WO2023042872A1 - 癌の治療及び／又は予防のための医薬品 - Google Patents

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WO2023042872A1
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cancer
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poly
agonist
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恭子 芝原
文義 岡野
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東レ株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a drug for treating and/or preventing cancer, characterized by separately administering a cancer antigen and an immunostimulator.
  • cancer vaccines have been attempted in which cancer antigens (proteins, peptide fragments thereof, etc.) that are specifically expressed in cancer cells are administered to induce immune responses against cancer cells in vivo. .
  • cancer antigens proteins, peptide fragments thereof, etc.
  • immune memory is established in the body, so it is expected to be effective in preventing recurrence.
  • Provenge a dendritic cell vaccine for prostate cancer
  • Imygic an oncolytic virus preparation for metastatic melanoma
  • Non-Patent Documents 1 and 2 a technique has been reported for an antigen-adjuvant particle complex in which an antigen is encapsulated in adjuvant particles made of an amphipathic polymer in which the hydrophobic segment is poly(hydroxy acid) and the hydrophilic segment is polysaccharide.
  • Patent Document 2 describes that an antitumor effect is exhibited by using a conjugated antigen expressed in cancer, and application of the particulate adjuvant as a therapeutic drug for cancer is expected.
  • Patent Document 1 In clinical practice, in order to increase the effectiveness of cancer therapeutic drugs, a treatment method that uses multiple cancer therapeutic drugs in combination is used as a standard treatment method. Regarding the particulate adjuvant described above, Patent Document 1 also describes that the immunostimulatory ability thereof is enhanced by mixing it with an immunostimulator.
  • an object of the present invention is to establish a technique for enhancing the therapeutic and preventive effects of cancer in pharmaceuticals that combine a particulate adjuvant and an immunostimulator.
  • an amphipathic amphipathic compound having a hydrophobic segment of poly(hydroxy acid) and a hydrophilic segment of polysaccharide, which is promising as a particulate adjuvant for the treatment or prevention of cancer.
  • particles containing a polymer and a cancer antigen hereinafter often referred to as "particles" in this specification
  • the present invention was completed based on the discovery that antitumor effects are exhibited.
  • the present invention has the following configurations (1) to (15). (1) that particles comprising an amphipathic polymer whose hydrophobic segment is poly(hydroxy acid) and hydrophilic segment is polysaccharide and a cancer antigen and an immunostimulator are used to be administered separately; A medicament for the treatment and/or prevention of cancer, characterized in that: (1-1) Treating and/or preventing cancer, comprising a particle containing an amphipathic polymer having a hydrophobic segment of poly(hydroxy acid) and a hydrophilic segment of polysaccharide, a cancer antigen, and an immune activator , wherein said use is characterized in that administration of said particles and administration of said immunostimulator are carried out separately.
  • the immune activation factor binds to Toll-like receptor (TLR), NOD-like receptor (NLR), RIG-like receptor, C-type lectin receptor (CLR) or interferon gene stimulator (STING);
  • the drug according to (2), wherein the ligand or agonist that binds to Toll-like receptor (TLR) is a ligand or agonist that binds to TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8, TLR9 or TLR11. .
  • TLR Toll-like receptor
  • a ligand or agonist that binds to TLR2 selected from the group consisting of peptidoglycan, lipoprotein, lipopolysaccharide and zymosan;
  • a ligand or agonist that binds to TLR4 selected from the group consisting of lipopolysaccharide (LPS), HSP60, RS09 and MPLA;
  • a ligand or agonist that binds to TLR7 or 8 selected from the group consisting of imidazoquinoline compounds and single-stranded RNA;
  • bacterial DNA unmethylated CpG DNA, hemoz
  • the cancer is basal cell carcinoma, Budget's disease, skin cancer, breast cancer, renal cancer, pancreatic cancer, colon cancer, lung cancer, brain tumor, gastric cancer, uterine cancer, ovarian cancer, prostate cancer, bladder cancer, esophageal cancer, leukemia (1)- (12) The drug according to any one of the items.
  • amphipathic polymer according to the present invention wherein the hydrophobic segment is poly(hydroxy acid) and the hydrophilic segment is polysaccharide, particles comprising a cancer antigen, and an immunostimulator to be administered separately, It exhibits a remarkable anti-tumor effect and is effective in the treatment and prevention of cancer.
  • FIG. 1 shows the results of 1 H-NMR measurement of dextran-PLGA.
  • Fig. 3 shows the results of GPC measurements of black yeast glucan- NH2 and black yeast glucan-PLGA.
  • 1 shows the results of 1 H-NMR measurement of black yeast glucan-PLGA.
  • FIG. 2 depicts the results of DLS measurements of OVA-containing dextran particles.
  • FIG. 2 shows the results of DLS measurements of OVA-containing black yeast glucan particles.
  • the present invention is used such that a particle comprising an amphiphilic polymer whose hydrophobic segment is a poly(hydroxy acid) and a hydrophilic segment is a polysaccharide and a cancer antigen and an immunostimulator are administered separately. It is characterized by inducing strong immune activation by The type of immune response elicited by the medicament of the invention is not limited. Types of immune response include Th1-type immune response and Th2-type immune response, and it is known that either type of immune response is predominantly induced depending on the type of antigen, administration site, administration method, and type of immune activation factor combined with the particles. However, the present invention can generate both Th1 and Th2 type immune responses.
  • the antitumor activity of the combination of particles containing an amphiphilic polymer having a poly(hydroxy acid) hydrophobic segment and a polysaccharide hydrophilic segment and a cancer antigen and an immunostimulator used in the present invention is described below. It can be evaluated by examining inhibition of tumor growth in tumor-bearing animals in vivo.
  • amphipathic polymers that form particles together with cancer antigens will be explained.
  • Amphipathic means having both hydrophilic and hydrophobic properties.
  • a site (segment) is said to be hydrophilic when its solubility in water is higher than that of other sites (segments).
  • the hydrophilic portion is preferably soluble in water, but even if it is poorly soluble, it is sufficient if the solubility in water is higher than that of the other portions.
  • the portion (segment) is said to be hydrophobic.
  • the hydrophobic site is desirably insoluble in water, but even if it is soluble, it suffices if the solubility in water is lower than that of other sites.
  • amphiphilic polymer is a polymer that has the above-mentioned amphipathic properties as a whole molecule.
  • An amphipathic “polymer” indicates a molecular structure in which a hydrophilic segment or a hydrophobic segment, or both, in an amphiphilic molecule is composed of repeating structures of minimum units (monomers).
  • the structure of the amphipathic polymer in the present invention is not particularly limited, and specific examples include a linear block-type polymer in which a polysaccharide and a poly(hydroxy acid) are linked, and a plurality of polysaccharides or poly(hydroxy acids).
  • Branched polymers having branches, graft-type polymers consisting of a polysaccharide main chain and poly(hydroxy acid) side chains, and graft-type polymers consisting of a poly(hydroxy acid) main chain and polysaccharide side chains are preferred.
  • the present invention is characterized in that the hydrophilic segment of the amphiphilic polymer is polysaccharide.
  • Polysaccharides are not particularly limited, but specific examples include dextran, ⁇ -glucan, mannan, chitin, chitosan, gellan gum, alginic acid, hyaluronic acid or pullulan, preferably dextran or ⁇ -glucan.
  • Glucan is a glucose-containing polysaccharide, and ⁇ -glucan contains one or more ⁇ -bonds between glucose subunits. That is, the ⁇ -glucan used in the present invention contains ⁇ -linkages, and may contain only ⁇ -linkages. Also, the ⁇ -glucan used in the present invention may be branched or linear. Preferred ⁇ -glucans include those containing one or more ⁇ -1,3 bonds and/or one or more ⁇ -1,6 bonds, and those containing one or more ⁇ -1,2 bonds and/or ⁇ - 1,4 bonds, but more preferably those containing one or more ⁇ -1,3 bonds and/or one or more ⁇ -1,6 bonds, and one or more ⁇ -1, Those containing 3 bonds are more preferred.
  • ⁇ -glucans containing one or more ⁇ -1,3 linkages include curdlan, pachyman, laminaran, lichenan, schizophyllan, lentinan, scleroglucan, black yeast glucan (preferably black yeast-derived ⁇ -1,3 glucan or ⁇ -1,6 glucan) or pachymaran, preferably curdlan, pachyman, laminaran, schizophyllan, scleroglucan, black yeast glucan or pachymaran.
  • Linear ⁇ -glucans containing one or more ⁇ -1,3 bonds include ⁇ -glucans mainly composed of ⁇ -1,3 bonds (eg, curdlan and pachyman), and ⁇ -1,3 bonds and Examples include ⁇ -glucans composed of ⁇ -bonds other than ⁇ -1,3-bonds (eg, laminaran and lichenan).
  • Branched ⁇ -glucans containing one or more ⁇ -1,3 bonds include ⁇ -glucans composed of ⁇ -1,3 and ⁇ -1,6 bonds (e.g., schizophyllan, lentinan, scleroglucan, , black yeast glucan).
  • the ⁇ -glucan used in the present invention may be a derivatized ⁇ -glucan.
  • derivatization include addition reactions of carboxymethyl groups and oxidative cleavage reactions.
  • derivatized ⁇ -glucans include carboxymethyl curdlan in which a carboxymethyl group is added to curdlan and pachymaran in which pachyman is cleaved.
  • the number average molecular weight of the polysaccharide is not particularly limited, it is preferably 500 to 100,000, more preferably 500 to 50,000, still more preferably 1,000 to 10,000, such as 1,000 to 9. ,000, 1,000-8,000, 1,000-7,000, 1,000-6,000, 1,000-5,000, 1,000-4,000, 1,000-3,000 is.
  • the number average molecular weight is an average molecular weight calculated by a method (simple average) that does not consider weighting of molecular size, and the number average molecular weight of polysaccharides can be determined by gel permeation chromatography (GPC).
  • the hydrophobic segment of the amphiphilic polymer is characterized by being poly(hydroxy acid).
  • poly(hydroxy acid) is not particularly limited, it is preferably a biocompatible polymer that does not have significant harmful effects when administered to the body.
  • biocompatibility means that the polymer has an LD50 of 2,000 mg/kg or more when orally administered to rats.
  • the poly(hydroxy acid) may also be a copolymer of more than one hydroxy acid, but preferably no more than two hydroxy acids.
  • poly(hydroxy acids) include polyglycolic acid, polylactic acid, poly(2-hydroxybutyric acid), poly(2-hydroxyvaleric acid), poly(2-hydroxycaproic acid), poly(2-hydroxy capric acid), poly (malic acid), or derivatives and copolymers of these polymer compounds, preferably poly (lactic acid-glycolic acid), polylactic acid or polyglycolic acid, more preferably poly ( lactic acid-glycolic acid).
  • the composition ratio (lactic acid/glycolic acid) (mol/mol) of poly(lactic acid-glycolic acid) achieves the object of the present invention. It is not particularly limited as long as it is 99/1 to 1/99, preferably 80/20 to 20/80, such as 60/40 to 40/60 or 50/50.
  • the number average molecular weight of the poly(hydroxy acid) moiety in the amphiphilic polymer of the present invention is not particularly limited, it is preferably 500 to 1,000,000, more preferably 500 to 100,000, and still more preferably. is 7,000-50,000, 7,000-50,000, 7,000-40,000, 7,000-30,000, 7,000-20,000, 7,000-15,000, 7 ,000 to 13,000 and 7,000 to 12,000.
  • the number average molecular weight of poly(hydroxy acid) is obtained from the difference between the number average molecular weight of an amphiphilic polymer whose hydrophobic segment is poly(hydroxy acid) and whose hydrophilic segment is polysaccharide and the number average molecular weight of polysaccharide.
  • the number average molecular weight of the amphiphilic polymer constituting the particles is not particularly limited, it is preferably 1,000 to 1,000,000, more preferably 1,000 to 100,000, still more preferably 9, 000 to 50,000, 9,000 to 50,000, 9,000 to 40,000, 9,000 to 30,000, 9,000 to 20,000, 9,000 to 15,000.
  • the number average molecular weight of the amphiphilic polymer is determined by gel permeation chromatography (GPC).
  • Amphiphilic polymers may be produced by known methods, specifically, a method of adding poly(hydroxy acid) to polysaccharide and performing a condensation reaction, and a method of adding a hydroxy acid-activated monomer to polysaccharide and performing a polymerization reaction.
  • An example is the method of performing and manufacturing.
  • amphiphilic polymer when it is a linear block-type polymer in which a polysaccharide and a poly(hydroxy acid) are linked, it may be produced by a known method.
  • a method of producing a poly(hydroxy acid) copolymer by condensing it with an activating agent for a terminal functional group [Macromol. Rapid Commun. , 31, p. 1664-1684 (2010)].
  • amphipathic polymer is a graft-type polymer consisting of a polysaccharide main chain and a poly(hydroxy acid) side chain
  • it can be produced as in the following (1), (2) or (3). can.
  • the amphipathic polymer is preferably water-insoluble as a whole so as not to be quickly excreted in the body in order to maintain its immunostimulatory action over a long period of time.
  • water-insoluble as used herein means that the solubility in water is 1 g (amphiphilic polymer)/100 ml (water) or less.
  • the amphiphilic polymer may be a modified amphiphilic polymer to which a desired function is imparted by modifying with a functional compound.
  • it may be a modified amphiphilic polymer in which an immunostimulator described later is bound to the amphiphilic polymer by a known method in order to enhance the immunostimulatory action.
  • a "cancer antigen” in the present invention is an antigen that can be used as a medicine or vaccine for the purpose of treating and/or preventing cancer by inducing an immune response in vivo.
  • particles containing the amphiphilic polymer of the present invention and cancer antigens as active ingredients, immune responses induced by cancer antigens can be enhanced.
  • the cancer antigen contained in the particles of the present invention is not particularly limited as long as the object of the present invention is achieved.
  • cancer antigens include peptides, proteins, glycoproteins, glycolipids, lipids, carbohydrates, nucleic acids, polysaccharides, and viruses, fungi, tissues, and cells containing these.
  • a model cancer antigen such as ovalbumin (OVA) is forcibly expressed in cancer cells.
  • OVA ovalbumin
  • An experimental system to act on may be used, and the cancer antigens mentioned here also include such model cancer antigens.
  • the number of cancer antigens contained in the particles of the present invention is not particularly limited, and may be one type or two or more types.
  • a particle composed of an amphiphilic polymer and an antigen, which is one of the active ingredients of the present invention, may contain additional components other than the cancer antigen and the amphiphilic polymer.
  • additional components include well-known lipids as constituents of liposomes and lipid nanoparticles, which are particles capable of encapsulating antigens such as cancer antigens. Since a sufficient expected effect can be obtained without using lipid as a component other than the constituent cancer antigen, it is preferable not to include lipid as an additional component constituting the particles.
  • the structure of the particles composed of the amphipathic polymer and the cancer antigen, which are one of the active ingredients of the present invention, is not particularly limited, but the particles are complexes of the amphipathic polymer and the cancer antigen, and therefore constitute the particles.
  • a structure in which the hydrophilic segment of the amphiphilic polymer is on the inside of the particle and the hydrophobic segment is on the outer layer of the particle is preferable because the cancer antigen can be encapsulated in the particle and more stably retained.
  • the method for producing the particles is not particularly limited, and includes a liquid drying method, a spray drying method, a pulverization method, and the like, but the particles in the present invention are preferably produced by the liquid drying method.
  • Examples of methods for producing particles by the in-liquid drying method include the O/W emulsion method, the W/O/W emulsion method, and the S/O/W emulsion method.
  • An example of the production of particles by the O/W emulsion method is a water-immiscible organic solvent in which amphipathic polymer powder constituting the particles is dissolved, and an aqueous solution in which a surface modifier and a cancer antigen are dissolved. to prepare an O/W emulsion solution, and removing the water-immiscible organic solvent from the O/W emulsion solution to obtain particles.
  • an aqueous solvent in which a cancer antigen is dissolved is mixed with a water-immiscible organic solvent in which an amphiphilic polymer powder constituting the particles is dissolved.
  • preparing a W/O emulsion solution mixing the W/O emulsion solution and an aqueous surface modifier solution to prepare a W/O/W emulsion solution; It can be produced by removing the solvent to obtain the particles.
  • an aqueous solvent in which a cancer antigen is dissolved is mixed with a water-immiscible organic solvent in which an amphiphilic polymer powder constituting the particles is dissolved.
  • the antigen content in the particles is preferably 0.01 to 20% by weight, more preferably 0.1 to 10% by weight.
  • Methods for quantifying the antigen content include extracting the antigen from the particles using an organic solvent and quantifying the extract by gel electrophoresis or liquid chromatography.
  • the surface modifier used for particle preparation is preferably a water-soluble polymer or surfactant.
  • the water-soluble polymer referred to here is a polymer compound having a solubility in water of 1 g (water-soluble polymer)/100 ml (water) or more.
  • the water-immiscible organic solvent used for particle preparation is preferably one in which the amphiphilic polymer is soluble and the polysaccharide is poorly soluble or insoluble.
  • the solubility of the water-immiscible organic solvent in water is preferably 30 g (water-immiscible organic solvent)/100 ml (water) or less.
  • Specific examples of water-immiscible organic solvents include ethyl acetate, isopropyl acetate, butyl acetate, dimethyl carbonate, diethyl carbonate, methylene chloride, and chloroform.
  • the aqueous solvent used for particle preparation is an aqueous solution containing water and optionally water-soluble components.
  • water-soluble component include inorganic salts, sugars, organic salts, amino acids, peptides, proteins, nucleic acids and the like.
  • the surface of the particles may be bound with the surface modifier used in the manufacturing process.
  • the bond here may be a non-covalent bond or a covalent bond.
  • the non-covalent bond is preferably a hydrophobic interaction, but may be an ionic bond (electrostatic interaction), a hydrogen bond, a coordinate bond, a van der Waals bond, a physical adsorption, or a combination of these good.
  • the average particle diameter of the particles is preferably 0.1 ⁇ m to 50 ⁇ m, more preferably 0.1 ⁇ m to 25 ⁇ m, still more preferably 0.1 ⁇ m to 10 ⁇ m, particularly preferably 0.1 ⁇ m to 1 ⁇ m, for example 0.2 ⁇ m. ⁇ 0.9 ⁇ m, 0.3 ⁇ m to 0.8 ⁇ m, 0.4 ⁇ m to 0.7 ⁇ m.
  • the average particle size referred to here can be determined by the cumulant method using a dynamic light scattering device (DLS: for example, Otsuka Electronics Co., Ltd., ELS-Z).
  • Treatment means treatment of cancer based on the aforementioned antitumor effect.
  • prevention means not only prevention of cancer development but also prevention of metastasis or recurrence of cancer.
  • tumor and cancer refer to malignant neoplasms and are used interchangeably.
  • the method of administering the particles to a living body is not particularly limited, but examples include subcutaneous administration, intradermal administration, intramuscular administration, nasal administration, pulmonary administration, and oral administration. Administration, transdermal administration, sublingual administration, vaginal administration, intraperitoneal administration, lymph node administration, etc., preferably intradermal administration or subcutaneous administration.
  • an administration method different from the administration of the immunostimulator described below is preferably selected.
  • the particles when administering an immunostimulator to a tumor site, the particles can be administered subcutaneously.
  • the dosage of the particles is appropriately set depending on the administration method and the number of administrations.
  • the dose should be selected in the range of 0.0001 mg to 1000 mg per kg of body weight per dose. is possible.
  • the dosage can be selected in the range of 0.001 mg/body to 100,000 mg/body per patient, or, for example, 1 mg to 30 mg per kg of the patient's body weight, but is not necessarily limited to these numerical values. do not have.
  • the dose and administration method vary depending on the body weight, age, sex, symptoms, etc. of the patient, but can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the immune activation factor which is one of the active ingredients of the present invention, will be explained.
  • the term “immunoactivator” as used herein means a substance that activates one or more types of immune cells and that can maintain and enhance the immune function of the cells.
  • the term “immune cells” as used herein includes, for example, T lymphocytes, B lymphocytes, NK cells, monocytes, dendritic cells, granulocytes, macrophages, myeloid-derived inhibitory cells, Langerhance cells and their progenitor cells, tumors It is the immune cell group that resides within.
  • the immune activation factor used in the present invention is not particularly limited, and specific examples include Toll-like receptor (TLR), NOD-like receptor (NLR), RIG-like receptor, C-type lectin receptor (CLR) or Ligands or agonists that bind to interferon gene stimulating factor (STING), preferably ligands or agonists that bind to TLRs.
  • TLR Toll-like receptor
  • NLR NOD-like receptor
  • RIG-like receptor C-type lectin receptor
  • STING interferon gene stimulating factor
  • TLRs include TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8, TLR9 or TLR11, and specific examples of ligands or agonists that bind to them include the following (i) to (vii). be done.
  • a ligand or agonist that binds to TLR2 selected from the group consisting of peptidoglycan, lipoprotein, lipopolysaccharide and zymosan;
  • a ligand or agonist that binds to TLR3 selected from the group consisting of poly(I:C) and poly(A:U);
  • a ligand or agonist that binds to TLR4 selected from the group consisting of lipopolysaccharide (LPS), HSP60, RS09 and MPLA.
  • a ligand or agonist that binds to TLR7 or 8 selected from the group consisting of imidazoquinoline class compounds and single-stranded RNA
  • a ligand or agonist that binds to TLR9 selected from the group consisting of bacterial DNA, unmethylated CpG DNA, hemozorin, ODN1585, ODN1668 and ODN1826.
  • a ligand or agonist that binds to TLR11 selected from the group consisting of profilin and uropathogenic bacteria
  • the immune activation factor is preferably a ligand or agonist that binds to TLR3, or a ligand or agonist that binds to TLR7 or / and 8, more preferably the following (ii) or (v) ligand or is an agonist.
  • the (ii) ligand or agonist that binds to TLR3 selected from the group consisting of Poly(I:C) and Poly(A:U) is preferably Poly(I:C).
  • Poly(I:C) is a double-stranded RNA formed by an RNA strand consisting only of inosine as a base and an RNA strand consisting only of cytidine as a base.
  • the chain length of Poly(I:C) used in the present invention is not particularly limited.
  • the imidazoquinoline compound (v) is not particularly limited as long as it binds to TLR7 or TLR8, but preferred specific examples include, for example, the compounds described in US Pat. for example 4-amino-2-(ethoxymethyl)-a,a-dimethyl-1H-imidazo[4,5-c]quinoline-1-ethanol (Resiquimod (R848)), 1 -(2-methylpropyl)-1H-imidazo[4,5-c]quinoline-4-amine (Imiquimod), 1-(4-amino-2-ethylaminomethylimidazo-[4,5-c]quinoline-1-yl) -2-methylpropan-2-ol (Gardiquimod), N-[4-(4-amino-2-ethyl-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-yl)butyl-]methanesulfonamide (PF-4878691 ), 4-amino-aa-dimethyl-2-methylethyl-1H-
  • Imiquimod is more preferred, and imiquimod is a compound with a molecular weight of about 240.3 represented by CAS number 99011-02-6.
  • the IUPAC name for imiquimod is 4-amino-1-(2-methylpropyl)-1H-imidazo[4,5-c]quinoline, alternative descriptions are R837, S-26308, 1-(2-METHYLPROPYL)- 1H-IMIDAZO[4,5-C]QUINOLIN-4-AMINE; 4-amino-1-isobutyl-1h-imidazo[4,5-c]quinoline, 1-isoButyl-1H-Inudazole[4.5-c] quinoline-4-amine; represented by 1-(2-Methylpropyl)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amine.
  • ligands or agonists that bind to NOD-like receptors include M-TriDAP and PGN.
  • Other examples include ligands or agonists for NOD1, such as Tri-DAP, iE-DAP, C12-iE.
  • ligands or agonists for NOD2 such as MDP, N-glycosyl-MDP, Murabutide, M-TriLyS-D-ASN, M-TriLYS, L18-MDP.
  • ligands or agonists that bind to RIG-like receptors include 5'ppp-dsRNA, poly (dA: dT), poly (dG: dC), and poly (I: C).
  • CLR C-type lectin receptors
  • Ligands or agonists that bind to interferon gene stimulating factor include c-di-GMP, c-di-AMP, 2'3'-cGAMP, 3'3'-cGAMP or 2'2'-cGAMP. be done.
  • Imiquimod may be obtained by chemical synthesis by a method known to those skilled in the art, but commercially available pharmaceuticals may also be used.
  • the dosage form for administering imiquimod to a patient is preferably a transdermal administration type, preferably a cream type formulation.
  • pharmaceuticals containing imiquimod as an active ingredient "Veselna Cream 5%” in Japan and "Aldara (registered trademark) Cream, 5%” in Europe and the United States are marketed. When using imiquimod in the present invention, these pharmaceuticals are attached. It can be administered according to the documented dosage and administration.
  • the term “combination” or “combination” means that the particles and the immunostimulator are administered to the same living body at the same time or at predetermined intervals as independent preparations (that is, separately). refers to The interval between one administration and the other administration is not particularly limited. The interval may be co-administration with one administration, 30 minutes after one administration, or 1 hour, 3 hours, 6 hours, 12 hours, 1 day, 3 days, 5 days, It may be 7 days, 2 weeks, 3 weeks, or 4 weeks. At least one of the particles and the immunostimulator is preferably administered when it can exhibit its activity in vivo. Moreover, it is preferable that the other is administered before the previously administered particle or immunostimulator loses its activity in vivo. Also, the particles may be administered first, and the immunostimulatory factor may be administered first.
  • the term "combination drug” refers to a drug containing multiple independent formulations for combined use as described above.
  • the combination drug of the present invention is a drug for treatment and/or prevention, and contains the particles and the immunostimulator as separate preparations.
  • the use of the combination pharmaceutical of the present invention is preferably characterized in that the administration of the particles and the administration of the immunostimulator are carried out separately by different administration methods.
  • the treatment and/or prevention using the combination pharmaceutical of the present invention conforms to the methods for treatment and/or prevention of cancer described below.
  • the method of administering the immunostimulatory factor is not particularly limited as long as the object of the present invention is achieved, but it is preferably an administration route different from that of the particles, and is preferably administered locally to the tumor.
  • the administration route may be oral or parenteral, and specific dosage forms include injection dosage forms, nasal dosage forms, pulmonary dosage forms, transdermal dosage forms and the like.
  • Injectable dosage forms can be administered systemically or locally by, for example, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, intratumoral injection, etc., preferably by intratumoral injection.
  • transdermal administration forms are those called liniments or topical drugs.
  • External medicines include solids, liquids, sprays, ointments, creams, and gels, and are preferably transdermally administered as creams.
  • the administration method used for local administration to the tumor is not particularly limited as long as the active ingredient can reach the subject's tumor without going through the systemic circulation. For example, it suffices if the active ingredient can be retained in the tumor or in the periphery of the tumor.
  • administration by injection such as intratumoral injection, subcutaneous injection into the skin around the tumor, and transdermal administration such as application of topical drugs to the surface of the skin around the tumor are used as local administration to the tumor. be able to.
  • the active ingredient of the pharmaceutical of the present invention may contain an anti-tumor agent known in the literature, etc., in addition to the particles and the immunostimulator, as long as it does not inhibit the effects of the pharmaceutical of the present invention.
  • Known antitumor agents are not particularly limited, but specific examples include paclitaxel, doxorubicin, daunorubicin, cyclophosphamide, methotrexate, 5-fluorouracil, thiotepa, busulfan, improsulfan, piposulfan, benzodopa, carbocone, meturedopa, uredopa, altretamine, triethylenemelamine, triethylenephosphoramide, triethylenethiophosphoramide, trimethylolomelamine, bratacin, bratacinone, camptothecin , bryostatin, callystatin, cryptophycin 1, cryptophycin 8, dolastatin, duocarmycin, eleuterobin, pancrati
  • the administration method of the antitumor agent to be used in combination is not particularly limited.
  • the method may be the same as or different from the method of administration of the particles or immunostimulator.
  • the administration method is oral or parenteral, and specific dosage forms include injection dosage forms, nasal dosage forms, pulmonary dosage forms, transdermal dosage forms and the like.
  • Injectable dosage forms can be administered systemically or locally, for example, by intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, intratumoral injection, and the like.
  • transdermal administration forms are those called liniments or topical drugs.
  • External medicines include solids, liquids, sprays, ointments, creams, and gels.
  • the treatment and/or prevention of cancer according to the present invention includes various forms in addition to administration as the aforementioned pharmaceuticals.
  • the method for treating and/or preventing cancer of the present invention is not particularly limited as long as the object of the present invention is achieved. and a particle containing an amphiphilic polymer whose hydrophilic segment is a polysaccharide and a cancer antigen) and the immunostimulator are separately administered by different administration methods.
  • the method for treating and/or preventing cancer of the present invention comprises the step of administering the particle to a subject and the step of administering the immunostimulator to the subject, but related to "combination" As described above, either step may be performed first, or both steps may be performed simultaneously.
  • surgical treatment and administration of other pharmaceutical agents eg, known anti-tumor agents as described above
  • each active ingredient of the combined pharmaceutical of the present invention can be administered simultaneously or separately according to the order.
  • the second active ingredient can be administered within a time interval of up to about three weeks, ie immediately after administration of the first active ingredient and up to about three weeks later.
  • the surgical treatment may be followed by the surgical treatment, or the surgical treatment may be performed between administrations of the first active ingredient and the second active ingredient.
  • the medicaments of the invention may be administered according to multiple dosing cycles. For example, when each active ingredient of the pharmaceutical of the present invention is administered simultaneously, both pharmaceuticals containing each active ingredient can be administered for about 2 days to about 3 weeks as one cycle. Thereafter, the treatment cycle can be repeated as necessary according to the judgment of the doctor in charge.
  • each active ingredient in the agent for treating and/or preventing cancer of the present invention can be set in the same manner as the dosage of each active ingredient in pharmaceuticals.
  • the administration period of the active ingredient is not particularly limited. Specifically, for example, it can be 3 days or more, 4 days or more, 5 days or more, 1 week or more, 10 days or more, or 2 weeks or more. Also, the number of administrations of each component during the administration period is not particularly limited. As mentioned above, it is preferable to administer each active ingredient so as to obtain its activity over the same administration period. Therefore, the number of times of administration or the frequency of administration can be appropriately set according to the period during which each active ingredient exhibits activity in the body. Specifically, for example, it may be set according to the administration method, dosage, type of active ingredient, and the like.
  • once a month or more, once every 3 weeks or more, once every 20 days or more, once every 10 days or more, once a week or more, or once a week can be administered two or more times per day.
  • once every 10 days or more, once a week or more, twice a week or more, once every three days or more, once every two days or more, or once a day or more can be administered at a frequency of
  • the target cancer in the present invention is not particularly limited as long as it expresses the cancer antigen contained in the particles.
  • palpable cancers More preferred are palpable cancers, subcutaneous cancers, intradermal cancers, superficial cancers, dermal cancers, and non-parenchymal organ cancers. Also, these cancers may be primary cancers, metastatic cancers, metastatic cancers or recurrent cancers.
  • the cancer is, for example, Bowen's disease, melanoma, squamous cell carcinoma, extramammary Paget's disease, mycosis fungoides, Sezary syndrome, cutaneous T/NK cell lymphoma, T cells with lesions only in the skin Leukemia/lymphoma, cutaneous B-cell lymphoma (indolent group), cutaneous T-cell lymphoma mammary carcinoma, combined breast adenocarcinoma, malignant mixed tumor of the breast, intraductal papillary adenocarcinoma, lung adenocarcinoma, squamous cell carcinoma, small cell carcinoma, large cell carcinoma, neuroepithelial tissue tumor glioma, glioblastoma, neuroblastoma, ventricular ependymoma, neurocellular tumor, embryonic neuroectodermal tumor, schwannoma, neurofibroma, meningioma, chronic lymphocytic leukemia, lymph
  • metastasis or recurrence of the above cancer as a primary source can result in palpable cancer, cancer existing under the skin, cancer existing in the skin, cancer existing in the dermis, or cancer existing in non-parenchymal organs. Cancer is included.
  • the combination of the particles, which are pharmaceutical agents of the present invention, and the immunostimulatory factor has cytotoxic activity in vivo. Therefore, the antitumor effect of the present invention can be known by examining its cytotoxic activity against cancer.
  • the cytotoxic activity is evaluated by administering the particles and the immunostimulatory factor together to a cancer-bearing organism (subject), measuring the size of the tumor after administration, and examining the size of the cancer over time. can.
  • the antitumor effect of the present invention can also be evaluated by examining the survival rate of subjects. It can also be evaluated by examining the ability to produce cytokines or chemokines.
  • the anti-tumor effect of the combination of the particles of the present invention and the immunostimulatory factor can also be determined by examining cancer prevention, metastasis prevention, or recurrence prevention.
  • Preferred subjects (patients) to be treated are mammals, for example, mammals including primates, pet animals, domestic animals, sports animals, and the like, with humans, dogs and cats being particularly preferred.
  • the drug of the present invention can be formulated by methods known to those skilled in the art.
  • they can be used parenterally in the form of injections such as sterile solutions or suspensions mixed with water or other pharmaceutically acceptable liquids.
  • pharmacologically acceptable carriers or media specifically sterile water, physiological saline, vegetable oils, emulsifiers, suspending agents, surfactants, stabilizers, fragrances, excipients, binders, etc. It is conceivable to formulate by combining appropriately with and admixing in a unit dosage form required for generally accepted pharmaceutical practice. The amount of active ingredient in these formulations is such that a suitable dosage in the range indicated will be obtained.
  • a sterile composition for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice using a vehicle such as distilled water for injection.
  • Aqueous solutions for injection include, for example, physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants, such as aqueous solutions containing D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride, and suitable solubilizing agents. agents such as alcohols, particularly ethanol, polyalcohols such as propylene glycol, polyethylene glycol, non-ionic surfactants such as polysorbate 80(TM), HCO-60.
  • Oily liquids include sesame oil and soybean oil, and may be used in combination with benzyl benzoate and benzyl alcohol as solubilizers.
  • buffers such as phosphate buffers, sodium acetate buffers, soothing agents such as procaine hydrochloride, stabilizers such as benzyl alcohol, phenol, and antioxidants.
  • soothing agents such as procaine hydrochloride
  • stabilizers such as benzyl alcohol, phenol, and antioxidants.
  • the present invention also relates to the use of each active ingredient in combination with other active ingredients as described above. Specifically, it relates to the use of said particles (particles comprising an amphipathic polymer whose hydrophobic segment is poly(hydroxy acid) and hydrophilic segment is polysaccharide and a cancer antigen) in the treatment and/or prevention of cancer. .
  • the use herein includes administering said particles in combination with an immunostimulator to a subject, preferably administering said particles and administering said immunostimulator separately by different administration methods. Characterized by
  • the present invention also relates to the use of immunostimulators in the treatment and/or prevention of cancer.
  • the use herein includes administering said immunostimulator in combination with said particles to a subject, preferably administering said particles and administering said immunostimulator separately by different administration methods. It is characterized by
  • the present invention further relates to compositions containing each active ingredient for use in said method. Specifically, it relates to a composition for use in treating and/or preventing cancer, comprising said particles.
  • the use herein includes administering said composition to a subject in combination with an immunostimulator, preferably administering said composition and administering said immunostimulator separately by different administration methods. It is characterized by This use can include, for example, administering the composition to a subject and administering the immune activator to the subject.
  • the present invention relates to a composition for use in treating and/or preventing cancer, which contains an immunostimulator.
  • the use herein comprises administering said composition to a subject in combination with said particles, preferably characterized in that administration of said particles and administration of said composition are performed separately by different administration methods. do.
  • This use can include, for example, administering the particles to a subject and administering the composition to the subject.
  • these compositions can be administered in the same dosage, administration method, and administration frequency as described above for the administration of the active ingredient.
  • these uses can include administering said particles to a subject and administering said immune stimulators to said subject, wherein administration of each active ingredient comprises the dosages, administration
  • administration The method, dosing interval, dosing time, dosing frequency and the like can be used.
  • Example 1 Synthesis of dextran-PLGA
  • poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) was added to dextran and a condensation reaction was performed to form a linear chain.
  • a block type polymer was synthesized.
  • the number average molecular weight of dextran-NH 2 was determined by GPC measurement (column: TSK-gel ⁇ -5000 ⁇ 2 manufactured by Tosoh Corporation, DMF-based solvent, detector: RI, standard: pullulan) (Fig. 1: dextran-NH 2 ). It was confirmed by 1 H-NMR measurement that a primary amino group was introduced at the reducing end of dextran.
  • dextran (dextran-NH 2 , number average molecular weight 2,700) (100 mg) having a primary amino group at the reducing end was added, and the active ester of NHS-PLGA-OH (NHS) and dextran-NH 2 were reacted. with primary amino groups was carried out for 110.5 hours.
  • dextran-PLGA polymer 1 was obtained by removing unreacted dextran-NH 2 by water dialysis and removing unreacted NHS-PLGA-OH by ultracentrifugation purification.
  • Dextran-PLGA polymer 2 was also obtained using dextran-NH 2 (number average molecular weight 1,800) and PLGA-5020 (number average molecular weight 8,900) in the same manner as dextran-PLGA polymer 1. .
  • the number average molecular weight of dextran-PLGA was determined by GPC measurement (column: Toso-TSK-gel ⁇ -5000x2, DMF solvent, detector: RI, standard: pullulan) (Table 1, Figure 1: Dextran -PLGA). 1 H-NMR measurement confirmed the progress of the condensation reaction (Fig. 2: dextran-PLGA).
  • Example 2 Synthesis of black yeast glucan-PLGA
  • a linear block polymer was synthesized by adding PLGA to black yeast glucan and conducting a condensation reaction.
  • Boc terminal group of black yeast glucan-NHBoc (1.19 g) was subjected to a deprotection reaction (35% hydrochloric acid aqueous solution (14.3 ml)/dimethyl sulfoxide (24 ml), stirred at room temperature for 2 hours), followed by water dialysis. and lyophilized to recover the polymer powder (black yeast glucan-NH 2 ).
  • the number average molecular weight of black yeast glucan- NH2 was determined by GPC measurement (column: TSK-gel ⁇ -5000 ⁇ 2 manufactured by Tosoh Corporation, DMF-based solvent, detector: RI, standard: pullulan) (Fig. 3: black yeast glucan-NH 2 ). By 1 H-NMR measurement, it was confirmed that a primary amino group was introduced at the reducing end of black yeast glucan.
  • Black yeast glucan (black yeast glucan- NH , number average molecular weight 1,500) (749 mg) having a primary amino group at the ⁇ -terminus was added to this reaction solution, and the active ester (NHS) of NHS-PLGA-OH was added.
  • a condensation reaction (270.5 hours) with primary amino groups of black yeast glucan- NH2 was performed. After the reaction, unreacted black yeast glucan-NH 2 was removed by water dialysis, and then unreacted NHS-PLGA-OH was removed by ultracentrifugation purification to obtain black yeast glucan-PLGA polymer 3.
  • black yeast glucan-NH 2 (number average molecular weight 1,200) and PLGA-5020 (number average molecular weight 8,900) were used in the same manner as black yeast glucan-PLGA polymer 3 to obtain black yeast glucan- PLGA polymer 4 was obtained and black yeast glucan-PLGA polymer 5 was obtained using black yeast glucan-NH 2 (number average molecular weight 2,300) and PLGA-5020 (number average molecular weight 8,900).
  • the number average molecular weight of black yeast glucan-PLGA was determined by GPC measurement (column: TSK-gel ⁇ -5000 ⁇ 2 manufactured by Tosoh Corporation, DMF-based solvent, detector: RI, standard product: pullulan) (Table 2, Fig. 3: Black yeast glucan-PLGA). 1 H-NMR measurement confirmed the progress of the condensation reaction (Fig. 4: black yeast glucan-PLGA).
  • Example 3 Preparation of particles using the S/O/W emulsion method (OVA-containing dextran particles (1), OVA-containing black yeast glucan particles (2))
  • Polymer powder (30 mg) of dextran-PLGA polymer (Amphiphilic polymer 1, Table 1) was dissolved in a mixed solution of 1.2 ml of dimethyl carbonate and 133 ⁇ l of tert-butanol to prepare a polymer solution.
  • 0.3 ml of 0.5% (w/v) OVA (ovalbumin, Sigma) aqueous solution was added dropwise to the polymer solution, and W /O emulsion solution was prepared.
  • the W/O emulsion solution After pre-freezing the W/O emulsion solution with liquid nitrogen, it was freeze-dried for 4 hours at a trap cooling temperature of ⁇ 45° C. and a degree of vacuum of 20 Pa using a freeze dryer (Tokyo Rika Kikai Co., Ltd., FD-1000). .
  • the obtained solid content was dispersed in 3 ml of ethyl acetate to prepare an S/O suspension solution.
  • the S/O suspension solution was added dropwise to 12 ml of a 1% (w/v) polyvinyl alcohol aqueous solution, and stirred at 5,000 rpm for 3 minutes using a mixer (Silverson, L5M-A) to obtain an S/O/W type.
  • An emulsion solution was prepared.
  • Ethyl acetate was removed from the S/O/W emulsion solution by submerged drying to obtain a particle suspension.
  • the suspension was transferred to a 50 ml tube and the particles were sedimented by centrifugation at 3,000 g for 30 minutes. After removing the supernatant, the particles were washed by resuspending them in 50 ml of distilled water and sedimenting the particles again by centrifugation under the above conditions. This washing operation was repeated once more, and the particles after removing the supernatant were suspended in 2.4 ml of an aqueous solution containing 5% (w/v) mannitol and 0.1% (w/v) polysorbate 80.
  • OVA-containing black yeast glucan particles (2) were obtained using a black yeast glucan-PLGA polymer (Table 2, amphiphilic polymer 3) in the same manner as for the OVA-containing dextran particles described above.
  • Table 3 shows the evaluation results of each particle.
  • the average particle size of the particles was calculated by the cumulant method using a dynamic light scattering device (ELS-Z, Otsuka Electronics Co., Ltd.) (Table 3, Figure 5: OVA-containing dextran particles, Figure 6: OVA-containing black yeast glucan particle).
  • the content rate (w/w) of the OVA antigen was determined by extracting the antigen from the particles using an organic solvent. was determined by staining using
  • Example 4 Antitumor effect of combined use of OVA-containing dextran particles (1) and imiquimod OVA-containing dextran particles (1) prepared in Example 3 and imiquimod were separately administered, and antitumor effects were observed in vivo in tumor-bearing mice. Tumor efficacy was evaluated.
  • OVA-containing dextran particles (1) 10 6 mouse lymphoma cell line EG7 was subcutaneously transplanted per mouse, and 0.5 mg of the OVA-containing dextran particles (1) prepared in Example 3 was applied twice a week from day 7 after transplantation. (excluding mannitol) was suspended in a solvent of PBS and water for injection so as to be isotonic, and administered subcutaneously to the right armpit of mice. Imiquimod was applied to the same mice at the same time as the first OVA-containing dextran particles (1).
  • imiquimod cream "Veselna Cream 5%” (Mochida Pharmaceutical Co., Ltd., hereinafter referred to as "imiquimod cream") containing imiquimod as an active ingredient was applied to the surface of the skin grafted with cancer cells for five consecutive days a week. After that, application was not performed for 2 days, and imiquimod cream was applied continuously for 5 days in the same manner as described above from the 8th day after the start of administration.
  • the tumors of the mice to which the OVA-containing dextran particles (1) prepared in Example 3 were administered and the imiquimod cream was applied regressed more than at the start of administration.
  • the mouse tumor that was administered only the OVA-containing dextran particles (1) prepared in Example 3 although the growth was delayed compared to the negative control, regression was not observed. Tumors in cancer mice were unchanged compared to negative controls.
  • Imiquimod cream was applied to the surface of the skin implanted with cancer cells for 5 consecutive days a week. After that, administration was not carried out for 2 days, and imiquimod cream was applied continuously for 5 days in the same manner as described above from the 8th day after the start of administration.
  • the tumors of the mice to which the OVA-containing black yeast glucan particles (2) prepared in Example 3 and the imiquimod cream were applied regressed more than at the start of administration.
  • the mouse tumor that was administered only the OVA-containing black yeast glucan particles (2) prepared in Example 3 although the growth was delayed compared to the negative control, regression was not observed, and only imiquimod cream was administered. Tumors in the tumor-bearing mice were unchanged compared to negative controls.
  • OVA-containing black yeast glucan particles and Poly (I:C) (Sigma, Catalog No.: P1530) were used in combination for anti-tumor examined the effects.
  • 10 6 mouse lymphoma cell line EG7 was subcutaneously transplanted per mouse, and the OVA-containing black yeast glucan particles prepared in Example 3 (2) were added twice a week from day 7 after transplantation.
  • 0.5 mg (excluding mannitol) was suspended in a solvent of PBS and water for injection so as to be isotonic, and subcutaneously administered to the right armpit of the mouse.
  • Poly(I:C) was administered intratumorally at the same time as the first OVA-containing black yeast glucan particles (2).
  • Poly(I:C) was administered at a dose of 50 ⁇ g per dose, twice a week for a total of 4 doses.
  • the tumors of the mice intratumorally administered Poly (I:C) separately from the OVA-containing black yeast glucan particles (2) produced in Example 3 regressed more than at the start of administration.
  • mouse tumors administered only the OVA-containing black yeast glucan particles (2) prepared in Example 3 showed delayed growth compared to the negative control, but no regression was observed.
  • Tumors in the treated tumor-bearing mice were unchanged compared to negative controls.
  • tumors in mice to which a mixture of OVA-containing black yeast glucan particles (2) and Poly (I:C) was administered showed delayed growth, but no regression was observed.
  • a combination pharmaceutical used for the treatment and/or prevention of cancer, which is characterized by being administered to can be used particularly for the treatment and/or prevention of infectious diseases, cancer, and the like.

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Abstract

疎水性セグメントがポリ（ヒドロキシ酸）であり、親水性セグメントが多糖である両親媒性ポリマー及び癌抗原を含む粒子、並びに免疫活性化因子を含む組合せ医薬品を、前記粒子及び免疫活性化因子が被験者に別々に投与されるように用いることによって、癌の治療及び／又は予防効果を高めることができる。

Description

癌の治療及び／又は予防のための医薬品
　本発明は、癌抗原と免疫活性化因子を別々に投与することを特徴とする、癌の治療及び／又は予防のための医薬品に関する。
　癌に対する治療又は予防法として、癌細胞に特異的に発現する癌抗原（タンパク質やそのペプチド断片等）を投与し、生体内で癌細胞に対する免疫反応を誘導する「癌ワクチン」が試みられている。一般的な低分子の抗癌剤と異なり、免疫細胞によって癌細胞のみが攻撃されるため副作用が少なく、さらに体内で免疫記憶が成立することで、再発防止効果も期待できる。しかしながら、癌ワクチンの上市例は、技術開発難易度の高さから“Ｐｒｏｖｅｎｇｅ”（前立腺癌に対する樹状細胞ワクチン）や“Ｉｍｙｇｉｃ”（転移性メラノーマに対する腫瘍溶解性ウイルス製剤）などごく少数に限られる。
　抗原に対する免疫応答を向上させるために、強力なアジュバントの開発が求められているが、現在のところ、安全上の懸念からヒトへ適用されるアジュバントは限られており、高いアジュバント効果が報告されている物質は承認されていない。例えば、水酸化アルミニウムアジュバントがあるが、このアジュバントは免疫活性化能が十分とは言えず免疫を獲得させるために繰り返し投与が必要である。
　高い免疫活性化能を目指した新たなアジュバントとして、抗原を粒子に内包する方法が試みられている。この方法では、粒子化により、抗原を内包することで、安全性の向上や、目的細胞への送達効率向上が見込まれる。脂肪酸、生分解性ポリマー、ウイルスタンパク質等多岐にわたる材料にて粒子化アジュバントが提案されてきた（非特許文献１、２）。近年、疎水性セグメントがポリ（ヒドロキシ酸）であり、親水性セグメントが多糖である両親媒性ポリマーからなるアジュバント粒子に抗原が内包された抗原－アジュバント粒子複合体に関する技術が報告されている（特許文献１、２）。特に特許文献２には癌に発現する抗原を複合体化して用いることで、抗腫瘍効果を示すことが記されており、粒子化アジュバントの癌治療薬としての適用が期待される。
　臨床においては、癌治療薬の有効性を高めるため、複数の癌治療薬を併用する治療法が標準的治療法として用いられている。前述の粒子化アジュバントについても、特許文献１において、免疫活性化因子を混合することでその免疫活性化能が増強されることが記載されている。
ＷＯ２０１０／０９８４３２ ＷＯ２０１５／０５３３５４
イムノロジー、２００６年１１７号、７８－８８ページ ネイチャー・マテリアルズ、２０１１年１０号、２４３－２５１ページ
　粒子化アジュバントと免疫活性化因子を併用することは癌治療法や予防法として有望であるが、その効果的な組み合わせ方についての検討は不十分であった。そこで、本発明は、粒子化アジュバントと免疫活性化因子を併用する医薬品において、癌の治療・予防効果を高める技術を確立することを課題とする。
　上記課題を克服するために、本発明者は、癌の治療又は予防用の粒子化アジュバントとして有望である、疎水性セグメントがポリ（ヒドロキシ酸）であり、親水性セグメントが多糖である両親媒性ポリマー及び癌抗原を含む粒子（以下、本明細書において、しばしば「粒子」と称する）に着目して鋭意検討を重ねた結果、当該粒子と免疫活性化因子を、別々に投与することで顕著な抗腫瘍効果が発揮されることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は以下の（１）～（１５）の構成を有する。
（１）疎水性セグメントがポリ（ヒドロキシ酸）であり、親水性セグメントが多糖である両親媒性ポリマー及び癌抗原を含む粒子並びに免疫活性化因子が、別々に投与されるように用いられることを特徴とする、癌の治療及び／又は予防のための医薬品。
（１－１）疎水性セグメントがポリ（ヒドロキシ酸）であり、親水性セグメントが多糖である両親媒性ポリマー及び癌抗原を含む粒子、並びに免疫活性化因子を含む、癌の治療及び／又は予防のために使用する組合せ医薬品であって、前記使用は、前記粒子の投与及び前記免疫活性化因子の投与が別々に行われることを特徴とする、前記医薬品。
（１－２）前記使用が、前記粒子の投与及び前記免疫活性化因子の投与が互いに異なる投与方法で別々に行われることを特徴とする、（１－１）に記載の医薬品。
（２）前記免疫活性化因子が、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、ＮＯＤ様受容体（ＮＬＲ）、ＲＩＧ様受容体、Ｃ型レクチン受容体（ＣＬＲ）又はインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）に結合するリガンド又はアゴニストである、（１）～（１－２）のいずれかに記載の医薬品。
（３）前記Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）に結合するリガンドまたはアゴニストが、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９又はＴＬＲ１１に結合するリガンド又はアゴニストである、（２）に記載の医薬品。
（４）前記Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）に結合するリガンド又はアゴニストが、以下の（ｉ）～（ｖｉｉ）のいずれかである、（３）に記載の医薬品。
（ｉ）ペプチドグリカン、リポタンパク質、リポポリサッカライド及びザイモザンからななる群から選択されるＴＬＲ２に結合するリガンド又はアゴニスト
（ｉｉ）Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）及びｐｏｌｙ（Ａ：Ｕ）からなる群から選択されるＴＬＲ３に結合するリガンド又はアゴニスト
（ｉｉｉ）リポポリサッカライド（ＬＰＳ）、ＨＳＰ６０、ＲＳ０９及びＭＰＬＡからなる群から選択されるＴＬＲ４に結合するリガンド又はアゴニスト
（ｉｖ）ＴＬＲ５に結合するリガンド又はアゴニストであるフラジェリン
（ｖ）イミダゾキノリン類化合物及び一重鎖ＲＮＡからなる群から選択されるＴＬＲ７又は８に結合するリガンド又はアゴニスト
（ｖｉ）バクテリアＤＮＡ、非メチル化ＣｐＧ　ＤＮＡ、ｈｅｍｏｚｏｒｉｎ、ＯＤＮ１５８５、ＯＤＮ１６６８及びＯＤＮ１８２６からなる群から選択されるＴＬＲ９に結合するリガンド又はアゴニスト
（ｖｉｉ）ｐｒｏｆｉｌｉｎ及びｕｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃバクテリアからなる群から選択されるＴＬＲ１１に結合するリガンド又はアゴニスト
（５）前記イミダゾキノリン類化合物がイミキモドである、（４）に記載の医薬品。
（６）前記免疫活性化因子が腫瘍局所に投与されることを特徴とする、（１）～（５）のいずれかに記載の医薬品。
（６－１）前記免疫活性化因子の投与が、腫瘍局所への投与である、（１）～（５）のいずれかに記載の医薬品。
（７）前記多糖が、デキストラン、β－グルカン、マンナン、キチン、キトサン、ジェランガム、アルギン酸、ヒアルロン酸又はプルランである、（１）～（６－１）のいずれかに記載の医薬品。
（８）前記β－グルカンが、１つ以上のβ－１，３結合及び／又は１つ以上のβ－１，６結合で連結されたグルコースの重合体である、（７）に記載の医薬品。
（９）前記β－グルカンが、黒酵母グルカン、カードラン、パキマン、ラミナラン、リケナン、シゾフィラン、レンチナン、スクレログルカン又はパキマランである、（７）又は（８）に記載の医薬品。
（１０）前記ポリ（ヒドロキシ酸）が、ポリ（乳酸－グリコール酸）、ポリ乳酸又はポリグリコール酸である、（１）～（９）のいずれかに記載の医薬品。
（１１）前記両親媒性ポリマーの数平均分子量が５００～１００，０００である、（１）～（１０）のいずれかに記載の医薬品。
（１２）粒子の平均粒径が０．１～５０μｍである、（１）～（１１）のいずれかに記載の医薬品。
（１３）前記癌が、基底細胞癌、バジェット病、皮膚癌、乳癌、腎癌、膵臓癌、大腸癌、肺癌、脳腫瘍、胃癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、食道癌、白血病、リンパ腫、肝臓癌、胆嚢癌、肉腫、肥満細胞腫、副腎皮質癌、ユーイング腫瘍、ホジキンリンパ腫、中皮腫、多発性骨髄腫、睾丸癌、甲状腺癌又は頭頸部癌である、（１）～（１２）のいずれかに記載の医薬品。
（１４）疎水性セグメントがポリ（ヒドロキシ酸）であり、親水性セグメントが多糖である両親媒性ポリマー及び癌抗原を含む粒子、並びに免疫活性化因子を、別々に投与することを特徴とする、癌の治療及び／又は予防のための方法。
（１５）前記粒子の投与及び前記免疫活性化因子の投与が、互いに異なる投与方法で別々に行われることを特徴とする、（１４）に記載の方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2021-150931号の開示内容を包含する。
　本発明に係る疎水性セグメントがポリ（ヒドロキシ酸）であり、親水性セグメントが多糖である両親媒性ポリマー及び癌抗原を含む粒子並びに免疫活性化因子を別々に投与されるように用いることは、顕著な抗腫瘍効果を発揮し、癌の治療や予防に有効である。
デキストラン－ＮＨ２とデキストラン－ＰＬＧＡのＧＰＣ測定の結果を表す。 デキストラン－ＰＬＧＡの１Ｈ－ＮＭＲ測定の結果を表す。 黒酵母グルカン－ＮＨ２と黒酵母グルカン－ＰＬＧＡのＧＰＣ測定の結果を表す。 黒酵母グルカン－ＰＬＧＡの１Ｈ－ＮＭＲ測定の結果を表す。 ＯＶＡ含有デキストラン粒子のＤＬＳ測定の結果を表す。 ＯＶＡ含有黒酵母グルカン粒子のＤＬＳ測定の結果を表す。
　本発明は、疎水性セグメントがポリ（ヒドロキシ酸）であり、親水性セグメントが多糖である両親媒性ポリマー及び癌抗原を含む粒子、並びに免疫活性化因子が、別々に投与されるように用いられることによって強力な免疫活性化を誘導することを特徴としている。本発明の医薬品が生じさせる免疫応答の種類は限定されない。免疫応答の種類としてはＴｈ１型免疫応答やＴｈ２型免疫応答があり、抗原や、投与部位、投与方法、前記粒子に組み合わせる免疫活性化因子の種類によってどちらかの免疫応答を優位に生じることが知られるが、本発明はＴｈ１型、Ｔｈ２型両方のタイプの免疫応答を生じさせうる。
　本発明で用いられる、疎水性セグメントがポリ（ヒドロキシ酸）であり、親水性セグメントが多糖である両親媒性ポリマー及び癌抗原を含む粒子と免疫活性化因子との併用による抗腫瘍活性は、後述するように生体内で担癌動物に対する腫瘍増殖の抑制を調べることによって評価することができる。
　本発明の医薬品のうち、癌抗原とともに粒子を構成する両親媒性ポリマーについて説明する。「両親媒性」とは、親水性と疎水性の両方の性質を有していることを意味する。ある部位（セグメント）の水への溶解度が、他の部位（セグメント）より高いとき、該部位を親水性であると言う。親水性部位は、水に可溶であることが望ましいが、難溶であっても他の部位と比較して、水への溶解度が高ければ良い。また、ある部位（セグメント）の水への溶解度が、他の部位より低いとき、該部位（セグメント）を疎水性であるという。疎水性部位は、水に不溶であることが望ましいが、可溶であっても他の部位と比較して、水への溶解度が低ければ良い。
　「両親媒性ポリマー」とは分子全体として上述の両親媒性を有するポリマーである。両親媒性「ポリマー」とは両親媒性分子中の親水性セグメント又は疎水性セグメント、又はその両方が最小単位（モノマー）の繰り返し構造で構成された分子構造であることを示す。本発明における両親媒性ポリマーの構造は特に限定されず、具体例としては、多糖とポリ（ヒドロキシ酸）がつながった直鎖状のブロック型ポリマー、多糖又はポリ（ヒドロキシ酸）が複数個存在する分岐を持った分岐ポリマー、多糖の主鎖及びポリ（ヒドロキシ酸）の側鎖からなるグラフト型ポリマー、ポリ（ヒドロキシ酸）の主鎖及び多糖の側鎖からなるグラフト型ポリマーが挙げられるが、好ましくは、多糖とポリ（ヒドロキシ酸）がつながった直鎖状のブロック型ポリマーである。
　本発明は、両親媒性ポリマーの親水性セグメントが多糖であることを特徴としている。多糖であれば特に限定されないが、具体例としては、デキストラン、β－グルカン、マンナン、キチン、キトサン、ジェランガム、アルギン酸、ヒアルロン酸又はプルランが挙げられ、好ましくはデキストラン又はβ－グルカンである。
　グルカンとはグルコース含有多糖類であり、β－グルカンはグルコースサブユニット間に１つ以上のβ－結合を含むものである。すなわち、本発明で使用されるβ－グルカンはβ－結合を含むものであり、β－結合のみを含むものであってもよい。また、本発明で使用されるβ－グルカンは分枝状であっても線状であってもよい。好ましいβ－グルカンとしては、１つ以上のβ－１，３結合及び／又は１つ以上のβ－１，６結合を含むものや、１つ以上のβ－１，２結合及び／又はβ－１，４結合を含むものが挙げられるが、１つ以上のβ－１，３結合及び／又は１つ以上のβ－１，６結合を含むものがより好ましく、１つ以上のβ－１，３結合を含むものがさらに好ましい。１つ以上のβ－１，３結合を含むβ－グルカンの具体例としては、カードラン、パキマン、ラミナラン、リケナン、シゾフィラン、レンチナン、スクレログルカン、黒酵母グルカン（好ましくは、黒酵母由来のβ－１，３グルカンもしくはβ－１，６グルカン）又はパキマランが挙げられ、好ましくはカードラン、パキマン、ラミナラン、シゾフィラン、スクレログルカン、黒酵母グルカン又はパキマランが挙げられる。
　１つ以上のβ－１，３結合を含む線状のβ－グルカンとしては、主としてβ－１，３結合からなるβ－グルカン（例えば、カードランやパキマン）や、β－１，３結合とβ－１，３結合以外のβ－結合からなるβ－グルカン（例えば、ラミナランやリケナン）が挙げられる。
　１つ以上のβ－１，３結合を含む分枝状のβ－グルカンとしては、β－１，３結合とβ－１，６結合からなるβ－グルカン（例えば、シゾフィランやレンチナン、スクレログルカン、黒酵母グルカン）が挙げられる。
　本発明で使用されるβ－グルカンは誘導体化されたβ－グルカンであってもよい。誘導体化の例としては、カルボキシメチル基の付加反応や酸化的開裂反応が挙げられる。誘導体化されたβ－グルカンの例としては、カードランにカルボキシメチル基が付加されたカルボキシメチルカードランや、パキマンが開裂されたパキマランが挙げられる。
　多糖の数平均分子量は特に限定されないが、好ましくは５００～１００，０００であり、より好ましくは５００～５０，０００であり、さらに好ましくは１，０００～１０，０００、例えば、１，０００～９，０００、１，０００～８，０００、１，０００～７，０００、１，０００～６，０００、１，０００～５，０００、１，０００～４，０００、１，０００～３，０００である。数平均分子量とは、分子の大きさの重み付けを考慮しない方法（単純平均）で算出した平均分子量であり、多糖の数平均分子量はゲルパーミションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）により求めることができる。
　本発明において、両親媒性ポリマーの疎水性セグメントは、ポリ（ヒドロキシ酸）であることを特徴としている。ポリ（ヒドロキシ酸）は特に限定されないが、生体投与時に著しく有害な影響を与えない生体適合性ポリマーであることが好ましい。ここで言う生体適合性とはラットに該ポリマーを経口投与する場合のＬＤ５０が２，０００ｍｇ／ｋｇ以上のものを指す。ポリ（ヒドロキシ酸）はまた、複数種類のヒドロキシ酸の共重合体であってもよいが、好ましくは２種類以下のヒドロキシ酸の重合体である。
　ポリ（ヒドロキシ酸）の好ましい具体例としては、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリ（２－ヒドロキシ酪酸）、ポリ（２－ヒドロキシ吉草酸）、ポリ（２－ヒドロキシカプロン酸）、ポリ（２－ヒドロキシカプリン酸）、ポリ（リンゴ酸）又はこれらの高分子化合物の誘導体ならびに共重合体が挙げられるが、好ましくはポリ（乳酸－グリコール酸）、ポリ乳酸又はポリグリコール酸であり、より好ましくはポリ（乳酸－グリコール酸）である。また、ポリ（ヒドロキシ酸）がポリ（乳酸－グリコール酸）である場合、ポリ（乳酸－グリコール酸）の組成比（乳酸／グリコール酸）（モル／モル）は、本発明の目的が達成される限りにおいて特に限定されないが、９９／１～１／９９のものが好ましく、８０／２０～２０／８０、例えば６０／４０～４０／６０、または５０／５０のものがより好ましい。
　本発明の両親媒性ポリマー中のポリ（ヒドロキシ酸）部位の数平均分子量は特に限定されないが、好ましくは５００～１，０００，０００であり、より好ましくは５００～１００，０００であり、さらに好ましくは７，０００～５０，０００、７，０００～５０，０００、７，０００～４０，０００、７，０００～３０，０００、７，０００～２０，０００、７，０００～１５，０００、７，０００～１３，０００、７，０００～１２，０００である。ポリ（ヒドロキシ酸）の数平均分子量は、疎水性セグメントがポリ（ヒドロキシ酸）であり、親水性セグメントが多糖である両親媒性ポリマーの数平均分子量と多糖の数平均分子量の差より求められる。
　粒子を構成する両親媒性ポリマーの数平均分子量は特に限定されないが、好ましくは１，０００～１，０００，０００であり、より好ましくは１，０００～１００，０００であり、さらに好ましくは９，０００～５０，０００、９，０００～５０，０００、９，０００～４０，０００、９，０００～３０，０００、９，０００～２０，０００、９，０００～１５，０００である。両親媒性ポリマーの数平均分子量はゲルパーミションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）より求められる。
　両親媒性ポリマーは既知の方法で製造すれば良く、具体的には、多糖にポリ（ヒドロキシ酸）を加えて縮合反応を行い製造する方法、多糖にヒドロキシ酸活性化モノマーを加えて重合反応を行い製造する方法が例として挙げられる。
　また、両親媒性ポリマーが多糖とポリ（ヒドロキシ酸）がつながった直鎖状のブロック型ポリマーである場合、既知の方法で製造すれば良く、具体的には、両親媒性ポリマーの多糖の還元末端に対して、ポリ（ヒドロキシ酸）共重合体を末端官能基の活性化剤を用いて縮合反応させることにより製造する方法［Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｒａｐｉｄ　Ｃｏｍｍｕｎ．，３１，ｐ．１６６４－１６８４（２０１０年）］が例として挙げられる。
　また、両親媒性ポリマーが多糖の主鎖及びポリ（ヒドロキシ酸）の側鎖からなるグラフト型ポリマーである場合、以下の（１）、（２）又は（３）のようにして製造することができる。
（１）すず触媒存在下、多糖にヒドロキシ酸活性化モノマーを加えて重合反応を行い、ポリ（ヒドロキシ酸）を導入することでグラフト型ポリマーを製造する方法［Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，３１，ｐ．１０３２－１０３９（１９９８年）］
（２）水酸基の大部分が置換基で保護された多糖の一部未保護の水酸基を塩基で活性化後、ヒドロキシ酸活性化モノマーを加えてポリ（ヒドロキシ酸）からなるグラフト鎖を導入し、最後に保護基を取り除くことにより、グラフト型ポリマーを製造する方法［Ｐｏｌｙｍｅｒ，４４，ｐ．３９２７－３９３３，（２００３年）］
（３）多糖に対して、ポリ（ヒドロキシ酸）の共重合体を脱水剤及び／又は官能基の活性化剤を用いて縮合反応させることにより、グラフト型ポリマーを製造する方法［Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，３３，ｐ．３６８０－３６８５（２０００年）］。
　両親媒性ポリマーは、長期に渡って免疫活性化作用を持続させるために、生体内ですぐに排泄されないよう全体として水不溶性であることが好ましい。ここでいう「水不溶性」とは、水への溶解度が１ｇ（両親媒性ポリマー）／１００ｍｌ（水）以下であることをいう。
　両親媒性ポリマーは、機能性化合物で修飾することで所望の機能を付与した修飾型両親媒性ポリマーであってもよい。具体例として、免疫活性化作用を高めるために、既知の方法により後段で説明されるような免疫活性化因子を両親媒性ポリマーに結合させた修飾型両親媒性ポリマーであってもよい。
　両親媒性ポリマーとともに粒子を構成する癌抗原について説明する。本発明における「癌抗原」とは、生体内で免疫応答を惹起することで、癌の治療及び／又は予防を目的とした医薬又はワクチンとして利用されえるものである。本発明の両親媒性ポリマーと癌抗原を含む粒子を有効成分にすることによって、癌抗原によって惹起される免疫応答を強化することができる。
　本発明の粒子に含まれる癌抗原は、本発明の目的が達成される限り特に限定されない。癌抗原の例としては、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、糖脂質、脂質、炭水化物、核酸、多糖類及びこれらを含むウイルス、菌体、組織、細胞、などが挙げられる。具体例としては、ＷＯ２０１７／１８１１２８に記載の癌抗原である、ＷＴ１、ＭＵＣ１、ＬＭＰ２、ＨＰＶ　Ｅ６、ＨＰＶ　Ｅ７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｈｅｒ－２／ｎｅｕ、イディオタイプ、ＭＡＧＥ　Ａ３、ｐ５３、ＮＹ－ＥＳＯ－１（ＣＴＡＧ１）、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、ＭｅｌａｎＡ／Ｍａｒｔ１、Ｒａｓ、ｇｐ１００、プロテイナーゼ３、ｂｃｒ－ａｂｌｅ、チロシナーゼ、サバイビン、ＰＳＡ、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイント（ｓａｒｃｏｍａ　ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ　ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔｓ）、ＥｐｈＡ２、ＰＡＰ、ＭＰ－ＩＡＰ、ＡＦＰ、ＥｐＣＡＭ、ＥＲＧ、ＮＡ１７－Ａ、ＰＡＸ３、ＡＬＫ、アンドロゲンレセプター、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＰｈｏＣ、ＴＲＰ－２、メソテリン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）、ＰＳＣＡ、ＭＡＧＥ　Ａ１、ＣＹＰ１Ｂ１、ＰＬＡＣ１、ＢＯＲＩＳ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＲＧＳ５、ＳＡＲＴ３、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ１、精子タンパク質１７、ＬＣＫ、ＨＭＷＭＡＡ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ１、Ｂ７－Ｈ３、レグマイン、Ｔｉｅ２、Ｐａｇｅ４、ＶＥＧＦＲ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＦＡＰ、ＰＡＰ、ＰＤＧＦＲ－ベータ、ＭＡＤ－ＣＴ－２、ＣＥＡ、ＴＲＰ－１（ｇｐ７５）、ＢＡＧＥ１、ＢＡＧＥ２、ＢＡＧＥ３、ＢＡＧＥ４、ＢＡＧＥ５、ＣＡＭＥＬ、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ５、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ８、ＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１１、ＭＡＧＥ－Ａ１２及びＦｏｓ関連抗原１が挙げられる。また、粒子化アジュバントによる癌抗原の抗腫瘍効果の増強を評価するモデル実験系として、卵白アルブミン（ＯＶＡ）などのモデル癌抗原を強制発現させた癌細胞に対して粒子化した当該モデル癌抗原を作用させる実験系が利用されることがあるが、ここで言う癌抗原にはこのようなモデル癌抗原も包含する。本発明の粒子に含まれる癌抗原の数は特に限定されず、１種類のみであってもよいし、２種以上であってもよい。
　本発明の有効成分のひとつである両親媒性ポリマー及び抗原で構成される粒子には、癌抗原及び両親媒性ポリマー以外の追加の成分が含まれてもよい。追加の成分の具体例としては、抗原、例えば癌抗原を内包しうる粒子であるリポソームや脂質ナノ粒子の構成成分として周知の脂質が挙げられるが、実施例において明らかなとおり、本発明では粒子を構成する癌抗原以外の成分として脂質を用いずとも十分に期待する効果が得られることから、粒子を構成する追加の成分として脂質を含まないことが好ましい。
　本発明の有効成分のひとつである両親媒性ポリマー及び癌抗原で構成される粒子の構造としては特に限定されないが、粒子は両親媒性ポリマーと癌抗原の複合体であるため、粒子を構成する両親媒性ポリマーの親水性セグメントを粒子の内側とし、疎水性セグメントを粒子の外層とする構造をとる場合、癌抗原が粒子に内包される形態となりより安定に保持されうるため、好ましい。
　粒子を製造する方法は特に限定されず、液中乾燥法、噴霧乾燥法、粉砕法などが挙げられるが、本発明における粒子は液中乾燥法によって好ましく製造される。
　液中乾燥法によって粒子を製造する方法としては、Ｏ／Ｗエマルジョン法、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルジョン法、Ｓ／Ｏ／Ｗエマルジョン法などが挙げられる。
　Ｏ／Ｗエマルジョン法により粒子を製造する場合の例を挙げると、粒子を構成する両親媒性ポリマーの粉体を溶解した水非混和性有機溶媒と、表面改質剤と癌抗原を溶解した水溶液を混合し、Ｏ／Ｗエマルジョン溶液を調製する工程、及びＯ／Ｗエマルジョン溶液から水非混和性有機溶媒を除去して粒子を得る工程によって製造することができる。
　Ｗ／Ｏ／Ｗエマルジョン法により粒子を製造する場合の例を挙げると、癌抗原を溶解した水系溶媒と、粒子を構成する両親媒性ポリマー粉体を溶解した水非混和性有機溶媒を混合しＷ／Ｏエマルジョン溶液を調製する工程、Ｗ／Ｏエマルジョン溶液と表面改質剤水溶液を混合しＷ／Ｏ／Ｗエマルジョン溶液を調製する工程、及びＷ／Ｏ／Ｗエマルジョン溶液から水非混和性有機溶媒を除去して粒子を得る工程によって製造することができる。
　Ｓ／Ｏ／Ｗエマルジョン法により粒子を製造する場合の例を挙げると、癌抗原を溶解した水系溶媒と、粒子を構成する両親媒性ポリマー粉体を溶解した水非混和性有機溶媒を混合しＷ／Ｏエマルジョン溶液を調製する工程、Ｗ／Ｏエマルジョン溶液から溶媒を除去し固形分を得る工程、固形分を水非混和性有機溶媒に分散させＳ／Ｏサスペンジョン溶液を得る工程、Ｓ／Ｏサスペンジョン溶液と表面改質剤水溶液を混合しＳ／Ｏ／Ｗエマルジョン溶液を調製する工程、及びＳ／Ｏ／Ｗエマルジョン溶液から水非混和性有機溶媒を除去して粒子を得る工程によって製造することができる。
　粒子中の抗原含有率（抗原／粒子）は、好ましくは０．０１～２０重量％、より好ましくは０．１～１０重量％である。抗原含有率の定量方法としては、粒子より有機溶媒を用いて抗原を抽出し、ゲル電気泳動又は液体クロマトグラフィーにより定量する方法が挙げられる。
　粒子調製に使用する表面改質剤としては、水溶性ポリマー又は界面活性剤であることが好ましい。ここでいう水溶性ポリマーとは、水への溶解度が１ｇ（水溶性ポリマー）／１００ｍｌ（水）以上の高分子化合物である。
　表面改質剤となる水溶性ポリマーの例としては、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンイミン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリ－１，３－ジオキソラン、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンポリマー、ポリ－１，３，６－トリオキサン、ポリアミノ酸、ペプチド、タンパク質、糖類（単糖類、少糖類、多糖類等）が挙げられるが、ポリビニルアルコールが好ましい。
　表面改質剤となる界面活性剤の例としては、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタンジ脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリンモノ脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリンジ脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等の非イオン性活性剤や、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸アンモニウム、ステアリル硫酸ナトリウムなどのアルキル硫酸塩又はレシチンが挙げられるが、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールが好ましい。
　粒子調製に使用する水非混和性有機溶媒は、両親媒性ポリマーが可溶で且つ、多糖が難溶又は不溶であることが好ましい。水非混和性有機溶媒の水への溶解度は、好ましくは３０ｇ（水非混和性有機溶媒）／１００ｍｌ（水）以下である。水非混和性有機溶媒の具体例としては、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、炭酸ジメチル、炭酸ジエチル、塩化メチレン、クロロホルムが挙げられる。
　粒子調製に使用する水系溶媒は、水および任意で水溶性成分を含有する水溶液である。該水溶性成分として、例えば、無機塩類、糖類、有機塩類、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、核酸などが挙げられる。
　粒子表面には、前記製造過程で使用される表面改質剤が結合していてもよい。ここでいう結合とは非共有結合であっても共有結合であっても良い。非共有結合は、好ましくは疎水的な相互作用であるが、イオン結合（静電相互作用）、水素結合、配位結合、ファン・デル・ワールス結合、物理吸着でも良く、それらが複合した結合でもよい。
　前記粒子の平均粒径は、好ましくは０．１μｍ～５０μｍであり、より好ましくは０．１μｍ～２５μｍ、さらに好ましくは０．１μｍ～１０μｍ、特に好ましくは０．１μｍ～１μｍ、例えば、０．２μｍ～０．９μｍ、０．３μｍ～０．８μｍ、０．４μｍ～０．７μｍである。ここでいう平均粒径は、動的光散乱装置（ＤＬＳ：例えば、大塚電子株式会社、ＥＬＳ－Ｚ）を用いてキュムラント法により求めることができる。
　本明細書で使用される「治療」とは前述の抗腫瘍効果に基づく癌の治療を意味する。また、本明細書で使用される「予防」とは、癌の発生の予防だけではなく、癌の転移又は再発の予防を意味する。
　本明細書で使用される「腫瘍」及び「癌」という用語は、悪性新生物を意味し、互換的に用いられる。
　本発明の医薬品のうち、前記粒子の生体（被験者）への投与方法に特に限定はないが、例を挙げると、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、経鼻投与、経肺投与、経口投与、経皮投与、舌下投与、腟内投与、腹腔内投与、リンパ節投与などであり、好ましくは皮内投与又は皮下投与である。
　前記粒子の投与方法として、後述の免疫活性化因子の投与とは異なる投与方法が好ましく選択される。例えば、免疫活性化因子の投与を腫瘍局所への投与で行う場合、前記粒子の投与を皮下投与により行うことができる。
　前記粒子の投与量は、投与方法、投与回数によって適宜設定されるが、例えばヒトに対して本発明の粒子を皮下投与する場合、一回につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり０．００１ｍｇ／ｂｏｄｙ～１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲、あるいは、例えば患者の体重１ｋｇあたり、１ｍｇから３０ｍｇで投与量を選ぶことができるが、これらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量、投与方法は、患者の体重、年齢、性別、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
　本発明の有効成分のひとつである免疫活性化因子について説明する。「免疫活性化因子」とは、ここでは１種以上の免疫細胞を活性化する因子であり、該細胞の免疫機能を維持、増強しうる物質を意味する。ここでいう「免疫細胞」とは、例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、顆粒球、マクロファージ、骨髄由来抑制性細胞、Ｌａｎｇｅｒｈａｎｃｅ細胞及びその前駆細胞群、腫瘍内に存在する前記免疫細胞群である。
　本発明で用いられる免疫活性化因子は特に限定されず、具体例としては、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、ＮＯＤ様受容体（ＮＬＲ）、ＲＩＧ様受容体、Ｃ型レクチン受容体（ＣＬＲ）又はインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）に結合するリガンド又はアゴニストが挙げられるが、好ましくはＴＬＲに結合するリガンド又はアゴニストである。
　ＴＬＲの具体例としては、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９又はＴＬＲ１１が挙げられ、それらに結合するリガンド又はアゴニストの具体例としては、以下の（ｉ）～（ｖｉｉ）が挙げられる。
　（ｉ）ペプチドグリカン、リポタンパク質、リポポリサッカライド及びザイモザンからなる群から選択されるＴＬＲ２に結合するリガンド又はアゴニスト。
　（ｉｉ）Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）及びｐｏｌｙ（Ａ：Ｕ）からなる群から選択されるＴＬＲ３に結合するリガンド又はアゴニスト。
　（ｉｉｉ）リポポリサッカライド（ＬＰＳ）、ＨＳＰ６０、ＲＳ０９及びＭＰＬＡからなる群から選択されるＴＬＲ４に結合するリガンド又はアゴニスト。
　（ｉｖ）ＴＬＲ５に結合するリガンド又はアゴニストであるフラジェリン。
　（ｖ）イミダゾキノリン類化合物及び一重鎖ＲＮＡからなる群から選択されるＴＬＲ７又は８に結合するリガンド又はアゴニスト。
　（ｖｉ）バクテリアＤＮＡ、非メチル化ＣｐＧ　ＤＮＡ、ｈｅｍｏｚｏｒｉｎ、ＯＤＮ１５８５、ＯＤＮ１６６８及びＯＤＮ１８２６からなる群から選択されるＴＬＲ９に結合するリガンド又はアゴニスト。
　（ｖｉｉ）ｐｒｏｆｉｌｉｎ及びｕｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃバクテリアからなる群から選択されるＴＬＲ１１に結合するリガンド又はアゴニスト。
　本発明において、免疫活性化因子は、好ましくはＴＬＲ３に結合するリガンド又はアゴニスト、あるいはＴＬＲ７又は／及び８に結合するリガンド又はアゴニストであり、より好ましくは以下の（ｉｉ）又は（ｖ）のリガンドまたはアゴニストである。
　前記（ｉｉ）Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）及びｐｏｌｙ（Ａ：Ｕ）からなる群から選択されるＴＬＲ３に結合するリガンド又はアゴニストとして、好ましくはＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）である。Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）は塩基としてイノシンのみからなるＲＮＡ鎖と、塩基としてシチジンのみからなるＲＮＡ鎖によって形成される、二本鎖ＲＮＡである。本発明で使用されるＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の鎖長は特に限定されない。
　前記（ｖ）のイミダゾキノリン類化合物は、ＴＬＲ７又はＴＬＲ８に結合するものであれば特に限定されないが、好ましい具体例としては、例えば米国特許８，９５１，５２８号に記載の化合物や、ＷＯ２０１５／１０３９８９に記載されている化合物があり、例えば、４－ａｍｉｎｏ－２－（ｅｔｈｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）－ａ，ａ－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏ［４，５－ｃ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ－１－ｅｔｈａｎｏｌ（Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ（Ｒ８４８））、１－（２－ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｙｌ）－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏ［４，５－ｃ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ－４－ａｍｉｎｅ（Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）、１－（４－ａｍｉｎｏ－２－ｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏ－［４，５－ｃ］ｑｕｉｎｏｌｉｎ－１－ｙｌ）－２－ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐａｎ－２－ｏｌ（Ｇａｒｄｉｑｕｉｍｏｄ）、Ｎ－［４－（４－ａｍｉｎｏ－２－ｅｔｈｙｌ－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏ［４，５－ｃ］ｑｕｉｎｏｌｉｎ－１－ｙｌ）ｂｕｔｙｌ－］ｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ（ＰＦ－４８７８６９１）、４－ａｍｉｎｏ－ａａ－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２－ｍｅｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌ－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏ［４，５－ｃ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ－１－ｅｔｈａｎｏｌ、１－（２－（３－（ｂｅｎｚｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｏｘｙ）ｅｔｈｙｌ）－２－（ｅｔｈｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏ［４，５－ｃ］ｑｕｉｎｏｌｉｎ－４－ａｍｉｎｅ、４－ａｍｉｎｏ－２－ｅｔｈｏｘｙｍｅｔｈｙｌ－ａａ－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－６，７，８，９－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏ［４，５－ｃ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ－１－ｅｔｈａｎｏｌ、Ｎ－（２－｛２－［４－ａｍｉｎｏ－２－（２－ｍｅｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏ［４，５－ｃ］ｑｕｉｎｏｌｉｎ―ｌ－ｙｌ］ｅｙｈｏｘｙ｝ｅｔｈｙｌ）－ｎ’－ｐｈｅｎｙｌｕｒｅａ、１－２－ａｍｉｎｏ－２－ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｙｌ）－２－（ｅｔｈｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏ［４，５－ｃ］ｑｕｉｎｏｌｉｎ－４－ａｍｉｎｅ、１－｛４－［（３，５－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｓｕｌｆｏｎｙｌ］ｂｕｔｙｌ｝－２－ｅｔｈｙｌ－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏ［４，５－ｃ］ｑｕｉｎｏｌｉｎ－４－ａｍｉｎｅ、Ｎ－（２－｛２－［４－ａｍｉｎｏ－２－（ｅｔｈｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏ［４，５－ｃ］ｑｕｉｎｏｌｉｎ－１－ｙｌ］ｅｔｈｏｘｙ｝ｅｔｈｙｌ）－ｎ’－ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｕｒｅａ、Ｎ－｛３－［４－ａｍｉｎｏ－２－（ｅｔｈｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏ［４，５－ｃ］ｑｕｉｎｏｌｉｎ－１－ｙｌ］ｐｒｏｐｙｌ｝－ｎ’－（３－ｃｙａｎｏｐｈｅｎｙｌ）ｔｈｉｏｕｒｅａ、Ｎ－［３－（４－ａｍｉｎｏ－２－ｂｕｔｙｌ－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏ［４，５－ｃ］ｑｕｉｎｏｌｉｎ－ｌ－ｙｌ）－２，２－ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｙｌ］ｂｅｎｚａｍｉｄｅ、２－ｂｕｔｙｌ－１－［３－（ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ）ｐｒｏｐｙｌ］－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏ［４，５－ｃ］ｑｕｉｎｏｌｉｎ－４－ａｍｉｎｅ及びこれらの誘導体が挙げられる。より好ましくはイミキモドであり、イミキモドは、ＣＡＳナンバー９９０１１－０２－６で表される分子量約２４０．３の化合物である。イミキモドのＩＵＰＡＣ名は４－ａｍｉｎｏ－１－（２－ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｙｌ）－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏ［４，５－ｃ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅであり、別の記述として、Ｒ８３７、Ｓ－２６３０８、１－（２－ＭＥＴＨＹＬＰＲＯＰＹＬ）－１Ｈ－ＩＭＩＤＡＺＯ［４，５－Ｃ］ＱＵＩＮＯＬＩＮ－４－ＡＭＩＮＥ；４－ａｍｉｎｏ－１－ｉｓｏｂｕｔｙｌ－１ｈ－ｉｍｉｄａｚｏ［４，５－ｃ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ、１－ｉｓｏＢｕｔｙｌ－１Ｈ－Ｉｎｕｄａｚｏｌｅ［４．５－ｃ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ－４－ａｍｉｎｅ；１－（２－Ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｙｌ）－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏ［４，５－ｃ］ｑｕｉｎｏｌｉｎ－４－ａｍｉｎｅで表される。
　ＮＯＤ様受容体（ＮＬＲ）に結合するリガンド又はアゴニストの具体例としては、例えば、Ｍ－ＴｒｉＤＡＰ、ＰＧＮが挙げられる。その他、ＮＯＤ１に対するリガンド又はアゴニスト、例えばＴｒｉ－ＤＡＰ、ｉＥ－ＤＡＰ、Ｃ１２－ｉＥも挙げられる。また、ＮＯＤ２に対するリガンド又はアゴニスト、例えばＭＤＰ、Ｎ－グリコシル－ＭＤＰ、Ｍｕｒａｂｕｔｉｄｅ、Ｍ－ＴｒｉＬｙＳ－Ｄ－ＡＳＮ、Ｍ－ＴｒｉＬＹＳ、Ｌ１８－ＭＤＰも挙げられる。
　ＲＩＧ様受容体に結合するリガンド又はアゴニストの具体例としては、例えば、５’ｐｐｐ－ｄｓＲＮＡ、ｐｏｌｙ（ｄＡ：ｄＴ）、ｐｏｌｙ（ｄＧ：ｄＣ）、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）が挙げられる。
　Ｃ型レクチン受容体（ＣＬＲ）に結合するリガンド又はアゴニストの具体例としては、トレハロース６，６－ジベヘン酸塩、ザイモザン、ＷＧＰ、ＨＫＳＣ、ＨＫＣＡならびにカードランＡＬが挙げられる。
　インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）に結合するリガンド又はアゴニストとしては、ｃ－ｄｉ－ＧＭＰ、ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ、２’３’－ｃＧＡＭＰ、３’３’－ｃＧＡＭＰ又は２’２’－ｃＧＡＭＰが挙げられる。
　イミキモドは当業者に公知の手法により化学合成することで得てもよいが、市販の医薬品を用いてもよい。イミキモドを患者に投与する際の剤形としては経皮投与型、好ましくはクリーム型の製剤であることが好ましい。イミキモドを有効成分とする医薬品として日本では“ベセルナクリーム５％”、欧米では“Ａｌｄａｒａ（登録商標）Ｃｒｅａｍ，５％”が上市されており、本発明においてイミキモドを利用する際にはこれら医薬品を添付文書に記載の用法・用量に従って投与することができる。
　本明細書において、「併用」あるいは「組合せ」とは、前記粒子と前記免疫活性化因子を同一生体へと同時にあるいは所定の間隔をおいて、それぞれ独立した製剤として（つまり、別々に）投与されることを指す。一方の投与と他方の投与の間隔は特に限定しない。その間隔は、一方の投与と同時投与であってもよく、一方の投与の３０分後、あるいは１時間後、３時間後、６時間後、１２時間後、１日後、３日後、５日後、７日後、２週間後、３週間後、４週間後であってもよい。粒子あるいは免疫活性化因子が生体内にてその活性を示し得るときに、少なくともいずれか一方が投与されることが好ましい。また、先に投与した粒子あるいは免疫活性化因子の生体内におけるその活性がなくなる前に、他方が投与されることが好ましい。また、前記粒子が先に投与されても良く、前記免疫活性化因子が先に投与されるものであっても良い。
　本明細書において「組合せ医薬品」とは、上述のような併用のためのそれぞれ独立した複数の製剤を含む医薬品を指す。本発明の組合せ医薬品は、治療及び／又は予防のために使用するための医薬品であり、前記粒子と前記免疫活性化因子をそれぞれ独立した製剤として含む。また、本発明の組合せ医薬品の使用は、好ましくは、粒子の投与及び前記免疫活性化因子の投与が互いに異なる投与方法で別々に行われることを特徴とする。本発明の組合せ医薬品が使用される治療及び／又は予防は、後述する癌の治療及び／又は予防のための方法に準ずる。
　前記免疫活性化因子の投与方法は、本発明の目的が達成される限り特に限定されないが、好ましくは前記粒子の投与と異なる投与経路であり、また好ましくは腫瘍局所への投与である。投与ルートは経口又は非経口であってもよく、具体的な剤形として、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型は、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、腫瘍内注射などにより全身又は局所的に投与することができるが、好ましくは腫瘍内注射により投与される。経皮投与型の例としては、例えば、塗布剤あるいは外用薬と呼ばれるものである。外用薬としては、固形剤、液剤、スプレー剤、軟膏剤、クリーム剤、あるいはゲル剤が挙げられるが、好ましくはクリーム剤として経皮投与される。
　腫瘍局所への投与に使用される投与方法は、有効成分が被験者の腫瘍に全身循環を介さずに到達可能であれば特に限定しない。例えば、腫瘍内又は腫瘍周辺部に有効成分を滞留できればよい。具体的には、腫瘍内注射、腫瘍周辺の皮膚への皮下注射などの注射による投与、腫瘍周辺の皮膚の表面への外用薬の塗布などの経皮投与などを腫瘍への局所投与として使用することができる。
　本発明の医薬品の有効成分としては、本発明の医薬品としての効果を阻害しない範囲において前記粒子並びに前記免疫活性化因子の他に、文献等で公知の抗腫瘍剤を含んでいてもよい。公知の抗腫瘍剤としては特に制限はないが、具体例としては、パクリタキセル、ドキソルビシン、ダウノルビシン、シクロフォスファミド、メトトレキサート、５－フルオロウラシル、チオテパ、ブスルファン、インプロスルファン、ピポスルファン、ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、ウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）、アルトレートアミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド（ｔｒｉｅｔｈｉｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、トリメチローロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）、ブラタシン、ブラタシノン、カンプトセシン、ブリオスタチン、カリスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）、クリプトフィシン１、クリプトフィシン８、ドラスタチン、ズオカルマイシン、エレウテロビン、パンクラチスタチン、サルコジクチン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）、スポンジスタチン、クロランブシル、クロロナファジン（ｃｈｌｏＲＮＡｐｈａｚｉｎｅ）、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン（ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、トロフォスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ウラシルマスタード、カルムスチン、クロロゾトシン（ｃｈｌｏｒｏｚｏｔｏｃｉｎ）、フォテムスチン（ｆｏｔｅｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、ダイネマイシン、クロドロネート、エスペラマイシン、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン（ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシン、ダクチノマイシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｂｉｃｉｎ）、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシンＣ、マイコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ　ａｃｉｄ）、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｍｙｃｉｎ）、オリボマイシン（ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎｓ）、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）、ウベニメクス、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ゾルビシン（ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ）、デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、プテロプテリン（ｐｔｅｒｏｐｔｅｒｉｎ）、トリメトレキセート（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン、アンシタビン、アザシチジン（ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ）、６－アザウリジン（ａｚａｕｒｉｄｉｎｅ）、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン（ｅｎｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、フロキシウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）；アンドロゲン類、例えばカルステロン（ｃａｌｕｓｔｅｒｏｎｅ）、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン（ｔｅｓｔｏｌａｃｔｏｎｅ）、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン、フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ　ａｃｉｄ）、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、エニルウラシル、アムサクリン（ａｍｓａｃｒｉｎｅ）、ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）、ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）、エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）、デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）、デメコルシン（ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ）、ジアジコン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）、エルフォルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）、酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ）、エポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）、エトグルシド（ｅｔｏｇｌｕｃｉｄ）、レンチナン、ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｍｉｎｅ）、メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）、アンサミトシン（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎｅ）、ミトグアゾン（ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）、ミトキサントロン、モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）、ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）、ペントスタチン、フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）、ピラルビシン、ロソキサントロン（ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ　ａｃｉｄ）、２－エチルヒドラジド、プロカルバジン、ラゾキサン（ｒａｚｏｘａｎｅ）、リゾキシン、シゾフィラン、スピロゲルマニウム（ｓｐｉｒｏｇｅｒｍａｎｉｕｍ）、テニュアゾン酸（ｔｅｎｕａｚｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）、トリアジコン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）、ロリジン（ｒｏｒｉｄｉｎｅ）Ａ、アングイジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ）、ウレタン、ビンデシン、ダカーバジン、マンノムスチン（ｍａｎｎｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ミトブロニトール、ミトラクトール（ｍｉｔｏｌａｃｔｏｌ）、ピポブロマン（ｐｉｐｏｂｒｏｍａｎ）、ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）、ドキセタキセル、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、６－チオグアニン、メルカプトプリン、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、ビンブラスチン、エトポシド、マイトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ノバントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）、テニポシド、エダトレキセート（ｅｄａｔｒｅｘａｔｅ）、ダウノマイシン、アミノプテリン、キセローダ（ｘｅｌｏｄａ）、イバンドロナート（ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ）、イリノテカン、トポイソメラーゼインヒビター、ジフルオロメチロールニチン（ＤＭＦＯ）、レチノイン酸、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、並びにそれらの薬学的に許容可能な（公知の）塩又は（公知の）誘導体を包含する。
　併用する抗腫瘍剤の投与方法は、特に限定しない。例えば、粒子又は免疫活性化因子の投与方法と同じ方法であっても異なる方法であってもよい。投与方法は、経口又は非経口であり、具体的な剤形として、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型は、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、腫瘍内注射などにより全身又は局所的に投与することができる。経皮投与型の例としては、例えば、塗布剤あるいは外用薬と呼ばれるものである。外用薬としては、固形剤、液剤、スプレー剤、軟膏剤、クリーム剤、あるいはゲル剤が挙げられる。
　本発明による癌の治療及び／又は予防は、前述の医薬品として投与することの他に様々な形式を含む。
　具体的には、本発明の癌の治療及び／又は予防のための方法は、本発明の目的が達成される限り特に限定されないが、好ましくは、前記粒子（疎水性セグメントがポリ（ヒドロキシ酸）であり、親水性セグメントが多糖である両親媒性ポリマー及び癌抗原を含む粒子）、並びに前記免疫活性化因子を、互いに異なる投与方法で別々に投与することを特徴とする。好ましくは、本発明の癌の治療及び／又は予防のための方法は、前記粒子を被験者に投与する工程、及び前記免疫活性化因子を被験者に投与する工程を含むが、「併用」に関連して前述した通り、いずれの工程を先に行ってもよく、両方の工程を同時に行ってもよい。また、必要に応じて、外科的処置や他の医薬品（例えば、前述の公知の抗腫瘍剤）の投与を追加で行うこともできる。
　例えば、本発明の組合せ医薬品の各有効成分は、同時に、又は順序に従って個別に投与することができる。具体例として、約３週間までの時間間隔内で、すなわち１番目の有効成分を投与した直後から約３週間までに２番目の有効成分を投与することができる。その際、例えば、外科的処置に引き続いて実施しても、１番目の有効成分と２番目の有効成分の投与間に外科的処置を実施してもよい。また、本発明の医薬品を、複数の投与サイクルに従って投与してもよい。例えば、本発明の医薬品の各有効成分の同時投与を実施した場合、各有効成分を含む医薬品両方を約２日から約３週間を１サイクルとして投与することができる。その後は該治療サイクルを担当する医師の判断に従って、必要に応じて繰り返すことも可能である。また、初回の各有効成分の投与を同時に行った場合であっても、その後の投与は、各成分を含む医薬品を互いに異なる投与サイクルで行ってもよい。この場合、初回以外の投与については、それぞれの個々の有効成分の投与期間が同じ期間に及ぶように調節する。同様に順序に従った処方を計画する場合、それぞれの個々の有効成分の投与期間が同じ期間に及ぶように調節する。サイクル間の間隔は０～２ヶ月まで変えることができる。本発明の癌の治療及び／又は予防剤の各有効成分の投与量は、医薬品での各有効成分の投与量と同様に設定することができる。
　有効成分の投与期間は特に限定しない。具体的には、例えば、３日以上、４日以上、５日以上、１週間以上、１０日以上又は２週間以上とすることができる。また、その投与期間中の各成分の投与回数も特に限定しない。前述の通り、同じ投与期間にわたって各有効成分の活性が得られるように投与されることが好ましい。そのため、投与の回数又は投与の頻度は、各有効成分が体内で活性を示す期間に応じて適宜設定することができる。具体的には、例えば、投与方法、投与量、有効成分の種類などに応じて設定すればよい。特に限定はしないが、例えば、注射剤の場合、１月に一回以上、３週間に１回以上、２０日に一回以上、１０日に一回以上、１週間に一回以上又は１週間に二回以上の頻度で投与することができる。また、例えば、外用薬の場合、１０日に一回以上、１週間に一回以上、１週間に二回以上、３日に１回以上、２日に一回以上又は１日に一回以上の頻度で投与することができる。
　本発明において対象となる癌としては、前記粒子に含まれる癌抗原を発現していれば特に限定されない。好ましくは前述の基底細胞癌、バジェット病、皮膚癌、乳癌、腎癌、膵臓癌、大腸癌、肺癌、脳腫瘍、胃癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、食道癌、白血病、リンパ腫、肝臓癌、胆嚢癌、肉腫、肥満細胞腫、副腎皮質癌、ユーイング腫瘍、ホジキンリンパ腫、中皮腫、多発性骨髄腫、睾丸癌、甲状腺癌、頭頸部癌である。さらに好ましくは、触診可能な癌、皮下に存在する癌、皮内に存在する癌、表在性の癌、真皮に存在する癌あるいは非実質臓器に存在する癌である。また、これら上記癌は、原発の癌、転移性の癌、転移した癌あるいは再発した癌であってもよい。
　前記癌は、より具体的には、例えば、ボーエン病、メラノーマ、有棘細胞癌、乳房外パジェット病、菌状息肉症、Ｓｅｚａｒｙ症候群、皮膚Ｔ／ＮＫ細胞リンパ腫、皮膚のみに病変を有するＴ細胞白血病・リンパ腫、皮膚Ｂ細胞リンパ腫（ｉｎｄｏｌｅｎｔ群）、皮膚Ｔ細胞リンパ乳線癌、複合型乳腺癌、乳腺悪性混合腫瘍、乳管内乳頭状腺癌、肺腺癌、扁平上皮癌、小細胞癌、大細胞癌、神経上皮組織性腫瘍である神経膠腫、膠芽腫、神経芽腫、脳室上衣腫、神経細胞性腫瘍、胎児型の神経外胚葉性腫瘍、神経鞘腫、神経線維腫、髄膜腫、慢性型リンパ球性白血病、リンパ腫、消化管型リンパ腫、消化器型リンパ腫、小～中細胞型リンパ腫、盲腸癌、上行結腸癌、下行結腸癌、横行結腸癌、Ｓ状結腸癌、直腸癌、卵巣上皮癌、胚細胞腫瘍、間質細胞腫瘍、膵管癌、浸潤性膵管癌、膵臓癌の腺癌、腺房細胞癌、腺扁平上皮癌、巨細胞腫、膵管内乳頭粘液性腫瘍、粘液性嚢胞腺癌、膵芽腫、膵頭細胞腫、Ｆｒａｎｔｚ腫瘍、漿液性嚢胞腺癌、固体乳頭状癌、ガストリノーマ、グルカゴノーマ、インスリノーマ、多発性内分泌腺腫症１（Ｗｅｒｍｅｒ症候群）、非機能性島細胞腫、ソマトスタチノーマ、ＶＩＰ産生腫瘍、子宮頸癌、子宮体癌、線維肉腫、骨・関節肉種、ユーイング肉腫、ウィルムス腫瘍、肝芽腫、軟部肉腫、急性白血病、慢性白血病、脊髄腫瘍、軟部悪性腫瘍、奇形腫群腫瘍、頭頸部癌には、下咽頭癌、中咽頭癌、舌癌、上咽頭癌、口腔癌、口唇癌、副鼻腔癌、喉頭癌等が包含されるが、これらに限定されない。また上記癌を原発とする触診可能な癌、皮下に存在する癌、皮内に存在する癌、表在性の癌、真皮に存在する癌あるいは非実質臓器に存在する癌が包含される。また上記癌を原発として、転移や再発することによって、触診可能な癌、皮下に存在する癌、皮内に存在する癌、表在性の癌、真皮に存在する癌あるいは非実質臓器に存在する癌が包含される。
　本発明の医薬品である前記粒子と前記免疫活性化因子との組合せは、インビボで細胞傷害活性を有する。よって本発明の抗腫瘍効果は、癌に対する細胞傷害活性を調べることによって知ることが可能である。細胞傷害活性は、癌を有する生体（被験者）へ前記粒子と前記免疫活性化因子を併用投与し、投与後の腫瘍の大きさを計測して、癌の大きさを経時的に調べる事によって評価できる。また、本発明の抗腫瘍効果は、被験者の生存率を調べることによっても評価できる。また、サイトカインあるいはケモカインの産生能を調べる事によっても評価できる。本発明の前記粒子と前記免疫活性化因子との組み合わせによる抗腫瘍効果は、さらに癌の予防、転移の予防あるいは再発の予防を調べることによっても知ることができる。
　また、対象となる好ましい被験者（患者）は、哺乳動物であり、例えば霊長類、ペット動物、家畜類、競技用動物等を含む哺乳動物であり、特にヒト、イヌ及びネコが好ましい。
　本発明の医薬品は、当業者に公知の方法で製剤化することが可能である。例えば水もしくはそれ以外の薬学的に許容しうる液と混和した無菌性溶液又は懸濁液剤等の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体又は媒体、具体的には、減菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、芳香剤、賦形剤、結合剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
　注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ－ソルビトール、Ｄ－マンノース、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウムを含む水溶液が挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ－６０と併用してもよい。油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
　さらなる態様について以下に記載する。
　本発明は、上述のように他の有効成分と組み合わせた各有効成分の使用にも関連する。具体的には、前記粒子（疎水性セグメントがポリ（ヒドロキシ酸）であり、親水性セグメントが多糖である両親媒性ポリマー及び癌抗原を含む粒子）の、癌の治療及び／又は予防における使用に関する。ここでの使用は、前記粒子を免疫活性化因子と組み合せて被験者に投与することを含み、好ましくは、前記粒子の投与及び前記免疫活性化因子の投与が異なる投与方法で別々に行われることを特徴とする。
　また同様に、本発明は、免疫活性化因子の、癌の治療及び／又は予防における使用にも関する。ここでの使用は、前記免疫活性化因子を、前記粒子と組み合せて被験者に投与することを含み、好ましくは、前記粒子の投与及び前記免疫活性化因子の投与が異なる投与方法で別々に行われることを特徴とする。
　本発明はさらに、前記方法に使用するための、各有効成分を含む組成物に関連する。具体的には、前記粒子を含む、癌の治療及び／又は予防に使用するための組成物に関する。ここでの使用は、前記組成物を免疫活性化因子と組み合せて被験者に投与することを含み、好ましくは、前記組成物の投与及び前記免疫活性化因子の投与が異なる投与方法で別々に行われることを特徴とする。この使用は、例えば、前記組成物を被験者に投与する工程、及び前記免疫活性化因子を被験者に投与する工程を含むことができる。
　また同様に、本発明は、免疫活性化因子を含む、癌の治療及び／又は予防に使用するための組成物に関する。ここでの使用は、前記組成物を、前記粒子と組み合せて被験者に投与することを含み、好ましくは、前記粒子の投与及び前記組成物の投与が異なる投与方法で別々に行われることを特徴とする。この使用は、例えば、前記粒子を被験者に投与する工程、及び前記組成物を被験者に投与する工程を含むことができる。ここで、これらの組成物の投与は、その有効成分の投与について前述した投与量、投与方法、投与回数と同様に行うことができる。
　これらの態様における使用は、癌の治療及び／又は予防のための方法、並びに本発明の医薬品の使用に関連して前述した内容に準ずる。例えば、これらの使用は、前記粒子を被験者に投与する工程、及び前記免疫活性化因子を被験者に投与する工程を含むことができ、各有効成分の投与には、それぞれについて前述した投与量、投与方法、投与間隔、投与時期、投与回数などを用いることができる。
　以下に実施例を示すが、本発明はこれら実施例により限定されない。
　（実施例１）デキストラン－ＰＬＧＡの合成
　本実施例では、デキストランにポリ（乳酸－グリコール酸）（ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ－ｃｏ－ｇｌｙｃｏｌｉｃ　ａｃｉｄ）；ＰＬＧＡ）を加えて縮合反応を行うことにより直鎖状のブロック型ポリマーを合成した。
　＜還元末端に一級アミノ基を有するデキストラン（デキストラン－ＮＨ２）の合成＞
　濃度５００ｍｇ／２ｍｌのデキストラン（数平均分子量２，１００、ＰＨＡＲＭＡＣＯＳＭＯＳ社）のジメチルスルホキシド溶液中に、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（２０３．５ｍｇ）とＮ－Ｂｏｃ－エチレンジアミン（７６．１μｌ）を投入した後、６０℃で９１時間撹拌しながら反応を行った。次いで、外液を水とする透析によって未反応のＮ－Ｂｏｃ－エチレンジアミンを除去した後、凍結乾燥を行い、デキストラン－ＮＨＢｏｃを合成した。次いで、デキストラン－ＮＨＢｏｃ（４５０ｍｇ）のＢｏｃ末端基の脱保護反応（３５％塩酸水溶液（５ｍｌ）／ジメチルスルホキシド（５ｍｌ）、常温で３５時間撹拌）を行った後、水透析にて精製し、凍結乾燥によってポリマー粉末（デキストラン－ＮＨ２）を回収した。
　デキストラン－ＮＨ２の数平均分子量はＧＰＣ測定（カラム：東ソ－株式会社製ＴＳＫ－ｇｅｌ　α－５０００×２、ＤＭＦ系溶媒、検出器：ＲＩ、標準品：プルラン）によって決定した（図１：デキストラン－ＮＨ２）。１Ｈ－ＮＭＲ測定により、デキストランの還元末端に一級アミノ基が導入されたことを確認した。
　＜デキストラン－ＰＬＧＡの合成＞
　ヘテロ二官能性末端基を持つポリ（乳酸－グリコール酸）（ＣＯＯＨ－ＰＬＧＡ－ＯＨ、富士フイルム和光純薬株式会社、ＰＬＧＡ－５０２０、数平均分子量８，９００）（３５０ｍｇ）を、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（３５．５ｍｇ）とＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（２１．３ｍｇ）のジメチルスルホキシド（０．５８ｍｌ）溶液に混合させた後、５０℃で２時間反応させ、α末端のカルボキシル基を活性エステル（ＮＨＳ）化させた。この反応溶液に、還元末端に一級アミノ基を有するデキストラン（デキストラン－ＮＨ２、数平均分子量２，７００）（１００ｍｇ）を投入し、ＮＨＳ－ＰＬＧＡ－ＯＨの活性エステル（ＮＨＳ）とデキストラン－ＮＨ２の一級アミノ基との縮合反応を１１０．５時間行った。反応後、水透析によって未反応のデキストラン－ＮＨ２を除去し、超遠心分離精製によって未反応のＮＨＳ－ＰＬＧＡ－ＯＨを除去することで、デキストラン－ＰＬＧＡポリマー１を得た。
　また、デキストラン－ＰＬＧＡポリマー１と同様の方法で、デキストラン－ＮＨ２（数平均分子量１，８００）とＰＬＧＡ－５０２０（数平均分子量８，９００）を使用して、デキストラン－ＰＬＧＡポリマー２を得た。
　デキストラン－ＰＬＧＡの数平均分子量はＧＰＣ測定（カラム：東ソ－　ＴＳＫ－ｇｅｌ　α－５０００×２、ＤＭＦ系溶媒、検出器：ＲＩ、標準品：プルラン）によって決定した（表１、図１：デキストラン－ＰＬＧＡ）。１Ｈ－ＮＭＲ測定により、縮合反応が進行したことを確認した（図２：デキストラン－ＰＬＧＡ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　（実施例２）黒酵母グルカン－ＰＬＧＡの合成
　本実施例では、黒酵母グルカンにＰＬＧＡを加えて縮合反応を行うことにより直鎖状のブロック型ポリマーを合成した。
　＜還元末端に一級アミノ基を有する黒酵母グルカン（黒酵母グルカン－ＮＨ２）の合成＞
　黒酵母グルカン（ダイソー株式会社）５ｇをジメチルスルホキシド１５０ｍｌに溶解した後、３５％塩酸水溶液５ｍｌを加え、１０５℃で２０分攪拌した。該反応溶液を透析膜に移し、水中で透析を行った後に、凍結乾燥を行い、黒酵母グルカン加水分解物（数平均分子量２，４００）を粉末として得た。
　濃度２．５ｇ／８ｍｌの黒酵母グルカン加水分解物（数平均分子量２，４００）のジメチルスルホキシド溶液中に、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（４１３．３ｍｇ）とＮ－Ｂｏｃ－エチレンジアミン（２４６．９μｌ）を投入した後、５５℃で１６９．５時間撹拌しながら反応を行った。次いで、外液を水とする透析によって未反応のＮ－Ｂｏｃ－エチレンジアミンを除去し、黒酵母グルカン－ＮＨＢｏｃを得た。次いで、黒酵母グルカン－ＮＨＢｏｃ（１．１９ｇ）のＢｏｃ末端基の脱保護反応（３５％塩酸水溶液（１４．３ｍｌ）／ジメチルスルホキシド（２４ｍｌ）、常温で２時間撹拌）を行った後、水透析にて精製し、凍結乾燥によってポリマー粉末（黒酵母グルカン－ＮＨ２）を回収した。
　黒酵母グルカン－ＮＨ２の数平均分子量はＧＰＣ測定（カラム：東ソー株式会社製ＴＳＫ－ｇｅｌ　α－５０００×２、ＤＭＦ系溶媒、検出器：ＲＩ、標準品：プルラン）によって決定した（図３：黒酵母グルカン－ＮＨ２）。１Ｈ－ＮＭＲ測定により、黒酵母グルカンの還元末端に一級アミノ基が導入されたことを確認した。
　＜黒酵母グルカン－ＰＬＧＡの合成＞
　ヘテロ二官能性末端基を持つポリ（乳酸－グリコール酸）（ＣＯＯＨ－ＰＬＧＡ－ＯＨ、富士フイルム和光純薬株式会社、ＰＬＧＡ－５０２０、数平均分子量８，９００）（４．４６２ｇ）を、ＥＤＣ（４７９．２５ｍｇ）とＮＨＳ（２８７．７３ｍｇ）のＤＭＳＯ（２．５ｍｌ）溶液に混合させた後、５０℃で約１８時間反応させ、α末端のカルボキシル基を活性エステル（ＮＨＳ）化させた。この反応溶液に、ω末端に一級アミノ基を有する黒酵母グルカン（黒酵母グルカン－ＮＨ２、数平均分子量１，５００）（７４９ｍｇ）を投入し、ＮＨＳ－ＰＬＧＡ－ＯＨの活性エステル（ＮＨＳ）と黒酵母グルカン－ＮＨ２の一級アミノ基との縮合反応（２７０．５時間）を行った。反応後、水透析によって未反応の黒酵母グルカン－ＮＨ２を除去した後、超遠心分離精製によって未反応のＮＨＳ－ＰＬＧＡ－ＯＨを除去することで、黒酵母グルカン－ＰＬＧＡポリマー３を得た。
　また、黒酵母グルカン－ＰＬＧＡポリマー３と同様の方法で、黒酵母グルカン－ＮＨ２（数平均分子量１，２００）とＰＬＧＡ－５０２０（数平均分子量８，９００）を使用して、黒酵母グルカン－ＰＬＧＡポリマー４を得て、黒酵母グルカン－ＮＨ２（数平均分子量２，３００）とＰＬＧＡ－５０２０（数平均分子量８，９００）を使用して、黒酵母グルカン－ＰＬＧＡポリマー５を得た。
　黒酵母グルカン－ＰＬＧＡの数平均分子量はＧＰＣ測定（カラム：東ソー株式会社製ＴＳＫ－ｇｅｌ　α－５０００×２、ＤＭＦ系溶媒、検出器：ＲＩ、標準品：プルラン）によって決定した（表２、図３：黒酵母グルカン－ＰＬＧＡ）。１Ｈ－ＮＭＲ測定により、縮合反応が進行したことを確認した（図４：黒酵母グルカン－ＰＬＧＡ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　（実施例３）Ｓ／Ｏ／Ｗエマルジョン法を用いた粒子の調製（ＯＶＡ含有デキストラン粒子（１）、ＯＶＡ含有黒酵母グルカン粒子（２））
　デキストラン－ＰＬＧＡポリマー（表１、両親媒性ポリマー１）のポリマー粉体（３０ｍｇ）を炭酸ジメチル１．２ｍｌ及びｔｅｒｔ－ブタノール１３３μｌの混合溶液に溶解し、ポリマー溶液を調製した。該ポリマー溶液に、０．５％（ｗ／ｖ）ＯＶＡ（卵白アルブミン、シグマ社）水溶液０．３ｍｌを滴下し、ミキサー（ポリトロン社、ＰＴ２１００Ｓ）を用いた１１，０００ｒｐｍ、１分間の撹拌によりＷ／Ｏエマルジョン溶液を製造した。該Ｗ／Ｏエマルジョン溶液を液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機（東京理化器械株式会社、ＦＤ－１０００）を用いて、トラップ冷却温度－４５℃、真空度２０Ｐａにて４時間凍結乾燥した。得られた固形分を酢酸エチル３ｍｌに分散させ、Ｓ／Ｏサスペンジョン溶液を調製した。該Ｓ／Ｏサスペンジョン溶液を１％（ｗ／ｖ）ポリビニルアルコール水溶液１２ｍｌに滴下し、ミキサー（シルバーソン社、Ｌ５Ｍ－Ａ）を用いた５，０００ｒｐｍ、３分間の撹拌によりＳ／Ｏ／Ｗ型エマルジョン溶液を調製した。該Ｓ／Ｏ／Ｗ型エマルジョン溶液から液中乾燥により酢酸エチルを除去して、粒子懸濁液とした。該懸濁液を５０ｍｌチューブに移し、３，０００ｇ、３０分間の遠心分離により粒子を沈殿させた。上清を除いた後に、粒子を５０ｍｌの蒸留水に再懸濁し、上記条件での遠心分離により粒子を再度沈殿させることにより洗浄した。この洗浄操作をもう一度繰り返し、上清を除いた後の粒子を、５％（ｗ／ｖ）マンニトール及び０．１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０を含む水溶液２．４ｍｌに懸濁させた。メッシュフィルター（１μｍ）でろ過し、該懸濁液を液体窒素で予備凍結した後、凍結乾燥機を用いて、トラップ冷却温度－４５℃、真空度２０Ｐａにて１２時間凍結乾燥することで、ＯＶＡ含有デキストラン粒子（１）を得た。
　また、前述のＯＶＡ含有デキストラン粒子と同様の方法で、黒酵母グルカン―ＰＬＧＡのポリマー（表２、両親媒性ポリマー３）を用いて、ＯＶＡ含有黒酵母グルカン粒子（２）を得た。
　各粒子の評価結果を表３に示す。粒子の平均粒径は、動的光散乱装置（大塚電子株式会社、ＥＬＳ－Ｚ）を用いてキュムラント法により算出した（表３、図５：ＯＶＡ含有デキストラン粒子、図６：ＯＶＡ含有黒酵母グルカン粒子）。ＯＶＡ抗原の含有率（ｗ／ｗ）は、粒子より有機溶媒を用いて抗原を抽出し、抽出した抗原をゲル電気泳動装置（ＴＥＦＣＯ社）でゲル電気泳動後に、コロイドＣＢＢ染色キット（ＴＥＦＣＯ社）を用いて染色を行うことにより決定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　（実施例４）ＯＶＡ含有デキストラン粒子（１）とイミキモドとの併用による抗腫瘍効果
　実施例３にて作製したＯＶＡ含有デキストラン粒子（１）とイミキモドを別々に投与し、担癌マウス生体内における抗腫瘍効果を評価した。
　具体的には、ＯＶＡ発現癌細胞を皮下に移植したＣ５７ＢＬ／６ＮＣＲマウスを用いて、ＯＶＡ含有デキストラン粒子（１）とイミキモドとの併用による抗腫瘍効果を検討した。マウス１匹あたり１０６個のマウスリンパ腫細胞株ＥＧ７を皮下に移植し、移植７日目より週一回の頻度で計２回、実施例３で作製したＯＶＡ含有デキストラン粒子（１）０．５ｍｇ（マンニトールを除く）を等張となるようにＰＢＳ及び注射用水の溶媒に懸濁し、マウス右脇皮下に投与した。同じマウスへ、初回のＯＶＡ含有デキストラン粒子（１）と同時にイミキモドの塗布を開始した。イミキモドを有効成分として含む“ベセルナクリーム５％”（持田製薬株式会社、以下「イミキモドクリーム」という）を一週間に５日間連続して、癌細胞を移植した皮膚の表面へと塗布した。その後２日間は塗布を行わず、投与開始から８日目より上記と同様に５日間連続してイミキモドクリームの塗布を行った。
　比較対照群として、担癌マウスへ、上記と同じＯＶＡ含有デキストラン粒子（１）のみを同様の投与量及び投与間隔にて投与した。さらに比較対照群として、別の担癌マウス個体へ、イミキモドクリームのみを同様の投与間隔で、癌細胞を移植した皮膚の表面へと塗布した。さらに無治療群の担癌マウスを陰性コントロールとした。投与開始後、担癌マウスの癌の大きさを経時的にノギスを用いて計測した。腫瘍体積は、定法に従い、計算式：（癌の長径の長さ）×（癌の短径の長さ）２×０．５にて算出した。
　評価の結果、実施例３で作製したＯＶＡ含有デキストラン粒子（１）の投与及びイミキモドクリームの塗布を行ったマウスの腫瘍は投与開始時よりも退縮した。それに対し、実施例３で作製したＯＶＡ含有デキストラン粒子（１）のみを投与されたマウス腫瘍では、陰性コントロールに対して成長が遅延したものの退縮は認められず、イミキモドクリームのみを投与された前記担癌マウスの腫瘍は陰性コントロールと比較して変化がなかった。
　本評価の結果、ＯＶＡ含有デキストラン粒子とイミキモドを別々に組み合わせて投与することによって、ＯＶＡ含有デキストラン粒子を単独で投与した場合並びにイミキモドを単独で投与した場合に比べて顕著な抗腫瘍効果を有することが示された。
　（実施例５）ＯＶＡ含有黒酵母グルカン粒子（２）とイミキモドとの併用による抗腫瘍効果
　実施例３にて作製したＯＶＡ含有黒酵母グルカン粒子（２）とイミキモドを別々に投与し、担癌マウス生体内における抗腫瘍効果を評価した。
　具体的には、ＯＶＡ発現癌細胞を皮下に移植したＣ５７ＢＬ／６ＮＣＲマウスを用いて、ＯＶＡ含有黒酵母グルカン粒子（２）とイミキモドとの併用による抗腫瘍効果を検討した。マウス１匹あたり１０６個のマウスリンパ腫細胞株ＥＧ７を皮下に移植し、移植７日目より週一回の頻度で計２回、実施例３で作製したＯＶＡ含有黒酵母グルカン粒子（２）０．５ｍｇ（マンニトールを除く）を等張となるようにＰＢＳ及び注射用水の溶媒に懸濁し、マウス右脇皮下に投与した。同じマウスへ、初回のＯＶＡ含有黒酵母グルカン粒子（２）と同時にイミキモドの塗布を開始した。イミキモドクリームを一週間に５日間連続して、癌細胞を移植した皮膚の表面へと塗布した。その後２日間は投与を行わず、投与開始から８日目より上記と同様に５日間連続してイミキモドクリームの塗布を行った。
　比較対照群として、担癌マウスへ、上記と同じＯＶＡ含有黒酵母グルカン粒子（２）のみを同様の投与量及び投与間隔にて投与した。さらに比較対照群として、別の担癌マウス個体へ、イミキモドクリームのみを同様の投与間隔で、癌細胞を移植した皮膚の表面へと塗布した。さらに無治療群の担癌マウスを陰性コントロールとした。投与開始後、担癌マウスの癌の大きさを経時的にノギスを用いて計測した。腫瘍体積は、定法に従い、計算式：（癌の長径の長さ）×（癌の短径の長さ）２×０．５にて算出した。
　評価の結果、実施例３で作製したＯＶＡ含有黒酵母グルカン粒子（２）の投与及びイミキモドクリームの塗布を行ったマウスの腫瘍は投与開始時よりも退縮した。それに対し、実施例３で作製したＯＶＡ含有黒酵母グルカン粒子（２）のみを投与されたマウス腫瘍では、陰性コントロールに対して成長が遅延したものの退縮は認められず、イミキモドクリームのみを投与された前記担癌マウスの腫瘍は陰性コントロールと比較して変化がなかった。
　本評価の結果、ＯＶＡ含有黒酵母グルカン粒子とイミキモドを別々に組み合わせて投与することによって、ＯＶＡ含有黒酵母グルカン粒子を単独で投与した場合並びにイミキモドを単独で投与した場合に比べて顕著な抗腫瘍効果を有することが示された。
　（実施例６）ＯＶＡ含有黒酵母グルカン粒子（２）とＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）との併用による抗腫瘍効果
　実施例３にて作製したＯＶＡ含有黒酵母グルカン粒子（２）と、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を別々に投与し、担癌マウス生体内における抗腫瘍効果を評価した。
　具体的には、ＯＶＡ発現癌細胞を皮下に移植したＣ５７ＢＬ／６ＮＣＲマウスを用いて、ＯＶＡ含有黒酵母グルカン粒子とＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（シグマ社、カタログ番号：Ｐ１５３０）との併用による抗腫瘍効果を検討した。マウス１匹あたり１０６個のマウスリンパ腫細胞株ＥＧ７を皮下に移植し、移植７日目より週一回の頻度で計２回、実施例３で作製したＯＶＡ含有黒酵母グルカン粒子（２）０．５ｍｇ（マンニトールを除く）を等張となるようにＰＢＳ及び注射用水の溶媒に懸濁し、マウス右脇皮下に投与した。同じマウスへ、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）は初回のＯＶＡ含有黒酵母グルカン粒子（２）と同時に腫瘍内に投与を開始した。Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）は１回あたり５０μｇの用量で、一週間に２回の頻度で計４回投与した。
　比較対照群として、担癌マウスへ、上記と同じＯＶＡ含有黒酵母グルカン粒子（２）のみを同様の投与量及び投与間隔にて投与した。さらに比較対照群として、別の担癌マウス個体へ、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）のみを同様の投与間隔及び投与量で、腫瘍内に投与した。また、別の担癌マウス個体へＯＶＡ含有黒酵母グルカン粒子（２）とＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の混合物を、マウス右脇皮下に同様の投与量及び投与間隔で投与した。無治療群の担癌マウスを陰性コントロールとした。投与開始後、担癌マウスの癌の大きさを経時的にノギスを用いて計測した。腫瘍体積は、定法に従い、計算式：（癌の長径の長さ）×（癌の短径の長さ）２×０．５にて算出した。
　評価の結果、実施例３で作製したＯＶＡ含有黒酵母グルカン粒子（２）と別々に腫瘍内にＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の投与を行ったマウスの腫瘍は投与開始時よりも退縮した。それに対し、実施例３で作製したＯＶＡ含有黒酵母グルカン粒子（２）のみを投与されたマウス腫瘍は陰性コントロールに対して成長が遅延したものの退縮は認められず、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）のみを投与された前記担癌マウスの腫瘍は陰性コントロールと比較して変化がなかった。また、ＯＶＡ含有黒酵母グルカン粒子（２）とＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の混合物を投与したマウスの腫瘍は、成長が遅延したものの退縮は認められなかった。
　本評価の結果、ＯＶＡ含有黒酵母グルカン粒子とＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を別々に組み合わせて投与することによって、ＯＶＡ含有黒酵母グルカン粒子を単独で投与した場合、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を単独で投与した場合及びＯＶＡ含有黒酵母グルカン粒子とＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を混合して投与した場合に比べて顕著な抗腫瘍効果を有することが示された。
　本発明の、疎水性セグメントがポリ（ヒドロキシ酸）であり、親水性セグメントが多糖である両親媒性ポリマー及び癌抗原を含む粒子、並びに免疫活性化因子を含み、粒子及び免疫活性化因子が別々に投与されることを特徴とする癌の治療及び／又は予防に使用する組合せ医薬品は、特に感染症や癌などの治療及び／又は予防に利用することができる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (16)

  1. 　疎水性セグメントがポリ（ヒドロキシ酸）であり、親水性セグメントが多糖である両親媒性ポリマー及び癌抗原を含む粒子、並びに免疫活性化因子を含む、癌の治療及び／又は予防のために使用する組合せ医薬品であって、
    　前記使用は、前記粒子の投与及び前記免疫活性化因子の投与が別々に行われることを特徴とする、前記医薬品。
  2. 　前記使用が、前記粒子の投与及び前記免疫活性化因子の投与が互いに異なる投与方法で別々に行われることを特徴とする、請求項１に記載の医薬品。
  3. 　前記免疫活性化因子が、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、ＮＯＤ様受容体（ＮＬＲ）、ＲＩＧ様受容体、Ｃ型レクチン受容体（ＣＬＲ）又はインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）に結合するリガンド又はアゴニストである、請求項１又は２に記載の医薬品。
  4. 　前記Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）に結合するリガンドまたはアゴニストが、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９又はＴＬＲ１１に結合するリガンド又はアゴニストである、請求項３に記載の医薬品。
  5. 　前記Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）に結合するリガンド又はアゴニストが、以下の（ｉ）～（ｖｉｉ）のいずれかである、請求項４に記載の医薬品。
    （ｉ）ペプチドグリカン、リポタンパク質、リポポリサッカライド及びザイモザンからななる群から選択されるＴＬＲ２に結合するリガンド又はアゴニスト
    （ｉｉ）Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）及びｐｏｌｙ（Ａ：Ｕ）からなる群から選択されるＴＬＲ３に結合するリガンド又はアゴニスト
    （ｉｉｉ）リポポリサッカライド（ＬＰＳ）、ＨＳＰ６０、ＲＳ０９及びＭＰＬＡからなる群から選択されるＴＬＲ４に結合するリガンド又はアゴニスト
    （ｉｖ）ＴＬＲ５に結合するリガンド又はアゴニストであるフラジェリン
    （ｖ）イミダゾキノリン類化合物及び一重鎖ＲＮＡからなる群から選択されるＴＬＲ７又は８に結合するリガンド又はアゴニスト
    （ｖｉ）バクテリアＤＮＡ、非メチル化ＣｐＧ　ＤＮＡ、ｈｅｍｏｚｏｒｉｎ、ＯＤＮ１５８５、ＯＤＮ１６６８及びＯＤＮ１８２６からなる群から選択されるＴＬＲ９に結合するリガンド又はアゴニスト
    （ｖｉｉ）ｐｒｏｆｉｌｉｎ及びｕｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃバクテリアからなる群から選択されるＴＬＲ１１に結合するリガンド又はアゴニスト
  6. 　前記イミダゾキノリン類化合物がイミキモドである、請求項５に記載の医薬品。
  7. 　前記免疫活性化因子の投与が、腫瘍局所への投与である、請求項１～６のいずれか一項に記載の医薬品。
  8. 　前記多糖が、デキストラン、β－グルカン、マンナン、キチン、キトサン、ジェランガム、アルギン酸、ヒアルロン酸又はプルランである、請求項１～７のいずれか一項に記載の医薬品。
  9. 　前記β－グルカンが、１つ以上のβ－１，３結合及び／又は１つ以上のβ－１，６結合で連結されたグルコースの重合体である、請求項８に記載の医薬品。
  10. 　前記β－グルカンが、黒酵母グルカン、カードラン、パキマン、ラミナラン、リケナン、シゾフィラン、レンチナン、スクレログルカン又はパキマランである、請求項８又は９に記載の医薬品。
  11. 　前記ポリ（ヒドロキシ酸）が、ポリ（乳酸－グリコール酸）、ポリ乳酸又はポリグリコール酸である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の医薬品。
  12. 　前記両親媒性ポリマーの数平均分子量が５００～１００，０００である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の医薬品。
  13. 　前記粒子の平均粒径が０．１～５０μｍである、請求項１～１２のいずれか一項に記載の医薬品。
  14. 　前記癌が、基底細胞癌、バジェット病、皮膚癌、乳癌、腎癌、膵臓癌、大腸癌、肺癌、脳腫瘍、胃癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、食道癌、白血病、リンパ腫、肝臓癌、胆嚢癌、肉腫、肥満細胞腫、副腎皮質癌、ユーイング腫瘍、ホジキンリンパ腫、中皮腫、多発性骨髄腫、睾丸癌、甲状腺癌又は頭頸部癌である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の医薬品。
  15. 　疎水性セグメントがポリ（ヒドロキシ酸）であり、親水性セグメントが多糖である両親媒性ポリマー及び癌抗原を含む粒子、並びに免疫活性化因子を、別々に投与することを特徴とする、癌の治療及び／又は予防のための方法。
  16. 　前記粒子の投与及び前記免疫活性化因子の投与が、互いに異なる投与方法で別々に行われることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
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