CN102421452B - 多价佐剂展示 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了佐剂‑聚合物构建体，其包含与3个或更多个佐剂共价连接的聚合物骨架，其中所述3个或更多个佐剂各自存在于悬垂的侧链中，所述佐剂直接或通过间隔基团连接至聚合物骨架。

Description

多价佐剂展示
本发明涉及使用佐剂刺激免疫系统的改进的技术。本发明特别涉及新的含有佐剂的制品，其以多展示形式(multiple display format)呈递佐剂；包含这些制品的组合物以及这些制品在免疫中的用途。
背景技术
佐剂通常是常见的病原体、例如病毒、细菌或真菌的成分(或类似物)。它们通常被模式受体、清道夫受体和toll样受体(TLR)识别。多数成功的佐剂以低亲和性(affinity)但是以高亲和力(avidity)与这些受体结合，这是由于多次重复呈递。最佳的佐剂倾向于是完整(或部分裂解的)细菌或双链病毒DNA。然而，目前本领域中趋向于具有单一可鉴定的、优选完全合成的成分的更加确定的制剂。不幸的是，干净的、离散的和单分散的佐剂不能刺激先天免疫系统达到如同最初的“脏”制剂那样的刺激程度。目前的合成佐剂，例如咪喹莫特(imiquimod)和Pam2Cys是难以配制和递送的溶解性差的低分子量试剂。
本领域中描述的佐剂的具体实例包括：合成的佐剂，例如描述于US 6,149,222中的那些。这些佐剂是由聚氧乙烯/聚氧丙烯嵌段共聚物构成的泊洛沙姆(poloxamer)，它们通过未充分确定的非离子型相互作用刺激多种细胞表面受体。US 6,610,310描述了由合成糖或其它聚合物上的多个负电荷构成的聚阴离子型合成聚合物。然而，此类合成佐剂一般具有差的亲和力和不足的佐剂活性。
已经进行了将合成佐剂掺入制剂的努力，其旨在改善递送。例如，US 2005/0233105描述了含有低分子量合成佐剂的制剂。但是，这些制剂是佐剂与病毒疫苗的简单混合物，它们不提供改善合成佐剂的内在活性的方法。
类似地，WO 2007/078879描述了含有自组装脂质体、聚合物复合物和乳化液体的组合物。这些组合物意在以更天然的形式呈递佐剂，但是它们难以被配制并且多数佐剂材料是不可达的，因为其被裹在疏水性核心内。这些制剂在一定条件下冻结，并且由于它们的不稳定性，它们通常需要在施用前即时配制。
因此，需要一种新的方法来设计提供免疫系统的改进的刺激的合成佐剂。
发明内容
因此，本发明提供了佐剂-聚合物构建体(在本文中也称作聚合物-佐剂构建体)，其包含与3个或更多个佐剂共价连接的聚合物骨架，其中所述3个或更多个佐剂各自存在于悬垂的侧链中，佐剂直接或通过间隔基团连接至聚合物骨架。
本发明人发现：相对于单独使用合成佐剂，将数个小的合成佐剂连接至聚合物、从而使佐剂以多价显示形式呈递，能够增强免疫刺激。通过以这种方式呈递多个佐剂，其暗示了病原体相关的分子模式(PAMP)，被认为改善受体亲和力并提供向toll-样受体和模式识别受体的更天然的呈递。此外，佐剂的多价显示促进受体交联和信号传导。这些因素都引起增强的免疫刺激，并因此能够降低所用的佐剂的剂量并减少副作用。按照这种方式将佐剂连接至聚合物链还增加佐剂成分的分子大小，这会辅助防止沥滤进入血流中，从而减少脱靶毒性。
在本发明的优选实施方式中，聚合物骨架本身是亲水性的，其辅助溶解通常为亲脂性的佐剂。这促进了佐剂的递送并使所用的制剂更加简单。另一个优点是增加了可与受体相互作用的分子数目，也能够降低所用的剂量。
本发明的佐剂-聚合物构建体通常与疫苗联合施用。因此，本发明还提供了包含与疫苗结合的本发明的佐剂-聚合物构建体的疫苗缀合物。还提供了组合物，其包含本发明的佐剂-聚合物构建体或疫苗缀合物和药学上可接收的载体或稀释剂。
本发明还提供了用于刺激或增强有此需要的受试者中的免疫应答的方法，包括向所述受试者施用有效、非毒性量的本发明的佐剂-聚合物构建体、疫苗缀合物或组合物。当佐剂-聚合物构建体或组合物不包含疫苗时，该方法还包括同时或分别施用疫苗的步骤。还提供了本发明的佐剂-聚合物构建体、疫苗缀合物或组合物，其用于刺激或增强免疫应答的方法。
附图说明
图1提供了神经酰胺类似物的合成示意图。
图2显示了根据本发明的聚合物-佐剂构建体的结构。
图3a显示了用于制备聚合物-佐剂构建体的反应性聚合物的结构。图3b显示了结合于神经酰胺佐剂和肽抗原的同一聚合物。
图4显示：在同一聚合物上多重呈递TLR2拮抗剂Pam3Cys引起细胞的更高的刺激。U937是淋巴瘤细胞系，其具有单核细胞样表型，表达一众TLR受体，包括TLR2。刺激TLR2导致NfkB的激活，并且这些细胞已经经过处于NfkB启动子控制下的报告质粒(萤光素酶)转染。在暴露于测试物质8小时之后，裂解细胞并就萤光素酶的表达进行分析。所有的测试物质均以100ng/ml加入(注意：Pam3Cys缀合物构建体中仅有5.22ng是Pam3Cys)。数据显示：与聚合物结合的Pam3Cys显示出比单独的Pam3Cys显著更高、与阳性对照LPS相当的刺激水平。
图5显示：在同一聚合物上多重呈递TLR2拮抗剂Pam2Cys引起细胞的更高的刺激。将骨髓衍生的DC暴露于连接于HPMA的50ng/ml Pam2Cys(P2C)或P2C，持续24小时。然后通过ELISA就IL-8测评细胞上清液。注意：仅5wt％(2.5ng)的Pam2Cys存在于50ng/ml的P2C-pHPMA样品中。
具体实施方式
如本文使用的“佐剂”是可以刺激免疫系统并增强对疫苗的应答而本身无任何特异性抗原效应的试剂。
本发明的构建体含有至少3个佐剂，它们可以是相同或不同的。在一个优选的实施方式中，3个或更多个佐剂是相同的。每个佐剂在悬垂侧链中结合于聚合物骨架。因此，佐剂不是聚合物骨架本身的一部分。这提供了佐剂的更好的呈递以被细胞受体识别，因为佐剂的空间-结合的排列更像完整细菌或病毒或其成分例如双链病毒RNA表面上的′PAMP′表位，并且引起针对细胞受体的更好的结合亲和力。
至少3个佐剂、优选至少5个、更优选至少10个佐剂，共价连接于每个聚合物，每个佐剂通常存在于单独的悬垂侧链中。通常最多50个佐剂存在于一个聚合物骨架上。在一个实施方式中，至少20个佐剂存在于聚合物骨架中。
佐剂可以包含多种结构，它们的特征在于促进针对疫苗的改善的免疫应答的能力。佐剂所结合的一类受体是Toll样受体(TLR；也称作“模式受体”，因为它们具有识别病原体表面上的重复的PAMP序列的能力)。TLR识别衍生自多种类别的病原体、包括革兰氏阳性和阴性细菌、DNA和RNA病毒、真菌和原生动物的保守的分子产物。已经在多种脊椎动物基因组中认识到了TLR基因，很多部分和全长序列是可获得的。已经鉴定了人类中的11种TLR，在搜索小鼠基因组时发现了13种。已经表明人和小鼠TLR家族成员具有不同的配体特异性，识别不同的分子结构。TLR1、TLR2、TLR4、TLR5和TLR6全部定位于识别细胞壁成分的胞质膜，而TLR3、TLR7、TLR8和TLR9优先表达于细胞内区室，例如内体，并识别核酸结构。已经部分地鉴定了不同TLR的配体要求：
TLR2异二聚体(主要是与TLR1或TLR6)——脂蛋白、肽聚糖、脂聚糖、脂胞壁酸、脂多糖、肽聚糖、酵母聚糖
TLR5——细菌鞭毛蛋白
TLR7——咪唑并喹啉(咪喹莫特、GArdiquimod)、CL264、洛索立宾
TLR8——单链RNA、大肠杆菌RNA
TLR7/TLR8异二聚体——CL075，CL097，Poly(dT)，R848
TLR9——DNA中的非甲基化CpG岛，包括含有CpG的寡核苷酸
TLR4——脂多糖、单磷酰脂A
TLR3——双链RNA
TLR配体的实例包括：
-咪喹莫特——TLR7的配体
-MALP-2[分离自发酵支原体(Mycoplasma Fermentans)的二酰基脂肽]——TLR6/TLR2的配体
-牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)脂多糖，脂胞壁酸——TLR2的配体
-Pam3CSK4——TLR2与TLR1的异二聚体的配体
-Pam2Cys——TLR2与TLR6的异二聚体的配体
-Poly(I).Poly(C)——TLR3的配体
TLR存在于先天免疫细胞(DC、巨噬细胞、自然杀伤细胞)，获得性免疫力的细胞(T和B淋巴细胞)中，也存在于非免疫细胞(上皮和内皮细胞，成纤维细胞)中。
用于本发明的优选佐剂是脂聚糖、脂多糖、脂阿拉伯甘露聚糖、脂胞壁酸、肽聚糖、天然和合成脂蛋白和脂肽、酵母多糖、糖脂、聚肌苷-聚胞苷酸、单磷酰脂A、TNFα、TNF肽、CD40配体、OX40、IL-4、IL-6、IL-8、IL-2、IL-12、甘露糖、GM-CSF、IFN-γ、IFN-α、鞭毛蛋白、咪唑并喹啉化合物、鸟苷、双链RNA(dsRNA)、单链DNA(ssDNA)和细菌DNA或合成的寡核苷酸中的含有非甲基化CpG的序列。
本发明的聚合物骨架可以是合成的或天然存在的聚合物。如本文使用的“聚合物”包括生物聚合物，例如核酸、蛋白和淀粉，以及合成的聚合物。在一个实施方式中，聚合物不是核酸。在另一个实施方式中，聚合物是合成的聚合物。
在一个实施方式中，聚合物是亲水性聚合物，其将赋予佐剂-聚合物构建体水溶性。例如，佐剂-聚合物构建体可以具有至少100μg/mL，例如至少150μg/mL或至少200μg/mL的水溶性。
聚合物本身可以是生物活性的，例如聚合物本身可以具有佐剂性质。在一个实施方式中，聚合物本身实质上不具有佐剂活性(即，单独的聚合物将不会增强免疫刺激)。可以通过例如使用腘淋巴结(PLN)测定法进行聚合物的佐剂活性的测定，其中聚合物与抗原一起被注射进入小鼠的后足垫。佐剂活性测定为：相对于给予所述抗原而不给予待测物质的动物、以及仅给予推定佐剂的动物中的PLN重量和细胞数目，接受抗原和待研究物质的动物中的PLN重量和细胞数目的增加。在另一个实施方式中，聚合物是无生物学活性的。
适宜的合成聚合物包括基于具有乙烯部分的单体的那些，例如甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酰胺、乙烯、乙烯醚、乙烯酯以及苯乙烯部分。该类别下的单体的具体实例有：甲基丙烯酸酯和甲基丙烯酰胺，特别是N-2-羟丙基甲基丙烯酰胺(HPMA)和羟乙基甲基丙烯酸酯(HEMA)和乙烯吡咯烷酮(PVP)。也可以使用适合于开环聚合和开环复分解的环式单体，例如环式酰胺，环式酯，环式氨基甲酸酯、环醚、环酐、环式硫化物、环胺以及单环和多环烯烃。
备选的聚合物骨架包括：核酸(例如，polyI:polyC、polyA:polyU、单链DNA、双链DNA)、聚乙二醇、聚(乙二醇-寡肽)、聚(氨基酸)(例如，聚[N-(2-羟乙基)-L-谷氨酰胺)和多糖，例如糖原、纤维素、葡聚糖、环糊精、藻酸盐、透明质酸、聚唾液酸、聚甘露聚糖和其它的基于葡萄糖或半乳糖的聚合物。可以用作聚合物骨架的另外的天然产品包括肝素、葡聚糖和淀粉。当骨架基于乙二醇-寡肽时，寡肽基团优选包含1-4个氨基酸，并且悬垂侧链通常由聚合物骨架的寡肽部分支持。
通常而言，聚合物骨架是基于选自甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酰胺、苯乙烯单体、乙烯单体、乙烯醚单体、乙烯酯单体、唾液酸单体、甘露糖单体、N-(2-羟乙基)-L-谷氨酰胺(HEG)单体和乙二醇-寡肽单体的单体单元。优选地，聚合物骨架是基于选自N-2-羟丙基甲基丙烯酰胺(HPMA)、N-(2-羟乙基)-L-谷氨酰胺(HEG)和乙二醇-寡肽的单体单元或者是聚唾液酸或聚甘露聚糖聚合物。
基于HPMA的聚合物骨架是更优选的。
聚合物的重均分子量通常是1kDa至100kDa，例如至少2kDa，更优选至少5kDa、最多80kDa，更优选最多40kDa。优选的聚合物具有5kDa至40kDa的重均分子量。
聚合物骨架可以是具有3个或更多个包含佐剂的悬垂侧链的线性聚合物。备选地，聚合物骨架本身可以是分支的结构。例如，考虑到树状和梳状聚合物。
在一些实施方式中，聚合物骨架可以与另外的聚合物交联，从而形成水凝胶。水凝胶优选是水解上不稳定的，或者是可被酶降解的，例如，基质金属蛋白酶2或9。这是为了使佐剂固定于水凝胶内，从而佐剂的释放可以被调控。因此，根据本发明的一个优选特征，在可能促进交联和形成水凝胶的条件下(例如高浓度的反应剂，无任何过量)或在存在可能促进交联的试剂例如二胺的情况下进行本发明的方法。一般使用描述于Subr，V.，Duncan，R.and Kopeck，J.(1990)″Release of macromolecules and daunomycin fromhydrophilic gels containing enzymatically degradable bonds″，J.Biomater.Sci.Polymer Edn.，1(4)61-278中的化学方法进行含有经修饰的佐剂的水凝胶的形成。
当聚合物骨架包含核酸时，可以将聚合物连接于另外的核酸以形成双链螺旋结构。
佐剂可以直接或通过间隔基团连接至聚合物骨架。在优选的实施方式中，存在间隔基团，从而佐剂-聚合物构建体具有下列结构：
P-[S-A]n
其中P是聚合物骨架，S是间隔基团，A是佐剂，n等于或大于3。
间隔基团可以是相同或不同的，通常选自：寡(烷氧基化合物)(例如pEG链，其长度为2-200个碳原子)；寡肽，其具有例如最多约20个氨基酸；C1-C12烷基部分(例如，C1-C6烷基部分，例如亚甲基、亚乙基、亚丙基或亚丁基)；C6-C10芳基部分(例如，苯基)；此类烷基和芳基部分的组合；聚酯和聚碳酸酯。适宜的聚酯和聚碳酸酯是例如具有10-30个碳原子的链的那些。间隔基团通常是亲水性的，并且可以掺入可降解的键，例如可还原的二硫键，易于发生酸催化水解的键，或可以通过酶促降解被切割的键。
优选的间隔基团是寡(烷氧基化合物)和寡肽，特别是寡肽。
在本发明的一个实施方式中，间隔基团是寡肽。优选地，寡肽含有最多10个，例如最多5个氨基酸。更优选地，寡肽含有1-4个，例如2或4个氨基酸。适宜的寡肽是-Gly-Phe-Leu-Gly-，-Gly-Gly-和Glu-Lys-Glu-。
在另一个实施方式中，间隔基团中掺入可降解的键。例如，间隔基团可以通过还原而被切割，例如：-NH-(CH2)2NHCO-(CH2)2-SS-(CH2)2-CO-。备选地，间隔基团可以通过酸催化的水解而被切割，例如：
其中x和y独立地是1至5的整数，例如1、2或3；并且R是例如C1-C8烷基，例如甲基或乙基。
n的值反映了包含佐剂的悬垂侧链的数目。至少3个佐剂存在于每个聚合物分子上，所以n至少是3。通常，最多50个佐剂存在于一个聚合物骨架上，所以n是最多50。在一个实施方式中，至少20个佐剂存在于聚合物骨架上。
在本发明的一个实施方式中，基团-S-A构成至少2mol％的佐剂-聚合物构建体。例如，基团-S-A可以构成至少5mol％的构建体。通常而言，基团-S-A构成不超过20mol％的佐剂-聚合物，例如最多10mol％。
本发明的佐剂-聚合物构建体可以含有携带除了佐剂之外的官能团的悬垂侧链。此类官能团可以直接或通过间隔基团结合至聚合物骨架。适宜的间隔基团是上文描述的那些。可以存在的官能团的实例有增溶性基团，例如胺、羟基、羧基和寡(亚烷基)基团。
本发明的佐剂-聚合物构建体的实例是式P-[S-A]n的那些，其中P是基于选自N-2-羟丙基甲基丙烯酰胺(HPMA)、N-(2-羟乙基)-1-谷氨酰胺(HEG)和乙二醇-寡肽的单体单元的聚合物或者是聚唾液酸或聚甘露聚糖聚合物；S是-Gly-Phe-Leu-Gly-，-Gly-Gly-或Glu-Lys-Glu-；n是3至10；A是如上文定义的佐剂。
考虑到用于合成本发明的构建体的数种不同方法：
1.使简单单体与官能化单体共聚以产生在悬垂侧链上具有反应基的聚合物骨架，然后将佐剂连接至这些反应基。
2.使佐剂或佐剂-间隔分子官能化，以掺入可聚合基团，并将官能化佐剂或佐剂-间隔子添加到聚合混合物中。
3.直接或通过间隔基团结合佐剂以改造天然或合成聚合物。
在通过合成方式产生的聚合物的情况下，适宜的聚合技术包括：自由基聚合技术，例如常规的和受控的技术，例如NMP(一氧化二氮介导的自由基聚合)、ATRP(原子转移自由基聚合)、RAFT(可逆加成-断裂链转移)或基于氰氧基(cyanoxyl)的聚合，例如描述于Scales，C.W.；Vasilieva，Y.A.；Convertine，A.J.；Lowe，A.B.；McCormick，C.L.Biomacromolecules 2005，6，1846-1850；Yanjarappa，M.J.；Gujraty，K.V.；Joshi，A.；Saraph，A.；Kane，R.S.Biomacromolecules 2006，7，1665-1670；Convertine，A.J.；Ayres，N.；Scales，C.W.；Lowe，A.B.；McCormick，C.L.Biomacromolecules 2004，5，1177-1180中的那些，它们的内容通过引用方式并入本文。可以使用开环聚合或开环复分解使环式单体聚合。
相关的技术也可以见于′Macromolecular design via reversible addition-fragmentation chain transfer(RAFT)/xanthates(MADIX)polymerization.′Perrier，Sebastien；Takolpuckdee，Pittaya.J.Polym.Sci.，Part A：Polym.Chem.(2005)，43(22)，5347-5393，其通过引用方式并入本文。
通常而言，在共聚反应中使用引发剂，优选AIBN。反应一般在有机溶剂中进行，通常是DMSO。通常将反应加热至50-70℃的温度，优选大约60℃。通常将反应加热至上述指定温度持续4-8小时，优选5-7小时，更优选大约6小时。由此获得的聚合物通常在丙酮-乙醚(3∶1)混合物中沉淀出来，滤出，以丙酮和乙醚洗涤并在真空下干燥。可以使用甲醇在Sephadex-LH 20柱中进一步纯化由此获得的聚合物。
用于聚合反应的单体通常是商业上可获得的或者可以使用已知的方法通过类比而制备，例如描述于Konak，et al，Langmuir，2008，24，7092-7098中的方法。
上述的合成(1)涉及在聚合反应中加入官能化的单体。此类官能化的单体通常具有结构PG-S-F或PG-F，其中PG是可聚合的单体，例如HPMA或甲基丙烯酰胺(上文还定义了适宜的单体)，S是如上文定义的间隔基团，F是官能团。如果需要，可以使用两种或更多种不同的官能化的单体的混合物。
在这种情况下，聚合混合物可以包括非官能化单体和官能化单体。官能化单体通常以最多大约20mol％、例如最多10mol％的量掺入到聚合物链中。优选地，官能化单体以至少2mol％、例如至少5mol％的量掺入。
适宜的官能团F包括增溶性基团，例如上文描述的那些，和反应基。也可以使用保护的基团，其为此类增溶性基团或反应基的前体。
将理解，如本文使用的术语“反应基”是指显示出显著的化学反应活性的基团，尤其是在与其它分子的互补性反应基、通常是与佐剂上的基团的偶联或连接反应中。
反应基可以用作佐剂或疫苗或备选官能团例如增溶性基团的连接点。例如，反应基可能能够与佐剂、疫苗或含有备选官能团的其它分子上的例如胺基、巯基、羟基、醛、酮、羧酸或糖基团形成共价键。在与佐剂或疫苗反应的情况下，如果必要，可以将佐剂或疫苗官能化，以在其中包括能够与反应基形成共价键的此类基团。
在一个实施方式中，反应基能够与胺基形成共价键。该实施方式中的适宜类型的反应基的实例包括酰基氯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、酰基-噻唑烷-2-硫酮、马来酰亚胺、N-羟基-琥珀酰亚胺酯(NHS酯)、硫代-N-羟基-琥珀酰亚胺酯(硫代-NHS酯)、4-硝基酚酯、环氧化物、2-亚氨基-2-甲氧基乙基-1-硫苷、氰尿酰素、咪唑基甲酸酯、琥珀酰亚胺琥珀酸酯、琥珀酰亚胺戊二酸酯、酰叠氮、酰基腈、二氯三嗪、2，4，5-三氯苯酚、二氢恶唑酮和氯甲酸酯。此类基团与胺容易地发生反应。酰基-噻唑烷-2-硫酮和硫代-NHS酯是优选的。酰基-噻唑烷-2-硫酮是优选的，是由于其高反应性和在水溶液中的相对稳定性。
在另一个实施方式中，反应基能够与巯基形成共价键。该实施方式中的适宜类型的反应基的实例包括烷基卤化物、卤代乙酰胺和马来酰亚胺。
在另一个实施方式中，反应基能够与羟基形成共价键。该实施方式中的适宜类型的反应基的实例包括氯甲酸酯和酰基卤。备选地，可以使用氧化剂例如高碘酸盐氧化羟基，然后与反应基反应，所述反应基包括肼、羟胺或胺。
在另一个实施方式中，反应基能够与醛或酮基团形成共价键。该实施方式中的适宜类型的反应基的实例包括肼、氨基脲、伯脂族胺、芳族胺和卡巴肼。
在另一个实施方式中，反应基能够与羧酸形成共价键。这可以例如这样实现：使用水溶性的碳二亚胺、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸激活羧酸、然后与作为反应基的胺反应。
在另一个实施方式中，反应基能够与糖反应以形成共价键。这可以例如这样实现：使用半乳糖氧化酶进行酶介导的糖的氧化以形成醛、然后与作为反应基的醛反应活性化合物例如肼反应。
反应基的优选实例有硝基酚酯(ONp)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、噻唑烷-2-硫酮(TT)和环氧基。
在聚合之后，掺入聚合物中的反应基可以直接与佐剂反应或转化为其它官能团，例如增溶性基团。备选地，反应基可以部分与含有备选反应基的分子反应，使得存在两种不同的反应活性官能团。然后可以使用双正交方法进一步修饰这些反应基。
含有官能化悬垂侧链的适宜的聚合物的实例公开于WO 98/19710并且包括：聚HPMA-GlyPheLeuGly-ONp、聚HPMA GlyPheLeuGly-NHS、聚HPMA-Gly-Gly-ONp、聚HPMA-Gly-Gly-NHS、聚(pEG-oligopeptide(-ONp))、聚(pEG-GluLysGlu(ONp))、pHEG-ONp、pHEG-NHS。这些化合物的制备公开于WO 98/19710。WO 98/19710的内容通过引用方式并入本文。适合用于本发明的另一种此类官能化聚合物是聚HPMA-GlyPheLeuGly-TT(其中TT是噻唑烷-2-硫酮)，其合成公开于WO 2005/007798。WO 2005/007798的内容通过引用方式并入本文。
用于合成本发明的构建体的备选方法包括使佐剂官能化以包括在聚合混合物内(上文的合成(2))。在该实施方式中，通常按照上文的描述进行聚合，但是使用具有结构PG-S-A或PG-A的官能化单体，其中PG和S如上文所定义，并且A是佐剂。可以使用两种或更多种此类官能化单体的混合物，或此类官能化单体与如上文描述的式PG-S-F或PG-F的混合物。
如上所述，以最多大约20mol％、例如最多10mol％的量掺入官能化单体。优选地，以至少2mol％、例如至少5mol％的量掺入官能化单体。
在另一个实施方式中，通过改造预形成的聚合物例如天然存在的聚合物来获得本发明的构建体(如上所述的合成(3))。在这种情况下，聚合物上的适宜的反应基用于添加佐剂，任选通过间隔基团，以及任何其它所需的官能团，例如增溶性基团。
在本发明的一个实施方式中，聚合物骨架含有两个或更多个不同的佐剂。在该实施方式中，佐剂可以随机排列或以特定顺序排列。例如，聚合物可以包括结构-A-B-A-B-的嵌段共聚物，其中A是具有包含佐剂(a)的一个或多个悬垂侧链的聚合物部分，B是具有包含佐剂(b)的一个或多个悬垂侧链的聚合物部分。佐剂的此类经选择的顺序可以提供协同效应。
在本发明的另一个实施方式中，聚合物骨架和/或悬垂侧链上的间隔基团是可降解的。因此，在聚合物骨架和/或一个或多个悬垂侧链中可以存在可降解的键。可降解的键是在体内可以自发或通过特别激发的事件而分解的键。通常而言，可降解的键适应于被内体摄入之后由于下降的pH而自发水解，或者是在细胞内还原环境下可还原切割的键。备选地，可降解的键可设计为被特定的酶切割。
使用生物可降解的键对于促进聚合物-佐剂构建体的降解、限制其佐剂活性并促进最终的排出以避免不想要的毒性是有利的。
用于本发明中的一些聚合物是内在可降解的，例如一些核酸。备选地，可以将可降解的键掺入到聚合物骨架或侧链中。此类可降解键的实例包括二硫键，通常使用温和还原条件例如金属亚硫酸盐或适当选择的酶来切割它们；通过pH依赖性水解而被切割的腙键、顺式乌头酰基键和原酸酯；或酶促可切割的键。
酶促可切割的键设计为被特定的酶切割，通常包括短的寡肽，例如在本文中描述为间隔基团的寡肽。
酶促可降解性提供的不稳定性是理想的，因为其允许聚合物(或聚合物与佐剂之间的键)设计为被所选的酶选择性切割。此类酶可以存在于靶位点处，赋予经修饰的佐剂在靶位点处的激发的崩解的可能性，从而释放佐剂以与靶组织相互作用。酶也可以是细胞内的酶，其可以使经修饰的佐剂在靶细胞的所选细胞区室内崩解，以增强佐剂的活性。备选地，可以将酶切割位点设计为促进经修饰的佐剂响应于适当的生物活性(例如入侵的或转移的表达金属蛋白酶的肿瘤细胞的到达)而发生崩解。在另一种改变的方式中，可以在适当的时间或位点施用能够激活经修饰的佐剂的酶，以介导经修饰的佐剂所需的崩解和随后的佐剂与组织之间的相互作用。
本发明的佐剂-聚合物构建体适合于与疫苗联合向人或哺乳动物受试者施用，以增强或刺激该患者对疫苗的免疫应答。
可以与本发明一起使用的适宜的疫苗的实例包括：病毒、蛋白、肽、糖和核酸。疫苗可以是预防性的(给予该疫苗以保护接受者免于疾病)或者是治疗性的(用于辅助免疫系统攻击已有的感染或病症)。一般地，疫苗可以是死亡的或灭活的生物体、衍生自它们的纯化产物、合成的肽、重组蛋白或编码靶生物体的成分的核酸疫苗。
一些疫苗含有杀死的微生物——它们是之前有毒的、已经被化学品或热杀死的微生物。实例有针对流感、霍乱、腹股沟鼠疫和甲型肝炎的疫苗。
减毒的疫苗含有活的、减毒的病毒微生物——它们是经过工程化的或在使它们的毒力特性失能的条件下培养的活的微生物或使用密切相关但危险性低的生物体来产生宽泛的免疫应答。它们通常激发更持久的免疫应答，是用于健康成人的优选类型。实例包括黄热、麻疹、风疹和流行性腮腺炎。活的结核疫苗不是接触传染的菌株，而是被称作“卡介苗”的相关菌株；其在美国罕用。
疫苗类别的其它实例有：
类毒素——它们是灭活的毒性化合物，当它们(而非微生物本身)引起疾病时。基于类毒素的疫苗的实例包括破伤风和白喉。不是所有的类毒素都是针对微生物的疫苗；例如，Crotalis atrox类毒素用于接种狗以防止被响尾蛇咬。
肽疫苗——含有来自疾病蛋白例如流感M2e肽的抗原性表位的合成肽。理论上讲，任何肽都可以被掺入含有佐剂的聚合物中，可以单一地或多拷贝地(1-20)掺入。优选的肽在序列中不包含关键性赖氨酸残基，除了所添加的为了与聚合物缀合的之外。对于在活性位点包含赖氨酸残基的肽，可以使用通过半胱氨酸残基的侧链进行的备选缀合。
蛋白亚基疫苗——不是将灭活的或减毒的微生物引入免疫系统(这将构成“完整试剂”疫苗)，而是其片段能够产生免疫应答。特征性实例包括针对乙型肝炎病毒的亚基疫苗，其仅由病毒的表面蛋白(在酵母中产生)构成；以及针对人乳头瘤病毒(HPV)的病毒样颗粒(VLP)疫苗，其由病毒主要衣壳蛋白构成。
缀合疫苗——某些细菌具有弱免疫原性的多糖外壳。通过将这些外壳与蛋白(例如毒素)连接，可以使免疫系统识别所述多糖，如同其是蛋白抗原一样。该方法用于嗜血菌乙型流感疫苗。
重组疫苗为：载体(有时是无害病毒，有时是质粒)被用作“特洛伊木马”以将编码靶病原体的成分的基因导入接受者的细胞(包括抗原呈递细胞例如树突细胞)中并表达之。例如，可以使用减毒的腺病毒载体以在宿主细胞中表达来自靶病原体(例如疟疾、结核、流感)的蛋白，使得能够产生针对靶病原体的免疫应答而不使接受者暴露于任何感染性物质。类似的方法可用于多种病毒载体，尤其是α病毒。
在一个实施方式中，疫苗缀合于佐剂-聚合物构建体以形成疫苗缀合物。可以通过这种方式缀合非常多的疫苗，包括肽、脂、蛋白、核酸、碳水化合物和合成疫苗，包括混合成分的疫苗。疫苗可以衍生于很多靶标，包括病毒、原生动物、线虫、真菌、酵母或细菌，或者它们可以意在进行针对癌症相关抗原的接种。疫苗与聚合物-佐剂构建体之间的键可以设计为在与细胞结合之后发生降解，以增强疫苗成分的细胞运输。此类生物可降解的键可以是可还原的键、水解上不稳定的键或作为被靶标相关的酶降解的底物的键。
可能的疫苗的范围包括但明显不限于：
●流感肽和流感蛋白，例如用于标准流感疫苗中的那些，包括H和N蛋白和M2
●衍生自HIV的肽，包括来自gp120、gp41、gag、nef和pol的表位
●HepB表面抗原
●癌症抗原，例如CEA、MUC-1和5T4
●炭疽蛋白，亚基和肽
●诺罗病毒蛋白和肽
●类毒素(见上文)
●来自多种鼠疫株[鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)]的蛋白、亚基和肽抗原
●衍生自疟疾的蛋白和肽——例如环子孢子抗原或合成的TRAP表位串
●病毒和病毒样颗粒(VLP)，包括腺病毒、呼吸道合胞病毒、α病毒、疱疹病毒、痘苗病毒、麻疹病毒、里奥病毒和慢病毒
聚合物-佐剂构建体与疫苗的缀合是这样实现的：在聚合物-佐剂构建体上提供一个或多个反应基，其能够结合疫苗上的基团。结合可以是共价的或者可以是另一种类型的相互作用，例如静电吸引。通常而言，提供多于一个反应基，例如，至少5个反应基，从而在疫苗与聚合物-佐剂构建体之间形成数个连接。
在聚合物-佐剂构建体与疫苗之间形成共价键的情况下，可以使用上文详细描述的反应基。反应基的确切性质取决于疫苗上可获得的结合位点。用于病毒疫苗并与病毒表面上的位点共价结合的优选的反应基的实例包括N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、硝基酚酯(ONp)和噻唑烷-2-硫酮(TT)基团。
在与疫苗发生静电相互作用的情况下，可以将带电的基团引入聚合物链中以促进向疫苗的静电吸引。
在一个具体实施方式中，可以使用聚合物-佐剂缀合物表面包被重组疫苗颗粒(该颗粒是基于包含编码针对靶病原体的基因的DNA的腺病毒载体)以增强其在接受者的细胞内表达病原体蛋白之后刺激免疫应答的能力。为了实现这一点，向聚合物-佐剂缀合物提供能够与腺病毒载体表面结合的互补基团，使聚合物与该表面连接，从而在病毒颗粒表面上呈递佐剂。在该实施方式中，适宜的反应基是能够与病毒间形成共价键的那些(例如NHS、ONP、TT基团)或带电基团。
疫苗上的结合位点可以是天然存在的或者可以是导入的。当导入结合位点时，它们应该与聚合物-佐剂构建体上的反应基是互补的。例如，可以工程化病毒载体以在其表面蛋白上表达特定反应基(例如，游离的巯基)，可以将对应的反应性导入聚合物-佐剂构建体(例如马来酰亚胺基团)以与病毒颗粒直接共价键合。
当聚合物-佐剂构建体和疫苗二者都具有多个互补的反应基时，它们的键合产物有可能聚集，或者甚至沉淀。虽然这对于提供佐剂化疫苗的局部库可能是有用的，但可以通过使用过量的一种成分(通常是聚合物-佐剂构建体)使交联效应最小化。备选地，可以仅向聚合物-佐剂构建体提供一个反应基残基，确保与疫苗的单价连接。在一个实施方式中，可以通过创建半遥爪反应性聚合物来实现这一点，其中每个聚合物分子的一个末端被反应基衍生，并且数个佐剂(作为衍生的共聚单体)被掺入聚合物链中。末端反应基选择为：其不与佐剂反应，但可用于缀合物与疫苗的连接。
在备选实施方式中，疫苗和佐剂-聚合物构建体以及药学上可接受的载体或稀释剂一起存在于单一组合物中。在另一个备选实施方式中，疫苗和佐剂-聚合物构建体分别配制，以提供两个单独的组合物。在后一种情况下，可以同时或分别向患者施用两个组合物。
因此，本发明提供了包含本发明的佐剂-聚合物构建体或疫苗缀合物以及药学上可接受的载体或稀释剂和任选包含疫苗的组合物。优选的组合物不含来自微生物的污染物和热源。
可以将本发明的组合物配制为多种剂型以施用。因此，它们可以经口施用，例如作为水性或油性悬浮液。本发明的组合物可以配制为用于通过胃肠外施用：皮下、静脉内、肌内、胸骨内、腹膜内、真皮内、经皮或通过输注技术。优选真皮和肌内施用。本发明的组合物可以配制为以气雾剂的形式经由吸入器或雾化器通过吸入来施用。
用于口服施用的制剂例如可以包含：如上所述的活性成分，以及，增溶剂，例如环糊精或改性的环糊精；稀释剂，例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、纤维素、玉米淀粉或马铃薯淀粉；润滑剂，例如硅石、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁或硬脂酸钙，和/或聚乙二醇；粘合剂，例如淀粉、阿拉伯树胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮；崩解剂，例如淀粉、藻酸、藻酸盐或羟基乙酸淀粉钠；起泡混合物；染料；甜味剂；润湿剂，例如卵磷脂、聚山梨酯、十二烷基硫酸酯；和一般地，用于药物制剂中的非毒性的和药理学上无活性的物质。
用于口服施用的液体分散液可以是溶液、糖浆剂、乳液和悬浮液。溶液可以含有增溶剂，例如环糊精或改性环糊精。糖浆可以含有例如蔗糖，或蔗糖与甘油和/或甘露醇和/或山梨醇，以作为载体。
悬浮液和乳液可以含有例如天然树胶、琼脂、藻酸钠、果胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯醇，以作为载体。用于肌内注射的悬浮液或溶液可以含有活性化合物以及药学上可接受的载体，例如无菌水、橄榄油、油酸乙酯、二醇，例如丙二醇；增溶剂，例如环糊精或改性环糊精，如果需要，还可以含有适当量的盐酸利多卡因。
用于静脉内或输注的溶液可以含有例如无菌水和增溶剂例如环糊精或改性环糊精，以作为载体，优选地，它们可以是无菌的、含水的、等渗的盐溶液的形式。
将治疗上有效量的本发明的佐剂-聚合物构建体施用至受试者。佐剂的多价显示使得能够使用低于之前提出的用于非聚合物结合的佐剂的浓度的佐剂。因此，所施用的佐剂的量等于或优选小于使用相同佐剂但不与聚合物结合的相应制剂中的剂量。通常以无毒性的量向受试者施用本发明的佐剂-聚合物构建体。疫苗也以治疗上有效的和无毒性的量施用。
本发明的聚合物-佐剂构建体用于在多个不同的医药领域中增强和刺激免疫应答。因此，本发明用于治疗或预防传染性疾病、癌症和自身免疫病，并用于治疗过敏症和高反应性。
传染性疾病的实例包括那些由选自病毒、细菌、寄生虫和真菌的物质引起的疾病。
病毒性传染性疾病可以是季节性流感、禽流感、呼吸道合胞病毒、人乳头瘤病毒、肝炎病毒、HIV/AIDS、单纯疱疹、水痘带状疱疹、巨细胞病毒、登革热、埃博拉出血热、手足口病、拉沙热、麻疹、马尔堡出血热、感染性单核细胞增多症、EB病毒、流行性腮腺炎、诺罗病毒、脊髓灰质炎、狂犬病、风疹、SARS、天花(痘症)、西尼罗河病、黄热、rotovirus、日本脑炎、科罗拉多蜱传热、普通感冒、病毒性脑炎、病毒性胃肠炎、病毒性脑膜炎或病毒性肺炎。
细菌感染性疾病可以是：细菌性脑膜炎、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(包括MRSA)、沙门菌病、志贺氏菌病、弯曲菌病、衣原体属、莱姆病、肺炎球菌性肺炎、炭疽、食物中毒、布鲁杆菌病、沙眼、结核、猫抓病、霍乱、白喉、流行性斑疹伤寒、淋病、脓疱病、军团杆菌病、麻疯病、钩端螺旋体病、利斯特菌病、类鼻疽、诺卡菌病、百日咳、鼠疫、鹦鹉热、Q热、洛矶山斑疹热、猩红热、梅毒、破伤风、土拉菌病、伤寒、斑疹伤寒、细菌性尿道感染、沙眼衣原体、幽门螺杆菌(Heliobacter pylori)。
寄生虫感染可以是疟疾、锥虫病、血吸虫病、囊虫病、美洲锥虫病、贾第虫病、黑热病、利什曼病、丝虫病、阿米巴病、蛔虫病、巴贝虫病、华支睾吸虫病、隐孢子虫病、裂头绦虫病、龙线虫病、棘球蚴病、蛲虫病、片形吸虫病、姜片虫病、自由生存阿米巴感染、腭口线虫病、膜壳绦虫病、等孢球虫病、后殖吸虫病、蝇蛆病、盘尾丝虫病、虱病、蛲虫感染、疥疮、绦虫病、弓蛔虫病、弓形体病、旋毛虫病、旋毛虫病、鞭虫病、滴虫病。
真菌感染性疾病可以是念珠菌病、曲霉菌病、芽生菌病、球孢菌病、隐球菌病、组织胞浆菌病、脚癣。
癌症的实例包括结肠直肠癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、肝癌、皮肤癌、黑素瘤、胃癌、小细胞肺癌、肉瘤、膀胱癌、食管癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、睾丸癌、肾细胞癌、鼻咽癌、头颈癌、甲状腺癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓增殖性疾病、视网膜母细胞瘤、胚胎肿瘤或转移癌。
自身免疫病的实例包括：类风湿性关节炎、糖尿病、多发性硬化、牛皮癣、克罗恩病、强直性脊柱炎、格雷夫斯病、桥本氏甲状腺炎、特发性粘液性水肿、基兰-巴瑞德综合征、系统性红斑狼疮、免疫性血小板减少性紫癜、寻常天疱疮、纤维肌痛、重症肌无力、肉状瘤病、斯耶格伦综合征、川畸病、Lou Gehrig病、脱髓鞘病、溶血性贫血、自身免疫性动脉炎、自身免疫性结肠炎、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性肌炎、自身免疫性关节炎和自身免疫性肝炎。
实施例
实施例1：用作聚合物增强的佐剂的与可溶性聚合物结合的化合物的合成
N-Pam3Cys-(N′-Boc-2，2′-(乙二氧基)二乙胺)(1)的合成
通过使碳二亚胺偶联于单-Boc-保护的二胺而修饰Pam3Cys。将Pam3Cys-OH(95mg，104μmol)溶解于无水的DCM(5mL)并加入到PS-碳二亚胺树脂(1.33mmol/g，138mg，185μmol)中，在氩气下摇动5分钟。将N-Boc-2，2′-(乙二氧基)二乙胺)(33mg，132μmol)加入到无水DCM(1ml)中并继续摇动16小时。薄层色谱(纯EtOAc)分析表明无残余Pam3Cys-OH。通过过滤除掉树脂，加入50mg PS-苯甲醛树脂作为胺清除剂。摇动24小时之后，过滤溶液，在减压下除掉溶剂。通过柱层析纯化粗品固体(DCM中的0-20％MeOH的梯度洗脱，产物Rf 0.6)，并分离为白色固体。
N-Pam3Cys-(2，2′-(乙二氧基)二乙胺)(2)的合成
将N-Pam3Cys-(N′-Boc-2，2′-(乙二氧基)乙二胺)(83mg，73μmol)溶解于1/1的DCM/TFA(4mL)并轻轻搅拌1小时。通过以甲苯、然后以乙醚共沸除掉溶剂和过量的酸。将得到的白色固体溶解于DCM与NaHCO3饱和水溶液的混合物中并剧烈搅拌2小时。收集有机层并以DCM萃取水相(2x10mL)。合并萃取物，在MgSO4上干燥，并蒸发以产生53mg白色固体。MS(ESI+)分析m/z 1041.8[M+H+]要求1040.8。
神经酰胺类似物(3)的合成
根据图1所示的方案制备神经酰胺类似物。
实施例2：聚合物缀合的佐剂的合成
可以修饰携带多个悬垂的氨基、羟基或巯基反应基的亲水性聚合物例如聚[N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺]以使其携带免疫刺激分子例如N-Pam3Cys-(2，2′-(乙二氧基)二乙胺)(2)或神经酰胺类似物例如(3)。本实施例描述了聚[HPMA][MA-GG-TT]的合成及其与神经酰胺类似物(3)的缀合。
多价氨基反应性亲水性共聚物的合成
聚[N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺3-(N-甲基丙烯酰基甘氨酰甘氨酰)噻唑烷-2-硫酮]的合成
将HPMA(1.00g，6.99mmol)，MA-GG-TT(234mg，0.77mmol)和AIBN(200mg，1.21mmol)溶解于无水DMSO，达到10mL的总体积(大约12.5wt％单体)。通过氩气鼓泡使溶液排气20分钟，然后密封烧瓶并置于60C油浴中，轻轻搅拌6小时。然后，通过将溶液逐滴加入到丙酮/乙醚的无水混合物(3/1)中而使聚合物沉淀。通过离心(15min，3000rpm)分离粉末，重悬于丙酮/乙醚，离心，然后在真空下干燥。通过在MeOH中通过UV-Vis.光谱分析测定TT含量。
携带氨基的佐剂与多价氨基反应性共聚物的缀合
通过在无水二甲基亚砜中混合实现佐剂与共聚物的共价缀合。然后使聚合物缀合物沉淀并干燥。通过水解除掉过量的反应基，通过透析和冻干纯化聚合物缀合物。得到的缀合物的结构显示于图2。
实施例3：与聚合物结合的佐剂与疫苗的连接
在本实施例中，将与聚合物结合的神经酰胺衍生物连接于AMSTTDLEA，其为衍生自乙肝病毒X蛋白的肽，并且已知其被细胞毒性T淋巴细胞识别。
按照上文实施例的描述合成神经酰胺-聚合物缀合物，但是通过比较反应时间、温度和试剂浓度的效应来优化反应条件和试剂的相对浓度，以在沉淀时维持聚合物上的大约1mol％的游离反应基。使该物质干燥并储存之。
通过从固相树脂切割而制备具有结构GGGAMSTTDLEA、具有封闭的羧基末端和游离的氨基末端的寡肽。将该寡肽溶解于DMF中并使其与携带1mol％反应性TT基团的聚合物-神经酰胺缀合物反应至完全。然后沉淀该试剂，透析并储存于-20℃。
实施例4：带正电的聚合物通过生物可降解的键与神经酰胺佐剂的连接以及与寡 肽疫苗的连接
在该实施例中，基于N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)的共聚物含有携带季胺基团的单体(在聚合混合物中，1.5mol％)和携带二硫的封端于噻唑烷基团的侧链(在产物中，3.4mol％，用于与佐剂以及与疫苗中的伯胺反应)。反应性聚合物的结构显示于图3a。
按照其它地方的描述(Subr V，Kostka L，Selby-Milic T，Fisher K，Ulbrich K，et al.(2009)Coating of adenovirus type 5 with polymers containing quaternaryamines prevents binding to blood components.J Control Release 135：152-158.)合成并表征反应性聚合物。其具有77,200的重均分子量和32,200的数均分子量。
按照上文的描述连接神经酰胺，留下1mol％的噻唑烷基团不反应，以用于随后共价连接肽抗原。在该实施例中，肽抗原衍生自肝炎病毒X抗原，具有结构GGGAMSTTDLEA，具有封闭的羧基末端和游离的氨基末端(见图3b)。
实施例5：与纳米凝胶结合的佐剂的制备
按照之前的报道(Blackburn et al.，Colloid Polym Sci.2008；286(5)：563-569)，通过自由基沉淀聚合法合成纳米凝胶核心颗粒。使用热相分离性聚合物能够使用沉淀聚合以合成高度单分散的纳米凝胶。摩尔组分为：98％N-异丙基甲基丙烯酰胺(NIPMAm)，2％N，N′-亚甲基双(丙烯酰胺)(BIS)，总的单体浓度为140mM。溶液还含有少量(大约0.1mM)的丙烯基氨基荧光素(AFA)以赋予纳米凝胶荧光，以通过共聚焦显微镜来显示。在典型的合成中，将100mL经过滤的NIPMAm、BIS和十二烷基硫酸钠(SDS，8mM总浓度)的水溶液加入到反应烧瓶中，然后将其加热到70℃。以氮气吹扫该溶液并剧烈搅拌直至温度保持恒定。加入AFA，10分钟后，通过加入1mL 800mM过硫酸铵(APS)溶液(使反应中的APS的终浓度为～8mM)来启动反应。溶液变得混浊，这表明成功启动了。使反应在氮气毯下进行4小时。合成之后，通过Whatman滤纸过滤该溶液以除掉少量的凝结物。
将10mL核心纳米凝胶溶液和0.0577g SDS加入到三颈圆底烧瓶中并在氮气下加热至70℃。在39.5mL dH2O中制备50mM单体溶液，其中按摩尔比为：97.5％NIPMAm，2％BIS和0.5％N-甘氨酰甲基丙烯酰胺。将该溶液加入到三颈圆底烧瓶中，使温度稳定在70℃，同时持续搅拌。通过加入0.5mL的0.05M APS的等份试样启动反应。反应在氮气下持续4小时。合成之后，通过Whatman滤纸过滤该溶液，通过离心纯化纳米凝胶，然后重悬于dH2O。
与胺结合的佐剂与纳米凝胶核心的缀合
通过使用二环己基碳二亚胺，以N-羟基琥珀酰亚胺激活酸官能度，使酸官能化的纳米凝胶缀合于携带胺的佐剂。纯化之后，携带胺的佐剂的加入直接与纳米凝胶表面反应。
实施例6：使用NfkB-萤光素酶报告分子细胞体外测定缀合于HPMA共聚物的TLR2激 动剂Pam3Cys的活性
使用经含有萤光素酶(在NfkB启动子控制下)的质粒(U937-luc)转染的THP-1细胞在体外测定聚合物-Pam3cys缀合物的佐剂活性。使U937-luc细胞生长至1x106/ml的密度，然后暴露于100ng/ml LPS、100ng/ml Pam3Cys、100ng/ml pHPMA或100ng/ml pHPMA-Pam3Cys。8小时后，使细胞沉淀下来，裂解，并就萤光素酶的表达进行测评(图4)。在该研究中，所使用的HPMA共聚物具有大约20kDa的重均分子量，并含有5.22wt％Pam3cys(GCMS)。HPMA通过甘氨酸-甘氨酸间隔物结合于Pam3cys。根据实施例1和2中描述的技术制备与聚合物结合的佐剂。数据显示：来自100ng Pam3Cys-HPMA的萤光素酶信号比单独的Pam3Cys高24.1倍，虽然该物质中仅有5.22ng是Pam3Cys。当由聚合物呈现时，Pam3Cys/分子的比活性高24.1x19.2＝462倍。
实施例7：使用衍生自鼠骨髓的树突细胞(BMDC)体外测定缀合于HPMA的TLR2激动 剂Pam2Cys的活性
已知BMDC对TLR2激动剂产生应答，引起炎性细胞因子(包括IL-8)的表达。我们使用该模型来证明与HPMA连接的Pam2Cyc的效力。在该实施例中，聚合物是大约80kDa，其是以5wt％Pam2Cys制备的。HPMA通过甘氨酸-甘氨酸间隔物结合于Pam2Cys。根据实施例1和2中描述的技术制备与聚合物结合的佐剂。使BMDC暴露于50ng/ml Pam2Cys或与聚合物结合的Pam2Cys，持续24小时。然后，收集上清液并通过ELISA测定IL-8的表达。图5显示：Pam2Cys在HPMA上的多价呈现引起较高水平的树突细胞激活，相对于单独的Pam2Cys，配体的量为1/20。
实施例8：在聚合物(HPMA)骨架上显示的由抗原性肽(流感M2e)和TLR激动剂 (Pam3Cys)组成的疫苗缀合物
流感M2e肽(SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD)是在不同病毒株中高度保守的表面抗原。虽然其自身免疫原性差，但M2e经常与佐剂一起施用。在该实施例中，使在悬垂的GSGS侧链上携带5wt％Pam3cys和1mol％游离的反应性TT基团的多价聚HPMA与寡肽的游离氨基末端反应至完全(在DMSO中)。通过柱层析除掉游离的寡肽。

Claims (13)

1.用于口服或胃肠外施用的佐剂-聚合物构建体，其包含实质上无佐剂活性并且是亲水性的合成的线性聚合物骨架，所述线性聚合物骨架与3个或更多个佐剂共价连接，其中所述3个或更多个佐剂是相同或不同的，并且各自存在于悬垂的侧链中，所述佐剂直接或通过间隔基团连接至聚合物骨架，
其中所述聚合物骨架是基于甲基丙烯酸酯或甲基丙烯酰胺的单体单元；
其中所述佐剂结合Toll样受体；并且其中所述间隔基团是相同或不同的，其各自独立地选自：寡(烷氧基化合物)、寡肽或C1-C12烷基部分，其中所述佐剂-聚合物构建体具有至少100μg/mL的水溶性。
2.权利要求1的佐剂-聚合物构建体，其中聚合物的重均分子量是1kDa至100kDa。
3.权利要求1或2的佐剂-聚合物构建体，其中聚合物骨架是基于N-2-羟丙基甲基丙烯酰胺(HPMA)的单体单元。
4.权利要求1-3任一项的佐剂-聚合物构建体，其中佐剂选自咪唑并喹啉、MALP-2、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)脂多糖、脂胞壁酸、Pam3CSK4、Pam2Cys和Poly(I)：Poly(C)。
5.权利要求1-4任一项的佐剂-聚合物构建体，其中佐剂是Pam3CSK4。
6.权利要求1-5任一项的佐剂-聚合物构建体，其中聚合物骨架和/或间隔基团含有可降解的键。
7.权利要求1-6任一项的佐剂-聚合物构建体，其中聚合物的重均分子量是5kDa至40kDa。
8.权利要求1-7任一项的佐剂-聚合物构建体，其中聚合物骨架直接或通过间隔基团共价连接于10至50个佐剂。
9.权利要求1-8任一项的佐剂-聚合物构建体，其中该构建体结合于疫苗以提供疫苗缀合物。
10.包含权利要求1-9任一项的佐剂-聚合物构建体和药学上可接受的载体的组合物。
11.包含权利要求1-9任一项的佐剂-聚合物构建体和药学上可接受的稀释剂的组合物。
12.权利要求10或11的组合物，其还包含疫苗。
13.权利要求10-12任一项的组合物，其用于刺激或增强有此需要的受试者中的免疫应答。
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