ES2615029T3 - Micropartículas que comprenden polinucleótidos adsorbidos en la superficie de micropartículas o atrapados en el interior de las mismas - Google Patents

Micropartículas que comprenden polinucleótidos adsorbidos en la superficie de micropartículas o atrapados en el interior de las mismas Download PDF

Info

Publication number
ES2615029T3
ES2615029T3 ES04702174.6T ES04702174T ES2615029T3 ES 2615029 T3 ES2615029 T3 ES 2615029T3 ES 04702174 T ES04702174 T ES 04702174T ES 2615029 T3 ES2615029 T3 ES 2615029T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
microparticles
microparticles according
dna
antigen
virus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES04702174.6T
Other languages
English (en)
Inventor
Derek O'hagan
Manmohan Singh
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
GlaxoSmithKline Biologicals SA
Original Assignee
GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by GlaxoSmithKline Biologicals SA filed Critical GlaxoSmithKline Biologicals SA
Application granted granted Critical
Publication of ES2615029T3 publication Critical patent/ES2615029T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/34—Macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamino acids, polysiloxanes, polyphosphazines, copolymers of polyalkylene glycol or poloxamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/167—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction with an outer layer or coating comprising drug; with chemically bound drugs or non-active substances on their surface
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/1629—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/1641—Organic macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, poloxamers
    • A61K9/1647—Polyesters, e.g. poly(lactide-co-glycolide)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
    • C12N2740/16371—Demonstrated in vivo effect

Abstract

Micropartículas que comprenden: (a) un polímero biodegradable seleccionado de entre un poli (ácido alfa-hidroxi), un ácido polihidroxi butírico, una policaprolactona, un poliortoéster, un polianhídrido y un policianoacrilato; (b) un tensioactivo catiónico; y (c) una primera molécula que contiene polinucleótidos adsorbidos sobre la superficie de las micropartículas, en el que la primera molécula que contiene polinucleótidos adsorbidos constituye entre el 10 y el 30 por ciento del peso total de las micropartículas.

Description

5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
DESCRIPCION
Micropartfculas que comprenden polinucleotidos adsorbidos en la superfine de micropartfculas o atrapados en el interior de las mismas
Dedaracion de la solicitud relacionada
La presente solicitud reivindica el beneficio respecto de prioridad a la solicitud de patente U.S. provisional N° 60/439.940, presentada el 14 de Enero de 2003.
Campo de la invencion
La presente invencion se refiere en general a composiciones farmaceuticas. En particular, la invencion se refiere a micropartfculas de polfmero que tiene superficies adsorbentes, en las que se absorben agentes biologicamente activos, particularmente especies que contienen polinucleotidos, tales como constructos vectoriales (por ejemplo, constructos vectoriales de ADN y ARN) o adyuvantes (por ejemplo, oligonucleotidos CpG), a procedimientos de preparacion de dichas micropartfculas y a sus usos, incluyendo la induccion de respuestas inmunitarias celulares en animales vertebrados.
Antecedentes
Los vehfculos particulados se han usado con antigenos adsorbidos o atrapados en intentos de provocar respuestas inmunes adecuadas. Dichos vehfculos presentan multiples copias de un antfgeno seleccionado para el sistema inmune y promueven la captura y la retencion de antigenos en los ganglios linfaticos locales. Las partfculas pueden ser fagocitadas por macrofagos y pueden mejorar la presentacion de antigenos mediante la liberacion de citoquinas.
Por ejemplo, la solicitud de patente internacional WO 98/33487 de propiedad legalmente adquirida y la solicitud de patente US N° de serie 09/015.652, en tramitacion , presentada el 29 de 1998, describen el uso de micropartfculas con antfgeno adsorbido y con antfgeno encapsulado para estimular respuestas inmunologicas, incluyendo respuestas inmunologicas mediadas por celulas, asf como procedimientos de fabricacion de las micropartfculas. Los polfmeros usados para formar las micropartfculas incluyen poli (lactido) y poli(lactido-co-glicolido), denominado tambien en la presente memoria "PLG".
La solicitud de patente internacional WO 00/06123, de propiedad legalmente adquirida, y la solicitud de patente US N° de serie 09/715.902, en tramitacion , describen procedimientos de fabricacion de micropartfculas que tienen macromoleculas adsorbidas, incluyendo ADN, polipeptidos, antfgenos y adyuvantes. Las micropartfculas comprenden, por ejemplo, un polfmero tal como un poli(acido alfa-hidroxi) (por ejemplo, PLG), un acido polihidroxi butrnco, una policaprolactona, un poliortoester, un polianddrido y similares, y se forman usando, por ejemplo, detergentes cationicos, anionicos o no ionicos. Las micropartfculas que contienen detergentes anionicos, tales como micropartfculas de PLG con dodecil sulfato de sodio (SDS), se proponen para el uso de macromoleculas cargadas positivamente, tales como polipeptidos. Las micropartfculas que contienen detergentes cationicos, tales como micropartfculas de PLG con CTAB (bromuro de cetiltrimetilamonio), se proponen para el uso de macromoleculas cargadas negativamente, tales como ADN. Se describe tambien el uso de dichas micropartfculas para estimular las respuestas inmunologicas, incluyendo respuestas inmunologicas mediadas por celulas.
Los documentos US2002002272, Fattal et al. Journal of Controlled Release, 53, 1-3, 1998, 137-143, WO013699, Denis- Mize et al. Gene Therapy, 7, 24, 2000, 2105-2112, O Hagen. Vaccine.2002.3389-3398, US20031138458 describen micropartfculas con polinucleotidos adsorbidos en su superficie. El porcentaje de ADN cargado es de aproximadamente el 1% p/p con respecto al peso de las micropartfculas.
En la actualidad, existe un deseo de aumentar los niveles de carga de ADN con relacion a los de la tecnica anterior, entre otras cosas, para reducir la cantidad de polfmero que se administra al animal huesped.
Sumario de la invencion
Segun una realization de la presente invencion, se proporcionan micropartfculas, que comprenden: (a) un polfmero que comprende un poli (acido a-hidroxi), un acido polihidroxi butrnco, una policaprolactona, un poliortoester, un polianhfdrido, o un policianoacrilato; (b) un tensioactivo cationico; y (c) una primera especie que contiene polinucleotidos adsorbidos a las micropartfculas, en el que la primera especie que contiene polinucleotidos constituye del 10 al 30 por ciento.
En varias realizaciones, las micropartfculas se forman a partir de un poli (acido a-hidroxi), tal como un poli (lactido) ("PLA"), un copolfmero de D,L-lactido y glicolido, tal como un poli(D,L-lactido-co-glicolido) ("PLG"), o un copolfmero de D,L-lactido y caprolactona. Los polfmeros poli(D,L-lactido-co-glicolido) incluyen aquellos que tienen una relacion molar de lactido/glicolido comprendida en el intervalo, por ejemplo, de 20:80 a 80:20, de 25:75 a 75:25, de 40:60 a 60:40 o de 55:45 a 45:55, y que tiene un intervalo de peso molecular comprendido, por ejemplo, en el intervalo de 5.000 a 200.000 Daltons, de 10.000 a 100.000 Daltons, de 20.000 Daltons a 70.000 Daltons, o de 40.000 a 50.000 Daltons.
2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
En otros aspectos de la invencion, se produce una composicion de micropartfculas que comprende un excipiente farmaceuticamente aceptable.
Las micropartfculas pueden tener opcionalmente una especie adicional, incluyendo una especie adicional que contiene polinucleotidos, que esta: (a) adsorbida sobre la superficie de las micropartfculas, (b) atrapada dentro de las micropartfculas, (c) en solucion, (d) adsorbida sobre una poblacion separada de micropartfculas, y/o (e) atrapada dentro de una poblacion separada de micropartfculas.
Por lo tanto, la invencion abarca una diversidad de combinaciones en las que una unica especie que contiene polinucleotidos es adsorbida sobre las micropartfculas y opcionalmente es atrapada dentro de las micropartfculas. Ademas, las micropartfculas de la invencion pueden tener especies adicionales que contienen polinucleotidos adsorbidas sobre las mismas o atrapadas en su interior. Ademas, especies distintas de las especies que contienen polinucleotidos, incluyendo productos farmaceuticos, hormonas, enzimas, mediadores de transcripcion o de traduccion, intermediarios de rutas metabolicas, inmunomoduladores, antigenos, incluyendo antigenos que contienen polipeptidos, adyuvantes incluyendo adyuvantes inmunologicos, o sus combinaciones, pueden ser adsorbidos sobre y/o atrapados dentro de las micropartfculas. Por ejemplo, uno o mas adyuvantes inmunologicos pueden ser adsorbidos sobre y/o atrapados dentro de las micropartfculas.
Como ejemplos adicionales, puede proporcionarse una poblacion adicional de micropartfculas, (a) que tienen la misma especie que contiene polinucleotidos adsorbida sobre las mismas, (b) que tienen una especie que contiene polinucleotidos diferente adsorbida sobre las mismas o atrapadas en su interior, (c) que tienen especies distintas de las especies que contienen polinucleotidos, por ejemplo, uno o mas adyuvantes inmunologicos, adsorbidas sobre las mismas o atrapadas en su interior. Como un ejemplo espedfico, puede proporcionarse una poblacion de micropartfculas de PLG que han adsorbido sobre las mismas una especie que contiene polinucleotidos, mientras que puede proporcionarse una poblacion adicional de micropartfculas de PLG, que tienen un adyuvante inmunologico adsorbido sobre las mismas y/o atrapado en su interior.
La presente invencion se dirige tambien a composiciones inmunogenicas que comprenden una cantidad inmunoestimulante de una especie que contiene polinucleotidos y una cantidad inmunoestimulante de una composicion adyuvante, tales como las descritas en la presente memoria. En algunas realizaciones de la invencion, la composicion inmunogenica comprende un adyuvante oligonucleotido CpG en combinacion con otra especie que contiene polinucleotidos, por ejemplo, un constructo vectorial, tal como un constructo vectorial de ARN, un vector pSINCP o un vector pCMV que codifica para un polipeptido antigenico. Una o ambas de las especies que contienen polinucleotidos pueden ser adsorbidas sobre la superficie de la micropartfcula.
Las especies que contienen polinucleotidos pueden ser, por ejemplo, (a) adyuvantes inmunologicos que contienen polinucleotidos, tales como oligonucleotidos CpG, oligonucleotidos que tienen cadenas principales modificadas, y ARNdc (ARN de doble cadena), (b) oligonucleotidos anti-sentido, y (c) una especie que contiene polinucleotidos que codifica para una especie que contiene polipeptidos.
Los ejemplos de especies que contienen polinucleotidos que codifican una especie que contiene polipeptidos incluyen, por ejemplo, (a) una secuencia de acido nucleico que codifica directamente un antfgeno que contiene polipeptidos (por ejemplo, una molecula de ARNm) o (b) un constructo vectorial que codifica indirectamente un antfgeno que contiene polipeptidos, por ejemplo, un constructo vectorial que expresa una secuencia de acido nucleico heterologa que, a su vez, codifica para un antfgeno que contiene polipeptidos (por ejemplo, un constructo vectorial de ADN o un vector constructo de ARN).
Los antfgenos que contienen polipeptidos pueden ser, por ejemplo, antfgenos tumorales o antfgenos provenientes de organismos patogenos, tales como virus, bacterias, hongos y/o parasitos. De esta manera, en algunas realizaciones, el antfgeno que contiene polipeptidos se deriva de a partir un virus tal como, por ejemplo, virus de la hepatitis A (HAV), virus de la hepatitis B (HBV), virus de la hepatitis C (VHC), virus del herpes simple (HSV), virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), citomegalovirus (CMV), virus de la gripe (por ejemplo, virus de la gripe A), y el virus de la rabia. En otras realizaciones, el antfgeno que contiene polipeptidos se deriva a partir de una bacteria tal como, por ejemplo, colera, difteria, tetanos, streptococcus (por ejemplo, streptococcus A y B), tos ferina, Neisseria meningitidis (por ejemplo, meningitis A, B, C, W, Y), Neisseria gonorrhoeae, Helicobacter pylori, Haemophilus influenza (por ejemplo, Haemophilus influenza tipo B) y antrax. En todavfa otras realizaciones, el antfgeno que contiene polipeptidos se deriva a partir de un parasito tal como, por ejemplo, un parasito de la malaria.
En otras realizaciones, la invencion se refiere a procedimientos de administracion de especies que contienen polinucleotidos a un animal huesped, que comprenden administrar al animal huesped cualquiera de las composiciones de micropartfculas descritas anteriormente. El animal huesped es preferentemente un animal vertebrado, mas preferentemente un mairnfero y aun mas preferentemente un ser humano.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
La presente invention se dirige tambien a procedimientos para estimular una respuesta inmune en un animal huesped, que comprenden administrar al animal cualquiera de las composiciones de micropartfculas descritas anteriormente en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmune. La respuesta inmune puede ser una respuesta inmune celular y/o humoral.
La presente invencion se dirige a procedimientos para estimular una respuesta inmune Th1, o una respuesta CTL, o lifoproliferacion, o production de citoquinas en un animal huesped que comprende administrar al animal cualquiera de las composiciones de micropartfculas inmunogenicas descritas en la presente memoria en una cantidad eficaz para inducir la respuesta inmune Th1 o la respuesta CTL o la lifoproliferacion o la produccion de citoquinas.
En otras realizaciones, la invencion esta dirigida a su uso para la fabrication de un medicamento para immunization, que comprende administrar a un animal huesped una cantidad terapeuticamente eficaz de cualquiera de las composiciones de micropartfculas descritas anteriormente.
La presente invencion esta dirigida tambien a su uso para la fabricacion de un medicamento para inmunizar un animal huesped contra, por ejemplo, un tumor o una infection viral, bacteriana o parasitaria, que comprende administrar al animal una composition de micropartfculas inmunogenicas descritas en la presente memoria en una cantidad eficaz para inducir una respuesta protectora.
El suministro de las composiciones de micropartfculas de la invencion puede realizarse mediante cualquier procedimiento conocido, incluyendo inyeccion directa (por ejemplo, subcutanea, intraperitoneal, intravenosa o intramuscularmente).
Por lo tanto, segun algunas realizaciones de la presente invencion, se proporcionan composiciones y procedimientos que tratan, incluyendo la inmunizacion profilactica y/o terapeutica, un animal huesped, por ejemplo, contra infecciones vincas, fungicas, micoplasmaticas, bacterianas o por protozoos, asf como contra tumores. Los usos de la presente invencion para la fabricacion de un medicamento se dirigen a conferir inmunidad profilactica y/o terapeutica a un mairnfero, preferentemente un ser humano. Los usos de la presente invencion pueden practicarse tambien en animales, distintos de seres humanos, incluyendo aplicaciones de investigacion biomedica.
Otras realizaciones de la presente invencion se refieren a procedimientos de produccion de las micropartfculas anteriores. Por ejemplo, las micropartfculas anteriores pueden producirse mediante un procedimiento que comprende: (a) formar una emulsion agua en agua (”w/o/w”) que comprende el pol^ero y el tensioactivo cationico; (b) eliminar el disolvente organico de la emulsion, para formar las micropartfculas; y (c) adsorber la especie que contiene polinucleotidos sobre las micropartfculas.
Una ventaja particular de las micropartfculas con especies que contienen polinucleotidos adsorbidas de la presente invencion es la capacidad de generar respuestas inmunes en un sujeto vertebrado. Ademas de una respuesta de anticuerpos convencional, las composiciones descritas en la presente memoria pueden permitir, por ejemplo, la asociacion de los antfgenos expresados con moleculas MHC de clase I de manera que pueda montarse una respuesta inmune celular in vivo al antfgeno de interes que estimula la produccion de CTLs para permitir el futuro reconocimiento del antfgeno. Ademas, puede provocarse una respuesta espedfica de antfgeno por parte de las celulas T auxiliares. Por consiguiente, los usos de la presente invencion para la fabricacion de un medicamento estan dirigidos a provocar respuestas inmunes celulares y/o humorales a una diversidad de antfgenos. Como un ejemplo espedfico, los antfgenos derivados de patogenos virales pueden inducir anticuerpos, epftopos de celulas T auxiliares y epftopos citotoxicos de celulas T. Dichos antfgenos incluyen los codificados por virus humanos y animales y pueden corresponder a protemas estructurales o no estructurales.
Descripcion detallada de la invencion
A menos que se indique lo contrario, la practica de la presente invencion empleara procedimientos convencionales de qmmica, qmmica de poftmeros, bioqmmica, biologfa molecular, inmunologfa y farmacologfa, dentro de la experiencia de la tecnica. Dichas tecnicas se explican completamente en la literatura. Veanse, por ejemplo, Remington Pharmaceutical Sciences, 18a Edition (Easton, Pensilvania: Mack Publishing Company, 1990); Methods in Enzymology (S. Colowick y N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir y C.C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications); Sambrook, et al, Molecular Cloning:. A Laboratory Manual (2a edicion, 1989); Handbook of Surface and Colloidal Chemistry (Birdi, K. S., ed, CRC Press, 1997) y Seymour/Carraher's Polymer Chemistry (4a edicion, Marcel Dekker Inc., 1996).
Tal como se usa en la presente memoria descriptiva y cualquiera de las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen referencias plurales, a menos que el contenido indique claramente lo contrario. De esta manera, por ejemplo, el termino "micropartfculas" se refiere a una o mas micropartfculas, etc.
A menos que se indique lo contrario, todos los porcentajes y proporciones en la presente memoria se proporcionan en base al peso.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
A. Definiciones
En la descripcion de la presente invencion, se emplearan los siguientes terminos, y se pretende que sean definidos tal como se indica a continuacion.
El termino "micropartfculas", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a una partfcula de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 150 pm de diametro, mas tipicamente de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 30 pm de diametro, y todavfa mas tfpicamente de aproximadamente 500 nm a aproximadamente 10-20 pm de diametro. Las micropartfculas de la presente invencion pueden agregarse en masas mas grandes bajo algunas circunstancias. Como un ejemplo espedfico, las micropartfculas de la presente invencion que tienen ADN adsorbido pueden ser, por ejemplo, de aproximadamente 0,5-2 pm de diametro antes de la liofilizacion, mientras que las mismas partfculas pueden estar, por ejemplo, en agregados que tienen un diametro de aproximadamente 5-15 pm despues de la liofilizacion. La micropartfcula sera generalmente de un diametro que permita la administracion parenteral o mucosal sin ocluir las agujas y los capilares. El tamano de las micropartfculas se determina facilmente mediante tecnicas bien conocidas en la tecnica, tales como espectroscopia de correlacion de fotones, difractometna laser y/o microscopfa electronica de barrido. El termino "partfcula" puede ser usado tambien para denotar una micropartfcula tal como se define en la presente memoria.
Las micropartfculas de polfmero para uso en la presente invencion se forman tfpicamente a partir de materiales que son esterilizables, sustancialmente no toxicos y biodegradables. Dichos materiales incluyen polfmeros biodegradables tales como poli(acido a-hidroxi), acido polihidroxibutfrico, policaprolactona, poliortoester, polianhfdrido y policianoacrilato (por ejemplo, polialquilcianoacrilato o "PACA"). Mas tfpicamente, las micropartfculas para su uso con la presente invencion son micropartfculas de polfmero derivadas a partir de un poli (acidos a-hidroxi), en particular, a partir de una poli(lactido) ("PLA") o un copolfmero de D,L-lactido y glicolido, tal como una poli(D,L-lactido-co-glicolido) ("PLG"), o un copolfmero de D,L-lactido y caprolactona. Las micropartfculas de polnriero pueden derivarse a partir de cualquiera de diversos materiales de partida polimericos que tienen una diversidad de pesos moleculares y, en el caso de los copolfmeros tales como PLG, una diversidad de proporciones de monomeros: (por ejemplo, lactido:glicolido), cuya seleccion sera en gran medida una cuestion de eleccion, dependiendo en parte de las especies co-administradas. Estos parametros se describen mas completamente a continuacion.
El termino "tensioactivo", tal como se usa en la presente memoria, incluye detergentes, agentes dispersantes, agentes de suspension y estabilizantes de la emulsion. Los tensioactivos cationicos para su uso en las composiciones de micropartfculas de la presente invencion incluyen, pero no se limitan a, bromuro de cetiltrimetilamonio o "CTAB" (por ejemplo, cetrimida), cloruro de benzalconio, DDA (dimetil dioctodecil bromuro de amonio), DOTAP (dioleoil-3- trimetilamonio -propano), etc. Los tensioactivos anionicos incluyen, pero no se limitan a, SDS (dodecil sulfato de sodio), SLS (lauril sulfato de sodio), DSS (disulfosuccinato), alcoholes grasos sulfatados, etc. Los tensioactivos no ionicos incluyen, pero se limitan a, PVA, povidona (tambien como polivinilpirrolidona o PVP), esteres de sorbitan, polisorbatos, monoeteres de glicol polioxietilados, alquil fenoles polioxietilados, poloxameros, etc.
El termino "macromolecula", tal como se usa en la presente memoria, se refiere, sin limitacion, a un producto farmaceutico, un polinucleotido, un polipeptido, una hormona, una enzima, un mediador de transcripcion o traduccion, un intermediario en una ruta metabolica, un inmunomodulador, un antfgeno, un adyuvante o sus combinaciones. Las macromoleculas particulares para uso con la presente invencion se describen mas detalladamente a continuacion.
El termino "farmaceutico" se refiere a compuestos biologicamente activos tales como antibioticos, agentes antivirales, factores de crecimiento, hormonas, etc.
El termino "adyuvante" se refiere a cualquier sustancia que ayuda a, o modifica, la accion de un producto farmaceutico, incluyendo pero sin limitarse a adyuvantes inmunologicos, que aumenta o diversifica la respuesta inmune a un antfgeno. Por lo tanto, los adyuvantes inmunologicos son compuestos que son capaces de potenciar una respuesta inmune a antfgenos. Los adyuvantes inmunologicos pueden potenciar la inmunidad tanto humoral y celular.
Un "polinucleotido" es un polfmero de acido nucleico. En algunos casos, por ejemplo, oligonucleotidos CpG, el polinucleotido actua como un adyuvante. En otros casos, por ejemplo, constructos vectoriales, el polinucleotido codifica para una o mas protemas o polipeptidos biologicamente activos (por ejemplo, inmunogenicos o terapeuticos). Un polinucleotido puede incluir tan solo 5, 6, 7 u 8 nucleotidos, por ejemplo, en el caso en el que el polinucleotido es un oligonucleotido CpG (los oligonucleotidos CpG vanan ampliamente en tamano, incluyendo, por ejemplo, 5, 10, 20, 50, 100, 200 o 500 nucleotidos, y asf sucesivamente, siendo tfpicos 20-40 nucleotidos). Ademas, un "polinucleotido" puede incluir secuencias tanto de doble cadena como de cadena simple y se refiere, pero no se limita, a secuencias de ADNc vrnco, ARNm procariota o eucariota, ARN y ADN genomico de ADN vmco (por ejemplo, ARN y ADN de virus y retrovirus) o procariota, y secuencias de ADN sintetico. El termino incluye tambien secuencias que incluyen cualquiera de los analogos de base conocidos de ADN y ARN. El termino incluye ademas modificaciones, tales como deleciones, adiciones y sustituciones (generalmente de naturaleza conservadora), a una secuencia nativa, por ejemplo, en la que la molecula de acido nucleico codifica para una protema terapeutica o antigenica. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como a
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
traves de mutagenesis dirigida al sitio, o pueden ser accidentales, tales como mediante mutaciones de los huespedes que producen los antfgenos.
Tal como se usa en la presente memoria, la expresion "acido nucleico" se refiere a ADN, ARN, o quimeras formadas a partir de los mismos.
Una "especie que contiene polinucleotidos" es una molecula, al menos una parte de la cual es un polinucleotido. Los ejemplos incluyen nucleotidos CpG, constructos vectoriales de ARN, constructos vectoriales de ADN, etc.
Los terminos "polipeptido" y "protema" se refieren a un poftmero de residuos de aminoacidos y no se limitan a una longitud minima del producto. De esta manera, peptidos, oligopeptidos, d^eros, multfmeros y similares se incluyen dentro de la definicion. Tanto las protemas de longitud completa como sus fragmentos estan incluidos en la definicion. Los terminos incluyen tambien modificaciones, tales como deleciones, adiciones y sustituciones (generalmente de naturaleza conservadora), a una secuencia nativa, por ejemplo, de manera que la protema mantenga la capacidad de provocar una respuesta inmunologica o tenga un efecto terapeutico sobre un sujeto al que se administra la protema.
Una "especie que contiene polipeptidos" es una molecula, al menos una parte de la cual es un polipeptido. Los ejemplos incluyen polipeptidos, protemas, incluyendo glicoprotemas, antfgenos de sacaridos conjugados a protemas portadoras, y asf sucesivamente.
Por "antfgeno" se entiende una molecula que contiene uno o mas epftopos capaces de estimular el sistema inmune de un huesped para formar una respuesta inmune espedfica de antfgeno celular cuando se presenta el antfgeno, o una respuesta de anticuerpo humoral. Un antfgeno puede ser capaz de provocar una respuesta celular o humoral por sf mismo o cuando esta presente en combinacion con otra molecula.
Un "epftopo" es aquella parte de una molecula antigenica o complejo antigenico que determina su especificidad inmunologica. Un epftopo esta dentro del alcance de la presente definicion de antfgeno. Comunmente, un epftopo es un polipeptido o polisacarido en un antfgeno de origen natural. En los antfgenos artificiales, puede ser una sustancia de bajo peso molecular tal como un derivado de acido arsamlico. Un epftopo reaccionara especfticamente in vivo o in vitro, por ejemplo, con anticuerpos homologos o linfocitos T. Descriptores alternativos son determinante antigenico, agrupamiento estructural antigenico y agrupamiento haptenico.
Tfpicamente, un epftopo lineal incluira entre aproximadamente 5-15 aminoacidos. Los epftopos de una protema determinada pueden identificarse usando cualquier numero de tecnicas de mapeo de epftopos, bien conocidas en la tecnica. Vease, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, Nueva Jersey. Por ejemplo, los epftopos lineales pueden determinarse, por ejemplo, sintetizando simultaneamente grandes numeros de peptidos sobre soportes solidos, en el que los peptidos corresponden a porciones de la molecula de protema, y haciendo reaccionar los peptidos con anticuerpos mientras los peptidos todavfa estan unidos a los soportes. Dichas tecnicas se conocen en la tecnica y se describen, por ejemplo, en la patente US N°4.708.871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23: 709-715. De manera similar, los epftopos conformacionales se identifican facilmente mediante la determinacion de la conformacion espacial de aminoacidos, tal como, por ejemplo, mediante cristalograffa de rayos X y resonancia magnetica nuclear 2-dimensional. Vease, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols, supra.
El termino "antfgeno", tal como se usa en la presente memoria, denota tanto antfgenos subunidad, es decir, antfgenos que estan separados y discretos de un organismo entero o celula tumoral con los que el antfgeno esta asociado en la naturaleza, asf como bacterias, virus, parasitos, hongos u otros patogenos o celulas tumorales muertos, atenuados o inactivados. Los anticuerpos tales como anticuerpos anti-idiotipo, o fragmentos de los mismos, y mimotopos peptfdicos sinteticos, que pueden imitar un antfgeno o determinante antigenico, estan incluidos tambien en la definicion de antfgeno, tal como se usa en la presente memoria.
De manera similar, un oligonucleotido o polinucleotido que expresa una protema inmunogenica, o determinante antigenico in vivo, tal como en aplicaciones de inmunizacion de acido nucleico, esta incluido tambien en la definicion de antfgeno en la presente memoria.
Ademas, para los propositos de la presente invencion, un "antigeno" se refiere a una protema que incluye modificaciones, tales como deleciones, adiciones y sustituciones (generalmente de naturaleza conservadora), a la secuencia nativa, siempre que la protema mantenga la capacidad de provocar una respuesta inmunologica. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, tal como mediante mutagenesis dirigida al sitio, o pueden ser accidentales, tal como mediante mutaciones de los huespedes que producen los antfgenos.
Una "respuesta inmunologica" a un antfgeno o composicion es el desarrollo en un sujeto de una respuesta inmune humoral y/o celular a las moleculas presentes en la composicion de interes. Para los propositos de la presente invencion, una "respuesta inmune humoral" se refiere a una respuesta inmune mediada por moleculas de anticuerpos, mientras que
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
una "respuesta inmunitaria cellar" es una respuesta mediada por linfocitos T y/u otros globulos blancos. Un aspecto importante de la inmunidad celular implica una respuesta espedfica de antfgeno por parte de las celulas T citolfticas ("CTL"). Las CTLs tienen especificidad para antigenos peptidicos que se presentan en asociacion con protemas codificadas por el complejo principal de histocompatibilidad (MHC) y expresadas sobre las superficies de las celulas. Las CTLs ayudan a inducir y promover la destruccion intracelular de microbios intracelulares, o la lisis de celulas infectadas con dichos microbios. Otro aspecto de la inmunidad celular implica una respuesta espedfica de antigeno por parte de las celulas T auxiliares. Las celulas T auxiliares actuan para ayudar a estimular la funcion, y enfocar la actividad de, celulas efectoras no especficas contra celulas que presentan antigenos peptfdicos en asociacion con moleculas del MHC sobre su superficie. Una "respuesta inmune celular" se refiere tambien a la produccion de citoquinas, quimioquinas y otras moleculas de este tipo producidas por celulas T activadas y/u otros globulos blancos, incluyendo los derivados de CD4 + y celulas T CD8 +.
Una composicion tal como una composicion inmunogenica o vacuna que provoca una respuesta inmune celular puede servir para sensibilizar un sujeto vertebrado mediante presentacion de antfgeno en asociacion con moleculas del MHC sobre la superficie celular. La respuesta inmune mediada por celulas se dirige a, o cerca de, las celulas presentadoras de antfgeno en su superficie. Ademas, los linfocitos T especficos de antfgeno pueden ser generados para permitir la proteccion futura de un huesped inmunizado.
La capacidad de un antfgeno o composicion particular para estimular una respuesta inmunologica mediada por celulas puede determinarse mediante una serie de ensayos, tal como mediante ensayos de linfoproliferacion (activacion de linfocitos), ensayos de celulas citotoxicas CTL, ensayando para linfocitos T especficos para el antfgeno en un sujeto sensibilizado, o mediante la medicion de la produccion de citoquinas por las celulas T en respuesta a una re-estimulacion con antigeno. Dichos ensayos son bien conocidos en la tecnica. Vease, por ejemplo, Erickson et al., J. Immunol. (1993)151: 4189-4199; Doe et al., Eur. J. Immunol. (1994)24: 2369-2376; y los ejemplos a continuacion.
El antfgeno de interes puede provocar tambien una respuesta inmune mediada por anticuerpos. Por lo tanto, una respuesta inmunologica puede incluir uno o mas de los siguientes efectos: la produccion de anticuerpos por las celulas B; y/o la activacion de celulas T supresoras y/o celulas T 5y dirigidas espedficamente a un antfgeno o antfgenos presentes en la composicion o la vacuna de interes. Estas respuestas pueden servir para neutralizar la infectividad, y/o mediar anticuerpo-complemento, o la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) para proporcionar proteccion a un huesped inmunizado. Dichas respuestas pueden determinarse usando inmunoensayos estandar y ensayos de neutralizacion, bien conocidos en la tecnica, por ejemplo, radioinmunoensayos y ensayos ELISA.
Una composicion que contiene un antfgeno seleccionado adsorbido a una micropartfcula, muestra "inmunogenicidad mejorada" cuando posee una mayor capacidad para provocar una respuesta inmune que la respuesta inmunitaria provocada por una cantidad equivalente del antfgeno cuando es suministrada sin asociacion con la micropartfcula. De esta manera, una composicion puede mostrar "inmunogenicidad mejorada", por ejemplo, debido a que el antfgeno es mas fuertemente inmunogenico en virtud de la adsorcion a la micropartfcula, o debido a que se necesita una dosis mas baja de antfgeno para conseguir una respuesta inmune en el sujeto al que es administrado. Dicha inmunogenicidad mejorada puede determinarse, por ejemplo, mediante la administracion de la composicion de micropartfculas/antfgeno y los controles de antfgeno, a animales y comparando los resultados del ensayo de ambos.
Tal como se usa en la presente memoria, "tratamiento" (incluyendo sus variaciones, por ejemplo, "tratar" o "tratado") se refiere a cualquiera de entre (i) prevencion de un patogeno o trastorno en cuestion (por ejemplo, cancer o infeccion por un patogeno, tal como en una vacuna tradicional), (ii) reduccion o eliminacion de smtomas, y (iii) eliminacion sustancial o completa del patogeno o trastorno en cuestion. El tratamiento puede efectuarse profilacticamente (antes del patogeno o trastorno en cuestion) o terapeuticamente (despues de la llegada de los mismos).
Los terminos "cantidad eficaz" o "cantidad farmaceuticamente eficaz" de una composicion que comprende las micropartfculas de la presente invention se refieren en la presente memoria a una cantidad suficiente de la composicion de micropartfculas para tratar o diagnosticar una afeccion de interes. La cantidad exacta requerida variara de sujeto a sujeto, dependiendo, por ejemplo, de la especie, la edad y el estado general del sujeto; la gravedad de la afeccion a tratar; la especie particular adsorbida/atrapada de interes; en el caso de una respuesta inmunologica, la capacidad del sistema inmune del sujeto para sintetizar anticuerpos y el grado de proteccion deseado; y su modo de administracion, entre otros factores. Una cantidad apropiada "eficaz" en cualquier caso individual puede ser determinada por una persona con conocimientos ordinarios en la materia. De esta manera, una "cantidad terapeuticamente eficaz" estara comprendida tfpicamente en un intervalo relativamente amplio que puede determinarse mediante ensayos rutinarios.
Por "sujeto vertebrado" se entiende cualquier miembro del subfilo cordados, incluyendo, sin limitation, mairnferos tales como vacas, ovejas, cerdos, cabras, caballos y seres humanos; animales domesticos tales como perros y gatos; y aves, incluyendo aves domesticas, salvajes y de caza tales como gallos y gallinas incluyendo pollos, pavos y otras aves gallinaceas. El termino no denota una edad en particular. De esta manera, estan cubiertos tanto los animales adultos como los recien nacidos.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Por "farmaceuticamente aceptable" o "farmacologicamente aceptable" se entiende un material que no es biologicamente o de otro modo indeseable, es decir, el material puede ser administrado a un individuo junto con la formulacion de micropartfculas sin causar ningun efecto biologico excesivamente indeseable en el individuo o sin interactuar de manera excesivamente perjudicial con cualquiera de los componentes de la composicion en la que esta contenido.
El termino "excipiente" se refiere esencialmente a cualquier sustancia accesoria que pueda estar presente en la forma de dosificacion acabada. Por ejemplo, el termino "excipiente" incluye vehfculos, aglutinantes, disgregantes, cargas (diluyentes), lubricantes, deslizantes (mejoradores de flujo), adyuvantes de compresion, colores, edulcorantes, conservantes, agentes de suspension/dispersantes, formadores de pelfcula/revestimientos, aromas y tintas de impresion.
Por "pH fisiologico" o "pH en el intervalo fisiologico" se entiende un pH comprendido en el intervalo de aproximadamente 7,2 a 8,0 ambos inclusive, mas tipicamente en el rango de aproximadamente 7,2 a 7,6, ambos inclusive.
Tal como se usa en la presente memoria, la expresion “oligonucleotido que comprende al menos un motivo CpG” se refiere a un polinucleotido que comprende al menos un dinucleotido CpG. Los oligonucleotidos que comprenden al menos un motivo CpG pueden comprender multiples motivos CpG. Estos oligonucleotidos se conocen tambien como "oligonucleotidos CpG" en la tecnica. Tal como se usa en la presente memoria, la expresion "motivo CpG" se refiere a una parte o partes de dinucleotido de un oligonucleotido que comprende un nucleotido de citosina seguido por un nucleotido de guanosina. Puede usarse tambien 5-metilcitosina en lugar de citosina.
Los oligonucleotidos que comprenden motivos CpG mezclados con antfgenos han demostrado que inducen fuertes respuestas inmunes Th1. Roman et al., Nat. Med., 1997, 3, 849-854; Weiner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94, 10833-10837; Davis et al., J. Immunol., 1998, 160, 870-876; Chu et al., J. Exp. Med., 1997, 186, 1623-1631; Lipford et al., Eur. J. Immunol., 1997, 27, 2340-2344; y Moldoveanu et al., Vaccine, 1988, 16, 1216-1224. Los dinucleotidos CpG no metilados son relativamente comunes en el ADN bacteriano, pero estan infra-representados y metilados en el ADN de los vertebrados. Bird, Trends Genet., 1987, 3, 342-347. El ADN bacteriano o los oligonucleotidos sinteticos que contienen motivos CpG no metilados son conocidos tambien por inducir respuestas inmunes que incluyen, por ejemplo, proliferacion de celulas B, secrecion de interleuquinas -6 y e inmunoglobulina, y resistencia a apoptosis. Krieg et al., Nature, 1995, 374, 546-549; Klinman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 2879-2883; Ballas et al., J. Immunol., 1996, 157, 18401845; Cowdery et al., J. Immunol., 1996, 156, 4570-4575; Halpern et al., Cell. Immunol., 1996, 167, 72-78; Yamamoto et al., Jpn. J. Cancer Res., 1988, 79, 866-873; Stacey et al., J. Immunol., 1996, 157, 2116-2122; Messina et al., J. Immunol., 1991, 147, 1759-1764; Yi et al., J. Immunol., 1996, 157, 4918-4925; Yi et al., J. Immunol., 1996, 157, 5394-5402; Yi et al., J. Immunol., 1998, 160, 4755-4761; y Yi et al., J. Immunol., 1998, 160, 5898-5906; Publicacion PCT WO 96/02555; Publicacion PCT WO 98/16247; Publicacion PCT WO 98/18810; Publicacion PCT WO 98/40100; Publicacion PCT WO 98/55495; Publicacion PCT WO 98/37919; y Publicacion PCT WO 98/52581.
Los oligonucleotidos CpG pueden prepararse usando tecnicas de smtesis de oligonucleotidos convencionales bien conocidas por las personas con conocimientos en la materia. Los oligonucleotidos CpG pueden comprender una cadena principal modificada, tal como un fosforotioato o acido peptidonucleico, con el fin de conferir al oligonucleotido resistencia a las nucleasas. Las cadenas principales modificadas son bien conocidas para las personas con conocimientos en la materia. Los acidos peptidonucleicos preferentes se describen en detalle en las patentes US N° 5.821.060, 5.789.573, 5.736.392 y 5.721.102, la patente japonesa N° 10231290, la patente europea N° 839.828 y las publicaciones PCT N° WO 98/42735, WO 98/42876, WO 98/36098, WO 98/27105, WO 98/20162, WO 98/16550, WO 98/15648, WO 98/04571, WO 97/41150, WO 97/39024 y WO 97/38013, cuyas descripciones se incorporan a la presente memoria por referencia en su totalidad.
Los oligonucleotidos CpG comprenden tfpicamente entre aproximadamente 6 y aproximadamente 100 nucleotidos, mas tfpicamente entre aproximadamente 8 y aproximadamente 50 nucleotidos, mas tfpicamente entre aproximadamente 10 y aproximadamente 40 nucleotidos. Ademas, los oligonucleotidos CpG de la invencion pueden comprender sustituciones de los restos de azucar y los restos de base nitrogenada. Los oligonucleotidos preferentes CpG se divulgan, por ejemplo, en Krieg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 12631-12636, Klinman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 2879-2883, Weiner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94, 10833-10837, Chu et al., J. Exp. Med., 1997, 186, 16231631, Brazolot-Millan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 15553-15558, Ballas et al., J. Immunol., 1996, 157, 1840-1845, Cowdery et al., J. Immunol., 1996, 156, 4570-4575, Halpern et al., Cell. Immunol., 1996, 167, 72-78, Yamamoto et al., Jpn. J. Cancer Res., 1988, 79, 866-873, Stacey et al., J. Immunol., 1996, 157, 2116-2122, Messina et al., J. Immunol., 1991, 147, 1759-1764, Yi et al., J. Immunol., 1996, 157, 4918-4925, Yi et al., J. Immunol., 1996, 157, 5394-5402, Yi et al., J. Immunol., 1998, 160, 4755-4761, Roman et al., Nat. Med., 1997, 3, 849-854, Davis et al., J. Immunol., 1998, 160, 870-876, Lipford et al., Eur. J. Immunol., 1997, 27, 2340-2344, Moldoveanu et al., Vaccine, 1988, 16, 1216-1224, Yi et al., J. Immunol., 1998, 160, 5898-5906, Publicacion PCT WO 96/02555, Publicacion PCT WO 98/16247, Publicacion PCT WO 98/18810, Publicacion PCT WO 98/40100, Publicacion PCT WO 98/55495, Publicacion PCT WO 98/37919, y Publicacion PCT WO 98/52581 y WO 02/26209, de titularidad compartida.
Tal como se usa en la presente memoria, "ARNdc" se refiere a ARN de doble cadena, que puede ser obtenido a partir de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
diversas fuentes. Una serie de organismos producen ARNdc naturalmente, incluyendo levaduras y virus. El ARNdc proveniente de dichas fuentes esta compuesto generalmente de pares de bases intermitentes acido riboguamlico-acido ribocitid^lico ([rG-rC]) y acido riboademlico-acido polribourid^lico ([rA-rU]). Se cree que todos los virus, excepto los virus de ADN de cadena sencilla, producen ARNdc. El ARNdc vmco existe generalmente bien en forma de duplex de cadenas de ARN complementarias o viene en forma de estructura secundaria intramolecular dentro de un ARN de cadena sencilla. Las fuentes vmcas de ARN de doble cadena para virus ARNdc (genomico), virus ARNss (intermedios de transcripcion), virus de ADNdc (transcripcion simetrica seguida de hibridacion ARN-ARN), y retrovirus (estructura secundaria en el ARNm vmco) son conocidas y se describen, por ejemplo, en Majde, J.A., J. Intenfer. Cytokine Res. (2000) 20:259-272 y Jacobs y Langland, Virology (1996) 219:339-349. Las fuentes particulares de ARNdc vmco incluyen, pero no se limitan a, ARNdc de celulas infectadas por mengovirus (Falcoff et al., Antimicrob. Agents Chemother. (1973)3: 590-598); ARNdc de reovirus y virus fungicos (Field et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1967) 58: 1004-1010, De Benedetti et al., J. Virol. (1985)54: 408-413); ARNdc de retrovirus (Jacobs y Langland, Virology (1996) 219: 339-349), tal como de VIH-1 (Maitra et al., Virology (1994) 204: 823-827); ARNdc extrafdo de celulas infectadas por picornavirus (Falcoff et al., Antimicrob. Agents Chemother. (1973)3: 590-598); ARNdc de pulmones infectados con gripe (Majde et al., Microb. Patogeno. (1991)10: 105-115); ARNdc de celulas de plantas infectadas (Lin y Langenberg, Virology (1985) 142: 291-298); ARNdc de togavirus (Stollar, B. D., Crit. Rev. Biochem. (1975)3: 45-69); ARNdc de celulas infectadas con virus de la rubeola (Lee et al., Virology (1994) 200: 307-312); ARNdc de celulas infectadas con virus Semliki Forest (Lee et al., Virology (1994) 200: 307-312); ARNdc de celulas infectadas con virus de dengue (MacKenzie et al., Virology (1996) 220: 232-240); los ARNdc conocidos como Larifan (Riga, Letonia) y Ridostin ("Diapharam" NOP "VECTOR", Berdsk, Rusia). Cualquiera de estos diferentes ARNdc, asf como los ARNdc de otras fuentes, encontraran uso con las composiciones y los procedimientos de la presente memoria.
El ARNdc de celulas infectadas se obtiene facilmente usando procedimientos estandar de extraccion de acido nucleico, tales como tecnicas de extraccion con fenol, y tal como se describe en varias de las publicaciones indicadas anteriormente. Vease, por ejemplo, Falcoff et al., Antimicrob. Agents Chemother. (1973)3: 590-598; Fayet et al., Prog. Immunobiol. Standard. (1972)5: 267-273; Majde et al., Microb. Pathogen. (1991)10: 105-115).
Se conocen tambien una serie de ARNdc sinteticos y encontraran uso en la presente memoria y se sintetizan usando tecnicas bien conocidas y descritas en la tecnica. Dichos ARNdc sinteticos incluyen, pero no se limitan a, acido poliriboinosmico-polirribocitidflico (poli[rI-rC]) y acido poliriboguamlico-polirribocitidflico (poli[rG-rC]) (vease, por ejemplo, Michelson et al., Prog. Nuc. Acid Res. Mol. Biol. (1967)6: 83-141); acido poliriboademlico-poliribouridflico (poli[rA-rU]); ARNdc de bajo peso molecular de composicion de base mixta, tal como, pero sin limitarse a, un ARNdc sintetico con 309 pb (Haines et al., J. Biol. Chem. (1992)267: 18315-18319); asf como los ARNdc sinteticos mal emparejados descritos, por ejemplo, en las patentes US N° 5.906.980 y 5.258.369. Ademas, Los ARNdc con cadenas principales modificadas pueden prepararse usando tecnicas bien conocidas en la materia. Puede encontrarse informacion adicional, por ejemplo, en el documento PCT/US02/30423 de titularidad compartida.
Tal como se usa en la presente memoria, la expresion "constructo vectorial" se refiere en general a cualquier conjunto que es capaz de dirigir la expresion de una secuencia o secuencias de acido nucleico o gen o genes de interes. Un constructo vectorial incluye tfpicamente un promotor/potenciador transcripcional o elemento o elementos definidores de locus, u otros elementos que controlan la expresion genica por otros medios, tales como corte y empalme alternativo, exportacion de ARN nuclear, modificacion post-traduccional de mensajero, o modificacion post-transcripcional de protema. Ademas, el constructo vectorial incluye tfpicamente una secuencia que, cuando se transcribe, esta unida operativamente a la secuencia o secuencias o gen o genes de interes y actua como una secuencia de iniciacion de la traduccion. El constructo vectorial puede incluir tambien opcionalmente una senal que dirige la poliadenilacion, un marcador seleccionable, asf como uno o mas sitios de restriccion y una secuencia de terminacion de traduccion. Ademas, si el constructo vectorial se coloca en un retrovirus, el constructo vectorial puede incluir una senal de empaquetamiento, repeticiones terminales largas (LTRs), y sitios de union de cebador de cadena positiva y negativa apropiados para el retrovirus usado (si estos no estan ya presentes).
Tal como se usa en la presente memoria, un "constructo vectorial de ADN" se refiere a una molecula de ADN que es capaz de dirigir su propia amplificacion o autorreplicacion in vivo, tfpicamente dentro de una celula diana.
Un tipo espedfico de constructo vectorial de ADN es un plasmido, que es una molecula de ADN episomal circular capaz de replicacion autonoma en una celula huesped. Tfpicamente, un plasmido es un ADN circular de doble cadena, que forma un bucle en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales. pCMV es un plasmido especfico que es bien conocido en la tecnica. Un vector pCMV preferente es uno que contiene el potenciador/promotor temprano inmediato de CMV y un terminador de la hormona de crecimiento bovina. Se describe en detalle en Chapman, B. S., et al. 1991. " Effect of intron A from human cytomegalovirus (Towne) immediate-early gene on heterologous expression in mammalian cells." Nucleic Acids Res. 19:3979-86.
Se conocen otros constructos vectoriales de ADN, que estan basados en virus de ARN. Estos constructos vectoriales de ADN comprenden tfpicamente un promotor que funciona en una celula, eucariota 5' de una secuencia de ADNc para la
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
que el producto de transcripcion es un constructo vectorial de ARN (por ejemplo, un replicon de vector de ARN de alfavirus), y una region 3' de terminacion. El constructo vectorial de ARN comprende preferentemente un genoma de ARN de un picornavirus, togavirus, flavivirus, coronavirus, paramixovirus, virus de la fiebre amarilla o alfavirus (por ejemplo, virus Sindbis, virus Semliki Forest, virus de la encefalitis equina venezolana o virus del no Ross), que ha sido modificado mediante la sustitucion de uno o mas genes de protemas estructurales con una secuencia heterologa de acido nucleico seleccionada que codifica para un producto de interes. Los constructos vectoriales de ARN pueden obtenerse mediante transcripcion in vitro a partir de una plantilla de ADN. Los ejemplos espedficos incluyen plasmidos basados en virus Sindbis (pSIN) tales como pSINCP, descritos, por ejemplo, en las patentes US 5.814.482 y 6.015.686, asf como en las solicitudes de patente internacionales WO 97/38087, WO 99/18226 y WO 02/26209, de propiedad legalmente adquirida. La construccion de dichos vectores, en general, se describe en las patentes US 5.814.482 y 6.015.686. Brevemente, el ARN se obtiene a partir de un virus de ARN, a continuacion, se sintetiza el ADNc mediante amplificacion por PCR usando cebadores apropiados para los genes particulares o las porciones del virus de ARN, cuyos cebadores pueden contener tambien sitios de restriccion adicionales, segun sea necesario. A continuacion, los fragmentos de ADNc se clonan en un plasmido y se transforman en un huesped apropiado, tal como E. coli. Las colonias positivas se cultivan para la purificacion del plasmido y, a continuacion, los plasmidos se ensamblan en el vector deseado con una parte que tiene ADN heterologo, tal como un gen deseado que codifica para un antfgeno.
Otros ejemplos de constructos vectoriales incluyen constructos vectoriales de ARN (por ejemplo, constructos vectoriales de alfavirus) y similares.
Tal como se usa en la presente memoria, "constructo vectorial de ARN", " replicon de vector de ARN" y "replicon" se refieren a una molecula de ARN que es capaz de dirigir su propia amplificacion o autorreplicacion in vivo, tfpicamente dentro de una celula diana. El constructo vectorial de ARN se usa directamente, sin el requisito de la introduccion de ADN en una celula y el transporte al nucleo, donde se producina la transcripcion. Al usar el vector de ARN para el suministro directo al citoplasma de la celula huesped, la replicacion y la traduccion autonomas de la secuencia de acido nucleico heterologo ocurren de manera eficiente.
En algunas realizaciones, el constructo vectorial de ARN se obtiene mediante transcripcion in vitro a partir de un constructo vectorial basado en ADN. Por ejemplo, el constructo vectorial de ARN puede derivarse del genoma de un alfavirus, mas preferentemente del virus Sindbis (SIN), virus Semliki Forest (SFV), virus de la encefalitis equina venezolana (VEE), o virus del no Ross (RRV). O el constructo vectorial de ARN puede derivarse de un virus distinto de un alfavirus. Dichos otros virus usados para la derivacion de constructos vectoriales de ARN incluyen virus de ARN de cadena positiva, por ejemplo, picornavirus, flavivirus, rubiviruses o coronavirus. Las composiciones y los procedimientos para la transcripcion in vitro de vectores de ARN basados en alfavirus se proporcionan en detalle en otros sitios (veanse la patente US 5.842.723, el documento WO 02/26209, de propiedad legalmente adquirida, y Polo et al, 1999, PNAS 96:4598-603).
Un replicon de vector de ARN derivado de alfavirus contiene tfpicamente los siguientes elementos: las secuencias 5' virales necesarias en cis para la replicacion (denominadas tambien 5' CSE), secuencias que, cuando se expresan, codifican para protemas no estructurales de alfavirus biologicamente activo (por ejemplo, de nsP1, nsP2, nsP3, nsP4), las secuencias virales 3' necesarias en cis para la replicacion (denominadas tambien 3' CSE), y un tracto de poliadenilato. Un replicon de vector de ARN derivado de alfavirus puede contener tambien un promotor de "region de union" subgenomico vrnco, secuencias a partir de uno o mas genes de protemas estructurales o porciones de los mismos, molecula o moleculas de acido nucleico extranas que son de un tamano suficiente para permitir la produccion de virus viable, asf como secuencia o secuencias heterologas a ser expresadas.
B. Procedimientos generales
Tal como se ha indicado anteriormente, diversas realizaciones de la presente invention se refieren a micropartmulas que comprenden: (a) un polfmero biodegradable, por ejemplo, uno que comprende un poli (acido a-hidroxi), un acido polihidroxi butmco, una policaprolactona, un poliortoester, un polianhfdrido o un policianoacrilato; (b) un tensioactivo cationico; y (c) una primera especie que contiene polinucleotidos adsorbidos en las micropartmulas, en el que la primera especie que contiene polinucleotidos constituye al menos el 5 por ciento del peso total de las micropartmulas, mas tfpicamente del 10 al 30 por ciento, e incluso mas tfpicamente del 10 al 20 por ciento.
Los presentes inventores han encontrado inesperadamente que las especies que contienen polinucleotidos pueden ser adsorbidas en micropartmulas a niveles altos. Por ejemplo, los presentes inventores han preparado micropartmulas que contienen el 8, 12, 16 y 20% en peso de una especie que contiene polinucleotidos adsorbidos (es decir, un constructo vectorial que codifica para polipeptido-antfgeno, mas espeaficamente un ADN de plasmido pCMV). Quizas incluso mas inesperadamente, se encontro que los niveles de adsorcion incrementados de las especies que contienen polinucleotidos resultaban en un incremento correspondiente en la inmunogenicidad observada tras la inyeccion en animales huesped (es decir, ratones).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
En muchas realizaciones, la especie que contiene polinucleotidos codifica para una especie que contiene polipeptidos, tal como un antfgeno que contiene polipeptidos. Como resultado, las micropartmulas de la presente invention son particularmente utiles para la immunization contra virus intracelulares que normalmente provocan respuestas inmunes pobres.
Por ejemplo, la presente invencion encontrara uso para estimular una respuesta inmune contra una amplia diversidad de antigenos que contienen polipeptidos de la familia herpesvirus, incluyendo protemas derivadas de virus herpes simplex (HSV) tipos 1 y 2, tales como HSV-1 y HSV -2 glicoprotemas gB, gD y gH; antigenos derivados del virus de la varicela zoster (VZV), virus Epstein-Barr (EBV) y citomegalovirus (CMV) incluyendo CMV gB y gH; y antfgenos derivados de otros herpesvirus humanos tales como HHV6 y HHV7. (Vease, por ejemplo Chee et al., Cytomegaloviruses (J.K. McDougall, ed., Springer-Verlag 1990) pp. 125-169, para un analisis del contenido codificador de protema del citomegalovirus; McGeoch et al., J. Gen. Virol. (1988) 69: 1531-1574, para una discusion de las diversas protemas codificadas por HSV-1; la patente US N° 5.171.568 para una discusion de las protemas de HSV-1 y HSV-2 gB y gD y los genes que codifican para las mismas; Baer el al., Nature (1984) 310: 207-211, para la identification de secuencias codificadoras de protemas en un genoma de EBV; y Davison y Scott, J. Gen. Virol. (1986) 67: 1859-16, para una revision de VZV).
Los antfgenos de la familia del virus de la hepatitis, incluyendo virus de la hepatitis A (HAV), virus de la hepatitis B (HBV), virus de la hepatitis C (HCV), virus de la hepatitis delta (HDV), virus de la hepatitis E (HEV) y virus de la hepatitis G (HGV), pueden ser usados tambien convenientemente en las tecnicas descritas en la presente memoria. A modo de ejemplo, la secuencia genomica viral de HCV es conocida, asf como los procedimientos para obtener la secuencia. Vease, por ejemplo, las publicaciones internacionales N° WO 89/04669; WO 90/11089 y WO 90/14436. El genoma del VHC codifica para varias protemas virales, incluyendo E1 (conocida tambien como E) y E2 (conocida tambien como E2/NSI) y una protema de nucleocapside N-terminal (denominada "core") (vease, Houghton et al., Hepatology (1991) 14: 381-388, para una discusion de las protemas del VHC, incluyendo E1 y E2). Cada una de estas protemas, asf como sus fragmentos antigenicos, encontrara uso en la composition y los procedimientos de la presente memoria.
De manera similar, la secuencia para el antfgeno 8 de HDV es conocida (vease, por ejemplo, la patente US N° 5.378.814) y este antfgeno puede usarse tambien convenientemente en la composicion y los procedimientos de la presente memoria. Ademas, los antfgenos derivados de HBV, tales como el antfgeno core, el antfgeno de superficie, sAg, asf como las secuencias presuperficie, pre-S1 y pre-S2 (anteriormente denominadas pre-S), asf como sus combinaciones, tales sAg/pre-S1, sAg/pre-S2, sAg/pre-S1/pre-S2 y pre-S1/pre-S2, encontraran uso en la presente memoria. Vease, por ejemplo, HBV Vaccines - from the laboratory to license: a case study" in Mackett, M. y Williamson, J.D., Human Vaccines and Vaccination, pp. 159-176, para una discusion de la estructura de HBV; y las patentes US N° 4.722.840, 5.098.704, 5.324.513, incorporadas a la presente memoria por referencia, en su totalidad; Beames et al., J. Virol. (1995) 69: 68336838, Bimbaum et al., J. Virol. (1990)64: 3319-3330; y Zhou et al., J. Virol. (1991)65: 5457-5464.
Los antfgenos derivados de otros virus encontraran tambien uso en las composiciones y los procedimientos de la presente invencion, tales como, sin limitation, protemas a partir de miembros de las familias Picornaviridae (por ejemplo, poliovirus, etc.); Caliciviridae; Togaviridae (por ejemplo, virus de la rubeola, virus del dengue, etc.); Flaviviridae; Coronaviridae; Reoviridae; Birnaviridae; Rhabodoviridae (por ejemplo, virus de la rabia, etc.); Filoviridiae; Paramyxoviridae (por ejemplo, virus de las paperas, virus del sarampion, virus respiratorio sincitial, etc.); Orthomyxoviridae (por ejemplo, virus de la gripe tipos A, B y C, etc.); Bunyaviridae; Arenaviridae; Retroviridae (por ejemplo, HTLV-I; HTLV-II; VIH-1 (conocido tambien como HTLV-III, LAV, ARV, hTLR, etc.)), incluyendo pero sin limitarse a los antfgenos de los aislados VIHnib, HIVsf2, HIVlav, HIVlai, HIVmn); VIH-1 CM235, VIH-1 us4; VIH-2; virus de la inmunodeficiencia en simios (SIV) entre otros. Ademas, los antfgenos pueden derivarse tambien a partir de virus del papiloma humano (VPH) y los virus de la encefalitis transmitida por garrapatas. Vease, por ejemplo Virology, 3a Edition (W. K. Joklik ed. 1988); Fundamental Virology, 2a Edicion (B. N. Fields y D. M. Knipe, eds. 1991), para una description de estos y otros virus.
Mas particularmente, las protemas de envoltura gp120 o gp140 de cualquiera de los aislados de VIH anteriores, incluyendo los miembros de los diversos subtipos geneticos de VIH, son bien conocidos y se ha informado acerca de los mismos (vease, por ejemplo, Myers et al., Los Alamos Database, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, Nuevo Mexico (1992); Myers et al, Human Retroviruses and Aids, 1990, Los Alamos, Nuevo Mexico: Los Alamos National Laboratory; y Modrow et al., J. Virol. (1987) 61: 570-578, para una comparacion de las secuencias de la envoltura de una variedad de aislados de VIH) y los antfgenos derivados de cualquiera de estos aislados encontraran uso en los procedimientos de la presente invencion. Ademas, la invencion es igualmente aplicable a otras protemas inmunogenicas derivadas a partir de cualquiera de los diversos aislados de VIH, incluyendo cualquiera de las diversas protemas de envoltura tales como gp160 y gp41, antfgenos gag tales como p24gag y p55gag, asf como protemas derivadas a partir de las regiones pol y tat.
El virus de la gripe es otro ejemplo de un virus para el que la presente invencion sera particularmente util. Espedficamente, las glicoprotemas de envoltura HA y NA de la gripe A son de particular interes para generar una respuesta inmune. Se han identificado numerosos subtipos HA de gripe A se han identificado (Kawaoka et al., Virology (1990) 179: 759-767; Webster et al., “Antigenic variation among type A influenza viruses", p. 127-168. En: P. Palese y
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
D.W. Kingsbury (ed.), Genetics of influenza viruses. Springer-Verlag, Nueva York). De esta manera, las protemas derivadas a partir de cualquiera de estos aislados pueden usarse tambien en las composiciones y los procedimientos descritos en la presente memoria.
Las composiciones y los procedimientos descritos en la presente memoria encontraran uso tambien con numerosos antigenos bacterianos, tales como los derivados a partir de organismos que causan difteria, colera, tuberculosis, antrax, tetanos, tos ferina, meningitis y otros estados patogenos, incluyendo, sin limitacion, Bordetella pertussis, Neisseria meningitidis (Por ejemplo A, B, C, Y, W, por ejemplo, W135), Neisseria gonorrhoeae, Helicobacter pylori y Haemophilus influenza. Hemophilus influenza tipo B (HIB), Helicobacter pylori y sus combinaciones. Los ejemplos de antigenos de Neisseria meningitidis B se divulgan en las siguientes solicitudes de patente de propiedad legalmente adquirida: PCT/US99/09346; PCT IB98/01665 y PCT IB99/00103. Los ejemplos de antfgenos parasitarios incluyen los derivados a partir de organismos que causan malaria y enfermedad de Lyme.
Los antfgenos adicionales para su uso con la invencion, no necesariamente exclusivamente los enumerados en otra parte de la presente solicitud, incluyen los siguientes: (a) un antfgeno de protema a partir de N. meningitidis serogrupo B, tal como los de las referencias 1-7, mas adelante; (b) una preparation de vesmula de membrana externa (OMV) de N. meningitidis serogrupo B, tal como las divulgadas en las referencias 8, 9, 10, 11, etc., mas adelante; (c) un antfgeno de sacarido de N. meningitidis serogrupo A, C, W135 y/o Y, tal como el oligosacarido divulgado en la referencia 12, mas adelante, del serogrupo C (vease tambien la referencia 13); (d) un antfgeno de sacarido de Streptococcus pneumoniae [por ejemplo, referencias 14,15, 16]. (e) un antfgeno de N. gonorrhoeae [por ejemplo, referencias 1,2, 3]; (e) un antfgeno de Chlamydia pneumoniae [por ejemplo, referencias 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23]; (f) un antfgeno de Chlamydia trachomatis [por ejemplo, referencia 24]; (g) un antfgeno de virus de hepatitis A, tal como virus inactivado [por ejemplo, referencias 25,
26] ; (h) un antfgeno de virus de la hepatitis B, tal como antfgenos de superficie y/o de nucleo [por ejemplo, referencias 26,
27] ; (i) un antfgeno de virus de la hepatitis C [por ejemplo, referencia 28]; (J) un antfgeno de Bordetella pertussis, tal como pertussis holotoxina (PT) y hemaglutinina filamentosa (FHA) de B. pertussis, opcionalmente tambien en combination con pertactina y/o aglutinogenos 2 y 3 [por ejemplo, referencias 29 y 30]; (k) un antfgeno de difteria, tal como toxoide difterico [por ejemplo, capftulo 3 de la referencia 31], por ejemplo, el mutante CRM197 [por ejemplo, referencia 32]; (1) un antfgeno de tetanos, tal como un toxoide tetanico [por ejemplo, capftulo 4 de la referencia 31]; (m) un antfgeno de protema de Helicobacter pylori tal como CagA [por ejemplo, referencia 33], VacA [por ejemplo, referencia 33], NAP [por ejemplo, referencia 34], HopX [por ejemplo, referencia 35], HopY [por ejemplo, referencia 35] y/o ureasa; (n) un antfgeno de sacarido de Haemophilus influenzae B [por ejemplo, referencia 13]; (o) un antfgeno de Porphyramonas gingivalis [por ejemplo referencia 36]; (P) antfgeno o antfgenos de la polio [por ejemplo, referencias 37, 38] tales como IPV u OPV; (Q) antfgeno o antfgenos de la rabia [por ejemplo, referencia 39] tal como virus inactivado liofilizado [por ejemplo, referencia 40, RabAvert™); (r) antfgenos de sarampion, paperas y/o de rubeola [por ejemplo, capftulos 9, 10 y 11 de la referencia 31]; (s) antfgeno o antfgenos de la gripe [por ejemplo, capftulo 19 de la referencia 31], tales como las protemas de superficie hemaglutinina y/o neuraminidasa; (t) un antfgeno de Moraxella catarrhalis [Por ejemplo, time 41]; (u) un antfgeno de Streptococcus agalactiae (Estreptococo del grupo B) [por ejemplo, referencias 42, 43]; (v) un antfgeno de Streptococcus pyogenes (Estreptococo del grupo A) [por ejemplo, referencias 43,44, 45]; (w) un antfgeno de Staphylococcus aureus [por ejemplo, referencia 46]; y (x) composiciones que comprenden uno o mas de estos antfgenos. Cuando se usa un antfgeno de sacarido o carbohidrato, se conjuga preferentemente con una protema portadora con el fin de mejorar la inmunogenicidad [por ejemplo, referencias 47 a 56]. Las protemas portadoras preferentes son toxinas o toxoides bacterianos, tales como los toxoides difterico o tetanico. El toxoide difterico CRM197 es particularmente preferente. Otras protemas portadoras adecuadas incluyen la protema de membrana externa de N. meningitidis [por ejemplo, referencia 57], peptidos sinteticos [por ejemplo, referencias 58, 59], protemas de choque termico [por ejemplo, referencia 60], protemas de pertussis [por ejemplo, referencias 61, 62], protema D de H. Influenzae [por ejemplo referencia 63], toxina A o B de C. difficile [por ejemplo referencia 64], etc. Cuando una mezcla comprende sacaridos capsulares de ambos serogrupos A y C, es preferente que la relation (p/p) de sacarido MenA:sacarido MenC sea mayor que 1 (por ejemplo, 2:1, 3:1,4:1,5:1, 10:1 o mayor). Los sacaridos de serogrupos diferentes de N. meningitidis pueden conjugarse con las mismas o diferentes protemas portadoras. Puede usarse cualquier reaction de conjugation adecuada, con cualquier conector adecuado, cuando sea necesario. Los antfgenos de protemas toxicas pueden ser detoxificados cuando sea necesario (por ejemplo detoxification de toxina de pertussis por medios qmmicos y/o medios [referencia 30]. Veanse: la solicitud de patente internacional 99/24578 [referencia 1]; la solicitud de patente internacional WO99/36544 [referencia 2]; la solicitud de patente internacional WO99/57280 [referencia 3]; la solicitud de patente internacional WO00/22430 [referencia 4]; Tettelin et al., (2000) Science 287:1809-1815 [referencia 5]; la solicitud de patente internacional WO96/29412 [referencia 6]; Pizza el al. (2000) Science 287:1816-1820 [referencia 7]; la solicitud de patente internacional PCT/IB01/00166 [referencia 8]; Bjune et al. (1991) Lancet 338(8775):1093-1096 [referencia 9]; Fukasawa et al. (1990) Vaccine 17:29512958 [referencia 10]; Rosenqvist et al. (1998) Dev. Biol. Stand. 92:323-333 [referencia 11]; Costantino et al. (1992) Vaccine 10:691-698 [referencia 12]; Costantino et al. (1999) Vaccine 17:1251-1263 [referencia 13]; Watson (2000) Padiatr Infect Dis J 19:331-332 [referencia 14]; Rubin (2000) Pediatr Clin North Am 47:269-285, v [referencia 15]; Jedrzejas (2001) Microbiol Mol Biol Rev 65:187-207 [referencia 16]; la solicitud de patente internacional presentada el 3 de Julio de 2001 que reivindica prioridad con respecto a GB-0016363.4 [referencia 17]; Kalman et al. (1999) Nature Genetics 21:385-389 [referencia 18]; Read et al. (2000) Nucleic Acids Res 28:1397-406 [referencia 19]; Shirai et al. (2000) J. Infect. Dis.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
181(Suppl 3):S524-S527 [referencia 20]; la solicitud de patente internacional WO99/27105 [referencia 21]; la solicitud de patente internacional WO00/27994 [referencia 22]; la solicitud de patente internacional WO00/37494 [referencia 23]; la solicitud de patente internacional WO99/28475 [referencia 24]; Bell (2000) Pediatr Infect Dis J 19:1187-1188 [referencia 25]; Iwarson (1995) APMIS 103:321-326 [referencia 26]; Gerlich et al. (1990) Vaccine 8 Suppl:S63-68 & 79-80 [referencia 27]; Hsu et al. (1999) Clin Liver Dis 3:901-915 [referencia 28]; Gustafsson et al. (1996) N. Engl. J. Med. 334:349-355 [referencia 29]; Rappuoli et al. (1991) TIBTECH 9:232-238 [referencia 30]; Vaccines (1988) eds. Plotkin & Mortimer. ISBN 0-7216-1946-0 [referencia 31]; Del Guidice et al. (1998) Molecular Aspects of Medicine 19:1-70 [referencia 32]; la solicitud de patente internacional WO93/18150 [referencia 33]; la solicitud de patente internacional WO99/53310 [referencia 34]; la solicitud de patente internacional WO98/04702 [referencia 35]; Ross et al. (2001) Vaccine 19:4135-4142 [referencia 36]; Sutter et al. (2000) Pediatr Clin North Am 47:287-308 [referencia 37]; Zimmerman & Spann (1999) Am Fam Physician 59:113-118, 125-126 [referencia 38]; Dreesen (1997) Vaccine 15 Suppl:S2-6 [referencia 39]; MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1998 Jan 16;47(1):12, 19 [referencia 40]; McMichael (2000) Vaccine 19 Suppl 1:S101 -107 [referencia 41]; Schuchat (1999) Lancet 353(9146):51-6 [referencia 42]; las solicitudes de patente GB 0026333.5, 0028727.6 & 0105640.7 [referencia 43]; Dale (1999) Infect Dis Clin North Am 13:227-43, viii [referencia 44]; Ferretti et al. (2001) PNAS USA 98:4658-4663 [referencia 45]; Kuroda et al. (2001) Lancet 357(9264):1225-1240; veanse tambien las paginas 1218-1219 [referencia 46]; Ramsay et al. (2001) Lancet 357(9251):195-196 [referencia 47]; Lindberg (1999) Vaccine 17 Suppl 2:S28- 36 [referencia 48]; Buttery & Moxon (2000) JR Coll Physicians London 34:163-168 [referencia 49]; Ahmad & Chapnick (1999) Infect Dis Clin North Am 13:113-133, vii [referencia 50]; Goldblatt (1998) J. Med. Microbiol. 47:563-567 [referencia 51]; la patente europea 0 477 508 [referencia 52]; la patente US N° 5.306.492 [referencia 53]; la solicitud de patente internacional WO98/42721 [referencia 54]; Conjugate Vaccines (eds. Cruse et al.) ISBN 3805549326, particularmente vol. 10:48-114 [referencia 55]; Hermanson (1996) Bioconjugate Techniques ISBN: 0123423368 & 012342335X [referencia 56]; la solicitud de patente europea 0372501 [referencia 57]; la solicitud de patente europea 0378881 [referencia 58]; la solicitud de patente europea 0427347 [referencia 59]; la solicitud de patente internacional WO93/17712 [referencia 60]; la solicitud de patente internacional WO98/58668 [referencia 61]; la solicitud de patente europea 0471177 [referencia 62]; la solicitud de patente internacional WO00/56360 [referencia 63]; la solicitud de patente internacional WO00/61761 [referencia 64].
Cuando se incluye antfgeno de difteria en la composicion, es preferente incluir tambien antfgeno del tetanos y antigenos de pertussis. De manera similar, cuando se incluye un antfgeno del tetanos, es preferente incluir tambien antigenos de difteria y de pertussis. De manera similar, cuando se incluye un antfgeno de pertussis, es preferente incluir tambien antigenos de difteria y de tetanos.
Los antfgenos adicionales incluyen antfgenos dirigidos a la peste, la fiebre maculosa de las Montanas Rocosas, la viruela, la fiebre tifoidea, tifus, el virus de la leucemia felina y la fiebre amarilla.
Las micropartfculas de la presente invention pueden usarse para suministrar una amplia diversidad de especies ademas de las especies que contienen polinucleotidos adsorbidos en la superficie. Dichas especies adicionales incluyen: (a) antigenos, tales como los antigenos que contienen polipeptidos indicados anteriormente, (b) productos farmaceuticos tales como antibioticos y agentes antivirales, farmacos antiinflamatorios no esteroideos, analgesicos, vasodilatadores, farmacos cardiovasculares, psicotropicos, neurolepticos, antidepresivos, farmacos antiparkinsonianos, bloqueadores beta, bloqueadores de los canales de calcio, inhibidores de la bradicinina, inhibidores de ECA, vasodilatadores, inhibidores de prolactina, esteroides, antagonistas de hormonas, antihistammicos, antagonistas de serotonina, heparina, agentes quimioterapeuticos, antineoplasicos y factores de crecimiento, incluyendo pero sin limitarse a PDGF, EGF, KGF, IGF-1 e IGF-2, FGF, (c) hormonas incluyendo hormonas peptfdicas tales como insulina, proinsulina, hormona del crecimiento, GHRH, LHRH, EGF, somatostatina, SNX-111, BNP, insulinotropina, ANP, FSH, LH, PSH y hCG, hormonas esteroides gonadales (androgenos, estrogenos y progesterona), hormona estimulante de tiroides, inhibina, colecistoquinina, ACTH, CRF, dinorfinas, endorfinas, endotelina, fragmentos de fibronectina, galanina, gastrina, insulinotropina, glucagon, fragmentos de protemas de union a GTP, guanilina, leukocininas, magainina, mastoparans, dermaseptina, sistemina, neuromedinas, neurotensina, pancreastatina, polipeptido pancreatico, sustancia P, secretina, timosina, etc., (d) enzimas, (e) mediadores de transcription o de traduction, (f) intermedios en vfas metabolicas, (g) inmunomoduladores, tales como cualquiera de las diversas citoquinas incluyendo interleuquinas -1, interleuquinas -2, interleuquinas -3, interleuquinas -4 y gamma-interferon, y (h) adyuvantes (vease a continuation).
Dichas especies adicionales pueden ser adsorbidas, por ejemplo, sobre las superficies de las micropartfculas junto con las especies que contienen polinucleotidos, atrapadas dentro de las micropartfculas, disueltas o dispersadas en solution, pero no unidas a las micropartfculas, y/o adsorbidas o atrapadas dentro de otro grupo de micropartfculas.
En algunas realizaciones, las composiciones de micropartfculas de la presente invencion pueden usarse para la administration dirigida espedfica de sitio. Por ejemplo, la administration intravenosa de las composiciones de micropartfculas puede usarse para dirigirlas al pulmon, hfgado, bazo, circulation sangumea o medula osea.
Los polfmeros biodegradables para la fabrication de micropartfculas para su uso en la presente invencion estan comercialmente disponibles, de manera sencilla, por ejemplo, en Boehringer Ingelheim, Alemania y Birmingham
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Polymers, Inc., Birmingham, AL. Por ejemplo, los poKmeros utiles para formar las micropartfculas de la presente memoria incluyen homopoKmeros, copolnmeros y poKmeros mezclados derivados a partir de los siguientes: acido polihidroxibutfrico (conocido tambien como polihidroxibutirato); acido polihidroxi valerico (conocido tambien como polihidroxivalerato); acido poliglicolico (PGA) (conocido tambien como poliglicolido): acido polilactico (PLA) (conocido tambien como polilactido); polidioxanona; policaprolactona; poliortoester; y poliantndrido. Mas preferentes son los poli (a-hidroxi acidos), tales como poli (L-lactido), poli (D,L-lactido) (conocidos ambos como “PLA” en la presente memoria), poli (hidroxibutiratos), copolfmeros de D,L-lactido y glicolido, tales como poli (D,L-lactido-co-glicolido) (designados como “PLG” en la presente memoria) o copolfmeros de D,L-lactido y caprolactona. Los poKmeros particularmente preferentes para uso en la presente memoria son los polfmeros PLA y PLG.
Estos polfmeros estan disponibles en una diversidad de pesos moleculares, y el peso molecular apropiado para un uso determinado es determinado facilmente por una persona con conocimientos en la materia. De esta manera, por ejemplo, para PLA, un peso molecular adecuado estara comprendido en el intervalo de aproximadamente 2000 a 5000. Para PLG, los pesos moleculares adecuados oscilaran generalmente entre aproximadamente 10.000 y aproximadamente 200.000, tfpicamente de aproximadamente 15.000 a aproximadamente 150.000
Si se usa un copolfmero, puede haber disponibles polfmeros con una diversidad de proporciones de monomeros. Por ejemplo, cuando se usa PLG para formar las micropartfculas, una diversidad de proporciones molares de lactido:glicolido encontraran uso en la presente memoria, y la relacion es, en gran medida, un problema de eleccion, dependiendo en parte de la especie absorbida/atrapada co-administrada y de la velocidad de degradacion deseada. Por ejemplo, un polfmero PLG 50:50, que contiene un 50% de D,L-lactido y un 50% de glicolido proporcionara un copolfmero de resorcion rapida, mientras que PLG 75:25 se degrada mas lentamente, y 85:15 y 90:10, incluso mas lentamente, debido al aumento en el componente lactido. Es evidente que una persona con conocimientos en la materia determina facilmente una relacion adecuada de lactido:glicolido en base, por ejemplo, a la naturaleza del antfgeno y el trastorno en cuestion. Ademas, las mezclas de micropartfculas con proporciones variables de lactido:glicolido pueden encontrar uso en la presente memoria con el fin de conseguir la cinetica de liberacion deseada. La velocidad de degradacion de las micropartfculas de la presente invencion puede ser contralada tambien mediante factores tales como el peso molecular y la cristalinidad del polfmero. Los copolfmeros PLG con proporciones lactido:glicolido y pesos moleculares variables estan comercialmente disponibles a partir de una serie de fuentes, incluyendo Boehringer Ingelheim, Alemania y Birmingham Polymers, Inc., Birmingham, AL. Algunos copolfmeros de PLG ejemplares incluyen: (a) RG 502, un PLG que tiene una relacion molar 50:50 de lactido/glicolido y un peso molecular de 12.000 Da; (b) RG 503, un PLG que tiene una relacion molar de 50:50 de lactido/glicolido y un peso molecular de 34.000 Da; (c) RG 504, un PLG que tiene una relacion molar de 50:50 de lactido/glicolido y un peso molecular de 48.000 Da, (d) RG 752, un PLG que tiene una relacion molar 75:25 de lactido/glicolido y un peso molecular de 22.000 da; y (e) RG 755, un PLG que tiene una relacion molar 75:25 de lactido/glicolido y un peso molecular de 68.000 Da. Los polfmeros de PLG pueden sintetizarse tambien mediante policondensacion simple del componente de acido lactico usando tecnicas bien conocidas en la tecnica, tales como las descritas en Tabata et al., J. Biomed. Mater. Res. (1988)22: 837-858.
Cuando se usan, los polfmeros poli (D,L-lactido-co-glicolido) son tfpicamente aquellos que tienen una relacion molar lactido/glicolido comprendida entre 20:80 y 80:20, tfpicamente de 40:60 a 60:40, y que tienen un molecular peso que varfa de 10.000 a 100.000 Daltons, tfpicamente de 20.000 Daltons a 70.000 Daltons.
Las micropartfculas de polnriero se preparan usando cualquiera de los diversos procedimientos bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, en algunas realizaciones, pueden usarse tecnicas de emulsion doble/evaporacion de disolvente, tales como las descritas en la patente US N° 3.523.907 y Ogawa et al., Chem. Pharm. Bull. (1988) 36:1095-1103 para fabricar las micropartfculas. Estas tecnicas implican la formacion de una emulsion primaria que consiste en gotitas de solucion de polfmero, que se mezclan subsiguientemente con una fase acuosa continua que contiene un estabilizador de partfcula/tensioactivo.
En otras realizaciones, las micropartfculas pueden formarse tambien usando un secado por pulverizacion y coacervado tal como se describe, por ejemplo, en Thomasin et al., J. Controlled Release (1996) 41:131; la patente US N° 2.800.457; Masters, K (1976) Spray Drying 2a Ed. Wiley, Nueva York; tecnicas de revestimiento en suspension aerea, tales como revestimiento en bandeja y revestimiento Wurster, tal como se describe en Hall et al. (1980) The “Wurster Process” en Controlled Release Technologies: Methods, Theory, and Applications (A.F. Kydonieus, ed.), Vol. 2, pp. 133-154 CRC Press, Boca Raton, Florida y Deasy, P.B., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. (1988) S(2):99-139; y gelificacion ionica tal como se describe, por ejemplo, en Lim et al., Science (1980) 210:908-910.
En realizaciones preferidas, puede usarse un sistema de evaporacion de disolvente agua-en-aceite-en-agua (w/o/w) para formar las micropartfculas, segun las lmeas descritas por O'Hagan et al., Vaccine (1993) 11:965-969, PCT/US99/17308 (WO 00/06123) de O'Hagan et al., y Jeffery et al., Pharm. Res. (1993) 10:362.
En general, un polfmero de interes, tal como PLG, se disuelve en un disolvente organico, tal como acetato de etilo, dimetilcloruro (denominado tambien cloruro de metileno y diclorometano), acetonitrilo, acetona, cloroformo y similares. El
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
poKmero se proporcionara en una solucion aproximadamente al 1-30%, preferentemente aproximadamente al 2-15%, mas preferentemente aproximadamente al 3-10% y todavfa mas preferentemente aproximadamente al 4-8%, en disolvente organico. A continuacion, la solucion de poKmero se combina con un primer volumen de solucion acuosa y se emulsiona para formar una emulsion de aceite/agua. La solucion acuosa puede ser, por ejemplo, agua desionizada, solucion salina normal o una solucion tamponada tal como solucion salina tamponada con fosfato (PBS) o una solucion tampon de citrato sodico/acido etilendiaminotetracetico (citrato sodico/EDTA). Estas ultimas soluciones pueden (a) proporcionar una tonicidad, es decir, osmolalidad, que es esencialmente la misma que la de los fluidos fisiologicos normales y (b) mantener un pH compatible con las condiciones fisiologicas normales. De manera alternativa, las caractensticas de tonicidad y/o de pH de las composiciones de la presente invention pueden ajustarse despues de la formation de las micropartfculas y antes de la administration. Cuando una o mas especies deben ser atrapadas dentro de las micropartfculas, las especies pueden anadirse a la solucion de polfmero o a la solucion acuosa. Preferentemente, la relation de volumen de la solucion de polfmero respecto a la solucion acuosa vana de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 20:1, mas preferentemente aproximadamente de 10:1. La emulsification se lleva a cabo usando cualquier equipamiento apropiado para esta tarea y, tfpicamente, es un aparato de alto cizallamiento, tal como, por ejemplo, un homogeneizador.
En algunas realizaciones, uno o mas componentes estan atrapados dentro de las micropartfculas. Por ejemplo, el componente o los componentes puede introducirse mediante la adicion del mismo: (a) a la solucion de polfmero, si esta en forma soluble en aceite o dispersable en aceite, o (b) a la solucion acuosa, si estan en una forma soluble en agua o dispersable en agua.
A continuacion, un volumen de la emulsion o/w se combina preferentemente con un segundo volumen mayor de una solucion acuosa, que contiene tfpicamente un agente tensioactivo. La relacion en volumen de la solucion acuosa a la emulsion o/w oscila tfpicamente entre aproximadamente 2:1 y 10:1, mas tfpicamente de aproximadamente 4:1. Los ejemplos de tensioactivos adecuados para la practica de la invencion se han enumeran anteriormente. Las personas con conocimientos ordinarios en la materia pueden seleccionar facilmente agentes tensioactivos apropiados para el tipo de especie a adsorber. Por ejemplo, las micropartfculas fabricadas en presencia de tensioactivos cargados, tales como tensioactivos anionicos o cationicos, pueden producir micropartfculas con una superficie que tiene una carga neta negativa o positiva, que puede adsorber una amplia diversidad de moleculas. Por ejemplo, micropartfculas fabricadas con tensioactivos anionicos, tales como dodecil sulfato de sodio (SDS), por ejemplo, micropartfculas SDS-PLG, adsorben especies cargadas positivamente, por ejemplo, especies que contienen polipeptidos tales como protemas. De manera similar, las micropartfculas fabricadas con tensioactivos cationicos, tales como CTAB, por ejemplo, micropartfculas PLG/CTAB, adsorben especies cargadas negativamente, por ejemplo, especies que contienen polinucleotidos, tales como ADN. Cuando la especie a ser adsorbida tiene regiones de carga positiva y negativa, los agentes tensioactivos cationicos o anionicos o no ionicos pueden ser apropiados. En la presente invencion, los tensioactivos cationicos son preferentes. Ciertas especies pueden adsorberse mas facilmente en micropartfculas que tienen una combination de tensioactivos. Ademas, en algunos casos, puede ser deseable anadir tensioactivo a la solucion organica anterior.
Cuando se usa un agente tensioactivo cationico tal como CTAB, se proporciona tfpicamente en una solucion aproximadamente al 0,00025-1%, mas tfpicamente una solucion aproximadamente al 0,0025-0,1%. En general, se usa una relacion de peso a peso de tensioactivo a polfmero comprendida en el intervalo de aproximadamente 0,0001:1 a aproximadamente 0,5:1, mas tfpicamente de aproximadamente 0,001:1 a aproximadamente 0,1:1, e incluso mas tfpicamente de aproximadamente 0,0025:1 a aproximadamente 0,05:1.
A continuacion, la mezcla se homogeneiza para producir una doble emulsion w/o/w estable. Cada una de las etapas de homogeneizacion anteriores se lleva a cabo tfpicamente a una temperatura ambiente (es decir, 25°C) o mas baja, mas tfpicamente mas baja, por ejemplo, mientras se enfna en un bano de hielo.
A continuacion, los disolventes organicos se evaporan.
Los parametros de formulation pueden manipularse para permitir la preparation de pequenas micropartfculas del orden de 0,05 pm (50 nm) a micropartfculas mas grandes de 50 pm o incluso mas grandes. Vease, por ejemplo, Jeffery et al., Pharm. Res. (1993)10: 362-368; McGee et al., J. Microencap. (1996). Por ejemplo, la agitation reducida resulta en micropartfculas mas grandes, al igual que un aumento del volumen de fase interna y un aumento en la concentration de polfmero. Las partfculas pequenas se producen con una mayor agitacion, asf como volumenes de fase acuosa bajos, altas concentraciones de estabilizantes de emulsion y una reduction en la concentracion de polnriero.
El tamano de partfcula puede determinarse, por ejemplo, mediante dispersion de luz laser, usando por ejemplo, un espectrometro que incorpora un laser de helio-neon. En general, el tamano de partfcula se determina a temperatura ambiente e implica multiples analisis de la muestra en cuestion (por ejemplo, 5-10 veces) para dar un valor medio para el diametro de partfcula. El tamano de partfcula se determina tambien facilmente usando microscopfa electronica de barrido (SEM).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Despues de la preparacion, las micropartfculas pueden almacenarse como estan o liofilizadas para uso futuro. Con el fin de adsorber las especies deseadas en las micropartfculas, la preparacion de micropartfculas puede mezclarse simplemente con las especies de interes y la formulacion resultante puede liofilizarse antes de su uso, si se desea. El contenido de las especies adsorbidas puede determinarse usando tecnicas estandar.
Por ejemplo, las especies que contienen polinucleotidos pueden anadirse a las micropartfculas para producir micropartfculas con especies que contienen polinucleotidos adsorbidas que tienen una relacion peso-peso de tipicamente 0,1:1 a 0,25:1.
Las micropartfculas de polfmero de la presente invention pueden tener una diversidad de especies atrapadas o encapsuladas dentro de las mismas, y pueden tener tambien una diversidad de especies adsorbidas sobre las mismas. De esta manera, por ejemplo, una persona con conocimientos en la materia puede preparar, segun la invencion, micropartfculas que tienen adyuvantes adsorbidos y/o antigenos polipeptfdicos adsorbidos, ademas de especies que contienen polinucleotidos adsorbidos. Una persona con conocimientos en la materia pueden preparar tambien, segun la invencion, micropartfculas que tienen, por ejemplo, adyuvantes encapsulados, antigenos polipeptfdicos encapsulados y/o especies que contienen polinucleotidos encapsulados.
Una vez producidas las especies con micropartfculas adsorbidas, se formulan en composiciones farmaceuticas, incluyendo vacunas, para tratar y/o diagnosticar una amplia diversidad de trastornos. Las composiciones incluiran generalmente uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables. Por ejemplo, pueden usarse vehfculos tales como agua, solution salina, glicerol, polietilenglicol, acido hialuronico, etanol, etc. Otros excipientes, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponantes biologicas y similares, pueden estar presentes en dichos veldculos. Un tampon biologico puede ser virtualmente cualquier solucion que sea farmacologicamente aceptable y que proporcione a la formulacion el pH deseado, es decir, un pH en el intervalo fisiologico. Los ejemplos de soluciones incluyen solucion salina, solucion salina tamponada con fosfato, solucion salina tamponada con Tris, solucion salina tamponada de Hank y similares. Pueden introducirse tambien otros excipientes conocidos en la tecnica en la forma de dosificacion final, incluyendo ligantes, disgregantes, cargas (diluyentes), lubricantes, deslizantes (mejoradores de flujo), adyuvantes de compresion, colores, edulcorantes, conservantes, agentes de suspension/dispersantes, formadores de pelfculas/revestimientos, aromas y tintas de impresion.
Pueden usarse adyuvantes para mejorar la eficacia de las composiciones de micropartfculas. Los adyuvantes pueden administrarse simultaneamente con las micropartfculas de la presente invencion, por ejemplo, en la misma composition o en composiciones separadas. De manera alternativa, puede administrarse un adyuvante antes o despues de las composiciones de micropartfculas de la presente invencion. En algunas realizaciones, el adyuvante, tal como un adyuvante inmunologico, es encapsulado en la micropartfcula. De manera alternativa, el adyuvante puede ser adsorbido sobre la micropartfcula.
Los adyuvantes inmunologicos incluyen, pero no se limitan a: (1) sales de aluminio (alumina), tales como hidroxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio, etc.; (2) formulaciones de emulsion de aceite en agua (con o sin otros agentes inmunoestimulantes espedficos tales como peptidos de muramilo (vease a continuation) o componentes de la pared celular bacteriana), tales como por ejemplo (a) MF59 (publication internacional N° WO90/14837; Capftulo 10 en Vaccine design: the subunit and adjuvant approach, eds. Powell & Newman, Plenum Press 1995), que contiene 5% de escualeno, 0,5% de Tween 80 y 0,5% de Span 85 (que contiene opcionalmente diversas cantidades de MTP-PE (vease a continuacion), aunque no es necesario) formuladas en partfculas submicrometricas usando un microfluidizador tal como el microfluidizador Modelo 110Y (Microfluidics, Newton, MA), (b) SAF, que contiene 10% de escualeno, 0,4% de Tween 80, 5% de polfmero Pluronic bloqueado L121, y thr-MDP (vease a continuacion) microfluidizado en una emulsion submicrometrica o sometido a agitation vorticial para generar una emulsion con un tamano de partfcula mas grande, y (c) sistema adyuvante Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) que contiene 2% de escualeno, 0,2% de Tween 80, y uno o mas componentes de la pared celular bacteriana del grupo que consiste en monofosforil lfpido A (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM) y esqueleto de la pared celular (CWS), preferentemente MPL + CWS (Detox™) (para una discusion adicional de las emulsiones submicrometricas aceite-en-agua adecuadas para su uso en la presente invencion, vease la solicitud de patente N° 09/015.736, de propiedad legalmente adquirida, presentada el 29 de Enero de 1998); (3) pueden usarse adyuvantes de saponina, tales como Quil A, o QS21 (por ejemplo, Stimulon™ (Cambridge Bioscience, Worcester, MA)) o partfculas generadas a partir de los mismos, tales como ISCOM (complejos inmunoestimulantes), cuyos ICOMS pueden estar desprovistos de detergente adicional, por ejemplo, el documento WO00/07621; (4) adyuvante completo de Freund (CFA) y adyuvante incompleto de Freund (IFA); (5) citoquinas, tales como interleuquinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 (WO99/44636), etc.), interferones (por ejemplo interferon gamma), factor estimulante de colonias de macrofagos (M-CSF), factor de necrosis tumoral (TNF), etc.; (6) fosfolfpidos, por ejemplo, compuestos monofosforil lfpido A, incluyendo monofosforil lfpido A (MPL) y sus derivados, tales como MPL 3-O-desacilado (3dMPL), por ejemplo, documentos GB-2220221, EP-A-0689454, opcionalmente en ausencia sustancial de alumina cuando se usa con sacaridos de neumococos, por ejemplo, WO00/56358; (7) combinaciones de 3dMPL, por ejemplo, con QS21 y/o emulsiones de aceite-en-agua, por ejemplo, documentos EP-A-0835318, EP-A-0735898, EP-A-0761231; (8) oligonucleotidos que comprenden motivos CpG, descritos anteriormente; (9) un eter de polioxietileno o un ester de
16
polioxietileno, por ejemplo, el documento WO99/52549; (10) un tensioactivo de ester de polioxietilen sorbitan en combinacion con un octoxinol (documento WO01/21207) O un eter de polioxietilen alquilo o tensioactivo de ester en combinacion con al menos un agente tensioactivo no ionico adicional tal como un octoxinol (documento WO01/21152); (11) una saponina y un oligonucleotido inmunoestimulante (por ejemplo, un oligonucleotido CpG) (documento 5 WO00/62800); (12) un inmunoestimulante y una partfcula de sal metalica, por ejemplo, documento WO00/23105; (13)
una saponina y una emulsion de aceite-en-agua, por ejemplo, documento WO99/11241; (14) una saponina (por ejemplo, QS21) + 3dMPL + IL-12 (opcionalmente + un esterol), por ejemplo, documento WO98/57659; (15) mutantes detoxificados de una toxina bacteriana que ribosila ADP, tal como una toxina del colera (CT), una toxina pertussis (PT), o una toxina termo-labil de E. coli (LT), particularmente LT-K63 (donde la lisina se sustituye por el aminoacido de tipo salvaje en la 10 posicion 63), LT-R72 (donde la arginina se sustituye por el aminoacido de tipo salvaje en la posicion 72), CT-S109 (donde
la serina se sustituye por el aminoacido de tipo salvaje en la posicion 109), y PT-K9/G129 (donde la lisina se sustituye por el aminoacido de tipo salvaje en la posicion 9 y la glicina sustituida en la posicion 129) (vease, por ejemplo, las publicaciones internacionales N° WO93/13202 y WO92/19265); (16) adyuvantes que comprenden ARNdc, descritos anteriormente; y (17) otras sustancias que actuan como agentes inmunoestimulantes para mejorar la eficacia de la 15 composicion.
Los peptidos de muramilo incluyen, pero no se limitan a, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil- normuramil-L-alanil-D-isoglutamo (nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isogluatminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn- glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE), etc.
Para ejemplos adicionales de adyuvantes, vease Vaccine Design, The Subunit and the Adjuvant Approach, Powell, M.F. y 20 Newman, M.J, eds., Plenum Press, 1995).
Una vez formuladas, las composiciones de la invention pueden administrarse por via parenteral, por ejemplo, por inyeccion (que puede ser sin aguja). Las composiciones pueden inyectarse por via subcutanea, intraperitoneal, intravenosa, intraarterial, intradermica o intramuscular. Otros modos de administration incluyen la administration nasal, mucosal, intraocular, rectal, vaginal, oral y pulmonar, supositorios, y aplicaciones transdermicas o transcutaneas.
25 El tratamiento de dosificacion puede ser un programa de dosis unica o un programa de dosis multiple. Un programa de dosis multiple es uno en el que puede proporcionarse un curso primario de administracion, por ejemplo, con 1-10 dosis separadas, seguido de otras dosis administradas a intervalos de tiempo posteriores, elegidos para mantener y/o reforzar la respuesta terapeutica, por ejemplo en 1-4 meses para una segunda dosis y, si es necesario, una dosis subsiguiente o dosis subsiguientes despues de varios meses. El regimen de dosificacion vendra determinado tambien, al menos en 30 parte, por la necesidad del sujeto y dependera del criterio del medico.
Ademas, si se desea la prevention de la enfermedad, las micropartfculas se administran generalmente antes de la infection primaria con el patogeno de interes. Si se desea el tratamiento, por ejemplo, la reduction de los smtomas o las recurrencias, las micropartfculas se administran generalmente despues de la infeccion primaria.
C. Parte experimental
35 A continuation, se presentan ejemplos de realizaciones espedficas para llevar a cabo la presente invencion. Los ejemplos
se ofrecen con propositos ilustrativos, y no pretenden limitar el alcance de la presente invencion, en modo alguno.
Se han realizado esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a las cifras usadas (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc.) pero, por supuesto, debenan permitirse algunos errores y desviaciones experimentales.
Ejemplo 1
40 Preparation de microparticulas
Se emulsionan 16,6 ml de 6% p/v RG504 (un polfmero PLG que tiene una relation molar de 50:50 de lactido/glicolido y un peso molecular de 42-45 kDaltons, disponible de Boehringer Ingelheim) en cloruro de dimetilo, en un bano de hielo, con 1,5 ml de tampon TE usando la sonda de 10 mm de un homogeneizador de mesa Omni durante 3 minutos a 10.000 rpm. A esta emulsion o/w primaria se anaden 70 ml de una solucion de agua destilada que contiene 10 mg de CTAB 45 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), seguido de homogeneizacion durante 15 minutos a 10.000 rpm, tambien en un bano de hielo. Esto resulta en la formation de una emulsion w/o/w, que se agita posteriormente con un agitador magnetico durante la noche, permitiendo que el cloruro de metileno se evapore. Despues de agitation durante la noche, permanecen 72 ml de una suspension, que contienen 1 g de PLG (14 mg PLG/ml) y 10 mg de CTAB (0,14 mg de CTAB/ml), o 1% de CTAB con relacion a PLG (denominado en la presente memoria una "suspension de CTAB al 1%").
50 Este procedimiento se repite, excepto que se proporcionan 40 mg de CTAB en la solution de agua destilada. Esto produce una suspension que contiene 1 g de PLG (14 mg de PLG/ml) y 40 mg de CTAB (0,56 mg PLG/ml), o 4% de CTAB vis-a-vis con PLG (denominado en la presente memoria una" suspension de CTAB al 4%").
Ejemplo 2
Absorcion de ADN sobre la superficie de las microparticulas
Se preparan soluciones de 2 mg/ml y de 4 mg/ml de ADN en 1x tampon TE. En este ejemplo, el ADN es un plasmido pCMVgag que codifica para protema p55 gag de VIH bajo el control del promotor temprano de citomegalovirus. Se 5 prepara una primera mezcla (denominada "1% CTAB, 4% de ADN") combinando 7,15 ml de la suspension de CTAB al 1% (que contiene 100 mg de PLG) con 2 ml de la solucion de ADN de 2 mg/ml (que contiene 4 mg de ADN). Se permite que la adsorcion se lleve a cabo agitando suavemente con un agitador magnetico durante 6 horas a 4°C, seguido de liofilizacion.
Se prepara una segunda mezcla (denominada como "1% de CTAB, 8% de ADN") combinando 7,15 ml de la suspension 10 de CTAB al 1% (que contiene 100 mg de PLG) con 2 ml de la solucion de ADN de 4 mg/ml (que contiene 8 mg de ADN), seguido de agitacion y liofilizacion.
Se crean mezclas adicionales, tal como se indica en la Tabla 1 a continuacion.
Tabla 1.
Suspension 1% deCTAB Suspension 4% de CTAB Solucion de ADN de 2 mg/ml Solucion de ADN de 4 mg/ml
1% de CTAB, 4% de ADN
7,15 ml 2 ml
1% de CTAB, 8% de ADN
7,15 ml 2 ml
1% de CTAB, 12% de ADN
7,15 ml 3 ml
1% de CTAB, 16% de ADN
7,15 ml 4 ml
1% de CTAB, 20% de ADN
7,15 ml 5 ml
4% de CTAB, 4% de ADN
7,15 ml 2 ml
4% de CTAB, 8% de ADN
7,15 ml 2 ml
4% de CTAB, 12% de ADN
7,15 ml 3 ml
4% de CTAB, 16% de ADN
7,15 ml 4 ml
4% de CTAB, 20% de ADN
7,15 ml 5 ml
15 El tamano de las microparticulas se determina en un medidor de tamanos Malvern Master despues de la liofilizacion. Los tamanos medidos fueron de 15 micrometros o menos.
Ejemplo 3
Cuantificacion de ADN sobre la superficie de las microparticulas
El contenido total de ADN se analizo re-suspendiendo 10 mg de las microparticulas de NaOH 0,2 N liofilizadas y 20 realizando una lectura de la solucion clara despues de la hidrolisis a 260 nm. Los resultados se proporcionan en la Tabla 2 a continuacion. Se analizo la liberacion de ADN in vitro re-suspendiendo 10 mg de las microparticulas liofilizadas en 1 ml de PBS y agitando a 37°C. El sobrenadante se ensayo despues de 24 horas para determinar el contenido de ADN mediante la lectura de la absorbancia a 260 nm.
La cantidad de ADN adsorbido (cargado) en las microparticulas despues de 24 horas se calcula restando la cantidad de 25 ADN en el sobrenadante del contenido total de ADN. La eficiencia de carga se calculo en base a la cantidad de ADN adsorbido con relacion al ADN que se anade a la suspension de CTAB (denominado "ADN diana"). Los resultados se proporcionan en la Tabla 2 a continuacion.
Tabla 2.
Carga de ADN diana (%p)
Eficiencia de carga (%)
5
10
15
20
25
1% de CTAB, 4% de ADN
4 76
1% de CTAB, 8% de ADN
8 72
1% de CTAB, 12% de ADN
12 68
1% de CTAB, 16% de ADN
16 54
1% de CTAB, 20% de ADN
20 54
4% de CTAB, 4% de ADN
4 88
4% de CTAB, 8% de ADN
8 78
4% de CTAB, 12% de ADN
12 76
4% de CTAB, 16% de ADN
16 64
4% de CTAB, 20% de ADN
20 62
Ejemplo 4
Protocolo de inmunizacion
Se preparan formulaciones inyectables de ADN mediante la suspension de micropartfculas liofilizadas de cada uno de los grupos anteriores (en el que la cantidad espedfica de cada grupo es la cantidad que se requiere para proporcionar 10 |jg de ADN) en 0,1 ml de agua para inyeccion. A continuacion, la formulacion inyectable de ADN se inyecta por via intramuscular a ratones Balb-C. Se inyectan tambien 10 g de ADN solo a los ratones como control. Cada formulacion se inyecta en 10 ratones. Los ratones recibieron dosis de refuerzo despues de cuatro semanas.
Ejemplo 5
Inmunoensayo
Dos semanas despues de la segunda inmunizacion (seis semanas en total), se recogio la sangre heparinizada y se recupero el plasma mediante centrifugacion. Se midieron los anticuerpos anti-VIH mediante un ensayo de inmunoabsorcion ligado a enzimas (ELISA) como se indica a continuacion. Los pocillos de placas de microtitulacion se revistieron con protema VIH-1.SF2 p55gag recombinante.a 5 microgramos/ml en PBS, 50 microlitros por pocillo, y se incubaron a 4°C durante la noche. Las placas se lavaron seis veces con tampon de lavado (PBS, 0,3% de Tween 20) y se bloquearon a 37°C durante 1 h con 200 microlitros por pocillo de tampon de bloqueo (PBS, 0,3% de Tween 20,5% de suero de cabra). Las muestras de ensayo se diluyeron 1:25 y, a continuacion, se diluyeron en serie tres veces en tampon de bloqueo. La solucion de bloqueo se aspiro y, a continuacion, las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h con 70 microlitros por pocillo de cada dilucion de plasma. Despues de lavarse seis veces, las placas se incubaron durante 1 h a 37°C anti-IgG conjugado con peroxidasa de rabano (dilucion 1:8.000). Despues de seis lavados, las placas se desarrollaron con sustrato TMB durante 15 minutos. La reaccion se detuvo con HCl 2 N y las densidades opticas (DO) se midieron a una longitud de onda de 450 nm. El tftulo se calculo que era el redproco de la dilucion a la que se consiguio una DO450nm de 0,5.
Los resultados se resumen en la Tabla 3 siguiente:
Tabla 3.
Formulacion
GMT Superior Inferior
PLG/1% CTAB, 4% p55 DNA, 10 pg
2.011 1.582 2.556
PLG/1% CTAB, 8% p55 DNA, 10 pg
1.100 522 2.318
PLG/1% CTAB, 12% p55 DNA, 10 pg
1.328 963 1.831
PLG/1% CTAB, 16% p55 DNA, 10 pg
2.517 1.908 3.321
PLG/1% CTAB, 20% p55 DNA, 10 pg
2.341 1.822 3.007
PLG/4% CTAB, 4% p55 DNA, 10 pg
143 67 308
PLG/4% CTAB, 8% p55 DNA, 10 pg
765 536 1.094
PLG/4% CTAB, 12% p55 DNA, 10 pg
292 217 391
PLG/4% CTAB, 16% p55 DNA, 10 pg
443 345 568
PLG/4% CTAB, 20% p55 DNA, 10 pg
525 276 1.001
VIH p55 DNA, 10 pg
343 191 617
Tal como puede verse a partir de la tabla anterior, las micropartfculas PLG-CTAB con el ADN adsorbido indujeron tftulos de anticuerpos significativamente mejorados en ratones en comparacion con el ADN desnudo. Ademas, para cada carga 5 diana de ADN (4%, 8%, 12%, 16% y 20%), las micropartfculas PLG con 1% de CTAB mostraron tftulos de anticuerpos significativamente mejorados en ratones con relacion a las micropartfculas PLG con 4% de CTAB.
Ejemplo 6
Ensayo CTL
Los bazos de los ratones inmunizados se recogieron tambien a las 6 semanas y se llevo a cabo un ensayo “immunospot” 10 ligado a enzima (ELISPOT) estandar. Brevemente, se preparan suspensiones unicelulares a partir del bazo y la concentracion se ajusta a 3 X 107 celulas/ml. Se anaden 100 pl de la suspension de celulas a la primera fila de placas de 96 pocillos PVDF (difluoruro de polivinilideno), que han sido revestidas previamente durante la noche con la IFN-y anti- raton de rata (Pharmingen). Despues de incubacion durante la noche a 37°C, las placas se lavan y se anade anti-IFN-Y biotinilado (Pharmingen). Despues de incubar las placas a temperatura ambiente durante 2 h y lavarlas, se anade avidina- 15 peroxidasa (Pharmingen), y las placas se incuban durante 30 min a 37°C y se lavan. Las placas se desarrollan con solucion de aminoetil carbazol (Sigma) durante 30 minutos. El desarrollo de color se detiene lavando con agua del grifo. Se realiza un recuento de las manchas en un lector Zeiss ELISPOT.
Los datos se presentan en la Tabla 4 siguiente.
Tabla 4.
GMT SE
1% de CTAB, 4% de ADN, 10 pg
564 110
1% de CTAB, 8% de ADN, 10 pg
633 103
1% de CTAB, 12% de ADN, 10 pg
1.077 278
1% de CTAB, 16% de ADN, 10 pg
1.576 152
1% de CTAB, 20% de ADN, 10 pg
782 352
4% de CTAB, 4% de ADN, 10 pg
-- --
(Cont.)
4% de CTAB, 8% de ADN, 10 pg
264 169
4% de CTAB, 12% de ADN, 10 pg
731 190
4% de CTAB, 16% de ADN, 10 pg
517 99
4% de CTAB, 20% de ADN, 10 pg
507 160
VIH p55 DNA, 10 pg
498 230
Tal como puede verse a partir de la tabla anterior, las micropartfculas PLG-CTAB con el ADN adsorbido resultaron en una mayor induccion de CTL en ratones en comparacion con el ADN desnudo. Ademas, para todas las cargas diana de ADN 5 (4%, 8%, 12%, 16% y 20%), las micropartfculas de PLG con 1% CTAB mostraron una induccion de CTL
significativamente mejorada con relacion a las micropartfculas de PLG con 4% CTAB.

Claims (38)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    REIVINDICACIONES
    1. Micropartfculas que comprenden: (a) un poKmero biodegradable seleccionado de entre un poli (acido alfa-hidroxi), un acido polihidroxi butfrico, una policaprolactona, un poliortoester, un poliantndrido y un policianoacrilato; (b) un tensioactivo cationico; y (c) una primera molecula que contiene polinucleotidos adsorbidos sobre la superficie de las micropartfculas, en el que la primera molecula que contiene polinucleotidos adsorbidos constituye entre el 10 y el 30 por ciento del peso total de las micropartfculas.
  2. 2. Micropartfculas segun la reivindicacion 1, en las que el tensioactivo cationico comprende bromuro de cetiltrimetilamonio.
  3. 3. Micropartfculas segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en las que las micropartfculas tienen un diametro comprendido entre 200 nanometros y 20 micrometros.
  4. 4. Micropartfculas segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en las que el polfmero comprende un acido polihidroxi butrnco, una policaprolactona, un poliortoester, un polianhfdrido o un policianoacrilato.
  5. 5. Micropartfculas segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en las que el polfmero comprende un poli (acido a- hidroxi).
  6. 6. Micropartfculas segun la reivindicacion 5, en las que el polfmero comprende un poli (acido a-hidroxi) seleccionado de entre poli (L-lactido), poli (D,L-lactido) y poli (lactido-co-glicolido).
  7. 7. Micropartfculas segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en las que la primera molecula que contiene polinucleotido es un adyuvante inmunologico, comprende un oligonucleotido CpG o ARNdc, codifica un antfgeno que contiene polipeptido, o es un constructo vectorial que codifica un antfgeno que contiene polipeptido.
  8. 8. Micropartfculas segun la reivindicacion 7, en las que el constructo vectorial es un constructo vectorial de ARN.
  9. 9. Micropartfculas segun la reivindicacion 7, en las que el constructo vectorial es un constructo vectorial de ADN.
  10. 10. Micropartfculas segun la reivindicacion 9, en las que el constructo vectorial de ADN es un plasmido.
  11. 11. Micropartfculas segun la reivindicacion 10, en las que el plasmido es pCMV.
  12. 12. Micropartfculas segun la reivindicacion 9, en las que el constructo vectorial de ADN es un plasmido basado en virus de ARN.
  13. 13. Micropartfculas segun la reivindicacion 12, en las que el plasmido basado en virus de ARN es un plasmido basado en alfavirus.
  14. 14. Micropartfculas segun la reivindicacion 13, en las que el plasmido basado en alfavirus es un plasmido basado en virus Sindbis.
  15. 15. Micropartfculas segun la reivindicacion 14, en las que el plasmido es pSINCP.
  16. 16. Micropartfculas segun la reivindicacion 9, en las que el constructo vectorial de ADN comprende un promotor 5' eucariotico de ADNc viral que inicia dentro de una celula la smtesis 5' a 3' de ARN a partir de ADNc, en las que el ARN comprende un constructo vectorial que se amplifica de manera autonoma en una celula, en las que el constructo vectorial expresa una secuencia de acido nucleico heterologa.
  17. 17. Micropartfculas segun una cualquiera de las reivindicaciones 7-16, en las que el antfgeno que contiene polipeptidos se deriva a partir de un organismo patogeno o un tumor.
  18. 18. Micropartfculas segun la reivindicacion 17, en las que el organismo patogeno se selecciona de entre un virus, una bacteria, un hongo y un parasito.
  19. 19. Micropartfculas segun la reivindicacion 17, en las que el organismo patogeno se selecciona de entre VIH, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, meningitis B, Haemophilus influenza tipo B, tos ferina, difteria, tetanos y virus de la gripe A.
  20. 20. Micropartfculas segun una cualquiera de las reivindicaciones 7-16, en las que el antfgeno que contiene polipeptidos se deriva a partir de VIH gp120, VIH gp140, VIH gp160, VIH p24gag o VIH p55gag.
  21. 21. Micropartfculas segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-20, que comprende ademas una molecula que contiene polinucleotidos, una molecula que contiene polipeptidos, una molecula que contiene polisacaridos, una hormona,
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    una enzima, o un adyuvante inmunologico, atrapados en el interior de las micropartfculas.
  22. 22. Micropartfculas segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-20, que comprende ademas una segunda molecula que contiene polinucleotidos, una molecula que contiene polipeptidos, una molecula que contiene polisacaridos, una hormona, una enzima o un adyuvante inmunologico, adsorbidos en las micropartfculas.
  23. 23. Micropartfculas segun la reivindicacion 21 o 22, en las que las micropartfculas comprenden ademas un antfgeno que contiene polipeptidos.
  24. 24. Micropartfculas segun la reivindicacion 21 o 22, en las que las micropartfculas comprenden ademas una molecula que contiene polinucleotidos.
  25. 25. Micropartfculas segun la reivindicacion 21 o 22, en las que las micropartfculas comprenden ademas un adyuvante inmunologico.
  26. 26. Micropartfculas segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-25, en las que las micropartfculas comprenden del 0,1 al 10% en peso de tensioactivo cationico.
  27. 27. Micropartfculas segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-26, en las que el tensioactivo cationico esta presente durante la formacion de las micropartfculas, y en las que no se lleva a cabo una etapa de eliminacion del tensioactivo cationico despues de la formacion de las micropartfculas.
  28. 28. Micropartfculas segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-27, en las que una primera parte del tensioactivo cationico se une al polfmero, en las que una segunda parte del tensioactivo cationico forma un complejo con la primera molecula que contiene polinucleotidos, en las que el complejo se adsorbe sobre la superficie de las micropartfculas, y en las que la primera parte del tensioactivo y la segunda parte del tensioactivo comprenden el mismo tensioactivo o tensioactivos diferentes.
  29. 29. Micropartfculas segun la reivindicacion 28, en las que las partes de tensioactivo primera y segunda comprenden el mismo tensioactivo.
  30. 30. Un procedimiento de produccion de las micropartfculas segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-30, que comprende: (a) formar una emulsion agua/aceite/agua que comprende el polfmero y el tensioactivo cationico; (b) eliminar el disolvente organico de la emulsion, para formar las micropartfculas; y (c) adsorber la primera molecula que contiene polinucleotido en las micropartfculas.
  31. 31. Procedimiento segun la reivindicacion 30, en la que las micropartfculas no se someten a una etapa de eliminacion de tensioactivo cationico despues de la formacion de las micropartfculas.
  32. 32. Micropartfculas fabricadas segun el procedimiento de la reivindicacion 30 o la reivindicacion 31.
  33. 33. Una composicion de micropartfculas que comprende las micropartfculas segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-29 y 32 y un excipiente farmaceuticamente aceptable.
  34. 34. Composicion de micropartfculas segun la reivindicacion 33, que comprende ademas un adyuvante inmunologico.
  35. 35. Composicion de micropartfculas segun la reivindicacion 34, en la que el adyuvante inmunologico se selecciona de entre oligonucleotidos CpG, MF59, ARNdc, toxinas termolabiles de E. coli, compuestos de fosfolfpidos y sales de aluminio.
  36. 36. Composicion de micropartfculas segun una cualquiera de las reivindicaciones 33-35, en la que la composicion de micropartfculas es una composicion inyectable.
  37. 37. Composicion de micropartfculas que comprende: (a) las micropartfculas segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-29 y 32, y (b) micropartfculas adicionales que comprenden un polfmero biodegradable y un adyuvante inmunologico adsorbido sobre la superficie de las micropartfculas adicionales.
  38. 38. Composicion de micropartfculas que comprende: (a) las micropartfculas segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-29 y 32, y (b) micropartfculas adicionales que comprenden un polfmero biodegradable y un adyuvante inmunologico atrapado en el interior de las micropartfculas adicionales.
ES04702174.6T 2003-01-14 2004-01-14 Micropartículas que comprenden polinucleótidos adsorbidos en la superficie de micropartículas o atrapados en el interior de las mismas Expired - Lifetime ES2615029T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US43994003P 2003-01-14 2003-01-14
US439940P 2003-01-14
PCT/US2004/000923 WO2004065578A2 (en) 2003-01-14 2004-01-14 Microparticles comprising polynucleotide adsorbed on the surface of or entrapped within the microparticles

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2615029T3 true ES2615029T3 (es) 2017-06-05

Family

ID=32771761

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES04702174.6T Expired - Lifetime ES2615029T3 (es) 2003-01-14 2004-01-14 Micropartículas que comprenden polinucleótidos adsorbidos en la superficie de micropartículas o atrapados en el interior de las mismas

Country Status (5)

Country Link
US (2) US20050191358A1 (es)
EP (1) EP1596834B1 (es)
CA (1) CA2513418C (es)
ES (1) ES2615029T3 (es)
WO (1) WO2004065578A2 (es)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060110736A1 (en) 2002-10-07 2006-05-25 John Donnelly Hiv vaccine formulations
CA2548992A1 (en) * 2003-12-11 2005-08-11 Vaxdesign Corporation Immunotherapy compositions, method of making and method of use thereof
ES2434029T3 (es) * 2004-11-15 2013-12-13 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Composiciones inmunogénicas que contiene antígeno de antrax, micropartículas de polímero biodegradable, y adyuvante inmunológico que contiene polinucleótido
WO2007099494A1 (en) 2006-03-01 2007-09-07 Koninklijke Philips Electronics, N.V. Motion adaptive ambient lighting
US9393295B2 (en) * 2008-04-28 2016-07-19 Novartis Ag Nanoparticles for use in pharmaceutical compositions
WO2011119881A1 (en) * 2010-03-24 2011-09-29 Northeastern University Multi-compartmental macrophage delivery
ES2829819T3 (es) 2010-08-26 2021-06-02 Toray Industries Composición inmunogénica

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6884435B1 (en) * 1997-01-30 2005-04-26 Chiron Corporation Microparticles with adsorbent surfaces, methods of making same, and uses thereof
JP4918188B2 (ja) * 1997-12-16 2012-04-18 ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド サブミクロンの水中油型エマルジョンと合わせた微粒子の使用
CA2392071C (en) * 1999-11-19 2012-01-10 Chiron Corporation Microparticle-based transfection and activation of dendritic cells
WO2001047551A2 (en) * 1999-12-01 2001-07-05 Chiron Corporation Eliciting antibodies specific for hepatitis c virus (hcv)
CA2420621C (en) * 2000-09-28 2011-05-24 Chiron Corporation Microparticle compositions and methods for the manufacture thereof
CN1468089B (zh) * 2000-09-28 2011-09-21 诺华疫苗和诊断公司 用于传送异源核酸的微粒体
WO2003002065A2 (en) * 2001-06-29 2003-01-09 Chiron Corporation Hcv e1e2 vaccine compositions
AR045702A1 (es) * 2001-10-03 2005-11-09 Chiron Corp Composiciones de adyuvantes.

Also Published As

Publication number Publication date
WO2004065578A3 (en) 2004-09-30
WO2004065578A2 (en) 2004-08-05
EP1596834B1 (en) 2016-11-30
CA2513418A1 (en) 2004-08-05
EP1596834A2 (en) 2005-11-23
US20050191358A1 (en) 2005-09-01
US20150072016A1 (en) 2015-03-12
CA2513418C (en) 2016-04-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2328697T3 (es) Composiciones inmunogenicas basadas en microparticulas biodegradables que comprenden un toxoide de difteria y de tetanos.
ES2278786T3 (es) Composiciones de microparticulas y procedimientos de fabricacion de las mismas.
JP5832485B2 (ja) 吸着したポリペプチド含有分子を有する微粒子
EP1585542B1 (en) Immunogenic compositions containing phospholipid
ES2260291T3 (es) Microparticulas para la administracion de acidos nucleicos heterologos.
US20150072016A1 (en) Microparticles with adsorbed polynucleotide-containing species
RU2295954C2 (ru) Микрочастицы для доставки гетерологичных нуклеиновых кислот
ES2387565T3 (es) Composiciones inmunogénicas que contienen fosfolípidos