CN105611936A - 免疫增强剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种免疫增强剂，其将β-葡聚糖和聚(羟基酸)共价结合了的β-葡聚糖修饰体作为有效成分。该免疫增强剂可以有力地增强β-葡聚糖的免疫活化作用。

Description

免疫增强剂
相关申请的参照
本专利申请基于2013年10月9日所申请的日本申请特愿2013-212103号主张优先权，该日本申请的全部公开内容通过引用作为本申请的公开的一部分。
技术领域
本发明涉及将β-葡聚糖和聚(羟基酸)共价结合了的β-葡聚糖修饰体作为有效成分的免疫增强剂。
背景技术
已知多糖类对生物体具有各种作用，其中，已知β-葡聚糖类与存在于生物体中的免疫细胞的受体(Dectin-1等)等结合来将免疫反应活化(参照非专利文献1)。迄今为止，虽然进行了利用了β-葡聚糖类所具有的免疫活化作用的免疫增强剂的开发研究(参照专利文献1)，但不能说β-葡聚糖类的免疫活化作用是有力的，为了获得充分的效果，研究了与其它免疫增强剂的并用(参照专利文献2)。
另一方面，多糖类作为生物体适应性的材料也是已知的，通过利用多糖类所具有的生物体适应性，从而用作水凝胶、缓释制材料的基材。此外，通过将生物降解性聚合物对多糖类进行修饰，从而能够在保持生物体适应性的状态下，改变其物性(参照专利文献3和非专利文献2)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平10-194977号公报
专利文献2：日本特开2011-504487号公报
专利文献3：日本特开2013-67709号公报
非专利文献
非专利文献1：マイコロジカル·リサーチ，2007年111号，635-652页
非专利文献2：ポリマー，2003年44号，3927-3933页
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于通过增强β-葡聚糖的免疫活化作用来提供有力的免疫增强剂。
用于解决课题的方法
为了克服上述课题，本发明人研究了增强β-葡聚糖的免疫活化作用的方法，结果发现通过用聚(羟基酸)来修饰β-葡聚糖，从而在生物体内具有高免疫活化能，因此完成本发明。
即，本发明具有以下的(1)～(12)的构成。
(1)一种免疫增强剂，其将β-葡聚糖修饰体作为有效成分，所述β-葡聚糖修饰体中β-葡聚糖和聚(羟基酸)共价结合。
(2)根据(1)所述的免疫增强剂，β-葡聚糖是通过1个以上β-1,3键和/或1个以上β-1,6键被连接的葡萄糖的聚合物。
(3)根据(1)或(2)所述的免疫增强剂，β-葡聚糖修饰体是由β-葡聚糖的主链和聚(羟基酸)的侧链构成的接枝型聚合物。
(4)根据(1)～(3)的任一项所述的免疫增强剂，β-葡聚糖链段的比率为1～50％(w/w)。
(5)根据(1)～(4)的任一项所述的免疫增强剂，β-葡聚糖为凝胶多糖、昆布多糖、茯苓聚糖、地衣多糖、裂裥菌素、蘑菇多糖、硬葡聚糖、黑酵母葡聚糖或茯苓多糖。
(6)根据(1)～(5)的任一项所述的免疫增强剂，β-葡聚糖的数均分子量为500～100,000。
(7)根据(1)～(6)的任一项所述的免疫增强剂，聚(羟基酸)为聚(乳酸-乙醇酸)共聚物、聚乳酸或聚乙醇酸。
(8)根据(1)～(7)的任一项所述的免疫增强剂，将β-葡聚糖修饰体的微粒作为有效成分。
(9)一种药物，其含有(1)～(8)的任一项所述的免疫增强剂作为有效成分。
(10)一种疫苗，其含有(1)～(8)的任一项所述的免疫增强剂和抗原作为有效成分。
(11)一种用于癌的治疗和/或预防的疫苗，其含有(1)～(8)的任一项所述的免疫增强剂和癌抗原作为有效成分。
(12)一种免疫增强方法，其将(1)～(8)的任一项所述的免疫增强剂或(9)所述的药物施与生物体。
发明的效果
通过本发明，可以提供与以往相比有力地活化免疫的免疫增强剂。
附图说明
图1表示昆布多糖和昆布多糖水解物(1)～(3)的GPC测定的结果。
图2表示昆布多糖修饰体(5)的GPC测定的结果。
图3表示TMS化昆布多糖(3)的1H-NMR测定的结果。
图4表示昆布多糖修饰体(5)的1H-NMR测定的结果。
图5表示凝胶多糖水解物(4)～(6)的GPC测定的结果。
图6表示凝胶多糖修饰体(9)的GPC测定的结果。
图7表示TMS化凝胶多糖(5)的1H-NMR测定的结果。
图8表示凝胶多糖修饰体(9)的1H-NMR测定的结果。
图9表示β-葡聚糖修饰体的体外刺激试验的结果。
图10表示将β-葡聚糖修饰体作为基材的微粒的体外刺激试验1的结果。
图11表示将β-葡聚糖修饰体作为基材的微粒的体外刺激试验2的结果。
图12表示β-葡聚糖修饰体的体内试验1的结果。
图13表示β-葡聚糖修饰体的体内试验2的结果。
图14表示β-葡聚糖修饰体的体内试验3的结果。
图15表示茯苓聚糖修饰体(16)的1H-NMR测定的结果。
图16表示裂裥菌素修饰体(17)的1H-NMR测定的结果。
图17表示黑酵母葡聚糖修饰体(18)的1H-NMR测定的结果。
图18表示硬葡聚糖修饰体(19)的1H-NMR测定的结果。
图19表示茯苓多糖修饰体(22)的1H-NMR测定的结果。
图20表示β-葡聚糖修饰体的体外刺激试验2的结果。
图21表示将β-葡聚糖修饰体作为基材的微粒的体外刺激试验3的结果。
图22表示β-葡聚糖修饰体的体内试验4的结果。
具体实施方式
本发明涉及将β-葡聚糖和聚(羟基酸)共价结合了的β-葡聚糖修饰体作为有效成分的免疫增强剂。
所谓葡聚糖，为含有葡萄糖的多糖类，β-葡聚糖在葡萄糖亚基间包含1个以上β-键。即，本发明所使用的β-葡聚糖包含β-键，可以仅包含β-键。此外，本发明所使用的β-葡聚糖可以为分支状也可以为线状。
作为本发明所使用的优选的β-葡聚糖，可举出包含1个以上β-1,3键和/或1个以上β-1,6键的β-葡聚糖、包含1个以上β-1,2键和/或β-1,4键的β-葡聚糖，更优选为包含1个以上β-1,3键和/或1个以上β-1,6键的β-葡聚糖，进一步优选为包含1个以上β-1,3键的β-葡聚糖。作为包含1个以上β-1,3键的β-葡聚糖的具体例，可举出凝胶多糖、茯苓聚糖、昆布多糖、地衣多糖、裂裥菌素、蘑菇多糖、硬葡聚糖、黑酵母葡聚糖(优选为来自黑酵母的β-1,3葡聚糖或β-1,6葡聚糖)或茯苓多糖，优选可举出凝胶多糖、茯苓聚糖、昆布多糖、裂裥菌素、硬葡聚糖、黑酵母葡聚糖或茯苓多糖。
作为包含1个以上β-1,3键的线状的β-葡聚糖，可举出主要包含β-1,3键的β-葡聚糖(例如，凝胶多糖、茯苓聚糖)、包含β-1,3键和β-1,3键以外的β-键的β-葡聚糖(例如，昆布多糖、地衣多糖)。
作为包含1个以上β-1,3键的分支状的β-葡聚糖，可举出包含β-1,3键和β-1,6键的β-葡聚糖(例如，裂裥菌素、蘑菇多糖、硬葡聚糖、黑酵母葡聚糖)。
此外，本发明所使用的β-葡聚糖可以被衍生物化。作为衍生物化的例子，可举出羧基甲基的加成反应、氧化断裂反应。作为被衍生物化了的β-葡聚糖的例子，可举出对凝胶多糖加成有羧基甲基的羧基甲基凝胶多糖、茯苓聚糖断裂了的茯苓多糖。
β-葡聚糖的数均分子量没有特别限定，优选为500～100,000，更优选为1,000～50,000，进一步优选为1,900～25,000。所谓数均分子量，是通过未考虑分子大小的加权的方法算出的平均分子量，β-葡聚糖的数均分子量可以通过凝胶渗透色谱(GPC)来求出。
聚(羟基酸)没有特别限定，从为免疫增强剂的构成成分这样的观点出发，优选为在生物体施与时不带来显著有害影响的生物体适应性聚合物。这里所谓生物体适应性，是指在对大鼠经口施与该聚合物的情况下的LD50为2,000mg/kg以上。此外，可以为多种羟基酸的共聚物，优选为2种以下羟基酸的聚合物。
作为聚(羟基酸)的优选具体例，可举出聚乙醇酸、聚乳酸、聚(2-羟基丁酸)、聚(2-羟基戊酸)、聚(2-羟基己酸)、聚(2-羟基癸酸)、聚(苹果酸)或这些高分子化合物的衍生物以及共聚物，更优选为聚(乳酸-乙醇酸)共聚物、聚乳酸或聚乙醇酸，进一步优选为聚(乳酸-乙醇酸)共聚物。聚(羟基酸)为聚(乳酸-乙醇酸)共聚物的情况下的聚(乳酸-乙醇酸)共聚物的组成比(乳酸/乙醇酸)(摩尔/摩尔)只要达成本发明的目的，就没有特别限定，优选为100/0～30/70，更优选为60/40～40/60。
聚(羟基酸)的数均分子量没有特别限定，优选为500～1,000,000，更优选为10,000～100,000，进一步优选为14,700～68,300。聚(羟基酸)的数均分子量通过β-葡聚糖修饰体的数均分子量与β-葡聚糖的数均分子量之差来求出。
β-葡聚糖修饰体的结构没有特别限定，作为具体例，可举出β-葡聚糖与聚(羟基酸)连接而成的直链状的嵌段型聚合物、具有β-葡聚糖或聚(羟基酸)多个存在的支链的支链聚合物、包含β-葡聚糖的主链和聚(羟基酸)的侧链的接枝型聚合物、包含聚(羟基酸)的主链和β-葡聚糖的侧链的接枝型聚合物，优选为包含β-葡聚糖的主链和聚(羟基酸)的侧链的接枝型聚合物。
β-葡聚糖修饰体由于长期维持免疫增强作用，因此为了避免在生物体内立即排泄优选作为整体为水不溶性。这里所谓水不溶性，是指在水中的溶解度为1g(β-葡聚糖修饰体)/100ml(水)以下。
β-葡聚糖修饰体的数均分子量没有特别限定，优选为1,000～1,000,000，更优选为10,000～100,000，进一步优选为13,800～84,000。β-葡聚糖修饰体的数均分子量由凝胶渗透色谱(GPC)求出。
β-葡聚糖修饰体中的β-葡聚糖链段的比率(β-葡聚糖链段/β-葡聚糖修饰体)没有特别限定，优选为1～50％(w/w)，更优选为5～45％(w/w)，进一步优选为8.3～42.5％(w/w)。β-葡聚糖修饰体中的β-葡聚糖链段的比率使用β-葡聚糖的数均分子量与β-葡聚糖修饰体的数均分子量之比来求出。
在包含β-葡聚糖的主链和聚(羟基酸)的侧链的接枝型聚合物的情况下，各接枝链的数均分子量没有特别限定，优选为1,000～10,000，更优选为1,300～6,400。各接枝链的数均分子量通过核磁共振(NMR)测定由末端残基的峰积分值与末端残基以外的峰积分值之比来求出。
在包含β-葡聚糖的主链和聚(羟基酸)的侧链的接枝型聚合物的情况下，接枝链数没有特别限定，优选为3～15。接枝链数通过将从β-葡聚糖修饰体的数均分子量中减去β-葡聚糖的数均分子量而得的值除以各接枝链的数均分子量来求出。
β-葡聚糖修饰体只要通过已知的方法来制造即可，具体而言，可举出在β-葡聚糖中添加聚(羟基酸)来进行缩合反应并制造的方法；在β-葡聚糖中添加羟基酸活化单体来进行聚合反应并制造的方法作为例子。
特别是在β-葡聚糖修饰体为包含β-葡聚糖的主链和聚(羟基酸)的侧链的接枝型聚合物的情况下，可以如以下的(1)、(2)或(3)那样操作来制造。
(1)在锡催化剂存在下，在β-葡聚糖中添加羟基酸活化单体来进行聚合反应，导入聚(羟基酸)，从而制造接枝型聚合物的方法[Macromolecules，31，p.1032-1039(1998年)]
(2)将羟基的大部分被取代基保护了的β-葡聚糖的一部分未保护的羟基用碱活化后，添加羟基酸活化单体来导入包含聚(羟基酸)的接枝链，最后除去保护基，从而制造接枝型聚合物的方法[Polymer，44，p.3927-3933，(2003年)]
(3)对β-葡聚糖，使用脱水剂和/或官能团的活化剂来使聚(羟基酸)的共聚物进行缩合反应，从而制造接枝型聚合物的方法[Macromolecules，33，p.3680-3685(2000年)]。
在将β-葡聚糖修饰体作为免疫增强剂使用的情况下的形态，可举出纤维、膜、微粒等，在将免疫增强剂施与生物体内的情况下，从施与的容易性出发，优选为微粒。
制造β-葡聚糖修饰体微粒的方法没有特别限定，可举出液中干燥法、喷雾干燥法、粉碎法等，优选通过液中干燥法来制造。
作为通过液中干燥法来制造微粒的方法，可举出O/W乳液法、W/O/W乳液法、S/O/W乳液法等。
如果举出通过O/W乳液法来制造微粒的情况下的例子，则可以通过如下工序来制造：将溶解有β-葡聚糖修饰体的水不混溶性有机溶剂与表面改性剂水溶液进行混合，调制O/W乳液溶液的工序；以及从O/W乳液溶液中除去水不混溶性有机溶剂而获得微粒的工序。
如果举出通过W/O/W乳液法来制造微粒的情况下的例子，则可以通过如下工序来制造：将水系溶剂与溶解有β-葡聚糖修饰体的水不混溶性有机溶剂进行混合，调制W/O乳液溶液的工序；将W/O乳液溶液与表面改性剂水溶液进行混合，调制W/O/W乳液溶液的工序；以及从W/O/W乳液溶液中除去水不混溶性有机溶剂而获得微粒的工序。
如果举出通过S/O/W乳液法来制造微粒的情况下的例子，则可以通过如下工序来制造：将水系溶剂与溶解有β-葡聚糖修饰体的水不混溶性有机溶剂进行混合，调制W/O乳液溶液的工序；从W/O乳液溶液除去溶剂，获得固体成分的工序；使固体成分分散于水不混溶性有机溶剂，获得S/O悬浮溶液的工序；将S/O悬浮溶液与表面改性剂水溶液进行混合，调制S/O/W乳液溶液的工序；以及从S/O/W乳液溶液除去水不混溶性有机溶剂，获得微粒的工序。
微粒调制所使用的表面改性剂优选为水溶性聚合物或表面活性剂。这里所谓水溶性聚合物，是指在水中的溶解度为1g(亲水性聚合物)/100ml(水)以上的高分子化合物。
作为成为表面改性剂的水溶性聚合物的例子，可举出聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙烯亚胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚-1,3-二氧戊环、2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱聚合物、聚-1,3,6-三烷、聚氨基酸、肽、蛋白质、糖类多糖类，更优选为聚乙烯醇。
作为成为表面改性剂的表面活性剂的例子，可举出聚氧乙烯聚氧丙烯二醇、蔗糖脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯失水山梨糖醇单脂肪酸酯、聚氧乙烯失水山梨糖醇二脂肪酸酯、聚氧乙烯甘油单脂肪酸酯、聚氧乙烯甘油二脂肪酸酯、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯硬化蓖麻油等非离子性活性剂、月桂基硫酸钠、月桂基硫酸铵、硬脂基硫酸钠等烷基硫酸盐或卵磷脂，更优选为聚氧乙烯聚氧丙烯二醇。
微粒调制所使用的水不混溶性有机溶剂优选β-葡聚糖修饰体为可溶且β-葡聚糖为难溶或不溶。水不混溶性有机溶剂在水中的溶解度优选为30g(水不混溶性有机溶剂)/100ml(水)以下。作为水不混溶性有机溶剂的具体例，可举出乙酸乙酯、乙酸异丙酯、乙酸丁酯、碳酸二甲酯、碳酸二乙酯、二氯甲烷、氯仿。
微粒调制所使用的水系溶剂是含有水或水溶性成分的水溶液。作为该水溶性成分，可举出例如，无机盐类、糖类、有机盐类、氨基酸、肽、蛋白质、核酸等。
在β-葡聚糖修饰体微粒的微粒表面，可以结合上述制造过程中所使用的表面改性剂。这里所谓结合，可以是非共价结合也可以是共价结合。非共价结合优选为疏水性的相互作用，可以为静电相互作用、氢键、范德华力，可以为它们复合了的结合。
上述微粒的平均粒径优选为0.01～10μm，进一步优选为0.1～1μm。这里所谓平均粒径，通过使用动态光散射装置(DLS：例如，大塚电子株式会社，ELS-Z)，测定光散射强度分布和扩散系数，通过累积量法进行解析来算出。
所谓免疫增强剂，是在生物体内使免疫应答活化的药剂，本发明的免疫增强剂的特征在于将β-葡聚糖修饰体作为有效成分。免疫增强剂所活化的免疫应答的种类不受限定，作为发生的免疫应答的种类，有Th1型免疫应答、Th2型免疫应答，已知根据抗原、施与部位、施与方法的种类某一免疫应答产生优势，但本发明的免疫增强剂能够产生Th1型、Th2型这两种类型的免疫应答。
本发明的免疫增强剂可以单独使用或与其它药剂并用而作为药物使用。在将本发明的免疫增强剂与其它药剂并用的情况下，可以将它们配合而制剂化，也可以以分别施与为目的而各自独立地制剂化。
与本发明的免疫增强剂并用的药剂没有特别限制，优选使用抗原。这里所谓抗原，是指在生物体内引起免疫的物质，作为以疾病的治疗和/或预防为目的的疫苗被利用。通过将本发明的免疫增强剂与抗原进行并用，从而可以强化由抗原引起的免疫应答。
作为抗原的例子，可举出肽、蛋白质、糖蛋白、糖脂、脂质、碳水化合物、核酸、多糖类和包含它们的病毒、菌体、变应原性物质、组织、细胞等。具体而言，可举出来源于花粉的抗原、来源于A型肝炎病毒的抗原、来源于B型肝炎病毒的抗原、来源于C型肝炎病毒的抗原、来源于D型肝炎病毒的抗原、来源于E型肝炎病毒的抗原、来源于F型肝炎病毒的抗原、来源于HIV病毒的抗原、来源于流行性感冒病毒的抗原、来源于疱疹病毒(HSV-1、HSV-2)的抗原、来源于炭疽菌的抗原、来源于衣原体的抗原、来源于肺炎球菌的抗原、来源于日本脑炎病毒的抗原、来源于麻疹病毒的抗原、来源于风疹病毒的抗原、来源于破伤风菌的抗原、来源于水痘病毒的抗原、来源于SARS病毒的抗原、来源于EB病毒的抗原、来源于乳头瘤病毒的抗原、来源于幽门螺杆(Helicobacterpylori)菌的抗原、来源于狂犬病病毒的抗原、来源于西尼罗病毒的抗原、来源于汉坦病毒的抗原、来源于链球菌的抗原、来源于葡萄球菌的抗原、来源于百日咳(Bordetellapertussis)菌的抗原、来源于结核菌(Mycobacteriumtuberculosis)的抗原、来源于疟原虫(Plasmodium)的抗原、来源于脊髓灰质炎病毒的抗原、来源于各种人畜共通传染病的抗原、来源于各种食物过敏反应的抗原、自身抗原等。
其它，作为抗原的优选例，可举出癌抗原。所谓癌抗原，为来源于在癌细胞中特异性地表达的蛋白质的物质，通过从生物体外施与生物体内，从而通过免疫应答发挥癌的治疗和/或预防的效果的抗原。通过将本发明的免疫增强剂与癌抗原一同使用，从而可以作为用于癌的治疗和/或预防的疫苗使用。
在本发明的免疫增强剂为β-葡聚糖修饰体微粒的情况下，优选抗原封入至该微粒。作为使抗原封入至β-葡聚糖修饰体微粒的方法，可举出使用抗原水溶液作为水系溶剂，通过W/O/W乳液法或S/O/W乳液法来制造β-葡聚糖修饰体微粒的方法。
在抗原封入至β-葡聚糖修饰体微粒的情况下，其封入率(抗原/β-葡聚糖修饰体)优选为0.01～20％(w/w)，更优选为0.1～10％(w/w)。作为封入率的定量方法，可举出使用有机溶剂从β-葡聚糖修饰体微粒提取抗原，通过凝胶电泳或液相色谱进行定量的方法。
根据本发明的优选方式，可以提供将本发明的免疫增强剂或药物施与至生物体(受验体)的免疫增强方法。对于使用本发明的免疫增强剂或药物来使免疫反应活化(增强)的方法，不受限定，可以将免疫增强剂或药物施与生物体，可以与取出至生物体外的免疫适格细胞进行接触。向生物体的施与方法没有特别限定，如果举例，则为皮下施与、皮内施与、肌肉内施与、经鼻施与、经肺施与、经口施与、经皮施与、舌下施与、阴道内施与、腹腔内施与、淋巴节施与等，优选为皮内施与或皮下施与。施与的生物体可以为人也可以为人以外的动物，优选为人或家畜、作为宠物或实验动物被饲养的猪、牛、鸟、绵羊、马、驴、山羊、骆驼、犬、猫、雪貂、兔、猴、大鼠、小鼠或豚鼠。
在将本发明的免疫增强剂作为药物(包含疫苗)使用的情况下，可以配合制剂学上有用的各种添加剂来制剂化，作为添加剂的具体例，可举出缓冲剂、抗氧化剂、盐、聚合物或糖。
关于将本发明的免疫增强剂作为药物使用的情况下的β-葡聚糖修饰体的施与量，根据施与方法、施与次数来适当设定，例如在对人皮下施与本发明的免疫增强剂的情况下，作为β-葡聚糖修饰体的量，每1次施与0.01～1,000mg。
关于将本发明的免疫增强剂与抗原并用的情况下的抗原等其它药剂的施与量，优选为0.001～100mg。
根据本发明的优选方式，提供一种免疫增强剂，其是将β-葡聚糖和聚(羟基酸)共价结合了的β-葡聚糖修饰体作为有效成分的免疫增强剂，该β-葡聚糖为凝胶多糖、茯苓聚糖、昆布多糖、裂裥菌素、硬葡聚糖、黑酵母葡聚糖或茯苓多糖，该聚(羟基酸)为聚(乳酸-乙醇酸)共聚物。
根据本发明的其它优选方式，提供一种疫苗，其是包含将β-葡聚糖和聚(羟基酸)共价结合了的β-葡聚糖修饰体作为有效成分的免疫增强剂和癌抗原作为有效成分的疫苗，该β-葡聚糖为凝胶多糖、茯苓聚糖、昆布多糖、裂裥菌素、硬葡聚糖、黑酵母葡聚糖或茯苓多糖，该聚(羟基酸)为聚(乳酸-乙醇酸)共聚物。
实施例
以下示出实施例，但本发明不受这些实施例限定。
实施例1聚(乳酸-乙醇酸)共聚物被修饰了的昆布多糖(昆布多糖修饰体(1)～(8))的合成
(1)昆布多糖的水解反应(昆布多糖水解物(1)～(3)的合成)
将昆布多糖(数均分子量25,000，东京化成工业株式会社)10g溶解于二甲亚砜120ml，然后添加0.5当量盐酸水溶液15ml，在105℃搅拌0.5小时。将该反应溶液转移至渗析膜，在水中进行渗析，然后进行冷冻干燥，作为粉末获得昆布多糖水解物(1)(数均分子量12,700)。在同样的条件下，反应1.5小时，使昆布多糖水解物(2)(数均分子量6,700)反应2小时，从而合成出昆布多糖水解物(3)(数均分子量4,100)。
昆布多糖和昆布多糖水解物的数均分子量通过GPC测定(柱：东ソー-TSK-gelG3000PWXL-CP×2，乙酸缓冲液系溶剂(10mM，pH＝5)，检测器：RI，标准品：普鲁兰多糖)来确定(图1：昆布多糖和昆布多糖水解物(1)～(3))。
(2)昆布多糖的三甲基甲硅烷基(TMS)化反应(TMS化昆布多糖(1)～(4)的合成)
向昆布多糖(数均分子量25,000，东京化成工业株式会社)2.4g中添加甲酰胺48ml，加热至80℃。在该溶液中经20分钟滴加1,1,1,3,3,3-六甲基二硅氮烷48ml，在80℃搅拌2.5小时。将该反应溶液转移至分液漏斗，进行静置直至分离为二层。将上层回收，减压下浓缩后，添加甲醇144ml，将所得的固体进行过滤、干燥，作为白色固体获得TMS化昆布多糖(1)3.14g。通过同样的方法，由昆布多糖水解物(1)合成出TMS化昆布多糖(2)，由昆布多糖水解物(2)合成出TMS化昆布多糖(3)，由昆布多糖水解物(3)合成出TMS化昆布多糖(4)。
TMS化反应进行通过1H-NMR测定(图3：TMS化昆布多糖(3))来确认。
(3)聚(乳酸-乙醇酸)共聚物对昆布多糖的修饰反应(昆布多糖修饰体(1)～(8)的合成)
将TMS化昆布多糖(1)0.5g和叔丁氧基钾(tBuOK)26mg在加热减压下干燥2小时后，添加四氢呋喃10ml，在室温搅拌1.5小时，获得活化溶液。将活化溶液的调制所使用的tBuOK的35倍摩尔的单体((DL)-丙交酯与乙交酯的摩尔比1:1的混合物)溶解于四氢呋喃，获得单体溶液。在该活化溶液中滴加该单体溶液，搅拌30分钟后，添加乙酸0.5ml而使反应停止。将反应结束后的溶液进行减压下浓缩，以氯仿(良溶剂)-甲醇(不良溶剂)系和氯仿(良溶剂)-环己烷(不良溶剂)系进行再沉淀精制，获得白色固体。将所得的白色固体溶解于氯仿5ml，添加三氟乙酸0.5ml，在室温搅拌30分钟。将该反应溶液进行减压下浓缩，以氯仿(良溶剂)-乙醚(不良溶剂)系进行再沉淀精制，作为白色固体获得昆布多糖修饰体(1)。
通过同样的方法，使tBuOK的50倍摩尔的单体与TMS化昆布多糖(1)进行反应从而合成出昆布多糖修饰体(2)，使tBuOK的35倍摩尔的单体与TMS化昆布多糖(2)进行反应从而合成出昆布多糖修饰体(3)，使tBuOK的50倍摩尔的单体与TMS化昆布多糖(2)进行反应从而合成出昆布多糖修饰体(4)，使tBuOK的30倍摩尔的单体与TMS化昆布多糖(3)进行反应从而合成出昆布多糖修饰体(5)，使tBuOK的35倍摩尔的单体与TMS化昆布多糖(3)进行反应从而合成出昆布多糖修饰体(6)，使tBuOK的50倍摩尔的单体与TMS化昆布多糖(3)进行反应从而合成出昆布多糖修饰体(7)，使tBuOK的35倍摩尔的单体与TMS化昆布多糖(4)进行反应从而合成出昆布多糖修饰体(8)。
将昆布多糖修饰体(1)～(8)的评价结果示于表1中。昆布多糖修饰体的数均分子量通过GPC测定(柱：东ソ-TSK-gelα-5000×2，DMF系溶剂，检测器：RI，标准品：普鲁兰多糖)来确定(图2：昆布多糖修饰体(5))。昆布多糖修饰体所包含的昆布多糖链段的比率(w/w)由合成所使用的昆布多糖的数均分子量和昆布多糖修饰体的数均分子量来确定。各接枝链的数均分子量通过1H-NMR测定来确定(图4：昆布多糖修饰体(5))。接枝链数目的平均通过将从昆布多糖修饰体的数均分子量中减去昆布多糖的数均分子量而得的值除以各接枝链的数均分子量来确定。
[表1]
表1：昆布多糖修饰体(1)～(8)的分析结果
实施例2聚(乳酸-乙醇酸)共聚物被修饰了的凝胶多糖(凝胶多糖修饰体(9)～(14))的合成
(1)凝胶多糖的水解反应(凝胶多糖水解物(4)～(6)的合成)
将凝胶多糖(数均分子量：约90,000，和光纯药工业株式会社)12.8g溶解于二甲亚砜384ml，然后添加1当量盐酸水溶液19.2ml，在110℃搅拌0.75小时。将该反应溶液转移至渗析膜，在水中进行渗析，然后进行冷冻干燥，作为粉末获得凝胶多糖水解物(4)(数均分子量2,800)。在同样的条件下，反应0.8小时，使凝胶多糖水解物(5)(数均分子量2,300)反应0.85小时，从而合成出凝胶多糖水解物(6)(数均分子量1,900)。
凝胶多糖的数均分子量通过GPC测定(柱：东ソ-TSK-gelG3000PWXL-CP×2，乙酸缓冲液系溶剂(10mM，pH＝5)，检测器：RI，标准品：普鲁兰多糖)来确定(图5：凝胶多糖水解物(4)～(6))。
(2)凝胶多糖的三甲基甲硅烷基(TMS)化反应(TMS化凝胶多糖(5)～(7)的合成)
将凝胶多糖水解物(4)1g添加至甲酰胺20ml，加热至80℃。在该溶液中经20分钟滴加1,1,1,3,3,3-六甲基二硅氮烷20ml，在80℃搅拌2.5小时。将该反应溶液转移至分液漏斗，进行静置直至分离为二层。将上层回收，减压下浓缩后，添加甲醇60ml，将所得的固体进行过滤、干燥，作为白色固体获得TMS化凝胶多糖(5)1g。通过同样的方法，由凝胶多糖水解物(5)合成出TMS化凝胶多糖(6)，由凝胶多糖水解物(6)合成出TMS化凝胶多糖(7)。
TMS化反应进行通过1H-NMR测定来确认(图7：TMS化凝胶多糖(5))。
(3)聚(乳酸-乙醇酸)共聚物对凝胶多糖的修饰反应(凝胶多糖修饰体(9)～(14)的合成)
将TMS化凝胶多糖(5)0.2g和叔丁氧基钾(tBuOK)14mg在加热减压下干燥2小时后，添加四氢呋喃5ml，在室温搅拌1.5小时，获得活化溶液。将活化溶液的调制所使用的tBuOK的35倍摩尔的单体((DL)-丙交酯与乙交酯的摩尔比1:1的混合物)溶解于四氢呋喃，获得单体溶液。在该活化溶液中滴加该单体溶液，搅拌30分钟后，添加乙酸0.2ml而使反应停止。将反应结束后的溶液在减压下浓缩，以氯仿(良溶剂)-甲醇(不良溶剂)系和氯仿(良溶剂)-环己烷(不良溶剂)系进行再沉淀精制，获得白色固体。将所得的白色固体溶解于氯仿5ml，添加三氟乙酸0.4ml，在室温搅拌30分钟。将该反应溶液进行减压下浓缩，以氯仿(良溶剂)-乙醚(不良溶剂)系进行再沉淀精制，作为白色固体获得凝胶多糖修饰体(9)。
通过同样的方法，使tBuOK的50倍摩尔的单体与TMS化凝胶多糖(5)进行反应从而合成出凝胶多糖修饰体(10)，使tBuOK的35倍摩尔的单体与TMS化凝胶多糖(6)进行反应从而合成出凝胶多糖修饰体(11)，使tBuOK的50倍摩尔的单体与TMS化凝胶多糖(6)进行反应从而合成出凝胶多糖修饰体(12)，使tBuOK的35倍摩尔的单体与TMS化凝胶多糖(7)进行反应从而合成出凝胶多糖修饰体(13)，使tBuOK的50倍摩尔的单体与TMS化凝胶多糖(7)进行反应从而合成出凝胶多糖修饰体(14)。
将凝胶多糖修饰体(9)～(14)的评价结果示于表2中。凝胶多糖修饰体的数均分子量通过GPC测定(柱：东ソ-TSK-gelα-5000×2，DMF系溶剂，检测器：RI，标准品：普鲁兰多糖)来确定(图6：凝胶多糖修饰体(9))。凝胶多糖修饰体所包含的凝胶多糖链段的比率(w/w)由合成所使用的凝胶多糖的数均分子量和凝胶多糖修饰体的数均分子量来确定。各接枝链的数均分子量通过1H-NMR测定来确定(图8：凝胶多糖修饰体(9))。接枝链数的平均通过将从凝胶多糖修饰体的数均分子量中减去凝胶多糖的数均分子量而得的值除以各接枝链的数均分子量来确定。
[表2]
表2：凝胶多糖修饰体(9)～(14)的分析结果
比较例1聚(乳酸-乙醇酸)共聚物被修饰了的右旋糖酐(右旋糖酐修饰体(15))的合成
使用右旋糖酐(数均分子量4,100，SERVA社)5g，通过与上述实施例1和实施例2同样的方法，作为白色固体获得TMS化右旋糖酐(8)5.2g。接着，通过与上述实施例1和实施例2同样的方法，使叔丁氧基钾(tBuOK)和tBuOK的35倍摩尔的单体((DL)-丙交酯与乙交酯的摩尔比1:1的混合物)与TMS化右旋糖酐(8)0.5g进行反应，从而作为白色固体获得右旋糖酐修饰体(15)0.9g。
将右旋糖酐修饰体(15)的评价结果示于表3中。关于各值，通过与上述实施例1和实施例2同样的方法来算出。
[表3]
表3：右旋糖酐修饰体(15)的分析结果
实施例3使用了O/W乳液法的微粒(凝胶多糖微粒(1)～(5)、昆布多糖微粒(6)、(7)、PLGA比较微粒(8)、右旋糖酐比较微粒(9))的调制
将表4所记载的凝胶多糖修饰体(9)～(13)10mg溶解于乙酸乙酯1ml，调制出聚合物溶液。将该聚合物溶液滴加至1％(w/v)聚乙烯醇水溶液4ml，通过使用了混合机(ポリトロン社，PT2100S)的11,000rpm、1分钟的搅拌，调制出O/W乳液溶液。从该O/W乳液溶液通过液中干燥来除去乙酸乙酯，制成微粒悬浮液。将该悬浮液转移至15ml管，通过8,000rpm、10分钟的离心来使微粒沉淀。除去上清液后，将微粒再悬浮于10ml的蒸馏水，通过上述条件下的离心来使微粒再次沉淀。将该洗涤操作再次反复，除去上清液后使微粒悬浮于包含5％(w/v)甘露糖醇和0.1％(w/v)聚山梨醇酯80的水溶液1.8ml。将该悬浮液用液氮预冷冻后，使用冷冻干燥机(东京理化器械株式会社，FD-1000)，以阱冷却温度-45℃、真空度20Pa冷冻干燥12小时，从而获得凝胶多糖微粒(1)～(5)。
通过同样的方法，获得将昆布多糖修饰体(3)、(8)分别作为基材的昆布多糖微粒(6)、(7)。
此外作为比较例，通过同样的方法，获得将聚(乳酸-乙醇酸)共聚物(PLGA，数均分子量5,000，和光纯药工业株式会社)作为基材的PLGA比较微粒(8)、和将右旋糖酐修饰体(15)作为基材的右旋糖酐比较微粒(9)。
微粒的平均粒径通过使用动态光散射装置(大塚电子株式会社，ELS-Z)，测定光散射强度分布和扩散系数，利用累积量法进行解析来算出。将结果示于表4中。
[表4]
表4：通过O/W乳液法调制的微粒(凝胶多糖微粒(1)～(5)、昆布多糖微粒(6)、(7)、PLGA比较微粒(8)、右旋糖酐比较微粒(9))的分析结果
基材 粒径
微粒(1) 凝胶多糖修饰体(9) 1024.0nm
微粒(2) 凝胶多糖修饰体(10) 1027.7nm
微粒(3) 凝胶多糖修饰体(11) 1049.6nm
微粒(4) 凝胶多糖修饰体(12) 1127.8nm
微粒(5) 凝胶多糖修饰体(13) 1026.2nm
微粒(6) 昆布多糖修饰体(3) 1270.0nm
微粒(7) 昆布多糖修饰体(8) 1059.0nm
比较微粒(8) 聚(乳酸-乙醇酸)共聚物 1095.3nm
比较微粒(9) 右旋糖酐修饰体(15) 957.9nm
实施例4使用了S/O/W乳液法的微粒(含有OVA的凝胶多糖微粒(10)、凝胶多糖微粒(11)、含有OVA的昆布多糖微粒(12)～(14)、含有OVA的右旋糖酐比较微粒(15))的调制
将凝胶多糖修饰体(13)100mg溶解于碳酸二甲酯1.8ml和叔丁醇200μl，调制出聚合物溶液。在该聚合物溶液中滴加0.1％(w/v)OVA(卵清蛋白，シグ社))水溶液1ml，通过使用了混合机(ポリトロン社，PT2100S)的11,000rpm、1分钟的搅拌，从而制造出W/O乳液溶液。将该W/O乳液溶液用液氮预冷冻后，使用冷冻干燥机(东京理化器械株式会社，FD-1000)，在阱冷却温度-45℃、真空度20Pa冷冻干燥12小时。使所得的固体成分分散于乙酸乙酯10ml，调制出S/O悬浮溶液。将该S/O悬浮溶液滴加至1％(w/v)聚乙烯醇水溶液40ml，通过使用了混合机(シルバ一ソン社，L5M-A)的6,000rpm、5分钟的搅拌，从而调制出S/O/W型乳液溶液。从该S/O/W型乳液溶液通过液中干燥来除去乙酸乙酯，制成微粒悬浮液。将该悬浮液转移至50ml管，通过8,000rpm、10分钟的离心来使微粒沉淀。除去上清液后，将微粒再悬浮于50ml的蒸馏水，通过上述条件下的离心来使微粒再次沉淀。将该洗涤操作再次反复，除去上清液后使微粒悬浮于包含5％(w/v)甘露糖醇和0.1％(w/v)聚山梨醇酯80的水溶液8ml。将该悬浮液用液氮预冷冻后，使用冷冻干燥机，以阱冷却温度-45℃、真空度20Pa冷冻干燥12小时，从而获得含有OVA的凝胶多糖微粒(10)。
通过同样的方法，代替OVA水溶液而使用蒸馏水，从而获得不含OVA的凝胶多糖微粒(11)。通过同样的方法，使用昆布多糖修饰体(1)、(3)、(5)，从而获得含有OVA的昆布多糖微粒(12)～(14)。
作为比较例，通过同样的方法，通过使用右旋糖酐修饰体(15)作为基材，从而获得含有OVA的右旋糖酐比较微粒(15)。
将微粒的评价结果示于表5中。微粒的平均粒径使用动态光散射装置(大塚电子株式会社，ELS-Z)通过累积量法来算出。抗原的封入率(w/w)通过使用有机溶剂从微粒提取抗原，将提取的抗原用凝胶电泳装置(TEFCO社)进行凝胶电泳后，使用胶体CBB染色试剂盒(TEFCO社)进行染色来确定。
[表5]
表5：通过S/O/W乳液法调制的微粒(含有OVA的凝胶多糖微粒(10)、凝胶多糖微粒(11)、含有OVA的昆布多糖微粒(12)～(14)、含有OVA的右旋糖酐比较微粒(15))的分析结果
基材 粒径 抗原的封入率
微粒(10) 凝胶多糖修饰体(13) 483.9nm 0.96％
微粒(11) 凝胶多糖修饰体(13) 484.4nm -
微粒(12) 昆布多糖修饰体(1) 508.0nm 0.94％
微粒(13) 昆布多糖修饰体(3) 556.3nm 0.93％
微粒(14) 昆布多糖修饰体(5) 517.9nm 0.85％
比较微粒(15) 右旋糖酐修饰体(15) 537.2nm 0.89％
参考例1来源于小鼠骨髓的树突细胞(BMDC)的诱导
使雄C57BL/6小鼠8周龄用二氧化碳安乐死后，取出大腿骨。将大腿骨的两端用剪刀剪断，使用注射器向大腿骨的内部注入包含10％FBS(シグ社)、100单位/ml青霉素(ライフテクノロジ一社)、100单位/ml链霉素(ライフテクノロジ一社)的RPMI1640培养基(以下，RPMI培养基)，将骨髓溶液进行回收。该骨髓溶液通过1,500rpm、5分钟的离心来使细胞沉淀，除去上清液。回收的细胞悬浮于溶血用缓冲液(1.66％(w/v)氯化铵水溶液)1ml，然后在4℃静置4分钟，使其溶血。在溶血后的细胞悬浮液中，添加RPMI培养基10ml，通过1,500rpm、5分钟的离心来使细胞沉淀，除去上清液。使细胞悬浮于包含10％FBS(シグマ社)、10ng/mlGM-CSF、100单位/ml青霉素(ライフテクノロジー社)、100单位/ml链霉素(ライフテクノロジー社)的RPMI1640培养基(以下，培养培养基)，然后接种于6孔板(IWAKI社，平底组织培养处理(FlatBottomTissuecultureTreated)，聚苯乙烯(Polystyrene))。接种后的板在设定为5％CO2、37℃、湿度100％的条件的CO2培养箱(NAPCO社)内培养3小时，使用微量加液器，通过强烈地悬浮，仅回收未粘接于板的细胞。使回收的细胞再悬浮于培养培养基，然后接种于6孔板，在CO2培养箱内进行培养。在培养第2天和第4天进行培养培养基的交换，在培养第5天使用微量加液器，通过强烈地悬浮，仅回收未粘接于板的细胞，即被诱导了的树突细胞。
实施例5使用了来源于小鼠骨髓的树突细胞(BMDC)的β-葡聚糖修饰体的体外刺激试验
＜方法＞
称量由实施例2获得的β-葡聚糖修饰体(凝胶多糖修饰体(9)～(12))10mg，溶解于乙腈10ml，获得聚合物溶液。将该聚合物溶液100μl(聚合物100μg分)滴加至6孔板，使其干燥，从而获得聚合物涂覆板。在该聚合物涂覆板上将由参考例1获得的树突细胞与培养培养基一起以每1孔为1×106个的方式进行接种。接种后的板在CO2培养箱内培养2天后，使用微量加液器，通过强烈地悬浮，仅回收未粘接于板的细胞。回收的细胞通过1,500rpm、5分钟的离心来使细胞沉淀，除去上清液，悬浮于RPMI培养基100μl。在该细胞悬浮液中添加FITC标记抗CD86抗体和PE标记抗CD11c抗体，在4℃静置15分钟，从而进行抗体标记反应。抗体标记反应结束后，通过流式细胞仪利用荧光强度(MFI)来评价活化标记物(CD86)的表达量。
作为比较例，使用同样地涂覆有由比较例1获得的右旋糖酐修饰体(15)、由实施例1获得的TMS化凝胶多糖(1)或聚(乳酸-乙醇酸)共聚物(PLGA，和光纯药株式会社，PLGA-5020)的板，同样地比较活化标记物的表达量。此外作为其它比较例，将由实施例1获得的凝胶多糖水解物(1)100μg或已知免疫活化能的polyI：C(シグマ社)100μg添加至培养培养基，同样地比较活化标记物的表达量。
＜结果＞
将作为CD86的表达量的指标的荧光强度(MFI)示于图9中。CD86为树突细胞的活化标记物之一。明确了在使用了凝胶多糖修饰体(9)～(12)的情况下，与使用了右旋糖酐修饰体(15)和聚(乳酸-乙醇酸)共聚物的情况相比，由于CD86的表达量高，因此β-葡聚糖修饰体具有强的树突细胞活化能。此外明确了，在使用了凝胶多糖水解物(1)和TMS化凝胶多糖(1)的情况下，与使用了β-葡聚糖修饰体的情况相比，由于CD86的表达量低，因此在树突细胞的活化时聚(羟基酸)对β-葡聚糖的修饰是重要的。
实施例6将使用了来源于小鼠骨髓的树突细胞(BMDC)的β-葡聚糖修饰体作为基材的微粒的体外刺激试验1
＜方法＞
将由参考例1获得的树突细胞与培养培养基一起以每1孔为1×106个的方式接种于6孔板，进一步添加由实施例3调制的微粒(凝胶多糖微粒(1)～(5)、PLGA比较微粒(8)、右旋糖酐比较微粒(9))0.2mg。接种后的板在CO2培养箱内培养2天，使用微量加液器，通过强烈地悬浮，仅回收未粘接于板的细胞。回收的细胞通过1,500rpm、5分钟的离心来使细胞沉淀，除去上清液，悬浮于RPMI培养基100μl。在该细胞悬浮液中，添加FITC标记抗CD86抗体和PE标记抗CD11c抗体，在4℃静置15分钟，从而进行抗体标记反应。抗体标记反应结束后，通过流式细胞仪利用荧光强度(MFI)来评价活化标记物(CD86)的表达量。
作为比较例，将polyI：C(シグマ社)100μg添加至培养培养基，同样地比较活化标记物的表达量。
＜结果＞
将各微粒中的作为CD86的表达量的指标的荧光强度(MFI)示于图10中。明确了在使用了微粒(凝胶多糖微粒(1)～(5)、PLGA比较微粒(8)、右旋糖酐比较微粒(8))的情况下，与未添加的情况相比，CD86的表达量高，因此微粒具有树突细胞活化能。进一步明确了在使用了凝胶多糖修饰体作为基材的微粒(凝胶多糖微粒(1)～(5))的情况下，与使用了将右旋糖酐修饰体作为基材的微粒(右旋糖酐比较微粒(9))、将PLGA作为基材的微粒(PLGA比较微粒(8))的情况相比，具有更有力的树突细胞活性能。确认了将β-葡聚糖修饰体作为基材的微粒具有强免疫活化能。
实施例7将使用了来源于小鼠骨髓的树突细胞(BMDC)的β-葡聚糖修饰体作为基材的微粒的体外刺激试验2
＜方法＞
通过与实施例6同样的方法，在接种了由参考例1获得的树突细胞的板上添加由实施例3调制的微粒(昆布多糖微粒(6)、(7)、PLGA比较微粒(8)、右旋糖酐比较微粒(9))0.2mg，利用荧光强度(MFI)来评价活化标记物(CD86)的表达量。
作为比较例，将polyI：C(シグマ社)100μg添加至培养培养基，同样地比较活化标记物的表达量。
＜结果＞
将各微粒中的作为CD86的表达量的指标的荧光强度(MFI)示于图11中。明确了在使用了将昆布多糖修饰体作为基材的微粒(昆布多糖微粒(6)、(7))的情况下，与使用了将右旋糖酐修饰体作为基材的微粒(右旋糖酐比较微粒(9))、将PLGA作为基材的微粒(PLGA比较微粒(8))的情况相比，具有更强的树突细胞活性能。即明确了将昆布多糖修饰体作为基材的微粒与实施例6的将凝胶多糖修饰体作为基材的微粒同样地具有强的树突细胞活化能。
实施例8使用了小鼠的β-葡聚糖修饰体的体内试验1(通过IFN-γ产生能进行的评价)
＜方法＞
关于实验所使用的小鼠，将由日本SLC社以5周龄购入的C57BL/6NCR小鼠5周龄雄性在公司内部饲养设施中在昼夜12小时循环的自由给食下饲养1周进行驯化。
对小鼠以表6所示的条件进行施与。条件(1)、(2)和比较条件(3)是，将由实施例4调制的微粒(含有OVA的凝胶多糖微粒(10)、含有OVA的右旋糖酐比较微粒(15))分散于4％(w/v)甘露糖醇水溶液50μl，然后在双足脚垫上使用29G注射针(テルモ社マイジェクター)来施与。比较条件(4)是，通过同样的方法，施与OVA(シグマ社)和polyI：C(シグマ社)。比较条件(5)是，通过同样的方法，施与不含抗原的溶液。
条件(2)和比较条件(3)、(4)是，在最初施与的3天后通过同样的方法进行第2次施与，在最初施与的6天后通过同样的方法进行第3次施与。
施与后的小鼠在能够自由给食、给水的环境下饲养，在从最初施与起2周后使用二氧化碳使其安乐死。将施与部位附近的膝下淋巴节无菌地取出，使内包的细胞分散后，用200μm过滤器(アズワン社，FILCONS，120-22S)进行过滤，除去碎屑。回收的细胞悬浮于包含10％FBS(シグマ社)、100单位/ml青霉素(ライフテクノロジー社)、100单位/ml链霉素(ライフテクノロジー社)的RPMI1640培养基(以下，RPMI培养基)，以使每1孔为5×105个的方式接种于96孔板(IWAKI社，平底组织培养聚苯乙烯(FlatBottomTissueCulturePolystyrene))，进一步添加包含OVA10μg、2巯基乙醇0.75μg的RPMI培养基进行刺激。接种后的板用CO2培养箱孵育48小时后，将培养上清液回收，通过ELISA法(MabTech社，小鼠IFN-γELISA试剂盒(MouseIFN-gammaELISAkit)(HRP))测定由各细胞群产生的IFN-γ浓度。
＜结果＞
将淋巴节细胞所产生的IFN-γ量示于图12中。IFN-γ为表示细胞性免疫的活化的指标。对于施与含有OVA的微粒的条件(条件(1)、(2)、比较条件(3))，与未施与抗原的条件(比较条件(5))、施与OVA和polyI：C的条件(比较条件(4))相比，确认了强的IFN-γ的产生，从而明确了含有抗原的微粒在抗原特异性的免疫的活化方面有效。对于施与了将凝胶多糖修饰体作为基材的微粒的条件(条件(1)、(2))，与施与了将右旋糖酐修饰体作为基材的微粒的条件(比较条件(3))相比，确认了更强的IFN-γ的产生。即，明确了将β-葡聚糖修饰体作为基材并含有抗原的微粒，增强抗原特异性的免疫。此外，对于施与了3次微粒的条件(条件(2))，与施与了1次微粒的条件(条件(1))相比，IFN-γ的产生量高，从而也明确了多次施与在免疫的进一步增强方面是有效的。
[表6]
表6：使用了小鼠的β-葡聚糖修饰体的体内试验1的施与条件
施与物 施与次数
条件(1) 含有OVA的凝胶多糖微粒(10)2.5mg 1次
条件(2) 含有OVA的凝胶多糖微粒(10)2.5mg 3次
比较条件(3) 含有OVA的右旋糖酐比较微粒(15)2.5mg 3次
比较条件(4) OVA25ug、poly I：C 25ug 3次
比较条件(5) - 1次
实施例9使用了小鼠的β-葡聚糖修饰体的体内试验2(通过IFN-γ产生能进行的评价)
<方法>
对在与实施例8相同条件下饲养了的小鼠以表7所示的条件进行施与。条件(6)～(8)和比较条件(9)为将由实施例4调制的微粒(含有OVA的昆布多糖微粒(12)～(14)、含有OVA的右旋糖酐比较微粒(15))分散于4％(w/v)甘露糖醇水溶液100μl，然后在双足脚垫上使用29G注射针(テルモ社イジエクタ一)来施与。比较条件(10)为通过同样的方法，施与OVA(シグ社)和polyI：C(シグ社)。比较条件(11)为通过同样的方法，施与OVA(シグ社)。比较条件(12)为通过同样的方法，施与不含抗原的溶液。
施与后的小鼠在能够自由给食、给水的环境下饲养，在从最初施与起2周后使用二氧化碳使其安乐死。通过与实施例8同样的方法，取出淋巴节所内包的细胞，测定用OVA刺激后的IFN-γ产生量。
<结果>
将淋巴节细胞所产生的IFN-γ量示于图13中。对于施与了含有OVA的昆布多糖微粒的条件(条件(6)～(8))，与施与了含有OVA的右旋糖酐比较微粒的条件(比较条件(9))、施与了OVA和polyI：C的条件(比较条件(10))相比，观察到强的IFN-γ产生。明确了将昆布多糖修饰体作为基材并含有抗原的微粒与实施例8的将凝胶多糖修饰体作为基材并含有抗原的微粒同样地，增强抗原特异性的免疫。
[表7]
表7：使用了小鼠的β-葡聚糖修饰体的体内试验2的施与条件
施与物 施与次数
条件(6) 含有OVA的昆布多糖微粒(12)5mg 1次
条件(7) 含有OVA的昆布多糖微粒(13)5mg 1次
条件(8) 含有OVA的昆布多糖微粒(14)5mg 1次
比较条件(9) 含有OVA的右旋糖酐比较微粒(15)5mg 1次
比较条件(10) OVA50ug、poly I：C 50ug 1次
比较条件(11) OVA50ug 1次
比较条件(12) - 1次
实施例10使用了小鼠的β-葡聚糖修饰体的体内试验3(抗肿瘤效果)
<方法>
将作为罹癌细胞的OVA表达小鼠癌细胞E.G7-OVA(ATCC社)预先保持对数增殖状态，使用RPMI培养基培养一周后，用灭菌了的PBS洗涤3次，调制出移植细胞。
作为宿主动物将由日本SLC社以5周龄购入的雄C57BL/6NCR小鼠在本公司饲养设施中在昼夜12小时循环的自由给食下饲养进行驯化后，在腹部皮下使用25G注射针将包含E.G7-OVA细胞2×106个的PBS100μl进行罹癌。
在从罹癌起第0天、第3天、第7天、第10天和第15天，在表8所示的条件下进行施与。对于条件(13)和条件(14)，将由实施例4调制的微粒(含有OVA的凝胶多糖微粒(10)、凝胶多糖微粒(11))分散于4％(w/v)甘露糖醇水溶液100μl，在罹癌部位附近使用29G注射针(テルモ社イジエクタ一)进行施与。对于比较条件(15)，通过同样的方法，施与OVA(シグ社)和polyI：C(シグマ社)。对于比较条件(16)，通过同样的方法，施与不含抗原也不含粒子的溶液。
施与后的小鼠在能够自由给食、给水的环境下饲养，测定肿瘤组织的体积。
<结果>
将各条件5只的罹癌后的肿瘤组织的体积平均值示于图14中。明确了对于施与了不含抗原的微粒的条件(条件(14))，与不施与抗原也不施与粒子的条件(比较条件(16))相比，抑制肿瘤体积的增加，从而将β-葡聚糖修饰体作为基材的微粒具有抗肿瘤效果。对于施与了含有抗原的微粒的条件(13)，与施与了不含抗原的微粒的条件(条件(14))、施与了OVA和polyI：C的条件(比较条件(15))相比，明确了进一步抑制肿瘤体积的增加，从而将β-葡聚糖修饰体作为基材且含有抗原的微粒具有更强的抗肿瘤效果。
[表8]
表8：使用了小鼠的β-葡聚糖修饰体的体内试验3的施与条件
施与物 施与次数
条件(13) 含有OVA的凝胶多糖微粒(10)5mg 5次16 -->
条件(14) 凝胶多糖微粒(11)5mg 5次
比较条件(15) OVA50ug、poly I：C 50ug 5次
比较条件(16) - 5次
实施例11聚(乳酸-乙醇酸)共聚物被修饰了的β-葡聚糖(茯苓聚糖修饰体(16)、裂裥菌素修饰体(17)、黑酵母葡聚糖修饰体(18)、硬葡聚糖修饰体(19)、凝胶多糖修饰体(20)(21))的合成
(1)β-葡聚糖的水解反应(茯苓聚糖水解物(7)、裂裥菌素水解物(8)、黑酵母葡聚糖水解物(9)、硬葡聚糖水解物(10)、凝胶多糖水解物(11)(12)的合成)
将茯苓聚糖(バイオサプライ社)320mg溶解于二甲亚砜27ml，然后添加1当量盐酸水溶液1.2ml，在110℃搅拌0.5小时。将该反应溶液转移至渗析膜，在水中进行渗析后，进行冷冻干燥，作为粉末获得茯苓聚糖水解物(7)(数均分子量1,900)。
在同样的条件下，使裂裥菌素(インビボジェン)反应1.3小时从而获得裂裥菌素水解物(8)(数均分子量4,400)，使黑酵母葡聚糖(ダイソー株式会社)反应0.15小时从而获得黑酵母葡聚糖水解物(9)(数均分子量2,700)，使硬葡聚糖(エチシチル社制)反应1.15小时从而获得硬葡聚糖水解物(10)(数均分子量3,000)，使凝胶多糖(和光纯药工业株式会社)反应0.1小时从而获得凝胶多糖水解物(11)(数均分子量18,700)，通过反应0.75小时从而获得凝胶多糖水解物(12)(数均分子量1,900)。
β-葡聚糖的数均分子量通过GPC测定(柱：东ソ-TSK-gelG3000PWXL-CP×2，乙酸缓冲液系溶剂(10mM，pH＝5)，检测器：RI，标准品：普鲁兰多糖)来确定。
(2)β-葡聚糖的三甲基甲硅烷基(TMS)化反应(TMS化茯苓聚糖(9)、TMS化裂裥菌素(10)、TMS化黑酵母葡聚糖(11)、TMS化硬葡聚糖(12)、TMS化凝胶多糖(13)(14)的合成)
将茯苓聚糖水解物(7)180mg添加至二甲亚砜25ml，加热至80℃。在该溶液中经20分钟滴加1,1,1,3,3,3-六甲基二硅氮烷20ml，在80℃搅拌16小时。将该反应溶液转移至分液漏斗，进行静置直至分离为二层。将上层回收，减压下浓缩后，添加甲醇5ml，将所得的固体进行过滤、干燥，作为白色固体获得TMS化茯苓聚糖(9)250mg。
通过同样的方法，由裂裥菌素水解物(8)合成出TMS化裂裥菌素(10)，由黑酵母葡聚糖水解物(9)合成出TMS化黑酵母葡聚糖(11)，由硬葡聚糖水解物(10)合成出TMS化硬葡聚糖(12)，由凝胶多糖水解物(11)合成出TMS化凝胶多糖(13)，由凝胶多糖水解物(12)合成出TMS化凝胶多糖(14)。
TMS化反应进行通过1H-NMR测定来确认。
(3)聚(乳酸-乙醇酸)共聚物对β-葡聚糖的修饰反应(茯苓聚糖修饰体(16)、裂裥菌素修饰体(17)、黑酵母葡聚糖修饰体(18)、硬葡聚糖修饰体(19)、凝胶多糖修饰体(20)、(21)的合成)
将TMS化茯苓聚糖(9)230mg和叔丁氧基钾(tBuOK)22mg在加热减压下干燥2小时后，添加四氢呋喃10ml，在室温下搅拌1.5小时，获得活化溶液。将活化溶液的调制所使用的tBuOK的35倍摩尔的单体((DL)-丙交酯与乙交酯的摩尔比1:1的混合物)溶解于四氢呋喃，获得单体溶液。在该活化溶液中滴加该单体溶液，搅拌30分钟后，添加乙酸0.2ml来使反应停止。将反应结束后的溶液在减压下浓缩，以氯仿(良溶剂)-甲醇(不良溶剂)系和氯仿(良溶剂)-环己烷(不良溶剂)系进行再沉淀精制，获得白色固体。将所得的白色固体溶解于氯仿9ml，添加三氟乙酸1ml，在室温搅拌30分钟。将该反应溶液在减压下浓缩，以氯仿(良溶剂)-乙醚(不良溶剂)系进行再沉淀精制，作为白色固体获得茯苓聚糖修饰体(16)287mg。
通过同样的方法，由TMS化裂裥菌素(10)合成出裂裥菌素修饰体(17)，由TMS化黑酵母葡聚糖(11)合成出黑酵母葡聚糖修饰体(18)，由TMS化硬葡聚糖(12)合成出硬葡聚糖修饰体(19)，由TMS化凝胶多糖(13)合成出凝胶多糖修饰体(20)，由TMS化凝胶多糖(14)合成出凝胶多糖修饰体(21)。
将β-葡聚糖修饰体的评价结果示于表9中。β-葡聚糖修饰体的数均分子量通过GPC测定(柱：东ソ-TSK-gelα-5000×2，DMF系溶剂，检测器：RI，标准品：普鲁兰多糖)来确定。β-葡聚糖修饰体所包含的β-葡聚糖链段的比率(w/w)由合成所使用的β-葡聚糖的数均分子量与β-葡聚糖修饰体的数均分子量来确定。各接枝链的数均分子量通过1H-NMR测定来确定(图15：茯苓聚糖修饰体(16)，图16：裂裥菌素修饰体(17)，图17：黑酵母葡聚糖修饰体(18)，图18：硬葡聚糖修饰体(19))。接枝链数的平均通过将从β-葡聚糖修饰体的数均分子量减去β-葡聚糖的数均分子量而得的值除以各接枝链的数均分子量来确定。
[表9]
表9：β葡聚糖修饰体(茯苓聚糖修饰体(16)、裂裥菌素修饰体(17)、黑酵母葡聚糖修饰体(18)、硬葡聚糖修饰体(19)、凝胶多糖修饰体(20)(21))的分析结果
实施例12聚(乳酸-乙醇酸)共聚物被修饰了的茯苓多糖(茯苓多糖修饰体(22))的合成
(1)茯苓聚糖的氧化断裂反应(茯苓多糖的合成)
在茯苓聚糖(バイオサプライ社)1g中混合水120ml，添加0.1M高碘酸钠水溶液40ml，在室温下搅拌40小时后，通过离心分离来回收反应物。在该反应物中混合水54ml，添加包含氢化硼钠216m的水溶液27ml，在室温下搅拌28小时后，通过离心分离来回收反应物。在该反应物中混合0.05M硫酸水溶液70mL，在室温下搅拌24小时后，通过离心分离来回收茯苓多糖0.91g。
(2)茯苓多糖的水解反应(茯苓多糖水解物(13)的合成)
通过与上述实施例11同样的方法进行水解，使用茯苓多糖360mg，作为粉末获得茯苓多糖水解物(13)(数均分子量2,100)229mg。
(3)茯苓多糖的三甲基甲硅烷基(TMS)化反应(TMS化茯苓多糖(15)的合成)
通过与上述实施例11同样的方法进行TMS化，使用茯苓多糖水解物(13)200mg，作为白色固体获得TMS化茯苓多糖(15)325mg。
(4)聚(乳酸-乙醇酸)共聚物对茯苓多糖的修饰反应(茯苓多糖修饰体(22)的合成)
通过与上述实施例11同样的方法，使叔丁氧基钾(tBuOK)和tBuOK的35倍摩尔的单体((DL)-丙交酯与乙交酯的摩尔比1:1的混合物)与TMS化茯苓多糖(15)300mg进行反应，从而作为白色固体获得茯苓多糖修饰体(22)353mg。
将茯苓多糖修饰体(22)的评价结果示于表10中。关于各值，通过与上述实施例11同样的方法，通过GPC测定和1H-NMR测定来确定(图19：茯苓多糖修饰体(22)的1H-NMR测定)。
[表10]
表10：茯苓多糖修饰体(22)的分析结果
实施例13使用了O/W乳液法的微粒2(茯苓聚糖微粒(16)、裂裥菌素微粒(17)、黑酵母葡聚糖微粒(18)、硬葡聚糖微粒(19)、凝胶多糖微粒(20)、茯苓多糖微粒(21)、右旋糖酐比较微粒(22))的调制
将茯苓聚糖修饰体(16)10mg溶解于乙酸乙酯1ml，调制出聚合物溶液。将该聚合物溶液滴加至1％(w/v)聚乙烯醇水溶液4ml，通过使用了混合机(ポリトロン社，PT2100S)的11,000rpm、5分钟的搅拌，从而调制出O/W乳液溶液。从该O/W乳液溶液通过液中干燥来除去乙酸乙酯，制成微粒悬浮液。将该悬浮液转移至15ml管，通过8,000rpm、10分钟的离心来使微粒沉淀。除去上清液后，将微粒再悬浮于10ml的蒸馏水，通过上述条件下的离心来使微粒再次沉淀。将该洗涤操作再次反复，除去上清液后使微粒悬浮于包含5％(w/v)甘露糖醇和0.1％(w/v)聚山梨醇酯80的水溶液1.8ml。将该悬浮液用液氮预冷冻后，使用冷冻干燥机(东京理化器械株式会社，FD-1000)，以阱冷却温度-45℃、真空度20Pa冷冻干燥12小时，从而获得茯苓聚糖微粒(16)。
通过同样的方法，获得将裂裥菌素修饰体(17)作为基材的裂裥菌素微粒(17)，获得将黑酵母葡聚糖修饰体(18)作为基材的黑酵母葡聚糖微粒(18)，获得将硬葡聚糖修饰体(19)作为基材的硬葡聚糖微粒(19)，获得将凝胶多糖修饰体(20)作为基材的凝胶多糖微粒(20)，获得将茯苓多糖修饰体(22)作为基材的茯苓多糖微粒(21)。
此外，作为比较例，通过同样的方法，获得将右旋糖酐修饰体(15-)作为基材的右旋糖酐比较微粒(22)。
将微粒的平均粒径使用动态光散射装置(大塚电子株式会社，ELS-Z)通过累积量法而算出的结果示于表11中。
[表11]
表11：通过O/W乳液法调制的微粒(茯苓聚糖微粒(16)、裂裥菌素微粒(17)、黑酵母葡聚糖微粒(18)、硬葡聚糖微粒(19)、凝胶多糖微粒(20)、茯苓多糖微粒(21)、右旋糖酐比较微粒(22))的分析结果
基材 粒径
茯苓聚糖微粒(16) 茯苓聚糖修饰体(16) 585nm
裂裥菌素微粒(17) 裂裥菌素修饰体(17) 504nm
黑酵母葡聚糖微粒(18) 黑酵母葡聚糖修饰体(18) 460nm
硬葡聚糖微粒(19) 硬葡聚糖修饰体(19) 470nm
凝胶多糖微粒(20) 凝胶多糖修饰体(20) 524nm
茯苓多糖微粒(21) 茯苓多糖修饰体(22) 428nm
右旋糖酐比较微粒(22) 右旋糖酐修饰体(15) 543nm
实施例14使用了S/O/W乳液法的微粒(含有OVA的凝胶多糖微粒(23)、(24)、含有OVA的硬葡聚糖微粒(25))的调制
将凝胶多糖修饰体(21)100mg溶解于碳酸二甲酯2.6ml和叔丁醇200μl，调制出聚合物溶液。在该聚合物溶液中滴加0.5％(w/v)OVA(卵清蛋白，シグ社))水溶液1ml，通过使用了混合机(ポリトロン社，PT2100S)的11,000rpm、1分钟的搅拌，从而制造出W/O乳液溶液。将该W/O乳液溶液用液氮预冷冻后，使用冷冻干燥机(东京理化器械株式会社，FD-1000)，以阱冷却温度-45℃、真空度20Pa冷冻干燥12小时。使所得的固体成分分散于乙酸乙酯10ml，调制出S/O悬浮溶液。将该S/O悬浮溶液滴加至1％(w/v)聚乙烯醇水溶液40ml，通过使用了混合机(シルバーソン社，L5M-A)的6,000rpm、5分钟的搅拌，从而调制出S/O/W型乳液溶液。从该S/O/W型乳液溶液通过液中干燥来除去乙酸乙酯，制成微粒悬浮液。将该悬浮液转移至50ml管，通过8,000rpm、10分钟的离心来使微粒沉淀。除去上清液后，将微粒再悬浮于50ml的蒸馏水，通过上述条件下的离心使微粒再次沉淀。将该洗涤操作再次反复，除去上清液后使微粒悬浮于包含5％(w/v)甘露糖醇和0.1％(w/v)聚山梨醇酯80的水溶液8ml。将该悬浮液用液氮预冷冻后，使用冷冻干燥机，以阱冷却温度-45℃、真空度20Pa冷冻干燥12小时，从而获得含有OVA的凝胶多糖微粒(23)。
通过同样的方法，通过使用凝胶多糖修饰体(20)从而获得含有OVA的凝胶多糖微粒(24)，通过使用硬葡聚糖修饰体(19)从而获得含有OVA的硬葡聚糖微粒(25)。
将微粒的评价结果示于表12中。微粒的平均粒径使用动态光散射装置(大塚电子株式会社，ELS-Z)通过累积量法来算出。抗原的封入率(w/w)使用有机溶剂由微粒来提取抗原，将提取的抗原用凝胶电泳装置(TEFCO社)进行凝胶电泳后，使用胶体CBB染色试剂盒(TEFCO社)进行染色来确定。
[表12]
表12：通过S/O/W乳液法调制的微粒(含有OVA的凝胶多糖微粒(23)、(24)、含有OVA的硬葡聚糖微粒(25))的分析结果
实施例15使用了来源于小鼠骨髓的树突细胞(BMDC)的β-葡聚糖修饰体(茯苓聚糖修饰体(16)、裂裥菌素修饰体(17)、黑酵母葡聚糖修饰体(18)、茯苓多糖修饰体(22))的体外刺激试验2
＜方法＞
称量由实施例11获得的β-葡聚糖修饰体(茯苓聚糖修饰体(16)、裂裥菌素修饰体(17)、黑酵母葡聚糖修饰体(18)、茯苓多糖修饰体(22))10mg，溶解于乙腈1ml，从而获得聚合物溶液。将该聚合物溶液100μl(聚合物1mg分)滴加至12孔板，使其干燥，从而获得聚合物涂覆板。在该聚合物涂覆板上将由参考例1获得的树突细胞与培养培养基一起以每1孔为3×105个的方式进行接种。接种后的板在CO2培养箱内中培养2天后，使用微量加液器，通过强烈地悬浮，仅回收未粘接于板的细胞。回收的细胞通过1,500rpm、5分钟的离心来使细胞沉淀，除去上清液，悬浮于RPMI培养基100μl。在该细胞悬浮液中，添加FITC标记抗CD86抗体和PE标记抗CD11c抗体，在4℃静置15分钟从而进行抗体标记反应。抗体标记反应结束后，通过流式细胞仪利用荧光强度(MFI)来评价树突细胞(CD11c阳性细胞)中的活化标记物(CD86)的表达量。
作为比较例，使用同样地涂覆了由比较例1获得的右旋糖酐修饰体(15)的板，同样地比较活化标记物的表达量。此外，作为其它比较例，将由实施例11获得的未修饰的β-葡聚糖(茯苓聚糖水解物(7)、裂裥菌素水解物(8)、黑酵母葡聚糖水解物(9)、茯苓多糖水解物(13))1mg或已知免疫活化能的polyI：C(シグマ社)100μg添加至培养培养基，同样地比较活化标记物的表达量。
＜结果＞
将作为树突细胞的活化标记物的CD86的表达量的指标的荧光强度(MFI)示于图20中。在使用了β-葡聚糖修饰体的情况下，与使用了右旋糖酐修饰体(15)的情况相比，CD86的表达量高，从而明确了β-葡聚糖修饰体具有强的树突细胞活化能。在使用了未修饰的β-葡聚糖的情况下，与使用了β-葡聚糖修饰体的情况相比，CD86的表达量低，从而明确了聚(羟基酸)对β-葡聚糖的修饰对免疫活化能是重要的。此外确认了，不仅线状的β-葡聚糖的修饰体(实施例4：凝胶多糖修饰体(9)～(12)、本实施例：茯苓聚糖修饰体(16))，而且分支上的β-葡聚糖的修饰体(本实施例：裂裥菌素修饰体(17)、黑酵母葡聚糖修饰体(18))、被衍生物化了的β-葡聚糖的修饰体(本实施例：茯苓多糖修饰体(22)也具有免疫活化能。
实施例16将使用了来源于小鼠骨髓的树突细胞(BMDC)的β-葡聚糖修饰体作为基材的微粒(茯苓聚糖微粒(16)、裂裥菌素微粒(17)、黑酵母葡聚糖微粒(18)、硬葡聚糖微粒(19)、凝胶多糖微粒(20)、茯苓多糖微粒(21))的体外刺激试验2
将由参考例1获得的树突细胞与培养培养基一起以每1孔为3×105个的方式接种于12孔板，进一步添加将β-葡聚糖修饰体作为基材的微粒(茯苓聚糖微粒(16)、裂裥菌素微粒(17)、黑酵母葡聚糖微粒(18)、硬葡聚糖微粒(19)、凝胶多糖微粒(20)、茯苓多糖微粒(21))0.05mg。接种后的板在CO2培养箱内培养2天，使用微量加液器，通过强烈地悬浮，仅回收未粘接于板的细胞。回收的细胞通过1,500rpm、5分钟的离心来使细胞沉淀，除去上清液，悬浮于RPMI培养基100μl。在该细胞悬浮液中，添加FITC标记抗CD86抗体和PE标记抗CD11c抗体，在4℃静置15分钟，从而进行抗体标记反应。抗体标记反应结束后，通过流式细胞仪利用荧光强度(MFI)来评价树突细胞(CD11c阳性细胞)的活化标记物(CD86)的表达量。
作为比较例，将右旋糖酐作为基材的微粒(右旋糖酐比较微粒(22))0.05mg添加至培养培养基，同样地比较活化标记物的表达量。
＜结果＞
将各微粒中的作为CD86的表达量的指标的荧光强度(MFI)示于图21中。在使用了将β-葡聚糖修饰体作为基材的微粒(茯苓聚糖微粒(16)、裂裥菌素微粒(17)、黑酵母葡聚糖微粒(18)、硬葡聚糖微粒(19)、凝胶多糖微粒(20)、茯苓多糖微粒(21))的情况下，与未添加的情况和使用了将右旋糖酐修饰体作为基材的微粒(右旋糖酐比较微粒(22))的情况相比，CD86的表达量高，从而明确了将β-葡聚糖修饰体作为基材的微粒将树突细胞强地活性化。
实施例17使用了小鼠的β-葡聚糖修饰体的体内试验4(通过IFN-γ产生能进行的评价)
＜方法＞
关于实验所使用的小鼠，将由日本SLC社以5周龄购入的C57BL/6NCR小鼠5周龄雄性在公司内部饲养设施中在昼夜12小时循环的自由给食下饲养1周进行驯化。
对小鼠以表13所示的条件进行施与。条件(17)～(19)为将由实施例14调制的微粒(含有OVA的凝胶多糖微粒(23)、(24)、含有OVA的硬葡聚糖微粒(25))分散于4％(w/v)甘露糖醇水溶液50μl，然后在双足脚垫上使用29G注射针(テルモ社マイジェクター)进行施与。比较条件(20)为通过同样的方法施与OVA(シグマ社)和凝胶多糖水解物(12)。
在全部的条件下，在初次施与的3天后通过同样的方法进行第2次施与，在初次施与的7天后通过同样的方法进行第3次施与，在初次施与的10天后通过同样的方法进行第4次施与。
施与后的小鼠在能够自由给食、给水的环境下饲养，从初次施与起16天后使用二氧化碳使其安乐死。将施与部位附近的膝下淋巴节无菌地取出，使内包的细胞分散后，用200μm过滤器(アズワン社，FILCONS，120-22S)进行过滤，除去碎屑。回收的细胞悬浮于包含10％FBS(シグマ社)、100单位/ml青霉素(ライフテクノロジー社)、100单位/ml链霉素(ライフテクノロジー社)的RPMI1640培养基(以下，RPMI培养基)，以使每1孔为5×105个的方式接种于96孔板(IWAKI社，平底组织培养聚苯乙烯(FlatBottomTissueCulturePolystyrene))，进一步添加包含OVA10μg、2巯基乙醇0.75μg的RPMI培养基进行刺激。接种后的板在CO2培养箱中孵育48小时后，将培养上清液回收，通过ELISA法(MabTech社，小鼠IFN-γELISA试剂盒(MouseIFN-gammaELISAkit)(HRP))测定由各细胞群产生的IFN-γ浓度。
＜结果＞
将淋巴节细胞所产生的IFN-γ量示于图22中。IFN-γ为表示细胞性免疫的活化的指标。对于施与了将凝胶多糖修饰体作为基材的含有OVA的微粒的条件(条件(17))，与施与了OVA和未修饰的凝胶多糖的条件(比较条件(20))相比，确认到强的IFN-γ的产生，从而明确了即使在体内β-葡聚糖修饰体与未修饰的β-葡聚糖相比也具有强免疫活化能。此外，即使在施与了将高分子量的凝胶多糖修饰体作为基材的含有OVA的微粒的条件(条件(18))、施与将分支上的硬葡聚糖修饰体作为基材的含有OVA的微粒的条件(条件(19))下，也确认到了强的IFN-γ的产生，从而与分子量、线状与分支状差异无关地，都显示β-葡聚糖修饰体具有强的免疫活化能。
[表13]
表13：使用了小鼠的β-葡聚糖修饰体的体内试验4的施与条件
产业可利用性
本发明的免疫增强剂可以作为药物，特别是作为用于传染病、癌等的治疗和/或预防的用于疫苗的免疫增强剂来利用。

Claims (12)

1.一种免疫增强剂，其将β-葡聚糖修饰体作为有效成分，所述β-葡聚糖修饰体中β-葡聚糖和聚(羟基酸)共价结合。
2.根据权利要求1所述的免疫增强剂，β-葡聚糖是通过1个以上β-1,3键和/或1个以上β-1,6键被连接的葡萄糖的聚合物。
3.根据权利要求1或2所述的免疫增强剂，β-葡聚糖修饰体是由β-葡聚糖的主链和聚(羟基酸)的侧链构成的接枝型聚合物。
4.根据权利要求1～3的任一项所述的免疫增强剂，β-葡聚糖链段的比率以w/w计为1～50％。
5.根据权利要求1～4的任一项所述的免疫增强剂，β-葡聚糖为凝胶多糖、茯苓聚糖、昆布多糖、地衣多糖、裂裥菌素、蘑菇多糖、硬葡聚糖、黑酵母葡聚糖或茯苓多糖。
6.根据权利要求1～5的任一项所述的免疫增强剂，β-葡聚糖的数均分子量为500～100,000。
7.根据权利要求1～6的任一项所述的免疫增强剂，聚(羟基酸)为聚(乳酸-乙醇酸)共聚物、聚乳酸或聚乙醇酸。
8.根据权利要求1～7的任一项所述的免疫增强剂，其将β-葡聚糖修饰体的微粒作为有效成分。
9.一种药物，其含有权利要求1～8的任一项所述的免疫增强剂作为有效成分。
10.一种疫苗，其含有权利要求1～8的任一项所述的免疫增强剂和抗原作为有效成分。
11.一种用于癌的治疗和/或预防的疫苗，其含有权利要求1～8的任一项所述的免疫增强剂和癌抗原作为有效成分。
12.一种免疫增强方法，其将权利要求1～8的任一项所述的免疫增强剂或权利要求9所述的药物施与生物体。
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