KR20240054289A - 면역원성 증강용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 소수성 세그먼트가 폴리(히드록시산)이며, 친수성 세그먼트가 다당인, 면역 활성화 인자가 결합한 양친매성 폴리머인, 수식형 양친매성 폴리머 및 항원을 포함하는 입자를 유효 성분으로서 함유하는 면역원성 증강용 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 양친매성 폴리머에 면역 활성화 인자가 결합한 수식형 양친매성 폴리머 및 항원을 포함하는 입자를 유효 성분으로서 함유하는 면역원성 증강용 조성물에 관한 것이다.
항원에 대한 면역 응답을 충분히 유도하기 위해서는, 항원만의 투여로는 불충분한 점에서 아쥬반트(면역 활성화 인자)가 병용된다. 그러나, 높은 아쥬반트 효과가 보고되어 있는 물질은, 안전성의 문제로 인간에게의 사용이 승인되어 있지 않다. 수산화알루미늄이나 MF59라는, 한정된 아쥬반트가 의약품에 사용되어 있지만, 안전성을 담보하면서 보다 강력하게 면역 응답을 유도 가능한 아쥬반트의 개발이 요구되어 있다.
상술한 과제를 해결하기 위해, 미립자 아쥬반트의 개발이 진행되어 있다. 입자화에 의해 항원이나 면역 활성화 인자를 내포함으로써, 안전성의 향상이나 목적 세포로의 송달 효율 향상이 기대된다. 지방산, 생분해성 폴리머, 바이러스 단백질 등 다방면에 걸친 재료에 의해 미립자 아쥬반트가 제안되어 왔다(비특허문헌 1, 2).
최근, 소수성 세그먼트가 폴리(히드록시산)이며, 친수성 세그먼트가 β-글루칸을 포함하는 다당인 양친매성 폴리머로 이루어지는 아쥬반트 미립자에 항원이 내포된 항원-아쥬반트 미립자 복합체에 관한 기술이 보고되어 있다(특허문헌 1, 2). 이 기술은 소량의 항원량, 적은 투여 회수로 항원에 대한 높은 면역 응답을 유도하는 것에 성공하고 있다. 그러나, 기존의 미립자를 사용한 기술로 종래의 아쥬반트를 훨씬 능가하는 성능을 갖는 효과적인 아쥬반트는, 그 개발이 대망되어 있음에도 불구하고 지금까지 실현되어 있지 않았다.
이뮤놀로지, 2006년 117호, 78-88페이지
네이처·머터리얼즈, 2011년 10호, 243-251페이지
본 발명의 목적은 소수성 세그먼트가 폴리(히드록시산)이며, 친수성 세그먼트가 다당인 양친매성 폴리머로 구성되는 입자의 면역 활성화 작용을 증강함으로써, 강력한 면역 활성화능을 갖는 면역원성 증강용 조성물을 제공하는 것에 있다.
상기 과제를 극복하기 위해, 본 발명자는 상기 양친매성 폴리머에 면역 활성화 인자가 결합한 수식형 양친매성 폴리머 및 항원을 포함하는 입자를 함유해서 이루어지는 면역원성 증강용 조성물이 유효한 것을 발견하여 본 발명을 완성했다.
즉, 본 발명은 이하의 (1)~(19)의 구성을 갖는다.
(1) 소수성 세그먼트가 폴리(히드록시산)이며, 친수성 세그먼트가 다당인, 면역 활성화 인자가 결합한 양친매성 폴리머인, 수식형 양친매성 폴리머 및 항원을 포함하는 입자를 유효 성분으로서 함유하는 면역원성 증강용 조성물.
(2) 상기 입자를 구성하는 항원 이외의 성분으로서 지질을 포함하지 않는 (1)에 기재된 면역원성 증강용 조성물.
(3) 상기 입자가 소수성 세그먼트가 폴리(히드록시산)이며, 친수성 세그먼트가 다당인, 면역 활성화 인자가 결합하고 있지 않은 양친매성 폴리머인, 비수식형 양친매성 폴리머를 더 포함하는 (1) 또는 (2)에 기재된 면역원성 증강용 조성물.
(4) 상기 다당이 덱스트란, β-글루칸, 만난, 키틴, 키토산, 젤란검, 알긴산, 히알루론산 또는 풀루란인 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 면역원성 증강용 조성물.
(5) 상기 β-글루칸이, 1개 이상의 β-1,3 결합 및/또는 1개 이상의 β-1,6 결합으로 연결된 글루코오스의 중합체인 (4)에 기재된 면역원성 증강용 조성물.
(6) 상기 β-글루칸이 흑효모 글루칸, 커들란, 파키만, 라미나란, 리케난, 시조피란, 렌티난, 스클레로글루칸 또는 파키마란인 (4) 또는 (5)에 기재된 면역원성 증강용 조성물.
(7) 상기 폴리(히드록시산)이 폴리(락트산-글리콜산), 폴리락트산 또는 폴리글리콜산인 (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 기재된 면역원성 증강용 조성물.
(8) 상기 수식형 양친매성 폴리머에 있어서의 상기 양친매성 폴리머와 상기 면역 활성화 인자의 결합이 공유 결합인 (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재된 면역원성 증강용 조성물.
(9) 상기 수식형 양친매성 폴리머에 있어서의 상기 면역 활성화 인자의 결합 부위가 상기 친수성 세그먼트인 (1) 내지 (8) 중 어느 하나에 기재된 면역원성 증강용 조성물.
(10) 상기 면역 활성화 인자가 Toll 유사 수용체(TLR), NOD 유사 수용체(NLR), RIG 유사 수용체 또는 C형 렉틴 수용체(CLR) 또는 인터페론 유전자 자극 인자(STING)에 결합하는 리간드 또는 아고니스트인 (1) 내지 (9) 중 어느 하나에 기재된 면역원성 증강용 조성물.
(11) 상기 Toll 유사 수용체(TLR)에 결합하는 리간드 또는 아고니스트가 TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8, TLR9 또는 TLR11에 결합하는 리간드 또는 아고니스트인 (10)에 기재된 면역원성 증강용 조성물.
(12) 상기 Toll 유사 수용체(TLR)에 결합하는 리간드 또는 아고니스트가 이하의 (i) 내지 (ⅶ) 중 어느 하나인 (10) 또는 (11)에 기재된 면역원성 증강용 조성물.
(ⅰ) 펩티드글리칸, 리포단백질, 리포폴리사카라이드 및 치모산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 TLR2에 결합하는 리간드 또는 아고니스트
(ⅱ) Poly(I:C) 및 poly(A:U)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 TLR3에 결합하는 리간드 또는 아고니스트
(ⅲ) 리포폴리사카라이드(LPS), HSP60, RS09 및 MPLA로 이루어지는 군으로부터 선택되는 TLR4에 결합하는 리간드 또는 아고니스트
(ⅳ) TLR5에 결합하는 리간드 또는 아고니스트인 플라젤린
(ⅴ) 이미다조퀴놀린류 화합물 및 단일 가닥 RNA로 이루어지는 군으로부터 선택되는 TLR7 또는 8에 결합하는 리간드 또는 아고니스트
(ⅵ) 박테리아 DNA, 비메틸화 CpG DNA, 헤모조인, ODN1585, ODN1668 및 ODN1826으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 TLR9에 결합하는 리간드 또는 아고니스트
(ⅶ) 프로필린 및 요로 병원성 박테리아로 이루어지는 군으로부터 선택되는 TLR11에 결합하는 리간드 또는 아고니스트
(13) 상기 수식형 양친매성 폴리머 1분자에 결합하는 상기 면역 활성화 인자의 분자수가 1~100인 (1) 내지 (12) 중 어느 하나에 기재된 면역원성 증강용 조성물.
(14) 상기 입자의 평균 입경이 0.1~50㎛인 (1) 내지 (13) 중 어느 하나에 기재된 면역원성 증강용 조성물.
(15) (1) 내지 (14) 중 어느 하나에 기재된 면역원성 증강용 조성물을 유효 성분으로서 함유하는 의약.
(16) (1) 내지 (14) 중 어느 하나에 기재된 면역원성 증강용 조성물을 유효 성분으로서 함유하는 백신.
(17) (1) 내지 (14) 중 어느 하나에 기재된 면역원성 증강용 조성물을 유효 성분으로서 함유하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 백신.
(18) (1) 내지 (14) 중 어느 하나에 기재된 면역 증강용 조성물을 피험체에게 투여하는 것을 포함하는 면역원성 증강 방법.
(19) (1) 내지 (14) 중 어느 하나에 기재된 면역원성 증강용 조성물, (15)에 기재된 의약, 또는 (16) 혹은 (17)에 기재된 백신을 피험체에게 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 방법.
본 명세서는 본원의 우선권의 기초가 되는 일본국 특허출원번호 2021-139683호의 개시 내용을 포함한다.
본 발명에 의해, 종래보다 강력한 면역 활성화가 가능해지는 면역원성 증강용 조성물이 제공된다.
도 1은 덱스트란-NH2의 GPC 측정의 결과를 나타낸다.
도 2는 덱스트란-PLGA의 GPC 측정의 결과를 나타낸다.
도 3은 R848-덱스트란-PLGA의 1H-NMR 측정의 결과를 나타낸다.
도 4는 흑효모 글루칸-NH2의 GPC 측정의 결과를 나타낸다.
도 5는 흑효모 글루칸-PLGA의 GPC 측정의 결과를 나타낸다.
도 6은 R848-흑효모 글루칸-PLGA의 1H-NMR 측정의 결과를 나타낸다.
도 7은 OVA 함유 R848 수식 덱스트란-PLGA 입자의 DLS 측정의 결과를 나타낸다.
도 8은 OVA 함유 R848 수식 흑효모 글루칸-PLGA 입자의 DLS 측정의 결과를 나타낸다.
도 9는 TRP2 함유 R848 수식 흑효모 글루칸-PLGA 입자의 DLS 측정의 결과를 나타낸다.
도 10은 면역원성 증강용 조성물에 의한 마우스 골수 유래 수지상 세포의 활성화의 결과를 나타낸다.
도 2는 덱스트란-PLGA의 GPC 측정의 결과를 나타낸다.
도 3은 R848-덱스트란-PLGA의 1H-NMR 측정의 결과를 나타낸다.
도 4는 흑효모 글루칸-NH2의 GPC 측정의 결과를 나타낸다.
도 5는 흑효모 글루칸-PLGA의 GPC 측정의 결과를 나타낸다.
도 6은 R848-흑효모 글루칸-PLGA의 1H-NMR 측정의 결과를 나타낸다.
도 7은 OVA 함유 R848 수식 덱스트란-PLGA 입자의 DLS 측정의 결과를 나타낸다.
도 8은 OVA 함유 R848 수식 흑효모 글루칸-PLGA 입자의 DLS 측정의 결과를 나타낸다.
도 9는 TRP2 함유 R848 수식 흑효모 글루칸-PLGA 입자의 DLS 측정의 결과를 나타낸다.
도 10은 면역원성 증강용 조성물에 의한 마우스 골수 유래 수지상 세포의 활성화의 결과를 나타낸다.
본 발명은 소수성 세그먼트가 폴리(히드록시산)이며, 친수성 세그먼트가 다당인, 면역 활성화 인자가 결합한 양친매성 폴리머인, 수식형 양친매성 폴리머 및 항원을 포함하는 입자, 바람직하게는 수식형 양친매성 폴리머, 항원, 및 소수성 세그먼트가 폴리(히드록시산)이며 친수성 세그먼트가 다당인, 면역 활성화 인자가 결합하고 있지 않은 양친매성 폴리머인, 비수식형 양친매성 폴리머를 포함하는 입자를 유효 성분으로서 함유하는 면역원성 조성물(특히, 면역원성 증강용 조성물)에 관한 것이다.
항원과 함께 입자를 구성하는 양친매성 폴리머에 대해서 설명한다. 「양친매성」이란, 친수성과 소수성의 양방의 성질을 갖고 있는 것을 의미한다. 어떤 부위(세그먼트)의 물에의 용해도가 다른 부위보다 높을 때, 상기 부위(세그먼트)를 친수성이라고 한다. 친수 부위는 물에 가용인 것이 바람직하지만, 난용이어도 다른 부위와 비교해서 물에의 용해도가 높으면 좋다. 또한, 어떤 부위(세그먼트)의 물에의 용해도가 다른 부위보다 낮을 때, 상기 부위(세그먼트)를 소수성이라고 한다. 소수성 부위는 물에 불용인 것이 바람직하지만, 가용이어도 다른 부위와 비교해서 물에의 용해도가 낮으면 좋다.
「양친매성 폴리머」란 분자 전체로서 상술한 양친매성을 갖는 폴리머이다. 양친매성 「폴리머」란 양친매성 분자 중의 친수성 세그먼트 또는 소수성 세그먼트, 또는 그 양방이 최소 단위(모노머)의 반복 구조로 구성된 분자 구조인 것을 나타낸다. 본 발명에 있어서의 양친매성 폴리머의 구조는 특별히 한정되지 않고, 구체예로서는 다당과 폴리(히드록시산)이 연결된 직쇄상의 블록형 폴리머, 다당 또는 폴리(히드록시산)이 복수 개 존재하는 분기를 가진 분기 폴리머, 다당의 주쇄 및 폴리(히드록시산)의 측쇄로 이루어지는 그래프트형 폴리머, 폴리(히드록시산)의 주쇄 및 다당의 측쇄로 이루어지는 그래프트형 폴리머를 들 수 있지만, 바람직하게는 다당과 폴리(히드록시산)이 연결된 직쇄상의 블록형 폴리머이다.
본 발명에 있어서, 양친매성 폴리머의 친수성 세그먼트는 다당인 것을 특징으로 하고 있다. 다당이면 특별히 한정되지 않지만, 구체예로서는 덱스트란, β-글루칸, 만난, 키틴, 키토산, 젤란검, 알긴산, 히알루론산 또는 풀루란을 들 수 있고, 바람직하게는 덱스트란 또는 β-글루칸이다.
글루칸이란 글루코오스 함유 다당류이며, β-글루칸은 글루코오스 서브유닛 사이에 1개 이상의 β-결합을 포함하는 것이다. 즉, 본 발명에서 사용되는 β-글루칸은 β-결합을 포함하는 것이며, β-결합만을 포함하는 것이어도 좋다. 또한, 본 발명에서 사용되는 β-글루칸은 분지상이어도 선상이어도 좋다. 바람직한 β-글루칸으로서는 1개 이상의 β-1,3 결합 및/또는 1개 이상의 β-1,6 결합을 포함하는 것이나, 1개 이상의 β-1,2 결합 및/또는 β-1,4 결합을 포함하는 것을 들 수 있지만, 1개 이상의 β-1,3 결합 및/또는 1개 이상의 β-1,6 결합을 포함하는 것이 보다 바람직하고, 1개 이상의 β-1,3 결합을 포함하는 것이 더 바람직하다. 1개 이상의 β-1,3 결합을 포함하는 β-글루칸의 구체예로서는 커들란, 파키만, 라미나란, 리케난, 시조피란, 렌티난, 스클레로글루칸, 흑효모 글루칸(바람직하게는, 흑효모 유래의 β-1,3 글루칸 혹은 β-1,6 글루칸) 또는 파키마란을 들 수 있고, 바람직하게는 커들란, 파키만, 라미나란, 시조피란, 스클레로글루칸, 흑효모 글루칸 또는 파키마란을 들 수 있다.
1개 이상의 β-1,3 결합을 포함하는 선상의 β-글루칸으로서는, 주로 β-1,3 결합으로 이루어지는 β-글루칸(예를 들면, 커들란이나 파키만)이나, β-1,3 결합과 β-1,3 결합 이외의 β-결합으로 이루어지는 β-글루칸(예를 들면, 라미나란이나 리케난)을 들 수 있다.
1개 이상의 β-1,3 결합을 포함하는 분지상의 β-글루칸으로서는, β-1,3 결합과 β-1,6 결합으로 이루어지는 β-글루칸(예를 들면, 시조피란이나 렌티난, 스클레로글루칸, 흑효모 글루칸)을 들 수 있다.
본 발명에서 사용되는 β-글루칸은 유도체화된 β-글루칸이어도 좋다. 유도체화의 예로서는, 카르복시메틸기의 부가 반응이나 산화적 개열 반응을 들 수 있다. 유도체화된 β-글루칸의 예로서는, 커들란에 카르복시메틸기가 부가된 카르복시메틸커들란이나, 파키만이 개열된 파키마란을 들 수 있다.
다당의 수 평균 분자량은 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 500~100,000이며, 보다 바람직하게는 500~50,000이며, 더 바람직하게는 1,000~10,000, 예를 들면 1,000~8,000, 1,000~6,000, 또는 1,000~4,000이다. 수 평균 분자량이란, 분자의 크기의 가중치를 고려하지 않는 방법으로 산출한 평균 분자량이며, 다당의 수 평균 분자량은 겔 퍼미에이션 크로마토그래피(GPC)에 의해 구할 수 있다.
본 발명에 있어서, 양친매성 폴리머의 소수성 세그먼트는 폴리(히드록시산)인 것을 특징으로 하고 있다. 폴리(히드록시산)은 특별히 한정되지 않지만, 생체 투여 시에 현저하게 유해한 영향을 부여하지 않는 생체 적합성 폴리머인 것이 바람직하다. 여기에서 말하는 생체 적합성이란 래트에 상기 폴리머를 경구 투여하는 경우의 LD50이 2,000㎎/㎏ 이상인 것을 가리킨다. 폴리(히드록시산)은 또한, 복수 종류의 히드록시산의 공중합체이어도 좋지만, 바람직하게는 2종류 이하의 히드록시산의 중합체이다.
폴리(히드록시산)의 바람직한 구체예로서는 폴리글리콜산, 폴리락트산, 폴리(2-히드록시부티르산), 폴리(2-히드록시발레르산), 폴리(2-히드록시카프로산), 폴리(2-히드록시카프르산), 폴리(말산) 또는 이들의 고분자 화합물의 유도체 및 공중합체를 들 수 있지만, 바람직하게는 폴리(락트산-글리콜산), 폴리락트산 또는 폴리글리콜산이며, 보다 바람직하게는 폴리(락트산-글리콜산)이다. 또한, 폴리(히드록시산)이 폴리(락트산-글리콜산)일 경우, 폴리(락트산-글리콜산)의 조성비(락트산/글리콜산)(몰/몰)는 본 발명의 목적이 달성되는 한에 있어서 특별히 한정되지 않지만, 99/1~1/99인 것이 바람직하고, 80/20~20/80, 예를 들면 60/40~40/60, 또는 50/50인 것이 보다 바람직하다.
폴리(히드록시산)의 수 평균 분자량은 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 500~1,000,000이며, 보다 바람직하게는 500~100,000이며, 더 바람직하게는 500~50,000, 예를 들면 500~40,000, 500~30,000, 500~20,000, 또는 500~15,000이다. 폴리(히드록시산)의 수 평균 분자량은 소수성 세그먼트가 폴리(히드록시산)이며, 친수성 세그먼트가 다당인 양친매성 폴리머의 수 평균 분자량과 다당의 수 평균 분자량의 차로부터 구해진다.
입자를 구성하는 양친매성 폴리머(면역 활성화 인자가 결합하고 있지 않은 비수식형 양친매성 폴리머)의 수 평균 분자량은 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 1,000~1,000,000이며, 보다 바람직하게는 1,000~100,000이며, 더 바람직하게는 9,000~50,000, 예를 들면 9,000~40,000, 9,000~30,000, 9,000~20,000, 9,000~15,000이다. 양친매성 폴리머의 수 평균 분자량은 겔 퍼미에이션 크로마토그래피(GPC)로부터 구해진다.
양친매성 폴리머는 기지의 방법으로 제조하면 좋고, 구체적으로는 다당에 폴리(히드록시산)을 첨가해서 축합 반응을 행하여 제조하는 방법, 다당에 히드록시산 활성화 모노머를 첨가해서 중합 반응을 행하여 제조하는 방법을 예로서 들 수 있다.
또한, 양친매성 폴리머가 다당과 폴리(히드록시산)이 연결된 직쇄상의 블록형 폴리머일 경우, 기지의 방법으로 제조하면 좋고, 구체적으로는 양친매성 폴리머의 다당의 환원 말단에 대해서, 폴리(히드록시산) 공중합체를 말단 관능기의 활성화제를 사용해서 축합 반응시킴으로써 제조하는 방법(Macromol.Rapid Commun., 31, p.1664-1684(2010년))을 예로서 들 수 있다.
또한, 양친매성 폴리머가 다당의 주쇄 및 폴리(히드록시산)의 측쇄로 이루어지는 그래프트형 폴리머일 경우, 이하의 (1), (2) 또는 (3)과 같이 해서 제조할 수 있다.
(1) 주석 촉매 존재하, 다당에 히드록시산 활성화 모노머를 첨가해서 중합 반응을 행하고, 폴리(히드록시산)을 도입함으로써 그래프트형 폴리머를 제조하는 방법(Macromolecules, 31, p.1032-1039(1998년)).
(2) 수산기의 대부분이 치환기로 보호된 다당의 일부 미보호의 수산기를 염기로 활성화 후, 히드록시산 활성화 모노머를 첨가해서 폴리(히드록시산)으로 이루어지는 그래프트쇄를 도입하고, 최후에 보호기를 제거함으로써 그래프트형 폴리머를 제조하는 방법(Polymer, 44, p.3927-3933(2003년)).
(3) 다당에 대해서, 폴리(히드록시산)의 공중합체를 탈수제 및/또는 관능기의 활성화제를 사용해서 축합 반응시킴으로써 그래프트형 폴리머를 제조하는 방법(Macromolecules, 33, p.3680-3685(2000년)).
「수식형 양친매성 폴리머」란, 상기 양친매성 폴리머에 면역 활성화 인자가 결합한 폴리머이다. 여기에서 말하는 결합이란 비공유 결합이어도 공유 결합이어도 좋지만, 바람직하게는 공유 결합이다. 비공유 결합은, 바람직하게는 소수적인 상호 작용이지만 이온 결합(정전 상호 작용), 수소 결합, 배위 결합, 반데르발스 결합, 물리 흡착이어도 좋고, 그들이 복합된 결합이어도 좋다.
「면역 활성화 인자」는, 여기에서는 1종 이상의 면역 세포를 활성화하는 인자이며, 상기 세포의 면역 기능을 유지, 증강할 수 있는 물질을 의미한다. 여기에서 말하는 「면역 세포」란, 예를 들면 T 림프구, B 림프구, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포, 과립구, 매크로파지, 골수 유래 억제성 세포, Langerhance 세포 및 그 전구 세포군, 종양 내에 존재하는 상기 면역 세포군이다.
본 발명에서 사용되는 면역 활성화 인자는 특별히 한정되지 않고, 구체예로서는 Toll 유사 수용체(TLR), NOD 유사 수용체(NLR), RIG 유사 수용체, C형 렉틴 수용체(CLR) 또는 인터페론 유전자 자극 인자(STING)에 결합하는 리간드 또는 아고니스트를 들 수 있지만, 바람직하게는 TLR에 결합하는 리간드 또는 아고니스트이다.
TLR의 구체예로서는 TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8, TLR9 또는 TLR11을 들 수 있고, 그들에 결합하는 리간드 또는 아고니스트의 구체예로서는 이하의 (i) 내지 (ⅶ)을 들 수 있다.
(ⅰ) 펩티드글리칸, 리포단백질, 리포폴리사카라이드 및 치모산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 TLR2에 결합하는 리간드 또는 아고니스트.
(ⅱ) Poly(I:C) 및 poly(A:U)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 TLR3에 결합하는 리간드 또는 아고니스트.
(ⅲ) 리포폴리사카라이드(LPS), HSP60, RS09 및 MPLA로 이루어지는 군으로부터 선택되는 TLR4에 결합하는 리간드 또는 아고니스트.
(ⅳ) TLR5에 결합하는 리간드 또는 아고니스트인 플라젤린.
(ⅴ) 이미다조퀴놀린류 화합물 및 단일 가닥 RNA로 이루어지는 군으로부터 선택되는 TLR7 또는 8에 결합하는 리간드 또는 아고니스트.
(ⅵ) 박테리아 DNA, 비메틸화 CpG DNA, 헤모조인, ODN1585, ODN1668 및 ODN1826으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 TLR9에 결합하는 리간드 또는 아고니스트.
(ⅶ) 프로필린 및 요로 병원성 박테리아로 이루어지는 군으로부터 선택되는 TLR11에 결합하는 리간드 또는 아고니스트.
본 발명에 있어서 면역 활성화 인자는, 바람직하게는 TLR7 또는 8에 결합하는 리간드 또는 아고니스트(TLR7/8 리간드 또는 아고니스트)이며, 보다 바람직하게는 상기 (ⅴ)의 리간드 또는 아고니스트이다.
상기 (ⅴ)의 이미다조퀴놀린류 화합물의 바람직한 구체예로서는, 예를 들면 미국특허 8,951,528호에 기재된 화합물이나, WO 2015/103989에 기재되어 있는 화합물이 있으며, 예를 들면 4-아미노-2-(에톡시메틸)-a,a-디메틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-에탄올(레시퀴모드(R848)), 1-(2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민(이미퀴모드), 1-(4-아미노-2-에틸아미노메틸이미다조-[4,5-c]퀴놀린-1-일)-2-메틸프로판-2-올(가르디퀴모드), N-[4-(4-아미노-2-에틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일)부틸-]메탄술폰아미드(PF-4878691), 4-아미노-aa-디메틸-2-메톡시에틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-에탄올, 1-(2-(3-(벤질옥시)프로폭시)에틸)-2-(에톡시메틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민, 4-아미노-2-에톡시메틸-aa-디메틸-6,7,8,9-테트라하이드로-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-에탄올, N-(2-{2-[4-아미노-2-(2-메톡시에틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-l-일]에톡시}에틸)-n'-페닐우레아, 1-2-아미노-2-메틸프로필)-2-(에톡시메틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민, 1-{4-[(3,5-디클로로페닐)술포닐]부틸}-2-에틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민, N-(2-{2-[4-아미노-2-(에톡시메틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]에톡시}에틸)-n'-시클로헥실우레아, N-{3-[4-아미노-2-(에톡시메틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]프로필}-n'-(3-시아노페닐)티오우레아, N-[3-(4-아미노-2-부틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-l-일)-2,2-디메틸프로필]벤즈아미드, 2-부틸-1-[3-(메틸술포닐)프로필]-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 및 이들의 유도체를 들 수 있지만, TLR7 또는 TLR8에 결합하는 것이면 특별히 한정되지 않는다.
NOD 유사 수용체(NLR)에 결합하는 리간드 또는 아고니스트의 구체예로서는, 예를 들면 M-TriDAP, PGN을 들 수 있다. 그 외, NOD1에 대한 리간드 또는 아고니스트, 예를 들면 Tri-DAP, iE-DAP, C12-iE도 들 수 있다. 또한, NOD2에 대한 리간드 또는 아고니스트, 예를 들면 MDP, N-글리코실-MDP, Murabutide, M-TriLyS-D-ASN, M-TriLYS, L18-MDP도 들 수 있다.
RIG 유사 수용체에 결합하는 리간드 또는 아고니스트의 구체예로서는, 예를 들면 5'ppp-dsRNA, poly(dA:dT), poly(dG:dC), poly(I:C)를 들 수 있다.
C형 렉틴 수용체(CLR)에 결합하는 리간드 또는 아고니스트의 구체예로서는 트레할로스 6,6-베헨산염, 치모산, WGP, HKSC, HKCA 및 커들란 AL을 들 수 있다.
인터페론 유전자 자극 인자(STING)에 결합하는 리간드 또는 아고니스트로서는 c-di-GMP, c-di-AMP, 2'3'-cGAMP, 3'3'-cGAMP 또는 2'2'-cGAMP를 들 수 있다.
수식형 양친매성 폴리머에 있어서의 면역 활성화 인자의 결합 부위에 대해서는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 다당 세그먼트이다. 또한, 면역 활성화 인자의 양친매성 폴리머에 대한 비율(몰비)(수식형 양친매성 폴리머 1분자에 결합하는 면역 활성화 인자의 분자수)은, 본 발명의 목적이 달성되는 한 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 수식형 양친매성 폴리머에 대해서 1~100, 보다 바람직하게는 1~50, 더 바람직하게는 1~30, 특히 바람직하게는 1~10이다.
수식형 양친매성 폴리머의 수 평균 분자량은 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 1,000~1,000,000이며, 보다 바람직하게는 1,000~100,000이며, 더 바람직하게는 2,000~50,000, 예를 들면 2,000~40,000, 2,000~30,000, 2,000~20,000, 2,000~15,000이다. 수식형 양친매성 폴리머의 수 평균 분자량은 겔 퍼미에이션 크로마토그래피(GPC)로부터 구해진다.
수식형 양친매성 폴리머는 기지의 방법으로 제조하면 좋고, 구체적으로는 이하의 (1) 또는 (2)와 같이 해서 제조할 수 있다.
(1) 양친매성 폴리머의 다당 세그먼트에 면역 활성화 인자를 결합시키는 방법
다당 주쇄의 수산기를 활성화하는 반응 시약, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 1,1'-카르보닐디이미다졸(CDI) 또는 디숙신이미딜카보네이트(DSC) 등으로 다당의 수산기를 정량적으로 활성화한 후, 면역 활성화 인자에 별도 도입한 활성화 수산기와 공유 결합하는 반응성 관능기, 예를 들면 아미노기 등을 상기 활성화한 수산기와 축합 반응시켜서 제조하는 방법, 다당의 수산기를 보다 반응성이 높은 다른 관능기, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 아미노기, 카르복실기, 말레이미드기, 티올기 등으로 변환한 후, 이들의 반응성 관능기와 결합하는 관능기를 별도 도입한 면역 활성화 인자를 상기 다당과 축합 반응시켜서 제조하는 방법, 또는 다당의 수산기를 양이온성의 아미노기 또는 음이온성의 카르복실기로 변환한 후, 상기 아미노기 또는 카르복실기와, 면역 활성화 인자에 별도 도입한 그것과는 반대 하전의 카르복실기 또는 아미노기를 정전 상호 작용에 의해 이온 결합시켜서 제조하는 방법 등을 들 수 있다.
(2) 양친매성 폴리머의 폴리(히드록시산) 세그먼트에 면역 활성화 인자를 결합시키는 방법
폴리(히드록시산)의 α 말단은 다당과 연결되어 공중합체를 형성할 수 있고, ω 말단은 다양한 반응성 관능기, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 아미노기, 카르복실기, 말레이미드기, 티올기 등을 도입할 수 있다. 폴리(히드록시산)의 ω 말단에 도입한 이들 반응성 관능기와 결합하는 관능기를 별도 도입한 면역 활성화 인자를 상기 폴리(히드록시산)과 축합 반응시켜서 제조하는 방법, 또는 폴리(히드록시산)의 ω 말단을 양이온성의 아미노기 또는 음이온성의 카르복실기로 변환한 후, 상기 아미노기 또는 카르복실기와, 면역 활성화 인자에 별도 도입한 그것과는 반대 하전의 카르복실기 또는 아미노기를 정전 상호 작용에 의해 이온 결합시켜서 제조하는 방법 등을 예로서 들 수 있다.
수식형 양친매성 폴리머는 장기에 걸쳐 면역 활성화 작용을 지속시키기 위해, 생체 내에서 금방 배설되지 않도록 전체적으로 수불용성인 것이 바람직하다. 여기에서 말하는 「수불용성」이란, 물에의 용해도가 1g(양친매성 폴리머)/100㎖(물) 이하인 것을 말한다.
본 발명의 면역원성 증강용 조성물의 유효 성분인 입자는, 항원 및 상기 수식형 양친매성 폴리머를 구성 성분으로서 포함하는 것을 특징으로 하고 있으며, 바람직하게는 면역 활성화 인자가 결합하고 있지 않은 비수식형 양친매성 폴리머를 더 포함하는 것을 특징으로 하고 있다. 본 발명에 있어서의 입자는, 항원 및 비수식형 양친매성 폴리머를 포함하고 수식형 양친매성 폴리머를 포함하지 않는 입자, 상기 입자와 면역 활성화 인자의 혼합물, 또는 항원 단독 등에 비해 현저하게 증강된 면역 활성화능을 가질 수 있다.
입자를 구성하는 항원 이외의 성분으로서 수식형 양친매성 폴리머와 비수식형 양친매성 폴리머의 조합이 포함될 경우, 상기 조합은 입자가 면역 활성화능을 갖는 한 특별히 제한은 없고, 수식형 양친매성 폴리머 및 비수식형 양친매성 폴리머의 친수성 세그먼트는 이종 폴리머이어도 동일종 폴리머이어도 좋고, 마찬가지로 수식형 양친매성 폴리머 및 비수식형 양친매성 폴리머의 소수성 세그먼트도 이종 폴리머이어도 동일종 폴리머이어도 좋다. 또한, 수식형 양친매성 폴리머 및 비수식형 양친매성 폴리머의 각 세그먼트가 이종 폴리머인 경우에는 3종 이상이어도 좋고, 수식형 양친매성 폴리머 및 비수식형 양친매성 폴리머의 친수성 세그먼트 및 소수성 세그먼트의 연결 양식은 상이해도 동일해도 좋고, 예를 들면 수식형 양친매성 폴리머가 블록형 폴리머이며, 비수식형 양친매성 폴리머가 그래프트형 폴리머인 조합이어도 좋다. 바람직하게는, 수식형 양친매성 폴리머 및 비수식형 양친매성 폴리머의 각 세그먼트는 동일종 폴리머로 구성된다.
입자를 구성하는 항원 이외의 성분으로서 수식형 양친매성 폴리머 및 비수식형 양친매성 폴리머의 조합이 포함될 경우, 수식형 양친매성 폴리머 중량과 비수식형 양친매성 폴리머 중량의 합계에 대한 수식형 양친매성 폴리머 중량의 비율은, 바람직하게는 0.01~99.99중량%, 보다 바람직하게는 0.1~99.9중량%, 더 바람직하게는 1~99중량%, 보다 더 바람직하게는 5~95중량%, 특히 바람직하게는 5~80중량%이다.
입자를 구성하는 항원 이외의 성분으로서 양친매성 폴리머 이외의 성분이 포함되어도 좋고, 구체예로서 항원을 내포할 수 있는 입자인 리포솜이나 지질 나노 입자의 구성 성분으로서 주지의 지질이 포함되어 있어도 좋지만, 실시예에 있어서 명백한 바와 같이, 본 발명에서는 지질을 사용하지 않아도 충분히 기대하는 효과가 얻어지는 점에서, 입자를 구성하는 항원 이외의 성분으로서 지질을 포함하지 않는 것이 바람직하다.
입자의 구조로서는 특별히 한정되지 않지만, 입자와 항원의 복합체를 구성하기 위해, 입자를 구성하는 양친매성 폴리머의 친수성 세그먼트를 입자의 내측으로 하고, 소수성 세그먼트를 입자의 외층으로 하는 구조를 취할 경우, 항원이 입자에 내포되는 형태가 되어 보다 안정적으로 유지될 수 있기 때문에 바람직하다.
입자를 제조하는 방법은 특별히 한정되지 않고, 액중 건조법, 분무 건조법, 분쇄법 등을 들 수 있지만, 본 발명에 있어서의 입자는 액중 건조법에 의해 바람직하게 제조된다.
액중 건조법에 의해 입자를 제조하는 방법으로서는 O/W 에멀션법, W/O/W 에멀션법, S/O/W 에멀션법 등을 들 수 있다.
O/W 에멀션법에 의해 입자를 제조하는 경우의 예를 들면, 입자를 구성하는 양친매성 폴리머의 분체를 용해한 수비혼화성 유기 용매와, 표면 개질제와 항원을 용해한 수용액을 혼합하고, O/W 에멀션 용액을 조제하는 공정, 및 O/W 에멀션 용액으로부터 수비혼화성 유기 용매를 제거해서 입자를 얻는 공정에 의해 제조할 수 있다.
W/O/W 에멀션법에 의해 입자를 제조하는 경우의 예를 들면, 항원을 용해한 수계 용매와 입자를 구성하는 양친매성 폴리머 분체를 용해한 수비혼화성 유기 용매를 혼합하여 W/O 에멀션 용액을 조제하는 공정, W/O 에멀션 용액과 표면 개질제 수용액을 혼합하여 W/O/W 에멀션 용액을 조제하는 공정, 및 W/O/W 에멀션 용액으로부터 수비혼화성 유기 용매를 제거해서 입자를 얻는 공정에 의해 제조할 수 있다.
S/O/W 에멀션법에 의해 입자를 제조하는 경우의 예를 들면, 항원을 용해한 수계 용매와 입자를 구성하는 양친매성 폴리머 분체를 용해한 수비혼화성 유기 용매를 혼합하여 W/O 에멀션 용액을 조제하는 공정, W/O 에멀션 용액으로부터 용매를 제거하여 고형분을 얻는 공정, 고형분을 수비혼화성 유기 용매에 분산시켜 S/O 서스펜션 용액을 얻는 공정, S/O 서스펜션 용액과 표면 개질제 수용액을 혼합하여 S/O/W 에멀션 용액을 조제하는 공정, 및 S/O/W 에멀션 용액으로부터 수비혼화성 유기 용매를 제거해서 입자를 얻는 공정에 의해 제조할 수 있다.
입자 중의 항원 함유율(항원/입자)은, 바람직하게는 0.01~20중량%, 보다 바람직하게는 0.1~10중량%, 예를 들면 0.5~10중량%이다. 항원 함유율의 정량 방법으로서는, 입자로부터 유기 용매를 사용해서 항원을 추출하고, 겔 전기영동 또는 액체 크로마토그래피에 의해 정량하는 방법을 들 수 있다.
입자 조제에 사용하는 표면 개질제로서는, 수용성 폴리머 또는 계면활성제인 것이 바람직하다. 여기에서 말하는 수용성 폴리머란, 물에의 용해도가 1g(수용성 폴리머)/100㎖(물) 이상인 고분자 화합물이다.
표면 개질제가 되는 수용성 폴리머의 예로서는 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌이민, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 폴리-1,3-디옥솔란, 2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린 폴리머, 폴리-1,3,6-트리옥산, 폴리아미노산, 펩티드, 단백질, 당질(단당류, 소당류, 다당류 등)을 들 수 있지만, 폴리비닐알코올이 보다 바람직하다.
표면 개질제가 되는 계면활성제의 예로서는 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜, 수크로오스 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌소르비탄모노 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌소르비탄디 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌글리세린모노 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌글리세린디 지방산 에스테르, 폴리글리세린 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 피마자유, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 등의 비이온성 활성제나, 라우릴황산 나트륨, 라우릴황산 암모늄, 스테아릴황산 나트륨 등의 알킬황산염 또는 레시틴을 들 수 있지만, 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜이 보다 바람직하다.
입자 조제에 사용하는 수비혼화성 유기 용매는, 양친매성 폴리머 및 수식형 양친매성 폴리머가 가용이며, 또한 다당이 난용 또는 불용인 것이 바람직하다. 수비혼화성 유기 용매의 물에의 용해도는, 바람직하게는 30g(수비혼화성 유기 용매)/100㎖(물) 이하이다. 수비혼화성 유기 용매의 구체예로서는 아세트산 에틸, 아세트산 이소프로필, 아세트산 부틸, 탄산 디메틸, 탄산 디에틸, 염화메틸렌, 클로로포름을 들 수 있다.
입자 조제에 사용하는 수계 용매는, 물 및 임의로 수용성 성분을 함유하는 수용액이다. 수용성 성분으로서, 예를 들면 무기염류, 당류, 유기염류, 아미노산, 펩티드, 단백질, 핵산 등을 들 수 있다.
입자 표면에는, 상기 제조 과정에서 사용되는 표면 개질제가 결합하고 있어도 좋다. 여기에서 말하는 결합이란 비공유 결합이어도 공유 결합이어도 좋다. 비공유 결합은, 바람직하게는 소수적인 상호 작용이지만, 이온 결합(정전 상호 작용), 수소 결합, 배위 결합, 반데르발스 결합, 물리 흡착이어도 좋고, 그들이 복합된 결합이어도 좋다.
상기 입자의 평균 입경은, 바람직하게는 0.1~50㎛이며, 보다 바람직하게는 0.1~25㎛, 더 바람직하게는 0.1~10㎛, 특히 바람직하게는 0.1~1㎛, 예를 들면 0.2~1㎛, 0.3~1㎛이다. 여기에서 말하는 평균 입경은, 동적 광 산란 장치(DLS: 예를 들면, Otsuka Electronics Co., Ltd., ELS-Z)를 사용해서 커뮬런트법에 의해 구할 수 있다.
본 발명에 있어서의 「면역원성 증강용 조성물」이란, 상기 양친매성 폴리머에 면역 활성화 인자가 결합한 수식형 양친매성 폴리머 및 항원을 포함하는 입자를 유효 성분으로서 포함하는, 생체 내에서 항원에 대한 면역 응답을 증강할 수 있는 조성물이다. 면역원성 증강용 조성물이 발생시키는 면역 응답의 종류는 한정되지 않는다. 발생시키는 면역 응답의 종류로서는 Th1형 면역 응답이나 Th2형 면역 응답이 있으며, 항원이나 면역 활성화 인자, 투여 부위, 투여 방법의 종류에 따라 어느 쪽의 면역 응답에 우위로 발생하는 것이 알려지지만, 본 발명은 Th1형, Th2형 양방의 타입의 면역 응답을 발생시킬 수 있다.
본 발명에 있어서의 「항원」이란, 생체 내에서 면역을 야기하는 물질이며, 질환의 치료 및/또는 예방을 목적으로 한 백신으로서 이용될 수 있는 것이다. 본 발명의 면역 활성화 인자가 결합한 수식형 양친매성 폴리머 및 항원을 포함하는 입자를 유효 성분으로 함으로써, 항원에 의해 야기되는 면역 응답을 강화할 수 있다.
항원의 예로서는 펩티드, 단백질, 당단백질, 당지질, 지질, 탄수화물, 핵산, 다당류 및 이들을 포함하는 바이러스, 균체, 알레르기 원인 물질, 조직, 세포 등을 들 수 있다. 구체적으로는 화분 유래 항원, A형 간염 바이러스 유래 항원, B형 간염 바이러스 유래 항원, C형 간염 바이러스 유래 항원, D형 간염 바이러스 유래 항원, E형 간염 바이러스 유래 항원, F형 간염 바이러스 유래 항원, HIV 바이러스 유래 항원, 인플루엔자 바이러스 유래 항원, 헤르페스 바이러스(HSV-1, HSV-2) 유래 항원, 탄저균 유래 항원, 클라디미아 유래 항원, 폐렴구균 유래 항원, 일본 뇌염 바이러스 유래 항원, 홍역 바이러스 유래 항원, 풍진 바이러스 유래 항원, 파상풍균 유래 항원, 수두 바이러스 유래 항원, SARS 바이러스 유래 항원, EB 바이러스 유래 항원, 파필로마 바이러스 유래 항원, 헬리코박터·파일로리(Helicobacterpylori)균 유래 항원, 광견병 바이러스 유래 항원, 웨스트나일 바이러스 유래 항원, 한타 바이러스 유래 항원, 연쇄 구균 유래 항원, 포도상 구균 유래 항원, 백일해균(Bordetellapertussis) 유래 항원, 결핵균(Mycobacteriumtuberculosis) 유래 항원, 말라리아 원충(Plasmodium) 유래 항원, 폴리오 바이러스 유래 항원, 각종 인축 공통 감염증 유래 항원, 각종 음식물 알레르기 유래 항원, 자기 항원 등을 들 수 있다.
그 외, 항원의 바람직한 예로서 암 항원을 들 수 있다. 암 항원이란, 암 세포에 특이적으로 발현하는 단백질로부터 유래되는 물질이며, 생체 밖으로부터 생체 내로 투여됨으로써 면역 응답에 의한 암의 치료 및/또는 예방의 효과를 나타내는 항원이다.
본 발명의 면역원성 증강용 조성물은 암, 감염증, 또는 알레르기 등의 질환의 치료 및/또는 예방을 위해 사용할 수 있다. 본 발명의 면역원성 증강용 조성물을 사용할 수 있는 암으로서는, 예를 들면 기저 세포암, 파제트병, 뇌종양, 방광암, 식도암, 백혈병, 림프종, 간장암, 담낭암, 육종, 비만 세포종, 부신 피질암, 유잉 종양, 호지킨 림프종, 중피종, 다발성 골수종, 갑상선암, 피부암(멜라노마 등), 폐암, 인두암, 위암, 췌장암, 대장암, 신장암, 방광암, 유방암, 자궁암, 난소암, 전립선암, 및 두경부암 등을 들 수 있다. 감염증으로서는 A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, D형 간염 바이러스, E형 간염 바이러스, F형 간염 바이러스, HIV 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 헤르페스 바이러스(HSV-1, HSV-2), 탄저균, 클라미디아, 폐렴 구균, 일본 뇌염 바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 파상풍균, 수두 바이러스, SARS 바이러스, EB 바이러스, 파필로마 바이러스, 헬리코박터·파일로리균, 광견병 바이러스, 웨스트나일 바이러스, 한타 바이러스, 연쇄 구균, 포도상 구균, 백일해균, 결핵균, 말라리아 원충, 또는 폴리오 바이러스 등에 의한 감염증을 들 수 있다. 알레르기로서는 화분 알레르기, 각종 음식물 알레르기, 및 자기 항원에 대한 알레르기 등을 들 수 있다.
본 발명의 면역원성 증강용 조성물은 항원으로서 암 항원을 사용할 경우, 암의 치료 및/또는 예방을 위한 백신의 유효 성분으로서 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 면역원성 증강용 조성물을 유효 성분으로서 함유하는 백신을 제공한다.
본 발명의 바람직한 양태에 의하면, 본 발명의 면역원성 증강용 조성물, 의약, 또는 백신을 (생체)피험체에게 투여하는 것을 포함하는 면역 활성화 방법(특히, 면역원성 증강 방법)이 제공된다. 또한, 본 발명의 면역원성 증강용 조성물, 의약, 또는 백신을 (생체)피험체에게 투여하는 것을 포함하는 암, 감염증, 또는 알레르기 등의 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 방법도 제공된다. 본 발명의 면역원성 증강용 조성물, 의약 또는 백신을 사용해서 면역 반응을 활성화시키는 방법, 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법에 대해서는 한정되지 않고, 면역원성 증강용 조성물, 의약, 또는 백신을 생체(피험체)에게 투여해도 좋고, 생체(피험체) 밖으로 적출한 면역 담당 세포에 접촉시켜도 좋다. 생체(피험체)에의 투여 방법에 특별히 한정은 없지만, 예를 들면 피하 투여, 피내 투여, 근육 내 투여, 경비 투여, 경폐 투여, 경구 투여, 경피 투여, 설하 투여, 질내 투여, 복강 내 투여, 림프절 투여 등이며, 바람직하게는 피내 투여 또는 피하 투여이다. 투여하는 생체(피험체)는 인간이어도 인간 이외의 동물이어도 좋지만, 바람직하게는 인간, 또는 가축, 애완 동물 또는 실험 동물로서 사육되고 있는 돼지, 소, 닭, 양, 말, 당나귀, 염소, 낙타, 개, 고양이, 페럿, 토끼, 원숭이, 래트, 마우스, 혹은 기니피그이다. 피험체는 암, 감염증, 또는 알레르기 등의 질환을 갖는 피험체이어도 좋고, 암, 감염증, 또는 알레르기 등의 질환을 갖지 않지만, 상기 질환을 발증하는 리스크가 높은 피험체이어도 좋다.
본 발명의 면역원성 증강용 조성물을 의약(백신을 포함한다)으로서 사용할 경우, 제제학적으로 유용한 각종 첨가제를 배합해서 제제화해도 좋고, 첨가제의 구체예로서는 완충제, 항산화제, 염, 폴리머 또는 당을 들 수 있다.
본 발명의 면역원성 증강용 조성물을 의약으로서 사용하는 경우의 입자의 투여량에 대해서는 투여 방법, 투여 회수에 따라 적당히 설정되지만, 예를 들면 인간에 대해서 본 발명의 면역원성 증강용 조성물을 피하 투여할 경우, 면역 활성화 인자가 결합한 입자의 양으로서 1회당 0.01~1,000㎎이 투여된다.
실시예
이하에 실시예를 나타내지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 한정되지 않는다.
(실시예 1) R848-덱스트란-PLGA의 합성
본 실시예에서는 덱스트란에 폴리(락트산-글리콜산)(poly(lactic-co-glycolic acid); PLGA)를 첨가해서 축합 반응을 행함으로써 직쇄상의 블록형 폴리머를 합성하고, 얻어진 양친매성 폴리머인 덱스트란-폴리(락트산-글리콜산)(덱스트란-PLGA)에, 면역 활성화 인자로서 이미다조퀴놀린류 화합물이며 TLR7/8 아고니스트로서 알려져 있는 레시퀴모드(Resiquimod(R848))를 공유 결합시켜 R848-덱스트란-폴리(락트산-글리콜산)(R848-덱스트란-PLGA)를 합성했다.
<환원 말단에 1급 아미노기를 갖는 덱스트란(덱스트란-NH2)의 합성>
농도 500㎎/2㎖의 덱스트란(수 평균 분자량 2,100, PHARMACOSMOS사)의 디메틸술폭시드 용액 중에 트리아세톡시수소화붕소나트륨(203.5㎎)과 N-Boc-에틸렌디아민(76.1㎕)을 투입한 후, 60℃에서 91시간 교반하면서 반응을 행했다. 이어서, 외액을 물로 하는 투석에 의해 미반응의 N-Boc-에틸렌디아민을 제거한 후, 동결 건조를 행하여 덱스트란-NHBoc를 합성했다. 얻어진 덱스트란-NHBoc(450㎎)의 Boc 말단기의 탈보호 반응(35% 염산 수용액(5㎖)/디메틸술폭시드(5㎖), 상온에서 35시간 교반)을 행한 후, 물 투석에 의해 정제하고, 동결 건조에 의해 폴리머 분말(덱스트란-NH2)을 회수했다.
덱스트란-NH2의 수 평균 분자량은 GPC 측정(컬럼: Tosoh Corporation제 TSK-gel α-5000×2, DMF계 용매, 검출기: RI, 표준품: 풀루란)에 의해 결정했다(표 1, 도 1: 덱스트란-NH2). 1H-NMR 측정에 의해 덱스트란의 환원 말단에 1급 아미노기가 도입된 것을 확인했다.
<덱스트란-PLGA의 합성>
헤테로 2관능성 말단기를 갖는 폴리(락트산-글리콜산)(COOH-PLGA-OH, FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, PLGA-5020, 수 평균 분자량 8,900)(350㎎)를 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염(EDC)(35.5㎎), N-히드록시숙신이미드(NHS)(21.3㎎)의 디메틸술폭시드(0.58㎖) 용액에 혼합시킨 후, 50℃에서 2시간 반응시켜서 편말단의 카르복실기를 활성 에스테르(NHS)화시켰다. 이 반응 용액에, 환원 말단에 1급 아미노기를 도입한 덱스트란(덱스트란-NH2, 수 평균 분자량 2,700)(100㎎)을 투입하고, NHS-PLGA-OH의 활성 에스테르(NHS)와 덱스트란-NH2의 1급 아미노기의 축합 반응을 110.5시간 행했다. 반응 후, 물 투석에 의해 미반응의 덱스트란-NH2를 제거한 후, 초원심 분리 정제에 의해 미반응의 NHS-PLGA-OH를 제거함으로써 양친매성 폴리머(1-1)를 얻었다.
덱스트란-PLGA의 수 평균 분자량은 GPC 측정(컬럼: Tosoh Corporation제 TSK-gel α-5000×2, DMF계 용매, 검출기: RI, 표준품: 풀루란)에 의해 결정했다(표 1, 도 2: 덱스트란-PLGA). 1H-NMR 측정에 의해 축합 반응이 진행된 것을 확인했다.
<덱스트란-PLGA에 대한 R848의 수식 반응>
(CASSPy-덱스트란-PLGA의 합성)
덱스트란-PLGA(100㎎)의 디메틸술폭시드(0.4㎖) 용액에 CDI(21.7㎎)의 디메틸술폭시드(0.1㎖) 용액을 적하한 후, 2,2'-디피리딜술피드에 시스테아민 염산염을 반응시킨 헤테로크로스링커(시스테아민 SS 피리딜; CASSPy)(4.9㎎)의 디메틸술폭시드(0.1㎖) 용액을 적하하고, 실온에서 2.5시간 교반했다. 반응액을 투석막에 넣어 디메틸술폭시드 투석, 이어서 물 투석을 행하고, 내용액을 원심 분리(9,000rpm, 4℃, 30분)해서 상청을 제거하고, 동결 건조해서 폴리머 분체를 얻었다.
CASSPy-덱스트란-PLGA의 수 평균 분자량은 GPC 측정(컬럼: Tosoh Corporation제 TSK-gel α-5000×2, DMF계 용매, 검출기: RI, 표준품: 풀루란)에 의해 결정했다. CASSPy 도입율(%)은 1H-NMR 측정에 의해 확인했다.
(SH-덱스트란-PLGA의 합성)
CASSPy-덱스트란-PLGA(108.8㎎)의 디메틸술폭시드(1.1㎖) 용액에 디술피드기(SS 결합)를 SH기로 환원시키는 시약으로서, 디티오트레이톨(DTT, 15.5㎎)의 디메틸술폭시드(0.05㎖) 용액을 투입한 후, 실온에서 4.5시간 반응시켰다. 이어서, 과잉량의 DTT를 제거하기 위한 정제법으로서 물 투석을 행한 후, 원심 분리(9000rpm, 30분, 4℃), 동결 건조에 의해 폴리머 분체를 회수했다. 1H-NMR 측정에 의해 피리딜이 탈보호되고, 티올기가 도입된 것을 확인했다.
(R848-덱스트란-PLGA의 합성)
SH-덱스트란-PLGA(40㎎)의 디메틸술폭시드(1㎖) 용액에 말레이미드기를 갖는 R848(Mal-R848; 레시퀴모드에 있는 3급 수산기에 2탄소 증탄해서 아미노기를 부착한 후, 숙신이미딜 4-(N-말레이미드메틸)시클로헥산-1-카르보킬레이트(SMCC)를 결합시킴으로써 합성된 레시퀴모드 유도체, NARD INSTITUTE, LTD.에 의해 의탁 합성)(0.008mmol)을 투입한 후, 실온에서 118시간 반응시켰다. 이어서, 미반응의 Mal-R848을 제거하기 위한 정제법으로서, 외액을 디메틸술폭시드 및 물로 하는 투석 정제를 순차로 행한 후 원심 분리(9000rpm, 30분, 4℃), 동결 건조에 의해 수식형 양친매성 폴리머(1-2)의 분체를 회수했다.
또한, 상기 덱스트란-NH2의 합성 방법에 준해서 수 평균 분자량 1,800의 덱스트란-NH2를 합성하고, 양친매성 폴리머(1-1)와 마찬가지의 합성 방법에 따라 덱스트란-NH2(수 평균 분자량 1,800)와 상기 PLGA-5020(수 평균 분자량 8,900)을 사용해서 양친매성 폴리머(2-1)를 얻은 후, 수식형 양친매성 폴리머(1-2)와 마찬가지의 합성 방법에 따라 수식형 양친매성 폴리머(2-2)를 얻었다. 각 폴리머의 평가 결과를 표 1에 나타낸다.
덱스트란-PLGA 및 R848-덱스트란-PLGA의 수 평균 분자량은 GPC 측정(컬럼: Tosoh Corporation제 TSK-gel α-5000×2, DMF계 용매, 검출기: RI, 표준품: 풀루란)에 의해 결정했다(표 1). R848-덱스트란-PLGA의 R848 도입율(%)은 1H-NMR 측정에 의해 확인했다(표 1, 도 3: R848-덱스트란-PLGA).
(실시예 2) R848-흑효모 글루칸-PLGA의 합성
본 실시예에서는, 흑효모 글루칸에 폴리(락트산-글리콜산)(PLGA)를 첨가해서 축합 반응을 행함으로써 직쇄상의 블록형 폴리머를 합성하고, 얻어진 양친매성 폴리머인 흑효모 글루칸-폴리(락트산-글리콜산)(흑효모 글루칸-PLGA)에 면역 활성화 인자로서 R848을 공유 결합시킨 R848-흑효모 글루칸-폴리(락트산-글리콜산)(R848-흑효모 글루칸-PLGA)를 합성했다.
<환원 말단에 1급 아미노기를 갖는 흑효모 글루칸(흑효모 글루칸-NH2)의 합성>
흑효모 글루칸(Daiso Industries Co., Ltd.) 5g을 디메틸술폭시드 150㎖에 용해한 후 35% 염산 수용액 5㎖를 첨가하고, 105℃에서 20분 교반했다. 상기 반응 용액을 투석막으로 옮기고, 수중에서 투석을 행한 후에 동결 건조를 행하여 흑효모 글루칸 가수 분해물(수 평균 분자량 2,400)을 분말로서 얻었다.
농도 2.5g/8㎖의 흑효모 글루칸 가수 분해물(수 평균 분자량 2,400)의 디메틸술폭시드 용액 중에 트리아세톡시수소화붕소나트륨(413.3㎎)과 N-Boc-에틸렌디아민(246.9㎕)을 투입한 후, 55℃에서 169.5시간 교반하면서 반응을 행했다. 이어서, 외액을 물로 하는 투석에 의해 미반응의 N-Boc-에틸렌디아민을 제거한 후, 흑효모 글루칸-NHBoc를 얻었다. 이어서, 흑효모 글루칸-NHBoc(1.19g)의 Boc 말단기의 탈보호 반응(35% 염산 수용액(14.3㎖)/디메틸술폭시드(24㎖), 상온에서 2시간 교반)을 행한 후 물 투석에 의해 정제하고, 동결 건조에 의해 폴리머 분말(흑효모 글루칸-NH2)을 회수했다.
흑효모 글루칸-NH2의 수 평균 분자량은 GPC 측정(컬럼: Tosoh Corporation제 TSK-gel α-5000×2, DMF계 용매, 검출기: RI, 표준품: 풀루란)에 의해 결정했다(표 1, 도 4: 흑효모 글루칸-NH2). 1H-NMR 측정에 의해 흑효모 글루칸의 환원 말단에 1급 아미노기가 도입된 것을 확인했다.
<흑효모 글루칸-PLGA의 합성>
헤테로 2관능성 말단기를 갖는 폴리(락트산-글리콜산)(COOH-PLGA-OH, FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, PLGA- 5020, 수 평균 분자량 8,900)(4.462g)를 EDC(479.25㎎), NHS(287.73㎎)의 디메틸술폭시드(2.5㎖) 용액에 혼합시킨 후, 50℃에서 약 18시간 반응시켜서 α 말단의 카르복실기를 활성 에스테르(NHS)화시켰다. 이 반응 용액에 ω 말단에 1급 아미노기를 갖는 흑효모 글루칸(흑효모 글루칸-NH2, 수 평균 분자량 1,500)(749㎎)을 투입하고, NHS-PLGA-OH의 활성 에스테르(NHS)와 흑효모 글루칸-NH2의 1급 아미노기의 축합 반응(270.5시간)을 행했다. 반응 후, 물 투석에 의해 미반응의 흑효모 글루칸-NH2를 제거한 후, 초원심 분리 정제에 의해 미반응의 NHS-PLGA-OH를 제거함으로써 비수식형 양친매성 폴리머(3-1)를 얻었다.
흑효모 글루칸-PLGA의 수 평균 분자량은 GPC 측정(컬럼: Tosoh Corporation제 TSK-gel α-5000×2, DMF계 용매, 검출기: RI, 표준품: 풀루란)에 의해 결정했다(표 1, 도 5: 흑효모 글루칸-PLGA). 1H-NMR 측정에 의해 축합 반응이 진행된 것을 확인했다.
<흑효모 글루칸-PLGA에 대한 R848의 수식 반응>
(CASSPy-흑효모 글루칸-PLGA의 합성)
흑효모 글루칸-PLGA(폴리머(3-1), 200㎎)의 디메틸술폭시드(0.5㎖) 용액에 CDI(26㎎)의 디메틸술폭시드(0.1㎖) 용액을 적하하고, 실온에서 22시간 교반했다. 이어서, 2,2'-디피리딜술피드에 시스테아민 염산염을 반응시킨 헤테로크로스링커(시스테아민 SS 피리딜; CASSPy)(29.1㎎)의 디메틸술폭시드(0.15㎖) 용액을 적하하고, 실온에서 65.5시간 교반했다. 반응액을 투석막에 넣어 디메틸술폭시드 투석, 이어서 물 투석을 행하고, 내용액을 원심 분리(9,000rpm, 4℃, 30분)해서 상청을 제거하고, 동결 건조에 의해 폴리머 분체를 얻었다.
CASSPy-흑효모 글루칸-PLGA의 수 평균 분자량은 GPC 측정(컬럼: Tosoh Corporation제 TSK-gel α-5000×2, DMF계 용매, 검출기: RI, 표준품: 풀루란)에 의해 결정했다. CASSPy 도입율(%)은 1H-NMR 측정에 의해 확인했다.
(SH-흑효모 글루칸-PLGA의 합성)
CASSPy-흑효모 글루칸-PLGA(150㎎)의 디메틸술폭시드(1㎖) 용액에, 디술피드기(SS 결합)를 SH기로 환원시키는 시약으로서 디티오트레이톨(DTT, 40㎎)의 디메틸술폭시드(0.1㎖) 용액을 투입한 후, 실온에서 4시간 반응시켰다. 이어서, 과잉량의 DTT를 제거하기 위한 정제법으로서 물 투석을 행한 후 원심 분리(9000rpm, 30분, 4℃), 동결 건조에 의해 폴리머 분체를 회수했다. 1H-NMR 측정에 의해 피리딜이 탈보호되고, 티올기가 도입된 것을 확인했다.
(R848-흑효모 글루칸-PLGA의 합성)
SH-흑효모 글루칸-PLGA(109.5㎎)의 디메틸술폭시드(0.75㎖) 용액에, 말레이미드기를 갖는 R848(Mal-R848, NARD INSTITUTE, LTD.에 의해 의탁 합성)(0.024mmol)을 투입한 후, 실온에서 약 69시간 반응시켰다. 이어서, 미반응의 Mal-R848을 제거하기 위한 정제법으로서, 외액을 디메틸술폭시드 및 물로 하는 투석 정제를 순차로 행한 후 원심 분리(9000rpm, 30분, 4℃), 동결 건조에 의해 수식형 양친매성 폴리머(3-2)의 분체를 회수했다.
R848-흑효모 글루칸-PLGA의 수 평균 분자량은 GPC 측정(컬럼: Tosoh Corporation제 TSK-gel α-5000×2, DMF계 용매, 검출기: RI, 표준품: 풀루란)에 의해 결정했다(표 1). R848-흑효모 글루칸-PLGA의 R848 도입율(%)은 1H-NMR 측정에 의해 확인했다(표 1, 도 6: R848-흑효모 글루칸-PLGA).
양친매성 폴리머 1분자에의 R848 수식량이 상이한 수식형 양친매성 폴리머에 대해서는, 마찬가지의 방법으로 다당 주쇄의 수산기에의 CASSPy의 도입량을 정량적으로 제어함으로써 합성했다. 예를 들면, 수식형 양친매성 폴리머(3-2) 1분자에의 R848 수식량이 1.5분자인 것에 비해, 동일한 양친매성 폴리머(3-1)를 사용해서 CASSPy의 도입량을 높게 제어함으로써 수식형 양친매성 폴리머(3-4)를 얻고, CASSPy의 도입량을 낮게 제어함으로써 수식형 양친매성 폴리머(3-3)를 얻었다.
또한, 상기 흑효모 글루칸-NH2의 합성 방법에 준해서 수 평균 분자량 1,200 및 2,300의 흑효모 글루칸-NH2, 및 수 평균 분자량 3,500의 커들란-NH2를 합성하고, 양친매성 폴리머(3-1) 및 수식형 양친매성 폴리머(3-2)와 마찬가지의 합성 방법에 따라, 흑효모 글루칸-NH2(수 평균 분자량 1,200)와 PLGA-5020(수 평균 분자량 8,900)을 사용해서 양친매성 폴리머(4-1) 및 수식형 양친매성 폴리머(4-2), 흑효모 글루칸-NH2(수 평균 분자량 2,300)와 PLGA-5020(수 평균 분자량 8,900)을 사용해서 양친매성 폴리머(5-1), 커들란-NH2(수 평균 분자량 3,500)와 PLGA-5020(수 평균 분자량 8,900)을 사용해서 양친매성 폴리머(6-1) 및 수식형 양친매성 폴리머(6-2)를 얻었다. 각 폴리머의 평가 결과를 표 1에 나타낸다.
(실시예 3) S/O/W 에멀션법을 사용한 입자(OVA 함유 R848 수식 덱스트란-PLGA 입자(1), OVA 함유 R848 수식 흑효모 글루칸-PLGA 입자(2)~(9), OVA 함유 R848 수식 커들란-PLGA 입자(10), 비교 입자: OVA 함유 덱스트란-PLGA 입자(11), OVA 함유 흑효모 글루칸-PLGA 입자(12))의 조제
<OVA 함유 R848 수식 덱스트란-PLGA 입자의 조제>
R848-덱스트란-PLGA(표 1, 양친매성 폴리머(1-2))(6㎎) 및 덱스트란-PLGA(표 1, 양친매성 폴리머(1-1))(24㎎)의 폴리머 혼합 분체(30㎎)를 탄산 디메틸 1.2㎖ 및 tert-부탄올 133㎕에 용해하여 폴리머 용액을 조제했다. 상기 폴리머 용액에 0.5%(w/v) OVA(난백 알부민, Sigma사) 수용액 0.3㎖를 적하하고, 믹서(Polytron사, PT2100S)를 사용한 11,000rpm, 1분간의 교반에 의해 W/O 에멀션 용액을 제조했다. 상기 W/O 에멀션 용액을 액체 질소로 예비 동결한 후, 동결 건조기(TOKYO RIKAKIKAI CO., LTD., FD-1000)를 사용해서 트랩 냉각 온도 -45℃, 진공도 20㎩로 4시간 동결 건조했다. 얻어진 고형분을 아세트산 에틸 3㎖에 분산시켜서 S/O 서스펜션 용액을 조제했다. 상기 S/O 서스펜션 용액을 1%(w/v) 폴리비닐알코올 수용액 12㎖에 적하하고, 믹서(Silverson사, L5M-A)를 사용한 5,000rpm, 3분간의 교반에 의해 S/O/W형 에멀션 용액을 조제했다. 상기 S/O/W형 에멀션 용액으로부터 액중 건조에 의해 아세트산 에틸을 제거하고, 입자 현탁액으로 했다. 상기 현탁액을 50㎖ 튜브로 옮기고, 3,000g, 30분간의 원심 분리에 의해 입자를 침전시켰다. 상청을 제거한 후에 입자를 50㎖의 증류수에 재현탁하고, 상기 조건에서의 원심 분리에 의해 입자를 다시 침전시킴으로써 세정했다. 이 세정 조작을 다시 한번 반복하고, 상청을 제거한 후에 입자를 5%(w/v) 만니톨 및 0.1%(w/v) 폴리소르베이트 80을 포함하는 수용액 2.4㎖에 현탁시켰다. 메시 필터(1㎛)로 여과하고, 상기 현탁액을 액체 질소로 예비 동결한 후, 동결 건조기를 사용해서 트랩 냉각 온도 -45℃, 진공도 20㎩에 의해 12시간 동결 건조함으로써 OVA 함유 R848 수식 덱스트란-PLGA 입자(1)를 얻었다.
<OVA 함유 R848 수식 흑효모 글루칸-PLGA 입자의 조제>
R848-흑효모 글루칸-PLGA(표 1, 수식형 양친매성 폴리머(3-2))(10㎎) 및 흑효모 글루칸-PLGA(표 1, 비수식형 양친매성 폴리머(3-1))(40㎎)의 폴리머 혼합 분체(50㎎)를 탄산 디메틸 0.9㎖ 및 tert-부탄올 100㎕의 혼합 용액에 용해하여 폴리머 용액을 조제했다. 상기 폴리머 용액에 0.5%(w/v) OVA(난백 알부민, Sigma사)) 수용액 0.5㎖를 적하하고, 믹서(Polytron사, PT2100S)를 사용한 11,000rpm, 1분간의 교반에 의해 W/O 에멀션 용액을 제조했다. 상기 W/O 에멀션 용액을 액체 질소로 예비 동결한 후, 동결 건조기(TOKYO RIKAKIKAI CO., LTD., FD-1000)를 사용해서 트랩 냉각 온도 -45℃, 진공도 20㎩로 12시간 동결 건조했다. 얻어진 고형분을 아세트산 에틸 5㎖에 분산시켜서 S/O 서스펜션 용액을 조제했다. 상기 S/O 서스펜션 용액을 1%(w/v) 폴리비닐알코올 수용액 20㎖에 적하하고, 믹서(Silverson사, L5M-A)를 사용한 6,000rpm, 5분간의 교반에 의해 S/O/W형 에멀션 용액을 조제했다. 상기 S/O/W형 에멀션 용액으로부터 액중 건조에 의해 아세트산 에틸을 제거하고, 입자 현탁액으로 했다. 상기 현탁액을 50㎖ 튜브로 옮기고, 8,000rpm, 10분간의 원심 분리에 의해 입자를 침전시켰다. 상청을 제거한 후에 입자를 25㎖의 증류수에 재현탁하고, 상기 조건에서의 원심 분리에 의해 입자를 다시 침전시킴으로써 세정했다. 이 세정 조작을 다시 한번 반복하고, 상청을 제거한 후에 입자를 5%(w/v) 만니톨 및 0.1%(w/v) 폴리소르베이트 80을 포함하는 수용액 4㎖에 현탁시켰다. 상기 현탁액을 액체 질소로 예비 동결한 후, 동결 건조기를 사용해서 트랩 냉각 온도 -45℃, 진공도 20㎩에 의해 12시간 동결 건조함으로써 OVA 함유 R848 수식 흑효모 글루칸-PLGA 입자(2)를 얻었다. 마찬가지의 방법으로, R848-흑효모 글루칸-PLGA 및 흑효모 글루칸-PLGA(표 1, 양친매성 폴리머(3-1)~(3-4),(4-1),(4-2))를 다양한 비율로 기재로 한 OVA 함유 R848 수식 흑효모 글루칸-PLGA 입자(3)~(9)를 얻었다.
<OVA 함유 R848 수식 커들란-PLGA 입자의 조제>
R848-커들란-PLGA(표 1, 수식형 양친매성 폴리머(6-2)) 및 커들란-PLGA(표 1, 비수식형 양친매성 폴리머(6-1))의 폴리머 혼합 분체를 사용해서, 상기와 마찬가지의 방법으로 OVA 함유 R848 수식 커들란-PLGA 입자(10)를 얻었다.
<비교 입자: OVA 함유 덱스트란-PLGA 입자, OVA 함유 흑효모 글루칸-PLGA 입자의 조제>
덱스트란-PLGA(표 1, 비수식형 양친매성 폴리머(1-1))의 폴리머 단독 분체를 사용해서, 상기와 마찬가지의 방법으로 OVA 함유 덱스트란-PLGA 입자(11)를 얻었다.
흑효모 글루칸-PLGA(표 1, 비수식형 양친매성 폴리머(3-1))의 폴리머 단독 분체를 사용해서, 상기와 마찬가지의 방법으로 OVA 함유 흑효모 글루칸-PLGA 입자(12)를 얻었다.
각 입자의 평가 결과를 표 2에 나타낸다. 입자의 평균 입경은, 동적 광 산란 장치(Otsuka Electronics Co., Ltd., ELS-Z)를 사용해서 커뮬런트법에 의해 산출했다(표 2, 도 7: OVA 함유 R848 수식 덱스트란-PLGA 입자, 도 8: OVA 함유 R848 수식 흑효모 글루칸-PLGA 입자). OVA 항원의 함유율(w/w)은, 입자로부터 유기 용매를 사용해서 항원을 추출하고, 추출한 항원을 겔 전기영동 장치(TEFCO사)로 겔 전기영동 후에, 콜로이드 CBB 염색 키트(TEFCO사)를 사용해서 염색을 행함으로써 결정했다.
(실시예 4) S/O/W 에멀션법을 사용한 입자(TRP2 함유 R848 수식 흑효모 글루칸-PLGA 입자(13)~입자(16), 비교 입자: TRP2 함유 흑효모 글루칸-PLGA 입자(17))의 조제
암 항원으로서, 특히 멜라노마 항원으로서 알려져 있는 티로시나아제 관련 단백질 2(TRP2)의 에피토프 펩티드, 구체적으로는 인간 유래 TRP2 아미노산 서열(UniProt 액세션 번호: P40126) 및 마우스 유래 TRP2 아미노산 서열(UniProt 액세션 번호: P29812)에 있어서의 공통 에피토프 펩티드인, 이들 아미노산 서열의 서열 번호 180~188번째의 영역의 폴리펩티드를 사용해서 이하의 입자를 제작했다.
<TRP2 함유 R848 수식 흑효모 글루칸-PLGA 입자의 조제>
R848-흑효모 글루칸-PLGA(표 1, 수식형 양친매성 폴리머(4-2)) 및 흑효모 글루칸-PLGA(표 1, 비수식형 양친매성 폴리머(4-1))의 폴리머 혼합 분체(100㎎)에 탄산 디메틸(20％ t-부탄올, 0.05％ span80을 포함한다) 4㎖를 첨가하고, 소형 믹서(11,000, 1분)에 의해 용해시켰다. 얻어진 폴리머 용액에 상기 TRP2 에피토프 펩티드(Greiner사)를 용해한 아세토니트릴 수용액(75%, 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA); TRP2 펩티드: 1㎎/㎖) 1㎖, 이어서 증류수 1㎖를 첨가하고, 소형 믹서(19,000rpm, 1분)에 의해 유화시켰다. 유화액을 동결 건조하고, 얻어진 분체에 대해서 아세트산 에틸 10㎖를 첨가해서 스터러 교반(300rpm, 1분)에 의해 분산시킨 후, 폴리비닐알코올(PVA) 수용액(The Nippon Synthetic Chemical Industry Co., Ltd., 1％ EG-05P) 40㎖를 첨가하고, 스터러 교반(500rpm, 1분)에 의해 조(粗)유화시켰다. 이 액을 추가로 믹서(5,000rpm, 10분)에 의해 교반하여 유화시켰다. 이어서, 탈기를 위해 스터러 교반(100rpm, 10분)한 후, 이배퍼레이터로 유기 용매를 제거했다. 잔존액을 셀 스트레이너(40㎛)로 여과하고, 30분 빙냉한 후 원심 분리(3,000g, 4℃, 30분)해서 상청을 제거했다. 또한, 0.1％ Tween80 수용액 50㎖를 첨가해서 보텍스에 의해 분산시킨 후 원심 분리(4,000g, 4℃, 30분)하고, 상청을 제거했다. 여기에 부형제로서 만니톨 수용액(5% 만니톨, 0.1％ PVA 수용액) 8㎖를 첨가해서 보텍스에 의해 분산시키고, 메시 필터(1㎛)를 사용해서 감압 여과하고, 하룻밤 동결 건조해서 TRP2 함유 R848 수식 흑효모 글루칸-PLGA 입자(14)를 얻었다. R848 수식 흑효모 글루칸-PLGA(표 1, 양친매성 폴리머 4-2) 및 흑효모 글루칸-PLGA(표 1, 양친매성 폴리머 4-1)를 상이한 중량 비율로 사용한 점을 제외하고, 마찬가지의 방법으로 TRP2 함유 R848 수식 흑효모 글루칸-PLGA 입자(13), (15), (16)를 얻었다.
<비교 입자: TRP2 함유 흑효모 글루칸-PLGA 입자의 조제>
흑효모 글루칸-PLGA(표 1, 비수식형 양친매성 폴리머(5-1))의 폴리머 단독 분체를 사용해서, 상기와 마찬가지의 방법으로 TRP2 함유 흑효모 글루칸-PLGA 입자(17)를 얻었다.
각 입자의 평가 결과를 표 3에 나타낸다. 입자의 평균 입경은, 동적 광 산란 장치(Otsuka Electronics Co., Ltd., ELS-Z)를 사용해서 커뮬런트법에 의해 산출했다(표 3, 도 9: TRP2 함유 R848 수식 흑효모 글루칸-PLGA 입자).
TRP2 펩티드(항원)의 함유율(w/w)은 HPLC에 의해 평가했다. 입자 분말 5㎎에 아세톤 1㎖를 첨가하고, 보텍스 30초, 초음파 처리 5분에 의해 분산시키고, 원심 분리(13,000rpm, 4℃, 5분) 후에 상청을 제거했다. 또한, 침전물에 대해서 아세톤 1㎖를 첨가하고, 보텍스 30초에 의해 분산시키고, 원심 분리(13,000rpm, 4℃, 5분) 후에 상청을 제거했다(합계 2회). 원심 이배퍼레이터에 의해 30℃에서 30분 건조시켰다. 건조 후의 추출 성분에 50% 아세토니트릴 수용액(0,1％ TFA 함유)을 200㎕ 첨가하고, 보텍스 3초, 초음파 처리 5분에 의해 용해시켰다. 여기에 내부 표준으로서 아세틸화트립토판(1% 디메틸술폭시드, 0.1％ TFA 수용액 중; 10㎍/㎖)을 20㎕ 첨가하고, 원심 분리(13,000rpm, 4℃, 5분) 후에 상청을 회수했다. 상청을 HPLC(SHIMADZU CORPORATION제 SCL-10A, 컬럼: YMC-pack ODS-AM[AM12S05-1506WT])에 주입하고, 용리액의 아세토니트릴 농도를 서서히 상승시키는 형태로 그라디언트 용리를 행했다. 검출은 자외 가시 흡수(220nm)에 의해 행하고, 내부 표준의 피크 면적에 대한 펩티드의 피크 면적의 비를 산출했다. 상기와 마찬가지의 처리를 실시한 TRP2 펩티드+만니톨 분말의 시료 측정 결과를 함유율 100%의 기준으로서 사용해서, TRP2 펩티드 항원의 함유율을 구했다.
(참고예 1) 마우스 골수 유래 수지상 세포의 유도
C57BL/6 마우스 메스(Japan SLC, Inc.제)를 경추 탈구에 의해 안락사시킨 후, 대퇴골을 제재했다. 대퇴골의 양단을 가위로 절단하고, 대퇴골의 내부에 주사기를 사용해서 10% 소 태아 혈청(FBS, Sigma사), 100단위/㎖ 페니실린, 100㎍/㎖ 스트렙토마이신(NACALAI TESQUE, INC.)을 포함하는 RPMI1640 배지(이하, RPMI 배지)를 주입하고, 골수 세포를 회수했다. 410g, 5분간의 원심 분리에 의해 세포를 침전시키고, 상청을 제거했다. 회수한 세포는 용혈용 버퍼(BD Bioscience사) 1㎖에 현탁시킨 후에, 실온에서 5분간 정치함으로써 용혈시켰다. 용혈 후의 세포 현탁액에 RPMI 배지 10㎖를 첨가하고, 1,500rpm, 5분간의 원심 분리에 의해 세포를 침전시키고, 상청을 제거했다. 세포는 GM-CSF를 포함하는 RPMI 배지(이하, 배양 배지)에 현탁시킨 후에 6웰 플레이트(Corning사, Flat Bottom Tissue culture Treated, Polystyrene)에 파종했다. 파종한 플레이트는 5％ CO2, 37℃, 습도 100%의 조건으로 설정한 CO2 인큐베이터(PHC사) 내에서 배양했다. 배양 2일째 및 5일째에 배양 배지의 교환을 행하고, 배양 6일째에 부유 세포를 흡인 후, 마이크로 피펫을 사용해서 강하게 현탁함으로써 플레이트에 가볍게 접착된 세포, 즉 유도된 수지상 세포만을 회수했다. 회수된 수지상 세포는 "CELLBANKER2"(NIPPON ZENYAKU KOGYO CO., LTD.) 중에 현탁하고, 사용할 때까지 -150℃에서 보존했다.
(실시예 5) 마우스 골수 유래 수지상 세포(BMDC)를 사용한 in ⅵtro 자극 시험(TRP2 함유 R848 수식 흑효모 글루칸-PLGA 입자(14))
<방법>
참고예 1에서 얻어진 수지상 세포를 배양 배지와 함께 1웰당 1×105개가 되도록 96웰 플레이트에 파종하고, 또한 실시예 4에서 얻어진 TRP2 함유 R848 수식 흑효모 글루칸-PLGA 입자(14)를 0.1㎎/㎖가 되도록 첨가했다. 파종한 플레이트는 CO2 인큐베이터 내에서 18시간 배양하고, 상청을 회수했다. 상청 중의 TNF-α양에 대해서, "Mouse TNF-α ELISA developing kit"(MABTECH사제)를 사용해서 부속의 프로토콜에 따라 측정했다. 비교예로서 0.1㎍/㎖ LPS(포지티브 컨트롤), 항원(TRP2 펩티드), 0.1㎎/㎖ TRP2 함유 흑효모 글루칸-PLGA 입자(17), 0.1㎎/㎖ TRP2 함유 흑효모 글루칸-PLGA 입자(17)와 R848의 혼합물을 사용했다. 또한, 비교예의 항원 및 R848에 대해서는, 0.1㎎/㎖ TRP2 함유 R848 수식 흑효모 글루칸-PLGA 입자(14) 중의 함유량과 동량이 되도록 첨가했다.
<결과>
상청 중의 TNF-α양을 도 10에 나타낸다. TRP2 함유 R848 수식 흑효모 글루칸-PLGA 입자(14)를 사용한 경우, TRP2 함유 흑효모 글루칸-PLGA 입자(17), TRP2 함유 흑효모 글루칸-PLGA 입자(17)와 R848의 혼합물과 비교해서 TNF-α의 산생량이 높은 점에서, R848을 TRP2 함유 흑효모 글루칸-PLGA 입자에 결합시킴으로써, 보다 강하게 수지상 세포를 활성화하는 것이 명백하게 되었다.
(실시예 6) 마우스 골수 유래 수지상 세포(BMDC)를 사용한 in ⅵtro 자극 시험 2(OVA 함유 R848 수식 덱스트란-PLGA 입자(1), OVA 함유 R848 수식 흑효모 글루칸-PLGA 입자(2))
<방법>
참고예 1에서 얻어진 수지상 세포를 배양 배지와 함께 1웰당 2×105개가 되도록 48웰 플레이트에 파종하고, 또한 실시예 3에서 얻어진 OVA 함유 R848 수식 흑효모 글루칸-PLGA 입자(2), OVA 함유 R848 수식 덱스트란-PLGA 입자(1)를 각각 0.1㎎/㎖가 되도록 첨가했다. 비교예로서, 입자와 동량의 OVA만을 첨가한 군을 설정했다. 그 후, 세포를 CO2 인큐베이터 내에서 18시간 배양하고, 상청을 제거한 후, 0.5mM EDTA를 첨가해서 5분 처리하여 세포를 박리하고, 마이크로 피펫을 사용해서 세포를 회수했다. 회수한 세포 현탁액을, 1％ FBS를 포함하는 인산 완충 용액 중으로 치환하고, APC 표식 항CD86 항체, FITC 표식 항CD11c 항체 및 APC-Cy7 표식 항MHCII 항체(어느 것이나 BD Bioscience사제)를 첨가하고, 4℃에서 30분간 정치함으로써 항체 표식 반응을 행했다. 항체 표식 반응 종료 후, 플로우 사이토메트리에 의해 수지상 세포(CD11c 양성 MHCII 양성 세포)의 활성화 마커(CD86)의 발현량을 형광 강도의 평균값(MFI)에 의해 평가했다. 비교예로서 OVA만(네거티브 컨트롤)을 동 농도가 되도록 첨가하고, 마찬가지로 활성화 마커의 발현량을 비교했다.
<결과>
CD86의 발현량의 지표인 MFI를 해석한 결과, OVA 함유 R848 수식 흑효모 글루칸-PLGA 입자(2)는 OVA만의 군과 비교해서 2.39배 높은 발현 강도를 나타냈다. 또한, OVA 함유 R848 수식 덱스트란-PLGA 입자(1)는 OVA만의 군과 비교해서 3.11배 높은 형광 강도를 나타냈다. 즉, 흑효모 글루칸-PLGA 입자와 마찬가지로, 덱스트란-PLGA 입자도 R848의 결합에 의해 현저하게 높은 수지상 세포 활성화능을 갖는 것이 명백하게 되었다.
(실시예 7) 마우스 골수 유래 수지상 세포(BMDC)를 사용한 in ⅵtro 자극 시험 3(OVA 함유 R848 수식 흑효모 글루칸-PLGA 입자(5), (7), (8), (9))
<방법>
실시예 3에서 얻어진 OVA 함유 R848 수식 흑효모 글루칸-PLGA 입자(5), (7), (8), (9)에 대해서, 참고예 1에서 얻어진 수지상 세포를 사용하고, 실시예 6과 마찬가지의 방법을 사용해서 평가를 행했다. OVA 함유 R848 수식 흑효모 글루칸-PLGA 입자(5), (7), (8), (9)는 0.1㎎/㎖가 되도록 첨가하고, 비교예로서 OVA만(네거티브 컨트롤)을 동 농도가 되도록 첨가했다.
<결과>
실시예 6과 마찬가지로 CD86의 발현량의 지표인 MFI를 해석한 결과, OVA 함유 R848 수식 흑효모 글루칸-PLGA 입자(5), (7), (8), (9)는 비교예인 OVA만의 군과 비교해서 각각 4.50배, 5.77배, 5.55배, 5.35배 높은 형광 강도를 나타냈다. 즉, 수식형 양친매성 폴리머 중량과 비수식형 양친매성 폴리머 중량의 합계에 대한 수식형 양친매성 폴리머 중량의 비율은 10~100% 중 어느 것이어도, 동 정도로 높은 수지상 세포 활성화능을 갖는 것이 명백하게 되었다.
본 발명의 면역원성 증강용 조성물은 의약으로서, 특히 감염증이나 암 등의 치료 및/또는 예방을 위한 백신으로서 이용할 수 있다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원은 그대로 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 것으로 한다.
Claims (19)
- 소수성 세그먼트가 폴리(히드록시산)이며, 친수성 세그먼트가 다당인, 면역 활성화 인자가 결합한 양친매성 폴리머인, 수식형 양친매성 폴리머 및 항원을 포함하는 입자를 유효 성분으로서 함유하는 면역원성 증강용 조성물.
- 제 1 항에 있어서,
상기 입자를 구성하는 항원 이외의 성분으로서 지질을 포함하지 않는 면역원성 증강용 조성물. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 입자가, 소수성 세그먼트가 폴리(히드록시산)이며, 친수성 세그먼트가 다당인, 면역 활성화 인자가 결합하고 있지 않은 양친매성 폴리머인, 비수식형 양친매성 폴리머를 더 포함하는 면역원성 증강용 조성물. - 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 다당이 덱스트란, β-글루칸, 만난, 키틴, 키토산, 젤란검, 알긴산, 히알루론산 또는 풀루란인 면역원성 증강용 조성물. - 제 4 항에 있어서,
상기 β-글루칸이 1개 이상의 β-1,3 결합 및/또는 1개 이상의 β-1,6 결합으로 연결된 글루코오스의 중합체인 면역원성 증강용 조성물. - 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서,
상기 β-글루칸이 흑효모 글루칸, 커들란, 파키만, 라미나란, 리케난, 시조피란, 렌티난, 스클레로글루칸 또는 파키마란인 면역원성 증강용 조성물. - 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리(히드록시산)이 폴리(락트산-글리콜산), 폴리락트산 또는 폴리글리콜산인 면역원성 증강용 조성물. - 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 수식형 양친매성 폴리머에 있어서의 상기 양친매성 폴리머와 상기 면역 활성화 인자의 결합이 공유 결합인 면역원성 증강용 조성물. - 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 수식형 양친매성 폴리머에 있어서의 상기 면역 활성화 인자의 결합 부위가 상기 친수성 세그먼트인 면역원성 증강용 조성물. - 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 면역 활성화 인자가 Toll 유사 수용체(TLR), NOD 유사 수용체(NLR), RIG 유사 수용체 또는 C형 렉틴 수용체(CLR) 또는 인터페론 유전자 자극 인자(STING)에 결합하는 리간드 또는 아고니스트인 면역원성 증강용 조성물. - 제 10 항에 있어서,
상기 Toll 유사 수용체(TLR)에 결합하는 리간드 또는 아고니스트가 TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8, TLR9 또는 TLR11에 결합하는 리간드 또는 아고니스트인 면역원성 증강용 조성물. - 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서,
상기 Toll 유사 수용체(TLR)에 결합하는 리간드 또는 아고니스트가 이하의 (i) 내지 (ⅶ) 중 어느 하나인 면역원성 증강용 조성물.
(ⅰ) 펩티드글리칸, 리포단백질, 리포폴리사카라이드 및 치모산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 TLR2에 결합하는 리간드 또는 아고니스트
(ⅱ) Poly(I:C) 및 poly(A:U)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 TLR3에 결합하는 리간드 또는 아고니스트
(ⅲ) 리포폴리사카라이드(LPS), HSP60, RS09 및 MPLA로 이루어지는 군으로부터 선택되는 TLR4에 결합하는 리간드 또는 아고니스트
(ⅳ) TLR5에 결합하는 리간드 또는 아고니스트인 플라젤린
(ⅴ) 이미다조퀴놀린류 화합물 및 단일 가닥 RNA로 이루어지는 군으로부터 선택되는 TLR7 또는 8에 결합하는 리간드 또는 아고니스트
(ⅵ) 박테리아 DNA, 비메틸화 CpG DNA, 헤모조인, ODN1585, ODN1668 및 ODN1826으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 TLR9에 결합하는 리간드 또는 아고니스트
(ⅶ) 프로필린 및 요로 병원성 박테리아로 이루어지는 군으로부터 선택되는 TLR11에 결합하는 리간드 또는 아고니스트 - 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 수식형 양친매성 폴리머 1분자에 결합하는 상기 면역 활성화 인자의 분자수가 1~100인 면역원성 증강용 조성물. - 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 입자의 평균 입경이 0.1~50㎛인 면역원성 증강용 조성물. - 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 기재된 면역원성 증강용 조성물을 유효 성분으로서 함유하는 의약.
- 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 기재된 면역원성 증강용 조성물을 유효 성분으로서 함유하는 백신.
- 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 기재된 면역원성 증강용 조성물을 유효 성분으로서 함유하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 백신.
- 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 기재된 면역 증강용 조성물을 피험체에게 투여하는 것을 포함하는 면역원성 증강 방법.
- 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 기재된 면역원성 증강용 조성물, 제 15 항에 기재된 의약, 또는 제 16 항 혹은 제 17 항에 기재된 백신을 피험체에게 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 방법.
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