KR20120023066A - 다원자가 아쥬반트 디스플레이 - Google Patents

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KR20120023066A
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adjuvants
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레오나드 찰스 윌리엄 세이머
케리 피셔
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싸이오서스 테라퓨틱스 엘티디.
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Abstract

본 발명은 3개 이상의 아쥬반트(adjuvant)에 공유결합으로 연결된 중합체 골격을 포함하는 아쥬반트-중합체 구조물을 제공하며, 여기서 3개 이상의 아쥬반트는 각각 펜던트 측쇄에 존재하고, 아쥬반트는 중합체 골격에 직접 또는 스페이서기를 통해 연결된다.

Description

다원자가 아쥬반트 디스플레이{MULTI-VALENT ADJUVANT DISPLAY}
본 발명은 아쥬반트(adjuvant)를 사용하여 면역계를 자극하는 개선된 기술에 관한 것이다. 본 발명은 특히 아쥬반트를 복수개의 디스플레이 방식으로 나타내는 신규한 아쥬반트-함유 생성물, 이들 생성물을 포함하는 조성물 및 면역화에서의 이들 생성물의 용도에 관한 것이다.
아쥬반트는 전형적으로 통상의 병원체, 이를테면 바이러스, 박테리아 또는 진균류의 구성 요소(또는 유사체)이다. 그들은 일반적으로 패턴 수용체, 스캐빈지 수용체 및 톨-유사 수용체(TLR)에 의해 인식된다. 대부분의 성공적인 아쥬반트는 다중-반복 형태로 인해 이들 수용체에 낮은 친화성이지만 높은 결합성으로 결합한다. 최고의 아쥬반트는 전체(또는 부분적으로 분해된) 박테리아 또는 이중가닥 바이러스 DNA인 경향이 있다. 그러나, 현재 당업계에는 구성 요소가 단일 인식 가능한, 그리고 바람직하게는 완전히 합성인 더 명확한 제제를 향한 움직임이 있다. 불운하게도 깔끔하고, 분리되며 단일-분산된 아쥬반트는 원래의 "더러운" 제제와 같은 범위로 선천성 면역계를 자극시키지 못한다. 현대의 합성 아쥬반트, 이를테면 이미퀴모드 및 Pam2Cys는 제제화하고 운반하기 어려운 저조하게 가용성인 낮은 분자량 제제이다.
당업계에서 기술된 아쥬반트의 특정 예시는 합성 아쥬반트, 이를테면 미국 제6,149,222호에 기술된 것들을 포함한다. 이들 아쥬반트는 폴리옥시에틸렌/폴리옥시프로필렌 블록 공중합체로 이루어진 폴록사머이고 다양한 세포 표면 수용체를 불명확한 비-이온성 상호작용으로 자극한다. 미국 제6,610,310호는 합성 당 또는 다른 중합체에 복수개의 음전하로 이루어진 폴리-음이온성 합성 중합체를 기술한다. 그러한 합성 아쥬반트는, 그러나, 일반적으로 불량한 결합성 및 불충분한 아쥬반트 활성을 갖는다.
운반을 개선시킬 목적으로 합성 아쥬반트를 제제에 혼입하기 위한 노력이 있어왔다. 예를 들어, 미국 제2005/0233105호는 낮은 분자량의 합성 아쥬반트를 포함하는 제제를 기술한다. 그러나 이들 제제는 바이러스 백신과의 아쥬반트의 단순한 혼합물이고 합성 아쥬반트의 고유 활성을 개선시키는 수단을 제공하지 못한다.
비슷하게, WO 2007/078879는 자가 조립 리포솜, 중합체 복합체 및 유화된 지질을 포함하는 조성물을 기술한다. 이들 조성물은 더 자연적인 방식으로 아쥬반트가 존재하도록 의도된 것이지만, 소수성 코어 내에 포획되어 있어서 제제화하기 힘들고 아쥬반트 물질의 대부분은 접근하기 어렵다. 이들 제제는 특정 조건 하에 엉기고 그들의 불안정성으로 인해 그들은 보통 투여 직전에 제조되어야 한다.
그러므로 면역계의 증진된 자극을 제공하는 합성 아쥬반트의 설계에 대한 새로운 접근의 필요가 있다.
본 발명은 그러므로 3개 이상의 아쥬반트에 공유결합으로 연결된 중합체 골격을 포함하는 아쥬반트-중합체 구조물(본원에서 중합체-아쥬반트 구조물로도 지칭됨)을 제공하며, 여기서 3개 이상의 아쥬반트는 각각 펜던트 측쇄에 존재하고, 아쥬반트는 중합체 골격에 직접 또는 스페이서기를 통해 연결된다.
본 발명은 아쥬반트가 다원자가 디스플레이 방식으로 존재하도록 몇몇 작은 합성 아쥬반트를 중합체로 연결하는 합성 아쥬반트 단독의 사용과 비교할 때 면역 자극을 증가시킬 수 있음을 밝혔다. 병원체-관련 분자 패턴(PAMP)를 연상시키는 방법으로의 복수개의 아쥬반트의 형태는 수용체 결합성을 증진시키고 톨-유사 수용체 및 패턴 인식 수용체에게 더 자연적인 형태를 제공하는 것으로 생각된다. 추가로, 아쥬반트의 다원자가 디스플레이는 수용체를 가교 및 신호전달을 하도록 돕는다. 이들 인자는 모두 증가된 면역 자극을 야기하고 그로써 아쥬반트의 더 낮은 용량이 사용될 수 있고 부작용은 감소된다.
이 방법으로 아쥬반트의 중합체 사슬로의 연결은 또한 아쥬반트 구성 요소의 분자 크기를 증가시며 혈류 내로의 침출을 예방함으로써 목표를 벗어난(off-target) 독성을 감소시키는 것을 돕는다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 중합체 골격 자체는 친수성이어서 전형적으로 친지성인 아쥬반트의 용해를 돕는다. 이는 아쥬반트의 운반을 촉진시키고 더욱 단순한 제제가 사용될 수 있게 한다. 추가 장점은 수용체와 상호작용 할 수 있는 분자의 수를 증가시키는 것이고, 이 또한 더 낮은 용량이 사용될 수 있게 한다.
본 발명의 아쥬반트-중합체 구조물은 전형적으로 백신과 함께 투여된다. 본 발명은 그러므로 또한 백신에 결합한 본 발명의 아쥬반트-중합체 구조물을 포함하는 백신 포합체를 제공한다. 또한 제공되는 것은 본 발명의 아쥬반트-중합체 구조물 또는 백신 포합체 및 제약상 허용가능한 운반체 또는 희석제를 포함하는 조성물이다.
본 발명은 또한 치료가 필요한 환자에서 면역 반응을 자극 또는 증진시키는 방법을 제공하며, 상기 환자에게 유효, 비-독성 양의 본 발명의 아쥬반트 중합체 구조물, 백신 포합체 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 아쥬반트-중합체 구조물 또는 조성물이 백신을 포함하지 않을 경우, 방법은 추가로 백신을 동시에 또는 별도로 투여하는 단계를 포함한다. 또한 제공되는 것은 면역 반응을 자극 또는 증진시키는 방법에서 사용하기 위한 본 발명의 아쥬반트-중합체 구조물, 백신 포합체 또는 조성물이다.
도 1은 세라미드 동족체의 합성을 나타내는 반응식을 제공한다.
도 2는 본 발명에 따른 중합체-아쥬반트 구조물의 구조를 도시한다.
도 3a은 중합체-아쥬반트 구조물을 제조하는데 사용하기 위한 반응성 중합체의 구조를 도시한다. 도 3b는 세라미드 아쥬반트 및 펩티드 항원에 결합한 동일한 중합체를 도시한다.
도 4는 동일한 중합체의 TLR 2 효능제 Pam3Cys의 복수개의 형태가 세포의 더 높은 자극을 야기하는 것을 도시한다. U937은 TLR2를 포함하는 TLR 수용체의 범위를 발현하는 단핵구-유사 표현형인 림프종 세포주이다. TLR2의 자극은 NfkB의 활성화를 야기하고 이들 세포는 NfkB 프로모터의 조절 하에 리포터 플라스미드(루시퍼라아제)에 형질감염되어있다. 시험 물질에의 8시간 노출 후에, 세포를 용해했고 루시퍼라아제 발현을 분석했다. 모든 시험 물질을 100 ng/ml(Pam3Cys 중합체 포합체의 단지 5.22 ng이 Pam3Cys 임을 주목하라)로 첨가했다. 데이터는 중합체 결합 Pam3Cys가 Pam3Cys 자체에 비해 그리고 양성 대조군 LPS와 견줄만하게 현저하게 높은 수준의 자극을 나타내는 것을 나타낸다.
도 5는 동일한 중합체의 TLR 2 효능제 Pam2Cys의 복수개의 형태가 세포의 더 높은 자극을 야기하는 것을 도시한다. 골수 유도 DC를 50 ng/ml의 Pam2Cys(P2C) 또는 HPMA에 연결된 P2C에 24시간 동안 노출시켰다. 세포 상등액을 그 후 IL-8에 대해 ELISA로 측정했다. Pam2Cys의 단지 5 중량%(2.5 ng)이 P2C-pHPMA의 50 ng/ml 시료에 존재했다.
본원에서 사용된 아쥬반트는 그 자체에 어느 특정 항원성 효과를 갖지 않는, 면역계를 자극할 수 있고 백신에의 반응을 증가시킬 수 있는 제제이다.
본 발명의 구조물은 같거나 다를 수 있는 3개 이상의 아쥬반트를 함유한다. 한 바람직한 실시양태에서, 3개 이상의 아쥬반트는 동일하다. 각각의 아쥬반트는 펜던트 측쇄 내 중합체 골격에 결합된다. 아쥬반트는 그러므로 중합체성 골격 자체의 부분이 아니다. 이는 아쥬반트의 공간-관련 배열이 전체 박테리아 또는 바이러스의 표면의 'PAMP' 에피토프, 또는 그것의 구성 요소, 이를테면 이중가닥 바이러스 RNA와 더욱 근접하게 닮기 때문에 아쥬반트의 세포 수용체에 의한 인식에 더 좋은 형태를 제공하고, 세포 수용체 또는 수용체(들)에 대한 더 우수한 결합력을 야기한다.
3개 이상의 아쥬반트, 바람직하게는 5개 이상, 더욱 바람직하게는 10개 이상의 아쥬반트는 각 중합체에 공유결합으로 결합하고, 각 아쥬반트는 전형적으로 별개의 펜던트 측쇄 상에 존재한다. 전형적으로 50개 이하의 아쥬반트가 단일 중합체 골격 상에 존재한다. 한 실시양태에서, 20개 이상의 아쥬반트가 중합체 골격 상에 존재한다.
아쥬반트는 광범위한 구조를 포함할 수 있고, 그들의 백신에 대해 증진된 면역 반응을 촉진시키는 능력으로 특징된다. 아쥬반트가 결합하는 수용체의 한 부류는 톨-유사 수용체(TLR; 병원체의 표면에의 반복된 PAMP 서열을 인식하는 그들의 능력 때문에 '패턴 수용체'로도 알려짐)이다. TLR은 그람-양성 및 -음성 박테리아, DNA 및 RNA 바이러스, 진균 및 원생생물을 포함하는, 다양한 병원체의 부류에서 유래된 보존된 분자 생성물을 인식한다. 많은 척추동물 게놈에서 TLR 유전자를 인식하였고, 상당 부분 및 전체-길이의 서열이 이용 가능하다. 13개의 TLR이 마우스 게놈의 검색에서 밝혀진 반면, 열한개의 TLR이 인간에서 동정되었다. 인간 및 마우스 TLR 족 구성원은 다른 분자 구조를 인식하는 별개의 리간드 특이성을 갖는 것으로 나타난다. TLR3, TLR7, TLR8 및 TLR9가 주로 세포내 구획, 이를테면 엔도솜에 발현되고 핵산 구조를 인식하는 반면, TLR1, TLR2, TLR4, TLR5 및 TLR6 모두는 세포 벽 구성요소를 인식하여 원형질막에 집중되어 있다. 다른 TLR의 리간드 요구조건은 부분적으로 특징된다:
TLR2 이형이량체(주로 TLR1 또는 TLR6과) - 지단백질, 펩티도글리칸, 리포글리칸, 리포테이코산, 지질다당류, 펩티도글리칸, 지모산
TLR5 - 박테리아 플라젤린
TLR7 - 이미다조퀴놀린(이미퀴모드, 가르디퀴모드), CL264, 록소리빈
TLR8 - 단일가닥 RNA, 대장균(E. coli) RNA
TLR7/TLR8 이형이량체 : CL075, CL097, 폴리(dT), R848
TLR9 - CpG-함유 올리고뉴클레오티드를 포함하는, DNA 내 비메틸화된 CpG 섬
TLR4 - 지질다당류, 단일인산화 지질 A
TLR3 - 이중가닥 RNA
TLR 리간드의 예시는 다음을 포함한다:
- 이미퀴모드 - TLR7에 대한 리간드
- MALP-2(마이코플라즈마 퍼먼탄스(Mycoplasma Fermentans)에서 분리된 디아실화된 리포펩티드) - TLR6/TLR2에 대한 리간드
- 포르피로모나스 긴기발리스(Porphyromonas gingivalis) 지질 다당류, 리포테이코산 - TLR2에 대한 리간드
- Pam3CSK4 - TLR1과의 이형이량체 TLR2에 대한 리간드
- Pam2Cys - TLR6과의 이형이량체 TLR2에 대한 리간드
- 폴리(I).폴리(C) - TLR3에 대한 리간드
TLR은 선천성 면역세포(DC, 대식세포, 자연살해세포), 후천성 면역 세포(T 및 B 림프구) 및 또한 비면역세포(상피 및 내피세포, 섬유아세포)에서 발견된다.
본 발명에서 사용하기에 바람직한 아쥬반트는 리포글리칸, 지질다당류, 리포아라비노만난, 리포테이코산, 펩티도글리칸, 천연 및 합성 지단백질 및 리포펩티드, 지모산, 당지질, 폴리이노신-폴리시티딜산, 단일인산화 지질 A, TNFα, TNF 펩티드, CD40 리간드, OX40, IL-4, IL-6, IL-8, IL-2, IL-12, 만노오스, GM-CSF, IFN-감마, IFN-알파, 플라젤린, 이미다조퀴놀린-화합물, 구아노신, 이중가닥 RNA(dsRNA), 단일가닥 DNA(ssDNA) 및 박테리아 DNA 또는 합성 올리고뉴클레오티드 내 비메틸화된 CpG-함유 서열이다.
본 발명의 중합체성 골격은 합성 또는 자연적으로 존재하는 중합체일 수 있다. 본원에서 사용되는 중합체는 생체중합체, 이를테면 핵산, 단백질 및 전분, 및 합성 중합체를 포함한다. 한 실시양태에서, 중합체는 핵산이 아니다. 또 다른 실시양태에서, 중합체는 합성 중합체이다.
한 실시양태에서, 중합체는 아쥬반트-중합체 구조물에 수용성을 부여할 친수성 중합체이다. 예를 들어, 아쥬반트-중합체 구조물은 100 μg/ml 이상, 예를 들어 150 μg/ml 이상 또는 200 μg/ml 이상의 수용성을 가질 수 있다.
중합체 자체는 생물학적으로 활성일 수 있고, 예를 들어 중합체 자체는 아쥬반트 특성을 가질 수 있다. 한 실시양태에서, 중합체 자체는 실질적으로 아쥬반트 활성을 가지지 않을 수 있다(즉, 중합체 단독으로는 면역 자극을 증가시키지 못할 것이다). 중합체의 아쥬반트 활성의 측정은, 중합체가 항원과 함께 마우스의 후방 족저에 주사되는 슬와 림프절(PLN) 분석을 사용하여 수행될 수 있다. 아쥬반트 활성은 논의되고 있는 물질 없이 항원을 받은 동물, 및 추정상의 아쥬반트 단독을 받은 동물에서의 PLN 중량 및 세포수 비교해서, 연구 중인 물질과 함께 항원을 수용한 동물에서의 PLN 중량 및 세포 수의 증가로 측정된다. 또 다른 실시양태에서, 중합체는 생물학적으로 불활성이다.
적합한 합성 중합체는 비닐 성분, 예를 들어 (메트)아크릴레이트, (메트)아크릴아미드, 비닐, 비닐 에테르, 비닐 에스테르 및 스티릴 성분을 갖는 단량체에 기초한 것들을 포함한다. 이 카테고리의 단량체의 특정 예시는 (메트)아크릴레이트 및 (메트)아크릴아미드, 특히 N-2-히드록시프로필메트아크릴아미드(HPMA) 및 히드록시에틸메트아크릴레이트(HEMA), 및 비닐피롤리돈(PVP)이다. 고리-열림 중합 및 고리-열림 복분해에 적합한 시클릭 단량체, 예를 들어 시클릭 아미드, 시클릭 에스테르, 시클릭 우레탄, 시클릭 에테르, 시클릭 무수물, 시클릭 술피드, 시클릭 아민, 및 모노- 및 다중-시클릭 알켄 또한 사용될 수 있다.
대체의 중합체 골격은 핵산(예를 들어, 폴리I:폴리C, 폴리A:폴리U, 단일가닥 DNA, 이중가닥 DNA), 폴리에틸렌 글리콜, 폴리(에틸렌 글리콜-올리고펩티드), 폴리(아미노산)(예를 들어 폴리[N-(2-히드록시에틸)-L-글루타민] 및 다당류, 이를테면 글리코겐, 셀룰로오스, 덱스트란, 시클로덱스트린, 알기네이트, 히알루론산, 폴리시알산, 폴리만난 또는 글루코오스 또는 갈락토오스에 기초한 다른 중합체를 포함한다. 추가의 중합체 골격으로 사용될 수 있는 천연 생성물은 헤파린, 덱스트란 및 전분을 포함한다. 에틸렌글리콜-올리고펩티드에 기초한 골격에서, 올리고펩티드기는 바람직하게는 1 내지 4개의 아미노산을 포함하고 펜던트 측쇄는 전형적으로 중합체 골격의 올리고펩티드 부분에 의해 지지된다.
전형적으로, 중합체 골격은 (메트)아크릴레이트, (메트)아크릴아미드, 스티릴 단량체, 비닐 단량체, 비닐 에테르 단량체, 비닐 에스테르 단량체, 시알산 단량체, 만노오스 단량체, N-(2-히드록시에틸)-L-글루타민(HEG) 단량체, 및 에틸렌글리콜-올리고펩티드 단량체로부터 선택된 단량체 단위에 기초한다. 바람직하게는, 중합체 골격은 N-2-히드록시프로필메트아크릴아미드(HPMA), N-(2-히드록시에틸)-L-글루타민(HEG), 및 에틸렌글리콜-올리고펩티드로부터 선택된 단량체 단위에 기초하거나, 폴리시알산 또는 폴리만난 중합체이다.
HPMA에 기초한 중합체 골격이 더욱 바람직하다.
중합체의 중량 평균 분자량은 전형적으로 1 내지 100 kDa, 예를 들어 2 이상, 바람직하게는 5 kDa 이상 80 kDa 이하, 더욱 바람직하게는 40 kDa 이하의 범위이다. 바람직한 중합체는 5 내지 40 kDa의 중량 평균 분자량을 갖는다.
중합체 골격은 아쥬반트를 포함하는 3개 이상의 펜던트 측쇄를 갖는 선형 중합체일 수 있다. 별법으로, 중합체 골격 자체는 분지된 구조일 수 있다. 예를 들어, 수지상(dendritic) 및 빗살 모양(comb) 중합체가 예상된다.
몇몇 실시양태에서, 중합체 골격은 추가 중합체에 가교되어 히드로겔을 형성할 수 있다. 히드로겔은 바람직하게는 가수분해적으로 불안정하거나 효소, 예를 들어 매트릭스 금속 단백질 분해효소(metalloproteinase) 2 또는 9에 의해 분해될 수 있다. 이는 아쥬반트가 히드로겔 내에 고정되어 아쥬반트의 분비가 조절될 수 있기 위함이다. 그러므로, 본 발명의 한 바람직한 특징에 따라, 본 발명의 공정은 가교 및 히드로겔을 형성하기 쉬운 조건(예를 들어 과량은 아닌 높은 농도의 시약)하에서 또는 가교를 촉진하기 쉬운 제제, 이를테면 디아민의 존재 하에서 수행된다. 개질 아쥬반트를 함유하는 히드로겔의 형성은 일반적으로 문헌[Subr, V., Duncan, R. and Kopeck, J. (1990)"Release of macromolecules and daunomycin from hydrophilic gels containing enzymatically degradable bonds", J. Biomater. Sci. Polymer Edn., 1 (4) 61-278]에 기재된 화학적 접근을 사용하여 행해질 것이다.
핵산을 포함하는 중합체 골격에서, 중합체는 추가 핵산과 연결되어 이중 가닥 나선 구조를 형성할 수 있다.
아쥬반트는 중합체 골격에 직접 또는 스페이서기를 통해 연결될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 스페이서기가 존재하여 아쥬반트-중합체 구조물은 하기의 구조를 가진다:
P-[S-A]n
(여기서 P는 중합체 골격이고, S는 스페이서기이며, A는 아쥬반트이고 n은 3 이상이다)
스페이서기는 같거나 다를 수 있고 전형적으로 올리고(알킬옥시드)(예를 들어, 2 내지 200개의 탄소 원자의 길이인 pEG 사슬); 예를 들어, 약 20개 이하의 아미노산을 갖는 올리고펩티드; C1-C12 알킬 성분(예를 들어, C1-C6 알킬 성분, 이를테면 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌 또는 부틸렌); C6-C10 아릴 성분(예를 들어, 페닐); 이들 알킬 및 아릴 성분의 조합; 폴리에스테르 및 폴리카보네이트로부터 선택된다. 적합한 폴리에스테르 및 폴리카보네이트는, 예를 들어, 10 내지 30개의 탄소 원자의 사슬을 갖는 것이다. 스페이서기는 전형적으로 친수성이고 분해성 결합, 이를테면 환원성 이황화결합, 산성-촉매 가수분해되기 쉬운 결합 또는 효소적 분해로 절단 가능한 결합을 혼입할 수 있다.
바람직한 스페이서기는 올리고(알콕시드) 및 올리고펩티드이고, 특히 올리고펩티드이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 스페이서기는 올리고펩티드이다. 바람직하게는, 올리고펩티드는 10개 이하, 예를 들어 5개 이하의 아미노산을 함유한다. 더욱 바람직하게는, 올리고펩티드는 1 내지 4개, 예를 들어 2 또는 4개의 아미노산을 함유한다. 적합한 올리고펩티드는 -Gly-Phe-Leu-Gly-, -Gly-Gly- 및 Glu-Lys-Glu-이다.
또 다른 실시양태에서, 스페이서기는 분해성 결합을 혼입한다. 예를 들어, 스페이서기는 환원으로 절단될 수 있다. 예를 들어: -NH-(CH2)2NHCO-(CH2)2-SS-(CH2)2-CO-이다. 별법으로, 스페이서기는 산성-촉매 가수분해, 예를 들어:
Figure pct00001
(여기서 x 및 y는 독립적으로 1 내지 5, 예를 들어 1, 2 또는 3인 정수이고 R은 예를 들어, C1-C8 알킬기, 예를 들어 메틸 또는 에틸이다)
로 절단될 수 있다.
n의 값은 아쥬반트를 포함하는 펜던트 측쇄의 수를 반영한다. 3개 이상의 아쥬반트가 각 중합체 분자에 존재하므로, n은 3 이상이다. 전형적으로 50개 이하의 아쥬반트가 단일 중합체 골격에 존재하므로, n은 50 이하이다. 한 실시양태에서 20개 이상의 아쥬반트가 중합체 골격에 존재한다.
본 발명의 한 실시양태에서, -S-A기는 2 몰% 이상의 아쥬반트-중합체 구조물을 포함한다. 예를 들어, -S-A기는 5 몰% 이상의 구조물을 포함할 수 있다. 전형적으로, -S-A기는 20 몰% 이하, 예를 들어 10 몰% 이하의 아쥬반트-중합체를 포함한다.
본 발명의 아쥬반트-중합체 구조물은 아쥬반트를 제외한 관능기를 보유하는 펜던트 측쇄를 함유할 수 있다. 그러한 관능기는 직접 또는 스페이서기를 통해 중합체 골격에 결합할 수 있다. 적합한 스페이서기는 상기에 기재되어 있다. 존재할 수 있는 관능기의 예시는 가용화기, 이를테면 아민, 히드록실, 카르복실 및 올리고(알킬렌)기이다.
본 발명의 아쥬반트-중합체 구조물의 예시는 화학식 P-[S-A]n인 것들이며, 여기서 P는 N-2-히드록시프로필메트아크릴아미드(HPMA), N-(2-히드록시에틸)-1-글루타민(HEG), 및 에틸렌글리콜-올리고펩티드로부터 선택된 단량체 단위에 기초한 중합체이거나, 또는 폴리시알산 또는 폴리만난 중합체이고; S는 -Gly-Phe-Leu-Gly-, -Gly-Gly- 또는 Glu-Lys-Glu-이며; n은 3 내지 10이고; A는 상기 정의한 아쥬반트이다.
본 발명의 구조물의 합성에의 몇몇 다른 접근이 예상된다:
1. 단순한 단량체의 관능화된 단량체와의 공중합으로 펜던트 측쇄 상에 반응기를 갖는 중합체 골격을 생성하고, 그 이후 이들 반응기에 아쥬반트를 부착함.
2. 아쥬반트 또는 아쥬반트-스페이서 분자의 관능화로 중합성기를 혼입하고, 관능화된 아쥬반트 또는 아쥬반트-스페이서를 중합 혼합물에 첨가함.
3. 아쥬반트를 직접 또는 스페이서기를 통해 결합하여 천연 또는 합성 중합체를 변형(adaptation)함.
합성적으로-생성된 중합체의 경우, 적합한 중합 기술은 자유 라디칼 중합 기술, 이를테면 통상적이고 조절된 기술, 예를 들어 NMP(니트록시드 매개 라디칼 중합), ATRP(원자 이동 라디칼 중합), RAFT(가역적 첨가-분절 연쇄 이동) 또는 시아녹실-기재 중합(예를 들어, 전체가 본원에 참고문헌으로 도입된 문헌[Scales, C. W.; Vasilieva, Y. A.; Convertine, A. J.; Lowe, A. B.; McCormick, C. L. Biomacromolecules 2005, 6, 1846-1850; Yanjarappa, M. J.; Gujraty, K. V.; Joshi, A.; Saraph, A.; Kane, R. S. Biomacromolecules 2006, 7, 1665-1670; Convertine, A. J.; Ayres, N.; Scales, C. W.; Lowe, A. B.; McCormick, C. L. Biomacromolecules 2004, 5, 1177-1180]에 기재됨)을 포함한다. 시클릭 단량체는 고리-열림 중합 또는 고리-열림 복분해를 사용하여 중합될 수 있다.
관련된 교시 또한 문헌[Macromolecular design via reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT)/xanthates (MADIX) Polymerization.' Perrier, Sebastien; Takolpuckdee, Pittaya. J. Polym. Sci., Part A: Polym. Chem. (2005), 43(22), 5347-5393]에서 찾을 수 있으며, 본원에 참고문헌으로 도입된다.
전형적으로 개시제가 공중합 반응에, 바람직하게는 AIBN에 사용된다. 반응은 일반적으로 유기 용매, 전형적으로 DMSO에서 일어난다. 반응은 일반적으로 50 내지 70℃, 바람직하게는 약 60℃의 온도로 가열된다. 반응은 일반적으로 상기-명시한 온도에서 4 내지 8시간, 바람직하게는 5 내지 7시간, 더욱 바람직하게는 약 6시간 동안 가열된다. 그로써 수득된 중합체는 전형적으로 아세톤-디에틸 에테르(3:1) 혼합물에서 침강되고, 여과되며, 아세톤 및 디에틸 에테르로 세척되며, 진공에서 건조된다. 그로써 수득된 중합체는 추가로 세파덱스-LH(Sephadex-LH) 20 컬럼에서 메탄올을 사용하여 정제될 수 있다.
중합 반응을 위한 단량체는 전형적으로 상업적으로 입수 가능하거나, 예를 들어 문헌[Konak, et al, Langmuir, 2008, 24, 7092 - 7098]에 기재된 공지된 방법과 유사한 방법으로 제조될 수 있다.
상기 기재된 합성 (1)은 관능화된 단량체의 중합 반응으로의 포접(inclusion)을 수반한다. 그러한 관능화된 단량체는 전형적으로 PG-S-F 또는 PG-F 구조를 갖고, 여기서 PG는 중합성 단량체, 이를테면 HPMA 또는 메트아크릴아미드(적합한 단량체는 추가로 상기에 정의되어 있음)이며, S는 상기에서 정의된 스페이서기이고, F는 관능기이다. 두개 이상의 다른 관능화된 단량체의 혼합물이 만약 바람직하다면 사용될 수 있다.
이 경우, 중합 혼합물은 비-관능화된 단량체 및 관능화된 단량체 모두를 포함할 것이다. 관능화된 단량체는 전형적으로 중합체 사슬 내에 약 20 몰% 이하, 예를 들어 10 몰% 이하의 양으로 혼입된다. 바람직하게는, 관능화된 단량체는 2 몰% 이상, 예를 들어 5 몰% 이상의 양으로 혼입된다.
적합한 관능기 F는 가용화기, 이를테면 상기에 기재된 것들, 및 반응기를 포함한다. 그러한 가용화기 또는 반응기의 전구체인 보호된 기(protected group) 또한 사용될 수 있다.
용어 "반응기"는 특히 다른 분자의 상보적인 반응기, 전형적으로 아쥬반트 상의 기와의 결합(coupling) 또는 연결(linking) 반응과 관련한, 중요한 화학적 반응성을 나타내는 기를 나타낸 것으로 본원에서 사용된 것으로 이해될 것이다.
반응기는 아쥬반트 또는 백신의 부착점으로 또는 대체의 관능기, 이를테면 가용화기로 사용될 수 있다. 예를 들어, 반응기는 아쥬반트, 백신 또는 대체의 관능기를 함유하는 다른 분자 상의 예를 들어, 아민기, 티올기, 히드록시기, 알데히드, 케톤, 카르복실산 또는 당기(sugar group)와 공유결합을 형성하는 것이 가능할 수 있다. 아쥬반트 또는 백신과의 반응의 경우, 아쥬반트 또는 백신은 관능화 되어, 필수적이라면, 반응기와 공유결합을 형성할 수 있는 그러한 기를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 반응기는 아민기와 공유결합을 형성할 수 있다. 이 실시양태에서 반응기의 적합한 유형의 예시는 산 염화물, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 아실-티아졸리딘-2-티온, 말레이미드, N-히드록시-숙신이미드 에스테르(NHS 에스테르), 술포-N-히드록시-숙신이미드 에스테르(술포-NHS 에스테르), 4-니트로페놀 에스테르, 에폭시드, 2-이미노-2-메톡시에틸-1-티오글리코시드, 시아누르산 염화물, 이미다졸릴 포르메이트, 숙신이미딜 숙시네이트, 숙신이미딜 글루타레이트, 아실 아지드, 아실 니트릴, 디클로로트리아진, 2,4,5-트리클로로페놀, 아즈락톤 및 클로로포르메이트를 포함한다. 그러한 기는 아민과 쉽게 반응한다. 아실-티아졸리딘-2-티온 및 술포-NHS 에스테르가 바람직하다. 아실-티아졸리딘-2-티온은 그들의 높은 반응성 및 수용액에서 비교적 안정함으로 인해 바람직하다.
또 다른 실시양태에서, 반응기는 티올기와 공유결합을 형성할 수 있다. 이 실시양태에서 반응기의 적합한 유형의 예시는 알킬 할로겐화물, 할로아세트아미드, 및 말레이미드를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 반응기는 히드록시기와 공유결합을 형성할 수 있다. 이 실시양태에서 반응기의 적합한 유형의 예시는 클로로포르메이트 및 산 할로겐화물을 포함한다. 별법으로, 히드록시기는 산화제, 예를 들어 과요오드산염(periodate)로 산화되고, 그 이후에 히드라진, 히드록실아민 또는 아민을 포함하는 반응기와 반응할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 반응기는 알데히드기 또는 케톤기와 공유결합을 형성할 수 있다. 이 실시양태에서 반응기의 적합한 유형의 예시는 히드라지드, 세미카르바지드, 1차 지방족 아민, 방향족 아민 및 카르보히드라지드를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 반응기는 카르복실산과 공유결합을 형성할 수 있다. 이는 예를 들어, 수용성 카르보디이미드, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드를 사용하여 카르복실산을 활성화하고, 그 이후 반응기로서 아민과 반응함으로써 이루어질 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 반응기는 당과 반응하여 공유결합을 형성할 수 있다. 이는 예를 들어, 당의 갈락토오스 산화효소로의 효소-매개 산화로 알데히드를 형성하고, 그 후 반응기로서 알데히드 반응성 화합물, 이를테면 히드라지드와 반응함으로써 이루어질 수 있다.
반응기의 바람직한 예시는 니트로페놀 에스테르(ONp), N-히드록시숙신이미드(NHS), 티아졸리딘-2-티온(TT) 및 에폭시기이다.
중합 후, 중합체 내에 혼입된 반응기는 직접 아쥬반트와 반응하거나 다른 관능성, 이를테면 가용화기로 전환될 수 있다. 별법으로, 반응기는 대체의 반응기를 함유하는 분자와 부분적으로 반응하여 두개의 다른 반응성 관능성의 존재를 야기할 수 있다. 이들 반응기는 그 후 두개의 직교 방법(orthogonal method)을 사용하여 추가로 개질될 수 있다.
관능화된 펜던트 측쇄를 함유하는 적합한 중합체의 예시는 WO 98/19710에 기재되어 있고, 폴리HPMA-GlyPheLeuGly-ONp, 폴리HPMA-GlyPheLeuGly-NHS, 폴리HPMA-Gly-Gly-ONp, 폴리HPMA-Gly-Gly-NHS, 폴리(pEG-올리고펩티드(-ONp)), 폴리(pEG-GluLysGlu(ONp)), pHEG-ONp, pHEG-NHS를 포함한다. 이들 화합물의 제조는 WO 98/19710에 기재되어 있다. WO 98/19710의 내용은 본원에 참고문헌으로 포함된다. 본 발명에 사용하기 적합한 또 다른 그러한 관능화된 중합체는 폴리HPMA-GlyPheLeuGly-TT(여기서 TT는 티아졸리딘-2-티온임)이고, 이것의 합성은 WO 2005/007798에 기재되어 있다. WO 2005/007798의 내용은 본원에 참고문헌으로 포함된다.
본 발명의 구조물의 합성을 위한 대체의 방법은 중합 혼합물 내로 포접하기 위한 아쥬반트의 관능화를 수반한다(상기 합성 (2)). 이 실시양태에서, 중합은 전형적으로 상기 기재된 것과 같이 수행되지만, PG-S-A 또는 PG-A 구조를 갖는 관능화된 단량체를 사용하며, 여기서 PG 및 S는 상기에서 정의된 것과 같고 A는 아쥬반트이다. 두개 이상의 그러한 관능화된 단량체의 혼합물, 또는 화학식 PG-S-F 또는 PG-F인 것과 그러한 관능화된 단량체의 혼합물(상기에 기재되어 있음)이 사용될 수 있다.
상기에 기재한 것과 같이, 관능화된 단량체는 약 20 몰% 이하, 예를 들어 10 몰% 이하의 양으로 혼입된다. 바람직하게는, 관능화된 단량체는 약 2 몰% 이상, 예를 들어 약 5 몰% 이상의 양으로 혼입된다.
추가 실시양태에서, 본 발명의 구조물은 사전-형성된 중합체, 이를테면 자연적으로 존재하는 중합체(상기 합성 (3))의 변형으로 수득된다. 이 경우에서, 중합체 상의 적합한 반응기는, 선택적으로 스페이서 기를 통한 아쥬반트, 및 임의의 추가의 소정의 관능기, 이를테면 가용화기의 첨가를 위해 사용된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 중합체 골격은 두개 이상의 다른 아쥬반트를 함유한다. 이 실시양태에서, 아쥬반트는 무작위적으로 또는 특정 서열로 배열할 수 있다. 예를 들어, 중합체는 -A-B-A-B- 구조의 블록 공중합체를 포함할 수 있으며, 여기서 A는 아쥬반트 (a)를 포함하는 하나 이상의 펜던트 측쇄를 갖는 중합체 부분이고, B는 아쥬반트 (b)를 포함하는 하나 이상의 펜던트 측쇄를 갖는 중합체 부분이다. 그러한 아쥬반트의 선택된 서열은 상승작용적 효과를 제공할 수 있다.
본 발명의 추가 실시양태에서, 펜던트 측쇄 상의 중합체 골격 및/또는 스페이서기는 분해성이다. 분해성 결합은 그러므로 중합체 골격 내에 및/또는 하나 이상의 펜던트 측쇄 내에 존재할 수 있다. 분해성 결합은 생체 내에서 자발적으로 또는 특별히 촉발된 사건을 통해 분해할 수 있는 것들이다. 전형적으로, 분해성 결합은 엔도솜의 pH가 떨어짐으로서 엔도솜의 흡수 후에 자발적인 가수분해가 일어나도록 조정되거나 또는 세포내 환원 환경에서 환원적으로 절단되는 결합일 수 있다. 별법으로, 분해성 결합은 특정 효소에 의해 절단되도록 설계될 수 있다.
생분해성 결합의 용도는 중합체-아쥬반트 포합체의 분해를 촉진시켜 그것의 아쥬반트 활성을 제한하고 사실상 배출을 촉진시켜 원하지 않는 독성을 피하는데 유리하다.
본 발명에서의 용도를 위한 몇몇 중합체, 예를 들어 몇몇 핵산은 본래 분해성이다. 별법으로, 분해성 결합은 중합체 골격 또는 측쇄 내에 혼입될 수 있다. 그러한 분해성 결합의 예시는 전형적으로 온화한(mild) 환원 조건, 이를테면 금속 아황산염 또는 적합하게 선택된 효소를 사용하여 절단되는 이황화결합; pH 의존 가수분해에 의해 절단되는 히드라존 결합, 시스-아코니틸 결합 및 오르토 에스테르; 또는 효소적으로 절단가능한 결합을 포함한다.
효소적으로 절단가능한 결합은 특정 효소에 의해 절단되도록 설계되고 전형적으로 짧은 올리고펩티드, 이를테면 본원에서 스페이서기로 기술된 올리고펩티드를 수반한다.
효소 분해능에 의해 제공된 불안정성은 그것이 중합체(또는 중합체와 아쥬반트 사이의 결합)가 선택된 효소에 의해 선택적으로 절단되도록 설계되게 하기 때문에 바람직할 수 있다. 그러한 효소는 표적 부위에 존재하여, 표적 부위에서 개질 아쥬반트에 촉발된 붕해 가능성을 부여함으로써, 표적 부위와의 상호작용을 위해 아쥬반트를 방출할 수 있다. 효소는 또한 개질 아쥬반트를 표적 세포의 선택된 세포 구획 내에 붕해하도록 야기하여 아쥬반트의 활성을 증진시키는 세포내 효소일 수 있다. 별법으로, 효소-절단 부위는 개질 아쥬반트가 적절한 생물학적 활성(예를 들어, 금속 단백질 분해효소를 발현하는 침입성 또는 전이성 종양 세포의 도달)에 반응하여 붕해가 촉진되도록 설계될 수 있다. 추가 변동에서, 개질 아쥬반트의 활성화가 가능한 효소를 적절한 시간 또는 부위에 투여하여 개질 아쥬반트의 필요한 붕해 및 후속의 조직과의 아쥬반트의 상호작용을 매개할 수 있다.
본 발명의 아쥬반트-중합체 구조물은 백신과 함께 인간 또는 포유류 대상체로 투여하여, 백신에 대한 환자의 면역반응을 증진 또는 자극시키는데 적합하다.
본 발명에서 사용될 수 있는 적합한 백신의 예시는 바이러스, 단백질, 펩티드, 당 및 핵산을 포함한다. 백신은 예방적(질병으로부터 환자를 보호함) 또는 치료적(존재하는 감염 또는 장애를 공격하도록 면역계를 보조)일 수 있다. 일반적인 백신은 죽은 또는 비활성화된 생물, 그들로부터 유래된 정제된 생성물, 합성 펩티드, 목표 생물의 구성요소를 암호화하는 재조합 단백질 또는 핵산 백신이다.
몇몇 백신은 죽은 미생물을 함유한다 - 이들은 이전에는 독성미생물이지만 화학 물질 또는 열로 사멸당했다. 인플루엔자, 콜레라, 선페스트, 및 A형 간염에 대한 백신이 그 예시이다.
감쇠된 백신은 살아있는, 감쇠된 바이러스 미생물을 함유한다 - 이들은 독성 특성을 무력화시키는 조건 하에서 조작되거나 배양된 살아있는 미생물이거나, 밀접하게 연관되었지만 덜 위험한 생물을 사용하여 넓은 면역 반응을 일으킨다. 그들은 전형적으로 더 지속적인 면역학적 반응을 유발하고 건강한 성인의 바람직한 유형이다. 예시는 황열, 홍역, 풍진, 및 볼거리(mumps)를 포함한다. 살아있는 결핵 백신은 전염성 균주가 아니고 "BCG"라고 불리는 연관된 균주이며, 미국에서 매우 드물게 사용된다.
백신 부류의 추가 예시는 다음과 같다:
변성독소 - 이들은 이들이(미생물 자체보다는) 병을 일으키는 경우에서 불활성화된 독성 화합물이다. 변성독소-기재 백신의 예시는 파상풍 및 디프테리아를 포함한다. 모든 변성독소가 미생물에 대한 백신은 아니다; 예를 들어, 서부 다이아몬드 방울뱀(Crotalis atrox) 변성독소는 방울뱀 물림에 대한 개의 예방 접종에 사용된다.
펩티드 백신 - 질병 단백질, 예를 들어 인플루엔자 M2e 펩티드로부터의 항원성 에피토프를 함유하는 합성 펩티드. 원칙적으로는, 임의의 펩티드도 중합체를 단일로 또는 복수개의 복사본(1-20)으로 함유하는 아쥬반트 상에 혼입될 수 있다. 바람직한 펩티드는 첨가되어 중합체에의 포합(conjugation)을 가능케 하는 것을 제외하고는 서열에 결정적인(critical) 리신 잔기를 함유하지 않는다. 리신 잔기를 활성 부위에 함유하는 펩티드를 위해, 시스테인 잔기의 측쇄를 통한 대체의 포합이 사용될 수 있다.
단백질 아단위 백신 - 불활성화된 또는 감쇠된 미생물의 면역계로의 도입("전체-제제" 백신을 구성할 것임)보다는, 면역반응을 일으킬 수 있는 단편. 특징적인 예시는 바이러스의 오직 표면 단백질만으로 구성되는 B형 간염 바이러스에 대한 아단위 백신(효모에서 생성됨) 및 바이러스 주 캡시드 단백질로 구성되는 인간 파필로마바이러스(HPV)에 대한 바이러스-유사 입자(VLP) 백신을 포함한다.
포합 백신(Conjugate vaccine) - 특정 박테리아는 불량하게 면역원성인 다당류 외피(outer coat)를 갖는다. 이들 외피를 단백질(예를 들어 독소)에 연결함으로써, 마치 단백질 항원인 것처럼 면역계가 다당류를 인식할 수 있게 된다. 이 접근은 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) B형 백신에 사용된다.
재조합 백신은 벡터(때로는 무해한 바이러스, 때로는 플라스미드)가 '트로이 목마'처럼 사용되어 항원-제시 세포, 이를테면 수지상 세포 내를 포함하는 수용자의 세포 내에 목표 병원체의 구성 요소를 암호화하는 유전자를 도입하고 발현시키는 것이다. 예를 들어 감쇠된 아데노바이러스 벡터가 사용되어 숙주 세포 내에 목표 병원체로부터의 단백질을 발현시켜(예를 들어, 말라리아, 결핵, 인플루엔자의 구성요소), 수용자를 어느 감염성 물질에도 노출시키지 않고 목표 병원체에 대한 면역 반응의 생성을 가능하게 할 수 있다. 비슷한 접근이 다양한 바이러스 벡터, 특히 알파 바이러스에 대해 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 백신은 아쥬반트-중합체 구조물에 포합되어 백신 포합체를 형성한다. 매우 광범위한 백신이 이 방법으로 포합될 수 있으며, 펩티드, 지질, 단백질, 핵산, 탄수화물 및 혼합된 조성물의 백신을 포함하는 합성 백신을 포함한다. 백신은 바이러스, 원생생물, 선충, 진균, 효모 또는 박테리아를 포함하는 다양한 목표로부터 유래될 수 있거나, 또는 그들은 암-관련 항원에 대해 예방 접종 되도록 의도될 수 있다. 백신과 중합체-아쥬반트 포합체 사이의 결합은 세포와의 회합(association) 후 분해되도록 설계되어 백신 구성 요소의 세포 교통(trafficking)을 증진시킬 수 있다. 그러한 생분해성 결합은 목표-관련 효소로의 분해에 대해 기질인, 가수분해적으로 불안정한 결합인 환원성 결합일 수 있다.
가능한 백신의 범위는 다음을 포함하지만, 이에 명확하게 제한되지는 않는다:
?인플루엔자 펩티드 및 인플루엔자 단백질, 예를 들어 H 및 N 단백질 및 M2를 포함하는, 표준 인플루엔자 백신에 사용되는 것들
?gp120, gp41, gag, nef 및 pol로부터의 에피토프를 포함하는, HIV로부터 유래된 펩티드
?HepB 표면 항원
?암 항원, 이를테면 CEA, MUC-1 및 5T4
?탄저균 단백질, 아단위 및 펩티드
?노로바이러스 단백질 및 펩티드
?변성독소 (상기 참조)
?페스트(Yersinia pestis)의 다양한 균주로부터의 단백질, 아단위 및 펩티드 항원
?말라리아로부터 유래된 단백질 및 펩티드 - 예를 들어 포자소체(circumsporozoite) 항원 또는 합성 TRAP 에피토프 일련
?아데노바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus), 알파바이러스, 헤르페스바이러스, 백시니아 바이러스, 홍역, 레오바이러스 및 렌티바이러스를 포함하는 바이러스 및 바이러스-유사-입자(VLP).
중합체-아쥬반트 구조물과 백신의 포합은 백신상의 기에 결합할 수 있는 하나 이상의 반응기를 중합체-아쥬반트 구조물 상에 제공함으로써 달성된다. 결합은 공유결합이거나 또는 다른 유형의 상호작용, 이를테면 정전기적 인력일 수 있다. 전형적으로, 하나 초과의 반응기, 예를 들어 5개 이상의 반응기가 제공되어 백신과 중합체-아쥬반트 구조물 사이에 몇몇의 연결이 형성된다.
중합체-아쥬반트 구조물과 백신 사이의 공유결합의 경우, 상기에서 자세히 설명된 반응기가 사용될 수 있다. 반응기의 본질은 백신상의 가능한 결합 부위에 좌우될 것이다. 바이러스 백신을 사용하는데 바람직하고 바이러스의 표면상의 부위에 공유결합적으로 결합할 반응기의 예시는 N-히드록시 숙신이미드(NHS), 니트로페놀 에스테르(ONp) 및 티아졸리딘-2-티온(TT)기를 포함한다.
백신과의 정전기적 상호작용의 경우, 백신에의 정전기적 인력을 증진시키기 위해 하전된 기가 중합체 사슬 내에 혼입될 수 있다.
한 특정 실시예에서, 목표 병원체에 대한 유전자를 암호화하는 DNA를 함유하는 아데노바이러스 벡터에 기초한 재조합 백신 입자는 병원체 단백질의 수용자의 세포 내에서의 발현 후에 그것의 면역 반응을 자극하는 능력을 증가시키기 위해 중합체-아쥬반트 포합체로 표면-코팅될 수 있다. 이 중합체-아쥬반트 포합체를 달성하기 위해 아데노바이러스 벡터의 표면에 결합할 수 있는 기의 상보체(complement)를 제조하여 중합체를 표면에 연결함으로써 아쥬반트를 바이러스 입자의 표면상에 제시한다. 이 실시양태에서, 적합한 반응기는 바이러스에 공유결합 또는 하전된 기를 생성할 수 있는 것들(예를 들어 NHS, ONP, TT기)이다.
백신상의 결합 부위는 자연적으로 존재할 수 있거나 또는 도입될 수 있다. 결합 부위가 도입되는 곳은, 중합체-아쥬반트 구조물상의 반응기에 상보적이어야 한다. 예를 들어, 바이러스 벡터가 조작되어 특정 반응기를 그것의 표면 단백질(예를 들어, 자유 티올기)에 발현할 수 있고, 상응하는 반응성이 중합체-아쥬반트 구조물(예를 들어, 말레이미드기) 내로 도입되어 바이러스 입자에 직접 공유결합을 가능케할 수 있다.
중합체-아쥬반트 구조물 및 백신 모두가 복수개의 상보적인 반응기를 갖는 경우, 그들 서로의 결합의 생성물이 응집물 또는 심지어 침강물일 가능성이 있다. 이것은 아쥬반트화된 백신의 국소 저장부를 제공하는데 유용할 수 있지만, 과량의 구성 요소(일반적으로 중합체-아쥬반트 구조물) 중 하나의 사용으로 가교 효과가 최소화될 수 있다. 별법으로 중합체-아쥬반트 구조물은 단 하나의 잔류 반응기로 생성되어, 백신에의 1가 결합을 보장할 수 있다. 한 실시양태에서, 이는 세미텔레켈릭(semitelechelic) 반응성 중합체를 생성함으로써 달성될 수 있으며, 여기서 각 중합체 분자의 한 말단은 반응기에서 유도되고 몇몇 아쥬반트는 중합체 사슬 내로 (유도된 공단량체와 같이) 혼입된다. 말단 반응기가 선택되어 아쥬반트와 반응하지 않지만, 포합체의 백신에의 결합에 사용될 수 있다.
한 대체의 실시양태에서, 백신 및 아쥬반트-중합체 구조물은 제약상 허용가능한 운반체 또는 희석제와 함께 단일 조성물 내에 존재한다. 추가의 대체의 실시양태에서, 백신 및 아쥬반트-중합체 구조물은 별도로 제제화되어 두개의 별도의 조성물을 제공한다. 후자의 경우, 두개의 조성물은 환자에게 동시에 또는 별도로 투여될 수 있다.
본 발명은 그러므로 본 발명의 아쥬반트-중합체 구조물 또는 백신 포합체를 제약성 허용가능한 운반체 또는 희석제와 함께 그리고 선택적으로 백신과 함께 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직한 조성물은 미생물 및 발열원(pyrogen)으로부터 오염되지 않은 것이다.
본 발명의 조성물은 다양한 투여 형태로의 투여를 위해 제제화될 수 있다. 그러므로, 그들은 예를 들어, 수성으로 또는 유성 현탁제로 구강으로 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 비경구적으로, 즉 피하적으로, 정맥내로, 근육내로, 흉골내로, 복강내로, 피부내로, 경피로, 또는 관주 기술(infusion technique)로 중 어느 것으로의 투여를 위해 제제화될 수 있다. 피부 및 근육내 투여가 바람직하다. 본 발명의 조성물은 흡입기 또는 분무기를 통한 에어로졸의 형태로 흡입으로의 투여를 위해 제제화될 수 있다.
경구 투여를 위한 제제는 상기 언급된 활성 성분, 가용화제, 예를 들어 시클로덱스트린 또는 개질 시클로덱스트린; 희석제, 예를 들어 락토오스, 덱스트로오스, 사카로오스, 셀룰로오스, 옥수수 전분 또는 감자 전분; 윤활제, 예를 들어 실리카, 탈크, 스테아르산, 마그네슘 또는 칼슘 스테아레이트, 및/또는 폴리에틸렌 글리콜; 결합제, 예를 들어 전분, 아라비아검, 젤라틴, 메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스 또는 폴리비닐 피롤리돈; 해리제, 예를 들어 녹말, 알긴산, 알기네이트 또는 전분 글리콜산 나트륨; 발포성 혼합물; 염료; 감미료; 습윤제, 이를테면 레시틴, 폴리소르베이트, 라우릴술페이트; 및 일반적으로, 제약 제제에서 사용되는 비-독성이고 제약적으로 불활성인 물질을 함께 함유할 수 있다.
경구 투여를 위한 액체 분산액은 용액제, 시럽제, 에멀젼제, 및 현탁제일 수 있다. 용액제는 가용화제, 예를 들어 시클로덱스트린 또는 개질된 시클로덱스트린을 함유할 수 있다. 시럽제는 운반체로, 예를 들어 사카로오스 또는 글리세린 및/또는 만니톨 및/또는 소르비톨을 갖는 사카로오스를 함유할 수 있다.
현탁제 및 에멀젼제는 운반체로, 예를 들어 천연 검, 아가, 알긴산나트륨, 펙틴, 메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 또는 폴리비닐 알콜을 함유할 수 있다. 근육내 주사를 위한 현탁제 또는 용액제는 활성 화합물과 함께 제약성 허용가능한 운반체, 예를 들어 멸균수, 올리브 오일, 에틸 올레에이트, 글리콜, 예를 들어 프로필렌 글리콜; 가용화제, 예를 들어 시클로덱스트린 또는 개질된 시클로덱스트린, 및 만약 원한다면, 적합한 양의 리도카인 히드로클로라이드를 함유할 수 있다.
정맥내 또는 관주를 위한 용액제는 운반체로, 예를 들어, 멸균수 및 가용화제, 예를 들어 시클로덱스트린 또는 개질된 시클로덱스트린을 함유할 수 있거나 또는 바람직하게는 멸균, 수성, 등장성 염수 용액제의 형태일 수 있다.
본 발명의 아쥬반트-중합체 구조물의 치료 유효량을 대상에게 투여한다. 아쥬반트의 다원자가 디스플레이는 이전에 비-중합체 결합 아쥬반트에 대해 제안된 것보다 낮은 아쥬반트 농도의 사용을 가능케한다. 투여된 아쥬반트의 양은 그러므로 동일한 아쥬반트를 사용하지만 중합체에 결합하지는 않은 상응하는 제제의 투여량과 같거나 또는 바람직하게는 그 미만이다. 본 발명의 아쥬반트-중합체 구조물은 전형적으로 비-독성 양으로 대상에게 투여된다. 백신 또한 치료 유효적이고 비-독성인 양으로 투여된다.
본 발명의 중합체-아쥬반트 구조물은 의약의 광범위한 다른 영역에서의 면역 반응의 증진 및 자극에 유용하다. 본 발명은 그러므로 감염성 질환, 암 및 자가면역 질환의 치료 또는 예방 및 알레르기 및 과민성의 치료에 유용하다.
감염성 질환의 예시는 바이러스, 박테리아, 기생충 및 진균으로 이루어진 군으로부터 선택된 요인에 의해 유발되는 것들을 포함한다.
바이러스 감염성 질환은 계절성 인플루엔자, 조류 인플루엔자, 호흡기 세포융합 바이러스, 인간 파필로마바이러스, 간염 바이러스, HIV/AIDS, 단순 헤르페스, 수두 대상포진(Varicella zoster), 거대세포바이러스(Cytomegalovirus), 뎅기열, 에볼라 출혈열, 손, 발 및 입 질환, 라사열, 홍역, 마르부르크 출혈열, 전염성 단핵증(Infectious mononucleosis), 엡스타인-바 바이러스, 볼거리, 노로바이러스, 소아마비(Poliomyelitis), 광견병(Rabies), 루벨라, SARS, 천연두(Variola), 웨스트 나일 질환, 황열, 로타바이러스, 일본 뇌염, 콜로라도 진드기열, 흔한 감기, 바이러스성 뇌염, 바이러스성 위장염, 바이러스성 뇌수막염 또는 바이러스성 폐렴일 수 있다.
박테리아 감염성 질환은 박테리아성 뇌수막염, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)(MRSA 포함), 살모넬라증, 세균성 이질(Shigellosis), 캄필로박테리아증(Campylobacteriosis), 클라미디아, 라임병, 폐렴균성 폐렴(Pneumococcal pneumonia), 탄저병, 보툴리눔 식중독, 브루셀라병, 트라코마, 결핵, 묘소병(Cat Scratch Disease), 콜레라, 디프테리아, 발진 티푸스, 임질, 농가진(Impetigo), 레지오넬라증, 나병, 렙토스피라증, 리스테리아증, 유비저(Melioidosis), 노카르디아증, 백일해(Pertussis), 흑사병(Plague), 앵무병(Psittacosis), Q 열, 록키산 홍반열, 성홍열(Scarlet Fever), 매독, 파상풍, 야토병(Tularemia), 장티푸스, 티푸스, 박테리아성 요로감염, 클라미디아 트리코마티스(Chlamydia trachomatis), 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)일 수 있다.
기생충 감염은 말라리아, 아프리카 수면병(Trypanosomiasis), 주혈흡충증(Schistosomiasis), 낭충증(Cysticercosis), 샤가스병, 편모충증(Giardiasis), 칼라-아자르, 레슈마니아증, 팔라리아증, 아메바증, 회충증(Ascariasis), 바베시아증, 간흡충증(Clonorchiasis), 크립토스포리디움증, 열두조충증(Diphyllobothriasis), 드라쿤쿨루스증, 포낭충증(Echinococcosis), 요충증(Enterobiasis), 간질증(Fascioliasis), 비대흡충증(Fasciolopsiasis), 자유생활 아메바성 감염, -악구충증(Gnathostomiasis), 막양조충증(Hymenolepiasis), 등포자충증(Isosporiasis), 메타고니무스흡충증(Metagonimiasis), 구더기증(Myiasis), 사상충증(Onchocerciasis), 음모슬종(Pediculosis), 요충 감염(Pinworm Infection), 옴(Scabies), 조충증(Taeniasis), 톡소카라증, 톡소플라스마증, 선모충증(Trichinellosis), 선모충병(Trichinosis), 편충증(Trichuriasis), 트리코모나스 감염증(Trichomoniasis)일 수 있다.
진균 감염성 질환은 칸디다증, 아스페르질루스증, 블라스토마이세스증, 콕시디오이데스증, 크립토콕쿠스증, 히스토플라스마증, 무좀(Tinea pedis)일 수 있다.
암의 예시는 대장암, 비-소세포폐암(non-small cell lung cancer), 전립선암, 유방암, 췌장암, 난소암, 간암, 피부암, 흑색종, 위암, 소세포폐암, 육종, 방광암, 식도암, 자궁 경부암, 자궁 내막암, 고환암, 신장암(renal cell cancer), 비인두암, 두경부암, 갑상선암, 신경교종(glioma), 성상세포종(astrocytoma), 림프종, 백혈병, 골수증식성 질환(myeloproliferative disorder), 망막아세포종, 및 배아종 또는 전이성암을 포함한다.
자가면역 질환의 예시는 류마티스 관절염, 당뇨병, 다발근경화증, 건선(psoriasis), 크론병, 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 특발성 점액수종(idiopathic myxedema), 기안-바레 증후군, 전신성 홍반성 루푸스, 면역 혈소판 감소증(immune thrombocytopenia purpura), 심상성천포창(pemphigus vulgaris), 섬유근육통(fibromyalgia), 중증 근무력증(myasthenia gravis), 유육종증(sarcoidosis), 쇼그렌 증후군, 카와사키병, 루게릭병, 탈수초성 질환(demyelinating disease), 용혈성 빈혈, 자가면역성 혈관염, 자가면역성 대장염, 자가면역성 포도막염(autoimmune uveitis), 자가면역성 근염, 자가면역성 관절염 및 자가면역성 간염을 포함한다,
실시예
실시예 1. 중합체 증진된 아쥬반트로서의 사용을 위한 가용성 중합체에 결합을 위한 화합물의 합성
N- Pam3Cys -( N' - Boc -2,2'-( 에틸렌디옥시 )디에틸아민)의 합성 (1)
Figure pct00002
Pam3Cys는 모노-Boc-보호된 디아민에 연결된 카르보디이미드에 의해 개질된다. Pam3Cys-OH(95 mg, 104 μmol)을 무수 DCM(5 ml)에 용해하고 PS-카르보디이미드 수지(1.33 mmol/g, 138 mg, 185 μmol)에 첨가했으며, 5분 동안 아르곤 하에서 진탕했다. N-Boc-2,2'-(에틸렌디옥시)디에틸아민)(33 mg, 132 μmol)을 무수 DCM(1 ml)에 첨가했고 16시간 동안 계속해서 진탕했다. TLC(순수한 EtOAc)로는 잔류 Pam3Cys-OH를 찾지 못했다. 수지를 여과로 제거하고 50 mg의 PS-벤즈알데히드 수지를 아민 제거제(scavenger)로 첨가했다. 24시간 진탕 후에 용액을 여과했고 용매를 감압 하에 제거했다. 조 고체(crude solid)를 컬럼 크로마토그래피(기울기 용리 DCM 내 0-20 % MeOH, 생성물 Rf 0.6)로 정제했고 백색 고체를 분리했다.
N- Pam3Cys -(2,2'-( 에틸렌디옥시 )디에틸아민)의 합성 (2)
Figure pct00003
N-Pam3Cys-(N'-Boc-2,2'-(에틸렌디옥시)디에틸아민)(83 mg, 73 μmol)을 1/1 DCM/TFA(4 ml)에 용해했고 1시간 동안 온화하게 진탕했다. 용매 및 과량의 산을 톨루엔 후 디에틸 에테르로의 공비(azeotroping)로 제거했다. 생성된 백섹 고체를 DCM와 포화된 수성 NaHCO3의 혼합물에 용해했고, 2시간 동안 격렬하게 교반했다. 유기층을 수집했고 DCM(2 x 10 mL)으로 수층을 추출했다. 추출물을 합했고, MgSO4로 건조하고 증발하여 53 mg의 백색 고체를 수득했다. MS(ESI+) 실측치(Found) m/z 1041.8 [M+H+]는 1040.8을 요한다.
세라미드 동족체의 합성 (3)
세라미드 동족체를 도 1에 도시한 방식에 따라 제조했다.
실시예 2: 중합체- 포합된 아쥬반트의 생성
친수성 중합체, 이를테면 복수개의 펜던트 아미노-, 히드록실-, 또는 티올-반응기를 보유하는 폴리[N-(2-히드록시프로필)메트아크릴아미드]는 개질되어 면역자극성 분자, 이를테면 N-Pam3Cys-(2,2'-(에틸렌디옥시)디에틸아민) (2) 또는 세라미드 동족체, 이를테면 (3)을 보유할 수 있다. 이 실시예는 폴리[HPMA][MA-GG-TT]의 합성 및 세라미드 동족체(3)에의 그것의 포합을 기술한다.
다원자가 아미노반응성 친수성 공중합체의 합성:
폴리[N-(2-히드록시프로필) 메트아크릴아미드3 -(N- 메트아크릴로일글리실글리 실) 티아졸리딘 -2- 티온 ]의 합성
HPMA(1.00 g, 6.99 mmol), MA-GG-TT(234 mg, 0.77 mmol) 및 AIBN(200 mg, 1.21 mmol)을 전체 부피가 10 ml이 되도록 무수 DMSO에 용해했다(대략 12.5 중량% 단량체). 용액을 아르곤 버블링(bubbling)으로 20분 동안 공기제거한 후에 플라스크를 밀봉하고 오일조(oil bath)에 60℃에서 6시간 동안 온화한 교반을 하면서 두었다. 그 후에, 아세톤/에테르(3/1)의 무수 혼합물로의 용액의 적가로 중합체를 침강시켰다. 분말을 원심분리(15분, @ 3000 rpm)로 분리했고, 아세톤/에테르에의 재현탁(resuspension), 원심분리 및 이어서 진공 하에서 건조했다. TT함량을 MeOH 내에서 자외선-가시광선 분광법으로 측정했다.
아미노-보유 아쥬반트의 다원자가 아미노반응성 공중합체로의 포합
아쥬반트의 공중합체에의 공유 결합은 무수 디메틸 술폭시드에서의 혼합으로 달성된다. 중합체 포합체를 그 후 침강하고 건조했다. 과량의 반응기를 가수분해로 제거했고 중합체 포합체를 투석으로 정제했고 동결건조했다. 생성된 포합체의 구조는 도 2에 도시되어 있다.
실시예 3. 중합체-결합 아쥬반트의 백신에의 결합
이 실시예에서, 중합체-결합 세라미드 유도체를 B형 간염 바이러스의 X 단백질로부터 유래되고 세포독성 T 림프구에 의해 인식되는 것으로 알려진 펩티드인 AMSTTDLEA에 연결했다.
세라미드-중합체 포합체를 침강시 대략 1 몰%의 자유 반응기를 중합체상에 유지하기 위해, 반응 조건 및 시약의 상대 농도를 반응 시간, 온도 및 시약 농도의 효과를 비교하여 최적으로 한 것을 제외하고는, 상기 실시예에 기술된 것과 같이 합성했다. 이 물질을 건조시켜 보관했다.
카르복시 말단 및 자유 아미노 말단이 차단된 GGGAMSTTDLEA 구조인 올리고펩티드를 고체상 수지로부터의 절단으로 제조했다. 올리고펩티드를 DMF에 용해했고 1 몰% 반응성 TT기를 보유하는 중합체-세라미드 포합체로 완료되도록 반응하게 했다. 이 제제를 그 후 침강했고, 투석했으며 -20도에서 보관했다.
실시예 4. 생분해성 결합을 통한 양이온으로- 하전된 중합체의 세라미드 아 쥬반트 및 올리고펩티드 백신에의 결합
이 실시예에서, N-(2-히드록시프로필)메트아크릴아미드(HPMA)에 기초한 공중합체는 4차 암모늄기를 보유하는 단량체(중합 혼합물 내 1.5 몰%) 및 티아졸리딘기를 말단기로 하는 디술피드-함유 측쇄(생성물 내 3.4 몰%, 아쥬반트 내 또한 백신 내의 1차 아민과의 반응을 위함)를 함유한다. 반응성 중합체의 구조는 도 3a에 도시되어있다.
반응성 중합체를 합성했고 문헌[Subr V, Kostka L, Selby-Milic T, Fisher K, Ulbrich K, et al. (2009) Coating of adenovirus type 5 with polymers containing quaternary amines prevents binding to blood components. J Control Release 135: 152-158]에 기재된 것과 같이 특징했다. 이는 77,200의 중량 평균 분자량 및 32,200의 수평균 분자량을 가졌다.
세라미드를 상기 기재된 것과 같이 미반응으로 남아있어 펩티드 항원의 후속의 공유 결합이 가능한 1 몰%의 티아졸리딘기와 연결했다. 이 실시예에서 펩티드 항원은 간염 바이러스 X 항원으로부터 유래됐으며, 카르복시 말단 및 자유 아미노 말단이 차단된 GGGAMSTTDLEA 구조를 갖는다(도 3b 참조).
실시예 5. 나노겔 -결합 아쥬반트의 제조
나노겔 코어 입자를, 이전에 문헌[Blackburn et al., Colloid Polym Sci. 2008; 286(5): 563-569]에서 보고된 것과 같이, 자유-라디칼 침강 중합으로 합성했다.
중합체를 분리하는 열상(thermally phase)의 사용은 매우 단순분산된 나노겔 합성을 위한 침강 중합의 사용을 가능케 한다. 몰 조성은 전체 단량체 농도가 140 mM로, 98%의 N-이소프로필메트아크릴아미드(NIPMAm), 2%의 N,N'-메틸렌비스(아크릴아미드)(BIS)였다. 용액은 또한 공초점 현미경을 통한 시각화를 위해 나노겔에 형광을 주기 위해 소량의(약 0.1 mM) 아크릴아미도플루오레세인(acrylamidofluorescein)(AFA)를 함유했다. 통상적인 합성에서, NIPMAm, BIS, 및 도데실 황산나트륨(SDS, 8 mM 전체 농도)의 여과된 수용액의 100 ml를 반응 플라스크에 첨가했고 그 후 70℃로 가열했다. 용액을 온도가 계속 안정할 때까지 N2 가스로 퍼징했고 격렬하게 교반했다. AFA를 첨가했고, 10분 후 800 mM 과황산암모늄(APS)의 용액의 1 ml의 첨가로 반응을 시작하여 반응에서 APS의 최종 농도를 약 8 mM로 하게 했다. 용액은 혼탁해졌고, 이는 성공적인 시작을 나타낸다. 반응을 4시간 동안 N2 블랭킷 하에서 지속되게 하였다. 합성 후, 용액을 왓맨(Whatman) 필터 종이를 통해 여과하여 소량의 응괴를 제거했다.
10 mL의 코어 나노겔 용액 및 0.0577 g의 SDS를 먼저 3-구 둥근-바닥 플라스크에 첨가했고 N2 가스 하에서 70℃로 가열했다. 몰 비가 97.5% NIPMAm, 2% BIS, 및 0.5% N-글리실 메트아크릴아미드인 50 mM 단량체 용액을 39.5 ml의 dH2O에서 제조했다. 용액을 3-구 둥근-바닥 플라스크에 첨가했고, 연속적으로 교반하면서 온도는 70℃에서 안정시켰다. 반응은 0.05 M APS의 0.5 ml 분액으로 시작했다. 반응은 4시간 동안 N2 가스 하에서 계속했다. 합성에 이어서, 용액을 왓맨 필터 종이를 통해 여과했고, 나노겔을 원심분리로 정제한 후에 dH2O에 재현탁했다.
아민 결합 아쥬반트의 나노겔 코어로의 포합
산 관능화된 나노겔을 먼저 디시클로헥실카르보디이미드를 사용하여 N-히드록시숙신이미드에의 산 관능성의 활성화로 아민 보유 아쥬반트에 포합했다. 이후의 정제에서, 아민 보유 아쥬반트의 첨가는 직접 나노겔 표면과 반응한다.
실시예 6. HPMA 공중합체에 포합된 TLR2 효능제 Pam3Cys 의 NfkB - 루시퍼라아 제 리포터 세포를 사용하는 시험관내 활성 평가
중합체-Pam3Cys 포합체의 아쥬반트 활성을 시험관 내에서 루시퍼라아제를 함유하는 플라스미드로 형질감염된 THP-1 세포를 사용하여 NfkB 프로모터(U937-luc)의 조절 하에 평가했다. U937-luc 세포를 100 ng/ml의 LPS, 100 ng/ml의 Pam3Cys, 100 ng/ml의 pHPMA 또는 100 ng/ml pHPMA-Pam3Cys로의 노출 전에 ml 당 1e6의 밀도로 키웠다. 8시간 후에, 세포를 펠렛화하고, 분해하고, 루시퍼라아제 발현에 대해 평가했다(도 4). 이 연구에서, 사용된 HPMA 공중합체는 대략 20 kDa의 평균 분자량을 가졌고 5.22 중량%의 Pam3Cys(GCMS)를 함유했다. HPMA는 글리신-글리신 스페이서로 Pam3Cys에 결합했다. 중합체-결합 아쥬반트는 실시예 1 및 2에 기재된 기술에 따라 제조했다. 데이터는 100 ng의 Pam3Cys-HPMA로부터의 루시퍼라아제 신호가 Pam3Cys 단독보다 24.1배 더 높은 것을 나타내며, 심지어 단지 이 물질의 5.22 ng이 Pam3Cys인 경우에도 그러하다. 분자당 Pam3Cys의 비활성(specific activity)은 중합체에 의해 표현된다면, 24.1 x 19.2 = 462 배 더 높았다.
실시예 7: 뮤린 ( murine ) 골수 유래 수지상 세포( BMDC )를 사용하는 HPMA 에 포 합된 TLR2 효능제 Pam2Cys 의 시험관내 활성 평가
BMDC는 TLR2 효능제에 반응하여 IL-8을 포함하는 염증성 시토카인의 발현을 야기하는 것으로 공지되어 있다. 본 발명자들은 이 모델을 사용하여 Pam2Cys가 HPMA에 연결되었을 경우의 효능을 입증했다. 이 실시예에서, 중합체는 대략 80 kDa이었고 5 중량%의 Pam2Cys로 제조하였다. HPMA는 글리신-글리신 스페이서로 Pam2Cys에 결합했다. 중합체-결합 아쥬반트는 실시예 1 및 2에 기재된 기술에 따라 제조했다. BMDC를 50 ng/ml의 Pam2Cys 또는 중합체 결합 Pam2Cys에 24시간 동안 노출했다. 상등액을 수집한 후, IL-8 발현을 ELISA로 측정했다. 도 5는 HPMA 상의 Pam2Cys의 복수개의 형태가 Pam2Cys 단독에 비해 20배 더 낮은 양의 리간드로 더 높은 수준의 수지상 세포 활성화를 야기하는 것을 도시한다.
실시예 8: 중합체( HPMA ) 골격을 따라 디스플레이된 항원성 펩티드(인플루엔자 M2e ) 및 TLR 효능제(Pam3Cys)로 구성되는 백신 포합체
인플루엔자 M2e 펩티드(SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD)는 바이러스의 다른 균주들에 걸쳐 매우 보존된 표면 항원이다. 그 자체는 불량한 면역원성이지만, M2e는 종종 아쥬반트와 함께 공동-투여된다. 이 실시예에서, 펜던트 GSGS 측쇄 상에 5 중량%의 Pam3Cys 및 1 몰%의 자유 반응성 TT기를 보유하는 다원자가 폴리HPMA를 올리고펩티드의 자유 아미노 말단으로 완료하도록 (DMSO 내에서) 반응시켰다. 자유 올리고펩티드는 컬럼 크로마토그래피로 제거했다.

Claims (17)

  1. 3개 이상의 아쥬반트(adjuvant)에 공유결합으로 연결된 중합체 골격을 포함하며,
    여기서 3개 이상의 아쥬반트가 같거나 다르고 각각 펜던트 측쇄에 존재하고, 아쥬반트가 중합체 골격에 직접 또는 스페이서기를 통해 연결되는, 아쥬반트-중합체 구조물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 중합체 골격은 실질적으로 아쥬반트 활성을 가지지 않는 아쥬반트-중합체 구조물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 중합체 골격은 적어도 부분적으로 수용성인 아쥬반트-중합체 구조물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체 골격이 (메트)아크릴레이트, (메트)아크릴아미드, 스티릴 단량체, 비닐 단량체, 비닐 에테르 단량체, 비닐 에스테르 단량체, 시알산 단량체, 만노오스 단량체, N-(2-히드록시에틸)-1-글루타민(HEG) 단량체, 및 에틸렌글리콜-올리고펩티드 단량체로부터 선택된 단량체 단위에 기초한 것인 아쥬반트-중합체 구조물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 중합체 골격이 N-2-히드록시프로필메트아크릴아미드(HPMA), N-(2-히드록시에틸)-1-글루타민(HEG), 및 에틸렌글리콜로부터 선택된 단량체 단위에 기초하거나, 폴리시알산 또는 폴리만난 중합체인 것인 아쥬반트-중합체 구조물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아쥬반트는 같거나 다르고 리포글리칸, 지질다당류, 리포테이코산, 펩티도글리칸, 합성 지단백질, 지모산, 당지질, 폴리이노신-폴리시티딜산, 단일인산화 지질 A, 플라젤린, 이미다조퀴놀린-화합물, 구아노신, TNF-알파(또는 그것의 펩티드), IL-2, IL-4, IL-8, CD40, OX40, GM-CSF, 및 박테리아 DNA 또는 합성 올리고뉴클레오타이드 내 CpG-함유 서열로부터 선택된 것인 아쥬반트-중합체 구조물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체 골격 및/또는 스페이서기(들)는 분해성 결합을 함유하는 아쥬반트-중합체 구조물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체의 중량 평균 분자량은 5 내지 40 kDa인 아쥬반트-중합체 구조물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체 골격이 직접 또는 스페이서기를 통해 10 내지 50개의 아쥬반트에 공유결합으로 연결된 아쥬반트-중합체 구조물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체는 분지된 중합체, 예를 들어 덴드리머(dendrimer) 또는 빗살 모양(comb) 중합체인 아쥬반트-중합체 구조물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체가 가교되어 히드로겔을 형성하는 아쥬반트-중합체 구조물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 구조물이 백신에 결합하여 백신 포합체를 제공하는 아쥬반트-중합체 구조물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 아쥬반트-중합체 구조물 및 제약상 허용가능한 운반체 또는 희석제를 포함하는 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 아쥬반트-중합체 구조물, 제약상 허용가능한 운반체 또는 희석제 및 추가로 백신을 포함하는 조성물.
  15. 치료가 필요한 환자에게 유효, 비-독성 양의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에서 정의된 아쥬반트-중합체 구조물, 또는 제13항 또는 제14항에서 정의된 조성물을 투여하는 단계를 포함하고,
    아쥬반트-중합체 구조물 또는 조성물이 백신을 포함하지 않을 경우, 상기 환자에게 유효, 비-독성 양의 백신을 투여하는 단계를 추가로 포함하는,
    치료가 필요한 환자에서 면역 반응을 자극 또는 증진시키는 방법.
  16. 면역 반응을 자극 또는 증진시키는 방법에 사용하기 위한, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 아쥬반트-중합체 구조물 또는 제13항 또는 제14항에 따른 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 아쥬반트-중합체 구조물 또는 조성물이 백신을 포함하지 않고, 면역 반응을 자극 또는 증진시키는 방법이 백신을 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 아쥬반트-중합체 구조물 또는 조성물.



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