KR20150088305A - Fgfr3 발현의 조절을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 FGFR3을 암호화하는 핵산 분자를 표적화하고 상기 분자에 하이브리드화하여 FGFR3의 발현을 감소시키는 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. FGFR3의 이상 발현의 감소는 연골무형성증과 같은 일부 의학적 질환들의 치료에 이롭다.

Description

FGFR3 발현의 조절을 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATION OF FGFR3 EXPRESSION}

본원은 섬유아세포 성장인자 수용체 유형 3(FGFR3)을 암호화하는 핵산을 표적화하고 하이브리드화하는 올리고뉴클레오티드 및 관련된 약학 조성물, 및 FGFR3의 발현을 조절하기 위해 상기 올리고뉴클레오티드를 사용하는 방법에 관한 것이다. 특히, 몇몇 실시태양은 FGFR3을 암호화하는 핵산, 예를 들어 mRNA와 하이브리드화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 및 상기와 같은 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의해 FGFR3의 발현을 조절하기 위한 방법에 관한 것이다. FGFR3 발현의 감소는 일련의 의학적 질환들, 예를 들어 연골무형성증에 이롭다.

섬유아세포 성장인자 수용체(FGFR)는 상기 섬유아세포 성장 인자에 대한 고-친화성 수용체이다. 상기 인자는 세포 성장, 분화 및 다른 생물학적 과정들에서 다양한 역할을 하며, 상기 인자의 정확한 기능은 표적 세포 및 발생 단계에 따라 변한다. 상기 FGFR 유전자의 돌연변이는 다양한 질환들을 야기하는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, FGFR1 및 FGFR2 돌연변이는 두개골유합증에서 발생하고, FGFR3의 돌연변이는 골격 이형성증, 예를 들어 연골무형성증, 연골저형성증 및 치사성 이형성증(I형 및 II형)에 관련되었다.

연골무형성증과 같은 이형성증의 치료를 위한 현행 요법들은 정형외과 수술, 예를 들어 인공 고관절 치환술 또는 다리 연장술 및 성장 호르몬 요법을 포함한다. 다리 연장술은 10세 이상에서 뼈를 절단하고 약 6개월간 수회의 과정에 걸쳐 특수 다리 연장 장치를 사용하여 신장을 점차적으로 증가시킴을 포함한다. 그러나, 이러한 시술은 환자에게 큰 통증을 가한다. 성장 호르몬 요법은 아동기에서 출발하여 주기적인 성장 호르몬 주사에 의해 신장을 증가시킨다. 그러나, 주사를 중단하면 성장도 멈춘다. 상기 요법들 중 어느 것도 치료가 아니며, 어느 것도 환자의 삶의 질의 관점에서 이상적인 것으로 생각되지 않는다. 연골무형성증의 치료를 위한, 예를 들어 치유 수단으로서 FGFR3의 발현을 조절하는 치료를 위한, 또는 적어도 인간의 연골무형성증과 관련된 생존 및 사망률을 개선시키는 신규한 요법들을 확인하기 위해서 추가적인 개발이 필요하다.

본원은 신규한 올리고뉴클레오티드, 특히 잠금(locked) 핵산(LNA) 안티센스 올리고뉴클레오티드, 및 FGFR3의 이상 발현과 관련된 질병(예를 들어, 연골무형성증과 같은 이형성증)의 치료에 유용한 치료학적 중재를 제공한다. 본원에 개시된 발명은 FGFR3을 이상 발현하는 세포 또는 조직을 본 발명의 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 것이 상기 FGFR3(및 특히 FGFR3의 돌연변이된 또는 천연 변이체)의 발현을 조절한다는 발견에 관한 것이다. 특정한 실시태양에서, 상기 FGFR3의 발현의 조절은, 예를 들어 정상 연골세포 기능을 복원시킨다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드 및 FGFR3의 이상 발현을 조절하기 위해 상기와 같은 올리고뉴클레오티드를 사용하는 방법은 FGFR3의 이상 발현, 예를 들어 연골무형성증과 관련된 생존 및 사망률을 개선시키거나, 심지어 치유하는 수단을 제공한다.

하나의 태양에서, 본 발명은 FGFR3 표적 서열, 예를 들어 포유동물 FGFR3 유전자 또는 mRNA 서열(예를 들어, 천연 FGFR3 유전자 또는 mRNA)에 하이브리드화하는 약 8 내지 약 50개 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 몇몇 태양에서 상기와 같은 올리고뉴클레오티드는 FGFR3 표적 서열에, FGFR3 유전자 산물(예를 들어, FGFR3 단백질)의 발현을 억제하기에 충분한 안정성으로(예를 들어, 충분한 하이브리드화 강도로, 충분한 기간 동안) 하이브리드화한다. 상기 목적 및 다른 목적들에 특히 적합한 올리고뉴클레오티드를 본원에서 개시한다.

본 발명에 사용되는 바와 같은 "하이브리드화하다"란 용어는 하이브리드화할 수 있는 것으로서 이해된다.

하나의 태양에서, 본 발명은 포유동물 FGFR3 유전자의 암호화 영역의 역 보체 또는 FGFR3을 암호화하는 mRNA의 보체에 상응하는 영역과 80% 이상의 일치성(예를 들어, 적어도 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치성)을 갖는 약 8 내지 약 30개 뉴클레오티드(예를 들어, 약 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개 뉴클레오티드 길이)의 연속적인 뉴클레오티드 서열(제1 영역)을 포함하는 약 8 내지 약 50개 뉴클레오티드 길이(예를 들어, 약 8 내지 30개, 8 내지 20개, 12 내지 18개 또는 14 내지 16개 뉴클레오티드 길이)의 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 FGFR3을 암호화하는 핵산 서열의 일부(예를 들어, FGFR3 DNA, 예비-mRNA 또는 mRNA)에 80% 이상 상보성인 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드는 돌연변이된 FGFR3 유전자의 영역 또는 상응하는 mRNA에 상보성인 핵산 서열을 포함할 수 있다. 유사하게, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드는 FGFR3 유전자의 유전자 산물(예를 들어, 상기 FGFR3 유전자에 의해 암호화된 mRNA) 또는 돌연변이, 예를 들어 서열번호 4 또는 그의 천연 변이체(예를 들어, SNP ID의 rs28931614, rs11943863 또는 rs17881656)에 의해 암호화되는 바와 같은 상기 FGFR3 유전자 산물의 380번 위치에서 글리신의 아르기닌으로의 치환(본 발명에서 G380R이라 칭한다)을 암호화하는 다형체 또는 그의 천연 변이체에 상보성인 서열을 포함할 수 있다. 특히, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드는 FGRF3 유전자 또는 mRNA의 돌연변이된 영역, 예를 들어 G380R 돌연변이를 암호화하는 영역 및 상기 G380R 돌연변이를 암호화하는 영역의 바로 상류 및/또는 하류 영역(예를 들어, 상기 G380R 돌연변이의 위치로부터 상류 및/또는 하류의 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250개 또는 그 이상의 뉴클레오티드)을 암호화하는 핵산 서열에 80% 이상 상보성(예를 들어, 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 상보성)일 수 있다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 약 8 내지 약 20개 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 제공하며, 이때 상기 올리고뉴클레오티드는 FGFR3을 암호화하는 핵산(예를 들어, FGFR3 mRNA)의 적어도 8-핵염기 부분에 하이브리드화한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 상기 G380R 돌연변이를 암호화하는 핵산(즉, mRNA), 또는 코돈 380의 1138번 위치에서 상기 FGFR3 G380R 돌연변이를 암호화하는 핵산 바로 주변 및/또는 상기 핵산에 바로 인접한 영역에 하이브리드화한다. 일부 실시태양에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 FGFR3을 암호화하는 단일 가닥 핵산 분자의 영역, 예를 들어 서열번호 4 또는 그의 천연 변이체(예를 들어, SNP ID의 rs28931614, rs11943863 또는 rs17881656)의 일부의 서열을 갖는 핵산 분자의 영역에 상보성이다.

일부 실시태양에서, 상기 특허청구된 올리고뉴클레오티드는 FGFR3 mRNA를 암호화하는 DNA 서열 또는 그의 일부에 상보성인 서열을 포함하거나, 한편으로 상기 특허청구된 올리고뉴클레오티드는 RNA 서열(예를 들어, 예비-mRNA 또는 mRNA) 또는 상기 서열에 의해 암호화된 부분에 하이브리드화한다. 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드는 표적 세포 또는 조직(예를 들어, 연골무형성증에 걸렸거나 상기 질병을 앓고 있는 환자의 장골의 성장판 중의 연골세포)과 접촉될 때 FGFR3(및 특히 돌연변이되거나 이상 발현된 FGFR3)의 발현을 선택적으로 감소시켜, 정상 연골세포 기능을 복원시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 돌연변이되거나 이상 발현된 FGFR3을 암호화하는 핵산(예를 들어, mRNA), 예를 들어 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19 및/또는 서열번호 20을 포함하거나 이들에 의해 암호화되는 mRNA, 또는 상기 중 어느 하나의 특정 부분 또는 영역(예를 들어, 상기 G380R 돌연변이를 암호화하는 영역)을 표적화하고 이에 의해 상기 FGFR3의 발현을, 상기 발현이 적어도 약 10%, 20%, 25%, 35%, 40%, 50%, 또는 바람직하게는 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100%까지 감소되고/되거나 억제되도록 조절할 수 있다.

더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같은 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 조성물은 본원에 개시된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제, 보조제, 또는 상기 조성물의 전달 또는 안정성을 촉진하거나 개선시키는 다른 분자와 함께 포함하는 약학 조성물을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 본원에 개시된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 상기 올리고뉴클레오티드에 부착된, 예를 들어 공유적으로 또는 비-공유적으로 부착된 하나 이상의 비-뉴클레오티드 또는 비-폴리뉴클레오티드 부분을 포함하는 접합체를 제공한다. 본원은 또한, 예를 들어 FGFR3의 이상 발현과 관련된 질병(예를 들어, 이형성증, 예를 들어 연골무형성증)의 치료를 위한 약제로서 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드 및 접합체 및 이들을 포함하는 약학 조성물, 및 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드, 접합체 및/또는 약학 조성물을 포유동물 피실험자, 예를 들어 인간 피실험자, 예를 들어 소아 인간 피실험자(출생 전 또는 후), 또는 성인 인간 피실험자에게 투여함으로써 상기와 같은 질병을 치료하는 방법을 개시한다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 연골무형성증의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 올리고뉴클레오티드 또는 그의 접합체의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 FGFR3의 이상 발현과 관련된 질병 또는 상태, 예를 들어 연골무형성증의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 유효량의 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드, 접합체 및/또는 약학 조성물을, 연골무형성증으로 고통받거나 달리 상기 질병에 걸렸거나 상기 질병을 앓고 있는 바와 같은 환자(예를 들어, 연골무형성증을 앓고 있거나 상기 질병에 민감한 인간 소아 또는 성인 환자)에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 FGFR3의 이상 발현과 관련된 질병, 질환 또는 상태는 FGFR3의 과-발현, 및 특히 돌연변이된 FGFR3(예를 들어, G380R 미스센스 돌연변이를 포함하는 FGFR3)의 과-발현과 관련된다. 일부 실시태양에서, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드, 접합체 및/또는 약학 조성물은 FGFR3 돌연변이체 또는 다형체 또는 천연 변이체, 예를 들어 380번 위치에서 글리신의 아르기닌으로의 치환(G380R)(예를 들어, 서열번호 4 또는 SNP ID의 rs28931614, rs11943863 또는 rs17881656에 의해 암호화되는 바와 같은)을 포함하는 FGFR3 돌연변이체, 다형체 또는 천연 변이체의 발현을 우선적으로 조절한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 의한 FGFR3 돌연변이체, 다형체 또는 천연 변이체의 발현의 상기와 같은 우선적인 조절은 야생형 FGFR3(예를 들어, 서열번호 1에 의해 암호화되는 바와 같은)의 발현에 비해 사실상 부분적이거나 절대적일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 이형접합성 연골무형성증이 있는 환자에게 투여시, 야생형 FGFR3을 암호화하는 mRNA 및 돌연변이된 FGFR3 다형체 또는 천연 변이체를 암호화하는 mRNA를 모두 표적화할 수 있으나, 상기와 같은 올리고뉴클레오티드는 각 표적의 발현을 다양한 정도로, 예를 들어 상기 돌연변이된 FGFR3 다형체 또는 변이체의 발현이 상기 야생형 FGFR3의 발현보다 더 큰 정도로 조절되도록 조절할 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어 G380R 치환(예를 들어, 서열번호 4 또는 SNP ID의 rs28931614, rs11943863 또는 rs17881656에 의해 암호화되는 바와 같은)을 포함하는 돌연변이된 FGFR3 다형체의 발현을 표적화하고 2, 4, 8, 10, 15, 25, 50, 75, 100 이상의 인자까지 감소시킬 수 있는 반면; 상기 동일한 올리고뉴클레오티드는 야생형 FGFR3(예를 들어, 서열번호 1에 의해 암호화되는 바와 같은)의 발현을 1, 2, 4, 5, 10, 15, 25, 50, 75, 100 이상까지 감소시킨다. 유사하게, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어 G380R 돌연변이(예를 들어, 서열번호 4 또는 SNP ID의 rs28931614, rs11943863 또는 rs17881656에 의해 암호화되는 바와 같은)를 포함하는 돌연변이된 FGFR3 다형체 또는 변이체의 발현을 표적화하고 약 1%, 2.5%, 5%, 10%, 20%, 35%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 이상까지 감소시킬 수 있는 반면; 상기 동일한 올리고뉴클레오티드는 야생형 FGFR3(예를 들어, 서열번호 1에 의해 암호화되는 바와 같은)의 발현을 약 1%, 2.5%, 5%, 10%, 20%, 35%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80% 또는 90%까지 감소시킨다. 본원은 또한 작용성 또는 야생형 FGFR3을 암호화하는 핵산에 대해 차별성에 근거하여 돌연변이된 FGFR3을 암호화하는 핵산을 표적화하고/하거나 상기 핵산에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오티드를 개시한다. 예를 들어, 이종접합성 연골무형성증 또는 암, 예를 들어 방광암이 있는 환자에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 돌연변이된 FGFR3 대립유전자의 발현을 표적화하고 작용성 또는 야생형 FGFR3 대립유전자의 발현에 비해 약 1%, 2.5%, 5%, 10%, 20%, 35%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 이상까지 감소시킬 수 있다. 한편으로, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 야생형 FGFR3 유전자 산물 또는 mRNA의 발현(예를 들어, 이종접합성 연골무형성증에 걸린 소아 환자에서) 대 돌연변이된 FGFR3 유전자 산물 또는 mRNA의 발현의 비를 증가시킬 수 있다. 일부 실시태양에서 상기 올리고뉴클레오티드, 접합체 및 약학 조성물은, 돌연변이를 암호화하지 않는 FGFR3의 발현에는 영향을 미치지 않거나 최소로 영향을 미치면서, 돌연변이된 FGFR3의 발현은 감소시키거나 달리 억제한다(예를 들어, 이종접합성 연골무형성증이 있는 환자의 대립유전자에서 FGFR3 G380R을 암호화하는 핵산(예를 들어, mRNA)을 우선적으로 표적화하고 상기 핵산에 하이브리드화함으로써).

일부 실시태양에서, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드는 FGFR3의 유전자 산물(즉, mRNA), 예를 들어 380번 위치에서 글리신의 아르기닌으로의 치환(예를 들어, 서열번호 4에 의해 암호화되는 바와 같은)을 포함하는 돌연변이된 FGFR3 다형체 또는 변이체에 의해 암호화되는 mRNA 유전자 산물에 하이브리드화한다. 다른 실시태양에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 돌연변이된 FGFR3 다형체 또는 변이체를 암호화하는 핵산의 유전자 산물(예를 들어, mRNA)에 하이브리드화하며, 이때 상기와 같은 FGFR3 다형체를 암호화하는 뉴클레오티드는 코돈 380의 1394번 위치에서 구아닌의 아데닌으로의 전이 치환을 포함한다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 돌연변이된 FGFR3 G380R 다형체 또는 변이체(예를 들어, 서열번호 4에 의해 암호화되는 바와 같은)를 암호화하는 핵산(즉, mRNA)의 유전자 산물에 특이적으로 하이브리드화할 수 있는 반면, 상기 동일한 올리고뉴클레오티드는 야생형 FGFR3(예를 들어, 서열번호 1에 의해 암호화되는 바와 같은)을 암호화하는 핵산(즉, mRNA)의 유전자 산물에는 하이브리드화하지 않는다. 상기 올리고뉴클레오티드의, 상기 돌연변이된 FGFR3 G380R 다형체를 암호화하는 핵산에의 상기와 같은 우선적인 또는 차별적인 하이브리드화는 상기 돌연변이 유전자 산물의 발현을 조절할 수 있는 반면, 상기 야생형 FGFR3 유전자 산물의 발현은 보존되거나 달리 변함없이 남아있는다. 예를 들어, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 서열번호 15 내지 20을 포함하는 핵산(또는 그의 단편)을 포함하거나 상기 핵산에 의해 암호화된 mRNA를 표적화하고, 상기와 같은 mRNA에 의해 암호화되는 단백질의 발현이 적어도 약 10%, 20%, 25%, 35%, 40%, 50%, 또는 바람직하게는 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 85%, 또는 가장 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100%까지 감소되고/되거나 억제되도록 상기 mRNA에 우선적으로 하이브리드화할 수 있다.

일부 실시태양에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 인간 FGFR3을 암호화하는 핵산(예를 들어, mRNA)(예를 들어, 임의의 변이체 및 그의 다형체를 포함하여, 수탁 번호 NM_000142에 의해 암호화된 FGFR3 mRNA)에 하이브리드화하며, 이때 상기와 같은 올리고뉴클레오티드는 다른 종의 FGFR3을 암호화하는 핵산에는 교차-하이브리드화하지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 인간 FGFR3 mRNA(예를 들어, 서열번호 1 및/또는 서열번호 4에 의해 암호화되는 바와 같은)를 표적화하고 이에 하이브리드화할 수 있으며 마우스 FGFR3 mRNA(예를 들어, 서열번호 7에 의해 암호화되는 바와 같은) 또는 래트 FGFR3 mRNA(예를 들어, 서열번호 8에 의해 암호화되는 바와 같은)에는 하이브리드화하지 않을 수 있다. 또한, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19 또는 서열번호 20을 포함하거나 이들에 의해 암호화되는 FGFR3 mRNA 표적 서열들 중 하나 이상에 우선적으로 하이브리드화하는 올리고뉴클레오티드를 고려한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 G380R 돌연변이를 암호화하는 인간 FGFR3 mRNA 또는 그의 단편(예를 들어, 수탁 번호 NM_000142에 의해 암호화된 FGFR3 mRNA)에 하이브리드화할 수 있는 반면, 마우스 또는 래트 FGFR3 유전자의 FGFR3 mRNA에는 교차-하이브리드화하지 않으며, 따라서 상기 표적화된 인간 FGFR3의 발현을 조절한다. 한편으로, 상기 동일한 올리고뉴클레오티드는 G380R 돌연변이를 암호화하는 FGFR3 다형체를 암호화하는 핵산에 특이적으로 하이브리드화할 수 있지만, 동일하거나 유사한 엄격성 조건하에 상기 G380R 돌연변이가 없거나 상기 돌연변이를 달리 암호화하지 않는 인간, 마우스 또는 래트 종의 야생형을 암호화하는 핵산에는 하이브리드화하지 않을 수도 있다.

또한, FGFR3의 이상 발현을 억제하는 방법 및 특히, 돌연변이된 FGFR3을 발현하는 세포(예를 들어, 연골세포 또는 방광 세포)에서 돌연변이된 FGFR3 유전자의 유전자 산물(예를 들어, FGFR3을 암호화하는 mRNA)의 이상 발현을 억제하는 방법을 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드, 접합체 또는 약학 조성물을 환자에게 투여하거나, 세포 또는 조직을, 상기와 같은 환자 또는 세포에서 FGFR3(예를 들어, G380R 돌연변이를 포함하는 FGFR3)의 발현을 억제하도록 상기와 같은 올리고뉴클레오티드, 접합체 또는 약학 조성물과 달리 접촉시킴을 포함한다.

또한, 약 8 내지 50개의 연속적인 단량체(예를 들어, 뉴클레오티드)의 제 1 영역을 포함하는 약 8 내지 50개 단량체의 올리고뉴클레오티드를 개시하며, 이때 상기와 같은 제 1 영역의 서열은 하나 이상의 선택된 표적 서열(예를 들어, 돌연변이된 FGFR3을 암호화하는 mRNA를 포함하는 표적 서열)에 80% 이상 일치한다(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상 일치한다). 일부 실시태양에서, 상기 선택된 표적 서열은 포유동물 FGFR3을 암호화하는 핵산(예를 들어, mRNA) 또는 그의 단편의 영역을 포함할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 8 내지 50개, 12 내지 30개 또는 12 내지 20개 뉴클레오티드 길이의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 추가로 제공한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 잠금 핵산(LNA) 잔기 또는 단량체 단위(예를 들어, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24 또는 서열번호 25)를 포함한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드가 2개 이상의 LNA 단량체 단위(예를 들어, 2개 이상의 β-D-옥시-LNA 단량체 단위)를 포함하는 경우, 상기와 같은 LNA 단량체 단위는 서로에 대해 연속적으로 배치되거나, 한편으로, 상기와 같은 LNA 단량체 단위는 서로에 대해 비-연속적으로 배치될 수 있다. 예를 들어, 본원은 서열번호 14를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 개시하며, 이때 상기 올리고뉴클레오티드는 FGFR3의 발현을 조절하고, 상기 올리고뉴클레오티드는 (a) 1번 위치의 구아닌 뉴클레오티드가 옥시-LNA이고; (b) 2 및 3번 위치 중 하나 이상의 아데닌 뉴클레오티드가 옥시-LNA이고; (c) 10 및 11번 위치 중 하나 이상의 시토신 뉴클레오티드가 옥시-LNA이고; (d) 12번 위치의 티민 뉴클레오티드가 옥시-LNA인 것으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 하나 이상의 잠금 핵산을 포함한다.

임의로, 상기와 같은 잠금 안티센스 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 당 치환, 예를 들어 2'-O-메톡시에틸 당 치환을 포함할 수 있다. 또한 본원은 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드들 중 하나 이상을 포함하는 접합체를 제공하며, 이때 상기와 같은 올리고뉴클레오티드는 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 공유적으로 부착되는 하나 이상의 비-뉴클레오티드 또는 비-폴리뉴클레오티드 부분을 포함한다.

본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 및 접합체 중 하나 이상, 및 약학적으로 허용되는 희석제, 담체, 용매, 염 또는 보조제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 또한 본 발명의 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 상기와 같은 약학 조성물을, 예를 들어 작용 표적 부위에 직접 주사 또는 주입에 의해 비경구적으로 투여하거나, 흡입, 복강내, 국소 또는 경구에 의해 투여할 수도 있다.

추가로, 세포 또는 조직에서 이상 발현된 FGFR3의 발현을 하향-조절하고(예를 들어, mRNA 수준에서), 특히 FGFR3의 돌연변이체 또는 천연 변이체(예를 들어, G380R, 또는 암, 예를 들어 방광암을 특성화하는 돌연변이)의 발현을 하향-조절하는 방법을 제공한다. 상기와 같은 방법은 상기 세포 또는 조직을 시험관내 또는 생체내에서 유효량의 본 발명의 올리고뉴클레오티드, 접합체 및 조성물 중 하나 이상과 접촉시킴을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 및 조성물은 포유동물(예를 들어, 암, 예를 들어 방광암 또는 이종접합성 연골무형성증을 앓고 있거나 달리 상기 질병에 걸린 인간 환자)에서 돌연변이되거나 이상 발현된 FGFR3의 발현을 하향-조절할 수 있는 반면, 정상적으로 기능하거나 야생형인 대립유전자의 발현은 조절하지 않거나 달리 영향을 미치지 않는다.

또한, FGFR3의 이상 발현 또는 과-발현과 관련된 질병 또는 상태를 갖는 것으로 의심이 가거나 상기 질병 또는 상태에 민감한 동물(예를 들어, 비-인간 동물 또는 인간)에게 치료학적 또는 예방학적 유효량의 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드, 접합체 및 약학 조성물 중 하나 이상을 투여함으로써 상기 동물을 치료하는 방법을 개시한다. 더욱 또한, 본원은 돌연변이되거나 이상 발현된 FGFR3(예를 들어, FGFR3의 돌연변이된 또는 천연 변이체)의 발현을 억제하고, FGFR3의 이상 발현 또는 활성과 관련된 질병의 치료를 위해서 올리고뉴클레오티드를 사용하는 방법을 제공한다.

또한, FGFR3의 이상 발현과 관련된 상태(예를 들어, 암 또는 이형성증, 예를 들어 연골무형성증)의 치료 방법을 제공한다. 또한, 본 발명의 올리고뉴클레오티드들 중 하나 이상을, FGFR3을 이상 발현하는 연골세포로 전달하거나 상기 세포와 접촉시킴을 포함하는, 연골세포 기능의 복원 방법을 제공한다. 상기 특허청구된 방법이 상기 올리고뉴클레오티드를 상기 연골세포에 도입시키는 조건은 상기 연골세포에서 이상 FGFR3 발현을 감소시키고, 이에 의해 정상적인 세포 기능을 복원시키기에 충분하다. 일부 실시태양에서, 상기와 같은 방법은 mRNA 수준에서 코돈 380의 1138번 위치(서열번호 4에 의해 암호화된 서열의 뉴클레오티드 1394번 위치에 상응한다)에 구아닌의 아데닌으로의 전이 치환을 포함하는 FGFR3 돌연변이체, 다형체 또는 천연 변이체의 발현을 우선적으로 감소시킨다. 본 발명은 암, 예를 들어 방광암 또는 연골무형성증과 같은 질병의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 유효량의 하나 이상의 올리고뉴클레오티드, 접합체 또는 그의 약학 조성물을 이를 필요로 하는 환자(예를 들어, 연골무형성증에 걸린 인간 소아 환자)에게 투여함을 포함한다. 본 발명은 세포 또는 조직에서 돌연변이되거나 이상 발현된 FGFR3의 발현을 (예를 들어, 하향-조절함으로써) 억제시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 세포 또는 조직을 유효량의 하나 이상의 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드, 또는 그의 접합체 또는 약학 조성물과 접촉시켜, 상기 돌연변이되거나 이상 발현된 FGFR3의 발현을 (예를 들어, mRNA 수준에서) 하향-조절하는 단계를 포함한다.

본 발명의 상기 논의된 특징들 및 수반되는 이점들, 및 다수의 다른 특징들 및 수반되는 이점들은 첨부되는 실시예들과 함께 하기 본 발명의 상세한 설명을 참조하여 보다 양호하게 이해될 것이다.

도 1a 및 1b는 FGFR3 G380R 돌연변이를 암호화하는 뉴클레오티드를 포함하고 둘러싸는 영역의 부분들에 상보성인 21개의 상이한 올리고뉴클레오티드로 형질감염된 A549 세포에서 플래그-태그된 야생형(WT) 및 돌연변이(MUT) 리포터 수준을 예시한다. 인간 A549 세포를 각각의 올리고뉴클레오티드 및 WT 또는 MUT 리포터 구조물로 동시-형질감염시켰다. 이어서 상기 세포를 형질감염 후 24시간째에 수확하고, 상기 플래그-태그된 리포터 전사물의 수준을 리포터-특이성 정량적 PCR 분석을 사용하여 측정하였다. 상기 결과를 모의-처리된 샘플의 백분율로서 나타낸다. 상기 결과를 올리고뉴클레오티드당 3개의 독립적인 연구들의 평균으로서 기록하고, 오차 막대는 표준 편차를 가리킨다. 도 1a 및 1b 모두에 예시된 바와 같이, 21개의 시험 올리고뉴클레오티드들은 각각 WT 리포터 구조물에 비해, MUT 리포터 구조물의 감소된 발현 및 우세하게 표적화됨을 나타내었다.
도 2a 및 2b는 FGFR3 G380R 돌연변이를 암호화하는 뉴클레오티드를 포함하고 둘러싸는 영역의 부분들에 상보성인 올리고뉴클레오티드에 의한 48시간의 짐노틱(gymnotic) 처리를 겪은 인간 A549 세포에서 플래그-태그된 야생형(WT) 및 돌연변이(MUT) 리포터 구조물 수준을 예시한다. 상기 인간 A549 세포를 상기 올리고뉴클레오티드에 의한 짐노틱 처리에 따라 상기 WT 또는 MUT 리포터 구조물로 형질감염시켰다. 이어서 상기 세포를 형질감염후 24시간째에 수확하고, 상기 플래그-태그된 리포터 전사물의 수준을 리포터-특이성 정량적 PCR 분석으로 측정하였다. 상기 결과를 모의-처리된 샘플의 백분율로서 기록하고 올리고뉴클레오티드당 3개의 독립적인 연구의 평균으로서 기록한다. 묘사된 오차 막대는 표준 편차를 가리킨다. 도 2a 및 2b 모두에 예시된 바와 같이, 21개 올리고뉴클레오티드는 WT 리포터에 비해 현저한 용량 반응을 갖는 상기 MUT 리포터 구조물의 확고한 녹-다운을 입증하였다.
도 3은 FGFR3 G380R 돌연변이를 포함하고 둘러싸는 영역의 상이한 부분들에 상보성인 10개 올리고뉴클레오티드 각각으로 형질감염된 HeLa 세포에서 플래그-태그된 야생형(WT) 및 돌연변이(MUT) 리포터 수준을 예시한다. 상기 올리고뉴클레오티드를 0.2 nM, 1.0 nM 및 5.0 nM의 초기 선별 농도에서 평가하였다. 상기 HeLa 세포를 올리고뉴클레오티드 및 상기 WT 또는 MUT 리포터 구조물로 동시-형질감염시켰다. 이어서 상기 세포를 형질감염 후 24시간째에 수확하고, 상기 리포터 구조물의 수준을 리포터-특이성 정량적 PCR 분석을 사용하여 측정하였다. 상기 결과를 올리고뉴클레오티드당 3개의 독립적인 연구들의 평균으로서 기록하고, 오차 막대는 표준 편차를 가리킨다. 도 3에 예시된 바와 같이, 10개의 올리고뉴클레오티드들은 모두 WT 리포터 구조물에 비해, 평가된 농도 범위에서 MUT 리포터 구조물의 용량-의존적인 녹-다운을 생성시키는 것으로 밝혀졌다.
도 4는 FGFR3 G380R 돌연변이를 암호화하는 뉴클레오티드를 포함하고 둘러싸는 영역의 부분들에 상보성이도록 설계된 선택된 올리고뉴클레오티드에 대한 최대 절반 억제 농도(IC₅₀) 곡선을 예시한다. 상기 플래그-태그된 야생형(WT) 또는 돌연변이(MUT) 리포터 구조물 및 10개의 올리고뉴클레오티드 중 하나를 인간 A549 세포에서 동시-형질감염시켰다. 이어서 상기 세포를 수확하고 형질감염에 이어서 24시간째에 리포터-특이성 정량적 PCR을 위해 RNA 추출하였다. 플롯팅된 데이터 점들은 3개의 독립적인 실험들의 평균 리포터 신호를 나타내고 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 회색 곡선은 상기 WT 리포터의 정합된 반응 곡선을 나타내고 흑색 곡선은 상기 MUT 리포터의 정합된 반응 곡선을 나타낸다. 각 곡선에 대한 상응하는 IC₅₀ 값을 각 그래프 및 또한 표 2에 나타낸다.
도 5a 및 5b는 각각 관련되지 않은 SCA3 및 PTEN 표적에 대한 FGFR3 G380 돌연변이를 암호화하는 뉴클레오티드를 포함하고 둘러싸는 영역의 부분들에 상보성인 10개 올리고뉴클레오티드 각각의 특이성을 예시한다. 상기 10개 올리고뉴클레오티드들을 각각 형질감염에 의해 인간 A549 세포로 전달하였다. 이어서 상기 인간 A549 세포를 수확하고 SCA3 또는 PTEN mRNA의 녹-다운에 대해 정량적인 PCR에 의해 시험하였다. 상기 결과를 예비-선도 올리고뉴클레오티드당 3개의 독립적인 연구들의 평균으로서 나타낸다. 오차 막대는 상기 올리고뉴클레오티드당 3개 연구의 표준 편차를 나타낸다. 도 5a 및 5b에 예시된 바와 같이, 비-특이성 SCA3 및 PTEN 표적에 대한 상기 10개 올리고뉴클레오티드 각각의 영향은 상기 FGFR3 표적에 대한 영향보다 현저하게 더 낮다.
도 6은 상기 FGFR3 G380 돌연변이를 암호화하는 뉴클레오티드를 포함하고 둘러싸는 영역의 부분들에 상보성인 10개 올리고뉴클레오티드 각각의 혈장 안정성을 예시한다. 상기 10개 올리고뉴클레오티드 각각을 37 ℃에서 마우스 혈장 중에서 96시간 이하로 배양하였다. 샘플을 24시간 마다 취하고 PAGE에 의해 분석하였다. 상기 10개 올리고뉴클레오티드 각각의 혈장 안정성이 예상된 범위내에 잘 있는 것으로 밝혀졌으며, 특히 상기 10개 올리고뉴클레오티드가 모두 96시간을 초과하는 전체적인 반감기를 갖는 것으로 밝혀졌다. 도 6에 예시된 바와 같이, 상기 10개 올리고뉴클레오티드의 대부분은 어떠한 인지 가능한 분해 산물도 생성시키지 않았다.
도 7은 상기 FGFR3 G380 돌연변이를 암호화하는 뉴클레오티드를 포함하고 둘러싸는 영역의 부분들에 상보성인 올리고뉴클레오티드를 14일까지 3일마다 마우스에게 투여한 16-일 생체내 관용 연구의 결과를 예시한다. 상기 마우스를 죽이고 16일째에 평가하였다. 대조군은 염수 대조군을 투여한 마우스를 포함하였다. 5개의 선택된 올리고뉴클레오티드(각각 서열번호 21, 22, 23, 24 및 25에 상응하는 SH02, SH13, SH19, SH20 및 SH21)는 간 효소 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) 및 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(AST)의 허용되는 상승을 생성시켰다.

본원에 개시된 올리고뉴클레오티드는 FGFR3의 발현을 조절할 수 있는 특수 치료 도구를 제공한다. 일부 실시태양에서, 본원에 개시된 짧은(예를 들어, 대개는 약 50, 40, 30, 20, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 10, 8개 이하의 뉴클레오티드 길이) 단일-가닥 합성 올리고뉴클레오티드는 상기 FGFR3 RNA 표적 서열(예를 들어, 예비-mRNA 또는 mRNA)에 상보성인 염기 서열을 가지며 수소 결합된 염기 짝짓기에 의해 하이브리드 듀플렉스를 형성한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 FGFR3을 암호화하는 핵산(예를 들어, FGFR3을 암호화하는 mRNA) 또는 그의 단편(예를 들어, 서열번호 5 또는 6)을 표적화하거나 상기 핵산 또는 그의 단편에 상보성일 수 있으며 이에 의해 FGFR3의 발현을 조절할 수 있다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 예비-mRNA의 가공 또는 mRNA의 번역에 관련된 효소들의 입체적 차단 또는 절단 작용 방식에 의해 작용할 수 있다. 상기 하이브리드화는 발현(즉, 표적 mRNA 암호의 그의 단백질 산물로의 번역)을 방지하고, 따라서 상기 단백질 산물의 후속 영향을 차단하는 것으로 예상될 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드 및 방법을 사용하여 FGFR3의 이상 발현과 관련된 하나 이상의 상태(예를 들어, 질병 또는 증후군), 예를 들어 암, 예를 들어 방광암, 골격이형성증, 예를 들어 연골무형성증, 연골저형성증 및 치사성 이형성증(I형 및 II형)을 개선시키거나 치료할 수 있다.

인간 왜소증 중 가장 흔한 형태인 연골무형성증은 FGFR3 유전자의 막관통 도메인 중의 점 돌연변이에 의해 야기된다. 연골저형성증 및 치사성 이형성증(I형 및 II형)도 또한 상기 FGFR3 유전자에서의 단일 돌연변이에 기인한다. 병든 환자에서, 신체 비율 및 신체적 특징은 출생시 비정상이며, 상기 비율 및 특징은 대부분의 경우에 출생시 또는 출생 직후 진단 기준을 형성한다. 왜소증의 징후는 나이에 따라 꾸준히 더 명백해진다. 전반적으로, 대부분의 환자는 비교적 정상적인 생활을 하며, 심혈관 합병증, 척수 폐쇄 및 상기도 폐쇄가 가장 심한 결과이다. 연골무형성증의 발병률은 정상 출산 110,000건 중 약 1 내지 130,000건 중 약 1이다.

이종접합성 연골무형성증의 임상적 특징은 환자들 가운데에서 매우 일관되며, 사지의 근위 단축, 중앙안면 저형성증, 척추의 간격 좁아짐 및 상대적인 대두증을 포함한다. 최종적인 연골무형성증 성인 신장 범위는 112 내지 145 ㎝이다. 조직학적으로, 연골무형성증 환자의 골단판 및 성장판 연골은 정상이다. 그러나, 상기와 같은 환자의 형태측정 검사는 상기 성장판이 정상보다 짧고 상기 단축이 이종접합성 연골무형성증에서보다 동종접합성에서 더 큰 것을 밝혔으며, 이는 유전자량 효과를 암시한다. 연골무형성증 환자의 척추간 기질은 정상보다 더 풍부하며 일부의 경우에 상기 연골의 혈관화 및 가로 터널링(혈관의 내측성장)의 집중이 관찰되었다. 또한, 현저한 골막성 골 형성이 관찰되었다. 연골무형성증의 근원적인 기전은 장골 성장판 연골세포의 성숙 결함인 것으로 여겨진다.

상기 성장판에서 FGFR3 유전자의 역할은 고유 성장률의 음의 조절 중 하나인 것으로 보인다. 특히, (예를 들어, 유전자 녹-아웃에 의해) FGFR3 삭제 대립유전자에 대해 동형접합성인 마우스는 척추후만증, 척추측만증, 장골의 과잉성장 및 성장판의 비후성 대역의 확대를 나타낸다. 이러한 표현형은 관상 장골의 성장판 및 두개골 봉합부에서 연골세포 증식(상부-비후성 세포) 및 최종 분화(하부-비후성 세포)의 조절에서 FGFR3의 역할과 일치한다.

연골무형성증은 상염색체 우성 방식으로 유전되며, FGFR3의 발현에서 기능획득 돌연변이에 의해 야기될 수 있다. 보고서들은 연골무형성증 환자가 염색체 4p16.3에 위치한 FGFR3의 돌연변이를 가질 수 있음을 입증하였다. 상기 FGFR3 유전자의 돌연변이들 중 2개는 연골무형성증 사례의 99%를 초과하여 야기하는 것으로 입증되었다. 이들 2개의 돌연변이 중에서, 약 97%는 FGFR3 유전자의 엑손 8에서의 G1138A 돌연변이와 관련되며, 약 2.5%는 FGFR3 유전자의 엑손 8에서의 G1138C 돌연변이와 관련된다. 상기 G1138A 돌연변이를 또한, FGFR3 NM_000142.4(서열번호 1)에 대한 현행 진뱅크 목록에 대해 지도화하는 경우 1394 G>A 돌연변이로서, 또는 구식 진뱅크 목록 NM_000142.1에 대해 지도화하는 경우 1138 G>A로서 칭한다. 후자의 명명법은, 구식이기는 하지만, 현대의 공보를 포함하여, 대부분의 문헌에서 유지된다. 상기 1394 및 1138번 위치는 본원에서 호환적으로 사용된다. 상기 G1138A 및 G1138C 돌연변이는 상기 FGFR3 아미노산 서열에서 380번 위치 코돈에서 글리신의 아르기닌으로의 아미노산 변화(때때로 "G380R" 돌연변이라 칭한다)를 생성시킬 수 있다. FGFR3에서의 다른 질병 유발 돌연변이는, FGFR3의 막관통 도메인 중에 있는 Gly 375의 Cys로의 돌연변이, 및 FGFR3의 Ig3-TM 링커 영역내의 Gly346의 Glu로의 돌연변이를 포함한다.

연골무형성증 외에, FGFR3의 발현 수준의 변화 및 돌연변이는 방광암과 강하게 상관되는 것으로 나타났다. 낮은 등급의 비-근육 침습성 유두상 방광 종양의 약 75%는 FGFR3 중에 활동성 돌연변이를 함유하는 것으로 나타났다. 근육 침습성 종양에서, FGFR3의 활동성 돌연변이의 우세는 보다 낮지만(20%), FGFR3의 발현 수준은 종양의 50%에서 증가되며, 이는 보다 높은 FGFR3 활성을 도출한다. FGFR3의 활동성 돌연변이 또는 증가된 발현수준과 종양 형성간의 상관성은, 암세포 증식이 FGFR3 활성의 증가에 의해 구동된다는 모델을 지지한다. 이는 FGFR3에 대한 소분자 억제제 및 항체가 방광암의 시험관내 모델에서 세포 증식을 감소시킬 수 있고 방광암의 설치류 모델에서 종양 크기를 현저하게 감소시킬 수 있다는 시험관내 및 생체내 실험에 의해 지지된다.

방광암의 치료는 현재 종양 절제술을 기본으로 하는데, 상기 방법은 높은 재발률이 몹시 문제가 되며, 상기 암을 진행 및 전이에 이르게 한다. 상기 절제술은 종종 화학요법이 이어지며, 상기 암이 근육을 침습하는 경우, 상기 방광의 제거가 이어진다. FGFR3-지시된 요법에 의한 상기 암의 낭내 치료는 종양 절제술의 필요성을 감소시키거나 제거하고 암 진행 및 전이의 비율을 감소시킬 수 있다.

다수의 특정한 FGFR3 돌연변이, 예를 들어 하기 표에 나타낸 것들이 방광암의 임상적 단리물에서 확인되었다. 일반적으로, 이들 돌연변이는 활동성 돌연변이이며, FGFR3의 이량체화, FGFR3에 의한 활성화 또는 신호전달에 영향을 미치고 종종 종양 세포의 리간드 독립적인 성장을 생성시킨다. FGFR3-지시된 안티센스 올리고뉴클레오티드를, 야생형 FGFR3 기능의 상실을 통해 매개되는 부작용을 최소화하기 위해서 특정한 돌연변이들에 대해 사용하거나, 상기 돌연변이로부터 먼 전사물 중의 부위에 대해 사용하여, 상기 돌연변이가 암을 소분자 또는 항체에 내성으로 만드는 상기 암의 치료를 허용할 수 있게 한다.

본원에 개시된 올리고뉴클레오티드, 약학 조성물 및 방법을 사용하여, 이상 FGFR3 핵산 분자의 발현 또는 기능을 감소시킴으로써 암, 예를 들어 방광암 또는 골격 이형성증, 예를 들어 연골무형성증을 개선시키거나 치료할 수 있다.

올리고뉴클레오티드

일부 실시태양에서, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드는 이상 발현된 FGFR3을 암호화하는 핵산(예를 들어, 서열번호 4에서 제공된 바와 같은 FGFR3을 암호화하는 mRNA 및/또는 서열번호 5 및 서열번호 6에 제공된 바와 같은 그의 단편) 및 상기와 같은 핵산의 천연 변이체를 표적화하며, 이에 의해 FGFR3의 발현을 조절한다. 본 발명에 사용되는 바와 같이, "올리고뉴클레오티드"란 용어는 2개 이상의 뉴클레오티드의 공유 결합에 의해 형성된 분자를 지칭한다. 올리고뉴클레오티드란 용어는 일반적으로 올리고뉴클레오시드, 올리고뉴클레오티드 유사체, 올리고뉴클레오티드 모방물질 및 이들의 키메릭 조합을 포함한다. 본 발명과 관련하여, 단일 뉴클레오티드 단위는 또한 단량체 또는 단위로서 지칭될 수 있다. 일부 실시태양에서, "뉴클레오시드", "뉴클레오티드", "단위" 및 "단량체"는 호환적으로 사용된다. 뉴클레오티드 또는 단량체의 서열을 지칭하는 경우, 상기는 염기, 예를 들어 A, T(또는 U), G 또는 C의 서열을 지칭하는 것으로 인식될 것이다.

일부 실시태양에서, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드는 안티센스 작용 기전을 통해 핵산 분자의 발현을 조절(예를 들어, 이상 발현된 FGFR3의 발현을 조절)하는데 유용하다. 상기 조절은, 예를 들어 하나 이상의 표적 핵산 분자, 예를 들어 mRNA(예를 들어, 서열번호 4)에 상보성이고/이거나 상기 분자에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오티드를 제공함으로써 수행될 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산의 특정한 영역(예를 들어, G380R 돌연변이를 암호화하는 FGFR3 mRNA의 영역)에 상보성이다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산의 특정한 영역(예를 들어, G380R 돌연변이를 암호화하는 FGR3 mRNA의 영역)에 하이브리드화할 수 있다.

본 발명에 사용되는 바와 같이, "표적 핵산"이란 어구는 DNA 및 상기와 같은 DNA로부터 전사되는 RNA(예비-mRNA 및 mRNA 또는 그의 일부 포함) 및 또한 상기와 같은 RNA로부터 유래되는 cDNA를 포함하고자 한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, "표적 핵산"이란 어구는 FGFR3을 암호화하는 핵산(예를 들어, mRNA), 또는 특히 돌연변이되거나 이상 발현된 FGFR3을 암호화하는 핵산을 지칭하는데 사용된다. 본 발명에 사용되는 바와 같이, "유전자 산물"이란 용어는 유전자 또는 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA)의 발현으로부터 생성되는 임의의 생화학적 물질을 지칭하며, 비제한적으로 mRNA, RNA 및/또는 단백질을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 상기 FGFR3 유전자에 관하여 사용될 때 상기 유전자 산물이란 어구는 FGFR3에 의해 암호화된 mRNA를 지칭한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 표적 핵산은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19 및 서열번호 20으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함한다. 다른 실시태양에서, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19 및/또는 서열번호 20 중 하나 이상을 포함하는 핵산 서열에 상보성이고/이거나 상기 서열에 하이브리드화한다.

일부 실시태양에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 화합물은 하나 이상의 표적 핵산(예를 들어, FGFR3을 암호화하는 mRNA)에 상보성이고 상기 표적화된 핵산의 통상적인 기능을 (예를 들어, 안티센스 작용 기전에 의해) 방해한다. 이는 일반적으로 "안티센스"라 지칭되는 것에 특이적으로 하이브리드화하는 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 의해 표적 핵산의 기능을 방해하거나 조절한다. 방해받는 DNA의 기능은 복제 및 전사를 포함할 수 있다. 방해받는 RNA의 기능은, 예를 들어 상기 RNA의 단백질 번역 부위로의 전좌, 상기 RNA로부터의 단백질의 번역, 하나 이상의 mRNA 종을 제공하기 위한 상기 RNA의 연접, 및 상기 RNA에 의해 참여되거나 촉진될 수 있는 촉매 활성과 같은 기능들을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 표적 핵산 기능을 방해하는 전반적인 효과는 상기와 같은 표적 핵산의 산물(예를 들어, FGFR3)의 발현 조절이다.

본 발명에 사용되는 "안티센스 화합물" 또는 "안티센스 올리고뉴클레오티드"란 어구들은 핵산 분자, 및 특히 표적 핵산, 예를 들어 이상 발현된 단백질 또는 효소를 암호화하는 mRNA의 영역에 적어도 부분적으로 상보성(예를 들어, 100%, 약 99%, 98%, 97.5%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55% 또는 50% 상보성)인 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 일부 실시태양에서, 상기 안티센스 화합물 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산에 하이브리드화하여, 이에 의해 그의 발현을 조절할 수 있다. 결과적으로, 모든 안티센스 화합물이 올리고뉴클레오티드라고 말할 수 있지만, 모든 올리고뉴클레오티드가 안티센스 화합물인 것은 아니다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 약 8 내지 50개 뉴클레오티드 길이, 예를 들어 8 내지 30개 뉴클레오티드 길이의 연속적인 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나 상기 서열을 포함한다. 다양한 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 RNA 단위 또는 단량체를 포함하지 않고, 오히려, 예를 들어 DNA 단위 또는 단량체 및/또는 일부의 경우에 LNA 단위 또는 단량체를 포함한다. 본 발명에 따른 화합물은 선형 분자이거나 선형 분자로서 합성되는 것이 바람직하다. 일부 실시태양에서 상기 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 분자이고, 바람직하게는 동일한 올리고뉴클레오티드(즉, 듀플렉스)내 동등한 영역에 상보성인 짧은, 예를 들어 3, 4 또는 5 이상의 연속적인 뉴클레오티드 영역은 포함하지 않는다. 이에 관하여, 상기 올리고뉴클레오티드는 필수적으로 이중 가닥은 아니다.

표적 서열

몇몇 실시태양에서, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드는 상기 FGFR3의 발현을 조절하거나, 일부 실시태양에서 하향-조절(예를 들어, 감소 또는 제거)할 수 있다(예를 들어, mRNA 수준에서 이상 발현된 FGFR3을 하향-조절할 수 있다). 이에 관하여, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 포유동물 세포, 예를 들어 인간 세포(예를 들어, A549 세포, HeLa 세포, 방광 세포 또는 연골세포)에서 FGFR3의 억제에 영향을 미칠 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산(예를 들어, 돌연변이되거나 이상 발현된 FGFR3 mRNA)에 하이브리드화하고 통상 발현 수준(예를 들어, 상기 올리고뉴클레오티드 또는 접합체 부재하에의 수준)에 비해 적어도 10% 또는 20%의 발현의 억제 또는 감소에 영향을 미친다. 예를 들어, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드는 FGFR3 돌연변이 대립유전자를 갖는 개인에서 나타나는 FGFR3의 통상적인 발현 수준에 비해 FGFR3의 발현의 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97.5%, 98%, 99% 또는 100%의 감소 또는 억제에 영향을 미칠 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기와 같은 조절은 표적화된 세포 또는 조직을 약 0.04 nM 내지 25 nM의 농도(예를 들어, 약 0.8 nM 내지 20 nM의 농도)의 본 발명의 화합물에 노출시킬 때 뚜렷하다. 상기 동일한 또는 상이한 실시태양에서, 상기 표적 핵산(예를 들어, 돌연변이된 FGFR3을 암호화하는 mRNA)의 발현의 억제는 100% 미만(예를 들어, 약 98% 미만의 억제, 약 95% 미만의 억제, 약 90% 미만의 억제, 약 80% 미만의 억제 또는 약 70% 미만의 억제)이다. 일부 실시태양에서, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드는 mRNA 수준에서 FGFR3의 발현을 조절할 수 있다(예를 들어, 돌연변이되거나 이상 발현된 FGFR3을 암호화하는 mRNA를 표적화하고 이에 하이브리드화함으로써). (예를 들어, mRNA 수준에서) 발현의 조절은 단백질 수준 또는 농도를 측정함으로써 측정될 수 있다(예를 들어, 표적 단백질에 대해 발생된 적합한 항체를 사용하여 SDS-PAGE에 이어서 웨스턴 블럿팅에 의해). 한편으로, (예를 들어, mRNA 수준에서) 발현의 조절은 mRNA의 수준 또는 농도를 측정함으로써 측정할 수 있다(예를 들어, 노던 블럿팅 또는 정량적인 RT-PCR에 의해서). mRNA 수준 또는 농도의 평가를 통해 발현을 측정하는 경우, 올리고뉴클레오티드의 적합한 투여량 또는 농도(예를 들어, 약 0.04 nM 내지 25 nM, 또는 약 0.8 nM 내지 20 nM)를 사용하는 경우의 하향-조절 정도는 본 발명의 올리고뉴클레오티드, 접합체 또는 조성물의 부재하에 관찰된 통상적인 수준 또는 농도에 비해 약 10% 초과, 약 10 내지 20%, 약 20% 초과, 약 25% 초과 또는 약 30% 초과일 수 있다.

본 발명과 관련하여, "조절하는" 또는 "조절"이란 용어는 유전자 또는 유전자 산물(예를 들어, FGFR3 mRNA)의 발현의 증가(예를 들어, 자극 또는 상향조절), 유전자 또는 유전자 산물(예를 들어, FGFR3 mRNA)의 발현의 감소(예를 들어, 하향조절 또는 억제), 및 2개 이상의 유전자 산물들간의 상대적인 발현의 변화(예를 들어, 야생형 FGFR3의 발현에 비해 돌연변이 FGFR3의 발현의 감소) 중 하나 이상을 의미할 수 있다. 본원에 개시된 일부 상황에서, 하향조절 및 억제가, 특히 돌연변이된 FGFR3의 발현을 조절함과 관련되므로 바람직한 조절의 형태들이다. 본원에 개시된 일부 상황에서, "발현"이란 용어는 유전자 또는 핵산(예를 들어, DNA)으로부터의 정보가 유전자 산물(예를 들어, mRNA, RNA 및/또는 단백질)의 합성에 사용되는 과정을 의미하며, 비제한적으로 복제, 전사 및 번역 단계 중 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 의해 조절될 수 있는 발현의 단계는, 예를 들어 단백질의 전사, 연접, 번역 및 번역후 변형을 포함할 수 있다.

"FGFR3"이란 용어는 표적화, 조절 및 발현과 관련될 때, 섬유아세포 성장 인자 수용체 유형 3 유전자 또는 그의 유전자 산물(예를 들어, 예비-mRNA, 성숙 mRNA, cDNA 또는 단백질)을 광범위하게 지칭할 수 있으며, 돌연변이된 및 야생형 형태 모두, 이들의 동형 및 변이체(예를 들어, 인간 FGFR3을 암호화하고 FGFR3 단백질을 암호화하는 핵산)를 포함할 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이 이탤릭체 용어 "FGFR3"은 전형적으로 FGFR3 유전자를 지칭한다. FGFR3을 개시함에 따른 "야생형"이란 용어는 피실험자 또는 집단에서 가장 흔하게 관찰되는 FGFR3 대립유전자, 뉴클레오티드 서열, 아미노산 서열, 또는 표현형을 지칭한다. 예를 들어, 이종접합성 연골무형성증 환자에서 G380R 돌연변이된 FGFR3 대립유전자에 비해, 상기 "야생형"이란 용어는 G380R 돌연변이를 포함하지 않는 나머지 대립유전자를 지칭한다. FGFR3을 개시함에 따른 "돌연변이된"이란 용어는 피실험자 또는 집단에서 변경된 대립유전자, 뉴클레오티드 서열, 아미노산 서열, 또는 표현형, 예를 들어 유전 물질(예를 들어, DNA 또는 RNA)의 단일 염기 뉴클레오티드의 또 다른 뉴클레오티드로의 치환을 생성시키는 전이 및 전환 점 돌연변이를 지칭한다. 돌연변이의 일례는 인간 FGFR3의 암호화 영역의 1138번 위치에서의 G의 A로의 전이 치환(인간 FGFR3(NM_000142)의 1394번 위치에 상응하며, 동일한 G의 A로의 전이 치환을 포함하는 임의의 변이체 및 그의 다형체를 포함한다)이며, 이는 380번 위치 코돈을 GGG(아르기닌 또는 R을 암호화한다)에서 AGG 또는 CGG(글리신 또는 G를 암호화한다)로 변화시키며, 따라서 상기 돌연변이를 기술하기 위해서 참조부호 "G380R"을 사용한다. 상기 돌연변이에 대한 SNP ID는 SNP rs28931614이다.

구체적으로 FGFR3과 관련하여, "발현을 조절하는"이란 어구는 FGFR3 유전자의 유전자 산물(예를 들어, 야생형 및/또는 돌연변이된 FGFR3의 유전자 산물)의 자극, 상향조절, 하향조절 및/또는 억제를 의미한다. 예를 들어, 이상 발현된 FGFR3을 암호화하는 핵산(예를 들어, mRNA)을 표적화하고 상기와 같은 핵산(예를 들어, FGFR3을 암호화하는 mRNA)에 특이적으로 하이브리드화하는 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 FGFR3 발현을 조절할 수 있다. 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드는 이종접합성 연골무형성증이 있는 환자에서 야생형 및 돌연변이된 FGFR3 모두의 발현을 조절할 수 있다. 한편으로, 바람직한 실시태양에서, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드는 돌연변이 FGFR3의 발현을 우선적으로 하향조절하거나 억제할 수 있다(예를 들어, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드는 상기 FGFR3 G380R 돌연변이에 의해 야기된 이종접합성 연골무형성증이 있는 환자에서 상기 G380R 돌연변이 FGFR3의 발현을 조절할 수 있다).

일부 실시태양에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 특정한 핵산을 표적화할 수 있다. 본원에 개시된 안티센스 올리고뉴클레오티드와 관련하여 특정 핵산에 대한 표적화는 다단계 과정일 수 있다. 상기 과정은 대개 조절되어야 하는 기능을 갖는 핵산 서열의 확인으로 시작한다. 상기 핵산은, 예를 들어 특정 질환 또는 질병 상태(예를 들어, 연골무형성증)와 관련된 발현을 갖는 핵산(예를 들어, mRNA)일 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 표적 핵산(예를 들어, mRNA)은 FGFR3을 암호화한다. 예를 들어, 상기 표적 핵산은 G380R FGFR3 돌연변이를 암호화하는 핵산의 영역 또는 단편을 포함할 수 있으며, 상기와 같은 영역을 표적화하는 올리고뉴클레오티드는 상기 FGFR3 mRNA를 암호화하는 핵산에 상보성이고/이거나 하이브리드화한다. 한편으로, 일부 실시태양에서 상기 표적 핵산은 상기 G380R 돌연변이를 암호화하는 FGFR3 유전자(또는 그의 상응하는 mRNA 유전자 산물)의 특정 영역을 암호화한다. 상기 표적화 과정은 또한 하나 이상의 목적하는 효과가 생성되도록 안티센스 상호작용을 발생시키기 위한 상기 표적 유전자내 부위 또는 부위들의 결정을 포함할 수 있다. 상기 하나 이상의 목적하는 효과는, 예를 들어 유전자 산물(예를 들어, 야생형 및/또는 돌연변이 mRNA 또는 단백질)의 발현의 조절, 동일한 유전자 또는 mRNA 또는 다른 유전자 또는 mRNA상의 다른 부위들에 비해 표적 부위에 대한 선택적인 결합(예를 들어, 증가된 결합 친화성), 표적으로의 충분한 또는 향상된 전달, 및 최소의 불필요한 부작용 또는 부작용 없음을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 바람직한 표적화된 핵산 또는 mRNA 부위는 상기 FGFR3 G380R 돌연변이 및/또는 상기와 같은 G380R 돌연변이를 둘러싸거나 이에 인접한 영역을 암호화한다. 특히, 바람직한 부위는 FGFR3의 코돈 380의 1138번 위치의 구아닌의 아데닌 뉴클레오티드로의 돌연변이를 포함한다.

상기 G380R 돌연변이는 연골무형성증의 발생에 원인이 되는 가장 통상적인 돌연변이를 나타낸다. 상술한 바와 같이, 상기 "G380R"이란 용어는 상기 FGFR3 단백질의 코돈 380에서 글리신(G) 대신 아르기닌(R)을 치환시키는 점 돌연변이를 지칭한다. 본 발명의 일부 상황에서, "G380R 영역"이라는 어구는 상기 G380R 돌연변이로부터 상류 및/또는 하류에 있는 코돈을 포함할 수 있으며, 예를 들어 상기 영역의 크기는 상기 G380R 돌연변이로부터 상류 및/또는 하류 약 2, 5, 10, 12, 20, 30, 50, 60, 75, 80, 100개 이상의 코돈이다. 상기 G380R 돌연변이(380번 위치의 코돈에서 GGG가 AGG 또는 CGG로 바뀜)는 상기 G380R 수용체 단백질의 막관통 도메인내에서 발생하며 상기 수용체의 과잉 활성화를 생성시킨다. FGFR3의 연장된 활성화는 연골세포 증식의 조기 중단, 및 조기 연골세포 분화를 생성시킨다. FGFR3의 G380R-돌연변이된 형태는 질병-유발 기능획득을 가지며, 따라서 본원에 개시된 안티센스 올리고뉴클레오티드는, 나머지 야생형 대립유전자가 장골에서 성장판의 적합한 팽창을 안내하게 함으로써 정상적인 연골세포 기능을 복원시키기 위해서 돌연변이된 FGFR3의 발현을 선택적으로 하향조절할 수 있다. 구체적으로, 이종접합성 연골무형성증이 있는 환자에서, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드는, 돌연변이된 FGFR3 대립유전자의 발현을 하향조절하거나 억제시키고, 반면에 동일한 화합물이 야생형 FGFR3(예를 들어, 서열번호 1)을 표적화하거나 이에 하이브리드화하지 않거나, 보다 적은 정도로 그렇게 하게 하여, 상기 나머지 야생형 대립유전자의 기능을 보존시키고, 이에 의해 정상적인 연골세포 기능을 복원시키고 장골에서 성장판의 적합한 팽창을 안내하도록, 차별성 또는 선택성 기준으로 G380R-돌연변이된 FGFR3을 암호화하는 핵산(즉, mRNA)(예를 들어, 서열번호 4를 포함하는 서열에 의해 암호화되는 핵산)을 표적화하고 이에 하이브리드화한다.

본원에 개시된 올리고뉴클레오티드를 동물, 포유동물, 인간 및 세포 중 하나 이상에 전달할 수 있다. 표적화된 세포 유형은 일부 실시태양에서 연골세포, HeLa 세포 또는 A549 세포를 포함할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기 사용되는 올리고뉴클레오티드 농도는 약 0.25 nM, 0.5 nM, 1 nM, 5 nM, 40 nM, 100 nM, 200 nM, 250 nM 또는 그 이상일 수 있다. 상기 사용되는 올리고뉴클레오티드 농도는 일부 실시태양에서 25 nM일 수 있다(예를 들어, 연골세포에서). 상기 사용되는 올리고뉴클레오티드 농도는 일부 실시태양에서 1 nM일 수 있다(예를 들어, 연골세포에서). 형질감염 시약의 부재하에(예를 들어, 짐노틱 전달을 사용하여), 약 1 μM 내지 25 μM(예를 들어, 약 5 μM)의 올리고뉴클레오티드 농도를 사용하여 상기 표적 유전자를 하향조절할 수 있다.

일부 실시태양에서, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드를 약 0.2 내지 약 20 ㎎/㎏의 용량으로 피실험자에게 주기적으로 투여할 수 있다(예를 들어, 매일, 매주, 매달, 1/4 분기별로, 반년마다 또는 매년 기준으로 인간에게 정맥내 또는 피하 투여할 수 있다)(예를 들어, 적어도 약 0.2 ㎎/㎏, 0.25 ㎎/㎏, 0.5 ㎎/㎏, 1.0 ㎎/㎏, 1.5 ㎎/㎏, 2.0 ㎎/㎏, 2.5 ㎎/㎏, 3.0 ㎎/㎏, 3.5 ㎎/㎏, 4.0 ㎎/㎏, 4.5 ㎎/㎏, 5.0 ㎎/㎏, 6.0 ㎎/㎏, 7.5 ㎎/㎏, 8.0 ㎎/㎏, 10 ㎎/㎏, 12.5 ㎎/㎏, 15 ㎎/㎏ 또는 20 ㎎/㎏의 용량을 매일 또는 매주 투여할 수 있다). 일부 실시태양에서, 상기 세포를 치료하기 위해 사용되는 올리고뉴클레오티드의 적합한 농도의 결정은 형질감염 시약(예를 들어, 리포펙틴(LIPOFECTIN))을 사용하여 시험관내 세포 분석에서 수행될 수 있음을 알아야 한다.

일부 실시태양에서, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드는 FGFR3의 효능 있는(즉, 세포 또는 조직을 비교적 저 농도의 상기 올리고뉴클레오티드에 노출시킬 때 상기 세포 또는 조직에서 FGFR3의 발현을 조절할 수 있는) 억제제이다. 일부 실시태양에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 비교적 저 농도의 상기와 같은 올리고뉴클레오티드에서 FGFR3(예를 들어, 돌연변이된 FGFR3)의 발현을 감소시키거나 달리 억제할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서 올리고뉴클레오티드는 비교적 저 농도에서(예를 들어, 형질감염 분석에 의해 측정시 약 5 nM 미만의 IC₅₀, 또는 약 4 nM 미만, 예를 들어 2 nM 미만의 IC₅₀) 세포에 의한 FGFR3의 발현을 억제시킬 수 있다. 본 발명에 사용되는 바와 같이, "IC₅₀"이란 용어는 목표 매개변수(예를 들어, FGFR3 단백질 발현)를 약 50%까지 억제하기에 충분한 올리고뉴클레오티드의 농도를 지칭한다. 몇몇 실시태양에서, 본원에 개시된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 야생형 FGFR3 단백질의 발현에 비해 돌연변이 FGFR3 단백질의 발현을 선택적으로 억제시킴을 특징으로 한다. 상응하게, 올리고뉴클레오티드는 야생형 FGFR3 단백질의 발현을 억제시키기에 필요한 농도에 비해 보다 낮은 농도(예를 들어, 약 2배 더 낮은 농도)에서 돌연변이 FGFR3 단백질의 발현을 억제시킴을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 상기 돌연변이와 야생형 FGFR3 단백질에 대한 IC₅₀에 대해서 2배 이상의 차이를 나타낼 수 있다(예를 들어, 이종접합성 연골무형성증이 있는 포유동물에서 정상 또는 야생형 단백질에 비해 상기 FGFR3 돌연변이 단백질의 발현을 억제하는데 필요한 IC₅₀이 약 2.5-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9- 또는 10-배 이상의 차이가 있다).

따라서 본 발명은 이상 발현된 FGFR3 단백질 및/또는 FGFR3 mRNA, 및 특히 G380R-돌연변이된 FGFR3 유전자에 의해 암호화되는 FGFR3 mRNA의 발현을, 상기와 같은 FGFR3 단백질 및/또는 mRNA를 이상 발현하는 세포(예를 들어, 상기 G380R 돌연변이 FGFR3 단백질 및/또는 mRNA를 발현하는 연골세포)에서 조절하는(예를 들어, 하향조절하거나 억제하는) 방법을 제공한다. 상기와 같은 방법은 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 또는 접합체를 세포에게 투여하여(또는 상기와 같은 세포를 상기와 같은 올리고뉴클레오티드 또는 접합체와 달리 접촉시켜) 상기 세포에서 FGFR3 단백질 및/또는 mRNA의 발현을 하향조절하거나 억제함을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 세포는 시험관내 또는 생체내 포유동물 세포, 예를 들어 인간 세포일 수 있다. 예를 들어, 돌연변이된 FGFR3 유전자를 표적화하고 그의 유전자 산물(예를 들어, 돌연변이된 FGFR3 mRNA)에 특이적으로 하이브리드화할 수 있는 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 돌연변이된 FGFR3의 발현을 조절할 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 이종접합성 연골무형성증이 있는 환자에서 야생형 및/또는 돌연변이된 FGFR3 대립유전자의 발현을 조절할 수 있다. 상기 환자(예를 들어, 인간 또는 포유동물), 피실험자(예를 들어, 인간 또는 포유동물), 및/또는 세포(예를 들어, 인간 또는 포유동물)에의 투여는 생체내, 생체외 또는 시험관내에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 약학적으로 허용되는 제형 및/또는 약학적으로 허용되는 담체 또는 전달 비히클 중의 상기 올리고뉴클레오티드를 본원에 개시된 방법에 의해, 상기 환자 또는 피실험자의 체내에 직접 투여할 수 있다. 한편으로, 일부 실시태양에서, 상기 올리고뉴클레오티드를, 상기 환자 또는 피실험자의 신체로부터 제거된 후 및 상기 신체로 반송되기 전의 세포에 투여할 수도 있다. 일부 실시태양에서, 상기 세포를 상기 환자 또는 피실험자의 신체로부터 제거된 후 및 상기 신체로 반송되기 전에 배양 조건하에 유지시킬 수도 있다.

본 발명에 사용되는 바와 같은 "표적 핵산"이란 어구는 포유동물 FGFR3을 암호화하는 핵산(예를 들어, mRNA), 및 특히 돌연변이되거나 이상 발현된 FGFR3을 암호화하는 핵산(예를 들어, mRNA)을 지칭한다. 예를 들어, 본원은 G380R-돌연변이된 FGFR3을 암호화하는 표적 핵산(예를 들어, 서열번호 4에 의해 암호화되는 바와 같은, G380R-돌연변이된 FGFR3을 암호화하는 mRNA)을 개시한다. 적합한 표적 핵산은 FGFR3 또는 그의 천연 변이체를 암호화하는 핵산, 및 상기로부터 유래되는 RNA 핵산(예를 들어, 서열번호 15 내지 20을 포함하거나 상기에 상응하는 mRNA 표적 서열), 바람직하게는 mRNA, 예를 들어 예비-mRNA를 포함하지만, 바람직하게는 성숙 mRNA를 포함한다. 일부 실시태양에서(예를 들어, 연구 또는 진단 상황에서 사용되는 경우), 상기 "표적 핵산"은 cDNA 또는 상기 DNA 또는 RNA 핵산 표적으로부터 유래된 합성 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산 또는 상기와 같은 표적 핵산의 유전자 산물에 하이브리드화할 수 있다. 일부 실시태양에서 상기 표적 핵산 서열은 cDNA 서열이고, 그 자체가 성숙 mRNA 표적 서열에 상응하는 것으로 인식될 것이지만, 상기 cDNA 서열에서 유라실을 티미딘으로 치환시킬 수도 있다.

"그의 천연 변이체"란 어구는 한정된 분류상 군, 예를 들어 포유동물, 예를 들어 마우스, 원숭이 및 바람직하게는 인간내에서 천연으로 존재하는 FGFR3 폴리펩티드 또는 핵산 서열의 변이체를 지칭한다. 전형적으로, 폴리뉴클레오티드의 "천연 변이체"를 언급하는 경우, 상기 용어는 또한 염색체 전좌 또는 중복에 의해 염색체 4p16.3에서 발견되는 FGFR3 암호화 게놈 DNA, 및 RNA, 예를 들어 상기로부터 유래된 mRNA의 임의의 대립유전자 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, FGFR3의 천연 변이체는, 예를 들어 서열번호 4에 의해 암호화되는 바와 같은 G380R 돌연변이체, 또는 그의 천연 변이체(예를 들어, SNP ID의 rs28931614, rs11943863 또는 rs17881656)를 포함할 수 있다. 천연 변이체는 또한 상기 FGFR3 mRNA의 교번 연접으로부터 유도되는 변이체를 포함할 수 있다. 특정한 폴리펩티드 서열을 언급하는 경우, 상기 용어는 또한 상기 단백질의 천연 형태를 포함하며, 따라서 예를 들어 공-번역 또는 번역-후 변형(예를 들어, 신호 펩티드 절단, 단백질분해 절단, 글리코실화 등)에 의해 가공될 수 있다.

서열

일부 실시태양에서 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1 또는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 1 또는 서열번호 4의 단편의 역 보체에 상응하는 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어진다. 따라서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 9, 10, 11, 12, 13 및 14로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어지며, 이때 상기 올리고뉴클레오티드(또는 그의 연속적인 뉴클레오티드 부분)는 상기 선택된 표적 서열에 대해 1, 2 또는 3개의 불합치(mismatch)를 임의로 가질 수도 있다. 일부 실시태양에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 G380R 돌연변이 및 상기와 같은 돌연변이를 둘러싸는 뉴클레오티드를 포함하는 상기 FGFR3 서열 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 역 보체에 상응하는 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서 상기 올리고뉴클레오티드는 표 1에 나타낸 서열들(즉, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 또는 서열번호 14)을 포함할 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 G380R 돌연변이를 포함하는 FGFR3을 암호화하는 핵산(예를 들어, mRNA)의 영역(예를 들어, 상기 G380R 돌연변이로부터 상류 및/또는 하류 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 뉴클레오티드인 영역), 예를 들어 표 1에 나타낸 표적 서열에 상보성일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 표 1에 나타낸 mRNA 표적 서열(예를 들어, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 또는 서열번호 20)에 상보성일 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기와 같은 상보성 올리고뉴클레오티드는 FGFR3의 유전자 산물(즉, FGFR3 mRNA), 및 특히 상기 G380R 돌연변이를 암호화하는 FGFR3의 유전자 산물에 하이브리드화할 수 있다.

올리고뉴클레오티드 서열번호	올리고뉴클레오티드 서열	mRNA 표적 서열 식별자	mRNA 표적 서열
서열번호 9	5' - C T GTAGCTGAGGATGC - 3'	서열번호 15	5' - GCAUCCUCAGCUACAG - 3'
서열번호 10	5' - GAAGCCCACCC T GTA - 3'	서열번호 16	5' - UACAGGGUGGGCUUC - 3'
서열번호 11	5' - GAAGAAGCCCACCC T G - 3'	서열번호 17	5' - CAGGGUGGGCUUCUUC - 3'
서열번호 12	5' - AAGAAGCCCACCC T - 3'	서열번호 18	5' - AGGGUGGGC UUCUU - 3'
서열번호 13	5' - GAAGAAGCCCACCC T - 3'	서열번호 19	5' - AGGGUGGGCUUCUUC - 3'
서열번호 14	5' - GAAGCCCACCC T - 3'	서열번호 20	5' - AGGGUGGGCUUC - 3'

상기 올리고뉴클레오티드는 포유동물 FGFR3(예를 들어, 서열번호 1, 서열번호 4 또는 그의 단편)을 암호화하는 핵산의 등가 영역에 완전히 상보성인(완벽하게 상보성인) 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어질 수 있다. 따라서, 상기 올리고뉴클레오티드는 FGFR3을 암호화하는 핵산(즉, FGFR3 mRNA)에 하이브리드화할 수 있는 안티센스 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어질 수 있다.

그러나, 일부 실시태양에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 표적 서열에 하이브리드화할 때 1, 2, 3 또는 4개(또는 그 이상)의 불합치를 허용할 수 있으며, 상기 표적에 여전히 충분히 결합하여 목적하는 효과(예를 들어, 상기 표적 mRNA의 하향조절)를 나타낼 수 있다. 불합치는, 예를 들어 상기 올리고뉴클레오티드 서열의 증가된 길이 및/또는 뉴클레오티드 서열내에 존재하는 상기 뉴클레오티드 유사체, 예를 들어 잠금 핵산(LNA)의 증가된 수에 의해 보상될 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 연속적인 뉴클레오티드 서열은 표적 서열, 예를 들어 포유동물 FGFR3 mRNA를 암호화하는 핵산의 상응하는 영역에 하이브리드화할 때 3개 이하의 불합치(예를 들어, 1개 이하 또는 2개 이하의 불합치)를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 연속적인 뉴클레오티드 서열은 표적 서열, 예를 들어 포유동물 FGFR3 mRNA를 암호화하는 핵산의 상응하는 영역에 하이브리드화할 때 하나 이하의 불합치를 포함한다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열 또는 연속적인 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 서열번호 15, 16, 17, 18, 19 및 20으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 80% 이상 상보성이다, 예를 들어 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 예를 들어 100% 이상 상보성이다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열 또는 연속적인 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 서열번호 4 중에 존재하는 상응하는 서열의 역 보체에 80% 이상 상동성, 예를 들어 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상 상동성, 97% 이상 상동성, 98% 이상 상동성, 99% 이상 상동성, 예를 들어 100% 이상 상동성(일치성)이다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열 또는 연속적인 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 서열번호 4 중에 존재하는 하위-서열에 80% 이상 상보성, 예를 들어 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상 상보성, 97% 이상 상보성, 98% 이상 상보성, 99% 이상 상보성, 예를 들어 100% 이상 상보성(완벽하게 상보성)이다.

일부 실시태양에서 상기 올리고뉴클레오티드(또는 그의 연속적인 뉴클레오티드 부분)는 서열번호 9, 10, 11, 12, 13 및 14로 이루어진 군으로부터 선택된 서열들, 및 그의 약 6 내지 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드의 하위-서열 중에서 선택되거나, 상기 서열들 중 하나를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 올리고뉴클레오티드(또는 그의 연속적인 뉴클레오티드 부분)는 상기 서열에 비해 1, 2 또는 3개의 불합치를 임의로 포함할 수도 있다.

일부 실시태양에서 상기 하위-서열은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 또는 29개의 연속적인 뉴클레오티드, 예를 들어 약 12 내지 22개, 예를 들어 약 12 내지 18개의 뉴클레오티드로 이루어질 수 있다. 적합하게, 일부 실시태양에서, 상기 하위-서열은 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 연속적인 뉴클레오티드 서열과 동일한 길이를 갖는다.

그러나, 일부 실시태양에서 상기 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열은 추가적인 5' 또는 3' 뉴클레오티드 또는 변형, 예를 들어 독립적으로 1, 2, 3, 4 또는 5개의 추가적인 뉴클레오티드 5' 및/또는 3'를 포함할 수 있으며, 이들은 표적 서열에 비-상보성이다. 이에 관하여, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 일부 실시태양에서 추가적인 뉴클레오티드에 의해 5' 또는 3' 측면에 인접한 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 추가적인 5' 또는 3' 뉴클레오티드는 천연 뉴클레오티드, 예를 들어 DNA 또는 RNA이다. 일부 실시태양에서, 상기 추가적인 5' 또는 3' 뉴클레오티드는 본원에 개시된 갭머(gapmer) 올리고뉴클레오티드와 관련하여 지칭되는 바와 같은 영역 W를 나타낼 수 있다.

일부 실시태양에서 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 서열번호 9, 10, 11, 12, 13 또는 14에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 이들의 하위-서열로 이루어지거나 이들 서열을 포함한다.

일부 실시태양에서 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 서열번호 9에 따른 뉴클레오티드 서열 또는 이의 하위-서열로 이루어지거나 상기 서열을 포함한다.

일부 실시태양에서 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 서열번호 10에 따른 뉴클레오티드 서열 또는 이의 하위-서열로 이루어지거나 상기 서열을 포함한다.

일부 실시태양에서 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 서열번호 11에 따른 뉴클레오티드 서열 또는 이의 하위-서열로 이루어지거나 상기 서열을 포함한다.

일부 실시태양에서 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 서열번호 12에 따른 뉴클레오티드 서열 또는 이의 하위-서열로 이루어지거나 상기 서열을 포함한다.

일부 실시태양에서 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 서열번호 13에 따른 뉴클레오티드 서열 또는 이의 하위-서열로 이루어지거나 상기 서열을 포함한다.

일부 실시태양에서 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 서열번호 14에 따른 뉴클레오티드 서열 또는 이의 하위-서열로 이루어지거나 상기 서열을 포함한다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드(또는 그의 영역) 및 핵산(예를 들어, 포유동물 FGFR3 단백질을 암호화하는 mRNA)의 표적 영역 간의 상보성의 정도를 측정함에 있어서, 상기 상보성(또는 상동성 또는 일치성)의 정도는 상기 올리고뉴클레오티드(또는 그의 영역)의 서열 및 상기 서열과 가장 잘 정렬하는 표적 영역(또는 상기 표적 영역의 역 보체)의 서열 간의 일치성 백분율(또는 상동성 백분율)로서 나타낸다. 상기 백분율을, 2개 서열간에 일치하는 정렬된 염기의 수를 세고, 상기 올리고뉴클레오티드 중의 연속적인 단량체의 총수로 나누고, 100을 곱하여 계산한다. 상기와 같은 비교에서, 틈이 존재하는 경우, 상기와 같은 틈은, 바람직하게는 상기 틈내의 단량체의 수가 본 발명의 올리고뉴클레오티드 및 표적 영역 간의 상이한 구역이기보다는 단지 불합치이다. 본 발명에 사용되는 바와 같이, "상동의" 및 "상동성"이란 용어들은 "일치성" 및 "일치하는"이란 용어들과 호환성이다.

"에 상응하는" 및 "에 상응하다"란 어구들은 상기 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열(즉, 핵염기 또는 염기 서열) 또는 연속적인 뉴클레오티드 서열 및 (i) 핵산 표적, 예를 들어 FGFR3 단백질을 암호화하는 mRNA의 역 보체의 하위-서열 및/또는 (ii) 서열번호 15, 16, 17, 18, 19 또는 20으로 이루어진 군과 같은, 본 발명에 제공되는 뉴클레오티드의 서열 또는 이들의 하위 서열 중에서 선택된 추가의 서열의 등가의 연속적인 뉴클레오티드 서열간의 비교를 지칭한다. 뉴클레오티드 유사체를 그의 등가의 또는 상응하는 뉴클레오티드에 직접 비교한다. (i) 또는 (ii) 하에서 추가의 서열에 상응하는 제 1 서열은 전형적으로는 상기 제 1 서열(예를 들어, 연속적인 뉴클레오티드 서열)의 길이에 걸쳐 상기 서열과 일치하거나, 본원에 개시된 바와 같이, 일부 실시태양에서 상응하는 서열에 80% 이상 상동성, 예를 들어 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상 상동성, 예를 들어 100% 이상 상동성(일치성)일 수 있다.

일단 하나 이상의 표적 부위가 확인되었으면, 표적에 충분히 상보성인(즉, 목적하는 효과를 제공하기 위해서 충분히 잘, 충분한 특이성으로 하이브리드화하는) 올리고뉴클레오티드를 선택한다. 예를 들어, 표적에 대한 FGFR3 mRNA의 영역을 확인할 때, 올리고뉴클레오티드를 상기 mRNA, 또는 한편으로 상기와 같은 mRNA 표적을 암호화하는 DNA에 대한 상보성을 근거로 선택할 수 있다. 이와 관련하여, "하이브리드화"는, 상보성 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 염기들 간의 수소 결합(이는 와트슨-크리크, 후그스틴 또는 역전된 후그스틴 수소 결합일 수 있다)을 의미한다. 예를 들어, 아데닌(A)과 티민(T)은 수소 결합의 형성을 통해 짝을 짓는 상보성 핵염기들이다. 본 발명에 사용되는 바와 같은 "상보성"은 2개 뉴클레오티드 간의 정확한 짝짓기 능력을 지칭한다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드의 어떤 위치의 뉴클레오티드가 DNA 또는 RNA 분자의 동일한 위치의 뉴클레오티드와 수소 결합할 수 있는 경우, 상기 올리고뉴클레오티드 및 상기 DNA 또는 RNA는 상기 위치에서 서로에 대해 상보성인 것으로 간주된다. 상기 올리고뉴클레오티드 및 상기 DNA 또는 RNA는, 각 분자 중의 충분한 수의 상응하는 위치가 서로 수소 결합할 수 있는 뉴클레오티드에 의해 점유되는 경우 서로에 대해 상보성이다. 따라서, "특이적으로 하이브리드화할 수 있는" 및 "상보성"이란 용어들은 상기 올리고뉴클레오티드 및 상기 DNA 또는 RNA 표적 사이에 안정하고 특이적인 결합이 발생하기에 충분한 정도의 상보성 또는 정확한 짝짓기를 가리키는데 사용된다. 당해 분야에서는 안티센스 화합물의 서열이 특이적으로 하이브리드화할 수 있기 위해서 그의 표적 핵산의 서열과 100% 상보성일 필요는 없는 것으로 이해된다. 안티센스 화합물의 서열은 특이적으로 하이브리드화할 수 있기 위해서 그의 표적 서열에 대해서, 예를 들어 약 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 97.5%, 99% 또는 100% 상보성일 수 있다. 안티센스 화합물은 표적 DNA 또는 RNA 분자에의 상기 화합물의 결합이 상기 표적 DNA 또는 RNA의 통상적인 기능을 방해하여 기능 또는 유용성을 상실시키는 경우 특이적으로 하이브리드화할 수 있으며, 특이적인 결합이 요구되는 조건하에(예를 들어, 생체내 분석 또는 치료학적 치료의 경우에 생리학적 조건하에, 및 시험관내 분석의 경우에 상기 분석을 수행하는 조건하에) 상기 안티센스 화합물의 비-표적 서열에의 비-특이적인 결합을 피하기에 충분한 정도의 상보성이 존재한다. 본 발명에 사용되는 바와 같은 "역 보체", "역 상보적" 및 "역 상보성"이란 어구는 "보체", "상보적" 및 "상보성"이란 용어들과 호환성이다.

표적 핵산(예를 들어, 돌연변이된 FGFR3 단백질을 암호화하는 mRNA)에 하이브리드화하고 상기 표적 핵산의 발현을 억제하는 본 발명의 안티센스 및 다른 올리고뉴클레오티드는 실험을 통해 확인되며, 이들 화합물의 서열들을 본원에서 본 발명의 바람직한 실시태양(예를 들어, 표 1에 나타낸 서열들)으로서 나타낸다. 이들 바람직한 서열에 상보성인 표적 핵산 또는 부위를 본 발명에서 "활성 부위"라 칭하며, 따라서 이들은 표적화에 바람직한 부위(예를 들어, 표 1에 나타낸 표적 서열)이다. 본 발명에 의해 고려되는 활성 부위의 일례는 FGFR3의 코돈 380에서의 글리신의 아르기닌으로의 돌연변이 주변의 영역들, 예를 들어 G380R 영역을 포함한다. 따라서 본 발명의 또 다른 실시태양은 상기 활성 부위 영역에 하이브리드화하는 화합물들을 포함하며, 상기 화합물들은 상기 활성 부위로부터 바로 상류 및/또는 바로 하류의 뉴클레오티드들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 영역의 크기는 상기 G380R 돌연변이로부터 상류 및/또는 하류의 약 1, 2, 5, 10, 12, 20, 30, 50, 60, 75, 80, 100개 또는 그 이상의 코돈이다.

"상응하는 뉴클레오티드 유사체" 및 "상응하는 뉴클레오티드"란 어구는 상기 뉴클레오티드 유사체 중의 뉴클레오티드 및 천연 뉴클레오티드가 일치함을 가리키고자 한다. 예를 들어, 상기 뉴클레오티드의 2-데옥시리보스 단위가 아데닌에 결합되는 경우, 상응하는 뉴클레오티드 유사체는 아데닌에 결합된 펜토스 단위(2-데옥시리보스와 상이한)를 함유한다.

길이

상기 올리고뉴클레오티드는 총 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 연속적인 뉴클레오티드 길이의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어질 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 총 약 8 내지 25개, 예를 들어 약 10 내지 22개, 예를 들어 약 12 내지 18개, 예를 들어 약 13 내지 17개, 또는 12 내지 16개, 예를 들어 약 13, 14, 15, 16개의 연속적인 뉴클레오티드 길이의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어진다. 일부 실시태양에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 총 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개의 연속적인 뉴클레오티드 길이의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어진다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 22개 이하의 뉴클레오티드, 예를 들어 20개 이하의 뉴클레오티드, 예를 들어 18개 이하의 뉴클레오티드, 예를 들어 15, 16 또는 17개 뉴클레오티드로 이루어진다. 일부 실시태양에서 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 20개 미만의 뉴클레오티드를 포함한다. 올리고뉴클레오티드 또는 연속적인 뉴클레오티드 서열의 길이에 대한 범위가 제공될 때, 상기 범위는 상기 범위내에 제공된 상한 및 하한 길이를 포함하고, 예를 들어 10 내지 30(또는 그 사이)은 10과 30을 모두 포함한다.

뉴클레오시드 및 뉴클레오시드 유사체

뉴클레오티드 유사체

본 발명에 사용되는 바와 같은 "뉴클레오티드"란 용어는 당 부분, 염기 부분 및 공유 결합된 기, 예를 들어 포스페이트 또는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합기를 포함하는 글리코시드를 지칭하며, 천연 뉴클레오티드, 예를 들어 DNA 또는 RNA, 및 변형된 당 및/또는 염기 부분을 포함하는 비-천연 뉴클레오티드(이를 또한 "뉴클레오티드 유사체"라 칭한다)를 모두 포함한다. 본원에서, 단일 뉴클레오티드(단위)를 또한 단량체 또는 핵산 단위라 칭할 수도 있다.

생화학 분야에서, "뉴클레오시드"란 용어는 당 부분 및 염기 부분을 포함하는 글리코시드를 지칭하는데 통상적으로 사용되며, 따라서 상기 올리고머의 뉴클레오티드들 간의 뉴클레오티드간 결합에 의해 공유 결합되는 상기 뉴클레오티드 단위를 지칭할 때 사용될 수 있다.

당해 분야의 통상적인 숙련가가 인식하는 바와 같이, 올리고뉴클레오티드의 5' 뉴클레오티드는 5' 뉴클레오티드간 결합기를 포함하지 않지만, 5' 말단기를 포함할 수도, 포함하지 않을 수도 있다.

비-천연 뉴클레오티드는 변형된 당 부분을 갖는 뉴클레오티드, 예를 들어 바이사이클릭 뉴클레오티드 또는 2' 변형된 뉴클레오티드, 예를 들어 2' 치환된 뉴클레오티드를 포함한다.

"뉴클레오티드 유사체"는 당 및/또는 염기 부분의 변형에 의한 천연 뉴클레오티드, 예를 들어 DNA 또는 RNA 뉴클레오티드의 변이체이다. 유사체는 원칙적으로 상기 올리고뉴클레오티드와 관련하여 상기 천연 뉴클레오티드에 단지 "잠재성"이거나 "등가"일 수 있고, 즉 상기 올리고뉴클레오티드가 표적 유전자 발현을 억제하도록 작용하는 방식에 작용 효과를 미치지 않는다. 상기와 같은 "등가의" 유사체는 그럼에도 불구하고, 예를 들어 상기 유사체가 제조에 용이하거나 보다 저렴하거나, 보관 또는 제조 조건에 보다 안정성이거나, 태그 또는 표지를 나타내는 경우 유용할 수 있다. 그러나, 바람직하게, 상기 유사체는 상기 올리고머가 발현을 억제하도록 작용하는 방식에, 예를 들어 상기 표적에 대한 증가된 결합 친화성 및/또는 세포내 뉴클레아제에 대한 증가된 내성 및/또는 세포내로의 증가된 운반 용이성을 생성시킴으로써 작용 효과를 미칠 것이다. 뉴클레오시드 유사체의 구체적인 예들이, 예를 들어 문헌[Freier & Altmann; Nucl . Acid Res ., 1997, 25, 4429-4443] 및 문헌[Uhlmann; Curr . Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213], 및 하기에 개시되어 있다:

따라서 상기 올리고머는 천연 뉴클레오티드, 바람직하게는 2'-데옥시뉴클레오티드(본원에서 일반적으로는 "DNA"라 칭한다), 및 또한 가능하게는 리보뉴클레오티드(본원에서 바림직하게는 "RNA"라 칭한다), 또는 상기와 같은 천연 뉴클레오티드 및 하나 이상의 비-천연 뉴클레오티드, 즉 뉴클레오티드 유사체의 조합의 단순한 서열을 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다. 상기와 같은 뉴클레오티드 유사체는 적합하게는 표적 서열에 대한 올리고머의 친화성을 증대시킬 수 있다.

적합하고 바람직한 뉴클레오티드 유사체의 예는 PCT/DK2006/000512 또는 상기 중의 참고문헌에 의해 제공된다.

상기 올리고머 중의 친화성-증대 뉴클레오티드 유사체, 예를 들어 LNA 또는 2'-치환된 당의 통합은 특이적으로 결합하는 올리고머의 크기를 감소되게 할 수 있으며, 또한 비-특이성 또는 이상 결합이 발생하기 전의 상기 올리고머의 크기에 대한 상한을 감소시킬 수 있다.

일부 실시태양에서, 상기 올리고머는 2개 이상의 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 올리고머는 3 내지 8개 뉴클레오티드 유사체, 예를 들어 6 또는 7개 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 단연코 가장 바람직한 실시태양에서, 상기 뉴클레오티드 유사체 중 하나 이상은 잠금 핵산(LNA)이며; 예를 들어 상기 뉴클레오티드 유사체들 중 3개 이상 또는 4개 이상 또는 5개 이상, 또는 6개 이상, 또는 7개 이상, 또는 8개가 LNA일 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 뉴클레오티드 유사체들은 모두 LNA일 수 있다.

오직 뉴클레오타이들만으로 이루어진 바람직한 뉴클레오티드 서열 모티프 또는 뉴클레오티드 서열을 언급할 때, 상기 서열에 의해 한정되는 본 발명의 올리고머는 상기 서열 중에 존재하는 뉴클레오티드들 중 하나 이상 대신에 상응하는 뉴클레오티드 유사체, 예를 들어 LNA 단위, 또는 상기 올리고머/표적 듀플렉스의 듀플렉스 안정성/T_m을 상승시키는 다른 뉴클레오티드 유사체(즉, 친화성 증대 뉴클레오티드 유사체)를 포함할 수 있다.

LNA

"LNA"란 용어는 C2^* 내지 C4^* 바이라디칼(가교)을 포함하는 바이사이클릭 뉴클레오시드 유사체를 지칭하며, "잠금 핵산" 또는 "BNA"("바이사이클릭 핵산" 또는 "가교된 핵산")로서 공지되어 있다. 상기 용어는 LNA 단량체를 지칭할 수 있거나, "LNA 올리고뉴클레오티드"와 관련하여 사용될 때, LNA는 하나 이상의 상기와 같은 바이사이클릭 뉴클레오티드 유사체를 함유하는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 일부 태양에서, 바이사이클릭 뉴클레오시드 유사체는 LNA 뉴클레오티드이며, 따라서 이들 용어는 호환적으로 사용될 수 있고, 상기와 같은 실시태양에서, 상기 용어는 둘 다 리보스 당 고리의 C2' 및 C4' 사이에 링커기(예를 들어, 가교)의 존재를 특징으로 한다.

일부 실시태양에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 화합물 중에 사용되는 LNA는 바람직하게는 하기 화학식 A의 구조를 갖는다:

[화학식 A]

상기 식에서,

Y는 -O-, -CH₂O-, -S-, -NH-, N(R^e) 및/또는 -CH₂-로 이루어진 군으로부터 선택되고;

Z 및 Z^*는 독립적으로 뉴클레오티드간 결합, R^H, 말단기 및 보호기 중에서 선택되고;

B는 천연 또는 비-천연 뉴클레오티드 염기 부분(핵염기)을 구성하고, R^H는 수소 및 C_{1 -4}-알킬 중에서 선택되고;

R^a, R^b, R^c, R^d 및 R^e는 임의로 독립적으로 수소, 임의로 치환된 C_{1 -12}-알킬, 임의로 치환된 C_{2 -12}-알케닐, 임의로 치환된 C_{2 -12}-알키닐, 하이드록시, C_{1 -12}-알콕시, C_2-12-알콕시알킬, C_2-12-알케닐옥시, 카복시, C_1-12-알콕시카보닐, C_1-12-알킬카보닐, 폼일, 아릴, 아릴옥시-카보닐, 아릴옥시, 아릴카보닐, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시-카보닐, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴카보닐, 아미노, 모노- 및 다이(C_1-6-알킬)아미노, 카바모일, 모노- 및 다이(C_1-6-알킬)-아미노-카보닐, 아미노-C_1-6-알킬-아미노카보닐, 모노- 및 다이(C_1-6-알킬)아미노-C_1-6-알킬-아미노카보닐, C_1-6-알킬-카보닐아미노, 카브아미도, C_1-6-알카노일옥시, 설포노, C_1-6-알킬설포닐옥시, 나이트로, 아지도, 설파닐, C_1-6-알킬티오, 할로겐, DNA 삽입제, 광화학적 활성기, 열화학적 활성기, 킬레이트기, 리포터기, 및 리간드로 이루어진 군으로부터 선택되고, 이때 아릴 및 헤테로아릴은 임의로 치환될 수 있으며 2개의 같은자리(geminal) 치환체 R^a 및 R^b는 함께 임의로 치환된 메틸렌(=CH₂)을 나타낼 수 있고;

R^H는 수소 및 C_{1 -4}-알킬 중에서 선택된다.

일부 실시태양에서, R^a, R^b, R^c, R^d 및 R^e는 임의로 독립적으로 수소 및 C_{1 -6} 알킬, 예를 들어 메틸로 이루어진 군으로부터 선택된다. 모든 키랄 중심에 대해서, 비대칭 기들이 R 또는 S 배향으로 발견될 수 있고, 예를 들어 2개의 예시적인 입체화학 이성질체는 베타-D 및 알파-L 이성질체를 포함하며, 이들 이성질체는 하기와 같이 예시될 수 있다:

구체적인 예시적인 LNA 단위들을 하기에 나타낸다:

"티오-LNA"란 용어는 상기 화학식에서 Y가 S 및 -CH₂-S- 중에서 선택되는 잠금 뉴클레오티드를 포함한다. 티오-LNA는 베타-D 및 알파-L-형태 모두로 있을 수 있다.

"아미노-LNA"란 용어는 상기 화학식에서 Y가 -N(H)-, N(R)-, CH₂-N(H)- 및 -CH₂-N(R)- 중에서 선택되고, 이때 R이 수소 및 C_{1 -4}-알킬 중에서 선택되는 잠금 뉴클레오티드를 포함한다. 아미노-LNA는 베타-D 및 알파-L-형태 모두로 있을 수 있다.

"옥시-LNA"란 용어는 상기 화학식에서 Y가 -O-를 나타내는 잠금 뉴클레오티드를 포함한다. 옥시-LNA는 베타-D 및 알파-L-형태 모두로 있을 수 있다.

"ENA"란 용어는 상기 화학식에서 Y가 -CH₂-O-인 잠금 뉴클레오티드(이때 -CH₂-O-의 산소 원자는 염기 B에 대해 2'-위치에 부착된다)를 포함한다. R^e는 수소 또는 메틸이다.

일부 예시적인 실시태양에서, LNA는 베타-D-X-LNA 및 알파-L-X-LNA(이때, X는 옥시, 아미노 또는 티오이다), 및 본원에 개시된 다른 LNA, 예를 들어 비제한적으로 (R/S) cET, cMOE 또는 5'-Me-LNA, 특히 베타-D-옥시-LNA 중에서 선택된다.

본 발명에 사용되는 바와 같이, "바이사이클릭 뉴클레오시드"는 바이사이클릭 당 부분을 포함하는 변형된 뉴클레오시드를 지칭한다. 바이사이클릭 뉴클레오시드의 예는 비제한적으로 4' 및 2' 리보실 고리 원자들 간의 가교를 포함하는 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명에서 제공된 화합물은 상기 가교가 4' 대 2' 바이사이클릭 뉴클레오시드를 포함하는 하나 이상의 바이사이클릭 뉴클레오시드를 포함한다. 상기와 같은 4' 대 2' 바이사이클릭 뉴클레오시드의 예는 비제한적으로 하기 화학식들 중 1종을 포함한다: 4'-(CH₂)-O-2'(LNA); 4'-(CH₂)-S-2'; 4^,-(CH₂)₂-O-2'(ENA); 4'-CH(CH₃)-O-2' 및 4'-CH(CH₂OCH₃)-O-2^*, 및 이들의 유사체(2008년 7월 15일자로 허여된 미국특허 제 7,399,845 호를 참조하시오); 4'-C(CH₃)(CH₃)-O-2', 및 그의 유사체(2009년 1월 8일자로 공개된 PCT 국제 출원공개 WO2009/006478을 참조하시오); 4'-CH₂-N(OCH₃)-2', 및 그의 유사체(2008년 12월 11일자로 공개된 PCT 국제 출원공개 WO2008/150729를 참조하시오); 4'-CH₂-O-N(CH₃)-2'(2004년 9월 2일자로 공개된 미국특허 출원 US2004/0171570을 참조하시오); 4'-CH₂-N(R)-O-2'(이때 R은 H, C_{1 -10} 알킬, 또는 보호기이다)(2008년 9월 23일자로 허여된 미국특허 제 7,427,672 호를 참조하시오); 4'-CH₂-C(H)(CH₃)-2'(문헌[Chattopadhyaya, et al, J. Org. Chem.,2009, 74, 118-134]을 참조하시오); 및 4'-CH₂-C(=CH₂)-2', 및 그의 유사체(2008년 12월 8일자로 공개된 PCT 국제 출원공개 WO2008/154401을 참조하시오). 또한, 예를 들어 하기 문헌들을 참조하시오: 문헌[Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456]; 문헌[Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630]; 문헌[Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 5633-5638]; 문헌[Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222]; 문헌[Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039]; 문헌[Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc, 129(26) 8362-8379 (Jul. 4, 2007)]; 문헌[Elayadi et al., Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561]; 문헌[Braasch et al., Chem. Biol, 2001, 8, 1-7]; 문헌[Oram et al, Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243]; 미국특허 제 6,670,461 호, 미국특허 제 7,053,207 호, 미국특허 제 6,268,490 호, 미국특허 제 6,770,748 호, 미국특허 제 6,794,499 호, 미국특허 제 7,034,133 호, 미국특허 제 6,525,191 호, 미국특허 제 7,399,845 호; PCT 국제 출원공개 WO2004/106356, WO94/14226, WO2005/021570, 및 WO2007/134181; 미국특허 공개 제 US2004/0171570 호, 미국특허 공개 제 US2007/0287831 호, 및 미국특허 공개 제 US2008/0039618 호; 및 미국특허 출원 제 12/129,154 호, 미국특허 출원 제 60/989,574 호, 미국특허 출원 제 61/026,995 호, 미국특허 출원 제 61/026,998 호, 미국특허 출원 제 61/056,564 호, 미국특허 출원 제 61/086,231 호, 미국특허 출원 제 61/097,787 호, 및 미국특허 출원 제 61/099,844 호; 및 PCT 국제 출원 PCT/US2008/064591, PCT/US2008/066154, 및 PCT/US2008/068922. 예를 들어 a-L-리보퓨라노스 및 베타-D-리보퓨라노스를 포함하여 하나 이상의 입체화학적 당 형태를 갖는 상기 바이사이클릭 뉴클레오시드들을 각각 제조할 수 있다(WO99/14226으로서 1999년 3월 25일자로 공개된 PCT 국제 출원 PCT DK98/00393을 참조하시오).

일부 실시태양에서, 바이사이클릭 당 부분은 비제한적으로 펜토퓨라노실 당 부분의 4' 및 2' 위치 간에 하나 이상의 가교를 갖는 화합물을 포함하며, 이때 상기와 같은 가교는 독립적으로 -[CiR_aXR_b)]-, -C(R_a)=C(R_b)-, -C(R_a)=N-, -C(=NR_a)-, -C(=O)-, -C(=S)-, - O -, -Si(R_a)₂-, -S(=O)_x- 및 -N(Ra)- 중에서 선택된 1 또는 2 내지 4개의 결합기를 포함하고; 이때 x는 0, 1, 또는 2이고; n은 1, 2, 3, 또는 4이고; 각각의 R_a 및 R_b는 독립적으로 H, 보호기, 하이드록실, C_{1 -12} 알킬, 치환된 C_{1 -12} 알킬, C_{2 -12} 알케닐, 치환된 C_{2 -12} 알케닐, C_{2 -12} 알키닐, 치환된 C_{2 -12} 알키닐, C_{5 -20} 아릴, 치환된 C_{5 -20} 아릴, 헤테로사이클 라디칼, 치환된 헤테로사이클 라디칼, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, C_{5 -7} 지환족 라디칼, 치환된 C_{5 -7} 지환족 라디칼, 할로겐, OJ₁, NJ₁J₂, SJ₁, N₃, COOJ₁, 아실(C(=O)- H), 치환된 아실, CN, 설포닐(S(=O)₂-J₁), 또는 설폭실 (S(=O)-J₁)이고; 각각의 J₁ 및 J₂는 독립적으로 H, C_{1 -6} 알킬, 치환된 C_{1 -12} 알킬, C_{2 -12} 알케닐, 치환된 C_{2 -12} 알케닐, C_{2 -12} 알키닐, 치환된 C_{2 -12} 알키닐, C_{5 -20} 아릴, 치환된 C_{5 -20} 아릴, 아실(C(=O)-H), 치환된 아실, 헤테로사이클 라디칼, 치환된 헤테로사이클 라디칼, C_{1 -12} 아미노알킬, 치환된 C_{1 -12} 아미노알킬, 또는 보호기이다.

일부 실시태양에서, 바이사이클릭 당 부분의 가교는 -[C(R_a)(Rb)]_n-, -[C(R_a)(R_b)]_n-O-, -C(R_aR_b)-N(R)-O- 또는 -C(R_aR_b)-O-N(R)-이다. 일부 실시태양에서, 상기 가교는 4'-CH₂-2', 4'-(CH₂)₂-2', 4'-(CH₂)₃-2', 4'-CH₂-O-2', 4^*-(CH₂)2-O-2', 4'-CH₂-O-N(R)-2', 및 4'-CH₂-N(R)-O-2'-이고, 이때 각각의 R은 독립적으로, H, 보호기, 또는 C_{1 -12} 알킬이다.

일부 실시태양에서, 바이사이클릭 뉴클레오시드는 이성질체 형태에 의해 추가로 한정된다. 예를 들어, 4'-2' 메틸렌-옥시 가교를 포함하는 뉴클레오시드는 a-L 형태로 또는 베타-D 형태로 존재할 수 있다. 앞서, a-L-메틸렌옥시(4'-CH₂-O-2')BNA는 안티센스 활성을 나타내는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 통합되었다(문헌[Frieden et al, Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365- 6372]).

일부 실시태양에서, 바이사이클릭 뉴클레오시드는 비제한적으로 하기에 도시되는 바와 같은 (A) a-L-메틸렌옥시(4'-CH₂-O-2')BNA, (B) 베타-D-메틸렌옥시(4'-CH₂-O-2')BNA, (C) 에틸렌옥시(4'-(CH₂)₂-O-2')BNA, (D) 아미노옥시(4'-CH₂-O-N(R)-2')BNA, (E) 옥시아미노(4'-CH₂-N(R)-O-2')BNA, (F), 메틸(메틸렌옥시)(4'-CH(CH₃)-O-2')BNA, (G) 메틸렌-티오(4'-CH₂-S-2')BNA, (H) 메틸렌-아미노(4'-CH₂-N(R)-2')BNA, (I) 메틸 카보사이클릭 (4'-CH₂-CH(CH₃)-2')BNA, 및 (J) 프로필렌 카보사이클릭(4'-(CH₂)₃-2')BNA를 포함한다.

상기 식에서,

Bx는 염기 부분이고;

R은 독립적으로 H, 보호기 또는 C_{1 -2} 알킬이다.

일부 실시태양에서, 바이사이클릭 뉴클레오시드는 하기 화학식 1을 갖는다:

[화학식 1]

상기 식에서,

Bx는 헤테로사이클릭 염기 부분이고;

-Q_a-Q_b-Q_c-는 -CH₂-N(Rc)-CH₂-, -C(=O)-N(R_c)-CH₂-, -CH₂-O-N(Rc)-, -CH₂-N(Rc)-O- 또는 -N(Rc)-O-CH₂이고;

R_c는 C_{1 -12} 알킬 또는 아미노 보호기이고;

T_a 및 T_b는 각각 독립적으로 H, 하이드록실 보호기, 접합체 기, 반응성 인 기, 인 부분, 또는 지지 매질에 대한 공유 부착이다.

일부 실시태양에서, 바이사이클릭 뉴클레오시드는 하기 화학식 2를 갖는다:

[화학식 2]

상기 식에서,

Bx는 헤테로사이클릭 염기 부분이고;

T_a 및 T_b는 각각 독립적으로 H, 하이드록실 보호기, 접합체 기, 반응성 인 기, 인 부분, 또는 지지 매질에 대한 공유 부착이고;

Z_a는 C_{1 -6} 알킬, C_{2 -6} 알케닐, C_{2 -6} 알키닐, 치환된 C_{1 -6} 알킬, 치환된 C_{2 -6} 알케닐, 치환된 C_{2 -6} 알키닐, 아실, 치환된 아실, 치환된 아미드, 티올, 또는 치환된 티오이다.

일부 실시태양에서, 상기 치환기는 각각 독립적으로 할로겐, 옥소, 하이드록실, OJ_c, NJ_d, SJ_C, N₃, OC(=X)J_c, 및 NJ_eC(=X)NJ_cJ_d(이때, 각각의 J_c, J_d, 및 J_e는 독립적으로 H, C_{1 -6} 알킬, 또는 치환된 C_{1 -6} 알킬이고, X는 O 또는 NJ_C이다)로부터 선택된 치환기로 단일- 또는 다중치환된다.

일부 실시태양에서, 바이사이클릭 뉴클레오시드는 하기 화학식 3을 갖는다:

[화학식 3]

상기 식에서,

Bx는 헤테로사이클릭 염기 부분이고;

T_a 및 T_b는 각각 독립적으로 H, 하이드록실 보호기, 접합체 기, 반응성 인 기, 인 부분, 또는 지지 매질에 대한 공유 부착이고;

Z_b는 C_{1 -6} 알킬, C_{2 -6} 알케닐, C_{2 -6} 알키닐, 치환된 C_{1 -6} 알킬, 치환된 C_{2 -6} 알케닐, 치환된 C_{2 -6} 알키닐, 또는 치환된 아실(C(=O)-)이다.

일부 실시태양에서, 바이사이클릭 뉴클레오시드는 하기 화학식 4를 갖는다:

[화학식 4]

상기 식에서,

Bx는 헤테로사이클릭 염기 부분이고;

T_a 및 T_b는 각각 독립적으로 H, 하이드록실 보호기, 접합체 기, 반응성 인 기, 인 부분, 또는 지지 매질에 대한 공유 부착이고;

R_d는 C_{1 -6} 알킬, C_{2 -6} 알케닐, C_{2 -6} 알키닐, 치환된 C_{1 -6} 알킬, 치환된 C_{2 -6} 알케닐, 또는 치환된 C_{2 -6} 알키닐이고;

각각의 q_b, q_c 및 q_d는 독립적으로 H, 할로겐, C_{1 -6} 알킬, C_{2 -6} 알케닐, C_{2 -6} 알키닐, 치환된 C_{1 -6} 알킬, 치환된 C_{2 -6} 알케닐, 치환된 C_{2 -6} 알키닐, C_{1 -6} 알콕시, 치환된 C_{1 -6} 알콕시, 아실, 치환된 아실, C_{1 -6} 아미노알킬 또는 치환된 C_{1 -6} 아미노알킬이다.

일부 실시태양에서, 바이사이클릭 뉴클레오시드는 하기 화학식 5를 갖는다:

[화학식 5]

상기 식에서,

Bx는 헤테로사이클릭 염기 부분이고;

T_a 및 T_b는 각각 독립적으로 H, 하이드록실 보호기, 접합체 기, 반응성 인 기, 인 부분, 또는 지지 매질에 대한 공유 부착이고;

q_a, q_b, q_c 및 q_f는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, C_{1 -12} 알킬, 치환된 C_{1 -12} 알킬, C_{2 -12} 알케닐, 치환된 C_{2 -12} 알케닐, C_{2 -12} 알키닐, 치환된 C_{2 -12} 알키닐, C_{1 -12} 알콕시, 치환된 C_{1 -12} 알콕시, OJ_j, SJ_j, SOJ_j, SO₂J_j, NJ_jJ_k, N₃, CN, C(=O)OJ_j, C(=O)NJ_jJ_k, C(=O)J_j, O-C(=O)NJ_jJ_k, N(H)C(=NH)NJ_jJ_k, N(H)C(=O)NJ_jJ_k 또는 N(H)C(=S)NJ_jJ_k이거나; q_e 및 q_f는 함께 =C(q_g)(q_h)이고; q_g 및 q_h는 각각 독립적으로, H, 할로겐, C_{1 -12} 알킬, 또는 치환된 C_{1 -12} 알킬이다.

상기 메틸렌옥시(4'-CH₂-O-2')BNA 단량체 아데닌, 시토신, 구아닌, 5-메틸-시토신, 티민, 및 유라실의 합성 및 제조는 이들의 올리고머화 및 핵산 인식 성질과 함께 개시되었다(예를 들어, 문헌[Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630]을 참조하시오). BNA 및 그의 제조가 또한 WO98/39352 및 WO99/14226에 개시되어 있다.

메틸렌옥시(4'-CH₂-O-2')BNA, 메틸렌옥시(4'-CH₂-O-2')BNA, 및 2'-티오-BNA의 유사체가 또한 제조되었다(예를 들어, 문헌[Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222]을 참조하시오). 핵산 폴리머라제에 대한 기질로서 올리고데옥시리보뉴클레오티드 듀플렉스를 포함하는 잠금 뉴클레오시드 유사체의 제조가 또한 개시되었다(예를 들어, 웽젤(Wengel) 등의 WO99/14226을 참조하시오). 더욱 또한, 형태학적으로 제한된 신규한 고-친화성 올리고뉴클레오티드 유사체인 2'-아미노-BNA의 합성이 당해 분야에 개시되었다(예를 들어, 문헌[Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039]을 참조하시오). 또한, 2'-아미노- 및 2'-메틸렌아미노-BNA가 제조되었으며, 이들의 상보성 RNA 및 DNA 가닥과의 듀플렉스의 열 안정성이 앞서 보고되었다.

일부 실시태양에서, 바이사이클릭 뉴클레오시드는 하기 화학식 6을 갖는다:

[화학식 6]

상기 식에서,

Bx는 헤테로사이클릭 염기 부분이고;

T_a 및 T_b는 각각 독립적으로 H, 하이드록실 보호기, 접합체 기, 반응성 인 기, 인 부분, 또는 지지 매질에 대한 공유 부착이고;

각각의 q_i, q_j, q_k 및 q_l은 독립적으로 수소, 할로겐, C_{1 -12} 알킬, 치환된 C_{1 -12} 알킬, C_{2 -12} 알케닐, 치환된 C_{2 -12} 알케닐, C_{2 -12} 알키닐, 치환된 C_{2 -12} 알키닐, C_{1 -12} 알콕시, 치환된 C_{2 -12} 알콕실, OJ_j, SJ_j, SOJ_j, SO₂J_j, NJ_jJ_k, N₃, CN, C(=O)OJ_j, C(=O)NJ_jJ_k, C(=O)J_j, O-C(=O)NJ_jJ_k, N(H)C(=NH)NJ_jJ_k, N(H)C(=O)NJ_jJ_k 또는 (H)C(=S)NJ_jJ_k이고; q_i 및 q_j 또는 q_l 및 qk는 함께 =C(q_g)(q_h)이고, 이때 q_g 및 q_h는 각각 독립적으로, H, 할로겐, C_{1 -12} 알킬, 또는 치환된 C_{1 -12} 알킬이다.

4'-(CH₂)₃-2' 가교 및 알케닐 유사체, 가교 4'-CH=CH-CH₂-2'를 갖는 하나의 카보사이클릭 바이사이클릭 뉴클레오시드가 개시되었다(예를 들어, 문헌[Freier et al, Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429- 4443] 및 문헌[Albaek et al, J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-77 '40]을 참조하시오). 카보사이클릭 바이사이클릭 뉴클레오시드의 합성 및 제조가 그의 올리고머화 및 생화학적 연구와 함께 또한 개시되었다(예를 들어, 문헌[Srivastava et al, J. Am. Chem. Soc. 2007, 129(26), 8362-8379]을 참조하시오).

본 발명에 사용된 바와 같이, "4'-2' 바이사이클릭 뉴클레오시드" 또는 "4' 대 2' 바이사이클릭 뉴클레오시드"는 2' 탄소 원자와 4' 탄소 원자를 연결하는 가교를 포함하는 퓨라노스 고리를 포함하는 바이사이클릭 뉴클레오시드를 지칭한다.

본 발명에 사용되는 바와 같이, "모노사이클릭 뉴클레오시드"는 바이사이클릭 당 부분이 아닌 변형된 당 부분을 포함하는 뉴클레오시드를 지칭한다. 일부 실시태양에서, 뉴클레오시드의 당 부분 또는 당 부분 유사체는 임의의 위치에서 변형되거나 치환될 수 있다.

본 발명에 사용되는 바와 같이, "2'-변형된 당"은 2' 위치에서 변형된 퓨라노실 당을 의미한다. 일부 실시태양에서, 상기와 같은 변형은 할라이드, 예를 들어 비제한적으로 치환 및 비치환된 알콕시, 치환 및 비치환된 티오알킬, 치환 및 비치환된 아미노 알킬, 치환 및 비치환된 알킬, 치환 및 비치환된 알릴, 및 치환 및 비치환된 알키닐 중에서 선택된 치환체들을 포함한다. 일부 실시태양에서, 2' 변형은 비제한적으로 O[(CH₂)_nO]_mCH₃, O(CH₂), NH₂, O(CH₂), CH₃, O(CH₂), ONH₂, OCH₂C(=O)N(H)CH₃ 및 O(CH₂)_nON[(CH₂)_nCH₃]₂(이때 n 및 m은 1 내지 약 10이다)를 포함하는 치환체들 중에서 선택된다. 다른 2'-치환기를 또한 C_{1 -12} 알킬; 치환된 알킬; 알케닐; 알키닐; 알크아릴; 아르알킬; O-알크아릴 및 O-아르알킬; SH; SCH₃; OCN; Cl; Br; CN; CF₃; OCF₃; SOCH₃; S0₂CH₃; ONO₂; NO₂; N₃; NH₂; 헤테로사이클로알킬; 헤테로사이클로알크아릴; 아미노알킬아미노; 폴리알킬아미노; 치환된 실릴; R; 절단기; 리포터기; 삽입제; 약동학적 성질을 개선시키기 위한 기; 및 안티센스 화합물의 약력학적 성질을 개선시키기 위한 기, 및 유사한 성질들을 갖는 다른 치환체들 중에서 선택할 수 있다. 일부 실시태양에서, 변형된 뉴클레오시드는 2'-MOE 측쇄를 포함한다(예를 들어, 문헌[Baker et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 1 1944-12000]을 참조하시오). 상기와 같은 2'-MOE 치환은 변형되지 않은 뉴클레오시드 및 다른 변형된 뉴클레오시드, 예를 들어 2'-O-메틸, O-프로필, 및 O-아미노프로필에 비해 개선된 결합 친화성을 갖는 것으로서 개시되었다. 상기 2-MOE 치환체를 갖는 올리고뉴클레오티드는 또한 생체내 용도에 대해 유망한 특징을 갖는 유전자 발현의 안티센스 억제제임이 입증되었다(예를 들어, 문헌[Martin, P., He/v. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504]; 문헌[Altmann et al., Chimia, 1996, 50, 168-176]; 문헌[Altmann et al., Biochem. Soc. Trans., 1996, 24, 630-637]; 및 문헌[Altmann et al., Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917-926]을 참조하시오).

본 발명에 사용되는 바와 같이, "변형된 테트라하이드로피란 뉴클레오시드" 또는 "변형된 THP 뉴클레오시드"는 통상적인 뉴클레오시드 중의 펜토퓨라노실 잔기에 대해 치환된 6-원 테트라하이드로피란 "당"을 갖는 뉴클레오시드(당 대용물)를 의미한다. 변형된 THP 뉴클레오시드는 비제한적으로, 당해 분야에서 헥시톨 핵산(HNA), 아니톨 핵산(ANA), 만니톨 핵산(MNA)(문헌[Leumann, CJ. Bioorg. and Med. Chem. (2002) 10:841-854]을 참조하시오), 플루오로 HNA(F-HNA)로서 지칭되는 것, 또는 하기 화학식 X를 갖는 화합물들을 포함한다:

[화학식 X]

상기 식에서,

상기 화학식 X의 하나 이상의 테트라하이드로피란 뉴클레오시드 유사체 각각에 대해 독립적으로

Bx는 헤테로사이클릭 염기 부분이고;

T₃ 및 T₄는 각각 독립적으로 상기 테트라하이드로피란 뉴클레오시드를 안티센스 화합물에 결합시키는 뉴클레오시드간 결합기이거나, T₃ 및 T₄ 중 하나는 상기 테트라하이드로피란 뉴클레오시드 유사체를 안티센스 화합물에 결합시키는 뉴클레오시드간 결합기이고, T₃ 및 T₄ 중 다른 것은 H, 하이드록실 보호기, 결합된 접합체기, 또는 5' 또는 3'-말단기이고;

q₁, q₂, q₃, q₄, q₅, q₆ 및 q₇은 각각 독립적으로 H, C_{1 -6} 알킬, 치환된 C_{1 -6} 알킬, C_{2 -6} 알케닐, 치환된 C_{2 -6} 알케닐, C_{2 -6} 알키닐, 또는 치환된 C_{2 -6} 알키닐이고;

R₁ 및 R₂ 중 하나는 수소이고 다른 것은 할로겐, 치환되거나 비치환된 알콕시, NJ, J₂, SJ, N₃, OC(=X)J₁, OC(=X)NJ₁J₂, NJ₃C(=X)NJ₁J₂, 및 CN 중에서 선택되고, 이때 X는 O, S, 또는 NJ₁이고, 각각의 J₁, J₂, 및 J₃은 독립적으로 H 또는 C_{1 -6} 알킬이다.

일부 실시태양에서, q_m, q_n, q_p, q_r, q_s, q_{t ,} 및 q_u가 각각 H인 화학식 X의 변형된 THP 뉴클레오시드를 제공한다. 일부 실시태양에서, q_m, q_n, q_p, q_r, q_s, q_t 및 q_u 중 하나 이상은 H 이외의 것이다. 일부 실시태양에서, q_m, q_n, q_p, q_r, q_s, q_t 및 q_u 중 하나 이상은 메틸이다. 일부 실시태양에서, R₁ 및 R₂ 중 하나가 F인 화학식 X의 THP 뉴클레오시드를 제공한다. 일부 실시태양에서, R₁은 플루오로이고 R₂는 H이며, R₁은 메톡시이고 R₂는 H이며, R₁은 메톡시에톡시이고 R₂는 H이다.

본 발명에 사용되는 바와 같이, "2'-변형된" 또는 "2'-치환된"은 2' 위치에 H 또는 OH 이외의 치환체를 포함하는 당을 포함하는 뉴클레오시드를 지칭한다. 2'-변형된 뉴클레오시드는 비제한적으로 비-가교 2' 치환체, 예를 들어 알릴, 아미노, 아지도, 티오, O-알릴, O-C_{1 -10} 알킬, -OCF₃, O-(CH₂)₂-O-CH₃, 2'-O(CH₂)₂SCH₃, O-(CH₂)₂-O-N(R_m)(R_n), 또는 O-CH₂-C(=O)-N(R_m)(R_n)(이때 각각의 R_m 및 R_n은 독립적으로 H 또는 치환되거나 비치환된 C_{1 -10} 알킬이다)을 갖는 뉴클레오시드를 포함한다. 2'-변형된 뉴클레오시드는, 예를 들어 상기 당의 다른 위치 및/또는 상기 핵염기에서 다른 변형들을 추가로 포함할 수도 있다.

본 발명에 사용되는 바와 같이, "2'-F"는 2' 위치에서 플루오로기를 포함하는 당을 지칭한다.

본 발명에 사용되는 바와 같이, "2'-OMe" 또는 "2-OCH₃" 또는 "2'-O-메틸"은 각각 당 고리의 2' 위치에 -OCH₃ 기를 포함하는 당을 포함하는 뉴클레오티드를 지칭한다.

본 발명에 사용되는 바와 같이, "올리고뉴클레오티드"는 다수의 결합된 뉴클레오시드를 포함하는 화합물을 지칭한다.

일부 실시태양에서, 상기 다수의 뉴클레오시드 중 하나 이상을 변형시킨다. 일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 리보뉴클레오시드(RNA) 및/또는 데옥시리보뉴클레오시드(DNA)를 포함한다.

뉴클레오시드를 안티센스 화합물에 통합시키기 위해 변형시키는데 사용될 수 있는 다수의 다른 바이사이클로 및 트라이사이클로 당 대용물 고리 시스템들이 또한 공지되어 있다(예를 들어, 고찰 논문: 문헌[Leumann, J. C, Bioorganic and Medicinal Chemistry, 2002, 10, 841-854]을 참조하시오). 상기와 같은 고리 시스템은 다양한 추가적인 치환을 겪어 활성을 증대시킬 수 있다. 변형된 당의 제조 방법들은 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지되어 있다. 변형된 당 부분을 갖는 뉴클레오티드에서, 상기 핵염기 부분(천연, 변형된 또는 이들의 조합)을 적합한 핵산 표적과의 하이브리드화를 위해 유지시킨다.

일부 실시태양에서, 안티센스 화합물은 변형된 당 부분을 갖는 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 변형된 당 부분은 2'-MOE이다. 일부 실시태양에서, 상기 2'-MOE 변형된 뉴클레오티드를 갭머 동기 중에 배열한다. 일부 실시태양에서, 상기 변형된 당 부분은 cEt이다. 일부 실시태양에서, 상기 cEt 변형된 뉴클레오티드를 갭머 동기의 날개 전체를 통해 배열한다.

일부 실시태양에서, 상기 BNA(LNA)에서, R^4* 및 R^2*는 함께 R- 또는 S- 형태의 바이라디칼 -O-CH(CH₂OCH₃)-(2'O-메톡시에틸 바이사이클릭 핵산 - 문헌[Seth at al., 2010, J. Org. Chem])을 나타낸다.

일부 실시태양에서, 상기 BNA(LNA)에서, R^4* 및 R^2*는 함께 R- 또는 S- 형태의 바이라디칼 -O-CH(CH₂OCH₃)-(2'O-에틸 바이사이클릭 핵산 - 문헌[Seth at al., 2010, J. Org. Chem])을 나타낸다.

일부 실시태양에서, 상기 BNA(LNA)에서, R^4* 및 R^2*는 함께 R- 또는 S- 형태의 바이라디칼 -O-CH(CH₃)-을 나타낸다. 일부 실시태양에서, R^{4 *} 및 R^{2 *}는 함께 바이라디칼 -O-CH₂-O-CH₂-(문헌[Seth at al., 2010, J. Org. Chem])를 나타낸다.

일부 실시태양에서, 상기 BNA(LNA)에서, R^{4 *} 및 R^{2 *}는 함께 바이라디칼 -O-NR-CH₃-(문헌[Seth at al., 2010, J. Org. Chem])을 나타낸다.

일부 실시태양에서, 상기 LNA 단위는 하기 기로부터 선택된 구조를 갖는다:

상기 올리고머, 예를 들어 BNA, (예를 들어) LNA 또는 2'-치환된 당에서 친화성-증대 뉴클레오티드 유사체의 통합은 특이적으로 결합하는 올리고머의 크기를 감소시킬 수 있으며, 또한 비-특이성 또는 이상 결합이 발생하기 전의 상기 올리고머의 크기에 대한 상한을 감소시킬 수 있다.

일부 실시태양에서, 상기 올리고머는 하나 이상의 뉴클레오시드 유사체를 포함한다. 일부 실시태양에서 상기 올리고머는 2개 이상의 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 올리고머는 3 내지 8개의 뉴클레오티드 유사체, 예를 들어 6 또는 7개의 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 단연코 가장 바람직한 실시태양에서, 상기 뉴클레오티드 유사체 중 하나 이상은 BNA, 예를 들어 잠금 핵산(LNA)이며; 예를 들어 상기 뉴클레오티드 유사체들 중 3개 이상 또는 4개 이상 또는 5개 이상, 또는 6개 이상, 또는 7개 이상, 또는 8개가 BNA, 예를 들어 LNA일 수 있다. 일부 실시태양에서 상기 뉴클레오티드 유사체들은 모두 BNA, 예를 들어 LNA일 수 있다.

오직 뉴클레오티드만으로 이루어진 바람직한 뉴클레오티드 서열 모티프 또는 뉴클레오티드 서열을 언급할 때, 상기 서열에 의해 한정되는 본 발명의 올리고머는 상기 서열 중에 존재하는 뉴클레오티드들 중 하나 이상 대신에 상응하는 뉴클레오티드 유사체, 예를 들어 BNA 단위, 또는 상기 올리고머/표적 듀플렉스의 듀플렉스 안정성/T_m을 상승시키는 다른 뉴클레오티드 유사체(즉, 친화성 증대 뉴클레오티드 유사체)를 포함할 수 있다.

바람직한 뉴클레오티드 유사체는 LNA, 예를 들어 옥시-LNA(예를 들어, 베타-D-옥시-LNA, 및 알파-L-옥시-LNA), 및/또는 아미노-LNA(예를 들어, 베타-D-아미노-LNA, 및 알파-L-아미노-LNA), 및/또는 티오-LNA(예를 들어, 베타-D-티오-LNA, 및 알파-L-티오-LNA), 및/또는 ENA(예를 들어, 베타-D-ENA, 및 알파-L-ENA)이다.

일부 실시태양에서, 본 발명의 올리고머, 예를 들어 영역 A는 BNA 또는 LNA 단위 및 다른 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 본 발명의 올리고머내에 존재하는 추가적인 뉴클레오티드 유사체는, 예를 들어 2'-O-알킬-RNA 단위, 2'-아미노-DNA 단위, 2'-플루오로-DNA 단위, BNA 단위, 예를 들어 LNA 단위, 아라비노 핵산(ANA) 단위, 2'-플루오로-ANA 단위, HNA 단위, INA(삽입 핵산 - 문헌[Christensen, 2002. Nucl. Acids. Res. 2002 30: 4918-4925](본 발명에 참고로 인용된다)) 단위 및 2'-MOE 단위 중에서 독립적으로 선택된다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 올리고머, 예를 들어 제 1 영역 또는 그의 연속적인 뉴클레오티드 서열 중에 존재하는 상기 유형의 뉴클레오티드 유사체들 중 단지 하나만이 존재한다.

일부 실시태양에서, 본 발명에 따른 올리고머(영역 A)는 따라서 하나 이상의 BNA, 예를 들어 잠금 핵산(LNA) 단위, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 BNA/LNA 단위, 예를 들어 3 내지 7개 또는 4 내지 8개 BNA/LNA 단위, 또는 3, 4, 5, 6 또는 7개 BNA/LNA 단위를 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 뉴클레오티드 유사체들은 모두 BNA, 예를 들어 LNA이다. 일부 실시태양에서, 상기 올리고머는 베타-D-옥시-LNA, 및 하기 LNA 단위들 중 하나 이상을 모두 포함할 수 있다: 베타-D 또는 알파-L 형태 또는 이들의 조합의 티오-LNA, 아미노-LNA, 옥시-LNA, 및/또는 ENA. 일부 실시태양에서 모든 BNA, 예를 들어 LNA, 시토신 단위는 5'-메틸-시토신이다. 본 발명의 일부 실시태양에서, 상기 올리고머(예를 들어, 제 1 및 임의로 제 2 영역)는 BNA 및 LNA 모두 및 DNA 단위를 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 LNA 및 DNA 단위를 합한 전체는 10 내지 25개, 예를 들어 10 내지 24개, 바람직하게는 10 내지 20개, 예를 들어 10 내지 18개, 예를 들어 12 내지 16개이다. 본 발명의 일부 실시태양에서, 상기 올리고머, 그의 제 1 영역의 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 연속적인 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 BNA, 예를 들어 LNA로 이루어지고 나머지 뉴클레오티드 단위는 DNA 단위이다. 일부 실시태양에서 상기 올리고머 또는 그의 제 1 영역은, 임의로 변형된 뉴클레오티드간 결합, 예를 들어 포스포로티오에이트를 갖는 BNA, 예를 들어 LNA, 뉴클레오티드 유사체 및 천연 뉴클레오티드(예를 들어, RNA 또는 DNA, 가장 바람직하게는 DNA 뉴클레오티드)만을 포함한다.

RNAse 보충

올리고뉴클레오티드는 표적 mRNA의 비 RNase-매개된 분해를 통해, 예를 들어 번역의 입체 장애, 또는 다른 방법에 의해 작용할 수 있지만, 본 발명의 바람직한 올리고뉴클레오티드는 엔도리보뉴클레아제(RNase), 예를 들어 RNase H를 보충(recruiting)할 수 있음이 인지되어 있다.

상기 올리고뉴클레오티드, 또는 연속적인 뉴클레오티드 서열은 6개 이상, 예를 들어 7개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 단위, 예를 들어 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하여, 8개 이상 또는 9개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 단위의 영역을 포함하는 것이 바람직하며, 상기 뉴클레오티드는 상보성 표적 RNA와 듀플렉스로 형성될 때 RNase를 보충할 수 있다. RNAse를 보충할 수 있는 상기 연속적인 서열은 본원에 개시된 갭머와 관련하여 지칭되는 바와 같은 영역 B일 수 있다. 일부 실시태양에서, RNAse를 보충할 수 있는 연속적인 서열, 예를 들어 영역 B의 크기는 더 클 수 있고, 예를 들어 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 단위일 수 있다.

EP 1 222 309는 RNaseH를 보충하는 능력을 측정하는데 사용될 수 있는 시험관내 RNaseH 활성 측정 방법을 제공한다. 올리고뉴클레오티드는, 상보성 RNA 표적이 제공될 때, EP 1 222 309의 실시예 91 내지 95에 의해 제공된 방법론을 사용하여 pmol/l/분으로 측정시, DNA만의 올리고뉴클레오티드(동일한 염기 서열을 갖지만 오직 DNA 단량체만을 함유하고, 2' 치환이 없으며, 상기 올리고뉴클레오티드 중의 모든 단량체들 간에 포스포로티오에이트 결합기가 있다)를 사용하여 측정된 초기 비율의 1% 이상, 예를 들어 5% 이상, 예를 들어 10% 이상, 또는 20% 초과의 초기 비율을 갖는 경우 RNaseH를 보충할 수 있는 것으로 간주된다.

일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는, 상보성 RNA 표적 및 RNaseH가 제공될 때, 상기 RNaseH 초기 비율이 EP 1 222 309에 의해 제공된 방법론을 사용하여 pmol/l/분으로 측정시, 등가의 DNA만의 올리고뉴클레오티드(2' 치환이 없으며, 상기 올리고뉴클레오티드 중의 모든 단량체들 간에 포스포로티오에이트 결합기가 있다)를 사용하여 측정된 초기 비율의 1% 미만, 예를 들어 5% 미만, 예를 들어 10% 미만, 또는 20% 미만인 경우 필수적으로 RNaseH를 보충할 수 없는 것으로 간주된다.

다른 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는, 상보성 RNA 표적, 및 RNaseH가 제공될 때, 상기 RNaseH 초기 비율이 EP 1 222 309의 실시예 91 내지 95에 의해 제공된 방법론을 사용하여 pmol/l/분으로 측정시, 등가의 DNA만의 올리고뉴클레오티드(2' 치환이 없으며, 상기 올리고뉴클레오티드 중의 모든 단량체들 간에 포스포로티오에이트 결합기가 있다)를 사용하여 측정된 초기 비율의 20% 이상, 예를 들어 40% 이상, 예를 들어 60% 이상, 또는 80% 이상인 경우 RNaseH를 보충할 수 있는 것으로 간주된다.

전형적으로 상보성 표적 RNA와 듀플렉스를 형성할 때 RNase를 보충할 수 있는 연속적인 뉴클레오티드 단위를 형성하는 올리고뉴클레오티드의 영역은 RNA 표적과 DNA/RNA형 듀플렉스를 형성하는 뉴클레오티드 단위로 이루어지며 알파-L 형태, 특히 바람직하게는 알파-L-옥시 LNA인 LNA 단위 및 DNA 단위를 모두 포함한다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체를 모두 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고, 갭머, 헤드머(headmer) 또는 믹스머(mixmer)의 형태로 존재할 수 있다.

"헤드머"는 영역 X 및 상기에 연속적인 영역 Y를 포함하는 올리고뉴클레오티드로서 정의되며, 이때 영역 Y의 가장-5' 단량체는 영역 X의 가장-3' 단량체에 결합된다. 영역 X는 비-RNase 보충 뉴클레오시드 유사체의 연속적인 신장부를 포함하고 영역 Y는 상기 RNase에 의해 인식될 수 있고 절단될 수 있는 DNA 단량체 또는 뉴클레오시드 유사체 단량체의 연속적인 신장부(예를 들어, 7개 이상의 연속적인 단량체)를 포함한다.

"테일머(tailmer)"는 영역 X 및 상기에 연속적인 영역 Y를 포함하는 올리고뉴클레오티드로서 정의되며, 이때 영역 Y의 가장-5' 단량체는 영역 X의 가장-3' 단량체에 결합된다. 영역 X는 RNase에 의해 인식될 수 있고 절단될 수 있는 DNA 단량체 또는 뉴클레오시드 유사체 단량체의 연속적인 신장부(예를 들어, 7개 이상의 연속적인 단량체)를 포함하고, 영역 X는 비-RNase 보충 뉴클레오시드 유사체의 연속적인 신장부를 포함한다.

"믹스머"라 칭하는 다른 "키메릭" 올리고뉴클레오티드는 (i) RNase에 의해 인식될 수 있고 절단될 수 있는 DNA 단량체 또는 뉴클레오시드 유사체 단량체, 및 (ii) 비-RNase 보충 뉴클레오시드 유사체 단량체의 교번 조성으로 이루어진다.

일부 실시태양에서, 표적 영역에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화성의 증대 외에, 일부 뉴클레오시드 유사체들은 또한 RNase(예를 들어, RNaseH) 결합 및 절단을 매개한다. α-L-LNA 단량체는 RNaseH 활성을 일정한 정도로 보충하기 때문에, 일부 실시태양에서, α-L-LNA 단량체를 함유하는 올리고뉴클레오티드들의 틈 영역(본 발명에서 지칭되는 바와 같은 영역 Y')은 상기 RNaseH에 의해 인식될 수 있고 절단될 수 있는 보다 적은 단량체들로 이루어지며, 상기 믹스머 구조에 보다 큰 가요성이 도입된다.

갭머 설계

일부 실시태양에서, 본 발명의 올리고머, 예를 들어 제 1 영역은 갭머를 포함하거나 갭머이다. 갭머 올리고머는 RNAse, 예를 들어 RNAseH를 보충할 수 있는 뉴클레오티드의 연속적인 신장부, 예를 들어 6 또는 7개 이상의 DNA 뉴클레오티드의 영역(본 발명에서 영역 Y'(Y')라 지칭된다)을 포함하는 올리고머이며, 이때 영역 Y'는 RNAse를 보충할 수 있는 뉴클레오티드의 연속적인 신장부에 대한 5' 및 3' 친화성 증대 뉴클레오티드 유사체, 예를 들어 1 내지 6개의 뉴클레오티드 유사체의 영역(상기 영역들을 각각 영역 X'(X') 및 Z'(Z')라 칭한다)에 의해 5' 및 3' 모두에 인접된다. 갭머의 예는 WO2004/046160, WO2008/113832, 및 WO2007/146511에 개시되어 있다.

일부 실시태양에서, RNAse를 보충할 수 있는 단량체는 DNA 단량체, 알파-L-LNA 단량체, C4' 알킬화된 DNA 단량체(본 발명에 참고로 인용된 PCT/EP2009/050349 및 문헌[Vester et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008) 2296 - 2300]을 참조하시오), 및 UNA(결합되지 않은 핵산) 뉴클레오티드(본 발명에 참고로 인용된 문헌[Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039]을 참조하시오)로 이루어진 군으로부터 선택된다. UNA는, 전형적으로 리보스의 C2-C3 C-C 결합이 제거된 경우 잠겨 있지 않은 "당" 잔기를 형성하는 잠겨 있지 않은 핵산이다. 바람직하게 상기 갭머는 화학식 (5'에서 3') X'-Y'-Z'의 (폴리)뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이때, 영역 X'(X')(5' 영역)는 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체, 예를 들어 하나 이상의 BNA(예를 들어, LNA) 단위, 예를 들어 1 내지 6개의 뉴클레오티드 유사체, 예를 들어 BNA(예를 들어, LNA) 단위로 이루어지거나 상기 단위를 포함하고; 영역 Y'(Y')는 RNAse를 보충할 수 있는(상보성 RNA 분자, 예를 들어 mRNA 표적과 듀플렉스로 형성될 때) 5개 이상의 연속적인 뉴클레오티드, 예를 들어 DNA 뉴클레오티드로 이루어지거나 상기를 포함하고; 영역 Z'(Z')(3' 영역)는 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체, 예를 들어 하나 이상의 BNA(예를 들어, LNA 단위), 예를 들어 1 내지 6개의 뉴클레오티드 유사체, 예를 들어 BNA(예를 들어, LNA) 단위로 이루어지거나 상기 단위를 포함한다.

일부 실시태양에서, 영역 X'는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 뉴클레오티드 유사체, 예를 들어 BNA(예를 들어, LNA) 단위, 예를 들어 2 내지 5개의 뉴클레오티드 유사체, 예를 들어 2 내지 5개의 LNA 단위, 예를 들어 3 또는 4개의 뉴클레오티드 유사체, 예를 들어 3 또는 4개의 LNA 단위로 이루어지고/지거나; 영역 Z는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 뉴클레오티드 유사체, 예를 들어 BNA(예를 들어, LNA) 단위, 예를 들어 2 내지 5개의 뉴클레오티드 유사체, 예를 들어 2 내지 5개의 BNA(예를 들어, LNA 단위), 예를 들어 3 또는 4개의 뉴클레오티드 유사체, 예를 들어 3 또는 4개의 BNA(예를 들어, LNA) 단위로 이루어진다.

일부 실시태양에서, Y'는 RNAse를 보충할 수 있는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 연속적인 뉴클레오티드, 또는 RNAse를 보충할 수 있는 6 내지 10개, 또는 7 내지 9개, 예를 들어 8개의 연속적인 뉴클레오티드로 이루어지거나 상기를 포함한다. 일부 실시태양에서, 영역 Y'는 하나 이상의 DNA 뉴클레오티드 단위, 예를 들어 1 내지 12개의 DNA 단위, 바람직하게는 4 내지 12개의 DNA 단위, 보다 바람직하게는 6 내지 10개의 DNA 단위, 예를 들어 7 내지 10개의 DNA 단위, 가장 바람직하게는 8, 9 또는 10개의 DNA 단위로 이루어지거나 상기 단위를 포함한다.

일부 실시태양에서, 영역 X'는 3 또는 4개의 뉴클레오티드 유사체, 예를 들어 BNA(예를 들어, LNA)로 이루어지고, 영역 X'는 7, 8, 9 또는 10개의 DNA 단위로 이루어지고, 영역 Z'는 3 또는 4개의 뉴클레오티드 유사체, 예를 들어 BNA(예를 들어, LNA)로 이루어진다. 상기와 같은 설계는 (X'-Y'-Z') 3-10-3, 3-10-4, 4-10-3, 3-9-3, 3-9-4, 4-9-3, 3-8-3, 3-8-4, 4-8-3, 3-7-3, 3-7-4, 4-7-3을 포함한다.

추가의 갭머 설계들이 본 발명에 참고로 인용된 WO2004/046160에 개시되어 있다. 본 발명에 참고로 인용된 미국 가출원 제 60/977,409 호로부터 우선권을 청구하는 WO2008/113832는 "쇼트머(shortmer)" 갭머 올리고머에 관한 것이다. 일부 실시태양에서, 본 발명에서 제공된 올리고머들은 상기와 같은 쇼트머 갭머일 수 있다.

일부 실시태양에서 상기 올리고머, 예를 들어 영역 X'는 총 10, 11, 12, 13 또는 14개의 뉴클레오티드 단위의 연속적인 뉴클레오티드 서열로 이루어지며, 이때 상기 연속적인 뉴클레오티드 서열은 화학식 (5' - 3') X'-Y'-Z'를 포함하거나 가지며, 이때, X'는 1, 2 또는 3개의 뉴클레오티드 유사체 단위, 예를 들어 BNA(예를 들어, LNA) 단위로 이루어지고; Y'는 RNAse를 보충할 수 있는(상보성 RNA 분자, 예를 들어 mRNA 표적과 듀플렉스로 형성될 때) 7, 8 또는 9개 연속적인 뉴클레오티드로 이루어지고; Z'는 1, 2 또는 3개의 뉴클레오티드 유사체 단위, 예를 들어 BNA(예를 들어, LNA 단위)로 이루어진다.

일부 실시태양에서, X'는 하나의 BNA(예를 들어, LNA) 단위로 이루어진다. 일부 실시태양에서, X'는 2개의 BNA(예를 들어, LNA) 단위로 이루어진다. 일부 실시태양에서, X'는 3개의 BNA(예를 들어, LNA) 단위로 이루어진다. 일부 실시태양에서, Z'는 하나의 BNA(예를 들어, LNA) 단위로 이루어진다. 일부 실시태양에서, Z'는 2개의 BNA(예를 들어, LNA) 단위로 이루어진다. 일부 실시태양에서, Z'는 3개의 BNA(예를 들어, LNA) 단위로 이루어진다. 일부 실시태양에서, Y'는 7개의 뉴클레오티드 단위로 이루어진다. 일부 실시태양에서, Y'는 8개의 뉴클레오티드 단위로 이루어진다. 일부 실시태양에서, Y'는 9개의 뉴클레오티드 단위로 이루어진다. 몇몇 실시태양에서, 영역 Y'는 10개의 뉴클레오티드 단량체로 이루어진다. 몇몇 실시태양에서, 영역 Y'는 1 내지 10개의 DNA 단량체로 이루어진다. 일부 실시태양에서, Y'는 1 내지 9개의 DNA 단위, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개의 DNA 단위를 포함한다. 일부 실시태양에서, Y'는 DNA 단위로 이루어진다. 일부 실시태양에서, Y'는 알파-L 형태인 하나 이상의 BNA 단위, 예를 들어 알파-L-형태인 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개의 LNA 단위를 포함한다. 일부 실시태양에서, Y'는 하나 이상의 알파-L-옥시 BNA/LNA 단위를 포함하거나 상기 알파-L-형태의 모든 LNA 단위는 알파-L-옥시 LNA 단위이다. 일부 실시태양에서, X'-Y'-Z' 중에 존재하는 뉴클레오티드의 수는 (뉴클레오티드 유사체 단위 - 영역 Y' - 뉴클레오티드 유사체 단위) 1-8-1, 1-8-2, 2-8-1, 2-8-2, 3-8-3, 2-8-3, 3-8-2, 4-8-1, 4-8-2, 1-8-4, 2-8-4, 및 1-9-1, 1-9-2, 2-9-1, 2-9-2, 2-9-3, 3-9-2, 1-9-3, 3-9-1, 4-9-1, 1-9-4, 및 1-10-1, 1-10-2, 2-10-1, 2-10-2, 1-10-3, 3-10-1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시태양에서 X'-Y'-Z' 중의 뉴클레오티드의 수는 2-7-1, 1-7-2, 2-7-2, 3-7-3, 2-7-3, 3-7-2, 3-7-4, 및 4-7-3으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 실시태양에서, 각각의 영역 X' 및 Y'는 3개의 BNA(예를 들어, LNA) 단량체로 이루어지고, 영역 Y'는 8 또는 9 또는 10개의 뉴클레오시드 단량체, 바람직하게는 DNA 단량체로 이루어진다. 일부 실시태양에서, X' 및 Z'는 모두 각각 2개의 BNA(예를 들어, LNA) 단위로 이루어지고, Y'는 8 또는 9개의 뉴클레오티드 단위, 바람직하게는 DNA 단위로 이루어진다. 다양한 실시태양에서, 다른 갭머 설계는 영역 X' 및/또는 Z'가 3, 4, 5 또는 6개의 뉴클레오시드 유사체, 예를 들어 2'-O-메톡시에틸-리보스 당(2'-MOE)을 함유하는 단량체 또는 2'-플루오로-데옥시리보스 당을 함유하는 단량체로 이루어지고, 영역 Y'가 8, 9, 10, 11 또는 12개의 뉴클레오시드, 예를 들어 DNA 단량체로 이루어지며, 이때 영역 X'-Y'-Z'는 3-9-3, 3-10-3, 5-10-5 또는 4-12-4 단량체를 갖는 것들을 포함한다. 추가의 갭머 설계는 본 발명에 참고로 인용된 WO2007/146511A2에 개시되어 있다.

뉴클레오티드간 결합

본원에 개시된 올리고뉴클레오티드의 단량체들은 결합기를 통해 함께 커플링된다. 적합하게, 각각의 단량체는 결합기를 통해 3' 인접 단량체에 결합된다. 당해 분야의 통상적인 숙련가는 본 발명과 관련하여, 올리고뉴클레오티드 단부의 5' 단량체가 5' 결합기를 포함하지 않지만, 5' 말단기를 포함할 수 있거나, 포함하지 않을 수 있음을 알 것이다.

"결합기" 및 "뉴클레오티드간 결합"이란 어구는 2개의 뉴클레오티드를 함께 공유 커플링시킬 수 있는 기를 의미하고자 한다. 구체적이고 바람직한 예는 포스페이트기 및 포스포로티오에이트기를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 본원에 개시된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 각각의 뉴클레오티드간 결합(예를 들어, 서열번호 21, 22, 23, 24 및 25)에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합을 갖는다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 또는 그의 연속적인 뉴클레오티드 서열은 결합기를 통해 함께 커플링된다. 적합하게 각각의 뉴클레오티드는 결합기를 통해 3' 인접 뉴클레오티드에 결합된다.

적합한 뉴클레오티드간 결합은 국제 출원공개 WO2007/031091 내에 나열된 것들, 예를 들어 WO2007/031091의 페이지 34의 첫 번째 단락에 나열된 뉴클레오티드간 결합들을 포함한다.

일부 실시태양에서, 상기 뉴클레오티드간 결합을 그의 통상적인 포스포다이에스터로부터 뉴클레아제 공격에 보다 내성인 것, 예를 들어 포스포로티오에이트 또는 보라노포스페이트(이들 2개는 RNaseH에 의해 절단가능하다)로 변형시키는 것이 바람직하며, 이는 또한 표적 유전자의 발현을 감소시킴에 있어서 상기 안티센스 억제 경로를 허용한다.

본 발명에서 제공된 바와 같은 적합한 황(S) 함유 뉴클레오티드간 결합이 바람직할 수 있다. 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합이 또한, 특히 갭머의 틈 영역(Y')에 바람직하다. 포스포로티오에이트 결합을 또한 측면 인접한 영역들(X' 및 Z')에 사용할 수도 있다.

그러나, 영역 X', Y' 및 Z'는, 특히 예를 들어 뉴클레오티드 유사체의 사용이 영역 X' 및 Z' 내의 뉴클레오티드간 결합을 엔도-뉴클레아제 분해로부터 보호하는 경우, 예를 들어 영역 X' 및 Z'가 LNA 뉴클레오티드를 포함하는 경우, 포스포로티오에이트 이외의 뉴클레오티드간 결합, 예를 들어 포스포다이에스터 결합을 포함할 수 있다.

상기 올리고뉴클레오티드 중의 뉴클레오티드간 결합은 표적화된 RNA의 RNase H 절단을 허용하도록 포스포다이에스터, 포스포로티오에이트 또는 보라노포스페이트일 수 있다. 포스포로티오에이트가, 개선된 뉴클레아제 내성 및 다른 이유, 예를 들어 제조 용이성 때문에 바람직하다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드의 하나의 태양에서, 상기 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체를 포스포로티오에이트기에 의해 서로 결합시킨다.

포스포다이에스터 결합, 예를 들어 1 또는 2개의 결합을, 다른 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드내에, 특히 뉴클레오티드 유사체 단위들 사이 또는 상기 단위들에 인접하여(전형적으로 영역 X' 및 또는 Z' 중에) 포함시킴은 올리고뉴클레오티드의 생물학적 이용효능 및/또는 생체-분포를 변형시킬 수 있는 것으로 인식된다(국제 출원공개 WO2008/053314를 참조하시오).

일부 실시태양, 예를 들어 상기에 언급된 실시태양들에서, 적합하고 구체적으로 나타내지 않은 경우 모든 나머지 결합기들은 포스포다이에스터 또는 포스포로티오에이트 또는 이들의 혼합물이다. 일부 실시태양에서 모든 뉴클레오티드간 결합기는 포스포로티오에이트이다.

특정한 갭머 올리고뉴클레오티드 서열, 예를 들어 본 발명에서 제공된 서열들을 언급할 때, 다양한 실시태양에서 상기 결합이 포스포로티오에이트 결합, 또 다른 결합, 예를 들어 본원에 개시된 결합들을 사용하는 경우, 예를 들어 포스페이트(포스포다이에스터) 결합을 특히 뉴클레오티드 유사체들, 예를 들어 LNA, 단위들간의 결합에 사용할 수 있음을 알 것이다. 마찬가지로, 특정한 갭머 올리고뉴클레오티드 서열, 예를 들어 본 발명에서 제공된 서열들을 언급할 때, C 잔기를 5' 메틸 변형된 시토신으로서 나타내는 경우, 다양한 실시태양에서 상기 올리고뉴클레오티드 중에 존재하는 C들 중 하나 이상은 변형되지 않은 C 잔기일 수 있다.

올리고뉴클레오티드

본 발명의 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어 서열번호 9, 10, 11, 12, 13 및 14로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24 및 서열번호 25로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어 표 1 또는 4에 나타낸 서열들로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

접합체

본 발명과 관련하여, "접합체"란 용어는 본원에 개시된 바와 같은 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 비-뉴클레오티드, 또는 비-폴리뉴클레오티드 부분에의 공유 부착에 의해 형성된 이종 분자를 가리키고자 한다. 비-뉴클레오티드 또는 비-폴리뉴클레오티드 부분의 예는 거대분자 물질, 예를 들어 단백질, 지방산쇄, 당 잔기, 당단백질, 중합체 또는 이들의 조합을 포함한다. 전형적으로 단백질은 표적 단백질에 대한 항체일 수 있다. 전형적인 중합체는 폴리에틸렌 글리콜일 수 있다.

따라서, 다양한 실시태양에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 뉴클레오티드들의 연속적인 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 영역 및 추가의 비-뉴클레오티드 영역을 모두 포함할 수 있다. 연속적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 언급하는 경우, 상기 화합물은 비-뉴클레오티드 성분, 예를 들어 접합체 성분을 포함할 수 있다.

본 발명의 다양한 실시태양에서 상기 올리고뉴클레오티드를, 예를 들어 올리고뉴클레오티드의 세포 흡수를 증가시키기 위해 사용될 수 있는 리간드/접합체에 결합시킨다. 국제 출원공개 WO2007/031091은 적합한 리간드 및 접합체를 제공한다.

본 발명은 또한 본원에 개시된 바와 같은 본 발명에 따른 화합물, 및 상기 화합물에 공유 부착된 하나 이상의 비-뉴클레오티드 또는 비-폴리뉴클레오티드 부분을 포함하는 접합체를 제공한다. 따라서, 본 발명의 화합물이 본원에 개시된 바와 같은 명시된 핵산 또는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 다양한 실시태양에서, 상기 화합물은 또한 상기 화합물에 공유 부착된 하나 이상의 비-뉴클레오티드 또는 비-폴리뉴클레오티드 부분(예를 들어, 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체를 포함하지 않음)을 포함할 수 있다.

접합은 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 활성, 세포 분포 또는 세포 흡수를 증대시킬 수 있다. 상기와 같은 부분은 비제한적으로 항체, 폴리펩티드, 지질 부분, 예를 들어 콜레스테롤 부분, 콜산, 티오에터, 예를 들어 헥실-s-트리틸티올, 티오콜레스테롤, 지방족쇄, 예를 들어 도데칸다이올 또는 운데실 잔기, 인지질, 예를 들어 다이-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트라이에틸암모늄 1,2-다이-o-헥사데실-rac-글리세로-3-h-포스포네이트, 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 쇄, 아다만탄 아세트산, 팔미틸 부분, 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카보닐-옥시콜레스테롤 부분을 포함한다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드를 또한 활성 약물 물질, 예를 들어 아스피린, 이부프로펜, 설파 약물, 당뇨병치료제, 항균제 또는 항생제에 접합시킬 수도 있다.

몇몇 실시태양에서, 상기 접합된 부분은 스테롤, 예를 들어 콜레스테롤이다.

다양한 실시태양에서, 상기 접합된 부분은 양으로 하전된 중합체, 예를 들어 약 1 내지 50개, 예를 들어 2 내지 20개, 예를 들어 3 내지 10개 아미노산 잔기 길이의 양으로 하전된 펩티드, 및/또는 폴리알킬렌 옥사이드, 예를 들어 폴리에틸렌글리콜(PEG) 또는 폴리프로필렌 글리콜(예를 들어, 국제 출원공개 WO2008/034123 참조)을 포함하거나 상기로 이루어진다. 적합하게는 양으로 하전된 중합체, 예를 들어 폴리알킬렌 옥사이드를 링커, 예를 들어 WO2008/034123에 개시된 이형가능한 링커를 통해 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 부착시킬 수 있다.

예로서, 하기의 접합체 부분을 본 발명의 접합체에 사용할 수 있다:

일부 실시태양에서, 상기 올리고머성 화합물은 안티센스 올리고머, 예를 들어 LNA 안티센스 올리고머(이를 본 발명에서 영역 A라 칭할 수도 있다), 임의로 생-절단가능한 링커(영역 B), 및 탄수화물 접합체(이를 본 발명에서 영역 C라 칭할 수도 있다)를 포함한다. 일부 실시태양에서, 영역 B는 포스페이트 뉴클레오티드 링커일 수 있다. 일부 실시태양에서, 영역 B는 1 내지 6개의 뉴클레오티드를 포함하고, 예를 들어 뉴클레오시드간 결합기, 예를 들어 포스포다이에스터 결합을 통해 상기 A 영역의 5' 또는 3' 뉴클레오티드에 공유 결합된다.

일부 실시태양에서, 상기 탄수화물 부분은 선형 탄수화물 중합체가 아니다. 그러나, 상기 탄수화물 부분은 다가일 수 있고, 예를 들어 2, 3, 4 또는 4개의 동일하거나 동일하지 않은 탄수화물 부분이 임의로 링커 또는 링커들을 통해 상기 올리고머에 공유 결합될 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 올리고머 및 탄수화물 접합체 부분을 포함하는 접합체를 제공한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 올리고머 및 아시알로당단백질 수용체 표적화 부분 접합체 부분, 예를 들어 GalNAc 부분(추가적인 영역(영역 C라 지칭된다)의 부분을 형성할 수 있다)을 포함하는 접합체를 제공한다.

활성화된 올리고뉴클레오티드

본 발명에 사용되는 바와 같은 "활성화된 올리고뉴클레오티드"란 용어는 올리고뉴클레오티드의, 하나 이상의 접합된 부분(즉, 핵산 또는 단량체 자신이 아닌 부분)에의 공유 결합을 허용하여 본원에 개시된 접합체를 형성시키는 하나 이상의 작용성 부분에 공유 결합되는(즉, 작용화되는) 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 전형적으로, 작용성 부분은, 예를 들어 바람직하게는 접합된 부분에 결합할 수 있는 친수성 말단기(예를 들어, 아미노, 설프하이드릴 또는 하이드록실기)인 이격자, 아데닌 염기의 3'-하이드록실기 또는 환외(exocyclic) NH₂ 기를 통해 상기 올리고뉴클레오티드에 공유 결합할 수 있는 화학적 기를 포함할 것이다. 일부 실시태양에서, 상기 말단기는 보호되지 않는다(예를 들어, NH₂ 기). 다른 실시태양에서, 상기 말단기는, 예를 들어 임의의 적합한 보호기, 예를 들어 문헌["Protective Groups in Organic Synthesis" by Theodora W Greene and Peter G M Wuts, 3rd edition (John Wiley & Sons, 1999)]에 개시된 것들에 의해 보호된다. 적합한 하이드록실 보호기의 예는 에스터, 예를 들어 아세테이트 에스터, 아르알킬기, 예를 들어 벤질, 다이페닐메틸, 또는 트라이페닐메틸, 및 테트라하이드로피라닐을 포함한다. 적합한 아미노 보호기의 예는 벤질, 알파-메틸벤질, 다이페닐메틸, 트라이페닐메틸, 벤질옥시카보닐, 3급-부톡시카보닐, 및 아실기, 예를 들어 트라이클로로아세틸 또는 트라이플루오로아세틸을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 작용성 부분은 자기-절단성이다. 다른 실시태양에서, 상기 작용성 부분은 생분해성이다(예를 들어, 미국특허 제 7,087,229 호를 참조하시오).

일부 실시태양에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 상기 올리고뉴클레오티드의 5' 단부에 상기 접합된 부분의 공유 부착을 허용하기 위해서 5' 단부에서 작용화된다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 3' 단부에서 작용화시킬 수 있다. 더욱 다른 실시태양에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 주쇄를 따라 또는 헤테로사이클릭 염기 부분상에서 작용화시킬 수 있다. 더욱 다른 실시태양에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 5' 단부, 3' 단부, 주쇄 및 염기 중에서 독립적으로 선택된 하나 초과의 위치에서 작용화시킬 수 있다.

일부 실시태양에서, 본 발명의 활성화된 올리고뉴클레오티드를, 합성 중에 작용성 부분에 공유 부착된 하나 이상의 단량체를 통합시킴으로써 합성시킨다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 활성화된 올리고뉴클레오티드를 작용화되지 않은 단량체로 합성하며, 상기 올리고뉴클레오티드는 합성의 완료시 작용화된다. 일부 실시태양에서, 상기 올리고뉴클레오티드를 장애 에스터 함유 아미노알킬 링커로 작용화하며, 이때 상기 알킬 부분은 화학식 (CH₂)_w를 갖고, 이때 w는 1 내지 10 범위의 정수, 바람직하게는 6이고, 상기 알킬아미노기의 알킬 부분은 직쇄 또는 분지쇄일 수 있으며, 상기 작용기를 에스터기(-O-C(O)-(CH₂)_w-NH)를 통해 상기 올리고뉴클레오티드에 부착시킨다.

다른 실시태양에서, 상기 올리고뉴클레오티드를 장애 에스터 함유 (CH₂)_w-설프하이드릴 (SH) 링커로 작용화하며, 이때 w는 1 내지 10 범위의 정수, 바람직하게는 6이고, 상기 알킬아미노기의 알킬 부분은 직쇄 또는 분지쇄일 수 있으며, 상기 작용기를 에스터기(-O-C(O)-(CH₂)_wSH)를 통해 상기 올리고뉴클레오티드에 부착시킨다.

일부 실시태양에서, 설프하이드릴-활성화된 올리고뉴클레오티드를 중합체 부분, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 또는 펩티드와 접합시킨다(다이설파이드 결합의 형성을 통해).

상술한 바와 같은 장애 에스터를 함유하는 활성화된 올리고뉴클레오티드를 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해서 및 특히 국제 출원공개 WO2008/034122 및 상기 중의 실시예들에 개시된 방법에 의해 합성할 수 있다.

더욱 다른 실시태양에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 실질적으로 미국특허 제 4,962,029 호 및 미국특허 제 4,914,210 호에 개시된 바와 같은 작용화 시약(즉, 한쪽 단부에, 보호되거나 보호되지 않은 설프하이드릴, 아미노 또는 하이드록실기를 포함하는 대향 단부에 친수성 이격자 쇄를 통해 결합된 포스포르아미다이트를 갖는 실질적으로 선형인 시약)에 의해 상기 올리고뉴클레오티드에 설프하이드릴, 아미노 또는 하이드록실기를 도입시킴으로써 작용화시킨다. 상기와 같은 시약들은 주로 상기 올리고뉴클레오티드의 하이드록실기와 반응한다. 일부 실시태양에서, 상기와 같은 활성화된 올리고뉴클레오티드는 상기 올리고뉴클레오티드의 5'-하이드록실기에 커플링된 작용화 시약을 갖는다. 다른 실시태양에서, 상기 활성화된 올리고뉴클레오티드는 3'-하이드록실기에 커플링된 작용화 시약을 갖는다. 더욱 다른 실시태양에서, 본 발명의 활성화된 올리고뉴클레오티드는 상기 올리고뉴클레오티드의 주쇄상의 하이드록실기에 커플링된 작용화 시약을 갖는다. 더욱 추가의 실시태양에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 미국특허 제 4,962,029 호 및 미국특허 제 4,914,210 호에 개시된 바와 같은 작용화 시약들 중 하나보다 많은 시약으로 작용화시킨다. 상기와 같은 작용화 시약의 합성 방법 및 상기 시약을 단량체 또는 올리고뉴클레오티드에 통합시키는 방법은 미국특허 제 4,962,029 호 및 미국특허 제 4,914,210 호에 개시되어 있다.

일부 실시태양에서, 고상 결합된 올리고뉴클레오티드의 5'-말단을 다이에닐 포스포르아미다이트 유도체로 작용화한 다음, 탈보호된 올리고뉴클레오티드를, 예를 들어 딜스-알더 고리화 첨가 반응을 통해 아미노산 또는 펩티드와 접합시킨다.

다양한 실시태양에서, 2'-당 치환을 함유하는 단량체, 예를 들어 2'-카바메이트 치환된 당 또는 2'-(O-펜틸-N-프탈이미도)-데옥시리보스 당의 올리고뉴클레오티드내로의 통합은 상기 올리고뉴클레오티드의 당에 대한 접합된 부분의 공유 부착을 촉진한다. 다른 실시태양에서, 하나 이상의 단량체의 2'-위치에 아미노-함유 링커를 갖는 올리고뉴클레오티드를 시약, 예를 들어 5'-다이메톡시트리틸-2'-O-(e-프탈이미딜아미노펜틸)-2'-데옥시아데노신-3'-N,N-다이이소프로필-시아노에톡시 포스포르아미다이트를 사용하여 제조한다(예를 들어, 문헌[Manoharan, et al., Tetrahedron Letters, (1991) 34:7171]을 참조하시오).

더욱 추가의 실시태양에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 N6 퓨린 아미노기, 구아닌의 환외 N2, 또는 시토신의 N4 또는 5번 위치를 포함하여, 핵염기상에 아민-함유 작용성 부분을 가질 수 있다. 다양한 실시태양들에서, 상기와 같은 작용화를 상기 올리고뉴클레오티드 합성에서 이미 작용화된 상업적인 시약을 사용하여 성취할 수도 있다.

일부 작용성 부분들을 상업적으로 입수할 수 있고, 예를 들어 이종이작용성 및 동종이작용성 결합 부분을 피어스 캄파니(Pierce Co.)(미국 일리노이주 록포드 소재)로부터 입수할 수 있다. 다른 상업적으로 입수할 수 있는 결합기는 5'-아미노-변형제 C6 및 3'-아미노-변형제 시약(둘 다 글렌 리써치 코포레이션(Glen Research Corporation)(미국 버지니아주 스털링 소재)으로부터 입수할 수 있다)이다. 5'-아미노-변형제 C6을 또한 ABI(어플라이드 바이오시스템스 인코포레이티드(Applied Biosystems Inc.), 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재)로부터 아미노링크(Aminolink)-2로서 입수할 수 있고, 3'-아미노-변형제를 또한 클론테크 레보라토리즈 인코포레이티드(Clontech Laboratories Inc.)(미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)로부터 입수할 수 있다.

약학 조성물

본 발명의 올리고뉴클레오티드를 약학 제형 및 조성물에 사용할 수 있다. 적합하게, 상기와 같은 조성물은 약학적으로 허용되는 용매, 예를 들어 물 또는 염수, 희석제, 담체, 염 또는 보조제를 포함한다. PCT/DK2006/000512는 적합하고 바람직한 약학적으로 허용되는 희석제, 담체, 용매 및 보조제를 제공한다. 적합한 투여량, 제형, 투여 경로, 조성물, 투여형, 다른 치료제들과의 조합, 전구약물 제형이 또한 PCT/DK2006/000512에 제공된다.

본 발명은 또한 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약학 조성물 및 제형을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물을, 국소 또는 전신 치료가 요구되는지에 따라 및 치료하고자 하는 영역에 따라 다수의 방식으로 투여할 수 있다. 투여는 국소(눈, 및 질 및 직장 전달을 포함한 점막 포함), 폐, 예를 들어 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 흡취에 의해, 예를 들어 분무기에 의해; 기관내, 비내, 상피 및 경피), 경구 또는 비경구일 수 있다. 비경구 투여는 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내 또는 근육내 주사 또는 주입; 또는 두개내(예를 들어, 뇌척수강내 또는 뇌실내 투여)를 포함한다. 하나 이상의 2'-O-메톡시에틸 치환 또는 변형을 갖는 올리고뉴클레오티드는 경구 투여에 특히 유용할 수 있다.

적용

본 발명의 올리고뉴클레오티드를, 예를 들어 진단, 치료 및 예방을 위한 연구 시약으로서 사용할 수 있다. 연구시, 상기와 같은 올리고뉴클레오티드를 사용하여 세포 및 실험 동물에서 FGFR3의 합성을 특이적으로 억제하고(전형적으로는 mRNA를 분해 또는 억제하고 이에 의해 단백질 형성을 방지함으로써), 이에 의해 표적의 기능 분석 또는 치료학적 중재를 위한 표적으로서 그의 유용성의 평가를 용이하게 할 수 있다.

진단시, 상기 올리고뉴클레오티드를 사용하여 노던 블럿팅, 원위치 하이브리드화 또는 유사한 기법에 의해 세포 및 조직에서의 FGFR3 발현을 검출 및 정량분석할 수 있다.

치료의 경우, 상기 FGFR3의 발현을 조절함으로써 치료될 수 있는 질병 또는 질환을 갖는 것으로 의심이 되는 동물 또는 인간을 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드를 투여함으로써 치료한다. 추가로 치료학적으로 또는 예방학적으로 유효한 양의 본 발명의 올리고뉴클레오티드 및 조성물 중 하나 이상을 투여함으로써, FGFR3의 발현과 관련된 질병 또는 상태를 갖는 것으로 의심되거나 상기 질병에 걸리기 쉬운 포유동물, 예를 들어 인간을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드, 접합체 또는 약학 조성물을 전형적으로는 유효량으로 투여한다.

본 발명은 또한 본 발명에서 언급된 바와 같은 질환의 치료를 위한 약제의 제조, 또는 본 발명에서 언급된 바와 같은 질환의 치료 방법을 위한 개시된 바와 같은 발명의 화합물 또는 접합체의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 본원에 개시된 바와 같은 본 발명에 따른 화합물 및/또는 본 발명에 따른 접합체 및/또는 본 발명에 따른 약학 조성물을 본 발명에서 언급된 바와 같은 질환의 치료가 필요한 환자에게 투여함을 포함하는, 상기 질환의 치료 방법을 제공한다.

의학적 적응증

본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 및 다른 조성물을 FGFR3의 과잉 발현 또는 돌연변이된 버전의 발현과 관련된 상태(예를 들어, 연골무형성증)의 치료에 사용할 수 있다. 본 발명은 또한 본원에서 지칭된 바와 같은 질병, 질환 또는 상태의 치료를 위한 약제의 제조에서 본 발명 화합물의 용도를 제공한다.

일반적으로 서술하자면, 본 발명의 하나의 태양은 FGFR3의 이상 수준 또는 이상 발현과 관련된(예를 들어, 돌연변이된 G380R FGFR3의 발현과 관련된) 상태를 앓고 있거나 상기 상태에 민감한 포유동물의 치료 방법에 관한 것으로서, 상기 포유동물에게 치료 유효량의, 하나 이상의 LNA 단위를 포함하는 FGFR3의 돌연변이된 또는 천연 변이체의 유전자 산물(예를 들어, 돌연변이된 FGFR3, 예를 들어 G380R 돌연변이를 암호화하는 mRNA)에 표적화된 올리고뉴클레오티드를 투여함을 포함한다. 상기 질병 또는 질환은 본 발명에서 언급된 바와 같이, 일부 실시태양에서 FGFR3 유전자 또는 FGFR3과 관련되거나 상호작용하는 단백질 산물을 갖는 유전자의 돌연변이와 관련될 수 있다. 따라서, 일부 실시태양에서, 상기 표적 mRNA는 FGFR3 mRNA의 돌연변이된 형태이다.

본 발명의 하나의 태양은 본 발명에서 지칭된 바와 같은 질병, 질환 또는 상태의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 올리고뉴클레오티드 또는 접합체의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 방법은 바람직하게는 이상 수준의 FGFR3에 의해 야기된 질병에 대한 치료 또는 예방에 사용된다. 한편으로 서술된 바와 같이, 일부 실시태양에서, 본 발명은 더욱 또한 이상 수준의 FGFR3의 치료 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 본 발명의 접합체 또는 본 발명의 약학 조성물을 상기 치료가 필요한 환자에게 투여함을 포함한다.

본 발명은 또한 약제로서 사용하기 위한 본 발명에 정의된 바와 같은 올리고뉴클레오티드, 조성물 또는 접합체에 관한 것이다.

본 발명은 또한 FGFR3의 이상 수준 또는 FGFR3의 돌연변이 형태(예를 들어, 대립유전자 변이체, 예를 들어 본 발명에서 언급된 질병들 중 하나와 관련된 것들)의 발현의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 본 발명에 정의된 바와 같은 화합물, 조성물 또는 접합체의 용도에 관한 것이다.

더욱이, 본 발명은 본 발명에서 언급된 바와 같은 질병 또는 상태를 앓고 있는 피실험자의 치료 방법에 관한 것이다.

치료가 필요한 환자는 상기 질병 또는 질환을 앓고 있거나 앓을 것 같은 환자이다.

일부 실시태양에서, 본 발명에 사용된 바와 같은 "치료"란 용어는 기존 질병(예를 들어, 본 발명에서 언급되는 바와 같은 질병 또는 질환)의 치료, 또는 질병의 예방(즉, 예방학적) 모두를 지칭한다. 따라서, 본 발명에서 언급되는 바와 같은 치료는 일부 실시태양에서 예방학적일 수도 있음을 알 것이다.

본 발명의 안티센스 화합물을 진단, 치료, 예방에, 및 연구 시약 및 키트로서 사용할 수 있다. 치료의 경우, FGFR3의 발현을 조절함으로써 치료될 수 있는 질병 또는 질환을 갖는 것으로 의심되는 동물, 바람직하게는 인간을 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드를 투여함으로써 치료한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드를, 유효량의 올리고뉴클레오티드를 적합한 약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체에 첨가함으로써 약학 조성물에 사용할 수 있다.

본 발명의 안티센스 화합물은 연구 및 진단에 유용한데, 그 이유는 상기 화합물이 FGFR3을 암호화하는 핵산에 하이브리드화하기 때문이며, 이러한 사실을 활용하여 샌드위치 및 다른 분석들을 쉽게 구성할 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드와 FGFR3을 암호화하는 핵산과의 하이브리드화를 당해 분야에 공지된 수단에 의해 검출할 수 있다. 상기와 같은 수단은 효소의 상기 올리고뉴클레오티드에의 접합, 상기 올리고뉴클레오티드의 방사성 표지화, 또는 임의의 다른 적합한 검출 수단을 포함할 수 있다. 샘플 중 FGFR3 단백질 또는 mRNA의 수준을 검출하기 위해 상기와 같은 검출 수단을 사용하는 키트를 또한 제조할 수 있다.

본 발명의 몇몇 화합물, 조성물 및 방법을 몇몇 실시태양들에 따라 한정하여 개시하였지만, 하기의 실시예들은 단지 본 발명의 화합물들을 예시하기 위한 것으로 제공될 뿐이며 이들을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 발명의 배경을 개시하고 본 발명의 실시에 관하여 추가적인 세부사항들을 제공하기 위해서 본 발명에서 참조한 공보, 참고 자료, 진뱅크 수탁 번호 등은 각각 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다.

본 발명의 명세서 및 특허청구범위에 사용된 바와 같은 "하나의"란 단수 표현은, 명백히 달리 나타내지 않는 한, 복수의 지시대상을 포함하는 것으로 이해해야 한다. 어느 한 군의 하나 이상의 구성원들 간에 "또는"을 포함하는 청구항 또는 묘사는, 명백히 달리 나타내거나 문맥상 달리 자명하지 않는 한, 상기 군의 구성원들 중 하나, 하나 초과, 또는 전부가 주어진 생성물 또는 공정 중에 존재하거나, 사용되거나, 달리 관련됨을 충족시키는 것으로 간주된다. 본 발명은 상기 군의 정확히 한 구성원이 주어진 생성물 또는 공정에 존재하거나, 사용되거나, 달리 관련되는 실시태양들을 포함한다. 본 발명은 또한 상기 군의 구성원들 중 하나 또는 전부가 주어진 생성물 또는 공정에 존재하거나, 사용되거나, 달리 관련되는 실시태양들을 포함한다. 더욱 또한, 본 발명은 나열된 청구항들 중 하나 이상으로부터 하나 이상의 제한, 요소, 단서조항, 기술 용어 등을, 달리 나타내지 않는 한, 또는 반박 또는 불일치가 발생하게 될 것이 당해 분야의 통상적인 숙련가에게 자명하지 않는 한, 동일한 기본 청구항(또는 적합한 경우, 임의의 다른 청구항)에 따라 또 다른 청구항에 도입시키는 모든 변화, 조합, 및 변경을 포함하는 것으로 이해해야 한다. 요소들이 목록으로서 제공되는 경우, 예를 들어 마쿠시 군 또는 유사한 포맷으로 제공되는 경우, 상기 요소의 각 하위군을 또한 개시하고 임의의 요소를 상기 군으로부터 제거할 수 있는 것으로 이해해야 한다. 일반적으로, 본 발명 또는 본 발명의 태양이 특정한 요소, 특징 등을 포함하는 것으로 언급되는 경우, 본 발명의 몇몇 실시태양 또는 본 발명의 태양이 상기와 같은 요소, 특징 등으로 이루어지거나 필수적으로 이루어짐은 물론이다. 간략성을 위해서 상기 실시태양들을 모든 경우에서 본 발명에 너무 많은 단어들로 구체적으로 설명하지 않았다. 또한 본 발명의 임의의 실시태양 또는 태양이, 특정한 제외를 명세서에서 인용하는지의 여부에 상관 없이, 청구항들로부터 명백히 제외될 수 있음은 물론이다.

본 발명의 실시태양

1. 서열번호 4를 포함하는 핵산에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오티드로서, 상기 올리고뉴클레오티드는 FGFR3의 발현을 조절한다.

2. 실시태양 1의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 4의 1394번 뉴클레오티드 위치를 포함하는 서열번호 4의 영역에 하이브리드화한다.

3. 실시태양 1의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24 및 서열번호 25로 이루어진 군으로부터 선택된다.

4. 실시태양 1의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13 및 서열번호 14로 이루어진 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드에 80% 이상 일치한다.

5. 실시태양 1의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 14개 뉴클레오티드의 길이이다.

6. 실시태양 1의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 15개 뉴클레오티드 이상의 길이이다.

7. 실시태양 1의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 16개 뉴클레오티드 이상의 길이이다.

8. 실시태양 1의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 18개 뉴클레오티드 이상의 길이이다.

9. 실시태양 1의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 G380R 돌연변이를 암호화하는 서열번호 4의 영역에 특이적으로 하이브리드화한다.

10. 실시태양 1의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 FGFR3의 발현을 약 50% 이상까지 감소시킨다.

11. 실시태양 1의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 FGFR3의 발현을 약 75% 이상까지 감소시킨다.

12. 실시태양 1의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 FGFR3의 발현을 약 90% 이상까지 감소시킨다.

13. 실시태양 1의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 FGFR3의 돌연변이된 형태의 발현을 조절한다.

14. 실시태양 1의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 FGFR3의 돌연변이된 형태의 발현을 FGFR3의 야생형 형태의 발현에 비해 우선적으로 조절한다.

15. 실시태양 1의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 FGFR3의 돌연변이된 형태의 발현을 억제시킨다.

16. 실시태양 1의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 FGFR3의 돌연변이된 형태의 발현을 하향조절한다.

17. 실시태양 1의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 FGFR3의 야생형 형태의 발현을 FGFR3의 돌연변이된 형태의 발현에 비해 상향조절한다.

18. 실시태양 1의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1을 포함하는 핵산에 하이브리드화하지 않는다.

19. 실시태양 1의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 7 또는 서열번호 8을 포함하는 핵산에 하이브리드화하지 않는다.

20. 실시태양 1의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 5 또는 서열번호 6을 포함하는 핵산에 하이브리드화한다.

21. 실시태양 1의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 코돈 380에서 서열번호 4를 포함하는 핵산에 하이브리드화한다.

22. 실시태양 1의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 G380R 영역에서 서열번호 4를 포함하는 핵산에 하이브리드화한다.

23. 실시태양 1의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 코돈 380의 1138번 위치에서 서열번호 4를 포함하는 핵산에 하이브리드화한다.

24. 실시태양 1의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.

25. 실시태양 23의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24 및 서열번호 25로 이루어진 군으로부터 선택된다.

26. 실시태양 1의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 잠금 핵산(LNA) 단위; 2'-O-알킬-RNA 단위, 2'-OMe-RNA 단위, 2'-아미노-DNA 단위, 및 2'-플루오로-DNA 단위로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 뉴클레오티드 단위를 포함한다.

27. 실시태양 1의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 2개 이상의 LNA 단량체 단위를 포함한다.

28. 실시태양 27의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 2개 이상의 LNA 단량체 단위는 서로에 인접하여 위치한다.

29. 실시태양 27의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 2개 이상의 LNA 단량체 단위는 서로에 대해 연속적으로 위치한다.

30. 실시태양 1의 올리고뉴클레오티드에서, FGFR3의 발현의 조절은 연골세포 기능을 복원시킨다.

31. FGFR3의 이상 발현과 관련된 상태의 치료를 위한 실시태양 1의 올리고뉴클레오티드의 용도.

32. 연골무형성증의 치료를 위한 실시태양 1의 올리고뉴클레오티드의 용도.

33. 서열번호 9를 포함하는 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 FGFR3의 발현을 조절한다.

34. 서열번호 10을 포함하는 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 FGFR3의 발현을 조절한다.

35. 서열번호 11을 포함하는 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 FGFR3의 발현을 조절한다.

36. 서열번호 12를 포함하는 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 FGFR3의 발현을 조절한다.

37. 서열번호 13을 포함하는 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 FGFR3의 발현을 조절한다.

38. 서열번호 1을 포함하는 핵산에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 LNA 단량체 단위를 포함하고, 상기 올리고뉴클레오티드는 FGFR3의 발현을 조절한다.

39. 실시태양 38의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 8개 뉴클레오티드의 길이이다.

40. 실시태양 38의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 15개 뉴클레오티드의 길이이다.

41. 실시태양 38의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 18개 뉴클레오티드의 길이이다.

42. 실시태양 38의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 FGFR3의 발현을 약 50% 이상까지 감소시킨다.

43. 실시태양 38의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 FGFR3의 발현을 약 75% 이상까지 감소시킨다.

44. 실시태양 38의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 FGFR3의 발현을 약 90% 이상까지 감소시킨다.

45. 실시태양 38의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 FGFR3의 돌연변이된 형태의 발현을 조절한다.

46. 실시태양 38의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 FGFR3의 돌연변이된 형태의 발현을 억제시킨다.

47. 실시태양 38의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 FGFR3의 돌연변이된 형태의 발현을 하향조절한다.

48. 실시태양 38의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 FGFR3의 야생형 형태의 발현을 상향조절한다.

49. 실시태양 38의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 4를 포함하는 핵산에 하이브리드화한다.

50. 실시태양 38의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 코돈 380의 1138번 위치에서 서열번호 4를 포함하는 핵산에 하이브리드화한다.

51. 실시태양 38의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 G380R 영역에서 서열번호 4를 포함하는 핵산에 하이브리드화한다.

52. 실시태양 38의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.

53. 실시태양 38의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 2개 이상의 LNA 단량체 단위를 포함한다.

54. 실시태양 53의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 2개 이상의 LNA 단량체 단위는 서로에 인접하여 위치한다.

55. 실시태양 53의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 2개 이상의 LNA 단량체 단위는 서로에 대해 연속적으로 위치한다.

56. 실시태양 38의 올리고뉴클레오티드에서, FGFR3의 발현의 조절은 연골세포 기능을 복원시킨다.

57. FGFR3의 이상 발현과 관련된 상태의 치료를 위한 실시태양 38의 올리고뉴클레오티드의 용도.

58. 연골무형성증의 치료를 위한 실시태양 38의 올리고뉴클레오티드의 용도.

59. 연골무형성증의 치료에 유용한 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1 또는 서열번호 4를 포함하는 핵산에 하이브리드화하고, 상기 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 LNA 단량체 단위를 포함한다.

60. 실시태양 59의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 8개 뉴클레오티드의 길이이다.

61. 실시태양 59의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 15개 뉴클레오티드의 길이이다.

62. 실시태양 59의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 18개 뉴클레오티드의 길이이다.

63. 실시태양 59의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 FGFR3의 발현을 하향조절한다.

64. 실시태양 59의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.

65. 암 또는 연골무형성증의 치료에 유용한 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 5를 포함하는 핵산의 G380R 영역에 하이브리드화하고, 상기 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 LNA 단량체 단위를 포함한다.

66. FGFR3 mRNA를 실시태양 1의 올리고뉴클레오티드와 하이브리드화하기에 적합한 조건하에 상기 FGFR3 mRNA에 상기 올리고뉴클레오티드를 전달하여, 상기 FGFR3 mRNA의 발현을 조절함을 포함하는, FGFR3 mRNA의 발현의 조절 방법.

67. 실시태양 66의 방법에서, 상기 FGFR3의 발현의 조절은 상기 FGFR3의 감소된 발현을 생성시킨다.

68. FGFR3을 실시태양 1의 올리고뉴클레오티드와 하이브리드화하기에 적합한 조건하에 상기 FGFR3을 상기 올리고뉴클레오티드와 접촉시켜, 상기 FGFR3의 발현을 조절함을 포함하는, FGFR3의 발현의 조절 방법.

69. 실시태양 68의 방법에서, 상기 FGFR3의 발현의 조절은 상기 FGFR3의 감소된 발현을 생성시킨다.

70. FGFR3의 이상 발현과 관련된 상태로 진단된 환자를 선택하고 상기 환자에게 실시태양 1의 올리고뉴클레오티드를 투여함을 포함하는, 상기 상태의 치료 방법.

71. FGFR3의 이상 발현과 관련된 상태로 진단된 환자를 선택하고 상기 환자에게 실시태양 38의 올리고뉴클레오티드를 투여함을 포함하는, 상기 상태의 치료 방법.

72. 서열번호 4를 포함하는 핵산에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 LNA 단량체 단위를 포함하고, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1을 포함하는 핵산에 하이브리드화하지 않는다.

73. 암, 예를 들어 방광암 또는 연골무형성증의 치료에 유용한 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약학 조성물에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1 또는 서열번호 4를 포함하는 핵산에 하이브리드화하고, 상기 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 LNA 단량체 단위를 포함한다.

74. 실시태양 73의 약학 조성물에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.

75. 실시태양 73의 약학 조성물에서, 상기 조성물을 폐 투여를 위해 제형화한다.

76. 실시태양 73의 약학 조성물에서, 상기 조성물을 비경구 투여를 위해 제형화한다.

77. 실시태양 73의 약학 조성물에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 4를 포함하는 핵산에 하이브리드화함으로써 FGFR3의 발현을 조절한다.

78. 실시태양 77의 약학 조성물에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1을 포함하는 핵산에 하이브리드화하지 않는다.

79. 실시태양 73의 약학 조성물에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1을 포함하는 핵산에 하이브리드화함으로써 FGFR3의 발현을 조절한다.

80. 실시태양 79의 약학 조성물에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 4를 포함하는 핵산에 하이브리드화하지 않는다.

81. FGFR3의 발현을 조절하는 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 LNA 단량체 단위를 포함한다.

82. 약 14 내지 20개 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 역 보체 서열번호 4 또는 그의 천연 변이체에 80% 이상 상동성인 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

83. 실시태양 82의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 연속적인 뉴클레오티드 서열은 서열번호 4의 역 보체와 하나 이하의 불합치를 포함한다.

84. 실시태양 82의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체를 포함한다.

85. 실시태양 84의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체는 야생형 올리고뉴클레오티드 중의 야생형 뉴클레오티드에 비해 화학적으로 변경된 당 부분을 포함한다.

86. 실시태양 85의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체는 잠금 핵산(LNA) 단위, 2'-O-알킬-RNA 단위, 2'-OMe-RNA 단위, 2'-아미노-DNA 단위, 및 2'-플루오로-DNA 단위로 이루어진 군으로부터 선택된다.

87. 실시태양 84의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체는 LNA이다.

88. 실시태양 82의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24 및 서열번호 25로 이루어진 군으로부터 선택된다.

89. 실시태양 82에 따른 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 갭머이다.

90. 실시태양 82의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 FGFR3 mRNA를 발현하는 세포에서 FGFR3 mRNA의 발현을 억제시킨다.

91. 실시태양 90의 올리고뉴클레오티드에서, FGFR3 mRNA는 돌연변이를 포함한다.

92. 실시태양 91의 올리고뉴클레오티드에서, 돌연변이는 G380R 돌연변이이다.

93. 실시태양 82의 올리고뉴클레오티드 및 상기 올리고뉴클레오티드에 공유 부착된 하나 이상의 비-뉴클레오티드 부분을 포함하는 접합체.

94. 실시태양 82의 올리고뉴클레오티드, 및 약학적으로 허용되는 희석제, 담체, 용매, 염 또는 보조제를 포함하는 약학 조성물.

95. 연골무형성증의 치료를 위한 실시태양 82의 올리고뉴클레오티드의 용도.

96. 암, 예를 들어 방광암 연골무형성증에 걸린 피실험자의 치료 방법으로서, 상기 방법은 상기 연골무형성증의 하나 이상의 목표 증상이 개선되도록 실시태양 82의 올리고뉴클레오티드를 상기 피실험자에게 투여하는 단계를 포함한다.

97. 실시태양 96의 방법에서, 상기 목표 증상을 증가된 근긴장도, 팔 늘리기, 다리 늘리기 및 증가된 신장으로 이루어진 군으로부터 선택한다.

98. FGFR3을 이상 발현하는 세포에서 FGFR3의 이상 발현을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은 상기 세포를, 상기 FGFR3의 발현이 감소되도록 실시태양 82의 올리고뉴클레오티드와 접촉시킴을 포함한다.

99. 실시태양 98의 방법에서, 상기 FGFR3은 G380R 돌연변이를 포함한다.

100. 암, 예를 들어 방광암 연골무형성증을 앓고 있는 포유동물의 치료 방법으로서, 상기 방법은 상기 포유동물에게 치료 유효량의, FGFR3에 표적화된 올리고뉴클레오티드를 투여함을 포함하고, 이때 상기 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 LNA 단위를 포함한다.

101. 실시태양 100의 방법에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24 및 서열번호 25로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다.

102. 실시태양 100의 방법에서, 상기 올리고뉴클레오티드를 비경구 투여한다.

103. 실시태양 100의 방법에서, 상기 올리고뉴클레오티드를 정맥내 투여한다.

104. 실시태양 100의 방법에서, 상기 올리고뉴클레오티드를 표적 기관 또는 조직에의 일시주사에 의해 투여한다.

105. 실시태양 100의 방법에서, 상기 올리고뉴클레오티드를 복강내 투여한다.

106. 서열번호 21을 포함하는 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 FGFR3의 발현을 조절한다.

107. 실시태양 106의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 FGFR3을 암호화하는 핵산에 하이브리드화하여, 약 60 ℃ 이상의 해리 T_m을 갖는 듀플렉스 구조를 형성한다.

108. 실시태양 106의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 FGFR3은 G380R 돌연변이를 포함하고, 상기 FGFR3의 발현을 조절하는 것은 FGFR3의 발현을 억제시킴을 포함한다.

109. 실시태양 108의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 FGFR3의 발현을 약 0.05 내지 약 0.75 nM의 IC₅₀ 농도에서 억제시킨다.

110. 실시태양 106의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 약 96 시간 이상 동안 37 ℃에서 혈장에서 안정하다.

111. 서열번호 22를 포함하는 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 FGFR3의 발현을 조절한다.

112. 실시태양 111의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 FGFR3을 암호화하는 핵산에 하이브리드화하여, 약 70 ℃ 이상의 해리 T_m을 갖는 듀플렉스 구조를 형성한다.

113. 실시태양 111의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 FGFR3은 G380R 돌연변이를 포함하고, 상기 FGFR3의 발현을 조절하는 것은 FGFR3의 발현을 억제시킴을 포함한다.

114. 실시태양 113의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 FGFR3의 발현을 약 0.05 내지 약 0.75 nM의 IC₅₀ 농도에서 억제시킨다.

115. 실시태양 111의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 약 96 시간 이상 동안 37 ℃에서 혈장에서 안정하다.

116. 서열번호 23을 포함하는 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 FGFR3의 발현을 조절한다.

117. 실시태양 116의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 FGFR3을 암호화하는 핵산에 하이브리드화하여, 약 70 ℃ 이상의 해리 T_m을 갖는 듀플렉스 구조를 형성한다.

118. 실시태양 116의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 FGFR3은 G380R 돌연변이를 포함하고, 상기 FGFR3의 발현을 조절하는 것은 FGFR3의 발현을 억제시킴을 포함한다.

119. 실시태양 118의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 FGFR3의 발현을 약 0.05 내지 약 0.75 nM의 IC₅₀ 농도에서 억제시킨다.

120. 실시태양 116의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 약 96 시간 이상 동안 37 ℃에서 혈장에서 안정하다.

121. 서열번호 24를 포함하는 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 FGFR3의 발현을 조절한다.

122. 실시태양 121의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 FGFR3을 암호화하는 핵산에 하이브리드화하여, 약 70 ℃ 이상의 해리 T_m을 갖는 듀플렉스 구조를 형성한다.

123. 실시태양 121의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 FGFR3은 G380R 돌연변이를 포함하고, 상기 FGFR3의 발현을 조절하는 것은 FGFR3의 발현을 억제시킴을 포함한다.

124. 실시태양 123의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 FGFR3의 발현을 약 0.05 내지 약 0.75 nM의 IC₅₀ 농도에서 억제시킨다.

125. 실시태양 121의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 약 96 시간 이상 동안 37 ℃에서 혈장에서 안정하다.

126. 서열번호 25를 포함하는 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 FGFR3의 발현을 조절한다.

127. 실시태양 126의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 FGFR3을 암호화하는 핵산에 하이브리드화하여, 약 70 ℃ 이상의 해리 T_m을 갖는 듀플렉스 구조를 형성한다.

128. 실시태양 127의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 FGFR3은 G380R 돌연변이를 포함하고, 상기 FGFR3의 발현을 조절하는 것은 FGFR3의 발현을 억제시킴을 포함한다.

129. 실시태양 128의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 FGFR3의 발현을 약 0.05 내지 약 0.75 nM의 IC₅₀ 농도에서 억제시킨다.

130. 실시태양 126의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 약 96 시간 이상 동안 37 ℃에서 혈장에서 안정하다.

131. 서열번호 20을 포함하는 핵산에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오티드로서, 상기 올리고뉴클레오티드는 FGFR3의 발현을 조절한다.

132. 실시태양 131의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 14를 포함한다.

133. 서열번호 14를 포함하는 올리고뉴클레오티드로서, 상기 올리고뉴클레오티드는 FGFR3의 발현을 조절한다.

134. 실시태양 133의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체를 포함하고 상기 뉴클레오티드 유사체는 잠금 핵산이다.

135. 서열번호 14를 포함하는 올리고뉴클레오티드로서, 상기 올리고뉴클레오티드는 FGFR3의 발현을 조절하고, 상기 올리고뉴클레오티드는

(a) 1번 위치의 구아닌 뉴클레오티드가 옥시-LNA임;

(b) 2번 및 3번 위치 중 하나 이상의 아데닌 뉴클레오티드가 옥시-LNA임;

(c) 10번 및 11번 위치 중 하나 이상의 시토신 뉴클레오티드가 옥시-LNA임; 및

(d) 12번 위치의 티민 뉴클레오티드가 옥시-LNA임

으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 위치의 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체를 포함한다.

136. 실시태양 135의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 11번 위치의 시토신 뉴클레오티드는 C5-메틸시토신이고, 이때 상기 C5-메틸시토신은 β-D-옥시-LNA이고, 상기 12번 위치의 티민 뉴클레오티드는 β-D-옥시-LNA이고, 모든 뉴클레오티드간 결합기는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합기이다.

137. 실시태양 135의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 1번 위치의 구아닌 뉴클레오티드는 β-D-옥시-LNA이고, 상기 2번 및 3번 위치의 아데닌 뉴클레오티드는 β-D-옥시-LNA이고, 모든 뉴클레오티드간 결합기는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합기이다.

138. 실시태양 135의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 1번 위치의 구아닌 뉴클레오티드는 β-D-옥시-LNA이고, 상기 10번 및 11번 위치의 시토신 뉴클레오티드는 모두 C5-메틸시토신이고, 이때 상기 C5-메틸시토신은 β-D-옥시-LNA이고, 상기 12번 위치의 티민 뉴클레오티드는 β-D-옥시-LNA이고, 모든 뉴클레오티드간 결합기는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합기이다.

139. 실시태양 135의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 10번 및 11번 위치의 시토신 뉴클레오티드는 모두 C5-메틸시토신이고, 이때 상기 C5-메틸시토신은 β-D-옥시-LNA이고, 상기 12번 위치의 티민 뉴클레오티드는 β-D-옥시-LNA이고, 모든 뉴클레오티드간 결합기는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합기이다.

140. 실시태양 135의 올리고뉴클레오티드에서, 하나 이상의 뉴클레오티드는 5-메틸시토신, 이소시토신, 슈도이소시토신, 5-브로모유라실, 5-프로피닐유라실, 6-아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 이노신, 다이아미노퓨린 및 2-클로로-6-아미노퓨린 시토신으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 변형된 핵염기이다.

141. 실시태양 135의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 10번 및 11번 위치의 시토신 뉴클레오티드는 각각 변형된 핵염기이다.

142. 실시태양 141의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 변형된 핵염기는 C5-메틸시토신이다.

143. 실시태양 135의 올리고뉴클레오티드에서, 상기 옥시-LNA는 β-D-옥시 LNA이다.

144. 실시태양 135의 올리고뉴클레오티드에서, 하나 이상의 뉴클레오티드간 결합기는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합기이다.

145. 실시태양 135의 올리고뉴클레오티드에서, 모든 뉴클레오티드간 결합기는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합기이다.

실시예

하기의 실시예들은 돌연변이 FGFR3 G380R mRNA 전사물을 표적화하는 다수의 올리고뉴클레오티드뿐만 아니라 이들 올리고뉴클레오티드의 다양한 우수한 성질들을 개시한다. 특히, 실시예 1은 21개 올리고뉴클레오티드의 녹-다운 돌연변이 G380R FGFR3 발현에 대한 효능 및 상기 21개 올리고뉴클레오티드의 선택성(예를 들어, 야생형 FGFR3 발현의 억제와 비교된 돌연변이 G380R FGFR3 발현의 억제)을 입증한다. 실시예 2는 IC₅₀ 값으로서 측정된, 돌연변이 G380R FGFR3 발현을 억제하는 10개 올리고뉴클레오티드들 각각의 강도, 및 야생형 FGFR3 발현에 대한 돌연변이 G380R FGFR3 발현을 억제하는 강도의 차이를 입증한다. 실시예 3은 2개의 관련되지 않은 표적에 대한 각 올리고뉴클레오티드의 억제 효과의 비교에 의한 상기 10개 올리고뉴클레오티드의 비-특이적인 효과에 대한 조사를 개시한다. 실시예 4는 상기 10개 올리고뉴클레오티드 각각과, 돌연변이 G380R FGFR3(완벽한 보체) 또는 야생형 FGFR3(돌연변이 부위에서 하나의 상보성 불합치)간의, 용융 온도(T_m)로서 측정된 결합 에너지를 개시한다. 실시예 5는 혈장 안정성으로서 측정된, 상기 10개 올리고뉴클레오티드의 뉴클레아제 민감성을 입증한다. 실시예 6은 표준 16-일 마우스 연구에서 선택된 올리고뉴클레오티드에 대한 생체내 관용의 평가를 개시한다.

실시예 1 - 21개 올리고뉴클레오티드에 대한 효능 및 선택성 시험

각각 잠금 핵산(LNA) 주쇄를 갖는, 총 21개 안티센스 올리고뉴클레오티드를 인간 FGFR3 G380R 돌연변이 및 상기 돌연변이 주변 또는 상기 돌연변이에 인접한 영역을 선택적으로 표적화하도록 설계하였다. 특히, 상기 21개 LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드를, FGFR3 mRNA의 1394번 위치의 "A"(즉, NM_000142.3의 1394번 위치에서 GGG → AGG 미스센스 돌연변이) 및 상기 1394번 위치의 상류 및/또는 하류의 뉴클레오티드를 포함하는, 1380 내지 1408번 범위의 위치의 영역에 하이브리드화하도록 설계하였다.

상기 G380R 돌연변이를 갖는 완전 길이 FGFR3 또는 상응하는 야생형 FGFR3의 FLAG-태그된 서열을 함유하는 벡터로 일시적으로 형질감염된 인간 세포를 상기 21개 올리고뉴클레오티드들 각각의 효능의 초기 특성화에 사용하였다. 상기 분석에 사용된 인간 A549 세포주를, 내인성 FGFR3의 비교적 낮은 발현 때문에 선택하였다. 정성적인 PCR(qPCR) 분석을 상기 FLAG 서열의 표적화에 의해 상기 벡터 발현 산물을 특이적으로 인식하도록 설계하였다. 또한, qPCR 분석을 FGFR3의 3'UTR(이는 상기 벡터 발현 시스템의 부분이 아니다)을 표적화함으로써 상기 내인성 발현 산물을 특이적으로 인식하도록 설계하였다.

상기 21개 올리고뉴클레오티드 각각의 효능 및 선택성을, 각각의 올리고뉴클레오티드 및 야생형(WT) 또는 돌연변이(MUT) FLAG-태그된 벡터 구조물로 인간 A549 세포를 동시-형질감염시킴으로써 분석하였다. 상기 올리고뉴클레오티드 농도를 0.25 nM, 0.5 nM 및 1.0 nM에서 평가하였다. 세포를 형질감염후 24시간째에 수확하고, 발현된 FLAG-태그 리포터의 수준을 리포터-특이성 qPCR 분석으로 측정하였다. 결과(상기 내인성 GAPDH 수준으로 표준화되었다)를 모의-처리된 샘플의 퍼센트로서 도 1a 및 1b에 나타낸다. 상기 21개 올리고뉴클레오티드를 식별자들(각각 "SH"로 시작한다)로 확인하는 반면, PCON으로서 나타낸 올리고뉴클레오티드는 상기 1394 돌연변이 부위와 다른 영역에서 야생형 및 돌연변이 FGFR3 전사물을 모두 표적화하는 양성 대조군을 나타낸다. 상기 모의-처리된 샘플을 시험 올리고뉴클레오티드의 부재하에(물로 대체됨) 상술한 FLAG-태그된 리포터 구조물로 형질감염시켰다. 또한, NCON으로서 나타낸 랜덤한 뒤섞인 올리고뉴클레오티드를 음성 대조군으로서 사용하였다.

도 1a 및 1b에 예시된 바와 같이, 몇몇 올리고뉴클레오티드는 상기 야생형 FGFR3 및/또는 돌연변이 FGFR3 발현을 상기 모의 샘플의 FGFR3 발현에 비해, 상기 올리고뉴클레오티드의 농도(0.25 nM, 0.5 nM 또는 1 nM)에 따라 80% 이하, 60% 이하, 50% 이하, 40% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 및 심지어 10% 이하까지 감소시켰다. 더욱이, 몇몇 올리고뉴클레오티드는 상기 돌연변이 FGFR3의 발현을 상기 야생형 FGFR3 발현에 비해 실질적으로 우선적으로 감소시켰다(즉, 발현을 하향-조절하였다). 예를 들어, 0.25 nM의 농도에서 SH13(서열번호 22)으로서 나타낸 올리고뉴클레오티드는 상기 돌연변이 FGFR3 수준을 상응하는 야생형 FGFR3 수준의 거의 절반으로 감소시켰다. PCON으로서 표시된 양성 대조군은 돌연변이 및 야생형 FGFR3 수준 모두의 실질적인 억제를 나타내었는데, 이는 돌연변이 부위에 관한 것이 아니기 때문에 특이성을 나타내지 않거나 거의 나타내지 않는다.

상기 21개 올리고뉴클레오티드를 또한, 상기 올리고뉴클레오티드의 상기 A549 세포내로의 도입 수단으로서 짐노시스(gymnosis)(즉, 무지원 흡수)를 사용하여 효능 및 선택성에 대해 시험하였다. 구체적으로, 상기 올리고뉴클레오티드를 48시간 동안 짐노시스에 의해 전달하고, 그 후에 상기 A549 세포를 철저히 세척하여 상기 세포의 표면에 여전히 부착되어 있거나 달리 배양 용기 중에 남아있는 임의의 올리고뉴클레오티드를 제거하였다. 이어서 상기 돌연변이 또는 야생형 구조물을 표준 형질감염에 의해 전달하고, 상기 A549 세포를 수확하고 24시간 후에 qPCR에 의해 분석하였다.

도 1a 및 1b에 제공된 형질감염 데이터의 경우와 같이, 현저한 용량 반응을 갖는 확고한 녹-다운이 도 2a 및 2b에 예시된 바와 같이, 시험된 대부분의 올리고뉴클레오티드에 대해서 나타났으며, 명확한 순위를 확립시킬 수 있었다. 실제로, 형질감염 및 짐노시스 연구 모두에서 상기 올리고뉴클레오티드의 순위 간에는 현저한 대응이 존재하였다. 그러나, 상기 돌연변이체와 야생형 리포터간의 구별은 상기 형질감염 연구에 비해 상기 짐노시스 연구에서 덜 두드러졌다. 상기 형질감염 실험 및 본 발명에 개시된 짐노시스 실험에서 수집한 데이터간의 순위에서 현저한 불일치는 보이지 않았다.

상기 형질감염 및 짐노시스 데이터는 상기 21개 올리고뉴클레오티드들이 각각 하나 이상의 농도에서 효능 및 선택성을 보임을 예시하였다. 상기 평가된 21개 올리고뉴클레오티드의 특이성 및/또는 효능의 측정에 사용된 상기 수집 데이터로부터, 상기 올리고뉴클레오티드들을 추가적인 특성화에 대해서 확인하였다.

FGFR3 발현을 녹-다운시키는 상기 10개의 선택된 올리고뉴클레오티드의 능력을 입증하기 위해서, 인간 A549 세포에서 상술한 바와 유사한 동시-형질감염 실험을 HeLa 세포에서 수행하였다. 구체적으로, 상기 10개 올리고뉴클레오티드 각각에 대해서, HeLa 세포를 상기 올리고뉴클레오티드 및 야생형(WT) 또는 돌연변이(MUT) 리포터 구조물로 동시-형질감염시켰다. 평가된 초기 선별 농도는 0.2 nM, 1.0 nM 및 5.0 nM이었다. 세포를 형질감염후 24시간째에 수확하고, 상기 전사물의 수준을 리포터-특이성 qPCR 분석으로 측정하였다. 결과를 내인성 GAPDH 수준에 대해 표준화하고 모의-처리된 샘플의 퍼센트로서 나타내었다.

도 3에 예시된 바와 같이, 10개의 올리고뉴클레오티드는 모두 상기 평가된 농도들에서 용량-의존적인 녹-다운을 나타내었다. 상기 올리고뉴클레오티드의 효과는 상기 A549 세포에서 관찰된 것과 유사하였지만, 약간의 차이는 분명하였다. 이러한 차이는 상기 A549 세포에서 리포터 표적에 대해 현저하게 더 효율적이었던 양성 대조군(PCON으로 표시됨)이 HeLa 세포에서 상기 돌연변이-특이성 올리고뉴클레오티드의 경우와 유사한 효율을 갖는다는 관찰을 포함하였다. 두 번째, 부수적인 차이는 앞서 가장 잘-수행하는 올리고뉴클레오티드(SH02로 표시되고 서열번호 21에 상응함)가 상기 HeLa 세포에서 나머지 선택보다 인식할 정도로 더 양호하게 수행하지는 못한다는 관찰이었다. 그러나, 이러한 부수적인 관찰은 본 연구의 전체적인 결론을 변경시키지 못하였으며 상기 시험된 올리고뉴클레오티드가 유효함을 입증하였고 HeLa 세포 및 A549 세포 모두에서 상기 돌연변이 및 야생형 리포터 구조물간의 선택성을 입증하였다.

실시예 2 - 10개 올리고뉴클레오티드에 대한 IC ₅₀ 시험

실시예 1에 개시된 연구의 결과로서 선택된 10개의 올리고뉴클레오티드를, 각 올리고뉴클레오티드에 대한 IC₅₀ 값을 평가함으로써 이들의 억제 강도에 대해 추가로 평가하였다. 특히, 형질감염된 올리고뉴클레오티드를 5 nM 미만의 IC₅₀ 값을 갖는 것들과 5 nM 초과의 IC₅₀ 값을 갖는 것들로 추가로 분류하였다. 각 올리고뉴클레오티드에 대한 두 번째 특성화 기준은 상기 올리고뉴클레오티드가 야생형 리포터에 비해 돌연변이 리포터에 대한 IC₅₀ 값들 간에 약 3배 차이를 나타내는지의 여부이었다.

상기 10개의 올리고뉴클레오티드 각각에 대한 IC₅₀ 값을 확립시키기 위해서, 각각의 올리고뉴클레오티드를 A549 세포에서 야생형(WT) 또는 돌연변이(MUT) 리포터 구조물로 동시-형질감염시켰다. 상기 올리고뉴클레오티드를 2.5 nM, 1 nM, 0.4 nM, 0.16 nM, 0.064 nM 및 0.0256 nM 농도로 형질감염시켰다. 세포를 수확하고 24시간 후에 qPCR을 위해 RNA를 추출하였다. 상기 연구를 3회 반복하고 그 값들을 비-선형 회귀를 사용하여 S자 반응 곡선에 대해 그래프패드 프리즘에서 플롯팅하였다. 상기 회귀로부터, 상기 리포터 분석에서의 IC₅₀ 값의 추정값을 측정하였다. 상기 회귀 곡선을 도 4에 나타내며, 상응하는 IC₅₀ 값들을 하기 표 2에 표로 나타낸다.

올리고		IC 50
PCON	WT	0.038
	MUT	0.040
SH02	WT	0.14
	MUT	0.068
SH13	WT	0.57
	MUT	0.31
SH19	WT	0.50
	MUT	0.34
SH20	WT	0.55
	MUT	0.28
SH21	WT	0.52
	MUT	0.22
NCON	WT
	MUT

표 2에 나타낸 바와 같이, 상기 (완벽하게 상보성인) 돌연변이 G380R FGFR3 표적에 대한 5개의 선택된 올리고뉴클레오티드에 대한 IC₅₀ 값들이 5 nM 아래, 및 심지어 0.5 nM 아래로 떨어졌다. 0.2 nM보다 양호한 IC₅₀을 나타낸 상기 선택된 올리고뉴클레오티드는 SH02(서열번호 21)로 표시된 뉴클레오티드였으며, 이는 0.068 nM의 IC₅₀ 값을 나타내었다. PCON으로 표시된 양성 대조군(돌연변이 부위로부터 떨어진 부위에서 2개의 리포터 전사물 모두를 표적화한다)은 상기 돌연변이 및 야생형 리포터 구조물 모두에 대해 약 0.04 nM의 IC₅₀을 나타내었다. 상기 야생형 FGFR3 리포터에 비해 상기 돌연변이 G380R FGFR3 리포터의 상기 선택된 올리고뉴클레오티드의 선택성에 관하여, 상기 야생형 리포터보다 상기 돌연변이에 대해 약 2.5 배 더 양호한 선택성을 나타낸 올리고뉴클레오티드는 없었다.

실시예 3 - 10개 올리고뉴클레오티드에 대한 표적 선택성

실시예 2에 개시된 10개의 올리고뉴클레오티드를 25 nM의 농도에서 비-표적화된 전사물을 비-특이적으로 녹-다운시키는 능력에 대해 추가로 평가하였다. 상기 10개의 올리고뉴클레오티드 각각 중 하나를 형질감염에 의해 동일한 A549 세포로 전달하였다. 상기 세포를 수확하고 qPCR에 의해 내인성 SCA3 mRNA(도 5a) 또는 PTEN mRNA(도 5b)의 녹-다운에 대해 시험하였다. 상기 제공된 결과를 내인성 GAPDH 수준에 대해 표준화하고 모의 처리된 샘플의 퍼센트로서 나타내었다.

도 5a 및 5b에 의해 예시된 바와 같이, 본 연구의 결과는 상기 올리고뉴클레오티드 중 일부에 의한 SCA3 및 PTEN 전사물 모두의 약간의 녹-다운을 입증하였지만, 이는 상기 실시예 1에 개시된 FGFR3 야생형 또는 돌연변이 전사물의 녹-다운보다 현저하게 작다. 따라서, 비-특이성 표적에 대한 상기 10개 올리고뉴클레오티드 각각의 효과는 특이성 FGFR3 표적에 대한 효과보다 현저하게 더 낮았다.

실시예 4 - 야생형 또는 돌연변이 FGFR3 에 어닐링된 10개 올리고뉴클레오티드에 대한 용융 온도

상기 실시예 2 및 3에 개시된 올리고뉴클레오티드 후보들의 특성화 부분으로서, 상보성 돌연변이 표적 RNA(cMUT라 표시됨)로부터의 각각의 올리고뉴클레오티드의 용융 온도(T_m)를 평가하였다. 상기 10개의 올리고뉴클레오티드 각각을 또한, G380R 돌연변이 부위에서 각각의 올리고뉴클레오티드에 대해 단일의 상보성 불합치를 포함하는 상기 야생형 대립유전자(cWT라 표시됨)를 나타내는 RNA에 대해 시험하였다.

상기 10개 올리고뉴클레오티드 각각에 대한 T_m 값을 2회 측정하였으며, T_m의 변화(ΔT_m)는 각 올리고뉴클레오티드에 대한 용융 및 어닐링 온도의 평균을 나타낸다. 5개의 선택된 올리고뉴클레오티드 후보를 나타내는 ΔT_m 데이터를 표 3에 제공하며, 이때 ΔT_m은 상기 cMUT(완벽한 보체) 및 cWT(돌연변이 부위에서 하나의 상보성 불합치) 값들 간의 차이로서 정의되었다.

올리고	RNA cMUT T m (℃)	RNA cWT T m (℃)	ΔT m ( MUT - WT ) (℃)
SH02	66.9	62.1	4.8
SH13	75.8	71.4	4.4
SH19	72.0	71.0	1.0
SH20	72.6	73.5	-0.9
SH21	71.2	72.3	-1.1

FGFR3의 WT 대립유전자에 대해 상기 10개 올리고뉴클레오티드를 표적화하는 경우, 상기 단일 불합치는 G-T 불합치이다. 이러한 특정한 불합치는 결합 에너지에 관하여 특별히 차별적이지 않으며, 상기 ΔT_m으로부터 분명히 명백한 사실이다. 상기 ΔT_m 범위는 4.8 ℃의 높은 온도에서부터 -1.1 ℃의 낮은 온도까지이며; 상기 낮은 온도는 상기 올리고뉴클레오티드들 중 2개가 상기 완벽하게 상보성인 RNA보다는 상기 단일-불합치 RNA에 더 양호하게 어닐링함을 가리킨다. 이러한 관찰은 상기 실시예 2에 개시된 바와 같이, 야생형 리포터 및 돌연변이 리포터간의 상기 10개 올리고뉴클레오티드 중 일부의 IC₅₀ 값으로부터 나타난 비교적 낮은 정도의 식별에 상응한다.

실시예 5 - 10개 올리고뉴클레오티드 각각에 대한 혈장 안정성

실시예 2, 3 및 4에 개시된 10개의 올리고뉴클레오티드의 특성화 부분으로서, 상기 10개의 올리고뉴클레오티드 각각의 뉴클레아제 민감성을 평가하였다. 구체적으로, 상기 10개 올리고뉴클레오티드 각각을 37 ℃에서 96시간 동안 마우스 혈장 중에서 배양하고, 샘플을 24시간마다 취하여 분석하였다. 상기 샘플을 완전 길이 올리고뉴클레오티드의 상실 및 분해 산물의 출현에 대해 젤 전기영동에 의해 평가하였다. 상기 샘플을 불안정한 대조용 올리고뉴클레오티드(Con으로 표시됨)와 비교하였다.

상기 올리고뉴클레오티드들 모두의 혈장 안정성은 예상 범위내에 있는 것으로 밝혀졌다. 도 6에 예시된 바와 같이, 상기 10개의 올리고뉴클레오티드는 모두 96시간을 초과하는 전체적인 반감기를 갖는 것으로 밝혀졌다.

실시예 6 - 10개 올리고뉴클레오티드 각각에 대한 생체내 관용 연구

상기 10개 올리고뉴클레오티드 각각의 생체내 관용을 표준 16-일 마우스 연구에서 시험하였다. 상기 10개의 올리고뉴클레오티드를 각각, 주로 간에 대한 임의의 바람직하지 못한 영향을 평가하기 위해서, 암컷 NMRI 마우스에서 생체내 관용에 대해 시험하였다. 상기 피실험 동물에게 14일까지 3일마다 15 ㎎/㎏을 정맥내 투여하고, 이어서 16일째에 죽였다. 혈청을 샘플링하고 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) 및 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(AST) 농도에 대해 분석하였다.

도 7에 묘사된 바와 같이 올리고뉴클레오티드 SH13(서열번호 22)은 간 효소의 수준에서 중간이지만, 허용되는 상승을 나타내었으며, SH02(서열번호 21), SH19(서열번호 23), SH20(서열번호 24), 및 SH21(서열번호 25)로 표시된 올리고뉴클레오티드들은 간 효소의 수준에서 무시할 정도의 상승을 나타내었다.

실시예 1 내지 6에서 확인된 특징들을 근거로, 5개의 올리고뉴클레오티드(즉, SH02, SH13, SH19, SH20 및 SH21로 표시된 올리고뉴클레오티드)가 (돌연변이) G380R FGFR3의 발현을 감소시키기 위해 피실험자에게 투여하는데 사용하기에 우수한 성질들을 가짐이 입증되었다. 상술한 바와 같이, 상기 선택된 올리고뉴클레오티드들은 선택되지 않은 올리고뉴클레오티드들의 집단에 비해 우수한 것으로서 선택되었다. 이들 5개 올리고뉴클레오티드의 서열을 하기 표 4에 나타내며, 이때 β-D-옥시 LNA는 오른쪽에 위첨자 "o"와 함께 굵은 대문자로 예시되고, 소문자는 데옥시리보스를 가리키고, "s" 및 "m"은 각각 포스포로티오에이트 및 C5-메틸시토신에 상응한다.

실시예 7 - 연골무형성증의 마우스 모델에서 올리고뉴클레오티드의 치료 이점의 입증

G380R-돌연변이 FGFR3의 발현과 관련된 질병 병리학을 감소시키는 SH02, SH13, SH19, SH20 및 SH21로 표시된 올리고뉴클레오티드(각각 서열번호 21, 22, 23, 24 및 25에 상응함)의 능력을 하기와 같이 측정한다. 동물 모델을 연골무형성증의 다수의 공지된 동물 모델로부터 선택한다. 바람직한 마우스 모델은 인간 돌연변이 FGFR3-G380R과 상관이 있다. FGFR3-G380R은 인간 연골무형성증 환자의 약 97%에서 발견되는 천연 돌연변이이며, 마우스에서 인간 연골무형성증을 모방하는 표현형을 생성시킨다. 생전 효능에 대한 주요 종점은, 예를 들어 성장률, 장골 비율의 정상화, 및 골단 성장판의 과증식 영역의 조직병리학적 평가를 포함할 수 있다. 질병 표현형, 및 각각의 올리고뉴클레오티드에 의한 그의 역전을 당해 분야에 공지된 다양한 방법론, 예를 들어 상기 골단 성장판의 조직학적 검사에 의해 확인할 수 있다.

조사하고자 하는 매개변수는 다른 것들 중에서도, 올리고뉴클레오티드-처리되지 않은 G380R 마우스에서보다 통계학적으로 더 긴 올리고뉴클레오티드-처리된 G380R 마우스에서의 대퇴골 길이의 증가 및/또는 올리고뉴클레오티드-처리되지 않은 G380R 마우스에서보다 통계학적으로 더 큰 올리고뉴클레오티드-처리된 G380R 마우스에서의 과증식 대역의 두께의 증가를 포함할 수 있다.

본 실시예에 개시된 연구들은 (1) 상기 G380 FGFR3 돌연변이와 관련된 질병의 유효 치료로서 돌연변이 G380R FGFR3에 대한 안티센스-잠금 핵산 올리고뉴클레오티드, (2) 특정한 연골무형성증 질병 모델에 사용하기 위한 및 약동학 및 독성학 연구에 대한 후보로서 올리고뉴클레오티드, 및 (3) 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드의 임상적 투여를 위한 투여 및 용량-스케줄의 추가적인 특성화를 제공할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> ROCHE INNOVATION CENTER COPENHAGEN A/S <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATION OF FGFR3 EXPRESSION <130> 1122WO <140> PCT/EP2013/074552 <141> 2013-11-25 <150> US 61/729,922 <151> 2012-11-26 <160> 25 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4304 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gtcgcgggca gctggcgccg cgcggtcctg ctctgccggt cgcacggacg caccggcggg 60 ccgccggccg gagggacggg gcgggagctg ggcccgcgga cagcgagccg gagcgggagc 120 cgcgcgtagc gagccgggct ccggcgctcg ccagtctccc gagcggcgcc cgcctcccgc 180 cggtgcccgc gccgggccgt ggggggcagc atgcccgcgc gcgctgcctg aggacgccgc 240 ggcccccgcc cccgccatgg gcgcccctgc ctgcgccctc gcgctctgcg tggccgtggc 300 catcgtggcc ggcgcctcct cggagtcctt ggggacggag cagcgcgtcg tggggcgagc 360 ggcagaagtc ccgggcccag agcccggcca gcaggagcag ttggtcttcg gcagcgggga 420 tgctgtggag ctgagctgtc ccccgcccgg gggtggtccc atggggccca ctgtctgggt 480 caaggatggc acagggctgg tgccctcgga gcgtgtcctg gtggggcccc agcggctgca 540 ggtgctgaat gcctcccacg aggactccgg ggcctacagc tgccggcagc ggctcacgca 600 gcgcgtactg tgccacttca gtgtgcgggt gacagacgct ccatcctcgg gagatgacga 660 agacggggag gacgaggctg aggacacagg tgtggacaca ggggcccctt actggacacg 720 gcccgagcgg atggacaaga agctgctggc cgtgccggcc gccaacaccg tccgcttccg 780 ctgcccagcc gctggcaacc ccactccctc catctcctgg ctgaagaacg gcagggagtt 840 ccgcggcgag caccgcattg gaggcatcaa gctgcggcat cagcagtgga gcctggtcat 900 ggaaagcgtg gtgccctcgg accgcggcaa ctacacctgc gtcgtggaga acaagtttgg 960 cagcatccgg cagacgtaca cgctggacgt gctggagcgc tccccgcacc ggcccatcct 1020 gcaggcgggg ctgccggcca accagacggc ggtgctgggc agcgacgtgg agttccactg 1080 caaggtgtac agtgacgcac agccccacat ccagtggctc aagcacgtgg aggtgaatgg 1140 cagcaaggtg ggcccggacg gcacacccta cgttaccgtg ctcaagacgg cgggcgctaa 1200 caccaccgac aaggagctag aggttctctc cttgcacaac gtcacctttg aggacgccgg 1260 ggagtacacc tgcctggcgg gcaattctat tgggttttct catcactctg cgtggctggt 1320 ggtgctgcca gccgaggagg agctggtgga ggctgacgag gcgggcagtg tgtatgcagg 1380 catcctcagc tacggggtgg gcttcttcct gttcatcctg gtggtggcgg ctgtgacgct 1440 ctgccgcctg cgcagccccc ccaagaaagg cctgggctcc cccaccgtgc acaagatctc 1500 ccgcttcccg ctcaagcgac aggtgtccct ggagtccaac gcgtccatga gctccaacac 1560 accactggtg cgcatcgcaa ggctgtcctc aggggagggc cccacgctgg ccaatgtctc 1620 cgagctcgag ctgcctgccg accccaaatg ggagctgtct cgggcccggc tgaccctggg 1680 caagcccctt ggggagggct gcttcggcca ggtggtcatg gcggaggcca tcggcattga 1740 caaggaccgg gccgccaagc ctgtcaccgt agccgtgaag atgctgaaag acgatgccac 1800 tgacaaggac ctgtcggacc tggtgtctga gatggagatg atgaagatga tcgggaaaca 1860 caaaaacatc atcaacctgc tgggcgcctg cacgcagggc gggcccctgt acgtgctggt 1920 ggagtacgcg gccaagggta acctgcggga gtttctgcgg gcgcggcggc ccccgggcct 1980 ggactactcc ttcgacacct gcaagccgcc cgaggagcag ctcaccttca aggacctggt 2040 gtcctgtgcc taccaggtgg cccggggcat ggagtacttg gcctcccaga agtgcatcca 2100 cagggacctg gctgcccgca atgtgctggt gaccgaggac aacgtgatga agatcgcaga 2160 cttcgggctg gcccgggacg tgcacaacct cgactactac aagaagacaa ccaacggccg 2220 gctgcccgtg aagtggatgg cgcctgaggc cttgtttgac cgagtctaca ctcaccagag 2280 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catgtccagc accttgtgcc tggggtgtta gtggcaccgc ctccccacct ccaggctttc 3180 ccacttccca ccctgcccct cagagactga aattacgggt acctgaagat gggagccttt 3240 accttttatg caaaaggttt attccggaaa ctagtgtaca tttctataaa tagatgctgt 3300 gtatatggta tatatacata tatatatata acatatatgg aagaggaaaa ggctggtaca 3360 acggaggcct gcgaccctgg gggcacagga ggcaggcatg gccctgggcg gggcgtgggg 3420 gggcgtggag ggaggcccca gggggtctca cccatgcaag cagaggacca gggccttttc 3480 tggcaccgca gttttgtttt aaaactggac ctgtatattt gtaaagctat ttatgggccc 3540 ctggcactct tgttcccaca ccccaacact tccagcattt agctggccac atggcggaga 3600 gttttaattt ttaacttatt gacaaccgag aaggtttatc ccgccgatag agggacggcc 3660 aagaatgtac gtccagcctg ccccggagct ggaggatccc ctccaagcct aaaaggttgt 3720 taatagttgg aggtgattcc agtgaagata ttttatttcc tttgtccttt ttcaggagaa 3780 ttagatttct ataggatttt tctttaggag atttattttt tggacttcaa agcaagctgg 3840 tattttcata caaattcttc taattgctgt gtgtcccagg cagggagacg gtttccaggg 3900 aggggccggc cctgtgtgca ggttccgatg ttattagatg ttacaagttt atatatatct 3960 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<220> <223> Oligonucleotide sequence motif <400> 13 gaagaagccc accct 15 <210> 14 <211> 12 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Oligonucleotide sequence motif <400> 14 gaagcccacc ct 12 <210> 15 <211> 16 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 15 gcauccucag cuacag 16 <210> 16 <211> 15 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 16 uacagggugg gcuuc 15 <210> 17 <211> 16 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 17 cagggugggc uucuuc 16 <210> 18 <211> 14 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 18 agggugggcu ucuu 14 <210> 19 <211> 15 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 19 agggugggcu ucuuc 15 <210> 20 <211> 12 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 20 agggugggcu uc 12 <210> 21 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> LNA antisense oligomer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Phosphorothioate internucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> LNA nucleosides, such as beta-D-oxy LNA <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5 methyl cytosine LNA <220> <221> misc_feature <222> (14)..(6) <223> LNA nucleosides, such as beta-D-oxy LNA <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> 5 methyl cytosine LNA <400> 21 ctgtagctga ggatgc 16 <210> 22 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> LNA antisense oligomer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(15) <223> Phosphorothioate internucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> LNA nucleosides, such as beta-D-oxy LNA <220> <221> misc_feature <222> (13)..(15) <223> LNA nucleosides, such as beta-D-oxy LNA <400> 22 gaagcccacc ctgta 15 <210> 23 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> LNA antisense oligomer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Phosphorothioate internucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> LNA nucleosides, such as beta-D-oxy LNA <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> LNA nucleosides, such as beta-D-oxy LNA <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> 5 methyl cytosine LNA <400> 23 gaagaagccc accctg 16 <210> 24 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> LNA antisense oligomer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(14) <223> Phosphorothioate internucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> LNA nucleosides, such as beta-D-oxy LNA <220> <221> misc_feature <222> (12)..(14) <223> LNA nucleosides, such as beta-D-oxy LNA <220> <221> misc_feature <222> (12)..(13) <223> 5 methyl cytosine LNA <400> 24 aataatccca ccct 14 <210> 25 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> LNA antisense oligomer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(15) <223> Phosphorothioate internucleoside linkages <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> LNA nucleosides, such as beta-D-oxy LNA <220> <221> misc_feature <222> (13)..(15) <223> LNA nucleosides, such as beta-D-oxy LNA <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> 5 methyl cytosine LNA <400> 25 gaagaagccc accct 15

Claims (15)

1. 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 8 내지 25개 뉴클레오티드 길이의 안티센스 올리고뉴클레오티드로서, 서열번호 4의 1394번 뉴클레오티드 위치를 포함하는 서열번호 4의 영역에 하이브리드화할 수 있는 올리고뉴클레오티드.
2. 제 1 항에 있어서,
   서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13 및 서열번호 14로 이루어진 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드에 80% 이상 일치하는 올리고뉴클레오티드.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   14 내지 18개 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
   섬유아세포 성장인자 수용체 유형 3(FGFR3)의 야생형 형태의 발현에 비해 FGFR3의 돌연변이된 형태의 발현을 우선적으로 조절하는 올리고뉴클레오티드.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
   서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24 및 서열번호 25로 이루어진 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드.
6. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
   하나 이상의 뉴클레오티드 유사체가 잠금 핵산(LNA) 단위, 2'-O-알킬-RNA 단위, 2'-OMe-RNA 단위, 2'-아미노-DNA 단위 및 2'-플루오로-DNA 단위로 이루어진 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드.
7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
   2개 이상의 LNA 단량체 단위를 포함하는 올리고뉴클레오티드.
8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
   서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24 및 서열번호 25로 이루어진 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드.
9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
   서열번호 21을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드 및 상기 올리고뉴클레오티드에 공유 부착된 하나 이상의 비-뉴클레오티드 부분을 포함하는 접합체.
11. FGFR3의 이상 발현과 관련된 상태, 예컨대 암 또는 연골무형성증의 치료를 위한, 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드, 또는 제 10 항에 따른 접합체의 용도.
12. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드 또는 제 10 항에 따른 접합체를 FGFR3 mRNA와 상기 올리고뉴클레오티드의 하이브리드화에 적합한 조건하에 상기 FGFR3 mRNA로 전달하여, 상기 FGFR3 mRNA의 발현을 감소시킴을 포함하는, FGFR3 mRNA의 발현을 감소시키는 방법.
13. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드 또는 제 10 항에 따른 접합체를 FGFR3 mRNA와 상기 올리고뉴클레오티드의 하이브리드화에 적합한 조건하에 상기 FGFR3 mRNA로 전달하여, 상기 FGFR3 mRNA의 발현을 감소시킴을 포함하는, FGFR3 mRNA의 발현을 감소시키는 시험관내 방법.
14. FGFR3의 이상 발현과 관련된 상태로 진단된 환자를 선택하고 상기 환자에게 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드 또는 제 10 항에 따른 접합체를 투여함을 포함하는, 상기 상태의 치료 방법.
15. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드 또는 제 10 항에 따른 접합체, 및 약학적으로 허용되는 희석제, 담체, 용매, 염 또는 보조제를 포함하는 약학 조성물.
    

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