ES2940887T3 - Método de preparación de oligonucleótidos quirales - Google Patents

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Abstract

La presente invención se refiere a oligonucleótidos controlados quiralmente, composiciones de oligonucleótidos controlados quiralmente y el método para fabricar y usar las mismas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Método de preparación de oligonucleótidos quirales
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
La presente solicitud reivindica prioridad a las solicitudes provisionales de Estados Unidos N.° de serie 61/671.655, presentada el 13 de julio de 2012, 61/671.656, presentada el 13 de julio de 2012, 61/671.722, presentada el 14 de julio de 2012, y 61/671.724, presentada el 14 de julio de 2012.
Antecedentes de la invención
Los oligonucleótidos son útiles en aplicaciones terapéuticas, de diagnóstico, de investigación y de nanomateriales. El uso de ácidos nucleicos que existen de forma natural (por ejemplo, ADN o ARN sin modificar) para terapéuticos puede estar limitado, por ejemplo, debido a su inestabilidad contra nucleasas extra- e intracelulares y/o su escasa penetración y distribución celular. Además, estudios in vitro han mostrado que propiedades de oligonucleótidos antisentido, tales como afinidad de unión, unión específica de secuencia al ARN complementario (Cosstick y Eckstein, 1985; LaPlanche et al., 1986; Latimer et al., 1989; Hacia et al., 1994; Mesmaeker et al., 1995) y estabilidad a nucleasas se pueden afectar por las configuraciones estereoquímicas absolutas de los átomos de fósforo (Cook, et al., documento de patente US005599797A). Por lo tanto, existe una necesidad de composiciones de oligonucleótidos nuevas y mejoradas.
El documento de patente WO 2011/005761 describe profármacos de ácido nucleico y profármacos de ácido nucleico que comprenden restos de fósforo quiral. También se describen en el documento de patente WO 2011/005761 métodos de preparación y uso de profármacos de ácido nucleico y profármacos de ácido nucleico que comprenden restos de fósforo quiral. El documento de patente US 2011/0294124 describe métodos de síntesis de ácidos nucleicos modificados en el átomo de fósforo que comprenden restos de X-fosfonato quiral. Los métodos descritos en el documento de patente US 2011/0294124 proporcionan ácidos nucleicos modificados en el esqueleto con alta pureza diastereomérica por una reacción asimétrica de una molécula aquiral que comprende un resto H-fosfonato químicamente estable con un nucleósido/nucleótido.
Sumario de la invención
La presente invención engloba el reconocimiento de que existe una necesidad de composiciones de oligonucleótidos quiralmente controlados y nuevos métodos de síntesis de las mismas. La invención engloba específicamente la identificación de la fuente de ciertos problemas con metodologías previas para preparar oligonucleótidos quirales, que incluyen problemas que prohíben la preparación de composiciones completamente quiralmente controladas, particularmente composiciones que comprenden una pluralidad de tipos de oligonucleótidos.
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona composiciones de oligonucleótidos quiralmente controlados.
La presente invención, como se reivindica, proporciona métodos de preparación de oligonucleótidos quiralmente controlados y composiciones de oligonucleótidos quiralmente controlados.
Por consiguiente, la presente invención, como se reivindica, se refiere a un método de preparación de un oligonucleótido o una composición de oligonucleótidos que comprende un oligonucleótido, que comprende las etapas de:
(1) acoplamiento;
(2) terminación;
(3) modificación;
(4) desbloqueo; y
(5) repetición de las etapas (1) -(4) hasta que se logra una longitud deseada;
en donde el método proporciona un oligonucleótido que existe en una única forma diastereomérica con respecto al fósforo del enlace quiral, y
en donde al menos una etapa (3) forma un enlace internucleotídico que tiene la estructura de la fórmula I-c:
Figure imgf000003_0001
(I-c)
en donde la al menos una etapa (3) comprende la sulfurización con un reactivo de sulfurización que tiene la estructura de la fórmula S-I:
Figure imgf000003_0002
(S-I)
en donde:
P* es un átomo de fósforo asimétrico y es o Rp o Sp;
L es un enlace covalente o un alquileno C1-C10 opcionalmente sustituido, lineal o ramificado, en donde una o más unidades de metileno de L están opcionalmente e independientemente sustituidas con un alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenileno C1-C6, -C=C-, -C(R')2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R')-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR')-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -N(R')C(O)O-, -OC(O)N(R')-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2N(R')-, -N(R')S(O)2-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(O)- o -C(O)O-;
R1 es halógeno, R, o un alifático C1-C50 opcionalmente sustituido, en donde una o más unidades de metileno están opcionalmente e independientemente sustituidas con un alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenileno C1-C6 , -C=C-, -C(R')2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R')-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR')-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -N(R')C(O)O-, -OC(O)N(R')-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2N(R')-, -N(R')S(O)2-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(O)- o -C(O)O-;
cada R' es independientemente -R, -C(O)R, -CO2R o -SO2R, o:
dos R' en el mismo nitrógeno se toman conjuntamente con sus átomos intermedios para formar un anillo heterocíclico o de heteroarilo opcionalmente sustituido, o
dos R' en el mismo carbono se toman conjuntamente con sus átomos intermedios para formar un anillo de arilo, carbocíclico, heterocíclico o de heteroarilo opcionalmente sustituido; -Cy- es un anillo bivalente opcionalmente sustituido seleccionado de fenileno, carbociclileno, arileno, heteroarileno o heterociclileno;
Rs1 es R;
cada R es independientemente hidrógeno, o un grupo opcionalmente sustituido seleccionado de alifático C1-C6, fenilo, carbociclilo, arilo, heteroarilo o heterociclilo; cada
Figure imgf000003_0003
representa independientemente una conexión a un nucleósido; y
R1 no es -H cuando L es un enlace covalente.
En algunas realizaciones, la etapa de acoplamiento comprende el uso de triflato de N-cianometilpirrolidinio y
Figure imgf000003_0004
en donde BPRO es una nucleobase protegida.
En algunas realizaciones, la etapa de terminación comprende las etapas de terminación de un grupo amino en un auxiliar quiral y terminación de 5'-OH sin reaccionar, en donde el auxiliar quiral es de la estructura:
Figure imgf000004_0001
en donde:
W1 es -NG5-, W2 es -O-;
cada uno de G1 y G2 es independientemente un grupo opcionalmente sustituido seleccionado de alquilo, aralquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heterociclilo, heteroarilo y arilo;
cada uno de G3, G4 y G5 es independientemente hidrógeno, o un grupo opcionalmente sustituido seleccionado de alquilo, aralquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heterociclilo, heteroarilo y arilo; o dos de G1, G2, G3, G4 y G5 se toman conjuntamente para formar un anillo carbocíclico opcionalmente sustituido, saturado, parcialmente insaturado o insaturado o que contiene heteroátomo de hasta aproximadamente 20 átomos de anillo que es monocíclico o policíclico, y está condensado o sin condensar.
En algunas realizaciones, el oligonucleótido tiene al menos 15 nucleótidos en longitud.
La invención reivindicada se define en las reivindicaciones adjuntas.
En el presente documento también se desvelan métodos de uso de oligonucleótidos quiralmente controlados y composiciones de oligonucleótidos quiralmente controlados.
Definiciones
Alifático: El término "alifático" o "grupo alifático", como se usa en el presente documento, significa una cadena de hidrocarburo de cadena lineal (es decir, no ramificada) o ramificada, sustituida o sin sustituir, que está completamente saturada o que contiene una o más unidades de instauración, o un hidrocarburo monocíclico o bicíclico o hidrocarburo policíclico que está completamente saturado o que contiene una o más unidades de instauración, pero que no es aromático (también denominado en el presente documento "carbociclo", "cicloalifático" o "cicloalquilo"), que tiene un único punto de unión al resto de la molécula. En algunas realizaciones, los grupos alifáticos contienen 1 -50 átomos de carbono alifático. A menos que se especifique de otro modo, los grupos alifáticos contienen 1-10 átomos de carbono alifático. En algunas realizaciones, los grupos alifáticos contienen 1-6 átomos de carbono alifático. En algunas realizaciones, los grupos alifáticos contienen 1-5 átomos de carbono alifático. En otras realizaciones, los grupos alifáticos contienen 1 -4 átomos de carbono alifático. En otras realizaciones más, grupos alifáticos contienen 1 -3 átomos de carbono alifático, y en aún otras realizaciones, los grupos alifáticos contienen 1-2 átomos de carbono alifático. En algunas realizaciones, "cicloalifático" (o "carbociclo" o "cicloalquilo") se refiere a un hidrocarburo C3-C10 monocíclico o bicíclico que está completamente saturado o que contiene una o más unidades de instauración, pero que no es aromático, que tiene un único punto de unión al resto de la molécula. En algunas realizaciones, "cicloalifático" (o "carbociclo" o "cicloalquilo") se refiere a un hidrocarburo C3-C6 monocíclico que está completamente saturado o que contiene una o más unidades de instauración, pero que no es aromático, que tiene un único punto de unión al resto de la molécula. Los grupos alifáticos adecuados incluyen, pero no se limitan a, grupos alquilo, alquenilo, alquinilo lineales o ramificados, sustituidos o sin sustituir, e híbridos de los mismos, tales como (cicloalquil)alquilo, (cicloalquenil)alquilo o (cicloalquil)alquenilo.
Alquileno: El término "alquileno" se refiere a un grupo alquilo bivalente. Una "cadena de alquileno" es un grupo polimetileno, es decir, -(CH2)n-, en donde n es un número entero positivo, preferentemente desde 1 hasta 6, desde 1 hasta 4, desde 1 hasta 3, desde 1 hasta 2, o desde 2 hasta 3. Una cadena de alquileno sustituida es un grupo polimetileno en el que uno o más átomos de hidrógeno del metileno están sustituidos con un sustituyente. Los sustituyentes adecuados incluyen los descritos a continuación para un grupo alifático sustituido.
Alquenileno: El término "alquenileno" se refiere a un grupo alquenilo bivalente. Una cadena de alquenileno sustituida es un grupo polimetileno que contiene al menos un doble enlace en el que uno o más átomos de hidrógeno están sustituidos con un sustituyente. Los sustituyentes adecuados incluyen los descritos a continuación para un grupo alifático sustituido.
Animal: Como se usa en el presente documento, el término "animal" se refiere a cualquier miembro del reino de los animales. En algunas realizaciones, "animal" se refiere a seres humanos, en cualquier etapa de desarrollo. En algunas realizaciones, "animal" se refiere a animales no humanos, en cualquier etapa de desarrollo. En ciertas realizaciones, el animal no humano es un mamífero (por ejemplo, un roedor, un ratón, una rata, un conejo, un mono, un perro, un gato, una oveja, ganado vacuno, un primate y/o un cerdo). En algunas realizaciones, los animales incluyen, pero no se limitan a, mamíferos, aves, reptiles, anfibios, peces y/o gusanos. En algunas realizaciones, un animal puede ser un animal transgénico, una animal genéticamente manipulado y/o un clon.
Aproximadamente: Como se usa en el presente documento, se considera que los términos "aproximadamente" o "alrededor de" en referencia a un número incluyen, en general, números que entran dentro de un intervalo del 5 %, 10 %, 15 % o 20 % en cualquier dirección (superior a o inferior a) del número, a menos que se establezca de otro modo o sea de otro modo evidente del contexto (excepto donde dicho número fuera inferior al 0 % o superara el 100 % de un valor posible). En algunas realizaciones, el uso del término "aproximadamente" en referencia a dosis significa ± 5 mg/kg/día.
Arito: El término "arilo", usado solo o como parte de un resto mayor como en "aralquilo", "aralcoxi" o "ariloxialquilo", se refiere a sistemas de anillos monocíclicos y bicíclicos que tienen un total de cinco a catorce miembros de anillo, en donde al menos un anillo en el sistema es aromático y en donde cada anillo en el sistema contiene tres a siete miembros de anillo. El término "arilo" se puede usar indistintamente con el término "anillo de arilo". En ciertas realizaciones del presente método inventivo, "arilo" se refiere a un sistema de anillos aromáticos que incluye, pero no se limitan a, fenilo, bifenilo, naftilo, antracilo y similares, que puede poseer uno o más sustituyentes. También está incluido dentro del alcance del término "arilo", como se usa en el presente documento, un grupo en el que un anillo aromático está condensado con uno o más anillos no aromáticos, tales como indanilo, ftalimidilo, naftimidilo, fenantridinilo o tetrahidronaftilo, y similares.
Porción característica: Como se usa en el presente documento, la expresión una "porción característica" de una proteína o polipéptido es una que contiene un tramo continuo de aminoácidos, o un conjunto de tramos continuos de aminoácidos, que juntos son característicos de una proteína o polipéptido. Cada dicho tramo continuo contendrá, en general, al menos dos aminoácidos. Además, los expertos habituales en la técnica apreciarán que normalmente se requieren al menos 5, 10, 15, 20 o más aminoácidos para ser característicos de una proteína. En general, una porción característica es una que, además de la identidad de secuencia especificada anteriormente, comparte al menos una característica funcional con la proteína intacta relevante.
Secuencia característica: Una "secuencia característica" es una secuencia que se encuentra en todos los miembros de una familia de polipéptidos o ácidos nucleicos y, por lo tanto, puede ser usada por los expertos habituales en la técnica para definir miembros de la familia.
Elemento estructural característico: El término "elemento estructural característico" se refiere a un elemento estructural distintivo (por ejemplo, estructura central, conjunto de datos laterales, elemento de secuencia, etc.) que se encuentra en todos los miembros de una familia de polipéptidos, moléculas pequeñas o ácidos nucleicos y, por lo tanto, puede ser usado por los expertos habituales en la técnica para definir miembros de la familia.
Comparable: El término "comparable" se usa en el presente documento para describir dos (o más) conjuntos de condiciones o circunstancias que son suficientemente similares entre sí como para permitir la comparación de resultados obtenidos o fenómenos observados. En algunas realizaciones, conjuntos comparables de condiciones o circunstancias se caracterizan por una pluralidad de características sustancialmente idénticas y uno o un pequeño número de características variadas. Los expertos habituales en la técnica apreciarán que los conjuntos de condiciones son comparables entre sí cuando se caracterizan por un número y tipo suficientes de características sustancialmente idénticas para garantizar una conclusión razonable de que las diferencias en los resultados obtenidos o fenómenos observados en los diferentes conjuntos de condiciones o circunstancias son causadas por o indicativas de la variación en las características que se varían.
Pauta posológica: Como se usa en el presente documento, una "pauta posológica" o "pauta terapéutica" se refiere a un conjunto de dosis unitarias (normalmente más de una) que se administra individualmente a un sujeto, normalmente separadas por periodos de tiempo. En algunas realizaciones, un agente terapéutico dado tiene una pauta posológica recomendada, que puede implicar una o más dosis. En algunas realizaciones, una pauta posológica comprende una pluralidad de dosis separadas entre sí por un periodo de tiempo de la misma longitud; en algunas realizaciones, una pauta posológica dada comprende una pluralidad de dosis y al menos dos periodos de tiempo diferentes que separan dosis individuales. En algunas realizaciones, todas las dosis dentro de una pauta posológica son de la misma cantidad de dosis unitaria. En algunas realizaciones, dosis diferentes dentro de una pauta posológica son de diferentes cantidades. En algunas realizaciones, una pauta posológica comprende una primera dosis en una primera cantidad de dosis, seguida por una o más dosis adicionales en una segunda cantidad de dosis diferente de la primera cantidad de dosis. En algunas realizaciones, una pauta posológica comprende una primera dosis en una primera cantidad de dosis, seguida por una o más dosis adicionales en una segunda cantidad de dosis igual a la primera cantidad de dosis.
Agentes equivalentes: Los expertos habituales en la técnica, que leen la presente divulgación, apreciarán que el alcance de los agentes útiles en el contexto de la presente invención no se limita a aquellos mencionados o ejemplificados específicamente en el presente documento. En particular, los expertos en la técnica reconocerán que los agentes activos tienen normalmente una estructura que consiste en un núcleo y restos laterales unidos, y además apreciarán que variaciones simples de dicho núcleo y/o restos laterales pueden no alterar significativamente la actividad del agente. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la sustitución de uno o más restos laterales con grupos de estructura tridimensional comparable y/o características de reactividad química puede generar un compuesto sustituido o porción equivalente a un compuesto o porción de referencia parental. En algunas realizaciones, la adición o retirada de uno o más restos laterales puede generar un compuesto sustituido equivalente a un compuesto de referencia parental. En algunas realizaciones, la alteración de la estructura de núcleo, por ejemplo mediante la adición o retirada de un pequeño número de enlaces (normalmente no más de 5, 4, 3, 2 o 1 enlaces, y frecuentemente solo un enlace sencillo) puede generar un compuesto sustituido equivalente a un compuesto de referencia parental. En muchas realizaciones, se pueden preparar compuestos equivalentes por métodos ilustrados en los esquemas de reacción generales como, por ejemplo, se describen a continuación, o por modificaciones de los mismos, usando materiales de partida fácilmente disponibles, reactivos y procedimientos de síntesis convencionales o proporcionados. En estas reacciones, también es posible hacer uso de variantes, que son en sí mismas conocidas, pero no se mencionan aquí.
Dosis equivalente: El término "dosis equivalente" se usa en el presente documento para comparar dosis de diferentes agentes farmacéuticamente activos que efectúan el mismo resultado biológico. Se considera que la dosis de dos agentes diferentes es "equivalente" entre sí según la presente divulgación si logran un nivel o grado comparable de resultado biológico. En algunas realizaciones, las dosis equivalentes de diferentes agentes farmacéuticos para su uso según la presente divulgación se determinan usando ensayos in vitro y/o in vivo como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, se utilizan uno o más agentes de activación lisosómicos para su uso según la presente divulgación en dosis equivalentes a una dosis de un agente de activación lisosómico de referencia; en algunas de dichas realizaciones, el agente de activación lisosómico de referencia para dicho fin se selecciona del grupo que consiste en activadores alostéricos de molécula pequeña (por ejemplo, pirazolpirimidinas), iminoazúcares (por ejemplo, isofagomina), antioxidantes (por ejemplo, n-acetilcisteína) y reguladores del tráfico celular (por ejemplo, polipéptido Rab1a).
Heteroalifático: El término "heteroalifático" se refiere a un grupo alifático en donde una o más unidades seleccionadas de C, CH, CH2 o CH3 se sustituyen independientemente con un heteroátomo. En algunas realizaciones, un grupo heteroalifático es heteroalquilo. En algunas realizaciones, un grupo heteroalifático es heteroalquenilo.
Heteroarilo: Los términos "heteroarilo" y "heteroar-," usados solos o como parte de un resto más grande, por ejemplo, "heteroaralquilo" o "heteroaralcoxi", se refieren a grupos que tienen 5 a 10 átomos de anillo, preferentemente 5, 6 o 9 átomos de anillo; que tienen 6, 10 o 14 electrones n compartidos en una matriz cíclica; y que tienen, además de átomos de carbono, de uno a cinco heteroátomos. El término "heteroátomo" se refiere a nitrógeno, oxígeno o azufre, e incluye cualquier forma oxidada del nitrógeno o azufre, y cualquier forma cuaternizada de un nitrógeno básico. Los grupos heteroarilo incluyen, sin limitación, tienilo, furanilo, pirrolilo, imidazolilo, pirazolilo, triazolilo, tetrazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, oxadiazolilo, tiazolilo, isotiazolilo, tiadiazolilo, piridilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, indolizinilo, purinilo, naftiridinilo y pteridinilo. Los términos "heteroarilo" y "heteroar-", como se usan en el presente documento, también incluyen grupos en los que un anillo heteroaromático está condensado con uno o más anillos de arilo, cicloalifáticos o de heterociclilo, donde el radical o punto de unión está en el anillo heteroaromático. Los ejemplos no limitantes incluyen indolilo, isoindolilo, benzotienilo, benzofuranilo, dibenzofuranilo, indazolilo, bencimidazolilo, benztiazolilo, quinolilo, isoquinolilo, cinolinilo, ftalazinilo, quinazolinilo, quinoxalinilo, 4H-quinolizinilo, carbazolilo, acridinilo, fenazinilo, fenotiazinilo, fenoxazinilo, tetrahidroquinolinilo, tetrahidroisoquinolinilo y pirido[2,3-b]-1,4-oxazin-3(4H)-ona. Un grupo heteroarilo puede ser mono- o bicíclico. El término "heteroarilo" se puede usar indistintamente con los términos "anillo de heteroarilo", "grupo heteroarilo" o "heteroaromático", cualquiera de cuyos términos incluye anillos que están opcionalmente sustituidos. El término "heteroaralquilo" se refiere a un grupo alquilo sustituido con un heteroarilo, en donde las porciones de alquilo y heteroarilo están independientemente opcionalmente sustituidas.
Heteroátomo: El término "heteroátomo" significa uno o más de oxígeno, azufre, nitrógeno, fósforo o silicio (incluyendo cualquier forma oxidada del nitrógeno, azufre, fósforo o silicio; la forma cuaternizada de cualquier nitrógeno básico o; un nitrógeno sustituible de un anillo heterocíclico, por ejemplo N (como en 3,4-dihidro-2H-pirrolilo), NH (como en pirrolidinilo) o NR+ (como en pirrolidinilo N-sustituido)).
Heterociclo: Como se usa en el presente documento, los términos "heterociclo", "heterociclilo", "radical heterocíclico" y "anillo heterocíclico" se usan indistintamente y se refieren a un resto heterocíclico estable monocíclico de 3 a 7 miembros o bicíclico de 7-10 miembros que está o saturado o parcialmente insaturado, y que tiene, además de átomos de carbono, uno o más, preferentemente uno a cuatro, heteroátomos, como se ha definido anteriormente. Cuando se usa en referencia a un átomo de anillo de un heterociclo, el término "nitrógeno" incluye un nitrógeno sustituido. Como un ejemplo, en un anillo saturado o parcialmente insaturado que tiene 0-3 heteroátomos seleccionados de oxígeno, azufre o nitrógeno, el nitrógeno puede ser N (como en 3,4-dihidro-2H-pirrolilo), NH (como en pirrolidinilo) o NR (como en pirrolidinilo W-sustituido).
Un anillo heterocíclico se puede unir a su grupo lateral en cualquier heteroátomo o átomo de carbono que produzca una estructura estable y cualquiera de los átomos de anillo puede estar opcionalmente sustituido. Los ejemplos de dichos radicales heterocíclicos saturados o parcialmente insaturados incluyen, sin limitación, tetrahidrofuranilo, tetrahidrotiofenilo, pirrolidinilo, piperidinilo, pirrolinilo, tetrahidroquinolinilo, tetrahidroisoquinolinilo, decahidroquinolinilo, oxazolidinilo, piperazinilo, dioxanilo, dioxolanilo, diazepinilo, oxazepinilo, tiazepinilo, morfolinilo y quinuclidinilo. Los términos "heterociclo", "heterociclilo", "anillo heterociclilo", "grupo heterocíclico", "resto heterocíclico" y "radical heterocíclico" se usan indistintamente en el presente documento, y también incluyen grupos en los que un anillo heterociclilo está condensado con uno o más anillos de arilo, heteroarilo o cicloalifáticos, tales como indolinilo, 3Hindolilo, cromanilo, fenantridinilo o tetrahidroquinolinilo, donde el radical o punto de unión está en el anillo heterociclilo. Un grupo heterociclilo puede ser mono- o bicíclico. El término "heterociclilalquilo" se refiere a un grupo alquilo sustituido con un heterociclilo, en donde las porciones de alquilo y heterociclilo están independientemente están opcionalmente sustituidas.
Intraperitoneal: Las expresiones "administración intraperitoneal" y "administrado por vía intraperitoneal", como se usan en el presente documento, tienen su significado entendido en la técnica con referencia a la administración de un compuesto o composición en el peritoneo de un sujeto.
In vitro: Como se usa en el presente documento, el término ”in vitro" se refiere a acontecimientos que ocurren en un entorno artificial, por ejemplo, en un tubo de ensayo o recipiente de reacción, en cultivo celular, etc., en vez de dentro de un organismo (por ejemplo, animal, planta y/o microbio).
In vivo: Como se usa en el presente documento, el término "in vivo" se refiere a acontecimientos que ocurren dentro de un organismo (por ejemplo, animal, planta y/o microbio).
Alquilo inferior: El término "alquilo inferior" se refiere a un grupo alquilo C1-4 lineal o ramificado. Los grupos alquilo inferior a modo de ejemplo son metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo y terc-butilo.
Haloalquilo inferior: El término "haloalquilo inferior" se refiere a un grupo alquilo C1-4 lineal o ramificado que está sustituido con uno o más átomos de halógeno.
Opcionalmente sustituido: Como se describe en el presente documento, los compuestos de la divulgación, tales como, por ejemplo, los compuestos usados en o proporcionados por el método inventivo, pueden contener restos "opcionalmente sustituidos". En general, el término "sustituido", tanto si va precedido por el término "opcionalmente" como no, significa que uno o más hidrógenos del resto diseñado están sustituidos con un sustituyente adecuado. A menos que se indique lo contrario, un grupo "opcionalmente sustituido" puede tener un sustituyente adecuado en cada posición sustituible del grupo, y cuando más de una posición en cualquier estructura dada se pueda sustituir con más de un sustituyente seleccionado de un grupo especificado, el sustituyente puede ser o el mismo o diferente en cada posición. Las combinaciones de sustituyentes previstas por la presente invención son preferentemente las que producen la formación de compuestos estables o químicamente factibles. El término "estable", como se usa en el presente documento, se refiere a compuestos que no son sustancialmente alterados cuando se someten a condiciones para permitir su producción, detección y, en ciertas realizaciones, su recuperación, purificación y uso para uno o más de los fines desvelados en el presente documento.
Los sustituyentes monovalentes adecuados en un átomo de carbono sustituible de un grupo "opcionalmente sustituido" son independientemente halógeno; -(CH2)0-4R°; -(CH2)0-4OR°; -O(CH2)0-4R°, -O-(CH2)0-4C(O)Or °; -(CH2)0-4CH(OR°)2; -(CH2)0-4SR°; -(CH2)0-4Ph, que se puede sustituir con R°; -(CH2)0-4O(CH2)0-1Ph que se puede sustituir con R°; -CH=CHPh, que se puede sustituir con R°; -(CH2)0-4O(CH2)0-1-piridilo que se puede sustituir con R°; -NO2 ; -CN; -N3 ; -(CH2)0-4N(R°)2; -(CH2)0-4N(R°)C(O)R°; -N(R°)C(S)R°; -(CH2)0-4N(R°)C(O)NR°2; -N(R°)C(S)NR°2; -(CH2)0-4N(R°)C(O)OR°; -N(R°)N(R°)C(O)R°; -N(R°)N(R°)C(O)NR°2; -N(R°)N(R°)C(O)OR°; -(CH2)0-4C(O)R°; -C(S)R°; -(CH2)0-4C(O)OR°; -(CH2)0-4C(O)SR°; -(CH2)0-4C(O)OSiR°3; -(CH2)0-4OC(O)R°; -OC(O)(CH2)0-4SR-, -SC(S)SR°; -(CH2)0-4SC(O)R°; -(CH2)0-4C(O)NR°2; -C(S)NR°2; -C(S)SR°; -SC(S)SR°, -(CH2)0-4OC(O)NR°2; -C(O)N(OR°)R°; -C(O)C(O)R°; -C(O)CH2C(O)R°; -C(NOR°)R°; -(CH2)0-4SSR°; -(CH2)0-4S(O)2R°; -(CH2)0-4S(O)2OR°; -(CH2)0-4OS(O)2R°; -S(O)2NR°2; -(CH2)0-4S(O)R°; -N(R°)S(O)2NR°2; -N(R°)S(O)2R°; -N(OR°)R°; -C(NH)NR°2; -P(O)2R°; -P(O)R°2; -OP(O)R°2; -Op (O)(OR°)2 ; -SiR°3; -(alquilen C1-4 lineal o ramificado)O-N(R°)2 ; o -(alquilen C1-4 lineal o ramificado)C(O)O-N(R°)2 , en donde cada R° se puede sustituir como se define a continuación y es independientemente hidrógeno, alifático C1-6, -CH2 Ph, -O(CH2)0-1Ph, -CH2-(anillo de heteroarilo de 5-6 miembros), o un anillo de 5-6 miembros saturado, parcialmente insaturado o de arilo que tiene 0-4 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre, o, a pesar de la definición anterior, dos apariciones independientes de R°, tomadas conjuntamente con su(s) átomo(s) intermedio(s), forman un anillo de 3-12 miembros saturado, parcialmente insaturado, o de arilo mono- o bicíclico que tiene 0-4 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre, que se puede sustituir como se define a continuación.
Los sustituyentes monovalentes adecuados en R° (o el anillo formado tomando dos apariciones independientes de R° junto con sus átomos intermedios), son independientemente halógeno, -(CH2)0-2R\ -(haloR^), -(CH2V 2OH, -(CH2)ü-2OR, -(CH2)0-2CH(OR-)2 ; -O(haloR-), -CN, -N3 , -(CH2)0-2C(O)R-, -(CH2)0-2C(O)OH, -(CH2)0-2C(O)OR-, -(CH2)0-2SR-, -(CH2)0-2SH, -(CH2)0-2NH2, -(CH2V 2NHR, -(CH2)0-2NR-2, -NO2 , -SiR^, -OSiR-3, -C(O)SR-, -(alquilen C1-4 lineal o ramificado)C(O)OR^, o -SSR^ en donde cada R^ está sin sustituir o donde va precedido por "halo" está sustituido solo con uno o más halógenos, y está seleccionado independientemente de alifático C1-4, -CH2 Ph, -O(CH2)0-1 Ph, o un anillo de 5-6 miembros saturado, parcialmente insaturado, o de arilo que tiene 0-4 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre. Los sustituyentes divalentes adecuados en un átomo de carbono saturado de R° incluyen =O y =S.
Los sustituyentes divalentes adecuados en un átomo de carbono saturado de un grupo "opcionalmente sustituido" incluyen los siguientes: =O, =S, =NNR*2 , =NNHC(O)R*, =NNHC(O)OR*, =NNHS(O)2 R*, =NR*, =NOR*, -O(C(R*2))2-3O-o -S(C(R*2))2-3S-, en donde cada aparición independiente de R* se selecciona de hidrógeno, alifático C1-6 que se puede sustituir como se define a continuación, o un anillo sin sustituir de 5-6 miembros saturado, parcialmente insaturado o de arilo que tiene 0-4 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre. Los sustituyentes divalentes adecuados que están unidos a carbonos sustituibles vecinales de un grupo "opcionalmente sustituido" incluyen: -O(CR*2)2-3O-, en donde cada aparición independiente de R* se selecciona de hidrógeno, alifático C1-6 que se puede sustituir como se define a continuación, o un anillo sin sustituir de 5-6 miembros saturado, parcialmente insaturado o de arilo que tiene 0-4 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre.
Los sustituyentes adecuados en el grupo alifático de R* incluyen halógeno, -R\ -(haloR^), -OH, -OR\ -O(haloR^), -CN, -C(O)OH, -C(O)OR^, -NH2 , -NHR^, +n R^ o -NO2 , en donde cada R^ está sin sustituir o donde va precedido por "halo" está sustituido solo con uno o más halógenos, y es independientemente alifático C1-4, -CH2 Ph, -O(CH2)ü-1Ph, o un anillo de 5-6 miembros saturado, parcialmente insaturado o de arilo que tiene 0-4 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre.
Los sustituyentes adecuados en un nitrógeno sustituible de un grupo "opcionalmente sustituido" incluyen -Rf , -NRf 2 , -C(O)Rt, -C(O)ORt, -C(O)C(O)Rt, -C(O)CH2C(O)Rt, -S(O)2 R t -S(O)2NRt2 , -C(S)NRt2 , -C(NH)NRf 2 o -N(R)S(O)2 Rt ; en donde cada Rt es independientemente hidrógeno, alifático C1-6 que se puede sustituir como se define a continuación, -OPh sin sustituir, o un anillo sin sustituir de 5-6 miembros saturado, parcialmente insaturado o de arilo que tiene 0-4 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre, o, a pesar de la definición anterior, dos apariciones independientes de Rt , tomadas conjuntamente con su(s) átomo(s) intermedio(s), forman un anillo mono- o bicíclico sin sustituir de 3-12 miembros saturado, parcialmente insaturado, o de arilo que tiene 0-4 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre.
Los sustituyentes adecuados en el grupo alifático de Rt son independientemente halógeno, -R\ -(haloR^), -OH, -OR\ -O(haloR^), -CN, -C(O)OH, -C(O)OR^, -NH2 , -NHR^, -NR^ o -NO2 , en donde cada R^ está sin sustituir o donde va precedido por "halo" está sustituido solo con uno o más halógenos, y es independientemente alifático C1-4, -CH2 Ph, -O(CH2)0-1Ph, o un anillo de 5-6 miembros saturado, parcialmente insaturado o de arilo que tiene 0-4 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre.
Oral: Las expresiones "administración por vía oral" y "administrado por vía oral", como se usan en el presente documento, tienen su significado entendido en la técnica con referencia a la administración por la boca de un compuesto o composición.
Parenteral: Las expresiones "administración parenteral" y "administrado por vía parenteral", como se usan en el presente documento, tienen su significado entendido en la técnica con referencia a modos de administración distintos de administración enteral y tópica, normalmente por inyección, e incluyen, sin limitación, inyección intravenosa, intramuscular, intrarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intrarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal e intraesternal, e infusión.
Parcialmente insaturado: Como se usa en el presente documento, el término "parcialmente insaturado" se refiere a un resto de anillo que incluye al menos un doble o triple enlace. El término "parcialmente insaturado" pretende englobar anillos que tienen múltiples sitios de insaturación, pero no pretende incluir restos arilo o heteroarilo, como se define en el presente documento.
Composición farmacéutica: Como se usa en el presente documento, el término "composición farmacéutica" se refiere a un agente activo, formulado junto con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, el agente activo está presente en una cantidad de dosis unitaria apropiada para administración en una pauta terapéutica que muestra una probabilidad estadísticamente significativa de lograr un efecto terapéutico predeterminado cuando se administra a una población relevante. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas pueden ser especialmente formuladas para administración en forma sólida o líquida, que incluyen las adaptadas para lo siguiente: administración por vía oral, por ejemplo, rociados (disoluciones o suspensiones acuosas o no acuosas), comprimidos, por ejemplo, los dirigidos para absorción yugal, sublingual y sistémica, bolos, polvos, gránulos, pastas para aplicación a la lengua; administración parenteral, por ejemplo, por inyección subcutánea, intramuscular, intravenosa o epidural como, por ejemplo, una disolución o suspensión estéril, o formulación de liberación sostenida; administración tópica, por ejemplo, como una crema, pomada, o un parche de liberación controlada o espray aplicado a la piel, los pulmones o la cavidad bucal; por vía intravaginal o por vía intrarrectal, por ejemplo, como un pesario, crema o espuma; por vía sublingual; por vía ocular; por vía transdérmica; o por vía nasal, pulmonar, y a otras superficies mucosas.
Farmacéuticamente aceptable: Como se usa en el presente documento, la expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas farmacéuticas que son, dentro del alcance de criterio médico sensato, adecuados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica, u otro problema o complicación, proporcional a una relación beneficio/riesgo razonable.
Vehículo farmacéuticamente aceptable'. Como se usa en el presente documento, el término "vehículo farmacéuticamente aceptable" significa un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como una carga líquida o sólida, diluyente, excipiente, o material de encapsulación de disolvente, implicado en llevar o transportar el compuesto objeto de un órgano, o porción del cuerpo, a otro órgano, o porción del cuerpo. Cada vehículo debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros componentes de la formulación y no perjudicial para el paciente. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen: azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa y acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; excipientes, tales como manteca de cacao y ceras de supositorio; aceites, tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de alazor, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; glicoles, tales como propilenglicol; polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; agentes de tamponamiento, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua sin pirógenos; solución salina isotónica; disolución de Ringer; alcohol etílico; disoluciones de pH tamponado; poliésteres, policarbonatos y/o polianhídridos; y otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en las formulaciones farmacéuticas.
Sal farmacéuticamente aceptable: El término "sal farmacéuticamente aceptable", como se usa en el presente documento, se refiere a sales de dichos compuestos que son apropiadas para su uso en contextos farmacéuticos, es decir, sales que están dentro del alcance del criterio médico sensato, adecuadas para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales inferiores sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica y similares, y son proporcionales a una relación beneficio/riesgo razonable. Se conocen bien en la técnica las sales farmacéuticamente aceptables. Por ejemplo, S. M. Berge, et al. describen sales farmacéuticamente aceptables con detalle en J. Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19 (1977). En algunas realizaciones, las sales farmacéuticamente aceptable incluyen, pero no se limitan a, sales de adición de ácido no tóxicas, que son sales de un grupo amino formado con ácidos inorgánicos, tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico y ácido perclórico, o con ácidos orgánicos, tales como ácido acético, ácido maleico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido succínico o ácido malónico, o usando otros métodos usados en la técnica, tales como intercambio iónico. En algunas realizaciones, las sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, las sales de adipato, alginato, ascorbato, aspartato, bencenosulfonato, benzoato, bisulfato, borato, butirato, canforato, canforsulfonato, citrato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, formiato, fumarato, glucoheptonato, glicerofosfato, gluconato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, yodhidrato, 2-hidroxi-etanosulfonato, lactobionato, lactato, laurato, lauril sulfato, malato, maleato, malonato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, estearato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato, p-toluenosulfonato, undecanoato, valerato y similares. Las sales de metales alcalinos o alcalinotérreos representativas incluyen sodio, litio, potasio, calcio, magnesio y similares. En algunas realizaciones, las sales farmacéuticamente aceptables incluyen, cuando convenga, cationes amonio, amonio cuaternario y amina no tóxicos formados usando contraiones, tales como haluro, hidróxido, carboxilato, sulfato, fosfato, nitrato, alquilo que tiene desde 1 hasta 6 átomos de carbono, sulfonato y arilsulfonato.
Profármaco: En general, un "profármaco", como se usa el término en el presente documento y como es entendido en la técnica, es una entidad que, cuando se administra a un organismo, es metabolizado en el cuerpo para administrar un agente activo (por ejemplo, terapéutico o de diagnóstico) de interés. Normalmente, dicho metabolismo implica la retirada de al menos un "resto de profármaco", de manera que se forme el agente activo. Se conocen en la técnica diversas formas de "profármacos". Para ejemplos de dichos restos de profármaco, véase:
a) Design of Prodrugs, editado por H. Bundgaard, (Elsevier, 1985) y Methods in Enzymology, 42:309-396, editado por K. Widder, et al. (Academic Press, 1985);
b) Prodrugs and Targeted Delivery, editado por J. Rautio (Wiley, 2011);
c) Prodrugs and Targeted Delivery, editado por J. Rautio (Wiley, 2011);
d) A Textbook of Drug Design and Development, editado por Krogsgaard-Larsen;
e) Bundgaard, Capítulo 5 "Design and Application of Prodrugs", por H. Bundgaard, p. 113-191 (1991);
f) Bundgaard, Advanced Drug Delivery Reviews, 8:1-38 (1992);
g) Bundgaard, et al., Journal of Pharmaceutical Sciences, 77:285 (1988); y
h) Kakeya, et al., Chem. Pharm. Bull., 32:692 (1984).
Al igual que con otros compuestos descritos en el presente documento, los profármacos se pueden proporcionar en cualquiera de una variedad de formas, por ejemplo, formas cristalinas, formas de sal, etc. En algunas realizaciones, los profármacos se proporcionan como sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
Grupo protector: El término "grupo protector", como se usa en el presente documento, se conoce bien en la técnica e incluye aquellos descritos en detalle en Protecting Groups in Organic Synthesis, T. W. Greene y P. G. M. Wuts, 3a edición, John Wiley & Sons, 1999. También se incluyen los grupos protectores especialmente adaptados para la química de nucleósidos y nucleótidos descrita en Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, editado por Serge L. Beaucage et al. 06/2012, a la totalidad del Capítulo 2 se hace referencia en el presente documento. Los grupos protectores de amino adecuados incluyen metilcarbamato, etilcarbamanto, 9-fluorenilmetilcarbamato (Fmoc), 9-(2-sulfo)fluorenilmetilcarbamato, 9-(2,7-dibromo)fluoroenilmetilcarbamato, 2,7-di-f-butil-[9-(10, 10-dioxo-10,10,10,10-tetrahidrotioxanthil)]metilcarbamato (DBD-Tmoc), 4-metoxifenacilcarbamato (Fenoc), 2,2,2-tricloroetilcarbamato (Troc), 2-trimetilsililetilcarbamato (Teoc), 2-feniletilcarbamato (hZ), 1-(1-adamantil)-1-metiletilcarbamato (Adpoc), 1,1-dimetil-2-haloetilcarbamato, 1,1-dimetil-2,2-dibromoetilcarbamato (DB-f-BOC), 1,1-dimetil-2,2,2-tricloroetilcarbamato (TCBOC), 1 -metil-1 -(4-bifenilil)etilcarbamato (Bpoc), 1 -(3,5-di-f-butilfenil)-1 -metiletilcarbamato (f-Bumeoc), 2-(2'- y 4'-piridil)etilcarbamato (Pyoc), 2-(W,W-diciclohexilcarboxamido)etilcarbamato, f-butilcarbamato (BOC), 1-adamantilcarbamato (Adoc), vinilcarbamato (Voc), alilcarbamato (Alloc), 1-isopropilalilcarbamato (Ipaoc), cinamilcarbamato (Coc), 4-nitrocinamilcarbamato (Noc), 8-quinolilcarbamato, W-hidroxipiperidinilcarbamato, alquilditiocarbamato, bencilcarbamato (Cbz), p-metoxibencilcarbamato (Moz), p-nitrobencilcarbamato, pbromobencilcarbamato, p-clorobencilcarbamato, 2,4-diclorobencilcarbamato, 4-metilsulfinilbencilcarbamato (Msz), 9-antrilmetilcarbamato, difenilmetilcarbamato, 2-metiltioetilcarbamato, 2-metilsulfoniletilcarbamato, 2-(p-toluenosulfonil)etilcarbamato, [2-(1,3-ditianil)]metilcarbamato (Dmoc), 4-metiltiofenilcarbamato (Mtpc), 2,4-dimetiltiofenilcarbamato (Bmpc), 2-fosfonioetilcarbamato (Peoc), 2-trifenilfosfonioisopropilcarbamato (Ppoc), 1,1-dimetil-2-cianoetilcarbamato, m-cloro-p-aciloxibencilcarbamato, p-(dihidroxiboril)bencilcarbamato, 5-bencisoxazolilmetilcarbamato, 2-(trifluorometil)-6-cromonilmetilcarbamato (Tcroc), m-nitrofenilcarbamato, 3,5-dimetoxibencilcarbamato, o-nitrobencilcarbamato, 3,4-dimetoxi-6-nitrobencilcarbamato, fenil(onitrofenil)metilcarbamato, derivado de fenotiazinil-(10)-carbonilo, derivado de W-p-toluenosulfonilaminocarbonilo, derivado de W-fenilaminotiocarbonilo, f-amilcarbamato, S-benciltiocarbamato, p-cianobencilcarbamato, ciclobutilcarbamato, ciclohexilcarbamato, ciclopentilcarbamato, ciclopropilmetilcarbamato, p-deciloxibencilcarbamato, 2,2-dimetoxicarbonilvinilcarbamato, o-(W,W-dimetilcarboxamido)bencilcarbamato, 1,1-dimetil-3-(W,W-dimetilcarboxamido)propilcarbamato, 1,1-dimetilpropinilcarbamato, di(2-piridil)metilcarbamato, 2-furanilmetilcarbamato, 2-yodoetilcarbamato, isobornilcarbamato, isobutilcarbamato, isonicotinilcarbamato, p-(p'-metoxifenilazo)bencilcarbamato, 1 -metilciclobutilcarbamato, 1 -metilciclohexilcarbamato, 1 -metil-1 -ciclopropilmetilcarbamato, 1 -metil-1 -(3,5-dimetoxifenil)etilcarbamato, 1 -metil-1 -(p-fenilazofenil)etilcarbamato, 1 -metil-1- feniletilcarbamato, 1 -metil-1 -(4-piridil)etilcarbamato, fenilcarbamato, p-(fenilazo)bencilcarbamato, 2,4,6-tri-fbutilfenilcarbamato, 4-(trimetilamonio)bencilcarbamato, 2,4,6-trimetilbencilcarbamato, formamida, acetamida, cloroacetamida, tricloroacetamida, trifluoroacetamida, fenilacetamida, 3-fenilpropanamida, picolinamida, 3-piridilcarboxamida, derivado de W-benzoilfenilalanilo, benzamida, p-fenilbenzamida, o-nitrofenilacetamida, o-nitrofenoxiacetamida, acetoacetamida, (W-ditiobenciloxicarbonilamino)acetamida, 3-(p-hidroxifenil)propanamida, 3-(onitrofenil)propanamida, 2-metil-2-(o-nitrofenoxi)propanamida, 2-metil-2-(o-fenilazofenoxi)propanamida, 4-clorobutanamida, 3-metil-3-nitrobutanamida, o-nitrocinamida, derivado de W-acetilmetionina, o-nitrobenzamida, o-(benzoiloximetil)benzamida, 4,5-difenil-3-oxazolin-2-ona, W-ftalimida, W-ditiasuccinimida (Dts), W-2,3-difenilmaleimida, W-2,5-dimetilpirrol, aducto de W-1,1,4,4-tetrametildisililazaciclopentano (STABASE), 1,3-dimetil-1,3,5-triazaciclohexan-2- ona 5-sustituida, 1,3-dibencil-1,3,5-triazaciclohexan-2-ona 5-sustituida, 3,5-dinitro-4-piridona 1-sustituida, W-metilamina, W-alilamina, W-[2-(trimetilsilil)etoxi]metilamina (SEM), W-3-acetoxipropilamina, W-(1-isopropil-4-nitro-2-oxo-3- piroolin-3-il)amina, sales de amonio cuaternario, W-bencilamina, W-di(4-metoxifenil)metilamina, W-5-dibenzosuberilamina, W-trifenilmetilamina (Tr), W-[(4-metoxifenil)difenilmetil]amina (MMTr), W-9-fenilfluorenilamina (PhF), W-2,7-dicloro-9-fluorenilmetilenamina, W-ferrocenilmetilamino (Fcm), W-óxido de W-2-picolilamino, W-1,1-dimetiltiometilenamina, W-bencilidenamina, W-p-metoxibencilidenamina, W-difenilmetilenamina, W-[(2-piridil)mesitil]metilenamina, W-(W,W-dimetilaminometileno)amina, W,W-isopropilidendiamina, W-p-nitrobencilidenamina, W-salicilidenamina, W-5-clorosalicilidenamina, W-(5-cloro-2-hidroxifenil)fenilmetilenamina, W-ciclohexilidenamina, W-(5,5-dimetil-3-oxo-1-ciclohexenil)amina, derivado de W-borano, derivado de ácido W-difenilborínico, W-[fenil(pentacarbonilcromo- o tungsteno)carbonil]amina, quelato de W-cobre, quelato de W-cinc, W-nitroamina, W-nitrosoamina, W-óxido de amina, difenilfosfinamida (Dpp), dimetiltiofosfinamida (Mpt), difeniltiofosfinamida (Ppt), dialquilfosforamidatos, dibencilfosforamidato, difenilfosforamidato, bencenosulfenamida, onitrobencenosulfenamida (Nps), 2,4-dinitrobencenosulfenamida, pentaclorobencenosulfenamida, 2-nitro-4-metoxibencenosulfenamida, trifenilmetilsulfenamida, 3-nitropiridinasulfenamida (Npys), p-toluenosulfonamida (Ts), bencenosulfonamida, 2,3,6-trimetil-4-metoxibencenosulfonamida (Mtr), 2,4,6-trimetoxibencenosulfonamida (Mtb), 2,6-dimetil-4-metoxibencenosulfonamida (Pme), 2,3,5,6-tetrametil-4-metoxibencenosulfonamida (Mte), 4-metoxibencenosulfonamida (Mbs), 2,4,6-trimetilbencenosulfonamida (Mts), 2,6-dimetoxi-4-metilbencenosulfonamida (iMds), 2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonamida (Pmc), metanosulfonamida (Ms), p-trimetilsililetanosulfonamida (SES), 9-antracenosulfonamida, 4-(4',8'-dimetoxinaftilmetil)bencenosulfonamida (DNMBS), bencilsulfonamida, trifluorometilsulfonamida y fenacilsulfonamida.
Los ácidos carboxílicos adecuadamente protegidos adicionales incluyen, pero no se limitan a, ácidos carboxílicos protegidos con sililo, alquilo, alquenilo, arilo y arilalquilo. Los ejemplos de grupos sililo adecuados incluyen trimetilsililo, trietilsililo, t-butildimetilsililo, t-butildifenilsililo, triisopropilsililo y similares. Los ejemplos de grupos alquilo adecuados incluyen metilo, bencilo, p-metoxibencilo, 3,4-dimetoxibencilo, tritilo, t-butilo, tetrahidropiran-2-ilo. Los ejemplos de grupos alquenilo adecuados incluyen alilo. Los ejemplos de grupos arilo adecuados incluyen fenilo, bifenilo o naftilo opcionalmente sustituido. Los ejemplos de grupos arilalquilo adecuados incluyen bencilo opcionalmente sustituido (por ejemplo, p-metoxibencilo (MPM), 3,4-dimetoxibencilo, O-nitrobencilo, p-nitrobencilo, p-halobencilo, 2,6-diclorobencilo, p-cianobencilo) y 2- y 4-picolilo.
Los grupos protectores de hidroxilo adecuados incluyen metilo, metoxilmetilo (MOM), metiltiometilo (MTM), t-butiltiometilo, (fenildimetilsilil)metoximetilo (SMOM), benciloximetilo (BOM), p-metoxibenciloximetilo (PMBM), (4-metoxifenoxi)metilo (p-AOM), guaiacolmetilo (GUM), t-butoximetilo, 4-penteniloximetilo (POM), siloximetilo, 2-metoxietoximetilo (MEM), 2,2,2-tricloroetoximetilo, bis(2-cloroetoxi)metilo, 2-(trimetilsilil)etoximetilo (SEMOR), tetrahidropiranilo (THP), 3-bromotetrahidropiranilo, tetrahidrotiopiranilo, 1-metoxiciclohexilo, 4-metoxitetrahidropiranilo (MTHP), 4-metoxitetrahidrotiopiranilo, S,S-dióxido de 4-metoxitetrahidrotiopiranilo, 1-[(2-cloro-4-metil)fenil]-4-metoxipiperidin-4-ilo (CTMP), 1,4-dioxan-2-ilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidrotiofuranilo, 2,3,3a,4,5,6,7,7a-octahidro-7,8,8-trimetil-4,7-metanobenzofuran-2-ilo, 1-etoxietilo, 1-(2-cloroetoxi)etilo, 1-metil-1-metoxietilo, 1 -metil-1 -benciloxietilo, 1-metil-1-benciloxi-2-fluoroetilo, 2,2,2-tricloroetilo, 2-trimetilsililetilo, 2-(fenilselenil)etilo, t-butilo, alilo, pclorofenilo, p-metoxifenilo, 2,4-dinitrofenilo, bencilo, p-metoxibencilo, 3,4-dimetoxibencilo, o-nitrobencilo, pnitrobencilo, p-halobencilo, 2,6-diclorobencilo, p-cianobencilo, p-fenilbencilo, 2-picolilo, 4-picolilo, W-oxido de 3-metil-2-picolilo, difenilmetilo, p,p'-dinitrobenzhidrilo, 5-dibenzosuberilo, trifenilmetilo, a-naftildifenilmetilo, pmetoxifenildifenilmetilo, di(p-metoxifenil)fenilmetilo, tri(p-metoxifenil)metilo, 4-(4'-bromofenaciloxifenil)difenilmetilo, 4,4',4"-tris(4,5-dicloroftalimidofenil)metilo, 4,4',4"-tris(levulinoiloxifenil)metilo, 4,4',4"-tris(benzoiloxifenil)metilo, 3-(imidazol-1 -il)bis(4',4"-dimetoxifenil)metilo, 1, 1 -bis(4-metoxifenil)-1 '-pirenilmetilo, 9-antrilo, 9-(9-fenil)xantenilo, 9-(9-fenil-10-oxo)antrilo, 1,3-benzoditiolan-2-ilo, S,S-dioxido de bencisotiazolilo, trimetilsililo (TMS), trietilsililo (TES), triisopropilsililo (TIPS), dimetilisopropilsililo (IPDMS), dietilisopropilsililo (DEIPS), dimetilthexilsililo, t-butildimetilsililo (TBDMS), t-butildifenilsililo (t Bd Ps ), tribencilsililo, tri-p-xililsililo, trifenilsililo, difenilmetilsililo (DPMS), tbutilmetoxifenilsililo (TBMPS), formiato, benzoilformiato, acetato, cloroacetato, dicloroacetato, tricloroacetato, trifluoroacetato, metoxiacetato, trifenilmetoxiacetato, fenoxiacetato, p-clorofenoxiacetato, 3-fenilpropionato, 4-oxopentanoato (levulinato), 4,4-(etilenoditio)pentanoato (levulinoilditioacetal), pivaloato, adamantoato, crotonato, 4-metoxicrotonato, benzoato, p-fenilbenzoato, 2,4,6-trimetilbenzoato (mesitoato), carbonato de alquilmetilo, 9-fluorenilmetilcarbonato (Fmoc), carbonato de alquiletilo, carbonato de alquil-2,2,2-tricloroetilo (Troc), 2-(trimetilsilil)etilcarbonato (TMSEC), 2-(fenilsulfonil)etilcarbonato (Psec), 2-(trifenilfosfonio)etilcarbonato (Peoc), alquilisobutilcarbonato, alquilvinilcarbonato alquilalilcarbonato, alquil-p-nitrofenilcarbonato, alquilbencilcarbonato, alquil-p-metoxibencilcarbonato, alquil-3,4-dimetoxibencilcarbonato, alquil-o-nitrobencilcarbonato, alquil-pnitrobencilcarbonato, alquil-S-benciltiocarbonato, 4-etoxi-1-naftilcarbonato, metilditiocarbonato, 2-yodobenzoato, 4-azidobutirato, 4-nitro-4-metilpentanoato, o-(dibromometil)benzoato, 2-formilbencenosulfonato, 2-(metiltiometoxi)etilo, 4-(metiltiometoxi)butirato, 2-(metiltiometoximetil)benzoato, 2,6-dicloro-4-metilfenoxiacetato, 2,6-dicloro-4-(1,1,3,3-tetrametilbutil)fenoxiacetato, 2,4-bis(1,1-dimetilpropil)fenoxiacetato, clorodifenilacetato, isobutirato, monosuccinoato, (£)-2-metil-2-butenoato, o-(metoxicarbonil)benzoato, a-naftoato, nitrato, W,W,W,W-tetrametilfosforodiamidato de alquilo, W-fenilcarbamato de alquilo, borato, dimetilfosfinotioílo, 2,4-dinitrofenilsulfenato de alquilo, sulfato, metanosulfonato (mesilato), bencilsulfonato y tosilato (Ts). Para proteger 1,2- o 1,3-dioles, los grupos protectores incluyen metilenacetal, etilidenacetal, 1 -t-butiletilidencetal, 1 -feniletilidencetal, (4-metoxifenil)etilidenacetal, 2,2,2-tricloroetilidenacetal, acetónido, ciclopentilidencetal, ciclohexilidencetal, cicloheptilidencetal, bencilidenacetal, p-metoxibencilidenacetal, 2,4-dimetoxibencilidencetal, 3,4-dimetoxibencilidenacetal, 2-nitrobencilidenacetal, metoximetilenacetal, etoximetilenacetal, orto-éster de dimetoximetileno, orto-éster de 1-metoxietilideno, orto-éster de 1-etoxietilidina, orto-éster de 1,2-dimetoxietilideno, orto-éster de a-metoxibencilideno, derivado de 1-(W,W-dimetilamino)etilideno, derivado de a-(W,W-dimetilamino)bencilideno, orto-éster de 2-oxaciclopentilideno, grupo di-tbutilsilileno (DTBS), derivado de 1,3-(1,1,3,3-tetraisopropildisiloxanilideno) (TIPDS), derivado de tetra-tbutoxidisiloxano-1,3-diilideno (TBDS), carbonatos cíclicos, boronatos cíclicos, etilboronato y fenilboronato.
En algunas realizaciones, un grupo protector de hidroxilo es acetilo, t-butilo, t-butoximetilo, metoximetilo, tetrahidropiranilo, 1-etoxietilo, 1-(2-cloroetoxi)etilo, 2-trimetilsililetilo, p-clorofenilo, 2,4-dinitrofenilo, bencilo, benzoílo, p-fenilbenzoílo, 2,6-diclorobencilo, difenilmetilo, p-nitrobencilo, trifenilmetilo (tritilo), 4,4'-dimetoxitritilo, trimetilsililo, trietilsililo, t-butildimetilsililo, t-butildifenilsililo, trifenilsililo, triisopropilsililo, benzoilformiato, cloroacetilo, tricloroacetilo, trifiuoroacetilo, pivaloílo, 9-fluorenilmetilcarbonato, mesilato, tosilato, triflato, tritilo, monometoxitritilo (MMTr), 4,4'-dimetoxitritilo, (DMTr) y 4,4',4"-trimetoxitritilo (TMTr), 2-cianoetilo (CE o Cne), 2-(trimetilsilil)etilo (TSE), 2-(2-nitrofenil)etilo, 2-(4-cianofenil)etil 2-(4-nitrofenil)etilo (NPE), 2-(4-nitrofenilsulfonil)etilo, 3,5-diclorofenilo, 2,4-dimetilfenilo, 2-nitrofenilo, 4-nitrofenilo, 2,4,6-trimetilfenilo, 2-(2-nitrofenil)etilo, butiltiocarbonilo, 4,4',4"-tris(benzoiloxi)tritilo, difenilcarbamoílo, levulinilo, 2-(dibromometil)benzoílo (Dbmb), 2-(isopropiltiometoximetil)benzoílo (Ptmt), 9-fenilxanten-9-ilo (Pixyl) o 9-(p-metoxifenil)xantina-9-ilo (MOX). En algunas realizaciones, cada uno de los grupos protectores de hidroxilo se selecciona independientemente de acetilo, bencilo, t- butildimetilsililo, tbutildifenilsililo y 4,4'-dimetoxitritilo. En algunas realizaciones, el grupo protector de hidroxilo se selecciona del grupo que consiste en grupo tritilo, monometoxitritilo y 4,4'-dimetoxitritilo.
En algunas realizaciones, un grupo protector de fósforo es un grupo unido al enlace internucleotídico de fósforo durante toda la síntesis de oligonucleótidos. En algunas realizaciones, el grupo protector de fósforo se une al átomo de azufre del enlace internucleotídico fosforotioato. En algunas realizaciones, el grupo protector de fósforo se une al átomo de oxígeno del enlace internucleotídico fosforotioato. En algunas realizaciones, el grupo protector de fósforo se une al átomo de oxígeno del enlace fosfato internucleotídico. En algunas realizaciones, el grupo protector de fósforo es 2-cianoetilo (CE o Cne), 2-trimetilsililetilo, 2-nitroetilo, 2-sulfoniletilo, metilo, bencilo, o-nitrobencilo, 2-(p-nitrofenil)etilo (NPE o Npe), 2-feniletilo, 3-(W-terc-butilcarboxamido)-1-propilo, 4-oxopentilo, 4-metiltio-1 -butilo, 2-ciano-1,1-dimetiletilo, 4-W-metilaminobutilo, 3-(2-piridil)-1 -propilo, 2-[W-metil-W-(2-piridil)]aminoetilo, 2-(W-formilo,W-metil)aminoetilo, 4-[W-metil-W-(2,2,2-trifluoroacetil)amino]butilo.
Proteína: Como se usa en el presente documento, el término "proteína" se refiere a un polipéptido (es decir, una tira de al menos dos aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos). En algunas realizaciones, las proteínas incluyen solo aminoácidos naturales. En algunas realizaciones, las proteínas incluyen uno o más aminoácidos que no existen de forma natural (por ejemplo, restos que forman uno o más enlaces peptídicos con aminoácidos adyacentes). En algunas realizaciones, uno o más restos en una cadena de proteína contienen un resto no de aminoácido (por ejemplo, un glicano, etc.). En algunas realizaciones, una proteína incluye más de una cadena de polipéptidos, por ejemplo unida por uno o más enlaces disulfuro o asociada por otros medios. En algunas realizaciones, las proteínas contienen L-aminoácidos, D-aminoácidos, o ambos; en algunas realizaciones, las proteínas contienen una o más modificaciones de aminoácidos o análogos conocidos en la técnica. Las modificaciones útiles incluyen, por ejemplo, acetilación terminal, amidación, metilación, etc. El término "péptido" se usa, en general, para referirse a un polipéptido que tiene una longitud de menos de aproximadamente 100 aminoácidos, menos de aproximadamente 50 aminoácidos, menos de 20 aminoácidos, o menos de 10 aminoácidos. En algunas realizaciones, las proteínas son anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, porciones biológicamente activas de los mismos, y/o porciones características de los mismos.
Muestra: Como se usa en el presente documento, el término "muestra" se refiere a una muestra biológica obtenida o derivada de una fuente de interés, como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, una fuente de interés comprende un organismo, tal como un animal o humano. En algunas realizaciones, una muestra biológica comprende tejido o líquido biológico. En algunas realizaciones, una muestra biológica es o comprende médula ósea; sangre; glóbulos sanguíneos; ascitis; muestras de biopsia de tejido o con aguja fina; líquidos corporales que contienen células; ácidos nucleicos de flotación libre; esputo; saliva; orina; líquido cefalorraquídeo, líquido peritoneal; líquido pleural; heces; linfa; líquidos ginecológicos; hisopos cutáneos; frotis vaginales; hisopos orales; hisopos nasales; enjuagues o lavados, tales como lavados ductales o lavados broncoalveolares; aspirados; raspados; especímenes de médula ósea; biopsia de especímenes de tejido; especímenes quirúrgicos; heces, otros líquidos corporales, secreciones y/o excreciones; y/o células de los mismos, etc. En algunas realizaciones, una muestra biológica es o comprende células obtenidas de un individuo. En algunas realizaciones, una muestra es una "muestra primaria" obtenida directamente de una fuente de interés por cualquier medio apropiado. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una muestra biológica primaria se obtiene por métodos seleccionados del grupo que consiste en biopsia (por ejemplo, aspiración con aguja fina o biopsia de tejido), cirugía, recogida de líquido corporal (por ejemplo, sangre, linfa, heces, etc.), etc. En algunas realizaciones, como será evidente del contexto, el término "muestra" se refiere a un preparado que se obtiene por procesamiento (por ejemplo, retirando uno o más componentes de y/o añadiendo uno o más agentes a) de una muestra primaria. Por ejemplo, el filtrado usando una membrana semipermeable. Dicha "muestra procesada" puede comprender, por ejemplo, ácidos nucleicos o proteínas extraídas de una muestra u obtenidas sometiendo una muestra primaria a técnicas tales como amplificación o transcripción inversa de ARNm, aislamiento y/o purificación de ciertos componentes, etc.
Formas estereoquímicamente isoméricas: La expresión "formas estereoquímicamente isoméricas", como se usa en el presente documento, se refiere a diferentes compuestos constituidos por los mismos átomos unidos por la misma secuencia de enlaces, pero que tienen diferentes estructuras tridimensionales que no son intercambiables. En algunas realizaciones del método inventivo, las composiciones químicas proporcionadas pueden ser o incluir preparados puros de formas estereoquímicamente isoméricas individuales de un compuesto; en algunas realizaciones, las composiciones químicas proporcionadas pueden ser o incluir mezclas de dos o más formas estereoquímicamente isoméricas del compuesto. En ciertas realizaciones, dichas mezclas contienen cantidades iguales de diferentes formas estereoquímicamente isoméricas; en ciertas realizaciones, dichas mezclas contienen diferentes cantidades de al menos dos formas estereoquímicamente isoméricas diferentes. En algunas realizaciones, una composición química puede contener todos los diastereómeros y/o enantiómeros del compuesto. En algunas realizaciones, una composición química puede contener menos de todos los diastereómeros y/o enantiómeros de un compuesto. En algunas realizaciones, si se desea un enantiómero particular de un compuesto, se puede preparar, por ejemplo, según el presente método inventivo, por síntesis asimétrica, o por derivación con un auxiliar quiral, donde la mezcla diastereomérica resultante se separa y se escinde del grupo auxiliar para proporcionar los enantiómeros deseados puros. Alternativamente, donde la molécula contenga un grupo funcional básico, tal como amino, se forman sales diastereomérica con un ácido ópticamente activo apropiado, y se resuelven, por ejemplo, mediante cristalización fraccionada.
Sujeto: Como se usa en el presente documento, el término "sujeto" o "sujeto de prueba" se refiere a cualquier organismo al que se administra un compuesto proporcionado o composición según la presente divulgación, por ejemplo, para fines experimentales, de diagnóstico, profilácticos y/o terapéuticos. Los sujetos típicos incluyen animales (por ejemplo, mamíferos, tales como ratones, ratas, conejos, primates no humanos y seres humanos; insectos; gusanos; etc.) y plantas. En algunas realizaciones, un sujeto pueden padecer, y/o ser susceptible, a una enfermedad, trastorno y/o afección.
Sustancialmente: Como se usa en el presente documento, el término "sustancialmente" se refiere a la afección cualitativa de presentar una extensión o grado total o casi total de una característica o propiedad de interés. Un experto en las técnicas biológicas entenderá que los fenómenos biológicos y químicos raramente, si alguna vez, llegan a completarse y/o proceden a la exhaustividad o logran o evitan un resultado absoluto. El término "sustancialmente" se usa, por tanto, en el presente documento para capturar la posible ausencia de exhaustividad inherente en muchos fenómenos biológicos y/o químicos.
Que padece: Un individuo "que padece" una enfermedad, trastorno y/o afección ha sido diagnosticado con y/o muestra uno o más síntomas de una enfermedad, trastorno y/o afección.
Susceptible a: Un individuo que es "susceptible a" una enfermedad, trastorno y/o afección es uno que tiene un mayor riesgo de desarrollar la enfermedad, trastorno y/o afección que un miembro del público general. En algunas realizaciones, un individuo que es susceptible a una enfermedad, trastorno y/o afección puede no haber sido diagnosticado con la enfermedad, trastorno y/o afección. En algunas realizaciones, un individuo que es susceptible a una enfermedad, trastorno, y/o afección puede presentar síntomas de la enfermedad, trastorno y/o afección. En algunas realizaciones, un individuo que es susceptible a una enfermedad, trastorno y/o afección puede no presentar síntomas de la enfermedad, trastorno, y/o afección. En algunas realizaciones, un individuo que es susceptible a una enfermedad, trastorno y/o afección desarrollará la enfermedad, trastorno y/o afección. En algunas realizaciones, un individuo que es susceptible a una enfermedad, trastorno y/o afección no desarrollará la enfermedad, trastorno y/o afección.
Sistémico: Las expresiones "administración sistémica", "administrado por vía sistémica", "administración periférica" y "administrado periféricamente", como se usa en el presente documento, tienen su significado entendido en la técnica con referencia a la administración de un compuesto o composición de forma que entre en el sistema del receptor.
Formas tautómeras: La expresión "formas tautómeras", como se usa en el presente documento, se usa para describir diferentes formas isoméricas de compuestos orgánicos que son capaces de una simple interconversión. Los tautómeros se pueden caracterizar por la migración formal de un átomo de hidrógeno o protón, acompañada por un cambio de un enlace sencillo y doble enlace adyacente. En algunas realizaciones, los tautómeros pueden resultar de tautomería prototrópica (es decir, la relocalización de un protón). En algunas realizaciones, los tautómeros pueden resultar de tautomería de valencia (es decir, la rápida reorganización de electrones de enlace). Todas esas formas tautómeras pretenden estar incluidas dentro del alcance del presente método inventivo. En algunas realizaciones, las formas tautómeras de un compuesto existen en equilibrio móvil entre sí, de manera que los intentos por preparar las sustancias separadas dan como resultado la formación de una mezcla. En algunas realizaciones, las formas tautómeras de un compuesto son compuestos separables y aislables. En algunas realizaciones del método inventivo, se pueden proporcionar composiciones químicas que son o incluyen preparados puros de una única forma tautómera de un compuesto. En algunas realizaciones del método inventivo, las composiciones químicas se pueden proporcionar como mezclas de dos o más formas tautómeras de un compuesto. En ciertas realizaciones, dichas mezclas contienen cantidades iguales de diferentes formas tautómeras; en ciertas realizaciones, dichas mezclas contienen diferentes cantidades de al menos dos formas tautómeras diferentes de un compuesto. En algunas realizaciones del método inventivo, las composiciones químicas pueden contener todas las formas tautómeras de un compuesto. En algunas realizaciones del método inventivo, las composiciones químicas pueden contener menos de todas las formas tautómeras de un compuesto. En algunas realizaciones del método inventivo, las composiciones químicas pueden contener una o más formas tautómeras de un compuesto en cantidades que varían con el tiempo como resultado de la interconversión. En algunas realizaciones del método inventivo, la tautomería es tautomería ceto-enol. Un experto en las técnicas químicas reconocería que un tautómero ceto-enol puede quedar "atrapado" (es decir, químicamente modificado de forma que quede en la forma "enol") usando cualquier reactivo adecuado conocido en las técnicas químicas para proporcionar un derivado de enol que se puede aislar posteriormente usando una o más técnicas adecuadas conocidas en la técnica. A menos que se indique lo contrario, el presente método inventivo engloba todas las formas tautómeras de los compuestos relevantes, tanto en forma pura como en mezcla entre sí.
Agente terapéutico: Como se usa en el presente documento, la expresión "agente terapéutico" se refiere a cualquier agente que, cuando se administra a un sujeto, tiene un efecto terapéutico y/o provoca un efecto biológico y/o farmacológico deseado. En algunas realizaciones, un agente terapéutico es cualquier sustancia que se puede usar para aliviar, mejorar, remediar, inhibir, prevenir, retrasar la aparición de, reducir la intensidad de y/o reducir la incidencia de uno o más síntomas o características de una enfermedad, trastorno y/o afección.
Cantidad terapéuticamente eficaz: Como se usa en el presente documento, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad de una sustancia (por ejemplo, un agente terapéutico, composición y/o formulación) que provoca una respuesta biológica deseada cuando se administra como parte de una pauta terapéutica. En algunas realizaciones, una cantidad terapéuticamente eficaz de una sustancia es una cantidad que es suficiente, cuando se administra a un sujeto que padece o susceptible a una enfermedad, trastorno y/o afección, para tratar, diagnosticar, prevenir y/o retrasar la aparición de la enfermedad, trastorno y/o afección. Como será apreciado por aquellos expertos habituales en esta técnica, la cantidad eficaz de una sustancia puede variar dependiendo de factores tales como el criterio de valoración biológico deseado, la sustancia a administrar, la célula o el tejido diana, etc. Por ejemplo, la cantidad eficaz de un compuesto en una formulación para tratar una enfermedad, trastorno y/o afección es la cantidad que alivia, mejora, remedia, inhibe, previene, retrasa la aparición de, reduce la intensidad de y/o reduce la incidencia de uno o más síntomas o características de la enfermedad, trastorno y/o afección. En algunas realizaciones, una cantidad terapéuticamente eficaz se administra en una dosis única; en algunas realizaciones, se requieren múltiples dosis unitarias para administrar una cantidad terapéuticamente eficaz.
Tratar: Como se usa en el presente documento, el término "tratar", "tratamiento" o "que trata" se refiere a cualquier método usado para aliviar parcial o completamente, mejorar, remediar, inhibir, prevenir, retrasar la aparición de, reducir la intensidad de y/o reducir la incidencia de uno o más síntomas o características de una enfermedad, trastorno y/o afección. El tratamiento se puede administrar a un sujeto que no presenta signos de una enfermedad, trastorno y/o afección. En algunas realizaciones, el tratamiento se puede administrar a un sujeto que presenta solo los primeros signos de la enfermedad, trastorno y/o afección, por ejemplo, con el fin de disminuir el riesgo de desarrollar una patología asociada con la enfermedad, trastorno y/o afección.
Insaturado: El término "insaturado", como se usa en el presente documento, significa que un resto tiene una o más unidades de insaturación.
Dosis unitaria: La expresión "dosis unitaria", como se usa en el presente documento, se refiere a una cantidad administrada como una dosis única y/o en una unidad físicamente discreta de una composición farmacéutica. En muchas realizaciones, una dosis unitaria contiene una cantidad predeterminada de un agente activo. En algunas realizaciones, una dosis unitaria contiene una dosis única completa del agente. En algunas realizaciones, se administra más de una dosis unitaria para lograr una dosis única total. En algunas realizaciones, se requiere la administración de múltiples dosis unitarias, o se espera que se requiera, para lograr un efecto previsto. Una dosis unitaria puede ser, por ejemplo, un volumen de líquido (por ejemplo, un vehículo aceptable) que contiene una cantidad predeterminada de uno o más agentes terapéuticos, una cantidad predeterminada de uno o más agentes terapéuticos en forma sólida, una formulación de liberación sostenida, o dispositivo de administración de fármaco que contiene una cantidad predeterminada de uno o más agentes terapéuticos, etc. Se apreciará que una dosis unitaria puede estar presente en una formulación que incluye cualquiera de una variedad de componentes, además del (de los) agente(s) terapéutico(s). Por ejemplo, se pueden incluir vehículos aceptables (por ejemplo, vehículos farmacéuticamente aceptables), diluyentes, estabilizadores, tampones, conservantes, etc., como se describe más adelante. Se apreciará por los expertos en la técnica, en muchas realizaciones, que una dosis diaria apropiada total de un agente terapéutico particular puede comprender una porción, o una pluralidad, de dosis unitarias, y puede ser decidida, por ejemplo, por el médico adjunto dentro del alcance del criterio médico sensato. En algunas realizaciones, el nivel de dosis eficaz específica para cualquier sujeto particular u organismo puede depender de una variedad de factores que incluyen el trastorno que está tratándose y la intensidad del trastorno; la actividad del compuesto activo específico empleado; la composición específica empleada; la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo y la dieta del sujeto; el tiempo de administración y la velocidad de eliminación del compuesto activo específico empleado; la duración del tratamiento; los fármacos y/o terapias adicionales usados en combinación o coincidentes con el (los) compuesto(s) específico(s) empleado(s), y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas.
Natural: Como se usa en el presente documento, el término "natural" tiene su significado entendido en la técnica, que se refiere a una entidad que tiene una estructura y/o actividad como se encuentra en la naturaleza en un estado o contexto "normal" (en contraste con mutante, enfermo, alterado, etc.). Los expertos habituales en la técnica apreciarán que los genes y polipéptidos naturales existen frecuentemente en múltiples formas diferentes (por ejemplo, alelos).
Ácido nucleico: El término "ácido nucleico" incluye cualquier nucleótido, análogos de los mismos y polímeros de los mismos. El término "polinucleótido", como se usa en el presente documento, se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sea ribonucleótidos (ARN) o desoxirribonucleótidos (ADN). Estos términos se refieren a la estructura primaria de las moléculas y, por lo tanto, incluyen ADN bi- y monocatenario, y ARN bi- y monocatenario. Estos términos incluyen, como equivalentes, análogos de cualquiera de ARN o ADN preparados a partir de análogos de nucleótidos y polinucleótidos modificados, tales como, aunque no se limitan a, nucleótidos o polinucleótidos metilados, protegidos y/o tapados. Los términos engloban poli- u oligo-ribonucleótidos (ARN) y poli- u oligo-desoxirribonucleótidos (ADN); ARN o ADN derivado de N-glucósidos o C-glucósidos de nucleobases y/o nucleobases modificadas; ácidos nucleicos derivados de azúcares y/o azúcares modificados; y ácidos nucleicos derivados de puentes de fosfato y/o puentes de átomos de fósforo modificados (también denominados en el presente documento "enlaces internucleotídicos"). El término engloba ácidos nucleicos que contienen cualquier combinación de nucleobases, nucleobases modificadas, azúcares, azúcares modificados, puentes de fosfato o puentes de átomos de fósforo modificados. Los ejemplos incluyen, y no se limitan a, ácidos nucleicos que contienen restos de ribosa, los ácidos nucleicos que contienen restos de desoxi-ribosa, ácidos nucleicos que contienen tanto restos de ribosa como de desoxirribosa, ácidos nucleicos que contienen restos de ribosa y ribosa modificada. El prefijo poli- se refiere a un ácido nucleico que contiene 2 a aproximadamente 10.000 unidades de monómeros de nucleótidos y en donde el prefijo oligo- se refiere a un ácido nucleico que contiene 2 a aproximadamente 200 unidades de monómeros de nucleótidos.
Nucleótido: El término "nucleótido", como se usa en el presente documento, se refiere a una unidad monomérica de un polinucleótido que consiste en una base heterocíclica, un azúcar y uno o más grupos fosfato o enlaces internucleotídicos que contienen fósforo. La bases naturales (guanina (G), adenina (A), citosina (C), timina (T) y uracilo (U)) son derivados de purina o pirimidina, aunque se debe entender que también están incluidos análogos de bases naturales y que no existen de forma natural. El azúcar natural es la desoxirribosa pentosa (azúcar de cinco carbonos) (que forma ADN) o ribosa (que forma ARN), aunque se debe entender que también están incluidos análogos de azúcares naturales y que no existen de forma natural. Los nucleótidos se unen por enlaces internucleotídicos para formar ácidos nucleicos, o polinucleótidos. Se conocen en la técnica muchos enlaces internucleotídicos (tales como, aunque no se limita a, fosfato, fosforotioatos, boranofosfatos y similares). Los ácidos nucleicos artificiales incluyen PNA (ácidos nucleicos peptídicos), fosfotriésteres, fosforotionatos, H-fosfonatos, fosforamidatos, boranofosfatos, metilfosfonatos, fosfonoacetatos, tiofosfonoacetatos y otras variantes del esqueleto de fosfato de ácidos nucleicos nativos, tales como los descritos en el presente documento.
Nucleósido: El término "nucleósido" se refiere a un resto en donde una nucleobase o una nucleobase modificada se une covalentemente a un azúcar o azúcar modificado.
Azúcar: El término "azúcar" se refiere a un monosacárido en forma cerrada y/u abierta. Los azúcares incluyen, pero no se limitan a, restos de ribosa, desoxirribosa, pentofuranosa, pentopiranosa y hexopiranosa. Como se usa en el presente documento, el término también engloba análogos estructurales usados en lugar de moléculas de azúcar convencional, tales como glicol, cuyo polímero forma el esqueleto del análogo de ácido nucleico, el ácido nucleico de glicol ("GNA").
Azúcar modificado: El término "azúcar modificado" se refiere a un resto que puede sustituir a un azúcar. El azúcar modificado imita la disposición espacial, las propiedades electrónicas, o alguna otra propiedad fisicoquímica de un azúcar.
Nucleobase: El término "nucleobase" se refiere a las partes de los ácidos nucleicos que participan en la unión al hidrógeno que une una cadena de ácido nucleico con otra cadena complementaria en un modo específico de secuencia. Las nucleobases naturales más comunes son adenina (A), guanina (G), uracilo (U), citosina (C) y timina (T). En algunas realizaciones, las nucleobases naturales son adenina, guanina, uracilo, citosina o timina modificado. En algunas realizaciones, las nucleobases naturales son adenina, guanina, uracilo, citosina o timina metilado. En algunas realizaciones, una nucleobase es una "nucleobase modificada", por ejemplo, una nucleobase distinta de adenina (A), guanina (G), uracilo (U), citosina (C) y timina (T). En algunas realizaciones, las nucleobases modificadas son adenina, guanina, uracilo, citosina o timina metilados. En algunas realizaciones, la nucleobase modificada imita la disposición espacial, las propiedades electrónicas, o alguna otra propiedad fisicoquímica de la nucleobase y retiene la propiedad de unión al hidrógeno que une una cadena de ácido nucleico con otra en un modo específico de secuencia. En algunas realizaciones, una nucleobase modificada puede emparejarse con todas las cinco bases naturales (uracilo, timina, adenina, citosina o guanina) sin afectar sustancialmente el comportamiento de fusión, el reconocimiento por enzimas intracelulares o la actividad del dúplex de oligonucleótido.
Ligando quiral: El término "ligando quiral" o "auxiliar quiral" se refiere a un resto que es quiral y se puede incorporar en una reacción de manera que la reacción se pueda llevar a cabo con cierta estereoselectividad.
Reactivo de condensación: En una reacción de condensación, el término "reactivo de condensación" se refiere a un reactivo que activa un sitio menos reactivo y hace que sea más susceptible al ataque por otro reactivo. En algunas realizaciones, dicho otro reactivo es un nucleófilo.
Grupo de bloqueo: El término "grupo de bloqueo" se refiere a un grupo que enmascara la reactividad de un grupo funcional. El grupo funcional puede ser posteriormente desenmascarado por retirada del grupo de bloqueo. En algunas realizaciones, un grupo de bloqueo es un grupo protector.
Resto: El término "resto" se refiere a un segmento o grupo funcional específico de una molécula. Los restos químicos son entidades químicas frecuentemente reconocidas incorporadas o unidas a una molécula.
Soporte sólido: El término "soporte sólido" se refiere a cualquier soporte que permita la síntesis de ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, el término se refiere a un vidrio o a un polímero, que es insoluble en el medio empleado en las etapas de reacción realizadas para sintetizar los ácidos nucleicos, y se derivatiza para comprender grupos reactivos. En algunas realizaciones, el soporte sólido es poliestireno altamente reticulado (HCP) o vidrio de poro controlado (CPG). En algunas realizaciones, el soporte sólido es vidrio de poro controlado (CPG). En algunas realizaciones, el soporte sólido es un soporte híbrido de vidrio de poro controlado (CPG) y poliestireno altamente reticulado (HCP).
Resto de unión: El término "resto de unión" se refiere a cualquier resto opcionalmente situado entre el nucleósido terminal y el sólido soporte o entre el nucleósido terminal y otro nucleósido, nucleótido o ácido nucleico.
Molécula de ADN: Una "molécula de ADN" se refiere a la forma polimérica de desoxirribonucleótidos (adenina, guanina, timina o citosina) en o su forma monocatenaria o una hélice bicatenaria. Este término se refiere solo a la estructura primaria y secundaria de la molécula, y no se limita a ninguna forma terciaria particular. Por lo tanto, este término incluye ADN bicatenario encontrado, entre otras cosas, en moléculas de ADN lineal (por ejemplo, fragmentos de restricción), virus, plásmidos y cromosomas. En el tratamiento de la estructura de moléculas de ADN bicatenario particulares, se pueden describir secuencias en el presente documento según la convención normal de dar solo la secuencia en la dirección de 5' a 3' a lo largo de la cadena no transcrita de ADN (es decir, la cadena que tiene una secuencia homóloga al ARNm).
Secuencia codificante: Una "secuencia codificante" o "región codificante" de ADN es una secuencia de ADN bicatenario que se transcribe y traduce en un polipéptido in vivo cuando se pone bajo el control de secuencias de control de la expresión apropiadas. Los límites de la secuencia codificante (el "marco de lectura abierto" o "ORF") se determinan por un codón de iniciación en el extremo 5' (amino) y un codón de terminación de la traducción en el extremo 3' (carboxilo). Una secuencia codificante puede incluir, pero no se limita a, secuencias procariotas, ADNc de ARNm eucariota, secuencias de ADN genómico de ADN eucariota (por ejemplo, de mamífero) y secuencias de ADN sintético. Una señal de poliadenilación y secuencia de terminación de la transcripción se localiza, normalmente, 3' con respecto a la secuencia codificante. El término "secuencia no codificante" o "región no codificante" se refiere a regiones de una secuencia de polinucleótidos que no se traducen en aminoácidos (por ejemplo, regiones no traducidas 5' y 3').
Marco de lectura: El término "marco de lectura" se refiere a uno de los seis posibles marcos de lectura, tres en cada dirección, de la molécula de ADN bicatenario. El marco de lectura que se usa determina qué codones se usan para codificar los aminoácidos dentro de la secuencia codificante de una molécula de ADN.
Antisentido: Como se usa en el presente documento, una molécula de ácido nucleico "antisentido" comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a un ácido nucleico "sentido" que codifica una proteína, por ejemplo, complementaria a la cadena codificante de una molécula de ADNc bicatenario, complementaria a una secuencia de ARNm o complementaria a la cadena codificante de un gen. Por consiguiente, una molécula de ácido nucleico antisentido se puede asociar por enlaces de hidrógeno con una molécula de ácido nucleico sentido.
Posición de titubeo: Como se usa en el presente documento, una "posición de titubeo" se refiere a la tercera posición de un codón. Las mutaciones en una molécula de ADN dentro de la posición de titubeo de un codón, en algunas realizaciones, dan como resultado mutaciones silenciosas o conservativas al nivel de aminoácido. Por ejemplo, hay cuatro codones que codifican glicina, es decir, GGU, GGC, GGA y GGG, así la mutación de cualquier nucleótido en la posición de titubeo, con respecto a cualquier otro nucleótido seleccionado de A, U, C y G, no produce un cambio al nivel de aminoácido de la proteína codificada y, por lo tanto, es una sustitución silenciosa.
Sustitución silenciosa: Una "sustitución silenciosa" o "mutación silenciosa" es una en la que un nucleótido dentro de un codón se modifica, pero no produce un cambio en el resto de aminoácido codificado por el codón. Los ejemplos incluyen mutaciones en la tercera posición de un codón, además de en la primera posición de ciertos codones, tales como en el codón "CGG" que, cuando se muta a AGG, todavía codifica Arg.
Gen: Los términos "gen", "gen recombinante" y "construcción génica", como se usan en el presente documento, se refieren a una molécula de ADN, o porción de una molécula de ADN, que codifica una proteína o una porción de la misma. La molécula de ADN puede contener un marco de lectura abierto que codifica la proteína (como secuencias de exón) y puede incluir además secuencias de intrón. El término "intrón", como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de ADN presente en un gen dado que no se traduce en proteína y se encuentra en algunos, pero no todos los casos, entre los exones. Puede ser conveniente que el gen esté unido operativamente a (o pueda comprender), uno o más promotores, potenciadores, represores y/u otras secuencias reguladoras para modular la actividad o expresión del gen, como se conoce bien en la técnica.
ADN complementario: Como se usa en el presente documento, un "ADN complementario" o "ADNc" incluye polinucleótidos recombinantes sintetizados por retrotranscripción de ARNm y de los que se han eliminado secuencias intercaladas (intrones).
Homología: "Homología" o "identidad" o "similitud" se refiere a la similitud de secuencias entre dos moléculas de ácidos nucleicos. La homología e identidad se pueden determinar cada una comparando una posición en cada secuencia que se puede alinear para los fines de comparación. Cuando una posición equivalente en las secuencias comparadas está ocupada por la misma base, entonces las moléculas son idénticas en esa posición; cuando el sitio equivalente está ocupado por el mismo resto de ácido nucleico o uno similar (por ejemplo, similar en naturaleza estérica y/o electrónica), entonces las moléculas se pueden denominar homólogas (similares) en esa posición. La expresión como un porcentaje de homología/similitud o identidad se refiere a una función del número de ácidos nucleicos idénticos o similares en las posiciones compartidas por las secuencias comparadas. Una secuencia que está "sin relacionar" o es "no homóloga" comparte menos del 40 % de identidad, menos del 35 % de identidad, menos del 30 % de identidad, o menos del 25 % de identidad con una secuencia descrita en el presente documento. En la comparación de dos secuencias, la ausencia de restos (aminoácidos o ácidos nucleicos) o la presencia de restos adicionales también disminuye la identidad y homología/similitud.
En algunas realizaciones, el término "homología" describe una comparación matemáticamente basada de similitudes de secuencias que se usa para identificar genes con funciones o motivos similares. Las secuencias de ácidos nucleicos descritas en el presente documento se pueden usar como una "secuencia problema" para realizar una búsqueda por comparación con bases de datos públicas, por ejemplo, para identificar otros miembros de la familia, secuencias u homólogos relacionados. En algunas realizaciones, dichas búsquedas se pueden realizar usando los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. En algunas realizaciones, las búsquedas de nucleótidos de BLAST se pueden realizar con el programa NBLAST, puntuación=100, longitud de palabra=12, para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a las moléculas de ácidos nucleicos de la divulgación. En algunas realizaciones, para obtener alineamientos con huecos para fines de comparación, se puede utilizar Gapped BLAST como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden usar los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y BLAST) (véase www.ncbi.nlm.nih.gov).
Identidad: Como se usa en el presente documento, "identidad" significa el porcentaje de restos de nucleótidos idénticos en posiciones correspondientes en dos o más secuencias cuando las secuencias se alinean para maximizar el apareamiento de secuencias, es decir, teniendo en cuenta huecos e inserciones. La identidad puede ser fácilmente calculada por métodos conocidos, que incluyen, pero no se limitan a, los descritos en (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A. M., y Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; y Carillo, H., y Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Los métodos de determinación de la identidad se diseñan para dar la mayor correspondencia entre las secuencias probadas. Además, los métodos de determinación de la identidad están codificados en programas informáticos públicamente disponibles. Los métodos de programas informáticos para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete de programas GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990) y Altschul et al. Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)). El programa BLAST X está públicamente disponible de NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S., et al., n Cb I Nl M NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). También se puede usar el algoritmo de Smith-Waterman bien conocido para determinar la identidad.
Heterólogo: Una región "heteróloga" de una secuencia de ADN es un segmento de ADN identificable dentro de una secuencia de ADN mayor que no se encuentra en asociación con la secuencia mayor en la naturaleza. Por lo tanto, cuando la región heteróloga codifica un gen de mamífero, el gen puede estar flanqueado normalmente por ADN que no flanquea el ADN genómico de mamífero en el genoma del organismo fuente. Otro ejemplo de una secuencia codificante heteróloga es una secuencia donde la secuencia codificante en sí misma no se encuentra en la naturaleza (por ejemplo, un ADNc donde la secuencia codificante genómica contiene intrones o secuencias sintéticas que tienen codones o motivos diferentes del gen sin modificar). Las variaciones alélicas o acontecimientos mutacionales naturales no dan lugar a una región de ADN heteróloga como se define en el presente documento.
Mutación de transición: El término "mutaciones de transición" se refiere a cambios de bases en una secuencia de ADN en la que una pirimidina (citidina (C) o timidina (T)) se sustituye por otra pirimidina, o una purina (adenosina (A) o guanosina (G)) se sustituye por otra purina.
Mutación de transversión: El término "mutaciones de transversión" se refiere a cambios de bases en una secuencia de ADN en la que una pirimidina (citidina (C) o timidina (T)) se sustituye por una purina (adenosina (A) o guanosina (G)), o una purina se sustituye por una pirimidina.
Oligonucleótido: El término "oligonucleótido" se refiere a un polímero u oligómero de monómeros de nucleótidos, que contiene cualquier combinación de nucleobases, nucleobases modificadas, azúcares, azúcares modificados, puentes de fosfato, o puentes de átomos de fósforo modificados (también denominados en el presente documento "enlace internucleotídico", definido además en el presente documento).
Los oligonucleótidos pueden ser monocatenarios o bicatenarios. Como se usa en el presente documento, el término "cadena de oligonucleótidos" engloba un oligonucleótido monocatenario. Un oligonucleótido monocatenario puede tener regiones bicatenarias y un oligonucleótido bicatenario puede tener regiones monocatenarias. Los oligonucleótidos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, genes estructurales, genes que incluyen regiones de control y de terminación, sistemas autorreplicantes, tales como ADN vírico o de plásmido, ARNip monocatenario y bicatenario y otros reactivos de interferencia de ARN (agentes de iARN o agentes ARNi), ARNhp, oligonucleótidos antisentido, ribozimas, microARN, miméticos de microARN, supermir, aptámeros, antimir, antagomir, adaptadores de Ul, oligonucleótidos formadores de tríplex, oligonucleótidos G-quadruplex, activadores de ARN, oligonucleótidos inmunoestimulantes y oligonucleótidos señuelo.
Los oligonucleótidos bicatenarios y monocatenarios que son eficaces en inducir la interferencia por ARN también se denominan ARNip, agente de iARN o agente de ARNi, en el presente documento. En algunas realizaciones, estos oligonucleótidos inductores de interferencia de ARN se asocian con un complejo citoplásmico multiprotéico conocido como complejo de silenciamiento inducido por iARN (RISC). En muchas realizaciones, los agentes de iARN monocatenarios y bicatenarios son lo suficientemente largos como para que puedan ser escindidos por una molécula endógena, por ejemplo, por Dicer, para producir oligonucleótidos más pequeños que pueden entrar en la maquinaria del RISC y participar en la escisión mediada por RISC de una secuencia diana, por ejemplo un ARNm diana.
Los oligonucleótidos proporcionados por el presente método inventivo pueden ser de diversas longitudes. En realizaciones particulares, los oligonucleótidos pueden variar desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 200 nucleótidos de longitud. En diversas realizaciones relacionadas, los oligonucleótidos, monocatenarios, bicatenarios y tricatenarios, pueden variar en longitud desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 10 nucleótidos, desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 50 nucleótidos, desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 50 nucleótidos, desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 30 nucleótidos, desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el oligonucleótido tiene desde aproximadamente 9 hasta aproximadamente 39 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el oligonucleótido tiene al menos 4 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el oligonucleótido tiene al menos 5 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el oligonucleótido tiene al menos 6 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el oligonucleótido tiene al menos 7 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el oligonucleótido tiene al menos 8 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el oligonucleótido tiene al menos 9 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el oligonucleótido tiene al menos 10 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el oligonucleótido tiene al menos 11 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el oligonucleótido tiene al menos 12 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el oligonucleótido tiene al menos 15 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el oligonucleótido tiene al menos 20 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el oligonucleótido tiene al menos 25 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el oligonucleótido tiene al menos 30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el oligonucleótido tiene un dúplex de cadenas complementarias de al menos 18 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el oligonucleótido tiene un dúplex de cadenas complementarias de al menos 21 nucleótidos de longitud.
Enlace intemucleotídico: Como se usa en el presente documento, la expresión "enlace internucleotídico" se refiere, en general, al enlace que contiene fósforo entre las unidades de nucleótidos de un oligonucleótido, y es intercambiable con "enlace interazúcar" y "puentes de átomos de fósforo", como se usa anteriormente y en el presente documento. En algunas realizaciones, un enlace internucleotídico es un enlace fosfodiéster, como se encuentra en moléculas de ADN y ARN naturales. En algunas realizaciones, un enlace internucleotídico es un "enlace internucleotídico modificado" en donde cada átomo de oxígeno del enlace fosfodiéster está opcionalmente e independientemente sustituido con un resto orgánico o inorgánico. En algunas realizaciones, dicho resto orgánico o inorgánico se selecciona de, pero no se limita a, =S, =Se, =NR', -SR', -SeR', -N(R')2 , B(R')3, -S-, -Se- y -N(R')-, en donde cada R' es independientemente como se define y se describe a continuación. En algunas realizaciones, un enlace internucleotídico es un enlace fosfotriéster, enlace diéster de fosforotioato
O
- { -O -P -O - f -
( S" ),
o enlace triéster de fosforotioato modificado. Se entiende por un experto habitual en la técnica que el enlace internucleotídico puede existir como un anión o catión a un pH dado debido a la existencia de restos de ácido o base en el enlace.
A menos que se especifique de otro modo, cuando se usa con una secuencia de oligonucleótidos, cada uno de s, s1, s2, s3, s4, s5, s6 y s7 representa independientemente el siguiente enlace internucleotídico modificado como se ilustra en la Tabla 1, a continuación.
Tabla 1. Enlace internucleotídico modificado a modo de ejemplo.
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Por ejemplo, (Rp, Sp)-ATsCs1GA tiene 1) un enlace internucleotídico de fosforotioato
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entre T y C; y 2) un enlace internucleotídico de triéster de fosforotioato que tiene la estructura de
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entre C y G. A menos que se especifique de otro modo, las designaciones Rp/Sp que preceden a una secuencia de oligonucleótidos describen las configuraciones de átomos de fósforo quirales del enlace en los enlaces internucleotídicos uno detrás del otro desde 5' hasta 3' de la secuencia de oligonucleótidos. Por ejemplo, en (Rp, Sp)-ATsCs1GA, el fósforo en el enlace "s" entre T y C tiene la configuración Rp y el fósforo en el enlace "s1" entre C y G tiene la configuración Sp. En algunas realizaciones, "Todos-(Rp)" o "Todos-(Sp)" se usa para indicar que todos los átomos de fósforo quirales del enlace en el oligonucleótido tienen la misma configuración Rp o Sp, respectivamente. Por ejemplo, Todos-(Rp)-GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC indica que todos los átomos de fósforo quirales del enlace en el oligonucleótido tienen la configuración Rp; Todos-(Sp)-GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC indica que todos los átomos de fósforo quirales del enlace en el oligonucleótido tienen la configuración Sp.
Tipo de oligonucleótido: Como se usa en el presente documento, la expresión "tipo de oligonucleótido" se usa para definir un oligonucleótido que tiene una secuencia de bases particular, patrón de enlaces del esqueleto (es decir, patrón de tipos de enlaces internucleotídicos, por ejemplo, fosfato, fosforotioato, etc.), patrón de centros quirales del esqueleto (es decir, patrón de estereoquímica del fósforo del enlace (Rp/Sp)) y patrón de las modificaciones del fósforo del esqueleto (por ejemplo, patrón de grupos "-XLR1" en la fórmula I). Los oligonucleótidos de un "tipo" designado común son estructuralmente idénticos entre sí.
Un experto en la técnica apreciará que los métodos de síntesis de la presente invención proporcionan un grado de control durante la síntesis de una cadena de oligonucleótidos tal que cada unidad de nucleótido de la cadena de oligonucleótidos se pueda diseñar y/o seleccionar por adelantado para tener una estereoquímica particular en el fósforo del enlace y/o una modificación particular en el fósforo del enlace, y/o una base particular, y/o un azúcar particular. En algunas realizaciones, una cadena de oligonucleótidos se diseña y/o selecciona por adelantado para tener una combinación particular de estereocentros en el fósforo del enlace. En algunas realizaciones, una cadena de oligonucleótidos se diseña y/o determina para tener una combinación particular de modificaciones en el fósforo del enlace. En algunas realizaciones, una cadena de oligonucleótidos se diseña y/o selecciona para tener una combinación particular de bases. En algunas realizaciones, una cadena de oligonucleótidos se diseña y/o selecciona para tener una combinación particular de una o más de las características estructurales anteriores. El presente método inventivo proporciona composiciones que comprenden o que consisten en una pluralidad de moléculas de oligonucleótido (por ejemplo, composiciones de oligonucleótidos quiralmente controlados). En algunas realizaciones, todas las moléculas son del mismo tipo (es decir, son estructuralmente idénticas entre sí). En muchas realizaciones, sin embargo, las composiciones proporcionadas comprenden una pluralidad de oligonucleótidos de diferentes tipos, normalmente en cantidades predeterminadas relativas.
Control quiral: Como se usa en el presente documento, "control quiral" se refiere a la capacidad para controlar la designación estereoquímica de cada fósforo del enlace quiral dentro de una cadena de oligonucleótidos. La expresión "oligonucleótido quiralmente controlado" se refiere a un oligonucleótido que existe en una única forma diastereomérica con respecto al fósforo del enlace quiral.
Composición de oligonucleótidos quiralmente controlados: Como se usa en el presente documento, la expresión "composición de oligonucleótidos quiralmente controlados" se refiere a una composición de oligonucleótidos que contiene niveles predeterminados de tipos de oligonucleótidos individuales. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una composición de oligonucleótidos quiralmente controlados comprende un tipo de oligonucleótido. En algunas realizaciones, una composición de oligonucleótidos quiralmente controlados comprende más de un tipo de oligonucleótido. En algunas realizaciones, una composición de oligonucleótidos quiralmente controlados comprende una mezcla de múltiples tipos de oligonucleótidos. Las composiciones de oligonucleótidos quiralmente controlados a modo de ejemplo se describen más adelante en el presente documento.
Quiralmente puro: Como se usa en el presente documento, la expresión "quiralmente puro" se usa para describir una composición de oligonucleótidos quiralmente controlados en la que todos los oligonucleótidos existen en una única forma diastereomérica con respecto al fósforo del enlace.
Quiralmente uniforme: como se usa en el presente documento, la expresión "quiralmente uniforme" se usa para describir una molécula o tipo de oligonucleótido en que todas las unidades de nucleótidos tienen la misma estereoquímica en el fósforo del enlace. Por ejemplo, un oligonucleótido cuyas unidades de nucleótido tengan todos estereoquímica Rp en el fósforo del enlace es quiralmente uniforme. Asimismo, un oligonucleótido cuyas unidades de nucleótido tengan todas estereoquímica Sp en el fósforo del enlace es quiralmente uniforme.
Predeterminado: Por predeterminado se indica deliberadamente seleccionado, por ejemplo, a diferencia de que ocurre o se logra aleatoriamente. Los expertos habituales en la técnica, que leen la presente memoria descriptiva, apreciarán que el presente método inventivo proporciona nuevas y sorprendentes tecnologías que permiten la selección de tipos de oligonucleótidos particulares para la preparación y/o inclusión en composiciones proporcionadas, y permite además la preparación controlada de precisamente los tipos particulares seleccionados, opcionalmente en cantidades relativas particulares seleccionadas, de manera que se preparen las composiciones proporcionadas. Dichas composiciones proporcionadas están "predeterminadas", como se describe en el presente documento. Las composiciones que pueden contener ciertos tipos de oligonucleótidos individuales debido a que se han generado a través de un proceso que no se puede controlar para generar intencionadamente los tipos de oligonucleótidos particulares no son una composición "predeterminada". En algunas realizaciones, una composición predeterminada es una que puede ser intencionadamente reproducida (por ejemplo, mediante la repetición de un proceso controlado).
Fósforo del enlace: Como se define en el presente documento, la expresión "fósforo del enlace" se usa para indicar que el átomo de fósforo particular que se denomina es el átomo de fósforo presente en el enlace internucleotídico, átomo de fósforo que corresponde al átomo de fósforo de un fosfodiéster de un enlace internucleotídico como ocurre en el ADN y ARN natural. En algunas realizaciones, un átomo de fósforo del enlace está en un enlace internucleotídico modificado, en donde cada átomo de oxígeno de un enlace fosfodiéster está opcionalmente e independientemente sustituido con un resto orgánico o inorgánico. En algunas realizaciones, un átomo de fósforo del enlace es P* de la fórmula I. En algunas realizaciones, un átomo de fósforo del enlace es quiral. En algunas realizaciones, un átomo de fósforo del enlace quiral es P* de la fórmula I.
Modificación en P: Como se usa en el presente documento, el término "modificación en P" se refiere a cualquier modificación en el fósforo del enlace distinta de una modificación estereoquímica. En algunas realizaciones, una modificación en P comprende la adición, sustitución o retirada de un resto lateral covalentemente unido a un fósforo del enlace. En algunas realizaciones, la "modificación en P" es -X-L-R1, en donde cada uno de X, L y R1 es independientemente como se define y se describe en el presente documento y a continuación.
Blockmero: El término "blockmero", como se usa en el presente documento, se refiere a una cadena de oligonucleótidos cuyo patrón de características estructurales que caracterizan cada unidad de nucleótido individual se caracteriza por la presencia de al menos dos unidades de nucleótidos consecutivas que comparten una característica estructural común en el enlace internucleotídico de fósforo. Por característica estructural común se indica la estereoquímica común en el fósforo del enlace o una modificación común en el fósforo del enlace. En algunas realizaciones, las al menos dos unidades de nucleótidos consecutivas que comparten una característica estructural común en el enlace internucleotídico de fósforo se denominan un "bloque" ("block").
En algunas realizaciones, un blockmero es un "estereoblockmero", por ejemplo, al menos dos unidades de nucleótidos consecutivas tienen la misma estereoquímica en el fósforo del enlace. Dichas al menos dos unidades de nucleótidos consecutivas forman un "estereobloque". Por ejemplo, (Sp, Sp)-ATsCs1GA es un estereoblockmero debido a que al menos dos unidades de nucleótidos consecutivas, Ts y Cs1, tienen la misma estereoquímica en el fósforo del enlace (ambas Sp). En el mismo oligonucleótido (Sp, Sp)-ATsCs1 GA, TsCs1 forma un bloque, y es un estereobloque.
En algunas realizaciones, un blockmero es un "blockmero de modificación en P", por ejemplo, al menos dos unidades de nucleótidos consecutivas tienen la misma modificación en el fósforo del enlace. Dichas al menos dos unidades de nucleótidos consecutivas forman un "bloque de modificación en P". Por ejemplo, (Rp, Sp)-ATsCsGA es un blockmero de modificación en P debido en el que al menos dos unidades de nucleótidos consecutivas, Ts y Cs, tienen la misma modificación en P (es decir, ambas son un diéster de fosforotioato). En el mismo oligonucleótido de (Rp, Sp)-ATsCsGA, TsCs forma un bloque, y es un bloque de modificación en P.
En algunas realizaciones, un blockmero es un "blockmero de enlace", por ejemplo, al menos dos unidades de nucleótidos consecutivas tienen estereoquímica idéntica y modificaciones idénticas en el fósforo del enlace. Al menos dos unidades de nucleótidos consecutivas forman un "bloque de enlace". Por ejemplo, (Rp, Rp)-ATsCsGA es un blockmero de enlace debido a que al menos dos unidades de nucleótidos consecutivas, Ts y Cs, tienen la misma estereoquímica (ambas Rp) y modificación en P (ambas fosforotioato). En el mismo oligonucleótido de (Rp, Rp)-ATsCsGA, TsCs forma un bloque, y es un bloque de enlace.
En algunas realizaciones, un blockmero comprende uno o más bloques seleccionados independientemente de un estereobloque, un bloque de modificación en P y un bloque de enlace. En algunas realizaciones, un blockmero es un estereoblockmero con respecto a un bloque, y/o un blockmero de modificación en P con respecto a otro bloque, y/o un blockmero de enlace con respecto a otro bloque más. Por ejemplo, (Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Sp, Sp, Sp)-AAsTsCsGsAs1Ts1Cs1Gs1ATCG es un estereoblockmero con respecto al estereobloque AsTsCsGsAs1 (todos Rp en el fósforo del enlace) o Ts1Cs1Gs1 (todos Sp en el fósforo del enlace), un blockmero de modificación en P con respecto al bloque de modificación en P AsTsCsGs (todos enlace s) o As1Ts1Cs1Gs1 (todos enlace s1), o un blockmero de enlace con respecto al bloque de enlace AsTsCsGs (todos Rp en el fósforo del enlace y todos enlace s) o Ts1 Cs1 Gs1 (todos Sp en el fósforo del enlace y todos enlace s1).
Altmero: el término "altmero", como se usa en el presente documento, se refiere a una cadena de oligonucleótidos cuyo patrón de características estructurales que caracteriza cada unidad de nucleótido individual se caracteriza porque dos unidades de nucleótidos consecutivas de la cadena de oligonucleótidos no comparten una característica estructural particular en el enlace internucleotídico de fósforo. En algunas realizaciones, se diseña un altmero de forma que comprenda un patrón de repetición. En algunas realizaciones, se diseña un altmero de forma que no comprenda un patrón de repetición.
En algunas realizaciones, un altmero es un "estereoaltmero", por ejemplo, dos unidades de nucleótidos consecutivas no tienen la misma estereoquímica en el fósforo del enlace. Por ejemplo, (Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp)-GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC.
En algunas realizaciones, un altmero es un "altmero de modificación en P", por ejemplo, dos unidades de nucleótidos consecutivas no tienen la misma modificación en el fósforo del enlace. Por ejemplo, Todo-(Sp)-CAs1GsT, en la que cada fósforo del enlace tiene una modificación en P diferente de las otras.
En algunas realizaciones, un altmero es un "altmero de enlace", por ejemplo, dos unidades de nucleótidos consecutivas no tienen estereoquímica idéntica o modificaciones idénticas en el fósforo del enlace. Por ejemplo, (Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp)-GsCs1 CsTs1 CsAs1 GsTs1 CsTs1 GsCs1TsTs2CsGs3CsAs4CsC.
Unímero: El término "unímero", como se usa en el presente documento, se refiere a una cadena de oligonucleótidos cuyo patrón de características estructurales que caracteriza cada unidad de nucleótido individual es tal que todas las unidades de nucleótidos dentro de la cadena compartan al menos una característica estructural común en el enlace internucleotídico de fósforo. Por característica estructural común se indica la estereoquímica común en el fósforo del enlace o una modificación común en el fósforo del enlace.
En algunas realizaciones, un unímero es un "estereounímero", por ejemplo, todas las unidades de nucleótido tienen la misma estereoquímica en el fósforo del enlace. Por ejemplo, Todo-(Sp)-CsAs1GsT, en el que todos los enlaces tienen fósforo Sp.
En algunas realizaciones, un unímero es un "unímero de modificación en P", por ejemplo, todas las unidades de nucleótidos tienen la misma modificación en el fósforo del enlace. Por ejemplo, (Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp)-GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC, en el que todos los enlaces internucleotídicos son diéster de fosforotioato.
En algunas realizaciones, un unímero es un "unímero de enlace", por ejemplo, todas las unidades de nucleótidos tienen la misma estereoquímica y las mismas modificaciones en el fósforo del enlace. Por ejemplo, Todo-(Sp)-GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC, en el que todos los enlaces internucleotídicos son diéster de fosforotioato que tienen fósforo del enlace Sp.
Gápmero: Como se usa en el presente documento, el término "gápmero" se refiere a una cadena de oligonucleótidos caracterizada porque al menos un enlace internucleotídico de fósforo de la cadena de oligonucleótidos es un enlace de diéster de fosfato, por ejemplo tal como el que existe en ADN o ARN natural. En algunas realizaciones, más de un enlace internucleotídico de fósforo de la cadena de oligonucleótidos es un enlace de diéster de fosfato, tal como el encontrado en ADN o ARN natural. Por ejemplo, Todo-(Sp)-CAs1GsT, en el que el enlace internucleotídico entre C y A es un enlace de diéster de fosfato.
Skipmero: Como se usa en el presente documento, el término "skipmero" se refiere a un tipo de gápmero en el que cada otro enlace internucleotídico de fósforo de la cadena de oligonucleótidos es un enlace de diéster de fosfato, por ejemplo tal como los encontrados en ADN o ARN natural, y cada otro enlace internucleotídico de fósforo de la cadena de oligonucleótidos es un enlace internucleotídico modificado. Por ejemplo, Todo-(Sp)-AsTCs1GAs2TCs3G.
Para los fines de la presente invención, los elementos químicos se identifican según la Periodic Table of the Elements, versión CAS, Handbook of Chemistry and Physics, 67a Ed., 1986-87, interior de la cubierta.
Los métodos y las estructuras descritos en el presente documento referentes a los compuestos y las composiciones del método inventivo también se aplican a las sales de adición de ácido o base farmacéuticamente aceptables y a todas las formas estereoisoméricas de estos compuestos y composiciones.
Breve descripción del dibujo
Figura 1. El oligonucleótido quiralmente controlado tiene tiempo de retención significativamente diferente en la HPLC en comparación con el oligonucleótido estereoaleatorio. A: Oligonucleótido quiralmente controlado en bruto (Oligonucleótido 101); C: el oligonucleótido estereoaleatorio correspondiente (Oligonucleótido 118). Figura 2. HPLC de oligonucleótidos quiralmente controlados y oligonucleótido estereoaleatorio. A: Oligonucleótido 101 (todo-Rp); B: Oligonucleótido 102 (todo-Sp); y C: Oligonucleótido 118 (estereoaleatorio). Figura 3. Tm de oligonucleótidos quiralmente controlados y oligonucleótido estereoaleatorio.
Figura 4. Datos representativos: Análisis de curvas de fusión de los pares de control diana y endógenos dan amplicones individuales.
Figura 5. Datos representativos y curvas de CI50 para los compuestos.
Figura 6. HPLC de (Rp, Fip, Sp, Fip, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp)-d[GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC] en bruto ((RRS)6-R, estereoblockmero y unímero de modificación en P (s-unímero)).
Figura 7. HPLC de (Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp)-d[GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC] purificado ((r RS)6-R, estereoblockmero y unímero de modificación en P (s-unímero)).
Figura 8. LCMS de (Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp)-d[GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC] ((RRS)6-R, estereoblockmero y unímero de modificación en P (s-unímero)).
Figura 9. HPLC de (Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp)-d[GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC] en bruto (S-(RRs )6, estereoblockmero y unímero de modificación en P (s-unímero)).
Figura 10. HPLC de (Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp)-d[GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC] purificado (S-(RRS)6, estereoblockmero y unímero de modificación en P (s-unímero)).
Figura 11. LCMS de (Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp)-d[GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC] (S-(RRS)6, estereoblockmero y unímero de modificación en P (s-unímero)).
Figura 12. HPLC de (Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp) d[GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC] en bruto (RS-(RRS)5-RR, estereoblockmero y unímero de modificación en P (s-unímero)).
Figura 13. HPLC de (Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp) d[GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC] purificado (RS-(RRS)5-RR, estereoblockmero y unímero de modificación en P (s-unímero)).
Figura 14. LCMS de (Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp)-d[GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC] (Rs -(RrS)5-RR, estereoblockmero y unímero de modificación en P (s-unímero)).
Figura 15. HPLC de (Rp, Rp, Rp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Rp, Rp, Rp)-d[5mCs1As1Gs1Ts15mCs1Ts1Gs15mCs1Ts1Ts15mCs1G] en bruto (3R-5S-3R, estereoblockmero y unímero de modificación en P (s1-unímero)).
Figura 16. HPLC de (Rp, Rp, Rp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Rp, Rp, Rp)-d[5mCs1As1Gs1Ts15mCs1Ts1Gs15mCs1Ts1Ts15mCs1G] purificado (3R-5S-3R, estereoblockmero y unímero de modificación en P (s1-unímero)).
Figura 17. LCMS de (Rp, Rp, Rp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Rp, Rp, Rp)-d[5mCs1As1Gs1Ts15mCs1Ts1Gs15mCs1Ts1Ts15mCs1G] (3R-5S-3R, estereoblockmero y unímero de modificación en P (s1-unímero)).
Figura 18. HPLC de Todo-(Rp)-d[Cs3As3Gs3T] en bruto (unímero de modificación en P (s3-unímero), estereounímero y unímero de enlace).
Figura 19. LCMS de Todo-(Rp)-d[Cs3As3Gs3T] (unímero de modificación en P (s3-unímero), estereounímero y unímero de enlace).
Figura 20. HPLC de Todo-(Rp)-d[Cs2As2Gs2T] en bruto (unímero de modificación en P (s2-unímero), estereounímero y unímero de enlace).
Figura 21. LCMS de Todo-(Rp)-d[Cs2As2Gs2T] (unímero de modificación en P (s2-unímero), estereounímero y unímero de enlace).
Figura 22. HPLC de Todo-(Sp)-d[Cs1AGs1T] en bruto (gápmero, estereoaltmero, altmero de modificación en P y altmero de enlace).
Figura 23. LCMS de Todo-(Sp)-d[Cs1AGs1T] (gápmero estereoaltmero, altmero de modificación en P y altmero de enlace).
Figura 24. Todo-(Rp)-d[TsCs1AsT] en bruto (estereounímero, altmero de modificación en P y altmero de enlace). Figura25. LCMS de Todo-(Rp)-d[TsCs1AsT] (estereounímero, altmero de modificación en P y altmero de enlace). Figura 26. Oligonucleótidos a modo de ejemplo descritos en el documento de patente WO2012/030683 y contemplados para síntesis usando los métodos de la presente invención.
Figura 27. Oligonucleótidos a modo de ejemplo descritos en el documento de patente WO2012/030683 y contemplados para síntesis usando los métodos de la presente invención.
Figura 28. Oligonucleótidos a modo de ejemplo descritos en el documento de patente WO2012/030683 y contemplados para síntesis usando los métodos de la presente invención.
Figura 29. Oligonucleótidos a modo de ejemplo descritos en el documento de patente WO2012/030683 y contemplados para síntesis usando los métodos de la presente invención.
Figura 30. Oligonucleótidos a modo de ejemplo descritos en el documento de patente WO2012/030683 y contemplados para síntesis usando los métodos de la presente invención.
Figura 31. Conectores a modo de ejemplo descritos en el documento de patente WO2012/030683 para su uso en los métodos de la presente invención.
Figura 32. Conectores a modo de ejemplo descritos en el documento de patente WO2012/030683 para su uso en los métodos de la presente invención.
Figura 33. Conectores a modo de ejemplo descritos en el documento de patente WO2012/030683 para su uso en los métodos de la presente invención.
Figura 34. Conectores a modo de ejemplo descritos en el documento de patente WO2012/030683 para su uso en los métodos de la presente invención.
Figura 35. RP-HPLC de DMT en bruto en oligonucleótido: ONT-75 (Panel A); ONT-80 (Panel B); ONT-77 (Panel C); ONT-81 (Panel D); ONT-87 (Panel E); ONT-88 (Panel F); ONT-89 (Panel G); ONT-82 (Panel H); ONT-84 (Panel I); ONT-85 (Panel J); ONT-86 (Panel K).
Figura 36. RP-HPLC de oligonucleótido DMT Apagado purificado: ONT-75 (Panel A); ONT-80 (Panel B); ONT-77 (Panel C); ONT-81 (Panel D); ONT-87 (Panel E); ONT-88 (Panel F); ONT-89 (Panel G); ONT-82 (Panel H); ONT-84 (Panel I); ONT-85 (Panel J); ONT-86 (Panel K).
Figura 37. Superposición de trazados de RP-HPLC de oligonucleótido DMT Apagado purificado: ONT-75, ONT-77, ONT-80, ONT-81, ONT-87, ONT-88, ONT-89 y ONT-41 (Panel A); vista ampliada de la superposición de ONT-75, ONT-77, ONT-80, ONT-81, ONT-87, ONT-88, ONT-89 y ONT-41 (Panel B).
Figura 38. Superposición de trazados de RP-HPLC de oligonucleótido DMT Apagado purificado: ONT-82, ONT-84, ONT-85, ONT-86, y ONT-83 (Panel A); vista ampliada de la superposición de ONT-82, ONT-84, ONT-85, ONT-86 y ONT-83 (Panel B).
Figura 39. Superposición de Tm de oligonucleótidos quiralmente controlados ONT-81, ONT-41, ONT-75, ONT-77 y ONT-80.
Figura 40. Representación gráfica de la evolución temporal de los niveles de la proteína apolipoproteína B humana en suero con respecto a PBS después de la administración IP de 5 mg/kg de estereoisómero o mipomersen en ratones huApoB para ONT-41, ONT-75, ONT-80, ONT-77 y ONT-81. Una flecha hacia abajo indica días de administración.
Figura 41. Representación gráfica de la evolución temporal de los niveles de la proteína apolipoproteína B humana en suero con respecto a PBS después de la administración IP de 5 mg/kg de estereoisómero o mipomersen en ratones huApoB para mipomersen, mipomersen "R completo", mipomersen "S completo", mipomersen "RSR", y mipomersen "SRS". Una flecha hacia abajo indica días de administración.
Figura 42. Representación gráfica de la evolución temporal de los niveles de la proteína apolipoproteína B humana en suero con respecto a PBS después de la administración IP de 10 mg/kg de estereoisómero o mipomersen en ratones huApoB para mipomersen, mipomersen "R completo", mipomersen "S completo", mipomersen "RSR", y mipomersen "SRS". Una flecha hacia abajo indica días de administración.
Figura 43. Representación gráfica de la evolución temporal de los niveles de la proteína apolipoproteína B humana en suero con respecto a PBS después de la administración IP de 5 mg/kg de estereoisómero o mipomersen en ratones huApoB para mipomersen, ONT-87, ONT-88 y ONT-89. Una flecha hacia abajo indica días de administración.
Figura 44. Representación gráfica de la evolución temporal de los niveles de la proteína apolipoproteína B humana en suero con respecto a PBS después de la administración IP de 10 mg/kg de estereoisómero o mipomersen en ratones huApoB para ONT-87, ONT-88 y ONT-89. Una flecha hacia abajo indica días de administración.
Figura 45. Representación gráfica del % de ARNm de PCSK-9 que queda después del tratamiento de Hep3B con dúplex de ARNip.
Figura 46. Representación gráfica del ajuste a curva del % de ARNm de PCSK-9 que queda después del tratamiento de Hep3B con dúplex de ARNip.
Figura 47. Representación gráfica de % de ARNm de PCSK-9 que queda después del tratamiento de HeLa con dúplex de ARNip.
Figura 48. Representación gráfica del ajuste a curva del % de ARNm de PCSK-9 que queda después del tratamiento de HeLa con dúplex de ARNip.
Figura 49. Representación gráfica del % de ARNm de PCSK-9 que queda después del tratamiento de HeLa con dúplex de ARNip que contiene 3 estereocentros fosforotioato.
Figura 50. Representación gráfica del ajuste a curva del % de ARNm de PCSK-9 que queda después del tratamiento de HeLa con dúplex de ARNip que contiene 3 estereocentros fosforotioato.
Figura 51. Superposición de trazados de RP-HPLC de oligonucleótido DMT Apagado purificado: ONT-108, ONT-109 y ONT-114.
Figura 52. Superposición de trazados de RP-HPLC de oligonucleótido DMT Apagado purificado: ONT-106, ONT-107 y ONT-114.
Figura 53. Representación gráfica de la evolución temporal de los niveles de la proteína apolipoproteína B humana en suero con respecto a PBS después de la administración IP de 10 mg/kg de estereoisómero o mipomersen en ratones huApoB. Una flecha hacia abajo indica días de administración.
Figura 54. Representación gráfica de la evolución temporal de los niveles de la proteína apolipoproteína B humana en suero con respecto a PBS después de múltiples dosis IP de 5 mg/kg de estereoisómero o mipomersen en ratones huApoB (n = 3-4). Una flecha hacia abajo indica días de administración.
Figura 55. Día 17 Niveles de la proteína apolipoproteína B humana en suero con respecto a PBS después de la administración IP de 10 mg/kg de estereoisómero (ONT-87, ONT-88 u ONT-89) o mipomersen en ratones huApoB.
Figura 56. Día 24 Niveles de la proteína apolipoproteína B humana en suero con respecto a PBS después de la administración IP de 10 mg/kg de estereoisómero (ONT-87, ONT-88 u ONT-89) o mipomersen en ratones huApoB.
Figura 57. Niveles de la proteína apolipoproteína B humana en suero con respecto a PBS después de la administración de 10 mg/kg de estereoisómero (ONT-41, ONT-87, ONT-88 u ONT-89) en ratones huApoB. Figura 58. Niveles de la proteína apolipoproteína B humana en suero con respecto a PBS después de la administración de 10 mg/kg de estereoisómero (ONT-87, ONT-88 u ONT-89) en ratones huApoB.
Figura 59. Gráfico del análisis de cuantificación de IEX-HPLC del estudio de digestión svPDE para los oligonucleótidos ONT-75, ONT-77, ONT-80, ONT-81, ONT-87, ONT-88, ONT-89 y ONT-41.
Figura 60. IEX-HPLC del estudio de digestión enzimática usando nP1 para el oligonucleótido ONT-75 (Todo (Rp))-Gs5mCs5mCsTs5mCsAsGsTs5mCsTsGs5mCsTsTs5mCsGs 5mCsAs5mCs5mC.
Figura 61. IEX-HPLC del estudio de digestión enzimática usando nP1 para el oligonucleótido ONT-77 (Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Rp, Rp, Rp, Rp)-Gs5mCs5mCsTs5mCsAsGsTs5mCsTsGs5mCsTsTs5mCsGs5mCsAs5mCs5mC (5R-10S-4R).
Figura 62. IEX-HPLC del estudio de digestión enzimática usando nP1 para el oligonucleótido ONT-80 (Todo (Sp))-Gs5mCs5mCsTs5mCsAsGsTs5mCsTsGs5mCsTsTs5mCs Gs5mCsAs 5mCs5mC.
Figura 63. IEX-HPLC del estudio de digestión enzimática usando nP1 para el oligonucleótido ONT-81 (Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Sp, Sp, Sp, Sp)-Gs5mCs5mCsTs5mCsAsGsTs5mCsTsGs5mCsTsTs5mCsGs5mCsAs5mCs5mC (5S-10R-4S).
Figura 64. IEX-HPLC del estudio de digestión enzimática usando nP1 para el oligonucleótido ONT-87 (Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Sp, Sp, Rp, Sp, Sp, Rp, Sp, Sp, Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Rp)-Gs5mCs5mCsTs5mCsAsGsTs5mCsTsGs5mCsTsTs5mCsGs5mCsAs5mCs5mC (5R-(s Sr )3 -5R).
Figura 65. IEX-HPLC del estudio de digestión enzimática usando nP1 para el oligonucleótido ONT-88 (Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp)-Gs5mCs5mCsTs5mCsAsGsTs5mCsTsGs5mCsTsTs5mCsGs5mCsAs 5mCs5mC (5S-(RRS)3-5S).
Figura 66. IEX-HPLC del estudio de digestión enzimática usando nP1 para el oligonucleótido ONT-89 (Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp)-Gs5mCs5mCsTs5mCsAsGsTs5mCsTsGs5mCsTsTs5mCsGs5mCsAs5mCs5mC ((SR)gS).
Figura 67. IEX-HPLC del estudio de digestión enzimática usando nP1 para el oligonucleótido ONT-41 (d/'asfereomezc/a)-Gs5mCs5mCsTs5mCsAsGsTs5mCsTsGs 5mCsTsTs5mCsGs5mCsAs5mCs5mC.
Figura 68. Comparación de la estabilidad de oligonucleótidos quiralmente puros ONT-75 y ONT-77 con el oligonucleótido estereoraleatorio "parental" ONT-41 (mipomersen) en homogeneizado de hígado de rata completo preincubado.
Figura 69. Perfil de UPLC en la producción de derivado de oligonucleótido usando el monómero de 13b.
Figura 70. Perfil de UPLC en la producción de derivado de oligonucleótido usando el monómero de 27.
Figura 71. Niveles de apolipoproteína B de ratón/ARNm de GAPDH con respecto a vector vacío y controles no tratados después de la transfección de hepatocitos primarios de ratón con estereoisómero (ONT-82, ONT-83, ONT-84, ONT-85 u ONT-86).
Figura 72. Niveles de apolipoproteína B de ratón/ARNm de GAPDH con respecto a vector vacío y controles no tratados después de la transfección de hepatocitos primarios de ratón con estereoisómero (ONT-83, ONT-84, ONT-85 u ONT-86).
Descripción detallada de ciertas realizaciones
Los oligonucleótidos sintéticos proporcionan herramientas moleculares útiles en una amplia variedad de aplicaciones. Por ejemplo, los oligonucleótidos son útiles en aplicaciones terapéuticas, de diagnóstico, de investigación y de nuevos nanomateriales. El uso de ácidos nucleicos naturales (por ejemplo, ADN o ARN no modificados) está limitado, por ejemplo, por su susceptibilidad a endo- y exo-nucleasas. Por ello, se han desarrollado diversos homólogos sintéticos para evitar estas limitaciones. Estos incluyen oligonucleótidos sintéticos que contienen modificaciones del esqueleto, que hacen que estas moléculas sean menos susceptibles a la degradación. Desde un punto de vista estructural, dichas modificaciones a los enlaces fosfato internucleotídicos introducen quiralidad. Ha quedado claro que ciertas propiedades de los oligonucleótidos pueden ser afectadas por las configuraciones de los átomos de fósforo que forman el esqueleto de los oligonucleótidos. Por ejemplo, estudios in vitro han mostrado que las propiedades de los nucleótidos antisentido, tales como la afinidad de unión, la unión específica de secuencia al ARN complementario, la estabilidad a nucleasas, están afectadas, entre otras cosas, por la quiralidad del esqueleto (por ejemplo, las configuraciones de los átomos de fósforo). Por lo tanto, la presente invención engloba el reconocimiento de que existe una necesidad de oligonucleótidos quiralmente controlados que comprendan ácidos nucleicos modificados en el átomo de fósforo, así como composiciones y métodos relacionados. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona oligonucleótidos quiralmente controlados que están optimizados estructuralmente para presentar ciertas características deseables, tales como, por ejemplo, elevada estabilidad y eficacia mejorada para aplicaciones in vitro y/o in vivo.
Se sabe que oligonucleótidos en los que uno o dos de los dos átomos de oxígeno no de puente de los fosfatos internucleotídicos está sustituido por un tipo diferente de átomo o sustituyente son útiles como agentes terapéuticos y sondas para esclarecer los mecanismos de reacción enzimática. Sin embargo, dichos oligonucleótidos presentan frecuentemente propiedades no deseables (por ejemplo, susceptibilidad a la degradación por nucleasas, escasa permeabilidad de la membrana celular) que prohíben su uso en numerosas aplicaciones. Por lo tanto, se han desarrollado diversos tipos de modificaciones químicas en un intento por mejorar sus propiedades y/o conferir nueva funcionalidad.
Estructuras de oligonucleótidos modificados
Como se observa anteriormente, en vista de la utilidad de las composiciones de oligonucleótidos en diversas aplicaciones e indicaciones, los expertos en la técnica han tratado de desarrollar modificaciones de estructuras de oligonucleótidos que pueden tener características o atributos preferidos o deseables en comparación con las moléculas de oligonucleótidos naturales, por ejemplo como se usa en aplicaciones e indicaciones particulares. A modo de ejemplo, dichas modificaciones se describen a continuación.
El documento de patente WO2010/141471 (en el presente documento "Traversa I") enseña la modificación de diferentes tipos de construcciones de ácido nucleico modificadas para tener una carga polianiónica neta reducida. El documento de patente WO2010/039543 (en el presente documento "Travera II") enseña composiciones y métodos de preparación de polinucleótidos neutros (NN) con carga polianiónica reducida. El documento de patente WO2008/008476 (en el presente documento "Traversa III") describe la síntesis de profármacos de fosfato de SATE (tipo Imbach). Traversa I, II y III no enseñan oligonucleótidos quiralmente controlados, composiciones de los mismos, ni métodos de preparación y uso de los mismos, como se describe por la presente divulgación.
El documento de patente WO2010/072831 (en el presente documento "Girindus et al.") también enseña la modificación de oligonucleótidos. En particular, Girindus et al. enseñan el uso de reactivos de sulfurización para generar triésteres de fosforotioato como profármacos. Girindus et al. no enseñan oligonucleótidos quiralmente controlados, composiciones de los mismos, ni métodos de preparación y uso de los mismos, como se describe por la presente divulgación.
Similarmente, el documento de patente WO2004/085454 (en el presente documento "Avecia I") enseña la preparación de oligonucleótidos de fosforotioato mediante, por ejemplo, sililación transitoria de diésteres de poli-H-fosfonato. El documento de patente WO2001/027126 (en el presente documento "Avecia II") enseña procesos para la síntesis en fase sólida de oligonucleótidos de fosfotriéster acoplando monómeros de H-fosfonato con un oligonucleótido de 5'-hidroxilo soportado sólido y sulfurización adicional del diéster de H-fosfonato resultante en un triéster de fosforotioato. La divulgación del documento de patente WO2001/064702 (en el presente documento "Avecia III") es similar a Avecia II y describe además la síntesis en fase sólida sobre diferentes soportes sólidos. Avecia I, II y III no enseñan oligonucleótidos quiralmente controlados, composiciones de los mismos, ni métodos de preparación y uso de los mismos, como se describe por la presente divulgación.
El documento de patente WO1997/006183 (en el presente documento "Chiron") enseña oligonucleótidos con enlaces internucleotídicos catiónicos que comprenden fósforo asimétrico, tal como amidatos estereopuros. Chiron enseña oligonucleótidos estereopuros obtenidos por cristalización de una mezcla de diastereómeros o por resolución usando, por ejemplo, cromatografía en columna. Chiron no enseña oligonucleótidos quiralmente controlados, composiciones de los mismos, ni métodos de preparación y uso de los mismos, como se describe por la presente divulgación.
El documento de patente WO2009/146123 (en el presente documento "Spring Bank I") enseña composiciones y métodos de tratamiento de infecciones víricas usando oligonucleótidos de fosfato sustituidos y triésteres de fosforotioato. El documento de patente WO2007/070598 (en el presente documento "Spring Bank II") enseña profármacos de fosfotriéster como ácidos nucleicos antivíricos y enseña la síntesis de profármacos de fosforotioato. Spring Bank I y II no enseñan oligonucleótidos quiralmente controlados, composiciones de los mismos, ni métodos de preparación y uso de los mismos, como se describe por la presente divulgación.
El documento de patente EP0779893 (en el presente documento "Hybridon") enseña profármacos lipófilos para el aumento de la captación celular de oligonucleótidos antisentido y observa que los fosforotioatos Rp y Sp y los dímeros de triésteres de fosforotioato pueden tener diferentes propiedades de estabilidad enzimática. Hybridon no enseña oligonucleótidos quiralmente controlados, composiciones de los mismos, ni métodos de preparación y uso de los mismos, como se describe por la presente divulgación.
El documento de patente WO1997/047637 (en el presente documento "Imbach I") enseña, en general, las composiciones de oligonucleótidos de profármaco Imbach "SATE" (S-acil tioetilo) y métodos. Imbach I describe, por ejemplo, profármacos de fosfotriéster biorreversibles y la preparación de ciertos oligonucleótidos de profármaco usando alquilación post-sintética o fosforamiditos que contienen grupo de profármaco. El documento de patente US 6.124.445 (en el presente documento "Imbach II") enseña oligonucleótidos de profármaco antisentido y quiméricos modificados. Imbach I y II no enseñan oligonucleótidos quiralmente controlados, composiciones de los mismos, ni métodos de preparación y uso de los mismos, como se describe por la presente divulgación.
El documento de patente WO2006/065751 (en el presente documento "Beaucage") enseña profármacos de fosforotioato de oligonucleótidos CpG que comprenden sustituyentes termolábiles (cuyos sustituyentes se introducen por un monómero fosforamidito), y aplicaciones de los mismos. Beaucage no enseñan oligonucleótidos quiralmente controlados, composiciones de los mismos, ni métodos de preparación y uso de los mismos, como se describe por la presente divulgación.
Takeshi Wada et al. desarrollaron novedosos métodos para la síntesis estereocontrolada de ácidos nucleicos P-quirales usando auxiliares quirales de amidito (documentos de patente JP4348077, WO2005/014609, WO2005/092909 y WO2010/064146, denominados de forma conjunta en el presente documento "Wada I"). En particular, el documento de patente WO2010/064146 (denominado en el presente documento "Wada II") desvela métodos de síntesis de ácidos nucleicos modificados en el átomo de fósforo, en donde la configuración estereoquímica en el fósforo está controlada. Sin embargo, los métodos de Wada II están limitados en que no proporcionan modificación en P individual de cada fósforo del enlace quiral en un modo controlado y diseñado. Es decir, los métodos para los enlaces modificados en P de Wada II proporcionan la generación de una cadena de oligonucleótidos de poli H-fosfonato intermedio condensado que, una vez formado hasta una longitud deseada, se modifica en masa en el fósforo del enlace para proporcionar, por ejemplo, un diéster de fosforotioato deseado, fosforamidato o boranofosfato, u otros ácidos nucleicos modificados con átomos de fósforo (denominada la vía B en el documento - Esquema 6, página 36). Además, las cadenas de oligonucleótidos de H-fosfonato de Wada II son de longitudes más cortas (por ejemplo, dímero, trímero o tetrámero). Combinado con el hecho de que no existe etapa de terminación en la vía B, que, en general, presenta baja pureza en bruto como resultado de la acumulación de subproductos de tipo "n-1", la vía de Wada II contiene limitaciones con respecto a la síntesis de oligonucleótidos más largos. Mientras que Wada II contempla, en general, que se pudiera prever un oligonucleótido particular para contener diferentes modificaciones en cada fósforo del enlace, Wada II no describe ni sugiere métodos para la instalación iterativa controlada de dichas modificaciones, como se describe en el presente documento. Hasta el punto que Wada II representa un ciclo sintético que no requiere un oligonucleótido intermedio de H-fosfonato para que sea completamente ensamblado antes de la modificación en el fósforo del enlace (denominado en el presente documento la vía A, página 35, Esquema 5, "Síntesis de un ácido nucleico que comprende un resto de X-fosfonato quiral de la fórmula 1 por la vía A"), esta divulgación general no enseña ciertas etapas clave que se requieren para instalar ciertas modificaciones en P, como se proporciona por el presente método inventivo, y especialmente no con ningún grado de eficiencia y versatilidad de forma que este ciclo fuera útil en la síntesis de oligonucleótidos modificados en P quiralmente controlados, y especialmente oligonucleótidos de longitudes mayores.
Al menos dicha ineficiencia de Wada II no es observada por Wada et al. en el documento de patente WO2012/039448 (en el presente documento "Wada III"). Wada III enseña novedosos auxiliares quirales para su uso en los métodos de Wada II para producir oligonucleótidos de H-fosfonato que, una vez formados, pueden ser posteriormente modificados para proporcionar, entre otras cosas, fosforotioatos y similares. Wada et al. observan en Wada III que los cuatro tipos de auxiliares quirales desvelados en Wada II formaron fuertes enlaces con el fósforo en el fósforo del enlace y así no permitieron la eficiente retirada. Wada III observa que la retirada de los auxiliares quirales de Wada II requirieron condiciones rigurosas, condiciones que fueron propensas a comprometer la integridad del oligonucleótido producto. Wada III observa que esto es especialmente problemático cuando se sintetizan oligonucleótidos de cadena larga por al menos el motivo que a medida que avanza(n) la(s) reacción (reacciones) de degradación, se generan subproductos adicionales que pueden reaccionar además con el oligonucleótido producto y degradarlo. Wada III proporciona, por lo tanto, auxiliares quirales que pueden ser más eficientemente escindidos del oligonucleótido en condiciones ácidas suaves a modo de un mecanismo Sn1 que libera el enlace internucleotídico de H-fosfonato (vía B), o en condiciones básicas relativamente suaves, por una vía de p-eliminación.
Un experto en las técnicas químicas y sintéticas apreciará inmediatamente las complejidades asociadas a generar oligonucleótidos quiralmente controlados, tales como los proporcionados por el presente método inventivo. Por ejemplo, para sintetizar y aislar un oligonucleótido quiralmente controlado, las condiciones para cada adición de monómero deben ser diseñadas de forma que (1) la química sea compatible con cada porción del oligonucleótido en crecimiento; (2) los subproductos generados durante cada adición de monómero no comprometan la integridad estructural y estereoquímica del oligonucleótido en crecimiento; y (3) la composición del producto final en bruto es una composición que permite el aislamiento del producto de oligonucleótido quiralmente controlado deseado.
Los fosforotioatos de oligonucleótido han mostrado potencial terapéutico (Stein et al., Science (1993), 261:1004-12; Agrawal et al., Antisense Res. y Dev. (1992), 2:261-66; Bayever et al., Antisense Res. y Dev. (1993), 3:383-390). Los fosforotioatos de oligonucleótido preparados sin consideración de la estereoquímica del fosforotioato existen como una mezcla de 2n diastereómeros, donde n es el número de enlaces internucleotídicos de fosforotioato. Las propiedades químicas y biológicas de estos fosforotioatos diastereoméricos pueden ser distintas. Por ejemplo, Wada et al (Nucleic Acids Symposium Series No. 51 p. 119-120; doi:10.1093/nass/nrm060) encontraron que el dúplex estereodefinido-(Rp)-(Ups)9U/(Ap)9A mostró un mayor valor de Tm que el de natural-(Up)9U/(Ap)9A y estereodefinido-(Sp)-(Ups)9U no formó un dúplex. En otro ejemplo, en un estudio por Tang et al., (Nucleosides Nucleotides (1995), 14:985-990) se encontró que los fosforotioatos de Rp-oligodesoxirribonucleósidos estereopuros poseían menor estabilidad a las nucleasas endógenas al suero humano que los fosforotioatos de oligodesoxirribonucleósidos parentales con quiralidad de fósforo no definida.
Oligonucleótidos quiralmente controlados y composiciones de oligonucleótidos quiralmente controlados
El presente método inventivo proporciona oligonucleótidos quiralmente controlados, y composiciones de oligonucleótidos quiralmente controlados que son de elevada pureza en bruto y de elevada pureza diastereomérica. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona oligonucleótidos quiralmente controlados, y composiciones de oligonucleótidos quiralmente controlados que son de elevada pureza en bruto. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona oligonucleótidos quiralmente controlados, y composiciones de oligonucleótidos quiralmente controlados que son de elevada pureza diastereomérica.
En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona composiciones quiralmente controladas que comprenden una pluralidad de oligonucleótidos de al menos un tipo, en donde cada tipo se define por: 1) secuencia de bases; 2) patrón de enlaces del esqueleto; 3) patrón de centros quirales del esqueleto; y 4) patrón de modificaciones en P del esqueleto.
En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona composiciones quiralmente controladas que comprenden una pluralidad de oligonucleótidos del mismo tipo, en donde cada tipo se define por: 1) secuencia de bases; 2) patrón de enlaces del esqueleto; 3) patrón de centros quirales del esqueleto; y 4) patrón de modificaciones en P del esqueleto. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona composiciones quiralmente controladas que comprenden una pluralidad de oligonucleótidos de dos o más tipos, en donde cada tipo se define por: 1) secuencia de bases; 2) patrón de enlaces del esqueleto; 3) patrón de centros quirales del esqueleto; y 4) patrón de modificaciones en P del esqueleto.
En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona oligonucleótidos que comprenden uno o más enlaces internucleotídicos diastereoméricamente puros con respecto al fósforo del enlace quiral. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona oligonucleótidos que comprenden uno o más enlaces internucleotídicos diastereoméricamente puros que tienen la estructura de la fórmula I. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona oligonucleótidos que comprenden uno o más enlaces internucleotídicos diastereoméricamente puros con respecto al fósforo del enlace quiral, y uno o más enlaces diéster de fosfato. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona oligonucleótidos que comprenden uno o más enlaces internucleotídicos diastereoméricamente puros que tienen la estructura de la fórmula I, y uno o más enlaces diéster de fosfato. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona oligonucleótidos que comprenden uno o más enlaces internucleotídicos diastereoméricamente puros que tienen la estructura de la fórmula I-c, y uno o más enlaces diéster de fosfato. En algunas realizaciones, dichos oligonucleótidos se preparan usando síntesis de oligonucleótidos estereoselectivos, como se describe en la presente solicitud, para formar enlaces internucleotídicos diastereoméricamente puros previamente diseñados con respecto al fósforo del enlace quiral. Por ejemplo, en un oligonucleótido a modo de ejemplo de (Rp/Sp, Rp/Sp, Rp/Sp, Rp, Rp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Rp, Rp, Rp, Rp, Rp)-d[GsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGs1Cs1As1CsC], los tres primeros enlaces internucleotídicos se construyen usando el método de síntesis de oligonucleótidos tradicional, y los enlaces internucleotídicos diastereoméricamente puros se construyen con control estereoquímico como se describe en la presente divulgación. Los enlaces internucleotídicos a modo de ejemplo, que incluye los que tienen estructuras de la fórmula I, se describen adicionalmente a continuación. En algunas realizaciones, dichos oligonucleótidos comprenden una secuencia adicional descrita en la divulgación, que incluye, pero no se limita a, aquella descrita en las Tablas 2 y 4, y Apéndices A, B y C.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado comprende una combinación de enlaces internucleotídicos estereopuros y estereoaleatorios con respecto a la quiralidad en el enlace fósforo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, es conveniente tener un bloque de uno o más enlaces internucleotídicos estereodefinidos dentro de un oligonucleótido que sea, por lo demás, estereoaleatorio con respecto a la quiralidad en el enlace fósforo. En algunas realizaciones, es conveniente tener un bloque de uno o más enlaces internucleotídicos que sean estereoaleatorios dentro de un oligonucleótido, es decir, por lo demás, estereodefinidos con respecto a la quiralidad en el enlace fósforo.
En algunas realizaciones, al menos una unidad de nucleótido de un oligonucleótido proporcionado se instala usando síntesis de oligonucleótidos estereoselectivos, como se describe en la presente divulgación, para formar un enlace internucleotídico diastereoméricamente puro predesignado con respecto al fósforo del enlace quiral. En algunas realizaciones, al menos dos unidades de nucleótido de un oligonucleótido proporcionado se instalan usando síntesis de oligonucleótidos estereoselectivos, como se describe en la presente divulgación, para formar al menos dos enlaces internucleotídicos diastereoméricamente puros predesignados con respecto al fósforo del enlace quiral. En algunas realizaciones, al menos tres unidades de nucleótido de un oligonucleótido proporcionado se instalan usando síntesis de oligonucleótidos estereoselectivos, como se describe en la presente divulgación, para formar al menos tres enlaces internucleotídicos diastereoméricamente puros predesignados con respecto al fósforo del enlace quiral. En algunas realizaciones, el al menos uno, dos o tres enlaces internucleotídicos diastereoméricamente puros predesignados son adyacentes entre sí. En algunas realizaciones, el al menos uno, dos o tres enlaces internucleotídicos diastereoméricamente puros predesignados no son adyacentes entre sí.
En algunas realizaciones, al menos aproximadamente el 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 % o 50 % de unidades de nucleótidos de un oligonucleótido proporcionado se instalan usando síntesis de oligonucleótidos estereoselectivos, como se describe en la presente divulgación, para formar un enlace internucleotídico diastereoméricamente puro predesignado con respecto al fósforo del enlace quiral. Como se describe en el presente documento, en algunas realizaciones, al menos aproximadamente el 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 % o 50 % de las unidades de nucleótido ocurren en uno o más bloques para proporcionar un blockmero. En algunas realizaciones, el al menos aproximadamente el 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 % o 50 % de unidades de nucleótido ocurren en un patrón alternante para proporcionar un altmero. Un experto en las técnicas relevantes reconocerá que cualquier patrón deseable se puede lograr usando los métodos de la presente invención y se contemplan en el presente documento.
En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado, en donde al menos dos de los enlaces internucleotídicos individuales dentro del oligonucleótido tienen diferente estereoquímica y/o diferentes modificaciones en P el uno con respecto al otro. En ciertas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado, en donde al menos dos enlaces internucleotídicos individuales dentro del oligonucleótido tienen diferentes modificaciones en P el uno con respecto al otro. En ciertas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado, en donde al menos dos de los enlaces internucleotídicos individuales dentro del oligonucleótido tienen diferentes modificaciones en P el uno con respecto al otro, y en donde el oligonucleótido quiralmente controlado comprende al menos un enlace internucleotídico de diéster de fosfato. En ciertas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado, en donde al menos dos de los enlaces internucleotídicos individuales dentro del oligonucleótido tienen diferentes modificaciones en P el uno con respecto al otro, y en donde el oligonucleótido quiralmente controlado comprende al menos un enlace internucleotídico de diéster de fosfato y al menos un enlace internucleotídico de diéster de fosforotioato. En ciertas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado, en donde al menos dos de los enlaces internucleotídicos individuales dentro del oligonucleótido tienen diferentes modificaciones en P el uno con respecto al otro, y en donde el oligonucleótido quiralmente controlado comprende al menos un enlace internucleotídico de triéster de fosforotioato. En ciertas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado, en donde al menos dos de los enlaces internucleotídicos individuales dentro del oligonucleótido tienen diferentes modificaciones en P el uno con respecto al otro, y en donde el oligonucleótido quiralmente controlado comprende al menos un enlace internucleotídico de diéster de fosfato y al menos un enlace internucleotídico de triéster de fosforotioato.
En ciertas realizaciones, la presente divulgación proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende uno o más enlaces internucleotídicos modificados independientemente que tiene la estructura de la fórmula I:
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en donde cada variable es como se define y se describe a continuación. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende uno o más enlaces internucleotídicos modificados de la fórmula I, y en donde los enlaces internucleotídicos individuales de la fórmula I dentro del oligonucleótido tienen diferentes modificaciones en P el uno con respecto al otro. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende uno o más enlaces internucleotídicos modificados de la fórmula I, y en donde los enlaces internucleotídicos individuales de la fórmula I dentro del oligonucleótido tienen diferente -X-L-R1 el uno con respecto al otro. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende uno o más enlaces internucleotídicos modificados de la fórmula I, y en donde los enlaces internucleotídicos individuales de la fórmula I dentro del oligonucleótido tienen diferentes X el uno con respecto al otro. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende uno o más enlaces internucleotídicos modificados de la fórmula I, y en donde los enlaces internucleotídicos individuales de la fórmula I dentro del oligonucleótido tienen diferente -L-R1 el uno con respecto al otro.
En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado, en donde al menos dos de los enlaces internucleotídicos individuales dentro del oligonucleótido tienen diferente estereoquímica y/o diferentes modificaciones en P entre sí. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado, en donde al menos dos de los enlaces internucleotídicos individuales dentro del oligonucleótido tienen diferente estereoquímica entre sí, y en donde al menos una porción de la estructura del oligonucleótido quiralmente controlado se caracteriza por un patrón de repetición de estereoquímica alterna.
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado, en donde al menos dos de los enlaces internucleotídicos individuales dentro del oligonucleótido tienen diferentes modificaciones en P entre sí, que tienen diferentes átomos X en sus restos -XLR1, y/o que tienen diferentes grupos L en sus restos -XLR1, y/o que tienen diferentes átomos R1 en sus restos -XLR1.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado, en donde al menos dos de los enlaces internucleotídicos individuales dentro del oligonucleótido tienen diferente estereoquímica y/o diferentes modificaciones en P entre sí y el oligonucleótido tiene una estructura representada por la siguiente fórmula:
[SBn1RBn2SBn3RBn4... SBnxRBny]
en donde:
cada RB representa independientemente un bloque de unidades de nucleótidos que tienen la configuración R en el fósforo del enlace;
cada SB representa independientemente un bloque de unidades de nucleótidos que tienen la configuración S en el fósforo del enlace;
cada uno de n1-ny es cero o un número entero, con el requisito que al menos un n impar y al menos un n par deben ser distintos de cero, de manera que el oligonucleótido incluya al menos dos enlaces internucleotídicos individuales con diferente estereoquímica el uno con respecto al otro; y
en donde la suma de n1-ny es entre 2 y 200, y en algunas realizaciones es entre un límite inferior seleccionado del grupo que consiste en 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25 o más y un límite superior seleccionado del grupo que consiste en 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 y 200, siendo el límite superior mayor que el límite inferior.
En algunas de dichas realizaciones, cada n tiene el mismo valor; en algunas realizaciones, cada n par tiene el mismo valor que cada otro n par; en algunas realizaciones, cada n impar tiene el mismo valor que cada otro n impar; en algunas realizaciones, al menos dos n pares tienen diferentes valores entre sí; en algunas realizaciones, al menos dos n impares tienen diferentes valores entre sí.
En algunas realizaciones, al menos dos n adyacentes son iguales entre sí, de manera que un oligonucleótido proporcionado incluye bloques adyacentes de enlaces estereoquímicos S y enlaces estereoquímicos R de longitudes iguales. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos proporcionados incluyen bloques repetidos de enlaces estereoquímicos S y R de longitudes iguales. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos proporcionados incluyen bloques repetidos de enlaces estereoquímicos S y R, donde al menos dos de dichos bloques son de diferentes longitudes entre sí; en algunas de dichas realizaciones, cada bloque estereoquímico S es de la misma longitud, y es de una longitud diferente de cada longitud estereoquímica R, que puede ser opcionalmente de la misma longitud que el otro.
En algunas realizaciones, al menos dos n adyacentes con salto son iguales entre sí, de manera que un oligonucleótido proporcionado incluye al menos dos bloques de enlaces de una primera estereoquímica que son de igual longitud entre sí y se separan por un bloque de enlaces de la otra estereoquímica, bloque de separación que puede ser de la misma longitud o de longitud diferente de los bloques de la primera estereoquímica.
En algunas realizaciones, n asociados a bloques de enlace en los extremos de un oligonucleótido proporcionado son de la misma longitud. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos proporcionados tienen bloques terminales de la misma estereoquímica de enlace. En algunas de dichas realizaciones, los bloques terminales se separan entre sí por un bloque central de la otra estereoquímica de enlace.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado de la fórmula [SBn1RBn2SBn3RBn4...SBnxRBny] es un estereoblockmero. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado de la fórmula [SBn1 RBn2SBn3RBn4...SBnxRBny] es un estereoskipmero. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado de la fórmula [SBn1RBn2SBn3RBn4...SBnxRBny] es un estereoaltmero. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado de la fórmula [SBn1 RBn2SBn3RBn4...SBnxRBny] es un gápmero.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado de la fórmula [SBn1RBn2SBn3RBn4...SBnxRBny] es de cualquiera de los patrones anteriormente descritos y comprende además patrones de modificaciones en P. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado de la fórmula [SBn1 RBn2SBn3RBn4...SBnxRBny] y es un estereoskipmero y skipmero con modificación en P. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado de la fórmula [SBn1 RBn2SBn3RBn4...SBnxRBny] y es un estereoblockmero y altmero con modificación en P. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado de la fórmula [SBn1 RBn2SBn3RBn4...SBnxRBny] y es un estereoaltmero y blockmero con modificación en P.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado de la fórmula [SBn1RBn2SBn3RBn4...SBnxRBny] es un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende uno o más enlaces internucleotídicos modificados que tiene independientemente la estructura de la fórmula I:
. W ii >
;_Y -p * -Z - Í -' X 1 -L -R - 1i
(I)
en donde:
P* es un átomo de fósforo asimétrico y es o Rp o Sp;
W es O, S o Se;
cada uno de X, Y y Z es independientemente -O-, -S-, -N(-L-R1)- o L;
L es un enlace covalente o un alquileno C1-C10 opcionalmente sustituido, lineal o ramificado, en donde una o más unidades de metileno de L están opcionalmente e independientemente sustituidas con un alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenileno C1-C6 , -CeC- , -C(R')2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R')-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR')-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -N(R')C(O)O-, -OC(O)N(R')-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2N(R')-, -N(R')S(O)2-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(O)- o -C(O)O-;
R1 es halógeno, R, o un alifático C1-C50 opcionalmente sustituido, en donde una o más unidades de metileno están opcionalmente e independientemente sustituidas con un alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenileno C1-C6 , -CeC-, -C(R')2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R')-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR')-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -N(R')C(O)O-, -OC(O)N(R')-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2N(R')-, -N(R')S(O)2-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(O)- o -C(O)O-;
cada R' es independientemente -R, -C(O)R, -CO2 R o -SO2 R, o:
dos R' en el mismo nitrógeno se toman conjuntamente con sus átomos intermedios para formar un anillo heterocíclico o de heteroarilo opcionalmente sustituido, o
dos R' en el mismo carbono se toman conjuntamente con sus átomos intermedios para formar un anillo de arilo, carbocíclico, heterocíclico o de heteroarilo opcionalmente sustituido;
-Cy- es un anillo bivalente opcionalmente sustituido seleccionado de fenileno, carbociclileno, arileno, heteroarileno o heterociclileno;
cada R es independientemente hidrógeno, o un grupo opcionalmente sustituido seleccionado de alifático C1-C6 , fenilo, carbociclilo, arilo, heteroarilo o heterociclilo; y
cada
Figure imgf000032_0001
representa independientemente una conexión a un nucleósido.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado comprende uno o más enlaces internucleotídicos de fósforo modificados. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado comprende, por ejemplo, un enlace de fosforotioato o de triéster de fosforotioato. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado comprende un enlace de triéster de fosforotioato. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado comprende al menos dos enlaces de triéster de fosforotioato. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado comprende al menos tres enlaces de triéster de fosforotioato. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado comprende al menos cuatro enlaces de triéster de fosforotioato. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado comprende al menos cinco enlaces de triéster de fosforotioato. A modo de ejemplo, dichos enlaces internucleotídicos de fósforo modificados se describen más adelante en el presente documento.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado comprende diferentes enlaces internucleotídicos de fósforo. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado comprende al menos un enlace internucleotídico de diéster de fosfato y al menos un enlace internucleotídico modificado. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado comprende al menos un enlace internucleotídico de diéster de fosfato y al menos un enlace de triéster de fosforotioato. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado comprende al menos un enlace internucleotídico de diéster de fosfato y al menos dos enlaces de triéster de fosforotioato. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado comprende al menos un enlace internucleotídico de diéster de fosfato y al menos tres enlaces de triéster de fosforotioato. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado comprende al menos un enlace internucleotídico de diéster de fosfato y al menos cuatro enlaces de triéster de fosforotioato. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado comprende al menos un enlace internucleotídico de diéster de fosfato y al menos cinco enlaces de triéster de fosforotioato. A modo de ejemplo, dichos enlaces internucleotídicos de fósforo modificados se describen más adelante en el presente documento.
En algunas realizaciones, un enlace de triéster de fosforotioato comprende un auxiliar quiral, que, por ejemplo, se usa para controlar la estereoselectividad de una reacción. En algunas realizaciones, un enlace de triéster de fosforotioato no comprende un auxiliar quiral. En algunas realizaciones, un enlace de triéster de fosforotioato se mantiene intencionadamente hasta que y/o durante la administración a un sujeto.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado está unido a un soporte sólido. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado se escinde de un soporte sólido.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado comprende al menos un enlace internucleotídico de diéster de fosfato y al menos dos enlaces internucleotídicos modificados consecutivos. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado comprende al menos un enlace internucleotídico de diéster de fosfato y al menos dos enlaces internucleotídicos de triéster de fosforotioato consecutivos.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado es un blockmero. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado es un estereoblockmero. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado es un blockmero con modificación en P. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado es un blockmero de enlace.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado es un altmero. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado es un estereoaltmero. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado es un altmero de modificación en P. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado es un altmero de enlace.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado es un unímero. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado es un estereounímero. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado es un unímero de modificación en P. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado es un unímero de enlace.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado es un gápmero.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado es un skipmero.
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende uno o más enlaces internucleotídicos modificados independientemente que tiene la estructura de la fórmula I:
Figure imgf000033_0001
en donde:
P* es un átomo de fósforo asimétrico y es o Rp o Sp;
W es O, S o Se;
cada uno de X, Y y Z es independientemente -O-, -S-, -N(-L-R1)- o L;
L es un enlace covalente o un alquileno C1-C10 opcionalmente sustituido, lineal o ramificado, en donde una o más unidades de metileno de L están opcionalmente e independientemente sustituidas con un alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenileno C1-C6 , -CeC-, -C(R')2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R')-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR')-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -N(R')C(O)O-, -OC(O)N(R')-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2N(R')-, -N(R')S(O)2-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(O)- o -C(O)O-;
R1 es halógeno, R, o un alifático C1-C50 opcionalmente sustituido, en donde una o más unidades de metileno están opcionalmente e independientemente sustituidas con un alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenileno C1-C6 , -CeC-, -C(R')2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R')-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR')-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -N(R')C(O)O-, -OC(O)N(R')-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2N(R')-, -N(R')S(O)2-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(O)- o -C(O)O-;
cada R' es independientemente -R, -C(O)R, -CO2 R o -SO2 R, o:
dos R' en el mismo nitrógeno se toman conjuntamente con sus átomos intermedios para formar un anillo heterocíclico o de heteroarilo opcionalmente sustituido, o
dos R' en el mismo carbono se toman conjuntamente con sus átomos intermedios para formar un anillo de arilo, carbocíclico, heterocíclico o de heteroarilo opcionalmente sustituido;
-Cy- es un anillo bivalente opcionalmente sustituido seleccionado de fenileno, carbociclileno, arileno, heteroarileno o heterociclileno;
cada R es independientemente hidrógeno, o un grupo opcionalmente sustituido seleccionado de alifático C1-C6 , fenilo, carbociclilo, arilo, de heteroarilo o heterociclilo; y
cada representa independientemente una conexión a un nucleósido.
Como se define, en general, anteriormente y en el presente documento, P* es un átomo de fósforo asimétrico y es o Rp o Sp. En algunas realizaciones, P* es Rp. En otras realizaciones, P* es Sp. En algunas realizaciones, un oligonucleótido comprende uno o más enlaces internucleotídicos de la fórmula I en donde cada P* es independientemente Rp o Sp. En algunas realizaciones, un oligonucleótido comprende uno o más enlaces internucleotídicos de la fórmula I en donde cada P* es Rp. En algunas realizaciones, un oligonucleótido comprende uno o más enlaces internucleotídicos de la fórmula I en donde cada P* es Sp. En algunas realizaciones, un oligonucleótido comprende al menos un enlace internucleotídico de la fórmula I en donde P* es Rp. En algunas realizaciones, un oligonucleótido comprende al menos un enlace internucleotídico de la fórmula I en donde P* es Sp. En algunas realizaciones, un oligonucleótido comprende al menos un enlace internucleotídico de la fórmula I en donde P* es Rp, y al menos un enlace internucleotídico de la fórmula I en donde P* es Sp.
Como se define, en general, anteriormente y en el presente documento, W es O, S o Se. En algunas realizaciones, W es O. En algunas realizaciones, W es S. En algunas realizaciones, W es Se. En algunas realizaciones, un oligonucleótido comprende al menos un enlace internucleotídico de la fórmula I en donde W es O. En algunas realizaciones, un oligonucleótido comprende al menos un enlace internucleotídico de la fórmula I en donde W es S. En algunas realizaciones, un oligonucleótido comprende al menos un enlace internucleotídico de la fórmula I en donde W es Se.
Como se define, en general, anteriormente y en el presente documento, cada R es independientemente hidrógeno, o un grupo opcionalmente sustituido seleccionado de alifático C1-C6 , fenilo, carbociclilo, arilo, heteroarilo o heterociclilo.
En algunas realizaciones, R es hidrógeno. En algunas realizaciones, R es un grupo opcionalmente sustituido seleccionado de alifático C1-C6 , fenilo, carbociclilo, arilo, heteroarilo o heterociclilo.
En algunas realizaciones, R es un alifático C1-C6 opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R es un alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R es hexilo opcionalmente sustituido, lineal o ramificado. En algunas realizaciones, R es pentilo opcionalmente sustituido, lineal o ramificado. En algunas realizaciones, R es butilo opcionalmente sustituido, lineal o ramificado. En algunas realizaciones, R es propilo opcionalmente sustituido, lineal o ramificado. En algunas realizaciones, R es etilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R es metilo opcionalmente sustituido.
En algunas realizaciones, R es fenilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R es fenilo sustituido. En algunas realizaciones, R es fenilo.
En algunas realizaciones, R es carbociclilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R es carbociclilo C3-C10 opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R es carbociclilo monocíclico opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R es cicloheptilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R es ciclohexilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R es ciclopentilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R es ciclobutilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R es un ciclopropilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R es carbociclilo bicíclico opcionalmente sustituido.
En algunas realizaciones, R es un arilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R es un anillo de arilo bicíclico opcionalmente sustituido.
En algunas realizaciones, R es un heteroarilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R es un anillo de heteroarilo monocíclico de 5-6 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1-3 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, azufre u oxígeno. En algunas realizaciones, R es un anillo de heteroarilo monocíclico de 5-6 miembros sustituido que tiene 1-3 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre. En algunas realizaciones, R es un es un anillo de heteroarilo monocíclico de 5-6 miembros sin sustituir que tiene 1-3 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, azufre u oxígeno.
En algunas realizaciones, R es un anillo de heteroarilo monocíclico de 5 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1-3 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre. En algunas realizaciones, R es un anillo de heteroarilo monocíclico de 6 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1-3 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre.
En algunas realizaciones, R es un anillo de heteroarilo monocíclico de 5 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1 heteroátomo seleccionado de nitrógeno, oxígeno o azufre. En algunas realizaciones, R se selecciona de pirrolilo, furanilo o tienilo.
En algunas realizaciones, R es un anillo de heteroarilo de 5 miembros opcionalmente sustituido que tiene 2 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre. En ciertas realizaciones, R es un anillo de heteroarilo de 5 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1 átomo de nitrógeno, y un heteroátomo adicional seleccionado de azufre u oxígeno. Los grupos R a modo de ejemplo incluyen pirazolilo, imidazolilo, tiazolilo, isotiazolilo, oxazolilo o isoxazolilo opcionalmente sustituido.
En algunas realizaciones, R es un anillo de heteroarilo de 6 miembros que tiene 1-3 átomos de nitrógeno. En otras realizaciones, R es un anillo de heteroarilo de 6 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1 -2 átomos de nitrógeno. En algunas realizaciones, R es un anillo de heteroarilo de 6 miembros opcionalmente sustituido que tiene 2 átomos de nitrógeno. En ciertas realizaciones, R es un anillo de heteroarilo de 6 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1 nitrógeno. Los grupos R a modo de ejemplo incluyen piridinilo, pirimidinilo, pirazinilo, piridazinilo, triazinilo o tetrazinilo opcionalmente sustituido.
En ciertas realizaciones, R es un anillo de heteroarilo bicíclico de 8-10 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1-4 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre. En algunas realizaciones, R es un anillo de heteroarilo 5,6-condensado opcionalmente sustituido que tiene 1-4 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre. En otras realizaciones, R es un anillo de heteroarilo 5,6-condensado opcionalmente sustituido que tiene 1-2 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre. En ciertas realizaciones, R es un anillo de heteroarilo 5,6-condensado opcionalmente sustituido que tiene 1 heteroátomo independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre. En algunas realizaciones, R es un indolilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R es un azabiciclo[3.2.1]octanilo opcionalmente sustituido. En ciertas realizaciones, R es un anillo de heteroarilo 5,6-condensado opcionalmente sustituido que tiene 2 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre. En algunas realizaciones, R es un azaindolilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R es un bencimidazolilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R es un benzotiazolilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R es un benzoxazolilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R es un indazolilo opcionalmente sustituido. En ciertas realizaciones, R es un anillo de heteroarilo 5,6-condensado opcionalmente sustituido que tiene 3 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre.
En ciertas realizaciones, R es un anillo de heteroarilo 6,6-condensado opcionalmente sustituido que tiene 1-4 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre. En algunas realizaciones, R es un anillo de heteroarilo 6,6-condensado opcionalmente sustituido que tiene 1-2 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre. En otras realizaciones, R es un anillo de heteroarilo 6,6-condensado opcionalmente sustituido que tiene 1 heteroátomo independientemente seleccionado de nitrógeno, oxígeno o azufre. En algunas realizaciones, R es un quinolinilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R es un isoquinolinilo opcionalmente sustituido. Según un aspecto, R es un anillo de heteroarilo 6,6-condensado opcionalmente sustituido que tiene 2 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre. En algunas realizaciones, R es una quinazolina o una quinoxalina.
En algunas realizaciones, R es un heterociclilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R es un anillo heterocíclico saturado o parcialmente insaturado de 3-7 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1-2 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre. En algunas realizaciones, R es un anillo heterocíclico saturado o parcialmente insaturado de 3-7 miembros sustituido que tiene 1-2 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre. En algunas realizaciones, R es un anillo heterocíclico saturado o parcialmente insaturado de 3-7 miembros sin sustituir que tiene 1-2 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre.
En algunas realizaciones, R es un heterociclilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R es un anillo heterocíclico saturado o parcialmente insaturado de 6 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1-2 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre. En algunas realizaciones, R es un anillo heterocíclico parcialmente insaturado de 6 miembros opcionalmente sustituido que tiene 2 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre. En algunas realizaciones, R es un anillo heterocíclico parcialmente insaturado de 6 miembros opcionalmente sustituido que tiene 2 átomos de oxígeno.
En ciertas realizaciones, R es un anillo heterocíclico saturado o parcialmente insaturado de 3-7 miembros que tiene 1 -2 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre. En ciertas realizaciones, R es oxiranilo, oxetanilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, oxepanoílo, aziridinoílo, azetidinoílo, pirrolidinilo, piperidinilo, azepanilo, tiiranilo, tietanilo, tetrahidrotiofenilo, tetrahidrotiopiranilo, tiepanilo, dioxolanilo, oxatiolanilo, oxazolidinilo, imidazolidinilo, tiazolidinilo, ditiolanilo, dioxanilo, morfolinilo, oxatianilo, piperazinilo, tiomorfolinilo, ditianilo, dioxepanilo, oxazepanilo, oxatiepanilo, ditiepanilo, diazepanilo, dihidrofuranonilo, tetrahidropiranonilo, oxepanonilo, pirolidinonilo, piperidinonilo, azepanonilo, dihidrotiofenonilo, tetrahidrotiopiranonilo, thiepanonilo, oxazolidinonilo, oxazinanonilo, oxazepanonilo, dioxolanonilo, dioxanonilo, dioxepanonilo, oxatiolinonilo, oxatianonilo, oxatiepanonilo, tiazolidinonilo, tiazinanonilo, tiazepanonilo, imidazolidinonilo, tetrahidropirimidinonilo, diazepanonilo, imidazolidinadionilo, oxazolidinadionilo, tiazolidinadionilo, dioxolanedionilo, oxatiolanedionilo, piperazinadionilo, morfolinadionilo, tiomorfolinadionilo, tetrahidropiranilo, tetrahidrofuranilo, morfolinilo, tiomorfolinilo, piperidinilo, piperazinilo, pirrolidinilo, tetrahidrotiofenilo o tetrahidrotiopiranilo. En algunas realizaciones, R es un anillo heterocíclico saturado o parcialmente insaturado de 5 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1-2 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre.
En ciertas realizaciones, R es un anillo monocíclico parcialmente insaturado de 5-6 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1-2 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre. En ciertas realizaciones, R es un grupo tetrahidropiridinilo, dihidrotiazolilo, dihidrooxazolilo u oxazolinilo opcionalmente sustituido.
En algunas realizaciones, R es un anillo heterocíclico bicíclico saturado o parcialmente insaturado de 8-10 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1-4 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre. En algunas realizaciones, R es un indolinilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R es un isoindolinilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R es una 1, 2, 3, 4-tetrahidroquinolina opcionalmente sustituida. En algunas realizaciones, R es una 1, 2, 3, 4-tetrahidroisoquinolina opcionalmente sustituida.
Como se define, en general, anteriormente y en el presente documento, cada R' es independientemente -R, -C(O)R, -CO2 R o -SO2 R, o:
dos R' en el mismo nitrógeno se toman conjuntamente con sus átomos intermedios para formar un anillo heterocíclico o de heteroarilo opcionalmente sustituido, o
dos R' en el mismo carbono se toman conjuntamente con sus átomos intermedios para formar un anillo de arilo, carbocíclico, heterocíclico o de heteroarilo opcionalmente sustituido.
En algunas realizaciones, R' es -R, -C(O)R, -CO2 R o -SO2 R, en donde R es como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, R' es -R, en donde R es como se ha definido y se describe anteriormente y en el presente documento. En algunas realizaciones, R' es hidrógeno.
En algunas realizaciones, R' es -C(O)R, en donde R es como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, R' es -CO2 R, en donde R es como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, R' es -SO2 R, en donde R es como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, dos R' en el mismo nitrógeno se toman conjuntamente con sus átomos intermedios para formar un anillo heterocíclico o de heteroarilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, dos R' en el mismo carbono se toman conjuntamente con sus átomos intermedios para formar un anillo de arilo, carbocíclico, heterocíclico o de heteroarilo opcionalmente sustituido.
Como se define, en general, anteriormente y en el presente documento, -Cy- es un anillo bivalente opcionalmente sustituido seleccionado de fenileno, carbociclileno, arileno, heteroarileno o heterociclileno.
En algunas realizaciones, -Cy- es fenileno opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, -Cy- es carbociclileno opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, -Cy- es arileno opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, -Cy- es heteroarileno opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, -Cy- es heterociclileno opcionalmente sustituido.
Como se define, en general, anteriormente y en el presente documento, cada uno de X, Y y Z es independientemente -O-, -S-, -N(-L-R1)- o L, en donde cada uno de L y R1 es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe a continuación.
En algunas realizaciones, X es -O-. En algunas realizaciones, X es -S-. En algunas realizaciones, X es -O- o -S-. En algunas realizaciones, un oligonucleótido comprende al menos un enlace internucleotídico de la fórmula I en donde X es -O-. En algunas realizaciones, un oligonucleótido comprende al menos un enlace internucleotídico de la fórmula I en donde X es -S-. En algunas realizaciones, un oligonucleótido comprende al menos un enlace internucleotídico de la fórmula I en donde X es -O-, y al menos un enlace internucleotídico de la fórmula I en donde X es -S-. En algunas realizaciones, un oligonucleótido comprende al menos un enlace internucleotídico de la fórmula I en donde X es -O-, y al menos un enlace internucleotídico de la fórmula I en donde X es -S-, y al menos un enlace internucleotídico de la fórmula I en donde L es un alquileno C1-C10 opcionalmente sustituido, lineal o ramificado, en donde una o más unidades de metileno de L están opcionalmente e independientemente sustituidas con un alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenileno C1-C6 , -CeC-, -C(R')2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R')-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR')-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -N(R')C(O)O-, -OC(O)N(R')-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2N(R')-, -N(R')S(O)2-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(O)- o -C(O)O-.
En algunas realizaciones, X es -N(-L-R1)-. En algunas realizaciones, X es -N(R1)-. En algunas realizaciones, X es -N(R')-. En algunas realizaciones, X es -N(R)-. En algunas realizaciones, X es -NH-.
En algunas realizaciones, X es L. En algunas realizaciones, X es un enlace covalente. En algunas realizaciones, X es o un alquileno C1-C10 opcionalmente sustituido, lineal o ramificado, en donde una o más unidades de metileno de L están opcionalmente e independientemente sustituidas con un alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenileno C1-C6 , -CeC-, -C(R')2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R')-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR')-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -N(R')C(O)O-, -OC(O)N(R')-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2N(R')-, -N(R')S(O)2-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(O)- o -C(O)O-. En algunas realizaciones, X es alquileno C1-C10 opcionalmente sustituido o alquenileno C1-C10. En algunas realizaciones, X es metileno.
En algunas realizaciones, Y es -O-. En algunas realizaciones, Y es -S-.
En algunas realizaciones, Y es -N(-L-R1)-. En algunas realizaciones, Y es -N(R1)-. En algunas realizaciones, Y es -N(R')-. En algunas realizaciones, Y es -N(R)-. En algunas realizaciones, Y es -NH-.
En algunas realizaciones, Y es L. En algunas realizaciones, Y es un enlace covalente. En algunas realizaciones, Y es o un alquileno C1-C10 opcionalmente sustituido, lineal o ramificado, en donde una o más unidades de metileno de L están opcionalmente e independientemente sustituidas con un alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenileno C1-C6 , -CeC-, -C(R')2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R')-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR')-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -N(R')C(O)O-, -OC(O)N(R')-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2N(R')-, -N(R')S(O)2-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(O)- o -C(O)O-. En algunas realizaciones, Y es un alquileno C1-C10 opcionalmente sustituido o alquenileno C1-C10. En algunas realizaciones, Y es metileno.
En algunas realizaciones, Z es -O-. En algunas realizaciones, Z es -S-.
En algunas realizaciones, Z es -N(-L-R1)-. En algunas realizaciones, Z es -N(R1)-. En algunas realizaciones, Z es -N(R')-. En algunas realizaciones, Z es -N(R)-. En algunas realizaciones, Z es -NH-.
En algunas realizaciones, Z es L. En algunas realizaciones, Z es un enlace covalente. En algunas realizaciones, Z es o un alquileno C1-C10 opcionalmente sustituido, lineal o ramificado, en donde una o más unidades de metileno de L están opcionalmente e independientemente sustituidas con un alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenileno C1-C6 , -CEC-, -C(R')2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R')-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR')-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -N(R')C(O)O-, -OC(O)N(R')-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2N(R')-, -N(R')S(O)2-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(O)- o -C(O)O-. En algunas realizaciones, Z es un alquileno C1-C10 opcionalmente sustituido o alquenileno C1-C10. En algunas realizaciones, Z es metileno.
Como se define, en general, anteriormente y en el presente documento, L es un enlace covalente o un alquileno C1-C10 opcionalmente sustituido, lineal o ramificado, en donde una o más unidades de metileno de L están opcionalmente e independientemente sustituidas con un alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenileno C1-C6 , -CeC-, -C(R')2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R')-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR')-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -N(R')C(O)O-, -OC(O)N(R')-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2N(R')-, -N(R')S(O)2-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(O)- o -C(O)O-.
En algunas realizaciones, L es un enlace covalente. En algunas realizaciones, L es un alquileno C1-C10 opcionalmente sustituido, lineal o ramificado, en donde una o más unidades de metileno de L están opcionalmente e independientemente sustituidas con un alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenileno C1-C6 , -CeC-, -C(R')2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R')-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR')-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -N(R')C(O)O-, -OC(O)N(R')-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2N(R')-, -N(R')S(O)2-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(O)- o -C(O)O-.
En algunas realizaciones, L tiene la estructura de -L1-V-, en donde:
L1 es un grupo opcionalmente sustituido seleccionado de
Figure imgf000038_0001
alquileno C1-C6 , alquenileno C1-C6 , carbociclileno, arileno, heteroalquileno C1-C6 , heterociclileno y heteroarileno; V se selecciona de -O-, -S-, -NR'-, C(R')2 , -S-S-, -B-S-S-C-,
Figure imgf000038_0002
o un grupo opcionalmente sustituido seleccionado de alquileno C1-C6 , arileno, heteroalquileno C1-C6 , heterociclileno y heteroarileno;
A es =O, =S, =NR' o =C(R>;
cada uno de B y C es independientemente -O-, -S-, -NR'-, -C(R')2-, o un grupo opcionalmente sustituido seleccionado de alquileno C1-C6 , carbociclileno, arileno, heterociclileno o heteroarileno; y
cada R' es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, L1 es
Figure imgf000038_0003
En algunas realizaciones, L1 es
Figure imgf000038_0004
en donde el anillo Cy' es un arileno, carbociclileno, heteroarileno o heterociclileno opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, L1 es opcionalmente sustituido
Figure imgf000038_0005
En algunas realizaciones, L1 es
Figure imgf000038_0006
En algunas realizaciones, L1 está conectado a X. En algunas realizaciones, L1 es un grupo opcionalmente sustituido seleccionado de
Figure imgf000039_0001
y el átomo de azufre está conectado con V. En algunas realizaciones, L1 es un grupo opcionalmente sustituido seleccionado de
Figure imgf000039_0002
y el átomo de carbono está conectado con X.
En algunas realizaciones, L tiene la estructura de:
Figure imgf000039_0003
en donde:
E es -O-, -S-, -NR'- o -C(R')2-;
===== es un enlace sencillo o doble;
los dos RL1 se toman conjuntamente con los dos átomos de carbono a los que están unidos para formar un anillo de arilo, carbocíclico, de heteroarilo o heterocíclico opcionalmente sustituido; y cada R' es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, L tiene la estructura de:
Figure imgf000039_0004
en donde:
G es -O-, -S- o -NR';
^ ^ .e s un único o doble enlace; y
los dos RL1 se toman conjuntamente con los dos átomos de carbono a los que están unidos para formar un anillo de arilo, carbocíclico C3-C10, heteroarilo o heterocíclico opcionalmente sustituido.
En algunas realizaciones, L tiene la estructura de:
Figure imgf000040_0001
en donde:
E es -O-, -S-, -NR'- o -C(R')2-;
D es =N-, =C(F)-, =C(Cl)-, =C(Br)-, =C(I)-, =C(CN)-, =C(NO2)-, =C(CO2-(alifático C1-C6))- o =C(CF3)-; y cada R' es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, L tiene la estructura de:
Figure imgf000040_0002
en donde:
G es -O-, -S- o -NR';
D es =N-, =C(F)-, =C(Cl)-, =C(Br)-, =C(I)-, =C(CN)-, =C(NO2)-, =C(CO2-(alifático C1-C6))- o =C(CF3)-.
En algunas realizaciones, L tiene la estructura de:
Figure imgf000040_0003
en donde:
E es -O-, -S-, -NR'- o -C(R')2-;
D es =N-, =C(F)-, =C(Cl)-, =C(Br)-, =C(I)-, =C(CN)-, =C(NO2)-, =C(CO2-(alifático C1-C6))- o =C(CF3)-; y cada R' es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, L tiene la estructura de:
Figure imgf000040_0004
en donde:
G es -O-, -S- o -NR';
D es =N-, =C(F)-, =C(Cl)-, =C(Br)-, =C(I)-, =C(CN)-, =C(NO2)-, =C(CO2-(alifático C1-C6))- o =C(CF3)-.
En algunas realizaciones, L tiene la estructura de:
Figure imgf000040_0005
en donde:
E es -O-, -S-, -NR'- o -C(R')2-;
es un enlace sencillo o doble;
los dos RL1 se toman conjuntamente con los dos átomos de carbono a los que están unidos para formar un anillo de arilo, carbocíclico C3-C10, de heteroarilo o heterocíclico opcionalmente sustituido;
y cada R' es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, L tiene la estructura de:
Figure imgf000041_0001
en donde:
G es -O-, -S- o -NR';
es un enlace sencillo o doble;
los dos RL1 se toman conjuntamente con los dos átomos de carbono a los que están unidos para formar un anillo de arilo, carbocíclico C3-C10, de heteroarilo o heterocíclico opcionalmente sustituido;
y cada R' es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, L tiene la estructura de:
Figure imgf000041_0002
en donde:
E es -O-, -S-, -NR'- o -C(R')2-;
D es =N-, =C(F)-, =C(Cl)-, =C(Br)-, =C(I)-, =C(CN)-, =C(NO2)-, =C(CO2-(alifático C1-C6))- o =C(CF3)-; y cada R' es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, L tiene la estructura de:
Figure imgf000041_0003
en donde:
G es -O-, -S- o -NR';
D es =N-, =C(F)-, =C(Cl)-, =C(Br)-, =C(I)-, =C(CN)-, =C(NO2)-, =C(CO2-(alifático C1-C6))- o =C(CF3)-; y cada R' es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, L tiene la estructura de:
Figure imgf000042_0001
en donde:
E es -O-, -S-, -NR'- o -C(R')2-;
D es =N-, =C(F)-, =C(Cl)-, =C(Br)-, =C(I)-, =C(CN)-, =C(NO2)-, =C(CO2-(alifático C1-C6))- o =C(CF3)-; y cada R' es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, L tiene la estructura de:
Figure imgf000042_0002
en donde:
G es -O-, -S- o -NR';
D es =N-, =C(F)-, =C(Cl)-, =C(Br)-, =C(I)-, =C(CN)-, =C(NO2)-, =C(CO2-(alifático C1-C6))- o =C(CF3)-; y cada R' es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, L tiene la estructura de:
Figure imgf000042_0003
en donde:
E es -O-, -S-, -NR'- o -C(R')2-;
es un enlace sencillo o doble;
los dos RL1 se toman conjuntamente con los dos átomos de carbono a los que están unidos para formar un anillo de arilo, carbocíclico C3-C10, de heteroarilo o heterocíclico opcionalmente sustituido; y cada R' es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, L tiene la estructura de:
Figure imgf000042_0004
en donde:
G es -O-, -S- o -NR';
es un enlace sencillo o doble;
los dos RL1 se toman conjuntamente con los dos átomos de carbono a los que están unidos para formar un anillo de arilo, carbocíclico C3-C10, de heteroarilo o heterocíclico opcionalmente sustituido; y cada R' es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, L tiene la estructura de:
Figure imgf000043_0001
en donde:
E es -O-, -S-, -NR'- o -C(R')2-;
D es =N-, =C(F)-, =C(Cl)-, =C(Br)-, =C(I)-, =C(CN)-, =C(NO2)-, =C(CO2-(alifático C1-C6))- o =C(CF3)-; y cada R' es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, L tiene la estructura de:
Figure imgf000043_0002
en donde:
G es -O-, -S- o -NR';
D es =N-, =C(F)-, =C(Cl)-, =C(Br)-, =C(I)-, =C(CN)-, =C(NO2)-, =C(CO2-(alifático C1-C6))- o =C(CF3)-; y R' es como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, L tiene la estructura de:
Figure imgf000043_0003
en donde:
E es -O-, -S-, -NR'- o -C(R')2-;
D es =N-, =C(F)-, =C(Cl)-, =C(Br)-, =C(I)-, =C(CN)-, =C(NO2)-, =C(CO2-(alifático C1-C6))- o =C(CF3)-; y cada R' es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, L tiene la estructura de:
Figure imgf000043_0004
en donde:
G es -O-, -S- o-NR';
D es =N-, =C(F)-, =C(Cl)-, =C(Br)-, =C(I)-, =C(CN)-, =C(NO2)-, =C(CO2-(alifático C1-C6))- o =C(CF3)-; y R' es como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, L tiene la estructura de:
Figure imgf000044_0001
en donde el anillo de fenilo está opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, el anillo de fenilo no está sustituido. En algunas realizaciones, el anillo de fenilo está sustituido.
En algunas realizaciones, L tiene la estructura de:
Figure imgf000044_0002
en donde el anillo de fenilo está opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, el anillo de fenilo no está sustituido. En algunas realizaciones, el anillo de fenilo está sustituido.
En algunas realizaciones, L tiene la estructura de:
Figure imgf000044_0003
en donde:
es un enlace sencillo o doble; y
los dos RL1 se toman conjuntamente con los dos átomos de carbono a los que están unidos para formar un anillo de arilo, carbocíclico C3-C10, de heteroarilo o heterocíclico opcionalmente sustituido.
En algunas realizaciones, L tiene la estructura de:
Figure imgf000044_0004
en donde:
G es -O-, -S- o -NR';
es un enlace sencillo o doble; y
los dos RL1 se toman conjuntamente con los dos átomos de carbono a los que están unidos para formar un anillo de arilo, carbocíclico C3-C10, de heteroarilo o heterocíclico opcionalmente sustituido.
Como se define, en general, anteriormente y en el presente documento, E es -O-, -S-, -NR'- o -C(R')2-, en donde cada R' es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, E es -O-, -S- o -NR'-. En algunas realizaciones, E es -O-, -S- o -NH-. En algunas realizaciones, E es -O-. En algunas realizaciones, E es -S-. En algunas realizaciones, E es -NH-.
Como se define, en general, anteriormente y en el presente documento, G es -O-, -S- o -NR', en donde cada R' es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, G es -O-, -S- o -NH-. En algunas realizaciones, G es -O-. En algunas realizaciones, G es -S-. En algunas realizaciones, G es -NH-.
En algunas realizaciones, L es -L3-G-, en donde:
L3 es un alquileno o alquenileno C1-C5 opcionalmente sustituido, en donde una o más unidades de metileno están opcionalmente e independientemente sustituidas con -O-, -S-, -N(R')-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR')-, -S(O)-, -S(O)2- o
Figure imgf000045_0001
y
en donde cada uno de G, R' y el anillo Cy' es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, L es -L3-S-, en donde L3 es como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, L es -L3-O-, en donde L3 es como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, L es -L3-N(R')-, en donde cada uno de L3 y R' es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, L es -L3-NH-, en donde cada uno de L3 y R' es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, L3 es un alquileno o alquenileno C5 opcionalmente sustituido, en donde una o más unidades de metileno están opcionalmente e independientemente sustituidas con -O-, -S-, -N(R')-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR')-, -S(O)-, -S(O)2- o
Figure imgf000045_0002
y cada uno de R' y el anillo Cy' es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, L3 es un alquileno C5 opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, -L3-G- es
Figure imgf000045_0003
En algunas realizaciones, L3 es un alquileno o alquenileno C4 opcionalmente sustituido, en donde una o más unidades de metileno están opcionalmente e independientemente sustituidas con -O-, -S-, -N(R')-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR')-, -S(O)-, -S(O)2- o
Figure imgf000045_0004
y cada uno de R' y Cy' es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, -L3-G- es
Figure imgf000045_0005
En algunas realizaciones, L3 es un alquileno o alquenileno C3 opcionalmente sustituido, en donde una o más unidades de metileno están opcionalmente e independientemente sustituidas con -O-, -S-, -N(R')-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR')-, -S(O)-, -S(O)2-, o
Figure imgf000045_0006
y cada uno de R' y Cy' es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, -L3-G- es
Figure imgf000046_0001
En algunas realizaciones, L es
Figure imgf000046_0002
En algunas realizaciones, L es
Figure imgf000046_0003
En algunas realizaciones, L es
Figure imgf000046_0004
En algunas realizaciones, L3 es un alquileno o alquenileno C2 opcionalmente sustituido, en donde una o más unidades de metileno están opcionalmente e independientemente sustituidas con -O-, -S-, -N(R')-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR')-, -S(O)-, -S(O)2- o
Figure imgf000046_0005
y cada uno de R' y Cy' es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, -L3-G- es
Figure imgf000046_0006
en donde cada uno de G y Cy' es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, L es
Figure imgf000046_0007
En algunas realizaciones, L es -L4-G-, en donde L4 es un alquileno C1-C2 opcionalmente sustituido; y G es como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, L es -L4-G-, en donde L4 es un alquileno C1-C2 opcionalmente sustituido; G es como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento; y G está conectado a R1. En algunas realizaciones, L es -L4-G-, en donde L4 es un metileno opcionalmente sustituido; G es como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento; y G está conectado a R1. En algunas realizaciones, L es -L4-G-, en donde L4 es metileno; G es como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento; y G está conectado a R1. En algunas realizaciones, L es -L4-G-, en donde L4 es un -(CH2)2-opcionalmente sustituido; G es como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento; y G está conectado a R1. En algunas realizaciones, L es -L4-G-, en donde L4 es -(CH2)2-; G es como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento; y G está conectado a R1.
En algunas realizaciones, L es
Figure imgf000047_0001
en donde G es como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento, y G está conectado a R1. En algunas realizaciones, L es
Figure imgf000047_0002
en donde G es como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento, y G está conectado a R1. En algunas realizaciones, L es
Figure imgf000047_0003
en donde G es como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento, y G está conectado a R1. En algunas realizaciones, L es
Figure imgf000047_0004
en donde el átomo de azufre está conectado a R1. En algunas realizaciones, L es
Figure imgf000047_0005
en donde el átomo de oxígeno está conectado a R1.
En algunas realizaciones, L es
Figure imgf000047_0006
en donde G es como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, L es -S-RL3- o -S-C(O)-RL3-, en donde RL3 es un alquileno C1-C9 opcionalmente sustituido, lineal o ramificado, en donde una o más unidades de metileno están opcionalmente e independientemente sustituidas con un alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenileno C1-C6 , -C=C-, -C(R')2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R')-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR')-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -N(R')C(O)O-, -OC(O)N(R')-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2 N(R')-, -N(R')S(O)2-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(O)- o -C(O)O-, en donde cada uno de R' y -Cy- es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, L es -S-RL3- o -S-C(O)-RL3-, en donde RL3 es un alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, L es -S-RL3- o -S-C(O)-RL3-, en donde RL3 es un alquenileno C1-C6 opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, L es -S-RL3- o -S-C(O)-RL3-, en donde RL3 es un alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, en donde una o más unidades de metileno están opcionalmente e independientemente sustituidas con un alquenileno C1-C6 , arileno o heteroarileno opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, En algunas realizaciones, RL3 es un -S-(alquenilen C1-C6)-, -S-(alquilen C1-C6)-, -S-(alquilen C1-C6)-arilen-(alquilen C1-C6)-, -S-CO-arilen-(alquilen C1-C6)- o -S-CO-(alquilen C1-C6)-arilen-(alquilen C1-C6)- opcionalmente sustituido.
En algunas realizaciones, L es
Figure imgf000047_0007
En algunas realizaciones, L es
Figure imgf000048_0001
En algunas realizaciones, L es
Figure imgf000048_0002
En algunas realizaciones,
Figure imgf000048_0003
En algunas realizaciones, el átomo de azufre en las realizaciones de L descritas anteriormente y en el presente documento está conectado a X. En algunas realizaciones, el átomo de azufre en las realizaciones de L descritas anteriormente y en el presente documento está conectado a R1.
Como se define, en general, anteriormente y en el presente documento, R1 es halógeno, R, o un alifático C1-C50 opcionalmente sustituido, en donde una o más unidades de metileno están opcionalmente e independientemente sustituidas con un alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenileno C1-C6 , -C=C-, -C(R')2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R')-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR')-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -N(R')C(O)O-, -OC(O)N(R')-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2N(R')-, -N(R')S(O)2-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(O)- o -C(O)O-, en donde cada variable es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, R1 es halógeno, R, o un alifático C1-C10 opcionalmente sustituido, en donde una o más unidades de metileno están opcionalmente e independientemente sustituidas con un alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenileno C1-C6 , -C=C- , -C(R>-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R')-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR')-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -N(R')C(O)O-, -OC(O)N(R')-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2N(R')-, -N(R')S(O)2-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(O)- o -C(O)O-, en donde cada variable es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, R1 es hidrógeno. En algunas realizaciones, R1 es halógeno. En algunas realizaciones, R1 es -F. En algunas realizaciones, R1 es -Cl. En algunas realizaciones, R1 es -Br. En algunas realizaciones, R1 es -I. En algunas realizaciones, R1 es R en donde R es como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, R1 es hidrógeno. En algunas realizaciones, R1 es un grupo opcionalmente sustituido seleccionado de alifático C1-C50, fenilo, carbociclilo, arilo, heteroarilo o heterociclilo.
En algunas realizaciones, R1 es un alifático C1-C50 opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R1 es un alifático C1-C10 opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R1 es un alifático C1-C6 opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R1 es un alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R1 es hexilo opcionalmente sustituido, lineal o ramificado. En algunas realizaciones, R1 es pentilo opcionalmente sustituido, lineal o ramificado. En algunas realizaciones, R1 es butilo opcionalmente sustituido, lineal o ramificado. En algunas realizaciones, R1 es propilo opcionalmente sustituido, lineal o ramificado. En algunas realizaciones, R1 es etilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R1 es metilo opcionalmente sustituido.
En algunas realizaciones, R1 es fenilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R1 es fenilo sustituido. En algunas realizaciones, R1 es fenilo.
En algunas realizaciones, R1 es carbociclilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R1 es carbociclilo C3-C10 opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R1 es carbociclilo monocíclico opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R1 es cicloheptilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R1 es ciclohexilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R1 es ciclopentilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R1 es ciclobutilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R1 es un ciclopropilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R1 es carbociclilo bicíclico opcionalmente sustituido.
En algunas realizaciones, R1 es un hidrocarburo policíclico C1-C50 opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R1 es un hidrocarburo policíclico C1-C50 opcionalmente sustituido, en donde una o más unidades de metileno están opcionalmente e independientemente sustituidas con un alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenileno C1-C6 , -C=C-, -C(R')2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R')-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR')-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -N(R')C(O)O-, -OC(O)N(R')-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2N(R')-, -N(R')S(O)2-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(O)- o -C(O)O-, en donde cada variable es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, R1 es opcionalmente sustituido
Figure imgf000048_0004
En algunas realizaciones, R1 es
Figure imgf000049_0001
En algunas realizaciones, R1 es opcionalmente sustituido
Figure imgf000049_0002
En algunas realizaciones, R1 es un alifático C1-C50 opcionalmente sustituido que comprende uno o más restos de hidrocarburo policíclico opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R1 es un alifático C1-C50 opcionalmente sustituido que comprende uno o más restos de hidrocarburo policíclico opcionalmente sustituido, en donde una o más unidades de metileno están opcionalmente e independientemente sustituidas con un alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenileno C1-C6 , -C=C-, -C(R')2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R')-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR')-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -N(R')C(O)O-, -OC(O)N(R')-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2N(R')-, -N(R')S(O)2-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(O)- o -C(O)O-, en donde cada variable es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, R1 es un alifático C1-C50 opcionalmente sustituido que comprende uno o más opcionalmente sustituido
Figure imgf000049_0006
En algunas realizaciones, R1 es
Figure imgf000049_0003
En algunas realizaciones, R1 es
Figure imgf000049_0004
En algunas realizaciones, R1 es
Figure imgf000049_0005
En algunas realizaciones, R1 es
Figure imgf000050_0001
En algunas realizaciones, R1 es
Figure imgf000050_0002
En algunas realizaciones, R1 es un arilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R1 es un anillo de arilo bicíclico opcionalmente sustituido.
En algunas realizaciones, R1 es un heteroarilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R1 es un anillo de heteroarilo monocíclico de 5-6 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1-3 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, azufre u oxígeno. En algunas realizaciones, R1 es un anillo de heteroarilo monocíclico de 5-6 miembros sustituido que tiene 1-3 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre. En algunas realizaciones, R1 es un anillo de heteroarilo monocíclico de 5-6 miembros sin sustituir que tiene 1­ 3 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, azufre u oxígeno.
En algunas realizaciones, R1 es un anillo de heteroarilo monocíclico de 5 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1-3 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre. En algunas realizaciones, R1 es un anillo de heteroarilo monocíclico de 6 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1-3 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre.
En algunas realizaciones, R1 es un anillo de heteroarilo monocíclico de 5 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1 heteroátomo seleccionado de nitrógeno, oxígeno o azufre. En algunas realizaciones, R1 se selecciona de pirrolilo, furanilo o tienilo.
En algunas realizaciones, R1 es un anillo de heteroarilo de 5 miembros opcionalmente sustituido que tiene 2 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre. En ciertas realizaciones, R1 es un anillo de heteroarilo de 5 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1 átomo de nitrógeno, y un heteroátomo adicional seleccionado de azufre u oxígeno. Los grupos R1 a modo de ejemplo incluyen pirazolilo, imidazolilo, tiazolilo, isotiazolilo, oxazolilo o isoxazolilo opcionalmente sustituido.
En algunas realizaciones, R1 es un anillo de heteroarilo de 6 miembros que tiene 1-3 átomos de nitrógeno. En otras realizaciones, R1 es un anillo de heteroarilo de 6 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1-2 átomos de nitrógeno. En algunas realizaciones, R1 es un anillo de heteroarilo de 6 miembros opcionalmente sustituido que tiene 2 átomos de nitrógeno. En ciertas realizaciones, R1 es un anillo de heteroarilo de 6 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1 nitrógeno. Los grupos R1 a modo de ejemplo incluyen piridinilo, pirimidinilo, pirazinilo, piridazinilo, triazinilo o tetrazinilo opcionalmente sustituido.
En ciertas realizaciones, R1 es un anillo de heteroarilo bicíclico de 8-10 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1-4 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre. En algunas realizaciones, R1 es un anillo de heteroarilo 5,6-condensado opcionalmente sustituido que tiene 1-4 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre. En otras realizaciones, R1 es un anillo de heteroarilo 5,6-condensado opcionalmente sustituido que tiene 1-2 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre. En ciertas realizaciones, R1 es un anillo de heteroarilo 5,6-condensado opcionalmente sustituido que tiene 1 heteroátomo independientemente seleccionado de nitrógeno, oxígeno o azufre. En algunas realizaciones, R1 es un indolilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R1 es un azabiciclo[3.2.1]octanilo opcionalmente sustituido. En ciertas realizaciones, R1 es un anillo de heteroarilo 5,6-condensado opcionalmente sustituido que tiene 2 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre. En algunas realizaciones, R1 es un azaindolilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R1 es un bencimidazolilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R1 es un benzotiazolilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R1 es un benzoxazolilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R1 es un indazolilo opcionalmente sustituido. En ciertas realizaciones, R1 es un anillo de heteroarilo 5,6-condensado opcionalmente sustituido que tiene 3 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre.
En ciertas realizaciones, R1 es un anillo de heteroarilo 6,6-condensado opcionalmente sustituido que tiene 1-4 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre. En algunas realizaciones, R1 es un anillo de heteroarilo 6,6-condensado opcionalmente sustituido que tiene 1-2 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre. En otras realizaciones, R1 es un anillo de heteroarilo 6,6-condensado opcionalmente sustituido que tiene 1 heteroátomo independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre. En algunas realizaciones, R1 es un quinolinilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R1 es un isoquinolinilo opcionalmente sustituido. Según un aspecto, R1 es un anillo de heteroarilo 6,6-condensado opcionalmente sustituido que tiene 2 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre. En algunas realizaciones, R1 es una quinazolina o una quinoxalina.
En algunas realizaciones, R1 es un heterociclilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R1 es un anillo heterocíclico saturado o parcialmente insaturado de 3-7 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1-2 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre. En algunas realizaciones, R1 es un anillo heterocíclico saturado o parcialmente insaturado de 3-7 miembros sustituido que tiene 1-2 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre. En algunas realizaciones, R1 es un anillo heterocíclico saturado o parcialmente insaturado de 3-7 miembros sin sustituir que tiene 1-2 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre.
En algunas realizaciones, R1 es un heterociclilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R1 es un anillo heterocíclico saturado o parcialmente insaturado de 6 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1-2 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre. En algunas realizaciones, R1 es un anillo heterocíclico parcialmente insaturado de 6 miembros opcionalmente sustituido que tiene 2 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre. En algunas realizaciones, R1 es un anillo heterocíclico parcialmente insaturado de 6 miembros opcionalmente sustituido que tiene 2 átomos de oxígeno.
En ciertas realizaciones, R1 es un anillo heterocíclico saturado o parcialmente insaturado de 3-7 miembros que tiene 1-2 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre. En ciertas realizaciones, R1 es oxiranilo, oxetanilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, oxepanoílo, aziridinoílo, azetidinoílo, pirrolidinilo, piperidinilo, azepanilo, tiiranilo, tietanilo, tetrahidrotiofenilo, tetrahidrotiopiranilo, tiepanilo, dioxolanilo, oxatiolanilo, oxazolidinilo, imidazolidinilo, tiazolidinilo, ditiolanilo, dioxanilo, morfolinilo, oxatianilo, piperazinilo, tiomorfolinilo, ditianilo, dioxepanilo, oxazepanilo, oxatiepanilo, ditiepanilo, diazepanilo, dihidrofuranonilo, tetrahidropiranonilo, oxepanonilo, pirolidinonilo, piperidinonilo, azepanonilo, dihidrotiofenonilo, tetrahidrotiopiranonilo, thiepanonilo, oxazolidinonilo, oxazinanonilo, oxazepanonilo, dioxolanonilo, dioxanonilo, dioxepanonilo, oxatiolinonilo, oxatianonilo, oxathiepanonilo, tiazolidinonilo, tiazinanonilo, tiazepanonilo, imidazolidinonilo, tetrahidropirimidinonilo, diazepanonilo, imidazolidinadionilo, oxazolidinadionilo, tiazolidinadionilo, dioxolanedionilo, oxatiolanedionilo, piperazinadionilo, morfolinadionilo, tiomorfolinadionilo, tetrahidropiranilo, tetrahidrofuranilo, morfolinilo, tiomorfolinilo, piperidinilo, piperazinilo, pirrolidinilo, tetrahidrotiofenilo o tetrahidrotiopiranilo. En algunas realizaciones, R1 es un anillo heterocíclico saturado o parcialmente insaturado de 5 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1-2 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre.
En ciertas realizaciones, R1 es un anillo monocíclico parcialmente insaturado de 5-6 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1-2 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre. En ciertas realizaciones, R1 es un grupo tetrahidropiridinilo, dihidrotiazolilo, dihidrooxazolilo u oxazolinilo opcionalmente sustituido.
En algunas realizaciones, R1 es un anillo heterocíclico bicíclico saturado o parcialmente insaturado de 8-10 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1-4 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno o azufre. En algunas realizaciones, R1 es un indolinilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R1 es un isoindolinilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R1 es una 1,2,3,4-tetrahidroquinolina opcionalmente sustituida. En algunas realizaciones, R1 es una 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina opcionalmente sustituida.
En algunas realizaciones, R1 es un alifático C1-C10 opcionalmente sustituido, en donde una o más unidades de metileno están opcionalmente e independientemente sustituidas con un alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenileno C1-C6 , -C=C-, -C(R')2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R')-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR')-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -N(R')C(O)O-, -OC(O)N(R')-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2N(R')-, -N(R')S(O)2-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(O)- o -C(O)O-, en donde cada variable es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, R1 es un alifático C1-C10 opcionalmente sustituido, en donde una o más unidades de metileno están opcionalmente e independientemente sustituidas por un opcionalmente -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R')-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR')-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -N(R')C(O)O-, -OC(O)N(R')-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2N(R')-, -n (r ')S(O)2-, -OC(O)- o -C(O)O-, en donde cada R' es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, R1 es un alifático C1-C10 opcionalmente sustituido, en donde una o más unidades de metileno están opcionalmente e independientemente sustituidas por un opcionalmente -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R')-, -C(O)-, -OC(O)- o -C(O)O-, en donde cada R' es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, R1 es
Figure imgf000051_0001
Figure imgf000052_0001
En algunas realizaciones, R1 es CH3-,
Figure imgf000053_0001
En algunas realizaciones, R1 comprende un resto -(CH2)2- terminal opcionalmente sustituido que está conectado a L. A modo de ejemplo, dichos grupos R1 se representan a continuación:
Figure imgf000053_0002
En algunas realizaciones, R1 comprende un resto -(CH2)- terminal opcionalmente sustituido que está conectado a L. A modo de ejemplo, dichos grupos R1 se representan a continuación:
Figure imgf000053_0003
En algunas realizaciones, R1 es -S-RL2, en donde RL2 es un alifático C1-C9 opcionalmente sustituido, en donde una o más unidades de metileno están opcionalmente e independientemente sustituidas con un alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenileno C1-C6 , -C=C-, -C(R')2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R')-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR')-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -N(R')C(O)O-, -OC(O)N(R')-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2N(R')-, -N(R')S(O)2-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(O)- o -C(O)O-, y cada uno de R' y -Cy- es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, R1 es -S-RL2, en donde el átomo de azufre está conectado con el átomo de azufre en el grupo L.
En algunas realizaciones, R1 es -C(O)-RL2, en donde RL2 es un alifático C1-C9 opcionalmente sustituido, en donde una o más unidades de metileno están opcionalmente e independientemente sustituidas con un alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenileno o C1-C6 , -C=C-, -C(R')2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R')-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR')-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -N(R')C(O)O-, -OC(O)N(R')-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2N(R')-, -N(R')S(O)2-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(O)- o -C(O)O-, y cada uno de R' y -Cy- es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, R1 es -C(O)-RL2, en donde el grupo carbonilo está conectado con G en el grupo L. En algunas realizaciones, R1 es -C(O)-RL2, en donde el grupo carbonilo está conectado con el átomo de azufre en el grupo L.
En algunas realizaciones, RL2 es alifático C1-C9 opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, RL2 es alquilo C1-C9 opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, RL2 es alquenilo C1-C9 opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, RL2 es alquinilo C1-C9 opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, RL2 es un alifático C1-C9 opcionalmente sustituido, en donde una o más unidades de metileno están opcionalmente e independientemente sustituidas con -Cy- o -C(O)-. En algunas realizaciones, RL2 es un alifático C1-C9 opcionalmente sustituido, en donde una o más unidades de metileno están opcionalmente e independientemente sustituidas con -Cy-. En algunas realizaciones, RL2 es un alifático C1-C9 opcionalmente sustituido, en donde una o más unidades de metileno están opcionalmente e independientemente sustituidas con un heterociclileno opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, RL2 es un alifático C1-C9 opcionalmente sustituido, en donde una o más unidades de metileno están opcionalmente e independientemente sustituidas por un arileno opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, RL2 es un alifático C1-C9 opcionalmente sustituido, en donde una o más unidades de metileno están opcionalmente e independientemente sustituidas por un heteroarileno opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, RL2 es un alifático C1-C9 opcionalmente sustituido, en donde una o más unidades de metileno están opcionalmente e independientemente sustituidas por un carbociclileno C3-C10 opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, RL2 es un alifático C1-C9 opcionalmente sustituido en donde dos unidades de metileno están opcionalmente e independientemente sustituidas con -Cy- o -C(O)-. En algunas realizaciones, RL2 es un alifático C1-C9 opcionalmente sustituido en donde dos unidades de metileno están opcionalmente e independientemente sustituidas con -Cy- o -C(O)-. Los grupos RL2 a modo de ejemplo se representan a continuación:
Figure imgf000054_0001
En algunas realizaciones, R1 es hidrógeno, o un grupo opcionalmente sustituido seleccionado de
Figure imgf000054_0002
-S-(alifático C1-C10), alifático C1-C10, arilo, heteroalquilo C1-C6 , heteroarilo y heterociclilo. En algunas realizaciones, R1 es
Figure imgf000054_0003
o -S-(alifático C1-C10). En algunas realizaciones, R1 es
Figure imgf000054_0004
En algunas realizaciones, R1 es un grupo opcionalmente sustituido seleccionado de -S-(alifático C1-C6), alifático C1-C10, heteroalifático C1-C6 , arilo, heterociclilo y heteroarilo.
En algunas realizaciones, R1 es
Figure imgf000054_0005
Figure imgf000055_0001
En algunas realizaciones, el átomo de azufre en las realizaciones de R1 descritas anteriormente y en el presente documento está conectado con el átomo de azufre, G, E o el resto -C(O)- en las realizaciones de L descritas anteriormente y en el presente documento. En algunas realizaciones, el resto -C(O)- en las realizaciones de R1 descritas anteriormente y en el presente documento está conectado con el átomo de azufre, G, E o el resto de -C(O)-en las realizaciones de L descritas anteriormente y en el presente documento.
En algunas realizaciones, -L-R1 es cualquier combinación de las realizaciones de L y las realizaciones de R1 descritas anteriormente y en el presente documento.
En algunas realizaciones, -L-R1 es -L3-G-R1 en donde cada variable es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, -L-R1 es -L4-G-R1 en donde cada variable es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, -L-R1 es -L3-G-S-RL2, en donde cada variable es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, -L-R1 es -L3-G-C(O)-RL2, en donde cada variable es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, -L-R1 es
Figure imgf000055_0002
en donde RL2 es un alifático C1-C9 opcionalmente sustituido, en donde una o más unidades de metileno están opcionalmente e independientemente sustituidas con un alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenileno C1-C6 , -C=C-, -C(R')2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R')-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR')-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -N(R')C(O)O-, -OC(O)N(R')-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2N(R')-, -N(R')S(O)2-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(O)- o -C(O)O-, y cada G es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, -L-R1 es -RL3-S-S-RL2, en donde cada variable es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, -L-R1 es -RL3-C(O)-S-S-RL2, en donde cada variable es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, -L-R1 tiene la estructura de:
Figure imgf000055_0003
en donde cada variable es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, -L-R1 tiene la estructura de:
Figure imgf000056_0001
en donde cada variable es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, -L-R1 tiene la estructura de:
Figure imgf000056_0002
en donde cada variable es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, -L-R1 tiene la estructura de:
Figure imgf000056_0003
en donde cada variable es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, -L-R1 tiene la estructura de:
Figure imgf000056_0004
en donde cada variable es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, -L-R1 tiene la estructura de:
Figure imgf000056_0005
en donde cada variable es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, -L-R1 tiene la estructura de:
Figure imgf000056_0006
en donde cada variable es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, -L-R1 tiene la estructura de:
Figure imgf000057_0001
en donde cada variable es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, -L-R1 tiene la estructura de:
Figure imgf000057_0002
en donde cada variable es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, -L-R1 tiene la estructura de:
Figure imgf000057_0003
en donde cada variable es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, -L-R1 tiene la estructura de:
Figure imgf000057_0004
en donde cada variable es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, -L-R1 tiene la estructura de:
Figure imgf000057_0005
en donde cada variable es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, -L-R1 tiene la estructura de:
Figure imgf000057_0006
en donde cada variable es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, -L-R1 tiene la estructura de:
Figure imgf000058_0001
en donde cada variable es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, -L-R1 tiene la estructura de:
Figure imgf000058_0002
en donde cada variable es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, -L-R1 tiene la estructura de:
Figure imgf000058_0003
en donde cada variable es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, -L-R1 tiene la estructura de:
Figure imgf000058_0004
en donde cada variable es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, -L-R1 tiene la estructura de:
Figure imgf000058_0005
en donde cada variable es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, -L-R1 tiene la estructura de:
Figure imgf000058_0006
en donde cada variable es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, -L-R1 tiene la estructura de:
Figure imgf000059_0001
en donde cada variable es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, -L-R1 tiene la estructura de:
Figure imgf000059_0002
en donde cada variable es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, L tiene la estructura de:
Figure imgf000059_0003
en donde cada variable es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, -X-L-R1 tiene la estructura de:
Figure imgf000059_0004
en donde:
el anillo de fenilo está opcionalmente sustituido, y
cada uno de R1 y X es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, -L-R1 es
Figure imgf000059_0005
Figure imgf000060_0001
En algunas realizaciones, -L-R1 es:
Figure imgf000061_0001
En algunas realizaciones,
Figure imgf000061_0005
En algunas realizaciones, -L-R1 es
Figure imgf000061_0002
En algunas realizaciones, -L-R1 comprende un resto -(CH2)2- terminal opcionalmente sustituido que está conectado a X. En algunas realizaciones, -L-R1 comprende un resto -(CH2)2- terminal que está conectado a X. A modo de ejemplo, dichos restos -L-R1 se representan a continuación:
Figure imgf000061_0003
En algunas realizaciones, -L-R1 comprende a terminal opcionalmente sustituido -(CH2)- resto que está conectado a X. En algunas realizaciones, -L-R1 comprende a terminal -(CH2)- resto que está conectado a X. A modo de ejemplo, dichos restos -L-R1 se representan a continuación:
Figure imgf000061_0004
Figure imgf000062_0001
En algunas realizaciones, -L-R1 es
Figure imgf000062_0002
En algunas realizaciones, -L-R1 es CH3-,
Figure imgf000062_0003
y X es -S-.
En algunas realizaciones, -L-R1 es CH3-
Figure imgf000062_0004
X es -S-, W es O, Y es -O-, y Z es -O
En algunas realizaciones, R1 es
Figure imgf000063_0001
o -S-(alifático C1-C10).
En algunas realizaciones, R1 es
Figure imgf000063_0002
En algunas realizaciones, X es -O- o -S-, y R1 es
Figure imgf000063_0003
o -S-(alifático C1-C10).
En algunas realizaciones, X es -O- o -S-, y R1 es
Figure imgf000063_0004
-S-(alifático C1-C10) o -S-(alifático C1-C50).
En algunas realizaciones, L es un enlace covalente y -L-R1 es R1.
En algunas realizaciones, -L-R1 no es hidrógeno.
En algunas realizaciones, -X-L-R1 es R1 es
Figure imgf000064_0001
-S-(alifático C1-C10) o -S-(alifático C1-C50).
En algunas realizaciones, -X-L-R1 tiene la estructura de
Figure imgf000064_0002
en donde el resto
Figure imgf000064_0003
está opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, -X-L-R1 es
Figure imgf000064_0004
En algunas realizaciones, -X-L-R1 es
Figure imgf000064_0005
En algunas realizaciones, -X-L-R1 es
Figure imgf000065_0001
En algunas realizaciones, -X-L-R1 tiene la estructura de
Figure imgf000065_0002
en donde X' es O o S, Y' es -O-, -S- o -NR'-, y el resto
Figure imgf000065_0003
está opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, Y' es -O-, -S- o -NH-. En algunas realizaciones,
Figure imgf000065_0004
En algunas realizaciones,
Figure imgf000065_0005
En algunas realizaciones,
Figure imgf000065_0006
es
Figure imgf000065_0007
En algunas realizaciones, -X-L-R1 tiene la estructura de
Figure imgf000065_0008
en donde X' es O o S, y el resto
Figure imgf000065_0009
está opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones,
Figure imgf000065_0010
En algunas realizaciones, -X-L-R1 es
Figure imgf000065_0011
en donde
está opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, -X-L-R1 es
Figure imgf000066_0001
en donde
Figure imgf000066_0002
está sustituido. En algunas realizaciones, -X-L-R1 es
Figure imgf000066_0003
, en donde
Figure imgf000066_0004
está sin sustituir.
En algunas realizaciones, -X-L-R1 es R1-C(O)-S-Lx-S-, en donde LX es un grupo opcionalmente sustituido seleccionado de
Figure imgf000066_0006
En algunas realizaciones, LX es
Figure imgf000066_0007
En algunas realizaciones, -X-L-R1 es (CH3)3C-S-S-Lx-S-. En algunas realizaciones, -X-L-R1 es R1-C(=X')-Y'-C(R)2-S-Lx-S-. En algunas realizaciones, -X-L-R1 es R-C(=X')-Y'-CH2-S-Lx-S-. En algunas realizaciones, -X-L-R1 es
Figure imgf000066_0005
Como será apreciado por un experto en la técnica, muchos de los grupos -X-L-R1 descritos en el presente documento son escindibles y se pueden convertir en -X- después de la administración a un sujeto. En algunas realizaciones, -X-L-R1 es escindible. En algunas realizaciones, -X-L-R1 es -S-L-R1, y se convierte en -S- después de la administración a un sujeto. En algunas realizaciones, la conversión es promovida por una enzima de un sujeto. Como se aprecia por un experto en la técnica, los métodos de determinación de si el grupo -S-L-R1 se convierte en -S- después de la administración son ampliamente conocidos y puestos en práctica en la técnica, que incluye los usados para estudiar el metabolismo y farmacocinética de fármacos.
En algunas realizaciones, el enlace internucleotídico que tiene la estructura de la fórmula I es
Figure imgf000067_0001
En algunas realizaciones, el enlace internucleotídico de la fórmula I tiene la estructura de la fórmula I-a:
Figure imgf000067_0002
en donde cada variable es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, el enlace internucleotídico de la fórmula I tiene la estructura de la fórmula I-b:
Figure imgf000067_0003
en donde cada variable es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, el enlace internucleotídico de la fórmula I es un enlace de triéster de fosforotioato que tiene la estructura de la fórmula I-c:
Figure imgf000067_0004
(I-c)
en donde:
P* es un átomo de fósforo asimétrico y es o Rp o Sp;
L es un enlace covalente o un alquileno C1-C10 opcionalmente sustituido, lineal o ramificado, en donde una o más unidades de metileno de L están opcionalmente e independientemente sustituidas con un alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenileno C1-C6 , -CeC-, -C(R')2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R')-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR')-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -N(R')C(O)O-, -OC(O)N(R')-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2N(R')-, -N(R')S(O)2-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(O)- o -C(O)O-;
R1 es halógeno, R, o un alifático C1-C50 opcionalmente sustituido, en donde una o más unidades de metileno están opcionalmente e independientemente sustituidas con un alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenileno C1-C6 , -CeC-, -C(R')2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R')-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR')-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -N(R')C(O)O-, -OC(O)N(R')-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2N(R')-, -N(R')S(O)2-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(O)- o -C(O)O-;
cada R' es independientemente -R, -C(O)R, -CO2 R o -SO2 R, o:
dos R' en el mismo nitrógeno se toman conjuntamente con sus átomos intermedios para formar un anillo heterocíclico o de heteroarilo opcionalmente sustituido, o
dos R' en el mismo carbono se toman conjuntamente con sus átomos intermedios para formar un anillo de arilo, carbocíclico, heterocíclico o de heteroarilo opcionalmente sustituido;
-Cy- es un anillo bivalente opcionalmente sustituido seleccionado de fenileno, carbociclileno, arileno, heteroarileno o heterociclileno;
cada R es independientemente hidrógeno, o un grupo opcionalmente sustituido seleccionado de alifático C1-C6 , fenilo, carbociclilo, arilo, heteroarilo o heterociclilo;
cada
Figure imgf000068_0001
representa independientemente una conexión a un nucleósido; y
R1 no es -H cuando L es un enlace covalente.
En algunas realizaciones, el enlace internucleotídico que tiene la estructura de la fórmula I es
Figure imgf000068_0002
En algunas realizaciones, el enlace internucleotídico que tiene la estructura de la fórmula I-c es
Figure imgf000068_0003
Figure imgf000069_0001
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende uno o más enlaces diéster de fosfato, y uno o más enlaces internucleotídicos modificados que tienen la fórmula de I-a, I-b o I-c (en algunas realizaciones del presente método).
En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende al menos un enlace internucleotídico de diéster de fosfato y al menos un enlace de triéster de fosforotioato que tiene la estructura de la fórmula I-c. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende al menos un enlace internucleotídico de diéster de fosfato y al menos dos enlaces de triéster de fosforotioato que tienen la estructura de la fórmula I-c. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende al menos un enlace internucleotídico de diéster de fosfato y al menos tres enlaces de triéster de fosforotioato que tienen la estructura de la fórmula I-c. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende al menos un enlace internucleotídico de diéster de fosfato y al menos cuatro enlaces de triéster de fosforotioato que tienen la estructura de la fórmula I-c. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende al menos un enlace internucleotídico de diéster de fosfato y al menos cinco enlaces de triéster de fosforotioato que tienen la estructura de la fórmula I-c.
En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende una secuencia encontrada en cualquiera de los Apéndices de la divulgación. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende una secuencia encontrada en el Apéndice A. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende una secuencia encontrada en el Apéndice B. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende una secuencia encontrada en el Apéndice C. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene una secuencia encontrada en cualquiera de los Apéndices de la divulgación. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene una secuencia encontrada en el Apéndice A. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene una secuencia encontrada en el Apéndice B. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene una secuencia encontrada en el Apéndice C.
En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende una secuencia encontrada en GCCTCAGTCTGCTTCGCACC. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende una secuencia encontrada en GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde dicha secuencia tiene más del 50 % de identidad con GCCTCAGTCTGCTTCGCACC. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende una secuencia encontrada en GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde dicha secuencia tiene más del 60 % de identidad con GCCTCAGTCTGCTTCGCACC. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende una secuencia encontrada en GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde dicha secuencia tiene más del 70 % de identidad con GCCTCAGTCTGCTTCGCACC. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende una secuencia encontrada en GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde dicha secuencia tiene más del 80 % de identidad con GCCTCAGTCTGCTTCGCACC. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende una secuencia encontrada en GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde dicha secuencia tiene más del 90 % de identidad con GCCTCAGTCTGCTTCGCACC. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende una secuencia encontrada en GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde dicha secuencia tiene más del 95 % de identidad con GCCTCAGTCTGCTTCGCACC. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC.
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende una secuencia encontrada en GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde al menos un enlace internucleotídico tiene un fósforo del enlace quiral. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende una secuencia encontrada en GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde al menos un enlace internucleotídico tiene la estructura de la fórmula I. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende una secuencia encontrada en GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde cada enlace internucleotídico tiene la estructura de la fórmula I. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende una secuencia encontrada en GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde al menos un enlace internucleotídico tiene la estructura de la fórmula I-c. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende una secuencia encontrada en GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde cada enlace internucleotídico tiene la estructura de la fórmula I-c. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende una secuencia encontrada en GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde al menos un enlace internucleotídico es
O
lo-p-o-f-
S~
En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende una secuencia encontrada en GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde cada enlace internucleotídico es
O
io - p - o i
S~
En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende una secuencia encontrada en GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde al menos un enlace internucleotídico es
Figure imgf000070_0001
En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende una secuencia encontrada en GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde cada enlace internucleotídico es
Figure imgf000070_0002
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde al menos un enlace internucleotídico tiene un fósforo del enlace quiral. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde al menos un enlace internucleotídico tiene la estructura de la fórmula I. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde cada enlace internucleotídico tiene la estructura de la fórmula I. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde al menos un enlace internucleotídico tiene la estructura de la fórmula I-c. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde cada enlace internucleotídico tiene la estructura de la fórmula I-c. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde al menos un enlace internucleotídico es
O
^ o -p -o i
S“ .
En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde cada enlace internucleotídico es
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S~
En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde al menos un enlace internucleotídico es
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En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde cada enlace internucleotídico es
Figure imgf000071_0002
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde al menos un enlace internucleotídico tiene un fósforo del enlace quiral. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde al menos un enlace internucleotídico tiene la estructura de la fórmula I. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde cada enlace internucleotídico tiene la estructura de la fórmula I. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde al menos un enlace internucleotídico tiene la estructura de la fórmula I-c. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde cada enlace internucleotídico tiene la estructura de la fórmula I-c. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde al menos un enlace internucleotídico es
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En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde cada enlace internucleotídico es
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En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde al menos un enlace internucleotídico es
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En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde cada enlace internucleotídico es
Figure imgf000071_0004
En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde al menos un enlace fósforo es Rp. Se entiende por un experto habitual en la técnica que en ciertas realizaciones en donde el oligonucleótido quiralmente controlado comprende una secuencia de ARN, cada T se sustituye independiente y opcionalmente con U. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde cada fósforo del enlace es Rp. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde al menos un fósforo del enlace es Sp. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde cada fósforo del enlace es Sp. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde el oligonucleótido es un blockmero. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde el oligonucleótido es un estereoblockmero. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde el oligonucleótido es un blockmero de modificación en P. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde el oligonucleótido es un blockmero de enlace. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde el oligonucleótido es un altmero. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde el oligonucleótido es un estereoaltmero. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde el oligonucleótido es un altmero de modificación en P. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde el oligonucleótido es un altmero de enlace. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde el oligonucleótido es un unímero. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde el oligonucleótido es un estereounímero. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde el oligonucleótido es un unímero de modificación en P. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde el oligonucleótido es un unímero de enlace. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde el oligonucleótido es un gápmero. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde el oligonucleótido es un skipmero.
En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde cada citosina está opcionalmente e independientemente sustituida con 5-metilcitosina. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde al menos una citosina está opcionalmente e independientemente sustituida con 5-metilcitosina. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC, en donde cada citosina está opcionalmente e independientemente sustituida con 5-metilcitosina. Los oligonucleótidos quiralmente controlados a modo de ejemplo que tienen la secuencia de GCCTCAGTCTGCTTCGCACC se representan en la Tabla 2, que sigue:
Tabla 2. Oligonucleótidos quiralmente controlados a modo de ejemplo.
Figure imgf000072_0001
Figure imgf000073_0001
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Figure imgf000077_0001
Figure imgf000078_0001
En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado se diseña de forma que uno o más nucleótidos comprenden una modificación de fósforo propensa a la "autoliberación" en ciertas condiciones. Es decir, en ciertas condiciones, se diseña una modificación de fósforo particular de forma que se autoescinda del oligonucleótido para proporcionar, por ejemplo, un diéster de fosfato tal como los encontrados en ADN y ARN natural. En algunas realizaciones, dicha modificación de fósforo tiene una estructura de -O-L-R1, en donde cada uno de L y R1 es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, un grupo de autoliberación comprende un grupo morfolino. En algunas realizaciones, un grupo de autoliberación se caracteriza por la capacidad para administrar un agente al conector de fósforo internucleotídico, agente que facilita la modificación adicional del átomo de fósforo tal como, por ejemplo, desulfurización. En algunas realizaciones, el agente es agua y la modificación adicional es la hidrólisis para formar un diéster de fosfato, como se encuentra en ADN y ARN natural.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado se diseña de forma que las propiedades farmacéuticas resultantes mejoren mediante una o más modificaciones particulares en el fósforo. Está bien documentado en la técnica que ciertos oligonucleótidos son degradados rápidamente por nucleasas y presentan una mala captación celular a través de la membrana celular citoplásmica (Poijarvi-Virta et al., Curr. Med. Chem. (2006), 13(28);3441-65; Wagner et al., Med. Res. Rev. (2000), 20(6):417-51; Peyrottes et al., Mini Rev. Med. Chem. (2004), 4(4):395-408; Gosselin et al., (1996), 43(1):196-208; Bologna et al., (2002), Antisense & Nucleic Acid Drug Development 12:33-41). Por ejemplo, Vives et al., (Nucleic Acids Research (1999), 27(20):4071-76) encontraron que los pro-oligonucleótidos de terc-butil SATE presentaron una penetración celular notablemente elevada en comparación con el oligonucleótido parental.
En algunas realizaciones, una modificación en un fósforo del enlace se caracteriza por su capacidad para ser transformado en un diéster de fosfato, tal como los presentes en el ADN y ARN natural, por una o más enzimas esterasas, nucleasas y/o citocromo P450, que incluyen, pero no se limitan a, las enumeradas en la Tabla 3, a continuación.
Tabla 3. Enzimas a modo de ejemplo.
Figure imgf000079_0001
En algunas realizaciones, una modificación en el fósforo produce un resto de modificación en P caracterizado porque actúa de profármaco, por ejemplo, el resto de modificación en P facilita la administración de un oligonucleótido a una localización deseada antes de la retirada. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un resto de modificación en P resulta de la PEGilación en el fósforo del enlace. Un experto en las técnicas relevantes apreciará que las diversas longitudes de cadena de PEG son útiles y que la selección de la longitud de cadena será determinada en parte por el resultado que se busca lograr por la PEGilación. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la PEGilación se efectúa para reducir la captación de RES y prolongar la vida útil en circulación in vivo de un oligonucleótido.
En algunas realizaciones, un reactivo de PEGilación para su uso según la presente invención es de un peso molecular de aproximadamente 300 g/mol a aproximadamente 100.000 g/mol. En algunas realizaciones, un reactivo de PEGilación es de un peso molecular de aproximadamente 300 g/mol a aproximadamente 10.000 g/mol. En algunas realizaciones, un reactivo de PEGilación es de un peso molecular de aproximadamente 300 g/mol a aproximadamente 5.000 g/mol. En algunas realizaciones, un reactivo de PEGilación es de un peso molecular de aproximadamente 500 g/mol. En algunas realizaciones, un reactivo de PEGilación es de un peso molecular de aproximadamente 1000 g/mol.
En algunas realizaciones, un reactivo de PEGilación es de un peso molecular de aproximadamente 3000 g/mol. En algunas realizaciones, un reactivo de PEGilación es de un peso molecular de aproximadamente 5000 g/mol.
En ciertas realizaciones, un reactivo de PEGilación es PEG500. En ciertas realizaciones, un reactivo de PEGilación es PEG1000. En ciertas realizaciones, un reactivo de PEGilación es PEG3000. En ciertas realizaciones, un reactivo de PEGilación es PEG5000.
En algunas realizaciones, un resto de modificación en P se caracteriza porque actúa como un potenciador de PK, por ejemplo, lípidos, lípidos PEGilados, etc.
En algunas realizaciones, un resto de modificación en P se caracteriza porque actúa de agente que promueve la entrada celular y/o el escape endosómico, tal como un lípido o péptido perturbador de la membrana.
En algunas realizaciones, un resto de modificación en P se caracteriza porque actúa como un agente de direccionamiento. En algunas realizaciones, un resto de modificación en P es o comprende un agente de direccionamiento. La expresión "agente de direccionamiento", como se usa en el presente documento, es una entidad que se asocia con una carga de interés (por ejemplo, con un oligonucleótido o composición de oligonucleótido) y también interactúa con un sitio diana de interés de manera que la carga de interés sea dirigida al sitio diana de interés cuando se asocie al agente de direccionamiento a un grado materialmente mayor que el observado en condiciones por lo demás comparables cuando la carga de interés no está asociada con el agente de direccionamiento. Un agente de direccionamiento puede ser, o comprender, cualquiera de una variedad de restos químicos, que incluyen, por ejemplo, restos de molécula pequeña, ácidos nucleicos, polipéptidos, hidratos de carbono, etc. Los agentes de direccionamiento se describen además por Adarsh et al., "Organelle Specific Targeted Drug Delivery - A Review," International Journal of Research in Pharmaceutical and Biomedical Sciences, 2011, p. 895.
A modo de ejemplo, dichos agentes de direccionamiento incluyen, pero no se limitan a, proteínas (por ejemplo, transferrina), oligopéptidos (por ejemplo, oligopéptidos cíclicos y que contienen RGD acíclico), anticuerpos (anticuerpos monoclonales y policlonales, por ejemplo, anticuerpos IgG, IgA, IgM, IgD, IgE), azúcares / hidratos de carbono (por ejemplo, monosacáridos y/u oligosacáridos (manosa, manosa-6-fosfato, galactosa y similares)), vitaminas (por ejemplo, folato), u otras biomoléculas pequeñas. En algunas realizaciones, un resto de direccionamiento es una molécula esteroidea (por ejemplo, ácidos biliares que incluyen ácido cólico, ácido desoxicólico, ácido deshidrocólico; cortisona; digoxigenina; testosterona; colesterol; esteroides catiónicos, tales como cortisona que tiene un grupo trimetilaminometilhidrazida unido por un doble enlace en la posición 3 del anillo de cortisona, etc.). En algunas realizaciones, un resto de direccionamiento es una molécula lipófila (por ejemplo, hidrocarburos alicíclicos, ácidos grasos saturados e insaturados, ceras, terpenos e hidrocarburos polialicíclicos, tales como adamantina y buckminsterfullerenos). En algunas realizaciones, una molécula lipófila es un terpenoide, tal como vitamina A, ácido retinoico, retinal o deshidrorretinal. En algunas realizaciones, un resto de direccionamiento es un péptido.
En algunas realizaciones, un resto de modificación en P es un agente de direccionamiento de la fórmula -X-L-R1, en donde cada uno de X, L y R1 son como se definen en la fórmula I anterior.
En algunas realizaciones, un resto de modificación en P se caracteriza porque facilita la administración específica de célula.
En algunas realizaciones, un resto de modificación en P se caracteriza porque se clasifica en una o más de las categorías anteriormente descritas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un resto de modificación en P actúa de potenciador de PK y de ligando de direccionamiento. En algunas realizaciones, un resto de modificación en P actúa de profármaco y de agente de escape endosómico. Un experto en las técnicas relevantes reconocería que son posibles numerosas de otras combinaciones y se contemplan por la presente invención.
Nucleobases
En algunas realizaciones, una nucleobase presente en un oligonucleótido proporcionado tiene una nucleobase natural o una nucleobase modificada derivada de una nucleobase natural. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, uracilo, timina, adenina, citosina y guanina que tienen sus grupos amino respectivos protegidos por grupos protectores acilo, 2-fluorouracilo, 2-fluorocitosina, 5-bromouracilo, 5-yodouracilo, 2,6-diaminopurina, azacitosina, análogos de pirimidina, tales como pseudoisocitosina y pseudouracilo, y otras nucleobases modificadas, tales como purinas sustituidas en 8, xantina, o hipoxantina (siendo las dos últimas los productos de degradación natural). Las nucleobases modificadas a modo de ejemplo se desvelan en Chiu y Rana, RNA, 2003, 9, 1034-1048, Limbach et al. Nucleic Acids Research, 1994, 22, 2183-2196 y Revankar y Rao, Comprehensive Natural Products Chemistry, vol. 7, 313.
Los compuestos representados por las siguientes fórmulas generales también se contemplan como nucleobases modificadas:
Figure imgf000080_0001
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en donde R8 es un grupo opcionalmente sustituido, lineal o ramificado, seleccionado de un grupo alifático, arilo, aralquilo, ariloxilalquilo, carbociclilo, heterociclilo o heteroarilo que tiene 1 a 15 átomos de carbono, que incluye, a modo de ejemplo solo, un grupo metilo, isopropilo, fenilo, bencilo o fenoximetilo; y cada uno de R9 y R10 es independientemente un grupo opcionalmente sustituido seleccionado de alifático, carbociclilo, arilo, heterociclilo y heteroarilo lineal o ramificado.
Las nucleobases modificadas también incluyen nucleobases de tamaño expandido en las que se han añadido uno o más anillos de arilo, tales como los anillos de fenilo. Se contempla que las sustituciones de bases nucleicas descritas en el catálogo de Glen Research (www.glenresearch.com); Krueger AT et al., Acc. Chem. Res., 2007, 40, 141-150; Kool, ET, Acc. Chem. Res., 2002, 35, 936-943; Benner S.A., et al., Nat. Rev. Genet., 2005, 6, 553-543; Romesberg, F.E., et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2003, 7, 723-733; Hirao, I., Curr. Opin. Chem. Biol., 2006, 10, 622-627, son útiles para la síntesis de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento. Algunos ejemplos de estas nucleobases de tamaño expandido se muestran a continuación:
Figure imgf000081_0002
En el presente documento, las nucleobases modificadas también engloban estructuras que no son consideradas nucleobases, sino que son otros restos tales como, pero no se limitan a, anillos derivados de corrina o porfirina. Las sustituciones de bases derivadas de porfirina se han descrito en Morales-Rojas, H y Kool, ET, Org. Lett., 2002, 4, 4377-4380. A continuación se muestra un ejemplo de un anillo derivado de porfirina que se puede usar como una sustitución de base:
Figure imgf000082_0001
En algunas realizaciones, las nucleobases modificadas son de una cualquiera de las siguientes estructuras, opcionalmente sustituidas:
Figure imgf000082_0002
En algunas realizaciones, una nucleobase modificada es fluorescente. A modo de ejemplo, dichas nucleobases modificadas fluorescentes incluyen fenantreno, pireno, estilbeno, isoxantina, isozantopterina, terfenilo, tertiofeno, benzotertiofeno, coumarina, lumazina, estilbeno unido, benzo-uracilo y nafto-uracilo, como se muestra a continuación:
Figure imgf000082_0003
En algunas realizaciones, una nucleobase modificada está sin sustituir. En algunas realizaciones, una nucleobase modificada está sustituida. En algunas realizaciones, una nucleobase modificada está sustituida de forma que contenga, por ejemplo, heteroátomos, grupos alquilo o restos de unión conectados a restos fluorescentes, biotina o restos de avidina, u otra proteína o péptidos. En algunas realizaciones, una nucleobase modificada es una "base universal" que no es una nucleobase en el sentido más clásico, pero que funciona similarmente a una nucleobase. Un ejemplo representativo de dicha base universal es 3-nitropirrol.
En algunas realizaciones, también se pueden usar otros nucleósidos en el proceso desvelado en el presente documento e incluyen nucleósidos que incorporan nucleobases modificadas, o nucleobases covalentemente unidas a azúcares modificados. Algunos ejemplos de nucleósidos que incorporan nucleobases modificadas incluyen 4-acetilcitidina; 5-(carboxihidroxilmetil)uridina; 2'-0-metilcitidina; 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina; 5-carboximetilaminometiluridina; dihidrouridina; 2'-0-metilpseudouridina; beta,D-galactosilqueosina; 2'-0-metilguanosina; N®-isopenteniladenosina; 1-metiladenosina; 1-metilpseudouridina; 1-metilguanosina; 1-metilinosina; 2,2-dimetilguanosina; 2-metiladenosina; 2-metilguanosina; W7-metilguanosina; 3-metil-citidina; 5-metilcitidina; 5-hidroximetilcitidina; 5-formilcitosina; 5-carboxilcitosina; N^metiladenosina; 7-metilguanosina; 5-metilaminoetiluridina; 5-metoxiaminometil-2-tiouridina; beta,D-manosilqueosina; 5-metoxicarbonilmetiluridina; 5-metoxiuridina; 2-metiltio-N6-isopenteniladenosina; W-((9-beta,D-ribofuranosil-2-metiltiopurina-6-il)carbamoil)treonina; N-((9-beta,D-ribofuranosilpurina-6-il)-N-metilcarbamoil)treonina; éster metílico de ácido uridina-5-oxiacético; ácido uridina-5-oxiacético (v); pseudouridina; queosina; 2-tiocitidina; 5-metil-2-tiouridina; 2-tiouridina; 4-tiouridina; 5-metiluridina; 2'-0-metil-5-metiluridina; y 2'-0-metiluridina.
En algunas realizaciones, los nucleósidos incluyen análogos de nucleósidos bicíclicos modificados en 6' que tienen quiralidad (R) o (S) en la posición 6' e incluyen los análogos descritos en la patente de EE. UU. N.° 7.399.845. En otras realizaciones, los nucleósidos incluyen análogos de nucleósidos bicíclicos modificados en 5' que tienen quiralidad (R) o (S) en la posición 5' e incluyen los análogos descritos en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. N.° 20070287831.
En algunas realizaciones, una nucleobase o nucleobase modificada comprende uno o más restos de unión a biomoléculas, tales como, por ejemplo, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, biotina, avidina, estreptavidina, ligandos de receptor o restos quelantes. En otras realizaciones, una nucleobase o nucleobase modificada es 5-bromouracilo, 5-yodouracilo o 2,6-diaminopurina. En algunas realizaciones, una nucleobase o nucleobase modificada se modifica por sustitución con un resto fluorescente o de unión a biomolécula. En algunas realizaciones, el sustituyente en una nucleobase o nucleobase modificada es un resto fluorescente. En algunas realizaciones, el sustituyente en una nucleobase o nucleobase modificada es biotina o avidina.
Las patentes de EE. UU. representativas que enseñan la preparación de ciertas de las nucleobases modificadas anteriormente indicadas, así como otras nucleobases modificadas, incluyen, pero no se limitan a, la patente de EE. UU. anteriormente indicada N.° 3.687.808, así como las patentes de EE. UU. N.° 4.845.205; 5.130.30; 5.134.066; 5.175.273; 5.367.066; 5.432.272; 5.457.187; 5.457.191; 5.459.255; 5.484.908; 5.502.177; 5.525.711; 5.552.540; 5.587.469; 5.594.121. 5.596.091; 5.614.617; 5.681.941; 5.750.692; 6.015.886; 6.147.200; 6.166.197; 6.222.025; 6.235.887; 6.380.368; 6.528.640; 6.639.062; 6.617.438; 7.045.610; 7.427.672; y 7.495.088.
Azúcares
Los nucleótidos naturales más comunes comprenden azúcares de ribosa unidos a las nucleobases adenosina (A), citosina (C), guanina (G) y timina (T), o uracilo (U). También se contemplan nucleótidos modificados, en donde un grupo fosfato o fósforo del enlace en los nucleótidos se puede unir a diversas posiciones de un azúcar o azúcar modificado. Como ejemplos no limitantes, el grupo fosfato o fósforo del enlace se puede unir al resto 2', 3', 4' o 5' hidroxilo de un azúcar o azúcar modificado. También se contemplan en este contexto nucleótidos que incorporan nucleobases modificadas como se describen en el presente documento. En algunas realizaciones, los nucleótidos o nucleótidos modificados que comprenden un resto -OH sin proteger se usan según métodos de la presente invención.
También se pueden incorporar otros azúcares modificados dentro de un oligonucleótido proporcionado. En algunas realizaciones, un azúcar modificado contiene uno o más sustituyentes en la posición 2', que incluyen uno de los siguientes: -F; -CF3, -CN, -N3 , -NO, -NO2 , -OR', -SR' o -N(R')2 , en donde cada R' es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento; -O-(alquilo C1-C10), -S-(alquilo C1-C10), -NH-(alquilo C1-C10) o -N(alquilo C1-C10)2 ; -O-(alquenilo C2-C10), -S-(alquenilo C2-C10), -NH-(alquenilo C2-C10) o -N(alquenilo C2-C10)2 ; -O-(alquinilo C2-C10), -S-(alquinilo C2-C10), -NH-(alquinilo C2-C10) o -N(alquinilo C2-C10)2 ; o -O-(alquilen C1-C10)-O-(alquilo C1-C10), -O-(alquilen C1-C10)-NH-(alquilo C1-C10) o -O-(alquilen C1-C10)-NH(alquilo C1-C10)2 , -NH-(alquilen C1-C10)-O-(alquilo C1-C10) o -N(alquil C1-C10)-(alquilen C1-C10)-O-(alquilo C1-C10), en donde el alquilo, alquileno, alquenilo y alquinilo pueden estar sustituidos o sin sustituir. Los ejemplos de sustituyentes incluyen, y no se limitan a, -O(CH2)nOCH3 y - O(CH2)nNH2 , en donde n es desde 1 hasta aproximadamente 10, MOE, DMAOE, DMAEOE. También se contemplan en el presente documento los azúcares modificados descritos en el documento de patente WO 2001/088198; y Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504. En algunas realizaciones, un azúcar modificado comprende uno o más grupos seleccionados de un grupo sililo sustituido, un grupo de escisión de ARN, un grupo indicador, una marca fluorescente, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un ácido nucleico, un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un ácido nucleico, u otros sustituyentes que tienen propiedades similares. En algunas realizaciones, las modificaciones se hacen en una o más de las posiciones 2', 3', 4', 5' o 6' del azúcar o azúcar modificado, que incluyen la posición 3' del azúcar en el nucleótido 3'-terminal o en la posición 5' del nucleótido 5'-terminal.
En algunas realizaciones, el 2'-OH de una ribosa se sustituye con un sustituyente que incluye uno de los siguientes: -H, -F; -CF3, -CN, -N3, -NO, -NO2 , -OR', -SR', o -N(R')2 , en donde cada R' es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento; -O-(alquilo C1-C10), -S-(alquilo C1-C10), -NH-(alquilo C1-C10), o -N(alquilo Ci-Cio)2 ; -O-(alquenilo C2-C10), -S-(alquenilo C2-C10), -NH-(alquenilo C2-C10) o -N(alquenilo C2-Cio)2 ; -O-(alquinilo C2-C10), -S-(alquinilo C2-C10), -NH-(alquinilo C2-C10) o -N(alquinilo C2-Cio)2 ; o -O-(alquilen Ci-Cio)-O-(alquilo
C1-C10), -O-(alquilen C i-C i0)-NH-(alquilo C1-C10) o -O-(alquilen C i-C i0)-NH(alquilo C i-C i0)2 , -NH-(alquilen C iC i0)-O-(alquilo C1-C10) o -N(alquil C i-C i0)-(alquilen C i-C i0)-O-(alquilo C1-C10), en donde el alquilo, alquileno, alquenilo y alquinilo puede estar sustituido o sin sustituir. En algunas realizaciones, el 2'-OH se sustituye por -H (desoxirribosa).
En algunas realizaciones, el 2'-OH se sustituye por -F. En algunas realizaciones, el 2'-OH se sustituye por -OR'. En algunas realizaciones, el 2'-OH se sustituye por -OMe. En algunas realizaciones, el 2'-OH se sustituye por -OCH2CH2OMe.
Los azúcares modificados también incluyen ácidos nucleicos bloqueados (LNA). En algunas realizaciones, el ácido nucleico bloqueado tiene la estructura indicada a continuación. Se indica un ácido nucleico bloqueado de la estructura a continuación, en donde Ba representa una nucleobase o nucleobase modificada como se describe en el presente documento, y en donde R2s es -OCH2C4 '-.
Figure imgf000084_0001
En algunas realizaciones, un azúcar modificado es un ENA, tal como los descritos en, por ejemplo, Seth et al., J Am
Chem Soc. 27 de octubre de 2010; 132(42): 14942-14950. En algunas realizaciones, un azúcar modificado es cualquiera de los encontrados en un XNA (ácido xenonucleico), por ejemplo, arabinosa, anhidrohexitol, treosa, 2'fluoroarabinosa o ciclohexeno.
Los azúcares modificados incluyen miméticos de azúcar, tales como restos de ciclobutilo o ciclopentilo en lugar del azúcar de pentofuranosilo. Las patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de dichas estructuras de azúcar modificado incluyen, pero no se limitan a, las patentes de EE. UU. N.° 4.981.957; 5.118.800;
5.319.080; y 5.359.044. Algunos azúcares modificados que se contemplan incluyen azúcares en los que el átomo de oxígeno dentro del anillo de ribosa está sustituido con nitrógeno, azufre, selenio o carbono. En algunas realizaciones, un azúcar modificado es una ribosa modificada, en donde el átomo de oxígeno dentro del anillo de ribosa está sustituido con nitrógeno, y en donde el nitrógeno está opcionalmente sustituido con un grupo alquilo (por ejemplo, metilo, etilo, isopropilo, etc.).
Los ejemplos no limitantes de azúcares modificados incluyen glicerol, que forma análogos de ácido nucleico de glicerol (GNA). Un ejemplo de un análogo de GNA se muestra a continuación y se describe en Zhang, R et al., J. Am. Chem.
Soc., 2008, 130, 5846-5847; Zhang L, et al., J. Am. Chem. Soc., 2005, 127, 4174-4175 y Tsai CH et al., PNAS, 2007, 14598-14603 (X = O-):
Figure imgf000084_0002
Otro ejemplo de un análogo derivado de GNA, el ácido nucleico flexible (FNA) basado el acetal aminal mixto de formil glicerol, se describe en Joyce GF et al., PNAS, 1987, 84, 4398-4402 y Heuberger BD y Switzer C, J. Am. Chem. Soc., 2008, 130, 412-413, y se muestra a continuación:
Figure imgf000085_0001
Ejemplos adicionales no limitantes de azúcares modificados incluyen azúcares de hexopiranosilo (6' a 4'), pentopiranosilo (4' a 2'), pentopiranosilo (4' a 3') o tetrofuranosilo (3' a 2'). En algunas realizaciones, un azúcar de hexopiranosilo (6' a 4') es de una cualquiera de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000085_0002
en donde Xs corresponde al grupo de modificación en P "-XLR1" descrito en el presente documento y Ba es como se define en el presente documento.
En algunas realizaciones, un azúcar de pentopiranosilo (4' a 2') es de una cualquiera de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000085_0003
en donde Xs corresponde al grupo de modificación en P "-XLR1" descrito en el presente documento y Ba es como se define en el presente documento.
En algunas realizaciones, un azúcar de pentopiranosilo (4' a 3') es de una cualquiera de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000085_0004
en donde Xs corresponde al grupo de modificación en P "-XLR1" descrito en el presente documento y Ba es como se define en el presente documento.
En algunas realizaciones, un azúcar de tetrofuranosilo (3' a 2') es de cualquiera de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000085_0005
en donde Xs corresponde al grupo de modificación en P "-XLR1" descrito en el presente documento y Ba es como se define en el presente documento.
En algunas realizaciones, un azúcar modificado es de una cualquiera de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000086_0001
en donde Xs corresponde al grupo de modificación en P "-XLR1" descrito en el presente documento y Ba es como se define en el presente documento.
En algunas realizaciones, uno o más grupos hidroxilo en un resto de azúcar están opcionalmente e independientemente sustituidos con halógeno, R' -N(R')2 , -OR' o -SR', en donde cada R' es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, un mimético de azúcar es como se ilustra a continuación, en donde Xs corresponde al grupo de modificación en P "-XLR1" descrito en el presente documento, Ba es como se define en el presente documento y X1 se selecciona de -S-, -Se-, -CH2-, -NMe-, -NEt- o -N/Pr-.
Figure imgf000086_0002
En algunas realizaciones, se modifican al menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 1 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 %, 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 % o más (por ejemplo, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o más), ambos incluidos, de los azúcares en una composición de oligonucleótidos quiralmente controlados. En algunas realizaciones, solo se modifican los restos de purina (se modifican, por ejemplo, aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 %, 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 % o más [por ejemplo, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o más] de los restos de purina). En algunas realizaciones, solo se modifican restos de pirimidina (por ejemplo, se modifican aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 %, 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 % o más [por ejemplo, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o más] de los restos de piridimina). En algunas realizaciones, se modifican tanto los restos de purina como de pirimidina.
Los azúcares modificados y miméticos de azúcar se pueden preparar por métodos conocidos en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a: A. Eschenmoser, Science (1999), 284:2118; M. Bohringer et al., Helv. Chim. Acta (1992), 75:1416-1477; M. Egli et al., J. Am. Chem. Soc. (2006), 128(33):10847-56; A. Eschenmoser en Chemical Synthesis: Gnosis to Prognosis, C. Chatgilialoglu y V. Sniekus, Ed., (Kluwer Academic, Países Bajos, 1996), p.293; K.-U. Schoning et al., Science (2000), 290:1347-1351; A. Eschenmoser et al., Helv. Chim. Acta (1992), 75:218; J. Hunziker et al., Helv. Chim. Acta (1993), 76:259; G. Otting et al., Helv. Chim. Acta (1993), 76:2701; K. Groebke et al., Helv. Chim. Acta (1998), 81:375; y A. Eschenmoser, Science (1999), 284:2118. Las modificaciones a las modificaciones en 2' se pueden encontrar en Verma, S. et al. Annu. Rev. Biochem. 1998, 67, 99-134 y todas las referencias en su interior. Modificaciones específicas a la ribosa se pueden encontrar en las siguientes referencias: 2’-flúor (Kawasaki et al., J. Med. Chem., 1993, 36, 831- 841), 2’-MOE (Martin, P. Helv. Chim. Acta 1996, 79, 1930-1938), "LNA" (Wengel, J. Acc. Chem. Res. 1999, 32, 301-310). En algunas realizaciones, un azúcar modificado es cualquiera de aquellos descritos en la publicación PCT N.° WO2012/030683, incorporada en el presente documento como referencia, y representada en las Figuras 26-30 de la presente divulgación.
Oligon ucleó tidos
En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona oligonucleótidos y composiciones de oligonucleótidos que están quiralmente controlados. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una composición proporcionada contiene niveles predeterminados de uno o más tipos de oligonucleótidos individuales, en donde un tipo de oligonucleótido se define por: 1) la secuencia de bases; 2) el patrón de enlaces del esqueleto; 3) el patrón de centros quirales del esqueleto; y 4) patrón de modificaciones en P del esqueleto.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado es un unímero. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado es un unímero de modificación en P. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado es un estereounímero. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado es un estereounímero de configuración Rp. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado es un estereounímero de configuración Sp.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado es un altmero. En algunas realizaciones, un oligonucleótido es un altmero de modificación en P. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado es un estereoaltmero.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado es un blockmero. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado es un blockmero con modificación en P. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado es un estereoblockmero.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado es un gápmero.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado es un skipmero.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado es una combinación de uno o más de unímero, altmero, blockmero, gápmero y skipmero. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado es tanto un altmero como un gápmero. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado es tanto un gápmero como un skipmero. Un experto en las artes químicas y sintéticas reconocerá que están disponibles numerosas otras combinaciones de patrones y están limitadas solo por la disponibilidad comercial y/o accesibilidad sintética de las partes constituyentes requeridas para sintetizar un oligonucleótido proporcionado según los métodos de la presente invención.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado comprende uno o más nucleótidos opcionalmente sustituidos. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado comprende uno o más nucleótidos modificados. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado comprende uno o más nucleósidos opcionalmente sustituidos. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado comprende uno o más nucleósidos modificados. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado comprende uno o más LNA opcionalmente sustituidos.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado comprende una o más nucleobases opcionalmente sustituidas. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado comprende una o más nucleobases naturales opcionalmente sustituidas. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado comprende una o más nucleobases modificadas opcionalmente sustituidas. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado comprende uno o más 5-metilcitidinas; 5-hidroximetilcitidinas, 5-formilcitosinas o 5-carboxilcitosinas. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado comprende una o más 5-metilcitidinas.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado comprende uno o más azúcares opcionalmente sustituidos. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado comprende uno o más azúcares opcionalmente sustituidos encontrados en ADN y ARN natural. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado comprende una o más ribosas o desoxirribosas opcionalmente sustituidas. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado comprende una o más ribosas o desoxirribosas opcionalmente sustituidas, en donde uno o más grupos hidroxilo del resto de ribosa o desoxirribosa están opcionalmente e independientemente sustituidos con halógeno, R', -N(R')2 , -OR' o -SR', en donde cada R' es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado comprende una o más desoxirribosas opcionalmente sustituidas, en donde la posición 2' de la desoxirribosa está opcionalmente e independientemente sustituida con halógeno, R', -N(R')2 , -OR' o -SR', en donde cada R' es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado comprende una o más desoxirribosas opcionalmente sustituidas, en donde la posición 2' de la desoxirribosa está opcionalmente e independientemente sustituida con halógeno. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado comprende una o más desoxirribosas opcionalmente sustituidas, en donde la posición 2' de la desoxirribosa está opcionalmente e independientemente sustituida con uno o más -F. halógeno. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado comprende una o más desoxirribosas opcionalmente sustituidas, en donde la posición 2' de la desoxirribosa está opcionalmente e independientemente sustituida con -OR', en donde cada R' es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado comprende una o más desoxirribosas opcionalmente sustituidas, en donde la posición 2' de la desoxirribosa está opcionalmente e independientemente sustituida con -OR', en donde cada R' es independientemente un alifático C1-C6 opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado comprende una o más desoxirribosas opcionalmente sustituidas, en donde la posición 2' de la desoxirribosa está opcionalmente e independientemente sustituida con -OR', en donde cada R' es independientemente un alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado comprende una o más desoxirribosas opcionalmente sustituidas, en donde la posición 2' de la desoxirribosa está opcionalmente e independientemente sustituida con -OMe. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado comprende una o más desoxirribosas opcionalmente sustituidas, en donde la posición 2' de la desoxirribosa está opcionalmente e independientemente sustituida con -O-metoxietilo.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado tiene oligonucleótido monocatenario.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado es una cadena de oligonucleótidos hibridada. En ciertas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado es una cadena de oligonucleótidos parcialmente hibridada. En ciertas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado es una cadena de oligonucleótidos completamente hibridada. En ciertas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado es un oligonucleótido bicatenario. En ciertas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado es un oligonucleótido tricatenario (por ejemplo, un tríplex).
En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado es quimérico. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado tiene quimera de ADN-ARN, quimera de ADN-LNA, etc.
En algunas realizaciones, una cualquiera de las estructuras que comprenden un oligonucleótido representado en el documento de patente WO2012/030683 se puede modificar según los métodos de la presente invención para proporcionar variantes quiralmente controladas de los mismos. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las variantes quiralmente controladas comprenden una modificación estereoquímica en uno cualquiera o más del fósforo del enlace y/o una modificación en P en uno cualquiera o más del fósforo del enlace. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una unidad de nucleótido particular de un oligonucleótido del documento de patente WO2012/030683 se preselecciona para ser estereoquímicamente modificado en el fósforo del enlace de esa unidad de nucleótido y/o modificado en P en el fósforo del enlace de esa unidad de nucleótido. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado tiene una cualquiera de las estructuras representadas en las Figuras 26-30. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado es una variante (por ejemplo, versión modificada) de una cualquiera de las estructuras representadas en las Figuras 26-30.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado es un agente terapéutico.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado es un oligonucleótido antisentido.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado es un oligonucleótido antigénico.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado es un oligonucleótido señuelo.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado es parte de una vacuna de ADN.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado es un oligonucleótido inmunomodulador, por ejemplo, oligonucleótido inmunoestimulante y oligonucleótido inmunoinhibidor.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado es un adyuvante.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado es un aptámero.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado es una ribozima.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado es una desoxirribozima (ADNzimas o enzimas de ADN).
En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado es un ARNip.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado es un microARN o miARN.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado es un ARNnc (ARN no codificantes), que incluye un ARN no codificante largo (ARNncl) y un ARN no codificante pequeño, tal como ARN que interactúa con piwi (ARNpi).
En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado es complementario a un ARN estructural, por ejemplo, ARNt.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado es un análogo de ácido nucleico, por ejemplo, GNA, LNA, PNA, TNA y morfolino.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado es un profármaco modificado en P.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado es un cebador. En algunas realizaciones, un cebador es para su uso en las reacciones en cadena de la polimerasa (es decir, PCR) para amplificar ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, un cebador es para su uso en cualquier variación conocida de PCR, tal como PCR con transcripción inversa (RT-PCR) y PCR en tiempo real.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado se caracteriza por tener la capacidad de modular la activación de RNasa H. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la activación de RNasa H se modula por la presencia de análogos de ácidos nucleicos de fosforotioato estereocontrolados, siendo el ADN/ARN natural más o igualmente susceptible que el estereoisómero Rp, que a su vez es más susceptible que el estereoisómero Sp correspondiente.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado se caracteriza por tener la capacidad de aumentar o disminuir indirecta o directamente la actividad de una proteína o inhibición o promoción de la expresión de una proteína. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado se caracteriza porque es útil en el control de la proliferación celular, replicación vírica y/o cualquier otro proceso de señalización de células.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado tiene desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 200 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado tiene desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 180 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado tiene desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 160 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado tiene desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 140 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado tiene desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 120 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado tiene desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 100 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado tiene desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 90 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado tiene desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 80 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado tiene desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 70 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado tiene desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 60 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado tiene desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 50 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado tiene desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 40 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado tiene desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 30 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado tiene desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 29 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado tiene desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 28 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado tiene desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 27 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado tiene desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 26 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado tiene desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 25 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado tiene desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 24 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado tiene desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 23 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado tiene desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 22 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado tiene desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 21 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado tiene desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 20 unidades de nucleótidos de longitud.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado tiene desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 200 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado tiene desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 180 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado tiene desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 160 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado tiene desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 140 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado tiene desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 120 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado tiene desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 100 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado tiene desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 90 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado tiene desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 80 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado tiene desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 70 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado tiene desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 60 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado tiene desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 50 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado tiene desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 40 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado tiene desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 30 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado tiene desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 29 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado tiene desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 28 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado tiene desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 27 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado tiene desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 26 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado tiene desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 25 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado tiene desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 24 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado tiene desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 23 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado tiene desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 22 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado tiene desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 21 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado tiene desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 20 unidades de nucleótidos de longitud.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado tiene desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 10 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado tiene desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 30 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado tiene desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 25 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado tiene desde aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24 o 25 unidades de nucleótidos de longitud.
En algunas realizaciones, el oligonucleótido tiene al menos 2 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el oligonucleótido tiene al menos 3 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el oligonucleótido tiene al menos 4 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el oligonucleótido tiene al menos 5 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el oligonucleótido tiene al menos 6 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el oligonucleótido tiene al menos 7 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el oligonucleótido tiene al menos 8 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el oligonucleótido tiene al menos 9 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el oligonucleótido tiene al menos 10 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el oligonucleótido tiene al menos 11 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el oligonucleótido tiene al menos 12 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el oligonucleótido tiene al menos 15 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones de la composición, el oligonucleótido tiene al menos 20 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el oligonucleótido tiene al menos 25 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas otras realizaciones, el oligonucleótido tiene al menos 30 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas otras realizaciones, el oligonucleótido es un dúplex de cadenas complementarias de al menos 18 unidades de nucleótidos de longitud. En algunas otras realizaciones, el oligonucleótido es un dúplex de cadenas complementarias de al menos 21 unidades de nucleótidos de longitud.
En algunas realizaciones, el extremo 5' y/o el extremo 3' de un oligonucleótido se modifica. En algunas realizaciones, el extremo 5' y/o el extremo 3' de un oligonucleótido proporcionado se modifica con un resto de terminación terminal. Dichas modificaciones a modo de ejemplo, que incluyen restos de terminación terminal, se describen ampliamente en el presente documento y en la técnica, por ejemplo, pero no se limitan a las descritas en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. US 2009/0023675A1.
Especies de oligonucleótidos
En ciertas realizaciones, un oligonucleótido de la fórmula I es de una cualquiera de las estructuras mostradas en la Tabla 2, anteriormente, y aquellos descritos en los ejemplos.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado comprende la secuencia de, o parte de la secuencia de mipomersen. Mipomersen se basa en la siguiente secuencia de bases GCCT/UCAGT/UCT/UGCT/UT/UCGCACC. En algunas realizaciones, uno o más de cualquiera del nucleótido o enlaces se pueden modificar según el presente método inventivo. En algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que tiene la secuencia de G*-C*-C*-U*-C*-dA-dG-dT-dC-dT-dG-dmC-dT-dT-dmC-G*-C*-A*-C*-C* [d = 2'-desoxi, * = 2'-O-(2-metoxietilo)] con enlaces fosforotioato 3 '^ 5 \ Las secuencias de mipomersen modificadas a modo de ejemplo se describen en toda la divulgación, que incluye, pero no se limita a, aquellas en la Tabla 4.
En ciertas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado es un unímero de mipomersen. En ciertos aspectos, un oligonucleótido proporcionado es un unímero de mipomersen de configuración Rp. En ciertos aspectos, un oligonucleótido proporcionado es un unímero de mipomersen de configuración Sp.
Los oligonucleótidos quiralmente controlados a modo de ejemplo que comprenden la secuencia de, o parte de la secuencia de mipomersen, se representan en la Tabla 4, a continuación.
Tabla 4. Secuencias relacionadas con mipomersen a modo de ejemplo.
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Composiciones de oligonucleótidos
El presente método inventivo proporciona composiciones que comprenden o que consiste en una pluralidad de oligonucleótidos proporcionados (por ejemplo, composiciones de oligonucleótidos quiralmente controlados). En algunas realizaciones, todos esos oligonucleótidos proporcionados son del mismo tipo, es decir, todos tienen la misma secuencia de bases, patrón de enlaces del esqueleto (es decir, patrón de tipos de enlaces internucleotídicos, por ejemplo, fosfato, fosforotioato, etc.), patrón de centros quirales del esqueleto (es decir, patrón de estereoquímica del fósforo del enlace (Rp/Sp)) y patrón de modificaciones del fósforo del esqueleto (por ejemplo, patrón de grupos "-XLR1" en la fórmula I). En muchas realizaciones, sin embargo, las composiciones proporcionadas comprenden una pluralidad de tipos de oligonucleótidos, normalmente en cantidades relativas predeterminadas.
En algunas realizaciones, una composición de oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionada es una composición de mipomersen quiralmente pura. Es decir, en algunas realizaciones, una composición de oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionada proporciona mipomersen como único diastereómero con respecto a la configuración del fósforo del enlace.
En algunas realizaciones, una composición de oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionada es una composición de mipomersen quiralmente uniforme. Es decir, en algunas realizaciones, cada fósforo del enlace de mipomersen está en la configuración Rp o cada fósforo del enlace de mipomersen está en la configuración Sp.
En algunas realizaciones, una composición de oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionada comprende una combinación de uno o más tipos de oligonucleótidos proporcionados. Un experto en las técnicas químicas y medicinales reconocerá que la selección y la cantidad de cada uno del uno o más tipos de oligonucleótidos proporcionados en una composición proporcionada dependerá del uso previsto de esa composición. Es decir, un experto en las técnicas relevantes diseñaría una composición de oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionada de forma que las cantidades y los tipos de oligonucleótidos proporcionados contenidos en ella hicieran que la composición en conjunto tuviera ciertas características deseables (por ejemplo, biológicamente deseable, terapéuticamente deseable, etc.).
En algunas realizaciones, una composición de oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionada comprende una combinación de dos o más tipos de oligonucleótidos proporcionados. En algunas realizaciones, una composición de oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionada comprende una combinación de tres o más tipos de oligonucleótidos proporcionados. En algunas realizaciones, una composición de oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionada comprende una combinación de cuatro o más tipos de oligonucleótidos proporcionados. En algunas realizaciones, una composición de oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionada comprende una combinación de cinco o más tipos de oligonucleótidos proporcionados. En algunas realizaciones, una composición de oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionada comprende una combinación de seis o más tipos de oligonucleótidos proporcionados. En algunas realizaciones, una composición de oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionada comprende una combinación de siete o más tipos de oligonucleótidos proporcionados. En algunas realizaciones, una composición de oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionada comprende una combinación de ocho o más tipos de oligonucleótidos proporcionados. En algunas realizaciones, una composición de oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionada comprende una combinación de nueve o más tipos de oligonucleótidos proporcionados. En algunas realizaciones, una composición de oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionada comprende una combinación de diez o más tipos de oligonucleótidos proporcionados. En algunas realizaciones, una composición de oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionada comprende una combinación de quince o más tipos de oligonucleótidos proporcionados.
En algunas realizaciones, una composición de oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionada es una combinación de una cantidad de mipomersen quiralmente uniforme de la configuración Rp y una cantidad de mipomersen quiralmente uniforme de la configuración Sp.
En algunas realizaciones, una composición de oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionada es una combinación de una cantidad de mipomersen quiralmente uniforme de la configuración Rp, una cantidad de mipomersen quiralmente uniforme de la configuración Sp, y una cantidad de uno o más mipomersen quiralmente puros de una forma diastereomérica deseada.
Métodos de preparación de oligonucleótidos quiralmente controlados y composiciones de los mismos
El presente método inventivo proporciona métodos de preparación de oligonucleótidos quiralmente controlados y composiciones quiralmente controladas que comprenden uno o más tipos de nucleótidos específicos. Como se observa anteriormente, la expresión "tipo de oligonucleótido", como se usa en el presente documento, define un oligonucleótido que tiene una secuencia de bases particular, patrón de enlaces del esqueleto, patrón de centros quirales del esqueleto y patrón de modificaciones de fósforo del esqueleto (por ejemplo, grupos "-XLR1"). Los oligonucleótidos de un "tipo" designado común son estructuralmente idénticos entre sí con respecto a la secuencia de bases, patrón de enlaces del esqueleto, patrón de centros quirales del esqueleto y patrón de modificaciones de fósforo del esqueleto.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado por el método inventivo tiene propiedades diferentes de las de la mezcla de oligonucleótidos estereoaleatorios correspondiente. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado tiene lipofilia diferente de la de la mezcla de oligonucleótidos estereoaleatorios. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado tiene un tiempo de retención diferente en HPLC. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado puede tener un tiempo de retención pico significativamente diferentes del de la mezcla de oligonucleótidos estereoaleatorios correspondiente. Durante la purificación de oligonucleótidos usando HPLC como se pone en práctica, en general, en la técnica, se perderán en gran medida ciertos oligonucleótidos quiralmente controlados, sino por completo. Durante la purificación de oligonucleótidos usando HPLC como se pone en práctica, en general, en la técnica, se perderán en gran medida ciertos oligonucleótidos quiralmente controlados, sino por completo. Una de las consecuencias es que ciertos diastereómeros de una mezcla de oligonucleótidos estereoaleatorios (ciertos oligonucleótidos quiralmente controlados) no se prueban en los ensayos. Otra consecuencia es que de lotes a lotes, debido a los inevitables errores instrumentales y humanos, el oligonucleótido estereoaleatorio supuestamente "puro" tendrá composiciones incoherentes en las que los diastereómeros en la composición, y sus cantidades relativas y absolutas, son diferentes de lotes a lotes. El oligonucleótido quiralmente controlado y la composición de oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionados por el método inventivo vence dichos problemas, ya que un oligonucleótido quiralmente controlado se sintetiza en un modo quiralmente controlado como un único diastereómero, y una composición de oligonucleótidos quiralmente controlados comprende niveles predeterminados de uno o más tipos de oligonucleótidos individuales.
Un experto en las técnicas químicas y sintéticas apreciará que los métodos de síntesis de la presente invención proporcionan un grado de control durante cada etapa de la síntesis de un oligonucleótido proporcionado de forma que cada unidad de nucleótido del oligonucleótido se pueda diseñar y/o seleccionar por adelantado para tener una estereoquímica particular en el fósforo del enlace y/o una modificación particular en el fósforo del enlace, y/o una base particular, y/o un azúcar particular. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado se diseña y/o selecciona por adelantado para tener una combinación particular de estereocentros en el fósforo del enlace del enlace internucleotídico.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado preparado usando los métodos de la presente invención se diseña y/o determina para tener una combinación particular de modificaciones del fósforo del enlace. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado preparado usando los métodos de la presente invención se diseña y/o determina para tener una combinación particular de bases. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado preparado usando los métodos de la presente invención se diseña y/o determina para tener una combinación particular de azúcares. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado preparado usando los métodos de la presente invención se diseña y/o determina para tener una combinación particular de una o más de las características estructurales anteriores.
Los métodos de la presente invención presentan un alto grado de control quiral. Por ejemplo, los métodos de la presente invención facilitan el control de la configuración estereoquímica de cada único fósforo del enlace dentro de un oligonucleótido proporcionado. En algunas realizaciones, los métodos de la presente invención proporcionan un oligonucleótido que comprende uno o más enlaces internucleotídicos modificados que tienen independientemente la estructura de la fórmula I.
En algunas realizaciones, los métodos de la presente invención proporcionan un oligonucleótido que es un unímero de mipomersen. En algunas realizaciones, los métodos de la presente invención proporcionan un oligonucleótido que es un unímero de mipomersen de la configuración Rp. En algunas realizaciones, los métodos de la presente invención proporcionan un oligonucleótido que es un unímero de mipomersen de configuración Sp.
En algunas realizaciones, los métodos de la presente invención proporcionan una composición de oligonucleótidos quiralmente controlados, es decir, una composición de oligonucleótidos que contiene niveles predeterminados de tipos de oligonucleótidos individuales. En algunas realizaciones, una composición de oligonucleótidos quiralmente controlados comprende un tipo de oligonucleótido. En algunas realizaciones, una composición de oligonucleótidos quiralmente controlados comprende más de un tipo de oligonucleótido. En algunas realizaciones, una composición de oligonucleótidos quiralmente controlados comprende una pluralidad de tipos de oligonucleótidos. Las composiciones de oligonucleótidos quiralmente controlados a modo de ejemplo preparadas según el presente método inventivo se describen en el presente documento.
En algunas realizaciones, los métodos de la presente invención proporcionan composiciones de mipomersen quiralmente puras con respecto a la configuración del fósforo del enlace. Es decir, en algunas realizaciones, los métodos de la presente invención pueden proporcionar composiciones de mipomersen en donde mipomersen existe en la composición en forma de un único diastereómero con respecto a la configuración del fósforo del enlace.
En algunas realizaciones, los métodos de la presente invención proporcionan composiciones de mipomersen quiralmente uniformes con respecto a la configuración del fósforo del enlace. Es decir, en algunas realizaciones, los métodos de la presente invención pueden proporcionar composiciones de mipomersen en las que todas las unidades de nucleótidos el presente documento tienen la misma estereoquímica con respecto a la configuración del fósforo del enlace, por ejemplo, todas las unidades de nucleótidos son de la configuración Rp en el fósforo del enlace o todas las unidades de nucleótidos son de la configuración Sp en el fósforo del enlace.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado tiene una pureza superior al 50 %. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado tiene una pureza superior a aproximadamente el 55 %. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado tiene una pureza superior a aproximadamente el 60 %. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado tiene una pureza superior a aproximadamente el 65 %. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado tiene una pureza superior a aproximadamente el 70 %. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado tiene una pureza superior a aproximadamente el 75 %. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado tiene una pureza superior a aproximadamente el 80 %. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado tiene una pureza superior a aproximadamente el 85 %. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado tiene una pureza superior a aproximadamente el 90 %. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado tiene una pureza superior a aproximadamente el 91 %. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado tiene una pureza superior a aproximadamente el 92 %. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado tiene una pureza superior a aproximadamente el 93 %. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado tiene una pureza superior a aproximadamente el 94 %. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado tiene una pureza superior a aproximadamente el 95 %. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado tiene una pureza superior a aproximadamente el 96 %. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado tiene una pureza superior a aproximadamente el 97 %. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado tiene una pureza superior a aproximadamente el 98 %. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado tiene una pureza superior a aproximadamente el 99 %. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado tiene una pureza superior a aproximadamente el 99,5 %. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado tiene una pureza superior a aproximadamente el 99,6 %. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado tiene una pureza superior a aproximadamente el 99,7 %. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado tiene una pureza superior a aproximadamente el 99,8 %. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado tiene una pureza superior a aproximadamente el 99,9 %. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado tiene una pureza superior a al menos aproximadamente el 99 %.
En algunas realizaciones, una composición de oligonucleótidos quiralmente controlados es una composición diseñada para comprender un único tipo de oligonucleótido. En ciertas realizaciones, dichas composiciones tienen una pureza diastereomérica del 50 %. En algunas realizaciones, dichas composiciones tienen una pureza diastereomérica del 50 %. En algunas realizaciones, dichas composiciones tienen una pureza diastereomérica del 50 %. En algunas realizaciones, dichas composiciones tienen una pureza diastereomérica del 55 %. En algunas realizaciones, dichas composiciones tienen una pureza diastereomérica del 60 %. En algunas realizaciones, dichas composiciones tienen una pureza diastereomérica del 65 %. En algunas realizaciones, dichas composiciones tienen una pureza diastereomérica del 70 %. En algunas realizaciones, dichas composiciones tienen una pureza diastereomérica del 75 %. En algunas realizaciones, dichas composiciones tienen una pureza diastereomérica del 80 %. En algunas realizaciones, dichas composiciones tienen una pureza diastereomérica del 85 %. En algunas realizaciones, dichas composiciones tienen una pureza diastereomérica del 90 %. En algunas realizaciones, dichas composiciones tienen una pureza diastereomérica del 91 %. En algunas realizaciones, dichas composiciones tienen una pureza diastereomérica del 92 %. En algunas realizaciones, dichas composiciones tienen una pureza diastereomérica del 93 %. En algunas realizaciones, dichas composiciones tienen una pureza diastereomérica del 94 %. En algunas realizaciones, dichas composiciones tienen una pureza diastereomérica del 95 %. En algunas realizaciones, dichas composiciones tienen una pureza diastereomérica del 96 %. En algunas realizaciones, dichas composiciones tienen una pureza diastereomérica del 97 %. En algunas realizaciones, dichas composiciones tienen una pureza diastereomérica del 98 %. En algunas realizaciones, dichas composiciones tienen una pureza diastereomérica del 99 %. En algunas realizaciones, dichas composiciones tienen una pureza diastereomérica del 99,5 %. En algunas realizaciones, dichas composiciones tienen una pureza diastereomérica del 99,6 %. En algunas realizaciones, dichas composiciones tienen una pureza diastereomérica del 99,7 %. En algunas realizaciones, dichas composiciones tienen una pureza diastereomérica del 99,8 %. En algunas realizaciones, dichas composiciones tienen una pureza diastereomérica del 99,9 %. En algunas realizaciones, dichas composiciones tienen una pureza diastereomérica de al menos el 99 %.
En algunas realizaciones, una composición de oligonucleótidos quiralmente controlados es una composición diseñada para comprender múltiples tipos de oligonucleótidos. En algunas realizaciones, los métodos de la presente invención permiten la generación de una biblioteca de oligonucleótidos quiralmente controlados de forma que una cantidad preseleccionada de uno cualquiera o más tipos de oligonucleótidos quiralmente controlados se pueda mezclar con uno cualquiera o varios de otros tipos de oligonucleótidos quiralmente controlados para crear una composición de oligonucleótidos quiralmente controlados. En algunas realizaciones, la cantidad preseleccionada de un tipo de oligonucleótido es una composición que tiene una cualquiera de las purezas diastereoméricas anteriormente descritas.
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona métodos de preparación de un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende etapas de:
(1) acoplamiento;
(2) terminación;
(3) modificación;
(4) desbloqueo; y
(5) repetir las etapas (1) -(4) hasta que se logre una longitud deseada.
Cuando se describen los métodos proporcionados, la palabra "ciclo" tiene su significado habitual como es entendido por un experto habitual en la técnica. En algunas realizaciones, una ronda de etapas (1 )-(4) se denomina un ciclo.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona métodos de preparación de composiciones de oligonucleótidos quiralmente controlados, que comprenden las etapas de:
(a) proporcionar una cantidad de un primer oligonucleótido quiralmente controlado; y
(b) opcionalmente proporcionar una cantidad de uno o más oligonucleótidos quiralmente controlados adicionales.
En algunas realizaciones, un primer oligonucleótido quiralmente controlado es un tipo de oligonucleótido, como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, uno o más oligonucleótidos quiralmente controlados adicionales tiene uno o más tipos de oligonucleótido, como se describe en el presente documento.
Un experto en las técnicas químicas y sintéticas relevantes reconocerá el grado de versatilidad y control de la variación estructural y la configuración estereoquímica de un oligonucleótido proporcionado cuando se sintetiza usando los métodos de la presente invención. Por ejemplo, después de completarse un primer ciclo, se puede realizar un ciclo posterior usando una unidad de nucleótido individualmente seleccionada para el ciclo posterior que, en algunas realizaciones, comprende una nucleobase y/o un azúcar que es diferente de la nucleobase y/o el azúcar del primer ciclo. Asimismo, el auxiliar quiral usado en la etapa de acoplamiento del ciclo posterior puede ser diferente del auxiliar quiral usado en el primer ciclo, de forma que el segundo ciclo genere un enlace de fósforo de una configuración estereoquímica diferente. En algunas realizaciones, la estereoquímica del fósforo del enlace en el enlace internucleotídico recién formado se controla usando fosforamiditos estereoquímicamente puros. Además, el reactivo de modificación usado en la etapa de modificación de un ciclo posterior puede ser diferente del reactivo de modificación usado en el primer ciclo o anterior. El efecto acumulado de este enfoque de ensamblaje iterativo es tal que cada componente de un oligonucleótido proporcionado puede ser estructuralmente y configuracionalmente confeccionado a un alto grado. Una ventaja adicional de este enfoque es que la etapa de terminación minimiza la formación de "n-1" impurezas que harían, de otro modo, que el aislamiento de un oligonucleótido proporcionado fuera extremadamente difícil, y especialmente los oligonucleótidos de mayores longitudes.
En algunas realizaciones, un ciclo a modo de ejemplo del método de preparación de oligonucleótidos quiralmente controlados se ilustra en el Esquema I. En el Esquema I, & representa el soporte sólido, y opcionalmente una porción del oligonucleótido quiralmente controlado en crecimiento unido al soporte sólido. El auxiliar quiral ejemplificado tiene la estructura de la fórmula 3-I:
Figure imgf000100_0001
que se describe más a continuación. "Tapa" es cualquier resto químico introducido en el átomo de nitrógeno por la etapa de terminación, y en algunas realizaciones, es un grupo protector de amino. Un experto habitual en la técnica entiende que en el primer ciclo puede haber solo un nucleósido unido al soporte sólido cuando empieza, y la salida del ciclo se puede realizar opcionalmente antes del desbloqueo. Como entiende un experto en la técnica, BPRO es una base protegida usada en la síntesis de oligonucleótidos. Cada etapa del ciclo anteriormente representado del Esquema I se describe a continuación.
Esquema I. Síntesis de oligonucleótido quiralmente controlado.
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Síntesis en soporte sólido
En algunas realizaciones, la síntesis de un oligonucleótido proporcionado se realiza en fase sólida. En algunas realizaciones, los grupos reactivos presentes en un soporte sólido están protegidos. En algunas realizaciones, los grupos reactivos presentes en un soporte sólido están sin proteger. Durante la síntesis de oligonucleótidos, un soporte sólido se trata con diversos reactivos en varios ciclos de síntesis para lograr la elongación escalonada de una cadena de oligonucleótidos en crecimiento con unidades de nucleótidos individuales. La unidad de nucleósidos en el extremo de la cadena que se une directamente al soporte sólido se llama "el primer nucleósido", como se usa en el presente documento. Un primer nucleósido se une a un soporte sólido por un resto conector, es decir, un dirradical con enlaces covalentes entre cualquiera de los CPG, un polímero u otro soporte sólido y un nucleósido. El conector permanece intacto durante los ciclos de síntesis realizados para ensamblar la cadena de oligonucleótido y se escinde después del ensamblaje de la cadena para liberar el oligonucleótido del soporte.
Los soportes sólidos para la síntesis de ácidos nucleicos en fase sólida incluyen los soportes descritos en, por ejemplo, las patentes de EE. UU. 4.659.774, 5.141.813, 4.458.066; las patentes de EE. u U. de Caruthers N.° 4.415.732, 4.458.066, 4.500.707, 4.668.777, 4.973.679 y 5.132.418; las patentes de EE. UU de Andrus et al. N.25.047.524, 5.262.530; y la patente de EE. u U. de Koster N.° 4.725.677 (reexpedida como Re34.069). En algunas realizaciones, una fase sólida es un soporte de polímero orgánico. En algunas realizaciones, una fase sólida es un soporte de polímero inorgánico. En algunas realizaciones, un soporte de polímero orgánico es poliestireno, aminometilpoliestireno, un copolímero de injerto de polietilenglicol-poliestireno, poliacrilamida, polimetacrilato, poli(alcohol vinílico), polímero altamente reticulado (HCP), u otros polímeros sintéticos, hidratos de carbono tales como celulosa y almidón u otros hidratos de carbono poliméricos, u otros polímeros orgánicos y cualquier copolímero, material compuesto o combinación de los materiales inorgánicos u orgánicos anteriores. En algunas realizaciones, un soporte de polímero inorgánico es sílice, alúmina, polividrio controlado (CPG), que es un soporte de gel de sílice, o aminopropil CPG. Otros soportes sólidos útiles incluyen soportes sólidos de flúor (véase, por ejemplo, el documento de patente WO/2005/070859), soportes sólidos de alquilamina de cadena larga (LCAA)-vidrio de poro controlado (CPG) (véanse, por ejemplo, S. P. Adams, K. S. Kavka, E. J. Wykes, S. B. Holder y G. R. Galluppi, J. Am. Chem. Soc., 1983, 105, 661 -663; G. R. Gough, M. J. Bruden y P. T. Gilham, Tetrahedron Lett., 1981,22, 4177-4180). Los soportes de membrana y las membranas poliméricas (véase, por ejemplo, Innovation and Perspectives in Solid Phase Synthesis, Peptides, Proteins and Nucleic Acids, ch 21 pp 157-162, 1994, Ed. Roger Epton y la patente de EE. UU. N.° 4.923.901) también son útiles para la síntesis de ácidos nucleicos. Una vez formada, una membrana puede ser químicamente funcionalizada para su uso en la síntesis de ácidos nucleicos. Además de la unión de un grupo funcional a la membrana, el uso de un grupo conector o espaciador unido a la membrana también se usa en algunas realizaciones para minimizar el impedimento estérico entre la membrana y la cadena sintetizada.
Otros soportes sólidos adecuados incluyen, en general, los conocidos en la técnica por ser adecuados para su uso en las metodologías de fase sólida, que incluyen, por ejemplo, vidrio comercializado como el soporte PrimerTM 200, vidrio de poro controlado (CPG), vidrio de poro controlado con oxalilo (véase, por ejemplo, Alul, et al., Nucleic Acids Research, 1991, 19, 1527), TentaGel Support - un soporte derivatizado con aminopolietilenglicol (véase, por ejemplo, Wright, et al., Tetrahedron Lett., 1993, 34, 3373) y Poros - un copolímero de poliestireno/divinilbenceno.
Se ha mostrado el uso de polímeros activados en la superficie en la síntesis de ácidos nucleicos y proteínas naturales y modificados en varios medios de soporte sólido. Un material de soporte sólido puede ser cualquier polímero de porosidad adecuadamente uniforme, que tiene contenido de amina suficiente, y flexibilidad suficiente para ser sometido a cualquier manipulación relacionada sin perder la integridad. Los ejemplos de materiales seleccionados adecuados incluyen nailon, polipropileno, poliéster, politetrafluoroetileno, poliestireno, policarbonato y nitrocelulosa. Otros materiales pueden servir de soporte sólido, dependiendo del diseño del investigador. En vista de algunos diseños, se puede seleccionar, por ejemplo, un metal recubierto, en particular oro o platino (véase, por ejemplo, la publicación de EE. UU. N.° 20010055761). En una realización de síntesis de oligonucleótidos, por ejemplo, un nucleósido está sin anclar a un soporte sólido que está funcionalizado con restos hidroxilo o amino. Alternativamente, un soporte sólido se derivatiza para proporcionar un grupo trialcoxitritilo lábil al ácido, tal como un grupo trimetoxitritilo (TMT). Sin desear quedar ligado a teoría, se espera que la presencia de un grupo protector trialcoxitritilo permita la destritilación inicial en condiciones comúnmente usadas en los sintetizadores de ADN. Para una liberación más rápida del material de oligonucleótido en disolución con amoniaco acuoso, se introduce opcionalmente un conector de diglicoato sobre el soporte.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado se sintetiza alternativamente de la dirección 5' a 3'. En algunas realizaciones, un ácido nucleico se une a un soporte sólido a través de su extremo 5’ del ácido nucleico en crecimiento, presentando así su grupo 3' para la reacción, es decir, usando fosforamiditos de 5'-nucleósido o en reacción enzimática (por ejemplo, ligación y polimerización usando 5'-trifosfatos de nucleósido). Cuando se considera la síntesis de 5' a 3', las etapas iterativas de la presente invención permanecen inalteradas (es decir, terminación y modificación en el fósforo quiral).
Resto de enlace
Se usa opcionalmente un resto de enlace o conector para conectar un soporte sólido con un compuesto que comprende un resto nucleófilo libre. Se conocen conectores adecuados, tales como moléculas cortas que sirven para conectar un soporte sólido con grupos funcionales (por ejemplo, grupos hidroxilo) de moléculas de nucleósidos iniciales en técnicas sintéticas en fase sólida. En algunas realizaciones, el resto de enlace es un conector de ácido succinámico, o un conector de succinato (-CO-CH2-CH2-CO-), o un conector de oxalilo (-CO-CO-). En algunas realizaciones, el resto de enlace y el nucleósido se unen juntos mediante un enlace éster. En algunas realizaciones, un resto de enlace y un nucleósido se unen juntos mediante un enlace amida. En algunas realizaciones, un resto de enlace conecta un nucleósido con otro nucleótido o ácido nucleico. Los conectores adecuados se desvelan en, por ejemplo, Oligonucleotides And Analogues A Practical Approach, Ekstein, F. Ed., IRL Press, N.Y., 1991, Capítulo 1, y Solid-Phase Supports for Oligonucleotide Synthesis, Pon, R. T., Curr. Prot. Nucleic Acid Chem., 2000, 3.1.1-3.1.28.
Se usa un resto conector para conectar un compuesto que comprende un resto nucleófilo libre con otro nucleósido, nucleótido o ácido nucleico. En algunas realizaciones, un resto de enlace es un enlace fosfodiéster. En algunas realizaciones, un resto de enlace es un resto H-fosfonato. En algunas realizaciones, un resto de enlace es un enlace de fósforo modificado como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, se usa un conector universal (UnyLinker) para unir el oligonucleótido con el soporte sólido (Ravikumar et al., Org. Process Res. Dev., 2008, 12 (3), 399-410). En algunas realizaciones, se usan otros conectores universales (Pon, R. T., Curr. Prot. Nucleic Acid Chem., 2000, 3.1.1-3.1.28). En algunas realizaciones, se usan diversos conectores ortogonales (tales como conectores disulfuro) (Pon, R. T., Curr. Prot. Nucleic Acid Chem., 2000, 3.1.1-3.1.28).
Condiciones generales - disolventes para síntesis
Las síntesis de oligonucleótidos proporcionados se realizan, en general, en disolventes orgánicos apróticos. En algunas realizaciones, un disolvente es un disolvente de nitrilo, tal como, por ejemplo, acetonitrilo. En algunas realizaciones, un disolvente es un disolvente de amina básica, tal como, por ejemplo, piridina. En algunas realizaciones, un disolvente es un disolvente etéreo, tal como, por ejemplo, tetrahidrofurano. En algunas realizaciones, un disolvente es un hidrocarburo halogenado, tal como, por ejemplo, diclorometano. En algunas realizaciones, se usa una mezcla de disolventes. En ciertas realizaciones, un disolvente es una mezcla de una cualquiera o más de las clases anteriormente descritas de disolventes.
En algunas realizaciones, cuando un disolvente orgánico aprótico no es básico, está presente una base en la etapa de reacción. En algunas realizaciones donde está presente una base, la base es una base de amina, tal como, por ejemplo, piridina, quinolina, o W,W-dimetilanilina. A modo de ejemplo, otras bases de amina incluyen pirrolidina, piperidina, W-metilpirrolidina, piridina, quinolina, W,W-dimetilaminopiridina (DMAP) o W,W-dimetilanilina.
En algunas realizaciones, una base es distinta de una base de amina.
En algunas realizaciones, un disolvente orgánico aprótico es anhidro. En algunas realizaciones, un disolvente orgánico aprótico anhidro está recién destilado. En algunas realizaciones, un disolvente orgánico aprótico anhidro recién destilado es un disolvente de amina básica, tal como, por ejemplo, piridina. En algunas realizaciones, un disolvente orgánico aprótico anhidro recién destilado es un disolvente etéreo, tal como, por ejemplo, tetrahidrofurano. En algunas realizaciones, un disolvente orgánico aprótico anhidro recién destilado es un disolvente de nitrilo, tal como, por ejemplo, acetonitrilo.
Reactivo quiral
En los métodos proporcionados, se usan reactivos quirales para conferir estereoselectividad en la producción de oligonucleótidos quiralmente controlados. Se pueden usar muchos reactivos quirales diferentes, también denominados por los expertos en la técnica y en el presente documento auxiliares quirales, según los métodos de la presente invención. Dichos reactivos quirales a modo de ejemplo se describen en el presente documento y en Wada I, II y III, citados anteriormente. En ciertas realizaciones, un reactivo quiral es como se describe por Wada I. En algunas realizaciones, un reactivo quiral para su uso según los métodos de la presente invención es de la fórmula 3-I, que sigue:
Figure imgf000103_0001
en donde W 1 y W2 son cualquiera de -O-, -S- o -NG5-, U1 y U3 son átomos de carbono que están unidos a U2 si está presente, o entre sí si r es 0, por un enlace sencillo, doble o triple. U2 es -C-, -CG8-, - CG8G8-, -NG8-, -N-, -O- o -S-donde r es un número entero de 0 a 5 y no más de dos heteroátomos son adyacentes. Cuando uno cualquiera de U2 es C, se debe formar un triple enlace entre un segundo caso de U2 , que es C, o con uno de U1 o U3. Similarmente, cuando una cualquiera de U2 es CG8, se forma un doble enlace entre un segundo caso de U2 que es -CG8- o -N-, o con uno de U1 o U3.
En algunas realizaciones, -U1-(U2)r-U3- es -CG3G4-CG1G2-. En algunas realizaciones, -U1-(U2)r-U3- es -CG3= CG1-. En algunas realizaciones, -U1-(U2)r-U3- es -CeC-. En algunas realizaciones, -U1-(U2)r-U3- es -CG3=CG8-CG1G2-. En algunas realizaciones, -U1-(U2)r-U3- es -CG3G4-O-CG1G2-. En algunas realizaciones, -U1-(U2)r-U3- es -CG3G4-NG8-CG1G2-. En algunas realizaciones, -U1-(U2)r-U3- es -CG3G4-N-CG2-. En algunas realizaciones, -U1-(U2)r-U3- es -CG3G4-N=C G8-CG1G2-.
Como se define en el presente documento, G1, G2, G3, G4, G5 y G8 son independientemente hidrógeno, o un grupo opcionalmente sustituido seleccionado de alquilo, aralquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heterociclilo, heteroarilo y arilo; o dos de G1, G2, G3, G4 y G5 son G6 se toman conjuntamente para formar un anillo carbocíclico opcionalmente sustituido, saturado, parcialmente insaturado o insaturado o que contiene un heteroátomo de hasta aproximadamente 20 átomos de anillo que es monocíclico o policíclico, y está condensado o sin condensar. En algunas realizaciones, un anillo así formado está sustituido por restos oxo, tioxo, alquilo, alquenilo, alquinilo, heteroarilo o arilo. En algunas realizaciones, cuando un anillo formado tomando dos G6 juntos está sustituido, está sustituido por un resto que es lo suficientemente voluminoso para conferir estereoselectividad durante la reacción.
En algunas realizaciones, un anillo formado tomando dos de G6 juntos es ciclopentilo, pirrolilo, ciclopropilo, ciclohexenilo, ciclopentenilo, tetrahidropiranilo o piperazinilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, un anillo formado tomando dos de G6 juntos es ciclopentilo, pirrolilo, ciclopropilo, ciclohexenilo, ciclopentenilo, tetrahidropiranilo, pirrolidinilo o piperazinilo opcionalmente sustituido.
En algunas realizaciones, G1 es fenilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, G1 es fenilo. En algunas realizaciones, G2 es metilo o hidrógeno. En algunas realizaciones, G1 es fenilo opcionalmente sustituido y G2 es metilo. En algunas realizaciones, G1 es fenilo y G2 es metilo.
En algunas realizaciones, r es 0.
En algunas realizaciones, W 1 es -NG5-. En algunas realizaciones, uno de G3 y G4 se toma conjuntamente con G5 para formar un anillo de pirrolidinilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, uno de G3 y G4 se toma conjuntamente con G5 para formar un anillo de pirrolidinilo.
En algunas realizaciones, W2 es -O-.
En algunas realizaciones, un reactivo quiral es un compuesto de la fórmula 3-AA:
Figure imgf000103_0002
en donde cada variable es independientemente como se ha definido anteriormente y descrito en el presente documento.
En algunas realizaciones de la fórmula 3AA, W 1 y W2 son independientemente -NG5-, -O-, o -S-; G1, G2, G3, G4 y G5 son independientemente hidrógeno, o un grupo opcionalmente sustituido seleccionado de alquilo, aralquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heterociclilo, heteroarilo o arilo; o dos de G1, G2, G3, G4 y G5 son G6 se toman conjuntamente para formar un anillo carbocíclico saturado opcionalmente sustituido, parcialmente insaturado o insaturado o que contiene heteroátomo de hasta aproximadamente 20 átomos de anillo que es monocíclico o policíclico, condensado o sin condensar, y no más de cuatro de G1, G2, G3, G4 y G5 son G6. Similarmente a los compuestos de la fórmula 3-I, cualquiera de G1, G2, G3, G4 o G5 se sustituyen opcionalmente por restos oxo, tioxo, alquilo, alquenilo, alquinilo, heteroarilo o arilo. En algunas realizaciones, dicha sustitución induce la estereoselectividad en la producción de oligonucleótidos quiralmente controlados.
En algunas realizaciones, un reactivo quiral tiene una de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000104_0001
Fórmulas 3-AB 3-BB 3-CC 3-DD 3-EE 3-EF
En algunas realizaciones, un reactivo quiral es un aminoalcohol. En algunas realizaciones, un reactivo quiral es un aminotiol. En algunas realizaciones, un reactivo quiral es un aminofenol. En algunas realizaciones, un reactivo quiral es (S)- y (R)-2-metilamino-1 -feniletanol, (1 R,2S)-efedrina, o (1 R,2S)-2-metilamino-1,2-difeniletanol.
En algunas realizaciones del método inventivo, un reactivo quiral es un compuesto de una de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000104_0002
La elección de reactivo quiral, por ejemplo, el isómero representado por la fórmula Q o su estereoisómero, la fórmula R, permite el control específico de la quiralidad en un fósforo de enlace. Por lo tanto, se puede seleccionar cualquiera de una configuración Rp o Sp en cada ciclo sintético, que permite el control de la estructura tridimensional global de un oligonucleótido quiralmente controlado. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado tiene todos los estereocentros Rp. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado por el método inventivo tiene todos los estereocentros Sp. En algunas realizaciones, cada fósforo de enlace en el oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado por el método inventivo es independientemente Rp o Sp. En algunas realizaciones, cada fósforo de enlace en el oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado por el método inventivo es independientemente Rp o Sp, y al menos uno es Rp y al menos uno es Sp. En algunas realizaciones, la selección de centros Rp y Sp se hace para conferir una superestructura tridimensional específica a un oligonucleótido quiralmente controlado. Dichas selecciones a modo de ejemplo se describen con más detalle en el presente documento.
En algunas realizaciones, un reactivo quiral para su uso según el presente método inventivo se selecciona para su capacidad para ser retirado en una etapa particular en el ciclo anteriormente representado. Por ejemplo, en algunas realizaciones es conveniente retirar un reactivo quiral durante la etapa de modificación del fósforo de enlace. En algunas realizaciones, es conveniente retirar un reactivo quiral antes de la etapa de modificación del fósforo de enlace. En algunas realizaciones, es conveniente retirar un reactivo quiral después de la etapa de modificación del fósforo de enlace. En algunas realizaciones, es conveniente retirar un reactivo quiral después de que haya ocurrido una primera etapa de acoplamiento pero antes de que haya ocurrido una segunda etapa de acoplamiento, de forma que un reactivo quiral no esté presente en el oligonucleótido en crecimiento durante el segundo acoplamiento (y asimismo para las etapas de acoplamiento posteriores adicionales). En algunas realizaciones, un reactivo quiral se retira durante la reacción de "desbloqueo" que ocurre después de la modificación del fósforo de enlace pero antes de que empiece un ciclo posterior. Los métodos y reactivos a modo de ejemplo para la retirada se describen en el presente documento.
En algunas realizaciones, la retirada del auxiliar quiral se logra cuando se realiza la etapa de modificación y/o desbloqueo, como se ilustra en el Esquema I. Puede ser beneficioso combinar el auxiliar quiral retirado junto con otras transformaciones, tales como modificación y desbloqueo. Un experto habitual en la técnica apreciaría que las etapas ahorradas/transformación podrían mejorar la eficiencia global de la síntesis, por ejemplo, con respecto al rendimiento y la pureza del producto, especialmente para oligonucleótidos más largos. Un ejemplo en donde el auxiliar quiral se retira durante la modificación y/o el desbloqueo se ilustra en el Esquema I.
En algunas realizaciones, un reactivo quiral para su uso según los métodos de la presente invención se caracteriza porque es extraíble en ciertas condiciones. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un reactivo quiral se selecciona para su capacidad para ser retirado en condiciones ácidas. En ciertas realizaciones, un reactivo quiral se selecciona para su capacidad para ser retirado en condiciones ligeramente ácidas. En ciertas realizaciones, un reactivo quiral se selecciona para su capacidad para ser retirado a modo de una reacción de eliminación E1 (por ejemplo, la retirada ocurre debido a la formación de un producto intermedio de catión en el reactivo quiral en condiciones ácidas, causando que el reactivo quiral se escinda del oligonucleótido). En algunas realizaciones, un reactivo quiral se caracteriza porque tiene una estructura reconocida por ser capaz de acomodar o facilitar una reacción de eliminación E1. Un experto de las artes relevantes apreciará que se prevería que las estructuras fueran propensas a experimentar dichas reacciones de eliminación.
En algunas realizaciones, un reactivo quiral se selecciona para su capacidad para ser retirado con un nucleófilo. En algunas realizaciones, un reactivo quiral se selecciona para su capacidad para ser retirado con un nucleófilo de amina. En algunas realizaciones, un reactivo quiral se selecciona para su capacidad para ser retirado con un nucleófilo distinto de una amina.
En algunas realizaciones, un reactivo quiral se selecciona para su capacidad para ser retirado con una base. En algunas realizaciones, un reactivo quiral se selecciona para su capacidad para ser retirado con una amina. En algunas realizaciones, un reactivo quiral se selecciona para su capacidad para ser retirado con una base distinta de una amina.
Realizaciones adicionales de reactivos quirales
En algunas realizaciones, la presente divulgación se refiere a un reactivo quiral que se puede usar para sintetizar oligonucleótidos quiralmente controlados.
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona reactivos quirales que son estables a las etapas de acoplamiento, terminación, modificación y desbloqueo descritas anteriormente y en el presente documento. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona reactivos quirales que son estables a las etapas de modificación y desbloqueo descritas anteriormente y en el presente documento. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona reactivos quirales que son estables a las etapas de sulfurización y desbloqueo descritas anteriormente y en el presente documento. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona reactivos quirales que son estables a la etapa de oxidación descrita anteriormente y en el presente documento. En algunas realizaciones, dicho reactivo quiral tiene una estructura de la fórmula Z-I.
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona reactivos quirales que se retiran mediante tratamiento con una base y/o un nucleófilo. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona reactivos quirales que se retiran mediante tratamiento con una base y/o un nucleófilo, y son estables a las etapas de acoplamiento, terminación, modificación y desbloqueo descritas anteriormente y en el presente documento. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona reactivos quirales que se retiran mediante tratamiento que comprenden una amina. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona reactivos quirales que se retiran mediante tratamiento que comprenden una amina, y son estables a las etapas de acoplamiento, terminación, modificación y desbloqueo descritas anteriormente y en el presente documento. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona reactivos quirales que se retiran por las condiciones de desprotección/escisión descritas en la presente divulgación, y son estables a las etapas de acoplamiento, terminación, modificación y desbloqueo descritas anteriormente y en el presente documento. En algunas realizaciones, dicho reactivo quiral tiene una estructura de la fórmula Z-I.
En algunas realizaciones, los reactivos quirales que son estables a las etapas de acoplamiento, terminación, modificación y desbloqueo se usan para sintetizar oligonucleótidos quiralmente controlados descritos anteriormente y en el presente documento. En algunas realizaciones, los reactivos quirales que son estables a las etapas de acoplamiento, terminación, modificación y desbloqueo se usan para sintetizar oligonucleótidos quiralmente controlados descritos anteriormente y en el presente documento, en donde los oligonucleótidos quiralmente controlados comprenden uno o más enlaces diéster de fosfato o diéster de fosforotioato. En algunas realizaciones, los reactivos quirales que son estables a las etapas de acoplamiento, terminación, modificación y desbloqueo se usan para sintetizar oligonucleótidos quiralmente controlados que comprenden uno o más enlaces diéster de fosfato o diéster de fosforotioato, y no se retiran hasta que se hayan logrado las longitudes de oligonucleótido deseadas. En algunas realizaciones, los reactivos quirales que son estables a las etapas de acoplamiento, terminación, modificación y desbloqueo se usan para sintetizar oligonucleótidos quiralmente controlados que comprenden uno o más enlaces diéster de fosfato o diéster de fosforotioato, y no se retiran hasta después de la salida del de ciclo. En algunas realizaciones, los reactivos quirales que son estables a las etapas de acoplamiento, terminación, modificación y desbloqueo se usan para sintetizar oligonucleótidos quiralmente controlados que comprenden uno o más enlaces diéster de fosfato o diéster de fosforotioato, y no se retiran hasta la escisión del soporte sólido. En algunas realizaciones, los reactivos quirales que son estables a las etapas de acoplamiento, terminación, modificación y desbloqueo se usan para sintetizar oligonucleótidos quiralmente controlados que comprenden uno o más enlaces diéster de fosfato o diéster de fosforotioato, y no se retiran hasta la escisión del soporte sólido, y la retirada se realiza en la misma etapa que la escisión del soporte sólido. En algunas realizaciones, dicho reactivo quiral tiene una estructura de la fórmula Z-I.
En algunas realizaciones, cuando un reactivo quiral que es estable a las etapas de acoplamiento, terminación, modificación y desbloqueo se usa en la síntesis de oligonucleótidos, el oligonucleótido con 5'-OH listo para el acoplamiento puede ser de cualquier ciclo sintético, que incluye los descritos en los Esquemas I, I-b, I-c, I-d, Z-1 y Z-2. En algunas realizaciones, el oligonucleótido con 5'-OH para el acoplamiento comprende diversos tipos de enlaces internucleotídicos como se ha descrito anteriormente y en el presente documento. Después del acoplamiento, la etapa de modificación como se describe en la presente divulgación instala la modificación deseada al fósforo del enlace. El producto puede ir a la salida de ciclo antes/después del desbloqueo, o entrar en el siguiente ciclo después del desbloqueo de 5'-OH. Un experto habitual en la técnica entiende que el siguiente ciclo puede ser cualquiera de los ciclos sintéticos descritos en la presente divulgación, que incluyen, pero no se limitan a, aquellos en los Esquemas I, I-b, I-c, I-d, Z-1 y Z-2.
En algunas realizaciones, un reactivo quiral o una sal del mismo para su uso según la presente divulgación es de la fórmula química (Z-I).
Figure imgf000106_0001
En la fórmula (Z-I), Gz1 y Gz2 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo nitro (-NO2), un átomo de halógeno, un grupo ciano (-CN), un grupo de la fórmula (Z-II) o (Z-III), o tanto G1 como G2 se toman conjuntamente para formar un grupo de la fórmula (Z-IV).
En algunas realizaciones, un grupo de la fórmula (Z-II) es como se representa a continuación:
Figure imgf000106_0002
en donde G21 a G23 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo nitro, un átomo de halógeno, un grupo ciano o un grupo alquilo C1-3.
En algunas realizaciones, un grupo de la fórmula (Z-III) es como se representa a continuación:
G31
---- Si— G32 (Z-III)
G33
en donde G31 a G33 son independientemente grupo alquilo C1-4, grupo arilo C6-14 grupo alcoxi C1-4, grupo aralquilo C7-14, grupo alquil C1-4-arilo C6-14, grupo alcoxi C1-4-arilo C6-14 o grupo aril C6-14-alquilo C1-4.
En algunas realizaciones, un grupo de la fórmula (Z-IV) es como se representa a continuación:
Figure imgf000106_0003
en donde G41 a G46 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo nitro, un átomo de halógeno, un grupo ciano o un grupo alquilo C1-3.
Gz3 y Gz4 son independientemente un átomo de hidrógeno, grupo alquilo C1-3, grupo arilo C6-14, o tanto Gz3 como Gz4 se toman conjuntamente para formar un anillo que contiene un heteroátomo que tiene 3 a 16 átomos de carbono, junto con el resto NH en la fórmula (Z-I).
En algunas realizaciones, un reactivo quiral tiene la siguiente fórmula química (Z-I'):
Figure imgf000107_0001
en donde Gz1 y Gz2 son los mismos que antes. Concretamente, Gz1 y Gz2 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo nitro, un átomo de halógeno, un grupo ciano, un grupo de la fórmula (Z-II) o (Z-III), o tanto Gz1 como Gz2 se toman conjuntamente para formar un grupo de la fórmula (Z-IV).
En ciertas realizaciones, un reactivo quiral tiene la fórmula química (Z-I') y cada uno de Gz1 y Gz2 es un grupo de la fórmula (Z-II), en donde G21 a G23 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo nitro, un átomo de halógeno, un grupo ciano o un grupo alquilo C1-3.
En ciertas realizaciones, un reactivo quiral tiene la fórmula química (Z-I') y cada uno de Gz1 y Gz2 es un grupo de la fórmula (Z-II) y cada uno de G21 a G23 es un átomo de hidrógeno.
En ciertas realizaciones, un reactivo quiral tiene la fórmula química (Z-I') y Gz1 es un átomo de hidrógeno, Gz2 es un grupo de la fórmula (Z-II), y G21 a G23 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo nitro, un átomo de halógeno, un grupo ciano o un grupo alquilo C1-3.
En ciertas realizaciones, un reactivo quiral tiene la fórmula química (Z-I') y Gz1 es un átomo de hidrógeno, Gz2 es un grupo de la fórmula (Z-II), cada uno de G21 y G22 es un átomo de hidrógeno y G23 es un grupo nitro.
En ciertas realizaciones, un reactivo quiral tiene la fórmula química (Z-I') y Gz1 es un átomo de hidrógeno y Gz2 es un grupo de la fórmula (III), y G31 a G33 son independientemente un grupo alquilo C1-4, grupo arilo C6-14, grupo aralquilo C7-14, grupo alquil C1-4-arilo C6-14, grupo alcoxi C1-4-arilo C6-14 o grupo aril C6-14-alquilo C1-4.
En algunas realizaciones, el reactivo quiral tiene la fórmula química (I') y G1 es un átomo de hidrógeno y G2 es un grupo de la fórmula (III), y G31 a G33 son independientemente grupo alquilo C1-4, grupo arilo C6, grupo aralquilo C7-10, grupo alquil C1-4-arilo C6, grupo alcoxi C1-4-arilo C6 o grupo aril C6-alquilo C1-4.
En ciertas realizaciones, un reactivo quiral tiene la fórmula química (Z-I') y Gz1 es un átomo de hidrógeno, Gz2 es un grupo de la fórmula (Z-III), y G31 a G33 son independientemente grupo alquilo C1-4 o grupo arilo C6. Los ejemplos de grupo alquilo C1-4 son grupo metilo, grupo etilo, grupo n-propilo, grupo /so-propilo, grupo n-butilo y grupo tere-butilo. En ciertas realizaciones, un reactivo quiral tiene la fórmula química (Z-I') y Gz1 es un átomo de hidrógeno, Gz2 es un grupo de la fórmula (Z-III), y G31 a G33 son independientemente grupo alquilo C1-4.
En ciertas realizaciones, un reactivo quiral tiene la fórmula química (Z-I') y Gz1 es un átomo de hidrógeno, Gz2 es un grupo de la fórmula (Z-III), y G31 y G33 son grupo arilo C6 y G32 es grupo alquilo C1-4.
En ciertas realizaciones, un reactivo quiral tiene la fórmula química (Z-I') y Gz1 y Gz2 se toman conjuntamente para formar un grupo de la fórmula (Z-IV), y G41 a G46 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo nitro, un átomo de halógeno, un grupo ciano o un grupo alquilo C1-4.
En ciertas realizaciones, un reactivo quiral tiene la fórmula química (Z-I') y Gz1 y Gz2 se toman conjuntamente para formar un grupo de la fórmula (Z-IV), en donde cada uno de G41 a G46 es un átomo de hidrógeno.
En ciertas realizaciones, un reactivo quiral se selecciona de una de las fórmulas químicas 3a, 3b, 5a, Z-5b, 7a, 7b, 9a, 9b, 11a y 11b:
Figure imgf000107_0002
Figure imgf000108_0001
En algunas realizaciones, un derivado de 3'-fosforamidito de nucleósido para su uso según la presente divulgación se representa por la fórmula (Z-Va) o (Z-Vb):
Figure imgf000108_0002
en donde Gz1 a Gz4 son los mismos que antes, Gz5 es un grupo protector del grupo hidroxilo y Bs es un grupo seleccionado de los grupos representados por la siguiente fórmula (Z-VI) a (Z-XI), o derivados de los mismos.
Figure imgf000108_0003
Ejemplos de Bs son una adenina, una timina, una citosina, una guanina, un uracilo, una 5-metilcitosina o derivado de los mismos;
Rz2 es independientemente hidrógeno, -OH, -SH, -NRdRd, -N3 , halógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y1-, alquenil-Y1-, alquinil-Y1-, aril-Y1-, heteroaril-Y1-, -ORb o -SRb, en donde Rb es un resto de bloqueo;
Y1 es O, NRd, S o Se;
Rd es independientemente hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, acilo, sililo sustituido, carbamato, -P(O)(Re)2 o -HP(O)(Re);
Re es independientemente hidrógeno, alquilo, arilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y2-, alquenil- Y2-, alquinil-Y2-, aril-Y2- o heteroaril-Y2-, o un catión que es Na+, Li+, o K+ o -O-;
Y2 es O, NRd o S;
Rz3 es un grupo representado por -CH2-, -(CH2)2-, -CH2NH- o -CH2N(CH3) -.
Ejemplos de G5 son tritilo, 4-monometoxitritilo, 4,4'-dimetoxitritilo, 4,4',4"-trimetoxitritilo, 9-fenilxantin-9-ilo (Pixilo) y 9-(p-metoxifenil)xantin-9-ilo (MOX).
En algunas realizaciones, un derivado de 3'-fosforamidito de nucleósido se representa por la fórmula (Z-Va') o (Z-Vb'):
Figure imgf000109_0001
en donde cada uno de Gz1, Gz2, Gz5, Bs, Rz2 y Rz3 es independientemente como se ha definido anteriormente y descrito en el presente documento.
En algunas realizaciones, la divulgación se refiere a un método para la síntesis de un oligonucleótido quiralmente controlado.
En algunas realizaciones, un método proporcionado comprende una primera etapa de hacer reaccionar una molécula que comprende un resto H-fosfonato aquiral, formando el primer reactivo activante y un reactivo quiral o una sal del mismo un monómero. En algunas realizaciones, un reactivo quiral tiene la fórmula química (Z-I) y el monómero se puede representar por la fórmula (Z-Va), (Z-Vb), (Z-Va') o (Z-Vb'). El monómero reacciona con el segundo reactivo activante y un nucleósido para formar un producto intermedio condensado. En algunas realizaciones, una etapa posterior comprende convertir el producto intermedio condensado en el ácido nucleico que comprende un resto X-fosfonato quiral.
En algunas realizaciones, los presentes métodos proporcionan materiales estables y comercialmente disponibles como materiales de partida. En algunas realizaciones, los presentes métodos proporcionan un oligonucleótido estereocontrolado modificado en el átomo de fósforo usando un material de partida aquiral.
Como se muestra en los ejemplos de trabajo, en algunas realizaciones los métodos de la presente divulgación no provocan la degradación durante las etapas de desprotección. Además, el método no requiere agentes de terminación especiales para producir derivados de oligonucleótidos modificados en el átomo de fósforo.
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un método para la síntesis de derivados de oligonucleótidos estereocontrolados modificados en el átomo de fósforo usando un monómero quiral. En algunas realizaciones, la primera etapa es hacer reaccionar un derivado de 3'-fosforamidito de nucleósido que se representa por la fórmula (Z-Va), (Z-Vb), (Z-Va') o (Z-Vb'), formando el segundo reactivo de activación y un nucleósido un producto intermedio condensado. La segunda etapa es convertir el producto intermedio condensado en el ácido nucleico que comprende un resto X-fosfonato quiral.
Como se usa en esta sección de "Realizaciones adicionales de reactivos quirales", en una reacción de condensación, el término "reactivo de activación" se refiere a un reactivo que activa un sitio menos reactivo y lo hace más susceptible al ataque por un nucleófilo.
Como se usa en esta sección de "Realizaciones adicionales de reactivos quirales", un grupo "alquilo" se refiere a un grupo de hidrocarburo alifático. El resto alquilo puede ser un grupo alquilo saturado (que significa que no contiene unidades de insaturación, por ejemplo, dobles enlaces carbono-carbono o triples enlaces carbono-carbono) o el resto alquilo puede ser un grupo alquilo insaturado (que significa que contiene al menos una unidad de insaturación). El resto alquilo, tanto saturado como insaturado, puede ser ramificado, de cadena lineal, o incluir una porción cíclica. El punto de unión de un alquilo está en un átomo de carbono que no es parte de un anillo. El resto "alquilo" puede tener 1 a 10 átomos de carbono (siempre que aparezca en el presente documento, un intervalo numérico tal como "1 a 10" se refiere a cada número entero en el intervalo dado; por ejemplo, "1 a 10 átomos de carbono" significa que el grupo alquilo puede consistir en 1 átomo de carbono, 2 átomos de carbono, 3 átomos de carbono, etc., hasta y que incluye 10 átomos de carbono, aunque la presente definición también cubre la aparición del término "alquilo" donde no se designa intervalo numérico). Alquilo incluye tanto grupos alquilo ramificado como de cadena lineal. El grupo alquilo de los compuestos descritos en el presente documento se puede designar "alquilo C1-C6" o designaciones similares. A modo de ejemplo solo, "alquilo C1-C6" indica que existen uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis átomos de carbono en la cadena de alquilo, es decir, la cadena de alquilo se selecciona de, por ejemplo, metilo, etilo, propilo, iso-propilo, nbutilo, iso-butilo, sec-butilo y terc-butilo. Grupos alquilo típicos incluyen, pero de ninguna forma se limitan a, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, terciaria butilo, pentilo, hexilo, alilo, ciclopropilmetilo, ciclobutilmetilo, ciclopentilmetilo, ciclohexilmetilo y similares. En un aspecto, un alquilo es un alquilo C1-C6. Grupo alquilo C1-3 significa grupo alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 3 átomos de carbono. Los ejemplos de grupo alquilo C1-3 son metilo, etilo, propilo e isopropilo. Grupo alquilo C1-4 significa grupo alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 4 átomos de carbono. Los ejemplos de grupo alquilo C1-4 son metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo y terc-butilo.
Como se usa en esta sección de "Realizaciones adicionales de reactivos quirales”, el término "arilo" se refiere a un anillo aromático en donde cada uno de los átomos que forma el anillo es un átomo de carbono. Los anillos de arilo están formados por cinco, seis, siete, ocho, nueve o más de nueve átomos de carbono. Los grupos arilo están sustituidos o sin sustituir. En un aspecto, un arilo es un fenilo o un naftalenilo. Dependiendo de la estructura, un grupo arilo puede ser un monorradical o un dirradical (es decir, un grupo arileno). En un aspecto, un arilo es un arilo C6-C10. El grupo arilo C6-14 significa grupo arilo que tiene 6 a 14 átomos de carbono. Los ejemplos de grupo arilo C6-14 son fenilo, bifenilo, naftilo, antracilo, indanilo, ftalimidilo, naftimidilo, fenantridinilo y tetrahidronaftilo.
El término "aralquilo" se refiere a un grupo alquilo sustituido con un grupo arilo. Los grupos aralquilo adecuados incluyen bencilo, picolilo y similares, todos los cuales se pueden sustituir opcionalmente.
Como se usa en esta sección de "Realizaciones adicionales de reactivos quirales", un "resto acilo" se refiere a un grupo alquil(C=O), aril(C=O) o aralquil(C=O). Un resto acilo puede tener un resto intermedio (Y) que es oxi, amino, tio o seleno entre el carbonilo y el grupo de hidrocarburo. Por ejemplo, un grupo acilo puede ser alquil-Y-(C=O), aril- Y-(C=O) o aralquil-Y-(C=O).
Como se usa en esta sección de "Realizaciones adicionales de reactivos quirales", grupos "alquenilo" son grupos de hidrocarburo de cadena lineal, cadena ramificada y cíclico que contienen al menos un doble enlace carbono-carbono. Los grupos alquenilo se pueden sustituir.
Como se usa en esta sección de "Realizaciones adicionales de reactivos quirales", grupos "alquinilo" son grupos de hidrocarburo de cadena lineal, cadena ramificada y cíclico que contienen al menos un triple enlace carbono-carbono. Los grupos alquinilo se pueden sustituir.
Como se usa en esta sección de "Realizaciones adicionales de reactivos quirales", un grupo "alcoxi" se refiere a un grupo alquilo unido a oxígeno, es decir, grupo (alquil)-O-, donde alquilo es como se define en el presente documento. Los ejemplos incluyen grupos metoxi (-OCH3) o etoxi (-OCH2CH3).
Como se usa en esta sección de "Realizaciones adicionales de reactivos quirales", un grupo "alqueniloxi" se refiere a un grupo alquenilo unido a oxígeno, es decir, grupo (alquenil)-O-, donde alquenilo es como se define en el presente documento.
Como se usa en esta sección de "Realizaciones adicionales de reactivos quirales", un grupo "alquiniloxi" se refiere a un grupo alquinilo unido a oxígeno, es decir, grupo (alquinil)-O-, donde alquinilo es como se define en el presente documento.
Como se usa en esta sección de "Realizaciones adicionales de reactivos quirales", un grupo "ariloxi" se refiere a un grupo arilo unido a oxígeno, es decir, grupo (aril)-O-, donde el arilo es como se define en el presente documento. Un ejemplo incluye grupo fenoxi (-OC6H5).
Como se usa en esta sección de "Realizaciones adicionales de reactivos quirales", el término "alquilseleno" se refiere a un grupo alquilo que tiene un grupo seleno sustituido unido al mismo, es decir, un grupo (alquil)-Se-, en donde alquilo se define en el presente documento.
Como se usa en esta sección de "Realizaciones adicionales de reactivos quirales", el término "alquenilseleno" se refiere a un grupo alquenilo que tiene un grupo seleno sustituido unido al mismo, es decir, grupo (alquenil)-Se-, en donde alquenilo se define en el presente documento.
Como se usa en esta sección de "Realizaciones adicionales de reactivos quirales", el término "alquinilseleno" se refiere a un grupo alquinilo que tiene un grupo seleno sustituido unido al mismo, es decir, grupo (alquinil)-Se-, en donde alquenilo se define en el presente documento.
Como se usa en esta sección de "Realizaciones adicionales de reactivos quirales", el término "alquiltio" se refiere a un grupo alquilo unido a un átomo de azufre de puente, es decir, grupo (alquil)-S-, en donde alquilo se define en el presente documento. Por ejemplo, un alquiltio es un metiltio y similares.
Como se usa en esta sección de "Realizaciones adicionales de reactivos quirales", el término "alqueniltio" se refiere a un grupo alquenilo unido a un átomo de azufre de puente, es decir, grupo (alquenil)-S-, en donde alquenilo se define en el presente documento.
Como se usa en esta sección de "Realizaciones adicionales de reactivos quirales", el término "alquiniltio" se refiere a un grupo alquinilo unido a un átomo de azufre de puente, es decir, grupo (alquinil)-S-, en donde alquenilo se define en el presente documento.
Como se usa en esta sección de "Realizaciones adicionales de reactivos quirales", el término "alquilamino" se refiere a un grupo amino sustituido con al menos un grupo alquilo, es decir, -NH(alquilo) o -N(alquilo)2, en donde alquilo se define en el presente documento.
Como se usa en esta sección de "Realizaciones adicionales de reactivos quirales", el término "alquenilamino" se refiere a un grupo amino sustituido con al menos un grupo alquenilo, es decir, -NH(alquenilo) o -N(alquenilo)2, en donde alquenilo se define en el presente documento.
Como se usa en esta sección de "Realizaciones adicionales de reactivos quirales", el término "alquinilamino" se refiere a un grupo amino sustituido con al menos un grupo alquinilo, es decir, -NH(alquinilo) o -N(alquinilo)2, en donde alquinilo se define en el presente documento.
Como se usa en esta sección de "Realizaciones adicionales de reactivos quirales", el término "halógeno" pretende incluir flúor, cloro, bromo y yodo.
Como se usa en esta sección de "Realizaciones adicionales de reactivos quirales", un "grupo fluorescente" se refiere a una molécula que, cuando se excita con luz que tiene una longitud de onda seleccionada, emite luz de una longitud de onda diferente. Los grupos fluorescentes incluyen, pero no se limitan a, grupos indol, fluoresceína, tetrametilrodamina, Texas Red, BODIPY, ácido 5-[(2-aminoetil)amino]naftaleno-1-sulfónico (EDANS), coumarina y amarillo Lucifer.
Como se usa en esta sección de "Realizaciones adicionales de reactivos quirales", un "ion amonio" es un catión poliatómico positivamente cargado de la fórmula química NH4+.
Como se usa en esta sección de "Realizaciones adicionales de reactivos quirales", un "ion alquilamonio" es un ion amonio que tiene al menos uno de sus átomos de hidrógeno sustituido con un grupo alquilo, en donde alquilo se define en el presente documento. Los ejemplos incluyen ion trietilamonio, ion W,W-diisopropiletilamonio.
Como se usa en esta sección de "Realizaciones adicionales de reactivos quirales", un "ion iminio" tiene la estructura general (Rx)2C=N(Rx)2+. Los grupos Rx se refieren a grupos alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo como se define en el presente documento. Un "ion iminio heteroaromático" se refiere a un ion iminio donde el nitrógeno y sus grupos Rx unidos forman un anillo heteroaromático. Un "ion iminio heterocíclico" se refiere a un ion iminio donde el nitrógeno y sus grupos Rx unidos forman un anillo heterocíclico.
Como se usa en esta sección de "Realizaciones adicionales de reactivos quirales", los términos "amino" o "amina" se refieren a un grupo de radicales -N(Rh)2 , donde cada Rh es independientemente hidrógeno, alquilo, fluoroalquilo, carbociclilo, carbociclilalquilo, arilo, aralquilo, heterociclilo, heterociclilalquilo, heteroarilo o heteroarilalquilo, a menos que se establezca de otro modo específicamente en la memoria descriptiva. Cuando un grupo -N(Rh)2 tiene dos Rh distintos de hidrógeno, se pueden combinar con el átomo de nitrógeno para formar un anillo de 4, 5, 6 o 7 miembros. Por ejemplo, se indica que -N(Rh)2 incluye, pero no se limita a, 1 -pirrolidinilo y 4-morfolinilo. Uno cualquiera o más del hidrógeno, alquilo, fluoroalquilo, carbociclilo, carbociclilalquilo, arilo, aralquilo, heterociclilo, heterociclilalquilo, heteroarilo o heteroarilalquilo se sustituyen opcionalmente con uno o más sustituyentes que son independientemente alquilo, heteroalquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, arilalquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo, hidroxi, halógeno, ciano, trifluorometilo, trifluorometoxi, nitro, trimetilsililo, -ORi, -SRi, -OC(O)Ri, -N(Ri)2, -C(O)Ri, -C(O)ORi, -OC(O)N(Ri)2, -C(O)N(Ri)2, -N(Ri)C(O)OR, -N(Ri)C(O)Ri, -N(Ri)C(O)N(Ri)2, N(Ri)C(NRi)N(Ri)2, -N(Ri)S(O)tRi (donde t es 1 o 2), -S(O) o -S(O)tN(Ri)2 (donde t es 1 o 2), donde cada Ri es independientemente hidrógeno, alquilo, fluoroalquilo, carbociclilo, carbociclilalquilo, arilo, aralquilo, heterociclilo, heterociclilalquilo, heteroarilo o heteroarilalquilo.
Como se usa en esta sección de "Realizaciones adicionales de reactivos quirales", "carbamato", como se usa en el presente documento, se refiere a un resto unido a un grupo amino que tiene la fórmula -C(O)OR donde R es alquilo, fluoroalquilo, carbociclilo, carbociclilalquilo, arilo, aralquilo, heterociclilo, heterociclilalquilo, heteroarilo o heteroarilalquilo. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, grupo Boc (terc-butil-OC(O)-), CBz (bencil-OC(O)-), Teoc (Me3SiCH2CH2OC(O)-), alloc (alil-OC(O)-) o Fmoc (9-fluorenilmetil-OC(O)-)
Como se usa en esta sección de "Realizaciones adicionales de reactivos quirales", "sililo sustituido", como se usa en el presente documento, se refiere a un resto que tiene la fórmula Rx3Si-. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, TBDMS (terc-butildimetilsililo), TBDPS (terc-butildifenilsililo) o TMS (trimetilsililo).
Como se usa en esta sección de "Realizaciones adicionales de reactivos quirales", el término "tiol" se refiere a grupos -SH, e incluyen grupos tiol sustituidos, es decir, grupos -SRJ, en donde RJ son cada uno independientemente un grupo alquilo, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, arilaralquilo, heterociclilo o heterociclilalquilo sustituido o sin sustituir como se define en el presente documento.
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un reactivo quiral o una sal del mismo. En algunas realizaciones, un reactivo quiral es de la siguiente fórmula química (Z-I):
Figure imgf000112_0001
en donde Gz1 y Gz2 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo nitro, un átomo de halógeno, un grupo ciano (-CN), un grupo de la fórmula (Z-II) o (Z-III), o tanto Gz1 como Gz2 se toman conjuntamente para formar un grupo de la fórmula (Z-IV). En algunas realizaciones, el término "reactivo quiral" es una composición química que se usa para producir un nucleótido estereocontrolado modificado en el átomo de fósforo o derivados de oligonucleótidos. Un reactivo quiral reacciona con un nucleósido para formar un producto intermedio quiral.
En algunas realizaciones, un grupo de la fórmula (Z-II) es de la siguiente fórmula:
Figure imgf000112_0002
en donde G21 a G23 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo nitro, un átomo de halógeno, un grupo ciano o un grupo alquilo C1-3. En algunas realizaciones, los ejemplos de G21 a G23 son un átomo de hidrógeno. En algunas realizaciones, un grupo de la fórmula (Z-III) es de la siguiente fórmula:
G31
---- Si— G32 (Z-III)
G33
en donde G31 a G33 son independientemente un grupo alquilo C1-4, grupo arilo C6-14, grupo alcoxi C1-4, grupo aralquilo C7-14, grupo alquil C1-4-arilo C6-14, grupo alcoxi C1-4-arilo C6-14 o grupo aril C6-14-alquilo C1-4. Los ejemplos de grupo alquil C1-4-arilo C6-14 son grupo metilfenilo y grupo etilfenilo. Los ejemplos de grupo alcoxi C1-4-arilo C6-14 son grupo metoxifenilo y grupo etoxifenilo. Los ejemplos de grupos aril C6-14-alquilo C1-4 son grupo bencilo y grupo feniletilo. En algunas realizaciones, los ejemplos de G31 a G33 son independientemente un grupo metilo y un grupo fenilo.
En algunas realizaciones, un grupo de la fórmula (Z-IV) es de la siguiente fórmula:
Figure imgf000112_0003
en donde G41 a G46 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo nitro, un átomo de halógeno, un grupo ciano o un grupo alquilo C1-3. En algunas realizaciones, los ejemplos de G41 a G46 son un átomo de hidrógeno. Gz3 y Gz4 son independientemente un átomo de hidrógeno, grupo alquilo C1-3, grupo arilo C6-14, o tanto Gz3 como Gz4 se toman conjuntamente para formar un anillo que contiene un heteroátomo que tiene 3 a 16 átomos de carbono. En algunas realizaciones, los ejemplos de G3 y G4 se toman conjuntamente para formar un anillo que contiene un heteroátomo que tiene 3 a 16 átomos de carbono con el resto NH en la fórmula (I).
En ciertas realizaciones, un reactivo quiral tiene la siguiente fórmula química (Z-I').
Figure imgf000113_0001
En la fórmula (Z-I'), Gz1 y Gz2 son los mismos que antes y Gz1 y Gz2 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo nitro, un átomo de halógeno, un grupo ciano, un grupo de la fórmula (Z-II) o (Z-III), o tanto Gz1 como Gz2 se toman conjuntamente para formar un grupo de la fórmula (Z-IV).
En ciertas realizaciones, un reactivo quiral tiene la fórmula química (Z-I') y cada uno de Gz1 y Gz2 es un grupo de la fórmula (Z-II), en donde G21 a G23 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo nitro, un átomo de halógeno, un grupo ciano o un grupo alquilo C1-3.
En ciertas realizaciones, un reactivo quiral tiene la fórmula química (Z-I') y cada uno de Gz1 y Gz2 es un grupo de la fórmula (Z-II) y cada uno de G21 a G23 es un átomo de hidrógeno.
En ciertas realizaciones, un reactivo quiral tiene la fórmula química (Z-I') y Gz1 es un átomo de hidrógeno, Gz2 es un grupo de la fórmula (Z-II), y G21 a G23 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo nitro, un átomo de halógeno, un grupo ciano o un grupo alquilo C1-3.
En ciertas realizaciones, un reactivo quiral tiene la fórmula química (Z-I') y Gz1 es un átomo de hidrógeno, Gz2 es un grupo de la fórmula (Z-II), cada uno de G21 y G22 es un átomo de hidrógeno y G23 es un grupo nitro (-NO2).
En ciertas realizaciones, un reactivo quiral tiene la fórmula química (Z-I') y Gz1 es un átomo de hidrógeno y Gz2 es un grupo de la fórmula (Z-III), y G31 a G33 son independientemente un grupo alquilo C1-4, grupo arilo C6-14, grupo aralquilo C7-14, grupo alquil C1-4-arilo C6-14, grupo alcoxi C1-4-arilo C6-14 o grupo aril C6-14-alquilo C1-4.
En algunas realizaciones, un reactivo quiral tiene la fórmula química (Z-I') y Gz1 es un átomo de hidrógeno, Gz2 es un grupo de la fórmula (Z-III), y G31 a G33 son independientemente un grupo alquilo C1-4 o grupo arilo C6 (un grupo fenilo). Los ejemplos de grupo alquilo C1-4 son grupo metilo, grupo etilo, grupo n-propilo, grupo /so-propilo, grupo n-butilo y grupo terc-butilo.
En ciertas realizaciones, un reactivo quiral tiene la fórmula química (Z-I') y Gz1 es un átomo de hidrógeno, Gz2 es un grupo de la fórmula (Z-III), y G31 a G33 son independientemente grupo alquilo C1-2 (un grupo metilo o un grupo etilo) o grupo arilo C6 (un grupo fenilo).
En ciertas realizaciones, un reactivo quiral tiene la fórmula química (Z-I') y Gz1 es un átomo de hidrógeno, Gz2 es un grupo de la fórmula (Z-III), y G31 a G33 son independientemente un grupo alquilo C1-4.
En ciertas realizaciones, un reactivo quiral tiene la fórmula química (Z-I') y Gz1 es un átomo de hidrógeno, Gz2 es un grupo de la fórmula (Z-III), y G31 y G33 son un grupo arilo C6 (un grupo fenilo) y G32 es grupo alquilo C1-2.
En ciertas realizaciones, un reactivo quiral tiene la fórmula química (Z-I') y Gz1 y Gz2 se toman conjuntamente para formar un grupo de la fórmula (Z-IV), y G41 a G46 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo nitro, un átomo de halógeno, un grupo ciano o un grupo alquilo C1-3.
En ciertas realizaciones, un reactivo quiral tiene la fórmula química (Z-I') y Gz1 y Gz2 se toman conjuntamente para formar un grupo de la fórmula (Z-IV), en donde cada uno de G41 a G46 es un átomo de hidrógeno.
En ciertas realizaciones, un reactivo quiral se selecciona de una de las fórmulas químicas 3a, 3b, 5a, Z-5b, 7a, 7b, 9a, 9b, 11a y 11b:
Figure imgf000113_0002
Figure imgf000114_0001
Concretamente, en algunas realizaciones, un reactivo quiral se selecciona de:
(S)-2-(Metildifenilsilil)-1 -((S)-1 -pirrolidin-2-il)etanol (3a),
(R) -2-(Metildifenilsilil)-1 -((R)-1 -pirrolidin-2-il)etanol (3b),
(S) -2-(Trimetilsilil)-1 -((S)-1 -pirrolidin-2-il)etanol (5a),
(R)-2-(Trimetilsilil)-1-((R)-1-pirrolidin-2-il)etanol (Z-5b),
(R) -2,2-Difenil-1 -((S)-pirrolidin-2-il)etanol (7a),
(S) -2,2-Difenil-1 -((R)-pirrolidin-2-il)etanol (7b),
(R) -2-(4-Nitrofenil)-1 -((S)-pirrolidin-2-il)etanol (9a),
(S) -2-(4-Nitrofenil)-1 -((R)-pirrolidin-2-il)etanol (9b),
(R) -(9H-Fluororen-9-il)((S)-pirrolidin-2-il)metanol (11a), o
(S) -(9H-Fluororen-9-il)((R)-pirrolidin-2-il)metanol (11b).
El reactivo quiral reacciona con un ácido nucleico o ácido nucleico modificado para ser un grupo auxiliar asimétrico. Un derivado de 3'-fosforamidito de nucleósido, que es un producto intermedio de la fabricación de un derivado de oligonucleótido estereocontrolado modificado en un átomo de fósforo, se obtiene por un reactivo quiral reaccionando con un ácido nucleico o ácido nucleico modificado.
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un derivado de 3'-fosforamidito de nucleósido que se representa por la fórmula (Z-Va) o (Z-Vb). Los compuestos de la fórmula (Z-Va) y (Z-Vb) se conocen como monómeros que se usan en la síntesis de derivados de oligonucleótidos. Estos compuestos también se conocen como monómeros de oxazafosfolidina. Los restos de azúcar de los compuestos representados por la fórmula (Z-Vb) se conocen como BNA y LNA (cuando Rz3 es un grupo metileno).
Figure imgf000114_0002
En la fórmula (Z-Va) y (Z-Va), Gz1 a Gz4 son los mismos que antes, Gz5 es un grupo protector del grupo hidroxilo y Bs es un grupo seleccionado de los grupos representados por la fórmula (Z-VI) a (Z-XI) o derivados de los mismos.
Figure imgf000115_0001
Los ejemplos de Bs son una adenina, una timina, una citosina, una guanina, un uracilo, una 5-metilcitosina o derivado de las mismas;
Rz2 es independientemente hidrógeno, -OH, -SH, -NRdRd, -N3 , halógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y1-, alquenil-Y1-, alquinil-Y1-, aril-Y1-, heteroaril-Y1-, -ORb o -SRb, en donde Rb es un resto de bloqueo;
Y1 es O, NRd, S o Se;
Rd es independientemente hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, acilo, sililo sustituido, carbamato, -P(O)(Re)2 o -HP(O)(Re);
Re es independientemente hidrógeno, alquilo, arilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y2-, alquenil- Y2- , alquinil-Y2-, aril-Y2-, o heteroaril-Y2-, o un catión que es Na+, Li+, o K+ o -O-;
Y2 es O, NRd o S;
Rz3 es un grupo representado por -CH2-, -(CH2)2-, -CH2NH- o -CH2N(CH3) -.
Ejemplos de Gz5 es tritilo, 4-monometoxitritilo, 4,4'-dimetoxitritilo, 4,4',4"-trimetoxitritilo, 9-fenilxantin-9-ilo (Pixilo) y 9­ (p-metoxifenil)xantin-9-ilo (MOX).
En algunas realizaciones, Bs es una adenina, una timina, una citosina, una guanina, o derivado de las mismas. En algunas realizaciones, Bs es una nucleobase o una nucleobase modificada. Los derivados a modo de ejemplo son, por ejemplo, los desvelados en el documento de patente JP 2005-89441 A, y se representan del siguiente modo:
Figure imgf000115_0002
en donde, en la fórmula anterior, cada uno de R8 a R10 es independientemente alquilo C1-10, arilo C6-C10, aralquilo C6-C10 o ariloxi C6-C10-alquilo. En algunas realizaciones, R8 es metilo, isopropilo, fenilo, bencilo y fenoximetilo. En algunas realizaciones, R9 y R10 son un grupo alquilo C1-4.
En algunas realizaciones, un derivado de 3'-fosforamidito de nucleósido se representa por la fórmula (Z-Va') o (Z-Vb'):
Figure imgf000116_0001
en donde, en la fórmula (Z-Va') y (Z-Vb'), cada uno de Gz1, Gz2, Gz5, Bs, Rz2 y Rz3 son los mismos que antes. En ciertas realizaciones, un derivado de 3'-fosforamidito de nucleósido es un monómero quiral que se usa para producir nucleótido y oligonucleótido estereocontrolado modificado en el átomo de fósforo. Los ejemplos de los derivados de 3'-fosforamidito de nucleósido se representan por las siguientes fórmulas: 12a, 12b, 13a, 13b, 14a, 14b, 15a, 15b, 16a, 16b, 17a, 17b, 18a, 18b, 19a, 19b, 20a, 20b, 21a, 21b, 22a, 22b, 23a, 23b, 24a, 24b, 25a, 25b, 26a, 26b, 27a, 27b, 28a, 28b, 29a, 29b, 30a, 30b, 31a, 31b, 32a, 32b, 33a, 33b, 34a, 34b y 35a.
Figure imgf000116_0002
Figure imgf000117_0001
Figure imgf000118_0001
Figure imgf000119_0001
Figure imgf000120_0001
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Figure imgf000122_0001
DMTr representa un grupo 4,4'-dimetoxitritilo y TOM representa un grupo triisopropilsiloximetilo.
Los ejemplos de uso de un derivado de 3'-fosforamidito de nucleósido se desvelan en, por ejemplo, el documento de patente JP 2005-89441 A. Por repetición de las etapas de condensación y desprotección, los métodos de la presente divulgación facilitan el alargamiento de la cadena del oligonucleótido, como se desvela en el presente documento. En algunas realizaciones, un oligonucleótido es como se muestra en la fórmula (Z-X):
Figure imgf000122_0002
en donde, en la fórmula (Z-X), Xz representa sulfuro (=S), alquilo C1-3, alcoxi C1-3, alquiltio C1-3, arilo C6-C10, aralquilo C6-C10 o ariloxi C6-C10-alquilo. En algunas realizaciones, Xz representa sulfuro (=S). nz es un número entero que representa 1 a 150, 1 a 100, 1 a 50, o 1 a 30. En algunas realizaciones, nz es preferentemente 2 a 100, preferentemente 10 a 100, preferentemente 10 a 50, y más preferentemente 15 a 30.
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona métodos de síntesis de un derivado de oligonucleótido estereocontrolado modificado en el átomo de fósforo. En algunas realizaciones, la primera etapa es una etapa de reacción de una molécula que comprende un resto de H-fosfonato aquiral, el primer reactivo de activación y un reactivo quiral o una sal del mismo para formar un monómero. En algunas realizaciones, el reactivo quiral tiene la fórmula química (Z-I) o (Z-I') y el monómero se puede representar por la fórmula (Z-Va), (Z-Vb), (Z-Va') o (Z-Vb'). El monómero reacciona con el segundo reactivo de activación y un nucleósido para formar un producto intermedio condensado. La siguiente etapa es una etapa de conversión del producto intermedio condensado en el ácido nucleico que comprende un resto de X-fosfonato quiral. En algunas realizaciones, los métodos son como se describen en el documento de patente WO 2010/064146. En algunas realizaciones, las etapas son como se describen en la vía A y la vía B del documento de patente WO 2010/064146.
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un método de síntesis de un oligonucleótido quiralmente controlado como se ilustra en el Esquema Z-1 que sigue.
Figure imgf000123_0001
Un resto de H-fosfonato aquiral se trata con el primer reactivo de activación para formar el primer producto intermedio. En una realización, el primer reactivo de activación se añade a la mezcla de reacción durante la etapa de condensación. El uso del primer reactivo de activación depende de las condiciones de reacción, tales como los disolventes que se usan para la reacción. Los ejemplos del primer reactivo de activación son fosgeno, triclorometilcloroformiato, bis(triclorometil)carbonato (BTC), cloruro de oxalilo, PhmPCh, (PhO)3PCl2, cloruro N,W-bis(2-oxo-3-oxazolidinil)fosfínico (BopCl), hexafluorofosfato de 1,3-dimetil-2-(3-nitro-1,2,4-triazol-1 -il)-2-pirrolidin-1 -il-1,3,2-diazafosfolidinio (MNTP) o hexafluorofosfato de 3-nitro-1,2,4-triazol-1-il-tris(pirrolidin-1-il)fosfonio (PyNTP).
El ejemplo de resto H-fosfonato aquiral es un compuesto mostrado en el esquema anterior. DBU representa 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno. H+DBU puede ser, por ejemplo, ion amonio, ion alquilamonio, ion iminio heteroaromático o ion iminio heterocíclico, cualquiera de los cuales es primario, secundario, terciario o cuaternario, o un ion metálico monovalente.
Reacción con reactivo quiral
Después de la primera etapa de activación, el resto H-fosfonato aquiral activado reacciona con un reactivo quiral, que se representa por la fórmula (Z-I) o (Z-I'), para formar un producto intermedio quiral de la fórmula (Z-Va), (Z-Vb), (Z-Va') o (Z-Vb').
Etapa de condensación estereoespecífica
Un producto intermedio quiral de la fórmula Z-Va ((Z-Vb), (Z-Va') o (Z-Vb')) se trata con el segundo reactivo de activación y un nucleósido para formar un producto intermedio condensado. El nucleósido puede estar sobre el soporte sólido. Los ejemplos del segundo reactivo de activación son 4,5-dicianoimidazol (DCI), 4,5-dicloroimidazol, triflato de 1 -fenilimidazolio (PhIMT), triflato de bencimidazolio (BIT), benzotriazol, 3-nitro-1,2,4-triazol (NT), tetrazol, 5-etiltiotetrazol (ETT), 5-benciltiotetrazol (BTT), 5-(4-nitrofenil)tetrazol, triflato de N-cianometilpirrolidinio (CMPT), triflato de N-cianometilpiperidinio, triflato de N-cianometildimetilamonio. Un producto intermedio quiral de la fórmula Z-Va ((Z-Vb), (Z-Va') o (Z-Vb')) se puede aislar como un monómero. Normalmente, el producto intermedio quiral de Z-Va ((Z-Vb), (Z-Va') o (Z-Vb')) no se aísla y se somete a una reacción en el mismo recipiente con un nucleósido o nucleósido modificado para proporcionar un compuesto de fosfito quiral, un producto intermedio condensado. En otras realizaciones, cuando el método se realiza por síntesis en fase sólida, el soporte sólido que comprende el compuesto se filtra de los productos secundarios, impurezas y/o reactivos.
Etapa de terminación
Si el ácido nucleico final es mayor que un dímero, el resto -OH sin terminar se termina con un grupo de bloqueo y el auxiliar quiral en el compuesto también puede ser terminado con un grupo de bloqueo para formar un producto intermedio condensado terminado. Si el ácido nucleico final es un dímero, entonces la etapa de terminación no es necesaria.
Etapa de modificación
El compuesto se modifica por reacción con un electrófilo. El producto intermedio condensado terminado se puede realizar en la etapa de modificación. En algunas realizaciones, la etapa de modificación se realiza usando un electrófilo de azufre, un electrófilo de selenio o un agente de boración. Los ejemplos de etapas de modificación son la etapa de oxidación y sulfurización.
En algunas realizaciones del método, el electrófilo de azufre es un compuesto que tiene una de las siguientes fórmulas:
S8 (Fórmula Z-B), Zz1-S-S-Zz2o Zz1-S-Vz-Zz2;
en donde Zz1 y Zz2 son independientemente alquilo, aminoalquilo, cicloalquilo, heterocíclico, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, alquiloxi, ariloxi, heteroariloxi, acilo, amida, imida o tiocarbonilo, o Zz1 y Zz2 se toman conjuntamente para formar un anillo alicíclico o heterocíclico de 3 a 8 miembros, que puede estar sustituido o sin sustituir; VZ es SO2, O o NRf; y Rf es hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo o arilo.
En algunas realizaciones del método, el electrófilo de azufre es un compuesto de la siguiente fórmula Z-A, Z-B, Z-C, Z-D, Z-E o Z-F:
Figure imgf000124_0001
En algunas realizaciones, el electrófilo de selenio es un compuesto que tiene una de las siguientes fórmulas:
Se (Fórmula Z-G), Zz3-Se-Se-Zz4 o Zz3-Se-Vz-Zz4;
en donde Zz3 y Zz4 son independientemente alquilo, aminoalquilo, cicloalquilo, heterocíclico, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, alquiloxi, ariloxi, heteroariloxi, acilo, amida, imida o tiocarbonilo, o Zz3 y Zz4 se toman conjuntamente para formar un anillo alicíclico o heterocíclico de 3 a 8 miembros, que puede estar sustituido o sin sustituir; VZ es SO2 , S, O o NRf; y Rf es hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo o arilo.
En algunas realizaciones, el electrófilo de selenio es un compuesto de la fórmula Z-G, Z-H, Z-I, Z-J, Z-K o Z-L.
Figure imgf000124_0002
En algunas realizaciones, el agente de boración es borano-A/,W-diisopropiletilamina (BH3 DIPEA), borano-piridina (BH3 Py), borano-2-cloropiridina (BH3 CPy), borano-anilina (BH3 An), borano-tetrahidrofurano (BH3 THF) o boranodimetilsulfuro (BH3 Me2S).
En algunas realizaciones del método, la etapa de modificación es una etapa de oxidación. En algunas realizaciones del método, la etapa de modificación es una etapa de oxidación que usa condiciones similares como se ha descrito anteriormente en la presente divulgación. En algunas realizaciones, una etapa de oxidación es como se desvela en, por ejemplo, los documentos de patente JP 2010-265304 A y WO2010/064146.
Ciclo de elongación de cadena y etapa de desprotección
El producto intermedio condensado terminado se desbloquea para retirar el grupo de bloqueo en el extremo 5' de la cadena de ácido nucleico en crecimiento para proporcionar un compuesto. Se permite opcionalmente que el compuesto vuelva a entrar en el ciclo de elongación de cadena para formar un producto intermedio condensado, un producto intermedio condensado terminado, un producto intermedio condensado terminado modificado y un producto intermedio terminado modificado desprotegido en 5'. Tras al menos una ronda del ciclo de elongación de cadena, el producto intermedio terminado modificado desprotegido en 5' se desbloquea aún más por retirada del ligando auxiliar quiral y otros grupos protectores para, por ejemplo, grupos protectores de nucleobase, nucleobase modificada, azúcar y azúcar modificado, para proporcionar un ácido nucleico. En otras realizaciones, el nucleósido que comprende un resto 5'-OH es un producto intermedio de un ciclo de elongación de cadena previo como se describe en el presente documento. En aún otras realizaciones, el nucleósido que comprende un resto 5'-OH es un producto intermedio obtenido de otro método de síntesis de ácidos nucleicos conocido. En realizaciones donde se usa un soporte sólido, el ácido nucleico modificado en el átomo de fósforo se escinde entonces del soporte sólido. En ciertas realizaciones, los ácidos nucleicos siguen unidos sobre el soporte sólido para fines de purificación y luego se escinden del soporte sólido tras la purificación.
En aún otras realizaciones, el nucleósido que comprende un resto 5'-OH es un producto intermedio obtenido de otro método de síntesis de ácidos nucleicos conocido. En aún otras realizaciones, el nucleósido que comprende un resto 5'-OH es un producto intermedio obtenido de otro método de síntesis de ácidos nucleicos conocido como se describe en la presente divulgación. En aún otras realizaciones, el nucleósido que comprende un resto 5'-OH es un producto intermedio obtenido de otro método de síntesis de ácidos nucleicos conocido que comprende uno o más ciclos ilustrados en el Esquema I. En aún otras realizaciones, el nucleósido que comprende un resto 5'-OH es un producto intermedio obtenido de otro método de síntesis de ácidos nucleicos conocido que comprende uno o más ciclos ilustrados en el Esquema I-b, I-c o I-d.
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona métodos de síntesis de oligonucleótidos que usan materiales estables y comercialmente disponibles como materiales de partida. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona métodos de síntesis de oligonucleótidos para producir derivados de oligonucleótidos modificados en el átomo de fósforo estereocontrolados usando un material de partida aquiral.
En algunas realizaciones, el método de la presente divulgación no provoca degradaciones en las etapas de desprotección. Además, el método no requiere agentes de terminación especiales para producir derivados de oligonucleótidos modificados en el átomo de fósforo.
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona métodos para la síntesis de derivados de oligonucleótidos estereocontrolados modificados en el átomo de fósforo usando un monómero quiral. En algunas realizaciones, la primera etapa es hacer reaccionar un derivado de 3'-fosforamidito de nucleósido que se representa por la fórmula (Z-Va), (Z-Vb), (Z-Va') o (Z-Vb') con el segundo reactivo de activación y un nucleósido para formar un producto intermedio condensado. La segunda etapa es convertir el producto intermedio condensado en el ácido nucleico que comprende un resto de X-fosfonato quiral. Un método a modo de ejemplo es el Esquema Z-2 ilustrado a continuación.
Figure imgf000125_0001
Las condiciones detalladas del Esquema Z-2 son similares a las del Esquema Z-1. El material de partida de la fórmula Z-Va (Z-Vb), especialmente de la fórmula Z-Va' (o Z-Vb'), es químicamente estable. Como se muestra en un ejemplo de trabajo, el método de la presente divulgación no provoca degradaciones en las etapas de desprotección. Además, el método no requiere agentes de terminación especiales para producir derivados de oligonucleótidos modificados en el átomo de fósforo.
En algunas realizaciones, el mecanismo para la retirada de auxiliares se muestra como se ilustra en el Esquema Z-3, a continuación.
Figure imgf000126_0001
En el esquema Z-3, Nu representa un nucleófilo. En algunas realizaciones, se cree que el mecanismo en el Esquema Z-3 es diferente del mecanismo previo para la retirada de auxiliares.
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un reactivo quiral o una sal del mismo, teniendo el reactivo quiral la siguiente fórmula química (Z-I):
Figure imgf000126_0002
en donde Gz1 y Gz2 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo nitro, un átomo de halógeno, un grupo ciano, un grupo de la fórmula (Z-II) o (Z-III), o tanto Gz1 como Gz2 se toman conjuntamente para formar un grupo de la fórmula (Z-IV),
Figure imgf000126_0003
en donde G21 a G23 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo nitro, un átomo de halógeno, un grupo ciano o un grupo alquilo C1-3,
G31
---- Si— G32 (Z-III)
G33
en donde G31 a G33 son independientemente un grupo alquilo C1-4, grupo alcoxi C1-4, grupo arilo C6-14, grupo aralquilo C7-14, grupo alquilo C1-4-arilo C6-14, grupo alcoxi C1-4-arilo C6-14 o grupo aril C6-14-alquilo C1-4,
Figure imgf000126_0004
en donde G41 a G46 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo nitro, un átomo de halógeno, un grupo ciano o un grupo alquilo C1-3,
Gz3 y Gz4 son independientemente un átomo de hidrógeno, grupo alquilo C1-3, grupo arilo C6-14, o tanto Gz3 como Gz4 se toman conjuntamente para formar un anillo que contiene un heteroátomo que tiene 3 a 16 átomos de carbono.
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un reactivo quiral, o una sal del mismo, de la fórmula Z-1 que tiene la siguiente fórmula química (Z-I')
Figure imgf000127_0001
en donde cada variable es independientemente como se ha definido anteriormente y descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un reactivo quiral, o una sal del mismo, de la fórmula (Z-1'), en donde cada uno de Gz1 y Gz2 es un grupo de la fórmula (Z-II), en donde G21 a G23 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo nitro, un átomo de halógeno, un grupo ciano o un grupo alquilo C1-3. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un reactivo quiral, o una sal del mismo, de la fórmula (Z-1'), en donde cada uno de Gz1 y Gz2 es un grupo de la fórmula (Z-II), en donde cada uno de G21 a G23 es un átomo de hidrógeno. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un reactivo quiral, o una sal del mismo, de la fórmula (Z-1'), en donde Gz1 es un átomo de hidrógeno, y Gz2 es un grupo de la fórmula (Z-II), en donde G21 a G23 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo nitro, un átomo de halógeno, un grupo ciano o un grupo alquilo C1-3. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un reactivo quiral, o una sal del mismo, de la fórmula (Z-1'), en donde Gz1 es un átomo de hidrógeno, y Gz2 es un grupo de la fórmula (Z-II), en donde cada uno de G21 y G22 es un átomo de hidrógeno y G23 es un grupo nitro. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un reactivo quiral, o una sal del mismo, de la fórmula (Z-1'), en donde Gz1 es un átomo de hidrógeno, y Gz2 es un grupo de la fórmula (Z-III), en donde G31 a G33 son independientemente un grupo alquilo C1-4, grupo arilo C6-14, grupo aralquilo C7-14, grupo alquil C1-4-arilo C6-14, grupo alcoxi C1-4-arilo C6-14 o grupo aril C6-14-alquilo C1-4. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un reactivo quiral, o una sal del mismo, de la fórmula (Z-1'), en donde Gz1 es un átomo de hidrógeno, y Gz2 es un grupo de la fórmula (Z-III), en donde G31 a G33 son independientemente un grupo alquilo C1-4, grupo arilo C6, grupo aralquilo C7-10, grupo alquil C1-4-arilo C6, grupo alcoxi C1-4-arilo C6 o grupo aril C6-alquilo C1-4. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un reactivo quiral, o una sal del mismo, de la fórmula (Z-1'), en donde Gz1 es un átomo de hidrógeno, y Gz2 es un grupo de la fórmula (Z-III), en donde G31 a G33 son independientemente un grupo alquilo C1-4, o grupo arilo C6. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un reactivo quiral, o una sal del mismo, de la fórmula (Z-1'), en donde Gz1 es un átomo de hidrógeno, y Gz2 es un grupo de la fórmula (Z-III), en donde G31 y G33 son un grupo arilo C6 y G32 es un grupo alquilo C1-2. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un reactivo quiral, o una sal del mismo, de la fórmula (Z-1'), en donde Gz1 es un átomo de hidrógeno, y Gz2 es un grupo de la fórmula (Z-III), en donde G31 a G33 son independientemente un grupo alquilo C1-4. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un reactivo quiral, o una sal del mismo, de la fórmula (Z-1'), en donde Gz1 es un átomo de hidrógeno, y Gz2 es un grupo de la fórmula (Z-III), en donde G31 y G33 son un grupo arilo C6 y G32 es grupo alquilo C1-4. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un reactivo quiral, o una sal del mismo, de la fórmula (Z-1'), en donde Gz1 es un átomo de hidrógeno, y Gz2 es un grupo de la fórmula (Z-IV), en donde G41 a G46 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo nitro, un átomo de halógeno, un grupo ciano o un grupo alquilo C1-3. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un reactivo quiral, o una sal del mismo, de la fórmula (Z-1'), en donde Gz1 y Gz2 se toman conjuntamente para formar un grupo de la fórmula (Z-IV), en donde G41 a G46 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo nitro, un átomo de halógeno, un grupo ciano o un grupo alquilo C1-3. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un reactivo quiral, o una sal del mismo, de la fórmula (Z-1'), en donde Gz1 y Gz2 se toman conjuntamente para formar un grupo de la fórmula (Z-IV), en donde cada uno de G41 a G46 es un átomo de hidrógeno.
En algunas realizaciones, un reactivo quiral o una sal del mismo se selecciona de las fórmulas 3a, 3b, 5a, Z-5b, 7a, 7b, 9a, 9b, 11a y 11b.
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un derivado de 3'-fosforamidito de nucleósido que se representa por la fórmula Z-Va o Z-Vb:
Figure imgf000127_0002
en donde Gz1 y Gz2 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo nitro, un átomo de halógeno, un grupo ciano, un grupo de la fórmula (Z-II) o (Z-III), o tanto Gz1 como Gz2 se toman conjuntamente para formar un grupo de la fórmula (Z-IV),
Figure imgf000128_0001
en donde G21 a G23 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo nitro, un átomo de halógeno, un grupo ciano o un grupo alquilo C1-3,
G31
---- Si— G32 (Z-III)
G33
en donde G31 a G33 son independientemente un grupo alquilo C1-4, grupo alcoxi C1-4, grupo arilo C6-14, grupo aralquilo C7-14, grupo alquil C1-4-arilo C6-14, grupo alcoxi C1-4-arilo C6-14 o grupo aril C6-14-alquilo C1-4,
Figure imgf000128_0002
en donde G41 a G46 son independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo nitro, un átomo de halógeno, un grupo ciano o un grupo alquilo C1-3;
Gz3 y Gz4 son independientemente un átomo de hidrógeno, grupo alquilo C1-3, grupo arilo C6-14, o tanto Gz3 como Gz4 se toman conjuntamente para formar un anillo que contiene un heteroátomo que tiene 3 a 16 átomos de carbono;
Gz5 es un grupo protector de un grupo hidroxilo;
Rz2 es independientemente hidrógeno, -OH, -SH, -NRdRd, -N3 , halógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y1-, alquenil-Y1-, alquinil-Y1-, aril-Y1-, heteroaril-Y1-, -ORb, o -SRb, en donde Rb es un resto de bloqueo;
Y1 es O, NRd, S o Se;
Rd es independientemente hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, acilo, sililo sustituido, carbamato, -P(O)(Re)2 o -HP(O)(Re);
Re es independientemente hidrógeno, alquilo, arilo, alquenilo, alquinilo, alquil-Y2-, alquenil- Y2-, alquinil-Y2-, aril-Y2- o heteroaril-Y2-, o un catión que es Na+, Li+, o K+, o -O-;
Y2 es O, NRd o S;
Rz3 es un grupo representado por -CH2-, -(CH2)2-, -CH2NH- o -CH2N(CH3) -; y
Bs es un grupo seleccionado de los grupos representados por la siguiente fórmula (Z-VI) a (Z-XI) o derivados del mismo.
Figure imgf000128_0003
Figure imgf000129_0001
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un derivado de 3'-fosforamidito de nucleósido de la fórmula Z-Va o Z-Vb, que tiene la estructura de (Z-Va') o (Z-Vb'):
Figure imgf000129_0002
en donde cada variable es independientemente como se ha definido anteriormente y descrito en el presente documento.
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un derivado de 3'-fosforamidito de nucleósido seleccionado de las fórmulas 12a, 12b, 13a, 13b, 14a, 14b, 15a, 15b, 16a, 16b, 17a, 17b, 18a, 18b, 19a, 19b, 20a, 20b, 21a, 21b, 22a, 22b, 23a, 23b, 24a, 24b, 25a, 25b, 26a, 26b, 27a, 27b, 28a, 28b, 29a, 29b, 30a, 30b, 31a, 31b, 32a, 32b, 33a, 33b, 34a, 34b y 35a. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un derivado de 3'-fosforamidito de nucleósido seleccionado de las fórmulas 12a, 12b, 13a, 13b, 14a, 14b, 15a, 15b, 16a, 16b, 17a, 17b, 18a, 18b, 19a, 19b, 20a, 20b, 21a, 21b, 22a, 22b, 23a, 23b, 24a, 24b, 25a, 25b, 26a o 26b.
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un método para la síntesis de derivados de oligonucleótido estereocontrolado modificado en el átomo de fósforo que comprende las etapas de: hacer reaccionar una molécula que comprende un resto de H-fosfonato aquiral, un reactivo quiral o una sal del mismo para formar un monómero de un derivado de 3'-fosforamidito de nucleósido;
hacer reaccionar el monómero y un nucleósido para formar un producto intermedio condensado; y convertir el producto intermedio condensado en el ácido nucleico que comprende un resto de X-fosfonato aquiral; en donde el reactivo quiral tiene la siguiente fórmula química (Z-I).
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un método para la síntesis de derivados de oligonucleótidos estereocontrolados modificados en el átomo de fósforo que comprende las etapas de: hacer reaccionar una molécula que comprende un resto de H-fosfonato aquiral, un reactivo quiral o una sal del mismo para formar un monómero de un derivado de 3'-fosforamidito de nucleósido;
hacer reaccionar el monómero y un nucleósido para formar un producto intermedio condensado; y convertir el producto intermedio condensado en el ácido nucleico que comprende un resto de X-fosfonato quiral; en donde el reactivo quiral tiene la siguiente fórmula química (Z-I').
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un método para la síntesis de derivados de oligonucleótidos estereocontrolados modificados en el átomo de fósforo que comprende las etapas de: hacer reaccionar una molécula que comprende un resto de H-fosfonato aquiral, un reactivo quiral o una sal del mismo para formar un monómero de un derivado de 3'-fosforamidito de nucleósido;
hacer reaccionar el monómero y un nucleósido para formar un producto intermedio condensado; y convertir el producto intermedio condensado en el ácido nucleico que comprende un resto de X-fosfonato quiral; en donde el reactivo quiral se selecciona de las fórmulas 3a, 3b, 5a, Z-5b, 7a, 7b, 9a, 9b, 11a y 11b.
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un método para la síntesis de derivados de oligonucleótidos estereocontrolados modificados en el átomo de fósforo que comprende etapas de:
hacer reaccionar un derivado de 3'-fosforamidito de nucleósido que se representa por la fórmula (Z-Va) o (Z-Vb), con un reactivo de activación y un nucleósido para formar un producto intermedio condensado; y convertir el producto intermedio condensado en el ácido nucleico que comprende un resto de X-fosfonato quiral. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un método para la síntesis de derivados de oligonucleótidos estereocontrolados modificados en el átomo de fósforo que comprende las etapas de:
hacer reaccionar un derivado de 3'-fosforamidito de nucleósido representado por la fórmula (Z-Va) o (Z-Vb), con un reactivo de activación y un nucleósido para formar un producto intermedio condensado; y convertir el producto intermedio condensado en el ácido nucleico que comprende un resto de X-fosfonato quiral; y en donde el derivado de 3'-fosforamidito de nucleósido representado por la fórmula (Z-Va) o (Z-Vb) se selecciona de las fórmulas 12a, 12b, 13a, 13b, 14a, 14b, 15a, 15b, 16a, 16b, 17a, 17b, 18a, 18b, 19a, 19b, 20a, 20b, 21a, 21b, 22a, 22b, 23a, 23b, 24a, 24b, 25a, 25b, 26a, 26b, 27a, 27b, 28a, 28b, 29a, 29b, 30a, 30b, 31a, 31b, 32a, 32b, 33a, 33b, 34a, 34b y 35a. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un método para la síntesis de derivados de oligonucleótidos estereocontrolados modificados en el átomo de fósforo que comprende las etapas de:
hacer reaccionar un derivado de 3'-fosforamidito de nucleósido representado por la fórmula (Z-Va) o (Z-Vb), con un reactivo de activación y un nucleósido para formar un producto intermedio condensado; y convertir el producto intermedio condensado en el ácido nucleico que comprende un resto de X-fosfonato quiral; y en donde el derivado de 3'-fosforamidito de nucleósido representado por la fórmula (Z-Va) o (Z-Vb) se selecciona de las fórmulas 12a, 12b, 13a, 13b, 14a, 14b, 15a, 15b, 16a, 16b, 17a, 17b, 18a, 18b, 19a, 19b, 20a, 20b, 21a, 21b, 22a, 22b, 23a, 23b, 24a, 24b, 25a, 25b, 26a y 26b.
Preparación y uso de ciertos auxiliares quirales de la fórmula Z-I
Abreviatura
ac: acetilo
bz: benzoílo
CSO: (1 S)-(+)-(10-alcanforsulfonil)oxaziridina
DBU: 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno
DCA: ácido dicloroacético
DCM: diclorometano, CH2Cl2
Tr: tritilo, trifenilmetilo
MeIm: W-metilimidazol
NIS: W-yodosuccinimida
pac: fenoxiacetilo
Ph: fenilo
PhIMT: triflato de W-fenilimidazolio
POS: 3-fenil-1,2,4-ditiazolin-5-ona
TBS: terc-butildimetilsililo
TBDPS: terc-butildifenilsililo
TOM: triisopropilsiloximetilo
TFA: ácido trifluoroacético
Procedimiento general para la síntesis de oligonucleótidos quiralmente controlados -1.
La síntesis automatizada en fase sólida de oligonucleótidos quiralmente controlados se realizó según los ciclos mostrados en la Tabla Z-1.
Tabla Z-1. Procedimiento de síntesis
etapa operación reactivos y disolvente volumen tiempo de espera 1 desnitrilación 3 % de DCA/DCM 1,6 ml 20 s 2 acoplamiento monómero 0,1 M/MeCN PhIMT 1 M 0,5 ml 5 min 3 terminación Ac2O/THF-piridina 16 % de MeIm/THF 0,5 ml 30 s 4 oxidación / sulfurización CSO 0,5 M/MeCN o POS 0,1 M/MeCN 0,5 ml 90 s
Procedimiento general para la síntesis de oligonucleótidos quiralmente controlados -2.
La síntesis automatizada en fase sólida de oligonucleótidos quiralmente controlados se realizó según los ciclos mostrados en la Tabla Z-2.
Tabla Z-2.
etapa operación reactivos y disolvente volumen tiempo de espera 1 desnitrilación 3 % de DCA/DCM 1,6 ml 20 s 2 acoplamiento monómero preactivado* PhIMT 1 M 0,5 ml 5 min 3 terminación Ac2O/THF-piridina 16 % de MeIm/THF 0,5 ml 30 s 4 oxidación / sulfurización CSO 0,5 M/MeCN o POS 0,1 M/MeCN 0,5 ml 90 s
* preparación de monómero preactivado en la etapa 2 de la Tabla Z-2:
Se seca monoéster de nucleósido-3'-H-fosfonato por coevaporaciones repetidas con tolueno seco y luego se disuelve en MeCN seco. Se añade Ph3PCl2 a la disolución, y la mezcla se agita durante 5 min. A la mezcla, se añade gota a gota por jeringa una disolución de reactivo quiral, que se coevapora repetidamente con tolueno seco y se disuelve en MeCN seco, y la mezcla se agita durante 5 min bajo argón.
Después de la síntesis, la resina se trató con una disolución acuosa al 25 % de NH3 (1 ml) durante 12 h a 55 °C. La mezcla se enfrió hasta temperatura ambiente y la resina se retiró por filtración en membrana. El filtrado se concentró a sequedad a presión reducida. El residuo se disolvió en H2O (3 ml) y se analizó por RP-UPLC-MS con un gradiente lineal de acetonitrilo (0-50 %/30 min) en tampón acetato de trietilamonio 0,1 M (pH 7,0) a 50 °C a una tasa de 0,3 ml/min.
Ejemplo Z-1.
(S)-1-Tritilpirrolidin-2-carbaldehído (1a).
Figure imgf000131_0001
1a
El compuesto 1a se sintetizó a partir de L-prolina según el procedimiento descrito en la bibliografía (Guga, P. Curr. Top. Med. Chem. 2007, 7, 695-713.).
(R)-1-Tritilpirrolidin-2-carbaldehído (1b).
Figure imgf000131_0002
El compuesto 1b se sintetizó a partir de D-prolina de una manera similar al compuesto 1a.
(S)-2-(Metildifenilsilil)-1-((S)-1-tritilpirrolidin-2-il)etanol (2a).
Figure imgf000132_0001
A una disolución de cloruro de metildifenilsililmetilmagnesio en THF preparada a partir de clorometildifenilmetilsilano (4,02 g, 16,3 mmoles) y magnesio (402 mg, 16,3 mmoles) en THF (14 ml) se añadió 1a (2,79 g, 8,14 mmoles) en disolución de THF (30 ml) con enfriamiento con hielo. Después de agitar durante 1,5 h con enfriamiento con hielo, la mezcla se calentó hasta temperatura ambiente y la agitación continuó durante 30 min. Se añadió NH4Cl acuoso saturado (100 ml) a la mezcla de reacción a 0 °C, y la extracción se realizó durante tres veces con dietil éter (100 ml). El extracto combinado se secó sobre Na2SO4 , se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía sobre gel de sílice proporcionando 2a como una espuma incolora (3,91 g, 87 %). 1H RMN (300 MHz, CDCta) 57,48-7,08 (25H, m), 4,33-4,23 (1H, m), 3,16-2,89 (3H, m), 2,84 (1 H, s a), 1,70-1,54 (1H, m), 1,35 (1 H, dd, J = 14,7, 6,3Hz), 1,10 (1H, dd, J = 14,7, 8,1Hz), 1,18-1,05 (1H, m), 1,04-0,90 (1H, m), 0,34 (3H, s), -0,17- -0,36 (1H, m).
(S)-2-(Metildifenilsilil)-1-((S)-1-pirrolidin-2-il)etanol (3a).
Figure imgf000133_0001
Se disolvió 2a (3,91 g, 7,06 mmoles) en 3 % de DCA en DCM (70 ml), y se agitó durante 10 min a temperatura ambiente. A la mezcla, se añadió NaOH 1 M (200 ml), y la extracción se realizó con DCM (100 ml) durante tres veces. El extracto combinado se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía sobre gel de sílice proporcionando 3a como un aceite amarillo claro (1,99 g, 90 %). 1H RMN (300 MHz, CDCh) ó 7,57-7,52 (5H, m), 7,38-7,33 (5H, m), 3,77 (1H, ddd, J = 8,9, 5,4, 3,5Hz), 3,01 (1H, dt, J = 7,4, 3,6Hz), 2,97­ 2,79 (2H, m), 2,27 (2H, s a), 1,76-1,53 (4H, m), 1,38 (1H, dd, J = 15,0, 9,0Hz), 1,24 (1H, dd, J = 15,0, 5,4Hz), 0,65 (3H, s); 13C RMN (100,4 MHz, CDCh) 5 137,4, 137,1, 134,6, 134,5, 129,1, 127,8, 69,5, 64,1,47,0, 25,8, 24,0, 19,6, -3,4. MALDI TOF-MS m/z Calculado para C ^ e N O S i [M+H]+ 312,18, hallado 312,06.
Ejemplo Z-2.
(R)-2-(Metildifenilsilil)-1-((R)-1-tritilpirrolidin-2-il)etanol (2b).
Figure imgf000133_0002
El compuesto 2b se obtuvo usando 1b en lugar de 1a de una manera similar al compuesto 2a. 1H RMN (300 MHz, CDCh) 57,48-7,12 (25H, m), 4,33-4,24 (1H, m), 3,16-2,89 (3H, m), 2,86 (1H, s a), 1,69-1,52 (1H, m), 1,35 (1H, dd, J = 14,4, 6,0Hz), 1,10 (1H, dd, J = 14,4, 8,4Hz), 1,18-1,05 (1H, m), 1,03-0,89 (1H, m), 0,33 (3H, s), -0,19- -0,39 (1H, m); 13C RMN (75,5 MHz, CDCh) 5144,5, 137,5, 136,8, 134,6, 134,3, 129,8, 129,0, 127,8, 127,7, 127,4, 126,1,77,9, 71,7, 65,1,53,5, 25,0, 24,8, 19,6, -4,0. MALDI TOF-MS m/z Calculado para C3sH40NOSi [M+H]+ 554,29, hallado 554,09.
(fí)-2-(Metildifenilsilil)-1-((fl)-1-pirrolidin-2-il)etanol (3b).
Figure imgf000133_0003
El compuesto 3b se obtuvo usando 2b en lugar de 2a de una manera similar al compuesto 3a.
1H RMN (300 MHz, CDCh) 57,58-7,52 (5H, m), 7,38-7,33 (5H, m), 3,78 (1H, ddd, J = 9,0, 5 ,1,3,6Hz), 3,00 (1H, dt, J= 7,4, 3,3Hz), 2,97-2,78 (2H, m), 2,19 (2H, s a), 1,76-1,53 (4H, m), 1,38 (1 H, dd, J = 14,6, 9,0Hz), 1,24 (1H, dd, J = 14,6, 5,1Hz), 0,66 (3H, s); 13C RMN (75,5 MHz, CDCh) 5 137,5, 137,1, 134,5, 134,4, 129,0, 127,7, 69,2, 64,2, 46,9, 25,8, 24,0, 19,7, -3,4. MALDI TOF-m S m/z Calculado para C19H26NOSi [M+H]+ 312,18, hallado 312.09.
Ejemplo Z-3.
(S)-2-(Trimetilsilil)-1-((S)-1-tritilpirrolidin-2-il)etanol (4a).
Figure imgf000133_0004
El compuesto 4a se obtuvo usando "clorometiltrimetilsilano" en lugar de "clorometildifenilmetilsilano" de una manera similar al compuesto 2a. 1H RMN (300 MHz, CDCh) 57,58-7,51 (5H, m), 7,31-7,14 (10H, m), 4,13 (1H, dt, J = 7,5, 3,0Hz), 3,39-3,31 (1 H, m), 3,20-2,99 (2H, m), 2,84 (1H, s), 1,74-1,57 (1 H, m), 1,29-1,10 (2H, m), 0,74 (1 H, dd, J = 14,4, 7,2Hz), 0,46 (1H, dd, J = 14,4, 7,2Hz), -0,15 (9H, s). MALDI TOF-MS m/z Calculado para C2aH36NOSi [M+H]+ 430,26, hallado 430,09.
(S)-2-(Trimetilsilil)-1-((S)-1-pirrolidin-2-il)etanol (5a).
Figure imgf000134_0001
El compuesto 5a se obtuvo usando 4a en lugar de 2a de una manera similar al compuesto 3a. 1H RMN (300 MHz, CDCI3) 53,76 (1 H, ddd, J = 8 ,8 , 5,7, 3,3Hz), 3,08 (1H, dt, J = 7,8, 3,3Hz), 3,02-2,87 (2H, m), 2,48 (2H, s a), 1,81 -1,58 (4H, m), 0,83 (1H, dd, J = 14,7, 8,7Hz), 0,68 (1H, dd, J = 14,7, 6,0Hz), 0,05 (9H, s); 13C RMN (75,5 MHz, CDCh) 5 69,6, 64,3, 46,9, 25,8, 23,9, 22,0, -0,8. MALDI TOF-MS m/z Calculado para C9H22NOSi [M+H]+ 188,15, hallado 188,00. Ejemplo Z-5.
(fí)-2,2-Difenil-1 -((S)-1 -tritilp irrolidin-2-il)etanol (6a).
Figure imgf000134_0002
A una disolución de difenilmetano (6,7 ml, 40 mmoles) en THF anhidro (36 ml), se añadió gota a gota n-BuLi (disolución 1,67 M de hexano, 24 ml, 40 mmoles) a temperatura ambiente y se agitó durante 1 h. A la mezcla, 1a (3,41 g, 10 mmoles), que se secó por coevaporaciones repetidas con tolueno, se añadió THF anhidro (40 ml) lentamente a 0 °C, y la agitación continuó durante 45 min. Entonces se añadió una disolución saturada de NH4G (100 ml) y Et2O (100 ml), y la fase orgánica se separó y la fase acuosa se extrajo con Et2O (2 x 100 ml). Se combinaron las fases orgánicas, se secaron sobre Na2SO4 , se filtraron y se concentraron a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía sobre gel de sílice proporcionando 6a (1,41 g, 28 %) como una espuma blanca.
(fl)-2,2-Difenil-1 -((S)-pirrolidin-2-il)etanol (7a).
Figure imgf000134_0003
Se disolvió 6a (650 mg, 1,27 mmoles) en 3 % de DCA en DCM (13 ml) y se agitó durante 10 min a temperatura ambiente. A la mezcla, se añadió NaOH 1 M (40 ml), y la extracción se realizó tres veces con DCM (30 ml). El extracto combinado se secó sobre Na2SO4, se filtró y se combinó a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía sobre gel de sílice proporcionando 7a como un aceite amarillo claro (316 mg, 93 %). 1H RMN (300 MHz, CDCh) 5 7,44-7,38 (2H, m), 7,33-7,14 (8H, m), 4,46 (1H, dd, J = 9,9, 3,3Hz), 3,91 (1H, d, J = 9,9Hz), 3,02-2,88 (2H, m), 2,81 -2,69 (1 H, m), 2,52 (2H, s a), 1,88-1,56 (4H, m); 13C RMN (75,5 MHz, CDCh) 5142,3, 142,0, 128,6, 128,5, 128,4, 128,2, 126.5, 126,4, 73,5, 60,1,55,8, 46,6, 25,8, 23,4. MALDI TOF-MS m/z Calculado para C18H22NO [M+H]+ 268,17, hallado 268.06.
Ejemplo Z-6.
(S)-2,2-Difenil-1-((fl)-1-tritilpirrolidin-2-il)etanol (6b).
Figure imgf000134_0004
El compuesto 6b se obtuvo usando 1b en lugar de 1a de una manera similar al compuesto 6a. 1H RMN (300 MHz, CDCh) 57,44-7,37 (6H, m), 7,30-7,01 (17H, m), 6,66-6,61 (2H, m), 4,80 (1H, d, J = 10,8Hz), 3,63 (1H, d, J = 10,8Hz), 3,36-3,28 (1H, m), 3,22-3,09 (1 H, m), 3,01 -2,89 (1 H, m), 2,66 (1 H, s), 1,90-1,75 (1 H, m), 1,29-1,04 (2H, m), 0,00--0,19 (1 H, m); 13C RMN (75,5 MHz, CDCh) 5 144,2, 142,9, 141,6, 130,0, 128,5, 128,4, 127,9, 127,8, 127,4, 126,4, 126,2, 77,9, 75,9, 61,9, 55,4, 53,4, 24,7, 24,5. MALDI TOF-MS m/z Calculado para C37H36NO [M+H]+ 510,28, hallado 510,11. (S)-2,2-Difenil-1-((fl)-pirrolidin-2-il)etanol (7b).
Figure imgf000135_0001
El compuesto 7b se obtuvo usando 6b en lugar de 6a de una manera similar al compuesto 7a. 1H RMN (300 MHz, CDCI3) 57,45-7,14 (10H, m), 4,45 (1H, dd, J= 9,9, 3,3Hz), 3,91 (1H, d, J = 9,9Hz), 3,00-2,89 (2H, m), 2,82-2,71 (1H, m), 2,40 (2H, s a), 1,87-1,55 (4H, m); 13C RMN (75,5 MHz, CDCh) 5 142,3, 142,0, 128,5, 128,3, 128,1, 126,3, 126,2, 73,4, 60,1,55,9, 46,5, 25,8, 23,5. MALDI TOF-MS m/z Calculado para C18H22NO [M+H]+ 268,17, hallado 268,03. Ejemplo Z-7.
(fí)-2-(4-Nitrofenil)-1 -((S)-1 -tritilp irrolidin-2-il)etanol (8a).
Figure imgf000135_0002
El compuesto 8a se obtuvo usando "cloruro de 4-nitrobencilo" en lugar de "difenilmetano" de una manera similar al compuesto 6a. 1H RMN (300 MHz, CDCh) 58,09-8,03 (2H, m), 7,49-7,43 (6H, m), 7,28-7,09 (11H, m), 4,23 (1H, ddd, J = 8,3, 5,6, 3,0Hz), 3,43-3,33 (1H, m), 3,23-3,11 (1H, m), 3,07-2,96 (1H, m), 2,83 (1H, s a), 2,74 (1H, dd, J = 13,8, 8,4Hz), 2,49 (1 H, dd, J = 13,8, 5,1Hz), 1,83-1,67 (1H, m), 1,41-1,17 (2H, m), 0,27-0,08 (1H, m); 13C RMN (75,5 MHz, CDCh) 5147,3, 146,3, 144,3, 129,8, 129,6, 127,5, 126,3, 123,4, 77,9, 74,8, 63,5, 53,2, 39,5, 25,0, 24,9. MALDI TOF-MS m/z Calculado para C31H31N2O3 [M+H]+ 479,23, hallado 479,08.
(fí)-2-(-((S)-pirrolidin-2-il)etanol (9a).
Figure imgf000135_0003
9a
El compuesto 9a se obtuvo usando 8a en lugar de 6a de una manera similar al compuesto 7a. 1H RMN (300 MHz, CDCh) 58,15 (2H, d, J = 8,7Hz), 7,42 (2H, d, J = 8,7Hz), 3,86-3,79 (1H, m), 3,16-3,07 (1H, m), 2,99-2,68 (6H, m), 1,84-1,68 (4H, m); 13C RMN (75,5 MHz, CDCh) 5147,4, 146,2, 129,9, 123,2, 72,4, 62,0, 46,6, 40,4, 25,7, 24,4. MALDI TOF-MS m/z Calculado para C12H17N2O3 [M+H]+ 237,12, hallado 237,01.
Ejemplo Z-8.
(S)-2-(4-Nitrofenil)-1-((fí)-1-tritilpirrolidin-2-il)etanol (8b).
Figure imgf000135_0004
8b
El compuesto 8b se obtuvo usando 1b en lugar de 1a de una manera similar al compuesto 8a. 1H RMN (300 MHz, CDCh) 58,09-8,04 (2H, m), 7,49-7,43 (6H, m), 7,28-7,09 (11H, m), 4,22 (1 H, ddd, J = 8,4, 5,6, 3,0Hz), 3,43-3,33 (1H, m), 3,24-3,10 (1H, m), 3,08-2,94 (1H, m), 2,81 (1H, s a), 2,75 (1H, dd, J = 14,0, 8,1Hz), 2,49 (1H, dd, J = 14,0, 5,1Hz), 1,81-1,67 (1 H, m), 1,40-1,16 (2H, m), 0,26-0,09 (1H, m); 13C RMN (75,5 MHz, CDCh) 5 147,3, 144,3, 129,8, 129,6, 129,4, 126,3, 123,5, 77,9, 74,8, 63,5, 53,2, 39,5, 25,0, 24,9. MALDI TOF-MS m/z Calculado para C31H31N2O3 [M+H]+ 479,23, hallado 479,08.
(S)-2-(4-Nitrofenil)-1 -((fl)-pirrolidin-2-il)etanol (9b).
Figure imgf000136_0001
El compuesto 9b se obtuvo usando 8b en lugar de 8a de una manera similar al compuesto 9a. 1H RMN (300 MHz, CDCI3) 58,19-8,13 (2H, m), 7,45-7,39 (2H, m), 3,83 (1H, ddd, J = 7,7, 5,4, 3,9Hz), 3,14 (1H, dt, J = 7,7, 3,9Hz), 3,01­ 2,87 (2H, m), 2,83 (1H, d, J = 3,3Hz), 2,81 (1 H, s), 2,62 (2H, s a), 1,79-1,72 (4H, m); 13C RMN (75,5 MHz, CDCh) 5 147,3, 146,5, 130,0, 123,5, 72,7, 61,7, 46,7, 40,1,25,8, 24,2. MALDI TOF-MS m /zCalculado para C12H17N2O3 [M+H]+ 237,12, hallado 237,02.
Ejemplo Z-9.
(fí)-(9H-Fluoren-9-il)((S)-1-tritilpirrolidin-2-il)metanol (10a).
Figure imgf000136_0002
El compuesto 10a se obtuvo usando "fluoreno" en lugar de "difenilmetano" de una manera similar al compuesto 6a. 1H RMN (300 MHz, CDCh) 57,70 (1 H, d, J = 7,5Hz), 7,66 (1H, d, J = 7,8Hz), 7,55 (2H, d, J = 7,5Hz), 7,44-7,09 (18H, m), 6,87-6,62 (1H, m), 4,55-4,48 (1 H, m), 4,06 (1H, d, J = 7,5Hz), 3,43-3,34 (1H, m), 3,18-3,06 (1H, m), 2,98-2,88 (1H, m), 2,85 (1H, s a), 1,42-1,24 (1H, m), 1,18-1,04 (1H, m), 0,53-0,39 (1H, m), -0,02- -0,20 (1H, m); MALDI TOF-MS m/z Calculado para C37H34NO [M+H]+ 508,26, hallado 508,12.
(fí)-(9W-Fluororen-9-il)((S)-pirrolidin-2-il)metanol (11a).
Figure imgf000136_0003
El compuesto 11a se obtuvo usando 10a en lugar de 6a de una manera similar al compuesto 7a. 1H RMN (300 MHz, CDCl3) 57,76 (2H, d, J = 7,5Hz), 7,68 (2H, t, J = 8,0Hz), 7,43-7,35 (2H, m), 7,34-7,25 (2H, m), 4,28 (1H, d, J = 6,3Hz), 4,03 (1H, dd, J = 6,5, 4,2Hz), 3,19-3,11 (1H, m), 2,97-2,88 (1H, m), 2,86-2,76 (1H, m), 2,02 (2H, s a), 1,77-1,53 (3H, m), 1,38-1,23 (1H, m); MALDI TOF-MS m/z Calculado para C18H20NO [M+H]+ 266,15, hallado 266,04.
(S)-2-T osil-1 -((S)-1 -tritilp irrolid in-2-il)etanol (12a').
Figure imgf000136_0004
El compuesto 12a' se obtuvo usando "clorometil p-tolil sulfona" en lugar de "clorometildifenilmetilsilano" de una manera similar al compuesto 2a.
1H RMN (600 MHz, CDCl3) 57,66 (2H, d, J = 8,4Hz), 7,48-7,44 (6H, m), 7,35 (2H, d, J = 7,2Hz), 7,21-7,13 (9H, m), 4,39-4,36 (1 H, m), 3,33 (1H, s), 3,24-3,20 (1H, m), 3,19-3,10 (2H, m), 2,98-2,92 (2H, m), 2,49 (3H, s), 1,55-1,49 (1H, m), 1,33-1,26 (1H, m), 1,12-1,04 (1H, m), 0,22-0,14 (1H, m); 13C RMN (150,9 MHz, CDCh) 5 144,6, 144,5, 136,3, 129,9, 129,5, 128,1, 127,5, 126,2, 78,0, 69,1,63,9, 60,2, 52,6, 25,5, 24,7, 21,7.
(S)-2-Tosil-1-((S)-1-tritilpirrolidin-2-il)etanol (13a').
Figure imgf000137_0001
El compuesto 13a' se obtuvo usando 12a' en lugar de 2a de una manera similar al compuesto 3a.
1H RMN (600 MHz, CDCta) 57,82 (2H, d, J = 8,4Hz), 7,37 (2H, d, J = 8,4Hz), 4,01 (1H, ddd, J = 12,0, 5 ,1,3,0Hz), 3,32 (1 H, dd, J = 14,4, 3,0Hz), 3,25 (1H, dd, J = 14,4, 9,0Hz), 3,16 (1H, dt, J = 7,8, 5,1Hz), 2,90-2,82 (2H, m), 2,46 (3H, s), 2,04 (2H, s a), 1,78-1,63 (3H, m), 1,62-1,55 (1H, m); 13C RMN (150,9 MHz, CDCh) 5144,5, 136,7, 129,7, 127,7, 67,4, 61,8, 60,1,46,7, 25,7, 21,4. MALDI TOF-MS m/z Calculado para C13H20NO3S [M+H]+ 270,12, hallado 270,04.
(fí)-2-Tosil-1-((fí)-1-tritilpirrolidin-2-il)etanol (12b').
Figure imgf000137_0002
El compuesto 12b' se obtuvo usando 1b en lugar de 1a de una manera similar al compuesto 12a'.
1H RMN (600 MHz, CDCta) 57,66 (2H, d, J = 8,4Hz), 7,47-7,44 (6H, m), 7,35 (2H, d, J = 7,8Hz), 7,21-7,13 (9H, m), 4,37 (1H, dt, J = 8,6, 2,4Hz), 3,33 (1H, s), 3,23-3,20 (1H, m), 3,19-3,12 (2H, m), 2,98-2,92 (2H, m), 2,49 (3H, s), 1,56­ 1,49 (1 H, m), 1,32-1,26 (1H, m), 1,11-1,03 (1H, m), 0,23-0,15 (1H, m); 13C RMN (150,9 MHz, CDCh) 5 144,6, 144,5, 136,3, 129,9, 129,6, 128,1, 127,6, 126,2, 78,0, 69,1,63,9, 60,2, 52,6, 25,5, 24,7, 21,7.
(fí)-2-Tosil-1-((fí)-1-tritilpirrolidin-2-il)etanol (13b').
Figure imgf000137_0003
El compuesto 13b' se obtuvo usando 12b' en lugar de 12a' de una manera similar al compuesto 13a'.
1H RMN (600 MHz, CDCh) 57,82 (2H, d, J = 8,4Hz), 7,37 (2H, d, J = 8,4Hz), 4,01 (1H, ddd, J = 9,0, 5 ,1,3,0Hz), 3,32 (1 H, dd, J = 14,4, 3,0Hz), 3,25 (1H, dd, J = 14,4, 9,0Hz), 3,17 (1H, dt, J = 7,2, 5,1Hz), 2,89-2,83 (2H, m), 2,46 (3H, s), 2,04 (2H, s a), 1,79-1,64 (3H, m), 1,62-1,55 (1H, m); 13C RMN (150,9 MHz, CDCh) 5144,8, 136,6, 129,8, 127,9, 67,7, 61,8, 60,1,46,8, 25,9, 25,8, 21,6. MALDI TOF-MS m/z Calculado para C13H20NO3S [M+H]+ 270,12, hallado 270,05. Ejemplo Z-10.
Monómero de oxazafosfolidina 12a.
Figure imgf000137_0004
Se secó 3a (560 mg, 1,80 mmoles) por coevaporaciones repetidas con tolueno seco y se disolvió en dietil éter seco (0,90 ml) bajo argón. Se añadió W-metilmorfolina (400 micro L, 3,60 mmoles) a la disolución, y la disolución resultante se añadió gota a gota a una disolución de PCh (160 micro L, 1,80 mmoles) en dietil éter seco (0,90 ml) a 0 °C bajo argón con agitación. Entonces se dejó que la mezcla se calentara hasta temperatura ambiente y se agitó durante 30 min. El clorhidrato de W-metilmorfolina resultante se retiró por filtración bajo nitrógeno, y el filtrado se concentró a sequedad a presión reducida proporcionando el derivado de 2-cloro-1,3,2-oxazafosfolidina en bruto. Los materiales en bruto se disolvieron en THF recién destilado (3,6 ml) dando disoluciones 0,5 M, que se usaron para sintetizar las 3'-0-oxazafosfolidinas de nucleósido sin más purificación.
Se secó 5'-0-(DMTr)-2-W-(fenoxiacetil)-6-0-(cianoetil)guanosina (636 mg, 0,84 mmoles) por coevaporaciones repetidas con tolueno seco, y se disolvió en THF recién destilado (2,5 ml) bajo argón. Se añadió Et3N (0,58 ml, 4,2 mmoles), y la mezcla se enfrió hasta -78 °C. Se añadió gota a gota por una jeringa una disolución 0,5 M del derivado de 2-cloro-1,3,2-oxazafosfolidina en bruto correspondiente en THF recién destilado (3,6 ml, 1,80 mmoles), y la mezcla se agitó durante 15 min a temperatura ambiente. Entonces se añadió una disolución acuosa saturada de NaHCÜ3 (70 ml) y CHCta (70 ml), y la fase orgánica se separó y se lavó con disoluciones acuosas saturadas de NaHCÜ3 (2 x 70 ml). Las fases acuosas combinadas se retroextrajeron con CHCta (70 ml). Las fases orgánicas se combinaron, se secaron sobre Na2SÜ4, se filtraron y se concentraron a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía sobre gel de sílice proporcionando 12a (829 mg, 90 %) como una espuma blanca. 1H RMN (300 MHz, CDCl3) 58,77 (1H, s a), 7,99 (1H, s), 7,54-6,98 (24H, m), 6,81-6,73 (4H, m), 6,35 (1H, dd, J = 8,0, 6,3Hz), 4,89-4,73 (4H, m), 4,68 (2H, s a), 4,05-3,98 (1H, m), 3,75 (6H, s), 3,62-3,46 (1 H, m), 3,41 -3,20 (3H, m), 3,18-3,04 (1H, m), 3,08 (2H, t, J = 6,6Hz), 2,58-2,36 (2H, m), 1,94-1,59 (2H, m), 1,56 (1H, dd, J = 15,0, 8,7Hz), 1,43 (1H, dd, J = 15,0, 5,7Hz), 1,33-1,16 (2H, m), 0,62 (3H, s); 31P RMN (121,5 MHz, CDCta) 5153,5 (1P, s).
Ejemplo Z-11.
Monómero de oxazafosfolidina 12b.
Figure imgf000138_0001
El compuesto 12b se obtuvo usando 3b en lugar de 3a de una manera similar al compuesto 12a. 1H RMN (300 MHz, CDCl3) 58,80 (1H, s a), 7,96 (1 H, s), 7,54-6,96 (24H, m), 6,79-6,71 (4H, m), 6,19 (1H, t, J = 6,6Hz), 4,90-4,73 (4H, m), 4,66 (2H, s a), 4,16-4,08 (1H, m), 3,76 (6H, s), 3,60-3,36 (2H, m), 3,29 (1H, d, J = 3,9Hz), 3,27-3,12 (2H, m), 3,09 (2H, t, J = 6,6Hz), 2,59-2,46 (1 H, m), 2,07-1,97 (1H, m), 1,94-1,41 (5H, m), 1,36-1,18 (1H, m), 0,65 (3H, s); 31P RMN (121,5 MHz, CDCl3) 5157,1 (1P, s).
Ejemplo Z-12.
Monómero de oxazafosfolidina 13a.
Figure imgf000138_0002
El compuesto 13a se obtuvo usando "5'-0-(DMTr)timidina" en lugar de "5'-0-(DMTr)-2-W-(fenoxiacetil)-6-0-(cianoetil)guanosina" de una manera similar al compuesto 12a. 1H RMN (300 MHz, CDCta) 57,58-7,23 (21H, m), 6,86­ 6,79 (4H, m), 6,35 (1 H, dd, J = 8 ,1,5,7Hz), 4,79-4,67 (2H, m), 3,83-3,78 (1H, m), 3,78 (6H, s), 3,59-3,43 (1H, m), 3,34 (1 H, dd, J = 10,5, 2,4Hz), 3,35-3,24 (1H, m), 3,20 (1H, dd, J = 10,5, 2,4Hz), 3,16-3,02 (1H, m), 2,36-2,26 (1H, m), 2,152,02 (1H, m), 1,92-1,77 (1 H, m), 1,74-1,59 (1 H, m), 1,52 (1 H, dd, J = 14,7, 9,0Hz), 1,40 (3H, s), 1,45-1,15 (3H, m), 0,60 (3H, s); 31P RMN (121,5 MHz, CDCI3) 5153,7 (IP, s).
Ejemplo Z-13.
Monómero de oxazafosfolidina 13b.
Figure imgf000139_0001
El compuesto 13b se obtuvo usando 3b en lugar de 3a de una manera similar al compuesto 13a. 1H RMN (300 MHz, CDCl3) 58,46 (1 H, s a), 7,59-7,20 (20H, m), 6,86-6,79 (4H, m), 6,26 (1H, t, J = 6,8Hz), 4,78-4,65 (2H, m), 4,01-3,95 (1 H, m), 3,78 (6H, s), 3,55-3,40 (1H, m), 3,42 (1H, dd, J = 10,5, 2,7Hz), 3,40-3,28 (1H, m), 3,22 (1H, dd, J = 10,5, 3,0Hz), 3,19-3,06 (1H, m), 2,16-1,95 (2H, m), 1,90-1,54 (3H, m), 1,49-1,35 (1H, m), 1,43 (3H, s), 1,34-1,17 (2H, m), 0,67 (3H, s); 31P RMN (121,5 MHz, c Dc I3) 5156,2 (IP, s). Los oligonucleótidos se sintetizaron usando el compuesto anterior 13b por el método general desvelado anteriormente.
Ejemplo Z-14.
Monómero de oxazafosfolidina 14a.
Figure imgf000139_0002
El compuesto 14a se obtuvo usando "5'-0-(DMTr)-4-A/-(isobutiril)citidina" en lugar de ”5'-0-(DMTr)-2-W-(fenoxiacetil)-6-0-(cianoetil)guanosina" de una manera similar al compuesto 12a. 1H RMN (300 MHz, CDCh) 58,33 (1H, s a), 8,17 (1 H, d, J = 7,5Hz), 7,52-7,22 (19H, m), 7,07 (1H, d, J = 7,5Hz), 6,88-6,81 (4H, m), 6,20 (1H, t, J = 6,2Hz), 4,81-4,64 (2H, m), 3,93-3,87 (1H, m), 3,79 (6H, s), 3,59-3,43 (1H, m), 3,39-3,29 (3H, m), 3,16-3,02 (1H, m), 2,69-2,52 (2H, m), 2,12-2,00 (1H, m), 1,91-1,50 (3H, m), 1,47-1,32 (2H, m), 1,27-1,16 (7H, m), 0,60 (3H, s); 31P RMN (121,5 MHz, CDCh) 5 154,8 (IP, s).
Ejemplo Z-16.
Monómero de oxazafosfolidina 14b.
Figure imgf000140_0001
El compuesto 14b se obtuvo usando 3b en lugar de 3a de una manera similar al compuesto 14a. 1H RMN (300 MHz, CDCl3) 58,33 (1H, d, J = 7,5Hz), 8,23 (1H, s a), 7,57-7,22 (19H, m), 7,12 (1H, d, J = 7,5Hz), 6,88-6,81 (4H, m), 6,15 (1 H, dd, J = 6,6, 4,2Hz), 4,82-4,63 (2H, m), 4,03-3,97 (1 H, m), 3,80 (6H, s), 3,55-3,26 (4H, m), 3,19-3,05 (1 H, m), 2,59 (1 H, quintuplete, J = 6,9Hz), 2,39-2,27 (1 H, m), 2,21 -2,10 (1H, m), 1,90-1,56 (3H, m), 1,50-1,32 (2H, m), 1,26-1,17 (7H, m), 0,66 (3H, s); 31P RMN (121,5 MHz, CDCh) 5157,2 (1P, s).
Ejemplo Z-17.
Monómero de oxazafosfolidina 15a.
Figure imgf000140_0002
El compuesto 15a se obtuvo usando "5'-0-(DMTr)-6-W-(benzoil)adenosina" en lugar de ”5'-0-(DMTr)-2-W-(fenoxiacetil)-6-0-(cianoetil)guanosina" de una manera similar al compuesto 12a.
1H RMN (600 MHz, CDCh) 58,71 (1H, s), 8,12 (1H, s), 8,04 (2H, d, J = 7,8Hz), 7,62-7,15 (23H, m), 6,80-6,75 (4H, m), 6,37 (1H, dd, J = 7,8, 6,0Hz), 4,94-4,88 (1H, m), 4,80 (1H, ddd, J = 12,0, 6,0, 5,4Hz), 4,07-4,04 (1H, m), 3,76 (6H, s), 3,58-3,49 (1 H, m), 3,41-3,34 (1H, m), 3,33 (1H, dd, J = 10,8, 4,8Hz), 3,25 (1H, dd, J = 10,8, 4,8Hz), 3,13-3,06 (1H, m), 2,66-2,58 (1 H, m), 2,40-2,35 (1H, m), 1,91 -1,84 (1H, m), 1,73-1,66 (1H, m), 1,56 (1H, dd, J= 15,0, 9,0Hz), 1,44 (1 H, dd, J = 15,0, 5,4Hz), 1,47-1,41 (1H, m), 1,30-1,23 (1H, m), 0,63 (3H, s); 31P RMN (243,0 MHz, CDCh) 5151,8 (1P, s).
Ejemplo Z-18.
Monómero de oxazafosfolidina 15b.
Figure imgf000141_0001
El compuesto 15b se obtuvo usando 3b en lugar de 3a de una manera similar al compuesto 15a. 1H RMN (300 MHz, CDCl3) 59,06 (1H, s a), 8,76 (1 H, s), 8,12 (1H, s), 8,07-7,99 (2H, m), 7,64-7,14 (22H, m), 6,83-6,75 (4H, m), 6,25 (1 H, t, J = 6,6Hz), 4,86-4,75 (2H, m), 4,20-4,15 (1H, m), 3,77 (6H, s), 3,61-3,38 (2H, m), 3,36 (1 H, dd, J = 10,2, 4,2Hz), 3,27 (1 H, dd, J = 10,2, 4,2Hz), 3,27-3,13 (1H, m), 2,71-2,59 (1H, m), 2,12-2,01 (1H, m), 1,94-1,42 (5H, m), 1,36-1,20 (1H, m), 0,67 (3H, s)); 31P RMN (121,5 MHz, CDCh) 5157,3 (IP, s).
Ejemplo Z-19.
Monómero de oxazafosfolidina 16a.
Figure imgf000141_0002
El compuesto 16a se obtuvo usando 7a en lugar de 3a de una manera similar al compuesto 13a. 1H RMN (300 MHz, CDCl3) 57,57 (1H, d, J = 0,9Hz), 7,37-6,94 (20H, m), 6,87-6,78 (4H, m), 6,48 (1H, dd, J = 8,6, 5,7Hz), 5,42 (1H, dd, J= 11,0, 5,1Hz), 4,81-4,71 (1H, m), 4,02 (1H, d, J = 11,0Hz), 3,83 (1H, d, J = 2,1Hz), 3,79 (6H, s), 3,61-3,41 (2H, m), 3,24-3,09 (1 H, m), 3,16 (1H, dd, J = 10,8, 2,4Hz), 3,02 (1H, dd, J = 10,8, 2,4Hz), 2,54-2,44 (1H, m), 2,34-2,22 (1H, m), 1,94-1,79 (1H, m), 1,74-1,56 (1H, m), 1,38 (3H, s), 1,38-1,28 (2H, m); 31P RMN (121,5 MHz, CDCh) 5160,9 (1P, s).
Ejemplo Z-20.
Monómero de oxazafosfolidina 16b.
Figure imgf000142_0001
El compuesto 16b se obtuvo usando 3b en lugar de 3a de una manera similar al compuesto 16a. 1H RMN (300 MHz, CDCta) 57,57 (1H, d, J = 1,5Hz), 7,43-7,11 (20H, m), 6,85-6,78 (4H, m), 6,48 (1H, dd, J = 7,5, 5,7Hz), 5,58 (1 H, dd, J = 11,4, 5,1Hz), 4,82-4,73 (1H, m), 4,17-4,02 (2H, m), 3,78 (6H, s), 3,56-3,40 (3H, m), 3,32 (1H, dd, J = 10,7, 2,4Hz), 3,22-3,07 (1H, m), 2,26-2,04 (2H, m), 1,95-1,81 (1 H, m), 1,74-1,56 (1 H, m), 1,40 (3H, d, J = 1,5Hz), 1,44-1,34 (2H, m); 31P RMN (121,5 MHz, CDCh) 5162,2 (IP, s).
Ejemplo Z-21.
Monómero de oxazafosfolidina 17a.
Figure imgf000142_0002
El compuesto 17a se obtuvo usando 9a en lugar de 3a de una manera similar al compuesto 13a. 1H RMN (300 MHz, CDCh) 59,22 (1 H, s a), 8,05-7,99 (2H, m), 7,52 (1H, d, J = 1,2Hz), 7,41 -7,19 (11H, m), 6,87-6,79 (4H, m), 6,37 (1H, dd, J= 8,4, 5,7Hz), 4,88-4,75 (2H, m), 3,86-3,80 (1H, m), 3,79 (6H, d, J= 1,2Hz), 3,64-3,49 (2H, m), 3,27-3,12 (3H, m), 2,97 (2H, d, J= 6,6Hz), 2,51 -2,41 (1H, m), 2,33-2,20 (1 H, m), 2,03-1,75 (2H, m), 1,72-1,59 (1 H, m), 1,46-1,36 (1H, m), 1,40 (3H, s); 31P RMN (121,5 MHz, CDCh) 5157,5 (IP, s).
Ejemplo Z-22.
Monómero de oxazafosfolidina 17b.
Figure imgf000142_0003
El compuesto 17b se obtuvo usando 9b en lugar de 9a de una manera similar al compuesto 17a. 1H RMN (300 MHz, CDCis) 58,67 (1 H, s a), 8,18-8,11 (2H, m), 7,57 (1H, d, J = 1,2Hz), 7,47-7,22 (11H, m), 6,86-6,79 (4H, m), 6,29 (1 H, t, J = 6,6Hz), 4,87 (1H, dt, J = 7,5, 5,7Hz), 4,80-4,72 (1H, m), 4,11-4,05 (1H, m), 3,79 (6H, s), 3,67-3,47 (2H, m), 3,43 (1 H, dd, J= 10,8, 2,7Hz), 3,27 (1 H, dd, J = 10,8, 2,4Hz), 3,25-3,13 (1H, m), 3,07-2,99 (2H, m), 2,19-2,12 (2H, m), 2,03­ 1,62 (3H, m), 1,46-1,30 (1H, m), 1,41 (3H, s); 31P RMN (121,5 MHz, CDCh) 5158,1 (IP, s).
Ejemplo Z-23.
Monómero de oxazafosfolidina 18a.
Figure imgf000143_0001
El compuesto 18a se obtuvo usando "5'-0-(DMTr)-2'-0-TOM-6-A/-(acetil)adenosina" en lugar de "5'-0-(DMTr)-2-W-(fenoxiacetil)-6-0-(cianoetil)guanosina" de una manera similar al compuesto 12a. 1H RMN (300 MHz, CDCh) 58,82 (1 H, s a), 8,49 (1H, s), 8,10 (1H, s), 7,58-7,17 (19H, m), 6,83-6,73 (4H, m), 6,11 (1H, d, J= 6,6Hz), 5,15 (1H, dd, J = 6,6, 5,4Hz), 4,98-4,77 (4H, m), 4,18-4,11 (1H, m), 3,76 (6H, s), 3,59-3,25 (4H, m), 3,16-3,02 (1H, m), 2,62 (3H, s), 1,91 -1,53 (3H, m), 1,49-1,18 (3H, m), 0,96-0,80 (3H, m), 0,90 (18H, s), 0,62 (3H, s); 31P RMN (121,5 MHz, CDCh) 5156,7 (IP, s).
Ejemplo Z-24.
Monómero de oxazafosfolidina 18b.
Figure imgf000143_0002
El compuesto 18b se obtuvo usando 3b en lugar de 3a de una manera similar al compuesto 18a. 1H RMN (300 MHz, CDCh) 58,56 (1H, s a), 8,55 (1 H, s), 8,13 (1H, s), 7,57-7,17 (19H, m), 6,82-6,73 (4H, m), 6,16 (1 H, d, J = 5,7Hz), 5,06 (1 H, t, J = 5,6Hz), 4,93 (1H, d, J = 5,1 Hz), 4,83 (1H, d, J = 5,1 Hz), 4,81 -4,69 (2H, m), 4,27-4,19 (1H, m), 3,76 (6H, s), 3,55-3,40 (2H, m), 3,33-3,16 (2H, m), 3,12-2,97 (1H, m), 2,63 (3H, s), 1,88-1,52 (3H, m), 1,45-1,16 (3H, m), 0,91 -0,79 (3H, m), 0,86 (18H, s), 0,64 (3H, s); 31P RMN (121,5 MHz, CDCh) 5154,8 (1 P, s).
Ejemplo Z-25.
Monómero de oxazafosfolidina 19a.
Figure imgf000144_0001
El compuesto 19a se obtuvo usando "5'-O-(DMTr)-2'-O-(metil)uridina" en lugar de "5'-0-(DMTr)-2-A/-(fenoxiacetil)-6--(cianoetil)guanosina” de una manera similar al compuesto 12a. 1H RMN (300 MHz, CDCta) 57,91 (1H, d, J = 7,8Hz), 7,58-7,20 (19H, m), 6,88-6,80 (4H, m), 5,96 (1H, d, J= 3,3Hz), 5,19 (1H, d, J = 7,8Hz), 4,88-4,78 (1H, m), 4,66-4,57 (1 H, m), 4,03-3,95 (1H, m), 3,90-3,74 (1H, m), 3,78 (6H, s), 3,77-3,71 (1H, m), 3,58-3,29 (2H, m), 3,45 (3H, s), 3,13­ 2,82 (2H, m), 1,88-1,53 (3H, m), 1,49-1,16 (3H, m), 0,60 (3H, s); 31P RMN (121,5 MHz, CDCh) 5155,3 (1P, s). Ejemplo Z-26.
Monómero de oxazafosfolidina 19b.
Figure imgf000144_0002
El compuesto 19b se obtuvo usando 3b en lugar de 3a de una manera similar al compuesto 19a. 1H RMN (300 MHz, CDCl3) 58,10 (1 H, d, J = 8,4Hz), 7,58-7,20 (19H, m), 6,87-6,79 (4H, m), 5,89 (1H, d, J= 1,5Hz), 5,21 (1H, d, J= 8,4Hz), 4,92-4,82 (1 H, m), 4,73-4,63 (1 H, m), 4,15-4,08 (1H, m), 3,89-3,73 (1 H, m), 3,78 (6H, s), 3,66-3,62 (1 H, m), 3,57-3,27 (2H, m), 3,30 (3H, s), 3,17-2,82 (2H, m), 1,89-1,55 (3H, m), 1,55-1,40 (1H, m), 1,35-1,15 (2H, m), 0,66 (3H, s); 31P RMN (121,5 MHz, CDCh) 5157,5 (1P, s).
Ejemplo Z-27.
Monómero de oxazafosfolidina 20a.
Figure imgf000144_0003
El compuesto 20a se obtuvo usando "5'-0-(DMTr)-2'-desoxi-2'-fluorouridina" en lugar de "5'-0-(DMTr)-2-W-(fenoxiacetil)-6-0-(cianoetil)guanosina" de una manera similar al compuesto 12a. 1H RMN (300 MHz, CDCh) 57,85 (1 H, d, J = 8,1Hz), 7,58-7,20 (19H, m), 6,87-6,79 (4H, m), 5,98 (1H, d, J = 16,5Hz), 5,23 (1H, d, J = 8,1Hz), 4,86-4,61 (3H, m), 3,99 (1H, d, J = 6,9Hz), 3,76 (6H, d, J = 3,0Hz), 3,56-3,34 (4H, m), 3,10-2,96 (1H, m), 1,88-1,74 (1 H, m), 1,72­ 1,52 (2H, m), 1,48-1,16 (3H, m), 0,61 (3H, s); 31P RMN (121,5 MHz, CDCh) 5154,3 (1P, d, J= 8,9Hz).
Ejemplo Z-28.
Monómero de oxazafosfolidina 20b.
Figure imgf000145_0001
El compuesto 20b se obtuvo usando 3b en lugar de 3a de una manera similar al compuesto 20a. 1H RMN (300 MHz, CDCh) 58,01 (1H, d, J = 8,4Hz), 7,58-7,20 (19H, m), 6,87-6,79 (4H, m), 6,03 (1H, d, J = 16,2Hz), 5,29 (1H, d, J = 8,4Hz), 4,96 (1 H, dd, J = 13,1,7,5Hz), 4,80-4,54 (2H, m), 4,15 (1H, d, J = 9,0Hz), 3,78 (6H, s), 3,61-3,39 (3H, m), 3,37­ 3,25 (1H, m), 3,23-3,09 (1H, m), 1,91-1,56 (3H, m), 1,51-1,13 (3H, m), 0,66 (3H, s); 31P RMN (121,5 MHz, CDCh) 5 158,9 (1P, d, J = 4,4Hz).
Ejemplo Z-29.
Monómero de oxazafosfolidina 21a.
Figure imgf000145_0002
El compuesto 21a se obtuvo usando "5'-0-(DMTr)-2'-0-metoxietil-5-metiluridina" en lugar de "5'-0-(DMTr)-2-A/-(fenoxiacetil)-6-0-(cianoetil)guanosina" de una manera similar al compuesto 12a. 1H RMN (300 MHz, CDCh) 57,62­ 7,18 (21H, m), 6,84 (4H, d, J = 8,7Hz), 6,07 (1H, d, J = 5,7Hz), 4,86-4,76 (1 H, m), 4,63-4,54 (1H, m), 4,20 (1H, t, J = 5,4Hz), 3,95-3,89 (1H, m), 3,78 (6H, s), 3,78-3,71 (2H, m), 3,60-3,48 (2H, m), 3,44-3,02 (5H, m), 3,31 (3H, s), 1,88­ 1,15 (6H, m), 1,35 (3H, s), 0,58 (3H, s); 31P RMN (121,5 MHz, CDCh) 5156,3 (1P, s).
Ejemplo Z-30.
Monómero de oxazafosfolidina 21b.
Figure imgf000146_0001
El compuesto 21b se obtuvo usando 3b en lugar de 3a de una manera similar al compuesto 21a. 1H RMN (300 MHz, CDCl3) 57,71 (1H, d, J = 1,2Hz), 7,55-7,22 (20H, m), 6,86-6,78 (4H, m), 5,99 (1H, d, J = 3,9Hz), 4,78-4,62 (2H, m), 4,13-4,08 (1 H, m), 4,07-4,02 (1 H, m), 3,77 (6H, s), 3,77-3,70 (1 H, m), 3,65-3,56 (1H, m), 3,52-3,36 (4H, m), 3,33-3,14 (2H, m), 3,29 (3H, s), 3,08-2,94 (1H, m), 1,86-1,72 (1H, m), 1,71-1,55 (2H, m), 1,30 (3H, d, J = 1,2Hz), 1,47-1,16 (3H, m) 0,64 (3H, s); 31P RMN (121,5 MHz, CDCh) 5155,6 (1P, s).
Ejemplo Z-31.
Monómero de oxazafosfolidina 22a.
Figure imgf000146_0002
El compuesto 22a se obtuvo usando "5'-0-(DMTr)-2'-0-metil-4-N-(isobutiril)citidina" en lugar de "5'-0-(DMTr)-2-W-(fenoxiacetil)-6-0-(cianoetil)guanosina" de una manera similar al compuesto 12a. 1H RMN (300 MHz, CDCh) 58,49 (1 H, d, J = 7,2Hz), 7,58-7,20 (19H, m), 6,96 (1H, d, J =7,2Hz), 6,90-6,82 (4H, m), 5,98 (1H, s), 4,84 (1H, dd, J = 13,1, 7,5Hz), 4,59 (1H, dt, J = 8,3, 4,5Hz), 4,19-4,13 (1H, m), 3,79 (6H, s), 3,78-3,72 (1H, m), 3,63-3,40 (3H, m), 3,55 (3H, s), 3,36-3,24 (1H, m), 3,09-2,95 (1 H, m), 2,59 (1 H, septuplete, J = 6,9Hz), 1,85-1,53 (5H, m), 1,48-1,37 (1 H, m), 1,24­ 1,17 (6H, m), 0,59 (3H, s); 31P RMN (121,5 MHz, CDCh) 5155,2 (1P, s).
Ejemplo Z-32.
Monómero de oxazafosfolidina 22b.
Figure imgf000147_0001
El compuesto 22b se obtuvo usando 3b en lugar de 3a de una manera similar al compuesto 22a. 1H RMN (300 MHz, CDCl3) 58,62 (1 H, d, J = 7,5Hz), 7,57-7,23 (19H, m), 7,02 (1H, d, J =7,5Hz), 6,89-6,81 (4H, m), 5,92 (1H, s), 4,90 (1 H, dt, J= 9,0, 5,7Hz), 4,61 (1H, dt, J = 8,7, 4,8Hz), 4,25-4,17 (1H, m), 3,81 (6H, s), 3,67 (1 H, d, J = 4,5Hz), 3,62-3,25 (4H, m), 3,38 (3H, s), 3,16-3,02 (1H, m), 2,58 (1H, septuplete, J = 6,9Hz), 1,87-1,40 (6H, m), 1,26-1,14 (6H, m), 0,64 (3H, s); 31P RMN (121,5 MHz, CDCh) 5158,2 (1P, s).
Ejemplo Z-33.
Monómero de oxazafosfolidina 23a.
Figure imgf000147_0002
El compuesto 23a se obtuvo usando "5'-0-(DMTr)-2'-0-metil-2-A/-(fenoxiacetil)-6-O-(cianoetil)guanosina" en lugar de "5'-0-(DMTr)-2-A/-(fenoxiacetil)-6-O-(cianoetil)guanosina" de una manera similar al compuesto 12a. 1H RMN (300 MHz, CDCh) 58,67 (1H, s a), 8,01 (1 H, s), 7,56-7,16 (24H, m), 6,83-6,74 (4H, m), 6,08 (1 H, d, J = 6,9Hz), 4,85-4,76 (1 H, m), 4,84 (2H, t, J = 6,6Hz), 4,65-4,56 (1H, m), 4,59 (2H, s a), 4,48 (1 H, dd, J = 6,6, 5,1Hz), 4,09-4,05 (1 H, m), 3,75 (6H, s), 3,60-3,42 (2H, m), 3,40-3,26 (2H, m), 3,35 (3H, s), 3,18-3,05 (1H, m), 3,08 (2H, t, J = 6,6Hz), 1,89-1,49 (3H, m), 1,48-1,16 (3H, m), 0,59 (3H, s); 31P RMN (121,5 MHz, CDCh) 5156,9 (1P, s).
Ejemplo Z-34.
Monómero de oxazafosfolidina 23b.
Figure imgf000148_0001
El compuesto 23b se obtuvo usando 3b en lugar de 3a de una manera similar al compuesto 23a. 1H RMN (300 MHz, CDCl3) 58,74 (1 H, s a), 8,09 (1 H, s), 7,56-6,94 (24H, m), 6,84-6,71 (4H, m), 6,09 (1H, d, J= 4,8Hz), 4,83-4,70 (2H, m), 4,83 (2H, t, J= 6,6Hz), 4,63 (2H, s a), 4,35 (1H, t, J = 5,0Hz), 4,23-4,16 (1H, m), 3,75 (6H, s), 3,58-3,19 (4H, m), 3,32 (3H, s), 3,16-3,04 (1 H, m), 3,07 (2H, t, J = 6,6Hz), 1,90-1,55 (3H, m), 1,48-1,15 (3H, m), 0,64 (3H, s); 31P RMN (121,5 MHz, CDCh) 5154,6 (1P, s).
Ejemplo Z-35.
Monómero de oxazafosfolidina 24a.
Figure imgf000148_0002
El compuesto 24a se obtuvo usando "5'-0-(DMTr)-2'-desoxi-2'-fluoro-2-A/-(fenoxiacetil)-6-O-(cianoetil)guanosina" en lugar de "5'-0-(DMTr)-2-A/-(fenoxiacetil)-6-0-(cianoetil)guanosina" de una manera similar al compuesto 12a. 1H RMN (300 MHz, CDCl3) 58,74 (1H, s a), 8,03 (1H, s), 7,55-6,94 (24H, m), 6,80-6,69 (4H, m), 6,21 (1H, dd, J = 14,9, 3,6Hz), 5,34 (1 H, dt, J = 52,3, 3,6Hz), 5,01-4,75 (2H, m), 4,84 (1H, t, J = 6,6Hz), 4,62 (2H, s a), 4,15-4,07 (1H, m), 3,73 (6H, s), 3,59-3,29 (4H, m), 3,15-3,00 (1H, m), 3,07 (2H, t, J = 6,6Hz), 1,90-1,49 (3H, m), 1,47-1,12 (3H, m), 0,58 (3H, s); 31P RMN (121,5 MHz, CDCh) 5155,6 (1P, d, J = 10,9Hz).
Ejemplo Z-36.
Monómero de oxazafosfolidina 24b.
Figure imgf000149_0001
El compuesto 24b se obtuvo usando 3b en lugar de 3a de una manera similar al compuesto 24a. 1H RMN (300 MHz, CDCta) 58,81 (1H, s a), 8,06 (1 H, s), 7,55-6,95 (24H, m), 6,77-6,69 (4H, m), 6,06 (1H, d, J = 17,1 Hz), 5,24-5,08 (1 H, m), 5,04-4,80 (2H, m), 4,87 (1H, t, J = 6,6Hz), 4,62 (2H, s a), 4,25-4,19 (1H, m), 3,73 (6H, s), 3,58-3,02 (5H, m), 3,10 (2H, t, J = 6,6Hz), 1,90-1,56 (3H, m), 1,50-1,15 (3H, m), 0,63 (3H, s); 31P RMN (121,5 MHz, CDCh) 5158,0 (1P, d, J = 4,4Hz).
Ejemplo Z-37.
Monómero de oxazafosfolidina 25a.
Figure imgf000149_0002
El compuesto 25a se obtuvo usando "5'-0-(DMTr)-2'-0-TOM-4-W-(acetil)citidina" en lugar de ”5'-0-(DMTr)-2-W-(fenoxiacetil)-6-0-(cianoetil)guanosina" de una manera similar al compuesto 12a. 1H RMN (300 MHz, CDCh) 5 10,04 (1 H, s a), 8,30 (1H, d, J = 7,5Hz), 7,51-7,21 (19H, m), 6,99 (1H, d, J = 7,5Hz), 6,89-6,81 (4H, m), 6,12 (1H, d, J = 3,3Hz), 5,07 (1H, d, J = 4,8Hz), 5,05 (1H, d, J = 4,8Hz), 4,84-4,75 (1 H, m), 4,62-4,52 (1H, m), 4,31 -4,25 (1 H, m), 4,08­ 4,01 (1H, m), 3,78 (6H, d, J= 3,0Hz), 3,55-3,23 (4H, m), 3,10-2,96 (1H, m), 2,24 (3H, s), 1,84-1,49 (3H, m), 1,46-0,96 (24H, m), 0,58 (3H, s); 31P RMN (121,5 MHz, CDCh) 5156,5 (1P, s).
Ejemplo Z-38.
Monómero de oxazafosfolidina 25b.
Figure imgf000150_0001
El compuesto 25b se obtuvo usando 3b en lugar de 3a de una manera similar al compuesto 25a. 1H RMN (300 MHz, CDCl3) 510,19 (1 H, s a), 8,46 (1H, d, J = 7,5Hz), 7,54-7,23 (19H, m), 7,01 (1H, d, J= 7,5Hz), 6,88-6,79 (4H, m), 6,19 (1 H, d, J = 1,8Hz), 5,11 (1H, d, J = 4,8Hz), 5,07 (1H, d, J = 4,8Hz), 4,81-4,71 (1H, m), 4,60-4,51 (1H, m), 4,26-4,18 (2H, m), 3,79 (6H, s), 3,63-3,55 (1H, m), 3,48-3,28 (2H, m), 3,21-2,94 (2H, m), 2,26 (3H, s), 1,81-1,49 (3H, m), 1,43­ 0,96 (24H, m), 0,62 (3H, s); 31P RMN (121,5 MHz, CDCta) 5156,4 (1P, s).
Ejemplo Z-39.
Monómero de oxazafosfolidina 26a.
Figure imgf000150_0002
El compuesto 26a se obtuvo usando "5'-0-(DMTr)-2'-desoxi-2'-fluoro-4-N-(isobutiril)citidina" en lugar de ”5'-0-(DMTr)-2-A/-(fenoxiacetil)-6-0-(cianoetil)guanosina" de una manera similar al compuesto 12a. 1H RMN (300 MHz, CDCh) 5 8,66 (1 H, s a), 8,41 (1 H, d, J = 7,5Hz), 7,55-7,20 (19H, m), 7,01 (1 H, d, J = 7,5Hz), 6,89-6,81 (4H, m), 6,06 (1 H, d, J = 15,9Hz), 4,85 (1 H, dd, J = 51,4, 3,9Hz), 4,84 (1H, dd, J = 12,9, 7,5Hz), 4,77-4,59 (1H, m), 4,15-4,08 (1 H, m), 3,79 (6H, s), 3,63-3,29 (4H, m), 3,10-2,96 (1H, m), 2,65 (1H, septuplete, J = 6,9Hz), 1,85-1,53 (3H, m), 1,48-1,17 (3H, m), 1,21 (3H, d, J = 4,8Hz), 1,19 (3H, d, J= 4,8Hz), 0,59 (3H, s); 31P RMN (121,5 MHz, CDCh) 5155,5 (1P, d, J = 6,6Hz).
Ejemplo Z-40.
Monómero de oxazafosfolidina 26b.
Figure imgf000151_0001
El compuesto 26b se obtuvo usando 3b en lugar de 3a de una manera similar al compuesto 26a. 1H RMN (300 MHz, CDCl3) 5 8,53 (1H, d, J= 7,5Hz), 7,57-7,23 (20H, m), 7,10 (1H, d, J = 7,5Hz), 6,89-6,81 (4H, m), 6,10 (1H, d, J = 15,9Hz), 5,00-4,92 (1H, m), 4,84 (1H, dd, J = 51,5, 3,3Hz), 4,75-4,58 (1H, m), 4,24 (1H, d, J = 9,3Hz), 3,81 (6H, s), 3,65-3,39 (3H, m), 3,32-3,06 (2H, m), 2,59 (1H, septuplete, J = 6,9Hz), 1,88-1,53 (4H, m), 1,49-1,34 (2H, m), 1,27-1,18 (6H, m), 0,65 (3H, s); 31P RMN (121,5 MHz, CDCh) 5159,0 (1 P, d, J = 4,4).
Monómero de oxazafosfolidina 27a
Figure imgf000151_0002
El compuesto 27a se obtuvo usando "5'-0-(DMTr)-2'-0-metil-6-A/-(benzoil)adenosina" en lugar de ”5'-0-(DMTr)-2-A/-(fenoxiacetil)-6-0-(cianoetil)guanosina" de una manera similar al compuesto 12a.
1H RMN (300 MHz, CDCh) 58,66 (1H, s), 8,13 (1H, s), 8,03 (2H, d, J = 7,2Hz), 7,64-7,16 (23H, m), 6,79 (4H, d, J = 8,7Hz), 6,08 (1H, d, J = 6,3Hz), 4,91-4,81 (1H, m), 4,77-4,69 (1H, m), 4,64-4,57 (1H, m), 4,15-4,10 (1H, m), 3,76 (6H, s), 3,60-3,23 (4H, m), 3,35 (3H, s), 3,14-3,00 (1H, m), 1,90-1,19 (6H, m), 0,62 (3H, s); 31P RMN (121,5 MHz, CDCh) 5 155,8 (1P, s).
Monómero de oxazafosfolidina 27b.
Figure imgf000152_0001
El compuesto 27b se obtuvo usando 3b en lugar de 3a de una manera similar al compuesto 27a.
1H RMN (300 MHz, CDCls) 59,12 (1H, s a), 8,73 (1H, s), 8,24 (1H, s), 8,07-8,01 (2H, m), 7,62-7,17 (22H, m), 6,83­ 6,77 (4H, m), 6,12 (1H, d, J= 4,8Hz), 4,84-4,73 (2H, m), 4,43 (1H, t, J = 4,8Hz), 4,25-4,19 (1H, m), 3,77 (6H, s), 3,55­ 3,20 (4H, m), 3,28 (3H, s), 3,16-3,03 (1H, m), 1,90-1,17 (6H, m), 0,65 (3H, s); 31P RMN (121,5 MHz, CDCh) 5155,0 (1P, s).
Monómero de oxazafosfolidina 28a.
Figure imgf000152_0002
El compuesto 28a se obtuvo usando "5'-0-(DMTr)-2'-desoxi-2'-fluoro-6-W-(benzoil)adenosina" en lugar de "5'-0-(DMTr)-2-A/-(fenoxiacetil)-6-0-(cianoetil)guanosina" de una manera similar al compuesto 12a.
1H RMN (300 MHz, CDCh) 58,64 (1H, s), 8,14 (1H, s), 8,06-8,01 (2H, m), 7,63-7,07 (23H, m), 6,78-6,70 (4H, m), 6,12 (1 H, dd, J= 18,0, 2,4Hz), 5,24-5,01 (2H, m), 4,94-4,84 (1 H, m), 4,17-4,06 (1H, m), 3,73 (6H, s), 3,55-3,40 (3H, m), 3,30­ 3,22 (1H, m), 3,03-2,88 (1H, m), 1,92-1,19 (6H, m), 0,62 (3H, s); 31P RMN (121,5 MHz, CDCh) 5 150,5 (1P, d, J = 7,7Hz).
Monómero de oxazafosfolidina 28b.
Figure imgf000153_0001
El compuesto 28b se obtuvo usando 3b en lugar de 3a de una manera similar al compuesto 28a.
1H RMN (300 MHz, CDCls) 59,07 (1H, s a), 8,80 (1H, s), 8,24 (1H, s), 8,08-8,01 (2H, m), 7,66-7,15 (22H, m), 6,81­ 6,75 (4H, m), 6,14 (1H, dd, J = 18,0, 1,8Hz), 5,16-4,91 (3H, m), 4,28-4,21 (1H, m), 3,76 (6H, s), 3,57-3,11 (5H, m), 1,82-1,16 (6H, m), 0,65 (3H, s); 31P RMN (121,5 MHz, CDCh) 5157,8 (1P, d, J = 5,6Hz).
Monómero de oxazafosfolidina 29a.
Figure imgf000153_0002
El compuesto 29a se obtuvo usando "5'-0-(DMTr)-2'-0-TOM-2-A/-(acetil)guanosina" en lugar de "5'-O-(DMTr)-2-N-(fenoxiacetil)-6-O-(cianoetil)guanosina" de una manera similar al compuesto 12a.
1H RMN (300 MHz, CDCh) 57,70 (1H, s), 7,63-7,13 (21H, m), 6,84-6,76 (4H, m), 5,77 (1H, d, J= 8,4Hz), 5,41-5,33 (1 H, m), 4,90 (2H, s), 4,78-4,68 (2H, m), 3,86 (1H, s a), 3,75 (3H, s), 3,74 (3H, s), 3,56-3,41 (2H, m), 3,32-2,90 (3H, m), 1,92-1,10 (9H, m), 0,97-0,87 (21H, m), 0,52 (3H, s); 31P RMN (121,5 MHz, CDCh) 5158,1 (1P, s).
Monómero de oxazafosfolidina 29b.
Figure imgf000153_0003
El compuesto 29b se obtuvo usando 3b en lugar de 3a de una manera similar al compuesto 29a.
1H RMN (300 MHz, CDCh) 57,77 (1H, s), 7,56-7,15 (21H, m), 6,82-6,75 (4H, m), 5,86 (1H, d, J = 7,5Hz), 5,26-5,17 (1 H, m), 4,95 (1H, d, J =5,4Hz), 4,85 (1H, d, J =5,4Hz), 4,78-4,71 (1H, m), 4,59-4,49 (1 H, m), 4,10-4,05 (1H, m), 3,74 (6H, s), 3,52-3,37 (2H, m), 3,30-3,18 (1H, m), 3,11-2,85 (2H, m), 1,85-1,15 (9H, m), 0,93-0,84 (21H, m), 0,62 (3H, s);
31P RMN (121,5 MHz, CDCI3) 5152,3 (1P, s).
Monómero de oxazafosfolidina 30a.
Figure imgf000154_0001
El compuesto 30a se obtuvo usando "5'-O-(DMTr)-2'-O-TOM-uridina" en lugar de "5'-0-(DMTr)-2-W-(fenoxiacetil)-6-0-(cianoetil)guanosina" de una manera similar al compuesto 12a.
1H RMN (300 MHz, CDCh) 57,76 (1H, d, J = 8,1Hz), 7,55-7,18 (20H, m), 6,88-6,80 (4H, m), 6,11 (1H, d, J = 6,0Hz), 5,32 (1 H, d, J = 8,1 Hz), 4,99 (1 H, d, J = 5,1 Hz), 4,93 (1H, d, J = 5,1 Hz), 4,84-4,75 (1H, m), 4,54-4,46 (1 H, m), 4,38 (1 H, t, J = 5,7Hz), 3,87-3,83 (1H, m), 3,78 (3H, s), 3,77 (3H, s), 3,56-3,42 (1 H, m), 3,39-3,28 (1 H, m), 3,36 (1H, dd, J= 11,0, 2,7Hz), 3,25 (1H, dd, J = 11,0, 2,7Hz), 3,16-3,03 (1H, m), 1,88-1,12 (6H, m), 1,08-0,97 (21H, m), 0,59 (3H, s);
31P RMN (121,5 MHz, CDCh) 5156,6 (1P, s).
Monómero de oxazafosfolidina 30b.
Figure imgf000154_0002
El compuesto 30b se obtuvo usando 3b en lugar de 3a de una manera similar al compuesto 30a.
1H RMN (600 MHz, CDCh) 57,87 (1H, d, J= 7,8Hz), 7,52-7,48 (4H, m), 7,38-7,21 (16H, m), 6,83-6,79 (4H, m), 6,14 (1 H, d, J = 4,8Hz), 5,33 (1 H, d, J = 7,8Hz), 4,99 (1 H, d, J = 5,4Hz), 4,89 (1 H, d, J = 5,4Hz), 4,67 (1H, dd, J = 13,8, 7,2Hz), 4,52 (1H, dt, J = 10,4, 4,8Hz), 4,31 (1H, t, J = 4,8Hz), 4,06-4,03 (1H, m), 3,78 (3H, s), 3,77 (3H, s), 3,47 (1 H, dd, J = 10,4, 2,4Hz), 3,47-3,39 (1 H, m), 3,22-3,17 (2H, m), 3,00 (1 H, ddd, J= 19,5, 10,4, 4,8Hz), 1,82-1,74 (1H, m), 1,68-1,58 (1 H, m), 1,56 (1H, dd, J = 14,4, 8,4Hz), 1,38 (1H, dd, J = 14,4, 7,2Hz), 1,31-1,25 (1H, m), 1,26-1,17 (1H, m), 1,08-0,98 (21 H, m), 0,63 (3H, s); 31P RMN (243,0 MHz, CDCh) 5154,3 (1P, s).
Monómero de oxazafosfolidina 31a.
Figure imgf000155_0001
El compuesto 31a se obtuvo usando "5'-O-(DMTr)-2'-O,4'-C-metileno-6-N-(benzoil)adenosina" en lugar de "5'-O-(DMTr)-2-A/-(fenoxiacetil)-6-O-(cianoetil)guanosina" de una manera similar al compuesto 12a.
1H RMN (300 MHz, CDCh) 59,10 (1H, s a), 8,76 (1 H, s), 8,32 (1H, s), 8,04 (2H, d, J = 7,2Hz), 7,64-7,18 (22H, m), 6,84 (4H, d, J = 8,7Hz), 6,10 (1 H, s), 4,76 (1H, d J = 6,9Hz), 4,58 (1H, s), 4,61 -4,51 (1 H, m), 3,91 (1H, d, J = 7,8Hz), 3,77 (1 H, d, J = 7,8Hz), 3,75 (6H, s), 3,50 (1H, s), 3,47-3,33 (1 H, m), 3,31 -3,19 (1H, m), 3,03-2,88 (1 H, m), 1,84-1,09 (6H, m), 0,51 (3H, s); 31P RMN (121,5 MHz, CDCh) 5152,9 (1P, s).
Monómero de oxazafosfolidina 31b.
Figure imgf000155_0002
El compuesto 31 b se obtuvo usando 3b en lugar de 3a de una manera similar al compuesto 31a.
1H RMN (300 MHz, CDCh) 58,81 (1H, s), 8,30 (1H, s), 8,07-8,00 (2H, m), 7,64-7,17 (22H, m), 6,86-6,79 (4H, m), 6,12 (1 H, s), 4,81-4,72 (1H, m), 4,62 (1H, d J = 7,2Hz), 4,57 (1H, s), 3,94 (1H, d, J = 7,8Hz), 3,89 (1H, d, J = 7,8Hz), 3,77 (6H, s), 3,48 (2H, s), 3,46-3,32 (1H, m), 3,24-3,13 (1H, m), 3,10-2,97 (1H, m), 1,84-1,49 (3H, m), 1,42-1,09 (3H, m), 0,58 (3H, s); 31P RMN (121,5 MHz, CDCh) 5157,3 (1P, s).
Monómero de oxazafosfolidina 32a.
Figure imgf000156_0001
El compuesto 32a se obtuvo usando "5'-O-(DMTr)-2'-O,4'-C-metileno-4-N-(isobutiril)-5-metilcitidina" en lugar de "5'-O-(DMTr)-2-A/-(fenoxiacetil)-6-O-(cianoetil)guanosina" de una manera similar al compuesto 12a.
1H RMN (300 MHz, CDCh) 57,88 (1H, s a), 7,58-7,18 (20H, m), 6,88-6,80 (4H, m), 5,65 (1H, s), 4,69-4,60 (1H, m), 4,52 (1 H, d, J = 6,6Hz), 4,49 (1H, s), 3,81 -3,74 (1 H, m), 3,75 (3H, s), 3,73 (3H, s), 3,64 (1 H, d, J = 8,1 Hz), 3,56 (1H, d, J = 11,1Hz), 3,53 (1H, d, J = 8,1 Hz), 3,46 (1H, d, J = 11,1Hz), 3,56-3,40 (1H, m), 3,32-3,20 (1 H, m), 3,14-3,00 (1 H, m), 1,85-1,12 (6H, m), 1,60 (3H, s), 1,19 (6H, d, J = 6,9Hz), 0,55 (3H, s); 31P RMN (121,5 MHz, CDCh) 5155,9 (1 P, s). Monómero de oxazafosfolidina 32b.
Figure imgf000156_0002
El compuesto 32b se obtuvo usando 3b en lugar de 3a de una manera similar al compuesto 32a.
1H RMN (300 MHz, CDCh) 57,86 (1H, s a), 7,56-7,19 (20H, m), 6,88-6,79 (4H, m), 5,69 (1H, s), 4,86-4,76 (1H, m), 4,46 (1H, s), 4,45 (1H, d, J = 7,5Hz), 3,80-3,75 (1H, m), 3,79 (6H, s), 3,74 (1H, d, J = 8,1Hz), 3,69 (1H, d, J = 8,1Hz), 3,51 (1H, d, J = 11,1Hz), 3,44-3,30 (1H, m), 3,39 (1H, d, J= 11,1Hz), 3,29-3,17 (1H, m), 3,11-2,97 (1H, m), 1,86-1,52 (3H, m), 1,64 (3H, s), 1,45-1,10 (3H, m), 1,21 (6H, d, J = 6,6Hz), 0,62 (3H, s); 31P RMN (121,5 MHz, CDCh) 5158,2 (1P, s).
Monómero de oxazafosfolidina 33a.
Figure imgf000157_0001
El compuesto 33a se obtuvo usando "5'-0-(DMTr)-2'-0,4'-C-metileno-2-A/-(fenoxiacetil)-6-O-(cianoetil)guanosina" en lugar de "5'-0-(DMTr)-2-W-(fenoxiacetil)-6-O-(cianoetil)guanosina" de una manera similar al compuesto 12a.
1H RMN (300 MHz, CDCh) 58,71 (1H, s a), 8,16 (1H, s), 7,50-7,17 (21H, m), 7,09-7,01 (3H, m), 6,86-6,79 (4H, m), 6,03 (1H, s), 4,84 (2H, t, J = 6,6Hz), 4,72 (2H, s), 4,68 (1 H, d, J = 7,2Hz), 4,55-4,46 (1H, m), 4,50 (1H, s), 3,90 (1 H, d, J = 7,8Hz), 3,77 (1 H, d, J = 7,8Hz), 3,75 (6H, s), 3,51 (1H, d, J = 10,8Hz), 3,47 (1H, d, J = 10,8Hz), 3,45-3,21 (2H, m), 3,08 (2H, t, J =6,6Hz), 3,03-2,89 (1H, m), 1,80-1,08 (6H, m), 0,47 (3H, s); 31P RMN (121,5 MHz, CDCh) 5153,2 (1P, s).
Monómero de oxazafosfolidina 33b.
Figure imgf000157_0002
El compuesto 33b se obtuvo usando 3b en lugar de 3a de una manera similar al compuesto 33a.
1H RMN (300 MHz, CDCh) 58,86 (1H, s a), 8,13 (1H, s), 7,55-7,17 (21H, m), 7,08-6,98 (3H, m), 6,95-6,78 (4H, m), 6,01 (1H, s), 4,86 (2H, t, J = 6,6Hz), 4,82-4,73 (1H, m), 4,70 (2H, s), 4,64 (1H, d, J = 7,5Hz), 4,49 (1 H, s), 3,94 (1H, d, J = 7,8Hz), 3,89 (1H, d, J = 7,8Hz), 3,77 (6H, s), 3,46 (2H, s), 3,45-3,30 (1H, m), 3,24-3,12 (1H, m), 3,09 (2H, t, J =6,6Hz), 3,09-2,96 (1H, m), 1,81-1,50 (3H, m), 1,41-1,06 (3H, m), 0,58 (3H, s); 31P RMN (121,5 MHz, CDCh) 5157,4 (1P, s).
Monómero de oxazafosfolidina 34a.
Figure imgf000157_0003
El compuesto 34a se obtuvo usando "5'-0-(DMTr)-2'-0,4'-C-metileno-5-metiluridina" en lugar de "5'-0-(DMTr)-2-W-(fenoxiacetil)-6-0-(cianoetil)guanosina" de una manera similar al compuesto 12a.
1H RMN (300 MHz, CDCl3) 57,71 (1H, d, J = 0,9Hz), 7,50-7,17 (20H, m), 6,87-6,80 (4H, m), 5,61 (1H, s), 4,69-4,60 (1 H, m), 4,55 (1 H, d, J = 6,9Hz), 4,41 (1 H, s), 3,74 (3H, s), 3,73 (3H, s), 3,64 (1 H, d, J = 7,8Hz), 3,55 (1 H, d, J = 7,8Hz), 3,53 (1H, d, J = 10,8Hz), 3,46 (1H, d, J = 10,8Hz), 3,56-3,42 (1H, m), 3,35-3,24 (1 H, m), 3,13-3,00 (1H, m), 1,85-1,45 (3H, m), 1,55 (3H, d, J = 0,9Hz), 1,41-1,12 (3H, m), 0,56 (3H, s); 31P RMN (121,5 MHz, CDCh) 5155,1 (1P, s).
Monómero de oxazafosfolidina 34b.
Figure imgf000158_0001
El compuesto 34b se obtuvo usando 3b en lugar de 3a de una manera similar al compuesto 34a.
1H RMN (300 MHz, CDCh) 57,69 (1H, s), 7,56-7,19 (20H, m), 6,88-6,79 (4H, m), 5,66 (1H, s), 4,87-4,77 (1H, m), 4,47 (1 H, d, J = 7,8Hz), 4,40 (1 H, s), 3,78 (6H, s), 3,74 (1H, d, J = 7,8Hz), 3,68 (1 H, d, J = 7,8Hz), 3,50 (1H, d, J = 10,8Hz), 3,46-3,32 (1 H, m), 3,39 (1H, d, J = 10,8Hz), 3,30-3,19 (1H, m), 3,12-2,98 (1 H, m), 1,85-1,56 (3H, m), 1,59 (3H, s), 1,46­ 1,12 (3H, m), 0,63 (3H, s); 31P RMN (121,5 MHz, CDCh) 5158,1 (1P, s).
Monómero de oxazafosfolidina 35a.
Figure imgf000158_0002
El compuesto 35a se obtuvo usando 13a' en lugar de 3a de una manera similar al compuesto 13a. 1H RMN (600 MHz, CDCh) 57,76 (2H, d, J= 9,0Hz), 7,62 (1H, d, J = 1,2Hz), 7,40 (2H, d, J = 7,2Hz), 7,32-7,23 (10H, m), 6,85 (4H, d, J = 8,4Hz), 6,41 (1 H, dd, J = 8,4, 5,4Hz), 4,94 (1H, dd, J = 12,3, 5,4Hz), 4,84-4,79 (1H, m), 4,03-4,01 (1H, m), 3,79 (6H, s), 3,59-3,53 (1H, m), 3,52-3,44 (2H, m), 3,41 (1H, dd, J = 14,7, 7,2Hz), 3,37-3,30 (2H, m), 3,13 (1H, ddd, J = 19,3, 10,3, 4,1Hz), 2,50-2,44 (1H, m), 2,39 (3H, s), 2,35-2,29 (1H, m), 1,91-1,72 (2H, m), 1,64-1,59 (1H, m), 1,40 (3H, s), 1,12-1,05 (1H, m); 31P RMN (243,0 MHz, CDCh) 5154,2 (1P, s).
Ejemplo Z-41.
Figure imgf000159_0001
El compuesto anterior Z-27, que representa un monómero convencional, se usó para producir oligonucleótidos. La Figura 70 muestra un diagrama de productos obtenidos a través del Ejemplo de comparación Z-1. Como se muestra en las Figuras 69 y 70, los presentes monómeros proporcionaron desprotección más completa y menos producto secundario, que facilita el aislamiento y/o la purificación de producto.
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona monómeros químicamente estables. Ejemplos de dichos monómeros se representan en los ejemplos anteriormente. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona monómeros con alto rendimiento aislado. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona monómeros con rendimiento aislado superior al método convencional. En algunas realizaciones, el rendimiento aislado es superior al 80 %. Ejemplos de dichos monómeros se representan en los ejemplos anteriormente.
Reactivo de condensación
Los reactivos de condensación (Cr) útiles según los métodos de la presente invención son de una cualquiera de las siguientes fórmulas generales:
Figure imgf000159_0002
Q"
en donde Z1, Z2, Z3, Z4, Z5, Z6, Z7, Z8 y Z9 son independientemente un grupo opcionalmente sustituido seleccionado de alquilo, aminoalquilo, cicloalquilo, heterocíclico, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, alquiloxi, ariloxi o heteroariloxi, o en donde cualquiera de Z2 y Z3, Z5 y Z6, Z7 y Z8, Z8 y Z9, Z9 y Z7, o Z7 y Z8 y Z9 se toman conjuntamente para formar un anillo alicíclico o heterocíclico de 3 a 20 miembros; Q- es un contra-anión; y LG es un grupo saliente.
En algunas realizaciones, un contraión de un reactivo de condensación Cr es Cl-, Br-, BF4", PF6-, TfO-, Tf2N-, AsF6-, ClÜ4' o SbF6-, en donde Tf es CF3SO2. En algunas realizaciones, un grupo saliente de un reactivo de condensación Cr es F, Cl, Br, I, 3-nitro-1,2,4-triazol, imidazol, alquiltriazol, tetrazol, pentafluorobenceno o 1-hidroxibenzotriazol.
Los ejemplos de reactivos de condensación usados según los métodos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, cloruro de pentafluorobenzoílo, carbonildiimidazol (CDI), 1 -mesitilenesulfonil-3-nitrotriazol (MSNT), clorhidrato de 1-etil-3-(3'-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDCl-HCl), hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxitris(dimetilamino)fosfonio (PyBOP), cloruro de N,W-bis(2-oxo-3-oxazolidinil)fosfínico (BopCl), hexafluorofosfato de 2-(1 H-7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (HATU) y hexafluorofosfato de O-benzotriazol-N,N,N',N'-tetrametiluronio (HBTU), DIPCDI; bromuro de N,W-bis(2-oxo-3-oxazolidinil)fosfínico (BopBr), hexafluorofosfato de 1,3-dimetil-2-(3-nitro-1,2,4-triazol-1 -il)-2-pirrolidin-1 -il-1,3,2-diazafosfolidinio (Mn TP), hexafluorofosfato de 3-nitro-1,2,4-triazol-1 -il-tris(pirrolidin-1 -il)fosfonio (PyNTP), hexafluorofosfato de bromotripirrolidinofosfonio (PyBrOP); tetrafluoroborato de O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N',W-tetrametiluronio (TBTU); y hexafluorofosfato de tetrametilfluoroformamidinio (TFFH). En ciertas realizaciones, un contraión del reactivo de condensación Cr es Cl-, Br-, BF4-, PF6-, TfO-, Tf2N-, AsF6-, ClO4- o SbF6-, en donde Tf es CF3SO2.
En algunas realizaciones, un reactivo de condensación es 1-(2,4,6-triisopropilbencenosulfonil)-5-(piridin-2-il)tetrazolida, cloruro de pivaloílo, hexafluorofosfato de bromotrispirrolidinofosfonio, cloruro N,N'-bis(2-oxo-3-oxazolidinil)fosfínico (BopCl) o 2-cloro-5,5-dimetil-2-oxo-1,3,2-dioxafosfinano. En alguna realización, un reactivo de condensación es cloruro N,W-bis(2-oxo-3-oxazolidinil)fosfínico (BopCl). En algunas realizaciones, un reactivo de condensación se selecciona de los descritos en el documento de patente WO/2006/066260).
En algunas realizaciones, un reactivo de condensación es hexafluorofosfato de 1,3-dimetil-2-(3-nitro-1,2,4-triazol-1 -il)-2-pirrolidin-1 -il-1,3,2-diazafosfolidinio (MNTP) o hexafluorofosfato de 3-nitro-1,2,4-triazol-1-il-tris(pirrolidin-1-il)fosfonio (PyNTP):
Figure imgf000160_0001
Selección de base y azúcar del componente de acoplamiento de nucleósidos
Como se describe en el presente documento, los componentes de acoplamiento de nucleósidos para su uso según los métodos de la presente invención pueden ser los mismos entre sí o pueden ser diferentes entre sí. En algunas realizaciones, los componentes de acoplamiento de nucleósidos para su uso en la síntesis de un oligonucleótido proporcionado son de la misma estructura y/o configuración estereoquímica entre sí. En algunas realizaciones, cada componente de acoplamiento de nucleósidos para su uso en la síntesis de un oligonucleótido proporcionado no es de la misma estructura y/o configuración estereoquímica que ciertos otros componentes de acoplamiento de nucleósidos del oligonucleótido. Las nucleobases y los azúcares a modo de ejemplo para su uso según los métodos de la presente invención se describen en el presente documento. Un experto en las técnicas químicas y sintéticas relevantes reconocerá que cualquier combinación de nucleobases y azúcares descrita en el presente documento se contempla para su uso según los métodos de la presente invención.
Etapa de acoplamiento:
Los procedimientos de acoplamiento y los reactivos quirales y reactivos de condensación a modo de ejemplo para su uso según la presente invención se exponen brevemente en, entre otros, Wada I (documentos de patente JP4348077; WO2005/014609; WO2005/092909), Wada II (documento de patente WO2010/064146) y Wada III (documento de patente WO2012/039448). Los componentes de acoplamiento de nucleósidos quirales para su uso según la presente invención también se denominan en el presente documento "amiditos de Wada". En algunas realizaciones, un componente de acoplamiento tiene la estructura de
Figure imgf000160_0002
en donde BPRO es una nucleobase protegida. En algunas realizaciones, un componente de acoplamiento tiene la estructura de
Figure imgf000160_0003
en donde BPRO es una nucleobase protegida. Los fosforamiditos quirales a modo de ejemplo como componente de acoplamiento se representan a continuación:
Figure imgf000160_0004
Figure imgf000161_0001
Uno de los métodos usados para sintetizar el componente de acoplamiento se representa en el Esquema II, a continuación.
Figure imgf000161_0002
En algunas realizaciones, la etapa de acoplamiento comprende hacer reaccionar un grupo hidroxilo libre de una unidad de nucleótido de un oligonucleótido con un componente de acoplamiento de nucleósidos en condiciones adecuadas para efectuar el acoplamiento. En algunas realizaciones, la etapa de acoplamiento va precedida por una etapa de desbloqueo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el grupo hidroxilo en 5' del oligonucleótido en crecimiento se bloquea (es decir, protege) y debe ser desbloqueado para reaccionar posteriormente con un componente de acoplamiento de nucleósidos.
Una vez se ha desbloqueado el grupo hidroxilo apropiado del oligonucleótido en crecimiento, el soporte se lava y se seca en preparación para el suministro de una disolución que comprende un reactivo quiral y una disolución que comprende un activador. En algunas realizaciones, se suministran simultáneamente un reactivo quiral y un activador. En algunas realizaciones, la coadministración comprende suministrar una cantidad de un reactivo quiral en disolución (por ejemplo, una disolución de fosforamidito) y una cantidad de activador en una disolución (por ejemplo, una disolución de CMPT) en un disolvente aprótico polar, tal como un disolvente de nitrilo (por ejemplo, acetonitrilo). En algunas realizaciones, la etapa de acoplamiento proporciona una composición de producto en bruto en la que el producto de fosfito quiral está presente en un exceso diastereomérico de > 95 %. En algunas realizaciones, el producto de fosfito quiral está presente en un exceso diastereomérico de > 96 %. En algunas realizaciones, el producto de fosfito quiral está presente en un exceso diastereomérico de > 97 %. En algunas realizaciones, el producto de fosfito quiral está presente en un exceso diastereomérico de > 98 %. En algunas realizaciones, el producto de fosfito quiral está presente en un exceso diastereomérico de > 99 %.
Etapa de terminación:
Los métodos de preparación de oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionados comprenden una etapa de terminación. En algunas realizaciones, una etapa de terminación es una etapa única. En algunas realizaciones, una etapa de terminación es dos etapas. En algunas realizaciones, una etapa de terminación es más de dos etapas.
En algunas realizaciones, una etapa de terminación comprende las etapas de terminar la amina libre del auxiliar quiral y terminar cualquier grupo hidroxilo en 5' sin reaccionar terminal. En algunas realizaciones, la amina libre del auxiliar quiral y los grupos hidroxilo en 5' sin reaccionar se terminan con el mismo grupo de terminación. En algunas realizaciones, la amina libre del auxiliar quiral y los grupos hidroxilo en 5' sin reaccionar se terminan con diferentes grupos de terminación. En ciertas realizaciones, la terminación con diferentes grupos de terminación permite la retirada selectiva de un grupo de terminación con respecto al otro durante la síntesis del oligonucleótido. En algunas realizaciones, la terminación de ambos grupos ocurre simultáneamente. En algunas realizaciones, la terminación de ambos grupos ocurre iterativamente.
En ciertas realizaciones, la terminación ocurre iterativamente y comprende una primera etapa de terminación de la amina libre, seguido por una segunda etapa de terminación del grupo hidroxilo en 5' libre, en donde tanto la amina libre como el grupo hidroxilo en 5' están terminados con el mismo grupo de terminación. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la amina libre del auxiliar quiral se termina usando un anhídrido (por ejemplo, anhídrido fenoxiacético, es decir, Pac2O) antes de la terminación del grupo hidroxilo en 5' con el mismo anhídrido. En ciertas realizaciones, la terminación del grupo hidroxilo en 5' con el mismo anhídrido ocurre en condiciones diferentes (por ejemplo, en presencia de uno o más reactivos adicionales). En algunas realizaciones, la terminación del grupo hidroxilo en 5' ocurre en presencia de una base de amina en un disolvente etéreo (por ejemplo, NMI (N-metilimidazol) en THF). La expresión "grupo de terminación" se usa indistintamente en el presente documento con las expresiones "grupo protector" y "grupo de bloqueo".
En algunas realizaciones, un grupo de terminación de amina se caracteriza porque termina eficazmente la amina de forma que previene la reordenación y/o la descomposición de las especies de fosfito intermedias. En algunas realizaciones, un grupo de terminación se selecciona para su capacidad para proteger la amina del auxiliar quiral para prevenir la escisión intramolecular del fósforo del enlace internucleotídico.
En algunas realizaciones, un grupo de terminación del grupo hidroxilo en 5' se caracteriza porque termina eficazmente el grupo hidroxilo de forma que se prevenga la aparición de "shortmeros", por ejemplo, "n-m" (m y n son números enteros y m<n; n es el número de bases en el oligonucleótido selectivo) impurezas que ocurren de la reacción de una cadena de oligonucleótido que deja de reaccionar en un primer ciclo, pero luego reacciona en uno o más ciclos posteriores. La presencia de dichos shortmeros, especialmente "n-1", tiene un efecto perjudicial sobre la pureza del oligonucleótido en bruto y hace que la purificación final del oligonucleótido sea tediosa y, en general, de bajo rendimiento.
En algunas realizaciones, se selecciona una tapa particular basándose en su tendencia para facilitar un tipo particular de reacción en condiciones particulares. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se selecciona un grupo de terminación por su capacidad para facilitar una reacción de eliminación E1, reacción que escinde la tapa y/o el auxiliar del oligonucleótido en crecimiento. En algunas realizaciones, se selecciona un grupo de terminación para su capacidad para facilitar una reacción de eliminación E2, reacción que escinde la tapa y/o el auxiliar del oligonucleótido en crecimiento. En algunas realizaciones, se selecciona un grupo de terminación para su capacidad para facilitar una reacción de p-eliminación, reacción que escinde la tapa y/o el auxiliar del oligonucleótido en crecimiento.
Etapa de modificación:
Como se usa en el presente documento, la expresión "etapa modificadora", "etapa de modificación" y "etapa de modificación en P" se usan indistintamente y se refieren, en general, a una cualquiera o más etapas usadas para instalar un enlace internucleotídico modificado. En algunas realizaciones, el enlace internucleotídico modificado tiene la estructura de la fórmula I. Una etapa de modificación en P de la presente invención ocurre durante el ensamblaje de un oligonucleótido proporcionado en vez de después de que se haya completado el ensamblaje de un oligonucleótido proporcionado. Por lo tanto, cada unidad de nucleótido de un oligonucleótido proporcionado puede ser individualmente modificada en el fósforo del enlace durante el ciclo dentro del que está instalada la unidad de nucleótido.
En algunas realizaciones, un reactivo de modificación en P adecuado es un electrófilo de azufre, electrófilo de selenio, electrófilo de oxígeno, reactivo de boración o un reactivo de azida.
Por ejemplo, en algunas realizaciones, un reactivo de selenio es selenio elemental, una sal de selenio o un diseleniuro sustituido. En algunas realizaciones, un electrófilo de oxígeno es oxígeno elemental, peróxido, o un peróxido sustituido. En algunas realizaciones, un reactivo de boración es un borano-amina (por ejemplo, W,W-diisopropiletilamina (BH3 DIPEA), borano-piridina (BH3-Py), borano-2-cloropiridina (BH3-CPy), borano-anilina (BH3-An)), un reactivo de borano-éter (por ejemplo, borano-tetrahidrofurano (BH3 THF)), un reactivo de borano-dialquilsulfuro (por ejemplo, BH3-Me2S), anilina-cianoborano o una trifenilfosfina-carboalcoxiborano. En algunas realizaciones, un reactivo de azida comprende un grupo azida capaz de someterse a una reducción posterior para proporcionar un grupo amina.
En algunas realizaciones, un reactivo de modificación en P es un reactivo de sulfurización como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, una etapa de modificación comprende la sulfurización de fósforo para proporcionar un enlace fosforotioato o enlace de triéster de fosforotioato. En algunas realizaciones, una etapa de modificación proporciona un oligonucleótido que tiene un enlace internucleotídico de la fórmula I.
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona reactivos de sulfurización, y métodos de preparación, y uso de los mismos en el método inventivo.
En algunas realizaciones, dichos reactivos de sulfurización son reactivos de tiosulfonato. En algunas realizaciones, un reactivo de tiosulfonato tiene una estructura de la fórmula S-I:
Figure imgf000163_0001
S-I
en donde:
Rs1 es R; y
cada uno de R, L y R1 es independientemente como se define y describe anteriormente y en el presente documento.
En algunas realizaciones, el reactivo de sulfurización es un reactivo de bis(tiosulfonato). En algunas realizaciones, el reactivo de bis(tiosulfonato) tiene la estructura de la fórmula S-II:
Figure imgf000163_0002
S-II
en donde cada uno de Rs1 y L es independientemente como se define y se describe anteriormente y en el presente documento.
Como se define, en general, anteriormente, Rs1 es R, en donde R es como se define y se describe anteriormente y en el presente documento. En algunas realizaciones, Rs1 es alifático, arilo, heterociclilo o heteroarilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, Rs1 es alquilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, Rs1 es alquilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, Rs1 es metilo. En algunas realizaciones, Rs1 es cianometilo. En algunas realizaciones, Rs1 es nitrometilo. En algunas realizaciones, Rs1 es arilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, Rs1 es fenilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, Rs1 es fenilo. En algunas realizaciones, Rs1 es p-nitrofenilo. En algunas realizaciones, Rs1 es p-metilfenilo. En algunas realizaciones, Rs1 es p-clorofenilo. En algunas realizaciones, Rs1 es o-clorofenilo. En algunas realizaciones, Rs1 es 2,4,6-triclorofenilo. En algunas realizaciones, Rs1 es pentafluorofenilo. En algunas realizaciones, Rs1 es heterociclilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, Rs1 es heteroarilo opcionalmente sustituido.
En algunas realizaciones, Rs1-S(O)2S- es
Figure imgf000163_0003
(MTS). En algunas realizaciones, Rs1-S(O)2S- es
Figure imgf000163_0004
(TTS). En algunas realizaciones, Rs1-S(O)2S- es
Figure imgf000163_0005
(NO2PheTS). En algunas realizaciones, Rs1-S(O)2S- es
Figure imgf000164_0001
(p-ClPheTS). En algunas realizaciones, Rs1-S(O)2S- es
Figure imgf000164_0002
(o-ClPheTS). En algunas realizaciones, Rs1-S(O)2S- es
Figure imgf000164_0003
(2,4,6-TriClPheTS). En algunas realizaciones, Rs1-S(O)2S- es
Figure imgf000164_0004
(PFPheTS). En algunas realizaciones, Rs1-S(O)2S- es
Figure imgf000164_0005
(a-CNMTS). En algunas realizaciones, Rs1-S(O)2S- es
Figure imgf000164_0006
(a-NO2MTS). En algunas realizaciones, Rs1-S(O)2S- es
Figure imgf000164_0007
(a-CF3MTS). En algunas realizaciones, Rs1-S(O)2S- es
Figure imgf000164_0008
(a-CF3TS). En algunas realizaciones, Rs1-S(O)2S- es
Figure imgf000164_0009
(a-CHF2TS). En algunas realizaciones, Rs1-S(O)2S- es
°VS CH2F
8 'b (a-CH2FTS).
En algunas realizaciones, el reactivo de sulfurización tiene la estructura de S-I o S-II, en donde L es -S-RL3- o -S-C(O)-RL3-. En algunas realizaciones, L es -S-RL3- o -S-C(O)-RL3-, en donde RL3 es un alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, L es -S-RL3- o -S-C(O)-RL3-, en donde RL3 es un alquenileno C1-C6 opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, L es -S-RL3- o -S-C(O)-RL3-, en donde RL3 es un alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, en donde una o más unidades de metileno están opcionalmente e independientemente sustituidas con un alquenileno C1-C6 , arileno o heteroarileno opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, En algunas realizaciones, RL3 es un -S-(alquenilen C1-C6)-, -S-(alquilen C1-C6)-, -S-(alquilen C1-C6)-arilen-(alquilen C1-C6)-, -S-CO-arilen-(alquilen C1-C6)- o -S-CO-(alquilen C1-C6)-arilen-(alquilen C1-C6)- opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, el reactivo de sulfurización tiene la estructura de S-I o S-II, en donde L es -S-RL3- o -S-C(O)-RL3-, y el átomo de azufre está conectado a R1.
En algunas realizaciones, el reactivo de sulfurización tiene la estructura de S-I o S-II, en donde L es alquileno, alquenileno, arileno o heteroarileno.
En algunas realizaciones, el reactivo de sulfurización tiene la estructura de S-I o S-II, en donde L es
Figure imgf000165_0001
En algunas realizaciones, L es
Figure imgf000165_0002
en donde el átomo de azufre está conectado a R1.
En algunas realizaciones, el reactivo de sulfurización tiene la estructura de S-I o S-II, en donde R1 es
Figure imgf000165_0004
En algunas realizaciones, R1 es
Figure imgf000165_0003
Figure imgf000166_0001
en donde el átomo de azufre está conectado a L.
En algunas realizaciones, el reactivo de sulfurización tiene la estructura de S-I o S-II, en donde L es
Figure imgf000166_0002
en donde el átomo de azufre está conectado a R1; y R1 es
Figure imgf000166_0003
en donde el átomo de azufre está conectado a L.
En algunas realizaciones, el reactivo de sulfurización tiene la estructura de S-I o S-II, en donde R1 es -S-RL2, en donde RL2 es como se define y se describe anteriormente y en el presente documento. En algunas realizaciones, RL2 es un grupo opcionalmente sustituido seleccionado de -S-(alquilen C1-C6)-heterociclilo, -S-(alquenilen C1-C6)-heterociclilo, -S-(alquilen C1-C6)-N(R>, -S-(alquilen C1-C6)-N(R')3, en donde cada R' es como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, -L-R1 es -RL3-S-S-RL2, en donde cada variable es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, -L-R1 es -RL3-C(O)-S-S-RL2, en donde cada variable es independientemente como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento.
Los reactivos de bis(tiosulfonato) a modo de ejemplo de la fórmula S-II se representan a continuación:
Figure imgf000166_0004
En algunas realizaciones, el reactivo de sulfurización es un compuesto que tiene una de las siguientes fórmulas:
S8, Rs2-S-S-Rs3, o Rs2-S-Xs-Rs3,
en donde:
cada uno de Rs2 y Rs3 es independientemente un grupo opcionalmente sustituido seleccionado de alifático, aminoalquilo, carbociclilo, heterociclilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, alquiloxi, ariloxi, heteroariloxi, acilo, amida, imida o tiocarbonilo; o
Rs2 y Rs3 se toman conjuntamente con los átomos a los que están unidos para formar un anillo heterocíclico o de heteroarilo opcionalmente sustituido;
Xs es -S(O)2-, -O- o -N(R')-; y
R' es como se define y se describe anteriormente y en el presente documento.
En algunas realizaciones, el reactivo de sulfurización es S8,
Figure imgf000167_0001
En algunas realizaciones, el reactivo de sulfurización es S8
Figure imgf000167_0002
En algunas realizaciones, el reactivo de sulfurización es
Figure imgf000167_0003
Los reactivos de sulfurización a modo de ejemplo se representan en la Tabla 5 a continuación.
Tabla 5. Reactivos de sulfurización a modo de ejemplo.
Figure imgf000167_0004
Figure imgf000168_0001
En algunas realizaciones, un reactivo de sulfurización proporcionado se usa para modificar un H-fosfonato. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se sintetiza un oligonucleótido de H-fosfonato usando, por ejemplo, un método de Wada I o Wada II, y se modifica usando un reactivo de sulfurización de la fórmula S-I o S-II:
Figure imgf000169_0001
S-l S-ll
en donde cada uno de RS1, L y R1 son como se describen y se definen anteriormente y en el presente documento. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un proceso de síntesis de un triéster de fosforotioato, que comprende las etapas de:
i) hacer reaccionar un H-fosfonato de la estructura:
> W ii
■' -Y-P i*-Z
H
en donde cada uno de W, Y y Z son como se describen y se definen anteriormente y en el presente documento, con un reactivo de sililación para proporcionar un sililoxifosfonato; y
ii) hacer reaccionar el sililoxifosfonato con un reactivo de sulfurización de la estructura S-I o S-II:
Figure imgf000169_0002
para proporcionar un fosforotiotriéster.
En algunas realizaciones, se usa un electrófilo de selenio en lugar de un reactivo de sulfurización para introducir la modificación al enlace internucleotídico. En algunas realizaciones, un electrófilo de selenio es un compuesto que tiene una de las siguientes fórmulas:
Se, Rs2-Se-Se- Rs3 o Rs2-Se-Xs-Rs3,
en donde:
cada uno de Rs2 y Rs3 es independientemente un grupo opcionalmente sustituido seleccionado de alifático, aminoalquilo, carbociclilo, heterociclilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, alquiloxi, ariloxi, heteroariloxi, acilo, amida, imida o tiocarbonilo; o
Rs2 y Rs3 se toman conjuntamente con los átomos a los que están unidos para formar un anillo heterocíclico o de heteroarilo opcionalmente sustituido;
Xs es -S(O)2-, -O- o -N(R')-; y
R' es como se define y se describe anteriormente y en el presente documento.
En otras realizaciones, el electrófilo de selenio es un compuesto de Se, KSeCN,
Figure imgf000169_0003
En algunas realizaciones, el electrófilo de selenio es Se o
Figure imgf000169_0004
En algunas realizaciones, un reactivo de sulfurización para su uso según la presente invención se caracteriza porque el resto transferido al fósforo durante la sulfurización es un azufre sustituido (por ejemplo, -SR) a diferencia de un único átomo de azufre (por ejemplo, -S- o =S).
En algunas realizaciones, un reactivo de sulfurización para su uso según la presente invención se caracteriza porque la actividad del reactivo es ajustable modificando el reactivo con un cierto grupo aceptor o donante de electrones.
En algunas realizaciones, un reactivo de sulfurización para su uso según la presente invención se caracteriza porque es cristalino. En algunas realizaciones, un reactivo de sulfurización para su uso según la presente invención se caracteriza porque tiene un alto grado de cristalinidad. En ciertas realizaciones, un reactivo de sulfurización para su uso según la presente invención se caracteriza por la facilidad de purificación del reactivo por, por ejemplo, recristalización. En ciertas realizaciones, un reactivo de sulfurización para su uso según la presente invención se caracteriza porque está sustancialmente libre de impurezas que contienen azufre. En algunas realizaciones, los reactivos de sulfurización que están sustancialmente libres de impurezas que contienen azufre muestran una elevada eficiencia.
En algunas realizaciones, el oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado comprende uno o más enlaces diéster de fosfato. Para sintetizar dichos oligonucleótidos quiralmente controlados, uno o más etapas de modificación opcionalmente sustituidas con una etapa de oxidación para instalar los enlaces diéster de fosfato correspondientes. En algunas realizaciones, la etapa de oxidación se realiza en un modo similar a la síntesis de oligonucleótidos habitual. En algunas realizaciones, una etapa de oxidación comprende el uso de I2. En algunas realizaciones, una etapa de oxidación comprende el uso de I2 y piridina. En algunas realizaciones, una etapa de oxidación comprende el uso de I2 0,02 M en un sistema de codisolventes de THF/piridina/agua (70:20:10 - v/v/v). Un ciclo a modo de ejemplo se representa en el Esquema I-c.
En algunas realizaciones, se usa un precursor de fosforotioato para sintetizar oligonucleótidos quiralmente controlados que comprenden enlaces fosforotioato. En algunas realizaciones, dicho precursor de fosforotioato es
Figure imgf000170_0001
En algunas realizaciones,
Figure imgf000170_0002
se convierte en enlaces diéster de fosforotioato durante procedimientos habituales de desprotección/liberación después de la salida del ciclo. A continuación se representan ejemplos.
En algunas realizaciones, el oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado comprende uno o más enlaces diéster de fosfato y uno o más enlaces diéster de fosforotioato. En algunas realizaciones, el oligonucleótido quiralmente controlado proporcionado comprende uno o más enlaces diéster de fosfato y uno o más enlaces diéster de fosforotioato, en donde al menos un enlace diéster de fosfato se instala después de todos los enlaces diéster de fosforotioato cuando se sintetizan de 3' a 5'. Para sintetizar dichos oligonucleótidos quiralmente controlados, en algunas realizaciones, una o más etapas de modificación se sustituyen opcionalmente con una etapa de oxidación para instalar los enlaces diéster de fosfato correspondientes, y se instala un precursor de fosforotioato para cada uno de los enlaces diéster de fosforotioato. En algunas realizaciones, un precursor de fosforotioato se convierte en un enlace diéster de fosforotioato después de que se logre la longitud de oligonucleótido deseada. En algunas realizaciones, la etapa de desprotección/liberación durante o después de la salida del ciclo convierte los precursores de fosforotioato en enlaces diéster de fosforotioato. En algunas realizaciones, un precursor de fosforotioato se caracteriza porque tiene la capacidad de ser retirado por una vía de beta-eliminación. En algunas realizaciones, un precursor de fosforotioato es
Figure imgf000170_0003
Como se entiende por un experto habitual en la técnica, uno de los beneficios de uso de un precursor de fosforotioato, por ejemplo,
Figure imgf000170_0004
durante síntesis es que
Figure imgf000171_0001
es más estable que el fosforotioato en ciertas condiciones.
En algunas realizaciones, un precursor de fosforotioato es un grupo protector de fósforo como se describen en el presente documento, por ejemplo, 2-cianoetilo (CE o Cne), 2-trimetilsililetilo, 2-nitroetilo, 2-sulfoniletilo, metilo, bencilo, o-nitrobencilo, 2-(p-nitrofenil)etilo (NPE o Npe), 2-feniletilo, 3-(N-ferc-butilcarboxamido)-1-propilo, 4-oxopentilo, 4-metiltio-1 -butilo, 2-ciano-1,1 -dimetiletilo, 4-N-metilaminobutilo, 3-(2-piridil)-1 -propilo, 2-[A/-metil-N-(2-piridil)]aminoetilo, 2-(A/-formilo,A/-metil)aminoetilo, 4-[A/-metil-A/-(2,2,2-trifluoroacetil)amino]butilo. A continuación se representan ejemplos.
Los métodos de síntesis de un reactivo de sulfurización deseado se describen en el presente documento y en la sección de ejemplos.
Como se observa anteriormente, en algunas realizaciones, la sulfurización ocurre en condiciones que escinden el reactivo quiral del oligonucleótido en crecimiento. En algunas realizaciones, la sulfurización ocurre en condiciones que no escinden el reactivo quiral del oligonucleótido en crecimiento.
En algunas realizaciones, un reactivo de sulfurización se disuelve en un disolvente adecuado y se suministra a la columna. En ciertas realizaciones, el disolvente es un disolvente aprótico polar, tal como un disolvente de nitrilo. En algunas realizaciones, el disolvente es acetonitrilo. En algunas realizaciones, una disolución del reactivo de sulfurización se prepara mezclando un reactivo de sulfurización (por ejemplo, un derivado de tiosulfonato como se describe en el presente documento) con BSTFA (N,O-bis-trimetilsilil-trifluoroacetamida) en un disolvente de nitrilo (por ejemplo, acetonitrilo). En algunas realizaciones, la BSTFA no se incluye. Por ejemplo, los presentes inventores han encontrado que reactivos de sulfurización relativamente más reactivos de la fórmula general Rs2-S-S(O)2-Rs3 pueden participar frecuentemente satisfactoriamente en las reacciones de sulfurización en ausencia de BSTFA. Solo para dar un ejemplo, los inventores han demostrado que donde Rs2 es p-nitrofenilo y Rs3 es metilo, entonces no se requiere BSTFA. En vista de la presente divulgación, los expertos en la técnica serán fácilmente capaces de determinar otras situaciones y/o reactivos de sulfurización que no requieren BSTFA.
En algunas realizaciones, la etapa de sulfurización se realiza a temperatura ambiente. En algunas realizaciones, la etapa de sulfurización se realiza a temperaturas más bajas, tales como aproximadamente 0 °C, aproximadamente 5 °C, aproximadamente 10 °C, o aproximadamente 15 °C. En algunas realizaciones, la etapa de sulfurización se realiza a temperaturas elevadas superiores a aproximadamente el 20 °C.
En algunas realizaciones, una reacción de sulfurización se realiza durante aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 120 minutos. En algunas realizaciones, una reacción de sulfurización se realiza durante aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 90 minutos. En algunas realizaciones, una reacción de sulfurización se realiza durante aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 60 minutos. En algunas realizaciones, una reacción de sulfurización se realiza durante aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 30 minutos. En algunas realizaciones, una reacción de sulfurización se realiza durante aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 25 minutos. En algunas realizaciones, una reacción de sulfurización se realiza durante aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 20 minutos. En algunas realizaciones, una reacción de sulfurización se realiza durante aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 15 minutos. En algunas realizaciones, una reacción de sulfurización se realiza durante aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 10 minutos. En algunas realizaciones, una reacción de sulfurización se realiza durante aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 60 minutos.
En algunas realizaciones, una reacción de sulfurización se realiza durante aproximadamente 5 minutos . En algunas realizaciones, una reacción de sulfurización se realiza durante aproximadamente 10 minutos. En algunas realizaciones, una reacción de sulfurización se realiza durante aproximadamente 15 minutos. En algunas realizaciones, una reacción de sulfurización se realiza durante aproximadamente 20 minutos. En algunas realizaciones, una reacción de sulfurización se realiza durante aproximadamente 25 minutos. En algunas realizaciones, una reacción de sulfurización se realiza durante aproximadamente 30 minutos. En algunas realizaciones, una reacción de sulfurización se realiza durante aproximadamente 35 minutos. En algunas realizaciones, una reacción de sulfurización se realiza durante aproximadamente 40 minutos. En algunas realizaciones, una reacción de sulfurización se realiza durante aproximadamente 45 minutos. En algunas realizaciones, una reacción de sulfurización se realiza durante aproximadamente 50 minutos. En algunas realizaciones, una reacción de sulfurización se realiza durante aproximadamente 55 minutos. En algunas realizaciones, una reacción de sulfurización se realiza durante aproximadamente 60 minutos.
Se descubrió inesperadamente que ciertos de los productos de modificación de la sulfurización preparados según los métodos de la presente invención son inesperadamente estable. En algunas realizaciones, los productos inesperadamente estables son los triésteres de fosforotioato. En algunas realizaciones, los productos inesperadamente estables son los oligonucleótidos quiralmente controlados que comprenden uno o más enlaces internucleotídicos que tienen la estructura de la fórmula I-c.
Un experto de las técnicas relevantes reconocerá que los métodos de sulfurización descritos en el presente documento y los reactivos de sulfurización descritos en el presente documento también son útiles en el contexto de la modificación de los oligonucleótidos de H-fosfonato, tales como los descritos en Wada II (documento de patente WO2010/064146).
En algunas realizaciones, la reacción de sulfurización tiene una eficiencia de sulfurización escalonada que es al menos aproximadamente el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 % o 98 %. En algunas realizaciones, la reacción de sulfurización proporciona una composición de producto de dinucleótido en bruto que es al menos del 98 %. En algunas realizaciones, la reacción de sulfurización proporciona una composición de producto de dinucleótido en bruto que es al menos del 90 %. En algunas realizaciones, la reacción de sulfurización proporciona una composición de producto de dinucleótido en bruto que es al menos del 70 %. En algunas realizaciones, la reacción de sulfurización proporciona una composición de producto de dinucleótido en bruto que es al menos del 50 %.
Una vez ha finalizado la etapa de modificación del fósforo del enlace, el oligonucleótido se somete a otra etapa de desbloqueo en preparación para volver a entrar en el ciclo. En algunas realizaciones, un auxiliar quiral sigue intacto después de la sulfurización y se desbloquea durante la posterior etapa de desbloqueo, que ocurre necesariamente antes de volver a entrar en el ciclo. El proceso de desbloqueo, acoplamiento, terminación y modificación se repiten hasta que el oligonucleótido en crecimiento alcance una longitud deseada, momento en el que el oligonucleótido puede o ser inmediatamente escindido del soporte sólido o dejado unido al soporte para fines de purificación y después se escinde. En algunas realizaciones, uno o más grupos protectores están presentes en una o más de las bases de nucleótidos, y la escisión del oligonucleótido del soporte y la desprotección de las bases ocurre en una única etapa. En algunas realizaciones, uno o más de los grupos protectores están presentes en una o más de las bases de nucleótidos, y la escisión del oligonucleótido del soporte y desprotección de las bases ocurre en más de una etapa. En algunas realizaciones, la desprotección y escisión del soporte ocurre en condiciones básicas usando, por ejemplo, una o más bases de amina. En ciertas realizaciones, la una o más bases de amina comprende propilamina. En ciertas realizaciones, la una o más bases de amina comprende piridina.
En algunas realizaciones, la escisión del soporte y/o la desprotección ocurre a temperaturas elevadas de aproximadamente 30 °C a aproximadamente 90 °C. En algunas realizaciones, la escisión del soporte y/o la desprotección ocurre a temperaturas elevadas de aproximadamente 40 °C a aproximadamente 80 °C. En algunas realizaciones, la escisión del soporte y/o la desprotección ocurre a temperaturas elevadas de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 70 °C. En algunas realizaciones, la escisión del soporte y/o la desprotección ocurre a temperaturas elevadas de aproximadamente 60 °C. En algunas realizaciones, la escisión del soporte y/o la desprotección ocurre a temperatura ambientes.
Los procedimientos de purificación a modo de ejemplo se describen en el presente documento y/o se conocen, en general, en las técnicas relevantes.
Es de notar que la retirada del auxiliar quiral del oligonucleótido en crecimiento durante cada ciclo es beneficiosa por al menos los motivos de que (1) el auxiliar no se tendrá que retirar en una etapa separada al final de la síntesis de oligonucleótidos cuando grupos funcionales potencialmente sensibles se instalen en el fósforo; y (2) se evitan productos intermedios auxiliares de fósforo inestables propensos a ser sometidos a reacciones laterales y/o a interferir con la química posterior. Por lo tanto, la retirada del auxiliar quiral durante cada ciclo hace más eficiente la síntesis global.
Aunque la etapa de desbloqueo en el contexto del ciclo se describe anteriormente, a continuación se incluyen métodos generales adicionales.
Etapa de desbloqueo
En algunas realizaciones, la etapa de acoplamiento va precedida por una etapa de desbloqueo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el grupo hidroxilo en 5' del oligonucleótido en crecimiento se bloquea (es decir, se protege) y debe ser desbloqueado para reaccionar posteriormente con un componente de acoplamiento de nucleósido.
En algunas realizaciones, se usa acidificación para retirar un grupo de bloqueo. En algunas realizaciones, el ácido es ácido de Bronsted o ácido de Lewis. Los ácidos de Bronsted útiles son ácidos carboxílicos, ácidos alquilsulfónicos, ácidos arilsulfónicos, ácido fosfórico y sus derivados, ácido fosfónico y sus derivados, ácidos alquilfosfónicos y sus derivados, ácidos arilfosfónicos y sus derivados, ácido fosfónico, ácidos dialquilfosfínicos y ácidos diarilfosfínico que tiene un valor de pKa (25 °C en agua) de -0,6 (ácido trifluoroacético) a 4,76 (ácido acético) en un disolvente orgánico o agua (en el caso de 80 % de ácido acético). La concentración del ácido (1 a 80 %) usada en la etapa de acidificación depende de la acidez del ácido. Se debe tener en cuenta la consideración de la concentración del ácido ya que las condiciones de ácido fuerte producirán despurinación/despirimidinación, en donde las bases de purinilo o pirimidinilo se escinden del anillo de ribosa y u otro anillo de azúcar. En algunas realizaciones, un ácido se selecciona de Ra1COOH, Ra1SO3H, Ra3SO3H,
o
Ra10-P -0H
ORa2
O o
Ra1—P-OH Ra1-P -O H
ORa2 o Ra2 5
en donde cada uno de Ra1 y Ra2 es independientemente hidrógeno o un alquilo o arilo opcionalmente sustituido, y Ra3 es un alquilo o arilo opcionalmente sustituido.
En algunas realizaciones, la acidificación se lleva a cabo por un ácido de Lewis en un disolvente orgánico. A modo de ejemplo, dichos ácidos de Lewis útiles son Zn(Xa)2 en donde Xa es Cl, Br, I, o CF3SO3.
En algunas realizaciones, la etapa de acidificación comprende añadir una cantidad de un ácido de Bronsted o de Lewis eficaz para retirar un grupo de bloqueo sin retirar los restos de purina del producto intermedio condensado.
Los ácidos que son útiles en la etapa de acidificación también incluyen, pero no se limitan a, 10 % de ácido fosfórico en un disolvente orgánico, 10 % de ácido clorhídrico en un disolvente orgánico, 1 % de ácido trifluoroacético en un disolvente orgánico, 3 % de ácido dicloroacético o ácido tricloroacético en un disolvente orgánico u 80 % de ácido acético en agua. La concentración de cualquier ácido de Bronsted o de Lewis usada en esta etapa se selecciona de forma que la concentración del ácido no supere una concentración que provoque la escisión de una nucleobase de un resto de azúcar.
En algunas realizaciones, la acidificación comprende añadir 1 % de ácido trifluoroacético en un disolvente orgánico. En algunas realizaciones, la acidificación comprende añadir aproximadamente 0,1 % a aproximadamente 8 % de ácido trifluoroacético en un disolvente orgánico. En algunas realizaciones, la acidificación comprende añadir 3 % de ácido dicloroacético o ácido tricloroacético en un disolvente orgánico. En algunas realizaciones, la acidificación comprende añadir aproximadamente 0,1 % a aproximadamente 10 % de ácido dicloroacético o ácido tricloroacético en un disolvente orgánico. En algunas realizaciones, la acidificación comprende añadir 3 % de ácido tricloroacético en un disolvente orgánico. En algunas realizaciones, la acidificación comprende añadir aproximadamente 0,1 % a aproximadamente 10 % de ácido tricloroacético en un disolvente orgánico. En algunas realizaciones, la acidificación comprende añadir 80 % de ácido acético en agua. En algunas realizaciones, la acidificación comprende añadir aproximadamente 50 % a aproximadamente 90 %, o aproximadamente 50 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 % a aproximadamente 90 % de ácido acético en agua. En algunas realizaciones, la acidificación comprende la adición adicional de secuestrantes de cationes a un ácido disolvente. En ciertas realizaciones, los secuestrantes de cationes pueden ser trietilsilano o triisopropilsilano. En algunas realizaciones, un grupo de bloqueo se desbloquea por acidificación, que comprende añadir 1 % de ácido trifluoroacético en un disolvente orgánico. En algunas realizaciones, un grupo de bloqueo se desbloquea por acidificación, que comprende añadir 3 % de ácido dicloroacético en un disolvente orgánico. En algunas realizaciones, un grupo de bloqueo se desbloquea por acidificación, que comprende añadir 3 % de ácido tricloroacético en un disolvente orgánico. En algunas realizaciones, un grupo de bloqueo se desbloquea por acidificación, que comprende añadir 3 % de ácido tricloroacético en diclorometano.
En ciertas realizaciones, los métodos de la presente invención se completan en un sintetizador y la etapa de desbloqueo del grupo hidroxilo del oligonucleótido en crecimiento comprende suministrar una cantidad de disolvente a la columna del sintetizador, columna que contiene un soporte sólido al que está unido el oligonucleótido. En algunas realizaciones, el disolvente es un disolvente halogenado (por ejemplo, diclorometano). En ciertas realizaciones, el disolvente comprende una cantidad de un ácido. En algunas realizaciones, el disolvente comprende una cantidad de un ácido orgánico tal como, por ejemplo, ácido tricloroacético. En ciertas realizaciones, el ácido está presente en una cantidad de aproximadamente 1 % a aproximadamente 20 % p/v. En ciertas realizaciones, el ácido está presente en una cantidad de aproximadamente 1 % a aproximadamente 10 % p/v. En ciertas realizaciones, el ácido está presente en una cantidad de aproximadamente 1 % a aproximadamente 5 % p/v. En ciertas realizaciones, el ácido está presente en una cantidad de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 % p/v. En ciertas realizaciones, el ácido está presente en una cantidad de aproximadamente 3 % peso/volumen. Los métodos de desbloqueo de un grupo hidroxilo se describen más en el presente documento. En algunas realizaciones, el ácido que está presente en 3 % p/v es diclorometano.
En algunas realizaciones, el auxiliar quiral se retira antes de la etapa de desbloqueo. En algunas realizaciones, el auxiliar quiral se retira durante la etapa de desbloqueo.
En algunas realizaciones, la salida del ciclo se realiza antes de la etapa de desbloqueo. En algunas realizaciones, la salida del ciclo se realiza después de la etapa de desbloqueo.
Condiciones generales para la retirada de grupos de bloqueo/grupos protectores
Los grupos funcionales, tales como restos hidroxilo o amino, que se localizan en nucleobases o restos de azúcar se bloquean rutinariamente con grupos (restos) de bloqueo (protectores) durante la síntesis y posteriormente se desbloquean. En general, un grupo de bloqueo convierte una funcionalidad química de una molécula inerte en condiciones de reacción específicas y después se puede retirar de dicha funcionalidad en una molécula sin dañar sustancialmente el resto de la molécula (véase, por ejemplo, Green and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2a ed., John Wiley & Sons, New York, 1991). Por ejemplo, los grupos amino se pueden bloquear con grupos de bloqueo de nitrógeno, tales como ftalimido, 9-fludrenilmetoxicarbonilo (FMOC), trifenilmetilsulfenilo, f-BOC, 4,4'-dimetoxitritilo (DMTr), 4-metoxitritilo (MMTr), 9-fenilxantin-9-ilo (Pixyl), tritilo (Tr), o 9-(p-metoxifenil)xanthin-9-ilo (MOX). Los grupos carboxilo se pueden proteger como grupos acetilo. Los grupos hidroxi se pueden proteger, tales como tetrahidropiranilo (THP), f-butildimetilsililo (TBDMS), 1-[(2-cloro-4-metil)fenil]-4-metoxipiperidin-4-ilo (Ctmp), 1-(2-fluorofenil)-4-metoxipiperidin-4-ilo (Fpmp), 1-(2-cloroetoxi)etilo, 3-metoxi-1,5-dicarbometoxipentan-3-ilo (MDP), bis(2-acetoxietoxi)metilo (ACE), triisopropilsililoximetilo (TOM), 1-(2-cianoetoxi)etilo (CEE), 2-cianoetoximetilo (CEM), [4-(W-dicloroacetil-W-metilamino)benciloxi]metilo, 2-cianoetilo (CN), pivaloiloximetilo (PivOM), levuniloximetilo (ALE). Se han descrito otros grupos de bloqueo de hidroxilo representativos (véase, por ejemplo, Beaucage et al., Tetrahedron, 1992, 46, 2223). En algunas realizaciones, los grupos de bloqueo de hidroxilo son grupos lábiles al ácido, tales como tritilo, monometoxitritilo, dimetoxitritilo, trimetoxitritilo, 9-fenilxantin-9-ilo (Pixyl) y 9-(p-metoxifenil)xantin-9-ilo (MOX). Los grupos funcionales químicos también se pueden bloquear incluyéndolos en una forma de precursor. Por lo tanto, un grupo azido se puede considerar una forma de bloqueo de una amina ya que el grupo azido se convierte fácilmente en la amina. Se conocen grupos protectores representativos adicionales utilizados en la síntesis de ácidos nucleicos (véase, por ejemplo, Agrawal et al., Protocols for Oligonucleotide Conjugates, Eds., Humana Press, New Jersey, 1994, Vol. 26, pp. 1-72).
Se conocen y usan diversos métodos para la retirada de grupos de bloqueo de ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, se retiran todos los grupos de bloqueo. En algunas realizaciones, se retira una porción de los grupos de bloqueo. En algunas realizaciones, se pueden ajustar las condiciones de reacción para retirar selectivamente ciertos grupos de bloqueo.
En algunas realizaciones, los grupos de bloqueo de nucleobases, si están presentes, son escindibles con un reactivo ácido después del ensamblaje de un oligonucleótido proporcionado. En alguna realización, los grupos de bloqueo de nucleobases, si están presentes, son escindibles en condiciones ni ácidas ni básicas, por ejemplo, escindibles con sales de fluoruro o complejos de ácido fluorhídrico. En algunas realizaciones, los grupos de bloqueo de nucleobases, si están presentes, son escindible en presencia de base o un disolvente básico después del ensamblaje de un oligonucleótido proporcionado. En ciertas realizaciones, uno o más de los grupos de bloqueo de nucleobases se caracterizan porque son escindibles en presencia de base o un disolvente básico después del ensamblaje de un oligonucleótido proporcionado, pero son estables a las condiciones particulares de una o más etapas de desprotección tempranas que ocurren durante el ensamblaje del oligonucleótido proporcionado.
En algunas realizaciones, no se requieren grupos de bloqueo para las nucleobases. En algunas realizaciones, se requieren grupos de bloqueo para las nucleobases. En algunas realizaciones, ciertas nucleobases requieren uno o más grupo de bloqueos mientras que otras nucleobases no requieren uno o más grupos de bloqueo.
En algunas realizaciones, el oligonucleótido se escinde del soporte sólido después de la síntesis. En algunas realizaciones, la escisión del soporte sólido comprende el uso de propilamina. En algunas realizaciones, la escisión del soporte sólido comprende el uso de propilamina en piridina. En algunas realizaciones, la escisión del soporte sólido comprende el uso de 20 % de propilamina en piridina. En algunas realizaciones, la escisión del soporte sólido comprende el uso de propilamina en piridina anhidra. En algunas realizaciones, la escisión del soporte sólido comprende el uso de 20 % de propilamina en piridina anhidra. En algunas realizaciones, la escisión del soporte sólido comprende uso de un disolvente aprótico polar, tal como acetonitrilo, NMP, DMSO, sulfona y/o lutidina. En algunas realizaciones, la escisión del soporte sólido comprende el uso de disolvente, por ejemplo, un disolvente aprótico polar, y una o más aminas primarias (por ejemplo, una amina C1-10), y/o uno o más de metoxilamina, hidracina y amoniaco anhidro puro.
En algunas realizaciones, la desprotección del oligonucleótido comprende el uso de propilamina. En algunas realizaciones, la desprotección del oligonucleótido comprende el uso de propilamina en piridina. En algunas realizaciones, la desprotección del oligonucleótido comprende el uso de 20 % de propilamina en piridina. En algunas realizaciones, la desprotección del oligonucleótido comprende el uso de propilamina en piridina anhidra. En algunas realizaciones, la desprotección del oligonucleótido comprende el uso de 20 % de propilamina en piridina anhidra.
En algunas realizaciones, el oligonucleótido se desprotege durante la escisión.
En algunas realizaciones, la escisión del oligonucleótido del soporte sólido, o la desprotección del oligonucleótido, se realiza a aproximadamente temperatura ambiente. En algunas realizaciones, la escisión del oligonucleótido del soporte sólido, o la desprotección del oligonucleótido, se realiza a temperatura elevada. En algunas realizaciones, la escisión del oligonucleótido del soporte sólido, o la desprotección del oligonucleótido, se realiza a por encima de aproximadamente 30 °C, 40 °C, 50 °C, 60 °C, 70°C, 80 °C 90 °C o 100 °C. En algunas realizaciones, la escisión del oligonucleótido del soporte sólido, o la desprotección del oligonucleótido, se realiza a aproximadamente 30 °C, 40 °C, 50 °C, 60 °C, 70°C, 80 °C 90 °C o 100 °C. En algunas realizaciones, la escisión del oligonucleótido del soporte sólido, o la desprotección del oligonucleótido, se realiza a aproximadamente 40-80 °C. En algunas realizaciones, la escisión del oligonucleótido del soporte sólido, o la desprotección del oligonucleótido, se realiza a aproximadamente 50-70 °C. En algunas realizaciones, la escisión del oligonucleótido del soporte sólido, o la desprotección del oligonucleótido, se realiza a aproximadamente 60 °C.
En algunas realizaciones, la escisión del oligonucleótido del soporte sólido, o la desprotección del oligonucleótido, se realiza durante más de 0,1 h, 1 h, 2 h, 5 h, 10 h, 15 h, 20 h, 24 h, 30 h o 40 h. En algunas realizaciones, la escisión del oligonucleótido del soporte sólido, o la desprotección del oligonucleótido, se realiza durante aproximadamente 0,1-5 h. En algunas realizaciones, la escisión del oligonucleótido del soporte sólido, o la desprotección del oligonucleótido, se realiza durante aproximadamente 3-10 h. En algunas realizaciones, la escisión del oligonucleótido del soporte sólido, o la desprotección del oligonucleótido, se realiza durante aproximadamente 5-15 h. En algunas realizaciones, la escisión del oligonucleótido del soporte sólido, o la desprotección del oligonucleótido, se realiza durante aproximadamente 10-20 h. En algunas realizaciones, la escisión del oligonucleótido del soporte sólido, o la desprotección del oligonucleótido, se realiza durante aproximadamente 15-25 h. En algunas realizaciones, la escisión del oligonucleótido del soporte sólido, o la desprotección del oligonucleótido, se realiza durante aproximadamente 20­ 40 h. En algunas realizaciones, la escisión del oligonucleótido del soporte sólido, o la desprotección del oligonucleótido, se realiza durante aproximadamente 2 h. En algunas realizaciones, la escisión del oligonucleótido del soporte sólido, o la desprotección del oligonucleótido, se realiza durante aproximadamente 5 h. En algunas realizaciones, la escisión del oligonucleótido del soporte sólido, o la desprotección del oligonucleótido, se realiza durante aproximadamente 10 h. En algunas realizaciones, la escisión del oligonucleótido del soporte sólido, o la desprotección del oligonucleótido, se realiza durante aproximadamente 15 h. En algunas realizaciones, la escisión del oligonucleótido del soporte sólido, o la desprotección del oligonucleótido, se realiza durante aproximadamente 18 h. En algunas realizaciones, la escisión del oligonucleótido del soporte sólido, o la desprotección del oligonucleótido, se realiza durante aproximadamente 24 h.
En algunas realizaciones, la escisión del oligonucleótido del soporte sólido, o la desprotección del oligonucleótido, se realiza a temperatura ambiente durante más de 0,1 h, 1 h, 2 h, 5 h, 10 h, 15 h, 20 h, 24 h, 30 h o 40 h. En algunas realizaciones, la escisión del oligonucleótido del soporte sólido, o la desprotección del oligonucleótido, se realiza a temperatura ambiente durante aproximadamente 5-48 h. En algunas realizaciones, la escisión del oligonucleótido del soporte sólido, o la desprotección del oligonucleótido, se realiza a temperatura ambiente durante aproximadamente 10-24 h. En algunas realizaciones, la escisión del oligonucleótido del soporte sólido, o la desprotección del oligonucleótido, se realiza a temperatura ambiente durante aproximadamente 18 h. En algunas realizaciones, la escisión del oligonucleótido del soporte sólido, o la desprotección del oligonucleótido, se realiza a temperatura elevada durante más de 0,1 h, 1 h, 2 h, 5 h, 10 h, 15 h, 20 h, 24 h, 30 h o 40 h. En algunas realizaciones, la escisión del oligonucleótido del soporte sólido, o la desprotección del oligonucleótido, se realiza a temperatura elevada durante aproximadamente 0,5-5 h. En algunas realizaciones, la escisión del oligonucleótido del soporte sólido, o la desprotección del oligonucleótido, se realiza a aproximadamente 60 °C durante aproximadamente 0,5-5 h. En algunas realizaciones, la escisión del oligonucleótido del soporte sólido, o la desprotección del oligonucleótido, se realiza a aproximadamente 60 °C durante aproximadamente 2 h.
En algunas realizaciones, la escisión del oligonucleótido del soporte sólido, o la desprotección del oligonucleótido comprende el uso de propilamina y se realiza a temperatura ambiente o temperatura elevada durante más de 0,1 h, 1 h, 2 h, 5 h, 10 h, 15 h, 20 h, 24 h, 30 h o 40 h. Las condiciones a modo de ejemplo son 20 % de propilamina en piridina a temperatura ambiente durante aproximadamente 18 h, y 20 % de propilamina en piridina a 60 °C durante aproximadamente 18 h.
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona métodos de preparación de un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende las etapas de:
(1) acoplamiento;
(2) terminación;
(3) modificación;
(4) desbloqueo; y
(5) repetición de las etapas (1) -(4) hasta que se logra una longitud deseada;
en donde el oligonucleótido quiralmente controlado comprende al menos un enlace de diéster de fosforotioato o al menos un enlace internucleotídico que tiene la estructura de la fórmula I-c.
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona métodos de preparación de un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende las etapas de:
(1) acoplamiento;
(2) terminación;
(3) modificación;
(4) desbloqueo; y
(5) repetición de las etapas (1) -(4) hasta que se logra una longitud deseada;
en donde:
al menos un ciclo de (1) a (4) forma un enlace de diéster de fosforotioato.
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona métodos de preparación de un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende las etapas de:
(1) acoplamiento;
(2) terminación;
(3) modificación;
(4) desbloqueo; y
(5) repetición de las etapas (1) -(4) hasta que se logra una longitud deseada;
en donde:
al menos un ciclo de (1) a (4) forma un enlace internucleotídico que tiene la estructura de la fórmula I-c.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona métodos de preparación de un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende las etapas de:
(1) acoplamiento;
(2) terminación;
(3) modificación;
(4) desbloqueo; y
(5) repetición de las etapas (1) -(4) hasta que se logra una longitud deseada;
en donde:
la etapa de acoplamiento comprende el uso de un grupo de activación y
o
Figure imgf000176_0001
en donde BPRO es una nucleobase protegida;
comprendiendo la etapa de terminación la terminación del grupo amino en el auxiliar quiral y la terminación de 5'-OH sin reaccionar;
comprendiendo la etapa de modificación la instalación del grupo -S-L-R1 al fósforo de enlace, en donde cada uno de L y R1 es independientemente como se ha definido anteriormente y descrito en el presente documento; comprendiendo la etapa de desbloqueo el uso de un ácido.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona métodos de preparación de un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende las etapas de:
(1) acoplamiento;
(2) terminación;
(3) modificación;
(4) desbloqueo; y
(5) repetición de las etapas (1) -(4) hasta que se logra una longitud deseada;
en donde:
la etapa de acoplamiento comprende el uso de CMPT y
Figure imgf000177_0001
en donde BPRO es una nucleobase protegida;
comprendiendo la etapa de terminación la terminación del grupo amino en el auxiliar quiral y la terminación de 5'-OH sin reaccionar;
comprendiendo la etapa de modificación la instalación del grupo -S-L-R1 con el fósforo de enlace, en donde cada uno de L y R1 es independientemente como se ha definido anteriormente y descrito en el presente documento; comprendiendo la etapa de desbloqueo el uso de un ácido.
En algunas realizaciones, un activador es un activador de "Wada", es decir, el activador es de uno cualquiera de los documentos de Wada I, II o III citados anteriormente.
Los grupos activadores a modo de ejemplo se representan a continuación:
Figure imgf000178_0002
Figure imgf000178_0003
Un ciclo a modo de ejemplo se representa en el Esquema I-b.
Esquema I-b. Instalación de enlaces de fosforotioato
Figure imgf000178_0001
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona métodos de preparación de un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende las etapas de:
(1) acoplamiento;
(2) terminación;
(3) modificación;
(4) desbloqueo; y
(5) repetición de las etapas (1) -(4) hasta que se logra una longitud deseada;
en donde:
el oligonucleótido quiralmente controlado comprende al menos un enlace de diéster de fosforotioato o al menos un enlace internucleotídico de la fórmula I-c, y al menos un enlace internucleotídico de diéster de fosfato; y al menos una etapa de modificación está sustituida por una etapa de oxidación.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona métodos de preparación de un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende las etapas de:
(1) acoplamiento;
(2) terminación;
(3) modificación;
(4) desbloqueo; y
(5) repetición de las etapas (1) -(4) hasta que se logra una longitud deseada;
en donde:
el oligonucleótido quiralmente controlado comprende al menos un enlace de diéster de fosforotioato o al menos un enlace internucleotídico de la fórmula I-c, y al menos un enlace internucleotídico de diéster de fosfato; y al menos una etapa de modificación está sustituida por una etapa de oxidación que comprende el uso de I2. Un ciclo a modo de ejemplo se ilustra en el Esquema I-c.
Esquema I-c. Instalación de tanto enlaces diéster de fosfato como internucleotídicos modificados
en un oligonucleótido quiralmente controlado.
Figure imgf000180_0001
En el Esquema I-c, el oligonucleótido (o nucleótido, u oligonucleótido con enlace internucleotídico modificado) en el soporte sólido (C-1) se acopla con fosforamidito C-2. Después del acoplamiento y la terminación, se realiza una etapa de oxidación. Después del desbloqueo, se forma un enlace diéster de fosfato. El producto del ciclo C-3 puede o volver a entrar en el ciclo C para instalar más enlaces diéster de fosfato, o entrar en otros ciclos para instalar otros tipos de enlaces internucleotídicos, o ir a la salida del ciclo.
En algunas realizaciones, se puede usar fosforamidito no quiralmente puro en lugar de C-2 en el Esquema I-c. En algunas realizaciones, se usan p-cianoetilfosforamiditos protegidos con DMTr. En algunas realizaciones, el fosforamidito que se usa tiene la estructura de
Figure imgf000180_0002
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona métodos de preparación de un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende las etapas de:
(1) acoplamiento;
(2) terminación;
(3) modificación;
(4) desbloqueo; y
(5) repetición de las etapas (1) -(4) hasta que se logra una longitud deseada;
en donde:
el oligonucleótido quiralmente controlado comprende uno o más enlaces de diéster de fosforotioato; y uno o más precursores de diéster de fosforotioato se forman para cada uno del enlace de diéster de fosforotioato correspondiente.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona métodos de preparación de un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende las etapas de:
(1) acoplamiento;
(2) terminación;
(3) modificación;
(4) desbloqueo; y
(5) repetición de las etapas (1) -(4) hasta que se logra una longitud deseada;
en donde:
el oligonucleótido quiralmente controlado comprende al menos un enlace de diéster de fosforotioato; uno o más precursores de diéster de fosforotioato se forman para cada uno del enlace de diéster de fosforotioato correspondiente; y
cada precursor de diéster de fosforotioato se convierte en un enlace de diéster de fosforotioato después de que se logre la longitud deseada.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona métodos de preparación de un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende las etapas de:
(1) acoplamiento;
(2) terminación;
(3) modificación;
(4) desbloqueo; y
(5) repetición de las etapas (1) -(4) hasta que se logra una longitud deseada;
en donde:
el oligonucleótido quiralmente controlado comprende al menos un enlace de diéster de fosforotioato y al menos un enlace internucleotídico de diéster de fosfato;
al menos una etapa de modificación se sustituye por una etapa de oxidación; y
al menos una etapa de modificación se realiza para instalar un precursor de diéster de fosforotioato para cada uno de los enlaces de diéster de fosforotioato; y
cada precursor de diéster de fosforotioato se convierte en un enlace de diéster de fosforotioato después de que se logre la longitud deseada.
En algunas realizaciones, el uso de un precursor de diéster de fosforotioato aumenta la estabilidad del oligonucleótido durante la síntesis. En algunas realizaciones, el uso de un precursor de diéster de fosforotioato mejora la eficiencia de la síntesis de oligonucleótidos quiralmente controlados. En algunas realizaciones, el uso de un precursor de diéster de fosforotioato mejora el rendimiento de la síntesis de oligonucleótidos quiralmente controlados. En algunas realizaciones, el uso de un precursor de diéster de fosforotioato mejora la pureza de productos de la síntesis de oligonucleótidos quiralmente controlados.
En algunas realizaciones, el precursor de diéster de fosforotioato en los métodos anteriormente mencionados es
Figure imgf000182_0001
En algunas realizaciones,
Figure imgf000182_0002
se convierte en un enlace diéster de fosforotioato durante la desprotección/liberación. Un ciclo a modo de ejemplo se representa en el Esquema I-d. Más ejemplos se representan a continuación.
Esquema I-d Precursor de diéster de fosforotioato en la síntesis de oligonucleótidos quiralmente controlados.
Figure imgf000182_0003
Como se ilustra en el Esquema I-d, tanto los enlaces diéster de fosforotioato como de fosfato se pueden incorporar en el mismo oligonucleótido quiralmente controlado. Como entiende un experto habitual en la técnica, los métodos proporcionados no requieren que el diéster de fosforotioato y el diéster de fosfato sean consecutivos - se pueden formar otros enlaces internucleotídicos entre ellos usando un ciclo como se ha descrito anteriormente. En el Esquema I-d, los precursores de diéster de fosforotioato,
Figure imgf000183_0001
se instalan en lugar de los enlaces diéster de fosforotioato. En algunas realizaciones, dicha sustitución proporcionada aumentó la eficiencia de síntesis durante ciertas etapas, por ejemplo, la etapa de oxidación. En algunas realizaciones, el uso de precursores de diéster de fosforotioato mejora, en general, la estabilidad de oligonucleótidos quiralmente controlados durante la síntesis y/o el almacenamiento. Después de la salida del ciclo, durante la desprotección/liberación, el precursor de diéster de fosforotioato se convierte en el enlace diéster de fosforotioato. En algunas realizaciones, es beneficioso usar el precursor de diéster de fosforotioato incluso cuando no esté presente enlace diéster de fosfato en el oligonucleótido quiralmente controlado, o no se requiera etapa de oxidación durante la síntesis.
Como en el Esquema I-c, en algunas realizaciones, se puede usar fosforamidito no quiralmente puro para ciclos que comprenden etapas de oxidación. En algunas realizaciones, se usan p-cianoetilfosforamiditos protegidos con DMTr. En algunas realizaciones, el fosforamidito que se usa tiene la estructura de
Figure imgf000183_0002
En algunas realizaciones, los métodos de la presente invención proporcionan composiciones de oligonucleótidos quiralmente controlados que están enriquecidas en un tipo de oligonucleótido particular.
En algunas realizaciones, al menos aproximadamente el 10 % de una composición en bruto proporcionada es de un tipo de oligonucleótido particular. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente el 20 % de una composición en bruto proporcionada es de un tipo de oligonucleótido particular. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente el 30 % de una composición en bruto proporcionada es de un tipo de oligonucleótido particular. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente el 40 % de una composición en bruto proporcionada es de un tipo de oligonucleótido particular. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente el 50 % de una composición en bruto proporcionada es de un tipo de oligonucleótido particular. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente el 60 % de una composición en bruto proporcionada es de un tipo de oligonucleótido particular. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente el 70 % de una composición en bruto proporcionada es de un tipo de oligonucleótido particular. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente el 80 % de una composición en bruto proporcionada es de un tipo de oligonucleótido particular. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente el 90 % de una composición en bruto proporcionada es de un tipo de oligonucleótido particular. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente el 95 % de una composición en bruto proporcionada es de un tipo de oligonucleótido particular.
En algunas realizaciones, al menos aproximadamente el 1 % de una composición proporcionada es de un tipo de oligonucleótido particular. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente el 2 % de una composición proporcionada es de un tipo de oligonucleótido particular. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente el 3 % de una composición proporcionada es de un tipo de oligonucleótido particular. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente el 4 % de una composición proporcionada es de un tipo de oligonucleótido particular. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente el 5 % de una composición proporcionada es de un tipo de oligonucleótido particular. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente el 10 % de una composición proporcionada es de un tipo de oligonucleótido particular. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente el 20 % de una composición proporcionada es de un tipo de oligonucleótido particular. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente el 30 % de una composición proporcionada es de un tipo de oligonucleótido particular. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente el 40 % de una composición proporcionada es de un tipo de oligonucleótido particular. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente el 50 % de una composición proporcionada es de un tipo de oligonucleótido particular. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente el 60 % de una composición proporcionada es de un tipo de oligonucleótido particular. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente el 70 % de una composición proporcionada es de un tipo de oligonucleótido particular. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente el 80 % de una composición proporcionada es de un tipo de oligonucleótido particular. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente el 90 % de una composición proporcionada es de un tipo de oligonucleótido particular. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente el 95 % de una composición proporcionada es de un tipo de oligonucleótido particular.
Aplicaciones biológicas
Como se trata con detalle en el presente documento, el presente método inventivo proporciona, entre otras cosas, una composición de oligonucleótidos quiralmente controlados, que significa que la composición contiene una pluralidad de oligonucleótidos de al menos un tipo. Cada molécula de oligonucleótido de un "tipo" particular comprende elementos estructurales preseleccionados (por ejemplo, predeterminados) con respecto a: (1) secuencia de bases; (2) patrón de enlaces del esqueleto; (3) patrón de centros quirales del esqueleto; y (4) patrón de restos de modificación en P del esqueleto. En algunas realizaciones, las composiciones de oligonucleótidos proporcionados contienen oligonucleótidos que se preparan en un único proceso de síntesis. En algunas realizaciones, las composiciones proporcionadas contienen oligonucleótidos que tienen más de una configuración quiral dentro de una única molécula de oligonucleótido (por ejemplo, donde diferentes restos a lo largo del oligonucleótido tienen diferente estereoquímica); en algunas de dichas realizaciones, dichos oligonucleótidos se pueden obtener en un único proceso de síntesis, sin la necesidad de etapas de conjugación secundaria para generar moléculas de oligonucleótidos individuales con más de una configuración quiral.
Las composiciones de oligonucleótidos como se proporcionan en el presente documento se pueden usar como agentes para modular varios procesos celulares y maquinarias, que incluyen, pero no se limitan a, transcripción, traducción, respuestas inmunitarias, epigenética, etc. Además, las composiciones de oligonucleótidos como se proporcionan en el presente documento se pueden usar como reactivos para fines de investigación y/o de diagnóstico. Un experto habitual en la técnica reconocerá fácilmente que la presente divulgación en el presente documento no se limita a un uso particular, sino que es aplicable a cualquier situación donde se desea el uso de oligonucleótidos sintéticos. Entre otras cosas, las composiciones proporcionadas son útiles en una variedad de aplicaciones terapéuticas, de diagnóstico, agrícolas y/o de investigación.
En algunas realizaciones, las composiciones de oligonucleótidos proporcionadas comprenden oligonucleótidos y/o restos de los mismos que incluyen una o más modificaciones estructurales como se describe en detalle en el presente documento. En algunas realizaciones, las composiciones de oligonucleótidos proporcionadas comprenden oligonucleótidos que contienen uno o más análogos de ácido nucleico. En algunas realizaciones, las composiciones de oligonucleótidos proporcionadas comprenden oligonucleótidos que contienen uno o más ácidos nucleicos o restos artificiales, que incluyen, pero no se limitan a: ácidos nucleicos peptídicos (PNA), morfolino y ácidos nucleicos bloqueados (LNA), ácidos nucleicos de glicol (GNA), ácidos nucleicos treósicos (TNA), ácidos xenonucleicos (ZNA), y cualquier combinación de los mismos.
En cualquiera de las realizaciones, la divulgación es útil para la modulación de la expresión génica basada en oligonucleótidos, respuesta inmunitaria, etc. Por consiguiente, las composiciones de oligonucleótidos estereodefinidas de la divulgación, que contienen oligonucleótidos de tipo predeterminado (es decir, que están controladas quiralmente, y son opcionalmente quiralmente puras), se pueden usar en lugar de los homólogos estereoaleatorios o quiralmente impuros convencionales. En algunas realizaciones, las composiciones proporcionadas muestran efectos previstos potenciados y/o efectos secundarios reducidos no deseados. Ciertas realizaciones de aplicaciones biológicas y clínicas/ terapéuticas de la divulgación se tratan explícitamente a continuación.
Se pueden utilizar diversas pautas posológicas para administrar las composiciones de oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionadas. En algunas realizaciones se administran múltiples dosis unitarias, separadas por periodos de tiempo. En algunas realizaciones, una composición dada tiene una pauta posológica recomendada, que puede implicar a una o más dosis. En algunas realizaciones, una pauta posológica comprende una pluralidad de dosis cada una separada por un periodo de tiempo de la misma longitud; en algunas realizaciones, una pauta posológica comprende una pluralidad de dosis y al menos dos periodos de tiempo diferentes que separan las dosis individuales. En algunas realizaciones, todas las dosis dentro de una pauta posológica son de la misma cantidad de dosis unitaria. En algunas realizaciones, diferentes dosis dentro de una pauta posológica son de diferentes cantidades. En algunas realizaciones, una pauta posológica comprende una primera dosis en una primera cantidad de dosis, seguido por uno o más dosis adicionales en una segunda cantidad de dosis diferente de la primera cantidad de dosis. En algunas realizaciones, una pauta posológica comprende una primera dosis en una primera cantidad de dosis, seguida por una o más dosis adicionales en una segunda (o posterior) cantidad de dosis que es la misma que o diferente de la primera cantidad de dosis (u otra dosis previa). En algunas realizaciones, una pauta posológica comprende administrar al menos una dosis unitaria durante al menos un día. En algunas realizaciones, una pauta posológica comprende administrar más de una dosis durante un periodo de tiempo de al menos un día, y algunas veces más de un día. En algunas realizaciones, una pauta posológica comprende administrar dosis múltiples durante un periodo de tiempo de al menos una semana. En algunas realizaciones, el periodo de tiempo es al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 2324, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 o más (por ejemplo, aproximadamente 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 o más) semanas. En algunas realizaciones, una pauta posológica comprende administrar una dosis por semana durante más de una semana. En algunas realizaciones, una pauta posológica comprende administrar una dosis por semana durante 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 o más (por ejemplo, aproximadamente 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 o más) semanas. En algunas realizaciones, una pauta posológica comprende administrar una dosis cada dos semanas durante un periodo de más de dos semanas. En algunas realizaciones, una pauta posológica comprende administrar una dosis cada dos semanas durante un periodo de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 2324, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 o más (por ejemplo, aproximadamente 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 o más) semanas. En algunas realizaciones, una pauta posológica comprende administrar una dosis por mes durante un mes. En algunas realizaciones, una pauta posológica comprende administrar una dosis por mes durante más de un mes. En algunas realizaciones, una pauta posológica comprende administrar una dosis por mes durante 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más meses. En algunas realizaciones, una pauta posológica comprende administrar una dosis por semana durante aproximadamente 10 semanas. En algunas realizaciones, una pauta posológica comprende administrar una dosis por semana durante aproximadamente 20 semanas. En algunas realizaciones, una pauta posológica comprende administrar una dosis por semana durante aproximadamente 30 semanas. En algunas realizaciones, una pauta posológica comprende administrar una dosis por semana durante 26 semanas. En algunas realizaciones, una composición de oligonucleótidos quiralmente controlados se administra según una pauta posológica que se diferencia de la utilizada para una composición de oligonucleótidos quiralmente no controlados (por ejemplo, estereoaleatorios) de la misma secuencia, y/o de una composición de oligonucleótidos quiralmente controlados diferente de la misma secuencia. En algunas realizaciones, una composición de oligonucleótidos quiralmente controlados se administra según una pauta posológica que se reduce en comparación con la de una composición de oligonucleótidos quiralmente no controlados (por ejemplo, estereoaleatorios) de la misma secuencia en la que se logra un menor nivel de exposición total con respecto a una unidad de tiempo dada, implica uno o más dosis unitarias menores y/o incluye un número más pequeño de dosis durante una unidad de tiempo dada. En algunas realizaciones, una composición de oligonucleótidos quiralmente controlados se administra según una pauta posológica que se extiende durante un periodo de tiempo más largo que el de una composición de oligonucleótidos quiralmente no controlados (por ejemplo, estereoaleatorios) de la misma secuencia Sin desear quedar limitado por teoría, el solicitante observa que en algunas realizaciones, la pauta posológica más corta, y/o los periodos de tiempo más largos entre dosis, pueden ser debidos a estabilidad mejorada, biodisponibilidad y/o eficacia de una composición de oligonucleótidos quiralmente controlados. En algunas realizaciones, una composición de oligonucleótidos quiralmente controlados tiene una pauta posológica más larga en comparación con la composición de oligonucleótidos quiralmente no controlados correspondiente. En algunas realizaciones, una composición de oligonucleótidos quiralmente controlados tiene un periodo de tiempo más corto entre al menos dos dosis en comparación con la composición de oligonucleótidos quiralmente no controlados correspondiente. Sin desear quedar limitado por teoría, el solicitante observa que en algunas realizaciones una pauta posológica más larga, y/o periodos de tiempo más cortos entre dosis, pueden ser debidos a la seguridad mejorada de una composición de oligonucleótidos quiralmente controlados.
Una dosis única puede contener diversas cantidades de un tipo de oligonucleótido quiralmente controlado, como se desee adecuado por la solicitud. En algunas realizaciones, una dosis única contiene aproximadamente 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300 o más (por ejemplo, aproximadamente 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 o más) mg de un tipo de oligonucleótido quiralmente controlado. En algunas realizaciones, una dosis única contiene aproximadamente 1 mg de un tipo de oligonucleótido quiralmente controlado. En algunas realizaciones, una dosis única contiene aproximadamente 5 mg de un tipo de oligonucleótido quiralmente controlado. En algunas realizaciones, una dosis única contiene aproximadamente 10 mg de un tipo de oligonucleótido quiralmente controlado. En algunas realizaciones, una dosis única contiene aproximadamente 15 mg de un tipo de oligonucleótido quiralmente controlado. En algunas realizaciones, una dosis única contiene aproximadamente 20 mg de un tipo de oligonucleótido quiralmente controlado. En algunas realizaciones, una dosis única contiene aproximadamente 50 mg de un tipo de oligonucleótido quiralmente controlado. En algunas realizaciones, una dosis única contiene aproximadamente 100 mg de un tipo de oligonucleótido quiralmente controlado. En algunas realizaciones, una dosis única contiene aproximadamente 150 mg de un tipo de oligonucleótido quiralmente controlado. En algunas realizaciones, una dosis única contiene aproximadamente 200 mg de un tipo de oligonucleótido quiralmente controlado. En algunas realizaciones, una dosis única contiene aproximadamente 250 mg de un tipo de oligonucleótido quiralmente controlado. En algunas realizaciones, una dosis única contiene aproximadamente 300 mg de un tipo de oligonucleótido quiralmente controlado. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado se administra en una cantidad menor en una dosis única, y/o en dosis total, que un oligonucleótido quiralmente no controlado. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado se administra en una cantidad menor en una dosis única, y/o en dosis total, que un oligonucleótido quiralmente no controlados debido a eficacia mejorada. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado se administra en una cantidad más alta en una dosis única, y/o en dosis total, que un oligonucleótido quiralmente no controlado. En algunas realizaciones, un oligonucleótido quiralmente controlado se administra en una cantidad más alta en una dosis única, y/o en dosis total, que un oligonucleótido quiralmente no controlado debido a seguridad mejorada.
Oligonucleótidos biológicamente activos
Una composición de oligonucleótidos proporcionada como se usa en el presente documento puede comprender oligonucleótidos monocatenarios y/o multicatenarios. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos monocatenarios contienen porciones autocomplementarias que se pueden hibridar en condiciones relevantes de manera que, como se usa, incluso oligonucleótidos monocatenarios puedan tener carácter al menos parcialmente bicatenario. En algunas realizaciones, un oligonucleótido incluido en una composición proporcionada es monocatenario, bicatenario o tricatenario. En algunas realizaciones, un oligonucleótido incluido en una composición proporcionada comprende una porción monocatenaria y una porción multicatenaria dentro del oligonucleótido. En algunas realizaciones, como se observa anteriormente, los oligonucleótidos monocatenarios individuales pueden tener regiones bicatenarias y regiones monocatenarias.
En algunas realizaciones, las composiciones proporcionadas incluyen uno o más oligonucleótidos completamente o parcialmente complementarios a la cadena de: genes estructurales, regiones de control y/o terminación de genes, y/o sistemas autorreplicantes, tales como ADN vírico o de plásmido. En algunas realizaciones, las composiciones proporcionadas incluyen uno o más oligonucleótidos que son o actúan de ARNip u otros reactivos de interferencia por ARN (agentes de iARN o agentes de ARNi), ARNhp, oligonucleótidos antisentido, ARN autoescisores, ribozimas, fragmento de los mismos y/o variantes de los mismos (tales como ARNr 23S de peptidil transferasa, RNasa P, intrones de grupo I y grupo II, ribozimas de ramificación GIR1, Leadzyme, ribozimas de horquilla, ribozimas en cabeza de martillo, ribozimas HDV, ribozima CPEB3 de mamífero, ribozimas VS, ribozimas glmS, ribozima CoTC, etc.), microARN, miméticos de microARN, supermir, aptámeros, antimir, antagomir, adaptadores de Ul, oligonucleótidos formadores de tríplex, activadores de ARN, ARN largos no codificantes, ARN cortos no codificantes (por ejemplo, ARNpi), oligonucleótidos inmunomoduladores (tales como oligonucleótidos inmunoestimulantes, oligonucleótidos inmunoinhibidores), GNA, LNA, ENA, PNA, TNA, morfolinos, G-quadruplex (ARN y ADN), oligonucleótidos antivíricos y oligonucleótidos señuelo.
En algunas realizaciones, las composiciones proporcionadas incluyen uno o más oligonucleótidos híbridos (por ejemplo, quiméricos). En el contexto de la presente divulgación, el término "híbrido" se refiere ampliamente a componentes estructurales mixtos de oligonucleótidos. Oligonucleótidos híbridos puede referirse a, por ejemplo, (1) una molécula de oligonucleótido que tiene clases mixtas de nucleótidos, por ejemplo, parte ADN y parte ARN dentro de la única molécula (por ejemplo, ADN-ARN); (2) pares complementarios de ácidos nucleicos de diferentes clases, de forma que el apareamiento de bases de ADN:ARN ocurra o intramolecularmente o intermolecularmente; o ambos; (3) un oligonucleótido con dos o más tipos de enlaces del esqueleto o internucleotídicos.
En algunas realizaciones, las composiciones proporcionadas incluyen uno o más oligonucleótidos que comprenden más de una clase de restos de ácido nucleico dentro de una única molécula. Por ejemplo, en cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, un oligonucleótido puede comprender una porción de ADN y una porción de ARN. En algunas realizaciones, un oligonucleótido puede comprender una porción sin modificar y una porción modificada.
Las composiciones de oligonucleótidos proporcionadas pueden incluir oligonucleótidos que contienen cualquiera de una variedad de modificaciones, por ejemplo como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, las modificaciones particulares se seleccionan, por ejemplo, en vista del uso previsto. En algunas realizaciones, es conveniente modificar una o ambas cadenas de un oligonucleótido bicatenario (o una porción bicatenaria de un oligonucleótido monocatenario). En algunas realizaciones, las dos cadenas (o porciones) incluyen diferentes modificaciones. En algunas realizaciones, las dos cadenas incluyen las mismas modificaciones. Un experto en la técnica apreciará que el grado y el tipo de modificaciones habilitadas por los métodos de la presente invención permiten hacer numerosas permutaciones de modificaciones. Dichas modificaciones a modo de ejemplo se describen en el presente documento y no pretenden ser limitantes.
Interferencia por ARN
Las composiciones de oligonucleótidos proporcionadas son útiles, entre otras cosas, para aplicaciones en interferencia por ARN.
La interferencia por ARN (iARN) se refiere a la inhibición de la expresión génica por moléculas de ARN. Normalmente, estas son moléculas pequeñas de ARN bicatenario. Puesto que la expresión génica controla la mayoría de los procesos celulares, la capacidad para inhibir la expresión génica proporciona una herramienta potencialmente poderosa para modular las condiciones biológicas, que incluye tratar enfermedades humanas y/o animales (por ejemplo, ganado o mascotas). Se han realizado varios estudios para demostrar el uso de iARN en la regulación o el control de la expresión génica asociada a enfermedad. Véanse, por ejemplo: Cullen, K.A., Hall, M.J. & Golosinskiy, A. Ambulatory surgery in the United States, 2006. Natl Health Stat Report 2009; 1-25; Elbashir S, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A, Weber K, Tuschl T. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature 2001; 411: 494-498; Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driveri SE & Mello C. Potent and specific RNA interference by double-stranded RNA in Caenorhadbditis elegans. Nature 1998; 391 (6669):806-811; Gauglitz, G.G., Kortin, H.C., Pavicic, T., Ruzicka, T., & Jeschke, M.G. Hypertrophic scarring and keloids: pathomechanisms and current emerging treatment strategies. Mol Med 2011; 17(1-2): 113-125; Li-Tsang, C.W., Lau, J.C. & Chan, C.C. Prevalence of hypertrophic scar formation and its characteristics among the Chinese population. Burns 2005; 31,610­ 616; Wang H, Ghosh A, Baigude H, Yang C, Qui L, Xia L, et al. Therapeutic gene silencing delivered by a chemically modified sírNa against mutant SOD1 slows AlS progression. Jb C 2008; 283 (23):15845-15852; Weiser, T.G., Regenbogen, S.E., Thompson, K.D., Haynes, A.B., Lipsitz, S.R., Berry, W.R. & Gawande, A.A. An estimation of the global volume of surgery: a modeling strategy based on available data. Lancet 2008; 372(9633):139-44.
El fenómeno de interferencia por ARN fue demostrado inicialmente en C. elegans, en el que la inyección de moléculas de ARNbc inhibieron la expresión génica complementaria. Aunque el uso de ARNip se ha convertido en una herramienta ampliamente usada para regular por disminución la expresión génica, se ha descrito bien la existencia de una vía natural en eucariotas. El origen de ARNip endógeno (o miARN) puede ser transposones, virus, secuencias repetitivas y genes. El proceso de producción de ARNip endógeno eficaz está regulado por tres enzimas. Las ARN polimerasas dependientes de ARN convierten el ARN monocatenario en ARN bicatenario. Alternativamente, las ARN polimerasas dependientes de ADN producen ARNbc por transcripción de repeticiones invertidas de ADN. Las moléculas de ARN grandes resultantes se someten a digestión por ribonucleasa III (Dicer) para producir moléculas de ARNip bicatenarias cortas. Entonces se requieren proteínas Argónaute para la unión de moléculas de ARNip para formar un complejo conocido como RISC (complejo de silenciamiento inducido por ARN). El RISC reconoce un fragmento de ARN bicatenario y separa las cadenas dobles, reteniendo una cadena en el complejo RISC. Los RISC pueden entonces promover el silenciamiento epigenético mediante la metilación de ADN dirigida por ARN o por escisión de ARN diana. Aunque la traducción de proteínas puede ser silenciada considerablemente, el ARNip no elimina normalmente la expresión de una diana de gen completamente. El RISC puede ayudar, por lo tanto, a la cadena guía de ARN a unirse a y destruir su diana de ARN mensajero celular correspondiente. Por lo tanto, la iARN proporciona un método de posible bloqueo de la creación de las proteínas que provocan la enfermedad.
La tecnología de ARNip representa una herramienta molecular útil. El uso de interferencia por ARN para manipular artificialmente la expresión génica estuvo limitado inicialmente por la activación de mecanismos antivíricos celulares. Se ha mostrado que la exposición de células a secuencias más largas de 30 nucleótidos induce la expresión génica de interferón, dando como resultado la degradación de ARN no específica y la reducción de la síntesis de proteínas. Sin embargo, este problema pueden ser evitado diseñando secuencias de ARNip cortas (por ejemplo, 19 a 22 nucleótidos). Los métodos para la administración de ARNip en células incluyen, sin limitación, adición basada en liposomas de ribonucleótidos purificados a los medios o transfección de vectores plasmídicos diseñados para expresar moléculas de ARNip. Los vectores plasmídicos se basan en el uso de dos promotores de la ARN polimerasa III (U6 y HI) para conducir la transcripción de la molécula de ARNip. La secuencia diana (19 a 29 nucleótidos) se pone en una orientación sentido y antisentido con un grupo espaciador pequeño entremedias (ARN de horquilla corta o ARNhc). Una vez transcrito, se forma una estructura de horquilla que podrá ser reconocida y escindida por Dicer. Alternativamente, los dúplex de ARN se pueden transcribir sin estructura de horquillas y procesar directamente por el RISC. Actualmente, existen una variedad de vectores plasmídicos y víricos que utilizan conceptos similares para producir moléculas de ARNip, ARNhc o ARNip monocatenario (ARNip-mc) (véase, por ejemplo, 2012 Cell-150-883 Walt Lima et al. ssRNAi activate RNAi in animals).
En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado o composición de oligonucleótidos es útil como ARNip-mc o ARNip conjugado con GalNAc.
La técnica está familiarizada con ciertas características estructurales que afectan el ARNip como una herramienta. Tras el descubrimiento del ARNip, varios estudios intentaron identificar las características óptimas requeridas para el diseño de ARNip. Algunos de los requisitos incluyen el uso de secuencias más cortas de 30 nucleótidos para evitar la activación de PKR, estabilidad de secuencias en el extremo 5' de la cadena no codificante con respecto al extremo 3' e inserción de un nucleótido protuberante TT. Basándose en estudios como estos, varios algoritmos han sido desarrollados por laboratorios académicos e industriales para predecir las secuencias diana más eficaces para un gen dado. Aunque la mayor parte de estos programas no son perfectos, la probabilidad de obtener una secuencia predicha es superior al diseño de secuencias sin consideración de las características recomendadas. Se puede requerir la síntesis y prueba de múltiples secuencias. El diseño de experimentos de ARNip puede contener algunos posibles obstáculos, por lo tanto, el diseño se debe hacer para incluir controles apropiados y criterios de valoración medibles. Un control negativo puede incluir una secuencia no complementaria con propiedades termodinámicamente similares a las de la secuencia de ARNip eficaz. Cuando se transfecta un vector plasmídico para introducir ARNip o ARNhc, la relación entre lípido y ácido nucleico puede ser igual y el vector de control puede contener una secuencia que se transcribe y procesa intracelularmente. También se puede llevar a cabo la validación del efecto del ARNip midiendo tanto la expresión de ARN como de proteínas.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado como se usa en el presente documento es bicatenario. Normalmente, los oligonucleótidos bicatenarios que comprenden una estructura de dúplex entre 20 y 23, pero específicamente 21, pares de bases han sido alabados como particularmente eficaces en la inducción de interferencia por ARN (Elbashir et al., EMBO 2001, 20:6877-6888). Sin embargo, otros han descubierto que también pueden ser eficaces oligonucleótidos bicatenarios más cortos o más largos.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido bicatenario utilizado según la presente divulgación comprende dos cadenas de oligonucleótidos que son suficientemente complementarias para hibridarse para formar una estructura de dúplex. En algunas realizaciones, una estructura de dúplex tiene entre aproximadamente 12 y aproximadamente 45 pares de bases de longitud. En algunas realizaciones, una estructura de dúplex tiene entre aproximadamente 18 y aproximadamente 25 pares de bases en longitud. En algunas realizaciones, una estructura de dúplex tiene entre aproximadamente 19 y aproximadamente 24 pares de bases en longitud. En algunas realizaciones, una estructura de dúplex tiene entre aproximadamente 19 y aproximadamente 21 pares de bases en longitud. En algunas realizaciones, una estructura de dúplex tiene oligonucleótidos bicatenarios de entre aproximadamente 25 y aproximadamente 30 pares de bases de longitud. En algunas realizaciones, una estructura de dúplex tiene un oligonucleótido bicatenario de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 15 pares de bases de longitud. En algunas realizaciones, un oligonucleótido bicatenario tiene al menos aproximadamente 21 nucleótidos de largo.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido bicatenario utilizado según la presente divulgación comprende una cadena codificante y una cadena no codificante, en donde la cadena no codificante de ARN tiene una región de complementariedad que es complementaria a al menos una parte de una secuencia diana, y la región de dúplex tiene aproximadamente 14 a aproximadamente 30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, una región de complementariedad con la secuencia diana tiene entre aproximadamente 14 y aproximadamente 30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, una región de complementariedad con la secuencia diana tiene entre aproximadamente 18 y aproximadamente 25 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, una región de complementariedad con la secuencia diana tiene entre aproximadamente 19 y aproximadamente 24 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, una región de complementariedad con la secuencia diana tiene aproximadamente 19 a aproximadamente 21 nucleótidos de longitud.
La expresión "cadena no codificante", como se usa en el presente documento, se refiere a un oligonucleótido que es sustancialmente o 100 % complementario a una secuencia diana de interés. La expresión "cadena no codificante" incluye la región antisentido de tanto oligonucleótidos que se forman a partir de dos cadenas separadas, así como oligonucleótidos unimoleculares que son capaces de formar estructuras de tipo horquilla o mancuerna. Los términos "cadena no codificante" y "cadena guía" se usan indistintamente en el presente documento.
La expresión "cadena codificante" se refiere a un oligonucleótido que tiene la misma secuencia de nucleósidos, por completo o en parte, que una secuencia diana, tal como un ARN mensajero o una secuencia de ADN. Los términos "cadena codificante" y "cadena pasajera" se usan indistintamente en el presente documento.
Por "secuencia diana" se indica cualquier secuencia del ácido nucleico cuya expresión o actividad se va a modular. El ácido nucleico diana puede ser ADN o ARN, tal como ADN o ARN endógeno, ADN vírico o ARN vírico, u otro ARN codificado por un gen, virus, bacteria, hongo, mamífero o planta. En algunas realizaciones, una secuencia diana está asociada con una enfermedad o trastorno.
Por "específicamente hibridable" y "complementario" se indica que un ácido nucleico puede formar enlace(s) de hidrógeno con otra secuencia del ácido nucleico por Watson-Crick tradicional u otros tipos no tradicionales. En referencia a las moléculas nucleicas de la presente divulgación, la energía libre de unión para una molécula de ácido nucleico con su secuencia complementaria es suficiente para permitir que avance la función relevante del ácido nucleico, por ejemplo, actividad de iARN. La determinación de las energías libres de unión para moléculas de ácidos nucleicos se conoce bien en la técnica (véase, por ejemplo, Turner et al., 1987, CSH Symp. Quant. Biol. LIT pp,123-133; Frier et al., 1986, Proc. Nat. Acad. Sci. USA83:9373-9377; Turner et al., 1987, /. Ain. Chem. Soc. 109:3783-3785)
Un porcentaje de complementariedad indica el porcentaje de restos contiguos en una molécula de ácido nucleico que puede formar enlaces de hidrógeno (por ejemplo, apareamiento de bases de Watson-Crick) con una segunda secuencia del ácido nucleico (por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9,10 de 10 que son el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % y 100 % complementarios). "Perfectamente complementario" o 100 % de complementariedad significa que todos los restos contiguos de una secuencia del ácido nucleico se unirán al hidrógeno con el mismo número de restos contiguos en una segunda secuencia del ácido nucleico. Menos de complementariedad perfecta se refiere a la situación en la que algunas unidades de nucleósidos de dos cadenas, pero no todas, se pueden unir por hidrógeno entre sí. "Complementariedad sustancial" se refiere a cadenas de polinucleótidos que presentan 90 % o mayor complementariedad, excluyendo regiones de las cadenas de polinucleótidos, tales como nucleótidos protuberantes, que se seleccionan de manera que sean no complementarios. La unión específica requiere un grado de complementariedad suficiente para evitar la unión no específica del compuesto oligomérico con secuencias no diana en condiciones en las que se desea la unión específica, por ejemplo, en condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapéutico, o en el caso de ensayos in vitro, en condiciones en las que se realizan los ensayos. En algunas realizaciones, las secuencias no diana se diferencian de secuencias diana correspondientes en al menos 5 nucleótidos.
Oligonucleótidos bicatenarios
En algunas realizaciones, un oligonucleótido bicatenario utilizado según la presente divulgación es suficientemente grande como para poder ser escindido por una molécula endógena, por ejemplo, por Dicer, para producir oligonucleótidos bicatenarios más pequeños, por ejemplo, agentes de iARN. En algunas realizaciones, un oligonucleótido bicatenario proporcionado modula la expresión de un gen diana por escisión mediada por RISC de la secuencia diana.
En algunas realizaciones, una región bicatenaria de un oligonucleótido bicatenario es igual a o al menos, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 pares de nucleótidos de longitud.
En algunas realizaciones, una cadena no codificante de un oligonucleótido bicatenario es igual a o al menos 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos de longitud.
En algunas realizaciones, una cadena codificante de un oligonucleótido bicatenario es igual a o al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos de longitud.
En algunas realizaciones, una cadena tiene al menos una extensión de 1-5 nucleótidos monocatenarios en la región bicatenaria. Por "extensión de nucleótidos monocatenarios en la región bicatenaria'' se indica que allí está presente al menos un par de bases de nucleótidos en ambos extremos de la extensión monocatenaria. En algunas realizaciones, ambas cadenas tienen al menos una extensión de 1-5 (por ejemplo, 1,2, 3, 4 o 5) nucleótidos monocatenarios en la región bicatenaria. Cuando ambas cadenas tienen una extensión de 1-5 (por ejemplo, 1, 2, 3, 4 o 5) nucleótidos monocatenarios en la región bicatenaria, dichos nucleótidos monocatenarios pueden estar opuestos entre sí (por ejemplo, una extensión de emparejamientos incorrectos) o se pueden localizar de forma que la segunda cadena no tenga nucleótidos monocatenarios opuestos a los oligonucleótidos monocatenarios de la primera cadena y viceversa (por ejemplo, un bucle monocatenario). En algunas realizaciones, los nucleótidos monocatenarios están presentes dentro de 8 nucleótidos desde cualquier extremo, por ejemplo, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2 nucleótidos desde cualquiera del extremo 5' o 3' de la región de complementariedad entre las dos cadenas.
En algunas realizaciones, cada cadena de un oligonucleótido bicatenario utilizada según la presente divulgación tiene una estructura ZXY, tal como se describe en la solicitud internacional N.° PCT/US2004/07070 presentada el 8 de marzo de 2004, cuyo contenido se incorpora por este documento en su totalidad.
Horquillas y mancuernas
En algunas realizaciones, un oligonucleótido bicatenario utilizado según la presente divulgación es una molécula individual que comprende regiones autocomplementarias; por lo tanto, las dos "cadenas" de regiones bicatenarias están de hecho unidas covalentemente entre sí. Dichas dos cadenas se pueden unir entre sí en ambos extremos, o en un solo extremo. Por enlace en un extremo se indica que el extremo 5' de la primera cadena está unido al extremo 3' de la segunda cadena o el extremo 3' de la primera cadena está unido al extremo 5' de la segunda cadena. Cuando las dos cadenas se unen entre sí en ambos extremos, el extremo 5' de la primera cadena se une al extremo 3' de la segunda cadena y el extremo 3' de la primera cadena se une al extremo 5' de la segunda cadena. En algunas realizaciones, dos cadenas se unen juntas por un conector de oligonucleótido que incluye, pero no se limita a, (N)n; en donde N es independientemente un nucleótido modificado o sin modificar y n es 3-23. En algunas realizaciones, n es 3-10, por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. En algunas realizaciones, un conector de oligonucleótido se selecciona del grupo que consiste en GNRA, (G)4 , (U)4 y (dT)4, en donde N es un nucleótido modificado o sin modificar y R es un nucleótido de purina modificado o sin modificar. En algunas realizaciones, algunos de los nucleótidos en el conector participan en las interacciones de pares de bases con otros nucleótidos en el conector. En algunas realizaciones, las dos cadenas se unen juntas por un conector no nucleosídico, por ejemplo.
En algunas realizaciones, los agentes de iARN de tipo horquilla y mancuerna tienen una región de dúplex igual a o al menos 14, 15, 15, 16, 17, 18, 19, 29, 21,22, 23, 24 o 25 pares de nucleótidos. En algunas realizaciones, la región de dúplex es igual a o menos de 200, 100 o 50, pares de nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, los intervalos para la región de dúplex son aproximadamente 15 a aproximadamente 30, aproximadamente 17 a aproximadamente 23, aproximadamente 19 a aproximadamente 23, y aproximadamente 19 a aproximadamente 21 nucleótidos de pares de longitud. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos de horquilla imitan los precursores naturales de microARN.
En algunas realizaciones, los agentes de iARN de horquilla pueden tener un nucleótido protuberante monocatenario o región sin aparear terminal, por ejemplo, en el extremo 3' en el lado antisentido de pelopina, etc.. En algunas realizaciones, los nucleótidos protuberantes tienen aproximadamente 1 a aproximadamente 4 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, los nucleótidos protuberantes tienen aproximadamente 2 a aproximadamente 3 nucleótidos de longitud.
En algunas realizaciones, un agente de iARN de horquilla se caracteriza porque el extremo 3' de una cadena no codificante está unido al extremo 5' de una cadena codificante. En algunas realizaciones, un agente de iARN de horquilla se caracteriza porque el extremo 5' de una cadena no codificante está unido al extremo 3' de una cadena codificante. Los oligonucleótidos de horquilla proporcionados también se denominan en el presente documento "ARNhc".
Oligonucleótidos monocatenarios
En algunas realizaciones, un oligonucleótido monocatenario utilizado según la presente divulgación comprende una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente complementaria a un ácido nucleico "codificante" que codifica un producto de expresión génica, por ejemplo, complementario a la cadena codificante de una molécula de ADNc bicatenario o complementario a una secuencia de ARN, por ejemplo, un pre-ARNm, ARNm, miARN o premiARN. Los oligonucleótidos monocatenarios proporcionados incluyen, pero no se limitan a, oligonucleótidos antisentido y agentes de iARN monocatenario. En algunas realizaciones, la región de complementariedad es inferior a aproximadamente 30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, la región de complementariedad tiene al menos aproximadamente 15 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un oligonucleótido monocatenario proporcionado tiene aproximadamente 10 a aproximadamente 25 nucleótidos de longitud (por ejemplo, aproximadamente 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 21,22, 23 o 24 nucleótidos de longitud). En algunas realizaciones, un oligonucleótido monocatenario proporcionado tiene aproximadamente 25 a aproximadamente 30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un oligonucleótido monocatenario proporcionado tiene aproximadamente 15 a aproximadamente 29 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un oligonucleótido monocatenario proporcionado se caracteriza por tener menos del 100 % de complementariedad con un ARNm, ARN o ADN. En algunas realizaciones, un oligonucleótido monocatenario proporcionado tiene una estructura ZXY, tal como se describe en la solicitud internacional N.° PCT/US2004/07070 presentada el 8 de marzo de 2004.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido monocatenario utilizado se puede hibridar con un ARN complementario, por ejemplo, ARNm, pre-ARNm, y prevenir el acceso de la maquinaria de traducción al transcrito de ARN diana, previniendo así la síntesis de proteínas. En algunas realizaciones, un oligonucleótido monocatenario proporcionado se puede hibridar con un ARN complementario y la diana de ARN se puede escindir posteriormente por una enzima, tal como RNasa H, previniéndose así la traducción de ARN diana. En algunas realizaciones, un oligonucleótido monocatenario proporcionado modula la expresión de un gen diana por la escisión mediada por RISC de la secuencia diana.
Un "agente de iARN monocatenario", como se usa en el presente documento, es un agente de iARN que está constituido por una única molécula. En algunas realizaciones, un agente de iARN monocatenario incluye una región de dúplex, formada por emparejamiento intracatenario, por ejemplo, es o incluye una horquilla o estructura de mango de sartén. En algunas realizaciones, los agentes de iARN monocatenarios son antisentido con respecto a la molécula diana. En algunas realizaciones, los agentes de iARN monocatenarios son suficientemente largos, de forma que son capaces de entrar en el RISC y participar en la escisión mediada por RISC de un ARNm diana. Se conocen ARNip monocatenarios (ARNip mc) a modo de ejemplo y se describen, por ejemplo, en la publicación de patente de EE. UU. N.° 2006/0166901.
En algunas realizaciones, un agente de iARN monocatenario tiene al menos aproximadamente 12 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un agente de iARN monocatenario tiene al menos aproximadamente 15 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un agente de iARN monocatenario tiene al menos aproximadamente 20 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un agente de iARN monocatenario tiene al menos aproximadamente 25 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un agente de iARN monocatenario tiene al menos aproximadamente 29 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un agente de iARN monocatenario tiene al menos aproximadamente 30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un agente de iARN monocatenario tiene al menos aproximadamente 35 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un agente de iARN monocatenario tiene al menos aproximadamente 40 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un agente de iARN monocatenario tiene al menos aproximadamente 50 nucleótidos de longitud.
En algunas realizaciones, un agente de iARN monocatenario tiene menos de 200 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un agente de iARN monocatenario tiene menos de 100 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un agente de iARN monocatenario tiene menos de 60 nucleótidos de longitud.
En algunas realizaciones. un agente de iARN monocatenario está fosforilado en 5'. En algunas realizaciones, un agente de iARN monocatenario incluye un análogo de fosforilo en el extremo 5' prima. En ciertas realizaciones, un agente de iARN monocatenario tiene una longitud desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 29 nucleótidos de longitud.
Los oligonucleótidos monocatenarios, que incluyen los descritos y/o identificados como ARNip monocatenarios, microARN o mir que se pueden usar como diana o pueden servir de molde para el diseño de oligonucleótidos de la divulgación, se enseñan en, por ejemplo, Esau, et al., publicación de EE. u U. N.° 20050261218 (USSN: 10/909125) titulada "Oligonucleotides and compositions for use in modulation small non-coding RNAs".
La presente divulgación engloba reactivos de investigación y/o diagnóstico que comprenden oligonucleótidos monocatenarios. En algunas realizaciones, un oligonucleótido monocatenario utilizado según la presente divulgación es y/o actúa de cebador. En algunas realizaciones, los cebadores se usan en reacciones de cadenas basadas en polimerasa (es decir, PCR) para amplificar ácidos nucleicos. Estas aplicaciones incluyen cualquier variación de PCR conocida, tal como PCR con transcripción inversa (RT-PCR) y PCR en tiempo real.
MicroARN
En algunas realizaciones, las composiciones proporcionadas comprenden uno o más oligonucleótidos que son o actúan de microARN.
Los microARN (miARN o mir) son una clase altamente conservada de moléculas pequeñas de ARN que se transcriben de ADN en los genomas de plantas y animales, pero no se traducen en proteína. Los pre-microARN se procesan en miARN. Los microARN procesados son moléculas de ARN monocatenario de 17-25 nucleótidos (nt) que se incorporan en el complejo de silenciamiento inducido por el ARN (RISC) y se han identificado como reguladores clave del desarrollo, proliferación celular, apoptosis y diferenciación. Se cree que desempeñan una función en la regulación de la expresión génica uniéndose a la región no traducida 3' de ARNm específicos. El RISC media en la regulación por disminución de la expresión génica mediante inhibición traduccional, escisión de transcritos, o ambos. El RISC también participa en el silenciamiento transcripcional en el núcleo de una amplia variedad de eucariotas.
Los microARN también participan en la modulación de patógenos en hospedadores. Por ejemplo, véase Jopling, C.L., et al., Science (2005) vol. 309, pp 1577-1581. Sin desear quedar ligado a teoría, la administración de un microARN, mimético de microARN y/u oligonucleótido anti-microARN, conduce a la modulación de la viabilidad, crecimiento, desarrollo y/o replicación de patógenos. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado es un microARN, mimético de microARN y/o anti-microARN, en donde el microARN es un microARN de hospedador. El número de secuencias de miARN identificadas hasta la fecha es grande y en crecimiento, cuyos ejemplos ilustrativos se pueden encontrar, por ejemplo, en: "miRBase: microRIVA sequences, targets and gene nomenclatura" Griffiths-Jones S, Grocock RJ, van Dongen S, Bateman A, Enright AJ. n Ar , 2006, 34, Número de la base de datos, D140-D144; 'The microRNA Registry" Griffiths-Jones S. Na R, 2004, 32, Número de la base de datos, D109-D111. Los ejemplos no limitantes de secuencias útiles de miARN también se proporcionan en el Apéndice (C) adjunto.
Ribozimas
En algunas realizaciones, las composiciones proporcionadas incluyen uno o más oligonucleótidos que son o actúan de ribozimas.
Las ribozimas son oligonucleótidos que tienen dominios catalíticos específicos que poseen actividad de endonucleasa (Kim y Cech, Proc Natl Acad Sci U S A. 1987 Dec;84(24):8788-92; Forster y Symons, Cell. 1987 Apr 24;49(2):211-20). Actualmente se conocen al menos seis variedades básicas de ARN enzimáticos que existen de forma natural. En general, los ácidos nucleicos enzimáticos actúan uniéndose primero a un ARN diana. Dicha unión ocurre mediante la porción de unión a diana de un ácido nucleico enzimático que se mantiene en estrecha proximidad a una porción enzimática de la molécula que actúa para escindir el ARN diana. Por lo tanto, el ácido nucleico enzimático reconoce primero y luego se une al ARN diana mediante emparejamiento de bases complementario, y una vez unido al sitio correcto, actúa enzimáticamente para cortar el ARN diana. La escisión estratégica de dicho ARN diana destruirá su capacidad para dirigir la síntesis de una proteína codificada. Después de que un ácido nucleico enzimático haya unido y escindido su diana de ARN, se libera de ese ARN para buscar otra diana y se puede unir repetidamente y escindir nuevas dianas.
Se conocen en la técnica métodos de producción de una ribozima dirigida a cualquier secuencia diana. Las ribozimas se pueden diseñar como se describe en, entre otros, la publicación de solicitud de patente internacional N.° WO 93/23569 y la publicación de solicitud de patente internacional N.° WO 94/02595, y sintetizar para ser probadas in vitro e in vivo, como se describe en el presente documento.
Aptámeros
En algunas realizaciones, las composiciones proporcionadas incluyen uno o más oligonucleótidos que son o actúan de aptámeros.
Los aptámeros son moléculas de ácido nucleico o péptido que se unen a una molécula de interés particular con alta afinidad y especificidad (Tuerk y Gold, Science 249:505 (1990); Ellington y Szostak, Nature 346:818 (1990)). Se han producido satisfactoriamente aptámeros de ADN o ARN que unen muchas entidades diferentes de proteínas grandes a moléculas orgánicas pequeñas. Véanse Eaton, Curr. Opin. Chem. Biol. 1:10-16 (1997), Famulok, Curr. Opin. Struct. Biol. 9:324-9(1999), y Hermann y Patel, Science 287:820-5 (2000). Los aptámeros pueden estar basados en ARN o ADN. En general, los aptámeros se manipulan mediante rondas repetidas de selección in vitro o, equivalentemente, SELEX (evolución sistemática de ligando por enriquecimiento exponencial) para unirse a diversas dianas moleculares, tales como moléculas pequeñas, proteínas, ácidos nucleicos, e incluso células, tejidos y organismos. El procedimiento SELEX es el protocolo en el que oligonucleótidos monocatenarios se seleccionan de amplias bibliotecas de secuencias, basándose en la afinidad de unión a una proteína diana u otra molécula (C. Tuerk, L. Gold, Science, 249 (1990), pp. 505-510; R. Green, A.D. Ellington, D.P. Bartel, J.W. Szostak, Methods Enzymol., 2 (1991), pp. 75-86; L. Gold, B. Polisky, O. Uhlenbeck, M. Yarus, Annu. Rev. Biochem., 64 (1995), pp. 763-797). El procedimiento SELEX se inicia normalmente con una biblioteca de ARN o ADN que consiste en unas 1014-1015 secuencias de oligonucleótidos al azar. En una biblioteca de oligonucleótidos completamente aleatorizada, cada molécula presentará una estructura terciaria única que dependerá de la secuencia de nucleótidos de esa molécula. La afinidad de unión del oligonucleótido por la proteína diana será determinada por el ajuste entre restos sobre la superficie del oligonucleótido y epítopes sobre la proteína diana. Como consecuencia de empezar a partir de una biblioteca de amplia diversidad, es frecuentemente posible identificar aptámeros de afinidad nM o sub-nM por la proteína diana y con selectividad por esa proteína diana con respecto a otras proteínas con un alto grado de homología estructural (K.W. Uphoff, S.D. Bell, A.D. Ellington, Curr. Opin. Struct. Biol., 6 (1996), pp. 281-288). Usando metodología de SELEX se han generado aptámeros de ARN o ADN para muchas proteínas, péptidos y moléculas pequeñas que incluyen dopamina (C. Mannironi, A. Di Nardo, P. Fruscoloni, G.P. Tocchini-Valentini, Biochemistry, 36 (1997), pp. 9726-9734), sustancia P (D. Nieuwlandt, M. Wecker, Biochemistry, 34 (1995), pp. 5651-5659), subtilisina (h . Takeno, S. Yamamoto, T. Tanaka, Y. Sakano, Y. Kikuchi, J. Biochem., 125 (1999), pp. 1115-1119), factor de crecimiento derivado de plaquetas (L.S. Green, D. Jellinek, R. Jenison, A. Ostman, C-H. Heldin, N. Janjic Biochemistry, 35 (1996), pp. 14413-14424), factor de crecimiento endotelial vascular (L.S. Green, D. Jellinek, C. Bell, L.A. Bebe, B.D. Feistner, S.C. Gill, F.M. Jucker, N. Janjic Chem. Biol., 2 (1995), pp. 683-695), trombina (L.C. Bock, L.C. Griffen, J.A. Latham, E.H. Vermaas, J.J. Toole, Nature, 355 (1992), pp. 564-566) y L-selectina (D. O'Connell, A. Koenig, S. Jennings, B. Hicke, H.L. Han, T. Fitzwater, Y.F. Chang, N. Varki, D. Parma Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93 (1996), pp. 5883-5887).
Como se revisa en Dua et al. (2008) Recent Patents on DNA & Gene Sequences, 2: 172-186 con más detalle, con los años, se han desarrollado varios protocolos de SELEX modificados. Los ejemplos no limitantes de métodos de SELEX modificados se describen en las siguientes publicaciones: Counter SELEX (US5580737), Flow cell SELEX (WO9833941), Truncation SELEX (WO0056930), Blended SELEX (US5683867), Transctiption free SELEX (US20026387620), Solution SELEX (US5567588), Chimeric SELEX (WO9604403), Tissue SELEX (US20026376474), Photo SELEX (US6001577), Toggle SELEX (US20077312325), Covalent SELEX/Chemi SELEX (US5763595), Genomic SELEX (US20016261774), SELEX without purified protein (WO0224954), CE-SELEX (WO03102212), Mirror-image SELEX - Spiegelmers (EP1386972) y Laser SEl Ex , DeSELEX (WO07035532). Los oligonucleótidos estereodefinidos englobados por la presente divulgación se pueden usar en una cualquiera o más de las variaciones de los métodos SELEX.
Un aptámero se puede preparar por cualquier método conocido, que incluye métodos sintéticos, recombinantes y de purificación, y se puede usar solo o en combinación con otros aptámeros específicos para la misma diana. Además, como se describe más completamente en el presente documento, el término "aptámero" incluye específicamente ''aptámeros secundarios" que contienen una secuencia consenso derivada de la comparación de dos o más aptámeros conocidos con una diana dada. Los aptámeros poseen varias características que los hacen agentes terapéuticos atractivos. Se ha mostrado que tanto los aptámeros de ADN como de ARN se unen a sus dianas con constantes de disociación (Kd) en el intervalo picomolar bajo a nanomolar bajo. La unión de un aptámero es una interacción altamente específica que pueden incluso discriminar entre proteínas relacionadas que comparten dominios estructurales comunes. Aunque la afinidad de unión de tanto los aptámeros como los anticuerpos está en el mismo intervalo, los aptámeros tienen muchas características adicionales que superan a su rival en muchos casos. A diferencia de los anticuerpos, los aptámeros se pueden dirigir incluso contra dianas no inmunogénicas. Durante la síntesis se pueden someter fácilmente a una modificación química que mejora su estabilidad y farmacocinética. Muestran niveles de inmunogenicidad de nulos a despreciables a dosis terapéuticas debido a su similitud con moléculas endógenas.
En algunas realizaciones, los oligonucleótidos utilizados según la presente divulgación son útiles como agentes antipatógenos, por ejemplo, agentes antivíricos, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos, etc. Se ha informado de dianas adecuadas para una variedad de agentes infecciosos, tales como virus y bacterias. Véanse, por ejemplo, la patente de EE. UU. 5726017, la patente de EE. UU. 5654151, la patente de EE. UU. 5496938, la patente de e E. UU.
5503978, la patente de EE. UU. 5587468, la patente de EE. UU. 5527894, US2005233317, la patente de EE. UU.
5496938, WO08 066231, JP2002165594, WO02081494, la patente de EE. UU. 5861501, WO9720072, la patente de EE. UU. 5475096, la patente de EE. UU. 6569630, los documentos de patente CN101109013 y WO03106476.
En algunas realizaciones, los oligonucleótidos utilizados según la presente divulgación son o actúan de agentes antineoplásicos. Cualquier factor conocido asociado al cáncer o a tumor, tal como proteínas implicadas en la regulación de la división o proliferación celular, progresión del ciclo celular, apoptosis, migración celular, reparación de ADN, etc., que incluye proteínas estructurales y moléculas de transducción de señales, pueden ser dirigido por un aptámero. Los ejemplos incluyen, sin limitación, véanse, por ejemplo, la patente de AU 775412, la patente de EE. UU. 6232071, el documento de patente WO 08/028534, la patente de Ee . UU. 6933114, el documento de patente WO 04/081574, la patente de AU 242462, la patente de EE. UU. 6995249, la patente de EE. UU. 5668264, la patente de EE. UU.
6699843, el documento de patente WO 04/094614 y la patente de EE. UU. 5846713.
En algunas realizaciones, los oligonucleótidos utilizados según la presente divulgación son o actúan de agentes antiangiogénicos. Los ejemplos no limitantes de dianas antiangiogénicas incluyen VEGF y receptores asociados, así como matriz extracelular o moléculas de adhesión. Véanse, por ejemplo, la patente de EE. UU. 6051698, el documento de patente US 2003175703, el documento de patente WO 95/21853 y la patente de EE. UU. 7094535.
En algunas realizaciones, los oligonucleótidos utilizados según la presente divulgación son o actúan de agentes anticoagulantes. Se sabe mucho sobre factores de coagulación de la sangre y su función, así como la regulación de proteínas de dicho proceso. Los aptámeros son útiles en el direccionamiento de uno o más de dichos factores en el tratamiento de afecciones, tales como enfermedades cardiovasculares y trastornos de coagulación de la sangre. Véanse, por ejemplo, el documento de patente WO 06/033854, la patente de EE. UU. 5543293, el documento de patente W o 07/025049, la patente de EE. UU. 6774118, el documento de patente WO 07/140000.
En algunas realizaciones, los oligonucleótidos utilizados según la presente divulgación son o actúan de agentes inmunomoduladores. Los aptámeros se han generado para dirigir moléculas inmunomoduladoras diana implicadas en trastornos autoinmunitarios. La presente divulgación puede ser útil para dirigir moléculas expresadas en células inmunitarias, tales como linfocitos T y células presentadoras de antígenos (CPA). Véanse, por ejemplo, la patente de EE. UU. 5869641, el documento de patente WO 01/09160. En algunas realizaciones, las moléculas implicadas en el sistema del complemento, tales como C1, C4, C2, C3 y C5, pueden ser dirigidas por un aptámero. El sistema del complemento participa en numerosas enfermedades renales, reumatológicas, neurológicas, dermatológicas, hematológicas, alérgicas, infecciosas, y otras enfermedades. Véanse, por ejemplo, los documentos de patente WO 97/28178 y WO 07/103549. Otras dianas inmunorrelacionadas incluyen, sin limitación, IL-12, IL-23 e IL-28 (véase, por ejemplo, el documento de patente WO 07/035922), IgE (véase, por ejemplo, el documento de patente WO 05/113813), Sp-1 y Sp1-, CD28, IL-2, GMCSF (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. 6994959), SDF-1, CXCR4 (véase, por ejemplo, el documento de patente WO 08/009437), IL-6, IL-12, IFN gamma (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. 6589940 y el documento de patente US2003125279) y TLR. Los aptámeros estereodefinidos pueden ocasionar eficacia mejorada contra dichas enfermedades.
En algunas realizaciones, los oligonucleótidos utilizados según la presente divulgación son o actúan de agentes antiinflamatorios. La enfermedad inflamatoria, tal como el síndrome disneico agudo (ARDS), choque séptico, enfisema pulmonar, fibrosis quística, artritis reumatoide y bronquitis crónica, tienen elastasa de neutrófilos implicada en su patogénesis. Por lo tanto, el elastato humano es una diana para tratar dichos trastornos usando un aptámero que regula la inflamación. Otras dianas adecuadas incluyen, sin limitación, fosfolipasa A2, tal como PLA2 secretora no pancreática (véase, por ejemplo, el documento de patente WO 96/27604), selectinas, E-, P- y L-(véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. 5780228), tres lectinas de tipo C homólogas, otras moléculas de adhesión a células expresadas en células, tales como leucocitos, células endoteliales y plaquetas; MCP-1 (véase, por ejemplo, el documento de patente WO 07/093409), NF-kappa B y NF-IL6 (véase, por ejemplo, el documento de patente WO 00/24404). Los aptámeros estereodefinidos pueden ocasionar eficacia mejorada contra dichas enfermedades.
En algunas realizaciones, los oligonucleótidos utilizados según la presente divulgación son útiles para tratar ciertas enfermedades del cerebro, que incluyen, pero no se limitan a: encefalopatías espongiformes transmisibles (EET) y enfermedad de Alzheimer. Dianas conocidas se describen en publicaciones que incluyen los documentos de patente WO 2006/138676 y DE19916417, y WO 08/008884. Los aptámeros estereodefinidos pueden provocar eficacia mejorada contra dichas enfermedades.
Oligonucleótidos señuelo
En algunas realizaciones, las composiciones proporcionadas incluyen uno o más oligonucleótidos que son o actúan de oligonucleótidos señuelo.
Debido a que los factores de transcripción reconocen sus secuencias de unión relativamente cortas, incluso en ausencia de ADN genómico circundante, los oligonucleótidos cortos que llevan la secuencia de unión consenso de un factor de transcripción específico se pueden usar como herramientas para manipular la expresión génica en células vivas. Esta estrategia implica la administración intracelular de dichos "oligonucleótidos señuelo", que entonces son reconocidos y unidos por el factor diana. La ocupación de los sitios de unión a ADN del factor de transcripción por el señuelo hace que el factor de transcripción sea incapaz de unirse posteriormente a las regiones promotoras de genes diana. Los señuelos se pueden usar como agentes terapéuticos, ya sea para inhibir la expresión de genes que se activan por un factor de transcripción, o para regular por incremento genes que son suprimidos por la unión de un factor de transcripción. Los ejemplos de utilización de oligonucleótidos señuelo se pueden encontrar en Mann et al., J. Clin. Invest., 2000, 106: 1071-1075.
Miméticos de miARN
En algunas realizaciones, las composiciones proporcionadas incluyen uno o más oligonucleótidos que son o actúan de miméticos de miARN.
Los miméticos de miARN representan una clase de moléculas que se puede usar para imitar la actividad moduladora del gen de uno o más miARN. Por lo tanto, el término ''mimético de microARN" se refiere a ARN no codificantes sintéticos (es decir, el miARN no se obtiene por purificación de una fuente del miARN endógeno) que son capaces de entrar en la vía de iARN y regular la expresión génica. Los miméticos de miARN se pueden diseñar como moléculas maduras (por ejemplo, monocatenarias) o imitar a precursores (por ejemplo, pri- o pre-miARN).
En algunas realizaciones, los miméticos de miARN son moléculas bicatenarias (por ejemplo, con una región de dúplex entre aproximadamente 16 y aproximadamente 31 nucleótidos de longitud) y contienen una o más secuencias que tienen identidad con la cadena madura de un miARN dado.
En algunas realizaciones, un mimético de miARN comprende una región de dúplex de entre aproximadamente 16 y aproximadamente 31 nucleótidos. En algunas realizaciones, los miméticos de miARN proporcionados pueden contener uno o más de los siguientes patrones de modificación química: la cadena codificante contiene modificaciones de 2'-Ometilo de los nucleótidos 1 y 2 (contando desde el extremo 5' del oligonucleótido codificante), y todas las C y U; las modificaciones de la cadena no codificante pueden comprender modificación 2' F de todas las C y U, fosforilación del extremo 5' del oligonucleótido y enlaces internucleotídicos estabilizados asociados a un nucleótido protuberante en 3' de 2 nucleótidos.
Supermir
En algunas realizaciones, las composiciones proporcionadas incluyen uno o más oligonucleótidos que son o actúan de supermir.
Un supermir se refiere a un oligonucleótido, por ejemplo, monocatenario, bicatenario o parcialmente bicatenario, que tiene una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente idéntica a un miARN y que es antisentido con respecto a su diana. Este término incluye oligonucleótidos que comprenden al menos una porción que no existe de forma natural que funciona similarmente. En algunas realizaciones, el supermir no incluye una cadena codificante. En algunas realizaciones, el supermir no se autohibrida a un grado significativo. En algunas realizaciones, un supermir tiene una estructura secundaria, pero es sustancialmente monocatenaria en condiciones fisiológicas. Un supermir que es sustancialmente monocatenario es monocatenario hasta el punto que menos de aproximadamente el 50 % (por ejemplo, menos de aproximadamente el 40 %, 30 %, 20 %, 10 % o 5 %) del supermir se duplexe consigo mismo. Un supermir puede incluir un segmento de horquilla, por ejemplo, secuencia, que preferentemente en el extremo 3' se puede autohibridar y formar una región de dúplex, por ejemplo, una región de dúplex de al menos 1, 2, 3 o 4 y preferentemente menos de 8, 7, 6 o 5 nucleótidos, por ejemplo, 5 nucleótidos. La región de dúplex se puede conectar por un conector, por ejemplo, un conector de nucleótido, por ejemplo, 3, 4, 5 o 6 dT, por ejemplo, dT modificados. En algunas realizaciones, un supermir se duplexa con un oligonucleótido más corto, por ejemplo, de 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleótidos de longitud, por ejemplo, en uno o ambos del extremo 3' y 5' o en un extremo y en el no terminal o centro del supermir.
Antimeros o inhibidores de miARN
En algunas realizaciones, las composiciones proporcionadas incluyen uno o más oligonucleótidos que son o actúan de antimeros o inhibidores de miARN.
Los términos "antimir", "inhibidor de microARN" o "inhibidor de miR" son sinónimos y se refieren a oligonucleótidos u oligonucleótidos modificados que interfieren con la actividad de miARN específicos. Los inhibidores pueden adoptar una variedad de configuraciones, que incluyen diseños monocatenarios, bicatenarios (ARN/ARN o dúplex de ARN/ADN) y de horquilla. En algunas realizaciones, los inhibidores de microARN comprenden una o más secuencias o porciones de secuencias que son complementarias o parcialmente complementarias con la cadena madura (cadenas maduras) y con la cadena madura (cadenas maduras) del miARN que va a ser dirigido. En algunas realizaciones, los inhibidores de miARN comprenden secuencias adicionales situadas 5' y 3' con respecto a la secuencia que es el complemento inverso del miARN maduro. Las secuencias adicionales pueden ser los complementos inversos de las secuencias que son adyacentes al miARN maduro en el primiARN del que deriva el miARN maduro, o secuencias adicionales pueden ser secuencias arbitrarias (que tienen una mezcla de A, G, C, U o dT). En algunas realizaciones, una o ambas de las secuencias adicionales son secuencias arbitrarias capaces de formar horquillas. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la secuencia que es el complemento inverso del miARN está flanqueado en el lado 5' y en el lado 3' por estructuras de horquilla. En algunas realizaciones, los inhibidores de microARN son bicatenarios. En algunas realizaciones, los inhibidores de microARN son bicatenarios e incluyen emparejamientos incorrectos entre nucleótidos en cadenas opuestas. En algunas realizaciones, los inhibidores de microARN están unidos a restos conjugados para facilitar la captación del inhibidor en una célula.
Los inhibidores de microARN, que incluyen inhibidores de miARN de horquilla, se describen con detalle en Vermeulen et al., "Double-Stranded Regions Are Essential Design Components Of Potent Inhibitors of RISC Function," RNA 13: 723-730 (2007) y en los documentos de patente WO2007/095387 y WO 2008/036825.
Una aplicación a modo de ejemplo de terapia basada en miARN se describe en Pan et al. (2007) World J Gastroenterol 13(33): 4431-36, "New therapeutic opportunities for Hepatitis C based on small RNA". Brevemente, los autores describen miR-122 maduro de 22 nucleótidos, derivado de un transcrito de ARN poliadenilado no codificante del gen hcr, que es un regulador del desarrollo específico del hígado. Debido a que miR-122 es un miARN específico del hígado que participa en la replicación vírica del VHC, el silenciamiento de miR-122 puede ser útil para el tratamiento del VHC.
Antagomir
En algunas realizaciones, las composiciones proporcionadas incluyen uno o más oligonucleótidos que son o actúan de antagomir.
Los antagomir son oligonucleótidos de tipo ARN que albergan diversas modificaciones para la protección de RNAsa y propiedades farmacológicas, tales como captación tisular y celular potenciada. Se diferencian del ARN normal por, por ejemplo, 2'-O-metilación completa de azúcar, enlace interazúcar de fosforotioato y, por ejemplo, un resto de colesterol en el extremo 3'. En algunas realizaciones, un antagomir comprende una modificación de 2'-O-metilo en todos los nucleótidos, un resto colesterol en el extremo 3', dos enlaces interazúcar de fosforotioato en las dos primeras posiciones en el extremo 5' y cuatro enlaces fosforotioato en el extremo 3' de la molécula. Los antagomir se pueden usar para silenciar eficientemente los miARN endógenos formando dúplex que comprenden antagomir y miARN endógeno, que previene así el silenciamiento génico inducido por miARN. Un ejemplo de silenciamiento de miARN mediado por antagomir es el silenciamiento de miR-122, descrito en Krutzfeldt et al, Nature, 2005, 438: 685-689.
Variaciones de oligonucleótidos individuales modificados
Normalmente, se percibe que se requieren dos componentes para activar la maquinaria de iARN - el motivo de ácido nucleico bicatenario, que se requiere para el reconocimiento por proteínas asociadas a iARN - y la cadena guía que sirve de cofactor de unión a ARNm en la proteína catalítica Argónaute de RISC. Más recientemente, se ha desarrollado un novedoso tipo de moléculas de iARN compuestas de un oligonucleótido individual corto (25-28 nt) capaz de autodimerizar en un dúplex parcialmente complementario. Se demostró que estas moléculas activaban eficientemente el RISC y producían silenciamiento de ARNm diana comparable al obtenido con potentes moléculas convencionales de iARN. Véase: Lapierre et al., "Potent and systematic RNAi mediated silencing with single oligonucleotide compounds." RNA 2011; 17:00. Véase también: documento de patente WO 2010/090762 "RNA DUPLEXES WITH SINGLE STRANDED PHOSPHOROTHIOATE NUCLEOTIDE REGIONS FOR ADDITIONAL FUNCTIONALITY" (PCT/US2010/00348).
Por lo tanto, la presente divulgación incluye construcciones de iARN que contienen regiones monocatenarias de nucleótidos modificados con fosforotioato, y los usos de dichas construcciones en el silenciamiento génico.
En algunas realizaciones, la divulgación utiliza moléculas bicatenarias aisladas del ácido nucleico que incluyen una cadena guía y una cadena pasajera, en donde la cadena pasajera está conectada mediante un conector escindible a una región monocatenaria de al menos ocho nucleótidos modificados de fosforotioato. En algunas realizaciones, la divulgación es una molécula del ácido nucleico bicatenario aislada que tiene una cadena guía y una cadena pasajera, en donde al menos una de la cadena guía y la cadena pasajera está conectada mediante un conector escindible a una región monocatenaria de al menos seis nucleótidos modificados de fosforotioato.
En algunas realizaciones, la divulgación utiliza una molécula del ácido nucleico bicatenario aislada que tiene una cadena guía y una cadena pasajera, en donde al menos una de la cadena guía y la cadena pasajera está conectada a través de un conector escindible a una región monocatenaria de al menos tres nucleótidos modificados de fosforotioato. En algunas realizaciones, la molécula del ácido nucleico bicatenario incluye al menos una de las siguientes propiedades. La cadena pasajera puede tener 8-18 nucleótidos de longitud. El ácido nucleico puede tener al menos una modificación de 2'-O-metilo o 2'-flúor. El enlace escindible puede ser distinto de un enlace nucleotídico. El ácido nucleico puede incluir un grupo lipófilo. La cadena guía puede tener 16-18 nucleótidos o 26-28 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, la región monocatenaria está conectada a la cadena guía.
En algunas realizaciones, el conector escindible incluye uno o más nucleótidos no modificados. En otras realizaciones, el conector escindible es un enlace fosfodiéster. En ciertas realizaciones, el conector escindible es S-S. En algunas realizaciones, el conector escindible es ADN o ARN. La región monocatenaria de al menos ocho nucleótidos modificados de fosforotioato puede estar en cualquiera del extremo 3' o 5' de la cadena pasajera. En algunas realizaciones, la región monocatenaria de al menos ocho nucleótidos modificados de fosforotioato es ADN, mientras que en otras realizaciones es ARN.
En algunas realizaciones, la región bicatenaria de la molécula del ácido nucleico es un dúplex perfecto. En otras realizaciones, la región bicatenaria contiene al menos una región de protuberancia. En algunas realizaciones, la cadena pasajera comprende una mella dentro de la región bicatenaria de la molécula. La región bicatenaria puede contener al menos un nucleótido que está modificado con fosforotioato.
Las moléculas del ácido nucleico utilizadas según la divulgación pueden estar modificadas químicamente. En ciertas realizaciones, la modificación química es 2'-O-metilo y/o 2'-flúor. En algunas realizaciones, está presente más de una modificación química en la misma molécula. En algunas realizaciones, la modificación química aumenta la estabilidad, aumenta la evasión de regulación inmune y/o previene el silenciamiento génico inespecífico. La modificación química puede estar presente en la cadena pasajera y/o la cadena guía. En algunas realizaciones, la región monocatenaria de al menos ocho nucleótidos modificados de fosforotioato se escinde de la región bicatenaria de la molécula del ácido nucleico en una célula. En algunas realizaciones, la región monocatenaria de al menos ocho nucleótidos modificados de fosforotioato tiene complementariedad con un gen de mamífero. En ciertas realizaciones, la región monocatenaria de al menos ocho nucleótidos modificados de fosforotioato funciona como una molécula antisentido. La región bicatenaria puede tener al menos 19 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, la región monocatenaria tiene al menos 12 nucleótidos de longitud.
En algunas realizaciones, la divulgación utiliza una molécula del ácido nucleico bifuncional que incluye una región bicatenaria que funciona en interferencia por ARN y una región monocatenaria que funciona en antisentido, en donde la región bicatenaria comprende una cadena guía y una cadena pasajera, y en donde la región bicatenaria y la región monocatenaria están conectadas a través de un conector escindible. En algunas realizaciones, el conector escindible incluye uno o más nucleótidos no modificados. En otras realizaciones, el conector escindible es un enlace fosfodiéster. En ciertas realizaciones, el conector escindible es S-S. En algunas realizaciones, el conector escindible es ADN o ARN.
En algunas realizaciones, la divulgación se refiere a métodos de inhibición de la expresión de un gen diana en una célula de mamífero, que incluye poner en contacto la célula de mamífero con una molécula bicatenaria aislada del ácido nucleico que comprende una cadena guía y una cadena pasajera, en donde la cadena pasajera está conectada a través de un conector escindible con una región monocatenaria de al menos ocho nucleótidos modificados de fosforotioato. En algunas realizaciones, el conector escindible incluye uno o más nucleótidos no modificados. En otras realizaciones, el conector escindible es un enlace fosfodiéster. En ciertas realizaciones, el conector escindible es S-S. En algunas realizaciones, el conector escindible es ADN o ARN.
En algunas realizaciones, la región monocatenaria comprende al menos ocho nucleótidos modificados en fosforotioato y pueden estar en cualquiera del extremo 3' o 5' de la cadena pasajera. En algunas realizaciones, la región monocatenaria de al menos ocho nucleótidos modificados en fosforotioato es ADN, mientras que en otras realizaciones es ARN. En algunas realizaciones, la región bicatenaria de la molécula del ácido nucleico es un dúplex perfecto. En otras realizaciones, la región bicatenaria contiene al menos una región protuberante. En algunas realizaciones, la cadena pasajera comprende una mella dentro de la región bicatenaria de la molécula. La región bicatenaria puede contener al menos un nucleótido que está modificado en fosforotioato.
Las moléculas del ácido nucleico utilizadas según la divulgación pueden estar modificadas químicamente. En ciertas realizaciones, la modificación química es 2'-O-metilo y/o 2'-flúor. En algunas realizaciones, más de una modificación química está presente en la misma molécula. En algunas realizaciones, la modificación química aumenta la estabilidad, aumenta la evasión regulación inmune y/o previene el silenciamiento génico inespecífico. La modificación química puede estar presente en la cadena pasajera y/o la cadena guía.
En algunas realizaciones, la región monocatenaria de al menos ocho nucleótidos modificados en fosforotioato se escinde de la región bicatenaria de la molécula del ácido nucleico en una célula. En algunas realizaciones, la región monocatenaria de al menos ocho nucleótidos modificados en fosforotioato tiene complementariedad con un gen de mamífero. En ciertas realizaciones, la región monocatenaria de al menos ocho nucleótidos modificados en fosforotioato sirve de una molécula antisentido. La región bicatenaria puede tener al menos 19 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, la región monocatenaria tiene al menos 12 nucleótidos de longitud.
En algunas realizaciones, la divulgación se refiere a métodos de inhibición de la expresión de un gen diana en una célula de mamífero, que comprende poner en contacto la célula de mamífero con una molécula bicatenaria aislada del ácido nucleico que comprende una cadena guía y una cadena pasajera, en donde la cadena guía está conectada a través de un conector escindible con una región monocatenaria de al menos ocho nucleótidos modificados en fosforotioato. En algunas realizaciones, el conector escindible incluye uno o más nucleótidos sin modificar. En otras realizaciones, el conector escindible es un enlace fosfodiéster. En ciertas realizaciones, el conector escindible es S-S. En algunas realizaciones, el conector escindible es ADN o ARN.
En algunas realizaciones, la divulgación se refiere a métodos de inhibición de la expresión de un gen diana en una célula de mamífero, que incluye poner en contacto la célula de mamífero con una molécula bifuncional del ácido nucleico que incluye una región bicatenaria que funciona en la interferencia por ARN y una región monocatenaria que funciona en antisentido, en donde la región bicatenaria incluye una cadena guía y una cadena pasajera, y en donde la región bicatenaria y la región monocatenaria están conectadas a través de un conector escindible. En otros aspectos, se proporciona un método de inhibición de la expresión de un gen diana en una célula de mamífero. El método implica poner en contacto la célula de mamífero con cualquiera de las moléculas bicatenarias aisladas del ácido nucleico descrito en el presente documento.
En algunas realizaciones, las moléculas bicatenarias aisladas del ácido nucleico utilizadas según la presente divulgación incluyen una modificación química que aumenta la estabilidad. En algunas realizaciones, las moléculas bicatenarias aisladas del ácido nucleico incluyen una modificación química que aumenta la evasión de regulación inmunitaria. En algunas realizaciones, las moléculas bicatenarias aisladas del ácido nucleico incluyen una modificación química que previene el silenciamiento génico inespecífico.
En algunas realizaciones, como se trata en el presente documento, los oligonucleótidos utilizados son moléculas de oligonucleótidos individuales capaces de autodimerizar en un dúplex parcialmente complementario. En algunas realizaciones, dichos oligonucleótidos individuales tienen aproximadamente 23-30 nucleótidos de longitud, por ejemplo, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 y 30. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos individuales capaces de autodimerización en un dúplex parcialmente complementario contienen una región de direccionamiento de ARNm de aproximadamente 14-18 nucleótidos, por ejemplo, 14, 15, 16, 17 y 18. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos individuales capaces de autodimerización en un dúplex parcialmente complementario contienen 7-11 nucleótidos adicionales, por ejemplo, 7, 8, 9, 10 y 11, para permitir la autodimerización en un dúplex parcialmente complementario. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos individuales capaces de autodimerización en un dúplex parcialmente complementario pueden entrar eficientemente en el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) y activarlo.
Adaptadores U1
En algunas realizaciones, las composiciones proporcionadas incluyen uno o más oligonucleótidos que son o actúan de adaptadores U1.
Los adaptadores U1 inhiben los sitios de poliadenilación y son oligonucleótidos bifuncionales con un dominio diana complementario a un sitio en el exón terminal del gen diana y un 'dominio U1' que se une al componente de ARN nuclear más pequeño U1 del snRNP U1. Véase, por ejemplo, la publicación de patente internacional N.° WO2008/121963 y Goraczniak, et al., 2008, Nature Biotechnology, 27(3), 257-263. snRNP de U1 es un complejo de ribonucleoproteína que funciona principalmente para dirigir las etapas tempranas en la formación de espliceosomas uniéndose al límite exón-intrón de pre-ARNm, Brown y Simpson, 1998, Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 49:77-95.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido utilizado es un adaptador de U1, en donde el oligonucleótido comprende al menos un dominio de hibridación (dominio de direccionamiento) unido a al menos un dominio efector (dominio U1), en donde el dominio de hibridación se hibrida con una secuencia de gen diana y el dominio efector se hibrida con el snRNA de U1 de snRNP de U1. En algunas realizaciones, el adaptador U1 comprende un dominio de hibridación. En algunas realizaciones, el adaptador U1 comprende un dominio efector.
Sin desear quedar ligado a teoría, el dominio de hibridación tendrá normalmente desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 50 nucleótidos de longitud, más normalmente desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 30 nucleótidos o aproximadamente 10 a aproximadamente 20 nucleótidos. En algunas realizaciones, el dominio de hibridación tiene 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 nucleótidos de longitud. El dominio de hibridación puede ser al menos 75 %; al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 97 %, o al menos aproximadamente 100 % complementario al gen diana. En algunas realizaciones, el dominio de hibridación se hibrida con un sitio diana dentro de exón terminal Y de un pre-ARNm, que incluye la región codificante terminal y la 3'UTR y secuencias de señalización de la polialenilación (por ejemplo, a través del sitio de poliadenilación). En algunas realizaciones, la secuencia diana está dentro de aproximadamente 500 pares de bases, aproximadamente 250 pares de bases, aproximadamente 100 pares de bases, o aproximadamente 50 pares de bases de la secuencia de señalización de poli (A) del pre-ARNm. En algunas realizaciones, el dominio de hibridación comprende 1, 2, 3 o 4 emparejamientos incorrectos con la secuencia del gen diana.
En algunas realizaciones, el dominio efector tiene desde aproximadamente 8 nucleótidos hasta aproximadamente 30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el dominio efector tiene desde aproximadamente 10 nucleótidos hasta aproximadamente 20 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el dominio efector tiene desde aproximadamente 10 nucleótidos hasta aproximadamente 15 nucleótidos de longitud. El dominio U1 se puede hibridar con ARNnp de U1, particularmente el extremo 5' y más específicamente los nucleótidos 2-11. En algunas realizaciones, el dominio U1 es perfectamente complementario a los nucleótidos 2-11 del ARNnp de U1 endógeno. En algunas realizaciones, el dominio U1 comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 (5'- GCCAGGIL1AAGUAU-3'), SEQ ID NO: 2 (5"-CCAGGLIAA.GUAII-3"), SEQ ID NO: 4 (5"-CAGGUAAGUAU-3'), SEQ ID NO: 5 (52-CAGGLIAAGU-3'), SEQ ID NO: 6 (5'-- CM,16ITAAC1-3') y SEQ ID NO: 7 (5'-CAGG1IA2=',,3'). En algunas realizaciones, el dominio III comprende una secuencia de nucleótidos, SEQ ID NO: 8 (5"-CAGGUAAGUA-3"). Sin desear quedar ligado a teoría, el aumento de la longitud del dominio U1 para incluir el emparejamiento de bases en el tallo 1 y/o el emparejamiento de bases con respecto a la posición 1 del ARNnp de U1 mejora la afinidad del adaptador de U1 por el ARNnp de U1.
Los dominios de hibridación y efectores del adaptador U1 pueden unirse de forma que el dominio efector esté en el extremo 5' y/o extremo 3' del dominio de hibridación. Los dos dominios pueden estar unidos de forma que el extremo 3' de un dominio se una al extremo 5' del otro dominio, o el extremo 3' de un dominio se una al extremo 3' del dominio, o el extremo 5' de un dominio se una al extremo 5' del otro dominio. Los dominios de hibridación y efectores pueden unirse directamente entre sí o por un conector basado en nucleótidos o no nucleótidos. En algunas realizaciones, un conector está basado en nucleótidos y comprende 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, hasta 15, hasta 20, o hasta 25 nucleótidos.
En algunas realizaciones, un conector entre un dominio de hibridación y un dominio efector es multivalente, por ejemplo, trivalente, tetravalente, pentavalente. Sin desear quedar ligado a teoría, un conector multivalente se puede usar para unir juntos un dominio de hibridación único con una pluralidad de dominios de adaptador.
En algunas realizaciones, un conector U1 comprende cualquier modificación de oligonucleótido descrita en el presente documento. Dichas modificaciones a modo de ejemplo incluyen aquellas que aumentan la afinidad de hibridación, especificidad, biodisponibilidad en la célula y organismo, transporte celular y/o nuclear, estabilidad, y/o resistencia a la degradación. En algunas realizaciones, el adaptador U1 se puede administrar en combinación con al menos otro agente de iARN.
Activadores de ARN
En algunas realizaciones, las composiciones proporcionadas incluyen uno o más oligonucleótidos que son o actúan de activadores de ARN.
Estudios recientes han descubierto que el ARNbc también puede activar la expresión génica, un mecanismo que se ha denominado "activación génica inducida por ARN pequeño" o aARN. Véase, por ejemplo, Li, L.C. et al. Proc Natl Acad Sci U S A. (2006), 103(46): 17337-42 y Li L.C. (2008). "Small RNAMediated Gene Activation". RNA and the Regulation of Gene Expression: A Hidden Layer of Complexity. Caister Academic Press. ISBN 978-1-904455-25-7. Se ha mostrado que los promotores génicos que se dirigen a ARNbc inducen una potente activación transcripcional de genes asociados. También se ha encontrado miARN endógeno que causa aARN en seres humanos. Check E. Nature (2007). 448 (7156): 855-858.
Otra observación es que la activación génica por aARN es duradera. Se ha observado la inducción de expresión génica durante más de diez días. El efecto prolongado de aARN se podría atribuir a cambios epigenéticos en sitios diana de ARNbc.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado es un activador de ARN, en donde un oligonucleótido proporcionado aumenta la expresión de un gen. En algunas realizaciones, la elevada expresión génica inhibe la viabilidad, el desarrollo de crecimiento y/o la reproducción.
ARN no codificantes (ARNnc)
La presente divulgación engloba ARN no codificantes, tales como ARN no codificantes largos (ARNncl) y ARN no codificantes cortos (ARNncc).
Por consiguiente, las composiciones de oligonucleótidos proporcionadas de la presente divulgación pueden ser útiles para modular ARN no codificante largo asociado a enfermedad. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos sintetizados según los métodos proporcionados en el presente documento se usan para bloquear específicamente la unión de complejos represores transcripcionales a regiones de ARNncl diana, por lo que se induce la expresión del gen diana asociado. En algunas realizaciones, el complejo represor transcripcional es un factor de silenciamiento. En algunas realizaciones, el complejo represor transcripcional tiene actividad de metiltransferasa de histona. En algunas realizaciones, el complejo represor transcripcional metila histona H3. En algunas realizaciones, el complejo represor transcripcional es PRC2 (complejo represivo Polycomb 2).
Se ha informado que ciertos ARNncl asociados a PRC2 son posibles dianas terapéuticas y/o biomarcadores (Zhao et al., 2010. "Genome-wide Identification of Polycomb-Associated RNAs by RIP-seq" Molecular Cell 40: 939-53). La expresión en exceso de proteínas PCR2 se ha asociado a diversos tipos de cáncer, que incluye cáncer de próstata y de mama metastásico, y cánceres de colon, mama e hígado. Se descubrió que la inhibición farmacológica de la represión génica mediada por PRC2 inducía la apoptosis en varias estirpes celulares de cáncer in vitro, pero no en diversos tipos de células normales. La inducción de la apoptosis en este sistema depende de la reactivación de genes que habían sido reprimidos por PRC2. También es evidencia que la represión génica mediada por PRC2 se puede unir al mantenimiento de las propiedades de células madre de células madre de cáncer. Estos resultados sugieren que al menos en algunos casos, la inhibición de la represión génica mediada por PRC2 -que incluye por direccionamiento de ARNncl que reclutan PRC2 a genes críticos- es una posible estrategia para tratar diversos tipos de cáncer. Secuencias no limitantes de ácidos nucleicos, que se pueden preparar según los métodos proporcionados en el presente documento, se pueden encontrar en, por ejemplo, la publicación de patente internacional WO 2012/065143 titulada "Polycomb-associated non-coding RNAs" (pCt /US2011/60493).
Las composiciones de oligonucleótidos proporcionadas de la presente divulgación pueden ser o actuar de ARN no codificantes pequeños, tales como ARN de interacción con piwi (ARNip). Los ARNip representan la clase más grande de moléculas de ARN no codificante pequeño que se expresa en células de animales y se encuentran en grupos en todo el genoma. Se conoce que los ARNip forman complejos de ARN-proteína mediante interacciones con proteínas piwi. Los complejos de ARNip participan en tanto el silenciamiento génico epigenético como postranscripcional de retrotransposones y otros elementos genéticos en células germinativas, que incluyen la espermatogénesis. Normalmente, los ARNip tienen 26-31 nucleótidos de longitud, y, en comparación con los miARN típicos, carecen de conservación de secuencias y presentan mayor complejidad. En algunas realizaciones, las composiciones de oligonucleótidos utilizadas según la presente divulgación comprenden 5' uridina. En algunas realizaciones, las composiciones de oligonucleótidos utilizadas según la presente divulgación comprenden 5' monofosfato y una modificación en 3' que actúa bloqueando el oxígeno en 2' o 3'. En algunas realizaciones, la modificación en 3' es una 2'-O-metilación.
Oligonucleótidos formadores de triplex
En algunas realizaciones, las composiciones proporcionadas incluyen uno o más oligonucleótidos que son o actúan de oligonucleótidos formadores de tríplex.
Estudios recientes han mostrado que se pueden diseñar oligonucleótidos formadores de tríplex (TFO) que pueden reconocer y unirse a regiones de polipurina/polipirimidina en ADN helicoidal bicatenario en un modo específico de secuencia. Estas reglas de reconocimiento se resumen por Maher III, L.J., et al., Science (1989) vol. 245, pp 725-730; Moser, H. E., et al., Science (1987) vol. 238, pp 645- 630; Beal, P.A., et al., Science (1992) vol. 251, pp 1360-1363; Conney, M., et al., Science (1988) vol. 241, pp 456-459 y Hogan, M.E., et al., publicación EP 375408. La modificación de los oligonucleótidos, tales como la introducción de intercaladores y sustituciones de enlace interazúcar, y la optimización de condiciones de unión (pH y concentración de catión) han ayudado a vencer obstáculos inherentes a la actividad de TFO, tales como repulsión de cargas e inestabilidad, y se mostró recientemente que los oligonucleótidos pueden ser dirigidos a secuencias específicas (para una revisión reciente véase Seidman y Glazer, Clin Invest 2003 2.:487-94). En general, el oligonucleótido formador de tríplex tiene la correspondencia de secuencia:
oligonucleótido 3'-A G G T
dúplex 5'-A G C T
dúplex 3'-T C G A
Sin embargo, se ha mostrado que los tripletes A-AT y G-GC tienen la mayor estabilidad helicoidal triple (Reither y Jeltsch, BMC Biochem, 2002, Sept12, Epub). Los mismos autores han demostrado que los TFO diseñados según la regla A-AT y G-GC no forman tríplex no específicos, que indica que la formación de tríplex es de hecho específica de secuencia. Por lo tanto, para una secuencia dada, se puede concebir una secuencia formadora de tríplex para cualquier secuencia dada. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos formadores de tríplex tienen al menos aproximadamente 15, aproximadamente 25, o aproximadamente 30 o más nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos formadores de tríplex son de hasta aproximadamente 50 o aproximadamente 100 nucleótidos de longitud.
La formación de la estructura helicoidal triple con el ADN diana induce cambios estéricos y funcionales, bloqueando la iniciación de la transcripción y elongación, lo que permite la introducción de cambios de secuencia deseados en el ADN endógeno y que dan como resultado la regulación por disminución específica de la expresión génica. Los ejemplos de dicha supresión de la expresión génica en células tratadas con TFO incluyen la inactivación de genes supFGI episómicos y HPRT endógenos en células de mamífero (Vasquez et al., Nucl Acids Res. 1999;27: 1176-81, y Puri, et al, J Biol Chem, 2001 ;276:28991 -98), y la regulación por disminución específica de secuencia y de diana de la expresión del factor de transcripción Ets2, importante en la etiología del cáncer de próstata (Carbone, et al., Nucl Acid Res. 2003 ;31:833-43) y el gen ICAM-I proinflamatorio (Besch et al, J Biol Chem, 2002;277:32473-79). Además, Vuyisich y Beal han mostrado recientemente que los TFO específicos de secuencia pueden unirse a ARNbc, que inhibe la actividad de enzimas dependientes de ARNbc, tales como cinasas dependientes de ARN (Vuyisich y Beal, Nuc. Acids Res 2000;28:2369-74).
Además, los TFO diseñados según los principios mencionados anteriormente pueden inducir mutagénesis dirigidas capaces de efectuar la reparación de ADN, proporcionándose así tanto la regulación por disminución como la regulación por incremento de la expresión de genes endógenos (Seidman y Glazer, JInvest 2003; 112:487-94). La descripción detallada del diseño, la síntesis y la administración de TFO eficaces se puede encontrar, véanse, las solicitudes de patente N.° 2003017068 y 20030096980 a Froehier et al. y 2002012821/8 y 20020123476 a Emanude et al., y la patente de EE. UU. N.° 5.721.138 a Lawn, cuyos contenidos se incorporan en el presente documento en sus totalidades.
Conjugados/ conectares
La divulgación también contempla que los oligonucleótidos utilizados, en algunas realizaciones, sean optimizados para captación celular. En cualquier oligonucleótido utilizado englobado por la presente divulgación, se pueden unir cadenas guía y/o pasajeras a un conjugado. En algunas realizaciones, el conjugado es hidrófobo. El conjugado hidrófobo puede ser una molécula pequeña con un coeficiente de reparto que es superior a 10. El conjugado puede ser una molécula de tipo esterol, tal como colesterol, o una molécula con un elevada longitud de cadena de policarbono unida a C17, y la presencia de un conjugado puede influir en la capacidad de una molécula de ARN para ser llevada a una célula con o sin un reactivo de transfección de lípidos. El conjugado se puede unir a la cadena pasajera o guía a través de un conector hidrófobo. En algunas realizaciones, un conector hidrófobo tiene 5-12C de longitud, y/o está basado en hidroxipirrolidina. En algunas realizaciones, un conjugado hidrófobo se une a la cadena pasajera y los restos CU de cualquiera de la cadena pasajera y/o guía se modifican. En algunas realizaciones, al menos el 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de los restos CU en la cadena pasajera y/o la cadena guía se modifican. En algunos aspectos, las moléculas asociadas a la divulgación son autoadministrantes (sd). Como se usa en el presente documento, la "autoadministración" se refiere a la capacidad de una molécula para ser administrada en una célula sin la necesidad de un vehículo de administración adicional, tal como un reactivo de transfección. Los aspectos de la divulgación se refieren a la selección de moléculas para su uso en iARN.
En cualquiera de las realizaciones englobadas en el presente documento, los oligonucleótidos utilizados se pueden asociar a un resto hidrófobo para el direccionamiento y/o la administración de la molécula a una célula. En algunas realizaciones, el resto hidrófobo está asociado con la molécula del ácido nucleico a través de un conector. En algunas realizaciones, la asociación es a través de interacciones no covalentes. En algunas otras, la asociación es a través de un enlace covalente. Se puede usar cualquier conector conocido en la técnica para asociar el ácido nucleico con el resto hidrófobo. Los conectores conocidos en la técnica se describen en las solicitudes PCT internacionales publicadas WO 92/03464, WO 95/23162, WO 2008/021157, WO 2009/021157, WO 2009/134487, WO 2009/126933, publicación de solicitud de patente de EE. UU. 2005/0107325, patente de EE. UU. 5.414.077, patente de EE. UU. 5.419.966, patente de EE. Uu .5.512.667, patente de EE. UU. 5.646.126 y patente de EE. UU. 5.652.359. El conector puede ser tan simple como un enlace covalente con un conector de múltiples átomos. El conector puede ser cíclico o acíclico. El conector se puede sustituir opcionalmente. En algunas realizaciones, el conector es capaz de ser escindido del ácido nucleico. En ciertas realizaciones, el conector es capaz de ser hidrolizado en condiciones fisiológicas. En algunas realizaciones, el conector es capaz de ser escindido por una enzima (por ejemplo, una esterasa o fosfodiesterasa). En algunas realizaciones, el conector comprende un elemento espaciador para separar el ácido nucleico del resto hidrófobo. El elemento espaciador puede incluir de uno a treinta átomos de carbono o heteroátomos. En ciertas realizaciones, el conector y/o elemento espaciador comprende grupos funcionales protonables. Dichos grupos funcionales protonables pueden promover el escape endosómico de la molécula del ácido nucleico. Los grupos funcionales protonables también pueden ayudar en la administración del ácido nucleico a una célula, por ejemplo, la neutralización de la carga global de la molécula. En algunas realizaciones, el conector y/o elemento espaciador es biológicamente inerte (es decir, no confiere actividad biológica o función a la molécula del ácido nucleico resultante).
La molécula hidrófoba se puede conectar al polinucleótido por un resto conector. Opcionalmente, el resto conector es un resto conector no nucleotídico. Los conectores no nucleotídicos son, por ejemplo, restos abásicos (dSpacer), oligoetilenglicol, tal como trietilenglicol (espaciador 9) o hexaetilengilcol (espaciador 18), o alcanodiol, tal como butanodiol. Las unidades espaciadoras se unen preferentemente por enlaces fosfodiéster o fosforotioato. Las unidades conectoras pueden aparecer solo una vez en la molécula o se pueden incorporar varias veces, por ejemplo, por enlaces fosfodiéster, fosforotioato, metilfosfonato o amida.
Los protocolos de conjugación típicos implican la síntesis de polinucleótidos que llevan un aminoconector a una o más posiciones de la secuencia, sin embargo, no se requiere un conector. El grupo amino se hace reaccionar entonces con la molécula que se conjuga usando reactivos de acoplamiento o activación apropiados. La reacción de conjugación se puede realizar o con el polinucleótido todavía unido a un soporte sólido, o tras la escisión del polinucleótido en fase de disolución. La purificación del polinucleótido modificado por HPLC da como resultado normalmente un material puro.
En algunas realizaciones, un grupo de enlace se puede unir a un nucleomonómero y el péptido transportador se puede unir covalentemente al conector. En algunas realizaciones, un conector puede servir tanto de un sitio de unión para un péptido transportador como puede proporcionar estabilidad contra nucleasas. Los ejemplos de conectores adecuados incluyen cadenas de alquilo C1-C20 sustituido o sin sustituir, cadenas de alquenilo C2-C20, cadenas de alquinilo C2-C20, péptidos y heteroátomos (por ejemplo, S, O, NH, etc.). Otros conectores a modo de ejemplo incluyen agentes de reticulación bifuncionales, tales como sulfosuccinimidil-4-(maleimidofenil)-butirato (SMPB) (véase, por ejemplo, Smith et al. Biochem J 1991,276: 417-2).
En algunas realizaciones, los oligonucleótidos proporcionados de la divulgación se sintetizan como conjugados moleculares que utilizan mecanismos endocitóticos mediados por receptor para administrar genes en células (véase, por ejemplo, Bunnell et al. 1992. Somatic Cell and Molecular Genetics. 18:559, y las referencias citadas en su interior).
Agentes de direccionamiento
En algunas realizaciones, las composiciones proporcionadas incluyen uno o más agentes de direccionamiento, asociados a la composición y/o con oligonucleótidos individuales en ellas. Ejemplos de dichos agentes de direccionamiento se han descrito anteriormente y más adelante en el presente documento. Las expresiones "agente de direccionamiento" y "resto de direccionamiento" se usan en el presente documento indistintamente.
La administración de oligonucleótidos y/o composiciones de los mismos puede mejorar frecuentemente por el direccionamiento de los oligonucleótidos a un receptor celular. Los restos de direccionamiento se pueden conjugar con los oligonucleótidos o unir a un grupo portador (es decir, poli(L-lisina) o liposomas) unido a los oligonucleótidos. Este método es muy apto para las células que muestran endocitosis mediada por receptor específico.
Por ejemplo, los conjugados de oligonucleótido con proteínas 6-fosfomanosiladas son internalizadas 20 veces más eficientemente por células que expresan receptores específicos de manosa 6-fosfato que oligonucleótidos libres. Los oligonucleótidos también se pueden acoplar a un ligando para un receptor celular usando un conector biodegradable. En otro ejemplo, la construcción de administración es estreptavidina manosilada que forma un complejo compacto con oligonucleótidos biotinilados. Se encontró que la estreptavidina manosilada aumentaba 20 veces la internalización de oligonucleótidos biotinilados (Vlassov et al. 1994. Biochimica et Biophysica Acta 1197:95-108).
El campo de la interferencia por ARN ha revolucionado el estudio de los procesos biológicos. Estas herramientas incluyen ARN inhibidor pequeño (ARNip), ARN de horquilla pequeña (ARNhp) y ribozimas. Como la interferencia por tecnología de ARN ha crecido, así lo ha hecho la lista de secuencias diana de ARN validadas y reactivos para su uso. Las composiciones proporcionadas y los métodos englobados por la presente divulgación pueden ser fácilmente aplicados a cada una de dichas secuencias diana. Para una base de datos de secuencias diana de ARNip validada y enlaces a kits y reactivos que se pueden usar para experimentos de interferencia por ARN, véase, por ejemplo, http://www.rnainterference.org/index.html. Secuencias diana de ARNip a modo de ejemplo útiles para la presente divulgación se proporcionan en el Apéndice (A) adjunto.
Oligonucleótidos inmunomoduladores
En algunas realizaciones, las composiciones proporcionadas incluyen uno o más oligonucleótidos que son o actúan de oligonucleótidos inmunomoduladores.
Lo oligonucleótidos utilizados según la divulgación pueden ser agentes inmunomoduladores, es decir, agentes que son capaces de modular o regular una respuesta inmunitaria cuando se administran a un sujeto. Las respuestas inmunitarias provocadas por dicho agente pueden ser una respuesta inmunitaria innata y/o adaptativa. El sistema inmunitario se divide en un sistema inmunitario más innato, y sistema inmunitario adaptativo adquirido de vertebrados, dividiéndose el último además en componentes celulares humorales. En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria puede ser mucosa. Los motivos inmunomoduladores descritos en el presente documento se pueden usar en el contexto de las clases previamente descritas de oligonucleótidos inmunomoduladores que incluyen clases de ODN, tales como la clase A, la clase B, la clase C, la clase E, la clase T y la clase P.
En algunas realizaciones de la divulgación, los oligonucleótidos inmunomoduladores utilizados según la presente divulgación incluyen uno o más motivos inmunoestimuladores. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos utilizados según la presente divulgación incluyen uno o más ''dinucleótidos CpG". Un dinucleótido CpG puede estar metilado o sin metilar. Un oligonucleótido inmunoestimulante que contiene al menos un dinucleótido CpG sin metilar es una molécula de oligonucleótido que contiene una secuencia de dinucleótidos de citosina-guanina sin metilar (es decir, una 5' citidina sin metilar seguida por 3' guanosina y unida por un enlace fosfato) y que activa el sistema inmunitario; dicho oligonucleótido inmunoestimulante es un oligonucleótido CpG. Los oligonucleótidos CpG se han descrito en varias patentes concedidas, solicitudes de patente publicadas y otras publicaciones, que incluyen: las patentes de EE. UU. N.26.194.388; 6.207.646; 6.214.806; 6.218.371; 6.239.116; y 6.339.068. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos utilizados son o actúan de un agonista para un receptor del tipo toll. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos utilizados son o actúan de un agonista para el receptor del tipo toll 9 (TLR9). En algunas realizaciones, los oligonucleótidos utilizados son o actúan de un antagonista para un receptor del tipo toll. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos utilizados son o actúan de un antagonista para el receptor del tipo toll 9 (TLR9). En algunas realizaciones, los oligonucleótidos estereodefinidos englobados por la divulgación presentan mayor afinidad por receptor/diana respectivo, en comparación con un homólogo estereoaleatorio. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos estereodefinidos englobados por la divulgación provocan una o más respuestas inmunitarias, cuando se administran a sujetos que cumplen ciertos criterios clínicos, con menos grado de variables entre la población, en comparación con el homólogo estereoaleatorio. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos estereodefinidos englobados por la divulgación provocan menos grado de efectos secundarios tóxicos o menos efectos secundarios, cuando se administran a sujetos que cumplen ciertos criterios clínicos, en comparación con el homólogo estereoaleatorio.
En algunas realizaciones, los oligonucleótidos inmunoestimulantes utilizados según la presente divulgación están libres de motivos de dinucleótidos CpG. Estos oligonucleótidos que están libres de dinucleótidos CpG se denominan oligonucleótidos no de CpG, y tienen motivos inmunoestimulantes no de CpG. En algunas realizaciones, estos son oligonucleótidos inmunoestimulantes ricos en T, tales como oligonucleótidos que tienen al menos 80 % de T.
En algunas realizaciones, los oligonucleótidos inmunoestimulantes utilizados según la presente divulgación son oligonucleótidos inmunomoduladores de la clase B.
Los ODN de "clase B" son potentes en la activación de linfocitos B, pero son relativamente débiles en la inducción de la activación de IFN-a y de células NK. Los oligonucleótidos CpG de la clase B están normalmente completamente estabilizados e incluyen un dinucleótido CpG sin metilar dentro de ciertos contextos de bases preferidos. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. N.26.194.388; 6.207.646; 6.214.806; 6.218.371; 6.239.116; y 6.339.068.
Otra clase es potente para inducir la activación de IFN-a y células NK, pero es relativamente débil en la estimulación de linfocitos B; esta clase se ha denominado la "clase A". En algunas realizaciones, los oligonucleótidos inmunoestimulantes utilizados según la presente divulgación son oligonucleótidos inmunomoduladores de clase A. Los oligonucleótidos CpG de clase A tienen normalmente secuencias de poli-G estabilizadas en los extremos 5' y 3' y una secuencia que contiene dinucleótidos CpG de fosfodiéster palindrómicos de al menos 6 nucleótidos. Véase, por ejemplo, la solicitud de patente publicada PCT/US00/26527 (WO 01/22990).
Aún otra clase de oligonucleótidos CpG activa linfocitos B y células NK e induce IFN-a; esta clase se ha denominado la clase C. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos inmunoestimulantes utilizados según la presente divulgación son oligonucleótidos inmunomoduladores de la clase C. Los oligonucleótidos inmunoestimulantes de la "clase C" contienen al menos dos motivos distintos que tienen efectos estimulantes únicos y deseables sobre las células del sistema inmunitario. Algunos de estos ODN tienen tanto una secuencia de CpG "estimulante" tradicional como un motivo "rico en GC" o "neutralizante de linfocitos B". Estos oligonucleótidos de motivos de combinación tienen efectos inmunoestimulantes que se encuentran en cualquier parte entre los efectos asociados a ODN de CpG de "clase B" tradicionales, que son fuertes inductores de la activación de linfocitos B y la activación de células dendríticas (DC), y los efectos asociados a una clase más recientemente descrita de oligonucleótidos inmunoestimulantes (ODN de CpG de "clase A") que son fuertes inductores de la activación de IFN-a y linfocitos citolíticos naturales (NK), pero inductores relativamente malos de la activación de linfocitos B y DC. Krieg AM et al. (1995) Nature 374:546-9; Ballas ZK et al. (1996) J Immunol 157:1840-5; Yamamoto S et al. (1992) J Immunol 48:4072-6. Mientras que los ODN de CpG de clase B tienen frecuentemente esqueletos de fosforotioato y los ODN de CpG de clase A preferidos tienen esqueletos mixtos o quiméricos, la clase C de oligonucleótidos inmunoestimulantes de motivo de combinación pueden tener esqueletos estabilizados, por ejemplo, de fosforotioato, quiméricos, o de fosfodiéster, y en algunas realizaciones preferidas, tienen esqueletos semiblandos. Esta clase se ha descrito en la solicitud de patente de EE. UU. USI 0/224.523 presentada el 19 de agosto de 2002.
En algunas realizaciones, los oligonucleótidos inmunoestimulantes utilizados según la presente divulgación son oligonucleótidos inmunoestimulantes de clase E. Los oligonucleótidos de "clase E" tienen una capacidad potenciada para inducir la secreción de IFN-alfa. Estos ODN tienen un análogo de nucleótido sustituido lipófilo 5' y/o 3' de un motivo YGZ. El compuesto de la fórmula de la clase E puede ser, por ejemplo, cualquiera de los siguientes análogos de nucleótidos sustituidos lipófilos: una pirimidina sustituida, un uracilo sustituido, un análogo de T hidrófobo, un tolueno sustituido, un imidazol o pirazol sustituido, un triazol sustituido, 5-cloro-uracilo, 5-bromo-uracilo, 5-yodouracilo, 5-etil-uracilo, 5-propil-uracilo, 5-propinil-uracilo, (E)-5-(2-bromovinil)-uracilo o 2,4-difluoro-tolueno. Los oligonucleótidos de clase E se describen al menos en la solicitud de patente provisional US 60/847.811.
En algunas realizaciones, los oligonucleótidos inmunoestimulantes utilizados según la presente divulgación son oligonucleótidos inmunomoduladores de clase T. Los oligonucleótidos de "clase T" inducen la secreción de niveles más bajos de IFN-alfa cuando no están modificados como en los ODN de la divulgación y las citocinas y quimiocinas relacionadas con IFN que los oligonucleótidos de clase B o clase C, mientras que retienen la capacidad de inducir niveles de IL-10 similares a los oligonucleótidos de clase B. Los oligonucleótidos de clase T se describen al menos en la solicitud de patente de EE. UU. N.° 11/099.683.
En algunas realizaciones, los oligonucleótidos inmunoestimulantes utilizados según la presente divulgación son oligonucleótidos inmunomoduladores de la clase P. Los oligonucleótidos inmunoestimulantes de "clase P" tienen varios dominios, que incluyen un dominio de activación de 5TLR, 2 regiones de formación de dúplex y un espaciador opcional y cola en 3'. Esta clase de oligonucleótidos tiene la capacidad en algunos casos de inducir niveles mucho mayores de secreción de IFN-a que la clase C. Los oligonucleótidos de clase P tienen la capacidad de autoensamblarse espontáneamente en concatámeros, ya sea in vitro y/o in vivo. Sin desear quedar ligado a teoría particular alguna para el método de acción de estas moléculas, una posible hipótesis es que esta propiedad dota a los oligonucleótidos de clase P de la capacidad de reticular más altamente TLR9 en el interior de ciertas células inmunitarias, induciendo un patrón distinto de activación inmune en comparación con las clases previamente descritas de oligonucleótidos CpG. La reticulación de receptores TLR9 puede inducir una activación más fuerte de la secreción de IFN-a a través del bucle de retroalimentación de IFNR de tipo I en células dendríticas plasmacitoides. Los oligonucleótidos de clase P se describen al menos en la solicitud de EE. UU. número de serie 11/706.561.
En algunas realizaciones, los oligonucleótidos inmunoestimulantes utilizados según la presente divulgación son oligonucleótidos inmunomoduladores de la clase S. Los oligonucleótidos inmunomoduladores de la presente divulgación pueden ser oligonucleótidos inmunosupresores. Los motivos inmunomoduladores descritos anteriormente se pueden usar en el contexto de las clases previamente descritas de oligonucleótidos inmunosupresores que incluyen clases de ODN tales como la "clase S ". Los ODN inhibidores, o de clase S, son útiles siempre que sea conveniente inhibir la inmunoestimulación. Los ODN inhibidores se pueden usar para prevenir y tratar choque séptico, inflamación, alergia, asma, rechazo del injerto, enfermedad injerto contra huésped (GvHD), enfermedades autoinmunitarias, enfermedades mediadas por Th1 o Th2, infecciones bacterianas, infecciones parasíticas, abortos espontáneos y tumores. El ODN inhibidor se puede usar, en general, para inhibir la activación de todas las células que expresan las TLR relevantes, y más específicamente para inhibir la activación de células presentadoras de antígeno, linfocitos B, células dendríticas plasmacitoides (pDCs), monocitos, células derivadas de monocitos, eosinófilos y neutrófilos. Los ODN de clase S se describen además al menos en la solicitud de EE. UU. N.° de serie 10/977.560.
Según la divulgación, los oligonucleótidos inmunomoduladores pueden tener un esqueleto de enlaces internucleotídicos estabilizados, además del (de los) nucleótido(s) de purina FANA estabilizantes, o tener un esqueleto quimérico de enlaces nucleotídicos estabilizados y de fosfodiéster. Un "enlace internucleotídico estabilizado" debe significar un enlace internucleotídico que es relativamente resistente a la degradación in vivo (por ejemplo, por una exo- o endo-nucleasa), en comparación con un enlace internucleotídico de un fosfodiéster. En algunas realizaciones, los enlaces internucleotídicos estabilizados incluyen, sin limitación, fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato, metilfosforotioato, fosfonoacetato, Rp-fosforotioato, Sp-fosforotioato, boranofosfato o 3'-tioformacetal, o combinaciones de los mismos. Otros oligonucleótidos estabilizados incluyen: análogos no iónicos de ADN, tales como alquil- y aril-fosfatos (en los que el oxígeno cargado del fosfonato está sustituido por un grupo alquilo o arilo), fosfodiéster y alquilfosfotriésteres, en los que el resto oxígeno cargado está alquilado. También se ha mostrado que los oligonucleótidos que contienen diol, tales como tetraetilenglicol o hexaetilenglicol, en cualquiera o ambos extremos, son sustancialmente resistentes a la degradación por nucleasas.
Como se describe en más detalle en el presente documento, según el método inventivo, estas y otras modificaciones pueden ser introducidas selectivamente en una posición(s)/patrón (patrones) predeterminados dentro de un oligonucleótido para obtener una molécula de oligonucleótido estereoespecífica. Además, según el método inventivo, se puede obtener una composición que comprende una pluralidad de dichos oligonucleótidos en un grado de pureza extremadamente alto (por ejemplo, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, esencialmente 100 %). Por lo tanto, las composiciones de oligonucleótidos proporcionadas que comprenden oligonucleótidos de uno o más tipos predeterminados son adecuadas para la administración in vivo. Se contempla que, debido al alto grado de pureza estructural de los oligonucleótidos en una composición (de forma que una composición comprenda un único tipo especificado de oligonucleótidos), las composiciones proporcionadas pueden provocar actividades biológicas mejoradas, aumento de la eficacia, variables reducidas en la respuesta y/o efectos secundarios no deseados reducidos, cuando se administran a sujetos.
Por consiguiente, los oligonucleótidos utilizados de la divulgación son particularmente útiles como un agente terapéutico cuando se formulan en una composición farmacéutica. En algunas realizaciones, dicho agente terapéutico es un agente inmunomodulador. En algunas realizaciones, los agentes inmunomoduladores proporcionados son agentes inmunoestimulantes. En algunas realizaciones, los agentes inmunomoduladores proporcionados son agentes inmunoinhibidores (o inmunosupresores). En algunas realizaciones, los agentes inmunomoduladores proporcionados actúan de adyuvante. En algunas realizaciones, los agentes inmunomoduladores proporcionados pueden cambiar una respuesta inmunitaria de tipo Th2 a una respuesta inmunitaria de tipo Th1 induciendo citocinas de tipo Th1 que pueden suprimir la respuesta inflamatoria de Th2. En algunas realizaciones, las composiciones de oligonucleótidos proporcionadas son útiles como un agente que regula la expresión génica. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las composiciones de oligonucleótidos proporcionadas son útiles como un agente capaz de silenciar un gen de interés, por ejemplo, genes asociados a enfermedad o trastorno. En algunas realizaciones, las composiciones de oligonucleótidos proporcionadas son útiles como un agente para regular el corte y empalme de ARN.
Por ejemplo, algunas realizaciones de dichos oligonucleótidos incluyen las que comprenden al menos un motivo de dinucleótido CpG. En algunas realizaciones, dichos oligonucleótidos comprenden al menos un motivo de dinucleótido CpG sin metilar. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos que contienen CpG útiles para la presente divulgación se clasifican como oligonucleótidos de clase A (tipo D). En algunas realizaciones, los oligonucleótidos que contienen CpG útiles para la presente divulgación se clasifican como oligonucleótidos de clase B (tipo K). En algunas realizaciones, los oligonucleótidos que contienen CpG útiles para la presente divulgación se clasifican como oligonucleótidos de clase C. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos que contienen CpG útiles para la presente divulgación se clasifican como oligonucleótidos de clase P. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos que contienen CpG útiles para la presente divulgación contienen al menos una secuencia palindrómica. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos que contienen CpG útiles para la presente divulgación pueden formar una estructura de "tipo mancuerna". En algunas realizaciones, los oligonucleótidos que contienen CpG útiles para la presente divulgación pueden formar una estructura en forma de "Y", o multímeros de los mismos. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos que contienen CpG útiles para la presente divulgación pueden formar una estructura tetraédrica. Para revisiones, véase, por ejemplo: Bode et al. (2011) Expert Rev. Vaccines 10(4): 499-511; Hanagata (2012) Int. J. Nanomedicine 7:2181-95.
En algunas realizaciones, los oligonucleótidos utilizados según la presente divulgación provocan efectos inmunomoduladores sobre células que expresan receptor(es) del tipo toll. En algunas realizaciones, las células diana que responden a dichos oligonucleótidos incluyen, pero no se limitan a, células presentadoras de antígenos (CPA), linfocitos T y B específicos de antígeno, linfocitos T citotóxicos (CTL), linfocitos citolíticos naturales (NK) y células dendríticas (DC). En algunas realizaciones, los efectos inmunomoduladores son los efectos directos provocados por células que expresan un receptor o receptores que reconocen dicho oligonucleótido. En algunas realizaciones, dichos oligonucleótidos provocan efectos inmunomoduladores sobre células que expresan el receptor del tipo toll 9 (TLR9) como ligandos. Por ejemplo, algunas realizaciones de la divulgación incluyen oligonucleótidos CpG que actúan como agonistas de uno o más receptores del tipo toll. Algunas realizaciones de la divulgación incluyen oligonucleótidos CpG que actúan de antagonistas de uno o más receptores del tipo toll. En algunas realizaciones, los efectos inmunomoduladores son efectos indirectos que ocurren aguas abajo, que implican a células que no responden necesariamente directamente a dichos oligonucleótidos o expresan dichos receptores.
En algunas realizaciones, los oligonucleótidos CpG útiles para la presente divulgación se caracterizan porque activan directamente linfocitos B humanos y células dendríticas plasmacitoides mediante TLR-9. En algunas realizaciones, los oligodesoxinucleótidos de CpG útiles para la presente divulgación se caracterizan porque soportan indirectamente la maduración y proliferación de linfocitos citolíticos espontáneos, linfocitos T y monocitos/macrófagos.
En algunas realizaciones, los oligonucleótidos CpG útiles para la presente divulgación desencadenan una respuesta inmunitaria, que se caracteriza por la producción de citocinas de tipo Th1 y proinflamatorias, quimiocinas e IgM polirreactiva.
En algunas realizaciones, los oligonucleótidos CpG útiles para la presente divulgación se caracterizan porque la inmunogenicidad de antígenos de proteína convencionales y vacunas basadas en péptidos se potencia por dichos oligonucleótidos. Sin desear quedar ligado a teoría particular, se cree que dicho efecto adyuvante está mediado por una función mejorada de células presentadoras de antígenos profesionales y la generación resultante de respuestas inmunitarias humorales y celulares específicas de antígeno.
En algunas realizaciones, los oligonucleótidos CpG útiles para la presente divulgación se caracterizan porque los oligonucleótidos CpG aumentan la magnitud y aceleran el desarrollo de respuestas inducidas por vacunas. También mejoran la inducción de memoria, prolongando así la duración de la inmunidad humoral y celular.
En algunas realizaciones, los oligonucleótidos CpG útiles para la presente divulgación se caracterizan porque refuerzan la inmunidad en grupos de sujetos (por ejemplo, poblaciones de pacientes) con función inmunitaria reducida, tales como los ancianos y aquellos con sistema inmunitario suprimido. Son eficaces cuando se administran ya sea por vía sistémica o por vía mucosa. Ensayos preclínicos y clínicos usando oligonucleótidos CpG de quiralidad mixta (por ejemplo, no quiralmente puros) demuestran que los oligonucleótidos CpG pueden reforzar la inmunogenicidad de vacunas que se dirigen a enfermedades infecciosas y al cáncer. Además, los ensayos clínicos indican que los oligonucleótidos de CpG son razonablemente seguros cuando se administran como adyuvantes de vacuna.
Los oligonucleótidos inmunomoduladores preparados según la presente divulgación son útiles para varias aplicaciones terapéuticas. Por lo tanto, los oligonucleótidos inmunomoduladores utilizados se pueden formular en composiciones farmacéuticas adecuadas. Dichas composiciones farmacéuticas se pueden administrar a un sujeto en una cantidad eficaz para tratar una enfermedad, trastorno o afección, como se describe en detalle adicional en el presente documento, por vías de administración adecuadas. Según la divulgación, una cantidad eficaz de los oligonucleótidos inmunoestimulantes se puede administrar a un sujeto que es probable que se beneficie del refuerzo del sistema inmunitario (por ejemplo, respuesta inmunitaria potenciada). En algunas realizaciones, se confieren beneficios clínicos directamente por un oligonucleótido inmunomodulador que actúa sobre sus células inmunitarias diana, por ejemplo, por unión del ligando a sus proteínas de receptor del tipo toll. En algunas realizaciones, se logran beneficios clínicos al menos en parte indirectamente por refuerzo global del sistema inmunitario del sujeto.
Como se usa en el presente documento, los términos "cantidad eficaz" y "dosis eficaz" se refieren a cualquier cantidad o dosis de un compuesto o composición que es suficiente para cumplir su fin(es) previsto(s), es decir, una respuesta biológica o medicinal deseada en un tejido o sujeto en una relación beneficio/riesgo aceptable. El fin relevante previsto puede ser objetivo (es decir, medible por alguna prueba o marcador) o subjetivo (es decir, el sujeto da una indicación o siente un efecto). En algunas realizaciones, una cantidad terapéuticamente eficaz es una cantidad que, cuando se administra a una población de sujetos que cumple ciertos criterios clínicos para una enfermedad o trastorno (por ejemplo, como se ha determinado por síntomas manifestados, progresión de la enfermedad/estadio, perfil genético, etc.), se obtiene una respuesta terapéutica estadísticamente significativa entre la población. Una cantidad terapéuticamente eficaz se administra comúnmente en una pauta posológica que puede comprender múltiples dosis unitarias. Para cualquier agente farmacéutico particular, una cantidad terapéuticamente eficaz (y/o una dosis unitaria apropiada dentro de una pauta posológica eficaz) puede variar, por ejemplo, dependiendo de la vía de administración, de la combinación con otros agentes farmacéuticos. En algunas realizaciones, la cantidad terapéuticamente eficaz específica (y/o dosis unitaria) para cualquier paciente particular puede depender de una variedad de factores que incluyen el trastorno que está tratándose y la gravedad del trastorno; la actividad del agente farmacéutico empleado específico; la composición específica empleada; la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo y la dieta del paciente; el momento de administración, la vía de administración y/o la velocidad de eliminación o el metabolismo del agente farmacéutico específico empleado; la duración del tratamiento; y factores similares como se conoce bien en las artes médicas. Los expertos habituales en la técnica apreciarán que en algunas realizaciones de la divulgación se puede considerar que una dosis unitaria contiene una cantidad eficaz si contiene una cantidad apropiada para administración en el contexto de una pauta posológica correlacionada con un resultado positivo. En algunas realizaciones, los oligodesoxinucleótidos CpG preparados según la presente divulgación pueden ejercer, por lo tanto, eficacia mejorada y efectos inmunomoduladores debido a su pureza quiral. En algunas realizaciones, una cantidad eficaz de oligonucleótidos inmunomoduladores proporcionados es inferior a la del homólogo menos puro.
En algunas realizaciones, una composición de oligonucleótido inmunomodulador se administra a un sujeto sano. En algunas realizaciones, una composición de oligonucleótido inmunomodulador se administra a un sujeto como parte de una vacuna, en la que el oligonucleótido inmunoestimulante actúa de adyuvante. En algunas realizaciones, una composición de oligonucleótido inmunoestimulante se administra a un sujeto con un sistema inmunitario suprimido (por ejemplo, inmunodeprimido). En algunas realizaciones, un sujeto, cuyo sistema inmunitario está suprimido y no responde suficientemente a una vacuna convencional, responde a una vacuna que comprende un oligonucleótido inmunoestimulante englobado por la presente divulgación. En algunas realizaciones, un sujeto que se puede beneficiar de dicha vacuna tiene un sistema inmunitario suprimido asociado a una infección, tal como infección vírica, por ejemplo, VIH, VHB, VHC, etc.
La divulgación engloba el uso de oligonucleótidos inmunomoduladores contemplados en el presente documento para el tratamiento de un sujeto que tiene una afección que se puede tratar por estimulación o supresión de la respuesta inmunitaria. Por lo tanto, las composiciones de oligonucleótidos inmunomoduladores proporcionadas son útiles para el tratamiento de enfermedades o afecciones, que incluyen, sin limitación, infección, cáncer, alergia, asma, una afección inflamatoria, una enfermedad autoinmunitaria, y cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, las composiciones de oligonucleótidos inmunomoduladores proporcionadas son útiles en algunos aspectos de la divulgación para el tratamiento de un sujeto en riesgo de desarrollar un estado clínico. Estados clínicos no limitantes incluyen alergia, asma, una infección con un organismo infeccioso, cáncer, inflamación y enfermedad autoinmunitaria. Un sujeto en riesgo como se usa en el presente documento es un sujeto que tiene algún riesgo de exposición a una infección que causa un patógeno o un cáncer o un alérgeno o un riesgo de desarrollar cáncer. Por ejemplo, un sujeto en riesgo puede ser un sujeto que planea viajar a un área donde se encuentra un tipo particular de agente infeccioso, o puede ser un sujeto que por su estilo de vida o procedimientos médicos se expone a líquidos corporales que pueden contener organismos infecciosos o directamente al organismo, o incluso cualquier sujeto que viva en un área donde se ha identificado un organismo infeccioso o un alérgeno. Los sujetos en riesgo de desarrollar infección también incluyen poblaciones generales a las que una agencia médica recomienda la vacunación con un antígeno de organismo infeccioso particular. Si el antígeno es un alérgeno y el sujeto desarrolla respuestas alérgicas a ese antígeno particular y el sujeto se puede exponer al antígeno, es decir, durante la estación del polen, entonces ese sujeto está en riesgo de exposición al antígeno. Un sujeto en riesgo de desarrollar alergia o asma incluye los sujetos que se ha identificado que tienen una alergia o asma, pero que no tienen la enfermedad activa durante el tratamiento con el oligonucleótido inmunomodulador, así como sujetos que se considera que están en riesgo de desarrollar estas enfermedades debido a factores genéticos o ambientales. Un sujeto en riesgo de desarrollar un cáncer es uno que tiene una alta probabilidad de desarrollar cáncer. Estos sujetos incluyen, por ejemplo, sujetos que tienen una anomalía genética, cuya presencia se ha demostrado que tiene una relación correlativa con una mayor probabilidad de desarrollar un cáncer y sujetos expuestos a agentes causantes del cáncer, tales como el tabaco, los asbestos, u otras toxinas químicas, o un sujeto que ha sido tratado previamente para el cáncer y está en aparente remisión. Cuando un sujeto en riesgo de desarrollar un cáncer se trata con un antígeno específico para el tipo de cáncer al que el sujeto está en riesgo de desarrollar y un oligonucleótido inmunoestimulante CpG, el sujeto puede ser capaz de destruir las células cancerosas a medida que se desarrollan. Si se empieza a formar un tumor en el sujeto, el sujeto desarrollará una respuesta inmunitaria específica contra el antígeno de tumor.
En algunas realizaciones, las composiciones de oligonucleótidos inmunomoduladores proporcionadas son útiles para tratar un sujeto que tiene una enfermedad o trastorno inmunitario, que incluye asma, alergia y afecciones relacionadas.
Un sujeto que tiene una alergia es un sujeto que tiene o está en riesgo de desarrollar una reacción alérgica en respuesta a un alérgeno. Una alergia se refiere a hipersensibilidad adquirida a una sustancia (alérgeno). Las afecciones alérgicas incluyen, pero no se limitan a, eccema, rinitis alérgica o catarro, fiebre del heno, conjuntivitis, asma bronquial, urticaria (ronchas) y alergias alimentarias, y otras afecciones atópicas.
Las alergias son causadas, en general, por la generación de anticuerpos IgE contra alérgenos inocuos. Las citocinas que son inducidas por la administración sistémica o a la mucosa de oligonucleótidos inmunomoduladores son predominantemente de una clase llamada Th1 (los ejemplos son IL-12, IP-10, IFN-a y IFN-y) y éstas inducen tanto respuestas inmunitarias humorales como celulares. El otro tipo importante de respuesta inmunitaria, que está asociada con la producción de citocinas IL-4 e IL-5, se llama una respuesta inmunitaria Th2. En general, parece que las enfermedades alérgicas están mediadas por respuestas inmunitarias de tipo Th2. Basándose en la capacidad del oligonucleótido inmunomodulador de cambiar la respuesta inmunitaria en un sujeto de una respuesta Th2 predominante (que está asociada con la producción de anticuerpos IgE y alergia) a una Th2/Th1 equilibrada (que es protectora contra reacciones alérgicas), una dosis eficaz para inducir una respuesta inmunitaria de un oligonucleótido inmunomodulador se puede administrar a un sujeto para tratar o prevenir asma y alergia.
Por lo tanto, las composiciones de oligonucleótidos inmunomoduladores proporcionadas tienen utilidad terapéutica significativa en el tratamiento de afecciones alérgicas y no alérgicas, tales como asma. Las citocinas Th2, especialmente IL-4 e IL-5, son elevadas en las vías respiratorias de sujetos asmáticos. Estas citocinas promueven aspecto importantes de la respuesta inflamatoria asmática, que incluye el cambio de isotipo de IgE, la quimiotaxis eosinófila y la activación y el crecimiento de mastocitos. Las citocinas Th1, especialmente IFN-y e IL-12, pueden suprimir la formación de clones de Th2 y la producción de citocinas Th2. El asma se refiere a un trastorno del aparato respiratorio caracterizado por inflamación, estrechamiento de las vías respiratorias y elevada reactividad de las vías respiratorias a agentes inhalados. El asma se asocia frecuentemente, aunque no exclusivamente, a síntomas atópicos o alérgicos.
Las composiciones de oligonucleótidos inmunomoduladores proporcionadas también se pueden administrar junto con una terapia antialérgica. Los métodos convencionales de prevención o tratamiento de alergia han implicado el uso de medicamentos para la alergia o terapias de desensibilización. Algunas terapias en evolución para tratar o prevenir la alergia incluyen el uso de anticuerpos anti-IgE neutralizantes. Los antihistamínicos y otros fármacos que bloquean los efectos de mediadores químicos de la reacción alérgica ayudan a regular la intensidad de los síntomas alérgicos, pero no previenen la reacción alérgica y no tienen efecto sobre respuestas alérgicas posteriores. Las terapias de desensibilización se realizan administrando pequeñas dosis de un alérgeno, normalmente por inyección bajo la piel, para inducir una respuesta de tipo IgG contra el alérgeno. Se cree que la presencia del anticuerpo IgG ayuda a neutralizar la producción de mediadores resultantes de la inducción de anticuerpos IgE. Inicialmente, el sujeto se trata con una dosis muy baja del alérgeno para evitar la inducción de una grave reacción y la dosis se aumenta lentamente. Este tipo de terapia es peligrosa debido a que el sujeto es administrado en realidad con los compuestos que provocan la respuesta alérgica y pueden resultar reacciones alérgicas intensas.
Los medicamentos antialérgicos incluyen, pero no se limitan a, antihistamínicos, corticosteroides e inductores de la prostaglandina. Los antihistamínicos son compuestos que contrarrestan la histamina liberada por mastocitos o basófilos. Estos compuestos se conocen bien en la técnica y se usan comúnmente para el tratamiento de alergia. Los antihistamínicos incluyen, pero no se limitan a, acrivastina, astemizol, azatadina, azelastina, betatastina, bromfeniramina, buclizina, cetirizina, análogos de cetirizina, clorfeniramina, clemastina, CS 560, ciproheptadina, desloratadina, dexclorfeniramina, ebastina, epinastina, fexofenadina, HSR 609, hidroxizina, levocabastina, loratidina, metescopolamina, mizolastina, norastemizol, fenindamina, prometazina, pirilamina, terfenadina y tranilast. Los corticosteroides incluyen, pero no se limitan a, metilprednisolona, prednisolona, prednisona, beclometasona, budesonida, dexametasona, flunisolida, propionato de fluticasona y triamcinolona. Aunque la dexametasona es un corticosteroide que tiene acción antiinflamatoria, no se usa regularmente para el tratamiento de alergia o asma en una forma inhalada debido a que es altamente absorbida y tiene efectos secundarios supresores a largo plazo a una dosis eficaz. La dexametasona, sin embargo, se puede usar según la divulgación para tratar alergia o asma debido a que cuando se administra en combinación con una composición de la divulgación se puede administrar a una baja dosis para reducir los efectos secundarios. Algunos de los efectos secundarios asociados al uso de corticosteroides incluyen tos, disfonía, estomatitis candidósica (candidiasis), y en dosis más altas, efectos sistémicos, tales como supresión suprarrenal, intolerancia a la glucosa, osteoporosis, necrosis aséptica de hueso, formación de cataratas, supresión del crecimiento, hipertensión, debilidad muscular, adelgazamiento de la piel y fácil aparición de hematomas. Barnes & Peterson (1993) Am Rev Respir Dis 148:S1-S26; y Kamada AK et al. (1996) Am J Respir Crit Care Med 153:1739-48.
Las composiciones y métodos de oligonucleótidos proporcionados según la divulgación se pueden usar solos o junto con otros agentes y métodos útiles para el tratamiento del asma. En un aspecto, la divulgación proporciona un método de tratamiento de un sujeto que tiene asma. El método según este aspecto de la divulgación incluye la etapa de administrar a un sujeto que tiene asma una cantidad eficaz de una composición de la divulgación para tratar el sujeto.
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un método de tratamiento de un sujeto que tiene asma. El método según este aspecto de la divulgación incluye la etapa de administrar a un sujeto que tiene asma una cantidad eficaz de la composición de la divulgación y una terapia antiasmática para tratar el sujeto.
"Asma", como se usa en el presente documento, se refiere a un trastorno del aparato respiratorio caracterizado por inflamación y estrechamiento de las vías respiratorias, y elevada reactividad de las vías respiratorias a agentes inhalados. El asma se asocia frecuentemente, aunque no exclusivamente, a una afección atópica o alérgica. Los síntomas del asma incluyen episodios recurrentes de sibilancias, disnea, opresión torácica y tos, resultantes de la obstrucción del flujo de aire. La inflamación de las vías respiratorias asociada al asma se puede detectar mediante la observación de varios cambios fisiológicos, tales como denudación de epitelio de las vías respiratorias, deposición de colágeno debajo de la membrana basal, edema, activación de mastocitos, infiltración de células inflamatorias, que incluyen neutrófilos, eosinófilos y linfocitos. Como resultado de la inflamación de las vías respiratorias, los pacientes con asma sufren frecuentemente hipersensibilidad de las vías respiratorias, limitación del flujo de aire, síntomas respiratorios y cronicidad de la enfermedad. Las limitaciones del flujo de aire incluyen broncoconstricción aguda, edema de las vías respiratorias, formación de tapón mucoso y remodelación de las vías respiratorias, características que frecuentemente conducen a obstrucción bronquial. En algunos casos de asma se puede producir fibrosis de la membrana subbasal, que conduce a anomalías persistentes en la función pulmonar.
La investigación de los últimos años ha revelado que el asma resulta probablemente de complejas interacciones entre las células inflamatorias, los mediadores y otras células y tejidos residentes en las vías respiratorias. Los mastocitos, los eosinófilos, las células epiteliales, el macrófago y los linfocitos T activados desempeñan todos una función importante en el proceso inflamatorio asociado al asma. Djukanovic R et al. (1990) Am Rev Respir Dis 142:434-457. Se cree que estas células pueden influir en la función de las vías respiratorias mediante la secreción de mediadores previamente formados y recientemente sintetizados que pueden actuar directa o indirectamente sobre el tejido local. También se ha reconocido que las subpoblaciones de linfocitos T (Th2) desempeñan una función importante en la regulación de la inflamación alérgica en las vías respiratorias liberando citocinas selectivas y estableciendo la cronicidad de la enfermedad. Robinson DS et al. (1992) N Engl J Med 326:298-304.
El asma es un trastorno complejo que se produce en diferentes etapas en el desarrollo y se puede clasificar basándose en el grado de síntomas como agudo, subagudo o crónico. Una respuesta inflamatoria aguda está asociada con un reclutamiento temprano de células en las vías respiratorias. La respuesta inflamatoria subaguda implica el reclutamiento de células, así como la activación de células residentes, que causa un patrón de inflamación más persistente. La respuesta inflamatoria crónica se caracteriza por un nivel persistente de daño celular y un proceso de reparación en curso, que puede dar como resultado anomalías permanentes en las vías respiratorias.
Un "sujeto que tiene asma" es un sujeto que tiene un trastorno del aparato respiratorio caracterizado por inflamación y estrechamiento de las vías respiratorias y elevada reactividad de las vías respiratorias a agentes inhalados. Los factores asociados al inicio del asma incluyen, pero no se limitan a, alérgenos, temperatura fría, ejercicio, infecciones víricas y SO2.
Como se ha mencionado anteriormente, el asma se puede asociar a un tipo Th2 de respuesta inmunitaria, que se caracteriza al menos en parte por citocinas Th2 IL-4 y IL-5, así como cambio del isotipo del anticuerpo a IgE. Las respuestas inmunitarias Th1 y Th2 son mutuamente contrarreguladoras, de manera que la desviación de la respuesta inmunitaria hacia un tipo Th1 de respuesta inmunitaria puede prevenir o mejorar un tipo Th2 de respuesta inmunitaria, que incluye a la alergia. Las composiciones de oligonucleótidos inmunomoduladores proporcionadas de la divulgación son, por lo tanto, útiles por sí mismas para tratar un sujeto que tiene asma debido a que los análogos pueden desviar la respuesta inmunitaria hacia un tipo Th1 de respuesta inmunitaria.
Las composiciones de oligonucleótidos inmunomoduladores proporcionadas de la divulgación también se pueden administrar junto con una terapia para el asma. Los métodos convencionales para tratar o prevenir el asma han implicado el uso de terapias antialérgicas (descritas anteriormente) y varios otros agentes, que incluyen agentes inhalados.
Las medicaciones para el tratamiento del asma se separan, en general, en dos categorías, medicaciones de alivio rápido y medicaciones de control a largo plazo. Los pacientes con asma toman diariamente las medicaciones de control a largo plazo para lograr y mantener el control del asma persistente. Las medicaciones de control a largo plazo incluyen agentes antiinflamatorios, tales como corticosteroides, cromoglicato disódico y nedocromilo; broncodilatadores de acción prolongada, tales como agonistas p2 de acción prolongada y metilxantinas; y modificadores del leucotrieno. Las medicaciones de alivio rápido incluyen agonistas p2 de acción corta, anticolinérgicos y corticosteroides sistémicos. Hay muchos efectos secundarios asociados a cada uno de estos fármacos y ninguno de los fármacos solo o en combinación es capaz de prevenir o tratar completamente el asma.
Los medicamentos antiasmáticos incluyen, pero no se limitan a, inhibidores de PDE-4, broncodilatador/agonistas beta-2, abridores de los canales de K+, antagonistas de VLA-4, antagonistas de neurocinina, inhibidores de la síntesis de tromboxano A2 (TXA2), xantinas, antagonistas de ácido araquidónico, inhibidores de la 5-lipooxigenasa, antagonistas del receptor de TXA2, antagonistas de TXA2, inhibidor de las proteínas de activación de 5-lipox e inhibidores de la proteasa.
El broncodilatador/agonistas p2 son una clase de compuestos que provocan broncodilatación o relajación del músculo liso. El broncodilatador/agonistas p2 incluyen, pero no se limitan a, salmeterol, salbutamol, albuterol, terbutalina, D2522/formoterol, fenoterol, bitolterol, pirbuterol metilxantinas y orciprenalina. Los agonistas p2 y broncodilatadores de acción prolongada son compuestos que se usan para la prevención a largo plazo de síntomas, además de las terapias antiinflamatorias. Los agonistas p2 de acción prolongada incluyen, pero no se limitan a, salmeterol y albuterol. Estos compuestos se usan normalmente en combinación con corticosteroides y, en general, no se usan sin terapia inflamatoria. Se han asociado a efectos secundarios, tales como taquicardia, temblor de músculo esquelético, hipopotasemia y prolongación del intervalo QTc en sobredosis.
Las metilxantinas, que incluyen, por ejemplo, teofilina, se han usado para el control y la prevención a largo plazo de síntomas. Estos compuestos provocan broncodilatación resultante de la inhibición de fosfodiesterasas y probablemente el antagonismo de adenosina. Las toxicidades agudas relacionadas con la dosis son un problema particular con estos tipos de compuestos. Como resultado, se debe monitorizar la concentración en suero establecida para tener en cuenta la toxicidad y el estrecho intervalo terapéutico que surge de diferencias individuales en la depuración metabólica. Los efectos secundarios incluyen taquicardia, taquiarritmias, náuseas y vómitos, estimulación del sistema nervioso central, cefalea, convulsiones, hematemesis, hiperglucemia e hipopotasemia. Los agonistas p2 de acción corta incluyen, pero no se limitan a, albuterol, bitolterol, pirbuterol y terbutalina. Algunos de los efectos adversos asociados a la administración de agonistas p2 de acción corta incluyen taquicardia, temblor de músculo esquelético, hipopotasemia, ácido láctico elevado, cefalea e hiperglucemia.
El cromoglicato disódico y el nedocromilo se usan como medicaciones de control a largo plazo para prevenir principalmente los síntomas del asma que surgen del ejercicio o síntomas alérgicos que surgen de alérgenos. Se cree que estos compuestos bloquean reacciones tempranas y tardías a alérgenos, interfiriendo con la función del canal de cloruro. También estabilizan membranas de los mastocitos e inhiben la activación y liberación de mediadores de eosinófilos y células epiteliales. Se requiere un periodo de administración de cuatro a seis semanas, en general, para lograr el máximo beneficio.
Los anticolinérgicos se usan, en general, para el alivio de broncoespasmo agudo. Se cree que estos compuestos funcionan por inhibición competitiva de receptores colinérgicos muscarínicos. Los anticolinérgicos incluyen, pero no se limitan a, bromuro de ipratropio. Estos compuestos invierten solo el broncoespasmo mediado colinérgicamente y no modifican ninguna reacción al antígeno. Los efectos secundarios incluyen sequedad de la boca y secreciones respiratorias, elevadas sibilancias en algunos individuos, y visión borrosa si se pulveriza en los ojos.
En algunas realizaciones, las composiciones de oligonucleótidos inmunomoduladores proporcionadas también pueden ser útiles para tratar remodelación de las vías respiratorias. La remodelación de las vías respiratorias resulta de la proliferación de células de músculo liso y/o engrosamiento de la submucosa en las vías respiratorias y, por último lugar, provoca el estrechamiento de las vías respiratorias, que conduce a flujo de aire restringido. Los oligonucleótidos inmunomoduladores de la divulgación pueden prevenir la remodelación adicional y posiblemente incluso reducir la formación de tejido resultante del proceso de remodelación.
En algunas realizaciones, las composiciones de oligonucleótidos inmunomoduladores proporcionadas son útiles para tratar un sujeto que tiene un trastorno inflamatorio. Como se usa en el presente documento, el término "trastorno inflamatorio" se refiere a una afección asociada a una reacción no específica de antígeno del sistema inmunitario innato que implica la acumulación y la activación de leucocitos y proteínas del plasma en un sitio de infección, exposición a toxinas o lesión celular. Las citocinas que son características de la inflamación incluyen factor de necrosis tumoral (TNF-a), interleucina 1 (IL-1), IL-6, IL-12, interferón alfa (IFN-a), interferón beta (IFN-p) y quimiocinas. Por lo tanto, ciertos tipos de asma, alergia y trastornos autoinmunitarios pueden tener características de un trastorno inflamatorio. Los trastornos inflamatorios también incluyen, por ejemplo, enfermedad cardiovascular, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), bronquiectasia, colecistitis crónica, tuberculosis, tiroiditis de Hashimoto, septicemia, sarcoidosis, silicosis y otras neumoconiosis, y un cuerpo extraño implantado en una herida, pero no están así limitados. Como se usa en el presente documento, el término "septicemia" se refiere a un síndrome clínico bien reconocido asociado a la respuesta inflamatoria sistémica de un hospedador a invasión microbiana. El término "septicemia", como se usa en el presente documento, se refiere a una afección que normalmente se manifiesta por fiebre o hipotermia, taquicardia y taquipnea, y en casos graves puede empeorar a hipotensión, disfunción de órganos, e incluso muerte.
En algunas realizaciones, las composiciones de oligonucleótidos inmunomoduladores proporcionadas son útiles para tratar un sujeto que tiene una infección. En algunas realizaciones, las composiciones de oligonucleótidos inmunomoduladores proporcionadas son útiles para tratar un sujeto que es susceptible a una infección, que incluye los que pueden haber estado expuestos a un patógeno o a patógenos. Los oligonucleótidos inmunomoduladores utilizados según la divulgación también pueden usar en algunos aspectos para tratar o prevenir infecciones por virus, bacterias, hongos o parásitos. Un sujeto que tiene una infección es un sujeto que se ha expuesto a un patógeno infeccioso y tiene niveles detectables agudos o crónicos del patógeno en el cuerpo. Los oligonucleótidos inmunomoduladores se pueden usar con o sin un antígeno para organizar una respuesta inmunitaria sistémica o mucosa específica de antígeno que es capaz de reducir el nivel de patógeno infeccioso o erradicarlo. Una enfermedad infecciosa, como se usa en el presente documento, es una enfermedad que surge de la presencia de un microorganismo extraño en el cuerpo. Es particularmente importante para desarrollar estrategias de vacuna eficaces y tratamientos para proteger las superficies mucosas del cuerpo, que son el principal sitio de entrada de patógenos.
Los virus son agentes infecciosos pequeños que, en general, contienen un núcleo de ácido nucleico y una envoltura de proteína, pero no son independientemente organismos vivos. Los virus también pueden adoptar la forma de ácidos nucleicos infecciosos que carecen de una proteína. Un virus no puede sobrevivir en ausencia de una célula viva dentro de la que se pueda replicar. Los virus entran en células vivas específicas, ya sea por endocitosis o inyección directa de ADN (fago), y se multiplican, causando la enfermedad. Los virus multiplicados pueden entonces ser liberados e infectar células adicionales. Algunos virus son virus que contienen ADN y otros son virus que contienen ARN. Los virus de ADN incluyen Pox, Herpes, Adeno, Papova, Parvo y Hepadna. Los virus de ARN incluyen Picorna, Calici, Astro, Toga, Flavi, Corona, Paramyxo, Orthomyxo, Bunya, Arena, Rhabdo, FiIo, Borna, Reo y Retro. En algunos aspectos, la divulgación también pretende tratar enfermedades en las que los priones participan en la progresión de la enfermedad, tales como, por ejemplo, encefalopatía espongiforme bovina (es decir, enfermedad de las vacas locas, EEB) o infección por encefalopatía espongiforme ovina en animales, o enfermedad de Creutzfeldt-Jakob en seres humanos.
Los virus incluyen, pero no se limitan a, enterovirus (que incluyen, pero no se limitan a, virus de la familia picornaviridae, tales como virus de la poliomielitis, virus de Coxsackie, ecovirus), rotavirus, adenovirus y virus de la hepatitis, tales como hepatitis A, B, C D y E. Los ejemplos específicos de virus que se han encontrado en seres humanos incluyen, pero no se limitan a: Retroviridae (por ejemplo, virus de la inmunodeficiencia humana, tal como VIH-1 (también denominado HTLV-III, LAV o HTLV-III/LAV o VIH-III; y otras cepas aisladas, tales como VIH-LP; Picornaviridae (por ejemplo, virus de la poliomielitis, virus de la hepatitis A; enterovirus, virus de Coxsackie humanos, rinovirus, ecovirus); Calciviridae (por ejemplo, cepas que provocan gastroenteritis); Togaviridae (por ejemplo, virus de la encefalitis equina, virus de la rubeola); Flaviviridae (por ejemplo, virus del dengue, virus de la encefalitis, virus de la fiebre amarilla); Coronaviridae (por ejemplo, coronavirus); Rhabdoviridae (por ejemplo, virus de la estomatitis vesicular, virus de la rabia); Filoviridae (por ejemplo, virus del Ébola); Paramyxoviridae (por ejemplo, virus paragripales, virus de las paperas, virus del sarampión, virus respiratorio sincitial); Orthomyxoviridae (por ejemplo, virus de la gripe); Bunyaviridae (por ejemplo, hantavirus, bunyavirus, flebovirus y virus de Nairo); Arenaviridae (virus de la fiebre hemorrágica); Reoviridae (por ejemplo, reovirus, orbivirus y rotavirus); Birnaviridae; Hepadnaviridae (virus de la hepatitis B); Parvoviridae (parvovirus); Papovaviridae (virus del papiloma, virus del polioma); Adenoviridae (la mayoría de los adenovirus); Herpesviridae (virus del herpes simple (VHS) 1 y 2, virus de la varicela-zóster, citomegalovirus (CMV)); Poxviridae (virus de la viruela, virus de la variolovacuna, poxvirus); Iridoviridae (por ejemplo, virus de la fiebre porcina africana); y otros virus, virus de la laringotraqueobronquitis aguda, alfavirus, virus del herpes asociado al sarcoma de Kaposi, virus de la enfermedad de Newcastle, virus de Nipah, virus de Norwalk, virus del papiloma, virus paragripal, gripe aviar, virus del SARS, virus del Nilo occidental. Los virus que infectan a las plantas incluyen, por ejemplo, virus de los géneros y/o familias de Alfamovirus: Bromoviridae, Alfacriptovirus: Partitiviridae, Badnavirus, Betacriptovirus: Partitiviridae, Bigeminivirus: Geminiviridae, Bromovirus: Bromoviridae, Bimovirus: Potyviridae, Capilovirus, Carlavirus, Carmovirus: Tombusviridae, Caulimovirus, Closterovirus, Comovirus: Comoviridae, Cucumovirus: Bromoviridae, Cytorhabdovirus: Rhabdoviridae, Diantovirus, Enamovirus, Fabavirus: Comoviridae, Fijivirus: Reoviridae, Furovirus, Hordeivirus, Hibrigeminivirus: Geminiviridae, Idaeovirus, Ilarvirus: Bromoviridae, Ipomovirus: Potyviridae, Luteovirus, Maclomovirus, Macluravirus, Marafivirus, Monogeminivirus: Geminiviridae, Nanavirus, Necrovirus, Nepovirus: Comoviridae, Nucleorabdovirus: Rhabdoviridae, Oryzavirus: Reoviridae, Ourmiavirus, Fitoreovirus: Reoviridae, Potexvirus, Potivirus: Potyviridae, Rimovirus: Potyviridae, ARN satélite, Satelivirus, Sequivirus: Sequiviridae, Sobemovirus, Tenuivirus, Tobamovirus, Tobravirus, Tombusvirus: Tombusviridae, Tospovirus: Bunyaviridae, Tricovirus, Timovirus, Umbravirus, potivirus sin asignar: Potyviridae, rhabdovirus sin asignar: Rhabdoviridae, Varicosavirus, Waikavirus: Sequiviridae, virus sin agrupar, Bromoviridae Potyviridae y Tymoviridae; virus de plantas relevantes particulares incluyen, por ejemplo, virus del mosaico del tabaco (TMV), virus de la marchitez manchada del tomate, virus del rizado amarillo de la hoja del tomate, virus del mosaico del pepino, virus Y de la patata, virus del mosaico de la coliflor, virus del mosaico de la yuca africana, virus de la viruela del ciruelo, virus del mosaico de Brome, virus X de la patata, virus de la tristeza de los cítricos, virus del enanismo amarillo de la cebada, virus del enrollamiento de la hoja de la patata y virus del enanismo arbustivo del tomate.
La hepatitis vírica es una inflamación del hígado que puede producir hinchazón, dolor con la palpación y algunas veces daño permanente al hígado. Si la inflamación del hígado continúa al menos seis meses o más, se denomina hepatitis crónica. Hay al menos cinco virus diferentes que se sabe que provocan la hepatitis vírica, que incluyen hepatitis A, B, C D y E. La hepatitis A se transmite, en general, a través de la comida o agua potable contaminada con heces humanas. La hepatitis B se transmite, en general, a través de los líquidos corporales, tales como la sangre. Por ejemplo, puede transmitirse de la madre al hijo al nacer, a través del contacto sexual, transfusiones de sangre contaminada y agujas. La hepatitis C es bastante común y al igual que la hepatitis B se transmite frecuentemente a través de trasfusiones de sangre y agujas contaminadas. La hepatitis D se encuentra casi siempre en usuarios de fármacos IV que son portadores del virus de la hepatitis B con el que se asocia conjuntamente. La hepatitis E es similar a la hepatitis A vírica y, en general, se asocia con malas condiciones higiénicas.
Tanto las bacterias gramnegativas como grampositivas sirven de antígenos en animales vertebrados. Dichas bacterias grampositivas incluyen, pero no se limitan a, especies de Pasteurella, especies de Staphylococci y especies de Streptococcus. Las bacterias gramnegativas incluyen, pero no se limitan a, Escherichia coli, especies de Pseudomonas y especies de Salmonella. Los ejemplos específicos de bacterias infecciosas incluyen, pero no se limitan a, Escherichia coli, especies de Pseudomonas y especies de Salmonella. Ejemplos específicos de bacterias infecciosas incluyen, pero no se limitan a, Helicobacter pyloris, Borelia burgdorferi, Legionella pneumophilia, Mycobacteria sps (por ejemplo, M. tuberculosis, M. avium, M. intracellular, M. kansaii, M. gordonae), Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes (Streptococcus del grupo A), Streptococcus agalactiae (Streptococcus del grupo B), Streptococcus (grupo viridans), Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus (esp. anaeróbica), Streptococcus pneumoniae, pathogenic Campylobacter sp., Enterococcus sp., Haemophilus influenzae, Bacillus antracis, corynebacterium diphtheriae, corynebacterium sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida, Bacteroides sp., Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira, Rickettsia y Actinomyces israelii.
Los ejemplos de hongos incluyen Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Chlamydia trachomatis, Candida albicans.
Otros organismos infecciosos (es decir, protistas) incluyen Plasmodium spp. tales como Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale, y Plasmodium vivax y Toxoplasma gondii. Los parásitos transmitidos por la sangre y/o de tejidos incluyen Plasmodium spp., Babesia microti, Babesia divergens, Leishmania tropica, Leishmania spp., Leishmania braziliensis, Leishmania donovani, Trypanosoma gambiense y Trypanosoma rhodesiense (enfermedad del sueño africana), Trypanosoma cruzi (enfermedad de Chagas) y Toxoplasma gondii.
Se han descrito ampliamente en la bibliografía otros microorganismos médicamente relevantes, por ejemplo, véase C.G.A Thomas, Medical Microbiology, Bailliere Tindall, Gran Bretaña, 1983. También se conocen microorganismos agrícolamente relevantes (por ejemplo, aquellos que infectan cultivos y/o ganado), por ejemplo, pero no se limitan a, los descritos en, por ejemplo, George N. Agrios, Plant Pathology, Elsevier Academic Press, 5a edición, 2005; John Lucas, Plant Pathology and Plant Pathogens, Wiley-Blackwell; 3a edición, 1998; Dwight C. Hirsh, N. James MacLachlan, Richard L. Walker, Veterinary Microbiology, Wiley-Blackwell; 2a edición, 2004; y P. J. Quinn, et al, Veterinary Microbiology and Microbial Disease, Wiley-Blackwell; 2a edición, 2011.
Las composiciones de oligonucleótidos proporcionadas de la divulgación se pueden administrar a un sujeto (incluyendo, por ejemplo, un sujeto humano o, en algunas realizaciones, un sujeto animal [por ejemplo, ganado o animal doméstico] o planta [por ejemplo, cultivo]) con un agente antimicrobiano. Un agente antimicrobiano, como se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto que ocurre naturalmente o sintético que es capaz de destruir o inhibir microorganismos infecciosos. El tipo de agente antimicrobiano útil según la divulgación dependerá del tipo de microorganismo con el que el sujeto se infecta o en riesgo de infectarse. Los agentes antimicrobianos incluyen, pero no se limitan a, agentes antibacterianos, agentes antivíricos, agentes antifúngicos y agentes antiparasíticos. Expresiones tales como "agente antiinfeccioso", "agente antibacteriano", "agente antivírico", "agente antifúngico", "agente antiparasítico" y "parasiticida" tienen los significados bien establecidos para los expertos habituales en la técnica y se definen en los textos médicos tradicionales. Brevemente, los agentes antibacterianos destruyen o inhiben bacterias, e incluyen antibióticos, así como otros compuestos sintéticos o naturales que tienen funciones similares. Los antibióticos son moléculas de bajo peso molecular que se producen como metabolitos secundarios por células, tales como microorganismos. En general, los antibióticos interfieren con una o más funciones o estructuras bacterianas que son específicas para el microorganismo y que no están presentes en células hospedadoras. Los agentes antivíricos se pueden aislar de fuentes naturales o sintetizadas y son útiles para la destrucción o inhibición de virus. Los agentes antifúngicos se usan para tratar infecciones fúngicas superficiales, así como infecciones fúngicas sistémicas oportunistas y primarias. Los agentes antiparasíticos destruyen o inhiben parásitos.
Los ejemplos de agentes antiparasíticos, también denominados parasiticidas, útiles para la administración humana incluyen, pero no se limitan a, albendazol, anfotericina B, benznidazol, bitionol, HCI de cloroquina, fosfato de cloroquina, clindamicina, deshidroemetina, dietilcarbamazina, furoato de diloxanida, eflornitina, furazolidona, glucocorticoides, halofantrina, yodoquinol, ivermectina, mebendazol, mefloquina, antimoniato de meglumina, melarsoprol, metrifonato, metronidazol, niclosamida, nifurtimox, oxamniquina, paromomicina, isetionato de pentamidina, piperazina, prazicuantel, fosfato de primaquina, proguanil, pamoato de pirantel, pirimetaminasulfonamidas, pirimetamina-sulfadoxina, HCI de quinacrina, sulfato de quinina, gluconato de quinidina, espiramicina, estibogluconato de sodio (gluconato de sodio y antimonio), suramin, tetraciclina, doxiciclina, tiabendazol, tinidazol, trimetroprim-sulfametoxazol y triparsamida, algunos de los cuales se usan solos o en combinación con otros.
Los agentes antibacterianos destruyen o inhiben el crecimiento o la función de bacterias. Una gran clase de agentes antibacterianos es los antibióticos. Los antibióticos, que son eficaces para la destrucción o inhibición de una amplia variedad de bacterias, se denominan antibióticos de amplio espectro. Otros tipos de antibióticos son predominantemente eficaces contra bacterias de la clase grampositivas o gramnegativas. Estos tipos de antibióticos se denominan antibióticos de estrecho espectro. Otros antibióticos que son eficaces contra un organismo o enfermedad individual y no contra otros tipos de bacterias se denominan antibióticos de espectro limitado. Los agentes antibacterianos se clasifican algunas veces basándose en su modo de acción primario. En general, los agentes antibacterianos son inhibidores de la síntesis de pared celular, inhibidores de la membrana celular, inhibidores de la síntesis de proteínas, síntesis de ácido nucleico o inhibidores funcionales, e inhibidores competitivos.
Los agentes antivíricos son compuestos que previenen la infección de células por virus o replicación del virus dentro de la célula. Hay muchos menos fármacos antivíricos que fármacos antibacterianos debido a que el proceso de replicación vírica está tan estrechamente relacionados con la replicación de ADN dentro de la célula hospedadora, que ningún agente antivírico específico sería frecuentemente tóxico para el hospedador. Hay varias etapas dentro del proceso de infección vírica que pueden ser bloqueadas o inhibidas por los agentes antivíricos. Estas etapas incluyen la fijación del virus a la célula hospedadora (inmunoglobulina o péptidos de unión), denudado del virus (por ejemplo, amantadina), síntesis o traducción de ARNm vírico (por ejemplo, interferón), replicación de ARN o ADN vírico (por ejemplo, análogos de nucleótidos), maduración de nuevas proteínas de virus (por ejemplo, inhibidores de la proteasa) y gemación y liberación del virus.
Los análogos de nucleótidos son compuestos sintéticos que son similares a los nucleótidos, pero que tienen un grupo desoxirribosa o ribosa incompleto o anormal. Una vez están en la célula los análogos de nucleótidos, se fosforilan, produciendo el trifosfato formado que compite con los nucleótidos normales por la incorporación en el ADN o ARN vírico. Una vez se incorpora la forma de trifosfato del análogo de nucleótido en la cadena de ácido nucleico en crecimiento, provoca la asociación irreversible con la polimerasa viral y así la terminación de cadena. Los análogos de nucleótido incluyen, pero no se limitan a, aciclovir (usado para el tratamiento de virus del herpes simple y virus de la varicela zóster), ganciclovir (útil para el tratamiento de citomegalovirus), idoxuridina, ribavirina (útil para el tratamiento del virus respiratorio sincitial), didesoxiinosina, didesoxicitidina, zidovudina (azidotimidina), imiquimod y resimiquimod.
Los interferones son citocinas que son secretadas por células infectadas por virus, así como células inmunitarias. Los interferones funcionan uniéndose a receptores específicos en células adyacentes a las células infectadas, provocando el cambio la célula que la protege de la infección por el virus. a y p-interferón también inducen la expresión de moléculas del MHC de clase I y clase II sobre la superficie de células infectadas, dando como resultado la elevada presentación de antígeno para el reconocimiento de células inmunitarias del hospedador. Los a y p-interferones están disponibles como formas recombinantes y se han usado para el tratamiento de infección crónica por hepatitis B y C. A las dosis que son eficaces para terapia antivírica, los interferones tienen efectos secundarios intensos, tales como fiebre, malestar general y pérdida de peso.
Los agentes antivíricos útiles en la divulgación incluyen, pero no se limitan a, inmunoglobulinas, amantadina, interferones, análogos de nucleótido e inhibidores de la proteasa. Los ejemplos específicos de antivíricos incluyen, pero no se limitan a, acemanano; aciclovir; aciclovir sódico; adefovir; alovudina; alvircept sudotox; clorhidrato de amantadina; aranotina; arildona; mesilato de atevirdina; avridina; cidofovir; cipamfilina; clorhidrato de citarabina; mesilato de delavirdina; desciclovir; didanosina; disoxarilo; edoxudina; enviradeno; enviroxima; famciclovir; clorhidrato de famotina; fiacitabina; fialuridina; fosarilato; foscarnet sódico; fosfonet sódico; ganciclovir; ganciclovir sódico; idoxuridina; cetoxal; lamivudina; lobucavir; clorhidrato de memotina; metisazona; nevirapina; penciclovir; pirodavir; ribavirina; clorhidrato de rimantadina; mesilato de saquinavir; clorhidrato de somantadina; sorivudina; estatolona; estavudina; clorhidrato de tilorona; trifluridina; clorhidrato de valaciclovir; vidarabina; fosfato de vidarabina; fosfato sódico de vidarabina; viroxima; zalcitabina; zidovudina; y zinviroxima.
Los agentes antifúngicos son útiles para el tratamiento y la prevención de hongos infecciosos. Los agentes antifúngicos se clasifican algunas veces por su mecanismo de acción. Algunos agentes antifúngicos sirven de inhibidores de la pared celular, inhibiendo la glucosa sintasa. Estos incluyen, pero no se limitan a, basiungina/ECB. Otros agentes antifúngicos funcionan desestabilizando la integridad de la membrana. Estos incluyen, pero no se limitan a, imidazoles, tales como clotrimazol, sertaconzol, fluconazol, itraconazol, ketoconazol, miconazol y voriconacol, así como FK 463, anfotericina B, BAY 38-9502, MK 991, pradimicina, UK 292, butenafina y terbinafina. Otros agentes antifúngicos funcionan por descomposición de quitina (por ejemplo, quitinasa) o inmunosupresión (501 cream).
En algunas realizaciones, las composiciones de oligonucleótidos inmunomoduladores proporcionadas son útiles para tratar un sujeto que tiene una enfermedad proliferativa de células, tal como cáncer. Un sujeto que tiene un cáncer es un sujeto que tiene células cancerosas detectables. El cáncer puede ser un cáncer maligno o no maligno. Los cánceres o tumores incluyen, pero no se limitan a, cáncer de las vías biliares; cáncer cerebral; cáncer de mama; cáncer de cuello uterino; coriocarcinoma; cáncer de colon; cáncer endometrial; cáncer de esófago; cáncer gástrico; neoplasias intraepiteliales; linfomas; cáncer de hígado; cáncer de pulmón (por ejemplo, células pequeñas y células no pequeñas); melanoma; neuroblastomas; cáncer de boca; cáncer de ovario; cáncer de páncreas; cáncer de próstata; cáncer de recto; sarcomas; cáncer de piel; cáncer testicular; cáncer de tiroides; y cáncer renal, así como otros carcinomas y sarcomas. En una realización, el cáncer es leucemia de células pilosas, leucemia mielógena crónica, leucemia cutánea de linfocitos T, mieloma múltiple, linfoma folicular, melanoma maligno, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células renales, carcinoma de próstata, carcinoma de células de la vejiga o carcinoma de colon.
Las composiciones de oligonucleótidos inmunomoduladores proporcionadas se pueden administrar solas o junto con una terapia antineoplásica. Las terapias antineoplásicas incluyen, pero no se limitan a, radioterapia, quimioterapia, inmunoterapia, una vacuna contra el cáncer, terapia hormonal, un modificador de la respuesta biológica y procedimientos quirúrgicos. Un medicamento para el cáncer se refiere a un agente que se administra a un sujeto con el fin de tratar un cáncer. Como se usa en el presente documento, "tratar cáncer" incluye prevenir el desarrollo de un cáncer, reducir los síntomas del cáncer y/o inhibir el crecimiento de un cáncer establecido. En otros aspectos, el medicamento para el cáncer se administra a un sujeto en riesgo de desarrollar un cáncer con el fin de reducir el riesgo de desarrollar el cáncer. Diversos tipos de medicamentos para el tratamiento del cáncer se describen en el presente documento. Con el fin de esta memoria descriptiva, los medicamentos para el cáncer se clasifican como agentes quimioterapéuticos, agentes inmunoterapéuticos, vacunas para el cáncer, terapia hormonal y modificadores de la respuesta biológica.
Además, los métodos de la divulgación pretenden englobar el uso de más de un medicamento para el cáncer junto con las composiciones de oligonucleótidos inmunomoduladores proporcionadas. Como un ejemplo, cuando corresponda, las composiciones de oligonucleótidos inmunomoduladores proporcionadas se pueden administrar con tanto un agente quimioterapéutico como un agente inmunoterapéutico. Alternativamente, el medicamento para el cáncer puede englobar un agente inmunoterapéutico y una vacuna para el cáncer, o un agente quimioterapéutico y una vacuna para el cáncer, o un agente quimioterapéutico, un agente inmunoterapéutico y una vacuna para el cáncer, todos administrados a un sujeto con el fin de tratar un sujeto que tiene un cáncer o en riesgo de desarrollar un cáncer.
El agente quimioterapéutico se puede seleccionar del grupo que consiste en metotrexato, vincristina, adriamicina, cisplatino, cloroetilnitrosoureas que no contienen azúcar, 5-fluorouracilo, mitomicina C, bleomicina, doxorubicina, dacarbazina, taxol, fragilina, meglamina GLA, valrubicina, carmustaina y poliferposan, MMI270, BAY 12-9566, inhibidor de la farnesil transferasa RAS, inhibidor de la farnesil transferasa, Mm P, MTA/LY231514, LY264618/Lometexol, Glamolec, CI-994, TNP-470, Hycamtin/topotecán, PKC412, Valspodar/PSC833, Novantrone/mitroxantrona, Metaret/suramin, Batimastat, E7070, BCH-4556, CS-682, 9-AC, AG3340, AG3433, lncel/VX-710, VX-853, ZD0101, ISI641, ODN 698, TA2516/marmistat, BB2516/marmistat, CDP 845, D2163, PD183805, DX8951f, Lemonal DP 2202, FK 317, Picibanil/OK-432, AD 32/valrubicina, Metastron/derivado de estroncio, Temodal/temozolomida, Evacet/doxorubicina liposómica, Yewtaxan/paclitaxel, Taxol/paclitaxel, Xeload/capecitabina, Furtulon/doxifluridina, Cyclopax/paclitaxel oral, taxoide oral, SPU-077/cisplatino, Hm R 1275/flavopiridol, CP-358 (774)/EGFR, CP-609 (754)/inhibidor del oncogén RAS, BMS-182751/platino oral, UFT(Tegafur/uracilo), Ergamisol/levamisol, Eniluracil/776C85/potenciador de 5FU, Campto/levamisol, Camptosar/irinotecán, Tumodex/ralitrexed, Leustatina/cladribina, Paxex/paclitaxel, Doxil/doxorubicina liposómica, Caelyx/doxorubicina liposómica, Fludara/fludarabina, Pharmarubicin/epirubicina, DepoCyt, ZD1839, Lu 79553/bis-naftalimida, LU 103793/dolastatina, Caetyx/doxorubicina liposómica, Gemzar/gemcitabina, ZD 0473/Anormed, YM 116, semillas de yodo, inhibidores de CDK4 y CDK2, inhibidores de PARP, D4809/dexifosamida, Ifes/Mesnex/ifosamida, Vumon/tenipósido, Paraplatin/carboplatino, Plantinol/cisplatino, Vepeside/etopósido, ZD 9331, Taxotere/docetaxel, profármaco de guanina arabinósido, análogo de taxano, nitrosoureas, agentes alquilantes tales como melfelán y ciclofosfamida, aminoglutetimida, asparaginasa, busulfán, carboplatino, clorambucilo, HCI de citarabina, dactinomicina, HCI de daunorubicina, fosfato sódico de estramustina, etopósido (VP16-213), floxuridina, fluorouracilo (5-FU), flutamida, hidroxiurea (hidroxicarbamida), ifosfamida, interferón alfa-2a, alfa-2b, acetato de leuprolida (análogo del factor de liberación de LHRH), lodemustina (CCNU), HCI de mecloretamina (mostaza nitrogenada), mercaptopurina, Mesna, mitotano (o.p -DDD), HCI de mitoxantrona, octreotida, plicamicina, HCI de procarbazina, estreptozocina, citrato de tamoxifeno, tioguanina, tiotepa, sulfato de vinblastina, amsacrina (m-AMSA), azacitidina, eritropoyetina, hexametilmelamina (HMM), interleucina 2, mitoguazona (metil-GAG; metil glioxal bis-guanilhidrazona; MGBG), pentostatina (2'-desoxicoformicina), semustina (metil-CCNU), tenipósido (VM-26) y sulfato de vindesina, pero no se limita así.
El agente inmunoterapéutico se puede seleccionar del grupo que consiste en Ributaxin, Herceptin, Quadramet, Panorex, IDEC-Y2B8, BEC2, C225, Oncolym, SMART M195, At Ra GEN, Ovarex, Bexxar, LDP-03, ior tp, MDX-210, MDX-11 , MDX- 22, OV103, 3622W94, anti-VEGF, Zenapax, MDX-220, MDX-447, MELIMMUNE-2, MELIMMUNE-1 , CEACIDE, Pretarget, NovoMAb-G2, TNT, Gliomab-H, g N i-250, EMD-72000, LymphoCide, CMA 676, Monopharm-C, 4B5, ior egf.r3, ior c5, BABS, anti-FLK- 2, MDX-260, ANA Ab, SMART 1 D10 Ab, SMART ABL 364 Ab e ImmuRAIT-CEA, pero no se limita así.
La vacuna para el cáncer se puede seleccionar del grupo que consiste en EGF, vacunas para el cáncer antidiotípicas, antígeno Gp75, vacuna para el melanoma GMK, vacuna conjugada de MGV gangliósido, Her2/neu, Ovarex, M-Vax, O-Vax, L-Vax, STn-KHL theratope, BLP25 (MUC-1), vacuna idiotípica liposómica, Melacine, vacunas de antígeno de péptido, vacunas de toxina/antígeno, vacuna basada en MVA, PACIS, vacuna BCG, TA-HPV, TA-CIN, DISC-virus e ImmuCyst/TheraCys, pero no se limita así.
Como se usa en el presente documento, los términos "antígeno del cáncer" y "antígeno de tumor" se usan indistintamente para referirse a antígenos que son expresados diferencialmente por células cancerosas y así pueden ser explotados para dirigirse a células cancerosas. Los antígenos del cáncer son antígenos que pueden estimular potencialmente respuestas inmunitarias aparentemente específicas de tumor. Algunos de estos antígenos están codificados, aunque no se expresen necesariamente, por células normales. Estos antígenos se pueden caracterizar como aquellos que normalmente son silenciosos (es decir, no se expresan) en células normales, aquellos que se expresan solo en ciertos estadios de diferenciación y aquellos que se expresan temporalmente, tales como antígenos embrionarios y fetales. Otros antígenos del cáncer están codificados por genes celulares mutantes, tales como oncogenes (por ejemplo, oncogén ras activado), genes supresores (por ejemplo, p53 mutante), proteínas de fusión resultantes de deleciones internas o translocaciones cromosómicas. Todavía otros antígenos del cáncer pueden ser codificados por genes víricos, tales como los llevados en virus tumorales de ARN y ADN.
En algunas realizaciones, las composiciones de oligonucleótidos inmunomoduladores proporcionadas también pueden ser útiles para tratar y prevenir enfermedad autoinmunitaria. La enfermedad autoinmunitaria es una clase de enfermedades en las que los propios anticuerpos de un sujeto reaccionan con tejido del hospedador o en las que linfocitos T efectores inmunitarios son autorreactivos a autopéptidos endógenos y provocan la destrucción de tejido. Por lo tanto, se organiza una respuesta inmunitaria contra los propios antígenos de un sujeto, denominados autoantígenos. Las enfermedades autoinmunitarias incluyen, pero no se limitan a, alopecia areata, hemofilia adquirida, espondilitis anquilosante, síndrome antifosfolípidos, infertilidad asociada a la autoinmunidad, encefalomielitis autoinmune, hepatitis autoinmune, anemia hemolítica autoinmune, diabetes mellitus autoinmune, púrpura trombocitopénica autoinmune, síndrome de Behcet, pénfigo ampolloso, cardiomiopatía, síndrome de disfunción inmune por fatiga crónica (CFIDS), polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, síndrome de Churg-Strauss, penfigoide cicatricial, síndrome de CREST, enfermedad de las aglutininas frías, dermatomiositis, lupus discoide, crioglobulinemia esencial mixta, fibromialgia, fibromiositis, síndrome de Guillain-Barre, tiroiditis de Hashimoto, glomerulonefritis (por ejemplo, glomerulonefritis crescéntica, glomerulonefritis proliferativa), enfermedad de Graves, enfermedad injerto contra huésped, síndrome de Goodpasture, pénfigo (por ejemplo, pénfigo vulgar), fibrosis pulmonar idiopática, púrpura trombocitopénica idiopática, resistencia a la insulina, enfermedad de Addison idiopática, nefropatía por IgA, enfermedad inflamatoria del intestino (incluyendo enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa), artritis juvenil, liquen plano, miastenia grave, esclerosis múltiple, enfermedad mixta del tejido conjuntivo, polimiositis, anemia perniciosa, poliarteritis nodosa, policondritis, síndromes poliglandulares, polimialgia reumática, agammaglobulinemia primaria, cirrosis biliar primaria, psoriasis, fenómenos de Raynaud, síndrome de Reiter, artritis reumatoide juvenil y del adulto, síndrome de Sjogren, esclerodermia con anticuerpos anticolágeno, sarcoidosis, síndrome del hombre rígido, lupus eritematoso sistémico (LES), artritis de Takayasu, rechazo de órgano trasplantado, arteritis temporal/arteritis de células gigantes, uveítis, colitis ulcerosa, vasculitis y vitiligo.
Un "autoantígeno", como se usa en el presente documento, se refiere a un antígeno de un tejido hospedador normal. El tejido hospedador normal no incluye células cancerosas. Por lo tanto, una respuesta inmunitaria organizada contra un autoantígeno, en el contexto de una enfermedad autoinmunitaria, es una respuesta inmunitaria no deseable y contribuye a la destrucción y el daño de tejido normal, mientras que una respuesta inmunitaria organizada contra un antígeno del cáncer es una respuesta inmunitaria deseable y contribuye a la destrucción del tumor o cáncer. Por lo tanto, en algunos aspectos de la divulgación que pretende tratar trastornos autoinmunitarios no se recomienda que los oligonucleótidos inmunomoduladores se administren con autoantígenos, particularmente los que son las dianas del trastorno autoinmunitario.
En otros casos, los oligonucleótidos inmunomoduladores usados según la presente divulgación se pueden administrar con bajas dosis de autoantígenos. Varios estudios en animales han demostrado que la administración a la mucosa de bajas dosis de antígeno puede dar como resultado un estado de hiposensibilidad inmunitaria o "tolerancia". El mecanismo activo parece ser una desviación inmunitaria mediada por citocina de una respuesta Th1 hacia una predominantemente Th2 y Th3 (es decir, dominada por TGF-p). La supresión activa con administración de antígeno a baja dosis también puede suprimir una respuesta inmunitaria no relacionada (supresión por vecindad) que es de interés considerable en la terapia de enfermedades autoinmunitarias, por ejemplo, artritis reumatoide y LES. La supresión por vecindad implica la secreción de Th1 - citocinas supresoras contrarregulatorias en el entorno local donde las citocinas proinflamatorias y Th1 son liberadas en o un modo específico de antígeno o no específico de antígeno. "Tolerancia", como se usa en el presente documento, se usa para referirse a este fenómeno. De hecho, la tolerancia oral ha sido eficaz en el tratamiento de varias enfermedades autoinmunitarias en animales que incluyen: encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), miastenia grave autoinmune experimental, artritis inducida por colágeno (AIC) y diabetes mellitus dependiente de insulina. En estos modelos, la prevención y la supresión de la enfermedad autoinmunitaria está asociada con un cambio en las respuestas humorales y celulares específicas de antígeno de una respuesta Th1 a Th2/Th3.
Ejemplos no limitantes de oligonucleótidos inmunomoduladores útiles que se pueden utilizar según la presente divulgación se proporcionan en el Apéndice (B) adjunto.
RIPtidos
En algunas realizaciones, los oligonucleótidos utilizados según la presente divulgación son o actúan de polinucleótidos que interactúan con ARN ("RIPtidos"). Los RIPtidos son una clase de terapéuticos previstos para abrir el espacio de dianas "no quimiomodulables" por inactivación de los ARN estructurales implicados en la enfermedad. Los RIPtidos son normalmente extensiones de nucleótidos pequeños (alrededor de 8 nucleótidos) que se unen y alteran la acción de ARN estructurado. Debido a su tamaño, estas moléculas pueden atravesar fácilmente la membrana celular. Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. 6.080.585.
Los RIPtidos pueden ser útiles para varias aplicaciones clínicas. En el contexto de la terapia del cáncer, al menos una diana es la telomerasa, que está presente en aproximadamente el 90 % de las células cancerosas. Por lo tanto, en algunas realizaciones, se pueden usar los oligonucleótidos estereodefinidos de la divulgación para dirigir la telomerasa para el tratamiento de diversos cánceres. Además, los RIPtidos pueden ser útiles para el tratamiento de enfermedad infecciosa. Los virus, tales como el VIH y la hepatitis C, deben ser capaces de hacerse cargo de una célula hospedadora para replicarse; por lo tanto, el ARN estructural puede desempeñar una función importante en la maduración y la replicación de muchos virus. Por consiguiente, en algunas realizaciones, los oligonucleótidos estereodefinidos de la divulgación se pueden usar para dirigir porciones de ADN o ARN implicadas en la maduración y/o replicación vírica.
Por lo tanto, la divulgación es útil para tratar diversas infecciones víricas. Los virus incluyen, pero no se limitan a, enterovirus (que incluyen, pero no se limitan a, virus de la familia picornaviridae, tales como virus de la poliomielitis, virus de Coxsackie, ecovirus), rotavirus, adenovirus y virus de la hepatitis, tales como hepatitis A, B, C D y E. Los ejemplos específicos de virus que se han encontrado en seres humanos incluyen, pero no se limitan a: Retroviridae (por ejemplo, virus de la inmunodeficiencia humana, tal como VIH-1 (también denominado HTLV-III, LAV o HTLV-iIi/LAV o VIH-III; y otras cepas aisladas, tales como VIH-LP; Picornaviridae (por ejemplo, virus de la poliomielitis, virus de la hepatitis A; enterovirus, virus de Coxsackie humanos, rinovirus, ecovirus); Calciviridae (por ejemplo, cepas que provocan gastroenteritis); Togaviridae (por ejemplo, virus de la encefalitis equina, virus de la rubeola); Flaviviridae (por ejemplo, virus del dengue, virus de la encefalitis, virus de la fiebre amarilla); Coronaviridae (por ejemplo, coronavirus); Rhabdoviridae (por ejemplo, virus de la estomatitis vesicular, virus de la rabia); Filoviridae (por ejemplo, virus del Ébola); Paramyxoviridae (por ejemplo, virus paragripales, virus de las paperas, virus del sarampión, virus respiratorio sincitial); Orthomyxoviridae (por ejemplo, virus de la gripe); Bunyaviridae (por ejemplo, hantavirus, bunyavirus, flebovirus y virus de Nairo); Arenaviridae (virus de la fiebre hemorrágica); Reoviridae (por ejemplo, reovirus, orbivirus y rotavirus); Birnaviridae; Hepadnaviridae (virus de la hepatitis B); Parvoviridae (parvovirus); Papovaviridae (virus del papiloma, virus del polioma); Adenoviridae (la mayoría de los adenovirus); Herpesviridae (virus del herpes simple (VHS) 1 y 2, virus de la varicela-zóster, citomegalovirus (CMV)); Poxviridae (virus de la viruela, virus de la variolovacuna, poxvirus); Iridoviridae (por ejemplo, virus de la fiebre porcina africana); y otros virus, virus de la laringotraqueobronquitis aguda, alfavirus, virus del herpes asociado al sarcoma de Kaposi, virus de la enfermedad de Newcastle, virus de Nipah, virus de Norwalk, virus del papiloma, virus paragripal, gripe aviar, virus del SARS, virus del Nilo occidental.
Fármacos antisentido
La presente divulgación también engloba una variedad de terapéuticos basados en antisentido. Normalmente, los fármacos antisentido son compuestos de tipo ADN o ARN pequeño (12-21 nucleótidos) que están modificados químicamente para manipular propiedades favorables del fármaco. Algunos de los agentes antisentido disponibles en la técnica incluyen fosforotioato o desoxioligonucleótidos, y en esta situación un grupo de azufre intercambia por un oxígeno no de puente en el esqueleto de fosfato. Esto aumenta la resistencia a la degradación por RNasa y mejora la estabilidad farmacológica. Sin embardo, en otros agentes, denominados "la próxima generación de moléculas antisentido", los oligonucleótidos la modificación de 2'-O-metoxietilo al esqueleto, que puede aumentar la afinidad de estos oligonucleótidos por el ARN diana. Sin embargo, en algunos casos, muchos de estos agentes están asociados con efectos secundarios, tales como respuestas inmunitarias no deseadas. Al menos en algunas situaciones, dichas propiedades no deseables de estos agentes son atribuibles al menos en parte a su naturaleza estereoaleatoria. La presente divulgación proporciona un homólogo estereodefinido que tiene propiedades preferidas, tales como lipofilia mejorada y elevada unión al ARN.
Se han desarrollado o están en desarrollo varios terapéuticos basados en antisentido. Los ejemplos no limitantes de terapias antisentido se proporcionan a continuación. Los oligonucleótidos estereodefinidos (por ejemplo, quiralmente puros), como se describen en el presente documento, se pueden preparar para lograr eficacia mejorada, elevada afinidad por diana, efectos secundarios reducidos, farmacocinética mejorada, estabilidad potenciada y/o elevada biodisponibilidad, con respecto a los fármacos antisentido actualmente disponibles en la técnica. En algunas realizaciones, los terapéuticos antisentido incluyen fármacos de morfolino. Véase, por ejemplo: Morcos, PA (2007). "Achieving targeted and quantifiable alteration of mRNA splicing with Morpholino oligos". Biochem Biophys Res Commun 358 (2): 521-7.
Retinitis por citomegalovirus: Fomivirsen (comercializado como Vitravene), fue autorizado por la FDA estadounidense en agosto de 1998 como un tratamiento para la retinitis por citomegalovirus.
Virus de la fiebre hemorrágica: A principios de 2006, científicos que estudiaban el virus de la fiebre hemorrágica del Ébola en el USAMRIID anunciaron una tasa de recuperación del 75 % después de infectar cuatro macacos de la India y luego tratarlos con un fármaco antisentido de morfolino desarrollado por AVI BioPharma, una empresa biotecnológica estadounidense. [U.S. Army Medical Research Institute of Infectious Diseases, Fort Detrick, Maryland. Comunicado de prensa: Gene-Specific Ebola Therapies Protect Nonhuman Primates from Lethal Disease. 13 de enero de 2006] La tasa usual de mortalidad para monos infectados con el virus del Ébola es del 100 %. A finales de 2008, AVI BioPharma presentó satisfactoriamente aplicaciones de producto en fase de investigación clínica (PEI) en la FDA para sus dos productos estrella para los virus de Marburgo y del Ébola. Estos fármacos, AVI-6002 (Lu, X; Yu, Q; Binder, GK; Chen, Z; Slepushkina, T; Rossi, J; Dropulic, B (2004). "Antisense-Mediated Inhibition of Human Immunodeficiency Virus (HTV) Replication by Use of an HIV Type 1-Based Vector Results in Severely Attenuated Mutants Incapable of Developing Resistance". Journal of Virology 78 (13): 7079-88) y AVI-6003 son análogos novedosos basados en química antisentido de PMO de AVI en los que la potencia antivírica se potencia mediante la adición de componentes positivamente cargados a la cadena de oligómero de morfolino. Resultados preclínicos de AVI-6002 y AVI-6003 demostraron tasas reproducibles y altas de supervivencia en primates no humanos expuestos a una infección letal con los virus del Ébola y de Marburgo, respectivamente (Medical News Today. AVI BioPharma Announces FDA Clears IND Applications For Clinical Trials Of RNA Therapeutic Agents For Treatment Of Ebola And Marburg Viruses. 30 de diciembre de 2008).
Cáncer: También en 2006, médicos alemanes informaron de un estudio de aumento de la dosis para el compuesto AP 12009 (un oligodesoxinucleótido antisentido de fosforotioato específico del ARNm de factor de crecimiento transformante humano TGF-beta2) en pacientes con gliomas de gran malignidad. En el momento del informe, la mediana de la supervivencia global no se había obtenido y los autores insinuaron una posible cura (Resultados de G004, un ensayo clínico de fase IIb activamente controlado con el compuesto dirigido TGF-b2 AP 12009 para astrocitoma anaplásico recurrente - Hau et al. 24 (suplemento 18): 1566 - Resúmenes de la reunión de ASCO).
Por ejemplo, trabedersen (AP 12009-P001) se desarrolla como monoterapia para el tratamiento de pacientes con cáncer pancreático avanzado, melanoma maligno, tumores cerebrales, astrocitoma anaplásico y carcinoma colorrectal. AP 12009-P001 en un estudio en abierto, multicéntrico, de fase I/II y de aumento de la dosis para evaluar la seguridad y tolerabilidad de la administración i.v. de trabedersen a 61 pacientes con tumores sólidos avanzados que se sabe que producen en exceso TGF-b2, que ya fueron o no tributarios de formas establecidas de terapias.
Otros ejemplos de fármacos antisentido que se dirigen a proteínas expresadas en exceso en cánceres incluyen: Clusterin (OGX-011/TV01011), que regula la transición epitelial-mesenquimatosa inducida por el factor de crecimiento TGF beta y el factor de transcripción TWIST1 en células de cáncer de próstata; ATL1101 (un inhibidor antisentido de segunda generación del receptor del factor de crecimiento similar a la insulina-I (IGF-IR)) en el tratamiento de cáncer de próstata; oblimersen (nombre comercial: Genasense) para tratar leucemia linfocítica crónica; G4460 y LR3001 (inhibidores de c-myb) para el tratamiento de LMC, melanoma, neuroblastoma y cánceres de mama, páncreas y colon; MG98 (inhibidor de ADN metiltransferasa I) para el tratamiento de carcinoma de células renales; ISIS 5132 (c-Raf antisentido); LY900003 (proteína cinasa C-alfa antisentido); G3139 (Bcl-2 antisentido), etc.
VIH/sida: A partir de 2004, investigadores en los EE. UU. han estado realizando investigaciones sobre el uso de tecnología antisentido para combatir el VIH. Se conoce que la inhibición mediada por antisentido de la replicación del virus de la inmunodeficiencia humana (HTV) por uso de un vector basado en el tipo 1 del VIH da como resultado mutantes intensamente atenuados incapaces de desarrollar resistencia. En febrero de 2010, los investigadores informaron del éxito en la reducción de la carga vírica del VIH usando linfocitos T del paciente que habían sido recogidos, modificados con una cadena no codificante de ARN con respecto a la proteína de la envoltura vírica del VIH y reinfundidos en el paciente durante un intervalo planificado en la farmacoterapia retrovírica.
Colesterol alto: En 2010, mipomersen (previamente ISIS 301012, nombre comercial Kynamro) logró completar ensayos de fase 3 para algunos tipos de colesterol alto. Mipomersen es un candidato a fármaco reductor del colesterol. Es un terapéutico antisentido que dirige el ARN mensajero para apolipoproteína B. Véase: Merki E, Graham MJ, Mullick AE, et al. (agosto de 2008). "Antisense oligonucleotide directed to human apolipoprotein B-100 reduces lipoprotein(a) levels and oxidized phospholipids on human apolipoprotein B-100 particles in lipoprotein(a) transgenic mice". Circulation 118 (7): 743-53; El Harchaoui K, Akdim F, Stroes ES, Trip MD, Kastelein jJ (2008). "Current and future pharmacologic options for the management of patients unable to achieve low-density lipoprotein-cholesterol goals with statins". Am J Cardiovasc Drugs 8 (4): 233-42; Athyros VG, Kakafika AI, Tziomalos K, Karagiannis A, Mikhailidis DP (July 2008). "Antisense technology for the prevention or the treatment of cardiovascular disease: the next blockbuster?". Expert Opin Investig Drugs 17 (7): 969-72. Se administra como una inyección semanal. El compuesto es un oligonucleótido antisentido de 'segunda generación'; los nucleótidos se unen con enlaces fosforotioato en vez de los enlaces fosfodiéster de ARN y ADN, y las partes de azúcar son desoxirribosa en la parte central de la molécula y la ribosa modificada con 2'-O-metoxietilo en los dos extremos. Estas modificaciones hacen que el fármaco sea resistente a la degradación por nucleasas, lo que permite que se administre semanalmente. El fármaco se acumula en el hígado, que es conveniente puesto que la apolipoproteína B actúa predominantemente aquí. La secuencia completa es
G*-C*-C*-U*-C*-dA-dG-dT-dC-dT-dG-dmC-dT-dT-dmC-G*-C*-A*-C*-C* [d = 2'-desoxi, * = 2'-O-(2-metoxietilo)] con enlaces fosforotioato 3 '^5 '. Los ensayos de fase 3 fueron en pacientes con hipercolesterolemia familiar (HF), tanto homocigóticos (ho) como heterocigóticos (he). La HF es un trastorno genético que provoca niveles excepcionalmente altos de colesterol por lipoproteínas de baja densidad. Ambos ensayos mostraron un rendimiento excepcional con la mayor eficacia vista hasta la fecha en las dos poblaciones de pacientes, y con tasas de abandono relativamente bajas en comparación con otros fármacos inyectables.
Distrofia muscular de Duchenne: En la distrofia muscular de Duchenne (DMD), las células musculares del paciente se rompen y se pierden, que conduce a debilidad muscular progresiva y a muerte. AVI-4658 es una terapia antisentido dirigida para restaurar la expresión de distrofina, una proteína clave de la que carecen los pacientes con distrofia muscular de Duchenne. Los resultados de un estudio en abierto, de fase 2 y de aumento de la dosis con 19 pacientes mostró que cuando se terminó el tratamiento, se hizo una biopsia de músculo de cada paciente. El equipo descubrió que la capacidad de los pacientes para producir ARNm funcional mediante "salto de exones" se restauraba con el uso de AVI-4658, lo que les permitía con el tiempo fabricar proteína distrofina funcional.
Distrofia miotónica: La distrofia miotónica es la enfermedad muscular más común en los adultos, que afecta principalmente a los músculos esqueléticos, el corazón y el sistema nervioso central. Ocurre debido a una mutación que causa numerosas repeticiones de tres letras del código genético (CTG) en un gen llamado DMPK. El ARN mensajero que se produce a partir del gen mutado también contiene las repeticiones anormales largas que hacen que el ARN se acumule en el núcleo de la célula. Allí, secuestra y bloquea la función de una proteína llamada Muscleblindlike 1 y activa otra proteína llamada CELF1. Estas proteínas se antagonizan entre sí y el resultado es la expresión anormal de proteínas de muchos otros genes en tejidos adultos, dando como resultado la enfermedad. Para contrarrestar esto, Cooper y sus colaboradores crearon oligonucleótidos antisentido que son simplemente cadenas de material genético que buscan porciones de las repeticiones anormales de ARN y dirigen RNasa H al ARN tóxico causando su degradación. También se informó que la combinación de los oligonucleótidos antisentido con otros oligonucleótidos antisentido que ayudó a liberar Muscleblind-like1 secuestrada puede potenciar el efecto.
Diabetes: SGLT2 (ISIS 388626) es un fármaco antisentido para lograr la reducción en los niveles de cotransportador de la glucosa dependiente de sodio de tipo 2 (SGLT2) que produjeron una reducción significativa en los niveles de glucosa en sangre en pacientes diabéticos.
Hepatitis: La infección persistente por el virus de la hepatitis C (VHC) es la principal causa de enfermedad hepática. Los oligonucleótidos antisentido representan una clase prometedora de agentes antivíricos. Dichos fármacos en desarrollo incluyen ISIS 14803, que es un oligodesoxinucleótido de fosforotioato de 20 unidades que inhibe la replicación del VHC y la expresión de proteínas.
Métodos de tratamiento
Los oligonucleótidos y composiciones proporcionados de los mismos, descritos en el presente documento, son útiles como agentes terapéuticos contra diversos estados de enfermedad, que incluyen su uso como agentes antivíricos. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos proporcionados se pueden usar como agentes para el tratamiento de enfermedades mediante la modulación de la actividad de ADN y/o ARN. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos proporcionados se pueden usar para inhibir la expresión génica específica. Por ejemplo, un oligonucleótido proporcionado puede ser complementario a una secuencia de ARN mensajero (ARNm) diana específico. Se puede usar para inhibir la replicación vírica de una miríada de virus. Las familias de virus a modo de ejemplo incluyen orthomyxovirus, poxvirus, virus del herpes, virus del papiloma, picornavirus, flavivirus, retrovirus, virus de la hepatitis, paramyxovirus, reovirus, parvovirus, filovirus, coronavirus, arenavirus, rhabdovirus y adenovirus. Se conocen familias de virus adicionales y también se contemplan en el presente documento. Otros ejemplos incluyen usos como compuestos antisentido contra ARN del VIH u otro ARN retrovírico o para la hibridación con ARNm del VIH que codifica la proteína tat, o contra la región TAR de ARNm del VIH . En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos imitan la estructura secundaria de la región TAR del ARNm del VIH, y haciendo eso se unen a la proteína tat. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado se usa para inhibir la expresión de una proteína diana poniendo en contacto una célula con un oligonucleótido proporcionado, en donde la expresión de otras proteínas en la célula no se inhiben o se inhiben mínimamente. En alguna realización, la inhibición de la proteína diana ocurre in vivo en un mamífero. En algunas realizaciones, se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de un oligonucleótido proporcionado para inhibir la expresión de una proteína diana.
Otros ejemplos de proteínas donde la expresión se puede modular incluyen las proteínas de cinasa aminoterminal Jun (JNK), diacilglicerol aciltransferasa I, apolipoproteína B, receptor de glucagón, Aurora B, acil CoA colesterol aciltransferasa-2, proteína c-reactiva, familia de proteínas STAT (transductores de señales y activadores de la transcripción) y P-glucoproteína de MDR. En algunas realizaciones, se puede usar un oligonucleótido proporcionado para inhibir la expresión de la proteína fosfatasa 1B (PTP1B), polimerasa vírica de ARN dependiente de ARN. En algunas realizaciones, se puede usar un oligonucleótido proporcionado para inducir acontecimientos, tales como la apoptosis en células cancerosas o para hacer que una célula sea más susceptible a la apoptosis. En algunas realizaciones, se puede usar un oligonucleótido proporcionado para modular actividades de las proteínas. En algunas realizaciones, un oligonucleótido proporcionado puede ayudar a modular la actividad de RNasa H que se dirige a moléculas de ARN multirresistentes (MDR).
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona métodos de tratamiento de una enfermedad mediada por la expresión génica no deseada en un sujeto (por ejemplo, mamíferos, tales como seres humanos) en necesidad de dicho tratamiento. Por "enfermedades" se indica enfermedades, o síntomas de enfermedad. Los métodos incluyen, por ejemplo, la administración al sujeto de una cantidad eficaz de un oligonucleótido proporcionado.
Los ejemplos de enfermedades no deseadas mediadas por la expresión génica incluyen cáncer (por ejemplo, leucemia, tumores y metástasis), alergia, asma, obesidad, inflamación (por ejemplo, enfermedades inflamatorias, tales como enfermedad inflamatoria de las vías respiratorias), hipercolesterolemia, trastornos hematológicos, síndrome respiratorio agudo grave (SRAG), enfermedad obstructiva de las vías respiratorias, asma, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades retrovíricas, tales como SIDA o VIH, otras infecciones víricas, infecciones intrauterinas, enfermedades metabólicas, infección (por ejemplo, bacteriana, vírica, por levadura, fúngica), enfermedades del SNC, tumores cerebrales, enfermedades neurales degenerativas, enfermedades cardiovasculares y enfermedades asociados a la angiogénesis, neovascularización y vasculogénesis.
En algunas realizaciones, los oligonucleótidos proporcionados son útiles para tratar cáncer, que incluye cáncer pancreático, y otras enfermedades o trastornos que implican proliferación celular anormal.
Situado en el abdomen superior (en el retroperitoneo), el páncreas es una glándula de función doble de aparato digestivo y sistema endocrino. En ciertos casos, el páncreas funciona como una glándula endocrina (por ejemplo, que produce varias hormonas importantes). En ciertos casos, el páncreas funciona como una glándula exocrina (por ejemplo, que secreta fluidos que contienen enzimas digestivas que pasan al intestino delgado).
El cáncer pancreático es la cuarta causa más común de muerte por cáncer en los EE. UU. (después de pulmón, colon y mama), que comprende el 6 % de todas las muertes relacionadas con el cáncer. Se estima que en el 2008 se diagnosticarán 37.680 nuevos casos de cáncer de páncreas en EE.UU., con 34.290 muertes. La incidencia de la enfermedad aumenta linealmente después de la edad de 50, siendo el único factor de riesgo definitivo el fumar cigarrillos (los fumadores tienen cuatro veces más probabilidad de desarrollar la enfermedad que los no fumadores). El cáncer pancreático invasivo es casi siempre mortal. La mediana del tiempo de supervivencia colectiva de todos los pacientes es 4-6 meses. La supervivencia relativa a 1 año es del 24 %; la tasa de supervivencia global a los 5 años es < 5 %.
El cáncer pancreático es asintomático en su fase temprana y frecuentemente sigue sin diagnosticar durante varios meses (siendo menos de un tercio de los pacientes diagnosticados en los 2 meses desde la aparición de los síntomas). En ciertos casos, el diagnóstico tardío da como resultado (ya sea parcialmente o completamente) la metástasis de las células cancerosas al hígado o los ganglios linfáticos.
Actualmente, la cirugía (extirpación del páncreas) es la principal y única terapia curativa para el cáncer pancreático. Sin embargo, solo el 15-25 % de los tumores son extirpables en el momento del diagnóstico y solo el 10-20 % de pacientes que se someten a cirugía sobreviven más de dos años. Una vez ocurre la infiltración tumoral y se han afectado otros tejidos, ya no es posible la cirugía.
En ciertos casos, la diabetes mellitus o pancreatitis predispone a un individuo a desarrollar un trastorno proliferativo de una pluralidad de células pancreáticas. En ciertos casos, los individuos están en un riesgo elevado de desarrollar un trastorno proliferativo de una pluralidad de células pancreáticas debido a un síndrome hereditario seleccionado del grupo que consiste en cáncer colorrectal hereditario no polipósico (CCHNP) y poliposis adenomatosa familiar (PAF). En ciertos casos, los individuos tienen un riesgo elevado de desarrollar un trastorno proliferativo de una pluralidad de células pancreáticas debido a una mutación en un gen seleccionado del grupo que consiste en MSH2, MSH6, MLH1 y APC.
Idealmente, el tratamiento eficaz del cáncer pancreático debe (i) controlar la masa tumoral primaria, tanto inicialmente como posteriormente, y (ii) tratar las células tumorales metastásicas. La quimioprevención (la administración de agentes, tales como fármacos, biológicos, nutrientes y similares) ralentiza la progresión de, revierte o inhibe la carcinogénesis, disminuyendo así el riesgo de desarrollar enfermedad invasiva o clínicamente significativa.
En el presente documento se desvela, en ciertas realizaciones, métodos de tratamiento de cáncer pancreático. Como se usa en el presente documento, "cáncer pancreático" incluye formas de cáncer de páncreas. En algunas realizaciones, un cáncer pancreático es cáncer pancreático metastásico. En algunas realizaciones, un cáncer pancreático es un carcinoma, sarcoma, cáncer o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, un cáncer pancreático que se va a tratar incluye cánceres pancreáticos esporádicos y hereditarios. En algunas realizaciones, un cáncer pancreático es carcinoma canalicular, carcinoma de células acinares, carcinoma mucinoso papilar, carcinoma de células de sello, carcinoma adenoescamoso, carcinoma no diferenciado, carcinoma mucinoso, carcinoma de células gigantes, carcinoma de células pequeñas, cáncer quístico, cáncer quístico seroso, cáncer quístico mucinoso, cáncer pancreático sin clasificar, pancreatoblastoma, o combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, un individuo en necesidad de tratamiento para cáncer pancreático presenta un tumor localizado del páncreas. En algunas realizaciones, un individuo en necesidad de tratamiento para cáncer pancreático presenta una biopsia regional negativa de los ganglios linfáticos. En algunas realizaciones, un individuo en necesidad de tratamiento para cáncer pancreático presenta una biopsia regional positiva de los ganglios linfáticos. En algunas realizaciones, un individuo en necesidad de tratamiento para cáncer pancreático presenta un tumor pancreático negativo nodal (por ejemplo, negativo para los nodos). En algunas realizaciones, un individuo en necesidad de tratamiento para cáncer pancreático presenta un tumor positivo nodal (por ejemplo, positivo para los nodos).
En algunas realizaciones, un cáncer pancreático en un individuo en necesidad de tratamiento para cáncer pancreático ha metastatizado a otras localizaciones en el cuerpo. En algunas realizaciones, un cáncer pancreático ha metastatizado a una localización seleccionada del grupo que consiste en ganglio linfático, estómago, vía biliar, hígado, hueso, ovario, peritoneo y cerebro.
En algunas realizaciones, células cancerosas o células precancerosas se identifican por tipado histológico o clasificación de una muestra de tejido (por ejemplo, una muestra de biopsia). En algunas realizaciones, las células cancerosas o células precancerosas se identifican mediante el uso de marcadores moleculares apropiados.
En algunas realizaciones, un cáncer pancreático en un individuo en necesidad de tratamiento para cáncer pancreático se clasifica según el sistema de clasificación del American Joint Committee on Cancer (AJCC) TNM, donde al tumor (T) se le ha asignado un estadio de Tx, T1, T2, T3, T4; y donde a los ganglios linfáticos regionales (N) se les ha asignado un estadio NX, N0, N1; y donde a las metástasis distantes (M) se les ha asignado un estadio de MX, M0 o M1. En algunas realizaciones, un cáncer pancreático en un individuo en necesidad de tratamiento para cáncer pancreático se estadifica como cáncer pancreático de estadio 0, I, IA, IB, II, IIA, IIB, III y IV. En algunas realizaciones, un cáncer pancreático en un individuo en necesidad de tratamiento para cáncer pancreático se estadifica como grado GX (por ejemplo, el grado no se puede evaluar), grado 1, grado 2, grado 3 o grado 4.
Más ejemplos específicos de cánceres tratados con los oligonucleótidos proporcionados incluyen cáncer de mama, cáncer de pulmón, melanoma, cáncer colorrectal, cáncer de vejiga, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer renal, cáncer de células escamosas, glioblastoma, sarcoma de Kaposi, mieloma múltiple y leucemia.
Evaluación y tratamiento del cáncer
El término "antígeno de célula tumoral" se define en el presente documento como un antígeno que está presente en mayores cantidades en una célula tumoral o en líquidos corporales que las células tumorales sin relacionar, células normales, o en líquido corporal normal. La presencia de antígeno se puede probar por cualquier número de ensayos conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, sin limitación, selección negativa y/o positiva con anticuerpos, tales como un ensayo de ELISA, un radioinmunoensayo, o por transferencia Western.
"Agente inductor de la apoptosis" se define en el presente documento para inducir la apoptosis/muerte celular programada, e incluye, por ejemplo, agentes antineoplásicos y tratamientos en donde las células (por ejemplo, células tumorales) son inducidas a experimentar muerte celular programada. Los agentes inductores de la apoptosis a modo de ejemplo se describen más abajo en más detalle.
Los términos "apoptosis" o "muerte celular programada" se refieren al proceso fisiológico por el que células no deseadas o inservibles se eliminan durante el desarrollo y otros procesos biológicos normales. La apoptosis es un modo de muerte celular que ocurre en condiciones fisiológicas normales y la célula es un participante activo en su propio fin ("suicida celular"). Se encuentra casi siempre durante la renovación de células normales y la homeostasis de tejidos, la embriogénesis, la inducción y el mantenimiento de la tolerancia inmunitaria, el desarrollo del sistema nervioso y la atrofia de tejido dependiente del endocrino. Las células que experimentan apoptosis muestran rasgos morfológicos y bioquímicos característicos. Estos rasgos incluyen agregación de cromatina, condensación nuclear y citoplásmica, partición del citoplasma y núcleo en vesículas unidas a la membrana (cuerpos apoptósicos), que contienen ribosomas, mitocondrias morfológicamente intactas y material nuclear. In vivo, estos cuerpos apoptósicos son rápidamente reconocidos y fagocitados por macrófagos, células dendríticas o células epiteliales adyacentes. Debido a este mecanismo eficiente para la retirada de células apoptósicas in vivo, no se provoca respuesta inflamatoria. In vitro, los cuerpos apoptósicos, así como los restantes fragmentos celulares, se hinchan por último lugar y finalmente se lisan. Esta fase terminal de la muerte celular in vitro se ha llamado "necrosis secundaria". La apoptosis se puede medir por métodos conocidos por los expertos en la técnica como fragmentación de ADN, exposición de anexina V, activación de caspasas, liberación de citocromo c, etc. Una célula que ha sido inducida para morir se llama en el presente documento una "célula apoptósica". La apoptosis también se pueden probar usando un ensayo de apoptosis convencional por anexina V: se cultivan células NIH:OVCAR-3 en placas de 6 pocillos (NUNC) y se irradian o tratan con un antagonista (o en combinación con otro fármaco antineoplásico) durante 4-48 horas, se lavan y se tiñen con anexina V-FITC (BD-Pharmingen) durante 1 hora. Las células se analizan por citometría de flujo (Becton-Dickinson, CellQuest), se contratiñen con yoduro de propidio y se analizan otra vez en el citómetro de flujo.
Los pacientes se pueden evaluar con respecto a los síntomas en uno o más momento de tiempo múltiples que incluyen antes, durante y después de las pautas de tratamiento. El tratamiento puede dar como resultado la mejora de la afección del sujeto y se puede evaluar determinando si han ocurrido uno o más de los siguientes factores: la disminución del tamaño del tumor, la disminución de la proliferación celular, la disminución de los números de células, la disminución de la neovascularización, el aumento de la apoptosis o la disminución de la supervivencia de al menos una porción de las células tumorales. Una o más de estas manifestaciones puede, en algunos casos, dar como resultado la eliminación parcial o total del cáncer y la prolongación de la supervivencia del paciente. Alternativamente, para cánceres en fase terminal, el tratamiento puede dar como resultado la estasia de la enfermedad, mejor calidad de vida y/o prolongación de la supervivencia.
Métodos de ensayo de la migración celular
Se han descrito en la bibliografía ensayos para la migración celular, por ejemplo, por Brooks, et al., J. Clin. Invest 1997, 99:1390-1398 y los expertos en la técnica conocen métodos de medición de la migración celular. En un método de medición de la migración celular descrito en el presente documento, se recubren con sustrato las membranas de las cámaras de migración de Transwell, se lavan los Transwell y se bloquean los sitios de unión no específica con BSA. Se recogen células tumorales de cultivos subconfluentes, se lavan y se resuspenden en tampón de migración en presencia o ausencia de anticuerpos de ensayo. Después de dejar que las células tumorales migren a la parte inferior de las membranas de Transwell recubiertas, se retiran las células que quedan sobre la cara superior de la membrana y las células que migran a la cara inferior se tiñen con violeta de cristal. Entonces se cuantifica la migración celular por recuento directo de células por campo microscópico.
Métodos de ensayo del crecimiento tumoral
Se puede ensayar el crecimiento tumoral por métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, el modelo de ratón SCID, el modelo de ratón sin pelo y ratones BALB/c con tumores singénicos. Los modelos de ratón SCID para el crecimiento tumoral se llevan a cabo del siguiente modo: se recogen células subconfluentes humanas de melanoma M21 (o cualquier tipo de células tumoral deseada), se lavan y se resuspenden en PBS estéril (20 x 106 por ml). Los ratones SCID se inyectan por vía subcutánea con 100 pl de suspensión de células de melanoma humano M21 (2 x 106). Tres días después de la inyección de las células tumorales, los ratones o no se tratan o se tratan por vía intraperitoneal con un antagonista en los intervalos de dosis deseados. Los ratones se tratan diariamente durante 24 días. El tamaño del tumor se mide con un compás calibrador y el volumen se estima usando la fórmula V = (L x W2)/2, donde V es igual al volumen, L es igual a la longitud y W es igual a la anchura.
Alternativamente, también se pueden utilizar modelos de ratón sin pelo, modelos de ratón SCID y/o modelos de ratón singénico BALB/c para evaluar el crecimiento tumoral y la inhibición del mismo por los anticuerpos humanizados antiendoglina o fragmentos de unión al antígeno descritos en el presente documento.
Métodos de ensayo de la proliferación celular
La proliferación celular se puede ensayar por métodos conocidos por los expertos en la técnica. Como se describe en el presente documento, se pueden resuspender células endoteliales subconfluentes humanas (HUVEC) en tampón de proliferación que contiene bajo (5,0 %) suero en presencia o ausencia de CM (25 pl) de células ECV o ECVL, y se permite que las células endoteliales proliferen durante 24 horas. La proliferación se puede cuantificar midiendo la actividad de deshidrogenasa mitocondrial usando un kit de ensayo WST-1 comercialmente disponible (Chemicon). Por tanto, como se describe en el presente documento, la proliferación se puede cuantificar midiendo la incorporación de 3H usando métodos convencionales. (She et al., Int. J. Cancer, 108: 251-257 (2004)).
Otros métodos de evaluación de la proliferación celular se conocen en la técnica y se contemplan en el presente documento. Ejemplos no limitantes adicionales se describen con más detalle en los ejemplos.
Se entendería que los sistemas de clasificación y estadificación descritos en el presente documento representan un medio de evaluación del tratamiento de cánceres descrito en el presente documento; además, se conocen en la técnica otros esquemas de estadificación y se pueden usar a propósito de los métodos descritos en el presente documento. A modo de ejemplo solo, la clasificación TNM de tumores malignos se puede usar como un sistema de estadificación del cáncer para describir el grado de cáncer en el cuerpo de un paciente. T describe el tamaño del tumor y si ha invadido tejido cercano, N describe ganglios linfáticos regionales que participan, y M describe metástasis distantes. TNM es mantenido por la Unión Internacional contra el cáncer (UICC) y es usado por el American Joint Committee on Cancer (AJCC) y la International Federation of Gynecology and Obstetrics (FIGO). Se entendería que no todos los tumores tienen clasificaciones TNM, tales como, por ejemplo, tumores cerebrales. En general, T (a,is,(0), 1 -4) se mide como el tamaño o el grado directo de tumor primario. N (0-3) se refiere al grado de diseminación a los ganglios linfáticos regionales: N0 significa que las células tumorales están ausentes de los ganglios linfáticos regionales, N1 significa que las células tumorales se diseminan a los ganglios linfáticos regionales más próximos o en pequeños números, N2 significa que las células tumorales se diseminan a un grado entre N1 y N3; N3 significa que las células tumorales se diseminan a los ganglios linfáticos regionales más distantes o numerosos. M (0/1) se refiere a la presencia de metástasis: M0 significa que no están presentes metástasis distantes; M1 significa que la metástasis ha ocurrido a órganos distantes (más allá de los ganglios linfáticos regionales). También se pueden evaluar otros parámetros. G (1 -4) se refiere al grado de células cancerosas (es decir, son de escasa malignidad si parecen similares a las células normales, y de gran malignidad si parecen poco diferenciadas). R (0/1/2) se refiere a la completitud de una exhaustividad de una operación (es decir, límites de la extirpación libres de células cancerosas o no). L (0/1) se refiere a invasión en vasos linfáticos. V (0/1) se refiere a invasión en vena. C (1-4) se refiere a un modificador de la certeza (calidad) de V.
En el presente documento se proporcionan métodos de degradación, inhibición del crecimiento o destrucción de células cancerosas que comprenden poner en contacto las células con una cantidad de un compuesto descrito en el presente documento eficaz para degradar, inhibir el crecimiento o destruir las células cancerosas.
En el presente documento se proporcionan métodos de inhibición del aumento del tamaño del tumor, reducción del tamaño de un tumor, reducción de la proliferación del tumor o prevención de la proliferación del tumor en un individuo que comprende administrar a dicho individuo una cantidad eficaz de un compuesto descrito en el presente documento para inhibir el aumento del tamaño del tumor, reducir el tamaño de un tumor, reducir la proliferación del tumor o prevenir la proliferación del tumor. El tratamiento de tumores en algunos casos incluye la estasia de síntomas, es decir, tratando el paciente, el cáncer no empeora y se prolonga la supervivencia del paciente.
Los pacientes se pueden evaluar con respecto a síntomas en uno o más momentos de tiempo múltiples que incluyen antes, durante y después de las pautas de tratamiento. El tratamiento puede dar como resultado la mejora de la afección del sujeto y se puede evaluar determinando si ha ocurrido uno o más de los siguientes acontecimientos: disminución del tamaño del tumor, disminución de la proliferación de células tumorales, disminución de los números de células, disminución de la neovascularización y/o aumento de la apoptosis. Una o más de estas manifestaciones pueden, en algunos casos, dar como resultado la eliminación parcial o total del cáncer y la prolongación de la supervivencia del paciente. Alternativamente, para cánceres en fase terminal, el tratamiento puede dar como resultado la estasia de la enfermedad, mejor calidad de vida y/o prolongación de la supervivencia.
Se conocen en la técnica otros métodos de evaluación del tratamiento y se contemplan en el presente documento. En una realización a modo de ejemplo, los compuestos de pro-oligonucleótido de la divulgación se administran a un sujeto, tal como un mamífero (por ejemplo, un humano), que padece un trastorno médico, por ejemplo, un cáncer, o afecciones no malignas caracterizadas por la presencia de una clase de células no deseadas.
Se pueden evaluar medidas de resultados primarios para pacientes tratados usando los métodos descritos en el presente documento e incluyen, por ejemplo, supervivencia sin progresión. En una realización, un aumento en la supervivencia sin progresión se observa en una cantidad de aproximadamente 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces o más en comparación con la ausencia de tratamiento. En otra realización, un aumento en la supervivencia sin progresión es un aumento en la supervivencia en aproximadamente 3 meses, aproximadamente 6 meses, aproximadamente 9 meses, aproximadamente 12 meses, aproximadamente 18 meses, aproximadamente 2 años, aproximadamente 3 años, aproximadamente 4 años, aproximadamente 5 años o más en comparación con la ausencia de tratamiento.
También se pueden evaluar medidas de resultados secundarios e incluyen duración de la respuesta, tiempo hasta la progresión tumoral, supervivencia global, acontecimientos adversos graves y no graves. Por ejemplo, un tratamiento puede prevenir la progresión de la enfermedad (es decir, estasia) o puede dar como resultado una mejora. Alternativamente, o además, se pueden medir otros objetivos con respecto a uno o más de los siguientes: disminución de la carga tumoral, disminución de la neovascularización, reducción de efectos secundarios, disminución de reacciones adversas y/o aumento del cumplimiento del paciente.
Otros ejemplos específicos de enfermedades o trastornos para los que el tratamiento por los compuestos o composiciones de la divulgación son útiles para el tratamiento o la prevención incluyen, pero no se limitan a, rechazo de trasplante (por ejemplo, riñón, hígado, corazón, pulmón, células de los islotes, páncreas, médula ósea, córnea, intestino delgado, aloinjertos o xenoinjertos de piel y otros trasplantes), enfermedad injerto contra huésped, osteoartritis, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, diabetes, retinopatía diabética, enfermedad inflamatoria del intestino (por ejemplo, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa y otras enfermedades intestinales), enfermedad renal, caquexia, choque séptico, lupus, miastenia grave, psoriasis, dermatitis, eccema, seborrea, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, protección de células madre durante la quimioterapia, selección ex vivo o purga ex vivo para el trasplante de médula ósea autólogo o alógeno, enfermedad ocular, retinopatías (por ejemplo, degeneración macular, retinopatía diabética y otras retinopatías), enfermedad de la córnea, glaucoma, infecciones (por ejemplo, bacteriana, vírica o fúngica), enfermedad cardíaca, que incluye, pero no se limita a, reestenosis.
Activación de RNAsa L
La vía del 2'-5' oligoadenilato (2-5A)/RNasa L es una de las vías enzimáticas inducidas por interferón. La RNasa L se activa después de la unión a fragmentos 5'-fosforoilados de ácido 2'-5' adenílico. Estos fragmentos de ácido 2'-5' adenílico (2-5A) se producen bajo el control de la 2'-5' oligo(A) sintetasa. Esta vía es parte del sistema inmunitario innato y tiene una función importante en prevenir la infección vírica. La escisión inducida por 2-5A de ARN monocatenario da como resultado la apoptosis. Se ha mostrado que los análogos de fosforotioato bioestables de 2-5A son potentes activadores de la Rnasa L (Xianh et al., Cancer Research (2003), 63:6795-6801). En este estudio, los análogos de 2-5A indujeron la actividad de Rnasa L y causaron la apoptosis en cultivos de estirpes de células humanas metastásicas de cáncer de próstata en fase terminal DU145, PC3 y LNCaP.
La activación sostenida de RNasa L desencadena una vía mitocondrial de apoptosis que elimina células infectadas por virus, así como células cancerosas/ tumorales. La RNasa L puede inhibir el crecimiento de fibrosarcoma, crecimiento de cáncer de próstata, crecimiento de cáncer colorrectal y crecimiento de cáncer pancreático. Dada la función común de la RNasa L en diferentes cánceres, se contempla que la divulgación descrita en el presente documento puede ser de uso para el tratamiento de cualquier tipo de cáncer. Silverman, RH, Cytokine Growth Factor Rev, 18(5-6): 381-388 (2007); Bisbal, C. y Silverman, RH, Biochimie. 89(6-7): 789-798 (2007). A modo de ejemplo, la regulación por disminución de RNasa L se refiere a cualquier reducción en los niveles de expresión del gen o genes que codifican RNasa L, silenciamiento del gen o genes que codifican RNasa L, reducción en los niveles de expresión/traducción de las proteínas que comprenden RNasa L, reducción en la cantidad de RNasa L presente dentro de una célula, y/o cualquier reducción en la actividad de RNasa L en comparación con un nivel predeterminado de RNasa L en una población sana a modo de ejemplo. Alternativamente, cualquier reducción en los niveles de RNasa L como se describe en el presente documento puede ser indicativa de regulación por disminución de RNasa L.
En algunas realizaciones, los oligonucleótidos proporcionados son útiles para el tratamiento de enfermedades que tienen RNasa L regulada por disminución. En alguna realización, una enfermedad asociada a RNasa L regulada por disminución es cáncer. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer pancreático, cáncer de próstata o cáncer colorrectal. Alternativamente, los oligonucleótidos proporcionados descritos en el presente documento son útiles para el tratamiento de enfermedad que tiene RNasa L regulada por incremento. En algunas realizaciones, la enfermedad que tiene RNasa L regulada por incremento es síndrome de fatiga crónica. Enfermedades adicionales que tienen RNasa L regulada por incremento se conocen en la técnica y son contempladas en el presente documento.
Cuando se usan como terapéuticos, un oligonucleótido proporcionado se administra como una composición farmacéutica. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un oligonucleótido proporcionado que comprende, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y al menos un principio inactivo farmacéuticamente aceptable seleccionado de diluyentes farmacéuticamente aceptables, excipientes farmacéuticamente aceptables y vehículos farmacéuticamente aceptables. En otra realización, la composición farmacéutica se formula para inyección intravenosa, administración por vía oral, administración yugal, inhalación, administración nasal, administración tópica, administración oftálmica o administración ótica. En realizaciones adicionales, la composición farmacéutica es un comprimido, una píldora, una cápsula, un líquido, un inhalante, una disolución en espray nasal, un supositorio, una suspensión, un gel, un coloide, una dispersión, una suspensión, una disolución, una emulsión, una pomada, una loción, un colirio o una gota ótica.
Composiciones farmacéuticas
Cuando se usan como terapéuticos, un oligonucleótido proporcionado o composición de oligonucleótidos descrita en el presente documento se administra como una composición farmacéutica. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un oligonucleótidos proporcionado, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y al menos un principio inactivo farmacéuticamente aceptable seleccionado de diluyentes farmacéuticamente aceptables, excipientes farmacéuticamente aceptables y vehículos farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se formula para inyección intravenosa, administración por vía oral, administración yugal, inhalación, administración nasal, administración tópica, administración oftálmica o administración ótica. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica es un comprimido, una píldora, una cápsula, un líquido, un inhalante, una disolución en espray nasal, un supositorio, una suspensión, un gel, un coloide, una dispersión, una suspensión, una disolución, una emulsión, una pomada, una loción, un colirio o una gota ótica.
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende oligonucleótido quiralmente controlado, o composición del mismo, en mezcla con un excipiente farmacéuticamente aceptable. Un experto en la técnica reconocerá que las composiciones farmacéuticas incluyen las sales farmacéuticamente aceptables del oligonucleótido quiralmente controlado, o composición del mismo, descritas anteriormente.
Compuestos para potenciar y dirigir la administración
Un oligonucleótido proporcionado como se describe en el presente documento se puede administrar usando una variedad de estrategias de administración, que incluyen conjugados de ácidos nucleicos con diversos ligandos, así como el uso de enfoques de nanoportador. Se contempla cualquier estrategia de administración de ácido nucleico para su uso con los oligonucleótidos proporcionados descritos en el presente documento. La elección entre estrategias de administración a modo de ejemplo, que incluyen, pero no se limitan a, conjugados químicos, vesículas de transferencia de lípido catiónico/liposómicas y nanoportadores supramoleculares, depende del contexto terapéutico, y métodos de determinación de la modalidad de administración óptima se conocen en la técnica y se contemplan además en el presente documento.
Compuestos que penetran en la célula ("CPC")
Se conocen numerosos compuestos que actúan de portadores para la carga, tales como ácidos nucleicos, y facilitan la entrada del ácido nucleico en una célula en un entorno in vivo. Los portadores a modo de ejemplo se describen en Dietz et al., Molecular & Cellular Neuroscience, 27(2): 85-131 (2004). Los CPC prototípicos derivados de Tat y reguladores transcripcionales de antennepedia se han unido por un gran número de restos nuevos. Como un ejemplo, los CPC que son péptidos pueden ser péptidos policatiónicos relativamente cortos (9-30 aminoácidos) ricos en arginina y lisina, o secuencias hidrófobas interactivas con la membrana. Los CPC pueden ser unidos por técnicas de ADN recombinante o acoplarse químicamente a péptidos, oligonucleótidos o nanoportadores, que entonces comprenden la 'carga' para el CPC.
Ligandos de direccionamiento celular ("CTL")
Otra estrategia es administrar oligonucleótidos por uso de un CTL que se une con alta afinidad a un receptor de la superficie celular que es capaz de experimentar una eficiente internalización. Los posibles ligandos incluyen anticuerpos, polipéptidos derivados de bibliotecas de presentación en fagos y moléculas orgánicas pequeñas. Se conocen en la técnica ligandos de direccionamiento celular adicionales, o se desarrollarán, y se contemplan para su uso con la divulgación descrita en el presente documento (para ARNip conjugado con ASGPR - GalNAc y oligonucleótidos, por ejemplo, el documento de patente WO2012037254A1). Debido a que diversos receptores se expresan frecuentemente preferentemente en tipos de células particulares, este enfoque ofrece la posibilidad de selectividad mejorada por los reactivos de oligonucleótido. Dianas de receptor a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, receptores de lipoproteína (tales como aquellos en el hígado), integrinas, tirosina cinasas de receptor y la superfamilia del receptor acoplado a proteína G (GPCR).
Nanoportadores
Se puede usar una variedad de nanoportadores supramoleculares para suministrar los ácidos nucleicos. Los nanoportadores a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, liposomas, complejos de polímeros catiónicos y diversas poliméricas. La complejación de ácidos nucleicos con diversos policationes es otro enfoque para suministro intracelular; esto incluye el uso de policationes PEGilados, complejos de polietilenamina (PEI), copolímeros de bloque catiónicos y dendrímeros. Varios nanoportadores catiónicos, que incluyen PEI y dendrímeros de poliamidoamina, ayudan a liberar el contenido de los endosomas. Otros enfoques incluyen el uso de nanopartículas poliméricas, micelas de polímero, puntos cuánticos y lipoplejos.
Se conocen estrategias de suministro de ácidos nucleicos adicionales, además de las estrategias de suministro a modo de ejemplo descritas en el presente documento.
En las aplicaciones terapéuticas y/o de diagnóstico, los compuestos de la divulgación se pueden formular para una variedad de modos de administración, que incluyen administración sistémica y tópica o localizada. Las técnicas y formulaciones se pueden encontrar, en general, en Remington, The Science and Practice of Pharmacy, (20a ed. 2000).
Los oligonucleótidos proporcionados, y las composiciones de los mismos, son eficaces en un amplio intervalo de dosis. Por ejemplo, en el tratamiento de seres humanos adultos, desde aproximadamente 0,01 hasta aproximadamente 1000 mg, desde aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 100 mg, desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 50 mg por día, y desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 100 mg por día son ejemplos de dosis que se pueden usar. La dosis exacta dependerá de la vía de administración, la forma en la que se administra el compuesto, el sujeto que se va a tratar, el peso corporal del sujeto que se va a tratar y la preferencia y experiencia del médico adjunto.
Los expertos habituales en la técnica conocen bien, en general, las sales farmacéuticamente aceptables y pueden incluir, a modo de ejemplo pero no de limitación, acetato, bencenosulfonato, besilato, benzoato, bicarbonato, bitartrato, bromuro, edetato de calcio, camsilato, carbonato, citrato, edetato, edisilato, estolato, esilato, fumarato, gluceptato, gluconato, glutamato, glicolilarsanilato, hexilresorcinato, hidrabamina, bromhidrato, clorhidrato, hidroxinaftoato, yoduro, isetionato, lactato, lactobionato, malato, maleato, mandelato, mesilato, mucato, napsilato, nitrato, pamoato (embonato), pantotenato, fosfato/difosfato, poligalacturonato, salicilato, estearato, subacetato, succinato, sulfato, tanato, tartrato o teoclato. Otras sales farmacéuticamente aceptables se pueden encontrar en, por ejemplo, Remington, The Science and Practice of Pharmacy (20a ed. 2000). Las sales farmacéuticamente aceptables preferidas incluyen, por ejemplo, acetato, benzoato, bromuro, carbonato, citrato, gluconato, bromhidrato, clorhidrato, maleato, mesilato, napsilato, pamoato (embonato), fosfato, salicilato, succinato, sulfato o tartrato.
Dependiendo de las afecciones específicas que están tratándose, dichos agentes se pueden formular en formas farmacéuticas líquidas o sólidas y se administran por vía sistémica o por vía local. Los agentes se pueden administrar, por ejemplo, en una forma de liberación lenta diferida o sostenida como conocen los expertos en la técnica. Las técnicas para la formulación y administración se pueden encontrar en Remington, The Science and Practice of Pharmacy (20a ed. 2000). Vías adecuadas pueden incluir oral, yugal, por espray para inhalación, sublingual, rectal, transdérmica, vaginal, transmucosa, administración nasal o intestinal; administración parenteral, que incluye intramuscular, subcutánea, inyecciones intramedulares, así como inyecciones intratecales, intraventriculares directas, intravenosas, intrarticulares, intraesternales, intrasinoviales, intrahepáticas, intralesionales, intracraneales, intraperitoneales, intranasales o intraoculares, u otros modos de administración.
Para inyección, los agentes de la divulgación se pueden formular y diluir en disoluciones acuosas, tal como en tampones fisiológicamente compatibles, tales como disolución de Hank, disolución de Ringer o tampón de solución salina fisiológica. Para dicha administración transmucosa, en la formulación se usan penetrantes apropiados para la barrera que se va a atravesar. Dichos penetrantes se conocen, en general, en la técnica.
El uso de vehículos inertes farmacéuticamente aceptables para formular los compuestos desvelados en el presente documento para la práctica de la divulgación en dosis adecuadas para administración sistémica está dentro del alcance de la divulgación. Con la elección apropiada del vehículo y la práctica de fabricación adecuada, las composiciones de la presente divulgación, en particular, las formuladas como disoluciones, se pueden administrar por vía parenteral, tal como por inyección intravenosa.
Los compuestos se pueden formular fácilmente usando vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica en dosis adecuadas para administración por vía oral. Dichos vehículos permiten que los compuestos de la divulgación se formulen como comprimidos, píldoras, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones, suspensiones y similares, para ingestión oral por un sujeto (por ejemplo, paciente) que se va a tratar.
Para administración nasal o por inhalación, los agentes de la divulgación también se pueden formular por métodos conocidos por los expertos en la técnica, y pueden incluir, por ejemplo, pero no se limitan a, ejemplos de sustancias solubilizantes, diluyentes o dispersantes, tales como solución salina, conservantes, tales como alcohol bencílico, promotores de la absorción y fluorocarbonos.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para su uso en la presente invención incluyen composiciones en donde los principios activos están contenidos en una cantidad eficaz para lograr su fin previsto. La determinación de las cantidades eficaces está perfectamente dentro de la capacidad de los expertos en la técnica, especialmente en vista de la divulgación detallada proporcionada en el presente documento.
Además de los principios activos, estas composiciones farmacéuticas pueden contener vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados que comprenden excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparados que se pueden usar farmacéuticamente. Los preparados formulados para administración por vía oral pueden estar en forma de comprimidos, comprimidos recubiertos de azúcar, cápsulas o disoluciones.
Los preparados farmacéuticos para uso oral se pueden obtener combinando los compuestos activos con excipientes sólidos, opcionalmente triturando una mezcla resultante, y procesando la mezcla de gránulos, después de añadir auxiliares adecuados, si se desea, para obtener comprimidos o núcleos de comprimidos recubiertos de azúcar. Los excipientes adecuados son, en particular, cargas tales como azúcares, que incluyen lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; preparados de celulosa, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica (CMC) y/o polivinilpirrolidona (PVP: povidona). Si se desea, se pueden añadir agentes disgregantes, tales como la polivinilpirrolidona reticulada, agar o ácido algínico, o una sal del mismo, tal como alginato de sodio.
Se proporcionan núcleos de comprimidos recubiertos de azúcar con recubrimientos adecuados. Para este fin, se pueden usar disoluciones concentradas de azúcar, que pueden contener opcionalmente goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol (PEG) y/o dióxido de titanio, disoluciones de laca, y disolventes orgánicos adecuados o mezclas de disolventes. Se pueden añadir colorantes o pigmentos a los comprimidos o recubrimientos de comprimidos recubiertos de azúcar para identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis de compuesto activo.
Los preparados farmacéuticos que se pueden usar por vía oral incluyen cápsulas duras hechas de gelatina, así como cápsulas selladas blandas hechas de gelatina, y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas duras pueden contener los principios activos en mezcla con carga, tales como lactosa, aglutinantes tales como almidones, y/o lubricantes tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizadores. En las cápsulas blandas, los compuestos activos se pueden disolver o suspender en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicoles (PEG) líquidos. Además, se pueden añadir estabilizadores.
Dependiendo de la afección particular, o estado de enfermedad, que se va a tratar o prevenir, se pueden administrar agentes terapéuticos adicionales, que normalmente se administran para tratar o prevenir esa afección, junto con los inhibidores de la presente divulgación. Por ejemplo, se pueden combinar agentes quimioterapéuticos u otros agentes antiproliferativos con los inhibidores de la presente divulgación para tratar enfermedades proliferativas y cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos conocidos incluyen, pero no se limitan a, adriamicina, dexametasona, vincristina, ciclofosfamida, fluorouracilo, topotecán, taxol, interferones y derivados de platino.
Otros ejemplos de agentes con los que también se puede combinar el pro-oligonucleótido no racémico de la presente divulgación incluyen, sin limitación, agentes antiinflamatorios, tales como corticosteroides, bloqueantes de TNF, IL-1 RA, azatioprina, ciclofosfamida y sulfasalazina; agentes inmunomoduladores e inmunosupresores, tales como ciclosporina, tacrolimus, rapamicina, micofenolato mofetil, interferones, corticosteroides, ciclofosfamida, azatioprina y sulfasalazina; factores neurotróficos, tales como inhibidores de la acetilcolinesterasa, inhibidores de MAO, interferones, anticonvulsivos, bloqueantes de los canales de iones, riluzol y agentes antiparkinsonianos; agentes para tratar enfermedad cardiovascular, tales como beta-bloqueantes, inhibidores de ACE, diuréticos, nitratos, bloqueantes de los canales de calcio y estatinas; agentes para tratar enfermedad hepática, tales como corticosteroides, colestiramina, interferones y agentes antivíricos; agentes para tratar trastornos de la sangre, tales como corticosteroides, agentes antileucémicos y factores de crecimiento; agentes para tratar diabetes, tales como insulina, análogos de insulina, inhibidores de alfa-glucosidasa, biguanidas y sensibilizadores de la insulina; y agentes para tratar trastornos de inmunodeficiencia, tales como globulina gamma.
Estos agentes adicionales se pueden administrar por separado, como parte de una pauta posológica múltiple, a partir de oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionados, y composición de los mismos. Alternativamente, estos agentes pueden ser parte de una forma farmacéutica única, mezclada junto con los oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionados, y composición de los mismos, en una única composición.
Los ejemplos y preparados proporcionados a continuación ilustran y ejemplifican además oligonucleótidos proporcionados y composiciones de los mismos, y métodos de preparación de los mismos. Se debe entender que el alcance de la presente invención no está limitado de modo alguno por el alcance de los siguientes ejemplos y preparados. La invención reivindicada se define en las reivindicaciones adjuntas.
La función y ventaja de esas y otras realizaciones de la presente invención será entendida más completamente a partir de los ejemplos descritos a continuación. Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar los beneficios de la presente invención, pero no ejemplifican el alcance completo de la invención. La invención reivindicada se define en las reivindicaciones adjuntas.
Método de análisis de composiciones de oligonucleótidos
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona métodos de análisis de composiciones de oligonucleótidos. En algunas realizaciones, un método proporcionado detecta, determina y/o cuantifica, por ejemplo, la identidad, pureza, cantidad y/o calidad de uno o más oligonucleótidos. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un método que comprende las etapas de:
a) realizar un primer análisis de una primera composición, primera composición que comprende una pluralidad de diferentes tipos de un oligonucleótido; y
b) comparar el primer análisis realizado con un segundo análisis, en condiciones comparables a las del primer análisis, de una segunda composición, segunda composición que es una composición quiralmente controlada del oligonucleótido, donde diferencias entre el primer y segundo análisis reflejan diferencias en la presencia o nivel de al menos un tipo de oligonucleótido en la primera composición en comparación con la segunda.
En algunas realizaciones, una segunda composición contiene solo un único tipo del oligonucleótido. En algunas realizaciones, una segunda composición contiene más de un tipo del oligonucleótido. En algunas realizaciones, se usa un método proporcionado para el control de calidad de composiciones de oligonucleótidos, por ejemplo, como se ilustra en los Ejemplos 17 y 48. Como será apreciado por los expertos en la técnica, los datos presentados en el Ejemplo 48 confirman que los análisis representados que comparan las composiciones muestran que la composición de oligonucleótidos aleatorios (la primera composición), como se prepara por síntesis de oligonucleótidos no quiralmente controlados, comprende un nivel extremadamente bajo de ciertos tipos de oligonucleótido, tales como el tipo Rp o Sp completo de la composición quiralmente controlada (la segunda composición).
Ejemplificación
Lo anterior ha sido una descripción de ciertas realizaciones no limitantes de la invención. Por consiguiente, se debe entender que las realizaciones de la invención descritas en el presente documento son simplemente ilustrativas de la aplicación de los principios de la invención. La invención reivindicada se define en las reivindicaciones adjuntas. Referencia en el presente documento a detalles de la realización ilustrada no pretenden limitar el alcance de las reivindicaciones.
Descripción general de la síntesis de oligonucleótidos
Como se ha descrito anteriormente y en el presente documento, en algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona oligonucleótidos y los métodos inventivos de preparación de los mismos. En algunas realizaciones, la síntesis del oligonucleótido se realiza usando un soporte sólido. En algunas realizaciones, la síntesis del oligonucleótido se realiza en disolución. En algunas realizaciones, la síntesis del oligonucleótido comprende etapas que usan un soporte sólido y etapas en fase de disolución. En algunas realizaciones, las etapas que usan un soporte sólido se realizan en un sintetizador de oligonucleótidos.
Preparación del soporte sólido: Se usó el soporte (poliestireno altamente reticulado (HCP) o vidrio de poro controlado (CPG)) para cargar el primer nucleósido protegido por 5'-O-DMTr contenido en la secuencia de oligonucleótidos. En algunas realizaciones, se usó un grupo oxalilo para enlazar el grupo 3'-OH del primer nucleósido a un grupo amina sobre el soporte sólido, como se describe en Alul et al., Oxalyl-CPG: a labile support for synthesis of sensitive oligonucleotide derivatives, Nucleic Acids Research 1991, 19(7), 1527. En algunas realizaciones, se usó el grupo succinilo convencional como conector.
Destritilación de nucleótido sobre el soporte sólido: Se suministró una disolución de 3 % de TCA (ácido tricloroacético) en diclorometano (DCM, CH2Cl2) a la columna que contenía el soporte que se instaló en un sintetizador para desbloquear 5'-0-DMTr.
Acoplamiento de fosforam idito quiral mediado por CMPT: Después de lavar el soporte sólido con acetonitrilo (ACN) anhidro y secar por lavado inverso con argón seco, se acopló el 5'-OH libre con el siguiente nucleótido en la secuencia de oligonucleótidos, creciendo del extremo 3' al 5'. Esto implicó el cosuministro al soporte sólido de una disolución del fosforamidito quiral junto con CMPT (a continuación), que produjo el acoplamiento altamente eficiente con excelente exceso diastereomérico (normalmente >99 %) dando un producto de diéster de fosfito quiral, como se describe por Wada et al. J. Am. Chem. Soc., 2008, 130, 16031 -1603; Angew. Chem. Intern. Ed. 2009, 48, 496-499. El disolvente era normalmente acetonitrilo (ACN), pero también se podrían usar otros disolventes.
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Fosforamiditos quirales que emplean estos estudios:
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Fosforamiditos adicionales:
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Terminación: En algunas realizaciones, la etapa de terminación se llevó a cabo en dos etapas. En algunas realizaciones, las dos etapas de terminación mencionadas anteriormente se combinaron en una y se realizaron en una etapa. A menos que se especifique de otro modo, la terminación de dos etapas se usó en la síntesis de los ejemplos descritos en el presente documento.
Para la terminación de dos etapas, después de lavar el soporte sólido con ACN anhidro y secar por lavado inverso con argón seco, el reactivo de la 'terminación A', que normalmente comprende 5 % de disolución de Pac2Ü en 2,6-lutidina/THF - 1:4 (v/v) se introdujo primero al soporte sólido. Sin la intención de limitar a teoría, la terminación A fue lo suficientemente reactiva como para terminar eficazmente (acilar) la amina libre del auxiliar quiral. En algunas realizaciones, dicha protección previene la transposición/descomposición del fosfito intermedio. Inmediatamente después de este tratamiento, una mezcla 1:1 de reactivos de 'terminación A' y 'terminación B' se envió a la columna que contenía el soporte sólido. La 'terminación B' era una disolución de 16 % de W-metilimidazol (NMI) en THF que, cuando se mezcló con la 'terminación A', efectuó la terminación de, por ejemplo, el oligonucleótido 5'-OH sin reaccionar unido al soporte sólido. Sin desear quedar limitado por teoría, la etapa de terminación fue extremadamente importante ya que, sin la terminación del grupo amino del auxiliar quiral, la posterior etapa de sulfurización dentro del ciclo indujo la escisión del enlace internucleotídico y la descomposición del oligonucleótido, por ejemplo, debido a un ataque nucleófilo intermolecular no deseado de la amina libre del auxiliar sobre el átomo de fósforo. Además, la terminación de los grupos 5'-OH de los shortmeros de oligonucleótido soportados sobre sólido no acoplados no iniciados es crucial con respecto a la obtención de alta pureza del oligonucleótido en bruto de longitud completa, que evita bajos rendimientos debido a la acumulación de largas secuencias fallidas y purificaciones finales tediosas y difíciles, si no imposibles.
Sulfurización: Después de lavar el soporte sólido con ACN anhidro y secar por lavado inverso con argón seco, el producto intermedio de triéster de fosfito terminado resultante se sometió a sulfurización oxidativa. Se preparó una disolución de reactivo de sulfurización mezclando el reactivo de sulfurización, por ejemplo, un derivado de tiosulfonato de alquilo (300 mM), con W,0-bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida (BSTFA) (100 mM) en ACN. Éste se suministró entonces a la columna que contenía el soporte sólido y se dejó que reaccionara durante una cierta cantidad de tiempo (normalmente 5 - 60 min). En algunas realizaciones, el reactivo de tiosulfonato de sulfurización se usó como una disolución 300 mM en ACN anhidro, sin adición de BSTFA. En algunas realizaciones, las disoluciones de reactivo con y sin BSTFA produjeron resultados similares.
Oxidación: En algunas realizaciones, la oxidación a fosfodiéster se realizó en lugar de la etapa de sulfurización. La oxidación se logró por suministro de una disolución de I20,02 M en un sistema de codisolventes de THF/piridina/agua (70:20:10 - v/v/v), formando un enlace fosfodiéster no quiral.
Desbloqueo en 5' del grupo DMTr: La retirada de DMTr se efectuó usando 3 % de TCA en DCM. Después del desbloqueo, el ciclo puede seguir adelante para otras rondas iterativas de acoplamiento, terminación, sulfurización/oxidación (ya sea sulfurización con el mismo agente de sulfurización, o sulfurización con un agente de sulfurización diferente, u oxidación en lugar de sulfurización, para cada uno de los siguientes ciclos) y desbloqueo. Alternativamente, si se alcanzó la longitud previamente diseñada, el oligonucleótido se sometió a salida del ciclo y, opcionalmente, tratamiento post-sintético. En algunas realizaciones, el oligonucleótido se retiró antes del desbloqueo del grupo 5'-O-DMTr terminal.
Retirada espontánea del auxiliar quiral: La retirada espontánea del auxiliar quiral se logró durante la sulfurización, oxidación, desbloqueo del grupo DMTr, o la combinación de los mismos. No se necesitó etapa específica para retirar el auxiliar quiral.
Escisión y desprotección: Se retiró el oligonucleótido de longitud deseada de su soporte sólido por escisión del conector correspondiente (HCP o CPG unido a oxalilo o succinilo), mientras que al mismo tiempo se desprotegieron los grupos protectores sobre el oligonucleótido. En algunas realizaciones, el oligonucleótido soportado en sólido se trató primero con una disolución anhidra 1 M de 1,5-diazabiciclo(4.3.0)non-5-eno (DBN) o 1,8-diazabicicloundec-7-eno (DBU) en ACN seco-cloruro de trimetilsililo - 16:1 (v/v) durante 10 min a ta y luego se lavó con ACN seco, como se describe por Reese y Yan, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 2002, 2619. En algunas realizaciones, el material se trató con disoluciones de propilamina seca en piridina seca (normalmente en una relación 1:4) durante un periodo de 18 h a ta o a 60 °C durante 2 h. En algunas realizaciones, cualquier condición proporcionó el compuesto en bruto con calidad similar. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos en bruto se escindieron del soporte y se desprotegieron mediante tratamiento con 28 % de amoniaco acuoso durante un periodo de 18 h a ta o a 60 °C durante 5 h. En algunas realizaciones, cualquier condición proporcionó el compuesto en bruto con calidad similar. Entonces se evaporaron los disolventes y el residuo se trató con disolución acuosa de pH ~ 1,5 (el pH se puede alterar si se desea) con 0-50 % de DMSO, y el producto en bruto se sometió a análisis por una combinación de HPLC y UPLC/MS. El producto se purificó por uno de o una combinación de HPLC de fase inversa (RP-HPLC), HPLC de fase normal, HPLC de intercambio iónico (IE-HPLC) o cromatografía de exclusión por tamaño. En algunas realizaciones, el oligonucleótido se retiró del soporte sólido, se desprotegió y se purificó antes del desbloqueo del grupo DMTr.
Ejemplo 1: Síntesis de reactivos de sulfurización y síntesis de fosforam iditos
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona reactivos de sulfurización, y métodos de preparación de los mismos. En algunas realizaciones, los reactivos de sulfurización proporcionados se usaron en la síntesis inventiva de oligonucleótidos descritos en la presente divulgación. Los reactivos de sulfurización a modo de ejemplo y sus síntesis se ilustran en el Esquema E-1
Esquema E -l- Síntesis de reactivos de sulfurización.
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(viii) luego (ix)
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IJ33
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
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
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(i) MsCI, NEt3; (ii) NaMTS; (iii) PivCl, NEt3; (iv) NaMTS, Nal; (v) compuesto 4; (vi) TMSCI, NEt3; (vii) compuesto 35, DEAD, PPh3; (viii) TBAF; (ix) TsCl, piridina; (x) AC2O, piridina; (xi) KTTS; (xii) (COCl)2 ; (xiii) Fmoc-OSu, Py; (xiv) NaOH (ac); (xv) Na-p-ClPheTS; 4-nitrobencenosulfinato de sodio, Br2 ; (xvii) H2O2 , NaI
Síntesis del compuesto 5
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Compuesto 2: Una disolución de (Z)-but-2-eno-1,4-diol (0,93 ml, 11,3 mmoles) y trietilamina (3,3 ml, 24 mmoles) en diclorometano (DCM, 50 ml) se añadió gota a gota a una disolución helada con agitación de cloruro de metanosulfonilo (1,9 ml, 24 mmoles) en DCM (50 ml). Después de agitar durante 0,5 h a ta, la mezcla se vertió sobre hielo y se extrajo.
La fase orgánica se recogió, se secó (MgSO4) y se filtró. Después de retirar el disolvente, se obtuvieron 2,66 g de compuesto 2 (96 %), que se consideró por RMN que era suficientemente puro para el uso directo en la siguiente etapa de la reacción. 1H RMN (399 MHz, CDCh) ó 5,94 (ddd, J = 5,4, 4,1, 1,3 Hz, 2H), 4,83 (dd, J = 4,1, 1,3 Hz, 4H), 3,04 (s, 6H); 13C RMN 128,34, 64,38, 38,27; MS (ESI ve): calc (M+NH4)+: 262,04, hallado: 262,05; Rf = 0,3 (1:1 de EtOAc/hexano).
Compuesto 3: Una disolución de metanosulfonotioato de sodio (1,51 g, 11,3 mmoles) en MeOH (20 ml) se trató con dimetanosulfonato de (Z)-but-2-eno-1,4-diílo puro (1,25 g, 5,12 mmoles) a temperatura ambiente. Después de 5 min, se observó que ocurrió la precipitación. Después de 36 h, la mezcla se repartió entre agua y DCM. La fase orgánica se separó, se secó (MgSO4) y se filtró. La retirada de disolvente proporcionó un aceite incoloro. La cromatografía en columna (ISCO) dio el compuesto 3 puro (0,89 g, 63 %) como un aceite incoloro. 1H RMN (399 MHz, CDCh) ó 5,84 (ddd, J = 6,6, 5,1, 1,5 Hz, 2H), 3,92 (dd, J = 5,1, 1,5 HZ, 4H), 3,33 (s, 6H); 13C RMN 128,1,51,47, 33,13; MS (ESI ve): calc (M+NH4)+: 294,00, hallado: 294,04; Rf = 0,4 (1 :1 de EtOAc/hexano).
Compuesto 4: Bajo una atmósfera de argón, se añadió morfolina (10 g, 115 mmoles) a sulfuro de etileno (15 g, 250 mmoles) en un matraz redondo. La reacción se agitó durante 7 horas y se cargó directamente sobre una columna de gel de sílice. La columna se lavó con DCM primero y luego se usó 2 % de MeOH/DCM para obtener el compuesto 4 (15,3 g, 91 %) como un aceite incoloro. 1H RMN (399MHz, CDCh) ó 3,67-3,59 (m, 4H), 2,63-2,52 (m, 2H), 2,51 -2,45 (m, 2H), 2,44-2,34 (m, 4H); MS (ESI ve): calc (M+H)+ = 148,07, hallado: 148,1.
Compuesto 5: Se añadió gota a gota por jeringa una disolución en DCM (1 ml) de 2-morfolinoetanotiol (0,21 g, 1,44 mmoles) a una disolución con agitación del compuesto 3 (0,40 g, 1,44 mmoles) en DCM (10 ml) a temperatura ambiente. Inmediatamente después de la adición, la reacción se comprobó por TLC, que muestra la rápida formación de producto y algo de dímero. Después de 0,5 h, la mezcla se repartió mediante la adición de agua. Tras la extracción, la fase orgánica se separó, se secó (MgSO4) y se filtró. Después de retirar el disolvente a vacío, la cromatografía en columna dio el compuesto 5 (0,29 g, 58 %) como un aceite incoloro. 1H RMN (399 MHz, CDCh) ó 5,78 (m, 2H), 3,92 (d, J = 7,3 Hz, 2H), 3,70 (t, J = 4,7 Hz, 4H), 3,46 (d, J = 5,5 Hz, 2H), 3,31 (s, 3H), 2,84 (dd, J = 7,8, 6,7 Hz, 2H), 2,66 (dd, J = 7,8, 6,7, 2H), 2,48 (t, J = 4,6 Hz, 4H); 13C RMN 130,35, 126,27, 66,97, 58,20, 53,67, 51,52, 36,22, 35,16, 33,67;
MS (ESI ve): calc (M+H)+: 344,05, hallado: 344,06; Rf = 0,3 (EtOAc).
Figure imgf000237_0001
Compuesto 5b: Se añadió gota a gota por jeringa una disolución de compuesto 4b (395 mg, 1,085 mmoles) en DCM (1 ml) a una disolución con agitación de DCM (15 ml) del compuesto 3 (300 mg, 1,085 mmoles) a ta. Después de 1 h, la disolución resultante se repartió mediante la adición de agua. Tras la extracción, la fase orgánica se separó, se secó (MgSO4) y se filtró. Después de retirar el disolvente a vacío, la cromatografía en columna dio el compuesto 5b como un aceite incoloro (0,35 g, 58 %). 1H RMN (399 MHz, CDCh) ó 5,83 - 5,70 (m, 2H), 5,35 - 5,21 (dt, J = 26,0, 9,3 Hz, 2H), 5,16 - 5,07 (m, 1H), 4,59 - 4,54 (d, J = 9. 5 Hz, 1H), 4,29 - 4,23 (m, 1H), 4,23 - 4,18 (m, 1H), 3,99 - 3,88 (dd, J= 6,7, 1,2 Hz, 2H), 3,80 - 3,72 (ddd, J= 10,1,4,6, 2,6 Hz, 1 H), 3,64 - 3,56 (m, 1H), 3,50 - 3,43 (m, 1H), 3,31 (s, 3H), 2,09 (s, 3H), 2,03 (s, 6H), 2,00 (s, 3H); 13C RMN (100 MHz, CDCh) ó 170,68, 170,30, 169,51,169,30, 129,43, 127,14, 87,73, 76,49, 73,89, 69,16, 67,99, 61,99, 51,64, 35,89, 33,58, 20,95, 20,80, 20,74, 20,71; MS (ESI ve): calc (M+NH4)+: 578,07, hallado: 577,96; Rf = 0,5 (1:1 de EtOAc/hexano).
Síntesis del compuesto 7
Figure imgf000237_0002
Compuesto 6: Se trató una disolución helada de (Z)-but-2-eno-1,4-diol (0,93 ml, 11,3 mmoles) y trietilamina (1,6 ml, 11,5 mmoles) en DCM (50 ml) por jeringa con cloruro de pivaloílo (1,4 ml, 11,4 mmoles) durante 2 min. Después de 1 h, la TLC mostró buenos resultados de la reacción. La mezcla resultante se repartió mediante la adición de agua. Tras la extracción, la fase orgánica se separó, se secó (MgSO4) y se concentró a vacío. Se encontró que este producto en bruto: no contenía por TLC (Rf = 0,6, 1:1 EtOAc/hexano) diol de partida y se usó en bruto para preparar el mesilato.
El material en bruto se recogió en DCM (50 ml) que contenía trietilamina (1,7 ml, 12 mmoles) y se enfrío sobre un baño de hielo. Se añadió gota a gota cloruro de metanosulfonilo (0,98 ml, 12,66 mmoles) por una jeringa durante 2 min. La TLC inmediatamente después de la adición indicó el consumo completo de material de partida. La mezcla resultante se repartió mediante la adición de agua. Tras la extracción, la fase orgánica se separó, se secó (MgSO4), se filtró y se concentró a vacío. La cromatografía en columna dio el compuesto 6 puro, 1,48 g, 52 %, como un aceite incoloro. 1H RMN (399 MHz, CDCL) 55,89 - 5,75 (m, 2H), 4,89 - 4,84 (d, J = 5,7 Hz, 2H), 4,68 - 4,63 (d, J = 5,9 Hz, 2H), 3,03 (s, 3H), 1,19 (s, 9H); 13C RMN (100 MHz, CDCL) 5 178,28, 130,61, 126,11, 65,08, 59,65, 38,84, 38,21,27,25; MS (ESI ve): calc (M+NH4)+: 268,12, hallado: 268,20; Rf = 0,3 (20 % de EtOAc/hexano).
Compuesto 7: Se agitó a ta durante 18 h una disolución de metanosulfonotioato de sodio (0,63 g, 4,70 mmoles) en MeOH (10 ml) y pivalato de (Z)-4-(metilsulfoniloxi)but-2-enilo (1,00 g, 4,00 mmoles) con formación de un precipitado blanco (después de 10 min). La mezcla resultante se repartió mediante la adición de agua y DCM. Tras la extracción en DCM, la fase orgánica se separó, se secó (MgSO4), se filtró y se concentró a vacío. La cromatografía en columna dio el compuesto 7, 0,83 g, 78 % como un aceite incoloro. 1H RMN (399 MHz, CDCL) 55,82 - 5,73 (m, 2H), 4,73 - 4,66 (m, 2H), 3,95 - 3,87 (m, 2H), 3,32 (s, 3H), 1,19 (s, 9H); 13C RMN (100 MHz, CDCL) 5178,35, 129,37, 127,32, 59,50, 51,44, 38,84, 33,61,27,28; MS (ESI ve): calc (M+NH4)+: 284,10, hallado: 284,19; Rf = 0,4 (20 % de EtOAc/hexano).
Síntesis del compuesto 9
Figure imgf000238_0001
Figure imgf000238_0004
Compuesto 9: Se añadió gota a gota cloruro de pivaloílo (0,60 g, 5,0 mmoles) a una disolución con agitación de metanosulfonotioato de S-2-hidroxietilo (0,65 g, 4,16 mmoles) en DCM (20 ml). Después de 2 h a ta, la mezcla resultante con precipitado blanco se repartió con agua. La fase orgánica se separó, se secó (Na2SO4), se concentró por filtración dando un aceite. La cromatografía en columna dio el compuesto 9 como un aceite incoloro (0,45 g, 45 %).
1H RMN (399 MHz, CDCL) 54,39 - 4,34 (t, J = 6,3 Hz, 2H), 3,44 - 3,39 (t, J = 6,3 Hz, 2H), 3,36 (s, 3H), 1,20 (s, 9H); 13C RMN (100 MHz, CDCL) 562,10, 51,11,38,96, 35,19, 27,24; MS (ESI ve): calc (M+NH4)+: 158,08, hallado: 158,04; Rf = 0,3 (20 % de EtOAc/hexano).
Síntesis del compuesto 12
Figure imgf000238_0002
Compuesto 11: Se añadió gota a gota cloruro de pivaloílo (4,96 ml, 40,3 mmoles) por una jeringa a una disolución helada de DCM (50 ml) de 2-(hidroximetil)fenol (5 g, 40,3 mmoles) y trietilamina (5,61 ml, 40,3 mmoles). Se trató una disolución helada del éster de pivalato en bruto con trietilamina (6,74 ml, 48,4 mmoles) y 50 ml de DCM. Entonces se añadió lentamente (5 min) por una jeringa cloruro de metanosulfonilo (3,43 ml, 44,3 mmoles) y la mezcla resultante se calentó hasta ta. La mezcla se vertió sobre hielo y la fase orgánica se separó, luego se lavó con NaHCO3 sat (ac), se secó (MgSO4), se filtró y se concentró proporcionando 10,5 g de aceite amarillo pálido en bruto. La cromatografía en columna (ISCO) dio 11 puro, 5,45 g, 47 %. 1H RMN (399 MHz, CDCL) 57,53 - 7,46 (dd, 7,7, 1,8 Hz, 1 H), 7,46 - 7,40 (dt, 7,7, 1,8 Hz, 1 H), 7,32 - 7,24 (t, 7,7 Hz, 1 H), 7,13 - 7,06 (d, 7,7 Hz, 1H), 5,21 (s, 2H), 2,79 (s, 3H), 1,40 (s, 9H); 13C RMN (100 MHz, CDCL) 5177,05, 150,06, 131,18, 131,07, 126,35, 125,94, 123,21,66,88, 39,48, 38,82, 27,30, 27,26. MS (ESI ve): calc (M+NH4)+: 304,12, hallado: 303,99; Rf = 0,4 (20 % de EtOAc/hexano).
Compuesto 12: Se trató una disolución de metanosulfonotioato de sodio (0,825 g, 6,15 mmoles) en MeOH (20 ml) con pivalato de 2-((metilsulfoniloxi)metil)fenilo (1,76 g, 6,15 mmoles) a ta y se dejó con agitación durante 18 h. La mezcla se repartió entre agua y DCM. La fase orgánica se separó, se secó (MgSO4), se filtró y se concentró proporcionando un aceite incoloro. La cromatografía en columna dio el compuesto 12 puro como un aceite incoloro pálido, 0,754 g, 41 %. 1H RMN (399 MHz, CDCL) 57,48 - 7,44 (dd, J = 7,7, 1,7 Hz, 1H), 7,39 - 7,34 (td, J = 7,8, 1,7 Hz, 1 H), 7,25 - 7,20 (td, J = 7,6, 1,2 Hz, 1H), 7,10 - 7,06 (dd, J = 8,2, 1,2 Hz, 1H), 4,29 (s, 2H), 2,90 (s, 3H), 1,39 (s, 9H); 13C RMN (100 MHz, CDCL) 5176,69, 149,59, 131,17, 129,85, 127,41,126,18, 123,40, 51,43, 39,47, 36,01,27,30; MS (ESI ve): calc (M+NH4)+: 320,10, hallado: 320,09; Rf = 0,4 (20 % de EtOAc/hexano).
Síntesis del compuesto 14
(iv)
cr o p í v
13
Figure imgf000238_0003
Compuesto 14: Se añadió pivalato de clorometilo (0,478 ml, 3,32 mmoles) a una mezcla con agitación de yoduro de sodio (0,050 g, 0,33 mmoles) y metanosulfonotioato de sodio (0,445 g, 3,32 mmoles) en acetona (7 ml) a ta. Después de 24 h, la TLC mostró buena conversión en producto. El disolvente se retiró, y el residuo se repartió entre agua y DCM. La fase orgánica se separó y se secó (MgSO4), se filtró y se concentró proporcionando un aceite incoloro. La cromatografía en columna dio 14 puro como un sólido ligeramente rosa, 0,41 g, 55 %. 1H RMN (399 MHz, CDCL) 5 5,67 (s, 2H), 3,39 (s, 3H), 1,24 (s, 9H); 13C RMN (100 MHz, CDCis) 5177,35, 67,84, 52,20, 38,93, 27,05; Rf = 0,5 (20 % de EtOAc/hexano).
Síntesis del compuesto 16
Figure imgf000239_0001
Figure imgf000239_0005
Compuesto 16: Se preparó a partir de 15 y NaMTS como se describe previamente en ei documento de patente US 3.484.473. 1H RMN (399 MHz, CDCI3) 54,86 (s, 2H), 3,45 (s, 6H); 13C RMN (100 MHz, CDCI3) 552,15, 41,50. Síntesis de los compuestos 18 y 19
Figure imgf000239_0002
Compuesto 18: Se preparó a partir de 17 y NaMTS como se describe previamente: Chem. Pharm. Buii. Voi. 12(11) p. 1271,1964. 1H RMN (399 MHz, CDCh) 53,55 (s, 4H), 3,40 (s, 6H); 13C RMN (100 MHz, CDCh) 550,67, 35,96. Compuesto 19: Se añadió gota a gota una disoiución de 2-morfoiinoetantioi (0,17 g, 1,2 mmoies) en DCM (1 mi) por una jeringa a una disoiución con agitación dei compuesto 18 (300 mg, 1,2 mmoies) en DCM (10 mi) a ta. Inmediatamente después de ia adición, ia TLC mostró ia rápida formación de producto y aigo de dímero. Después de 0,5 h, ia mezcia se repartió mediante ia adición de disoiución de NaHCO3. Tras ia extracción, ia fase orgánica se separó, se secó (MgSO4), se fiitró y se concentró a vacío. La cromatografía en coiumna dio 19 puro (0,20 g, 53 %) como un aceite incoioro. 1H RMN (399 MHz, CDCh) 53,73 - 3,67 (t, J = 4,7 Hz, 4H), 3,51 - 3,46 (m, 2H), 3,35(s, 3H), 3,07 - 3,01 (m, 2H), 2,88 - 2,83 (m, 2H), 2,69 - 2,63 (m, 2H), 2,52 - 2,43 (t, J = 4,6 Hz, 4H); 13C RMN (100 MHz, CDCh) 5 66,96, 57,91,53,58, 50,79, 37,66, 36,10, 35,52; MS (ESI ve): caic (M+H)+: 318,03, haiiado: 318,04; Rf = 0,3 (EtOAc). Síntesis del compuesto 22
Figure imgf000239_0003
Compuesto 21: Ei compuesto 20 se convirtió en ei compuesto 21 mediante un procedimiento anáiogo ai descrito para ei compuesto 11. 1H RMN (399 MHz, CDCh) 57,45 - 7,36 (m, 4H), 5,37 (s, 2H), 5,21 (s, 2H), 2,93 (s, 3H), 1,21 (s, 9H); 13C RMN (100 MHz, CDCh) 5 178,20, 135,65, 131,92, 130,48, 129,98, 129,78, 128,88, 69,05, 63,39, 38,94, 38,36, 27,27; MS (ESI ve): caic (M+NH4)+: 318,24, haiiado: 318,14; Rf = 0,4 (20 % de EtOAc/hexano).
Compuesto 22: Ei compuesto 21 se convirtió en ei compuesto 22 mediante un procedimiento anáiogo ai descrito para ei compuesto 12. 1H RMN (399 MHz, CDCh) 57,46 - 7,32, (m, 4H), 5,21 (s, 2H), 4,50 (s, 2H), 3,03 (s, 3H), 1,21 (s, 9H); 13C RMN (100 MHz, CDCh) 5178,24, 135,10, 133,15, 130,93, 130,32, 129,05, 129,00, 63,61,51,07, 38,97, 38,03, 27,30; MS (ESI ve): caic (M+NH4)+: 334,11, haiiado: 334,13; Rf = 0,4 (20 % de EtOAc/hexano).
Síntesis del compuesto 25
Figure imgf000239_0004
Compuesto 23: Ei compuesto 23 se prepara según un método de ia bibiiografía (Journai of Medicinai Chemistry, 50(23), 5568-5570, 2007).
Compuesto 24: Se trata sucesivamente una disoiución dei compuesto 23 (1 mmoi) en piridina heiada (10 mi), gota a gota, con cioruro de acetiio (1 mmoi), iuego después de 5 min con MsCi (1,1 mmoies). La disoiución se caiienta hasta temperatura ambiente, iuego se retira ei disoivente. Ei residuo se disueive en EtOAc, se iava con agua, se seca (MgSO4), se fiitra y se concentra a vacío. La purificación por cromatografía en coiumna proporciona ei compuesto 24 puro.
Compuesto 25: El compuesto 24 se convierte en el compuesto 25 mediante un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 12.
Síntesis del compuesto 27
Figure imgf000240_0001
Compuesto 27: El compuesto 26 se convirtió en el compuesto 27 mediante un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 14. 1H RMN (399 MHz, CDCh) 53,97 (s, 2H), 3,79 (s, 3H), 3,48 (s, 3H); 13C RMN (100 MHz, CDCta) 5 168,84, 53,35, 51,53, 37,83; MS (ESI ve): calc (M+NH4)+: 202,02, hallado: 201,96; Rf = 0,2 (20 % de EtOAc/hexano). Síntesis del compuesto 29
Figure imgf000240_0002
Compuesto 29: El compuesto 28 se convirtió en el compuesto 29 mediante un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 14. 1H RMN (399 MHz, CDCh) 53,72 (s, 3H), 3,39 (t, J = 6,8 Hz, 2H), 3,34 (s, 3H), 2,85 (t, J = 6,8 Hz, 2H); 13C RMN (100 MHz, CDCta) 5171,53, 52,29, 50,66, 34,51,31,20; MS (ESI ve): calc (M+NH4)+: 216,10, hallado: 216,04; Rf = 0,2 (20 % de EtOAc/hexano).
Síntesis del compuesto 31
Figure imgf000240_0003
Compuesto 30: El compuesto 30 se prepara según un método de la bibliografía (Tetrahedron, 42(2), 601-607; 1986). Compuesto 31: El compuesto 31 se prepara a partir del compuesto 30 según un procedimiento de patente (US 20090181444).
Síntesis del compuesto 33
Figure imgf000240_0004
Figure imgf000240_0006
Compuesto 33: El compuesto 33 se prepara a partir del compuesto 32 según un procedimiento de patente (US 20090181444).
Síntesis del compuesto 38
Figure imgf000240_0005
Compuesto 36: Una disolución del compuesto 34 (1 mmol) en DCM enfriada (20 ml) se trata con NEt3 (1 mmol), seguido por la adición gota a gota de TMS-Cl (1,1 mmoles). Después de 1 h, la disolución se lava con agua, se seca (MgSO4), se filtra y se concentra a vacío. El material protegido con TMS en bruto se vuelve a disolver en THF (10 ml), tras lo cual se añaden sucesivamente PPh3 (1,2 mmoles), compuesto 35 (1,2 mmoles), luego DEAD (1,2 mmoles, gota a gota). Después de agitar a temperatura ambiente durante 18 h, el disolvente se retira a vacío, el residuo se vuelve a disolver en DCM, cuya disolución se lava con agua, se seca (MgSO4), se filtra y se concentra a vacío. La purificación por cromatografía en columna proporciona el compuesto 36 puro.
Compuesto 37: Se trata una disolución del compuesto 36 (0,5 mmoles) en THF (10 ml) con TBAF (1 mmol de una disolución 1 M en THF), con monitorización por TLC. Tras finalizar la escisión de TMS, el disolvente se retira a vacío, y el residuo se vuelve a disolver en DCM, cuya disolución se lava con agua, se seca (MgSO4), se filtra y se reduce a vacío. El alcohol en bruto se vuelve a disolver en piridina (5 ml), y se añade TsCl (0,55 mmoles). Después de 18 h a temperatura ambiente, el disolvente se retira, y el residuo se vuelve a disolver en DCM, cuya disolución se lava con agua, se seca (MgSO4), se filtra y se reduce a vacío. La purificación por cromatografía en columna proporciona el compuesto 37 puro.
Compuesto 38: El compuesto 37 se convierte en el compuesto 38 mediante un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 12.
Síntesis del compuesto 41
Figure imgf000241_0001
Compuesto 40: Una disolución del compuesto 39 (1 mmol) en DCM helada (20 ml) se trata con NEt3 (1 mmol), seguido por la adición gota a gota de TMS-Cl (1,1 mmoles). Después de 1 h, la disolución se lava con agua, se seca (MgSO4), se filtra y se concentra a vacío. El material protegido con TMS en bruto se vuelve a disolver en THF (10 ml), tras lo cual se añaden sucesivamente PPh3 (1,2 mmoles), p-toluenotiosulfonato de potasio (KTTS, 1,2 mmoles), ZnCl2 anhidro (1 mmol), luego DEAD (1,2 mmoles, gota a gota). Después de agitar a ta durante 18 h, el disolvente se retira a vacío, y el residuo se vuelve a disolver en DCM, cuya disolución se lava con agua, se seca (MgSO4), se filtra y se concentra a vacío. La purificación por cromatografía en columna proporciona el compuesto 40 puro.
Compuesto 41: Se trata una disolución del compuesto 40 (0,5 mmoles) en THF (10 ml) con TBAF (1 mmol de una disolución 1 M en THF), con monitorización por TLC. Tras finalizar la escisión de TMS, el disolvente se retira a vacío, y el residuo se vuelve a disolver en DCM, cuya disolución se lava con agua, se seca (MgSO4), se filtra y se concentra a vacío. El alcohol en bruto se vuelve a disolver en THF (10 ml), tras lo cual se añaden sucesivamente PPh3 (1,2 mmoles), compuesto 35 (1,2 mmoles), luego DEAD (1,2 mmoles, gota a gota). Después de agitar a ta durante 18 h, el disolvente se retira a vacío, y el residuo se vuelve a disolver en DCM, cuya disolución se lava con agua, se seca (MgSO4), se filtra y se concentra a vacío. La purificación por cromatografía en columna proporciona el compuesto 41 puro.
Síntesis del compuesto 43
Figure imgf000241_0002
Compuesto 43: El compuesto 42 se convierte en el compuesto 43 mediante un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 14.
Síntesis del compuesto 45a, 45b, 47a y 47b
Figure imgf000241_0003
Compuesto 45a: Se agitó una mezcla de clorhidrato de 4-(2-cloroetil)morfolina (compuesto 44) (50 g, 269 mmoles), yoduro de sodio (4,03 g, 26,9 mmoles) y 4-metilbencenosulfonotioato de potasio (73,0 g, 322 mmoles) en MeOH (200 ml) y se calentó a 60 °C durante 72 h. La mezcla de color amarillo pálido se enfrió y se diluyó con 200 ml de agua, se agitó durante 0,5 h, luego el sólido blanco se recogió por filtración, se lavó con agua (100 ml), IPA (200 ml), EtOAc (200 ml) y éter (200 ml). Masa secada = 68 g. El polvo microcristalino recristalizó en agua a 90 °C (200 ml) y la masa cristalina se recogió por filtración después de reposar a ta durante la noche (64 g, 71 %). 1H RMN (500 MHz, CDCh) 5 7,83 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,36 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 3,67 (t, J = 4,7 Hz, 4H), 3,16 (t, J = 6,9 Hz, 2H), 2,64 (t, J = 6,9 Hz, 2H), 2,47 (s, 3H), 2,41 (t, J = 4,4 Hz, 4H); 13C RMN (100 MHz, CDCh) 5144,82, 141,99, 129,95, 127,14, 66,85, 56,54, 53,18, 33,44, 21,78; MS (ESI ve): calc (M+H)+: 302,08, hallado: 302,22.
Compuesto 45b: Sustituyendo 4-metilbencenosulfonotioato de potasio con 4-clorobencenosulfonotioato de potasio, el compuesto 45b se sintetizó por un método análogo al descrito para el compuesto 45a. (ESI va): calc (M+H)+:
324,03, 322,04, hallado: 324,22, 322,20 (patrón de isótopos 37Cl, 35Cl).
Compuesto 47a: Sustituyendo clorhidrato de 4-(2-cloroetil)morfolina con bromhidrato de 4-(2-bromooetil)-A/-metilpiperazina (compuesto 46), el compuesto 47a se sintetizó por un método análogo al descrito para el compuesto 45a. MS (ESI va): calc (M+H)+: 315,12, hallado: 315,07.
Compuesto 47b: Sustituyendo clorhidrato de 4-(2-cloroetil)morfolina con bromhidrato de 4-(2-bromooetil)-W-metilpiperazina y 4-metilbencenosulfonotioato de potasio con 4-clorobencenosulfonotioatode potasio, el compuesto 47b se sintetiza por un método análogo al descrito para el compuesto 45a.
Síntesis del compuesto 50
Figure imgf000242_0001
Compuesto 49: Una mezcla del compuesto 48, (500 mg, 1,894 mmoles) y metanosulfonotioato de sodio (534 mg, 3,98 mmoles) se disolvió en acetona (10 ml) y se agitó a ta durante 4 h. La TLC indicó una reacción completa. Entonces se retiró el disolvente, la mezcla se repartió mediante la adición de agua y DCM. Tras la extracción, la fase orgánica se separó, entonces se secó (MgSO4), se filtró y se concentró a vacío. La cromatografía en columna proporcionó el producto puro como un sólido incoloro (0,60 g, 97 %). 1H RMN (399 MHz, CDCh) 57,47 (dd, J = 5,5, 3,5 Hz, 2H), 7,38 (dd, J = 5,5, 3,5 Hz, 2H), 4,55 (s, 4H), 3,13 (s, 6H); 13C RMN (100 MHz, CDCh) 5133,41,131,75, 129,51,51,02, 37,09;
MS (ESI ve): calc (M+NH4)+: 344,01, hallado: 344,01; Rf = 0,5 (1:1 de EtOAc/hexano).
Compuesto 50: Se añadió gota a gota una disolución del compuesto 4, (180 mg, 1,225 mmoles) en DCM (2 ml) por una jeringa una disolución con agitación del compuesto 49 (400 mg, 1,225 mmoles) en DCM (20 ml) a ta. Después de 0,5 h, la mezcla se repartió mediante la adición de NaHCO3. Tras la extracción, la fase orgánica se separó, entonces se secó (MgSO4), se filtró y se concentró a vacío. La cromatografía en columna dio el producto (170 mg, 35 %) como un aceite incoloro. 1H RMN (399 MHz, CDCh) 57,43 - 7,39 (m, 1H), 7,35 - 7,27 (m, 3H), 4,54 (s, 2H), 4,03 (s, 2H), 3,67 (t, J = 4,6 Hz, 4H), 3,05 (s, 3H), 2,58 - 2,50 (m, 4H), 2,38 (t, J= 4,6 Hz, 4H); 13C RMN (100 MHz, CDCh) 5136,09, 133,20, 131,87, 131,21, 128,86, 128,54, 66,95, 57,95, 53,52, 51,04, 40,81, 38,18, 35,82; MS (ESI ve): calc (M+H):
394,06, hallado: 394,23; Rf = 0,5 (EtOAc).
Síntesis del compuesto 55
Figure imgf000242_0002
Figure imgf000242_0003
Compuesto 54: Se añadió gota a gota durante 0,5 h bromo (0,246 ml, 4,78 mmoles) en DCM (50 ml) a una mezcla con agitación de 4-nitrobencenosulfinato de sodio (2 g, 9,56 mmoles) y disulfuro de 2-hidroxietilo (0,585 ml, 4,78 mmoles) en DCM (50 ml) a ta. Después de 2 h a ta, la mezcla se filtró para retirar la sal. El disolvente se retiró, entonces la purificación en columna por cromatografía en columna dio el producto (2,1 g, 83 %) como un aceite incoloro. Rf = 0,4 (1:1 EA/hexano. 1H RMN (399 MHz, CDCh) 58,41 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 8,13 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 3,89 (t, J = 5,8 Hz, 2H), 3,23 (t, J = 5,8 Hz, 2H), 2,02 - 1,94 (s, a, 1H); 13C RMN (100 MHz, CDCh) 5149,73, 128,40, 124,82, 60,94, 39,28.
Compuesto 55: El compuesto 51 (1 g, 3,07 mmoles) en DCM (50 ml) se trató gota a gota con cloruro de oxalilo (0,527 ml, 6,15 mmoles) y se agitó a ta. Durante la reacción se formó una disolución homogénea incolora. Después de 1 h a ta, el disolvente se retiró a presión reducida. El residuo blanco (cloruro de ácido en bruto, compuesto 52) se volvió a disolver en DCM (20 ml) y se añadió a una disolución con agitación del compuesto 54 (0,48 g, 3,1 mmoles) en piridina (20 ml). Después de 18 h, se consideró que la reacción había terminado. Los disolventes se retiraron. El residuo se volvió a disolver en tolueno y se repartió con agua. Los extractos de tolueno se recogieron, se lavaron con salmuera, se secaron (MgSO4), se filtraron y se concentraron. La cromatografía en columna proporcionó el compuesto 55 puro (0,86 g, 60 %) como un sólido incoloro. 1H RMN (399 MHz, CDCI3) 58,31 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 8,03 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 7,7 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,58 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,42 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 7,32 (dt, J = 7,5, 1,2 Hz, 2H), 5,22 (s, a, 1H), 4,34 (s, a, 4H), 4,19 (t, J = 6,8 Hz, 1H), 3,23 (t, J = 6,0 Hz, 2H), 4,17 (s, a, 6H); 13C RMN (100 MHz, CDCla) 5 173,91, 155,10, 150,60, 149,53, 143,85, 141,42, 128,27, 128,20, 127,91, 127,22, 127,18, 125,12, 124,84, 120,17, 66,81,62,60, 56,40, 47,25, 34,76, 25,37; MS (ESI ve): calc (M+H)+: 571,11, hallado: 571,00; Rf = 0,5 (EtOAc).
Síntesis del compuesto 59
Figure imgf000243_0001
Compuesto 57: El compuesto 57 se prepara a partir del compuesto 56 (1 mmol) por reacción con 1,5 eq de Fmoc-OSu en piridina a ta durante 18 h. Procesamiento acuoso, luego la cromatografía en columna proporciona el compuesto 57 puro.
Compuesto 59: El compuesto 59 se prepara a partir del compuesto 57 mediante un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 55.
Síntesis del compuesto 63
Figure imgf000243_0002
Compuesto 61: El compuesto 61 se prepara a partir del compuesto 60 mediante un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 57.
Compuesto 63: El compuesto 63 se prepara a partir del compuesto 61 mediante un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 55.
Síntesis del compuesto 69
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Figure imgf000244_0002
Compuesto 65: Se añadió isobutirato de etilo (11,6 g, 100 mmoles) durante 0,5 h a una disolución enfriada (-78 °C) de LDA en THF (53 ml, 2 M). Entonces se calentó la mezcla naranja hasta 0 °C brevemente antes de volver a enfriarse hasta -78 °C. Entonces se añadió 1,2-dibromoetano (20 g, 106 mmoles) durante 0,5 h a la disolución que se calentó gradualmente a ta y se agitó durante la noche. La mezcla resultante se repartió mediante la adición de agua y AE. Tras la extracción en AE y el lavado con salmuera, la fase orgánica se separó, entonces se secó (MgSO4), se filtró y se concentró a vacío. La cromatografía en columna dio el producto puro como un aceite incoloro (6,0 g, 25 %). 1H RMN (399 MHz, CDCto) 54,15 (c, J = 7,1 Hz, 2H), 3,35 (t, J = 8,4 Hz, 2H), 2,16 (t, J = 8,4 Hz, 2H), 1,27 (t, J = 7,1 Hz, 3H), 1,22 (s, 6H); 13C RMN (100 MHz, CDCls) 5 176,78, 60,83, 43,83, 42,89, 28,45, 25,20, 14,32; Rf = 0,5 (5 % de EtOAc/hexano).
Compuesto 66: Una mezcla del compuesto 65 (3,4 g, 15,24 mmoles) y morfolina (13,28 g, 152 mmoles) en THF (20 ml) se calentó a 50 °C en un frasco a presión de vidrio durante 72 h. Se observó que se formaba un precipitado blanco. La mezcla se separó entre agua y AE. Los extractos de AE se secaron (MgSO4), se filtraron y se concentraron. La cromatografía en columna dio el producto como un líquido incoloro (3,5 g, 100 %). 1H RMN (399 MHz, CDCl3) 5 4,11 (c, J = 7,1 Hz, 2H), 3,67 (t, J = 4,7 Hz, 4H), 2,41 (t, a, J = 4,0 Hz, 4H), 2,30 - 2,26 (m, 2H), 1,74 - 1,70 (m, 2H), 1,23 (t, J = 7,1 Hz, 3H), 1,17 (s, 6H); 13C RMN (100 MHz, CDCla) 5 177,69, 67,11,55,15, 54,02, 41,10, 37,04, 25,49, 14,35; MS (ESI ve): calc (M+H)+: 230,18, hallado: 230,33; Rf = 0,5 (5 % de EtOAc/hexano).
Compuesto 67: Se agitaron juntos el compuesto 66 (120 mg, 0,523 mmoles) e hidróxido sódico (120 mg, 3,00 mmoles) en 1:1 de EtOH/H2O (10 ml). Después de 36 h, el pH de la disolución se ajustó a aprox. 2 mediante la adición de HCl conc., entonces se añadió NEt3 hasta que el pH alcanzó aprox. 10. Se añadió SiO2 (2 g) y se evaporaron los disolventes/agua. La cromatografía en columna con carga seca (MeOH/DCM, con 2 % de NEt3 en DCM), dio el producto como una sal parcial de HNEt3 (aprox. 1/3 eq en moles). El rendimiento ajustado fue 103 mg, 84 %. 1H RMN (399 MHz, CDCl3 más 3 gotas de DMSO-d6) 53,62 (t, J = 4,7 Hz, 4H), 2,51 - 2,46 (a, 4H), 2,40 (t, J = 7,1 Hz, 2H), 1,62 (J = 7,1 Hz, 2H), 1,08 (s, 6H); 13C RMN (100 MHz, CDCls) 5 179,91, 65,91, 54,29, 52,87, 45,44, 41,37, 35,09, 25,93, 8,56; MS (ESI -ve): calc (M-H)-: 200,13, hallado: 200,16; Rf = 0,5 (2% NEts/10% MeOH/DCM).
Compuesto 69a: Se trató una suspensión del compuesto 67 (11 g, 54,9 mmoles) en DCM (200 ml) con cloruro de oxalilo (9,42 ml, 110 mmoles) y se agitó a ta. Durante la reacción se formó una disolución homogénea incolora. Después de 1 h a ta, el disolvente se retiró a presión reducida. El residuo amarillo se suspendió en una mezcla de DCM (200 ml) y Py (100 ml), luego se añadió el compuesto 54 de S-2-hidroxietilo (15,91 g, 60,4 mmoles) (DB-7-5) todo de una vez y la reacción se monitorizó por HPLC/MS. Después de 18 h, se consideró por MS y TLC que la reacción estaba prácticamente finalizada. Entonces se retiraron los disolventes, el residuo se volvió a disolver en DCM/bicarbonato. Los extractos orgánicos combinados se secaron (MgSO4), se filtraron y se redujeron. La purificación por cromatografía en columna dio 12,5 g, 51 % de compuesto 69a como un aceite amarillo que cristalizó dejándolo estar. 1H RMN (399 MHz, CDCls) 58,41 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 8,13 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 4,27 (t, J = 6,3 Hz, 2H), 3,65 (t, J = 4,6 Hz, 4H), 3,28 (t, J = 6,3 Hz, 2H), 2,40 (s, a, 4H), 2,27 (t, J = 7,7 Hz, 2H), 1,71 (t, J = 7,7 Hz, 2H), 1,14 (s, 6H); 13C RMN (100 MHz, CDCl3) 5 177,11, 150,71, 149,69, 128,34, 124,92, 66,96, 61,66, 54,95, 53,92, 41,25, 46,81, 35,11, 25,36; MS (ESI ve): calc (M+H)+: 447,12, hallado: 446,98.
Compuesto 69b: Una suspensión del compuesto 67 (128 mg, 0,636 mmoles) en DCM (12 ml) se trató gota a gota con cloruro de oxalilo (545 pl, 6,36 mmoles) y se agitó a ta. Durante la reacción se formó una disolución homogénea incolora que pronto desarrolló un precipitado incoloro. La HPLC/MS indicó buena conversión en cloruro de ácido (compuesto 68) como se muestra por conversión en la W-propilamida. El disolvente se retiró a presión reducida. El residuo blanco se enfrió en un baño de hielo y se trató con una disolución de metanosulfonotioato de S-2-hidroxietilo (compuesto 54) (99 mg, 0,636 mmoles) en DCM (12 ml), seguido de la adición gota a gota de base de Hunig (0,34 g, 2,6 mmoles, 4 eq) con agitación. Después de 1,5 h, la disolución se lavó con NaHCO3 diluido (ac). Los extractos combinados se secaron (MgSO4), se filtraron y se concentraron. La cromatografía en columna dio el producto como un aceite incoloro (84 mg, 39 %). 1H RMN (399 MHz, CDCI3) 54,40 (t, J = 6,2 Hz, 2H), 3,70 (t, J = 4,6 Hz, 4H), 3,44 (t, J = 6,2 Hz, 2H), 3,39 (s, 3H), 2,47 - 2,43 (a, 4H), 2,32 (t, J = 7,7 Hz, 2H), 1,77 (t, J = 7,7 Hz, 2H), 1,64 - 1,58 (a, 4H), 1,22 (s, 6H); 13C RMN (100 MHz, CDCh) 5177,30, 67,08, 62,27, 55,03, 54,01,51,07, 41,32, 36,99, 35,14, 25,44; MS (ESI ve): calc (M+H)+: 340,13, hallado: 340,27; Rf = 0,2 (EtOAc).
Síntesis del compuesto 73
Figure imgf000245_0001
Compuesto 70: El compuesto 70 se preparó haciendo reaccionar N-metilpiperazina con el compuesto 65 mediante un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 66. 1H RMN (399 MHz, CDCh) 54,10 (c, J = 7,1 Hz, 2H), 2,3 - 2,6 (a, 8H), 2,28 (t, J = 8,0 Hz, 2H), 2,26 (s, 3H), 1,72 (t, J = 8,0 Hz, 2H), 1,23 (t, J = 7,1 Hz, 3H), 1,15 (s, 6H); 13C RMN (100 MHz, CDCh) 5 177,71, 60,44, 55,27, 54,64, 53,50, 46,18, 41,15, 37,36, 25,47, 14,34; MS (ESI ve): calc (M+H)+: 243,20, hallado: 243,31.
Compuesto 71: El compuesto 71 se preparó por hidrólisis del compuesto 70 usando un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 67. 1H RMN (399 MHz, CDCh) 512 - 10 (vbr, 1H), 3,2 - 2,2 (vbr, 8H), 2,44 (t, J = 8,0 Hz, 2H), 2,36 (s, 3H), 1,71 (t, J = 8,0 Hz, 2H), 1,17 (s, 6H), 13C RMN (100 MHz, CDCh) 5 181,36, 55,18, 53,51, 52,18, 44,31,41,57, 37,19, 26,28; MS (ESI ve): calc (M+H)+: 215,17, hallado: 215,19.
Compuesto 83: Se añadió gota a gota bromo (2,58 ml, 50,0 mmoles) en DCM (50 ml) durante 0,5 h a una mezcla con agitación de bencenosulfinato de sodio (16,4 g, 100 mmoles) y disulfuro de 2-hidroxietilo (6,11 ml, 49,9 mmoles) en DCM (50 ml) a ta. Después de 2 h a ta, la TLC mostró buena reacción (Rf = 0,4 (1:1 de AE/hexano), por lo que la mezcla se filtró para retirar la sal. El disolvente se retiró, entonces la cromatografía en columna dio el producto (17,4 g, 80 %) como un aceite incoloro.
Compuesto 73: El compuesto 71 (1,342 g, 6,29 mmoles) en DCM (20 ml) se trató con cloruro de oxalilo (1,079 ml, 12,58 mmoles) y se agitó a ta. Durante la reacción, se observó que se formaba un precipitado amarillo pálido. Después de 0,5 h a ta, el disolvente se retiró a presión reducida. El residuo amarillo pálido se suspendió en una mezcla de DCM (20 ml) y Py (20 ml), entonces se añadió todo el compuesto 83 (2,060 g, 9,44 mmoles) de una vez. Después de 18 h, se consideró por TLC que la reacción había terminado. Los disolventes se retiraron, entonces el residuo se volvió a disolver en agua y se lavó con éter. La fase acuosa se redujo a un sólido marrón. La recristalización en EtOH hirviendo (10 ml) dio una sal de HCl ligeramente impura que se liberó de la base (NEt3 en DCM), entonces se cargó directamente sobre gel de sílice. La cromatografía en columna dio 0,95 g, 36 % de compuesto 73 puro. 1H RMN (399 MHz, CDCh) 5 7,96 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 7,68 (t, J = 7,2 Hz, 1 H), 7,59 (t, J = 7,7 Hz, 2H), 4,25 (t, J = 6,3 Hz, 2H), 3,25 (t, J = 6,3 Hz, 2H), 2,8 - 2,3 (vbr, 8H), 2,36 (s, 3H), 2,33 (t, J= 7,7 Hz, 2H), 1,74 (t, J= 7,7 Hz, 2H), 1,16 (s, 6H); 13C RMN (100 MHz, CDCh) 5177,13, 144,68, 134,09, 129,59, 127,09, 61,99, 54,86, 54,35, 52,84, 45,95, 45,71,41,26, 37,05, 34,66, 25,39; MS (ESI ve): calc (M+H)+: 415,17, hallado: 415,09.
Síntesis del compuesto 76
Figure imgf000245_0002
Compuesto 75: El compuesto 74 se convirtió en el compuesto 75 mediante un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 2. 1H RMN (500 MHz, CDCh) 56,49 - 6,41 (a, d, J = 6,3 Hz, 1H), 4,91 (dt, J= 6,3, 2,7 Hz, 1 H), 4,59 (ddd, J = 31,4, 10,6, 3,0 Hz, 2H), 3,84 (s, 3H), 3,04 (s, 3H), 2,09 (s, 3H); 170,27, 169,05, 68,90, 53,33, 52,03, 37,63, 23,16; MS (ESI ve): calc (M+H)+: 240,06, hallado: 240,24.
Compuesto 76: El compuesto 75 se convirtió en el compuesto 76 mediante un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 3. 1H RMN (500 MHz, CDCh) 56,56 - 6,40 (a, d, J = 6,2 Hz, 1H), 4,93 (c, J = 5,9 Hz, 1H), 3,81 (s, 3H), 4 3,74 (dd, J = 14,6, 4,8 Hz, 1H), 3,57 (dd, J= 14,6, 5,6 Hz, 1H), 3,38 (s, 3H), 2,07 (s, 3H); 13C RMN (126 MHz, CDCh) 5 170,44, 170,19, 53,23, 52,02, 50,73, 37,77, 23,12; MS (ESI ve): calc (M+H)+: 256,03, hallado: 256,21.
Síntesis del compuesto 78
Figure imgf000246_0001
Se agitó una mezcla del compuesto 77 (2,49 ml, 32,8 mmoles) y metanosulfonotioato de sodio (4,4 g, 32,8 mmoles) en acetona (80 ml) durante 6 h. La acetona se retiró por evaporación rotatoria y la mezcla se trituró con DCM. Después de la filtración, la DCM se retiró por evaporación (rendimiento en bruto 5 g) y la mezcla se sometió a purificación por cromatografía en columna. El rendimiento del compuesto 78 puro fue 2,8 g, 55 %, aceite incoloro, Rf = 0,3 (20 % de AE/hexano). 1H RMN (500 MHz, CDCh) 55,30 (s, 2H), 3,48 (s, 3H), 3,38 (s, 3H); 13C RMN (126 MHz, CDCh) 580,07, 57,40, 22,71.
Síntesis del compuesto 80
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Se trató una disolución helada del compuesto 79 (5 g, 65,7 mmoles) y trietilamina (11 ml, 79 mmoles) en DCM (150 ml) con cloruro de metanosulfonilo (5,59 ml, 72,3 mmoles) durante 2 min. Después de 1 h, se consideró que la reacción estaba completa por TLC. Se añadió agua y los extractos orgánicos se lavaron uno detrás de otro con HCl diluido, bicarbonato sódico saturado, salmuera, luego se secaron (MgSÜ4), se filtraron y se redujeron. El producto mesilato (9,4 g, 61 mmoles, 96 %) se recogió en acetona (200 ml), entonces se añadió la sal de potasio de ácido toluenotiosulfínico (61 mmoles) y la disolución se agitó a 50 °C durante 18 h. Se observó que se formó un precipitado blanco denso. La mezcla se filtró, se redujo a un aceite, luego se extrajo en DCM/agua. Los extractos orgánicos se secaron (MgSÜ4), se filtraron y se redujeron. La cromatografía en columna dio el compuesto 80 puro como un aceite incoloro que cristalizó dejándolo estar. Rf = 0,3 (20 % de AE/hexano)
Síntesis del compuesto 82
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Se agitó en MeÜH (50 ml) una mezcla de clorhidrato de 2-cloro-A/,A/-dimetiletanamina (10 g, 69,4 mmoles), yoduro de sodio (1,041 g, 6,94 mmoles) y 4-metilbencenosulfonotioato de potasio (18,86 g, 83 mmoles) y se calentó a 60 °C durante 72 h. El procesamiento acuoso, luego la cromatografía en columna dio el compuesto 82 puro (8,5 g, 47 %) como un aceite incoloro. 1H RMN (399 MHz, CDCh) 57,81 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,33 (dd, J = 8,4, 0,6 Hz, 2H), 3,09 (t, J = 6,8 Hz, 2H), 2,53 (t, J = 6,8 Hz, 2H), 2,44 (s, 3H), 2,17 (s, 6H); 13C RMN (100 MHz, CDCh) 5 144,76, 142,03, 129,92, 127,18, 57,51,45,14, 34,29, 21,77; MS (ESI ve): calc (M+H)+: 260,07, hallado: 260,16.
Síntesis del compuesto 85
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Se dispuso metanosulfonato de sodio (11,5 g, 86 mmoles) en un matraz seco de 50 ml de una boca. Se añadió 30 ml de DMF anhidro (Aldrich) usando una jeringuilla de vidrio seca. Se añadieron 5 ml de 3-bromopropionitrilo (compuesto 84) (8,2 g, 61,2 mmoles) usando una jeringuilla de vidrio seca. El matraz de reacción se cerró bajo argón, se selló y se agitó durante 24 h a 50 °C. La reacción se monitorizó usando TLC (sistema: hexanos/acetato de etilo - 5:5 - v/v). La mezcla de reacción se diluyó con 100 ml de acetato de etilo y se lavó 5 veces con agua (5 x 100 ml). Las fases orgánicas se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se evaporaron a sequedad. El residuo se disolvió en 5 ml de diclorometano y se purificó por cromatografía en gel de sílice (CombiFlash) usando un gradiente lineal de acetato de etilo en hexanos. El compuesto 85 puro (7,2 g, 52 %) se obtuvo como un aceite incoloro. 1H-RMN (CDCh, 399 MHz). 53,43 (s, 3H), 3,41 (t, 2H, J = 2,5 Hz), 2,93 (t, 2H, J = 2,5 Hz); 13C-RMN (CDCh, 100 MHz) 5117,7, 51,2, 31,7, 19,6.
Síntesis del compuesto 87
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Compuesto 87: El compuesto 86 (1,11 ml, 12,5 mmoles) y 4-nitrobencenosulfinato de sodio (5,23 g, 25,0 mmoles) se añadieron en DCM (12,5 ml) dando una suspensión blanca. Se añadió dibromo (0,64 ml, 12,5 mmoles) a la disolución con agitación. La disolución se agitó durante 30 min a ta y se filtró para retirar la sal, entonces el filtrado se evaporó a presión reducida. El producto en bruto se añadió a una columna de gel de sílice y se eluyó con hexano- EtOAc dando el compuesto 87 puro (4,80 g, 20,6 mmoles, 82 % de rendimiento). 1H RMN (399 MHz, CDCh) 58,44 - 8,40 (m, 2H), 8,15 - 8,10 (m, 2H), 2,58 (s, 3H); 13C RMN (100 MHz, CDCta) 5149,00, 128,54, 124,87, 94,61, 18,55; R/= 0,60 (1:1 de EtOAc/hexano).
Síntesis del compuesto 90
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Compuesto 89: En un matraz redondo de 1 l se disolvió A/-(2-mercaptoetil)acetamida, 88 (11,92 g, 100 mmoles) en EtOAc (300 ml) dando una disolución incolora. Se añadieron yoduro de sodio (0,150 g, 1,000 mmoles) y 30 % de peróxido de hidrógeno (3,40 g, 100 mmoles) en H2O (11,3 ml) a la disolución, que se agitó durante 45 min a ta. Se añadió Na2S2O3 saturado a la disolución. La fase acuosa se extrajo con EtOAc (3 x 300 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron con Na2SO4 , se filtraron y se concentraron por evaporación rotatoria. El producto en bruto se sometió a cromatografía en columna y se eluyó con un gradiente de MeOH/DCM dando el compuesto 89 puro (4,94 g, 20,90 mmoles, 41,8 % de rendimiento), que se consideró por TLC que era suficientemente puro para su uso directo en la siguiente etapa de la reacción. Rf = 0,35 (9:1 de DCM/metanol)
Compuesto 90: En un matraz redondo de 100 ml, se disolvieron el compuesto 89 (2,364 g, 10,00 mmoles) y 4-nitrobencenosulfinato de sodio (4,18 g, 20 mmoles) en CH2G 2 (20 ml) dando una suspensión blanca. Se añadió dibromo (0,516 ml, 10,00 mmoles) a la disolución con agitación. La disolución se agitó durante 30 min a ta y se filtró para retirar la sal, entonces el filtrado se evaporó a presión reducida. El producto en bruto se añadió a una columna de gel de sílice y se eluyó con hexano-EtOAc dando el compuesto 90 puro (2,37 g, 7,79 mmoles, 39 % de rendimiento).
1H RMN (399 MHz, CDCh) 58,45 - 8,40 (m, 2H), 8,17 - 8,12 (m, 2H), 3,60 - 3,54 (dt, 2H), 3,21 - 3,16 (t, 2H), 2,00 (s, 3H); 13C RMN (100 MHz, CDCh) 5130,35, 126,27, 66,97, 58,20, 53,67, 51,52, 36,22, 35,16, 33,67; Rf = 0,40 (EtOAc).
Síntesis de los compuestos 93 y 94
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Compuesto 92: En un matraz redondo de 250 ml, se disolvió 4-clorobencenosulfonotioato de sodio (14,5 g, 63,0 mmoles) en MeOH. Se añadió c/s-1,4-dicloro-2-buteno, 91 (3,16 g, 30,0 mmoles) y yoduro de sodio (450 mg, 3,0 mmoles) a la disolución con agitación. La disolución se agitó durante 3 h a ta, entonces se calentó hasta 50 °C. Después de agitar durante 18 h a 50 °C, los disolventes se retiraron a presión reducida. El material resultante en bruto se diluyó con DCM (300 ml) y se lavó con agua (1 x 100 ml). La fase acuosa se extrajo con DCM (1 x 100 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron con Na2SO4 , se filtraron y se concentraron. El producto en bruto se sometió a cromatografía en columna y se eluyó con un gradiente de EtOAc/hexano dando el compuesto 92 (5,99 g, 12,8 mmoles, 43 % de rendimiento). 1H Rm N (399 MHz, CDCh) 57,87-7,84 (m, 4H), 7,56-7,51 (m, 4H), 5,56-5,50 (m, 2H), 3,72-3,68 (m, 4H); 13C RMN (100 MHz, CDCh)130,35, 126,27, 66,97, 58,20, 53,67, 51,52, 36,22, 35,16, 33,67; Rf = 0,35 (1:3 de EtOAc/hexano).
Compuesto 93: En un matraz redondo de 100 ml, se disolvió el compuesto 92 (3,09 g, 6,58 mmoles) en THF a 0 °C.
Se añadieron trietilamina (459 pl, 3,29 mmoles) y 2-metil-2-propanotiol (742 pl, 6,58 mmoles) a la disolución con agitación a 0 °C. La disolución se agitó durante 20 min a 0 °C, entonces se añadió trietilamina (230 gl, 1,65 mmoles) a la disolución con agitación a 0 °C. Después de agitar durante 40 min a 0 °C, los disolventes se retiraron a presión reducida. Lo resultante se sometió a cromatografía en columna y se eluyó con un gradiente de EtOAc/hexano dando el compuesto 93 (1,77 g, 4,62 mmoles, 70 % rendimiento). 1H RMN (399 MHz, CDCh) ó 7,90 - 7,85 (m, 2H), 7,56 -7,52 (m, 2H), 5,73 - 5,65 (m, 1H), 5,55 - 5,48 (m, 1H), 3,78 - 3,75 (d, 2H), 3,36 - 3,32 (d, 2H), 1,32 (s, 9H); 13C RMN (100 MHz, CDCh) 5 143,54, 140,60, 130,90, 129,83, 128,66, 124,56, 48,29, 37,05, 33,35, 30,16; R/= 0,60 (1:3 de EtOAc/hexano).
Compuesto 94: Usando un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 93, y sustituyendo el 2-metil-2-propanotiol por 2-propanotiol, se obtuvo el compuesto 94 puro (1,13 g, 3,06 mmoles, 72 % rendimiento). 1H RMN (399 MHz, CDCh) 57,90 - 7,82 (m, 2H), 7,56 - 7,48 (m, 2H), 5,72 - 5,64 (m, 1H), 5,57 - 5,47 (m, 1 H), 3,79 - 3,72 (d, 2H), 3,33 - 3,26 (d, 2H), 3,61 - 2,92 (m, 1H), 1,27 (d, 6H); 13C RMN (100 MHz, CDCh) 5 143,28, 140,36, 131,37, 125,63, 124,55, 124,56, 41,32, 38,02, 35,81,33,08, 22,54; R,= 0,55 (1:3 de EtOAc/hexano).
Síntesis del compuesto 96
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Compuesto 96: Se combinaron los compuestos 9 (1,81 g, 5,50 mmoles) y 54 (2,17 g, 8,25 mmoles) y se secaron por coevaporación con tolueno anhidro (3 x 2 ml). La mezcla se disolvió en 1,2-dicloroetano seco (16,5 ml). Se añadieron tamices moleculares 4 Á a la disolución y la mezcla se agitó 30 min a ta. Se añadió trimetilsililtriflato (497 gl, 2.75 mmoles) a la disolución con agitación. La disolución se agitó durante 9 h a ta, entonces se añadió 54 (0,723 g, 2.75 mmoles) adicional a la disolución con agitación. Después de agitar 16 h a ta, la disolución se diluyó con DCM (100 ml) y se lavó con NaHCO3 sat. (1 x 100 ml). La fase acuosa se extrajo con DCM (1 x 50 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron con Na2SO4, se filtraron y se concentraron por evaporación rotatoria. El producto en bruto resultante se sometió a cromatografía en columna y se eluyó con un gradiente de EtOAc/hexano dando el compuesto 96 (2,21 g, 3,73 mmoles, 68 % de rendimiento). 1H RMN (399 MHz, CDCh) 58,42 - 8,36 (d, 2H), 8,12 8,06 (d, 2H), 6,07 - 6,00 (d, 1H), 5,33 - 5,30 (d, 1H), 5,23 - 5,15 (dd, 1H), 4,69 - 4,63 (d, 1H), 4,15 - 4,04 (m, 3H), 4,04-3,87 (m, 2H), 3,84-3,73 (m, 1H), 3,22-3,12 (t, 2H), 2,12-1,92 (m, 12H); 13C RMN (100 MHz, CDCh)179,95, 170,74, 170,48, 150,77, 149,59, 128,47, 125,03, 101,40, 71,08, 70,02, 67,39, 66,92, 61,76, 51,12, 36,51, 23,72, 20,92; Rf = 0,25 (1:9 de MeOH/DCM).
Síntesis del compuesto 100
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Compuesto 98: Se trató con anhídrido fenoxiacético una disolución helada del compuesto 97 (4,87 g, 22,0 mmoles) en piridina seca (70 ml) (37,8 g, 132,0 mmoles) y 4-dimetilaminopiridina (26,9 mg, 220 gmoles). Después de agitar a ta durante 12 h, la mezcla se concentró y se evaporó conjuntamente con tolueno a vacío. Lo resultante se diluyó por DCM (400 ml) y se lavó con NaHCO3 sat. (1 x 400 ml). Tras la extracción, la fase orgánica se separó, se secó con Na2SO4, se filtró y se concentró a vacío. Lo resultante se sometió a cromatografía en columna y se eluyó con un gradiente de EtOAc/hexano dando el compuesto 98 puro (16,7 g, 22,0 mmoles, 100 % de rendimiento). 1H RMN (399 MHz, CDCh) 57,36 - 6,75 (m, 20H), 6,27 - 6,20 (d, 1 H), 5,43 - 5,36 (m, 1 H), 5,22 - 5,06 (m, 2H), 4,81 - 4,65 (m, 3H), 4,60 - 4,52 (m, 2H), 4,45 - 4,29 (m, 2H), 4,17 - 4,02 (m, 2H), 3,97 - 3,87 (m, 1H), 1,85 y 1,74 (d, 3H, rotámero); 13C RMN (100 MHz, CDCh) 5 170,20, 168,78, 168,70, 168,36, 167,52, 157,56, 157,48, 157,40, 130,09, 129,70, 129,66, 129,60, 122,32, 122,01, 121,94, 114,61, 114,58, 114,58, 114,39, 91,93, 68,37, 68,25, 67,30, 64,54, 61,25, 46,43, 22,95; Rf = 0,35 (1:1 de EtOAc/hexano).
Compuesto 99: El compuesto 98 (15,15 g, 20,0 mmoles) se disolvió en CICH2CH2CI (40 ml) y se añadió trifluorometanosulfonato de trimetilsililo (5,43 ml, 30,0 mmoles) a la disolución con agitación a ta. La disolución se agitó durante 24 h a 50 °C, se añadió trietilamina (12,6 ml, 90,0 mmoles) y la mezcla se concentró a vacío. Lo resultante se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (EtOAc (2,5 % de Et3N)-hexano) dando el compuesto 99 ligeramente impuro que contenía minúsculas cantidades de ácido fenoxiacético. Este material se usó en la siguiente etapa del esquema de reacción sin más purificación.
Compuesto 100: Se disolvieron el compuesto 99 (3,63 g, 6 mmoles) y S-2-hidroxietil-4-nitrobencenosulfonotioato, 54 (2,76 g, 10,5 mmoles) en ClCH2CH2Cl (18 ml) dando una disolución incolora. Se añadieron tamices moleculares 4Á a la disolución con agitación a ta. La disolución se agitó a ta durante 30 min, entonces se añadió trifluorometanosulfonato de trimetilsililo (0,543 ml, 3,00 mmoles). La mezcla se agitó a ta durante 24 h y la TLC mostró que había terminado aproximadamente el 90 % de la reacción. Se añadió 54 (237,0 mg, 0,90 mmoles) adicional a la mezcla y se agitó durante 36 h adicionales para terminar la reacción. La mezcla se diluyó con DCM (100 ml) y se lavó con NaHCO3 sat. (1 x 100 ml). La fase acuosa se retroextrajo con CH2G 2 (1 x 50 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron con Na2SO4, se filtraron, se concentraron y se disolvieron en 120 ml de Ac2O-piridina (1:9, v/v). La mezcla se agitó durante 12 h, luego se concentró a presión reducida. Lo resultante se diluyó con CH2G 2 (100 ml) y se lavó con NaHCO3 sat. (1 x 100 ml). La fase acuosa se retroextrajo con CH2G 2 (1 x 50 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron con Na2SO4, se filtraron y se concentraron. Lo resultante se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (gradiente de EtOAc-hexano) dando el compuesto 100 puro (2,56 g, 2,94 mmoles, 49,0 % de rendimiento). 1H RMN (399 MHz, CDCh) ó 8,70 - 8,62 (d, 2H), 8,41 - 8,33 (d, 2H), 7,65 - 7,03 (m, 15H), 6,35 - 6,27 (d, 1H), 5,81 - 5,72 (m, 2H), 5,06 - 4,97 (m, 3H), 4,92 - 4,85 (m, 2H), 4,83 - 4,62 (m, 2H), 4,58 - 4,44 (m, 2H), 4,34 - 4,26 (m, 2H), 4,26 - 4,15 (m, 1H), 4,06 - 3,95 (m, 1H), 3,51 - 3,40 (m, 2H), 2,22 y 2,18 (d, 3H, rotámero); 13C RMN (100 MHz, CDCh) ó 171,17, 169,13, 169,05, 168,92, 157,86, 157,80, 157,76, 150,82, 149,63, 130,01, 129,96, 128,47, 125,06, 122,27, 122,23, 114,93, 114,74, 100,86, 70,64, 70,54, 65,36, 64,90, 62,21,51,30, 36,54, 23,74; Rf = 0,60 (1:1 de EtOAc/hexano).
Síntesis del compuesto 104
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Compuesto 102: Usando un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 98, y sustituyendo el compuesto 97 por el compuesto 101, se obtiene el compuesto 102 puro.
Compuesto 103 Usando un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 99, y sustituyendo el compuesto 98 por el compuesto 102, se obtiene el compuesto 103 puro.
Compuesto 104 Usando un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 100, y sustituyendo el compuesto 99 por el compuesto 103, se obtiene el compuesto 103 puro.
Síntesis de los compuestos 109 y 111
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Compuesto 106: Se trata una disolución del compuesto 105 (100 mmoles) en 1,2-dicloroetano seco (300 ml) gota a gota por una jeringa con TiCU (110 mmoles) durante 2 min. Después de someter a reflujo durante 16 h, la TLC muestra reacción completa. El producto en bruto se diluye con DCM y se lava con NaHCO3 sat. Las fases orgánicas combinadas se secan con Na2SO4, se filtran, se concentran y se usan para la siguiente reacción sin más purificación.
Compuesto 107: Se disuelven tiourea (150 mmoles) y el compuesto 106 (100 mmoles) en acetona (200 ml) bajo Ar. La mezcla de reacción se calienta hasta 60 °C y se agita. Después de 2 h, se retira por filtración un precipitado sólido blanco. El precipitado recristaliza. Se añaden los cristales filtrados y Na2S2O5 (140 mmoles) a una mezcla con agitación de DCM (500 ml) y H2O (250 ml). La mezcla de reacción se calienta hasta reflujo bajo Ar. Después de 3 h, la mezcla de reacción se enfría hasta ta y se separan las fases. La fase acuosa se retroextrae con DCM. Las fases orgánicas combinadas se secan sobre Na2SO4, se filtran y se concentran dando el compuesto 107.
Compuesto 108: Se disuelven 1-bromo-2-cloroetano (100 mmoles), trietilamina (200 mmoles) y el compuesto 107 (100 mmoles) en acetonitrilo (200 ml) bajo Ar. La mezcla de reacción se calienta hasta 60 °C y se agita. La TLC muestra la reacción terminada. La mezcla se diluye con DCM (500 ml) y se lava con NaHCO3 (250 ml). La fase orgánica se seca sobre Na2SO4, se filtra, se concentra y se purifica dando el compuesto 108.
Compuesto 109: Se disuelven el compuesto 112 (120 mmoles), yoduro de sodio (10,0 mmoles) y el compuesto 108 (100 mmoles) en MeOH (200 ml) bajo Ar. La mezcla de reacción se calienta hasta 60 °C y se agita. La TLC muestra la reacción terminada. La mezcla se diluye con DCM (500 ml) y se lava con NaHCO3 (250 ml). La fase orgánica se seca sobre Na2SO4, se filtra, se concentra y se purifica dando el compuesto 109.
Compuesto 110: Se disuelven 1-bromo-4-cloro-2,3-c/'s-buteno (100 mmoles), trietilamina (200 mmoles) y el compuesto 107 (100 mmoles) en acetonitrilo (200 ml) bajo Ar. La mezcla de reacción se calienta hasta 60 °C. La TLC muestra la reacción terminada. La mezcla se diluye con DCM (500 ml) y se lava con NaHCO3 (250 ml). La fase orgánica se seca sobre Na2SO4, se filtra, se concentra y se purifica dando el compuesto 110.
Compuesto 111: Se disuelven el compuesto 112 (120 mmoles), yoduro de sodio (10,0 mmoles) y el compuesto 110 (100 mmoles) en MeOH (200 ml) bajo Ar. La mezcla de reacción se calienta hasta 60 °C. La TLC muestra la reacción terminada. La mezcla se diluye con DCM (500 ml) y se lava con NaHCO3 (250 ml). La fase orgánica se seca sobre Na2SO4, se filtra, se concentra y se purifica dando el compuesto 111.
Síntesis del compuesto 115
Figure imgf000250_0002
Compuesto 113: Se prepara 2-clorosulfonilacetonitrilo (113) siguiendo el procedimiento de Sammes (como se describe en la patente GB1252903).
Compuesto 114: Se recoge sulfuro de sodio nonahidratado (65 mmoles) en 100 ml de agua. El matraz se mantiene en un baño de agua. El compuesto 113 (50 mmoles) se añade gota a gota a la disolución mientras se agita y se calienta suavemente el baño de agua. Se observa que aparece azufre y luego desaparece en el matraz. El disolvente se evapora a vacío y el residuo recristaliza en etanol. Así se obtiene cianometanosulfonotioato de sodio (compuesto 114) como un sólido cristalino incoloro.
Compuesto 115: El compuesto 114 (13,69 g, 86 mmoles) se recoge, con agitación, en DMF anhidro (30 ml) en un matraz redondo de 100 ml. Entonces se añade 3-bromopropionitrilo (5 ml, 8,2 g, 61,2 mmoles) y la mezcla resultante se agita durante 18 h a 50 °C con monitorización por TLC. Tras finalizar la reacción (consumo completo de 3-bromopropionitrilo), la mezcla de reacción se diluye con EtOAc (100 ml) y la fase orgánica se lava con 5 x 20 ml de H2O. Entonces se seca la fase orgánica separada (MgSO4), se filtra y se reduce dando un aceite por evaporación rotatoria. El aceite en bruto se purifica por cromatografía en columna usando un gradiente de EtOAc/hexano y las fracciones que contienen material puro se recogen y el disolvente se retira por evaporación rotatoria, luego secado adicional a vacío proporcionando el compuesto 115 puro como un aceite incoloro.
Síntesis del compuesto 118
Figure imgf000251_0001
Compuesto 116: Se trató el compuesto 51 (2,9 g, 8,91 mmoles) en DCM (50 ml) gota a gota con cloruro de oxalilo (0,53 ml, 6,15 mmoles), luego DMF (10 pl) y se agitó a ta. Durante la reacción se formó una disolución homogénea incolora. Después de 2 h a ta, el disolvente se retiró a presión reducida. El residuo blanco se volvió a disolver en DCM (20 ml), luego se añadió gota a gota a una disolución con agitación de etano-1,2-ditiol (8,40 g, 89 mmoles) en piridina (10 ml), con monitorización por UPLC/MS. Después de 18 h, se consideró que la reacción había terminado. Los disolventes se retiraron y el etanotiol restante se retiró por destilación en trampas en serie, luego el residuo se sometió a purificación por cromatografía en columna con DCM proporcionando el compuesto puro 116 como un sólido incoloro. El rendimiento fue 1,82 g, 51 %. MS (ESI ): calc (M+Na)+: 424,10, hallado: 424,06. 1H RMN (500 MHz, CDCh) 57,79 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,63 (d, J = 5,7 Hz, 2H), 7,43 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 7,34 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 5,40 - 5,15 (a, 1H), 4,60 -4,35 (a, 2H), 4,31 - 4,19 (m, 1H), 3,15 - 3,04 (a, 2H), 2,95 - 2,80 (m, 1 H), 2,75 - 2,60 (a, 2H), 1,72 - 1,43 (m, 6H); 13C RMN (126 MHz, CDCh) 5203,14, 154,75, 143,92, 141,49, 127,84, 127,19, 125,17, 120,13, 66,81,62,69, 47,41,33,01, 25,78, 24,60.
Compuesto 117: A una disolución con agitación del compuesto 116 (1,7 g, 4,23 mmoles) en EtOAc (12 ml) se añadió yoduro de sodio (6,35 mg, 0,042 mmoles) y peróxido de hidrógeno (0,144 g, 4,23 mmoles) (0,45 ml de una disolución acuosa al 30 %) y la mezcla se agitó a ta durante 15 min. La TLC mostró el consumo completo del material de partida. Se añadió tiosulfato de sodio acuoso hasta que la disolución se volvió incolora. La disolución se lavó con agua, se secó (MgSO4), luego la cromatografía en columna (EtOAc/hexano) dio el compuesto 117 puro como una espuma sólida incolora (1,45 g, 86 %). MS (ESI ): calc (M+H)+: 802,07, hallado: 802,08. 1H RMN (500 MHz, CDCh) 57,78 (d, J = 7,6 Hz, 4H), 7,63 (d, J = 5,8 Hz, 4H), 7,42 (t, J = 7,5 Hz, 4H), 7,33 (t, J = 7,5 Hz, 4H), 5,42 - 5,25 (a, 2H), 4,55 -4,35 (a, 4H), 4,30 - 4,18 (a, 2H), 3,25 - 3,10 (a, 4H), 2,95 - 2,70 (a, 4H), 1,65 - 1,45 (a, 12H); 13C RMN (126 MHz, CDCh) 5203,19, 154,71, 143,90, 141,45, 127,80, 127,17, 125,16, 120,10, 66,76, 62,65, 47,37, 37,90, 28,56, 25,73.
Compuesto 118: Se añadió dibromo (0,091 ml, 1,77 mmoles) gota a gota durante 2 min a una mezcla con agitación de 4-nitrobencenosulfinato de sodio (0,742 g, 3,55 mmoles) y el compuesto 117 (1,42 g, 1,773 mmoles) en DCM (10 ml) a ta. Después de 30 min agitación a ta, la mezcla se filtró y el filtrado se redujo dando una espuma sólida naranja a vacío. La cromatografía en columna (DCM/hexano) dio el compuesto 118 puro (1,26 g, 60 %) como una espuma sólida de color amarillo pálido. MS (ESI ): calc (M+H)+: 587,71, hallado: 802,08. 1H RMN (500 MHz, CDCh) 5 8,36 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 8,14 (d, J = 7,3 Hz, 2H), 7,79 (d, J = 7,0 Hz, 2H), 7,63 (s, 2H), 7,43 (t, J = 6,7 Hz, 2H), 7,35 (d, J = 6,8 Hz, 2H), 5,35 - 5,15 (a, 1H), 4,55 - 4,35 (a, 2H), 4,30 - 4,20 (a, 1H), 3,30 - 3,00 (a, 4H), 1,70 - 1,25 (a, 6H); 13C RMN (126 MHz, CDCh) 5202,71,154,66, 150,60, 149,63, 143,78, 141,46, 128,40, 127,91,127,21,125,12, 124,81, 120,18, 66,86, 62,59, 47,35, 35,84, 28,42, 25,61.
Síntesis del compuesto 120
Figure imgf000252_0001
Compuesto 120: Se agitaron en MeOH (10 ml) el compuesto 119 (1 g, 7,04 mmoles) comercialmente disponible y 4-metilbencenosulfonotioato de potasio (1,753 g, 7,75 mmoles) durante 5 días a ta, luego a 40 °C durante 24 h. La TLC mostró buena conversión en el producto. El MeOH se evaporó y el residuo se recogió en DCM (30 ml) y se añadió Boc2O (1,54 g, 7,04 mmoles). La mezcla se trató con trietilamina (1,030 ml, 7,39 mmoles) gota a gota durante 10 min a ta hasta que la disolución se volvió prácticamente homogénea. El lavado con agua (50 ml), el secado (MgSO4), la filtración y la evaporación dieron el producto en bruto que se purificó adicionalmente por cromatografía en columna dando el compuesto 120 puro (1,64 g, 65 %) como un sólido incoloro. MS (ESI ): calc (M+Na)+: 380,10, hallado:
380,11. 1H RMN (399 MHz, CDCta) 57,80 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 7,34 (dd, J = 8,5, 0,8 Hz, 2H), 5,54 (ddt, J = 24,7, 16,6, 7,9 Hz, 2H), 4,65 (s, 1H), 3,77 - 3,66 (m, 4H), 2,45 (s, 3H), 1,43 (s, 9H); 13C RMN (100 MHz, CDCta) 5155,83, 145,05, 142,06, 131,80, 130,01, 127,15, 124,55, 79,72, 37,29, 32,75, 28,51,21,79.
Síntesis del compuesto 122
Figure imgf000252_0002
Compuesto 122: Se trató de una vez una disolución del compuesto 121 (1 g, 3,59 mmoles) comercialmente disponible en agua (1 ml) con una disolución de hexafluorofosfato de potasio (0,662 g, 3,59 mmoles) en agua (10 ml) y se removió agitando a ta durante 5 min. El sólido resultante se recogió por filtración, se lavó con 2 x 3 ml de agua y se secó a vacío sobre KOH dando el compuesto 122 puro como un sólido incoloro (1,01 g, 82 %). 1H RMN (300 MHz, CD3CN) 5 3,67 - 3,60 (m, 2H), 3,49 (s, 3H), 3,53 - 3,45 (m, 2H), 3,10 (s, 9H); 13C RMN (126 MHz, CD3CN) 565,98, 54,05 (c, J = 4,1 Hz), 51,11,28,99; 19F RMN (376 MHz, CD3CN) 5 -73,15 (d, J = 706,5 Hz); 31P RMN (162 MHz, CD3CN) 5 -143,50 (hept, J = 706,6 Hz).
Síntesis del compuesto 125
Figure imgf000252_0003
Compuesto 124: Se trata una disolución del compuesto 123 (10 mmoles) en DMF (50 ml) comercialmente disponible sucesivamente con 2-aminoacetato de terc-butilo (22 mmoles), diisopropiletilamina (50 mmoles) y HBTU (24 mmoles).
Después de 1 h de agitación a ta, se añade agua (100 ml) y la disolución resultante se extrae con EtOAc (2 x 50 ml) y se lava con 5 % de NaHCO3 (2 x 25 ml), luego salmuera diluida (2 x 25 ml), se seca (MgSO4), se filtra y se reduce por evaporación rotatoria. La purificación por cromatografía en columna proporciona el compuesto 124 puro.
Compuesto 125: Se añade dibromo (0,091 ml, 1,77 mmoles) gota a gota durante 2 min a una mezcla con agitación de 4-nitrobencenosulfinato de sodio (0,742 g, 3,55 mmoles) y di-te/-c-butil-2,2'-((4,4'-disulfanodiilbis(butanoil))bis(azanodiil))diacetato (824 mg, 1,77 mmoles) en DCM (10 ml) a ta. Después de 30 min de agitación a ta, la mezcla se filtra y el filtrado se reduce dando una espuma sólida a vacío. La cromatografía en columna da el producto puro como una espuma sólida.
Síntesis del compuesto 129
Figure imgf000253_0001
Compuesto 127: Se trató una disolución de etano-1,2-ditiol (1,130 g, 12 mmoles) en TFA (10 ml) toda de una vez con el compuesto 126 (0,89 g, 9,99 mmoles) comercialmente disponible. La disolución se calentó. Después de 1 h de agitación a ta, los volátiles se retiraron y el residuo se sometió a cromatografía en columna dando el compuesto 127 puro como un aceite incoloro (0,95 g, 48 %). Rf = 0,6 (5 % de MeOH/DCM); 1H RMN (500 MHz, CDCh) ó 6,09 - 5,93 (a, 1H), 4,41 (d, J = 6,4 Hz, 2H), 2,87 - 2,83 (m, 2H), 2,79 (ddd, J = 9,7, 7,3, 3,5 Hz, 2H), 2,04 (s, 3H), 1,71 (t, J = 8,0 Hz, 1 H); 13C RMN (126 MHz, CDCta) 5170,25, 40,89, 35,22, 24,91,23,44.
Compuesto 129: Se trató una disolución caliente (35 °C) de DMF (10 ml) del compuesto 128 (939 mg, 3,0 mmoles) comercialmente disponible gota a gota durante 5 min con una disolución del compuesto 127 (250 mg, 1,513 mmoles) de DCM (5 ml). Después de comprobar por TLC, los disolventes se retiraron por evaporación rotatoria bajo alto vacío, entonces el residuo se trituró con DCM (50 ml), se filtró y el filtrado se lavó con 5 x 5 % de NaHCO3, luego se secó (MgSO4), se filtró y se redujo dando un sólido amarillo pálido. La cromatografía en columna dio el compuesto 129 puro como un sólido amarillo pálido. MS (ESI ): calc (M+H)+: 320,02, hallado: 320,34; 1H RMN (500 MHz, CDCh) 59,28 (dd, J= 2,7, 0,7 Hz, 1H), 8,43 (dd, J= 8,9, 2,6 Hz, 1 H), 7,93 (dd, J = 8,9, 0,7 Hz, 1H), 6,10 - 5,90 (a, 1H), 4,41 (d, J = 6,5 Hz, 2H), 3,13 (dd, J = 8,6, 6,3 Hz, 2H), 2,93 (dd, J = 8,6, 6,4 Hz, 2H), 2,00 (s, 3H); 13C RMN (126 MHz, CDCh) 5 170,18, 168,57, 145,22, 142,22, 131,81, 119,59, 40,65, 38,59, 30,07, 23,39.
Síntesis del compuesto 134
Figure imgf000253_0002
Compuesto 130: El compuesto 130 se prepara por un método previamente descrito (Heterocycles, Vol 54, p 139, 2001).
Compuesto 132: Usando un procedimiento análogo descrito previamente para la síntesis del compuesto 126 (Organic Syntheses, Coll. Vol. 6, p.5 (1988)), el compuesto 131 (Tetrahedron Letters, 48(39), 7038-7041; 2007) se convierte en el compuesto 132 calentando suavemente en presencia de una disolución acuosa de formaldehído que contiene K2CO3.
Compuesto 133: Usando un procedimiento análogo al descrito para la síntesis del compuesto 127 y sustituyendo el compuesto 126 por el compuesto 132 y el etano-1,2-ditiol por el compuesto 130, así se obtiene el compuesto 133 puro.
Compuesto 134: Usando un procedimiento análogo al descrito para la síntesis del compuesto 129 y sustituyendo el compuesto 127 por el compuesto 133, así se obtiene el compuesto 134 puro.
Síntesis del compuesto 140
Figure imgf000254_0001
Compuesto 136: Una disolución helada del compuesto 135 (50 g, 342 mmoles) comercialmente disponible y metanol (277 ml) se trató gota a gota con ácido sulfúrico (3,36 g, 34,2 mmoles) durante 10 min, luego se calentó hasta ta gradualmente durante la noche. La mayoría del disolvente se retiró por evaporación rotatoria, entonces se añadió cuidadosamente NaHCO3 acuoso saturado. El pH de la disolución se ajustó a 1,9 mediante la adición de HCl 1 M, luego se extrajo en EtOAc (200 ml), se lavó con salmuera diluida (50 ml), se secó (MgSO4), se filtró y se redujo dando 29 g de aceite incoloro. La cromatografía en columna dio el compuesto 136 puro como un sólido incoloro (12,5 g, 23 %). 1H RMN (500 MHz, CDCta) 512,5 - 10,5 (vbr, 1H), 3,69 (s, 3H), 2,63 (s, 2H), 1,32 (s, 6H); 13C RMN (126 MHz, CDCl3) 5183,32, 171,76, 51,72, 43,88, 40,60, 25,34.
Síntesis del compuesto 138: El compuesto 136 (10 mmoles) en DCM (50 ml) se trata gota a gota con cloruro de oxalilo (10 mmoles), luego DMF (10 pl) y se agita a ta. Durante la reacción se forma una disolución incolora homogénea. Después de 2 h a ta, el disolvente se retira a presión reducida. El residuo blanco se vuelve a disolver en DCM (20 ml), luego se añade gota a gota a una disolución con agitación del compuesto 137 (10 mmoles) de piridina (10 ml), con monitorización por TLC. Después de 18 h, los disolventes se retiran y el residuo se somete a purificación por cromatografía en columna con DCM proporcionando el compuesto 137 puro.
Compuesto 139: El compuesto 138 (5 mmoles) como una disolución en THF (20 ml) se añade a una disolución helada de LiBH4 (5 mmoles) en THF (20 ml). El progreso de la reacción a ta se considera por TLC. Después de terminar la reacción (consumo completo del material de partida), se añade cuidadosamente agua (100 ml) a la disolución helada que se extrae posteriormente con EtOAc (2 x 100 ml). Los extractos orgánicos combinados se secan (MgSO4), se filtran y los disolventes se retiran por evaporación rotatoria. El residuo se somete a cromatografía en columna, así se obtiene el compuesto 139 puro.
Compuesto 140: Usando un procedimiento análogo al descrito para la síntesis del compuesto 80, y sustituyendo el compuesto para el compuesto 79 por el compuesto 139, así se obtiene el compuesto 140 puro.
Síntesis del compuesto 143
Figure imgf000254_0002
Figure imgf000254_0003
Compuesto 139: Usando un procedimiento análogo al descrito para la síntesis del compuesto 139 y sustituyendo el compuesto 138 por el compuesto 136, así se obtiene el compuesto 141 puro.
Compuesto 142: Una disolución del compuesto 141 (8,39 mmoles) en DCM/MeOH (12/3 ml) se trata gota a gota a 0 °C con una disolución 2 M de (diazometil)trimetilsilano (1,05 g, 9,23 mmoles) en éter durante 30 min. Después de extinguir el exceso de reactivo con AcOH, lavado con agua (2 x 5 ml), secado (MgSO4), filtración, retirada de disolvente por evaporación rotatoria, luego cromatografía en columna, se obtiene el compuesto 142 puro.
Compuesto 143: Usando un procedimiento análogo al descrito para la síntesis del compuesto 80, y sustituyendo el compuesto 79 por el compuesto 142, así se obtiene el compuesto 143 puro.
Síntesis del compuesto 147
Figure imgf000255_0001
Figure imgf000255_0004
Compuesto 144: Usando un procedimiento análogo al descrito para la síntesis del compuesto 69a, y sustituyendo el compuesto 67 por el compuesto 136, y el NH4Cl por el compuesto 54 más iPr2NEt, así se obtiene el compuesto 144 puro.
Compuesto 145: Se añade LiAlH4 (100 ml de una disolución 2 M en THF) gota a gota a una disolución del compuesto 144 (86 mmoles) en THF helado (500 ml). La mezcla se calienta a ta, luego se somete a reflujo durante 0,5 h. El LiAlH4 residual se destruye por la cuidadosa adición de Na2SO4 saturado a la disolución helada hasta que se forma un precipitado granular. La mezcla se filtra y se reduce, entonces se vuelve a disolver en EtOAc, se seca (MgSO4), se filtra y se reduce a vacío proporcionando el compuesto 145 que es suficientemente puro para uso directo en la siguiente etapa de la reacción.
Compuesto 146: Usando un procedimiento análogo al descrito para la síntesis del compuesto 124, y sustituyendo el compuesto 123 por el compuesto 145, y 2-aminoacetato de terc-butilo por Leu-Fmoc-OH, así se obtiene el compuesto 146 puro.
Compuesto 147: Usando un procedimiento análogo al descrito para la síntesis del compuesto 80, y sustituyendo el compuesto 79 por el compuesto 146, y el 4-metilbencenosulfonotioato de potasio por el compuesto 114, así se obtiene el compuesto 147 puro.
Síntesis del compuesto 150
Figure imgf000255_0002
Figure imgf000255_0003
Compuesto 148: Se añade pivalato de clorometilo (10 mmoles) comercialmente disponible gota a gota a una disolución con agitación del compuesto 130 (20 mmoles) en 1,2-dicloroetano (100 ml) bajo Ar. La disolución resultante se calienta para forzar hacia la finalización (notada por la desaparición de material de clorometilpivalato por TLC). El disolvente se retira por evaporación rotatoria, entonces el residuo se somete a cromatografía en columna proporcionando el compuesto 148 puro.
Compuesto 149: Usando un procedimiento análogo al descrito para la síntesis del compuesto 89, y sustituyendo el compuesto 88 por el compuesto 148, así se obtiene el compuesto 149 puro.
Compuesto 150: Usando un procedimiento análogo al descrito para la síntesis del compuesto 87, y sustituyendo el compuesto 86 por el compuesto 149, así se obtiene el compuesto 150 puro.
Reactivos de sulfurización adicionales:
Figure imgf000256_0001
en donde Sa indica cualquiera de las siguientes estructuras:
Figure imgf000256_0002
Síntesis de fosforam iditos
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona fosforamiditos, y métodos de preparación de los mismos. En algunas realizaciones, los fosforamiditos proporcionados se usaron en el método de síntesis inventivo de oligonucleótidos descrito en la presente divulgación. Los fosforamiditos a modo de ejemplo y su síntesis se describen a continuación.
Síntesis del compuesto 203
Figure imgf000256_0003
Compuesto 202: Se trató W4-Bz-5'-0LDMTr-2'-0-MOE-5-metilcitidina (201) (2,00 g, 2,77 mmoles) con amoniaco 2 M en 2-propanol (Aldrich, anhidro, 45 ml) y piridina (22,5 ml) a 60 °C durante 5 h, luego a ta durante la noche, con monitorización por TLC y UPLC/MS. El disolvente se retiró (3x azeótropo con tolueno), luego la cromatografía en columna (0 - 10 % de MeOH/DCM) dio el compuesto 202 puro (1,62 g, 95 %) como un sólido incoloro que fue homogéneo por TLC y HPLC. (ESI ): calc (M+H)+: 618,28, hallado: 618,53. 1H RMN (399 MHz, CDCh) ó 7,82 (d, J= 1,3 Hz, 1H), 7,47 - 7,40 (m, 2H), 7,37 - 7,18 (m, 8H), 6,83 (dd, J = 8,9, 1,7 Hz, 4H), 5,93 (d, J = 1,1 Hz, 1H), 4,43 (td, J = 8,3, 4,9 Hz, 1H), 4,24 (ddd, J = 11,7, 5,1,3,0 Hz, 1 H), 4,07 (dt, J = 8,6, 2,4 Hz, 1 H), 4,03 - 3,98 (m, 1H), 3,90 (ddd, J = 11,7, 6,3, 3,3 Hz, 1 H), 3,79 (d, J = 1,0 Hz, 6H), 3,63 - 3,52 (m, 3H), 3,44 (dd, J= 11,0, 3,0 Hz, 1 H), 3,37 (s, 3H), 3,32 (d, J = 9,4 Hz, 1H), 1,80 - 1,64 (s, a, 1H), 1,13 (s, 3H).
Compuesto 203: Se añadió anhídrido isobutírico (0,48 ml, 2,9 mmoles) gota a gota a una disolución del compuesto 202 (1,61 g, 2,61 mmoles) en DMF (13 ml) a ta. La disolución se dejó con agitación a ta durante 24 h, entonces el disolvente se retiró a vacío a 35 °C. La extracción en éter/bicarbonato, luego el secado (MgSÜ4), la filtración y la retirada del disolvente dio el producto en bruto como una espuma incolora sólida. La cromatografía en columna (0 -4 % de MeÜH/DCM) dio el producto puro (1,75 g, 98 %) como una espuma incolora sólida que fue homogénea por TLC y HPLC. (ESI ): calc (M+H)+: 688,32, hallado: 688,56. 1H RMN (399 MHz, CDCh) ó 8,00 - 7,75 (a, 1H), 7,45 -7,39 (m, 2H), 7,34 - 7,20 (m, 8H), 6,84 (dd, J = 9,0, 1,2 Hz, 4H), 5,97 (s, 1H), 4,43 (d, J = 6,1 Hz, 1H), 4,20 - 4,04 (m, 3H), 3,79 (d, J = 0,9 Hz, 6H), 3,64 - 3,58 (m, 1H), 3,64 - 3,52 (m, 2H), 3,47 - 3,40 (m, 2H), 3,38 (s, 3H), 1,70 - 1,55 (a, 1H), 1,39 (d, J = 1,0 Hz, 3H), 1,18 (d, J = 6,9 Hz, 6H).
Síntesis del compuesto 205
Figure imgf000257_0001
Compuesto 205: Se secó por destilación azeotrópica (R)-1-fenil-1-((S)-pirrolidin-2-il)etanol (4) con tolueno (3x3 ml).
Se añadió una disolución de compuesto 4 secado (0,725 g, 3,79 mmoles) y 4-metilmorfolina (0,833 ml, 7,58 mmoles) en tolueno (5 ml) a una disolución helada de triclorofosfina (0,331 ml, 3,79 mmoles) en tolueno (5 ml) que entonces se calentó hasta ta durante 1 h, luego se filtró bajo Ar y se redujo dando un aceite que se usó en la siguiente etapa de la reacción sin más purificación.
Síntesis del compuesto 207
Figure imgf000257_0002
Compuesto 207: Usando un procedimiento análogo al descrito para la síntesis del compuesto 205, y sustituyendo el compuesto 204 por el compuesto 206, el compuesto 207 se obtuvo como un aceite marrón en bruto y se usó en la siguiente etapa de la reacción sin más purificación.
Síntesis del compuesto 208
Figure imgf000257_0003
Compuesto 208: El compuesto 203 (1,74 g, 2,53 mmoles) se secó por coevaporación con piridina (3x5 ml), luego tolueno (5x5 ml). El 203 secado resultante se disolvió en THF (15 ml), entonces se añadió trietilamina (2,47 ml, 17,7 mmoles) y la disolución se enfrió hasta -78 °C por medio de baño de refrigeración de CÜ2(s)/acetona. Se añadió gota a gota una disolución del compuesto en bruto 205 (3,79 mmoles) en THF (15 ml) durante 0,5 h, entonces se calentó gradualmente hasta ta. Después de 1 h a ta, la TLC indicó la conversión completa del compuesto 203 en el producto. La mezcla se lavó en un embudo de decantación con cloroformo (100 ml), entonces se extrajo con NaHCÜ3 (saturado, acuoso, 50 ml, luego 2x25 ml). En cada extracción, los extractos acuosos se lavaron con 1x10 ml adicionales de cloroformo. Los extractos combinados de cloroformo se secaron (MgSÜ4 ), se filtraron y se combinaron por evaporación rotatoria a 32 °C. El sólido en bruto así obtenido se volvió a disolver en DCM que contenía algunas gotas de trietilamina, entonces se sometió a cromatografía en columna con un gradiente de hexano/EtÜAc que contenía una concentración estacionaria de 2 % de trietilamina dando el compuesto 208 puro como una espuma sólida blanca. 1 H RMN (399 MHz, CD3CN) 57,92 - 7,80 (s, 1H), 7,52 - 7,47 (m, 2H), 7,40 - 7,24 (m, 12H), 6,88 (dd, J = 9,0, 1,1 Hz, 4H), 5,94 (d, J= 3,9 Hz, 1H), 4,79 (dt, J = 9,6, 5,6 Hz, 1 H), 4,31 - 4,27 (m, 1H), 4,27 - 4,22 (m, 1H), 3,87 (t, J = 4,7 Hz, 2H), 3,75 (d, J = 2,0 Hz, 6H), 3,66 (td, J = 5,9, 5,5, 2,2 Hz, 1 H), 3,58 - 3,53 (m, 2H), 3,50 (dd, J = 11,1,2,4 Hz, 1H), 3,38 (dd, J = 11,0, 3,3 Hz, 1H), 3,31 (s, 3H), 2,85 (dq, J = 10,5, 7,4, 6,9 Hz, 2H), 1,73 (s, 3H), 1,52 (d, J = 1,0 Hz, 3H), 1,47 - 1,32 (m, 2H), 1,17(dd, J = 6,9, 0,7 Hz, 6H), 1,05 - 0,90 (m, 2H); 31 P RMN (162 MHz, CD3CN) 5155,35.
Síntesis del compuesto 210
Figure imgf000258_0001
Compuesto 210: Usando un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 208 y sustituyendo el compuesto 203 por el compuesto 209 y el compuesto 205 por el compuesto 207, se obtuvo el compuesto 210 puro como una espuma sólida incolora. 1 H RMN (399 MHz, CD3CN) 58,31 - 8,27 (m, 2H), 7,86 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 7,62 - 7,55 (m, 1H), 7,55 - 7,45 (m, 5H), 7,44 - 7,24 (m, 12H), 6,94 - 6,90 (m, 4H), 5,96 (d, J= 3,7 Hz, 1 H), 4,86 - 4,76 (m, 1H), 4,29 (dd, J= 5,0, 3,8 Hz, 1H), 4,23 (dt, J = 5,8, 2,8 Hz, 1H), 3,92 - 3,80 (m, 2H), 3,78 (s, 6H), 3,74 (ddd, J = 7,1,5,3, 2,1 Hz, 1H), 3,55 (t, J = 4,7 Hz, 2H), 3,51 (d, J = 2,3 Hz, 1 H), 3,41 (dd, J = 11,1,3,4 Hz, 1H), 3,30 (s, 3H), 3,26 (ddd, J= 10,3, 6,1,2,2 Hz, 1H), 2,86 (ddt, J = 10,1, 8,2, 7,2 Hz, 1H), 1,72 (d, J = 0,7 Hz, 3H), 1,62 (d, J = 1,1 Hz, 3H), 1,56 - 1,41 (m, 2H), 1,09 - 0,87 (m, 2H); 31 P RMN (162 MHz, CD3CN) 5155,22.
Síntesis del compuesto 212
Figure imgf000258_0002
Compuesto 212: Usando un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 208 y sustituyendo el compuesto 203 por el compuesto 211, se obtuvo el compuesto 212 puro como una espuma sólida incolora. 1H RMN (399 MHz, CDCl3) 59,25 - 8,70 (a, 1H), 7,69 (d, J = 1,3 Hz, 1H), 7,46 - 7,40 (m, 2H), 7,40 - 7,17 (m, 12H), 6,81 (dd, J = 9,0, 2,5 Hz, 4H), 6,09 (d, J = 4,3 Hz, 1H), 4,78 (dt, J = 9,6, 5,2 Hz, 1H), 4,36 - 4,26 (m, 2H), 3,94 - 3,88 (m, 2H), 3,74 (dd, J = 4,0, 0,9 Hz, 6H), 3,69 (td, J = 6,4, 2,9 Hz, 1H), 3,64 - 3,56 (m, 3H), 3,44 - 3,37 (m, 2H), 3,36 (d, J = 0,9 Hz, 3H), 3,00 (dtd, J = 10,3, 7,9, 6,4 Hz, 1H), 1,72 (s, 3H), 1,54 - 1,44 (m, 1H), 1,38 (dd, J = 6,8, 5,4 Hz, 1H), 1,34 (d, J = 1,2 Hz, 3H), 1,23 - 1,13 (m, 1H), 0,97 - 0,87 (m, 1H); 31P RMN (162 MHz, CDCh) 5158,18.
Síntesis del compuesto 213
Figure imgf000258_0003
Compuesto 213: Usando un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 210 y sustituyendo el compuesto 209 por el compuesto 211, se obtuvo el compuesto 213 puro como una espuma sólida incolora. 1H RMN (399 MHz, CDCh) 59,55 - 9,10 (a, 1 H), 8,09 (d, J = 1,5 Hz, 1 H), 7,80 - 7,71 (m, 2H), 7,69 - 7,47 (m, 12H), 7,20 - 7,08 (m, 4H), 6,32 (d, J = 2,9 Hz, 1H), 5,20 - 5,11 (m, 1H), 4,66 - 4,59 (m, 1H), 4,49 - 4,39 (m, 1H), 4,33 - 4,24 (m, 1H), 4,16 - 4,02 (m, 8H), 4,00 - 3,93 (m, 1H), 3,91 - 3,84 (m, 2H), 3,73 (dd, J = 11,0, 2,5 Hz, 1H), 3,65 - 3,52 (m, 4H), 3,27 - 3,16 (m, 1H), 2,15 (s, 3H), 1,88 - 1,76 (m, 1H), 1,76 - 1,65 (m, 1 H), 1,63 - 1,49 (m, 4H), 1,29 - 1,18 (m, 1H); 31 P RMN (162 MHz, CDCI3) 5160,08.
Síntesis del compuesto 215
Figure imgf000259_0001
(i) TMSCl, NEt3, 0 °C; (ii) cloruro de 2,4,6-trimetilbenceno-1-sulfonilo, DMAP; (iii) 1-metilpirrolidina, 3-hidroxipropanonitriIo, DBU, 0°C; (iv) MeOH/H2O, 4 d, temperatura ambiente
Compuesto 215: (i) Protección transitoria de TMS: Se recogió una disolución de W2 -isobutiril-5'-0-DMTr-2'-0-MOE-guanosina (compuesto 214) (15,04 g, 21,1 mmoles) y trietilamina (11,8 ml, 85 mmoles) en ACN (200 ml), entonces se añadió clorotrimetilsilano (10,4 ml, 82 mmoles) gota a gota a la disolución helada, que se agitó a ta durante 1 h con monitorización por TLC. La filtración y retirada de disolvente, luego la extracción (DCM/NaHCO3 500 ml/200 ml), el secado (MgSO4), la filtración y la retirada del disolvente dio el compuesto en bruto que se usó en la siguiente etapa de la reacción sin más purificación. El compuesto fue homogéneo por TLC (Rf= 0,6, (5 % de MeOH/DCM)). (ii) Activación de la posición Q6 para la protección de cianoetilo: El residuo se volvió a disolver en DCM (500 ml), entonces se añadió trietilamina (13,1 ml, 94 mmoles), seguido por cloruro de 2,4,6-trimetilbenceno-1-sulfonilo (6,15 g, 28,1 mmoles) y DMAP (0,14 g, 1,146 mmoles). La mezcla se agitó a ta durante 3 h con monitorización por TLC, hasta la desaparición completa del material de partida y la aparición de una nueva mancha por TLC (Rf= 0,9, (5 % de MeOH/DCM)). (iii) Protección de cianoetilo: Se añadió lentamente 1-metilpirrolidina (22,43 ml, 211 mmoles) gota a gota a la disolución helada con reacción adicional a 0 °C durante 1 h, monitorización por TLC (nueva mancha, Rf = 0,2, franja, (5 % de MeOH/DCM)). Se añadieron 3-hidroxipropanonitrilo (14,40 ml, 211,0 mmoles), luego DBU (6,32 ml, 42,1 mmoles), gota a gota sucesivamente a la disolución todavía helada y la agitación continuó durante 90 min adicionales, monitorizando por TLC (nueva mancha, Rf = 0,6, (5 % de MeOH/DCM)). Para forzar la reacción casi hasta la finalización, se añadieron gota a gota 1,6 ml adicionales de DBU con cuidadosa monitorización por TLC. La mezcla se vertió sobre NaH2 PO4 (50 g en 400 ml de agua), los extractos orgánicos se separaron, y se lavaron con NaH2 PO4 diluido (10 g en 200 ml de agua), se secaron (MgSO4 ), se filtraron y se redujeron por evaporación rotatoria, (iv) Desprotección de TMS: El residuo así obtenido en la etapa previa se volvió a disolver en MeOH (250 ml), entonces se añadió agua en un modo gota a gota, siendo cuidadosos de no inducir la precipitación. La adición gota a gota continuó durante 4 días con monitorización por TLC. La mayor parte del disolvente se retiró y el residuo se extrajo (DCM/NaHCO3 (500/200 ml), se filtró y se redujo. El residuo se sometió a purificación en columna (0-5 % de MeOH/DCM) dando el compuesto 215 puro como una espuma blanca que era homogénea por TLC y HPLC. (ESI ): calc (M+H)+: 767,34, hallado: 767,03. 1 H RMN (300 MHz, CD3CN) 58,63 (s, 1H), 8,07 (s, 1H), 7,44 - 7,36 (m, 2H), 7,33 - 7,18 (m, 7H), 6,84 - 6,72 (m, 4H), 6,02 (d, J = 3,2 Hz, 1 H), 4,74 (td, J = 6,2, 0,9 Hz, 2H), 4,71 - 4,64 (m, 2H), 4,14 - 4,06 (m, 1 H), 3,88 - 3,73 (m, 8H), 3,57 - 3,41 (m, 4H), 3,32 - 3,23 (m, 3H), 3,08 (t, J = 6,2 Hz, 2H), 2,77 (dt, J = 13,7, 6,9 Hz, 1 H), 1,14 (dd, J = 6,9, 1,2 Hz, 6H).
Síntesis del compuesto 216
Figure imgf000259_0002
Compuesto 216: Usando un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 208 y sustituyendo el compuesto 203 por el compuesto 215, se obtuvo el compuesto 216 puro como una espuma sólida incolora. 1 H RMN (399 MHz, CD3CN) 58,41 (s, 1 H), 8,12 (s, 1H), 7,50 - 7,44 (m, 2H), 7,40 - 7,19 (m, 12H), 6,80 (dd, J = 8,9, 5,2 Hz, 4H), 6,04 (d, J = 5,7 Hz, 1 H), 4,99 (t, J = 5,5 Hz, 1H), 4,94 (ddd, J = 9,9, 5,2, 3,7 Hz, 1H), 4,75 (t, J = 6,2 Hz, 2H), 4,29 (c, J = 3,8 Hz, 1H), 3,89 - 3,82 (m, 1 H), 3,76 - 3,68 (m, 7H), 3,64 (ddd, J = 6,8, 5,5, 2,3 Hz, 1H), 3,50 - 3,46 (m, 2H), 3,42 (s, 2H), 3,38 - 3,28 (m, 1 H), 3,21 (s, 3H), 3,09 (t, J = 6,2 Hz, 2H), 2,84 (dq, J = 10,2, 7,3 Hz, 1H), 2,70 - 2,58 (m, 1H), 1,76 (s, 3H), 1,46 - 1,27 (m, 2H), 1,12 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 1,07 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 1,04 - 0,89 (m, 2H); 31 P RMN (162 MHz, CD3CN) 5154,40.
Síntesis del compuesto 217
Figure imgf000260_0001
Compuesto 217: Usando un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 210 y sustituyendo el compuesto 209 por el compuesto 215, se obtuvo el compuesto 217 puro como una espuma sólida incolora. 1 H RMN (399 MHz, CD3CN) 58,56 (s, 1H), 8,13 (s, 1H), 7,44 (dd, J = 8,2, 1,5 Hz, 2H), 7,39 - 7,19 (m, 12H), 6,81 (dd, J = 10,4, 8,9 Hz, 4H), 6,06 (d, J = 4,5 Hz, 1H), 4,96 - 4,86 (m, 2H), 4,75 (t, J = 6,2 Hz, 2H), 4,30 (td, J = 5,1,4,7, 2,4 Hz, 1 H), 3,83 (dt, J = 11,2, 4,3 Hz, 1 H), 3,79- 3,70 (m, 7H), 3,67 (ddd, J = 7,1,5,2, 2,0 Hz, 1H), 3,52 - 3,45 (m, 3H), 3,41 (dd, J = 10,8, 2,7 Hz, 1H), 3,34 - 3,24 (m, 1H), 3,21 (s, 3H), 3,08 (t, J= 6,1 Hz, 2H), 2,89 - 2,72 (m, 2H), 1,68 (s, 3H), 1,54 - 1,38 (m, 2H), 1,14 (dd, J = 6,8, 5,4 Hz, 6H), 1,09 - 1,00 (m, 1H), 0,95 - 0,83 (m, 1H); 31 P RMN (162 MHz, CD3CN) 5154,93.
Síntesis del compuesto 219
Figure imgf000260_0002
Compuesto 219: Usando un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 208 y sustituyendo el compuesto 203 por el compuesto 218, se obtuvo el compuesto 219 puro como una espuma sólida incolora. 1H RMN (399 MHz, CDCl3) 59,31 (s, 1 H), 8,72 (s, 1H), 8,26 (s, 1 H), 8,07 - 7,98 (m, 2H), 7,60 - 7,53 (m, 1 H), 7,52 - 7,43 (m, 4H), 7,38 -7,15 (m, 12H), 6,83 - 6,74 (m, 4H), 6,24 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 5,03 - 4,92 (m, 2H), 4,45 (c, J = 3,8 Hz, 1H), 3,93 (dt, J = 11,4, 4,2 Hz, 1 H), 3,77 (ddd, J = 7,5, 5,8, 3,2 Hz, 2H), 3,73 (s, 6H), 3,60 - 3,49 (m, 3H), 3,47 - 3,37 (m, 2H), 3,26 (s, 3H), 3,02 - 2,92 (m, 1H), 1,81 (s, 3H), 1,56 - 1,43 (m, 1H), 1,37 (dq, J= 13,2, 6,5 Hz, 1H), 1,22 - 1,09 (m, 1 H), 0,96 (ddt, J = 13,1,7,9, 6,8 Hz, 1 H); 31P RMN (162 MHz, CDCh) 5157,73.
Síntesis del compuesto 220
Figure imgf000260_0003
Compuesto 220: Usando un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 210 y sustituyendo el compuesto 209 por el compuesto 218, se obtuvo el compuesto 220 puro como una espuma sólida incolora. 1H RMN (399 MHz, CDCh) 59,26 (s, 1 H), 8,73 (s, 1H), 8,31 (s, 1H), 8,02 (d, J = 7,6 Hz, 2H), 7,60 - 7,53 (m, 1 H), 7,52 - 7,40 (m, 4H), 7,39 - 7,13 (m, 12H), 6,84 - 6,76 (m, 4H), 6,24 (d, J = 4,5 Hz, 1H), 4,99 (dt, J = 10,0, 5,0 Hz, 1H), 4,84 (t, J = 4,7 Hz, 1 H), 4,46 (c, J = 4,0 Hz, 1 H), 3,91 (dt, J = 11,1,4,2 Hz, 1H), 3,85 - 3,69 (m, 8H), 3,63 - 3,50 (m, 3H), 3,42 (dd, J = 10,7, 4,0 Hz, 1H), 3,40 - 3,31 (m, 1 H), 3,27 (s, 3H), 3,00 - 2,89 (m, 1H), 1,82 (s, 3H), 1,58 - 1,38 (m, 2H), 1,20 - 1,09 (m, 1 H), 1,00 (ddt, J = 12,3, 8,8, 5,9 Hz, 1H); 31P RMN (162 MHz, CDCh) 5158,98.
Síntesis del compuesto 222
Figure imgf000261_0001
Compuesto 222: Usando un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 208 y sustituyendo el compuesto 203 por el compuesto 221, se obtuvo el compuesto 222 puro como una espuma sólida incolora. 1H RMN (499 MHz, CDCh) 510,46 (s, a, 1H), 8,62 (d, J= 7,5 Hz, 1H), 7,42 (d, J = 7,1 Hz, 2H), 7,36 - 7,21 (m, 12H), 7,00 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 6,82 (dd, J = 9,0, 7,1 Hz, 4H), 6,03 (s, 1 H), 4,77 (td, J = 8,7, 4,8 Hz, 1H), 4,34 (dt, J = 9,4, 2,3 Hz, 1H), 3,97 (d, J = 4,8 Hz, 1 H), 3,78 (dd, J = 6,7, 3,4 Hz, 1H), 3,74 (s, 3H), 3,71 (s, 6H), 3,68 - 3,58 (m, 2H), 3,48 - 3,38 (m, 1 H), 3,01 (p, J = 7,8 Hz, 1H), 2,27 (s, 3H), 1,72 (s, 3H), 1,49 (tt, J = 12,3, 7,0 Hz, 1H), 1,40 (dq, J = 13,2, 6,6 Hz, 1H), 1,18 (dq, J = 13,9, 7,0 Hz, 1 H), 1,02 - 0,90 (m, 1H); 31P RMN (202 MHz, CDCh) 5158,71.
Síntesis del compuesto 223
Figure imgf000261_0002
Compuesto 223: Usando un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 210 y sustituyendo el compuesto 221 por el compuesto 209, se obtuvo el compuesto 223 puro como una espuma sólida incolora. 1H RMN (500 MHz, CDCh) 59,76 (s, 1H), 8,70 (d, J = 7,4 Hz, 1H), 7,48 - 7,41 (m, 2H), 7,41 - 7,18 (m, 12H), 7,06 (d, J = 7,4 Hz, 1H), 6,87 (dd, J = 8,9, 1,9 Hz, 4H), 6,00 (s, 1H), 4,80 (td, J = 9,2, 4,7 Hz, 1 H), 4,33 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 3,84 (d, J = 4,7 Hz, 1 H), 3,81 (s, 3H), 3,80 (s, 3H), 3,72 (td, J = 6,6, 3,4 Hz, 1H), 3,70 - 3,62 (m, 4H), 3,53 (dd, J = 11,3, 2,2 Hz, 1H), 3,34 (tdd, J = 10,7, 7,8, 4,9 Hz, 1 H), 2,96 (dq, J= 10,3, 7,6 Hz, 1H), 2,25 (s, 3H), 1,83 (s, 3H), 1,56 - 1,48 (m, 1H), 1,43 (dq, J= 13,1,6,4 Hz, 1H), 1,24 - 1,16 (m, 1H), 1,00 - 0,91 (m, 1H). 31P RMN (202 MHz, CDCh) 5157,17.
Síntesis del compuesto 225
Figure imgf000261_0003
Compuesto 225: Usando un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 208 y sustituyendo el compuesto 203 por el compuesto 224, se obtuvo el compuesto 225 puro como una espuma sólida incolora. 1H RMN (500 MHz, CDCh) 59,76 (s, a, 1H), 8,70 (d, J = 7,4 Hz, 1H), 7,48 - 7,41 (m, 2H), 7,41 - 7,18 (m, 12H), 7,06 (d, J = 7,4 Hz, 1H), 6,87 (dd, J = 8,9, 1,9 Hz, 4H), 6,00 (s, 1H), 4,80 (td, J = 9,2, 4,7 Hz, 1 H), 4,33 (d, J = 9,5 Hz, 1 H), 3,84 (d, J = 4,7 Hz, 1H), 3,81 (s, 3H), 3,80 (s, 3H), 3,72 (td, J= 6,6, 3,4 Hz, 1H), 3,69 - 3,62 (m, 4H), 3,53 (dd, J = 11,3, 2,2 Hz, 1H), 3,34 (tdd, J = 10,7, 7,8, 4,9 Hz, 1H), 2,96 (dq, J = 10,3, 7,6 Hz, 1 H), 2,25 (s, 3H), 1,83 (s, 3H), 1,56 - 1,48 (m, 1 H), 1,43 (dq, J = 13,1,6,4 Hz, 1 H), 1,24 - 1,16 (m, 1H), 1,00 - 0,91 (m, 1H); 31P RMN (202 MHz, CDCh) 5158,97.
Síntesis del compuesto 226
Figure imgf000262_0001
Compuesto 226: Usando un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 210 y sustituyendo el compuesto 209 por el compuesto 224, se obtuvo el compuesto 226 puro como una espuma sólida incolora. 1H RMN (499 MHz, CDCta) 59,8 - 9,0 (a, 1H), 8,09 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,40 (d, J = 7,4 Hz, 2H), 7,36 - 7,19 (m, 12H), 6,80 (dd, J = 11,4, 8,8 Hz, 4H), 6,02 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 5,22 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 4,82 (td, J= 8,1,4,9 Hz, 1 H), 4,27 (d, J= 7,4 Hz, 1H), 3,96 (dd, J = 5,0, 2,2 Hz, 1 H), 3,81 - 3,76 (m, 1 H), 3,74 (s, 3H), 3,70 (s, 3H), 3,62 (s, 3H), 3,61 - 3,54 (m, 2H), 3,50 -3,41 (m, 1H), 3,04 (dtd, J = 10,2, 8,0, 6,3 Hz, 1H), 1,75 (s, 3H), 1,56 - 1,47 (m, 1H), 1,44 - 1,35 (m, 1H), 1,26 - 1,18 (m, 1H), 0,95 (dq, J = 12,3, 7,5 Hz, 1H); 31P RMN (202 MHz, CDCta) 5158,96.
Síntesis del compuesto 228
Figure imgf000262_0002
Compuesto 228: Usando un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 208 y sustituyendo el compuesto 203 por el compuesto 227, se obtuvo el compuesto 228 puro como una espuma sólida incolora. RMN 31 P (202 MHz, CDCl3) 5158,16.
Síntesis del compuesto 229
Figure imgf000262_0003
Compuesto 229: Usando un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 210 y sustituyendo el compuesto 209 por el compuesto 227, se obtuvo el compuesto 229 puro como una espuma sólida incolora. RMN 31P (202 MHz, CDCta) 5158,84.
Síntesis del compuesto 231
Figure imgf000263_0001
Compuesto 231: Usando un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 208 y sustituyendo el compuesto 203 por el compuesto 230, se obtuvo el compuesto 231 puro como una espuma sólida incolora. 1H RMN (499 MHz, CDCta) ó 9,6 - 9,3 (s, 1 H), 8,73 (s, 1 H), 8,32 (s, 1H), 7,50 - 7,41 (m, 2H), 7,39 - 7,16 (m, 14H), 7,10 - 7,01 (m, 3H), 6,82 (d, J = 8,8 Hz, 4H), 6,21 (d, J = 4,1 Hz, 1H), 4,96 (dt, J = 10,1,5,1 Hz, 1H), 4,86 (s, 2H), 4,54 (t, J = 4,5 Hz, 1H), 4,43 (c, J = 3,9 Hz, 1 H), 3,81 - 3,75 (m, 7H), 3,62 (dd, J= 10,8, 3,3 Hz, 1H), 3,54 (s, 3H), 3,46 - 3,42 (m, 1 H), 3,41 - 3,33 (m, 1H), 3,01 - 2,93 (m, 1H), 1,82 (s, 3H), 1,56 - 1,47 (m, 1H), 1,44 (dq, J = 13,2, 6,5 Hz, 1H), 1,22 - 1,11 (m, 1H), 1,03 -0,94 (m, 1H); 31P RMN (202 MHz, CDCta) 5158,11.
Síntesis del compuesto 232
Figure imgf000263_0002
Compuesto 232: Usando un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 210 y sustituyendo el compuesto 209 por el compuesto 230, se obtuvo el compuesto 232 puro como una espuma sólida incolora. 1H RMN (499 MHz, CDCl3) 59,8 - 9,2 (a, 1 H), 8,71 (s, 1 H), 8,23 (s, 1 H), 7,49 - 7,43 (m, 2H), 7,40 - 7,15 (m, 14H), 7,09 - 7,02 (m, 3H), 6,79 (d, J = 8,9 Hz, 4H), 6,20 (d, J = 5,6 Hz, 1 H), 4,93 (ddd, J = 9,3, 5,0, 3,8 Hz, 1H), 4,86 (s, 2H), 4,73 (t, J = 5,3 Hz, 1H), 4,43 (c, J = 3,9 Hz, 1 H), 3,79 - 3,75 (m, 1H), 3,74 (s, 3H), 3,74 (s, 3H), 3,57 (dt, J = 6,8, 3,8 Hz, 1 H), 3,52 (s, 3H), 3,46 - 3,36 (m, 2H), 2,99 (dtd, J = 10,1,7,9, 6,5 Hz, 1H), 1,80 (s, 3H), 1,54 - 1,45 (m, 1H), 1,39 - 1,31 (m, 1H), 1,23 - 1,13 (m, 1 H), 0,99 - 0,90 (m, 1H); 31P RMN (202 MHz, CDCh) 5158,13.
Síntesis del compuesto 234
Figure imgf000263_0003
Compuesto 234: Usando un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 208 y sustituyendo el compuesto 203 por el compuesto 233, se obtuvo el compuesto 234 puro como una espuma sólida incolora.
Síntesis del compuesto 235
Figure imgf000264_0001
Compuesto 235: Usando un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 210 y sustituyendo el compuesto 209 por el compuesto 233, se obtuvo el compuesto 235 puro como una espuma sólida incolora. RMN 31P (202 MHz, CDCh) 5158,75.
Síntesis del compuesto 237
Figure imgf000264_0002
Compuesto 237: Usando un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 208 y sustituyendo el compuesto 203 por el compuesto 236, se obtuvo el compuesto 237 puro como una espuma sólida incolora. RMN 31P (202 MHz, cloroformo-a) 5159,51 (d, Jp-f = 9,5 Hz).
Síntesis del compuesto 238
Figure imgf000264_0003
Compuesto 238: Usando un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 210 y sustituyendo el compuesto 209 por el compuesto 236, se obtuvo el compuesto 238 puro como una espuma sólida incolora. RMN 31P (202 MHz, cloroformo-a) 5159,48.
Síntesis del compuesto 240
Figure imgf000265_0001
Compuesto 240: Usando un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 208 y sustituyendo el compuesto 203 por el compuesto 239, se obtuvo el compuesto 240 puro como una espuma sólida incolora. RMN 31P (202 MHz, CDCh) 5160,20 (d, Jp-f = 11,0 Hz).
Síntesis del compuesto 241
Figure imgf000265_0002
Compuesto 241: Usando un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 210 y sustituyendo el compuesto 209 por el compuesto 239, se obtuvo el compuesto 241 puro como una espuma sólida incolora. RMN 31P (202 MHz, CDCh) 5159,66 (d, Jp-f = 8,4 Hz).
Síntesis del compuesto 243
Figure imgf000265_0003
Compuesto 243: Usando un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 208 y sustituyendo el compuesto 203 por el compuesto 242, se obtuvo el compuesto 243 puro como una espuma sólida incolora. RMN 31P (202 MHz, CDCh) 5160,20 (d, J = 11,0 Hz).
Síntesis del compuesto 244
Figure imgf000265_0004
Compuesto 244: Usando un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 210 y sustituyendo el compuesto 209 por el compuesto 242, se obtuvo el compuesto 244 puro como una espuma sólida incolora. RMN 31P (202 MHz, CDCls) 5156,52 (d, Jp-f = 8,5 Hz).
Síntesis del compuesto 246
Figure imgf000266_0001
Compuesto 246: Usando un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 208 y sustituyendo el compuesto 203 por el compuesto 245, se obtiene el compuesto 246 puro como una espuma sólida incolora.
Síntesis del compuesto 247
Figure imgf000266_0002
Compuesto 247: Usando un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 210 y sustituyendo el compuesto 209 por el compuesto 245, se obtiene el compuesto 247 puro como una espuma sólida incolora.
Síntesis del compuesto 249
Figure imgf000266_0003
Compuesto 249: Usando un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 208 y sustituyendo el compuesto 203 por el compuesto 248, se obtiene el compuesto 249 puro como una espuma sólida incolora.
Síntesis del compuesto 250
Figure imgf000267_0001
Compuesto 250: Usando un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 210 y sustituyendo el compuesto 209 por el compuesto 248, se obtiene el compuesto 250 puro como una espuma sólida incolora.
Síntesis del compuesto 252
Figure imgf000267_0002
Compuesto 252: Usando un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 208 y sustituyendo el compuesto 203 por el compuesto 251, se obtiene el compuesto 252 puro como una espuma sólida incolora.
Síntesis del compuesto 253
Figure imgf000267_0003
Compuesto 253: Usando un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 210 y sustituyendo el compuesto 209 por el compuesto 251, se obtiene el compuesto 253 puro como una espuma sólida incolora.
Síntesis del compuesto 255
Figure imgf000267_0004
Compuesto 255: Usando un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 208 y sustituyendo el compuesto 203 por el compuesto 254, se obtiene el compuesto 255 puro como una espuma sólida incolora.
Síntesis del compuesto 256
Figure imgf000268_0001
Compuesto 256: Usando un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 210 y sustituyendo el compuesto 209 por el compuesto 254, se obtiene el compuesto 256 puro como una espuma sólida incolora.
Síntesis del compuesto 258
Figure imgf000268_0002
Compuesto 258: Usando un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 208 y sustituyendo el compuesto 203 por el compuesto 257, se obtiene el compuesto 258 puro como una espuma sólida incolora.
Síntesis del compuesto 259
Figure imgf000268_0003
Compuesto 259: Usando un procedimiento análogo al descrito para el compuesto 210 y sustituyendo el compuesto 209 por el compuesto 257, se obtiene el compuesto 259 puro como una espuma sólida incolora.
Ejemplos 2-16.
A continuación se resume en la Tabla E-1 el procedimiento de síntesis para los Ejemplos 2-16 en el sintetizador de ADN/ARN ABI-394.
abla E-1. Resumen de la síntesis de oligonucleótidos en un sintetizador de ADN/ARN ABI-394 usado para la síntesis de los Ejemplos 2-16.
etapa reacción reactivo tiempo de tiempo de espera (s)
administración (s)
1 gmol 10 gmoles 1 gmol 10 gmoles
1 destritilación 3 % de TCA en DCM 3 60 3 90 10 N.A. N.A.
10
2 acoplamiento fosforamidito 0,15 M en ACN 5 4 10 6 30 600 30 600
CMPT 1,2 M en ACN
3 terminación 1 5 % de Pac2O en THF/2,6- 20 30 60 60
lutidina
4 terminación 2 5 % de Pac2O en THF/2,6- 20 30 60 60
lutidina 16 % de NMI en
THF
5 sulfurización S-cianoetil-MetilTio-Sulfonato 10 15 4x4 300 300
0,3 M 4x2 3x150+ 3x150+
600 600
Figure imgf000269_0001
en ACN/BSTFA
Ejemplos 2-9: Los oligonucleótidos que contienen enlaces internucleotídicos de diéster de fosforotioato estereodefinidos se sintetizaron en un sintetizador de ADN/ARN ABI-394 según el ciclo resumido en la Tabla E-1 usando una columna de síntesis de 10 gmoles y 6,5 gmoles de dC unido a succinilo sobre CPG. El ciclo de síntesis se realizó con retirada del grupo 5'-0-DMTr terminal (DMT Apagado). El soporte sólido se lavó con ACN seco y se secó bajo un flujo de argón. El soporte sólido seco se trató entonces con 5 ml de disolución 1 M anhidra de 1,8-diazabicicloundec-7-eno (DBU) en ACN seco-cloruro de trimetilsililo - 16:1 (v/v) durante 10 min a ta, tiempo durante el cual la disolución fue empujada lentamente a través de la columna por medio de un jeringa luer de plástico unida a la salida de la columna. El soporte se lavó entonces con ACN seco y se secó a vacío. El CPG seco se puso en un vial de plástico y entonces se trató con 3 ml de amoniaco acuoso al 28 % durante un periodo de 18 h a ta. Los disolventes se evaporaron a sequedad, el residuo se volvió a suspender en 10 % de DMSO acuoso, y el soporte sólido se separó por filtración. El producto en bruto se purificó por HPLC preparativa de intercambio aniónico (gradiente de NaCl 0,25 a 1,75 M en NaOH 20 mM). Se reunieron las fracciones que tenían pureza superior al 95 %, se concentraron y se desalaron por HPLC de fase inversa (gradiente del 0 al 80 % de ACN). El producto desalado final se liofilizó del agua.
Ejemplos 10-16: Los oligonucleótidos que contienen enlaces internucleotídicos de diéster de fosforotioato estereodefinidos se sintetizaron en un sintetizador de ADN/ARN ABI-394 según el ciclo resumido en la Tabla E-1 usando una columna de síntesis de 1 gmol y 3 gmoles de dC unido a succinilo sobre CPG. El ciclo de síntesis se realizó con retirada del grupo 5'-0-DMTr terminal (DMT Apagado). El soporte sólido se lavó con ACN seco y se secó bajo un flujo de argón. El soporte sólido seco se trató entonces con 5 ml de disolución 1 M anhidra de 1,5-diazabiciclo(4.3.0)non-5-eno (DBN) en ACN seco-cloruro de trimetilsililo - 16:1 (v/v) durante 10 min a ta. La disolución de DBN se empujó lentamente a través de la columna por medio de una jeringa luer de plástico unida a la salida de la columna. El soporte se lavó entonces con ACN seco y se secó a vacío. El CPG seco se puso en un vial de plástico y se trató con 2 ml de amoniaco acuoso al 28 % durante un periodo de 18 h a ta. Los disolventes se evaporaron a sequedad, el residuo se volvió a suspender en 10 % de DMSO acuoso y el soporte sólido se separó por filtración.
Purificación y desalación de los Ejemplos 2-16:
El producto en bruto se purificó por el sistema de HPLC Waters 2525 BGM, equipado con un detector de longitud de onda doble 2487 y con FCO y Flex inyect. Se llenó una columna de vidrio AP-1 de Waters, 10 x 200 mm, con Source 15Q Support (GE Healthcare, pieza N.° 17-0947-01) y se usó con un caudal de 4 ml/min. La columna se calentó durante todas las purificaciones usando un calentador de fase móvil TL600 y controlador de temperatura TL150 (Timberline Instruments) establecido a 75 °C. Se usaron tampón A: NaOH 20 mM y tampón B: NaOH 20 mM, NaCl 2,5 M con gradientes de etapa a partir de 30 % de B a 70 % de B. Las fracciones que tenían pureza por encima del 95 % se reunieron, se concentraron y se desalaron en el mismo sistema de HPLC por columna de fase inversa (XBridge Semi Prep, 250 x 10mm, C18, 5 gm) con un gradiente de agua al 80 % de ACN y caudal de 4 ml/min. El producto desalado final se concentró en Speedvac seguido por liofilización del agua.
Análisis de HPLC de oligonucleótidos purificados: la calidad de los oligonucleótidos se determinó usando DNA Pac 100 (10 x 250 mm) y usando las siguientes condiciones:
Tampón A: Tris HCl 10 mM, 50 % de HCl, pH= 8,0
Tampón B: A NaClÜ4 0,8 M, pH=8,0
Temperatura de la columna: 60 °C
Método del gradiente:
Tiempo Caudal % de A % de B Curva 1 0,01 1,00 85,0 15,0
2 3,00 1,00 85,0 15,0 1
3 23,00 1,00 40,0 60,0 6
4 25,00 1,00 5,0 95,0 6
5 25,50 1,00 85,0 15,0 6
6 30,00 1,00 85,0 15,0 1
Método de análisis de LCMS:
Eluyente A: TEA 15 mM, HFIP 400 mM, agua
Eluyente B: 50:50 de tampón A/metanol
Columna: UPLC@OST C181,7 gm, 2,1 x 500 mm
Temperatura de la columna = 50 °C
Método del gradiente:
Tiempo Caudal % de A % de B Curva
0 0,2 95 5
10 0,2 35 65 6
12 0,2 5 95 6
12,5 0,2 95 5 6
15 0,2 95 5 1
Eiemplo 2. Síntesis del o ligonucleótido 101 (Todo-(flp)-dfGsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsCl)
Se sintetizó el oligonucleótido 101 como se ha descrito anteriormente. RT en IEX-HPLC: 14,70 min. UPLC/ESI-MS: Calcd para C191H246N67O102P19S19: 6310,2; hallado: 6310,4.
Ejemplo 3. Síntesis del oligonucleótido 102 (Todo-(Sp)-dfGsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsCI)
Se sintetizó el oligonucleótido 102 como se ha descrito anteriormente. RT en IEX-HPLC: 15,49 min. UPLC/ESI-MS:
Caled para C191H246N67O102P19S19: 6310,2; hallado: 6310,2.
Ejemplo 4. Síntesis del oligonucleótido 103 (( f ío, Ro. Rp , Ro. Ro. Sp ,
Figure imgf000271_0001
So. Sp , So.
Ro. Ro. fíp)-dfGsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC1 (5R-9S-5R))
Se sintetizó el oligonucleótido 103 como se ha descrito anteriormente. RT en IEX-HPLC: 15,10 min. UPLC/ESI-MS:
Caled para C191H246N67O102P19S19: 6310,2; hallado: 6310,3.
Ejemplo 5. Síntesis del oligonucleótido 104 ((Sp. Sp . Sp. Sp . Sp . Rp .
Figure imgf000271_0002
Rp . Rp . Rp . Rp . Rp . Rp .
Sp . Sp. Sp)-dfGsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC1 (5S-9R-5S))
Se sintetizó el oligonucleótido 104 como se ha descrito anteriormente. RT en IEX-HPLC: 15,04 min. UPLC/ESI-MS:
Calcd para C191H246N67O102P19S19: 6310,2; hallado: 6307,2.
Ejemplo 6. Síntesis del o ligonucleótido 105 ((Sp . Ro. Rp . Rp . Rp . Rp .
Figure imgf000271_0003
Rp . Rp . Rp . Rp . Rp .
Ro. Ro. So)-dfGsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC1 (1S-17R-1S))
Se sintetizó el oligonucleótido 105 como se ha descrito anteriormente. RT en IEX-HPLC: 14,75 min. UPLC/ESI-MS:
Calcd para C191H246N67O102P19S19: 6310,2; hallado: 6310,2.
Ejemplo 7. Síntesis del o ligonucleótido 106 ((Rp , So, So, So, Sp . So,
Figure imgf000271_0004
So, So, So, So, So, Ro)-dfGsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC1 (1R-17S-1R))
Se sintetizó el oligonucleótido 106 como se ha descrito anteriormente. RT en IEX-HPLC: 15,43 min. UPLC/ESI-MS:
Calcd para C191H246N67O102P19S19: 6310,2; hallado: 6309,6.
Ejemplo 8. Síntesis del o ligonucleótido 107 ((Rp , So, Rp . So, Rp , So,
Figure imgf000271_0005
Rp, So, Rp , Rp . So, Ro)-dfGsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC1 ((R/S)9 R))
Se sintetizó el oligonucleótido 107 como se ha descrito anteriormente. RT en IEX-HPLC: 15,02 min. UPLC/ESI-MS:
Calcd para C191H246N67O102P19S19: 6310,2; hallado: 6310,7.
Ejemplo 9. Síntesis del o ligonucleótido 108 ((So, Rp , So, Rp , So, Rp , So, Rp , So, Rp . So, Ro. Sp . Rp , Sp . Ro.
So, Rp, Sp)-dfGsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC1 ((SB^S))
Se sintetizó el oligonucleótido 108 como se ha descrito anteriormente. RT en IEX-HPLC: 15,10 min. UPLC/ESI-MS:
Calcd para C191H246N67O102P19S19: 6310,2; hallado: 6307,9.
Ejemplo 10. Síntesis del o ligonucleótido 109 ((So, So, So, Rp , Rp , Rp , Rp , Rp , Rp , Rp , Rp , Rp , Rp , Rp , Rp , Rp,
So, So, So)dfGsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC1 (3S-13R-3S))
Se sintetizó el oligonucleótido 109 como se ha descrito anteriormente. RT en IEX-HPLC: 14,91 min. UPLC/ESI-MS:
Calcd para C191H246N67O102P19S19: 6310,2; hallado: 6309,5.
Ejemplo 11. Síntesis del o ligonucleótido 110 ((Rp , Rp, Rp . So, So, So, So, So, So, So, So, So, So, So, So, So,
Rp , Rp, Rp)-dfGsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC1 (3R-13S-3R))
Se sintetizó el oligonucleótido 110 como se ha descrito anteriormente. RT en IEX-HPLC: 15,24 min. UPLC/ESI-MS:
Calcd para C191H246N67O102P19S19: 6310,2; hallado: 6309,3.
Ejemplo 12. Síntesis del o ligonucleótido 111 ((So, So, So, So, So, So, So, So, So, So, So, So, So, So, So, So,
So, So, Ro)-dfGsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC1 ((18S/R19))
Se sintetizó el oligonucleótido 111 como se ha descrito anteriormente. RT en IEX-HPLC: 15,69 min. UPLC/ESI-MS:
Calcd para C191H246N67O102P19S19: 6310,2; hallado: 6309,4.
Ejemplo 13. Síntesis del o ligonucleótido 113 ((So, Rp , So, So, So, So, So, So, So, So, So, So, So, So, So, So,
So, So, Sp)-dfGsCsCsTsCsAsGsTsCsTsGsCsTsTsCsGsCsAsCsC1 (18S/R2))
Se sintetizó el oligonucleótido 113 como se ha descrito anteriormente. RT en IEX-HPLC: 15,72 min. UPLC/ESI-MS:
Calcd para C191H246N67O102P19S19: 6310,2; hallado: 6311,0.
Figure imgf000272_0001
S
L o s r e s u l t a d o s d e l o s E j e m p l o s 2 - 1 6 s e r e s u m e n e n l a T a b l a E - 2 , q u e s i g u e :
T a b l a E - 2 . R e s u m e n d e l o s E j e m p l o s 2 - 1 6 .
Figure imgf000272_0002
Figure imgf000273_0001
Ejemplo 17. Síntesis de los oligonucleótidos de control
Se sintetizaron los oligonucleótidos de control (véase la Tabla E-3) usando los métodos de química habitual para la síntesis automatizada de oligonucleótidos en fase sólida (Beaucage, S.L. y Iyer, R.P., Tetrahedron, 1992, 48, 2223­ 2311). Más específicamente, se sintetizó ADN estereoaleatorio usando fosforamiditos de ADN habitual (ChemGenes Co.), etiltiotetrazol (ETT, Muang et al., Tetrahedron Lett., 2004, 45, 6497-6499) como activador (Glen Research) y N,N-dimetil-N'-(3-tioxo-3H-1,2,4-ditiazol-5-il)metanimidamida (DDTT, AM Chemicals) como reactivo de sulfurización (Guzaev, A.; Tetrahedron Lett., 2011,52, 434-437). El tiempo de acoplamiento de fosforamidito fue 2 min y el tiempo de sulfurización fue 10 min. El oligonucleótido se desprotegió y se purificó usando métodos convencionales. Se sintetizó fosfodiéster de ADN usando fosforamiditos de ADN habituales, ETT como activador y yodo/piridina/agua como reactivo de oxidación. Se sintetizó ADN de 2'-0-metoxietilo (MOE) usando fosforamiditos de 2'-0-metoxietilo (MOE) preparados internamente (Martin, P.; Helv. Chim. Acta. 1995, 78, 486-504; Ross, B.; Song, Q.; 2004, publicación de patente de EE. UU. N.° 20040082775), ETT como activador y DDTT como reactivo de sulfurización. Los tiempos para el acoplamiento fueron 10 min y los tiempos para la sulfurización fueron 10 min. Se sintetizó ARN usando fosforamiditos de ARN habituales (ChemGenes Co.), ETT como activador y yodo/piridina/agua como reactivo de oxidación. Los tiempos de acoplamiento fueron 10 min.
Todos los oligonucleótidos se desprotegieron y se purificaron usando métodos convencionales.
Purificación de ARN (Oligonucleótido 117):
Waters 2525 BGM, detector de longitud de onda doble 2487 equipado con FCO e inyector Flex
Tampón A: Fosfato de sodio 20 mM pH=8,5
Tampón B: Fosfato de sodio 20 mM, NaBr 1 M pH=8,5
Columna: Columna de vidrio AP-1 de Waters, 10 x 200 mm, rellena con Super Q-5PW (20), gel TSK (intercambio aniónico) de TOSOH
Temperatura de la columna: 70 °C (Timberline Instruments, calentador de fase móvil TL600 y controlador de temperatura TL150)
Gradiente usado:
Tiempo Caudal (ml/min) % de A % de B Curva Inicial 100 0
10 4 100 0 1
Tiempo Caudal (ml/min) % de A % de B Curva
Inicial 100 0
25 4 80 20 6
i 15 4 55 45 6
i 25 4 0 100 6
i 30 4 100 0 6
i 40 4 100 0 1
Como se muestra en la Figura 1, el oligonucleótido 20-mero de diéster de fosforotioato quiralmente controlado (Todo-(Rp), oligonucleótido 101, Figura 1, A) tiene un tiempo de retención diferente del oligonucleótido estereoaleatorio habitual 20-mero de diéster de fosforotioato (oligonucleótido 118, Figura 1, C) y tiene un pico más afilado. Un experto en la técnica entiende que durante la purificación del oligonucleótido estereoaleatorio 108, es probable que se pierda la mayoría del oligonucleótido todo-(Rp) (101, presente en una fracción de aproximadamente 1/219 de la mezcla del oligonucleótido estereoaleatorio 108).
Los resultados del Ejemplo 17 se resumen en la Tabla E-3, que sigue.
Tabla E-3. Resumen del Ejemplo 17.
Figure imgf000274_0001
Procedimientos para los Ejemplos 18-21: Se sintetizaron oligonucleótidos que contenían enlaces internucleotídicos de triéster de morfolinoetilfosforotioato estereodefinidos en un sintetizador de ADN/ARN ABI-394 según el ciclo resumido en la Tabla E-4 usando una columna de síntesis de 1 pmol y 0,8 pmoles de dC unido a oxalilo sobre HCP. El ciclo de síntesis se realizó con retirada del grupo 5'-0-DMTr terminal (DMT Apagado). El soporte sólido se lavó con ACN seco y se secó bajo un flujo de argón. El HCP seco se puso en un vial de plástico y se trató con 1 ml de propilamina seca en piridina seca (en una relación 1:4) durante un periodo de 18 h a ta. Entonces se evaporaron los disolventes y el residuo se volvió a suspender con disolución acuosa de pH ~ 1,5 que contenía 10 % de DMSO y el soporte de HCP se separó por filtración. El producto en bruto se purificó por HPLC preparativa de fase inversa. Se reunieron las fracciones que tenían pureza superior al 95 %, se concentraron y se desalaron por HPLC de fase inversa (gradiente del 0 al 80 % de ACN). El producto desalado final se liofilizó del agua.
Tabla E-4. Resumen de la síntesis de oligonucleótidos en un sintetizador de ADN/ARN ABI-394 usado para la síntesis de los Ejemplos 18-21.
etapa reacción reactivo tiempo de tiempo de administración (s) espera (s)
1 destritilación 3 % de TCA en DCM 3 60 10 N.A.
2 acoplamiento fosforamidito 0,15 M en ACN CMPT 1,2 M en ACN 5 4 30 600
3 terminación 1 5 % de Pac2Ü en THF/2,6-lutidina 20 60
4 terminación 2 5 % de Pac2Ü en THF/2,6-lutidina 16 % de NMI en 20 60
THF
5 sulfurización S-Morfolinoetil-ToluilTioSulfonato 0,3 M 10 4x2 300+3x150+
Figure imgf000275_0001
600
en ACN/BSTFA
Método de purificación general para los Ejemplos 18-21:
Tampón A: Fosfato 20 mM pH=6,0 (ajustado con ácido fosfórico)
Tampón B: ACN
Columna: XBridge Prep Ci8, 5 pm, Ci8, 250 x 10 mm, pieza N.° 186003256
Temperatura establecida del calentador de tampón = 50 °C
Señal monitorizada a 254 y 280 nm
Gradiente usado:
Tiempo Caudal (ml/min) % de A % de B Curva
Inicial 99 1
5 4 99 1 1
10 4 77 23 6
60 4 70 30 6
65 4 20 80 6
70 4 20 80 6
71 4 99 1 6
80 4 99 1 1
Métodos de HPLC analítica para oligonucleótidos.
Método 1 de HPLC:
Tampón A: Fosfato 20 mM pH=6,0 (ajustado con ácido fosfórico)
Tampón B: ACN
Columna: XBridge Ci8, 3,5 pm, Ci8, 4,6 x 50 mm, pieza N.° 186003034
Temperatura establecida del calentador de tampón = 35 °C
Señal monitorizada a 254 y 280 nm
Gradiente usado:
Tiempo Caudal (ml/min) % de A % de B Curva Inicial 95 5
3 1 95 5 1
23 1 60 40 6
25 1 40 60 6
25,5 1 95 5 6
30 1 95 5 1
Método 2 de HPLC:
Tampón A: TEAA 50 mM, pH 7,8
Tampón B: ACN
Columna: XBridge Ci8, 3,5 pm, Ci8, 4,6 x 50 mm, pieza N.° 186003034
Temperatura establecida del calentador de tampón = 60 °C
Señal monitorizada a 254 y 280 nm
Gradiente usado:
Tiempo Caudal (ml/min) % de A % de B Curva Inicial 99 1
2 1 99 1 1
22 1 65 35 6
25 1 5 95 6
25,5 1 5 95 6
30 1 99 1 1
Método 3 de HPLC:
T i e m p o C a u d a l ( m l / m i n ) % d e A % d e B C u r v a
I n i c i a l
85 15
2 1 85 15 1
20 1 60 40 6
22 1 5 95 6
25 1 5 95 6
25 , 5 1 85 15 6
30 1 85 15 1
M é t o d o 4 d e H P L C :
T i e m p o C a u d a l ( m l / m i n ) % d e A % d e B C u r v a
I n i c i a l
85 15
2 1 85 15 1
20 1 40 60 6
22 1 5 95 6
25 1 5 95 6
25 , 5 1 85 15 6
30 1 85 15 1
E m l 1 ín i li n l i 122 T -R -
Figure imgf000277_0001
Rp, Rp
Ejemplo________ 20.________ Síntesis________ del________ oligonucleótido________ 124________ (Todo-(Sp)-díGs1Cs1Cs1Ts1Cs1As1Gs1Ts1Cs1Ts1Gs1Cs1Ts1Ts1Cs1Gs1Cs1As1Cs1C1)
Figure imgf000277_0002
Ejemplo 21. Síntesis del oligonucleótido 125 (Todo-(flp)-dr5mCs1As1Ts1G1)
Se sintetizó el oligonucleótido 125 como se ha descrito anteriormente. RT en RP-HPLC (Método 2 de HPLC): 16,32 min. UPLC/ESI-MS: Calcd para C58H85N18O22P3S3 : 1575,5; hallado: 1575,2.
En los Ejemplos 22 y 42 se sintetizó el oligonucleótido que contenía enlaces internucleotídicos de triéster de metoxietilfosforotioato estereodefinidos en un sintetizador de ADN/ARN ABI-394 según el ciclo resumido en la Tabla E-5 usando una columna de síntesis de 1 gmol y 0,8 gmoles de dC unido a oxalilo sobre HCP. El ciclo de síntesis se realizó con retirada del grupo 5'-0-DMTr terminal (DMT Apagado). El soporte sólido se lavó con ACN seco y se secó bajo un flujo de argón. El HCP seco se puso en un vial de plástico y se trató con 1 ml de propilamina seca en piridina seca (en una relación 1:4) durante un periodo de 18 h a ta. Entonces se evaporaron los disolventes y el residuo se volvió a suspender con disolución acuosa de pH ~ 1,5 que contenía 10 % de DMSO y el soporte de HCP se separó por filtración. El producto en bruto se purificó por HPLC preparativa de fase inversa (gradiente del 5 al 65 % de ACN en tampón fosfato de sodio 20 mM, pH = 6,0). Se reunieron las fracciones que tenían pureza superior al 95 %, se concentraron y se desalaron por HPLC de fase inversa (gradiente del 0 al 80 % de ACN). El producto desalado final se liofilizó del agua.
Tabla E-5. Resumen de la síntesis de oligonucleótidos en un sintetizador de ADN/ARN ABI-394 usado para la síntesis de los Ejemplos 22 y 42.
etapa reacción reactivo tiempo de tiempo de administración (s) espera (s)
1 destritilación 3 % de TCA en DCM 3 60 10 N.A.
2 acoplamiento fosforamidito 0,15 M en ACN CMPT 1,2 M en 5 4 30 600
ACN
3 terminación 1 5 % de Pac2O en THF/2,6-lutidina 20 60
4 terminación 2 5 % de Pac2O en THF/2,6-lutidina 16 % de NMI 20 60
en THF
5 sulfurización Toluiltiosulfonato de S-MOE 0,3 M 10 4x2 300+3x150+
600
Figure imgf000278_0001
Ejemplo 22. Síntesis del oligonucleótido 126 (Todo-(fíp)-drCs2As2Gs2T1 (s2
Figure imgf000278_0002
Se sintetizó el oligonucleótido 126 como se ha descrito anteriormente. RT en RP-HPLC (Método 2 de HPLC): 16,23 min. UPLC/ESI-MS: Calcd para C48H68N15O22P3S3 : 1396,2; hallado: 1395,2.
Ejemplo 23: Se sintetizó el oligonucleótido que contenía enlaces internucleotídicos triéster de fosforotioato del éster voluminoso de W-metilpiperazino estereodefinidos en un sintetizador de ADN/ARN ABI-394 según el ciclo resumido en la Tabla E-6 usando una columna de síntesis de 1 gmol y 1,5 gmoles de dT unido a oxalilo sobre HCP. El ciclo de síntesis se realizó con retirada del grupo 5'-0-DMTr terminal (DMT Apagado). El soporte sólido se lavó con ACN seco y se secó bajo un flujo de argón. El HCP seco se puso en un vial de plástico y se trató con 1 ml de propilamina seca en piridina seca (en una relación 1:4) durante un periodo de 18 h a ta. Entonces se evaporaron los disolventes y el residuo se volvió a suspender con disolución acuosa de pH ~ 1,5 que contenía 10 % de DMSO y el soporte de HCP se separó por filtración. El producto en bruto se purificó por HPLC preparativa de fase inversa (gradiente del 5 al 65 % de a Cn en tampón fosfato de sodio 20 mM, pH = 6,0). Se reunieron las fracciones que tenían pureza superior al 95 %, se concentraron y se desalaron por HPLC de fase inversa (gradiente del 0 al 80 % de ACN). El producto desalado final se liofilizó del agua.
Tabla E-6. Resumen de la síntesis de oligonucleótidos en un sintetizador de ADN/ARN ABI-394 usado para la síntesis del Ejemplo 23.
etapa reacción reactivo tiempo de tiempo de administración (s) espera (s)
1 destritilación 3 % de TCA en DCM 3 60 10 N.A.
2 acoplamiento fosforamidito 0,15 M en ACN CMPT 5 4 30 600
1,2 M en ACN
3 terminación 1 5 % de Pac2O en THF/2,6-lutidina 20 60
4 terminación 2 5 % de Pac2O en THF/2,6-lutidina 20 60
16 % de NMI en THF
5 sulfurización W-Metil Piperazino éster 10 4x2 300 3x150
FenilTioSulfonato 0,3 M 600
Figure imgf000279_0001
en ACN/BSTFA
Ejemplo 23. Síntesis del oligonucleótido 127 (Todo-(fíp)-dfCs3As3Gs3T1 (s3
Figure imgf000279_0002
Se sintetizó el oligonucleótido 127 como se ha descrito anteriormente. RT en RP-HPLC (Método 2 de HPLC): 20,24 min. UPLC/ESI-MS: Calcd para C78H122N21O25P3S3 : 1943,1; hallado: 1941,0.
Ejemplos 24 y 43: Se sintetizó el oligonucleótido que contenía enlaces internucleotídicos triéster de fosforotioato del éster voluminoso de morfolino estereodefinidos en un sintetizador de ADN/ARN ABI-394 según el ciclo resumido en la Tabla E-7 usando una columna de síntesis de 1 pmol y 1,5 pmol de dT unido a oxalilo sobre HCP. El ciclo de síntesis se realizó con retirada del grupo 5'-0-DMTr terminal (DMT Apagado). El soporte sólido se lavó con ACN seco y se secó bajo un flujo de argón. El HCP seco se puso en un vial de plástico y se trató con 1 ml de propilamina seca en piridina seca (en una relación 1:4) durante un periodo de 18 h a ta. Entonces se evaporaron los disolventes y el residuo se volvió a suspender con disolución acuosa de pH ~ 1,5 que contenía 10 % de DMSO y el soporte de HCP se separó por filtración. El producto en bruto se purificó por HPLC preparativa de fase inversa (gradiente del 5 al 65 % de ACN en tampón fosfato de sodio 20 mM, pH = 6,0). Se reunieron las fracciones que tenían pureza superior al 95 %, se concentraron y se desalaron por HPLC de fase inversa (gradiente del 0 al 80 % de ACN). El producto desalado final se liofilizó del agua.
Tabla E-7. Resumen de la síntesis de oligonucleótidos en un sintetizador de ADN/ARN ABI-394 usado para la síntesis de los Ejemplos 24 y 43.
etapa reacción reactivo tiempo de tiempo de administración (s) espera (s)
1 destritilación 3 % de TCA en DCM 3 60 10 N.A.
etapa reacción reactivo tiempo de tiempo de administración (s) espera (s) 2 acoplamiento fosforamidito 0,15 M en ACN CMPT 1,2 M en ACN 5+4 30 600 3 terminación 1 5 % de Pac2O en THF/2,6-lutidina 20 60
4 terminación 2 5 % de Pac2O en THF/2,6-lutidina 16 % de NMI en 20 60
THF
5 sulfurización morfolino éster NitroFenilTioSulfonato 0,3 M 10 4x2 300+3x150+
600
Figure imgf000280_0001
en ACN/BSTFA
Ejemplo 24. Síntesis del o ligonucleótido 128 (Todo-(Sp)-drCs4As4Gs4T1 (s4 =
Figure imgf000280_0002
Se sintetizó el oligonucleótido 128 como se ha descrito anteriormente. RT en RP-HPLC (Método 3 de HPLC): 19,75 min. UPLC/ESI-MS: Calcd para C75H113N18O28P3S3 : 1902,9; hallado: 1904,0.
Ejemplo 25: Se sintetizó el oligonucleótido que contenía enlaces internucleotídicos triéster de fosforotioato del dimetilaminoetilo estereodefinidos en un sintetizador de ADN/ARN ABI-394 según el ciclo resumido en la Tabla E-8 usando una columna de síntesis de 1 gmol y 1,5 gmoles de dT unido a oxalilo sobre HCP. El ciclo de síntesis se realizó con retirada del grupo 5'-0-DMTr terminal (DMT Apagado). El soporte sólido se lavó con ACN seco y se secó bajo un flujo de argón. El h Cp seco se puso en un vial de plástico y se trató con 1 ml de propilamina seca en piridina seca (en una relación 1:4) durante un periodo de 18 h a ta. Entonces se evaporaron los disolventes y el residuo se volvió a suspender con disolución acuosa de pH ~ 1,5 que contenía 10 % de DMSO y el soporte de HCP se separó por filtración. El producto en bruto se purificó por HPLC preparativa de fase inversa (gradiente del 5 al 65 % de ACN en tampón fosfato de sodio 20 mM, pH = 6,0). Se reunieron las fracciones que tenían pureza superior al 95 %, se concentraron y se desalaron por HPLC de fase inversa (gradiente del 0 al 80 % de ACN). El producto desalado final se liofilizó del agua.
Tabla E-8. Resumen de la síntesis de oligonucleótidos en un sintetizador de ADN/ARN ABI-394 usado para la síntesis del Ejemplo 25.
Etapa reacción reactivo tiempo de tiempo de administración (s) espera (s) 1 destritilación 3 % de TCA en DCM 3 60 10 N.A.
2 acoplamiento fosforamidito 0,15 M en ACN CMPT 1,2 M en ACN 5+4 30 600 3 terminación 1 5 % de Pac2O en THF/2,6-lutidina 20 60
4 terminación 2 5 % de Pac2O en THF/2,6-lutidina 16 % de NMI en 20 60
THF
Etapa reacción reactivo tiempo de tiempo de administración (s) espera (s)
5 sulfurización dimetilaminoetil-ToluilTioSulfonato 0,3 M 10 4x2 900 3x600
Figure imgf000281_0001
en ACN/BSTFA
Ejemplo 25. Síntesis del o ligonucleótido 129 (Todo-(Sp)-drCs5As5Gs5T1 (s5 =
Figure imgf000281_0002
Se sintetizó el oligonucleótido 129 como se ha descrito anteriormente. RT en RP-HPLC (Método 2 de HPLC): 17,25 min. UPLC/ESI-MS: Calcd para C51H77N18O19P3S3 : 1435,4; hallado: 1435,0.
Ejemplo 26: Se sintetizó el oligonucleótido que contenía enlaces internucleotídicos triéster de fosforotioato del éster de dimetilalanina estereodefinidos en un sintetizador de ADN/ARN ABI-394 según el ciclo resumido en la Tabla E-9 usando una columna de síntesis de 1 pmol y 1,5 pmoles de dT unido a oxalilo sobre HCP. El ciclo de síntesis se realizó con retirada del grupo 5'-0-DMTr terminal (DMT Apagado). El soporte sólido se lavó con ACN seco y se secó bajo un flujo de argón. El h Cp seco se puso en un vial de plástico y se trató con 1 ml de propilamina seca en piridina seca (en una relación 1:4) durante un periodo de 18 h a ta. Entonces se evaporaron los disolventes y el residuo se volvió a suspender con disolución acuosa de pH ~ 1,5 que contenía 10 % de DMSO y el soporte de HCP se separó por filtración. El producto en bruto se purificó por HPLC preparativa de fase inversa (gradiente del 5 al 65 % de ACN en tampón fosfato de sodio 20 mM, pH = 6,0). Se reunieron las fracciones que tenían pureza superior al 95 %, se concentraron y se desalaron por HPLC de fase inversa (gradiente del 0 al 80 % de ACN). El producto desalado final se liofilizó del agua.
Tabla E-9. Resumen de la síntesis de oligonucleótidos en un sintetizador de ADN/ARN ABI-394 usado para la síntesis del Ejemplo 26.
etapa reacción reactivo tiempo de tiempo de administración (s) espera (s)
1 destritilación 3 % de TCA en DCM 3 60 10 N.A.
2 acoplamiento fosforamidito 0,15 M en ACN CMPT 1,2 M 5+4 30 600
en ACN
3 terminación 1 5 % de Pac2O en THF/2,6-lutidina 20 60
4 terminación 2 5 % de Pac2O en THF/2,6-lutidina 16 % de 20 60
NMI en THF
5 sulfurización dimetilalanina-Fmoc éster 10 4x2 900 3 x NitroFenilTioSulfonato 0,3 M 600 900
Figure imgf000281_0003
en ACN/BSTFA
Ejemplo 26. Síntesis del o ligonucleótido 130 (Todo-(Sp)-drCs6As6Gs6T1 (s6 =
Figure imgf000282_0001
Se sintetizó el oligonucleótido 130 como se ha descrito anteriormente. RT en RP-HPLC (Método 2 de HPLC): 16,45 min. UPLC/ESI-MS: Calcd para C57H83N18O25P3S3 : 1609,5; hallado: 1609,6.
Ejemplos 27 y 28: Se sintetizó el oligonucleótido que contenía enlaces internucleotídicos triéster de fosforotioato del S-metilo estereodefinidos en un sintetizador de a Dn /ARN ABI-394 según el ciclo resumido en la Tabla E-10 usando una columna de síntesis de 1 gmol y 0,8 gmoles de dC unido a oxalilo sobre HCP. El ciclo de síntesis se realizó con retirada del grupo 5'-0-DMTr terminal (DMT Apagado). El soporte sólido se lavó con ACN seco y se secó bajo un flujo de argón. El h Cp seco se puso en un vial de plástico y se trató con 1 ml de propilamina seca en piridina seca (en una relación 1:4) con 50 % de DMSO durante un periodo de 18 h a ta. Entonces se evaporaron los disolventes y el residuo se volvió a suspender con disolución acuosa de pH ~ 1,5 que contenía 10 % de DMSO y el soporte de HCP se separó por filtración. El producto en bruto se purificó por HPLC preparativa de fase inversa (gradiente del 5 al 65 % de ACN en tampón fosfato de sodio 20 mM, pH = 6,0). Se reunieron las fracciones que tenían pureza superior al 95 %, se concentraron y se desalaron por HPLC de fase inversa (gradiente del 0 al 80 % de ACN). El producto desalado final se liofilizó del agua.
Tabla E-10. Resumen de la síntesis de oligonucleótidos en un sintetizador de ADN/ARN ABI-394 usado para la síntesis de los Ejemplos 27 y 28.
etapa reacción reactivo tiempo de tiempo de administración (s) espera (s)
1 destritilación 3 % de TCA en DCM 3 60 10 N.A.
2 acoplamiento fosforamidito 0,15 M en ACN CMPT 1,2 M en 5+4 30 600
ACN
3 terminación 1 5 % de Pac2O en THF/2,6-lutidina 20 60
4 terminación 2 5 % de Pac2O en THF/2,6-lutidina 16 % de NMI 20 60
en THF
5 sulfurización NitroFenilTioSulfonato de S-metilo 0,3 M 10 4x2 300+3x150+
Figure imgf000282_0002
600
en ACN
Ejemplo 27. Síntesis del o ligonucleótido 131 (Todo-(fíp)-drGs7Cs7Cs7Ts7Cs7As7Gs7Ts7Cs7Ts7 gs7Cs7Ts7Ts7Cs7Gs7Cs7As7Cs7C1 (s7 =
O " v P P ^ C H 3
o ü
________ D
Se sintetizó el oligonucleótido 131 como se ha descrito anteriormente. RT en RP-HPLC: 27,65 min. UPLC/ESI-MS: Calcd para C210H284N67O102P19S19: 6576,71; hallado: 6575. 6.
Ejemplo________ 28.________ Síntesis________ de]________ oligonucleótido________132_________ (Todo-(Sp)-dfGs7Cs7Cs7Ts7Cs7As7Gs7Ts7Cs7Ts7Ggs7Cs7Ts7Ts7Cs7Gs7Cs7As7Cs7C1 (s7 =
'%
O " v P P ^ C H 3
o ü
: * ________ D
Se sintetizó el oligonucleótido 132 como se ha descrito anteriormente. RT en RP-HPLC: 32,65 min. UPLC/ESI-MS: Caled para C210H284N67O102P19S19: 6576,71; hallado: 6574,8.
Síntesis de oligonucleótidos quiralmente controlados que comprenden nucleobases modificadas
Como se ha descrito, en general, anteriormente y en el presente documento, en algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona oligonucleótidos quiralmente controlados que comprenden oligonucleótidos distintos de A, T, C y G. En algunas realizaciones, dichos oligonucleótidos quiralmente controlados comprenden 5-metilcitosina (5mC). Los ejemplos no limitantes se presentan en los Ejemplos 21 y más adelante.
Los Ejemplos 29-41 se sintetizaron usando la síntesis automatizada en el sintetizador de ADN/ARN ABI-394 según el ciclo sintético resumido en la Tabla E-11, usando una columna de síntesis de 1 pmol y 1,75 pmoles de dG unido a oxalilo sobre HCP. El ciclo de síntesis se realizó con retirada del grupo 5’-0-DMTr terminal (DMT Apagado). Después de finalizar la síntesis automatizada de oligonucleótidos, el soporte de HCP se lavó con ACN seco y se secó a vacío. El HCP seco se puso en un vial de plástico y se trató con 1 ml de propilamina seca en piridina seca (en una relación 1:4) durante un periodo de 18 h a ta. Entonces se evaporaron los disolventes y el residuo se volvió a suspender con disolución acuosa de pH ~ 1,5 que contenía 10 % de DMSO y el soporte de h Cp se separó por filtración. El producto en bruto se purificó por HPLC preparativa de fase inversa (según el procedimiento descrito más adelante). Se reunieron las fracciones que tenían pureza superior al 95 %, se concentraron y se desalaron por HPLC de fase inversa (gradiente del 0 al 30 % de ACN). El producto desalado final se liofilizó del agua.
Tabla E-11. Resumen de la síntesis de oligonucleótidos en un sintetizador de ADN/ARN ABI-394 usado para la síntesis de los Ejemplos 29-41.
etapa reacción reactivo tiempo de tiempo de administración (s) espera (s)
1 destritilación 3 % de TCA en DCM 3 60 10 N.A.
2 acoplamiento fosforamidito 0,15 M en ACN CMPT 1,2 M 5+4 30 600
en ACN
3 terminación 1 5 % de Pac2O en THF/2,6-lutidina 20 60
4 terminación 2 5 % de Pac2O en THF/2,6-lutidina 16 % 20 60
de NMI en THF
5 sulfurización ToluilTioSulfonato de S-morfolinoetilo 0,3 M 10 4x2 300+3x150+
Figure imgf000283_0001
600
en ACN/BSTFA
Método de purificación general para los Ejemplos 29-41:
Tampón A: Fosfato 20 mM pH=6,0 (ajustado con ácido fosfórico)
Tampón B: ACN
Columna: XBridge Prep C18, 5 pm, C18, 250 x 10 mm, pieza N.° 186003256
Temperatura establecida del calentador de tampón = 50 °C
Señal monitorizada a 254 y 280 nm
Gradiente usado:
Tiempo Caudal (ml/min) % de A % de B Curva Inicial 99 1
5 4 99 1 1
10 4 77 23 6
60 4 70 30 6
65 4 20 80 6
70 4 20 80 6
71 4 99 1 6
80 4 99 1 1
Ejemplo________29________ Síntesis________ dej________ oligonucleótido________ 135________ (Todo-(Rp)-df5mCs1As1Gs1Ts15mCs1Ts1Gs15mCs1Ts1Ts15mCs1G1)
Se sintetizó el oligonucleótido 135 como se ha descrito anteriormente. RT en RP-HPLC (Método 1 de HPLC): 17,50 min. UPLC/ESI-MS: Calcd para C186H278N51O73P11S11: 5090,0; hallado: 5091,9.
Ejemplo________30:________ Síntesis________ del________ oligonucleótido_________136________ (Todo-(Sp)-df5mCs1As1Gs1Ts15mCs1Ts1Gs15mCs1Ts1Ts15mCs1G1)
Se sintetizó el oligonucleótido 136 como se ha descrito anteriormente. RT en RP-HPLC (Método 1 de HPLC): 19,25 min. UPLC/ESI-MS: Calcd para C186H278N51O73P11S11: 5090,0; hallado: 5090,8.
Ejemplo 31. Síntesis del oligonucleótido 137 ((Sp, Rp, Rp , Rp , Rp , Rp , Rp , Rp , Rp , Rp , Sp)-df5mCs1As1Gs1Ts15mCs1Ts1Gs15mCs1Ts1Ts15mCs1G1 (1S-9R-1S))
Se sintetizó el oligonucleótido 137 como se ha descrito anteriormente. RT en RP-HPLC (Método 1 de HPLC): 17,85 min. UPLC/ESI-MS: Calcd para C186H278N51O73P11S11: 5090,0; hallado: 5091,9.
Ejemplo 32. Síntesis del o ligonucleótido 138 ((Sp, Sp, Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Sp, Sp)-d[5mCs1 As1Gs1 Ts15mCs1 Ts1Gs15mCs1 Ts1 Ts15mCs1 G1 (2S-7R-2S))
Se sintetizó el oligonucleótido 138 como se ha descrito anteriormente. RT en RP-HPLC (Método 1 de HPLC): 18,10 min. UPLC/ESI-MS: Calcd para C186H278N51O73P11S11: 5090,0; hallado: 5091,9.
Ejemplo 33. Síntesis del o ligonucleótido 139 ((Rp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Rp)-df5mCs1As1Gs1Ts15mCs1Ts1Gs15mCs1Ts1Ts15mCs1G1 (1R-9S-1R))
Se sintetizó el oligonucleótido 139 como se ha descrito anteriormente. RT en RP-HPLC (Método 1 de HPLC): 18,75 min. UPLC/ESI-MS: Calcd para C186H278N51O73P11S11: 5090,0; hallado: 5088,9.
Ejemplo 34. Síntesis del o ligonucleótido 140 ((Rp, Rp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Rp, Rp)-df5mCs1As1Gs1Ts15mCs1Ts1Gs15mCs1Ts1Ts15mCs1G1 (2R-7S-2R))
Se sintetizó el oligonucleótido 140 como se ha descrito anteriormente. RT en RP-HPLC (Método 1 de HPLC): 18,72 min. UPLC/ESI-MS: Calcd para C186H278N51O73P11S11: 5090,0; hallado: 5091,3.
Ejemplo 35. Síntesis del o ligonucleótido 141 ((Sp, Sp, Sp, Rp, Rp , Rp, Rp , Rp, Sp, Sp, Sp)-df5mCs1As1Gs1Ts15mCs1Ts1Gs15mCs1Ts1Ts15mCs1G1 (3S-5R-3S))
Se sintetizó el oligonucleótido 141 como se ha descrito anteriormente. RT en RP-HPLC (Método 1 de HPLC): 18,09 min. UPLC/ESI-MS: Calcd para C186H278N51O73P11S11: 5090,0; hallado: 5090,9.
Figure imgf000285_0001
Se sintetizó el oligonucleótido 142 como se ha descrito anteriormente. RT en RP-HPLC: 18,35 min. UPLC/ESI-MS (Método 1 de HPLC): Calcd para C186H278N51O73P11S11: 5090,0; hallado: 5088,9.
Figure imgf000285_0002
Se sintetizó el oligonucleótido 143 como se ha descrito anteriormente. RT en RP-HPLC (Método 1 de HPLC): 18,48 min. UPLC/ESI-MS: Calcd para C186H278N51O73P11S11: 5090,0; hallado: 5092,0.
Figure imgf000285_0003
Se sintetizó el oligonucleótido 144 como se ha descrito anteriormente. RT en RP-HPLC (Método 1 de HPLC): 18,02 min. UPLC/ESI-MS: Calcd para C186H278N51O73P11S11: 5090,0; hallado: 5091,4.
E j e m p l o ________________ 3 9 ________________ S í n t e s i s ________________ d e j ________________ o l i g o n u c l e ó t i d o ________________ 1 4 5 _______________ ( T o d o -( R p ) -d f 5 m C s 1 T s 1 5 m C s 1 A s 1 G s 1 T s 1 5 m C s 1 T s 1 G s 1 5 m C s 1 T s 1 T s 1 5 m C s 1 G s 1 5 m C 1 )
Se sintetizó el oligonucleótido 145 como se ha descrito anteriormente. RT en RP-HPLC (Método 1 de HPLC): 17.30 min. UPLC/ESI-MS: Calcd para C234H352N62O92P14S14: 6388,3; hallado: 6390,6.
E j e m p l o 4 0 . S í n t e s i s d e l o l i g o n u c l e ó t i d o 1 4 6 ( T o d o -( R p ) - d f G s 1 5 m C s 1 T s 1 G 1 )
Se sintetizó el oligonucleótido 146 como se ha descrito anteriormente. RT en RP-HPLC (Método 2 de HPLC): 15,89 min. UPLC/ESI-MS: Calcd para C58H85N18O23P3S3 : 1591,5; hallado: 1590,8.
E j e m p l o 4 1 . S í n t e s i s d e l o l i g o n u c l e ó t i d o 1 4 7 ( T o d o -( f í p ) - d f 5 m C s 1 A s 1 G s 1 T 1 )
Se sintetizó el oligonucleótido 147 como se ha descrito anteriormente. RT en RP-HPLC (Método 2 de HPLC): 16.30 min. UPLC/ESI-MS: Calcd para C58H85N18O22P3S3 : 1575,5; hallado: 1575,2.
E j e m p l o ______________ 4 2 ^ ________________ S í n t e s i s ________________ d e l ________________ o l i g o n u c l e ó t i d o ________________ 1 4 8 ________________ ( T o d o -( R p ) -d f 5 m C s 2 A s 2 G s 2 T s 2 5 m C s 2 T s 2 G s 2 5 m C s 2 T s 2 T s 2 5 m C s 2 G 1 )
Se sintetizó el oligonucleótido 148 como se ha descrito anteriormente, usando el reactivo de sulfurización en el Ejemplo 22. RT en RP-HPLC (Método 3 de HPLC): 16,51 min. UPLC/ESI-MS: Calcd para C153H223N40O73P11S11: 4484,1; hallado: 4483,0.
E j e m p l o ______________ 4 3 ________________ S í n t e s i s ________________ d e l ________________ o l i g o n u c l e ó t i d o ________________ 1 4 9 ________________ ( T o d o -( R p ) -d f 5 m C s 4 A s 4 G s 4 T s 4 5 m C s 4 T s 4 G s 4 5 m C s 4 T s 4 T s 4 5 m C s 4 G 1 )
Se sintetizó el oligonucleótido 149 como se ha descrito anteriormente, usando el reactivo de sulfurización en el Ejemplo 24. RT en RP-HPLC (Método 4 de HPLC): 17,87 min. UPLC/ESI-MS: Calcd para C252H388N51O95P11S11: 6345,6; hallado: 6346,5.
Síntesis de oligonucleótidos quiméricos quiralmente controlados que comprenden diferentes enlaces in tern ucleo tídicos
Como se ha descrito, en general, anteriormente y en el presente documento, en algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona un oligonucleótido quiralmente controlado que comprende diferentes enlaces internucleotídicos. Los ejemplos no limitantes que siguen ilustran dichos oligonucleótidos quiralmente controlados, y los métodos de síntesis de los mismos.
Los Ejemplos 44-45 ilustran la síntesis de un oligonucleótido quimérico quiralmente controlado que comprende diferentes enlaces internucleotídicos. Los oligonucleótidos que contienen enlaces internucleotídicos mixtos diastereoméricamente puros triéster de fosforotioato / diéster de fosforotioato del morfolinoetilo se sintetizaron en un sintetizador de ADN/ARN ABI-394 según el ciclo resumido en la Tabla E-12 usando una columna de síntesis de 1 gmol y 1,5 emoles de dT unido a oxalilo sobre HCP. Como cada ciclo iterativo permite que reaccione un reactivo de sulfurización diferente, se usaron dos tiosulfonatos diferentes. La síntesis se realizó con retirada del grupo 5'-0-DMTr terminal (DMT Apagado). El soporte sólido se lavó con ACN seco y se secó bajo un flujo de argón. Entonces se trató el soporte sólido seco con 5 ml de disolución anhidra 1 M de 1,5-diazabiciclo(4.3.0)non-5-eno (DBN) en ACN secocloruro de trimetilsililo - 16:1 (v/v) durante 10 min a ta. La disolución de DBN se empujó lentamente a través de la columna por medio de una jeringa luer de plástico unida a la salida de la columna. Entonces se lavó el soporte con ACN seco y se secó a vacío. El HCP seco se puso en un vial de plástico y se trató con 1 ml de propilamina seca en piridina seca (en una relación 1:4) durante un periodo de 18 h a ta. Entonces se evaporaron los disolventes y el residuo se volvió a suspender con disolución acuosa de pH ~ 1,5 que contenía 10 % de DMSO y el soporte de HCP se separó por filtración. El producto en bruto se purificó por HPLC preparativa de fase inversa (gradiente del 5 al 65 % de ACN en tampón fosfato de sodio 20 mM, pH = 6,0). Se reunieron las fracciones que tenían pureza superior al 95 %, se concentraron y se desalaron por HPLC de fase inversa (gradiente del 0 al 80 % de ACN). El producto desalado final se liofilizó del agua.
Tabla E-12. Resumen de la síntesis de oligonucleótidos en un sintetizador de ADN/ARN ABI-394 usado para la síntesis de los Ejemplos 44-45.
etapa reacción reactivo tiempo de tiempo de administración (s) espera (s)
1 destritilación 3 % de TCA en DCM 3 60 10 N.A.
2 acoplamiento fosforamidito 0,15 M en ACN CMPT 1,2 M en ACN 5 4 30 600
3 terminación 1 5 % de Pac2O en THF/2,6-lutidina 20 60
4 terminación 2 5 % de Pac2O en THF/2,6-lutidina 16 % de NMI en 20 60
THF
5 sulfurización 1 Toluiltiosulfonato de S-morfolinoetilo 0,3 M 10 4x2 300+3x150+
600
r N —
O - / s-|<>Me
en ACN/BSTFA
6 sulfurización 2 Metiltiosulfonato de S-cianoetilo 0,3 M 10 4x2 300+3x150+
Figure imgf000286_0001
600
en ACN/BSTFA
Ejemplo 44. Síntesis del o ligonucleótido 150 (Todo-(fíp)-dfTsCs1AsT1)
Se sintetizó el oligonucleótido 150 como se ha descrito anteriormente. RT en RP-HPLC (Método 2 de HPLC): 12,72 min. UPLC/ESI-MS: Calcd para C45H62N13O21P3S3 : 1310,2; hallado: 1309,2
Ejemplo 45. Síntesis del o ligonucleótido 151 (Todo-(Sp)-dfCs1AsGs1T1)
Se sintetizó el oligonucleótido 151 como se ha descrito anteriormente. RT en RP-HPLC (Método 2 de HPLC): 14,71 min. UPLC/ESI-MS: Calcd para C51H72N17O21P3S3 : 1448,4; hallado: 1446,9.
El Ejemplo 46 describe la síntesis de un oligonucleótido quimérico quiralmente controlado que comprende tanto enlace internucleotídico de diéster de fosfato como enlaces internucleotídicos modificados. Los oligonucleótidos a modo de ejemplo que contienen enlaces internucleotídicos mixtos triéster/fosfodiéster de fosforotioato del morfolinoetilo se sintetizaron en un sintetizador de ADN/ARN ABI-394 según el ciclo resumido en la Tabla E-13 usando una columna de síntesis de 1 pmol y 1,5 pmoles de dT unido a oxalilo sobre HCP. Como cada ciclo iterativo permite hacer reaccionar diferentes reactivos de sulfurización u oxidación, se usó un reactivo de tiosulfonato para la sulfurización en un ciclo y se usó la oxidación promovida por yodo en otro ciclo. La síntesis se realizó con retirada del grupo 5'-0-DMTr terminal (DMT Apagado). El soporte sólido se lavó con ACN seco y se secó bajo un flujo de argón. El h Cp seco se puso en un vial de plástico y se trató con 1 ml de propilamina seca en piridina seca (en una relación 1:4) durante un periodo de 18 h a ta. Entonces se evaporaron los disolventes y el residuo se volvió a suspender con disolución acuosa de pH ~ 1,5 que contenía 10 % de DMSO y el soporte de h Cp se separó por filtración. El producto en bruto se purificó por HPLC preparativa de fase inversa (gradiente del 5 al 65 % de ACN en tampón fosfato de sodio 20 mM, pH = 6,0). Se reunieron las fracciones que tenían pureza superior al 95 %, se concentraron y se desalaron por HPLC de fase inversa (gradiente del 0 al 80 % de ACN). El producto desalado final se liofilizó del agua.
Tabla E-13. Resumen de la síntesis de oligonucleótidos en un sintetizador de ADN/ARN ABI-394 usado para la síntesis del Ejemplo 46.
etapa reacción reactivo tiempo de tiempo de administración (s) espera (s)
1 destritilación 3 % de TCA en DCM 3 60 10 N.A.
2 acoplamiento fosforamidito 0,15 M en ACN CMPT 1,2 M en ACN 5 4 30 600
3 terminación 1 5 % de Pac2O en THF/2,6-lutidina 20 60
4 terminación 2 5 % de Pac2O en THF/2,6-lutidina 16 % de NMI en 20 60
THF
5 sulfurización Toluiltiosulfonato de S-morfolinoetilo 0,3 M 10 4x2 300 3x150
600
Figure imgf000287_0001
en ACN/BSTFA
6 oxidación I20,02 M, piridina/agua 10 300
Ejemplo 46. Síntesis del o ligonucleótido 152 (Todo-(Sp)-d[Cs1AGs1T1)
Se sintetizó el oligonucleótido 152 como se ha descrito anteriormente. RT en RP-HPLC (Método 2 de HPLC): 13,42 min. UPLC/ESI-MS: Calcd para C51H72N17O22P3S2 : 1432,3; hallado: 1431,7.
El Ejemplo 47 describe la síntesis de un oligonucleótido quimérico quiralmente controlado que comprende un enlace internucleotídico fosfodiéster y enlaces internucleotídicos tanto fosfotriéster como fosfodiéster modificados quiralmente puros. Los oligonucleótidos quiralmente controlados que contienen enlaces mixtos triéster de fosforotioato/fosfodiéster/diéster de fosforotioato del morfolinoetilo se sintetizaron en un sintetizador de ADN/ARN ABI-394 según el ciclo resumido en la Tabla E-14 usando una columna de síntesis de 1 pmol y 1,5 pmoles de dT unido a oxalilo sobre HCP. Como cada ciclo iterativo permite hacer reaccionar diferentes reactivos de sulfurización u oxidación, se usaron dos reactivos de tiosulfonato diferentes para los dos ciclos de sulfurización diferentes y se usó oxidación promovida por yodo para otro ciclo. La síntesis se realizó con retirada del grupo 5-O-DMTr terminal (DMT Apagado). El soporte sólido se lavó con ACN seco y se secó bajo un flujo de argón. Entonces se trató el soporte sólido seco con 5 ml de disolución anhidra 1 M de 1,5-diazabiciclo(4.3.0)non-5-eno (DBN) en ACN seco-cloruro de trimetilsililo - 16:1 (v/v) durante 10 min a ta. La disolución de DBN se empujó lentamente a través de la columna por medio de una jeringa luer de plástico unida a la salida de la columna. Entonces se lavó el soporte con ACN seco y se secó a vacío. El HCP seco se puso en un vial de plástico y se trató con 1 ml de propilamina seca en piridina seca (en una relación 1:4) durante un periodo de 18 h a ta. Entonces se evaporaron los disolventes y el residuo se volvió a suspender con disolución acuosa de pH ~ 1,5 que contenía 10 % de DMSO y el soporte de HCP se separó por filtración. El producto en bruto se purificó por HPLC preparativa de fase inversa (gradiente del 5 al 65 % de a Cn en tampón fosfato de sodio 20 mM, pH = 6,0). Se reunieron las fracciones que tenían pureza superior al 95 %, se concentraron y se desalaron por HPLC de fase inversa (gradiente del 0 al 80 % de ACN). El producto desalado final se liofilizó del agua.
Tabla E-14. Resumen de la síntesis de oligonucleótidos en un sintetizador de ADN/ARN ABI-394 usado para la síntesis del Ejemplo 47.
etapa reacción reactivo tiempo de tiempo de administración (s) espera (s)
1 destritilación 3 % de TCA en DCM 3 60 10 N.A.
etapa reacción reactivo tiempo de tiempo de administración (s) espera (s)
2 acoplamiento fosforamidito 0,15 M en ACN CMPT 1,2 M en 5 4 30 600
ACN
3 terminación 1 5 % de Pac2O en THF/2,6-lutidina 20 60
4 terminación 2 5 % de Pac2O en THF/2,6-lutidina 16 % de NMI 20 60
en THF
5 sulfurización 1 MetilTioSulfonato de S-cianoetilo 0,3 M 10 4x2 300+3x150+
600
0
11
/« v .S -S -M e
N C ^ 1
O
en ACN/BSTFA
6 sulfurización 2 ToluilTioSulfonato de S-morfolinoetilo 0,3 M 10 4x2 300+3x150+
600
Figure imgf000288_0001
7 oxidación I20,02 M, piridina/agua 10 300
Ejemplo 47. Síntesis del o ligonucleótido 153 (Todo-(Sp)-d[CAs1GsT]).
Se sintetizó el oligonucleótido 153 como se ha descrito anteriormente. RT en RP-HPLC (Método 2 de HPLC): 11,48 min. UPLC/ESI-MS: Calcd para C45H61N16O21P3S2 : 1318,1; hallado: 1318,1.
Como será apreciado por un experto en la técnica, siguiendo los Ejemplos 46 y 47, y otros ejemplos y métodos descritos en el presente documento, se pueden preparar oligonucleótidos quiralmente controlados quiméricos más largos.
Los oligonucleótidos quiralmente puros tienen propiedades diferentes de la mezcla de diastereómeros de la síntesis no estereoespecífica
Como se ha descrito anteriormente y en el presente documento, en algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona oligonucleótidos quiralmente puros que tienen propiedades químicas y biológicas diferentes de la mezcla de diastereómeros con la misma secuencia de bases, pero sintetizados mediante síntesis de oligonucleótidos no estereoespecífica.
Ejemplo 48. Perfil de HPLC de oligonucleótidos quiralmente puros y mezcla de diastereómeros de la síntesis no estereoespecífica
Se analizaron oligonucleótidos de diéster de fosforotioato quiralmente puros A (Rp completo, oligonucleótido 101) y B (Sp completo, oligonucleótido 102) y no estereoespecíficos C (enlaces internucleotídicos de diéster de fosforotioato estereoaleatorios), que se prepararon por síntesis de oligonucleótidos no estereoespecíficos convencional, por las mismas condiciones de RP-HPLC y los trazados de HPLC correspondientes se representan en la Figura 2.
Como se demostró claramente en la Figura 2, la estereoquímica de los oligonucleótidos 20-meros de diéster de fosforotioato afecta su comportamiento como se ha determinado por RP-HPLC y IEX-HPLC. Sin la intención de quedar limitado por teoría, se observa una correlación entre los tiempos de retención (RT) obtenidos por RP-HPLC y IEX-HPLC, ya que las tendencias de RT se conservan. El estereoisómero de Rp completo (A) tiene una retención más corta que el estereoisómero de Sp completo (B), mientras que el oligonucleótido de diéster de fosforotioato estereoaleatorio (C), que es una mezcla de los 219 estereoisómeros, tiene un pico de HPLC ancho, que eluye entre los diastereoisómeros extremos de Rp completo y Sp completo.
Como será apreciado por los expertos en la técnica, los datos presentados en la presente confirman que los análisis representados que comparan diferentes composiciones de oligonucleótidos quiralmente controlados o sin controlar (por ejemplo, estereoaleatorios) de la misma secuencia muestran que la composición de oligonucleótidos quiralmente sin controlar ejemplificada (es decir, como se prepara por síntesis de oligonucleótidos no quiralmente controlados), incluye solo un nivel extremadamente bajo de ciertos tipos de oligonucleótidos, tales como el tipo Rp o Sp completo.
Ejemplo 49. Experimento de desnaturalización térm ica (Tm).
Se mezcló cada cadena de ADN con ARN complementario en concentración equimolar de 0,5 pM en IxPBS. Se preparó una disolución total de 2,5 ml para cada dúplex y la mezcla se calentó a 90 °C durante 2 min y se dejó enfriar durante el transcurso de varias horas. Las mezclas se almacenaron entonces a 4 °C durante 2 horas. Se registró la absorbancia a 254 nm en un intervalo de 0,5 min empezando el gradiente de temperatura desde 15 °C hasta 90 °C con aumento de 0,5 °C/minuto, usando un espectrofotómetro de UV de Perkin Elmer equipado con una unidad de Peltier. La absorbancia a 254 nm se representó frente a la temperatura y los valores de Tm se calcularon a partir de la primera derivada respectiva de cada curva.
La Figura 3 ilustra la diferencia en Tm entre dos oligonucleótidos de fosforotioato de diastereoisómero estereopuro (20-mero de Rp completo A y 20-mero de Sp completo B) y el oligonucleótido de fosforotioato estereoaleatorio (C). ADN de fosforotioato de Rp completo demuestran mayor afinidad hacia ARN complementario cuando se compara con tanto el diastereoisómero de Sp completo opuesto como el 20-mero estereoaleatorio.
La Tabla E-15 que sigue resume las diferencias entre oligonucleótidos quiralmente controlados y oligonucleótido estereoaleatorio.
Tabla E-15. Diferencias entre oligonucleótidos quiralmente controlados y estereoaleatorios.
Figure imgf000289_0001
Figure imgf000290_0001
Ejemplo 50. Actividad biológica de oligonucleótidos quiralmente puros
Después de comprobar la DO de todas las moléculas candidatas a oligonucleótidos, se diluyeron hasta una concentración inicial de 20 pM. Se estableció un experimento de transfección directa de dosis múltiple en placas de 96 pocillos usando células Hep3B (ATCC®, Cat.HB-8064™) usando el reactivo de transfección Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Cat. 11668-019).
Protocolo de transfección:
Se sembraron 2x104 células Hep3B por pocillo y se incubaron durante 24 horas a 37 °C en una estufa de incubación con CO2 en 100 pl de medio MEM sin antibiótico (Life Technologies, Cat. 11095098) que contenía 10 % de FBS y 1 % de Glutamax I (Life Technologies, Cat. 35050061). Se establecieron doce diluciones en agua sin nucleasa (Tabla E-16).
Tabla E-16. Concentraciones de la placa de reserva de transfección de oligonucleótido s.
Figure imgf000290_0002
Para cada pocillo, se mezclaron 0,5 pl de Lipofectamine 2000 con 9,5 pl de medio de suero reducido en Opti MEM I (Life Technologies, Cat. 31985062) y se incubaron durante 5 minutos. Tras la incubación, se mezclaron 10 pl de cada uno de los candidatos en las concentraciones informadas con Lipofectamine 2000 diluida por pipeteado suave. La mezcla se incubó entonces durante 20 minutos a temperatura ambiente para permitir la formación de complejos. Durante este tiempo, el medio de crecimiento celular se sustituyó con 80 pl de MEM sin antibiótico recién preparado como se describe previamente. Se mezclaron suavemente 20 pl de complejo de lípido-oligonucleótido en cada pocillo llevando el volumen total a 100 pl. Las células se incubaron entonces durante 24 horas a 37 °C en una estufa de incubación con CO2.
Extracción de ARN:
Después de 24 horas de incubación, se retiró el medio de crecimiento celular y se extrajo el ARN usando un kit Dynabeads mRNA Direct (Life Technologies, Cat. 61012) siguiendo las instrucciones proporcionadas en el manual del kit sin modificaciones. Este sistema de perlas magnético Oligo (dT)25 permite la extracción de ARN de poli (A) rentable, robusta y de alto rendimiento evitando el tratamiento con DNAsa. El ARN se eluyó en agua sin nucleasa y se almacenó a -80 °C.
Síntesis de ADNc:
Se usaron 10 pl de ARN en una reacción de síntesis de ADNc de 20 pl usando un kit High Capacity cDNA Reverse Transcription (Life Technologies, Cat. 4374967) usando el protocolo del kit con inhibidor de RNAsa. La transcripción inversa se realizó en un formato de 96 pocillos en un ciclador térmico C1000 Touch (Biorad, Cat. 185-1196EDU).
Análisis de la expresión génica:
La expresión génica se midió por PCR cuantitativa usando un LightCycler® 480 SYBR Green I Master (Roche, Cat.
04707516001) en el instrumento de PCR en tiempo real LightCycler 480. Se diseñaron y se pidieron de IDT los cebadores para las secuencias de Homo Sapiens de la apolipoproteína B (Apo B) diana (NM_000384) y el control endógeno gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) (n M_002046) (Tabla E-17).
Tabla E-17. Secuencias de cebadores purificados por HPLC usados para la cuantificación de la expresión géni ca.
Figure imgf000291_0001
La medición de la diana y el control endógeno se realizó en pocilios separados usando material del mismo molde de ADNc. Se establecieron las condiciones de PCR del ensayo SYBR green como se describe en el protocolo SYBR Green I Master (Tabla E-18).
Tabla E-18: Condiciones de PCR en tiempo real para el ensayo SYBR Green.
Figure imgf000291_0002
Los análisis de las curvas de fusión muestran picos de amplicón individuales para cada par de cebadores (Figura 4).
Los datos son un resultado de 3 duplicados biológicos. Todas las muestras se compararon con control sin transfectar intacto. Se observaron los siguientes resultados cuando se evaluó la expresión génica por PCR en tiempo real usando SYBR Green (Tabla E-19, Figura 5).
Tabla E-19. Datos completos de CI50 evaluados por SYBR Green.
Figure imgf000292_0001
En algunas realizaciones, los oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionados muestran una CI50 inferior a 8 nM. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionados muestran una CI50 inferior a 7 nM. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionados muestran una CI50 inferior a 6 nM. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionados muestran una CI50 inferior a 5 nM. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionados muestran una CI50 inferior a 4 nM. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionados muestran una CI50 inferior a 3 nM. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionados muestran una CI50 inferior a 2 nM. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionados muestran una CI50 dentro de un intervalo de 0,5-8 nM. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionados muestran una CI50 dentro de un intervalo de 1-4 nM. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionados muestran una CI50 dentro de un intervalo de 1,5-3 nM. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionados muestran una CI50 dentro de un intervalo de 1,5-2 nM. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionados muestran una CI50 dentro de un intervalo de 0,5-2 nM. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionados muestran una CI50 dentro de un intervalo de 1-2,5 nM. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionados muestran una CI50 dentro de un intervalo de 1,5-3 nM. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionados muestran una CI50 dentro de un intervalo de 2,5-5 nM. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionados muestran una CI50 dentro de un intervalo de 3-6 nM. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionados muestran una CI50 dentro de un intervalo de 5-8 nM. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionados muestran una CI50 dentro de un intervalo entre un límite superior y un límite inferior. En algunos dichas realizaciones, el límite superior es 8, 5, 4 o 3 nM. En algunos dichas realizaciones, el límite inferior es 1, 1,5, 2 o 2,5 nM. Como se puede apreciar con referencia a los ejemplos, la presente divulgación ejemplifica específicamente diversos oligonucleótidos quiralmente controlados o composiciones de oligonucleótidos quiralmente controlados que muestran dichos valores representativos de CI50.
La Tabla E-19 ilustra que cuando se prueban en forma quiralmente controlada, ciertos oligonucleótidos quiralmente controlados/composiciones de oligonucleótidos son más potentes que la mezcla de oligonucleótidos estereoaleatorios correspondiente (oligonucleótidos 105, 109, 115 y 116 en comparación con el oligonucleótido 118); también son más activos que Mipomersen, que es una mezcla de oligonucleótidos estereoaleatorios (oligonucleótidos 104, 105, 106, 107, 109, 115 y 116 en comparación con 120).
Preparados quiralmente controlados adicionales
Ejemplo 51. Preparación de preparados quiralmente controlados de oligonucleótidos
Figure imgf000293_0001
El presente ejemplo describe la preparación de una variedad de composiciones quiralmente controladas particulares de ciertos oligonucleótidos como se describe en el presente documento. En particular, el presente ejemplo describe la preparación de oligonucleótidos con la utilización de lcaa-CPG-500 cargado.
Se disolvió W4 -Bz-5'-0-DMTr-2'-0-MOE-5mC (1) (4,0 g, 5,5 mmoles) en DCM anhidro (20 ml) y se mezcló con 2 equiv de anhídrido succínico (1,1 g, 11,1 mmoles) y 3 equiv de 4-N,N-dimetilaminopiridina (2,0 g, 16,6 mmoles). La reacción se agitó bajo argón a temperatura ambiente. Después del consumo completo del material de partida como se ha determinado por TLC (1 hora), los disolventes se evaporaron a sequedad, el residuo en bruto se disolvió en DCM que contenía 1 % de trietilamina, luego se purificó por cromatografía ultrarrápida en gel de sílice usando un gradiente de 0 - 2 % de MeOH en DCM que contenía 2 % de trietilamina. El rendimiento del compuesto (2) puro después de la evaporación fue de 4,5 g, 88 %. Se recogieron el 3'-0-succinato (2) resultante (0,92 g, 1,0 mmol), N,N-diisopropiletilamina (0,82 ml, 5,0 mmoles) y CPG-500 (10 g) en DMF (50 ml), luego se añadió HBTU (0,42 g, 1,1 mmoles). La mezcla se agitó durante 2 h, luego se filtró. El soporte se lavó con DMF, MeOH y finalmente DCM, luego se secó a vacío. El análisis del catión tritilo (monitorización a 504 nm) mostró que la carga del nucleósido sobre el soporte (3) era 63 pmol/g.
Las composiciones quiralmente controladas de oligonucleótidos que contenían enlaces internucleotídicos desoxi y triéster de fosforotioato 2'-0-MOE quiméricos estereodefinidos se sintetizaron en el sintetizador de ADN/ARN MerMade-12 (BioAutomation) según el ciclo resumido en la Tabla E-20 usando una columna de síntesis MM-6-200 (BioAutomation) cargada con 2,0 g (126 pmoles) de N4-Bz-5'-0-DMTr-2'-0-MOE-5mC unido a succinilo sin terminar (63 pmol/g, lcaa CPG-500 de Glen Research. El ciclo de síntesis de oligonucleótidos se realizó con una etapa de terminación preliminar (terminación 2) y sin retirada del grupo de oligonucleótido 5'-0-DMTr terminal final (DMT Encendido). Las etapas de sulfurización estereoespecíficas se realizaron usando el reactivo S-(2-cianoetil)metiltiosulfonato 0,3 M siguiendo el acoplamiento de la fosforamida quiral correspondiente y el proceso de terminación de dos etapas (Tabla E-20).
Una vez terminó el ciclo de síntesis automatizada de oligonucleótidos con el grupo 5'-0-DMTr final mantenido Encendido, la columna de síntesis se sacó del sintetizador de ADN/ARN y se secó a vacío. El soporte secado se transfirió a un sintetizador de péptidos manual de vidrio vacío y se pasaron continuamente 40 ml de disolución de 1,5-diazabiciclo[4.3.0]non-5-eno (d Bn ) 0,5 M, N,0-bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida (BSTFA) 0,25 M en ACN a través del soporte durante 5 min sin detener el flujo en el sintetizador de péptidos manual. El soporte se lavó con 50 % de Py/ACN y se secó con flujo de argón durante 1 s. Entonces, el soporte se transfirió a un vial de plástico de tapa roscada vacío y se trató con 5 % de EtOH/NH3 conc. (20 ml) a 60 °C durante 6 h, y se dejó a temperatura ambiente durante 12 h. El soporte se retiró por filtración y se lavó con NH3 conc. El filtrado se secó a vacío, luego se disolvió lo resultante en TEAA 50 mM (120 ml). Se realizó filtración adicional cuando hubo una suspensión en la disolución. La disolución se cargó en un cartucho Sep-Pak (Waters, cartuchos Sep-Pak Vac 35cc (10 g) C18). El cartucho se lavó con 20 % de ACN/TEAA 50 mM (70 ml) para retirar todas las secuencias truncadas terminadas y 50 % de ACN/agua que contenía 0,5 % de NH3 conc. (50 ml) para eluir el oligonucleótido de longitud completa DMT Encendido. La disolución que contenía el oligonucleótido DMT Encendido se secó a vacío, luego se diluyó con TEAA 50 mM (120 ml) y se cargó en otro cartucho Sep-Pak (Waters, cartuchos Sep-Pak Vac 35cc (10 g) C18). El cartucho se lavó con agua milli-Q (50 ml), 2 % de TFA/agua (50 ml), luego agua (50 ml). El oligonucleótido DMT Apagado se eluyó con 50 % de ACN/agua que contenía 0,5 % de NH3 conc. (50 ml).
Tabla E-20. Resumen de la síntesis de oligonucleótidos en un sintetizador de ADN/ARN MerMade 12 usado para la síntesis quiralmente controlada.
etapa reacción reactivo volumen de tiempo de espera (s)
administración (ml)
1 destritilación 3 % de TCA en DCM
Figure imgf000294_0001
2 acoplamiento fosforamidito quiral 0,15 M en ACN CMPT 2 X 3,4 2 x 450 (MOE)
1,2 M en ACN
2 x 300 (ADN)
3 terminación 1 5 % de Pac2O en THF/2,6-lutidina 8 60
4 terminación 2 5 % de Pac2O en THF/2,6-lutidina 16 % de 6,8 60
NMI en THF
5 sulfurización Metanotiosulfonato de S-(2-cianoetilo) 0,3 M 9 600
Figure imgf000294_0002
en ACN/BSTFA
Síntesis del oligonucleótido ONT-75 (Todo (Rp))-Gs5mCs5mCsTs5mCsAs GsTs5mCsTsGs5mCsTsTs5mCsGs5mCsAs5mCs5mC
Síntesis del oligonucleótido ONT-80 (Todo (Sp))-Gs5mCs5mCsTs5mCsAs GsTs5mCsTsGs5mCsTsTs5mCsGs5mCsAs5mCs5mC
Síntesis del oligonucleótido ONT-77 (Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Sp,
Figure imgf000294_0003
p, Sp, Sp, Sp, Sp, Rp)-Gs5mCs5mCsTs5mCsAs
GsTs5mCsTsGs5mCsTsTs5mCsGs5mCsAs 5mCs5mC (5R-10S-4R)
Síntesis del oligonucleótido ONT-81 (Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Sp, Sp, Sp, Sp)-Gs5mCs5mCsTs5mCsAs
GsTs5mCsTsGs5mCsTsTs5mCsGs5mCsAs 5mCs5mC (5S-10R-4S)
Síntesis del oligonucleótido ONT-87 (Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Sp, Sp, Rp, Sp, Sp, Rp, Sp, Sp, Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Rp)-Gs5mCs5mCsTs5mCsAs
GsTs5mCsTsGs5mCsTsTs5mCsGs5mCsAs 5mCs5mC (5R-(SSR)3 -5R)
Síntesis del oligonucleótido ONT-88 (Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Rp, Rp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp)-Gs5mCs5mCsTs5mCsAs
GsTs5mCsTsGs5mCsTsTs5mCsGs5mCsAs 5mCs5mC (5S-(RRS)3 -5S)
Síntesis del oligonucleótido ONT-89 (Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp)-Gs5mCs5mCsTs5mCsAs
GsTs5mCsTsGs5mCsTsTs5mCsGs5mCsAs5mCs5mC ((SR)gS)
Síntesis del oligonucleótido ONT-82 (Todo (Rp))-GsTs5mCs5mCs5mCsTsGsAsAsGsAsTsGsTs5mCsAsAsTsGs5mC
Síntesis del oligonucleótido ONT-84 (Todo (Sp))-GsTs5mCs5mCs5mCsTsGsAsAsGsAsTsGsTs5mCsAsAsTsGs5mC
Síntesis del oligonucleótido ONT-85 (Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Rp)-GsTs5mCs5mCs5mCsTsGsAsAsGsAsTsGsTs5mCsAsAsTsGs5mC (5R-10S-4R)
Síntesis del oligonucleótido ONT-86 (Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Sp, Sp, Sp, Sp)-GsTs5mCs5mCs5mCsTsGsAsAsGsAsTsGsTs5mCsAsAsTsGs5mC (5S-10R-4S)
Ejemplo 52: Método de RP-HPLC general para el análisis de oligonucleótidos DMT Encendido en bruto y DMT Apagado purificado
El presente ejemplo describe el análisis de RP-HPLC de composiciones de oligonucleótidos en bruto y purificadas preparadas por síntesis quiralmente controlada como se describe en el presente documento.
Tampón A: TEAA 50 mM, pH 7,0
Tampón B: ACN
Columna: XBridge Ci8, 3,5 gm, Ci8, 4,6 x 50 mm, pieza N.° 186003034
Temperatura de la columna = 50 °C
Señal monitorizada a 254 y 280 nm
Gradiente usado:
Tiempo (min) Caudal (ml/min) % de A % de B Curva
Inicial 99 1
2 1 99 1 6
52 1 50 50 6
55 1 5 95 6
55,5 1 5 95 6
56 1 99 1 6
60 1 99 1 1
Figure imgf000295_0001
Figure imgf000296_0001
Ejemplo 53: Método general de IEX-HPLC para el análisis de oligonucleótidos DMT Encendido en bruto y DMT Apagado purificados
El presente ejemplo describe el análisis de IEX-HPLC de composiciones de oligonucleótidos en bruto y purificados preparadas por síntesis quiralmente controlada como se describe en el presente documento.
Tampón A: TrisHCl 10 mM, 50 % de ACN, pH 8,0
Tampón B: TrisHCl 10 mM, NaClO4800 mM, 50 % de ACN, pH 8,0
Columna: DIONEX, DNAPac, PA-100, analítica, 4,0 x 250 mm, pieza N.° 063000
Temperatura de la columna = 60 °C
Señal monitorizada a 254 y 280 nm
Gradiente usado:
Tiempo (min) Caudal (ml/min) % de A % de B Curva
Inicial 85 15
3 1 85 15 1
23 1 60 40 6
25 1 5 95 6
25,5 1 85 15 6
30 1 85 15 1
Ejemplo 54: Método general de UPLC-LCMS para el análisis de oligonucleótidos DMT Encendido purificados El presente ejemplo describe el análisis de UPLC-LCMS de composiciones de oligonucleótidos purificadas preparadas por síntesis quiralmente controlada como se describe en el presente documento.
Tampón A: TEA 15 mM, HFIP 400 mM, agua
Tampón B: 50:50 de tampón A/metanol
Columna: UPLC@OST Cis 1,7 pm, 2,1 x 500mm
Temperatura de la columna = 50 °C
Gradiente usado:
Tiempo (min) Caudal (ml/min) % de A % de B Curva
Inicial 0,2 80 20
2 0,2 80 20 1
22 0,2 30 70 6
25 0,2 5 95 6
25,5 0,2 80 20 6
30 0,2 80 20 1
Ejemplo 55: Método general de IEX-HPLC para la purificación de oligonucleótido DMT Apagado en bruto El presente ejemplo describe la purificación por IEX-HPLC de composiciones de oligonucleótidos en bruto preparadas por síntesis quiralmente controlada como se describe en el presente documento.
Tampón A: NaOH 20 mM, pH 11,0
Tampón B: NaOH 20 mM, NaCl 2,5 M, pH 11,0
Columna: Columna vacía Waters AP-2 (Waters), rellena internamente de forma personalizada con el soporte Source 15Q (GE Healthcare). Las columnas de purificación individuales se rellenaron y se usaron para los diferentes oligonucleótidos estereopuros.
Instrumento: AKTA Purifier, equipado con la bomba P-900, el detector UPC-900 y SuperLoop de inyección de 50 ml (GE Healthcare)
Temperatura del calentador de tampón establecida a = 70 °C
Señal monitorizada a 254 nm
Fracciones volumen: 5 ml
Gradiente usado:
Tiempo (min) Inicial Caudal (ml/min) % de A 100 % de B Curva
25 10 100 0 1
40 10 85 15 6
60 10 85 15 1
Tiempo (min) Inicial Caudal (ml/min) % de A 100 % de B Curva
80 10 70 30 6
100 10 70 30 1
140 10 60 40 6
180 10 60 40 1
200 10 45 55 6
210 10 45 55 1
211 10 100 0 6
235 10 100 0 1
Las fracciones recogidas se analizaron individualmente por IEX-HPLC analítica usando las condiciones analíticas y el gradiente descritos anteriormente. Las fracciones puras se reunieron para proporcionar material purificados del 95 % de pureza y superior como se ha determinado por los perfiles de absorbancia de UV a 254 nm.
Tabla E-21. Compilación de las propiedades fisicoquím icas para los oligonucleótidos de fosforotioato estereopuros sintetizados como se describe en el Ejemplo XX.
Figure imgf000298_0001
Figure imgf000299_0001
S e cu e n c ia A : se cu e n c ia de A po B hu m a n a 5'-G s 5 m C s 5 m C s T s 5 m C s A s G s T s 5 m C s T s G s 5 m C s T s T s 5 m C s G s 5 m C s A s 5 m C s 5 m C -3 '.
S e cu e n c ia B: se cu e n c ia de A p o B de ra tón 5 '-G sT s5 m C s 5 m C s 5 m C s T s G s A s A s G s A s T s G s T s 5 m C s A s A s T s G s 5 m C -3'.
Los nu c le ó tid o s su b ra ya d o s d e s ig n a n 2 '-0 -M O E . s = e n la ce fo s fo ro tio a to . 5m C = 5 -m e til-2 '-d e so x ic it id in a . 5 m C = 5-m e til-2 '-0 -M O E -c it id in a . Las e s te re o a rq u ite c tu ra d e sc rib e la na tu ra le za de l e s te re o is ó m e ro (R p /S p ) de c a d a á to m o de fó s fo ro en un e n la ce fo s fo ro tio a to de l o lig o n u c le ó tid o . Los va lo re s de t ie m p o de re tenc ión ( ír) en IE X -H P LC y peso m o le cu la r (M W ) ha lla do se o b tu v ie ro n u sa nd o los m é tod os an a lítico s c o rre sp o n d ie n te s p a ra los co m p u e s to s p u rif ica d o s (d e scritos an te rio rm e n te ).
Figure imgf000299_0002
Ejemplo 56: Método general de RP-HPLC para los análisis de superposición de oligonucleótidos DMT Apagado purificados
El p re se n te e je m p lo d e sc rib e e l an á lis is de R P -H P LC de c o m p o s ic io n e s de o lig o n u c le ó tid o s p u rif ica d o s p re p a ra d a s p o r s ín tes is q u ira lm e n te co n tro la d a co m o se d e sc rib e en el p re se n te do cu m e n to .
T am pó n A : T E A A 50 m M , pH 7,0
T a m p ó n B: A C N
Columna: XBridge Ci8, 3,5 pm, Ci8, 4,6 x 50 mm
Temperatura de la columna = 50 °C
Señal monitorizada a 254 y 280 nm
Gradiente usado:
Tiempo (min) Caudal (ml/min) % de A % de B Curva
Inicial 95 5
2 1 95 5 1
52 1 70 30 6
54 1 5 95 6
54,5 1 5 95 1
55 1 99 1 6
60 1 99 1 1
El panel A de la Figura 37 es una superposición de trazados de RP-HPLC del oligonucleótido DMT Apagado purificado ONT-75, ONT-77, ONT-80, ONT-81, ONT-87, ONT-88, ONT-89 y ONT-41 (diastereomezcla)-Gs5mCs5mCsTs5mCsAsGsTs5mCsTsGs5mCsTsTs5mCsGs5mCsAs 5mCs5mC.
El panel B de la Figura 37 muestra una vista ampliada del panel A, con cada curva marcada del siguiente modo:
Figure imgf000300_0001
El panel A de la Figura 38 es una superposición de RP-HPLC del oligonucleótido DMT Apagado purificado ONT-82, ONT-84, ONT-85, ONT-86, y ONT-83 (diastereomezcla)-GsTs5mCs5mCs5mCsTsGsAsAsGsAsTsGsTs5mCsAsAsTsGs5mC
El panel B de la Figura 38 muestra una vista ampliada del panel A, con cada curva marcada del siguiente modo:
Figure imgf000301_0002
Ejemplo 57: Experimento de desnaturalización térmica (Tm)
El presente ejemplo describe la caracterización de composiciones de oligonucleótidos quiralmente controlados usando desnaturalización térmica.
Se mezcló cada cadena de ADN con su cadena de ARN complementario en concentración equimolar de 1 pM en IxPBS. Se prepararon 3 ml de disolución en total para cada dúplex y la mezcla se calentó a 90 °C durante 2 min y se dejó enfriar durante el transcurso de varias horas. Las mezclas se almacenaron entonces a 4 °C durante 2 horas. Se registró la absorbancia a 254 nm en un intervalo de 0,5 min empezando el gradiente de temperatura desde 15,0 °C hasta 95,0 °C con un aumento de 0,5 °C/minuto, usando Cary100 Series (Agilent Technologies). La absorbancia a 254 nm se representó frente a la temperatura y los valores de Tm se calcularon a partir de la primera derivada respectiva de cada curva.
La Figura 39 presenta una superposición de Tm de oligonucleótidos quiralmente controlados y oligonucleótido estereoaleatorio.
La Figura 39 ilustra la diferencia en Tm entre cuatro oligonucleótidos de fosforotioato del diastereoisómero estereopuro (Todo-Rp 20-mero, Todo-Sp 20-mero, gápmeros 5R-10S-4R y 5S-10R-4S) y el oligonucleótido de fosforotioato estereoaleatorio. El ADN de Rp fosforotioato demuestra la mayor afinidad hacia el ARN complementario (Tm = 85,1 °C) cuando se comparó con el Sp 20-mero completo (Tm = 75,1 °C) que tiene la menor afinidad. Los gápmeros 5R-10S-4R y 5S-10R-4S y los oligonucleótidos de fosforotioato estereoaleatorios mostraron todos valores intermedios (intervalo de Tm = 80,1-81,2 °C).
La Tabla E-22, que sigue, da valores de Tm para los oligonucleótidos de fosforotioato estereopuros y estereoaleatorios estudiados que tienen la secuencia de ApoB humana 5'-Gs5mCs5mCsTs5mCsAsGsTs5mCsTsGs5mCsTsTs5mCsGs5mCsAs5mCs5mC-3' con diversas arquitecturas estereoquímicas en el esqueleto de fosforotioato.
Tabla E-22
Figure imgf000301_0001
Ejemplo 58: Preparación de oligonucleótidos de ARNip quiralmente controlados a modo de ejemplo que se dirigen a PCSK9
La proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 9 (PCSK9) es una enzima que participa en el metabolismo del colesterol. PCSK9 se une al receptor de la lipoproteína de baja densidad (LDL), desencadenando su destrucción. Aunque la LDL asociada al receptor también se elimina cuando el receptor se destruye, el efecto neto de la unión de PCSK9 aumenta de hecho los niveles de LDL, ya que el receptor volvería de otro modo a la superficie celular y eliminaría más colesterol.
Varias empresas están diseñando agentes terapéuticos que se dirigen a PCSK9. De particular relevancia para la presente divulgación, cada una de Isis Pharmaceuticals, Santaris Pharma y Alnylam Pharmaceuticals están desarrollando un agente de ácido nucleico que inhibe PCSK9. Se ha mostrado que el producto de Isis Pharmaceuticals, un oligonucleótido antisentido, aumenta la expresión de LDLR y disminuye los niveles de colesterol total circulante en ratones (Graham et al., "Antisense inhibition of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 reduces serum LDL in hyperlipidemic mice". J. Lipid Res. 48 (4): 763-7, abril de 2007). Ensayos clínicos iniciales con el producto de Alnylam Pharmaceuticals, ALN-PCS, revelan que la interferencia por ARN ofrece un mecanismo eficaz para inhibir PCSK9 (Frank-Kamenetsky et al., "Therapeutic RNAi targeting PCSK9 acutely lowers plasma cholesterol in rodents and LDL cholesterol in nonhuman primates". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (33): 11915-20, agosto de 2008).
El presente ejemplo describe la preparación de una variedad de agentes de ARNip quiralmente controlados o estereoaleatorios dirigidos a PCSK9. Específicamente, este ejemplo describe la preparación de cada una de las siguiente composiciones de oligonucleótidos como se ilustra en la Tabla E-23 que sigue:
Tabla E-23:
Figure imgf000302_0002
Lcaa-CPG-500 usado en la preparación de estos oligonucleótidos se preparó según la siguiente reacción:
Figure imgf000302_0001
En particular, se disolvió 5'-0-DMTr-2'-desoxitimidina (1) (4,28 g, 7,86 mmoles) en DCM anhidro (50 ml) y se mezcló con 2 equiv de anhídrido succínico (1,57 g, 15,7 mmoles) y 3 equiv de 4-W,W-dimetilaminopiridina (2,88 g, 23,6 mmoles). La reacción se agitó bajo argón a temperatura ambiente. Después del consumo completo del material de partida como se ha determinado por TLC (1 hora), los disolventes se evaporaron a sequedad, el residuo en bruto se disolvió en DCM que contenía 1 % de trietilamina, luego se purificó por cromatografía ultrarrápida en gel de sílice usando un gradiente de 0 - 2 % de MeOH en DCM que contenía 2 % de trietilamina. El rendimiento de compuesto (2) puro después de evaporación fue 5,5 g, 94 %. Se recogieron el 5'-0-DMTr-2'-desoxitimidina-3'-0-succinato (2) resultante (0,60 g, 0,81 mmoles), W,W-diisopropiletilamina (0,71 ml, 4,02 mmoles) y CPG-500 (10 g) en DMF (50 ml), entonces se añadió HBTU (0,37 g, 0,97 mmoles). La mezcla se agitó durante 2 h, luego se filtró. El soporte se lavó con DMF, MeOH y finalmente DCM, luego se secó a vacío. El análisis del catión tritilo (monitorizando a 504 nm) mostró que la carga del nucleósido sobre el soporte (3) era 38 gmol/g.
Cada oligonucleótido, que contenía enlaces internucleotídicos fosfodiéster 2'-OH y 2'-OMe y diéster de fosforotioato 2'-desoxi y 2'-OMe estereodefinidos como se indica anteriormente en la Tabla E-23, se sintetizó en un sintetizador de ADN/ARN ABI 394 según los ciclos resumidos en la Tabla E-24 y la Tabla E-25, respectivamente, usando una columna de síntesis de 10 gmoles de capacidad cargada con 130 mg (4,9 gmoles) de 5'-0-DMTr-2'-desoxitimidina unida a succinilo (38 gmol/g). Antes de la síntesis, se realizó una etapa de terminación preliminar (terminación 2) y la síntesis se terminó con la retirada de grupos 5'-0-DMTr terminales. La etapa de oxidación se realizó usando una disolución 5­ 6 M comercialmente disponible de hidroperóxido de ferc-butilo (TBHP) en decano que entonces se diluyó con cuatro partes de diclorometano. La etapa de sulfurización estereoespecífica se realizó usando el reactivo S-cianoetilmetiltiosulfonato 0,3 M tras el acoplamiento de la fosforamida quiral correspondiente y el proceso de terminación de dos etapas (Tabla E-25).
Una vez terminó el ciclo automatizado de síntesis de oligonucleótidos y se retiró el grupo 5'-O-DMTr final, la columna de síntesis se sacó del sintetizador de ADN/ARN y se secó a vacío. Se añadieron continuamente 10 ml de disolución de 1,5-diazabiciclo[4.3.0]non-5-eno (DBN) 0,5 M, se añadió continuamente N,O-bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida (BSTFA) 0,25 M en ACN al soporte a través de la columna de síntesis durante 1 min sin detener el flujo usando una jeringa unida a un extremo de la columna de síntesis. Entonces se lavó el soporte con ACN anhidro y se secó a vacío. Entonces, el soporte secado se transfirió a un vial de plástico de tapa roscada vacío y se trató con 40 % de disolución acuosa de MeNH2 (0,5 ml) a 60 °C durante 10 min. Después de que el vial se enfriara inmediatamente y después de la dilución con DMSO (0,5 ml), el soporte se retiró por filtración, se lavó otra vez con DMSO (1 ml) y se filtró. El filtrado se enfrió y luego se trató inmediatamente con 3HF Et3N (0,75 ml) a 60 °C durante 10 min, luego se congeló inmediatamente y se guardó a 4 °C antes de la purificación.
Tabla E-24. Resumen de la síntesis de oligonucleótidos en un sintetizador de ADN/ARN ABI 394 (ciclo de ARN sustitu ido en 2'-0-TBDMS y 2'-OMe)
etapa reacción reactivo tiempo de tiempo de administración (s) espera (s) 1 destritilación 3 % de TCA en DCM 3 120 10 N. A.
2 acoplamiento fosforamidito 0,15 M en ACN CMPT 2 M en ACN 7 6 30 600 3 terminación 5 % de Pac2O en THF/2,6-lutidina 16 % de NMI en THF 10 20
4 oxidación hidroperóxido de ferc-butilo 1,1 M en 4:1 de 20 110
diclorometano:decano
Tabla E-25. Resumen de la síntesis de oligonucleótidos en un sintetizador de ADN/ARN ABI 394 (ciclo de 2'-desoxi y 2'-OMe ARN del fosforotioato estereodefinido)
etapa reacción reactivo tiempo de tiempo de espera (s)
administración (s)
1 destritilación 3 % de TCA en DCM 3 120+ 10 N. A.
2 acoplamiento Fosforamidito quiral 0,15 M en 8 6 30 900 (2'-OMe ARN) ACN CMPT 2 M en ACN 30 600 (ADN)
3 terminación 1 5 % de Pac2O en THF/2,6- 30 60
lutidina
4 terminación 2 5 % de Pac2O en THF/2,6- 30 60
lutidina 16 % de NMI en THF
5 sulfurización Metiltiosulfonato de S-(2- 15 3x4 120 3x60 300
cianoetilo) 0,3 M
Figure imgf000304_0001
en ACN/BSTFA
Ejemplo 59. Método general de IEX-HPLC para el análisis de oligonucleótidos de ARN en bruto y DMT Apagado purificados.
Tampón A: Fosfato 20 mM de sodio, pH 11,0
Tampón B: Fosfato 20 mM de sodio, NaBr 1 M, pH 11,0
Columna: DIONEX, DNAPac, PA-100, analítica, 4,0 x 250mm
Temperatura de la columna = 60 °C
Señal monitorizada a 254 y 280 nm
Gradiente usado:
Tiempo (min) Caudal (ml/min) % de A % de B Curva
Inicial 95 5
3 1 95 5 1
23 1 20 80 6
25 1 5 95 6
25,5 1 95 5 6
30 1 95 5 1
Ejemplo 60. Método general de UPLC-LCMS para el análisis de oligonucleótidos de ARN DMT Apagado purificado ARN.
Tampón A: TEA 15 mM, HFIP 400 mM, agua
Tampón B: 50:50 de tampón A/metanol
Columna: UPLC@OST Cis 1,7 pm, 2,1 x 500mm
Temperatura de la columna = 50 °C
Gradiente usado:
Tiempo (min) Caudal (ml/min) % de A % de B Curva
Inicial 0,2 95 5
10 0,2 35 65 6
12 0,2 5 95 6
12,5 0,2 95 5 6
15 0,2 95 5 1
Ejemplo 61. Método general de IEX-HPLC para la purificación de oligonucleótidos de ARN DMT Apagado en bruto.
Tampón A: Fosfato 20 mM de sodio, pH 8,5
Tampón B: Fosfato 20 mM de sodio, NaBr 1 M, pH 8,5
Columna: Columna vacía Waters AP-2 (Waters), rellena internamente de forma personalizada con el soporte Source 15Q (GE Healthcare). Se usó la misma columna de purificación para los diferentes oligonucleótidos estereopuros. Instrumento: Unidad de HPLC de Waters equipada con el módulo de gradiente binario 2525, el detector de absorbancia doble 2487 y el inyector Flex de 20 ml (Waters).
Temperatura del calentador de tampón establecida a = 70 °C
Señal monitorizada a 254 nm y 280 nm
Fracciones de volumen: 4,5 ml
Gradiente usado:
Tiempo (min) Caudal (ml/min) % de A % de B Curva
Inicial 100 0
10 10 100 0 1
25 10 80 20 6
85 10 67,5 32,5 6
95 10 67,5 32,5 1
155 10 55 45 6
165 10 0 100 6
170 10 100 0 6
180 10 100 0 1
Las fracciones recogidas se analizaron individualmente por IEX-HPLC analítica usando las condiciones analíticas y el gradiente descrito anteriormente. Las fracciones puras se reunieron para proporcionar material purificado del 95 % de pureza y superior como se ha determinado por los perfiles de absorbancia de UV a 254 nm.
Ejemplo 62. Método general de RP-Sep-Pak para la desalación de oligonucleótidos de ARN purificados. La disolución de fracciones puras reunidas se cargó en un cartucho Sep-Pak (Waters, Sep-Pak Vac 35cc (10 g) C18 Cartridges) previamente acondicionado con agua. Después de cargar la muestra (100 ml), el cartucho se lavó con agua milli-Q (50 ml) para retirar toda la sal y entonces se lavó con 50 % de ACN/agua para eluir el oligonucleótido de ARN desalado de longitud completa. La disolución recogida se concentró a vacío dando un volumen de 5 ml y se liofilizó del agua.
Ejemplo 63: Preparación de agentes de ARNip bicatenario usando cadenas de oligonucleótido quiralmente controlado
El presente ejemplo describe la preparación de agentes de ARNip bicatenario por hibridación térmica de cadenas de oligonucleótidos quiralmente controlados como se ha descrito anteriormente.
Cada cadena de ARN se mezcló con su cadena de ARN complementario en concentración equimolar de 10 pM en 1xPBS. Se prepararon 0,5 ml de disolución en total para cada dúplex y la mezcla se calentó a 90 °C durante 2 min y se dejó enfriar durante el transcurso de varias horas. Las mezclas se almacenaron entonces a 4 °C. Las propiedades fisicoquímicas de las cadenas de ARN utilizadas se presentan a continuación en la Tabla E-26.
Tabla E-26.
Figure imgf000306_0001
Figure imgf000307_0001
Secuencias de oligonucleótidos usadas, ARNip de PCSK9 humano: Cadena codificante (S) 5'-uucuAGAccuGuuuuGcuudTsdT-3'; Cadena no codificante 1 (AS1) 5'-AAGcAAAAcAGGUCuAGAAdTsdT-3'; Cadena no codificante 2 (AS2) 5'-asAGcAAAAcAGGUCuAGAAdTsdT-3'. Nucleótidos en mayúscula: ARN, nucleótidos en minúscula 2'-OMe, d = 2'-desoxi, s = fosforotioato. La estereoarquitectura describe la naturaleza del estereoisómero (configuración absoluta Rp/Sp) de cada átomo de fósforo en un enlace fosforotioato dado del oligonucleótido. Se obtuvieron valores de peso molecular (MW) hallado usando los métodos analíticos correspondientes para los compuestos purificados (descritos anteriormente).
Las Figuras 51 muestran superposiciones de perfiles de IEX-HPLC que muestran la diferencia en tiempos de retención entre oligonucleótidos de ARN estereopuros.
Figure imgf000308_0002
Las Figuras 52 muestran superposiciones de perfiles de IEX-HPLC que muestran la diferencia en tiempos de retención entre oligonucleótidos de ARN estereopuros.
Figure imgf000308_0003
Además de los oligonucleótidos de ARNip quiralmente controlados preparados ejemplificados específicamente anteriormente, la presente invención proporciona la preparación de dúplex de ARNip que tienen varios enlaces internucleotídicos fosforotioato quiral, y enlaces internucleotídicos fosforotioato quiral completo.
Por ejemplo, según la presente invención, se introducen múltiples enlaces fosforotioato quiral en el interior de un oligonucleótido de ARN usando los 3'-fosforamiditos de ARN quiral apropiados, que tienen grupos protectores 2'-OH adecuados, tales como 2'-O-PivOM (Debart et al., Chem. Eur. J., 2008, 14, 9135), 2'-0-CEM (Ohgi et al., Org. Lett., 2005, 7, 7913; Wada et al., J. Org. Chem., 2012, 77, 7913), 2'-O-TOM (Pitsch et al., Helv. Chim. Acta, 2001,84, 3773) o 2'-O-TC (Dellinger et al., J. Am. Chem. Soc., 2011, 133, 11540). Se puede preparar cada una de las siguientes cadenas codificantes de ARNip de PCSK9 humano que tienen varios enlaces internucleotídicos fosforotioato quiral e internucleotídicos fosforotioato quiral completo según la presente invención:
Figure imgf000308_0001
Figure imgf000309_0001
Ejemplos de síntesis para cadenas no codificantes de ARNip de PCSK9 humano que tiene varios enlaces internucleotídicos fosforotioato quiral y enlaces internucleotídicos fosforotioato quiral completo.
Figure imgf000309_0002
Alternativamente o además, la presente invención proporciona la preparación de dúplex de ARNip que tienen varios enlaces internucleotídicos fosforotioato quiral y enlaces internucleotídicos fosforotioato quiral completo y restos ribosa completamente modificados.
Por ejemplo, según la presente invención, se introducen múltiples enlaces fosforotioato quiral en el interior de un oligonucleótido de ARN completamente modificado en ribosa usando los 3'-fosforamiditos de ARN quiral completo, que tienen la modificación química en 2' de ribosa deseada correspondiente, tal como 2'-desoxi-2'-flúor (2'-F) o 2'-O-metilo (2'-OMe). Para dar algunos ejemplos, se pueden preparar cada una de las siguientes cadenas codificantes de 2'-F/2'-OMe completamente modificadas de ARNip de PCSK9 humana que tienen varios enlaces internucleotídicos fosforotioato quiral y enlaces internucleotídicos fosforotioato quiral completo.
Figure imgf000310_0001
Ejemplos de síntesis para cadenas no codificantes de 2'-F/2'-OMe completamente modificadas de ARNip de PCSK9 humana que tienen varios enlaces internucleotídicos fosforotioato quiral y enlaces internucleotídicos fosforotioato quiral completo.
Figure imgf000310_0002
Para ensamblar dúplex, se realiza la hibridación térmica de cadenas de ARN y la preparación de dúplex de ARNip. Específicamente, cada cadena de ARN se mezcla con su cadena de ARN complementario en concentración equimolar de 10 pM en IxPBS. Se prepara la disolución de 0,5 ml en total para cada dúplex y la mezcla se calienta a 90 °C durante 2 min y se deja enfriar durante el transcurso de varias horas. Entonces se almacenan las mezclas a 4 °C.
Tras la etapa de hibridación térmica de cadenas de ARN, todas las posibles combinaciones de dúplex de ARNip se pueden preparar por hibridación de cualquiera de las cadenas codificantes con cualquier cadena complementaria posible de las cadenas no codificantes.
Todos los dúplex de ARNip preparados se pueden evaluar in vitro para sus propiedades de silenciamiento génico de PCSK9, tras la transfección en células HeLa o células Hep3B (por ejemplo, como se describe en el presente documento). Según la presente divulgación, se pueden observar diferentes potencias para diferentes dúplex, por ejemplo, que varían en número, posición y/o estereoarquitectura de los enlaces del esqueleto de fosforotioato quiral, y opcionalmente también en presencia, nivel y o tipo de una o varias de otras modificaciones químicas.
Cualquiera o todas las propiedades del ARNip, tales como: resistencia a nucleasas, penetración celular, escape endosómico, estabilidad termodinámica del dúplex, estructura tridimensional del dúplex, afinidad hacia las diversas etapas mecanísticas de las interacciones de enzimas, afinidad hacia el ARNm diana, efectos inespecíficos específicos, inmunoestimulación, duración de la acción, farmacocinética, etc., se pueden modular e influir por la estereoquímica de los enlaces del esqueleto de fosforotioato quiral, como se describe en el presente documento.
Ejemplo 64. Preparación de preparaciones quiralmente controladas de oligonucleótido
Figure imgf000311_0001
El presente ejemplo describe la preparación de una variedad de composiciones quiralmente controladas particulares de ciertos oligonucleótidos descritos en su interior.
Se disolvió N4-acetil-5'-0-DMTr-2'-0-metilcitidina (1) (1,15 g, 1,91 mmoles) en DCM anhidro (20 ml) y se mezcló con 2 equiv de anhídrido succínico (0,383 g, 3,82 mmoles) y 3 equiv de 4-N,N-dimetilaminopiridina (0,701 g, 5,73 mmoles). La reacción se agitó bajo argón a temperatura ambiente. Después del consumo completo de material de partida como se ha determinado por TLC (1 hora), los disolventes se evaporaron a sequedad, el residuo en bruto se disolvió en DCM que contenía 1 % de trietilamina, luego se purificó por cromatografía ultrarrápida en gel de sílice usando un gradiente de 0 - 2 % de MeOH en DCM que contenía 2 % de trietilamina. El rendimiento del compuesto de succinilo (2) puro después de la evaporación fue 1,50 g, 98 %. MS (ESI va): calc (M+H)+: 702,27, hallado: 702,34. La W^-acetil-5'-O-DMTr-3'-O-succinil-2'-O-metilcitidina (2) propiletilamina (0,18 ml, 0,79 mmoles) y GE Custom Support™ Amino (1 g) se recogieron en DMF (5 ml), luego se añadió HBTU (0,10 g, 0,26 mmoles). La mezcla se agitó durante 2 h, luego se filtró. El soporte se lavó con DMF, MeOH y finalmente DCM, luego se secó a vacío. El análisis del catión tritilo (monitorizando a 504 nm) mostró que la carga de nucleósido sobre el soporte (3) era 180 pmol/g.
Ejemplo 65. Preparación de preparaciones quiralmente controladas de oligonucleótido
Figure imgf000311_0002
Usando un procedimiento análogo al descrito en el ejemplo 64, se cargó N2-fenoxiacetil-5'-O-DMTr-3'-O-succinil-2'-O-metilguanosina (4, MS (ESI va): calc (M+H)+: 834,30, hallado: 834,32) sobre GE Custom Support™ Amino. El análisis del catión tritilo (monitorizando a 504 nm) mostró que la carga de nucleósido sobre el soporte (6) era 140 pmol/g.
En algunas realizaciones, los oligonucleótidos que contenían enlaces internucleotídicos estereodefinidos de triéster de fosforotioato de 2'-OMe se sintetizaron en un sintetizador de ADN/ARN ABI 394 según el ciclo resumido en la Tabla E-27 usando una columna de síntesis de 10 pmoles de capacidad cargada con 60 mg (10,8 y 8,4 pmoles, respectivamente) de o 5'-O-DMTr-2'-O-metil-GPac unido a succinilo sin terminar (6, 140 pmol/g) o 5'-O-DMTr-2'-O-metil-CAc (3, 180 pmol/g). El ciclo de síntesis se realizó con una etapa de terminación preliminar (terminación 2) y con retirada del grupo 5'-O-DMTr terminal. Las etapas de sulfurización estereoespecíficas se realizaron usando el reactivo S-(2-cianoetil)metiltiosulfonato 0,3 M en ACN que contenía BSTFA, siguiendo el acoplamiento de la fosforamida quiral correspondiente y el proceso de terminación de dos etapas (Tabla E-27).
Una vez había terminado el ciclo de síntesis de oligonucleótidos automático, y retirado el grupo 5'-O-DMTr final, la columna de síntesis se sacó del sintetizador de ADN/ARN y se secó a vacío. El soporte secado se transfirió sobre un sintetizador de péptidos manual de vidrio vacío y se añadieron continuamente 10 ml de disolución de 1,5-diazabiciclo[4.3.0]non-5-eno (DBN) 0,5 M, W,0-bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida (BSTFA) 0,25 M en ACN al soporte durante 5 min sin detener el flujo en el sintetizador de péptidos manual. El soporte se lavó por ACN y se secó a vacío.
Entonces, el soporte se trató con 5 % de EtOH/NH3 conc. (5 ml) a 60 °C durante 6 h, y se dejó a temperatura ambiente durante 12 h. El soporte se retiró por filtración y se lavó con NH3 conc. El filtrado se concentró a vacío, luego se purificó por I EX.
Tabla E-27. Sumario para la síntesis de oligonucleótidos.
etapa reacción reactivo tiempo de tiempo de administración (s) espera (s)
1 destritilación 3 % de TCA en DCM 3 120 10 N. A.
2 acoplamiento fosforamidito 0,15 M en ACN CMPT 2 M en ACN 8 6 30 900
3 terminación 1 5 % de Pac2O en THF/2,6-lutidina 30 60
4 terminación 2 5 % de Pac2O en THF/2,6-lutidina 16 % de NMI 30 60
en THF
5 sulfurización (S-cianoetil)-metiltiosulfonato 0,3 M 15 3x4 120 3x60
300
0
N C '^ S”O F Me
en ACN/BSTFA
Síntesis del oligonucleótido ONT-94: (Todo (Sp))-gsgsusgsgsasasgsgsc. ír (IEX-HPLC): 18,26 min. MW calc:
3563,9; MW hallado: 3562,6.
Síntesis del oligonucleótido ONT-96: (Todo (Rp))-gsgsusgsgsasasgsgsc. tR (IEX-HPLC): 18,16 min. MW calc:
3563,9; MW hallado: 3561,7.
Síntesis del oligonucleótido ONT-98: (Rp, Sp, Rp, Sp, Rp,
Figure imgf000312_0001
Rp) - gsgsus HPLC): 18,05 min. MW calc: 3563,9; MW hallado: 3562,5.
Síntesis del oligonucleótido ONT-100: (Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp) - gsgsusgsgsasasgsgsc. tR (IEX-HPLC): 17,86 min. MW calc: 3563,9; MW hallado: 3561,1.
Síntesis del oligonucleótido ONT-102: (Rp, Rp, Sp, Sp, Sp, Sp, Sp, Rp, Rp) - gsgsusgsgsasasgsgsc. tR (IEX-HPLC): 18,30 min. MW calc: 3563,9; MW hallado: 3561,3.
Síntesis del oligonucleótido ONT-104: (Sp, Sp, Rp, Rp, Rp, Rp, Rp, Sp, Sp) - gsgsusgsgsasasgsgsc. tR (IEX-HPLC): 17,95 min. MW calc3563,9; MW hallado: 3562,7.
Síntesis del oligonucleótido ONT-95: (Todo (Sp))- gscscsuscscsasg. tR (IEX-HPLC): 14,78 min. MW calc: 2709,2;
MW hallado: 2707,4.
Síntesis del oligonucleótido ONT-97: (Todo (Rp))- gscscsuscscsasg. ír (IEX-HPLC): 15,60 min. MW calc: 2709,2;
MW hallado: 2708,3.
Síntesis del oligonucleótido ONT-99: (Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp) - gscscsuscscsasg. ír (IEX-HPLC): 16,10 min.
MW calc: 2709,2; MW hallado: 2708,0.
Síntesis del oligonucleótido ONT-101: (Sp, Rp, Sp, Rp, Sp, Rp, Sp) - gscscsuscscsasg. ír (IEX-HPLC): 16,23 min.
MW calc: 2709,2; MW hallado: 2708,2.
Síntesis del oligonucleótido ONT-103: (Rp, Rp, Sp, Sp, Sp, Rp, Rp) - gscscsuscscsasg. ír (IEX-HPLC): 16,26 min.
MW calc: 2709,2; MW hallado: 2707,8.
Síntesis del oligonucleótido ONT-105: (Sp, Sp, Rp, Rp, Rp, Sp, Sp) - gscscsuscscsasg. ír (IEX-HPLC): 16,22 min. MW calc: 2709,2; MW hallado: 2710,0.
Los oligonucleótidos que contenían enlaces internucleotídicos estereodefinidos triéster de fosforotioato de 2'-OMe quimérico y triéster de fosforotioato de 2'-O-MOE se sintetizaron en un ADN/ARN ABI 394 en un modo análogo a aquellos descritos en los ejemplos en el presente documento.
Síntesis del oligonucleótido ONT-90: (Todo (Rp)) - GMOEsGMOEsusGMOEsGMOEsasasGMOEsGMOEsc. ír (IEX-HPLC): 15,35 min. MW calc: 3828,2; MW hallado: 3826,5.
Síntesis del oligonucleótido ONT-119: (Todo (Sp)) - GMOEsGMOEsusGMOEsGMOEsasasGMOEsGMOEsc. ír (IEX-HPLC): 16,42 min. MW calc: 3828,2; MW hallado: 3827,2.
Síntesis del oligonucleótido ONT-91: (Todo (Rp)) -GMOEscscsuscscsasg. ír (IEX-HPLC): 15,69 min. MW calc: 2753,3; MW hallado: 2751,5.
Síntesis del oligonucleótido ONT-120: (Todo (Sp)) -GMOEscscsuscscsasg. ír (IEX-HPLC): 14,71 min. MW calc: 2753,3; MW hallado: 2751,4.
Ejemplo 66. Método general de IEX-HPLC para el análisis de oligonucleótidos de RIPtido en bruto y DMT Apagado purificados:
Tampón A: TrisHCl 10 mM, 50 % de ACN, pH 8,0
Tampón B: TrisHCl 10 mM, NaClO4800 mM, 50 % de ACN, pH 8,0
Columna: DIONEX, DNAPac, PA-200, analítica, 4,0 x 250 mm
Temperatura de la columna = 60 °C
Señal monitorizada a 254 y 280 nm
Gradiente usado:
Tiempo (min) Caudal (ml/min) % de A % de B Curva
Inicial 95 5
2 1 95 5 1
22 1 70 30 6
25 1 5 95 6
25,5 1 95 5 6
30 1 95 5 1
Ejemplo 67. Método general de UPLC-LCMS para el análisis de oligonucleótidos de RIPtido DMT Apagado purificados
Tampón A: TEA 15 mM, HFIP 400 mM, agua
Tampón B: 50:50 de tampón A/metanol
Columna: UPLC@OST C181,7 pm, 2,1 x 500 mm
Temperatura de la columna = 50 °C
Gradiente usado:
Tiempo (min) Caudal (ml/min) % de A % de B Curva
Inicial 0,2 80 20
2 0,2 80 20 1
22 0,2 30 70 6
25 0,2 5 95 6
25,5 0,2 80 20 6
30 0,2 80 20 1
Ejemplo 68. Método general de IEX-HPLC para la purificación de oligonucleótido de RIPtido de DMT Apagado en bruto:
Tampón A: NaOH 20 mM, pH 11,0
Tampón B: NaOH 20 mM, NaCI 2,5 M, pH 11,0
Columna: Columna vacía Waters AP-1 (Waters), rellena internamente de forma personalizada con el soporte Source 15Q (GE Healthcare). Se usó la misma columna de purificación para los diferentes oligonucleótidos de RIPtido estereopuros.
Instrumento: AKTA Purifier, equipado con la bomba P-900, el detector UPC-900 y un SuperLoop de inyección de 50 ml (GE Healthcare)
Temperatura del calentador de tampón establecida a = 70 °C
Cinta del calentador de columna calentador establecida a = 70 °C
Señal monitorizada a 254 nm
Fracciones de volumen: 5 ml
Gradiente usado:
Tiempo (min) Caudal (ml/min) % de A % de B Curva
Inicial 100 0
15 4 100 0 1
25 4 90 10 6
35 4 90 10 1
45 4 80 20 6
60 4 80 20 1
80 4 65 35 6
95 4 65 35 1
120 4 45 55 6
125 4 45 55 1
Tiempo (min) Caudal (ml/min) % de A % de B Curva
Inicial 100 0
126 4 100 0 6
140 4 100 0 1
Las fracciones recogidas se analizaron individualmente por IEX-HPLC analítica usando las condiciones analíticas y el gradiente descrito anteriormente. Las fracciones puras se reunieron para proporcionar material purificado del 95 % de pureza y superior como se ha determinado por los perfiles de absorbancia de UV a 254 nm.
Método general RP-Sep-Pak para la desalación de oligonucleótidos de RIPtidos purificados. La disolución de fracciones puras reunidas se cargó en un cartucho Sep-Pak (Waters, Sep-Pak Vac 35cc (10 g) C18 Cartridges) previamente acondicionado con agua. Después de cargar la muestra (100 ml), el cartucho se lavó con agua milli-Q (50 ml) para retirar toda la sal y entonces se lavó con 50 % de ACN/agua para eluir el oligonucleótido de ARN desalado de longitud completa. La disolución recogida se concentró a vacío dando un volumen de 5 ml y se liofilizó del agua.
Se investiga un panel de RIPtidos modificados del fosforotioato completamente estereocontrolado (8-mero o 10-mero) que se unen a hTR desnudo para la inhibición in vitro de la actividad del complejo de RNP telomerasa. El ensayo de Cy5-TRAP (Shay et al., Nat. Protoc., 2006, 1, 1583), una variación de TRAP (Shay et al., Science, 1994, 266, 2011), se usa para determinar los valores de CI50 para los RIPtidos de fosforotioato estereocontrolados usando extractos de células HeLa, según protocolos previamente informados (Verdine et al., J. Biol. Chem., 2012, 287, 18843).
Se realizan ensayos TRAP siguiendo protocolos previamente informados que usan fluorescencia como sistema de cuantificación, con algunas modificaciones. Brevemente, la extensión de un sustrato artificial fluorescente por telomerasa se lleva a cabo durante 30 minutos a 30 °C, seguido por amplificación con 30 ciclos de PCR (34 °C 30 s, 59 °C 30 s, 72 °C 1 min). El potencial inhibidor de los RIPtidos se evalúa inicialmente en extractos de células HeLa, en experimentos por duplicado, usando un intervalo de concentración 600 pM-60 pM. Experimentos con RIPtidos seleccionados se repiten para un intervalo de concentración de 0,06 pM-60 pM en extractos de células HeLa, DU145 (cáncer de próstata) y HEK293. Se usan varios controles en estos ensayos: un control positivo (lisado celular sin tratar), controles negativos (tampón solo, extractos de células inactivados por calor y tratados por RNasa) y control de amplificación por PCR (60 pM de RIPtido añadido después de la elongación de la telomerasa y antes de la PCR). En ciertas realizaciones, preparados de RIPtidos quiralmente controlados muestran inhibición potenciada de hTR en comparación con el control positivo y/o la inhibición potenciada de hTRa en comparación con el control negativo; en algunas realizaciones, algunos, pero opcionalmente no todos los RIPtidos de una secuencia dada, muestran dichas propiedades. En algunas realizaciones, por "potenciado" en este contexto se indica potenciado por entre aproximadamente cinco veces y aproximadamente diez veces. En algunas realizaciones, por "potenciado" se indica al menos aproximadamente 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5 o 10,0 veces.
Condiciones de cultivo celular. La estirpe celular de riñón embrionario transformado HEK293 y la estirpe de células de cáncer de próstata DU145 se mantienen en DMEM complementado con 10 % de suero bovino fetal en 5 % de CO2 a 37 °C. Los extractos celulares solubles para ensayos TRAP se preparan por lisis en detergente de 106 células con 200 pl 1X tampón de lisis CHAPS (Chemicon) como se describe en las instrucciones del fabricante.
Según la presente divulgación, se pueden observar diferentes potencias y/u otras propiedades diferentes para las diversas estereoarquitecturas de RIPtidos de fosforotioato completamente estereocontrolados. Por ejemplo, las propiedades de RIPtidos, tales como: resistencia a nucleasas, acumulación en tejido, penetración celular, escape endosómico, estructura tridimensional del RIPtido, afinidad hacia el ARN de hTR plegado diana, inmunoestimulación, duración de la acción, farmacocinética, etc., pueden variar para preparados de RIPtidos quiralmente controlados que comparten la misma secuencia, pero se diferencian entre sí con respecto a diferente localización y/o estereoquímica de uno o más enlaces del esqueleto fosforotioato quiral.
Ejemplo 69: Composiciones de oligonucleótidos quiralmente controlados muestran diferente actividad in vivo en comparación con composiciones quiralmente no controladas que tienen la misma secuencia
El presente ejemplo compara la actividad farmacológica in vivo de oligonucleótidos quiralmente puros con la observada para la mezcla estereoaleatoria "parental" (es decir, para una composición que contiene oligonucleótidos de la misma secuencia que los oligonucleótidos quiralmente puros, pero que no presentan pureza quiral, por ejemplo, como resultado de haber sido preparada por un proceso estereoaleatorio). Cuatro oligonucleótidos quiralmente puros, cada uno de los cuales tenía una secuencia complementaria a la de un transcrito diana particular o gen que codifica una proteína de interés, se sintetizaron, se formularon y se administraron dos veces por semana durante 5 semanas en dos niveles de dosis cada uno, a animales que expresaban el gen diana. Se cuantificaron los niveles de los niveles de proteína codificada. En este ejemplo, se usaron los oligonucleótidos que tenían una secuencia antisentido con respecto a (y, por lo tanto, que se dirige a) apolipoproteína-B (ApoB) para el estudio de viabilidad en ratones transgénicos que expresan ApoB humana.
Productos experimentales
Los productos experimentales fueron PBS solo (es decir, sin control de oligonucleótido), o la composición de oligonucleótidos relevante (es decir, los oligonucleótidos Mipomersen (ONT-41), ONT-75, ONT-77, ONT-80 u ONT-81 (véase el Ejemplo 52 para estructuras) se formuló en 1X PBS (diluido a partir de 10X PBS (Life Technologies, AM9624) usando agua sin nucleasas (Qiagen, 129115)) a 0,5 y 1 mg/ml para una dosis de 5 y 10 mg/kg, respectivamente. Las formulaciones se basaron en masa absoluta sin ajuste para el material activo. Las concentraciones de oligonucleótidos se confirmaron por medición con un Carry-100 UV-Vis (Agilent Technologies). Se comprobaron las muestras de todos los productos experimentales para niveles de endotoxina usando un ensayo cinético de endotoxina cromogénica de pirocromo (Associates of Cape Cod, 1500-5, E005-5). Se encontró que todas las muestras probadas tenían una menor cantidad de endotoxina que el límite aceptable de 0,5 UE/ml.
Animales y procedim ientos in vivo
Se obtuvieron ratones transgénicos hembra (ratones huApoB) que expresaban altas concentraciones plasmáticas de apolipoproteína B100 humana y lipoproteína(a) (J. Clin. Invest. 92: 3029-3037) de Taconic (raza B6.SJL-Tg(APOB)1 102Sgy N20+?, modelo N.° 1004-F). Todos los animales fueron genotipados antes de la administración.
Se entregó los ratones y se dejó que se aclimataran durante al menos siete días antes del comienzo del estudio. Todos los ratones se administraron con pienso regular y agua a voluntad, y no ayunaron antes de la administración del compuesto. Los ratones se aleatorizaron a grupos de estudio, y se administraron por vía intraperitoneal (IP) a 10 ml/kg en los días 1,4, 8, 11, 15, 18, 22, 25, 29 y 32, basándose en el peso corporal del ratón individual medido antes de la administración en cada día de dosis. Se recogió sangre durante el transcurso del estudio en los días 0 (día antes de la primera dosis), 17, 24, 31, 38, 45, 52 y 60 por sangrado submandibular (mejilla) y en el sacrificio en el día 66 por punción cardíaca, y luego se procesó en suero.
Ensayo de la proteína apolipoproteína B
Se midieron los niveles de proteína ApoB en suero usando un kit de ELISA ApoB Human (Abcam, ab108807). Se diluyeron muestras de suero 1:20.000 y se ensayaron por el protocolo recomendado por el kit sin modificaciones. Se hicieron lavados automatizados con periodos de remojo de 30 segundos usando un Aquamax 4000 (Molecular Devices). Las reacciones se detuvieron después de incubaciones de 12 minutos con sustrato Chromogen y las mediciones se hicieron con un Spectramax M5 (Molecular Devices).
Se generaron curvas patrón por representación de la concentración habitual en el eje x y la absorbancia media correspondiente a 450 nm en el eje y. La línea de mejor ajuste se determinó por análisis de regresión usando el ajuste a curva log-log. Cada placa de ensayo incluyó un control negativo (tratado con PBS) y uno positivo (tratado con mipomersen) y cada muestra de suero de ratón se ensayó en 4 duplicados técnicos.
Para cada muestra, el nivel absoluto medio de ApoB se normalizó al valor medio para el grupo tratado con PBS, para obtener el nivel relativo de expresión de proteínas ApoB. En un caso, un animal se excluyó del análisis ya que las mediciones se desviaron de la media de la cohorte en 2 desviaciones estándar. Se usaron niveles relativos de expresión de proteínas ApoB para el análisis estadístico (Graphpad Prism) por ANOVA bifactorial seguido por la prueba a posteriori de Newman-Keuls.
Resultados
Los resultados se muestran en la Tabla E-28a y la Figura 40. Con respecto a PBS, 5 mg/kg IP de ONT-75 produjeron reducciones significativas de los niveles de proteína ApoB en suero en el día 24 del estudio, hasta el 87 % (p < 0,05). Con respecto a PBS, 5 mg/kg IP de ONT-77 produjeron reducciones significativas de niveles de proteína ApoB en suero en los días 24 y 31 del estudio, hasta el 72 % (p < 0,0001), 81 % (p < 0,05) de niveles de control, respectivamente. Con respecto a PBS, 5 mg/kg IP de ONT-80 produjeron reducciones significativas de niveles de proteína ApoB en suero en los días 24 y 31 del estudio, hasta el 83 % (p < 0,05), 80 % (p < 0,05) de niveles de control, respectivamente. Con respecto a PBS, 5 mg/kg IP de ONT-81 produjeron reducciones significativas de niveles de proteína ApoB en suero en los días 17 y 24 del estudio, hasta el 85 % (p < 0,05), 70 % (p < 0,0001) de niveles de control, respectivamente.
Tabla E-28a: Niveles de apolipoproteína B humana en suero con respecto a PBS después de múltiples dosis IP de 5 mg/kg de estereoisómero o mipomersen en ratones huApoB (N = 4-5]
Figure imgf000317_0001
En comparación con 5 mg/kg IP de mipomersen, el ONT-75 administrado con el mismo paradigma de administración produjo significativamente menos reducción de los niveles de proteína ApoB en suero en los días 17, 24, 31 y 38 (p<0,0001) y 45 (p<0,05) del estudio. En comparación con 5 mg/kg IP de mipomersen, ONT-77 administrado con el mismo paradigma de administración produjo significativamente menos reducción de niveles de proteína ApoB en suero en los días 17,31 y 38 (p<0,0001), 24 (p<0,001) y 45 (p<0,05) del estudio. En comparación con 5 mg/kg IP de mipomersen, ONT-80 administrado con el mismo paradigma de dosis produjo significativamente menos reducción de niveles de proteína ApoB en suero en los días 17, 24, 31 y 38 (p<0,0001), pero no fue diferente en el día 45 (p>0,05) del estudio. En comparación con 5 mg/kg IP de mipomersen, ONT-81 administrado con el mismo paradigma de dosis produjo significativamente menos reducción de niveles de proteína ApoB en suero en los días 17, 31 y 38 (p<0,0001), 24 (p<0,001) y 45 (p<0,01) del estudio. La Figura 40 muestra la evolución de los niveles de proteína apolipoproteína B humana en suero con respecto a PBS después de la administración de 5 mg/kg de estereoisómero o mipomersen IP en ratones huApoB. Las flechas hacia abajo indican los días de administración. Se muestran las medias de los grupos normalizadas al grupo de control de PBS, donde cada grupo comprendía 4-5 animales. Las barras de error representan desviaciones estándar.
Los resultados del paradigma de administración de 10 mg/kg se muestran en la Tabla E-28b y la Figura 53. Con respecto a PBS, 10 mg/kg IP de ONT-75 produjeron reducciones significativas de niveles de proteína ApoB en suero en los días 17, 24 y 38 del estudio, hasta el 78 % (p<0,0001), 76 % (p<0,0001) y 82 % (p<0,001), respectivamente. Con respecto a PBS, 10 mg/kg IP de ONT-77 produjeron reducciones significativas de niveles de proteína ApoB en suero en los días 17, 24, 31, 38, 45 y 52 del estudio, hasta el 62 % (p<0,0001), 61 % (p<0,0001), 54 % (p<0,0001), 59 % (p<0,0001), 72 % (p<0,0001) y 73 % (p<0,0001) de los niveles de control, respectivamente. Con respecto a Pb S, 10 mg/kg IP de ONT-80 produjeron reducciones significativas de niveles de proteína ApoB en suero en los días 17, 24, 31, 38, 45, 52 y 66 del estudio, hasta el 55 % (p<0,0001), 59 % (p<0,0001), 73 % (p<0,0001), 67 % (p<0,0001), 76 % (p<0,0001), 76 % (p<0,0001) y 80 % (p<0,01) de los niveles de control, respectivamente. Con respecto a PBS, 10 mg/kg IP de ONT-81 produjeron reducciones significativas de los niveles de proteína ApoB en suero en los días 17, 24, 31,38 y 45 del estudio, hasta el 49 % (p<0,0001), 62 % (p<0,0001), 71 % (p<0,0001), 74 % (p<0,0001) y 79 % (p<0,001) de los niveles de control, respectivamente.
Tabla E-28b: Niveles de apolipoproteína B humana en suero con respecto a PBS después de múltiples dosis IP de 10 mg/kg de estereoisómero (ONT-75, -77, -80 o -81) o mipomersen en ratones huApoB (N = 4-5)
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En comparación con 10 mg/kg IP de mipomersen, ONT-75 administrado con el mismo paradigma de dosis produjo significativamente menor reducción (atenuación) de los niveles de proteína ApoB en suero en los días 17, 24, 31,38, 45, 52, 60 (p<0,0001) y 66 (p<0,001) del estudio. En comparación con 10 mg/kg IP de mipomersen, ONT-77 administrado con el mismo paradigma de dosis produjo significativamente menor reducción (atenuación) de los niveles de proteína ApoB en suero en los días 17, 24, 31,38 y 45 (p<0,0001), 60 (p<0,05) y 66 (p<0,01) del estudio. En comparación con 10 mg/kg IP de mipomersen, ONT-80 administrado con el mismo paradigma de dosis produjo significativamente menor reducción (atenuación) de los niveles de proteína ApoB en suero en los días 24,31,38 y 45 (p<0,0001),17 (p<0,001) y 66 (p<0,01). En comparación con 10 mg/kg IP de mipomersen, ONT-81 administrado con el mismo paradigma de dosis produjo significativamente menor reducción (atenuación) de los niveles de proteína ApoB en suero en los días 24, 31,38 y 45 (p<0,0001), 17 (p<0,01), 52 y 66 (p<0,001) del estudio.
En el día 38 (es decir, 6 días después de la última dosis), los niveles de proteína ApoB en suero habían vuelto al nivel basal después de ONT-75. Considerando la reducción inicial del nivel de proteína ApoB en suero, la tasa de retorno al nivel basal de la proteína ApoB en suero fue más lenta después de ONT-77 y ONT-80 y el nivel de proteína ApoB en suero es similar a los niveles de mipomersen en el día 52.
Los resultados del paradigma de dosis de 5 mg/kg de arquitecturas estereopuras adicionales se muestran en la Tabla E-28c y la Figura 54. Con respecto a PBS, 5 mg/kg IP de ONT-87 produjeron reducciones significativas de los niveles de proteína ApoB en suero en los días 17, 24, 31 y 38 del estudio, hasta el 27 % (p<0,0001), 40 % (p<0,0001), 55 % (p<0,0001) y 71 % (p<0,0001) de los niveles de control, respectivamente. Con respecto a PBS, 5 mg/kg IP de ONT-88 produjeron reducciones significativas de niveles de proteína ApoB en suero en los días 17, 24, 31 y 38 del estudio, hasta el 47 % (p<0,0001), 34 % (p<0,0001), 69 % (p<0,0001) y 85 % (p<0,0001) de los niveles de control, respectivamente. Con respecto a PBS, 5 mg/kg IP de ONT-89 produjeron reducciones significativas de niveles de proteína ApoB en suero en los días 17, 24 y 31 del estudio, hasta el 43 % (p<0,0001), 48 % (p<0,0001) y 85 % (p<0,05) de los niveles de control, respectivamente.
Tabla E-28c: Niveles de apolipoproteína B humana en suero con respecto a PBS después de múltiples dosis IP de 5 mg/kg de estereoisómero (ONT-87, -88 o -89) o mipomersen en ratones huApoB (N = 3-4)
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En comparación con 5 mg/kg IP de mipomersen, ONT-87 administrado con el mismo paradigma de dosis produjo significativamente mayor reducción (atenuación) de los niveles de proteína ApoB en suero en el día 31, (p<0,01) del estudio. En comparación con 5 mg/kg IP de mipomersen, ONT-88 administrado con el mismo paradigma de dosis produjo significativamente menor reducción (atenuación) de los niveles de proteína ApoB en suero en el día 17 (p<0,05 del estudio). En comparación con 5 mg/kg IP de mipomersen, ONT-89 administrado con el mismo paradigma de dosis produjo significativamente menor reducción (atenuación) de los niveles de proteína ApoB en suero en el día 38 (p<0,05) del estudio.
Los resultados del paradigma de dosis de 10 mg/kg de arquitecturas estereopuras adicionales se muestran en la Tabla E-28d y las Figuras 55 y 56. Con respecto a PBS, 10 mg/kg IP de ONT-87 produjeron reducciones significativas de los niveles de proteína ApoB en suero en los días 17, y 24 del estudio, hasta el 27 % (p<0,0001), 14 % (p<0,0001) de los niveles de control, respectivamente. Con respecto a PBS, 10 mg/kg IP de ONT-88 produjeron reducciones significativas de los niveles de proteína ApoB en suero en los días 17,y 24 del estudio, hasta el 23 % (p<0,0001) y 17 % (p<0,0001) de los niveles de control, respectivamente. Con respecto a PBS, 10 mg/kg IP de ONT-89 produjeron reducciones significativas de los niveles de proteína ApoB en suero en los días 17 y 24 del estudio, hasta el 29 % (p<0,0001) y 23 % (p<0,0001) de los niveles de control, respectivamente.
Tabla E-28d: Niveles de apolipoproteína B humana en suero con respecto a PBS después de múltiples dosis IP de 10 mg/kg de estereoisómero (ONT-87, -88 o -89) o Mipomersen en ratones huApoB (N = 3-4)
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En comparación con 10 mg/kg IP de mipomersen, ONT-87 administrado con el mismo paradigma de dosis produjo significativamente mayor reducción (atenuación) de los niveles de proteína ApoB en suero en el día 17 (p<0,05) del estudio. En comparación con 10 mg/kg IP de mipomersen, ONT-88 administrado con el mismo paradigma de dosis produjo significativamente mayor reducción (atenuación) de los niveles de proteína ApoB en suero en el día 17 (p<0,05) del estudio. En comparación con 10 mg/kg IP de mipomersen, ONT-89 administrado con el mismo paradigma de dosis produjo significativamente mayor reducción (atenuación) de los niveles de proteína ApoB en suero en el día 17 (p<0,05) del estudio.
Por lo tanto, en al menos algunas realizaciones, el presente método inventivo proporciona composiciones de oligonucleótidos quiralmente controlados que muestran una actividad biológica y se caracterizan por persistencia prolongada y/o menor tasa de descomposición de esa actividad con el tiempo en comparación con una referencia apropiada (por ejemplo, un preparado de oligonucleótidos de la misma secuencia pero diferente especificidad quiral, que incluye particularmente preparados estereoaleatorios). En algunas realizaciones donde se observa dicha persistencia prolongada y/o menor tasa de descomposición, las composiciones quiralmente controladas proporcionadas se pueden administrar según una pauta posológica con menos dosis totales y/o periodos más largos entre dos o más dosis que las utilizadas con la composición estereoaleatoria "parental" para lograr un efecto biológico y/o terapéutico comparable. Por ejemplo, el regreso más lento al nivel basal de la proteína ApoB en suero tras el tratamiento con oligonucleótido quiralmente puro en comparación con Mipomersen como se demuestra en el presente ejemplo, sugiere que los oligonucleótidos ApoB quiralmente puros pueden ser administrados menos frecuentemente que la mezcla estereoaleatoria parental mezcla (por ejemplo, que Mipomersen).
Los resultados presentados en este ejemplo demuestran, por ejemplo, que las composiciones de oligonucleótidos quiralmente puros pueden tener actividad farmacológica significativamente diferentes in vivo en comparación con una re fe re n c ia a p ro p ia d a (po r e jem p lo , un p re p a ra d o de o lig o n u c le ó tid o s de la m ism a s e cu e n c ia pe ro e sp e c ific id a d qu ira l d ife re n te , que in c luye p a rticu la rm e n te p re p a ra d o s e s te re o a le a to rio s ), y e sp e c ífica m e n te en c o m p a ra c ió n con un p re p a ra d o e s te re o a le a to r io "p a ren ta l" . Los e xp e rto s en la té cn ica , en v is ta de e s ta d e m o n s tra c ió n , a p rec ia rán q u e las co m p o s ic io n e s de o lig o n u c le ó tid o s q u ira lm e n te co n tro la d o s p ro p o rc io n a d a s p o r la p re se n te d ivu lg a c ió n tien en a c tiv id a d e s y ca ra c te rís tica s in esp e rad as . Los e xp e rto s en la té cn ica , en v is ta de la p re sen te d ivu lg a c ió n , a p rec ia rán a d e m á s que se p ro po rc ion an d ive rsa s m e tod o log ía s , que in c luye n m é tod os te ra p é u tic o s que u tilizan pa u tas p o so ló g ica s que se d ife re n c ia n de las u tiliza d o s pa ra c o m p o s ic io n e s no q u ira lm e n te co n tro la d a s (po r e jem p lo , de la m ism a s e cu e n c ia de nuc le ó tido s ). En a lgu nas re a liza c io n e s , se pu ed en u tiliz a r do s is in d iv id u a le s re la tiva m e n te m ayo res de o lig o n u c le ó tid o s q u ira lm e n te co n tro la d o s (po r e je m p lo , q u ira lm e n te pu ros) en c o m p a ra c ió n con un con tro l (po r e jem p lo , un con tro l e s te re o a le a to rio ). En a lg u n a s rea liza c io nes , se pu ed en u tiliz a r d o s is in d iv id u a le s re la tiva m e n te m ás p e q u e ñ a s de o lig o n u c le ó tid o s q u ira lm e n te c o n tro la d o s (po r e je m p lo , q u ira lm e n te pu ros) en c o m p a ra c ió n con un con tro l (p o r e jem p lo , un con tro l e s te re o a le a to rio ). En a lgu nas rea liza c io nes , se pu ed en u tiliz a r re la tiva m e n te m enos d o s is de o lig o n u c le ó tid o s q u ira lm e n te co n tro la d o s (po r e jem p lo , q u ira lm e n te pu ros) en c o m p a ra c ió n con un con tro l (po r e jem p lo , un con tro l e s te re o a le a to rio ) de n tro d e un p e rio do de t ie m p o dado.
Ejemplo 70: Agentes de ARNip que comprenden oligonucleótidos quiralmente controlados inhiben PCSK-9 El p re se n te e je m p lo d e m u e s tra la in h ib ic ión sa tis fa c to ria de la e xp re s ió n de l gen d ia n a u sa nd o ag en te s de A R N ip que co m p re n d e n o lig o n u c le ó tid o s q u ira lm e n te co n tro la d o s co m o se d e sc rib e en el p re se n te do cu m e n to . E spe c íficam en te , e s te e je m p lo d e sc rib e la h ib rid ac ión de c a d e n a s de o lig o n u c le ó tid o s in d iv id u a le s p re p a ra d a s m ed ia n te s ín tes is q u ira lm e n te co n tro la d a co m o se d e sc rib e en e l p re se n te do cu m e n to , de m an e ra q u e se p ro p o rc io n e n c o m p o s ic io n e s de o lig o n u c le ó tid o s de A R N ip b ica te n a rio q u ira lm e n te co n tro la d o s . Este e je m p lo ad ic io n a l d e m u e s tra la tra n s fe cc ió n s a tis fa c to r ia de cé lu la s con d ich o s ag e n te s y, ad em á s , la inh ib ic ión sa tis fa c to ria de la e xp re s ió n de l gen d iana . Transfección de ARNip de moléculas quirales de ARNip
S e tra n s fe c ta ro n de fo rm a in ve rsa cé lu la s H ep3B o H eLa a u n a de n s id a d de 2 ,0 x 104 c é lu la s /p o c illo en p laca s de 96 poc illo s . La tra n s fe cc ió n de A R N ip se llevó a ca b o con L ip o fe c ta m in e R N A iM ax (L ife T e ch n o lo g ie s , ca t. N .° 13778 ­ 150) u sa n d o e l p ro to co lo de l fa b rica n te , e xce p to con un a ca n tid a d re d u c id a de L ip o fe c ta m in e R N A iM ax de 0 ,2 ul po r poc illo . S e c rea ron d o ce d ilu c io n e s 1 :3 de d ú p le x de A R N ip e m p e z a n d o en 1 uM , 10 ul de 10x d ú p le x de A R N ip , luego se lipop le ja ro n con u n a m ezc la p re p a ra d a de 9 ,8 ul de m ed io s in sue ro y 0 ,2 ul de L ip o fe c ta m in e R N A iM a x p o r poc illo . D espués de u n a in cub ac ió n de 10 -15 m inu tos, se añ ad ie ro n 2 ,0 x 104 cé lu la s en 80 ul de m ed io de c re c im ie n to de cé lu la s E M E M (A TC C , 30 -2003 ) pa ra lle va r e l v o lu m e n fina l a 100 ul p o r po c illo . S e rea liza ron dos e ve n to s de tra n s fe c c ió n s e p a ra d o s pa ra c a d a dos is .
24 ho ras d e sp u é s de la tra n s fe cc ió n , se lisa ron cé lu la s H ep3B o H e La y se pu rificó A R N m de P C S K 9 u sa n d o el k it de a is la m ie n to de A R N to ta l M agM AX™ -96 (L ife T e ch n o lo g ie s , A M 1830 ); se s in te tiza ro n 15 ul de A D N c con el k it H igh C a p a c ity cD N A R e verse T ra n sc rip tio n con in h ib id o r de R N asa (L ife T e ch n o lo g ie s , 4374967 ). La e xp re s ió n g é n ic a se e va lu ó p o r P C R en t ie m p o real en un L ig h tcyc le r 480 (R oche ) u sa nd o P robes M a s te r M ix (R oche , 04 707 494 001) seg ún e l p ro to co lo de l fa b rica n te u sa nd o un co n ju n to de s o n d a T a q m a n m a rca d a con FAM p a ra P C S K 9 (L ife T e ch n o lo g ie s , H s03037355 _ m 1 ) y un con tro l e n d ó g e n o lim itado a c e b a d o r de G A P D H m arca do con V IC (L ife T e ch n o lo g ie s , N M _ 002046.3 ).
CI50 y análisis de datos
S e usó e l m é todo de d e lta C t p a ra c a lc u la r va lo re s . Las m ue s tra s se no rm a liza ro n a hG A P D H y se c a lib ra ro n a m u e s tra s tra n s fe c ta d a s con v e c to r va c ío y sin tra ta r. S e usó un a m o lé cu la e s te re o a le a to r ia co m o con tro l pos itivo . Los d a to s se rep re se n ta n co m o u n a m e d ia de 2 d u p lica d o s b io ló g ico s u sa nd o G raph pa d P rism . S e a ju s tó u n a cu rv a de reg res ió n linea l de cu a tro p a rá m e tro s a los d a to s y la pa rte s u p e rio r y la pa rte in fe rio r se lim ita ron a u n a co n s ta n te de 0 y 100, re sp e c tiva m e n te , pa ra c a lc u la r una C I50 re la tiva .
Tabla E-29. Valores relativos de CI50 [transfección de Hep3B]
Figure imgf000322_0001
Figure imgf000323_0001
Tabla E-30. Valores relativos de CI50 [transfección de HeLa]
Figure imgf000323_0002
Tabla E-31. Valores relativos de CI50 de ARNip con 3 estereocentros de fosforotioato [transfección de HeLa]
Figure imgf000323_0003
Las Figuras 45-50 presentan los resultados de estos estudios. La Figura 45 muestra el % de ARNm de PCSK-9 que queda después del tratamiento de Hep3B con dúplex de ARNip. La Figura 46 muestra el ajuste de la curva del % de ARNm de PCSK-9 que queda después del tratamiento de Hep3B con dúplex de ARNip. La Figura 47 muestra el % de ARNm de PCSK-9 que queda después del tratamiento de HeLa con dúplex de ARNip. La Figura 48 muestra el ajuste de la curva del % de ARNm de PCSK-9 que queda después del tratamiento de HeLa con el dúplex de ARNip. La Figura 49 muestra el % de ARNm de PCSK-9 que queda después del tratamiento de HeLa con dúplex de ARNip que contiene 3 estereocentros de fosforotioato. La Figura 50 muestra el ajuste de la curva del % de ARNm de PCSK-9 que queda después del tratamiento de HeLa con dúplex de ARNip que contiene 3 estereocentros de fosforotioato.
Como se puede apreciar, en moléculas con un único fosforotioato estereoquímicamente definido en cada cadena, se observó una potencia ligeramente elevada con moléculas con estereoquímica Sp en el fosforotioato en tanto cadenas codificantes como no codificantes Mientras que los agentes de ARNip específicamente ejemplificados contuvieron solo un centro quiral por cadena, los expertos en la técnica, que leen la presente divulgación, reconocerán la significancia del efecto diferencial demostrado como prueba del principio de que la presencia de quiralidad puede afectar la actividad.
El impacto de la quiralidad es más pronunciado en ARNip con más de dos estereocentros. En los ARNip con 3 fosforotioatos quirales (uno en la cadena codificante y dos en la cadena no codificante), una estereoquímica 5'p en el extremo 5' (entre los nucleótidos n1 y n2) combinada con una estereoquímica Rp en el extremo 3' (entre los nucleótidos n20 y n21) de la cadena no codificante tuvo un efecto perjudicial sobre la potencia. Sin embargo, una estereoquímica Rp en el extremo 5' (entre los nucleótidos n1 y n2) combinada con una estereoquímica Sp en el extremo 3' (entre los nucleótidos n20 y n21) de la cadena no codificante mostró una mejora significativa en la atenuación de ARNm de PCSK-9 con respecto al ARNip de control estereoaleatorio. Los resultados sugieren que ambas cadenas están afectadas por la estereoquímica del fosforotioato. Es probable que el diferencial de eficacia observado aumente para agentes con mayores números de centros quirales y además que tanto la localización como el tipo de centro quiral pueda afectar la actividad, por ejemplo, mediante efectos sobre la estabilidad, la potencia, y/o ambas. Los expertos en la técnica, que leen la presente divulgación, apreciarán, por lo tanto, que proporciona enseñanzas de composiciones de oligonucleótidos quiralmente controlados tanto mono- como bicatenarios, y usos de los mismos, que, en al menos algunas realizaciones, distinguen dichos oligonucleótidos quiralmente controlados y agentes de agentes estereoaleatorios de secuencia idéntica.
Ejemplo 71. O ligonucleótidos adicionales a modo de ejemplo y síntesis de los mismos.
Figure imgf000324_0001
Se sintetizaron los oligonucleótidos N101-N104 usando la síntesis automatizada en el sintetizador de ADN/ARN ABI-394 según el ciclo sintético resumido en la Tabla E-32, usando una columna de síntesis de 1 pmol y 1,7 pmoles de dGCEPac unido a oxalilo sobre HCP. El ciclo de síntesis se realizó con retirada del grupo 5'-0-DMTr terminal (DMT Apagado). Después de terminar la síntesis automatizada de oligonucleótidos, el soporte de HCP se lavó con ACN seco y se secó a vacío. El HCP seco se puso en un vial de plástico y se trató con 1 ml de NH3 sat./Py durante 1 h a 55 °C, luego 1 ml de propilamina seca en piridina seca (en una relación 1:4) durante 18 h a TA. Entonces se evaporaron los disolventes y el residuo se volvió a suspender con disolución acuosa de HCl de pH ~ 1,5 que contenía 10 % de DMSO y el soporte de HCP se separó por filtración. El producto en bruto se purificó por HPLC preparativa de fase inversa (según el procedimiento descrito a continuación). Se reunieron las fracciones que tenían pureza superior al 95 %, se concentraron y se desalaron por HPLC de fase inversa (según el procedimiento descrito a continuación). El producto desalado final se liofilizó del agua.
Tabla E-32. Resumen de la síntesis de oligonucleótidos en un sintetizador de ADN/ARN ABI-394 usado para la síntesis de oligonucleótidos N101-N102.
e ta p a reacc ión reac tivo tie m p o de t ie m p o de a d m in is tra c ió n (s) e sp e ra (s)
1 d e s tritila c ió n 3 % de T C A en D C M 3 60 10 N .A .
2 a co p la m ie n to fo s fo ra m id ito 0 ,15 M en A C N C M P T 1,2 M en 5 4 30 600
A C N
3 te rm in a c ió n 1 5 % de P ac2Ü en T H F /2 ,6 - lu tid in a 20 60
4 te rm in a c ió n 2 5 % de P ac2Ü en T H F /2 ,6 - lu tid in a 16 % de NMI 20 60
en TH F
5 su lfu riza c ió n S -(N -m e tilp ip e ra z in o e til-T o lu ilT io S u lfo n a to 0,3 M 7 1 ,5 x 4 360 3 x 180
900
Figure imgf000325_0001
en A C N /B S T F A
Ejemplo 72. Método de HPLC para N101 y N102:
T am pó n A : T E A A 50 m M , pH 9 ,6 (a jus tad o con TE A )
T am pó n B: A C N
C o lum n a : X B rid g e Cs, 3 ,5 pm , 4 ,6 x 50 m m , p ie za N.° 186003034
T e m p e ra tu ra e s ta b le c id a de l c a le n ta d o r de ta m p ó n = 35 °C
S eñ a l m o n ito r iza d a a 254 y 280 nm
G ra d ie n te usado :
T ie m p o C a u d a l (m l/m in ) % de A % de B C u rva In ic ia l 99 1
2 1 99 1 1
22 1 70 30 6
25 1 5 95 6
25 ,5 1 5 95 6
30 1 99 1 1
Ejemplo 73. Método general de UPLC-LCMS para N101 y N102.
T am pó n A : fo rm ia to de a m o n io 10 m M , pH 9,5 (a jus tad o con N H 3 ac.)
T a m p ó n B: A C N
C o lu m n a : U P L C @ O S T C is 1,7 pm , 2,1 x 500 mm
T e m p e ra tu ra de la c o lu m n a = 35 °C
G ra d ie n te usado :
T ie m p o (m in) C a ud a l (m l/m in ) % de A % de B C u rva
In ic ia l 0 ,5 99 1
2 0,5 99 1 1
12 0,5 60 40 6
13 0,5 5 95 6
13,5 0,5 5 95 6
15 0,5 99 1 1
Ejemplo 74. Método general de purificación para N101 y N102:
T a m p ó n A : T E A A 50 m M p H = 9 ,6 (a ju s ta d o con TE A )
T a m p ó n B: A C N
o lu m n a : X B rid g e P rep C is, 5 pm , C is, 250 x 10 m m , p ie za N.° 186003256
T e m p e ra tu ra e s ta b le c id a de l c a le n ta d o r de ta m p ó n = TA
S eña l m o n ito riza d a a 254 y 280 nm
G ra d ie n te usado :
T ie m p o C a ud a l (m l/m in ) % de A % de B C u rva In ic ia l 99 1
5 4 99 1 1
10 4 95 5 6
30 4 74 26 6
35 4 5 95 6
36 4 5 95 6
38 4 99 1 6
45 4 99 1 1
S e a ñ ad ie ro n 100 p l de 49-51 % de ác ido fo s fó r ic o a ca d a fra cc ió n (pH 3) y se co m p ro b ó p o r H P LC , e n to n ce s se g u a rd ó a -80 °C ha s ta q u e se co n g e ló . Las fra cc io n e s se m an tu v ie ro n en el lio filiz a d o r d u ra n te un p a r de ho ras hasta v o lú m e n e s de / , e n to n ce s se g u a rd a ro n a -80 °C.
Ejemplo 75. Método general de desalación para N101 y N102:
T am pó n A : Á c id o fó rm ico 10 mM
T am pó n B: A C N
C o lum n a : X B rid g e P rep Ci8, 5 pm , C i8, 250 x 10 m m , p ie za N .° 186003256
T e m p e ra tu ra e s ta b le c id a de l c a le n ta d o r de ta m p ó n = TA
S eñ a l m o n ito r iza d a a 254 y 280 nm
G ra d ie n te usado :
T iem p o C a u d a l (m l/m in ) % de A % de B C u rva
In ic ia l 100 0
12 4 100 0 1
13 4 65 35 6
21 4 65 35 1
21 ,5 4 100 0 6
30 4 100 0 1
Las fra cc io n e s re co g id a s se a lm a ce n a ro n a -80 °C h a s ta que se co n g e la ro n y se m an tu v ie ron en un lio filiza d o r hasta se q u e d a d y se co m p ro b a ro n po r H PLC .
Ejemplo 76. Síntesis del o ligonucleótido N101 (Todo-(fíp)-df5mCs16As16Gs16T1 (s16 =
Figure imgf000327_0001
S e s in te tizó el o lig o n u c le ó tid o N101 com o se ha d e sc rito a n te r io rm e n te y se pu rificó . RT en R P -H P LC : (M é tod o N1 de H P LC ): 15 ,9 m in . U P L C /E S I-M S : C a lcd : 1614 ,64 ; ha lla do [+H ]: 1615 ,06.
Ejemplo 77. Síntesis del o ligonucleótido N102 (Todo-(Sp)-df5mCs16As16Gs16T1)
O lig o n u c le ó tid o N 102 co m o se ha d e sc rito a n te r io rm e n te y pu rifie d . R T en R P -H P LC (M é tod o N1 de H P LC ): 16,4 m in. U P L C /E S I-M S : C a lcd : 1614 ,64 ; ha lla do [+H ]: 1614 ,97.
Ejemplo________7 8.________Síntesis________ de]________oligonucleótido________ N103________ (Todo-(fíp)-d[5mCs16As16Gs16Ts165mCs16Ts16Ggs165mCs16Ts16Ts165mCs16G1)
S e s in te tizó el o lig o n u c le ó tid o N 103 c o m o se ha d e sc rito an te rio rm e n te . RT en R P -H P LC (M é tod o N1 de H P LC ): 18 ,4 m in. U P L C /E S I-M S : C a lcd p a ra C 197H311N 62O 62P 11S 11: 5233 ,38 ; ha lla do : 5234 ,7.
Ejemplo________7 9.________Síntesis________ del________oligonucleótido________ N104________ (Todo-(Sp)-d[5mCs16As16Gs16Ts165mCs16Ts16Gs165mCs16Ts16Ts165mCs16Gl1
S e s in te tizó el o lig o n u c le ó tid o N 104 c o m o se ha d e sc rito an te rio rm e n te . RT en R P -H P LC (M é tod o N1 de H P LC ): 18 ,7 m in. U P L C /E S I-M S : C a lcd : 5233 ,38 ; ha llado : 5232 ,9.
S e s in te tiza ro n los o lig o n u c le ó tid o s N 105 -N 106 usa nd o la s ín te s is a u to m a tiz a d a en el s in te tiz a d o r de A D N /A R N A B I-394 según el c ic lo s in té tico resu m ido en la T a b la E-33, usando una c o lu m n a de s ín te s is de 1 pm o l y 1,7 pm o le s de d G CE Pac un id o a oxa lilo sob re H C P. El c ic lo de s ín te s is se rea lizó con re tira d a de l g ru p o 5 '-0 -D M T r te rm in a l (D M T A p a g a d o ). D e spu és de f in a liza r la s ín te s is a u to m a tiz a d a de o lig o n u c le ó tid o s , e l so p o rte de H C P se lavó con A C N seco y se secó a vac ío . El H C P seco se puso en un v ia l de p lás tico y se tra tó con 1 m l de N H 3 sa t./i-P rO H d u ra n te 16 h a 55 °C. E n to nces se eva p o ró el d iso lve n te y el res iduo se vo lv ió a su sp e n d e r con d iso lu c ió n a cu o sa de pH 7 ,0 que c o n te n ía 10 % de D M S O y el so p o rte de H C P se se p a ró po r filtrac ión . El p ro du c to en b ru to se pu rificó po r H P LC p re p a ra tiv a de fa se inversa . Se reun ie ron las fra cc io n e s que ten ía n p u re za su p e rio r al 95 % , se co n ce n tra ro n y se d e sa la ro n po r H P LC de fase inve rsa . El p ro d u c to d e sa la d o fina l se lio filizó de l agua .
Tabla E-33. Resumen de la síntesis de oligonucleótidos en un sintetizador de ADN/ARN ABI-394 usado para la síntesis de oligonucleótidos N105-N106.
e ta p a reacc ión reac tivo tie m p o de tie m p o de
a d m in is tra c ió n (s) e sp e ra (s)
1 de s tritila c ió n 3 % de T C A en DC M 3 60 10 N.A.
2 aco p la m ie n to fo s fo ra m id ito 0 ,15 M en A C N C M P T 5 4 30 600
1,2 M en A C N
3 te rm in a c ió n 1 5 % de P ac2O en T H F /2 ,6 - lu tid in a 20 60
4 te rm in a c ió n 2 5 % de P ac2O en T H F /2 ,6 - lu tid in a 20 60
16 % de NMI en T H F
5 su lfu riza c ió n 0,3 M 7 1 ,5 x 4 360 3 x 180
900
Figure imgf000328_0001
en A C N /B S T F A
Ejemplo 80. Método de HPLC para N101 y N102:
T am pó n A : T E A A 50 m M , pH 7,0
T am pó n B: A C N
C o lum n a : X B rid g e Cs, 3 ,5 pm , 4 ,6 x 150 m m , p ie za N.° 186003034
T e m p e ra tu ra e s ta b le c id a de l c a le n ta d o r de ta m p ó n = 35 °C
S eña l m o n ito riza d a a 254 y 280 nm
G ra d ie n te usado :
T iem p o C a u d a l (m l/m in ) % de A % de B C u rva In ic ia l 99 1
2 1 99 1 1
22 1 80 20 6
25 1 5 95 6
25 ,5 1 5 95 6
30 1 99 1 1
Ejemplo 81. Método general de UPLC-LCMS para N101 y N102.
T a m p ó n A : fo rm ia to de am o n io 10 m M , pH 7,0
T a m p ó n B: A C N
C o lu m n a : U P L C @ O S T C i8 1,7 pm , 2,1 x 500 mm
T e m p e ra tu ra de la c o lu m n a = 35 °C
G ra d ie n te usado :
T ie m p o (m in) C a ud a l (m l/m in ) % de A % de B C u rva
In ic ia l 0,5 99 1
2 0,5 99 1 1
12 0,5 70 30 6
13 0,5 5 95 6
13,5 0,5 5 95 6
15 0,5 99 1 1
Ejemplo 82. Síntesis del oligonucleótido N105 (Todo-(fíp)-df5mCs9As9Gs9T1 (s9 =
Figure imgf000329_0001
S e s in te tizó el o lig o n u c le ó tid o N 105 co m o se ha d e sc rito an te rio rm e n te . RT en R P -H P LC : (M é tod o N 2 de H P LC ): 14,1 m in . U P L C /E S I-M S : C a lcd : 1977 ,78 ; ha lla do [-H ]: 1978 ,8.
Ejemplo 83. Síntesis del oligonucleótido N106 (Todo-(Sp)-d[5mCs9As9Gs9T1
S e s in te tizó el o lig o n u c le ó tid o N 106 y se p u rificó co m o se ha d e sc rito a n te rio rm e n te . RT en R P -H P LC (M é tod o N2 de H P LC ): 14 ,7 m in . U P L C /E S I-M S : C a lcd : 1977 ,78 ; ha lla do [-H ]: 1977 ,37.
S e s in te tiza ro n los o lig o n u c le ó tid o s xxx usa n d o la s ín te s is a u to m a tiza d a en el s in te tiz a d o r de A D N /A R N A B I-394 según el c ic lo s in té tico resu m ido en la T a b la E-33, usa nd o u n a c o lu m n a de s ín te s is de 1 pm o l y 1,7 p m o le s de d G CEPac un ido a o xa lilo sob re H C P. El c ic lo de s ín te s is se rea lizó con re tira da de l g ru p o 5 '-0 -D M T r te rm in a l (D M T A p a g a d o ). D espués de fin a liz a r la s ín te s is a u to m a tiz a d a de o lig o n u c le ó tid o s , el so p o rte de HC P se lavó con A C N seco y se secó a vacío . El H C P seco se puso en un v ia l de p lá s tico y se tra tó con 1 m l de N H 3 sa t./i-P rO H d u ra n te 16 h a 55 °C . El d iso lve n te e n to n ce s se e va p o ró y el res iduo se v o lv ió a s u s p e n d e r con d iso lu c ió n a c u o s a a pH 7,0 que c o n te n ía 10 % de D M S O y el so p o rte de H C P se sep a ró p o r filtra c ió n . El p ro d u c to en b ru to se p u rificó po r H P LC p re p a ra tiv a de fase inversa . S e reu n ie ron las fra cc io n e s que ten ía n p u re za s u p e rio r al 95 % , se co n ce n tra ro n y se d e sa la ro n po r H P LC de fase inve rsa . El p ro d u c to d e sa la d o fina l se lio filizó de l agua .
Tabla E-34. Resumen de la síntesis de oligonucleótidos en un sintetizador de ADN/ARN ABI-394.
e ta p a reacc ión rea c tivo tie m p o de tie m p o de a d m in is tra c ió n (s) e sp e ra (s)
1 d e s tritila c ió n 3 % de T C A en DC M 3 60 10 N.A.
2 aco p la m ie n to fo s fo ra m id ito 0 ,15 M en A C N C M P T 1,2 M en A C N 5 4 30 600 e ta p a reacc ión reac tivo tie m p o de t ie m p o de ad m in is tra c ió n (s) e sp e ra (s)
3 te rm in a c ió n 1 5 % de P ac2Ü en T H F /2 ,6 - lu tid in a 20 60
4 te rm in a c ió n 2 5 % de P ac2Ü en T H F /2 ,6 - lu tid in a 16 % de
Figure imgf000330_0001
TH F
5 su lfu riza c ió n 0,3 M 10 4 x2 300 3 x 150
600
Figure imgf000330_0002
n A C N /B S T F A
Ejemplo 84. Método general de purificación
T am pó n A : T E A A 50 m M
T am pó n B: A C N
C o lum n a : X B rid g e P rep Ci8, 5 pm , C i8, 250 x 10 m m , p ie za N .° 186003256
T e m p e ra tu ra e s ta b le c id a de l c a le n ta d o r de ta m p ó n = ta
S eñ a l m o n ito r iza d a a 254 y 280 nm
G ra d ie n te usado :
T ie m p o C a u d a l (m l/m in ) % de A % de B C u rva
In ic ia l 99 1
5 4 99 1 1
10 4 95 5 6
30 4 74 26 6
35 4 5 95 6
36 4 5 95 6
38 4 99 1 6
45 4 99 1 1
M étodo 5 de H P LC :
T ie m p o C a ud a l (m l/m in ) % de A % de B C u rva
In ic ia l 80 20
2 1 80 20 1
22 1 45 55 6
25 1 5 95 6
25 ,5 1 5 95 6
26 1 85 20 6
30 1 85 20 1
ONT-60: O ligonucleótido 149 Todo-(Rp)-dr5mCs8As8Gs8Ts85mCs8Ts8Gs85mCs8Ts8Ts85mCs8G1 (s8
Figure imgf000331_0001
S e s in te tizó el o lig o n u c le ó tid o co m o se ha d e sc rito a n te rio rm e n te . RT en R P -H P LC (M é tod o de H P LC 5): 15 ,80 m in. U P L C /E S I-M S : C a lcd : 6345 ,6 ; ha lla do : 6340 ,7.
ONT-69: Todo-(Sp)-dí5mCsl6As8Gs8Ts85mCs8Ts8Gs85mCs8Ts8Ts85mCs8G1
S e s in te tizó el o lig o n u c le ó tid o co m o se ha d e sc rito a n te rio rm e n te . RT en R P -H P LC (M é tod o 5 de H P LC ): 18,61 m in. U P L C /E S I-M S : C a lcd : 6345 ,6 ; ha lla do : 6340 ,6.
Ejemplo 85.
S e s in te tiza ro n los o lig o n u c le ó tid o s b lo ckm e ro y a ltm e ro m o d ifica d o s en P que c o n te n ía n ta n to en la ces in te rn u c le o tíd ico s de d ié s te r de fo s fo ro tio a to e s te re o d e fin id o s co m o tr ié s te r de fo s fo ro tio a to de m orfo lin o e tilo e s te re o d e fin id o s en un s in te tiz a d o r de A D N /A R N A B I-394 seg ún el c ic lo resu m ido en la T a b la E-4 usa n d o u n a co lu m n a de s ín te s is de 1 pm o l y 1 ,7 p m o le s de d G CEPac un ido a o xa lilo sob re H C P. S e in tro du jo cu a lq u ie r en la ce fo s fo ro tio a to m o d ifica d o en P e s te re o d e fin id o en p o s ic io n e s p re d e te rm in a d a s d e n tro de la s e c u e n c ia rea liza nd o cu a lq u ie ra de las e ta pas de s u lfu riza c ió n (1) o (2). El c ic lo de s ín te s is se rea lizó con re tira d a de l g ru p o 5 '-0 -D M T r te rm in a l (D M T A pa ga do ). El sop o rte só lido se lavó con A C N seco y se secó ba jo un flu jo de a rgón . El H C P seco se puso en un v ia l de p lás tico y se tra tó con 1 m l de p ro p ila m in a s e ca en p ir id in a se ca (en u n a re lac ión 1 :4) d u ra n te un p e rio do de 18 h a ta. E n to nces se eva p o ra ro n los d iso lve n te s y el res iduo se v o lv ió a s u s p e n d e r en D M S O y el so p o rte de H C P se sep a ró po r filtrac ión . El p ro d u c to en b ru to se pu rificó p o r H P LC p re p a ra tiv a de fase inve rsa . S e reu n ie ron las fra cc io n e s q u e ten ía n p u re za su p e rio r al 95 % , se co n ce n tra ro n y se d e sa la ro n po r H P LC de fase in ve rsa (g ra d ie n te de l 0 al 80 % de A C N ). El p ro d u c to d e sa la d o fina l se lio filizó de l agua .
Tabla E-4. Resumen de la síntesis de oligonucleótidos en un sintetizador de ADN/ARN ABI-394 usado para la síntesis del ejemplo 85.
e ta p a reacc ión reac tivo tie m p o de t ie m p o de e sp e ra a d m in is tra c ió n (s) (s)
1 d e s tritila c ió n 3 % de T C A en DC M 3 60 10 N.A.
2 a co p la m ie n to fo s fo ra m id ito 0 ,15 M en A C N C M P T 1,2 M en 5 4 30 600
A C N
3 te rm in a c ió n 1 5 % de P ac2O en T H F /2 ,6 - lu tid in a 20 60
e ta p a reacc ión reac tivo tie m p o de tie m p o de e sp e ra a d m in is tra c ió n (s) (s)
4 te rm in a c ió n 2 5 % de P ac2Ü en T H F /2 ,6 - lu tid in a 16 % de NMI 20 60
en T H F
5 su lfu riza c ió n 1 p -C lo ro fe n il t io su lfo n a to de S -m o rfo lin o e tilo 0 ,3 M 10 4 x2 300 3 x 150
600
Figure imgf000332_0001
en A C N /B S T F A
6 su lfu riza c ió n 2 M e tiltio su lfo n a to de S -c ia n o e tilo 0 ,3 M 10 4 x2 300 3 x 150
600
Figure imgf000332_0002
en A C N /B S T F A
Ejemplo 86. Método general de purificación para el Ejemplo 85:
T am pó n A : F osfa to 20 m M p H = 6 ,0 (a jus tad o con ác ido fos fó rico )
T am pó n B: A C N
C o lum n a : X B rid g e P rep C i8, 5 pm , C i8, 250 x 10 m m , p ie za N.° 186003256
T e m p e ra tu ra e s ta b le c id a de l c a le n ta d o r de ta m p ó n = 50 °C
S eña l m o n ito riza d a a 254 y 280 nm
G ra d ie n te usado :
T ie m p o C a ud a l (m l/m in ) % de A % de B C u rva
In ic ia l 99 1
5 4 99 1 1
10 4 77 23 6
60 4 70 30 6
65 4 20 80 6
70 4 20 80 6
71 4 99 1 6
80 4 99 1 1
M étodo 6 de H P LC
T am pó n A : A ce ta to de a m o n io 20 m M , pH 6,0
T a m p ó n B: A C N
C o lu m n a : X B rid g e Cs, 3 ,5 gm , 4 ,6 x 150 m m , p ieza N.° 186003034
T e m p e ra tu ra e s ta b le c id a de l c a le n ta d o r de ta m p ó n = 60 °C
S eñ a l m o n ito riza d a a 254 y 280 nm
G ra d ie n te usado :
T ie m p o C a ud a l (m l/m in ) % de A % de B C u rva
In ic ia l 90 10
2 1 90 10 1
22 1 75 25 6
25 1 5 95 6
25 1 5 95 6
25 ,5 1 90 10 6
30 1 90 10 1
ONT-71: Todo-(Rp)- df5mCs1As1GsTsSmCsTsGsSmCsTsTs15mCs1G1
S e s in te tizó el o lig o n u c le ó tid o co m o se ha de sc rito a n te rio rm en te . RT en R P -H P LC (M é tod o de H P LC 6): 9 ,39 m in. U P L C /E S I-M S : C a lcd : 4297 ,9 ; ha lla do : 4295 ,3
ONT-72: Todo-(Sp)- df5mCs1As1GsTsSmCsTsGsSmCsTsTs15mCs1G1
S e s in te tizó e l o lig o n u c le ó tid o co m o se ha d e sc rito an te rio rm e n te . RT en R P -H P LC (M é tod o de H P LC 6): 10 ,84 m in. U P L C /E S I-M S : C a lcd : 4297 ,9 ; ha lla do : 4295 ,7
ONT-73: Todo-(Rp)- df5mCs1AsGs1Ts5mCs1TsGs1SmCsTs1Ts5mCs1G1
S e s in te tizó e l o lig o n u c le ó tid o co m o se ha d e sc rito an te rio rm e n te . RT en R P -H P LC (M é tod o de H P LC 6): 13 ,54 m in. U P L C /E S I-M S : C a lcd : 4524 ,2 ; ha lla do : 4522 ,6
ONT-74: Todo-(Sp)- df5mCs1AsGs1Ts5mCs1TsGs1SmCsTs1Ts5mCs1G1
S e s in te tizó e l o lig o n u c le ó tid o co m o se ha d e sc rito an te rio rm e n te . RT en R P -H P LC (M é tod o de H P LC 6): 15 ,52 m in. U P L C /E S I-M S : C a lcd : 4524 ,2 ; ha lla do : 4521 ,0
Las p ro p ie d a d e s de los o lig o n u c le ó tid o s de p ro fá rm a co , ta le s com o : re s is te n c ia a nu c le asas , a cu m u la c ió n en te jido , pe n e tra c ió n ce lu la r, e sca p e e n d o só m ico , in m u n o e s tim u la c ió n , d u ra c ió n de la acc ión , fa rm a co c in é tica , e tc ., son to d o s m o d u la d o s e in flu id os p o r la e s te re o q u ím ic a de los e n la ce s de l e sq u e le to de fo s fo ro tio a to qu ira l.
Se s in te tiza n o lig o n u c le ó tid o s de A R N q u e co n te n ía n 2 '-O H , 2 '-O M e, 2 '-F , 2 '-de sox i, e n la ce s in te rn u c le o tíd ico s fo s fo d ié s te r o d ié s te r de fo s fo ro tio a to e s te re o d e fin id o s in te rn u c le o tíd ico s o tr ié s te r de fo s fo ro tio a to es te re o d e fin id o s in te rn u c le o tíd ico s (P roD rug) (ya sea libe ra nd o un fo s fo d ié s te r in te rn u c le o tíd ico (PO ) o un d ié s te r de fo s fo ro tio a to e s te re o d e fin id o in te rn u c le o tíd ico (PS)) en un s in te tiz a d o r de A D N /A R N A B I 394 seg ún los c ic lo s resu m ido s en la T a b la E-35, T a b la E-36, T a b la E -37 y T a b la E -38 , u sa n d o una co lu m n a de s ín te s is de 10 g m o le s de ca p a c id a d c a rg a d a con 130 m g (4,9 g m o le s ) de 5 '-O -D M T r-2 '-d e s o x itim id in a un id a a o xa lilo p re p a ra d a co m o se d e sc rib e p re v ia m e n te . A n tes de la s ín tes is , se rea liza una e ta p a de te rm in a c ió n p re lim in a r (te rm in ac ió n 2) y la s ín tes is se te rm in a con la re tira da de g ru p o s 5 '-0 -D M T r te rm in a le s . La e ta p a de o x id a c ió n se rea liza u sa nd o u n a d iso lu c ió n 5-6 M co m e rc ia lm e n te d is p o n ib le de h id ro p e ró x id o de fe rc -bu tilo (T B H P ) en de can o , q u e luego se d ilu yó con cu a tro pa rte s de d ic lo ro m e ta n o . La e ta p a de su lfu riza c ió n e s te re o e s p e c ífic a p a ra e l en la ce d ié s te r de fo s fo ro tio a to e s te re o d e fin id o in te rn u c le o tíd ico se re a liza u sa nd o el rea c tivo de S -c ia n o e tilm e tilt io su lfo n a to 0 ,3 M tra s e l a c o p la m ie n to de la fo s fo ra m id a qu ira l c o rre s p o n d ie n te y el p ro ceso de te rm in a c ió n de do s e ta p a s (T ab la E-36). La e ta p a de su lfu riza c ió n e s te re o e sp e c ífica p a ra e l tr ié s te r de fo s fo ro tio a to e s te re o d e fin id o in te rn u c le o tíd ico q u e libe ra un e n la ce fo s fo d ié s te r (P S ) in te rn u c le o tíd ico e s te re o d e fin id o se re a liza u sa nd o e l rea c tivo S -fW -m o rfo lin oe tiltioé s te r-e tiO -pa ra -n itro -to lu iltio su lfon a to 0 ,3 M tra s el a c o p la m ie n to de la fo s fo ra m id a qu ira l co rre sp o n d ie n te y el p ro ce so de te rm in a c ió n de dos e ta p a s (T ab la E-37). La e ta p a de su lfu riza c ió n e s te re o e s p e c ífic a pa ra e l tr ié s te r de fo s fo ro tio a to e s te re o d e fin id o in te rn u c le o tíd ico qu e libe ra un e n la ce fo s fo d ié s te r (P O ) in te rn u c le o tíd ico se re a liza u sa nd o el rea c tivo S -fW -m o rfo lin o e til)-to lu iltio su lfo n a to 0 ,3 M tras el a c o p la m ie n to de la fo s fo ra m id a qu ira l c o rre s p o n d ie n te y el p ro ce so de te rm in a c ió n de do s e ta p a s (T a b la E-38). Para los nu c le ó tid o s de A R N 2 '-O H , se usan g ru p o s p ro te c to re s 2 '-O -base , ta le s co m o 2 '-O -P ivO M (D e ba rt e t a l., C hem . Eur. J., 2008 , 14, 9135 ) o 2 '-O -T C (D e llin g e r e t a/., J. A m . C hem . S oc., 2011 ,133 , 11540). S e usan g ru p o s p ro te c to res u ltra -su a ve s (C -A c, G -P ac, A -P ac ) pa ra to d a s las nuc le oba ses .
U na vez se ha te rm in a d o e l c ic lo de s ín te s is a u to m a tiza d a de o lig o n u c le ó tid o s y se re tira el g ru p o 5 '-O -D M T r fina l, la co lu m n a de s ín tes is se sa ca de l s in te tiz a d o r de A D N /A R N y se se ca a vac ío . S e añ ad en c o n tin u a m e n te 10 ml de d iso lu c ió n de 1 ,5 -d ia za b ic ic lo [4.3.0 ]n o n -5 -e n o (D B N ) 0 ,5 M, N ,O -b is (tr im e tils ilil) tr if lu o ro a c e ta m id a (B S T F A ) 0 ,25 M en A C N al sop o rte a tra v é s de la co lu m n a de s ín tes is d u ra n te 1 m in sin d e te n e r el f lu jo u sa nd o un a je r in g a un id a a un e x tre m o de la c o lu m n a de s ín tes is . El sop o rte se lava e n to n ce s con A C N a n h id ro y se s e ca a vac ío . E n tonces, el so p o rte se ca d o se tra n s fie re en un v ia l de p lá s tico de ta p a rosca da va c ío y se tra ta con d iso lu c ió n al 10 % de n -P rN H 2 en p ir id in a a n h id ra (1,5 m l) a te m p e ra tu ra am b ie n te d u ra n te 12 h. D espués de qu e los d iso lve n te s se e va p o re n a se q u e d a d y el res iduo q u e inc luye el sop o rte só lido se d isu e lva en 2 ml de a g u a /D M S O (50 /50 ) a pH 5, e l sop o rte se s e p a ra p o r filtra c ió n y los filtra d o s se recogen , se con g e la n in m e d ia ta m e n te y se g u a rd an a -80 °C an tes de la pu rifica c ión .
Tabla E-35. Resumen de la síntesis de oligonucleótidos en un sintetizador de ADN/ARN ABI 394
e ta p a reacc ión reac tivo tie m p o de t ie m p o de a d m in is tra c ió n (s) e s p e ra (s)
1 de s tritila c ió n 3 % de T C A en DCM 3 120 10 N. A.
2 a co p la m ie n to fo s fo ra m id ito 0 ,15 M en A C N C M P T 2 M en A C N 7 6 30 600
3 te rm in a c ió n 5 % de P ac2O en T H F /2 ,6 - lu tid in a 16 % de NMI en T H F 10 20
4 ox id a c ió n h id ro p e ró x id o de te rc -b u tilo 1,1 M en 4:1 de 20 110
d ic lo ro m e ta n o :d e ca n o
Tabla E-36. Resumen de la síntesis de oligonucleótidos en un sintetizador de ADN/ARN ABI 394
e ta p a reacc ión rea c tivo tie m p o de t ie m p o de e s p e ra (s) ad m in is tra c ió n
(s)
1 d e s tritila c ió n 3 % de T C A en DCM 3 120 10 N. A.
2 a co p la m ie n to fo s fo ra m id ito qu ira l 0 ,15 M en A C N C M P T 2 M 8 6 30 900 (2 '-O M e en A C N A R N ) 30 600 (A D N )
3 te rm in a c ió n 1 5 % de P ac2O en T H F /2 ,6 - lu tid in a 30 60
Figure imgf000334_0001
tid in a 16 % de 30 60 etapa reacción reactivo tiempo de tiempo de espera (s) administración
(s)
5 sulfurización S-(2-cianoetil)metiltiosulfonato 0,3 M 15+3x4 120+3x60+300
Figure imgf000335_0001
en ACN/BSTFA
Tabla E-37. Resumen de la síntesis de oligonucleótidos en un sintetizador de ADN/ARN ABI-394.
etapa reacción reactivo tiempo de tiempo de administración (s) espera (s)
1 destritilación 3 % de TCA en DCM 3 60 10 N.A.
2 acoplamiento fosforamidito 0,15 M en ACN CMPT 5 4 30 600
1,2 M en ACN
3 terminación 1 5 % de Pac2Ü en THF/2,6-lutidina 20 60
4 terminación 2 5 % de Pac2Ü en THF/2,6-lutidina 20 60
16 % de NMI en THF
5 sulfurización S-(A/-morfolinotioéster-etil-p-nitro- 10+4x2 300+3x150+
toluiltiosulfonato 0,3 M 600
Figure imgf000335_0002
n ACN/BSTFA
Tabla E-38. Resumen de la síntesis de oligonucleótidos en un sintetizador de ADN/ARN ABI-394.
etapa reacción reactivo tiempo de tiempo de espera administración (s) (s)
1 destritilación 3 % de TCA en DCM 3 60 10 N.A.
2 acoplamiento fosforamidito 0,15 M en ACN CMPT 5 4 30 600
1,2 M en ACN
3 terminación 1 5 % de Pac2Ü en THF/2,6-lutidina 20 60
4 terminación 2 5 % de Pac2Ü en THF/2,6-lutidina 20 60
16 % de NMI en THF
etapa reacción reactivo tiempo de tiempo de espera administración (s) (s)
5 sulfurización S-MorfolinoetilToluiltiosulfonato 0,3 M 10 4x2 300 3x150 600
Figure imgf000336_0002
Síntesis del oligonucleótido: (Rp)- uucuAGAccuGuuuuGcuudTs10dT
Síntesis del oligonucleótido ONT-107: (Sp)- uucuAGAccuGuuuuGcuudTs10dT
Síntesis del oligonucleótido ONT-108: (Rp)-AAGcAAAAcAGGUCuAGAAdTs10dT
Síntesis del oligonucleótido ONT-109: (Sp)-AAGcAAAAcAGGUCuAGAAdTs10dT
(si
Figure imgf000336_0001
Síntesis del oligonucleótido: (Rp, Rp)-as 1AGcAAAAcAGGUCuAGAAdTsdT
Síntesis del oligonucleótido: (Sp, Rp)- as 1GcAAAAcAGGUCuAGAAdTsdT
Síntesis del oligonucleótido: (Sp, Sp)- As1GcAAAAcAGGUCuAGAAdTsdT
Síntesis del oligonucleótido: (Rp, Sp)- As1GcAAAAcAGGUCuAGAAdTsdT
Síntesis del oligonucleótido: (Todo (Sp))-us 1 ucus 1 AGAccs 1 uGus 1 uus 1 uGcuudTs 10dT
Síntesis del oligonucleótido: (Todo (Rp))-As 1 OAGcAAAAcAGGs1 UCuAs1GAs1AdTs10dT
Hibridación térmica de cadenas de ARN y preparación de dúplex de ARNip. Se mezcla cada cadena de ARN con cadena de ARN complementario en concentración equimolar de 10 pM en 1 xPBS. Se prepara una disolución de 0,5 ml en total para cada dúplex y la mezcla se calienta a 90 °C durante 2 min y se deja enfriar durante el transcurso de varias horas. Las mezclas se almacenan entonces a 4 °C.
Tras la etapa de hibridación térmica de cadenas de ARN, se preparan todas las posibles combinaciones de dúplex de ARNip por hibridación de cualquiera de las cadenas codificantes con cualquier cadena complementaria posible de las cadenas no codificantes.
Todos los dúplex de ARNip preparados se evalúan in vitro para sus propiedades de silenciamiento génico de PCSK9, tras la transfección en células HeLa o células Hep3B.
Todos los dúplex de ARNip preparados con grupos ProDrug se evalúan in vitro para sus propiedades de silenciamiento génico de PCSK9, tras la captación libre en células Hep3B, Huh-7 o hepatocitos primarios humanos.
Se observan diferentes potencias, moduladas por el número, la posición y la estereoarquitectura de los enlaces del esqueleto de fosforotioato quiral, combinadas con las capas de modificaciones químicas adicionales y grupos ProDrug explorados.
Las propiedades del ARNip, tales como: resistencia a nucleasas, penetración celular, escape endosómico, estabilidad termodinámica del dúplex, estructura tridimensional del dúplex, afinidad hacia las diversas etapas mecanísticas de las interacciones de enzimas, afinidad hacia el ARNm diana, efectos inespecíficos específicos, inmunoestimulación, duración de la acción, farmacocinética, etc., son todos modulados e influidos por la estereoquímica de los enlaces del esqueleto de fosforotioato quiral, así como la presencia o la ausencia del grupo ProDrug.
La unión de grupos ProDrug que liberan PO y PS a los dúplex de ARNip potencia su administración intracelular y captación libre en ausencia de reactivo de transfección o ligando de direccionamiento.
Ejemplo 87: Estudios de estabilidad de los o ligonucleótidos diastereoméricamente puros
El presente ejemplo compara la estabilidad in vitro de oligonucleótidos quiralmente puros con la observada para la mezcla estereoaleatoria "parental" (es decir, para una composición que contiene oligonucleótidos de la misma secuencia que los oligonucleótidos quiralmente puros, pero que no presentan pureza quiral, por ejemplo, como resultado de haber sido preparados por un proceso estereoaleatorio). Siete oligonucleótidos quiralmente puros, cada uno de los cuales tenía una secuencia complementaria a la de un transcrito diana particular o gen que codifica una proteína de interés, se sintetizaron, formularon y evaluaron para estabilidad metabólica usando tres matrices biológicas diferentes: fosfodiesterasa de veneno de serpiente (svPDE), nucleasa P1 (nP1) y homogeneizados de hígado completo de rata. Se cuantificaron los niveles de oligonucleótido de longitud completa por IEX-HPLC después de diferentes periodos de incubación. Los resultados presentados en este ejemplo demuestran, por ejemplo, que las composiciones de oligonucleótidos quiralmente puros pueden tener estabilidad metabólica significativamente diferente en comparación con una referencia apropiada (por ejemplo, un preparado de oligonucleótidos de la misma secuencia, pero especificidad quiral diferente, que incluye preparados particularmente estereoaleatorios), y específicamente en comparación con un preparado estereoaleatorio "parental". En este ejemplo, los oligonucleótidos que tienen una secuencia antisentido (y, por lo tanto, que se dirigen a) apolipoproteína-B (ApoB) humana se usaron para el estudio de viabilidad en los estudios de estabilidad metabólica.
Estudio de digestión de fosfodiesterasa de veneno de serpiente (svPDE) para los oligonucleótidos ONT-75, ONT-77, ONT-80, ONT-81, ONT-87, ONT-88, ONT-89 y ONT-41
Los presentes inventores usaron el protocolo informado por Oka et al. (J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 16031-16037) con modificaciones menores. Se añadió oligonucleótido purificado (10 nmoles) en agua (50 pl) a la disolución acuosa (450 pl, pH 8,6) que contenía svPDE (4 x 10-3 unidades), Tris-HCl 100 mM y MgCl2 15 mM. La mezcla se incubó a 37 °C con agitación a 400 rpm. Se tomó una alícuota de 50 pl en cada momento (0 h, 12 h, 1 d, 2 d, 3 d, 4 d, 5 d, 6 d y 7 d) y se inactivó con 25 pl de EDTA 150 mM, 2 pl de disolución de proteinasa K (20 mg/ml) y 30 pl de tampón de lisis (Qiagen, N.° 129115) y la mezcla se calentó a 60 °C durante 20 min. Se añadieron 5 pl de patrón interno (5'-Gc GTTTGCTCTTCt TCt TGCGTTTTTT-3', un oligonucleótido 27-mero (los nucleótidos subrayados están modificados con 2'-MOE) (200 pM) a la alícuota. Los análisis de cuantificación se realizaron por IEX-HPLC y la identificación de metabolitos se llevó a cabo por UPLC/MS. Los resultados se ilustraron en la Figura 59.
El análisis de IEX-HPLC mostró la degradación de fosforotioato 20-mero durante la incubación con svPDE sin diferencia significativa entre estereoisómeros. El análisis de LCMS de metabolitos reveló que la mayoría de los productos de degradación se formaron como resultado de la desulfurización. Como se informó previamente por Prakash et al. (Biochemistry 2002, 41, 11642-11648), Prhavc et al. (Org.Lett., 2003, 5, 2017-2020) y otros, los presentes inventores también observaron que las modificaciones de 2'-MOE en los extremos 5' y 3' protegen estos oligómeros de la digestión de svPDE, que es una 3 '^ 5 ' exonucleasa.
Estudio de digestión de nucleasa P1 (nP1) para los oligonucleótidos ONT-75, ONT-77, ONT-80, ONT-81, ONT-87, ONT-88, ONT-89 y ONT-41
Los presentes inventores emplearon el protocolo informado por Oka et al. (J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 16031­ 16037) con modificaciones menores. Se añadió oligonucleótido purificado (10 nmoles) en agua (50 pl) a una disolución acuosa (500 pl, pH 7,2) que contenía nP1 (20 unidades), Tris-HCl 100 mM y ZnCl21 mM. La mezcla se incubó a 37 °C con agitación a 400 rpm. Se tomó una alícuota de 50 pl en cada momento (0 h, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h, 1 d, 2 d) y se inactivó con 25 pl de tampón de parada (EDTA 150 mM, 2 pl de disolución de proteinasa K (20 mg/ml) y 30 pl de tampón de lisis (Qiagen, N.° 129115) y la mezcla se calentó a 60 °C durante 20 min. Se añadieron 5 pl de patrón interno (5'-GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT-3'). un oligonucleótido 27-mero (los nucleótidos subrayados están modificados con 2'-MOE) (200 pM) a la alícuota. Los análisis de cuantificación se realizaron por IEX-HPLC y la identificación de metabolitos se llevó a cabo por UPLC/MS. Los resultados se ilustraron en las Figuras 60-67.
Se ha informado previamente que la nucleasa nP1 escinde específicamente los enlaces fosforotioato del ADN que tienen una configuración absoluta (Sp) en los átomos de fósforo (Porter et al., Biochemistry, 1983, 22, 1369-1377; Oka et al., J. Am. Chem. Soc., 2008, 130, 16031 -16037). Los presentes inventores observaron un patrón de escisión similar para los oligonucleótidos del fosforotioato del gápmero 5-10-52'-MOE estudiados, donde se descubrió que nP1 digería eficientemente el núcleo de ADN de los oligonucleótidos del gápmero en los centros de fosforotioato (Sp), sin afectar las alas de 2'-MOE, que fueron estables independientemente de la estereoquímica. La digestión completa del núcleo de ADN se observó en una hora para el oligonucleótido de la diastereomezcla estereoaleatoria ONT-41, así como para los oligonucleótidos estereopuros que contienen los enlaces internucleotídicos (Sp)-fosforotioato en el núcleo de ADN (ONT-77, ONT-80, ONT-87, ONT-88 y ONT-89). Todos los productos de escisión fueron claramente identificados por UPLC/MS. Como se informó previamente en la bibliografía, los presentes inventores descubrieron que el ADN del fosforotioato (Rp) no era claramente un sustrato para nP1. Los dos oligonucleótidos quiralmente puros que tenían núcleos de ADN del fosforotioato (Rp) (ONT-75 y ONT-81) fueron completamente estables para nP1 durante un periodo de incubación de 1 h a 37 °C. ONT-75 y ONT-81 mostraron aproximadamente el 10-15 % de pérdida de los p ro d u c to s de lo ng itud c o m p le ta d u ra n te el tra n scu rso de la in cub ac ió n d u ra n te va rio s d ías . Los resu ltad os p re se n ta d o s en e s te e je m p lo d e m u e s tra n , p o r e jem p lo , q u e las co m p o s ic io n e s de o lig o n u c le ó tid o s q u ira lm e n te pu ros po d ían te n e r e s ta b ilid a d m e ta b ó lica s ig n ifica tiva m e n te d ife re n te en un e n sa yo nP1 en c o m p a ra c ió n con u n a re fe re n c ia a p ro p ia d a (po r e jem p lo , un p re p a ra d o de o lig o n u c le ó tid o s de la m ism a secu en c ia , pe ro e sp e c ific id a d qu ira l d ife ren te , que inc luye p a rticu la rm e n te p re p a ra d o s e s te re o a le a to rio s ), y e sp e c ífica m e n te en c o m p a ra c ió n con un p re p a ra d o e s te re o a le a to rio "pa ren ta l" .
Método general de IEX-HPLC para el análisis de productos de digestión enzimática
T a m p ó n A : T risH C l 10 m M , 50 % de A C N , pH 8,0
T a m p ó n B: T risH C l 10 m M , NaC lO 4 800 nM , 50 % de A C N , pH 8,0
C o lum n a : D IO N E X , D N A P ac, P A -100 , 4 ,0 x 250 m m , p ieza N.° 063000
T e m p e ra tu ra de la c o lu m n a = 60 °C
S eñ a l m o n ito riza d a a 254 y 280 nm
G ra d ie n te usado :
T ie m p o (m in) C a ud a l (m l/m in ) % de A % de B C u rva
In ic ia l 95 5
2 1 95 5 1
3 1 75 25 6
10 1 35 65 6
10 ,1 1 95 5 6
12,5 1 95 5 1
Método general de UPLC-LCMS para el análisis de productos de digestión enzimática.
T a m p ó n A : T E A 15 m M , H F IP 400 m M , ag ua
T a m p ó n B: 50 :50 de ta m p ó n A /m e tan o l
C o lu m n a : U P L C @ O S T C 18 1,7 gm , 2,1 x 500 mm
T e m p e ra tu ra de la c o lu m n a = 60 °C
G ra d ie n te usado :
T ie m p o (m in) C a ud a l (m l/m in ) % de A % de B C u rva
In ic ia l 0,2 70 30
2 0,2 70 30 1
27 0,2 35 65 6
27,5 0,2 5 95 6
28,5 0,2 5 95 6
Tiempo (min) Caudal (ml/min) % de A % de B Curva
Inicial 0,2 70 30
29 0,2 70 30 6
30 0,2 70 30 1
Estabilidades metabólicas in vitro de oligonucleótidos diastereoméricamente puros humanos en homogeneizados preincubados de hígado completo de rata
Se midió la estabilidad metabólica de oligonucleótidos quiralmente puros en homogeneizados de hígado completo de rata in vitro. El protocolo empleado aquí ha sido previamente informado y usado para evaluar la estabilidad de fármacos de oligonucleótido.
Protocolo: En el presente estudio se empleó el protocolo informado por Geary et al. (Oligonucleotides, 2010, 20, 309) con algunas modificaciones.
Sistema de prueba: Fueron suministradas dos ratas Sprague-Dawley macho (Rattus norvegicus) por Charles River Laboratories, Inc., (Hollister, CA).
Recogida de te jido: Se aclimató a los animales a la sala del estudio durante dos días antes de la recogida del tejido. En el momento de la recogida de tejido, los animales se anestesiaron con una inyección intraperitoneal (IP) de disolución de pentobarbital sódico. La perfusión del hígado se realizó usando 500 ml de solución salina enfriada/animal, administrada por la vena porta hepática. Después de la perfusión, se diseccionaron los hígados y se mantuvieron sobre hielo. Los hígados se trituraron en trozos pequeños, luego se pesaron.
Preparación de homogeneizado de hígado: Se transfirieron los trozos triturados de tejidos de hígado a tubos de centrifugadora tarados de 50 ml y se pesaron. Se añadió tampón de homogenización enfriado (Tris 100 mM a pH 8,0, acetato de magnesio 1 mM, con antibióticos-antimicóticos) a cada tubo, de forma que el (los) tubo(s) contuviera(n) 5 ml de tampón por gramo de tejido. Usando un homogeneizador de tejido TissueRuptor de QIAGEN, se homogeneizó la mezcla de hígado/tampón mientras se mantenía el tubo sobre hielo. Se determinó la concentración de proteína del homogeneizado de hígado usando un ensayo de proteína BCA de Pierce. Se dividieron los homogeneizados de hígado en alícuotas de 1 ml, se transfirieron a crioviales y se guardaron a -60 °C.
Condiciones de incubación: Se descongelaron alícuotas de 1 ml de homogeneizado de hígado congelado (concentración de proteína = 31,9 mg/ml) y se incubaron a 37 °C durante 24 h. Se cogieron seis tubos Eppendorf (2 ml) y se añadió 450 ul de homogeneizado a cada tubo. Se añadió 50 pl del oligonucleótido de prueba (200 uM) a cada tubo. Inmediatamente después de la mezcla, se añadió 125 pl de (5X) tampón de parada (2,5 % de IGEPAL, NaCl 0,5 M, EDTA 5 mM, Tris 50 mM, pH=8,0) y 12,5 pl de 20 mg/ml de proteinasa K (Ambion, N.° AM2546) a un tubo durante el momento de tiempo 0 horas. Entonces se calentó la mezcla a 60 °C durante una hora. Las mezclas de reacción restantes se incubaron a 37 °C con agitación a 400 rpm en un agitador de microplacas de incubación VWR. Después de la incubación durante un periodo designado (1,2, 3, 4 y 5 días), cada mezcla se trató con 125 pl de (5X) tampón de parada (2,5 % de IG E P a L, NaCl 0,5 M, E d T a 5 mM, Tris 50 mM, pH=8,0) y 12,5 pl de 20 mg/ml de proteinasa K (Ambion, N.° AM2546).
Procesamiento y bioanálisis: Se usó (5'-GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT-3'), un oligonucleótido 27-mero (los nucleótidos subrayados están modificadas con 2'-MOE) como patrón interno para la cuantificación de oligonucleótidos diastereoméricamente puros. Se añadió 50 pl de patrón interno (200 pM) a cada tubo, seguido por la adición de 250 pl de 30 % de hidróxido de amonio, 800 pl de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25:24:1). Después de la mezcla y centrifugación a 600 rpm, se evaporó la fase acuosa en SpeedVac hasta 100 pl y se cargó sobre una columna Sep Pak (C18, 1 g, WAT 036905). Todos los lavados acuosos de la columna Sep Pak se probaron con el método de IEX rápido-HPLC para garantizar que no se encontró producto allí. El eluato de acetonitrilo se concentró a sequedad y se disolvió en 100 pl de agua y se analizó usando RP-HPLC.
Eluyente A = acetato de tributilamonio 10 mM, pH=7,0
Eluyente B = ACN
Columna: XTerra MS C18, 3,5 pm, 4,6 x 150 mm, número de pieza: 186000432
Temperatura de la columna = 60 °C
Gradiente de HPLC:
T ie m p o C a ud a l % de A % de B C u rva
1 1,0 65 35
2 5,0 1,0 65 35 1
3 30 ,0 1,0 40 60 6
4 35 ,0 1,0 5 90 6
5 36 ,0 1,0 65 35 6
6 40 ,0 1,0 65 35 1
La F igu ra 68 m u e s tra qu e o lig o n u c le ó tid o s q u ira lm e n te pu ros d ife re n te s tie n e n pe rfile s de e s ta b ilid a d m e ta b ó lica d ife re n te s en h o m o g e n e iza d o de h íg ado c o m p le to de rata. El e x p e rim e n to ta m b ié n d e m u e s tra que la m ezc la d ia s te re o is o m é ric a O NT-41 t ie n e un pe rfil de e s ta b ilid a d m e ta b ó lica d ife re n te en c o m p a ra c ió n con o lig o n u c le ó tid o s e s te re o d e fin id o s d ia s te re o m é ric a m e n te pu ros con la m ism a s e c u e n c ia y co m p o s ic ió n q u ím ica (O N T -75 y O N T -77 se usan a q u í co m o e jem p los , pero e s ta o b se rva c ió n , co m o se a p re c ia p o r un e xp e rto ha b itu a l en la té cn ica , se puede e x tra p o la r a o tro s po s ib les d ia s te re o is ó m e ro s de fo s fo ro tio a to e s te re o d e fin id o s d ia s te re o m é ric a m e n te pu ros de es ta m o lécu la ).
El o lig o n u c le ó tid o O N T -75 , que tie n e un e sq u e le to de fo s fo ro tio a to e s te re o c o n tro la d o con co n fig u ra c ió n a b so lu ta de Rp co m p le ta en to d o s los á to m o s de fó s fo ro , se d e g ra d ó co m p le ta m e n te en un d ía en ho m o g e n e iza d o s de h íg ado c o m p le to de ra ta p re in cu b a d o s a 37 °C , qu e d e m u e s tra la e s ta b ilid a d m e ta b ó lica m ás ba ja de los tres usa do s en el es tu d io .
El o tro o lig o n u c le ó tid o de fo s fo ro tio a to e s te re o d e fin id o d ia s te re o m é ric a m e n te pu ro O N T -77 (que t ie n e co n fig u ra c ió n a b so lu ta : 5 R -10 S -4 R ) fu e m ás de dos ve ce s m ás e s ta b le que el O NT-41 e s te re o a le a to r io (m ip om erse n ). D e spués de la in cub ac ió n d u ra n te 5 d ías , qu e d ó el 40 % de l o lig o n u c le ó tid o de lo ng itud co m p le ta p a ra e l O N T -77 d ia s te re o m é ric a m e n te pu ro fre n te a a p ro x im a d a m e n te el 15 % de o lig o n u c le ó tid o de long itud co m p le ta pa ra e l O N T-41 e s te re o a le a to r io (m ip om erse n ). U na c o m p a ra c ió n d ire c ta e n tre O N T -77 y O N T-41 d e m o s tró c la ra m e n te una e s ta b ilid a d m e ta b ó lica s ig n ifica tiva m e n te m ás a lta pa ra e l isó m ero e s te re o c o n tro la d o 5R -10 S -4 R (O N T -77), en tod os los m o m e n tos de t ie m p o an a lizad os . La a rq u ite c tu ra e s te re o d e fin id a de l isó m ero d ia s te re o m é ric a m e n te pu ro O N T -77 a fe c ta c la ra m e n te la ta s a de d e g ra d a c ió n y la e s ta b ilid a d m e ta b ó lica g lo b a l de es te o lig o n u c le ó tid o . E stas o b s e rv a c io n e s co n d u ce n a la co n c lu s ió n , sin la in te nc ión de lim ita r p o r te o ría , que la e s te re o q u ím ic a S p a p lica d a al nú c le o de A D N de l o lig o n u c le ó tid o de g á p m e ro 5 -10 -5 p ro p o rc io n a re s is te n c ia a e n d o n u c le a s a s p o te n c ia d a y, po r ta n to , e s ta b ilid a d m e ta b ó lica p o te n c ia d a en c o m p a ra c ió n con la d ia s te re o m e z c la es te re o a le a to ria . C a b ría e s p e ra r que a lg u n a s o tras e s te re o a rq u ite c tu ra s usa da s pa ra o tro s isó m eros de fo s fo ro tio a to e s te re o co n tro la d o s d ia s te re o m é ric a m e n te pu ros de e s ta s e cu e n c ia m o s tra ra e s ta b ilid a d m e ta b ó lica in c luso m ás a lta en es te e xp e rim e n to .
A u n q u e no se d e s e a q u e d a r lim itado p o r te o ría , los resu ltad os p re se n ta d o s en es te e je m p lo d e m u e s tra n , p o r e jem p lo , q u e la e s te re o q u ím ic a Rp en e l e n la ce fo s fo ro tio a to (O N T -75) es m e ta b ó lica m e n te m en os e s ta b le en ho m o g e n e iza d o s de h íg ado de ra ta q u e O N T -77 , q u e co n tie n e e l nú c le o de A D N Sp. Los resu ltad os p re se n ta d o s en e s te e jem p lo ta m b ié n d e m u e s tra n , p o r e jem p lo , q u e las c o m p o s ic io n e s de o lig o n u c le ó tid o s q u ira lm e n te pu ros pu eden te n e r e s ta b ilid a d m e ta b ó lica s ig n ifica tiva m e n te d ife re n te en h o m o g e n e iza d o de h íg ado de ra ta en c o m p a ra c ió n con una re fe re n c ia a p ro p ia d a (p o r e jem p lo , un p re p a ra d o de o lig o n u c le ó tid o s de la m ism a se cu e n c ia pe ro e sp e c ific id a d qu ira l d ife ren te , qu e in c luye p a rticu la rm e n te p re p a ra d o s e s te re o a le a to rio s ), y e sp e c ífica m e n te en c o m p a ra c ió n con un p re p a ra d o e s te re o a le a to r io "p a ren ta l" . En es te e je m p lo , se usa ron o lig o n u c le ó tid o s q u e te n ía n u n a se cu e n c ia a n tise n tid o con resp ec to a (y, p o r lo tan to , q u e se d ir ig e a) a p o lip o p ro te ín a -B (A poB ) h u m an a pa ra el e s tu d io de v ia b ilid a d en los e s tu d io s de es ta b ilid a d m e tab ó lica . Un o lig o n u c le ó tid o q u ira lm e n te c o n tro la d o p ro p o rc io n a d o pued e te n e r e s ta b ilid a d e le v a d a o red u c id a ha c ia e n z im a s e n d ó g e n a s . P rop o rc iona nd o el o lig o n u c le ó tid o q u ira lm e n te co n tro la d o y c o m p o s ic io n e s y m é to d o s de l m ism o, el p re sen te m é tod o inven tivo p ro p o rc io n ó o lig o n u c le ó tid o s y co m p o s ic io n e s q u e te n ía n p ro p ie d a d e s fa rm a c o ló g ic a s po te n c ia d a s en c o m p a ra c ió n con los o lig o n u c le ó tid o s no co n tro la d o s q u ira lm e n te co n o c id o s y sus co m p o s ic io n e s .
Estabilidades metabólicas in vitro de dúplex de ARNip de PCSK9 humano que tienen enlaces de diéster de fosforotioato estereocontrolados en suero humano.
Se u sa un p ro to co lo s im ila r al de los p ro ce d im ie n to s p re v ia m e n te in fo rm ad os (O ka e t a/., J. A m . C hem . Soc. 2008 , 130, 16031 -16037). S e añ ad en d ú p le x de A R N ip (2 ,5 g m o le s ) en ag ua (50 g l) a sue ro h u m an o (450 gl). La m ezc la se incuba a 37 °C con agitación a 400 rpm. Se toman alícuotas de 50 gl en cada momento (0 h, 0,5 h, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h y 24 h) y se inactivan con 25 gl de EDTA 150 mM, 2 gl de disolución de proteinasa K (20 mg/ml) y 30 gl de tampón de lisis (Qiagen, N.° 129115) y la mezcla se calienta a 60 °C durante 20 min. Se añade 5 gl de patrón interno (5'-GCGTt Tg CTc Tt CTTCTTGCGTTTTTT-3'. un oligonucleótido 27-mero (los nucleótidos subrayados están modificados con 2'-MOE) (200 gM) a la alícuota. Los análisis de cuantificación se realizan por IEX-HPLC y la identificación de metabolitos se lleva a cabo por UPLC/MS.
En algunas realizaciones, los dúplex de ARNip que tienen un fosforotioato diastereoméricamente puro en el extremo 3' con la configuración Sp muestran mayor estabilidad metabólica en suero humano en comparación con los ARNip que tienen el fosforotioato con la configuración Rp, o la diastereomezcla estereoaleatoria, en la misma posición. En otras realizaciones, los dúplex de ARNip que tienen un fosforotioato diastereoméricamente puro en el extremo 5' con la configuración Sp muestran mayor estabilidad metabólica en suero humano en comparación con los ARNip que tienen el fosforotioato con la configuración Rp, o la diastereomezcla estereoaleatoria, en la misma posición. En otras realizaciones, los dúplex de ARNip que tienen fosforotioatos diastereoméricamente puros con la configuración Sp en ambos de los extremos 3' y 5' muestran mayor estabilidad metabólica en suero humano en comparación con los ARNip que tienen el fosforotioato con la configuración Rp, o las diastereomezclas estereoaleatorias, en las mismas posiciones. En otras realizaciones, los dúplex de ARNip que tienen múltiples fosforotioatos diastereoméricamente puros con la configuración Sp muestran mayor estabilidad metabólica en suero humano en comparación con los ARNip que tienen múltiples fosforotioatos con la configuración Rp, o las diastereomezclas estereoaleatorias. En otras realizaciones, los dúplex de ARNip que tienen esqueleto completo de fosforotioatos diastereoméricamente puros con la configuración Sp muestran mayor estabilidad metabólica en suero humano en comparación con los ARNip que tienen el esqueleto completo de fosforotioatos con la configuración Rp, o las diastereomezclas estereoaleatorias.
Ejemplo 88. Composiciones de oligonucleótidos quiralmente controlados muestran diferente potencia in vitro en comparación con composiciones no controladas quiralmente que tienen la misma secuencia
El presente ejemplo compara la actividad farmacológica in vitro de oligonucleótidos quiralmente puros con la observada para la mezcla estereoaleatoria "parental" (es decir, para una composición que contiene oligonucleótidos de la misma secuencia que los oligonucleótidos quiralmente puros, pero que no presenta pureza quiral, por ejemplo, como resultado de haber sido preparada por un proceso estereoaleatorio). Cuatro oligonucleótidos quiralmente puros, cada uno de los cuales tenía una secuencia complementaria a la de un transcrito diana particular o gen que codifica una proteína de interés, se sintetizaron, se formularon y se transfectaron en hepatocitos primarios de ratón. Se cuantificaron los niveles de ARNm para evaluar el nivel de supresión. En este ejemplo, se usaron los oligonucleótidos que tenían una secuencia antisentido con respecto a (y, por lo tanto, que se dirige a) apolipoproteína-B (ApoB) para el estudio de viabilidad en ratones transgénicos que expresan ApoB humana.
Transfección de hepatocitos primarios de ratón con oligonucleótidos
Se usaron ratones C57BL6 macho, 7 semanas de edad, para extraer y sembrar hepatocitos primarios de ratón en placas de 96 pocillos (sin superposición) (Celsis/Bioreclamation IVT). La transfección de hepatocitos primarios se llevó a cabo con Lipofectin (Life Technologies, cat. N.° 18292-037) usando el protocolo del fabricante, usando 0,5 ul de Lipofectin por pocillo de placa de 96. Se crearon doce diluciones 1:3 de dúplex de ARNip empezando en 6 uM. Entonces se lipoplejaron 10 ul de 10x oligonucleótido con una mezcla preparada de 9,5 ul de medio sin suero In vitro Gro HI Medium (Cat. de Celsis Z99009) y 0,5 ul de Lipofectin por pocillo. Después de una incubación de 10-15 minutos, se añadieron 20 ul de oligonucleótidos lipoplejados a hepatocitos primarios en 80 ul de In vitro Gro HI Medium para llevar el volumen final a 100 ul por pocillo. 24 horas después de la transfección, las células se lisaron.
Ensayo de ARNm de apolipoproteína B
Se purificó ARNm total de lisados celulares usando el kit de aislamiento de ARN total MagMAX™-96 (Life Technologies, AM1830); se sintetizaron 15 ul de ADNc con el kit h High Capacity cDNA Reverse Transcription con inhibidor de RNasa (Life Technologies, 4374967). La expresión génica se evaluó por PCR en tiempo real en un Lightcycler 480 (Roche) usando Probes Master Mix (Roche, 04707494001) según el protocolo del fabricante usando los siguientes cebadores:
Cebadores de apolipoproteína B de ratón:
[Molde: (Número de acceso de GenBank M35186)]
• cebador directo: CGTGGGCTCCAGCATTCTA
• cebador inverso: AGTCATTTCTGCCTTTGCGTC
• sonda de PCR: FAM-CCAATGGTCGGGCACTGCTCAA-TAMRA
Cebadores de GAPDH de ratón:
• cebador directo: GGCAAATTCAACGGCACAGT
• cebador inverso: GGGTCTCGCTCCTGGAAGAT
• sonda de PCR: 5' JOE-AAGGCCGAGAATGGGAAGCTTGTCATC-TAMRA 3'
Análisis de datos
Se usó el método de delta delta Ct para calcular valores. Para cada muestra, la señal media de ApoB se normalizó a la señal de GAPDH media, y entonces se normalizó a la relación media correspondiente para muestras transfectadas con vector vacío y sin tratar, para obtener el nivel relativo de expresión de proteínas ApoB. La mezcla estereoaleatoria "parental" se usó para la referencia. Se ajustó una curva de regresión lineal de cuatro parámetros a los datos, y la parte superior y la parte inferior se limitaron a constantes del 0 % y 100 %, respectivamente, para calcular una CI50 relativa usando Graphpad Prism.
Las respuestas a la dosis in vitro (Figuras 71 y 72) muestran que los oligonucleótidos quiralmente puros tienen potencias significativamente diferentes, siendo ONT-83 el más potente, y siendo ONT-84 y ONT-85 los menos potentes, con una diferencia de 8,6 veces en CI50 (Tabla E-39).
Tabla E-39. Valores de CI50 de estereoisómeros (ONT-83, -84, -85 o -86) para la supresión de niveles de ARNm de apolipoproteína B de ratón/GAPDH en hepatocitos primarios de ratón
Figure imgf000342_0001
Los resultados presentados en este ejemplo demuestran, por ejemplo, que las composiciones de oligonucleótidos quiralmente puros pueden tener actividad farmacológica significativamente diferente in vitro en comparación con una referencia apropiada (por ejemplo, un preparado de oligonucleótidos de la misma secuencia pero diferente especificidad quiral, que incluye particularmente preparados estereoaleatorios), y específicamente en comparación con un preparado estereoaleatorio "parental". Los expertos en la técnica, en vista de esta demostración, apreciarán que las composiciones de oligonucleótidos quiralmente controlados proporcionadas por la presente divulgación tienen actividades y características inesperadas.
Figure imgf000343_0001
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ij44
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
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Figure imgf000386_0001
ij86 APÉNDICE (B)
TABLA 1
Estimulaciónde oligonucleótidos delinfocitos B de ratón
índice de estimulación
Producción
deODN Secuencia (5'a 3')t 3Hüridi na IgM 1 ■ £E3 1L' KOsl3¡ SCTAGACO'ITAGCGr í . i xi 0,c i- i,3 A 3,£ J.AL (SVQ. Si> KOí-4}............ t ..................... -1* s 0,2 3. , > * 0,5 1b {SZQ ID MCÍ!l4;>.............. 2 .................... \¡ j* & 0 r i 1,3 * 0,0
Figure imgf000387_0001
id twa ÍD W>r!6 j ..A.T. .CÍAGC. .n,o £ a,.- IR 93 •V. 7,5
a (SSS ÍP KO í 1 ? J A'DGÍAÍvW'íKCA^ S'TTOW
Figure imgf000387_0002
6.2 U S ¿ 2,«
ÜS CPíi viM..SttUÍÍ) , ,C.,£tC..G............... 7,7 = Ü,S 24 ,2 ± 3,2 íb (SES ID * .% í CTDíÍG í . 3 , , M Ú,$ 2, a ír 2.2 ÍSE3 A.O IíOi23) , .7.. iK . o ; ............ 3,1 = o,e 7,3 £ 1,4 2ú {SE-3 ID m 3¿,I í *1 » * V rC . í G. í i i j .2. i 7,4 3; 1,4 27,7 3K5,4
Figure imgf000387_0003
3ííc í 3E3 ID ISO £36).........................C..A. 3*6 0,2 14,2 5,2 ■i TCAACÍTT í , 1 1,4 i 9 ,2 5,2 4a 1 * - *GC * ■ 1 , 1 0,2 1,3 1 * 1 4b . ..GOcC, 4 , 3 o ,¿ 9 , 4 iU4
ác * . .TC&&. a,7 1 , 0 Sií TABLA 1 - continuación
Estimulación de oligonucleótidos de linfocitos B de ratón
Indice de estimulación'
Figure imgf000388_0001
LPS * 2,S 4,2
’Los índices de estimulación son inedias y desviaciones estándar
de al menos 3 experimentos separados, y se comparan con pocilios
Figure imgf000388_0002
sin ODN añadido.
ND = no realizado
Los dinucleótidos CpG están subrayados.
Los puntos indican identidad; los guiones indican deleción.
Z indica 5 metil citosina.
TABLA 2
Identificación del motivo CpG óptimo para la producción de IL-6 murina y la activación de linfocitos B.
IL-6 (pg/ml)c3
LINFOCITOS B
(ng/ml)cSECUENCIA (5'-3') CH12.LX ESPLÉNICOS igM
512 (SEQ ID No: 37) TCCATGTCGGTCCTGATGCT 1300 ± 106 627 rfc43 5,8 ± 0,3 7315 £ 1324 1637 (SEQ ID NO: 38) .....C............. 136 ± 27 46 ± 6 1,7 ± 0,2 770 ± 72
1615 (SEQ ID No: 39) .....G............. 1201 £ 155 850 ± 202 3,7 ± 0,3 3212 * 617 1614 (SEQ ID NO: 40) .....A............. 1533 ± 321 1812 ± 103 10,8 ± 0,6 7558 ± 414 1636 (SEQ ID NO: 41) ........A.......... 1181 £ 76 947 132 5,4 * 0,4 3983 485 1634 (SEQ ID NO: 42) ........C.......... 1049 ± 223 1671 ± 175 9,2 ± 0,9 6256 ± 261 1619 (SEQ ID NO: 43) ........T.......... 1555 £ 304 2908 £ 129 12,5 * 1,0 8243 698 1618 (SEQ ID NO: 4 4 ) .....A.,T......... 2109 £ 291 2596 £ 166 12,9 £ 0,7 10425 £ 674 1639 (SEQ ID NO: 4 5 ) ....AA.,T .......... 1827 ± 83 2012 ± 132 11,5 ± 0,4 9439 £ 103 1707 (SEQ ID NO: 46) .....A..TC........ ND 1147 ± 175 4,0 ± 0,2 3534 ± 217 1708 (SEQ ID No: 47) ....CA.,TG......... ND 59 ± 3 1,5 ± 0,1 466 ± 109
Los puntos indican identidad; los dinucleótidos CpG están subrayados; ND = no hecho
aEl experimento se hizo al menos tres veces con resultados similares. El nivel de IL-6 de cultivos de control no estimulados de tanto CH32.LX como linfocitos B esplénicos fue % en pg/ml. El nivel de IgM de cultivo no estimulado fue 547 ± 82 ng/ml. Los dinucleótidos CpG están subrayados y los puntos indican identidad.
sLa captación de [3fí]uridina se indicó como un aumento en veces (IE: índice de estimulación) de control no estimulado (2322,67 ± 213,68 cpm).Las células se estimularon con 20 pM de diversos ODN de CpG. Los datos presentan la media ± DE de triplicados.
^Medido por ELISA.
Figure imgf000389_0001

TABLA 5
Inducción de la secreción de citocinas de CMSP por oligonucleótidos de CpG
Figure imgf000390_0001
ID 150:33
1515 k t k t t b <J » « 4 4 t « t 1 4 i 1 i * €00 145 7 ,5 45 ISO S 2 Q ID Rí>; 39
1S14 .. . . . . A .. ........................... SSS 31 u SD ISO TABLA 5 - continuación
Inducción de la secreción de citocinas de CMSP por oligonucleótidos de CpG QDN Secuencia ( 5 ' - 3 ' ) 1 L ~ 4 1 TK?-<CS IF R - 'j1 GS-CSF IL - 12 Sí® ID 3CS0S40
Figure imgf000390_0002
S£S$ ID KOJ 47
TABLA 9
Inducción de la actividad de NK por motivos CpG que contienen ADN pero no por ADN no CpG
Figure imgf000391_0001
ADN o citocina añadida Células de ratón Células humanas
Expt.* Ninguno 3,00 0,$C
S
Figure imgf000391_0002
TABLA 10
Diferentes motivos CpG estimulan la activación óptima de linfoeitos E y NK murinos
Figure imgf000391_0003
NlMtiONO 367 0,00 L js í j h jc j co i. ido-E CpG o -h. i luí s u b ra y a d a s ¡t Los ó l ig o p n c J é □t id o s se a in t e t i z a r o n co n e s q u e le to ? m o d if ic a d o s en f o s f o r e n c a to p a ra m e jo r a r su r e s i s t e n c ia a n u c le a s a e , ■Medido p o r in c o r p o r a c ió n de 'H b i t i i d i n a d e s p u é s de 49 h d e c u l t i v o con
o l ig o d e E o K in ü c lo ó t I d o a a una c o h c o n i r a c ió n 200 nM domo se d e a C r ib e e n e l E je m p lo 1.
'Medido ej. unidades . n : ;a3.
TABLA 1
ero de ODN células/mi x 104 í’M N i n l x 30 * % V M S
expt 1, ratones C3H/BFeJ
19 CM 61,4 s.15,£ 59,2 * 15,7 95 ,S « 0,95 n m 22,8 a 3 , 5 * 25,8 k 5 , 0 " 93,3 a 2,3 m \ 47,6 ± . 11,1 46,1 ± 10,7 66,4 i 1 , 11 . m s 43,8 ± 7 ,:i 44,4 t 7,1 96,6 ± 0,73 .1759 71 ,f)* w # 07,7 x 20,4 96,8 s 2,6
3^8 * 7 ,S H3 t ?,S» < B ,$ x 1,4 Ninguno
(solución salina) 71, 6,9
e 0
x *
pt 7 , ,40 V ,3 t
z, 97,8 * 1,3 ratones C57 Bl/6
15 K B * 2,6 J 6,6 t 2,7 95,2 * 3,7
1760 10,2 * 2 , 3 * 8,8* 2 , 1 * 02,0 * 3,0
1585 13,0 s 2 , 2 * 9,5 * %2* 04,6 * 2,9 2010 m * 2 , 1 11,S* 3,9 83,4 * 2 , 1 . Ninguno 1 7 , 9 t 3 A 169 , * 2,1
(solución salina)
Espl 3
190 S Í%Q t 2,5 16,9 t 2,1 89,4 s 1,4 1760 6 , 1 . a 0 , 8 * 7,7 ± ü ,T 84,6 s 0,5 1972 15,3 a 3,6 13,5 ± 1,4 84,2 a 1,2 2001 13,0 *i, V 11,8 * 1,6 90,4 * 2,2
* P>0,05, prueba de la O de Mann-Whitney
TABLA 2
Inducción de la actividad de NK por oligodesoxinucleótidos (ODN)
%de lisis especifi ca de YAC-1* de 1x5is especifica de 2C11 Efectoras:Diana Efectoras:Diana
ODN 50:1 100:1 S D i m
Ninguno ~ : U - 1,4 15,3
Figure imgf000392_0001
1 m 24,5 38,7 47,2
3 D d 17,1 77,0 37,0 40 »
ODN no CpG -1,6 - 1,7 14,8 15,4
TABLA 3
Inducción de la actividad de NK por motivos CpG que contienen ADN pero no por ADN no Cpg
ADN o citocina añadida UL/105 Células humanas Células de ratón
Expt, l Ninguno 0,00 0,00
IJ,-x ,03 15,02 ADN de E. c o l i ? t '¿ i $ f 0 s ADN de timo de ternero 0,00 ü y íW'íVrt iíx&t-. 2 Ninguno 0,00 Y K- V 1565 ggSGTCAAQgTTSACggf;g (SEQ ID 7,38 17,98 15 2 9 --------gtc— ------ (SEQ ID TÍO;22) 0,00 4,4 Expt, 3 Ninguno 0,00
1513 SCTAGACGT2ASTGT (ísliCí ID KO:23) 5,22 17c? - ----- X~~.. ID KO¡24) 0,02 NB
161 9 ICC&TQTSSSTOCCTG&TSCT (S.EQ ID EOS5) 3,35
i ?€ S --- ~~ ---------- i SEQ ID HOsíS) 0,11
L o s d i n u c l e ó t i d o s C p G e n s e c u e n c i a s d e ODN e s t á n i n d i c a d o s s u b r a y a d o s ; X i n d i ­ c a m e t i l c i t o s i n a . L a s l e t r a s e n m i n ú s c u l a i n d i c a n e n l a c e s i n t e r n u c l e o t i d i c o s m o d i f i c a d o s d e f o s f o r o t i a t o r e s i s t e n t e s a n u c l e a s a s q u e , e n e x p e r i m e n t o s d e v a l o r a c i ó r i , f u e r o n m á s d e 20 v e c e s m á s p o t e n t e s q u e l o s ODN n o m o d i f i c a d o s , d e ­ p e n d i e n d o d e l a s b a s e s f l a n q u e a n t e s . L o s e x t r e m o s d e p o l i G ( g ) s e u s a r o n e n a l g u n o s O D N , d e b i d o a q u e a u m e n t a n s i g n i f i c a t i v a m e n t e e l n i v e l d e c a p t a c i ó n d e O D N . L o s g u i o n e s i n d i c a n q u e a l g u n a s b a s e s s o n i d é n t i c a s a a q u e l l a s e n l a s e ­ c u e n c i a d i r e c t a m e n t e p r e c e d e n t e , c o n l a e x c e p c i ó n d e l o s c a m b i o s i n d i c a d o s .
TABLA 4
Inducción por ODN de la actividad litica de NK (UL) ODN Secuencia (5'-3') UL Ninguno 0,91
Figure imgf000394_0001
1S2S TCAGCGTGOGCC i SEO ID NQíJS) 0,01
Figure imgf000394_0002
TABLA 5
Inducción de UL de NK por ODN CpG de fosforotioato con buenos motivos
DDNj Secuencia (5'-3') expt* 1 expt-. 2
Figure imgf000395_0001
Ninguno M Q .1,26 0,45 m s (S6Q ID NDí421 2,33 ND NO TCCTC'lCgXTCCTOIQQT'I (SSQ id »t4$] ND 0,40 0,96
TC.CH?Q?S£TTTTTGT£STT (SSQ ID NOU?) 4,03 1,23 5,OS
1962 TCCTG'I.Qg.TTuC.'XTGT£gTT tSSQ ID NO:1;í; ND 1,60 5,? á Í H Í TCCfTG-TCGTTCCTSTCGST (SSQ ID JÍOS46; 3,« ND ND 1965 (siq ID NO:14} 6,46 0,42 3,48 1966 l^TQÜCTGTC TCSSCTTCTT (SSQ ID SDi44) 2,fi2 ND m- 19S7 J^TS&CTGTCTGCCCTTCTT (SSQ ID NOílS j 5,82 1,64 8,32 12>«S TSSP^SlCTGTTG^^TTTCTT (SSQ ID NO?l§) 3*77 5,as 4,11 197$, TCCATCT*GTTCCTGT2GTT (SSQ ID 1,32 ND NO 1962 TCCAGGACTTCTCTCñSGTT (SSQ ID SO¡56i 0,05 KD Q.S8 u n TCCATGCGTGCGTgCGTTTT (SSQ ID m i l i ) 2,10 ND ND U * n TCCATGCGTTS.QtTTGCG.TT (SSQ ID SO:52 ) 0,89 ND ND 2062 TCCACGACSTTTTCGACGTT (SSQ ID 8Gí53) 4,02 1,31 S,7S 2065 TCGTCGTTGTCGTTGTCGTT (SSQ ID DO:7) ND 4,32 12,75 2065 TCGTCSTTTT'J'ÍCGl'Tl'TSTCGTT (SIQ ID ÜÜdS ) ND 6,17 12,82 20§7 TCGTCSTTBTC.GTTTTGTCSTT (SSQ ID NGt8> ND 2,68 9,66 2008 £SSQ ID üíO í33- ND 1,37 8,15 2016 gCQQCGQgQBSeaCQCgCCC (ssa ID üO:54j ND 0,01 0.05 2012 TSTCGSTTGTC-GTTS6TCGTT (SSQ ID N0:I$j ND 2,02 11,61
Figure imgf000395_0002
d .
Figure imgf000396_0001
TABLA 7
Inducción de la secreción de IL-12 humana por ODN CpG de fosforotioato
IL-Í.L íbaM.}.
ODN; Secuencia (5'-3')
Ninguno 19#2 TCCTSTCGTTCCTEGTCST? (Siti? Iíí *30 r O )
’w zjm w & nrriN & T K & T s ÍSS$ I.P ISOí.ti) i m i XD *20*15)
I M S TGGTCGCTGTTGTCiGTTTC.TT ÍCS$ ES liOilL) .2 o e s TCGTCGTTGT'CG'ITG-TGGT'T {SE;-Q XS m i l ] 20Í-6 7CG7CGTTTTGTCG7XTT5TCGTT {SSS ID BQiB} 201 & Í<JTC©TTSTCG2TGTCSTT {SS§ ID KOMI } 2015 TCG'i’tliTCGTCGi'T {iSS$ ID K0M2) 2QI® TG'i'CGTTGuGGTi! {£E$ ID íiü:56)
1Se recogieron CMSP de donantes normales y se cen Ficoll, luego se cultivaron a 106 células/pocillo microtitulación de 96 pocilios son o sin el CliN i añadieron a cultivos en 6 ¡ig/ml. Se recogieron lo a las 24 h y se probaron para niveles de IL-12 po describió en los métodos. Se realizó una curva pa
Figure imgf000396_0002
experimento, qué representa a un. donante d : ó r e n t
TABLA 8
Diferentes motivos CpG estimulan la activación óptima de linfocitos B y NK murinos
GÍ>i':JSecuencia Activación de linfocitos B1 Activación de N
Figure imgf000397_0001
CCATGñCGlTGAGCT (SEQ ID m i $ ) íiTGGJiAGGTCCAi^STTCIC i S S Q ID 130:: 6} .ATCG^CTCTCIiAGCGTTCTC iSEQ m 1 0 : 7 ) ¿¡32, S&CTCT2 Q M íl GTTCTC Í&ZQ ID 10 í 8 ) AT.SQACTCTCGA.GCGTTCTC i m ¿ ID NOt 9 ) AireACTC'TCGAGCSTTElTC i m ± m NO: 10} AiCGñCTCTC-iAACGlTCT!:: i £-10 ID 10 í 11 )
Figure imgf000397_0002
C-AG&ACGCTGGÍ.C.2 TTCC m i&EQ IB NOs 1 7 )
GAGA/lCGAiG-GilCCTTCCAT í BSQ IB 130: m
TABLA 1 - continuación secuencias
« » 3 M ^ tC C f t« » C J C K r ;sse to >K>i iS J c c ftm i^ c *T C C 'iíc íM ^c ,r t335Q 10 m 3 20) A7GC7&7TC07GMGCT CS5CQ ID Hi'it 23 )
Figure imgf000398_0001
tssg IP ÜÍJ! 22 )
TCC ATGTC.OGTZCTviaTGG T fsso ID NO; 23 j ‘TCCATG&C^TC-í^ATGCT ;.W£ ID NO; ;í 4> ■ E cca se is flS íccss iM C A is r g 10 HOa 2S) TCAACGTT i SEO i :d NOí 2E.) ’SCRAGCTT fSÍ-'i ID NO i 27.S ' K A S Q j p t r£ iQ ID NOt 23) T c r 'jm A T Í3XQ ID >10; 29 )
Figure imgf000398_0002
<3aíKJC.SSlSíK<;ACES(5!S t«SQ IB w>« 63) ^C7AC=ÍS.QSTTAGTÍ37 fsse ID NO; 34) GC?AGMGT71kGIG7 ísse ID NO? 55) TCCATGIWTTCCTÍATGCI (SSQ ID m : 56) TABLA 1 - continuación secuencias TCcM:GT2:§TlCCT(m'l>'mv (SEg IB 540: 57} ACC^T^ACCATCTOT’FíCCaC'rC iSr*G 10 SO ! 53} 'i'STCccftGce'recGcc&T i & m ID SOi 59} TACC5CSTGCSACCCTCT i $ m ID SO* 60} ACCATSGACSMCTOTTííCCCICTC t m ID SO: m ACCATGGACGAGCTSTTTCCGCTC <SEQ IB SO; 62}
Figure imgf000399_0001
ACCAT'SGAJXTACl^TSCCCCTC f£SQ ID SO; 64} ACCM:G&AC«'3TCaXWmXÍC;TC i SSg ív 80f 65} AeCATSSACGTTCTGrm:£CCTC ÍSSg ID SO: 65} C^GTTOffiGGSGCftT 1SSg ID so; 67} CTscreajSAcrGSM i SES ID MOí 63} TSSW50Sr®3JCC tSSQ ID SO: 69} M'QACGTTCCTGACCTT (S8& ID SO; 79} TCTCCCAGCGSGCGCAT {."”0 ID SO; 7.1} TCTCCOlSCCCGCGCCaír <sss ID SO; 75} TOeATGTCGTTCCTSTO&TT f£EQ IB UO ; 73} TCCATAGCGT'TCeTÍSCGTT i SEO i_D SO; 74) i’CSTG.SCl'ÍTCTCCGÍTTGÍT { ss® ID SO: 75} TCCT3ACGTTCCTS&C.CTU' {£Eg IB no: 76} TCCTGT£tit,?CC:rGTCS1'rT <S®Q ID SO: 77) «CCJ^CS^TSCTKW^JT (ssg ID SO: 73} TCC^TSOTwCnWSfOT: {SEO ID SOS 7?)
t m ID SO; Sí); i ? .T i IB so; 81.} T i SEO ID SO! 82} T (SSQ TD SO; 83} íSSg ID SO; 84}
1SSQ ID SO; 85}
Figure imgf000399_0002
<££g ID SO: 85} TABLA 1 - continuación secuencias
Figure imgf000400_0001
tÜ S T C S T a ^ g S f f fT S T C g tT fSEQ w m t 9 1 )
^ T C ^ S T T e T ^ r a S l ^ T T f«5Q ID TÍO; 92 ) OÍGÜCGc^CGGCSCSCGCCC. Í & E Q ID m t 53 )
'I STCGTTTG''rCís;Trí T STÜ3TT (SSQ ID ÍKSí 94 }
t r ^ m r T c n m t T c ^ c G T T & T m ^ 1 C3SG ID ISOí 95 )
Figure imgf000400_0002
(SEQ ID SO; 96 )
^ e s T ^ a w ^ T ? (SEQ 10 SO; 97 )
T ^ fiS T O R S Z C T F (SEQ ID Pí>; 98 )
TC C .aTA^g^TC C ^AG £gTT (SSQ ID 3SOT 99 ) TCCATCACCfTCC'Sfí&CeTI? fSSQ ID SO; .100)
G 7 C G iT /C )T ;SEQ ID TCf; 101.}
7G T C G (T /C )T (SEQ ID SO: 102 )
TCCATGáSCTTCCTGMTCT £SSQ ID IÍO í 103 )
TCTCCCAGCSTSGGCCaT £SBQ ID TÍO: 104 ) 'i<::cAT.2ACc:rTCC'iSA-:c':i [SEQ ID SO i 105 }
TABLA 2
In d u c c ió n de la s e c re c ió n de I l - l f humana p o r o l ig o n u c le ó t id o cpG de f o s f o r e t ie a t o
..EL-12... f r a / n í l .. .
Figure imgf000401_0001
2
¿015 ^ífCQJKG-TCCTT (£8$ 13 HOt971 U 0
íOTCCínOTOfflT ( f?Q, W N 0 :9 í!l 3 5
ogieron CMSP de donantes norm-iles y se centrifugaron sobre luego se cultivaron a 10* có iujgs /puc iiio en placan dttulación de 96 pocilios oon o sin el oligonueleóticto indicado que se on a cultivos en |,ig/ml. Se recogieron les sobrenadantes a h y se probaron para niveles de IL-12 por ELISA como se ió en !03 métodos. Se realizó una curva patrón en cada
Figure imgf000401_0002
ento, que representa a un donante diferente.
TABLA 3
COSís C040 Proliferación d< Compuesto (5 Esp) (4 Exq¡ linfocitos T
Figure imgf000401_0003
TABLA 1
Figure imgf000402_0001
TABLA 1 - continuación
Estimu1ación de oligonucleótidos de 1infocitos B de ratón índice de estimulación’
Figure imgf000403_0001
4 b (SK8 !® W ):$6J . * .0C$0 * 4,5 0,2 5 , 6 £ 3,4
4c (fiEQ ID NGt$7) . x.1CGA. 2, í ± 1,0 ND
4d (&EQ ID NO i 93) xxTTí x AA 1,3 ± G, 2 ND
4 « {R esidí*© c f ' *•*-- • \ 3 * 0,2 1 , 1 0 ,5
&XQ ID NO:94)
■íí ¡¿É5 ID 540: 9 ?) C ...... . 3 , 5 £ 1,4 NO
4<; ¡fe-EÍd-j* 11-13 s£-------¿ i . ,C2 1,4 £ G, 3 ND
S5Q -IDNO;!?)
Figure imgf000403_0002
1,2 £ 0,2 ND
Llé> 7,6 * 2,5 4 , 8 r 1,0
'Los índices de estimulación son medias y desviaciones estándar derivadas de al menos 3 experimentos separados, y se comparan con pocilios cultivados sin ODN añadido.
ND = no realizado.
Los dinucleótidos CpG están subrayados.
Los puntos indican identidad; los guiones indican deleción.
Z indica 5 metil citosina.
TABLA 2
Identificación del motivo CpG óptimo para La producción de IL-6 muriña y la activación de linfocitos B IL-s (pg/pljf*
OCH SECtlEMCI h (5 ' - 3 ' ) Cíili.Li: lülFUCiTOÍ 6 1“ :gü (agfaj 3<:
3 12 IS IÍ I D NdI2 Í¡ tcc^t ü íí í íü í-Il: r.ijL'is.ii 13ü:. S 19$ v il X 13 3,9 £ 4,3 I$15 v U IJ
i , 7 £ P,f 7?í ~ 71
Figure imgf000404_0001
»>7 ± C,3 J ílJ £ I? I "3 U U [ i í( í
Figure imgf000404_0002
...........A u ............. 1533 !f m l i l i « K3 ie ,9 A C'.t 7539 t 414
Figure imgf000404_0003
lóJi is io Ü 3 ;il
Figure imgf000404_0004
............ 13Í7 A a ¿413 ± 131 u , i = C,í S i í í E 163
.......... ñ j^ íí;........... BE 11 7 JJi 4,ü £ 0,* ¿S31 t ÍL3 1ÍBE \ Í 1 0 ID N ii ie í > .........O W K ........... hC Sii 4 3 - í “ £ o.,i <£C * ÍÜ9
Loa punto» Indican ¿dantidadí loa dinueleotidea CpGestán subrayados; MD no realizado éEI experimento se hizo al menos trea veces con resuitadoa simia re». El nivel de IL-6 de cul­ tivos de control no estimulados de tinto CHÍS-Lftcorto iinfocitos ü eapiénicos Cue< l'j pg/ml.
El nivel de ígMde cultivo no estiaulado fue S47 * B2 ng/ftil.. Loa dinucleútidos CpGeatán subra­ yadas y Lo»puntos indií-an identidad.
ELa captación d» | 2HÍuriditia a® indicó como un auswnto v #e*s ÍIE; in d ica da •acitti'uleeión^ da contral no *?3t implado ÍÍ3Z¿F&7 ■ 213,6# cpmí+ La*■ célulL-- si* eatirauirtroñ con 20 pH dv JivcrsCs ODN de CpGr Los dates presentan la ruad i a i DE de trip licad o s ,
=Hcdsda por ELISA,.
Figure imgf000405_0001
TABLA 3 - continuación
Inducción de la secreción de IL-6 murina por motivos CpG en ADN bacteriano u oligonucleótidos
Figure imgf000406_0001
Se inyectaron por via i.v. ratones (2 ratones/grupo) con 100 jal de DBS, 200 pg de ADN de E. coli oADN de timo de ternero, o
500 pg de S-ODN CpG o S-ODN de control no CpG.Los ratones se sangraron 2 h después de la inyección y se analizó la dilución 1:10 de cada suero por ELISA de IL-6. El limite de sensibilidad de ELISA de IL-6 fue 5 pg/ml. Las secuencias del S-ODN CpG es 5'GCATGACGTTGAGCT3’ (SEQ ID NO: 6)y del S-ODN no estimulante es 5 'GCTAGATGTTAGCGT3' (SEQ ID NO: 49). Obsérvese que aunque hay un CpG en la secuencia 48, está muy próximo al extremo 3' para efectuar la estimulación, como se explicó antes. Los datos representan media ± DE de duplicados. El experimento se hizo al menos dos veces con resultados similares.
TABLA 5
Inducción de la secreción de citocinas de CMSP humanas por oligonucleótidos CpG
ODN Secuencia (5'-3') Ii.-6 L TMP-.* ÍFN'-yl GM-CSP 1T.-Í2
512 TCCAartTCGCTCrmATOT 500 140 lS.á 70 250 SEQ ID NO;2S
1437 .. .ÍE ........ 550 U 7,(3 .15,6 16
SEO ID NO:27
HE 5 .....G*......... 60Q 145 7,8 45 145
SEQ ID NO: 101
TABLA 5 - continuación
Inducción de la secreción de citocinas de CMSP humanas por oligonucleótidos CpG
ODN Secuencia (5'-3') II,"S>; TNF"al IFN'vl GM'CSF 11,412
16.14 iuji. A i. >. j . ,-j vii .-.i 550 3.1 0 50 3.1.
s e q n> m a m
J63fe .......^ A .,....... 325 250 35 40 250 SEQ ID H S O :m
1634 •
Figure imgf000407_0001
........ 300 400 40 85 400
SEO ID NO: 194
i m .......2 } ' .......... 275 450 200 80 450 SEQ ID NO:IOS
16.18 • ■ A _T ....... 300 60 35 ,6 15,6 62
SEQ ID SO:?
1639 .... A A 1E .......... 625 220 15,6 40 230
SEQ ID NO:3
1707 ......A„TC..«..„. 300 70 17 0 70
SEQ ID 140:88
r m .....C A J ’G-......... 270 10 17 ND 10 s e o i d m . m
tos puntos indican identidad; los oligonucleótidos CpG están subrayados iinedido por ELISA usando el kit Quantikine de R&D Systems (pg/ml) . Las células se: cultivaron en 10 % de suero autólogo oon los oligodesoxinucleótidos indicados (12 (ig/ml) durante 4 h en el caso de
TNF-a o 24 h para las otras citocinas antes de la recogida de sobrenadante y el ensayo. Los datos se presentan como el nivel de citocina por encima de aquél en pocilios sin oligodesoxinucleótido
añadido.
TABLA 6
ADN de cpc induce le secreción de citecinas per cmsjp humana
TNL ik'ú TFN*7 RANTFS
ADN «ípg./mí)1 fp&wS) íPS/mii (jígf'fnl)
AON de EC (50 jqg/ml) 12.(300 70S 1560
ADN de EC (5 pg/na> m I Í jOOO 400 m
ADN de EC (0,5 ng/ml) sm SO áw 0
ADN de EC (0,05 ¿ig/ml) «3.5 lO.GGO 15,6 0
ADN de EC (50 ng/ml> + 0 ND ND ND
D-LME3
ADN de EC (10 pg/ml) Metil , 3 fj 5 ND ND
ADN de CT (50 pg/ml) 0 tíOO Q 0
¡Los niveles de todas las citecinas se determinaron por
ELISA usando klt^ QuantLkine de R&D Systems como se des­ cribieron en la tabla previa* Los resultados son represen­ tativos usando CMSP de diferentes donantes*
■'Las células se pretrataron durante lli min con éster metí­ lico de L-leucil-L-leucina (M-LMEJ para determinar si la producción de citocinas en estas condiciones era de
monocitos (u otras células sensibles a L-LMEÍ,
SE1 ADN de EC se metilo usando ¿ U/Mg de ADN fie CpG
met.iJ.asa (New Enqland Biolabsí según J.as indicaciones del fabricante, y la tnet1.1ación se confirmé por digestión con H p a - T T y M s p - T _ ( " l o m o c o n t r o l n e g a t i v o s o i n c l u y e r o n m u e s ­ t r a s q u e e o n t e n l a i i d o s v e c e s La máxima c a n t i d a d d e ].p.l
c o n t e n i d a e n l a mayor c o n c e n t r a c i ó n d e ADN d e EC q u e d e j ó d e i n d u c i r p r o d u c c i ó n d e t e c t a b l e d e c i t o c i n a s en e s t a s
c o n d i c i o n e s e x p e r i m e n t a l e s -N D= iw t dore
Figure imgf000408_0001
TABLA 8
Inducción de la actividad de NK por oligodesoxinucleótidos CpG {ODN)
Figure imgf000409_0001
ODN 50:1 100:1 50: i 100:3
Ninguno _ 5 1 - ] ,4 15,3 lí»,6
16,1 24,5 38,7 47,2
:H)d 17,1 n o 37,0 40,0
ODN no CpG " M - i? 14,8 15,4
TABLA 9
Inducción de la actividad de NK por motivos CpG que contienen ADN pero no por ADN no CpG
UL/106
ADN o citocina añadida Células de ratón Células humar E x p t . 1 Ninguno 0 , 00 0 , 00
IL —2 16 , 68 15 , $2
ADN de E . c o l i 7 , 23 5 , 05
ADN de timo de ternero 0 , 00 0 , 00 S K p t., 2 Ninguno G,0Q 3 , 2 S 1585 ggGGTCAACGTTGACgggg (S1Q ID lis?. 12 ) 7 , 3S 1 7 , 98 1 S 23 -------------- g t c ----------- (S IQ ID D o , 5¡>) 0 , 00 4 , 4 S K p t * 3 Ninguno G,00
1613 GCTAGACGTTAGTGT (SEQ ID H a * 42) 5 , 22
1765 -------------- Z -----------
Figure imgf000410_0001
0 , 02 TE)
IS i 9 '^CCATG'rCGTTCCTGA'TGCT ÍS£Q ID N o i 38) 3 , 35
17 6 5 -------------- K-------------------- ¡S IQ ID l ío . 53 ) o , u
L o s d i n u c l e ó t i d o s C p G e n s e c u e n c i a s d e ODN e s t á n i n d i c a d o s s u b r a y a d o s ; Z i n d i ­ c a m e t i l c i t o s i n a . L a s l e t r a s e n m i n ú s c u l a i n d i c a n e n l a c e s i n t e r n u c l e o t i d i c o s m o d i f i c a d o s d e f o s f o r o t i a t o r e s i s t e n t e s a n u c l e a s a s q u e , e n e x p e r i m e n t o s d e v a l o r a c i ó n , f u e r o n m á s d e 20 v e c e s m á s p o t e n t e s q u e l o s OD N n o m o d i f i c a d o s , d e p e n d i e n d o d e l a s b a s e s f l a n q u e a n t e s . L o s e x t r e m o s d e p o l i G ( g ) s e u s a r o n e n a l g u n o s O D N , d e b i d o a q u e a u m e n t a n s i g n i f i c a t i v a m e n t e e l n i v e l d e c a p t a c i ó n d e O D N .
TABLA 10
Inducción por ODN de la actividad litica de NK (UL) OES
Células UL
solas Secuencia (5'-3') 0, 01
1754 ACCHTGGACG&TCTGTTTCCOCTC 0,32 £EQ ID SO: 59 175a TCTCCCAQCGTSCGCCaj C,35 SEQ ID SQ: 45 1761 TACCGCGTGCGACCCTCT E,05 SEQ 12 SO: SO
1775 A.CCA'r'SGACGMCTG'm’CCCCTC 3,03 BEQ 12 SO: 51 1777 ACCA ^ACaaOCSOTTTCCCCTC 3,05 3SQ ID SO; 52
1778 ACCATGCACGACCTCrTTCCCCTC 3,01 ¿m I» NG¡ 63
Figure imgf000411_0001
1790 ACC&TGG&CGGTCTGTTTCCCCTC B,25 SEQ ID SO: 65 1781 ftCCSTGÚACUTTCTGTTTCCOCTC 0,3S 3EQ ID SO: 56 1323 GCATOACCTIOÍlGCT 3,08 SÜQ ID MCr 6
1324 CACGTTGfiGGGGCAT 0,01 SEQ ID SO: 87 1S25 CT3CTGAGACTGGAG 3,31 3EQ ID NO: £B 1825 TCAOCUTSCGCC 0,51 s sq ID NO: 69
Figure imgf000411_0002
1830" SECUENCIA ALEATORIA S,25
u m ICTCCCAGCGGCCG-CAT 3,30 sig ID SO: 7.1 1S3S TCTGCS&C5C5CGCGCCM 0r4S 8BQ ID SO: 12 1840 TCCATGTCGTTeOKTCGTT .2,70 SEO ID SO: 73 1841 TCCATftQCG-TTCCTASCGTT 1,45 3EQ ID NO: 74 1842 TCCTCGCTG'TCTCCC-CTTCTT 3,06 SEQ ID NO: 7,5 1851 TCCTGACGTTCCTGACGTT 2,32 5SQ ID NO: 76
2Se midieron las unidades líbicas (UL) como se describió (8). Brevemente, se recogieron CMSP de donantes inorrñales y se ::(:•••í.I.íi.on'::-'i sobre.
Ficoll, luego se cultivaron con y sin el ODN in­ dicado (.que se añadieron a cultivos a 6 )l.g/ml) durante 24 Ji. Luego se detérfrtinó su capacidad pa­ ra iisar células K562 marcadas con 51Cr. Los re­ sultados mostrados son típicos de los obtenidos
con varios donantes humanos normales diferentes.
2Esta mezcla de oligonucleótidos contuvo una se­ lección aleatoria de las 4 bases en cada posi­
ción .
TABLA 11
Inducción de UL de NK por ODN CpG de fosforotioato con buenos motivos
Figure imgf000412_0001
2DO7 IfCG^CG’riGTCG'TTTTOT£GrE 49 RD 2,68 9,65 2001 GCGIGCSTTGTCGT’TGTgGTT 66 ED 1,37 8,15
201$ CCGGCG-SGC'GGC&IGCGCCC 81 ED 0,01 0,35
2M 2 tW^Tl"II31S2STTOSSSn 4$ I® 2,02 u,si 2013 KTCG TlVlTOTO^ST'rGTCGTT 34 ED 0,58 5,22 2014 TGTCGTrCTCGTISSgGTT 60 ND 5,74 10,39
Figure imgf000412_0002
51 ND 4,53 10,13
201Í TGwg&mGv^n? S5 m 6,54 3,9£ *CMSP esencialmente como se describen en el presente documento. Los resultados son representativos de 6 experimentos separados; cada ex­ perimento representa un donante diferente.
2Esta es la versión metilada de ODN 1840 (SEQ ID NO:83); Z = 5-metil citosina en los restos 8 y 17; UL es unidades líticas; ND = no rea­ lizado; los dinucleótidos CpG están subrayados para claridad.
TABLA 12
Inducción de la proliferación de linfocitos B humanos por ODN CpG de fosforotioato índice de estimulación1
Figure imgf000413_0001
TABLA 12 - continuación
Inducción de la proliferación de linfocitos B humanos por ODN CpG de fosforotioato
índice de estimulación1
0©??Secuencia (5'-3’) SEQ ID JsCJs expt. 1. sa.pt, 2 expt, 3 ®Kpv.. 4 sxpt, 5 s*pt, £
1560-TCC'ESTCGTTCÜTt'TCGT'i 77 ND 2,0 2,0 3,6 ND ÜD
196iTCCATÍíTCS^WCíXCiiOT ?S 2 3,9 1,3 3,7 3íD T i
15Í2TCCP3XWI3KeraaT«i!FT 52 m 3,3 1,9 3,9 5,4 3%
i»« TCC.rrGT^rrc.cTGTCGTr 79 3 s?» Kfi ND 2ÍD NS
1SÍ5TCCSGir&TSS'l'l'TGrrei'í 53 4 3,? 2,4 4,7 5,0 4 3
i 96 7TCSTCGC'aSTCTGOCE'gICTT 54 ED 4,4 2,0 4,5 5,8 H
1968TffiTCTCTGTiGTCOTTTCTT 55 ND V 2,0 4,9 S,7 n
1932TCC&GGACT1-CTCTC&SG'ST 79 3 1,8 1,3 3,1 3,2 12
2002TCCASS6£GXTTT^B.C31T 86 ND 2,7 M .1,4 3?D 14
2G0S-TCG7CGTIGTCG-TTGTCGIT 47 s 3,2 1,2 3,0 7,5 37
Figure imgf000413_0002
2014TGTCaJTGTCGTTSICGTT 50 3 2,5 4,0 3,2 8,7 14
2015TiSTSTSICSTT 51 3 I,S 2,6 4,5 5,4 1
2016TGT£3SmT£3*TT 55 m 1,1 1,7 2,7 7,3 1
-‘Células = se guardaron células humanas del bazo a -70 °C después de la recogida quirúrgica o se recogieron CMSP de donantes normales y se centrifugaron sobre Ficoll. Las células se cultivaron
en placas de microtitulación de fondo en U de 96 pocilios son o sin el ODN indicado (que se aña­
dieron a los cultivos a 6 (mil).N = 12 experimentos. Las células se cultivaron durante 4-7
dias, se pulsaron con 1 i^Ci de 3H timidina durante 18 h antes de la recogida y el recuento por
centelleo. índice de estimulación = la relación de cpm en los pocilios sin ODN con respecto a
aquellas en los pocilios que se hablan estimulado durante todo el periodo de cultivo con el ODN
indicado (no hubo más adiciones de ODN después de que se establecieran los cultivos).ND = no
realizado.
TABLA 13
Inducción de la secreción de IL-12 humana por ODN CpG de fosforotioato
Figure imgf000414_0001
e x p t „ e x p t * OCií5 secuencia (5'-3') HO 1 2
células 0 0 solas
1362 SCCTGTCGTTCCTTGTCGTT 52 19 0
19 <5 TCCTGTCGTTTfTTaTCGTT 53 3 6 a
19*7 TCGTCvCTGTCTGCCCTTCTT 54 n a
1968 TGGTCGCTGTTGTCGTTTCTT 55 24 a
2005 TCGTCGTTGTCGTl'GTCGTT 47 2 5 0
.aoosj TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 4$ 2 9 i 5
Figure imgf000414_0002
Inducción de la secreción de IL-12 humana por ODN CpG de fosforotioato
Figure imgf000414_0003
ID e x p t . e x p t . ODN1 secuencia (5'-3') NO 1 2
2 0 H SGTCGTTOTOSXTGTCGTT 50 2B O
2015 TCOTCGTCOTCGTT 51 14 0
2016 TGTCGIT GTCGTf S5 3 0
1Se recogieron CMSP de donantes normales y se centri­ fugaron sobre Ficoll, luego se cultivaron a 106 células/pocillo en placas de microtitulación de 96 poci­ lios son o sin el ODN indicado que se añadieron a cultivos a 6 (ig/ml. Se recogieron los sobrenadantes a las 24 h y se probaron para niveles de IL-12 por ELISA como se describió en los métodos. Se realizó una curva patrón en cada experimento, que representa a un donante diferente.
TABLA 14
Diferentes motivos CpG estimulan la activación óptima de linfocitos B y NK murinos
ODíJ Secuencia Activación de linfocitos B1 Activación de NK2
15S3 T CC AT GACGTTCCIGATSCT ÍS2Q.SD.ÍÍO; 7) 42,849 2,52
1759 TClCCCAtSCfiTSOSCCAT (S2Q.ID.SO.45) 1,747 6,66
Figure imgf000415_0001
p o r in h ib id o r e s de la a c id i f i c a c ió n ondosóm ica o a c t iv a c ió n do NFkB
o r e s . NAt iTt"A
c < jro iIu l [ ' a o n e n s in a ^ fjflt G lio to x in a B U J g n d M U M
Figure imgf000415_0002
< M M q /^ 1 <10 g > ¿ y j fí\y ( f l, i ,,,/b d i m u |ig/» i>
Figure imgf000415_0003
TABLA 3
Plásmidos que contienen motivos CpG inmunoestimulantes
Especificidad de especies y N.° CpG, equivalencia de ODN de CpG-S Plásmido Esqueleto motivos Inserción
pHCG-26 pEAS ie Motivo CpG especifico de ratón pHCG-SG pKftS SG N.° 18261
pace- pKftS 3í¿G
10C
pace» pHAS 20G
200
pHCG-3& pKAS 30 Motivo CpG especifico de humano 0 pKAS 50 sin equivalente de ODN 2 pK ce» plíAS 500
100
pECG- pHAS 2GC
200
I¿H7S“5C pKAS 50 Motivo CpG especifico de humano
TABLA 3 - continuación
Plásmidos que contienen motivos CpG inmunoestimulantes
Especificidad de especies y N.° CpG, equivalencia de ODN de CpG-S Plásmido Esqueletc motivos Inserción
pHIS-£4 p M A S É4 N . ° 20 063
í>HÍS- pHAS 125
128
pflSS- p£fk£ 192
192
xL a s e c u e n c i a d e 1826 e s tccatgacgttcctgacgtt
2L a s e c u e n c i a u s a d a com o f u e n t e d e l o s m o t i v o s CpG e s gactt
CGTGTCGTTCTTCTGT CGTCTTTAGCGCTTCTCCTGCGTG CGTCCCTTG(SEQ ID NO: 14)
3L a s e c u e n c i a d e 2006 e s TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 3)
TABLA 4
P l á s m i d o s q u e c o d i f i c a n e l a n t i g e n o d e s u p e r f i c i e d e l a h e p a t i t i s B ( d e r i v a d o d e l o s s u b t i p o s a y w o a d w d e VHB)
Figure imgf000416_0001
TABLA 4 continuación Plásmidos que codifican el antigeno de superficie de la hepatitis B (derivado de los subtipos ayw o adw de VHB)
Plásmido Esqueleto Inserción
¡sMCCÚfS-S oiIC (i-3B V H B - S ( a y w )
jt lO ü S ú -S í i í í í T í -S!) V H B - S ( a y w )
^hTCTríOCí-S pífO O -lO C V H B - S ( a y w )
yEfaiSO O -S v m r ^ x >:• V H B - S ( a y w )
¡!¡itS-lC-Síaí! p1H.S-44! V H B - S ( a d w 2 )
n lS S -t¡4 V H B - S ( a d w 2 )
p r a s - n s V H B - S ( a d w 2 )
p í i m ía - S í a d ) p1H S-192 V H B - S ( a d w 2 )
*pUK21-ñXfuecreado delecionandoel origenfl de pUK21-A
TABLA 6
ODN usado con ADN de plásmido
Número de
Esqueleto código de ODN Secuencia
(SEO ID NOs 51) S-03N 1825 TCCATÚACG'rTCCTGAgGTf
(SSv ID NO:52)
Figure imgf000418_0001
20i7 CCC:CCCCGCCCCCCCCCCCC
*S8Q ID NQ;5S) O-O.ON 2061 TccfiTCAc^Trcc'rGACG'ri
<3SQ ID TIO:57) 2001 ■jGCG<]íOGGCGGCGGCbGkíiG
i $3Q id NO:58) SOS-ODN 1980 irCCATGAffiTTCCTGÍ^jrX
(SEQ ID NO:59) 1SSS GíjGTíIAACGTTGAGGGGSG
<S3Q ID NO:60)
UU4 TCTCCCAGCGTGCGCCATAT
{Ssq-id NO:61) 1972 GGGG'ICtGTGCrEÍTTGGGGGG (SEQ ID NO:62)
2042 2CAGGGGTGGGGGGAACCTT
(SEQ 10 NO!53) 19SI GGGGT1í9í\QgTTITGGGGGG
(S3Q ID 110:64) 2018 TCTíiGCG1TTTTAGCGTTCC
(SSQ ID NO:65)
2021 TC GTCGTTGTCGTTG'ÍCGTT
ÍSSQ ID NO:66) 2022 ^QÍP&ÍPTT7GTSSTTTTOTggTT (SEQ ID NO:67) 2023 ICGttGl'IGl^GT'müTCS!ET Nota: (SEQ ID NO: 51-67, respectivamente)
TABLA 10
Motivos CpG inhibidores pueden bloquear la proliferación de linfocitos B inducida por un motivo CpG estimulante
Oligonucleótido añadido epm
medio 194
1668 (TCCATSAC6TTCCTGATGCT)(SEQ ID NO*68} 34,669
1MB 4 2735 <GCGTTTFTmTSCO) ID ISO*69} 24.452
1720 (TCCAUSAGC^ETCCTGÍÍTSCT)(SEQ ID NO;70) &5H
1720 4 1735 1109
TABLA 11
Efectos inhibidores de motivos CpG "malos" sobre el oligonucleótido CpG "bueno" 1619
Oligonucleótido añadido IL-12 en pg/ml
medio 0 1619 solo 6 161$ * 1949 ( TCCATGTCGTrCCTGKKSCG{SEQ ID BOs72)) 16 161.9 1952 (TCCATGTCGTTCCQCQKJCGfSEQ ID NO:73)} 0 1619 4 1953 {TCCAiGTCGTTCCT5CCGCT{5 EQ ID 210:74}) 0 1619 4 1955 {GC.GGCGGGCGGCGCGCGCCC ( SEQ ID ISO;75)) 0
Notas:
La secuencia del oligonucleótido 1619 es TCCATGTCGTTCCTGATGCT (SEQ ID NO:71)
1949 tiene solo 1 GCG en el extremo 3', que no tiene esencial­ mente actividad inhibidora.
TABLA 13
Identificación de motivos CpG neutralizantes que reducen la inducción de la secreción de citoxirias por un motivo CpG-S en el mismo ODN ____________________________(neutralización en cis)___________________________
Expresión de citocinas inducida por ODN¿
Figure imgf000420_0001
1953 ... « i t t • < .CG. . (S S Q ID 150 :74 ) 557 1854 2 C'Ü 0
1Puntos en la secuencia de ODN 1952 y 1953 indican identidad con ODN 1619; los dinucleótidos CpG están subrayados para claridad. ODN sin mo­ tivos CpG-N o CpG-S tuvieron de poco a ningún efecto sobre la produc­ ción de citocinas. Los datos mostrados son representativos de 4 experi­ mentos .
zTodas las citocinas se dan en pg/ml; medida por ELISñ en sobrenadantes de células del bazo DBA/2 cultivadas en placas de 96 pocilios a 2 x 107 células/ml durante 24 h con el ODN indicado a 30 |.lg/ml. La desviación estándar de los pocilios por triplicado fue < 7 %. Ninguno de los ODN indujo cantidades significativas de IL-5.
TAJ3LA 14
Inhibición de la secreción de citocinas inducida por CpG por ODN que contienen motivos CpG-N
secuencia 8h-71 Secreción de IL-12* Secreción de IL-12 inducida per CpC-S n i n g u n a 2Í% 545 J
d c a c a s a z Q ia g a a i& if r - - ( ¿ e s ID 121 2729
1896 CCJSCCtGC^iC-CpOGCiSC-15 iC íí> S C ¡T 7 j 2Í2 2'Vj
i w tó j u c ^ c c n c c a a c o c c o c c c c (*sw T-b- Níis í 1. ) j!70 a i vw
2C3" TC:ATGC£ST7CCICC£S7T{SEC ID H O iJS Í 4ÍÓ a w 7
'Células del bazo BALB/c se cultivaron en placas de 96 pocilios a 2 * 10Jcélulas/ml con el ODN indicado durante 24 h y entonces el sobrenadante se evaluó para IL-12 por ELISA {pq/ml) .
■Las células se establecieron como en *, excepto que la secreción de IL-12se indujo por la adición del CpG ODN 1619 (TCCATGTCGTTCCTGATGCT) a 30 pg/ml. Los datos mostra­ dos son representativos de 5 experimentos.
A P E N D IC E (C )
S e c u e n c ia s d e m iA R N a m o d o d e e je m p lo
>hsa-let-7a-l MI0000060 UGGGAUGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUUAGGGUCACACCCACCACUGGGAGAUAACUAUACAAUCUACUGUCUUUC CUA
>hsa-let-7a-2 MI0000061 AGGUUGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUAGAAUUACAUCAAGGGAGAUAACUGUACAGCCUCCUAGCUUUCCU
>hsa-let-7a-3 MI0000062 GGGUGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUGGGGCUCUGCCCUGCUAUGGGAUAACUAUACAAUCUACUGUCUUUCCU
>hsa-let-7b MI0000063 CGGGGUGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUUUCAGGGCAGUGAUGUUGCCCCUCGGAAGAUAACUAUACAACCUACUGCCU UCCCUG
>hsa-let-7c MI0000064 GCAUCCGGGUUGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUUUAGAGUUACACCCUGGGAGUUAACUGUACAACCUUCUAGCUUUCC UUGGAGC
>hsa-let-7d MI0000065 CCUAGGAAGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUUUUAGGGCAGGGAUUUUGCCCACAAGGAGGUAACUAUACGACCUGCUGC CUUUCUUAGG
>hsa-let-7e MI0000066 CCCGGGCUGAGGUAGGAGGUUGUAUAGUUGAGGAGGACACCCAAGGAGAUCACUAUACGGCCUCCUAGCUUUCCCCA GG
>hsa-let-7f-l MI0000067 UCAGAGUGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUUGUGGGGUAGUGAUUUUACCCUGUUCAGGAGAUAACUAUACAAUCUAUUG CCUUCCCUGA
>hsa-let-7f-2 MI0000068 UGUGGGAUGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUUUUAGGGUCAUACCCCAUCUUGGAGAUAACUAUACAGUCUACUGUCUUU CCCACG
>hsa-let-7g MI0000433 AGGCUGAGGUAGUAGUUUGUACAGUUUGAGGGUCUAUGAUACCACCCGGUACAGGAGAUAACUGUACAGGCCACUGC CUUGCCA
>hsa-let-7i MI0000434 CUGGCUGAGGUAGUAGUUUGUGCUGUUGGUCGGGUUGUGACAUUGCCCGCUGUGGAGAUAACUGCGCAAGCUACUGC CUUGCUA
>hsa-mir-1-l MI0000651 UGGGAAACAUACUUCUUUAUAUGCCCAUAUGGACCUGCUAAGCUAUGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAUCUCA
>hsa-mir-1-2 MI0000437 ACCUACUCAGAGUACAUACUUCUUUAUGUACCCAUAUGAACAUACAAUGCUAUGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAUUUU UGGUAGGC
>hsa-mir-7-l MI0000263 UUGGAUGUUGGCCUAGUUCUGUGUGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGUUUUUAGAUAACUAAAUCGACAACAAAUCACA GUCUGCCAUAUGGCACAGGCCAUGCCUCUACAG
>hsa-mir-7-2 MI0000264 CUGGAUACAGAGUGGACCGGCUGGCCCCAUCUGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGUUGUCUUACUGCGCUCAACAACAA AUCCCAGUCUACCUAAUGGUGCCAGCCAUCGCA
>hsa-mir-7-3 MI0000265 AGAUUAGAGUGGCUGUGGUCUAGUGCUGUGUGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGUUCUGAUGUACUACGACAACAAGUC ACAGCCGGCCUCAUAGCGCAGACUCCCUUCGAC
>hsa-mir-9-l MI0000466 CGGGGUUGGUUGUUAUCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGAGUGGUGUGGAGUCUUCAUAAAGCUAGAUAACCGAAAGUA AAAAUAACCCCA
>hsa-mir-9-2 MI0000467 GGAAGCGAGUUGUUAUCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGAGUGUAUUGGUCUUCAUAAAGCUAGAUAACCGAAAGUAAA AACUCCUUCA
>hsa-mir-9-3 MI0000468 GGAGGCCCGUUUCUCUCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGAGUGCCACAGAGCCGUCAUAAAGCUAGAUAACCGAAAGUA GAAAUGAUUCUCA
>hsa-mir-10a MI0000266 GAUCUGUCUGUCUUCUGUAUAUACCCUGUAGAUCCGAAUUUGUGUAAGGAAUUUUGUGGUCACAAAUUCGUAUCUAG GGGAAUAUGUAGUUGACAUAAACACUCCGCUCU
>hsa-mir-10b MI0000267 CCAGAGGUUGUAACGUUGUCUAUAUAUACCCUGUAGAACCGAAUUUGUGUGGUAUCCGUAUAGUCACAGAUUCGAUU CUAGGGGAAUAUAUGGUCGAUGCAAAAACUUCA
>hsa-mir-15a MI0000069 CCUUGGAGUAAAGUAGCAGCACAUAAUGGUUUGUGGAUUUUGAAAAGGUGCAGGCCAUAUUGUGCUGCCUCAAAAAU ACAAGG
>hsa-mir-15b MI0000438 UUGAGGCCUUAAAGUACUGUAGCAGCACAUCAUGGUUUACAUGCUACAGUCAAGAUGCGAAUCAUUAUUUGCUGCUC UAGAAAUUUAAGGAAAUUCAU
>hsa-mir-16-l MI0000070 GUCAGCAGUGCCUUAGCAGCACGUAAAUAUUGGCGUUAAGAUUCUAAAAUUAUCUCCAGUAUUAACUGUGCUGCUGA AGUAAGGUUGAC
>hsa-mir-16-2 MI0000115 GUUCCACUCUAGCAGCACGUAAAUAUUGGCGUAGUGAAAUAUAUAUUAAACACCAAUAUUACUGUGCUGCUUUAGUG UGAC
>hsa-mir-17 MI0000071 GUCAGAAUAAUGUCAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAGUGAUAUGUGCAUCUACUGCAGUGAAGGCACUUGUAGCAUUA UGGUGAC
>hsa-mir-18a MI0000072 UGUUCUAAGGUGCAUCUAGUGCAGAUAGUGAAGUAGAUUAGCAUCUACUGCCCUAAGUGCUCCUUCUGGCA
>hsa-mir-18b MI0001518 UGUGUUAAGGUGCAUCUAGUGCAGUUAGUGAAGCAGCUUAGAAUCUACUGCCCUAAAUGCCCCUUCUGGCA
>hsa-mir-19a MI0000073 GCAGUCCUCUGUUAGUUUUGCAUAGUUGCACUACAAGAAGAAUGUAGUUGUGCAAAUCUAUGCAAAACUGAUGGUGG CCUGC
>hsa-mir-19b-l MI0000074 CACUGUUCUAUGGUUAGUUUUGCAGGUUUGCAUCCAGCUGUGUGAUAUUCUGCUGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGAC UGUGGUAGUG
>hsa-mir-19b-2 MI0000075 ACAUUGCUACUUACAAUIJAGUUUUGCAGGUUUGCAUUUCAGCGIJAUAUAUGUAUAUGUGGCUGUGCAAAIJCCAUGCA AAACUGAUUGUGAUAAUGU
>hsa-mir-20a MI0000076 GLJAGCACUAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAGUGUUUAGUUAUCUACUGCAUUAUGAGCACUUAAAGUACLJGC
>hsa-mir-20b MI0001519 AGUACCAAAGUGCUCAUAGUGCAGGUAGUUUUGGCAUGACUCUACUGUAGUAUGGGCACUUCCAGUACU
>hsa-mir-21 MI0000077 UGUCGGGUAGCUUAUCAGACUGAUGUUGACUGUUGAAUCUCAUGGCAACACCAGUCGAUGGGCUGUCUGACA
>hsa-mir-22 MI0000078 GGCUGAGCCGCAGUAGUUCUUCAGUGGCAAGCUUUAUGUCCUGACCCAGCUAAAGCUGCCAGUUGAAGAACUGUUGC CCUCUGCC
>hsa-mir-23a MI0000079 GGCCGGCUGGGGUUCCUGGGGAUGGGAUUUGCUUCCUGUCACAAAUCACAUUGCCAGGGAUUUCCAACCGACC
>hsa-mir-23b MI0000439 CUCAGGUGCUCUGGCUGCUUGGGUUCCUGGCAUGCUGAUUUGUGACUUAAGAUUAAAAUCACAUUGCCAGGGAUUAC CACGCAACCACGACCUUGGC
>hsa-mir-23c MI0016010 AGUGACUUUCCAGGUGUCACACAGUGAGUGGCAUAAUCAGAGUACAAUUUGAGUCAUGCCCAUACAUCACAUUGCCA GUGAUUACCCAAGGAAAGUGACG
>hsa-mir-24-l MI0000080 CUCCGGUGCCUACUGAGCUGAUAUCAGUUCUCAUUUUACACACUGGCUCAGUUCAGCAGGAACAGGAG
>hsa-mir-24-2 MI0000081
CUCUGCCUCCCGUGCCUACUGAGCUGAAACACAGUUGGUUUGUGUACACUGGCUCAGUUCAGCAGGAACAGGG >hsa-mir-25 MI0000082 GGCCAGUGUUGAGAGGCGGAGACUUGGGCAAUUGCUGGACGCUGCCCUGGGCAUUGCACUUGUCUCGGUCUGACAGU GCCGGCC
>hsa-mir-26a-l MI0000083 GUGGCCUCGUUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCUGUGCAGGUCCCAAUGGGCCUAUUCUUGGUUACUUGCACGGGGACGC
>hsa-mir-26a-2 MI0000750 GGCUGUGGCUGGAUUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCUGUUUCCAUCUGUGAGGCCUAUUCUUGAUUACUUGUUUCUGGA GGCAGCU
>hsa-mir-26b MI0000084 CCGGGACCCAGUUCAAGUAAUUCAGGAUAGGUUGUGUGCUGUCCAGCCUGUUCUCCAUUACUUGGCUCGGGGACCGG
>hsa-mir-27a MI0000085 CUGAGGAGCAGGGCUUAGCUGCUUGUGAGCAGGGUCCACACCAAGUCGUGUUCACAGUGGCUAAGUUCCGCCCCCCA
G
>hsa-mir-27b MI0000440 ACCUCUCUAACAAGGUGCAGAGCUUAGCUGAUUGGUGAACAGUGAUUGGUUUCCGCUUUGUUCACAGUGGCUAAGUU CUGCACCUGAAGAGAAGGUG
>hsa-mir-28 MI0000086 GGUCCUUGCCCUCAAGGAGCUCACAGUCUAUUGAGUUACCUUUCUGACUUUCCCACUAGAUUGUGAGCUCCUGGAGG GCAGGCACU
>hsa-mir-29a MI0000087 AUGACUGAUUUCUUUUGGUGUUCAGAGUCAAUAUAAUUUUCUAGCACCAUCUGAAAUCGGUUAU
>hsa-mir-29b-l MI0000105 CUUCAGGAAGCUGGUUUCAUAUGGUGGUUUAGAUUUAAAUAGUGAUUGUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUUCUUG GGGG
>hsa-mir-29b-2 MI0000107 CUUCUGGAAGCUGGUUUCACAUGGUGGCUUAGAUUUUUCCAUCUUUGUAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUUUUA GGAG
>hsa-mir-29c MI0000735 AUCUCUUACACAGGCUGACCGAUUUCUCCUGGUGUUCAGAGUCUGUUUUUGUCUAGCACCAUUUGAAAUCGGUUAUG AUGUAGGGGGA
>hsa-mir-30a MI0000088 GCGACUGUAAACAUCCUCGACUGGAAGCUGUGAAGCCACAGAUGGGCUUUCAGUCGGAUGUUUGCAGCLJGC
>hsa-mir-30b MI0000441 ACCAAGUUUCAGUUCAUGUAAACAUCCUACACUCAGCUGUAAUACAUGGAUUGGCUGGGAGGUGGAUGUUUACUUCA GCUGACUUGGA
>hsa-mir-30c-l MI0000736 ACCAUGCUGUAGUGUGUGUAAACAUCCUACACUCUCAGCUGUGAGCUCAAGGUGGCUGGGAGAGGGUUGUUUACUCC UUCUGCCAUGGA
>hsa-mir-30c-2 MI0000254 AGAUACUGUAAACAUCCUACACUCUCAGCUGUGGAAAGUAAGAAAGCUGGGAGAAGGCUGUUUACUCUUUCU
>hsa-mir-30d MI0000255 GUUGUUGUAAACAUCCCCGACUGGAAGCUGUAAGACACAGCUAAGCUUUCAGUCAGAUGUUUGCUGCUAC
>hsa-mir-30e MI0000749 GGGCAGUCUUUGCUACUGUAAACAUCCUUGACUGGAAGCUGUAAGGUGUUCAGAGGAGCUUUCAGUCGGAUGUUUAC AGCGGCAGGCUGCCA
>hsa-mir-31 MI0000089 GGAGAGGAGGCAAGAUGCUGGCAUAGCUGUUGAACUGGGAACCUGCUAUGCCAACAUAUUGCCAUCUUUCC
>hsa-mir-32 MI0000090 GGAGAUAUUGCACAUUACUAAGUUGCAUGUUGUCACGGCCUCAAUGCAAUUUAGUGUGUGUGAUAUUUUC
>hsa-mir-33a MIOOOOOS1 CUGUGGUGCAUUGUAGUUGCAUUGCAUGUUCUGGUGGUACCCAUGCAAUGUUUCCACAGUGCAUCACAG
>hsa-mir-33b MI0003646 GCGGGCGGCCCCGCGGUGCAUUGCUGUUGCAUUGCACGUGUGUGAGGCGGGUGCAGUGCCUCGGCAGUGCAGCCCGG AGCCGGCCCCUGGCACCAC
>hsa-mir-34a MI0000268
GGCCAGCUGUGAGIJGUUUCUUUGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUGUGAGCAAUAGUAAGGAAGCAAUCAGCAAGUAU ACUGCCCUAGAAGUGCUGCACGUUGUGGGGCCC
>hsa-mir-34b MI0000742 GUGCUCGGUUUGUAGGCAGUGUCAUUAGCUGAUUGUACUGUGGUGGUUACAAUCACUAACUCCACUGCCAUCAAAAC AAGGCAC
>hsa-mir-34c MI0000743 AGUCUAGUUACUAGGCAGUGUAGUUAGCUGAUUGCUAAUAGUACCAAUCACUAACCACACGGCCAGGUAAAAAGAUU
>hsa-mir-92a-l MIOOOOOS3 CUUUCUACACAGGUUGGGAUCGGUUGCAAUGCUGUGUUUCUGUAUGGUAUUGCACUUGUCCCGGCCUGUUGAGUUUG
G
>hsa-mir-92a-2 MI0000094 UCAUCCCUGGGUGGGGAUUUGUUGCAUUACUUGUGUUCUAUAUAAAGUAUUGCACUUGUCCCGGCCUGUGGAAGA
>hsa-mir-92b MI0003560 CGGGCCCCGGGCGGGCGGGAGGGACGGGACGCGGUGCAGUGUUGUUUUUUCCCCCGCCAAUAUUGCACUCGUCCCGG CCUCCGGCCCCCCCGGCCC
>hsa-mir-93 MI0000095 CUGGGGGCUCCAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAGUGUGAUUACCCAACCUACUGCUGAGCUAGCACUUCCCGAGCCCC CGG
>hsa-mir-95 MI0000097 AACACAGUGGGCACUCAAOAAAUGUCUGUUGAAUUGAAAUGCGUUACAUUCAACGGGUAUUUAUUGAGCACCCACUC UGUG
>hsa-mir-96 MI0000098 UGGCCGAUUUUGGCACUAGCACAUUUUUGCUUGUGUCUCUCCGCUCUGAGCAAUCAUGUGCAGUGCCAAUAUGGGAA
A
>hsa-mir-98 MI0000100 AGGAUUCUGCUCAUGCCAGGGUGAGGUAGUAAGUUGUAUUGUUGUGGGGUAGGGAUAUUAGGCCCCAAUUAGAAGAU AACUAUACAACUUACUACUUUCCCUGGUGUGUGGCAUAUUCA
>hsa-mir-99a MI0000101 CCCAUUGGCAUAAACCCGUAGAUCCGAUCUUGUGGUGAAGUGGACCGCACAAGCUCGCUUCUAUGGGUCUGUGUCAG UGUG
>hsa-mir-99b MI0000746 GGCACCCACCCGUAGAACCGACCUUGCGGGGCCUUCGCCGCACACAAGCUCGUGUCUGUGGGUCCGUGUC
>hsa-mir-100 MI0000102 CCUGUUGCCACAAACCCGUAGAUCCGAACUUGUGGUAUUAGUCCGCACAAGCUUGUAUCUAUAGGUAUGUGUCUGUU AGG
>hsa-mir-101-l MI0000103 UGCCCUGGCUCAGUUAUCACAGUGCUGAUGCUGUCUAUUCUAAAGGUACAGUACUGUGAUAACUGAAGGAUGGCA
>hsa-mir-101-2 MI0000739 ACUGUCCUUUUUCGGUUAUCAUGGUACCGAUGCUGUAUAUCUGAAAGGUACAGUACUGUGAUAACUGAAGAAUGGUG GU
>hsa-mir-103a-l MI0000109 UACUGCCCUCGGCUUCUUUACAGUGCUGCCUUGUUGCAUAUGGAUCAAGCAGCAUUGUACAGGGCUAUGAAGGCAUU
G
>hsa-mir-103a-2 MI0000108 UUGUGCUUUCAGCUUCUUUACAGUGCUGCCUUGUAGCAUUCAGGUCAAGCAGCAUUGUACAGGGCUAUGAAAGAACC
A
>hsa-mir-103b-l MI0007261 UCAUAGCCCUGUACAAUGCUGCUUGAUCCAUAUGCAACAAGGCAGCACUGUAAAGAAGCCGA
>hsa-mir-103b-2 MI0007262 UCAUAGCCCUGUACAAUGCUGCUUGACCUGAAUGCUACAAGGCAGCACUGUAAAGAAGCUGA
>hsa-mir-105-l MI0000111 UGUGCAUCGUGGUCAAAUGCUCAGACUCCUGUGGUGGCUGCUCAUGCACCACGGAUGUUUGAGCAUGUGCUACGGUG UCUA
>hsa-mir-105-2 MI0000112 UGUGCAUCGUGGUCAAAUGCUCAGACUCCUGUGGUGGCUGCUUAUGCACCACGGAUGUUUGAGCAUGUGCUAUGGUG UCUA
>hsa-mir-106a MI0000113
CCUUGGCCAUGUAAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAGCUUUUUGAGAUCUACUGCAAUGUAAGCACUUCUUACAUUACC AUGG
>hsa-mir-106b MI0000734 CCUGCCGGGGCUAAAGUGCUGACAGUGCAGAUAGUGGUCCUCUCCGUGCUACCGCACUGUGGGUACUUGCUGCUCCA GCAGG
>hsa-mir-107 MI0000114 CUCUCUGCUUUCAGCUUCUUUACAGUGUUGCCUUGUGGCAUGGAGUUCAAGCAGCAUUGUACAGGGCUAUCAAAGCA CAGA
>hsa-mir-122 MI0000442 CCUUAGCAGAGCUGUGGAGUGUGACAAUGGUGUUUGUGUCUAAACUAUCAAACGCCAUUAUCACACUAAAUAGCUAC UGCUAGGC
>hsa-mir-124-l MI0000443 AGGCCUCUCUCUCCGUGUUCACAGCGGACCUUGAUUUAAAUGUCCAUACAAUUAAGGCACGCGGUGAAUGCCAAGAA UGGGGCUG
>hsa-mir-124-2 MI0000444 AUCAAGAUUAGAGGCUCUGCUCUCCGUGUUCACAGCGGACCUUGAUUUAAUGUCAUACAAUUAAGGCACGCGGUGAA UGCCAAGAGCGGAGCCUACGGCUGCACUUGAA
>hsa-mir-124-3 MI0000445 UGAGGGCCCCUCUGCGUGUUCACAGCGGACCUUGAUUUAAUGUCUAUACAAUUAAGGCACGCGGUGAAUGCCAAGAG AGGCGCCUCC
>hsa-mir-125a MI0000469 UGCCAGUCUCUAGGUCCCUGAGACCCUUUAACCUGUGAGGACAUCCAGGGUCACAGGUGAGGUUCUUGGGAGCCUGG CGUCUGGCC
>hsa-mir-125b-l MI0000446 UGCGCUCCUCUCAGUCCCUGAGACCCUAACUUGUGAUGUUUACCGUUUAAAUCCACGGGUUAGGCUCUUGGGAGCUG CGAGUCGUGCU
>hsa-mir-125b-2 MI0000470 ACCAGACUUUUCCUAGUCCCUGAGACCCUAACUUGUGAGGUAUUUUAGUAACAUCACAAGUCAGGCUCUUGGGACCU AGGCGGAGGGGA
>hsa-mir-126 MI0000471 CGCUGGCGACGGGACAUUAUUACUUUUGGUACGCGCUGUGACACUUCAAACUCGUACCGUGAGUAAUAAUGCGCCGU CCACGGCA
>hsa-mir-127 MI0000472 UGUGAUCACUGUCUCCAGCCUGCUGAAGCUCAGAGGGCUCUGAUUCAGAAAGAUCAUCGGAUCCGUCUGAGCUUGGC UGGUCGGAAGUCUCAUCAUC
>hsa-mir-128-l MI0000447 UGAGCUGUUGGAUUCGGGGCCGUAGCACUGUCUGAGAGGUUUACAUUUCUCACAGUGAACCGGUCUCUUUUUCAGCU GCUUC
>hsa-mir-128-2 MI0000727 UGUGCAGUGGGAAGGGGGGCCGAUACACUGUACGAGAGUGAGUAGCAGGUCUCACAGUGAACCGGUCUCUUUCCCUA CUGUGUC
>hsa-mir-129-l MI0000252 GGAUCUUUUUGCGGUCUGGGCUUGCUGUUCCUCUCAACAGUAGUCAGGAAGCCCUUACCCCAAAAAGUAUCU
>hsa-mir-129-2 MI0000473 UGCCCUUCGCGAAUCUUUUUGCGGUCUGGGCUUGCUGUACAUAACUCAAUAGCCGGAAGCCCUUACCCCAAAAAGCA UUUGCGGAGGGCG
>hsa-mir-130a MI0000448 UGCUGCUGGCCAGAGCUCUUUUCACAUUGUGCUACUGUCUGCACCUGUCACUAGCAGUGCAAUGUUAAAAGGGCAUU GGCCGUGUAGUG
>hsa-mir-130b MI0000748 GGCCUGCCCGACACUCUUUCCCUGUUGCACUACUAUAGGCCGCUGGGAAGCAGUGCAAUGAUGAAAGGGCAUCGGUC AGGLJC
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Claims (5)

R E IV IN D IC A C IO N E S
1. Un método de preparación de un oligonucleótido o una composición de oligonucleótido que comprende un oligonucleótido, que comprende las etapas de:
(1) acoplamiento;
(2) terminación;
(3) modificación;
(4) desbloqueo; y
(5) repetición de las etapas (1) -(4) hasta que se logra una longitud deseada;
en donde el método proporciona un oligonucleótido que existe en una única forma diastereomérica con respecto al fósforo de enlace quiral, y
en donde al menos una etapa (3) forma un enlace internucleotídico que tiene la estructura de la fórmula I-c :
Figure imgf000492_0001
(I-c)
en donde la al menos una etapa (3) comprende la sulfurización con un reactivo de sulfurización que tiene la estructura de la fórmula S -I:
Figure imgf000492_0002
en donde:
P* es un átomo de fósforo asimétrico y es o Rp o Sp;
L es un enlace covalente o un alquileno C1-C10 opcionalmente sustituido, lineal o ramificado, en donde una o más unidades de metileno de L están opcionalmente e independientemente sustituidas con un alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenileno C1-C6, -C=C-, -C(R')2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R')-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR')-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -N(R')C(O)O-, -OC(O)N(R')-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2N(R')-, -N(R')S(O)2-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(O)- o -C(O)O-;
R1 es halógeno, R, o un alifático C1-C50 opcionalmente sustituido, en donde una o más unidades de metileno están opcionalmente e independientemente sustituidas con un alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenileno C1-C6, -C=C-, -C(R')2-, -Cy-, -O-, -S-, -S-S-, -N(R')-, -C(O)-, -C(S)-, -C(NR')-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -N(R')C(O)O-, -OC(O)N(R')-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2N(R')-, -N(R')S(O)2-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(O)- o -C(O)O-;
cada R' es independientemente -R, -C(O)R, -CO2R, o -SO2R, o:
dos R' en el mismo nitrógeno se toman conjuntamente con sus átomos intermedios para formar un anillo heterocíclico o de heteroarilo opcionalmente sustituido, o
dos R' en el mismo carbono se toman conjuntamente con sus átomos intermedios para formar un anillo de arilo, carbocíclico, heterocíclico o de heteroarilo opcionalmente sustituido;
-Cy- es un anillo bivalente opcionalmente sustituido seleccionado de fenileno, carbociclileno, arileno, heteroarileno o heterociclileno;
Rs1 es R;
cada R es independientemente hidrógeno, o un grupo opcionalmente sustituido seleccionado de alifático C1-C6, fenilo, carbociclilo, arilo, heteroarilo o heterociclilo;
cada * representa independientemente una conexión a un nucleósido; y
R1 no es -H cuando L es un enlace covalente.
2. El método de la reivindicación 1, en donde la etapa de acoplamiento comprende el uso de triflato de N-cianometilpirrolidinio y
Figure imgf000493_0001
en donde BPRO es una nucleobase protegida.
3. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde la etapa de terminación comprende las etapas de terminación de un grupo amino en un auxiliar quiral y terminación de 5'-OH sin reaccionar, en donde el auxiliar quiral es de la estructura:
Figure imgf000493_0002
en donde:
W1 es -NG5-, W2 es -O-;
cada uno de G1 y G2 es independientemente un grupo opcionalmente sustituido seleccionado de alquilo, aralquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heterociclilo, heteroarilo y arilo;
cada uno de G3, G4 y G5 es independientemente hidrógeno, o un grupo opcionalmente sustituido seleccionado de alquilo, aralquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heterociclilo, heteroarilo y arilo; o dos de G1, G2, G3, G4 y G5 se toman conjuntamente para formar un anillo carbocíclico opcionalmente sustituido, saturado, parcialmente insaturado o insaturado o que contiene un heteroátomo de hasta aproximadamente 20 átomos de anillo que es monocíclico o policíclico, y está condensado o sin condensar.
4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el oligonucleótido tiene al menos 15 nucleótidos de longitud.
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