ES2829819T3

ES2829819T3 - Composición inmunogénica

Info

Publication number: ES2829819T3
Application number: ES11819971T
Authority: ES
Inventors: Yoichiro Koshi; Reiji Nishio; Yoshinori Kakizawa
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 2010-08-26
Filing date: 2011-08-25
Publication date: 2021-06-02
Anticipated expiration: 2031-08-25
Also published as: KR101843385B1; CA2809230A1; EP2609931A4; AU2011294244B2; CA2809230C; DK2609931T3; AU2011294244A1; RU2593789C2; MX2013002193A; US20130156859A1; JP5895535B2; BR112013004353B1; EP2609931B1; EP2609931A1; JPWO2012026508A1; WO2012026508A1; US20160038421A1; US9980913B2; BR112013004353A2; KR20130115098A

Abstract

Composición inmunogénica que comprende, como ingredientes eficaces: una micropartícula inmunogénica compuesta por un complejo de antígeno-micropartícula adyuvante, en la que uno o más antígenos están encapsulados en una micropartícula adyuvante compuesta por uno o más polímeros anfifílicos, cuyo segmento o segmentos hidrófobos son ácido poli(láctico-co-glicólico) y cuyo segmento hidrófilo es un polisacárido; y un surfactante; estando dicho surfactante encapsulado en dicha micropartícula inmunogénica y comprendiendo una estructura de éster de ácido graso.

Description

DESCRIPCIÓN

Composición inmunogénica

SECTOR TÉCNICO

La presente invención se refiere a una composición inmunogénica que comprende como ingrediente eficaz una micropartícula inmunogénica, la cual comprende: un complejo de antígeno-micropartícula adyuvante, en el que uno o más antígenos están encapsulados en una micropartícula adyuvante compuesta por uno o más polímeros anfifílicos; y un surfactante.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

Para la mejora de la capacidad de activación inmune de un antígeno, se utiliza un adyuvante junto con el antígeno. Aunque se sabe que el adyuvante completo de Freund (CFA, complete Freund adjuvant) tiene un efecto excelente como adyuvante, el CFA está compuesto de bacterias muertas y una emulsión en aceite y, por lo tanto, tiene efectos secundarios potentes, tales como una fuerte reacción inflamatoria y la formación de hinchazón ulcerativa (granuloma) en el sitio de administración. Por lo tanto, la utilización del CFA para seres humanos no está permitida por motivos de seguridad. Por consiguiente, los adyuvantes cuya administración a seres humanos está permitida son limitados.

Entre los ejemplos de adyuvantes cuya administración a seres humanos está permitida se incluyen adyuvantes de hidróxido de aluminio, pero sus capacidades de activación inmune no son necesariamente suficientes y, por tanto, deben administrarse repetidamente para lograr la adquisición de inmunidad. Por lo tanto, se ha exigido el desarrollo de una composición inmunogénica que utilice un adyuvante potente y eficaz, cuya composición se pueda utilizar en seres humanos.

Para el desarrollo de un adyuvante novedoso con el objetivo de lograr una capacidad de activación inmune elevada, se ha intentado un procedimiento en el que se encapsula un antígeno en una micropartícula. Se ha descrito que la administración de un antígeno microparticulado potencia reacciones inmunológicas, tales como la producción de anticuerpos, en comparación con el caso de la administración de un antígeno solo, pero el efecto de su administración no es necesariamente elevado y solamente se ha descrito un efecto casi al mismo nivel que en el caso del adyuvante de hidróxido de aluminio mencionado anteriormente. Se considera que esto es debido a la dificultad en un encapsulado eficaz de las moléculas de antígeno hidrófilas, tales como proteínas, en micropartículas estudiadas hasta el momento, tales como micropartículas compuestas por copolímeros hidrófobos de ácido poliláctico-ácido poliglicólico, manteniendo a la vez las estructuras de las moléculas de antígeno (documento que no es de patente 1).

En los últimos años, se ha descrito una nueva tecnología de micropartículas (documentos de patente 1 y 2), cuya tecnología utiliza un polímero anfifílico y permite la encapsulación altamente eficaz de una proteína de alto peso molecular. Aunque esta micropartícula novedosa se ha estudiado por su rendimiento de liberación sostenida para fármacos, no se ha estudiado en absoluto su función adyuvante en casos de encapsulación de un antígeno en la misma. Además, con respecto al mecanismo mediante el cual una micropartícula que contiene un antígeno funciona como adyuvante, se cree que la función de liberación sostenida de la molécula de antígeno, así como el mecanismo mediante el cual la micropartícula que contiene un antígeno se incorpora en su totalidad en un inmunocito y libera el antígeno en la célula son importantes, y que la función de liberación del fármaco de la partícula y el rendimiento como adyuvante no están necesariamente correlacionados entre sí. Por lo tanto, es difícil inferir la función de adyuvante basándose en el rendimiento de liberación sostenida de la partícula, y hasta ahora no se ha conseguido un adyuvante eficaz que tenga un rendimiento mucho mejor que los adyuvantes de aluminio mediante tecnologías convencionales que utilizan micropartículas a pesar de la demanda de su desarrollo.

El documento de patente 3, un documento en virtud del artículo 54(3) CPE, da a conocer una composición inmunogénica que comprende un antígeno encapsulado en micropartículas de dextrano-PLGA que después de la administración a ratones generó una respuesta de anticuerpos superior a la obtenida con el antígeno adyuvantado con Alum.

El documento de patente 4 se refiere a una composición inmunogénica que comprende un antígeno encapsulado en micropartículas de dextrano-PLGA o dextrano-PLA. Se puede añadir un modificador de superficie, tal como éster de ácido monograso de polioxietilensorbitán a la capa exterior del polímero anfifílico.

El documento que no es de patente 2 da a conocer micropartículas de PLG preparadas utilizando diferentes surfactantes. En particular, se prepararon micropartículas de poli (lactida-co-glicólido) (PLGA) mediante la técnica de emulsificación/evaporación del disolvente, en la que las micropartículas de PLGA han encapsulado un antígeno proteico (OVA) asociado con las micropartículas. Tres tipos de surfactantes, PVA, poli(monooleato de oxietilenglicerol) y sales biliares se unieron a la superficie de las micropartículas.

DOCUMENTOS DEL ESTADO DE LA TÉCNICA

Documentos de patente

[Documento de patente 1] WO2006/095668

[Documento de patente 2] JP 2008-088158 A

[Documento de patente 3] EP 2402032 A1

[Documento de patente 4] WO 2009/104706 A1

Documentos que no son de patente

[Documento que no es de patente 1] Advanced drug delivery reviews, 2005, volumen 57, págs. 391-410.

[Documento que no es de patente 2] VACCINE, volumen 15, no. 17-18, 1997, págs. 1.888-1.897.

CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN

PROBLEMAS QUE DEBE RESOLVER LA INVENCIÓN

La presente invención pretende dar a conocer una composición inmunogénica que muestra una alta capacidad de activación inmune, incluso con una cantidad pequeña de antígeno y/o un número pequeño de dosis.

MEDIOS PARA RESOLVER LOS PROBLEMAS

A efectos de resolver los problemas descritos anteriormente, los inventores de la presente invención estudiaron un procedimiento mediante el cual se puede inducir un nivel elevado de activación inmune utilizando una cantidad pequeña de antígeno y con un número pequeño de dosis del mismo y, como resultado, descubrieron que una composición inmunogénica que comprende, como ingredientes eficaces: una micropartícula inmunogénica compuesta por un complejo de antígeno-micropartícula adyuvante, en el que uno o más antígenos están encapsulados en una micropartícula adyuvante; y un surfactante; tiene una capacidad elevada de activación inmune in vivo. Es decir, la presente invención tiene la siguiente constitución.

(1) Una composición inmunogénica que comprende, como ingredientes eficaces: una micropartícula inmunogénica compuesta por un complejo de antígeno-micropartícula adyuvante, en el que uno o más antígenos están encapsulados en una micropartícula adyuvante compuesta por uno o más polímeros anfifílicos, cuyo segmento o segmentos hidrófobos son ácido poli(láctico-co-glicólico) y cuyo segmento hidrófilo es un polisacárido; y un surfactante; estando el surfactante encapsulado en la micropartícula inmunogénica y comprendiendo una estructura de éster de ácido graso.

(2) La composición inmunogénica, según (1), en la que la micropartícula inmunogénica es una partícula compuesta por el complejo de antígeno-micropartícula adyuvante asociado entre sí.

(3) La composición inmunogénica, según (1) o (2), en la que el polímero anfifílico es un polímero anfifílico de injerto compuesto por una cadena principal de polisacárido y una o más cadenas de injerto de ácido poli(láctico-co-glicólico).

(4) La composición inmunogénica, según (1) a (3), en la que el polisacárido es dextrano.

(5) La composición inmunogénica, según cualquiera de (1) a (4), en la que el surfactante comprende, además, una estructura o estructuras de monosacárido y/o polietilenglicol.

(6) La composición inmunogénica, según cualquiera de (1) a (5), en la que el surfactante es uno o más seleccionados del grupo que consiste en polisorbato 80, polisorbato 20, monooleato de sorbitán, trioleato de sorbitán y aceite de ricino hidrogenado y polioxietilenado.

(7) Un procedimiento para preparar una composición inmunogénica que comprende como ingrediente eficaz una micropartícula inmunogénica, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

disolver uno o más surfactantes en un disolvente acuoso A, en el que uno o más antígenos están disueltos o en un disolvente orgánico B inmiscible en agua, en el que están disueltos uno o más polímeros anfifílicos, cuyo segmento o segmentos hidrófobos son poli(ácido láctico-co-glicólico) y cuyo segmento hidrófilo es un polisacárido, y mezclar la mezcla resultante para formar una emulsión de fase inversa; y

eliminar el disolvente de la emulsión de fase inversa.

(8) Una composición inmunogénica que comprende dos o más micropartículas inmunogénicas, tal como se define en la reivindicación 1, asociadas entre sí para formar un agregado, obteniéndose la composición inmunogénica mediante un procedimiento que comprende las etapas de:

mezclar un disolvente acuoso A, en el que uno o más antígenos están disueltos, y un disolvente orgánico B inmiscible en agua en el que están disueltos uno o más polímeros anfifílicos, cuyo segmento o segmentos hidrófobos son poli(ácido láctico-co-glicólico) y cuyo segmento hidrófilo es un polisacárido, para formar una emulsión de fase inversa;

eliminar el disolvente de la emulsión de fase inversa para obtener un complejo de antígeno-micropartícula adyuvante;

dispersar el complejo de antígeno-micropartícula adyuvante obtenido en un medio de dispersión para formar una dispersión C del complejo de antígeno-micropartícula adyuvante; e

introducir la dispersión C del complejo de antígeno-micropartícula adyuvante en una fase líquida D, en la que está disuelto un modificador de superficie seleccionado entre un polímero hidrófilo y un compuesto anfifílico, seguido de la eliminación del medio de dispersión;

en el que uno o más surfactantes se disuelven en el disolvente acuoso A, el disolvente orgánico B inmiscible en agua y/o la dispersión C.

EFECTO DE LA INVENCION

Mediante la presente invención, se da a conocer una composición inmunogénica con la que es posible una activación inmune in vivo más fuerte que antes.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS DIBUJOS

La figura 1 muestra la evaluación inmunológica 1 de micropartículas inmunogénicas que contienen CEA. La figura 2 muestra la evaluación inmunológica 2 de micropartículas inmunogénicas que contienen CEA. La figura 3 muestra la evaluación inmunológica 3 de micropartículas inmunogénicas que contienen CEA. La figura 4 muestra la evaluación inmunológica 4 de micropartículas

inmunogénicas que contienen CEA. La figura 5 muestra la evaluación inmunológica 5 de micropartículas inmunogénicas que contienen CEA. La figura 6 muestra la evaluación inmunológica de micropartículas inmunogénicas que contienen OVA.

MODO ÓPTIMO DE REALIZAR LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a una composición inmunogénica que comprende, como ingredientes eficaces: una micropartícula inmunogénica compuesta por un complejo de antígeno-micropartícula adyuvante, en el que uno o más antígenos están encapsulados en una micropartícula adyuvante compuesta por uno o más polímeros anfifílicos, cuyo segmento o segmentos hidrófobos son ácido poli(láctico-co-glicólico) y cuyo segmento hidrófilo es un polisacárido; y un surfactante, estando el surfactante encapsulado en la micropartícula inmunogénica y comprendiendo una estructura de éster de ácido graso.

En primer lugar, se describe el polímero anfifílico que constituye la micropartícula adyuvante. Ser "anfifílico" significa que se conservan las propiedades tanto de hidrofilia como de hidrofobicidad. Cuando la solubilidad de una determinada parte en agua es mayor que la de otras partes, se dice que la parte es hidrófila. La parte hidrófila es, de manera preferente, soluble en agua, pero incluso en los casos en los que la parte tiene poca solubilidad en agua, es suficiente si la solubilidad en agua es mayor que la de otras partes. Cuando la solubilidad de una determinada parte en agua es inferior a la de otras partes, se dice que el segmento es hidrófobo. La parte hidrófoba es, de manera preferente, insoluble en agua, pero incluso en los casos en los que la parte es soluble en agua, es suficiente si la solubilidad en agua es inferior a la de otras partes.

El polímero anfifílico significa un polímero que tiene la anfifilicidad mencionada anteriormente como molécula completa. El polímero significa que la molécula tiene una estructura molecular en la que uno o más segmentos hidrófilos o uno o más segmentos hidrófobos del polímero anfifílico, o ambos, están constituidos por una estructura o estructuras en las que se repiten unidades mínimas (monómeros). El polímero anfifílico de la presente invención no está limitado, siempre que tenga una estructura que tenga uno o más segmentos hidrófilos y uno o más segmentos hidrófobos, tal como se define en la reivindicación 1, y puede ser un polímero de bloque lineal que tiene uno o más segmentos hidrófilos y un uno o más segmentos hidrófobos unidos entre sí; un polímero ramificado que tiene una o más ramas en las que existe una pluralidad de segmentos hidrófilos o segmentos hidrófobos, o ambos; o un polímero de injerto en el que se injertan una pluralidad de segmentos hidrófobos en un segmento hidrófilo o se injertan una pluralidad de segmentos hidrófilos en un segmento hidrófobo. El polímero anfifílico de la presente invención es, de manera preferente, un polímero que tiene un segmento hidrófilo, de la manera más preferente, un polímero de bloque lineal que tiene un segmento hidrófilo y un segmento hidrófobo, o un polímero de injerto que tiene una pluralidad de segmentos hidrófobos injertados en una cadena principal del segmento hidrófilo.

Los polímeros anfifílicos que constituyen la composición inmunogénica pueden ser un conjunto de una pluralidad de tipos de polímeros anfifílicos compuestos por polímeros constituyentes que tienen diferentes partes hidrófilas y/o partes hidrófilas, o un conjunto de polímeros anfifílicos que tienen el mismo polímero constituyente, pero que tienen una pluralidad de tipos de patrones de unión, siempre que los polímeros anfifílicos tengan propiedades como micropartícula adyuvante. A efectos de conseguir un rendimiento estable y una productividad mejorada, los polímeros anfifílicos son, de manera preferente, un conjunto de un pequeño número de tipos de polímeros anfifílicos, de manera más preferente, un conjunto de principalmente no más de 2 tipos de polímeros anfifílicos y, de manera aún más preferente, constituidos principalmente por un solo tipo de polímero anfifílico.

En la presente invención, el segmento hidrófobo del polímero anfifílico es poli(hidroxiácido). El poli(hidroxiácido) es, de manera preferente, un polímero biocompatible que no tiene un efecto adverso grave después de la administración a un organismo vivo. La biocompatibilidad en el presente documento significa que la DL50 en el caso de la administración oral del polímero a ratas no es inferior a 2.000 mg/kg. Además, el polímero puede ser un copolímero de una pluralidad de tipos de hidroxiácidos y es, de manera preferente, un polímero de no más de 2 tipos de hidroxiácidos. En el ácido poli(láctico-co-glicólico), la proporción de composición del ácido poli(láctico-co-glicólico) (ácido láctico/ácido glicólico) (% mol/mol) no está limitada, siempre que se consiga el propósito de la presente invención con la misma, y la proporción es, de manera preferente, de 100/0 a 30/70, de manera más preferente, de 60/40 a 40/60.

El segmento hidrófilo del polímero anfifílico es, de manera preferente, un polímero biocompatible, como en el caso del segmento hidrófobo. Además, a efectos de proporcionar una capacidad adyuvante persistente a la micropartícula adyuvante compuesta por uno o más polímeros anfifílicos, el segmento es, de manera preferente, un polímero refractario que no se descompone fácilmente en un organismo vivo o una célula de un mamífero o ave. El polímero biocompatible y refractario es un polisacárido (por ejemplo, celulosa, quitina, quitosano, goma gellan, ácido algínico, ácido hialurónico, pululano y dextrano). El polímero anfifílico es, de manera preferente, un polímero de injerto que tiene una pluralidad de segmentos hidrofóbicos injertados en una cadena principal de segmento hidrofílico. Además, el polisacárido es, de manera preferente, dextrano.

El polímero anfifílico que tiene uno o más segmentos hidrófobos compuestos por poli (ácido láctico-co-glicólico) y uno o más segmentos hidrófilos compuestos por un polisacárido tiene, de manera preferente, inmiscibilidad en agua como todo el polímero, en vista de la capacidad de encapsulación de antígeno de la composición inmunogénica y la persistencia después de la administración a un organismo vivo.

El peso molecular promedio del segmento hidrófilo del polímero anfifílico no está limitado y, en el caso de un polímero de bloque, en el que uno o más segmentos hidrófilos y uno o más segmentos hidrófobos están unidos linealmente entre sí, el peso molecular promedio es, de manera preferente, de 1.000 a 50.000, de manera más preferente, de 2.000 a 15.000. El término "bloque" en el presente documento significa una parte en una molécula de polímero, cuya parte está compuesta por no menos de 5 unidades de monómero y es diferente de la otra parte o partes adyacentes en términos de la estructura o configuración química. Un polímero constituido, como mínimo, por dos bloques unidos linealmente entre sí se denomina polímero de bloques. Cada bloque en sí que constituye el polímero de bloque puede ser un polímero aleatorio, alterno o en gradiente compuesto por no menos de 2 tipos de unidades monoméricas. De manera preferente, en la presente invención, el polímero de bloque es aquel en el que una unidad de un polímero que forma un segmento hidrófilo y una unidad de poli(hidroxiácido) están, de manera preferente, unidas entre sí.

En el caso de un polímero de injerto que tiene uno o más segmentos hidrófobos injertados sobre una cadena principal de segmento hidrófilo, el peso molecular promedio del segmento hidrófilo es, de manera preferente, de 1.000 a 100.000, de manera más preferente, de 2.000 a 50.000, de manera aún más preferente, de 10.000 a 40.000. El número de cadenas de injerto es, de manera preferente, de 2 a 50. El número de cadenas de injerto se puede calcular basándose en la proporción entre la cadena principal de segmentos hidrófilos y la cadena principal de segmentos hidrófobos, y el peso molecular promedio del segmento hidrófobo, tal como se obtiene mediante la medición de 1H-RMN, y el peso molecular promedio de la cadena principal del segmento hidrófilo utilizado.

La proporción de pesos moleculares promedio preferente entre el segmento hidrófobo y el segmento hidrófilo varía dependiendo del polímero anfifílico, y, en el caso de un polímero de bloque en el que uno o más segmentos hidrófobos y uno o más segmentos hidrófilos están linealmente unidos entre sí, la proporción de pesos moleculares promedio entre el segmento hidrófilo y el segmento hidrófobo es, de manera preferente, 1:1 o más, de manera más preferente, 1:2 o más, de manera aún más preferente, 1:4 o más, de manera especialmente preferente, 1:4 o más y 1:25 o menos.

De manera preferente, en el caso de un polímero de injerto que tiene una pluralidad de segmentos hidrófobos injertados en una cadena principal de segmentos hidrófilos, la proporción de pesos moleculares promedio entre la parte de la cadena principal de segmentos hidrófilos y todas las cadenas de injerto de segmentos hidrófobos es de 1:3 o más, y el peso molecular promedio de cada cadena de injerto es de 2.500 a 40.000. De manera más preferente, la proporción de peso molecular promedio global es de 1:5 o más y el peso molecular promedio de cada cadena de injerto es de 5.000 a 40.000.

Debe indicarse que el peso molecular promedio mencionado anteriormente es un peso molecular promedio en número, a menos que se especifique lo contrario. El peso molecular promedio en número es un peso molecular promedio calculado sin ponderar el tamaño molecular, y los pesos moleculares promedio en número del polímero anfifílico y los polímeros que constituyen el segmento o los segmentos hidrófilos del polímero anfifílico se pueden calcular como pesos moleculares en términos de poliestireno o pululano medidos mediante cromatografía de permeación en gel (CPG). Además, el peso molecular promedio del poli(hidroxiácido) se puede calcular mediante la medición de la resonancia magnética nuclear (RMN) basándose en la proporción entre el valor de integración del pico para residuos terminales y el valor de integración del pico para los demás.

El polímero anfifílico utilizado en la presente invención puede sintetizarse mediante un procedimiento conocido y entre los ejemplos del procedimiento se incluyen un procedimiento en el que se añade un polímero de poli(ácido láctico-co-glicólico) a un polímero de polisacárido para utilizar como un segmento hidrófilo y se lleva a cabo una reacción de condensación con la mezcla resultante para producir un polímero anfifílico; un procedimiento en el que se añaden monómeros de hidroxiácidos activados a un polímero para utilizar como segmento hidrófilo y se lleva a cabo una reacción de polimerización con la mezcla resultante para producir un polímero anfifílico; y un procedimiento en el que, a la inversa, se añaden monómeros para constituir un segmento hidrófilo a un segmento hidrófobo que es un polímero de ácido poli(láctico-co-glicólico) y se lleva a cabo una reacción de polimerización con la mezcla resultante.

Por ejemplo, se puede producir un polímero anfifílico de tipo injerto constituido por un polisacárido y una o más cadenas de injerto de copolímero de ácido poli(láctico-co-glicólico), tal como se describe en (1), (2) o (3), a continuación:

(1) un procedimiento en el que, en presencia de un catalizador de estaño, se añaden monómeros de hidroxiácidos activados a un polisacárido para realizar una reacción de polimerización para la introducción de ácido poli(láctico-co-glicólico), produciendo así un polímero anfifílico de tipo injerto [Macromolecules, 31, pág. 1.032-1.039 (1998)];

(2) un procedimiento en el que los grupos hidroxilo no protegidos en parte de un polisacárido en el que la mayoría de sus grupos hidroxilo están protegidos por sustituyentes se activan con una base, y se añaden monómeros de hidroxiácidos activados a los mismos para introducir una o más cadenas de injerto compuestas por ácido poli(láctico-co-glicólico), seguido de la extracción final de los grupos protectores, produciendo así un polímero anfifílico de tipo injerto [Polymer, 44, pág. 3.927-3.933, (2003)]; y

(3) un procedimiento en el que se lleva a cabo una reacción de condensación de un ácido poli(láctico-coglicólico) con un polisacárido utilizando un agente deshidratante y/o un agente de activación de grupos funcionales, para producir un polímero anfifílico de tipo injerto. [Macromolecules, 33, pág. 3.680-3.685 (2000)].

La micropartícula adyuvante se describe a continuación. La micropartícula adyuvante es una micropartícula que tiene capacidad adyuvante, y la capacidad adyuvante significa una capacidad con la cual se puede causar una respuesta inmune después de la administración de un antígeno a un organismo vivo a un nivel más elevado que en el caso de la administración del antígeno solo. Además, en la presente invención, la micropartícula adyuvante es una micropartícula compuesta por el polímero o los polímeros anfifílicos anteriores, y uno o más antígenos están encapsulados en la micropartícula adyuvante para formar un complejo de antígeno-micropartícula adyuvante, cuyo complejo constituye la micropartícula como ingrediente eficaz de la composición inmunogénica de la presente invención.

La estructura de la micropartícula adyuvante no está limitada y es preferente una estructura en la que uno o más segmentos hidrófilos del polímero o los polímeros anfifílicos están contenidos dentro de la micropartícula adyuvante y uno o más segmentos hidrófobos del polímero o los polímeros anfifílicos están contenidos como una capa externa en vista de la retención de manera estable del antígeno o los antígenos encapsulados.

El tipo de antígeno encapsulado en la micropartícula adyuvante no está limitado y puede ser un péptido, proteína, glicoproteína, glicolípido, lípido, carbohidrato, ácido nucleico o polisacárido; o un virus, célula bacteriana, sustancia alergénica, tejido o célula que los comprenda. Entre los ejemplos específicos del antígeno se incluyen antígenos derivados del polen, antígenos derivados del virus de la hepatitis A, antígenos derivados del virus de la hepatitis B, antígenos derivados del virus de la hepatitis C, antígenos derivados del virus de la hepatitis D, antígenos derivados del virus de la hepatitis E, antígenos derivados del virus de la hepatitis F, antígenos derivados del virus del VIH, antígenos derivados del virus de la gripe, antígenos derivados del virus del herpes (HSV-1, HSV-2), antígenos derivados del ántrax, antígenos derivados de clamidia, antígenos derivados de neumococo, antígenos derivados del virus de la encefalitis japonesa, antígenos derivados del virus del sarampión, antígenos derivados del virus de la rubeola, antígenos derivados de Clostridium tetan, antígenos derivados del virus de la varicela, antígenos derivados del virus SARS, antígenos derivados del virus de EB, antígenos derivados del virus del papiloma, antígenos derivados de Helicobacter pylori, antígenos derivados del virus de la rabia, antígenos derivados del virus del Nilo Occidental, antígenos derivados de hantavirus, antígenos derivados de Streptococcus, antígenos derivados de Staphylococcus, antígenos derivados de Bordetella pertussis, antígenos derivados de Mycobacterium tuberculosis, antígenos derivados de Plasmodium, antígenos derivados de poliovirus, antígenos derivados de diversas infecciones zoonóticas, antígenos de cáncer y antígenos derivados de diversas alergias alimenticias.

El antígeno encapsulado no necesita ser un único antígeno. En vista de la aplicación de la presente invención, se pueden inducir respuestas inmunes contra células cancerosas, bacterias, virus o similares que están constituidos por una pluralidad de constituyentes. En dichos casos, el antígeno puede ser una pluralidad de tipos de proteínas o similares que pueden causar respuestas inmunes, o una mezcla de sustancias, cuyos tipos no se pueden especificar. Además, la inclusión de una pluralidad de tipos de antígenos para inducir positivamente respuestas inmunes contra la pluralidad de tipos de antígenos es uno de los modos de utilización de la composición inmunogénica de la presente invención. De manera preferente, no más de 3 tipos, de manera más preferente, un solo tipo de antígeno o antígenos se encapsula en la micropartícula adyuvante.

El complejo de antígeno-micropartícula adyuvante en la presente invención puede cambiar la capacidad de retención del antígeno contenido dependiendo del tipo o los tipos y el procedimiento o los procedimientos de preparación del polímero o los polímeros que constituyen la micropartícula adyuvante. Entre los posibles ejemplos del mecanismo por el cual se proporciona inmunogenicidad mediante el complejo de antígeno-micropartícula adyuvante en la presente invención se incluyen una pluralidad de procedimientos, tales como un procedimiento en el que el antígeno liberado de la micropartícula adyuvante es reconocido por células inmunocompetentes, y un procedimiento en el que la propia micropartícula adyuvante es reconocida por células inmunocompetentes. También se puede obtener un efecto excelente mediante el efecto sinérgico de estos procedimientos.

El tipo de respuesta inmune inducida mediante el procedimiento en el que el complejo de antígeno-micropartícula adyuvante hace que las células inmunocompetentes reconozcan el antígeno varía según el tipo de procedimiento, y se puede seleccionar un procedimiento preferente según el tipo de respuesta inmune que se va a inducir y el sitio de administración. Es decir, en un modo preferente de utilización, no es necesario que el antígeno se libere del complejo de antígeno-micropartícula adyuvante, y el modo con el que se realiza la inmunogenicidad óptima de interés se consigue mediante la optimización dependiendo del antígeno y del tipo de la respuesta inmune para activar. Sin embargo, en los casos en los que el antígeno se libera de manera extremadamente rápida del complejo de antígeno-micropartícula adyuvante, no se puede obtener una acción de activación inmune continua a largo plazo, que es una propiedad excelente de la presente invención, de manera que, de manera preferente, no menos del 10 % del antígeno en el complejo de antígeno-micropartícula adyuvante todavía se retiene en el organismo vivo como complejo una semana después de la administración y, de manera más preferente, no menos del 50 % del antígeno está todavía encapsulado una semana después de la administración. Estos comportamientos de liberación se pueden confirmar mediante una evaluación in vitro que imita el entorno in vivo.

El complejo de antígeno-micropartícula adyuvante consigue un buen efecto incluso en un estado de partículas en el que el complejo está asociado entre sí. El término "asociación" en el presente documento significa que dos o más partículas están unidas mediante una fuerza entre partículas o mediante otra sustancia, para formar un agregado. La fuerza entre partículas no está limitada y entre los ejemplos de la misma se incluyen la interacción hidrófoba, el enlace de hidrógeno y la fuerza de van der Waals. La asociación no se limita al estado en el que las micropartículas están en contacto entre sí, y puede existir entre las micropartículas una sustancia que tenga afinidad por las micropartículas, o las micropartículas pueden estar dispersas en una matriz. Como sustancia que tiene afinidad por las micropartículas, o la matriz, es preferente un polímero, y es más preferente un polímero anfifílico cuya parte hidrófoba es poli(hidroxiácido) y que tiene el mismo constituyente que el de la micropartícula adyuvante. Entre los ejemplos particulares del mismo se incluyen polímeros anfifílicos, compuestos cada uno por una cadena principal de polisacárido y una o más cadenas de injerto de poli(hidroxiácido), polímeros de bloque, compuestos cada uno por polietilenglicol y poli(hidroxiácido), y poli (hidroxiácido).

La asociación del complejo de antígeno-micropartícula adyuvante puede ser en un estado en el que se produce un reaislamiento después de la utilización o en un estado en el que no se produce un reaislamiento después de la utilización. Cabe indicar que, incluso en los casos en los que la forma de la partícula compuesta por el complejo de antígeno-micropartícula adyuvante asociado entre sí está en un estado a partir del cual no se puede conocer la asociación del complejo, se considera que la partícula se ha formado mediante asociación del complejo, siempre que el procedimiento de producción de la partícula comprenda la etapa de asociar el complejo.

El tamaño de partícula promedio del complejo de antígeno-micropartícula adyuvante o la partícula formada mediante la asociación del complejo es, de manera preferente, de 0,1 a 50 pm, de manera más preferente, de 0,1 a 10 pm. En particular, el tamaño de partícula promedio del complejo de antígeno-micropartícula adyuvante es, de manera preferente, de 0,1 a 1 pm, de manera más preferente, de 0,1 a 0,5 pm, y el tamaño de partícula promedio del complejo de antígeno-micropartícula adyuvante es, de manera preferente, de 0,1 a 50 pm, de manera más preferente, de 0,1 a 10 pm, de manera aún más preferente, de 1 a 10 pm. El tamaño de partícula promedio del complejo de antígeno-micropartícula adyuvante o la partícula formada mediante asociación del complejo se puede medir directamente mediante análisis de imágenes utilizando un microscopio electrónico de barrido (SEM, por ejemplo, S-4800 fabricado por Hitachi, Ltd.).

El complejo de antígeno-micropartícula adyuvante o la partícula formada mediante la asociación del complejo tienen un efecto para mejorar la inmunogenicidad del antígeno encapsulado. Los inventores de la presente invención descubrieron que la inmunogenicidad del antígeno encapsulado puede mejorar aún más encapsulando, como ingrediente eficaz, uno o más surfactantes en la micropartícula inmunogénica compuesta por el complejo de antígeno-micropartícula adyuvante o la partícula formada mediante la asociación del complejo (en lo sucesivo, denominada "micropartícula inmunogénica"). Es decir, la micropartícula inmunogénica, como ingrediente eficaz de la composición inmunogénica de la presente invención, comprende, como constituyente, un surfactante encapsulado en la misma.

El surfactante utilizado en la presente invención es, de manera preferente, polisorbato 20, polisorbato 40, polisorbato 60, polisorbato 65, polisorbato 80, polisorbato 85, monooleato de glicerina, monooleato de sorbitán, monooleato de polietilenglicol, monoestearato de etilenglicol, monoestearato de glicerina, monoestearato de sorbitán, monoestearato de propilenglicol, monoestearato de polietilenglicol, monopalmitato de sorbitán, monomiristato de glicerina, monolaurato de sorbitán, monolaurato de polietilenglicol, trioleato de sorbitán, triestearato de sorbitán, aceite de ricino hidrogenado y polioxietilenado, dietanolamida de ácido graso (por ejemplo, dietanolamida de ácido esteárico, dietanolamida de ácido oleico y dietanolamida de ácido láurico), lecitina y ácido graso de sodio (por ejemplo, estearato de sodio, oleato de sodio y laurato de sodio). El surfactante utilizado en la presente invención puede ser de un solo tipo o de 2 o más tipos.

El surfactante utilizado en la presente invención es, de manera preferente, uno que se haya demostrado como aditivo farmacéutico. Entre los ejemplos específicos de surfactantes que se han demostrado como aditivos farmacéuticos se incluyen polisorbato 20, polisorbato 40, polisorbato 60, polisorbato 65, polisorbato 80, polisorbato 85, monooleato de glicerina, monooleato de sorbitán, monooleato de polietilenglicol, monoestearato de etilenglicol, monoestearato de glicerina, monoestearato de sorbitán, monoestearato de propilenglicol, monoestearato de polietilenglicol, monopalmitato de sorbitán, monomiristato de glicerina, monolaurato de sorbitán, monolaurato de polietilenglicol, trioleato de sorbitán, triestearato de sorbitán, aceite de ricino hidrogenado y polioxietilenado, dietanolamida de de ácido graso (por ejemplo, dietanolamida de ácido esteárico, dietanolamida de ácido oleico y dietanolamida de ácido láurico), lecitina y ácido graso de sodio (por ejemplo, estearato de sodio, oleato de sodio y laurato de sodio).

El surfactante utilizado en la presente invención es, de manera preferente, un surfactante no iónico. Entre los ejemplos específicos de surfactante no iónico se incluyen polisorbato 20, polisorbato 40, polisorbato 60, polisorbato 65, polisorbato 80, polisorbato 85, monooleato de glicerina, monooleato de sorbitán, monooleato de polietilenglicol, monoestearato de etilenglicol, monoestearato de glicerina, monoestearato de sorbitán, monoestearato de propilenglicol, monoestearato de polietilenglicol, monopalmitato de sorbitán, monomiristato de glicerina, monolaurato de sorbitán, monolaurato de polietilenglicol, trioleato de sorbitán, triestearato de sorbitán, aceite de ricino hidrogenado y polioxietilenado y dietanolamida de ácido graso (por ejemplo, dietanolamida de ácido esteárico, dietanolamida de ácido oleico y dietanolamida de ácido láurico).

Entre los ejemplos específicos de la estructura de éster de ácido graso se incluyen éster de ácido láurico, éster de ácido palmítico, éster de ácido esteárico, éster de ácido oleico y aceite de ricino hidrogenado, y entre los ejemplos específicos preferentes de la estructura de éster de ácido graso se incluyen éster de ácido láurico, éster de ácido oleico y aceite de ricino hidrogenado. Entre los ejemplos específicos de los surfactantes que comprenden una estructura de éster de ácido graso se incluyen polisorbato 20, polisorbato 40, polisorbato 60, polisorbato 65, polisorbato 80, polisorbato 85, monooleato de glicerina, monooleato de sorbitán, monooleato de polietilenglicol, monoestearato de etilenglicol, monoestearato de glicerina, monoestearato de sorbitán, monoestearato de propilenglicol, monoestearato de polietilenglicol, monopalmitato de sorbitán, monomiristato de glicerina, monolaurato de sorbitán, monolaurato de polietilenglicol, trioleato de sorbitán, triestearato de sorbitán y aceite de ricino hidrogenado y polioxietilenado.

Además, con respecto a estructuras distintas de los ésteres de ácidos grasos, el surfactante comprende, de manera preferente, una molécula biocompatible. Entre los ejemplos específicos de la molécula biocompatible distinta de los ésteres de ácidos grasos en el surfactante se incluyen aminoácidos, ácidos nucleicos, ácido fosfórico, azúcares (por ejemplo, monosacáridos, tales como sacarosa, sorbitol, manosa y glucosa), polietilenglicol y glicerina. La molécula biocompatible está constituida, de manera preferente, por uno o más monosacáridos y/o polietilenglicol, y es, de manera más preferente, sorbitol. Entre los ejemplos específicos del surfactante que comprende una molécula biocompatible, como estructura distinta a los ésteres de ácidos grasos, se incluyen polisorbato 20, polisorbato 40, polisorbato 60, polisorbato 65, polisorbato 80, polisorbato 85, monooleato de glicerina, monooleato de sorbitán, monooleato de polietilenglicol, monoestearato de etilenglicol, monoestearato de glicerina, monoestearato de sorbitán, monoestearato de propilenglicol, monoestearato de polietilenglicol, monopalmitato de sorbitán, monomiristato de glicerina, monolaurato de sorbitán, monolaurato de polietilenglicol, trioleato de sorbitán, triestearato de sorbitán y aceite de ricino hidrogenado y polioxietilenado, y entre los ejemplos específicos preferentes del surfactante se incluyen polisorbato 80, polisorbato 20, trioleato de sorbitán y aceite de ricino hidrogenado y polioxietilenado.

En la micropartícula inmunogénica, el surfactante está encapsulado en una micropartícula. La encapsulación de un surfactante en el presente documento significa un estado en el que un surfactante está presente en la parte interna de la micropartícula y el surfactante puede estar presente en toda la parte interna de la micropartícula o puede estar localizado en una parte de la parte interna de la micropartícula. Con respecto a la encapsulación de un surfactante, se considera que el surfactante está encapsulado en la partícula en los casos en los que el procedimiento de producción de la micropartícula comprende la etapa de encapsular un surfactante en la micropartícula. La cantidad del surfactante o los surfactantes en la micropartícula inmunogénica no está limitada, siempre y cuando no se inhiba el efecto de la presente invención, y es, de manera preferente, del 0,01 al 50 % (p/p), de manera más preferente, del 0,1 al 20 % (p/p), de manera aún más preferente, del 1 al 10 % (p/p), con respecto a la cantidad de polímero anfifílico alimentado en el procedimiento de producción de la micropartícula inmunogénica. La cantidad del surfactante o los surfactantes en la micropartícula inmunogénica se mide extrayendo el surfactante o los surfactantes de la micropartícula inmunogénica utilizando un disolvente en el que se pueda disolver el polímero anfifílico y purificando el extracto resultante, seguido del análisis del extracto purificado mediante cromatografía líquida utilizando una columna de fase inversa, midiendo así la cantidad del surfactante o los surfactantes contenida en el extracto. Basándose en la cantidad del surfactante o los surfactantes contenida en el extracto, se calcula la cantidad del surfactante los surfactantes con respecto a la cantidad del polímero o los polímeros anfifílicos alimentados en el procedimiento de producción de la micropartícula inmunogénica.

El procedimiento para producir la micropartícula inmunogénica no está limitado y, en casos en los que la micropartícula inmunogénica está constituida por un complejo de antígeno-micropartícula adyuvante, los ejemplos del procedimiento mediante el cual se puede producir la micropartícula inmunogénica incluyen un procedimiento que comprende las etapas de: (a) mezclar un disolvente acuoso A, en el que están disueltos uno o más antígenos, y un disolvente orgánico B inmiscible en agua, en el que están disueltos uno o más polímeros anfifílicos, para formar una emulsión de fase inversa; y (b) eliminar el disolvente de la emulsión de fase inversa para obtener una micropartícula inmunogénica. Las etapas (a) y (b) se describen a continuación.

Como disolvente acuoso A en la etapa (a), se utiliza agua o una solución acuosa que contiene un componente soluble en agua. Entre los ejemplos del componente soluble en agua se incluyen sales inorgánicas, azúcares, sales orgánicas y aminoácidos.

El disolvente orgánico B inmiscible en agua en la etapa (a) es, de manera preferente, un disolvente en el que el poli(ácido láctico-co-glicólico) del polímero anfifílico es soluble y el polímero que constituye el segmento hidrófilo es poco soluble o insoluble y, de manera preferente, el disolvente se puede eliminar mediante sublimación mediante liofilización. La solubilidad del disolvente orgánico B inmiscible en agua en agua es, de manera preferente, no superior a 30 g (disolvente orgánico B inmiscible en agua)/100 ml (agua). Entre los ejemplos particulares del disolvente orgánico B inmiscible en agua se incluyen acetato de etilo, acetato de isopropilo, acetato de butilo, carbonato de dimetilo, carbonato de dietilo, cloruro de metileno y cloroformo.

La proporción entre el disolvente orgánico B inmiscible en agua y el disolvente acuoso A es de 1.000:1 a 1:1, de manera preferente, de 100:1 a 1:1. La concentración del polímero o los polímeros anfifílicos en el disolvente orgánico B inmiscible en agua varía según los tipos de disolvente orgánico B inmiscible en agua y del polímero o los polímeros anfifílicos, y la concentración es del 0,01 al 90 % (p/p), de manera preferente, del 0,1 al 50 % (p/p), de manera más preferente, del 1 al 20 % (p/p).

Mediante la disolución de uno o más surfactantes, ya sea en el disolvente acuoso A o el disolvente orgánico B inmiscible en agua utilizados en la etapa (a), el surfactante o los surfactantes pueden encapsularse en la micropartícula inmunogénica. La cantidad del surfactante o los surfactantes añadida en la etapa (a) es, de manera preferente, del 0,01 al 50 % (p/p), de manera más preferente, del 0,1 al 20 % (p/p), de manera aún más preferente, del 1 al 10 % (p/p), con respecto a la cantidad del polímero o los polímeros anfifílicos disuelta en el disolvente orgánico B inmiscible en agua.

En la etapa (a), en el procedimiento de formación de una emulsión de fase inversa con un disolvente acuoso A y un disolvente orgánico B inmiscible en agua en el que están disueltos uno o más polímeros anfifílicos, la emulsión de fase inversa se puede formar utilizando, dependiendo del propósito farmacéutico, un disolvente orgánico B inmiscible en agua en el que están disueltos dos o más tipos de polímeros anfifílicos.

En la etapa (a), a efectos de ayudar en la formación de una emulsión de fase inversa y para formar una emulsión de fase inversa uniforme y fina, se puede añadir uno o más aditivos. El aditivo es, de manera preferente, un compuesto seleccionado entre alcoholes de alquilo C3-C6, alquil C3-C6 aminas y ácidos alquil C3-C6 carboxílicos. La estructura de cada cadena de alquilo en estos aditivos no está limitada y la cadena de alquilo puede tener una estructura lineal o una estructura ramificada, y puede ser un alquilo saturado o un alquilo insaturado. En la presente invención, el aditivo es, de manera especialmente preferente, terc-butanol, isopropanol o pentanol.

En la etapa (b), el procedimiento de eliminación del disolvente de la emulsión de fase inversa no está limitado y entre los ejemplos del mismo se incluyen calentamiento, secado a presión reducida, diálisis, liofilización, centrifugación, filtración y reprecipitación y combinaciones de los mismos. Entre los procedimientos de eliminación del disolvente de la emulsión de fase inversa, la liofilización es preferente, ya que provoca menos cambios estructurales debido a la fusión de partículas en la emulsión de fase inversa, o similares. Las condiciones y el aparato para la liofilización son los que permiten la inclusión de un procedimiento de congelación y una etapa de secado a presión reducida, y el procedimiento de liofilización comprende, de manera especialmente preferente, una congelación previa, un secado primario a presión reducida a baja temperatura y un secado secundario a presión reducida, que se llevan a cabo convencionalmente en la liofilización. Por ejemplo, en los casos en los que se quiere obtener una dispersión de un complejo de antígeno-micropartícula adyuvante en un disolvente inmiscible en agua, la emulsión de fase inversa se enfría/congela hasta, como máximo, los puntos de fusión del disolvente acuoso A y el disolvente orgánico B inmiscible en agua que constituyen la emulsión de fase inversa, y, a continuación, se seca a presión reducida para obtener micropartículas adyuvantes liofilizadas. La temperatura para la congelación previa puede determinarse experimentalmente, según sea apropiado, dependiendo de la composición del disolvente y, de manera preferente, no es superior a -20 °C. El grado de reducción de la presión durante el procedimiento de secado también se puede determinar, según sea apropiado, dependiendo de la composición del disolvente, y, de manera preferente, no es superior a 3.000 Pa, de manera más preferente, no es superior a 500 Pa, en vista de acortar el tiempo de secado. La liofilización se lleva a cabo, de manera preferente, utilizando un liofilizador para uso en laboratorio que tiene una trampa de frío y se puede conectar a una bomba de vacío, o un liofilizador de vacío de tipo estante utilizado para la producción de productos farmacéuticos o similares. Después de la congelación previa con nitrógeno líquido, un medio de enfriamiento o similar, puede llevarse a cabo el secado a presión reducida con enfriamiento o a temperatura ambiente utilizando un dispositivo de vacío, tal como una bomba de vacío.

En los casos en los que la micropartícula inmunogénica está constituida por una micropartícula compuesta por un complejo de antígeno-micropartícula adyuvante asociado entre sí, entre los ejemplos de producción de la micropartícula inmunogénica se incluyen un procedimiento que comprende las etapas de: (a') mezclar un disolvente acuoso A en el que uno o más antígenos están disueltos y un disolvente orgánico B inmiscible en agua en el que uno o más polímeros anfifílicos están disueltos, para formar una emulsión de fase inversa; (b') eliminar el disolvente de la emulsión de fase inversa para obtener un complejo de antígeno-micropartícula adyuvante; y (c') introducir una dispersión C de complejo de antígeno-micropartícula adyuvante en una fase líquida D que comprende el modificador de superficie, tal como se define en la reivindicación 8, seguido de la eliminación del medio de dispersión; mediante el cual se puede obtener la micropartícula inmunogénica compuesta por un complejo de antígeno-micropartícula adyuvante asociado entre sí.

Las condiciones del disolvente acuoso A en la etapa (a') y el disolvente orgánico B inmiscible con agua en la etapa (b') son las mismas que en las etapas (a) y (b) mencionadas anteriormente.

El procedimiento utilizado para eliminar el disolvente de la emulsión de fase inversa en la etapa (b') es el mismo que el procedimiento mencionado anteriormente en la etapa (b).

En la etapa (c'), el medio de dispersión para utilizar para dispersar el complejo de antígeno-micropartícula adyuvante para preparar la dispersión del complejo C no está limitado, y en los casos en los que la micropartícula adyuvante tiene, en su parte interna, una parte hidrófila compuesta por uno o más segmentos hidrófilos del polímero hidrófilo, y tiene, en la capa externa, una parte hidrófoba compuesta por uno o más segmentos hidrófobos del polímero hidrófilo, el medio de dispersión es, de manera preferente, un disolvente en el que el ácido poli(láctico-co-glicólico) del polímero anfifílico es soluble y el polímero que constituye el segmento hidrófilo es sustancialmente insoluble, con el fin de proteger la estructura de la micropartícula adyuvante. En este caso, el disolvente puede ser un disolvente orgánico inmiscible en agua o un disolvente orgánico miscible en agua. Entre los ejemplos particulares del disolvente en el que es soluble el ácido poli(láctico-co-glicólico) del polímero anfifílico y es sustancialmente insoluble el polímero que constituye el segmento hidrófilo se incluyen acetato de etilo, acetato de isopropilo, acetato de butilo, carbonato de dimetilo, carbonato de dietilo, cloruro de metileno, cloroformo, dioxano, tolueno y xileno.

De manera preferente, la fase líquida D en la etapa (c') es una en la que un modificador de superficie es soluble y tiene un punto de ebullición más elevado que el medio de dispersión de la dispersión C. La fase líquida D puede ser cualquiera de un disolvente acuoso, disolvente orgánico inmiscible en agua y disolvente orgánico miscible en agua. Como disolvente acuoso, son preferentes agua o una solución acuosa que contenga un componente soluble en agua, y entre los ejemplos del componente soluble en agua se incluyen sales inorgánicas, azúcares, sales orgánicas y aminoácidos. Entre los ejemplos del disolvente orgánico inmiscible en agua se incluyen aceite de silicona, aceite de sésamo, aceite de soja, aceite de maíz, aceite de semilla de algodón, aceite de coco, aceite de linaza, aceite mineral, aceite de ricino, aceite de ricino hidrogenado, parafina líquida, n-hexano, n-heptano, glicerol y ácido oleico. Entre los ejemplos del disolvente orgánico miscible en agua se incluyen glicerina, acetona, etanol, ácido acético, dipropilenglicol, trietanolamina y trietilenglicol. Entre éstos, en la presente invención, la fase líquida D es, de manera preferente, un disolvente acuoso o un disolvente orgánico miscible en agua. En los casos en los que la fase líquida D es un disolvente acuoso y el medio de dispersión es un disolvente orgánico inmiscible en agua, la suspensión obtenida de un complejo de antígeno-micropartícula adyuvante está en forma de la denominada emulsión de sólido en aceite en agua (S/O/W) y, en los casos en los que la fase líquida D es un disolvente orgánico inmiscible en agua o un disolvente orgánico miscible en agua e inmiscible en el medio de dispersión, la suspensión está en forma de una emulsión de sólido en aceite en aceite (S/O1/O2).

Mediante la disolución de uno o más surfactantes en el disolvente acuoso A o el disolvente orgánico B inmiscible en agua utilizados en la etapa (a') o en la dispersión C utilizada en la etapa (c'), el surfactante o los surfactantes pueden encapsularse en la micropartícula inmunogénica compuesta por un complejo de antígeno-micropartícula adyuvante asociado entre sí. Por otro lado, en los casos en los que se disuelve uno o más surfactantes en la fase líquida D utilizada en la etapa (c'), el surfactante o los surfactantes se unen a la superficie de la micropartícula inmunogénica compuesta por un complejo de antígeno-micropartícula adyuvante asociado entre sí, de manera que no se puede obtener el efecto de la presente invención. La cantidad del surfactante o los surfactantes añadidos en la etapa (a') o (c') es, de manera preferente, del 0,01 al 50 % (p/p), de manera más preferente, del 0,1 al 20 % (p/p), de manera aún más preferente, del 1 al 10 % (p/p), con respecto a la cantidad del polímero o los polímeros anfifílicos disueltos en el disolvente orgánico inmiscible en agua.

El modificador de superficie que se añade en la etapa (c') es, de manera preferente, un compuesto que estabiliza la interfase agua-aceite de la emulsión S/O/W o la interfase aceite-aceite de la emulsión S/O1/O2, cuyo compuesto tiene la propiedad de mejorar la estabilidad coloidal de la partícula compuesta por el complejo de antígeno-micropartícula adyuvante asociado entre sí. La mejora de la estabilidad coloidal en el presente documento significa la prevención o el retraso de la agregación, en el disolvente, de las partículas compuestas por el complejo de antígeno-micropartícula adyuvante asociado entre sí. El modificador de superficie puede ser un solo agente o una mezcla de una pluralidad de agentes.

El modificador de superficie es un polímero hidrófilo o un compuesto anfifílico.

El polímero hidrófilo como modificador de superficie es, de manera preferente, polietilenglicol, polivinilpirrolidona, alcohol polivinílico, polietilenimina, ácido poliacrílico, ácido polimetacrílico, poli-1,3-dioxolano, polímero de 2-metacriloiloxietil fosforilcolina, poli-1,3,6-trioxano, poliaminoácido, péptido, proteína o polisacárido de azúcares, o un análogo de cualquiera de éstos. Entre los ejemplos del análogo del polímero hidrófilo se incluyen, pero sin limitarse a los mismos, los preparados a partir de polímeros hidrófilos mediante, por ejemplo, modificación parcial de grupos hidrófobos, tales como alquilo de cadena larga.

El análogo de polietilenglicol como modificador de la superficie es, de manera preferente, "Pluronic" (marca registrada de BASF), disponible en el mercado de BASF, o su equivalente.

El poliaminoácido como modificador de superficie es, de manera preferente, ácido poliaspártico o ácido poliglutámico, o su análogo. Son más preferentes los análogos preparados mediante la introducción de alquilo de cadena larga en una parte del ácido poliaspártico o del ácido poliglutámico.

Entre los ejemplos del péptido como modificador de superficie se incluyen péptidos básicos, y la proteína como modificador de superficie es, de manera preferente, gelatina, caseína o albúmina, en vista de la mejora de la capacidad de dispersión de las partículas. Entre los ejemplos preferentes de la proteína también se incluyen anticuerpos.

El azúcar como un modificador de superficie es, de manera preferente, un monosacárido, oligosacárido o polisacárido. El polisacárido es, de manera preferente, celulosa, quitina, quitosano, goma gellan, ácido algínico, ácido hialurónico, pululano o dextrano, y el pululano que contiene colesterol es especialmente preferente en vista de la mejora de la capacidad de dispersión de las partículas. Es preferente un análogo de cualquiera de celulosa, quitina, quitosano, goma gellan, ácido algínico, ácido hialurónico, pululano y dextrano.

El péptido, proteína o azúcar como modificador de superficie es especialmente, de manera preferente, un análogo preparado, por ejemplo, mediante la modificación parcial de grupos hidrófobos, tales como alquilo de cadena larga, o un análogo preparado mediante la modificación del polímero hidrófilo o compuesto anfifílico mencionados anteriormente.

Entre los ejemplos preferentes del compuesto anfifílico como modificador de superficie se incluyen activadores no iónicos, tales como copolímeros de polioxietileno y polipropilenglicol, ésteres de ácidos grasos de sacarosa, ésteres de ácidos grasos de polietilenglicol, ésteres de ácidos monograsos de sorbitán polioxietilenado, ésteres de ácidos digrasos de sorbitán polioxietilenado, ésteres de ácidos monograsos con glicerol polioxietilenado, ésteres de ácidos digrasos de glicerol polioxietilenado, ésteres de ácidos grasos de poliglicerol, aceite de ricino polioxietilenado y aceite de ricino hidrogenado y polioxietilenado; sulfatos de alquilo, tales como laurilsulfato de sodio, laurilsulfato de amonio y estearilsulfato de sodio; y lecitina.

La proporción en volumen entre el medio de dispersión en el que se dispersa el complejo de antígeno-micropartícula adyuvante y la fase líquida D es de 1.000:1 a 1:1.000, de manera preferente, de 100:1 a 1:100. El número de asociación del complejo de antígeno-micropartícula adyuvante obtenido varía dependiendo de esta proporción de volumen y, a medida que aumenta la proporción de la fase lipídica D, se obtiene una dispersión, en agua, de partículas compuestas por un mayor número de complejo de antígeno-micropartícula adyuvante asociados entre sí, mientras que, a medida que disminuye la proporción de la fase lipídica D, el número de asociación disminuye. En los casos en los que la proporción de la fase líquida D es menor que una proporción de solución de 1:4, la mayoría de las partículas en la dispersión en agua están constituidas cada una por un único complejo de antígeno-micropartícula adyuvante. De este modo, mediante el control de la proporción en volumen de la fase líquida D en la serie de procedimientos para la producción de la partícula compuesta por el complejo de antígeno-micropartícula adyuvante asociado entre sí, se pueden preparar de manera selectiva el complejo de antígeno-micropartícula adyuvante y la partícula compuesta por el complejo asociado entre sí.

Cuando el medio de dispersión que contiene el complejo de antígeno-micropartícula adyuvante se mezcla con la fase D líquida, se puede utilizar, según se requiera, un dispositivo de agitación, tal como un agitador magnético, agitador de turbina, homogeneizador, aparato de emulsificación de membrana equipado con una membrana porosa, o similares.

La fase D líquida puede contener, además del modificador de superficie, diversos aditivos, tales como un tampón, antioxidante, sal, polímero y/o azúcar, dependiendo del propósito farmacéutico. Además, el medio de dispersión en el que se va a dispersar el complejo de antígeno-micropartícula adyuvante puede contener varios aditivos solubles en el medio de dispersión, tales como un compuesto ácido, un compuesto básico, un polímero anfifílico y/o un polímero biodegradable, con el fin de controlar la velocidad de liberación del antígeno o antígenos encapsulados mediante degradación o disgregación del complejo.

Además, una operación de emulsificación de la emulsión de sólido en aceite en agua (S/O/W) o la emulsión de sólido en aceite en aceite (S/O1/O2) formadas puede llevarse a cabo con el fin de producir una partícula más fina compuesta por el complejo de antígeno-micropartícula adyuvante asociado entre sí. El procedimiento de emulsificación no está limitado, siempre que se pueda preparar una emulsión estable mediante el mismo, y entre los ejemplos del mismo se incluyen procedimientos mediante agitación y procedimientos que utilizan un homogeneizador de alta presión, un homomezclador de alta velocidad o similares.

En los casos en que el complejo de antígeno-micropartícula adyuvante está ya dispersado en un medio de dispersión y se añade la dispersión C obtenida a la fase líquida D que contiene un modificador de superficie, se puede obtener una suspensión de la partícula compuesta por una micropartícula adyuvante deseada asociada entre sí mediante la eliminación del medio de dispersión. El procedimiento de eliminación del medio de dispersión no está limitado, y entre los ejemplos del mismo se incluyen evaporación del disolvente, diálisis, liofilización, centrifugación, filtración y reprecipitación, entre los que la evaporación del disolvente y la liofilización son especialmente preferentes. En los casos en los que se utiliza un disolvente acuoso como fase líquida D, mediante esta etapa se puede obtener una dispersión acuosa de la partícula compuesta por el complejo de antígeno-micropartícula adyuvante asociado entre sí.

En una realización preferente, el modificador de superficie está unido a la micropartícula inmunogénica. La unión en el presente documento puede ser un enlace no covalente o un enlace covalente. El enlace no covalente es, de manera preferente, una interacción hidrófoba y también puede ser una interacción electrostática, enlace de hidrógeno o fuerza de van der Waals, o una combinación de estos enlaces. En los casos de un enlace no covalente, el poli(hidroxiácido) de la micropartícula inmunogénica que contiene el polímero anfifílico se une, de manera preferente, a la parte hidrófoba del modificador de superficie mediante una interacción hidrófoba y, en este caso, el medio de dispersión para el complejo de antígeno-micropartícula adyuvante en la dispersión de micropartículas es, de manera preferente, agua, tampón, solución salina fisiológica, solución acuosa modificadora de superficie o disolvente hidrófilo.

La composición inmunogénica de la presente invención es una composición que puede inducir una respuesta inmune en un organismo vivo y contiene la micropartícula inmunogénica como ingrediente eficaz. El tipo de respuesta inmune inducida por la composición inmunogénica no está limitado. Entre los ejemplos del tipo de respuesta inmune inducida se incluyen la respuesta inmune Th1 y la respuesta inmune Th2, y se sabe que una de estas respuestas inmunes es inducida predominantemente dependiendo del antígeno, el sitio de administración y el tipo de procedimiento de administración. La presente invención puede inducir tanto la respuesta inmune Th1 como la Th2. La respuesta inmune Th1 puede inducirse de manera eficaz por el complejo de antígeno-micropartícula adyuvante de la presente invención que tiene un tamaño de partícula pequeño o por la partícula compuesta por el complejo asociado entre sí, tal como se muestra en los ejemplos. Los grados de la respuesta inmune Th1 y la respuesta inmune Th2 pueden evaluarse mediante varios procedimientos conocidos. Por ejemplo, en el caso del ratón, se sabe que la cantidad de producción del anticuerpo IgG2a es un índice de la respuesta inmune Th1. Además, como índices de la respuesta inmune Th2, se conocen las cantidades del anticuerpo IgG1 y el anticuerpo IgG total.

La composición inmunogénica de la presente invención puede conseguir una capacidad de activación inmune elevada mediante la inclusión adicional de una sustancia de activación inmune. La sustancia de activación inmune puede estar contenida en el exterior de la micropartícula adyuvante o encapsulada en la misma, y la sustancia se encapsula, de manera preferente, en la micropartícula adyuvante. La sustancia de activación inmune no está limitada, siempre que pueda funcionar como una sustancia de activación inmune, y entre los ejemplos de la misma se incluyen aceites, sales de aluminio, sales de calcio, polímeros formadores de gel, citocinas de activación inmune y ligandos del receptor TLR, entre los que se prefieren las citocinas de activación inmune y los ligandos del receptor TLR.

Entre los ejemplos de citocinas de activación inmune se incluyen interleucina 12, interferón a, interleucina 18, TNFa, interleucina 6, NO, interferón y e interferón p.

Entre los ejemplos de ligandos del receptor TLR se incluyen lipoproteínas; ARN bicatenarios, tales como poli I:C y poli I:CLC; flagelina; ARN monocatenarios; CpG; profilina; MPL; QS21; y TDM, entre los cuales los ácidos nucleicos, tales como ARN bicatenarios, ARN monocatenarios y CpG son preferentes, y el CpG es más preferente. El CpG en el presente documento significa ADN con motivos CpG (citosina-guanina) no metilados que existen en virus, bacterias y similares (véase la solicitud de patente PCT traducida al japonés abierta a inspección pública No. 2001-503254). Se describen varias secuencias eficaces como motivos CpG y el tipo de secuencia no está limitado, siempre que tenga capacidad de activación inmune, y la secuencia se pueda preparar utilizando análogos de bases o se pueda seleccionar de varios tipos de productos modificados.

En los casos en que la composición inmunogénica de la presente invención se utiliza como una composición farmacéutica o una vacuna, pueden estar contenidos diversos aditivos farmacéuticamente útiles, además del polímero anfifílico, sustancia activa hidrófila, modificador de la superficie y medio de dispersión. Entre los ejemplos de aditivos que pueden añadirse se incluyen tampones, antioxidantes, sales, polímeros y azúcares.

El procedimiento de inducción de una respuesta inmune utilizando la composición inmunogénica de la presente invención no está limitado y la composición inmunogénica puede administrarse a un organismo vivo o ponerse en contacto con células inmunocompetentes extraídas al exterior de un organismo vivo. El procedimiento de administración de la composición inmunogénica a un organismo vivo no está limitado y entre los ejemplos del mismo se incluyen administración subcutánea, administración intradérmica, administración intramuscular, administración transnasal, administración pulmonar, administración oral, administración transdérmica, administración sublingual, administración intravaginal, administración intraperitoneal y administración en los ganglios linfáticos, entre los que se prefieren la administración intradérmica y la administración subcutánea. La administración a un organismo vivo no está incluida en el alcance de las presentes reivindicaciones.

Con respecto a la cantidad de la composición inmunogénica de la presente invención para utilizar después de la inducción de la respuesta inmune, la cantidad necesaria del antígeno requerida para la inducción de la reacción inmune de interés se establece, de manera apropiada, dependiendo del tipo de antígeno, el procedimiento de administración y el número de dosis. Por ejemplo, en los casos en los que la composición inmunogénica de la presente invención se administra por vía subcutánea a un ser humano para inducir una respuesta inmune, la composición se administra a una dosis de 0,01 a 1.000 pg cada vez con respecto a la cantidad de antígeno contenido en la composición inmunogénica. El número de dosis también se puede establecer de forma apropiada de manera similar a la dosis, la respuesta inmune se puede inducir mediante de 1 a 10 veces la administración, ya que la composición inmunogénica de la presente invención presenta la acción de inducir una respuesta inmune de manera continua.

El organismo vivo al que se administra la composición inmunogénica puede ser un ser humano o un animal no humano, y el organismo vivo es, de manera preferente, un ser humano; o cerdo, vaca, pájaro, oveja, caballo, burro, cabra, camello, perro, gato, hurón, conejo, mono, rata, ratón o cobaya, que se mantienen como ganado, animal de compañía o animal de experimentación. La administración a un organismo vivo no está incluida en el alcance de las presentes reivindicaciones.

EJEMPLOS

Los ejemplos se describen a continuación, pero la presente invención no está limitada por estos ejemplos.

Ejemplo 1 Síntesis de dextrano-ácido poli(láctico-co-glicólico) (PLGA)

(1-1) Síntesis de TMS-Dextrano (compuesto (1))

Se añadió dextrano (Nacalai Tesque, calidad especial, según las normas de Nacalai; peso molecular promedio en número, 13.000; 5,0 g) a formamida (100 ml), y la mezcla resultante se calentó hasta 80 °C. A esta solución, se le añadió, gota a gota, 1,1,1,3,3,3-hexametildisilazano (100 ml) durante 20 minutos. Posteriormente, la mezcla resultante se agitó a 80 °C durante 2 horas. Una vez completada la reacción, la solución de reacción se dejó enfriar hasta temperatura ambiente y se separaron dos capas entre sí con un embudo de decantación. La capa superior se concentró a presión reducida y se le añadió metanol (300 ml), seguido de filtración y secado de los sólidos obtenidos, para obtener TMS-dextrano (compuesto (1)) (11,4 g) como sólidos blancos.

(1-2) Síntesis de dextrano-PLGA (compuesto (2))

Se secaron el compuesto (1) (0,5 g) y terc-butóxido de potasio (35 mg) con calor a presión reducida durante 2 horas y se añadió tetrahidrofurano (10 ml) a los mismos, seguido de agitación de la mezcla resultante durante 1,5 horas a temperatura ambiente. A esta solución, se le añadió, gota a gota, una solución de (DL)-lactida (0,56 g) y glicólido (0,9 g) en tetrahidrofurano (15 ml) y la mezcla resultante se agitó durante 5 minutos, seguido de la adición de 2 gotas de ácido acético para detener la reacción. Una vez completada la reacción, se concentró el disolvente a presión reducida y se llevó a cabo una purificación por reprecipitación con el sistema cloroformo-metanol y el sistema cloroformo-éter dietílico, para obtener sólidos blancos, que, a continuación, se disolvieron en cloroformo (9 ml). A la solución resultante se le añadió ácido trifluoroacético (1,0 ml), y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Una vez completada la reacción, el disolvente se evaporó a presión reducida y el residuo se disolvió en cloroformo (10 ml), seguido de la adición, gota a gota, de la solución resultante a éter dietílico que se había enfriado preliminarmente a 0 °C y la filtración del producto obtenido, para obtener un polímero anfifílico dextrano-PLGA en forma de sólidos blancos (compuesto (2)). Se determinó mediante la medición de 1H-RMN que el peso molecular promedio en número de las cadenas del injerto de PLGA del dextrano-PLGA es 5.571 y el número de cadenas del injerto es de 30.

Ejemplo 2 Preparación de micropartículas inmunogénicas (partículas (1) a (10) y partículas comparativas (1) y (2))

En 100 pl de carbonato de dimetilo, se disolvieron 5 mg de dextrano-ácido poli(láctico-co-glicólico) (PLGA) en el ejemplo 1 (compuesto (2)) para preparar una solución de polímero anfifílico (B) 50 mg/ml. A la solución de polímero anfifílico (B), se añadieron 20 pl de terc-butanol y se le añadieron, gota a gota, 50 pl de una solución acuosa de CEA (antígeno carcinoembrionario) (A) (COSMO BIO Co., Ltd.) al 0,025 % (p/v), seguido de agitación de la mezcla resultante con un mezclador de vórtice para producir una emulsión de fase inversa.

La emulsión de fase inversa se sometió a congelación previa con nitrógeno líquido y se liofilizó utilizando un liofilizador (EYELA, FREEZE DRYER FD-1000) a una temperatura de enfriamiento de la trampa de -45 °C a un grado de vacío de 20 Pa durante 24 horas. Los sólidos obtenidos se dispersaron en 200 pl de carbonato de dimetilo para preparar una dispersión (C). La dispersión (C) se añadió, gota a gota, a 2 ml de una solución acuosa que contenía un modificador de superficie (alcohol polivinílico o Pluronic F-68) al 10 % (p/v) que se muestra en la tabla 1, y la mezcla resultante se agitó y emulsionó con un mezclador de vórtice para preparar una emulsión S/O/W. De la emulsión S/O/W, se eliminó el carbonato de dimetilo mediante evaporación del disolvente para preparar una suspensión de micropartículas inmunogénicas. La suspensión se transfirió a un tubo de 15 ml y se sometió a centrifugación a 8.000 rpm durante 10 minutos para precipitar las partículas. Después de eliminar el sobrenadante, las partículas se resuspendieron en 10 ml de agua destilada y la suspensión resultante se sometió a centrifugación en las mismas condiciones descritas anteriormente para realizar la reprecipitación de las partículas. Esta operación de lavado se repitió una vez más y, después de la eliminación del sobrenadante, las partículas se suspendieron en 200 pl de una solución acuosa que contenía manitol al 5 % (p/v), carboximetilcelulosa sódica al 0,5 % (p/v) y polisorbato 80 al 0,1 % (p/v). La suspensión resultante se sometió a congelación previa con nitrógeno líquido y se liofilizó utilizando un liofilizador (EYe La , FREEZE DRYER FD-1000) a una temperatura de enfriamiento de la trampa de -45 °C a un grado de vacío de 20 Pa durante 24 horas para obtener una micropartícula inmunogénica.

Como surfactante, se disolvió polisorbato 80, polisorbato 20, trioleato de sorbitán o monooleato de sorbitán (éstos fueron fabricados por Kanto Chemical Co., Inc.) o aceite de ricino hidrogenado y polioxietilenado (fabricado por Nikko Chemicals Co., Ltd.) en la solución acuosa de CEA (A), solución de polímero anfifílico (B) o dispersión (C), tal como se muestra en la tabla 1, en una cantidad de 500 pg, que correspondía al 10 % (p/p) con respecto a la cantidad del polímero anfifílico.

T l 1

Ejemplo 3 Medición de la tasa de encapsulación de antígeno en micropartículas inmunogénicas

Cada tipo de micropartículas inmunogénicas preparadas mediante el procedimiento del ejemplo 2 (partículas (3) a (7) y partícula comparativa (2)) se disolvió en 200 pl de solución salina fisiológica tamponada con fosfato para preparar una suspensión de partículas. En un tubo Eppendorf, se colocaron 100 pl de la suspensión de partículas y se le añadió 1 ml de agua destilada, seguido de centrifugación de la mezcla resultante a 13.000 rpm durante 10 minutos para precipitar las partículas. Después de eliminar el sobrenadante, las partículas se resuspendieron en 1 ml de agua destilada y la suspensión resultante se sometió a centrifugación en las mismas condiciones descritas anteriormente para realizar la reprecipitación de las partículas. Después de eliminar el sobrenadante, las partículas se disolvieron en 0,5 ml de una solución mixta 1:3 de cloruro de metileno y acetona. La solución de partículas resultante se sometió a centrifugación a 13.000 rpm durante 10 minutos para precipitar CEA. Después de eliminar el sobrenadante, el precipitado se disolvió en 0,5 ml de la solución mixta y se llevó a cabo la centrifugación en las condiciones descritas anteriormente para volver a precipitar CEA. Después de eliminar el sobrenadante, se llevó a cabo un secado por centrifugación durante 30 minutos para secar el precipitado de CEA. Se añadió un tampón de muestreo para electroforesis en gel (fabricado por TEFCO) al precipitado de CEA y el precipitado se disolvió en el mismo a 95 °C durante 3 minutos, seguido de la realización de electroforesis en gel utilizando gel de poliacrilamida (fabricado por TEFCO). A continuación, el gel se tiñó utilizando un kit de tinción CBB coloidal (fabricado por TEFCO) y se calculó la velocidad de encapsulación de CEA en las partículas. Los resultados se muestran en la tabla 2.

Las tasas de encapsulación de antígeno (CEA) de las micropartículas inmunogénicas fueron tal como se muestra en la tabla 2 y se observó que la tasa de encapsulación fue casi la misma entre cualquiera de las micropartículas inmunogénicas que contienen un surfactante (partículas (3) a (7)) y la partícula que no contiene surfactante (partícula comparativa (2)). Por tanto, se demostró que los surfactantes no afectan negativamente a la tasa de encapsulación del antígeno de la micropartícula inmunogénica.

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Ejemplo 4 Administración subcutánea de una composición inmunogénica que contiene CEA a ratones (1)

Cada tipo de micropartículas inmunogénicas preparadas en el ejemplo 2 que contenían polisorbato 80 o trioleato de sorbitán (partículas (1) y (2)) se suspendió en 200 pl de solución salina fisiológica tamponada con fosfato para proporcionar una solución de administración. Esta solución se administró por vía subcutánea mediante una única inyección en el lomo de ratones Balb/C macho de 7 semanas de vida (Japan SLC, Inc.) a una dosis de 5 pg en términos de CEA por individuo. Como ejemplos comparativos, se administraron por vía subcutánea partículas que no contenían surfactante (partícula comparativa (1)) o una solución preparada mezclando 50 pl de la solución de CEA con 50 pl de "Imject Alum" (fabricado por Thermo Scientific, en lo sucesivo también denominado Alum) como adyuvante mediante una única inyección en el lomo de ratones Balb/C macho a una dosis de 5 pg en términos de CEA por individuo. En cada condición, la administración se llevó a cabo para 5 individuos de ratones. Los cambios en el título de anticuerpos con el tiempo se muestran en la figura 1.

Los ratones después de la administración se mantuvieron en un ambiente en el que los ratones pueden tomar comida y agua libremente, mientras que se extrajo sangre de la vena de la cola con el tiempo. A la sangre recogida, se añadió heparina a una concentración final de 3,3 UI/ml y se llevó a cabo una centrifugación a 5.000 rpm durante 5 minutos para recoger el plasma sanguíneo, seguido de la medición del título de anticuerpos contra CEA en el plasma sanguíneo. El título de anticuerpos contra CEA se midió mediante el siguiente procedimiento. En una microplaca de 96 pocillos (MaxiSorp, fabricada por Nunc), se colocaron 100 pl de una solución de PBS que contenía 1 pg/ml de proteína CEA y la placa se dejó reposar a 4 °C durante la noche. Se descartó la solución y se colocaron en la placa 400 pl de PBS suplementado con BSA al 0,5 %, seguido de la realización de un bloqueo a temperatura ambiente durante 2 horas. El pocillo se lavó una vez con 400 pl de un líquido de lavado (PBS suplementado con Tween 20 al 0,05 %) y se colocaron en el pocillo 100 pl de una muestra de plasma sanguíneo que se había diluido de 1.000 a 100.000 veces con un líquido de dilución (PBS suplementado con BSA al 0,25 % y Tween 20 al 0,05%), y se dejó que la reacción transcurriera a temperatura ambiente durante 40 minutos con agitación. El pocillo se lavó tres veces con el líquido de lavado y se colocaron en el pocillo 100 pl de anticuerpo contra IgG de ratón marcado con HRP (peroxidasa de rábano picante) (Zymed) (diluido 10.000 veces con el líquido de dilución), y se dejó que la reacción transcurriera a temperatura ambiente durante 20 minutos con agitación. El pocillo se lavó tres veces con el líquido de lavado y se colocaron en el pocillo 100 pl de un líquido colorante (tampón acetato de sodio/citrato 0,1 M (pH 4,5) que contenía peróxido de hidrógeno al 0,006 % y tetrametilbencidina 0,2 mg/ml), y se dejó que la reacción transcurriera a temperatura ambiente durante 10 minutos con agitación. La reacción se detuvo mediante la adición de 100 pl de ácido sulfúrico 1 N y se midió la absorbancia a 450 nm utilizando un lector de microplacas. Como muestra patrón, se midió al mismo tiempo un anticuerpo monoclonal contra CEA diluido en serie (MA1-5308, fabricado por Affinity Bioreagents) para proporcionar una curva de calibración y se calculó la cantidad de anticuerpo en cada muestra en términos de concentración en peso (ng/ml).

Los cambios en el valor promedio del título de anticuerpos contra CEA en el plasma sanguíneo con el tiempo se muestran en la figura 1. La partícula (1) que contiene polisorbato 80 y la partícula (2) que contiene trioleato de sorbitán mostraron un efecto continuo de aumento del título de anticuerpos durante 8 semanas, y el efecto fue mucho mayor que en el caso del ejemplo comparativo, en el que se administró el antígeno Alum. El título de anticuerpo fue incluso mayor que en el caso de la partícula comparativa (1) que no contenía surfactante y se demostró que la micropartícula inmunogénica muestra una mayor capacidad adyuvante mediante la inclusión de un surfactante. Ejemplo 5 Administración subcutánea de una composición inmunogénica que contiene CEA a ratones (2) <Procedimiento>

Cada tipo de las micropartículas inmunogénicas preparadas en el ejemplo 2 (partículas (3) a (7)) se administró por vía subcutánea mediante una única inyección en el lomo de ratones Balb/C macho de 7 semanas de vida (Japan SLC, Inc.) a una dosis de 5 |xg en términos de CEA por individuo mediante el procedimiento descrito en el ejemplo 4. Como ejemplo comparativo, se administraron por vía subcutánea partículas que no contenían surfactante (partícula comparativa (2)) mediante una única inyección en el lomo de ratones Balb/C macho a una dosis de 5 |xg en términos de CEA por individuo. En cada condición, la administración se llevó a cabo para 5 individuos de ratones. La figura 2 muestra el valor promedio del título de anticuerpos. La recogida de sangre y la medición del título de anticuerpos se llevaron a cabo mediante los procedimientos descritos en el ejemplo 4.

El valor promedio del título de anticuerpos contra CEA en el plasma sanguíneo en la semana 4 después de la administración se muestra en la figura 2. De forma similar a los casos de partículas que contienen polisorbato 80 o trioleato de sorbitán ((3), (4)) descritas en el ejemplo 4, las partículas que contienen polisorbato 20, monooleato de sorbitán o aceite de ricino hidrogenado y polioxietilenado ((5) a (7)) también mostraron valores más elevados del título de anticuerpos en comparación con la partícula comparativa (2) que no contenía surfactante. De este modo, se demostró que la micropartícula inmunogénica muestra una mayor capacidad adyuvante mediante la inclusión de un surfactante.

Ejemplo 6 Administración subcutánea de una composición inmunogénica que contiene CEA a ratones (3) <Procedimiento>

Cada tipo de las micropartículas inmunogénicas preparadas en el ejemplo 2 que contenían polisorbato 80 (partículas (8) a (10)) se administró mediante una única inyección en la planta de las patas de ratones Balb/C macho de 7 semanas de vida (Japan SLC, Inc.) a una dosis de 5 |xg en términos de CEA por individuo mediante el procedimiento descrito en el ejemplo 4. Como ejemplo comparativo, se preparó una solución mezclando 50 p.l de la solución de antígeno y 50 p.l de Alum, y la mezcla resultante se administró mediante una única inyección en la planta de la pata de ratones Balb/C machos a una dosis de 5 |xg en términos de CEA por individuo. En cada condición, la administración se llevó a cabo para 3 individuos de ratones. La figura 3 muestra el valor promedio del título de anticuerpos. La medición del título de anticuerpos se llevó a cabo mediante el procedimiento descrito en el ejemplo 4. <Resultados>

El valor promedio del título de anticuerpos contra CEA en el plasma sanguíneo en la semana 2 después de la administración se muestra en la figura 3. En todos los tipos de partículas ((8) a (10)) en los que se utilizaron diferentes soluciones para disolver el polisorbato 80 en el procedimiento de preparación, el título de anticuerpos fue drásticamente más elevado que en el caso de la administración del antígeno Alum en el ejemplo comparativo. Es decir, se demostró que la micropartícula inmunogénica tiene una fuerte capacidad adyuvante también en los casos en los que el surfactante se disolvió en cualquiera de la solución acuosa de CEA (A), la solución de polímero anfifílico (B) y la dispersión (C).

Ejemplo 7 Medición del surfactante contenido en micropartículas inmunogénicas

Las micropartículas inmunogénicas (partícula (1)) que contenían polisorbato 80 preparadas en el ejemplo 2 se suspendieron en 1 ml de agua destilada y se precipitaron mediante centrifugación a 13.000 rpm durante 10 minutos. Después de eliminar el sobrenadante, las partículas se resuspendieron en 1 ml de agua destilada y se sometieron a centrifugación en las mismas condiciones descritas anteriormente para volver a precipitar las partículas. Después de eliminar el sobrenadante, las partículas se disolvieron en 100 p.l de acetato de etilo. A esta solución de partículas se le añadieron 300 p.l de etanol y la mezcla resultante se sometió a centrifugación a 13.000 rpm durante 10 minutos para precipitar el polímero anfifílico. Se recogió el sobrenadante y se eliminó el disolvente mediante evaporación a presión reducida, seguido de disolución del residuo en 100 pl de agua destilada para preparar un extracto de partículas. El extracto de partículas se analizó mediante cromatografía líquida de alta resolución (fabricada por Shimadzu Corporation) utilizando una columna de fase inversa (YMC-Pack PROTEIN-RP, fabricada por YMC) para medir el contenido de polisorbato 80 contenido en la micropartícula inmunogénica.

Mediante el análisis por cromatografía líquida de alta resolución, se observó que el extracto de partículas contenía el 0,24 % (p/v) de polisorbato 80. En base a este resultado, se reveló que la micropartícula inmunogénica contiene polisorbato 80 en una cantidad del 4,8 % (p/p) con respecto a la cantidad alimentada del polímero anfifílico que constituye la micropartícula inmunogénica, y se observó que el 48 % (p/p) del polisorbato 80 añadido en el procedimiento de preparación del ejemplo 2 estaba contenido en la micropartícula inmunogénica.

Ejemplo 8 Preparación de micropartículas inmunogénicas que contienen CEA (partículas (11) a (15) y partículas comparativas (3) a (5))

En 100 pl de carbonato de dimetilo, se disolvieron 5 mg de dextrano-ácido poli(láctico-co-glicólico) (PLGA) (compuesto (2)) preparado en el ejemplo 1 para preparar una solución de polímero anfifílico (B) 50 mg/ml. A la solución de polímero anfifílico (B), se añadieron 20 pl de terc-butanol y se le añadieron, gota a gota, 50 pl de una solución acuosa de CEA (antígeno carcinoembrionario) (A) (COSMO BIO Co., Ltd.) al 0,025 % (p/v), seguido de agitación de la mezcla resultante con un mezclador de vórtice para producir una emulsión de fase inversa.

La emulsión de fase inversa se sometió a congelación previa con nitrógeno líquido y se liofilizó utilizando un liofilizador (EYELA, FREEZE DRYER FD-1000) a una temperatura de enfriamiento de la trampa de -45 °C a un grado de vacío de 20 Pa durante 24 horas. Los sólidos obtenidos se dispersaron en 200 pl de carbonato de dimetilo para preparar una dispersión (C). La dispersión (C) se añadió, gota a gota, a 2 ml de una solución acuosa (D) que contenía un modificador de superficie (Pluronic F-68) al 10 % (p/v) y la mezcla resultante se agitó y emulsionó con un mezclador de vórtice para preparar una emulsión S/O/W. De la emulsión S/O/W, se eliminó el carbonato de dimetilo mediante evaporación del disolvente para preparar una suspensión de micropartículas inmunogénicas. La suspensión se transfirió a un tubo de 15 ml y se sometió a centrifugación a 8.000 rpm durante 10 minutos para precipitar las partículas. Después de eliminar el sobrenadante, las partículas se resuspendieron en 10 ml de agua destilada y la suspensión resultante se sometió a centrifugación en las mismas condiciones descritas anteriormente para realizar la reprecipitación de las partículas. Esta operación de lavado se repitió una vez más y, después de la eliminación del sobrenadante, las partículas se suspendieron en 200 pl de una solución acuosa (solución de inyección (E)) que contenía manitol al 5 % (p/v), carboximetilcelulosa sódica al 0,5 % (p/v) y polisorbato 80 al 0,1 % (p/v). La suspensión resultante se sometió a congelación previa con nitrógeno líquido y se liofilizó utilizando un liofilizador (EYELA, FREEZE DRYER FD-1000) a una temperatura de enfriamiento de la trampa de -45 °C a un grado de vacío de 20 Pa durante 24 horas para obtener una micropartícula inmunogénica.

Como surfactante, se disolvió polisorbato 80 en la solución acuosa de CEA (A), solución de polímero anfifílico (B) o dispersión (C), tal como se muestra en la tabla 3, en una cantidad correspondiente al 10 % (p/p), 1 % (p/p) o 0,1 % (p/p) con respecto a la cantidad del polímero anfifílico, para preparar las partículas (11) a (15). Además, en términos de partículas comparativas, se disolvió polisorbato 80 en la solución acuosa (D) que contenía un modificador de superficie o una solución de inyección (E), en la cantidad correspondiente al 10 % (p/p) con respecto a la cantidad del polímero anfifílico, para preparar la partícula comparativa (3), en la que el surfactante está unido a las superficies de las micropartículas, la partícula comparativa (4), en la que el surfactante y las micropartículas inmunogénicas coexisten sin estar unidas entre sí, así como la partícula comparativa (5), en la que el surfactante no se añadió en el procedimiento de preparación de micropartículas inmunogénicas.

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Ejemplo 9 Administración subcutánea de una composición inmunogénica que contiene CEA a ratones (4)

Cada tipo de las micropartículas inmunogénicas preparadas en el ejemplo 8 (partículas (11) a (13)) se administró por vía subcutánea mediante el procedimiento descrito en el ejemplo 4 mediante una única inyección en el lomo de ratones Balb/C macho de 7 semanas de vida (Japan SLC, Inc.) a una dosis de 5 |xg en términos de CEA por individuo. Como ejemplos comparativos, se administraron por vía subcutánea partículas a las que se añadió el surfactante de diferentes maneras (partículas comparativas (3) y (4)) mediante una única inyección en el lomo de ratones Balb/C a una dosis de 5 |xg en términos de CEA por individuo. En cada condición, la administración se llevó a cabo para 5 individuos de ratones. La figura 4 muestra el valor promedio del título de anticuerpos. La recogida de sangre y la medición del título de anticuerpos se llevaron a cabo mediante los procedimientos descritos en el ejemplo 4.

El valor promedio del título de anticuerpos contra CEA en el plasma sanguíneo en la semana 5 después de la administración se muestra en la figura 4. En los casos en los que el surfactante se añadió a la solución acuosa de CEA (A), la solución de polímero (B) o la dispersión (C) (partículas (11) a (13)), el surfactante está presente dentro de la emulsión S/O/W, de manera que el surfactante está encapsulado en la micropartícula. Por otro lado, en el caso de la partícula (partícula comparativa (3)) añadida a la solución acuosa (D) que contiene un modificador de superficie, el polisorbato 80 está presente fuera de la emulsión S/O/W, de manera que el surfactante está unido a la superficie de la micropartícula. En el caso de la partícula (partícula comparativa (4)) añadida a la solución de inyección (E), el surfactante y las micropartículas coexisten sin estar unidas entre sí. Dado que las micropartículas inmunogénicas (partículas (11) a (13)), en las que el surfactante está encapsulado, mostraron títulos de anticuerpos más elevados en comparación con la partícula (partículas comparativas (3)), en la que el surfactante está unido a la superficie, y la partícula (partículas comparativas (4)), en la que el surfactante no está unido a la superficie, se observó que la encapsulación del surfactante en la micropartícula inmunogénica es importante en la presente invención.

Ejemplo 10 Administración subcutánea de una composición inmunogénica que contiene CEA a ratones (5)

Cada tipo de las micropartículas inmunogénicas preparadas en el ejemplo 8 (partículas (11), (14) y (15)) se administró por vía subcutánea mediante el procedimiento descrito en el ejemplo 4 mediante una única inyección en el lomo de ratones Balb/C macho de 7 semanas de vida (Japan SLC, Inc.) a una dosis de 5 |xg en términos de CEA por individuo. Como ejemplo comparativo, se administraron por vía subcutánea partículas que no contenían surfactante (partícula comparativa (5)) mediante una única inyección en el lomo de ratones Balb/C a una dosis de 5 |xg en términos de CEA por individuo. En cada condición, la administración se llevó a cabo para 5 individuos de ratones. La figura 5 muestra el valor promedio del título de anticuerpos. La recogida de sangre y la medición del título de anticuerpos se llevaron a cabo mediante los procedimientos descritos en el ejemplo 4.

El valor promedio del título de anticuerpos contra CEA en el plasma sanguíneo en la semana 3 después de la administración se muestra en la figura 5. Las partículas en las que un surfactante está encapsulado (partículas (11), (14) y (15)) mostraron títulos de anticuerpos más elevados en comparación con la partícula que no contenía surfactante (partícula comparativa (5)). Además, entre las partículas en las que un surfactante está encapsulado, cuanto mayor era la cantidad de surfactante añadida, mayor era el título de anticuerpos. De este modo, se demostró que el efecto aumenta a medida que aumenta la cantidad de surfactante encapsulado en la partícula.

Ejemplo 11 Medición del surfactante contenido en micropartículas inmunogénicas (2)

Las micropartículas inmunogénicas preparadas en el ejemplo 8 (partículas (11) a (13) y partícula comparativa (3)) se utilizaron para medir el contenido de polisorbato 80 contenido en las micropartículas inmunogénicas mediante el procedimiento descrito en el ejemplo 7.

Mediante cromatografía líquida de alta resolución, se analizó el contenido de polisorbato 80 con respecto a la cantidad alimentada del polímero anfifílico que constituye la micropartícula inmunogénica o con respecto a la cantidad de surfactante alimentado en el procedimiento de producción. Los resultados se muestran en la tabla 4. En las partículas en las que se añadió un surfactante a la solución acuosa de CEA (A), solución de polímero anfifílico (B) o dispersión (C) (partículas (11) a (13)), el surfactante fue encapsulado en las micropartículas en el procedimiento de preparación. Por consiguiente, se observó que aproximadamente el 30 % (p/p) del surfactante añadido en el procedimiento de preparación del ejemplo 8 estaba contenido en las partículas. Por otro lado, en el caso de las partículas (partícula comparativa (3)) preparadas mediante el procedimiento en el que el surfactante se añadió a la solución acuosa (D) que contenía un modificador de superficie, el surfactante se une a las superficies de las micropartículas y se observó que sólo estaba contenido aproximadamente el 3 % del surfactante añadido en el procedimiento de preparación.

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Ejemplo 12 Preparación de micropartículas inmunogénicas que contienen OVA (partículas (16) a (18) y partícula comparativa (6))

En 100 pl de carbonato de dimetilo se disolvieron 5 mg de dextrano-ácido poli(láctico-co-glicólico) (PLGA) (compuesto (2)) preparado en el ejemplo 1, para preparar una solución de polímero anfifílico (B) 50 mg/ml. A la solución de polímero anfifílico (B), se añadieron 20 pl de terc-butanol y, a continuación, se le añadieron, gota a gota, 50 pl de solución acuosa de OVA (ovoalbúmina) (A) (SIGMA) al 0,25% (p/v) (cantidad de OVA alimentada, 125 pg), seguido de agitación de la mezcla resultante con un mezclador de vórtice para producir una emulsión de fase inversa.

La emulsión de fase inversa se sometió a congelación previa con nitrógeno líquido y se liofilizó utilizando un liofilizador (EYELA, FREEZE DRYER FD-1000) a una temperatura de enfriamiento de la trampa de -45 °C a un grado de vacío de 20 Pa durante 24 horas. Los sólidos obtenidos se dispersaron en 200 pl de carbonato de dimetilo para preparar una dispersión. La dispersión se añadió, gota a gota, a 2 ml de una solución acuosa (C) que contenía un modificador de superficie al 10 % (p/v) (Pluronic F-68) y la mezcla resultante se agitó y emulsionó con un mezclador de vórtice para preparar una emulsión S/O/W. De la emulsión S/O/W, se eliminó el carbonato de dimetilo mediante evaporación del disolvente para preparar una suspensión de micropartículas inmunogénicas. La suspensión se transfirió a un matraz tipo berenjena y se sometió a congelación previa con nitrógeno líquido, seguido de liofilización utilizando un liofilizador (EYELA, FREEZE DRYER FD-1000) a una temperatura de enfriamiento de la trampa de -45 °C a un grado de vacío de 20 Pa durante 24 horas para obtener micropartículas inmunogénicas.

Tal como se muestra en la tabla 5, en términos del surfactante, se disolvió polisorbato 80 o monooleato de sorbitán (éstos fueron fabricados por Kanto Chemical Co., Inc.) o aceite de ricino hidrogenado y polioxietilenado (fabricado por Nikko Chemicals Co., Ltd.) en la solución acuosa de OVA (A) o en la solución de polímero anfifílico (B), en una cantidad de 500 pg, que correspondía al 10 % (p/p) con respecto a la cantidad de polímero anfifílico.

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Ejemplo 13 Prueba de estimulación in vitro de composiciones inmunogénicas que contienen OVA utilizando macrófagos peritoneales de ratón

Se llevó a cabo una prueba de estimulación in vitro utilizando macrófagos peritoneales de ratón mediante el siguiente procedimiento. Utilizando una aguja de inyección 26-G (Terumo Corporation), se administraron por vía intraperitoneal 5 ml de medio tioglicolato (GIBCO) como líquido de estimulación a un ratón Balb/C macho de 12 semanas de vida y el ratón se mantuvo durante 72 horas en un ambiente en el que el ratón pudo comer libremente. A continuación, se sacrificó al ratón utilizando hielo seco y se inyectaron al ratón por vía intraperitoneal 10 ml de solución de PBS (0 °C, filtrada) con una aguja de inyección de 26 G, seguido de reposo del ratón mientras se masajeaba el abdomen del ratón durante 5 minutos. A continuación, se recogió una solución que contenía células abdominales utilizando una micropipeta.

La solución recogida se centrifugó utilizando una centrífuga refrigerada (fabricada por Hitachi, Ltd., himacCF16RX) a 4 °C a 400 g x 5 minutos para precipitar las células abdominales de ratón y se eliminó el sobrenadante, seguido de la adición a la misma de 10 ml de medio RPMI1640 (GIBCO) (en lo sucesivo denominado solución de lavado) y la resuspensión de las células. La centrifugación se llevó a cabo nuevamente a 400 g x 5 minutos a 4 °C para eliminar el sobrenadante y las células se sembraron en una placa de 24 pocillos (microplaca fabricada por Iwaki, Flat Bottom Tissue culture Treated, Polystyrene), de manera que cada pocillo contenía 8 x 105 células junto con 1 ml de medio RPMI1640 suplementado con FBS al 5% (SIGMA), 100 U/ml de penicilina (Invitrogen) y 100 U/ml de estreptomicina (Invitrogen) (en lo sucesivo denominado medio de cultivo). La placa después de la siembra se incubó utilizando una incubadora de CO2 (NAPCO) bajo CO2 al 5 % a 37 °C y el 100 % de humedad (condiciones para el cultivo de macrófagos) durante 3 horas, y las células se suspendieron vigorosamente utilizando una micropipeta para eliminar las células que no se adhirieron a la placa para obtener solo macrófagos peritoneales de ratón que se adhieren a la placa. Se añadió el medio de cultivo a las células y las células se incubaron en las condiciones de cultivo para macrófagos durante 5 días para proporcionar células que se utilizarían en el experimento.

Como partículas para añadir a las células, las micropartículas inmunogénicas (partículas (16) a (18)) preparadas en el ejemplo 12, en las que el surfactante está encapsulado, cuyas micropartículas estaban en estado liofilizado, se utilizaron después del pretratamiento. Más específicamente, se pesaron partículas en la cantidad correspondiente a 3 mg en términos de la cantidad de polímero anfifílico que constituye las partículas y se colocaron en un tubo de 1,5 ml. Se le añadió la solución de lavado y la mezcla resultante se enfrió previamente a 0 °C, seguido de lavado de las partículas 3 veces a 8.400 g durante 10 minutos. A continuación, las partículas se añadieron a la placa de 24 pocillos, en la que se sembraron los macrófagos peritoneales de ratón, junto con 500 |jJ/pocillo del medio de cultivo. Como ejemplo comparativo, se añadieron de forma similar partículas que no contenían surfactante (partícula comparativa (6)).

Además, tal como se muestra en la tabla 6 como otros ejemplos comparativos (ejemplos comparativos (1) a (3)), se añadieron OVA en una cantidad de 75 |xg (calculada en base a la proporción en peso entre la cantidad alimentada del polímero anfifílico y la cantidad alimentada de OVA), que era la misma que la cantidad de OVA contenida en las partículas (16) a (18), y 300 |xg de polisorbato 80, monooleato de sorbitán o aceite de ricino hidrogenado y polioxietilenado, a cada pocillo de las placas de 24 pocillos en los que se sembraron los macrófagos peritoneales de ratón, junto con 500 |j.l del medio de cultivo. Además, como ejemplo comparativo (4), se añadieron 75 |xg de OVA junto con 500 |jJ del medio de cultivo.

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Las células a las que se añadieron las partículas se cultivaron durante 24 horas y se recuperó el medio, seguido de la medición de la cantidad de TNFa contenido en el medio con ELISA. La medición con ELISA se llevó a cabo utilizando un kit fabricado por Thermo Scientific.

La concentración de TNFa en el medio fue tal como se muestra en la figura 6. Las partículas en las que un surfactante está encapsulado (partículas (16) a (18)) mostraron concentraciones más elevadas de TNFa en comparación con las partículas (partícula comparativa (6)) en las que ningún surfactante está encapsulado. El TNFa es un tipo de citocina que induce inmunidad y se demostró que se puede conseguir una inducción eficaz de la inmunidad mediante la encapsulación de un surfactante en la partícula. Además, en los ejemplos comparativos en los que el antígeno no estaba en forma de partículas y se añadió junto con un surfactante (ejemplos comparativos (1) a (4)), la concentración de TNFa fue menor que en los casos en los que el antígeno estaba en forma de partículas. De este modo, se demostró que la formación en partículas es importante para la inducción de inmunidad.

APLICABILIDAD INDUSTRIAL

La composición inmunogénica de la presente invención se puede utilizar como una vacuna para la terapia y/o profilaxis de enfermedades infecciosas y cánceres.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Composición inmunogénica que comprende, como ingredientes eficaces: una micropartícula inmunogénica compuesta por un complejo de antígeno-micropartícula adyuvante, en la que uno o más antígenos están encapsulados en una micropartícula adyuvante compuesta por uno o más polímeros anfifílicos, cuyo segmento o segmentos hidrófobos son ácido poli(láctico-co-glicólico) y cuyo segmento hidrófilo es un polisacárido; y un surfactante; estando dicho surfactante encapsulado en dicha micropartícula inmunogénica y comprendiendo una estructura de éster de ácido graso.

2. Composición inmunogénica que comprende dos o más micropartículas inmunogénicas, según la reivindicación 1, asociadas entre sí para formar un agregado.

3. Composición inmunogénica, según la reivindicación 1 o 2, en la que dicho polímero anfifílico es un polímero anfifílico de injerto compuesto por una cadena principal de polisacárido y una o más cadenas de injerto de ácido poli(láctico-co-glicólico).

4. Composición inmunogénica, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicho polisacárido es dextrano.

5. Composición inmunogénica, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicho surfactante comprende, además, una o más estructuras de monosacárido y/o polietilenglicol.

6. Composición inmunogénica, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicho surfactante es uno o más seleccionados del grupo que consiste en polisorbato 80, polisorbato 20, monooleato de sorbitán, trioleato de sorbitán y aceite de ricino hidrogenado y polioxietilenado.

7. Procedimiento para preparar una composición inmunogénica que comprende como ingrediente eficaz una micropartícula inmunogénica, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

disolver uno o más surfactantes que comprenden una estructura de éster de ácido graso en un disolvente acuoso A, en el que uno o más antígenos están disueltos, o en un disolvente orgánico B inmiscible en agua, en el que están disueltos uno o más polímeros anfifílicos, cuyo segmento o segmentos hidrófobos son ácido poli(láctico-co-glicólico) y cuyo segmento hidrófilo es un polisacárido, mezclar la mezcla que comprende dicho disolvente acuoso A con la mezcla que comprende dicho disolvente orgánico B inmiscible en agua, mezclar la mezcla resultante para formar una emulsión de fase inversa; y eliminar el disolvente de dicha emulsión de fase inversa.

8. Composición inmunogénica que comprende dos o más micropartículas inmunogénicas, según la reivindicación 1, asociadas entre sí para formar un agregado, obteniéndose dicha composición inmunogénica mediante un procedimiento que comprende las etapas de:

mezclar un disolvente acuoso A, en el que uno o más antígenos están disueltos, y un disolvente orgánico B inmiscible en agua en el que están disueltos uno o más polímeros anfifílicos, cuyo segmento o segmentos hidrófobos son ácido poli(láctico-co-glicólico) y cuyo segmento hidrófilo es un polisacárido, para formar una emulsión de fase inversa;

eliminar el disolvente de dicha emulsión de fase inversa para obtener un complejo de antígeno-micropartícula adyuvante; dispersar el complejo de antígeno-micropartícula adyuvante obtenido en un medio de dispersión para formar una dispersión C del complejo de antígeno-micropartícula adyuvante; e

introducir dicha dispersión C del complejo de antígeno-micropartícula adyuvante en una fase líquida D, en la que está disuelto un modificador de superficie seleccionado entre un polímero hidrófilo y un compuesto anfifílico, seguido de la eliminación del medio de dispersión;

en el que dicho procedimiento comprende disolver uno o más surfactantes que comprenden una estructura de éster de ácido graso en dicho disolvente acuoso A, en dicho disolvente orgánico B inmiscible en agua y/o en dicha dispersión C.