CZ20033515A3 - Kompozice vakcíny HCV E1E2 - Google Patents

Description

Oblast techniky

Tento vynález se obecně zabývá kompozicemi vakcíny. Zejména se tento vynález vztahuje ke kompozicím vakcíny HCV E1E2 obsahujícím antigeny E1E2, submikronové emulze olej ve vodě a CpG oligonukleotidy.

Dosavadní stav vynálezu

Virus hepatitidy C (HCV) je základní příčinou parenterální hepatitidy jiného typu než A, jiného typu než B (NANBH). Tento virus se vyskytuje u 0,4 až 2,0 % dárců krve. Chronická hepatitida se vyvíjí u zhruba 50 % infekcí a z nich se zhruba ve 20 % infikovaných jedinců vyvíjí jaterní cirhóza, která někdy vede k hepatocelulárnímu karcinomu. V souladu s tím má studie a kontrola této choroby význam v lékařství.

HCV byl poprvé identifikován a charakterizován jako příčina NANBH Houghtonem a kol. Virová genomová sekvence HCV je známá stejně jako způsoby obdržení této sekvence. Viz například mezinárodní publikace č. WO 89/04669, WO 90/11089 a WO 90/14436. HCV má genom jednovláknové ribonukleové kyseliny kladného smyslu 9,5 kb a je členem čeledi virů Flaviridae. Na základě fylogenetických analýz se identifikuje nejméně šest rozdílných, avšak příbuzných genotypů HCV [Simmonds a kol., J. Gen. Virol., 74, 2391-2399 (1993)]. Virus kóduje jednotlivý polyprotein mající více než 3000 aminokyselinových zbytků [Choo a kol., Science, 244, 359-362 (1989), Choo a kol., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 88, 2451-2455 (1991), Han a kol., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, • · • · « • « • · • * · • ·· ·

88, 1711-1715 (1991)]. Tento polyprotein se zpracovává kontranslačně a posttranslačně do strukturních a nestrukturních (NS) proteinů.

Několik proteinů se zejména kóduje, jak ukazuje obrázek 1, genomem HCV. Pořadí a nomenklatura produktů štěpení polyproteinu HCV je následující: NH₂-C-El-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH. Počáteční štěpení polyproteinu se charakterizuje hostitelskými proteasami uvolňujícími tři strukturní proteiny, N-terminální nukleokapsidový protein (zvaný jádro) a dva glykoproteiny obálky El (též známý jako E) a E2 (též známý jako E2/NS1) stejně tak jako nestrukturní (NS) proteiny obsahující virové enzymy. Oblasti NS se nazývají NS2, NS3, NS4 a NS5. NS2 je integrální membránový protein s proteolytickou aktivitou a v kombinaci s NS3 štěpí jednoduchou vazbu NS2-NS3, která opět vytváří konec NS3 N a uvolňuje velký polyprotein, který zahrnuje aktivity serin proteasy a RNA helikasy. Proteasa NS3 slouží pro zpracování zbývajícího polyproteinu. V těchto reakcích uvolňuje NS3 kofaktor NS3 (NS4a), dva proteiny (NS4b a NS5a) a RNA-dependentní RNA polymerasu (NS5b). Dokončení zrání polyproteinu se spouští autokatalytickým štěpením při spojce NS3-NS4a katalyzovaným serin proteasou NS3.

El se detekuje jako složka 32 až 35 kDa a převádí se na jednotlivý endo H-senzitivní pás o zhruba 18 kDa. Naproti tomu vykazuje E2 komplexní typ při imunoprecipitaci konzistentně s tvorbou vícečetných složek [Spaete a kol., Virol., 188. 819-830 (1992), Selby a kol., J. Virol., 70, 5177-5182 (1996), Grakoui a kol., J. Virol., 67, 1385-1395 (1993), Tomei a kol., J. Virol., £7, 4017-4026 (1993)].Glykoproteiny El a E2 obálky HCV tvoří stabilní komplex schopný koimunoprecipitace [Grakoui a kol., J. Virol., 67, 1385-1395 • · (1993), Lanford a kol., Virology, 197, 225-235 (1993), Ralston a kol., J. Virol., £7, 6753-6761 (1993)].

El a E2 se udržují uvnitř buněk a postrádají komplexní glycid, pokud se exprimují stabilně nebo v přechodném virovém systému Vaccinia [Spaete a kol., Virology, 188.

819-830 (1992), Ralston a kol., J. Virol., 67, 6753-6761 (1993)]. Jelikož jsou proteiny El a E2 v těchto expresních systémech normálně vázané na membrány, připravují se vylučované formy pro usnadnění purifikace proteinů. Viz například US patent č. 6 121 020. Navíc se popisuje intracelulární tvorba E1E2 v Hela buňkách. Viz například mezinárodní publikace č. WO 98/50556.

Glykoproteiny HCV El a E2 jsou předmětem značného zájmu, neboť vykazují ochranu proti vystavení virům ve studiích na primátech [Choo a kol., Proč. Nati. Acad. Sci, USA, 91, 1294-1298 (1994)]. Je však stále potřeba vakcinových směsí obsahujících tyto antigeny pro prevenci infekce HCV.

Vakcinové kompozice často obsahují imunologické adjuvantní látky pro zvýšení imunitní odpovědi. Například úplné Freundovo adjuvans (CFA) je vysoce účinným imunostimulačním prostředkem, který se s úspěchem používá s mnoha antigeny na experimentální bázi. CFA zahrnuje tři složky: minerální olej, emulgační prostředek a usmrcené mykobakterie, jako je Mycobacterium tuberculosis. Vodné roztoky antigenu se smísí s těmito složkami s vytvořením emulze vody v oleji. CFA, i když je účinný jako adjuvantní prostředek, způsobuje závažné vedlejší účinky včetně bolesti, tvorby abscesů a horečky, především jako důsledek přítomnosti mykobakteriální složky. Proto se CFA v lidských a veterinárních vakcínách nepoužívá.

'· 9 ···· • · 9 · ·· 9 ··

Muramyldipeptid (MDP) je minimální jednotkou mykobakteriálního komplexu buněčné stěny, která generuje adjuvantní aktivitu pozorovanou u CFA. Viz například Ellouz a kol., Bochem. Biophys. Res. Commun., 59, 1317 (1974). Několik vytvořených syntetických analogů MDP vykazuje široké rozmezí adjuvantního působení a vedlejších účinků. Ohledně přehledu těchto analogů viz Chedid a kol., Prog. Allergy, 25. 63 (1978). Reprezentativní analogy MDP zahrnují deriváty threonylu MDP (Byars a kol., Vaccine, 5, 223 (1987), n-butylderiváty MDP (Chedid a kol., Infect. Immun,, 35. 417) a lipofilní deriváty muramyltripetidu (Gisler a kol., v Immunomodulations of Microbial Products and Related Synthetic Compounds, 1981, redakce Y. Yamamura a S. Kotani, Excerpta Medica, Amsterdam, str. 167).

Jedním lipofilním derivátem MDP je N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isogluatminyl-L-alanin-2-(1'-2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyfosforyloxy)ethylamin (MTP-PE). Tento muramyltripeptid zahrnuje fosfolipidové konce, které umožňují připojení hydrofobní části molekuly k lípidovému prostředí, zatímco muramylpeptidová část se spojuje s vodným prostředím. Proto je MTP-PE samotný schopen působit jako emulgační prostředek pro tvorbu stabilních emulzí oleje ve vodě.

MTP-PE se používá v emulzi 4% skvalenu s 0,008% Tween™80 zvaným MTP-PE-LO (nízký olej) pro dodávku antigenu viru gD herpes simplex s účinnými výsledky (Sanchez-Pescador a kol., J. Immunol., 141. 1720-1727 (1988) i když při špatné fyzikální stabilitě. Nedávno byla vyvinuta MF59, bezpečná vysoce imunogenní submikronová emulze olej ve vodě obsahující 4 až 5 % (hmotnost/objem) skvalenu, 0,5 % (hmotnost/objem) Tween 80™, 0,5 % Spán 85™ a případně různá množství MTP-PE pro použití ve vakcínových kompozicích. Viz například Ott • · • · a kol., MF59 - Design and Evaluation of a Safe and Potent Adjuvant for Human Vaccines ve Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (M. F. Powell a M. J. Newman, red.) Plenům Press, New York, 1995, str. 277 až 296. Choo a kol., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 21, 1294-1298 (1994) a Houghton a kol., ve Viral Hepatitis and Liver Disease (1997), str. 656, popisují použití komplexů HCV E1/E2 se submikronovou emulzí olej ve vodě obsahující MTP-PE.

Bakteriální deoxyribonukleová kyselina obsahuje nemethylované CpG dinukleotidy mající imunostimulační účinky na mononukleární buňky v periferní krvi in vitro. Krieg a kol., J. Clin. Immunol., 15, 284-292 (1995). CpG oligonukleotidy se používají pro zvýšení imunitních odpovědí. Viz například US patenty č, 6 207 646, 6 214 806, 6 218 371 a 6 406 705.

Přes použití těchto adjuvantů konvenční vakcíny často selhávají při zajišťování adekvátní ochrany proti cílovému patogenu. V souladu s tím existuje nadále potřeba efektivních vakcínových kompozicí proti HCV obsahujících bezpečné a netoxické adjuvanty.

Podstata vynálezu

Tento vynález se částečně zakládá na překvapivém objevu skutečnosti, že použití antigenů HCV E1E2 v kombinaci se submíkronovýmí emulzemi oleje ve vodě a oligonukleotidy obsahujícími imunostimulační sekvence nukleových kyselin (ISS) , jako je CpY, CpR a nemethylované CpG motivy (cytosin následovaný guanosinem a připojený fosfátovou vazbou) poskytují významně vyšší titry protilátek než ty, které lze pozorovat bez těchto adjuvantů. Alternativně lze tyto kompozice • · ·· používat se samotnými ISS bez submikronových emulzí olej ve vodě nebo se samotnými emulzemi olej ve vodě postrádajícími MTP-PE, bez ISS. Použití těchto kombinací poskytuje bezpečný a účinný způsob zvyšování imunogenního působení antígenů HCV E1E2 .

V souladu s tím se v jednom ztělesnění tento vynález zaměřuje na kompozici obsahující antigen HCV E1E2 a submikronovou emulzi olej ve vodě bez MTP-PE, kde je tato submikronová emulze olej ve vodě schopná zvyšovat imunitní odpověď na antigen HCV E1E2. Tato kompozice může dále obsahovat ISS jako oligonukleotid obsahující nemethylované CpG motivy {CpG oligonukleotid), který v případě přítomnosti působí zvyšováním imunitní odpovědi na antigen.

V ještě dalším ztělesnění se tento vynález zaměřuje na způsob stimulace imunitní odpovědi u obratlovce, který zahrnuje podávání subjektu terapeuticky účinného množství HCV E1E2 antigenu a submikronové emulze oleje ve vodě bez MTP-PE, kde je tato submíkronová emulze oleje ve vodě schopná zvyšovat imunitní odpověď na antigen HCV E1E2. Subjektu lze též podávat jeden či více ISS, jako je jeden či více oligonukleotidů obsahujících nemethylované CpG motivy, kde ISS může zvyšovat imunitní odpověď antigenu HCV E1E2. Submikronová emulze oleje ve vodě může být přítomná ve stejné kompozici jako antigen nebo se může podávat v oddělené kompozici. Navíc, pokud je přítomný ISS, může být ve stejné kompozici jako antigen a/nebo submíkronová emulze oleje ve vodě nebo v jiné kompozici.

V dalším ztělesnění se tento vynález zaměřuje na způsob přípravy kompozice obsahující kombinaci submikronové emulze oleje ve vodě bez MTP-PE s antigenem HCV E1E2. V ur- 7 čitých ztělesněních tento způsob dále obsahuje kombinaci ISS, jako je oligonukleotid obsahující nemethylované motivy CpG schopný zvyšovat imunitní odpověď na antigen HCV E1E2 s antigenem E1E2 a submikronovou emulzí oleje ve vodě.

V dalších ztělesněních se tento vynález zaměřuje na kompozici obsahující antigen HCV E1E2 a ISS, jako je CpG oligonukleotid schopný zvyšovat imunitní odpověď na antigen HCV E1E2.

V ještě dalším ztělesnění se tento vynález zaměřuje na způsob stimulace imunitní odpovědi u obratlovce zahrnující podávání subjektu terapeuticky účinného množství antigenu HCV E1E2 a ISS, jako je CpG oligonukleotid, kde ISS může zvyšovat imunitní odpověď antigenu HCV E1E2. ISS může být ve stejných kompozicích jako antigen nebo se může podávat v oddělené kompozici.

V ještě dalších ztělesněních se tento vynález zaměřuje na způsob přípravy kompozicí obsahujících kombinaci ISS, jako je CpG oligonukleotid s antigenem HCV E1E2, kde ISS může zvyšovat imunitní odpověď na antigen HCV E1E2.

CpG molekula ve kterémkoliv výše popsaném ztělesnění může mít vzorec 5'-X X CGX X , kde X a X j sou sekvence zvolené ze skupiny zahrnující GpT, GpG, GpA, ApA, ApT, ApG, CpT, CpA, CpG, TpA, TpT a TpG, a X₃ a X^ se volí z případů TpT, CpT, ApT, ApG, CpG, TpC, ApC, CpC, TpA, ApA, GpT, CpA a TpG, kde p označuje fosfátovou vazbu. V určitých ztělesněních zahrnuje CpG oligonukleotid sekvenci GACGTT, GACGTC, GTCGTT nebo GTCGCT s několika připojenými přídavnými nukleotidy .

• · • ··

V jednom dalším ztělesnění má CpG oligonukleotid pro použití v těchto kompozicích sekvenci 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3' (číslo identifikace sekvence 1) nebo sekvenci 5'-TCGTCGTTTGTCGTTTTGTCGTT-3' (číslo identifikace sekvence 5) .

V určitých ztělesněních obsahuje submikronová emulze olej ve vodě:

(1) metabolizovatelný olej, který je přítomný v množství 0,5 % až 20 % celkového objemu a (2) emulgační prostředek, který je přítomný v množství 0,01 % až 2,5 % (hmotnost/objem) a kde tento olej a emulgační prostředek jsou přítomné ve formě emulze olej ve vodě s kapičkami, které mají v podstatě průměr okolo 100 nm do méně než 1 mikrometru, kde je submikronová emulze olej ve vodě schopná zvyšovat imunitní odpověd antigenu HCV E1E2.

V dalších ztělesněních je submikronová emulze olej ve vodě podle popisu výše a postrádá jakékoliv polyoxypropylen-polyoxyethylenové blokové kopolymery stejně tak jako jakýkoliv muramylpeptid.

V dalších ztělesněních obsahuje emulgační prostředek mono-, di- nebo triester polyoxyethylensorbítanu a/nebo mono-, di- nebo triester sorbitanu.

V určitých ztělesněních je množství oleje 1 % až 12 %, jako je 1 % až 4 % celkového objemu a množství emulgačního prostředku je 0,01 % až 1 % (hmotnost/objem), jako je

9999 • · • 9 • · • · · • 999

0,01 % až 0,05 % (hmotnost/objem).

V dalších ztělesněních popisovaných zde obsahuje submikronová emulze olej ve vodě 4 až 5 % (hmot- nost/objem) skvalenu, 0,25 až 1,0 % (hmotnost/objem) Tween 80™ (polyoxyethylensorbitan-monooleát) a/nebo 0,25 až 1,0 % Spán 85™ (sorbitan-trioleát) a případně N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isogluatminyl-L-alanin-2-(1'-2'-dípalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyfosforyloxy)ethylamin (MTP-PE).

V dalších ztělesněních obsahuje submikronová emulze olej ve vodě v podstatě (1) 5 objemových % skvalenu a (2) jeden či více emulgačních prostředků zvolených z případů Tween 80™ (polyoxyethylensorbitan-monooleát) a Spán 85™ (sorbitan-trioleát), kde celkové množství emulgačního prostředku (prostředků) jel hmotnostní % (hmotnost/objem), kde skvalen a emulgační prostředek (prostředky) jsou ve formě emulze olej ve vodě mající olejové kapičky z nichž v podstatě všechny jsou velikosti zhruba 100 nm až méně než 1 mikrometr v průměru a kde kompozice neobsahuje žádný polyoxypropylen-polyoxyethylenový blokový kopolymer a dále kde je submikronová emulze olej ve vodě schopná zvyšovat imunitní odpověď na antigen HCV.

V dalším ztělesnění představuje jeden či více emulgačních prostředků polyoxyethylensorbitan-monoleát a sorbitan-trioleát a celkové množství polyoxyethylensorbitan-monooleátu a sorbitan-trioleátu je 1 hmotnostní % (hmotnost/objem).

• 4 94 • 44 · · 4 • · · * 9 9 4 4

4'9 9 9444 9 4 4 4444

9 4 9 4 4

449 99 4

V určitých ztělesněních kompozice postrádá muramylpeptid.

Tyto a další aspekty tohoto vynálezu jsou zřejmé s odkazem na následující podrobný popis a připojené výkresy.

Popis obrázků na výkresech

Obrázek 1 je diagram znázorňující HCV genom zobrazující různé oblasti polyproteinu HCV.

Obrázky 2A až 2C (číslo identifikace sekvence 3 a 4) ukazují nukleotid a odpovídající aminokyselinovou sekvenci oblasti HCV-1 El/E2/p7. Čísla na obrázku se vztahují k celkové délce polyproteinu HCV-1. Jsou znázorněné oblasti El,

E2 a p7.

Obrázek 3 je diagram plasmidu pMHElE2-809 kódujícího ElE2_sos, reprezentativní E1E2 protein pro použití podle tohoto vynálezu.

Obrázek 4 ukazuje titry protilátek Ε1Ε2_βθθΕΙΑ z myší imunizovaných Ε1Ε2_βθ3 plus CpG, Ε1Ε2_βθθ plus MF59, Ε1Ε2θ_οβ plus CpG a MF59 a ElE2_aos plus 4XMF59, jak se popisuje v příkladech. Kroužky ukazují titry jednotlivých protilátek myšího séra. Čtverečky ukazují geometrický průměr titru protilátek (GMT) skupiny 10 myší. Úsečky chyb představují srovnávací intervaly pro statisticky významné rozdíly stanovené jednostrannou analýzou rozptylu.

Následuje podrobný popis vynálezu.

Praxe tohoto vynálezu používá, pokud se neuvádí ji- 11

9 9 999 99 9 • 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9999 9999 9 9 9 9999

9 · · ' · 9 9 9

99 · ·· ·· · ·· · nak, konvenčních způsobů chemie, biochemie, způsobů rekombinantních deoxyribonukleových kyselin a imunologie v rámci znalosti oboru. Tyto způsoby se plně vysvětlují v literatuře. Viz například Fundamental Virology, 2. vydání, díl I &

II (Β. N. Fields a D. M. Knipe, red.), Handbook of Experimental Immunology, díly I až IV {D. M. Weir a C. C. Blackwell, red., Blackwell Scientific Publications), T. E. Creighton, Proteíns: Structures and Molecular Properties (W. H. Freeman and Company, 1993), A. L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, lne.), Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. vydání, 1989), Methods In Enzymology (S. Colowick a N. Kaplan red., Academie Press, lne.) .

Je třeba poznamenat, ze pri použiti v tomto popisu a připojených nárocích zahrnují singulární formy a, an a the i odkazy na plurál, pokud obsah zřetelně neurčuje jinak. Proto například pojem antigen zahrnuje směs 2 či více antigenů a podobně.

V celém textu se užívají následující zkratky aminoky selin:

Alanin: Ala (A)

Asparagin: Asn (N)

Cystein: Cya (C)

Kyselina glutamová: Glu (E) Histidin: His (H)

Leucin: Leu (L)

Methionin: Met (M)

Prolin: Pro (P)

Threonin: Thr (T)

Tyrosin: Tyr (Y)

Arginin: Arg (R)

Kyselina aspartová: Asp (D) Glutamin: Gin (Q)

Glycin: Gly (G)

Isoleucin: Ile (I)

Lysin: Lys (K)

Fenylalanin: Phe (F)

Serin: Ser (S)

Tryptofan: Trp (W)

Valin: Val (V)

Φ Φ · φφφφ φ φ φ

• ΦΦΦ

I. Definice

Při popisu tohoto vynálezu se používají následující termíny a jejich definice se uvažují tak, jak se popisuje níže.

Pojmy polypeptid a protein se týkají polymeru aminokyselinových zbytků a neomezují se na minimální délku produktu. Proto se do této definice zahrnují peptidy, oligopeptídy, dimery, multimery a podobně. Tato definice zahrnuje proteiny plné délky i fragmenty. Tyto termíny též zahrnují postexpresní modifikace polypeptidů, například glykosylaci, acetylaci, fosforylaci a podobně. Dále pro účely tohoto vynálezu se polypeptid týká proteinu, který zahrnuje modifikace, jako jsou delece, adice a substituce (obecně povahou konzervativní), nativní sekvence pokud protein zachovává požadovanou aktivitu. Modifikace mohou být úmyslné, jako je to v případě mutageneze zaměřené na místo nebo náhodné, jako je tomu při mutacích hostitele poskytujících proteiny či chyby následkem amplifikace PCR.

El polypeptid znamená molekulu odvozenou od oblasti HCV El. Zralá oblast El HCV-1 začíná zhruba při aminokyselině 192 polyproteinu a pokračuje zhruba k aminokyselině 383, číslováno vzhledem k HCV-1 polyproteinu plné délky. (Viz obrázky 1 a 2A až 2C. Aminokyseliny 192 až 383 obrázků 2A až 2C odpovídají polohám aminokyselin 20 až 211 sekvence identifikačního čísla 4). Aminokyseliny okolo 173 až zhruba 191 (aminokyseliny 1 až 19 sekvence identifikačního čísla 4) slouží jako signální sekvence pro El. Proto El polypeptid znamená buď prekurzorový El protein včetně signální sekvence nebo zralý El polypeptid, který postrádá tuto sekvenci ne• ftftft ftft * ftft • · ftft ftft • · ftft • ftftftft • ftftft ftftftft ftftft ftft ft ftft • · · · • · · ftftftft • ftft • ft · bo dokonce El polypeptid s heterologní signální sekvencí. Tento El polypeptid zahrnuje C-terminální membránovou kotvící sekvenci, která se vyskytuje zhruba při polohách aminokyselin 360 až 383 (viz mezinárodní publikaci č. WO 96/04301, vydanou 15. února 1996). El polypeptid, jak se zde definuje, může nebo nemusí zahrnovat C-terminální kotvící sekvenci ani její části.

E2 polypeptid znamená molekulu odvozenou od oblasti HCV E2. Zralá oblast E2 HCV-1 začíná zhruba při aminokyselině 383 až 385, číslováno vzhledem k polyproteinu HCV-1 plné délky. (Viz obrázky 1 a 2A až 2C. Aminokyseliny 383 až 385 obrázků 2A až 2C odpovídají polohám aminokyselin 211 až 213 sekvence identifikačního čísla 4). Signální peptid začíná zhruba při aminokyselině 364 tohoto polyproteinu. E2 polypeptid tedy znamená buď prekurzorový E2 protein včetně signální sekvence nebo zralý E2 polypeptid postrádající tuto sekvenci nebo dokonce E2 polypeptid s heterologní signální sekvencí. E2 polypeptid zahrnuje C-terminální membránovou kotvící sekvenci vyskytující se zhruba pří polohách aminokyselin 715 až 730, která může pokračovat až zhruba k aminokyselinovému zbytku 746 [viz Lín a kol., J. Virol., 68, 5063-5073 (1994)]. Polypeptid E2, jak se zde definuje, může a nemusí zahrnovat C-terminální kotvící sekvenci ani její části. Navíc E2 polypeptid může zahrnovat celou oblast p7 nebo její část, která se vyskytuje bezprostředně při konci C E2. Jak ukazují obrázky 1 a 2A až 2C, nalézá se oblast p7 při polohách 747 až 809, číslovaných vzhledem k polyproteinu HCV-1 plné délky (aminokyselinové polohy 575 až 637 sekvence identifikačního čísla 4). Navíc existují četné známé složky HCV E2 [Spaete a kol., Virol., 188, 819-830 (1992), Selby a kol., J. Virol., 70, 5177-5182 (1996), Grakoui a kol., J. Virol., 67, 1385-1395 (1993), Tomei a kol., J. Virol., £7, φφφ φφφ φ φφφ φ φφφ φ φφφφφ · φ φφφφφ φφφ φφφ •Φ φ φφ φ φφ ·· φ

Φ φφφφ

4017-4026 (1993)] . V souladu s tím pro účely tohoto vynálezu pojem E2 zahrnuje ty složky E2 zahrnující bez omezení složky, které mají delece 1 až 20 nebo více aminokyselin z konce N E2, jako jsou například delece 1, 2, 3, 4,

5....10...15, 16, 17, 18, 19...atd. aminokyselin. Takové složky zahrnují ty, které začínají při aminokyselině 387, aminokyselině 402, aminokyselině 403 atd.

Reprezentativní oblasti El a E2 z HCV-l ukazují obrázky 2A až 2C a sekvence identifikačního čísla 4. Pro účely tohoto vynálezu se oblasti El a E2 definují vzhledem k číslu aminokyseliny polyproteinu kódované genomem HCV-l, kde iniciátor methioninu určuje polohu 1. Viz například Choo a kol., Proč. Nati. Acad. Sci, USA, 2451-2455 (1991). Je třeba poznamenat, že pojem El polypeptid nebo E2 polypeptid, jak se zde používá, se neomezuje na sekvenci HCV-l.

V tomto směru lze odpovídající oblasti El nebo E2 v jiných izolátech HCV snadno určit přiřazením sekvencí z izolátů způsobem, který dosahuje maximálního přiřazení sekvencí. To lze provést kterýmkoliv z řady souborů počítačového programového vybavení, jako je ALIGN 1.0, který lze obdržet od University of Virginia, Department of Biochemistry (Dr. Willam R. Pearson). Viz Pearson a kol., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, ££, 2444-2448 (1988).

Dále El polypeptid nebo E2 polypeptid, jak se zde definuje, se neomezuje na polypeptid mající přesnou sekvenci znázorněnou na obrázcích. Genom HCV je ve skutečnosti ve stavu konstantního toku in vivo a obsahuje několik proměnných domén vykazujících relativně vysoké stupně variability mezi izoláty. Počet zachovaných a variabilních oblastí je mezi těmito kmeny známý a obecně budou mít aminokyselinové sekvence epitopy odvozené od těchto oblastí vyšší stupeň • 4

4 · · • 4444 · · • 4 • 4 · 4 • ···· sekvenční homologie, například aminokyselinovou sekvenční homologii více než 30 %, přednostně více než 40 %, vice než 60 % a dokonce ještě více než 80 až 90 % při přiřazení dvou sekvencí. Je zřejmé, že tyto termíny zahrnují El a E2 polypeptidy ze kteréhokoliv z různých kmenů HCV a izolátů včetně izolátů majících kterýkoliv ze šesti genů typů HCV popsaných Simmondsem a kol., J. Gen. Virol., 74., 2391-2399 (1993) (například kmeny 1, 2, 3, 4 atd.), stejně tak jako nově identifikovaných izolátů a subtypů těchto izolátů, jako jsou HCVla, HCVib atd.

Pojmy El nebo E2 polypeptid se tedy vztahují k nativním sekvencím El nebo E2 z různých kmenů HCV stejně tak jako analogů muteinů a imunogenních fragmentů, jak se dále definují níže. Jsou známy úplné genotypy mnohých z těchto kmenů. Viz například US patent č. 6 150 087 a GenBank Accession č. AJ23880Q a AJ238799.

Dále termíny El polypeptid a E2 polypeptid zahrnují proteiny včetně modifikací nativní sekvence, jako jsou vnitřní delece, adice a substituce (obecně povahou konzervativní) . Tyto modifikace mohou být úmyslné, jako je mutageneze cílená na místo nebo náhodné, jako jsou přirozené případy mutace. Všechny tyto modifikace se zahrnují do tohoto vynálezu pokud modifikované El a E2 polypeptidy slouží pro zamýšlený účel. Tak například jestliže se polypeptidy El a/nebo E2 používají v kompozicích vakcín, musí být modifikace takové, aby imunologická aktivita (to jest schopnost vyvolat humorální buněčnou imunitní odpověď na polypeptid) byla zachovaná.

Komplex E1E2 znamená protein obsahující alespoň jeden polypeptid El a alespoň jeden polypeptid E2, jak se po16 • · 0 0 0

0· 0 0 0 0

00000 0 0 000*

0 0 0 0

00 0 pisují výše. Tento komplex může též zahrnovat celou oblast p7 nebo její část, které bezprostředně přiléhá ke konci C E2. Jak ukazují obrázky 1 a 2A až 2C, je oblast p7 při polohách 747 až 809 číslovaných vzhledem k polyproteinu HCV-l plné délky (polohy aminokyselin 576 až 637 sekvence identifikačního čísla 4). Reprezentativní komplex E1E2 obsahující protein p7 se zde nazývá ElE2_eog.

Režim připojení El a E2 v komplexu E1E2 je nepodstatný. Polypeptidy El a E2 se mohou spojovat nekovalentnimi interakcemi, jako jsou elektrostatické síly, nebo kovalentními vazbami. Například mohou být E1E2 polypeptidy podle této přihlášky ve formě hybridního proteinu, který zahrnuje imunogenní El polypeptid a imunogenní E2 polypeptid, jak se definují výše. Fúze se může exprimovat z polynukleotidu kódujícího chiméru E1E2. Alternativně se mohou komplexy E1E2 vytvářet spontánně jednoduchým smísením El a E2 proteinů, které byly připraveny jednotlivě. Podobně při současné expresi a vylučování do média mohou proteiny El a E2 vytvářet komplex spontánně. Termín komplexy E1E2 (též zvané agregáty) tedy zahrnuje spontánní formu při purifikaci El a/nebo E2. Takové agregáty mohou zahrnovat jeden či více monomerů El ve spojení s jedním či více monomery E2. Počet přítomných monomerů El a E2 nemusí být stejný, pokud je přítomný alespoň jeden monomer El a jeden monomer E2. Detekce přítomnosti komplexu E1E2 se snadno určí standardními způsoby detekce proteinů, jako je eiektroforéza na polyakrylamidovém gelu a imunologických způsobů, jako je imunoprecipitace.

Pojmy analog a mutein” se týkají biologicky aktivních derivátů referenční molekuly nebo fragmentů těchto derivátů, které uchovávají požadovanou aktivitu, jako je imunoreaktivita, ve studích, které se zde popisují. Obecně ter«· • » · • ···· · • · • · · • ···· min analog znamená sloučeniny mající nativní polypeptidovou sekvenci a strukturu s jednou či více aminokyselinovou adicí, substitucí (povahou obecně přirozenou) a/nebo delecí vzhledem k nativní molekule pokud tyto modifikace nenarušují imunogenní aktivitu. Pojem mutein se týká peptidů majících jedno či více peptidových mimetik (peptoidů), jako jsou ty, které popisuje mezinárodní publikace č. WO 91/04282. Přednostně má analog či mutein alespoň stejnou imunoaktivitu jako nativní molekula. Způsoby přípravy polypeptidových analogů a muteinů jsou v oboru známé a popisují se níže.

Zvláště preferované analogy zahrnují substituce, které jsou svou povahou konzervativní, to jest ty substitucce, které nastávají v rámci jedné skupiny aminokyselin a týkají se jejich postranních řetězců. Konkrétně se aminokyseliny obecně dělí do čtyř skupin: (1) kyselé - aspartát a glutamát, (2) bázické - lysin, arginin, histidin, (3) nepolární - alanin, valin, leucin, isoleucin, prolin, fenylalanin, methionin, tryptofan a (4) polární bez náboje - glycin, asparagin, glutamin, cystein, serin, threonin, tyrosin. Fenylalanin, tryptofan a tyrosin se někdy klasifikují jako aromatické aminokyseliny. Například lze rozumně předvídat, že izolovaná náhrada leucinu isoleucinem či valinem, aspartátu glutamátem a threoninu serinem nebo podobná konzervativní náhrada aminokyseliny strukturně příbuznou aminokyselinou nebude mít značný vliv na biologickou aktivitu. Například může daný polypeptid mít až zhruba 5 až 10 konzervativních nebo nekonzervativních aminokyselinových substitucí nebo dokonce až zhruba 15 až 25 nebo 50 konzervativních nebo nekonzervativních aminokyselinových substitucí nebo jakýkoliv počet mezi 5 až 50, pokud se zachovává požadovaná funkce molekuly. Ten, kdo má zkušenost v oboru, může snadno určit oblasti dané molekuly, které mohou tolerovat změnu s použi- 18

Φφ φ φφ » • · φ * φ φ • · · · φ φφφ • ·····«· φφφφ» φφφ · · · • Φ · φφ · tím vynesení Hopp/Woods a Kyte-Doolittle dobře známých v oboru.

Pojem fragment znamená polypeptid skládající se pouze z části intaktní polypeptidové sekvence a struktury plné délky. Fragment může zahrnovat C-terminální deleci a N-terminální deleci a/nebo vnitřní deleci nativního polypeptidu. Imunogenní fragment daného proteinu HCV obecně zahrnuje alespoň zhruba 5 až 10 souvislých aminokyselinových zbytků molekuly plné délky, přednostně alespoň zhruba 15 až 25 souvislých aminokyselinových zbytků molekuly plné délky a nejlépe alespoň zhruba 20 až 50 či více souvislých aminokyselinových zbytků molekuly plné délky, které definují epitop nebo jakýkoliv počet mezi 5 aminokyselinami a sekvencí plné délky s podmínkou, že tento fragment zachovává schopnost vyvolávat imunologickou odpověď, jak se zde definuje. Ohledně popisu imunogenních fragmentů El a E2 HCV viz například Chien a kol., mezinárodní publikace č. WO 93/00365.

Pojem epitop, jak se zde používá, se týká sekvence alespoň zhruba 3 až 5, přednostně zhruba 5 až 10 nebo 15 a ne více než zhruba 500 aminokyselin {nebo jakéhokoliv počtu mezi těmito hodnotami), které definují sekvenci, která sama o sobě nebo jako část větší sekvence vyvolává imunologickou odpověď po podání subjektu. Často se epitop váže na protilátku vytvořenou jako odpověď na tuto sekvenci. Neexistuje žádná kritická horní hranice pro délku fragmentu, která může zahrnovat proteinovou sekvenci téměř celé délky nebo dokonce hybridní protein obsahující dva či více epitopů polyproteinu HCV. Epitop pro použití v tomto vynálezu se neomezuje na polypeptid mající přesnou sekvenci části mateřského proteinu, ze kterého se odvozuje. Ve skutečnosti jsou virové genomy ve stavu konstantního toku a obsahují několik

4444 « 44 4 44 Ί • 4 4 4» · · · • 4 ··· 4 4 4 4 • 4 · · ·4·4 4 4 · 4444 · 4 · 4 4* «44 ·· 4 44 4 proměnných domén, které vykazují relativně vysoké stupně variability mezi izoláty. Proto pojem epitop zahrnuje sekvence identické s nativní sekvencí stejné tak jako modifikace nativních sekvencí, jako jsou delece, adice a substituce (povahou obecně konzervativní).

Oblasti daného polypeptidů obsahující epitop lze identifikovat s použitím jakéhokoliv počtu způsobů mapování epitopů dobře známých v oboru. Viz například Epitop Mapping Protocols v Methods in Molecular Biology, díl 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Human Press, Totowa, New Jersey. Lineární epitopy lze určit například současnou přípravou velkého počtu peptidů na pevných nosičích, kde tyto peptidy odpovídají částem molekuly proteinu a reakcí těchto peptidů s protilátkami, v průběhu které jsou peptidy dosud připojené na nosiče. Tyto způsoby jsou v oboru známé a popisují se například v US patentu č. 4 708 871, Geysen a kol., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 81, 3998-4002 (1984), Geysen a kol, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 82. 178-182 (1985), Geysen a kol., Molec. Immunol., 22, 709-715 (1986). Těmito způsoby lze identifikovat řadu epitopů HCV. Viz například Chien a kol., Viral Hepatitis and Liver Disease, str. 320-324 (1994) a další práce níže. Podobně se konformační epitopy snadno identifikují stanovením prostorové konformace aminokyselin, například rentgenovou krystalografií a dvojrozměrnou nukleární magnetickou rezonancí. Viz například Epitope Mapping Protocols, výše. Antigenní oblasti proteinů lze též identifikovat standardním vynesením antigenního chování a hydropatie, jako je tomu například v programu Omiga verse 1.0 od Oxford Molecular Group. Tento počítačový program používá metodu Hopp/Woods, Hoop a kol., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 72, 3824-3828 (1981) pro stanovení profilů antigenního chování a Kyte-Doolittlovu techniku, Kyte a kol., J. Mol. Biol. ,

• ·

157, 105-132 (1982) pro vynesení hydropatie.

Pojem konformační epitop, jak se zde používá, se týká části proteinu nebo proteinu plné délky nebo jeho analogu či muteinu, který má strukturní charakteristiky nativní vzhledem k aminokyselinové sekvenci kódující epitop v rámci přirozeného proteinu plné délky. Nativní strukturní vlastnosti zahrnují, avšak bez omezení, glykosylaci a trojrozměrnou strukturu. Délka sekvence definující epitop může být předmětem širokých variací, nebot se uvažuje, že se tyto epitopy tvoří trojrozměrným tvarem antigenu (například skládáním) . Proto může být aminokyselin definujících epitop relativně málo, avšak mohou být široce rozložené podél délky molekuly (nebo dokonce na různých molekulách v případě dimerů atd.) a jsou přivedeny do správné konformace epitopu skládáním. Podíly antigenu mezí zbytky definujícími epitop nemusí být pro konformační strukturu epitopu kritické. Například delece nebo substituce těchto zasahujících sekvencí nemusí ovlivňovat konformační epitop, pokud se zachovají sekvence kritické pro konformaci epitopu (například cysteiny, které se účastní disulfidických vazeb, glykosylační místa atd.).

Konformační epitopy se snadno identifikují s použitím výše popsaných způsobů. Dále přítomnost či nepřítomnost konformačního epitopu v daném polypeptidů lze snadno stanovit screeningem daného antigenu s protilátkou (polyklonální sérum nebo monoklonální pro konformační epitop) a srovnáním jeho reaktivity s reaktivitou denaturované verze antigenu, která zachovává pouze lineární epitopy (pokud vůbec některé zachovává). Při takovém screeningu s použitím polyklonálních protilátek může být výhodné absorbovat polyklonální sérum nejprve s denaturovaným antigenem a pozorovat, zda zachovává

0 0

0 · 0 0 · • · 0 0 0 · • · · · 0 ·00 • 0 00000 0 0 00000 • 0 0 0 0 0 • · 0 0 0 0 · protilátky proti danému antigenů. Konformační epitopy odvozené od oblastí El a E2 se popisují například v mezinárodní publikaci č. WO 94/01778.

Imunologická odpověď na antigen HCV nebo kompozici znamená vývoj humorální a/nebo buněčné imunitní odpovědi subjektu na molekuly přítomné v dané kompozici. Pro účely tohoto vynálezu se humorální imunitní odpověď týká imunitní odpovědi zprostředkované molekulami protilátky, zatímco buněčná imunitní odpověď je taková, která je zprostředkovaná T-lymfocyty a/nebo jinými bílými krvinkami. Jedním důležitým aspektem buněčné imunity je antigen-specifická odpověď zprostředkovaná cytolytickými T-buňkami (CTL). CTL jsou specifické pro peptidové antigeny, které jsou přítomné ve spojení s proteiny kódovanými hlavním histokompatibilním komplexem (MHC) a exprimovanými na povrchách buněk. CTL pomáhají vyvolávat a podporovat intracelulární destrukci intracelulárních mikrobů nebo cytolýzu buněk infikovaných těmito mikroby. Dalším aspektem celulární imunity je antigen- specifická odpověď T-buněčnými helpery. T-buněčné helpery pomáhají stimulovat funkci a zaměřovat aktivitu nespecifických efektorových buněk proti buňkám vykazujícím peptidové antigeny ve spojení s molekulami MHC na jejich povrchu. Celulární imunitní odpověď se též týká tvorby cytokinů, chemokinů a dalších takových molekul produkovaných aktivovanými T-buňkami a/nebo jinými bílými krvinkami včetně těch, které jsou odvozené od CD4+ a CD8+ T-buněk. Kompozice vakcíny, která vyvolává buněčnou imunitní odpověď, může sloužit pro senzibilizaci obratlovce prezentací antigenů ve spojení s MHC molekulami při buněčném povrchu. Imunitní odpověď zprostředkovaná buňkami je zaměřená do blízkosti buněk nebo na buňky prezentující na svém povrchu antigen. Navíc lze vytvářet antigen-specifické T-lymfocyty pro umožnění budoucí • · • · · · · · · ····· · · · · ··· ochrany imunizovaného hostitele. Schopnost daného antigenu stimulovat buňkami zprostředkovanou imunologickou odpověď lze určit řadou analýz, jako je lymfoproliferace (aktivace lymfocytů), CTL cytotoxické eseje nebo stanovením T-lymfocytů specifických pro antigen u senzibilizovaného subjektu. Tyto způsoby jsou v oboru dobře známy, viz například Erikson a kol., J. Immunol., 151, 4189-4199 (1993), Doe a kol, Eur. J. Immunol., 24, 2369-2376 (1994).

Proto imunologická odpověď, jak se zde používá, může být taková, která stimuluje tvorbu CTL a produkci či aktivaci T-buněčných helperů. Daný antigen může též vyvolat imunitní odpověď zprostředkovanou protilátkou včetně například neutralizace vazby (NOB) protilátek. Přítomnost odpovědi protilátky NOB lze snadno stanovit způsoby popsanými například autory Rosa a kol, Proč. Nati. Acad. Sci, USA, 93,

1759 (1996). Proto může imunologická odpověď zahrnovat jeden či více z následujících účinků: tvorba protilátek B-buňkami a/nebo aktivace supresorových T-buněk a/nebo gama δ T-buněk zaměřených specificky na antigen či antigeny přítomné v kompozici dané vakcíny. Tyto odpovědi mohou sloužit pro neutralizaci neúčinnosti a/nebo zprostředkování protilátkového komplementu nebo protilátkově-dependentní buněčné cytotoxicity (ADCC) pro poskytnutí ochrany či úlevy od symptomů imunizovaného hostitele. Takové odpovědi lze stanovit s použitím standardních imunoesejí a neutralizačních eseji dobře známých v oboru.

Pojem imunostimulační nukleotidová sekvence nebo ISS, jak se zde používá, znamená polynukleotid, který obsahuje alespoň jeden imunostimulační oligonukleotidový (ISS-ODN) zbytek. Tento ISS zbytek je jednoduchá nebo dvojitá šroubovice DNA nebo RNA oligonukleotídu majícího alespoň

9 4 4 9

4 ·

44444 9 šest nukleotidových bází, které mohou zahrnovat nebo které mohou tvořit modifikovaný oligonukleotid ěi sekvenci modifikovaných nukleosidů. Zbytky ISS zahrnují nebo se mohou připojovat k molekule CG obsahující nukleotidovou sekvenci nebo p(IC) nukleotidovou sekvenci, která může být palindromní. Cystein může být methylovaný nebo nemethylovaný. Příklady konkrétních ISS molekul pro použití v tomto vynálezu zahrnují CpG molekuly diskutované dále níže, stejně tak jako CpY a CpR molekuly a podobné.

Složka HCV E1E2, jako je submikronová emulze olej ve vodě nebo CpG oligonukleotid, posiluje imunitní odpověď na antigen HCV E1E2 přítomný v kompozici, jestliže kompozice má větší schopnost vyvolávat imunitní odpověď než je imunitní odpověď vyvolaná ekvivalentním množstvím antigenu dodaného bez přídavné složky. Taková posílená imunita se může stanovit podáním antigenové kompozice za přítomnosti nebo bez přítomnosti dalších složek a srovnáním titrů protilátek proti dvěma použitým standardním esejím, jako je radioimunoesej a ELISA, dobře známým v oboru.

Rekombinantní protein je protein, který zachovává požadovanou aktivitu a který se připraví způsoby rekombinantních DNA, jak se zde popisuje. Obecně se daný gen klonuje a poté se exprimuje v transformovaném organismu, jak se popisuje dále níže. Hostitelský organismus exprimuje cizí gen s obdržením proteinu za podmínek exprese.

Pojem izolovaný při odkazu na některý polypeptid znamená, že je daná molekula oddělená a diskrétní vůči celému organismu, ve kterém se molekula nachází v přírodě nebo že je přítomná v podstatě v nepřítomnosti dalších biologických makromolekul téhož typu. Pojem izolovaný vzhledem ·· · k polynukleotidu je molekula nukleové kyseliny prostá jako celek nebo část sekvencí normálně spojených s jeho povahou nebo sekvencí, která existuje v přírodě, avšak mající heterologní sekvence nebo molekulu disasociovanou od chromosomu.

Pojem ekvivalentní antigenní determinant znamená antigenní determinant z různých poddruhů či kmenů HCV, jako jsou kmeny 1, 2, 3 atd. HCV, jehož antigenní determinanty nejsou nezbytně identické následkem variace sekvence, avšak které se vyskytují v ekvivalentních polohách v dané sekvenci HCV. Obecně budou mít aminokyselinové sekvence ekvivalentních antigenních determinantů vysoký stupeň sekvenční homologie, to jest homologii sekvence aminokyselin více než 30 %, obvykle více než 40 %, jako je více než 60 % a dokonce ještě více než 80 až 90 % homologie při přiřazení obou sekvencí .

Homologie se týká procentické identity mezi dvěma polynukleotidy nebo dvěma polypeptidovými zbytky. Dvě DNA nebo dvě polypeptidové sekvence jsou v podstatě homologní, jestliže vykazují alespoň 50 %, přednostně alespoň 75 %, lépe alespoň 80 až 85 %, ještě lépe alespoň 90 % a nejlépe alespoň 95 % až 98 % sekvenční identity podél definované délky těchto molekul. Pojem v podstatě homologní, jak se zde používá, se též týká sekvencí vykazujících úplnou identitu s danou DNA nebo polypeptidovou sekvencí.

Identita obecně znamená přesnou shodu nukleotid po nukleotidu nebo aminokyselina po aminokyselině pro příslušné dvě polynukleotidové nebo polypeptidové sekvence. Procento identity lze stanovit přímým srovnáním sekvenční informace mezi dvěma molekulami přiřazením sekvencí, počítáním přesného počtu souhlasu mezi dvěma přiřazenými sekvencemi, dělením • 9 9

9 • •99 9 »·

9 9

9 9 9 9 9

99·· * · · ····

9 9 9

99 9 délkou kratší sekvence a vynásobením výsledku číslem 100.

Při této analýze lze použít snadno dostupné počítačové programy, jako je ALIGN, M. 0. Dayhoff v Atlas of Protein Sequence and Structure, M. 0. Dayhoff red., 5 Suppl., 3.,

353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, DC, která přizpůsobuje algoritmus lokální homologie Smithe a Watermana, Advances in Appl Math., 2, 482-489 (1981) pro analýzu peptidů. Programy pro stanovení nukleotidové sekvenční identity jsou k dispozici ve Verzi 8 souboru Wisconsin Sequence Analysis Package (od Genetics Computer Group, Madison, WI) například programy BESTFIT, FASTA a GAP, které se rovněž zakládají na algoritmu Smithe a Watermana. Tyto programy se snadno používají s parametry standardního nastavení doporučenými výrobcem a popsanými ve Wisconsin Sequence Analysis Package citovaném výše. Například procentická identita dané nukleotidové sekvence s referenční sekvencí se stanoví s použitím algoritmu homologie Smithe a Watermana s tabulkou skóre standardního nastavení a gap penalty šesti nukleotidových poloh.

Další způsob zjištění procentické identity v souvislosti s tímto vynálezem je použití souboru programů MPSRCH s autorským právem University of Edinburgh vyvinutých John F. Collinsem a Shane S. Sturrokem a distribuovaných IntelliGenetics, lne. (Mountain View, CA). Z těchto souborů lze použít Smithův-Watermanův algoritmus, kde se používají parametry standardního nastavení pro tabulku skóre (například gap open penalty 12, gap extension penalty 1 a gap 6). Z generovaných údajů hodnota Match (shody) odráží sekvenční identitu. Další vhodné programy pro výpočet procentické identity či podobnosti mezi sekvencemi jsou obecně známé v oboru, například další program pro přiřazení je BLAST používaný s parametry standardního nastavení. Například lze použít BLASTN a BLASTP s použitím parametrů standardního nastavení: genetický kód = standardní, filtr = žádný, vlákna = obě, zkrácení = 60, očekávání = 10, matrice = BL0SUM62, popisy = 50 sekvencí, třídění = HIGH SCORE, databáze = neredundantní, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + Swiss protein + Spupdate + PIR. Podrobnosti o těchto programech lze nalézt na následující internetové adrese: http://www.nebi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST.

Alternativně lze homologii stanovit hybridizací polynukleotidů za podmínek, které vytvářejí stabilní duplexy mezí homologními oblastmi s následující digescí jednovláknově specifické nukleasy (nukleas) a stanovením velikosti fragmentu po digesci. DNA sekvence, které jsou v podstatě homologní, lze identifikovat v Southernově hybridizačním experimentu například za přísných podmínek definovaných pro daný systém. Definice příslušných hybridizačnich podmínek patří do rámce zkušenosti v oboru. Viz například Sambrook a kol., výše, DNA Cloning, výše, Nucleic Acid Hybridization, výše.

II. Způsoby provedení vynálezu

Před podrobným popisem tohoto vynálezu je třeba si uvědomit, že se tento vynález neomezuje na konkrétní formulace či procesní parametry a jako takový může vykazovat odchylky. Je rovněž třeba si uvědomit, že terminologie, která se zde používá, slouží pouze pro účely popisů jednotlivých ztělesnění tohoto vynálezu a nezamýšlí se jako omezující.

I když v praxi tohoto vynálezu lze použít řadu kompozicí a způsobů podobných či ekvivalentních těm, které se zde popisují, předkládá se zde popis preferovaných látek a způsobů .

» ·

- 27 Jak se popisuje výše, zakládá se tento vynález na objevu, že antigeny HCV E1E2 v kombinaci se submikronovými emulzemi olej ve vodě bez MTP-PE stejně tak jako se submikronovými emulzemi olej ve vodě a imunostimulačními molekulami nukleových kyselin, jako jsou CpG oligonukleotidy, poskytují kompozice, které vyvolávají významně vyšší titry protilátek než jsou hodnoty pozorované bez těchto adjuvantních prostředků. Vyvolání HCV-specifických protilátek polypeptidy E1E2 poskytuje systémy modelů in vitro a in vivo pro vývoj HCV vakcín, zejména pro identifikaci HCV El, E2 a HCV E1E2 polypeptidových epitopů souvisejících s tvorbou silných titrů protilátek proti El, proti E2 a/nebo proti E1E2 a/nebo s celulární imunitní odpovědí zaměřenou proti HCV. E1E2 polypeptidy lze též použít pro získání imunitní odpovědi proti HCV u savce, zejména odpovědi protilátky proti El proti E2 a/nebo proti E1E2 a/nebo celulární buněčné odpovědi pro buď terapeutické nebo profylaktické účely.

Pro další pochopení tohoto vynálezu se níže poskytuje podrobná diskuse ohledně E1E2 polypeptidů pro použití v daných kompozicích stejně tak jako pro přípravu submikronových emulzí olej ve vodě, imunostimulačních molekul nukleových kyselin a kompozicí uvažovaných výše.

Polypeptidy E1E2

Jak se popisuje výše, komplexy E1E2 pro použití s kompozicemi podle tohoto vynálezu zahrnují polypeptidy El a E2 spojené buď nekovalentnimi nebo kovalentními interakcemi. Genom viru hepatity C obsahuje jednoduchý otevřený čtecí rámec zhruba 9600 nukleotidů, který se transkribuje do polyproteinu. Polyprotein HCV se štěpí obdržením řady odděle28 ných produktů v pořadí NH₂-C-El-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH {viz obrázek l). Polypeptid HCV El je glykoprotein a je zhruba od aminokyseliny 192 do aminokyseliny

383 {číslování vzhledem k polyproteinu HCV-1). Viz Choo a kol., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 88, 2451-2455 (1991). Aminokyseliny při zhruba 173 až zhruba 191 představují signální sekvenci pro El. Polypeptid HCV E2 je rovněž glykoprotein a vyskytuje se zhruba od aminokyseliny 383 nebo 384 k aminokyselině 748.

Signální peptid pro E2 začíná zhruba při aminokyselině 364 polyperoteinu. Termín El plné délky nebo nezkrácený El, jak se zde používá, se tedy týká polypeptidů zahrnujících alespoň aminokyseliny 192 až 383 polyproteinu HCV (číslování vzhledem k HCV-1). Vzhledem k E2 pojem plné délky nebo nezkrácený, jak se zde používá, se zde týká polypeptidů, které zahrnují alespoň aminokyseliny 383 nebo 384 až 746 polyproteinu HCV (číslování vzhledem k HCV-1). Jak bude zřejmé z tohoto popisu, mohou polypeptidy E2 pro použití v tomto vynálezu zahrnovat další aminokyseliny z oblasti p7, jako jsou aminokyseliny 747 až 809.

Jak se popisuje výše, existuje E2 ve formě více složek [Spaete a kol., Virol, 188, 819-830 (1992), Selby a kol., J. Virol., ZQ, 5177-5182 (1996), Grakoui a kol., J. Virol., 67, 1385-1395 (1993), Tomei a kol., J. Virol., 67, 4017-4026 (1993)] a může docházet k odstřižení a proteolýze na koncích N a C polypeptidů El a E2. Proto může polypeptid E2 pro toto použití obsahovat alespoň aminokyseliny 405 až 661, například 400, 401, 402... až 661, jako je 383 nebo

384 až 661, 383 nebo 384 až 715, 383 nebo 384 až 746, 383 nebo 384 až 749 nebo 383 nebo 384 až 809 nebo 383 nebo 384 u jakéhokoliv konce C mezi 661 až 809 polyproteinu HCV « Φ · φ · • · · · φ φ • · φ φ φ φφφφ • ·

Φ Ο Φ φ φ φ φ <

φφφφ φφφ «φ s číslováním vzhledem k polyproteinu plné délky HCV-1. Podobně mohou preferovatelné El polypeptidy pro toto použití obsahovat aminokyseliny 192 až 326, 192 až 330, 192 až 333, 192 až 360, 192 až 363, 192 až 383 nebo 192 u kteréhokoliv konce C mezi 326 a 383 polyproteinu HCV.

Komplexy E1E2 lze též připravit z imunogenních fragmentů El a E2 obsahujících epitopy. Například fragmenty polypeptidů El mohou obsahovat od zhruba 5 do téměř plné délky molekuly, jako je 6, 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175,

185 nebo více aminokyselin polypeptidu El nebo jakékoliv celé číslo mezí těmito vyjmenovanými čísly. Podobně fragmenty polypeptidů E2 mohou obsahovat 6, 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300 nebo 350 aminokyselin polypeptidu E2 nebo jakékoliv celé číslo mezi těmito vyjmenovanými čísly. Polypeptidy El a E2 mohou být od stejných nebo rozdílných kmenů HCV.

Například epitopy odvozené od hypervariabilní oblasti E2, jako je oblast rozmezí aminokyselin 384 až 410 nebo 390 až 410, mohou být zahrnuté do polypeptidu E2. Zvláště efektivní epitop E2 pro inkorporaci do sekvence E2 je takový, který zahrnuje sekvenci konsensu odvozenou z této oblasti, jako je sekvence konsensu Gly-Ser-Ala-Ala-Arg-Thr-Thr-Ser-Gly-Phe-Val-Ser-Leu-Phe-Ala-Pro-Gly-Ala-Lys-Gln-Asn, která představuje sekvenci konsensu pro aminokyseliny 390 až 410 genomu typu 1 HCV. Jsou známy další epitopy El a E2 a popisují se například v Chien a kol., mezinárodní publikace č. WO 93/00365.

Navíc mohou komplexy polypeptidů El a E2 postrádat celou doménu překlenující membránu nebo její část. Sekvence membránového kotvení slouží pro připojení polypeptidu • · · · · · · ····· · · · · * · · • · · · · · * · ······· ·· · · · · k endoplasmatickému retikulu. Normálně jsou tyto polypeptidy schopné sekrece do růstového média, ve kterém se pěstuje organismus exprimující protein. Avšak, jak se popisuje v mezinárodní publikaci č. WO 98/50556, lze tyto polypeptidy získávat intracelulámě. Sekrece do růstového média se snadno stanoví s použitím řady detekčních způsobů, včetně například polyakrylamidové gelové elektroforézy a podobně a imunologických způsobů, jako jsou imunoprecipitační analýzy, jak popisuje například mezinárodní publikace č. WO 96/04301 vydaná 15. února 1996. Pro El obecně polypeptidy končící okolo aminokyselinové polohy 370 a výše (podle číslování HCV-l El) se zadrží ER a proto se nevylučují do růstového média. Pro E2 polypeptidy končící okolo aminokyselinové polohy 731 a výše (rovněž podle číslování sekvence HCV-l E2) se zadrží ER a nevylučují se. (Viz například mezinárodní publikaci č. WO 96/04301, vydanou 15. února 1996).

Je třeba poznamenat, že tyto aminokyselinové polohy nejsou absolutní a mohou se do určitého stupně měnit. Proto tento vynález uvažuje použití polypeptidů El a E2 udržujících transmembránovou vazebnou doménu stejně tak jako polypeptidů, kterým chybí část nebo celá transmembránová vazebná doména včetně El polypeptidů končících okolo aminokyselin. 369 a níže a E2 polypeptidů končících okolo aminokyselin 730 a níže takovým způsobem, že spadají do tohoto vynálezu. Dále lze C-terminální zkrácení rozšířit mimo transmembránovou překlenující membránu směrem ke konci N. Proto například zkrácení El v polohách nižších než například 360 a zkrácení E2 v polohách nižších než například 715 rovněž patří do tohoto vynálezu. Je pouze nezbytné to, aby zkrácené polypeptidy El a E2 zůstaly funkčními pro zamýšlené úkoly. Avšak zejména preferované zkrácené El konstrukty jsou ty, které nepřekračují aminokyselinu 300. Většina preferovaných jsou ty, které končí v poloze 360. Preferované zkrácené E2 konstrukty • · • ·

9 99 • · · · • · ···

9 99 9 • · · • · · · jsou ty, jejichž C-terminální zkrácení nepřekračuje polohu aminokyseliny 715. Zvláště preferovaná zkrácení E2 představuje ty molekuly, které jsou zkrácené po jakékoliv aminokyselině 715 až 730, jako je 725. Pokud se použijí zkrácené molekuly, je preferované použiti molekul El a E2, které jsou obě zkrácené.

Polypeptidy El a E2 a jejich komplexy mohou být též přítomny jako asialoglykoproteiny. Tyto asialoglykoproteiny se tvoří způsoby známými v oboru, jako je použiti buněk s blokovanou terminální glykosylací. Když se tyto proteiny exprimují v těchto buňkách a izolují GNA lektinovou afinitní chromatografií, agregují proteiny El a E2 spontánně. Podrobné způsoby pro přípravu těchto agregátů E1E2 se popisují například v US patentu č. 6 074 852.

Dále mohou být kompexy E1E2 přítomny jako heterogenní směs molekul následkem odřezávání a proteolytického štěpení, jak se popisuje výše. Proto mohou komplexy včetně E1E2 zahrnovat vicečetné složky E1E2, jako je E1E2 končící při aminokyselině 746 (E1E2 ), E1E28 končící při aminokyselině 809 (ElE2_so&) a jakékoliv další molekuly El a E2 popsané výše, jako jsou E2 molekuly s N-terminálním zkrácením od 1 do 20 aminokyselin, jako jsou složky E2 počínaje aminokyselinou 387, aminokyselinou 402, aminokyselinou 403 atd.

Komplexy E1E2 se snadno získávají rekombinantně, buď jako hybridní proteiny nebo například kotransfekcí hostitelských buněk s konstrukty kódujícími dané El a E2 polypeptidy. Kotransfekcí lze uskutečnit buď v poloze trans nebo cis, to jest použitím různých vektorů nebo použitím jednoho vektoru, který nese oba geny El a E2. Při použití jednoho vektoru lze oba geny řídit jedním souborem kontrolních prvků • · · • · · · · • · nebo alternativně mohou být geny přítomné na vektoru v jednotlivých expresních kazetách řízených jednotlivými kontrolními elementy. Po expresi se El a E2 proteiny spontánně spojují. Alternativně lze vytvářet komplexy mícháním jednotlivých proteinů navzájem, které byly vytvořené odděleně, buď v purifikované nebo semipurifikované formě nebo dokonce smísením médií, ve kterých se pěstovaly hostitelské buňky exprímující proteiny, pokud se proteiny vylučují. Konečně lze komplexy E1E2 podle tohoto vynálezu exprimovat jako hybridní protein, kde se žádaná část El připojuje na žádanou část E2.

Způsoby tvorby komplexů E1E2 z plné délky, ze zkrácených proteinů El a E2, které se vylučují do média, stejně tak jako z intracelulárně získaných zkrácených proteinů jsou známy v oboru. Takové komplexy lze například obdržet rekombinantně, jak popisuje US patent č. 6 121 020, Ralston a kol., J. Virol., 67, 6753-6761 (1993), Grakoui a kol.,

67. 1385-1395 (1993) a Lanford a kol., Virology, 197. 225 až 235 (1993).

Polynukleotidy kódující polypeptidy El a E2 HCV pro použití v tomto vynálezu lze tedy získávat standardními způsoby molekulární biologie. Například polynukleotidové sekvence kódující výše popisované molekuly lze obdržet rekombinantními způsoby, jako je screening cDNA a genomové knihovny z buněk exprimující gen nebo odvozením genu od vektoru, o kterém je známo, že je obsahuje. Dále lze požadovaný gen izolovat přímo z molekul virových nukleových kyselin způsoby popisovanými v oboru například v Houghton a kol., US patent č. 5 350 671. Daný gen lze též obdržet synteticky spíše než klonovat. Molekuly mohou být konstruovány příslušnými kodony pro danou sekvenci. Úplná sekvence se poté sestaví z přesahuj ících oligonuklidů připravených standardními způsoby • · ···· » · · · · · • · · · · · · · · · • · · t ······· · ♦·· · • · ··· · · ······· ·· · · · ·

- 33 a sestavených do úplné kódovací sekvence. Viz například Edge, Nátuře, 292. 756 (1981). Nambair a kol., Science, 223. 1299 (1984) a Jay a kol., J. Biol. Chem., 259. 6311 (1984).

Dané nukleotidové sekvence lze tedy obdržet z vektorů uchovávajících příslušné sekvence nebo připravit synteticky úplné nebo částečně s použitím různých způsobů syntézy oligonukleotidů známých v oboru, jako je mutageneze zaměřená na místo a způsoby polymerasové řetězové reakce (PCR) tam, kde je to vhodné. Viz například Sambrook, výše. Konkrétně jeden způsob obdržení nukleotidové sekvence kódující požadované sekvence je spojování komplementárních souborů přesahujících syntetických oligonukleotidů obdržených v konvenčním automatizovaném syntetizátoru polynukleotidů s následnou ligací příslušnou DNA ligasou a amplifikací ligované nukleotidové sekvence prostřednictvím PCR. Viz například Jayaraman a kol., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 88, 4084-4088 (1991). Navíc lze použít syntézu směrovanou na oligonukleotid [Jones a kol., Nátuře, 54, 75-82 (1986)], mutagenesi předem existujících nukleotidových regionů orientovanou na oligonukleotidy [Riechmann a kol., Nátuře, 332, 323-327 (1988) a Verhoeyn a kol., Science, 239. 1534-1536 (1988)] a enzymatické zaplňování oligonukleotidů s mezerami s použitím T^DNA polymerasy [Queen a kol., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 86. 10029-10033 (1989)] s obdržením molekul majících pozměněné či zvýšené schopnosti vazby antigenu a imunogenní vlastnosti.

Když se kódující sekvence připraví či izolují, mohou se klonovat do jakéhokoliv vhodného vektoru či replikonu. Četné klonovací vektory jsou známé tomu, kdo má zkušenost v oboru a výběr příslušného klonovacího vektoru je otázkou volby. Vhodné vektory zahrnují, avšak bez omezení, plasmidy, fágy, transposony, kosmidy, chromosomy nebo viry, které jsou ·· • · · · • · ·· 4 · 4 9 9 9

4 4 4 4 · 4 444 • 4444 4444 44 4 4444

4 444 444

4444444 4· · 4 * 4 schopné replikace při spojení se správnými kontrolními elementy .

Kódovací sekvence se poté přivede pod kontrolu vhodných kontrolních elementů v závislosti na systému, který se má použít pro expresi. Kódovací sekvence se může uvést pod kontrolu promotoru, vazebného místa ribosomů (pro bakteriální expresi) a případně operátoru, takže se daná sekvence DNA transkribuje do RNA vhodným transformantem. kódovací sekvence může a nemusí obsahovat signální peptid vedoucí sekvence, který může poté odstraněn hostitelem při posttranslačním zpracování. Viz například US patent č. 4 431 739,

425 437, 4 338 397.

Navíc se mohou požadovat kontrolní sekvence pro přidání regulačních sekvencí, které umožňují regulaci exprese sekvencí vzhledem k růstu hostitelské buňky. Regulační sekvence jsou známy tomu, kdo má zkušenost v oboru a příklady zahrnují ty, které způsobují zapnutí nebo vypnutí exprese genu jako odpověď na chemický či fyzikální podnět včetně přítomnosti regulační sloučeniny. Další typy regulačních elementů mohou být rovněž přítomné ve vektoru. Například enhancerové elementy lze zde použít pro zvýšení hladin exprese konstruktů. Příklady zahrnují časný genový enhancer SV40 [Dijkema a kol., EMBO J., 4, 761 (1985)], enhancer/promotor odvozený od dlouhého terminálního opakování (LTR) viru Rousova sarkomu [Gorman a kol., Proč. Nati. Acad. Sci., USA,

79. 6777 (1982)] a elementy odvozené od lidského CMV [Boshart a kol., Cell, 41, 521 (1985)] jako elementy, které jsou součástí sekvence CMV intronu A (US patent č. 5 688 688). Expresní kazeta může dále zahrnovat působ replikace pro autonomní replikaci ve vhodné hostitelské buňce, jeden či více volitelných markérů, jedno či více restrikčních míst, mož·· 0

00* 0 000

0 00000 0 0 00000

0 0 0 0 0 00 0 00 0 nost vysokého počtu kopií a silný promotor.

Expresní vektor se konstruuje takovým způsobem, že se ve vektoru umístí příslušná kódovací sekvence s příslušnými regulačními sekvencemi, přičemž umístění a orientace kódovací sekvence vzhledem ke kontrolním sekvencím je takové, že se kódovací sekvence transkribuje pod kontrolou kontrolní sekvencí (to jest RNA polymerasa, která se váže na molekulu DNA při kontrolních sekvencích transkribuje kódovací sekvenci) . Modifikace sekvencí kódujících danou molekulu může být žádoucí k tomuto účelu. Například v některých případech může nastat nutnost modifikovat sekvenci, tak, aby ji bylo možno připojit ke kontrolním sekvencím v příslušné orientaci, to jest udržovat čtecí rámec. Kontrolní sekvence a další sekvence lze ligovat s kódovací sekvencí před vložením do vektoru. Alternativně lze kódovací sekvenci kódovat přímo do expresního vektoru, který již obsahuje kontrolní sekvence a příslušné restrikční místo.

Jak se vysvětluje výše, může být též vhodné vytvářet mutanty či analogy daného polypeptidů. Mutanty nebo analogy HCV polypeptidů pro použití v těchto kompozicích lze připravit delecí části sekvence kódující daný polypeptid, inzercí sekvence a/nebo substitucí jednoho či více nukleotidů v rámci sekvence. Způsoby modifikace nukleotidových sekvencí, jako je mutageneze zaměřená na místo a podobně, jsou dobře známy tomu, kdo má zkušenost v oboru. Viz například Sambrook a kol., výše, T. A. Kunkel, Proč. Nati. Acad. Sci., USA,

82. 448 (1985), Geisselsoder a kol., BioTechniques, 5., 786 (1987), Zoller a Smith, Methods Enzymol., 100. 468 (1983),

Dalbie-McFarland a kol., Proč. Nati., Acad. Sci., USA, 22,

6409 (1982).

• · • · · • · · ♦«

Molekuly lze exprimovat širokým rozmezím systémů včetně hmyzích, savčích, bakteriálních, virových a kvasinkových expresních systémů vesměs dobře známých v oboru.

Například expresní systémy hmyzích buněk, jako jsou bakulovirové systémy, jsou dobře známy tomu, kdo má zkušenost v oboru a popisují se například v Summers a Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin č. 1555 (1987). Materiály a způsoby systémů exprese buněk bakulovirů/hmyzu jsou komerčně dostupné ve formě souprav mimo jiné od Invitrogen, San Diego CA (MaxBac kit). Podobně systémy exprese bakteriálních a savčích buněk jsou dobře známy v oboru a popisují se například v Sambrook a kol, výše. Kvasinkové expresní systémy jsou rovněž známy v oboru a popisují se například v Yeast Genetic Engineering (Barr a kol., red.,

1989) Butterworths, Londýn.

Je rovněž známá řada příslušných hostitelských buněk pro použití se systémy výše. Například savčí buněčné linie jsou známy v oboru a zahrnují immortalizované buněčné linie od American Type Culture Collection (ATCC), jako jsou, avšak bez omezení, buňky ovárií čínského křečka (CHO), HeLa buňky, buňky ledvin mláďat křečka (BHK), buňky ledvin opic (COS), lidské embryonální buňky ledvin, buňky lidského hepatocelulárního karcinomu (například Hep G2), buňky bovinní ledviny Madin-Darby (MDBK) a další. Podobně bakteriální hostitelé, jako je E. coli, Bacillus subtilis a Streptococcus spp., nalézají použití s těmito expresními konstrukty. Kvasinkoví hostitelé použitelní v tomto vynálezu zahrnují mimo jiné Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondii, Píchia pastoria, Schizosaccharomyces pombe a Yarrowia lipolytica. Hmyzí buňky pro po9 • 9

9 9 • ·9 99 • 9

9 9

9 9 9 9 • 9 užití s bakulovirovými expresními vektory zahrnují mimo jiné Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx moři, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda a Trichoplusia ní.

Molekuly nukleových kyselin obsahující dané nukleotidové sekvence lze stabilně integrovat do genomu hostitelské buňky nebo udržovat na stabilním episomálním elementu ve vhodné hostitelské buňce s použitím různých způsobů dodávky genu dobře známých v oboru. Viz například US patent č.

399 346.

V závislosti na zvoleném expresním systému a hostiteli se molekuly tvoří rostoucími hostitelskými buňkami transformovanými expresním vektorem popsaným výše za podmínek, při kterých se tento protein exprimuje. Expresní protein se poté izoluje z hostitelských buněk a purifikuje. Pokud expresní systém vylučuje protein do růstového média, lze produkt purifikovat přímo z tohoto média. Pokud se nevylučuje, může se izolovat z buněčných lyzátů. Volba příslušných růstových podmínek a způsobů získávání patří do rámce zkušeností v oboru.

Kompozice

Když se antigeny E1E2 připraví, mohou se použít v kompozicích vakcíny například v profylaktických (to jest pro zabránění infekce) nebo terapeutických (pro léčení HCV po infekci) vakcínách. Tyto vakcíny mohou zahrnovat směsi jednoho či více komplexů E1E2, jako jsou komplexy E1E2 odvozené od více než jednoho virového izolátu stejně tak jako od dalších antigenu HCV. Dále, jak se popisuje výše, se mohou komplexy E1E2 prezentovat jako heterogenní směs molekul odstřihováním a proteolytickým štěpením. Kompozice obsahující • · • · ·

99 9 99 99 9 ·* · • · · « • · 9999 komplexy E1E2 může tedy obsahovat více složek E1E2, jako je E1E2 končící při aminokyselině 746 (Ε1Ε2_74<_) , E1E28 končící při aminokyselině 809 (E1E2_so£j) nebo kterákoliv z různých molekul El a E2 popisovaných výše, jako jsou molekuly E2 s N-terminálním zkrácením o 1 až 20 aminokyselin, jako jsou složky E2 počínající při aminokyselině 387, aminokyselině 402, aminokyselině 403 atd.

Tyto vakcíny lze podávat ve spojení s jinými antigeny a imunoregulačními prostředky, například imunoglobuliny, cytokiny, lymfokiny a chemokiny včetně, avšak bez omezení, cytokinů jako je IL-2, modifikovaný IL-2 (cysl25->serl25), GM-CSF, IL-12, gama-interferon, IP-10, MIP1S, FLP-3, ribavirin a RANTES.

Vakcíny obecně zahrnují jeden či více farmaceutických pomocných látek či vehikulí, jako je voda, fyziologický roztok, glycerol, ethanol atd. Navíc v těchto vehikulích mohou být pomocné látky, jako jsou smáčecí a emulgační prostředky, látky pufrující pH a podobně.

Případně je přítomný nosič, což je molekula, která sama o sobě neindukuje tvorbu protilátek škodlivou subjektu, který obdrží tuto kompozicí. Vhodnými nosiči jsou obvykle velké, pomalu metabolizované makromolekuly, jako jsou proteiny, pólysacharidy, polymléčné kyseliny, polyglykolové kyseliny, polymerní aminokyseliny, aminokyselinové kopolymery, lipidové agregáty (jako jsou kapíčky oleje či liposomy) a inaktivní virové částice. Tyto nosiče jsou dobře známy tomu, kdo má běžnou zkušenost v oboru. Dále se může HCV polypeptid připojovat na bakteriální toxoid, jako je toxoid difterie, tetanu, cholery atd.

• · • ·

Φ·

Φ···

Jak se zde popisuje, mohou být v téže kompozici pro zvýšení imunitní odpovědi submikronové emulze olej ve vodě a/nebo ISS, jako jsou CpG oligonukleotídy (popisované dále níže). Mohou být též přítomné další adjuvantní látky jako jsou, avšak bez omezení (1) hlinité soli (alum) , jako je hydroxid hlinitý, fosforečnan hlinitý, síran hlinitý atd., (2) adjuvantní systém Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) obsahující 2 % Skvalenu, 0,2 % Tween 80 a jednu či více komponent bakteriální buněčné stěny ze skupiny zahrnující monofosforyllipid A (MPL), trehalosa-dimykolát (TDM) a skelet buněčné stěny (CWS), přednostně MPL+CWS (Detox™) , (3) saponinové adjuvantní látky, jako je QS21 nebo Stimulon™ (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) použité jako částice vytvořené jako ISCOM (imunostimulační komplexy), které mohou být prosté přídavných detergentů (viz například mezinárodní publikaci č. WO 00/07621), (4) úplné Freundovo adjuvans (CFA) a neúplné Freundovo adjuvans (IFA), (5) cytokiny, jako jsou interleukiny, jako je IL-1, IL-2, IL-4,

IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 atd. (viz například mezinárodní publikaci č. WO 99/44636), interferony, jako je gama interferon, makrofágní faktor stimulující tvorbu kolonií (M-CSF), faktor nekrózy tumoru (TNF) atd, (6) detoxifikované mutanty a bakteriální ADP-ribosylační toxin, jako je toxin cholery (CT), toxin černého kašle (PT) nebo tepelně labilní toxin E. coli (LT), zejména LT-K36 (kde se substituuje lysin místo přirozené aminokyseliny v poloze 63), LT-R72 (kde se substituuje arginin místo přirozené aminokyseliny v poloze 72), CT S109 (kde se substituuje serin místo přirozené aminokyseliny v poloze 109) a PT-K9/G129 (kde se substituuje lysin místo přirozené aminokyseliny v poloze 9 a glycin v poloze 129) (viz například mezinárodní publikace č. WO 93/13202 a WO 92/19265), (7) monofosforyllipid A (MPL) nebo 3-O-deacylovaný MPL (3dMPL) (viz například GB 2220221, EPA 0689454)

4 44 9 99 9

9 99 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9999 9999 99 9 9999

9 9 9 9 9 9 9

9999 999 99 9 . 44 4 případně vpodstatě v nepřítomnosti alum (viz například mezinárodní publikaci č. 00/56358), (8) kombinace 3dMPL například s QS21 a/nebo emulzemi olej ve vodě (viz například EPA 0835318, EPA 0735898, EPA 0761231), (9) polyoxyethylenether nebo polyoxyethylenester (viz například mezinárodní publikaci č. WO 99/52549), (10) saponin a imunostimulační oligonukleotid, jako je CpG oligonukleotid (viz například mezinárodní publikaci č. WO 00/62800), (11) některý imunostimulant a částici kovové soli (viz například mezinárodní publikaci č. WO 00/23105), (12) saponin a emulze olej ve vodě (viz například mezinárodní publikaci č. WO 99/11241), (13) saponin (například QS21) + 3dMPL + IL-12 (případně + sterol) (viz například mezinárodní publikaci č. WO 98/57659) a (14) další látky působící jako imunostimulační prostředky pro zvyšování účinnosti kompozice.

Muramylové peptidy zahrnují, avšak bez omezení N-acetylmuramyl-L-threonyl-D-isoglutamin (thr-MDP), N-acetylnormuramyl-L-alanyl-D-isoglutam (nor-MDP), acetylmuramyl-L-alanyl-D-isogluatminyl-L-alanin-2-(l'-2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyfosforyloxy)ethylamin (MTP-PE) atd.

Obvykle se vakcínové kompozice připravují jako injekční látky, buď jako kapalné roztoky či suspenze. Lze též připravovat tuhé formy vhodné pro rozpuštění či suspendování v kapalných vehikulích před injekčním podáváním.

Tyto vakcíny obsahují terapeuticky účinné množství komplexů E1E2 a kteroukoliv z dalších více popisovaných komponent podle potřeby. Terapeuticky účinné množství znamená množství proteinu E1E2, které vyvolá imunologickou odpověď, přednostně protektivní imunologickou odpověď u subjektu,

4

4 4

4444

4

· 4 4444 4 4

4 4 4

4 4 4

4 4 4 4 kterému se podá. Tato odpověď obecně povede k rozvoji u tohoto subjektu sekreční buněčné a/nebo protilátkou zprostředkované imunitní odpovědi na vakcínu. Obvykle tato odpověď zahrnuje, avšak bez omezení, jeden či více z následujících účinků: tvorbu protilátek kterékoliv imunologické třídy, jako jsou imunoglobuliny A, D, E, G nebo M, proliferaci B a T lymfocytů, zajištění aktivace růstu a diferenciačních signálů pro imunologické buňky, expanze helperových T buněk, supresorových T buněk a/nebo cytotoxických T buněk a/nebo gamaó T buněčných populací.

Připravené vakcíny se podávají konvenčním způsobem parenterálnš, například injekcí, buď subkutánně nebo intramuskulárně. Další formulace pro jiné způsoby podávání zahrnují perorální a plicní formulace, čípky a transdermální způsoby aplikací. Rozpis dávek může být jednodávkový či vícedávkový. Přednostně je účinné množství dostatečné k tomu, aby poskytlo léčení či prevenci symptomů onemocnění. Přesné potřebné množství se bude měnit v závislosti na léčeném subjektu, stáří a obecném stavu jednotlivce, který se má léčit, kapacitě imunitního systému jednotlivce pro tvorbu protilátek, stupni požadované protekce, závažnosti léčeného stavu, konkrétního zvoleného polypeptidů E1E2 a způsobu jeho podávání kromě jiných faktorů. Příslušné účinné množství může snadno stanovit ten, kdo má zkušenost v oboru. Terapeuticky účinné množství bude v relativně širokém rozmezí, které lze stanovit rutinními zkouškami na modelech in vitro a in vivo známých v oboru. Množství polypeptidů E1E2 použitých v příkladech níže poskytuje obecné vodítko, které lze použít pro optimalizaci vyvolání protilátek proti El, proti E2 a proti E1E2 .

Zejména lze komplex E1E2 přednostně podávat intramus42 ·· · ·· · • · » · » • · · · · » · ······· · ··· • * » · · ·· · ·· · kulárně většímu savci, jako je primát, například paviánovi, šimpanzovi nebo člověku v dávce zhruba 0,1 /zg až 5,0 mg na jednu dávku nebo v množství mezi hodnotami, jako je 0,5 /zg až zhruba 1,0 mg, 1 /zg až zhruba 500 /zg, 2,5 /zg až zhruba 250 /tg, 4 /tg až zhruba 200 pg, jako je 4, 5, 6, 7, 8, 9,

10...20...30...40...50...60...70...80...90...100 atd /zg na jednu dávku. Polypeptidy E1E2 lze podávat bud' savci, který se neinfikuje HCV nebo je lze podávat savci infikovanému HCV.

Podávání polypeptidů E1E2 může vyvolat titr protilátek proti El, proti E2 a/nebo proti E1E2 po dobu alespoň 1 týdne, 2 týdnů, 1 měsíce, 2 měsíců, 3 měsíců, 4 měsíců, 6 měsíců, 1 roku nebo déle. Polypeptidy E1E2 lze též podávat pro zajištění paměťové odpovědi. Pokud se dosáhne takové od povědí, může titr protilátek klesat v průběhu času, avšak expozice viru HCV nebo imunogenu vede k rychlé indukci protilátek, například během pouze několika dnů. Případně lze titry protilátek uvažovat u savce zajištěním jedné či více posilovačích injekcí polypeptidů E1E2 2 týdny, 1 měsíc, 2 měsíce, 3 měsíce, 4 měsíce, 5 měsíců, 6 měsíců, 1 rok nebo déle po první injekci.

Přednostně vyvolává polypeptid E1E2 titr protilátek alespoň 10, 100, 150, 175, 200, 300, 400, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 3000, 5000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000 (titr geometrického průměru) nebo více nebo jakoukoliv hodnotu mezi těmito titry, jak se stanoví s použitím standard ní imunoeseje, jako je imunoesej popisovaná v příkladech ní že. Viz například Chien a kol., Lancet, 342. 933 (1993) a Chien a kol., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 89, 10011 (1992) .

• 0 0 • *

0 0

0001

0 0 · 0 ♦ 0 · • · · · · • 0 0 · • 0000 · ·

Submikronové emulze olej ve vodě

Jak se popisuje výše, mohou se submikronové prostředky ve formě emulze olej ve vodě podávat obratlovci buď před, současně s, a nebo následně po dodávce antigenů E1E2. Submikronové emulze olej ve vodě pro toto použití zahrnují netoxické metabolizovatelné oleje a komerční emulgátory. Příklady netoxických metabolizovatelných olejů zahrnují bez omezení rostlinné oleje, rybí oleje, živočišné oleje nebo synteticky připravené oleje. Preferují se rybí tuky, jako je olej z tresčích jater, olej žraločích jater a velrybí tuky, zejména se preferuje skvalen, 2,6,10,15,19,23-hexamethyl-2,6,10,14,18,22-tetrakosahexan přítomný v tuku žraločích jater. Tato tuková složka bude přítomná v množství od zhruba 0,5 do zhruba 20 objemových %, přednostně v množství až 15 %, přednostněji v množství od zhruba 1 % do zhruba 12 % a nejlépe od 1 % do 4 % tuku.

Vodný podíl adjuvantního prostředku může být pufrovaný fyziologický roztok nebo čistá voda. Jelikož se kompozice zamýšlejí pro parenterální podávání, je- lepší připravovat konečné roztoky tak, aby tonicita, to jest osmolalita, byla v podstatě stejná jako u normálních fyziologických roztoků, aby se zabránilo otokům či rychlé absorpci po podání kompozice následkem různých iontových koncentrací mezi kompozicí a fyziologickými kapalinami. Pokud se používá spíše fyziologický roztok než voda, je lepší jej pufrovat pro udržení pH kompatibilního s normálními fyziologickými podmínkami.

V některých případech může být též nezbytné udržovat pH na konkrétní hladině pro zajištění stability určitých složek kompozice. Proto bude pH kompozice obecně 6 až 8 a bude se udržovat s použitím kteréhokoliv fyziologicky přijatelného pufru, jako je fosfátový, acetátový, tris, bikarbonátový, ft ft • ftft

ft · • ftft • ftftft karbonátový či podobně. Množství vodného prostředku bude obecně množství nezbytné k doplnění kompozice do požadovaného konečného objemu.

Emulgační prostředky vhodné pro použití ve formulacích olej ve vodě zahrnují bez omezení neiontové povrchově aktivní látky na bázi sorbitanu, jako je sorbitan mon-, dinebo triester, například ty, které jsou komerčně dostupné pod názvem Spán™ nebo Arlacel™, jako je Spán™ 85 (sorbitan-trioleát), polyoxyethylensorbitan mono-, di- nebo triestery komerčně známé pod názvy Tween™, jako je Tween 80™ (polyoxyethylensorbitan-monooleát), polyoxyethylenové mastné kyseliny dostupné pod názvem Myrj™, ethery polyoxyethylenových mastných kyselin odvozené od lauryl-, acetyl-, stearyl- a oleylalkoholů, jako jsou ty, které jsou známé pod názvem Brij™ a podobně. Tyto látky jsou snadno dostupné od řady komerčních zdrojů včetně Sigma, St. Louis, MO a ICI America's lne., Wilmington, DE. Tyto emulgační prostředky lze použít samotné nebo v kombinaci. Emulgační prostředek bude obvykle přítomen v množství 0,02 % až 2,5 hmotnostních % (hmotnost/objem), přednostně 0,05 % až zhruba 1 % a nejlépe 0,01 % až zhruba 0,5 %. Toto přítomné množství bude obecně okolo 20 až 30 hmotnostních % v použitém oleji.

Emulze mohou též obsahovat další imunostimulační prostředky, jako jsou muramylpeptidy včetně, avšak bez omezení, N-acetylmuramyl-L-threonyl-D-isoglutaminu (thr-MDP), N-acetylnormuramyl-L-alanyl-D-isogluatmu (nor-MDP), acetylmuramyl-L-alanyl-D-isogluatminyl-L-alanin-2-(1'-2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyfosforyloxy)ethylaminu (MTP-PE) atd. Mohou být též přítomné imunostimulační složky bakteriální buněčné stěny, jako je monofosforyllipid A (MPL), trehalosa-dimykolát (TDM) a skelet buněčné stěny (CWS) . Al- 45

9» 9 ·· 9

9» 999 · 9 9 9 999

9 9 »«·9 9 9 9 9999

9 9 9 9 9

9 99 9 ternativně mohou být emulze prosté těchto prostředků, jako jsou emulze prosté MTP-PE. Submikronové emulze olej ve vodě podle tohoto vynálezu mohou být též prosté polyoxypropylen-polyoxyethylenových (POP-POE) blokových kopolymerů. Pro popis různých vhodných submikronových formulací olej ve vodě pro použití podle tohoto vynálezu stejně tak jako imunostimulačních prostředků viz například mezinárodní publikaci č. WO 90/14837, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Půblishing Company, Easton, Pennsylvania, 19. vydání, 1995, Van Nést a kol., Advanced adjuvant formulations for use with recombinant subunit vaccines, ve Vaccines 92, Modern Approaches to New Vaccines (Brown a kol., red.) Cold Spring Harbor Laboratory Press, str. 57-62 (1992), Ott a kol., MF59 - Design and Evaluation of a Safe and Potent Adjuvant for Human Vaccines ve Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (M. F. Powell a M. J. Newman, red.) Plenům Press, New York (1995) str. 277-296 a US patent č.

299 884.

Pro tvorbu submikronových částic, to jest částic menších než 1 mikrometr v průměru a částic v nanometrovém rozmezí rozměrů, lze použít řadu způsobů. Například lze použít komerční emulgátory pracující na principu vysokých smykových sil vyvinutých protlačováním kapalin malými otvory za vysokého tlaku. Příklady komerčních emulgačních zařízení zahrnují bez omezení mikrofluidizační zařízení Model 110Y (Microfluidics, Newton, MA), Gaulin Model 30CD (Gaulin, lne., Everett, MA) a Rainnie Minilab Type 8.30H (Miro Atomizer Food and Dairy, lne., Hudson, WI). Příslušný tlak pro použití s jednotlivým emulgačním zařízením snadno stanoví ten, kdo má zkušenost v oboru. Například při použití mikrofluidizačního zařízení Model 110Y poskytuje provoz při tlacích 34,5 až 207 MPa olejové kapičky o průměrech 100 až 750 nm.

• · ·· · • · ·· • · « · • · ·♦·· ··· ·· · • · • · · • ···· · • · ·· · ·· · • · · • · · · • · ···« • * « ·· ·

Velikost olejových kapiček se může měnit změnou poměru povrchově aktivní látky k oleji (rostoucí poměr zmenšuje rozměr kapiček), provozního tlaku (rostoucí provozní tlak snižuje rozměr kapiček), teploty (rostoucí teplota snižuje rozměr kapiček) a přídavkem amfipatického imunostimulačního prostředku (přídavek tohoto prostředku snižuje rozměr kapiček) . Skutečný rozměr kapiček se bude měnit s daným povrchově aktivním prostředkem, olejem a imunostimulačním prostředkem (pokud je přítomen) a s danými zvolenými provozními podmínkami. Velikost kapičky lze ověřit použitím třídících přístrojů, jako je SubMicron Particle Analyzer (Model N4MD) od Coulter Corporation a tyto parametry se mohou měnit s použitím vodítek popsaných výše tak, aby všechny kapičky měly v průměru menší rozměr než 1 mikrometr, přednostně menší než zhruba 0,8 mikrometrů v průměru a nejlépe menší než 0,5 mikrometrů v průměru. V podstatě všechny znamená alespoň 80 % počtu kapiček, přednostně alespoň zhruba 90 %, přednostněji alespoň zhruba 95 % a nejlépe alespoň zhruba 98 %. Distribuce velikosti částic je obvykle Gaussovská, takže střední průměr je menší než popisované meze.

Zvláště preferované submikronové emulze olej ve vodě pro toto použití jsou emulze skvalen/voda obsahující různá množství MTP-PE, jako jsou submikronové emulze olej ve vodě obsahující 4 až 5 % (hmotnost/objemem) skvalenu, 0,25 až 1,0 % (hmotnost/objemem) Tween 80™ (polyoxyethylensorbitan-monooleát) a/nebo 0,25 až 1,0 % Spán 85™ (sorbitan-trioleát) a případně N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isogluatminyl-L-alanin-2-(1'-2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyfosforyloxy)ethylamin (MPT-PE), například submikronové emulze olej ve vodě známá jako MF59 (mezinárodní publikace č. WO 90/14837, US patent č. 6 299 884 a Ott a kol., MF59 - De·· · ·

9 9 9 9 9 9

99999 9 9 99999 sign and Evaluation of a Safe and Potent Adjuvant for Human Vaccines ve Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (M. F. Powell a M. J. Newman, red.) Plenům Press, New York, 1995, str. 277-296) . MF59 obsahuje 4 až 5 % (hmotnost/objem) Skvalenu (například 4,3 %), 0,25 až 0,5 % (hmotnost/objem) Tween 80™ a 0,5 % (hmotnost/objem) Spán 85™ a případně různá množství MTP-PE formulovaná do submikronových částic s použitím míkrofluidízačního zařízení, jako je mikrofluidizační zařízení Model 110Y (Microfluidics, Newton, MA). MTP-PE může být například v množství 0 až 500 gg/dávka, přednostně 0 až 250 gg/dávka a nejlépe 0 až 100 gg/dávka. Pojem MF59-0, jak se zde používá, se vztahuje k výše popsané submikronové emulzi olej ve vodě bez MTP-PE, zatímco pojem MF59-MTP označuje formulaci obsahující MTP-PE. Například MF59-100 obsahuje 100 gg MTP-PE na dávku atd. MF69, další submikronová emulze olej ve vodě pro toto použití, obsahuje 4,3 % skvalenu (hmotnost/objem), 0,25 % Tween 80™ (hmotnost/objem) a 0,75 % Spán 85™ (hmotnost/objem) a případné MTP-PE. Další submikronovou emulzí olej ve vodě je MF75, též známá jako SAF, obsahující 10 % skvalenu, 0,4 % Tween 80™, 5 % blokového polymeru pluronik L121 a thr-MDP, rovněž mikrofluidizované do submikronové emulze. MF75-MTP označuje formulaci MF75 obsahující MTP v množství 100 až 400 gg MTP-PE na dávku.

Submikronové emulze olej ve vodě, způsoby jejich přípravy a imunostimulační prostředky, jako jsou muramylpeptidy pro použití v těchto kompozicích se podrobně popisují v mezinárodní publikaci č. WO 90/14837.

Když se vytvoří submikronová suspenze olej ve vodě, může se podávat obratlovci buď před podáním, současně s podáním nebo po podání antigenů a ISS, pokud se používá. Jest- 48 liže se používá před imunizací antigenem podává se adjuvantní formulace již 5 až 10 d před imunizací, přednostně 3 až 5 d před imunizací a nejlépe 1 až 3 nebo 2 d před imunizací danými antigeny. Jestliže se podává oddělené, lze dodávat submikronovou formulaci olej ve vodě buď do stejného místa dodávky jako kompozice antigenu nebo do jiného místa.

Pokud se požaduje současné podání, může se submikronová formulace olej ve vodě zahrnout do antigenových kompozicí. Obecně lze antigeny a submikronovou emulzi olej-voda kombinovat jednoduchým míšením, mícháním či třepáním. Lze též použít jiné způsoby, jako je rychlý průchod směsi těchto dvou složek malým otvorem (jako je podkožní jehla) pro obdržení vakcínových kompozicí.

V případě kombinace mohou být různé složky kompozice přítomny v širokých rozmezích poměrů. Například se složky antigenu a emulze obvykle používají v objemovém poměru 1:50 až 50:1, přednostně 1:10 až 10:1, přednostněji od zhruba 1:5 do 3:1 a nej lépe zhruba 1:1. Avšak pro konkrétní účely mohou být vhodné jiné poměry, například když daný antigen má nízkou imunogenitu, kdy se požaduje vyšší relativní množství antigenové složky.

Imunostimulační molekuly nukleových kyselin (ISS)

Popisuje se, že bakteriální DNA stimuluje savčí imunitní odpovědi. Viz například Krieg a kol., Nátuře, 374, 546-549 (1995). Imunostimulační schopnost se přisuzuje vysoké frekvenci imunostimulačních molekul nukleových kyselin (ISS), jako jsou nemethylované CpG dinukleotidy přítomné v bakteriální DNA. Oligonukleotidy obsahující nemethylované CpG motivy indukují aktivaci B buněk, NK buněk a buněk pre49

•. · · · • · · · · ····· · · ····· • · · · · • ·· · zentujících antigen (APC), jako jsou monocyty a makrofágy. Viz například US patent č. 6 207 646.

Tento vynález používá adjuvanty odvozené od ISS. ISS podle tohoto vynálezu zahrnuje oligonukleotid, který může být částí většího nukleotidového konstruktu, jako je plasmid nebo bakteriální DNA. Tento oligonukleotid může být uspořádaný lineárně či kruhově nebo může obsahovat lineární i kruhové segmenty. Tento oligonukleotid může zahrnovat modifikace, jako jsou, avšak bez omezení, modifikace YOH nebo 5ΌΗ skupiny, modifikace nukleotidové báze, modifikace složky cukru a modifikace fosfátové skupiny. ISS může obsahovat nukleotidy (obsahující ribosu jako jedinou principiální glycidovou složku), deoxyribonukleotidy (obsahující deoxyribosu jako zásadní glycidovou složku). Modifikované cukry či analogy cukrů lze rovněž inkorporovat do oligonukleotidu. Příklady zbytků cukru, které lze použít, zahrnují ribosu, deoxyribosu, pentosu, deoxypentosu, hexosu, deoxyhexosu, glukosu, arabinosu, xylosu, lyxosu a cyklopentylovou skupinu analogickou cukru. Cukr může být v pyranosylové nebo furanosylové formě. Fosforečný derivát (nebo modifikovaná fosfátová skupina se může použít jako monofosfát, difosfát, trifosfát, alkylfosfát, alkanfosfát, fosforothioát, fosforodithioát nebo podobně. Báze nukleových kyselin, které se inkorporují do oligonukleotidové báze ISS, mohou být přirozené purinové a pyrimidové báze, zejména uráčil nebo thymin, cytosin, adenin a guanin stejně tak jako přirozené a syntetické modifikace těchto bází. Navíc je k dispozici velký počet nepřirozených nukleosidů obsahujících různé heterocyklické báze a různé zbytky cukru (a analogů cukru) známých tomu, kdo má zkušenost v oboru.

Strukturně základním oligonukleotidem ISS je nukleo• · · · • · · · · · • · ·

- 50 • · · • · · · • · · · · <

• · · • · · p(lC) nukleotidová sekCytosin může být methylotidová sekvence obsahující CG nebo vence, která může být palindromní. váný nebo nemethylováný. Příklady konkrétních molekul ISS pro použití podle tohoto vynálezu zahrnují molekuly CpG, CpY a CpR a podobně známé v oboru.

Preferované ISS jsou ty, které se odvozují od skupiny molekul CpG, CpG dinukleotidy a syntetické oligonukleotidy obsahující motivy CpG (viz například Krieg a kol., Nátuře, 374. 546 (1995) a Davis a kol., J. Immunol., 160, 870-876 (1998), jako jsou kterékoliv z různých imunostimulačních CpG oligonukleotidů popsané v US patentu č. 6 207 646. Tyto CpG oligonukleotidy obecně obsahují alespoň 8 až zhruba 100 nukleotidů, přednostně 8 až 40 nukleotidů, přednostněji 15 až 35 nukleotidů, přednostně 15 až 25 nukleotidů a jakýkoliv počet nukleotidů mezi těmito hodnotami. Například oligonukleotidy obsahující motiv konsensu CpG představované vzorcem 5'-X_iCGX₂-3', kde Χ_χ a X₂ jsou nukleotidy a C je nemethylovaný, nalézají použití jako imunostimulační CpG molekuly. Obecně X je A, G nebo T a X₂ je C nebo T. Další použitelné CpG molekuly zahrnují molekuly vzorce 5'-X_xX₂CGX₃X₄, kde Χ_χ a X₂ jsou sekvence jako je GpT, GpG, GpA, ApA, ApT, ApG,

CpT, CpA, CpG, TpA, TpT nebo TpG a X₃ a X₄ jsou TpT, CpT, ApT, ApG, CpG, TpC, ApC, CpC, TpA, ApA, GpT, CpA nebo TpG, kde p označuje fosfátovou vazbu. Přednostně oligonukleotidy nezahrnují GCG sekvenci na konci nebo blízko konce 5' a/nebo 3'. Navíc se k CpG přednostně připojují na jeho konci 5' dva puriny (přednostně GpA dinukleotid) nebo purin a pyrimidin (přednostně GpT) a na konci 3' se připojují dva pyrimidiny, přednostně TpT nebo TpC dinukleotid. Preferované molekuly tedy budou obsahovat sekvenci GACGTT, GACGTC,

GTCGTT nebo GTCGCT a k těmto sekvencím se bude připojovat několik dalších nukleotidů jako je 1 až 20 nebo více nukleo51 tidů, přednostně 2 až 10 nukleotidů a přednostněji 3 až 5 nukleotidů nebo jakýkoliv počet mezi těmito hodnotami. Nukleotidy vně centrálního jádra jsou zvláště náchylné ke změně .

Dále mohou být CpG oligonukleotidy pro toto použití jednovláknové či dvouvláknové. Dvouvláknové molekuly jsou stabilnější in vivo, zatímco jednovláknové molekuly vykazují zvýšenou imunitní aktivitu. Navíc může být základní fosfátový řetězec modifikovaný, jako je modifikovaný fosforodithioátem pro dosažení imunostimulační aktivity CpG molekuly. Jak se popisuje v US patentu č. 6 207 646, aktivují CpG molekuly s fosforothioátovými základními řetězci preferenčně B-buňky, zatímco ty, které mají fosfodiesterové základní řetězce, aktivují preferenčně monocytární (makrofágy, dendritické buňky a monocyty) a NK buňky.

Příklady CpG oligonukleotidů pro použití v těchto kompozicích zahrnují molekuly o sekvenci 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3' (číslo identifikace sekvence 1) a 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3' (číslo identifikace sekvence 5).

Molekuly ISS lze snadno testovat ohledně jejích schopnosti stimulovat imunitní odpověď standardními způsoby dobře známými v oboru. Například schopnost molekuly stimulovat humorální a/nebo buněčnou imunitní odpověď se snadno stanoví výše popsanými imunoesejemi. navíc lze submikronové kompozice olej ve vodě podávat za přítomnosti i bez přítomnosti ISS pro stanovení, zda se imunitní odpověď zvyšuje.

Jak se popisuje výše, lze ISS podávat buď před podáním, současně s podáním nebo po podání antigenu a/nebo submikronové emulze olej ve vodě. Pokud se podávají před imuni• · 4

4 4 4

44444 žací antigenem a/nebo submikronovou emulzí olej ve vodě, lze je podávat již 5 až 10 d před imunizací, přednostně 3 až 5 d před imunizací a nejlépe 1 až 3 nebo 2 d před imunizací. Pokud se podávají odděleně, lze je dodávat buď do stejného místa jako kompozice antigenu nebo do jiného místa. Pokud se požaduje současné podání, lze ISS zahrnout do kompozicí antigenu.

Obecně se použije 0,5 fig až 5000 μg ISS, běžněji 0,5 μg až zhruba 1000 μg_l přednostně 0,5 μg až zhruba 500 pg nebo od 1 do 100 pg, přednostně od 5 do zhruba 50 pg, přednostněji 5 až zhruba 30 pg nebo kterékoliv množství v těchto rozmezích ISS na dávku při těchto způsobech.

Způsoby provedení vynálezu

Níže se popisují příklady specifických ztělesnění provádění tohoto vynálezu. Tyto příklady se nabízejí pouze jako ilustrace a neomezují žádným způsobem rozsah tohoto vynálezu .

Je snaha zajišťovat správnost při uvádění použitých čísel (například množství, teploty atd.), avšak je třeba připustit určité experimentální chyby a odchylky.

Příklad 1

Tvorba HCV E1E2

Komplex HCV E1E2 pro použití v těchto vakcinových kompozicích se připraví následujícím způsobem jako hybridní protein. Konkrétně savčí expresní plasmid pMH-ElE2-809 (obrázek 3) kóduje hybridní protein E1E2, který též zahrnuje • · aminokyseliny 192 až 809 HCV-1 [viz Choo a kol., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, £8, 2451-2455 (1991)]. Sekvenci molekuly E1E2 zde ukazují obrázky 2A až 2C.

Buňky ovarií čínského křečka (CHO) se používají pro expresi sekvence HCVE1E2 z pMH-ElE2-809. Zejména se používají buňky DG44 CHO. Tyto buňky popisuje Uraub a kol., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 77, 4216-4220 (1980), odvozují se od buněk K-l CHO a učiní se dihydrofoliát reduktasa deficientními (dhfr) působením dvojité delece v genu dhfr.

Provede se transfekce buněk DG44 pMH-ElE2-809. Buňky po transfekci se pěstují v selektivním prostředí tak, aby mohly růst pouze buňky exprimující gen dhfr (Sambrook a kol., výše). Izolované kolonie CHO se umístí (zhruba 800 kolonií) do jednotlivých jamek 96 jamkové destičky. Z původních 96 jamkových destiček se připraví duplikáty pro provedení experimentů exprese. Replikátní mističky se pěstují tak dlouho, až buňky vytvoří splývající monovrstvu. Buňky se fixují k jamkám destičky a permeabilizuji chladným methanolem. Jako sonda pro fixované buňky se použije 3D5C3, monoklonální protilátka proti E1E2 a 3E5-1, monoklonální protilátka proti E2. Po přidání protimyšího HRP konjugátu a následném přidání substrátu se stanoví buněčné linie s nejvyšší expresí. Linie buněk s nejvyšší expresí se potom expandují ve 24 jamkových klusterových destičkách. Stanovení exprese se opakuje a opět se expandují buněčné linie s nejvyšší expresí do jamek většího objemu. To se opakuje tak dlouho až se buněčné linie s nejvyšší expresí expandují z 6 jamkových mističek do baněk pro tkáňové kultury. V tomto okamžiku je dostatečné množství buněk pro přesné počítání a sběr buněk a provede se kvantitativní vyhodnocení exprese. ELISA [Spaete a kol., Virol., 188. 819-830 (1992)] se provede na buněčném extraktu pro • · « • · • · · · · • · · • · · · • · · · · · · • · · · · · ······· ·· · ··

- 54 stanovení vysokých expresorů.

Příklad 2

Purifikace HCV E1E2

Po expresi se buňky podrobí cytolýze a poté se intracelulárně vytvořený E1E2 purifikuje GNA lektinovou afinitní chromatografii (krok GNA) s následující sloupcovou chromatografii na hydroxyapatitu (krok HAP), DV50 membránovou filtrací (krok DV50), SP sefarosovou vysokovýkonnou sloupcovou chromatografii (krok SP), Q membránovou filtrací (krok Q) a G25 sefadexovou sloupcovou chromatografii (krok G25). Při dokončení každého z těchto kroků se celkový produkt buď zfiltruje filtrem 0,2 μτα a udržuje při teplotě 2 až 8 °C nebo se ihned zpracuje v dalším purifikačním kroku. Při ukončení purifikačního procesu se antigen zfiltruje filtrem 0,2 μπι a udržuje ve zmrazeném stavu při teplotě -60 °C nebo nižší do filtrace pro přípravu.

Konkrétně se pro cytolýzu použijí dva objemy vychlazeného pufru pro cytolýzu (1% Triton X-100 ve 100 mM Tris, pH 8 a 1 mM EDTA) přidané k buňkám CHO při teplotě 2 až 8 °C. Směs se centrifuguje při frekvenci otáčení 5000 min^-x po dobu 45 min při teplotě 2 až 8 °C pro odstranění zbytků rozpadlých buněk. Supernatant se odebírá a filtruje filtrem Sartorias 0,65 μτα Sartopure (Sartorius) a poté filtrem Sartorias 0,65 mm Sartofine, dále filtrem Sartorias 0,45 μτα Sartobran a filtrem 0,2 μτα. Sartobran. Filtrovaný lyzát se udržuje na ledu před nanesením na sloupec GNA.

GNA agarosový sloupec (1885 nml, 200 x 600, Vector Labs, Burlingame, CA) se předem upraví šestinásobkem objemu • ·

sloupce ekvilibračního pufru {25 mM fosforečnanu sodného,

1,0 M chloridu sodného, 12 % Triton X-100, pH 6,8) před nanesením. Lyzát se aplikuje na sloupec pří průtoku 31,4 ml/min (6 cm/h) přes noc. Sloupec se promývá 4 objemy náplní ekvilibračního pufru, poté se promyje opět 5 objemy náplně téhož pufru. Produkt se eluuje 1 M methyl a-D-mannopyranosidem (MMP), 10 mM fosforečnanem sodným, 80 mM chloridem sodným, 0,1 % Tritonem X-100, pH 6,8. Eluční pík, zhruba 1 objem sloupce, se odebere, zfiltruje filtrem 0,2 μτα. a ukládá při teplotě nižší než -60 °C pro chromatografii na sloupci hydroxyapatitu.

Chromatografie na hydroxyapatitu se provede při teplotě místnosti. Keramická hydroxyapatitová kolona typu I (BioRad) 1200 ml (100 x 150 mm) se upraví objemem jednoho sloupce 0,4 M fosforečnanu sodného pH 6,8, poté se upraví alespoň desetinásobkem objemu sloupce roztoku 10 mM fosforečnanu sodného, 80 mM chloridu sodného, 0,1 % Tritonu X-100, pH 6,8. Čtyři podíly celkového eluátu GNA se ponechají roztát v cirkulující vodní lázni při teplotě nepřevyšující 30 °C, zfiltrují filtrem 0,2 gm a nanesou na kolonu upravenou při průtoku 131 ml/min (100 cm/h). Pufr pro ekvilibraci hydroxyapatitu se aplikuje na sloupec jako pufr sledující náplň. Protékající kapalina se sbírá, když UV vzroste na výchozí hladinu. Sběr produktu se zastaví, když celkový objem produktu dosáhne objemu náplně plus 75 % objemu sloupce. Celkový průtok z HAP se dále zpracuje filtrací DV50 pro redukci virů.

Filtrace DV50 se provede při teplotě místnosti. Náplň

DV50 se připraví dvojnásobným zředěním HAP a úpravou roztokem 0,15 % Tritonu X-100, 1 mM kyseliny ethylendiamintetraoctové, pH 5,3. Zředění a úprava se dosáhne přídavkem zřeďo- 56 vacího pufru 1 {koncentrace 3 mM kyseliny citrónové, 2 mM kyseliny ethylendiamintetraoctové, 0,2 % Tritonu X-100) pro úpravu pH celkového produktu na 5,3 s následujícím přídavkem zřeďovacího pufru 2 (koncentrace 2 mM EDTA, 0,2 % Tritonu X-100, pH 5,3) tak, aby konečný objem byl dvojnásobkem původního celkového objemu HAP.

Zředěné a upravené celkové množství HAP (náplň DV50) se zfiltruje membránovou kartridží (Pall) Pall Ultipor VF DV50, 25,4 cm. Kryt filtru se opatří filtrační kartridží, předvlhčí vodou a sterilizuje autoklávováním při teplotě 123 °C po dobu 60 min s pomalým vyčerpáním před použitím. Filtr se poté předvlhčí ekvilibračním pufrem SP (koncentrace 10 mM citrátu sodného, 1 mM kyseliny ethylendiamintetraoctové, 0,15 % Tritonu X-100, pH 5,3) a vysuší před aplikací náplně DV50 při tlaku nepřevyšujícím 310 kPa. Náplň DV50 se poté aplikuje při průtoku zhruba 800 ml/min a transmembránovém tlaku zhruba 207 kPa. Filtrát se odebírá a ukládá při teplotách 2 až 8 °C přes noc a použije se v kroku SP.

SP (sefarosová) chromatografie se provede při teplotě místnosti. Sloupce 88 ml (50 x 45 mm)SP Sepharose HP (Pharmacia, Peapack, NJ) se ekvilibruje 15 násobkem objemu sloupce ekvilibračního pufru (koncentrace 10 mM citrátu sodného, mM kyseliny ethylendiamintetraoctové, 0,15 % Tritonu X-100, pH 5,3). Filtrát DV50 se aplikuje na sloupec. Tento sloupec se promyje nejprve 5 násobkem objemu kolony ekvilibračního pufru a poté 20 násobkem objemu kolony promývacího pufru o koncentracích 10 mM citrátu sodného, 15 mM chloridu sodného, 1 mM kyseliny ethylendiamintetraoctové, 0,1 % Tween-80™, pH 6,0. Produkt se eluuje ze sloupce roztokem o koncentracích 10 mM citrátu sodného, 180 mM chloridu sodného, 1 mM kyseliny ethylendiamintetraoctové, 0,1 % • · ····

Tween-80™, pH 6,0. Celá oblast absorpčního vrcholu při 280 nm se sbírá jako celkový produkt. Celkový produkt se ukládá při teplotě 2 až 8 ^OC přes noc a použije se v Q-membránovém filtračním kroku.

Q-membránový filtrační krok se provádí při teplotě místnosti. Dvě sterilizované diskové membrány Sartorious Q100X se zapojí řadově. Membrány se ekvilibrují alespoň 300 ml Q ekvilibračního pufru (koncentrace 10 mM citrátu sodného, 180 mM chloridu sodného, 1 mM kyseliny ethylendiamintetraoctové, 0,1 % Tween-80™, pH 6,0) . Celkový eluát SP se filtruje ekvilibrovanými Q membránami pří průtoku 30 až 100 ml/min s následným promytím 40 ml Q ekvilibračního pufru. Filtrát a promývací podíl se sbírají a spojují jako celkový produkt a používají v kroku G25.

Krok G25 se provede při teplotě místnosti. Sloupec 1115 ml (100 x 142 mm) Pharmacia Sephadex G-25 (Pharmacia, Peapack, NJ) se ekvilibruje alespoň pětinásobkem objemu formulačního pufru (koncentrace 10 mM citrátu sodného, 270 mM chloridu sodného, 1 mM kyseliny ethylendiamintetraoctové,

0,1 % Tween-80™, pH 6,0) . Celkový Q filtrát se aplikuje na sloupec a průtok ze sloupce se odebírá, zfiltruje filtrem 0,22 μτη (Millipore) a uloží zmrazený při teplotě -60 °C nebo níže do doby použití.

Příklad 3

Imunogenita vakcínových kompozicí HCV E1E2 u myší

Imunogenita HCV ElE2_sos obržených a purifikovaných, jak se popisuje výše, v kombinaci se submikronovou emulzí olej ve vodě a/nebo CpG oligonukleotidem se stanoví následu• 4 ···· • 4 • · • 44« 4

44 4 ·

- 58 jícím způsobem.

Formulace použité v této studii se shrnují v tabulce

1. MF59, submikronová emulze olej ve vodě obsahující 4 až 5 % (hmotnost/objem) skvalenu, 0,5 % (hmotnost/objem) Tween 80™, 0,5 % Spán 85™ se obdrží podle popisu výše. Viz mezi národní publikaci č. WO 90/14837, US patent č. 6 299 884 a Ott a kol., MF59 - Design and Evaluation of a Safe and Potent Adjuvant for Human Vaccines ve Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (M. F. Powell a M. J. Newman, red.) Plenům Press, New York, 1995, str. 277-296. Pro skupí ny 4 a 9 se použije čtyřnásobné množství MF59. MF59 použité v této studii je MF59-0 a neobsahuje MTP-PE.

Formulace použité pro skupiny 1, 3, 6 a 8 též zahrnu jí 25 /xg aktivní CpG molekuly na dávku. Sekvence aktivní mo lekuly je 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3' (číslo identifikace sekvence l).

Formulace použitá pro skupinu 5 zahrnuje 25 μg neaktivní kontrolní CpG molekuly na dávku. Sekvence neaktivní CpG molekuly je 5'-TCCAGGACTTCTCTCAGGTT-3' (číslo identifikace sekvence 2).

Formulace použité pro skupiny 1 až 4 zahrnuje 2,8 gg na dávku antigenu HCV Ε1Ε2_βοθ obdrženého podle popisu výše.

Formulace použité pro skupiny 5 až 9 zahrnují 2,0 pg na dávku HCV zkráceného E2 proteinu obdrženého z CHO buněk, jak popisuje US patent č. 6 12 020.

Myši Balb/C o stáří 6 měsíců se rozdělí do 9 skupin (10 myší na skupinu) a dostávají intramuskulárně 50 μΐ kom• · ·

4 4

444«

4 4 4« 4 4·« pozice vakcíny se složkami vyjmenovanými v tabulce 1. Posilovači vakcína se dodá v době 30 a 90 d po počáteční injekci. Sérum se odebírá 14 d po poslední injekci a titry protilátek proti E1E2 a proti E2 se stanoví enzymatickou imunoesejí. Viz Chien a kol., Lancet, 342. 933 (1993).

Výsledky ukazuje tabulka 1 a obrázek 4. Jak lze vidět, myši imunizované HCV E1E2 s použitím CpG v kombinaci s MF59 jako adjuvantním prostředkem poskytují významně vyšší (P < 0,05) hladiny protilátek E1E2 než myši imunizované E1E2 s použitím samotného MF59 nebo samotného 4 x MF59 jako adjuvantních prostředků. CpG samotný poskytuje hladiny protilátek vyšší než jsou hladiny protilátek se samotným MF59, i když tento rozdíl není významný. Oproti tomu myši imunizované Ε2_7ιξ s použitím MF59 a/nebo CpG poskytují velice nízké hladiny protilátek s méně než 50 % myší vykazujících odpověď. To je překvapivé, nebot dřívější pokusy s E2_7=ls poskytují vysoké hladiny protilátek u myší a odpověď u všech zvířat .

• · · · · - 60 - ···· ··· ·· ·

Tabulka 1

Imunogenita HCV Ε1Ε2_βθ9 a E2_vxs s použitím CPG a/nebo MF59 jako adjuvantních prostředků. Čísla v závorkách ukazují počet zvířat tvořících protilátky ve vztahu k počtu imunizovaných zvířat.

Skupina Vakcína, Dávka adjuvantní prostředek

1	E1E2 S O 9 r CpG	2,8,	2,8,
2	E1E2 809' MF59	2,8,	2,8,
3	E1E2 809 ’ CpG+MF59	2,8,	2,8,
4	E1E2 809 ' 4xMF59	2,8,	2,8,
5	E2 715 ' kontrola CpG	2,0,	2,0,
6	E2 7 15 ’ CpG	2,0,	2,0,
7	E2 7 15 MF59	2,0,	2,0,
8	E2 71S ' CpG+MF59	2,0,	2,0,
9	E2 715 ' 4XMF59	2,0,	2,0,

	Geometrický průměr titru protilátky E1E2 EIA	Geometrický průměr titru protilátky E2 EIA
2,8	5,167 (10/10)	ND
2,8	2,716 (10/10)	ND
2,8	19,159® (10/10) P<0,05	ND
2,8	3,335 (10/10)	ND
2,0	ND	1,3 (1/10)
2, 0	ND	3,1 (2/20)
2,0	ND	6,1 (4/10)
2,0	ND	26,8 (5/10)
2,0	ND	9,7 (4/10)

0 • · · · • 9 9999 • 00 . 00 0 » 0 0

0 0 0

9 9999

0 0

Příklad 4

Imunogenita vakcínových kompozicí HCV E1E2 u šimpanzů

Imunogenita HCV ElE2_goa vytvořených a purifikovaných, jak se popisuje výše, v kombinaci se submikronovou emulzí olej ve vodě a/nebo CpG oligonukleotidem se stanoví následujícím způsobem.

Formulace použité v této studii sumarizuje tabulka

2. MF59 a Ε1Ε2_θθ9 se popisují výše. Sekvence použité molekuly CpG je 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’ (identifikační číslo sekvence 5).

Šimpanzi se rozdělí do dvou skupin (5 zvířat na skupinu) a dostávají intramuskulárně kompozici vakcíny se složkami specifikovanými v tabulce 1. Konkrétně se jedna skupina zvířat imunizuje v době 0, 1 a 6 měsíců 20 /ig ElE2_eog a MF59. Druhá skupina zvířat se rovněž imunizuje v dobách 0, 1 a 6 měsíců 20 /zg Ε1Ε2θ_θ9 a MF59 stejně tak jako 500 ptg CpG.

Vzorky séra se obdrží 14 d po poslední imunizaci a titry protilátek proti E1E2 se stanoví enzymovými imunoesejemi. Konkrétně se antigenem ETE2 potahují polystyrénové mikrotitrační misky a navázaná protilátka se detekuje HRP konjugovanou protilidskou protilátkou s následujícím rozvojem tetramethylbenzidinového substrátu.

Jak tabulka 2 ukazuje, šimpanzi imunizovaní HCV E1E2 s použitím CpG v kombinaci s adjuvantem MF59 poskytují významně vyšší (P<0,05) hladiny protilátek E1E2 než zvířata •v · ·· ·

9 9 9 9

9 9 9 9 9 9

9999 9 9 · ··»· • · 9 9 9 · 99 9.

imunizovaná E1E2 s použitím samotného MF59.

Tabulka 2

Imunogenita HCV nich prostředků	E1E2_ 809	s použitím CpG	a MF59 jako ad
Vakcína,	Šimpanz	Títr pro-	Geometrický
adj uvant	č.	tilátky	průměr titru
		E1E2 EIA	protilátky
			E1E2 EIA
Skupina 1:	1	84	261
E1E2 ,	2	101
CpG	3	131
	4	421
	5	2580
Skupina 2:	1	8835	2713
E1E2eo,'	2	2713
CpG+MF59	3	3201
	4	510
	5	1238

Podle tohoto vynálezu se popisují nové HCV vakcinační kompozice a způsoby jejich použití. Z výše poskytnutého popisu lze usoudit, že i když se popisují preferovaná ztělesnění předmětu vynálezu do určitých podrobností, je třeba si uvědomit, že lze zřejmě provést pozměnění bez odchýlení se od ducha a obsahu tohoto vynálezu, jak se definuje v připojených nárocích.

Claims (42)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Kompozice, vyznačující se t i m, že obsahuje antigen E1E2 viru hepatitidy C (HCV) a submikronovou emulzi olej ve vodě neobsahující N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-ísogluatminyl-L-alanin-2-{1'-2’-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyfosforyloxy)ethylamin (MTP-PE), kde tato submikronová emulze olej ve vodě je schopná zvyšovat imunitní odpověď antigenu E1E2 HCV.
2. 2. Kompozice podle nároku 1, vyznačuj ící se t i m, že antigen E1E2 HCV obsahuje sekvenci aminokyselin s alespoň 80% sekvenční identitou se souvislou sekvencí aminokyselin znázorněných v polohách 192 až 809 obrázků 2A až 2C.
3. 3. Kompozice podle nároku 2, vyznačující se t i m, že antigen E1E2 HCV obsahuje sekvenci aminokyselin znázorněnou v polohách 192 až 809 obrázků 2A až 2C.
4. 4. Kompozice podle nároku 1, vyznačující se t i m, že dále obsahuje sekvenci imunostimulační nukleové kyseliny (ISS) .
5. 5. Kompozice podle nároku 4, vyznačující se t i m, že ISS je CpG oligonukleotid.
6. 6. Kompozice podle nároku 5, vyznačující se t i m, že tento CpG oligonukleotid obsahuje sekvenci 5'-X X CGX X , kde X a X se volí ze sekvence ze skupiny zahrnující GpT, GpG, GpA, ApA, ApT, ApG, CpT, CpA, CpG, TpA, TpT a TpG a X₃ a X^ se volí ze skupiny zahrnující TpT, CpT, ApT, ApG, CpG, TpC, ApC, CpC, TpA, ApA, GpT, CpA a TpG, kde « · p značí fosfátovou vazbu.
7. 7. Kompozice podle nároku 5, vyznačující se t í m, že tento oligonukleotid obsahuje sekvenci GACGTT, GACGTC, GTCGTT nebo GTCGCT.
8. 8. Kompozice podle nároku 7, vyznačující se t í m, že tento CpG oligonukleotid obsahuje sekvenci 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3' {číslo identifikace sekvence 1).
9. 9. Kompozice podle nároku 7, vyznačující se t i m, že tento CpG oligonukleotid obsahuje sekvenci

   5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3' (číslo identifikace sekvence 5) .
10. 10. Kompozice podle nároku 1, vyznačuj i cí se t i m, že submikronová emulze olej ve vodě obsahuje (1) metabolizovatelný olej, který je přítomný v množství 0,5 až 20 % celkového objemu a (2) emulgační prostředek, který je přítomný v množství 0,01 až 2,5 hmotnostních % (hmotnost/objem) a tento olej a emulgační prostředek jsou přítomné ve formě emulze olej ve vodě mající kapičky oleje, které jsou v podstatě všechny o průměru zhruba 100 nm až méně než 1 mikrometr.
11. 11. Kompozice podle nároku 10, vyznačuj ící se t í m, že tento olej je přítomný v množství 1 % až 12 % celkového objemu a emulgační prostředek je přítomný v množství 0,01 až l hmotnostní % (hmotnost/objem).
12. 12. Kompozice podle nároku 10, vyznačuj ící se t í m, že tento emulgační prostředek obsahuje mono-, di- nebo triester polyoxyethylensorbitanu nebo mono-, di- • · · • · nebo triester sorbitanu.
13. 13. Kompozice podle nároku 10, vyznačuj ící se t i m, že submikronová emulze olej ve vodě obsahuje 4 až 5 % (hmotnost/objem) skvalenu, 0,25 až 1,0 % (hmotnost/objem) polyoxyethylensorbitan-monooleátu a/nebo 0,25 až 1,0 % sorbitan-trioleátu.
14. 14. Kompozice podle nároku 13, vyznačuj ící se t i m, že submikronová emulze olej ve vodě obsahuje v podstatě 5 objemových % skvalenu a jedno či více emulgačních prostředků zvolených ze skupiny zahrnující polyoxyethylensorbitan-monooleát a sorbitan-trioleát, kde celkový objem emulgačního prostředku (emulgačních prostředků) představuje 1 hmotnostní % (hmotnost/objem).
15. 15. Kompozice podle nároku 14, vyznačuj ící se t i m, že tento jeden či více emulgačních prostředků představuje (představují) polyoxyethylensorbitan-monooleát a sorbitan-trioleát a celkové množství přítomného polyoxyethylensorbitan-monooleátu a sorbitan-trioleátu je 1 hmotnostní % (hmotnost/objem).
16. 16. Kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje antigen E1E2 viru hepatitidy C (HCV) a sekvenci imunostimulační nukleové kyseliny (ISS), kde tato ISS je schopná zvyšovat imunitní odpověď antigenu E1E2 HCV.
17. 17. Kompozice podle nároku 16, vyznačuj ící se t i m, že ISS je CpG oligonukleotid.
18. 18. Kompozice podle nároku 17, vyznačuj ící se t i m, že antigen E1E2 HCV obsahuje sekvenci aminoky• · • · · · · • · «1 · · · • ··· · ··· • · ····· · · · ··· • · · · · · • · · · · · selin s alespoň 80% sekvenční identitou se spojitou sekvencí aminokyselin znázorněnou v polohách 192 až 809 obrázků 2A až 2C.
19. 19. Kompozice podle nároku 18, vyznačuj ící se t i m, že tento antigen E1E2 HCV obsahuje sekvenci aminokyselin znázorněnou v polohách 192 až 809 obrázků 2A až 2C.
20. 20. Kompozice podle nároku 16, vyznačuj ící se t i m, že tento CpG oligonukleotid obsahuje sekvenci ⁵' -^ACGX₃X₄, kde Χ_χ a X₂ se volí ze sekvencí skupiny zahrnující GpT, GpG, GpA, ApA, ApT, ApG, CpT, CpA, CpG, TpA, TpT a TpG a X₃ a X₄ se volí ze skupiny zahrnující TpT, CpT, ApT, ApG, CpG, TpC, ApC, CpC, TpA, ApA, GpT, CpA a TpG, kde p značí fosfátovou vazbu.
21. 21. Kompozice podle nároku 16, vyznačuj icí se t i m, že tento oligonukleotid obsahuje sekvenci GACGTT, GACGTC, GTCGTT nebo GTCGCT.
22. 22. Kompozice podle nároku 21, vyznačuj ící se t i m, že tento CpG oligonukleotid obsahuje sekvenci 5’-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3’ (číslo identifikace sekvence 1).
23. 23. Kompozice podle nároku 21, vyznačuj ící se t i m, že tento CpG oligonukleotid obsahuje sekvenci 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3' (číslo identifikace sekvence 5) .
24. 24. Kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje (a) antigen E1E2 viru hepatitidy C (HCV) zahrnující sekvenci aminokyselin s alespoň 80% sekvenční identitou se spojitou sekvencí aminokyselin znázorněnou v polohách 192 až 809 obrázků 2A až 2C, (b) submíkronová emulze olej ve vodě schopná zvyšovat imunitní odpověď na antigen E1E2 HCV, kde tato submíkronová emulze olej ve vodě obsahuje (i) metabolizovatelný olej, který je přítomný v množství 1 % až 12 % z celkového objemu a (ii) emulgační prostředek, kde tento emulgační prostředek je přítomný v množství 0,01 až 1,0 hmotnostní % (hmotnost/objem) a obsahuje mono-, di- nebo triester polyoxyethylensorbitanu a/nebo mono-, di- nebo triester sorbitanu, kde tento olej a emulgační prostředek jsou ve formě emulze olej ve vodě mající kapičky oleje, které jsou v podstatě všechny o průměru zhruba 10 nm .až méně než 1 μχα a (c) CpG oligonukleotid, kde tento CpG oligonukleotid obsahuje sekvence GACGTT, GACGTC, GTCGTT nebo GTCGCT.
25. 25. Kompozice podle nároku 24, vyznačuj ící se t i m, že tento antigen E1E2 HCV obsahuje sekvenci aminokyselin znázorněnou v polohách 192 až 809 obrázků 2A až 2C.
26. 26. Kompozice podle nároku 24, vyznačuj ící se t i m, že tento CpG oligonukleotid obsahuje sekvenci 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3' (číslo identifikace sekvence 1).
27. 27. Kompozice podle nároku 24, vyznačuj ící se t i m, že tento CpG oligonukleotid obsahuje sekvenci 5¹-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3' (číslo identifikace sekvence 5) .

    Φ φ φ*· φφφ φφφ • · · φ φ φ φφφφ • φφφφ φφφφ · φ φ φφφφ • · φφφ φφφ ••ΦΦΦΦ φφ φ φφ φ
28. 28. Kompozice podle nároku 24, vyznačuj i ci se t i m, že tato submikronová emulze olej ve vodě obsahuje 4 až 5 % (hmotnost/objem) skvalenu, 0,25 až 1,0 % (hmotnost/objem) monooleátu polyoxyethylensorbítanu a/nebo 0,25 až 1,0 % trioleátu sorbitanu a případně N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1'-2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyfosforyloxy)ethylamin (MTP-PE).
29. 29. Kompozice podle nároku 24, vyznačuj ící se t i m, že tato submikronová emulze olej ve vodě obsahuje v podstatě 5 objemových % skvalenu a alespoň jeden emulgační prostředek zvolený z případů monooleátu polyoxyethylensorbitanu a trioleátu sorbitanu, kde celkové množství emulgačního prostředku {emulgačních prostředků) je 1 hmotnostní % (hmotnost/objem).
30. 30. Kompozice podle nároku 29, vyznačuj ící se t i m, že tento alespoň jeden emulgační prostředek je monooleát polyoxyethylensorbítanu a trioleát sorbitanu a celkové množství monooleátu polyoxyethylensorbítanu a trioleátu sorbitanu jel hmotnostní % (hmotnost/objem).
31. 31. Kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje (a) antigen E1E2 viru hepatitidy C (HCV) zahrnující sekvenci aminokyselin znázorněnou v polohách 192 až 809 obrázků 2A až 2C, (b) submikronovou emulzi olej ve vodě schopnou zvyšovat imunitní odpověď na antigen E1E2 HCV, kde tato submikronová emulze olej ve vodě obsahuje 4 až 5 % (hmotnost/objem) skva• » lénu, 0,25 až 1,0 % (hmotnost/objem) monooleátu polyoxyethylensorbitanu a/nebo 0,25 až 1,0 % trioleátu sorbitanu a případně N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isogluatminyl-L-alanin-2-(l'-2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyfosforyloxy)ethylamin (MTP-PE), kde tento olej a emulgační prostředek jsou přítomné ve formě emulze olej ve vodě mající kapičky oleje o průměru v podstatě vesměs zhruba 100 nm až méně než 1 μτα a (c) CpG oligonukleotid, který obsahuje sekvenci 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3’ (číslo identifikace sekvence 1) nebo sekvenci 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3' (číslo identifikace sekvence 5).
32. 32. Kompozice podle nároku 31, vyznačuj ící se t i m, že tento antigen E1E2 HCV obsahuje sekvenci aminokyselin znázorněnou v polohách 192 až 809 obrázků 2A až 2C.
33. 33. Kompozice podle nároku 32, vyznačující se t i m, že tato submikronová emulze olej ve vodě obsahuje v podstatě (i) 5 objemových % skvalenu a (ii) jeden či více emulgačních prostředků zvolených z případů monooleátu polyoxyethylensorbitanu a trioleátu sorbitanu, kde celkové množství emulgačního prostředku (emulgačních prostředků) je 1 hmotnostní % (hmotnost/objem).
34. 34. Kompozice podle nároku 33, vyznačující se t i m, že tímto alespoň jedním emulgačním prostředkem je monooleát polyoxyethylensorbitanu a trioleát sorbitanu a celkové množství monooleátu polyoxyethlensorbitanu a trioleátu sorbitanu jel hmotnostní % (hmotnost/objem), ·· · • · ·
35. 35. Použití kompozice podle nároků 1 až 34 ve způsobu stimulace imunitní odpovědi některého obratlovce.
36. 36. Způsob stimulace imunitní odpovědi u některého obratlovce, vyznačující se t i m, že se mu podává terapeuticky účinné množství antigenu E1E2 viru hepatitidy C (HCV) a submikronová emulze olej ve vodě bez N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isogluatminyl-L-alanin-2-(1'-2¹-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyfosforyloxy)ethylaminu (MTP-PE), kde tato submikronová emulze olej ve vodě je schopná zvyšovat imunitní odpověď na antigen E1E2 HCV.
37. 37. Způsob stimulace imunitní odpovědi u některého obratlovce, vyznačující se tím, že se mu podává terapeuticky účinné množství E1E2 antigenu viru hepatitidy C (HCV) a imunostimulační molekula nukleové kyseliny (ISS), kde tato ISS je schopná zvyšovat imunitní odpověď na antigen E1E2 HCV.
38. 38. Způsob stimulace imunitní odpovědi u některého obraltovce, vyznačující se tím, že se mu podává terapeuticky účinné množství kompozice obsahující (a) antigen E1E2 viru hepatitidy C (HCV) zahrnující sekvenci aminokyselin s alespoň 80% sekvenční identitou se spojitou sekvencí aminokyselin znázorněnou v polohách 192 až 809 obrázků 2A až 2C, (b) submikronovou emulzi olej ve vodě schopnou zvyšovat imunitní odpověď na antigen E1E2 HCV, kde tato submikronová emulze olej ve vodě obsahuje (i) metabolizovatelný olej, který je přítomný v množství 1 % až 12 % z celkového objemu a (ii) emulgační prostředek, kde tento emulgační prostředek • ·

    71 ·· · · · · • · · · · · • ·· ····»·· • · » · · · » • ·» «· · · · « je přítomný v množství 0,01 až 1,0 hmotnostní % (hmotnost/objem) a obsahuje mono-, di- nebo triester polyoxyethylensorbitanu a/nebo mono-, di- nebo triester sorbitanu, kde tento olej a emulgační prostředek jsou ve formě emulze olej ve vodě mající kapičky oleje, které jsou v podstatě všechny o průměru zhruba 10 nm až méně než 1 μιη a (c) CpG oligonukleotid, kde tento CpG oligonukleotid obsahuje sekvence GACGTT, GACGTC, GTCGTT nebo GTCGCT.
39. 39. Způsob stimulace imunitní odpovědi u některého obratlovce, vyznačující se tím, že se mu podává terapeuticky účinné množství kompozice obsahující (a) antigen E1E2 viru hepatitidy C (HCV) zahrnující sekvenci aminokyselin znázorněnou v polohách 192 až 809 obrázků 2A až 2C, (b) submikronovou emulzi olej ve vodě schopnou zvyšovat imunitní odpověď na antigen E1E2 HCV, kde tato submikronová emulze olej ve vodě obsahuje 4 až 5 % (hmotnost/objem) skvalenu, 0,25 až 1,0 % (hmotnost/objem) monooleátu polyoxyethylensorbitanu a/nebo 0,25 až 1,0 % trioleátu sorbitanu a případně N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-i sogluatminyl-L-alanin- 2 -(1'-2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyfosforyloxy)ethylamin (MTP-PE), kde tento olej a emulgační prostředek jsou přítomné ve formě emulze olej ve vodě mající kapičky oleje o průměru v podstatě vesměs zhruba 100 nm až méně než 1 μπι a (c) CpG oligonukleotid, který obsahuje sekvenci 5¹-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3’ (číslo identifikace sekvence 1) nebo sekvenci 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3' (číslo identifikace sekvence 5).

    • · • · 9 · · 9 • 9 9 9 · 9·· » · · · · · « 9 9 · · 9 · • 99 · · » • 9 9 · · ·
40. 40. Způsob přípravy kompozice, vyznačuj ící se t i m, že se spojí submikronová emulze olej ve vodě bez N-acetylmuramy1- L -alanyl- D - isogluatminyl-L-alanin-2-(1*-2 ’-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyfosforyloxy)ethylaminu (MTP-PE) s antigenem E1E2 hepatitidy viru C (HCV).
41. 41. Způsob podle nároku 40, vyznačuj ící se t i m, že dále zahrnuje kombinaci ímunostimulační sekvence nukleové kyseliny (ISS) s antigenem E1E2 a submikronovou emulzí olej ve vodě.
42. 42. Způsob přípravy kompozice, vyznačuj ící se t i m, že se kombinuje sekvence Ímunostimulační nukleové kyseliny (ISS) s antigenem E1E2 viru hepatitidy C (HCV).