PL203526B1 - Kompozycje zawieraj ace antygeny E1E2 wirusa zapalenia w atroby typu C (HCV), zastosowanie tych kompozycji i sposoby wytwarzania kompozycji - Google Patents

Description

Opis wynalazku Dziedzina techniki Niniejszy wynalazek dotyczy kompozycji zawieraj acych antygeny E1E2 wirusa zapalenia w atro- by typu C (HCV), zastosowania tych kompozycji i sposobów wytwarzania kompozycji. Tlo wynalazku Wirus zapalenia w atroby typu C (HCV) jest zasadnicz a przyczyn a pozajelitowego zapalenia w a- troby nie-A i nie-B(NANBH). Wirus ten jest obecny u 0,4 do 2% dawców krwi. Chroniczne zapalenie w atroby rozwija si e w oko lo 50% zaka ze n i w sród nich u oko lo 20% zaka zonych osobników rozwija si e marsko sc w atroby, która czasem prowadzi do raka w atrobowokomórkowego. W zwi azku z tym, bada- nia i kontrola tej choroby jest medycznie wa zne. HCV by l po raz pierwszy zidentyfikowany i scharakteryzowany jako przypadek NANBH przez Houghtona i wsp. Wirusowa sekwencja genomowa HCV jest znana, tak jak s a znane metody uzyski- wania tej sekwencji. Patrz, np., Publikacja Mi edzynarodowa nr WO 89/04669; WO 90/11089 i WO 90/14436. HCV ma 9,5 kb pozytywny-sensowny, jednoniciowy genom RNA i jest cz lonkiem ro- dziny wirusów Flaviwirusów. W oparciu o analiz e filogenetyczn a zidentyfikowano co najmniej sze sc odr ebnych, lecz pokrewnych genotypów HCV (Simmonds i wsp., J. Gen. Virol. (1993) 74:2391-2399). Wirus ten koduje pojedyncz a poliprotein e posiadaj ac a wi ecej ni z 3000 reszt aminokwasowych (Choo i wsp., Science (1989) 244:359-362; Choo i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:2451-2455; Han i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:1711-1715). Poliproteina ta jest przetwarzana ko- i post-translacyjnie w bia lka zarówno strukturalne i nie-strukturalne (NS). Jak wykazano na Fig. 1, wiele bia lek jest kodowanych przez genom HCV. Porz adek i nazewnic- two produktów rozk ladu poliproteiny HCV jest nast epuj acy: NH 2 -C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b- NS5a-NS5b-COOH. Pocz atkowy rozk lad poliproteiny jest katalizowany przez proteazy gospodarza, które uwalniaj a trzy bia lka strukturalne, N-ko ncowe bia lko nukleokapsydu (nazywane „rdze n") i dwie otoczki glikoproteinowe, „E1" (tak ze znany jako E) i „E2" (tak ze znane jako E2/NS1), jak równie z bia l- ko nie strukturalne (NS), które zawiera enzymy wirusowe. Te regiony NS s a nazwane NS2, NS3, NS4 i NS5. NS2 jest integralnym bia lkiem b lonowym z aktywno scia proteolityczn a i w kombinacji z NS3, rozk lada siostrzane wi azanie NS2-NS3, które z kolei generuje N-koniec NS3 i uwalnia du za poliprote- in e zawieraj ac a proteaz e serynow a jak i helikaz e RNA. Proteaza NS3 s lu zy do wytwarzania pozosta lej poliproteiny. W tych reakcjach, NS3 uwalnia kofaktor NS3 (NS4a), dwa bia lka (NS4b i NS5a) i zale zn a od RNA polimeraz e RNA (NS5b). Zako nczenie dojrzewania poliproteiny jest zapocz atkowywane przez autokatalityczne rozerwanie wi azania NS3-NS4a katalizowane przez proteaz e serynow a NS3. E1 jest wykrywany jako 32-35 kDa rodzaje i jest przekszta lcany w pojedynczy sród H-pozytywny prazek o oko lo 18 kDa. Przeciwnie do tego, E2 wykazuje z lo zony wzór w immunoprecypitacji zgodnie z generowaniem wielu rodzajów (Speate i wsp., Virol (1992) 188:819-930; Selby i wsp., J. Virol. (1996) 70:5177-5182; Grakoui i wsp., J. Virol. (1993) 67:1385-1395; Tomei i wsp., J. Virol. (1993) 67:4017-4026). Glikoproteiny E1 i E2 otoczki HCV tworz a trwa ly kompleks to jest podlegaj acy ko-immunoprecypitacji (Grakoui i wsp., J. Virol. (1993) 67:1385-1395; Lanford i wsp., Virology (1993) 197:225-235; Ralston i wsp., J. Virol (1993)67:6753-6761). E1 i E2 pozostaj a w komórce i s a pozbawione kompleksu w eglowodoru kiedy s a wyra zane w trwa lym lub przej sciowym uk ladzie wirusa ospy (Spaete i wsp., Virology (1992) 188:818-830; Ral- ston i wsp., J. Virol. (1993)67:6753-6761). Poniewa z bia lka E1 i E2 s a normalnie zwi azane z b lon a w tym uk ladzie ekspresji, wydzielane postacie by ly wytwarzane w celu u latwienia oczyszczania tych bia lek. Patrz. Patent St. Zjedn. Am. 6,121,020. Dodatkowo, by lo opisane wewn atrzkomórkowe wytwa- rzanie E1E2 w komórkach HeLa. Patrz np. Publikacja Mi edzynarodowa nr WO 98/50556. Glikoproteiny HCV E1 i E2 s a przedmiotem znacznego zainteresowania poniewa z by ly one po- kazane jako zabezpieczaj ace przed prowokacj a wirusem w badaniach na naczelnych. (Choo i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994)91:1294-1298). Jednak ze, wci az jest potrzebna skuteczna kompo- zycja szczepionki zawieraj acej te antygeny do zapobiegania zaka zeniom HCV. Kompozycja szczepionki cz esto obejmuje adiuwanty immunologiczne dla wzmocnienia odpo- wiedzi immunologicznej. Na przyk lad Kompletny Adiuwant Freund'a (CFA) jest silnym czynnikiem immunostymuluj acym jaki by l stosowany z sukcesem z wieloma antygenami na zasadach do swiad- czalnych. CFA zawiera trzy sk ladniki: olej mineralny, czynnik emulguj acy i zabite mykobakterie, takie jak Mycobacterium tuberculosis. Wodne roztwory antygenu s a mieszane z tymi sk ladnikami w celu stworzenia emulsji woda w oleju. Chocia z skuteczny jako adiuwant, CFA powoduje powa zne efektyPL 203 526 B1 3 uboczne, w laczaj ac ból, tworzenie si e ropni i gor aczk e, g lównie wynikaj ace z obecno sci komponenty mykobakteryjnej. Dlatego CFA nie jest u zywany w ludzkich i w weterynaryjnych szczepionkach. Dipeptyd muramylowy (MDP) jest jednostk a minimaln a kompleksu mykobakteryjnej sciany ko- mórkowej jaki generuje aktywnosc adiuwanta obserwowan a z CFA. Patrz, np., Ellouz i wsp., Biochwm. Biophys. Res. Commun. (1974)59:1317. Generowano wiele syntetycznych analogów MDP, które wy- kazywa ly szeroki zakres si ly adiuwanta i efekty uboczne. Przegl ad tych analogów, znajduje si e w Chedid i wsp., Prog. Allergy (1978)25:63. Reprezentatywne analogi MDP zawieraj a pochodne tre- onylowe MDP (Byars i wsp., Vaccine (1987)5:223), n-butylowe pochodne MDP (Chedid i wsp., In- fect.Immun.35:417) i lipofilowe pochodne tripeptydu muramylowego (Gisler i wsp., Immunomodula- tions of Microbial Products and Related Synthetic Compounds (1981) Y. Yamamura and S. Kotani, wyd., Excerpta Medica, Amsterdam, str., 167). Jedna lipofilowa pochodna MDP jest N-acetylomuramylo-L-alanylo-D-izoglutaminylo-L-alanino- -2-(1'-2'-dipalmitoilo-sn-glcero-3-hydroksyfosforyloksy)-etylamin a MTP-PE. Ten tripeptyd muramylowy zawiera fosfolipidowy ogon, który pozwala na zwi azanie cz esci hydrofobowej tej cz asteczki z lipido- wym srodowiskiem podczas gdy czesc cz asteczki peptydu muroamylowego wi aze si e z srodowiskiem wodnym. Zatem MTP-PE sam jest zdolny do dzia lania jako czynnik emulguj acy do generowania trwa- lej emulsji olej w wodzie. MTP-PE by l TM stosowany w emulsji 4% skwalen z 0,008% Tween TM 80, nazwany MTP-PE-LO (niski olej), dla dostarczenia antygenu gD wirusa opryszczki zwyk lej z wynikiem pozytywnym (Sanchez-Pescador i wsp., J. Immunol. (1988) 141:1720-1727), ale o raczej s labej trwa- losci fizycznej. Ostatnio, utworzono do stosowania w kompozycjach szczepionki, bezpieczn a, wysoko immunogenn a, submikronow a emulsj e olej w wodzie - MF59, która zawiera 4-5% skwalenu w/v, 0,5% w/v Tween 80™, 0,5% Span 85™ oraz ewentualnie ró zne ilo sci MTP-PE. Patrz, np., Ott i wsp., „MF59-Desin and Evaluation of a safe and Potent Adjuvant for Human Vaccines" w Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (Powell, M.F. i Newman, M.J. wyd.) Plenum Press, New York, 1995, str. 277-296. Choo i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1994)91:1294-1298 i Houghton i wsp., w Viral Hepatitis and Liver Disease (1997), str. 656, opisuje u zycie kompleksów E1/E2 HCV w submi- kronowych emulsjach olej w wodzie zawieraj acych MTP-PE. Bakteryjny DNA zawiera nie metylowane dinukleotydy CpG, które maj a dzia lania immunosty- muluj ace na jednoj adrowe komórki krwi obwodowej in vitro. Krieg i wsp., J. Clin. Immunol. (1995)15:284-292. Oligonukleotydy CpG u zyte by ly do wzmocnienia odpowiedzi immunologicznych. Patrz np., patent St. Zjedn. Am. 6,207,646; 6,214,806; 6,218,371; i 6,406,705. Pomimo stosowania takich adiuwantów, szczepionki konwencjonalne nie dostarczaj a odpo- wiedniego zabezpieczenia przed patogenem. W zwi azku z tym, istniej sta la potrzeba skutecznych kompozycji przeciwko HCV, która obejmuje bezpieczne i nie toksyczne adiuwanty. Streszczenie wynalazku Niniejszy wynalazek w cz esci jest oparty na zaskakuj acym spostrze zeniu, ze zastosowanie an- tygenów E1E2 HCV w polaczeniu z submikronow a emulsj a olej w wodzie i oligonukleotydami zawiera- jacymi immunostymuluj ace sekwencje kwasów nukleinowych (ISS), takich jak CpY, CpR i nie metylo- wane motywy CpG (cytozyna po guanozynie i zwi azane wi azaniem fosforowym), pozwala na znacz a- ce podwy zszenie miana przeciwcia l ni z to obserwowane bez takich adiuwantów. Alternatywnie, kom- pozycje wed lug wynalazku mog a by c stosowane jedynie z ISS, bez submikronowej emulsji olej w wodzie, lub tylko z submikronow a emulsj a olej w wodzie której brak MTP-PE, bez ISS. Zastosowa- nie takich kombinacji dostarcza bezpiecznego i skutecznego podej scia do wzmacniania immunoge- niczno sci antygenów E1E2 HCV. W zwi azku z tym, przedmiotem wynalazku jest kompozycja zawieraj aca antygen E1E2 wirusa zapalenia w atroby typu C (HCV) i submikronow a emulsj e olej w wodzie pozbawion a N-acety- lomuramylo-L-alanylo-D-izoglutaminylo-L-alanino-2-(1'-2'-dipalmitoilo-sn-glicero-3-hydroksyfosforylo- ksy)-etylominy (MPT-PE), przy czym ta submikronowa emulsja olej w wodzie jest zdolna do wzmac- niania odpowiedzi immunologicznej na antygen E1E2. W korzystnym wykonaniu wynalazku w kompozycji wed lug wynalazku antygen E1E2 zawiera sekwencj e aminokwasów o co najmniej 80% identyczno sci sekwencji z s asiaduj ac a sekwencj a amino- kwasow a przedstawion a w pozycjach 192-809 Figur 2A-2C. Bardziej korzystnie antygen E1E2 HCV mo ze zawiera c sekwencj e aminokwasów przedstawion a w pozycjach 192-809 Figur 2A-2C. Ponadto kompozycja wed lug wynalazku korzystnie mo ze zawiera c immunostymuluj ac a se- kwencj e kwasu nukleinowego (ISS), który bardziej korzystnie jest oligonukleotydem CpG.PL 203 526 B1 4 Oligonukleotyd CpG zawiera sekwencj e 5'-X 1 X 2 CGX 3 X 4 , w której X 1 i X 2 jest sekwencj a wybra- n a z grupy obejmuj acej GpT, GpG, GpA, ApA, ApT, ApG, CpT, CpA, CpG, TpA, TpT i TpG; i X 3 i X 4 s a wybrane z grupy stanowi acej TpT, CpT, ApT, ApG, CpG, TpC, ApC, CpC, TpA, ApA, GpT, CpA i TpG gdzie p oznacza wi azanie fosforowe. W kolejnym korzystnym rozwi azaniu, w kompozycji wed lug wynalazku oligonukleotyd CpG za- wiera sekwencj e GACGTT, GACGTC, GTCGTT lub GTCGCT, ewentualnie oligonukleotyd CpG za- wiera sekwencj e 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3' (SEQ ID nr 1), ewentualnie oligonukleotyd za- wiera sekwencj e 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3' (SEQ ID NO: 5). W innym korzystnym rozwi azaniu, kompozycja wed lug wynalazku charakteryzuje si e tym, ze submikronowa emulsja olej w wodzie zawiera: (1) podlegaj acy metabolizowaniu olej, przy czym olej ten jest obecny w ilo sci 0,5% do 20% ca l- kowitej objeto sci i (2) czynnik emulguj acy, obecny w ilo sci 0,01% do 2,5% wagowych (w/v) i przy czym olej i czyn- nik emulguj acy s a obecne w postaci submikronowej emulsji olej w wodzie posiadaj acej zasadniczo wszystkie kropelki oleju o srednicy oko lo 100 nm do mniej ni z 1 mikron. W kompozycji wed lug wynalazku olej jest obecny w ilo sci 1% do 12% ca lkowitej obj eto sci i czynnik emulguj acy jest obecny w ilo sci 0,01% do 1% (w/v). W kompozycji wed lug wynalazku czynnik emulguj acy zawiera mono-, di- lub triester poloksyety- leno sorbitanu i/lub di- lub triester sorbitanu. W kompozycji wed lug wynalazku submikronowa emulsja olej w wodzie zawiera 4-5% w/v skwa- lenu, 0,25-1,0% w/v monooleinianu polioksyetylenosorbitanu, i/lub 0,25-1,0% trójoleinianu sorbitanu, lub ewentualnie submikronowa emulsja olej w wodzie zawiera zasadniczo 5% obj eto sciowo skwalenu i jeden lub wi ecej czynników emulguj acych wybranych z grupy sk ladaj acej si e z monooleinianu poliok- syetylenosorbitanu i trioleinianu sorbitanu, przy czym ca lkowita ilosc obecnych czynników emulguj a- cych wynosi 1% wagowo (w/v). Czynniki emulguj ace w kompozycji wed lug wynalazku stanowi a monooleinian polioksyetyleno- sorbitanu i trioleinian sorbitanu i ca lkowita ilosc obecnych monooleinianu polioksyetylenosorbitanu i trioleinian sorbitanu wynosi 1% wagowo (w/v). Przedmiotem wynalazku jest równie z kompozycja zawieraj aca antygen E1E2 wirusa zapalenia w atroby typu C (HCV) i immunostymuluj ac a sekwencj e kwasu nukleinowego (ISS), charakteryzuj aca sie tym, ze ISS jest zdolny do zwi ekszania odpowiedzi immunologicznej na antygen E1E2 HCV, a ponadto ISS jest oligonukleatydem CpG. W korzystnej postaci kompozycji wed lug wynalazku antygen E1E2 HCV zawiera sekwencj e aminokwasów o najmniej 80% identyczno sci do sekwencji do przyleg lej sekwencji aminokwasowej przedstawionej w pozycjach 192-809 Figur 2A-2C, bardziej korzystnie antygen E1E2 HCV zawiera sekwencj e aminokwasów przedstawion a w pozycjach 192-809 Figur 2A-2C. Inn a korzystn a odmian a kompozycji wed lug wynalazku jest kompozycja w której oligonukleotyd CpG zawiera sekwencj e 5'-X 1 X 2 CGX 3 X 4 , w którym X 1 i X 2 s a sekwencjami wybranymi z grupy obejmu- jacej GpT, GpG, GpA, ApA, ApT, ApG, CpT, CpA, CpG, TpA i TpG; i X 3 i X 4 s a wybrane z grupy obej- mujacej TpT, CpT, ApT, ApG, CpG, TpG, ApC, CpC, TpA, ApA, GpT, CpA i TpG, w którym p oznacza wi azanie fosforowe, lub równie z korzystnie, oligonukleotyd CpG zawiera sekwencj e GACGTT, GA- CGTC, GTCGTT lub GTCGCT. Kompozycja ta bardziej korzystnie posiada oligonukleotyd CpG, który zawiera sekwencj e 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3' (SEQ ID nr 1), lub sekwencj e 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTC- GTT-3' (SEQ ID NO: 5). Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja zawieraj aca: (a) antygen E1E2 wirusa zapalenia w atroby typu C (HCV) zawieraj acy sekwencj e aminokwaso- w a o co najmniej 80% identyczno sci sekwencji do s asiaduj acej sekwencji aminokwasowej przedsta- wionej w pozycjach 192-809 Figur 2A-2C; (b) submikronow a emulsj e olej w wodzie zdoln a do zwi ekszania odpowiedzi immunologicznej na antygen E1E2 HCV, przy czym ta submikronowa emulsja olej w wodzie zawiera (i) podlegaj acy metabolizowaniu olej, przy czym olej ten jest obecny w ilo sci 1% do 12% ca lkowitej obj eto sci i (ii) czynnik emulguj acy, przy czym czynnik emulguj acy jest obecny w ilo sci 0,01 do 1% wagowo (w/v) i zawiera mono-, di- lub triester polioksyetyleno sorbitanu i/lub mono-, di- lub triester sorbitanu, przy czym olej i czynnik emulguj acy s a obecne w postaci emulsji olej w wodzie posiadaj acej zasadniczo wszystkie kropelki oleju o srednicy oko lo 100 nm do mniej ni z 1 mikron srednicy; iPL 203 526 B1 5 (c) oligonukleotyd CpG, który zawiera sekwencj e GACGTT, GACGTC, GTCGTT lub GTCGCT. Korzystnie, powy zsza kompozycja wed lug wynalazku, zawiera antygen E1E2 HCV obejmuj acy sekwencj e aminokwasów przedstawion a w pozycjach 192-809 Figur 2A-2C, przy czym oligonukleotyd CpG zawiera sekwencj e 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3' (SEQ ID nr 1), natomiast submikronowa emulsja olej w wodzie zawiera 4-5% skwalenu, 0,25-1,0% w/v monooleinianu polioksyetylenosorbita- nu, i/lub 0,25-1,0% trioleinianu sorbitanu i ewentualnie N-acetylomuramylo-L-alanylo-D-izoglutaminylo- L-alanino-2-(1'-2'-dipalmitoilo-sn-glicero-3-hydroksyfosforyloksy)-etylaminy (MPT-PE). W innym ko- rzystnym wykonaniu submikronowa emulsja olej w wodzie stanowi zasadniczo 5% obj eto sciowo skwa- lenu, i jeden lub wi ecej czynników emulguj acych wybranych z grupy obejmujacej monooleinian poliok- syetylenosorbitanu i trioleinian sorbitanu, przy czym ca lkowita ilo sc czynników obecnych emulguj acych wynosi 1% wagowo (w/v). W kolejnym korzystnym wykonaniu, kompozycja wed lug wynalazku charakteryzuje si e tym, ze jeden lub wi ecej czynników emulguj acych jest monooleinianem polioksyetylenosorbitanu i trioole- inianem sorbitanu i ca lkowita ilosc monooleinianu polioksyetylenosorbitanu i triooleinianu sorbitanu obecnego wynosi 1% wagowo (w/v). Nast epnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja % zawieraj aca: (a) antygen E1E2 wirusa zapalenia w atroby typu C (HCV) obejmuj acy sekwencj e aminokwasów przedstawion a w pozycjach 192-809 Figur 2A-2C; (b) submikronow a emulsj e olej w wodzie zdoln a do zwi ekszania odpowiedzi immunologicznej na antygen E1E2 HCV, przy czym submikronowa emulsja olej w wodzie zawiera 4-5% w/v skwalenu, 0,25-1,0% w/v monooleinianu polioksyetylenosorbitanu i/lub 0,25%-1,0% trioleinianu sorbitanu i ewen- tualnie N-acetylomuramylo-L-alanylo-D-izoglutaminylo-L-alanino-2-(1'-2'-dipalmitoilo-sn-glicero-3-hy- droksyfosforyloksy)-etylaminy (MTP-PE), przy czym olej i czynnik emulguj acy s a obecne w postaci emulsji olej w wodzie posiadaj acej kropelki oleju wszystkie zasadniczo które s a oko lo 100 nm lub mniejsze ni z 1 mikron srednicy; i (c) oligonukleotyd CpG, zawieraj acy sekwencj e 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT- 3' (SEQ ID nr 1) lub sekwencj e 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3' (SEQ ID NO: 5). Kompozycja ta korzystnie zawiera taki antygen E1E2 HCV, który stanowi sekwencj e aminokwa- sow a przedstawion a w pozycji 192-809 na Figurach 2A-2C. Ponadto w tej kompozycji wed lug wyna- lazku submikronowa emulsja olej w wodzie stanowi zasadniczo (i) 5% obj eto sciowo skwalenu i (ii) jeden lub wi ecej czynników, korzystnie emulguj acych wybranych z grupy sk ladaj acej si e z monoole- inianu polioksyetylenosorbitanu i triooleinianu sorbitanu, przy czym ca lkowita ilosc obecnych czynni- ków emulguj acych wynosi 1% wagowo (w/v), bardziej korzystnie jeden lub wi ecej czynników emulgu- jacych stanowi a monooleinianem polioksyetylenosorbitanu i trioleinianem sorbitanu i ca lkowita ilosc obecnego monooleinianu polioksyetylenosorbitanu i trioleinianu sorbitanu wynosi 1% wagowo (w/v). Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie kompozycji antygenu E1E2 wirusa zapa- lenia w atroby typu C (HCV) i submikronowej emulsji olej w wodzie pozbawionej N-acetylomuramylo-L- -alanylo-D-izoglutaminylo-L-alanino-2-(1'-2'-dipalmitoilo-sn-glicero-3-hydroksyfosforyloksy)-etylaminy (MTP-PE), do wytwarzania leku do pobudzania odpowiedzi immunologicznej u kr egowca, przy czym ta submikronowa emulsja olej w wodzie jest zdolna do zwi ekszania odpowiedzi immunologicznej na antygen E1E2 HCV. Nast epnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie kompozycji antygenu E1E2 wirusa za- palenia w atroby typu C (HCV) i immunostymuluj acej cz asteczki kwasu nukleinowego (ISS) do wytwa- rzania leku do zwi ekszenia odpowiedzi immunologicznej na antygen E1E2 HCV. Kolejno, przedmiotem wynalazku jest zastosowanie kompozycji zawieraj acej: (a) antygen E1E2 wirusa zapalenia w atroby typu C (HCV) zawieraj acy sekwencj e aminokwaso- w a o najmniej 80% identyczno sci do przylegaj acej sekwencji aminokwasów przedstawionej w pozy- cjach 192-809 na Figurach 2A-2C. (b) submikronow a emulsj e olej w wodzie zdoln a do zwi ekszenia odpowiedzi immunologicznej na antygen E1E2 HCV, przy czym submikronowa emulsja olej w wodzie zawiera (i) metabolizowalny olej, przy czym olej ten jest obecny w ilo sci 1% do 12% ca lkowitej obj eto sci i (ii) czynnik emulguj acy, przy czym czynnik emulguj acy jest obecny w ilo sci 0,01% do 1% (w/v) i zawiera mono-, di- lub triester polioksyetyleno sorbitanu i/lub mono-, di- lub triester sorbitanu, przy czym olej i czynnik emulguj acy s a obecne w postaci emulsji olej w wodzie posiadaj acej zasadniczo wszystkie kropelki oleju o srednicy oko lo 100 nm do mniej ni z 1 mikron srednicy; iPL 203 526 B1 6 (c) oligonukleotyd CpG, który zawiera sekwencj e GACGTT, GACGTC, GTCGTT lub GTCGCT do wytwarzania leku do pobudzania odpowiedzi immunologicznej u kr egowca. Przedmiotem wynalazku jest równie z zastosowanie kompozycji zawieraj acej: (a) antygen E1E2 wirusa zapalenia w atroby typu C (HCV) zawieraj acy sekwencj e aminokwasów przedstawion a w pozycjach 192-809 Figur 2A-2C; (b) submikronow a emulsj e olej w wodzie zdoln a do zwi ekszania odpowiedzi immunologicznej na antygen HCV E1E2, przy czym submikronowa emulsja olej w wodzie zawiera 4-5% w/v skwalenu, 0,25-1,0% w/v monooleinianu polioksyetylenosorbitanu i/lub 0,25%-1,0% trioleinianu sorbitanu i ewen- tualnie N-acetylomuramylo-L-alanylo-D-izoglutaminylo-L-alanino-2-(1'-2'-dipalmitoilo-sn-glicero-3-hy- droksyposforyloksy)-etylaminy (MTP-PE), przy czym olej i czynnik emulguj acy s a obecne w postaci emulsji olej w wodzie posiadaj acej kropelki oleju wszystkie zasadniczo, o srednicy oko lo 100 nm lub mniej niz 1 mikron srednicy; i (c) oligonukleotyd CpG, zawieraj acy sekwencj e 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3' (SEQ ID nr 1) lub sekwencj e 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3' (SEQ ID NO: 5) do wytwarzania leku do pobudzania odpowiedzi immunologicznej u kr egowca. Nast epnym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania kompozycji polegaj acy na po la- czeniu submikronowej emulsji olej w wodzie pozbawionej N-acetylomuramylo-L-alanylo-D-izoglu- taminylo-L-alanino-2-(1'-2'-dipalmitoilo-sn-glicero-3-hydroksyposforyloksy)-etylaminy (MTP-PE) z an- tygenem E1E2 wirusa zapalenia w atroby typu C (HCV). Korzystnie, w sposobie wed lug wynalazku ponadto dokonuje si e laczenia immunostymulujacej sekwencji kwasu nukleinowego (ISS) z antyge- nem E1E2 i submikronow a emulsj e olej w wodzie. Przedmiotem wynalazku jest tak ze sposób wytwarzania kompozycji, polegaj acy na tym, ze la- czy si e immunostymulujac a sekwencj e kwasu nukleinowego (ISS) z antygenem E1E2 wirusowego zapalenia w atroby typu C (HCV). Przy u zyciu kompozycji wed lug wynalazku mo zna pobudza c odpowied z immunologiczn a u kr e- gowca, które obejmuje podawanie osobnikowi skutecznej terapeutycznie dawki antygenu E1E2 HCV i submikronowej emulsji olej w wodzie bez MTP-PE, przy czym ta submikronowa emulsja olej w wo- dzie jest zdolna do zwi ekszania odpowiedzi immunologicznej na antygen E1E2 HCV. Osobnik mo zna tak ze otrzymywa c jeden lub wi ecej ISS, takich jak jeden lub wi eksza ilo sc oligonukleotydów zawieraj a- cych nie metylowany motyw CpG, przy czym ISS jest zdolny do podwy zszania odpowiedzi immunolo- gicznej na antygen E1E2 HCV. Submikronowa emulsja olej w wodzie mo ze by c obecna w tej samej kompozycji co antygen lub mo ze by c podawana w odr ebnej kompozycji. Ponadto, je sli ISS jest obec- ny, mo ze on by c obecny w tej samej kompozycji co antygen i/lub submikronowa emulsja olej w wo- dzie, lub w innej kompozycji. Krótki opis rysunków Figura 1 jest schematycznym przedstawieniem genomu HCV, opisuj acym ró zne regiony polipro- teiny HCV. Figura 2A-2C (SEQ ID nr: 3 i 4) pokazuje nukleotyd i odpowiadajac a sekwencj e aminokwasow a dla regionu E1/E2/p7 HCV-1. Numery pokazane na tej figurze dotycz a pe lnej d lugo sci poliproteiny HCV-1. Pokazane s a regiony E1, E2 i p7. Figura 3 jest schematem plazmidu pMHE1E2-809, koduj acym E1E2 809 , reprezentatywnej prote- iny E1E2 do stosowania w niniejszym wynalazku. Figura 4 pokazuje miana przeciwcia l E1E2 809 EIA z myszy immunizowanych E1E2 809 plus CpG; E1E2 809 plus MF59; E1E2 809 plus CpG i MF59; oraz E1E2 809 plus 4XMF59, jak opisano w przyk ladach. Kó lka pokazuj a miana przeciwcia l w poszczególnych surowicach mysich. Kwadraty pokazuj a sredni a geometryczn a miana przeciwcia la (GMT) grupy 10 myszy. S lupki b ledów s a porównaniem przedzialów dla ró znic znamiennych statystycznie jak oznaczono przez jednokierunkow a analiz e wariancji. Szczegó lowy opis wynalazku W niniejszym wynalazku wykorzystuje si e, o ile nie wskazano inaczej, konwencjonalne metody chemiczne, biochemiczne, technik e rekombinacji DNA i immunologii, mieszcz ace si e w zakresie umie- jetno sci fachowca w tej dziedzinie. Techniki te s a wyja snione w literaturze. Patrz, np., Fundamental Virology, Wydanie 2-gie, Tom I i II (B.N. Fields i D.M. Knipe, wyd.); Handbook of Exparimental Immu- nology, Tomy I-IV (D.M. Weir I CC. Blackwell wyd., Blackwell Scientific Publications); T.E. Creighton, Proteins:Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers Inc., wydanie bie zace); Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Labo-PL 203 526 B1 7 ratory Manual (Wydanie 2-gie, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick i N. Kaplan wyd., Aca- demic Press. Inc.). Trzeba zaznaczy c, ze jak stosuje si e w niniejszym opisie i w za laczonych zastrze zeniach, po- stacie liczby pojedynczej obejmuj a odniesienia mnogie chyba, ze z kontekstu wynika, i z jest inaczej. Zatem, na przyk lad, okre slenie „antygen" obejmuje mieszanin e dwóch lub wi ecej antygenów i tym podobnie. W tek scie stosowane s a nast epuj ace skróty aminokwasów: Alanina: Ala (A) Arginina: Arg (R) Asparagina: Asn (N) Kwas asparaginowy: Asp (D) Cysteina: Cys (C) Glutamina: Gln (Q) Kwas glutaminowy: Glu (E) Glicyna: Gly (G) Histydyna: His (H) Izoleuzyna: Ile (I) Leucyna: Leu (L) Lizyna: Lys (K) Metionina: Met (M) Fenyloalanina: Phe (F) Prolina: Pro (P) Seryna: Ser (S) Treonina: Thr (T) Teryptofan Trp (W) Tyrozyna: Tyr (Y) Walina: Val (V) I. Definicje Przy opisywaniu niniejszego wynalazku, zastosowano nast epuj ace okre slenia, których definicje wskazano poni zej. Okre slenie „polipeptyd" i „proteina" odnosi si e do polimeru reszt aminokwasowych i nie jest ograniczone do minimalnej d lugo sci tego produktu. Tak wi ec, peptydy, oligopeptydy, dimery, multime- ry i tym podobne, s a w laczone do tej definicji. Zarówno proteiny pe lnej d lugo sci i ich fragmenty s a obj ete t a definicj a. Okre slenia te zawieraj a tak ze post-ekspresyjne modyfikacje peptydu, na przyk lad, glikozylacje, acetylacje, fosforylacje i tym podobne. Ponadto, dla celów niniejszego wynalazku, „poli- peptyd" odnosi si e do proteiny, która zawiera modyfikacje, takie jak delecje, addycje i substytucje, (ogólnie natury konserwatywnej), do sekwencji natywnej, tak d lugo jak d lugo ta proteina utrzymuje pozadan a aktywno sc. Modyfikacje te mog a by c zamierzone jak poprzez mutagenezy skierowane na miejsce, lub mog a by c przypadkowe, tak jak poprzez mutacje gospodarza, który wytwarza te bialka lub b ledy wynik le z amplifikacji PCR. Przez „polipeptyd E1" rozumie si e cz asteczk e pochodz ac a z regionu E1 HCV. Dojrza ly region E1 HCV-1 rozpoczyna si e przy oko lo 192 aminokwasie poliproteiny i jest kontynuowany do oko lo 383 ami- nokwasu, ponumerowanego wzgl edem pe lnej d lugo sci poliproteiny HCV-1. (Patrz, Figury 1 i 2A-2C. Aminokwasy 192-383 z Figur 2A-2C odpowiadaj a pozycjom aminokwasów 20-211 SEQ ID nr: 4). Aminokwasy przy oko lo 173 przez oko lo 191 (aminokwasy 1-19 z SEQ ID nr: 4) s lu za jako sekwencja sygna lowa dla E1. Zatem, przez „polipeptyd E1" rozumie si e zarówno prekursora proteiny E1, w lacza- jac sekwencj e sygna low a, lub dojrza ly polipeptyd E1, który pozbawiony jest tej sekwencji, lub nawet polipeptyd E1 z sekwencj a sygna low a heterologiczn a. Polipeptyd E1 zawiera C-ko ncow a zakotwiczo- n a b lonowo sekwencj e, która znajduje si e przy w przybli zeniu pozycjach aminokwasowych 360-383 (patrz, Publikacja Mi edzynarodowa nr WO 96/04301, opublikowana w 15 lutego 1996). Polipeptyd E1, jak zdefiniowano, mo ze lub nie zawiera c C-ko ncow a zakotwiczon a sekwencj e lub jej cz esci. Przez „polipeptyd E2" rozumie si e cz asteczk e pochodz ac a z regionu E2 HCV. Dojrza ly region E2 HCV-1 zaczyna si e oko lo 383-385 aminokwasu, ponumerowanych wzgl edem pe lnej d lugo sci poli- proteiny HCV-1. (Patrz, Figury 1 i 2A-2C. Aminokwasy 383-385 z Figury 2A-2C odpowiadaj a amino- kwasom w pozycjach 211-213 SEQ ID nr: 4). Peptyd sygna lowy zaczyna si e oko lo aminokwasu 364 tej poliproteiny. Zatem, przez „polipeptyd E2" rozumie si e zarówno prekursor proteiny E2, obejmuj acej sekwencj e sygna low a, lub dojrza ly polipeptyd E2, który pozbawiony jest tej sekwencji, lub nawet poli- peptyd E2 z heterologiczn a sekwencj a sygna low a. Polipeptyd E2 zawiera C-ko ncow a sekwencj e za- kotwiczon a b lonowo, która wyst epuje w przybli zeniu przy pozycjach aminokwasowych 715-730 i mo ze przed lu za c si e w przybli zeniu do 746 reszty aminokwasowej (patrz, Lin i wsp., J Virol. (1994)68:5063- 5073). Polipeptyd E2, jak zdefiniowano powy zej, mo ze lub nie zawiera c C-ko ncow a sekwencj e zako- twiczon a b lonowo lub cz esc tej sekwencji. Ponadto, polipeptyd E2 mo ze tak ze zawiera c wszystkie lub cz esc regionu p7, który wyst epuje bezpo srednio obok C-ko nca E2. Jak pokazano na Figurach 1 i 2A-2C, region p7 jest stwierdzany w pozycjach 747-809, ponumerowanych wzgl edem pe lnej d lugo sci poliproteiny HCV-1 (pozycje aminokwasowe 575-637 w SEQ ID NO: 4). Ponadto, wiadomo, ze istniej a wielorakie ro- dzaje HCV E2 (Speate i wsp., Virol (1992) 188:819-830; Selby i wsp., J. Virol. (1996) 70:5177-5182; Gra-PL 203 526 B1 8 koui i wsp., J. Virol. (1993) 67:1385-1395; Tomei i wsp., J. Virol. (1993) 67:4017-4026). W zwi azku z tym, dla celów tego wynalazku, okre slenie „E2" obejmuje ka zdy z tych rodzajów E2 obejmuj ac, bez ograni- czenia, rodzaje jakie maj a delecje 1-20 lub wi ecej aminokwasów z N-ko ncami E2, takie jak np., dele- cje aminokwasów 1, 2, 3, 4, 5....10...15, 16, 17, 18, 19...i tak dalej. Takie rodzaje E2 obejmuj a te roz- poczynaj ace si e przy aminokwasie 387, aminokwasie 402, aminokwasie 403, i tym podobne. Reprezentatywne regiony E1 i E2 z HCV-1 s a pokazane na Figurach 2A-2C i na SEQ ID NO: 4. Dla celów niniejszego wynalazku, regiony E1 i E2 s a zdefiniowane w odniesieniu do numeru amino- kwasu poliproteiny kodowanej przez genom HCV-1, z inicjatorem metioninowym oznaczanym w pozy- cji 1. Patrz, np., Choo i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci USA(1991)88:2451-2455. Jednak, nale zy zauwa- zy c, ze okre slenie „polipeptyd E1" lub „polipeptyd E2", tak jak stosuje si e tutaj, nie jest ograniczony do sekwencji HCV-1. Pod tym wzgl edem, odpowiednie regiony E1 lub E2 w innych izolatach HCV mog a by c latwo oznaczone przez przyrównanie sekwencji tych izolatów w sposób który sprowadza te se- kwencje do maksymalnego uporz adkowania. Mo zna to przeprowadzi c za pomoc a którego s z wielu pakietów oprogramowania komputerowego, takiego jak ALIGN 1.0, dost epnego z Universty of Virgi- nia, Department of Biochemistry (Attn: Dr. William R. Pearson). Patrz, Pearson i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1988)85:2444-2448. Ponadto, „polipeptyd E1" lub „polipeptyd E2" jak tutaj zdefiniowano nie jest ograniczony do poli- peptydu posiadaj acego dok ladnie sekwencj e przedstawion a na Figurach. Faktycznie, genom HCV jest w stanie ci ag lego zmieniania si e in vivo i zawiera wiele domen zmiennych, które wykazuja wysoki stopie n zmienno sci pomi edzy izolatami. Wiele z regionów konserwatywnych i zmiennych jest znanych w sród tych szczepów, i ogólnie sekwencje aminokwasowe epitopów pochodz ace z tych regionów b ed a mia ly wysoki stopie n homologii sekwencji, np., homologi e sekwencji aminokwasowej wi ecej ni z 30%, korzystnie wi ecej ni z 40%, wi ecej ni z 60% i wi ecej ni z 80-90% homologii, gdy te dwie sekwencje przyrównuje si e. Jest oczywistym, ze okre slenie to obejmuje polipeptydy E1 i E2 z ka zdego z ró znych szczepów HCV i izolatów obejmuj acych izolaty posiadaj ace jeden z 6 genotypów HCV opisanych u Simmonds i wsp., J. Gen. Virol. (1993) 74:2391-2399 (np., szczepy 1, 2, 3, 4 i tak dalej), jak równie z nowo zidentyfikowane izolaty i podtypy tych izolatów, takie jak HCV1a, HCV1b i tym podobne. Zatem, na przyk lad, okre slenie „polipeptyd E1 lub E2" odnosi si e do sekwencji E1 i E2 z które- gokolwiek z ró znych szczepów HCV, jak te z analogi, muteiny i immunogenne fragmenty, jak zdefinio- wano poni zej. Pe lne genotypy wielu z tych szczepów s a znane. Patrz, np., patent St. Zjedn. Am. nr 6,150,087 i GenBank numery dost epu AJ238800 i AJ238799. Ponadto, okre slenia „polipeptyd E1" i „polipeptyd E2" obejmuj a proteiny, które zawieraj a mody- fikacje w sekwencji natywnej, takie jak wewn etrzne delecje i substytucje (ogólnie w naturze konserwa- tywnych). Modyfikacje te mog a by c rozwa zane jako mutagenezy skierowane na miejsce, lub mog a by c przypadkowe, takie jak w naturalnie wyst epuj acych zdarzeniach mutacyjnych. Wszystkie z tych mody- fikacji s a objete niniejszym wynalazkiem tak d lugo jak modyfikowane peptydy E1 i E2 dzia laj a zgodnie z zamierzonym przeznaczeniem. Zatem, na przyk lad, je sli polipeptydy E1 i/lub E2 maj a by c zastoso- wane w kompozycjach szczepionki, modyfikacje te musz a by c takie aby aktywno sc immunologiczna (to znaczy zdolno sc do ujawniania humoralnej lub komórkowej odpowiedzi na ten polipeptyd) nie zo- stala utracona. Kompleks E1E2 rozumiany jest jako proteina zawieraj aca co najmniej jeden polipeptyd E1 i co najmniej jeden polipeptyd E2, jak opisano powy zej. Taki kompleks mo ze zawiera c ca ly lub cz esc regionu p7, który wyst epuje jako bezpo srednio s asiaduj acy z C ko ncem E2. Jak pokazano na Figurach 1 i 2A-2C, region p7 jest znajdowany w pozycjach 747-809, ponumerowanych wzgl edem pe lnej d lugo sci poliproteiny HCV-1 (pozycje aminokwasowe 575-637 w SEQ ID NO: 4). Reprezenta- tywny kompleks, E1E2, który zawiera bia lko p7 jest nazwany E1E2 809 . Sposób laczenia E1 i E2 w kompleks E1E2 jest niematerialny. Polipeptydy E1 i E2 wed lug ni- niejszego wynalazku mog a by c laczone poprzez kowalencyjne interakcje takie jak poprzez si ly elek- trostatyczne lub przez wi azania kowalencyjne. Na przyk lad polipeptydy E1E2 wed lug wynalazku mog a by c w postaci bia lka fuzyjnego, które zawiera immunogenny polipeptyd E1 i immunogenny polipeptyd E2, jak zdefiniowano powy zej. Fuzja ta mo ze by c wyra zona z polinukleotydu koduj acego chimer e bia lka E1E2. Alternatywnie, kompleks E1E2 mo ze tworzy c si e samorzutnie po prostu przez mieszania bia lek E1 i E2, które by ly wytworzone indywidualnie. Podobnie, bia lka E1 i E2 je sli s a wydzielane do pod lo za mog a tworzy c kompleks samorzutnie. Zatem, okre slenia te obejmuj a kompleksy E1E2 (tak ze zwany agregatami), które spontanicznie tworz a si e podczas oczyszczania E1 i/lub E2. Takie agregaty mog a zawiera c jeden lub wi ecej E1 monomerów w po laczeniu z jednym lub wi ecej monomerów E2.PL 203 526 B1 9 Ilosc obecnych monomerów E1 i E2 nie musi by c równa tak d lugo jak co najmniej jeden monomer E1 i jeden monomer E2 jest obecny. Wykrywanie obecno sci kompleksu E1E2 jest latwe do oznaczenia u zywaj ac standardowych technik detekcji bia lka takich jak elektroforeza na zelu poliakrylamidowym i techniki immunologiczne jak immunoprecypitacja. Okre slenie, „analog" i „muteina" odnosi si e do biologicznie aktywnych pochodnych omawianej cz asteczki, lub fragmentów takich pochodnych, które w opisanych badaniach zachowa ly pozadan a aktywnosc, tak a jak immunoreaktywnosc. Ogólnie, okre slenie, „analog" odnosi si e do zwi azków po- siadaj acych sekwencj e natywnego polipeptydu i budow e z jedn a lub wi ecej addycjami aminokwaso- wymi, substytucjami (ogólnie konserwatywnymi w naturze) i/lub delecjami, wzgl edem natywnej cz a- steczki, tak d lugo jak te modyfikacja nie niszczy aktywno sci immunologicznej. Okre slenie „muteina" odnosi si e do peptydów posiadaj acych jeden lub wi ecej peptydowych na sladowców („peptoidów"), tak jak te opisane w Publikacji Mi edzynarodowej nr WO 91/04282. Korzystnie, analog lub muteina ma tak a sam a aktywnosc immunologiczn a jak cz asteczka natywna. Sposoby wytwarzania analogów pep- tydowych i mutein s a znane w stanie techniki i s a opisane dalej poni zej. Szczególnie korzystne analogami obejmuj a podstawienia, które s a konserwatywne w naturze to znaczy takie podstawienia, które maj a miejsce w rodzinie aminokwasowej zwi azane z ich la ncuchami bocznymi. Aminokwasy dzieli si e na cztery rodziny: (1) kwasowe - asparaginian i glutaminian; (2) za- sadowe - lizyna, arginina, histydyna; (3) nie polarne - alanina, walina, leucyna, izoleucyna, prolina, fenyloalanina, metionina, tryptofan; i (4) polarne bez ladunku - glicyna, asparagina, glutamina, cyste- ina, seryna, treonina, tyrozyna. Fenyloalanina, tryptofan i tyrozyna s a czasami klasyfikowane jako aromatyczne aminokwasy. Na przyk lad, daje si e racjonalnie przewidzie c, ze izolowane zast apienie leucyny izoleucyn a lub walin a, asparaginianu glutaminianem, treoniny seryn a lub podobne konserwa- tywne podstawienia aminokwasowe pokrewnym strukturalnie aminokwasem, nie b edzie mia lo wielkie- go wp lywu na aktywno sc biologiczn a. Na przyk lad, polipeptyd b ed acy przedmiotem zainteresowania zawiera do 5-10 konserwatywnych lub nie konserwatywnych podstawie n aminokwasowych, lub nawet do oko lo 15-25 lub 50 konserwatywnych lub nie konserwatywnych podstawie n aminokwasowych, lub ka zd a liczb e ca lkowit a pomiedzy 5-50, tak d lugo a z pozadana funkcja tej cz asteczki pozostanie niena- ruszona. Fachowiec mo ze latwo oznaczy c regiony cz asteczki poszukiwanej jaka mo ze tolerowa c zmiany poprzez odniesienie do wykresów Hoop/Woods i Kyte-Doolittle, dobrze znanych w stanie techniki. Przez „fragment" rozumie si e polipeptyd stanowi acy tylko cz es c nienaruszonej pe lnej d lugo sci sekwencji i struktury polipeptydu. Fragment ten moze zawiera c delecje C-ko ncowe i 4 N-ko ncowe i/lub delecje wewn etrzne natywnego polipeptydu. „Fragment immunogenny" szczególnej proteiny HCV generalnie zawiera co najmniej oko lo 5-10 s asiaduj acych reszt aminokwasowych pe lnej d lugo sci cz a- steczki, korzystnie co najmniej oko lo 15-25 s asiaduj acych reszt aminokwasowych pe lnej d lugo sci cz asteczki, a najbardziej korzystnie co najmniej oko lo 20-50 lub wi ecej s asiadujacych reszt amino- kwasowych cz asteczki pe lnej d lugo sci, które definiuj a epitop, lub ka zd a liczb e ca lkowit a pomi edzy 5 aminokwasami a sekwencj a pe lnej d lugo sci, sprawiaj ac, ze fragment badany zachowuje zdolnosc do ujawniania odpowiedzi immunologicznej jak tutaj zdefiniowano. Dla opisu znanych fragmentów E1 i E2 immunogennego HCV, patrz Chien i wsp., Publikacja Mi edzynarodowa nr WO 93/00365. Okre slenie „epitop" tak jak tutaj si e stosuje, odnosi si e do sekwencji co najmniej 3 do 5, ko- rzystnie 5 do 10 lub 15 i nie wi ecej ni z 500 aminokwasów (lub ka zdej liczby ca lkowitej pomi edzy nimi), który definiuje sekwencj e, która sama jedna lub jako cz es c wi ekszej sekwencji, wywo luje odpowied z immunologiczn a u osobnika któremu jest podana. Cz esto epitop wi aze si e przeciwcia lem generowa- nym w odpowiedzi na t a sekwencj e. Nie ma ostatecznego limitu górnego co do d lugo sci tego fragmen- tu, który mo ze zawiera c prawie ca lej d lugo sci sekwencj e tego bia lka, lub nawet bia lka fuzyjnego za- wierajacego dwa lub wi ecej epitopów z poliproteiny HCV. Epitop do stosowania w niniejszym wyna- lazku nie jest ograniczony do polipeptydu posiadaj acego dok ladn a sekwencj e tej cz esci rodzicielskiej proteiny z której on pochodzi. W rzeczywisto sci, genomy wirusowe s a w stanie nieustaj acych zmian i zawieraj a wiele domen zmiennych, które wykazuj a wzgl ednie wysokie poziomy zmienno sci pomi edzy izolatami. Tak wi ec okre slenie „epitop" obejmuje sekwencje identyczne z natywn a sekwencj a jak te z modyfikacje tej sekwencji natywnej, takie jak delecje, addycje i substytucje (ogólnie natury konserwa- tywnej). Regiony danego polipeptydu jakie zawieraj a epitop mog a by c zidentyfikowane stosuj ac wiele technik mapowania epitopu, dobrze znanych w stanie techniki. Patrz, np., Epitope Mapping Protocols in Method in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, NewPL 203 526 B1 10 Jersey. Na przyk lad, epitopy liniowe, mog a by c oznaczane przez np., jednoczesne syntetyzowanie du zej liczby polipeptydów na pod lo zu sta lym, peptydów odpowiadaj acych czesci cz asteczki bia lka i prowadzenie reakcji peptydów z przeciwcia lami kiedy peptydy te wci az przylegaj a do pod lo za. Tech- niki takie s a znane w literaturze i opisane s a np., w patencie St. Zjedn. Am. nr 4,708,871; Geysen i wsp., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci USA 81:3998-4002; Geysen i wsp., (1985) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 82:178-182; Geysen i wsp., (1986) Molec. Immunol. 23:709-715. Stosuj ac takie techniki, wiele epitopów HCV zosta lo zidentyfikowanych. Patrz np., Chien i wsp., Viral Hepatitis and Liver Disease (1994) str. 320-324, i dalsze poni zej. Podobnie, epitopy konformacyjne s a tak ze latwe do identyfikacji przez okre slenie przestrzennej konformacji aminokwasów, jak np., przez krystalografie promieniowaniem X i 2 wymiarowym rezonan- sem magnetycznym. Patrz np., Epitope Mapping Protocols, powy zej. Antygenowe regiony bia lkowe mog a tak ze by c zidentyfikowane stosuj ac standardowy wykres antygenowo sci i hydropatii takie jak wyliczone stosuj ac oprogramowanie Omiga wersja 1.0 dost epnego z Oxford Molecular Group. Ten program komputerowy wykorzystuje metod e Hoop/Woods, Hoop i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1981) 78:3824-3828 dla oznaczenia profilu antygenowo sci i technik a Kyte-Doolittle, Kyte i wsp., J. Mol. Biol. (1982) 157:105-132 dla wykresu hydropatii. Tak jak u zyto tutaj, okre slenie „epitop konformacyjny" odnosi si e do pewnej cz esci pe lnej d lugo- sci bia lka lub analogu lub jego muteiny, posiadaj acych strukturalne cechy natywne do sekwencji ami- nokwasowej koduj acej ten epitop w pe lnej d lugo sci bia lku naturalnym. Natywne cechy strukturalne obejmuj a, lecz nie s a ograniczone do glikozylacji i trójwymiarowej struktury. D lugosc sekwencji definiu- jacej epitop mo ze by c przedmiotem du zej zmienno sci jako, ze epitopy te s a uwa zane jako utworzone przez trójwymiarow a struktur e tego antygenu (np., pofa ldowanie). Zatem, aminokwasów definiuj acych epitop mo ze by c stosunkowo niewiele co do ilo sci, ale mog a by c szeroko rozproszone wzd lu z d lugo sci tej cz asteczki (lub nawet na ró znych cz asteczkach w przypadku dimerów, i tym podobnie), b ed ac sprowadzane do w la sciwej konformacji epitopowej poprzez pofa ldowanie. Cz esc antygenu pomi edzy resztami definiuj acymi ten epitop mo ze nie by c krytyczn a dla konformacyjnej struktury tego epitopu. Na przyk lad, delecje lub substytucje tych wtr aconych sekwencji mog a nie zmienia c konformacji tego epitopu przy zastrze zeniu, ze sekwencje krytyczne dla epitopu s a zachowane (np., cysteiny zaanga- zowane w wi azaniu dwusiarczkowym, miejsca glikozylacji, itp.). Epitopy konformacyjne s a latwo identyfikowane stosuj ac omówione powy zej metody. Ponad- to, obecno sc i nieobecno sc epitopu konformacyjnego w danym polipeptydzie mo ze by c latwo ozna- czone poprzez przeszukiwanie antygenu badanego za pomoc a przeciwcia la (poliklonalna lub mono- klonalna surowica dla epitopu konformacyjnego) i porównanie ich reaktywno sci z zdenaturowan a wersj e antygenu, który zachowuje tylko liniowe epitopy je sli w ogóle). W takim przeszukiwaniu sto- suj ac przeciwcia la poliklonalne, korzystnym mo ze by c absorbowanie surowicy poliklonalnej najpierw z zdenaturowanym antygenem i patrzenie czy zatrzymuje ono przeciwcia la do antygenu badanego. Epitopy konformacyjne pochodz ace z regionów E1 i E2 s a opisane np., w Publikacji Mi edzynarodo- wej nr WO 94/01 778. „Odpowied z Immunologiczna" na antygen HCV lub kompozycja jest rozwojem u osobnika hu- moralnej i/lub komórkowej odpowiedzi immunologicznej na cz asteczki obecne w kompozycji badanej. Dla celów niniejszego wynalazku „humoralna odpowied z immunologiczna" odnosi si e do odpowiedzi immunologicznej w której po srednicz a cz asteczki przeciwcia la, podczas gdy w „komórkowej odpowie- dzi immunologicznej" po srednicz a limfocyty-T i/lub inne bia le krwinki krwi. Jeden wa zny aspekt ko- mórkowej odporno sci immunologicznej zwi azany jest z specyficzn a antygenowo odpowiedzi a prowa- dzon a przez cytolityczne komórki T („CTL"). CTL posiadaj a specyficzno sc wobec antygenów pepty- dowych jakie s a prezentowane w powi azaniu z bia lkami kodowanymi przez g lówny kompleks zgodno- sci histologicznej (MHC) i wyra zane na powierzchni komórek. CTL pomagaj a wywo lywa c i pobudza c destrukcj e wewn atrzkomórkow a bakterii wewn atrzkomórkowych lub liz e zainfekowanych komórek z takimi bakteriami. Inny aspekt immunologicznej odporno sci komórkowej wymaga antygenowo- -specyficznej odpowiedzi komórek pomocniczych T. Komórki pomocnicze T pomagaj a w pobudzaniu funkcji i skupiaj a aktywno sc na niespecyficznych komórek efektorowych przeciwko ujawnionym pepty- dom antygenowym w powi azaniu z cz asteczkami MHC na ich powierzchni. „Komórkowa odpowied z immunologiczna" odnosi si e tak ze do wytwarzania cytokin, chemokin i innych takich cz asteczek wy- twarzanych przez aktywowane komórki T i/lub inne bia le komórki krwi, w laczaj ac te otrzymane z ko- mórek CD+ i CD8+T. Kompozycja lub szczepionka, która wywo luje komórkow a odpowied z immunolo- giczn a mo ze s lu zy c do uczulania kr egowca przez prezentowanie antygenu w powi azaniu z cz astecz-PL 203 526 B1 11 kami kompleksu MHC na powierzchni komórki. Odpowied z immunologiczna, w której po sredniczy komórka jest kierowana na, lub prawie na komórki prezentuj ace antygen na swojej powierzchni. Po- nadto, antygenowo specyficzne limfocyty T mog a by c generowane w celu dopuszczenia do dalszego zabezpieczenia immunizowanego gospodarza. Zdolnosc poszczególnych antygenów do stymulowania odpowiedzi immunologicznej komórkowej mo ze by c oznaczane w wielu badaniach, takich jak próby limfoproliferacji (aktywacja limfocytów), bada n cytotoksycznych komórek CTL, lub przez badanie T-limfocytów specyficznych dla antygenu u uczulonego osobnika. Takie badania s a dobrze znane ze stanu techniki, patrz, np., Erickson i wsp., J. Immunol. (1993) 151:4189-4199; Doe i wsp., Eur. J. Im- munol. (1994) 24:2369-2376. Zatem, odpowied z immunologiczna tak jak zastosowano tutaj mo ze by c t a, która pobudza wy- twarzania CTL i/lub wytwarzanie lub aktywacj e pomocniczych komórek T. Antygen badany mo ze tak- ze ujawnia c wywo lywan a przez przeciwcia lo odpowied z immunologiczn a, wlaczaj ac, na przyk lad, neutralizacj e wiaz acych przeciwcia l (NOB). Obecno sc odpowiedzi przeciwcia l NOB jest latwo ozna- czana za pomoc a technik opisanych przez np., Rosa i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93:1759. W zwi azku z tym, odpowied z immunologiczna mo ze zawiera c jeden lub wi ecej nast epuj a- cych efektów: wytwarzanie przeciwcia l przez komórki B; i/lub aktywowanie supresora komórek T i/lub y d komórek T skierowanych specyficznie na antygen lub antygeny obecne w tej kompozycji lub bada- nej szczepionce. Te odpowiedzi mog a s lu zy c do neutralizowania zaka zenia i/lub zmienia c komple- ment przeciwciala lub cytotoksyczno sc zale zn a od przeciwcia la (ADCC) dla dostarczenia ochrony lub ust apienia objawów u immunizowanego gospodarza. Takie odpowiedzi mog a by c oznaczane stosuj ac standardowe immunotesty i badania neutralizacji, dobrze znane ze stanu techniki. Jak stosuje si e tutaj „immunostymuluj aca sekwencja nukleotydowa" lub „ISS" oznacza polinu- kleotyd zawieraj acy co najmniej jedn a cz astk e immunostymuluj acego oligonukleotydu (ISS-ODN). Ta cz astka ISS jest jednoniciowym lub dwuniciowym DNA lub RNA oligonukleotydem posiadaj acym co najmniej sze sc zasad nukleotydowych jakie mo ze zawiera c, lub sk lada si e z zmodyfikowanego oligo- nukleotydu lub sekwencji modyfikowanych nukleozydów. Te cz astki ISS zawieraj a lub mog a by c oflankowane przez sekwencj e nukleotydow a zawieraj ac a CG lub sekwencj e nukleotydow a p(1C), która mo ze by c palindromow a. Cysteina mo ze by c metylowana lub nie metylowana. Przyk lady szcze- gólnych cz asteczek ISS do stosowania w niniejszym wynalazku obejmuj a cz asteczki CpG, opisane poni zej, jak te z CpY i CpR cz asteczki i tym podobne. Sk ladnik kompozycji E1E2, taki jak submikronowa emulsja olej w wodzie lub oligonukleotyd CpG, wzmagaj a odpowied z immunologiczn a na obecny w kompozycji antygen E1E2 HCV gdy kom- pozycja posiada wi eksz a zdolno sc do wywo lywania odpowiedzi immunologicznej ni z odpowied z im- munologiczna wywo lywana przez równowa zn a ilo sc antygenu kiedy dostarczana jest bez dodatkowe- go sk ladnika. Tak zwi ekszona immunogeniczno sc mo ze by c oznaczana przez podanie kompozycji antygenu z i bez dodatkowych sk ladników i porównanie mian przeciwcia la przeciwko tym obu stosuj ac standardowe próby takie jak radioimmunotesty i ELISA, dobrze znane ze stanu techniki. Bia lko „rekombinowane" jest bia lkiem, które zachowuje po zadan a aktywno sc i które by lo przy- gotowane technikami rekombinacji DNA jak opisano tutaj. Ogólnie, gen badany jest klonowany i na- st epnie jest wyra zany w stransformowanych organizmach, jak opisano poni zej. Organizm gospodarza wyra za gen obcy w celu wytwarzania bialka w warunkach ekspresji. „Izolowany" rozumie si e, kiedy odnosimy to do polipeptydu, jest rozumiane tak, ze izolowana cz asteczka jest oddzielana i wydzielana z ca lego organizmu, w którym cz asteczka ta znajdowana jest w naturze lub jest obecna w znacz acej mniejszo sci w stosunku do innych biologicznych makrocz aste- czek tego samego typu. Termin „izolowany" w odniesieniu do polinukleotydu oznacza cz asteczk a kwasu nukleinowego, pozbawion a w calosci lub w cz esci, sekwencji normalnie zwi azanych z ni a w naturze; lub sekwencj e, jaka istnieje w naturze, lecz posiadaj aca sekwencj e heterologiczn a z ni a zwi azan a; lub cz asteczk e od laczon a od chromosomu. Przez „równowa znik determinanty antygenowej" rozumie si e determinant e antygenow a z ró z- nych pod-gatunków lub szczepów HCV, takich jak ze szczepów 1, 2, 3 itp., HCV, które to antygenowe determinanty nie koniecznie s a identyczne ze wzgl edu na ró znorodno sc sekwencji, lecz które wyst e- puj a w równowa znych pozycjach w badanej sekwencji HCV. Zazwyczaj, sekwencja aminokwasowa równowa znika determinaty antygenowej b edzie mia la wysoki stopie n homologii sekwencji np., homo- logi e sekwencji aminokwasowej wi eksz a ni z 30%, zwykle wi eksz a ni z 40%, wi eksz a ni z 60% i nawet wi eksz a ni z 80-90% homologii, kiedy te dwie sekwencje s a przyrównywane.PL 203 526 B1 12 „Homologia" odnosi si e do procentowej identyczno sci pomi edzy dwoma polinukleotydami lub dwiema cz asteczkami polipeptydowymi. Dwie sekwencje DNA lub dwie polipeptydowe s a „zasadniczo homologiczne" jedna do drugiej, kiedy sekwencje te wykazuj a co najmniej 50%, korzystnie co najmniej oko lo 75%, bardziej korzystnie co najmniej 80-85%, korzystnie co najmniej oko lo 90% i najkorzystniej co najmniej oko lo 95-98% identyczno sc sekwencji w porównaniu z okre slon a d lugo sci a tej cz asteczki. Jak zastosowano tutaj, zasadniczo homologiczna odnosi si e tak ze do sekwencji wykazuj acej ca lkowi- t a identyczno sc z okre slon a sekwencj a DNA lub polipeptydow a. Zwykle „to zsamosc" odnosi si e do dok ladnej odpowiednio sci nukleotyd do nukleotydu lub ami- nokwas do aminokwasu je sli porówna si e dwie sekwencje polinukleotydowe lub polipeptydowe. Iden- tyczno sc w procentach mo ze by c okre slona przez proste porównanie informacji o sekwencji pomi edzy dwiema cz asteczkami przez przyrównanie tych sekwencji, obliczenie dok ladnej liczby par pomiedzy dwiema przyrównanymi sekwencjami, podzielenie przez d lugo sc krótszej sekwencji i pomno zenie wyniku przez 100. W tym celu do analizy mog a by c stosowane latwo dost epne programy komputero- we ALIGN, Dayhoff, M.O. w Atlas of Protein Sequence and Structure M.O. Dayhoff wyd., 5 Suppl. 3:353-358, National bimedica Researcg Foudation, Washington, DC, które dla analizy peptydowej adaptuj a algorytm homologii lokalnej Smith i Waterman Advances in Appl., Math. 2:482-489. 1981. Programy do analizy identyczno sci sekwencji nukleotydu s a dost epne w Wisconsin Sequence Analy- sis Package, wersja 8 (dost epnej z Genetics Computer Group, Madison, WI) na przyk lad, programy: BESTFIT, FASTA i GAP, które tak ze polegaj a na algorytmie Smith i Waterman. Programy te s a latwe do wykorzystania z domy sln a ilo scia parametrów zalecan a przez wytwórc e i opisanych w wy zej wspomnianym Wisconsin Sequence Analysis Package. Na przyk lad, procent identyczno sci poszcze- gólnych sekwencji nukleotydowych z odno sn a sekwencj a mo ze by c oznaczony stosuj ac algorytm homologii Smith'a i Watermana z tabel a domy slnych danych i przedzia lem kar sze sciu pozycji nukle- otydowych. Inn a metod a ustalania procentowej identyczno sci w kontek scie niniejszego wynalazku jest za- stosowanie pakietu programów MPSRCH wydanych przez University of Edinbourgh, u lo zonych przez John F. Collins and Shane S. Sturrok i rozprowadzanych przez Intell i Geneteics, Inc. (Mountain View, CA). Z tego zestawu pakietowego algorytm Smith-Waterman mo ze by c zastosowany gdzie do tabel wyników s a stosowane parametry domy slne (na przyk lad, kara za przerw e otwart a 12, kara za wyd lu- zenie przerwy jeden i przerwa 6). Z danych generowanych wartosc „Match" odzwierciedla „identycz- nosc sekwencji". Inne odpowiednie programy do obliczania procentu identyczno sci lub podobie nstwa pomi edzy sekwencjami s a ogólnie znane ze stanu techniki, na przyk lad, innym programem porównu- jacym jest BLAST, stosowany z parametrami domy slnymi. Na przyk lad BLASTN i BLASTP mog a by c stosowane u zywaj ac nast epuj ace parametry domy slne: kod genetyczny = standard; filtr = zaden; ni c = podwójna; odci ecie = 60; spodziewane = 10, Matrix BLOSUM62; Descriptions = 50 sekwencji; zliczane co = HIGH SCORE; Baza danych = nie-zbyteczna, Genank + DDBJ + PDB +GenBank trans- lacje CDS + bia lko Swiss + Spupdate + PIR. Szczegó ly tych programów mo zna znale zc pod nast epu- jacym adresem internetowym: http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST. Homologi e mo zna oznacza c w inny sposób poprzez hybrydyzacj e polinukleotydów w warun- kach, w których tworz a si e stabilne dupleksy pomi edzy regionami homologicznymi, a nast epnie przez trawienie za pomoc a nuklezy(az) specyficznych dla pojedynczej nici i oznaczanie rozmiaru tych tra- wionych fragmentów. Sekwencje DNA, które s a zasadniczo homologiczne mo ze by c identyfikowane w do swiadczeniu hybrydyzacji Southern w na przyk lad, warunkach ostrych, jak zdefiniowano dla tego szczególnego uk ladu. Zdefiniowanie odpowiednich warunków hybrydyzacji mie sci si e w zakresie wie- dzy fachowca w tej dziedzinie. Patrz, np., Sambrook i wsp., supera; DNA Cloning, supra; Nucleic Acid Hybridization, powy zej. II. Tryby przeprowadzania wynalazku Przed opisaniem niniejszego wynalazku w szczegó lach, nale zy zrozumie c, ze wynalazek ten nie jest ograniczony do szczególnych preparatów lub parametrów procesu, które mog a si e oczywi scie ró zni c. Nale zy tak ze rozumie c, ze zastosowana tutaj terminologia jest podana tylko w celu opisania poszczególnych postaci tego wynalazku i nie jest zamierzona jako ograniczaj aca. Jakkolwiek w praktycznym wykonaniu niniejszego wynalazku mo zna zastosowa c wiele kompo- zycji i sposobów podobnych lub równowa znych do tego opisanego, korzystne materia ly i sposoby zostaly opisane w niniejszym zg loszeniu. Jak zauwa zono powy zej, niniejszy wynalazek jest oparty na odkryciu, ze antygeny E1E2 HCV w po laczeniu z submikronow a emulsj a olej w wodzie pozbawion a MTP-PE jak równie z z submikrono-PL 203 526 B1 13 w a emulsj a olej w wodzie i immunostymulacyjnymi cz asteczkami kwasu nukleinowego, takimi jak oli- gonukleotydy CpG, dostarczaj a kompozycji, które wywo luj a znacz aco wy zsze miano przeciwcia la ni z to obserwowane bez takich adiuwantów. Wywo lanie specyficznych do HCV przeciwcia l przez peptydy E1E2 dostarczaj a uk lady modelowe do konstruowania szczepionek HCV zarówno in vitro jak i in vivo, zw laszcza do identyfikowania epitopów polipeptydu HCV E1, E2 i E1E2 HCV zwi azanych z wytwarza- niem silnych anty-E1, anty-E2 i/lub antyE1E2 mian przeciwcia l i/lub komórkowej odpowiedzi immuno- logicznej skierowanej przeciwko HCV. Polipeptydy E1E2 mog a tak ze by c stosowane do generowania odpowiedzi immunologicznej przeciwko HCV. Polipeptydy E1E2 mog a tak ze by c stosowane do gene- rowania odpowiedzi immunologicznej przeciwko HCV u ssaka, zw laszcza odpowiedzi przeciwcia la anty-E1, anty-E2 i/lub E1E2 i/lub immunologicznej odpowiedzi komórkowej, do celów zarówno leczni- czych jak i profilaktycznych. Polipeptydy E1E2 Jak wyja sniono powy zej, kompleksy E1E2 w kompozycjach wed lug wynalazku zawieraj a poli- peptydy E1 i E2, po laczone przez interakcje zarówno nie kowalencyjne jak i kowalencyjne. Genom wirusa zapalenia w atroby typu C typowo zawiera pojedyncz a otwart a ramk e odczytu o oko lo 9600 nukleotydach, która jest transkrybowana do poliproteiny. Poliproteina HCV jest rozk ladana z wytwo- rzeniem wielu odr ebnych produktów, w kolejno sci NH 2 -C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a- COOH (patrz Figura 1). Polipeptyd E1 HCV jest glikoprotein a i rozci aga si e od aminokwasu oko lo 192 do aminokwasu 383 (ponumerowanego wzgl edem poliproteiny HCV-1). Patrz, Choo i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:2451-2455. Aminokwasy przy okolo 173 przez oko lo 191 reprezentuj a poje- dyncz a sekwencj e dla E1. Polipeptyd E2 HCV jest tak ze glikoprotein a i rozpo sciera si e od oko lo 383 aminokwasu lub 384 do 746. Peptyd sygna lowy E2 zaczyna si e przy oko lo 364 aminokwasie poliproteiny. Zatem, okre slenie „pe lnej d lugo sci" E1 lub nie skrócony" E1, jak stosuje si e tutaj, odnosi si e do polipeptydów jakie zawie- raja co najmniej aminokwasy 192-383 poliproteiny HCV (ponumerowane wed lug HCV-1). W odniesie- niu do E2, okre slenie „pe lnej d lugo sci" lub „nie skrócony" jak stosuje si e tutaj, odnosi si e polipeptydów jakie zawieraj a co najmniej aminokwasy 383-384 do aminokwasu 746 poliproteiny HCV (ponumero- wanej wzgl edem HCV-1). Jak stanie si e oczywistym z tego ujawnienia, polipeptydy do stosowania w niniejszym wynalazku mog a zawiera c dodatkowe aminokwasy z regionu p7, takie jak aminokwasy 747-809. Jak wyja sniono powy zej, E2 istnieje jako wielokrotny gatunek (Spaete i wsp., Virol. (1992) 188:819-830; Selby i wsp., J. Virol (1996) 70:5177-5182; Grakoui i wsp., J. Virol. (1993)67:1385-1395; Tomei i wsp., J. Virol (1993) 67:4017-4026) i przeci ecie oraz proteoliza mo ze zaj sc w N- i C-zako nczeniu polipeptydów E1 i E2. Zatem, polipeptyd E2 do niniejszego zastosowania mo ze za- wiera c co najmniej aminokwasy 405-661, np., 400, 401, 402... do 661, takie jak 383 lub 384-661, 383 lub 384-715, 383 lub 384-746, 383 lub 384-748 lub 383 lub 384-809, lub 383 lub 384 do jakiegokol- wiek C-zako nczenia pomi edzy 661-809 poliproteiny HCV, ponumerowanych wzgl edem poliproteiny HCV-1 pelnej d lugo sci. Podobnie, korzystne polipeptydy E1 do niniejszego zastosowania mog a zawie- ra c aminokwasy 192-326, 192-330, 192-333, 192-360, 192-363, 192-383, lub 192 do jakiegokolwiek C-zako nczenia pomi edzy 326-383 poliproteiny HCV. Kompleksy E1E2 mog a tak ze by c wytworzone z immunogennych fragmentów E1 i E2, które zawieraj a epitopy. Na przyk lad, fragmenty polipeptydów E1 mog a zawiera c od oko lo 5-ciu do prawie pe lnej d lugo sci cz asteczki, tak jak 6, 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 185 lub wi ecej aminokwasów polipeptydu E1, lub ka zd a liczb e ca lkowit a pomiedzy tymi liczbami. Podobnie, fragmenty E2 polipep- tydów mog a zawiera c 6, 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300 lub 350 aminokwasów polipeptydu E2, lub ka zd a liczb e ca lkowit a pomi edzy tymi liczbami. Polipeptydy E1 i E2 mog a by c od tego samego lub ró znych szczepów HCV. Na przyk lad, epitopy pochodz ace z np., superzmiennego regionu E2, takiego jak region pomi e- dzy aminokwasami 384-410 lub 390-410, mog a by c w laczone w polipeptyd E2. Szczególnie skutecz- nym epitopem E2 do w laczenia w sekwencj e E2 jest taki epitop, który zawiera sekwencj e zgodno sci pochodz ac a z tego regionu, tak a jak sekwencja zgodno sci Gly-Ser-Ala-Ala-Arg-Thr-Thr-Ser-Gly-Phe- Val-Ser-Leu-Phe-Ala-Pro-Gly-Ala-Lys-Gln-Asn, która stanowi sekwencj e zgodno sci dla aminokwasów 390-410 genomu HCV typu 1. Dodatkowe epitopy E1 i E2 s a znane i opisane w np., Chien i wsp., Publikacja Mi edzynarodowa nr WO 93/00365. Ponadto, polipeptydy E1 i E2 tego kompleksu mog a nie mie c ca lej lub czesci domeny spinaj acej b lon e. Zakotwiczona w b lonie sekwencja dzia la dla skojarzenia tego polipeptydu z retikulum endopla-PL 203 526 B1 14 zmatycznym. Normalnie, polipeptydy takie s a zdolne do wydzielania w medium wzrostowym w którym organizm wyra zaj acy to bia lko jest hodowany. Chocia z, jak opisano w Mi edzynarodowej Publikacji WO 98/50556, takie polipeptydy mog a by c odzyskiwane sródkomórkowo. Sekrecja do medium wzro- stowego jest latwa do oznaczenia stosuj ac wiele technik detekcji, w laczaj ac, np., elektroforez e na zelu poliakrylamidowym i podobne oraz techniki immunologiczne takie jak testy immunoprecypitacji jak opisano w np., Mi edzynarodowej Publikacji nr WO 96/04301, opublikowanej 15 lutego 1996 r. Polipep- tydy z E1, zazwyczaj ko ncz ace si e przy pozycji oko lo 370 i wy zszej (bazuj ac na numeracji HCV-1 E1) b ed a pozostawiane w ER i w ten sposób nie b ed a wydziela ly si e do srodowiska wzrostowego. Poli- peptydy z E2, ko ncz ace si e na oko lo 731 pozycji aminokwasowej i wy zszej (tak ze bazuj ac na nume- racji sekwencji HCV-1 E2) b ed a zatrzymywane przez ER i nie wydzielane. (Patrz, np., Mi edzynarodo- wa Publikacja nr WO 96/0430, opublikowana 15 lutego 1996). Trzeba zauwa zy c, ze te pozycje amino- kwasów nie s a absolutne i mog a ró zni c si e do pewnego stopnia. Zatem, niniejszy wynalazek rozwa za zastosowanie polipeptydów E1 i E2, które zachowuj a sródb lonow a domen e wiazac a, jak te z polipep- tydów, które maj a brak cz esci sródb lonowej domeny wi az acej, w laczaj ac polipeptydy E1 ko ncz ace si e przy oko lo 369 i ni zszych aminokwasach, oraz polipeptydy E2, ko ncz ace si e przy oko lo 730 i ni zszych aminokwasach i s a one obj ete zakresem tego wynalazku. Ponadto, skrócenie C-ko ncowe mo ze roz- ciagnac poza sródb lonow a domen e spinaj ac a w kierunku ko nca N. Zatem, na przyk lad, skrócenia E1 zachodz ace przy pozycji ni zszej ni z np., 360 i skrócenia E2 zachodz ace przy pozycjach ni zszych ni z, np., 715 s a tak ze obj ete niniejszym wynalazkiem. Jest to konieczne aby skrócone polipeptydy E1 i E2 zachowywa ly swoje okre slone zamierzone funkcje. Jednak ze, szczególnie korzystnymi skróconymi konstruktami E1 s a te, które nie wykraczaja poza oko lo 300-ny aminokwas. Najbardziej korzystnymi s a te ko ncz ace si e przy pozycji 360. Korzystnymi skróconymi konstruktami E2 s a te z C-ko ncowymi skróceniami, nie przekraczaj acymi pozycji aminokwasowej 715. Szczególnie korzystnymi ko ncami E2 s a te cz asteczki skrócone po którymkolwiek z aminokwasów 715-730, takim jak 725. Je sli stosuje si e skrócone cz asteczki, korzystnym jest stosowanie obu skróconych cz asteczek E1 i E2. Polipeptydy E1 i E2 i ich kompleksy mog a tak ze by c obecne jak asialoglikoproteiny. Takie asia- loglikoproteiny s a wytwarzane metodami znanymi w stanie techniki, takimi jak przez zastosowanie komórek w których ko ncowa glikozylacja jest blokowana. Kiedy te proteiny s a wyra zane w takich ko- mórkach i izolowane przez chromatografi e powinowactwa do GNA lektyny, proteiny E1 i E2 agreguj a spontanicznie. Szczegó lowe metody wytwarzania tych agregatów E1E2 s a opisane w np., patencie St. Zjedn. Am. Nr 6,074,852. Ponadto, te kompleksy E1E2 mog a by c obecne jako mieszaniny heterogenicznych cz asteczek, wynik le z obcinania i rozk ladu proteolitycznego, jak opisano powy zej. Zatem, kompozycja obejmuj aca kompleksy E1E2 mo ze obejmowa c wiele gatunków E1E2, takich jak E1E2 ko ncz ace si e przy amino- kwasie 746 (E1E2 746 ), E1E228 ko ncz ace si e przy aminokwasie 809 (E1E2 809 ), lub którakolwiek z in- nych ró znych cz asteczek E1 i E2 opisanych powy zej, taka jak cz asteczki E2 z N-ko ncowymi zako n- czeniami z 1-20 aminokwasami, takie jak gatunek E2 zaczynaj acy si e przy aminokwasie 387, amino- kwasie 402, aminokwasie 403 i tak dalej. Kompleksy E1E2 s a latwo wytwarzane rekombinacyjnie, albo jako bia lka fuzyjne albo przez tak zwan a ko-transformacj e komórek gospodarza konstruktami koduj acymi poszukiwane polipeptydy E1 i E2. Ko-transformacja mo ze by c zako nczona albo w trans albo w cis, to znaczy przez zastosowanie osobnych wektorów lub przez zastosowanie pojedynczego wektora, który niesie geny zarówno E1 jak i E2. Je sli wykonuje si e j a stosuj ac pojedynczy wektor, oba geny mog a by c prowadzone przez poje- dynczy zestaw elementów kontrolnych lub alternatywnie, geny te moga by c obecne na wektorze w indywidualnych kasetach ekspresji, prowadzonych przez indywidualne elementy kontrolne. Po eks- presji proteiny E1 i E2 b ed a si e spontanicznie laczy ly. Alternatywnie, kompleksy mog a by c tworzone przez mieszanie razem pojedynczych bia lek, które by ly wytworzone osobno, zarówno w postaci oczyszczonej jak i pó l oczyszczonej, lub nawet przez mieszanie medium hodowlanego, w którym ko- mórki gospodarza wyra zaj ace te proteiny by ly hodowane, je sli proteiny te s a wydzielane. Na koniec, kompleksy E1E2 wed lug niniejszego wynalazku mog a by c wyra zane jako bia lko fuzyjne, w którym pozadana cz esc E1 jest laczona jako fuzja z po zadan a czesci a E2. Metody wytwarzania kompleksów E1E2 z pe lnej d lugo sci, skróconych protein E1 i E2, które s a wydzielane do medium, jak te z wewn atrzkomórkowo wytwarzanych skróconych protein, s a znane ze stanu techniki. Na przyk lad, kompleksy takie mog a by c wytwarzane rekombinacyjnie, jak opisano w patencie St. Zjedn. Am. nr 6,121,02 0; Ralston i wsp., J. Virol. (1993)67:6753-6761, Grakoui i wsp., J. Virol. (1993)67:1385-1395; i Lanford i wsp., Virology (1993) 197:225-235.PL 203 526 B1 15 Zatem, polipeptydy koduj ace polipeptydy E1 i E2 HCV do zastosowania w niniejszym wynalaz- ku, mog a by c wykonane stosuj ac standardowe techniki biologii molekularnej. Na przyk lad, sekwencje polinukleotydowe koduj ace powy zej opisane cz asteczki mog a by c otrzymane z komórek wyra zaj acych ten gen lub przez wyprowadzenie genu z wektora o którym wiadomo, ze zawiera ten gen. Ponadto, pozadany gen mo ze by c wyizolowany bezpo srednio z cz asteczek kwasu nukleinowego, stosuj ac me- tody opisane w stanie techniki, takie jak Houghton i wsp., patent St. Zjedn. Am. nr 5, 350, 671. Gen poszukiwany mo ze by c tak ze wytwarzany syntetycznie, raczej ni z klonowany. Cz asteczki mog a by c oznaczane za pomoc a odpowiednich kodonów dla poszczególnej sekwencji. Pe lna sekwencja jest nast epnie sk ladana z zachodz acych na siebie oligonukleotydów wytworzonych metodami standardo- wymi i sk ladana w pe lna sekwencj e koduj ac a. Patrz np., Edge (1981) Nature 292:756; Nambair i wsp., (1984) Science 223:1299; i Jay i wsp.,(1984) J. Biol. Chem. 259:6311. Zatem, poszczególna sekwencja nukleotydowa mo ze by c otrzymana z wektorów zawieraj acych pozadane sekwencje lub syntetyzowanych ca lkowicie, lub w czesci stosuj ac ró zne techniki syntez oligonukleotydów znanych ze stanu techniki, odpowiednimi by ly takie jak mutageneza skierowana na miejsce i techniki reakcji la ncuchowej polimerazy (PCR). Patrz np., Sambrook, powy zej. Zw laszcza, jedn a metod a otrzymywania sekwencji nukleotydowych koduj acych po zadane sekwencje jest topienie komplementarnego zestawu splecionych syntetycznych oligonukleotydów wytworzonych w konwen- cjonalnych syntetyzatorach polinukleotydów a nast epnie poddaniu ligacji odpowiedni a ligaz a DNA i amplifikacji tych zligowanych sekwencji nukleotydowych w reakcji PCR. Patrz, np., Jayaraman i wsp., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4084-4088. Dodatkowo, dla dostarczenia cz asteczek posiadaj a- cych zmienion a lub zwi ekszon a zdolno sc wi azania antygenu i immunogeniczno sc mo zna stosowa c syntez e ukierunkowan a na oligonukleotyd (Jones i wsp., (1986) Nature 54:75-82), mutagenez e skie- rowan a na oligonukleotyd pre-istniej acych rejonów nukleotydu (Reichman i wsp., (1988) Nature 332:323-327 i Verhoeyen i wsp., (1988) Science 239:1534-1536) i enzymatyczne wype lnienie oligo- nukleotydów z przerw a stosuj ac polimeraz e T4 DNA (Queen i wsp., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033). Kiedy sekwencja koduj aca zosta la przygotowana lub wyizolowana, takie sekwencje mog a by c klonowane do jakiegokolwiek odpowiedniego wektora lub replikona. Wiele wektorów klonuj acych jest znanych fachowcom w tej dziedzinie i wybranie odpowiedniego wektora klonuj acego jest kwesti a wy- boru. Odpowiednie wektory obejmuj a lecz nie s a ograniczone do plazmidów, fagów, transpozonów, kosmidów, chromosomów lub wirusów, które s a zdolne do replikacji kiedy s a zwi azane z w la sciwymi elementami kontrolnymi. Sekwencja koduj aca jest nast epnie umieszczana pod kontrol a odpowiednich elementów kontro- lnych zale znie od uk ladu jaki jest stosowany do ekspresji. Zatem, sekwencja koduj aca mo ze by c umieszczana pod kontrol a promotora, miejsca wi azacego rybosom (dla ekspresji bakteryjnej) i ewen- tualnie operatora, w taki sposób, ze sekwencja DNA b ed aca przedmiotem zainteresowania jest tran- skrybowana do RNA przez odpowiedniego transformanta. Ta sekwencja koduj aca mo ze zawiera c lub mo ze nie zawiera c peptydu sygna lowego lub sekwencji liderowej, która potem mo ze by c usuwana przez gospodarza w post-translacyjnym przetwarzaniu. Patrz, np., patent St. Zjedn. Am. nr 4,431,739; 4,425,437; 4,338,397. W dodatku do sekwencji kontrolnych, pozadanym mo ze by c dodanie sekwencji regulatorowych, które pozwalaj a na regulacj e ekspresji sekwencji wzgl edem wzrostu komórek gospodarza. Sekwencje regulatorowe s a znane fachowcom w stanie techniki, a przyk lady obejmuj a takie, które powoduj a eks- presj e genu jaki ma by c w laczony lub wy laczony w odpowiedzi na chemiczny lub fizyczny bodziec, w laczaj ac obecnosc zwi azku regulatorowego. Inne typy elementów regulatorowych mog a by c obecne tak ze w wektorze. Na przyk lad, dla podwy zszenia poziomu ekspresji konstruktu mog a zosta c u zyte elementy wzmacniacza. Przyk lady obejmuja wzmacniacz wczesnego genu SV40 (Dijkema i wsp., (1985) EMBO J. 4:761), wzmacniacz/starter pochodz acy z d lugiego terminalnego powtórzenia (long terminal repeat) (LTR) wirusa mi esaka Rousa (Rous Sarcoma Virus) (Gorman i wsp., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777) i elementów pochodz acych od cz lowieka CMV (Boshart i wsp., (1985) Cell 41:521), takie jak elementy zawarte w sekwencji A intronu CMV (patent St. Zjedn. Am. nr 5,688,688). Kaseta ekspresji mo ze ponadto zawiera c sekwencje ori replikacji dla replikacji autono- micznej w odpowiedniej komórce gospodarza, jeden lub wi ecej daj acych si e wybra c markerów, jeden lub wi ecej miejsc restrykcyjnych, odpowiedni dla du zej liczby kopii i silny starter. Wektor ekspresji jest tak konstruowany, ze szczególna sekwencja koduj aca jest po lo zona w wektorze z odpowiednimi sekwencjami regulatorowymi, po lo zenie i orientacja sekwencji koduj acejPL 203 526 B1 16 wzgl edem sekwencji kontrolnych jest taka, ze sekwencja koduj aca jest transkrybowana pod „kontrol a" sekwencji kontrolnych (tj., polimerazy RNA, wi az aca si e z cz asteczk a DNA przy sekwencji kontrolnej transkrybuje sekwencj e koduj ac a). Modyfikacja sekwencji koduj acej cz asteczk e b ed ac a przedmiotem zainteresowania mo ze by c pozadane dla osiagni ecia tego zako nczenia. Na przyk lad, w niektórych przypadkach mo ze by c koniecznym zmodyfikowanie sekwencji w taki sposób aby mog la ona przycze- pi c si e do sekwencji kontrolnej w odpowiedniej orientacji; tj., dla utrzymania ramki odczytu. Sekwencja kontrolna i inne sekwencje regulatorowe mog a by c ligowane do sekwencji koduj acej przed insercj a do wektora. Alternatywnie, sekwencja koduj aca mo ze by c klonowana bezpo srednio do wektora ekspresji, który ju z zawiera sekwencje kontrolne i odpowiednie miejsce restrykcyjne. Jak wyja sniono powy zej, mo ze by c tak ze po zadanym wytworzenie mutantów lub analogów po- lipeptydu b ed acego przedmiotem zainteresowania. Mutanty lub analogi polipeptydów HCV do zasto- sowania w niniejszej kompozycji mog a by c przygotowane przez delecje cz esci sekwencji koduj acej polipeptyd b ed acy przedmiotem zainteresowania, przez insercj e sekwencji i/lub podstawienie jednego lub wi ecej nukleotydów do tej sekwencji. Przetworzone technicznie lub modyfikowane sekwencje nu- kleotydowe, tak jak mutageneza skierowana na miejsce, i tym podobne, s a dobrze znane fachowcowi w tej dziedzinie. Patrz, np., Sambrook i wsp., powy zej; Kunkel. T.A. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985)82:448; Geisselsoder i wsp., (1987) BioTechniques 5:786; Zoller and Smith (1983) Methods Enzymol. 100:468; Dalbie-McFarland i wsp., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6409. Ekspresja cz asteczek mo ze zachodzi c w szerokim zakresie uk ladów, w laczaj ac owadzie, ssa- cze, bakteryjne, wirusowe i dro zd zowe uk lady ekspresji, jak te z dobrze znane ze stanu techniki. Na przyk lad, uk lady ekspresji komórek owadzich, takich jak uk lady bakulowirusów s a znane fa- chowcom w tej dziedzinie i opisane w np., Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin nr 1555 (1987). Materia ly i metody dla uk ladów ekspresji bakulowirus/komórka owadzia s a dost epne w handlu w postaci zestawu mi edzy innymi z Invitrogen, San Diego CA (zestaw „MaxBac"). Podobnie, bakteryjne uk lady ekspresji i uk lady ekspresyjne komórek ssaków s a dobrze znane z litera- tury fachowej i s a opisane w np., Sambrook i wsp., jak wy zej. Dro zd zowe uk lady ekspresji s a znane w stanie techniki i opisane w np., Yeast Genetic Engineering (Barr i wsp., wyd., 1989) Butterworths, Londyn. Znanych jest tak ze wiele odpowiednich komórek gospodarza do zastosowania w powy zszych uk ladach. Na przyk lad, linie komórek ssaków s a znane w stanie techniki i obejmuj a unie smiertelnione linie komórkowe dost epne z Ameryka nskiej Kolekcji Hodowli Typowych (American Type Culture Col- lection) (ATCC), takie jak, lecz nie ograniczaj ace si e do nich, komórki jajnika chomika chi nskiego (Chinese hamster ovary) (CHO), komórki HeLa, komórki nerek nowo narodzonych chomików syryj- skich (baby hamster kidney) (BHK), komórki nerek malpy (monkey kidney cells)(COS), ludzkie em- brionalne komórki nerek, ludzkie komórki raka w atrobowokomórkowego (np., Hep G2), komórki nerek krowy Madin-Darby (Madin-Darby bovine kidney) („MDBK"), jak równie z inne. Podobnie, gospodarze bakteryjni tacy jak E. coli, Bacillus subtilis i Streptococcus spp., b ed a znajdowa ly zastosowanie w ni- niejszych uk ladach ekspresji. Gospodarze dro zd zowi w niniejszym wynalazku obejmuj a mi edzy innymi Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromy- ces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe i Yarrowia lipolytica. Komórki owadzie do zastosowania z wektorami ekspresji bakulowirusa obejmuj a mi edzy innymi Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda i Trichoplusiani. Cz asteczki kwasu nukleinowego zawieraj ace sekwencje nukleotydowe b ed ace przedmiotem zainteresowania mog a by c trwale integrowane do genomu komórki gospodarza lub utrzymywane na stalym elemencie episomalnym w odpowiedniej komórce gospodarza stosuj ac ró zne techniki dostar- czania genu dobrze znanych ze stanu techniki. Patrz, np., patent St. Zjedn. Am. nr 5,399,346. W zale zno sci od uk ladu ekspresji i wybranego gospodarza, cz asteczki te s a produkowane przez rosn ace komórki gospodarza, transformowane opisanym powy zej wektorem ekspresji w warun- kach w których zachodzi ekspresja bia lka. Wyra zone bia lko jest nast epnie izolowane z komórek go- spodarza i oczyszczane. Je zeli uk lad ekspresji wydziela bia lko do medium wzrostowego, to produkt mo ze by c oczyszczany bezpo srednio z medium. Je zeli nie jest on wydzielany, mo ze on by c izolowany z lizatu komórkowego. Dobór odpowiednich warunków wzrostu i metod odzyskiwania jest w zakresie wiedzy fachowca w tej dziedzinie.PL 203 526 B1 17 Kompozycje Raz wytworzone, antygeny E1E2 mog a by c dostarczane w kompozycjach szczepionek, w szczepionkach np.: profilaktycznych (tj., do zapobiegania infekcjom) lub leczniczym (do leczenia HCV w nast epstwie infekcji). Szczepionki te mog a zawiera c mieszaniny jednego lub wi ecej komplek- sów E1E2, taki jak kompleksy E1E2 pochodz ace z wi ecej ni z jednego izolatu wirusowego, jak równie z z dodatkowych antygenów HCV. Ponadto, jak wyja sniono powy zej, kompleksy E1E2 mog a by c obec- ne jako heterogeniczne mieszaniny cz asteczek, wynikaj ace ze przecinania lub rozk ladu proteolitycz- nego. Zatem, kompozycja obejmuj aca kompleksy E1E2 mo ze obejmowa c rozmaite gatunki E1E2, takie jak E1E2 ko ncz ace si e przy aminokwasie 746 (E1E2 746 ), E1E2 ko ncz ace si e przy aminokwasie 809 (E1E2 809 ), lub jakakolwiek z innych ró znych cz asteczek E1 i E2 opisanych powy zej, takie jak cz a- steczki E2 z N-ko ncowymi obci eciami od 1-20 aminokwasów, taki jak gatunki E2 zaczynaj ace si e przy aminokwasie 387, aminokwasie 402, aminokwasie 403, itp. Szczepionki te mog a by c podawane w po laczeniu z innymi antygenami i czynnikami immunore- guluj acymi, na przyk lad, immunoglobulinami, cytokinami, limfokinami i chemokinami, obejmujacymi lecz nie ograniczonymi do cytokin takimi jak IL-2, modyfikowana IL-2 (cys125 ? ser125), GM-CSF, 11-12, ?-interferon, IP-10, MIP1 ß, FLP-3, rybawiryna i RANTES. Szczepionki b ed a zwykle zawiera c jeden lub wi ecej „farmaceutycznie akceptowanych zaróbek lub no sników" takich jak woda, sól fizjologiczna, glicerol, etanol, itp. Ponadto, substancje pomocnicze, takie jak czynniki zwil zaj ace lub emulguj ace, substancje buforuj ace pH i tym podobne, mog a by c obecne w takich no snikach. Ewentualnie jest obecny no snik, który jest cz asteczk a, która sama nie wywo luje produkcji szko- dliwych dla osobnika, otrzymuj acego t a kompozycj e, przeciwcia l. Odpowiednie no sniki s a typowo du- zymi, powoli metabolizowanymi makrocz asteczkami takimi jak bia lka, polisacharydy, kwasy polimle- kowe, kwasy poliglikolowe, aminokwasy polimerowe, aminokwasy kopolimerowe, agregaty lipidowe (takie jak krople oleju lub liposomy) i nieaktywne czastki wirusa. Takie no sniki s a dobrze znane fa- chowcom w tej dziedzinie. Ponadto, polipeptyd HCV mo ze by c koniugowany do toksoidu bakteryjne- go, takiego jak tosoid z b lonicy, t ezca, cholery, itp. Jak wyja sniono tutaj, submikronowa emulsja olej w wodzie i/lub ISS taki jak oligonukleotydy CpG (opisane poni zej), mo ze by c obecny w tej samej kompozycji w celu zwi ekszenia odpowiedzi im- munologicznej. Dodatkowe adiuwanty moga by c tak ze obecne, takie jak ale nie ograniczone do: (1) soli glinu (alum), takich jak chlorowodorek glinu, fosforan glinu, siarczanglinu, itp.: (2) uk lad adiuwanta Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) zawieraj acy 2% skwalenu, 0,2% Tween 80 i jedn a lub wi ecej komponentów bakteryjnej b lony komórkowej z grupy sk ladaj acej si e z monofosforolipidu A (MPL), dimikolanu trehalozy (TDM) i szkieletonu sciany komórkej (cell wali skeleton) (CWS), korzyst- nie MPL+CWS (Detox™); (3) adiuwantów saponinowych, takich jak QS21 lub Stimulon™ (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) mog a by c stosowane lub generowane z nich cz astki takie jak ISCOM(y) (kompleksy immunostymuluj ace), które ISKOM(y) mog a by c pozbawione dodatkowego detergentu (patrz, np., Publikacja Mi edzynarodowa nr WO 00/07621); (4) Pe lny Adiuwant Freunda (Complete Freunds Adjuvent) (CFA) i Niepe lny Adiuwant Freunda (Incomplete Freunds Adjuvant)(IFA); (5) cyto- kiny, takie jak interleukiny, takie jak Il-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 itp. (patrz, np., Publikacja Mi edzynarodowa nr WO 99/44636), interferony takie jak interferon gamma, czynnik stymuluj acy kolo- nie makrofagów (M-CSF), czynnik martwicy nowotworu (TNF), itp.; (6) detoksyfikowane mutanty bak- teryjnej toksyny ADP-rybozyluj acej takiej jak toksyna cholery (CT), toksyna krztu sca (PT), lub ciep lo- chwiejna toksyna E. coli (LT), zw laszcza LT-K63 (gdzie lizyna jest podstawiona w pozycji 63 w dzikim typie aminokwasu) LT-R72 (gdzie arginina jest podstawiona w pozycji 72 w dzikim typie aminokwasu), CT-S109 (gdzie seryna jest podstawiona w pozycji 109 w dzikim typie aminokwasu), PT-K9/G129 (gdzie lizyna jest podstawiona w pozycji 9 w dzikim typie aminokwasu i glicyna jest podstawiona w pozycji 129) (patrz, np., Publikacja Mi edzynarodowa nr WO93/13202 i WO92/19265); (7) monofos- forolipid A (MPL) lub 3-O-deacylowany MPL (3dMPL) (patrz, np., GB 2220221; EPA 0689454), ewen- tualnie w znacz acej nieobecno sci glinu (patrz, np., Publikacja Mi edzynarodowa nr WO 00/56358); (8) po laczenia 3dMPL z, na przyk lad, QS21 i/lub emulsj a olej w wodzie (patrz., np., EPA 0835318; EPA 0735898; EPA 0761231); (9) eter polioksoetylenowy lub ester polioksoetylenowy (patrz, np., Publikacja Mi edzynarodowa nr WO 99/52549): (10) saponina i immunostymulujacy oligonukleotyd taki jak CpG oligonukleotyd (patrz, np., Publikacja Mi edzynarodowa nr WO 99/11241; (13) samonina (np., QS21)+3dMPL+IL-12 (ewentualnie + sterol)(patrz, np., Publikacja Mi edzynarodowa nr WO 98/57659);PL 203 526 B1 18 i (14) inne substancje, które dzia laj a jako czynniki immunostymuluj ace dla zwi ekszenia skuteczno sci kompozycji. Peptydy muramylowe zawieraj a, lecz nie s a ograniczone do: N-acetylo-muramylo-L-treonylo-D- -izoglutaminy (thr-MDP), N-acetylo-normuranylo-L-alanylo-D-izoglutaminianu (nor-MDP), -acetylmura- mylo-L-alanylo-D-izoglutaminylo-L-alanino-2-(1'-2'-dipamitoilo-sn-glicero-3-hydroksyfosforyloksy)-ety- loaminy (MTP-PE), itp. Typowo, kompozycje szczepionki s a przygotowywane jako nadaj ace si e do wstrzykniec, zarów- no jako roztwór p lynny lub zawiesina; mog a by c tak ze przygotowywane postacie sta le odpowiednie do rozpuszczania lub zawieszania w no sniku ciek lym przed wstrzykni eciem. Szczepionki b ed a zawiera ly terapeutycznie skuteczn a ilo sc kompleksów E1E2 i ka zdy inny z powy zej wspomnianych komponentów, je sli potrzeba. Przez „skuteczna terapeutycznie ilo sc" rozumie si e ilo sc bia lka E1E2 jaka b edzie indukowa c odpowied z immunologiczn a, korzystnie za- bezpieczaj ac a odpowied z immunologiczn a, w osobnikach którym jest podana. Taka odpowied z b edzie ogólnie powodowa la rozwój u osobnika wydzielniczej, komórkowej i/lub zwi azanej z prze- ciwcia lem odpowiedzi immunologicznej na t a szczepionk e. Zwykle, taka odpowied z obejmuje lecz nie jest ograniczona jednego do lub wi ecej takich efektów jak: produkcja przeciwcia l z jednej z immunologicznych klas, takie jak immunoglobuliny A, D, E, G lub M; proliferacj e limfocytów B i T; zabezpieczenia aktywacji, sygna lów wzrostu i ró znicowania do komórek immunologicznych; rozprzestrzenienia si e populacji komórek pomocniczych T; supresorowych komórek T, i/lub popu- lacji cytotoksycznych komórek T i/lub komórek ?d. Raz wytworzone, szczepionki s a konwencjonalnie podawane pozajetitowo, np., przez wstrzyk- ni ecie, albo podskórne lub sródmi esniowe. Ponadto do innych trybów podawania nale za preparaty doustne lub preparaty do-p lucne, czopki i podania sródskórne. Traktowanie dawkowaniem mo ze by c harmonogramem jedno-dawkowym lub wielo-dawkowym. Korzystnie, skuteczna ilo sc jest wystarcza- jaca do wyleczenia z objawów lub zapobie zenia objawom. Dok ladna ilo sc konieczna b edzie si e ró zni c w zale zno sci od podmiotu jaki jest leczony; wieku i ogólnego stanu osobnika leczonego; wydolno sci uk ladu immunologicznego osobnika do syntezy przeciwcia l; stopnia zadanej ochrony; ciezko sci stanu jaki jest leczony; okre slonego wybranego polipeptydu E1E2 i jego trybu podawania, po sród innych czynników. W la sciwa skuteczna ilosc mo ze by c latwo oznaczona przez fachowca w tej dziedzinie. Ilosc „skuteczna terapeutycznie" mie sci si e w zakresie wzgl ednie szerokim jaki mo ze by c oznaczony w rutynowym post epowaniu stosuj ac znane w stanie techniki modele in vivo i in vitro. Ilosc polipepty- dów E1E2 stosowane w poni zszych przyk ladach dostarcza generalnej wskazówki, które mog a by c zastosowane do optymalizacji wywo lania przeciwcia l anty-E1, anty-E2 i/lub anty-E1E2. Zw laszcza kompleks E1E2 jest korzystnie wstrzykiwany sródmiesniowo du zym ssakom, takim jak naczelne, na przyk lad, pawiany, szympansy, lub ludzie, w dawce w przybli zeniu 0,1 µg do oko lo 5,0 mg na dawk e, lub jak akolwiek inn a ilosc pomi edzy stwierdzonymi zakresami takim jak 5 µg do oko lo 1,0 mg, 1 µg do oko lo 500 µg, 2,5 µg do oko lo 250 µg, 4 µg do oko lo 200 µg, takimi jak 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10... 20... 30...40... 50... 60... 70... 80... 90... 100 itp., µg na dawk e. Polipeptydy E1E2 mog a by c podawane ssakom nie zaka zonym albo zaka zonym HCV ssakom. Podawanie polipeptydów E1E2 mo ze wywo lywa c anty-E1, anty E2 i/lub anty E1E2 miano u ssaków, które utrzymuje si e przez 1 tydzie n, 2 tygodnie, 2 miesi ace, 3 miesi ace, 4 miesi ace, 6 miesi ecy, 1 rok i d lu zej. Polipeptydy E1E2 mog a tak ze by c podawane w celu dostarczenia pa- mi eci odpowiedzi. Je sli tak a odpowied z uzyska si e, miano przeciwcia la mo ze spa sc w czasie, jakkolwiek ekspozycja na wirus HCV lub immunogen powoduje szybk a indukcj e przeciwcia l, np., w ci agu tylko kilku dni. Ewentualnie, miano przeciwcia l mo ze by c utrzymane u ssaków przez do- starczenie jednego lub wi ecej wstrzykni ec dawki przypominaj acej polipeptydów E1E2 w 2 tygo- dnie, 1 miesi ac, 2 miesi ace, 3 miesi ace, 4 miesi ace, 5 miesi ecy, 6 miesi ecy, 1 roku lub wi ecej po pierwszym wstrzykni eciu. Korzystnie, polipeptyd E1E2 wywo luje miano przeciwcia la 10, 100, 150, 175, 200, 300, 400, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 3000, 5000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000 (geometryczna srednia miana), lub wy zsze, lub ka zd a liczb e pomi edzy stwierdzonym mianem jak oznaczano stosuj ac stan- dardowy immunotest, taki jak immunotest opisany w poni zej przedstawionych przyk ladach. Patrz, np., Chien i wsp., Lancet (1993) 342:933; i Chien i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:10011. Submikronowe emulsje olej w wodzie Jak wyja sniono powy zej, submikronowy preparat emulsja olej w wodzie moze tak ze by c poda- wany kr egowcom, przed, podczas, lub po dostarczeniu antygenu E1E2. Submikronowe emulsje olejPL 203 526 B1 19 w wodzie do niniejszego zastosowania zawieraj a nie toksyczne podlegaj ace metabolizowaniu oleje i handlowe emulgatory. Przyk lady nie toksycznych daj acych si e metabolizowa c olei obejmuj a, nie b ed ac ograniczone do, olei rybich, olei zwierz ecych lub syntetycznie sporz adzanych olei. Preferowane s a oleje rybie, takie jak olej z w atroby dorsza, olej z w atroby rekina i oleje wielorybie, z szczególnie korzystnym skwalenem, 2,6,10,15,19,23-heksametylo-2,6,10,14,18,22-tetrakosaheksanem, znajdo- wanym w w atrobie rekina. Olejowe sk ladniki b ed a obecne w ilo sci od 0,5% do oko lo 20% obj eto scio- wo, korzystnie w ilo sci oko lo do 15%, bardziej korzystnie w ilo sci od oko lo 1% do oko lo 12% i najko- rzystniej od 1% do oko lo 4% oleju. Wodna cz esc adiuwanta mo ze by c buforowan a sol a lub nieska zon a wod a. Poniewa z kompozy- cje te s a przeznaczone do podawania pozajelitowego, korzystnym jest wykonanie ostatecznych roz- tworów tak ze tonicznosc, to znaczy osmolalno sc jest zasadniczo taka sama jak normalnych p lynów fizjologicznych w celu zapobie zenia post-wstrzykni eciowemu obrz ekowi lub szybkiej absorbcji tej kom- pozycji spowodowanych ró znym st ezeniom jonów pomi edzy kompozycj a i p lynami fizjologicznymi. Je sli sól jest u zywana raczej ni z woda, korzystnie sól buforuje si e w celu utrzymania dopasowanego do normalnych warunków fizjologicznych pH. Tak ze w pewnych warunkach, koniecznym mo ze by c utrzymanie pH na odpowiednim poziomie w celu zapewnienia stabilnosci pewnych sk ladników kom- pozycji. Tak wi ec, pH tej kompozycji b edzie generalnie pH 6-8 i mo ze by c utrzymane stosuj ac jakikol- wiek fizjologicznie akceptowalny bufor, taki jak: fosforanowy, octanowy, dwuw eglanowy lub w eglano- wy itp. Ilo sc czynnika wodnego obecnie b edzie generalnie ilo scia konieczn a do doprowadzenia kom- pozycji do po zadanej obj eto sci ko ncowej. Czynniki emulguj ace odpowiednie do zastosowania w emulsji olej w wodzie zawieraj a bez ograniczenia, oparty o sorbitan nie jonowy srodek powierzchniowo czynny taki jak sorbitan mono-, di-, lub triestrowy, na przyk lad, taki jak dost epny handlowo pod nazw a Span™ lub Arlacel™ lub Span™85 (sorbitan trójoleinianowy); mono-, di-, lub trójester polioksoetylenosorbitanu znany pod nazw a handlo- w a Tween™, taki jak Tween 80™ (monooleinian polioksyetylenosorbitanu); kwasy t luszczowe poliok- syetylenu dost epne pod nazw a Myrj™; etery kwasu t luszczowego polioksyetylenu pochodzace z lau- rylu, acetylu, starylu i alkoholi olejowych, takich jak te znanych pod nazw a Brij™; i tym podobne. Sub- stancje te s a latwo dost epne z wielu zróde l handlowych, w lacznie z Sigma, St. Louis, MO i ICI Ame- rica's Inc., Wilmington, DE. Te czynniki emulguj ace mog a by c u zyte same albo w po laczeniu. Czynnik emulguj acy b edzie zwykle obecny w ilo sci 0,02% do oko lo 2,5% wagowych (w/v), korzystnie 0,05% do oko lo 1% i najbardziej korzystnie 0,01% do oko lo 0,5. Ilo sc obecna b edzie generalnie wynosi la oko lo 20-30% ciezaru u zytego oleju. Emulsje te mog a tak ze zawiera c inne czynniki immunostymuluj ace, takie jak peptydy muramy- lowe, w laczaj ac ale nie ograniczaj ac do, N-acetylo-muramylo-L-treonylo-D-izoglutaminy (thr-MDP), N-acetylo-normuramylo-L-alanylo-D-izoglutaminianu (nor-MDP), N-acetylomuramylo-L-alanylo-D-izo- glutaminylo-L-alanino-2-(1'-2'-dipalmtoilo-sn-glicero-3-hydroksyfoforylooksy)-etylaminy (MTP-PE), itp. Immunostymuluj ace sk ladniki bakteryjnej sciany komórkowej, takie jak monofosforolipid A (MPL), dimikolan trehalozy (TDM), i skeleton sciany komórkowej (CWS), mo ze tak ze by c obecny. Alternatyw- nie, emulsja mo ze by c wolna od czynników takich jak MPT-PE. Ta submikronowa emulsja olej w wo- dzie wed lug wynalazku mo ze by c pozbawiona jakichkolwiek kopolimerów blokowych polioksypropyle- no-poloksyetylen (POP-POE). W celu opisania ró znych odpowiednich preparatów submikronowej emulsji olej w wodzie do zastosowania w niniejszym wynalazku, jak te z czynników immunostymuluj a- cych patrz np., Mi edzynarodowa Publikacja nr WO 90/14837; Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 19 wydanie, 1995; Van Nest i wsp., „Advanced adjuvant formulations for use with recombinant subunit vaccines", In Vaccines 92, Modern Approaches to New Vaccines (Brown i wsp., wyd.) Cold Spring Harbor Laboratory Press, str., 57-62 (1992); Ott i wsp., "MF59-Design and Evaluation of a Safe and Potent Adjuvant for Human Vaccines" w Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (Powell, M.F. i Newman, M.J. wyd.) Plenum Press, New York (1995) str. 277-296; i patent St. Zjedn. Am. nr 6,299,884. Dla wytworzenia cz astek submikronowych mo zna zastosowa c wiele technik np., cz astki mniej- sze ni z 1 mikron srednicy oraz w zakresie nanometrowym. Na przyk lad, mog a by c u zyte handlowe emulgatory, które dzia laj a na zasadzie rozwijania wysokich si l scinania przez wt laczanie p lynów przez ma le szczeliny pod wysokim ci snieniem. Przyk lady handlowych emulgatorów obejmuj a, bez ograni- czenia, Model 110Y mikrofluidyzera (Microfluidics, Newton, MA), Gaulin Model 30 CD (Gaulin, Inc., Everett, MA) i Rainnie Minilab Type 8.30H (Miro Atomizer Food and Dairy, Inc., Hudson, WI). W la sci- we ci snienie do zastosowania z indywidualnym emulgatorem jest latwe do okre slenia przez fachowcaPL 203 526 B1 20 w tej dziedzinie. Na przyk lad, gdy stosuje si e Model 110Y mikrofluidyzera dzia lanie przy 5000 do 30000 psi produkuje kropelki oleju o srednicach oko lo 100 do 750 nm. Rozmiar kropelek oleju mo ze waha c si e przez zmienianie stosunku detergentu do oleju (podno- szenie stosunku zmniejsza rozmiar kropelek), ci snienie robocze (podwy zszenie ci snienia roboczego zmniejsza rozmiar kropelki), temperatura (wzrost temperatury obni za rozmiar kropelek) i dodawanie amfipatycznego czynnika immunostymulujacego (dodanie takich czynników obni za rozmiar kropelek). Aktualny rozmiar kropelek bedzie waha l si e w zale zno sci od poszczególnego detergentu, oleju i czyn- nika immunostymuluj acego (je sli w ogóle) i od wybranych szczególnych czynników roboczych. Roz- miar kropli mo ze by c sprawdzany przez zastosowanie instrumentów sortuj acych, takich jak handlowy Sub-Micron Particie Analyzer (Model N4MD) wytwarzany przez Coulter Corporation i parametry te mog a ró zni c si e stosuj ac wskazówki przedstawione powy zej a z zasadniczo wszystkie kropelki b ed a mniejsze ni z 1 mikron srednicy, korzystnie mniej ni z 0,8 mikronów srednicy i najbardziej korzystnie mniej ni z oko lo 0,5 mikronów srednicy. Przez „zasadniczo wszystkie" jest rozumiane co najmniej okolo 80% (liczbowo), korzystnie co najmniej 90%, bardziej korzystnie co najmniej oko lo 95% i najkorzyst- niej co najmniej oko lo 98%. Rozk lad rozmiaru cz astek jest typowo Gausowski, tak ze srednia srednicy jest mniejsza ni z stwierdzone limity. Szczególnie korzystnymi emulsjami submikronowymi olej w wodzie do stosowania tutaj s a emulsje skwalen/woda ewentualnie zawieraj ace ró zne ilo sci MPT-PE, takie jak emulsje submikro- nowe olej w wodzie zawieraj ace 4-5% w/v skwalenu, 0,25-1,0% w/v Tween™ (polioksoetyleno- sorbitan monooleinianou) i/lub 0,25-1,0% Span85™ (sorbitan trójoleinianu) i ewentualnie, N-ace- tylomuramylo-L-alanylo-D-izoglutaminylo-L-alanino-2-(1'-2'-dipalmitoilo-sn-glicero-3-hydroksyfos- foryloksy)-etyloamina (MPT-PE), na przyk lad, submikronowa emulsja olej w wodzie znana jako MF59 (Publikacja Mi edzynarodowa nr WO 90/14837; patent St. Zjedn. Am. nr 6,299,844 i Ott i wsp., „MF59-design and Evaluation of a Safe and Potent Adjuvant for Human Vaccines" w Vac- cine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (Powell, M.F. i Newman, M.J. wyd.) Plenum Press, New York, 1995, str 277-296). MF59 zawiera 4-5% w/v Skwalenu (np. 4,3%), 0,25-0,5% w/v Tween 80™ i 0,5% w/v Span 85™ i ewentualnie zawiera ró zne ilo sci MTP-PE, utworzona w postaci submikronowych cz astek stosuj ac mikrofluidyzator taki jak mikrofluidyzator Model 110Y (Microfluidics, Newton, MA). Na przyk lad, MTP-PE mo ze by c obecny w ilo sci oko lo 0-500 µg/dawk e, bardziej korzystnie 0-250 µg/dawk e i najbardziej korzystnie 0-100 µg/dawk e. Tak jak stosuje si e tutaj, termin „MF59-0" odnosi si e do powy zszej emulsji olej w wodzie bez MTP-PE, podczas gdy termin MF59-MTP oznacza preparat zawieraj acy MTP-PE. Na przyk lad, „MF59-100" zawiera 100 µg MTP-PE na dawk e i tak dalej. MF69, inna submikronowa emulsja olej w wodzie do zastosowania tutaj, zawiera 4,4% w/v skwalenu, 0,25% w/v Tween 80™ i 0,75% w/v Spam85™ i ewentualnie MTP-PE. Jeszcze inna submikronowa emulsja olej w wodzie jest MF75, znana tak ze jako SAF, zawieraj aca 10% skwalenu, 0,4% Tween 80™, 5% pluronik-polimer blo- kowy L121 i thr-MDP, tak ze mikrofluidyzowane do emulsji submikronowej. MF75-MTP oznacza preparat MF75, który zawiera MTP, taki jak z 100-400 µg MTP-PT na dawk e. Submikronowa emulsja olej w wodzie, sposoby wytwarzania jej i czynniki immunostymuluj ace takie jak peptydy muramylowe, do zastosowania w tej kompozycji s a opisane w Publikacji Mi edzyna- rodowej nr WO 90/14837. Utworzon a w ten sposób submikronowa emulsj e olej w wodzie mo zna podawa c kr egowcom, przed, w tym samym czasie, lub po dostarczeniu antygenu i ISS, je sli taki stosuje si e. Je zeli podawa- na jest przed immunizacj a z antygenem, to preparat adiuwanta mo ze by c podany na 5-10 dni przed immunizacj a, korzystnie 3-5 dni przed immunizacj a i najbardziej korzystnie 1-3 dni lub 2 dni przed immunizacj a antygenem b ed acym przedmiotem zainteresowania. Je zeli podaje si e osobno, preparat submikronowej emulsji olej w wodzie mo ze by c dostarczany albo do tego samego miejsca co dostar- czone by ly kompozycje antygenowe lub do innego miejsca. Je sli pozadane jest dostarczanie jednoczesne, preparat submikronowej emulsji olej w wodzie mo ze by c wlaczony do kompozycji antygenu. Generalnie, antygeny i submikronowa emulsja olej w wodzie mo ze by c laczona przez proste polaczenie, zmieszanie lub wytrz asanie. Inne techniki takie jak szybkie przeciskanie mieszaniny tych dwóch sk ladników przez ma le otwory (takie jak ig ly podskór- ne) mo ze by c tak ze stosowane do otrzymania kompozycji szczepionek. Je sli kompozycja jest laczona, to ró zne sk ladniki kompozycji mog a by c obecne w szerokim za- kresie proporcji. Na przyk lad, sk ladniki antygen i emulsja s a typowo stosowane w stosunku obj eto- sciowym 1:50 do 50:1, korzystnie 1:10 do 10:1, bardziej korzystnie od oko lo 1:5 do 3:1 i najbardziejPL 203 526 B1 21 korzystnie oko lo 1:1. Jednak ze, inne proporcje mog a by c bardziej odpowiednie dla specjalnych celów, takich jak wtedy, gdy szczególny antygen ma nisk a immunogeniczno sc, w którym to przypadku wy- magana jest relatywnie wi eksza ilo sc sk ladnika antygenowego. Immunostymuluj ace cz asteczki kwasu nukleinowego Uprzednio bakteryjny DNA by l opisany jako stymuluj acy odpowied z immunologiczn a u ssaków. Patrz, np., Kreig i wsp., Nature (1995) 374:546-549. Ta zdolno sc do immunostymulacji by la przypisy- wana du zej cz esto sci cz asteczek immunostymulacyjnego kwasu nukleinowego (ISS), takich jak nie metylowane dinukleotydy CpG obecne w bakteryjnym DNA. Oligonukleotydy zawieraj ace nie metylo- wane motywy CpG by ly wskazane jako indukuj ace aktywacj e komórek B, komórek NK i prezentuj a- cych antygen komórek (APC), takich jak monocyty i makrofagi. Patrz np., patent St. Zjedn. Am. nr 6,207,646. Niniejszy wynalazek wykorzystuje adiuwanty pochodz ace z ISS(ów). ISS wed lug wynalazku zawiera oligonukleotyd, który mo ze by c cz escia wi ekszego konstruktu nukleotydowego takiego jak plazmid lub bakteryjny DNA. Oligonukleotyd mo ze by c konfiguracji liniowej lub ko lowej, lub mo ze za- wiera c zarówno liniowe jak i ko lowe segmenty. Oligonukleotyd mo ze zawiera c modyfikacje takie jak, lecz nie ograniczone do, modyfikacje YOH lub 5' OH grupy, modyfikacje zasady nukleotydowej, mody- fikacji sk ladnika cukrowego i modyfikacje grupy fosforowej. ISS mo ze zawiera c rybonuklotydy (zawie- rajace ryboz e jako jedyny lub zasadniczy sk ladnik cukrowy), deoksyrybonukleotydy (zawieraj ace de- oksyryboz e jako zasadniczy sk ladnik cukrowy). Cukry modyfkowane lub analogi cukrów mog a by c w laczone w oligonukleotyd. Przyk lady cz asteczek cukru jakie mog a by c stosowane obejmuj a ryboz e, deksyryboz e, pentoz e, deoksypentoz e, glukoz e, arabinoz e, ksyloz e, liksoza i cukrowy analog grupy cyklopentylowej. Cukier ten mo ze by c w postaci piranozylu lub furanozylu. Pochodna fosforowa (lub modyfikowana grupa fosforanowa) mo ze by c stosowana i mo ze by c monofosforanem, difosforanem, trifosforanem, alkilofosforanem, alkenofosforanem, fosforotioanem, fosforoditioanem, lub podobnymi. Zasady kwasów nukleinowych jakie s a wbudowywane w zasad e oligonukleotydow a ISS mog a by c wyst epuj acymi naturalnie zasadami purynowymi lub pirymidynowymi, mianowicie uracylem lub tymi- dyn a, cytozyn a, adenin a i guanin a jak równie z naturalnie wyst epuj acymi lub syntetycznymi modyfika- cjami tych zasad. Ponadto, du za liczba nie naturalnych nukleozydów zawieraj acych ró zne zasady heterocykliczne i ró zne cz asteczki cukru (i analogi cukru) s a dost epne i znane fachowcom w tej dzie- dzinie. Strukturalnie, zród lem oligonukleotydu ISS jest sekwencja nukleotydowa zawieraj aca CG lub sekwencja nukleotydowa p(1C), która mo ze by c palindromowa. Przyk lady poszczególnych cz asteczek ISS do stosowania w niniejszym wynalazku obejmuj a cz asteczki CpG, CpY i CpR i tym podobne zna- ne ze stanu techniki. Korzystnymi ISS(ami) s a te, które pochodz a z rodziny cz asteczek CpG, dinukleoydów CpG i syntetycznych oligonukleotydów, które zawieraj a motywy CpG (patrz, np., Krieg i wsp., Nature (1995) 374:546 i Davis i wsp., J. Immunol. (1998) 160:870-876), takie jak którykolwiek z ró znych immunosty- mulujacych oligonukleotydów ujawnionych w patencie St. Zjedn. Am. nr 6,270,647. Takie oligonukle- otydy generalnie zawieraj a co najmniej 8 do oko lo 100 nukleotydów, korzystnie 8 do 40 nukleotydów, bardziej korzystnie 15-35 nukleotydów, korzystnie 15-25 nukleotydów i jak akolwiek liczb e nukleotydów pomi edzy tymi warto sciami. Na przyk lad, oligonukleotydy zawieraj ace motyw konsensusowy CpG, reprezentowany przez wzór 5'-X 1 CGX 2 -3', w którym X 1 i X 2 s a nuklotydami i C jest nie metylowane, znajdowa c b ed a zastosowanie jako immunostymuluj ace cz asteczki CpG. Zwykle, X 1 jest A, G lub T i X 2 jest C lub T. Inne u zyteczne cz asteczki CpG obejmuj a te obj ete wzorem 5'-X 1 X 2 CGX 3 X 4 , w którym X 1 i X 2 s a sekwencj a tak a jak GpT, GpG, GpA, ApA, ApT, ApG, CpT, CpA, CpG, TpA, TpT lub TpG i X 3 i X 4 s a TpT, CpT, ApT, ApG, CpG, TpC, ApC, CpC, TpA, ApA, GpT, CpA lub TpG, w których „p" oznacza wi azanie fosforowe. Korzystnie, oligonukleotydy nie zawieraj a sekwencji GCG przy lub blisko zako ncze n 5' i 3'. Ponadto, CpG jest korzystnie oflankowany na swoim ko ncu 5' dwiema purynami (korzystnie dwunukleotydem GpA) lub puryn a i pirymidyn a (korzystnie, GpT) i na ko ncu 3' oflankowa- ny dwiema pirymidynami, korzystnie dinuklotydem TpT lub TpC. Zatem, korzystne cz asteczki b ed a zawiera ly sekwencj e GACGTT, GACGTC, GTCGTT lub GTCGCT i sekwencje te b ed a oflankowane przez wiele dodatkowych nukleotydów, takich jak 1-20 lub wi ecej nukleotydów, korzystnie 2-10 nu- kleotydów i bardziej korzystnie 3 do 5 nukleotydów, lub ka zd a liczb e ca lkowit a pomi edzy tak stwier- dzonym zakresem. Nukleotydy poza centralnym obszarem rdzenia okaza ly si e bardzo podatne na zmian e.PL 203 526 B1 22 Ponadto, oligonukleotydy CpG do zastosowania tutaj mog a by c jedno- lub dwuniciowe. Dwuni- ciowe cz asteczki s a bardziej stabilne in vivo podczas, gdy jednoniciowe cz asteczki wykazuj a zwi ek- szon a aktywno sc immunologiczn a. Ponadto, szkielet fosforanowy mo ze by c modyfikowany, jak mody- fikowany fosforoditioanowo, w celu zwi ekszenia aktywno sci cz asteczki CpG. Jak opisano w patencie St. Zjedn. Am. nr 6,207,646, cz asteczki CpG z szkieletami fosforotioanowymi preferencyjnie aktywuj a komórki monocytów (makrofagi, komórki dendrytyczne i monocyty) i komórki NK. Przyk ladowe oligonukleotydy CpG do stosowania w niniejszych kompozycjach obejmuj a cz a- steczki z sekwencj a 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3' (SEQ ID nr: 1) i 5'-TCGTCGTTTTGTCG- TTTTGTCGTT-3' (SEQ ID nr: 5). Cz asteczki ISS mog a latwo by c testowane na ich zdolno sc do stymulowania odpowiedzi immu- nologicznej stosuj ac techniki standardowe, dobrze znane ze stanu techniki. Na przyk lad, zdolno sc cz asteczki do stymulowania humoralnej i/lub komórkowej odpowiedzi immunologicznej jest latwo oznaczy c stosuj ac immunotesty opisane powy zej. Ponadto, antygen i kompozycje submikronowej emulsji olej w wodzie mog a by c podawane z lub bez ISS w celu okre slenia czy odpowied z immunolo- giczna jest podwy zszona. Jak wyja sniono powy zej, ISS mo ze by c podawany albo przed, równocze snie lub po dostarcze- niu antygenu i/lub submikronowej emulsji olej w wodzie. Je zeli podawany jest przed immunizacj a an- tygenem i/lub submikronow a emulsj a olej w wodzie, ISS mo ze by c podawany na 5-10 dni przed im- munizacj a, korzystnie 3-5 dni przed immunizacj a i najbardziej korzystnie 1-3 dni lub 2 dni przed immu- nizacj a. Je sli jest podawany osobno, ISS mo ze by c dostarczany albo w to samo miejsce dostarczania co kompozycje antygenowe lub w inne miejsce dostarczania. Je sli dostarczenie jednoczesne jest po- zadane, ISS mo ze by c w laczony do kompozycji antygenowych. Generalnie b edzie si e stosowa lo oko lo 5 µg do 5000 µg ISS, bardziej ogólnie 5 µg do oko lo 1000, korzystnie 5 µg do oko lo 500 µg, lub od 1 do 100 µg, korzystnie oko lo 5 do oko lo 50 µg, ko- rzystnie w niniejszych sposobach znajdzie zastosowanie 5 do oko lo 30 µg, lub jakakolwiek ilo sc w tych granicach, ISS na dawk e. III. Do swiadczenia Poni zej znajduj a si e przyk lady specyficznych postaci przeprowadzenia niniejszego wynalazku. Przyk lady te s a zaproponowane tylko dla celów ilustracyjnych a nie z zamiarem ograniczenia zakresu niniejszego wynalazku. Do lo zono stara n w celu zapewnienia dok ladno sci co do stosowanych liczb (np., ilo sci, tempera- tury, itp.), lecz dopuszcza si e oczywi scie pewne b ledy do swiadczalne i odchylenia. P r z y k l a d 1 Wytwarzanie E1E2 HCV Kompleks E1E2 HCV do stosowania w niniejszych kompozycjach szczepionek by l przygotowa- ny jako bia lko fuzyjne w sposób nast epuj acy. W szczególno sci, ssaczy plazmid ekspresyjny pMH- E1E2-809 (Figura 3) koduje bia lko fuzyjne E1E2, które zawiera aminokwasy 192-809 HCV-1 (patrz, Choo i wsp., Proc, Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:2451-2455). Sekwencja cz asteczek E1E2 809 jest pokazana na Figurach 2A-2C. Komórki jajnika chomika mongolskiego (CHO) stosowane by ly do wyra zania sekwencji E1E2 HCV z pMH-E1E2-809. Zw laszcza, stosowane by ly komórki CHO DG44. Komórki te opisa- ne przez Uraub i wsp., Proc Natl. Acad. Sci USA (1980) 77:4216-4220, pobierano z komórek CHO K-1 i powodowano, ze by ly one pozbawione reduktazy dihydrofolianu (dhfr) z racji podwójnej de- lecji w genie dhfr. Komórki DG44 transfekowano pMH-E1E2-809. Transfekowane komórki ros ly w selektywnym medium takim, ze tylko te komórki z ekspresj a genu dhfr mog ly rosnac (Sambrook i wsp., jak wy zej). Izolowane kolonie CHO by ly pobierane (~800 kolonii) do indywidualnych studzienek na 96-stu- dzienkowych p lytkach. Z oryginalnych 96-studzienkowych p lytek, tworzono powtórzenia dla przepro- wadzenia do swiadcze n ekspresji. Powtórzeniowe p lytki hodowano a z komórki wytworzy ly zlan a mo- nowarstw e. Komórki te by ly przyczepione do scian p lytki i czynione przenikalnymi stosuj ac zimny me- tanol. 3D5C3, przeciwcia lo monoklonalne przeciwko E1E2 i 3E5-1 monoklonalne przeciwcia lo prze- ciwko E2 stosowano dla zbadania przyczepionych komórek. Po dodaniu anty-mysiego koniugatu HRP a nast epnie substratu, linie komórkowe z najwi eksz a ekspresj a by ly oznaczane. Nast epnie linie ko- mórkowe o najwi ekszej ekspresji przenoszono na grup e 24-studzienkowych p lytek. Prób e ekspresji powtórzono i ponownie linie komórkow a z najwy zsz a ekspresj a przenoszono do studzienek o wi ekszej obj eto sci. Powtarzano to a z linie komórkowe o najwy zszej ekspresji zosta ly przeniesione z 6-stu-PL 203 526 B1 23 dzienkowych p lytek do s loi do hodowli tkankowych. Od tego momentu ilo sc komórek by la wystarcza- jaca pozwalaj ac na precyzyjne liczenie i zebranie komórek oraz wykonanie ilo sciowego testu ekspre- sji. Na ekstraktach komórek przeprowadzono test ELISA (Speate i wsp., Virol. (1992) 188:819-830) w celu oznaczenia wysoko sci ekspresji. P r z y k l a d 2 Oczyszczanie E1E2 HCV Po ekspresji, komórki CHO poddawano lizie i wytworzony wewn atrzkomórkowo E1E2 809 oczyszczano chromatografi a powinowactwa GNA-lektyna (etap GNA), a nast epnie na kolumnie hy- droksyapatytowej (HAP) (etap HAP), przez s aczenie przez membran e (etap DV50), chromatografi a kolumnow a SP Sepharose HP (etap SP), s aczeniem przez membran e Q (etap Q) i chromatografi e kolumnow a G25 Sephadex (etap G25). Na ko ncu ka zdego przeprowadzanego etapu, porcja produktu by la s aczona przez s aczek 0,2 µ i przechowywany w 2-8°C lub przetwarzany natychmiast w nast ep- nym etapie oczyszczania. Na zako nczenie procesu oczyszczania, antygen by l s aczony przez s aczek 0,2 µm i zamra zany i przechowywany w zamro zeniu przy -60°C, lub ni zszej, a z do s aczenia przy two- rzeniu preparatu. Szczegó lowo, w celu przeprowadzenia lizy komórek, dwie obj eto sci sch lodzonego buforu do lizy (1% Tryton X-100 w 100 mM Tris, pH8 i 1 mM EDTA) dodawano do komórek CHO w 2-8°C. Mieszanin e wirowano przy 5000 rpm przez 45 minut w 2-8°C dla usuni ecia zanieczysz- cze n. Supernatant zbierano i s aczono przez filtr wst epny Sartopure Sartorias 0,65 µm (Sartorius) a nast epnie filtr wst epny Sartofine Sartorias 0,65 mm, po czym przez Sartobran filtr Sartorius 0,45 µm i Sartobran filtr 0,2 µm. Przes aczone lizaty trzymano na lodzie przed na lo zeniem na ko- lumn e GNA. Kolumna agarozowa GNA (1885 ml, 200x600, Vector Labs, Burlingame, CA) przed za ladowa- niem by la wst epnie równowa zona o smioma objeto sciami kolumny buforem do równowa zenia (25 mM NaPO 4 , 1,0 M NaCl, 12% Triton X-100, pH 6,8). Lizat nak ladano na kolumn e przy 31,4 ml/min (6 cm/godzin e) przez noc. Kolumn e myto 4 obj eto sciami z lo za buforem do równowa zenia, a nast epnie myto 5 obj eto sciami z lo za 10 mM NaPO 4 , 80 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, pH 6,8. Produkt eluowano 1M metylo- a-D-mannopiranozydem (MMP), 10 mM NaPO 4 , 80 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, pH 6,8. Szczyt elucji, o obj eto sci oko lo 1 kolumny zbierano, s aczono przez s aczek 0,2 µm i przechowywano w -60°C lub ni zszej do chromatografii HAP. Chromatografia HAP prowadzona by la w temperaturze pokojowej. 1200 ml ceramiczn a kolum- n e hydroksyapatytow a typu I (100x150 mm) (BioRad) kondycjonowano jedn a obj eto scia kolumny 0,4 M NaPO 4 , pH 6,8, nast epnie równowa zono co najmniej 10 obj eto sciami, 10 mM NaPO 4 , 80 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, pH 6,8. Cztery partie pul eluatu GNA rozmrazano w obiegowej k apieli wod- nej przy nie mniej ni z 30°C, 0,2 µm przes aczano i nak ladano na zrównowa zon a kolumn e przy 131 ml/min (100 cm/godzin e). Bufor do równowa zenia HAP by l na lozony na kolumn e jako bufor ra- mowy po za ladowaniu. Przes acz by l zbierany kiedy UV wzros lo powy zej linii podstawowej. Zbieranie produktu zatrzymywano kiedy obj eto sc zebranego produktu zbli za la si e do obj eto sci ladunku plus 75% obj eto sci kolumny. Pula przes aczu HAP by la nast epnie poddawana filtracyjnej redukcji wirusów za pomoc a DV50. S aczenie DV50 przeprowadzano w temperaturze pokojowej. Ladunek DV50 by l sporz adzany przez dwukrotne rozcie nczenie porcji HAP i doprowadzenie do 0,15% Triton X-100, 1 mM EDTA, pH 5,3. Rozcie nczanie i nastawienie uzyskano przez dodanie Dilution Buffer-1 (3 mM kwas cytrynowy, 2 mM EDTA, 0,2 % Triton X-100) w celu doprowadzenia pH porcji produktu do 5,3, nast epnie przez dodanie Dilution Buffer-2 (2 mM EDTA, 0,2% Triton X-100, pH 5,3) do uzyskania, w stosunku do ory- ginalnej obj eto sci puli HAP, obj eto sci ko ncowej 2-krotnej. Rozcie nczona i nastawiona porcja HAP (DV50 Ladunek) by la s aczona przez 10 calowy kase- towy membranowy Pall Ultipor VF DV50 (Pall). Obudowa filtru by la sk ladana razem z wk ladem filtru, zwil zana wod a i sterylizowana w autoklawie w 123°C przez 60 minut i powoli usuwana przed u zyciem. Filtr by l nast epnie zwil zany buforem do równowa zenia SP (cytrynian sodowy 10 mM, 1 mM EDTA, 0,15% Triton X-100, pH 5,3), i osuszany przed na lo zeniem DV50 pod ci snieniem nie wi ekszym ni z 45 psi. ladunek DV50 by l nast epnie nanoszony z szybko sci a przep lywu oko lo 800 ml/min pod ci snie- niem przezb lonowym oko lo 30 psi. Filtrat by l zbierany i przechowywany w 2-8°C przez noc i u zywany w etapie SP. Chromatografia SP prowadzona by la w temperaturze pokojowej. Kolumn e 88-militrowa (50x45 mm) SP Sepharoza HP (Pharmacia, Peapack, NJ) równowa zono 15 obj eto sciami kolumnyPL 203 526 B1 24 buforem do równowa zenia (10 mM cytrynian sodu, 1 mM EDTA, 0,15% Triton X-100, pH 5,3). Filtrat DV50 by l naniesiony na kolumn e. Kolumn e p lukano najpierw 5 obj eto sciami kolumny buforem do rów- nowa zenia a nast epnie 20 obj eto sciami kolumny buforem do p lukania zawieraj acym 10 mM cytrynian sodu, 15 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1 Tween-80™, pH 6,0. Produkt wymywano z kolumny 10 mM cy- trynianem sodu, 180 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% Tween-80™, pH 6,0. Ca lkowity szczyt absorpcji przy 280 nm by l zbierany jako porcja produktu. Porcja produktu by la przechowywana w 2-8°C przez noc i stosowana w etapie s aczenia przez membran e Q. Etap s aczenia przez membran e Q by l prowadzony w temperaturze pokojowej. Dwie steryli- zowane membrany dyskowate Sartorius Q100X by ly laczone w seri e. Membrany równowa zono za pomoc a nie mniej ni z 300 ml buforu do równowa zenia Q (10 mM cytrynian sodowy, 180 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% Tween 80™, pH 6,0). Ca la porcj e eluatu SP s aczono przez zrównowa zone membrany Q przy szybko sci przep lywu 30-100 ml/min, a nast epnie przep lukano strumieniem 40 ml buforu Q do równowa zenia. Filtrat i odp luk by ly zbierane i laczone jako porcja produktu i stosowane w etapie G25. Etap G25 by l przeprowadzany w temperaturze pokojowej. Kolumna 1115-mililitrowa (100x142) Pharmacia Sephadex G-25 (Pharmacia, Peapack, NJ) by la równowa zona nie mniej ni z pi ecioma obj eto sciami kolumny buforem do opracowywania (10 mM cytrynian sodu, 270 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% Tween 80™, pH 6,0). Porcja filtratu Q by la nak ladana na kolumn e i przes acz z kolumny zbierano, filtrowano przez filtr 0,22 µm (Millipore) i przechowywano zamro zony w -60°C, a z do zastosowania. P r z y k l a d 3 Immunogeniczno sc kompozycji szczepionki E1E2 HCV u myszy Immunogeniczno sc E1E2 809 HCV wytworzonej i oczyszczonej jak pisano powy zej, w po laczeniu z submikronow a emulsj a olej w wodzie i/lub oligonukleotydem CpG oznaczano nast epuj aco. Preparaty uzywane w tych badaniach s a podsumowane w Tabeli 1. Submikronowa emulsja olej w wodzie MF59, która zawiera 4-5% skwalenu, 0,5% w/v Tween 80™, 0,5% Span 85™, by la wytwo- rzona jak opisano poprzednio. Patrz, Publikacja Mi edzynarodowa WO 90/14837, patent St. Zjedn. Am. nr 6,299,884 i Ott i wsp., „MF59-Design and Evaluation of a Safe Adjuvant for Human Vaccines" w Vaccine Design: The subunit and Adjuvant Approach (Powell, M.F. and Newman, M.J. wyd.) Ple- num Press, New York, 1995, str. 277-296. Dla grup 4 i 9 u zyto cztery razy ilo sci MF59. U zywany w tych badaniach MF59 by l MF59-0 i nie zawiera l zadnych MTP-PE. Preparaty uzyte dla grup 1, 3, 6 i 8 tak ze zawiera ly 25 µg aktywnej cz asteczki CpG na dawk e. Sekwencja u zytej aktywnej cz asteczki CpG by la nast epuj aca: 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3' (SEQ ID NO: 1). Preparaty uzyte dla grupy 5 zawiera ly 25 µg nieaktywnej cz asteczki CpG na dawk e. Sekwencja u zytej nieaktywnej cz asteczki CpG by la nast epuj aca: 5'-TCCAGGACTTCTCTCAGGTT-3' (SEQ ID NO: 2). Preparaty zastosowane dla grup 1-4 zawiera ly 2,8 µg antygenu E1E2 809 HCV na dawk e, wytwo- rzonego jak opisano powy zej. Preparaty u zyte dla grup 5-9 zawiera ly 2,0 µg na dawk e E2 715 HCV, skrócone bia lko E2, wytwo- rzone w komórkach CHO, jak opisano w patencie St. Zjedn. Am. nr 6,12,020. Sze sciotygodniowe myszy Balb/C podzielono na 9 grup (10 myszy na grup e) i podawano szczepionk e kompozycji sródmi esniowo 50 µl z komponentami wymienionymi w Tabeli 1. Zwierz eta by ly odciazane 30 i 90 dnia po wst epnym wstrzykni eciu. Surowic e zbierano 14 dni po ostatnim wstrzyknieciu i miano przeciwcia l anty-E1E2 i anty-E2 oznaczano w te scie immunoenzymatycznym. Patrz, Chien i wsp., Lancet (1993) 342:933. Wyniki pokazano w Tabeli 1 na Figurze 4. Jak mo zna stwierdzi c, myszy immunizowane E1E2HCV stosuj ac CpG laczony z MF59 jako adiuwantem, wytwarza ly znacz aco wy zszy (p<0,05) poziom przeciwcia l E1E2 ni z myszy immunizowane E1E2 stosuj ac tylko sam MF59 lub tylko sam 4xMF59 jako adiuwanty. Sam CpG wytwarzal poziom przeciwcia l wy zszy ni z poziom przeciwcia l tylko z MF59, jakkolwiek wy zszy nie znamiennie statystycznie. Przeciwnie, myszy immunizowane E2 715 stosuj ac MF59 i/lub CpG, wytwarza ly bardzo niski poziom przeciwcia l z odpowiedzi a mniejsz a ni z u 50% myszy. Jest to niespodziewane poniewa z pierwsze do swiadczenia z E2 715 wytwarza ly wy zsze poziomy przeciwcia l u myszy, z odpowiedzi a u wszystkich myszy testowanych.PL 203 526 B1 25 T a b e l a 1 Immunogeniczno sc E1E2 809 HCV i E2 715 przy zastosowaniu CPG i lub MF59 jako adiuwantów. Liczby w nawia- sach wskazuj a liczb e zwierz at wytwarzaj acych przeciwcia la w stosunku do zwierz at immunizowanych. Grupa Szczepionka; Adiuwant Dawka Srednia geometryczna miana przeciwcia la E1E2 EIA Srednia geometryczna miana przeciwcia la E2 EIA 1 E1E2 809 2,8, 2,8, 2,8 5,167 (10/10) ND 2 E1E2 809 ; MF59 2,8, 2,8, 2,8 2,716 (10/10) ND 3 E1E2 809 ; CpG+MF59 2,8, 2,8, 2,8 19,159 B (10/10) ND 4 E1E2 809 ; 4XMF59 2,8, 2,8, 2,8 3,335 (10/10) ND 5 E2 715 ; Kontrola CpG 2,0, 2,0, 2,0 ND 1,3 1/10) 6 E2 715 ; CpG 2,0, 2,0, 2,0 ND 3,1 (2/20) 7 E2 715 ; MF59 2,0, 2,0, 2,0 ND 6,1 (4/10) 8 E2 715 ; CpG+MF59 2,0, 2,0, 2,0 ND 26,8 (5/10) 3 E2 715 ; 4xMF59 2,0, 2,0, 2,0 ND 9,7 (4/10) P r z y k l a d 4 Immunogeniczno sc kompozycji szczepionki E1E2HCV u szympansa Immunogeniczno sc E1E2 809 HCV, wytworzonego i oczyszczonego jak opisano powy zej w po lacze- niu z submikronow a emulsj a olej w wodzie i/lub oligonukleotydem CpG oznaczano w sposób nast epuj acy. Preparaty uzyte w tych badaniach zosta ly podsumowane w Tabeli 2. MF59 i E1E2 809 s a opisa- ne powy zej. Sekwencja cz asteczki CpG zastosowanej by la 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTGGTT-3' (SEQ ID nr: 5). Szympansy podzielono na 2 grupy (5 zwierz at na grup e) i podawano sródmiesniowo kompozy- cje szczepionki z komponentami wymienionymi w Tabeli 1. Zw laszcza jedna grupa zwierz at by la im- munizowana przez 1 i 6 miesi ecy 20 µg E1E2 809 i M59 jak równie z 500 µg CpG. Próbki surowicy by ly otrzymane 14 dni po ostatniej immunizacji i miano przeciwcia l anty-E1E2 oznaczano w enzymatycznych immunotestach. Szczegó lowo, antygen E1E2 by l na lozony na polisty- renowe p lytki do mikromianowania i zwi azane przeciwcia lo oznaczano anty-ludzkim przeciwcia lem skoniugowanym z HRP a nast epnie przez rozwini ecie w substracie tetrametylobenzydyny. Jak mo zna zauwa zy c w Tabeli 2, szympansy immunizowane E1E2HCV stosuj ac CpG po laczo- ne z MF59 jako adiuwantem, wytworzy ly znacz aco wy zszy poziom przeciwcia l E1E2(P<0,05) ni z zwie- rz eta immunizowane za pomoc a tylko MF59. T a b e l a 2 Immunogeniczno sc HCV E1E2 809 stosuj ac CPG i jako adiuwanta MF59. Szczepionka; Adiuwant Szympans E1E2EIA Miano przeciwcia la Srednia geometryczna miana przeciwcia la E1E2 Grupa 1: E1E2 809 ; CpG 1 2 3 4 5 84 101 131 421 2580 261 Grupa 2; E1E2 809 ; CpG+MF59 1 2 3 4 5 8835 2713 3201 510 1238 2713 Tak wi ec, ujawniono nowe kompozycje szczepionek i sposoby ich zastosowania. Jak wynika z powy zszego, jakkolwiek korzystne postacie niniejszego wynalazku zosta ly opisane w pewnych szczegó lach, rozumie si e, ze oczywiste odmiany mog a by c wykonane bez oddalania si e od ducha i zakresu tego wynalazku jak zdefiniowano w do laczonych zastrze zeniach.PL 203 526 B1 26PL 203 526 B1 27PL 203 526 B1 28PL 203 526 B1 29PL 203 526 B1 30PL 203 526 B1 31 PL PL PL

Claims (26)

1. Zastrze zenia patentowe 1. Kompozycja zawieraj aca antygen E1E2 wirusa zapalenia w atroby typu C (HCV) i submikro- now a emulsj e olej w wodzie pozbawion a N-acetylomuramylo-L-alanylo-D-izoglutaminylo-L-alanino-2- -(1'-2'-dipalmitoilo-sn-glicero-3-hydroksyfosforyloksy)-etylominy (MPT-PE), przy czym ta submikrono- wa emulsja olej w wodzie jest zdolna do wzmacniania odpowiedzi immunologicznej na antygen E1E2.

2. Kompozycja wed lug zastrz. 1, znamienna tym, ze antygen E1E2 zawiera sekwencj e amino- kwasów o co najmniej 80% identyczno sci sekwencji z s asiaduj ac a sekwencj a aminokwasow a przed- stawion a w pozycjach 192-809 Figur 2A-2C.

3. Kompozycja wed lug zastrz. 2, znamienna tym, ze antygen E1E2 HCV zawiera sekwencj e aminokwasów przedstawion a w pozycjach 192-809 Figur 2A-2C.

4. Kompozycja wed lug zastrz. 1, znamienna tym, ze zawiera ponadto immunostymuluj ac a se- kwencj e kwasu nukleinowego (ISS).

5. Kompozycja wed lug zastrz. 4, znamienna tym, ze ISS jest oligonukleotydem CpG.

6. Kompozycja wed lug zastrz. 5, znamienna tym, ze oligonukleotyd CpG zawiera sekwencj e 5'-X 1 X 2 CGX 3 X 4 , w której X 1 i X 2 jest sekwencj a wybran a z grupy obejmujacej GpT, GpG, GpA, ApA,PL 203 526 B1 32 ApT, ApG, CpT, CpA, CpG, TpA, TpT i TpG; i X 3 i X 4 s a wybrane z grupy stanowi acej TpT, CpT, ApT, ApG, CpG, TpC, ApC, CpC, TpA, ApA, GpT, CpA i TpG gdzie p oznacza wi azanie fosforowe.

7. Kompozycja wed lug zastrz. 5, znamienna tym, ze oligonukleotyd CpG zawiera sekwencj e GACGTT, GACGTC, GTCGTT lub GTCGCT.

8. Kompozycja wed lug zastrz. 7, znamienna tym, ze oligonukleotyd CpG zawiera sekwencj e 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3' (SEQ ID nr 1).

9. Kompozycja wed lug zastrz. 7, znamienna tym, ze CpG oligonukleotyd zawiera sekwencj e 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3' (SEQ ID NO: 5).

10. Kompozycja wed lug zastrz. 1, znamienna tym, ze submikronowa emulsja olej w wodzie zawiera: (1) podlegaj acy metabolizowaniu olej, przy czym olej ten jest obecny w ilo sci 0,5% do 20% ca l- kowitej objeto sci i (2) czynnik emulguj acy, obecny w ilo sci 0,01% do 2,5% wagowych (w/v) i przy czym olej i czyn- nik emulguj acy s a obecne w postaci submikronowej emulsji olej w wodzie posiadaj acej zasadniczo wszystkie kropelki oleju o srednicy oko lo 100 nm do mniej ni z 1 mikron.

11. Kompozycja wed lug zastrz. 10, znamienna tym, ze olej jest obecny w ilosci 1% do 12% ca l- kowitej objeto sci i czynnik emulguj acy jest obecny w ilo sci 0,01% do 1% wagowo (w/v).

12. Kompozycja wed lug zastrz. 10, znamienna tym, ze czynnik emulguj acy zawiera mono-, di- lub triester poloksyetyleno sorbitanu i/lub di- lub triester sorbitanu.

13. Kompozycja wed lug zastrz. 10, znamienna tym, ze submikronowa emulsja olej w wodzie zawiera 4-5% w/v skwalenu, 0,25-1,0% w/v monooleinianu polioksyetylenosorbitanu, i/lub 0,25-1,0% trójoleinianu sorbitanu.

14. Kompozycja wed lug zastrz. 13, znamienna tym, ze submikronowa emulsja olej w wodzie zawiera zasadniczo 5% obj eto sciowo skwalenu i jeden lub wi ecej czynników emulguj acych wybranych z grupy sk ladaj acej si e z monooleinianu polioksyetylenosorbitanu i trioleinianu sorbitanu, przy czym ca lkowita ilo sc obecnych czynników emulguj acych wynosi 1% wagowo (w/v).

15. Kompozycja wed lug zastrz. 13, znamienna tym, ze jeden lub wi ecej czynników emulguja- cych stanowi monooleinian polioksyetylenosorbitanu i trioleinian sorbitanu i ca lkowita ilo sc obecnych monooleinianu polioksyetylenosorbitanu i trioleinian sorbitanu wynosi 1% wagowo (w/v).

16. Kompozycja zawieraj aca antygen E1E2 wirusa zapalenia w atroby typu C (HCV) i immuno- stymuluj ac a sekwencj e kwasu nukleinowego (ISS), znamienna tym, ze ISS jest zdolny do zwi eksza- nia odpowiedzi immunologicznej na antygen E1E2 HCV.

17. Kompozycja wed lug zastrz. 16, znamienna tym ze, w ISS jest oligonukleatydem CpG.

18. Kompozycja wed lug zastrz. 17, znamienna tym, ze antygen E1E2 HCV zawiera sekwencj e aminokwasów o najmniej 80% identyczno sci do sekwencji do przyleg lej sekwencji aminokwasowej przedstawionej w pozycjach 192-809 Figur 2A-2C.

19. Kompozycja wed lug zastrz. 18, znamienna tym, ze antygen E1E2 HCV zawiera sekwencj e aminokwasów przedstawion a w pozycjach 192-809 Figur 2A-2C.

20. Kompozycja wed lug zastrz. 16, znamienna tym, ze oligonukleotyd CpG zawiera sekwencj e 5'-X 1 X 2 CGX 3 X 4 , w którym X 1 i X 2 s a sekwencjami wybranymi z grupy obejmuj acej GpT, GpG, GpA, ApA, ApT, ApG, CpT, CpA, CpG, TpA i TpG; i X 3 i X 4 s a wybrane z grupy obejmuj acej TpT, CpT, ApT, ApG, CpG, TpG, ApC, CpC, TpA, ApA, GpT, CpA i TpG, w którym p oznacza wi azanie fosforowe.

21. Kompozycja wed lug zastrz. 16, znamienna tym, ze oligonukleotyd CpG zawiera sekwencj e GACGTT, GACGTC, GTCGTT lub GTCGCT.

22. Kompozycja wed lug zastrz. 21, znamienna tym, ze oligonukleotyd CpG zawiera sekwencj e 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3' (SEQ ID nr 1).

23. Kompozycja wed lug zastrz. 21, znamienna tym, ze oligonukleotyd CpG zawiera sekwencj e 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3' (SEQ ID NO: 5).

24. Kompozycja zawieraj aca: (a) antygen E1E2 wirusa zapalenia w atroby typu C (HCV) zawieraj acy sekwencj e aminokwaso- w a o co najmniej 80% identyczno sci sekwencji do s asiaduj acej sekwencji aminokwasowej przedsta- wionej w pozycjach 192-809 Figur 2A-2C; (b) submikronow a emulsj e olej w wodzie zdoln a do zwi ekszania odpowiedzi immunologicznej na antygen E1E2 HCV, przy czym ta submikronowa emulsja olej w wodzie zawiera (i) podlegaj acy metabolizowaniu olej, przy czym olej ten jest obecny w ilo sci 1% do 12% ca lkowitej obj eto sci i (ii) czynnik emulguj acy, przy czym czynnik emulguj acy jest obecny w ilo sci 0,01 do 1% wagowo (w/v)PL 203 526 B1 33 i zawiera mono-, di- lub triester polioksyetyleno sorbitanu i/lub mono-, di- lub triester sorbitanu, przy czym olej i czynnik emulguj acy s a obecne w postaci emulsji olej w wodzie posiadaj acej zasadniczo wszystkie kropelki oleju o srednicy oko lo 100 nm do mniej ni z 1 mikron srednicy; i (c) oligonukleotyd CpG, który zawiera sekwencj e GACGTT, GACGTC, GTCGTT lub GTCGCT.

25. Kompozycja wed lug zastrz. 24, znamienna tym, ze antygen E1E2 HCV zawiera sekwencj e aminokwasów przedstawion a w pozycjach 192-809 Figur 2A-2C.

26. Kompozycja wed lug zastrz. 24, znamienna tym, ze oligonukleotyd CpG zawiera sekwencj e 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3' (SEQ ID nr 1). 28. Kompozycja wed lug zastrz. 24, znamienna tym, ze submikronowa emulsja olej w wodzie zawiera 4-5% skwalenu, 0,25-1,0% w/v monooleinianu polioksyetylenosorbitanu, i/lub 0,25-1,0% trio- leinianu sorbitanu i ewentualnie N-acetylomuramylo-L-alanylo-D-izoglutaminylo-L-alanino-2-(1'-2'-di- -palmitoilo-sn-glicero-3-hydroksyfosforyloksy)-etylaminy (MPT-PE). 29. Kompozycja wed lug zastrz. 24, znamienna tym, ze submikronowa emulsja olej w wodzie stanowi zasadniczo 5% obj eto sciowo skwalenu, i jeden lub wi ecej czynników emulguj acych wybra- nych z grupy obejmuj acej monooleinian polioksyetylenosorbitanu i trioleinian sorbitanu, przy czym ca lkowita ilo sc czynników obecnych emulguj acych wynosi 1% wagowo (w/v). 30. Kompozycja wed lug zastrz. 29, znamienna tym, ze jeden lub wi ecej czynników emulguja- cych jest monooleinianem polioksyetylenosorbitanu i triooleinianem sorbitanu i ca lkowita ilo sc mono- oleinianu polioksyetylenosorbitanu i triooleinianu sorbitanu obecnego wynosi 1% wagowo (w/v). 31. Kompozycja zawieraj aca: (a) antygen E1E2 wirusa zapalenia w atroby typu C (HCV) obejmuj acy sekwencj e aminokwasów przedstawion a w pozycjach 192-809 Figur 2A-2C; (b) submikronow a emulsj e olej w wodzie zdoln a do zwi ekszania odpowiedzi immunologicznej na antygen E1E2 HCV, przy czym submikronowa emulsja olej w wodzie zawiera 4-5% w/v skwalenu, 0,25-1,0% w/v monooleinianu polioksyetylenosorbitanu i/lub 0,25%-1,0% trioleinianu sorbitanu i ewen- tualnie N-acetylomuramylo-L-alanylo-D-izoglutaminylo-L-alanino-2-(1'-2'-dipalmitoilo-sn-glicero-3-hy- droksyfosforyloksy)-etylaminy (MTP-PE), przy czym olej i czynnik emulguj acy s a obecne w postaci emulsji olej w wodzie posiadaj acej kropelki oleju wszystkie zasadniczo które s a oko lo 100 nm lub mniejsze ni z 1 mikron srednicy; i (c) oligonukleotyd CpG, zawieraj acy sekwencj e 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3' (SEQ ID nr 1) lub sekwencj e 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3' (SEQ ID NO: 5). 32. Kompozycja wed lug zastrz. 31, znamienna tym, ze antygen E1E2 HCV stanowi sekwencj e aminokwasow a przedstawion a w pozycji 192-809 na Figurach 2A-2C. 33. Kompozycja wed lug zastrz. 32, znamienna tym, ze submikronowa emulsja olej w wodzie stanowi zasadniczo (i) 5% obj eto sciowo skwalenu i (ii) jeden lub wi ecej czynników emulguj acych wy- branych z grupy sk ladaj acej si e z monooleinianu polioksyetylenosorbitanu i triooleinianu sorbitanu, przy czym ca lkowita ilo sc obecnych czynników emulguj acych wynosi 1% wagowo (w/v). 34. Kompozycja wed lug zastrz. 33, znamienna tym, ze jeden lub wi ecej czynników emulguja- cych s a monooleinianem polioksyetylenosorbitanu i trioleinianem sorbitanu i ca lkowita ilo sc obecnego monooleinianu polioksyetylenosorbitanu i trioleinianu sorbitanu wynosi 1% wagowo (w/v). 34. Zastosowanie kompozycji jak zdefiniowano w zastrz. 1, 16, 24 i 31 w sposobie pobudzania odpowiedzi immunologicznej u kr egowca. 35. Zastosowanie kompozycji antygenu E1E2 wirusa zapalenia w atroby typu C (HCV) i submi- kronowej emulsji olej w wodzie pozbawionej N-acetylomuramylo-L-alanylo-D-izoglutaminylo-L-alanino- -2-(1'-2'-dipalmitoilo-sn-glicero-3-hydroksyfosforyloksy)-etylaminy (MTP-PE), do wytwarzania leku do pobudzania odpowiedzi immunologicznej u kr egowca. 36. Zastosowanie kompozycji antygenu E1E2 wirusa zapalenia w atroby typu C (HCV) i submi- kronowej emulsji olej w wodzie pozbawionej N-acetylomuramylo-L-alanylo-D-izoglutaminylo-L-alanino- -2-(1'-2'-dipalmitoilo-sn-glicero-3-hydroksyfosforyloksy)-etylaminy (MTP-PE), do wytwarzania leku do pobudzania odpowiedzi immunologicznej u kr egowca, przy czym ta submikronowa emulsja olej w wodzie jest zdolna do zwi ekszania odpowiedzi immunologicznej na antygen E1E2 HCV. 37. Zastosowanie kompozycji antygenu E1E2 wirusa zapalenia w atroby typu C (HCV) i immu- nostymuluj acej cz asteczki kwasu nukleinowego (ISS) do wytwarzania leku do zwi ekszenia odpowiedzi immunologicznej na antygen E1E2 HCV.PL 203 526 B1 34 38. Zastosowanie kompozycji zawierajacej: (a) antygen E1E2 wirusa zapalenia w atroby typu C (HCV) zawieraj acy sekwencje aminokwaso- w a o najmniej 80% identyczno sci do przylegaj acej sekwencji aminokwasów przedstawionej w pozy- cjach 192-809 na Figurach 2A-2C. (b) submikronow a emulsj e olej w wodzie zdoln a do zwi ekszenia odpowiedzi immunologicznej na antygen E1E2 HCV, przy czym submikronowa emulsja olej w wodzie zawiera (i) metabolizowalny olej, przy czym olej ten jest obecny w ilo sci 1% do 12% ca lkowitej obj eto sci i (ii) czynnik emulguj acy, przy czym czynnik emulguj acy jest obecny w ilo sci 0,01% do 1% wagowo (w/v) i zawiera mono-, di- lub triester polioksyetyleno sorbitanu i/lub mono-, di- lub triester sorbitanu, przy czym olej i czynnik emulguj acy s a obecne w postaci emulsji olej w wodzie posiadaj acej zasadniczo wszystkie kropelki oleju o srednicy oko lo 100 nm do mniej ni z 1 mikron srednicy; i (c) oligonukleotyd CpG, który zawiera sekwencj e GACGTT, GACGTC, GTCGTT lub GTCGCT do wytwarzania leku do pobudzania odpowiedzi immunologicznej u kr egowca. 39. Zastosowanie kompozycji zawierajacej: (a) antygen E1E2 wirusa zapalenia w atroby typu C (HCV) zawieraj acy sekwencj e aminokwasów przedstawion a w pozycjach 192-809 Figur 2A-2C; (b) submikronow a emulsj e olej w wodzie zdoln a do zwi ekszania odpowiedzi immunologicznej na antygen HCV E1E2, przy czym submikronowa emulsja olej w wodzie zawiera 4-5% w/v skwalenu, 0,25-1,0% w/v monooleinianu polioksyetylenosorbitanu i/lub 0,25%-1,0% trioleinianu sorbitanu i ewen- tualnie N-acetylomuramylo-L-alanylo-D-izoglutaminylo-L-alanino-2-(1'-2'-dipalmitoilo-sn-glicero-3-hy- droksyposforyloksy)-etylaminy (MTP-PE), przy czym olej i czynnik emulguj acy s a obecne w postaci emulsji olej w wodzie posiadaj acej kropelki oleju wszystkie zasadniczo o srednicy oko lo 100 nm lub mniejsze ni z 1 mikron srednicy; i (c) oligonukleotyd CpG, zawieraj acy sekwencj e 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3' (SEQ ID nr 1) lub sekwencj e 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3' (SEQ ID NO: 5) do wytwarzania leku do pobudzania odpowiedzi immunologicznej u kr egowca. 40. Sposób wytwarzania kompozycji, znamienny tym, ze laczy si e submikronow a emulsj e olej w wodzie pozbawion a N-acetylomuramylo-L-alanylo-D-izoglutaminylo-L-alanino-2-(1'-2'-dipalmitoilo- -sn-glicero-3-hydroksyposforyloksy)-etylaminy (MTP-PE) z antygenem E1E2 wirusa zapalenia w atroby typu C (HCV). 41. Sposób wed lug zastrz. 40, znamienny tym, ze obejmuje ponadto laczenie immunostymulu- jacej sekwencji kwasu nukleinowego (ISS) z antygenem E1E2 i submikronow a emulsj e olej w wodzie. 42. Sposób wytwarzania kompozycji, znamienny tym, ze laczy si e immunostymuluj ac a se- kwencj e kwasu nukleinowego (ISS) z antygenem E1E2 wirusowego zapalenia w atroby typu C (HCV).PL 203 526 B1 35 RysunkiPL 203 526 B1 36PL 203 526 B1 37PL 203 526 B1 38PL 203 526 B1 39PL 203 526 B1 40 Departament Wydawnictw UP RP Cena 6,00 z l. PL PL PL