MX2014001142A

MX2014001142A - Nanoportadores sinteticos que generan respuestas inmunitarias humorales y de linfocitos t citotoxicos (ctl).

Info

Publication number: MX2014001142A
Application number: MX2014001142A
Authority: MX
Inventors: David H Altreuter; Petr Ilyinskii; Conlin O'neil
Original assignee: Selecta Biosciences Inc
Priority date: 2011-07-29
Filing date: 2012-07-27
Publication date: 2014-02-27
Also published as: WO2013019669A2; KR20140050698A; WO2013019658A2; AU2017261562A1; EA201490381A1; JP2018030837A; IL230269B; CN103702687A; JP2014521687A; US20130028857A1; IL273674A; CN109125722A; US10933129B2; BR112014002139A2; AU2012290306B2; AU2019236653A1; WO2013019669A3; CN109172819A; US20130039954A1; EP2736537A4

Abstract

Se divulgan métodos para generar respuestas inmunitarias humorales y de linfocitos T citotóxicos (CTL) en un sujeto y composiciones relacionadas.

Description

NANOPORTADORES SINTÉTICOS QUE GENERAN RESPUESTAS INMUNITARIAS HUMORALES Y DE LINFOCITOS T CITOTÓXICOS (CTL) SOLICITUDES RELACIONADAS La presente solicitud reivindica el beneficio en virtud del Artículo §1 19 del Título 35 del Código de los Estados Unidos de la solicitud provisional de los Estados Unidos 61/513,496, 61/513,526 Y 61/513,527, ambas presentadas el 29 de julio de 2011 , cuyo contenido se incorpora a la presente a modo de referencia.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a métodos para generar respuestas inmunitarias humorales y de linfocitos T citotóxicos (CTL) en un sujeto y composiciones relacionadas. Generalmente, las respuestas inmunitarias humorales y de CTL son generadas con composiciones de nanoportadores sintéticos que comprenden una proteína que comprende al menos un epítopo humoral y al menos un epítopo restringido por MHC de Clase I.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Tradicionalmente, las vacunas han promovido una sola rama del sistema inmunitario, por ejemplo, la generación de una respuesta inmunitaria humoral que consiste en anticuerpos para un antígeno o, alternativamente, la activación de una respuesta de CTL a un antigeno. Adicionalmente, las vacunas convencionales generalmente no se dirigen a los sitios de acción de células de interés, tales como las APC, de un modo óptimo. Se necesitan métodos y composiciones para activar de manera efectiva ambas ramas del sistema inmunitario de forma óptima para generar de manera efectiva respuestas inmunitarias y/o reducir los efectos inesperados y la toxicidad.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En la presente se proporcionan métodos y composiciones relacionadas para generar respuestas inmunitarias humorales y de CTL en un sujeto. En un aspecto, se proporciona un método que comprende identificar un sujeto que necesita una respuesta inmunitaria humoral y de CTL a una primera proteína y administrar al sujeto una composición que comprende una población de nanoportadores sintéticos acoplados a la primera proteina, en donde la primera proteína comprende al menos un epítopo humoral y al menos un epítopo restringido por MHC de clase I que no son el mismo epítopo, en donde la población de nanoportadores sintéticos no comprende un adyuvante de saponina-colesterol y en donde la media de una distribución del tamaño de partícula obtenida utilizando dispersión de luz dinámica de la población de nanoportadores sintéticos es una dimensión máxima de 20 nm a 250 nm. En otra modalidad, la media de una distribución de DLS se determina mediante cualquiera de los ejemplos de dicho método proporcionado en la presente. Dichos ejemplos se describen en más detalle a continuación. En una modalidad, la composición se administra en una cantidad efectiva para generar una respuesta inmunitaria humoral y de CTL a la primera proteína.

En otro aspecto, se proporciona un método que comprende administrar al sujeto una composición que comprende una población de nanoportadores sintéticos acoplados a una primera proteina; en donde la primera proteína comprende al menos un epítopo humoral y al menos un epítopo restringido por MHC de clase I que no son el mismo epítopo, en donde la población de nanoportadores sintéticos no comprende un adyuvante de saponina-colesterol, en donde la media de una distribución del tamaño de partícula obtenida utilizando dispersión de luz dinámica de la población de nanoportadores sintéticos es una dimensión máxima de 20 nm a 250 nm y en donde la composición se administra de acuerdo con un régimen de vacunación.

En otro aspecto, se proporciona un método que comprende administrar al sujeto una composición que comprende una población de nanoportadores sintéticos acoplados a una primera proteína; en donde la primera proteína comprende al menos un epítopo humoral y al menos un epítopo restringido por MHC de clase I que no son el mismo epítopo, en donde la población de nanoportadores sintéticos no comprende un adyuvante de saponina-colesterol, en donde la media de una distribución del tamaño de partícula obtenida utilizando dispersión de luz dinámica de la población de nanoportadores sintéticos es una dimensión máxima de 20 nm a 250 nm, y en donde la composición se administra de acuerdo con un protocolo que se demostró previamente que resulta en una respuesta inmunitaria humoral y de CTL específica de la primera proteina en uno o más sujetos de prueba.

En una modalidad, los métodos proporcionados en la presente comprenden, además, identificar a un sujeto que necesita una respuesta inmunitaria humoral y de linfocitos T citotóxicos (CTL) a la primera proteína. En otra modalidad, la composición se administra de acuerdo con un régimen de vacunación. En otra modalidad adicional, la composición se administra de acuerdo con un protocolo que se demostró previamente que resulta en una respuesta inmunitaria humoral y de CTL específica de la primera proteína en uno o más sujetos de prueba.

En otra modalidad, la composición comprende, además, uno o más adyuvantes. En otra modalidad, el método comprende, además, administrar uno o más adyuvantes. En una modalidad adicional, el o los adyuvantes comprenden estimuladores o agonistas de receptores de reconocimiento de patrones, sales minerales, alumbre, alumbre combinado con lipido monofosforilo A de Enterobacterias (MPL), MPL® (AS04), AS15, saponinas, QS-21 ,Quil-A, ISCOMs, ISCOMATRIX™, MF59™, Montanide® ISA 51 , Montanide® ISA 720, AS02, liposomas y formulaciones liposomales, AS01 , micropartículas y microportadores sintetizados o específicamente preparados, vesículas de membrana externa derivadas de bacterias de N. gonorrheae o Chlamydia trachomatis, partículas de quitosán, agentes formadores de depósitos, copolímeros de bloque Pluronic®, péptidos específicamente modificados o preparados, dipéptido de muramilo, 4-fosfatos de aminoalquil glucosaminida, RC529, toxoides bacterianos, fragmentos de toxinas, agonistas de receptores tipo Toll 2, 3? 4, 5, 7, 8, 9 y/o combinaciones de los mismos; derivados de adenina; ADN inmunoestimulador; ARN inmunoestimulador; aminas de imidazoquinolína, aminas de imídazopiridina, aminas de cicloalquilimidazopiridina 6,7-fusionadas, aminas de imidazoquinolína con puente en 1 ,2; ¡miquímod; resiquimod; agonista para la molécula CD40 de superficie de DC; interferones de tipo I; poli l:C; lipopolisacárido bacteriano (LPS); VSV-G; HMGB-1 ; flagelina o porciones o derivados de los mismos; moléculas de ADN inmunoestimulador que comprenden CpG; estímulos proínflamatorios liberados de células necróticas; cristales de urato; componentes activados de la cascada de complementos; componentes activados de complejos inmunitarios; agonistas de receptores de complementos; citoquinas; o agonistas de receptores de citoquinas. En otra modalidad adicional, el o los adyuvantes comprenden un agonista de los receptores tipo Toll 2, 3, 4, 7, 8 o 9. En otra modalidad adicional, el o los adyuvantes comprenden una imidazoquinolína u oxoadenina. En otra modalidad adicional, la imidazoquinolína comprende resiquimod o ¡miquímod.

En otra modalidad, el o los adyuvantes están acoplados a los nanoportadores sintéticos de la población de nanoportadores sintéticos.

En otra modalidad adicional, la composición comprende, además, o el método comprende, además, administrar otra población de nanoportadores sintéticos y el o los adyuvantes se acoplan a los nanoportadores sintéticos de la otra población de nanoportadores sintéticos.

En una modalidad adicional, el o los adyuvantes no están acoplados a un nanoportador sintético.

En otra modalidad, la composición comprende, además, uno o más antígenos adicionales o el método comprende, además, administrar uno o más antígenos adicionales. En una modalidad, el o los antígenos adicionales comprenden al menos un epítopo humoral y/o al menos un epítopo restringido por MHC de clase I. En otra modalidad, el o los antígenos adicionales comprenden al menos un epítopo humoral y al menos un epítopo restringido por MHC de clase I que no son el mismo epítopo. En una modalidad, el o los antígenos adicionales comprenden una segunda proteína. En otra modalidad, el o los antígenos adicionales comprenden un epítopo humoral y/o un epítopo restringido por MHC de clase I. En otra modalidad adicional, el o los antígenos adicionales comprenden un epitopo humoral y un epítopo restringido por MHC de clase I. En otra modalidad adicional, el o los antígenos adicionales comprenden al menos un epítopo humoral y al menos un epítopo restringido por MHC de clase I que no son el mismo epítopo.

En una modalidad, el o los antígenos adicionales están acoplados a los nanoportadores sintéticos.

En otra modalidad, la composición comprende, además, o el método comprende, además, administrar otra población de nanoportadores sintéticos y el o los antígenos adicionales se acoplan a los nanoportadores sintéticos de la otra población de nanoportadores sintéticos.

En otra modalidad adicional, el o los antigenos adicionales no están acoplados a un nanoportador sintético.

En una modalidad, los nanoportadores sintéticos y/u otros nanoportadores sintéticos comprenden una nanopartícula polimérica, una nanopartícula metálica, un dendrímero, un futboleno, un nanohilo, una partícula similar a virus o una partícula de péptido o proteína. En otra modalidad, los nanoportadores sintéticos y/u otros nanoportadores sintéticos comprenden uno o más polímeros. En otra modalidad adicional, el o los polímeros comprenden un poliéster, ácido de poliamino, policarbonato, poliacetal, policetal, polisacárido, polietiloxazolina o polietilenoimina. En una modalidad adicional, el o los polímeros comprenden un poliéster. En una modalidad, el poliéster comprende un ácido poli(láctico), ácido poli(glicólico), ácido poli(láctico-co-glicólico) o policaprolactona. En otra modalidad, el poliéster se acopla al poliéter. En otra modalidad adicional, el poliéter comprende polietilenglicol.

En una modalidad, la primera proteína y/o el o los antígenos adicionales son antígenos asociados con cáncer, una infección o enfermedad infecciosa o una enfermedad no autoinmunitaria o degenerativa. En otra modalidad, la primera proteína y/o el o los antigenos adicionales son antígenos asociados con el virus de inmunodeficiencia humana (VIH), malaria, leishmaniasis, una infección por filovirus humano, una infección por togavirus, una infección por alfavirus, una infección por arenavirus, una infección por bunyavirus, una infección por flavivirus, una infección por virus del papiloma humano, una infección por virus A de la influenza humana, una infección por hepatitis B o una infección por hepatitis C.

En otra modalidad, el sujeto tiene o corre el riesgo de tener cáncer, una infección o enfermedades infecciosas o una enfermedad no autoinmunitaria o degenerativa. En otra modalidad adicional, el sujeto tiene o corre el riesgo de tener VIH, malaria, leishmaniasis, una infección por filovirus humano, una infección por togavirus, una infección por alfavirus, una infección por arenavirus, una infección por bunyavirus, una infección por flavivirus, una infección por virus del papiloma humano, una infección por virus A de la influenza humana, una infección por hepatitis B o una infección por hepatitis C.

En otra modalidad adicional, las respuestas inmunitarias humorales y de CTL que se generan son clínicamente efectivas. En una modalidad, las respuestas inmunitarias son efectivas para tratar o prevenir cáncer, una infección o enfermedad infecciosa o una enfermedad no autoinmunitaria o degenerativa en el sujeto. En otra modalidad, las respuestas inmunitarias son efectivas para tratar o prevenir VIH, malaria, leishmaniasis, una infección por filovirus humano, una infección por togavirus, una infección por alfavirus, una infección por arenavirus, una infección por bunyavirus, una infección por flavivirus, una infección por virus del papiloma humano, una infección por virus A de la influenza humana, una infección por hepatitis B o una infección por hepatitis C.

En una modalidad, la composición adicionalmente comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable.

En otra modalidad, la composición es estéril.

En otra modalidad, la composición se reconstituye de una forma liofilizada.

En otro aspecto, se proporciona una forma farmacéutica que comprende cualquiera de las composiciones proporcionadas.

En otro aspecto adicional, se proporciona una vacuna que comprende cualquiera de las composiciones y formas de dosificación proporcionadas.

En otra modalidad adicional, la composición se administra mediante administración intravenosa, oral, subcutánea, pulmonar, intranasal, intradérmica, transmucosa, intramucosa o intramuscular.

En otro aspecto adicional, se proporciona un método que comprende administrar cualquiera de las composiciones proporcionadas en la presente a un sujeto que lo necesita. En una modalidad, el individuo es un ser humano. En otra modalidad, el individuo padece o se encuentra en riesgo de padecer cáncer. En otra modalidad adicional, el sujeto tiene o corre el riesgo de tener una infección o enfermedad infecciosa. En otra modalidad adicional, el sujeto tiene o corre el riesgo de tener una enfermedad auto-tnmunitaria o degenerativa. En otra modalidad adicional, el sujeto tiene o corre el riesgo de tener VIH. En otra modalidad, el sujeto tiene o corre el riesgo de tener malaria, leishmaniasis, una infección por filovirus humano, una infección por togavirus, una infección por alfavirus, una infección por arenavirus, una infección por bunyavirus, una infección por flavivirus, una infección por virus del papiloma humano, una infección por virus A de la influenza humana, una infección por hepatitis B o una infección por hepatitis C.

En una modalidad de cualquiera de los métodos proporcionados en la presente, cualquiera de las composiciones proporcionadas puede administrarse a un sujeto, tal como un humano, de acuerdo con un régimen de vacunación.

En otra modalidad de cualquiera de los métodos proporcionados en la presente, se demostró que cualquiera de las composiciones proporcionadas puede administrarse a un sujeto de acuerdo con un protocolo que previamente resultó en una respuesta inmunitaria humoral y de CTL específica a la primera proteína en el o los sujetos de prueba.

En otro aspecto, cualquiera de los métodos proporcionados puede comprender, además, evaluar la respuesta inmunitaria humoral y de CTL en el sujeto. Los métodos para evaluar la respuesta inmunitaria humoral y de CTL pueden ser cualquiera de los métodos proporcionados en la presente.

En otro aspecto adicional, se proporciona un método que comprende preparar cualquiera de las composiciones proporcionadas en la presente y evaluar la generación de una respuesta inmunitaria humoral y de CTL. En una modalidad, la composición comprende nanoportadores acoplados a una primera proteína que comprende al menos un epítopo humoral y al menos un epítopo restringido por MHC de clase I que no son el mismo epítopo. En otra modalidad, la población de nanoportadores sintéticos acoplados a la primera proteína no comprende un adyuvante de saponina-colesterol y/o la media de una distribución del tamaño de partícula obtenida utilizando dispersión de luz dinámica de la población de nanoportadores sintéticos es una dimensión máxima de 20 nm a 250 nm En un aspecto, se proporciona una composición que comprende una población de nanoportadores sintéticos acoplados a una primera proteína, en donde la primera proteína comprende al menos un epítopo humoral y al menos un epítopo restringido por MHC de clase I que no son el mismo epítopo, en donde la población de nanoportadores sintéticos no comprende un adyuvante de saponina-colesterol, y en donde la media de una distribución del tamaño de partícula obtenida utilizando dispersión de luz dinámica de la población de nanoportadores sintéticos es una dimensión máxima de 20 nm a 250 nm, para su uso en terapia o profilaxis.

En otro aspecto, se proporciona una composición que comprende una población de nanoportadores sintéticos acoplados a una primera proteína, en donde la primera proteina comprende al menos un epítopo humoral y al menos un epítopo restringido por MHC de clase I que no son el mismo epítopo, en donde la población de nanoportadores sintéticos no comprende un adyuvante de saponina-colesterol, y en donde la media de una distribución del tamaño de partícula obtenida utilizando dispersión de luz dinámica de la población de nanoportadores sintéticos es una dimensión máxima de 20 nm a 250 nm, para su uso en cualquiera de los métodos proporcionados en la presente.

En otro aspecto adicional, se proporciona una composición que comprende una población de nanoportadores sintéticos acoplados a una primera proteína, en donde la primera proteína comprende al menos un epítopo humoral y al menos un epítopo restringido por MHC de clase I que no son el mismo epítopo, en donde la población de nanoportadores sintéticos no comprende un adyuvante de saponina-colesterol, y en donde la media de una distribución del tamaño de partícula obtenida utilizando dispersión de luz dinámica de la población de nanoportadores sintéticos es una dimensión máxima de 20 nm a 250 nm, para su uso en vacunación.

En otro aspecto adicional, se proporciona una composición que comprende una población de nanoportadores sintéticos acoplados a una primera proteína, en donde la primera proteína comprende al menos un epítopo humoral y al menos un epítopo restringido por MHC de clase I que no son el mismo epítopo, en donde la población de nanoportadores sintéticos no comprende un adyuvante de saponina-colesterol, y en donde la media de una distribución del tamaño de partícula obtenida utilizando dispersión de luz dinámica de la población de nanoportadores sintéticos es una dimensión máxima de 20 nm a 250 nm, para su uso en generar una respuesta inmunitaria humoral y de CTL a la primera proteína en un sujeto. En una modalidad, estas respuestas inmunitarias son clínicamente efectivas. En otra modalidad, estas respuestas inmunitarias son cada una efectiva en alcanzar inmunidad contra una enfermedad.

En otro aspecto, se proporciona una composición que comprende una población de nanoportadores sintéticos acoplados a una primera proteína, en donde la primera proteína comprende al menos un epítopo humoral y al menos un epitopo restringido por MHC de clase I que no son el mismo epítopo, en donde la población de nanoportadores sintéticos no comprende un adyuvante de saponina-colesterol, y en donde la media de una distribución del tamaño de partícula obtenida utilizando dispersión de luz dinámica de la población de nanoportadores sintéticos es una dimensión máxima de 20 nm a 250 nm, para su uso en un método de terapia o profilaxis de cáncer, una infección o enfermedad infecciosa, una enfermedad no autoinmunitaria o degenerativa, VIH, malaria, leishmaniasis, una infección por filovirus humano, una infección por togavirus, una infección por alfavirus, una infección por arenavirus, una infección por bunyavirus, una infección por flavivirus, una infección por virus del papiloma humano, una infección por virus A de la influenza humana, una infección por hepatitis B o una infección por hepatitis C.

En otro aspecto adicional, se proporciona una composición que comprende una población de nanoportadores sintéticos acoplados a una primera proteína, en donde la primera proteína comprende al menos un epítopo humoral y al menos un epítopo restringido por MHC de clase I que no son el mismo epítopo, en donde la población de nanoportadores sintéticos no comprende un adyuvante de saponina-colesterol, y en donde la media de una distribución del tamaño de partícula obtenida utilizando dispersión de luz dinámica de la población de nanoportadores sintéticos es una dimensión máxima de 20 nm a 250 nm, para su uso en un método de terapia o profilaxis que comprende la administración mediante administración intravenosa, oral, subcutánea, pulmonar, intranasal, intradérmica, transmucosa, intramucosa o intramuscular.

En otro aspecto adicional, se proporciona una composición que comprende una población de nanoportadores sintéticos acoplados a una primera proteína, en donde la primera proteína comprende al menos un epítopo humoral y al menos un epítopo restringido por MHC de clase I que no son el mismo epítopo, en donde la población de nanoportadores sintéticos no comprende un adyuvante de saponina-colesterol, y en donde la media de una distribución del tamaño de partícula obtenida utilizando dispersión de luz dinámica de la población de nanoportadores sintéticos es una dimensión máxima de 20 nm a 250 nm, para la fabricación de un medicamento, por ejemplo una vacuna, para su uso en cualquiera de los métodos proporcionados en la presente.

En otro aspecto, se proporciona una composición para su uso tal como se define para cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en la presente, en donde la composición es cualquiera de las composiciones proporcionadas en la presente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Fig. 1 muestra las valoraciones de anticuerpos generadas los días 12, 26, 43 y 57 siguiendo un régimen de vacunación de sensibilización y un refuerzo (el día 28).

La Fig. 2 muestra las valoraciones de anticuerpos generadas los días 26 y 34 siguiendo un régimen de vacunación de sensibilización y un refuerzo (el día 14).

La Fig. 3 muestra la inducción de respuesta de CTL de memoria local mediante nanoportadores sintéticos acoplados a ovalbúmina (OVA).

La Fig. 4 muestra la inducción de respuesta de CTL central mediante nanoportadores sintéticos acoplados a ovalbúmina.

La Fig. 5 muestra la inducción de inducción de CTL central mediante composiciones de nanoportadores sintéticos con ovalbúmina y adyuvante.

La Fig. 6 muestra las valoraciones de anticuerpos generadas los días 25 y 42 siguiendo un régimen de vacunación de sensibilización y dos refuerzos (el día 14 y 28).

La Fig. 7 muestra el desarrollo de valoraciones de anticuerpos después de una única inyección por NC-R848 + NC-OVA. Se muestran valoraciones individuales y promedios para cada grupo experimental.

Nanoportador=NC=NP.

La Fig. 8 muestra la citotoxicidad específica in vivo después de una única inmunización con NC-R848 + NC-OVA. Se muestran promedios para cada grupo con desviación estándar.

La Fig. 9 muestra las valoraciones de anticuerpos anti-ovalbúmina tras la inmunización con nanoportadores que portan CpG y OVA con respecto a CpG (5x) y OVA (5x) libre.

La Fig. 10 muestra la inducción de respuesta de CTL específica de OVA en drenar ganglios linfáticos y bazos mediante la inmunización con nanoportadores que portan CpG y OVA con respecto a CpG (5x) y OVA (5x) libre.

La Fig. 1 1 muestra la expansión de CTL in vitro específicos de OVA inducidos sistémicamente tras la inmunización con nanoportadores que portan CpG y OVA con respecto CpG (5x) y OVA (5x) libre. Eje Y izquierdo (barras a rayas oscuras) - fracción de células CD8+ específicas de SIINFEKL (SEQ ID NO:1 ) después de la expansión; eje Y derecho (barras a rayas claras) - potencial de expansión presentado como proporción de post- y pre-expansión de CTL específicos de SIINFEKL (SEQ ID NO:1 ).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Antes de describir la presente invención detalladamente, se debe sobreentender que esta invención no está limitada a los materiales o parámetros de proceso particularmente ejemplificados, ya que, por supuesto, estos pueden variar. También se debe sobreentender que la terminología utilizada en la presente tiene como fin únicamente describir modalidades particulares de la invención y no se pretende que limite el uso de terminología alternativa para describir la presente invención.

Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas en la presente, ya sea previa o posteriormente, se incorporan a la presente por referencia en su totalidad a todos los efectos.

Las formas en singular "un/una" y "el/la", tal como se utilizan en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, incluyen los referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, la referencia a "un polímero" incluye una mezcla de dos o más de dichas moléculas o una mezcla de diferentes pesos moleculares de una sola especie de polímeros, la referencia a "un nanoportador sintético" incluye una mezcla de dos o más de dichos nanoportadores sintéticos o una pluralidad de dichos nanoportadores sintéticos, la referencia a "una molécula de ADN" incluye una mezcla de dos o más de dichas moléculas de ADN o una pluralidad de dichas moléculas de ADN, la referencia a "un adyuvante" incluye una mezcla de dos o más de dichas moléculas de adyuvante o una pluralidad de dichas moléculas de adyuvante y similares.

Tal como se utilizan en la presente, el término "comprenden" o variaciones del mismo, tales como "comprende" o "que comprende", pretenden indicar la inclusión de cualquiera de los números enteros descritos (por ejemplo un rasgo, elemento, característica, propiedad, etapa o limitación del método/proceso) o grupo de números enteros (por ejemplo rasgos, elementos, características, propiedades, etapas o limitaciones del método/proceso) pero no la exclusión de cualquier otro número entero o grupo de números enteros. De este modo, la expresión "que comprende", tal como se utiliza en la presente, es inclusiva y no excluye entidades ni pasos del proceso/método adicionales que no se hayan mencionado.

En las modalidades de cualquiera de las composiciones y métodos proporcionados en la presente, la expresión "que comprende" se puede reemplazar por "constituido esencialmente por" o "constituido por". La expresión "constituido esencialmente por" se emplea en la presente para requerir la(s) entidad(es) o pasos especificados, así como también aquellos que no afectan materialmente al carácter o la función de la invención reivindicada. Tal como se utiliza en la presente, el término "que consiste" se utiliza para indicar la presencia del número entero descrito (por ejemplo un rasgo, elemento, característica, propiedad, etapa o limitación del método/proceso) o grupo de números enteros (por ejemplo rasgos, elementos, características, propiedades, etapas o limitaciones del método/proceso) solo.

A. Introducción El tratamiento de enfermedades desafiantes tales como VIH, malaria, hepatitis B y cáncer con vacunas terapéuticas o profilácticas puede mejorarse mediante, o en algunas circunstancias requerir, respuestas inmunitarias humorales y de CTL combinadas. Si bien se han propuesto abordajes de vacunas para crear una respuesta inmunitaria humoral y de CTL combinada, abordajes alternativos podrían proporcionar mejoras valiosas en la eficacia clínica, seguridad y/o factibilidad de fabricación. En la presente se proporcionan métodos para utilizar composiciones de nanoportadores sintéticos y composiciones relacionadas que se cree no han demostrado previamente que generen respuestas inmunitarias humorales y de CTL efectivas. Dichas composiciones pueden dirigirse de manera efectiva a células inmunitarias de interés para generar respuestas inmunitarias más efectivas.

Los inventores han descubierto inesperada y sorprendentemente que los problemas y las limitaciones que se han indicado anteriormente se pueden resolver llevando a la práctica la invención que se describe en la presente. En particular, se ha descubierto de forma inesperada y sorprendente que las respuestas inmunitarias humorales y de CTL efectivas pueden generarse con nanoportadores sintéticos a los cuales una proteína, que comprende al menos un epitopo humoral y al menos un epitopo restringido por MHC de clase I que no son el mismo epitopo, se acopla, en donde la población de nanoportadores sintéticos no comprende un adyuvante de saponina-colesterol y en donde la media de una distribución del tamaño de partícula obtenida utilizando dispersión de luz dinámica de la población de nanoportadores sintéticos es una dimensión máxima de 20 nm a 250 nm. Por lo tanto, en un aspecto, se proporciona un método que comprende administrar dicha composición. En una modalidad, el método comprende identificar un sujeto que necesita una respuesta inmunitaria humoral y de CTL a una primera proteína y administrar al sujeto una composición que comprende dichos nanoportadores sintéticos. En algunas modalidades, la composición se encuentra en una cantidad efectiva para generar una respuesta inmunitaria humoral y de CTL a la primera proteína. En otra modalidad, se demostró que el método comprende administrar dicha composición a un sujeto de acuerdo con un protocolo que previamente resultó en una respuesta inmunitaria humoral y de CTL específica de la primera proteína en uno o más sujetos de prueba.

En las modalidades, las respuestas inmunitarias que se generan son clínicamente efectivas. En algunas modalidades, el sujeto al cual se administran las composiciones puede tener o estar en riesgo de tener cáncer, una infección o enfermedad infecciosa o una enfermedad no autoinmunitaria o degenerativa. En otras modalidades, el sujeto puede tener o estar en riesgo de tener VIH, malaria, leishmaniasis, una infección por filovirus humano, una infección por togavirus, una infección por alfavírus, una infección por arenavirus, una infección por bunyavirus, una infección por flavivirus, una infección por virus del papiloma humano, una infección por virus A de la influenza humana, una infección por hepatitis B o una infección por hepatitis C.

En otras modalidades, las composiciones se administran a un sujeto, tal como un humano, de acuerdo con un régimen de vacunación.

La invención se describirá ahora en más detalle a continuación.

B. Definiciones "Adyuvante" significa un agente que no constituye un antígeno específico, pero que incrementa la fuerza y longevidad de la respuesta inmunitaria a un antígeno administrado de forma concomitante. Tales adyuvantes pueden incluir, a modo no taxativo, estimuladores de receptores de reconocimiento de patrones, tales como receptores tipo T.oll, receptores tipo RIG-1 y NOD (NLR), sales minerales, como alumbre, alumbre combinado con monofosforil lípido (MPL) A de Enterobacteria, como Escherichia coli, Salmonella minnesota, Salmonella typhimuriu o Shigella flexneri o específicamente con MPL® (AS04), MPL A de las bacterias mencionadas anteriormente separadamente, saponinas, como QS-21 ,Quil-A, ISCOM, ISCOMATRIX®, emulsiones como MF59®, Montanide® ISA 51 e ISA 720, AS02 (QS21 +escualeno+ MPL®), liposomas y formulaciones liposomales como AS01 , micropartículas y microportadores sintetizados o preparados específicamente como vesículas fuera de la membrana (OMV) derivadas de bacterias de N. gonorrheae, Chlamydia trachomatis y otras, o partículas de quitosano, agentes formadores de depósitos, como copolímeros de bloque Pluronic®, péptidos modificados o preparados específicamente, como dipéptido de muramilo, 4-fosfatos de aminoalquil glucosaminida, como RC529, o proteínas, como toxoides bacterianos o fragmentos de toxina. "Adyuvantes de saponina-colesterol" son adyuvantes de saponina que se estabilizan con una mezcla con colesterol. Dichos adyuvantes incluyen, por ejemplo, adyuvantes de ISCOMs e ISCOMATRIX. Preferentemente, en algunas modalidades, los nanoportadores sintéticos proporcionados en la presente no son o no comprenden tales adyuvantes. En otras modalidades, las composiciones proporcionadas en la presente no comprenden tales adyuvantes.

En las modalidades, los adyuvantes comprenden agonistas para los receptores de reconocimiento de patrones (PRR) que incluyen, a modo no taxativo, receptores tipo Toll (TLR), específicamente TLR 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9 y/o sus combinaciones. En otras modalidades, los adyuvantes comprenden agonistas para receptores de tipo Toll 3, agonistas para receptores de tipo Toll 7 y 8, o agonistas para el receptor de tipo Toll 9; preferentemente, los adyuvantes citados comprenden imidazoquinolinas tales como R848; derivados de adenina tales como los que se describen en la Patente de EE. UU. 6,29,81 (empresa farmacéutica Sumitomo), la Solicitud de Patente Publicada de EE. UU. 2010/0075995 concedida a Biggadike et al., o WO 2010/018132 concedida a Campos et al.; ADN inmunoestimulador; o ARN inmunoestimulador. En modalidades específicas, los nanovehículos sintéticos se incorporan como compuestos adyuvantes que son agonistas para los receptores tipo Toll (TLR) 7 y 8 ("agonistas de TLR 7/8"). Los compuestos agonistas de TLR 7/8 descritos en la Patente de EE. UU. 6,696,076 concedida a Tomai et al. son de utilidad, incluidas, sin carácter limitante, las aminas de tipo imidazoquinolina, aminas de tipo imidazopiridina, aminas de tipo cicloalquilimidazopiridina condensada en las posiciones 6,7 y aminas de tipo imidazoquinolina con un puente en las posiciones 1 ,2. Los adyuvantes preferidos comprenden imiquimod y resiquimod (también conocido como R848). En modalidades específicas, un adyuvante puede ser un agonista para la molécula CD40 de superficie de DC. En ciertas modalidades, para estimular la inmunidad en lugar de la tolerancia, un nanoportador sintético incorpora un adyuvante que propicia la maduración de DC (necesaria para el cebado de linfocitos T sin tratamiento previo) y la producción de citocinas, tales como interferones de tipo I, que propician las respuestas inmunológicas de los anticuerpos. En las modalidades, los adyuvantes pueden comprender, además, moléculas de ARN inmunoestimuladoras tales como, a modo no taxativo, ARN bicatenario, poli l:C o poli l:poli C12U (disponible como Ampligen ®, tanto poli l:C como poli l:poliC12U son conocidos como estimuladores de TLR3), y/o los descritos en F. Heil et al., "Species-Specific Recognition of Single-Stranded RNA via Toll-like Receptor 7 and 8" Science 303(5663), 1526-1529 (2004); J. Vollmer et al., "Immune modulation by chemically modified ribonucleosides and oligoribonucleotides" WO 2008033432 A2; A. Forsbach et al., "Immunostimulatory oligoribonucleotides containing specific sequence motif(s) and targeting the Toll-like receptor 8 pathway" WO 2007062107 A2; E. Uhlmann et al., "Modified oligcoribonucleotide analogs with enhanced immunostimulatory activity". de Solicitud de Patente de EE. UU. US 2006241076; G. Lipford et al. , "Immunostimulatory viral RNA oligonucleotides and use for treating cáncer and infections" WO 2005097993 A2; G. Lipford et al., "Immunostimulatory G,U-containing oligoribonucleotides, compositions, and screening methods" WO 2003086280 A2. En algunas modalidades, un adyuvante puede ser un agonista de TLR-4 tal como un lipopolisacárido bacteriano (LPS), VSV-G, y/o HMGB-1. En algunas modalidades, los adyuvantes pueden comprender agonistas de TLR-5 tales como flagelina o porciones o derivados de esta, incluidos, sin carácter limitante, los descritos en las Patentes de EE. UU. 6, 130,082, 6,585,980 y 7, 192,725. En modalidades específicas, los nanoportadores sintéticos incorporan un ligando para un receptor de tipo Toll (TLR)-9, tal como moléculas de ADN inmunoestimuladoras que comprenden CpG, que inducen la secreción de interferones de tipo I y estimulan la activación de linfocitos T y B, esto conlleva una mayor producción de anticuerpos y respuestas de los linfocitos T citotóxicos (Krieg et al. , CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B cell activation. Nature. 1995. 374:546-549; Chu et al. CpG oligodeoxynucleotides act as adjuvants that switch on T helper 1 (Th1 ) immunity. J. Exp. Med. 1997. 186: 1623-1631 ; Lipford et al. CpG-containing synthetic oligonucleotides promote B and cytotoxic T cell responses to protein antigen: a new class of vaccine adjuvants. Eur. J. Immunol. 1997. 27:2340-2344; Román et al. Immunostimulatory DNA sequences function as T helper-1 -promoting adjuvants . Nat. Med. 1997. 3:849-854; Davis et al. CpG DNA is a potent enhancer of specific immunity in mice immunized with recombinant hepatitis B surface antigen. J. Immunol. 1998. 160:870-876; Lipford et al., Bacterial DNA as immune cell activator. Trends Microbiol. 1998. 6:496-500; Patente de EE.UU. 6,207,646 de Krieg et al.; Patente de EE.UU. 7,223,398 de Tuck et al.; Patente de EE.UU. 7,250,403 de Van Nest et al.; o Patente de EE.UU. 7,566,703 de Krieg et al.

En algunas modalidades, los adyuvantes pueden ser estímulos proinflamatorios liberados por células necróticas (por ejemplo, cristales de urato). En algunas modalidades, los adyuvantes pueden ser componentes activados de la cascada del complemento (p. ej., CD21 , CD35, etc.). En algunas modalidades, los adyuvantes pueden ser componentes activados de complejos inmunológicos. Los adyuvantes también incluyen agonistas de receptores del complemento tales como una molécula que se une a CD21 o CD35. En algunas modalidades, el agonista de receptores del complemento induce la opsonización del complemento endógeno del nanoportador sintético. En algunas modalidades, los adyuvantes son citocinas, que son proteínas o factores biológicos de bajo peso molecular (en el intervalo de 5 kD - 20 kD) que son liberados por las células y tienen efectos específicos sobre la interacción célula-célula, la comunicación y el comportamiento de otras células. En algunas modalidades, el agonista de receptores de citocinas es una molécula de bajo peso molecular, anticuerpo, proteina de fusión o aptámero.

En algunas modalidades, al menos una porción de la dosis de adyuvante se puede acoplar a nanoportadores sintéticos, preferentemente, toda la dosis de adyuvante se acopla a nanoportadores sintéticos. En otras modalidades, al menos una porción de la dosis de adyuvante no está acoplada a los nanoportadores sintéticos. En algunas modalidades, la dosis de adyuvante comprende dos o más tipos de adyuvantes. Por ejemplo, sin carácter limitante, se pueden combinar adyuvantes que actúan sobre receptores de TLR diferentes. A modo de ejemplo, en una modalidad se puede combinar un agonista de TLR 7/8 con un agonista de TLR 9. En otra modalidad, se puede combinar un agonista de TLR 7/8 con un agonista de TLR 4. En otra modalidad más, se puede combinar un agonista de TLR 9 con un agonista de TLR 3.

"Administrar" o "administración" significa proporcionar un material, tal como un fármaco, a un sujeto en una forma que es farmacológicamente útil.

"Cantidad eficaz" es cualquier cantidad de una composición proporcionada en la presente que produce una o más respuestas deseadas, como una o más respuestas inmunitarias deseadas. Esta cantidad puede ser para aplicaciones in vitro o in vivo. A los efectos in vivo, la cantidad puede ser una que el médico considere que puede tener un beneficio clínico para un sujeto que necesita una respuesta inmunitaria humoral y una respuesta inmunitaria de CTL a una única proteína. La cantidad eficaz que el médico consideraría que puede tener un beneficio clínico para dicho sujeto también se denomina en la presente una "cantidad clínicamente eficaz". En las modalidades, tanto la respuesta inmunitaria humoral como la respuesta ¡nmunitaria de CTL que es provocada por una composición proporcionada en la presente resulta en un efecto clínico de cada una de estas ramas del sistema inmunitario. En otras modalidades, las cantidades clínicamente eficaces son cantidades eficaces que pueden ser útiles en el tratamiento de un sujeto que padece una enfermedad o afección en la que una respuesta inmunitaria humoral y una respuesta ¡nmunitaria de CTL a una única proteina proporcionarían un beneficio. Tales sujetos incluyen, en algunas modalidades, los que padecen o se encuentran en riesgo de padecer cáncer, una infección o enfermedad infecciosa o una enfermedad no autoinmune o degenerativa. En otras modalidades, tales sujetos incluyen los que padecen o se encuentran en riesgo de padecer VIH, malaria, leishmaniasis, infección por filovirus humano, infección por togavirus, infección por alfavirus, infección por arenavirus, infección por bunyavirus, infección por flavivirus, infección por el virus del papiloma humano, infección por virus de influenza A humano, infección por hepatitis B o infección por hepatitis C.

Las cantidades eficaces incluyen aquellas que implican la producción de una respuesta inmunitaria humoral contra un epítopo humoral y una respuesta inmunitaria de CTL contra un epítopo restringido por MHC de clase I administrado en una de las composiciones proporcionadas en la presente. La respuesta inmunitaria humoral y de CTL puede controlarse mediante métodos de rutina. La cantidad que es eficaz para producir una o más respuestas ¡nmunitarias deseadas como se establece en la presente puede ser también una cantidad de una composición proporcionada en la presente que produce un criterio de valoración terapéutico deseado o un resultado terapéutico deseado. En una modalidad, la cantidad que es eficaz es una que proporciona una inmunidad eficaz contra una enfermedad o agente que provoca la enfermedad como se establece en la presente. En otra modalidad, la inmunidad continúa en el sujeto durante al menos 6, 12, 18, 24, 36, 48, 60 o más meses. En otra modalidad adicional, la inmunidad resulta o continúa debido a la administración de una composición proporcionada en la presente de acuerdo con un régimen de vacunación.

Las cantidades eficaces dependerán, por supuesto, del sujeto particular que se está tratando; la gravedad de la afección, enfermedad o trastorno; los parámetros individuales del paciente que incluyen la edad, estado físico, tamaño y peso; la duración del tratamiento; la naturaleza de la terapia concurrente (si la hubiera); la vía de administración específica y factores similares dentro del conocimiento y experiencia del médico. Los expertos en la técnica estarán familiarizados con estos factores los cuales se pueden determinar simplemente mediante experimentación rutinaria. Por lo general, se prefiere emplear una dosis máxima, es decir, la dosis segura más elevada de acuerdo con un juicio médico razonable. Sin embargo, los expertos en la técnica sobreentenderán que un paciente puede insistir en tomar una dosis inferior o una dosis tolerable por motivos médicos, motivos psicológicos o virtualmente por cualquier otro motivo.

En general, las dosis de las composiciones de la invención pueden variar de aproximadamente 10 µg/kg a aproximadamente 100,000 µglkg. En algunas modalidades, las dosis pueden variar de aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg. En otras modalidades más, las dosis pueden variar entre aproximadamente 0.1 mg/kg y aproximadamente 25 mg/kg, entre aproximadamente 25 mg/kg y aproximadamente 50 mg/kg, entre aproximadamente 50 mg/kg y aproximadamente 75 mg/kg o entre aproximadamente 75 mg/kg y aproximadamente 100 mg/kg. Alternativamente, la dosis puede administrarse en base a la cantidad nanovehículos sintéticos. Por ejemplo, las dosis útiles incluyen aquellas superiores a 106, 107, 108, 109 o 1010 nanoportadores sintéticos por dosis. Otros ejemplos de dosis útiles incluyen entre aproximadamente 1x106 y aproximadamente 1x1010, entre aproximadamente 1x107 y aproximadamente 1x109 o entre aproximadamente 1x108 y aproximadamente 1x109 nanoportadores sintéticos por dosis.

"Antígeno" significa cualquier antígeno que pueda generar una o más respuestas inmunitarias. El antígeno puede ser uno que genere una respuesta inmunitaria humoral y/o de CTL. Dichos antígenos incluyen, a modo no taxativo, proteínas, péptidos, moléculas pequeñas, oligosacáridos y carbohidratos. En algunas modalidades, dicho antígeno comprende un antígeno no proteico (es decir, no es un antígeno de proteína o péptido). En algunas modalidades, el antígeno que genera una respuesta inmunitaria humoral comprende un carbohidrato asociado con un agente infeccioso. En algunas modalidades, el antígeno que genera una respuesta inmunitaria humoral comprende una glicoproteína o un glícopéptido asociado con un agente infeccioso. El agente infeccioso puede ser una bacteria, virus, hongo, protozoo o parásito. Los antigenos pueden ser antígenos de linfocitos B o de linfocitos T.

Las composiciones de nanoportadores sintéticos para su uso en los métodos de la invención proporcionados en la presente se acoplan a un antígeno que es una proteina que comprende al menos un epítopo humoral y al menos un epítopo restringido por MHC de clase I que no es el mismo epítopo. Dichas composiciones pueden, en algunas modalidades, comprender uno o más antígenos adicionales que también pueden limitarse de esta manera, aunque no necesariamente. El o los antígenos adicionales para su uso en los métodos y composiciones proporcionados en la presente pueden ser cualquier antígeno que incluye antígenos que comprenden epítopos humorales y/o epítopos restringidos por MHC de clase I. El o los antígenos adicionales también pueden incluir epítopos restringidos por MHC de clase II. En otras modalidades, el o los antígenos adicionales pueden ser cualquier antígeno que genere una respuesta inmunitaria humoral. En otras modalidades, el o los antígenos pueden ser cualquiera de los antígenos de linfocitos T descritos en la presente, incluido el antigeno restringido por CD-1. En otras modalidades, el o los antígenos pueden ser una proteína, péptido, molécula pequeña, oligosacárido y carbohidrato.

En las modalidades, los antígenos, incluida una proteina que comprende al menos un epítopo humoral y al menos un epítopo restringido por MHC de clase I que no son el mismo epítopo, se acoplan a los nanoportadores sintéticos En otras modalidades, los antígenos no se acoplan a los nanoportadores sintéticos. En otras modalidades, los antígenos se encapsulan en los nanoportadores sintéticos. La expresión "tipo(s) de antigenos" se refiere a moléculas que comparten las mismas características antigénicas o sustancialmente las mismas.

La expresión "antigenos asociados" con una enfermedad, trastorno o afección proporcionada en la presente se refiere a antígenos que pueden generar una respuesta inmunitaria no deseada contra la enfermedad, trastorno o afección, como resultado de esta o en conjunción con esta; la causa de la enfermedad, trastorno o afección (o un síntoma o efecto de esta); y/o pueden generar una respuesta inmunitaria no deseada que es un síntoma, resultado o efecto de la enfermedad, trastorno o afección. En algunas modalidades, como con el cáncer, tales antígenos se expresan en o sobre células enfermas, como células cancerosas o tumorales, pero no en o sobre células normales o sanas (o células no enfermas). Tales antígenos pueden comprender, además, un antígeno que se expresa en o sobre células enfermas y sobre células normales o sanas (o células no enfermas) pero se expresa en o sobre células enfermas en un nivel superior que sobre las células normales o sanas (células no enfermas). Preferentemente, el uso de un antígeno asociado con una enfermedad o afección proporcionada en la presente no conducirá a una respuesta inmunitaria sustancial o perjudicial contra las células normales o sanas o conducirá a una respuesta inmunitaria beneficiosa contra la enfermedad o afección que justificará cualquier respuesta inmunitaria contra las células normales o sanas (o células no enfermas). Los antigenos asociados con una enfermedad o afección proporcionada en la presente, en algunas modalidades, son proteínas que se acoplan a nanoportadores sintéticos que comprenden epítopos humorales y/o restringidos por MHC de clase I. En otras modalidades, tales proteínas comprenden un epítopo humoral y uno restringido por MHC de clase I. En otras modalidades, tales proteínas comprenden al menos un epítopo humoral y al menos un epítopo restringido por MHC de clase I que no es el mismo epítopo. Los ejemplos de antígenos, incluidas las proteínas que anteceden, se proporcionan en otras partes de la presente.

"Al menos una porción de la dosis" significa al menos alguna parte de la dosis que varía hasta incluir la totalidad de la dosis.

Un individuo que "se encuentra en riesgo" es uno del que un médico cree que tiene una posibilidad de padecer una enfermedad o afección tal como se proporciona en la presente.

"Antígeno de linfocitos B" significa cualquier antígeno que es reconocido por un linfocito B o dispara una respuesta inmunitaria en un linfocito B (por ejemplo, un antígeno que es reconocido específicamente por un linfocito B o un receptor en un linfocito B). En algunas modalidades, un antígeno que es un antígeno de linfocitos T también es un antígeno de linfocitos B. En otras modalidades, el antígeno de linfocitos T no es además un antígeno de linfocitos B. Los antigenos de linfocitos B incluyen, a modo no taxativo, proteínas, péptidos, moléculas pequeñas, oligosacáridos y carbohidratos.

"Acoplar" o "acoplado" (y similares) significa asociar químicamente una entidad (por ejemplo una porción) con otra. En algunas modalidades, el acoplamiento es covalente, lo cual significa que el acoplamiento tiene lugar en el contexto de la presencia de un enlace covalente entre las dos entidades. En las modalidades no covalentes, el acoplamiento no covalente está mediado por interacciones no covalentes que incluyen, sin carácter limitante, interacciones de cargas, interacciones de afinidad, coordinación de metales, adsorción física, interacciones de receptor-sustrato, interacciones hidrófobas, interacciones aromáticas, interacciones de puente de hidrógeno, interacciones de van der Waals, interacciones magnéticas, interacciones electrostáticas, interacciones dipolo-dipolo y/o combinaciones de estas. En las modalidades, la encapsulación es una forma de acoplamiento.

"Respuesta inmunitaria del linfocito T citotóxico (CTL)" significa cualquier estimulación, inducción o proliferación de linfocitos T citotóxicos, preferentemente linfocitos T citotóxicos que son específicos para un epítopo, como un epítopo restringido por MHC de clase I. En las modalidades, el epítopo es o se compone de un antígeno que se encuentra asociado con cualquiera de las enfermedades o afecciones proporcionadas en la presente. Los métodos para evaluar la respuesta inmunitaria de CTL son conocidos por los expertos en la técnica. Los ejemplos de dicho método se proporcionan en los ejemplos.

La expresión "forma farmacéutica" se refiere a un material farmacológica y/o inmunológicamente activo en un medio, portador, vehículo o dispositivo adecuado para su administración a un sujeto.

El término "encapsular" se refiere a encerrar al menos una porción de una sustancia dentro de un nanoportador sintético. En algunas modalidades, una sustancia se encierra completamente dentro de un nanoportador sintético. En otras modalidades, la mayor parte o la totalidad de una sustancia que está encapsulada no está expuesta al entorno local externo al nanoportador sintético. En otras modalidades, no más de un 50%, 40%, 30%, 20%, 10% o 5% (peso/peso) está expuesto al entorno local. La encapsulación es distinta de la absorción, que sitúa la mayor parte o la totalidad de una sustancia sobre una superficie de un nanoportador sintético y deja la sustancia expuesta al entorno local externo al nanoportador sintético.

El término "epitopo", también conocido como determinante antigénico, es la parte de un antígeno que es reconocida por el sistema inmunitario, específicamente por, por ejemplo, anticuerpos, linfocitos B o linfocitos T. Tal como se utiliza en la presente, un "epitopo humoral" es uno que es reconocido por anticuerpos o linfocitos B, mientras que un "epitopo restringido por MHC de clase I" es uno que es presentado a las células inmunitarias por moléculas MHC de clase I encontradas en células nucleadas. La expresión "epítopos restringidos por MHC de clase II" se refiere a epítopos que son presentados a las células inmunitarias por moléculas MHC de clase II que se encuentran en células presentadoras de antígeno (APC), Por ejemplo, en células inmunitarias presentadoras de antígeno profesionales, tales como macrófagos, linfocitos B y células dendríticas, o en células no hematopoyéticas, tales como hepatocitos.

Los expertos en la técnica estarán familiarizados con múltiples epitopos y los epitopos ilustrativos adecuados de acuerdo con algunos aspectos de esta invención incluyen, sin carácter limitante, los enumerados en la base de datos de epitopos inmunitarios (www.immuneepitope.org, Vita R, Zarebski L, Greenbaum JA, Emami H, Hoof I, Salimi N, Damle R, Serte A, Peters B. The immune epitope datábase 2.0. Nucleic Acids Res. enero de 2010;38(edición de la base de datos):D854-62; el contenido de la cual se incorpora en su totalidad a la presente por referencia así como también todas las entradas de la base de datos de la versión 2.4 de IEDB, agosto de 2011 , y en particular todos los epítopos descritos en ellas). Los epítopos también se pueden identificar con algoritmos de acceso público, por ejemplo, los algoritmos descritos en Wang P, Sidney J, Kim Y, Sette A, Lund O, Nielsen M, Peters B. 2010. Peptide binding predictions for HLA DR, DP and DQ molecules. BMC Bioinformatics 2010, 1 1.568; Wang P, Sidney J, Dow C, Mothé B, Sette A, Peters B. 2008. A systematic assessment of MHC class II peptide binding predictions and evaluation of a consensus approach. PLoS Comput Biol. 4(4):e1000048; Nielsen M, Lund O. 2009. NN-align. An artificial neural network-based alignment algorithm for MHC class II peptide binding prediction. BMC Bioinformatics. 10:296; Nielsen M, Lundegaard C, Lund O 2007. Prediction of MHC class II binding affinity using SMM-align, a novel stabilization matrix alignment method. BMC Bioinformatics. 8:238; Bui HH, Sidney J, Peters B, Sathiamurthy M, Sinichi A, Purton KA, Mothé BR, Chisari FV, Watkins DI, Sette A. 2005. Immunogenetics. 57:304-314; Sturniolo T, Bono E, Ding J, Raddrizzani L, Tuereci O, Sahin U, Braxenthaler M, Gallazzi F, Protti MP, Sinigaglia F, Hammer J. 1999. Generation of tissue-specific and promiscuous HLA ligand databases using DNA microarrays and virtual HLA class II matrices. Nat Biotechnol. 17(6):555-561 ; Nielsen M, Lundegaard C, Worning P, Lauemoller SL, Lamberth K, Buus S, Brunak S, Lund O. 2003. Reliable prediction of T-cell epitopes using neural networks with novel sequence representations. Protein Sci 12:1007-1017; Bui HH, Sidney J, Peters B, Sathiamurthy M, Sinichi A, Purton KA, Mothe BR, Chisari FV, Watkins DI, Sette A. 2005. Automated generation and evaluation of specific MHC binding predictive tools: ARB matrix applications. Immunogenetics 57:304-314; Peters B, Sette A. 2005. Generating quantitative models describing the sequence specificity of biological processes with the stabilized matrix method. BMC Bioinformatics 6:132; Chou PY, Fasman GD. 1978. Prediction of the secondary structure of proteins from their amino acid sequence. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol 47:45-148; Emini EA, Hughes JV, Perlow DS, Boger J. 1985. Induction of hepatitis A virus-neutralizing antibody by a virus-specific synthetic peptide. J Virol 55:836-839; Karplus PA, Schulz GE. 1985. Prediction of chain flexibility in proteins. Naturwissenschaften 72:212-213; Kolaskar AS, Tongaonkar PC. 1990. A semi-empirical method for prediction of antigenic determinante on protein antigens. FEBS Lett276: 172-174; Parker JM, Guo D, Hodges RS. 1986. New hydrophilicity scale derived from high-performance liquid chromatography peptide retention data: correlation of predicted surface residues with antigenicity and X-ray-derived accessible sites. Biochemistry 25:5425-5432; Larsen JE, Lund O, Nielsen M. 2006. Improved method for predicting linear B-cell epitopes. Immunome Res 2:2; Ponomarenko JV, Bourne PE. 2007. Antibody-protein interactions: benchmark datasets and prediction tools evaluation BMC Struct Biol 7:64; Haste Andersen P, Nielsen M, Lund 0. 2006. Prediction of residues in discontinuous B-cell epitopes using protein 3D structures. Protein Sci 15:2558-2567; Ponomarenko JV, Bui H, Li W, Fusseder N, Bourne PE, Sette A, Peters B. 2008. ElliPro: a new structure-based tool for the prediction of antibody epitopes. BMC Bioinformatics 9:514; Nielsen M, Lundegaard C, Blicher T, Peters B, Sette A, Justesen S, Buus S, and Lund O. 2008. PLoS Comput Biol.4(7)e1000107. Quantitative predictions of peptide binding to any HLA-DR molecule of known sequence: NetMHCIIpan; el contenido de cada uno de los cuales se incorpora en su totalidad a la presente por referencia para la descripción de métodos y algoritmos para la identificación de epitopos.

Que "genera" significa que provoca una acción, como una respuesta inmunitaria (por ejemplo, una respuesta inmunitaria humoral o una respuesta inmunitaria de CTL) contra un epítopo, ya sea directamente uno mismo o indirectamente tal como, a modo no taxativo, un tercero no relacionado que realiza una acción por la confianza en las palabras o acciones de uno.

La expresión "respuesta inmunitaria humoral" se refiere a cualquier respuesta inmunitaria que provoque la producción o estimulación de linfocitos B y/o la producción de anticuerpos. Preferentemente, la respuesta inmunitaria humoral es especifica para un epítopo comprendido dentro de una composición de la invención o administrado durante la puesta en práctica de un método de la invención. Los métodos para evaluar si una respuesta humoral es inducida son conocidos para los expertos en la técnica. En la presente, la producción de anticuerpos se denomina "respuesta de anticuerpos". "Valoración de anticuerpo" significa la producción de un nivel medióle de anticuerpos. Preferentemente, la respuesta de anticuerpo o generación de la valoración de anticuerpo se produce en un humano. En algunas modalidades, los anticuerpos son anticuerpos de un cierto isotipo, como IgG o una subclase de este. Los métodos para medir las valoraciones de anticuerpos son conocidos en la técnica e incluyen el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Los métodos para medir las valoraciones de anticuerpos también se describen en cierto detalle en los ejemplos. Preferentemente, la respuesta de anticuerpo o valoración de anticuerpo es especifica para un epitopo como se establece en la presente. En las modalidades, la respuesta de anticuerpos se puede cuantificar, por ejemplo, como el número de anticuerpos, la concentración de anticuerpos o la titulación. Los valores pueden ser absolutos o pueden ser relativos. Los ensayos para cuantificar una respuesta de anticuerpos incluyen los ensayos de captura de anticuerpos, enzimoinmunoensayos (ELISA), ensayos de inhibición de la absorción en fase liquida (ILPAA), ensayos de inmunoelectroforesis en cohete (RIE) y ensayos de ¡nmunoelectroforesis en linea (LIE). Cuando una respuesta de anticuerpos se compara con otra respuesta de anticuerpos, es preferible utilizar el mismo tipo de valor cuantitativo (p. ej., titulación) y método de medición (p. ej., ELISA) para realizar la comparación.

Un método de ELISA para medir la valoración de un anticuerpo, por ejemplo, puede consistir en las siguientes etapas (i) preparar un material de recubrimiento de placa de ELISA de forma tal que el objetivo de anticuerpo de interés se acople a un polímero sustrato u otro material adecuado (ii) preparar el material de recubrimiento en una solución acuosa (como PBS) y administrar la solución de material de recubrimiento a los pocilios de una placa de múltiples pocilios para una deposición durante la noche del recubrimiento en la placa de múltiples pocilios (iii) lavar profusamente la placa de múltiples pocilios con un tampón de lavado (como Tween-20 al 0.05% en PBS) para quitar el exceso de material de recubrimiento (iv) bloquear la placa para la unión no específica mediante la aplicación de una solución de diluyente (como suero bovino fetal al 10% en PBS), (v) lavar la solución de bloqueo/diluyente de la placa con tampón de lavado (vi) diluir la/s muestra(s) de suero que contienen anticuerpos y estándares adecuados (testigos positivos) con diluyente según sea necesario para obtener una concentración que sature de forma adecuada la respuesta de ELISA (vii) diluir en serie las muestras de plasma sobre la placa de múltiples pocilios de forma tal de cubrir un intervalo de concentraciones adecuadas para generar una curva de respuesta de ELISA (viii) incubar la placa para proporcionar una unión anticuerpo-objetivo (ix) lavar la placa con tampón de lavado para quitar los anticuerpos que no se encuentran unidos a un antígeno (x) agregar una concentración adecuada de un anticuerpo de detección secundario en el mismo diluyente, como un anticuerpo de detección unido a biotina capaz de unirse al anticuerpo primario (xi) incubar la placa con el anticuerpo de detección aplicado, seguido por el lavado con tampón de lavado (xii) agregar una enzima como estreptavidina-HRP (peroxidasa de rábano picante) que se unirá a la biotina encontrada en los anticuerpos biotinilados e incubar (xiii) lavar la placa de múltiples pocilios (xiv) agregar sustrato(s) (como solución de TMB) a la placa (xv) aplicar una solución de detención (como ácido sulfúrico 2N) cuando el desarrollo de color se encuentre completo (xvi) leer la densidad óptica de los pocilios de la placa a una longitud de onda especifica para el sustrato (450 nm con sustracción de las lecturas a 570 nm) (xvi) aplicar una curva multiparamétrica adecuada ajustada a los datos y definir la concentración efectiva media máxima (EC50) como la concentración sobre la curva en la que se logra la mitad del valor de OD máximo para los estándares de la placa.

El término "identificar" se refiere a una acción o un conjunto de acciones que permite a un médico reconocer a un sujeto como aquel que se puede beneficiar de las composiciones y métodos proporcionados en la presente. Preferentemente, el sujeto identificado es uno que necesita una respuesta inmunitaria humoral y una respuesta inmunitaria de CTL para una única proteina. Tales sujetos incluyen cualquier sujeto que padezca o se encuentre en riesgo de padecer cualquiera de las enfermedades o afecciones proprocionadas en la presente. La acción o conjunto de acciones puede tratarse de directamente uno mismo o indirectamente, tal como, sin carácter limitante, un tercero no relacionado que ejerce una acción debido a la confianza en la información o acciones de otro.

Una "infección" o "enfermedad infecciosa" es cualquier afección o enfermedad causada por un microorganismo, patógeno u otro agente como una bacteria, hongo, prión o virus.

La expresión "dimensión máxima de un nanoportador sintético" se refiere a la mayor dimensión de un nanoportador medida a lo largo de cualquier eje del nanoportador sintético. La expresión "dimensión mínima de un nanoportador sintético" se refiere a la dimensión más pequeña de un nanoportador sintético medida a lo largo de cualquier eje del nanoportador sintético. Por ejemplo, para un nanoportador sintético esferoidal, la dimensión máxima y la mínima del nanoportador sintético serian sustancialmente idénticas y serian del tamaño de su diámetro. De manera similar, para un nanoportador sintético cuboidal, la dimensión mínima del nanoportador sintético sería la más pequeña de su altura, ancho o largo, mientras que la dimensión máxima del nanoportador sintético sería la mayor de su altura, ancho o largo. En una modalidad, la dimensión mínima de al menos un 75%, preferentemente al menos un 80%, más preferentemente al menos un 90%, de los nanoportadores sintéticos en una muestra, basándose en el número total de nanoportadores sintéticos en la muestra, es mayor o igual a 100 nm.

En una modalidad, la dimensión máxima de al menos un 75%, preferentemente al menos un 80%, más preferentemente al menos un 90%, de los nanoportadores sintéticos en una muestra, basándose en el número total de nanoportadores sintéticos en la muestra, es inferior o igual a 5 µ??. Preferentemente, la dimensión mínima de al menos un 75%, preferentemente al menos un 80%, más preferentemente al menos un 90%, de los nanoportadores sintéticos en una muestra, basándose en el número total de nanoportadores sintéticos en la muestra, es superior a 110 nm, más preferentemente superior a 120 nm, más preferentemente superior a 130 nm y aún más preferentemente superior a 150 nm. Las relaciones entre dimensiones para las dimensiones máxima y mínima de los nanoportadores sintéticos de la invención pueden variar dependiendo de la modalidad. Por ejemplo, las relaciones entre dimensiones para las dimensiones máxima frente a mínima de los nanoportadores sintéticos pueden variar desde 1 :1 hasta 1 000 000:1 , preferentemente desde 1 :1 hasta 100 000:1 , más preferentemente desde 1 :1 hasta 10 000:1 , más preferentemente desde 1 :1 hasta 1000:1 , aún más preferentemente desde 1 :1 hasta 100:1 , e incluso más preferentemente desde 1 :1 hasta 10:1. Preferentemente, la dimensión máxima de al menos un 75%, preferentemente al menos un 80%, más preferentemente al menos un 90%, de los nanoportadores sintéticos en una muestra, basándose en el número total de nanoportadores sintéticos en la muestra, es menor o igual a 3 µp?, más preferentemente menor o igual a 2 µ?t), más preferentemente menor o igual a 1 µ??, más preferentemente menor o igual a 800 nm, más preferentemente menor o igual a 600 nm, y aún más preferentemente menor o igual a 500 nm. En las modalidades preferidas, la dimensión mínima de al menos un 75%, preferentemente al menos un 80%, más preferentemente al menos un 90%, de los nanoportadores sintéticos en una muestra, basándose en el número total de nanoportadores sintéticos en la muestra, es mayor o igual a 100 nm, más preferentemente mayor o igual a 120 nm, más preferentemente mayor o igual a 130 nm, más preferentemente mayor o igual a 140 nm, y aún más preferentemente mayor o igual a 150 nm. La medición de las dimensiones de los nanoportadores sintéticos (p. ej., diámetro) se obtiene suspendiendo los nanoportadores sintéticos en un medio líquido (generalmente acuoso) y utilizando dispersión de luz dinámica (DLS) (p. ej., utilizando un instrumento Brookhaven ZetaPALS). Por ejemplo, una suspensión de nanoportadores sintéticos se puede diluir a partir de un tampón acuoso en agua purificada para conseguir una concentración final de la suspensión de nanoportadores sintéticos comprendida entre aproximadamente 0.01 y 0.1 mg/mL. La suspensión diluida se puede preparar directamente dentro de una cubeta adecuada para el análisis por DLS o se puede transferir a dicha cubeta. A continuación, la cubeta se puede colocar en el DLS, dejar que se equilibre hasta la temperatura controlada y después escanear durante un tiempo suficiente para adquirir una distribución estable y reproducible basándose en los parámetros adecuados para la viscosidad del medio y los índices de refracción de la muestra. A continuación se registra el diámetro eficaz o la media de la distribución. El término "dimensión", "tamaño" o "diámetro" de los nanoportadores sintéticos se refiere a la media de una distribución del tamaño de partícula obtenida utilizando dispersión de luz dinámica.

El término "MHC" se refiere al complejo de histocompatibilidad principal, una familia de genes o región genómica grande que se encuentra en la mayoría de los vertebrados la cual codifica moléculas MHC que exhiben fragmentos o epítopos de proteínas procesadas en la superficie celular. La presentación de MHC:péptido en las superficies celulares permite la vigilancia por parte de las células inmunitarias, normalmente un linfocito T. Existen dos clases generales de moléculas MHC: Clase I y Clase II. Generalmente, las moléculas MHC de clase I se encuentran en células nucleadas y presentan péptidos a los linfocitos T citotóxicos. Las moléculas MHC de clase II se encuentran en ciertas células inmunitarias, principalmente macrófagos, linfocitos B y células dendríticas, colectivamente conocidas como APC. Los genes más conocidos en la región MHC son el subconjunto que codifica proteínas presentadoras de antigeno en la superficie celular. En los seres humanos, estos genes se denominan genes de antígenos leucocitarios humanos (HLA, por sus siglas en inglés).

"Excipiente farmacéuticamente aceptable" significa un material farmacológicamente inactivo utilizado junto con los nanoportadores sintéticos mencionados para formular las composiciones. Los excipientes farmacéuticamente aceptables comprenden una variedad de materiales conocidos en la técnica incluidos, a modo no taxativo, sacáridos (tales como glucosa, lactosa y similares), conservantes tales como agentes antimicrobianos, auxiliares de reconstitución, solución salina (tal como solución salina tamponada con fosfato) y tampones.

"Proteína(s)" significa compuestos, que generalmente tienen un peso molecular mayor que 1000 daltons, que comprenden residuos de aminoácidos unidos entre sí principalmente por enlaces peptidicos entre los grupos carboxilo y amino de residuos de aminoácidos contiguos. Las proteínas pueden comprender, además, estructuras de enlace adicionales como estructuras secundarias, estructuras terciarias y similares. Ciertos de los enlaces peptidicos en las proteínas pueden reemplazarse por otros tipos de enlace, para varias finalidades, como la estabilización o acoplamiento. Cuando se acoplan a nanoportadores sintéticos, preferentemente, existen múltiples copias de la proteína que se acoplan a cada nanoportador sintético.

El término "protocolo" se refiere a cualquier régimen posológico de una o más sustancias para un sujeto. Un régimen posológico puede incluir la cantidad, la frecuencia y/o el modo de administración. En algunas modalidades, este tipo de protocolo se puede utilizar para administrar una o más composiciones de la invención a uno o más sujetos objeto de estudio. Las respuestas inmunítarias en estos sujetos de prueba después pueden evaluarse para determinar si el protocolo fue eficaz o no en la generación de la/s respuesta(s) inmunitaria(s) deseada(s). También pueden evaluarse cualesquiera otros efectos terapéuticos y/o profilácticos en lugar de o además de las respuestas inmunítarias mencionadas anteriormente. Se puede determinar si un protocolo ejerce o no un efecto deseado utilizando cualquiera de los métodos proporcionados en la presente o conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede obtenerse una población de células de un sujeto al cual se le administró una composición proporcionada en la presente de acuerdo con un protocolo específico para determinar si se generaron, activaron, etc. o no células inmunitarias, citocinas, anticuerpos, etc. Los métodos útiles para detectar la presencia y/o cantidad de células inmunitarias incluyen, a modo no taxativo, métodos de citometria de flujo (por ejemplo, FACS) y métodos de inmunohistoquímica. Se pueden adquirir de proveedores comerciales anticuerpos y otros agentes ligantes para la tinción específica de marcadores de células inmunitarias. Los kits de este tipo normalmente incluyen reactivos colorantes para múltiples antígenos que permiten la detección, separación y/o cuantificación basadas en FACS de una población de células deseada a partir de una población heterogénea de células.

El término "sujeto" se refiere a animales, incluidos los mamíferos de sangre caliente tales como seres humanos y primates; aves; animales domésticos, mascotas o animales de granja tales como gatos, perros, ovejas, cabras, reses, caballos y cerdos; animales de laboratorio tales como ratones, ratas y conejillos de Indias; peces; reptiles; animales de zoológico y animales salvajes; y similares.

La expresión "nanoportador(es) sintético(s)" se refiere a un objeto específico que no se encuentra en la naturaleza y que posee al menos una dimensión que tiene un tamaño menor o igual a 5 mieras. Las nanoparticulas de albúmina generalmente se incluyen como nanoportadores sintéticos, sin embargo, en ciertas modalidades los nanoportadores sintéticos no comprenden nanoparticulas de albúmina. En las modalidades, los nanoportadores sintéticos no comprenden quitosano. En ciertas modalidades, los nanoportadores sintéticos no comprenden quitosano. En otras modalidades, los nanoportadores sintéticos de la invención no son nanoparticulas a base de lipidos. En otras modalidades, los nanoportadores sintéticos de la invención no comprenden un fosfolípido.

Un nanoportador sintético puede ser, sin carácter limitante, una o una pluralidad de nanoparticulas a base de lipidos (también denominadas en la presente nanoparticulas lipidicas, es decir, nanoparticulas en las que la mayor parte del material que constituye su estructura son lipidos), nanoparticulas poliméricas, nanoparticulas metálicas, emulsiones a base de surfactante, dendrímeros, futbolenos, nanohilos, partículas pseudovíricas (es decir, partículas que están constituidas principalmente por proteínas estructurales víricas pero que no son infecciosas o tienen una infectividad baja), partículas a base de péptidos o proteínas (también denominadas en la presente partículas proteicas, es decir, partículas en las que la mayor parte del material que constituye su estructura son péptidos o proteínas) (tales como nanoparticulas de albúmina) y/o nanoparticulas que se elaboran utilizando una combinación de nanomateriales tales como nanoparticulas poliméricas-lipídicas. Los nanoportadores sintéticos pueden tener una variedad de formas diferentes, incluidas, sin carácter limitante, esferoidal, cuboidal, piramidal, oblonga, cilindrica, toroidal y similares. Los nanoportadores sintéticos de acuerdo con la invención comprenden una o más superficies. Los nanoportadores sintéticos ilustrativos que pueden adaptarse para emplearlos en la práctica de la presente invención comprenden: (1 ) las nanopartículas biodegradables descritas en la Patente de EE. UU. 5,543,158 concedida a Gref et al., (2) las nanopartículas poliméricas de la Solicitud de Patente de EE. UU. Publicada 20060002852 concedida a Saltzman et al., (3) las nanopartículas construidas litográficamente de la Solicitud de Patente de EE. UU. Publicada 20090028910 concedida a DeSimone et al., (4) la descripción de WO 2009/051837 concedida a von Andrian et al., (5) las nanopartículas descritas en la Solicitud de Patente de EE. UU. Publicada 2008/0145441 concedida a Penades et al., (6) las nanopartículas proteicas descritas en la Solicitud de Patente de EE. UU. Publicada 20090226525 concedida a de los Rios et al., (7) las partículas pseudovíricas descritas en la Solicitud de Patente de EE. UU. Publicada 20060222652 concedida a Sebbel et al., (8) las partículas pseudovíricas acopladas a ácido nucleico descritas en la Solicitud de Patente de EE. UU. Publicada 20060251677 concedida a Bachmann et al., (9) las partículas pseudovíricas descritas en WO2010047839A1 o WO2009106999A2, (10) las nanopartículas nanoprecipitadas descritas en P. Paolicelli et al., "Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that can Efficiently Associate and Deliver Virus-like Particles" Nanomedicine. 5(6):843-853 (2010) o (1 1 ) células apoptóticas, cuerpos apoptóticos o los miméticos sintéticos o semisintéticos divulgados en la publicación de EE.UU. 2002/0086049. En las modalidades, los nanoportadores sintéticos pueden poseer una relación de aspecto mayor que 1 : 1 , 1 :1.2, 1 :1.5, 1 :2, 1.3, 1 :5, 1 :7 o mayor que 1 :10.

Los nanoportadores sintéticos de acuerdo con la invención que tienen una dimensión mínima menor o igual a aproximadamente 100 nm, preferentemente menor o igual a 100 nm, no comprenden una superficie con grupos hidroxilo que activen el complemento o, como alternativa, comprenden una superficie constituida esencialmente por restos que no son grupos hidroxilo que activan el complemento. En una modalidad preferida, los nanoportadores sintéticos de acuerdo con la invención que tienen una dimensión mínima menor o igual a aproximadamente 100 nm, preferentemente menor o igual a 100 nm, no comprenden una superficie que active sustancialmente el complemento o, como alternativa, comprenden una superficie constituida esencialmente por restos que no activan sustancialmente el complemento. En una modalidad más preferida, los nanoportadores sintéticos de acuerdo con la invención que tienen una dimensión mínima menor o igual a aproximadamente 100 nm, preferentemente menor o igual a 100 nm, no comprenden una superficie que active el complemento o, como alternativa, comprenden una superficie constituida esencialmente por restos que no activan el complemento. En algunas modalidades, los nanoportadores sintéticos excluyen partículas pseudovíricas. En algunas modalidades, cuando los nanoportadores sintéticos comprenden partículas pseudovíricas, las partículas pseudovíricas comprenden un adyuvante no natural (lo cual significa que las partículas VLP comprenden un adyuvante distinto del ARN de origen natural generado durante la producción de las VLP). En las modalidades, los nanoportadores sintéticos pueden poseer una relación de aspecto mayor que 1 :1 , 1 :1.2, 1 :1.5, 1 :2, 1 :3, 1 :5, 1 :7 o mayor que 1 :10.

"Antígeno de linfocitos T" significa cualquier antígeno que sea reconocido y dispare una respuesta inmunitaria en un linfocito T (por ejemplo, un antígeno que sea específicamente reconocido por un receptor de linfocitos T en un linfocito T o en una célula NKT mediante la presentación del antígeno o su porción unida a una molécula del complejo mayor de histocompatibílídad (MHC) de clase I o clase II o unida a un complejo CD1). En algunas modalidades, un antígeno que es un antígeno de linfocitos T también es un antígeno de linfocitos B. En otras modalidades, el antigeno de linfocitos T no es además un antígeno de linfocitos B. Los antígenos de linfocitos T son generalmente proteínas o péptidos. Los antígenos de linfocitos T pueden ser un antígeno que estimule una respuesta de los linfocitos T CD8+, una respuesta de los linfocitos T CD4+ o ambas. Por lo tanto, los nanoportadores en algunas modalidades pueden estimular eficazmente ambos tipos de respuestas.

En algunas modalidades, el antígeno de linfocitos T es un antígeno de linfocitos T cooperadores (es decir, uno que puede generar una respuesta mejorada frente a un antígeno de linfocitos B, preferentemente un antígeno de linfocitos B no relacionado, a través de la estimulación de linfocitos T cooperadores). En algunas modalidades, un antigeno de linfocitos T cooperadores puede comprender uno o más péptidos obtenidos o derivados de toxoide del tétano, virus de Epstein-Barr, virus de la gripe, virus sincitial respiratorio, virus del sarampión, virus de las paperas, virus de la rubéola, citomegalovirus, adenovirus, toxoide de difteria o un péptido PADRE (conocido por el trabajo de Sette et al. Patente de EE. UU. 7,202,51). En otras modalidades, un antígeno de linfocitos T cooperadores puede comprender uno o más lipidos o glicolipidos, que incluyen, sin carácter limitante: -galactosilceramida (a-GalCer), glicoesfingolípidos unidos a a (de Sphingomonas spp.), galactosil diacilgliceroles (de Borrelia burgdorferi), lipofosfoglicano (de Leishmania donovani) y fosfatidilinositol tetramanósido (PIM4) (de Mycobacterium leprae). Para consultar lipidos y/o glicolipidos adicionales útiles como antigenos de linfocitos T cooperadores, remítase a V. Cerundolo et al., "Harnessing invariant NKT cells in vaccination strategies". Nature Rev Immun, 9:28-38 (2009). En algunas modalidades, los antígenos de linfocitos T CD4+ pueden ser derivados de un antígeno de linfocitos T CD4+ que se obtiene de una fuente tal como una fuente natural. En dichas modalidades, las secuencias del antígeno de linfocitos T CD4+, tales como los péptidos que se unen a MHC II, pueden presentar al menos un 70%, 80%, 90% o 95% de identidad respecto al antígeno obtenido de la fuente. En algunas modalidades, el antígeno de linfocitos T, preferentemente un antígeno de linfocitos T cooperadores, puede acoplarse a, o desacoplarse de, un nanoportador sintético. En algunas modalidades, el antígeno de linfocitos T se encuentra encapsulado en los nanoportadores sintéticos de las composiciones.

"Vacuna" significa una composición de material que mejora la respuesta inmune a un patógeno o enfermedad particular. Una vacuna suele contener factores que estimulan el sistema inmunológico de un sujeto para que reconozca un antígeno específico como extraño y lo elimine del cuerpo del sujeto. Una vacuna también establece una 'memoria' inmunológica de modo que el antígeno será rápidamente reconocido y se responderá a él si una persona vuelve a ser expuesta. Las vacunas pueden ser profilácticas (por ejemplo, para prevenir una futura infección de cualquier patógeno) o terapéuticas (por ejemplo, una vacuna contra un antígeno especifico de un tumor para el tratamiento del cáncer). En algunas modalidades, una vacuna puede compreder formas farmacéuticas de acuerdo con la invención.

"Régimen de vacunas" o "régimen de vacunación" es un cronograma de una o más vacunaciones que incluye la cantidad y tiempo de dosis de una vacuna. Generalmente, los regímenes de vacunación pretenden alcanzar la inmunidad contra el desarrollo de una enfermedad o afección. Preferentemente, el régimen de vacunación es uno que alcanza la inmunidad a través de las ramas humoral y de CTL del sistema inmunitario.

C. Composiciones para el uso en los métodos de la invención En la presente se proporcionan métodos y composiciones relacionadas para la generación de una respuesta inmunitaria humoral y de CTL eficaz. Se ha descubierto que los nanoportadores sintéticos a los que una proteína que comprende al menos un epítopo humoral y al menos un epítopo restringido por MHC de clase I que no son el mismo epítopo se encuentra acoplada, donde los nanoportadores no comprenden un adyuvante de saponina-colesterol y donde el promedio de una distribución de tamaño de partícula obtenida mediante el uso de dispersión de luz dinámica de la población de nanoportadores sintéticos es una dimensión máxima de 20 nm a 250 nm, pueden generar respuestas inmunitarias humorales y de CTL eficaces y fuertes. Las composiciones proporcionadas pueden utilizarse para una variedad de criterios de valoración clínicos deseados, tal como para la vacunación.

Puede utilizarse una amplia variedad de nanoportadores sintéticos de acuerdo con la invención. En algunas modalidades, los nanoportadores sintéticos son esferas o esferoides. En algunas modalidades, los nanoportadores sintéticos son planos o en forma de placa. En algunas modalidades, los nanoportadores sintéticos son cubos o cúbicos. En algunas modalidades, los nanoportadores sintéticos son óvalos o elipses. En algunas modalidades, los nanoportadores sintéticos son cilindros, conos o pirámides.

En algunas modalidades, es deseable utilizar una población de nanoportadores sintéticos que sea relativamente uniforme en cuanto al tamaño, la forma y/o la composición, de modo que cada nanoportador sintético tenga propiedades similares. Por ejemplo, al menos un 80%, al menos un 90% o al menos un 95% de los nanoportadores sintéticos, basándose en el número total de nanoportadores sintéticos, puede tener una dimensión mínima o dimensión máxima comprendida dentro de un 5%, 10% o 20% del diámetro medio o la dimensión media de los nanoportadores sintéticos. En algunas modalidades, una población de nanoportadores sintéticos puede ser heterogénea con respecto al tamaño, la forma y/o la composición.

Los nanoportadores sintéticos pueden ser sólidos o estar huecos y pueden comprender una o más capas. En algunas modalidades, cada capa tiene una composición única y propiedades únicas con respecto a la(s) otra(s) capa(s). Para proporcionar solamente un ejemplo, los nanoportadores sintéticos pueden tener una estructura de núcleo/cubierta, donde el núcleo es una capa (p. ej., un núcleo polimérico) y la cubierta es una segunda capa (p. ej., una monocapa o bicapa lipídica). Los nanoportadores sintéticos pueden comprender una pluralidad de capas diferentes.

En algunas modalidades, los nanoportadores sintéticos pueden comprender partículas metálicas, puntos cuánticos, partículas cerámicas, etc. En algunas modalidades, un nanoportador sintético no polimérico es un agregado de componentes no poliméricos, tal como un agregado de átomos metálicos (p. ej., átomos de oro).

En algunas modalidades, los nanoportadores sintéticos pueden comprender opcionalmente uno o más lípidos. En algunas modalidades, un nanoportador sintético puede comprender un liposoma. En algunas modalidades, un nanoportador sintético puede comprender una bicapa lipídica. En algunas modalidades, un nanoportador sintético puede comprender una monocapa lipídica. En algunas modalidades, un nanoportador sintético puede comprender una micela. En algunas modalidades, un nanoportador sintético puede comprender un núcleo que comprenda una matriz polimérica rodeada de una capa lipídica (p. ej., bicapa lipídica, monocapa lipídica, etc.). En algunas modalidades, un nanoportador sintético puede comprender un núcleo no polimérico (p. ej., partícula metálica, punto cuántico, partícula de cerámica, partícula ósea, partícula vírica, proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos, etc.) rodeado de una capa lipídica (p. ej., bicapa lipídica, monocapa lipídica, etc.).

En algunas modalidades, los nanoportadores sintéticos pueden comprender uno o más polímeros. En algunas modalidades, dicho polímero puede estar rodeado por una capa de recubrimiento (p. ej., liposoma, monocapa lipídica, micela, etc.). En algunas modalidades, varios elementos (es decir, componentes) de los nanoportadores sintéticos pueden acoplarse con el polímero.

En algunas modalidades, un componente puede asociarse covalentemente con una matriz polimérica. En algunas modalidades, la asociación covalente está mediada por un conector. En algunas modalidades, un componente puede asociarse de forma no covalente con una matriz polimérica. Por ejemplo, en algunas modalidades, un componente puede estar encapsulado dentro de una matriz polimérica, ser rodeados por esta y/o dispersarse en ella. De forma alternativa o adicional, un componente puede asociarse con una matriz polimérica mediante interacciones hidrófobas, interacciones de carga y fuerzas de Van Der Waals, etc.

Una amplia variedad de polímeros y métodos para formar matrices poliméricas a partir de estos se conocen convencionalmente. En general, la matriz polimérica comprende uno o más polímeros.

Los nanoportadores sintéticos proporcionados en la presente pueden ser nanoportadores poliméricos. Los polímeros pueden ser polímeros naturales o no naturales (sintéticos). Los polímeros pueden ser homopolímeros o copolímeros que comprenden dos o más monómeros. En cuanto a la secuencia, los copolímeros pueden ser aleatorios, en bloque o comprender una combinación de secuencias aleatorias y en bloque. Normalmente, los polímeros de acuerdo con la presente invención son polímeros orgánicos.

En algunas modalidades, los nanoportadores comprenden uno o más polímeros que comprenden un poliéster, policarbonato, poliamida o poliéter o unidad de los mismos. En otras modalidades, el polímero comprende poli(etilenglicol) (PEG), ácido poli(láctico), ácido poli(glicólico), ácido poli(láctico-co-glicólico) o policaprolactona o unidad de los mismos. En algunas modalidades, se prefiere que el polímero sea biodegradable. Por lo tanto, en estas modalidades, se prefiere que, si el polímero comprende un poliéter, tal como poli(etilenglicol) o unidad del mismo, el polímero comprenda un copolímero de bloque de un poliéter y un polímero biodegradable de forma tal que el polímero sea biodegradable. En otras modalidades, el polímero no comprende únicamente un poliéter o unidad del mismo, tal como poli(etilenglicol) o unidad del mismo. El o los polímeros pueden estar comprendidos dentro de un nanoportador sintético polimérico o pueden estar compuestos de una variedad de otros tipos diferentes de nanoportadores sintéticos.

Los ejemplos de polímeros adecuados para su uso en la presente invención incluyen, a modo no taxativo, polietilenos, policarbonatos (por ejemplo, poli(1 ,3-dioxan-2-ona)), polianhídridos (por ejemplo, anhídrido poli(sebácico)), polipropilfumaratos, poliamidas (por ejemplo, policaprolactama), poliacetales, poliéteres, poliésteres (por ejemplo, poliláctido, poliglicólido, poliláctido-co-glicólido, policaprolactona, polihidroxiácidos (por ejemplo, poli( -hidroxialkanoato))), poli(ortoésteres), policianoacrilatos, alcoholes de polivinilo, poliuretanos, polifosfazenos, poliacrilatos, polimetacrilatos, poliureas, poliestirenos, poliaminas, polilisina, copolímeros de polilisina-PEG, poli(etilenimina) y copolímeros de poli(etilen imina)-PEG.

En algunas modalidades, los polímeros de acuerdo con la presente invención incluyen polímeros que fueron aprobados por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) para su uso en humanos según el Artículo 177.2600 del Título 21 del C.F.R. incluidos, a modo no taxativo, poliésteres (por ejemplo, ácido poliláctico, ácido poli(láctico-coglicólico), policaprolactona, polivalerolactona, poli(1 ,3-dioxan-2- ona))¡ polianhídridos (por ejemplo, anhídrido poli(sebácico)); poliéteres (por ejemplo, polietilenglicol); poliuretanos; polimetacrilatos; poliacrilatos y policianoacrilatos.

En algunas modalidades, los polímeros pueden ser hidrófilos. Por ejemplo, los polímeros pueden comprender grupos aniónicos (p. ej., grupo fosfato, grupo sulfato, grupo carboxilato); grupos catiónicos (p. ej., grupo de amina cuaternaria); o grupos polares (p. ej., grupo hidroxilo, grupo tiol, grupo amina). En algunas modalidades, un nanoportador sintético que comprende una matriz polimérica hidrófila genera un entorno hidrófilo dentro del nanoportador sintético. En algunas modalidades, los polímeros pueden ser hidrófobos. En algunas modalidades, un nanoportador sintético que comprende una matriz polimérica hidrófoba genera un entorno hidrófobo dentro del nanoportador sintético. La selección de la hidrofilicidad o hidrofobicidad del polímero puede afectar a la naturaleza de los materiales que se incorporan (p. ej., se acoplan) dentro del nanoportador sintético.

En algunas modalidades, los polímeros pueden modificarse con uno o más restos y/o grupos funcionales. Se pueden emplear varios restos o grupos funcionales de acuerdo con la presente invención. En algunas modalidades, los polímeros se pueden modificar con polietilenglicol (PEG), con un carbohidrato y/o con poliacetales aciclicos derivados de polisacáridos (Papisov, 2001 , Serie de Congresos de la ACS, 786:301). Ciertas modalidades se pueden preparar empleando los conocimientos generales que se describen en la Patente de EE. UU. N.° 5543 58 concedida a Gref et al. o la publicación WO WO2009/051837 de Von Andrian et al.

En algunas modalidades, los polímeros se pueden modificar con un grupo de tipo ácido graso o lípido. En algunas modalidades, un grupo de tipo ácido graso puede ser uno o más de los siguientes: ácido butírico, caproico, caprílico, cáprico, láurico, mirístico, palmítico, esteárico, araquídico, behénico o lignocérico. En algunas modalidades, un grupo de tipo ácido graso puede ser uno o más de los siguientes: ácido palmitoleico, oleico, vaccénico, linoleico, alfa-linoleico, gamma-linoleico, araquidónico, gadoleico, araquidónico, eicosapentaenoico, docosahexaenoico o erúcico.

En algunas modalidades, los polímeros pueden ser poliésteres, incluidos los copolimeros que comprenden unidades de ácido láctico y ácido glicólico, tales como poli(ácido láctico-co-ácido glicólico) y poli(láctido-co-glicólido), denominados colectivamente en la presente "PLGA"; y homopolímeros que comprenden unidades de ácido glicólico, denominados en la presente "PGA", y unidades de ácido láctico, tales como ácido poli-L-láctico, ácido poli-D-láctico, ácido poli-D,L-láctico, poli-L-láctido, poli-D-láctido y poli-D,L-láctido, denominados colectivamente en la presente "PLA". En algunas modalidades, los poliésteres ilustrativos incluyen, por ejemplo, polihidroxiácidos; copolimeros de PEG y copolimeros de láctido y glicólido (p. ej., copolimeros de PLA-PEG, copolimeros de PGA-PEG, copolimeros de PLGA-PEG y derivados de estos. En algunas modalidades, los poliésteres incluyen, por ejemplo, poli(caprolactona), copolimeros de poli(caprolactona)-PEG, poli(L-láctido-co-L-lisina), poli(éster de serina), poli(éster de 4-hidroxi-L- prolina), poli[ácido a-(4-aminobutil)-L-glicólico] y derivados de estos.

En algunas modalidades, un polímero puede ser PLGA. PLGA es un copolimero biocompatible y biodegradable de ácido láctico y ácido glicólico, y varias formas de PLGA se caracterizan por la proporción de ácido láctico:ácido glicólico. El ácido láctico puede ser ácido L-láctico, ácido D-láctico o ácido D, L-láctico. La tasa de degradación del PLGA puede ajustarse alterando la proporción de ácido láctico:ácido glicólico. En algunas modalidades, el PLGA que se ha de utilizar de acuerdo con la presente invención se caracteriza por una proporción de ácido láctico:ácido glicólico de aproximadamente 85:15, aproximadamente 75:25, aproximadamente 60:40, aproximadamente 50:50, aproximadamente 40:60, aproximadamente 25:75 o aproximadamente 15:85.

En algunas modalidades, los polímeros pueden ser uno o más polímeros acrilicos. En ciertas modalidades, los polímeros acrílicos incluyen, por ejemplo, copolímeros de ácido acrílico y ácido metacrílico, copolímeros de metacrilato de metilo, metacrilatos de etoxietilo, metacrilato de cianoetilo, copolimero de metacrilato de aminoalquilo, poli(ácido acrílico), poli(ácido metacrílico), copolimero de alquilamida de ácido metacrílico, poli(metacrilato de metilo), poli(anhídrido de ácido metacrílico), metacrilato de metilo, polimetacrilato, copolimero de poli(metacrilato de metilo), poliacrilamida, copolimero de metacrilato de aminoalquilo, copolímeros de metacrilato de glicidilo, policianoacrilatos y combinaciones que comprenden uno o más de los polímeros precedentes. El polímero acrílico puede comprender copolímeros totalmente polimerizados de ésteres de ácido acrílico y metacrílico con un bajo contenido de grupos amonio cuaternario.

En algunas modalidades, los polímeros pueden ser polímeros catiónicos. En general, los polímeros catiónicos son capaces de condensar y/o proteger hebras de ácidos nucleicos con carga negativa (p. ej., ADN o sus derivados). Los polímeros que contienen amina, tales como los dendrímeros de poli(lisina) (Zauner et al., 1998, Adv. Drug Del. Rev. , 30:97; y abanov et al., 1995, Bioconjugate Chem., 6:7), poli(etilenimina) (PEI; Boussif et al., 1995, Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 1995, 92:7297) y poli(amidoamina) (Kukowska-Latallo et al., 1996, Proc. Nati. Acad. Sel., USA, 93:4897; Tang et al., 1996, Bioconjugate Chem., 7:703; y Haensler et al. , 1993, Bioconjugate Chem., 4:372) están cargados positivamente a pH fisiológico, forman pares iónicos con ácidos nucleicos y median la transfección en varias líneas celulares. En las modalidades, los nanoportadores sintéticos pueden no comprender (o pueden excluir) polímeros catiónicos.

En algunas modalidades, los polímeros pueden ser poliésteres degradables que contienen cadenas laterales catiónicas (Putnam et al., 1999, Macromolecules, 32:3658; Barrera er a/., 1993, J. Am. Chem. Soc, 1 15:1 1010; Kwon et al., 1989, Macromolecules, 22:3250; Lim et al., 1999, J. Am. Chem. Soc, 121 :5633; y Zhou et al., 1990, Macromolecules, 23:3399). Los ejemplos de estos poliésteres incluyen poli(L-láctido-co-L-lisina) (Barrera et al. , 1993, J. Am. Chem. Soc, 1 15: 1 1010), poli(éster de serina) (Zhou et al. , 1990, Macromolecules, 23:3399), poli(éster de 4-hidroxi-L-prolina) (Putnam et al., 1999, Macromolecules, 32:3658; y Lim et al., 1999, J. Am. Chem. Soc , 121 :5633) y poli(éster de 4-hidroxi-L-prolina) (Putnam et al., 1999, Macromolecules, 32:3658; y Lim er a/., 1999, J. Am. Chem. Soc, 121 :5633).

Las propiedades de estos y otros polímeros y los métodos para prepararlos son muy conocidos en la técnica (remítase, por ejemplo, a las Patentes de EE. UU. 6,123,727, 5,804,178, 5,770,417, 5,736,72, 5,716,404, 6,095,148, 5,837,752, 5,902,599, 5,696,175, 5,514,78, 5,512,600, 5,99,665, 5,019,79, 5,010, 167, 4,806,621 , 4,638,045 y 4,946,929; Wang et al., 2001 , J. Am. Chem. Soc, 123:9480; Lim et al., 2001 , J. Am. Chem. Soc , 123:2460; Langer, 2000, Acc. Chem. Res., 33:94; Langer, 1999, J. Control. Reléase, 62:7; y Uhrich et al., 1999, Chem. Rev., 99:3181). De forma más general, se describen varios métodos para sintetizar ciertos polímeros adecuados en Concise Encyclopedia of Polymer Science and Polymeric Amines and Ammonium Salts, Ed. de Goethals, Pergamon Press, 1980; Principies of Polymerization de Odian, John Wiley & Sons, Cuarta Edición, 2004; Contemporary Polymer Chemistry de Allcock et al., Prentice-Hall, 1981 ; Deming et al., 1997, Nature, 390:386; y en las Patentes de EE. UU. 6,506,577, 6,632,922, 6,686,446 y 6,818,732.

En algunas modalidades, los polímeros pueden ser polímeros lineales o ramificados. En algunas modalidades, los polímeros pueden ser dendrímeros. En algunas modalidades, los polímeros pueden estar sustancialmente reticulados entre si. En algunas modalidades, los polímeros pueden estar sustancialmente exentos de reticulación En algunas modalidades, los polímeros pueden utilizarse de acuerdo con la presente invención sin someterse a una etapa de reticulación. Debe entenderse además que los nanoportadores sintéticos pueden comprender copolímeros de bloque, copolímeros de injertos, mezclas y/o aductos de cualquiera de los polímeros que anteceden u otros polímeros. Los expertos en la técnica reconocerán que los polímeros listados en la presente representan una lista ejemplar, no exhaustiva, de los polímeros que pueden utilizarse de acuerdo con la presente invención.

En algunas modalidades, los nanoportadores sintéticos pueden comprender de forma opcional una o más entidades anfifílicas. En algunas modalidades, una entidad anfifílica puede propiciar la producción de nanoportadores sintéticos con mayor estabilidad, uniformidad mejorada o mayor viscosidad. En algunas modalidades, las entidades anfifílicas pueden asociarse con la superficie interior de una membrana lipídica (p. ej., bicapa lipídica, monocapa lipídica, etc.). Muchas entidades anfifílicas conocidas en la técnica son adecuadas para ser utilizadas en la preparación de nanoportadores sintéticos de acuerdo con la presente invención. Dichas entidades anfifílicas incluyen, sin carácter limitante, fosfoglicéridos; fosfatidilcolinas; dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC); dioleilfosfatidiletanolamina (DOPE); dioleiloxipropiltrietilamonio (DOTMA); dioleoilfosfatidilcolina; colesterol; éster de colesterol; diacilglicerol; succinato de diacilglicerol; difosfatidilglicerol (DPPG); hexanodecanol; alcoholes grasos tales como polietilenglicol (PEG); éter polioxietilen-9-laurílico; un ácido graso tensioactivo, tal como ácido palmítico o ácido oleico; ácidos grasos; monoglicéridos de ácidos grasos; diglicéridos de ácidos grasos; amidas de ácidos grasos; glicocolato de trioleato de sorbitán (Span®85); monolaurato de sorbitán (Span®20); polisorbato 20 (Tween®20); polisorbato 60 (Tween®60); polisorbato 65 (Tween®65); polisorbato 80 (Tween®80); polisorbato 85 (Tween®85); monoestearato de polioxietileno; surfactina; un poloxómero; un éster de ácido graso de sorbitán tal como trioleato de sorbitán; lecitina; lisolecitina; fosfatidilserina, fosfatidilinositol; esfingomielina; fosfatidiletanolamina (cefalina); cardiolipina; ácido fosfatídico; cerebrósidos; fosfato de dicetilo; dipalmitoilfosfatidilglicerol; estearilamina; dodecilamina; hexadecilamina; palmitato de acetilo; ricinoleato de glicerol; estearato de hexadecilo; miristato de isopropilo; tiloxapol; polietilenglicol 5000-fosfatidiletanolamina; monoestearato de polietilenglicol 400; fosfolipidos; detergentes sintéticos y/o naturales que tienen buenas propiedades tensioactivas; desoxicolatos; ciclodextrinas; sales caotrópicas; agentes de apareamiento iónico y combinaciones de estos. Un componente de la entidad anfifílica puede ser una mezcla de entidades anfifílicas diferentes. Los expertos en la técnica reconocerán que se trata de una lista ilustrativa, pero no exhaustiva, de sustancias con actividad tensioactiva. Puede utilizarse cualquier entidad anfifílica en la producción de nanoportadores sintéticos que se han de utilizar de acuerdo con la presente invención.

En algunas modalidades, los nanoportadores sintéticos pueden comprender opcionalmente uno o más carbohidratos. Los carbohidratos pueden ser naturales o sintéticos. Un carbohidrato puede ser un carbohidrato natural derivatizado. En ciertas modalidades, un carbohidrato comprende un monosacárido o disacárido, incluidos, sin carácter limitante, glucosa, fructosa, galactosa, ribosa, lactosa, sacarosa, maltosa, trehalosa, celbiosa, mañosa, xilosa, arabinosa, ácido glucurónico, ácido galacturónico, ácido manurónico, glucosamina, galatosamina y ácido neurámico. En ciertas modalidades, un carbohidrato es un poiisacárido, incluidos, sin carácter limitante, pululano, celulosa, celulosa microcristalina, hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), hidroxicelulosa (HC), metilcelulosa (MC), dextrano, ciclodextrano, glicógeno, hidroxietilalmidón, carragenina, glicón, amilosa, quitosano, N,0-carboxilmetilquitosano, algina y ácido algínico, almidón, quitina, inulina, konjac, glucomanán, pustulán, heparina, ácido hialurónico, curdlano y xantano. En las modalidades, los nanoportadores sintéticos no comprenden (o excluyen específicamente) carbohidratos, como un poiisacárido. En ciertas modalidades, el carbohidrato puede comprender un derivado de carbohidratos, tal como un alcohol de azúcar, incluido, a modo no taxativo, manitol, sorbitol, xilitol, eritritol, maltitol y lactitol.

Las composiciones para su uso en los métodos de acuerdo con la invención comprenden los nanoportadores sintéticos en combinación con excipientes farmacéuticamente aceptables, como conservantes, tampones, soluciones salinas o solución salina tamponada con fosfato. Las composiciones se pueden preparar utilizando técnicas farmacéuticas convencionales de elaboración y formulación para obtener formas farmacéuticas útiles. En una modalidad, los nanoportadores sintéticos se suspenden en solución salina estéril para inyección junto con un conservante.

En las modalidades, cuando se preparan nanoportadores sintéticos como portadores para su uso en vacunas, los métodos para acoplar los componentes a los nanoportadores sintéticos pueden ser útiles. Si el componente es una molécula de bajo peso molecular, puede resultar beneficioso unir el componente a un polímero antes de acoplar los nanoportadores sintéticos. En las modalidades, también puede resultar beneficioso preparar los nanoportadores sintéticos con grupos superficiales - . --que se emplean para acoplar el componente al nanoportador sintético mediante el uso de estos grupos superficiales en lugar de unir el componente a un polímero y después emplear esté conjugado polimérico en la construcción de los nanoportadores sintéticos.

En ciertas modalidades, el acoplamiento puede ser un conector covalente. En las modalidades, los componentes de acuerdo con la invención pueden acoplarse mediante enlace covalente a la superficie externa mediante un conector de 1 ,2,3-triazol formado por la reacción de cicloadición 1 ,3-dipolar de los grupos azido sobre la superficie del nanoportador con el componente que contiene un grupo alquino o mediante la reacción de cicloadición 1 ,3- dipolar de alquinos sobre la superficie del nanoportador con componentes que contienen un grupo azido. Estas reacciones de cicloadición se llevan a cabo preferentemente en presencia de un catalizador de Cu(l) junto con un ligando de Cu(l) adecuado y un agente reductor para reducir el compuesto de Cu(ll) al compuesto de Cu(l) catalíticamente activo. Esta cicloadición de azida-alquino catalizada por Cu(l) (CuAAC) también se puede denominar reacción "click".

Además, el acoplamiento covalente puede comprender un conector covalente que comprende un conector de tipo amida, un conector de tipo disulfuro, un conector de tipo tioéter, un conector de tipo hidrazona, un conector de tipo hidrazida, un conector de tipo imina u oxima, un conector de tipo urea o tiourea, un conector de tipo amidina, un conector de tipo amina y un conector de tipo sulfonamida.

Un conector de tipo amida se forma mediante un enlace de tipo amida entre una amina en un componente y el grupo ácido carboxílico de un segundo componente, tal como el nanoportador. El enlace amida en el enlace puede realizarse mediante el uso de cualquiera de las reacciones que forman enlaces amida convencionales con aminoácidos o antígenos o adyuvantes protegidos de forma adecuada y ácido carboxílico activado como éster activado por N-hidroxisuccinimida.

Un conector de tipo disulfuro se obtiene mediante la formación de un enlace de tipo disulfuro (S-S) entre dos átomos de azufre con la forma, por ejemplo, de R1-S-S-R2. El enlace de disulfuro puede formarse mediante el intercambio de tiol de un antigeno o adyuvante que contiene un grupo tiol/mercaptano (-SH) con otro grupo tiol activado sobre un polímero o nanoportador o un nanoportador que contiene grupos tiol/mercaptano con un componente que contiene un grupo tiol activado.

El conector de triazol, específicamente un 1 ,2,3-triazol de la , donde R1 y R2 pueden ser cualquier entidad química, se forma mediante la reacción de cicloadición 1 ,3-dipolar de una azida unida a un primer componente como el nanoportador con un alquino terminal unido a un segundo componente. La reacción de cicloadición 1 ,3-dipolar se lleva a cabo con o sin un catalizador, preferentemente con un catalizador de Cu(l), que une los dos componentes a través de una función de tipo 1 ,2,3-triazdL Este tipo de química se describe detalladamente en Sharpless et al., Angew. Chem. Int. Ed. 41 (14), 2596, (2002) y Meldal et al., Chem. Rev., 2008, 108(8), 2952-3015 y a menudo se denomina reacción "click" o CuAAC.

En las modalidades, se prepara un polímero que contiene un grupo azida o alquino terminal respecto a la cadena polimérica. A continuación, este polímero se utiliza para preparar un nanoportador sintético de manera tal que una pluralidad de los grupos alquino o azida se posicionen sobre la superficie de dicho nanoportador. Como alternativa, el nanoportador sintético se puede preparar mediante otra ruta y posteriormente se puede funcionalizar con grupos alquino o azida. El componente se prepara en presencia de un grupo alquino (si el polímero contiene una azida) o un grupo azida (si el polímero contiene un alquino). A continuación, se permite que el componente reaccione con el nanoportador mediante la reacción de cicloadición 1 ,3-dipolar con o sin un catalizador, de este modo el componente se acopla covalentemente a la partícula a través de un conector de tipo 1 ,2,3-triazol 1 ,4- disustituido.

Un conector de tipo tioéter se obtiene mediante la formación de un enlace de tipo azufre-carbono (tioéter) con la forma, por ejemplo, de R1-S-R2. El tioéter puede prepararse mediante alquilación de un grupo tiol/mercaptano (-SH) en un componente con un grupo de alquilación como haluro o epóxido en un segundo componente como el nanoportador. Los conectores de tipo tioéter también se pueden formar mediante la adición de Michael de un grupo tiol/mercaptano en un componente a un grupo alqueno electrodeficiente en un segundo componente, tal como un polímero que contiene un grupo maleimida o un grupo vinilsulfona como aceptor de Michael. De otro modo, los conectores de tipo tioéter se pueden preparar mediante la reacción radicalaria tiol-eno de un grupo tiol/mercaptano en un componente con un grupo alqueno en un segundo componente, tal como un polímero o nanoportador.

Un conector de tipo hidrazona se obtiene mediante la reacción de un grupo hidrazida en un componente con un grupo aldehido/cetona en el segundo componente tal como el nanoportador.

Un conector de tipo hidrazida se forma mediante la reacción de un grupo hidrazina en un componente con un grupo ácido carboxilico en el segundo componente, tal como el nanoportador. Esta reacción se lleva a cabo generalmente utilizando una química similar a la de la formación del enlace de tipo amida, donde el ácido carboxilico se activa con un reactivo activante.

Un conector de tipo imina u oxima se forma mediante la reacción de un grupo amina o /V-alcoxiamina (o aminoxi) en un componente con un grupo aldehido o cetona en el segundo componente, tal como el nanoportador.

Un conector de tipo urea o tiourea se prepara mediante la reacción de un grupo amina en un componente con un grupo isocianato o tioisocianato en el segundo componente, tal como el nanoportador.

Un conector de tipo amidina se prepara mediante la reacción de un grupo amina en un componente con un grupo imidoéster en el segundo componente, tal como el nanoportador.

Un conector de tipo amina se obtiene mediante la reacción de alquilación de un grupo amina en un componente con un grupo alquilante, tal como un grupo haluro, epóxido o sulfonato, en el segundo componente, tal como el nanoportador. Como alternativa, un conector de tipo amina también se puede obtener mediante la aminación reductiva de un grupo amina en un componente con un grupo aldehido o cetona en el segundo componente, tal como el nanoportador, empleando un reactivo reductor adecuado, tal como cianoborohidruro de sodio o triacetoxiborohidruro de sodio.

Un conector de tipo sulfonamida se obtiene mediante la reacción de un grupo amina en un componente con un grupo haluro de sulfonilo (tal como cloruro de sulfonilo) en el segundo componente, tal como el nanoportador.

El conector de sulfona se prepara mediante adición de Michael de un nucleófilo a una vinil sulfona. La sulfona vinílica o el nucleófilo pueden estar sobre la superficie del nanoportador o unidos a un componente.

El componente también se puede conjugar con el nanoportador mediante métodos de conjugación no covalente. Por ejemplo, un componente con carga negativa puede conjugarse en un nanoportador con carga positiva a través de adsorción electroestática. También se puede conjugar un componente que contenga un ligando de metales a un nanoportador que contenga un complejo metálico mediante un complejo metal-ligando.

En las modalidades, el componente se puede unir un polímero, por ejemplo, ácido poliláctico-bloque-polietilenglicol, antes de acoplar el nanoportador sintético, o se puede formar el nanoportador sintético con grupos reactivos o activables sobre su superficie. En el último caso, el componente se puede preparar con un grupo que sea compatible con la química de enlace presentada por la superficie del nanoportador sintético. En otras modalidades, el componente puede unirse a VLP o liposomas mediante el uso de un conector adecuado. Un conector es un compuesto o reactivo capaz de acoplar dos moléculas entre si. En una modalidad, el enlace puede ser un reactivo homobifuncional u heterobifuncional como se describe en Hermanson 2008. Por ejemplo, un nanoportador sintético de liposomas o VLP que contenga un grupo carboxilico sobre la superficie se puede tratar con un conector homobifuncional, dihidrazida adipica (ADH, pos sus siglas en inglés), en presencia de EDC para formar el nanoportador sintético correspondiente con el conector ADH. El nanoportador sintético resultante unido al ADH a continuación se conjuga con un componente que contiene un grupo ácido a través del otro extremo del conector de ADH sobre NC para producir el correspondiente conjugado peptidico de VLP o liposoma.

Por descripciones detalladas de métodos de conjugación disponibles, ver Hermanson G T "Bioconjugate Techniques", 2da edición, publicada por Academic Press, Inc., 2008. Además del enlace covalente, el componente puede acoplarse mediante adsorción a un nanoportador sintético preformado o puede acoplase mediante encapsulación durante la formación del nanoportador sintético.

En algunas modalidades, puede aislarse un componente, tal como un antígeno o adyuvante. El término "aislado" se refiere a la separación del elemento de su entorno nativo y su presencia en cantidades suficientes para permitir su identificación o uso. Esto significa, por ejemplo, que el elemento se puede (i) producir selectivamente por clonación de expresión o (ii) purificar, por ejemplo, por cromatografía o electroforesis. Los elementos aislados pueden ser, aunque no necesariamente, sustancialmente puros. Dado que un elemento aislado se puede mezclar con un excipiente farmacéuticamente aceptable en un preparado farmacéutico, puede que el elemento constituya únicamente un pequeño porcentaje en peso del preparado. No obstante, el elemento está aislado porque se ha separado de las sustancias con las cuales puede estar asociado en sistemas vivos, es decir, se ha separado de otras proteínas o lipidos. Cualquiera de los elementos proporcionados en la presente puede estar aislado. Cualquiera de los antigenos proporcionados en la presente se puede incluir en las composiciones en forma aislada.

D. Métodos para el uso y la preparación de composiciones de nanoportadores sintéticos Los nanoportadores sintéticos se pueden preparar empleando una amplia variedad de métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los nanoportadores sintéticos se pueden formar mediante métodos tales como nanoprecipitación, flujo focalizado utilizando canales fluídicos, deshidratación por aspersión, evaporación de disolvente de emulsión simple o doble, extracción de disolvente, separación de fases, molienda, procedimientos de microemulsión, microfabricación, nanofabricación, capas sacrificiales, coacervación simple y compleja, y otros métodos con los que estarán familiarizados los expertos en la técnica. Como alternativa o además, se han descrito síntesis en disolventes acuosos y orgánicos para nanomateriales semiconductores monodispersos, conductores, magnéticos, orgánicos y de otros tipos (Pellegrino et al., 2005, Small, 1 :48; Murray et al., 2000, Ann. Rev. Mat. Sci., 30:545; y Trindade et al., 2001 , Chem. Mal , 13:3843). En la bibliografía se han descrito métodos adicionales (remítase, p. ej., a Doubrow, Ed., "Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy", CRC Press, Boca Ratón, 1992; Mathiowitz et al., 1987, J. Control. Reléase, 5:13; Mathiowitz et al. , 1987, Reactive Polymers, 6:275; y Mathiowitz et al. , 1988, J. Appl. Polymer Sci., 35:755; Patentes de EE. UU. 5578325 y 6007845); P. Paolicelli et al., "Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that can Efficiently Associate and Deliver Virus-like Particles" Nanomedicine. 5(6):843-853 (2010)).

Se pueden encapsular diferentes materiales en nanoportadores sintéticos, según sea deseable, utilizando diversos métodos, que incluyen, sin carácter limitante, C. Astete et al., "Synthesis and characterization of PLGA nanoparticles" J. Biomater. Sci. Polymer Edn, Vol. 17, N.° 3, págs. 247-289 (2006); K. Avgoustakis "Pegylated Poly(Lactide) and Poly(Lactide-Co-Glycolide) Nanoparticles: Preparation, Properties and Possible Applications in Drug Delivery" Curren! Drug Delivery 1 :321-333 (2004); C. Reis et al., "Nanoencapsulation I. Methods for preparation of drug-loaded polymeric nanoparticles" Nanomedicine 2:8- 21 (2006); P. Paolicelli et al., "Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that can Efficiently Associate and Deliver Virus-like Particles" Nanomedicine. 5(6):843-853 (2010). Pueden utilizarse otros métodos adecuados para encapsular materiales en nanoportadores sintéticos, que incluyen, sin carácter limitante, los métodos descritos en la Patente de EE. UU. 6,632,671 concedida a Unger el 14 de octubre de 2003.

En ciertas modalidades, los nanoportadores sintéticos se preparan mediante un proceso de nanoprecipitación o deshidratación por aspersión. Las condiciones utilizadas en la preparación de los nanoportadores sintéticos se pueden modificar para proporcionar partículas que tengan un tamaño o una propiedad deseada (p. ej., hidrofobicidad, hidrofilicidad, morfología externa, "adhesividad", forma, etc.). El método de preparación de los nanoportadores sintéticos y las condiciones (p. ej., disolvente, temperatura, concentración, tasa de flujo de aire, etc.) utilizadas pueden depender de los materiales que se deseen acoplar a los nanoportadores sintéticos y/o la composición de la matriz polimérica.

Si las partículas preparadas por cualquiera de los métodos anteriores presentan un rango de tamaños fuera del rango deseado, se le puede dar a las partículas un tamaño adecuado, por ejemplo, utilizando un tamiz.

Los elementos de los nanoportadores sintéticos pueden acoplarse al nanoportador sintético global, por ejemplo, mediante uno o más enlaces covalentes, o pueden acoplarse por medio de uno o más conectores. Otros métodos de funcionalización de nanoportadores sintéticos pueden adaptarse a partir de la Solicitud de Patente de EE. UU. Publicada 2006/0002852 concedida a Saltzman et al., la Solicitud de Patente de EE. UU. Publicada 2009/0028910 concedida a DeSimone et al. o la Solicitud de Patente Internacional Publicada WO/2008/127532 A1 concedida a Murthy et al.

De forma alternativa o adicional, los nanoportadores sintéticos pueden acoplarse a los elementos directamente o indirectamente mediante interacciones no covalentes. En las modalidades no covalentes, el acoplamiento no covalente está mediado por interacciones no covalentes que incluyen, sin carácter limitante, interacciones de cargas, interacciones de afinidad, coordinación de metales, adsorción física, interacciones de receptor-sustrato, interacciones hidrófobas, interacciones aromáticas, interacciones de puente de hidrógeno, interacciones de van der Waals, interacciones magnéticas, interacciones electrostáticas, interacciones dipolo-dipolo y/o combinaciones de estas. Tales acoplamientos pueden disponerse para encontrarse sobre una superficie externa o superficie interna de un nanoportador sintético. En las modalidades, la encapsulación y/o absorción es una forma de acoplamiento.

En las modalidades, los nanoportadores sintéticos pueden combinarse con adyuvantes mediante la mezcla en el mismo vehículo o sistema de administración. Tales adyuvantes pueden incluir, a modo no taxativo, sales minerales, como alumbre, alumbre combinado con monofosforil lípido (MPL) A de Enterobacteria, corrió Escherichia coli, Salmonella minnesota, Salmonella typhimurium, o Shigella flexneri o específicamente con MPL® (AS04), MPL A de las bacterias mencionadas anteriormente separadamente, saponinas, como QS-21 ,Quil-A, ISCOM, ISCOMATRIX®, emulsiones como MF59®, Montanide® ISA 51 e ISA 720, AS02 (QS21+escualeno+ MPL®), liposomas y formulaciones liposomales como AS01 , mícropartículas y microportadores sintetizados o preparados específicamente como vesículas fuera de la membrana (OMV) derivadas de bacterias de N. gonorrheae, Chlamydia trachomatis y otras, o partículas de quitosano, agentes formadores de depósitos, como copolímeros de bloque Pluronic®, péptidos modificados o preparados específicamente, como dipéptído de muramilo, 4-fosfatos de aminoalquil glucosaminida, como RC529, o proteínas como toxoídes bacterianos o fragmentos de toxina. Las dosis de tales otros adyuvantes pueden determinarse mediante el uso de estudios de graduación de dosis convencionales.

En las modalidades, los nanoportadores sintéticos pueden combinarse con un antígeno diferente, similar o idéntico a los acoplados a un nanoportador (con o sin adyuvante, mediante el uso o no de otro vehículo de administración) administrado separadamente en un intervalo de tiempo diferente y/o en una ubicación del cuerpo diferente y/o mediante una vía de inmunización diferente o con otro antígeno y/o nanoportador sintético que tiene un adyuvante administrado separadamente en un intervalo de tiempo diferente y/o en una ubicación del cuerpo diferente y/o mediante una vía de inmunización diferente.

Las poblaciones de nanoportadores sintéticos se pueden combinar para obtener formas farmacéuticas de acuerdo con la presente invención empleando métodos de mezcla farmacéuticos tradicionales. Estos incluyen la mezcla líquido-líquido en la cual dos o más suspensiones, donde cada una de ellas contiene uno o más subconjuntos de nanoportadores, se combinan directamente o se juntan por medio de uno o más recipientes que contienen diluyente. Dado que los nanoportadores sintéticos también se pueden producir o almacenar en forma de polvo, se podría realizar una mezcla polvo-polvo en seco al igual que una resuspensión de dos o más polvos en un medio común. Dependiendo de las propiedades de los nanoportadores y sus potenciales de interacción, se pueden conferir ventajas a una u otra ruta de mezcla.

Las composiciones típicas que comprenden nanoportadores sintéticos pueden comprender tampones orgánicos o inorgánicos (por ejemplo, sales de sodio o potasio de fosfato, carbonato, acetato o citrato) y agentes de ajuste de pH (por ejemplo, ácido clorhídrico, hidróxido de sodio o potasio, sales de citrato o acetato, aminoácidos y sus sales) antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, alfa-tocoferol), tensioactivos (por ejemplo, polisorbato 20, polisorbato 80, polioxietilen9-10 nonil fenol, desoxicolato de sodio), estabilizadores de solución y/o crio/lio estabilizadores (por ejemplo, sucrosa, lactosa, manitol, trehalosa), agentes de ajuste osmótico (por ejemplo, sales o azúcares), agentes antibacterianos (por ejemplo, ácido benzoico, fenol, gentamicina), agentes antiespumantes (por ejemplo, polidimetilsilozona), conservantes (por ejemplo, timerosal, 2-fenoxietanol, EDTA), estabilizadores poliméricos y agentes de ajuste de la viscosidad (por ejemplo, polivinilpirrolidona, poloxámero 488, carboximetilcelulosa) y cosolventes (por ejemplo, glicerol, polietilenglicol, etanol).

Las composiciones de acuerdo con la invención comprenden nanoportadores sintéticos en combinación con excipientes farmacéuticamente aceptables. Las composiciones se pueden preparar utilizando técnicas farmacéuticas convencionales de elaboración y formulación para obtener formas farmacéuticas útiles. Las técnicas adecuadas para su uso en la práctica de la presente invención pueden encontrarse en el Handbook of Industrial Mixing: Science and Practice, editado por Edward L. Paul, Víctor A. Atiemo-Obeng y Suzanne M. Kresta, 2004 John Wiley & Sons, Inc.; y Pharmaceutics: The Science of Dosage Form Design, 2da edición, editado por M. E. Auten, 2001 , Churchill Livingstone. En una modalidad, los nanoportadores sintéticos se suspenden en solución salina estéril para la inyección junto con un conservante.

Debe entenderse que las composiciones de nanoportadores sintéticos pueden prepararse en cualquier forma adecuada y la invención no se limita en ninguna forma al uso de las composiciones que pueden producirse mediante el uso de los métodos descritos en la presente. La selección de un método adecuado puede requerir la atención a las propiedades de los elementos particulares que se están asociando.

En algunas modalidades, los nanoportadores sintéticos de la invención se fabrican en condiciones estériles o se esterilizan en fase terminal. Esto puede garantizar que la composición resultante sea estéril y no infecciosa, de este modo se mejora la seguridad en comparación con las composiciones no estériles. Esto proporciona una medida de seguridad valiosa, especialmente cuando los sujetos que reciben los nanoportadores sintéticos presentan defectos inmunitarios, padecen una infección y/o son propensos a padecer una infección. En algunas modalidades, los nanoportadores sintéticos pueden liofilizarse y almacenarse en suspensión o como un polvo liofilizado en función de la estrategia de formulación para periodos extendidos de tiempo sin perder actividad.

Las composiciones de la invención se pueden administrar por varias vías, incluidas, sin carácter limitante, la vía subcutánea, intranasal, oral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, transmucosal, transmucosal, sublingual, rectal, oftálmica, pulmonar, intradérmica, transdérmica, transcutánea o intradérmica, o mediante una combinación de estas vías. Las vías de administración también incluyen la administración por inhalación o aerosol pulmonar. Las técnicas para preparar sistemas de administración en aerosol son bien conocidas por los expertos en la técnica (ver, por ejemplo, Sciarra y Cutie, "Aerosols," en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18va edición, 1990, páginas 1694-1712; incorporada a modo de referencia).

Las dosis de las formas de dosificación contienen cantidades variables de poblaciones de nanoportadores sintéticos y cantidades variables de proteínas y/o adyuvantes y/o antígenos adicionales de acuerdo con la invención. La cantidad de nanoportadores sintéticos y/o proteínas y/o adyuvantes y/o antígenos adicionales presentes en las formas de dosificación puede ser variada de acuerdo con la naturaleza de los elementos presentes, el beneficio terapéutico que se pretende lograr y otros parámetros similares. En las modalidades pueden realizarse estudios de intervalos de dosis para establecer la cantidad terapéutica óptima de la población de nanoportadores sintéticos y la cantidad de proteínas y/o adyuvantes y/o antígenos adicionales que deben estar presentes en la forma de dosificación. En las modalidades, los nanoportadores sintéticos y las proteínas y/o adyuvantes y/o antígenos adicionales se encuentran presentes en la forma de dosificación en una cantidad eficaz para generar una respuesta inmunitaria a las proteínas y/o antígenos adicionales tras la administración a un sujeto. Es posible determinar las cantidades eficaces para generar una respuesta inmunitaria mediante el uso de estudios de intervalos de dosis y técnicas convencionales en sujetos. Las formas de dosificación pueden administrarse en una variedad de frecuencias. En una modalidad preferida, al menos una administración de la forma de dosificación es suficiente para generar una respuesta farmacológicamente relevante. En una modalidad más preferida, al menos dos administraciones, al menos tres administraciones o al menos cuatro administraciones de la forma de dosificación se utilizan para asegurar una respuesta farmacológicamente relevante.

Las composiciones y métodos descritos en la presente pueden utilizarse para inducir, mejorar, suprimir, modular, dirigir o redirigir una respuesta inmunitaria. Las composiciones y métodos descritos en la presente pueden utilizarse en el diagnóstico, profilaxis y/o tratamiento de afecciones como el cáncer, enfermedades infecciosas, enfermedades metabólicas, enfermedades degenerativas, enfermedades no autoinmunes, VIH, malaria, hepatitis B o cualquiera de los demás trastornos y/o afecciones proporcionados en la presente.

Los ejemplos de enfermedades infecciosas incluyen, a modo no taxativo, enfermedades infecciosas virales, como SIDA, varicela, resfrio común, infección por citomegalovirus, fiebre por garrapatas de Colorado, fiebre por dengue, fiebre hemorrágica por el virus de ébola, fiebre aftosa, hepatitis, herpes simple, herpes zóster, virus del papiloma humano (VPH), influenza (gripe), fiebre de Lassa, sarampión, fiebre hemorrágica de Marburgo, mononucleosis infecciosa, paperas, norovirus, poliomielitis, leucoencefalopatía multifocal progresiva, rabia, rubéola, síndrome respiratorio agudo severo (SARS), viruela, encefalitis viral, gastroenteritis viral, meningitis viral, neumonía viral, enfermedad del Nilo occidental y fiebre amarilla; enfermedades infecciosas bacterianas, como ántrax, meningitis bacteriana, botulismo, brucelosis, campilobacteriosis, enfermedad por arañazo de gato, cólera, difteria, tifus epidémico, gonorrea, impétigo, legionelosis, lepra (enfermedad de Hansen), leptoespirosis, listeriosis, enfermedad de Lyme, melioidosis, fiebre reumática, infección por Safilococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA), nocardiosis, Pertussis (tos fariña), plaga, neumonía neumocócica, psitacosis, fiebre Q, fiebre maculosa de las montañas rocosas (RMSF), salmonelosís, fiebre escarlata, shigelosis, sífilis, tétano, tracoma, tuberculosis, tularemia, fiebre tifoidea, tifus e infecciones del tracto urinario; enfermedades infecciosas parasíticas, tales como tripanosomiasis africana, amebiasis, Ascariasis, babesiasis, enfermedad de Chagas, clonorquiasis, criptosporidiosis, cisticercosis, difilobotriasis, dracunculiasis, equinococosis, enterobiasis, fascioliasis, fasciolopsiasis, filariasis, infección por amebas de vida libre, giardiasis, gnatostomiasis, himenolepiasis, isoesporiasis, Kala-azar, leishmaniasis, malaria, metagonimiasis, miasis, oncocercíasis, pediculosis, infección por oxiuros, sarna, esquistosomiasis, teniasis, toxocariasis, toxoplasmosis, triquinelosis, triquinosis, trichuríasis, tricomoniasis y tripanosomiasis; enfermedad infecciosa fúngica, como aspergilosís, blastomicosis, candidiasis, coccidioidomicosis, Criptococosis, histoplasmosis, tinea pedís (pie de atleta) y tinea cruris; enfermedades infecciosas por priones, como enfermedad de Alper, insomnio fatal familiar, síndrome de Gerstmann-Stráussler-Scheinker, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob y la variante Kuru.

Los ejemplos de cánceres incluyen, a modo no taxativo, cáncer de mama; cáncer del tracto biliar; cáncer de vejiga; cáncer cerebral incluidos los glioblastomas y meduloblastomas; cáncer cervical; coriocarcinoma; cáncer de colon; cáncer de endometrio; cáncer esofágico; cáncer gástrico; neoplasmas hematológicos que incluyen leucemia linfocítica y mielógena aguda, por ejemplo, leucemia linfocítica crónica de linfocitos B; leucemia/linfoma linfoblástico agudo de linfocitos T; leucemia de células pilosas; leucemia mielógena crónica, mieloma múltiple; leucemias asociadas con el SIDA y leucemia/linfoma de linfocitos T adultos; neoplasmas intraepiteliales que incluyen enfermedad de Bowen y enfermedad de Paget; cáncer de hígado; cáncer de pulmón; linfomas que incluyen enfermedad de Hodgkin y linfomas linfocíticos; neuroblastomas; cáncer oral que incluye carcinoma de células escamosas; cáncer de ovarios que incluye los que surgen de las células epiteliales, células estromales, células germinativas y células mesenquimales; cáncer pancreático; cáncer de próstata; cáncer rectal; sarcomas que incluyen leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, liposarcoma, fibrosarcoma y osteosarcoma; cáncer de piel que incluye melanoma, carcinoma de células de Merkel, sarcoma de Kaposi, carcinoma de células básales y cáncer de células escamosas; cáncer testicular que incluye tumores germinales como seminoma, no seminoma (teratomas, coriocarcinomas), tumores estromales y tumores de células germinativas; cáncer de tiroides que incluye adenocarcinoma de tiroides y carcinoma medular; y cáncer renal que incluye adenocarcinoma y tumor de Wilms.

Ejemplos de enfermedades metabólicas incluyen, a modo no taxativo, trastornos del metabolismo de los carbohidratos, metabolismo de los aminoácidos, metabolismo de los ácidos orgánicos, metabolismo de la oxidación de los ácidos grasos y mitocondrial, metabolismo de profirina, purina o pirimidina, metabolismo esteroideo, función mitocondrial lisosomal, función peroxisomal, almacenamiento lisosomal, trastornos del ciclo de la urea (por ejemplo, deficiencia de N-acetil glutamato sintetasa, deficiencia de carbamilfosfato sintasa, deficiencia de ornitina carbamil 'transferasa, arciduria arginosuccinica, citrulinemia, deficiencia de arginasa), trastornos de los aminoácidos (por ejemplo, hiperglicinemia no cetósica, tirosinemia (tipo I), enfermedad de la orina con olor a jarabe de arce), acidemias orgánicas (por ejemplo, acidemia isovalérica, acidemia metilmalónica, acidemia propiónica, aciduria glutárica tipo I, aciduria glutárica tipo I y II), trastornos mitocondriales (por ejemplo, defectos de carboxilasa, miopatías mitocondriales, acidosis láctica (defectos del complejo de piruvato deshidrogenasa), acidosis láctica congénita, defectos de la cadena respiratoria mitocondrial, cistinosis, enfermedad de Gaucher, enfermedad de Fabry, enfermedad de Pompe, mucopolisacaroidosis I, mucopolisacaroidosis II, mucopolisacaroidosis VI).

Ejemplos de enfermedades degenerativas incluyen, a modo no taxativo, enfermedad degenerativa del mesénquima/mesodermo, enfermedad degenerativa muscular, enfermedad degenerativa endotelial, enfermedad neurodegenerativa, enfermedad degenerativa de las articulaciones (por ejemplo, osteoartritis), tipos principales de enfermedad degenerativa cardíaca (por ejemplo, enfermedad cardíaca coronaria, enfermedad cardíaca congénita, enfermedad cardíaca reumática, angina pectoris), enfermedad neurodegenerativa (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica, ataxia de Friedreich, enfermedad de Huntington, enfermedad de cuerpos de Lewy, enfermedad de Parkinson, atrofia muscular espinal), trastornos neuromusculares (por ejemplo, distrofia muscular, distrofia muscular de Duchenne, distrofia muscular facioescapulohumeral, distrofia muscular miotónica, miopatia congénita, cardiomiopatía familiar, cardiomiopatía dilatada, cardiomiopatía hipertrófica, cardiomiopatía restrictiva o enfermedad de las arterias coronarias).

Las proteínas para acoplarse a los nanoportadores sintéticos y/o a los antígenos adicionales proporcionados en la presente pueden ser antígenos asociados con cualquiera de las enfermedades o afecciones proporcionadas en la presente. Estos incluyen antigenos relacionados con el cáncer, infecciones o enfermedad infecciosa o degenerativa o enfermedad no autoinmune. También se incluyen los antígenos asociados con el VIH, malaria, leishmaniasis, infección por filovirus humano, infección por togavirus, infección por alfavirus, infección por arenavirus, infección por bunyavirus, infección por flavivirus, infección por el virus del papiloma humano, infección por virus de influenza A humano, infección por hepatitis B o infección por hepatitis C.

Ejemplos de antigenos de cáncer incluyen HER 2 (p185), CD20, CD33, gangliósido GD3, gangliósido GD2, antigeno carcinoembriónico (CEA), CD22, proteina nuclear tipo mucina de la leche, TAG-72, antígeno A de Lewis, antígenos asociados a los ovarios como OV-TL3 y Ov18, antigenos de melanoma de alto contenido Mr reconocidos por el anticuerpo 9 2.27, HMFG-2, SM-3, B72.3, PR5C5, PR4D2 y similares. Otros ejemplos incluyen MAGE, MART-1/Melan-A, gp100, dipeptidil peptidasa IV (DPPIV), proteína de unión a adenosina deaminasa (ADAbp), FAP, ciclofilina b, antigeno colorrectal (CRC)--C017-1A/GA733, antígeno carcinoembriónico (CEA) y sus epítopos inmunogénicos CAP-1 y CAP-2, etv6, aml1 , fosfatasa ácida prostética (PAP), antígeno específico de la próstata (PSA) y sus epítopos inmunogénicos PSA-1 , PSA-2 y PSA-3, antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA), receptor de linfocitos T/cadena zeta CD3, familia MAGE de antigenos tumorales (por ejemplo, las familias MAGE-I o MAGE-II) (por ejemplo, MAGE-A1 , MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A1 1 , MAGE-A12, MAGE-Xp2 (MAGE-B2), MAGE-Xp3 (MAGE-B3), MAGE-Xp4 (MAGE-B4), MAGE-C1 , MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-C4, MAGE-C5), familia GAGE de antígenos tumorales (por ejemplo, GAGE-1 , GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, GAGE-9), BAGE, RAGE, LAGE-1 , NAG, GnT-V, MUM-1 , CDK4, tirosinasa, p53, familia MUC, HER2/neu, p21 ras, RCAS1 , a-fetoproteína, E-cadherina, a-catenina, ß-catenina y ?-catenina, p120ctn, gp100Pmel1 17, PRAME, NY-ESO-1 , cdc27, proteína coli de poliosis adenomatosa (APC), fodrina, conexina 37, idiotipo Ig, p15, gp75, gangliósidos GM2 y GD2, productos virales como proteínas del virus del papiloma humano, familia Smad de antigenos tumorales, lmp-1 , P1A, antígeno nuclear codificado por EBV (EBNA)-1 , glucógeno fosfo lasa cerebral, SSX-1, SSX-2 (HOM-MEL-40), SSX-1 , SSX-4, SSX-5, SCP-1 y CT-7, CD20 y c-erbB-2.

En otra modalidad, los antigenos asociados con infección o enfermedad infecciosa se asocian con cualquiera de los agentes infecciosos proporcionados en la presente. En una modalidad, el agente infeccioso es un virus de la familia Adenoviridae, Picornaviridae, Herpesviridae, Hepadnaviridae, Flaviviridae, Retroviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Papillomaviridae, Rhabdoviridae, Togaviridae o Paroviridae. En otra modalidad, el agente infeccioso es adenovirus, virus de Coxsackie, virus de hepatitis A, poliovirus, rinovirus, virus del herpes simple, virus varicela-zóster, virus de Epstein-Barr, citomegalovirus humano, virus del herpes humano, virus de hepatitis B, virus de hepatitis C, virus de la fiebre amarilla, virus del dengue, virus del Nilo occidental, HIV, virus de influenza, virus del sarampión, virus de paperas, virus de la parainfluenza, virus sincitial respiratorio, metaneumovirus humano, virus del papiloma humano, virus de la rabia, virus de la rubéola, bocavirus o parvovirus humano B19. En otra modalidad, el agente infeccioso es una bacteria del género Bordetella, Borrelia, Brucella, Campylobacter, Chlamydia y Chlamydophila, Clostridium, Corynebacterium, Enterococcus, Escherichia, Francisella, Haemophilus, Helicobacter, Legionella, Leptospira, Listeria, Mycobacterium, Mycoplasma, Neisseria, Pseudomonas, Rickettsia, Salmonella, Shigella, Staphylococcus, Streptococcus, Treponema Vibrio o Yersinia. En una modalidad adicional, el agente infeccioso es Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Brucella abortus, Brucella canis, Brucella melitensis, Brucella suis, Campylobacter jejuni, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila psittaci, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Francisella tularensis, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Legionella pneumophila, Leptospira interrogans, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium ulcerans, Mycoplasma pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitides, Pseudomonas aeruginosa, Rickettsia rickettsii, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Treponema pallidum, Vibrio cholerae o Yersinia pestis. En otra modalidad, el agente infeccioso es un hongo del género Candida, Aspergillus, Cryptococcus, Histoplasma, Pneumocystis o Stachybotrys. En otra modalidad, el agente infeccioso es C. albicans, Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Cryptococcus neoformans, Cryptococcus laurentii, Cryptococcus albidus, Cryptococcus gattii, Histoplasma capsulatum, Pneumocystis jirovecii o Stachybotrys chartarum.

En otra modalidad, el antigeno asociado con infección o enfermedad infecciosa es uno que comprende VI, VII, E1A, E3-19K, 52K, VP1 , antigeno de superficie, proteína 3A, proteína de la cápside, nucleocápside, proyección superficial, proteínas transmembranales, UL6, UL18, UL35, UL38, UL19, antígeno prematuro, antígeno de la cápside, Pp65, gB, p52, antigeno nuclear latente-1 , NS3, proteína envolvente, dominio E2 de proteína envolvente, gp120, p24, lipopéptidos Gag (17-35), Gag (253-284), Nef (66-97), Nef (116-145), Pol (325-355), neuraminidasa, proteína de la nucleocápside, proteína de matriz, fosfoproteína, proteína de fusión, hemaglutinina, hemaglutinina-neuraminidasa, glicoproteína, E6, E7, lipoproteina envolvente o proteína no estructural (NS). En otra modalidad, el antígeno comprende la toxina Pertussis (PT), hemaglutinina filamentosa (FHA), pertactina (PRN), fimbrias (FIM 2/3), VlsE; DbpA, OspA, Hia, PrpA, MltA, L7/L12, D15, 0187, VirJ, Mdh, AfuA, L7/L12, proteína fuera de la membrana, LPS, antígeno tipo A, antigeno tipo B, antígeno tipo C, antígeno tipo D, antígeno tipo E, FliC, FliD, Cwp84, alfa-toxina, teta-toxina, fructosa 1 ,6-bifosfato-aldolasa (FBA), gliceraldehídos-3-fosfato deshidrogenasa (GPD), piruvato:ferredoxina oxidoreductasa (PFOR), factor de elongación-G (EF-G), proteína hipotética (HP), toxina T, antígeno toxoide, polisacárido capsular, proteína D, Mip, nucleoproteina (NP), RD1 , PE35, PPE68, EsxA, EsxB, RD9, EsxV, Hsp70, lipopolisacárido, antígeno de superficie, Sp1 , Sp2, Sp3, glicerofosfodiéster fosfodiesterasa, proteína fuera de la membrana, proteína chaperona-Usher, proteína capsular (F1) o proteína V. En otra modalidad, el antígeno es uno que comprende glicoproteína capsular, Yps3P, Hsp60, proteína principal de superficie, MsgC1 , sgC3, MsgC8, MsgC9 o SchS34.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Formulación de nanoportador sintético, lote No. 1 Materiales La proteina de ovoalbúmina se adquirió en Worthington Biochemical Corporation (730 Vassar Avenue, Lakewood, NJ 08701. Código de Producto 3048). Se sintetizó PLGA-R848 de aproximadamente 5,200 Da preparado a partir de PLGA de una relación 3:1 entre láctido y glicólido y con un contenido de R848 conjugado de 12.7% p/p. Se sintetizó PLA-PEG-Nicotina con un bloque de PEG terminado en nicotina de aproximadamente 5,000 Da y un bloque de DL-PLA de aproximadamente 19,000 Da. PLA con una viscosidad inherente de 0.21 dL/g se adquirió de SurModics Pharmaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211. Código de Producto 100 DL 2A). El alcohol polivinílico (PM = 1 1 000 - 31 000, hidrolizado en un 87-89%) se adquirió de J.T. Baker (Artículo Número U232-08).

Método Las soluciones se prepararon en la siguiente forma: Solución 1 : Proteína de ovoalbúmina a 20 mg/mL en tampón fosfato 10mM.

Solución 2: PLGA-R848 a 50 mg/mL, PLA-PEG-Nicotina a 25 mg/mL, PLA a 25 mg/ml en diclorometano. La solución se preparó mediante la disolución por separado de cada polímero como 100 mg/mL en diclorometano, después mediante la mezcla de las soluciones con la adición de 2 partes de una solución de PLGA-R848 por cada 1 parte de cada solución de PLA-PEG-Nicotina y solución de PLA.

Solución 3: Alcohol polivinílico con una concentración de 50 mg/mL en tampón de fosfato 100 mM, pH de 8.

Solución 4: Tampón de fosfato 70 mM, pH de 8.

En primer lugar, se creó una emulsión primaria (W1/0) empleando la Solución 1 y la Solución 2. La Solución 1 (0.2 mL) y la Solución 2 (1.0 mL) se combinaron en un tubo de vidrio pequeño resistente a la presión y se sometieron a ultrasonidos con una amplitud de un 50% durante 40 segundos empleando un sonicador digital 250 de Branson. A continuación se formó una emulsión secundaria (W1/0/W2) mediante la adición de la solución 3 (2.0 mL) a la emulsión primaria y después se sónico a un 30% de amplitud durante 40 segundos mediante el uso de un sonificador Branson Digital Sonifier 250. La emulsión secundaria se agregó a un vaso de precipitados de 50 mL abierto que contenía 70 mM de tampón de fosfato (30 mL) y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas para permitir que el diclorometano se evaporara y que los nanoportadores se formaran en suspensión. Una porción de los nanoportadores suspendidos se lavó mediante la transferencia de la suspensión de nanoportadores a un tubo de centrifuga, la centrifugación a 13,823g durante una hora, la extracción del sobrenadante y la resuspensión del sedimento en solución salina tamponada con fosfato. Este procedimiento de lavado se repitió y después el sedimento se volvió a suspender en solución salina tamponada con fosfato para lograr una suspensión de nanoportadores que tuviera una concentración nominal de 10 mg/mL en base a los polímeros. La suspensión se almacenó congelada a -20°C hasta su uso.

TABLA 1 Caracterización de nanovehiculo EJEMPLO 2 Formulación de nanoportador sintético, lote No. 2 Materiales La proteína de ovoalbúmina se adquirió en Worthington Biochemical Corporation (730 Vassar Avenue, Lakewood, NJ 08701. Código de Producto 3048). El péptido de ovoalbúmina 323-339 amida en forma de sal de tipo acetato se adquirió de Bachem Americas Inc. (3132 Kashiwa Street, Torrance CA 90505. Código del producto 4065609). Se sintetizó PLGA-R848 de aproximadamente 5,200 Da preparado a partir de PLGA de una relación 3:1 entre láctido y glicólido y con un contenido de R848 conjugado de 12.7% p/p. Se sintetizó PLA-PEG-Nicotina con un bloque de PEG acabado con nicotina de aproximadamente 5,000 Da y un bloque de DL-PLA de aproximadamente 19,000 Da. PLA con una viscosidad inherente de 0.21 dL/g se adquirió de SurModics Pharmaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211. Código de Producto 100 DL 2A). El alcohol polivinílico (PM = 1 1 000 - 31 000, hidrolizado en un 87-89%) se adquirió de J.T. Baker (Artículo Número U232-08).

Método Las soluciones se prepararon en la siguiente forma: Solución 1A: Proteína de ovoalbúmina a 40 mg/mL en tampón de fosfato 10mM.

Solución 1 B: Péptido de ovoalbúmina 323 - 339 amida a 40 mg/mL en solución acuosa de ácido clorhídrico diluido.

Solución 4: Tampón de fosfato 70 mM, pH de 8.

Se creó la primera emulsión primaria (W1/0) mediante el uso de la solución 1A y la solución 2. La solución 1A (0.2 mL) y la solución 2 (1.0 mL) se combinaron en un tubo de vidrio pequeño a presión y se sonicaron a un 50% de amplitud durante 40 segundos mediante el uso de un sonificador Branson Digital Sonifier 250. Se creó una segunda emulsión primaria (W1/0) mediante el uso de la solución 1 B y la solución 2. La solución 1 B (0.2 mL) y la solución 2 (1.0 mL) se combinaron en un tubo de vidrio pequeño a presión y se sonicaron a un 50% de amplitud durante 40 segundos mediante el uso de un sonificador Branson Digital Sonifier 250. Aproximadamente ½ de la segunda emulsión primaria se extrajo de su tubo a presión y se desechó y después 1/2 de la primera emulsión primaria (0.500 mL) se agregó al tubo para crear una mezcla 1 :1 de las dos emulsiones primarias en un volumen total de aproximadamente 1 mL. A continuación se formó una emulsión secundaria (W1/0/W2) mediante la adición de la solución 3 (2.0 mL) a la emulsión primaria y después se sónico a un 30% de amplitud durante 40 segundos mediante el uso de un sonificador Branson Digital Sonifier 250. La emulsión secundaria se agregó a un vaso de precipitados de 50 mL abierto que contenía 70 mM de tampón de fosfato (30 mL) y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas para permitir que el diclorometano se evaporara y que los nanoportadores se formaran en suspensión. Una porción de los nanoportadores suspendidos se lavó mediante la transferencia de la suspensión de nanoportadores a un tubo de centrífuga, la centrifugación a 13,823g durante una hora, la extracción del sobrenadante y la resuspensión del sedimento en solución salina tamponada con fosfato. Este procedimiento de lavado se repitió y después el sedimento se volvió a suspender en solución salina tamponada con fosfato para lograr una suspensión de nanoportadores que tuviera una concentración nominal de 10 mg/mL en base a los polímeros. La suspensión se almacenó congelada a -20°C hasta su uso.

TABLA 2 Caracterización de nanovehículo EJEMPLO 3 Formulación de nanoportador sintético, lote No. 3 Materiales La proteina de ovoalbúmina se adquirió en Worthington Biochemical Corporation (730 Vassar Avenue, Lakewood, NJ 08701. Código de Producto 3048). Se sintetizó PLGA-R848 de aproximadamente 5,200 Da preparado a partir de PLGA de una relación 3:1 entre láctido y glicólido y con un contenido de R848 conjugado de 12.7% p/p. Se sintetizó el copolímero de bloque de PLA-PEG-OMe con un bloque de PEG terminado en metil éter de 2,000 Da y un bloque de DL-PLA de aproximadamente 19,000 Da. PLA con una viscosidad inherente de 0.21 dUg se adquirió de SurModics Pharmaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 3521 1. Código de Producto 100 DL 2A). El alcohol polivinílico (PM = 1 1 000 - 31 000, hidrolizado en un 87-89%) se adquirió de J.T. Baker (Artículo Número U232-08).

Método Las soluciones se prepararon en la siguiente forma: Solución 1 : Proteína de ovoalbúmina a 20 mg/mL en tampón de fosfato 10mM.

Solución 2: PLGA-R848 a 50 mg/mL, PLA-PEG-OMe a 25 mg/mL, PLA a 25 mg/ml en diclorometano. La solución se preparó mediante la disolución por separado de cada polímero como 100 mg/mL en diclorometano, después mediante la mezcla de las soluciones con la adición de 2 partes de una solución de PLGA-R848 por cada 1 parte de cada solución de PLA-PEG-OMe y solución de PLA.

Solución 4: Tampón de fosfato 70 mM, pH de 8.

En primer lugar, se creó una emulsión primaria (W1/0) empleando la Solución 1 y la Solución 2. La Solución 1 (0.2 mL) y la Solución 2 (1.0 mL) se combinaron en un tubo de vidrio pequeño resistente a la presión y se sometieron a ultrasonidos con una amplitud de un 50% durante 40 segundos empleando un sonicador digital 250 de Branson. A continuación se formó una emulsión secundaria (W1/0/W2) mediante la adición de la solución 3 (2.0 ml_) a la emulsión primaria, y después se sónico a un 30% de amplitud durante 40 segundos mediante el uso de un sonificador Branson Digital Sonifier 250. La emulsión secundaria se agregó a un vaso de precipitados de 50 mL que contenía 70 mM de tampón de fosfato (30 ml_) y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas para permitir que el diclorometano se evaporara y que los nanoportadores se formaran en suspensión. Una porción de los nanoportadores suspendidos se lavó mediante la transferencia de la suspensión de nanoportadores a un tubo de centrífuga, la centrifugación a 13,823g durante una hora, la extracción del sobrenadante y la resuspensión del sedimento en solución salina tamponada con fosfato. Este procedimiento de lavado se repitió y después el sedimento se volvió a suspender en solución salina tamponada con fosfato para lograr una suspensión de nanoportadores que tuviera una concentración nominal de 10 mg/mL en base a los polímeros. La suspensión se almacenó congelada a -20°C hasta su uso.

TABLA 3 Caracterización de nanovehiculo EJEMPLO 4 Formulación de nanoportador sintético, lote No. 4 La proteina de ovoalbúmina se adquirió en Worthington Biochemical Corporation (730 Vassar Avenue, Lakewood, NJ 08701. Código de Producto 3048). El péptido de ovoalbúmina 323-339 amida en forma de sal de tipo acetato se adquirió de Bachem Americas Inc. (3132 Kashiwa Street, Torrance CA 90505. Código del producto 4065609). Se sintetizó PLGA-R848 de aproximadamente 5,200 Da preparado a partir de PLGA de una relación 3:1 entre láctido y glicólido y con un contenido de R848 conjugado de 12.7% p/p. Se sintetizó el copolímero de bloque de PLA-PEG-OMe con un bloque de PEG terminado en metil éter de 2,000 Da y un bloque DL-PLA de aproximadamente 19,000 Da. PLA con una viscosidad inherente de 0.21 dL/g se adquirió de SurModics Pharmaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211. Código de Producto 100 DL 2A). El alcohol polivinílico (PM = 11 000 - 31 000, hidrolizado en un 87-89%) se adquirió de J.T. Baker (Articulo Número U232-08).

Solución 4: Tampón de fosfato 70 mM, pH de 8.

Se creó la primera emulsión primaria (W1/0) mediante el uso de la solución 1A y la solución 2. La solución 1A (0.2 mL) y la solución 2 (1.0 mL) se combinaron en un tubo de vidrio pequeño a presión y se sonicaron a un 50% de amplitud durante 40 segundos mediante el uso de un sonificador Branson Digital Sonifier 250. Se creó una segunda emulsión primaria (W1/O) mediante el uso de la solución 1 B y la solución 2. La solución 1 B (0.2 mL) y la solución 2 (1.0 mL) se combinaron en un tubo de vidrio pequeño a presión y se sonicaron a un 50% de amplitud durante 40 segundos mediante el uso de un sonificador Branson Digital Sonifier 250. Las dos emulsiones primarias se combinaron, en parte, mediante la transferencia de 0.6 mL de cada una a un tercer tubo de vidrio a presión para crear una mezcla 1 :1 de las dos emulsiones primarias en un volumen total de aproximadamente 1.2 mL. A continuación se formó una emulsión secundaria (W1/O/W2) mediante la adición de la solución 3 (2.0 ml_) a la emulsión primaria, y después se sónico a un 30% de amplitud durante 40 segundos mediante el uso de un sonificador Branson Digital Sonifier 250. La emulsión secundaria se agregó a un vaso de precipitados de 50 mL abierto que contenía 70 mM de tampón de fosfato (30 mL) y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas para permitir que el diclorometano se evaporara y que los nanoportadores se formaran en suspensión. Una porción de los nanoportadores suspendidos se lavó mediante la transferencia de la suspensión de nanoportadores a un tubo de centrífuga, la centrifugación a 13,823g durante una hora, la extracción del sobrenadante y la resuspensión del sedimento en solución salina tamponada con fosfato. Este procedimiento de lavado se repitió y después el sedimento se volvió a suspender en solución salina tamponada con fosfato para lograr una suspensión de nanoportadores que tuviera una concentración nominal de 10 mg/mL en base a los polímeros. La suspensión se almacenó congelada a - 20°C hasta su uso.

TABLA 4 Caracterización de nanovehiculo EJEMPLO 5 Formulación de nanoportador sintético, lote No. 5 Materiales SIINFEKL (SEQ ID NO: 1) (péptido de ovoalbúmina [257 - 264]), se adquirió en Bachem Americas Inc. (3132 Kashiwa Street, Torrance CA 90505. Código de Producto H-4866). El péptido de ovoalbúmina 323-339 amida en forma de sal de tipo acetato se adquirió de Bachem Americas Inc. (3132 Kashiwa Street, Torrance CA 90505. Código del producto 4065609). Se sintetizó PLGA-R848 de aproximadamente 4,500 Da preparado a partir de PLGA de una relación 3:1 entre láctido y glicólido y con un contenido de R848 conjugado de 15% p/p. Se sintetizó PLA-PEG-Nicotina con un bloque de PEG terminado en nicotina de aproximadamente 5,000 Da y un bloque DL-PLA de aproximadamente 17,000 Da. PLA con una viscosidad inherente de 0.21 dL/g se adquirió de SurModics Pharmaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 3521 1. Código de Producto 100 DL 2A). El alcohol polivinílico (PM = 1 000 - 31 000, hidrolizado en un 87-89%) se adquirió de J.T. Baker (Articulo Número U232-08).

Método Las soluciones se prepararon en la siguiente forma: Solución 1A: SIINFEKL (SEQ ID NO:1) a 200 mg/mL DMSO Solución 1 B: Péptido de ovoalbúmina 323 - 339 amida mg/mL en solución acuosa de ácido clorhídrico diluido.

Solución 3: Alcohol polivinilico con una concentración de 50 mg/mL en tampón de fosfato 100 mM, pH de 8.

Solución 4: Tampón de fosfato 70 mM, pH de 8.

Se creó la primera emulsión primaria (S/O) mediante el uso de la solución 1A y la solución 2. La solución 1A (0.025 mL) y la solución 2 (1.0 mL) se combinaron en un tubo de vidrio pequeño a presión y se sonicaron a un 50% de amplitud durante 40 segundos mediante el uso de un sonificador Branson Digital Sonifier 250. Se creó una emulsión primaria en serie (W1/(S/0)) mediante el uso de la solución 1B y la primera emulsión primaria. La solución 1 B (0.25 mL) se agregó al tubo de vidrio pequeño a presión que contenía la primera emulsión primaria y después se sónico a un 50% de amplitud durante 40 segundos mediante el uso del sonificador Branson Digital Sonifier 250. A continuación se formó una emulsión secundaria ((S+W1)/0/W2) mediante la adición de la solución 3 (2.0 mL) a la emulsión primaria en serie, y después se sónico a un 30% de amplitud durante 40 segundos mediante el uso de un sonificador Branson Digital Sonifier 250. La emulsión secundaria se agregó a un vaso de precipitados de 50 mL que contenía 70 mM de tampón de fosfato (30 mL) y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas para permitir que el diclorometano se evaporara y que los nanoportadores se formaran en suspensión. Una porción de los nanoportadores suspendidos se lavó mediante la transferencia de la suspensión de nanoportadores a un tubo de centrífuga, la centrifugación a 13,823g durante una hora, la extracción del sobrenadante y la resuspensión del sedimento en solución salina tamponada con fosfato. Este procedimiento de lavado se repitió y después el sedimento se volvió a suspender en solución salina tamponada con fosfato para lograr una suspensión de nanoportadores que tuviera una concentración nominal de 10 mg/mL en base a los polímeros. La suspensión se almacenó congelada a -20°C hasta su uso.

TABLA 5 Caracterización de nanovehículo EJEMPLO 6 Las composiciones de nanoportadores sintéticos generan valoraciones altas de anticuerpos y una fuerte actividad de CTL específica para el antigeno Se realizó el 3er y 4t0 estudio de inmunización in vivo (ratones C57BLJ6). Se introdujo la formulación de nanoportador polimérico que antecede (No. 3) que proporciona un agonista de TLR (R848) y proteína de ovoalbúmina (OVA) atrapada y produjo valoraciones altas de anticuerpos (por ejemplo, valoraciones de IgG anti-OVA de ~1e6) y una fuerte actividad de CTL específica para el antígeno de las células linfáticas y del bazo.

Los ratones inmunizados se desangraron en las fechas indicadas y se midieron los anticuerpos para la ovoalbúmina en ELISA estándar mediante el uso de diluciones en serie de sueros de prueba. Se utilizó Ig anti-ratón de cabra biotinilada como un anticuerpo de detección (BD Biosciences, San Diego, CA). La EC50 se determinó con base en las curvas de valoración La actividad de CTL se midió de la siguiente forma. A los 4 a 5 días de la inyección final (subcutánea, s.c, o intranasal, i.n.) con las preparaciones de nanoportadores o los testigos proteicos, se extrajeron los ganglios linfáticos (LN) que drenaban, se trataron con colagenasa, se homogeneizaron, se lavaron e incubaron con 10 a 100 unidades/ml de IL-2 durante 4 a 5 días. A continuación, se contaron las poblaciones celulares y se utilizaron como células efectoras en ensayos de citotoxicidad. Las células EL- 4 singénicas pulsadas con el péptido de SIINFEKL (SEQ ID NO:1) o las células EG.7-OVA (transfectadas de forma estable con ovoalbúmina) sirvieron como objetivos con células EL-4 intactas para el testigo de fondo. Se midió la citotoxicidad en varias proporciones efector:objetivo durante 24 horas (37°C) mediante el uso del ensayo de integridad de membrana homogéneo CytoTox-ONE™ (Promega, Madison, Wl) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

TABLA 6 Formulación de nanoportador TABLA 7 Diseño del experimento 1 TABLA 8 Diseño del experimento 2 EJEMPLO 7 Formulación de nanoportador sintético, lote No. 6 Materiales La proteina de ovoalbúmina se adquirió en Worthington Biochemical Corporation (730 Vassar Avenue, Lakewood, NJ 08701 ). Código de Producto LS003054. El PLGA-R848, poli-D/L-láctido-coglicólido, 4-amino-2-(etoximetil)-a,a-dimetil-1 H-imidazo[4,5-c]quinolina-1-etanolamida de aproximadamente 7,800 Da preparada a partir de PLGA con una relación 3:1 de láctido con respecto a glicólido y que presenta un contenido de aproximadamente un 8.5% p/p de resiquimod conjugado se fabricó de forma personalizada en Princeton Global Synthesis (300 George Patterson Drive #206, Bristol, PA 19007). Número de lote PGS 16-52. PLA con una viscosidad inherente de 0.21 dL/g se adquirió de SurModics Pharmaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211. Código de Producto 100 DL 2A). Se sintetizó el copolimero de bloque de PLA-PEG-OMe con un bloque de PEG terminado en metil éter de aproximadamente 5,000 Da y un bloque de PLA de aproximadamente 21 ,000 Da mediante H-NMR (Mn de 2 kDa). El alcohol polivinilico 5-88 EMPROVE®, USP (85 a 89% hidrolizado, con una viscosidad de 4.3 a 5.7 mPa.s) se adquirió en EMD Chemicals Inc. (480 South Democrat Road Gibbstown, NJ 08027. Número de parte 1.41354). Solución salina tamponada con fosfato 1X (PBS 1X) De Mediatech Inc. (9345 Discovery Blvd. Manassas, VA 20109). Código de Producto 21-040-CV.

Método Las soluciones se prepararon en la siguiente forma: Solución 1 : Se preparó proteína de ovoalbúmina a 20 mg/mL en PBS 1X a temperatura ambiente.

Solución 2: Se preparó PLA mediante la disolución de PLA a 100 mg por 1 ml_ de diclorometano en la campana de extracción de vapores químicos.

Solución 3: Se preparó PLA-PEG-OMe mediante la disolución de PLA-PEG-OMe a 100 mg por 1 ml_ de diclorometano en la campana de extracción de vapores químicos.

Solución 4: Se preparó PLGA-R848 mediante la disolución de PLGA-R848 a 100 mg por 1 ml_ de diclorometano en la campana de extracción de vapores químicos.

Solución 5: Alcohol polivinílico con una concentración de 50 mg/mL en tampón de fosfato 100 mM, pH de 8.

Solución 6: Tampón de fosfato 70 mM, pH de 8.

Este lote se preparó por duplicado y a continuación se combinó después del lavado. Primero se creó una emulsión primaria (W1/0) mediante la mezcla de las soluciones 1 a 4. La solución 1 (0.2 mL), la solución 2 (0.50 mL), la solución 3 (0.25 mL) y la solución 4 (0.25 mL) se combinaron en un tubo de vidrio pequeño a presión y se sonicaron a un 50% de amplitud durante 40 segundos en un sonificador Branson Digital Sonifier 250. A continuación se formó una emulsión secundaria (W1/0 W2) mediante la adición de la solución 5 (2.0 mL) a la emulsión primaria, con agitación excéntrica para crear una dispersión bruta y después se sónico a un 30% de amplitud durante 60 segundos mediante el uso de un sonificador Branson Digital Sonifier 250. La emulsión secundaria se agregó a un vaso de precipitados de 50 mL abierto que contenía la solución 6 (30 mL) y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas para permitir que el diclorometano se evaporara y que los nanoportadores se formaran en suspensión. Una porción de los nanoportadores suspendidos se lavó mediante la transferencia de la suspensión de nanoportadores a un tubo de centrífuga, la centrifugación a 21 ,000 rcf durante 45 minutos, la extracción del sobrenadante y la resuspensión del sedimento en solución salina tamponada con fosfato. Este procedimiento de lavado se repitió y después el sedimento se volvió a suspender en PBS 1X para lograr una suspensión de nanoportadores que tuviera una concentración nominal de 10 mg/mL en base a los polímeros. La suspensión se almacenó congelada a -20°C hasta su uso.

TABLA 9 Caracterización de nanovehículo EJEMPLO 8 Formulación de nanoportador sintético, lote No. 7 Materiales La proteína de ovoalbúmina se adquirió en Worthington Biochemical Corporation (730 Vassar Avenue, Lakewood, NJ 08701). Código de Producto LS003054. El PLGA-R848, poli-D/L-láctido-coglicólido, 4-amino-2-(etoximetil)-a,a-dimetil-1 H-imidazo[4,5-c]quinolina-1-etanolamida de aproximadamente 7,800 Da preparada a partir de PLGA con una relación 3: 1 de láctido con respecto a glicólido y que presenta un contenido de aproximadamente un 8.5% p/p de resiquimod conjugado se fabricó de forma personalizada en Princeton Global Synthesis (300 George Patterson Drive #206, Bristol, PA 19007). Número de lote PGS 16-52. PLA con una viscosidad inherente de 0.21 dL/g se adquirió de SurModics Pharmaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 3521 1. Código de Producto 100 DL 2A). Se sintetizó el copolimero de bloque de PLA-PEG-OMe con un bloque de PEG terminado en metil éter de aproximadamente 5,000 Da y un bloque de PLA de aproximadamente 21 ,000 Da mediante 1H-NMR (Mn de 21 kDa). El alcohol polivinílico 5-88 EMPROVE®, USP (85 a 89% hidrolizado, con una viscosidad de 4.3 a 5.7 mPa.s) se adquirió en EMD Chemicals Inc. (480 South Democrat Road Gibbstown, NJ 08027. Número de parte 1.41354). Solución salina tamponada con fosfato 1X (PBS 1X) De Mediatech Inc. (9345 Discovery Blvd. Manassas, VA 20109). Código de Producto 21 -040-CV.

Método Las soluciones se prepararon en la siguiente forma: Solución 1 : Se preparó proteína de ovoalbúmina a 5 mg/mL en PBS 1X a temperatura ambiente.

Solución 6: Tampón de fosfato 70 mM, pH de 8.

Este lote se preparó por duplicado y a continuación se combinó después del lavado. Primero se creó una emulsión primaria (W1/0) mediante la mezcla de las soluciones 1 a 4. La solución 1 (0.2 mL), la solución 2 (0.50 mL), la solución 3 (0.25 mL) y la solución 4 (0.25 mL) se combinaron en un tubo de vidrio pequeño a presión y se sonicaron a un 50% de amplitud durante 40 segundos en un sonificador Branson Digital Sonifier 250. A continuación se formó una emulsión secundaria (W1/G7W2) mediante la adición de la solución 5 (2.0 mL) a la emulsión primaria, con agitación excéntrica para crear una dispersión bruta y después se sonicó a un 30% de amplitud durante 60 segundos mediante el uso de un sonificador Branson Digital Sonifier 250. La emulsión secundaria se agregó a un vaso de precipitados de 50 mL abierto que contenía la solución 6 (30 mL) y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas para permitir que el diclorometano se evaporara y que los nanoportadores se formaran en suspensión. Una porción de los nanoportadores suspendidos se lavó mediante la transferencia de la suspensión de nanoportadores a un tubo de centrífuga, la centrifugación a 21 ,000 rcf durante 45 minutos, la extracción del sobrenadante y la resuspensión del sedimento en solución salina tamponada con fosfato. Este procedimiento de lavado se repitió y después el sedimento se volvió a suspender en PBS 1X para lograr una suspensión de nanoportadores que tuviera una concentración nominal de 10 mg/mL en base a los polímeros. La suspensión se almacenó congelada a -20°C hasta su uso.

TABLA 10 Caracterización de nanovehiculo EJEMPLO 9 Formulación de nanoportador sintético, tote No. 8 Materiales La proteína de ovoalbúmina se adquirió en Worthington Biochemical Corporation (730 Vassar Avenue, Lakewood, NJ 08701). Código de Producto LS003054. El PLGA-R848, poli-D/L-láctido-coglicólido, 4-amino-2-(etoximetil)-a,a-dimetil-1 H-imidazo[4,5-c]quinolina-1-etanolamida de aproximadamente 7,800 Da preparada a partir de PLGA con una relación 3:1 de láctido con respecto a glicólido y que presenta un contenido de aproximadamente un 8.5% p/p de resiquimod conjugado se fabricó de forma personalizada en Princeton Global Synthesis (300 George Patterson Drive #206, Bristol, PA 19007). PLA con una viscosidad inherente de 0.21 dL/g se adquirió de SurModics Pharmaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 352 1. Código de Producto 100 DL 2A). Se sintetizó el copolimero de bloque de PLA-PEG-OMe con un bloque de PEG terminado en metil éter de aproximadamente 5,000 Da y un bloque de PLA de aproximadamente 21 ,000 Da mediante 1H-NMR (Mn de 21 kDa). El alcohol polivinílico 5-88 EMPROVE®, USP (85 a 89% hidrolizado, con una viscosidad de 4.3 a 5.7 mPa.s) se adquirió en EMD Chemicals Inc. (480 South Democrat Road Gibbstown, NJ 08027. Número de parte 1.41354). Solución salina tamponada con fosfato 1X (PBS 1X) De Mediatech Inc. (9345 Discovery Blvd. Manassas, VA 20109). Código de Producto 21-040-CV.

Método Las soluciones se prepararon en la siguiente forma: Solución 1 : Se preparó proteina de ovoalbúmina a 20 mg/mL en PBS 1X a temperatura ambiente.

Solución 3: Se preparó PLA-PEG-OMe mediante la disolución de PLA-PEG-OMe a 100 mg por 1 mL de diclorometano en la campana de extracción de vapores químicos.

Solución 4: Se preparó PLGA-R848 mediante la disolución de PLGA-R848 a 100 mg por 1 mL de diclorometano en la campana de extracción de vapores químicos.

Solución 6: Tampón de fosfato 70 mM, pH de 8.

Este lote se preparó por duplicado y a continuación se combinó después del lavado. Primero se creó una emulsión primaria (W1/0) mediante la mezcla de las soluciones 1 a 4. La solución 1 (0.2 mL), la solución 2 (0.50 mL), la solución 3 (0.25 mL) y la solución 4 (0.25 mL) se combinaron en un tubo de vidrio pequeño a presión y se sonicaron a un 50% de amplitud durante 40 segundos en un sonificador Branson Digital Sonifier 250. A continuación se formó una emulsión secundaria (W1/0/W2) mediante la adición de la solución 5 (2.0 mL) a la emulsión primaria, con agitación excéntrica para crear una dispersión bruta y después se sonicó a un 30% de amplitud durante 60 segundos mediante el uso de un sonificador Branson Digital Sonifier 250. La emulsión secundaria se agregó a un vaso de precipitados de 50 mL abierto que contenia la solución 6 (30 mL) y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas para permitir que el diclorometano se evaporara y que los nanoportadores se formaran en suspensión. Una porción de los nanoportadores suspendidos se lavó mediante la transferencia de la suspensión de nanoportadores a un tubo de centrífuga, la centrifugación a 21 ,000 rcf durante 45 minutos, la extracción del sobrenadante y la resuspensión del sedimento en solución salina tamponada con fosfato. Este procedimiento de lavado se repitió y después el sedimento se volvió a suspender en PBS 1X para lograr una suspensión de nanoportadores que tuviera una concentración nominal de 10 mg/mL en base a los polímeros. La suspensión se almacenó congelada a -20°C hasta su uso.

TABLA 11 Caracterización de nanovehículo EJEMPLO 10 Las composiciones de nanoportadores sintéticos generan valoraciones altas de anticuerpos y una fuerte actividad de CTL específica para el antígeno Los nanoportadores sintéticos que proporcionaban R848 y OVA fueron tan exitosos como el testigo de comparación positivo que consistía en una dosis elevada de PS-CpG más una dosis 6 veces más elevada de OVA libre en la generación de una respuesta de CTL específica para OVA (bazo) y también en la creación de una respuesta humoral tan fuerte (o más fuerte) específica para OVA.

A los 4 a 5 días de la inyección s.c. con las preparaciones de nanoportadores o los testigos, se extrajeron los ganglios linfáticos (LN) que drenaban, se trataron con colagenasa, se homogeneizaron, se lavaron e incubaron con 10 a 100 unidades/ml de IL-2 durante 4 a 5 días. A continuación, se contaron las poblaciones celulares resultantes y se utilizaron como células efectoras en ensayos de citotoxicidad. Las células EL-4 síngénicas pulsadas con el péptido de SIINFEKL (SEQ ID NO:1) o las células EG.7-OVA (transfectadas de forma estable con ovoalbúmina) sirvieron como objetivos con células EL-4 intactas para el testigo de fondo. Se midió la citotoxicidad en varias proporciones efector:objetivo durante 24 horas (37°C) mediante el uso del ensayo de integridad de membrana homogéneo CytoTox-ONE™ (Promega, Madison, Wl) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

TABLA 12 EJEMPLO 11 Desarrollo de mediciones de las respuestas inmunitarias humorales y celulares al antígeno encapsulado en nanoportadores después de una única inyección de mezcla de NC-OVA + NC-R848 Materiales - lote No. 9 El PLGA-R848 (S-205), poli-D/L-láctido-coglicólido, 4-amino-2- (etoximetil)-a,a-dimetil-1 H-imidazo[4,5-c]quinolina-1 -etanolamida de aproximadamente 7,800 Da preparada a partir de PLGA con una relación 3: 1 de láctido con respecto a glicólido y que presenta un contenido de aproximadamente un 8.5% p/p de resiquimod conjugado se fabricó de forma personalizada en Princeton Global Synthesis (300 George Patterson Drive #206, Bristol, PA 19007). PLA con una viscosidad inherente de 0.19 dL/g se adquirió de SurModics Pharmaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 3521 1 . Código de Producto 100 DL 2A). El copolimero de bloque de PLA- PEG-OMe con un bloque de PEG terminado en metil éter de aproximadamente 5,000 Da y un bloque de PLA de aproximadamente 28,000 Da se adquirió en SurModics Pharmaceuticals (Código de Producto 100 DL mPEG 5000 5CE). El alcohol polivinílico 4-88 EMPROVE®, USP (85 a 89% hidrolizado, con una viscosidad de 3.4 a 4.6 mPa.s) se adquirió en EMD Chemicals Inc. (480 South Democrat Road Gibbstown, NJ 08027). Solución salina tamponada con fosfato 1X (PBS 1X) De Mediatech Inc. (9345 Discovery Blvd. Manassas, VA 20109). Código de Producto 21-040-CV.

Método - lote No. 9 Las soluciones se prepararon en la siguiente forma: Solución 1 : Se preparó PLGA-R848 mediante el pesaje de polvos de PLGA-R848, PLA y PLA-PEG-OMe en una relación en peso de 2:1 :1 y la disolución posterior de los polímeros mezclados en diclorometano para alcanzar una concentración total de polímeros de 00 mg por 1 mL.

Solución 2: Alcohol polivinílico a 35 mg/mL en 100 mM de tampón de fosfato, pH 8.

Se creó una emulsión de G7W mediante la mezcla de las soluciones 1 y 2 y la creación posterior de una emulsión granulosa antes de una emulsión fina. La solución 1 (2 mL) se emulsionó granulosamente con la solución 2 (8 mL), mediante el uso de 10 pasadas a través de una aguja de emulsificación de 18G. Se preparó una emulsión fina mediante la carga de la emulsión granulosa en un homogeneizador de alta presión cebado y enfriado con agua helada (Microfluidics LV1 ) y la modalidad de tres pasadas a 5000 psi. La emulsión de O/W fina se agregó a un vaso de precipitados de 100 mL abierto que contenía 1X PBS (60 mL) y se agitó a temperatura ambiente durante más de 2 horas para permitir que el diclorometano se evaporara y que los nanoportadores se formaran en suspensión. Una porción de los nanovehículos suspendidos se lavó mediante la transferencia de la suspensión de nanovehículos a un tubo de centrífuga, la centrifugación a 75,600 rcf durante 35 minutos, la extracción del sobrenadante y la resuspensión del sedimento en solución salina tamponada con fosfato. Este procedimiento de lavado se repitió y después el sedimento se volvió a suspender en PBS 1X para lograr una suspensión de nanoportadores que tuviera una concentración nominal de 10 mg/mL en base a los polímeros. El proceso de formación de nanoportadores se repitió otras tres veces 1x or 2x la misma escala. Las cuatro suspensiones se combinaron y después se filtraron a través de un filtro de jeringa de 0.22 micrones y después se almacenaron a -20°C hasta su uso.

Materiales - lote No. 10 El PLGA-R848 (S-205), poli-D/L-láctido-coglicólido, 4-amino-2-(etoximetil)-a,a-dimetil-1H-imidazo[4,5-c]quinolina-1 -etanolamida de aproximadamente 7,800 Da preparada a partir de PLGA con una relación 3:1 de láctido con respecto a glicólido y que presenta un contenido de aproximadamente un 8.5% p/p de resiquimod conjugado se fabricó de forma personalizada en Princeton Global Synthesis (300 George Patterson Drive #206, Bristol, PA 19007). PLA con una viscosidad inherente de 0.19 dL/g se adquirió de SurModics Pharmaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 3521 1. Código de Producto 100 DL 2A). El copolímero de bloque de PLA-PEG-OMe con un bloque de PEG terminado en metil éter de aproximadamente 5,000 Da y un bloque de PLA de aproximadamente 28,000 Da se adquirió en SurModics Pharmaceuticals (Código de Producto 100 DL mPEG 5000 5CE). El alcohol polivinílico 4-88 EMPROVE®, USP (85 a 89% hidrolizado, con una viscosidad de 3.4 a 4.6 mPa.s) se adquirió en EMD Chemicals Inc. (480 South Democrat Road Gibbstown, NJ 08027). Solución salina tamponada con fosfato 1X (PBS 1X) De Mediatech Inc. (9345 Discovery Blvd. Manassas, VA 20109). Product Code 21-040-CV.

Método - lote No. 10 Las soluciones se prepararon en la siguiente forma: Solución 1 : Se preparó PLGA-R848 mediante la disolución de PLGA-R848 a 100 mg por 1 mL de diclorometano en la campana de extracción de vapores químicos.

Solución 2: Se preparó PLA mediante la disolución de PLA a 100 mg por 1 mL de diclorometano en la campana de extracción de vapores químicos.

Solución 4: Alcohol polivinílico a 50 mg/mL en 100 mM de tampón de fosfato, pH 8.

Se creó una emulsión primaria (O/W) mediante la mezcla de las soluciones 1 a 4 y la creación posterior de una emulsión granulosa antes de una emulsión fina. La solución 1 (1mL), la solución 2 (0.5 mL) y la solución 3 (0.5 mL) se combinaron primero y después se emulsionaron granulosamente con la solución 4 (8 mL) mediante agitación conjunta a 350 rpm en un vaso de precipitados durante dos minutos y mediante pipeteado repetido. Se preparó una emulsión fina mediante la carga de la emulsión granulosa en un homogeneizador de alta presión cebado (Microfluidics LV1) y la modalidad de tres pasadas a 5000 psi. La emulsión de O/W fina se agregó a un vaso de precipitados de 50 mL abierto que contenía 1X PBS (30 mL) y se agitó a temperatura ambiente durante más de 2 horas para permitir que el diclorometano se evaporara y que los nanoportadores se formaran en suspensión. Una porción de los nanovehículos suspendidos se lavó mediante la transferencia de la suspensión de nanovehículos a un tubo de centrífuga, la centrifugación a 75,600 rcf durante 35 minutos, la extracción del sobrenadante y la resuspensión del sedimento en solución salina tamponada con fosfato. Este procedimiento de lavado se repitió y después el sedimento se volvió a suspender en PBS 1X para lograr una suspensión de nanoportadores que tuviera una concentración nominal de 10 mg/mL en base a los polímeros. A continuación, la suspensión de nanoportadores se filtró a través de un filtro de jeringa PES de 0.22 micrones y después se almacenó a -20°C hasta su uso.

Materiales - lote No. 1 La proteína de ovoalbúmina se adquirió en Worthington Biochemical Corporation (730 Vassar Avenue, Lakewood, NJ 08701). Código de Producto LS003054. PLGA con un contenido de un 75% de láctido y 25% de glicólido y una viscosidad inherente de 0.24 dL/g se adquirió en SurModics Pharmaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211. Código de Producto 7525 DLG 2.5A). PLA con una viscosidad inherente de 0.2 dUg se adquirió en SurModics Pharmaceuticals (Código de Producto 100 DL 2A). Se sintetizó el copolimero de bloqueo de PLA-PEG-OMe con un bloque PEG terminado en metil éter de aproximadamente 5.000 Da y un bloque PLA de aproximadamente 21.000 Da. El alcohol polivinílico 4-88 EMPROVE®, USP (85 a 89% hidrolizado, con una viscosidad de 3.4 a 4.6 mPa.s) se adquirió en EMD Chemicals Inc. (480 South Democrat Road Gibbstown, NJ 08027). Solución salina tamponada con fosfato 1X (PBS 1X) de Mediatech Inc. (9345 Discovery Blvd. Manassas, VA 20109.) Código de Producto 21-040-CV.

Método - lote No. 11 Las soluciones se prepararon en la siguiente forma: Solución 1 : Se preparó proteína de ovoalbúmina a 50 mg/mL en PBS 1X a temperatura ambiente.

Solución 2: PLGA, PLA y PLA-PEG-OMe se pesaron en una relación en peso de 2:1 :1 y se disolvieron en diclorometano en la campana de extracción de vapores químicos para lograr una concentración total de polímeros de 100 mg por 1 mL.

Solución 3: Alcohol polivinílico a 50 mg/mL en 100 mM de tampón de fosfato, pH 8.

Solución 4: Tampón de fosfato 70 mM, pH de 8.

Primero se creó una emulsión primaria (W1/0) mediante la mezcla de las soluciones 1 y 2. La solución 1 (66 mL) y la solución 2 (264 mL) se combinaron y formaron una emulsión granulosa mediante el uso de una mezcladora de hélice en un vaso de precipitados de 1 L. La emulsión granulosa se transfirió a un recipiente de homogeneización hecho a medida de temperatura controlada y se homogeneizó mediante el uso de un estator de rotor de alta cizalla. A continuación se formó una emulsión granulosa secundaria (W1/0/W2) mediante la transferencia de ½ de la emulsión primaria a un vaso de precipitados que contenía 330 mL de la solución 3 y el mezclado con una mezcladora de hélice. A continuación, la emulsión granulosa secundaria se volvió a colocar en el recipiente de homogeneización hecho a medida y se homogeneizó en una emulsión fina mediante el uso de alta cizalla. A continuación, la emulsión secundaria se agregó a un recipiente de 6L purgado que contenia la solución 4 (3.2 L) y se agitó durante la noche a temperatura ambiente para que se evaporara y para que los nanoportadores se formaran en suspensión. Las porciones (30 mL cada una) de los nanoportadores suspendidos se lavaron mediante la transferencia de la suspensión de nanoportadores a un tubo de centrífuga, la centrifugación a 75,600 rcf durante 35 minutos, la extracción del sobrenadante y la resuspensión del sedimento en solución salina tamponada con fosfato. Este procedimiento de lavado se repitió y a continuación el sedimento se volvió a suspender en PBS 1X para alcanzar la concentración de nanoportadores diana. La suspensión se filtró y se almacenó congelada a -20°C hasta su uso.

Ratones hembra C57BL/6 (2-3/grupo) se inmunizaron una vez con una mezcla de 100 pg de NC-OVA y 100 pg de NC-R848 que contenía 4.3 pg de R848 y 6.2 pg de OVA (por cada ratón). En los días 4, 7, 10 y 14 después de la inoculación con los nanoportadores los ratones se desangraron y se determinó su valoración de anticuerpos (IgG) contra OVA mediante ELISA. Además, los ratones se inyectaron (i.v.) en los mismos intervalos de tiempo con esplenocitos singénicos pulsados con un péptido que representaba un epítopo de CTL dominante de OVA (SIINFEKL (SEQ ID ??. )) y se etiquetaron de forma diferencial con CSFE. Al día siguiente, se tomaron los esplenocitos de los ratones inmunizados y se analizaron mediante FACS y se determinó la citotoxicidad específica en cada animal en comparación con el nivel de citotoxicidad básico en los animales a los que se les inyectó PBS (sin tratamiento previo) (%=100x[1-RRstp/RRinm]).

Una única inmunización con NC-OVA + NC-R848 conduce a la inducción rápida de las respuestas inmunitarias celulares y humorales, donde la primera se detecta apenas a los 4 días de la inyección y después persiste durante al menos diez días con un pico en el día 7 y la última se detecta a los 7 días después de la inyección y alcanza un nivel significativo a los 10 días después de la inoculación.

EJEMPLO 12 Nanoportadores sintéticos que proporcionan CpG y OVA Materiales - lote No. 12 El oligonucleótido de ADN PO-1826 con estructura principal de fosfodiéster que presentaba la secuencia de nucleótidos 5'-TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT-3' (SEQ ID NO:2) con un contraión se adquirió en Oligo Factory (120 Jeffrey Avenue, Holliston, MA 01746). PLGA con un contenido de un 54% de láctido y un 46% de glicólido y una viscosidad inherente de 0.24 dL/g se adquirió en SurModics Pharmaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 3521 1. Código de Producto 5050 DL 2.5A). El copolímero de bloque de PLA-PEG-OMe con un bloque de PEG terminado en metil éter de aproximadamente 2,000 Da y un bloque de PLA con un contenido de 75% láctido/25% glicólido de aproximadamente 88,000 Da se adquirió en SurModics Pharmaceuticals (Código de Producto 7525 DLG PEG 2000 7E-P). El alcohol polivinílico 4-88 EMPROVE®, USP (85 a 89% hidrolizado, con una viscosidad de 3.4 a 4.6 mPa.s) se adquirió en EMD Chemicals Inc. (480 South Democrat Road Gibbstown, NJ 08027). Solución salina tamponada con fosfato 1X (PBS 1X) De Mediatech Inc. (9345 Discovery Blvd. Manassas, VA 20109). Código de Producto 21-040-CV.

Método - lote No. 12 Las soluciones se prepararon en la siguiente forma: Solución 1 : Se preparó PO-1826 mediante la disolución a 40 mg por 1 mL de una solución acuosa que contenía 250 mg de colato de Na por 1 mL de agua sin endotoxinas.

Solución 2: Se preparó PLGA mediante la disolución de PLA a 100 mg por 1 mL de diclorometano en la campana de extracción de vapores químicos.

Solución 3: Se preparó PLGA-PEG-OMe mediante la disolución de PLGA-PEG-OMe a 100 mg por 1 mL de diclorometano en la campana de extracción de vapores químicos.

Solución 5: Tampón de fosfato 70 mM, pH de 8.

Se creó una emulsión primaria (W/O) mediante la mezcla de las soluciones 1 a 3 y la creación posterior de una emulsión granulosa antes de una emulsión fina. La solución 1 (0.2 mL), la solución 2 (0.5 mL) y la solución 3 (0.5 mL) se combinaron en un tubo de vidrio pequeño a presión, se emulsionaron mediante pipeteado repetido y se sonicaron a un 50% de amplitud durante 40 segundos sobre un baño de hielo mediante el uso de un sonificador Branson Digital Sonifier 250. A continuación se formó una emulsión secundaria (W1/OAA/2) mediante la adición de la solución 4 (3.0 mL) a la emulsión primaria, con agitación excéntrica para crear una dispersión bruta y después se sónico a un 30% de amplitud durante 60 segundos sobre un baño de hielo mediante el uso de un sonificador Branson Digital Sonifier 250. La emulsión fina W1/0/W2 se agregó a un vaso de precipitados de 50 mL abierto que contenia 70 mM de tampón de fosfato (30 ml_) y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas para permitir que el diclorometano se evaporara y que los nanoportadores se formaran en suspensión. Una porción de los nanoportadores suspendidos se lavó mediante la transferencia de la suspensión de nanoportadores a un tubo de centrífuga, la centrifugación a 21 ,000 rcf durante 90 minutos, la extracción del sobrenadante y la resuspensión del sedimento en solución salina tamponada con fosfato. Este procedimiento de lavado se repitió y después el sedimento se volvió a suspender en PBS 1X para lograr una suspensión de nanoportadores que tuviera una concentración nominal de 10 mg/mL en base a los polímeros. A continuación, la suspensión de nanoportadores se filtró a través de filtros de jeringa PES de 0.22 micrones, se almacenó refrigerada hasta que se determinó la concentración y después la concentración se ajustó y se almacenó congelada a -20°C hasta su uso.

Materiales - lote No. 13 La proteína de ovoalbúmina se adquirió en Worthington Biochemical Corporation (730 Vassar Avenue, Lakewood, NJ 08701). Código de Producto LS003054. PLGA con un contenido de un 75% de láctido y 25% de glicólido y una viscosidad inherente de 0.2 dL/g se adquirió en SurModics Pharmaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 3521 1 . Código de Producto 7525 DLG 2A). Se sintetizó el copolímero de bloque de PLA-PEG-OMe con un bloque de PEG terminado en metil éter de aproximadamente 5,000 Da y un bloque de PLA de aproximadamente 21 ,000 Da mediante 1 H-NMR (Mn de 21 kDa). El alcohol polivinílico 4-88 EMPROVE®, USP (85 a 89% hidrolizado, con una viscosidad de 3.4 a 4.6 mPa.s) se adquirió en EMD Chemicals Inc. (480 South Democrat Road Gibbstown, NJ 08027). Solución salina tamponada con fosfato 1X (PBS 1X) De Mediatech Inc. (9345 Discovery Blvd. Manassas, VA 20109). Código de Producto 21-040-CV.

Método - lote No. 13 Las soluciones se prepararon en la siguiente forma: Solución 1 : Se preparó proteína de ovoalbúmina a 50 mg/mL en PBS 1X a temperatura ambiente.

Solución 2: Se preparó PLGA mediante la disolución de PLGA a 100 mg por 1 mL de diclorometano en la campana de extracción de vapores químicos.

Solución 5: Tampón de fosfato 70 mM, pH de 8.

Primero se creó una emulsión primaria (W1/0) mediante la mezcla de las soluciones 1 a 3. La solución 1 (0.2 ml_), la solución 2 (0.75 ml_) y la solución 3 (0.25 ml_) se combinaron en un tubo de vidrio pequeño a presión y se sonicaron a un 50% de amplitud durante 40 segundos sobre un baño de hielo mediante el uso de un sonificador Branson Digital Sonifier 250. A continuación se formó una emulsión secundaria (W1/0/W2) mediante la adición de la solución 4 (3.0 ml_) a la emulsión primaria, con agitación excéntrica para crear una dispersión bruta y después se sónico a un 30% de amplitud durante 60 segundos sobre un baño de hielo mediante el uso de un sonificador Branson Digital Sonifier 250. La emulsión secundaria se agregó a un vaso de precipitados de 50 mL abierto que contenia la solución 5 (30 mL) y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas para permitir que el diclorometano se evaporara y que los nanoportadores se formaran en suspensión. Una porción de los nanoportadores suspendidos se lavó mediante la transferencia de la suspensión de nanoportadores a un tubo de centrífuga, la centrifugación a 21 ,000 rcf durante 130 minutos, la extracción del sobrenadante y la resuspensión del sedimento en solución salina tamponada con fosfato. Este procedimiento de lavado se repitió y después el sedimento se volvió a suspender en PBS 1X para lograr una suspensión de nanoportadores que tuviera una concentración nominal de 10 mg/mL en base a los polímeros. La suspensión se almacenó congelada a -20°C hasta su uso.

Materiales - lote No. 14 La proteína de ovoalbúmina se compró a Worthington Biochemical Corporation (730 Vassar Avenue, Lakewood, NJ 08701. Código de Producto LS003054). PLGA con un contenido de un 76% de láctido y 24% de glicólido y una viscosidad inherente de 0.69 dL/g se adquirió en SurModics Pharmaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211. Código de Producto 7525 DLG 7A). PLA con una viscosidad inherente de 0.22 dL/g se adquirió en SurModics Pharmaceuticals (Product Code 100 DL 2A). Se sintetizó el copolímero de bloqueo de PLA-PEG-OMe con un bloque PEG terminado en metil éter de aproximadamente 5.000 Da y un bloque PLA de aproximadamente 21.000 Da. El alcohol polivinilico 4-88 EMPROVE®, USP (85 a 89% hidrolizado, con una viscosidad de 3.4 a 4.6 mPa.s) se adquirió en EMD Chemicals Inc. (480 South Democrat Road Gibbstown, NJ 08027). La solución salina tamponada con fosfato 1X (PBS 1X) se adquirió en Mediatech Inc. (9345 Discovery Blvd. Manassas, VA 20109). Código de Producto 21-040-CV.

Método - lote No. 14 Las soluciones se prepararon en la siguiente forma: Solución 1 : Se preparó proteína de ovoalbúmina a 50 mg/mL en PBS 1X a temperatura ambiente.

Solución 3: Se preparó PLGA mediante la disolución de PLGA a 100 mg por 1 mL de diclorometano en la campana de extracción de vapores químicos.

Solución 4: Se preparó PLA-PEG-OMe mediante la disolución de PLA-PEG-OMe a 100 mg por 1 mL de diclorometano en la campana de extracción de vapores químicos.

Solución 5: Alcohol polivinílico a 50 mg/mL en 100 mM de tampón de fosfato, pH 8.

Solución 6: Tampón de fosfato 70 mM, pH de 8 Primero se creó una emulsión primaria (W1/0) mediante la mezcla de las soluciones 1 a 4. La solución 1 (0.2 mL), la solución 2 (0.5 mL), la solución 3 (0.25 mL) y la solución 4 (0.25 mL) se combinaron en un tubo de vidrio pequeño a presión y se sonicaron a un 50% de amplitud durante 40 segundos mediante el uso de un sonificador Branson Digital Sonifier 250. A continuación se formó una emulsión secundaria (W1/G7W2) mediante la adición de la solución 5 (3.0 mL) a la emulsión primaria, con agitación excéntrica para crear una dispersión bruta y después se sonicó a un 30% de amplitud durante 60 segundos sobre un baño de hielo mediante el uso de un sonificador Branson Digital Sonifier 250. La emulsión secundaria se agregó a un vaso de precipitados de 50 mL abierto que contenia la solución 6 (30 mL) y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas para permitir que el diclorometano se evaporara y que los nanoportadores se formaran en suspensión. Una porción de los nanovehículos suspendidos se lavó mediante la transferencia de la suspensión de nanovehículos a un tubo de centrifuga, la centrifugación a 25,600 rcf durante 45 minutos, la extracción del sobrenadante y la resuspensión del sedimento en solución salina tamponada con fosfato. Este procedimiento de lavado se repitió y después el sedimento se volvió a suspender en PBS 1X para lograr una suspensión de nanoportadores que tuviera una concentración nominal de 10 mg/mL en base a los polímeros. La suspensión se almacenó congelada a -20°C hasta su uso.

Materiales - lote No. 15 El oligonucleótido de ADN PO-1826 con estructura principal de fosfodiéster que presentaba la secuencia de nucleótidos 5'-TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT-3' (SEQ ID NO:2) con un contraión de sodio se adquirió en Oligo Factory (120 Jeffrey Avenue, Holliston, MA 01746). PLGA con un contenido de un 54% de láctido y un 46% de glicólido y una viscosidad inherente de 0.24 dL/g se adquirió en SurModics Pharmaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211. Código de Producto 5050 DLG 2.5A). Se sintetizó el copolímero de bloqueo de PLA-PEG-OMe con un bloque PEG terminado en metil éter de aproximadamente 5.000 Da y un bloque PLA de aproximadamente 21.000 Da. El alcohol polivinilico 4-88 EMPROVE®, USP (85 a 89% hidrolizado, con una viscosidad de 3.4 a 4.6 mPa.s) se adquirió en EMD Chemicals Inc. (480 South Democrat Road Gibbstown, NJ 08027). El colato de Na se adquirió en Sigma Aldrich LLC. (3050 Spruce St. St. Louis, MO 6310. Código de Producto C6445-100G). La solución salina tamponada con fosfato 1X (PBS 1X) se adquirió en Mediatech Inc. (9345 Discovery Blvd. Manassas, VA 20 09. Código de Producto 21-040-CV).

Método - lote No. 15 Las soluciones se prepararon en la siguiente forma: Solución 1 : Se preparó PO-1826 mediante la disolución a 40 mg por 1 mL de una solución acuosa que contenía 150 mg de KCI por 1 mL de agua sin endotoxinas.

Solución 2: El colato de Na se preparó mediante la disolución del polvo seco a 200 mg por 1 mL 1X PBS a temperatura ambiente.

Solución 3. Se preparó PLGA mediante la disolución de PLGA a 100 mg por 1 mL de diclorometano en la campana de extracción de vapores químicos.

Solución 4: Se preparó PLGA-PEG-OMe mediante la disolución de PLGA-PEG-OMe a 100 mg por 1 mL de diclorometano en la campana de extracción de vapores químicos.

Solución 5: Alcohol polívinílico a 50 mg/mL en 100 mM de lampón de fosfato, pH 8.

Solución 6: Tampón de fosfato 70 mM, pH de 8.

Se creó una emulsión primaria (W/O) mediante la mezcla de las soluciones 1 a 4 y la creación posterior de una emulsión granulosa antes de una emulsión fina. La solución 1 (0.25 mL), la solución 2 (0.25 mL), la solución 3 (0.5 ml_) y la solución 4 (0.5 mL) se combinaron en un tubo de vidrio pequeño a presión, se emulsionaron granulosamente mediante pipeteado repetido y se sonicaron a un 50% de amplitud durante 40 segundos sobre un baño de hielo mediante el uso de un sonificador Branson Digital Sonifier 250. A continuación se formó una emulsión secundaria (W1/0/W2) mediante la adición de la solución 5 (3.0 mL) a la emulsión primaria, con agitación excéntrica para crear una dispersión bruta y después se sónico a un 30% de amplitud durante 60 segundos sobre un baño de hielo mediante el uso de un sonificador Branson Digital Sonifier 250. La emulsión fina W1/0/W2 se agregó a un vaso de precipitados de 50 mL abierto que contenia 70 mM de tampón de fosfato (30 mL) y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas para permitir que el diclorometano se evaporara y que los nanoportadores se formaran en suspensión. Una porción de los nanoportadores suspendidos se lavó mediante la transferencia de la suspensión de nanoportadores a un tubo de centrifuga, la centrifugación a 21 ,000 rcf durante 90 minutos, la extracción del sobrenadante y la resuspensión del sedimento en solución salina tamponada con fosfato. Este procedimiento de lavado se repitió y después el sedimento se volvió a suspender en PBS 1X para lograr una suspensión de nanoportadores que tuviera una concentración nominal de 10 mg/mL en base a los polímeros. A continuación, la suspensión de nanoportadores se almacenó refrigerada hasta que se determinó la concentración y después la concentración se ajustó y se almacenó congelada a -20°C hasta su uso.

Materiales - lote No. 16 El oligonucleótido de ADN PO-1826 con estructura principal de fosfodiéster que presentaba la secuencia de nucleótidos 5'-TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT-3' (SEQ ID NO:2) con un contraión de sodio se adquirió en Oligo Factory (120 Jeffrey Avenue, Holliston, MA 01746). PLGA con un contenido de un 54% de láctido y un 46% de glicólido y una viscosidad inherente de 0.24 dL/g se adquirió en SurModics Pharmaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 3521 1. Código de Producto 5050 DLG 2.5A). Se sintetizó el copolímero de bloqueo de PI_A-PEG-OMe con un bloque PEG terminado en metil éter de aproximadamente 5.000 Da y un bloque PLA de aproximadamente 21.000 Da. El alcohol polivinílico 4-88 EMPROVE®, USP (85 a 89% hidrolizado, con una viscosidad de 3.4 a 4.6 mPa.s) se adquirió en EMD Chemicals Inc. (480 South Democrat Road Gibbstown, NJ 08027). La solución salina tamponada con fosfato 1X (PBS 1X) se adquirió en Mediatech Inc. (9345 Discovery Blvd. Manassas, VA 20109. Código de Producto 21-040-CV).

Método - lote No. 16 Las soluciones se prepararon en la siguiente forma: Solución 1 : Se preparó PO-1826 mediante la disolución a 40 mg por 1 mL de una solución acuosa que contenia 150 mg de KCI por 1 mL de agua sin endotoxinas.

Solución 2: Alcohol polivinílico a 100 mg/mL en 100 mM de tampón de fosfato, pH 8.

Solución 5: Alcohol polivinílico a 100 mg/mL en 100 mM de tampón de fosfato, pH 8.

Solución 6: Tampón de fosfato 70 mM, pH de 8.

Se creó una emulsión primaria (W/O) mediante la mezcla de las soluciones 1 a 4 y la creación posterior de una emulsión granulosa antes de una emulsión fina. La solución 1 (0.25 mL), la solución 2 (0.25 mL), la solución 3 (0.5 mL) y la solución 4 (0.5 mL) se combinaron en un tubo de vidrio pequeño a presión, se emulsionaron granulosamente mediante pipeteado repetido y se sonicaron a un 50% de amplitud durante 40 segundos sobre un baño de hielo mediante el uso de un sonificador Branson Digital Sonifíer 250. A continuación se formó una emulsión secundaria (W1/0/W2) mediante la adición de la solución 5 (3.0 mL) a la emulsión primaria, con agitación excéntrica para crear una dispersión bruta y después se sónico a un 30% de amplitud durante 60 segundos sobre un baño de hielo mediante el uso de un sonificador Branson Digital Sonifier 250. La emulsión fina W1/0/W2 se agregó a un vaso de precipitados de 50 mL abierto que contenía 70 mM de tampón de fosfato (30 mL) y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas para permitir que el diclorometano se evaporara y que los nanoportadores se formaran en suspensión. Una porción de los nanoportadores suspendidos se lavó mediante la transferencia de la suspensión de nanoportadores a un tubo de centrífuga, la centrifugación a 21 ,000 rcf durante 90 minutos, la extracción del sobrenadante y la resuspensión del sedimento en solución salina tamponada con fosfato. Este procedimiento de lavado se repitió y después el sedimento se volvió a suspender en PBS 1X para lograr una suspensión de nanoportadores que tuviera una concentración nominal de 10 mg/ml_ en base a los polímeros. A continuación, la suspensión de nanoportadores se almacenó refrigerada hasta que se determinó la concentración y después la concentración se ajustó y se almacenó congelada a -20°C hasta su uso.

Los nanoportadores sintéticos que proporcionaban CpG y OVA fueron superiores en la capacidad de inducción rápida de anticuerpos con respecto a CpG y OVA libres de dosis elevada (tanto CpG libre como OVA libre se utilizaron en una dosis 5 veces superior) e igual o más exitosos en la inducción de CTL locales y sistémicos específicos para antígenos que la misma dosis elevada de CpG libre y OVA libre.

Se inmunizaron grupos de tres animales (ratones C57BL/6 hembra) (sensibilización-refuerzo, días 0 y 10; extremidades traseras, s.c.) con tres combinaciones de CpG incorporado a nanoportador (ODN 1826) y OVA en paralelo con inmunización con un exceso de 5 veces de CpG y OVA libre. Se utilizaron tres formulaciones diferentes de NC-CpG con la misma formulación de NC-OVA (ver detalles en la tabla 13). A los 4 días de la segunda inmunización los animales se sacrificaron y se recolectaron su suero, ganglios linfáticos (LN) que drenaban (poplíteos) y los bazos. Los sueros de los ratones inmunizados se utilizaron para determinar la valoración de anticuerpos contra ovoalbúmina, que se midió en ELISA estándar con diluciones en serie de los sueros de prueba. Se utilizó Ig anti-ratón de cabra biotinilada como un anticuerpo de detección (BD Biosciences, San Diego, CA). La EC50 se determinó con base en las curvas de valoración. Todas las formulaciones de NC-CpG combinadas con NC-OVA indujeron una respuesta de anticuerpo prematura contra OVA 30 veces superior a las dosis 5 veces más elevadas de CpG y OVA libre.

En paralelo, se evaluó la inducción de CTL específicos para OVA ex vivo (sin expansión in vitro) en los LN que drenaban (localmente) o en los bazos (sistémicamente) mediante análisis de FACS. En resumen, ambos tejidos se trataron con colagenasa, se homogeneizaron, se lavaron, las células se contaron mediante el uso de exclusión de tripano (Countess, Invitrogen, CA, USA) y se etiquetaron con anticuerpos o pentámeros restringidos por MHC de clase I acoplados con tintes fluorescentes capaces de reconocer el CD8 de superficie (marcador de linfocitos T), el CD19 (marcador de linfocitos B) y el receptor de linfocitos T (TCR) específicos para el péptido derivado de OVA inmunodominante restringido por MHC de clase I SIINFEKL (SEQ ID NO:1). A continuación, las poblaciones de células se analizaron mediante FACS y las células que mostraron expresión de CD8 (CD8+), no mostraron expresión de CD 9 (CD ET) y se unieron a SIINFEKL en complejo con MHC de clase I (SEQ ID NO:1) (SIINFEKL+ (SEQ ID NO:1 )) se consideraron una representación de una especie principal de CTL específicos para OVA. Al menos una de las formulaciones de NC-CpG utilizadas tiene una capacidad igual o superior de producir CTL a corto plazo localmente y sistémicamente cuando se encuentra acoplada con NC-OVA con respecto a las cantidades 5 veces más elevadas de CpG y OVA libre. Cabe destacar que las diferentes formulaciones de NC-CpG han sido especialmente beneficiosas para la inducción de la respuesta de CTL local o sistémica contra el antígeno de ovoalbúmina incorporado con un nanoportador.

Asimismo, los esplenocitos purificados de animales inmunizados también se expandieron in vitro (100 u/mL IL-2) mediante su estimulación con células de EG.7-OVA tratadas con mitomicina (células singénicas transfectadas de forma estable con ovoalbúmina), lo que debería resultar en la expansión preferencial de células CD8+ específicas para OVA. A los 1 1 días de la incubación in vitro, los cultivos expandidos se etiquetaron como se describe anteriormente y se analizaron mediante FACS. Todas las formulaciones de NC-CpG probadas resultaron en la inducción de CTL específicos para Ag con un potencial de expansión superior al de los inducidos con dosis 5x de CpG y OVA libre. Cabe destacar que una formulación de CpG (NC-CpG) tuvo un potencial especialmente alto para la expansión de CTL y otra (NC-CpG) superó los niveles de inducción sistémica de CTL con CpG y OVA libres de dosis elevada cuando se analizaron ex vivo y tras la expansión in vitro.

TABLA 13 Diseño experimental para probar la respuesta inmunitaria humoral y celular inducida por CpG y OVA incorporados con nanoportador con respecto a CpG y OVA libres

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1. El uso de una composición que comprende una población de nanoportadores sintéticos acoplados a una primera proteína; en donde la primera proteína comprende al menos un epítopo humoral y al menos un epitopo restringido por MHC de clase I que no son el mismo epítopo, en donde la población de nanoportadores sintéticos no comprende un adyuvante de saponina-colesterol y en donde la media de una distribución del tamaño de partícula obtenida utilizando dispersión de luz dinámica de la población de nanoportadores sintéticos es una dimensión máxima de 20 nm a 250 nm, en la elaboración de un medicamento para generar una respuesta inmunitaria humoral y de linfocitos T citotóxicos (CTL) a la primera proteína en uno o más sujetos de prueba.

2. El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde se identifica un sujeto que necesita una respuesta inmunitaria humoral y de linfocitos T citotóxicos (CTL) a la primera proteína.

3. El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde el medicamento está adaptado para ser administrable de acuerdo con un régimen de vacunación.

4. El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde el medicamento está adaptado para ser administrable de acuerdo con un protocolo que se demostró previamente que resulta en una respuesta inmunitaria humoral y de CTL especifica de la primera proteína en uno o más sujetos de prueba.

5. El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable en una cantidad efectiva para generar una respuesta inmunitaria humoral y de CTL a la primera proteína.

6. El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la composición comprende, además, uno o más adyuvantes.

7. El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el medicamento se adapta adicionalmente para ser administrable con uno o más adyuvantes.

8. El uso como se reclama en las reivindicaciones 6 ó 7, en donde el o los adyuvantes comprenden estimuladores o agonistas de receptores de reconocimiento de patrones, sales minerales, alumbre, alumbre combinado con lípido monofosforilo A de Enterobacterias (MPL), MPL® (AS04), AS15, saponinas, QS-21 ,Quil-A, ISCOMs, ISCOMATRIX™, MF59™, Montanide® ISA 51 , Montanide® ISA 720, AS02, liposomas y formulaciones liposomales, AS01, micropartículas y microportadores sintetizados o específicamente preparados, vesículas de membrana externa derivadas de bacterias de N. gonorrheae o Chlamydia trachomatis, partículas de quitosán, agentes formadores de depósitos, copolímeros de bloque Pluronic®, péptidos específicamente modificados o preparados, dipéptido de muramilo, 4-fosfatos de aminoalquil glucosaminida, RC529, toxoides bacterianos, fragmentos de toxinas, agonistas de receptores tipo Toll 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9 y/o combinaciones de los mismos; derivados de adenina; ADN inmunoestimulador, ARN inmunoestimulador; aminas de imidazoquinolina, aminas de imidazopiridina, aminas de cicloalquilimidazopiridina 6,7-fusionadas, aminas de imidazoquinolina con puente en 1 ,2; imiquimod; resiquimod; agonista para la molécula CD40 de superficie de DC; interferones de tipo I; poli l:C; lipopolisacárido bacteriano (LPS); VSV-G; HMGB-1 ; flagelina o porciones o derivados de los mismos; moléculas de ADN inmunoestimulador que comprenden CpG; estímulos proinflamatorios liberados de células necróticas; cristales de urato; componentes activados de la cascada de complementos; componentes activados de complejos inmunitarios; agonistas de receptores de complementos; citoquinas o agonistas de receptores de citoquinas. 9. El uso como se reclama en la reivindicación 8, en donde uno o más adyuvantes comprenden un agonista de receptores tipo Toll 2, 3, 4, 7, 8 ó

9.

10. El uso como se reclama en la reivindicación 8, en donde uno o más adyuvantes comprenden una imidazoquinolina u oxoadenina.

1 1. El uso como se reclama la reivindicación 10, en donde la imidazoquinolina comprende resiquimod o imiquimod.

12. El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 1 1 , en donde uno o más adyuvantes se acoplan a los nanoportadores sintéticos de la población de nanoportadores sintéticos.

13. El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11 , en donde la composición comprende, además, otra población de nanoportadores sintéticos y en donde uno o más adyuvantes se acoplan a los nanoportadores sintéticos de la otra población de nanoportadores sintéticos.

14. El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11 , en donde uno o más adyuvantes no están acoplados a un nanoportador sintético.

15. El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde la composición comprende, además, uno o más antígenos adicionales.

16. El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde el medicamento se adapta adicionalmente para ser administrable con uno o más antígenos adicionales.

17. El uso como se reclama en la reivindicación 15 ó 16, en donde uno o más antigenos adicionales comprenden una segunda proteína.

18. El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en donde uno o más antígenos adicionales comprenden un epítopo humoral y/o un epítopo restringido por MHC de clase I.

19. El uso como se reclama en la reivindicación 18, en donde uno o más antigenos adicionales comprenden un epítopo humoral y un epítopo restringido por MHC de clase I.

20. El uso como se reclama en la reivindicación 18 ó 19, en donde uno o más antígenos adicionales comprenden al menos un epítopo humoral y al menos un epítopo restringido por MHC de clase I que no son el mismo epítopo.

21. El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20, en donde uno o más antigenos adicionales están acoplados a un nanoportador sintético.

22. El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20, en donde la composición comprende además otra población de nanoportadores sintéticos y en donde uno o más antigenos adicionales se acoplan a los nanoportadores sintéticos de la otra población de nanoportadores sintéticos.

23. El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20, en donde uno o más antígenos adicionales no están acoplados a un nanoportador sintético.

24. El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, en donde los nanoportadores sintéticos y/u otros nanoportadores sintéticos comprenden una nanopartícula polimérica, una nanopartícula metálica, un dendrímero, un futboleno, un nanohilo, una partícula similar a virus o una partícula de péptido o proteína.

25. El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, en donde los nanoportadores sintéticos y/u otros nanoportadores sintéticos comprenden uno o más polímeros.

26. El uso como se reclama en la reivindicación 25, en donde uno o más polímeros comprenden un poliéster, ácido de poliamino, policarbonato, poliacetal, policetal, polisacárido, polietiloxazolina o polietilenoimina.

27. El uso como se reclama en la reivindicación 25 ó 26, en donde uno o más polímeros comprenden un poliéster.

28. El uso como se reclama en la reivindicación 27, en donde el poliéster comprende un ácido poli(láctico), ácido poli(glicólico), ácido poli(láctico-co-glicólico) o policaprolactona.

29. El uso como se reclama en la reivindicación 27 ó 28, en - donde el poliéster se acopla a un pbliéter.

30. El uso como se reclama en la reivindicación 29, en donde el poliéter comprende polietilenglicol.

31. El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30, en donde la primera proteína y/o uno o más antígenos adicionales son antígenos asociados con cáncer, una infección o enfermedad infecciosa, una enfermedad no autoinmunitaria o degenerativa, VIH, malaria, leishmaniasis, filovirus humano, togavirus, alfavirus, arenavirus, bunyavirus, flavivirus, virus del papiloma humano, virus A de la influenza humana, hepatitis B o hepatitis C.

32. El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31 , en donde el sujeto tiene o corre el riesgo de tener cáncer, una infección o enfermedad infecciosa o una enfermedad no autoinmunitaria o degenerativa.

33. El uso como se reclama en la reivindicación 32, en donde el sujeto tiene o corre el riesgo de tener VIH, malaria, leishmaniasis, una infección por filovirus humano, una infección por togavirus, una infección por alfavirus, una infección por arenavirus, una infección por bunyavirus, una infección por flavivirus, una infección por virus del papiloma humano, una infección por virus A de la influenza humana, una infección por hepatitis B o una infección por hepatitis C.

34. El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33, en donde las respuestas inmunitarias humorales y de CTL que se generan son clínicamente efectivas.

35. El uso como se reclama en la reivindicación 34, en donde las respuestas inmunitarias humorales y de CTL son efectivas para tratar o prevenir cáncer, una infección o enfermedad infecciosa o una enfermedad no autoinmunitaria o degenerativa en el sujeto.

36. El uso como se reclama en la reivindicación 35, en donde las respuestas inmunitarias humorales y de CTL son efectivas para tratar o prevenir VIH, malaria, leishmaniasis, una infección por filovirus humano, una infección por togavirus, una infección por alfavirus, una infección por arenavirus, una infección por bunyavirus, una infección por flavivirus, una infección por virus del papiloma humano, una infección por virus A de la influenza humana, una infección por hepatitis B o una infección por hepatitis C.

37. El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 36, en donde la composición comprende, además, un excipiente farmacéuticamente aceptable.

38. El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 37, en donde la composición es estéril.

39. El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 38, en donde la composición se reconstituye de forma liofilizada.

40. El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 39, en donde la composición es una forma de dosificación.

41. El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 40, en donde la composición es una vacuna.

42. El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 41 , en donde el medicamento está adaptado para ser administrable mediante administración intravenosa, oral, subcutánea, pulmonar, intranasal, intradérmica, transmucosa, ¡ntramuscosa o intramuscular.

43. Una composición que comprende una población de nanoportadores sintéticos acoplados a una primera proteína, en donde la primera proteina comprende al menos un epítopo humoral y al menos un epítopo restringido por MHC de clase I que no son el mismo epítopo, en donde la población de nanoportadores sintéticos no comprende un adyuvante de saponina-colesterol, y en donde la media de una distribución del tamaño de partícula obtenida utilizando dispersión de luz dinámica de la población de nanoportadores sintéticos es una dimensión máxima de 20 nm a 250 nm, para su uso en terapia o profilaxis.

44. Una composición que comprende una población de nanoportadores sintéticos acoplados a una primera protelna, en donde la primera proteina comprende al menos un epitopo humoral y al menos un epitopo restringido por MHC de clase I que no son el mismo epitopo, en donde la población de nanoportadores sintéticos no comprende un adyuvante de saponina-colesterol, y en donde la media de una distribución del tamaño de partícula obtenida utilizando dispersión de luz dinámica de la población de nanoportadores sintéticos es una dimensión máxima de 20 nm a 250 nm, para su uso en vacunación.

45. Una composición que comprende una población de nanoportadores sintéticos acoplados a una primera proteína, en donde la primera proteína comprende al menos un epitopo humoral y al menos un epitopo restringido por MHC de clase I que no son el mismo epitopo, en donde la población de nanoportadores sintéticos no comprende un adyuvante de saponina-colesterol, y en donde la media de una distribución del tamaño de partícula obtenida utilizando dispersión de luz dinámica de la población de nanoportadores sintéticos es una dimensión máxima de 20 nm a 250 nm, para su uso en generar una respuesta inmunitaria humoral y de CTL a la primera proteína en uno o más sujetos.

46. Una composición que comprende una población de nanoportadores sintéticos acoplados a una primera proteína, en donde la primera proteína comprende al menos un epitopo humoral y al menos un epitopo restringido por MHC de clase I que no son el mismo epítopo, en donde la población de nanoportadores sintéticos no comprende un adyuvante de saponina-colesterol, y en donde la media de una distribución del tamaño de partícula obtenida utilizando dispersión de luz dinámica de la población de nanoportadores sintéticos es una dimensión máxima de 20 nm a 250 nm, para usarse en terapia o profilaxis de cáncer, una infección o enfermedad infecciosa, una enfermedad no autoinmunitaria o degenerativa, VIH, malaria, leishmaniasis, una infección por filovirus -humano, una infección por togavirus, una infección por alfavirus, una infección por arenavirus, una infección por bunyavirus, una infección por flavivirus, una infección por virus del papiloma humano, una infección por virus A de la influenza humana, una infección por hepatitis B o una infección por hepatitis C.

47. Una composición para usarse como se define en cualquiera de las reivindicaciones 43 a 46, en donde la composición está adaptada para ser administrable por administración intravenosa, oral, subcutánea, pulmonar, intrana.sal, intradérmica, intramucosa, transmucosa o intramuscular.

48. El uso de una composición que comprende una población de nanoportadores sintéticos acoplados a una primera proteina, en donde la primera proteína comprende al menos un epítopo humoral y al menos un epítopo restringido por MHC de clase I que no son el mismo epítopo, en donde la población de nanoportadores sintéticos no comprende un adyuvante de saponina-colesterol, y en donde la media de una distribución del tamaño de partícula obtenida utilizando dispersión de luz dinámica de la población de nanoportadores sintéticos es una dimensión máxima de 20 nm a 250 nm, para la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir cáncer, una infección o enfermedad infecciosa, una enfermedad no autoinmunitaria o degenerativa, VIH, malaria, leishmaniasis, una infección por filovirus humano, una infección por togavirus, una infección por alfavirus, una infección por arenavirus, una infección por bunyavirus, una infección por flavivirus, una infección por virus del papiloma humano, una infección por virus A de la influenza humana, una infección por hepatitis B o una infección por hepatitis C.

49. Una composición para usarse tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 43 a 47 o el uso de la reivindicación 48 en donde la composición es tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 42.