CN103052402A - 免疫原性组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种免疫原性组合物，含有免疫原性微粒及表面活性剂作为有效成分，所述免疫原性微粒包含抗原-佐剂微粒复合物，所述抗原包埋在佐剂微粒中，所述佐剂微粒包含疏水性链段为聚(羟基酸)的两亲性聚合物，表面活性剂包埋在免疫原性微粒中，所述免疫原性组合物即使在抗原量少、给药次数少的情况下在生物体内也具有高的免疫活化能。
Description
技术领域
本发明涉及一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物以免疫原性微粒为有效成分，所述免疫原性微粒含有抗原-佐剂微粒复合物及表面活性剂，所述抗原包埋在佐剂微粒中，所述佐剂微粒包含两亲性聚合物。
背景技术
为了提高抗原的免疫活化能，佐剂与抗原一起使用。已知作为佐剂具有高效果的是弗氏完全佐剂(CFA)，但由死菌及油乳液形成的CFA具有很强的副作用，在给药部位发生强的炎症反应和形成溃疡性的肿胀(肉芽肿)等，所以有安全上的忧虑，不允许用于人。因此，允许对人给药的佐剂有限。
作为允许对人给药的佐剂，有氢氧化铝佐剂，但该佐剂的免疫活化能力不能说是充分的，为了获得免疫，需要反复给药。因此，人们期待开发出一种使用了能够用于人的、效率好且效力大的佐剂的免疫原性组合物。
对于以高的免疫活化能作为目标的新型佐剂的开发，尝试了将抗原包埋在微粒中的方法。据报道，通过将抗原制成微粒后给药，与抗原单独给药时相比，产生抗体等的免疫反应增强，但其效果未必高，仅报道了具有与上述的氢氧化铝佐剂同程度的效果。认为其原因是，迄今为止所研究的微粒、例如由疏水性的聚乳酸-聚乙醇酸共聚物聚合物构成的微粒难以将蛋白等亲水性的抗原分子高效率地在保持了结构的状态下包埋(非专利文献1)。
近年来，报道了利用两亲性聚合物能以高效率封入高分子量蛋白质的新型微粒技术(专利文献1、2)。对于该新型微粒，对药物的缓释性能做了研究，但对于包埋有抗原时的佐剂功能完全没有做研究。进而，对于含有抗原的微粒作为佐剂发挥功能的机制，认为与对抗原分子缓释的功能相组合，含有抗原的微粒连同颗粒被免疫细胞摄取后在细胞内将抗原游离的机制是重要的，并认为药物从颗粒中释放的功能与作为佐剂的性能是不一致的，所以难以从颗粒的缓释性能推测佐剂功能，尽管期待开发出具有远远超过铝佐剂的性能的有效的佐剂，但在使用了现有的微粒的技术中迄今为止没有实现这种佐剂。
专利文献1：WO2006/095668号
专利文献2：日本特开2008-088158号公报
非专利文献1：Advanced Drug Delivery Reviews，2005年57号，391-410页
发明内容
本发明的目的在于提供一种在抗原量少、给药次数少的情况下具有高的免疫活化能的免疫原性组合物。
为了克服上述课题，本发明人等研究了使用少量的抗原在给药次数少的情况下能够引起较强的免疫活化的方法，结果发现下述免疫原性组合物在生物体内具有高的免疫活化能，所述免疫原性组合物含有免疫原性微粒及表面活性剂作为有效成分，所述免疫原性微粒包含抗原-佐剂微粒复合物，所述抗原包埋在佐剂微粒内。即，本发明具有如下构成。
(1)一种免疫原性组合物，含有免疫原性微粒及表面活性剂作为有效成分，所述免疫原性微粒包含抗原-佐剂微粒复合物，所述抗原包埋在佐剂微粒中，所述佐剂微粒包含疏水性链段为聚(羟基酸)的两亲性聚合物，表面活性剂包埋在免疫原性微粒中。
(2)如(1)所述的免疫原性组合物，其中，上述免疫原性微粒为抗原-佐剂微粒复合物缔合而成的颗粒。
(3)如(1)或(2)所述的免疫原性组合物，其中，上述表面活性剂含有脂肪酸酯结构。
(4)如(1)～(3)中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，佐剂微粒在内部具有包含两亲性聚合物的亲水性链段的亲水性部分，并具有包含两亲性聚合物的疏水性链段的疏水部分的外层。
(5)如(1)～(4)中任一项所述的免疫原性组合物，其中，两亲性聚合物的亲水性链段为多糖。
(6)如(1)～(5)中任一项所述的免疫原性组合物，其中，两亲性聚合物为包含多糖主链及聚(羟基酸)接枝链的接枝型两亲性聚合物。
(7)如(5)或(6)所述的免疫原性组合物，其中，多糖为葡聚糖。
(8)如(1)～(7)中任一项所述的免疫原性组合物，其中，聚(羟基酸)为聚(乳酸-乙醇酸)。
(9)如(1)～(8)中任一项所述的免疫原性组合物，其中，上述表面活性剂进一步含有单糖及/或聚乙二醇结构。
(10)如(1)～(9)中任一项所述的免疫原性组合物，其中，上述表面活性剂为选自聚山梨酸酯80、聚山梨酸酯20、失水山梨醇单油酸酯、失水山梨醇三油酸酯及聚氧乙烯氢化蓖麻油中的一种或两种以上。
(11)一种免疫原性组合物，其以免疫原性微粒为有效成分，所述免疫原性微粒通过下述工序得到：将表面活性剂溶解于溶解有抗原的水性溶剂A或溶解有疏水性链段为聚(羟基酸)的两亲性聚合物的与水不混合的有机溶剂B中，将它们混合，由此形成反相乳液的工序；及从反相乳液中除去溶剂的工序。
(12)一种免疫原性组合物，其以免疫原性微粒为有效成分，所述免疫原性微粒通过在抗原-佐剂微粒复合物缔合而成的颗粒的制造工序中使表面活性剂溶解在水性溶剂A、与水不混合的有机溶剂B或分散液C中而得到，所述制造工序包括如下工序：将溶解有抗原的水性溶剂A及溶解有疏水性链段为聚(羟基酸)的两亲性聚合物的与水不混合的有机溶剂B混合由此形成反相乳液的工序；从反相乳液中除去溶剂得到抗原-佐剂微粒复合物的工序；及将抗原-佐剂微粒复合物分散液C导入溶解有表面改性剂的液相D中除去分散介质的工序。
通过本发明，提供一种比以往效力强大的在生物体内可免疫活化的免疫原性组合物。
附图说明
图1为含CEA的免疫原性微粒的免疫评价1。
图2为含CEA的免疫原性微粒的免疫评价2。
图3为含CEA的免疫原性微粒的免疫评价3。
图4为含CEA的免疫原性微粒的免疫评价4。
图5为含CEA的免疫原性微粒的免疫评价5。
图6为含OVA的免疫原性微粒的免疫评价。
具体实施方式
本发明涉及一种免疫原性组合物，含有免疫原性微粒及表面活性剂作为有效成分，所述免疫原性微粒包含抗原-佐剂微粒复合物，所述抗原包埋在佐剂微粒中，所述佐剂微粒包含疏水性链段为聚(羟基酸)的两亲性聚合物。
首先，对于构成佐剂微粒的两亲性聚合物进行说明。两亲性是指具有亲水性和疏水性这两种性质，因而，对于亲水性，任意部位对水的溶解度都比其他部位的高时，称该部位为亲水性。亲水部位优选可溶于水，但即使难溶，对水的溶解度也比其他部位的高即可。另外，对于疏水性，任意部位对水的溶解度都比其他部位的低时，称该链段为疏水性的。疏水性部位优选不溶于水，但即使可溶，对水的溶解度也比其他部位的低即可。
所谓的两亲性聚合物是作为分子整体具有上述两亲性的聚合物。所谓的聚合物表示两亲性聚合物的亲水性链段或疏水性链段、
或这两种链段通过最小单位(单体)的重复结构来构成的分子结构。本发明中的两亲性聚合物只要为具有亲水性链段和疏水性链段的结构即可，既可以为亲水性链段和疏水性链段连接在一起的直链状的嵌段聚合物，也可以为因存在多个亲水性链段或疏水性链段、或这两种链段而导致具备支链的支链聚合物、在亲水性链段上接枝有多个疏水性链段、或在疏水性链段上接枝有多个亲水性链段的接枝聚合物。优选为具有1个亲水性链段的聚合物，最优选为具有亲水性链段、疏水性链段各1个的直链状嵌段聚合物或在亲水性链段主链上接枝有多个疏水性链段的接枝聚合物。
只要具有作为佐剂微粒的性质，则构成免疫原性组合物的两亲性聚合物也可以为由亲水部分、疏水部分或这两部分不同的构成聚合物组成的多种两亲性聚合物、构成聚合物相同但具有多种连接方式的两亲性聚合物的集合，但是为了发挥稳定的性能、提高生产率，优选较少种类的两亲性聚合物的集合，较优选主要为两种以下的两亲性聚合物的集合，更优选主要由单一种类的的两亲性聚合物构成。
在本发明中，以两亲性聚合物的疏水性链段为聚(羟基酸)作为特征。只要为聚(羟基酸)，就没有特别限定，然而优选为给药时对生物体不带来显著的有害影响的生物体相容性聚合物。在此所说的生物体相容性是指将该聚合物对大鼠口服给药时的LD50为2,000mg/kg以上。另外，也可以为多种羟基酸的共聚物，但优选为两种以下的羟基酸的聚合物。作为优选的聚(羟基酸)的具体例，可以举出聚乙醇酸、聚乳酸、聚(2-羟基丁酸)、聚(2-羟基戊酸)、聚(2-羟基己酸)、聚(2-羟基癸酸)、聚(苹果酸)或它们的高分子化合物的衍生物以及共聚物，较优选聚乳酸、聚乙醇酸或聚(乳酸-乙醇酸)的共聚物。另外，聚(羟基酸)为聚(乳酸-乙醇酸)时，对于聚(乳酸-乙醇酸)的组成比(乳酸/乙醇酸)(摩尔/摩尔％)没有特别限定，只要可达成本发明的目的即可，但优选为100/0～30/70，更优选为60/40～40/60。
对于两亲性聚合物的亲水性链段，没有特别限定，与疏水性链段同样地优选为生物体相容性聚合物。另外，为了对包含两亲性聚合物的佐剂微粒赋予持续的佐剂能，优选为在哺乳类或鸟类的生物体内或细胞内难以分解的难分解性聚合物。作为生物体相容性分子中的难分解性聚合物的具体例，可以举出聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙烯亚胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚-1，3-二氧戊环、2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱聚合物、聚-1，3，6-三氧杂环己烷、聚氨基酸或难分解性的多糖(例如，纤维素、壳多糖、壳聚糖、结冷胶、藻酸、透明质酸、支链淀粉(pullulan)或葡聚糖)，亲水性链段为聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙烯亚胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚-1，3-二氧戊环、2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱聚合物、聚-1，3，6-三氧杂环己烷或聚氨基酸时，两亲性聚合物优选为具有亲水性链段及疏水性链段各1个的直链状嵌段聚合物；亲水性链段为多糖时，两亲性聚合物优选为在亲水性链段主链上接枝有多个疏水性链段的接枝聚合物。另外，作为两亲性聚合物的亲水性链段，优选为聚乙二醇或难分解性的多糖，作为多糖较优选葡聚糖。
包含上述聚(羟基酸)的疏水性链段和亲水性链段的两亲性聚合物优选作为聚合物整体具有与水不混合的性质，以使免疫原性组合物的抗原包埋性及生物体给药时的持续性提高。
对两亲性聚合物中的亲水性链段的平均分子量没有特别限定，在亲水性链段和疏水性链段以直链状键合得到的嵌段聚合物的情况下，亲水性链段的平均分子量优选为1,000～50,000，较优选为2,000～15,000。此处，术语“嵌段”是指聚合物分子的一部分，该部分由至少5个以上的单体单元构成，该部分与其所相邻的其他部分在化学结构上或立体配置上不同，将至少2个以上的嵌段进行线状连接而成的聚合物称为嵌段聚合物。构成嵌段聚合物的各嵌段本身由两种以上的单体单元构成，可以为无规、交替、梯度聚合物。在本发明中，优选为形成亲水性链段的聚合物和聚羟基酸分别各一个连接而成的嵌段聚合物。
另外，在亲水性链段主链上接枝有疏水性链段的接枝聚合物的情况下，亲水性链段的平均分子量优选为1,000～100,000，较优选为2,000～50,000，更优选为10,000～40,000。另外，接枝链的链数优选为2至50。接枝链数能够由通过1H-NMR测定得到的亲水性链段主链与疏水性链段主链的比例及疏水性链段的平均分子量、以及使用的亲水性链段主链的平均分子量求出。
疏水性链段与亲水性链段的优选的平均分子量比根据两亲性聚合物的不同而不同，但是在疏水性链段与亲水性链段直链状连接在一起的嵌段聚合物的情况下，亲水性链段与疏水性链段的平均分子量比优选为1∶1以上，更优选为1∶2以上，进一步优选为1∶4以上，特别优选为1∶4以上且为1∶25以下。
在亲水性链段主链上键合有多个疏水性链段接枝链的接枝聚合物的情况下，优选亲水性链段主链部与疏水性链段接枝链全体的平均分子量比为1∶3以上且各接枝链的平均分子量为2,500～40,000，更优选所述与全体接枝链的平均分子量比为1∶5以上、各接枝链的平均分子量为5,000～40,000。
需要说明的是，只要不特别说明，上述的平均分子量表示数均分子量。数均分子量是指用未考虑分子大小的加权的方法算出的平均分子量，两亲性聚合物及构成两亲性聚合物的亲水性链段的聚合物的数均分子量能够以通过凝胶渗透色谱法(GPC)测定的聚苯乙烯或支链淀粉换算的分子量的形式求出。另外，聚(羟基酸)的平均分子量能够通过核磁共振(NMR)测定由末端残基的峰积分值与末端残基以外的峰积分值的比求出。
本发明所使用的两亲性聚合物用已知的方法合成即可，作为例子可举出在成为亲水性链段的聚合物中加入聚(羟基酸)聚合物进行缩合反应来制造的方法、在成为亲水性链段的聚合物中加入羟基酸活化单体进行聚合反应来制造的方法、或者相反在作为聚(羟基酸)聚合物的疏水性链段中加入构成亲水性链段的单体进行聚合反应的方法。
如果是例如由聚乙二醇及聚(羟基酸)构成的两亲性聚合物，则能够通过下述方法制造：在锡催化剂存在下在聚乙二醇中加入羟基酸活化单体进行聚合反应，通过导入聚(羟基酸)，制造两亲性嵌段聚合物[Journal of Controlled Release，71，p.203-211(2001年)]。
另外，如果是例如由多糖及聚(羟基酸)接枝链构成的接枝型两亲性聚合物，则能够如以下(1)、(2)或(3)那样制造。
(1)在锡催化剂存在下在多糖中加入羟基酸活化单体进行聚合反应，通过导入聚(羟基酸)，制造接枝型两亲性聚合物的方法[Macromolecules，31，p.1032-1039(1998年)]
(2)对大部分羟基被取代基保护了的多糖用碱将一部分未保护的羟基活化后，加入羟基酸活化单体，导入由聚(羟基酸)形成的接枝链，最后去掉保护基，由此制造接枝型两亲性聚合物的方法[Polymer，44，p.3927-3933，(2003年)]
(3)通过使用脱水剂及/或官能基的活化剂使聚(羟基酸)的共聚物相对于多糖进行缩合反应，制造接枝型两亲性聚合物的方法[Macromolecules，33，p.3680-3685(2000年)]。
接下来，对于佐剂微粒进行说明。佐剂微粒是指具有佐剂能的微粒，佐剂能是指与单独给予抗原时相比能够提高引起在生物体内给予抗原时的免疫应答的能力。另外，在本发明中，佐剂微粒的特征在于，其为包含两亲性聚合物的微粒，进而，佐剂微粒的特征在于，通过包埋抗原，形成抗原-佐剂微粒复合物，该复合物构成本发明免疫原性组合物的有效成分即微粒。
作为佐剂微粒的结构，没有特别限定，形成在佐剂微粒的内侧具有两亲性聚合物的亲水性链段、具有两亲性聚合物的疏水性链段的外层的结构时，可稳定保持所包埋的抗原，所以是优选的。
对于包埋在佐剂微粒中的抗原的种类没有特别限定，为肽、蛋白质、糖蛋白质、糖脂质、脂质、碳水化合物、核酸、多糖类及含有这些物质的病毒、菌体、过敏原物质、组织、细胞等即可。举出具体例的话，有来源于花粉的抗原、来源于甲型肝炎病毒的抗原、来源于乙型肝炎病毒的抗原、来源于丙型肝炎病毒的抗原、来源于丁型肝炎病毒的抗原、来源于戊型肝炎病毒的抗原、来源于己型肝炎病毒的抗原、来源于HIV病毒的抗原、来源于流行性感冒病毒的抗原、来源于疱疹病毒(HSV-1、HSV-2)的抗原、来源于炭疽菌的抗原、来源于衣原体的抗原、来源于肺炎球菌的抗原、来源于日本脑炎病毒的抗原、来源于麻疹病毒的抗原、来源于风疹病毒的抗原、来源于破伤风菌的抗原、来源于水痘病毒的抗原、来源于SARS病毒的抗原、来源于EB病毒的抗原、来源于乳头瘤病毒的抗原、来源于幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)菌的抗原、来源于狂犬病病毒的抗原、来源于西尼罗河病毒的抗原、来源于汉坦病毒的抗原、来源于链球菌的抗原、来源于葡萄球菌的抗原、来源于百日咳(Bordetellapertussis)菌的抗原、来源于结核菌(Mycobacteriumtuberculosis)的抗原、来源于疟原虫(Plasmodium)的抗原、来源于脊髓灰质炎病毒的抗原、来源于各种人畜共通感染疾病的抗原、癌抗原、来源于各种食物过敏的抗原等。
包埋的抗原不需要为单一的抗原。这是因为在考虑到本发明的应用的情况下，有时并不是对单独的蛋白或肽引起免疫应答，而是对癌细胞、细菌、病毒等多种构成物构成的物质引起免疫应答，此时抗原也可以为可引起免疫应答的多个种类的蛋白质等或种类不能确定的混合物。另外，以积极地对多个种类的抗原引起免疫应答为目的，含有多个种类的抗原也是本发明的免疫原性组合物的一个利用形态。优选3个种类以下、更优选单一种类的抗原包埋在佐剂微粒中。
本发明中的抗原-佐剂微粒复合物可根据构成佐剂微粒的聚合物的种类及制备方法改变含有的抗原的保持性。作为本发明中的抗原-佐剂微粒复合物产生免疫原性的机制，认为是从佐剂微粒释放的抗原被免疫担当细胞识别的过程、连同佐剂微粒也被免疫担当细胞识别的过程等多个过程，通过这些过程的协同效果也可获得较高的效果。
对于抗原-佐剂微粒复合物使免疫担当细胞识别抗原的过程，每个该过程所引起的免疫反应的种类也不相同，根据想要产生的免疫反应的种类、给药部位选择优选的过程即可。即，抗原无需一定从抗原-佐剂微粒复合物中被释放，优选的使用方法是根据抗原和想要活化的免疫反应的种类最优化为具有作为目标的最好的免疫原性的形态。但是抗原被明显地快速地从抗原-佐剂微粒复合物释放时，得不到本发明的良好性质即长期且持续的免疫活化作用，所以优选抗原-佐剂微粒复合物中的抗原的10％以上在给与生物体内1周后还保持为复合物形态，更优选在给药1周后包埋抗原的50％以上。这些释放行动能够通过模拟生物体内环境的体外(in vitro)评价来确认。
另外，抗原-佐剂微粒复合物即使处于该复合物缔合的颗粒状态也发挥良好的效果，在此所说的缔合是指，2个以上颗粒通过颗粒间力或其他物质结合，形成集合体。对颗粒间力没有特别限定，可举出疏水性相互作用、氢键、范德华力。缔合不限于微粒彼此相接的状态，可以在微粒间存在与微粒具有亲和性的物质，也可以在基质中分散微粒。作为对微粒具有亲和性的物质、基质，优选聚合物，更优选疏水性部分为聚(羟基酸)的两亲性聚合物、构成成分与佐剂微粒相同的聚合物，作为具体例可举出由多糖主链和聚(羟基酸)接枝链构成的两亲性聚合物、由聚乙二醇和聚(羟基酸)构成的嵌段聚合物或聚(羟基酸)。
抗原-佐剂微粒复合物的缔合既可以为使用时发生再分离的状态，也可以为不发生再分离的状态。另外，抗原-佐剂微粒复合物缔合而成的颗粒的形态即使为不确定该复合物缔合了的状态，在其制造工序中包含使该复合物缔合的工序时，也认为是该复合物缔合了的颗粒。
抗原-佐剂微粒复合物或该复合物缔合而成的颗粒的平均粒径优选为0.1～50μm，更优选为0.1～10μm。特别地，抗原-佐剂微粒复合物的平均粒径优选为0.1～1μm，更优选为0.1～0.5μm，抗原-佐剂微粒复合物的平均粒径优选为0.1～50μm，更优选为0.1～10μm，进一步优选为1～10μm。抗原-佐剂微粒复合物或该复合物缔合而成的颗粒的平均粒径，能够使用利用扫描型电子显微镜(SEM：例如株式会社日立制作所制造的S-4800)进行的图像解析法直接测定平均粒径。
上述抗原-佐剂微粒复合物或该复合物缔合而成的颗粒具有增强被包埋的抗原的免疫原性的效果，本发明人发现通过在包含上述抗原-佐剂微粒复合物或该复合物缔合而成的颗粒的免疫原性微粒(以下称为“免疫原性微粒”。)中包埋表面活性剂作为有效成分，能够进一步增强被包埋的抗原的免疫原性。即，特征在于在本发明的免疫原性组合物的有效成分即免疫原性微粒中作为构成成分包埋表面活性剂。
本发明中使用的表面活性剂没有特别限定，作为具体例可以举出聚山梨酸酯20、聚山梨酸酯40、聚山梨酸酯60、聚山梨酸酯65、聚山梨酸酯80、聚山梨酸酯85、单油酸甘油酯、失水山梨醇单油酸酯、聚乙二醇单油酸酯、乙二醇单硬脂酸酯、单硬脂酸甘油酯、失水山梨糖醇单硬脂酸酯、丙二醇单硬脂酸酯、聚乙二醇单硬脂酸酯、失水山梨糖醇单棕榈酸酯、单肉豆蔻酸甘油酯、失水山梨糖醇单月桂酸酯、聚乙二醇单月桂酸酯、失水山梨醇三油酸酯、失水山梨糖醇三硬脂酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯聚丙二醇共聚物、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚氧乙烯烷基醚、脂肪酸二乙醇酰胺(硬脂酸二乙醇酰胺、油酸二乙醇酰胺、月桂酸二乙醇酰胺等)、卵磷脂、脂肪酸钠(硬脂酸钠、油酸钠、月桂酸钠等)、烷基硫酸酯钠、聚氧乙烯辛基苯基醚、烷基苷等。另外，本发明中使用的表面活性剂可以为一种，也可以为两种以上。
另外，本发明中使用的表面活性剂优选具有作为药物添加物的实际效果。作为具有作为药物添加物的实际效果的表面活性剂的具体例，可以举出聚山梨酸酯20、聚山梨酸酯40、聚山梨酸酯60、聚山梨酸酯65、聚山梨酸酯80、聚山梨酸酯85、单油酸甘油酯、失水山梨醇单油酸酯、聚乙二醇单油酸酯、乙二醇单硬脂酸酯、单硬脂酸甘油酯、失水山梨糖醇单硬脂酸酯、丙二醇单硬脂酸酯、聚乙二醇单硬脂酸酯、失水山梨糖醇单棕榈酸酯、单肉豆蔻酸甘油酯、失水山梨糖醇单月桂酸酯、聚乙二醇单月桂酸酯、失水山梨醇三油酸酯、失水山梨糖醇三硬脂酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯聚丙二醇共聚物、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚氧乙烯烷基醚、脂肪酸二乙醇酰胺(硬脂酸二乙醇酰胺、油酸二乙醇酰胺、月桂酸二乙醇酰胺等)、卵磷脂、脂肪酸钠(硬脂酸钠、油酸钠、月桂酸钠等)、烷基硫酸酯钠等。
另外，本发明中使用的表面活性剂优选为非离子性表面活性剂。作为非离子性表面活性剂的具体例，可以举出聚山梨酸酯20、聚山梨酸酯40、聚山梨酸酯60、聚山梨酸酯65、聚山梨酸酯80、聚山梨酸酯85、单油酸甘油酯、失水山梨醇单油酸酯、聚乙二醇单油酸酯、乙二醇单硬脂酸酯、单硬脂酸甘油酯、失水山梨糖醇单硬脂酸酯、丙二醇单硬脂酸酯、聚乙二醇单硬脂酸酯、失水山梨糖醇单棕榈酸酯、单肉豆蔻酸甘油酯、失水山梨糖醇单月桂酸酯、聚乙二醇单月桂酸酯、失水山梨醇三油酸酯、失水山梨糖醇三硬脂酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯聚丙二醇共聚物、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚氧乙烯烷基醚、脂肪酸二乙醇酰胺(硬脂酸二乙醇酰胺、油酸二乙醇酰胺、月桂酸二乙醇酰胺等)等。
上述表面活性剂中，也优选使用具有脂肪酸酯结构的表面活性剂。作为脂肪酸酯结构的具体例，可以举出月桂酸酯、棕榈酸酯、硬脂酸酯、油酸酯或氢化蓖麻油，优选举出月桂酸酯、油酸酯或氢化蓖麻油。作为具有脂肪酸酯结构的表面活性剂的具体例，可以举出聚山梨酸酯20、聚山梨酸酯40、聚山梨酸酯60、聚山梨酸酯65、聚山梨酸酯80、聚山梨酸酯85、单油酸甘油酯、失水山梨醇单油酸酯、聚乙二醇单油酸酯、乙二醇单硬脂酸酯、单硬脂酸甘油酯、失水山梨糖醇单硬脂酸酯、丙二醇单硬脂酸酯、聚乙二醇单硬脂酸酯、失水山梨糖醇单棕榈酸酯、单肉豆蔻酸甘油酯、失水山梨糖醇单月桂酸酯、聚乙二醇单月桂酸酯、失水山梨醇三油酸酯、失水山梨糖醇三硬脂酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油等。
另外，作为脂肪酸酯以外的结构，优选含有生物体相容性的分子。作为表面活性剂的脂肪酸酯以外的生态适应性分子的具体例，可以举出氨基酸、核酸、磷酸、糖(例如，蔗糖、山梨糖醇、甘露糖或葡萄糖等单糖)、聚乙二醇或甘油，优选由单糖及/或聚乙二醇构成，较优选为山梨糖醇。作为脂肪酸酯以外的结构，含有生物体相容性分子的表面活性剂的具体例，可以举出聚山梨酸酯20、聚山梨酸酯40、聚山梨酸酯60、聚山梨酸酯65、聚山梨酸酯80、聚山梨酸酯85、单油酸甘油酯、失水山梨醇单油酸酯、聚乙二醇单油酸酯、乙二醇单硬脂酸酯、单硬脂酸甘油酯、失水山梨糖醇单硬脂酸酯、丙二醇单硬脂酸酯、聚乙二醇单硬脂酸酯、失水山梨糖醇单棕榈酸酯、单肉豆蔻酸甘油酯、失水山梨糖醇单月桂酸酯、聚乙二醇单月桂酸酯、失水山梨醇三油酸酯、失水山梨糖醇三硬脂酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油等，作为优选的具体例可以举出聚山梨酸酯80、聚山梨酸酯20、失水山梨醇三油酸酯或聚氧乙烯氢化蓖麻油。
在免疫原性微粒中，表面活性剂被包埋在微粒中。此处所谓的表面活性剂的包埋为表面活性剂存在于微粒的内部的状态，可以存在于整个微粒内部，也可以局部存在于微粒内部的一部分中。关于表面活性剂的包埋，在微粒的制造工序中包括将表面活性剂进行包埋的工序的情况下，认为是包埋有表面活性剂的颗粒。免疫原性微粒中的表面活性剂的量在不损害本发明的效果的范围内没有特别限定，相对于免疫原性微粒的制造工序中的两亲性聚合物的加入量优选为0.01～50％(w/w)、较优选为0.1～20％(w/w)、更优选为1～10％(w/w)。免疫原性微粒中的表面活性剂的量如下测定：使用溶解两亲性聚合物的溶剂从免疫原性微粒中提取表面活性剂，将该提取液精制后使用反相色谱柱通过液相色谱法进行分析，由此测定该提取液中含有的表面活性剂的量。由该提取液中含有的表面活性剂的量算出相对于在免疫原性微粒的制造工序中的两亲性聚合物的加入量的、表面活性剂的量。
作为制造免疫原性微粒的方法没有限定，举出免疫原性微粒由抗原-佐剂微粒复合物构成的情况下的例子时，可以通过下述方法制造，所述方法包括下述工序：(a)将溶解有抗原的水性溶剂A与溶解有两亲性聚合物的与水不混合的有机溶剂B混合，由此形成反相乳液的工序；及(b)从反相乳液中除去溶剂得到免疫原性微粒的工序。以下，说明工序(a)及(b)。
工序(a)中的水性溶剂A使用水或者含有水溶性成分的水溶液。作为该水溶性成分，可以举出例如无机盐类、糖类、有机盐类、氨基酸等。
另外，对于工序(a)中的与水不混合的有机溶剂B来说，优选该两亲性聚合物的聚(羟基酸)可溶、且构成亲水性链段的聚合物难溶或不溶，进一步优选能够通过冷冻干燥挥散除去。该与水不混合的有机溶剂B对水的溶解度优选为30g(与水不混合的有机溶剂B)/100ml(水)以下。作为与水不混合的有机溶剂B的具体例，可以举出乙酸乙酯、乙酸异丙酯、乙酸丁酯、碳酸二甲酯、碳酸二乙酯、二氯甲烷、氯仿。
水性溶剂A和与水不混合的有机溶剂B的比为1,000∶1～1∶1、优选为100∶1～1∶1。该与水不混合的有机溶剂B中的两亲性聚合物的浓度根据与水不混合的有机溶剂B、两亲性聚合物的种类的不同而不同，为0.01～90％(w/w)、优选为0.1～50％(w/w)、更优选为1～20％(w/w)。
将表面活性剂溶解于工序(a)中使用的水性溶剂A及与水不混合的有机溶剂B中的任一种，由此能够使其包埋在免疫原性微粒中。工序(a)中添加的表面活性剂的量相对于溶解于与水不混合的有机溶剂B中的两亲性聚合物量优选为0.01～50％(w/w)、较优选0.1～20％(w/w)、更优选1～10％(w/w)。
在利用工序(a)中的水性溶剂A、溶解有两亲性聚合物的与水不混合的有机溶剂B来形成反相乳液的工序中，可以根据制剂学的目的，利用2种以上的溶解有两亲性聚合物的与水不混合的有机溶剂B来形成反相乳液。
在工序(a)中，为了对反相乳液的形成进行辅助，形成均一且微小的反相乳液，能够添加辅助表面活性剂。作为辅助表面活性剂，优选从碳原子数为3至6的烷基醇、碳原子数为3至6的烷基胺、碳原子数为3至6的烷基羧酸中选择的化合物。对这些辅助表面活性剂的烷基链的结构没有特别限定，可以为直链结构，也可以为支链结构，可以为饱和烷基，也可以为不饱和烷基。在本发明中，作为辅助表面活性剂，特别优选叔丁醇、异丙醇、戊醇。
工序(b)中，对从反相乳液中除去溶剂的方法没有特别限定，例如可以举出加热、减压干燥、透析、冷冻干燥、离心操作、过滤、再沉淀及它们的组合。上述从反相乳液中除去溶剂的方法中，冷冻干燥较少发生由反相乳液中的颗粒合一等所致的结构变化，是优选的。作为冷冻干燥的条件、装置，其包含冷冻过程和减压下的干燥工序，特别优选的工序是经历作为冷冻干燥的常规方法的预冷冻、在减压和低温下的一次干燥、减压下的二次干燥的工序。例如在获得抗原-佐剂微粒复合物的与水不混合的溶剂分散体时，在构成反相乳液的水性溶剂A和与水不混合的有机溶剂B的融点以下进行冷却·冷冻，接下来减压干燥，由此可得到冷冻干燥后的佐剂微粒。作为预冷冻的温度，由溶剂组成适宜地根据实验决定即可，但优选在-20℃以下。另外，干燥过程中的减压度也由溶剂组成适宜地根据实验决定即可，但优选为3,000Pa以下，在500Pa以下时干燥时间缩短，所以是更优选的。冷冻干燥中优选使用具备冷阱可与真空泵连接的实验用冷冻干燥机、或在药物的制造等中所使用的棚式真空冷冻干燥机，用液氮、制冷剂等预冷冻后，在冷却下或在室温下用真空泵等减压装置进行减压干燥即可。
另外，如果举出免疫原性微粒由抗原-佐剂微粒复合物缔合而成的颗粒构成时的制造例的话，则通过下述工序可以得到抗原-佐剂微粒复合物缔合而成的免疫原性微粒：(a’)将溶解有抗原的水性溶剂A及溶解有两亲性聚合物的与水不混合的有机溶剂B混合，由此形成反相乳液的工序；(b’)从反相乳液中除去溶剂得到抗原-佐剂微粒复合物的工序；(c’)将抗原-佐剂微粒复合物分散液C导入含有表面改性剂的液相D中除去分散介质的工序。
工序(a’)中的水性溶剂A及工序(b’)中的与水不混合的有机溶剂是与上述工序(a)及(b)相同的条件。
作为工序(b’)中从反相乳液除去溶剂的方法，可以采用与上述工序(b)的方法相同的方法。
作为工序(c’)中使抗原-佐剂微粒复合物分散制备该复合物分散液C的分散介质，没有特别限定，但是在佐剂微粒在内部具有包含两亲性聚合物亲水性链段的亲水性部分、在外层具有包含两亲性聚合物疏水性链段的疏水部分时，为了保护其结构，分散介质优选为两亲性聚合物的聚(羟基酸)可溶且构成亲水性链段的聚合物实质上不溶解的溶剂，此时可以为与水不混合的有机溶剂，也可以为水混合性有机溶剂。作为两亲性聚合物的聚(羟基酸)可溶且构成亲水性链段的聚合物实质上不溶解的溶剂的具体例，可以举出乙酸乙酯、乙酸异丙酯、乙酸丁酯、碳酸二甲酯、碳酸二乙酯、二氯甲烷、氯仿、二氧杂环己烷、甲苯、二甲苯等。
作为工序(c’)中的液相D，优选可溶解表面改性剂且具有比分散液C的分散介质高的沸点，可以为水性溶剂、与水不混合的有机溶剂、水混合性有机溶剂中的任一种。作为上述的水性溶剂，优选水或者含有水溶性成分的水溶液，作为该水溶性成分，可举出例如无机盐类、糖类、有机盐类、氨基酸等。作为与水不混合的有机溶剂，可举出例如硅油、芝麻油、大豆油、玉米油、棉籽油、椰子油、亚麻子油、矿物油、蓖麻油、氢化蓖麻油、液体石蜡、正己烷、正庚烷、甘油、油酸等。作为水混合性有机溶剂，可举出例如甘油、丙酮、乙醇、乙酸、双丙甘醇、三乙醇胺、三甘醇等。其中，在本发明中，液相D优选为水性溶剂或水混合性有机溶剂。在液相D为水性溶剂且分散介质为与水不混合的有机溶剂的情况下，所得的抗原-佐剂微粒复合物悬浮液形成所谓的水包油包固体(S/O/W)型乳液，在液相D为与水不混合的有机溶剂或水混合性有机溶剂且不与分散介质混合的情况下，形成油包油包固体(S/O1/O2)型乳液。
将表面活性剂溶解于工序(a’)中使用的水性溶剂A、与水不混合的有机溶剂B或工序(c’)中使用的分散液C中，由此能够使其包埋在抗原-佐剂微粒复合物缔合而成的免疫原性微粒中。另一方面，将表面活性剂溶解于在工序(c’)中使用的液相D中时，导致表面活性剂键合于由抗原-佐剂微粒复合物缔合而成的免疫原性微粒的表面，因此，无法获得本发明的效果。在工序(a’)或(c’)中添加的表面活性剂的量，相对于溶解于与水不混合的有机溶剂中的两亲性聚合物量，优选为0.01～50％(w/w)，较优选为0.1～20％(w/w)，更优选为1～10％(w/w)。
作为在工序(c’)中添加的表面改性剂，优选为使S/O/W型乳液的水-油界面或者S/O1/O2型乳液的油-油界面稳定的表面改性剂，另外，优选为具有使由抗原-佐剂微粒复合物缔合而成的颗粒的胶体稳定性提高的性质的化合物。此处使胶体稳定性提高是指，防止由抗原-佐剂微粒复合物缔合而成的颗粒在溶剂中凝集或使该凝集延迟。另外，表面改性剂可以为1种，也可以为多种的混合物。
表面改性剂优选为亲水性聚合物或两亲性化合物。
对于作为表面改性剂的亲水性聚合物，优选为聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙烯亚胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚-1，3-二氧戊环、2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱聚合物、聚-1，3，6-三氧杂环己烷、聚氨基酸、肽、蛋白质、糖类多糖类或任一种的类似物。作为该亲水性聚合物的类似物，可以举出对亲水性聚合物的长链烷基等疏水基进行部分修饰等而得到的物质，但并不限定于此。
对于作为表面改性剂的聚乙二醇类似物，优选由BASF公司市售的“Pluronic”(BASF公司的注册商标)或其同等品。
对于作为表面改性剂的聚氨基酸，优选聚天冬氨酸或聚谷氨酸或它们的类似物，更优选在聚天冬氨酸或聚谷氨酸的一部分中导入长链烷基所形成的类似物。
对于作为表面改性剂的肽，可以举出碱性肽，作为表面改性剂的蛋白质，明胶、酪蛋白或白蛋白由于提高颗粒的分散性，所以是优选的。此外，作为蛋白质还可以举出抗体作为优选例。
对于作为表面改性剂的糖类，优选单糖类、寡糖类、多糖类。作为多糖类，优选纤维素、壳多糖、壳聚糖、结冷胶、藻酸、透明质酸、支链淀粉或葡聚糖，胆固醇化支链淀粉由于提高颗粒的分散性，所以是特别优选的，并且优选纤维素、壳多糖、壳聚糖、结冷胶、藻酸、透明质酸、支链淀粉或葡聚糖中的任一种的类似物。
作为表面改性剂的这些肽、蛋白质或糖类，特别优选为对长链烷基等疏水基进行部分修饰等而得到的类似物、对上述亲水性聚合物或两亲性化合物进行修饰而得到的类似物。
对于作为表面改性剂的两亲性化合物，优选聚氧乙烯聚丙二醇共聚物、蔗糖脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐二脂肪酸酯、聚氧乙烯甘油单脂肪酸酯、聚氧乙烯甘油二脂肪酸酯、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油等非离子性活性剂；十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸铵、十八烷基硫酸钠等烷基硫酸盐；或卵磷脂。
液相D相对于分散抗原-佐剂微粒复合物的分散介质的体积比为1,000∶1～1∶1,000，优选为100∶1～1∶100。需要说明的是，所得的抗原-佐剂微粒复合物的缔合数根据该体积比而变化，液相D的比例越高，得到抗原-佐剂微粒复合物就越多地缔合而成的颗粒的水分散体，另外，液相D少时缔合数变少，在液相D的比例小于溶液比1∶4时，大部分形成由一个抗原-佐剂微粒复合物构成的颗粒的水分散体，所以在制造抗原-佐剂微粒复合物缔合而成的颗粒的一系列过程中，通过调整液相D的体积比，能够区分制作抗原-佐剂微粒复合物和由该复合物缔合而成的颗粒。
在使含有抗原-佐剂微粒复合物的分散介质混合在液相D中时，必要的话，可以使用例如磁力搅拌器等搅拌装置、涡轮型搅拌机、均化器、装备有多孔膜的膜乳化装置等。
根据制剂学的目的，除表面改性剂外在液相D中也可以含有各种添加物，例如缓冲剂、抗氧化剂、盐、聚合物或糖等。另外，为了调节该复合物的分解或崩解所致的所包埋的抗原的释放速度，在使抗原-佐剂微粒复合物分散的分散介质中也可以含有可溶于分散介质的各种添加剂，例如酸性化合物、碱性化合物、两亲性聚合物或生物降解性聚合物等。
此外，为了制造更微细的抗原-佐剂微粒复合物缔合而成的颗粒，也可以对形成的水包油包固体(S/O/W)型乳液或油包油包固体(S/O1/O2)型乳液进行乳化操作。乳化方法只要是能够制备稳定的乳液的方法，就没有特别限定，例如可以举出搅拌的方法、使用高压均化器、高速均相混合机等的方法等。
在使抗原-佐剂微粒复合物暂且分散在分散介质中，将得到的分散液C添加在含有表面改性剂的液相D中的情况下，通过除去分散介质，可以得到所期望的由佐剂微粒缔合而成的颗粒的悬浮液。对除去分散介质的方法，没有特别限定，可以举出例如液中干燥、透析、冷冻干燥、离心操作、过滤、再沉淀，特别优选液中干燥、冷冻干燥。在使用水性溶剂作为液相D时，通过本工序，可得到由抗原-佐剂微粒复合物缔合而成的颗粒的水性分散体。
需要说明的是，表面改性剂结合在免疫原性微粒上也是一种优选方式。此处所述的结合可以为非共价结合，也可以为共价结合。非共价结合优选为疏水性相互作用，可以为静电相互作用、氢键、范德华力，也可以为这些作用组合起来的结合。在非共价结合中，优选包含两亲性聚合物的免疫原性微粒的聚(羟基酸)与表面改性剂的疏水部分通过疏水性相互作用结合，此时，优选为抗原-佐剂微粒复合物的分散介质为水、缓冲液、生理盐水、表面改性剂水溶液或亲水性溶剂的微粒分散体。
本发明中的免疫原性组合物是指在生物体内可引起免疫应答的组合物，含有上述免疫原性微粒作为有效成分。对免疫原性组合物所产生的免疫应答的种类没有限定。作为所产生的免疫应答的种类，有Th1型免疫应答、Th2型免疫应答，已知根据抗原、给药部位、给药方法的种类产生任一占优势的免疫应答，本发明可产生Th1型、Th2型两种类型的免疫应答。Th1型的免疫反应如实施例中所示能够通过小粒径的本发明的抗原-佐剂微粒复合物或由该复合物缔合而成的颗粒有效引发。有关Th1型免疫应答和Th2免疫应答的程度，能够用已知的各种方法评价。举例来说，对于小鼠，作为Th1型免疫应答的指标获知IgG2a抗体的产生量。另外，作为Th2型免疫应答的指标获知IgG1抗体的量、IgG抗体总量。
另外，本发明的免疫原性组合物通过进一步含有免疫活性物质能够实现高活性的免疫活性。这些免疫活性物质可以在佐剂微粒外，也可以被包埋在佐剂微粒中，但优选被包埋在佐剂微粒中。作为免疫活性物质，举例来说，只要为油类、铝盐、钙盐、凝胶性高分子、免疫活性细胞因子、TLR受体配体等可作为免疫活性物质发挥功能的物质即可，没有限定，然而优选免疫活性细胞因子或TLR受体配体。
作为免疫活性细胞因子，可以举出白细胞介素12、干扰素α、白细胞介素18、TNFα、白细胞介素6、NO、干扰素γ、干扰素β。
作为TLR受体配体，为脂蛋白、polyI：C、polyI：CLC等双链RNA、鞭毛蛋白、单链RNA、CpG、抑制蛋白、MPL、QS21、TDM，优选为双链RNA、单链RNA、CpG等核酸，更优选为CpG。此处CpG表示在病毒、细菌等中存在的非甲基化CpG(胞嘧啶-鸟嘌呤)基序DNA(参照日本特表2001-503254号公报)。对于CpG基序，报道了各种有效配列，只要具有免疫活化能即可，对配列的种类就没有限制，可以为使用了碱基类似物的序列，也可以为各种修饰体。
将本发明的免疫原性组合物用作药物组合物或疫苗时，除两亲性聚合物、亲水性活性物质、表面改性剂、分散介质外，也可以含有制剂学上有用的各种添加剂，作为能够添加的添加物，优选为缓冲剂、抗氧化剂、盐、聚合物或糖。
对于使用本发明的免疫原性组合物引起免疫应答的方法没有限定，既可以将免疫原性组合物对生物体给药，也可以使免疫原性组合物与取出到生物体外的免疫担当细胞接触。作为将免疫原性组合物对生物体给药的方法，没有限定，举例来说，有皮下给药、皮内给药、肌肉内给药、经鼻给药、经肺给药、口服给药、经皮给药、舌下给药、阴道内给药、腹腔内给药、淋巴节给药等，优选为皮内给药或皮下给药。
对于使用本发明免疫原性组合物引起免疫应答时的使用量，根据抗原的种类、给药方法、给药次数适宜地对产生目标免疫反应所需的抗原量进行设定，例如将本发明的免疫原性组合物对人皮下给药诱导免疫应答时，作为含在免疫原性组合物中的抗原量，每1次给药0.01～1,000μg。另外，对于给药次数，也与使用量同样地适宜设定，但由于本发明的免疫原性组合物具有持续产生免疫应答的作用，所以通过1～10次给药可以诱导免疫应答。
给药的生物体可以为人，也可以为人以外的动物，但优选为人或作为家畜、宠物或实验动物饲养的猪、牛、鸟、羊、马、驴、山羊、骆驼、狗、猫、鼬、兔子、猴、大鼠、小鼠或豚鼠。
实施例
以下给出实施例，但本发明不受这些实施例的限定。
实施例1 葡聚糖-聚(乳酸-乙醇酸)(PLGA)的合成
(1-1)TMS-葡聚糖(化合物(1))的合成
将葡聚糖(Nacalai Tesque株式会社、Nacalai规格特级合格品、数均分子量13,000、5.0g)加入甲酰胺(100ml)中，加热到80℃。用20分钟在该溶液中滴加1，1，1，3，3，3-六甲基二硅氨烷(100ml)。滴加结束后，于80℃搅拌2小时。反应结束后，将反应溶液恢复至室温，用分液漏斗将2层分离。将上层在减压下浓缩后，加入甲醇(300ml)，将得到的固体过滤、干燥，作为白色固体得到TMS-葡聚糖(化合物(1))(11.4g)。
(1-2)葡聚糖-PLGA(化合物(2))的合成
将化合物(1)(0.5g)和叔丁醇钾(35mg)在加热减压下干燥2小时后，加入四氢呋喃(10ml)，于室温搅拌1.5小时。在该溶液中滴加(DL)-丙交酯(0.56g)和乙交酯(0.9g)的四氢呋喃(15ml)溶液，搅拌5分钟后，加2滴乙酸，使反应停止。反应结束后，减压下浓缩溶剂，通过用氯仿-甲醇体系和氯仿-乙醚体系进行再沉淀精制得到白色固体，将该白色固体溶解在氯仿(9ml)中。在该溶液中加入三氟乙酸(1.0ml)，于室温搅拌30分钟。反应结束后，减压下蒸馏除去溶剂，然后将残渣溶解在氯仿(10ml)中，滴加冷却为0℃的乙醚，将得到的产物过滤，由此作为白色固体得到作为两亲性聚合物的葡聚糖-PLGA(化合物(2))。通过1H-NMR测定确定葡聚糖-PLGA的PLGA接枝链的数均分子量为5571，接枝链数为30。
实施例2 免疫原性微粒(颗粒(1)～(10)及比较颗粒(1)、(2))的制备
将实施例1的葡聚糖-聚(乳酸-乙醇酸)(PLGA)(化合物(2))5mg溶解在碳酸二甲酯100μl中，制备50mg/ml的两亲性聚合物溶液(B)。在两亲性聚合物溶液(B)中添加叔丁醇20μl后，滴加0.025％(w/v)CEA(癌胚抗原)(COSMO BIO公司))水溶液(A)50μl，用VORTEX混合器搅拌制造反相乳液。
将该反相乳液用液氮预冷冻后，用冷冻干燥机(EYELA、FREEZEDRYERFD-1000)在阱冷却温度-45℃、真空度20Pa的条件下冷冻干燥24小时。使得到的固体成分分散在碳酸二甲酯200μl中，制备分散液(C)。将分散液(C)滴加在含有10％(w/v)表1所示的表面改性剂(聚乙烯醇或PluronicF-68)的水溶液2ml中，用VORTEX混合器搅拌·乳化，制备S/O/W型乳液。从该S/O/W型乳液中通过液中干燥除去碳酸二甲酯，形成免疫原性微粒悬浮液。将该悬浮液移至15ml管中，通过8,000rpm、10分钟的离心使颗粒沉淀。除去上清后，将颗粒再次悬浮在10ml的蒸馏水中，通过上述条件下的离心使颗粒再度沉淀。再重复一次该清洗操作，除去上清后将颗粒悬浮在含有5％(w/v)甘露糖醇、0.5％(w/v)羧甲基纤维素钠及0.1％(w/v)聚山梨酸酯80的水溶液200μl中。将该悬浮液用液氮预冷冻后，使用冷冻干燥机(EYELA、FREEZEDRYER FD-1000)，在阱冷却温度-45℃、真空度20Pa的条件下冷冻干燥24小时，由此得到免疫原性微粒。
就表面活性剂而言，如表1所示，将与相对于两亲性聚合物量而言10％(w/w)相当的500μg的聚山梨酸酯80、聚山梨酸酯20、失水山梨醇三油酸酯、失水山梨醇单油酸酯(均为关东化学公司制)及聚氧乙烯氢化蓖麻油(日光Chemical公司制)中的任一种溶解于CEA水溶液(A)、两亲性聚合物溶液(B)及分散液(C)的任一种溶液中。
[表1]
【表1】
免疫原性微粒(颗粒(1)～(10)及比较颗粒(1)、(2))的制备方法
实施例3 免疫原性微粒中的抗原包埋率的测定
<方法>
将采用实施例2的方法制作的免疫原性微粒(颗粒(3)～(7)及比较颗粒(2))用200μl的磷酸缓冲生理盐水进行悬浮，制备颗粒悬浮液。将颗粒悬浮液100μl移至Eppendorf管中，加入1ml的蒸馏水，通过13,000rpm、10分钟的离心使颗粒沉淀。除去上清后，将颗粒再次悬浮在1ml的蒸馏水中，通过上述条件下的离心使颗粒再度沉淀。除去上清后，将颗粒溶解于二氯甲烷与丙酮以1∶3的比例混合所得的混合溶液0.5ml中。将该颗粒溶解液通过13,000rpm、10分钟的离心使CEA沉淀。除去上清后，将沉淀溶解于混合溶液0.5ml中，通过上述条件下的离心使CEA再度沉淀。除去上清后，进行30分钟离心干燥使CEA的沉淀干燥。在CEA的沉淀中加入凝胶电泳用样品缓冲液(TEFCO公司制)在95℃下使其溶解3分钟后，使用聚丙烯酰胺凝胶(TEFCO公司制)进行凝胶电泳。泳动后，使用胶体CBB染色试剂盒(TEFCO公司制)进行染色，算出CEA在颗粒中的包埋率，示于表2。
<结果>
免疫原性微粒的抗原(CEA)包埋率如表2所示，所有的含有表面活性剂的免疫原性微粒(颗粒(3)～(7))与不含表面活性剂的颗粒(比较颗粒(2))具有相同程度的包埋率，表明表面活性剂不对免疫原性微粒中的抗原的包埋率带来不良影响。
[表2]
【表2】
免疫原性微粒(颗粒(3)～(7)及比较颗粒(2))的CEA的包埋率
实施例4 含CEA的免疫原性组合物的小鼠皮下给药(1)
<方法>
将实施例2中制作的含有聚山梨酸酯80及失水山梨醇三油酸酯的免疫原性微粒(颗粒(1)、(2))用200μl的磷酸缓冲生理盐水进行悬浮，作为给药溶液。将本溶液对7周龄的雄性Balb/C小鼠(日本SLC公司)的背部皮下单次注射给药，使每1只为5μg CEA。作为比较例，对Balb/C小鼠的背部皮下分别单次注射给与不含表面活性剂的颗粒(比较颗粒(1))、或将CEA溶液50μl与作为佐剂的“ImjectAlum”(Thermo Scientific公司制、以下也称为Alum。)50μl混合而成的溶液，使每1只为5μg CEA。每种条件下都对5只小鼠给药，将抗体效价的经时变化示于图1。
在可自由进食、饮水的环境下饲养给药后的小鼠，经时性地从尾静脉进行采血。对所采取的血液添加最终浓度为3.3IU/ml的肝素，以5,000rpm离心5分钟，回收血浆，测定血浆中的相对于CEA的抗体效价。相对于CEA的抗体效价采用以下方法进行测定。在96孔微孔板(Nunc公司制MaxiSorp)中加入含有1μg/ml的CEA蛋白的PBS溶液100μl，于4℃静置1夜。弃去溶液，加入400μl含0.5％BSA的PBS，于室温进行2小时的封闭(blocking)。用清洗液(含0.05％Tween20的PBS)400μl将孔清洗1次后，加入100μl用稀释液(含0.25％BSA、0.05％Tween20的PBS)进行了1,000倍至100,000倍稀释的血浆样品，于室温进行40分钟振荡反应。用清洗液将孔清洗3次后，加入HRP(辣根过氧化物酶)标识抗小鼠IgG抗体(Zymed公司)(用稀释液稀释10,000倍)100μl，于室温下进行20分钟振荡反应。用清洗液将孔清洗3次后，加入显色液(含0.006％过氧化氢、0.2mg/ml四甲基联苯胺的0.1M乙酸-柠檬酸钠缓冲液(pH4.5))100μl，于室温进行10分钟振荡反应。加入1N硫酸100μl停止反应，使用微孔板读数仪(Microplate Reader)测定450nm的吸光度。作为标准样品，对连续稀释后的抗CEA单克隆抗体(AffinityBioreagents公司制MA1-5308)同时进行测定，将其制作标准曲线，将各样品中的抗体量换算成重量浓度(ng/ml)。
<结果>
血浆中的抗CEA抗体效价的平均值的经时变化示于图1。含有了聚山梨酸酯80的颗粒(1)及含有了失水山梨醇三油酸酯的颗粒(2)在8周中显示持续的抗体效价升高效果，大大超出作为比较例的抗原+Alum的给药。另外，与不含表面活性剂的比较颗粒(1)相比也显示高的抗体效价，表明免疫原性微粒通过含有表面活性剂具有更强的佐剂能。
实施例5含CEA的免疫原性组合物的小鼠皮下给药(2)
<方法>
将在实施例2中制作的免疫原性微粒(颗粒(3)～(7))通过实施例4中示出的方法对7周龄的雄性Balb/C小鼠(日本SLC公司)的背部皮下进行单次注射给药，使每1只为5μg CEA。作为比较例，将不含表面活性剂的颗粒(比较颗粒(2))对Balb/C小鼠的背部皮下进行单次注射给药，使每1只为5μg CEA。每种条件下都对5只小鼠给药，在图2中示出抗体效价的平均值。采血及抗体效价的测定按照实施例4所示的方法进行。
<结果>
将给药后第4周的血浆中的抗CEA抗体效价的平均值示于图2。与实施例4中所示的含有了聚山梨酸酯80或失水山梨醇三油酸酯的颗粒((3)、(4))同样，含有了聚山梨酸酯20、失水山梨醇单油酸酯或聚氧乙烯氢化蓖麻油的颗粒((5)～(7))，与不含表面活性剂的比较颗粒(2)相比也显示高的抗体效价，表明免疫原性微粒通过含有表面活性剂具有更强的佐剂能。
实施例6 含CEA的免疫原性组合物的小鼠皮下给药(3)
<方法>
将实施例2中制作的含有聚山梨酸酯80的免疫原性微粒(颗粒(8)～(10))采用实施例4中所示的方法对7周龄的雄性Balb/C小鼠(日本SLC公司)的爪垫(Foot Pad)进行单次注射给药，使每1只为5μg CEA。另外，作为比较例将混合有抗原溶液50μl和Alum50μl的溶液对Balb/C小鼠的爪垫进行单次注射给药，使每1只为5μg CEA。每种条件下都对3只小鼠给药，图3示出了抗体效价的平均值。抗体效价的测定通过实施例4所示的方法进行。
<结果>
将给药后第2周的血浆中的抗CEA抗体效价的平均值示于图3。制备工序中溶解有聚山梨酸酯80的溶液不同的颗粒((8)～(10))的抗体效价均大大超出比较例、即给与抗原+Alum的情况。即，表示将表面活性剂溶解于CEA水溶液(A)、两亲性聚合物溶液(B)及分散液(C)的任一种中时所得到的免疫原性微粒均具有强的佐剂能。
实施例7 免疫原性微粒中含有的表面活性剂的测定
<方法>
将实施例2中制作的含有聚山梨酸酯80的免疫原性微粒(颗粒(1))悬浮在1ml的蒸馏水中，通过13,000rpm、10分钟的离心使颗粒沉淀。除去上清后，将颗粒再次悬浮在1ml的蒸馏水中，通过上述条件下的离心使颗粒再度沉淀。除去上清后，将颗粒溶解在100μl的乙酸乙酯中。在该颗粒溶解液中加入300μl的乙醇后通过13,000rpm、10分钟的离心使两亲性聚合物沉淀。回收上清，通过减压馏除除去溶剂，之后将残渣溶解在100μl的蒸馏水中，由此制作颗粒提取液。将该颗粒提取液使用反相色谱柱(YMC-Pack PROTEIN-RP、YMC公司制)通过高效液相色谱法(岛津制作所制)进行分析，由此测定免疫原性微粒中含有的聚山梨酸酯80的含量。
<结果>
通过基于高效液相色谱法的分析，确认到该颗粒提取液中含有0.24(w/v)％的聚山梨酸酯80。根据本结果，表明相对于构成免疫原性微粒的两亲性聚合物的加入量，免疫原性微粒中含有4.8(w/w)％的聚山梨酸酯80，表示在实施例2的制备工序中添加的聚山梨酸酯80的48％(w/w)包含在免疫原性微粒中。
实施例8含CEA的免疫原性微粒(颗粒(11)～(15)及比较颗粒(3)～(5))的制备
将实施例1中制作的葡聚糖-聚(乳酸-乙醇酸)(PLGA)(化合物(2))5mg溶解在碳酸二甲酯100μl中，制备50mg/ml的两亲性聚合物溶液(B)。在两亲性聚合物溶液(B)中添加叔丁醇20μl后，滴加0.025％(w/v)CEA(癌胚抗原)(COSMO BIO公司))水溶液(A)50μl，用VORTEX混合器搅拌制造反相乳液。
用液氮对该反相乳液进行预冷冻后，使用冷冻干燥机(EYELA、FREEZE DRYER FD-1000)，在阱冷却温度-45℃、真空度20Pa下冷冻干燥24小时。将得到的固体成分分散在碳酸二甲酯200μl中，制备分散液(C)。将分散液(C)滴加到含有10％(w/v)表面改性剂(Pluronic F-68)的水溶液(D)2ml中，采用VORTEX混合器将其搅拌·乳化，制备S/O/W型乳液。从该S/O/W型乳液中通过液中干燥除去碳酸二甲酯，形成免疫原性微粒悬浮液。将该悬浮液移至15ml管中，通过8,000rpm、10分钟的离心使颗粒沉淀。除去上清后，将颗粒再次悬浮在10ml的蒸馏水中，通过上述条件的离心使颗粒再度沉淀。再重复一次该清洗操作，除去上清后将颗粒悬浮在含有5％(w/v)甘露糖醇、0.5％(w/v)羧甲基纤维素钠及0.1％(w/v)聚山梨酸酯80的水溶液(注射液(E))200μl中。用液氮将该悬浮液预冷冻后，使用冷冻干燥机(EYELA、FREEZEDRYER FD-1000)，在阱冷却温度-45℃、真空度20Pa的条件下冷冻干燥24小时，由此得到免疫原性微粒。
对于表面活性剂来说，如表3所示，在CEA水溶液(A)、两亲性聚合物溶液(B)及分散液(C)的任一种溶液中，以与相对于两亲性聚合物量而言10％(w/w)、1％(w/w)及0.1％(w/w)中的任一种相当的量溶解聚山梨酸酯80，由此制备颗粒(11)～(15)。另外，作为比较颗粒，在含有表面改性剂的水溶液(D)及注射液(E)的任一种溶液中，以与相对于两亲性聚合物量而言10％(w/w)相当的量溶解聚山梨酸酯80，制备表面活性剂键合于免疫原性微粒的表面的比较颗粒(3)、表面活性剂与免疫原性微粒未键合而是共存的比较颗粒(4)，并且制备在免疫原性微粒的制备工序中未添加表面活性剂的比较颗粒(5)。
[表3]
【表3】
含CEA的免疫原性微粒(颗粒(11)～(15)及比较颗粒(3)～(5))的制备方法
实施例9 含CEA的免疫原性组合物的小鼠皮下给药(4)
<方法>
将实施例8中制作的免疫原性微粒(颗粒(11)～(13))采用实施例4所示的方法对7周龄的雄性Balb/C小鼠(日本SLC公司)的背部皮下进行单次注射给药，使每1只为5μg CEA。作为比较例，将表面活性剂的添加方法不同的颗粒(比较颗粒(3)、(4))对Balb/C小鼠的背部皮下进行单次注射给药，使每1只为5μgCEA。每种条件下都对5只小鼠给药，图4示出了抗体效价的平均值。采血及抗体效价的测定通过实施例4所示的方法进行。
<结果>
给药后第5周的血浆中的抗CEA抗体效价的平均值示于图4。为在CEA水溶液(A)、聚合物溶液(B)及分散液(C)中添加有表面活性剂的颗粒(颗粒(11)～(13))的情况下，由于S/O/W型乳液内部存在表面活性剂，所以表面活性剂被包埋在微粒中。另一方面，为在含有表面改性剂的水溶液(D)中添加有表面活性剂的颗粒(比较颗粒(3))的情况下，由于S/O/W型乳液外部存在聚山梨酸酯80，所以表面活性剂键合并存在于微粒的表面。为在注射液(E)中添加表面活性剂的颗粒(比较颗粒(4))的情况下，表面活性剂与微粒未键合地共存。对于包埋有表面活性剂的免疫原性微粒(颗粒(11)～(13))来说，与表面活性剂键合并存在于表面的颗粒(比较颗粒(3))及表面活性剂与表面未键合地存在的情况相比(比较颗粒(4))，显示出高抗体效价，因此表明本发明中表面活性剂包埋在免疫原性微粒中是重要的。
实施例10 含CEA的免疫原性组合物的小鼠皮下给药(5)
<方法>
将实施例8中制作的免疫原性微粒(颗粒(11)、(14)、(15))采用实施例4所示的方法对7周龄的雄性Balb/C小鼠(日本SLC公司)的背部皮下进行单次注射给药，使每1只为5μg CEA。作为比较例将不含表面活性剂的颗粒(比较颗粒(5))对Balb/C小鼠的背部皮下进行单次注射给药，使每1只为5μg CEA。每种条件下都对5只小鼠给药，图5示出了抗体效价的平均值。采血及抗体效价的测定采用实施例4所示的方法进行。
<结果>
给药后第3周的血浆中的抗CEA抗体效价的平均值示于图5。包埋有表面活性剂的颗粒(颗粒(11)、(14)、(15))与不含表面活性剂的颗粒(比较颗粒(5))相比，显示高抗体效价。另外，包埋有表面活性剂的颗粒之间，表面活性剂的添加量多的颗粒显示出更高的抗体效价，因此表明颗粒中包埋的表面活性剂的量越多越能得到较高的效果。
实施例11 免疫原性微粒中含有的表面活性剂的测定(2)
<方法>
使用实施例8中制作的免疫原性微粒(颗粒(11)～(13)及比较颗粒(3))，采用实施例7所示的方法测定免疫原性微粒中含有的聚山梨酸酯80的含量。
<结果>
通过基于高效液相色谱法的分析，将相对于构成免疫原性微粒的两亲性聚合物的加入量的聚山梨酸酯80的含量及相对于制造工序中添加的量的聚山梨酸酯80的含量示于表4。对于在CEA水溶液(A)、聚合物溶液(B)及分散液(C)中添加有表面活性剂的颗粒(颗粒(11)～(13))来说，通过制备工序，表面活性剂被包埋在微粒中，因此，表明在实施例8的制备工序中添加的表面活性剂的约30％(w/w)包含在颗粒中。另一方面，对于在含有表面改性剂的水溶液(D)中添加有表面活性剂的颗粒(比较颗粒(3))来说，由于表面活性剂键合于微粒的表面，所以表明在制备工序中添加的表面活性剂中只有约3％被包含在颗粒中。
[表4]
【表4】
免疫原性微粒(颗粒(11)～(13)及比较颗粒(3))中含有的表面活性剂的量
实施例12 含OVA的免疫原性微粒(颗粒(16)～(18)及比较颗粒(6))的制备
将实施例1中制作的葡聚糖-聚(乳酸-乙醇酸)(PLGA)(化合物(2))5mg溶解于碳酸二甲酯100μl中，制备50mg/ml的两亲性聚合物溶液(B)。在两亲性聚合物溶液(B)中添加叔丁醇20μl后，滴加0.25％(w/v)OVA(卵白白蛋白)(Sigma公司))水溶液(A)50μl(OVA加入量：125μg)，通过VORTEX混合器进行搅拌制造反相乳液。
用液氮对该反相乳液进行预冷冻后，使用冷冻干燥机(EYELA、FREEZE DRYER FD-1000)，在阱冷却温度-45℃、真空度20Pa下冷冻干燥24小时。将得到的固体成分分散在碳酸二甲酯200μl中，制备分散液。将分散液滴加到含有10％(w/v)表面改性剂(PluronicF-68)的水溶液(C)2ml中，采用VORTEX混合器将其搅拌·乳化，制备S/O/W型乳液。从该S/O/W型乳液中通过液中干燥除去碳酸二甲酯，形成免疫原性微粒悬浮液。将该悬浮液移至茄形瓶中，用液氮预冷冻后，使用冷冻干燥机(EYELA、FREEZE DRYERFD-1000)，在阱冷却温度-45℃、真空度20Pa下冷冻干燥24小时，由此得到免疫原性微粒。
对于表面活性剂，如表5所示，将与相对于两亲性聚合物量而言10％(w/w)相当的500μg的聚山梨酸酯80、失水山梨醇单油酸酯(均为关东化学公司制)及聚氧乙烯氢化蓖麻油(日光Chemical公司制)的任一种溶解于OVA水溶液(A)及两亲性聚合物溶液(B)的任一种中。
[表5]
【表5】
含OVA的免疫原性微粒(颗粒(16)～(18)及比较颗粒(6))的制备方法
实施例13 含OVA的免疫原性组合物的使用了小鼠腹腔巨噬细胞的体外刺激试验
<方法>
使用了小鼠腹腔巨噬细胞的体外刺激试验采用以下所示的方法进行。使用26G注射针(Terumo公司)，对12周龄雄性Balb/c小鼠的腹腔内给予巯基乙酸培养基(GIBCO公司)5ml作为刺激液，在自由进食的条件下饲养72小时。使用干冰将其实施安乐死，向该已安乐死的小鼠的腹腔内使用26G注射针注入PBS溶液(0℃，经过滤器过滤)10ml，之后对小鼠腹部进行按摩并放置5分钟。之后，使用微量吸移管，回收含有小鼠腹腔细胞的溶液。
回收后的溶液使用冷却离心器(日立制作所公司制、himacCF16RX)在4℃、400g×5分钟的条件下离心，使小鼠腹腔细胞沉淀，之后除去上清，再次加入RPMI1640培养基(GIBCO公司)(以下，清洗溶液)10ml使其再悬浮。再次在400g×5分钟、4℃的条件下离心，除去上清后，在24孔板(Iwaki公司微孔板、Flat BottomTissue culture Treated，Polystyrene)中，以每1孔8×105个细胞的方式，与含有5％FBS(SIGMA公司)、100单元/ml青霉素(Invitrogen)、100单位/ml链霉素(Invitrogen)的RPMI1640培养基(以下，培养基)1ml一同进行接种。接种后的板使用CO2培养箱(NAPCO公司)，在5％CO2、37℃、湿度100％的条件(巨噬细胞培养条件)下培养3小时，之后，使用微量吸移管使其强烈悬浮，由此将未粘接在板上的细胞除去后，得到的仅为粘接在板上的小鼠腹腔巨噬细胞，对于所得到的细胞，加入培养基在巨噬细胞培养条件下培养5日后用于实验。
作为在细胞中添加的颗粒，对在实施例12中制作的包埋有表面活性剂的免疫原性微粒(颗粒(16)～(18))的冷冻干燥状态的微粒进行前处理加以使用。具体而言，在1.5ml管中称取以构成颗粒的两亲性聚合物量计相当于3mg的颗粒，加入清洗溶液，事先冷却至0℃后，在8400g、10分钟的条件下清洗3次后，在接种了小鼠腹腔巨噬细胞的24孔板中，与500μl的培养基一同添加在每1孔中。作为比较例，同样地添加不含表面活性剂的颗粒(比较颗粒(6))。
另外，作为其他的比较例(比较例(1)～(3))，如表6所示，在接种了小鼠腹腔巨噬细胞的24孔板中，在每1孔中，与500μl的培养基一同添加与颗粒(16)～(18)中含有的OVA量相同的75μg(由两亲性聚合物加入量与OVA加入量的重量比换算。)的OVA及300μg的聚山梨酸酯80、失水山梨醇单油酸酯及聚氧乙烯氢化蓖麻油中的任一种，另外，作为比较例(4)与500μl的培养基一同添加75μg的OVA。
[表6]
【表6】
体外刺激试验中的比较例(比较例(1)～(4))中使用的表面活性剂的种类和添加量
将添加有颗粒的细胞培养24小时，之后回收培养基，通过ELISA测定培养基中含有的TNFα量。基于ELISA的测定中使用ThermoScientific公司的试剂盒。
<结果>
培养基中的TNFα的浓度示于图6。包埋有表面活性剂的颗粒(颗粒(16)～(18))与未包埋表面活性剂的颗粒(比较颗粒(6))相比显示出高的TNFα浓度。TNFα是进行免疫诱导的细胞因子的1种，表明通过在颗粒中包埋表面活性剂能够有效地诱导免疫。另外，添加有未颗粒化的抗原及表面活性剂的比较例(比较例(1)～(4))，与颗粒化后的情况相比，TNFα的浓度较低，由此表明颗粒化对于免疫的诱导来说十分重要。
产业上的可利用性
本发明的免疫原性组合物能够用作用于治疗及/或预防感染疾病及癌等的疫苗。
Claims (12)
1.一种免疫原性组合物，含有免疫原性微粒及表面活性剂作为有效成分，所述免疫原性微粒包含抗原-佐剂微粒复合物，所述抗原包埋在佐剂微粒中，所述佐剂微粒包含疏水性链段为聚(羟基酸)的两亲性聚合物，表面活性剂包埋在免疫原性微粒中。
2.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述免疫原性微粒为抗原-佐剂微粒复合物缔合而成的颗粒。
3.如权利要求1或2所述的免疫原性组合物，其中，所述表面活性剂含有脂肪酸酯结构。
4.如权利要求1～3中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，佐剂微粒在内部具有包含两亲性聚合物的亲水性链段的亲水性部分，并具有包含两亲性聚合物的疏水性链段的疏水部分的外层。
5.如权利要求1～4中任一项所述的免疫原性组合物，其中，两亲性聚合物的亲水性链段为多糖。
6.如权利要求1～5中任一项所述的免疫原性组合物，其中，两亲性聚合物为包含多糖主链及聚(羟基酸)接枝链的接枝型两亲性聚合物。
7.如权利要求5或6所述的免疫原性组合物，其中，多糖为葡聚糖。
8.如权利要求1～7中任一项所述的免疫原性组合物，其中，聚(羟基酸)为聚(乳酸-乙醇酸)。
9.如权利要求1～8中任一项所述的免疫原性组合物，其中，所述表面活性剂进一步含有单糖及/或聚乙二醇结构。
10.如权利要求1～9中任一项所述的免疫原性组合物，其中，所述表面活性剂为选自聚山梨酸酯80、聚山梨酸酯20、失水山梨醇单油酸酯、失水山梨醇三油酸酯及聚氧乙烯氢化蓖麻油中的一种或两种以上。
11.一种免疫原性组合物，其以免疫原性微粒为有效成分，所述免疫原性微粒通过下述工序得到：将表面活性剂溶解于溶解有抗原的水系溶剂A或溶解有疏水性链段为聚(羟基酸)的两亲性聚合物的与水不混合的有机溶剂B中，将它们混合，由此形成反相乳液的工序；及从反相乳液中除去溶剂的工序。
12.一种免疫原性组合物，其以免疫原性微粒为有效成分，所述免疫原性微粒通过在抗原-佐剂微粒复合物缔合而成的颗粒的制造工序中使表面活性剂溶解在水系溶剂A、与水不混合的有机溶剂B或分散液C中而得到，所述制造工序包括如下工序：将溶解有抗原的水系溶剂A及溶解有疏水性链段为聚(羟基酸)的两亲性聚合物的与水不混合的有机溶剂B混合由此形成反相乳液的工序；从反相乳液中除去溶剂得到抗原-佐剂微粒复合物的工序；及将抗原-佐剂微粒复合物分散液C导入溶解有表面改性剂的液相D中除去分散介质的工序。
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