KR101646643B1 - 생체친화성 음이온 고분자 기반 약물 전달용 조성물 및 이의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

생체친화성 음이온 고분자 기반 약물 전달용 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

생체친화성 음이온 고분자 기반 약물 전달용 조성물 및 이의 제조 방법{COMPOSITON BASED ON BIOCOMPATIBLE ANIONIC POLYMER FOR DRUG DELIVERY AND PREPARING METHOD THEREOF}
본원은 생체친화성 음이온 고분자 기반 약물 전달용 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
암은 사망에 이르게 하는 원인 중의 하나로 지속되어 왔으며, 150 만 명 이상의 신규 사례 및 50 만 명 이상의 사망이 집계된다. 종양은 혈관의 공진화, 항종양(tumor-resistant) 면역 세포, 보조 종양 세포가 치료적 개입을 피하도록 하는 섬유모세포를 함유하는 세포외기질(extracellular matrix)을 포함하는 복합체 및 이종 구조이다. 화학요법이 중요한 항암 방법으로 사용되어 왔지만, 항암 약물은 부작용 및 질환의 재발의 높은 발병률을 갖는 것으로 알려져 있다. 파크리탁셀(paclitaxel)은 유방암, 비-소세포 폐암(non-small cell lung cancer), 난소암, 악성 뇌종양, 및 다른 고형 종양들과 같은 다양한 암을 치료하는데 사용되는 강한 화학치료제이다. 임상 효능은 파크리탁셀의 전신성 부작용, 물에서의 난용성 및 낮은 생체이용률 때문에 떨어진다. 파크리탁셀의 효과적이고 표적화된 전달을 위한 다양한 새로운 접근법들이 진행 중인 가운데, 파크리탁셀은 다양한 다른 방법들과 병용하기 위한 바람직한 후보 약물이 되어 왔지만, 임상 시도에서는 제한적인 성공을 얻어왔다.
종양은 전환 성장 인자-β(TGF-β) 분비에 의하거나 조절 T 세포를 통한 종양 반응성 T 세포의 억제와 같은 다양한 메커니즘에 의해, 또는 Fas-L과 같은 사멸 리간드의 직접 상향 조절에 의해 면역 시스템을 피하는 능력을 가지고 있기 때문에, 면역 시스템은 종양 미세 환경의 필수 양상이 된다. 따라서, 수지상세포 및 T 세포 기반 백신, 사이토카인, 톨-유사 수용체(Toll-like receptor; TLR) 작용제, 바이러스 백신, 펩타이드 기반 백신, 또는 DNA 기반 백신과 같은 암을 위한 면역치료적인 접근법들이 중요해지고 있다. 최근, TLR 자극의 역할이 암 치료를 위해 강조되어 왔고, 암 치료를 위한 T 세포 조절, 항-CTLA4 치료법, 또는 CD40L 플라스미드 DNA와 같은 다른 치료 방법들과 TLR 작용제의 병용이 보고되어 왔다. TLR 작용제가 항암 치료를 위해 연구되고 있는 반면에, 암 세포는 TLRs를 발현하는 것으로 알려져 있고, TLR 작용제는 또한 종양 증식 및 전이를 용이하게 하고 세포사멸을 억제하는 것으로 확인되었다. 따라서, 암 치료를 위해 적합한 TLR 작용제의 선택은 중요한 단계이다. TLR-7 작용제인 이미퀴모드(imiquimod)는 암 치료 및 생식기 혹(genital warts), 광선 각화증(actinic keratoses), 얕은 기저 세포암(superficial basal cell carcinoma), 및 악성 흑색점(lentigo maligna)과 같은 질환에서 국소 투여용으로 FDA에 승인된 R837로도 알려져 있다. 이미퀴모드는 증가된 항종양 특성을 이용하여 세포독성 T 세포를 부여할 수 있다. 이미퀴모드는 또한 냉동수술 환자에게 전신 면역을 유도하는 것으로 알려져 있다. 임상시험에서, 비록 최소한의 부작용으로 잘 저항할 수 있었지만, 효과적인 치료 반응은 관찰되지 않았다. 암에서 TLR 작용제의 이중성 때문에 단독으로 TLR 작용제를 사용하는 단일치료법은 불충분한 치료를 초래하고, 임시성을 위한 많은 기회를 갖는다.
화학요법 및 면역요법의 한계를 고려하여, 화학-면역요법이 매우 유망한 결과를 갖는 암 연구의 새로운 분야로서 부상해왔다. 호스트 면역이 또한 고려된다면, 화학치료제의 효능은 증가될 수 있다. Ⅲ 상 단계에서 화학치료제인 5-플루오로우라실(5-FU) 및 아드리아마이신과 TLR3 작용제인 폴리아데닐-폴리우리딜산(polyadenylic-polyuridylic acid: poly A:U)과 병용하여 사용하는 것은 화학요법만을 단독으로 사용했을 때와 비교하여 환자의 생존을 현저하게 연장시켰다. 연구에서, 파크리탁셀 및 TLR4 작용제의 병용은 파크리탁셀을 단독으로 사용했을 때와 비교하여 마우스의 종양을 40% 감소시키는 것으로 나타났다. 또 다른 보고서에서, 입양 T 세포 전달(adoptive T cell transfer), 바이러스 백신, 및 면역자극 TLR 작용제에 의해 보완된 화학치료제로 전처리하는 것은 흑색종을 완전히 제거할 수 있게 하는 것으로 입증되었다. 이러한 결과는 상기 종양 감시가 무너지면, 이후에 매우 낮은 농도의 항암 약물이어도 감소된 부작용을 갖는 효과가 있다는 것을 제시한다. 그러나, 상기 형성(challenge)은, 항암 약물과 TLR 작용제의 적절한 병용을 측정하는 것이며, 이는 질환의 어떠한 재발도 없이 상기 종양을 완전히 제거할 수 있는 것이다. 또 다른 고려사항은, 상기 동일 농도의 치료에서 종양 세포를 사멸시킬 수 있어야 하는 반면에, 항암 약물이 면역 세포에 최소한의 부작용을 가져야만 한다는 것이다. 또한, 상기 선택된 TLR 작용제는 종양 내에서 면역-억제 환경에 대응할 수 있어야 할 뿐만 아니라, 항종양 환경의 발전에 충분한 면역 세포에 의한 사이토카인(cytokine)의 방출을 유발할 수 있어야만 한다.
종래 상용화되고 있는 대부분의 항암제 및 면역 활성 물질은 비친수성인 성질로 인해 제형을 제조하기 위해서 다양한 유기 용매 및 각종 부형제를 사용하는데, 그 독성으로 인한 부작용이 심하여 액상 주사제로만 투여가 가능하다는 문제점이 있다. 또한, 난용성 물질을 수용액에 분산시키기 위해 사용되는 리포좀 또는 에멀젼 제조 공정은 특별한 제조 설비가 필요한 번거로움이 있을 뿐만 아니라, 에멀젼 형성 기간이 극히 짧아서 혼합 직후 수 분간만 에멀젼 형상이 유지될 뿐 곧바로 상분리를 일으키게 된다[대한민국 공개특허 제10-2003-0003320호 및 제10-2004-0066300호 참조].
이에, 본원은 생체친화성 음이온 고분자 기반 약물 전달용 조성물 및 이의 제조 방법을 제공하고자 한다.
그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본원의 제 1 측면은, 생체친화성 음이온 고분자; 면역자극 물질의 작용제; 및 의약 활성 성분을 포함하는, 약물 전달용 조성물을 제공한다.
본원의 제 2 측면은, 생체친화성 음이온 고분자에 분산된 면역자극 물질의 작용제를 유기 용매에 분산시키고 초음파를 사용하여 처리하면서 생체친화성 음이온 고분자를 첨가하여 생체친화성 음이온 고분자-면역자극 물질의 작용제 분산액을 제조한 후 상기 분산액을 동결 건조하여 상기 유기 용매를 제거함으로써 상기 생체친화성 음이온 고분자에 분산된 면역자극 물질의 작용제의 파우더를 수득하는 단계 (a); 의약 활성 성분을 유기 용매에 분산시키고 초음파를 사용하여 처리하면서 생체친화성 음이온 고분자를 첨가하여 생체친화성 음이온 고분자-의약 활성 성분 분산액을 제조한 후 상기 분산액을 동결 건조하여 상기 유기 용매를 제거함으로써 상기 생체친화성 음이온 고분자에 분산된 의약 활성 성분의 파우더를 수득하는 단계 (b); 및, 상기 단계 (a) 및 (b) 에서 수득된 파우더들을 증류수에 재분산시키는 단계 (c)를 포함하는, 본원의 제 1 측면에 따른 약물 전달용 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본원의 제 3 측면은, 상기 본원의 제 1 측면에 따른 약물 전달용 조성물을 유효성분으로 포함하는, 항암 치료용 조성물을 제공한다.
본원의 일 구현예에 따른 γ-PGA 기반 제형의 제조는, 편리한 단일 단계 합성 방법(공용매에 γ-PGA 및 약물을 혼합한 후 동결 건조)으로서, 대량생산하는 것이 가능하다.
본원의 일 구현예에 따른 γ-PGA 기반 제형의 제조는, (나노입자, 리포좀, 및 고분자 매트릭스와 같은 다른 전달 시스템에서와 같이) 세척 또는 원심분리법과 같은 합성 단계를 포함하지 않으므로, 약물의 손실이 없어 100%의 약물의 캡슐화 효율을 제공할 수 있다.
도 1은, 본원의 일 실시예에 따른 약물 전달용 조성물의 생체 내 종양 사멸 기작을 나타낸 개략도이다.
도 2는, 본원의 일 실시예에 따른 약물 전달용 조성물(γ-PGA/Ptx, γ-PGA/Imq, 및 γ-PGA/Ptx/Imq)의 주사전자현미경(SEM) 이미지이다.
도 3은, 본원의 일 실시예에 따른 약물 전달용 조성물(γ-PGA/Ptx, γ-PGA/Imq, 및 γ-PGA/Ptx/Imq)의 입자 크기와 단분산지수를 나타낸 표이다.
도 4는, 파크리탁셀, 이미퀴모드 또는 이들의 혼합물을 γ-PGA 및 증류수에 각각 분산시킨 후 시간 경화에 따른 분산 상태를 나타낸다.
도 5는, 본원의 일 실시예에 따른 약물 전달용 조성물을 (A) B-16 흑색종 세포, (B) 유방암 세포 HeLa, (C) A549 폐암 세포에 각각 처리한 후, 24 시간 및 48 시간에서의 세포 생존율을 측정한 그래프이다.
도 6은, 본원의 일 실시예에 따른 약물 전달용 조성물을 (A) RAW264.7 면역세포와 (B) BMDCs 면역세포 에 각각 처리한 후 24 시간과 48 시간에서의 세포 생존율을 측정한 그래프이다.
도 7은, 본원의 일 실시예에 따른 약물 전달용 조성물에 의한 BMDCs의 활성을 확인한 그래프로서, (A) IL-12, (B) TNF-α, (C) IL-6, (D) IL-1β의 사이토카인 분비량을 측정한 결과이다.
도 8은, 본원의 일 실시예에 따른 약물 전달용 조성물에 의한 BMDCs의 성숙을 확인한 그래프로서, (A) CD80, (B) MHCII, (C) MHCI의 세포표면 발현 정도를 측정한 결과이다.
도 9는, 본원의 일 실험예에 따른 종양의 크기와 마우스의 생존율을 측정한 그래프로서, 종양의 크기는 시료 주입 후, 23 일까지 측정한 결과이다.
도 10은, 본원의 일 실험예에 따라 γ-PGA/Ptx에서 파크리탁셀의 농도를 200 μg으로 높인 후 종양의 크기 및 마우스의 생존율을 측정한 그래프이다.
도 11은, 본원의 일 실험예에 따른 약물 전달 조성물 투여 후, 16 일째에 종양 주변 림프절에서의 면역세포 증식을 확인한 결과이다.
도 12는, 본원의 일 실험예에 따른 CD11c+ 수지상세포의 성숙 여부를 (A) CD40, (B) CD 80, (C) CD 86, (D) MHCII 발현양을 통해 확인한 결과이다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 "연결"되어 있다고 할 때, 이는 "직접적으로 연결"되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 소자를 사이에 두고 "전기적으로 연결"되어 있는 경우도 포함한다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부재가 다른 부재 "상에" 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "~(하는) 단계" 또는 "~의 단계"는 "~를 위한 단계"를 의미하지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합(들)"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B"의 기재는, "A 또는 B, 또는 A 및 B"를 의미한다.
본원 명세서 전체에서, "개체"는 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하며, 보다 구체적으로는 인간, 또는 비-인간인 영장류, 마우스(mouse), 랫(rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본원 명세서 전체에서, "약제학적 유효량"은 질환에 대한 예방 또는 치료, 바람직하게는 예방 효과를 달성하는 데 충분한 양을 의미하는 것으로서, 투여하고자 하는 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하게 조절될 수 있다.
이하, 본원의 구현예를 상세히 설명하였으나, 본원이 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 제 1 측면은, 생체친화성 음이온 고분자; 면역자극 물질의 작용제; 및 의약 활성 성분을 포함하는, 약물 전달용 조성물을 제공한다.
수난용성 치료제의 효과적인 전달은 이들을 임상에 적용하는데 있어 주요 걸림돌 중의 하나이다. 습식 분쇄 공정(wet milling process), 용융 압출(melt extrusion), 또는 안정제를 사용한 고체 분산액, 미세 현탁액, 및 나노 현탁액과 같은 다양한 접근법들이 연구되고 있다. 상기 선택된 항암 약물인 파크리탁셀 및 면역 자극제인 이미퀴모드는 자연적으로 수난용성이다. 따라서, 본원의 일 구현예에 있어서, 두 가지 약물의 효과적인 투여였고, 이를 위해 수용성 고분자인 γ-PGA를 사용하여 상기 약물이 공용매를 사용하여 미세 분산액으로 형성되도록 한다.
본원의 일 구현예에 있어서, 다양한 약물의 병용물이 개별 약물의 상대적 양에 어떠한 손실을 야기하거나 방해하지 않고 원하는 비율로 쉽게 분산될 수 있기 때문에, γ-PGA 기반 제형은 병용요법에 특히 이롭다. γ-PGA는 약물 결정의 효과적인 분산을 유도하는 약물 분자에 존재하는 아민기와 수소 결합과 같은 비공유 결합을 가지는 것으로 예상되는 자유 카르복실기를 갖는다. 상기 현탁액의 안정성은 분산된 미세-결정의 침전을 방지하는 γ-PGA 용액의 점성에 또한 기여할 수 있다. 상기 분산액은 6 개월까지 어떠한 상 분리 없이 안정적이다.
특히, 모든 항암 면역치료에서 가장 중요한 목표 중의 하나는 종양 세포를 인식하고 사멸시킬 수 있는 면역 세포에 의해 강한 종양 특이 면역 반응을 유도하는 것이다. 수지상세포, T 세포 기반 또는 연속적인 살해 세포 기반 치료법을 포함하는 세포 기반 치료법의 중요성이 높아지고 있고, 다양한 임상평가가 진행 중이며, 이들 과정은 다단계의 환자 치료 과정을 포함한다. 체내에서(in-situ) 강력한 면역 반응을 생성하기 위해 면역자극제를 투여하는 것은 항암 면역요법의 편리한 접근법이 될 수 있다. 따라서, 본원의 일 구현예에 따른 적은 양의 항암 약물과 면역강화제를 병용하는 것은 종양 특이 항원의 생성을 용이하게 할 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 음이온 고분자, 면역자극 물질의 작용제 및 의약 활성 성분은 약 1 : 약 0.01 내지 약 300 : 약 0.01 내지 약 300의 중량비로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 생체친화성 음이온 고분자는 카르복실기, 하이드록시기, 술폰기, 설페이트기, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 함유하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 생체친화성 음이온 고분자는 폴리감마글루탐산, 히알루론산, 셀룰로오스, 폴리아크릴산, 폴리아미노산, 다당류, 이들의 유도체 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 면역자극 물질은 톨-유사 수용체(toll-like receptor, TLR), 엔오디-유사 수용체(NOD-like receptors), 또는 사이토카인(cytokine)을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 톨-유사 수용체는 주로 면역 세포에서 발현되어 면역 활성에 중요한 역할을 담당하는 수용체로서, 의약 활성 성분의 자극을 통해 수지상세포의 성숙을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 상기 톨 유사 수용체는, 예를 들어, TLR-1, TLR-2, TLR-3, TLR-4, TLR-5, TLR-6, TLR-7, TLR-8, 및 TLR-9로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 엔오디-유사 수용체는 식작용 또는 포어(pore)를 통해 세포 내로 진입하는 PAMPs(pathogen-associated molecular patterns) 및 세포 스트레스와 관련된 DAMPs(damage-associated molecular pattern molecules)의 세포내 센서로서, 패턴 인식 수용체의 부분이며 선천성 면역 반응에서 중요한 역할을 한다. 상기 엔오디-유사 수용체는, 예를 들어, NLRA, NLRB, NLRC, 또는 NLRP를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 사이토카인은 면역 세포가 분비하는 단백질의 총칭으로서, 대식세포의 증식을 유도하거나 자기 자신의 분화를 촉진하는 것으로 알려져 있다. 상기 사이토카인은, 예를 들어, IL-1α, IL-1β, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, TNF-α, TNF-β, IFNα, 또는 IFNβ를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 면역자극 물질의 작용제는 폴리(l:CU), CpG, 이미퀴모드, 레시퀴모드, dSLIM, 엠피엘에이(MPLA), 플라겔린(Flagellin), 플라스미드 디엔에이 더블스트렌드 디엔에이, 싱글스트렌드 디엔에이, 사포닌, 인터루킨 사이토카인을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 의약 활성 성분은 항암제를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 항암제는 파크리탁셀, 도세탁셀, 독소루비신, 아드리아마이신, 시스-플라틴(cis-platin), 미토마이신-C, 다우노마이신, 5-플루오로우라실, 글리세오풀빈, 디곡신, 디피리다몰, 스피로노락톤, 시클로스포린, 암포테리신 비, 에토포시드, 6-머캅토퓨린, 덱사메타손, 퍼페나진, 20-S-캄프토테신, 9-니트로-캄프토테신, 9-아미노-캄프토테신, 10,11-메틸렌디옥시-캄프토테신, 택솔, 택솔-A, 미토탄, 메토트렉세이트, 로무스틴, 인터페론, 로우라실, 및 에토피시드로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 생체친화성 음이온 고분자, 상기 면역자극 물질의 작용제 및 상기 의약 활성 성분은 분자 사이 비공유결합에 의해 서로 연결되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 생체친화성 음이온 고분자에 분산된 상기 면역자극 물질의 작용제에 있어서, 상기 생체친화성 음이온 고분자와 상기 면역자극 물질의 작용제는 약 1 : 약 0.01 내지 약 300의 중량비로 포함되고;
상기 생체친화성 음이온 고분자에 분산된 의약 활성 성분에 있어서, 상기 생체친화성 음이온 고분자와 의약 활성 성분은 약 1 : 약 0.01 내지 약 300의 중량비로 포함되고;
상기 생체친화성 음이온 고분자에 분산된 면역자극 물질의 작용제와 상기 생체친화성 음이온 고분자에 분산된 의약 활성 성분은 약 1 : 약 1 내지 약 5의 중량비로 포함되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 제 2 측면은, 생체친화성 음이온 고분자에 분산된 면역자극 물질의 작용제를 유기 용매에 분산시키고 초음파를 사용하여 처리하면서 생체친화성 음이온 고분자를 첨가하여 생체친화성 음이온 고분자-면역자극 물질의 작용제 분산액을 제조한 후 상기 분산액을 동결 건조하여 상기 유기 용매를 제거함으로써 상기 생체친화성 음이온 고분자에 분산된 면역자극 물질의 작용제의 파우더를 수득하는 단계 (a); 의약 활성 성분을 유기 용매에 분산시키고 초음파를 사용하여 처리하면서 생체친화성 음이온 고분자를 첨가하여 생체친화성 음이온 고분자-의약 활성 성분 분산액을 제조한 후 상기 분산액을 동결 건조하여 상기 유기 용매를 제거함으로써 상기 생체친화성 음이온 고분자에 분산된 의약 활성 성분의 파우더를 수득하는 단계 (b); 및, 상기 단계 (a) 및 (b) 에서 수득된 파우더들을 증류수에 재분산시키는 단계 (c)를 포함하는, 본원의 제 1 측면에 따른 약물 전달용 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 생체친화성 음이온 고분자는 카르복실기, 하이드록시기, 술폰기, 설페이트기 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 함유하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 유기 용매는 상기 면역자극 물질의 작용제 및 상기 의약 활성 성분을 용해시키는 것이면 특별히 제한이 없이 사용할 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 생체친화성 음이온 고분자는 폴리감마글루탐산, 히알루론산, 셀룰로오스, 폴리아크릴산, 폴리아미노산, 이들의 유도체, 다당류 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 면역자극 물질은 톨-유사 수용체(toll-like receptor), 엔오디-유사 수용체(NOD-like receptors), 또는 사이토카인(cytokine)을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 톨-유사 수용체는 주로 면역 세포에서 발현되어 면역 활성에 중요한 역할을 담당하는 수용체로서, 의약 활성 성분의 자극을 통해 수지상세포의 성숙을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 상기 톨 유사 수용체는, 예를 들어, TLR-1, TLR-2, TLR-3, TLR-4, TLR-5, TLR-6, TLR-7, TLR-8, 및 TLR-9로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 엔오디-유사 수용체는 식작용 또는 포어(pore)를 통해 세포 내로 진입하는 PAMPs(pathogen-associated molecular patterns) 및 세포 스트레스와 관련된 DAMPs(damage-associated molecular pattern molecules)의 세포내 센서로서, 패턴 인식 수용체의 부분이며 선천성 면역 반응에서 중요한 역할을 한다. 상기 엔오디-유사 수용체는, 예를 들어, NLRA, NLRB, NLRC, 또는 NLRP를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 사이토카인은 면역 세포가 분비하는 단백질의 총칭으로서, 대식세포의 증식을 유도하거나 자기 자신의 분화를 촉진하는 것으로 알려져 있다. 상기 사이토카인은, 예를 들어, IL-1α, IL-1β, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, TNF-α, TNF-β, IFNα, 또는 IFNβ를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 면역자극 물질의 작용제는 폴리(l:CU), CpG, 이미퀴모드, 레시퀴모드, dSLIM, 엠피엘에이(MPLA), 플라겔린(Flagellin), 플라스미드 디엔에이 더블스트렌드 디엔에이, 싱글스트렌드 디엔에이, 사포닌, 또는 인터루킨 사이토카인을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 의약 활성 성분은 항암제를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 항암제는 파크리탁셀, 도세탁셀, 독소루비신, 아드리아마이신, 시스-플라틴(cis-platin), 미토마이신-C, 다우노마이신, 5-플루오로우라실, 글리세오풀빈, 디곡신, 디피리다몰, 스피로노락톤, 시클로스포린, 암포테리신 비, 에토포시드, 6-머캅토퓨린, 덱사메타손, 퍼페나진, 20-S-캄프토테신, 9-니트로-캄프토테신, 9-아미노-캄프토테신, 10,11-메틸렌디옥시-캄프토테신, 택솔, 택솔-A, 미토탄, 메토트렉세이트, 로무스틴, 인터페론, 로우라실, 및 에토피시드로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 생체친화성 음이온 고분자에 분산된 상기 면역자극 물질의 작용제 및 상기 의약 활성 성분은 분자 사이 비공유결합에 의해 서로 연결되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 제 3 측면은, 상기 본원의 제 1 측면에 따른 약물 전달용 조성물을 유효 성분으로서 포함하는, 항암 치료용 조성물을 제공한다.
본원의 일 구현예에 의하면, 상기 면역자극 물질의 작용제 및 상기 의약 활성 성분은 약물의 미세 분산 형성을 유도하는 공-용매 시스템을 사용하는 폴리(γ-글루탐산)의 도움으로 물에 분산되어, 내부-종양의 성장을 현저하게 억제할 수 있으므로, 다양한 약물 전달 체계에 응용이 가능하다 (도 1).
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 항암 치료용 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 생리식염수, 폴리에틸렌글리콜, 에탄올, 식물성 오일, 및 이소프로필미리스테이트 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 항암 치료용 조성물은 약제학적 유효량으로 개체에 투여될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 약제학적 유효량은 투여하고자 하는 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하게 조절될 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 항암 치료용 조성물의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로, 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직하게는, 1 일 약 0.001 mg/체중kg 내지 약 100 mg/체중kg, 예를 들어, 약 0.01 mg/체중kg 내지 약 50 mg/체중kg으로 투여할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 투여는 1 일 1 회 또는 여러 번 나누어 투여할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항암 치료용 조성물은 전체 조성물 총 중량에 대하여 약 0.0001 중량% 내지 약 50 중량%, 예를 들어, 약 0.001 중량% 내지 약 10 중량%의 양으로 존재할 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 항암 치료용 조성물은 인간을 포함하는 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여방법에는 제한이 없으며, 예를 들어, 경구, 직장, 복강 내, 폐 내, 비강 내, 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막, 또는 뇌혈관(intra cerbroventricular)으로 투여될 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 항암 치료용 조성물에 의해 치료되는 암은 제한이 없으나, 예를 들어, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 폐암, 폐선암, 담도암, 대장암, 흑색종, 신경아세포종, 또는 췌장암을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 제 3 측면에 있어서, 본원의 제 1 측면 또는 제 2 측면과 중복되는 부분들에 대해서는 상세한 설명을 생략하였으나, 본원의 제 1 측면 및 제 2 측면에 대해 설명한 내용은 본원의 제 3 측면에서 그 설명이 생략되었더라도 동일하게 적용될 수 있다.
이하, 본원에 대하여 실시예를 이용하여 좀더 구체적으로 설명하지만, 하기 실시예는 본원의 이해를 돕기 위하여 예시하는 것일 뿐, 본원의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
본 실시예에서, 저용량의 항암 약물(파크리탁셀)과 면역자극제(이미퀴모드)의 폴리감마글루탐산(γ-PGA) 기반 병용은 고형 종양에 대항하는 상승 효과를 위해 시험되었다. 상기 파크리탁셀 치료는 종양 특이 항원뿐만 아니라 분자 패턴과 관련된 손상(DAMPs)으로도 알려진 위험 신호 생성을 유도해야만 하는 종양 세포 사멸을 야기하는 것으로 추측되었다. 상기 이미퀴모드는 항원보강제로서 사용되었고, 항종양 면역 반응을 유발하기 위한 면역 세포의 활성화 및 성숙을 유도하는 것으로 예상되었다. 상기 파크리탁셀 및 상기 이미퀴모드는 둘 다 모두 수난용성 약물들이기 때문에, 수용성 생물유도 음이온 고분자인 γ-PGA는 상기 두 가지 약물의 안정한 수성 미세-분산액을 형성하기 위해 사용되었다. 종양에 대항하는 상기 기억 반응은 또한 제형의 지속성 및 임상적 응용성을 시험하기 위해 평가되었다.
두 그룹 비대칭 t-테스트 사이의 통계적 차이점을 분석하기 위해 웰치의 보정(Welch's correction)이 사용되었다. 두 그룹 이상의 통계적 차이점을 분석하기 위해, 본페로니 후 테스트와 함께 이원 방식의 ANOVA가 사용되었다. 생존율 데이터의 통계적 유효성를 분석하기 위해 롱-랭크(long-rank)(Mantel-Cox) 테스트가 사용되었고, p 값 < 0.05이 통계적으로 유효한 것으로 고려되었다. 모든 값은 평균 ± 표준편차로서 표현되었다. 모든 통계 분석을 위해 그래프패드 프리즘 소프트웨어(GraphPad Prism software)가 사용되었다.
실시예 1: 고분자-약물 미세 분산액의 제조
γ-PGA/파크리탁셀 미세-분산액(γ-PGA/Ptx)을 제조하기 위해, 500 μL DMSO 중의 파크리탁셀 (ChemieTek, Indianapolis, USA) 10 mg을 2 분간 프로브 초음파처리기를 사용하여 초음파로 처리하면서 2.5% γ-PGA(50 kDa) (BioLeaders Corporation, Daejeon, South Korea) 2 mL에 첨가하였다. γ-PGA/이미퀴모드 미세-분산액 (γ-PGA/Imq)을 제조하기 위해, 2 mL의 DMSO에 이미퀴모드 (TCI, Tokyo, Japan) 10 mg을 60℃에서 가열하여 용해시켰다. 상기 용액을 2 분간 프로브 초음파처리기를 사용하여 초음파처리하면서 2.5 % γ-PGA(50 kDa) 2 mL에 첨가하였다. 위의 두 용액은 유기 용매를 제거하기 위해 각각 동결건조하였다. 상기 동결건조된 분말을 안정한 분산액을 얻기 위해 증류수에 각각 재분산시켰다. 병용요법에 사용된 γ-PGA/파크리탁셀/이미퀴모드 미세-분산액(γ-PGA/Ptx/Imq)의 제조를 위해 앞서 얻은 상기 재분산된 용액은 1 : 5 (γ-PGA/Ptx : γ-PGA/Imq)의 중량비로 혼합되었다.
실험예 1: 미세-분산액의 특성 분석
γ-PGA/Ptx 및 γ-PGA/Imq의 재분산된 용액의 크기는 전기영동 광 산란기-ELS Z (Otsuka Electronics, Osaka, Japan)를 통해 측정되었다. 상기 분산액의 안정도는 분산액을 증류수에 분산시킨 후에 4℃에서 1 주일 동안 보관하면서 시료에서의 뭉침 정도나 상분리를 관찰하여 평가하였다. 이러한 미세-분산액의 형태는 FE-SEM (JSM-7000F, JEOL Ltd. Japan) 및 FE-TEM (JEM-2100F HR, JEOL Ltd., Japan)을 통해 관찰하였다. SEM 시료 제조를 위해, 상기 동결건조되고 재분산된 현탁액을 실리콘웨이퍼 판 상에 증착시켰고, 진공에서 건조시켜 수분을 제거하였으며, 30 mA에서 90 초 동안 테크닉스 휴머 II 스퍼터 코터 (Technics Hummer II sputter coater)를 이용하여 백금 코팅하였다. TEM 시료 제조를 위해 재분산된 현탁액 2 μL를 포름바/탄소 코팅된 구리 그리드 상에 위치시킨 후, 진공에서 건조하여 수분을 제거하였다.
도 2에서 나타낸 바와 같이, 건조된 미세-분산액의 전자현미경 이미지는 γ-PGA의 고분자성 매트릭스 내에 단단히 박혀있는 가늘고 긴 파크리탁셀과 정육면체의 이미퀴모드 결정의 존재를 나타내었다. TEM 이미지로부터, 각 약물들의 잘 분산된 결정들이 명확히 확인되었다. 도 3은 약물 전달용 조성물(γ-PGA/Ptx, γ-PGA/Imq, 및 γ-PGA/Ptx/Imq)의 입자 크기와 단분산지수를 나타낸 표로서, 동결 건조된 미세 분산액의 수성 분산액의 크기 및 크기 분포를 분석한 결과이다. γ-PGA/Imq와 γ-PGA/Ptx/Imq의 뚜렷한 단분산 피크가 관찰되었으며, 이는 균일한 크기 분포를 나타내는 것이다(도 3). γ-PGA/Ptx의 경우에는 두 개의 피크가 관찰되었는데, 이는 파크리탁셀 결정의 높은 종횡비 때문일 수 있다. 도 4는 파크리탁셀과 이미퀴모드 또는 이들의 혼합물을 γ-PGA 및 증류수에 각각 분산시킨 후 시간 경화에 따른 분산 상태를 나타낸다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 상기 현탁액 모두는 7 일 동안 γ-PGA 매트릭스에 잘 분산되었고, 또한 오랜 시간(6개월 이상) 동안 안정하게 재분산될 수 있었던 것으로 확인되었다 (도 4). 그러나, 파크리탁셀, 이미퀴모드, 및 이 두 약물의 병용물이 상기 γ-PGA의 부재 하에 물에 분산되었을 때 이들의 소수성 성질에 의해 응집되거나 침전되었다.
실험예 2: in-vitro 생존율 분석
종양 세포[A549 인간 폐선암상피 세포주, B-16 쥐(murine) 흑색종 세포주, 및 HeLa 인간 자궁경부암 세포주] 및 면역 세포(골수 유래 수지상세포-BMDCs, RAW264.7 대식세포)에 다양한 농도의 γ-PGA/Ptx, γ-PGA/Imq, 및 γ-PGA/Ptx/Imq를 처리한 후 in-vitro 생존율을 시험하였다. 모든 종양 세포주 및 RAW264.7은 ARCC사로부터 입수되었다. BMDCs는 기존에 보고된 바와 같이 마우스 골수로부터 분리하였다. 미토콘드리아의 활성을 분석하기 위한 MTS(메틸티아졸 설페이트) 분석이 세포 생존율의 측정을 위해 사용되었다. 100 μL 배지 중의 1 × 104 세포를 96 웰 플레이트(Corning Costar, Cambridge, MA, USA)에 웰마다 접종하였다. 세포 배양 배지에 시료 분산액 100 μL가 첨가되었고, 37℃ 및 5% CO2에서 24 시간 및 48 시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, MTS 용액-셀 티터 96 어퀴어스 원 솔루션 키트(MTS solution-Cell Titer 96 Aqueous One Solution kit) (Promega, Madison, WI, USA) 20 μL를 각 웰에 첨가하고, 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 상기 시료의 흡광도는 490 nm에서 측정하였고(VersaMax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA), 비처리 세포의 흡광도에 대하여 정규화(normalize)하였다.
세 가지의 다른 종양 세포주는 24 시간 및 48 시간 후에 γ-PGA/Ptx 내의 상이한 농도(Ptx- 0.1, 1, 5, 및 10 ㎍/mL)의 파크리탁셀과 γ-PGA/Imq 내의 동일 농도(Imq- 0.1, 1, 5, 및 10 ㎍/mL)의 이미퀴모드의 존재 하에 생존율을 시험하였다. γ-PGA/Ptx/Imq의 병용물을 시험하기 위해 이미퀴모드의 농도를 0.1 ㎍/mL, 1 ㎍/mL, 5 ㎍/mL, 및 10 ㎍/mL로 한 반면, 파크리탁셀의 농도를 각 시료의 이미퀴모드의 농도의 1/5로 하였다. 도 5는 약물 전달용 조성물을 (A) B-16 흑색종 세포, (B) 유방암 세포 HeLa, (C) A549 폐암 세포에 각각 처리한 후, 24 시간 및 48 시간에서의 세포 생존율을 측정한 그래프이며, B-16 흑색종, A549 폐암 및 HeLa 자궁경부암 세포에서 γ-PGA/Ptx과 γ-PGA/Ptx/Imq는 모두 48 시간 후에 현저한 독성 효과를 가졌다. 도 5의 각 데이터는 본페로니 후 테스트(Bonferroni post test)와 함께, 이원방식 ANOVA에 의한 **p < 0.01, ***p < 0.001 값을 가졌다(도 5). 세 가지의 모든 종양 세포주의 경우에서, γ-PGA/Imq는 이미퀴모드의 직접 항종양 활성의 결핍을 나타내는 어떠한 현저한 독성 효과도 갖지 않았다. 파크리탁셀은 미세관 고분자를 안정화시키고 분해로부터 이를 보호하는 유사분열 억제제이다. 파크리탁셀 활동의 메커니즘이 비특이적이기 때문에, 그것은 또한 정상 세포에 손상을 주고, 따라서 많은 부작용과 관련된 것으로 알려져 있다. 도 6은 약물 전달용 조성물을 (A) RAW264.7 면역세포와 (B) BMDCs 면역세포에 각각 처리한 후 24 시간및 48 시간에서의 세포 생존율을 측정한 그래프로서, 이의 독성 효과는 또한 RAW264.7 면역세포에서 관찰되었지만, γ-PGA/Imq는 독성은 아니었다(도 6A). 도 6의 각 데이터는 본페로니 후 테스트와 함께, 이원방식 ANOVA에 의한 *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 값을 가졌다.
흥미롭게도, 세 가지의 시료 모두 상기 BMDCs의 증식을 증가시키는 효과를 가졌다. γ-PGA/Ptx는 수지상세포의 증식에서 용량 의존성 증가를 가졌으며, 이는 수지상세포가 파크리탁셀의 이들 농도에서 세포독성에 저항하는 것뿐만 아니라, 증가된 증식을 가능하게 함을 나타내는 것이다. 유사한 결과가 또한 이전에도 관찰되었고, 이는 파크리탁셀에 의한 수지상세포의 TLR4 자극으로 인한 것으로 추측되었다. 또한, 도 6에 따르면, γ-PGA/Imq와 γ-PGA/Ptx/Imq는 48 시간 후에 세포 생존율의 현저한 증가(>250%)를 가졌다(도 6B). 파크리탁셀 및 이미퀴모드 둘 다의 존재 하에 상기 증가된 BMDC 수는 종양의 면역 억제 미세환경 내에서 수지상세포의 대량 증식을 유도하는 것으로 예상되었다.
실험예 3: in-vitro BMDC 활성화 및 성숙
10% FBS 및 1% 항생-항진균 용액이 보충된 RPMI 배지 1 mL 중의 1 × 106 BMDCs를 6 웰 플레이트(Corning Costar, Cambridge, MA, USA)에 웰마다 접종하였다. 시료 1 mL를 처리하고, 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 상기 플레이트는 5 분 동안 1500 rpm으로 원심분리하였고, 상청액을 수집하여, ELISA 키트 (BD Biosciences)를 사용하여 다양한 사이토카인(IL-1β, IL-12, IL-6 및 TNF-α)을 분석하였다. 24 시간 동안 시료를 인큐베이션한 후에, 성숙 표지자(marker)의 상향조절의 분석을 위해, 상기 세포를 수집하고 4% 파라포름알데하이드를 사용하여 고정시켰다. 이들 세포를 4℃에서 30 분 동안 인큐베이션하면서 형광 표지된 표지자 항체 FITC-CD80 (BD PharMingen, San Diego, CA, USA), PE-MHCI (eBioscience, San Diego, CA, USA) 및 PE-MHCII (eBioscience, San Diego, CA, USA)로 처리한 후 PBS로 2 회 세척하였다. 이후, 104 세포는 MACS (Miltenyl Biotec, Germany)를 사용하여 형광을 분석하였다. 데이터는 MACSQuant 분석기 (Miltenyl biotec, Germany)를 이용하여 추가 분석하였다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 상기 BMDCs의 성숙 및 활성화는 전구-염증 사이토카인 (IL-6, IL-1β, TNF-α)과 Th1 사이토카인 (IL-12)의 분비 정도를 분석함으로써 연구되었다. 면역 자극 시료 γ-PGA/Imq 및 γ-PGA/Ptx/Imq에서 IL-12 분비의 용량 의존성 증가가 관찰되었다(도 7A). IL-12는 Th1 세포에 대한 순수한(na
Figure 112014082006162-pat00001
ve) T 세포의 구별을 용이하게 하는 것으로 알려져 있다. 세포 사멸을 유도하고 및 종양 형성을 억제하는 것으로 알려진 TNF-α의 분비 정도는 γ-PGA/Ptx/Imq 병용의 존재 하에 큰 폭으로 증가되었다 (도 7B). 전구-염증 사이토카인(IL-6 및 IL-1β)의 분비 또한 면역자극 시료 γ-PGA/Imq 및 γ-PGA/Ptx/Imq의 존재 하에 상당히 증가되었다(도 7C, 7D). 도 7의 각 데이터는 본페로니 후 테스트와 함께, 이원방식 ANOVA에 의한 **p < 0.01, ***p < 0.001 값을 가졌다.
또한 활성 표지자인 CD80, MHC II 및 MHC I은 대조(control)에 비해 3 종류의 모든 γ-PGA 미세분산액의 존재 하에 상향조절되었다. (A) CD80, (B) MHCII, (C) MHCI의 세포표면 발현 정도를 측정한 결과는, 약물 전달용 조성물에 의한 BMDCs의 성숙을 확인한 그래프로 도 8에 나타내었다. CD80은 T 세포 활성화를 위한 동시자극적 분자로서 작용하는 것으로 알려져 있다. 상기 단백질은 γ-PGA/Ptx/Imq의 존재 하에 상당히 상향조절되었다(도 8A). MHC II 및 MHC I의 상향조절의 용량 의존성 증가는 또한 모든 시료에서 관찰되었으며, γ-PGA/Ptx/Imq에서 최대였다 (도 8B, 8C). 파크리탁셀은 TLR4의 자극을 통해 DCs의 성숙을 증가시키며, TLR7 작용제인 이미퀴모드는 MyD88 의존경로를 통해 수지상세포의 성숙과 활성을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 결국, 이러한 결과는, BMDCs의 활성화 및 성숙 정도가 γ-PGA/Ptx와 γ-PGA/Imq가 단독으로 사용되었을 때와 비교하여 γ-PGA/Ptx/Imq 병용물이 사용되었을 경우 더 높아지는 것을 입증하였다.
실험예 4: in-vivo 항암 효능 실험
(1) 마우스 및 세포주
5 주 내지 6 주령의 암컷 C57BL/6 (H-2b) 마우스를 KOATECH 사 (Pyeongtaek, Korea)로부터 입수하였다. 상기 마우스를 병원균 부재 조건하에 유지시켰다. 마우스를 사용하는 모든 실험은 실험실 동물의 주의 및 사용을 위한 한국 NIH 지침에 따라서 수행되었다. 쥐 흑색종 세포주인 B16-F10은 ATCC 사로부터 입수하였다. 상기 세포주를 37℃, 5% CO2/95% 습한 공기에서 10% FBS 및 1% 항생-항진균 용액이 보충된 DMEM에서 성장시켰다.
(2) in-vivo 항종양 활성의 평가
B16-F10 흑색종 세포(1 × 105)를 5 주 내지 6 주령 C57BL/6 마우스의 우측 옆구리에 접종하였다. 종양 이식 1 주 후에, 4 mm 내지 6 mm의 평균 종양 직경을 가진 동물들이 선별되었다. 이들 마우스를 5 가지 처리 그룹(n = 7)으로 나누고, 번호를 붙였다. 각 약물을 내부-종양에 주입함으로써 투여하였다. 상기 약물 처리를 종양 이식 후에 7 일로부터 3 일 간격으로 19 일째까지 지속하였다. 총 4 회의 주입이 이루어졌다(7 일째, 11 일째, 15 일째, 19 일째). 상기 종양의 직경을 종양 이식 후 23 일째까지 슬라이딩 캘리퍼(sliding caliper)를 사용하여 측정하였다. 종양의 부피는 하기 식을 이용하여 계산하였다: 종양 부피(mm3) = 길이 × (높이)2/2.
23 일째에 마우스를 안락사시키고, 종양을 해부하여 사진을 찍었다. 생존 연구를 위해, 상기 처리된 동물을 41 일 동안 관찰하였다. 2 차 종양 형성을 위해, 23 일째에 종양이 없는 마우스의 반대편 옆구리에 5 × 104 B16-F10 흑색종 세포를 재접종시켰다.
복합체의 효과를 측정하기 위해 4 일 간격으로 종양의 용적을 분석하였다. 파크리탁셀(γ-PGA/Ptx) 2 mg/kg(40 ㎍)은 PBS 대조와 비교하여 종양의 성장을 억제하기에 불충분하였다. 도 9는 종양의 크기와 마우스의 생존율을 측정한 그래프로서, 시료 주입 후, 23 일까지 종양의 크기를 측정한 결과이다. 면역조절제 단독으로 γ-PGA/Imq(200 ㎍ 또는 10 mg/kg)는 23 일째까지 종양 성장을 다소 억제하는 것이 가능했으나, 결국 종양이 크게 성장하여 41 일째에 0%의 생존율에 이르렀다. 흥미롭게도 저용량의 파크리탁셀(40 ㎍) 및 이미퀴모드(200 ㎍)를 포함하는 γ-PGA/Ptx/Imq의 병용물을 이용하는 치료는 고형 종양의 성장을 굉장히 억제하였다. 도 9A의 각 약물로 처리한 종양 크기 데이터는 일원 분산분석(one-way ANOVA), 본페로니의 다중 비교 분석(Bonferroni's Multiple Comparison)에 의한 p 값 = 0.0001, ***p < 0.001을 가졌으며, 도 9C의 생존률은 로그-랭크[Log-rank (Mantel-Cox)] 분석에 의한 p 값 = 0.0007, ***p < 0.001을 가졌고, 도 9D의 종양 재형성 후 23 일까지의 종양 크기 분석은 웰치의 보정에 의한 비대칭 t-테스트에 의한 p 값 = 0.0026, **p < 0.01을 가졌다. 7 마리의 마우스 중에서 3 마리는 완전히 종양으로부터 회복되었으며, 남은 4 마리도 도 9B에서 보여지는 바와 같이 매우 작은 크기의 종양을 가졌다. 게다가, 생존 데이터로부터 γ-PGA/Ptx/Imq가 41 일째까지 70% 이상의 마우스를 생존시키는 것으로 확인되었다(도 9C).
γ-PGA/Ptx에서 더욱 고용량의 파크리탁셀(10 mg/kg 또는 200 ㎍)을 단독으로 사용하여 항종양 효능을 또한 시험하였다. 상기 종양 성장은 제한된 크기로 억제되었으며, 이후 41 일째에 생존율을 0%에 이르게 했다(도 10). 종양 재형성 실험은 항종양 기억 반응의 존재를 확인하기 위해 1차 종양 형성으로부터 완전히 회복된 γ-PGA/Ptx/Imq로 치료된 세 마리의 마우스에게 수행되었다. 종양 용적 분석은 연령별로 매칭된 순수한 마우스와 비교하여 γ-PGA/Ptx/Imq로 백신접종된 마우스의 2 차 종양 성장의 현저한 억제를 나타냈다(도 9D). 상기 종양이 마우스의 반대편 옆구리에 접종된 이후로; 종양 성장의 이러한 억제는 γ-PGA/Ptx/Imq로 처리된 후에 마우스의 전신 종양 특이 면역 반응의 발생을 나타냈다. 이러한 결과는 수지상세포 활성화 및 성숙을 매개하는 이미퀴모드와 결합된 저용량의 파크리탁셀에 의해 매개된 방출된 종양 항원이 특이 항종양 면역 반응을 발생시킨 것을 나타낸다. 전신 기억 면역 반응은 종양 전이 및 종양 재발을 체크하기 위해 종양 치료법에서 중요하다.
실험예 5: 종양 배출 림프절 in-vivo 면역 상태의 평가
상기 실험예 4와 같이 마우스에 종양을 형성시키고, 3 차 내부-종양을 주입하여 처리하였다. 16 일째에 상기 종양 배출 림프절을 분리하기 위해 완전 RPMI 배지 내에서 70 nm 세포 여과기에 통과시켰다. 상기 세포를 고정시킨 후에, 하기와 같은 특이 세포 유형의 형광 표지자 항체를 4℃에서 30 분 동안 인큐베이션하여 표지하고 PBS로 2 회 세척하였다: 대식세포를 위한 FITC 항-마우스 CD14 (BD Phar-Mingen, San Diego, CA, USA), 수지상세포를 위한 FITC 항-마우스 CD11c (BD Phar-Mingen, San Diego, CA, USA). 이후, 최소 104의 세포를 MACS(Miltenyl Biotec, Germany)를 사용하여 형광을 분석하였다. 데이터는 MACSQuant Analyzer (Miltenyl Biotec, Germany)를 사용하여 추가 분석하였다. CD11c+ 수지상세포를 위한 성숙 표지자 (CD40, CD80, CD86, 및 MHCII) 상향조절은 기존에 했던 바와 같이 추가 분석하였다.
상기 마우스를 세 가지의 모든 γ-PGA 미세 분산액으로 처리한 후에 in-vivo 면역 자극을 시험하였다. 종양 배출 림프종은 γ-PGA/Ptx, γ-PGA/Imq, 및 γ-PGA/Ptx/Imq로 처리한 후에, 항원발현세포(APCs)인, CD14+ 대식세포와 CD11c+ 수지상세포의 존재 수를 분석하였다. 도 11은 약물 전달 조성물 투여 후, 16 일째에 종양 주변 림프절에서의 면역세포 증식을 확인한 결과로서, (A) CD14+ 대식세포와 (B) CD11c+ 수지상세포의 상대적인 수를 나타내는 평균 형광 강도(MFI)는 PBS(음성 대조), γ-PGA/Ptx, 및 γ-PGA/Imq 개별 성분으로 처리한 마우스와 비교하여 γ-PGA/Ptx/Imq로 치료한 마우스에서 상당히 더 높았다(도 11). 도 12는 CD11c+ 수지상세포의 성숙 여부를 CD40, CD80, CD86, MHCII 발현양을 통해 확인한 결과이다. 종양 배출 림프종에서 CD11c+ 수지상세포의 성숙 상태를 추가 분석한 결과, 성숙 표지자인 (A) CD40, (B) CD80, (C) CD86, 및 (D) MHCII는 대조와 비교 시에, γ-PGA/Ptx/Imq로 치료한 마우스에서 상당히 상향 조절된 것으로 확인되었다(도 12). γ-PGA/Ptx 및 γ-PGA/Imq 둘 다는 이들의 TLR4 및 TLR7의 각각의 자극성 때문에 APCs의 수를 증가시키고 성숙을 다소 유도할 수 있었다. 그러나, 이러한 자극의 달성 정도는 종양 형성 실험에서 관찰한 바와 같이 종양을 억제하기에는 불충분하였다. 반면에, γ-PGA/Ptx/Imq에서 두 가지의 치료제를 병용하는 것은, 종양에서 면역 억제 환경을 극복하고 강한 항종양 면역 반응의 발생을 위한 림프절에서 T 세포의 활성을 유도할 수 있는 수지상세포의 현저한 증식 및 성숙이 관찰되었다.
수난용성 치료제의 효과적인 전달은 이들을 임상에 적용하는데 있어 주요 걸림돌 중의 하나이다. 습식 분쇄 공정(wet milling process), 용융 압출(melt extrusion), 또는 안정제를 사용한 고체 분산액, 미세 현탁액, 및 나노 현탁액과 같은 다양한 접근법들이 연구되고 있다. 상기 선택된 항암 약물인 파크리탁셀 및 면역 자극제인 이미퀴모드는 자연적으로 수난용성이다. 따라서, 본원의 일 구현예에 있어서, 두 가지 약물의 효과적인 투여였고, 이를 위해 수용성 고분자인 γ-PGA를 사용하여 상기 약물이 공용매를 사용하여 미세 분산액으로 형성되도록 했다.
다양한 약물의 병용물이 개별 약물의 상대적 양에 어떠한 손실을 야기하거나 방해하지 않고 원하는 비율로 쉽게 분산될 수 있기 때문에, γ-PGA 기반 제형은 병용요법에 특히 이롭다. γ-PGA는 약물 결정의 효과적인 분산을 유도하는 약물 분자에 존재하는 아민기와 수소 결합과 같은 비공유 결합을 가지는 것으로 예상되는 자유 카르복실기를 갖는다. 상기 현탁액의 안정성은 분산된 미세-결정의 침전을 방지하는 γ-PGA 용액의 점성에 또한 기여할 수 있다. 상기 분산액은 6 개월까지 어떠한 상 분리 없이 안정적인 것으로 확인되었다.
특히, 모든 항암 면역치료에서 가장 중요한 목표 중의 하나는 종양 세포를 인식하고 사멸시킬 수 있는 면역 세포에 의해 강한 종양 특이 면역 반응을 유도하는 것이다. 수지상세포, T 세포 기반 또는 연속적인 살해 세포 기반 치료법을 포함하는 세포 기반 치료법의 중요성이 높아지고 있고, 다양한 임상평가가 진행 중이며, 이들 과정은 다단계의 환자 치료 과정을 포함한다. 체내에서(in-situ) 강력한 면역 반응을 생성하기 위해 면역자극제를 투여하는 것은 항암 면역요법의 편리한 접근법이 될 수 있다. 본원의 일 구현예에 따른 적은 양의 항암 약물과 면역강화제를 병용하는 것은 종양 특이 항원의 생성을 용이하게 할 수 있다.
세포 생존율 분석은 시스템의 다재성을 확인하기 위해 시험되는, 다양한 종양 세포주 상에서 파크리탁셀과 이미퀴모드 개별 또는 둘의 병용 효과를 나타냈다. 파크리탁셀을 함유하는 시료들(γ-PGA/Ptx 및 γ-PGA/Ptx/Imq)은 상기 모든 암세포주에서 세포독성 효과를 가졌지만, γ-PGA/Imq 복합체는 종양 세포 상에 직접 세포독성 효과를 나타내지는 않았다. 반면에, BMDCs의 증식은 세 가지 모든 시료의 존재에서 상당히 증가하였고, γ-PGA/Ptx/Imq의 경우에 가장 높았다. 파크리탁셀은 수지상세포 상에 용량 의존성 자극 효과를 다소 갖는 것으로 알려져있다. 이는 in-vitro 및 in-vivo 둘 다에서 파크리탁셀의 세포독성 농도의 존재에서 BMDCs의 증가된 증식의 유력한 원인이 되는 것으로 추측된다. 파크리탁셀은, DCs의 TLR4 자극에 의해 또한 종양 세포사멸의 유도 후 DCs를 위해 자신을 찾고, 자신을 먹는 중요한 신호인 열 충격 단백질 (HSPs), 고 유동성 그룹 박스-1 (HMBG-1) 및 칼레티쿨린(calreticulin)과 같은 손상 관련 분자 패턴(damage associated molecular patterns: DAMPs)의 방출에 의해 면역 자극에 기여하는 것으로 또한 예상된다. 이러한 결과는, in-vivo 항종양 효능 결과로 입증되었을 시에, 개별 성분들의 역할을 명확하게 설명한다. 비록, γ-PGA/Ptx가 직접 항종양 활성을 가졌지만, 매우 고용량(200 ㎍)의 약물도 종양의 성장을 완전하게 억제할 수는 없었다. γ-PGA/Ptx에 의해 설명되는 상기 면역자극 효과는 종양 치료법으로는 불충분하였다. 직접 항종양 특성이 부족한 γ-PGA/Imq 복합체의 내부-종양 투여는 종양의 성장을 어느 정도 억제할 수 있었으며, 이는 아마도 DCs에 종양을 파괴하는 활성을 부여하여 퍼포린(perforin) 및 그랜자임 B(granzyme B)를 분비할 수 있도록 하는 것으로도 알려져 있는 이미퀴모드 때문이다. γ-PGA/Imq를 이용하여, 종양의 성장을 지연시키기는 했지만, 상기 종양의 크기는 41 일째까지 결국 마우스가 100% 사망에 이르도록 커짐에 따라, 완전히 억제되지는 않았다. 흥미롭게도, 이미퀴모드와 저용량의 파크리탁셀의 병용은 41 일째에 생존율을 70%로 종양의 성장을 크게 억제시켰다. 7 마리 중 3 마리의 마우스는 γ-PGA/Ptx/Imq의 4 회 투여 후에 종양이 완전히 제거되었음을 나타내었다. 이러한 상승효과는 저용량의 파크리탁셀의 존재로 인해 종양 항원을 발생시키고, 이어서 이미퀴모드의 존재로 인해 강한 종양 특이 면역 반응을 발생시키는 것에서 기인된다. 이러한 면역 반응은 수지상세포에 의해 주로 매개되는 것으로 설명된다. 일반적으로, 종양 내로 침투한 수지상세포는 다양한 면역-억제 메커니즘으로 인해 항원 흡수, 항원 제시 및 T 세포의 활성화에 비효율적이다. 이미퀴모드와 같은 면역자극제의 도움으로 수지상세포는 종양 세포에 대항하는 기능이 제공될 수 있다. 이들 성숙 및 활성을 갖는 수지상세포는 종양 제거를 위해 다른 세포독성 면역 세포를 끌어들이고 자극을 주게 된다. 저용량의 파크리탁셀의 내부-종양으로의 투여는 화학요법과 관련된 전신 부작용을 감소시키므로, 강한 국부적인 효과를 유도한다. 확산되는 면역자극제(사멸된 종양 세포로부터 방출된 이미퀴모드 및 DAMPs)는 주변(외부에서 내부로)으로부터 종양을 사멸시키도록 면역세포를 활성화하면서, 항암 약물이 고형 종양의 내부(내부에서 외부로)로부터 종양 세포를 사멸시킴에 따라, 이러한 유형의 전략을 고형 종양을 치료하기 위한 양방향성 전략으로 칭할 수 있다(도 1). 따라서, 이러한 양방향성 화학요법 및 면역원성 종양 세포 사멸은 고형 종양을 완전히 제거한다.
성공적인 항종양 치료법에서 또 다른 중요한 보틀-넥(bottle-neck)은 2 차 종양을 발생시키는 모든 유형의 암과 관련되고, 암 환자를 주로 사망에 이르게 하는 전이 및 재발이다. 상기 질환의 완전한 박멸을 위해서는 종양 특이 면역 반응을 전신으로 오래 지속시키는 것이 요구되는 것으로 모든 항암 방법에 도전하고 있다. 본원에서, 상기 약물들이 비록 내부-종양으로 투여되었지만, 상기 발생된 반응은 전신적이었다. 4 차 내부-종양 주입 후 6 주째에, 종양 성장의 현저한 억제가 마우스의 반대편 옆구리에 수행되었던 2 차 종양 형성에서 관찰되었다. 이는 종양 내에 존재하는 항원발현세포가 종양 항원으로 효과적으로 적재되었고, T 세포 자극이 발생하는 종양 배출 림프절로 이동했다는 것을 나타낸다. γ-PGA/Ptx/Imq가 처리된 마우스의 종양 배출 림프절에서 수지상세포 및 대식세포 수의 증가가 확인되었다. DCs의 성숙 상태도 대조 시료와 비교했을 때, γ-PGA/Ptx/Imq로 치료된 마우스에서 또한 더 좋아졌다. DCs는 사멸된 종양 세포와 유일한 종류의 소통을 가지며, 방출된 사이토카인 및 DAMPs의 양 또는 성질에 의존하여, 면역-자극 또는 저항력에 대하여 수지상세포의 운명이 결정된다. γ-PGA/Ptx 및 γ-PGA/Imq 시료의 경우에, 종양 배출 림프절에서 DCs가 성숙하는 것으로 나타나지만, 달성된 정도는 고형 종양을 퇴행시키기에는 충분하지 않았다. 이들 결과들은 국부적으로 및 전신으로 모두 강력한 항-종양 면역 반응을 생성하는 APCs(주로 수지상세포)의 중심적인 역할을 명확하게 보여준다. 이러한 병용 요법을 사용하는 것은 종양에 대항하는 기억 반응을 발생시키는데 있어서 유망한 접근법이 되는 것으로 보인다.
본원의 실시예 또는 실험예에 따른 면역-자극 물질인 톨-유사 수용체 7 (TLR-7)의 작용제인 이미퀴모드(imiquimod) 및 저용량 화학치료제인 파크리탁셀(paclitaxel)은 항종양 기억 효과를 수반하는 종양 치료법을 입증하기 위해 서로 보완하여 작용되었다. 수난용성인 두 치료제는 수용성 폴리머인, 약물의 미세 분산 형성을 유도하는 공-용매 시스템을 사용하는 폴리감마글루탐산(γ-PGA)의 도움에 의하여 물에 분산되었다. 파크리탁셀 및 이미퀴모드는 2 ㎛ 내지 3 ㎛ 크기의 결정성 미세구조를 형성했고, 6개월 이상 동안 γ-PGA 매트릭스 내에서 안정하게 분산되었다. 파크리탁셀, 및 파크리탁셀과 이미퀴모드의 병용물은 다양한 종양 세포주에서 종양을 제거하는 현저한 in-vitro 효과를 가졌던 반면에, 상기 병용물과 함께 동일한 농도의 이미퀴모드를 이용하여 처리한 항원발현세포(수지상세포-DCs)는 증가된 증식(250%)을 나타냈다. DCs에서, 전구 염증 및 Th1 사이토카인의 증가된 분비가 γ-PGA에 분산된 파크리탁셀과 이미퀴모드를 함께 처리한 세포에서 관찰되었다. 마우스 흑색종 종양 모델에서 내부-종양을 주입함으로써 투여하였을 때에, 병용하여 치료하는 것이, 41 일째에 생존율이 0%인 개별 성분으로 치료하는 것과 비교하여, 생존율을 70%까지 유도하며 종양 성장의 급격한 억제를 보이는 것으로 확인되었다. 상기 백신을 접종한 마우스에서 처리 6 주 후에 다른 위치에의 2 차 암의 발생이 현저하게 지연되었기 때문에, 발생된 항종양 반응이 전신 기억 반응(systemic memory response)을 갖는 것으로 또한 확인되었다. in-vivo DCs의 상대적인 수 및 활성화 상태는 병용하여 처리된 마우스의 경우에 급격하게 증가된 것으로 확인되었다. 병용하여 처리된 종양의 급격한 억제는 화학요법에 의한 종양 세포 사멸 후에 방출된 항원의 DCs로의 흡수 둘 다에 의해 매개되며, DCs의 증가된 증식 및 DCs의 활성화에 기인한 것으로 예상된다.
단일 화학요법 또는 면역요법은 전신성 부작용, 불충분한 면역-자극, 면역 세포의 종양 유도된 저항력, 전신 및 종양 특이 면역 반응의 부족, 및 종양 재발과 같은 한계를 갖는다. 이에 반해, 본원은 수난용성 치료제를 사용한 고형 종양의 제거를 위한 면역요법과 화학요법의 병용 개념을 강조한다. 대부분의 이들 물질들은 자연적으로 수난용성인 반면에, 치료 모이어티(moiety)의 미세-분산액의 제형을 위한 폴리(γ-글루탐산)을 사용하는 것은 간단하고 실행 가능한 접근법으로 보인다. 저용량의 항암 약물인 파크리탁셀은 최소한의 부작용을 갖지만, 충분한 양의 종양 항원 및 종양 특이 면역 반응의 발생을 위한 위험 신호를 발생시킬 수 있을 것으로 예상된다. 마우스 모델에서, γ-PGA 매트릭스에 분산된 파크리탁셀과 병용된 이미퀴모드의 내부-종양 투여는 강력한 면역 종양 세포 사멸에 이어서 기억 효과의 존재를 나타내는 2 차 종양을 억제하도록 했다. 이러한 병용은 치료요법뿐만 아니라, 예방적인 항종양 요법 둘 다에서 가능성이 있는 것으로 보여진다. 상기 접근법의 다재성은 항암 약물 및 면역 자극제의 다양한 병용을 연구함으로써 추가 설명될 수 있다.
전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수도 있다.
본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (18)

  1. 폴리감마글루탐산;
    이미퀴모드; 및
    항암제
    를 포함하는, 약물 전달용 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 항암제는 파크리탁셀, 도세탁셀, 독소루비신, 아드리아마이신, 시스-플라틴(cis-platin), 미토마이신-C, 다우노마이신, 5-플루오로우라실, 글리세오풀빈, 디곡신, 디피리다몰, 스피로노락톤, 시클로스포린, 암포테리신 비, 에토포시드, 6-머캅토퓨린, 덱사메타손, 퍼페나진, 20-S-캄프토테신, 9-니트로-캄프토테신, 9-아미노-캄프토테신, 10,11-메틸렌디옥시-캄프토테신, 택솔, 택솔-A, 미토탄, 메토트렉세이트, 로무스틴, 인터페론, 로우라실, 및 에토피시드로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하는 것인, 약물 전달용 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 폴리감마글루탐산, 상기 이미퀴모드 및 상기 항암제는 분자 사이 비공유결합에 의해 서로 연결되는 것인, 약물 전달용 조성물.
  9. 이미퀴모드를 유기 용매에 분산시키고 초음파를 사용하여 처리하면서 폴리감마글루탐산을 첨가하여 폴리감마글루탐산-이미퀴모드 분산액을 제조한 후 상기 분산액을 동결 건조하여 상기 유기 용매를 제거함으로써 상기 폴리감마글루탐산에 분산된 이미퀴모드의 파우더를 수득하는 단계 (a);
    항암제를 유기 용매에 분산시키고 초음파를 사용하여 처리하면서 폴리감마글루탐산을 첨가하여 폴리감마글루탐산-항암제 분산액을 제조한 후 상기 분산액을 동결 건조하여 상기 유기 용매를 제거함으로써 상기 폴리감마글루탐산에 분산된 항암제의 파우더를 수득하는 단계 (b); 및
    상기 단계 (a) 및 (b) 에서 수득된 파우더들을 증류수에 재분산시키는 단계 (c)
    를 포함하는, 제 1 항, 제 7 항 및 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 약물 전달용 조성물의 제조 방법.
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  15. 제 9 항에 있어서,
    상기 항암제는 파크리탁셀, 도세탁셀, 독소루비신, 아드리아마이신, 시스-플라틴(cis-platin), 미토마이신-C, 다우노마이신, 5-플루오로우라실, 글리세오풀빈, 디곡신, 디피리다몰, 스피로노락톤, 시클로스포린, 암포테리신 비, 에토포시드, 6-머캅토퓨린, 덱사메타손, 퍼페나진, 20-S-캄프토테신, 9-니트로-캄프토테신, 9-아미노-캄프토테신, 10,11-메틸렌디옥시-캄프토테신, 택솔, 택솔-A, 미토탄, 메토트렉세이트, 로무스틴, 인터페론, 로우라실, 및 에토피시드로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하는 것인, 약물 전달용 조성물의 제조 방법.
  16. 제 9 항에 있어서,
    상기 폴리감마글루탐산에 분산된 상기 이미퀴모드 및 상기 폴리감마글루탐산에 분산된 상기 항암제가 분자 사이 비공유결합에 의해 서로 연결되는 것인, 약물 전달용 조성물의 제조 방법.
  17. 제 9 항에 있어서,
    상기 폴리감마글루탐산에 분산된 상기 이미퀴모드에 있어서, 상기 폴리감마글루탐산과 상기 이미퀴모드는 1 : 0.01 내지 300의 중량비로 포함되고;
    상기 폴리감마글루탐산에 분산된 상기 항암제에 있어서, 상기 폴리감마글루탐산과 상기 항암제는 1 : 0.01 내지 300의 중량비로 포함되고;
    상기 폴리감마글루탐산에 분산된 상기 이미퀴모드와 상기 폴리감마글루탐산에 분산된 상기 항암제는 1 : 1 내지 5의 중량비로 포함되는 것인, 약물 전달용 조성물의 제조 방법.
  18. 제 1 항, 제 7 항 및 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 약물 전달용 조성물을 유효성분으로 포함하는, 항암 치료용 조성물.
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