KR20160060072A - 면역 부활화제 - Google Patents

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Abstract

β-글루칸과 폴리(히드록시산)이 공유 결합된 β-글루칸 수식체를 유효 성분으로 하는 면역 부활화제가 제공된다. 상기 면역 부활화제는 β-글루칸의 면역 활성화 작용을 강력하게 증강할 수 있다.

Description

면역 부활화제{IMMUNOPOTENTIATOR}
[관련 출원의 참조]
본 특허출원은 2013년 10월 9일에 출원된 일본 특허출원 2013-212103호에 의거하는 우선권의 주장을 따르는 것이며, 이 일본 출원의 전체 개시 내용은 인용함으로써 본원의 개시의 일부로 된다.
본 발명은 β-글루칸과 폴리(히드록시산)이 공유 결합된 β-글루칸 수식체를 유효 성분으로 하는 면역 부활화제에 관한 것이다.
다당류는 생체에 대하여 여러 가지 작용을 갖고 있는 것이 알려져 있고, 그 중에서도 β-글루칸류는 생체 중의 면역세포에 존재하는 리셉터(Dectin-1 등) 등과 결합해서 면역 반응을 활성화하는 것이 알려져 있다(비특허문헌 1 참조). 지금까지 β-글루칸류가 갖는 면역 활성화 작용을 이용한 면역 부활화제의 개발 연구가 행해져 왔지만(특허문헌 1 참조), β-글루칸류의 면역 활성화 작용은 강력하다고는 할 수 없고, 충분한 효과를 얻기 위해서 다른 면역 부활화제와의 병용이 검토되어 왔다(특허문헌 2 참조).
한편, 다당류는 생체 적합성의 재료로서도 알려져 있고, 다당류가 갖는 생체 적합성을 이용함으로써 히드로겔이나 서방제 재료의 기재로서 사용되고 있다. 또한, 생분해성 폴리머를 다당류에 수식함으로써 생체 적합성을 유지한 상태로 그 물성을 변환하는 것이 가능하게 되어 있다(특허문헌 3 및 비특허문헌 2 참조).
일본 특허 공개 평 10-194977호 공보 일본 특허 공개 2011-504487호 공보 일본 특허 공개 2013-67709호 공보
마이콜로지컬·리서치, 2007년 111호, 635-652페이지 폴리머, 2003년 44호, 3927-3933페이지
본 발명의 목적은 β-글루칸의 면역 활성화 작용을 증강함으로써 강력한 면역 부활화제를 제공하는 것에 있다.
상기 과제를 극복하기 위해서, 본 발명자는 β-글루칸의 면역 활성화 작용을 증강하는 수단을 검토한 결과, β-글루칸을 폴리(히드록시산)으로 수식함으로써 생체 내에서 높은 면역 활성화능을 갖는 것을 발견하여 본 발명을 완성했다.
즉, 본 발명은 이하의 (1)∼(12)의 구성을 갖는다.
(1) β-글루칸과 폴리(히드록시산)이 공유 결합된 β-글루칸 수식체를 유효 성분으로 하는, 면역 부활화제.
(2) β-글루칸이 1개 이상의 β-1,3 결합 및/또는 1개 이상의 β-1,6 결합으로 연결된 글루코오스의 중합체인, (1)에 기재된 면역 부활화제.
(3) β-글루칸 수식체가 β-글루칸의 주쇄 및 폴리(히드록시산)의 측쇄로 구성되는 그래프트형 폴리머인, (1) 또는 (2)에 기재된 면역 부활화제.
(4) β-글루칸 세그먼트의 비율이 1∼50%(w/w)인, (1)∼(3) 중 어느 하나에 기재된 면역 부활화제.
(5) β-글루칸이 커드란, 라미나란, 파키만, 리케난, 시조피란, 렌티난, 스클레로글루칸, 흑효모 글루칸 또는 파키마란인, (1)∼(4) 중 어느 하나에 기재된 면역 부활화제.
(6) β-글루칸의 수평균 분자량이 500∼100,000인, (1)∼(5) 중 어느 하나에 기재된 면역 부활화제.
(7) 폴리(히드록시산)이 폴리(락트산-글리콜산) 공중합체, 폴리락트산 또는 폴리글리콜산인, (1)∼(6) 중 어느 하나에 기재된 면역 부활화제.
(8) β-글루칸 수식체의 미립자를 유효 성분으로 하는, (1)∼(7) 중 어느 하나에 기재된 면역 부활화제.
(9) (1)∼(8) 중 어느 하나에 기재된 면역 부활화제를 유효 성분으로서 함유하는, 의약.
(10) (1)∼(8) 중 어느 하나에 기재된 면역 부활화제 및 항원을 유효 성분으로서 함유하는, 백신.
(11) (1)∼(8) 중 어느 하나에 기재된 면역 부활화제 및 암 항원을 유효 성분으로서 함유하는, 암의 치료 및/또는 예방을 위한 백신.
(12) (1)∼(8) 중 어느 하나에 기재된 면역 부활화제 또는 (9)에 기재된 의약을 생체에 투여하는, 면역 부활화 방법.
(발명의 효과)
본 발명에 의해, 종래보다 강력하게 면역을 활성화하는 면역 부활화제가 제공된다.
도 1은 라미나란 및 라미나란 가수분해물 (1)∼(3)의 GPC 측정의 결과를 나타낸다.
도 2는 라미나란 수식체(5)의 GPC 측정의 결과를 나타낸다.
도 3은 TMS화 라미나란(3)의 1H-NMR 측정의 결과를 나타낸다.
도 4는 라미나란 수식체(5)의 1H-NMR 측정의 결과를 나타낸다.
도 5는 커드란 가수분해물 (4)∼(6)의 GPC 측정의 결과를 나타낸다.
도 6은 커드란 수식체(9)의 GPC 측정의 결과를 나타낸다.
도 7은 TMS화 커드란(5)의 1H-NMR 측정의 결과를 나타낸다.
도 8은 커드란 수식체(9)의 1H-NMR 측정의 결과를 나타낸다.
도 9는 β-글루칸 수식체의 in vitro 자극 시험의 결과를 나타낸다.
도 10은 β-글루칸 수식체를 기재로 한 미립자의 in vitro 자극 시험 1의 결과를 나타낸다.
도 11은 β-글루칸 수식체를 기재로 한 미립자의 in vitro 자극 시험 2의 결과를 나타낸다.
도 12는 β-글루칸 수식체의 in vivo 시험 1의 결과를 나타낸다.
도 13은 β-글루칸 수식체의 in vivo 시험 2의 결과를 나타낸다.
도 14는 β-글루칸 수식체의 in vivo 시험 3의 결과를 나타낸다.
도 15는 파키만 수식체(16)의 1H-NMR 측정의 결과를 나타낸다.
도 16은 시조피란 수식체(17)의 1H-NMR 측정의 결과를 나타낸다.
도 17은 흑효모 글루칸 수식체(18)의 1H-NMR 측정의 결과를 나타낸다.
도 18은 스클레로글루칸 수식체(19)의 1H-NMR 측정의 결과를 나타낸다.
도 19는 파키마란 수식체(22)의 1H-NMR 측정의 결과를 나타낸다.
도 20은 β-글루칸 수식체의 in vitro 자극 시험 2의 결과를 나타낸다.
도 21은 β-글루칸 수식체를 기재로 한 미립자의 in vitro 자극 시험 3의 결과를 나타낸다.
도 22는 β-글루칸 수식체의 in vivo 시험 4의 결과를 나타낸다.
본 발명은 β-글루칸과 폴리(히드록시산)이 공유 결합된 β-글루칸 수식체를 유효 성분으로 하는 면역 부활화제에 관한 것이다.
글루칸이란 글루코오스 함유 다당류이며, β-글루칸은 글루코오스 서브유닛간에 1개 이상의 β- 결합을 포함하는 것이다. 즉, 본 발명에서 사용되는 β-글루칸은 β- 결합을 포함하는 것이며, β- 결합만을 포함하는 것이라도 좋다. 또한, 본 발명에서 사용되는 β-글루칸은 분기상이라도 좋고 선상이라도 좋다.
본 발명에서 사용되는 바람직한 β-글루칸으로서는, 1개 이상의 β-1,3 결합 및/또는 1개 이상의 β-1,6 결합을 포함하는 것이나, 1개 이상의 β-1,2 결합 및/또는 β-1,4 결합을 포함하는 것을 들 수 있지만, 1개 이상의 β-1,3 결합 및/또는 1개 이상의 β-1,6 결합을 포함하는 것이 보다 바람직하고, 1개 이상의 β-1,3 결합을 포함하는 것이 더욱 바람직하다. 1개 이상의 β-1,3 결합을 포함하는 β-글루칸의 구체예로서는 커드란, 파키만, 라미나란, 리케난, 시조피란, 렌티난, 스클레로글루칸, 흑효모 글루칸(바람직하게는 흑효모 유래 β-1,3 글루칸 또는 β-1,6 글루칸) 또는 파키마란을 들 수 있고, 바람직하게는 커드란, 파키만, 라미나란, 시조피란, 스클레로글루칸, 흑효모 글루칸 또는 파키마란을 들 수 있다.
1개 이상의 β-1,3 결합을 포함하는 선상의 β-글루칸으로서는, 주로 β-1,3 결합으로 이루어지는 β-글루칸(예를 들면, 커드란이나 파키만)이나, β-1,3 결합과 β-1,3 결합 이외의 β- 결합으로 이루어지는 β-글루칸(예를 들면, 라미나란이나 리케난)을 들 수 있다.
1개 이상의 β-1,3 결합을 포함하는 분기상의 β-글루칸으로서는, β-1,3 결합과 β-1,6 결합으로 이루어지는 β-글루칸(예를 들면, 시조피란이나 렌티난, 스클레로글루칸, 흑효모 글루칸)을 들 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용되는 β-글루칸은 유도체화되어 있어도 좋다. 유도체화의 예로서는, 카르복시메틸기의 부가 반응이나 산화적 개열 반응을 들 수 있다. 유도체화된 β-글루칸의 예로서는, 커드란에 카르복시메틸기가 부가된 카르복시메틸커드란이나, 파키만이 개열된 파키마란을 들 수 있다.
β-글루칸의 수평균 분자량은 특별하게 한정되지 않지만, 바람직하게는 500∼100,000이며, 보다 바람직하게는 1,000∼50,000이며, 더욱 바람직하게는 1,900∼25,000이다. 수평균 분자량이란 분자의 크기의 가중치를 고려하지 않는 방법으로 산출한 평균 분자량이며, β-글루칸의 수평균 분자량은 겔 퍼미에이션 크로마토그래피(GPC)에 의해 구할 수 있다.
폴리(히드록시산)은 특별하게 한정되지 않지만, 면역 부활화제의 구성 성분이라고 하는 관점으로부터 생체 투여시에 현저하게 유해한 영향을 주지 않는 생체 적합성 폴리머인 것이 바람직하다. 여기에서 말하는 생체 적합성이란 래트에 상기 폴리머를 경구 투여할 경우의 LD50이 2,000㎎/㎏ 이상인 것을 가리킨다. 또한, 복수 종류의 히드록시산의 공중합체라도 좋지만, 바람직하게는 2종류 이하의 히드록시산의 중합체이다.
폴리(히드록시산)의 바람직한 구체예로서는 폴리글리콜산, 폴리락트산, 폴리(2-히드록시부티르산), 폴리(2-히드록시발레르산), 폴리(2-히드록시카프로산), 폴리(2-히드록시카프르산), 폴리(말산) 또는 이것들의 고분자 화합물의 유도체 및 공중합체를 들 수 있지만, 폴리(락트산-글리콜산) 공중합체, 폴리락트산 또는 폴리글리콜산이 보다 바람직하고, 폴리(락트산-글리콜산) 공중합체가 더욱 바람직하다. 폴리(히드록시산)이 폴리(락트산-글리콜산) 공중합체일 경우의 폴리(락트산-글리콜산) 공중합체의 조성비(락트산/글리콜산)(몰/몰)는 본 발명의 목적이 달성되는 한에 있어서 특별하게 한정되지 않지만, 100/0∼30/70인 것이 바람직하고, 60/40∼40/60인 것이 보다 바람직하다.
폴리(히드록시산)의 수평균 분자량은 특별하게 한정되지 않지만, 바람직하게는 500∼1,000,000이며, 보다 바람직하게는 10,000∼100,000이며, 더욱 바람직하게는 14,700∼68,300이다. 폴리(히드록시산)의 수평균 분자량은 β-글루칸 수식체의 수평균 분자량과 β-글루칸의 수평균 분자량의 차로부터 구해진다.
β-글루칸 수식체의 구조는 특별하게 한정되지 않고, 구체예로서는 β-글루칸과 폴리(히드록시산)이 연결된 직쇄상의 블록형 폴리머, β-글루칸 또는 폴리(히드록시산)이 복수개 존재하는 분기를 가진 분기 폴리머, β-글루칸의 주쇄 및 폴리(히드록시산)의 측쇄로 이루어지는 그래프트형 폴리머, 폴리(히드록시산)의 주쇄 및 β-글루칸의 측쇄로 이루어지는 그래프트형 폴리머를 들 수 있지만, 바람직하게는 β-글루칸의 주쇄 및 폴리(히드록시산)의 측쇄로 이루어지는 그래프트형 폴리머이다.
β-글루칸 수식체는 장기에 걸쳐서 면역 부활화 작용을 지속시키기 위해서, 생체 내에서 바로 배설되지 않도록 전체적으로 수불용성인 것이 바람직하다. 여기에서 말하는 수불용성이란, 물로의 용해도가 1g(β-글루칸 수식체)/100㎖(물) 이하인 것을 말한다.
β-글루칸 수식체의 수평균 분자량은 특별하게 한정되지 않지만, 바람직하게는 1,000∼1,000,000이며, 보다 바람직하게는 10,000∼100,000이며, 더욱 바람직하게는 13,800∼84,000이다. β-글루칸 수식체의 수평균 분자량은 겔 퍼미에이션 크로마토그래피(GPC)로부터 구해진다.
β-글루칸 수식체에 있어서의 β-글루칸 세그먼트의 비율(β-글루칸 세그먼트/β-글루칸 수식체)은 특별하게 한정되지 않지만, 바람직하게는 1∼50%(w/w)이며, 보다 바람직하게 5∼45%(w/w)이며, 더욱 바람직하게는 8.3∼42.5%(w/w)이다. β-글루칸 수식체에 있어서의 β-글루칸 세그먼트의 비율은 β-글루칸의 수평균 분자량과 β-글루칸 수식체의 수평균 분자량의 비를 이용하여 구해진다.
β-글루칸의 주쇄 및 폴리(히드록시산)의 측쇄로 이루어지는 그래프트형 폴리머의 경우, 각 그래프트쇄의 수평균 분자량은 특별하게 한정되지 않지만 바람직하게는 1,000∼10,000이며, 보다 바람직하게는 1,300∼6,400이다. 각 그래프트쇄의 수평균 분자량은 핵 자기 공명(NMR) 측정에 의해 말단 잔기의 피크 적분값과 말단 잔기 이외의 피크 적분값의 비로부터 구해진다.
β-글루칸의 주쇄 및 폴리(히드록시산)의 측쇄로 이루어지는 그래프트형 폴리머의 경우, 그래프트쇄의 수는 특별하게 한정되지 않지만 바람직하게는 3∼15이다. 그래프트쇄 수는 β-글루칸 수식체의 수평균 분자량에서 β-글루칸의 수평균 분자량을 뺀 값을 각 그래프트쇄의 수평균 분자량으로 나눔으로써 구해진다.
β-글루칸 수식체는 기지의 방법으로 제조하면 좋고, 구체적으로는 β-글루칸에 폴리(히드록시산)을 첨가해서 축합 반응을 행하여 제조하는 방법, β-글루칸에 히드록시산 활성화 모노머를 첨가해서 중합 반응을 행하여 제조하는 방법을 예로서 들 수 있다.
특히, β-글루칸 수식체가 β-글루칸의 주쇄 및 폴리(히드록시산)의 측쇄로 이루어지는 그래프트형 폴리머일 경우, 이하의 (1), (2) 또는 (3)과 같이 해서 제조할 수 있다.
(1) 주석 촉매 존재 하, β-글루칸에 히드록시산 활성화 모노머를 첨가해서 중합 반응을 행하고, 폴리(히드록시산)을 도입함으로써 그래프트형 폴리머를 제조하는 방법[Macromolecules, 31, p.1032-1039(1998년)]
(2) 수산기의 대부분이 치환기로 보호된 β-글루칸의 일부 미보호의 수산기를 염기로 활성화 후, 히드록시산 활성화 모노머를 첨가해서 폴리(히드록시산)으로 이루어지는 그래프트쇄를 도입하고, 최후에 보호기를 제거함으로써 그래프트형 폴리머를 제조하는 방법[Polymer, 44, p.3927-3933, (2003년)]
(3) β-글루칸에 대하여 폴리(히드록시산)의 공중합체를 탈수제 및/또는 관능기의 활성화제를 이용하여 축합 반응시킴으로써 그래프트형 폴리머를 제조하는 방법[Macromolecules, 33, p.3680-3685(2000년)].
β-글루칸 수식체를 면역 부활화제로서 사용할 경우의 형태는 파이버, 필름, 미립자 등을 들 수 있지만, 면역 부활화제를 생체 내에 투여할 경우, 투여의 용이성으로부터 미립자가 바람직하다.
β-글루칸 수식체 미립자를 제조하는 방법은 특별하게 한정되지 않고, 액중 건조법, 분무 건조법, 분쇄법 등을 들 수 있지만, 액중 건조법에 의해 바람직하게 제조된다.
액중 건조법에 의해 미립자를 제조하는 방법으로서는 O/W 에멀션법, W/O/W 에멀션법, S/O/W 에멀션법 등을 들 수 있다.
O/W 에멀션법에 의해 미립자를 제조할 경우의 예를 들면, β-글루칸 수식체를 용해한 수비혼화성 유기 용매와 표면 개질제 수용액을 혼합해서 O/W 에멀션 용액을 조제하는 공정, 및 O/W 에멀션 용액으로부터 수비혼화성 유기 용매를 제거해서 미립자를 얻는 공정에 의해 제조할 수 있다.
W/O/W 에멀션법에 의해 미립자를 제조할 경우의 예를 들면, 수계 용매와 β-글루칸 수식체를 용해한 수비혼화성 유기 용매를 혼합해서 W/O 에멀션 용액을 조제하는 공정, W/O 에멀션 용액과 표면 개질제 수용액을 혼합해서 W/O/W 에멀션 용액을 조제하는 공정, 및 W/O/W 에멀션 용액으로부터 수비혼화성 유기 용매를 제거해서 미립자를 얻는 공정에 의해 제조할 수 있다.
S/O/W 에멀션법에 의해 미립자를 제조할 경우의 예를 들면, 수계 용매와 β-글루칸 수식체를 용해한 수비혼화성 유기 용매를 혼합해서 W/O 에멀션 용액을 조제하는 공정, W/O 에멀션 용액으로부터 용매를 제거하여 고형분을 얻는 공정, 고형분을 수비혼화성 유기 용매에 분산시켜 S/O 서스펜션 용액을 얻는 공정, S/O 서스펜션 용액과 표면 개질제 수용액을 혼합하여 S/O/W 에멀션 용액을 조제하는 공정, 및 S/O/W 에멀션 용액으로부터 수비혼화성 유기 용매를 제거해서 미립자를 얻는 공정에 의해 제조할 수 있다.
미립자 조제에 사용하는 표면 개질제는 수용성 폴리머 또는 계면활성제인 것이 바람직하다. 여기에서 말하는 수용성 폴리머란, 물로의 용해도가 1g(친수성 폴리머)/100㎖(물) 이상인 고분자 화합물이다.
표면 개질제가 되는 수용성 폴리머의 예로서는, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알콜, 폴리에틸렌이민, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 폴리-1,3-디옥솔란, 2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린 폴리머, 폴리-1,3,6-트리옥산, 폴리아미노산, 펩티드, 단백질, 당류, 다당류를 들 수 있지만, 폴리비닐알콜이 보다 바람직하다.
표면 개질제가 되는 계면활성제의 예로서는, 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜, 수크로오스 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌소르비탄모노 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌소르비탄디 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌글리세린모노 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌글리세린디 지방산 에스테르, 폴리글리세린 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 피마자유, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 등의 비이온성 활성제나, 라우릴황산 나트륨, 라우릴황산 암모늄, 스테아릴황산 나트륨 등의 알킬황산염 또는 레시틴을 들 수 있지만, 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜이 보다 바람직하다.
미립자 조제에 사용하는 수비혼화성 유기 용매는 β-글루칸 수식체가 가용이며, 또한 β-글루칸이 난용 또는 불용인 것이 바람직하다. 수비혼화성 유기 용매의 물로의 용해도는 바람직하게는 30g(수비혼화성 유기 용매)/100㎖(물) 이하이다. 수비혼화성 유기 용매의 구체예로서는, 아세트산 에틸, 아세트산 이소프로필, 아세트산 부틸, 탄산 디메틸, 탄산 디에틸, 염화메틸렌, 클로로포름을 들 수 있다.
미립자 조제에 사용하는 수계 용매는 물 또는 수용성 성분을 함유하는 수용액이다. 상기 수용성 성분으로서, 예를 들면 무기염류, 당류, 유기염류, 아미노산, 펩티드, 단백질, 핵산 등을 들 수 있다.
β-글루칸 수식체 미립자의 미립자 표면에는 상기 제조 과정에서 사용되는 표면 개질제가 결합되어 있어도 좋다. 여기에서 말하는 결합이란, 비공유 결합이라도 좋고 공유 결합이라도 좋다. 비공유 결합은 바람직하게는 소수적인 상호 작용이지만, 정전 상호 작용, 수소 결합, 반데르발스힘이라도 좋고, 그것들이 복합된 결합이라도 좋다.
상기 미립자의 평균 입자 지름은 0.01∼10㎛인 것이 바람직하고, 0.1∼1㎛인 것이 더욱 바람직하다. 여기에서 말하는 평균 입자 지름은 동적 광산란 장치(DLS: 예를 들면, 오츠카덴시 가부시키가이샤, ELS-Z)를 이용하여 광산란 강도 분포 및 확산 계수를 측정하고, 커뮬런트법에 의해 해석함으로써 산출했다.
면역 부활화제란 생체 내에서 면역 응답을 활성화시키는 약제이며, 본 발명의 면역 부활화제는 β-글루칸 수식체를 유효 성분으로 하는 것을 특징으로 하고 있다. 면역 부활화제가 활성화시키는 면역 응답의 종류는 한정되지 않고, 발생시키는 면역 응답의 종류로서는 Th1형 면역 응답이나 Th2형 면역 응답이 있고, 항원이나 투여 부위, 투여 방법의 종류에 따라서 어느 한쪽의 면역 응답에 우위에 발생하는 것이 알려지지만, 본 발명의 면역 부활화제는 Th1형, Th2형 양쪽 타입의 면역 응답을 발생시킬 수 있다.
본 발명의 면역 부활화제는 단독 또는 다른 약제와 병용해서 의약으로서 사용할 수 있다. 본 발명의 면역 부활화제와 다른 약제를 병용할 경우, 이것들을 배합해서 제제화해도 좋고, 각각 투여하는 것을 목적으로 각각 독립하여 제제화해도 좋다.
본 발명의 면역 부활화제와 병용하는 약제는 특별하게 제한은 없지만, 항원이 바람직하게 사용된다. 여기에서 말하는 항원이란, 생체 내에서 면역을 야기하는 물질로서, 질환의 치료 및/또는 예방을 목적으로 한 백신으로서 이용되는 것이다. 본 발명의 면역 부활화제와 항원을 병용함으로써, 항원에 의해 야기되는 면역 응답을 강화시킬 수 있다.
항원의 예로서는 펩티드, 단백질, 당단백질, 당지질, 지질, 탄수화물, 핵산, 다당류 및 이것들을 포함하는 바이러스, 균체, 알레르기 원인 물질, 조직, 세포 등을 들 수 있다. 구체적으로는 화분 유래 항원, A형 간염 바이러스 유래 항원, B형 간염 바이러스 유래 항원, C형 간염 바이러스 유래 항원, D형 간염 바이러스 유래 항원, E형 간염 바이러스 유래 항원, F형 간염 바이러스 유래 항원, HIV 바이러스 유래 항원, 인플루엔자 바이러스 유래 항원, 헤르페스 바이러스(HSV-1, HSV-2) 유래 항원, 탄저균 유래 항원, 클라디미아 유래 항원, 폐렴구균 유래 항원, 일본뇌염 바이러스 유래 항원, 홍역 바이러스 유래 항원, 풍진 바이러스 유래 항원, 파상풍균 유래 항원, 수두 바이러스 유래 항원, SARS 바이러스 유래 항원, EB 바이러스 유래 항원, 파필로마 바이러스 유래 항원, 헬리코박터·파일로리(Helicobacterpylori)균 유래 항원, 광견병 바이러스 유래 항원, 웨스트나일 바이러스 유래 항원, 한타 바이러스 유래 항원, 연쇄 구균 유래 항원, 포도상구균 유래 항원, 백일해(Bordetellapertussis)균 유래 항원, 결핵균(Mycobacteriumtuberculosis) 유래 항원, 말라리아 원충(Plasmodium) 유래 항원, 폴리오 바이러스 유래 항원, 각종 인축 공통 감염증 유래 항원, 각종 음식물 알레르기 유래 항원, 자기 항원 등을 들 수 있다.
기타, 항원의 바람직한 예로서 암 항원을 들 수 있다. 암 항원이란 암세포에 특이적으로 발현하는 단백질로부터 유래되는 물질로서, 생체 외로부터 생체 내로 투여됨으로써 면역 응답에 의해 암의 치료 및/또는 예방의 효과를 갖는 항원이다. 본 발명의 면역 부활화제와 암 항원을 함께 사용함으로써, 암의 치료 및/또는 예방을 위한 백신으로서 사용할 수 있다.
본 발명의 면역 부활화제가 β-글루칸 수식체 미립자인 경우에는 항원은 그 미립자에 봉입되는 것이 바람직하다. β-글루칸 수식체 미립자에 항원을 봉입시키는 방법으로서는, 수계 용매로서 항원 수용액을 이용하여 W/O/W 에멀션법 또는 S/O/W 에멀션법에 의해 β-글루칸 수식체 미립자를 제조하는 방법을 들 수 있다.
항원이 β-글루칸 수식체 미립자에 봉입될 경우, 그 봉입률(항원/β-글루칸 수식체)은 바람직하게는 0.01∼20%(w/w), 보다 바람직하게는 0.1∼10%(w/w)이다. 봉입률의 정량 방법으로서는 β-글루칸 수식체 미립자로부터 유기 용매를 이용하여 항원을 추출하고, 겔 전기영동 또는 액체 크로마토그래피에 의해 정량하는 방법을 들 수 있다.
본 발명의 바람직한 형태에 의하면, 본 발명의 면역 부활화제 또는 의약을 생체(피검체)에 투여하는 면역 부활화 방법이 제공된다. 본 발명의 면역 부활화제 또는 의약을 이용하여 면역 반응을 활성화(부활화)시키는 방법에 대해서는 한정되지 않고, 면역 부활화제 또는 의약을 생체에 투여해도 좋고, 생체 외로 적출한 면역 담당세포에 접촉시켜도 좋다. 생체로의 투여 방법에 특별하게 한정은 없지만, 예를 들면 피하 투여, 피내 투여, 근육내 투여, 경비 투여, 경폐 투여, 경구 투여, 경피 투여, 설하 투여, 질내 투여, 복강내 투여, 림프절 투여 등이며, 바람직하게는 피내 투여 또는 피하 투여이다. 투여하는 생체는 인간이라도 좋고 인간 이외의 동물이라도 좋지만, 바람직하게는 인간 또는 가축, 애완동물 또는 실험동물로서 사육되고 있는 돼지, 소, 새, 양, 말, 당나귀, 염소, 낙타, 개, 고양이, 페럿, 토끼, 원숭이, 래트, 마우스 또는 모르모트이다.
본 발명의 면역 부활화제를 의약(백신을 포함함)으로서 사용할 경우, 제제학적으로 유용한 각종 첨가제를 배합해서 제제화해도 좋고, 첨가제의 구체예로서는 완충제, 항산화제, 염, 폴리머 또는 당을 들 수 있다.
본 발명의 면역 부활화제를 의약으로서 사용할 경우의 β-글루칸 수식체의 투여량에 대해서는 투여 방법, 투여 횟수에 따라서 적당하게 설정되지만, 예를 들면 인간에 대하여 본 발명의 면역 부활화제를 피하 투여할 경우, β-글루칸 수식체의 양으로서 1회당 0.01∼1,000㎎이 투여된다.
본 발명의 면역 부활화제를 항원과 병용할 경우의 항원 등 다른 약제의 투여량에 대해서는 0.001∼100㎎이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 형태에 의하면, β-글루칸과 폴리(히드록시산)이 공유 결합된 β-글루칸 수식체를 유효 성분으로 하는 면역 부활화제로서, 상기 β-글루칸이 커드란, 파키만, 라미나란, 시조피란, 스클레로글루칸, 흑효모 글루칸 또는 파키마란이며, 상기 폴리(히드록시산)이 폴리(락트산-글리콜산) 공중합체인 면역 부활화제가 제공된다.
본 발명의 다른 바람직한 형태에 의하면, β-글루칸과 폴리(히드록시산)이 공유 결합된 β-글루칸 수식체를 유효 성분으로 하는 면역 부활화제 및 암 항원을 유효 성분으로서 함유하는 백신으로서, 상기 β-글루칸이 커드란, 파키만, 라미나란, 시조피란, 스클레로글루칸, 흑효모 글루칸 또는 파키마란이며, 상기 폴리(히드록시산)이 폴리(락트산-글리콜산) 공중합체인 백신이 제공된다.
실시예
이하에 실시예를 나타내지만, 본 발명은 이것들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 폴리(락트산-글리콜산) 공중합체가 수식된 라미나란[라미나란 수식체 (1)∼(8)]의 합성
(1) 라미나란의 가수분해 반응[라미나란 가수분해물 (1)∼(3)의 합성]
라미나란(수평균 분자량 25,000, 도쿄카세이코교 가부시키가이샤) 10g을 디메틸술폭시드 120㎖에 용해한 후, 0.5 규정 염산 수용액 15㎖를 첨가하고, 105℃에서 5시간 교반했다. 상기 반응 용액을 투석막으로 옮기고, 수중에서 투석을 행한 후에, 동결 건조를 행하여 라미나란 가수분해물(1)(수평균 분자량 12,700)을 분말로서 얻었다. 마찬가지의 조건으로, 1.5시간 반응시킴으로써 라미나란 가수분해물(2)(수평균 분자량 6,700)를, 2시간 반응시킴으로써 라미나란 가수분해물(3)(수평균 분자량 4,100)을 합성했다.
라미나란 및 라미나란 가수분해물의 수평균 분자량은 GPC 측정[컬럼: 토소 -TSK-gel G3000PWXL-CP×2, 아세트산 완충액계 용매(10mM, pH=5), 검출기: RI, 표준품: 풀루란]에 의해 결정했다[도 1: 라미나란 및 라미나란 가수분해물 (1)∼(3)].
(2) 라미나란의 트리메틸실릴(TMS)화 반응[TMS화 라미나란 (1)∼(4)의 합성]
라미나란(수평균 분자량 25,000, 도쿄카세이코교 가부시키가이샤) 2.4g에 포름아미드 48㎖에 첨가하고, 80℃로 가열했다. 이 용액에 1,1,1,3,3,3-헥사메틸디실라잔 48㎖를 20분 걸쳐서 적하하고, 80℃에서 2.5시간 교반했다. 상기 반응 용액을 분액 깔대기에 옮기고, 2층으로 분리될 때까지 정치했다. 상층을 회수하고, 감압 하 농축한 후, 메탄올 144㎖를 첨가하고, 얻어진 고체를 여과, 건조하여 TMS화 라미나란(1) 3.14g을 백색 고체로서 얻었다. 마찬가지의 방법으로, 라미나란 가수분해물(1)로부터 TMS화 라미나란(2)를, 라미나란 가수분해물(2)로부터 TMS화 라미나란(3)을, 라미나란 가수분해물(3)으로부터 TMS화 라미나란(4)를 합성했다.
TMS화 반응 진행은 1H-NMR 측정[도 3: TMS화 라미나란(3)]에 의해 확인했다.
(3) 라미나란에 대한 폴리(락트산-글리콜산) 공중합체의 수식 반응[라미나란 수식체 (1)∼(8)의 합성]
TMS화 라미나란(1) 0.5g과 tert-부톡시칼륨(tBuOK) 26㎎을 가열 감압 하 2시간 건조 후, 테트라히드로푸란 10㎖를 첨가하고, 1.5시간 실온에서 교반하여 활성화 용액을 얻었다. 활성화 용액의 조제에 사용한 tBuOK의 35배몰의 모노머[(DL)-락티드와 글리콜리드의 몰비 1:1의 혼합물]를 테트라히드로푸란에 용해하여 모노머 용액을 얻었다. 상기 활성화 용액에 상기 모노머 용액을 적하하고, 30분간 교반 후, 아세트산 0.5㎖ 첨가해서 반응을 정지시켰다. 반응 종료 후의 용액을 감압 하 농축하고, 클로로포름(양용매)-메탄올(빈용매)계 및 클로로포름(양용매)-시클로헥산(빈용매)계로 재침전 정제를 행하여 백색 고체를 얻었다. 얻어진 백색 고체를 클로로포름 5㎖에 용해하고, 트리플루오로아세트산 0.5㎖를 첨가하고, 실온에서 30분간 교반했다. 상기 반응 용액을 감압 하 농축하고, 클로로포름(양용매)-디에틸에테르(빈용매)계로 재침전 정제를 행하여 라미나란 수식체(1)을 백색 고체로서 얻었다.
마찬가지의 방법으로, TMS화 라미나란(1)에 tBuOK의 50배몰의 모노머를 반응시킴으로써 라미나란 수식체(2)를, TMS화 라미나란(2)에 tBuOK의 35배몰의 모노머를 반응시킴으로써 라미나란 수식체(3)을, TMS화 라미나란(2)에 tBuOK의 50배몰의 모노머를 반응시킴으로써 라미나란 수식체(4)를, TMS화 라미나란(3)에 tBuOK의 30배몰의 모노머를 반응시킴으로써 라미나란 수식체(5)를, TMS화 라미나란(3)에 tBuOK의 35배몰의 모노머를 반응시킴으로써 라미나란 수식체(6)을, TMS화 라미나란(3)에 tBuOK의 50배몰의 모노머를 반응시킴으로써 라미나란 수식체(7)을, TMS화 라미나란(4)에 tBuOK의 35배몰의 모노머를 반응시킴으로써 라미나란 수식체(8)을 합성했다.
라미나란 수식체 (1)∼(8)의 평가 결과를 표 1에 나타낸다. 라미나란 수식체의 수평균 분자량은 GPC 측정(컬럼: 토소 TSK-gel α-5000×2, DMF계 용매, 검출기: RI, 표준품: 풀루란)에 의해 결정했다[도 2: 라미나란 수식체(5)]. 라미나란 수식체에 포함되는 라미나란 세그먼트의 비율(w/w)은 합성에 사용한 라미나란의 수평균 분자량과 라미나란 수식체의 수평균 분자량으로부터 결정했다. 각 그래프트쇄의 수평균 분자량은 1H-NMR 측정에 의해 결정했다[도 4: 라미나란 수식체(5)]. 그래프트쇄 수의 평균은 라미나란 수식체의 수평균 분자량에서 라미나란의 수평균 분자량을 뺀 값을 각 그래프트쇄의 수평균 분자량으로 나눔으로써 결정했다.
Figure pct00001
실시예 2 폴리(락트산-글리콜산) 공중합체가 수식된 커드란[커드란 수식체 (9)∼(14)]의 합성
(1) 커드란의 가수분해 반응[커드란 가수분해물 (4)∼(6)의 합성]
커드란(수평균 분자량: 약 90,000, 와코쥰야쿠코교 가부시키가이샤) 12.8g을 디메틸술폭시드 384㎖에 용해한 후, 1 규정 염산 수용액 19.2㎖를 첨가하고, 110℃에서 0.75시간 교반했다. 상기 반응 용액을 투석막으로 옮기고, 수중에서 투석을 행한 후에, 동결 건조를 행하여 커드란 가수분해물(4)(수평균 분자량 2,800)를 분말로서 얻었다. 마찬가지의 조건으로, 0.8시간 반응시킴으로써 커드란 가수분해물(5)(수평균 분자량 2,300)를, 0.85시간 반응시킴으로써 커드란 가수분해물(6)(수평균 분자량 1,900)을 합성했다.
커드란의 수평균 분자량은 GPC 측정[컬럼: 토소 TSK-gel G3000PWXL-CP×2, 아세트산 완충액계 용매(10mM, pH=5), 검출기: RI, 표준품: 풀루란]에 의해 결정했다[도 5: 커드란 가수분해물 (4)∼(6)].
(2) 커드란의 트리메틸실릴(TMS)화 반응[TMS화 커드란 (5)∼(7)의 합성]
커드란 가수분해물(4) 1g을 포름아미드 20㎖에 첨가하여 80℃로 가열했다. 이 용액에 1,1,1,3,3,3-헥사메틸디실라잔 20㎖를 20분 걸쳐서 적하하고, 80℃에서 2.5시간 교반했다. 상기 반응 용액을 분액 깔대기로 옮기고, 2층으로 분리될 때까지 정치했다. 상층을 회수하여 감압 하 농축한 후, 메탄올 60㎖를 첨가하고, 얻어진 고체를 여과, 건조하여 TMS화 커드란(5) 1g을 백색 고체로서 얻었다. 마찬가지의 방법으로, 커드란 가수분해물(5)로부터 TMS화 커드란(6)을, 커드란 가수분해물(6)으로부터 TMS화 커드란(7)을 합성했다.
TMS화 반응 진행은 1H-NMR 측정에 의해 확인했다[도 7: TMS화 커드란(5)].
(3) 커드란에 대한 폴리(락트산-글리콜산) 공중합체의 수식 반응[커드란 수식체 (9)∼(14)의 합성]
TMS화 커드란(5) 0.2g과 tert-부톡시칼륨(tBuOK) 14㎎을 가열 감압 하 2시간 건조 후, 테트라히드로푸란 5㎖를 첨가하고, 1.5시간 실온에서 교반하여 활성화 용액을 얻었다. 활성화 용액의 조제에 사용한 tBuOK의 35배몰의 모노머[(DL)-락티드와 글리콜리드의 몰비 1:1의 혼합물]를 테트라히드로푸란에 용해하여 모노머 용액을 얻었다. 상기 활성화 용액에 상기 모노머 용액을 적하하고, 30분간 교반 후, 아세트산 0.2㎖ 첨가하여 반응을 정지시켰다. 반응 종료 후의 용액을 감압 하 농축하고, 클로로포름(양용매)-메탄올(빈용매)계 및 클로로포름(양용매)-시클로헥산(빈용매)계로 재침전 정제를 행하여 백색 고체를 얻었다. 얻어진 백색 고체를 클로로포름 5㎖에 용해하고, 트리플루오로아세트산 0.4㎖를 첨가하고, 실온에서 30분간 교반했다. 상기 반응 용액을 감압 하 농축하고, 클로로포름(양용매)-디에틸에테르(빈용매)계로 재침전 정제를 행하여 커드란 수식체(9)를 백색 고체로서 얻었다.
마찬가지의 방법으로, TMS화 커드란(5)에 tBuOK의 50배몰의 모노머를 반응시킴으로써 커드란 수식체(10)을, TMS화 커드란(6)에 tBuOK의 35배몰의 모노머를 반응시킴으로써 커드란 수식체(11)을, TMS화 커드란(6)에 tBuOK의 50배몰의 모노머를 반응시킴으로써 커드란 수식체(12)를, TMS화 커드란(7)에 tBuOK의 35배몰의 모노머를 반응시킴으로써 커드란 수식체(13)을, TMS화 커드란(7)에 tBuOK의 50배몰의 모노머를 반응시킴으로써 커드란 수식체(14)를 합성했다.
커드란 수식체 (9)∼(14)의 평가 결과를 표 2에 나타낸다. 커드란 수식체의 수평균 분자량은 GPC 측정(컬럼: 토소 TSK-gel α-5000×2, DMF계 용매, 검출기: RI, 표준품: 풀루란)에 의해 결정했다[도 6: 커드란 수식체(9)]. 커드란 수식체에 포함되는 커드란 세그먼트의 비율(w/w)은 합성에 사용한 커드란의 수평균 분자량과 커드란 수식체의 수평균 분자량으로부터 결정했다. 각 그래프트쇄의 수평균 분자량은 1H-NMR 측정에 의해 결정했다[도 8: 커드란 수식체(9)]. 그래프트쇄 수의 평균은 커드란 수식체의 수평균 분자량에서 커드란의 수평균 분자량을 뺀 값을 각 그래프트쇄의 수평균 분자량으로 나눔으로써 결정했다.
Figure pct00002
비교예 1 폴리(락트산-글리콜산) 공중합체가 수식된 덱스트란[덱스트란 수식체(15)]의 합성
덱스트란(수평균 분자량 4,100, SERVA사) 5g을 사용하고, 상기 실시예 1 및 실시예 2와 마찬가지의 방법으로, TMS화 덱스트란(8) 5.2g을 백색 고체로서 얻었다. 이어서, TMS화 덱스트란(8) 0.5g에 상기 실시예 1 및 실시예 2와 마찬가지의 방법으로, tert-부톡시칼륨(tBuOK)과 tBuOK의 35배몰의 모노머[(DL)-락티드와 글리콜리드의 몰비 1:1의 혼합물]를 반응시킴으로써 덱스트란 수식체(15) 0.9g을 백색 고체로서 얻었다.
덱스트란 수식체(15)의 평가 결과를 표 3에 나타낸다. 각 값에 대해서는 상기 실시예 1 및 실시예 2와 마찬가지의 방법으로 산출했다.
Figure pct00003
실시예 3 O/W 에멀션법을 사용한 미립자[커드란 미립자 (1)∼(5), 라미나란 미립자 (6), (7), PLGA 비교 미립자(8), 덱스트란 비교 미립자(9)]의 조제
표 4에 기재한 커드란 수식체 (9)∼(13) 10㎎을 아세트산 에틸 1㎖에 용해하여 폴리머 용액을 조제했다. 상기 폴리머 용액을 1%(w/v) 폴리비닐알콜 수용액 4㎖에 적하하고, 믹서(폴리트론사, PT2100S)를 사용한 11,000rpm, 1분간의 교반에 의해 O/W 에멀션 용액을 조제했다. 상기 O/W 에멀션 용액으로부터 액중 건조에 의해 아세트산 에틸을 제거하여 미립자 현탁액으로 했다. 상기 현탁액을 15㎖ 튜브로 옮기고, 8,000rpm, 10분간의 원심에 의해 미립자를 침전시켰다. 상청을 제거한 후에, 미립자를 10㎖의 증류수에 재현탁하고, 상기 조건에서의 원심에 의해 미립자를 다시 침전시켰다. 이 세정 조작을 한번 더 반복하여, 상청을 제거한 후에 미립자를 5%(w/v) 만니톨 및 0.1%(w/v) 폴리솔베이트 80을 포함하는 수용액 1.8㎖에 현탁시켰다. 상기 현탁액을 액체 질소로 예비 동결한 후, 동결 건조기(도쿄리카키카이 가부시키가이샤, FD-1000)를 사용하여 트랩 냉각 온도 -45℃, 진공도 20㎩로 12시간 동결 건조함으로써 커드란 미립자 (1)∼(5)를 얻었다.
마찬가지의 방법으로, 라미나란 수식체 (3), (8)을 각각 기재로 한 라미나란 미립자 (6), (7)을 얻었다.
또한 비교예로서, 마찬가지의 방법으로 폴리(락트산-글리콜산) 공중합체(PLGA, 수평균 분자량 5,000, 와코쥰야쿠코교 가부시키가이샤)를 기재로 한 PLGA 비교 미립자(8), 및 덱스트란 수식체(15)를 기재로 한 덱스트란 비교 미립자(9)를 얻었다.
미립자의 평균 입자 지름은 동적 광산란 장치(오츠카덴시 가부시키가이샤, ELS-Z)를 이용하여 광산란 강도 분포 및 확산 계수를 측정하고, 커뮬런트법에 의해 해석함으로써 산출했다. 결과를 표 4에 나타낸다.
Figure pct00004
실시예 4 S/O/W 에멀션법을 사용한 미립자[OVA 함유 커드란 미립자(10), 커드란 미립자(11), OVA 함유 라미나란 미립자 (12)∼(14), OVA 함유 덱스트란 비교 미립자(15)]의 조제
커드란 수식체(13) 100㎎을 탄산 디메틸 1.8㎖ 및 tert-부탄올 200㎕에 용해하여 폴리머 용액을 조제했다. 상기 폴리머 용액에 0.1%(w/v) OVA(난백 알부민, 시그마사) 수용액 1㎖를 적하하고, 믹서(폴리트론사, PT2100S)를 사용한 11,000rpm, 1분간의 교반에 의해 W/O 에멀션 용액을 제조했다. 상기 W/O 에멀션 용액을 액체 질소로 예비 동결한 후, 동결 건조기(도쿄리카키카이 가부시키가이샤, FD-1000)를 사용하여 트랩 냉각 온도 -45℃, 진공도 20㎩로 12시간 동결 건조했다. 얻어진 고형분을 아세트산 에틸 10㎖에 분산시켜 S/O 서스펜션 용액을 조제했다. 상기 S/O 서스펜션 용액을 1%(w/v) 폴리비닐알콜 수용액 40㎖에 적하하고, 믹서(실버손사, L5M-A)를 사용한 6,000rpm, 5분간의 교반에 의해 S/O/W형 에멀션 용액을 조제했다. 상기 S/O/W형 에멀션 용액으로부터 액중 건조에 의해 아세트산 에틸을 제거하여 미립자 현탁액으로 했다. 상기 현탁액을 50㎖ 튜브로 옮기고, 8,000rpm, 10분간의 원심에 의해 미립자를 침전시켰다. 상청을 제거한 후에, 미립자를 50㎖의 증류수에 재현탁하고, 상기 조건에서의 원심에 의해 미립자를 다시 침전시켰다. 이 세정 조작을 한번 더 반복하여, 상청을 제거한 후에 미립자를 5%(w/v) 만니톨 및 0.1%(w/v) 폴리솔베이트 80을 포함하는 수용액 8㎖에 현탁시켰다. 상기 현탁액을 액체 질소로 예비 동결한 후, 동결 건조기를 이용하여 트랩 냉각 온도 -45℃, 진공도 20㎩로 12시간 동결 건조함으로써 OVA 함유 커드란 미립자(10)을 얻었다.
마찬가지의 방법으로, OVA 수용액 대신에 증류수를 사용함으로써 OVA를 포함하지 않는 커드란 미립자(11)을 얻었다. 마찬가지의 방법으로, 라미나란 수식체 (1), (3), (5)를 사용함으로써 OVA 함유 라미나란 미립자 (12)∼(14)를 얻었다.
비교예로서, 마찬가지의 방법으로 덱스트란 수식체(15)를 기재로서 사용함으로써 OVA 함유 덱스트란 비교 미립자(15)를 얻었다.
미립자의 평가 결과를 표 5에 나타낸다. 미립자의 평균 입자 지름은 동적 광산란 장치(오츠카덴시 가부시키가이샤, ELS-Z)를 이용하여 커뮬런트법에 의해 산출했다. 항원의 봉입률(w/w)은 미립자로부터 유기 용매를 이용하여 항원을 추출하고, 추출한 항원을 겔 전기영동 장치(TEFCO사)에서 겔 전기영동 후에, 콜로이드 CBB 염색 키트(TEFCO사)를 이용하여 염색을 행함으로써 결정했다.
Figure pct00005
참고예 1 마우스 골수 유래 수상세포(BMDC)의 유도
수컷 C57BL/6 마우스 8주령을 탄산 가스로 안락사시킨 후에, 대퇴골을 채용했다. 대퇴골의 양단을 가위로 절단하고, 대퇴골의 내부에 주사기를 이용하여 10% FBS(시그마사), 100단위/㎖ 페니실린(라이프테크놀로지사), 100단위/㎖ 스트렙토마이신(라이프테크놀로지사)을 포함하는 RPMI1640 배지(이하, RPMI 배지)를 주입하고, 골수 용액을 회수했다. 상기 골수 용액은 1,500rpm, 5분간의 원심에 의해 세포를 침전시켜, 상청을 제거했다. 회수한 세포는 용혈용 버퍼[1.66%(w/v) 염화암모늄 수용액] 1㎖에 현탁시킨 후에, 4℃에서 4분간 정치함으로써 용혈시켰다. 용혈 후의 세포 현탁액에 RPMI 배지 10㎖를 첨가하고, 1,500rpm, 5분간의 원심에 의해 세포를 침전시켜, 상청을 제거했다. 세포는 10% FBS(시그마사), 10ng/㎖ GM-CSF, 100단위/㎖ 페니실린(라이프테크놀로지사), 100단위/㎖ 스트렙토마이신(라이프테크놀로지사)을 포함하는 RPMI1640 배지(이하, 배양 배지)에 현탁시킨 후에, 6웰 플레이트(IWAKI사, Flat Bottom Tissue culture Treated, Polystyrene)에 파종했다. 파종한 플레이트는 5% CO2, 37℃, 습도 100%의 조건으로 설정한 CO2 인큐베이터(NAPCO사) 내에서 3시간 배양하고, 마이크로피펫을 이용하여 강하게 현탁함으로써 플레이트에 접착되어 있지 않은 세포만을 회수했다. 회수한 세포는 배양 배지에 재현탁시킨 후에, 6웰 플레이트에 파종하고, CO2 인큐베이터 내에서 배양했다. 배양 2일째 및 4일째에 배양 배지의 교환을 행하고, 배양 5일째에 마이크로피펫을 이용하여 강하게 현탁함으로써 플레이트에 접착되어 있지 않은 세포, 즉 유도된 수상세포만을 회수했다.
실시예 5 마우스 골수 유래 수상세포(BMDC)를 사용한 β-글루칸 수식체의 in vitro 자극 시험
<방법>
실시예 2에서 얻어진 β-글루칸 수식체[커드란 수식체 (9)∼(12)] 10㎎을 칭량하고, 아세토니트릴 10㎖에 용해하여 폴리머 용액을 얻었다. 상기 폴리머 용액 100㎕(폴리머 100㎍분)를 6웰 플레이트에 적하하고, 건조시킴으로써 폴리머 코트 플레이트를 얻었다. 상기 폴리머 코트 플레이트에 참고예 1에서 얻어진 수상세포를 배양 배지와 함께 1웰당 1×106개가 되도록 파종했다. 파종한 플레이트는 CO2 인큐베이터 내에서 2일간 배양한 후에, 마이크로피펫을 이용하여 강하게 현탁함으로써 플레이트에 접착되어 있지 않은 세포만을 회수했다. 회수한 세포는 1,500rpm, 5분간의 원심에 의해 세포를 침전시켜, 상청을 제거하고, RPMI 배지 100㎕에 현탁시켰다. 상기 세포 현탁액에 FITC 표식 항CD86 항체 및 PE 표식 항CD11c 항체를 첨가하고, 4℃에서 15분간 정치함으로써 항체 표식 반응을 행했다. 항체 표식 반응 종료 후, 플로우사이타머트리에 의해 활성화 마커(CD86)의 발현량을 형광 강도(MFI)에 의해 평가했다.
비교예로서는 비교예 1에서 얻어진 덱스트란 수식체(15), 실시예 1에서 얻어진 TMS화 커드란(1) 또는 폴리(락트산-글리콜산) 공중합체(PLGA, 와코쥰야쿠 가부시키가이샤, PLGA-5020)를 마찬가지로 코트한 플레이트를 이용하여, 마찬가지로 활성화 마커의 발현량을 비교했다. 또한, 별도의 비교예로서, 실시예 1에서 얻어진 커드란 가수분해물(1) 100㎍ 또는 면역 활성화능이 알려져 있는 poly I:C(시그마사) 100㎍을 배양 배지에 첨가하고, 마찬가지로 활성화 마커의 발현량을 비교했다.
<결과>
CD86의 발현량의 지표인 형광 강도(MFI)를 도 9에 나타낸다. CD86은 수상세포의 활성화 마커 중 1개이다. 커드란 수식체 (9)∼(12)를 사용한 경우에는 덱스트란 수식체(15) 및 폴리(락트산-글리콜산) 공중합체를 사용했을 경우와 비교해서 CD86의 발현량이 높은 점으로부터, β-글루칸 수식체는 강한 수상세포가 활성화능을 갖는 것이 명확해졌다. 또한, 커드란 가수분해물(1) 및 TMS화 커드란(1)을 사용한 경우에는 β-글루칸 수식체를 사용했을 경우와 비교해서 CD86의 발현량이 낮은 점으로부터, 수상세포의 활성화에는 β-글루칸으로의 폴리(히드록시산)의 수식이 중요한 것이 명확해졌다.
실시예 6 마우스 골수 유래 수상세포(BMDC)를 사용한 β-글루칸 수식체를 기재로 한 미립자의 in vitro 자극 시험 1
<방법>
참고예 1에서 얻어진 수상세포를 배양 배지와 함께 1웰당 1×106개가 되도록 6웰 플레이트에 파종하고, 또한 실시예 3에서 조제한 미립자[커드란 미립자 (1)∼(5), PLGA 비교 미립자(8), 덱스트란 비교 미립자(9)] 0.2㎎을 첨가했다. 파종한 플레이트는 CO2 인큐베이터 내에서 2일간 배양하고, 마이크로피펫을 이용하여 강하게 현탁함으로써 플레이트에 접착되어 있지 않은 세포만을 회수했다. 회수한 세포는 1,500rpm, 5분간의 원심에 의해 세포를 침전시켜, 상청을 제거하고, RPMI 배지 100㎕에 현탁시켰다. 상기 세포 현탁액에 FITC 표식 항CD86 항체 및 PE 표식 항CD11c 항체를 첨가하고, 4℃에서 15분간 정치함으로써 항체 표식 반응을 행했다. 항체 표식 반응 종료 후, 플로우사이타머트리에 의해 활성화 마커(CD86)의 발현량을 형광 강도(MFI)에 의해 평가했다.
비교예로서, poly I:C(시그마사) 100㎍을 배양 배지에 첨가하고, 마찬가지로 활성화 마커의 발현량을 비교했다.
<결과>
각 미립자에 있어서의 CD86의 발현량의 지표인 형광 강도(MFI)를 도 10에 나타낸다. 미립자[커드란 미립자 (1)∼(5), PLGA 비교 미립자(8), 덱스트란 비교 미립자(8)]를 사용한 경우에는 미첨가의 경우와 비교해서 CD86의 발현량이 높은 점으로부터, 미립자가 수상세포 활성화능을 갖는 것이 명확해졌다. 또한, 커드란 수식체를 기재로 한 미립자[커드란 미립자 (1)∼(5)]를 사용한 경우에는 덱스트란 수식체를 기재로 한 미립자[덱스트란 비교 미립자(9)]나 PLGA를 기재로 한 미립자[PLGA 비교 미립자(8)]를 사용했을 경우와 비교해서 보다 강력한 수상세포 활성능을 갖는 것이 명확해졌다. β-글루칸 수식체를 기재로 한 미립자는 강한 면역 활성화능을 갖는 것이 확인되었다.
실시예 7 마우스 골수 유래 수상세포(BMDC)를 사용한 β-글루칸 수식체를 기재로 한 미립자의 in vitro 자극 시험 2
<방법>
실시예 6과 마찬가지의 방법으로, 참고예 1에서 얻어진 수상세포를 파종한 플레이트에 실시예 3에서 조제한 미립자[라미나란 미립자 (6), (7), PLGA 비교 미립자(8), 덱스트란 비교 미립자(9)] 0.2㎎을 첨가하고, 활성화 마커(CD86)의 발현량을 형광 강도(MFI)에 의해 평가했다.
비교예로서, poly I:C(시그마사) 100㎍을 배양 배지에 첨가하고, 마찬가지로 활성화 마커의 발현량을 비교했다.
<결과>
각 미립자에 있어서의 CD86의 발현량의 지표인 형광 강도(MFI)를 도 11에 나타낸다. 라미나란 수식체를 기재로 한 미립자[라미나란 미립자 (6), (7)]를 사용한 경우에는 덱스트란 수식체를 기재로 한 미립자[덱스트란 비교 미립자(9)]나 PLGA를 기재로 한 미립자[PLGA 비교 미립자(8)]를 사용했을 경우와 비교해서 보다 강한 수상세포 활성능을 갖는 것이 명확해졌다. 즉, 라미나란 수식체를 기재로 한 미립자는 실시예 6의 커드란 수식체를 기재로 한 미립자와 마찬가지로 강한 수상세포 활성화능을 갖는 것이 명확해졌다.
실시예 8 마우스를 사용한 β-글루칸 수식체의 in vivo 시험 1(IFN-γ 산생능에 의한 평가)
<방법>
실험에 사용하는 마우스는 니혼 SLC사에서 5주령으로 구입한 C57BL/6NCR 마우스 5주령 수컷을 사내 사육 시설에서 주야로 12시간 사이클의 자유 급이(給餌) 하에서 1주간 사육하여 순화했다.
마우스에 표 6에 나타내는 조건으로 투여를 행했다. 조건 (1), (2) 및 비교 조건(3)은 실시예 4에서 조제한 미립자[OVA 함유 커드란 미립자(10), OVA 함유 덱스트란 비교 미립자(15)]를 4%(w/v) 만니톨 수용액 50㎕에 분산시키고, 양쪽 뒷발 풋패드에 29G 주사 바늘(테루모사 마이젝터)을 이용하여 투여했다. 비교 조건(4)는 마찬가지의 방법으로, OVA(시그마사) 및 poly I:C(시그마사)를 투여했다. 비교 조건(5)는 마찬가지의 방법으로, 항원을 포함하지 않는 용액을 투여했다.
조건(2) 및 비교 조건 (3), (4)는 최초의 투여의 3일 후에 마찬가지의 방법으로 2회째의 투여를, 최초의 투여의 6일 후에 마찬가지의 방법으로 3회째의 투여를 행했다.
투여 후의 마우스는 자유 급이, 급수 가능한 환경에서 사육하고, 최초의 투여로부터 2주간 후에 탄산 가스를 이용하여 안락사시켰다. 투여 부위 근방의 슬하 림프절을 무균적으로 적출하고, 내포되는 세포를 분산시킨 후, 200㎛ 필터(애즈원사, FILCONS, 120-22S)로 여과하여 데브리(debris)를 제거했다. 회수한 세포는 10% FBS(시그마사), 100단위/㎖ 페니실린(라이프테크놀로지사), 100단위/㎖ 스트렙토마이신(라이프테크놀로지사)을 포함하는 RPMI1640 배지(이하, RPMI 배지)에 현탁하고, 1웰당 5×105개가 되도록 96공 플레이트(IWAKI사, Flat Bottom Tissue Culture Polystyrene)에 파종하고, 또한 OVA 10㎍, 2메르캅토에탄올 0.75㎍을 포함하는 RPMI 배지를 첨가해서 자극했다. 파종한 플레이트는 CO2 인큐베이터에서 48시간 인큐베이트 후, 배양 상청을 회수하여 ELISA법[MabTech사, Mouse IFN-gamma ELISA kit(HRP)]에 의해 각 세포군으로부터 산생된 IFN-γ 농도를 측정했다.
<결과>
림프절 세포의 산생되는 IFN-γ량을 도 12에 나타낸다. IFN-γ는 세포성 면역의 활성화를 나타내는 지표이다. OVA 함유 미립자를 투여한 조건[조건 (1), (2), 비교 조건(3)]에서는 항원을 투여하지 않는 조건[비교 조건(5)]이나 OVA와 poly I:C를 투여한 조건[비교 조건(4)]과 비교해서 강한 IFN-γ의 산생이 확인된 점으로부터, 항원을 함유한 미립자가 항원 특이적인 면역의 활성화에 유효한 것이 명확해졌다. 커드란 수식체를 기재로 한 미립자를 투여한 조건[조건 (1), (2)]에서는 덱스트란 수식체를 기재로 한 미립자를 투여한 조건[비교 조건(3)]과 비교해서 더욱 강한 IFN-γ의 산생이 확인되었다. 즉, β-글루칸 수식체를 기재로 하여 항원을 함유한 미립자는 항원 특이적인 면역을 증강하는 것이 명확해졌다. 또한, 미립자를 3회 투여한 조건[조건(2)]에서는 미립자를 1회 투여한 조건[조건(1)]과 비교해서 IFN-γ의 산생량이 높은 점으로부터, 복수회의 투여가 면역의 더 나은 증강에 유효한 것도 명확해졌다.
Figure pct00006
실시예 9 마우스를 사용한 β-글루칸 수식체의 in vivo 시험 2(IFN-γ 산생능에 의한 평가)
<방법>
실시예 8과 같은 조건으로 사육한 마우스에, 표 7에 나타내는 조건으로 투여를 행했다. 조건 (6)∼(8) 및 비교 조건(9)는 실시예 4에서 조제한 미립자[OVA 함유 라미나란 미립자 (12)∼(14), OVA 함유 덱스트란 비교 미립자(15)]를 4%(w/v) 만니톨 수용액 100㎕에 분산시키고, 양쪽 뒷발 풋패드에 29G 주사 바늘(테루모사 마이젝터)을 이용하여 투여했다. 비교 조건(10)은 마찬가지의 방법으로, OVA(시그마사) 및 poly I:C(시그마사)를 투여했다. 비교 조건(11)은 마찬가지의 방법으로, OVA(시그마사)를 투여했다. 비교 조건(12)는 마찬가지의 방법으로, 항원을 포함하지 않는 용액을 투여했다.
투여 후의 마우스는 자유 급이, 급수 가능한 환경에서 사육하고, 최초의 투여로부터 2주간 후에 탄산 가스를 이용하여 안락사시켰다. 실시예 8과 마찬가지의 방법으로, 림프절에 내포되는 세포를 인출하고, OVA로 자극 후의 IFN-γ 산생량을 측정했다.
<결과>
림프절세포의 산생되는 IFN-γ량을 도 13에 나타낸다. OVA 함유 라미나란 미립자를 투여한 조건[조건 (6)∼(8)]에서는 OVA 함유 덱스트란 비교 미립자를 투여한 조건[비교 조건(9)]이나 OVA와 poly I:C를 투여한 조건[비교 조건(10)]과 비교해서 강한 IFN-γ 산생이 관찰되었다. 라미나란 수식체를 기재로 해서 항원을 함유한 미립자는 실시예 8의 커드란 수식체를 기재로 해서 항원을 함유한 미립자와 마찬가지로, 항원 특이적인 면역을 증강하는 것이 명확해졌다.
Figure pct00007
실시예 10 마우스를 사용한 β-글루칸 수식체의 in vivo 시험 3(항종양 효과)
<방법>
담암세포로서 OVA 발현 마우스 암세포 E.G7-OVA(ATCC사)를 사전에 대수 증식 상태를 유지하고, RPMI 배지를 이용하여 1주간 배양한 후, 멸균한 PBS로 3회 세정하여 이식 세포를 조제했다.
호스트 동물로서는 니혼 SLC사에서 5주령으로 구입한 수컷 C57BL/6NCR 마우스를 폐사 사육 시설에서 주야로 12시간 사이클의 자유 급이 하에서 사육하여 순화한 후, E.G7-OVA세포 2×106개를 포함하는 PBS 100㎕를 복부 피하에 25G 주사 바늘을 이용하여 담암했다.
담암으로부터 0일째, 3일째, 7일째, 10일째 및 15일째에, 표 8에 나타내는 조건으로 투여를 행했다. 조건(13) 및 조건(14)에서는 실시예 4에서 조제한 미립자[OVA 함유 커드란 미립자(10), 커드란 미립자(11)]를 4%(w/v) 만니톨 수용액 100㎕에 분산시키고, 담암 부위 근방에 29G 주사 바늘(테루모사 마이젝터)을 이용하여 투여했다. 비교 조건(15)에서는 마찬가지의 방법으로, OVA(시그마사) 및 poly I:C(시그마사)를 투여했다. 비교 조건(16)에서는 마찬가지의 방법으로, 항원도 입자를 포함하지 않는 용액을 투여했다.
투여 후의 마우스는 자유 급이, 급수 가능한 환경에서 사육하고, 종양 조직의 체적을 측정했다.
<결과>
각 조건 5마리의 담암 후의 종양 조직의 체적 평균값을 도 14에 나타낸다. 항원을 포함하지 않는 미립자를 투여한 조건[조건(14)]에서는 항원도 입자도 투여하지 않는 조건[비교 조건(16)]과 비교해서 종양 체적의 증가가 억제되어 있는 점으로부터, β-글루칸 수식체를 기재로 한 미립자가 항종양 효과를 갖는 것이 명확해졌다. 항원을 함유한 미립자를 투여한 조건(13)에서는 항원을 포함하지 않는 미립자를 투여한 조건[조건(14)]이나 OVA와 poly I:C를 투여한 조건[비교 조건(15)]과 비교해서 종양 체적의 증가가 보다 억제되어 있었던 점으로부터, β-글루칸 수식체를 기재로 해서 항원을 함유한 미립자는 보다 강한 항종양 효과를 갖는 것이 명확해졌다.
Figure pct00008
실시예 11 폴리(락트산-글리콜산) 공중합체가 수식된 β-글루칸[파키만 수식체(16), 시조피란 수식체(17), 흑효모 글루칸 수식체(18), 스클레로글루칸 수식체(19), 커드란 수식체 (20), (21)]의 합성
(1) β-글루칸의 가수분해 반응[파키만 가수분해물(7), 시조피란 가수분해물(8), 흑효모 글루칸 가수분해물(9), 스클레로글루칸 가수분해물(10), 커드란 가수분해물 (11), (12)의 합성]
파키만(바이오서플라이사) 320㎎을 디메틸술폭시드 27㎖에 용해한 후, 1 규정 염산 수용액 1.2㎖를 첨가하고, 110℃에서 0.5시간 교반했다. 상기 반응 용액을 투석막으로 옮기고, 수중에서 투석을 행한 후에, 동결 건조를 행하여 파키만 가수분해물(7)(수평균 분자량 1,900)을 분말로서 얻었다.
마찬가지의 조건으로, 시조피란(인비보젠)을 1.3시간 반응시킴으로써 시조피란 가수분해물(8)(수평균 분자량 4,400)을, 흑효모 글루칸(다이소 가부시키가이샤)을 0.15시간 반응시킴으로써 흑효모 글루칸 가수분해물(9)(수평균 분자량 2,700)를, 스클레로글루칸(에티시틸사 제)을 1.15시간 반응시킴으로써 스클레로글루칸 가수분해물(10)(수평균 분자량 3,000)을, 커드란(와코쥰야쿠코교 가부시키가이샤)을 0.1시간 반응시킴으로써 커드란 가수분해물(11)(수평균 분자량 18,700)을, 0.75시간 반응시킴으로써 커드란 가수분해물(12)(수평균 분자량 1,900)를 얻었다.
β-글루칸의 수평균 분자량은 GPC 측정[컬럼: 토소 TSK-gel G3000PWXL-CP×2, 아세트산 완충액계 용매(10mM, pH=5), 검출기: RI, 표준품: 풀루란]에 의해 결정했다.
(2) β-글루칸의 트리메틸실릴(TMS)화 반응[TMS화 파키만(9), TMS화 시조피란(10), TMS화 흑효모 글루칸(11), TMS화 스클레로글루칸(12), TMS화 커드란 (13), (14)의 합성]
파키만 가수분해물(7) 180㎎ 디메틸술폭시드 25㎖에 첨가하여 80℃로 가열했다. 이 용액에 1,1,1,3,3,3-헥사메틸디실라잔 20㎖를 20분 걸쳐서 적하하고, 80℃에서 16시간 교반했다. 상기 반응 용액을 분액 깔대기로 옮기고, 2층으로 분리될 때까지 정치했다. 상층을 회수하여 감압 하 농축한 후, 메탄올 5㎖를 첨가하고, 얻어진 고체를 여과, 건조하여 TMS화 파키만(9) 250㎎을 백색 고체로서 얻었다.
마찬가지의 방법으로, 시조피란 가수분해물(8)로부터 TMS화 시조피란(10)을, 흑효모 글루칸 가수분해물(9)로부터 TMS화 흑효모 글루칸(11)을, 스클레로글루칸 가수분해물(10)으로부터 TMS화 스클로레로글루칸(12)를, 커드란 가수분해물(11)로부터 TMS화 커드란(13)을, 커드란 가수분해물(12)로부터 TMS화 커드란(14)를 합성했다.
TMS화 반응 진행은 1H-NMR 측정에 의해 확인했다.
(3) β-글루칸에 대한 폴리(락트산-글리콜산) 공중합체의 수식 반응[파키만 수식체(16), 시조피란 수식체(17), 흑효모 글루칸 수식체(18), 스클레로글루칸 수식체(19), 커드란 수식체 (20), (21)의 합성]
TMS화 파키만(9) 230㎎과 tert-부톡시칼륨(tBuOK) 22㎎을 가열 감압 하 2시간 건조 후, 테트라히드로푸란 10㎖를 첨가하고, 1.5시간 실온에서 교반하여 활성화 용액을 얻었다. 활성화 용액의 조제에 사용한 tBuOK의 35배몰의 모노머[(DL)-락티드와 글리콜리드의 몰비 1:1의 혼합물]를 테트라히드로푸란에 용해하여 모노머 용액을 얻었다. 상기 활성화 용액에 상기 모노머 용액을 적하하고, 30분간 교반 후, 아세트산 0.2㎖ 첨가해서 반응을 정지시켰다. 반응 종료 후의 용액을 감압 하 농축하고, 클로로포름(양용매)-메탄올(빈용매)계 및 클로로포름(양용매)-시클로헥산(빈용매)계로 재침전 정제를 행하여 백색 고체를 얻었다. 얻어진 백색 고체를 클로로포름 9㎖에 용해하고, 트리플루오로 아세트산 1㎖를 첨가하여 실온에서 30분간 교반했다. 상기 반응 용액을 감압 하 농축하고, 클로로포름(양용매)-디에틸에테르(빈용매)계로 재침전 정제를 행하여 파키만 수식체(16) 287㎎을 백색 고체로서 얻었다.
마찬가지의 방법으로, TMS화 시조피란(10)으로부터 시조피란 수식체(17)을, TMS화 흑효모 글루칸(11)로부터 흑효모 글루칸 수식체(18)을, TMS화 스클레로글루칸(12)로부터 스클레로글루칸 수식체(19), TMS화 커드란(13)으로부터 커드란 수식체(20), TMS화 커드란(14)로부터 커드란 수식체(21)을 합성했다.
β-글루칸 수식체의 평가 결과를 표 9에 나타낸다. β-글루칸 수식체의 수평균 분자량은 GPC 측정(컬럼: 토소 TSK-gel α-5000×2, DMF계 용매, 검출기: RI, 표준품: 풀루란)에 의해 결정했다. β-글루칸 수식체에 포함되는 β-글루칸 세그먼트의 비율(w/w)은 합성에 사용한 β-글루칸의 수평균 분자량과 β-글루칸 수식체의 수평균 분자량으로부터 결정했다. 각 그래프트쇄의 수평균 분자량은 1H-NMR 측정에 의해 결정했다[도 15: 파키만 수식체(16), 도 16: 시조피란 수식체(17), 도 17: 흑효모 글루칸 수식체(18), 도 18: 스클레로글루칸 수식체(19)]. 그래프트쇄 수의 평균은 β-글루칸 수식체의 수평균 분자량에서 β-글루칸의 수평균 분자량을 뺀 값을 각 그래프트쇄의 수평균 분자량으로 나눔으로써 결정했다.
Figure pct00009
실시예 12 폴리(락트산-글리콜산) 공중합체가 수식된 파키마란[파키마란 수식체(22)]의 합성
(1) 파키만의 산화 개열 반응(파키마란의 합성)
파키만(바이오서플라이사) 1g에 물 120㎖에 혼합시키고, 0.1M 과요오드산 나트륨 수용액 40㎖를 첨가하고, 실온에서 40시간 교반한 후에, 원심 분리에 의해 반응물을 회수했다. 상기 반응물에 물 54㎖에 혼합시키고, 수소화붕소나트륨 216m를 포함하는 수용액 27㎖를 첨가하고, 실온에서 28시간 교반한 후에, 원심 분리에 의해 반응물을 회수했다. 상기 반응물에 0.05M 황산 수용액 70㎖에 혼합시키고, 실온에서 24시간 교반한 후에, 원심 분리에 의해 파키마란 0.91g을 회수했다.
(2) 파키마란의 가수분해 반응[파키마란 가수분해물(13)의 합성]
상기 실시예 11과 마찬가지의 방법으로 가수분해를 행하고, 파키마란 360㎎을 이용하여 파키마란 가수분해물(13)(수평균 분자량 2,100) 229㎎을 분말로서 얻었다.
(3) 파키마란의 트리메틸실릴(TMS)화 반응[TMS화 파키마란(15)의 합성]
상기 실시예 11과 마찬가지의 방법으로 TMS화를 행하고, 파키마란 가수분해물(13) 200㎎을 이용하여 TMS화 파키마란(15) 325㎎을 백색 고체로서 얻었다.
(4) 파키마란에 대한 폴리(락트산-글리콜산) 공중합체의 수식 반응[파키마란 수식체(22)의 합성]
상기 실시예 11과 마찬가지의 방법으로, TMS화 파키마란(15) 300㎎에 tert-부톡시칼륨(tBuOK)과 tBuOK의 35배몰의 모노머[(DL)-락티드와 글리콜리드의 몰비 1:1의 혼합물]를 반응시킴으로써 파키마란 수식체(22) 353㎎을 백색 고체로서 얻었다.
파키마란 수식체(22)의 평가 결과를 표 10에 나타낸다. 각 값에 대해서는 상기 실시예 11과 마찬가지의 방법으로, GPC 측정 및 1H-NMR 측정에 의해 결정했다[도 19: 파키마란 수식체(22)의 1H-NMR 측정].
Figure pct00010
실시예 13 O/W 에멀션법을 사용한 미립자 2[파키만 미립자(16), 시조피란 미립자(17), 흑효모 글루칸 미립자(18), 스클레로글루칸 미립자(19), 커드란 미립자(20), 파키마란 미립자(21), 덱스트란 비교 미립자(22)]의 조제
파키만 수식체(16) 10㎎을 아세트산 에틸 1㎖에 용해하여 폴리머 용액을 조제했다. 상기 폴리머 용액을 1%(w/v) 폴리비닐알콜 수용액 4㎖에 적하하고, 믹서(폴리트론사, PT2100S)를 사용한 11,000rpm, 5분간의 교반에 의해 O/W 에멀션 용액을 조제했다. 상기 O/W 에멀션 용액으로부터 액중 건조에 의해 아세트산 에틸을 제거하여 미립자 현탁액으로 했다. 상기 현탁액을 15㎖ 튜브에 옮기고, 8,000rpm, 10분간의 원심에 의해 미립자를 침전시켰다. 상청을 제거한 후에, 미립자를 10㎖의 증류수에 재현탁하고, 상기 조건에서의 원심에 의해 미립자를 다시 침전시켰다. 이 세정 조작을 한번 더 반복하여, 상청을 제거한 후에 미립자를 5%(w/v) 만니톨 및 0.1%(w/v) 폴리솔베이트 80을 포함하는 수용액 1.8㎖에 현탁시켰다. 상기 현탁액을 액체 질소로 예비 동결한 후, 동결 건조기(도쿄리카키카이 가부시키가이샤, FD-1000)를 사용하여 트랩 냉각 온도 -45℃, 진공도 20㎩로 12시간 동결 건조함으로써 파키만 미립자(16)을 얻었다.
마찬가지의 방법으로, 시조피란 수식체(17)을 기재로 한 시조피란 미립자(17)을, 흑효모 글루칸 수식체(18)을 기재로 한 흑효모 글루칸 미립자(18)을, 스클레로글루칸 수식체(19)를 기재로 한 스클레로글루칸 미립자(19)를, 커드란 수식체(20)을 기재로 한 커드란 미립자(20)을, 파키마란 수식체(22)를 기재로 한 파키마란 미립자(21)을 얻었다.
또한 비교예로서, 마찬가지의 방법으로 덱스트란 수식체(15)를 기재로 한 덱스트란 비교 미립자(22)를 얻었다.
미립자의 평균 입자 지름을 동적 광산란 장치(오츠카덴시 가부시키가이샤, ELS-Z)를 이용하여 커뮬런트법에 의해 산출한 결과를 표 11에 나타낸다.
Figure pct00011
실시예 14 S/O/W 에멀션법을 사용한 미립자[OVA 함유 커드란 미립자 (23), (24), OVA 함유 스클레로글루칸 미립자(25)]의 조제
커드란 수식체(21) 100㎎을 탄산 디메틸 2.6㎖ 및 tert-부탄올 200㎕에 용해하여 폴리머 용액을 조제했다. 상기 폴리머 용액에 0.5%(w/v) OVA(난백 알부민, 시그마사) 수용액 1㎖를 적하하고, 믹서(폴리트론사, PT2100S)를 사용한 11,000rpm, 1분간의 교반에 의해 W/O 에멀션 용액을 제조했다. 상기 W/O 에멀션 용액을 액체 질소로 예비 동결한 후, 동결 건조기(도쿄리카키카이 가부시키가이샤, FD-1000)를 사용하여 트랩 냉각 온도 -45℃, 진공도 20㎩로 12시간 동결 건조했다. 얻어진 고형분을 아세트산 에틸 10㎖에 분산시켜서 S/O 서스펜션 용액을 조제했다. 상기 S/O 서스펜션 용액을 1%(w/v) 폴리비닐알콜 수용액 40㎖에 적하하고, 믹서(실버손사, L5M-A)를 사용한 6,000rpm, 5분간의 교반에 의해 S/O/W형 에멀션 용액을 조제했다. 상기 S/O/W형 에멀션 용액으로부터 액중 건조에 의해 아세트산 에틸을 제거하여 미립자 현탁액으로 했다. 상기 현탁액을 50㎖ 튜브에 옮기고, 8,000rpm, 10분간의 원심에 의해 미립자를 침전시켰다. 상청을 제거한 후에, 미립자를 50㎖의 증류수에 재현탁하고, 상기 조건에서의 원심에 의해 미립자를 다시 침전시켰다. 이 세정 조작을 한번 더 반복하여, 상청을 제거한 후에 미립자를 5%(w/v) 만니톨 및 0.1%(w/v) 폴리솔베이트 80을 포함하는 수용액 8㎖에 현탁시켰다. 상기 현탁액을 액체 질소로 예비 동결한 후, 동결 건조기를 이용하여 트랩 냉각 온도 -45℃, 진공도 20㎩로 12시간 동결 건조함으로써 OVA 함유 커드란 미립자(23)을 얻었다.
마찬가지의 방법으로, 커드란 수식체(20)을 사용함으로써 OVA 함유 커드란 미립자(24)를, 스클레로글루칸 수식체(19)를 사용함으로써 OVA 함유 스클레로글루칸 미립자(25)를 얻었다.
미립자의 평가 결과를 표 12에 나타낸다. 미립자의 평균 입자 지름은 동적 광산란 장치(오츠카덴시 가부시키가이샤, ELS-Z)를 이용하여 커뮬런트법에 의해 산출했다. 항원의 봉입률(w/w)은 미립자로부터 유기 용매를 이용하여 항원을 추출하고, 추출한 항원을 겔 전기영동 장치(TEFCO사)에서 겔 전기영동 후에, 콜로이드 CBB 염색 키트(TEFCO사)를 이용하여 염색을 행함으로써 결정했다.
Figure pct00012
실시예 15 마우스 골수 유래 수상세포(BMDC)를 사용한 β-글루칸 수식체[파키만 수식체(16), 시조피란 수식체(17), 흑효모 글루칸 수식체(18), 파키마란 수식체(22)]의 in vitro 자극 시험 2
<방법>
실시예 11에서 얻어진 β-글루칸 수식체[파키만 수식체(16), 시조피란 수식체(17), 흑효모 글루칸 수식체(18), 파키마란 수식체(22)] 10㎎을 칭량하고, 아세토니트릴 1㎖에 용해하여 폴리머 용액을 얻었다. 상기 폴리머 용액 100㎕(폴리머 1㎎분)를 12웰 플레이트에 적하하고, 건조시킴으로써 폴리머 코트 플레이트를 얻었다. 상기 폴리머 코트 플레이트에 참고예 1에서 얻어진 수상세포를 배양 배지와 함께 1웰당 3×105개가 되도록 파종했다. 파종한 플레이트는 CO2 인큐베이터 내에서 2일간 배양한 후에, 마이크로피펫을 이용하여 강하게 현탁함으로써 플레이트에 접착되어 있지 않은 세포만을 회수했다. 회수한 세포는 1,500rpm, 5분간의 원심에 의해 세포를 침전시켜 상청을 제거하고, RPMI 배지 100㎕에 현탁시켰다. 상기 세포 현탁액에 FITC 표식 항CD86 항체 및 PE 표식 항CD11c 항체를 첨가하고, 4℃에서 15분간 정치함으로써 항체 표식 반응을 행했다. 항체 표식 반응 종료 후, 플로우사이타머트리에 의해 수상세포(CD11c 양성세포)에 있어서의 활성화 마커(CD86)의 발현량을 형광 강도(MFI)에 의해 평가했다.
비교예로서는, 비교예 1에서 얻어진 덱스트란 수식체(15)와 마찬가지로 코트한 플레이트를 이용하여, 마찬가지로 활성화 마커의 발현량을 비교했다. 또한, 별도의 비교예로서는 실시예 11에서 얻어진 미수식의 β-글루칸[파키만 가수분해물(7), 시조피란 가수분해물(8), 흑효모 글루칸 가수분해물(9), 파키마란 가수분해물(13)] 1㎎ 또는 면역 활성화능이 알려져 있는 poly I:C(시그마사) 100㎍을 배양 배지에 첨가하고, 마찬가지로 활성화 마커의 발현량을 비교했다.
<결과>
수상세포의 활성화 마커인 CD86의 발현량의 지표인 형광 강도(MFI)를 도 20에 나타낸다. β-글루칸 수식체를 사용한 경우에는 덱스트란 수식체(15)를 사용했을 경우와 비교해서 CD86의 발현량이 높은 점으로부터, β-글루칸 수식체는 강한 수상세포가 활성화능을 갖는 것이 명확해졌다. 미수식의 β-글루칸을 사용한 경우에는 β-글루칸 수식체를 사용했을 경우와 비교해서 CD86의 발현량이 낮은 점으로부터, β-글루칸으로의 폴리(히드록시산)의 수식이 면역 활성화능에 중요한 것이 명확해졌다. 또한, 선상의 β-글루칸의 수식체[실시예 4: 커드란 수식체 (9)∼(12), 본 실시예: 파키만 수식체(16)]뿐만 아니라, 분기상의 β-글루칸의 수식체[본 실시예: 시조피란 수식체(17), 흑효모 글루칸 수식체(18)]나 유도체화된 β-글루칸의 수식체[본 실시예: 파키마란 수식체(22)]도 면역 활성화능을 갖는 것이 확인되었다.
실시예 16 마우스 골수 유래 수상세포(BMDC)를 사용한 β-글루칸 수식체를 기재로 한 미립자[파키만 미립자(16), 시조피란 미립자(17), 흑효모 글루칸 미립자(18), 스클레로글루칸 미립자(19), 커드란 미립자(20), 파키마란 미립자(21)]의 in vitro 자극 시험 2
참고예 1에서 얻어진 수상세포를 배양 배지와 함께 1웰당 3×105개가 되도록 12웰 플레이트에 파종하고, 또한 β-글루칸 수식체를 기재로 한 미립자[파키만 미립자(16), 시조피란 미립자(17), 흑효모 글루칸 미립자(18), 스클레로글루칸 미립자(19), 커드란 미립자(20), 파키마란 미립자(21)] 0.05㎎을 첨가했다. 파종한 플레이트는 CO2 인큐베이터 내에서 2일간 배양하고, 마이크로피펫을 이용하여 강하게 현탁함으로써 플레이트에 접착되어 있지 않은 세포만을 회수했다. 회수한 세포는 1,500rpm, 5분간의 원심에 의해 세포를 침전시켜 상청을 제거하고, RPMI 배지 100㎕에 현탁시켰다. 상기 세포 현탁액에 FITC 표식 항CD86 항체 및 PE 표식 항CD11c 항체를 첨가하고, 4℃에서 15분간 정치함으로써 항체 표식 반응을 행했다. 항체 표식 반응 종료 후, 플로우사이타머트리에 의해 수상세포(CD11c 양성세포)의 활성화 마커(CD86)의 발현량을 형광 강도(MFI)에 의해 평가했다.
비교예로서, 덱스트란을 기재로 한 미립자[덱스트란 비교 미립자(22)] 0.05㎎을 배양 배지에 첨가하고, 마찬가지로 활성화 마커의 발현량을 비교했다.
<결과>
각 미립자에 있어서의 CD86의 발현량의 지표인 형광 강도(MFI)를 도 21에 나타낸다. β-글루칸 수식체를 기재로 한 미립자[파키만 미립자(16), 시조피란 미립자(17), 흑효모 글루칸 미립자(18), 스클레로글루칸 미립자(19), 커드란 미립자(20), 파키마란 미립자(21)]를 사용한 경우에는 미첨가의 경우 및 덱스트란 수식체를 기재로 한 미립자[덱스트란 비교 미립자(22)]를 사용했을 경우와 비교해서 CD86의 발현량이 높은 점으로부터, β-글루칸 수식체를 기재로 한 미립자가 수상세포를 강하게 활성시키고 있는 것이 명확해졌다.
실시예 17 마우스를 사용한 β-글루칸 수식체의 in vivo 시험 4(IFN-γ 산생능에 의한 평가)
<방법>
실험에 사용하는 마우스는 니혼 SLC사에서 5주령으로 구입한 C57BL/6NCR 마우스 5주령 수컷을 사내 사육 시설에서 주야로 12시간 사이클의 자유 급이 하에서 1주간 사육하여 순화했다.
마우스에 표 13에 나타내는 조건으로 투여를 행했다. 조건 (17)∼(19)는 실시예 14에서 조제한 미립자[OVA 함유 커드란 미립자 (23), (24), OVA 함유 스클레로글루칸 미립자(25)]를 4%(w/v) 만니톨 수용액 50㎕에 분산시키고, 양쪽 뒷발 풋패드에 29G 주사 바늘(테루모사 마이젝터)을 이용하여 투여했다. 비교 조건(20)은 마찬가지의 방법으로, OVA(시그마사) 및 커드란 가수분해물(12)를 투여했다.
모든 조건에서, 첫회 투여의 3일 후에 마찬가지의 방법으로 2회째의 투여를, 첫회 투여의 7일 후에 마찬가지의 방법으로 3회째의 투여를, 첫회 투여의 10일 후에 마찬가지의 방법으로 4회째의 투여를 행했다.
투여 후의 마우스는 자유 급이, 급수 가능한 환경에서 사육하고, 첫회 투여로부터 16일 후에 탄산 가스를 이용하여 안락사시켰다. 투여 부위 근방의 슬하 림프절을 무균적으로 적출하고, 내포되는 세포를 분산시킨 후, 200㎛ 필터(애즈원사, FILCONS, 120-22S)로 여과하여 데브리를 제거했다. 회수한 세포는 10% FBS(시그마사), 100단위/㎖ 페니실린(라이프테크놀로지사), 100단위/㎖ 스트렙토마이신(라이프테크놀로지사)을 포함하는 RPMI1640 배지(이하, RPMI 배지)에 현탁하고, 1웰당 5×105개가 되도록 96공 플레이트(IWAKI사, Flat Bottom Tissue Culture Polystyrene)에 파종하고, 또한 OVA 10㎍, 2메르캅토에탄올 0.75㎍을 포함하는 RPMI 배지를 첨가해서 자극했다. 파종한 플레이트는 CO2 인큐베이터에서 48시간 인큐베이트 후, 배양 상청을 회수하여 ELISA법[MabTech사, Mouse IFN-gamma ELISA kit(HRP)]에 의해 각 세포군으로부터 산생된 IFN-γ 농도를 측정했다.
<결과>
림프절세포의 산생되는 IFN-γ량을 도 22에 나타낸다. IFN-γ는 세포성 면역의 활성화를 나타내는 지표이다. 커드란 수식체를 기재로 한 OVA 함유 미립자를 투여한 조건[조건(17)]에서는 OVA와 미수식의 커드란을 투여한 조건[비교 조건(20)]과 비교해서 강한 IFN-γ의 산생이 확인된 점으로부터, in vivo에 있어서도 β-글루칸 수식체가 미수식의 β-글루칸과 비교해서 강한 면역 활성화능을 갖는 것이 명확해졌다. 또한, 고분자량의 커드란 수식체를 기재로 한 OVA 함유 미립자를 투여한 조건[조건(18)]이나 분기상의 스클레로글루칸 수식체를 기재로 한 OVA 함유 미립자를 투여한 조건[조건(19)]에 있어서도 강한 IFN-γ의 산생이 확인된 점으로부터, 분자량이나 선상과 분기상의 차이에 상관없이 β-글루칸 수식체가 강한 면역 활성화능을 갖는 것이 나타내어졌다.
Figure pct00013
(산업상의 이용 가능성)
본 발명의 면역 부활화제는 의약으로서, 특히 감염증이나 암 등의 치료 및/또는 예방을 위한 백신을 위한 면역 활성화제로서 이용할 수 있다.

Claims (12)

  1. β-글루칸과 폴리(히드록시산)이 공유 결합된 β-글루칸 수식체를 유효 성분으로 하는, 면역 부활화제.
  2. 제 1 항에 있어서,
    β-글루칸은 1개 이상의 β-1,3 결합 및/또는 1개 이상의 β-1,6 결합으로 연결된 글루코오스의 중합체인, 면역 부활화제.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    β-글루칸 수식체는 β-글루칸의 주쇄 및 폴리(히드록시산)의 측쇄로 구성되는 그래프트형 폴리머인, 면역 부활화제.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    β-글루칸 세그먼트의 비율은 1∼50%(w/w)인, 면역 부활화제.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    β-글루칸은 커드란, 파키만, 라미나란, 리케난, 시조피란, 렌티난, 스클레로글루칸, 흑효모 글루칸 또는 파키마란인, 면역 부활화제.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    β-글루칸의 수평균 분자량은 500∼100,000인, 면역 부활화제.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    폴리(히드록시산)은 폴리(락트산-글리콜산) 공중합체, 폴리락트산 또는 폴리글리콜산인, 면역 부활화제.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    β-글루칸 수식체의 미립자를 유효 성분으로 하는, 면역 부활화제.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 기재된 면역 부활화제를 유효 성분으로서 함유하는, 의약.
  10. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 기재된 면역 부활화제 및 항원을 유효 성분으로서 함유하는, 백신.
  11. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 기재된 면역 부활화제 및 암 항원을 유효 성분으로서 함유하는, 암의 치료 및/또는 예방을 위한 백신.
  12. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 기재된 면역 부활화제 또는 제 9 항에 기재된 의약을 생체에 투여하는, 면역 부활화 방법.
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