MX2013002193A - Composicion inmunogenica. - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere a una composición inmunogénica que comprende, como ingredientes activos, partículas inmunogénicas obtenidas de complejos de micropartículas adyuvantes-antígenos en donde el antígeno está encerrado en micropartículas adyuvantes obtenidas de un polímero anfifílico que tiene un poli(hidroxi ácido) para los segmentos hidrofóbicos; y un agente tensioactivo. La composición inmunogénica obtenida por el agente tensioactivo que está encerrada en las micropartículas inmunogénicas tiene una excelente capacidad para activar la inmunidad in vivo aún con cantidades pequeñas del antígeno y pocas inmunizaciones.
Description
COMPOSICION I MUNOGENICA
Campo de la Invención
La presente invención se refiere a una composición inmunogénica que comprende como un ingrediente eficaz una micropartícula inmunogénica, tal micropartícula inmunogénica comprende: un complejo de micropartícula adyuvante-antígeno en donde un (os) antígeno(s) está/están encapsulado (s) en una micropartícula adyuvante compuesta de un(os) polímero (s) anfifílico (s) ; y un agente tensioactivo .
Antecedentes de la Invención
Para la mejora de una capacidad de activación inmunológica de un antígeno, se utiliza un adyuvante conjuntamente con el antígeno. Aunque el adyuvante de Freund completo (CFA, por sus siglas en inglés) ya se sabe que tiene un excelente efecto como un adyuvante, el CFA está compuesto de bacterias exterminadas y una emulsión de aceite, y por consiguiente tiene efectos secundarios fuertes tales como una reacción inflamatoria fuerte y la formación de una hinchazón ulcerante (granuloma) en el sitio de administración. Por lo tanto, el uso de CFA para los seres humanos no está permitido en vista de la seguridad. En consecuencia, los adyuvantes cuya administración a un ser humano es permitida, son limitados.
Los ejemplos de los adyuvantes cuya administración
Ref. 237347 al ser humano es permitida incluyen los adyuvantes de hidróxido de aluminio, pero sus capacidades de activación inmunológica no necesariamente son suficientes y por consiguiente necesitan ser administrados repetidamente para lograr una adquisición de inmunidad. Por lo tanto, el desarrollo de una composición inmunogénica que utilice un adyuvante eficiente y fuerte, cuya composición pueda ser utilizada para los seres humanos, ha sido demandado.
Para el desarrollo de un adyuvante novedoso que tenga como objetivo lograr una capacidad de activación inmunológica elevada, se ha intentado un método en donde un antígeno sea encapsulado en una micropartícula . Se ha reportado que la administración de un antígeno microparticulado mejora las reacciones inmunológicas tales como la producción de un anticuerpo comparado con el caso de la administración de un antígeno solo, pero el efecto de su administración no necesariamente es elevado, y solamente un efecto a casi el mismo nivel que en el caso del adyuvante de hidróxido de aluminio mencionado anteriormente ha sido reportado. Esto se considera que va a ser debido a la dificultad en encapsular eficientemente las moléculas de los antígenos hidrofilicos tales como las proteínas en las micropartículas estudiadas siempre que tales micropartículas compuestas de copolímeros de ácido poliláctico-ácido pliglicólico, hidrofóbicos , mantengan las estructuras de las moléculas del antígeno (Documento no de patente 1) .
En años recientes, una tecnología de micropartículas novedosa ha sido reportada (Documentos de Patente 1 y 2) , tal tecnología utiliza un polímero anfifílico y hace posible una encapsulación altamente eficiente de una proteína de peso molecular elevado. Aunque esta micropartlcula novedosa ha sido estudiada para verificar su funcionamiento de liberación sostenida para los fármacos, su función del adyuvante en los casos de la encapsulación de un antígeno no ha sido estudiada allí para nada. Además, en términos del mecanismo por el cual una micropartícula que contiene un antígeno funciona como un adyuvante, se piensa que la función para la liberación sostenida de la molécula de antígeno así como el mecanismo por el cual la micropartícula que contiene un antígeno es incorporada en su totalidad en un inmunocito y la liberación del antígeno en las células son importantes, y que la función de la liberación del fármaco desde la partícula y el funcionamiento como un adyuvante no necesariamente están correlacionados entre sí. Por lo tanto, es difícil inferir la función adyuvante basado en el funcionamiento de liberación sostenida de la partícula, y un adyuvante efectivo que tiene un mucho mejor funcionamiento que los adyuvantes de aluminio no ha sido obtenido por las tecnologías convencionales utilizando las micropartículas a pesar de la demanda de su desarrollo.
Documentos del Arte Previo
Documentos de Patente
[Documento de patente 1] WO2006/095668
[Documento de patente 2] JP 2008-088158 A
Documentos no de Patente
[Documento no de Patente 1] Advanced drug delivery reviews, 2005, vol. 57, pp. 391-410.
Breve Descripción de la Invención
Problemas que van a ser resueltos por la invención
La presente invención tiene por objeto proporcionar una composición inmunogénica que muestre una capacidad de activación inmunológica elevada aún con una cantidad del antígeno pequeña y/o un número pequeño de dosis.
Medios para resolver los problemas
Para resolver los problemas descritos anteriormente, los presentes inventores estudiaron un método por el cual un nivel elevado de activación inmunológica puede ser inducido utilizando una cantidad pequeña del antígeno y con un número pequeño de dosis del mismo, y, como resultado, se descubrió que una composición inmunogénica que- comprende, como ingredientes eficaces: una micropartícula inmunogénica compuesta de un complejo de micropartícula adyuvante-antígeno en donde un (os) antígeno (s) es/son encapsulado (s) en una micropartícula adyuvante; y un agente tensioactivo; tiene una capacidad de activación inmunológica in vivo. Es decir, la presente invención tiene la siguiente constitución.
(1) Una composición inmunogénica que comprende, como ingredientes eficaces: una micropartícula inmunogénica compuesta de un complejo de micropartícula adyuvante-antígeno en donde un (os) antígeno(s) es/son encapsulado (s) en una micropartícula adyuvante compuesta de un (os) polímero (s) anfifílico (s) cuyo(s) segmento (s) hidrofóbico (s) es/son un poli (hidroxi ácido); y un agente tensioactivo; el agente tensioactivo está encapsulado. en la micropartícula inmunogénica .
(2) La composición inmunogénica de acuerdo con (1) , en donde la micropartícula inmunogénica es una partícula compuesta de un complejo de micropartícula adyuvante-antígeno asociado conjuntamente.
(3) La composición inmunogénica de acuerdo con (1) o (2) , en donde el agente tensioactivo comprende una estructura del éster de ácido graso.
(4) La composición inmunogénica de acuerdo con cualquiera de (1) a (3), en donde la micropartícula adyuvante tiene, en la porción interna del mismo, una(s) porción(es) hidrofílica (s) compuesta (s) de un (os) segmento (s) hidrofílico (s) del (de los) polímero (s) anfifílico (s) , y tiene una capa externa compuesta de una(s) porción (es) hidrofóbica (s) compuesta (s) de un (os) segmento (s) hidrofóbico (s) del(de los) polímero(s) anfifílico (s) .
(5) La composición inmunogénica de acuerdo con cualquiera de (1) a (4) , en donde el segmento hidrofílico del polímero anfifílico es un polisacárido .
(6) La composición inmunogénica de acuerdo con cualquiera de (1) a (5) , en donde el polímero anfifílico es un polímero anfifílico de injerto, compuesto de una cadena principal de polisacárido y una(s) cadena (s) de injerto de poli (hidroxi ácido) .
(7) La composición inmunogénica de acuerdo con (5) o (6) , en donde el polisacárido es el dextrano.
(8) La composición inmunogénica de acuerdo con cualquiera de (1) a (7) , en donde el poli (hidroxi ácido) es el poli (ácido láctico-co-glicólico) .
(9) La composición inmunogénica de acuerdo con cualquiera de (1) a (8), en donde el agente tensioactivo comprende además un monosacárido y/o estructura (s) de polietilen glicol.
(10) La composición inmunogénica de acuerdo con cualquiera de (1) a (9) en donde el agente tensioactivo es uno o más seleccionados del grupo que consiste de polisorbato 80, polisorbato 20, monooleato de sorbítan, trioleato de sorbitan y aceite de ricino hidrogenado polioxietileno.
(11) Una composición inmunogénica que comprende como un ingrediente eficaz una micropartícula inmunogénica obtenida por las etapas de:
disolver un (os) agente (s) tensioactivo (s) en un solvente acuoso A en donde un (os) antígeno(s) es/son disuelto (s) o en un solvente orgánico B inmiscible en agua en donde un(os) polímero(s) anfifílico ( s) cuyo(s) segmento(s) hidrofóbico (s) es/son el poli (hidroxi ácido) está/están disuelto (s), y mezclar la mezcla resultante para formar una emulsión de fase inversa; y
eliminar el solvente de la emulsión de fase inversa.
(12) Una composición inmunogénica que comprende como un ingrediente eficaz una micropartícula inmunogénica obtenida por un proceso para la producción de una partícula compuesta de un complejo de micropartícula adyuvante-antígeno asociado conjuntamente, el proceso comprende las etapas de:
mezclar un solvente acuoso A en donde un (os) antígeno(s) es/son disuelto (s) y un solvente orgánico B inmiscible en agua en donde un (os) polímero (s) anfifílico (s) cuyo(s) segmento (s) hidrofóbico ( s) es/son el poli (hidroxi ácido) está/están disuelto (s), para formar una emulsión de fase inversa;
eliminar el solvente de la emulsión de fase inversa para obtener un complejo de micropartícula adyuvante-antígeno; e
introducir una dispersión C del complejo de micro-partícula adyuvante-antígeno a una fase líquida D en donde un modificador de la superficie es disuelto, seguido por la eliminación del medio de dispersión;
en donde un (os) agente (s) tensioactivo (s) es/son disuelto (s) en el solvente acuoso A, el solvente orgánico B inmiscible en agua y/o la dispersión C.
Efecto de la Invención
Por la presente invención, una composición inmunogénica con una activación inmunológica más fuerte que anteriormente es posible que sea provista in vivo.
Breve Descripción de las Figuras
La Figura 1 muestra una evaluación inmunológica 1 de las micropartículas inmunogénicas que contienen CEA.
La Figura 2 muestra una evaluación inmunológica 2 de las micropartículas inmunogénicas que contienen CEA.
La Figura 3 muestra una evaluación inmunológica 3 de las micropartículas inmunogénicas que contienen CEA.
La Figura 4 muestra una evaluación inmunológica 4 de las micropartículas inmunogénicas que contienen CEA.
La Figura 5 muestra una evaluación inmunológica 5 de las micropartículas inmunogénicas que contienen CEA.
La Figura 6 muestra una evaluación inmunológica de las micropartículas inmunogénicas que contienen OVA.
Descripción Detallada de la Invención
La presente invención se refiere a una composición inmunogénica que comprende, como ingredientes eficaces: una micropartícula inmunogénica compuesta de un complejo de micropartícula adyuvante-antígeno en donde un (os) antígeno(s) es/son encapsulado (s) en una micropartícula adyuvante compuesta de un (os) polímero (s) anfifílico (s) cuyo(s) segmento (s) hidrofóbico (s) es/son el poli(hidroxi ácido); y un agente tensioactivo .
En primer lugar, el polímero anfifílico que constituye la micropartícula adyuvante es descrito. Que sea "anfifílico" significa que las propiedades tanto de hidrofilicidad como hidrofobicidad son retenidas. Cuando la solubilidad de una cierta porción en el agua es más elevada que aquella de las otras porciones, la porción se dice que va a ser hidrofílica. La porción hidrofílica preferentemente es soluble en agua, pero aún en los casos en donde la porción tenga una solubilidad escasa en el agua, es suficiente si la solubilidad en el agua es más elevada que aquella de las otras porciones. Cuando la solubilidad de una cierta porción en el agua es inferior que aquella de las otras porciones, el segmento se dice que va a ser hidrofóbico. La porción hidrofóbica es preferentemente insoluble en agua, pero aún en los casos en donde la porción sea soluble en agua, es suficiente si la solubilidad en el agua es inferior que aquella de las otras porciones .
El polímero anfifílico significa un polímero que tiene la anfifilicidad mencionada anteriormente como la molécula entera. El polímero significa que la molécula tiene una estructura molecular en donde un (os) segmento (s) hidrofílico (s) o un(os) segmento (s) hidrofóbico (s) del polímero anfifílico, o ambos, está/están constituido (s) por una(s) estructura (s) en la(s) cual (es) las unidades mínimas (monómeros) son repetidas. El polímero anfifílico de la presente invención no está restringido siempre que el mismo tenga una estructura que tenga un(os) segmento (s) hidrofílico (s) y un(os) segmento(s) hidrofóbico (s) , y puede ser un polímero de bloques, lineal, que tenga un (os) segmento (s) hidrofílico (s) y un(os) segmento (s) hidrofóbico (s) enlazados entre sí; un polímero ramificado que tenga una(s') ramificación (es) en el cual una pluralidad de segmentos hidrofílicos o segmentos hidrofóbicos , o ambos de estos, existan; o un polímero de injerto en el cual una pluralidad de segmentos hidrofóbicos sean injertados a un segmento hidrofílico o una pluralidad de segmentos hidrofílicos sean injertados a un segmento hidrofóbico. El polímero anfifílico de la presente invención es preferentemente un polímero que tenga un segmento hidrofílico, más preferentemente un polímero de bloques, lineal, que tiene uno de cada uno de un segmento hidrofílico y de un segmento hidrofóbico, o un polímero de injerto, o un polímero de injerto que tiene una pluralidad de segmentos hidrofóbicos injertados sobre una cadena principal del segmento hidrofílico.
Los polímeros anfifílicos que constituyen la composición · inmunogénica pueden ser un conjunto de una pluralidad de tipos de polímeros anfifílicos compuestos de los polímeros constituyentes que tienen diferentes porciones hidrofílicas y/o porciones hidrofílicas , o un conjunto de polímeros anfifílicos que tienen el mismo constituyente polimérico pero que tienen una pluralidad de tipos de configuraciones de enlace, siempre que los polímetros anfifílicos tengan propiedades como una micropartícula adyuvante. En vista del logro de un funcionamiento estable y una productividad mejorada, los polímeros anfifílicos son preferentemente un conjunto de un número pequeño de tipos de polímeros anfifílicos, más preferentemente un conjunto de principalmente no más de 2 tipos de polímeros anfifílicos, y todavía constituido más preferentemente por principalmente un solo tipo del polímero anfifílico.
En la presente invención, el segmento hidrofóbico del polímero anfifílico es un poli (hidroxi ácido). El poli(hidroxi ácido) no está restringido, y preferentemente es un polímero biocompatible que no tenga un efecto adverso severo durante la administración a un cuerpo viviente. La biocompatibilidad significa aquí que LD50 en el caso de la administración oral del polímero a las ratas no es menor que 2,000 mg/kg. Además, el polímero puede ser un copolímero de una pluralidad de tipos de hidroxiácidos , y es preferentemente un polímero de no más de 2 tipos de hidroxiácidos. Los ejemplos preferidos particulares del poli(hidroxi ácido) incluyen el ácido poliglicólico, ácido poliláctico, poli (ácido 2-hidroxibutírico) , poli (ácido 2-hidroxivalérico) , poli (ácido 2 -hidroxicaproico) , poli (ácido 2-hidroxacáprico) y poli (ácido málico) ; y los derivados y copolímeros de estos compuestos macromoleculares; entre los cuales son más preferidos el ácido poliláctico, ácido poliglicólico, y los copolímeros de poli (ácido láctico-co-glicólico) . Además, en los casos en donde el poli (hidroxi ácido) es el poli (ácido láctico-co-glicólico) , la relación de la composición del poli (ácido láctico-co-glicólico) (ácido láctico/ácido glicólico) (% mol/mol) no está restringido siempre que el propósito de la presente invención sea logrado con el presente, y la relación es preferentemente 100/0 hasta 30/70, más preferentemente 60/40 hasta 40/60.
El segmento hidrofílico del polímero anfifílico no está restringido, y preferentemente es un polímero biocompatible , como en el caso del segmento hidrofóbico. Además, para proporcionar una capacidad adyuvante persistente a la micropartícula adyuvante compuesta de un(os) polímero(s) anfifílico (s) , el segmento es preferentemente un polímero refractario que no es descompuesto fácilmente en un cuerpo viviente o una célula de un mamífero o ave. Los ejemplos particulares del polímero biocompatible y refractario incluyen polietilen glicol, polivinil pirrolidona, alcohol polivinílico, polietilenimina, ácido poliacrílico, ácido polimetacrílico, poli-1, 3 -dioxolano, polímero de la 2-metacriloiloxietil fosforil colina, poli-1 , 3 , 6- trioxano, poliaminoácido y polisacáridos refractarios (por ejemplo, celulosa, quitina, quitosana, goma de gelano, ácido algínico, ácido hialurónico, pululano y dextrano) . En los casos en donde el segmento hidrofílico es el polietilen glicol, polivinil pirrolidona, alcohol polivinílico, polietilenimina, ácido poliacrílico, ácido polimetacrílico, poli-1, 3-dioxolano, polímero de la 2-metacriloiloxietil fosforil colina, poli-1 , 3 , 6 -trioxano o un poliaminoácido, el polímero anfifílico es preferentemente un polímero de bloques, lineal, que tiene uno de cada uno de un segmento hidrofílico y un segmento hidrofóbico, y, en los casos en donde el segmento hidrofílico. es un polisacárido, el polímero anfifílico es preferentemente un polímero de injerto que tiene una pluralidad de segmentos hidrofóbicos injertados sobre una cadena principal del segmento hidrofílico. Además, el segmento hidrofílico del polímero anfifílico es preferentemente el polietilen glicol o un polisacárido refractario, y el polisacárido es más preferentemente el dextrano .
El polímero anfifílico que tiene un (os) segmento (s) hidrofóbico (s) compuesto (s) de poli(hidroxi ácido) y un (os) segmento (s) hidrofílico (s) preferentemente tiene una inmiscibilidad en el agua como el polímero completo, en vista de la capacidad de encapsulación del antígeno de la composición inmunogénica y la persistencia durante la administración a un cuerpo viviente.
El peso molecular promedio del segmento hidrofílico del polímero anfifílico no está restringido, y, en el caso de un polímero de bloques en donde un (os) segmento (s) hidrofílico (s) y un (os) segmento (s) hidrofóbico (s) están enlazados linealmente entre sí, el peso molecular promedio es preferentemente de 1,000 hasta 50,000, más preferentemente 2,000 hasta 15,000. El término "bloque" significa aquí que una porción en una molécula polimérica, tal porción está compuesta de no menos de 5 unidades monoméricas y son diferentes de la(s) otra(s) porción(es) adyacente (s) en términos de la estructura o configuración química. Un polímero constituido por al menos dos bloques enlazados linealmente entre sí es llamado un polímero de bloques. Cada bloque que constituye por sí mismo el polímero de bloques puede ser un polímero aleatorio, alternativo o de gradientes, compuesto de no menos de 2 tipos de unidades monoméricas. Preferentemente, en la presente invención, el polímero de bloques es uno en donde una unidad de un polímero que forma un segmento hidrofílico y una unidad del poli (hidroxi ácido) preferentemente están enlazados conjuntamente.
En el caso de un polímero de injerto que tiene un (os) segmento (s) hidrofóbico (s) injertado (s) sobre una cadena principal del segmento hidrofílico, el peso molecular promedio del segmento hidrofílico es preferentemente de 1,000 hasta 100,000, más preferentemente 2,000 hasta 50,000, todavía más preferentemente de 10,000 hasta 40,000. El número de cadenas de injerto es preferentemente de 2 hasta 50. El número de las cadenas de injerto puede ser calculado con base en la relación entre el soporte del segmento hidrofílico y el soporte del segmento hidrofóbico, y el peso molecular promedio del segmento hidrofóbico, como es obtenido por la medición de 1H-RMN, y el peso molecular promedio del soporte del segmento hidrofílico utilizado.
La relación del peso molecular promedio preferido entre el segmento hidrofílico y el segmento hidrofóbico varía dependiendo del polímero anfifílico, y, en el caso de un polímero de bloques en donde un (os) segmento (s) hidrofóbico (s) y un (os) segmento (s) hidrofílico (s) están enlazados linealmente entre sí, la relación del peso molecular promedio entre el segmento hidrofílico y el segmento hidrofóbico es preferentemente 1:1 o mayor, más preferentemente 1:2 o mayor, todavía más preferentemente 1:4 o mayor, especialmente de manera preferible 1:4 o mayor y 1:25 o menor.
Preferentemente, en el caso de un polímero de injerto que tiene una pluralidad de segmentos hidrofóbicos injertados sobre una cadena principal del segmento hidrofílico, la relación del peso molecular promedio entre la porción del soporte del segmento hidrofílico y las cadenas de injerto del segmento hidrofóbico completo es de 1:3 o mayor, y el peso molecular promedio de cada cadena de injerto es de 2,500 hasta 40,000. Más preferentemente, la relación del peso molecular promedio total es de 1:5 o mayor y el peso molecular promedio de cada cadena de injerto es de 5,000 hasta 40, 000.
Se debe señalar que el peso molecular promedio mencionado anteriormente es un peso molecular promedio numérico a menos que se especifique de otra manera. El peso molecular promedio numérico es un peso molecular promedio calculado sin compensar por el tamaño molecular, y los pesos moleculares promedio numéricos del polímero anfifílico y los polímeros que constituyen el (los) segmento (s) hidrofílico (s) del polímero anfifílico pueden ser calculados como pesos moleculares en términos del poliestireno o el pululano como se mide por la cromatografía de permeación en un gel (GPC, por sus siglas en inglés) . Además, el peso molecular promedio de poli(hidroxi ácido) puede ser calculado por la medición por resonancia magnética nuclear (RMN) basado en la relación entre el valor de integración máximo para los residuos terminales y el valor de integración máximo para los otros.
El polímero anfifílico utilizado en la presente invención puede ser sintetizado por un método conocido, y los ejemplos del método incluyen un método en donde un polímero de poli(hidroxi ácido) es agregado a un polímero que va a ser utilizado como un segmento hidrofílico y la reacción de condensación se lleva á cabo con la mezcla resultante para producir un polímero anfifílico; un método en donde los monómeros del hidroxi ácido activado son agregados a un polímero que va a ser utilizado como un segmento hidrofílico y la reacción de polimerización se lleva a cabo con la mezcla resultante para producir un polímero anfifílico; y un método en donde, por el contrario, los monómeros para constituir un segmento hidrofílico son agregados a un segmento hidrofóbico que es un polímero de poli (hidroxi ácido) y la reacción de polimerización se lleva a cabo con la mezcla resultante.
Por ejemplo, un polímero anfifílico constituido por el polietilen glicol y el poli (hidroxi ácido) pueden ser producidos por un método en el cual los monómeros del hidroxi ácido, activados, son agregados al polietilen glicol en. la presencia de un catalizador de estaño para efectuar la reacción de polimerización para la introducción del poli(hidroxi ácido), por lo cual se produce un polímero de bloques anfifílicos [Journal of Controlled Reléase, 71, p. 203-211 (2001) ] .
Además, por ejemplo, un polímero anfifílico del' tipo de injerto constituido por un polisacárido y una(s) cadena(s) de injerto del poli (hidroxi ácido) puede ser producido como se describió en (1), (2) o (3) que se dan enseguida:
(1) un método en donde, en la presencia de un catalizador de estaño, los monómeros del hidroxi ácido, activados, son agregados a un polisacárido para efectuar la reacción de polimerización para la introducción del poli (hidroxi ácido) , por lo cual se produce un polímero anfifílico del tipo de injerto [Macromolecules , 31, p. 1032-1039 (1998)];
(2) un método en donde los grupos hidroxilo no protegidos en parte de un polisacárido en el cual la mayoría de sus grupos hidroxilo están protegidos por substxtuyentes, son activados con una base, y los monómeros de hidroxi ácido activados son agregados al mismo para introducir una(s) cadena(s) de injerto compuestas de poli (hidroxi ácido), seguido finalmente por. la eliminación de los grupos protectores, por lo cual se produce un polímero anfifílico del tipo de injerto [Polymer, 44, p. 3927-3933, (2003)]; y (3) un método en donde la reacción de condensación de un copolímero de poli (hidroxi ácido) con un polisacárido se lleva a cabo utilizando un agente de deshidratación y/o un agente de activación del grupo funcional, para producir un polímero anfifílico del tipo de injerto [Macromolecules , 33, p. 3680-3685 (2000) ] .
La micropartícula adyuvante es descrita posteriormente. La micropartícula adyuvante es una micropartícula que tiene una capacidad adyuvante, y la capacidad adyuvante significa una capacidad con la cual la respuesta inmunológica durante la administración de un antígeno a un cuerpo viviente puede ser provocada a un nivel más elevado que en el caso de la administración del antígeno solo. Además, en la presente invención, la micropartícula del adyuvante es una micropartícula compuesta de un (os) polímero(s) anfifílico (s) , y un(os) antígeno(s) es/son encapsulado (s) en la micropartícula del adyuvante para formar un complejo de micropartícula adyuvante-antígeno, tal complejo constituye la micropartícula como un ingrediente eficaz de la composición inmunogénica de la presente invención.
La estructura de la micropartícula adyuvante no está restringida, y una estructura en donde un (os) segmento (s) hidrofílico (s) del (de los) polímero (s) anfifílico ( s ) está/están contenidos dentro de la micropartícula adyuvante y un (os) segmento (s) hidrofóbico (s) del (de los) polímero (s) anfifílico ( s) está/están contenido (s) como una capa externa se prefiere en vista de la retención de la estabilidad del (de los) antígeno(s) encapsulado (s) .
El tipo del antígeno encapsulado en la micropartícula adyuvante no está restringido, y puede ser un péptido, proteína, glucoproteína, glucolípido, lípido, carbohidrato, ácido nucleico o polisacárido; o un virus, célula bacteriana, sustancia alergénica, tejido o célula que comprende estos. Los ejemplos específicos del antígeno incluyen los antígenos derivados de polen, los antígenos derivados del virus de la hepatitis A, los antígenos derivados del virus de la hepatitis B, los antígenos derivados del virus de la hepatitis c, los antígenos derivados del virus de la hepatitis D, los antígenos derivados del virus de la hepatitis E, los antígenos derivados del virus de la hepatitis F, los antígenos derivados del virus del VIH, los antígenos derivados del virus de la influenza , los antígenos derivados del virus del herpes (HSV-1, HSV-2) , los antígenos derivados del ántrax, los antígenos derivados del clamidia, los antígenos derivados del neumococo, los antígenos derivados del virus de la encefalitis japonesa, los antígenos derivados del virus del sarampión, los antígenos derivados del virus de la rubéola, los antígenos derivados de Clostridiu tetan!, los antígenos derivados del virus de la varicela, los antígenos derivados del virus de SARS, los antígenos derivados del virus de EB, los antígenos derivados del virus de papiloma, los antígenos derivados de Helicobacter pylori, los antígenos derivados del virus de la rabia, los antígenos derivados del virus del Nilo oriental, los antígenos derivados del hantavirus, los antígenos derivados de Streptococcus, los antígenos derivados de Staphylococcus, los antígenos derivados de Bordetella pertussis, los antígenos derivados de Mycobacterium tuberculosis, los antígenos derivados de Plas odium, los antígenos derivados del poliovirus, los antígenos derivados de varias infecciones zoonóticas, los antígenos del cáncer, y los antígenos derivados de varias alergias producidas por alimentos .
El antígeno encapsulado no necesita ser un solo antígeno. En vista de la aplicación de la presente invención, las respuestas inmunológicas pueden ser inducidas contra las células del cáncer, las bacterias, los virus o semejantes que están constituidos por una pluralidad de constituyentes. En tales casos, el antígeno puede ser una pluralidad de tipos de proteínas o semejantes, las cuales pueden provocar respuestas inmunológicas, o una mezcla de substancias cuyos tipos no pueden ser especificados. Además, la inclusión de una pluralidad de tipos de antígenos para inducir positivamente respuestas inmunológicas contra la pluralidad de los tipos de antígenos es uno de los modos de uso de la composición inmunogénica de la presente invención. Preferentemente no más de 3 tipos, más preferentemente un solo tipo de antígeno(s) está/están encapsulado (s) en la micropartícula adyuvante.
El complejo de micropartícula adyuvante-antígeno en la presente invención puede cambiar la capacidad de retención del antígeno contenido dependiendo del (de los) tipo(s) y el (los) método (s) de preparación del (de los) polímero (s) que constituye (n) la micropartícula adyuvante. Los posibles ejemplos del mecanismo por el cual la inmunogenicidad es provista por el complejo de micropartícula adyuvante-antígeno en la presente invención incluyen una pluralidad de procesos, tal como un proceso en donde el antígeno liberado de la micropartícula adyuvante es reconocido por las células inmunocompetentes , y un proceso en donde la propia micropartícula adyuvante es reconocida por las células inmunocompetentes . Se puede obtener un excelente efecto también por el efecto sinergístico de estos procesos.
El tipo de la respuesta inmunológica inducida por el proceso en el cual el complejo de la micropartícula adyuvante-antígeno hace que las células inmunocompetentes reconozcan el antígeno, varía dependiendo del tipo del proceso, y un proceso preferido puede ser seleccionado dependiendo del tipo de la respuesta inmunológica que va a ser inducida y el sitio de la administración. Es decir, en un modo de uso preferido, el antígeno no necesariamente necesita ser liberado del complejo de micropartícula adyuvante-antígeno, y el modo con el cual la inmunogenicidad óptima de interés es obtenida, se logra por la optimización dependiendo del antígeno y del tipo de la respuesta inmunológica que va a ser activada. Sin embargo, en los casos en donde el antígeno es liberado extremadamente rápido del complejo de micropartícula adyuvante-antígeno, una acción de activación inmunológica, continua, a largo plazo, la cual es una excelente propiedad de la presente invención, no puede ser obtenida, de modo que, preferentemente, menos del 10 % del antígeno en el complejo de micropartícula adyuvante-antígeno todavía está retenida en el cuerpo viviente como el complejo una semana después de la administración, y, más preferentemente, no menos de 50 % del antígeno todavía está encapsulado una semana después de la administración. Estos comportamientos de la liberación pueden ser confirmados por una evaluación in vitro que imita el medio ambiente in vivo.
El complejo de micropartícula adyuvante-antígeno logra un buen efecto aún en el estado particulado en donde el complejo es asociado conjuntamente. El término "asociación" significa aquí que dos o más partículas son unidas conjuntamente por una fuerza interpartículas o por medio de otra substancia, para formar un agregado. La fuerza interpartícula no está restringida, y los ejemplos de la misma incluyen la interacción hidrofóbica, el enlace de hidrógeno y las fuerzas de van der Waals. La asociación no está restringida al estado en donde las micropartículas están en contacto entre sí, y una substancia que tiene afinidad a las micropartículas puede existir entre las micropartículas, o las micropartículas pueden ser dispersadas en una matriz. Como la substancia que tiene afinidad hacia las micropartículas, o la matriz, se prefiere un polímero, y un polímero anfifílico cuya porción hidrofóbica es el poli(hidroxi ácido) y el cual tiene el mismo constituyente que aquel de la micropartícula adyuvante es más preferido. Los ejemplos particulares del mismo incluyen los polímeros anfifílicos cada uno compuesto de una cadena principal del polisacárido y una(s) cadena (s) de injerto de poli(hidroxi ácido) , los polímeros de bloques están compuestos de polietilen glicol y poli(hidroxi ácido), y de poli (hidroxi ácido) .
La asociación del complejo de micropartícula adyuvante-antígeno puede ser ya sea en un estado en donde ocurre el reaislamiento durante el uso o en un estado en donde el reaislamiento no ocurre durante el uso. Se debe señalar que, aún en los casos en donde la forma de la partícula compuesta del complejo de micropartícula adyuvante-antígeno asociado conjuntamente está en un estado a partir del cual la asociación del complejo no puede ser conocida, la partícula se considera que ha sido formada por la asociación del complejo siempre que el proceso de producción de la partícula comprenda la etapa de asociación del complejo.
El tamaño de partícula promedio del complejo de micropartícula adyuvante-antígeno o la partícula formada por la asociación del complejo es preferentemente de 0.1 a 50 pm, más preferentemente 0.1 a 10 um. En particular, el tamaño de partícula promedio del complejo de micropartícula adyuvante-antígeno es preferentemente de 0.1 a 1 pm, más preferentemente de 0.1 a 0.5 pm, y el tamaño de partícula promedio del complejo de micropartícula adyuvante-antígeno es preferentemente de 0.1 a 50 pm, más preferentemente 0.1 a 10 pm, todavía más preferentemente 1 a 10 pm. El tamaño de partícula promedio del complejo de micropartícula adyuvante-antígeno o la partícula formada por la asociación del complejo puede ser medida directamente por el análisis de imágenes utilizando un microscopio de barrido electrónico (SEM, por ejemplo, S-4800 fabricado por Hitachi, Ltd) .
El complejo de micropartícula adyuvante-antígeno o la partícula formada por la asociación del complejo tiene un efecto para mejorar la inmunogenicidad del antígeno encapsulado. Los presentes inventores descubrieron que la inmunogenicidad del antígeno encapsulado puede ser mejorada adicionalmente por la encapsulación como un ingrediente eficaz de un (os) agente (s) tensioactivo (s) en la micropartícula inmunogénica compuesta del complejo de micropartícula adyuvante-antígeno o la partícula formada por la asociación del complejo (referida aquí posteriormente como la "micropartícula inmunogénica") . Es decir, la micropartícula inmunogénica como un ingrediente eficaz de la composición inmunogénica de la presente invención comprende como un constituyente un agente tensioactivo encapsulado en la misma.
El agente tensioactivo utilizado en la presente invención no está restringido, y los ejemplos específicos del agente tensioactivo incluyen polisorbato 20, polisorbato 40, polisorbato 60, polisorbato 65, polisorbato 80, polisorbato 85, monooleato de glicerina, monooleato de sorbitan, monooleato de polietilen glicol, monoestearato de etilen glicol, monoestearato de glicerina, monoestearato de sorbitan, monoestearato de propilen glicol, monoestearato de polietilen glicol, monopalmitato de sorbitan, monomiristato de glicerina, monolaurato de sorbitan, monolaurato de polietilen glicol, trioleato de sorbitan, triestearato de sorbitan, aceite de ricino hidrogenado-polioxietileno, copolímeros de polioxietilen propilen glicol, polietilen glicol, alcohol polivinílico, éter de alquilo polioxietileno, dietanol amida del ácido graso (por ejemplo, dietanol amida del ácido esteárico, dietanol amida del ácido oleico y dietanol amida del ácido láurico) , lecitina, ácido graso de sodio (por ejemplo, estearato de sodio, oleato de sodio y laurato de sodio) , sulfato de alquilo y sodio, éter de polioxietilen octil fenilo y glucósido de alquilo. El agente tensioactivo utilizado en la presente invención puede ser ya sea de un solo tipo o de 2 o más tipos.
El agente tensioactivo utilizado en la presente invención es preferentemente uno provisto como un aditivo farmacéutico. Los ejemplos específicos de los agentes tensioactivos provistos como aditivos farmacéuticos incluyen polisorbato 20, polisorbato 40, polisorbato 60, polisorbato 65, polisorbato 80, polisorbato 85, monooleato de glicerina, monooleato de sorbitan, monooleato de polietilen glicol, monoestearato de etilen glicol, monoestearato de glicerina, monoestearato de sorbitan, monoestearato de propilen glicol, monoestearato de polietilen glicol, monopalmitato de sorbitan, monomiristato de glicerina, monolaurato de sorbitan, monolaurato de polietilen glicol, trioleato de sorbitan, triestearato de sorbitan, aceite de ricino hidrogenado polioxietileno, copolímeros de polioxietileno propilen glicol, polietilen glicol, alcohol polivinílico, éter de alquilo polioxietileno, dietanol amida del ácido graso (por ejemplo, dietanol amida del ácido esteárico, dietanol amida del ácido oleico y dietanol amida del ácido láurico) , lecitina, ácido graso sódico (por ejemplo, estearato de sodio, oleato de sodio y laurato de sodio) y sulfato de alquilo sódico.
El agente tensioactivo utilizado en la presente invención es preferentemente un agente tensioactivo no iónico. Los ejemplos específicos del agente tensioactivo no iónico incluyen polisorbato 20, polisorbato 40, polisorbato 60, polisorbato 65, polisorbato 80, polisorbato 85, monooleato de glicerina, monooleato de sorbitan, monooleato de polietilen glicol, monoestearato de etilen glicol, monoestearato de glicerina, monoestearato de sorbitan, monoestearato de propilen glicol, monoestearato de polietilen glicol, monopalmitato de sorbitan, monomiristato de glicerina, monolaurato de sorbitan, monolaurato de polietilen glicol, trioleato de sorbitan, triestearato de sorbitan, aceite de ricino hidrogenado polioxietileno, copolímeros de polioxietileno propilen glicol, polietilen glicol, alcohol polivinílico, éter de alquilo polioxietileho y dietanol amida del ácido graso (por ejemplo, dietanol amida del ácido esteárico, dietanol amida del ácido oleico y dietanol amida del ácido láurico) .
Entre los agentes tensioactivos , los agentes tensioactivos que comprenden una estructura del éster del ácido graso son utilizados preferentemente. Los ejemplos específicos de la estructura del éster del ácido graso incluyen el éster de ácido láurico, el éster de ácido palmítico, el éster del ácido esteárico, el éster del ácido oleico y el aceite de ricino hidrogenado, y los ejemplos específicos preferidos de la estructura del éster del ácido graso incluyen el éster del ácido láurico, el éster del ácido oleico y el aceite de ricino hidrogenado. Los ejemplos específicos de los agentes tensioactivos que comprenden una estructura del éster del ácido graso incluyen polisorbato 20, polisorbato 40, polisorbato 60, polisorbato 65, polisorbato 80, polisorbato 85, monooleato de glicerina, monooleato de sorbitan, monooleato de polietilen glicol, monoestearato de etilen glicol, monoestearato de glicerina, monoestearato de sorbitan, monoestearato de propilen glicol, monoestearato de polietilen glicol, monopalmitato de sorbitan, monomiristato de glicerina, monolaurato de sorbitan, monolaurato de polietilen glicol, trioleato de sorbitan, triestearato de sorbitan y aceite de ricino hidrogenado polioxietileno .
Además, en términos de las estructuras diferentes que los esteres del ácido graso, el agente tensioactivo preferentemente comprende una molécula biocompatible . Los ejemplos específicos de la molécula biocompatible diferentes que los ésteres del ácido graso en el agente tensioactivo incluyen los aminoácidos, ácidos nucleicos, ácido fosfórico, azúcares (por ejemplo, monosacáridos tales como la sucrosa, sorbitol, mañosa y glucosa) , polietilen glicol y glicerina. La molécula biocompatible está constituida preferentemente por un(os) monosacárido (s) y/o el polietilen glicol, y es más preferentemente el sorbitol. Los ejemplos específicos del agente tensioactivo que comprende una molécula biocompatible como una estructura diferente que los ésteres de ácido graso incluyen polisorbato 20, polisorbato 40, polisorbato 60, polisorbato 65, polisorbato 80, polisorbato 85, monooleato de glicerina, monooleato de sorbitan, monooleato de polietilen glicol, monoestearato de etilen glicol, monoestearato de glicerina, monoestearato de sorbitan, monoestearato de propilen glicol, monoestearato de polietilen glicol, monopalmitato de sorbitan, monomiristato de glicerina, monolaurato de sorbitan, monolaurato de polietilen glicol, trioleato de sorbitan, triestearato de sorbitan y aceite de ricino hidrogenado polioxietileno, y los ejemplos específicos preferidos del agente tensioactivo incluyen polisorbato 80, polisorbato 20, trioleato de sorbitan y aceite de ricino hidrogenado polioxietileno.
En la micropartícula inmunogénica, el agente tensioactivo es encapsulado en una micropartícula. La encapsulación de un agente tensioactivo aquí significa un estado en donde un agente tensioactivo está presente en la porción interna de la micropartícula, y el agente tensioactivo puede estar presente en la porción interna completa de la micropartícula o puede estar localizado en una parte de la porción interna de la micropartícula. En términos de la encapsulación de un agente tensioactivo, el agente tensioactivo se considera que está encapsulado en la partícula en los casos en donde el proceso de producción de la micropartícula comprende la etapa de encapsular un agente tensioactivo en la micropartícula. La cantidad del (de los) agente (s) tensioactivo (s) en la micropartícula inmunogénica no está restringida siempre que el efecto de la presente invención no sea inhibido, y es preferentemente de 0.01 hasta 50 % (p/p) , más preferentemente 0.1 a 20 % (p/p) , todavía más preferentemente 1 a 10 % (p/p) con respecto a la cantidad del polímero anfifílico alimentado en el proceso de producción de la micropartícula inmunogénica. La cantidad del (de los) agente (s) tensioactivo (s) en la micropartícula inmunogénica se mide extrayendo el (los) agente (s) tensioactivo (s) desde la micropartícula inmunogénica utilizando un solvente en el cual el polímero anfifílico puede ser disuelto, y purificando el extracto resultante, seguido por el análisis del extracto purificado por cromatografía líquida utilizando una columna de fase inversa, midiendo por medio de esto la cantidad del (de los) agente (s) tensioactivo (s) contenida en el extracto. Basado en la cantidad del (de los) agente (s) tensioactivo (s) contenido (s) en el extracto, la cantidad del (de los) agente (s) tensioactivo (s ) con respecto a la cantidad del (de los) polímero (s) anfifílico (s) alimentada en el proceso de producción de la micropartícula inmunogénica es calculada.
El método de producción de la micropartícula. inmunogénica no está restringido, y, en los casos en donde la micropartícula inmunogénica está constituida por un complejo de micropartícula adyuvante-antígeno, los ejemplos del método por el cual la micropartícula inmunogénica puede ser producida incluyen un método que comprende las etapas de: (a) mezclar un solvente acuoso A en donde un antígeno(s) es/son disuelto (s) en un solvente orgánico B inmiscible en agua en donde un (os) polímero (s) anfifílico (s) es/son disuelto (s) para formar una emulsión en fase inversa; y (b) eliminar el solvente de la emulsión en fase inversa para obtener una micropartícula inmunogénica. Las etapas (a) y (b) son descritas posteriormente.
Como el solvente acuoso A en la etapa (a) , el agua, o una solución acuosa que contiene un componente soluble en agua, es utilizado. Los ejemplos del componente soluble en agua incluyen las sales inorgánicas, los azúcares, sales orgánicas y aminoácidos .
El solvente B orgánico, inmiscible en agua, en la etapa (a) es preferentemente un solvente en el cual el poli (hidroxi ácido) del polímero anfifílico es soluble y el polímero que constituye el segmento hidrofílico es escasamente soluble o insoluble, y, preferentemente el solvente puede ser eliminado por sublimación por secado con congelamiento. La solubilidad del solvente orgánico B inmiscible en agua, en el agua, es preferentemente no mayor que 30 g (solvente orgánico B inmiscible en agua)/100 mi (agua) . Los ejemplos particulares del solvente orgánico B inmiscible en agua incluyen el acetato de etilo, acetato de isopropilo, acetato de butilo, carbonato de dimetilo, carbonato de dietilo, cloruro de metileno y cloroformo.
La proporción entre el solvente orgánico B inmiscible en agua, y el solvente acuoso A es 1,000:1 hasta 1:1, preferentemente 100:1 hasta 1:1. La concentración del (de los) polímero (s) anfifilico (s) en el solvente orgánico B inmiscible en agua varía dependiendo de los tipos del solvente B orgánico inmiscible en agua y el (los) polímero (s) anfifílico (s) , y la concentración es de 0.01 hasta 90 % (p/p) , preferentemente 0.1 a 50 % (p/p) , más preferentemente 1 a 20 % (p/p) .
Disolviendo un (os) agente (s) tensioactivo (s) en ya sea el solvente acuoso A o el solvente orgánico B inmiscible en agua utilizado en la etapa (a), el (los) agente (s) tensioactivo (s) puede (n) ser encapsulado ( s ) en la micropartícula inmunogénica . La cantidad de del (de los) agente (s) tensioactivo (s) agregada en al etapa (a) es preferentemente de 0.01 a 50 % (p/p), más preferentemente 0.1 a 20 % (p/p) , todavía más preferentemente 1 a 10 % (p/p) con respecto a la cantidad del (de los) polímero (s) anfifílico (s) disuelto (s) en el solvente orgánico B inmiscible en agua.
En la etapa (a) , en el proceso de formación de una emulsión de fase inversa con el solvente acuoso A y un solvente orgánico B inmiscible en agua en el cual un (os) polímero (s) anfifílico (s) es/son disuelto (s), la emulsión de fase inversa puede ser formada utilizando, dependiendo del propósito farmacéutico, un solvente orgánico B inmiscible en agua en el cual dos o más tipos de polímeros anfifílicos son disueltos.
En la etapa (a) , ' para ayudar a la formación de una emulsión de fase inversa y para formar una emulsión de fase inversa uniforme y fina, se puede (n) agregar un(os) aditivo(s). El aditivo es preferentemente un compuesto seleccionado de los alcoholes de alquilo de C3-C6, alquilaminas de C3-C6 y ácidos alquilcarboxílieos de C3-C6. La estructura de cada cadena de alquilo en estos aditivos no está restringida, y la cadena de alquilo puede tener ya sea una estructura lineal o una estructura ramificada, y puede ser ya sea un alquilo saturado o un alquilo insaturado. En la presente invención, el aditivo es preferentemente de manera especial el terc-butanol , iso-propanol o pentanol .
En la etapa (b) el método de eliminación del solvente de la emulsión de fase inversa no está restringido, y los ejemplos de los mismos incluyen el calentamiento, secado bajo .presión reducida, diálisis, secado por congelamiento, centrifugación, filtración y reprecipitación, y combinaciones de los mismos. Entre los métodos de eliminación del solvente de la emulsión de fase inversa, se prefiere el secado por congelamiento puesto que el mismo provoca menos cambios estructurales debido a la fusión de las partículas en la emulsión de fase inversa, o semejantes. Las condiciones y el aparato para el secado por congelamiento son aquellos que permiten la inclusión de un proceso de congelamiento y una etapa de secado bajo presión reducida, y el proceso de secado por congelamiento comprende especialmente de manera preferible previo al congelamiento, el secado primario bajo presión reducida a baja temperatura, y un secado secundario bajo presión reducida, los cuales son llevados a cabo convencionalmente en el secado por congelamiento. Por ejemplo, en los casos en donde una dispersión de un .complejo de micropartícula adyuvante-antígeno en un solvente inmiscible en agua va a ser obtenido, la emulsión de fase inversa es enfriada/congelada a un valor no mayor que los puntos de fusión del solvente acuoso A y el solvente orgánico B inmiscible en agua que constituye la emulsión de fase inversa, y luego se seca bajo presión reducida para obtener micropartículas adyuvantes secadas con congelamiento. La temperatura para el congelamiento previo puede ser determinada experimentalmente cuando sea apropiado dependiendo de la composición del solvente, y preferentemente no es mayor que -20 °C. El grado de reducción de la presión durante el proceso de secado también puede ser determinado cuando sea apropiado dependiendo de la composición del solvente, y preferentemente, no es mayor que 3,000 Pa, más preferentemente no mayor que 500 Pa, en vista de la reducción del tiempo de secado. El secado por congelamiento se lleva a cabo preferentemente utilizando un aparato para secado por congelamiento de uso de laboratorio el cual tiene una trampa criogénica y puede ser conectada a una bomba de vacío, o a un aparato de secado por congelamiento al vacío del tipo de gabinete, utilizado para la producción de substancias farmacéuticas o semejantes. Después del congelamiento previo con el nitrógeno líquido, un medio de enfriamiento o semejante, el secado bajo presión reducida puede ser llevado a cabo con enfriamiento o a temperatura ambiente utilizando un dispositivo de vacío tal como una bomba de vacío.
En los casos en donde la micropartícula inmunogénica está constituida por una micropartícula compuesta de un complejo de micropartícula adyuvante-antígeno asociado conjuntamente, los ejemplos de producción de la micropartícula inmunogénica incluyen un método que comprende las etapas de: (a1) mezclar un solvente acuoso A en donde un (os) antígeno(s) es/son disuelto (s) y un solvente orgánico B inmiscible en agua en donde un (os) polímero (s) anfifílico (s) es/son disuelto(s), para formar una emulsión en fase inversa; (b1) eliminar el solvente de la emulsión de fase inversa para obtener un complejo de micropartícula adyuvante -antígeno; y (c1) introducir una dispersión C del complejo de micropartícula adyuvante -antígeno a una fase líquida D que comprende un modificador de la superficie, seguido por la eliminación del medio de la dispersión; por lo cual la micropartícula inmunogénica compuesta de un complejo de micropartícula adyuvante-antígeno asociado conjuntamente, puede ser obtenida.
Las condiciones del solvente acuoso A en la etapa
(a') y el. solvente orgánico B inmiscible en agua en la etapa (b1) son las mismas que en las etapas (a) y (b) mencionadas anteriormente .
El método empleado para eliminar el solvente de la emulsión de fase inversa en la etapa (b1) es el mismo que el método mencionado anteriormente en la etapa (b) .
En la etapa (c') # el medio de dispersión que va a ser utilizado para la dispersión del complejo de micropartícula adyuvante-antígeno para preparar el complejo de la dispersión C no está restringido, y en los casos en donde la micropartícula adyuvante - tiene, en su porción interna, una porción hidrofílica compuesta de un (os) segmento (s) hidrofílico (s) del polímero hidrofílico, y tiene, en la capa externa, una porción hidrofóbica compuesta de un (os) segmento (s) hidrofóbico (s) del polímero hidrofílico, el medio de la dispersión es preferentemente un solvente en el cual el poli (hidroxi ácido) del polímero anfifílico es soluble y el polímero que constituye el segmento hidrofílico es substancialmente insoluble, para el propósito de proteger la estructura de la micropartícula adyuvante. En este caso, el solvente puede ser ya sea un solvente orgánico inmiscible en agua o un solvente orgánico miscible en agua. Los ejemplos particulares del solvente en los cuales el poli (hidroxi ácido) del polímero anfifílico es soluble y el polímero que constituye el segmento hidrofílico es substancialmente insoluble incluyen el acetato de etilo, acetato de isopropilo, acetato de butilo, carbonato de dimetilo, carbonato de dietilo, cloruro de metileno, cloroformo, dioxano, tolueno y xileno.
Preferentemente, la fase líquida D en la etapa (c1) es una en la cual un modificador de la superficie es soluble, y tiene un punto de ebullición más elevado que el medio de la dispersión C. La fase líquida D puede ser cualquiera de un solvente acuoso, un solvente orgánico inmiscible en agua y un solvente orgánico miscible en agua. Debido a que el solvente acuoso, el agua, o una solución acuosa que contiene un componente soluble en agua es preferido, y los ejemplos del componente soluble en agua incluyen sales inorgánicas, azúcares , sales orgánicas y aminoácidos. Los ejemplos del solvente orgánico inmiscible en agua incluyen el aceite de silicona, el aceite de sésamo, el aceite de soja, el aceite de maíz, el aceite de semilla de algodón, aceite de coco, aceite de linaza, aceite mineral, aceite de ricino, aceite de ricino hidrogenado, parafina líquida, n-hexano, n-heptano, glicerol, y ácido oleico. Los ejemplos del solvente orgánico miscible en agua incluyen la glicerina, acetona, etanol, ácido acético, dipropilen glicol, trietanolamina y trietilen glicol. Entre estos, en la presente invención, la fase líquida D es preferentemente un solvente acuoso o un solvente orgánico miscible en agua. En los casos en donde la fase líquida D es un solvente acuoso y el medio de la dispersión es un solvente orgánico inmiscible en agua, la suspensión obtenida de un complejo de micropartícula adyuvante-antígeno está en la forma de la así llamada emulsión de sólido en aceite en agua (S/O/W) , y, en los casos en donde la fase líquida D es un solvente orgánico inmiscible en agua o un solvente orgánico miscible en agua e inmiscible en el medio de la dispersión, la suspensión está en la forma de una emulsión de un sólido en aceite en aceite (S/Ol/02) .
Disolviendo un (os) agente (s) tensioactivo (s ) en el solvente acuoso A o el solvente orgánico B inmiscible en agua utilizado en la etapa (a') o en la dispersión utilizada en la etapa (C), el (los) agente (s) tensioactivo (s) puede (n) ser encapsulado (s) en la micropartícula inmunogénica compuesta de un complejo de micropartícula adyuvante-antígeno asociado conjuntamente. Por otra parte, en los casos en donde un (os) agente (s) tensioactivo (s) es/son disuelto (s) en la fase líquida D utilizada en la etapa (c'), el (los) agente (s) tensioactivo (s ) es/son unido (s) a la superficie de la micropartícula inmunogénica compuesta de un complejo de micropartícula adyuvante-antígeno asociado conjuntamente, de modo que el efecto de la presente invención no pueda ser obtenido. La cantidad del (de los) agente (s) tensioactivo (s) agregada en la etapa (a1) o (c1) es preferentemente 0.01 hasta 50 % (p/p) , más preferentemente 0.1 hasta 20 % (p/p) , todavía más preferentemente 1 a 10 % (p/p) con respecto a la cantidad del (de los) polímero (s) anfifílico (s) disueltos en el solvente orgánico inmiscible en agua.
El modificador de la superficie que va a ser agregado en la etapa (c1) es preferentemente un compuesto que estabiliza la interfaz de agua-aceite de la emulsión de S/O/W o la interfaz de aceite-aceite de la emulsión de S/01/02, tal compuesto tiene la propiedad de mejorar la estabilidad coloidal de la partícula compuesta del complejo de la micropartícula adyuvante-antígeno asociado conjuntamente. La mejora de la estabilidad coloidal significa aquí que la prevención o el retardo de la agregación, en un solvente, de las partículas compuestas del complejo de la micropartícula adyuvante-antlgeno asociado conjuntamente. El modificador de la superficie puede ser un agente solo o una mezcla de una pluralidad de agentes.
El modificador de la superficie es preferentemente un polímero hidrofílico o un compuesto anfifílico.
El polímero hidrofílico como un modificador de la superficie es preferentemente el polietilen glicol, polivinil pirrolidona, alcohol polivinílico, polietilenimina, ácido poliacrílico, ácido polimetacrílico, poli-1 , 3 -dioxolano, polímero de 2-metacriloiloxietil fosforil colina, poli-1, 3, 6-trioxano, poliaminoácido, péptido, proteína o polisacárido de azúcar, o un análogo de cualquiera de estos. Los ejemplos del análogo del polímero hidrofílico incluyen, pero no están limitados a, aquellos preparados a partir de los polímeros hidrofílicos , por ejemplo, por la modificación parcial de los grupos hidrofóbicos tales como un alquilo de cadena larga.
El análogo de polietilen glicol como un modificador de la superficie es preferentemente "Pluronic" (marca registrada de BASF) disponible comercialmente de BASF, o su equivalente .
El poliaminoácido como un modificador de la superficie es preferentemente el ácido aspártico o el ácido poliglutárnico, o su análogo. Los análogos preparados introduciendo un alquilo de cadena larga a una parte del ácido poliaspártico o el ácido poliglutárnico son más preferidos .
Los ejemplos del péptido como un modificador de la superficie incluyen péptidos básicos, y la proteína como un modificador de la superficie es preferentemente una gelatina, caseína, o albúmina en vista de la mejora de la dispersabilidad de, las partículas. Los ejemplos preferidos de la proteína también incluyen anticuerpos.
El azúcar como un modificador de la superficie es preferentemente un monosacárido, oligosacárido o polisacárido. El polisacárido es preferentemente la celulosa, quitina, quitosana, goma de gelano, ácido algínico, ácido hialurónico, pululano o dextrano, y el pululano que lleva colesterol, es especialmente preferido en vista de la mejora de la dispersabilidad de las partículas. Un análogo de cualquiera de la celulosa, quitina, quitosana, goma de gelano, ácido algínico, ácido hialurónico, pululano, y dextrano, es preferido.
El péptido, la proteína o el azúcar como un modificador de la superficie es especialmente de manera preferible un análogo preparado por, por ejemplo, la modificación parcial de los grupos hidrofóbicos tales como el alquilo de cadena larga, o un análogo preparado por la modificación del polímero hidrofílico o el compuesto anfifílico, mencionados anteriormente.
Los ejemplos preferidos del compuesto anfifílico como un modificador de la superficie incluyen los agentes activadores no iónicos tales como los copolímeros de polioxietileno polipropilen glicol, los ásteres de ácido graso sucrosa, los ásteres de ácido graso polietilen glicol, los ásteres de ácido monograso polioxietileno sorbitan, los ásteres de ácido digraso polioxietileno sorbitan, los ásteres de ácido monograso polioxietileno glicerol, los ásteres de ácido digraso polioxietileno glicerol, los ásteres de ácido graso poliglicerol , el aceite de ricino polioxietileno y el aceite de ricino hidrogenado polioxietileno; los sulfatos de alquilo tales como el sulfato de laurilo sódico, el sulfato de laurilo y amonio y el sulfato de estearilo sódico; y la lecitina.
La relación volumétrica entre el medio de la dispersión en el cual el complejo de micropartícula adyuvante-antlgeno es dispersado y la fase líquida D es 1,000:1 hasta 1:1,000, preferentemente 100:1 hasta 1:100. El número de asociación del complejo de micropartícula adyuvante-antígeno obtenido, varía dependiendo de esta relación volumétrica, y, cuando la relación de la fase D de los lípidos se incrementa, una dispersión, en agua, de las partículas compuestas de un número más grande del complejo de micropartícula adyuvante-antígeno asociado conjuntamente es obtenido, mientras que, cuando la relación de la fase D de los lípidos se reduce, el número de asociación se reduce. En los casos en donde la proporción de la fase líquida D es más pequeña que una relación de la solución de 1:4, la mayoría de las partículas en la dispersión en el agua están constituidas cada una por un solo complejo de micropartícula adyuvante-antígeno. Por consiguiente, controlando la relación volumétrica de la fase líquida D en las series de proceso para producción de la partícula compuesta del complejo de micropartícula adyuvante-antígeno asociado conjuntamente, el complejo de micropartícula adyuvante-antígeno y la partícula compuesta del complejo asociado conjuntamente, puedan ser preparados selectivamente.
Cuando el medio de dispersión que contiene el complejo de micropartícula adyuvante-antígeno es mezclado con la fase líquida D, un dispositivo de agitación tal como un agitador magnético, un agitador de turbina, un homogeneizador, un aparato de emulsificación de membrana equipado con una membrana porosa, o semejante, puede ser utilizado cuando sea requerido.
La fase liquida D puede contener, además del modificador de la superficie, varios aditivos tales como un amortiguador, antioxidante, sal, polímero y/o azúcar dependiendo del propósito f rmacéutico. Además, el medio de la dispersión en el cual el complejo de micropartícula adyuvante-antígeno va a ser dispersado puede contener varios aditivos solubles en el medio de dispersión, tal como un compuesto ácido, un compuesto básico, un polímero anfifílico, y/o un polímero biodegradable , para el propósito de controlar la velocidad de liberación del (de los) antígeno(s) encapsulado (s) por la degradación o desintegración del complejo.
Además, una operación de emulsificación de la emulsión del sólido en aceite en agua (S/O/W) formado o la emulsión del sólido en aceite en aceite (S/01/02) puede ser llevada a cabo con el propósito de producir una partícula más fina compuesta del complejo de la micropartícula adyuvante-antígeno asociado conjuntamente. El método de emulsificación no está restringido siempre que la emulsión estable pueda ser preparada por medio de esto, y los ejemplos de los mismos incluyen los métodos por agitación y los métodos que utilizan un homogeneizador de alta presión, o un homomezclador de alta velocidad o semejantes.
En los casos en donde el complejo de micropartícula adyuvante-antígeno es dispersado una vez en un medio de dispersión y la dispersión C obtenida es agregada a la fase líquida D que contiene un modificador de la superficie, una suspensión de la partícula compuesta de una micropartícula adyuvante deseada asociada conjuntamente puede ser obtenida por la eliminación del medio de dispersión. El método de eliminación del medio de dispersión no está restringido, y los ejemplos del mismo incluyen la evaporación del solvente, diálisis, secado por congelamiento, centrifugación, filtración y reprecipitación, entre los cuales la evaporación del solvente y el secado por congelamiento, son preferidos especialmente. En los casos en donde en solvente acuoso es utilÍ2ado como la fase líquida D, una dispersión acuosa de la partícula compuesta del complejo de micropartícula adyuvante-antígeno asociado conjuntamente, pueden ser obtenida por esta etapa .
En una modalidad preferida, el modificador de la superficie está unido a la micropartícula inmunogénic . La unión de aquí puede ser ya sea un enlace no covalente o un enlace covalente. El enlace no covalente es preferentemente de una interacción hidrofóbica, y puede ser también de una interacción electroestática, un enlace de hidrógeno o las fuerzas de van der Waals, o una combinación de estos enlaces. En los casos en donde un enlace no covalente, el poli (hidroxi ácido) de la micropartícula inmunogénica que contiene el polímero anfifílico es unida preferentemente a la porción hidrofóbica del modificador de la superficie por una interacción hidrofóbica, y, en este caso, el medio de la dispersión para el complejo de micropartícula adyuvante-antígeno en la dispersión de micropartículas es preferentemente el agua, un amortiguador, una salmuera fisiológica, una solución modificadora de la superficie, acuosa, o un solvente hidrofílico.
La composición inmunogénica en la presente invención es una composición que puede inducir una respuesta inmunológica en un cuerpo viviente, y contiene la micropartícula inmunogénica como un ingrediente eficaz. El tipo de la respuesta inmunológica inducida por la composición inmunogénica no está restringido. Los ejemplos del tipo de la respuesta inmunológica inducida incluyen la respuesta inmunológica de Thl y la respuesta inmunológica de Th2, y ya se sabe que una de estas respuestas inmunológicas es inducida predominantemente dependiendo del antígeno, el sitio de administración, y el tipo del método de administración. La presente invención puede inducir las respuestas inmunológicas tanto de Thl como de Th2. La respuesta inmunológica de Thl puede ser inducida efectivamente por el complejo de micropartícula adyuvante-antígeno de la presente invención que tiene un tamaño de partícula pequeño, o por la partícula compuesta del complejo asociado conjuntamente, como se muestra en los ejemplos. Los grados de la respuesta inmunológica de Thl y la respuesta inmunológica de Th2 pueden ser evaluados por varios métodos conocidos. Por ejemplo, en el caso del ratón, la cantidad de producción del anticuerpo de IgG2a ya se sabe que va a ser un índice de la respuesta inmunológica de Thl. Además, como los índices de la respuesta inmunológica de Th2 , las cantidades del anticuerpo de IgGl y el anticuerpo de IgG total ya son conocidos.
La composición inmunogénica de la presente invención puede obtener una capacidad de activación inmunológica por la inclusión adicional de una substancia de activación inmunológica. La substancia de activación inmunológica puede estar ya sea contenida en la parte externa de la micropartícula adyuvante o encapsulada en el mismo, y la substancia es encapsulada preferentemente en la micropartícula adyuvante. La substancia de activación inmunológica no está restringida siempre que la misma pueda funcionar como una substancia de activación inmunológica, y los ejemplos de la misma incluyen los aceites, sales de aluminio, sales de calcio, polímeros formadores de un gel, citoquinas de activación inmunológica y ligandos del receptor de TLR, entre los cuales las citoquinas de activación inmunológica y los ligandos del receptor de TLR son preferidos .
Los ejemplos de las citocinas de activación inmunológica incluyen la interleucina 12, el interferón , la interleucina 18, TNFa, la interleucina 6, NO, el interferón ? y el interferón ß.
Los ejemplos de los ligandos del receptor de TLR incluyen las lipoproteínas ; los ARNs de hebra doble tales como poli I:C y poli I:CLC; flagelina; ARNs de hebra simple; CpG; profilina; MPL; QS21; y TDM, entre los cuales los ácidos nucleicos tales como los ARNs de hebra doble, los ARNs de hebra simple y CpG son preferidos, y el CpG es el más preferido. El CpG significa aquí los ADNs de la porción de CpG (citosina-guanina) , no metilada, existentes en los virus, las bacterias y semejantes (véase la solicitud de patente PCT traducida del japonés presentada abierta al público No. 2001-503254) . Varias secuencias efectivas son reportadas como porciones de CpG, y el tipo de la secuencia no está restringido siempre que el mismo tenga una capacidad de activación inmunológica, y la secuencia puede ser preparada utilizando análogos básicos o pueden ser seleccionados de varios tipos de productos modificados.
En los casos en donde la composición inmunogénica de la presente invención es utilizada como una composición farmacéutica o una vacuna, varios aditivos útiles farmacéuticamente pueden estar contenidos además del polímero anfifílico, la substancia activa hidrofílica, el modificador de la superficie y el medio de la dispersión. Los ejemplos de los aditivos que pueden ser agregados incluyen los amortiguadores, antioxidantes, sales, polímeros y azúcares.
El método de inducción de una respuesta inmunológica que utiliza la composición inmunogénica de la presente invención no está restringida, y la composición inmunogénica puede ser ya sea administrada a un cuerpo viviente o llevada en contacto con las células inmunocompetentes eliminadas hacia la parte externa de un cuerpo viviente. El método de administración de la composición inmunogénica a un cuerpo viviente no está restringida, y los ejemplos de la misma incluyen la administración subcutánea, la administración intradérmica, la administración intramuscular, la administración transnasal, la administración pulmonar, la administración oral, la administración transdérmica, la administración sublingual, la administración vaginal, la administración intraperitoneal y la administración por los nodos linfáticos, entre los cuales se prefieren la administración intradérmica y la administración subcutánea.
En términos de la cantidad de la composición inmunogénica de la presente invención que va a ser utilizada durante la inducción de la respuesta inmunológica, la cantidad necesaria del antígeno requerida para la inducción de la reacción inmunológica de interés es fijada apropiadamente dependiendo del tipo del antígeno, el método de administración, y el número de las dosis. Por ejemplo, en los casos en donde la composición inmunogénica de la presente invención es administrada subcutáneamente a un ser humano para inducir una respuesta inmunológica, la composición es administrada a una dosis de 0.01 a 1,000 ug cada vez en términos de la cantidad del antígeno contenido en la composición inmunogénica. El número de , las dosis también puede ser fijado apropiadamente de manera semejante a la dosis, y al respuesta inmunológica puede ser inducida por 1 a 10 veces la administración puesto que la composición inmunogénica de la presente invención tiene una acción para inducir una respuesta inmunológica continuamente.
El cuerpo viviente al cual la composición inmunogénica es administrada puede ser un animal ya sea humano o no humano, y el cuerpo viviente es preferentemente de un ser humano; o de un cerdo, vaca, pájaro, ovej , caballo, burro, cabra, camello, perro, gato, hurón, conejo, mono, rata, ratón o conejillo de indias, que es mantenido como el ganado, un animal que es una mascota o un animal experimental.
Ej emplos
Los ejemplos son descritos enseguida, pero la presente invención no está restringida por estos ejemplos. Ejemplo 1: Síntesis del Dextrano-Poli (Ácido Láctico-co-glicólico) (PLGA)
(1-1) Síntesis del TMS-Dextrano (Compuesto (1))
El dextrano (Nacalai Tesque; grado especial de acuerdo con los estándares de Nacalai; peso molecular promedio numérico, 13,000; 5.0 g) fue agregado a la formamida (100 mi) , y la mezcla resultante se calienta a 80 °C. A esta solución, se agrega por goteo el 1,1,1,3,3,3-hexametildisilazano (100 mi) durante 20 minutos. Después de esto, la mezcla de la reacción se agita a 80 °C durante 2 horas. Después del complemento de la reacción, la solución de la reacción se deja que se enfríe a temperatura ambiente, y dos capas fueron separadas una de la otra con un embudo de separación. La capa superior fue concentrada bajo presión reducida, y se agrega metanol (300 mi) a la misma, seguido por filtración y secado de los sólidos obtenidos, para obtener el TMS-dextrano (Compuesto (1)) (11.4 g) como sólidos blancos .
(1—2) Síntesis del Dextrano-PLGA (Compuesto (2))
El Compuesto (1) (0.5 g) y el terc-butóxido de potasio (35 mg) fueron secados bajo calentamiento y bajo presión reducida durante 2 horas, y se agrega tetrahidrofurano (10 mi) al mismo, seguido por la agitación de la mezcla resultante durante 1.5 horas a temperatura ambiente. A esta solución, se agrega por goteo una solución del (DL) -láctido (0.56 g) y el glicólido (0.9 g) en tetrahidrofurano (15 mi) ; y la mezcla resultante se agita durante 5 minutos, seguido por la adición de 2 gotas de ácido acético para detener la reacción. Después del complemento de la reacción, el solvente se concentra bajo presión reducida, y la purificación por reprecipitación con el sistema del cloroformo-metanol y el sistema de cloroformo-éter dietílico fue llevado a cabo, para obtener sólidos blancos, los cuales fueron disueltos entonces en cloroformo (9 mi) . A la solución resultante, se agrega ácido trifluoroacético (1.0 mi), y la mezcla resultante se agita a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después del complemento de la reacción, el solvente se evapora bajo presión reducida, y el residuo se disuelve en cloroformo (10 mi) , seguido por la adición de la solución resultante por goteo al éter dietílico en cual ha sido enfriado preliminarmente a 0 °C y la filtración del producto obtenido, para obtener un polímero anfifílico dextrano-PLGA como sólidos blancos (Compuesto (2) ) . Se determinó por la medición de 1H-RMN que el peso molecular promedio numérico de las hebras de injerto de PLGA del dextrano-PLGA es de 5571 y el número de la cadena de injerto es de 30.
Ejemplo 2 - Preparación de las Micropartlculas Inmunogénicas (Partículas (1) a (10) y Partículas Comparativas (1) y (2))
En 100 µ? del carbonato de dimetilo, se disuelven 5 mg del dextrano-poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) en el Ejemplo 1 (Compuesto (2)) fueron disueltos, para preparar 50 mg/ml de la solución del polímero anfifílico (B) . A la solución del polímero anfifílico (B) , se agregan 20 µ? del terc-butanol, y 50 µ? de la solución de CEA acuosa al 0.025 % (p/v) (A) (antígeno carcínoembriónico) (COSMO BIO Co . , Ltd.) se agrega por goteo al mismo, seguido por agitación de la mezcla resultante con un agitador con efecto de remolino para producir una emulsión de fase inversa.
La emulsión de fase inversa fue sometida a congelamiento previo con nitrógeno líquido, y se seca por congelamiento utilizando un secador por congelamiento (EYELA, FREEZE DRYER FD-1000) a una temperatura de enfriamiento de la trampa de -45 °C a un grado de vacío de 20 Pa durante 24 horas. Los sólidos obtenidos se dispersan en 200 µ? de carbonato de dimetilo, para preparar una dispersión (C) . La dispersión (C) se agrega por goteo a 2 mi de una solución acuosa que contiene un modificador de la superficie al 10 % (p/v) (alcohol polivinílico o Pluronic F-68) mostrado en la Tabla 1, y la mezcla resultante se agita y se emulsifica con un mezclador con efecto de remolino, para preparar una emulsión de S/O/W. De la emulsión de S/O/W, se elimina el carbonato de dimetilo por evaporación del solvente, para preparar una suspensión de micropartícula inmunogénica . La suspensión se transfiere a un tubo de 15 mi, y se somete a centrifugación a 8,000 rpm durante 10 minutos, para precipitar las partículas. Después de la eliminación del sobrenadante, las partículas fueron resuspendidas en 10 mi de agua destilada, y la suspensión resultante se somete a centrifugación bajo las mismas condiciones como se describieron anteriormente para efectuar la reprecipitación de las partículas. Esta operación de lavado se repitió una vez más, y, después de la eliminación del sobrenadante, las partículas se suspenden en 200 µ? de una solución acuosa que contiene 5 % (p/v) de manitol, 0.5 % (p/v) de carboximetilcelulosa sódica y 0.1 % (p/v) de polisorbato 80. La suspensión resultante se somete a congelamiento previo con nitrógeno líquido y secado por congelamiento utilizando un secador por congelamiento (EYELA, FREEZE DRYER FD-1000) a una temperatura de enfriamiento de la trampa de -45 °C y a un grado de vacío de 20 Pa durante 24 horas, para obtener una micropartícula inmunogénica .
Como un agente tensioactivo, el polisorbato 80, el polisorbato 20, el trioleato de sorbitan o el monooleato de sorbitan (estos fueron fabricados por Kanto Chemical Co., Inc.) o aceite de ricino hidrogenado polioxietileno (fabricado por Nikko Chemicals Co., Ltd) se disuelve en la solución de CEA acuosa (A) , una solución del polímero anfifílico (B) o una dispersión (C) como se muestra en la Tabla 1, en una cantidad de 500 g, la cual correspondió a 10 % (p/p) con respecto a la cantidad del polímero anfifílico. Tabla 1
Método para preparar micropartículas inmunogénicas (Partículas (1) a (10) y Partículas Comparativas (1) y (2))
Tabla 1 (cont.)
Ejemplo 3 - Medición de la Velocidad de Encapsulación del Antígeno en la Micropartícula Inmunogénica
Método
Cada tipo de micropartículas inmunogénicas preparadas por el método en el Ejemplo 2 (Partículas (3) a (7) y la Partxcula Comparativa (2)) se disuelve en 200 µ? de la salmuera fisiológica amortiguada con fosfato, para preparar una suspensión de partículas. En un tubo de Eppendorf, se colocan 100 µ? de la suspensión de las partículas, y se agrega 1 mi de agua destilada a la misma, seguido por centrifugación de la mezcla resultante a 13,000 rpm durante 10 minutos para la precipitación de las partículas. Después de la eliminación del sobrenadante, las partículas se resuspenden en 1 mi de agua destilada, y la suspensión resultante se somete a centrifugación bajo las mismas condiciones que se describieron anteriormente para efectuar la reprecipitación de las partículas. Después de la eliminación del sobrenadante, las partículas se disuelven en 0.5 mi de una solución mezclada 1:3 de cloruro de metileno y acetona. La solución de las partículas resultantes se somete a centrifugación a 13,000 rpm durante 10 minutos, para precipitar el CEA. Después de la eliminación del sobrenadante, el precipitado se disuelve en 0.5 mi de la solución mezclada, y la centrifugación se lleva a cabo bajo las condiciones descritas anteriormente para reprecipitar el CEA. Después de la eliminación del sobrenadante, el secado por centrifugación se lleva a cabo durante 30 minutos para secar el precipitado de CEA. Un amortiguador de muestreo para la electrofóresis en un gel (fabricado por TEFCO) fue agregado al precipitado de CEA, y el precipitado se disuelve en el mismo a 95 °C durante 3 minutos, seguido por efectuar la electrofóresis en un gel utilizando un gel de poliacrilamida (fabricado por TEFCO) . Después de esto, el gel se tiñe utilizando un kit de teñido de CBB coloidal (fabricado por TEFCO) , y se calcula la velocidad de encapsulacion de CEA en las partículas. Los resultados son mostrados en la Tabla 2.
Resultados
Las velocidades de encapsulacion del antígeno (CEA) de las micropartículas inmunogénicas fueron como se mostró en la Tabla 2, y se muestra que la velocidad de encapsulacion fue casi la misma entre cualquiera de las micropartículas inmunogénicas que contienen un agente tensioactivo (Partículas (3) a . (7) ) y la partícula que no contiene un agente tensioactivo (Partícula Comparativa (2) ) . Por consiguiente, se ha mostrado que los agentes tensioactivos no afectan adversamente la velocidad de encapsulacion del antígeno de la micropartícula inmunogénic .
Tabla 2
Velocidad de encapsulacion de CEA en las micropartículas inmunogénicas (Partículas (3) a (7) y Partícula Comparativa (2) )
Tabla (2) (cont.)
Ejemplo 4 Administración Subcutánea de una Composición
Inmunogénica que contiene CEA, a los Ratones (1)
Método
Cada tipo de las micropartículas inmunogénicas preparadas en el Ejemplo 2 que contienen polisorbato 80 o trioleato dé sorbitan (Partículas (1) y (2) ) se suspenden en 200 µ? de la salmuera fisiológica amortiguada con fosfato, para proporcionar una solución de administración. Esta solución fue administrada subcutáneamente por una sola inyección a la espalda de los ratones Balb/C machos de 7 semanas de edad (Japan SLC, Inc.) a una dosis de 5 ug en términos del CEA por individuo. Como los ejemplos comparativos, las partículas que no contienen el agente tensioactivo (Partícula Comparativa (1) ) o una solución preparada mezclando 50 µ? de la solución de CEA con 50 µ? de "Alumbre Imject" (fabricado por Thermo Scientific, también referido aquí posteriormente como alumbre) como un adyuvante fue administrado subcutáneamente por una sola inyección a la espalda de los ratones Balb/C machos a una dosis de 5 pg en términos de CEA por individuo. Bajo cada condición, la administración se lleva a cabo para 5 individuos de los ratones . Los cambios en la concentración del anticuerpo durante el transcurso del tiempo son mostrados en la Figura 1.
Los ratones después de la administración fueron mantenidos en un medio ambiente en el cual a los ratones se les pueden administrar libremente el agua y los alimentos, mientras que la sangre fue recolectada de la vena de la cola en el transcurso del tiempo. A la sangre recolectada, se agrega heparina a una concentración final de 3.3 IU/ml, y la centrifugación se lleva a cabo a 5,000 rpm durante 5 minutos para recolectar el plasma de la sangre, seguido por la medición de la concentración del anticuerpo contra CEA en el plasma de la sangre. La concentración del anticuerpo contra CEA se mide por el siguiente método. En una microplaca de 96 cavidades (MaxiSorp, fabricada por Nunc) , se colocan 100 µ? de una solución de PBS que contiene 1 ug/ml de la proteína de CEA, y la placa se deja reposar a 4 °C toda la noche. La solución se desecha, y 400 µ? de PBS suplementado con 0.5 % de BSA fueron colocados en la placa, seguido por llevar a cabo el bloqueo a temperatura ambiente durante 2 horas. La cavidad se lava una vez con 400 µ? del líquido de lavado (PBS suplementado con 0.05 % de Tween 20), y 100 µ? en una muestra del plasma de la sangre que ha sido diluida 1,000 hasta 100,000 veces con un líquido de disolución (PBS suplementado con 0.25 % de BSA y 0.05 % de Tween 20) se coloca en la cavidad, seguido por dejar que la reacción proceda a temperatura ambiente durante 40 minutos con agitación. La cavidad se lava tres veces con el líquido de lavado, y se colocan 100 µ? del anticuerpo de IgG de antiratón, etiquetada con HRP (peroxidasa de rábano picante) (Zymed) (diluido 10,000 veces con el líquido de disolución) en la cavidad, seguido por dejar que la reacción proceda a temperatura ambiente durante 20 minutos con agitación. La cavidad se lava tres veces con el líquido de lavado, y se colocan 100 µ? de un líquido colorante (acetato de sodio/amortiguador de citrato 0.1 M (pH 4.5) que contiene 0.006 % de peróxido de hidrógeno y 0.2 mg/ml de tetrametilbencidina) en la cavidad, seguido por dejar que la reacción proceda a temperatura ambiente durante 10 minutos con agitación. La reacción fue detenida por la adición de 100 µ? de ácido sulfúrico 1 , y la absorbancia a 450 nm se mide utilizando un lector de microplacas . Como una muestra estándar, un anticuerpo monoclonal de anti-CEA diluido en serie (MAI-5308, fabricado por Affinity Bioreagents) fue medida al mismo tiempo para proporcionar una curva de calibración, y la cantidad del anticuerpo en cada muestra se calcula en términos de la concentración en peso (mg/ml) .
Resultados
Los cambios en el valor promedio de la concentración del anticuerpo de anti-CEA en el plasma de la sangre durante el transcurso del tiempo son mostrados en la Figura 1. La Partícula (1) que contiene el polisorbato 80 y la Partícula (2) que contiene el trioleato de sorbitan mostró un efecto continuo del incremento de la concentración del anticuerpo durante 8 semanas, y el efecto fue mucho más elevado que en el caso del ejemplo comparativo en donde se administra el antígeno + alumbre. La concentración del anticuerpo fue aún más elevada que en el caso de la Partícula Comparativa (1) que no contiene el agente tensioactivo, y se mostró que la micropartícula inmunogénica muestra una capacidad adyuvante más elevada por la inclusión de un agente tensioactivo.
Ejemplo 5 - Administración Subcutánea de la Composición
Inmunogénica que Contiene CEA a los Ratones (2)
Método
Cada tipo de las micropart ículas inmunogénicas preparadas en el Ejemplo 2 (Partícula (3) a (7) ) fue administrada subcutáneamente por una sola inyección a la espalda de ratones Balb/C machos de 7 semanas de edad (Japan SLC, Inc.) a una dosis de 5 pg en términos de CEA por individuo por el método descrito en el Ejemplo 4. Como un ejemplo comparativo, las partículas que no contienen un agente tensioactivo (Partícula Comparativa (2)) fueron administradas subcutáneamente por una sola inyección a la espalda de los ratones Balb/C machos a una dosis de 5 pg en términos de CEA por individuo. Bajo cada condición, la administración fue llevada a cabo para 5 individuos de los ratones. La Figura 2 muestra el valor promedio de la concentración del anticuerpo. La recolección de la sangre y la medición de la concentración del anticuerpo se llevaron a cabo por los métodos descritos en el Ejemplo 4.
Resultados
El valor promedio de la concentración del anticuerpo en el plasma de la sangre en la semana 4 después de la administración se muestra en la Figura 2. De manera semejante a los casos de las partículas que contienen polisorbato 80 o trioleato de sorbitan ((3), (4)) descritos en el Ejemplo 4, las partículas que contienen polisorbato 20, monooleato de sorbitan o aceite de ricino hidrogenado polioxietileno ((5) a (7)) también mostraron niveles más elevados de la concentración del anticuerpo comparado con la Partícula Comparativa (2) que no contiene el agente tensioactivo. Así, se ha mostrado que la micropartícula inmunogénica muestra una capacidad adyuvante más elevada por la inclusión de un agente tensioactivo .
Ejemplo 6 - Administración Subcutánea de la Composición
Inmunogénica que Contiene CEA a los Ratones (3)
Método
Cada tipo de micropartículas inmunogénicas preparadas en el Ejemplo 2 que contienen el polisorbato 80 (Partículas (8) a (10)) se administran por inyección única a lá almohadilla plantar de los ratones Balb/C machos de 7 semanas de edad (Japan SCL, Inc.) a una dosis de 5 ug en términos de CEA por individuo por el método descrito en el Ejemplo 4. Como un ejemplo comparativo, se prepara una solución por el mezclado de 50 µ? de la solución del antígeno y 50 µ? del alumbre, y la mezcla resultante se administra por una sola inyección a la almohadilla plantar de los ratones Balb/C a una dosis de 5 g en términos de CEA por individuo. Bajo cada condición, la administración se lleva a cabo para 3 individuos de los ratones. La Figura 3 muestra el valor promedio de la concentración del anticuerpo. La medición de la concentración del anticuerpo se lleva a cabo por el método descrito en el Ejemplo 4.
Resultados
El valor promedio de la concentración del anticuerpo de anti-CEA en el plasma de la sangre en la semana 2 después de la administración es mostrada en la Figura 3. En todos los tipos de partículas ((8) a (10)) en los cuales se utilizaron diferentes soluciones para disolver el polisorbato 80 en el proceso de preparación, la concentración del anticuerpo fue drásticamente más elevada que en el caso de la administración del antígeno + alumbre en el ejemplo comparativo. Es decir, se mostró que la micropartícula inmunogénica tiene una fuerte capacidad adyuvante también en los casos en donde el agente tensioactivo fue disuelto en cualquiera de la solución de CEA acuosa (A) , la solución del polímero anfifílico (B) y la dispersión (C) .
Ejemplo 7 - Medición del Agente Tensioactivo Contenido en la Micropartícula Inmunogénica
Método
Las micropartículas inmunogénicas (Partícula (1)) que contienen el polisorbato 80 preparadas en el Ejemplo 2, se suspenden en 1 mi del agua destilada, y se precipitan por centrifugación a 13,000 rpm durante 10 minutos. Después de la eliminación del sobrenadante, las partículas se resuspenden en 1 mi del agua destilada, y se someten a centrifugación bajo las mismas condiciones que se describieron anteriormente para reprecipitar las partículas. Después de la eliminación del sobrenadante, las partículas se disuelven en 100 µ? de acetato de etilo. A esta solución de las partículas, se agregan 300 µ? de etanol, y la mezcla resultante se somete a centrifugación a 13,000 rpm durante 10 minutos para precipitar el polímero anfifílico. El sobrenadante fue recolectado y el solvente se elimina por evaporación bajo presión reducida, seguido por la disolución del residuo en 100 µ? de agua destilada, para preparar un extracto de la partícula. El extracto de la partícula se analiza por cromatografía líquida de alta resolución (fabricada por Shimadzu Corporation) utilizando una columna de fase inversa (YMC-Pack PROTEIN-RP, fabricada por YMC) , para medir el contenido del polisorbato 80 contenido en la micropartícula inmunogénica .
Resultados
Por el análisis por cromatografía líquida de alta resolución, se encontró que el extracto de las partículas contuvo 0.24 % (p/v) del polisorbato 80. Basado en este resultado, se reveló que la micropartícula inmunogénica contuvo polisorbato 80 en una cantidad de 4.8 % (p/p) con respecto a la cantidad alimentada del polímero anfifílico que constituye la micropartícula inmunogénica, y se mostró que 48 % (p/p) del polisorbato 80 agregado en el proceso de preparación en el Ejemplo 2 estuvo contenido en la micropartícula inmunogénica.
Ejemplo 8 - Preparación de las Micropartículas Inmunogénicas que Contienen CEA (Partículas (11) a (15) y Partículas Comparativas (3) a (5) )
En 100 yl de carbonato de dimetilo, se disuelven 5 mg del dextrano-poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) (Compuesto 2) preparado en el Ejemplo 1, para preparar una solución del polímero anfifílico en una cantidad de 50 g/ml (B) . A la solución del polímero anfifílico (B) , se agregan por goteo 20 µ? de terc-butanol , y 50 µ? de una solución (A) de CEA (antígeno carcinoembriónico) (COSMO BIO Co . , Ltd) acuosa al 0.025 % (p/v) , a la misma, seguido por la agitación de la mezcla resultante con un agitador con efecto de remolino para producir una emulsión de fase inversa.
La emulsión de fase inversa se somete a congelamiento previo con nitrógeno líquido, y se seca por congelamiento utilizando un secador por congelamiento (EYELA, FREEZE DRYER FD-1000) a una temperatura de enfriamiento de la trampa de -45 °C a un grado de vacío de 20 Pa durante 24 horas. Los sólidos obtenidos se dispersan en 200 µ? de carbonato de dimetilo, para preparar una dispersión (C) . La dispersión (C) fue agregada por goteo a 2 mi de una solución acuosa (D) que contiene un modificador de la superficie al 10 % (p/v) (Pluronic F-68) , y la mezcla resultante se agita y se emulsifica con un mezclador con efecto de remolino, para preparar una emulsión de S/O/ . De la emulsión de S/O/W, el carbonato de dimetilo se elimina por evaporación del solvente, para preparar una suspensión de micropartículas inmunogénicas . La suspensión se transfiere a un tubo de 15 mi, y se somete a centrifugación a 8,000 rpm durante 10 minutos, para precipitar las partículas. Después de la eliminación del sobrenadante, las partículas se resuspenden en 10 mi de agua destilada, y la suspensión resultante se somete a centrifugación bajo las mismas condiciones que se describieron anteriormente para efectuar la reprecipitación de las partículas. Esta operación de lavado fue repetida una vez más, y, después de la eliminación del sobrenadante, las partículas se suspenden en 200 µ? de una solución acuosa (solución de inyección (E) ) que contiene 5 % (p/v) de manitol, 0.5 % (p/v) de carboximetilcelulosa sódica y 0.1 % (p/v) de polisorbato 80. La suspensión resultante se somete a congelamiento previo con nitrógeno líquido, y se seca por congelamiento utilizando un secador por congelamiento (EYELA, FREEZE DRYER FD-1000) a una temperatura de enfriamiento de la trampa de -45 °C a un grado de vacío de 20 Pa durante 24 horas, para obtener una micropartícula inmunogénica .
Como un agente tensioactivo, el polisorbato 80 se disuelve en una solución de CEA acuosa (A) , la solución del polímero anfifílico (B) o la dispersión (C) como se muestra en la Tabla 3, en una cantidad correspondiente al 10 % (p/p) , 1 % (p/p) o 0.1 % (p/p) con respecto a la cantidad del polímero anfifílico, para preparar las partículas (11) a (15) . Además, en términos de las partículas comparativas, el polisorbato 80 se disuelve en la solución acuosa (D) que contiene un modificador de la superficie o la solución de inyección (E) , en la cantidad que corresponde al 10 % (p/p) con respecto a la cantidad del polímero anfifílico, para preparar la Partícula Comparativa (3) en la cual el agente tensioactivo es unido a las superficies de las micropartículas , la Partícula Comparativa (4) en la cual coexisten el agente tensioactivo y las micropartículas inmunogénicas sin que estén unidas entre sí, así como la Partícula Comparativa (5) en la cual el agente tensioactivo no fue agregado en el proceso de preparación de las micropartículas inmunogénicas .
Tabla 3
Método para preparar las micropartículas inmunogénicas que contienen CEA (Partículas (11) a (15) y Partículas Comparativas (3) a (5) )
Ejemplo 9 - Administración Subcutánea de la Composición - Inmunogénica que Contiene CEA a los Ratones (4)
Método
Cada tipo de las micropartículas inmunogénicas preparadas en el Ejemplo 8 (Partículas (11) a (13) ) fue administrada subcutáneamente por el método descrito en el Ejemplo 4 por la inyección única a la espalda de los ratones Balb/C machos de 7 semanas de edad (Japan SCL, Inc.) a una dosis de 5 pg en términos de CEA por individuo. Como los ejemplos comparativos, las partículas a las cuales el agente tensioactivo fue agregado de diferentes maneras (Partículas Comparativas (3) y (4)) fueron administradas subcutáneamente por una sola inyección a la espalda de los ratones Balb/C a una dosis de 5 g en términos de CEA por individuo. Bajo cada condición, la administración fue llevada a cabo para 5 individuos de los ratones. La Figura 4 muestra el valor promedio de la concentración del anticuerpo. La recolección de la sangre y la medición de la concentración del anticuerpo se llevaron a cabo por los métodos descritos en .el Ejemplo 4.
Resultados
El valor promedio de la concentración del anticuerpo de anti-CEA en el plasma de la sangre en la semana 5 después de la administración es mostrado en la Figura 4. En los casos en donde el agente tensioactivo fue agregado a la solución de CEA acuosa (A) , la solución polimérica (B) o la dispersión (C) (Partículas (11) a (13)), el agente tensioactivo está presente dentro de la emulsión de S/O/W, de modo que el agente tensioactivo sea encapsulado en la micropartícula. Por otra parte, en el caso de la partícula (Partícula Comparativa (3)) agregada a la solución acuosa (D) que contiene un modificador de la superficie, el polisorbato 80 está presente fuera de la emulsión de S/O/W, de modo que el agente tensioactivo esté unido a la superficie de la micropartícula. En el caso de la partícula (Partícula Comparativa (4)) agregada a la solución de inyección (E) , el agente tensioactivo y las micropartículas coexisten sin que estén unidas entre sí. Puesto que las micropartículas inmunogénicas (Partículas (11) a (13)) en donde el agente tensioactivo está encapsulado mostraron concentraciones del anticuerpo más elevadas comparado con la partícula (Partícula Comparativa (3)) en donde el agente tensioactivo está unido a la superficie y la partícula (Partícula Comparativa (4)) en donde el agente tensioactivo no está unido a la superficie, se mostró que la encapsulación del agente tensioactivo en la micropartícula inmunogénica es importante en la presente invención.
Ejemplo 10 - Administración Subcutánea de la Composición
Inmunogénica que contiene CEA a los Ratones (5)
Método
Cada tipo de las micropartículas inmunogénicas preparadas en el Ejemplo 8 (Partículas (11), (14) y (15)) fueron administradas subcutáneamente por el método descrito en el Ejemplo 4 por una sola inyección a la espalda de los ratones Balb/C machos de 7 semanas de edad (Japan SLC, Inc.) a una dosis de 5 pg en términos de CEA por individuo. Como un ejemplo comparativo, las partículas que no contienen el agente tensioactivo (Partícula Comparativa (5)) fueron administradas subcutáneamente por una sola inyección a la espalda de los ratones Balb/C a una dosis de 5 pg en términos de CEA por individuo. Bajo cada condición, la administración se llevó a cabo para 5 individuos de los ratones. La Figura 5 muestra el valor promedio de la concentración del anticuerpo. La recolección de la sangre y la medición de la concentración del anticuerpo se llevaron a cabo por los métodos descritos en el Ejemplo 4.
Resultados
El valor promedio de la concentración del anticuerpo de anti-CEA en el plasma de la sangre de la semana 3 después de la administración es mostrado en la Figura 5. Las partículas en donde un agente tensioactivo es encapsulado (Partículas (11), (14) y (15)) mostraron concentraciones del anticuerpo más elevadas comparado con la partícula que no contiene un agente tensioactivo (Partícula Comparativa (5) ) . Además, entre las partículas en donde un agente tensioactivo es encapsulado, mientras más grande es la cantidad del agente tensioactivo agregada, más grande es la concentración del anticuerpo. Por consiguiente, se muestra que el efecto se incrementa cuando la cantidad del agente tensioactivo encapsulado en la partícula se incrementa.
Ejemplo 11 - Medición del Agente Tensioactivo Contenido en la Micropartícula Inmunogénica (2)
Método
Las micropartículas inmunogénicas preparadas en el Ejemplo 8 (Partículas (11) a (13) y la Partícula Comparativa (3) ) fueron utilizadas para medir los contenidos del polisorbato 80 contenido en las micropartículas inmunogénicas, por el método descrito en el Ejemplo 7.
Resultados
Por la cromatografía líquida de alta resolución, el contenido del polisorbato 80 con respecto a la cantidad alimentada del polímero anfifílico que constituye la micropartícula inmunogénica o con respecto a la cantidad del agente tensioactivo alimentado en el proceso de producción, fue analizado. Los resultados son mostrados en la Tabla 4. En las partículas en donde un agente tensioactivo fue agregado a la solución de CEA acuosa (A) , la solución del polímero anfifílico (B) o la dispersión (C) (Partículas (11) a (13)), el agente tensioactivo fue encapsulado en las micropartículas en el proceso de preparación. En consecuencia, se mostró que aproximadamente 30 % (p/p) del agente tensioactivo agregado en el proceso de preparación en el Ejemplo 8 estuvo contenido en las partículas. Por otra parte, en el caso de las partículas (Partícula Comparativa (3)) preparada por el proceso en donde el agente tensioactivo fue agregado a la solución acuosa (D) que contiene un modificador de la superficie, el agente tensioactivo es unido a las superficies de las micropartículas, y se muestra que solo aproximadamente 30 % del agente tensioactivo agregado en el proceso de preparación estuvo contenido.
Tabla 4
Cantidad del Agente Tensioactivo Contenido en las Micropartículas Inmunogénicas (Partículas (11) a (13) y Partícula Comparativa (3))
Ejemplo 12 - Preparación de las Micropartículas Inmunogénicas que Contienen OVA (Partículas (16) a (18) y Partícula Comparativa (6) )
En 100 µ? del carbonato de dimetilo, se disuelven 5 mg del dextrano-poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) (Compuesto (2)) en el Ejemplo 1, para preparar 50 mg/ml de la solución del polímero anfifílico (B) . A la solución del polímero anfifílico (B) , se agregan 20 µ? del terc-butanol , y 50 µ? de la solución (A) de OVA (ovalbúmina) (SIGMA) , acuosa, al 0.025 % (p/v) se agregan entonces por goteo a la misma (cantidad de OVA alimentada, 125 g) , seguido por agitación de la mezcla resultante con un agitador con efecto de remolino para producir una emulsión de fase inversa.
La emulsión de fase inversa fue sometida a congelamiento previo con nitrógeno líquido, y se seca por congelamiento utilizando un secador por congelamiento (EYELA, FREEZE DRYER FD-1000) a una temperatura de enfriamiento de la trampa de -45 °C a un grado de vacío de 20 Pa durante 24 horas. Los sólidos obtenidos se dispersan en 200 µ? de carbonato de dimetilo, para preparar una dispersión. La dispersión se agrega por goteo a 2 mi de una solución acuosa (C) que contiene un modificador de la superficie al 10 % (p/v) (Pluronic F-68) , y la mezcla resultante se agita y se emulsifica con un mezclador con efecto de remolino, para preparar una emulsión de S/O/W. De la emulsión de S/O/W, se elimina el carbonato de dimetilo por evaporación del solvente, para preparar una suspensión de micropartícula inmunogénica . La suspensión se transfiere a un recipiente del tipo de berenjena, y se somete a congelamiento previo con nitrógeno líquido, seguido por secado por congelamiento utilizando un secador por congelamiento (EYELA, FREEZE DYER FD-1000) a una temperatura de enfriamiento de la trampa de -45 °C y a un grado de vacío de 20 Pa durante 24 horas, para obtener las micropartículas inmunogénicas .
Como se muestra en la Tabla 5, en términos del agente tensioactivo, el polisorbato 80 o el monooleato de sorbitan (estos fueron fabricados por Kanto Chemical Co., Inc.) o aceite de ricino hidrogenado polioxietileno (fabricado por Nikko Chemicals Co., Ltd.) se disuelve en la solución de OVA acuosa (A) o la solución del polímero anfifílico (B) , en una cantidad de 500 pg, la cual correspondió al 10 % (p/p) con respecto a la cantidad del polímero anfifílico.
Tabla 5
Método para la preparación de micropartículas inmunogénicas que contienen OVA (Partículas (16) a (18) y Partícula Comparativa (6))
Tabla 5 (cont . )
Ejemplo 13 - Prueba de Estimulación In vitro de las Composiciones Inmunogénicas que contienen OVA Utilizando los Macrofagos Peritoneales del Ratón
Método
Una prueba de estimulación in vitro que utiliza los macrofagos peritoneales del ratón se llevó a cabo por el siguiente método. Utilizando una aguja de inyección 26-G (Terumo Corporation) , fueron administrados 5 mi del medio de tioglicolato (GIBCO) como un líquido de estimulación intraperitonealmente a un ratón Balb/C macho de 12 semanas de edad, y el ratón se mantuvo durante 72 horas en un medio ambiente en el cual el ratón tuvo libertad de tomar alimentos. El ratón fue eutanizado entonces utilizando hielo seco, y 10 mi de una solución de PBS (0 °C, filtrada) fueron inyectados intraperitonealmente al ratón utilizando una aguja de inyección 26-G, seguido por dejar que el ratón repose mientras que se masajea el abdomen del ratón durante 5 minutos. Después de esto, una solución que contienen las células abdominales fue recolectada utilizando una micropipeta.
La solución recolectada fue centrifugada utilizando una máquina centrífuga refrigerada (fabricada por Hitachi, Ltd., himacCF16RX) a 4 °C a 400 g x 5 minutos para precipitar las células abdominales del ratón, y el sobrenadante fue eliminado, seguido por la adición de 10 mi del medio de RPMI1640 (GIBCO) (referido aquí posteriormente como una solución de lavado) a la misma y la resuspensión de las células. La centrifugación se lleva a cabo nuevamente a 400 g x 5 minutos a 4 °C para eliminar el sobrenadante, y las células se colocan en placas en una placa de 24 cavidades (microplaca fabricada por Iwaki, de poliestireno, tratado para el cultivo de tejidos, de fondo plano) de tal modo que cada cavidad contuvo 8 x 105 células junto con 1 mi del medio de RPMI1640 suplementado con 5 % de FBS (SIGMA) , 100 U/ml de penicilina (Invitrogen) y 100 U/ml de estreptomicina (Invitrogen) (referido aquí posteriormente como el medio de cultivo) . La placa después del revestimiento, se incuba utilizando un incubador de C02 (NAPCQ) bajo 5 % de C02 a 37 °C a una humedad del 100 % (condiciones para el cultivo del macrófago) durante 3 horas, y las células fueron suspendidas vigorosamente utilizando una micropipeta para eliminar las células que no se adhieren a la placa, para obtener solamente los macrófagos peritoneales del ratón que se adhieren a la placa. El medio de cultivo fue agregado a las células, y las células fueron incubadas bajo las condiciones del cultivo para los macrófagos durante 5 días, para proporcionar las células que van a ser utilizadas en el experimento.
Como las partículas que van a ser agregadas a las células, las micropartículas inmunogénicas (Partículas (16) a (18) ) preparadas en el Ejemplo 12 en donde el agente tensioactivo está encapsulado, tales micropartículas estuvieron en el estado secado por congelamiento, fueron utilizadas después del pretratamiento . Más específicamente, las partículas en la cantidad correspondiente a 3 mg en términos de la cantidad del polímero anfifílico que constituye las partículas fueron pesadas y colocadas en un tubo de 1.5 mi. La solución de lavado fue agregada a la misma, y la mezcla resultante fue preenfriada a 0 °C, seguido por el lavado de las partículas 3 veces a 8400 g durante 10 minutos. Después de esto, las partículas fueron agregadas a la placa de 24 cavidades en donde los macrófagos peritoneales del ratón fueron colocados en la placa, junto con 500 µ?/cavidad del medio de cultivo. Como el ejemplo comparativo, las partículas que no contienen un agente tensioactivo (Partícula Comparativa (6) ) fueron agregadas de manera semejante.
Además, como se muestra en la Tabla 6 como otros ejemplos comparativos (Ejemplos Comparativos' (1) a (3)), OVA en una cantidad de 75 ug (calculada con base en la relación en peso entre la cantidad alimentada del polímero anfifílico y la cantidad alimentada de OVA) , la cual fue la misma que la cantidad de OVA contenida en las Partículas (16) a (18) y 300 µg del polisorbato 80, monooleato de sorbítan o aceite de ricino hidrogenado polioxietileno, fueron agregados a cada cavidad de la placa de 24 cavidades en donde los macrófagos peritoneales del ratón fueron colocados en la placa, junto con 500 µ? del medio de cultivo. Además, como en el Ejemplo Comparativo (4) , se agregan 75 µg de OVA junto con 500 µ? del medio de cultivo.
Tabla 6
Tipos y cantidades de los agentes tensioactivos agregados en las pruebas de estimulación en vitro en los Ejemplos Comparativos (Ejemplos Comparativos (1) a (4))
Las células a las cuales las partículas fueron agregadas, fueron cultivadas durante 24 horas, y el medio fue recuperado, seguido por la medición de la cantidad de TNFa contenido en el medio con ELISA. La medición con ELISA se llevó a cabo utilizando un kit fabricado por Thermo Scientific.
Resultados
La concentración del TNFa en el medio fue como se muestra en la figura 6. Las partículas en donde un agente tensioactivo es encapsulado (Partículas (16) hasta (18)) mostraron concentraciones de TNFa más elevadas comparado con las partículas (Partícula Comparativa (6) ) en donde ningún agente tensioactivo está encapsulado. El TNFa es una clase de citoquina que induce inmunidad, y se mostró que la inducción eficiente de inmunidad puede ser lograda por la encapsulación de un agente tensioactivo en la partícula. Además, en los Ejemplos Comparativos en donde el antígeno no estuvo en la forma de partículas y se agrega junto con un agente tensioactivo (Ejemplos Comparativos (1) a (4)), la concentración de TNFa fue inferior que en los casos en donde el antígeno estuvo en la forma de partículas. Por consiguiente, se muestra que la formación en partículas es importante para la inducción de la inmunidad.
Aplicabilidad industrial
La composición inmunogénica de la presente invención puede ser utilizada como una vacuna para la terapia y/o profilaxis de las enfermedades infecciosas, los cánceres y semejantes.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.
Claims (12)
1. Una composición inmunogénica, caracterizada porque comprende, como ingredientes eficaces: una micropartícula inmunogénica compuesta de un complejo de micropartícula adyuvante-antígeno en donde un (os) antígeno(s) es/son encapsulado (s) en una micropartícula adyuvante compuesta de un (os) polímero (s) anfifílico (s) cuyo(s) segmento (s) idrofóbico (s) es/son un poli (hidroxi ácido); y un agente tensioactivo; el agente tensioactivo está encapsulado en la micropartícula inmunogénica.
2. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la micropartícula inmunogénica es una partícula compuesta del complejo de micropartícula adyuvante-antígeno asociado conjuntamente.
3. La composición inmunogénica de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque el agente tensioactivo comprende una estructura del éster de ácido graso .
. La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque la micropartícula adyuvante tiene, en la porción interna del mismo, una(s) porción(es) hidrofílica (s) compuesta (s) de un (os) segmento (s) hidrofílico (s) del (de los) polímero (s) anfifílico (s), y tiene una capa externa compuesta de una(s) porción (es) hidrofóbica (s) compuesta (s) de un (os) segmento (s) hidrofóbico (s) del (de los) polímero (s) anfifílico (s) .
5. La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque el segmento hidrofílico del polímero anfifílico es un polisacárido.
6. La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque el polímero anfifílico es un polímero anfifílico de injerto, compuesto de una cadena principal de polisacárido y una(s) cadena(s) de injerto de poli(hidroxi ácido).
7. La composición inmunogénica de conformidad con las reivindicaciones 5 o 6, caracterizada porque el polisacárido es el dextrano.
8. La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque el poli (hidroxi ácido) es el poli (ácido láctico-co-glicólico) .
9. La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque el agente tensioactivo comprende además un monosacárido y/o una(s) estructura (s) de polietilen glicol.
10. La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque el agente tensioactivo es uno o más seleccionados del grupo que consiste de polisorbato 80, polisorbato 20, monooleato de sorbitan, trioleato de sorbitan y aceite de ricino hidrogenado polioxietileno .
11. Una composición inmunogénica, caracterizada porque comprende como un ingrediente eficaz una micropartícula inmunogénica obtenida por las etapas de: disolver un (os) agente (s) tensioactivo (s) en un solvente acuoso A en donde un (os) antígeno(s) es/son disuelto (s) o en un solvente orgánico B inmiscible en agua en donde un (os) polímero (s) anfifílico (s) cuyo(s) segmento (s) hidrofóbico (s) es/son el poli (hidroxi ácido) está/están disuelto(s), y mezclar la mezcla resultante para formar una emulsión de fase inversa; y eliminar el solvente de la emulsión de fase inversa .
12. Una composición inmunogénica caracterizada porque comprende como un ingrediente eficaz una micropartícula inmunogénica obtenida por un proceso para la producción de una partícula compuesta de un complejo de micropartícula adyuvante-antígeno asociado conjuntamente, el proceso comprende las etapas de : mezclar un solvente acuoso A en donde un (os) antígeno(s) es/son disuelto (s) y un solvente orgánico B inmiscible en agua en donde un (os) polímero (s) anfifílico (s) cuyo(s) segmento (s) hidrofóbico (s) es/son el poli (hidroxi ácido) está/están disuelto(s), para formar una emulsión de fase inversa; eliminar el solvente de la emulsión de fase inversa para obtener un complejo de micropartícula adyuvante-antígeno; e introducir una dispersión C del complejo de micropartícula adyuvante-antígeno a una fase líquida D en donde un modificador de la superficie es disuelto, seguido por la eliminación del medio de dispersión; en donde un (os) agente (s) tensioactivo (s) es/son disuelto (s) en el solvente acuoso A, el solvente orgánico B inmiscible en agua y/o la dispersión C.
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