CN117813112A - 免疫原性增强用组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及免疫原性增强用组合物,含有包含修饰型两亲性聚合物和抗原的颗粒作为有效成分,所述修饰型两亲性聚合物是结合有免疫激活因子的两亲性聚合物,其中,疏水性链段是聚(羟基酸),亲水性链段是多糖。
Description
技术领域
本发明涉及免疫原性增强用组合物,含有包含在两亲性聚合物上结合有免疫激活因子的修饰型两亲性聚合物和抗原的颗粒作为有效成分。
背景技术
为了充分诱导对抗原的免疫应答,仅施与抗原是不充分的,因而联用佐剂(免疫激活因子)。然而,被报告了高的佐剂效果的物质由于安全性的问题而没有被认可对人的使用。氢氧化铝、MF59这样的有限的佐剂被用于药品,但要求开发在保证安全性的同时能够更强地诱导免疫应答的佐剂。
为了解决前述的课题,进行了微粒佐剂的开发。通过利用颗粒化来将抗原、免疫激活因子内包,从而预期安全性的提高、向目的细胞的送达效率提高。利用脂肪酸、可生物降解性聚合物、病毒蛋白质等多种材质的材料提出了微粒佐剂(非专利文献1、2)。
近年来,报告了涉及在由疏水性链段是聚(羟基酸)、亲水性链段是包含β-葡聚糖的多糖的两亲性聚合物形成的佐剂微粒中内包了抗原的抗原-佐剂微粒复合物的技术(专利文献1、2)。该技术成功地以少量的抗原量、少的施与次数诱导了对抗原的高免疫应答。然而,在已有的使用微粒的技术中,期望开发具有远超越现有的佐剂的性能的有效佐剂,尽管如此,到目前其开发尚未实现。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:WO2010/098432号
专利文献2:WO2015/053354号
非专利文献
非专利文献1:Immunology、2006年117号、78-88页
非专利文献2:Nature Materials、2011年10号、243-251页
发明内容
发明要解决的课题
本发明的目的是通过增强由疏水性链段是聚(羟基酸)、亲水性链段是多糖的两亲性聚合物构成的颗粒的免疫激活作用,从而提供具有强的免疫激活能力的免疫原性增强用组合物。
用于解决课题的手段
为了克服上述课题,本发明者发现,含有包含在所述两亲性聚合物上结合有免疫激活因子的修饰型两亲性聚合物和抗原的颗粒的免疫原性增强用组合物是有效的,从而完成了本发明。
即,本发明具有以下(1)~(19)的构成。
(1)免疫原性增强用组合物,含有包含修饰型两亲性聚合物和抗原的颗粒作为有效成分,所述修饰型两亲性聚合物是结合有免疫激活因子的两亲性聚合物,其中,疏水性链段是聚(羟基酸),亲水性链段是多糖。
(2)根据(1)所述的免疫原性增强用组合物,作为构成所述颗粒的除抗原以外的成分,不包含脂质。
(3)根据(1)或(2)所述的免疫原性增强用组合物,所述颗粒还包含非修饰型两亲性聚合物,所述非修饰型两亲性聚合物是没有结合免疫激活因子的两亲性聚合物,其中,疏水性链段是聚(羟基酸),亲水性链段是多糖。
(4)根据(1)~(3)的任一项所述的免疫原性增强用组合物,所述多糖是右旋糖酐、β-葡聚糖、甘露聚糖、几丁质、脱乙酰几丁质、结冷胶、褐藻酸、透明质酸或短梗霉聚糖。
(5)根据(4)所述的免疫原性增强用组合物,所述β-葡聚糖是通过1个以上的β-1,3键和/或1个以上的β-1,6键连接而成的葡萄糖的聚合物。
(6)根据(4)或(5)所述的免疫原性增强用组合物,所述β-葡聚糖是黑酵母葡聚糖、凝结多糖、茯苓聚糖、昆布多糖、地衣多糖、裂褶菌多糖、香菇多糖、小核菌聚糖或茯苓次聚糖。
(7)根据(1)~(6)的任一项所述的免疫原性增强用组合物,所述聚(羟基酸)是聚(乳酸-乙醇酸)、聚乳酸或聚乙醇酸。
(8)根据(1)~(7)的任一项所述的免疫原性增强用组合物,所述修饰型两亲性聚合物中的所述两亲性聚合物与所述免疫激活因子的结合是共价结合。
(9)根据(1)~(8)的任一项所述的免疫原性增强用组合物,所述修饰型两亲性聚合物中的所述免疫激活因子的结合部位是所述亲水性链段。
(10)根据(1)~(9)的任一项所述的免疫原性增强用组合物,所述免疫激活因子是与Toll样受体即TLR、NOD样受体即NLR、RIG样受体或C型凝集素受体即CLR或干扰素基因刺激因子即STING结合的配体或激动剂。
(11)根据(10)所述的免疫原性增强用组合物,与所述Toll样受体即TLR结合的配体或激动剂是与TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8、TLR9或TLR11结合的配体或激动剂。
(12)根据(10)或(11)所述的免疫原性增强用组合物,与所述Toll样受体即TLR结合的配体或激动剂是以下(i)~(vii)的任意者,
(i)选自肽聚糖、脂蛋白、脂多糖和酵母聚糖中的与TLR2结合的配体或激动剂
(ii)选自Poly(I:C)和poly(A:U)中的与TLR3结合的配体或激动剂
(iii)选自脂多糖即LPS、HSP60、RS09和MPLA中的与TLR4结合的配体或激动剂
(iv)作为与TLR5结合的配体或激动剂的鞭毛蛋白
(v)选自咪唑并喹啉类化合物和单链RNA中的与TLR7或TLR8结合的配体或激动剂
(vi)选自细菌DNA、非甲基化CpG DNA、疟原虫色素即hemozorin、ODN1585、ODN1668和ODN1826中的与TLR9结合的配体或激动剂
(vii)选自组装抑制蛋白和尿路致病菌中的与TLR11结合的配体或激动剂。
(13)根据(1)~(12)的任一项所述的免疫原性增强用组合物,与1分子所述修饰型两亲性聚合物结合的所述免疫激活因子的分子数为1~100。
(14)根据(1)~(13)的任一项所述的免疫原性增强用组合物,所述颗粒的平均粒径为0.1~50μm。
(15)含有(1)~(14)的任一项所述的免疫原性增强用组合物作为有效成分的药物。
(16)含有(1)~(14)的任一项所述的免疫原性增强用组合物作为有效成分的疫苗。
(17)用于癌的治疗和/或预防的疫苗,含有(1)~(14)的任一项所述的免疫原性增强用组合物作为有效成分。
(18)免疫原性增强方法,包括:将(1)~(14)的任一项所述的免疫增强用组合物施与受检体。
(19)用于癌的治疗和/或预防的方法,包括:将(1)~(14)的任一项所述的免疫原性增强用组合物、(15)所述的药物、或(16)或(17)所述的疫苗施与受检体。
本说明书包含成为本申请的优先权基础的日本专利申请号2021-139683号的公开内容。
发明的效果
根据本发明,提供能够实现比现有更强的免疫激活的免疫原性增强用组合物。
附图说明
图1表示右旋糖酐-NH2的GPC测定的结果。
图2表示右旋糖酐-PLGA的GPC测定的结果。
图3表示R848-右旋糖酐-PLGA的1H-NMR测定的结果。
图4表示黑酵母葡聚糖-NH2的GPC测定的结果。
图5表示黑酵母葡聚糖-PLGA的GPC测定的结果。
图6表示R848-黑酵母葡聚糖-PLGA的1H-NMR测定的结果。
图7表示含OVA的R848修饰右旋糖酐-PLGA颗粒的DLS测定的结果。
图8表示含OVA的R848修饰黑酵母葡聚糖-PLGA颗粒的DLS测定的结果。
图9表示含TRP2的R848修饰黑酵母葡聚糖-PLGA颗粒的DLS测定的结果。
图10表示由免疫原性增强用组合物产生的小鼠骨髓来源的树突状细胞的激活的结果。
具体实施方式
本发明涉及含有包含作为疏水性链段是聚(羟基酸)、亲水性链段是多糖的结合有免疫激活因子的两亲性聚合物的修饰型两亲性聚合物、和抗原的颗粒作为有效成分,优选含有包含修饰型两亲性聚合物、抗原、和作为疏水性链段是聚(羟基酸)、亲水性链段是多糖的没有结合免疫激活因子的两亲性聚合物的非修饰型两亲性聚合物的颗粒作为有效成分的免疫原性组合物(特别是免疫原性增强用组合物)。
对于与抗原一起构成颗粒的两亲性聚合物进行说明。所谓“两亲性”是指具有亲水性和疏水性的双方的性质。在某个部位(链段)对水的溶解度高于其他部位时,将该部位(链段)称为亲水性。亲水部位期望对水为可溶,但即使为难溶,只要与其他部位相比对水的溶解度高也可以。另外,在某个部位(链段)对水的溶解度低于其他部位时,将该部位(链段)称为疏水性。疏水性部位期望对水为不溶,但即使为可溶,只要与其他部位向地对水的溶解度低也可以。
所谓“两亲性聚合物”是作为分子整体具有上述的两亲性的聚合物。所谓两亲性“聚合物”,表示是两亲性分子中的亲水性链段或疏水性链段、或其双方由最小单元(单体)的重复结构构成的分子结构。本发明中的两亲性聚合物的结构不特别限定,作为具体例,可列举多糖与聚(羟基酸)连接而成的直链状的嵌段型聚合物、具有多糖或聚(羟基酸)多个存在的支链的支链聚合物、由多糖的主链和聚(羟基酸)的侧链形成的接枝型聚合物、由聚(羟基酸)的主链和多糖的侧链形成的接枝型聚合物,优选为多糖与聚(羟基酸)连接而成的直链状的嵌段型聚合物。
在本发明中,以两亲性聚合物的亲水性链段是多糖作为特征。只要是多糖就不特别限定,但作为具体例,可列举右旋糖酐、β-葡聚糖、甘露聚糖、几丁质、脱乙酰几丁质、结冷胶、褐藻酸、透明质酸或短梗霉聚糖,优选右旋糖酐或β-葡聚糖。
作为葡聚糖是含葡萄糖的多糖类,β-葡聚糖是在葡萄糖亚基之间包含1个以上的β-键的葡聚糖。即,本发明中使用的β-葡聚糖是包含β-键的葡聚糖,也可以是仅包含β-键的葡聚糖。另外,本发明中使用的β-葡聚糖可以是支链型也可以是线型。作为优选的β-葡聚糖,可列举包含1个以上的β-1,3键和/或1个以上的β-1,6键的β-葡聚糖、包含1个以上的β-1,2键和/或β-1,4键的β-葡聚糖,但更优选包含1个以上的β-1,3键和/或1个以上的β-1,6键的β-葡聚糖,进一步优选包含1个以上的β-1,3键的β-葡聚糖。作为包含1个以上的β-1,3键的β-葡聚糖的具体例,可列举凝结多糖、茯苓聚糖、昆布多糖、地衣多糖、裂褶菌多糖、香菇多糖、小核菌聚糖、黑酵母葡聚糖(优选为黑酵母来源的β-1,3葡聚糖或β-1,6葡聚糖)或茯苓次聚糖,优选凝结多糖、茯苓聚糖、昆布多糖、裂褶菌多糖、小核菌聚糖、黑酵母葡聚糖或茯苓次聚糖。
作为包含1个以上的β-1,3键的线型的β-葡聚糖,可列举主要由β-1,3键形成的β-葡聚糖(例如,凝结多糖、茯苓聚糖)、由β-1,3键和除了β-1,3键以外的β-键形成的β-葡聚糖(例如,昆布多糖、地衣多糖)。
作为包含1个以上的β-1,3键的支链型的β-葡聚糖,可列举由β-1,3键和β-1,6键形成的β-葡聚糖(例如,裂褶菌多糖、香菇多糖、小核菌聚糖、黑酵母葡聚糖)。
本发明中使用的β-葡聚糖也可以是被衍生物化了的β-葡聚糖。作为衍生物化的例子,可列举羧甲基的加成反应、氧化的断裂反应。作为被衍生物化了的β-葡聚糖的例子,可列举对凝结多糖加成了羧甲基的羧甲基凝结多糖、茯苓聚糖被断裂了的茯苓次聚糖。
多糖的数均分子量不特别限定,优选为500~100,000,更优选为500~50,000,进一步优选为1,000~10,000、例如1,000~8,000、1,000~6,000、或1,000~4,000。所谓数均分子量,是通过不考虑分子的大小的加权的方法计算出的平均分子量,多糖的数均分子量可以通过凝胶渗透色谱(GPC)求出。
在本发明中,以两亲性聚合物的疏水性链段是聚(羟基酸)为特征。聚(羟基酸)不特别限定,优选为施与生物体施与时不显著给出有害影响的生物体适合性聚合物。这里所说的生物体适合性,是指对大鼠经口施与该聚合物时的LD50为2,000mg/kg以上的性质。聚(羟基酸)还可以是多种羟基酸的共聚物,优选为2种以下的羟基酸的聚合物。
作为聚(羟基酸)的优选的具体例,可列举聚乙醇酸、聚乳酸、聚(2-羟基丁酸)、聚(2-羟基戊酸)、聚(2-羟基己酸)、聚(2-羟基癸酸)、聚(苹果酸)或这些高分子化合物的衍生物以及共聚物,优选为聚(乳酸-乙醇酸)、聚乳酸或聚乙醇酸,更优选为聚(乳酸-乙醇酸)。另外,在聚(羟基酸)是聚(乳酸-乙醇酸)的情况下,聚(乳酸-乙醇酸)的组成比(乳酸/乙醇酸)(摩尔/摩尔)只要能够实现本发明的目的就不特别限定,但优选为99/1~1/99,更优选为80/20~20/80、例如60/40~40/60、或50/50。
聚(羟基酸)的数均分子量不特别限定,优选为500~1,000,000,更优选为500~100,000,进一步优选为500~50,000、例如500~40,000、500~30,000、500~20,000、或500~15,000。聚(羟基酸)的数均分子量通过疏水性链段是聚(羟基酸)、亲水性链段是多糖的两亲性聚合物的数均分子量与多糖的数均分子量的差而求出。
构成颗粒的两亲性聚合物(没有结合免疫激活因子的非修饰型两亲性聚合物)的数均分子量不特别限定,优选为1,000~1,000,000,更优选为1,000~100,000,进一步优选为9,000~50,000、例如9,000~40,000、9,000~30,000、9,000~20,000、9,000~15,000。两亲性聚合物的数均分子量可以通过凝胶渗透色谱(GPC)求出。
两亲性聚合物通过已知的方法制造即可,具体可列举对多糖添加聚(羟基酸)进行缩合反应而制造的方法、对多糖添加羟基酸活化单体进行聚合反应而制造的方法作为例子。
另外,在两亲性聚合物是多糖与聚(羟基酸)连接而成的直链状的嵌段型聚合物的情况下,通过已知的方法制造即可,具体可列举,通过对两亲性聚合物的多糖的还原末端使用末端官能基的活化剂使聚(羟基酸)共聚物进行缩合反应来制造的方法(Macromol.RapidCommun.,31,p.1664-1684(2010年))作为例子。
另外,在两亲性聚合物是由多糖的主链和聚(羟基酸)的侧链形成的接枝型聚合物的情况下,可以如以下的(1)、(2)或(3)那样制造。
(1)在锡催化剂存在下,对多糖加入羟基酸活化单体进行聚合反应,导入聚(羟基酸),从而制造接枝型聚合物的方法(Macromolecules,31,p.1032-1039(1998年))。
(2)将羟基的大部分被取代基保护了的多糖的一部分未保护的羟基用碱活化后,加入羟基酸活化单体而导入由聚(羟基酸)形成的接枝链,最后除掉保护基,从而制造接枝型聚合物的方法(Polymer,44,p.3927-3933,(2003年))。
(3)对多糖,使用脱水剂和/或官能基的活化剂使聚(羟基酸)的共聚物进行缩合反应,从而制造接枝型聚合物的方法(Macromolecules,33,p.3680-3685(2000年))。
所谓“修饰型两亲性聚合物”,是在所述两亲性聚合物上结合有免疫激活因子的聚合物。这里所说的结合,既可以是非共价结合也可以是共价结合,但优选为共价结合。非共价结合优选为疏水的相互作用,但也可以是离子键(静电相互作用)、氢键、配位键、范德华力结合、物理吸附,也可以是它们复合而成的结合。
“免疫激活因子”这里是激活1种以上的免疫细胞的因子,是指能够维持、增强该细胞的免疫功能的物质。这里所说的“免疫细胞”,是例如,T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞、树突状细胞、粒细胞、巨噬细胞、骨髓来源的抑制性细胞、朗格汉斯细胞及其前体细胞群、存在于肿瘤内的上述免疫细胞群。
本发明中使用的免疫激活因子不特别限定,作为具体例,可列举与Toll样受体(TLR)、NOD样受体(NLR)、RIG样受体、C型凝集素受体(CLR)或干扰素基因刺激因子(STING)结合的配体或激动剂,优选为与TLR结合的配体或激动剂。
作为TLR的具体例,可列举TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8、TLR9或TLR11,作为与它们结合的配体或激动剂的具体例,可列举以下的(i)~(vii)。
(i)选自肽聚糖、脂蛋白、脂多糖和酵母聚糖中的与TLR2结合的配体或激动剂。
(ii)选自Poly(I:C)和poly(A:U)中的与TLR3结合的配体或激动剂。
(iii)选自脂多糖即LPS、HSP60、RS09和MPLA中的与TLR4结合的配体或激动剂。
(iv)作为与TLR5结合的配体或激动剂的鞭毛蛋白。
(v)选自咪唑并喹啉类化合物和单链RNA中的与TLR7或TLR8结合的配体或激动剂。
(vi)选自细菌DNA、非甲基化CpG DNA、疟原虫色素即hemozorin、ODN1585、ODN1668和ODN1826中的与TLR9结合的配体或激动剂。
(vii)选自组装抑制蛋白和尿路致病菌中的与TLR11结合的配体或激动剂。
在本发明中,免疫激活因子优选为与TLR7或8结合的配体或激动剂(TLR7/8配体或激动剂),更优选为所述(v)的配体或激动剂。
作为所述(v)的咪唑并喹啉类化合物的优选的具体例,例如有美国专利8,951,528号中记载的化合物、WO2015/103989中记载的化合物,可列举例如,4-氨基-2-(乙氧基甲基)-a,a-二甲基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-乙醇(雷西莫特,Resiquimod(R848))、1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺(咪喹莫特,Imiquimod)、1-(4-氨基-2-乙基氨基甲基咪唑并-[4,5-c]喹啉-1-基)-2-甲基丙烷-2-醇(嘎德莫特,Gardiquimod)、N-[4-(4-氨基-2-乙基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丙基-]甲基磺酰胺(PF-4878691)、4-氨基-aa-二甲基-2-甲氧基乙基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-乙醇、1-(2-(3-(卞氧基)丙氧基)乙基)-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺、4-氨基-2-乙氧基甲基-aa-二甲基-6,7,8,9-四氢-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-乙醇、N-(2-{2-[4-氨基-2-(2-甲氧基乙基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-l-基]乙氧基}乙基)-n’-苯基脲、1-2-氨基-2-甲基丙基)-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺、1-{4-[(3,5-二氯苯基)磺酰基]丙基}-2-乙基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺、N-(2-{2-[4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]乙氧基}乙基)-n’-环己基脲、N-{3-[4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]丙基}-n’-(3-氰基苯基)硫脲、N-[3-(4-氨基-2-丙基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-l-基)-2,2-二甲基丙基]苯甲酰胺、2-丙基-1-[3-(甲基磺酰基)丙基]-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺和它们的衍生物,但只要与TLR7或TLR8结合就不特别限定。
作为与NOD样受体(NLR)结合的配体或激动剂的具体例,可列举例如,M-TriDAP、PGN。此外,可列举针对NOD1的配体或激动剂,例如Tri-DAP、iE-DAP、C12-iE。另外,可列举针对NOD2的配体或激动剂,例如MDP、N-糖基-MDP、莫拉布胺、M-TriLyS-D-ASN、M-TriLYS、L18-MDP。
作为与RIG样受体结合的配体或激动剂的具体例,可列举例如,5’ppp-dsRNA、poly(dA:dT)、poly(dG:dC)、poly(I:C)。
作为与C型凝集素受体(CLR)结合的配体或激动剂的具体例,可列举海藻糖6,6-二山萮酸酯、酵母聚糖、WGP、HKSC、HKCA以及凝结多糖AL。
作为与干扰素基因刺激因子(STING)结合的配体或激动剂,可列举c-di-GMP、c-di-AMP、2’3’-cGAMP、3’3’-cGAMP或2’2’-cGAMP。
对于修饰型两亲性聚合物中的免疫激活因子的结合部位不特别限定,优选为多糖链段。另外,免疫激活因子相对于两亲性聚合物的比率(摩尔比)(与1分子修饰型两亲性聚合物结合的免疫激活因子的分子数)只要能够实现本发明的目的就不特别限定,优选相对于修饰型两亲性聚合物为1~100、更优选为1~50、进一步优选为1~30、特别优选为1~10。
修饰型两亲性聚合物的数均分子量不特别限定,优选为1,000~1,000,000,更优选为1,000~100,000,进一步优选为2,000~50,000、例如2,000~40,000、2,000~30,000、2,000~20,000、2,000~15,000。修饰型两亲性聚合物的数均分子量可以通过凝胶渗透色谱(GPC)求出。
修饰型两亲性聚合物用已知的方法制造即可,具体地,可以如以下(1)或(2)那样制造。
(1)使两亲性聚合物的多糖链段结合免疫激活因子的方法
可列举:用将多糖主链的羟基活化的反应试剂、虽不特别限定但例如1,1’-羰基二咪唑(CDI)或二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)等将多糖的羟基定量地活化之后,使另外导入了与免疫激活因子中的活化羟基共价结合的反应性官能基、例如氨基等与上述活化了的羟基进行缩合反应而制造的方法;将多糖的羟基转换成反应性更高的其他官能基、虽不特别限定但例如氨基、羧基、马来酰亚胺基、硫醇基等之后,使另外导入了与这些反应性官能基结合的官能基的免疫激活因子与上述多糖进行缩合反应而制造的方法;或将多糖的羟基转换成阳离子性的氨基或阴离子性的羧基之后,使该氨基或羧基、与另外导入了免疫激活因子中的与其相反带电的羧基或氨基通过静电相互作用而形成离子键而制造的方法等。
(2)使两亲性聚合物的聚(羟基酸)链段结合免疫激活因子的方法
聚(羟基酸)的α末端可以与多糖相连而形成共聚物,ω末端可以导入各种各样的反应性官能基、虽不特别限定但例如氨基、羧基、马来酰亚胺基、硫醇基等。可列举使另外导入了与导入聚(羟基酸)的ω末端的这些反应性官能基结合的官能基的免疫激活因子,与上述聚(羟基酸)进行缩合反应而制造的方法;或将聚(羟基酸)的ω末端转换成阳离子性的氨基或阴离子性的羧基之后,使该氨基或羧基、与另外导入了免疫激活因子中的与其相反带电的羧基或氨基通过静电相互作用而形成离子键而制造的方法等作为例子。
为了使免疫激活作用长期持续,修饰型两亲性聚合物优选以在生物体内不立即被排泄的方式作为整体为水不溶性。这里所说的“水不溶性”是指对水的溶解度为1g(两亲性聚合物)/100ml(水)以下。
作为本发明的免疫原性增强用组合物的有效成分的颗粒的特征是包含抗原和所述修饰型两亲性聚合物作为构成成分,优选的特征是进一步包含没有结合免疫激活因子的非修饰型两亲性聚合物。本发明中的颗粒与包含抗原和非修饰型两亲性聚合物但不包含修饰型两亲性聚合物的颗粒、该颗粒与免疫激活因子的混合物、或抗原单独等相比,能够具有显著被增强了的免疫激活能力。
在作为构成颗粒的除抗原以外的成分包含修饰型两亲性聚合物与非修饰型两亲性聚合物的组合的情况下,该组合只要颗粒具有免疫激活能力就不特别限制,修饰型两亲性聚合物和非修饰型两亲性聚合物的亲水性链段既可以是异种聚合物也可以是同一种聚合物,同样地修饰型两亲性聚合物和非修饰型两亲性聚合物的疏水性链段也既可以是异种聚合物也可以是同一种聚合物。另外,在修饰型两亲性聚合物和非修饰型两亲性聚合物的各链段是异种聚合物的情况下,也可以是3种以上,修饰型两亲性聚合物和非修饰型两亲性聚合物的亲水性链段和疏水性链段的连接方式可以不同也可以相同,例如,也可以是修饰型两亲性聚合物是嵌段型聚合物、非修饰型两亲性聚合物是接枝型聚合物的组合。优选修饰型两亲性聚合物和非修饰型两亲性聚合物的各链段由同一种聚合物构成。
在作为构成颗粒的除抗原以外的成分包含修饰型两亲性聚合物和非修饰型两亲性聚合物的组合的情况下,修饰型两亲性聚合物重量相对于修饰型两亲性聚合物重量与非修饰型两亲性聚合物重量的合计的比率优选为0.01~99.99重量%、更优选为0.1~99.9重量%、进一步优选为1~99重量%、更进一步优选为5~95重量%、特别优选为5~80重量%。
作为构成颗粒的除抗原以外的成分也可以包含除两亲性聚合物以外的成分,作为具体例,可以包含作为能够内包抗原的颗粒的脂质体、脂质纳米颗粒的构成成分周知的脂质,但如实施例中搞清楚的那样,本发明中即使不使用脂质也能够充分得到期待的效果,因此作为构成颗粒的除抗原以外的成分优选不包含脂质。
作为颗粒的结构不特别限定,在为了构成颗粒与抗原的复合物,而采取以构成颗粒的两亲性聚合物的亲水性链段作为颗粒的内侧、以疏水性链段作为颗粒的外层的结构的情况下,形成抗原被颗粒内包的方式能够更稳定地保持,因此是优选的。
制造颗粒的方法不特别限定,可列举液中干燥法、喷雾干燥法、粉碎法等,但本发明中的颗粒可以通过液中干燥法优选地制造。
作为通过液中干燥法制作颗粒的方法,可列举O/W乳化法、W/O/W乳化法、S/O/W乳化法等。
如果举出通过O/W乳化法制造颗粒时的例子,可以通过如下工序来制造:将溶解有构成颗粒的两亲性聚合物的粉体的水非混和性有机溶剂、与溶解有表面改质剂和抗原的水溶液混合,制备O/W乳化溶液的工序;和由O/W乳化溶液除去水非混和性有机溶剂而获得颗粒的工序。
如果举出通过W/O/W乳化法制造颗粒时的例子,可以通过如下工序来制造:将溶解有抗原的水系溶剂与溶解有构成颗粒的两亲性聚合物粉体的水非混和性有机溶剂混合而制备W/O乳化溶液的工序;将W/O乳化溶液与表面改质剂水溶液混合而制备W/O/W乳化溶液的工序;和由W/O/W乳化溶液除去水非混和性有机溶剂而获得颗粒的工序。
如果举出通过S/O/W乳化法制造颗粒时的例子,可以通过如下工序来制造:将溶解有抗原的水系溶剂与溶解有构成颗粒的两亲性聚合物粉体的水非混和性有机溶剂混合而制备W/O乳化溶液的工序;由W/O乳化溶液除去溶剂而获得固体成分的工序;使固体成分分散于水非混和性有机溶剂而获得S/O悬浮溶液的工序;使S/O悬浮溶液与表面改质剂水溶液混合而制备S/O/W乳化溶液的工序;和由S/O/W乳化溶液除去水非混和性有机溶剂而获得颗粒的工序。
颗粒中的抗原含有率(抗原/颗粒)优选为0.01~20重量%、更优选为0.1~10重量%、例如0.5~10重量%。作为抗原含有率的定量方法,可列举使用有机溶剂从颗粒提取抗原,通过凝胶电泳或液相色谱来定量的方法。
作为在颗粒制备中使用的表面改质剂,优选为水溶性聚合物或表面活性剂。这里所谓水溶性聚合物,是对水的溶解度为1g(水溶性聚合物)/100ml(水)以上的高分子化合物。
作为成为表面改质剂的水溶性聚合物的例子,可列举聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙烯亚胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚-1,3-二氧戊环、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱聚合物、聚-1,3,6-三氧杂环己烷、多聚氨基酸、肽、蛋白质、糖质(单糖类、寡糖类、多糖类等),更优选为聚乙烯醇。
作为成为表面改质剂的表面活性剂的例子,可列举聚氧乙烯聚氧丙烯二醇、蔗糖脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯失水山梨糖醇单脂肪酸酯、聚氧乙烯失水山梨糖醇二脂肪酸酯、聚氧乙烯甘油单脂肪酸酯、聚氧乙烯甘油二脂肪酸酯、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯硬化蓖麻油等非离子性活性剂、月桂基硫酸钠、月桂基硫酸铵、硬脂基硫酸钠等烷基硫酸盐或卵磷脂,更优选为聚氧乙烯聚氧丙烯二醇。
在颗粒制备中使用的水非混和性有机溶剂优选两亲性聚合物和修饰型两亲性聚合物为可溶、且多糖为难溶或不溶。水非混和性有机溶剂对水的溶解度优选为30g(水非混和性有机溶剂)/100ml(水)以下。作为水非混和性有机溶剂的具体例,可列举乙酸乙酯、乙酸异丙酯、乙酸丁酯、碳酸二甲酯、碳酸二乙酯、二氯甲烷、氯仿。
在颗粒制备中使用的水系溶剂是含有水和任意的水溶性成分的水溶液。作为水溶性成分,可列举例如,无机盐类、糖类、有机盐类、氨基酸、肽、蛋白质、核酸等。
颗粒表面可以结合在所述制造过程中使用的表面改质剂。这里所说的结合既可以是非共价结合也可以是共价结合。非共价结合优选为疏水相互作用,但也可以是离子键(静电相互作用)、氢键、配位键、范德华力结合、物理吸附,也可以是它们复合而成的结合。
所述颗粒的平均粒径优选为0.1~50μm、更优选为0.1~25μm、进一步优选为0.1~10μm、特别优选为0.1~1μm、例如0.2~1μm、0.3~1μm。这里所说的平均粒径可以使用动态光散射装置(DLS:例如,大塚电子株式会社、ELS-Z)通过半不变量法求出。
本发明中的所谓“免疫原性增强用组合物”,是包含含有在所述两亲性聚合物上结合有免疫激活因子的修饰型两亲性聚合物和抗原的颗粒作为有效成分的、能够在生物体内增强针对抗原的免疫应答的组合物。由免疫原性增强用组合物产生的免疫应答的种类不限定。作为产生的免疫应答的种类有Th1型免疫应答、Th2型免疫应答,根据抗原、免疫激活因子、施与部位、施与方法的种类不同哪一种免疫应答优势地产生是已知的,但本发明能够产生Th1型、Th2型两种类型的免疫应答。
本发明中的所谓“抗原”,是在生物体内诱发免疫的物质,是可以作为以疾病的治疗和/或预防为目的的疫苗利用的物质。通过以本发明的包含结合有免疫激活因子的修饰型两亲性聚合物和抗原的颗粒作为有效成分,能够强化由抗原诱发的免疫应答。
作为抗原的例子,可列举肽、蛋白质、糖蛋白质、糖脂质、脂质、碳水化合物、核酸、多糖类和包含它们的病毒、菌体、变应原、组织、细胞、等。具体可列举花粉来源的抗原、A型肝炎病毒来源的抗原、B型肝炎病毒来源的抗原、C型肝炎病毒来源的抗原、D型肝炎病毒来源的抗原、E型肝炎病毒来源的抗原、F型肝炎病毒来源的抗原、HIV病毒来源的抗原、流感病毒来源的抗原、疱疹病毒(HSV-1、HSV-2)来源的抗原、炭疽菌来源的抗原、衣原体来源的抗原、肺炎球菌来源的抗原、日本脑炎病毒来源的抗原、麻疹病毒来源的抗原、风疹病毒来源的抗原、破伤风菌来源的抗原、水痘病毒来源的抗原、SARS病毒来源的抗原、EB病毒来源的抗原、乳头瘤病毒来源的抗原、幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)来源的抗原、狂犬病病毒来源的抗原、西尼罗病毒来源的抗原、汉坦病毒来源的抗原、链球菌来源的抗原、葡萄球菌来源的抗原、百日咳菌(Bordetellapertussis)来源的抗原、结核菌(Mycobacteriumtuberculosis)来源的抗原、疟原虫(Plasmodium)来源的抗原、脊髓灰质炎病毒来源的抗原、各种人畜共患感染症来源的抗原、各种食物变态反应来源的抗原、自身抗原等。
此外,作为抗原的优选的例子可列举癌抗原。所谓癌抗原,是来源于在癌细胞中特异性地表达的蛋白质的物质,是通过由生物体外向生物体内施与而利用免疫应答发挥癌的治疗和/或预防的效果的抗原。
本发明的免疫原性增强用组合物可以为了癌、感染症、或变态反应等疾病的治疗和/或预防而使用。作为可以使用本发明的免疫原性增强用组合物的癌,可列举例如,基底细胞癌、佩吉特病、脑肿瘤、膀胱癌、食道癌、白血病、淋巴瘤、肝癌、胆囊癌、肉瘤、肥大细胞瘤、肾上腺皮质癌、尤文肉瘤、霍奇金淋巴瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、甲状腺癌、皮肤癌(黑素瘤等)、肺癌、咽喉癌、胃癌、胰癌、大肠癌、肾癌、膀胱癌、乳癌、子宫癌、卵巢癌、前列腺癌、和头颈癌等。作为感染症,可列举由A型肝炎病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、D型肝炎病毒、E型肝炎病毒、F型肝炎病毒、HIV病毒、流感病毒、疱疹病毒(HSV-1、HSV-2)、炭疽菌、衣原体、肺炎球菌、日本脑炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、破伤风菌、水痘病毒、SARS病毒、EB病毒、乳头瘤病毒、幽门螺杆菌、狂犬病病毒、西尼罗病毒、汉坦病毒、链球菌、葡萄球菌、百日咳菌、结核菌、疟原虫、或脊髓灰质炎病毒等引起的感染症。作为变态反应,可列举花粉变态反应、各种食物变态反应、和对自身抗原的变态反应等。
本发明的免疫原性增强用组合物在作为抗原使用癌抗原的情况下,可以作为用于癌的治疗和/或预防的疫苗的有效成分使用。因此,本发明提供含有本发明的免疫原性增强用组合物作为有效成分的疫苗。
根据本发明的优选的方案,提供免疫激活方法(特别是免疫原性增强方法),包括将本发明的免疫原性增强用组合物、药物、或疫苗施与(生物体)受检体。另外,还提供用于癌、感染症、或变态反应等疾病的治疗和/或预防的方法,包括将本发明的免疫原性增强用组合物、药物、或疫苗施与(生物体)受检体。对于使用本发明的免疫原性增强用组合物、药物或疫苗激活免疫反应的方法、治疗和/或预防疾病的方法不限定,可以将免疫原性增强用组合物、药物、或疫苗施与生物体(受检体),也可以使其与摘出到生物体(受检体)外的免疫细胞接触。对生物体(受检体)的施与方法不特别限定,如果举例,则为皮下施与、皮内施与、肌肉内施与、经鼻施与、经肺施与、经口施与、经皮施与、舌下施与、阴道内施与、腹腔内施与、淋巴结施与等,优选为皮内施与或皮下施与。施与的生物体(受检体)既可以是人也可以是除人以外的动物,但优选为人、或者作为家畜、宠物或实验动物饲养的猪、牛、鸟、绵羊、马、驴、山羊、骆驼、犬、猫、雪貂、兔、猴、大鼠、小鼠、或豚鼠。受检体既可以是具有癌、感染症、或变态反应等疾病的受检体,也可以是不具有癌、感染症、或变态反应等疾病、但发病该疾病的风险高的受检体。
在使用本发明的免疫原性增强用组合物作为药物(包含疫苗)的情况下,可以配合制剂学上有用的各种添加剂而进行制剂化,作为添加剂的具体例,可列举缓冲剂、抗氧化剂、盐、聚合物或糖。
关于使用本发明的免疫原性增强用组合物作为药物时的颗粒的施与量,可以根据施与方法、施与次数适宜设定,但例如在人皮下施与本发明的免疫原性增强用组合物的情况下,作为结合有免疫激活因子的颗粒的量每1次施与0.01~1,000mg。
实施例
以下显示实施例,但本发明不限于这些实施例。
(实施例1)R848-右旋糖酐-PLGA的合成
在本实施例中,通过对右旋糖酐加入聚(乳酸-乙醇酸)(poly(lactic-co-glycolic acid);PLGA)进行缩合反应,从而合成直链状的嵌段型聚合物,对所得的作为两亲性聚合物的右旋糖酐-聚(乳酸-乙醇酸)(右旋糖酐-PLGA),使作为免疫激活因子的咪唑并喹啉类化合物且作为TLR7/8激动剂已知的雷西莫特(Resiquimod(R848))共价结合,合成R848-右旋糖酐-聚(乳酸-乙醇酸)(R848-右旋糖酐-PLGA)。
<还原末端具有伯氨基的右旋糖酐(右旋糖酐-NH2)的合成>
在浓度500mg/2ml的右旋糖酐(数均分子量2,100、PHARMACOSMOS社)的二甲基亚砜溶液中加入三乙酰氧基硼氢化钠(203.5mg)和N-Boc-乙二胺(76.1μl)之后,一边在60℃搅拌91小时一边进行反应。接着,通过外液为水的透析除去未反应的N-Boc-乙二胺之后,进行冷冻干燥,合成右旋糖酐-NHBoc。进行所得的右旋糖酐-NHBoc(450mg)的Boc末端基的脱保护反应(35%盐酸水溶液(5ml)/二甲基亚砜(5ml)、在常温搅拌35小时)之后,通过水透析进行纯化,通过冷冻干燥而回收聚合物粉末(右旋糖酐-NH2)。
右旋糖酐-NH2的数均分子量通过GPC测定(柱:東ソー株式会社制TSK-gelα-5000×2、DMF系溶剂、检测器:RI、标准品:短梗霉聚糖)来确定(表1、图1:右旋糖酐-NH2)。通过1H-NMR测定,确认了在右旋糖酐的还原末端导入了伯氨基。
<右旋糖酐-PLGA的合成>
使具有异源二官能性末端基的聚(乳酸-乙醇酸)(COOH-PLGA-OH、富士フイルム和光純薬株式会社、PLGA-5020、数均分子量8,900)(350mg)在1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)(35.5mg)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(21.3mg)的二甲基亚砜(0.58ml)溶液中混合之后,使其在50℃反应2小时,使一个末端的羧基活性酯(NHS)化。在该反应溶液中加入还原末端导入了伯氨基的右旋糖酐(右旋糖酐-NH2、数均分子量2,700)(100mg),将NHS-PLGA-OH的活性酯(NHS)与右旋糖酐-NH2的伯氨基的缩合反应进行110.5小时。反应后,通过水透析除去未反应的右旋糖酐-NH2,然后通过超离心分离纯化除去未反应的NHS-PLGA-OH,从而获得两亲性聚合物(1-1)。
右旋糖酐-PLGA的数均分子量通过GPC测定(柱:東ソー株式会社制TSK-gelα-5000×2、DMF系溶剂、检测器:RI、标准品:短梗霉聚糖)来确定(表1,图2:右旋糖酐-PLGA)。通过1H-NMR测定,确认了缩合反应进行了。
<R848对右旋糖酐-PLGA的修饰反应>
(CASSPy-右旋糖酐-PLGA的合成)
在右旋糖酐-PLGA(100mg)的二甲基亚砜(0.4ml)溶液中滴加CDI(21.7mg)的二甲基亚砜(0.1ml)溶液,然后滴加使2,2’-二硫二吡啶与半胱胺盐酸盐反应而得的异源交联剂(半胱胺SS吡啶;CASSPy)(4.9mg)的二甲基亚砜(0.1ml)溶液,在室温搅拌2.5小时。将反应液装入透析膜进行二甲基亚砜透析,接着进行水透析,将内容液进行离心分离(9,000rpm,4℃,30分钟)除去上清,冷冻干燥而获得聚合物粉体。
CASSPy-右旋糖酐-PLGA的数均分子量通过GPC测定(柱:東ソー株式会社制TSK-gelα-5000×2、DMF系溶剂、检测器:RI、标准品:短梗霉聚糖)而确定。CASSPy导入率(%)通过1H-NMR测定而确认。
(SH-右旋糖酐-PLGA的合成)
在CASSPy-右旋糖酐-PLGA(108.8mg)的二甲基亚砜(1.1ml)溶液中,作为使二硫基(SS结合)还原为SH基的试剂加入了二硫苏糖醇(DTT,15.5mg)的二甲基亚砜(0.05ml)溶液之后,在室温使其反应4.5小时。接着,作为用于除去过量的DTT的纯化法,进行水透析之后,通过离心分离(9000rpm,30分钟,4℃)、冷冻干燥回收聚合物粉体。通过1H-NMR测定,确认了吡啶被脱保护,硫醇基被导入。
(R848-右旋糖酐-PLGA的合成)
在SH-右旋糖酐-PLGA(40mg)的二甲基亚砜(1ml)溶液中,加入具有马来酰亚胺基的R848(Mal-R848;对雷西莫特中的三级羟基增加2个碳并添加氨基之后,使琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)结合而合成的雷西莫特衍生物、委托株式会社ナード研究所合成)(0.008mmol),然后在室温使其反应118小时。接着,作为用于除去未反应的Mal-R848的纯化法,依次进行外液为二甲基亚砜和水的透析纯化之后,通过离心分离(9000rpm,30分钟,4℃)、冷冻干燥回收修饰型两亲性聚合物(1-2)的粉体。
另外,依照所述右旋糖酐-NH2的合成方法合成数均分子量1,800的右旋糖酐-NH2,按照与两亲性聚合物(1-1)同样的合成方法,使用右旋糖酐-NH2(数均分子量1,800)和所述PLGA-5020(数均分子量8,900)获得两亲性聚合物(2-1)之后,按照与修饰型两亲性聚合物(1-2)同样的合成方法获得修饰型两亲性聚合物(2-2)。将各聚合物的评价结果示于表1。
右旋糖酐-PLGA和R848-右旋糖酐-PLGA的数均分子量通过GPC测定(柱:東ソー株式会社制TSK-gelα-5000×2、DMF系溶剂、检测器:RI、标准品:短梗霉聚糖)而确定(表1)。R848-右旋糖酐-PLGA的R848导入率(%)通过1H-NMR测定而确认(表1,图3:R848-右旋糖酐-PLGA)。
(实施例2)R848-黑酵母葡聚糖-PLGA的合成
在本实施例中,在黑酵母葡聚糖中加入聚(乳酸-乙醇酸)(PLGA)进行缩合反应,从而合成直链状的嵌段型聚合物,使所得的作为两亲性聚合物的黑酵母葡聚糖-聚(乳酸-乙醇酸)(黑酵母葡聚糖-PLGA)共价结合作为免疫激活因子的R848,合成R848-黑酵母葡聚糖-聚(乳酸-乙醇酸)(R848-黑酵母葡聚糖-PLGA)。
<还原末端具有伯氨基的黑酵母葡聚糖(黑酵母葡聚糖-NH2)的合成>
将黑酵母葡聚糖(ダイソー株式会社)5g溶解于二甲基亚砜150ml之后,加入35%盐酸水溶液5ml,在105℃搅拌20分钟。将该反应溶液移至透析膜中,在水中进行透析之后,进行冷冻干燥,作为粉末获得黑酵母葡聚糖加水分解物(数均分子量2,400)。
在浓度2.5g/8ml的黑酵母葡聚糖加水分解物(数均分子量2,400)的二甲基亚砜溶液中加入三乙酰氧基硼氢化钠(413.3mg)和N-Boc-乙二胺(246.9μl),然后一边在55℃搅拌169.5小时一边进行反应。接着,通过外液为水的透析除去未反应的N-Boc-乙二胺之后,获得黑酵母葡聚糖-NHBoc。接着,进行黑酵母葡聚糖-NHBoc(1.19g)的Boc末端基的脱保护反应(35%盐酸水溶液(14.3ml)/二甲基亚砜(24ml)、在常温搅拌2小时)之后,通过水透析进行纯化,通过冷冻干燥回收聚合物粉末(黑酵母葡聚糖-NH2)。
黑酵母葡聚糖-NH2的数均分子量通过GPC测定(柱:東ソー株式会社制TSK-gelα-5000×2、DMF系溶剂、检测器:RI、标准品:短梗霉聚糖)而确定(表1、图4:黑酵母葡聚糖-NH2)。通过1H-NMR测定,确认黑酵母葡聚糖的还原末端导入了伯氨基。
<黑酵母葡聚糖-PLGA的合成>
使具有异源二官能性末端基的聚(乳酸-乙醇酸)(COOH-PLGA-OH、富士フイルム和光純薬株式会社、PLGA-5020、数均分子量8,900)(4.462g)在EDC(479.25mg)、NHS(287.73mg)的二甲基亚砜(2.5ml)溶液中混合,然后在50℃使其反应约18小时,使α末端的羧基活性酯(NHS)化。在该反应溶液中加入ω末端具有伯氨基的黑酵母葡聚糖(黑酵母葡聚糖-NH2、数均分子量1,500)(749mg),进行NHS-PLGA-OH的活性酯(NHS)与黑酵母葡聚糖-NH2的伯氨基的缩合反应(270.5小时)。反应后,通过水透析除去未反应的黑酵母葡聚糖-NH2,然后通过超离心分离纯化除去未反应的NHS-PLGA-OH,从而获得非修饰型两亲性聚合物(3-1)。
黑酵母葡聚糖-PLGA的数均分子量通过GPC测定(柱:東ソー株式会社制TSK-gelα-5000×2、DMF系溶剂、检测器:RI、标准品:短梗霉聚糖)而确定(表1、图5:黑酵母葡聚糖-PLGA)。通过1H-NMR测定确认缩合反应进行了。
<R848对黑酵母葡聚糖-PLGA的修饰反应>
(CASSPy-黑酵母葡聚糖-PLGA的合成)
在黑酵母葡聚糖-PLGA(聚合物(3-1)、200mg)的二甲基亚砜(0.5ml)溶液中滴加CDI(26mg)的二甲基亚砜(0.1ml)溶液,在室温搅拌22小时。接着,滴加使2,2’-二硫二吡啶与半胱胺盐酸盐反应而得的异源交联剂(半胱胺SS吡啶;CASSPy)(29.1mg)的二甲基亚砜(0.15ml)溶液,在室温搅拌65.5小时。将反应液装入透析膜进行二甲基亚砜透析、接着进行水透析,将内容液离心分离(9,000rpm,4℃,30分钟)而除去上清,冷冻干燥而获得聚合物粉体。
CASSPy-黑酵母葡聚糖-PLGA的数均分子量通过GPC测定(柱:東ソー株式会社制TSK-gelα-5000×2、DMF系溶剂、检测器:RI、标准品:短梗霉聚糖)而确定。CASSPy导入率(%)通过1H-NMR测定而确认。
(SH-黑酵母葡聚糖-PLGA的合成)
在CASSPy-黑酵母葡聚糖-PLGA(150mg)的二甲基亚砜(1ml)溶液中,作为使二硫基(SS结合)还原为SH基的试剂加入二硫苏糖醇(DTT,40mg)的二甲基亚砜(0.1ml)溶液,然后在室温使其反应4小时。接着,作为用于除去过量的DTT的纯化法进行水透析之后,通过离心分离(9000rpm,30分钟,4℃)、冷冻干燥回收聚合物粉体。通过1H-NMR测定确认了吡啶被脱保护、硫醇基被导入。
(R848-黑酵母葡聚糖-PLGA的合成)
在SH-黑酵母葡聚糖-PLGA(109.5mg)的二甲基亚砜(0.75ml)溶液中加入具有马来酰亚胺基的R848(Mal-R848、委托株式会社ナード研究所合成)(0.024mmol),然后在室温使其反应约69小时。接着,作为用于除去未反应的Mal-R848的纯化法,依次进行外液为二甲基亚砜和水的透析纯化之后,通过离心分离(9000rpm,30分钟,4℃)、冷冻干燥回收修饰型两亲性聚合物(3-2)的粉体。
R848-黑酵母葡聚糖-PLGA的数均分子量通过GPC测定(柱:東ソー株式会社制TSK-gelα-5000×2、DMF系溶剂、检测器:RI、标准品:短梗霉聚糖)而确定(表1)。R848-黑酵母葡聚糖-PLGA的R848导入率(%)通过1H-NMR测定而确认(表1、图6:R848-黑酵母葡聚糖-PLGA)。
关于对1分子两亲性聚合物的R848修饰量不同的修饰型两亲性聚合物,通过以同样的方法定量地控制对多糖主链的羟基的CASSPy的导入量,从而合成。例如,对1分子修饰型两亲性聚合物(3-2)的R848修饰量为1.5分子,与此相对,使用相同的两亲性聚合物(3-1)通过将CASSPy的导入量控制得较高来获得修饰型两亲性聚合物(3-4),通过将CASSPy的导入量控制得较低来获得修饰型两亲性聚合物(3-3)。
另外,依照所述黑酵母葡聚糖-NH2的合成方法合成数均分子量1,200和2,300的黑酵母葡聚糖-NH2、以及数均分子量3,500的凝结多糖-NH2,按照与两亲性聚合物(3-1)和修饰型两亲性聚合物(3-2)同样的合成方法,使用黑酵母葡聚糖-NH2(数均分子量1,200)和PLGA-5020(数均分子量8,900)获得两亲性聚合物(4-1)和修饰型两亲性聚合物(4-2),使用黑酵母葡聚糖-NH2(数均分子量2,300)和PLGA-5020(数均分子量8,900)获得两亲性聚合物(5-1),使用凝结多糖-NH2(数均分子量3,500)和PLGA-5020(数均分子量8,900)获得两亲性聚合物(6-1)和修饰型两亲性聚合物(6-2)。各聚合物的评价结果示于表1。
表1各种两亲性聚合物(多糖-PLGA)的分析结果
(实施例3)使用了S/O/W乳化法的颗粒(含OVA的R848修饰右旋糖酐-PLGA颗粒(1)、含OVA的R848修饰黑酵母葡聚糖-PLGA颗粒(2)~(9)、含OVA的R848修饰凝结多糖-PLGA颗粒(10)、比较颗粒:含OVA的右旋糖酐-PLGA颗粒(11)、含OVA的黑酵母葡聚糖-PLGA颗粒(12))的制备
<含OVA的R848修饰右旋糖酐-PLGA颗粒的制备>
将R848-右旋糖酐-PLGA(表1、两亲性聚合物(1-2))(6mg)和右旋糖酐-PLGA(表1、两亲性聚合物(1-1))(24mg)的聚合物混合粉体(30mg)溶解于碳酸二甲酯1.2ml和叔丁醇133μl,制备聚合物溶液。在该聚合物溶液中滴加0.5%(w/v)OVA(乳清白蛋白、シグマ社)水溶液0.3ml,通过使用了混合器(ポリトロン社、PT2100S)的11,000rpm、1分钟的搅拌来制造W/O乳化溶液。将该W/O乳化溶液用液氮预冷冻之后,使用冷冻干燥机(东京理化器械株式会社、FD-1000),以冷阱温度-45℃、真空度20Pa冷冻干燥4小时。使所得的固体成分分散于乙酸乙酯3ml,制备S/O悬浮溶液。将该S/O悬浮溶液滴加到1%(w/v)聚乙烯醇水溶液12ml中,通过使用了混合器(シルバーソン社、L5M-A)的5,000rpm、3分钟的搅拌来制备S/O/W型乳化溶液。通过液中干燥由该S/O/W型乳化溶液除去乙酸乙酯,制成颗粒悬浮液。将该悬浮液移至50ml管,通过3,000g、30分钟的离心分离使颗粒沉淀。除去上清之后,将颗粒在50ml的蒸馏水中再悬浮,通过上述条件下的离心分离使颗粒再次沉淀,从而洗涤。将该洗涤操作再一次重复,除去上清之后使颗粒悬浮于包含5%(w/v)甘露糖醇和0.1%(w/v)聚山梨醇酯80的水溶液2.4ml。用筛网过滤器(1μm)过滤,将该悬浮液用液氮预冷冻之后,使用冷冻干燥机以冷阱温度-45℃、真空度20Pa冷冻干燥12小时,从而获得含OVA的R848修饰右旋糖酐-PLGA颗粒(1)。
<含OVA的R848修饰黑酵母葡聚糖-PLGA颗粒的制备>
将R848-黑酵母葡聚糖-PLGA(表1、修饰型两亲性聚合物(3-2))(10mg)和黑酵母葡聚糖-PLGA(表1、非修饰型两亲性聚合物(3-1))(40mg)的聚合物混合粉体(50mg)溶解于碳酸二甲酯0.9ml和叔丁醇100μl的混合溶液,制备聚合物溶液。在该聚合物溶液中滴加0.5%(w/v)OVA(乳清白蛋白、シグマ社))水溶液0.5ml,通过使用混合器(ポリトロン社、PT2100S)的11,000rpm、1分钟的搅拌制造W/O乳化溶液。将该W/O乳化溶液用液氮预冷冻之后,使用冷冻干燥机(东京理化器械株式会社、FD-1000),以冷阱温度-45℃、真空度20Pa冷冻干燥12小时。使所得的固体成分分散于乙酸乙酯5ml,制备S/O悬浮溶液。将该S/O悬浮溶液滴加到1%(w/v)聚乙烯醇水溶液20ml中,通过使用了混合器(シルバーソン社、L5M-A)的6,000rpm、5分钟的搅拌制备S/O/W型乳化溶液。通过液中干燥由该S/O/W型乳化溶液除去乙酸乙酯,制成颗粒悬浮液。将该悬浮液移至50ml管,通过8,000rpm、10分钟的离心分离使颗粒沉淀。除去上清之后,将颗粒在25ml的蒸馏水中再悬浮,通过上述条件下的离心分离使颗粒再次沉淀,从而洗涤。将该洗涤操作再一次重复,在除去上清之后使颗粒悬浮于包含5%(w/v)甘露糖醇和0.1%(w/v)聚山梨醇酯80的水溶液4ml。将该悬浮液用液氮预冷冻之后,使用冷冻干燥机以冷阱温度-45℃、真空度20Pa冷冻干燥12小时,从而获得含OVA的R848修饰黑酵母葡聚糖-PLGA颗粒(2)。用同样的方法得到将R848-黑酵母葡聚糖-PLGA和黑酵母葡聚糖-PLGA(表1、两亲性聚合物(3-1)~(3-4)、(4-1)、(4-2))以各种比率作为基材的含OVA的R848修饰黑酵母葡聚糖-PLGA颗粒(3)~(9)。
<含OVA的R848修饰凝结多糖-PLGA颗粒的制备>
使用R848-凝结多糖-PLGA(表1、修饰型两亲性聚合物(6-2))和凝结多糖-PLGA(表1、非修饰型两亲性聚合物(6-1))的聚合物混合粉体,用与上述同样的方法获得含OVA的R848修饰凝结多糖-PLGA颗粒(10)。
<比较颗粒:含OVA的右旋糖酐-PLGA颗粒、含OVA的黑酵母葡聚糖-PLGA颗粒的制备>
使用右旋糖酐-PLGA(表1、非修饰型两亲性聚合物(1-1))的聚合物单独粉体,用与上述同样的方法获得含OVA的右旋糖酐-PLGA颗粒(11)。
使用黑酵母葡聚糖-PLGA(表1、非修饰型两亲性聚合物(3-1))的聚合物单独粉体,用与上述同样的方法获得含OVA的黑酵母葡聚糖-PLGA颗粒(12)。
将各颗粒的评价结果示于表2。颗粒的平均粒径使用动态光散射装置(大塚电子株式会社、ELS-Z)通过半不变量法计算出(表2、图7:含OVA的R848修饰右旋糖酐-PLGA颗粒、图8:含OVA的R848修饰黑酵母葡聚糖-PLGA颗粒)。OVA抗原的含有率(w/w)通过使用有机溶剂从颗粒提取抗原,将提取出的抗原用凝胶电泳装置(TEFCO社)进行凝胶电泳,然后使用胶体CBB染色试剂盒(TEFCO社)进行染色,从而确定。
表2含OVA的各种颗粒的分析结果
(实施例4)使用了S/O/W乳化法的颗粒(含TRP2的R848修饰黑酵母葡聚糖-PLGA颗粒(13)~(16)、比较颗粒:含TRP2的黑酵母葡聚糖-PLGA颗粒(17))的制备
作为癌抗原,使用特别作为黑素瘤抗原已知的酪氨酸酶相关蛋白质2(TRP2)的表位肽、具体为作为人来源的TRP2氨基酸序列(UniProt接受号:P40126)和小鼠来源的TRP2氨基酸序列(UniProt接受号:P29812)中的共同表位肽的、这些氨基酸序列的序列编号180~188位的区域的多肽制作以下的颗粒。
<含TRP2的R848修饰黑酵母葡聚糖-PLGA颗粒的制备>
在R848-黑酵母葡聚糖-PLGA(表1、修饰型两亲性聚合物(4-2))和黑酵母葡聚糖-PLGA(表1、非修饰型两亲性聚合物(4-1))的聚合物混合粉体(100mg)中添加碳酸二甲酯(包含20%叔丁醇、0.05%span80)4ml,用小型混合器(11,000、1分钟)使其溶解。在所得的聚合物溶液中添加溶解有所述TRP2表位肽(Greiner社)的乙腈水溶液(75%、0.1%三氟乙酸(TFA);TRP2肽:1mg/ml)1ml、接着添加蒸馏水1ml,用小型混合器(19,000rpm、1分钟)使其乳化。将乳化液冷冻干燥,对所得的粉体添加乙酸乙酯10ml通过搅拌装置搅拌(300rpm、1分钟)使其分散,然后添加聚乙烯醇(PVA)水溶液(日本合成化学工业株式会社、1%EG-05P)40ml,通过搅拌装置搅拌(500rpm、1分钟)使其粗乳化。将该液进一步用混合器(5,000rpm、10分钟)搅拌,使其乳化。接着为了脱气而进行搅拌装置搅拌(100rpm、10分钟),然后用蒸发器除去有机溶剂。将残存液用细胞过滤网(40μm)过滤,进行30分钟冰冷却之后,离心分离(3,000g、4℃、30分钟)而除去上清。进一步添加0.1%Tween80水溶液50ml用涡旋振荡器使其分散之后,进行离心分离(4,000g、4℃、30分钟),除去上清。在其中作为赋形剂添加甘露糖醇水溶液(5%甘露糖醇、0.1%PVA水溶液)8ml通过涡旋振荡器使其分散,使用筛网过滤器(1μm)进行减压过滤,冷冻干燥一晚,得到含TRP2的R848修饰黑酵母葡聚糖-PLGA颗粒(14)。除了将R848修饰黑酵母葡聚糖-PLGA(表1、两亲性聚合物4-2)和黑酵母葡聚糖-PLGA(表1、两亲性聚合物4-1)以不同重量比率使用这一点之外,通过同样的方法获得含TRP2的R848修饰黑酵母葡聚糖-PLGA颗粒(13)、(15)、(16)。
<比较颗粒:含TRP2的黑酵母葡聚糖-PLGA颗粒的制备>
使用黑酵母葡聚糖-PLGA(表1、非修饰型两亲性聚合物(5-1))的聚合物单独粉体,用与上述同样的方法,得到含TRP2的黑酵母葡聚糖-PLGA颗粒(17)。
将各颗粒的评价结果示于表3。颗粒的平均粒径使用动态光散射装置(大塚电子株式会社、ELS-Z)通过半不变量法计算出(表3、图9:含TRP2的R848修饰黑酵母葡聚糖-PLGA颗粒)。
TRP2肽(抗原)的含有率(w/w)通过HPLC进行了评价。在颗粒粉末5mg中添加丙酮1ml,通过涡旋振荡器30秒、超声波处理5分钟使其分散,离心分离(13,000rpm、4℃、5分钟)之后除去上清。进而对沉淀物添加丙酮1ml,通过涡旋振荡器30秒使其分散,离心分离(13,000rpm、4℃、5分钟)之后除去上清(共2次)。用离心蒸发器在30℃使其干燥30分钟。干燥后的提取成分中添加50%乙腈水溶液(含有0,1%TFA)200μl,通过涡旋振荡器3秒、超声波处理5分钟使其溶解。在其中作为内标添加乙酰化色氨酸(1%二甲基亚砜、0.1%TFA水溶液中;10μg/ml)20μl,离心分离(13,000rpm、4℃、5分钟)之后回收上清。将上清注入HPLC(株式会社岛津制作所社制SCL-10A,柱:YMC-pack ODS-AM[AM12S05-1506WT])中,以使洗脱液的乙腈浓度缓缓上升的方式进行梯度洗脱。检测通过紫外可见吸收(220nm)进行,计算出肽的峰面积相对于内标的峰面积的比。使用实施了与上述同样的处理的TRP2肽+甘露糖醇粉末的试样测定结果作为含有率100%的基准,求出TRP2肽抗原的含有率。
表3
含TRP2的各种颗粒的分析结果
(参考例1)小鼠骨髓来源的树突状细胞的诱导
使C57BL/6小鼠雌性(日本エスエルシー株式会社制)通过颈椎脱臼安乐死,然后采集大腿骨。将大腿骨的两端用剪刀切断,在大腿骨的内部使用注射器注入包含10%胎牛血清(FBS、シグマ社)、100单元/ml青霉素、100μg/ml链霉素(ナカライテスク社)的RPMI1640培养基(以下、RPMI培养基),回收骨髓细胞。通过410g、5分钟的离心分离使细胞沉淀,除去上清。将回收的细胞悬浮在溶血用缓冲液(BD Bioscience社)1ml中之后,通过在室温静置5分钟使其溶血。在溶血后的细胞悬浮液中加入RPMI培养基10ml,通过1,500rpm、5分钟的离心分离使细胞沉淀,除去上清。使细胞悬浮于包含GM-CSF的RPMI培养基(以下,培养基)中之后,接种于6孔板(Corning社、Flat Bottom Tissue culture Treated,Polystyrene)中。接种后的板在设定为5%CO2、37℃、湿度100%的条件的CO2孵育箱(PHC社)内进行培养。在培养第2天和第5天进行培养基的交换,在培养第6天吸引浮游细胞之后,使用微量移液器强烈地进行悬浮,从而仅回收轻度黏附于板的细胞、即被诱导出的树突状细胞。将所回收的树突状细胞悬浮在“CELLBANKER2”(日本全药工业社)中,在-150℃保存直到使用。
(实施例5)使用了小鼠骨髓来源的树突状细胞(BMDC)的体外刺激试验(含TRP2的R848修饰黑酵母葡聚糖-PLGA颗粒(14))
<方法>
将参考例1中得到的树突状细胞与培养基一起以每1孔1×105个的方式接种于96孔板,进一步将实施例4中得到的含TRP2的R848修饰黑酵母葡聚糖-PLGA颗粒(14)以0.1mg/ml添加。接种后的板在CO2孵育箱内培养18小时,回收上清。关于上清中的TNF-α量,使用“Mouse TNF-αELISA developing kit”(MABTECH社制),按照附带的方案进行了测定。作为比较例,使用了0.1μg/ml LPS(阳性对照)、抗原(TRP2肽)、0.1mg/ml含TRP2的黑酵母葡聚糖-PLGA颗粒(17)、0.1mg/ml含TRP2的黑酵母葡聚糖-PLGA颗粒(17)与R848的混合物。此外,关于比较例的抗原和R848,以与0.1mg/ml含TRP2的R848修饰黑酵母葡聚糖-PLGA颗粒(14)中的含量相同的量添加。
<结果>
将上清中的TNF-α量示于图10。在使用含TRP2的R848修饰黑酵母葡聚糖-PLGA颗粒(14)的情况下,与含TRP2的黑酵母葡聚糖-PLGA颗粒(17)、含TRP2的黑酵母葡聚糖-PLGA颗粒(17)与R848的混合物相比,TNF-α的产生量高,因而表明,通过使R848与含TRP2的黑酵母葡聚糖-PLGA颗粒结合,从而能够更强地激活树突状细胞。
(实施例6)使用小鼠骨髓来源的树突状细胞(BMDC)的体外刺激试验2(含OVA的R848修饰右旋糖酐-PLGA颗粒(1)、含OVA的R848修饰黑酵母葡聚糖-PLGA颗粒(2))
<方法>
将参考例1中得到的树突状细胞与培养基一起以每1孔2×105个的方式接种于48孔板,进而将实施例3中得到的含OVA的R848修饰黑酵母葡聚糖-PLGA颗粒(2)、含OVA的R848修饰右旋糖酐-PLGA颗粒(1)分别以0.1mg/ml添加。作为比较例,设定了仅添加了与颗粒相同量的OVA的组。然后,将细胞在CO2孵育箱内培养18小时,除去上清,然后添加0.5mM EDTA进行5分钟处理而剥离细胞,使用微量移液器回收细胞。将所回收的细胞悬浮液置换到包含1%FBS的磷酸缓冲溶液中,添加APC标记抗CD86抗体、FITC标记抗CD11c抗体和APC-Cy7标记抗MHCII抗体(均为BD Bioscience社制),在4℃静置30分钟,从而进行抗体标记反应。抗体标记反应结束后,通过流式细胞仪利用荧光强度的平均值(MFI)评价了树突状细胞(CD11c阳性MHCII阳性细胞)的激活标志物(CD86)的表达量。作为比较例,仅以相同浓度添加OVA(阴性对照),同样地比较了激活标志物的表达量。
<结果>
分析作为CD86的表达量的指标的MFI,结果显示,含OVA的R848修饰黑酵母葡聚糖-PLGA颗粒(2)与仅OVA的组相比显示2.39倍高的表达强度。进而,含OVA的R848修饰右旋糖酐-PLGA颗粒(1)与仅OVA的组相比显示3.11倍高的荧光强度。即表明,与黑酵母葡聚糖-PLGA颗粒同样地,右旋糖酐-PLGA颗粒液通过R848的结合而具有显著高的树突状细胞激活能力。
(实施例7)使用了小鼠骨髓来源的树突状细胞(BMDC)的体外刺激试验3(含OVA的R848修饰黑酵母葡聚糖-PLGA颗粒(5)、(7)、(8)、(9))
<方法>
对于实施例3中得到的含OVA的R848修饰黑酵母葡聚糖-PLGA颗粒(5)、(7)、(8)、(9),使用参考例1中得到的树突状细胞,使用与实施例6同样的方法进行评价。含OVA的R848修饰黑酵母葡聚糖-PLGA颗粒(5)、(7)、(8)、(9)以0.1mg/ml添加,作为比较例仅将OVA(阴性对照)以相同浓度添加。
<结果>
与实施例6同样地分析作为CD86的表达量的指标的MFI,结果含OVA的R848修饰黑酵母葡聚糖-PLGA颗粒(5)、(7)、(8)、(9)与作为比较例的仅OVA的组相比,分别显示4.50倍、5.77倍、5.55倍、5.35倍高的荧光强度。即表明,修饰型两亲性聚合物重量相对于修饰型两亲性聚合物重量与非修饰型两亲性聚合物重量的合计的比率为10~100%的任意,都具有相同程度高的树突状细胞激活能力。
产业可利用性
本发明的免疫原性增强用组合物可以作为药物利用,特别是可以作为用于感染症、癌等的治疗和/或预防的疫苗利用。
本说明书中引用的全部期刊、专利和专利申请均直接通过引用而纳入本说明书中。
Claims (19)
1.免疫原性增强用组合物,含有包含修饰型两亲性聚合物和抗原的颗粒作为有效成分,所述修饰型两亲性聚合物是结合有免疫激活因子的两亲性聚合物,其中,疏水性链段是聚(羟基酸),亲水性链段是多糖。
2.根据权利要求1所述的免疫原性增强用组合物,作为构成所述颗粒的除抗原以外的成分,不包含脂质。
3.根据权利要求1或2所述的免疫原性增强用组合物,所述颗粒还包含非修饰型两亲性聚合物,所述非修饰型两亲性聚合物是没有结合免疫激活因子的两亲性聚合物,其中,疏水性链段是聚(羟基酸),亲水性链段是多糖。
4.根据权利要求1~3的任一项所述的免疫原性增强用组合物,所述多糖是右旋糖酐、β-葡聚糖、甘露聚糖、几丁质、脱乙酰几丁质、结冷胶、褐藻酸、透明质酸或短梗霉聚糖。
5.根据权利要求4所述的免疫原性增强用组合物,所述β-葡聚糖是通过1个以上的β-1,3键和/或1个以上的β-1,6键连接而成的葡萄糖的聚合物。
6.根据权利要求4或5所述的免疫原性增强用组合物,所述β-葡聚糖是黑酵母葡聚糖、凝结多糖、茯苓聚糖、昆布多糖、地衣多糖、裂褶菌多糖、香菇多糖、小核菌聚糖或茯苓次聚糖。
7.根据权利要求1~6的任一项所述的免疫原性增强用组合物,所述聚(羟基酸)是聚(乳酸-乙醇酸)、聚乳酸或聚乙醇酸。
8.根据权利要求1~7的任一项所述的免疫原性增强用组合物,所述修饰型两亲性聚合物中的所述两亲性聚合物与所述免疫激活因子的结合是共价结合。
9.根据权利要求1~8的任一项所述的免疫原性增强用组合物,所述修饰型两亲性聚合物中的所述免疫激活因子的结合部位是所述亲水性链段。
10.根据权利要求1~9的任一项所述的免疫原性增强用组合物,所述免疫激活因子是与Toll样受体即TLR、NOD样受体即NLR、RIG样受体或C型凝集素受体即CLR或干扰素基因刺激因子即STING结合的配体或激动剂。
11.根据权利要求10所述的免疫原性增强用组合物,与所述Toll样受体即TLR结合的配体或激动剂是与TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8、TLR9或TLR11结合的配体或激动剂。
12.根据权利要求10或11所述的免疫原性增强用组合物,与所述Toll样受体即TLR结合的配体或激动剂是以下(i)~(vii)的任意者,
(i)选自肽聚糖、脂蛋白、脂多糖和酵母聚糖中的与TLR2结合的配体或激动剂
(ii)选自Poly(I:C)和poly(A:U)中的与TLR3结合的配体或激动剂
(iii)选自脂多糖即LPS、HSP60、RS09和MPLA中的与TLR4结合的配体或激动剂
(iv)作为与TLR5结合的配体或激动剂的鞭毛蛋白
(v)选自咪唑并喹啉类化合物和单链RNA中的与TLR7或TLR8结合的配体或激动剂
(vi)选自细菌DNA、非甲基化CpG DNA、疟原虫色素即hemozorin、ODN1585、ODN1668和ODN1826中的与TLR9结合的配体或激动剂
(vii)选自组装抑制蛋白和尿路致病菌中的与TLR11结合的配体或激动剂。
13.根据权利要求1~12的任一项所述的免疫原性增强用组合物,与1分子所述修饰型两亲性聚合物结合的所述免疫激活因子的分子数为1~100。
14.根据权利要求1~13的任一项所述的免疫原性增强用组合物,所述颗粒的平均粒径为0.1~50μm。
15.含有权利要求1~14的任一项所述的免疫原性增强用组合物作为有效成分的药物。
16.含有权利要求1~14的任一项所述的免疫原性增强用组合物作为有效成分的疫苗。
17.用于癌的治疗和/或预防的疫苗,含有权利要求1~14的任一项所述的免疫原性增强用组合物作为有效成分。
18.免疫原性增强方法,包括:将权利要求1~14的任一项所述的免疫增强用组合物施与受检体。
19.用于癌的治疗和/或预防的方法,包括:将权利要求1~14的任一项所述的免疫原性增强用组合物、权利要求15所述的药物、或权利要求16或17所述的疫苗施与受检体。
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