’末端基であり;q1、q2、q3、q4、q5、q6及びq7は、各々独立して、H、C1−C6アルキル、置換C1−C6アルキル、C2−C6アルケニル、置換C2−C6アルケニル、C2−C6アルキニル、又は置換C2−C6アルキニルであり;R1及びR2の一方は水素であり、他方はハロゲン、置換又は非置換アルコキシ、NJ、J2、SJ、N3、OC(=X)J1、OC(=X)NJ1J2、NJ3C(=X)NJ1J2及びCNから選択され、XはO、S、又はNJ1であり、各J1、J2及びJ3は、独立して、H又はC1−C6アルキルである)
を有する化合物として当技術分野において言及されているものを含むがこれらに限定されない。
オリゴヌクレオチドは、リボヌクレアーゼによって媒介されない標的mRNAの分解を介して、例えば翻訳の立体障害、又は他の方法によって機能し得ると認識されているが、本発明の好ましいオリゴヌクレオチドは、リボヌクレアーゼHなどのエンドリボヌクレアーゼ(リボヌクレアーゼ)を動員することができる。
いくつかの実施態様において、本発明のオリゴマー、例えば第一領域はギャップマーを含むか又はギャップマーである。ギャップマーオリゴマーは、リボヌクレアーゼ、例えばリボヌクレアーゼHを動員することのできる連続ヌクレオチド区間、例えば少なくとも6又は7つのDNAヌクレオチド領域(本明細書においては領域Y’(Y’)と称される)を含むオリゴマーであり、領域Y’は、リボヌクレアーゼを動員することのできる連続ヌクレオチド区間に対して5’及び3’にある1〜6つのヌクレオチド類似体(これらの領域はそれぞれ領域Z’(Z’)及びZ’(Z’)と称される)などの、親和性増強ヌクレオチド類似体領域によって5’及び3’の両方がフランキングされている。ギャップマーの例は、国際公開公報第2004/046160号、国際公開公報第2008/113832号及び国際公開公報第2007/146511号に開示されている。
本明細書に記載のオリゴヌクレオチドのモノマーを連結基を介して一緒に結合させる。適切には、各モノマーを連結基を介して3’隣接モノマーに連結させる。当業者は、本発明の脈絡において、オリゴヌクレオチド末端における5’モノマーは、5’末端基を含んでいても含んでいなくてもよいが、5’連結基を含まないことを理解しているだろう。
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号9、10、11、12、13及び14からなる群より選択された配列を含み得る。特定の実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24及び配列番号25からなる群より選択された配列を含み得る。いくつかの実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、表1又は4に同定された配列からなる群より選択され得る。
本発明の脈絡において、「コンジュゲート」という用語は、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドの、1つ以上の非ヌクレオチド、又は非ポリヌクレオチド部分への共有結合的な付着によって形成された異種分子を示すことを意図する。非ヌクレオチド又は非ポリヌクレオチド部分の例としては、巨大分子物質、例えばタンパク質、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、ポリマー、又はその組合せが挙げられる。典型的には、タンパク質は標的タンパク質に対する抗体であり得る。典型的なポリマーはポリエチレングリコールであり得る。
本明細書において使用される「活性化オリゴヌクレオチド」という用語は、オリゴヌクレオチドが1つ以上のコンジュゲート部分(すなわちそれ自体核酸又はモノマーではない部分)に共有結合的に連結して本明細書に記載のコンジュゲートを形成することを許容する、少なくとも1つの機能的部分に共有結合的に連結(すなわち官能基化)された本発明のオリゴヌクレオチドを指す。典型的には、機能的部分は、アデニン塩基の3’−ヒドロキシル基又は環外NH2基を介して、オリゴヌクレオチドに共有結合することのできる化学基、好ましくは親水性であるスペーサー、及びコンジュゲート部分(例えばアミノ、スルフヒドリル、又はヒドロキシル基)に結合することのできる末端基を含む。いくつかの実施態様において、この末端基は保護されていない(例えばNH2基)。他の実施態様において、末端基は、例えば、Theodora W Greene and Peter G M Wuts, 3rd edition (John Wiley & Sons, 1999)による「Protective Groups in Organic Synthesis」に記載の基などの任意の適切な保護基によって保護される。適切なヒドロキシル保護基の例としては、エステル、例えば酢酸エステル、アラルキル基、例えばベンジル、ジフェニルメチル、又はトリフェニルメチル、及びテトラヒドロピラニルが挙げられる。適切なアミノ保護基の例としては、ベンジル、α−メチルベンジル、ジフェニルメチル、トリフェニルメチル、ベンジルオキシカルボニル、tert−ブトキシカルボニル、及びアシル基、例えばトリクロロアセチル又はトリフルオロアセチルが挙げられる。いくつかの実施態様において、機能的部分は自己切断性である。他の実施態様において、機能的部分は生分解性である(例えば米国特許第7,087,229号参照)。
本発明のオリゴヌクレオチドは、医薬製剤及び組成物に使用され得る。適切には、このような組成物は、薬学的に許容される溶媒、例えば水又は食塩水、希釈剤、担体、塩又は補助剤を含む。PCT/DK2006/000512は、適切かつ好ましい薬学的に許容される希釈剤、担体、溶媒、及び補助剤を提供する。適切な投与量、製剤、投与経路、組成物、剤形、他の治療剤との組合せ、プロドラッグ製剤も、PCT/DK2006/000512に提供される。
本発明のオリゴヌクレオチドは、研究試薬として、例えば、診断、治療及び予防のために使用され得る。研究では、このようなオリゴヌクレオチドは、細胞及び実験動物におけるFGFR3の合成を特異的に阻害するために使用され得(典型的には、mRNAを分解又は阻害し、これによりタンパク質の形成を妨げることによって)、これにより、標的の機能的分析、又は、治療的介入の標的としてのその有用性の評価を容易にし得る。
本発明によるオリゴヌクレオチド及び他の組成物は、FGFR3の過剰発現又は突然変異型のFGFR3の発現に関連した容態(例えば軟骨無形成症)の処置のために使用され得る。本発明はさらに、本明細書に言及される疾病、疾患又は容態の処置のための医薬品の製造における本発明の化合物の使用を提供する。
1.配列番号4を含む核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドはFGFR3の発現を調節する。
2.該オリゴヌクレオチドは、配列番号4のヌクレオチド1394位を含む配列番号4の領域にハイブリダイズする、実施態様1のオリゴヌクレオチド。
3.該オリゴヌクレオチドは、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、及び配列番号25からなる群より選択される、実施態様1のオリゴヌクレオチド。
4.該オリゴヌクレオチドは、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13及び配列番号14からなる群より選択されたオリゴヌクレオチドに対して少なくとも80%同一である、実施態様1のオリゴヌクレオチド。
5.該オリゴヌクレオチドは14ヌクレオチド長である、実施態様1のオリゴヌクレオチド。
6.該オリゴヌクレオチドは少なくとも15ヌクレオチド長である、実施態様1のオリゴヌクレオチド。
7.該オリゴヌクレオチドは少なくとも16ヌクレオチド長である、実施態様1のオリゴヌクレオチド。
8.該オリゴヌクレオチドは少なくとも18ヌクレオチド長である、実施態様1のオリゴヌクレオチド。
9.該オリゴヌクレオチドは、G380R突然変異をコードする配列番号4の領域に特異的にハイブリダイズする、実施態様1のオリゴヌクレオチド。
10.該オリゴヌクレオチドはFGFR3の発現を少なくとも約50%低減させる、実施態様1のオリゴヌクレオチド。
11.該オリゴヌクレオチドはFGFR3の発現を少なくとも約75%低減させる、実施態様1のオリゴヌクレオチド。
12.該オリゴヌクレオチドはFGFR3の発現を少なくとも約90%低減させる、実施態様1のオリゴヌクレオチド。
13.該オリゴヌクレオチドは突然変異型のFGFR3の発現を調節する、実施態様1のオリゴヌクレオチド。
14.該オリゴヌクレオチドは野生型形のFGFR3の発現と比較して、突然変異型のFGFR3の発現を優先的に調節する、実施態様1のオリゴヌクレオチド。
15.該オリゴヌクレオチドは突然変異型のFGFR3の発現を阻害する、実施態様1のオリゴヌクレオチド。
16.該オリゴヌクレオチドは、突然変異型のFGFR3の発現をダウンレギュレートする、実施態様1のオリゴヌクレオチド。
17.該オリゴヌクレオチドは、突然変異型のFGFR3の発現と比較して、野生型形のFGFR3の発現をアップレギュレートする、実施態様1のオリゴヌクレオチド。
18.該オリゴヌクレオチドは配列番号1を含む核酸にハイブリダイズしない、実施態様1のオリゴヌクレオチド。
19.該オリゴヌクレオチドは、配列番号7又は配列番号8を含む核酸にハイブリダイズしない、実施態様1のオリゴヌクレオチド。
20.該オリゴヌクレオチドは配列番号5又は配列番号6を含む核酸にハイブリダイズする、実施態様1のオリゴヌクレオチド。
21.該オリゴヌクレオチドは配列番号4を含む核酸のコドン380にハイブリダイズする、実施態様1のオリゴヌクレオチド。
22.該オリゴヌクレオチドは配列番号4を含む核酸のG380R領域にハイブリダイズする、実施態様1のオリゴヌクレオチド。
23.該オリゴヌクレオチドは配列番号4を含む核酸のコドン380の1138位にハイブリダイズする、実施態様1のオリゴヌクレオチド。
24.該オリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、実施態様1のオリゴヌクレオチド。
25.該オリゴヌクレオチドは、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24及び配列番号25からなる群より選択される、実施態様23のオリゴヌクレオチド。
26.該オリゴヌクレオチドは、ロックド核酸(LNA)単位;2’−O−アルキル−RNA単位、2’−OMe−RNA単位、2’−アミノ−DNA単位、及び2’−フルオロ−DNA単位からなる群より選択された1つ以上のヌクレオチド単位を含む、実施態様1のオリゴヌクレオチド。
27.該オリゴヌクレオチドは2つ以上のLNAモノマー単位を含む、実施態様1のオリゴヌクレオチド。
28.2つ以上のLNAモノマー単位は互いに隣接して位置する、実施態様27のオリゴヌクレオチド。
29.2つ以上のLNAモノマー単位は、互いに対して連続的に位置する、実施態様27のオリゴヌクレオチド。
30.FGFR3の発現の調節は軟骨細胞の機能を回復させる、実施態様1のオリゴヌクレオチド。
31.FGFR3の異常発現に関連した容態の処置のための実施態様1のオリゴヌクレオチドの使用。
32.軟骨無形成症の処置のための実施態様1のオリゴヌクレオチドの使用。
33.該オリゴヌクレオチドはFGFR3の発現を調節する、配列番号9を含むオリゴヌクレオチド。
34.該オリゴヌクレオチドはFGFR3の発現を調節する、配列番号10を含むオリゴヌクレオチド。
35.該オリゴヌクレオチドはFGFR3の発現を調節する、配列番号11を含むオリゴヌクレオチド。
36.該オリゴヌクレオチドはFGFR3の発現を調節する、配列番号12を含むオリゴヌクレオチド。
37.該オリゴヌクレオチドはFGRR3の発現を調節する、配列番号13を含むオリゴヌクレオチド。
38.配列番号1を含む核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドは、1つ以上のLNAモノマー単位を含み、該オリゴヌクレオチドはFGFR3の発現を調節する。
39.該オリゴヌクレオチドは8ヌクレオチド長である、実施態様38のオリゴヌクレオチド。
40.該オリゴヌクレオチドは15ヌクレオチド長である、実施態様38のオリゴヌクレオチド。
41.該オリゴヌクレオチドは18ヌクレオチド長である、実施態様38のオリゴヌクレオチド。
42.該オリゴヌクレオチドはFGFR3の発現を少なくとも約50%低減させる、請求項38のオリゴヌクレオチド。
43.該オリゴヌクレオチドはFGFR3の発現を少なくとも約75%低減させる、請求項38のオリゴヌクレオチド。
44.該オリゴヌクレオチドはFGFR3の発現を少なくとも約90%低減させる、請求項38のオリゴヌクレオチド。
45.該オリゴヌクレオチドは突然変異型のFGFR3の発現を調節する、請求項38のオリゴヌクレオチド。
46.該オリゴヌクレオチドは突然変異型のFGFR3の発現を阻害する、請求項38のオリゴヌクレオチド。
47.該オリゴヌクレオチドは突然変異型のFGFR3の発現をダウンレギュレートする、請求項38のオリゴヌクレオチド。
48.該オリゴヌクレオチドは野生型形のFGFR3の発現をアップレギュレートする、請求項38のオリゴヌクレオチド。
49.該オリゴヌクレオチドは、配列番号4を含む核酸にハイブリダイズする、実施態様38のオリゴヌクレオチド。
50.該オリゴヌクレオチドは、配列番号4を含む核酸のコドン380の1138位にハイブリダイズする、実施態様38のオリゴヌクレオチド。
51.該オリゴヌクレオチドは配列番号4を含む核酸のG380R領域にハイブリダイズする、実施態様38のオリゴヌクレオチド。
52.該オリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、実施態様38のオリゴヌクレオチド。
53.該オリゴヌクレオチドは2つ以上のLNAモノマー単位を含む、実施態様38のオリゴヌクレオチド。
54.2つ以上のLNAモノマー単位は互いに隣接して位置する、実施態様53のオリゴヌクレオチド。
55.2つ以上のLNAモノマー単位は互いに対して連続的に位置する、実施態様53のオリゴヌクレオチド。
56.FGFR3の発現の調節は軟骨細胞の機能を回復させる、実施態様38のオリゴヌクレオチド。
57.FGFR3の異常発現に関連した容態の処置のための実施態様38のオリゴヌクレオチドの使用。
58.軟骨無形成症の処置のための実施態様38のオリゴヌクレオチドの使用。
59.軟骨無形成症の処置のために有用なオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドは、配列番号1又は配列番号4を含む核酸にハイブリダイズし、該オリゴヌクレオチドは少なくとも1つのLNAモノマー単位を含む。
60.該オリゴヌクレオチドは8ヌクレオチド長である、実施態様59のオリゴヌクレオチド。
61.該オリゴヌクレオチドは15ヌクレオチド長である、実施態様59のオリゴヌクレオチド。
62.該オリゴヌクレオチドは18ヌクレオチド長である、実施態様59のオリゴヌクレオチド。
63.該オリゴヌクレオチドはFGFR3の発現をダウンレギュレートする、実施態様59のオリゴヌクレオチド。
64.該オリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、実施態様59のオリゴヌクレオチド。
65.癌又は軟骨無形成症の処置に有用なオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドは、配列番号5を含む核酸のG380R領域にハイブリダイズし、該オリゴヌクレオチドは少なくとも1つのLNAモノマー単位を含む。
66.FGFR3mRNAを、実施態様1のオリゴヌクレオチドに、該FGFRmRNAと該オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに適切な条件下で送達し、これにより、FGFR3mRNAの発現を調節することを含む、FGFR3mRNAの発現を調節する方法。
67.FGFR3の発現の調節により、FGFR3の発現は低減する、実施態様66の方法。
68.FGFR3を実施態様1のオリゴヌクレオチドと、該FGFR3と該オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに適切な条件下で接触させ、これによりFGFR3の発現を調節することを含む、FGFR3の発現を調節する方法。
69.FGFR3の発現の調節により、FGFR3の発現は低減する、実施態様68の方法。
70.FGFR3の異常発現に関連した容態を処置する方法であって、該容態と診断された患者を選択し、該患者に実施態様1のオリゴヌクレオチドを投与することを含む方法。
71.FGFR3の異常発現に関連した容態を処置する方法であって、該容態と診断された患者を選択し、該患者に実施態様38のオリゴヌクレオチドを投与することを含む方法。
72.配列番号4を含む核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドは少なくとも1つのLNAモノマー単位を含み、該オリゴヌクレオチドは、配列番号1を含む核酸にハイブリダイズしない。
73.癌、例えば膀胱癌又は軟骨無形成症の処置に有用なオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物であって、該オリゴヌクレオチドは、配列番号1又は配列番号4を含む核酸にハイブリダイズし、該オリゴヌクレオチドは少なくとも1つのLNAモノマー単位を含む。
74.該オリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、実施態様73の医薬組成物。
75.該組成物は肺内投与のために製剤化される、実施態様73の医薬組成物。
76.該組成物は非経口投与のために製剤化される、実施態様73の医薬組成物。
77.該オリゴヌクレオチドは、配列番号4を含む核酸にハイブリダイズすることによってFGFR3の発現を調節する、実施態様73の医薬組成物。
78.該オリゴヌクレオチドは配列番号1を含む核酸にハイブリダイズしない、実施態様77の医薬組成物。
79.該オリゴヌクレオチドは配列番号1を含む核酸にハイブリダイズすることによってFGFR3の発現を調節する、実施態様73の医薬組成物。
80.該オリゴヌクレオチドは配列番号4を含む核酸にハイブリダイズしない、実施態様79の医薬組成物。
81.該オリゴヌクレオチドは少なくとも1つのLNAモノマー単位を含む、FGFR3の発現を調節するオリゴヌクレオチド。
82.該オリゴヌクレオチドは、逆相補体配列番号4又はその天然変異体に対して少なくとも80%相同であるヌクレオチド配列を含む、約14〜20ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド。
83.連続ヌクレオチド配列は、配列番号4の逆相補体と1つ以下のミスマッチを含む、実施態様82のオリゴヌクレオチド。
84.ヌクレオチド配列は1つ以上のヌクレオチド類似体を含む、実施態様82のオリゴヌクレオチド。
85.1つ以上のヌクレオチド類似体は、野生型オリゴヌクレオチド中の野生型ヌクレオチドと比較して、化学的に改変された糖部分を含む、実施態様84のオリゴヌクレオチド。
86.1つ以上のオリゴヌクレオチド類似体は、ロックド核酸(LNA)単位、2’−O−アルキル−RNA単位、2’−OMe−RNA単位、2’−アミノ−DNA単位、及び2’−フルオロ−DNA単位からなる群より選択される、実施態様85のオリゴヌクレオチド。
87.1つ以上のヌクレオチド類似体はLNAである、実施態様84のオリゴヌクレオチド。
88.該オリゴヌクレオチドは、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24及び配列番号25からなる群より選択される、実施態様82のオリゴヌクレオチド。
89.該オリゴヌクレオチドはギャップマーである、実施態様82によるオリゴヌクレオチド。
90.該オリゴヌクレオチドは、FGFR3mRNAを発現している細胞におけるFGFR3mRNAの発現を阻害する、実施態様82のオリゴヌクレオチド。
91.FGFR3mRNAは突然変異を含む、実施態様90のオリゴヌクレオチド。
92.突然変異はG380R突然変異である、実施態様91のオリゴヌクレオチド。
93.実施態様82のオリゴヌクレオチドと該オリゴヌクレオチドに共有結合的に付着した少なくとも1つの非ヌクレオチド部分とを含むコンジュゲート。
94.実施態様82のオリゴヌクレオチド及び薬学的に許容される希釈剤、担体、溶媒、塩、又は補助剤を含む、医薬組成物。
95.軟骨無形成症の処置のための実施態様82のオリゴヌクレオチドの使用。
96.癌、例えば膀胱癌、軟骨無形成症に罹患した被験体を処置する方法であって、該方法は、実施態様82のオリゴヌクレオチドを被験体に、軟骨無形成症の1つ以上の他覚的な症状が改善されるように投与する工程を含む。
97.他覚的な症状は、増加した筋緊張、腕の延長、脚の延長、及び伸びた身長からなる群より選択される、実施態様96の方法。
98.異常発現したFGFR3を発現している細胞におけるFGFR3の異常発現を低減させる方法であって、該方法は、該細胞を、実施態様82のオリゴヌクレオチドと接触させ、よってFGFR3の発現を低減させることを含む。
99.FGFR3はG380R突然変異を含む、実施態様98の方法。
100.癌、例えば膀胱癌、軟骨無形成症を患う哺乳動物を処置する方法であって、該方法は、哺乳動物に、治療有効量のFGFR3に標的化されたオリゴヌクレオチドを投与することを含み、該オリゴヌクレオチドは1つ以上のLNA単位を含む。
101.該オリゴヌクレオチドは、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24及び配列番号25からなる群より選択された配列を含む、実施態様100の方法。
102.該オリゴヌクレオチドは非経口投与される、実施態様100の方法。
103.該オリゴヌクレオチドは静脈内投与される、実施態様100の方法。
104.該オリゴヌクレオチドは標的器官又は組織にボーラス注射によって投与される、実施態様100の方法。
105.該オリゴヌクレオチドは腹腔内投与される、実施態様100の方法。
106.該オリゴヌクレオチドはFGFR3の発現を調節する、配列番号21を含むオリゴヌクレオチド。
107.該オリゴヌクレオチドはFGFR3をコードする核酸にハイブリダイズして、少なくとも約60℃の解離Tmを有する二本鎖構造を形成する、実施態様106のオリゴヌクレオチド。
108.該FGFR3はG380R突然変異を含み、FGFR3の発現の該調節は、FGFR3の発現を阻害することを含む、実施態様106のオリゴヌクレオチド。
109.該オリゴヌクレオチドは、約0.05から約0.75nMのIC50濃度でFGFR3の該発現を阻害する、実施態様108のオリゴヌクレオチド。
110.該オリゴヌクレオチドは血漿中37℃で少なくとも約96時間安定である、実施態様106のオリゴヌクレオチド。
111.該オリゴヌクレオチドはFGFR3の発現を調節する、配列番号22を含むオリゴヌクレオチド。
112.該オリゴヌクレオチドはFGFR3をコードする核酸にハイブリダイズし、少なくとも約70℃の解離Tmを有する二本鎖構造を形成する、実施態様111のオリゴヌクレオチド。
113.該FGFR3はG380R突然変異を含み、FGFR3の発現の該調節はFGFR3の発現の阻害を含む、実施態様111のオリゴヌクレオチド。
114.該オリゴヌクレオチドは約0.05から約0.75nMのIC50濃度でFGFR3の該発現を阻害する、実施態様113のオリゴヌクレオチド。
115.該オリゴヌクレオチドは血漿中37℃で少なくとも約96時間安定である、実施態様111のオリゴヌクレオチド。
116.該オリゴヌクレオチドはFGFR3の発現を調節する、配列番号23を含むオリゴヌクレオチド。
117.該オリゴヌクレオチドはFGFR3をコードする核酸にハイブリダイズし、少なくとも約70℃の解離Tmを有する二本鎖構造を形成する、実施態様116のオリゴヌクレオチド。
118.該FGFRはG380R突然変異を含み、FGFR3の発現の該調節はFGFR3の発現の阻害を含む、実施態様116のオリゴヌクレオチド。
119.該オリゴヌクレオチドは約0.05から約0.75nMのIC50濃度でFGFR3の該発現を阻害する、実施態様118のオリゴヌクレオチド。
120.該オリゴヌクレオチドは血漿中37℃で少なくとも約96時間安定である、実施態様116のオリゴヌクレオチド。
121.該オリゴヌクレオチドはFGFR3の発現を調節する、配列番号24を含むオリゴヌクレオチド。
122.該オリゴヌクレオチドはFGFR3をコードする核酸にハイブリダイズし、少なくとも約70℃の解離Tmを有する二本鎖構造を形成する、実施態様121のオリゴヌクレオチド。
123.該FGFR3はG380R突然変異を含み、FGFR3の発現の該調節はFGFR3の発現の阻害を含む、実施態様121のオリゴヌクレオチド。
124.該オリゴヌクレオチドは約0.05から約0.75nMのIC50濃度でFGFR3の該発現を阻害する、実施態様123のオリゴヌクレオチド。
125.該オリゴヌクレオチドは血漿中37℃で少なくとも約96時間安定である、実施態様121のオリゴヌクレオチド。
126.該オリゴヌクレオチドはFGFR3の発現を調節する、配列番号25を含むオリゴヌクレオチド。
127.該オリゴヌクレオチドはFGFR3をコードする核酸にハイブリダイズし、少なくとも約70℃の解離Tmを有する二本鎖構造を形成する、実施態様126のオリゴヌクレオチド。
128.該FGFR3はG380R突然変異を含み、FGFR3の発現の該調節はFGFR3の発現の阻害を含む、実施態様127のオリゴヌクレオチド。
129.該オリゴヌクレオチドは約0.05から約0.75nMのIC50濃度でFGFR3の該発現を阻害する、実施態様128のオリゴヌクレオチド。
130.該オリゴヌクレオチドは血漿中37℃で少なくとも約96時間安定である、実施態様126のオリゴヌクレオチド。
131.該オリゴヌクレオチドはFGFR3の発現を調節する、配列番号20を含む核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
132.該オリゴヌクレオチドは配列番号14を含む、実施態様131のオリゴヌクレオチド。
133.該オリゴヌクレオチドはFGFR3の発現を調節する、配列番号14を含むオリゴヌクレオチド。
134.該オリゴヌクレオチドは少なくとも1つのヌクレオチド類似体を含み、該ヌクレオチド類似体はロックド核酸である、実施態様133のオリゴヌクレオチド。
135.該オリゴヌクレオチドはFGFR3の発現を調節し、該オリゴヌクレオチドは少なくとも1つのヌクレオチド類似体を、
(a)1位のグアニジンヌクレオチドはオキシ−LNAである;
(b)2位及び3位の1つ以上におけるアデニンヌクレオチドはオキシ−LNAである;
(c)10位及び11位の1つ以上におけるシトシンヌクレオチドはオキシ−LNAである;及び
(d)12位におけるチミンヌクレオチドはオキシ−LNAである
からなる群より選択された1つ以上の位置において含む、配列番号14を含むオリゴヌクレオチド。
136.11位の該シトシンヌクレオチドはC5−メチルシトシンであり、該C5−メチルシトシンはβ−D−オキシ−LNAであり、12位の該チミンヌクレオチドはβ−D−オキシ−LNAであり、全てのヌクレオチド間連結基はホスホロチオエートヌクレオチド間連結基である、実施態様135のオリゴヌクレオチド。
137.1位の該グアニンヌクレオチドはβ−D−オキシ−LNAであり、2位及び3位の該アデニンヌクレオチドはβ−D−オキシ−LNAであり、全てのヌクレオチド間連結基はホスホロチオエートヌクレオチド間連結基である、実施態様135のオリゴヌクレオチド。
138.1位の該グアニンヌクレオチドはβ−D−オキシ−LNAであり、10位及び11位の該シトシンヌクレオチドは両方共C5−メチルシトシンであり、該C5−メチルシトシンはβ−D−オキシ−LNAであり、12位の該チミンヌクレオチドはβ−D−オキシ−LNAであり、全てのヌクレオチド間連結基はホスホロチオエートヌクレオチド間連結基である、実施態様135のオリゴヌクレオチド。
139.10位及び11位の該シトシンヌクレオチドは両方共C5−メチルシトシンであり、該C5−メチルシトシンはβ−D−オキシ−LNAであり、12位の該チミンヌクレオチドはβ−D−オキシ−LNAであり、全てのヌクレオチド間連結基はホスホロチオエートヌクレオチド間連結基である、実施態様135のオリゴヌクレオチド。
140.少なくとも1つのヌクレオチドは、5−メチルシトシン、イソシトシン、プソイドイソシトシン、5−ブロモウラシル、5−プロピニルウラシル、6−アミノプリン、2−アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、及び2−クロロ−6−アミノプリンシトシンからなる群より独立して選択された修飾された核酸塩基である、実施態様135のオリゴヌクレオチド。
141.10位及び11位の該シトシンヌクレオチドの各々は、修飾核酸塩基である、実施態様135のオリゴヌクレオチド。
142.該修飾核酸塩基はC5−メチルシトシンである、実施態様141のオリゴヌクレオチド。
143.該オキシ−LNAはβ−D−オキシLNAである、実施態様135のオリゴヌクレオチド。
144.少なくとも1つのヌクレオチド間連結基はホスホロチオエートヌクレオチド間連結基である、実施態様135のオリゴヌクレオチド。
145.全てのヌクレオチド間連結基はホスホロチオエートヌクレオチド間連結基である、実施態様135のオリゴヌクレオチド。
以下の実施例は、突然変異FGFR3 G380R mRNA転写物を標的化するいくつかのオリゴヌクレオチド、並びに、これらのオリゴヌクレオチドの様々な優れた特性を記載する。特に、実施例1は、21個のオリゴヌクレオチドが突然変異G380R FGFR3発現をノックダウンする効力、及び、そうした21個のオリゴヌクレオチドの選択性(例えば、野生型FGFR3発現の阻害と比較した、突然変異G380R FGFR3発現の阻害)を実証する。実施例2は、IC50値として測定された、10個の各オリゴヌクレオチドが突然変異G380R FGFR3発現を阻害する強度、及び、野生型FGFR3発現と比較した突然変異G380R FGFR3発現を阻害する強度の差を実証する。実施例3は、2つの関連していない標的に対する各オリゴヌクレオチドの阻害作用を比較することによる、そうした10個のオリゴヌクレオチドの非特異的作用の調査を記載する。実施例4は、そうした10個の各オリゴヌクレオチドと、突然変異G380R FGFR3(完璧な相補体)又は野生型FGFR3(突然変異部位における1つの相補性ミスマッチ)のいずれかとの間の、融解温度(Tm)として測定された、結合エネルギーを記載する。実施例5は、そうした10個のオリゴヌクレオチドの、血漿中の安定性として測定された、ヌクレアーゼに対する感受性を示す。実施例6は、標準的な16日間のマウス試験における、選択されたオリゴヌクレオチドに対するインビボでの耐容性の評価を記載する。
全部で21個のアンチセンスオリゴヌクレオチド(各々、ロックド核酸(LNA)骨格を有する)を、ヒトFGFR3 G380R突然変異及び該突然変異の周囲又は隣接する領域を選択的に標的化するように設計した。特に、21個のLNAアンチセンスオリゴヌクレオチドは、FGFR3mRNAの1394位の「A」(すなわち、NM_000142.3の1394位のGGG→AGGミスセンス突然変異)並びに1380位から1408位の範囲の1394位の上流及び/又は下流のヌクレオチドを含む、領域にハイブリダイズするように設計した。
実施例1に記載された研究の結果として選択された10個のオリゴヌクレオチドを、各オリゴヌクレオチドについてのIC50値を評価することによってその阻害強度についてさらに評価した。特に、トランスフェクトされたオリゴヌクレオチドは、5nM未満のIC50値を有するものと、5nMを超えるIC50値を有するものにさらに分類された。各オリゴヌクレオチドについての第二の特徴付け基準は、野生型レポーターのIC50値と突然変異型レポーターのIC50値との間におおよそ3倍の差異を示したかどうかであった。
実施例2に記載の10個のオリゴヌクレオチドを、25nMの濃度で非標的化転写物を非特異的にノックダウンするその能力についてさらに評価した。10個の各オリゴヌクレオチドの1つを、トランスフェクションによって同じA549細胞に送達した。細胞を収集し、内因性SCA3mRNA(図5A)又はPTENmRNA(図5B)のノックダウンについてqPCRによって試験した。提示された結果を内因性GAPDHレベルに標準化し、偽処置試料に対する%として表現した。
上記の実施例2及び3に記載されたオリゴヌクレオチド候補の特徴付けの一部として、相補的突然変異RNA(cMUTと命名された)からの各オリゴヌクレオチドの融解温度(Tm)を評価した。10個の各オリゴヌクレオチドもまた、G380R突然変異部位における各オリゴヌクレオチドに対する単一の相補性ミスマッチを含んだ、野生型対立遺伝子(cWTと命名された)を示すRNAに対して試験した。
実施例2、3及び4に記載の10個のオリゴヌクレオチドの特徴付けの一部として、10個の各オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼに対する感受性を評価した。具体的には、10個の各オリゴヌクレオチドを、37℃で96時間マウス血漿中でインキュベートし、試料を24時間毎に採取し、分析した。試料を、完全長オリゴヌクレオチドの消失及び分解産物の発生についてゲル電気泳動によって評価した。試料を不安定な対照オリゴヌクレオチド(Conと命名された)と比較した。
10個の各オリゴヌクレオチドのインビボにおける耐容性を、標準的な16日間のマウス研究で試験した。10個の各オリゴヌクレオチドを、雌NMRIマウスにおいてインビボにおける耐容性について試験し、主に、肝臓に対するあらゆる望ましくない作用を評価した。被験体動物に、14日目まで3日毎に15mg/kgを静脈内投与し、その後、16日目に屠殺した。血清をサンプリングし、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)の濃度について分析した。
SH02、SH13、SH19、SH20及びSH21(配列番号21、22、23、24及び25にそれぞれ対応する)と命名されたオリゴヌクレオチドがG380R突然変異FGFR3の発現に関連した疾病病態を低減させる能力は以下のように決定される。動物モデルは、いくつかの公知の軟骨無形成症動物モデルから選択される。好ましいマウスモデルは、ヒト突然変異FGFR3−G380Rに相関する。FGFR3−G380Rは、ヒト軟骨無形成症患者の約97%に見られる天然の突然変異であり、マウスでは、ヒト軟骨無形成症を模倣する表現型がもたらされる。生存中の効力についての主要評価項目としては、例えば、成長速度、長骨比率の正常化、及び骨端成長板の過増殖領域の組織病理学的評価が挙げられ得る。疾病の表現型、及び各オリゴヌクレオチドによるその逆転は、当技術分野において公知の様々な方法によって、例えば骨端成長板の組織学的検査によって確認され得る。
Claims (8)
- 配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12及び配列番号13からなる群より選択された配列からなる、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
- 該オリゴヌクレオチドが、野生型形のFGFR3の発現と比較して、突然変異型のFGFR3の発現を優先的に調節する、請求項1のオリゴヌクレオチドであって、突然変異型のFGFR3遺伝子産物又はmRNAの発現に対する野生型のFGFR3遺伝子産物又はmRNAの発現の割合が増加する、オリゴヌクレオチド。
- ロックド核酸(LNA)単位;2’−O−アルキル−RNA単位、2’−OMe−RNA単位、2’−アミノ−DNA単位、及び2’−フルオロ−DNA単位からなる群より選択される1つ以上のヌクレオチド類似体を含む、請求項1又は2のオリゴヌクレオチド。
- 該オリゴヌクレオチドが、2つ以上のLNA単量体単位を含む、請求項1〜3のいずれか一項のオリゴヌクレオチド。
- 該オリゴヌクレオチドが、以下の配列:
からなる群より選択される、請求項1〜4のいずれか一項のオリゴヌクレオチド。 - 配列番号21からなる、請求項1〜5のいずれか一項のオリゴヌクレオチド。
- 癌又は軟骨無形成症などのFGFR3の異常発現に関連した容態の処置のための請求項1〜6のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物。
- 請求項1〜6のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド及び薬学的に許容される希釈剤、担体、溶媒、塩又は補助剤を含む、医薬組成物。
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