KR20110128284A

KR20110128284A - 면역원성 조성물

Info

Publication number: KR20110128284A
Application number: KR1020117020493A
Authority: KR
Inventors: 레이지 니시오; 노부오 이다
Original assignee: 도레이 카부시키가이샤
Priority date: 2009-02-27
Filing date: 2010-02-26
Publication date: 2011-11-29
Also published as: JP6008345B2; ES2755361T3; US9056095B2; HUE046865T2; BRPI1005919B1; WO2010098432A1; JPWO2010098432A1; MX2011008923A; AU2010218752B2; AU2010218752A1; PT2402032T; CN102333541A; PL2402032T3; EP2402032B1; BRPI1005919A2; CA2753567A1; EP2402032A4; CA2753567C; DK2402032T3; CN102333541B

Abstract

소수성 세그먼트가 폴리(히드록시산)인 양친매성 폴리머로 이루어지는 아쥬반트 미립자에 항원이 내포된 항원-아쥬반트 미립자 복합체 또는 상기 복합체가 회합해서 이루어지는 입자를 유효 성분으로서 함유하는 면역원성 조성물은 소량의 항원, 적은 투여 횟수로 항원에 대한 높은 면역응답을 유도할 수 있으므로 감염증이나 암 등의 치료 및 예방에 유효한 백신으로서 유용하다.

Description

면역원성 조성물{IMMUNOGENIC COMPOSITION}

본 발명은 양친매성 폴리머로 이루어지는 아쥬반트 미립자에 항원이 내포된 항원-아쥬반트 미립자 복합체를 유효 성분으로서 함유하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.

항원의 면역 활성화능을 향상시키기 위해서 아쥬반트가 항원과 함께 사용되고 있다. 아쥬반트로서 높은 효과가 알려져 있는 것은 완전 프로인트 아쥬반트(CFA)이지만, 사균 및 오일 에멀션으로 이루어지는 CFA는 투여 부위에 강한 염증반응 및 궤양성 종장(육아종) 형성이 생기는 등 강한 부작용이 있으므로 안전상의 우려가 있어 인간에게 사용하는 것은 허가되어 있지 않다. 인간에게의 투여가 허가되어 있는 아쥬반트는 한정되어 있다. 인간에게의 투여가 허가된 아쥬반트에 수산화알루미늄 아쥬반트가 있지만, 이 아쥬반트는 면역 활성화 능력이 충분하다고는 할 수 없어 면역을 획득시키기 위해서 반복 투여가 필요하다. 이 때문에 인간에게 사용할 수 있는 효율적이며 강력한 아쥬반트를 사용한 면역원성 조성물의 개발이 요망되고 있다.

높은 면역 활성화능을 목표로 한 새로운 아쥬반트의 개발로서 항원을 미립자에 내포하는 방법이 시도되고 있다. 항원을 미립자화해서 투여함으로써 항원을 단독으로 투여하는 경우에 비해 항체 산생 등의 면역반응이 높아지는 것이 보고되고 있지만, 그 효과는 그다지 높지 않고, 상술한 수산화알루미늄 아쥬반트와 같은 정도의 효과가 보고되고 있을 뿐이다. 이것은 지금까지 검토되어 온 미립자, 예를 들면 소수성의 폴리락트산-폴리글리콜산 공중합체 폴리머로 이루어지는 미립자는 단백 등의 친수성의 항원분자를 효율 좋게 구조를 유지한 상태로 내포시키는 것이 곤란한 것이 원인으로서 여겨진다(비특허문헌 1).

최근, 양친매성 폴리머를 이용한 고분자량의 단백질을 높은 효율로 봉입시킬 수 있는 새로운 미립자 기술이 보고되고 있다(특허문헌 1, 2). 이 새로운 미립자에 대해서는 약물의 서방성능에 관한 검토가 이루어지고 있지만, 항원을 내포시킨 경우의 아쥬반트 기능에 대해서는 전혀 검토가 이루어지고 있지 않다. 또한, 항원을 포함하는 미립자가 아쥬반트로서 기능하는 메커니즘은 항원분자를 서방하는 기능과 아울러 항원을 포함하는 미립자가 입자마다 면역세포에 도입되어 세포 내에서 항원을 유리하는 메커니즘이 중요하다고 생각되어지고 있으며, 입자로부터의 약물방출의 기능과 아쥬반트로서의 성능은 일치하지 않다라고 생각되어지고 있으므로 입자의 서방성능으로부터 아쥬반트 기능을 추측하는 것은 곤란하며, 기존의 미립자를 사용한 기술이며, 알루미늄 아쥬반트를 훨씬 능가하는 성능을 갖는 효과적인 아쥬반트는 그 개발이 요망되고 있음에도 불구하고 지금까지 실현되고 있지 않았다.

WO 2006/095668호 일본 특허 공개 2008-088158호 공보

어드밴스드 드러그 딜리버리 리뷰즈, 2005년 57호, 391-410페이지

본 발명의 목적은 적은 항원량, 적은 투여 횟수로 높은 면역 활성화능을 갖는 면역원성 조성물을 제공하는 것에 있다.

상기 과제를 극복하기 위해서 본 발명자들은 소량의 항원을 사용해서 적은 투여 횟수로 높은 면역 활성화를 일으킬 수 있는 수단을 검토한 결과, 아쥬반트 미립자에 항원을 내포시킨 항원-아쥬반트 미립자 복합체가 생체 내에서 높은 면역 활성화능을 갖는 것을 발견했다. 즉, 본 발명은 이하와 같은 구성을 갖는다.

(1) 소수성 세그먼트가 폴리(히드록시산)인 양친매성 폴리머로 이루어지는 아쥬반트 미립자에 항원이 내포된 항원-아쥬반트 미립자 복합체를 유효 성분으로서 함유하는 면역원성 조성물.

(2) (1)에 있어서, 항원-아쥬반트 미립자 복합체가 회합해서 이루어지는 입자를 유효 성분으로서 함유하는 면역원성 조성물.

(3) (1) 또는 (2)에 있어서, 아쥬반트 미립자가 양친매성 폴리머의 친수성 세그먼트로 이루어지는 친수성 부분을 내부에 갖고, 양친매성 폴리머의 소수성 세그먼트로 이루어지는 소수부분의 외층을 갖는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.

(4) (1)∼(3) 중 어느 하나에 있어서, 양친매성 폴리머의 친수성 세그먼트가 다당 또는 폴리에틸렌글리콜인 면역원성 조성물.

(5) (1)∼(4) 중 어느 하나에 있어서, 양친매성 폴리머가 다당 주쇄 및 폴리(히드록시산) 그래프트쇄로 이루어지는 그래프트형 양친매성 폴리머인 면역원성 조성물.

(6) (4) 또는 (5)에 있어서, 다당이 덱스트란인 면역원성 조성물.

(7) (1)∼(4) 중 어느 하나에 있어서, 양친매성 폴리머가 폴리(히드록시산) 및 폴리에틸렌글리콜로 이루어지는 블럭 폴리머인 면역원성 조성물.

(8) (1)∼(7) 중 어느 하나에 있어서, 폴리(히드록시산)이 폴리(락트산-글리콜산)인 면역원성 조성물.

(9) (1)∼(8) 중 어느 하나에 있어서, 표면 개질제가 아쥬반트 미립자의 폴리(히드록시산)에 결합되어 있는 면역원성 조성물.

(10) 항원-아쥬반트 미립자 복합체 또는 항원-아쥬반트 미립자 복합체가 회합해서 이루어지는 입자의 평균 입경이 0.1∼50㎛인 면역원성 조성물.

(11) (1)∼(10) 중 어느 하나에 있어서, 면역 활성화 물질을 더 함유하는 면역원성 조성물.

(12) (11)에 있어서, 면역 활성화 물질이 핵산인 면역원성 조성물.

(13) (11) 또는 (12)에 있어서, 면역 활성화 물질이 CpG인 면역원성 조성물.

(발명의 효과)

본 발명에 의해 종래보다 생체 내에서 강력한 면역 활성화가 가능해지는 면역원성 조성물이 제공된다.

도 1은 OVA 함유 면역원성 조성물의 면역평가 1.
도 2는 CEA 함유 면역원성 조성물의 면역평가(전체 IgG).
도 3은 CEA 함유 면역원성 조성물의 면역평가(IgG2a).
도 4는 OVA 함유 면역원성 조성물의 면역평가 2.
도 5는 OVA 함유 면역원성 조성물의 면역평가 3.
도 6은 HCV 구성 단백 함유 면역원성 조성물의 면역평가.
도 7은 CEA 함유 면역원성 조성물의 면역평가 2.
도 8은 CEA 함유 면역원성 조성물의 면역평가 3.
도 9는 OVA 함유 면역원성 조성물의 면역평가 4.
도 10은 CEA 함유 면역원성 조성물의 면역평가 4.
도 11은 CEA 함유 면역원성 조성물의 면역평가(IgG2a/IgG1 비율).

본 발명은 소수성 세그먼트가 폴리(히드록시산)인 양친매성 폴리머로 이루어지는 아쥬반트 미립자에 항원이 내포된 항원-아쥬반트 미립자 복합체를 함유하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.

우선, 아쥬반트 미립자를 구성하는 양친매성 폴리머에 대해서 설명한다. 양친매성이란 친수성과 소수성 양쪽의 성질을 갖고 있다는 것이며, 친수성이란 임의의 부위의 물에의 용해도가 다른 부위보다 높을 때 상기 부위를 친수성이라고 한다. 친수부위는 물에 가용인 것이 바람직하지만, 난용이어도 다른 부위와 비교해서 물에의 용해도가 높으면 좋다. 또한, 소수성이란 임의의 부위의 물에의 용해도가 다른 부위보다 낮을 때 상기 세그먼트를 소수성이라고 한다. 소수성 부위는 물에 불용인 것이 바람직하지만, 가용이어도 다른 부위와 비교해서 물에의 용해도가 낮으면 좋다.

양친매성 폴리머란 분자 전체로서 상술한 양친매성을 갖는 폴리머이다. 폴리머란 양친매성 폴리머의 친수성 세그먼트 또는 소수성 세그먼트, 또는 그 양쪽이 최소 단위(모노머)의 반복 구조로 구성된 분자 구조인 것을 나타낸다. 본 발명에 있어서의 양친매성 폴리머는 친수성 세그먼트와 소수성 세그먼트를 갖는 구조이면 좋고, 친수성 세그먼트와 소수성 세그먼트가 연결된 직쇄상의 블럭 폴리머이어도 좋고, 친수성 세그먼트 또는 소수성 세그먼트, 또는 그 양쪽이 복수개 존재하는 분기를 갖는 분기 폴리머, 친수성 세그먼트에 복수의 소수성 세그먼트가 그래프트되어 있거나, 또는 소수성 세그먼트에 복수의 친수성 세그먼트가 그래프트되어 있는 그래프트 폴리머이어도 좋다. 바람직하게는 친수성 세그먼트가 1개의 폴리머이며, 가장 바람직하게는 친수성 세그먼트, 소수성 세그먼트를 1개씩 갖는 직쇄상의 블럭 폴리머 또는 친수성 세그먼트 주쇄에 복수의 소수성 세그먼트가 그래프트되어 있는 그래프트 폴리머이다.

면역원성 조성물을 구성하는 양친매성 폴리머는 아쥬반트 미립자로서의 성질을 갖는 한은 친수부분 또는 소수부분, 또는 그 양쪽이 다른 구성 폴리머로 이루어지는 복수 종류의 양친매성 폴리머, 구성 폴리머는 같아도 복수 종류의 연결 양식을 갖는 양친매성 폴리머의 집합이어도 좋지만, 안정된 성능을 달성시켜 생산성을 높이기 위해서는 적은 종류의 양친매성 폴리머의 집합인 것이 바람직하고, 바람직하게는 주로 2종류 이하의 양친매성 폴리머의 집합, 보다 바람직하게는 주로 단일 종류의 양친매성 폴리머로 구성되어 있는 것이다.

본 발명에 있어서는 양친매성 폴리머의 소수성 세그먼트가 폴리(히드록시산)인 것을 특징으로 하고 있다. 폴리(히드록시산)이면 특별히 한정되지 않지만, 생체 투여시에 현저하게 유해한 영향을 주지 않는 생체 적합성 폴리머인 것이 바람직하다. 여기에서 말하는 생체 적합성이란 래트에 상기 폴리머를 경구 투여하는 경우의 LD50이 2,000mg/kg 이상인 것을 가리킨다. 또한, 복수 종류의 히드록시산의 공중합체이어도 좋지만, 바람직하게는 2종류 이하의 히드록시산의 중합체이다. 바람직한 폴리(히드록시산)의 구체예로서는 폴리글리콜산, 폴리락트산, 폴리(2-히드록시부티르산), 폴리(2-히드록시발레르산), 폴리(2-히드록시카프론산), 폴리(2-히드록시카프린산), 폴리(말산) 또는 이들의 고분자 화합물의 유도체 및 공중합체를 들 수 있지만, 폴리락트산, 폴리글리콜산 또는 폴리(락트산-글리콜산)의 공중합체가 보다 바람직하다. 또한, 폴리(히드록시산)이 폴리(락트산-글리콜산)인 경우 폴리(락트산-글리콜산)의 조성비(락트산/글리콜산)(몰/몰%)는 본 발명의 목적이 달성되는 한 특별히 한정되지 않지만, 100/0∼30/70의 것이 바람직하고, 60/40∼40/60의 것이 보다 바람직하다.

양친매성 폴리머의 친수성 세그먼트에 대해서는 특별히 한정되지 않지만, 소수성 세그먼트와 마찬가지로 생체 적합성 폴리머인 것이 바람직하다. 또한, 양친매성 폴리머로 이루어지는 아쥬반트 미립자에 지속적인 아쥬반트능을 부여하기 위해서는 포유류 또는 조류의 생체 내 또는 세포 내에서 분해되기 어려운 난분해성 폴리머인 것이 바람직하다. 생체 적합성 분자이며 난분해성 폴리머의 구체예로서는 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알콜, 폴리에틸렌이민, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 폴리-1,3-디옥솔란, 2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린폴리머, 폴리-1,3,6-트리옥산, 폴리아미노산 또는 난분해성의 다당(예를 들면, 셀룰로오스, 키틴, 키토산, 젤란검, 아르긴산, 히알루론산, 풀루란 또는 덱스트란)을 들 수 있고, 친수성 세그먼트가 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알콜, 폴리에틸렌이민, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 폴리-1,3-디옥솔란, 2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린폴리머, 폴리-1,3,6-트리옥산 또는 폴리아미노산인 경우 양친매성 폴리머는 친수성 세그먼트 및 소수성 세그먼트를 1개씩 갖는 직쇄상의 블럭 폴리머인 것이 바람직하고, 친수성 세그먼트가 다당인 경우 양친매성 폴리머는 친수성 세그먼트 주쇄에 복수의 소수성 세그먼트가 그래프트되어 있는 그래프트 폴리머인 것이 바람직하다. 또한, 양친매성 폴리머의 친수성 세그먼트로서는 폴리에틸렌글리콜 또는 난분해성의 다당인 것이 바람직하고, 다당으로서는 덱스트란이 보다 바람직하다.

상기 폴리(히드록시산)의 소수성 세그먼트와 친수성 세그먼트로 이루어지는 양친매성 폴리머는 폴리머 전체로서 수비혼화성의 성질인 것이 면역원성 조성물의 항원 내포성 및 생체 투여시의 지속성이 향상되므로 바람직하다.

양친매성 폴리머에 있어서의 친수성 세그먼트의 평균 분자량은 특별히 한정되지 않지만, 친수성 세그먼트와 소수성 세그먼트가 직쇄상으로 결합된 블럭 폴리머인 경우 바람직하게는 1,000∼50,000이며, 보다 바람직하게는 2,000∼15,000이다. 여기에서, 용어 「블럭」이란 폴리머 분자의 일부분이며, 적어도 5개 이상의 모노머 단위로 이루어지고, 그 부분에 인접하는 다른 부분과 화학 구조 상 또는 입체 배치 상 다른 것을 말하며, 적어도 2 이상의 블럭이 선상으로 연결되어 생긴 폴리머를 블럭 폴리머라고 한다. 블럭 폴리머를 구성하는 각 블럭 자체가 2종류 이상의 모노머 단위로 이루어지는 랜덤, 교대, 그라디언트 폴리머이어도 좋다. 본 발명에 있어서는 친수성 세그먼트를 형성하는 폴리머와 폴리히드록시산이 각각 1개씩 연결된 블럭 폴리머인 것이 바람직하다.

또한, 친수성 세그먼트 주쇄에 소수성 세그먼트가 그래프트되어 있는 그래프트 폴리머의 경우 친수성 세그먼트의 평균 분자량은 바람직하게는 1,000∼100,000이며, 보다 바람직하게는 2,000∼50,000, 더욱 바람직하게는 10,000∼40,000이다. 또한, 그래프트쇄의 수는 바람직하게는 2∼50이다. 그래프트쇄의 수는 ¹H-NMR 측정에 의해 얻어지는 친수성 세그먼트 주쇄와 소수성 세그먼트 주쇄의 비율 및 소수성 세그먼트의 평균 분자량과, 사용한 친수성 세그먼트 주쇄의 평균 분자량으로부터 구할 수 있다.

소수성 세그먼트와 친수성 세그먼트의 바람직한 평균 분자량비는 양친매성 폴리머에 따라 다르지만, 소수성 세그먼트와 친수성 세그먼트가 직쇄상으로 연결된 블럭 폴리머의 경우 친수성 세그먼트와 소수성 세그먼트의 평균 분자량비는 1:1 이상이 바람직하고, 1:2 이상이 보다 바람직하고, 1:4 이상이 더욱 바람직하고, 특히 바람직한 것은 1:4 이상 1:25 이하이다.

친수성 세그먼트 주쇄에 복수의 소수성 세그먼트 그래프트쇄가 결합된 그래프트 폴리머의 경우 친수성 세그먼트 주쇄부와 소수성 세그먼트 그래프트쇄 전체의 평균 분자량비가 1:3 이상이며, 또한 각 그래프트쇄의 평균 분자량이 2,500∼40,000인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 전체의 평균 분자량비가 1:5 이상이며, 각 그래프트쇄의 평균 분자량이 5,000∼40,000이다.

또한, 상술의 평균 분자량이란 특별히 기재하지 않는 한 수평균 분자량을 말한다. 수평균 분자량이란 분자의 크기의 가중을 고려하지 않는 방법으로 산출한 평균 분자량이며, 양친매성 폴리머 및 양친매성 폴리머의 친수성 세그먼트를 구성하는 폴리머의 수평균 분자량은 겔퍼미션 크로마토그래피(GPC)로 측정한 폴리스티렌이나 풀루란 환산의 분자량으로서 구할 수 있다. 또한, 폴리(히드록시산)의 평균 분자량은 핵자기 공명(NMR) 측정에 의해 말단 잔기의 피크 적분값과 말단 잔기 이외의 피크 적분값의 비로부터 구할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 양친매성 폴리머는 기지의 방법으로 합성하면 좋고, 친수성 세그먼트가 되는 폴리머에 폴리(히드록시산) 폴리머를 첨가해서 축합반응을 행하여 제조하는 방법, 친수성 세그먼트가 되는 폴리머에 히드록시산 활성화 모노머를 첨가해서 중합 반응을 행하여 제조하는 방법이나, 또한 반대로 폴리(히드록시산) 중합체인 소수성 세그먼트에 친수성 세그먼트를 구성하는 모노머를 첨가해서 중합 반응을 행하는 방법을 예로서 들 수 있다.

예를 들면, 폴리에틸렌글리콜 및 폴리(히드록시산)으로 이루어지는 양친매성 폴리머이면, 주석 촉매 존재 하에서 폴리에틸렌글리콜에 히드록시산 활성화 모노머를 첨가해서 중합 반응을 행하고, 폴리(히드록시산)을 도입함으로써 양친매성 블럭 폴리머를 제조하는 방법[Journal of Controlled Release, 71, p.203-211(2001년)]에 의해 제조할 수 있다.

또한, 예를 들면, 다당 및 폴리(히드록시산) 그래프트쇄로 이루어지는 그래프트형 양친매성 폴리머이면 이하의 (1), (2) 또는 (3)과 같이 해서 제조할 수 있다.

(1) 주석 촉매 존재 하에서 다당에 히드록시산 활성화 모노머를 첨가해서 중합 반응을 행하고, 폴리(히드록시산)을 도입함으로써 그래프트형 양친매성 폴리머를 제조하는 방법[Macromolecules, 31, p.1032-1039(1998년)]

(2) 수산기의 대부분이 치환기로 보호된 다당의 일부 미보호의 수산기를 염기로 활성화한 후, 히드록시산 활성화 모노머를 첨가해서 폴리(히드록시산)으로 이루어지는 그래프트쇄를 도입하고, 마지막에 보호기를 제거함으로써 그래프트형 양친매성 폴리머를 제조하는 방법[Polymer, 44, p.3927-3933,(2003년)]

(3) 다당에 대하여 폴리(히드록시산)의 공중합체를 탈수제 및/또는 관능기의 활성화제를 사용해서 축합반응시킴으로써 그래프트형 양친매성 폴리머를 제조하는 방법[Macromolecules, 33, p.3680-3685(2000년)].

이어서, 아쥬반트 미립자에 대해서 설명한다. 아쥬반트 미립자란 아쥬반트능을 갖는 미립자이며, 아쥬반트능이란 항원을 생체 내에 투여한 경우의 면역응답을 항원단독을 투여했을 때에 비해서 높게 일으킬 수 있는 것을 나타낸다. 또한, 본 발명에 있어서는 아쥬반트 미립자는 양친매성 폴리머로 이루어지는 미립자인 것을 특징으로 하고, 또한, 아쥬반트 미립자는 항원을 내포함으로써 항원-아쥬반트 미립자 복합체를 형성하고, 상기 복합체가 본 발명의 면역원성 조성물의 유효 성분이 되는 것을 특징으로 하고 있다.

아쥬반트 미립자의 구조로서는 특별히 한정되지 않지만, 양친매성 폴리머의 친수성 세그먼트를 아쥬반트 미립자의 내측에 갖고, 양친매성 폴리머의 소수성 세그먼트의 외층을 갖는 구조를 취할 경우 내포되는 항원이 안정되게 유지되므로 바람직하다. 상기 구조의 아쥬반트 미립자를 제조하는 방법으로서는 한정되지 않지만, 예를 들면 (a) 수계 용매 A와 양친매성 폴리머를 용해한 수비혼화성 유기 용매 B를 혼합함으로써 역상 에멀션을 형성하는 공정 및 (b) 역상 에멀션으로부터 용매를 제거해서 아쥬반트 미립자를 얻는 공정을 포함하는 방법에 의해 제조할 수 있다. 그 때, 수계 용매 A에 항원을 함유시킴으로써 항원이 내포된 항원-아쥬반트 미립자 복합체를 구성할 수 있다. 이하, 공정 (a) 및 (b)에 대해서 설명한다.

공정 (a)에 있어서의 수계 용매 A에는 물 또는 수용성 성분을 함유하는 수용액을 사용한다. 상기 수용성 성분으로서 예를 들면, 무기 염류, 당류, 유기 염류, 아미노산 등을 들 수 있다.

또한, 공정 (a)에 있어서의 수비혼화성 유기 용매 B는 상기 양친매성 폴리머의 폴리(히드록시산)이 가용이며 또한, 친수성 세그먼트를 구성하는 폴리머가 난용 또는 불용인 것이 바람직하고, 또한 동결 건조에 의해 휘산 제거할 수 있는 것이 바람직하다. 상기 수비혼화성 유기 용매 B의 물에의 용해도는 바람직하게는 30g(수비혼화성 유기 용매 B)/100㎖(물) 이하이다. 수비혼화성 유기 용매 B의 구체예로서는 아세트산 에틸, 아세트산 이소프로필, 아세트산 부틸, 탄산 디메틸, 탄산 디에틸, 염화메틸렌, 클로로포름을 들 수 있다.

수비혼화성 유기 용매 B에 대한 수계 용매 A의 비는 1,000:1∼1:1, 바람직하게는 100:1∼1:1이다. 상기 수비혼화성 유기 용매 B 중의 양친매성 폴리머의 농도는 수비혼화성 유기 용매 B, 양친매성 폴리머의 종류에 따라 다르지만, 0.01∼90%(w/w), 바람직하게는 0.1∼50%(w/w), 보다 바람직하게는 1∼20%(w/w)이다.

공정 (a)에 있어서의 수계 용매 A, 양친매성 폴리머를 용해한 수비혼화성 유기 용매 B에 의해 역상 에멀션을 형성하는 공정에 있어서 제제학적 목적에 따라서 2종 이상의 양친매성 폴리머를 용해한 수비혼화성 유기 용매 B에 의해 역상 에멀션을 형성해도 좋다.

공정 (a)에 있어서는 역상 에멀션의 형성을 보조하고, 균일하며 또한 미소한 역상 에멀션을 형성할 목적을 위해서 공제를 첨가할 수 있다. 공제로서는 탄소수 3∼6의 알킬알콜, 탄소수 3∼6의 알킬아민, 탄소수 3∼6의 알킬카르복실산으로부터 선택되는 화합물이 바람직하다. 이들 공제의 알킬쇄의 구조는 특별히 한정되지 않고, 직쇄 구조이어도 분기 구조이어도 좋고, 포화 알킬이어도, 불포화 알킬이어도 좋다. 본 발명에 있어서 공제로서는 tert-부탄올, iso-프로판올, 펜탄올이 특히 바람직하다.

공정 (b)에 있어서, 역상 에멀션으로부터 용매를 제거하는 방법은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 가열, 감압 건조, 투석, 동결 건조, 원심 조작, 여과, 재침전 및, 이들의 조합을 들 수 있다. 상기 역상 에멀션으로부터 용매를 제거하는 방법 중에서도 동결 건조는 역상 에멀션 중의 입자의 합일 등에 의한 구조변화가 적어 바람직하다. 동결 건조의 조건, 장치로서는 동결 과정과 감압 하에서의 건조 공정을 포함하는 것이며, 동결 건조의 상법인 예비 동결, 감압·저온 하에서의 1차 건조, 감압 하에서의 2차 건조를 거치는 공정이 특히 바람직하다. 예를 들면 항원-아쥬반트 미립자 복합체의 수비혼화성 용매 분산체를 얻는 경우는 역상 에멀션을 구성하는 수계 용매 A와 수비혼화성 유기 용매 B의 융점 이하로 냉각·동결하고, 이어서 감압 건조함으로써 동결 건조된 아쥬반트 미립자가 얻어진다. 예비동결의 온도로서는 용매 조성으로부터 적당히 실험적으로 결정하면 좋지만, -20℃ 이하가 바람직하다. 또한, 건조 과정에 있어서의 감압도도 용매 조성으로부터 적당히 실험적으로 결정하면 좋지만, 3,000Pa 이하가 바람직하고, 500Pa 이하가 건조 시간의 단축을 위해 보다 바람직하다. 동결 건조에는 콜드 트랩을 구비해서 진공 펌프와 접속 가능한 래버러토리용 동결 건조기나 의약품의 제조 등에 사용되는 선반식 진공 동결 건조기를 사용하는 것이 바람직하고, 액체 질소, 냉매 등에 의한 예비 동결 후, 냉각 하 또는 실온에서 진공 펌프 등의 감압 장치로 감압 건조를 행하면 좋다.

아쥬반트 미립자에 내포되는 항원의 종류는 특별히 한정되는 것은 아니고, 펩티드, 단백질, 당단백질, 당지질, 지질, 탄수화물, 핵산, 다당류 및 이들을 포함하는 바이러스, 균체, 알레르기 원인 물질, 조직, 세포 등이면 좋다. 구체예를 들면 화분 유래 항원, A형 간염 바이러스 유래 항원, B형 간염 바이러스 유래 항원, C형 간염 바이러스 유래 항원, D형 간염 바이러스 유래 항원, E형 간염 바이러스 유래 항원, F형 간염 바이러스 유래 항원, HIV 바이러스 유래 항원, 인플루엔자 바이러스 유래 항원, 헤르페스 바이러스(HSV-1, HSV-2) 유래 항원, 탄저균 유래 항원, 크라디미아 유래 항원, 폐렴구균 유래 항원, 일본 뇌염 바이러스 유래 항원, 홍역 바이러스 유래 항원, 풍진 바이러스 유래 항원, 파상풍균 유래 항원, 수두 바이러스 유래 항원, SARS 바이러스 유래 항원, EB 바이러스 유래 항원, 파피로마 바이러스 유래 항원, 헬리코박터피로리(Helicobacterpylori)균 유래 항원, 광견병 바이러스 유래 항원, 웨스트나일 바이러스 유래 항원, 한타 바이러스 유래 항원, 연쇄구균 유래 항원, 포도상구균 유래 항원, 백일해(Bordetellapertussis)균 유래 항원, 결핵균(Mycobacteriumtuberculosis) 유래 항원, 말라리아 원충(Plasmodium) 유래 항원, 폴리오 바이러스 유래 항원, 각종 인축 공통 감염증 유래 항원, 암 항원, 각종 음식물 알레르기 유래 항원 등이다.

내포되는 항원은 단일일 필요는 없다. 이것은 본 발명의 응용을 고려한 경우에 단독의 단백이나 펩티드가 아닌 암 세포나, 세균, 바이러스 등 복수의 구성물로 구성된 것에 대한 면역응답을 일으키는 경우가 있고, 이 경우는 면역응답을 일으킬 수 있는 복수 종류의 단백질 등이나, 종류를 특정할 수 없는 혼합물이어도 좋다. 또한 적극적으로 복수 종류의 항원에 대한 면역응답을 일으키는 것을 목적으로 하고, 복수 종류의 항원을 함유시키는 것도 본 발명의 면역원성 조성물의 이용 형태의 하나이다. 바람직하게는 3종류 이하, 보다 바람직하게는 단일 종류인 항원이 아쥬반트 미립자에 내포된다.

본 발명에 있어서의 항원-아쥬반트 미립자 복합체는 아쥬반트 미립자를 구성하는 폴리머의 종류 및 조제 방법에 따라 함유되는 항원의 유지성을 변화시킬 수 있다. 본 발명에 있어서의 항원-아쥬반트 미립자 복합체가 면역원성을 초래하는 메커니즘으로서는 아쥬반트 미립자로부터 방출된 항원이 면역담당 세포에 인식되는 과정이나, 아쥬반트 미립자째 면역담당 세포에 인식되는 과정 등 복수의 과정이 고려되고, 이들 과정의 상승 효과에 따라서도 효과가 얻어진다.

항원-아쥬반트 미립자 복합체가 면역담당 세포에 항원을 인식시키는 과정은 그 과정마다 야기되는 면역반응의 종류도 달라 발생시키고 싶은 면역반응의 종류나 투여 부위에 따라 바람직한 과정을 선택하면 좋다. 즉, 항원은 항원-아쥬반트 미립자 복합체로부터 반드시 방출될 필요는 없고, 목적으로 하는 최량의 면역원성을 갖는 형태는 항원과 활성화시키고 싶은 면역반응의 종류에 따라 최적화되는 것이 바람직한 사용 방법이다. 그러나 항원이 현저하게 빠르게 항원-아쥬반트 미립자 복합체로부터 방출되는 경우는 본 발명의 양호한 성질인 장기간의 지속적인 면역 활성화 작용이 얻어지지 않기 때문에 항원-아쥬반트 미립자 복합체에 있어서의 항원의 10% 이상이 생체 내에 투여 1주간 후에도 복합체로서 유지되어 있는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 투여 1주간 후에 50% 이상이 내포되어 있는 것이다. 이들의 방출 거동은 실시예에도 나타내는 바와 같이 생체 내 환경을 모방한 in vitro 평가에 의해 확인할 수 있다.

또한, 항원-아쥬반트 미립자 복합체는 상기 복합체가 회합한 입자상태에 있어도 본 발명의 면역원성 조성물의 유효 성분으로서 양호하게 효과를 나타내는 여기에서 말하는 회합이란 2 이상의 입자가 입자간력 또는 타물질을 통해 결합되어 집합체를 형성하는 것이다. 입자간력은 특별히 한정되지 않지만, 소수성 상호작용, 수소결합, 반데르발스력을 들 수 있다. 회합은 미립자끼리가 접하고 있는 상태에 한정되지 않고, 미립자간에 미립자와 친화성을 갖는 물질이 존재하고 있어도 좋고, 매트릭스에 미립자가 분산되어 있어도 좋다. 미립자에 친화성을 갖는 물질, 매트릭스로서는 폴리머가 바람직하고, 소수성 부분이 폴리(히드록시산)인 양친매성 폴리머이며, 아쥬반트 미립자와 같은 구성 성분인 폴리머가 보다 바람직하고, 구체예로서 다당 주쇄 및 폴리(히드록시산) 그래프트쇄로 이루어지는 양친매성 폴리머, 폴리에틸렌글리콜과 폴리(히드록시산)으로 이루어지는 블럭 폴리머 또는 폴리(히드록시산)을 들 수 있다.

항원-아쥬반트 미립자 복합체의 회합은 사용시에 재분리되는 상태이어도 좋고, 재분리되지 않는 상태이어도 좋다. 또한, 항원-아쥬반트 미립자 복합체가 회합해서 이루어지는 입자의 형태가 상기 복합체가 회합한 것을 모르는 상태이어도 그 제조 공정에 상기 복합체를 회합시키는 공정을 포함할 경우 상기 복합체가 회합한 입자인 것이라 여겨진다.

항원-아쥬반트 미립자 복합체를 회합시키는 공정은 특별히 제한되는 것이 아니지만, 구체예로서 항원-아쥬반트 미립자 복합체 또는 상기 복합체 분산액을 표면 개질제를 포함하는 액상 C에 도입해서 분산매를 제거함으로써 회합시키는 공정을 들 수 있고, 이하, 상기 공정에 대해서 설명한다.

항원-아쥬반트 미립자 복합체를 분산매에 분산시키고, 상기 복합체 분산액을 조제할 경우 분산매로서는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 아쥬반트 미립자가 내부에 양친매성 폴리머의 친수성 세그먼트로 이루어지는 친수성 부분을 갖고, 양친매성 폴리머의 소수성 세그먼트로 이루어지는 소수부분을 외층에 갖는 경우는 그 구조를 보호할 목적으로 양친매성 폴리머의 폴리(히드록시산)이 가용이며 또한, 친수성 세그먼트를 구성하는 폴리머를 실질적으로 용해하지 않는 용매인 것이 바람직하고, 그 경우, 수비혼화성 유기 용매이어도 수혼화성 유기 용매이어도 좋다. 양친매성 폴리머의 폴리(히드록시산)이 가용이며 또한, 친수성 세그먼트를 구성하는 폴리머를 실질적으로 용해하지 않는 용매의 구체예로서는 아세트산 에틸, 아세트산 이소프로필, 아세트산 부틸, 탄산 디메틸, 탄산 디에틸, 염화메틸렌, 클로로포름, 디옥산, 톨루엔, 크실렌 등을 들 수 있다.

액상 C으로서는 표면 개질제를 가용이며 또한, 분산매보다 높은 비점을 갖는 것이 바람직하고, 수계 용매, 수비혼화성 유기 용매, 수혼화성 유기 용매 중 어느이어도 좋다. 여기에서 말하는 수계 용매로서는 물 또는 수용성 성분을 함유하는 수용액이 바람직하고, 상기 수용성 성분으로서, 예를 들면, 무기 염류, 당류, 유기 염류, 아미노산 등을 들 수 있다. 수비혼화성 유기 용매로서는 예를 들면, 실리콘유, 참깨유, 대두유, 콘유, 면실유, 코코넛유, 아마씨유, 광물유, 피마자유, 경화 피마자유, 유동 파라핀, n-헥산, n-헵탄, 글리세롤, 올레인산 등을 들 수 있다. 수혼화성 유기 용매로서는 예를 들면, 글리세린, 아세톤, 에탄올, 아세트산, 디프로필렌글리콜, 트리에탄올아민, 트리에틸렌글리콜 등을 들 수 있다. 그 중에서도 본 발명에 있어서는 액상 C는 수계 용매 또는 수혼화성 유기 용매인 것이 바람직하다. 액상 C가 수계 용매이며, 또한 분산매가 수비혼화성 유기 용매인 경우에는 얻어지는 항원-아쥬반트 미립자 복합체 현탁액은 소위 솔리드 인 오일 인 워터(S/O/W)형 에멀션이 되고, 액상 C가 수비혼화성 유기 용매 또는 수혼화성 유기 용매이며 또한 분산매와 혼화하지 않는 경우에는 솔리드 인 오일 인 오일(S/O1/O2)형 에멀션이 된다.

표면 개질제로서는 S/O/W형 에멀션의 물-오일 계면 또는 S/O1/O2형 에멀션의 오일-오일 계면을 안정화하는 것이 바람직하고, 또한, 항원-아쥬반트 미립자 복합체가 회합해서 이루어지는 입자의 콜로이드 안정성을 향상시키는 성질을 갖는 화합물인 것이 바람직하다. 여기서 콜로이드 안정성을 향상시킨다란 항원-아쥬반트 미립자 복합체가 회합해서 이루어지는 입자의 용매 중에 있어서의 응집을 방지하는 것 또는 지연시키는 것을 말한다. 또 표면 개질제는 1종이어도 복수의 혼합물이어도 좋다.

본 발명에서 사용되는 표면 개질제는 친수성 폴리머 또는 양친매성 화합물인 것이 바람직하다.

표면 개질제인 친수성 폴리머로서는 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알콜, 폴리에틸렌이민, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 폴리-1,3-디옥솔란, 2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린폴리머, 폴리-1,3,6-트리옥산, 폴리아미노산, 펩티드, 단백질, 당류 다당류 또는 어느 하나의 유연체인 것이 바람직하다. 상기 친수성 폴리머의 유연체로서는 친수성 폴리머를 장쇄 알킬 등의 소수기를 부분적으로 수식하거나 한 계면활성제를 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

표면 개질제인 폴리에틸렌글리콜 유연체로서는 BASF사로부터 시판되는 "Pluronic"(BASF사의 등록상표) 또는 그 동등품이 바람직하다.

표면 개질제인 폴리아미노산으로서는 폴리아스파라긴산 또는 폴리글루탐산 또는 이들의 유연체가 바람직하고, 폴리아스파르긴산 또는 폴리글루탐산의 일부에 장쇄 알킬기를 도입한 유연체는 보다 바람직하다.

표면 개질제인 펩티드로서는 염기성 펩티드를 들 수 있고, 표면 개질제의 단백질로서는 젤라틴, 카제인 또는 알부민이 입자의 분산성 향상을 위해 바람직하다. 그 외, 단백질로서는 항체도 바람직한 일례로서 들 수 있다.

표면 개질제인 당류로서는 단당류, 올리고당류, 다당류가 바람직하다. 다당류로서는 셀룰로오스, 키틴, 키토산, 젤라검, 아르긴산, 히알루론산, 풀루란 또는 덱스트란이 바람직하고, 특히 콜레스테롤화 풀루란은 입자의 분산성 향상을 위해 바람직하고, 셀룰로오스, 키틴, 키토산, 젤라검, 아르긴산, 히알루론산, 풀루란 또는 덱스트란 중 어느 하나의 유연체가 바람직하다.

표면 개질제로서의 이들 펩티드, 단백질 또는 당류는 장쇄 알킬 등의 소수기를 부분적으로 수식하거나 한 유연체나 상술의 친수성 폴리머나 양친매성 화합물을 수식한 유연체가 특히 바람직하다.

표면 개질제인 양친매성 화합물로서는 지방질 또는 계면활성제를 들 수 있다. 계면활성제로서는 폴리옥시에틸렌폴리프로필렌글리콜 공중합체, 수크로오스 지방산 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌소르비탄모노 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌소르비탄디 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌글리세린모노 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌글리세린디 지방산 에스테르, 폴리글리세린 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 피마자유, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 등의 비이온성 활성제나, 라우릴 황산 나트륨, 라우릴 황산 암모늄, 스테아릴 황산 나트륨 등의 알킬 황산염 또는 레시틴이 바람직하다.

항원-아쥬반트 미립자 복합체를 분산시키는 분산매에 대한 액상 C의 용적비는 1,000:1∼1:1,000, 바람직하게는 100:1∼1:100이다. 또한, 이 용적비에 따라서 얻어지는 항원-아쥬반트 미립자 복합체의 회합수는 변화되고, 액상 C의 비율이 높을수록 많은 항원-아쥬반트 미립자 복합체가 회합한 입자의 수분산체가 얻어지고, 또한, 적은 경우에는 회합수가 적어지고, 용액비 1:4보다 액상 C의 비율이 작은 경우에는 대부분이 항원-아쥬반트 미립자 복합체 하나로 구성되는 입자의 수분산체가 되기 때문에 항원-아쥬반트 미립자 복합체가 회합해서 이루어지는 입자를 제조하는 일련의 과정에 있어서 액상 C의 용적비를 조정함으로써 항원-아쥬반트 미립자 복합체와 상기 복합체가 회합해서 이루어지는 입자를 나누어 만들 수 있다.

항원-아쥬반트 미립자 복합체를 포함하는 분산매를 액상 C에 혼화시킬 경우에는 필요하면, 예를 들면, 마그네틱 스터러 등의 교반 장치, 터빈형 교반기, 호모지나이저, 다공질막을 장비한 막유화 장치 등을 사용해도 좋다.

액상 C에는 표면 개질제에 추가해서 제제학적인 목적에 따라서 각종 첨가물, 예를 들면, 완충제, 항산화제, 염, 폴리머 또는 당 등을 함유해도 좋다. 또한, 항원-아쥬반트 미립자 복합체를 분산시키는 분산매에는 상기 복합체의 분해 또는 붕괴에 의한 내포된 항원의 방출 속도의 제어를 목적으로 분산매에 가용인 각종 첨가제, 예를 들면 산성 화합물, 염기성 화합물, 양친매성 폴리머 또는 생분해성 폴리머 등을 함유해도 좋다.

기타, 보다 미세한 항원-아쥬반트 미립자 복합체가 회합해서 이루어지는 입자를 제조할 목적으로 형성되는 솔리드 인 오일 인 워터(S/O/W)형 에멀션 또는 솔리드 인 오일 인 오일(S/O1/O2)형 에멀션의 유화 조작을 행해도 좋다. 유화 방법은 안정된 에멀션을 조제할 수 있는 것이면 특별히 한정되는 것은 아니고, 예를 들면, 교반에 의한 방법, 고압 호모지나이저, 고속 호모믹서 등을 사용하는 방법 등을 들 수 있다.

항원-아쥬반트 미립자 복합체를 일단 분산매에 분산시키고, 얻어진 분산액을 표면 개질제를 포함하는 액상 C에 첨가한 경우에는 분산매를 제거함으로써 소망의 아쥬반트 미립자가 회합해서 이루어지는 입자의 현탁액이 얻어진다. 분산매를 제거하는 방법은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 액중 건조, 투석, 동결 건조, 원심 조작, 여과, 재침전을 들 수 있고, 액중 건조, 동결 건조가 특히 바람직하다. 액상 C로서 수계 용매를 사용한 경우에는 본 공정에 의해 항원-아쥬반트 미립자 복합체가 회합해서 이루어지는 입자의 수계 분산체가 얻어진다.

또한, 표면 개질제가 항원-아쥬반트 미립자 복합체 또는 항원-아쥬반트 미립자 복합체가 회합해서 이루어지는 입자에 결합하고 있는 것에 대해서도 바람직한 형태의 하나이다. 여기에서 말하는 결합이란 비공유 결합이어도 공유 결합이어도 좋다. 비공유 결합은 바람직하게는 소수적인 상호작용이지만, 정전 상호작용, 수소 결합, 반데르발스력이어도 좋고, 이들이 복합된 결합이어도 좋다. 비공유 결합에 있어서는 양친매성 폴리머를 포함하는 미립자의 폴리(히드록시산)과 표면 개질제의 소수부분이 소수적인 상호작용에 의해 결합되어 있는 것이 바람직하고, 이 경우, 항원-아쥬반트 미립자 복합체의 분산매가 물, 완충액, 생리식염수, 표면 개질제 수용액 또는 친수성 용매인 미립자 분산체인 것이 바람직하다.

상술에 의해 얻어지는 항원-아쥬반트 미립자 복합체 또는 상기 복합체가 회합해서 이루어지는 입자의 평균 입경은 0.1∼50㎛인 것이 바람직하고, 0.1∼10㎛인 것이 보다 바람직하다. 특히, 항원-아쥬반트 미립자 복합체의 평균 입경은 바람직하게는 0.1∼1㎛, 보다 바람직하게는 0.1∼0.5㎛이며, 항원-아쥬반트 미립자 복합체의 평균 입경은 바람직하게는 0.1∼50㎛, 보다 바람직하게는 0.1∼10㎛, 더욱 바람직하게는 1∼10㎛이다. 항원-아쥬반트 미립자 복합체 또는 상기 복합체가 회합해서 이루어지는 입자의 평균 입경은 주사형 전자현미경(SEM: 예를 들면 가부시키가이샤 히타치 세이사쿠쇼제 S-4800)에 의한 화상 해석법을 사용해서 직접 평균 입경을 측정할 수 있다.

본 발명에 있어서의 면역원성 조성물이란 생체 내에서 면역응답을 일으킬 수 있는 조성물이며, 상기 항원-아쥬반트 미립자 복합체를 면역원성 물질로서 포함하고 있다. 면역원성 조성물이 발생시키는 면역응답의 종류는 한정되지 않는다. 발생시키는 면역응답의 종류로서는 Th1형 면역응답이나 Th2형 면역응답이 있고, 항원이나 투여 부위, 투여 방법의 종류에 따라 어느 한쪽의 면역응답에 우위가 발생되는 것이 알려지지만, 본 발명은 Th1형, Th2형 양쪽의 타입의 면역응답을 발생시킬 수 있다. Th1형 면역반응은 실시예에서 나타내는 바와 같이 소입경의 본 발명의 항원-아쥬반트 미립자 복합체 또는 상기 복합체가 회합해서 이루어지는 입자에 의해 효과적으로 발생시킬 수 있다. Th1형 면역응답과 Th2형 면역응답의 정도에 관해서는 기지의 여러가지 방법으로 평가할 수 있다. 예를 들면 마우스의 경우는 IgG2a 항체의 산생량이 Th1형 면역응답의 지표로서 알려진다. 또 Th2형 면역응답의 지표로서는 IgG1 항체, 총 IgG 항체량이 지표로서 알려진다.

또한, 본 발명의 면역원성 조성물은 항원-아쥬반트 미립자 복합체 또는 상기 복합체가 회합해서 이루어지는 입자를 유효 성분으로서 함유하는 점에서 아쥬반트 능을 갖지만, 또한 면역 활성화 물질을 포함함으로써 높은 면역 활성화 활성을 실현할 수 있다. 이들 면역 활성화 물질은 아쥬반트 미립자의 밖이어도 내포되어 있어도 좋지만, 아쥬반트 미립자에 내포되어 있는 것이 바람직하다. 면역 활성화 물질로서 예를 들면, 오일류, 알루미늄염, 칼슘염, 겔성 고분자, 면역 활성화 사이토카인, TLR 수용체 리간드 등 면역 활성화 물질로서 기능할 수 있는 것이면 한정되지 않지만, 면역 활성화 사이토카인 또는 TLR 수용체 리간드가 바람직하다.

면역 활성화 사이토카인으로서는 인터로이킨12, 인터페론α, 인터로이킨18, TNFα, 인터로이킨6, NO, 인터페론γ, 인터페론β를 들 수 있다.

TLR 수용체 리간드로서는 리포단백질, polyI:C, polyI:CLC 등의 2개쇄 RNA, 플라젤린, 1개쇄 RNA, CpG, 프로피린, MPL, QS21, TDM이며, 바람직하게는 2개쇄 RNA, 1개쇄 RNA, CpG 등의 핵산이며, 보다 바람직하게는 CpG이다. 여기서 CpG란 바이러스, 세균 등에 존재하는 비메틸화 CpG(시토신-구아닌)모티프 DNA를 나타낸다(일본 특허 공표 2001-503254호 공보 참조). CpG 모티프에는 여러가지 유효서열이 보고되고 있지만, 서열의 종류는 면역 활성화능을 갖는 한은 제한되지 않고, 염기 아날로그를 사용한 것이어도 각종 수식체이어도 좋다.

본 발명의 면역원성 조성물을 의약품 조성물이나 백신으로서 사용할 경우 양친매성 폴리머, 친수성 활성물질, 표면 개질제, 분산매 이외에 제제학적으로 유용한 각종 첨가제를 함유하고 있어도 좋고, 첨가할 수 있는 첨가물로서 바람직하게는 완충제, 항산화제, 염, 폴리머 또는 당이다.

본 발명의 면역원성 조성물을 사용해서 면역응답을 일으키는 방법에 대해서는 한정되지 않고, 면역원성 조성물을 생체에 투여해도 좋고, 생체 밖으로 적출한 면역 담당 세포에 접촉시켜도 좋다. 면역원성 조성물을 생체에 투여하는 방법으로서는 한정되지 않지만, 예를 들면, 피하 투여, 피내 투여, 근육내 투여, 경비 투여, 경폐 투여, 경구 투여, 경피 투여, 설하 투여, 질내 투여, 복강내 투여, 림프절 투여 등이며, 바람직하게는 피내 투여 또는 피하 투여이다.

본 발명의 면역원성 조성물을 사용해서 면역응답을 일으키는 경우의 사용 용량에 대해서는 목적으로 하는 면역반응을 발생시키는 데에 필요한 항원량은 항원의 종류나 투여 방법, 투여 횟수에 따라 적당히 설정되지만, 예를 들면 인간에 대하여 본 발명의 면역원성 조성물을 피하 투여해서 면역응답을 유도할 경우 면역원성 조성물에 함유하는 항원량으로서 1회당 0.01∼1,000μg이 투여된다. 또한, 투여 횟수에 대해서도 사용 용량과 마찬가지로 적당히 설정되지만, 본 발명의 면역원성 조성물은 지속적으로 면역응답을 발생시키는 작용을 갖고 있기 때문에 1∼10회의 투여에 의해 면역응답을 유도하는 것이 가능하다.

투여하는 생체는 인간이어도 인간 이외의 동물이어도 좋지만, 바람직하게는 인간 또는 가축, 애완 동물 또는 실험 동물로서 사육되고 있는 돼지, 소, 새, 양, 말, 당나귀, 염소 또는 낙타, 개, 고양이, 페럿, 토끼, 원숭이, 래트, 마우스, 모르모트이다.

실시예

이하에 실시예를 나타내지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 한정되지 않는다.

실시예 1 덱스트란-폴리(락트산-글리콜산)(PLGA)의 합성

(1-1) TMS-덱스트란의 합성

덱스트란(나카라이테스크 가부시키가이샤, 나카라이 규격 특급 적합품, 수평균 분자량 13,000, 5.0g)을 포름아미드(100㎖)에 첨가하여 80℃로 가열했다. 이 용액에 1,1,1,3,3,3-헥사메틸디실라잔(100㎖)을 20분에 걸쳐 적하했다. 적하 종료 후 80℃에서 2시간 교반했다. 반응 종료 후 반응 용액을 실온으로 되돌리고 분액 깔대기로 2층을 분리했다. 위의 층을 감압 하에서 농축한 후 메탄올(300㎖)을 첨가하고, 얻어진 고체를 여과, 건조시켜 TMS-덱스트란(화합물(1))(11.4g)을 백색 고체로서 얻었다.

동일한 방법을 사용하여 덱스트란(시그마사제, 평균 분자량 1,500 이하)을 사용해서 화합물(2) 및 (3)을, 덱스트란(SERVA사제, 평균 분자량 5,000)을 사용해서 화합물(4) 및 (5)를, 덱스트란(화합물(1) 조제시와 동일한 것)을 사용해서 화합물(6)을, 덱스트란(나카라이테스크사제, 평균 분자량 40,000)을 사용해서 화합물(7), (8) 및 (9)를 조제했다.

(1-2) 덱스트란-PLGA(화합물(12)∼(23))의 합성

화합물(1)(0.5g)과 tert-부톡시칼륨(35mg)을 가열 감압 하에서 2시간 건조 후 테트라히드로푸란(10㎖)을 첨가하여 1.5시간 실온에서 교반했다. 이 용액에 (DL)-락티드(0.56g)와 글리콜리드(0.45g)의 테트라히드로푸란(15㎖) 용액을 적하하고, 5분간 교반 후 아세트산을 2방울 첨가하여 반응을 정지시켰다. 반응 종료 후 용매를 감압 하에서 농축하고, 클로로포름-메탄올계 및 클로로포름-디에틸에테르계로 재침전 정제를 행함으로써 얻어지는 백색 고체를 클로로포름(9㎖)에 용해했다. 이 용액에 트리플루오로아세트산(1.0㎖)을 첨가하고 실온에서 30분간 교반했다. 반응 종료 후 용매를 감압 하에서 증류 제거 후 잔사를 클로로포름(10㎖)에 용해하고, 0℃로 냉각한 디에틸에테르에 적하함으로써 얻어진 생성물을 여과함으로써 덱스트란-PLGA를 백색 고체로서 얻었다(화합물(12)). 같은 방법으로 (DL)-락티드(0.78g)와 글리콜리드(0.63g)의 투입량으로 화합물(13)을, 같은 방법으로 (DL)-락티드(1.12g)와 글리콜리드(0.9g)의 투입량에서 화합물(14)을, 같은 방법으로 (DL)-락티드(1.67g)와 글리콜리드(1.35g)의 투입량으로 화합물(15)을 합성했다.

또, 화합물(2)을 사용해서 (DL)-락티드(0.56g)와 글리콜리드(0.45g)의 투입량으로 화합물(16)을, 화합물(3)을 사용해서 (DL)-락티드(0.67g)와 글리콜리드(0.54g)의 투입량으로 화합물(17)을, 화합물(4)을 사용해서 (DL)-락티드(0.78g)와 글리콜리드(0.63g)의 투입량으로 화합물(18)을, 화합물(5)을 사용해서 (DL)-락티드(0.89g)와 글리콜리드(0.72g)의 투입량으로 화합물(19)을, 화합물(6)을 사용해서 (DL)-락티드(0.78g)와 글리콜리드(0.63g)의 투입량으로 화합물(20)을, 화합물(7)을 사용해서 (DL)-락티드(0.78g)와 글리콜리드(0.63g)의 투입량으로 화합물(21)을, 화합물(8)을 사용해서 (DL)-락티드(1.12g)와 글리콜리드(0.9g)의 투입량으로 화합물(22)을, 화합물(9)을 사용해서 (DL)-락티드(1.12g)와 글리콜리드(0.9g)의 투입량으로 화합물(23)을 합성했다.

화합물(12)∼(15)의 폴리머의 중량 평균 분자량, 수평균 분자량은 GPC 측정(컬럼:토소 가부시키가이샤제 TSK-gel α-5000×2, DMF계 용매, 검출기:RI, 표준품:풀루란)에 의해 결정했다. 또한, 화합물(12)∼(23)의 그래프트쇄의 수평균 분자량, 그래프트쇄의 수는 ¹H-NMR 측정에 의해 결정했다(표1).

실시예 2 PEG-PLGA의 합성(화합물(10), (11))

폴리에틸렌글리콜모노메틸에테르(니혼유시 가부시키가이샤제 SUNBRIGHT MEH-20H, 수평균 분자량 5,128, Mw/Mn=1.02), (DL)-락티드와 글리콜리드를 표 2의 투입량으로 혼합하고 140℃로 가열했다. 20분 교반 후 옥틸산 주석(II)(폴리에틸렌글리콜모노메틸에테르에 대하여 0.05중량%)을 첨가하고, 180℃에서 3시간 교반했다. 반응액을 실온으로 되돌린 후 클로로포름(약 100mg/㎖ 농도가 되도록)에 용해하고, 0℃로 냉각한 디에틸에테르로 재침전 정제하고, 얻어진 고체를 여과 분별, 감압 건조시킴으로써 PEG-PLGA 폴리머를 백색, 또는 연갈색의 고체로서 얻었다. 본 폴리머의 수평균 분자량은 ¹H-NMR로부터 구했다(표 2).

실시예 3 Dex-g-PLGA 폴리머를 사용한 항원-아쥬반트 미립자 복합체의 조제(Dex-g-PLGA 입자(1)∼(28))

실시예 1의 덱스트란-폴리(락트산-글리콜산)(PLGA)(화합물(12)∼(23)) 5mg을 탄산 디메틸 100㎕에 용해하고, 50mg/㎖의 폴리머 용액을 조제했다. 상기 폴리머 용액에 tert-부탄올 20㎕를 첨가 후 표 3의 내포 항원((OVA(난백 알부민)(시그마사) 또는 CEA(암태아성 항원)(코스모 바이오사)) 및 면역 활성화 물질(CpG)을 표기의 농도로 50㎕를 적하하고, 보텍스(vortex)로 교반해서 역상 에멀션을 제조했다. CpG로서는 5'-gggggggCGACGATCGTCAgG-3'(서열 중의 소문자는 포스포로티오에이트 수식 염기를 나타냄)(시그마제노시스사에 위탁 합성)을 사용했다.

상기 역상 에멀션을 액체 질소로 예비 동결한 후 동결 건조기(EYELA, FREEZE DRYER FD-1000)를 사용하여 트랩 냉각 온도 -45℃, 진공도 20Pa에서 24시간 동결 건조했다. 얻어진 고형분을 표 3에 기재하는 양의 분산 용매에 분산시켜서 S/O 서스펜션을 조제했다. 상기 S/O 서스펜션을 10% Pluronic F-68 함유 수용액 2㎖에 적하하고, 표 3에 기재된 교반 방법으로 교반·유화시켜서 S/O/W형 에멀션을 조제했다. 상기 S/O/W형 에멀션으로 액 중 건조에 의해 수비혼화성 유기 용매를 제거하고, 항원-아쥬반트 미립자 복합체 분산액으로 했다. 상기 분산액을 액체 질소로 예비 동결한 후 동결 건조기(EYELA, FREEZE DRYER FD-1000)를 사용하여 트랩 냉각 온도 -45℃, 진공도 20Pa에서 24시간 동결 건조함으로써 항원-아쥬반트 미립자 복합체(평균 입경 0.4㎛) 및 항원-아쥬반트 미립자 복합체가 회합해서 이루어지는 입자(평균 입경5∼40㎛) 건조 분말을 얻었다. 얻어진 입자의 평균 입경을 주사형 전자 현미경(SEM:가부시키가이샤 히타치 세이사쿠쇼제 S-4800)에 의해 관찰함으로써 산출한 결과를 표 3에 나타낸다.

실시예 4 PEG-PLGA 폴리머를 사용한 항원-아쥬반트 미립자 복합체의 조제(PEG-PLGA 입자(1)∼(4))

실시예 2에서 제작한 PEG-PLGA 폴리머(화합물(10), (11)) 5mg을 탄산 디메틸 100㎕에 용해하여 50mg/㎖의 폴리머 용액을 조제했다. 상기 폴리머 용액에 tert-부탄올을 20㎕ 첨가 후 표 4에 나타내는 항원 함유 용액 50㎕를 첨가하고, 교반함으로써 역상 에멀션 용액을 제조했다. 상기 역상 에멀션 용액을 액체 질소로 예비 동결한 후 동결 건조기(EYELA, FREEZE DRYER FD-1000)를 사용하여 트랩 냉각 온도 -45℃, 진공도 20Pa에서 24시간 동결 건조했다. 얻어진 고형분을 표 4에 나타내는 양의 아세트산 에틸에 분산시켜 S/O 서스펜션을 조제했다. 상기 S/O 서스펜션을 10% Pluronic F-68 함유 수용액 2㎖에 적하하고, 보텍스 믹서로 교반·유화시켜서 S/O/W형 에멀션을 조제했다. 상기 S/O/W형 에멀션으로 액중 건조에 의해 수비혼화성 유기 용매를 제거하여 항원-아쥬반트 미립자 복합체 분산액으로 했다. 상기 분산액을 액체 질소로 예비 동결한 후 동결 건조기(EYELA, FREEZE DRYER FD-1000)를 사용하여 트랩 냉각 온도 -45℃, 진공도 20Pa에서 24시간 동결 건조함으로써 항원-아쥬반트 미립자 복합체 건조 분말을 얻었다. 항원-아쥬반트 미립자 복합체의 평균 입경을 주사형 전자 현미경(SEM:가부시키가이샤 히타치 세이사쿠쇼제 S-4800)에 의해 관찰함으로써 산출한 결과를 표 4에 나타낸다.

비교예 1 항원을 함유한 PLGA 호모 폴리머 입자(PLGA 입자(1), (2))의 제작

항원을 함유한 PLGA 입자에 관해서는 기지의 기술(인터내셔널 저널 오브 파머스틱스, 2007년, 334호, 137-148 페이지)을 사용해서 조제했다. PLGA(SIGMA사제, 평균 분자량 40,000-75,000) 200mg을 염화메틸렌 15㎖에 용해시켜 13.3mg/㎖의 PLGA 용액을 조제했다. 5mg/㎖의 OVA 수용액 100㎕를 상기 폴리머 용액 2㎖에 19,000rpm(Polytron사제 호모지나이저)으로 교반한 상태로 첨가하고, 또한 5분간 동일하게 교반함으로써 W/O 용액을 제조했다. 상기 W/O 용액을 1% 폴리비닐알콜 수용액 20㎖에 19,000rpm으로 교반한 상태로 첨가하고, 또한 5분간 동일하게 교반함으로써 W/O/W 용액을 제조했다. 상기 W/O/W 용액을 200rpm으로 12시간 교반한 후에 액체 질소로 예비 동결하고, 동결 건조기(EYELA, FREEZE DRYER FD-1000)를 사용해서 트랩 냉각 온도 -45℃, 진공도 20Pa에서 12시간 동결 건조함으로써 항원을 함유한 PLGA 입자를 얻었다. 얻어진 입자를 주사형 전자 현미경(SEM:가부시키가이샤 히타치 세이사쿠쇼제 S-4800)에 의해 관찰함으로써 평균 입경을 산출한 결과 2㎛였다. 또한, 동일한 방법으로 CEA 수용액(0.25mg/㎖)을 사용해서 PLGA 입자(2)를 제작하고, 동일하게 SEM으로 평균 입경을 산출한 결과 2㎛였다.

실시예 5 CEA-아쥬반트 미립자 복합체 또는 그 회합 입자에 있어서의 항원 내포율과 항원 유지성의 측정

<방법>

실시예 3 및 4의 방법으로 작성한 CEA-아쥬반트 미립자 복합체 또는 그 회합 입자(이하, CEA 내포 입자라고 한다.) 20mg을 1.5㎖ 에펜돌프 튜브에 칭량하고, 1㎖의 완충액 A(0.1% 소 혈청 알부민, 0.1% PluronicF-68 및 0.02% 아디화 나트륨을 포함하는 PBS)에 용해해서 18,000×g, 10분간의 원심에 의해 입자(침전)와 상청을 분리했다. 상청을 다른 튜브에 회수한 후, 입자를 1㎖의 완충액에 재현탁하고, 상기 조건에서의 원심에 의한 입자와 상청의 분리를 다시 행했다. 이 세정 조작을 또 한번 반복해서(총 3회 원심), 각 원심으로 회수한 상청 중의 CEA 농도는 ELISA 키트(Hope Laboratories사제 TM-201)를 사용해서 측정했다.

입자 제작시의 투입의 CEA량(CEA 내포 입자 중량 20mg당)으로부터 3회의 원심 상청 중의 CEA량 합계를 뺌으로써 이하의 식에 의해 내포율을 계산했다.

항원의 방출성 측정은 3회 세정을 행한 입자를 1.2㎖의 완충액 A에 현탁 분산시켰다. 이 용액으로부터 일부(40㎕)를 다른 튜브로 옮기고, 18,000×g으로 10분간의 원심에 의해 입자를 침전시키고, 상청 30㎕를 다른 튜브에 회수했다(0시간 샘플). 나머지의 입자 현탁액은 1.5㎖ 에펜돌프 튜브 안에서 37℃ 인큐베이터 내에서 로테이터를 사용해서 6rpm의 속도로 천천히 전도 혼화시켰다. 이 용액으로부터 경시적으로 소량(40㎕)을 분취해서 상기와 동일하게 원심에 의한 상청 분리를 행했다. 각 시점에서 회수한 상청 샘플 중의 CEA 농도를 상기 ELISA법으로 측정하고, 방출량(%)을 이하의 식에 의해 계산했다.

<결과>

CEA 내포 입자의 항원 내포율은 표 5와 같이 되고, 모두 CEA 내포 입자도 높은 효율로 항원이 내포되어 있는 것이 나타내어졌다. 항원의 유지성은 소수 그래프트쇄의 짧은 Dex-g-PLGA 입자(7)에서 낮아 1주간 동안에 내포하는 항원의 67.3%가 방출되었다. 한편, 소수 그래프트쇄가 길어짐에 따라 항원의 유지성은 상승하고, 소수 그래프트쇄의 긴 Dex-g-PLGA 입자에서는 1주간 후에도 투입 항원의 90% 정도가 함유된 상태였다. PEG-PLGA 입자도 1주간에 4% 정도의 항원이 방출되는 것에 그쳐 높은 항원 유지성을 나타냈다.

실시예 6 OVA 함유 면역원성 조성물의 마우스 피하 투여(1)

<방법>

실시예 3 및 4에서 제작한 OVA-아쥬반트 미립자 복합체 회합 입자(이하, OVA 내포 회합 입자) 또는 OVA-아쥬반트 미립자 복합체(이하, OVA 내포 입자) 중 소수쇄의 길이가 다른 OVA 내포 회합 입자(Dex-g-PLGA 입자(2)(3)(4)), Dex-g-PLGA 입자(3)와 입경이 다른 OVA 내포 회합 입자 및 OVA 내포 입자(Dex-g-PLGA 입자(5)(6)), PEG-PLGA 입자(3) 각각 40mg(항원 투입량 50μg)을 3㎖의 인산 생리완충액(PBS)에 현탁 분산시켜 80×g, 5분간의 원심에 의해 입자를 침전시키고, 상청을 별도 튜브로 옮겼다. 상청은 다시 80×g, 5분간의 원심을 행해서 잔존하고 있는 입자를 침전시키고, 상청은 제거했다. 1회째의 원심 침전과 2회째의 원심 침전을 합쳐서 1㎖의 PBS에 재분산시키고, 같은 원심 세정 조작을 3회 반복함으로써 입자에 내포되어 있지 않은 항원을 제거했다. 마지막에 침전을 150㎕의 PBS에 재분산시켜 투여 용액으로 했다. 본 용액을 9주령의 수컷 Balb/C 마우스(니혼 SLC사)의 등부 피하에 단회 주사 투여했다. 비교예로서는 비교예 1에서 제조한 PLGA 입자 또는 항원 용액(50㎕)뿐이고, 또한 참고예로서 항원 용액 50㎕와 아쥬반트로서 "Imject Alum"(서모 사이언티픽사제, 이하, Alum이라고도 한다.) 50㎕를 혼합한 용액을 각각 단회 주사 투여했다. 각각의 조건마다 4마리의 마우스에 투여해서 도 1에서는 항체가의 평균값을 나타냈다.

투여한 마우스는 자유롭게 급이, 급수 가능한 환경에서 사육하고, 경시적으로 미정맥으로부터 채혈을 행했다. 채취한 혈액은 종농도 3.3IU/㎖의 헤파린을 첨가해서 5,000rpm으로 5분간 원심해서 혈장을 회수하고, 혈장 중의 OVA에 대한 항체가를 측정했다.

항체가는 이하의 방법으로 측정을 행했다. 96혈 마이크로 플레이트(Nunc사제 MaxiSorp)에 1μg/㎖의 OVA를 포함하는 PBS 용액 100㎕를 넣고, 4℃에서 하룻밤 정치했다. 용액을 버리고, 0.5% BSA를 포함하는 PBS 400㎕를 넣어서 실온에서 2시간 블록킹을 행했다. 웰을 세정액(0.05% Tween 20을 포함하는 PBS) 400㎕로 1회 세정 후 희석액(0.25% BSA, 0.05% Tween20을 포함하는 PBS)으로 1,000로부터 100,000배로 희석한 혈장 샘플 100㎕를 넣고, 실온에서 40분간 진탕 반응을 행했다. 웰을 세정액으로 3회 세정 후 HRP(서양 고추냉이 퍼옥시다아제) 표식 항마우스 IgG 항체(Zymed사)(희석액으로 10,000배 희석) 100㎕를 넣고, 실온에서 20분간 진탕 반응을 행했다. 웰을 세정액으로 3회 세정 후 발색액(0.006% 과산화수소, 0.2mg/㎖ 테트라메틸벤지딘을 포함하는 0.1M 아세트산-시트르산 나트륨 완충액(pH4.5))을 100㎕ 넣고 실온에서 10분간 진탕 반응을 행했다. 1N 황산 100㎕를 첨가해서 반응을 정지시키고, 마이크로 플레이트 리더를 사용해서 450nm의 흡광도를 측정했다. 표준 샘플로서 단계 희석한 항OVA 모노클로날 항체(Antibody Shop사제 HYB 094-05)를 동시에 측정하고, 이것을 검량선으로서 각 샘플 중의 항체량을 중량 농도(ng/㎖)로 환산했다.

<결과>

혈장 중의 항OVA 항체가의 평균값의 경시 변화를 도 1에 나타낸다. Dex-g-PLGA를 사용한 OVA 내포 입자 또는 OVA 내포 회합 입자(Dex-g-PLGA 입자(2)(3)(4)(5)(6)), PEG-PLGA를 사용한 OVA 내포 회합 입자(PEG-PLGA 입자(3))는 6주간 이상에 걸쳐 지속적인 항체가 상승 효과를 나타내고, 비교예인 PLGA 입자나 항원만의 투여, 참고예인 항원+Alum의 투여를 크게 상회했다. 또한, 입자지름이 작은 Dex-g-PLGA 입자(6)가 가장 높은 항체가 상승 효과를 갖는 경향을 나타냈다.

실시예 7 CEA 함유 면역원성 조성물의 마우스 피하 투여

<방법>

실시예 3 및 4의 방법으로 작성한 CEA-아쥬반트 미립자 복합체(이하, CEA 내포 입자) 또는 그 회합 입자(이하, CEA 내포 회합 입자)에 대해서 실시예 6과 동일한 방법으로 평가를 행했다. 1마리당 투여량은 1mg(항원 5μg)으로 하고, 그것을 단회 주사 투여했다. CEA 내포 입자 및 CEA 내포 회합 입자로서는 소수 그래프트쇄의 길이가 다른 Dex-g-PLGA 입자(8)(9)(10), Dex-g-PLGA 입자(9)와 같은 화합물(4)을 사용해서 조제한 입자지름이 다른 Dex-g-PLGA 입자(11)(12), Dex-g-PLGA 입자(9)에 항원과 함께 CpG 25μg을 함께 함유시킨 Dex-g-PLGA 입자(13), PEG-PLGA 입자(4)를 평가했다. 또한, 비교예로서는 항원 5μg을 포함하는 수용액 50㎕, 참고예로서는 항원 5μg을 포함하는 수용액 50㎕ 및 Alum 50㎕를 혼합해서 단회 주사 투여했다. 각각의 조건마다 4마리의 마우스에 투여하고, 도 2 및 도 3에서는 각 군의 평균값을 나타냈다.

CEA에 대한 항체가는 이하의 방법으로 측정을 행했다. 96혈 마이크로 플레이트(Nunc사제 MaxiSorp)에 1μg/㎖의 CEA 단백을 포함하는 PBS 용액 100㎕를 넣고, 4℃에서 하룻밤 정치했다. 용액을 버리고, 0.5% BSA를 포함하는 PBS 400㎕를 넣어서 실온에서 2시간 블록킹을 행했다. 웰을 세정액(0.05% Tween20을 포함하는 PBS) 400㎕로 1회 세정 후 희석액(0.25% BSA, 0.05% Tween20을 포함하는 PBS)으로 1,000배로부터 100,000배로 희석한 혈장 샘플 100㎕를 넣고, 실온에서 40분간 진탕 반응을 행했다. 웰을 세정액으로 3회 세정 후, HRP(서양 고추냉이 퍼옥시다아제) 표식 항마우스 IgG 항체(Zymed사)(희석액으로 10,000배 희석) 100㎕를 넣고, 실온에서 20분간 진탕 반응을 행했다. 웰을 세정액으로 3회 세정 후, 발색액(0.006% 과산화수소, 0.2mg/㎖ 테트라메틸벤지딘을 포함하는 0.1M 아세트산-시트르산 나트륨 완충액(pH4.5))을 100㎕ 넣고 실온에서 10분간 진탕 반응을 행했다. 1N 황산 100㎕를 첨가해서 반응을 정지시키고, 마이크로 플레이트 리더를 사용해서 450nm의 흡광도를 측정했다. 표준 샘플로서 단계 희석한 항CEA 모노클로날 항체(Affinity Bioreagents사제 MA1-5308)를 동시에 측정하고, 이것을 검량선으로 해서 각 샘플 중의 항체량을 중량 농도(ng/㎖)로 환산했다. IgG2a 항체가의 측정은 HRP 표식 항마우스IgG 항체 대신에 HRP 표식 항마우스 IgG2a 항체(Bethyl사제 A90-107P)를 사용하고, 항체가가 상승한 1마리의 마우스의 혈장 샘플을 기준 샘플로서 사용하고, 이것을 단계 희석한 샘플을 표준으로서 검량선을 작성하고, 64,000배 희석 샘플에 상당하는 항체가를 1U로서 나타냈다.

<결과>

Dex-g-PLGA를 CEA 내포 입자 또는 CEA 내포 회합 입자(Dex-g-PLGA 입자(8)(9)(10)(11)(12), PEG-PLGA 입자(4))는 약 6주간에 걸쳐 지속적인 항체가 상승을 나타내고, 이들 중에서 입자지름이 작은 입자인 CEA 내포 입자(Dex-g-PLGA 입자(12))가 가장 높은 항체가 상승 효과를 나타냈다. 또한, Dex-g-PLGA 입자(9)에 항원과 함께 CpG를 함유시킨 Dex-g-PLGA 입자(13)는 Dex-g-PLGA 입자(9)와 비교해서 높은 항체가 상승 효과를 나타냈다(도 2).

항IgG2a 항체가는 Dex-g-PLGA 입자(8)(9)(10)(11)(12) 및 PEG-PLGA 입자(4)에서 지속적인 상승이 확인되었다. Dex-g-PLGA 입자(9)에 항원과 함께 CpG를 함유시킨 Dex-g-PLGA 입자(13)는 Dex-g-PLGA 입자(9)와 비교해서 높은 항체가 상승 효과를 나타냈다. 한편, 참고예인 항원과 Alum을 혼합해서 투여한 경우에는 항체가의 지속적인 상승은 보여지지만, 그 밖의 Dex-g-PLGA 입자와 비교하면 그 효과는 약했다. 본 발명의 면역원성 조성물은 마우스 IgG2a가 상승이 지표로서 알려지는 세포성 면역도 지속적으로 장기간에 걸쳐 활성화되어 있는 것이 확인되었다(도 3).

실시예 8 OVA 함유 면역원성 조성물의 마우스 피하 투여(2)

<방법>

실시예 1의 화합물(4)과 같은 방법으로 조제한 Dex-g-PLGA 폴리머를 사용하고, 실시예 3의 Dex-g-PLGA 입자(3)와 같은 방법으로 조제한 입자(Dex-g-PLGA 입자(A))를 실시예 6에 기재한 방법을 사용해서 평가를 행했다. 1마리당 투여량은 16mg(내포 OVA량 20μg)으로 하고, 그것을 단회 주사 투여했다. 또 참고예로서 20μg의 OVA 항원을 포함하는 수용액 50㎕와 Alum 50㎕를 혼합한 용액을 1회, 또는 1주간 간격으로 3회 주사 투여했다. 각각의 조건마다 2마리의 마우스에 투여하고, 도 4에서는 항체가의 평균값을 450nm의 흡광도 측정값의 수치로서 표기했다.

<결과>

혈장 중의 항OVA 항체의 경시 변화를 도 4에 나타낸다. Alum과 항원의 혼합 용액을 1회만 투여한 참고예에서는 항체가의 상승은 거의 보여지지 않았다. Alum 과 항원을 3회 투여한 참고예에서는 3회째의 투여로부터 급격한 항체가의 상승이 보여졌지만, 상승은 일과성이며 35일 이후 상승은 보여지지 않았다. 본 발명의 면역원성 조성물(Dex-g-PLGA 입자(A))을 단회 주사 투여한 마우스에서는 투여 2주간째부터 지속적인 상승이 보여지고, 56일후까지 지속적인 항체가 상승이 확인되었다.

실시예 9 OVA 함유 면역원성 조성물의 마우스 피하 투여(3)

<방법>

평가는 실시예 6과 같은 방법으로 행했다. 투여량은 모두 1마리당 OVA 내포 회합 입자 10mg(항원 투입량 12.5μg)으로 하고, 실시예 1의 화합물(4)과 같은 방법으로 조제한 Dex-g-PLGA 폴리머를 사용하고, 실시예 3의 Dex-g-PLGA 입자(3)와 같은 방법으로 조제한 입자(Dex-g-PLGA 입자(B)) 및, 실시예 1의 화합물(4)과 같은 방법으로 조제한 Dex-g-PLGA 폴리머를 사용하고, 실시예 3의 Dex-g-PLGA 입자(3)의 조제시에 OVA와 함께 1마리당 투여량이 6.25μg이 되도록 CpG를 함유시킨 입자(Dex-g-PLGA 입자(C)), 및 PEG-PLGA 입자(1) 및 (2)를 단회 주사 투여했다. 비교예로서는 항원 12.5μg, 참고예로서는 항원 12.5μg과 CpG 6.25μg을 혼합해서 단회 주사 투여했다. 항체가는 투여로부터 4주째부터 1주간간격으로 채혈을 행하고, 실시예 6과 같은 방법으로 측정했다. 각 조건에 대해서 2마리의 마우스에 투여해서 도 5에서는 항체가의 평균값을 나타냈다.

<결과>

OVA 내포 회합 입자(PEG-PLGA 입자(1)(2), Dex-g-PLGA 입자(B)(C))는 모두 투여 후 6주간 이상에 걸쳐 투여 동물의 항체가를 상승시켰다. Dex-g-PLGA 입자는 PEG-PLGA 입자보다 높은 면역 활성화능을 나타냈다. 또한, CpG를 내포한 OVA 내포 입자(Dex-g-PLGA 입자(C))는 CpG를 포함하지 않는 OVA 내포 입자(Dex-g-PLGA 입자(B))보다 높은 항체가 상승 효과를 나타냈다.

실시예 10 HCV 구성 단백질 함유 면역원성 조성물의 마우스 피하 투여

<방법>

실시예 1의 화합물(4)과 같은 방법으로 조제한 Dex-g-PLGA 폴리머를 사용하고, 실시예 3의 Dex-g-PLGA 입자(3)와 같은 조제 방법을 사용하여 HCV 구성 단백질을 함유시킨 HCV 구성 단백질-아쥬반트 미립자 복합체가 회합해서 이루어지는 입자Dex-g-PLGA 입자(D)(이하, HCV-E2 내포 회합 입자)를 조제해서 실시예 6과 같은 방법으로 단회 주사 투여했다. HCV 구성 단백질로서는 일본 특허 출원 2008-254338에 기재된 방법에 따라서 조제한 J6CF주 유래의 E2 단백질과 인간 IgG의 Fc 단백질로 이루어지는 키메라 단백질을 사용했다. 1마리당 투여량은 80mg(항원 1.5μg)으로 했다. 또 CpG 25μg과 Dex-g-PLGA 입자(D)를 혼합한 것, CpG 25μg과 Alum 50㎕를 Dex-g-PLGA 입자(D)와 혼합한 것을 각각 단회 주사 투여했다. 비교예로서는 항원만 1.5μg, 참고예로서 항원 1.5μg 및 CpG 25μg을 포함하는 수용액 100㎕, 항원 1.5μg 및 Alum 50㎕를 포함하는 수용액 100㎕, 또는 항원 1.5μg, Alum 50㎕ 및 CpG 25μg을 포함하는 수용액 100㎕를 각각 단회 주사 투여했다. 각각의 조건마다 2마리의 마우스에 투여했다.

HCV 구성 단백질에 대한 항체가는 이하의 방법으로 측정을 행했다. 96혈 마이크로 플레이트(Nunc사제 MaxiSorp)에 0.5μg/㎖의 HCV 구성 단백질을 포함하는 PBS 용액 100㎕를 넣고, 4℃에서 하룻밤 정치했다. 용액을 버리고 0.5% BSA를 포함하는 PBS 400㎕를 넣고 실온에서 2시간 블록킹을 행했다. 웰을 세정액(0.05% Tween20을 포함하는 PBS) 400㎕로 1회 세정 후, 희석액(0.25% BSA, 0.05% Tween20을 포함하는 PBS)으로 1,000배로부터 100,000배로 희석한 혈장 샘플 100㎕를 넣고, 실온에서 40분간 진탕 반응을 행했다. 웰을 세정액으로 3회 세정후, HRP(서양 고추냉이 퍼옥시다아제) 표식 항마우스 IgG 항체(Zymed사)(희석액으로 10,000배 희석) 100㎕를 넣고, 실온에서 20분간 진탕 반응을 행했다. 웰을 세정액으로 3회 세정 후, 발색액(0.006% 과산화수소, 0.2mg/㎖ 테트라메틸벤지딘을 포함하는 0.1M 아세트산-시트르산 나트륨 완충액(pH4.5))을 100㎕ 넣고, 실온에서 10분간 진탕 반응을 행했다. 1N 황산 100㎕를 첨가해서 반응을 정지시키고, 마이크로 플레이트 리더를 사용해서 450nm의 흡광도를 측정했다. 도 6에서는 항체가의 평균값을 450nm의 흡광도 측정값의 수치로서 표기했다.

<결과>

HCV-E2 내포 회합 입자(Dex-g-PLGA 입자(D))는 7주간에 걸쳐 지속적인 항체가 상승 효과를 나타냈다. 또 HCV-E2 내포 회합 입자에 CpG를 혼합한 경우, 및 HCV-E2 내포 회합 입자에 CpG 및 Alum을 혼합한 경우에는 HCV-E2 내포 회합 입자 단독을 투여한 경우에 비해 높은 항체가 상승 효과를 나타냈다. 항원만을 투여한 비교예에서는 거의 항체가 상승이 관찰되지 않았다. 항원 및 Alum, 항원 및 CpG, 또는 항원, CpG 및 Alum을 각각 혼합해서 투여한 참고예에서는 항원 단독에 비해 항체가 상승 효과는 상승했지만, HCV-E2 내포 회합 입자를 투여한 경우와 비교해 훨씬 뒤떨어지는 항체가 상승 효과밖에 나타내지 않았다.

실시예 11 CEA 함유 면역원성 조성물의 마우스 피하 투여(2)

<방법>

실시예 3 및 4의 방법으로 작성한 CEA-아쥬반트 미립자 복합체 회합 입자(이하, CEA 내포 회합 입자)에 대해서 실시예 7과 같은 방법으로 평가를 행했다. 1마리당 투여량은 400μg(항원 1μg)으로 하고 그것을 0주째와 4주째에 투여했다. CEA 내포 회합 입자로서는 덱스트란 분자량 1,500을 친수쇄로 하는 Dex-g-PLGA 입자(14)(15), 덱스트란 분자량 5,000을 친수쇄로 하는 Dex-g-PLGA 입자(16)(17), 덱스트란 분자량 175,000을 친수쇄로 하는 Dex-g-PLGA 입자(18), 덱스트란 분자량 40,000을 친수쇄로 하는 Dex-g-PLGA 입자(19)를 평가했다. 각각의 조건마다 5마리의 마우스에 투여하고, 도 7에서는 각 군의 평균값을 나타냈다. CEA에 대한 항체가는 실시예 7과 같은 방법으로 측정했다.

<결과>

Dex-g-PLGA를 사용한 CEA 내포 회합 입자(Dex-g-PLGA 입자(14)(15)(16)(17)(18)(19))는 지속적인 항체가 상승을 나타냈다. 이들 중에서 덱스트란 분자량 175,000 및 분자량 40,000으로 구성되는 CEA 내포 회합 입자(Dex-g-PLGA 입자(18)(19)는 덱스트란 친수쇄의 분자량 1,500 및 분자량 5,000으로 구성되는 CEA 내포 회합 입자(Dex-g-PLGA 입자(14)(15)(16)(17))와 비교해서 높은 항체가 상승 효과를 나타냈다(도 7).

실시예 12 CEA 함유 면역원성 조성물의 마우스 피하 투여(3)

<방법>

실시예 3 및 4의 방법으로 작성한 CEA-아쥬반트 미립자 복합체 회합 입자(이하, CEA 내포 회합 입자)에 대해서 실시예 7과 같은 방법으로 평가를 행했다. 1마리당 투여량은 400μg(항원 1μg)으로 하고 그것을 0주째와 4주째에 투여했다. CEA 내포 회합 입자로서는 동일한 폴리머를 사용하고, 다른 입경에 조제한 입자 3종류의 입자(Dex-g-PLGA 입자(20)(입경 0.4㎛), Dex-g-PLGA 입자(21)(입경 5㎛), Dex-g-PLGA 입자(입경 40㎛))를 평가했다. 각각의 조건마다 5마리의 마우스에 투여하고, 도 8에서는 각 군의 평균값을 나타냈다. CEA에 대한 항체가는 실시예 7과 같은 방법으로 측정했다.

<결과>

Dex-g-PLGA를 사용한 CEA 내포 입자 및 CEA 내포 회합 입자(Dex-g-PLGA 입자(20)(21)(22))는 지속적인 항체가 상승을 나타냈다. 이들 중에서 평균 입경 0.4㎛의 Dex-g-PLGA 입자(20)가 가장 높은 항체가 상승 효과를 나타내고, 다음에 평균 입경 5㎛의 Dex-g-PLGA 입자(21), 그리고, 평균 입경 40㎛의 Dex-g-PLGA 입자(22)는 가장 낮은 항체가 상승 효과를 나타냈다(도 8).

실시예 13 OVA 함유 면역원성 조성물의 마우스 피하 투여(4)

<방법>

평가는 실시예 9와 같은 방법으로 행했다. 투여량은 모두 1회 투여당 항원량을 20μg으로 하고 0주째, 2주째, 4주째에 3회의 항원 투여를 행했다. 평가는 OVA 20μg과 항원을 포함하지 않는 Dex-g-PLGA 입자(24)(폴리머량 16mg분)를 혼합해서 투여한 경우, OVA 20μg을 포함하는 Dex-g-PLGA 입자(23)(폴리머량 16mg분)를 투여한 경우, OVA 20μg과 Alum 50㎕를 혼합해서 투여한 경우, OVA 20μg과 항원을 포함하지 않는 Dex-g-PLGA 입자(24)를 다른 장소에 투여한 경우를 비교했다. 혈중 항체가는 실시예 9와 같은 방법으로 측정했다. 각 조건에 대해서 2마리의 마우스에 투여해서 도 9에서는 항체가의 평균값을 나타냈다.

<결과>

어느 입자나 항체가 상승 효과를 나타냈다. OVA와 항원을 포함하지 않는 입자(Dex-g-PLGA 입자(24))를 혼합해서 투여한 경우, 및 OVA와 Dex-g-PLGA 입자(24)를 별도의 장소에 투여한 경우에 비해 OVA 내포 회합 입자(Dex-g-PLGA 입자(23))가 높은 항체가 상승 효과를 나타냈다.

실시예 14 CEA 함유 면역원성 조성물의 마우스 피하 투여(4)

<방법>

평가는 실시예 7과 같은 방법으로 행했다. CEA와 Alum을 혼합해서 투여한 경우만, 0주째, 2주째, 4주째에 모두 3회의 투여를 행하고, 그 밖의 CEA 내포 입자 및, CEA 내포 회합 입자는 0주째에 단회 투여를 행했다. 평가는 동일한 폴리머를 사용해서 조제한 입경이 다른 입자, Dex-g-PLGA 입자(25)(입경 0.4㎛, 폴리머 함유량 4mg, 항원 투여량 10μg), Dex-g-PLGA 입자(26)(입경 5㎛, 폴리머 함유량 4mg, 항원 투여량 10μg), Dex-g-PLGA 입자(27)(입경 40㎛, 폴리머 함유량 4mg, 항원 투여량 10μg), Dex-g-PLGA 입자(28)(입경 0.4㎛, 폴리머 함유량 4mg, 항원 투여량 1μg)를 비교했다. 또한, Dex-g-PLGA 입자(25)에 관해서는 투여량을 10분의 1(폴리머 함유량 400μg, 항원 투여량 1μg), 100분의 1(폴리머 함유량 40μg, 항원 투여량 0.1μg)로 줄여서 투여한 경우와의 비교를 행했다. 비교예로서는 CEA를 내포시켜서 조제한 PLGA 입자(2)를 평가했다. 각각의 항목마다 6마리의 마우스에 투여를 행해 혈중 항체가 및 IgG1, IgG2a는 실시예 7과 같은 방법으로 측정을 행하고, 도 10, 도 11에서는 그 평균값을 나타냈다.

<결과>

평균 입경 0.4㎛ 및 평균 입경 5㎛의 CEA 내포 입자(Dex-g-PLGA 입자(25)(26))는 평균 입경 40㎛의 CEA 내포 입자(Dex-g-PLGA 입자(27))와 비교해서 높은 항체가 상승 효과를 나타냈다. Dex-g-PLGA 입자(25)가 높은 항체가 상승 효과를 나타낸 것에 대해서 그 투여량을 10분의 1, 100분의 1로 줄임으로써 항체가 상승 효과는 저하되고, 투여량을 100분의 1로 한 입자에서는 낮은 항체가 상승 효과밖에 가지지 않았다. 항원 투여량 1μg으로 한 Dex-g-PLGA 입자(25) 10분의 1량 투여, Dex-g-PLGA 입자(28)의 비교에서는 투여 폴리머량이 많은 쪽이 높은 항체가 유도 효과를 나타냈다(도 10).

또, 6주간째의 혈액에 관해서 실시예 7과 같은 방법으로 IgG2a 항체가를 측정하고, IgG2a 항체가 측정과 같은 방법으로 IgG1 항체를 갖고 IgG1 항체가를 측정하고, 그 비를 계측한 결과 Alum과 항원을 혼합해서 투여한 경우에는 낮은 IgG2a/IgG1값을 나타내는 것에 대해서 Dex-g-PLGA 입자(25)(26)(27)는 높은 IgG2a/IgG1값을 나타내고, 입경이 작을수록 IgG2a/IgG1값이 높아지는 경향이 보여졌다(도 11).

(산업상의 이용 가능성)

본 발명의 면역원성 조성물은 감염증이나 암 등의 치료 및/또는 예방을 위한 백신으로서 이용할 수 있다.

Claims

소수성 세그먼트가 폴리(히드록시산)인 양친매성 폴리머로 이루어지는 아쥬반트 미립자에 항원이 내포된 항원-아쥬반트 미립자 복합체를 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 항원-아쥬반트 미립자 복합체가 회합해서 이루어지는 입자를 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 아쥬반트 미립자는 상기 양친매성 폴리머의 친수성 세그먼트로 이루어지는 친수성 부분을 내부에 갖고, 상기 양친매성 폴리머의 소수성 세그먼트로 이루어지는 소수부분의 외층을 갖는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 양친매성 폴리머의 친수성 세그먼트는 다당 또는 폴리에틸렌글리콜인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 양친매성 폴리머는 다당 주쇄 및 폴리(히드록시산) 그래프트쇄로 이루어지는 그래프트형 양친매성 폴리머인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
제 4 항 또는 제 5 항에 있어서,
상기 다당은 덱스트란인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 양친매성 폴리머는 폴리(히드록시산) 및 폴리에틸렌글리콜로 이루어지는 블럭 폴리머인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리(히드록시산)은 폴리(락트산-글리콜산)인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
표면 개질제가 상기 아쥬반트 미립자의 폴리(히드록시산)에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항원-아쥬반트 미립자 복합체 또는 항원-아쥬반트 미립자 복합체가 회합해서 이루어지는 입자의 평균 입경은 0.1∼50㎛인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
면역 활성화 물질을 유효 성분으로서 더 함유하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
제 11 항에 있어서,
상기 면역 활성화 물질은 핵산인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
제 11 항 또는 제 12 항에 있어서,
상기 면역 활성화 물질은 CpG인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.