JP6008345B2 - 免疫原性組成物 - Google Patents
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Description
(1)すず触媒存在下、多糖にヒドロキシ酸活性化モノマーを加えて重合反応を行い、ポリ(ヒドロキシ酸)を導入することでグラフト型両親媒性ポリマーを製造する方法[Macromolecules,31,p.1032−1039(1998年)]
(2)水酸基の大部分が置換基で保護された多糖の一部未保護の水酸基を塩基で活性化後、ヒドロキシ酸活性化モノマーを加えてポリ(ヒドロキシ酸)からなるグラフト鎖を導入し、最後に保護基を取り除くことにより、グラフト型両親媒性ポリマーを製造する方法[Polymer,44,p.3927−3933,(2003年)]
(3)多糖に対して、ポリ(ヒドロキシ酸)の共重合体を脱水剤および/または官能基の活性化剤を用いて縮合反応させることにより、グラフト型両親媒性ポリマーを製造する方法[Macromolecules,33,p.3680−3685(2000年)]。
(1−1)TMS−デキストランの合成
デキストラン(ナカライテスク株式会社、ナカライ規格特級適合品、数平均分子量13,000、5.0g)をホルムアミド(100ml)に加え、80℃に加熱した。この溶液に1,1,1,3,3,3−ヘキサメチルジシラザン(100ml)を20分掛けて滴下した。滴下終了後、80℃で2時間攪拌した。反応終了後、反応溶液を室温に戻し、分液漏斗で2層を分離した。上の層を減圧下濃縮した後、メタノール(300ml)を加え、得られた固体をろ過、乾燥し、TMS−デキストラン(化合物(1))(11.4g)を白色固体として得た。
化合物(1)(0.5g)とtert−ブトキシカリウム(35mg)を加熱減圧下2時間乾燥後、テトラヒドロフラン(10ml)を加え、1.5時間室温で攪拌した。この溶液に(DL)−ラクチド(0.56g)とグリコリド(0.45g)のテトラヒドロフラン(15ml)溶液を滴下し、5分間攪拌後、酢酸を2滴加えて反応を停止させた。反応終了後、溶媒を減圧下濃縮し、クロロフォルム−メタノール系およびクロロフォルム−ジエチルエーテル系で再沈殿精製を行うことによって得られる白色固体をクロロフォルム(9ml)に溶解した。この溶液にトリフルオロ酢酸(1.0ml)を加え、室温で30分間攪拌した。反応終了後、溶媒を減圧下留去後、残渣をクロロフォルム(10ml)に溶解し、0℃に冷却したジエチルエーテルに滴下することにより得られた生成物をろ過することによりデキストラン−PLGAを白色固体として得た(化合物(12))。同様な方法で、(DL)−ラクチド(0.78g)とグリコリド(0.63g)の仕込量で化合物(13)を、同様な方法で、(DL)−ラクチド(1.12g)とグリコリド(0.9g)の仕込量で化合物(14)を、同様な方法で(DL)−ラクチド(1.67g)とグリコリド(1.35g)の仕込量で化合物(15)を合成した。
ポリエチレングリコールモノメチルエーテル(日本油脂株式会社製 SUNBRIGHT MEH−20H、数平均分子量5,128、Mw/Mn=1.02)、(DL)−ラクチドとグリコリドを表2の仕込量で混合し、140℃に加熱した。20分攪拌後、オクチル酸すず(II)(ポリエチレングリコールモノメチルエーテルに対して0.05重量%)を加え、180℃で3時間攪拌した。反応液を室温に戻した後、クロロフォルム(約100mg/ml濃度になるよう)に溶解し、0℃に冷却したジエチルエーテルで再沈殿精製し、得られた固体を濾別、減圧乾燥することでPEG−PLGAポリマーを白色、または薄茶色の固体として得た。本ポリマーの数平均分子量は1H−NMRから求めた(表2)。
実施例1のデキストラン-ポリ(乳酸−グリコール酸)(PLGA)(化合物(12)〜(23))5mgを炭酸ジメチル100μlに溶解し、50mg/mlのポリマー溶液を調製した。該ポリマー溶液にtert−ブタノール20μlを添加後、表3の内包抗原((OVA(卵白アルブミン)(シグマ社)またはCEA(癌胎児性抗原)(コスモバイオ社))および免疫活性化物質(CpG)を表記の濃度で50μlを滴下し、ボルテックスで撹拌して逆相エマルジョンを製造した。CpGとしては5’−gggggggCGACGATCGTCAgG−3’(配列中の小文字は、ホスホロチオエート修飾塩基を表わす)(シグマジェノシス社に委託合成)を用いた。
実施例2で作製したPEG−PLGAポリマー(化合物(10)、(11))5mgを炭酸ジメチル100μlに溶解し、50mg/mlのポリマー溶液を調製した。該ポリマー溶液にtert−ブタノールを20μl添加後、表4に示す抗原含有溶液50μlを加え、攪拌することで逆相エマルジョン溶液を製造した。該逆相エマルジョン溶液を、液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機(EYELA、FREEZE DRYER FD−1000)を用いて、トラップ冷却温度−45℃、真空度20Paにて24時間凍結乾燥した。得られた固形分を表4に示す量の酢酸エチルに分散させ、S/Oサスペンションを調製した。該S/Oサスペンションを10%Pluronic F−68含有水溶液2mlに滴下し、ボルテックスミキサーで撹拌・乳化させてS/O/W型エマルジョンを調製した。該S/O/W型エマルジョンから液中乾燥により水非混和性有機溶媒を除去して、抗原−アジュバント微粒子複合体分散液とした。該分散液を液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機(EYELA、FREEZE DRYER FD−1000)を用いて、トラップ冷却温度−45℃、真空度20Paにて24時間凍結乾燥することで抗原−アジュバント微粒子複合体乾燥粉末を得た。抗原−アジュバント微粒子複合体の平均粒径を走査型電子顕微鏡(SEM:株式会社日立製作所製 S−4800)により観察することで算出した結果を表4に示す。
抗原を含有したPLGA粒子に関しては既知の技術(インターナショナル・ジャーナル・オブ・ファーマスティックス、2007年、334号、137-148ページ)を用いて調製した。PLGA(SIGMA社製、平均分子量40,000−75,000)200mgを塩化メチレン 15mlに溶解させ13.3mg/mlのPLGA溶液を調製した。5mg/mlのOVA水溶液100μlを該ポリマー溶液2mlに19,000rpm(Polytron社製ホモジナイザー)で攪拌した状態で添加し、さらに5分間同様に攪拌することでW/O溶液を製造した。該W/O溶液を1%ポリビニルアルコール水溶液20mLに19,000rpmで攪拌した状態で添加し、さらに5分間同様に攪拌することでW/O/W溶液を製造した。該W/O/W溶液を200rpmで12時間攪拌した後に、液体窒素で予備凍結し、凍結乾燥機(EYELA、FREEZE DRYER FD−1000)を用いて、トラップ冷却温度−45℃、真空度20Paにて12時間凍結乾燥することで、抗原を含有したPLGA粒子を得た。得られた粒子を走査型電子顕微鏡(SEM:株式会社日立製作所製 S−4800)により観察することで平均粒径を算出したところ、2μmであった。また、同様の方法でCEA水溶液(0.25mg/ml)を用いてPLGA粒子(2)を作製し、同様にSEMにて平均粒径を算出したところ、2μmであった。
<方法>
実施例3および4の方法で作成したCEA−アジュバント微粒子複合体またはその会合粒子(以下、CEA内包粒子という。)20mgを1.5mlエッペンドルフチューブに秤量し、1mlの緩衝液A(0.1%ウシ血清アルブミン、0.1%PluronicF−68および0.02%アジ化ナトリウムを含むPBS)に溶解して18,000×g、10分間の遠心により粒子(沈殿)と上清を分離した。上清を別のチューブに回収した後、粒子を1mlの緩衝液に再けん濁し、上記条件での遠心による粒子と上清の分離を再度行った。この洗浄操作をもう一度繰り返し(計3回遠心)、各遠心で回収した上清中のCEA濃度はELISAキット(Hope Laboratories社製 TM−201)を用いて測定した。
CEA内包粒子の抗原内包率は表5のようになり、いずれのCEA内包粒子も高い効率で抗原が内包されていることが示された。抗原の保持性は疎水グラフト鎖の短いDex−g−PLGA粒子(7)で低く、1週間の間に内包する抗原の67.3%が放出された。一方、疎水グラフト鎖が長くなるにつれ、抗原の保持性は上昇し、疎水グラフト鎖の長いDex−g−PLGA粒子では1週間後も仕込抗原の90%程度が含有されたままであった。PEG−PLGA粒子も1週間で4%程度の抗原が放出されるに留まり、高い抗原保持性を示した。
<方法>
実施例3および4で作製したOVA−アジュバント微粒子複合体会合粒子(以下、OVA内包会合粒子)またはOVA−アジュバント微粒子複合体(以下、OVA内包粒子)のうち、疎水鎖の長さの異なるOVA内包会合粒子(Dex−g−PLGA粒子(2)(3)(4))、Dex−g−PLGA粒子(3)と粒径の異なるOVA内包会合粒子およびOVA内包粒子(Dex−g−PLGA粒子(5)(6))、PEG−PLGA粒子(3)それぞれ40mg(抗原仕込み量50μg)を3mlのリン酸生理緩衝液(PBS)にけん濁分散させ80×g、5分間の遠心により粒子を沈殿させ、上清を別チューブに移した。上清は再度80×g、5分間の遠心を行って残存している粒子を沈殿させ、上清は除去した。1回目の遠心沈殿と2回目の遠心沈殿をあわせて1mlのPBSに再分散し、同様の遠心洗浄操作を3回繰り返すことにより、粒子に内包されていない抗原を除去した。最後に沈殿を150μlのPBSに再分散して、投与溶液とした。本溶液を、9週令の雄Balb/Cマウス(日本SLC社)の背部皮下に単回注射投与した。比較例としては比較例1で製造したPLGA粒子または抗原溶液(50μl)のみ、さらに参考例として抗原溶液50μlとアジュバントとして“Imject Alum”(サーモ・サイエンティフィック社製、以下、Alumとも言う。)50μlを混合した溶液をそれぞれ単回注射投与した。それぞれの条件ごとに4匹のマウスに投与し図1では抗体価の平均値を示した。
血漿中の抗OVA抗体価の平均値の経時変化を図1に示す。Dex−g−PLGAを用いたOVA内包粒子またはOVA内包会合粒子(Dex−g−PLGA粒子(2)(3)(4)(5)(6))、PEG−PLGAを用いたOVA内包会合粒子(PEG−PLGA粒子(3))は6週間以上にわたり持続的な抗体価上昇効果を示し、比較例であるPLGA粒子や抗原のみの投与、参考例である抗原+Alumの投与を大きく上回った。なお、粒子径の小さいDex−g−PLGA粒子(6)が最も高い抗体価上昇効果を持つ傾向を示した。
<方法>
実施例3および4の方法で作成したCEA―アジュバント微粒子複合体(以下、CEA内包粒子)またはその会合粒子(以下、CEA内包会合粒子)について、実施例6と同様の方法にて評価を行った。1匹あたりの投与量は1mg(抗原5μg)とし、それを単回注射投与した。CEA内包粒子およびCEA内包会合粒子としては疎水グラフト鎖の長さの異なるDex−g−PLGA粒子(8)(9)(10)、Dex−g−PLGA粒子(9)と同じ化合物(4)を用いて調製した粒子径の異なるDex−g−PLGA粒子(11)(12)、Dex−g−PLGA粒子(9)に抗原と共にCpG25μgを共に含有させたDex−g−PLGA粒子(13)、PEG−PLGA粒子(4)を評価した。また、比較例としては抗原5μgを含む水溶液50μl、参考例としては抗原5μgを含む水溶液50μlおよびAlum50μlを混合して単回注射投与した。それぞれの条件ごとに4匹のマウスに投与し、図2および図3では各群の平均値を示した。
Dex−g−PLGAを用いたCEA内包粒子またはCEA内包会合粒子(Dex−g−PLGA粒子(8)(9)(10)(11)(12)、PEG−PLGA粒子(4))はおよそ6週間にわたり持続的な抗体価上昇を示し、これらの中で粒子径の小さな粒子であるCEA内包粒子(Dex−g−PLGA粒子(12))が最も高い抗体価上昇効果を示した。また、Dex−g−PLGA粒子(9)に抗原と共にCpGを含有させたDex−g−PLGA粒子(13)はDex−g−PLGA粒子(9)と比較し高い抗体価上昇効果を示した(図2)。
<方法>
実施例1の化合物(4)と同様の方法で調製したDex−g−PLGAポリマーを用い、実施例3のDex−g−PLGA粒子(3)と同様の方法で調製した粒子(Dex−g−PLGA粒子(A))を実施例6に記載の方法を用いて評価を行った。1匹あたりの投与量は16mg(内包OVA量20μg)とし、それを単回注射投与した。また参考例として、20μgのOVA抗原を含む水溶液50μlとAlum50μlを混合した溶液を1回、または1週間おきに3回注射投与した。それぞれの条件ごとに2匹のマウスに投与し、図4では抗体価の平均値を450nmの吸光度測定値の数値として表記した。
血漿中の抗OVA抗体の経時変化を図4に示す。Alumと抗原の混合溶液を1回のみ投与した参考例では抗体価の上昇はほとんど見られなかった。Alumと抗原を3回投与した参考例では3回目の投与から急激な抗体価の上昇が見られたが、上昇は一過性で35日以降上昇は見られなかった。本発明の免疫原性組成物(Dex−g−PLGA粒子(A))を単回注射投与したマウスでは投与2週間目から持続的な上昇が見られ、56日後まで持続的な抗体価上昇が確認された。
<方法>
評価は実施例6と同様の方法にて行った。投与量はいずれも1匹あたりOVA内包会合粒子10mg(抗原仕込み量12.5μg)とし、実施例1の化合物(4)と同様の手法で調製したDex−g−PLGAポリマーを用い、実施例3のDex−g−PLGA粒子(3)と同様の方法で調製した粒子(Dex−g−PLGA粒子(B))および、実施例1の化合物(4)と同様の手法で調製したDex−g−PLGAポリマーを用い、実施例3のDex−g−PLGA粒子(3)の調製時にOVAと共に1匹あたりの投与量が6.25μgになるようにCpGを含有させた粒子(Dex−g−PLGA粒子(C))、およびPEG−PLGA粒子(1)および(2)を単回注射投与した。比較例としては抗原12.5μg、参考例としては抗原12.5μgとCpG6.25μgを混合して単回注射投与した。抗体価は投与から4週目より1週間おきに採血を行い、実施例6と同様の方法で測定した。各条件につき2匹のマウスに投与し図5では抗体価の平均値を示した。
OVA内包会合粒子(PEG−PLGA粒子(1)(2)、Dex−g−PLGA粒子(B)(C))はいずれも投与後6週間以上にわたり投与動物の抗体価を上昇させた。Dex−g−PLGA粒子はPEG−PLGA粒子よりも高い免疫活性化能を示した。また、CpGを内包したOVA内包粒子(Dex−g−PLGA粒子(C))は、CpGを含まないOVA内包粒子(Dex−g−PLGA粒子(B))よりも高い抗体価上昇効果を示した。
<方法>
実施例1の化合物(4)と同様の手法で調製したDex−g−PLGAポリマーを用い、実施例3のDex−g−PLGA粒子(3)と同様の調製方法を用いて、HCV構成タンパク質を含有させたHCV構成タンパク質−アジュバント微粒子複合体が会合してなる粒子Dex−g−PLGA粒子(D)(以下、HCV−E2内包会合粒子)を調製し実施例6と同様の方法で単回注射投与した。HCV構成タンパク質としては特願2008−254338に記載された方法に従って調製したJ6CF株由来のE2タンパク質とヒトIgGのFcタンパク質からなるキメラタンパク質を用いた。1匹あたりの投与量は80mg(抗原1.5μg)とした。またCpG25μgとDex−g−PLGA粒子(D)を混合したもの、CpG25μgとAlum50μlをDex−g−PLGA粒子(D)と混合したものをそれぞれ単回注射投与した。比較例としては抗原のみ1.5μg、参考例として抗原1.5μgおよびCpG25μgを含む水溶液100μl、抗原1.5μgおよびAlum50μlを含む水溶液100μl、あるいは抗原1.5μg、Alum50μlおよびCpG25μgを含む水溶液100μlをそれぞれ単回注射投与した。それぞれの条件ごとに2匹のマウスに投与した。
HCV−E2内包会合粒子(Dex−g−PLGA粒子(D))は7週間にわたり持続的な抗体価上昇効果を示した。またHCV−E2内包会合粒子にCpGを混合した場合、およびHCV−E2内包会合粒子にCpGおよびAlumを混合した場合は、HCV−E2内包会合粒子単独を投与した場合に比べ高い抗体価上昇効果を示した。抗原のみを投与した比較例では、ほとんど抗体価上昇が観察されなかった。抗原およびAlum、抗原およびCpG、あるいは抗原、CpGおよびAlumをそれぞれ混合して投与した参考例では抗原単独に比べ抗体価上昇効果は上昇したが、HCV−E2内包会合粒子を投与した場合と比較し遙かに劣る抗体価上昇効果しか示さなかった。
<方法>
実施例3および4の方法で作成したCEA―アジュバント微粒子複合体会合粒子(以下、CEA内包会合粒子)について、実施例7と同様の方法にて評価を行った。1匹あたりの投与量は400μg(抗原1μg)とし、それを0週目と4週目に投与した。CEA内包会合粒子としてはデキストラン分子量1,500を親水鎖とするDex−g−PLGA粒子(14)(15)、デキストラン分子量5,000を親水鎖とするDex−g−PLGA粒子(16)(17)、デキストラン分子量175,000を親水鎖とするDex−g−PLGA粒子(18)、デキストラン分子量40,000を親水鎖とするDex−g−PLGA粒子(19)を評価した。それぞれの条件ごとに5匹のマウスに投与し、図7では各群の平均値を示した。CEAに対する抗体価は、実施例7と同様の方法で測定した。
Dex−g−PLGAを用いたCEA内包会合粒子(Dex−g−PLGA粒子(14)(15)(16)(17)(18)(19))は持続的な抗体価上昇を示した。これらの中でデキストラン分子量175,000および分子量40,000から構成されるCEA内包会合粒子(Dex−g−PLGA粒子(18)(19)は、デキストラン親水鎖の分子量1,500および分子量5,000から構成されるCEA内包会合粒子(Dex−g−PLGA粒子(14)(15)(16)(17)と比較し高い抗体価上昇効果を示した(図7)。
<方法>
実施例3および4の方法で作成したCEA−アジュバント微粒子複合体会合粒子(以下、CEA内包会合粒子)について、実施例7と同様の方法にて評価を行った。1匹あたりの投与量は400μg(抗原1μg)とし、それを0週目と4週目に投与した。CEA内包会合粒子としては同一のポリマーを用い、異なる粒径に調製した粒子3種類の粒子(Dex−g−PLGA粒子(20)(粒径0.4μm)、Dex−g−PLGA粒子(21)(粒径5μm)、Dex−g−PLGA粒子(粒径40μm)を評価した。それぞれの条件ごとに5匹のマウスに投与し、図8では各群の平均値を示した。CEAに対する抗体価は、実施例7と同様の方法で測定した。
Dex−g−PLGAを用いたCEA内包粒子およびCEA内包会合粒子(Dex−g−PLGA粒子(20)(21)(22))は持続的な抗体価上昇を示した。これらの中で、平均粒径0.4μmのDex−g−PLGA粒子(20)が最も高い抗体価上昇効果を示し、次に平均粒径5μmのDex−g−PLGA粒子(21)、そして、平均粒径40μmのDex−g−PLGA粒子(22)は最も低い抗体価上昇効果を示した(図8)。
<方法>
評価は実施例9と同様の方法にて行った。投与量はいずれも1回投与あたりの抗原量を20μgとし、0週目、2週目、4週目に3回の抗原投与を行った。評価はOVA20μgと抗原を含まないDex−g−PLGA粒子(24)(ポリマー量16mg分)を混合して投与した場合、OVA20μgを含むDex−g−PLGA粒子(23)(ポリマー量16mg分)を投与した場合、OVA20μgとAlum50μlを混合して投与した場合、OVA20μgと抗原を含まないDex−g−PLGA粒子(24)を別の場所に投与した場合を比較した。血中の抗体価は実施例9と同様の方法で測定した。各条件につき2匹のマウスに投与し図9では抗体価の平均値を示した。
いずれの粒子も抗体価上昇効果を示した。OVAと抗原を含まない粒子(Dex−g−PLGA粒子(24))を混合して投与した場合、およびOVAとDex−g−PLGA粒子(24)を別々の場所に投与した場合に比べ、OVA内包会合粒子(Dex−g−PLGA粒子(23))が高い抗体価上昇効果を示した。
<方法>
評価は実施例7と同様の方法にて行った。CEAとAlumを混合して投与した場合のみ、0週目、2週目、4週目に合わせて3回の投与を行い、その他のCEA内包粒子および、CEA内包会合粒子は0週目に単回投与を行った。評価は同一のポリマーを用いて調製した粒径の異なる粒子、Dex−g−PLGA粒子(25)(粒径0.4μm、ポリマー含有量4mg、抗原投与量10μg)、Dex−g−PLGA粒子(26)(粒径5μm、ポリマー含有量4mg、抗原投与量10μg)、Dex−g−PLGA粒子(27)(粒径40μm、ポリマー含有量4mg、抗原投与量10μg)、Dex−g−PLGA粒子(28)(粒径0.4μm、ポリマー含有量4mg、抗原投与量1μg)を比較した。また、Dex−g−PLGA粒子(25)に関しては投与量を10分の1(ポリマー含有量400μg、抗原投与量1μg)、100分の1(ポリマー含有量40μg、抗原投与量0.1μg)に減らして投与した場合との比較を行った。比較例としては、CEAを内包させて調製したPLGA粒子(2)を評価した。それぞれの項目ごとに6匹のマウスに投与を行い血中の抗体価およびIgG1、IgG2aは実施例7と同様の方法で測定を行い、図10、図11ではその平均値を示した。
平均粒径0.4μmおよび平均粒径5μmのCEA内包粒子(Dex−g−PLGA粒子(25)(26))は、平均粒径40μmのCEA内包粒子(Dex−g−PLGA粒子(27))と比較し高い抗体価上昇効果を示した。Dex−g−PLGA粒子(25)が高い抗体価上昇効果を示したのに対し、その投与量を10分の1,100分の1と減らすことで、抗体価上昇効果は低下し、投与量を100分の1とした粒子では低い抗体価上昇効果しか持たなかった。抗原投与量1μgとした、Dex−g−PLGA粒子(25)10分の1量投与、Dex−g−PLGA粒子(28)のの比較では、投与ポリマー量が多い方が高い抗体価誘導効果を示した(図10)。
Claims (11)
- 疎水性セグメントがポリ(ヒドロキシ酸)であり、親水性セグメントが多糖である両親媒性ポリマーからなるアジュバント微粒子に抗原が内包された抗原−アジュバント微粒子複合体を有効成分として含有する、免疫原性増強用組成物。
- 抗原−アジュバント微粒子複合体が会合してなる粒子を有効成分として含有する、請求項1に記載の免疫原性増強用組成物。
- アジュバント微粒子が両親媒性ポリマーの親水性セグメントからなる親水性部分を内部に有し、両親媒性ポリマーの疎水性セグメントからなる疎水部分の外層を有することを特徴とする、請求項1または2に記載の免疫原性増強用組成物。
- 両親媒性ポリマーが多糖主鎖およびポリ(ヒドロキシ酸)グラフト鎖からなるグラフト型両親媒性ポリマーである、請求項1〜3のいずれかに記載の免疫原性増強用組成物。
- 多糖がデキストランである、請求項1〜4のいずれかに記載の免疫原性増強用組成物。
- ポリ(ヒドロキシ酸)がポリ(乳酸−グリコール酸)である、請求項1〜5のいずれかに記載の免疫原性増強用組成物。
- 表面改質剤がアジュバント微粒子のポリ(ヒドロキシ酸)に結合している、請求項1〜6のいずれかに記載の免疫原性増強用組成物。
- 抗原−アジュバント微粒子複合体または抗原−アジュバント微粒子複合体が会合してなる粒子の平均粒径が0.1〜50μmである、請求項1〜7のいずれかに記載の免疫原性増強用組成物。
- さらに免疫活性化物質を有効成分として含有する、請求項1〜8のいずれかに記載の免疫原性増強用組成物。
- 免疫活性化物質が核酸である、請求項9に記載の免疫原性増強用組成物。
- 免疫活性化物質がCpGである、請求項9または10に記載の免疫原性増強用組成物。
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