KR20140050698A - 체액성 및 세포독성 t 림프구(ctl) 면역 반응을 발생시키는 합성 나노운반체 - Google Patents

체액성 및 세포독성 t 림프구(ctl) 면역 반응을 발생시키는 합성 나노운반체 Download PDF

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KR20140050698A
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KR1020147005410A
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데이비드 에이치. 알트로이터
콘린 오닐
페트르 일인스키
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셀렉타 바이오사이언시즈, 인크.
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Abstract

피검체에서 체액성 및 세포독성 T 림프구(CTL) 면역 반응을 발생시키기 위한 방법 및 관련 조성물이 개시된다.

Description

체액성 및 세포독성 T 림프구(CTL) 면역 반응을 발생시키는 합성 나노운반체{SYNTHETIC NANOCARRIERS THAT GENERATE HUMORAL AND CYTOTOXIC T LYMPHOCYTE (CTL) IMMUNE RESPONSES}
관련 출원
본 출원은 35 U.S.C. § 119하에서 2011년 7월 29일에 각각 출원된 미국 가출원 61/513,496호, 61/513,526호 및 61/513,527호의 이익을 주장하며, 상기 출원 각각의 전체내용은 참조로서 본원에 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 피검체에서 체액성 및 세포독성 T 림프구(CTL) 면역 반응을 발생시키기 위한 방법 및 관련 조성물에 관한 것이다. 일반적으로, 체액성 및 CTL 면역 반응은 적어도 하나의 체액성 에피토프 및 적어도 하나의 MHC 클래스 I-제한 에피토프를 포함하는 단백질을 포함하는 합성 나노운반체 조성물을 이용하여 발생된다.
발명의 배경
전통적으로, 백신은 면역계의 단일 아암(arm), 예를 들어, 항원에 대한 항체로 구성되는 체액성 면역 반응의 발생 또는 대안적으로 항원에 대한 CTL 반응의 활성화를 촉진시켜 왔다. 추가로, 통상적인 백신은 일반적으로 최적 방식으로 관심 세포, 예를 들어, APC의 작용 부위를 표적으로 하지 않는다. 면역 반응을 효과적으로 발생시키고/시키거나, 표적외 효과 및 독성을 감소시키기 위해 최적으로 면역계의 상기 아암 둘 모두를 효과적으로 활성화시키는 방법 및 조성물이 필요하다.
발명의 개요
피검체에서 체액성 및 CTL 면역 반응을 발생시키기 위한 방법, 및 관련 조성물이 본원에 제공된다. 한 양태에서, 제1 단백질에 대한 체액성 및 CTL 면역 반응을 필요로 하는 피검체를 확인하는 단계, 및 제1 단백질에 결합된 합성 나노운반체의 집단을 포함하는 조성물을 피검체에 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공되며, 상기 제1 단백질은 적어도 하나의 체액성 에피토프 및 동일 에피토프가 아닌 적어도 하나의 MHC 클래스 I-제한 에피토프를 포함하고, 상기 합성 나노운반체의 집단은 사포닌-콜레스테롤 애쥬번트를 포함하지 않고, 상기 합성 나노운반체의 집단의 동적광산란을 이용하여 수득된 입자 크기 분포의 평균은 최대 치수가 20 nm 내지 250 nm이다. 또 다른 구현예에서, DLS 분포의 평균은 본원에 제공된 상기 방법의 예 중 임의의 예에 의해 결정된다. 상기 예는 하기에 보다 상세히 기재된다. 한 구현예에서, 상기 조성물은 제1 단백질에 대한 체액성 및 CTL 면역 반응을 발생시키는 유효량으로 투여된다.
또 다른 양태에서, 제1 단백질에 결합된 합성 나노운반체의 집단을 포함하는 조성물을 피검체에 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공되며, 상기 제1 단백질은 적어도 하나의 체액성 에피토프 및 동일 에피토프가 아닌 적어도 하나의 MHC 클래스 I-제한 에피토프를 포함하고, 상기 합성 나노운반체의 집단은 사포닌-콜레스테롤 애쥬번트를 포함하지 않고, 상기 합성 나노운반체의 집단의 동적광산란을 이용하여 수득된 입자 크기 분포의 평균은 최대 치수가 20 nm 내지 250 nm이고, 상기 조성물은 예방접종 요법에 따라 투여된다.
또 다른 양태에서, 제1 단백질에 결합된 합성 나노운반체의 집단을 포함하는 조성물을 피검체에 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공되며, 상기 제1 단백질은 적어도 하나의 체액성 에피토프 및 동일 에피토프가 아닌 적어도 하나의 MHC 클래스 I-제한 에피토프를 포함하고, 상기 합성 나노운반체의 집단은 사포닌-콜레스테롤 애쥬번트를 포함하지 않고, 상기 합성 나노운반체의 집단의 동적광산란을 이용하여 수득된 입자 크기 분포의 평균은 최대 치수가 20 nm 내지 250 nm이고, 상기 조성물은 하나 이상의 시험 피검체에서 제1 단백질에 특이적인 체액성 및 CTL 면역 반응을 발생시키는 것으로 이전에 밝혀진 프로토콜에 따라 투여된다.
한 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 제1 단백질에 대한 체액성 및 세포독성 T 림프구(CTL) 면역 반응을 필요로 하는 피검체를 확인하는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 예방접종 요법에 따라 투여된다. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 하나 이상의 시험 피검체에서 제1 단백질에 특이적인 체액성 및 CTL 면역 반응을 발생시키는 것으로 이전에 밝혀진 프로토콜에 따라 투여된다.
또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 하나 이상의 애쥬번트를 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 하나 이상의 애쥬번트를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 한 추가 구현예에서, 하나 이상의 애쥬번트는 패턴 인식 수용체의 자극제 또는 효능제, 무기염, 명반(alum), 장내세균(Enterobacteria)의 모노포스포릴 지질(MPL) A와 조합된 명반, MPL®(AS04), AS15, 사포닌(saponin), QS-21, Quil-A, ISCOM, ISCOMATRIX™, MF59™, Montanide® ISA 51, Montanide® ISA 720, AS02, 리포솜 및 리포솜 제형, AS01, 합성되거나 특이적으로 제조된 미세입자 및 미세운반체, N. 고노레아(N. gonorrheae) 또는 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis)의 박테리아-유래 외막 소포, 키토산 입자, 데포-형성 작용제(depot-forming agent), Pluronic® 블록 공중합체, 특별히 변형되거나 제조된 펩티드, 뮤라밀 디펩티드, 아미노알킬 글루코사미니드 4-포스페이트, RC529, 박테리아 톡소이드, 독소 단편, Toll-유사 수용체 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9의 효능제 및/또는 이들의 조합물; 아데닌 유도체; 면역자극성 DNA; 면역자극성 RNA; 이미다조퀴놀린 아민, 이미다조피리딘 아민, 6,7-융합된 사이클로알킬이미다조피리딘 아민, 1,2-브릿징된 이미다조퀴놀린 아민; 이미퀴모드(imiquimod); 레시퀴모드(resiquimod); DC 표면 분자 CD40의 효능제; 타입 I 인터페론; 폴리 I:C; 박테리아 지질다당류(LPS); VSV-G; HMGB-1; 플라젤린(flagellin) 및 이의 일부 또는 유도체; CpG를 포함하는 면역자극성 DNA 분자; 괴사 세포로부터 방출된 전염증성 자극; 요산염 결정; 보체 연쇄반응의 활성화된 성분; 면역 복합체의 활성화된 성분; 보체 수용체 효능제; 사이토카인; 또는 사이토카인 수용체 효능제를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 애쥬번트는 Toll-유사 수용체 2, 3, 4, 7, 8 또는 9의 효능제를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 애쥬번트는 이미다조퀴놀린 또는 옥소아데닌을 포함한다. 한 구현예에서, 이미다조퀴놀린은 레시퀴모드 또는 이미퀴모드를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 하나 이상의 애쥬번트는 합성 나노운반체의 집단의 합성 나노운반체에 결합된다.
또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 합성 나노운반체의 또 다른 집단을 투여하는 것을 추가로 포함하거나, 상기 방법은 합성 나노운반체의 또 다른 집단을 투여하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 하나 이상의 애쥬번트는 합성 나노운반체의 다른 집단의 합성 나노운반체에 결합된다.
한 추가 구현예에서, 하나 이상의 애쥬번트는 합성 나노운반체에 결합되지 않는다.
또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 하나 이상의 추가 항원을 추가로 포함하거나, 상기 방법은 하나 이상의 추가 항원을 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 한 구현예에서, 하나 이상의 추가 항원은 적어도 하나의 체액성 에피토프 및/또는 적어도 하나의 MHC 클래스 I-제한 에피토프를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 추가 항원은 하나 이상의 체액성 에피토프 및 동일 에피토프가 아닌 적어도 하나의 MHC 클래스 I-제한 에피토프를 포함한다. 한 구현예에서, 하나 이상의 추가 항원은 제2 단백질을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 추가 항원은 체액성 에피토프 및/또는 MHC 클래스 I-제한 에피토프를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 추가 항원은 체액성 에피토프 및 MHC 클래스 I-제한 에피토프를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 추가 항원은 적어도 하나의 체액성 에피토프 및 동일 에피토프가 아닌 적어도 하나의 MHC 클래스 I-제한 에피토프를 포함한다.
한 구현예에서, 하나 이상의 추가 항원은 합성 나노운반체에 결합된다.
또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 합성 나노운반체의 또 다른 집단을 투여하는 것을 추가로 포함하거나, 상기 방법은 합성 나노운반체의 또 다른 집단을 투여하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 하나 이상의 추가 항원은 합성 나노운반체의 다른 집단의 합성 나노운반체에 결합된다.
또 다른 구현예에서, 하나 이상의 추가 항원은 합성 나노운반체에 결합되지 않는다.
한 구현예에서, 합성 나노운반체 및/또는 다른 합성 나노운반체는 중합체 나노입자, 금속 나노입자, 덴드리머(dendrimer), 벅키볼(buckyball), 나노와이어(nanowire), 바이러스-유사 입자 또는 펩티드 또는 단백질 입자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 합성 나노운반체 및/또는 다른 합성 나노운반체는 하나 이상의 중합체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 중합체는 폴리에스테르, 폴리아미노산, 폴리카보네이트, 폴리아세탈, 폴리케탈, 다당류, 폴리에틸옥사졸린 또는 폴리에틸렌이민을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 중합체는 폴리에스테르를 포함한다. 한 구현예에서, 폴리에스테르는 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 폴리(락틱-코-글리콜산) 또는 폴리카프로락톤을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 폴리에스테르는 폴리에테르에 결합된다. 또 다른 구현예에서, 폴리에테르는 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.
한 구현예에서, 제1 단백질 및/또는 하나 이상의 추가 항원은 암, 감염 또는 감염성 질병 또는 비-자가면역 또는 퇴행성 질병과 관련된 항원이다. 또 다른 구현예에서, 제1 단백질 및/또는 하나 이상의 추가 항원은 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 말라리아, 리슈만편모충증, 인간 필로바이러스 감염, 토가바이러스 감염, 알파바이러스 감염, 아레나바이러스 감염, 버냐바이러스 감염, 플라비바이러스 감염, 인간 유두종바이러스 감염, 인간 인플루엔자 A 바이러스 감염, B형 간염 감염 또는 C형 간염 감염과 관련된 항원이다.
또 다른 구현예에서, 피검체는 암, 감염 또는 감염성 질병 또는 비-자가면역 또는 퇴행성 질병을 갖거나, 상기 질병들을 가질 위험이 있다. 또 다른 구현예에서, 피검체는 HIV, 말라리아, 리슈만편모충증, 인간 필로바이러스 감염, 토가바이러스 감염, 알파바이러스 감염, 아레나바이러스 감염, 버냐바이러스 감염, 플라비바이러스 감염, 인간 유두종바이러스 감염, 인간 인플루엔자 A 바이러스 감염, B형 간염 감염 또는 C형 간염 감염을 갖거나, 상기 질병들을 가질 위험이 있다.
또 다른 구현예에서, 발생되는 체액성 및 CTL 면역 반응은 임상적으로 효과적이다. 한 구현예에서, 면역 반응은 피검체에서 암, 감염 또는 감염성 질병 또는 비-자가면역 또는 퇴행성 질병을 치료하거나 예방하는데 효과적이다. 또 다른 구현예에서, 면역 반응은 피검체에서 HIV, 말라리아, 리슈만편모충증, 인간 필로바이러스 감염, 토가바이러스 감염, 알파바이러스 감염, 아레나바이러스 감염, 버냐바이러스 감염, 플라비바이러스 감염, 인간 유두종바이러스 감염, 인간 인플루엔자 A 바이러스 감염, B형 간염 감염 또는 C형 간염 감염을 치료하거나 예방하는데 효과적이다.
한 구현예에서, 상기 조성물은 약학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함한다.
또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 멸균 조성물이다.
또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 동결건조된 형태로부터 재구성된다.
또 다른 양태에서, 상기 제공된 조성물 중 임의의 조성물을 포함하는 투여 형태가 제공된다.
또 다른 양태에서, 상기 제공된 조성물 및 투여 형태 중 임의의 조성물 및 투여 형태를 포함하는 백신이 제공된다.
한 추가 구현예에서, 상기 조성물은 정맥내, 경구, 피하, 폐, 비내, 피내, 경점막, 점막내 또는 근내 투여에 의해 투여된다.
또 다른 양태에서, 본원에 제공된 조성물 중 임의의 조성물을 필요로 하는 피검체에게 본원에 제공된 조성물 중 임의의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 한 구현예에서, 상기 피검체는 인간이다. 또 다른 구현예에서, 상기 피검체는 암을 갖거나, 암을 가질 위험이 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 피검체는 감염 또는 감염성 질병을 갖거나, 상기 질병들을 가질 위험이 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 피검체는 비-자가면역 또는 퇴행성 질병을 갖거나, 상기 질병들을 가질 위험이 있다. 한 추가 구현예에서, 상기 피검체는 HIV를 갖거나, HIV를 가질 위험이 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 피검체는 말라리아, 리슈만편모충증, 인간 필로바이러스 감염, 토가바이러스 감염, 알파바이러스 감염, 아레나바이러스 감염, 버냐바이러스 감염, 플라비바이러스 감염, 인간 유두종바이러스 감염, 인간 인플루엔자 A 바이러스 감염, B형 간염 감염 또는 C형 간염 감염을 갖거나, 상기 질병들을 가질 위험이 있다.
본원에 제공된 방법 중 임의의 방법의 한 구현예에서, 제공된 조성물 중 임의의 조성물이 예방접종 요법에 따라 피검체, 예를 들어, 인간에게 투여될 수 있다.
본원에 제공된 방법 중 임의의 방법의 또 다른 구현예에서, 제공된 조성물 중 임의의 조성물은 제공된 하나 이상의 시험 피검체에서 제1 단백질에 특이적인 체액성 및 CTL 면역 반응을 발생시키는 것으로 이전에 밝혀진 프로토콜에 따라 피검체에 투여될 수 있다.
또 다른 양태에서, 제공된 방법 중 임의의 방법은 피검체에서 체액성 및 CTL 면역 반응을 평가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 체액성 및 CTL 면역 반응을 평가하기 위한 방법은 본원에 제공된 방법 중 임의의 방법일 수 있다.
또 다른 양태에서, 본원에 제공된 조성물 중 임의의 조성물을 제조하는 단계 및 체액성 및 CTL 면역 반응의 발생을 평가하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 한 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 하나의 체액성 에피토프 및 동일 에피토프가 아닌 적어도 하나의 MHC 클래스 I-제한 에피토프를 포함하는 제1 단백질에 결합된 합성 나노운반체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 제1 단백질에 결합된 합성 나노운반체의 집단은 사포닌-콜레스테롤 애쥬번트를 포함하지 않고/않거나, 합성 나노운반체의 집단의 동적광산란을 이용하여 수득된 입자 크기 분포의 평균은 최대 치수가 20 nm 내지 250 nm이다.
한 양태에서, 치료 또는 예방에 사용하기 위한 제1 단백질에 결합된 합성 나노운반체의 집단을 포함하는 조성물이 제공되며, 상기 제1 단백질은 적어도 하나의 체액성 에피토프 및 동일 에피토프가 아닌 적어도 하나의 MHC 클래스 I-제한 에피토프를 포함하고, 상기 합성 나노운반체의 집단은 사포닌-콜레스테롤 애쥬번트를 포함하지 않고, 상기 합성 나노운반체의 집단의 동적광산란을 이용하여 수득된 입자 크기 분포의 평균은 최대 치수가 20 nm 내지 250 nm이다.
또 다른 양태에서, 본원에 제공된 방법 중 임의의 방법에서 사용하기 위한 제1 단백질에 결합된 합성 나노운반체의 집단을 포함하는 조성물이 제공되며, 상기 제1 단백질은 적어도 하나의 체액성 에피토프 및 동일 에피토프가 아닌 적어도 하나의 MHC 클래스 I-제한 에피토프를 포함하고, 상기 합성 나노운반체의 집단은 사포닌-콜레스테롤 애쥬번트를 포함하지 않고, 상기 합성 나노운반체의 집단의 동적광산란을 이용하여 수득된 입자 크기 분포의 평균은 최대 치수가 20 nm 내지 250 nm이다.
또 다른 양태에서, 예방접종에서 사용하기 위한 제1 단백질에 결합된 합성 나노운반체의 집단을 포함하는 조성물이 제공되며, 상기 제1 단백질은 적어도 하나의 체액성 에피토프 및 동일 에피토프가 아닌 적어도 하나의 MHC 클래스 I-제한 에피토프를 포함하고, 상기 합성 나노운반체의 집단은 사포닌-콜레스테롤 애쥬번트를 포함하지 않고, 상기 합성 나노운반체의 집단의 동적광산란을 이용하여 수득된 입자 크기 분포의 평균은 최대 치수가 20 nm 내지 250 nm이다.
또 다른 양태에서, 피검체에서 제1 단백질에 대한 체액성 및 CTL 면역 반응을 발생시키는데 사용하기 위한 제1 단백질에 결합된 합성 나노운반체의 집단을 포함하는 조성물이 제공되며, 상기 제1 단백질은 적어도 하나의 체액성 에피토프 및 동일 에피토프가 아닌 적어도 하나의 MHC 클래스 I-제한 에피토프를 포함하고, 상기 합성 나노운반체의 집단은 사포닌-콜레스테롤 애쥬번트를 포함하지 않고, 상기 합성 나노운반체의 집단의 동적광산란을 이용하여 수득된 입자 크기 분포의 평균은 최대 치수가 20 nm 내지 250 nm이다. 한 구현예에서, 상기 면역 반응은 임상적으로 효과적이다. 또 다른 구현예에서, 상기 면역 반응은 질병에 대한 면역성을 달성하는데 각각 효과적이다.
한 추가 양태에서, 암, 감염 또는 감염성 질병, 비-자가면역 또는 퇴행성 질병, HIV, 말라리아, 리슈만편모충증, 인간 필로바이러스 감염, 토가바이러스 감염, 알파바이러스 감염, 아레나바이러스 감염, 버냐바이러스 감염, 플라비바이러스 감염, 인간 유두종바이러스 감염, 인간 인플루엔자 A 바이러스 감염, B형 간염 감염 또는 C형 간염 감염의 치료 또는 예방 방법에 사용하기 위한 제1 단백질에 결합된 합성 나노운반체의 집단을 포함하는 조성물이 제공되며, 상기 제1 단백질은 적어도 하나의 체액성 에피토프 및 동일 에피토프가 아닌 적어도 하나의 MHC 클래스 I-제한 에피토프를 포함하고, 상기 합성 나노운반체의 집단은 사포닌-콜레스테롤 애쥬번트를 포함하지 않고, 상기 합성 나노운반체의 집단의 동적광산란을 이용하여 수득된 입자 크기 분포의 평균은 최대 치수가 20 nm 내지 250 nm이다.
한 추가 양태에서, 정맥내, 경구, 피하, 폐, 비내, 피내, 경점막, 점막내 또는 근내 투여에 의한 투여를 포함하는 치료 또는 예방 방법에 사용하기 위한 제1 단백질에 결합된 합성 나노운반체의 집단을 포함하는 조성물이 제공되며, 상기 제1 단백질은 적어도 하나의 체액성 에피토프 및 동일 에피토프가 아닌 적어도 하나의 MHC 클래스 I-제한 에피토프를 포함하고, 상기 합성 나노운반체의 집단은 사포닌-콜레스테롤 애쥬번트를 포함하지 않고, 상기 합성 나노운반체의 집단의 동적광산란을 이용하여 수득된 입자 크기 분포의 평균은 최대 치수가 20 nm 내지 250 nm이다.
한 추가 양태에서, 본원에 제공된 방법 중 임의의 방법에서 사용하기 위한 제1 단백질에 결합된 합성 나노운반체의 집단을 포함하는 조성물이 제공되며, 상기 제1 단백질은 적어도 하나의 체액성 에피토프 및 동일 에피토프가 아닌 적어도 하나의 MHC 클래스 I-제한 에피토프를 포함하고, 상기 합성 나노운반체의 집단은 사포닌-콜레스테롤 애쥬번트를 포함하지 않고, 상기 합성 나노운반체의 집단의 동적광산란을 이용하여 수득된 입자 크기 분포의 평균은 최대 치수가 20 nm 내지 250 nm이다.
또 다른 양태에서, 본원에 제공된 조성물 또는 방법 중 임의의 조성물 또는 방법에 대해 정의된 바와 같이 사용하기 위한 조성물이 제공되며, 상기 조성물은 본원에 제공된 조성물 중 임의의 조성물이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 프라임(prime) 및 1회의 부스트(boost)(28일) 예방접종 요법 후 12, 26, 43 및 57일에 발생된 항체 역가를 도시한다.
도 2는 프라임 및 1회의 부스트(14일) 예방접종 요법 후 26일 및 34일에 발생된 항체 역가를 도시한다.
도 3은 난알부민(ovalbumin, OVA)에 결합된 합성 나노운반체에 의한 국소 기억 CTL 반응의 유도를 도시한다.
도 4는 난알부민에 결합된 합성 나노운반체에 의한 중심 CTL 반응의 유도를 도시한다.
도 5는 난알부민 및 애쥬번트를 갖는 합성 나노운반체 조성물에 의한 중심 CTL 유도의 유도를 도시한다.
도 6은 프라임 및 2회의 부스트(14일 및 28일) 예방접종 요법 후 25일 및 42일에서 발생된 항체 역가를 도시한다.
도 7은 NC-R848 + NC-OVA에 의한 단일 주사 후의 항체 역가의 발생을 도시한다. 각 실험 그룹에 대한 개별적 역가 및 평균이 제시된다. 나노운반체=NC=NP.
도 8은 NC-R848 + NC-OVA를 이용한 단일 면역화 후의 생체내에서의 특정 세포독성을 도시한다. 표준 편차와 함께 각 그룹에 대한 평균이 제시된다.
도 9는 CpG 및 OVA 대 자유 CpG(5x) 및 OVA(5x)를 갖는 나노운반체를 이용한 면역화 후의 항-난알부민 항체 역가를 도시한다.
도 10은 CpG 및 OVA 대 자유 CpG(5x) 및 OVA(5x)를 갖는 나노운반체를 이용한 면역화에 의한 유출 림프절 및 비장에서의 OVA-특이적 CTL 반응의 유도를 도시한다.
도 11은 CpG 및 OVA 대 자유 CpG(5x) 및 OVA(5x)를 갖는 나노운반체를 이용한 면역화 후의 시험관내에서의 전신적으로 유도된 OVA-특이적 CTL의 확장을 도시한다. 좌측 Y 축(어두운 줄무늬가 있는 막대) - 확장 후 SIINFEKL(SEQ ID NO:1)의 분획-특이적 CD8+ 세포; 우측 Y 축(밝은 줄무늬가 있는 막대) - 확장전 및 확장후 SIINFEKL(SEQ ID NO:1)-특이적 CTL의 비율로 제시되는 확장 잠재성.
발명의 상세한 설명
본 발명을 상세하게 기재하기 전에, 본 발명은 물론 다양할 수 있는 구체적으로 예시되어 있는 재료 또는 공정 파라미터에 제한되지 않는 것이 이해되어야 한다. 또한, 본원에서 사용된 용어는 본 발명의 특정 구현예를 설명하기 위한 목적일 뿐이며, 본 발명을 기재하는 대안적 용어의 사용을 제한하고자 하지 않음이 이해되어야 한다.
상기 또는 이하에서 본원에서 인용된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 본 명세서에서 모든 목적을 위해 이들 전체내용이 참조로서 포함된다.
본 명세서 및 첨부되는 청구항에서 사용된 바와 같이, 단수 형태("a" "an" 및 "the")는 문맥상 명백히 다르게 지시하지 않는 한 복수의 지시대상체를 포함한다. 예를 들어, "중합체"에 대한 언급은 둘 이상의 이러한 분자의 혼합물 또는 상이한 분자량의 단일의 중합체 종의 혼합물을 포함하며, "합성 나노운반체"에 대한 언급은 둘 이상의 이러한 합성 나노운반체 또는 복수의 이러한 합성 나노운반체의 혼합물을 포함하고, "DNA 분자"에 대한 언급은 둘 이상의 이러한 DNA 분자 또는 복수의 이러한 DNA 분자의 혼합물을 포함하며, "애쥬번트"에 대한 언급은 둘 이상의 이러한 애쥬번트 분자 또는 복수의 애쥬번트 분자의 혼합물을 포함하며, 그 밖에도 동일하다.
본원에서 사용되는 용어 "-들을 포함하다" 또는 "-을 포함한다" 또는 "포함하는"과 같은 이의 변형은 임의의 언급한 정수(예를 들어, 특성, 요소, 특징, 속성, 방법/공정 단계 또는 한정) 또는 정수들의 그룹(예를 들어, 특성들, 요소들, 특징들, 속성들, 방법/공정 단계들 또는 한정들)의 포함을 나타내는 것으로 이해되어야 하나, 임의의 다른 정수 또는 정수들의 그룹을 배제하지는 않는다. 따라서, 본원에서 사용된 용어 "포함하는"은 포괄적인 것이며, 추가적인, 언급되지 않은 정수들 또는 방법/공정 단계들을 배제하지 않는다.
본원에서 제공된 조성물 및 방법 중 임의의 조성물 및 방법의 구현예에서, "포함하는"은 "본질적으로 구성되는" 또는 "구성되는"으로 대체될 수 있다. 어구 "본질적으로 구성되는"은 본원에서 특정 정수(들) 또는 단계들 뿐 아니라 청구된 발명의 특징 또는 기능에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것들을 필요로 하는 것으로 사용된다. 본 명세서에 사용되는 용어 "구성되는"은 언급된 정수(예를 들어, 특성, 요소, 특징, 속성, 방법/공정 단계 또는 한정) 또는 정수들의 그룹(예를 들어, 특성들, 요소들, 특징들, 속성들, 방법/공정 단계들 또는 한정들) 단독의 존재를 나타내는 것으로 사용된다.
A. 도입
치료 또는 예방 백신을 이용한 공격 질병, 예를 들어, HIV, 말라리아, B형 간염 및 암의 치료는 조합된 체액성 및 CTL 면역 반응에 의해 향상될 수 있거나, 일부 환경에서, 상기 조합된 체액성 및 CTL 면역 반응을 필요로 할 수 있다. 조합된 CTL 및 체액성 면역 반응을 생성시키는 것에 대해 백신 방법이 제안되어 왔으나, 대안적 방법이 임상 효능, 안전성, 및/또는 제조성에서 가치있는 개선을 제공할 수 있다. 강하고 효과적인 체액성 및 CTL 면역 반응을 발생시키는 것으로 이전에 밝혀지지 않은 것으로 생각되는 합성 나노운반체 조성물, 및 관련 조성물을 이용하는 방법이 본원에 제공된다. 이러한 조성물은 더욱 효과적인 면역 반응을 발생시키기 위해 관심 면역 세포를 효과적으로 표적으로 할 수 있다.
본 발명자는 상기 기재된 문제 및 제한이 본원에 개시된 발명을 실시함으로써 극복될 수 있음을 예기치 않고 놀랍게도 발견하였다. 특히, 적어도 하나의 체액성 에피토프 및 동일 에피토프가 아닌 적어도 하나의 MHC 클래스 I-제한 에피토프를 포함하는 단백질이 결합되는 합성 나노운반체를 이용하여 효과적인 체액성 및 CTL 면역 반응이 발생될 수 있으며, 상기 합성 나노운반체의 집단은 사포닌-콜레스테롤 애쥬번트를 포함하지 않고, 상기 합성 나노운반체의 집단의 동적광산란을 이용하여 수득된 입자 크기 분포의 평균은 최대 치수가 20 nm 내지 250 nm인 것이 예기치 않고 놀랍게도 발견되었다. 따라서, 한 양태에서, 상기 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 한 구현예에서, 상기 방법은 제1 단백질에 대한 체액성 및 CTL 면역 반응을 필요로 하는 피검체를 확인하는 단계, 및 상기 합성 나노운반체를 포함하는 조성물을 피검체에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 제1 단백질에 대한 체액성 및 CTL 면역 반응을 발생시키는 유효량으로 존재한다. 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 하나 이상의 시험 피검체에서 제1 단백질에 특이적인 체액성 및 CTL 면역 반응을 발생시키는 것으로 이전에 밝혀진 프로토콜에 따라 피검체에 상기 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
구현예들에서, 발생되는 면역 반응은 임상적으로 효과적이다. 일부 구현예에서, 조성물이 투여되는 피검체는 암, 감염 또는 감염성 질병 또는 비-자가면역 또는 퇴행성 질병을 가질 수 있거나, 상기 질병들을 가질 위험이 있을 수 있다. 다른 구현예에서, 피검체는 HIV, 말라리아, 리슈만편모충증, 인간 필로바이러스 감염, 토가바이러스 감염, 알파바이러스 감염, 아레나바이러스 감염, 버냐바이러스 감염, 플라비바이러스 감염, 인간 유두종바이러스 감염, 인간 인플루엔자 A 바이러스 감염, B형 간염 감염 또는 C형 간염 감염을 가질 수 있거나, 상기 질병들을 가질 위험이 있을 수 있다.
다른 구현예에서, 조성물은 예방접종 요법에 따라 피검체, 예를 들어, 인간에게 투여될 수 있다.
본 발명은 이제 하기에 보다 상세히 기재될 것이다.
B. 정의
"애쥬번트"는 특이적 항원을 구성하지 않지만, 동시에 투여된 항원에 대한 면역 반응의 강도 및 수명을 부스팅(boosting)시키는 작용제를 의미한다. 상기 애쥬번트는 패턴 인식 수용체의 자극제, 예를 들어, Toll-유사 수용체, RIG-1 및 NOD-유사 수용체(NLR), 무기염, 예를 들어, 명반(alum), 장내세균, 예를 들어, 에스케리히아 콜리(Escherihia coli), 살모넬라 미네소타(Salmonella minnesota), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 또는 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri)의 모노포스포릴 지질(MPL) A 또는 특히 MPL®(AS04)과 조합된 명반, 개별적으로 상기 언급된 박테리아의 MPL A, 사포닌, 예를 들어, QS-21, Quil-A, ISCOM, ISCOMATRIX™, 에멀젼, 예를 들어, MF59™, Montanide® ISA 51 및 ISA 720, AS02(QS21+스쿠알렌+MPL®), 리포솜 및 리포솜 제형, 예를 들어, AS01, 합성되거나 특이적으로 제조된 미세입자 및 미세운반체, 예를 들어, N. 고노레아(N. gonorrheae), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 및 그 밖의 박테리아의 박테리아-유래된 외막 소포(OMV), 또는 키토산 입자, 데포-형성 작용제(depot-forming agent), 예를 들어, Pluronic® 블록 공중합체, 특이적으로 변형되거나 제조된 펩티드, 예를 들어, 뮤라밀 디펩티드, 아미노알킬 글루코사미니드 4-포스페이트, 예를 들어, RC529, 또는 단백질, 예를 들어, 박테리아 톡소이드 또는 독소 단편을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. "사포닌-콜레스테롤 애쥬번트"는 콜레스테롤과의 혼합에 의해 안정화되는 사포닌 애쥬번트이다. 상기 애쥬번트는, 예를 들어, ISCOM 및 ISCOMATRIX 애쥬번트를 포함한다. 바람직하게는, 일부 구현예에서, 본원에 제공된 합성 나노운반체는 상기 애쥬번트가 아니거나, 상기 애쥬번트를 포함하지 않는다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 조성물은 상기 애쥬번트를 포함하지 않는다.
구현예들에서, 애쥬번트는 Toll-유사 수용체(TLR), 특히 TLR 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9 및/또는 이들의 조합물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 패턴 인식 수용체(PRR)에 대한 효능제를 포함한다. 다른 구현예에서, 애쥬번트는 Toll-유사 수용체 3에 대한 효능제, Toll-유사 수용체 7 및 8에 대한 효능제, 또는 Toll-유사 수용체 9에 대한 효능제를 포함하며; 바람직하게는, 언급된 애쥬번트는 이미다조퀴놀린; 예를 들어, R848; 아데닌 유도체, 예를 들어, 미국 특허 6,329,381호(Sumitomo Pharmaceutical Company), 미국 공개 특허 출원 2010/0075995호(Biggadike et al.), 또는 WO 2010/018132호(Campos et al.)에 개시된 것; 면역자극성 DNA; 또는 면역자극성 RNA를 포함한다. 특정 구현예에서, 합성 나노운반체는 toll-유사 수용체(TLR) 7 & 8에 대한 효능제("TLR 7/8 효능제")를 애쥬번트 화합물로서 포함한다. 이미다조퀴놀린 아민, 이미다조피리딘 아민, 6,7-융합된 사이클로알킬이미다조피리딘 아민, 및 1,2-브릿징된 이미다조퀴놀린 아민을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 미국 특허 6,696,076호(Tomai et al.)에 개시된 TLR 7/8 효능제 화합물이 유용하다. 바람직한 애쥬번트는 이미퀴모드 및 레시퀴모드(R848로도 공지됨)를 포함한다. 특정 구현예에서, 애쥬번트는 DC 표면 분자 CD40에 대한 효능제일 수 있다. 특정 구현예에서, 내성이 아닌 면역성을 자극하기 위해, 합성 나노운반체는 DC 성숙(나이브 T 세포의 프라이밍에 필요함) 및 항체 면역 반응을 촉진하는 사이토카인, 예를 들어, 타입 I 인터페론의 생성을 촉진하는 애쥬번트를 포함한다. 구현예들에서, 애쥬번트는 또한 면역자극성 RNA 분자, 비제한적인 예로, dsRNA, 폴리 I:C 또는 폴리 I:폴리 C12U(Ampligen®로 이용가능함, 폴리 I:C 및 폴리 I:폴리C12U 둘 모두는 TLR3 자극제로 공지됨), 및/또는 문헌[F. Heil et al., "Species-Specific Recognition of Single-Stranded RNA via Toll-like Receptor 7 and 8" Science 303(5663), 1526-1529 (2004); J. Vollmer et al., "Immune modulation by chemically modified ribonucleosides and oligoribonucleotides" WO 2008033432 A2; A. Forsbach et al., "Immunostimulatory oligoribonucleotides containing specific sequence motif(s) and targeting the Toll-like receptor 8 pathway" WO 2007062107 A2; E. Uhlmann et al., "Modified oligoribonucleotide analogs with enhanced immunostimulatory activity" U.S. Pat. Appl. Publ. US 2006241076; G. Lipford et al., "Immunostimulatory viral RNA oligonucleotides and use for treating cancer and infections" WO 2005097993 A2; G. Lipford et al., "Immunostimulatory G,U-containing oligoribonucleotides, compositions, and screening methods" WO 2003086280 A2]에 개시된 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 애쥬번트는 TLR-4 효능제, 예를 들어, 박테리아 지질다당류(LPS), VSV-G, 및/또는 HMGB-1일 수 있다. 일부 구현예에서, 애쥬번트는 미국 특허 6,130,082호, 6,585,980호, 및 7,192,725호에 개시된 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는 TLR-5 효능제, 예를 들어, 플라젤린, 또는 이들의 일부 또는 유도체를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 합성 나노운반체는 타입 I 인터페론 분비를 유도하고, 증가된 항체 생성 및 세포독성 T 세포 반응을 발생시키는 T 및 B 세포 활성화를 자극하는 CpG를 포함하는 면역자극성 DNA 분자와 같은 Toll-유사 수용체(TLR)-9에 대한 리간드를 포함한다(Krieg et al., CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B cell activation. Nature. 1995. 374:546-549; Chu et al. CpG oligodeoxynucleotides act as adjuvants that switch on T helper 1 (Th1) immunity. J. Exp. Med. 1997. 186: 1623-1631; Lipford et al. CpG-containing synthetic oligonucleotides promote B and cytotoxic T cell responses to protein antigen: a new class of vaccine adjuvants. Eur. J. Immunol. 1997. 27:2340-2344; Roman et al. Immunostimulatory DNA sequences function as T helper-1-promoting adjuvants.. Nat. Med. 1997. 3:849-854; Davis et al. CpG DNA is a potent enhancer of specific immunity in mice immunized with recombinant hepatitis B surface antigen. J. Immunol. 1998. 160:870-876; Lipford et al., Bacterial DNA as immune cell activator. Trends Microbiol. 1998. 6:496-500; US Patent 6,207,646 to Krieg et al.; US Patent 7,223,398 to Tuck et al.; US Patent 7,250,403 to Van Nest et al.; 또는 US Patent 7,566,703 to Krieg et al.).
일부 구현예에서, 애쥬번트는 괴사 세포(예를 들어, 요산염 결정)로부터 방출된 전염증성 자극일 수 있다. 일부 구현예에서, 애쥬번트는 보체 연쇄반응의 활성화된 성분(예를 들어, CD21, CD35 등)일 수 있다. 일부 구현예에서, 애쥬번트는 면역 복합체의 활성화된 성분일 수 있다. 애쥬번트는 또한 CD21 또는 CD35에 결합하는 분자와 같은 보체 수용체 효능제를 포함한다. 일부 구현예에서, 보체 수용체 효능제는 합성 나노운반체의 내인성 보체 옵소닌화를 유도한다. 일부 구현예에서, 애쥬번트는 세포에 의해 방출되고, 세포-세포 상호작용, 소통 및 다른 세포의 거동에 대한 특정 효과를 갖는 작은 단백질 또는 생물학적 인자(5 kD - 20 kD의 범위 내)인 사이토카인이다. 일부 구현예에서, 사이토카인 수용체 효능제는 소분자, 항체, 융합 단백질, 또는 앱타머(aptamer)이다.
구현예들에서, 애쥬번트의 용량의 적어도 일부는 합성 나노운반체에 결합될 수 있고, 바람직하게는, 애쥬번트의 용량 모두는 합성 나노운반체에 결합된다. 다른 구현예에서, 애쥬번트의 용량의 적어도 일부는 합성 나노운반체에 결합되지 않는다. 구현예들에서, 애쥬번트의 용량은 2개 이상의 유형의 애쥬번트를 포함한다. 예를 들어, 비제한적으로, 다양한 TLR 수용체에 대해 작용하는 애쥬번트는 조합될 수 있다. 예로서, 한 구현예에서, TLR 7/8 효능제는 TLR 9 효능제와 조합될 수 있다. 또 다른 구현예에서, TLR 7/8 효능제는 TLR 4 효능제와 조합될 수 있다. 또 다른 구현예에서, TLR 9 효능제는 TLR 3 효능제와 조합될 수 있다.
"투여하는" 또는 "투여"는 약리학적으로 유용한 방식으로 피검체에 물질, 예를 들어, 약물을 제공하는 것을 의미한다.
"유효량"은 하나 이상의 요망되는 반응, 예를 들어, 하나 이상의 요망되는 면역 반응을 생성시키는 본원에 제공된 조성물의 임의의 양이다. 이러한 양은 시험관내 또는 생체내 목적을 위한 것일 수 있다. 생체내 목적을 위해, 상기 양은 임상의가 단일 단백질에 대한 체액성 면역 반응 및 CTL 면역 반응을 필요로 하는 피검체에 대해 임상적 이점을 가질 수 있는 것으로 생각하는 양일 수 있다. 임상의가 상기 피검체에 대해 임상적 이점을 가질 수 있는 것으로 생각하는 유효량은 "임상적 유효량"으로 또한 본원에 언급된다. 구현예들에서, 본원에 제공된 조성물에 의해 유도되는 체액성 면역 반응 및 CTL 면역 반응 둘 모두는 면역계의 상기 아암 각각으로부터의 임상 효과를 발생시킨다. 다른 구현예에서, 임상적 유효량은 단일 단백질에 대한 체액성 면역 반응 및 CTL 면역 반응이 이점을 제공하는 질병 또는 질환을 갖는 피검체의 치료에 도움이 될 수 있는 유효량이다. 상기 피검체는, 일부 구현예에서, 암, 감염 또는 감염성 질병 또는 비-자가면역 또는 퇴행성 질병을 갖거나, 상기 질병들을 가질 위험이 있는 피검체를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 피검체는 HIV, 말라리아, 리슈만편모충증, 인간 필로바이러스 감염, 토가바이러스 감염, 알파바이러스 감염, 아레나바이러스 감염, 버냐바이러스 감염, 플라비바이러스 감염, 인간 유두종바이러스 감염, 인간 인플루엔자 A 바이러스 감염, B형 간염 감염 또는 C형 간염 감염을 갖거나, 상기 질병들을 가질 위험이 있는 피검체이다.
유효량은 본원에 제공된 조성물 중 하나로 투여되는 체액성 에피토프에 대한 체액성 면역 반응 및 MHC 클래스 I-제한 에피토프에 대한 CTL 면역 반응의 생성을 포함하는 양을 포함한다. 피검체의 체액성 및 CTL 면역 반응은 통상적인 방법에 의해 모니터될 수 있다. 본원에 제공된 바와 같은 요망되는 면역 반응을 발생시키는 유효량은 또한 요망되는 치료적 종점 또는 요망되는 치료적 결과를 발생시키는 본원에 제공된 조성물의 양일 수 있다. 한 구현예에서, 유효량은 질병 또는 본원에 제공된 바와 같은 질병을 야기시키는 작용제에 대한 효과적인 면역성을 제공하는 양이다. 또 다른 구현예에서, 면역성은 적어도 6, 12, 18, 24, 36, 48, 60 또는 그 초과의 개월 동안 피검체에서 지속된다. 또 다른 구현예에서, 면역성은 예방접종 요법에 따라 본원에 제공된 조성물의 투여로 인해 발생하거나 지속된다.
유효량은 물론 보건의의 지식 및 의견 내에서 치료되는 특정 피검체; 질환, 질병 또는 장애의 중증도; 연령, 신체 상태, 크기 및 체중을 포함하는 개별 환자의 파라미터; 치료 기간; 동반 치료(존재시)의 특성; 특정 투여 경로 및 유사 요인에 좌우될 것이다. 이러한 요인은 당업자에게 널리 공지되어 있고, 이는 통상적인 실험 내에서 다루어질 수 있다. 일반적으로, 최대 용량, 즉 확실한 임상적 판단에 따른 안전한 가장 높은 용량이 사용되는 것이 바람직하다. 그러나, 환자는 임상적 이유, 심리학적 이유 또는 실질적으로 임의의 다른 이유로 보다 적은 용량 또는 관용 용량을 고수할 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다.
일반적으로, 본 발명의 조성물의 용량은 약 10㎍/㎏ 내지 약 100,000㎍/㎏의 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 용량은 약 0.1㎎/㎏ 내지 약 100㎎/㎏의 범위일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 용량은 약 0.1㎎/㎏ 내지 약 25㎎/㎏, 약 25㎎/㎏ 내지 약 50㎎/㎏, 약 50㎎/㎏ 내지 약 75㎎/㎏ 또는 약 75㎎/㎏ 내지 약 100㎎/㎏의 범위일 수 있다. 대안적으로, 상기 용량은 합성 나노운반체의 개수에 기초하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 유용한 용량은 용량당 106, 107, 108, 109 또는 1010개 초과의 합성 나노운반체를 포함한다. 다른 유용한 용량의 예에는 용량당 약 1×106 내지 약 1×1010, 약 1×107 내지 약 1×109개 또는 약 1×108 내지 약 1×109개의 합성 나노운반체가 포함된다.
"항원"은 하나 이상의 면역 반응을 발생시킬 수 있는 임의의 항원을 의미한다. 항원은 체액성 및/또는 CTL 면역 반응을 발생시키는 것일 수 있다. 상기 항원은 펩티드, 소분자, 올리고당류, 및 탄수화물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 상기 항원은 비-단백질 항원(즉, 단백질 또는 펩티드 항원이 아님)을 포함한다. 일부 구현예에서, 체액성 면역 반응을 발생시키는 항원은 감염성 작용제와 관련된 탄수화물을 포함한다. 일부 구현예에서, 체액성 면역 반응을 발생시키는 항원은 감염성 작용제와 관련된 당단백질 또는 당펩티드를 포함한다. 감염성 작용제는 박테리아, 바이러스, 진균, 원생동물, 또는 기생충일 수 있다. 항원은 B 세포 또는 T 세포 항원일 수 있다.
본원에 제공된 본 발명의 방법에 사용하기 위한 합성 나노운반체 조성물은 적어도 하나의 체액성 에피토프 및 동일 에피토프가 아닌 적어도 하나의 MHC 클래스 I-제한 에피토프를 포함하는 단백질인 항원에 결합된다. 상기 조성물은, 일부 구현예에서, 제한될 수 있으나 반드시 그러하지는 않을 수 있는 하나 이상의 추가 항원을 포함할 수 있다. 본원에 제공된 방법 및 조성물에서 사용하기 위한 하나 이상의 추가 항원은 체액성 에피토프 및/또는 MHC 클래스 I-제한 에피토프를 포함하는 항원을 포함하는 임의의 항원일 수 있다. 하나 이상의 추가 항원은 또한 MHC 클래스 II-제한 에피토프를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 추가 항원은 체액성 면역 반응을 발생시키는 임의의 항원일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 추가 항원은 CD-I 제한 항원을 포함하는 본원에 기재된 T 세포 항원 중 임의의 T 세포 항원일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 추가 항원은 단백질, 펩티드, 소분자, 올리고당류 및 탄수화물일 수 있다.
구현예들에서, 적어도 하나의 체액성 에피토프 및 동일 에피토프가 아닌 적어도 하나의 MHC 클래스 I-제한 에피토프를 포함하는 단백질을 포함하는 항원이 합성 나노운반체에 결합된다. 다른 구현예에서, 항원은 합성 나노운반체에 결합되지 않는다. 또 다른 구현예에서, 항원은 합성 나노운반체 내에 캡슐화된다. "항원의 유형(들)"은 동일하거나 실질적으로 동일한 항원성 특징을 공유하는 분자를 의미한다.
본원에 제공되는 질병, 장애 또는 질환과 "관련된 항원"은 질병, 장애 또는 질환의 결과로서 또는 이와 조합되어; 질병, 장애 또는 질환(또는 이의 증상 또는 영향)의 원인에 대한 원치 않는 면역 반응을 발생시킬 수 있고/거나; 질병, 장애 또는 질환의 증상, 결과 또는 영향인 원치 않는 면역 반응을 발생시킬 수 있는 항원이다. 암과 같은 일부 구현예에서, 상기 항원은 병에 걸린 세포, 예를 들어, 암 또는 종양 세포 내 또는 상기 세포 상에서 발현되나, 정상 또는 건강한 세포(또는 병에 걸리지 않은 세포) 내 또는 상기 세포 상에서는 발현되지 않는다. 상기 항원은 또한 병에 걸린 세포 내 또는 상 및 정상 또는 건강한 세포(또는 병에 걸리지 않은 세포) 상에서 발현되나, 정상 또는 건강한 세포(또는 병에 걸리지 않은 세포) 상에서보다 큰 수준으로 질병에 걸린 세포 내 또는 상에서 발현되는 항원을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본원에 제공된 질병 또는 질환과 관련된 항원의 사용은 정상 또는 건강한 세포에 대한 실질적 또는 유해한 면역 반응을 초래하지 않거나, 정상 또는 건강한 세포(또는 질병에 걸리지 않은 세포)에 대한 임의의 면역 반응보다 더한 질병 또는 질환에 대한 이로운 면역 반응을 초래할 것이다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 질병 또는 질환과 관련된 항원은 체액성 및/또는 MHC 클래스 I-제한 에피토프를 포함하는 합성 나노운반체에 결합되는 단백질이다. 다른 구현예에서, 상기 단백질은 체액성 및 MHC 클래스 I-제한 에피토프를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 단백질은 적어도 하나의 체액성 에피토프 및 동일 에피토프가 아닌 적어도 하나의 MHC 클래스 I-제한 에피토프를 포함한다. 상기 단백질을 포함하는 항원의 예는 본원의 다른 곳에 제공된다.
"용량의 적어도 일부"는 용량의 전부를 포함하는 범위의 용량의 적어도 일부의 부분을 의미한다.
"위험이 있는" 피검체는 보건의가 본원에 제공된 바와 같은 질병 또는 질환을 가질 가능성을 갖는 것으로 생각하는 피검체이다.
"B 세포 항원"은 B 세포에서의 면역 반응에 의해 인지되거나 촉발되는 임의의 항원(예를 들어, B 세포 또는 그 위의 수용체에 의해 특이적으로 인지되는 항원)을 의미한다. 일부 구현예에서, T 세포 항원인 항원은 또한 B 세포 항원이다. 다른 구현예에서, T 세포 항원은 또한 B 세포 항원이 아니다. B 세포 항원은 단백질, 펩티드, 소분자, 올리고당류 및 탄수화물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
"결합" 또는 "결합된" 또는 "결합들" (등)은 하나의 엔티티(entity)(예를 들어, 하나의 모이어티(moiety))를 다른 것에 화학적으로 회합시키는 것을 의미한다. 일부 구현예에서, 결합은 공유이며, 이는 결합이 2개의 엔티티 사이의 공유 결합의 존재의 상황에서 발생하는 것을 의미한다. 비-공유 구현예에서, 비-공유 결합은 전하 상호작용, 친화성 상호작용, 금속 배위, 물리적 흡착(absorption), 호스트-게스트 상호작용, 소수성 상호작용, TT 스태킹(stacking) 상호작용, 수소 결합 상호작용, 반데르발스 상호작용, 자기적 상호작용, 정전기적 상호작용, 쌍극자-쌍극자 상호작용 및/또는 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는 비-공유 상호작용에 의해 매개된다. 구현예들에서, 캡슐화는 결합의 한 형태이다.
"세포독성 T 림프구(CTL) 면역 반응"은 세포독성 T 세포, 바람직하게는 에피토프, 예를 들어, MHC 클래스 I-제한 에피토프에 특이적인 세포독성 T 세포의 임의의 자극, 유도 또는 증식을 의미한다. 구현예들에서, 에피토프는 본원에 제공된 질병 또는 질환 중 임의의 질병 또는 질환과 관련된 항원이거나, 상기 질병 또는 질환과 관련된 항원의 에피토프이다. CTL 면역 반응을 평가하기 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 상기 방법의 예는 실시예에 제공된다.
"투여 형태"는 피검체로의 투여에 적절한 매질, 운반체, 비히클 또는 장치 중의 약리학적 및/또는 면역학적 활성 물질을 의미한다.
"캡슐화"는 합성 나노운반체 내에 물질의 적어도 일부가 둘러싸이는 것을 의미한다. 일부 구현예에서, 물질이 합성 나노운반체 내에서 완전히 둘러싸인다. 다른 구현예에서, 캡슐화되는 대부분의 물질 또는 모든 물질은 합성 나노운반체의 외부 국소 환경에 노출되지 않는다. 다른 구현예에서, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5%(중량/중량) 이하가 국소 환경에 노출된다. 캡슐화는 합성 나노운반체의 표면 상에 대부분의 물질 또는 모든 물질을 배치하고, 물질이 합성 나노운반체의 외부의 국소 환경에 노출되게 남겨두는 흡착과는 상이하다.
항원 결정기로도 공지된 "에피토프"는 면역계, 특히, 예를 들어, 항체, B 세포, 또는 T 세포에 의해 인지되는 항원의 일부이다. 본원에서 사용되는 "체액성 에피토프"는 항체 또는 B 세포에 의해 인지되는 것인 반면, "MHC 클래스 I-제한 에피토프"는 유핵 세포에서 발견되는 MHC 클래스 I 분자에 의해 면역 세포에 제시되는 것이다. "MHC 클래스 II-제한 에피토프"는 항원 제시 세포(APC), 예를 들어, 전문적인 항원-제시 면역 세포, 예를 들어, 대식세포, B 세포, 및 수지상 세포, 또는 비-조혈 세포, 예를 들어, 간세포 상에서 발견되는 MHC 클래스 II 분자에 의해 면역 세포에 제시되는 에피토프이다.
수많은 에피토프가 당업자에게 공지되어 있으며, 본 발명의 일부 양태에 따라 적절한 예시적인 에피토프에는 면역 에피토프 데이터베이스(Immune Epitope Database)(www.immuneepitope.org, Vita R, Zarebski L, Greenbaum JA, Emami H, Hoof I, Salimi N, Damle R, Sette A, Peters B. The immune epitope database 2.0. Nucleic Acids Res. 2010 Jan;38(Database issue):D854-62; IEDB 버전 2.4의 전체 내용 뿐 아니라 모든 데이터베이스 엔트리, 2011년 8월, 및 특히 상기 문헌에 개시된 모든 에피토프가 본원에 참고로 포함됨)에 열거된 것들이 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 또한, 에피토프는 공중 이용가능한 알고리즘, 예를 들어, 문헌[Wang P, Sidney J, Kim Y, Sette A, Lund O, Nielsen M, Peters B. 2010. peptide binding predictions for HLA DR, DP and DQ molecules. BMC Bioinformatics 2010, 11:568; Wang P, Sidney J, Dow C, Mothe B, Sette A, Peters B. 2008. A systematic assessment of MHC class II peptide binding predictions and evaluation of a consensus approach. PLoS Comput Biol. 4(4):e1000048; Nielsen M, Lund O. 2009. NN-align. An artificial neural network-based alignment algorithm for MHC class II peptide binding prediction. BMC Bioinformatics. 10:296; Nielsen M, Lundegaard C, Lund O. 2007. Prediction of MHC class II binding affinity using SMM-align, a novel stabilization matrix alignment method. BMC Bioinformatics. 8:238; Bui HH, Sidney J, Peters B, Sathiamurthy M, Sinichi A, Purton KA, Mothe BR, Chisari FV, Watkins DI, Sette A. 2005. Immunogenetics. 57:304-314; Sturniolo T, Bono E, Ding J, Raddrizzani L, Tuereci O, Sahin U, Braxenthaler M, Gallazzi F, Protti MP, Sinigaglia F, Hammer J. 1999. Generation of tissue-specific and promiscuous HLA ligand databases using DNA microarrays and virtual HLA class II matrices. Nat Biotechnol. 17(6):555-561; Nielsen M, Lundegaard C, Worning P, Lauemoller SL, Lamberth K, Buus S, Brunak S, Lund O. 2003. Reliable prediction of T-cell epitopes using neural networks with novel sequence representations. Protein Sci 12:1007-1017; Bui HH, Sidney J, Peters B, Sathiamurthy M, Sinichi A, Purton KA, Mothe BR, Chisari FV, Watkins DI, Sette A. 2005. Automated generation and evaluation of specific MHC binding predictive tools: ARB matrix applications. Immunogenetics 57:304-314; Peters B, Sette A. 2005. Generating quantitative models describing the sequence specificity of biological processes with the stabilized matrix method. BMC Bioinformatics 6:132; Chou PY, Fasman GD. 1978. Prediction of the secondary structure of proteins from their amino acid sequence. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol 47:45-148; Emini EA, Hughes JV, Perlow DS, Boger J. 1985. Induction of hepatitis A virus-neutralizing antibody by a virus-specific synthetic peptide. J Virol 55:836-839; Karplus PA, Schulz GE. 1985. Prediction of chain flexibility in proteins. Naturwissenschaften 72:212-213; Kolaskar AS, Tongaonkar PC. 1990. A semi-empirical method for prediction of antigenic determinants on protein antigens. FEBS Lett276:172-174; Parker JM, Guo D, Hodges RS. 1986. New hydrophilicity scale derived from high-performance liquid chromatography peptide retention data: correlation of predicted surface residues with antigenicity and X-ray-derived accessible sites. Biochemistry 25:5425-5432; Larsen JE, Lund O, Nielsen M. 2006. Improved method for predicting linear B-cell epitopes. Immunome Res 2:2; Ponomarenko JV, Bourne PE. 2007. Antibody-protein interactions: benchmark datasets and prediction tools evaluation. BMC Struct Biol 7:64; Haste Andersen P, Nielsen M, Lund O. 2006. Prediction of residues in discontinuous B-cell epitopes using protein 3D structures. Protein Sci 15:2558-2567; Ponomarenko JV, Bui H, Li W, Fusseder N, Bourne PE, Sette A, Peters B. 2008. ElliPro: a new structure-based tool for the prediction of antibody epitopes. BMC Bioinformatics 9:514; Nielsen M, Lundegaard C, Blicher T, Peters B, Sette A, Justesen S, Buus S, and Lund O. 2008. PLoS Comput Biol.4(7)e1000107. Quantitative predictions of peptide binding to any HLA-DR molecule of known sequence: NetMHCIIpan]에 기재된 알고리즘으로 확인될 수 있으며; 상기 문헌 각각의 전체 내용은 에피토프의 확인을 위한 방법 및 알고리즘의 개시내용을 위한 참조로 본원에 포함된다.
"발생시키는"은 작용, 예를 들어, 에피토프에 대한 면역 반응(예를 들어, 체액성 면역 반응 또는 CTL 면역 반응)이 단독으로 직접적으로 또는, 비제한적으로, 용어 또는 실행에 대한 의존을 통해 작용하는 관련되지 않은 제3의 파티에 의해 간접적으로 발생하도록 하는 것을 의미한다.
"체액성 면역 반응"은 B 세포의 생성 또는 자극 및/또는 항체의 생성을 발생시키는 임의의 면역 반응을 의미한다. 바람직하게는, 체액성 면역 반응은 본 발명의 조성물에 포함되거나 본 발명의 방법의 실시 동안 투여되는 에피토프에 특이적이다. 체액성 반응이 유도되는지의 여부를 평가하기 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 항체의 생성은 "항체 반응"으로 본원에서 언급된다. "항체 역가"는 측정가능한 수준의 항체의 생성을 의미한다. 바람직하게는, 항체 반응 또는 항체 역가의 발생은 인간에서의 항체 반응 또는 항체 역가의 발생이다. 일부 구현예에서, 항체는 특정 아이소형(isotype), 예를 들어, IgG 또는 이의 하위클래스의 항체이다. 항체 역가를 측정하기 위한 방법은 당 분야에 공지되어 있고, 이는 효소결합면역흡착검정(ELISA)을 포함한다. 항체 역가를 측정하기 위한 방법은 또한 실시예에 다소 상세하게 기재되어 있다. 바람직하게는, 항체 반응 또는 항체 역가는 본원에 제공된 바와 같은 에피토프에 특이적이다. 구현예들에서, 항체 반응은, 예를 들어, 항체의 수, 항체의 농도 또는 역가로서 정량될 수 있다. 상기 값은 절대값일 수 있거나, 이들은 상대값일 수 있다. 항체 반응을 정량하기 위한 검정은 항체 포획 검정, 효소결합면역흡착검정(ELISA), 억제 액체상 흡착 검정(ILPAA), 로케트 면역전기영동(RIE) 검정 및 라인 면역전기영동(line Immunoelectrophoresis, LIE) 검정을 포함한다. 항체 반응을 또 다른 항체 반응과 비교하는 경우, 비교를 하기 위해 바람직하게는 동일 유형의 정량적 값(예를 들어, 역가) 및 측정 방법(예를 들어, ELISA)이 사용된다.
항체 역가를 측정하기 위한 ELISA 방법은, 예를 들어, (i) 관심 항체 표적이 기질 중합체 또는 다른 적합한 물질에 결합되도록 ELISA-플레이트 코팅 물질을 제조하는 단계, (ii) 수용액(예를 들어, PBS) 중에 코팅 물질을 제조하고, 다중웰 플레이트로의 코팅의 밤새 증착을 위해 다중웰 플레이트의 웰로 코팅 물질 용액을 전달하는 단계, (iii) 과량의 코팅 물질을 제거하기 위해 세척 완충액(예를 들어, PBS 중 0.05% Tween-20)을 이용하여 다중웰 플레이트를 충분히 세척하는 단계, (iv) 희석 용액(예를 들어, PBS 중 10% 소 태아 혈청)을 적용함으로써 비특이적 결합에 대해 플레이트를 블로킹하는 단계, (v) 세척 완충액을 이용하여 플레이트로부터 블로킹/희석 용액을 세척하는 단계, (vi) ELISA 반응을 적합하게 포화시키는 농도를 수득하는데 필요한 바에 따라 희석제를 이용하여 항체를 함유하는 혈청 샘플(들) 및 적절한 표준(양성 대조군)을 희석시키는 단계, (vii) ELISA 반응 곡선을 발생시키는데 적합한 일정 범위의 농도를 포함하도록 다중웰 플레이트 상의 혈장 샘플을 연속적으로 희석시키는 단계, (viii) 항체-표적 결합을 제공하기 위해 플레이트를 인큐베이션시키는 단계, (ix) 항원에 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 세척 완충액으로 플레이트를 세척하는 단계, (x) 일차 항체에 결합할 수 있는 비오틴-결합된 검출 항체와 같은 동일 희석액 중에 적절한 농도의 이차 검출 항체를 첨가하는 단계, (xi) 적용된 검출 항체와 함께 플레이트를 인큐베이션시킨 후, 세척 완충액으로 세척하는 단계, (xii) 비오티닐화된 항체에서 발견되는 비오틴에 결합하는 스트렙타비딘-HRP(호스라디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase))와 같은 효소를 첨가하고 인큐베이션하는 단계, (xiii) 다중웰 플레이트를 세척하는 단계, (xiv) 플레이트에 기질(들)(예를 들어, TMB 용액)을 첨가하는 단계, (xv) 색 발달이 완료되는 경우 정지 용액(예를 들어, 2N 황산)을 적용시키는 단계, (xvi) 기질에 대한 특이적 파장(570 nm에서의 판독의 공제와 함께 450 nm)에서 플레이트 웰의 광학 밀도를 판독하는 단계, (xvi) 데이터에 대해 적합한 다중파라미터 곡선 적합도를 적용시키고, 플레이트 표준에 대한 최대 절반 OD 값이 달성되는 곡선 상의 농도로서 최대 절반 유효 농도(EC50)를 규정하는 단계로 구성될 수 있다.
"확인하는"은 임상의가 피검체를 본원에 제공된 방법 및 조성물로부터 이로울 수 있는 피검체로서 인지하는 것을 가능케 하는 임의의 작용 또는 일련의 작용들이다. 바람직하게는, 확인된 피검체는 단일 단백질에 대한 체액성 면역 반응 및 CTL 면역 반응을 필요로 하는 피검체이다. 상기 피검체는 본원에 제공된 질병 또는 질환 중 임의의 질병 또는 질환을 갖거나, 상기 질병들을 가질 위험이 있는 임의의 피검체를 포함한다. 상기 작용 또는 일련의 작용들은 단독으로 직접적으로 또는, 비제한적으로, 용어 또는 실행에 대한 의존을 통해 작용하는 관련되지 않은 제3의 파티에 의해 간접적으로 이루어질 수 있다.
"감염" 또는 "감염성 질병"은 미생물, 병원체 또는 다른 작용제, 예를 들어, 박테리아, 진균, 프리온 또는 바이러스에 의해 야기되는 임의의 질환 또는 질병이다.
"합성 나노운반체의 최대 치수"는 합성 나노운반체의 임의의 축을 따라 측정되는 나노운반체의 가장 큰 치수를 의미한다. "합성 나노운반체의 최소 치수"는 합성 나노운반체의 임의의 축을 따라 측정되는 합성 나노운반체의 가장 작은 치수를 의미한다. 예를 들어, 구형 합성 나노운반체에 있어서, 합성 나노운반체의 최대 및 최소 치수는 실질적으로 동일할 것이며, 이의 직경의 크기일 것이다. 유사하게, 입방형 합성 나노운반체에 있어서, 합성 나노운반체의 최소 치수는 이의 높이, 너비 또는 길이 중 가장 작은 것일 것이며, 합성 나노운반체의 최대 치수는 이의 높이, 너비 또는 길이 중 가장 큰 것일 것이다. 일 구현예에서, 샘플 중의 합성 나노운반체의 총 개수에 기초하여, 샘플 중의 합성 나노운반체의 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%의 최소 치수는 100nm 이상이다. 일 구현예에서, 샘플 중의 합성 나노운반체의 총 개수에 기초하여, 샘플 중의 합성 나노운반체의 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%의 최대 치수는 5㎛ 이하이다. 바람직하게는, 샘플 중의 합성 나노운반체의 총 개수에 기초하여, 샘플 중의 합성 나노운반체의 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%의 최소 치수는 110nm 초과, 더욱 바람직하게는 120nm 초과, 더욱 바람직하게는 130nm 초과, 더욱 바람직하게는 150nm 초과이다. 본 발명의 합성 나노운반체의 최대 대 최소 치수의 종횡비는 구현예에 따라 다양할 수 있다. 예를 들어, 합성 나노운반체의 최대 대 최소 치수의 종횡비는 1:1 내지 1,000,000:1, 바람직하게는 1:1 내지 100,000:1, 더욱 바람직하게는 1:1 내지 10,000:1, 더욱 바람직하게는 1:1 내지 1000:1, 더욱 바람직하게는 1:1 내지 100:1, 더욱 바람직하게는 1:1 내지 10:1로 다양할 수 있다. 바람직하게는, 샘플 중의 합성 나노운반체의 총 개수에 기초하여, 샘플 중의 합성 나노운반체의 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%의 최대 치수는 3㎛ 이하, 더욱 바람직하게는 2㎛ 이하, 더욱 바람직하게는 1㎛ 이하, 더욱 바람직하게는 800nm 이하, 더욱 바람직하게는 600nm 이하, 더욱 바람직하게는 500nm 이하이다. 바람직한 구현예에서, 샘플 중의 합성 나노운반체의 총 개수에 기초하여, 샘플 중의 합성 나노운반체의 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%의 최소 치수는 100nm 이상, 더욱 바람직하게는 120nm 이상, 더욱 바람직하게는 130nm 이상, 더욱 바람직하게는 140nm 이상, 더욱 바람직하게는 150nm 이상이다. 합성 나노운반체 치수(예를 들어, 직경)의 측정은 합성 나노운반체를 액체(통상 수성) 매질 중에 현탁시키고, 동적광산란(DLS)(예를 들어, Brookhaven ZetaPALS 기기를 사용)을 사용하여 수득된다. 예를 들어, 합성 나노운반체의 현탁액은 수성 완충제로부터 정제수로 희석하여, 약 0.01 내지 0.1㎎/㎖의 최종 합성 나노운반체 현탁액 농도가 달성될 수 있다. 희석된 현탁액은 내측에서 직접적으로 제조되거나, DLS 분석에 적절한 큐벳(cuvette)으로 전달될 수 있다. 이후, 큐벳은 DLS에 배치되고, 조절된 온도로 평형화된 후, 충분한 시간 동안 스캐닝되어, 매질의 점도 및 샘플의 굴절률에 대한 적절한 입력에 기초하여 안정한 재현가능한 분포가 획득될 수 있다. 이후, 유효 직경 또는 분포의 평균이 보고된다. 합성 나노운반체의 "치수", "크기" 또는 "직경"은 동적광산란을 사용하여 수득되는 입자 크기 분포의 평균을 의미한다.
"MHC"는 세포 표면상의 처리된 단백질의 단편 또는 에피토프를 제시하는 MHC 분자를 인코딩하는 대부분의 척추동물에서 관찰되는 주조직적합성 복합체, 큰 유전체 영역 또는 유전자 패밀리를 나타낸다. 세포 표면상의 MHC:펩티드의 제시는 면역 세포, 통상 T 세포에 의한 감시를 가능하게 한다. 2개의 일반적 MHC 분자의 부류가 존재한다: 클래스 I 및 클래스 II. 일반적으로, 클래스 I MHC 분자는 유핵 세포상에서 관찰되며, 펩티드를 세포독성 T 세포에 제시한다. 클래스 II MHC 분자는 소정의 면역 세포, 주로, 집합적으로 APC로 알려져 있는 대식세포, B 세포 및 수지상 세포상에서 관찰된다. MHC 영역 내의 가장 잘 알려져 있는 유전자는 세포 표면 상의 항원-제시 단백질을 인코딩하는 서브셋이다. 인간에서, 이들 유전자는 인간 백혈구 항원(HLA) 유전자로 언급된다.
"약학적으로 허용되는 부형제"는 본 발명의 조성물을 제형화하기 위해 열거된 합성 나노운반체와 함께 사용되는 약리학적 비활성 물질을 의미한다. 약학적으로 허용되는 부형제는 당류(예를 들어, 글루코스, 락토스 등), 보존제, 예를 들어, 항미생물제, 재구성 보조제, 착색제, 염수(예를 들어, 포스페이트 완충 염수) 및 완충제를 포함하나 이들에 제한되지는 않는 당 분야에 공지된 다양한 물질을 포함한다.
"단백질(들)"은 통상적으로 인접한 아미노산 잔기의 카르복실기와 아미노기 사이의 펩티드 결합에 의해 주로 함께 연결된 아미노산 잔기를 포함하는 1000 달톤을 초과하는 분자량을 갖는 화합물을 의미한다. 단백질은 또한 추가 결합 구조, 예를 들어, 이차 구조, 삼차 구조 등을 포함할 수 있다. 단백질에서의 특정 펩티드 결합은 다양한 목적, 예를 들어, 안정화 또는 결합을 위해 다른 결합 유형에 의해 대체될 수 있다. 합성 나노운반체에 결합되는 경우, 바람직하게는, 각각의 합성 나노운반체에 결합되는 단백질의 다수의 카피가 존재한다.
"프로토콜"은 피검체로의 하나 이상의 물질의 임의의 투여 요법을 나타낸다. 투여 요법은 투여량, 투여 빈도 및/또는 투여 방식을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 프로토콜은 하나 이상의 시험 피검체에게 본 발명의 하나 이상의 조성물을 투여하는데 사용될 수 있다. 상기 시험 피검체에서의 면역 반응은 이후 상기 프로토콜이 요망되는 면역 반응(들)을 발생시키는데 효과적인지 아닌지의 여부를 결정하기 위해 평가될 수 있다. 임의의 다른 치료적 및/또는 예방적 효과는 또한 상기 언급된 면역 반응 대신 또는 상기 언급된 면역 반응에 더하여 평가될 수 있다. 프로토콜이 요망되는 효과를 갖는지 아닌지의 여부는 본원에 제공되거나 당 분야에 달리 공지된 방법 중 임의의 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 세포의 집단은 본원에 제공된 조성물이 특정 면역 세포, 사이토카인, 항체 등이 발생되거나 활성화되었거나 그렇지 않은 지의 여부 등을 결정하기 위해 특정 프로토콜에 따라 투여된 피검체로부터 수득될 수 있다. 면역 세포의 존재 및/또는 수를 검출하기에 유용한 방법은 유세포분석법(예를 들어, FACS) 및 면역조직화학 방법을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 면역 세포 마커의 특이적 염색을 위한 항체 및 다른 결합제는 상업적으로 이용가능하다. 상기 키트는 통상적으로 세포의 이종성 집단으로부터 요망되는 세포 집단의 FACS-기반 검출, 분리 및/또는 정량을 가능케 하는 다수의 항원에 대한 염색 시약을 포함한다.
"피검체"는 온혈 포유동물, 예를 들어 인간 및 영장류; 조류; 가정 또는 농장 동물, 예를 들어, 고양이, 개, 양, 염소, 소, 말 및 돼지; 실험실 동물, 예를 들어, 마우스, 래트 및 기니아 피그; 어류; 파충류; 동물원 및 야생 동물 등을 포함하는 동물을 의미한다.
"합성 나노운반체(들)"는 자연에서 관찰되지 않으며, 크기가 5㎛ 이하인 적어도 하나의 치수를 갖는 별개의 피검체를 의미한다. 알부민 나노입자는 일반적으로 합성 나노운반체로서 포함되나, 특정 구현예에서, 합성 나노운반체는 알부민 나노입자를 포함하지 않는다. 구현예들에서, 합성 나노운반체는 키토산을 포함하지 않는다. 특정한 다른 구현예에서, 합성 나노운반체는 키토산을 포함하지 않는다. 다른 구현예에서, 본 발명의 합성 나노운반체는 지질-기반의 나노입자가 아니다. 추가의 구현예에서, 본 발명의 합성 나노운반체는 인지질을 포함하지 않는다.
합성 나노운반체는 비제한적으로, 하나 또는 복수의 지질-기반의 나노입자(본원에서 지질 나노입자, 즉 이들의 구조를 이루는 대다수의 물질이 지질인 나노입자로도 언급됨), 중합체 나노입자, 금속 나노입자, 계면활성제-기반의 에멀전, 덴드리머, 벅키볼, 나노와이어, 바이러스-유사 입자(즉, 주로 바이러스 구조 단백질로 구성되나, 감염성을 갖지 않거나, 감염성이 낮은 입자), 펩티드 또는 단백질-기반의 입자(본원에서 단백질 입자, 즉, 이들의 구조를 이루는 대다수의 물질이 펩티드 또는 단백질인 입자로도 언급됨)(예를 들어, 알부민 나노입자) 및/또는 지질-중합체 나노입자와 같은 나노물질의 조합을 사용하여 개발된 나노입자일 수 있다. 합성 나노운반체는 구형, 입방형, 피라미드형, 직사각형, 원통형, 도넛형 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 상이한 형태일 수 있다. 본 발명에 따른 합성 나노운반체는 하나 이상의 표면을 포함한다. 본 발명의 실시에 사용하기 위해 적합화될 수 있는 예시적인 합성 나노운반체에는 (1) 미국 특허 5,543,158호(Gref et al.)에 개시된 생물분해성 나노입자, (2) 미국 특허 출원 공개 20060002852호(Saltzman et al.)의 중합체 나노입자, (3) 미국 특허 출원 공개 20090028910호(DeSimone et al.)의 리소그래피로 구축된 나노입자, (4) WO 2009/051837호(von Andrian et al.)의 개시내용, (5) 미국 특허 출원 공개 2008/0145441호(Penades et al.)에 개시된 나노입자, (6) 미국 특허 출원 공개 20090226525호(de los Rios et al.)에 개시된 단백질 나노입자, (7) 미국 특허 출원 공개 20060222652호(Sebbel et al.)에 개시된 바이러스-유사 입자, (8) 미국 특허 출원 공개 20060251677호(Bachmann et al.)에 개시된 핵산 결합된 바이러스-유사 입자, (9) WO2010047839A1호 또는 WO2009106999A2호에 개시된 바이러스-유사 입자, (10) 문헌[P. Paolicelli et al., "Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that can Efficiently Associate and Deliver Virus-like Particles" Nanomedicine. 5(6):843-853 (2010)]에 개시된 나노침전형(nanoprecipitated) 나노입자, 또는 (11) 미국 공개 2002/0086049호에 개시된 아폽토시스 세포, 아폽토시스 소체(apoptotic body), 또는 합성 또는 반합성 모방체가 포함된다. 구현예들에서, 합성 나노운반체는 1:1, 1:1.2, 1:1.5, 1:2, 1:3, 1:5, 1:7 초과 또는 1:10 초과의 종횡비를 가질 수 있다.
약 100nm 이하, 바람직하게는 100nm 이하의 최소 치수를 갖는 본 발명에 따른 합성 나노운반체는 상보체를 활성화시키는 하이드록실기가 있는 표면을 포함하지 않거나, 대안적으로, 상보체를 활성화시키는 하이드록실기가 아닌 모이어티로 본질적으로 구성된 표면을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 약 100nm 이하, 바람직하게는 100nm 이하의 최소 치수를 갖는 본 발명에 따른 합성 나노운반체는 상보체를 실질적으로 활성화시키는 표면을 포함하지 않거나, 대안적으로, 상보체를 실질적으로 활성화시키지 않는 모이어티로 본질적으로 구성되는 표면을 포함한다. 더욱 바람직한 구현예에서, 약 100nm 이하, 바람직하게는 100nm 이하의 최소 치수를 갖는 본 발명에 따른 합성 나노운반체는 상보체를 활성화시키는 표면을 포함하지 않거나, 대안적으로, 상보체를 활성화시키지 않는 모이어티로 본질적으로 구성되는 표면을 포함한다. 구현예들에서, 합성 나노운반체는 바이러스-유사 입자를 배제한다. 구현예들에서, 합성 나노운반체가 바이러스-유사 입자를 포함하는 경우, 이러한 바이러스-유사 입자는 비-자연 애쥬번트를 포함한다(이는 VLP가 VLP의 생성 동안 발생된 자연 발생 RNA가 아닌 애쥬번트를 포함하는 것을 의미한다). 구현예들에서, 합성 나노운반체는 1:1, 1:1.2, 1:1.5, 1:2, 1:3, 1:5, 1:7 초과, 또는 1:10 초과의 종횡비를 가질 수 있다.
"T 세포 항원"은 T 세포에 의해 인지되고 T 세포에서의 면역 반응을 촉발시키는 임의의 항원(예를 들어, 클래스 I 또는 클래스 II 주조직적합성 복합체 분자(MHC)에 결합되거나, CD1 복합체에 결합된 항원 또는 이의 일부의 제시를 통해 T 세포 또는 NKT 세포 상의 T 세포 수용체에 의해 특이적으로 인지되는 항원)을 의미한다. 일부 구현예에서, T 세포 항원인 항원은 또한 B 세포 항원이다. 다른 구현예에서, T 세포 항원은 또한 B 세포 항원이 아니다. T 세포 항원은 일반적으로 단백질 또는 펩티드이다. T 세포 항원은 CD8+ T 세포 반응, CD4+ T 세포 반응, 또는 CD8+ T 세포 반응 및 CD4+ T 세포 반응 둘 모두를 자극하는 항원일 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 나노운반체는 둘 모두의 유형의 반응을 효과적으로 자극할 수 있다.
일부 구현예에서, T 세포 항원은 T 헬퍼 세포 항원(즉, T 세포 헬프(help)의 자극을 통해 B 세포 항원, 바람직하게는 관련되지 않은 B 세포 항원에 대한 향상된 반응을 발생시킬 수 있는 항원)이다. 구현예들에서, T 헬퍼 세포 항원은 파상풍 톡소이드, 엡스타인-바 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 호흡기세포융합바이러스, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 풍진 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 아데노바이러스, 디프테리아 톡소이드로부터 수득되거나 유래된 하나 이상의 펩티드, 또는 PADRE 펩티드(세테 등(Sette et al.)의 미국 특허 7,202,351호의 작업으로부터 공지됨)를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, T 헬퍼 세포 항원은 α-갈락토실세라미드(α-GalCer), α-결합 글리코스핑고지질(스핑고모나스 종(Sphingomonas spp.)으로터 유래), 갈락토실 디아실글리세롤(보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi)로부터 유래), 리포포스포글리칸(리슈마니아 도노반니(Leishmania donovani)로부터 유래), 및 포스파티딜이노시톨 테트라만노시드(PIM4)(미코박테리움 레프라에(Mycobacterium leprae)로부터 유래)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 하나 이상의 지질, 또는 당지질을 포함할 수 있다. T 헬퍼 세포 항원으로서 유용한 추가 지질 및/또는 당지질에 대해, 문헌[V. Cerundolo et al., "Harnessing invariant NKT cells in vaccination strategies." Nature Rev Immun, 9:28-38 (2009)]을 참조하라. 구현예들에서, CD4+ T-세포 항원은 공급원, 예를 들어, 자연원으로부터 수득되는 CD4+ T-세포 항원의 유도체일 수 있다. 상기 구현예에서, CD4+ T-세포 항원 서열, 예를 들어, MHC II에 결합하는 펩티드는 공급원으로부터 수득된 항원과 적어도 70%, 80%, 90%, 또는 95%의 동일성을 가질 수 있다. 구현예들에서, T 세포 항원, 바람직하게는 T 헬퍼 세포 항원은 합성 나노운반체에 결합되거나, 합성 나노운반체로부터 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포 항원은 조성물의 합성 나노운반체 내에 캡슐화된다.
"백신"은 특정 병원체 또는 질병에 대한 면역 반응을 개선시키는 물질의 조성물을 의미한다. 백신은 통상적으로 이물질로서 특정 항원을 인지하고 피검체의 신체로부터 이를 제거하는 피검체의 면역계를 자극하는 인자를 함유한다. 백신은 또한 사람이 재공격되는 경우 항원이 신속히 인지되고 반응되도록 하는 면역학적 '기억'을 확립시킨다. 백신은 예방적(예를 들어, 임의의 병원체에 의한 미래의 감염을 예방하기 위한 것)이거나, 치료적(예를 들어, 암의 치료를 위한 종양 특이적 항원에 대한 백신)인 백신일 수 있다. 구현예들에서, 백신은 본 발명에 따른 투여 형태를 포함할 수 있다.
"백신 요법" 또는 "예방접종 요법"은 백신의 용량의 수 및 시기를 포함하는 하나 이상의 예방접종의 스케줄이다. 일반적으로, 예방접종 요법은 질병 또는 질환의 발생에 대해 면역성을 달성하도록 의도된다. 바람직하게는, 백신 요법은 면역계의 체액성 및 CTL 아암 둘 모두를 통해 면역성을 달성하는 것이다.
C. 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 조성물
효과적인 체액성 및 CTL 면역 반응 발생을 위한 방법 및 관련 조성물이 본원에 제공된다. 적어도 하나의 체액성 에피토프 및 동일 에피토프가 아닌 적어도 하나의 MHC 클래스 I-제한 에피토프를 포함하는 단백질이 결합되는 합성 나노운반체가 효과적이고 강한 체액성 및 CTL 면역 반응을 발생시키는데 사용될 수 있는 것으로 밝혀졌으며, 상기 합성 나노운반체는 사포닌-콜레스테롤 애쥬번트를 포함하지 않고, 상기 합성 나노운반체의 집단의 동적광산란을 이용하여 수득된 입자 크기 분포의 평균은 최대 치수가 20 nm 내지 250 nm이다. 제공된 조성물은 다양한 요망되는 임상 종점, 예를 들어, 예방접종에 사용될 수 있다.
매우 다양한 합성 나노운반체가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 합성 나노운반체는 구체 또는 구형이다. 일부 구현예에서, 합성 나노운반체는 편평하거나 판-형상이다. 일부 구현예에서, 합성 나노운반체는 정육면체 또는 입방체이다. 일부 구현예에서, 합성 나노운반체는 타원형 또는 타원이다. 일부 구현예에서, 합성 나노운반체는 원통형, 원뿔형 또는 피라미드형이다.
일부 구현예에서, 각 합성 나노운반체가 유사한 특성을 갖도록 크기, 형상 및/또는 조성의 면에서 상대적으로 균일한 합성 나노운반체의 집단을 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 합성 나노운반체의 총 개수에 기초하여, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 합성 나노운반체가 합성 나노운반체의 평균 직경 또는 평균 치수의 5%, 10% 또는 20%에 속하는 최소 치수 또는 최대 치수를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 합성 나노운반체의 집단은 크기, 형상 및/또는 조성에 관하여 이종성일 수 있다.
합성 나노운반체는 고체 또는 중공체(hollow)일 수 있으며, 하나 이상의 층을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 각 층은 다른 층(들)에 비하여 독특한 조성 및 독특한 특성을 갖는다. 그러나, 일 예를 제공하기 위하여, 합성 나노운반체는 코어/쉘 구조를 가질 수 있으며, 여기서, 코어는 하나의 층(예를 들어, 중합체 코어)이며, 쉘은 제2의 층(예를 들어, 지질 이중층 또는 단층)이다. 합성 나노운반체는 복수의 상이한 층을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 합성 나노운반체는 금속 입자, 양자점(quantum dot), 세라믹 입자 등을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 비-중합체 합성 나노운반체는 비-중합체 성분의 응집물, 예를 들어, 금속 원자(예를 들어, 금 원자)의 응집물이다.
일부 구현예에서, 합성 나노운반체는 임의로 하나 이상의 지질을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 합성 나노운반체는 리포솜을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 합성 나노운반체는 지질 이중층을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 합성 나노운반체는 지질 단층을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 합성 나노운반체는 마이셀(micelle)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 합성 나노운반체는 지질층(예를 들어, 지질 이중층, 지질 단층 등)으로 둘러싸인 중합체 매트릭스를 포함하는 코어를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 합성 나노운반체는 지질층(예를 들어, 지질 이중층, 지질 단층 등)으로 둘러싸인 비-중합체 코어(예를 들어, 금속 입자, 양자점, 세라믹 입자, 뼈 입자(bone particle), 바이러스 입자, 단백질, 핵산, 탄수화물 등)를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 합성 나노운반체는 하나 이상의 중합체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 중합체는 코팅층(예를 들어, 리포솜, 지질 단층, 마이셀 등)에 의해 둘러싸일 수 있다. 일부 구현예에서, 합성 나노운반체의 다양한 성분(즉, 성분들)은 중합체와 결합될 수 있다.
일부 구현예에서, 성분은 중합체 기질과 공유적으로 회합될 수 있다. 일부 구현예에서, 공유 회합은 링커에 의해 매개된다. 일부 구현예에서, 성분은 중합체 기질과 비공유적으로 회합될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 성분은 중합체 기질 내에 캡슐화되고/되거나, 중합체 기질에 의해 둘러싸이고/거나, 중합체 기질을 통해 분산될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 성분은 소수성 상호작용, 전하 상호작용, 반데르발스 힘 등에 의해 중합체 기질과 회합될 수 있다.
중합체로부터 중합체 기질을 형성시키기 위한 매우 다양한 중합체 및 방법이 통상적으로 공지되어 있다. 일반적으로, 중합체 기질은 하나 이상의 중합체를 포함한다.
본원에 제공된 합성 나노운반체는 중합체 나노운반체일 수 있다. 중합체는 자연 또는 비자연(합성) 중합체일 수 있다. 중합체는 2개 이상의 단량체를 포함하는 동종중합체 또는 공중합체일 수 있다. 서열과 관련하여, 공중합체는 무작위 또는 블록 공중합체일 수 있거나, 무작위 및 블록 서열의 조합을 포함할 수 있다. 통상적으로, 본 발명에 따른 중합체는 유기 중합체이다.
일부 구현예에서, 합성 나노운반체는 폴리에스테르, 폴리카보네이트, 폴리아미드, 또는 폴리에테르, 또는 이들의 단위를 포함하는 하나 이상의 중합체를 포함한다. 다른 구현예에서, 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG), 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 폴리(락틱-코-글리콜산), 또는 폴리카프로락톤, 또는 이들의 단위를 포함한다. 일부 구현예에서, 중합체가 생물분해성 중합체인 것이 바람직하다. 따라서, 상기 구현예에서, 중합체가 폴리에테르, 예를 들어, 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 이들의 단위를 포함하는 경우, 중합체는 폴리에테르 및 상기 중합체가 생물분해성이 되도록 하는 생물분해성 중합체의 블록-공중합체를 포함하는 것이 바람직하다. 다른 구현예에서, 중합체는 폴리에테르 또는 이의 단위, 예를 들어, 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 이들의 단위를 단독으로 포함하지 않는다. 하나 이상의 중합체는 중합체 합성 나노운반체 내에 포함될 수 있거나, 다수의 다른 다양한 유형의 합성 나노운반체에 포함될 수 있다.
본 발명에 사용하기에 적절한 중합체의 예에는 또한 폴리에틸렌, 폴리카보네이트(예를 들어, 폴리(1,3-다이옥산-2온)), 폴리무수물(예를 들어, 폴리(세바스산 무수물)), 폴리프로필푸메레이트, 폴리아미드(예를 들어, 폴리카프로락탐), 폴리아세탈, 폴리에테르, 폴리에스테르(예를 들어, 폴리락티드, 폴리글리콜리드, 폴리락티드-코-글리콜리드, 폴리카프로락톤, 폴리하이드록시산(예를 들어, 폴리(β-하이드록시알카노에이트))), 폴리(오르토에스테르), 폴리시아노아크릴레이트, 폴리비닐 알코올, 폴리우레탄, 폴리포스파젠, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리우레아, 폴리스티렌 및 폴리아민, 폴리리신, 폴리리신-PEG 공중합체 및 폴리(에틸렌이민), 폴리(에틸렌 이민)-PEG 공중합체가 포함되나 이에 제한되지는 않는다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 중합체에는 폴리에스테르(예를 들어, 폴리락트산, 폴리(락틱-코-글리콜산), 폴리카프로락톤, 폴리발레로락톤, 폴리(1,3-다이옥산-2온)); 폴리무수물(예를 들어, 폴리(세바스산 무수물)); 폴리에테르(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜); 폴리우레탄; 폴리메타크릴레이트; 폴리아크릴레이트; 및 폴리시아노아크릴레이트를 포함하나 이에 제한되지는 않는 21 C.F.R. §177.2600 하에 미국 식품의약국(U.S. Food and Drug Administration, FDA)에 의해 인간에서의 사용을 위해 승인된 중합체가 포함된다.
일부 구현예에서, 중합체는 친수성일 수 있다. 예를 들어, 중합체는 음이온성 기(예를 들어, 포스페이트기, 설페이트기, 카르복실레이트기); 양이온성 기(예를 들어, 4차 아민기); 또는 극성 기(예를 들어, 하이드록실기, 티올기, 아민기)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 친수성 중합체 매트릭스를 포함하는 합성 나노운반체는 합성 나노운반체 내에 친수성 환경을 생성한다. 일부 구현예에서, 중합체는 소수성일 수 있다. 일부 구현예에서, 소수성 중합체 매트릭스를 포함하는 합성 나노운반체는 합성 나노운반체 내에 소수성 환경을 생성한다. 중합체의 친수성 또는 소수성의 선택은 합성 나노운반체 내에 포함되는(예를 들어, 결합되는) 물질의 성질에 영향을 미칠 수 있다.
일부 구현예에서, 중합체는 하나 이상의 모이어티 및/또는 작용기로 변형될 수 있다. 다양한 모이어티 또는 작용기가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 탄수화물 및/또는 다당류 유래의 비환상 폴리아세탈로 변형될 수 있다(Papisov, 2001, ACS Symposium Series, 786:301). 특정 구현예들은 미국 특허 번호 5543158호(Gref et al.) 또는 WO 공개 WO2009/051837호(Von Andrian et al.)의 일반적 교시를 사용하여 이루어질 수 있다.
일부 구현예에서, 중합체는 지질 또는 지방산기로 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 지방산기는 부티르산, 카프로산, 카프릴산, 카프르산, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 아라키드산, 베헨산 또는 리그노세르산 중 하나 이상일 수 있다. 일부 구현예에서, 지방산기는 팔미톨레산, 올레산, 박센산, 리놀레산, 알파-리놀레산, 감마-리놀레산, 아라키돈산, 가돌레산, 아라키돈산, 에이코사펜타엔산, 도코사헥사엔산 또는 에루스산 중 하나 이상일 수 있다.
일부 구현예에서, 중합체는 폴리에스테르일 수 있는데, 이에는 락트산 및 글리콜산 단위를 포함하는 공중합체, 예를 들어 폴리(락트산-코-글리콜산) 및 폴리(락티드-코-글리콜리드)(본원에서 집합적으로 "PLGA"로 언급됨); 및 글리콜산 단위를 포함하는 동종중합체(본원에서 "PGA"로 언급됨), 및 락트산 단위를 포함하는 동종중합체, 예를 들어 폴리-L-락트산, 폴리-D-락트산, 폴리-D,L-락트산, 폴리-L-락티드, 폴리-D-락티드, 및 폴리-D,L-락티드(본원에서 집합적으로 "PLA"로 언급됨)가 포함된다. 일부 구현예에서, 예시되는 폴리에스테르에는, 예를 들어, 폴리하이드록시산; 락티드 및 글리콜리드의 PEG 공중합체 및 공중합체(예를 들어, PLA-PEG 공중합체, PGA-PEG 공중합체, PLGA-PEG 공중합체, 및 이의 유도체)가 포함된다. 일부 구현예에서, 폴리에스테르에는, 예를 들어, 폴리(카프로락톤), 폴리(카프로락톤)-PEG 공중합체, 폴리(L-락티드-코-L-리신), 폴리(세린 에스테르), 폴리(4-하이드록시-L-프롤린 에스테르), 폴리[α-(4-아미노부틸)-L-글리콜산], 및 이의 유도체가 포함된다.
일부 구현예에서, 중합체는 PLGA일 수 있다. PLGA는 락트산과 글리콜산의 생체적합성 및 생물분해성 공중합체이고, 다양한 형태의 PLGA는 락트산:글리콜산의 비에 의해 특성화된다. 락트산은 L-락트산, D-락트산, 또는 D,L-락트산일 수 있다. PLGA의 분해 속도는 락트산:글리콜산 비를 변경시킴으로써 조정될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따라 사용되는 PLGA는 약 85:15, 약 75:25, 약 60:40, 약 50:50, 약 40:60, 약 25:75, 또는 약 15:85의 락트산:글리코산 비를 특징으로 한다.
일부 구현예에서, 중합체는 하나 이상의 아크릴계 중합체일 수 있다. 특정 구현예에서, 아크릴계 중합체에는, 예를 들어, 아크릴산 및 메타크릴산 공중합체, 메틸 메타크릴레이트 공중합체, 에톡시에틸 메타크릴레이트, 시아노에틸 메타크릴레이트, 아미노알킬 메타크릴레이트 공중합체, 폴리(아크릴산), 폴리(메타크릴산), 메타크릴산 알킬아미드 공중합체, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(메타크릴산 무수물), 메틸 메타크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리(메틸 메타크릴레이트) 공중합체, 폴리아크릴아미드, 아미노알킬 메타크릴레이트 공중합체, 글리시딜 메타크릴레이트 공중합체, 폴리시아노아크릴레이트, 및 전술한 중합체 중 하나 이상을 포함하는 조합물이 포함된다. 아크릴계 중합체는 아크릴산 및 메타크릴산 에스테르와 저 함량의 4차 암모늄기와의 완전히 중합된 공중합체를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 중합체는 양이온성 중합체일 수 있다. 일반적으로, 양이온성 중합체는 핵산(예를 들어, DNA, 또는 이의 유도체)의 음 전하를 띤 가닥을 축합 및/또는 보호할 수 있다. 아민 함유 중합체, 예를 들어 폴리(리신)(Zauner et al., 1998, Adv. Drug Del. Rev., 30:97; 및 Kabanov et al., 1995, Bioconjugate Chem., 6:7), 폴리(에틸렌 이민)(PEI; Boussif et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1995, 92:7297), 및 폴리(아미도아민) 덴드리머(Kukowska-Latallo et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 93:4897; Tang et al., 1996, Bioconjugate Chem., 7:703; 및 Haensler et al., 1993, Bioconjugate Chem., 4:372)는 생리적 pH에서 양으로 하전되며, 핵산과 이온쌍을 형성하며, 다양한 세포주에서 트랜스펙션을 매개한다. 구현예들에서, 합성 나노운반체는 양이온성 중합체를 포함하지 않을 수 있다(또는 배제할 수 있다).
일부 구현예에서, 중합체는 양이온성 측쇄를 갖는 분해가능한 폴리에스테르일 수 있다(Putnam et al., 1999, Macromolecules, 32:3658; Barrera et al., 1993, J. Am. Chem. Soc., 115:11010; Kwon et al., 1989, Macromolecules, 22:3250; Lim et al., 1999, J. Am. Chem. Soc., 121:5633; 및 Zhou et al., 1990, Macromolecules, 23:3399). 이들 폴리에스테르의 예에는 폴리(L-락티드-코-L-리신)(Barrera et al., 1993, J. Am. Chem. Soc., 115:11010), 폴리(세린 에스테르)(Zhou et al., 1990, Macromolecules, 23:3399), 폴리(4-하이드록시-L-프롤린 에스테르)(Putnam et al., 1999, Macromolecules, 32:3658; 및 Lim et al., 1999, J. Am. Chem. Soc., 121:5633) 및 폴리(4-하이드록시-L-프롤린 에스테르)(Putnam et al., 1999, Macromolecules, 32:3658; 및 Lim et al., 1999, J. Am. Chem. Soc., 121:5633)가 포함된다.
이들 중합체 및 기타 중합체의 특성 및 이들의 제조 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다(예를 들어, 미국 특허 6,123,727호; 5,804,178호; 5,770,417호; 5,736,372호; 5,716,404호; 6,095,148호; 5,837,752호; 5,902,599호; 5,696,175호; 5,514,378호; 5,512,600호; 5,399,665호; 5,019,379호; 5,010,167호; 4,806,621호; 4,638,045호; 및 4,946,929호; Wang et al., 2001, J. Am. Chem. Soc., 123:9480; Lim et al., 2001, J. Am. Chem. Soc., 123:2460; Langer, 2000, Acc. Chem. Res., 33:94; Langer, 1999, J. Control. Release, 62:7; 및 Uhrich et al., 1999, Chem. Rev., 99:3181 참조). 더욱 일반적으로, 소정의 적절한 중합체를 합성하는 다양한 방법은 문헌[Concise Encyclopedia of Polymer Science and Polymeric Amines and Ammonium Salts, Ed. by Goethals, Pergamon Press, 1980; Principles of Polymerization by Odian, John Wiley & Sons, Fourth Edition, 2004; Contemporary Polymer Chemistry by Allcock et al., Prentice-Hall, 1981; Deming et al., 1997, Nature, 390:386; 및 미국 특허 6,506,577호, 6,632,922호, 6,686,446호 및 6,818,732호에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 중합체는 선형 또는 분지형 중합체일 수 있다. 일부 구현예에서, 중합체는 덴드리머일 수 있다. 일부 구현예에서, 중합체는 실질적으로 서로 교차결합될 수 있다. 일부 구현예에서, 중합체는 교차 결합이 실질적으로 없을 수 있다. 일부 구현예에서, 중합체는 교차 결합 단계를 겪지 않고, 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 합성 나노운반체가 블록 공중합체, 그라프트 공중합체, 이들 및 기타 중합체 중 임의의 것의 블렌드, 혼합물 및/또는 부가물을 포함할 수 있는 것이 추가로 이해되어야 한다. 당업자는 본원에 열거된 중합체가 본 발명에 따라 사용될 수 있는 중합체의 예시적이이며, 포괄적인 목록이 아님을 인식할 것이다.
일부 구현예에서, 합성 나노운반체는 임의로 하나 이상의 양친매성 엔티티를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 양친매성 엔티티는 안정성이 증가되거나, 균일성이 개선되거나, 점도가 증가된 합성 나노운반체의 생성을 촉진시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 양친매성 엔티티는 지질막(예를 들어, 지질 이중층, 지질 단일층 등)의 내표면과 회합될 수 있다. 당 분야에 공지되어 있는 많은 양친매성 엔티티가 본 발명에 따른 합성 나노운반체의 제조에 사용하기에 적절하다. 이러한 양친매성 엔티티에는 포스포글리세리드; 포스파티딜콜린; 디팔미토일 포스파티딜콜린(DPPC); 디올레일포스파티딜 에탄올아민(DOPE); 디올레일옥시프로필트리에틸암모늄(DOTMA); 디올레오일포스파티딜콜린; 콜레스테롤; 콜레스테롤 에스테르; 디아실글리세롤; 디아실글리세롤숙시네이트; 디포스파티딜 글리세롤(DPPG); 헥산데칸올; 지방 알코올, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG); 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르; 표면 활성 지방산, 예를 들어, 팔미트산 또는 올레산; 지방산; 지방산 모노글리세리드; 지방산 디글리세리드; 지방산 아미드; 소르비탄 트리올레에이트(Span® 85) 글리코콜레이트; 소르비탄 모노라우레이트(Span® 20); 폴리소르베이트 20(Tween® 20); 폴리소르베이트 60(Tween® 60); 폴리소르베이트 65(Tween® 65); 폴리소르베이트 80(Tween® 80); 폴리소르베이트 85(Tween® 85); 폴리옥시에틸렌 모노스테아레이트; 서팩틴; 폴록소머; 소르비탄 지방산 에스테르, 예를 들어 소르비탄 트리올레에이트; 레시틴; 리소레시틴; 포스파티딜세린; 포스파티딜이노시톨; 스핑고미엘린; 포스파티딜에탄올아민(세팔린); 카르디올리핀; 포스파티드산; 세레브로시드; 디세틸포스페이트; 디팔미토일포스파티딜글리세롤; 스테아릴아민; 도데실아민; 헥사데실-아민; 아세틸 팔미테이트; 글리세롤 리시놀레에이트; 헥사데실 스테레이트; 이소프로필 미리스테이트; 틸록사폴; 폴리(에틸렌 글리콜) 5000-포스파티딜에탄올아민; 폴리(에틸렌 글리콜) 400-모노스테아레이트; 인지질; 높은 계면활성제 특성을 가진 합성 및/또는 천연 세제; 데옥시콜레이트; 사이클로덱스트린; 카오트로픽 염(chaotropic salts); 이온쌍 형성제; 및 이들의 조합물이 포함되지만, 이로 제한되지는 않는다. 양친매성 엔티티 구성성분은 상이한 양친매성 엔티티의 혼합물일 수 있다. 당업자는 이것이 계면활성제 활성을 갖는 물질의 예시이며, 포괄적인 목록이 아님을 인식할 것이다. 임의의 양친매성 엔티티가 본 발명에 따라 사용되는 합성 나노운반체의 생성에 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 합성 나노운반체는 임의로 하나 이상의 탄수화물을 포함할 수 있다. 탄수화물은 자연 또는 합성 탄수화물일 수 있다. 탄수화물은 유도체화된 자연 탄수화물일 수 있다. 특정 구현예에서, 탄수화물은 글루코스, 프룩토스, 갈락토스, 리보스, 락토스, 수크로스, 말토스, 트레할로스, 셀비오스, 만노스, 자일로스, 아라비노스, 글루쿠론산, 갈락토론산, 만누론산, 글루코사민, 갈락토사민, 및 뉴람산를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 단당류 또는 이당류를 포함한다. 특정 구현예에서, 탄수화물은 풀룰란, 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스(HPMC), 하이드록시셀룰로스(HC), 메틸셀룰로스(MC), 덱스트란, 사이클로덱스트란, 글리코겐, 하이드록시에틸녹말, 카라기난, 글리콘, 아밀로스, 키토산, N,O-카르복실메틸키토산, 알긴 및 알긴산, 녹말, 키틴, 이눌린, 곤약, 글루코만난, 푸스툴란, 헤파린, 히알루론산, 커들란, 및 잔탄을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다당류이다. 구현예들에서, 합성 나노운반체는 탄수화물, 예를 들어, 다당류를 포함하지 않는다(또는 구체적으로 배제한다). 특정 구현예에서, 탄수화물은 탄수화물 유도체, 예를 들어, 만니톨, 소르비톨, 자일리톨, 에리트리톨, 말티톨 및 락티톨을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 당 알코올을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 방법에서 사용하기 위한 조성물은 약학적으로 허용되는 부형제, 예를 들어, 보존제, 완충제, 염수 또는 포스페이트 완충 염수와 조합된 합성 나노운반체를 포함한다. 조성물은 통상의 약학적 제조 및 배합 기술을 사용하여 제조하여, 유용한 투여 형태에 이를 수 있다. 일 구현예에서, 합성 나노운반체는 보존제와 함께 주사용 멸균 염수 용액 중에 현탁된다.
구현예들에서, 백신에서 사용하기 위한 운반체로서 합성 나노운반체를 제조하는 경우, 구성성분을 합성 나노운반체에 결합시키는 방법이 유용할 수 있다. 구성성분이 소분자이면, 합성 나노운반체의 어셈블리(assembly) 전에 구성성분을 중합체에 부착시키는 것이 유리할 수 있다. 구현예들에서, 또한, 구성성분을 중합체에 부착시킨 다음, 이러한 중합체 컨쥬게이트를 합성 나노운반체의 구축에 사용하는 것보다는 표면기를 갖는 합성 나노운반체를 제조하여, 구성성분을 상기 표면기의 사용을 통하여 합성 나노운반체에 결합시키는데 사용하는 것이 유리할 수 있다.
특정 구현예에서, 결합은 공유 링커일 수 있다. 구현예들에서, 본 발명에 따른 구성성분은 나노운반체의 표면상의 아지도기와 알킨기를 함유하는 구성성분의 1,3-쌍극성 고리부가 반응에 의해, 또는 나노운반체의 표면상의 알킨과 아지도기를 함유하는 구성성분의 1,3-쌍극성 고리부가 반응에 의해 형성되는 1,2,3-트리아졸 링커를 통하여 외표면에 공유 결합될 수 있다. 이러한 고리부가 반응은 바람직하게는 적절한 Cu(I)-리간드 및 Cu(II) 화합물을 촉매적 활성 Cu(I) 화합물로 환원시키기 위한 환원제와 함께 Cu(I) 촉매의 존재하에서 수행된다. 이러한 Cu(I)-촉매된 아지드-알킨 고리부가(CuAAC)는 또한 클릭(click) 반응으로도 언급될 수 있다.
추가로, 공유 결합은 아미드 링커, 디설파이드 링커, 티오에테르 링커, 히드라존 링커, 히드라지드 링커, 이민 또는 옥심 링커 또는 우레아 또는 티오우레아 링커, 아미딘 링커, 아민 링커 및 설폰아미드 링커를 포함하는 공유 링커를 포함할 수 있다.
아미드 링커는 한 성분 상의 아민과 제2의 성분, 예를 들어, 나노운반체의 카르복실산기 사이의 아미드 결합을 통해 형성된다. 링커 내의 아미드 결합은 적합하게 보호된 아미노산 또는 항원 또는 애쥬번트 및 활성화된 카르복실산, 예를 들어, N-하이드록시숙신이미드-활성화 에스테르와 반응을 형성하는 통상적인 아미드 결합 중 임의의 아미드 결합을 이용하여 이루어질 수 있다.
디설파이드 링커는, 예를 들어, R1-S-S-R2의 형태의 2개의 황 원자 간의 디설파이드(S-S) 결합의 형성을 통해 이루어진다. 디설파이드 결합은 티올/머캅탄기(-SH)를 함유하는 항원 또는 애쥬번트와 중합체 또는 나노운반체상의 다른 활성화된 티올기, 또는 티올/머캅탄기를 함유하는 나노운반체와 활성화된 티올기를 함유하는 구성성분의 티올 교환에 의해 형성될 수 있다.
트리아졸 링커, 구체적으로, 형태
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의 1,2,3-트리아졸(여기서, R1 및 R2는 임의의 화학적 엔티티일 수 있음)은 제1 구성성분, 예를 들어, 나노운반체에 부착된 아지드와, 제2 구성성분에 부착된 말단 알킨의 1,3-쌍극성 고리부가 반응에 의해 이루어진다. 1,3-쌍극성 고리부가 반응은 촉매와 함께 또는 촉매 없이, 바람직하게는 Cu(I)-촉매와 함께 수행되며, 이는 1,2,3-트리아졸 작용기를 통해 2개의 구성성분을 연결한다. 이러한 화학물질은 문헌[Sharpless et al., Angew. Chem. Int. Ed. 41(14), 2596, (2002)] 및 문헌[Meldal, et al, Chem. Rev., 2008, 108(8), 2952-3015]에 상세하게 기재되어 있으며, 종종 "클릭" 반응 또는 CuAAC로 언급된다.
구현예들에서, 중합체 사슬에 대하여 말단인 아지드 또는 알킨기를 함유하는 중합체가 제조된다. 이후, 이러한 중합체를 사용하여 복수의 알킨 또는 아지드기가 나노운반체의 표면 상에 배치되는 방식으로 합성 나노운반체가 제조된다. 대안적으로, 합성 나노운반체는 다른 경로에 의해 제조되고, 이후에, 알킨 또는 아지드기로 작용기화될 수 있다. 구성성분은 알킨(중합체가 아지드를 함유하는 경우) 또는 아지드(중합체가 알킨을 함유하는 경우)기 중 어느 하나의 존재 하에 제조한다. 이후, 구성성분이 1,4-이치환된 1,2,3-트리아졸 링커를 통해 구성성분을 입자에 공유적으로 결합시키는 촉매와 함께 또는 촉매 없이 1,3-쌍극성 고리부가 반응을 통해 나노운반체와 반응된다.
티오에테르 링커는 예를 들어, R1-S-R2의 형태의 황-탄소(티오에테르) 결합의 형성에 의해 제조된다. 티오에테르는 하나의 구성성분 상의 티올/머캅탄(-SH)기의 제2의 구성성분, 예를 들어, 나노운반체 상의 알킬화기, 예를 들어, 할라이드 또는 에폭시드와의 알킬화에 의해 제조될 수 있다. 티오에테르 링커는 또한 하나의 구성성분 상의 티올/머캅탄기의 마이클 수용체로서 말레이미드기 또는 비닐 설폰기를 함유하는 제2 구성성분, 예를 들어, 중합체 상의 전자-결핍 알켄기로의 마이클 부가에 의해 형성될 수 있다. 다른 방식으로, 티오에테르 링커는 하나의 구성성분 상의 티올/머캅탄기의 제2 구성성분, 예를 들어, 중합체 또는 나노운반체 상의 알켄기와의 라디칼 티올-엔 반응에 의해 제조될 수 있다.
히드라존 링커는 하나의 구성성분 상의 히드라지드기와 제2의 구성성분, 예를 들어, 나노운반체 상의 알데히드/케톤기의 반응에 의해 제조된다.
히드라지드 링커는 하나의 구성성분 상의 히드라진기와 제2의 구성성분, 예를 들어, 나노운반체 상의 카르복실산기의 반응에 의해 형성된다. 이러한 반응은 일반적으로 아미드 결합의 형성과 유사한 화학작용을 이용하여 수행되며, 여기서, 카르복실산은 활성화 시약으로 활성화된다.
이민 또는 옥심 링커는 하나의 구성성분 상의 아민 또는 N-알콕시아민(또는 아미노옥시)기와 제2의 구성성분, 예를 들어, 나노운반체 상의 알데히드 또는 케톤기의 반응에 의해 형성된다.
우레아 또는 티오우레아 링커는 하나의 구성성분 상의 아민기와 제2의 구성성분, 예를 들어, 나노운반체 상의 이소시아네이트 또는 티오이소시아네이트기의 반응에 의해 생성된다.
아미딘 링커는 하나의 구성성분 상의 아민기와 제2의 구성성분, 예를 들어, 나노운반체 상의 이미도에스테르기의 반응에 의해 제조된다.
아민 링커는 하나의 구성성분 상의 아민기와 제2의 구성성분, 예를 들어, 나노운반체 상의 알킬화기, 예를 들어, 할라이드, 에폭시드 또는 설포네이트 에스테르기의 알킬화 반응에 의해 제조된다. 대안적으로, 아민 링커는 또한 적절한 환원 시약, 예를 들어, 소듐 시아노보로히드라이드 또는 소듐 트리아세톡시보로히드라이드를 사용한, 하나의 구성성분 상의 아민기와 제2의 구성성분, 예를 들어, 나노운반체 상의 알데히드 또는 케톤기의 환원성 아민화에 의해 제조될 수 있다.
설폰아미드 링커는 하나의 구성성분 상의 아민기와 제2의 구성성분, 예를 들어, 나노운반체 상의 설포닐 할라이드(예를 들어, 설포닐 클로라이드)기의 반응에 의해 제조된다.
설폰 링커는 친핵체의 비닐 설폰으로의 마이클 부가에 의해 제조된다. 비닐 설폰 또는 친핵체 중 어느 하나는 나노운반체의 표면 상에 존재하거나 구성성분에 부착될 수 있다.
상기 구성성분은 또한 비-공유 컨쥬게이션 방법을 통해 나노운반체에 컨쥬게이션될 수 있다. 예를 들어, 음성 하전된 구성성분은 정전기 흡착을 통해 양성 하전된 나노운반체에 컨쥬게이션될 수 있다. 금속 리간드를 함유하는 구성성분은 또한 금속-리간드 복합체를 통해 금속 복합체를 함유하는 나노운반체에 컨쥬게이션될 수 있다.
구현예들에서, 구성성분은 합성 나노운반체의 어셈블리 전에 중합체, 예를 들어, 폴리락트산-블록-폴리에틸렌 글리콜에 부착될 수 있거나, 합성 나노운반체는 이의 표면 상의 반응성 또는 활성화가능한 기와 함께 형성될 수 있다. 후자의 경우, 구성성분은 합성 나노운반체의 표면에 의해 제시되는 부착 화학물질과 양립되는 기와 함께 제조될 수 있다. 다른 구현예에서, 구성성분은 적절한 링커를 사용하여 VLP 또는 리포솜에 부착될 수 있다. 링커는 2개의 분자를 함께 결합시킬 수 있는 화합물 또는 시약이다. 일 구현예에서, 링커는 문헌[Hermanson 2008]에 기재된 바와 같은 동종이기능성(homobifuntional) 또는 이종이기능성(heterobifunctional) 시약일 수 있다. 예를 들어, 표면 상에 카르복실산기를 함유하는 VLP 또는 리포솜 합성 나노운반체는 EDC의 존재하에서 동종이기능성 링커, 아디픽 디히드라지드(ADH)로 처리되어, ADH 링커가 있는 상응하는 합성 나노운반체를 형성할 수 있다. 이후, 생성된 ADH 연결된 합성 나노운반체는 NC 상의 ADH 링커의 다른 말단을 통하여 산성기를 함유하는 구성성분과 컨쥬게이션되어, 상응하는 VLP 또는 리포솜 펩티드 컨쥬게이트를 생성한다.
이용가능한 컨쥬게이션 방법의 상세한 설명에 대해서는, 문헌[Hermanson G T "Bioconjugate Techniques", 2nd Edition Published by Academic Press, Inc., 2008]을 참조한다. 공유 부착에 더하여, 구성성분은 사전-형성된 합성 나노운반체에 대한 흡착에 의해 결합될 수 있거나, 이는 합성 나노운반체의 형성 동안 캡슐화에 의해 결합될 수 있다.
일부 구현예에서, 구성성분, 예를 들어, 항원 또는 애쥬번트는 분리될 수 있다. 분리된이란 이의 자연 환경으로부터 분리되고 이의 확인 또는 사용을 가능하게 하기에 충분한 양으로 존재하는 요소를 나타낸다. 이는 예를 들어, 상기 요소가 (i) 발현 클로닝에 의해 선택적으로 생성되거나 (ii) 크로마토그래피 또는 전기영동에 의해서와 같이 정제될 수 있음을 의미한다. 분리된 요소는 실질적으로 순수할 수 있지만, 그럴 필요는 없다. 분리된 요소가 약학적 제조물에서 약학적으로 허용되는 부형제와 혼합될 수 있기 때문에, 요소는 작용제의 중량 기준으로 단지 작은 백분율로 포함될 수 있다. 그렇지만, 요소는 이것이 생명계에서 회합될 수 있는 물질로부터 분리되고, 즉, 다른 지질 또는 단백질로부터 분리된다는 점에서 분리된다. 본원에 제공된 임의의 요소는 분리될 수 있다. 본원에 제공된 임의의 항원은 분리된 형태로 조성물에 포함될 수 있다.
D. 합성 나노운반체 조성물을 이용하고 제조하는 방법
합성 나노운반체는 당 분야에 공지되어 있는 매우 다양한 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 합성 나노운반체는 나노침전(nanoprecipitation), 유체 채널을 사용한 유동 포커싱(flow focusing), 분무 건조, 단일 및 이중 에멀전 용매 증발, 용매 추출, 상 분리, 밀링(milling), 마이크로에멀전 절차, 마이크로제작(microfabrication), 나노제작(nanofabrication), 희생층(sacrificial layer), 단순 및 복합 코아세르베이션(coacervation) 및 당업자에게 널리 공지되어 있는 기타 방법과 같은 방법에 의해 형성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 단분산 반도체, 전도성, 자성, 유기 및 기타 나노물질을 위한 수성 및 유기 용매 합성이 기재되어 있다(Pellegrino et al., 2005, Small, 1:48; Murray et al., 2000, Ann. Rev. Mat. Sci., 30:545; 및 Trindade et al., 2001, Chem. Mat., 13:3843). 추가의 방법이 문헌에 기재되어 있다(예를 들어, Doubrow, Ed., "Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy,"CRC Press, Boca Raton, 1992; Mathiowitz et al., 1987, J. Control. Release, 5:13; Mathiowitz et al., 1987, Reactive Polymers, 6:275; 및 Mathiowitz et al., 1988, J. Appl. Polymer Sci., 35:755; 미국 특허 5578325호 및 6007845호; P. Paolicelli et al., "Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that can Efficiently Associate and Deliver Virus-like Particles" Nanomedicine. 5(6):843-853 (2010) 참조).
다양한 물질이 문헌[C. Astete et al., "Synthesis and characterization of PLGA nanoparticles" J. Biomater. Sci. Polymer Edn, Vol. 17, No. 3, pp. 247-89 (2006); K. Avgoustakis "Pegylated Poly(Lactide) and Poly(Lactide-Co-Glycolide) Nanoparticles: Preparation, Properties and Possible Applications in Drug Delivery" Current Drug Delivery 1:321-333 (2004); C. Reis et al., "Nanoencapsulation I. Methods for preparation of drug-loaded polymeric nanoparticles" Nanomedicine 2:8-21 (2006); P. Paolicelli et al., "Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that can Efficiently Associate and Deliver Virus-like Particles" Nanomedicine. 5(6):843-853 (2010)]을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 방법을 사용하여 바람직한 합성 나노운반체로 캡슐화될 수 있다. 미국 특허 6,632,671호(Unger, 2003년 10월 14일)에 개시된 방법을 포함하나 이에 제한되지는 않는 물질을 합성 나노운반체에 캡슐화하는데 적절한 다른 방법이 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 합성 나노운반체는 나노침전 과정 또는 분무 건조에 의해 제조된다. 합성 나노운반체의 제조에 사용되는 조건을 변경시켜, 요망되는 크기 또는 특성(예를 들어, 소수성, 친수성, 외부 형태, "점착성", 형상 등)의 입자를 생성시킬 수 있다. 합성 나노운반체의 제조 방법 및 이용되는 조건(예를 들어, 용매, 온도, 농도, 공기 흐름 속도 등)은 합성 나노운반체 및/또는 중합체 매트릭스의 조성물에 결합될 물질에 좌우될 수 있다.
상기 방법 중 임의의 방법에 의해 제조되는 입자가 요망되는 범위 밖의 크기 범위를 갖는다면, 입자는 예를 들어, 체(sieve)를 사용하여 사이징(sizing)될 수 있다.
합성 나노운반체의 구성요소는, 예를 들어, 하나 이상의 공유 결합에 의해 전체 합성 나노운반체에 결합될 수 있거나, 하나 이상의 링커에 의해 결합될 수 있다. 합성 나노운반체를 작용기화시키는 추가의 방법은 미국 특허 출원 공개 2006/0002852호(Saltzman et al.), 미국 특허 출원 공개 2009/0028910호(DeSimone et al.) 또는 국제 특허 출원 공개 WO/2008/127532 A1호(Murthy et al.)로부터 적합화될 수 있다.
대안적으로 또는 추가로, 합성 나노운반체는 비-공유 상호작용을 통하여 직접적으로 또는 간접적으로 구성성분에 결합될 수 있다. 비공유 구현예에서, 비-공유 결합은 전하 상호작용, 친화성 상호작용, 금속 배위, 물리적 흡착, 호스트-게스트 상호작용, 소수성 상호작용, TT 스태킹 상호작용, 수소 결합 상호작용, 반데르발스 상호작용, 자기적 상호작용, 정전기적 상호작용, 쌍극자-쌍극자 상호작용 및/또는 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는 비-공유 상호작용에 의해 매개된다. 이러한 결합은 합성 나노운반체의 외표면 또는 내표면 상에 존재하도록 배열될 수 있다. 구현예들에서, 캡슐화 및/또는 흡착은 결합의 한 형태이다.
구현예들에서, 합성 나노운반체는 동일 비히클 또는 전달 시스템과 혼합시킴으로써 애쥬번트와 조합될 수 있다. 상기 애쥬번트는 무기염, 예를 들어, 명반, 장내세균(Enterobacteria), 예를 들어, 에스케리히아 콜리, 살모넬라 미네소타, 살모넬라 티피뮤리움, 또는 시겔라 플렉스네리의 모노포스포릴 지질(MPL) A 또는 특히 MPL®(AS04)과 조합된 명반, 개별적으로 상기 언급된 박테리아의 MPL A, 사포닌, 예를 들어, QS-21, Quil-A, ISCOM, ISCOMATRIX™, 에멀젼, 예를 들어, MF59™, Montanide® ISA 51 및 ISA 720, AS02(QS21+스쿠알렌+MPL®), 리포솜 및 리포솜 제형, 예를 들어, AS01, 합성되거나 특이적으로 제조된 미세입자 및 미세운반체, 예를 들어, N. 고노레아, 클라미디아 트라코마티스 및 그 밖의 박테리아의 박테리아-유래된 외막 소포(OMV), 또는 키토산 입자, 데포-형성 작용제, 예를 들어, Pluronic® 블록 공중합체, 특이적으로 변형되거나 제조된 펩티드, 예를 들어, 뮤라밀 디펩티드, 아미노알킬 글루코사미니드 4-포스페이트, 예를 들어, RC529, 또는 단백질, 예를 들어, 박테리아 톡소이드 또는 독소 단편을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 다른 애쥬번트의 용량은 통상적인 용량 범위 연구를 이용하여 결정될 수 있다.
구현예들에서, 합성 나노운반체는 다양한 시점에서 및/또는 다양한 신체 위치에서 및/또는 다양한 면역화 경로에 의해 별개로 투여되는 나노운반체(애쥬번트를 갖거나 갖지 않고, 또 다른 전달 비히클을 이용하거나 이용하지 않음)에 결합된 것과 상이하거나, 유사하거나, 동일한 항원, 또는 다양한 시점에서 및/또는 다양한 신체 위치에서 및/또는 다양한 면역화 경로에 의해 별개로 투여되는 또 다른 항원 및/또는 애쥬번트-함유 합성 나노운반체와 조합될 수 있다.
합성 나노운반체의 집단은 조합되어, 통상의 약학적 혼합 방법을 사용하여 본 발명에 따른 약학적 투여형을 형성할 수 있다. 이들은 각각이 하나 이상의 나노운반체의 서브셋을 함유하는 둘 이상의 현탁액이 직접 조합되거나, 희석제를 함유하는 하나 이상의 용기를 통해 섞이는 액체-액체 혼합을 포함한다. 또한, 합성 나노운반체가 분말 형태로 생성되거나 저장될 수 있기 때문에, 통상의 매질 중의 둘 이상의 분말의 재현탁액과 같이 건조 분말-분말 혼합을 수행할 수 있다. 나노운반체의 특성 및 이들의 상호작용 잠재성에 따라, 하나의 또는 다른 경로의 혼합으로 부여되는 이점이 존재할 수 있다.
합성 나노운반체를 포함하는 전형적인 조성물은 무기 또는 유기 완충제(예를 들어, 포스페이트, 카보네이트, 아세테이트 또는 시트레이트의 소듐 또는 포타슘 염) 및 pH 조절제(예를 들어, 염산, 소듐 또는 포타슘 하이드록시드, 시트레이트 또는 아세테이트의 염, 아미노산 및 이들의 염), 산화방지제(예를 들어, 아스코르브산, 알파-토코페롤), 계면활성제(예를 들어, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 폴리옥시에틸렌9-10 노닐 페놀, 소듐 데스옥시콜레이트), 용액 및/또는 냉동/동결 안정화제(예를 들어, 수크로스, 락토스, 만니톨, 트레할로스), 삼투압 조절제(예를 들어, 염 또는 당), 항박테리아제(예를 들어, 벤조산, 페놀, 젠타마이신), 소포제(예를 들어, 폴리디메틸실로존), 보존제(예를 들어, 티메로살, 2-페녹시에탄올, EDTA), 중합체 안정화제 및 점도-조절제(예를 들어, 폴리비닐피롤리돈, 폴록사머 488, 카르복시메틸셀룰로스) 및 공-용매(예를 들어, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜, 에탄올)를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 허용되는 부형제와 조합된 합성 나노운반체를 포함한다. 조성물은 통상의 약학적 제조 및 배합 기술을 사용하여 제조되어, 유용한 투여 형태에 이를 수 있다. 본 발명을 실시하는데 사용하기에 적절한 기술은 문헌[Handbook of Industrial Mixing: Science and Practice, Edited by Edward L. Paul, Victor A. Atiemo-Obeng, and Suzanne M. Kresta, 2004 John Wiley & Sons, Inc.; 및 Pharmaceutics: The Science of Dosage Form Design, 2nd Ed. Edited by M. E. Auten, 2001, Churchill Livingstone]에서 찾을 수 있다. 일 구현예에서, 합성 나노운반체는 보존제와 함께 주사용 멸균 염수 용액 중에 현탁된다.
합성 나노운반체의 조성물은 임의의 적합한 방법으로 제조될 수 있으며, 본 발명은 본원에 기재된 방법을 이용하여 생성될 수 있는 조성물의 용도로 결코 제한되지 않음이 이해되어야 한다. 적절한 방법의 선택은 회합되는 특정 구성요소의 특성에 대한 주의를 필요로 할 수 있다.
일부 구현예에서, 합성 나노운반체는 멸균 조건 하에서 제조되거나 최종적으로 멸균된다. 이는 생성된 조성물이 멸균이며, 비-감염성이어서, 비-멸균 조성물에 비하여 안전성이 개선되는 것을 보장할 수 있다. 이는 특히 합성 나노운반체를 제공하는 피검체가 면역 결함을 갖고/갖거나, 감염을 앓고 있고/있거나 감염되기 쉬운 경우에, 가치있는 안전성 척도를 제공한다. 일부 구현예에서, 합성 나노운반체는 동결건조될 수 있으며, 활성의 손실 없이 연장된 기간 동안 제형화 방법에 따라 현탁액 중에 또는 동결건조 분말로서 저장될 수 있다.
본 발명의 조성물은 피하, 비내, 경구, 정맥내, 복강내, 근내, 경점막, 경점막, 설하, 직장, 눈, 폐, 피내, 경피(transdermal), 피부관통(transcutaneous) 또는 피내를 포함하거나 이에 제한되지는 않는 다양한 경로에 의해 또는 이들 경로의 조합에 의해 투여될 수 있다. 또한, 투여 경로는 흡입 또는 폐 에어로졸에 의한 투여를 포함한다. 에어로졸 전달 시스템의 제조 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다(예를 들어, 참조로 포함되는 문헌[Sciarra and Cutie, "Aerosols," in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, 1990, pp. 1694-1712] 참조).
투여 형태의 용량은 합성 나노운반체의 집단의 양을 다양화시키고, 본 발명에 따른 단백질 및/또는 애쥬번트 및/또는 추가 항원의 양을 다양화시키는 것을 함유한다. 투여 형태에 존재하는 합성 나노운반체 및/또는 단백질 및/또는 애쥬번트 및/또는 추가 항원의 양은 존재하는 구성요소의 특성, 달성되는 치료 이익, 및 다른 상기 파라미터에 따라 다양화될 수 있다. 구현예들에서, 용량 범위 연구는 합성 나노운반체의 집단의 최적 치료량 및 투여 형태에 존재하는 단백질 및/또는 애쥬번트 및/또는 추가 항원의 양을 달성하기 위해 수행될 수 있다. 구현예들에서, 합성 나노운반체 및 단백질 및/또는 애쥬번트 및/또는 추가 항원은 피검체로의 투여후 단백질 및/또는 추가 항원에 대한 면역 반응을 발생시키는 유효량으로 투여 형태에 존재한다. 피검체에서 통상적인 용량 범위 연구 및 기술을 이용하여 면역 반응을 발생시키는 유효량을 결정할 수 있다. 투여 형태는 다양한 빈도로 투여될 수 있다. 한 바람직한 구현예에서, 투여 형태의 적어도 1회 투여가 약리학적으로 관련된 반응을 발생시키는데 충분하다. 더욱 바람직한 구현예에서, 투여 형태의 적어도 2회의 투여, 적어도 3회의 투여, 또는 적어도 4회의 투여가 약리학적으로 관련된 반응을 보장하기 위해 이용된다.
본원에 기재된 조성물 및 방법은 면역 반응을 유도하거나, 향상시키거나, 억제하거나, 조절하거나, 지도하거나, 재지도하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 기재된 조성물 및 방법은 질환, 예를 들어, 암, 감염성 질병, 대사 질병, 퇴행성 질병, 비-자가면역 질병, HIV, 말라리아, B형 간염 또는 본원에 제공된 임의의 다른 장애 및/또는 질환의 진단, 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다.
감염성 질병의 예는 바이러스 감염성 질병, 예를 들어, AIDS, 수두(바리셀라(Varicella)), 감기, 사이토메갈로바이러스 감염, 콜로라도 진드기 열, 뎅기열, 에볼라 출혈열, 수족구병, 간염, 단순 포진, 대상 포진, HPV, 인플루엔자(독감), 라사 열, 홍역, 마르부르크 출혈열, 감염성 단핵구증, 유행성 이하선염, 노로바이러스, 소아마비, 진행성 다발성 백질뇌병증, 광견병, 풍진, SARS, 천연두(바리올라(Variola)), 바이러스성 뇌염, 바이러스성 위장염, 바이러스성 뇌막염, 바이러스성 폐렴, 웨스트 나일 질환 및 황열병; 세균성 감염성 질병, 예를 들어, 탄저병, 세균성 수막염, 보툴리누스중독증, 브루셀라증, 캄필로박터증, 고양이할큄병, 콜레라, 디프테리아, 유행성 발진티푸스, 임질, 농가진, 레지오넬라증, 나병(한센병), 렙토스피라증, 리스테리아증, 라임병, 유사비저, 류마티스 열, MRSA 감염, 노카르디아증, 백일해(백일 기침), 페스트, 폐렴구균 폐렴, 앵무새병, Q열, 록키산 홍반열(RMSF), 살모넬라증, 성홍열, 시겔라증, 매독, 파상풍, 트라코마, 결핵, 야토병, 장티푸스, 발진티푸스 및 요로 감염; 기생충 감염성 질병, 예를 들어, 아프리카 트리파노소마증, 아메바증, 회충증, 바베시아증, 샤가스병, 간흡충증, 크립토스포리듐증, 낭미충증, 열두조충증, 메디나충증, 포충증, 요충증, 간질증, 비대흡충증, 사상충증, 자유 생활 아메바 감염(Free-living amebic infection), 람블편모충증, 턱구충증, 왜소조충증, 이소스포라증, 칼라-아자르, 리슈만편모충증, 말라리아, 요코가와흡충증, 구더기증, 회선사상충증, 이감염증, 요충 감염, 옴, 주혈흡충증, 조충증, 개회충증, 톡소포자충증, 선모충증(Trichinellosis), 선모충증(Trichinosis), 편충증, 트리코모나스증 및 파동편모충증; 진균 감염성 질병, 예를 들어, 아스페르길루스증, 분아균증, 칸디다증, 콕시디오이데스진균증, 크립토코쿠스증, 히스토플라스마증, 발백선증(무좀) 및 샅백선증; 프리온 감염성 질병, 예를 들어, 앨퍼스병(Alpers' disease), 치명성 가계 불면증, 게르스트만-슈트라우슬러-쉐인커 증후군(Gerstmann-Straussler-Scheinker Syndrome), 쿠루 및 변종 크로이츠펠트-야콥병을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
암의 예는 유방암; 담도암; 방광암; 아교모세포종 및 수모세포종을 포함하는 뇌암; 자궁경부암; 융모막암종; 결장암; 자궁내막암; 식도암; 위암; 급성 림프구성 백혈병 및 골수성 백혈병을 포함하는 혈액학적 신생물, 예를 들어, B 세포 CLL; T-세포 급성 림프구성 백혈병/림프종; 털세포 백혈병; 만성 골수성 백혈병, 다발골수종; AIDS-관련 백혈병 및 성인 T-세포 백혈병/림프종; 보엔병 및 파제트병을 포함하는 상피내 신생물; 간암; 폐암; 호지킨병 및 림프구성 림프종을 포함하는 림프종; 신경모세포종; 편평 세포 암종을 포함하는 구강암; 상피 세포, 간질 세포, 생식 세포 및 중간엽 세포로부터 발생하는 것을 포함하는 난소암; 췌장암; 전립선암; 직장암; 평활근육종, 횡문근육종, 지방육종, 섬유육종, 및 골육종을 포함하는 육종; 흑색종, 메르켈 세포 암종, 카포시 육종, 기저세포 암종, 및 편평 세포 암을 포함하는 피부암; 종자 종양, 예를 들어, 고환종, 비정상피종(기형종, 융모막암종), 간질 종양, 및 생식 세포 종양을 포함하는 고환암; 갑상샘 샘암종 및 수질 암종을 포함하는 갑상샘 암; 및 샘암종 및 윌름즈 종양을 포함하는 신장암을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
대사성 질병의 예는 탄수화물 대사, 아미노산 대사, 유기산 대사, 지방산 산화 및 미토콘드리아 대사, 프로피린(prophyrin) 대사, 퓨린 또는 피리미딘 대사, 스테로이드 대사, 리소솜성 미토콘드리아 기능, 퍼옥시좀 기능, 리소솜 저장의 장애, 요소 주기 장애(예를 들어, N-아세틸 글루타메이트 신세타제(synthetase) 결핍, 카르바밀포스페이트 신타제(synthase) 결핍, 오르니틴 카르바밀 전이효소 결핍, 시르기노숙신산(crginosuccinic) 산뇨, 시트룰린혈증, 아르기나제 결핍), 아미노산 장애(예를 들어, 비-케톤 과글리신혈증, 티로신혈증(타입 I), 단풍시럽뇨병), 유기산혈증(예를 들어, 아이소발레르산 혈증, 메틸말론산증, 프로피온산증, 글루타르산 요증 타입 I, 글루타르산증 타입 I & II), 미토콘드리아 장애(예를 들어, 카르복실라제 결함, 미토콘드리아 근육병증, 젖산 산증(피루베이트 탈수소효소 복합체 결함), 선천성 젖산 산증, 미토콘드리아 호흡 사슬 결함, 시스틴증, 고셔병, 파브리병, 폼페병, 점액다당류증 I, 점액다당류증 II, 점액다당류증 VI)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
퇴행성 질병의 예는 중간엽/중배엽 퇴행성 질병, 퇴행성 근육 질병, 내피 퇴행성 질병, 퇴행성 신경 질병, 퇴행성 관절 질병(예를 들어, 골관절염), 주요 유형의 퇴행성 심장 질병(예를 들어, 관상동맥 심장 질병, 선천성 심장 질병, 류마티스성 심장 질병, 협심증), 신경퇴행성 질병(예를 들어, 알츠하이머병, 근위축성 측삭 경화증, 프리드리히 실조증, 헌팅턴병, 레비 소체 질병, 파킨슨병, 척수근육 위축증), 신경근육 장애(예를 들어, 근육퇴행위축, 뒤시엔느 근육퇴행위축, 얼굴어깨위팔근육퇴행위축, 근육긴장퇴행위축, 선천성 근육병증, 가족성 심장근육병증, 확장심장근육병증, 비대심장근육병증, 제한심장근육병증, 또는 관상동맥 질병)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 제공된 합성 나노운반체 및/또는 추가 항원으로의 결합을 위한 단백질은 본원에 제공된 질병 또는 질환 중 임의의 질병 또는 질환과 관련된 항원일 수 있다. 이들은 암, 감염 또는 감염성 질병 또는 퇴행성 또는 비-자가면역 질병과 관련된 항원을 포함한다. HIV, 말라리아, 리슈만편모충증, 인간 필로바이러스 감염, 토가바이러스 감염, 알파바이러스 감염, 아레나바이러스 감염, 버냐바이러스 감염, 플라비바이러스 감염, 인간 유두종바이러스 감염, 인간 인플루엔자 A 바이러스 감염, B형 간염 감염 또는 C형 간염과 관련된 항원이 또한 포함된다.
암 항원의 예는 HER 2(p185), CD20, CD33, GD3 강글리오시드, GD2 강글리오시드, 암배아항원(CEA), CD22, 밀크 점액소 코어 단백질, TAG-72, 루이스 A 항원, 난소 관련 항원, 예를 들어, OV-TL3 및 MOv18, 항체 9.2.27에 의해 인지되는 고 Mr 흑색종 항원, HMFG-2, SM-3, B72.3, PR5C5, PR4D2 등을 포함한다. 추가 예는 MAGE, MART-1/Melan-A, gp100, 디펩티딜 펩티다제 IV(DPPIV), 아데노신 데아미나제-결합 단백질(ADAbp), FAP, 사이클로필린 b, 결장직장 관련 항원(CRC)--C017-1A/GA733, 암배아항원(CEA) 및 이의 면역원성 에피토프 CAP-1 및 CAP-2, etv6, aml1, 전립선 산 포스파타제(PAP), 전립선 특이적 항원(PSA) 및 이의 면역원성 에피토프 PSA-1, PSA-2, 및 PSA-3, 전립선-특이적 막 항원(PSMA), T-세포 수용체/CD3-제타 사슬, 종양 항원의 MAGE-패밀리(예를 들어, MAGE-I 또는 MAGE-II 패밀리)(예를 들어, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-Xp2(MAGE-B2), MAGE-Xp3(MAGE-B3), MAGE-Xp4(MAGE-B4), MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-C4, MAGE-C5), 종양 항원의 GAGE-패밀리(예를 들어, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, GAGE-9), BAGE, RAGE, LAGE-1, NAG, GnT-V, MUM-1, CDK4, 티로시나제, p53, MUC 패밀리, HER2/neu, p21ras, RCAS1, α-태아단백질, E-카드헤린, α-카테닌, β-카테닌 및 γ-카테닌, p120ctn, gp100Pmel117, PRAME, NY-ESO-1, cdc27, 샘종 폴립증 coli 단백질(APC), 포드린(fodrin), 코넥신(Connexin) 37, Ig-이디오타입(Ig-idiotype), p15, gp75, GM2 및 GD2 강글리오시드, 바이러스 생성물, 예를 들어, 인간 유두종바이러스 단백질, 종양 항원의 Smad 패밀리, lmp-1, P1A, EBV-인코딩된 핵 항원(EBNA)-1, 뇌 글리코겐 포스포릴라제, SSX-1, SSX-2(HOM-MEL-40), SSX-1, SSX-4, SSX-5, SCP-1 및 CT-7, CD20 및 c-erbB-2를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 감염 또는 감염성 질병과 관련된 항원은 본원에 제공된 감염성 작용제 중 임의의 감염성 작용제와 관련된다. 한 구현예에서, 감염성 작용제는 아데노바이러스과, 피코르나바이러스과, 헤르페스바이러스과, 헤파드나바이러스과, 플라비바이러스과, 레트로바이러스과, 오르쏘믹소바이러스과, 파라믹소바이러스과, 파필로마바이러스과, 랍도바이러스과, 토가바이러스과 또는 파로바이러스과 패밀리의 바이러스이다. 또 다른 구현예에서, 감염성 작용제는 아데노바이러스, 콕사키바이러스, A형 간염 바이러스, 폴리오바이러스, 리노바이러스, 단순 포진 바이러스, 수두-대상 포진 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 인간 사이토메갈로바이러스, 인간 헤르페스바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 황열 바이러스, 뎅기 바이러스, 서부 나일강 바이러스, HIV, 인플루엔자 바이러스, 홍역 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 인간 메타뉴모바이러스, 인간 유두종바이러스, 광견병 바이러스, 풍진 바이러스, 인간 보카바이러스 또는 파르보바이러스 B19이다. 또 다른 구현예에서, 감염성 작용제는 보르데텔라(Bordetella), 보렐리아(Borrelia), 브루셀라(Brucella), 캄필로박터(Campylobacter), 클라미디아(Chlamydia) 및 클라미도필라(Chlamydophila), 클로스트리듐(Clostridium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 엔테로코쿠스(Enterococcus), 에스케리키아(Escherichia), 프란시셀라(Francisella), 헤모필러스(Haemophilus), 헬리코박터(Helicobacter), 레지오넬라(Legionella), 렙토스피라(Leptospira), 리스테리아(Listeria), 미코박테륨(Mycobacterium), 미코플라즈마(Mycoplasma), 나이세리아(Neisseria), 슈도모나스(Pseudomonas), 리케차(Rickettsia), 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 스태필로코쿠스(Staphylococcus), 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 매독 비브리오(Treponema Vibrio) 또는 예르시니아(Yersinia) 속의 박테리아이다. 한 추가 구현예에서, 감염성 작용제는 보르데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis), 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi), 브루셀라 아보르투스(Brucella abortus), 브루셀라 캐니스(Brucella canis), 브루셀라 멜리텐시스(Brucella melitensis), 브루셀라 수이스(Brucella suis), 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 클라미디아 뉴모니아(Chlamydia pneumoniae), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 클라미디아 시타시(Chlamydophila psittaci), 클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리듐 디피실레(Clostridium difficile), 클로스트리듐 퍼프 린젠스(Clostridium perfringens), 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani), 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae), 엔테로코쿠스 파에칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코쿠스 파에시움(Enterococcus faecium), 에스케리키아 콜리(Escherichia coli), 프란시셀라 툴라렌신스(Francisella tularensis), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 미코박테리움 레프라에(Mycobacterium leprae), 미코박테리움 튜베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 미코박테리움 울세란스(Mycobacterium ulcerans), 미코플라스마 뉴모니아(Mycoplasma pneumoniae), 나이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhoeae), 나이세리아 메닌지티데스(Neisseria meningitides), 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 리케차 리케치이(Rickettsia rickettsii), 살모넬라 티피(Salmonella typhi), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 시겔라 손네이(Shigella sonnei), 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스태필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 스태필로코쿠스 사프로피티쿠스(Staphylococcus saprophyticus), 스트렙토코쿠스 아갈락티애(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코쿠스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae) 또는 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis)이다. 또 다른 구현예에서, 감염성 작용제는 칸디다(Candida), 아스퍼질러스(Aspergillus), 크립토코쿠스(Cryptococcus), 히스토플라스마(Histoplasma), 뉴모시스티스(Pneumocystis) 또는 스태키보트리스(Stachybotrys) 속의 진균이다. 또 다른 구현예에서, 감염성 작용제는 C. 알비칸스(C. albicans), 아스퍼질러스 퓨미가투스(Aspergillus fumigatus), 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus), 크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 크립토코쿠스 라우렌티이(Cryptococcus laurentii), 크립토코쿠스 알비두스(Cryptococcus albidus), 크립토코쿠스 가티이(Cryptococcus gattii), 히스토플라스마 캡슐라툼(Histoplasma capsulatum), 뉴모시스티스 지로베시이(Pneumocystis jirovecii) 또는 스태키보트리스 카르타룸(Stachybotrys chartarum)이다.
또 다른 구현예에서, 감염 또는 감염성 질병과 관련된 항원은 VI, VII, E1A, E3-19K, 52K, VP1, 표면 항원, 3A 단백질, 캡시드 단백질, 뉴클레오캡시드, 표면 돌기(surface projection), 막횡단 단백질, UL6, UL18, UL35, UL38, UL19, 초기 항원, 캡시드 항원, Pp65, gB, p52, 잠복 핵 항원-1, NS3, 외피 단백질, 외피 단백질 E2 도메인, gp120, p24, 지질펩티드 Gag(17-35), Gag(253-284), Nef(66-97), Nef(116-145), Pol(325-355), 뉴라미니다제, 뉴클레오캡시드 단백질, 기질 단백질, 인단백질, 융합 단백질, 헤마글루티닌, 헤마글루티닌-뉴라미니다제, 당단백질, E6, E7, 외피 지질단백질 또는 비-구조 단백질(NS)을 포함하는 것이다. 또 다른 구현예에서, 항원은 백일해 독소(PT), 섬유상 헤마글루티닌(FHA), 퍼탁틴(pertactin)(PRN), 섬모(FIM 2/3), VlsE; DbpA, OspA, Hia, PrpA, MltA, L7/L12, D15, 0187, VirJ, Mdh, AfuA, L7/L12, 외막 단백질, LPS, 항원 타입 A, 항원 타입 B, 항원 타입 C, 항원 타입 D, 항원 타입 E, FliC, FliD, Cwp84, 알파-독소, 쎄타-독소, 프룩토스 1,6-비포스페이트-알돌라제(FBA), 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소(GPD), 피루베이트:페레독신 산화환원효소(PFOR), 연장 인자-G(EF-G), 가설 단백질(HP), T 독소, 톡소이드 항원, 캡슐 다당류, 단백질 D, Mip, 핵산단백질(NP), RD1, PE35, PPE68, EsxA, EsxB, RD9, EsxV, Hsp70, 지질다당류, 표면 항원, Sp1, Sp2, Sp3, 글리세로포스포디에스테르 포스포디에스테라제, 외막 단백질, 샤페론-안내(chaperone-usher) 단백질, 캡슐 단백질(F1) 또는 V 단백질을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항원은 캡슐 당단백질, Yps3P, Hsp60, 주요 표면 단백질, MsgC1, MsgC3, MsgC8, MsgC9 또는 SchS34를 포함하는 것이다.
실시예
실시예 1: 합성 나노운반체 제형 Lot #1
재료
난알부민 단백질을 Worthington Biochemical Corporation(730 Vassar Avenue, Lakewood, NJ 08701. Product Code 3048)으로부터 구입하였다. 3:1의 락티드 대 글리콜리드 비의 PLGA로부터 제조되고, 12.7% w/w의 컨쥬게이션된 R848 함량을 갖는 약 5,200 Da의 PLGA-R848을 합성하였다. 약 5,000 Da의 니코틴-말단화된 PEG 블록 및 약 19,000 Da의 DL-PLA 블록을 갖는 PLA-PEG-니코틴을 합성하였다. 0.21 dL/g의 고유 점도를 갖는 PLA를 SurModics Pharmaceuticals(756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211. Product Code 100 DL 2A)로부터 구입하였다. 폴리비닐 알코올(Mw = 11,000 내지 31,000, 87 내지 89% 가수분해됨)을 J.T. Baker(Part Number U232-08)로부터 구입하였다.
방법
용액을 하기와 같이 제조하였다:
용액 1: 10mM 포스페이트 완충액 중 20 ㎎/㎖의 난알부민 단백질.
용액 2: 디클로로메탄 중 50 ㎎/㎖의 PLGA-R848, 25 ㎎/㎖의 PLA-PEG-니코틴, 25 ㎎/㎖의 PLA. 용액을 디클로로메탄 중 100 ㎎/㎖로서 각각의 중합체를 개별적으로 용해시킨 후, 1부의 각각의 PLA-PEG-니코틴 용액 및 PLA 용액에 2부의 PLGA-R848 용액을 첨가함으로써 용액을 혼합시켜 제조하였다.
용액 3: 100mM 포스페이트 완충액, pH 8 100 mM 중 50 ㎎/㎖의 폴리비닐 알코올.
용액 4: 70 mM 포스페이트 완충액, pH 8.
용액 1 & 용액 2를 이용하여 먼저 일차(W1/O) 에멀젼을 생성시켰다. 용액 1(0.2 ㎖) 및 용액 2(1.0 ㎖)를 작은 유리 압력 튜브에서 조합시키고, Branson Digital Sonifier 250을 이용하여 40초 동안 50% 진폭에서 음파처리하였다. 이후, 일차 에멀젼에 용액 3(2.0 ㎖)을 첨가한 후, Branson Digital Sonifier 250을 이용하여 40초 동안 30% 진폭에서 음파처리하여 이차(W1/O/W2) 에멀젼을 형성시켰다. 이차 에멀젼을 70 mM 포스페이트 완충액(30 ㎖)을 함유하는 개방된 50 ㎖ 비커에 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 교반시켜 디클로로메탄을 증발시키고, 나노운반체를 현탁액 중에 형성시켰다. 나노운반체 현탁액을 원심분리 튜브로 옮기고, 1시간 동안 13,823g에서 회전시키고, 상층액을 제거하고, 포스페이트 완충 염수 중에 펠렛을 재현탁시킴으로써 현탁된 나노운반체의 일부를 세척하였다. 이러한 세척 절차를 반복한 후, 펠렛을 포스페이트 완충 염수에 재현탁시켜, 중합체를 기준으로 10 ㎎/㎖의 공칭 농도를 갖는 나노운반체 현탁액을 수득하였다. 현탁액을 사용때까지 -20℃에 동결 저장하였다.
표 1: 나노운반체 특성규명
Figure pct00002
실시예 2: 합성 나노운반체 제형 Lot #2
재료
난알부민 단백질을 Worthington Biochemical Corporation(730 Vassar Avenue, Lakewood, NJ 08701. Product Code 3048)으로부터 구입하였다. 난알부민 펩티드 323-339 아미드 아세테이트 염을 Bachem Americas Inc.(3132 Kashiwa Street, Torrance CA 90505. Product code 4065609)로부터 구입하였다. 3:1의 락티드 대 글리콜리드 비의 PLGA로부터 제조되고, 12.7% w/w의 컨쥬게이션된 R848 함량을 갖는 약 5,200 Da의 PLGA-R848을 합성하였다. 약 5,000 Da의 니코틴-말단화된 PEG 블록 및 약 19,000 Da의 DL-PLA 블록을 갖는 PLA-PEG-니코틴을 합성하였다. 0.21 dL/g의 고유 점도를 갖는 PLA를 SurModics Pharmaceuticals(756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211. Product Code 100 DL 2A)로부터 구입하였다. 폴리비닐 알코올(Mw = 11,000 내지 31,000, 87 내지 89% 가수분해됨)을 J.T. Baker(Part Number U232-08)로부터 구입하였다.
방법
용액을 하기와 같이 제조하였다:
용액 1A: 10mM 포스페이트 완충액 중 40 ㎎/㎖의 난알부민 단백질.
용액 1B: 희석 염산 수용액 중 40 ㎎/㎖의 난알부민 펩티드 아미드 323 - 339.
용액 2: 디클로로메탄 중 50 ㎎/㎖의 PLGA-R848, 25 ㎎/㎖의 PLA-PEG-니코틴, 25 ㎎/㎖의 PLA. 용액을 디클로로메탄 중 100 ㎎/㎖로서 각각의 중합체를 개별적으로 용해시킨 후, 1부의 각각의 PLA-PEG-니코틴 용액 및 PLA 용액에 2부의 PLGA-R848 용액을 첨가함으로써 용액을 혼합시켜 제조하였다.
용액 3: 100mM 포스페이트 완충액, pH 8 100 mM 중 50 ㎎/㎖의 폴리비닐 알코올.
용액 4: 70 mM 포스페이트 완충액, pH 8.
용액 1A & 용액 2를 이용하여 제1의 일차(W1/O) 에멀젼을 생성시켰다. 용액 1A(0.2 ㎖) 및 용액 2(1.0 ㎖)를 작은 유리 압력 튜브에서 조합시키고, Branson Digital Sonifier 250을 이용하여 40초 동안 50% 진폭에서 음파처리하였다. 용액 1B & 용액 2를 이용하여 제2의 일차(W1/O) 에멀젼을 생성시켰다. 용액 1B(0.2 ㎖) 및 용액 2(1.0 ㎖)를 작은 유리 압력 튜브에서 조합시키고, Branson Digital Sonifier 250을 이용하여 40초 동안 50% 진폭에서 음파처리하였다. 제2의 일차 에멀젼의 약 ½을 이의 압력 튜브로부터 분리시켜 폐기시킨 후, 제1의 일차 에멀젼의 ½(0.500 ㎖)을 튜브에 첨가하여, 약 1 ㎖의 전체 부피의 2개의 일차 에멀젼의 1:1 혼합물을 생성시켰다. 이후, 일차 에멀젼에 용액 3(2.0 ㎖)을 첨가한 후, Branson Digital Sonifier 250을 이용하여 40초 동안 30% 진폭에서 음파처리하여 이차(W1/O/W2) 에멀젼을 형성시켰다. 이차 에멀젼을 70 mM 포스페이트 완충액(30 ㎖)을 함유하는 개방된 50 ㎖ 비커에 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 교반시켜 디클로로메탄을 증발시키고, 나노운반체를 현탁액 중에 형성시켰다. 나노운반체 현탁액을 원심분리 튜브로 옮기고, 1시간 동안 13,823g에서 회전시키고, 상층액을 제거하고, 포스페이트 완충 염수 중에 펠렛을 재현탁시킴으로써 현탁된 나노운반체의 일부를 세척하였다. 이러한 세척 절차를 반복한 후, 펠렛을 포스페이트 완충 염수에 재현탁시켜, 중합체를 기준으로 10 ㎎/㎖의 공칭 농도를 갖는 나노운반체 현탁액을 수득하였다. 현탁액을 사용때까지 -20℃에 동결 저장하였다.
표 2: 나노운반체 특성규명
Figure pct00003
실시예 3: 합성 나노운반체 제형 Lot #3
재료
난알부민 단백질을 Worthington Biochemical Corporation(730 Vassar Avenue, Lakewood, NJ 08701. Product Code 3048)으로부터 구입하였다. 3:1의 락티드 대 글리콜리드 비의 PLGA로부터 제조되고, 12.7% w/w의 컨쥬게이션된 R848 함량을 갖는 약 5,200 Da의 PLGA-R848을 합성하였다. 2,000 Da의 메틸 에테르 말단화된 PEG 블록 및 약 19,000 Da의 DL-PLA 블록을 갖는 PLA-PEG-OMe 블록 공중합체를 합성하였다. 0.21 dL/g의 고유 점도를 갖는 PLA를 SurModics Pharmaceuticals(756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211. Product Code 100 DL 2A)로부터 구입하였다. 폴리비닐 알코올(Mw = 11,000 내지 31,000, 87 내지 89% 가수분해됨)을 J.T. Baker(Part Number U232-08)로부터 구입하였다.
방법
용액을 하기와 같이 제조하였다:
용액 1: 10mM 포스페이트 완충액 중 20 ㎎/㎖의 난알부민 단백질.
용액 2: 디클로로메탄 중 50 ㎎/㎖의 PLGA-R848, 25 ㎎/㎖의 PLA-PEG-OMe, 25 ㎎/㎖의 PLA. 용액을 디클로로메탄 중 100 ㎎/㎖로서 각각의 중합체를 개별적으로 용해시킨 후, 1부의 각각의 PLA-PEG-OMe 용액 및 PLA 용액에 2부의 PLGA-R848 용액을 첨가함으로써 용액을 혼합시켜 제조하였다.
용액 3: 100mM 포스페이트 완충액, pH 8 100 mM 중 50 ㎎/㎖의 폴리비닐 알코올.
용액 4: 70 mM 포스페이트 완충액, pH 8.
용액 1 & 용액 2를 이용하여 먼저 일차(W1/O) 에멀젼을 생성시켰다. 용액 1(0.2 ㎖) 및 용액 2(1.0 ㎖)를 작은 유리 압력 튜브에서 조합시키고, Branson Digital Sonifier 250을 이용하여 40초 동안 50% 진폭에서 음파처리하였다. 이후, 일차 에멀젼에 용액 3(2.0 ㎖)을 첨가한 후, Branson Digital Sonifier 250을 이용하여 40초 동안 30% 진폭에서 음파처리하여 이차(W1/O/W2) 에멀젼을 형성시켰다. 이차 에멀젼을 70 mM 포스페이트 완충액(30 ㎖)을 함유하는 개방된 50 ㎖ 비커에 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 교반시켜 디클로로메탄을 증발시키고, 나노운반체를 현탁액 중에 형성시켰다. 나노운반체 현탁액을 원심분리 튜브로 옮기고, 1시간 동안 13,823g에서 회전시키고, 상층액을 제거하고, 포스페이트 완충 염수 중에 펠렛을 재현탁시킴으로써 현탁된 나노운반체의 일부를 세척하였다. 이러한 세척 절차를 반복한 후, 펠렛을 포스페이트 완충 염수에 재현탁시켜, 중합체를 기준으로 10 ㎎/㎖의 공칭 농도를 갖는 나노운반체 현탁액을 수득하였다. 현탁액을 사용때까지 -20℃에 동결 저장하였다.
표 3: 나노운반체 특성규명
Figure pct00004
실시예 4: 합성 나노운반체 제형 Lot #4
난알부민 단백질을 Worthington Biochemical Corporation(730 Vassar Avenue, Lakewood, NJ 08701. Product Code 3048)으로부터 구입하였다. 난알부민 펩티드 323-339 아미드 아세테이트 염을 Bachem Americas Inc.(3132 Kashiwa Street, Torrance CA 90505. Product code 4065609)으로부터 구입하였다. 3:1의 락티드 대 글리콜리드 비의 PLGA로부터 제조되고, 12.7% w/w의 컨쥬게이션된 R848 함량을 갖는 약 5,200 Da의 PLGA-R848을 합성하였다. 약 2,000 Da의 메틸 에테르 말단화된 PEG 블록 및 약 19,000 Da의 DL-PLA 블록을 갖는 PLA-PEG-OMe 블록 공중합체를 합성하였다. 0.21 dL/g의 고유 점도를 갖는 PLA를 SurModics Pharmaceuticals(756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211. Product Code 100 DL 2A)로부터 구입하였다. 폴리비닐 알코올(Mw = 11,000 내지 31,000, 87 내지 89% 가수분해됨)을 J.T. Baker(Part Number U232-08)로부터 구입하였다.
방법
용액을 하기와 같이 제조하였다:
용액 1A: 10mM 포스페이트 완충액 중 40 ㎎/㎖의 난알부민 단백질.
용액 1B: 희석 염산 수용액 중 40 ㎎/㎖의 난알부민 펩티드 아미드 323 - 339.
용액 2: 디클로로메탄 중 50 ㎎/㎖의 PLGA-R848, 25 ㎎/㎖의 PLA-PEG-OMe, 25 ㎎/㎖의 PLA. 용액을 디클로로메탄 중 100 ㎎/㎖로서 각각의 중합체를 개별적으로 용해시킨 후, 1부의 각각의 PLA-PEG-OMe 용액 및 PLA 용액에 2부의 PLGA-R848 용액을 첨가함으로써 용액을 혼합시켜 제조하였다.
용액 3: 100mM 포스페이트 완충액, pH 8 100 mM 중 50 ㎎/㎖의 폴리비닐 알코올.
용액 4: 70 mM 포스페이트 완충액, pH 8.
용액 1A & 용액 2를 이용하여 제1의 일차(W1/O) 에멀젼을 생성시켰다. 용액 1A(0.2 ㎖) 및 용액 2(1.0 ㎖)를 작은 유리 압력 튜브에서 조합시키고, Branson Digital Sonifier 250을 이용하여 40초 동안 50% 진폭에서 음파처리하였다. 용액 1B & 용액 2를 이용하여 제2의 일차(W1/O) 에멀젼을 생성시켰다. 용액 1B(0.2 ㎖) 및 용액 2(1.0 ㎖)를 작은 유리 압력 튜브에서 조합시키고, Branson Digital Sonifier 250을 이용하여 40초 동안 50% 진폭에서 음파처리하였다. 각각의 0.6 ㎖를 제3의 유리 압력 튜브로 옮겨 부분적으로 2개의 일차 에멀젼을 조합시켜, 약 1.2 ㎖의 전체 부피의 2개의 일차 에멀젼의 1:1 혼합물을 생성시켰다. 이후, 일차 에멀젼에 용액 3(2.0 ㎖)을 첨가한 후, Branson Digital Sonifier 250을 이용하여 40초 동안 30% 진폭에서 음파처리하여 이차(W1/O/W2) 에멀젼을 형성시켰다. 이차 에멀젼을 70 mM 포스페이트 완충액(30 ㎖)을 함유하는 개방된 50 ㎖ 비커에 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 교반시켜 디클로로메탄을 증발시키고, 나노운반체를 현탁액 중에 형성시켰다. 나노운반체 현탁액을 원심분리 튜브로 옮기고, 1시간 동안 13,823g에서 회전시키고, 상층액을 제거하고, 포스페이트 완충 염수 중에 펠렛을 재현탁시킴으로써 현탁된 나노운반체의 일부를 세척하였다. 이러한 세척 절차를 반복한 후, 펠렛을 포스페이트 완충 염수에 재현탁시켜, 중합체를 기준으로 10 ㎎/㎖의 공칭 농도를 갖는 나노운반체 현탁액을 수득하였다. 현탁액을 사용때까지 -20℃에 동결 저장하였다.
표 4: 나노운반체 특성규명
Figure pct00005
실시예 5: 합성 나노운반체 제형 Lot #5
재료
SIINFEKL(SEQ ID NO:1)(난알부민 펩티드 [257 - 264])을 Bachem Americas Inc.(3132 Kashiwa Street, Torrance CA 90505. Product code H-4866)로부터 구입하였다. 난알부민 펩티드 323-339 아미드 아세테이트 염을 Bachem Americas Inc. (3132 Kashiwa Street, Torrance CA 90505. Product code 4065609)으로부터 구입하였다. 3:1의 락티드 대 글리콜리드 비의 PLGA로부터 제조되고, 15% w/w의 컨쥬게이션된 R848 함량을 갖는 약 4,500 Da의 PLGA-R848을 합성하였다. 약 5,000 Da의 니코틴-말단화된 PEG 블록 및 약 17,000 Da의 DL-PLA 블록을 갖는 PLA-PEG-니코틴을 합성하였다. 0.21 dL/g의 고유 점도를 갖는 PLA를 SurModics Pharmaceuticals(756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211. Product Code 100 DL 2A)로부터 구입하였다. 폴리비닐 알코올(Mw = 11,000 내지 31,000, 87 내지 89% 가수분해됨)을 J.T. Baker (Part Number U232-08)로부터 구입하였다.
방법
용액을 하기와 같이 제조하였다:
용액 1A: DMSO 중 200 ㎎/㎖의 SIINFEKL(SEQ ID NO:1).
용액 1B: 희석 염산 수용액 중 20 ㎎/㎖의 난알부민 펩티드 아미드 323 - 339.
용액 2: 디클로로메탄 중 50 ㎎/㎖의 PLGA-R848, 25 ㎎/㎖의 PLA-PEG-니코틴, 25 ㎎/㎖의 PLA. 용액을 디클로로메탄 중 100 ㎎/㎖로서 각각의 중합체를 개별적으로 용해시킨 후, 1부의 각각의 PLA-PEG-니코틴 용액 및 PLA 용액에 2부의 PLGA-R848 용액을 첨가함으로써 용액을 혼합시켜 제조하였다.
용액 3: 100mM 포스페이트 완충액, pH 8 100 mM 중 50 ㎎/㎖의 폴리비닐 알코올.
용액 4: 70 mM 포스페이트 완충액, pH 8.
용액 1A & 용액 2를 이용하여 제1의 일차(S/O) 에멀젼을 생성시켰다. 용액 1A(0.025 ㎖) 및 용액 2(1.0 ㎖)를 작은 유리 압력 튜브에서 조합시키고, Branson Digital Sonifier 250을 이용하여 40초 동안 50% 진폭에서 음파처리하였다. 용액 1B 및 제1의 일차 에멀젼을 이용하여 연속 일차(W1/(S/O)) 에멀젼을 생성시켰다. 용액 1B(0.25 ㎖)를 제1의 일차 에멀젼을 함유하는 작은 유리 압력 튜브에 첨가한 후, Branson Digital Sonifier 250을 이용하여 40초 동안 50% 진폭에서 음파처리하였다. 이후, 연속 일차 에멀젼에 용액 3(2.0 ㎖)을 첨가한 후, Branson Digital Sonifier 250을 이용하여 40초 동안 30% 진폭에서 음파처리하여 이차((S+W1)/O/W2) 에멀젼을 형성시켰다. 이차 에멀젼을 70 mM 포스페이트 완충액(30 ㎖)을 함유하는 개방된 50 ㎖ 비커에 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 교반시켜 디클로로메탄을 증발시키고, 나노운반체를 현탁액 중에 형성시켰다. 나노운반체 현탁액을 원심분리 튜브로 옮기고, 1시간 동안 13,823g에서 회전시키고, 상층액을 제거하고, 포스페이트 완충 염수 중에 펠렛을 재현탁시킴으로써 현탁된 나노운반체의 일부를 세척하였다. 이러한 세척 절차를 반복한 후, 펠렛을 포스페이트 완충 염수에 재현탁시켜, 중합체를 기준으로 10 ㎎/㎖의 공칭 농도를 갖는 나노운반체 현탁액을 수득하였다. 현탁액을 사용때까지 -20℃에 동결 저장하였다.
표 5: 나노운반체 특성규명
Figure pct00006
실시예 6: 합성 나노운반체 조성물은 높은 항체 역가 및 강한 항원-특이적 CTL 활성을 발생시킨다.
세번째 및 네번째 생체내(C57BL/6 마우스) 면역화 연구를 수행하였다. TLR 효능제(R848) 및 엔트랩핑(entrapping)된 난알부민 단백질(OVA)을 전달하는 상기 중합체 나노운반체 제형(#3)을 도입시켰고, 이는 국소 림프 및 비장 세포로부터 높은 항체 역가(예를 들어, 1e6까지의 항-OVA IgG 역가) 및 강한 항원-특이적 CTL 활성을 생성시켰다.
면역화된 마우스를 지정일에 채혈하고, 시험 혈청의 연속 희석액을 이용한 표준 ELISA로 난알부민에 대한 항체를 측정하였다. 비오티닐화된 염소 항-마우스 Ig를 검출 항체로 사용하였다(BD Biosciences, San Diego, CA). EC50을 적정 곡선을 기초로 하려 결정하였다. CTL 활성을 다음과 같이 측정하였다. 나노운반체 제조물 또는 단백질 대조군을 이용한 최종 주사(피하, s.c, 또는 비내, i.n.) 4 내지 5일 후, 유출 림프절(LN)을 분리시키고, 콜라게나제로 처리하고, 균질화시키고, 세척하고, 4 내지 5일 동안 10 내지 100 units/㎖의 IL-2와 함께 인큐베이션시켰다. 이후, 생성된 세포 집단을 계수하고, 세포독성 검정에서 효과기 세포로 사용하였다. SIINFEKL(SEQ ID NO:1) 펩티드 또는 EG.7-OVA 세포(난알부민으로 안정적으로 트랜스펙션됨)로 펄싱된 동계 EL-4 세포를 표적으로 제공하였고, 온전한 EL-4 세포를 백그라운드 대조군으로 제공하였다. 다양한 효과기:표적 비에서의 세포독성을 제조업체의 권고에 따라 CytoTox-ONE™ Homogenuous Membrane Integrity Assay(Promega, Madison, WI)을 이용하여 24시간(37℃)에 걸쳐 측정하였다.
표 6. 나노운반체의 제형
Figure pct00007
표 7. 실험 1 설계
Figure pct00008
표 8. 실험 2 설계
Figure pct00009
실시예 7: 합성 나노운반체 제형 Lot #6
재료
난알부민 단백질을 Worthington Biochemical Corporation (730 Vassar Avenue, Lakewood, NJ 08701. Product Code LS003054)으로부터 구입하였다. 3:1의 락티드 대 글리콜리드 비의 PLGA로부터 제조되고, 8.5% w/w의 컨쥬게이션된 레시퀴모드 함량을 갖는 약 7,800 Da의 PLGA-R848, 폴리-D/L-락티드-코-글리콜리드, 4-아미노-2-(에톡시메틸)-α,α-디메틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-에탄올아미드를 Princeton Global Synthesis(300 George Patterson Drive #206, Bristol, PA 19007. Lot number PGS 16-52)에서 맞춤 제조하였다. 0.21 dL/g의 고유 점도를 갖는 PLA를 SurModics Pharmaceuticals(756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211. Product Code 100 DL 2A)로부터 구입하였다. 약 5,000 Da의 메틸 에테르 말단화된 PEG 블록 및 1H-NMR에 의해 약 21,000 Da(21kDa의 Mn)의 PLA 블록을 갖는 PLA-PEG-OMe 블록 공중합체를 합성하였다. EMPROVE® Polyvinyl Alcohol 5-88, USP(85 내지 89% 가수분해됨, 4.3 내지 5.7 mPa.s의 점도)를 EMD Chemicals Inc.(480 South Democrat Road Gibbstown, NJ 08027. Part Number 1.41354)로부터 구입하였다. 포스페이트-완충 염수 1X(PBS 1X). Mediatech Inc.(9345 Discovery Blvd. Manassas, VA 20109). 제품 코드 21-040-CV.
방법
용액을 하기와 같이 제조하였다:
용액 1: 20 ㎎/㎖의 난알부민 단백질을 실온에서 PBS 1X 중에서 제조하였다.
용액 2: 화학 흄 후드(fume hood) 내에서 1 ㎖의 디클로로메탄 당 100 ㎎의 PLA를 용해시켜 PLA를 제조하였다.
용액 3: 화학 흄 후드 내에서 1 ㎖의 디클로로메탄 당 100 ㎎의 PLA-PEG-OMe를 용해시켜 PLA-PEG-OMe를 제조하였다.
용액 4: 화학 흄 후드 내에서 1 ㎖의 디클로로메탄 당 100 ㎎의 PLGA-R848을 용해시켜 PLGA-R848을 제조하였다.
용액 5: 100mM 포스페이트 완충액, pH 8 100 mM 중 50 ㎎/㎖의 폴리비닐 알코올.
용액 6: 70 mM 포스페이트 완충액, pH 8.
이러한 lot를 이중으로 제조한 후, 세척 후에 조합시켰다. 일차(W1/O) 에멀젼을 먼저 용액 1 내지 4를 혼합시켜 생성시켰다. 용액 1(0.2 ㎖), 용액 2(0.50 ㎖), 용액 3(0.25㎖) 및 용액 4(0.25㎖)를 작은 유리 압력 튜브 내에서 조합시키고, Branson Digital Sonifier 250을 이용하여 40초 동안 50% 진폭에서 음파처리하였다. 이후, 용액 5(2.0 ㎖)를 일차 에멀젼에 첨가하고, 볼텍싱시켜 미정제 분산액을 생성시킨 후, Branson Digital Sonifier 250을 이용하여 60초 동안 30% 진폭에서 음파처리하여 이차(W1/O/W2) 에멀젼을 형성시켰다. 이차 에멀젼을 용액 6(30 ㎖)을 함유하는 개방된 50 ㎖ 비커에 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 교반시켜 디클로로메탄을 증발시키고, 나노운반체를 현탁액 중에 형성시켰다. 나노운반체 현탁액을 원심분리 튜브로 옮기고, 45분 동안 21,000 rcf에서 회전시키고, 상층액을 제거하고, 포스페이트 완충 염수 중에 펠렛을 재현탁시킴으로써 현탁된 나노운반체의 일부를 세척하였다. 이러한 세척 절차를 반복한 후, 펠렛을 PBS 1X에 재현탁시켜, 중합체를 기준으로 10 ㎎/㎖의 공칭 농도를 갖는 나노운반체 현탁액을 수득하였다. 현탁액을 사용때까지 -20C에 동결 저장하였다.
표 9: 나노운반체 특성규명
Figure pct00010
실시예 8: 합성 나노운반체 제형 Lot #7
재료
난알부민 단백질을 Worthington Biochemical Corporation(730 Vassar Avenue, Lakewood, NJ 08701. Product Code LS003054)으로부터 구입하였다. 3:1의 락티드 대 글리콜리드 비의 PLGA로부터 제조되고, 8.5% w/w의 컨쥬게이션된 레시퀴모드 함량을 갖는 약 7,800 Da의 PLGA-R848, 폴리-D/L-락티드-코-글리콜리드, 4-아미노-2-(에톡시메틸)-α,α-디메틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-에탄올아미드를 Princeton Global Synthesis(300 George Patterson Drive #206, Bristol, PA 19007. Lot number PGS 16-52)에서 맞춤 제조하였다. 0.21 dL/g의 고유 점도를 갖는 PLA를 SurModics Pharmaceuticals(756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211. Product Code 100 DL 2A)로부터 구입하였다. 약 5,000 Da의 메틸 에테르 말단화된 PEG 블록 및 1H-NMR에 의해 약 21,000 Da(21kDa의 Mn)의 PLA 블록을 갖는 PLA-PEG-OMe 블록 공중합체를 합성하였다. EMPROVE® Polyvinyl Alcohol 5-88, USP(85 내지 89% 가수분해됨, 4.3 내지 5.7 mPa.s의 점도)를 EMD Chemicals Inc.(480 South Democrat Road Gibbstown, NJ 08027. Part Number 1.41354)로부터 구입하였다. 포스페이트-완충 염수 1X(PBS 1X). Mediatech Inc.(9345 Discovery Blvd. Manassas, VA 20109). 제품 코드 21-040-CV.
방법
용액을 하기와 같이 제조하였다:
용액 1: 5 ㎎/㎖의 난알부민 단백질을 실온에서 PBS 1X 중에서 제조하였다.
용액 2: 화학 흄 후드 내에서 1 ㎖의 디클로로메탄 당 100 ㎎의 PLA를 용해시켜 PLA를 제조하였다.
용액 3: 화학 흄 후드 내에서 1 ㎖의 디클로로메탄 당 100 ㎎의 PLA-PEG-OMe를 용해시켜 PLA-PEG-OMe를 제조하였다.
용액 4: 화학 흄 후드 내에서 1 ㎖의 디클로로메탄 당 100 ㎎의 PLGA-R848을 용해시켜 PLGA-R848을 제조하였다.
용액 5: 100mM 포스페이트 완충액, pH 8 100 mM 중 50 ㎎/㎖의 폴리비닐 알코올.
용액 6: 70 mM 포스페이트 완충액, pH 8.
이러한 lot를 이중으로 제조한 후, 세척 후에 조합시켰다. 일차(W1/O) 에멀젼을 먼저 용액 1 내지 4를 혼합시켜 생성시켰다. 용액 1(0.2 ㎖), 용액 2(0.50 ㎖), 용액 3(0.25㎖) 및 용액 4(0.25㎖)를 작은 유리 압력 튜브 내에서 조합시키고, Branson Digital Sonifier 250을 이용하여 40초 동안 50% 진폭에서 음파처리하였다. 이후, 용액 5(2.0 ㎖)를 일차 에멀젼에 첨가하고, 볼텍싱시켜 미정제 분산액을 생성시킨 후, Branson Digital Sonifier 250을 이용하여 60초 동안 30% 진폭에서 음파처리하여 이차(W1/O/W2) 에멀젼을 형성시켰다. 이차 에멀젼을 용액 6(30 ㎖)을 함유하는 개방된 50 ㎖ 비커에 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 교반시켜 디클로로메탄을 증발시키고, 나노운반체를 현탁액 중에 형성시켰다. 나노운반체 현탁액을 원심분리 튜브로 옮기고, 45분 동안 21,000 rcf에서 회전시키고, 상층액을 제거하고, 포스페이트 완충 염수 중에 펠렛을 재현탁시킴으로써 현탁된 나노운반체의 일부를 세척하였다. 이러한 세척 절차를 반복한 후, 펠렛을 PBS 1X에 재현탁시켜, 중합체를 기준으로 10 ㎎/㎖의 공칭 농도를 갖는 나노운반체 현탁액을 수득하였다. 현탁액을 사용때까지 -20C에 동결 저장하였다.
표 10: 나노운반체 특성규명
Figure pct00011
실시예 9: 합성 나노운반체 제형 Lot #8
재료
난알부민 단백질을 Worthington Biochemical Corporation(730 Vassar Avenue, Lakewood, NJ 08701. Product Code LS003054)으로부터 구입하였다. 3:1의 락티드 대 글리콜리드 비의 PLGA로부터 제조되고, 8.5% w/w의 컨쥬게이션된 레시퀴모드 함량을 갖는 약 7,800 Da의 PLGA-R848, 폴리-D/L-락티드-코-글리콜리드, 4-아미노-2-(에톡시메틸)-α,α-디메틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-에탄올아미드를 Princeton Global Synthesis(300 George Patterson Drive #206, Bristol, PA 19007)에서 맞춤 제조하였다. 0.21 dL/g의 고유 점도를 갖는 PLA를 SurModics Pharmaceuticals(756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211. Product Code 100 DL 2A)로부터 구입하였다. 약 5,000 Da의 메틸 에테르 말단화된 PEG 블록 및 1H-NMR에 의해 약 21,000 Da(21kDa의 Mn)의 PLA 블록을 갖는 PLA-PEG-OMe 블록 공중합체를 합성하였다. EMPROVE® Polyvinyl Alcohol 5-88, USP(85 내지 89% 가수분해됨, 4.3 내지 5.7 mPa.s의 점도)를 EMD Chemicals Inc.(480 South Democrat Road Gibbstown, NJ 08027. Part Number 1.41354)로부터 구입하였다. 포스페이트-완충 염수 1X(PBS 1X). Mediatech Inc.(9345 Discovery Blvd. Manassas, VA 20109). 제품 코드 21-040-CV.
방법
용액을 하기와 같이 제조하였다:
용액 1: 20 ㎎/㎖의 난알부민 단백질을 실온에서 PBS 1X 중에서 제조하였다.
용액 2: 화학 흄 후드 내에서 1 ㎖의 디클로로메탄 당 100 ㎎의 PLA를 용해시켜 PLA를 제조하였다.
용액 3: 화학 흄 후드 내에서 1 ㎖의 디클로로메탄 당 100 ㎎의 PLA-PEG-OMe를 용해시켜 PLA-PEG-OMe를 제조하였다.
용액 4: 화학 흄 후드 내에서 1 ㎖의 디클로로메탄 당 100 ㎎의 PLGA-R848을 용해시켜 PLGA-R848을 제조하였다.
용액 5: 100mM 포스페이트 완충액, pH 8 100 mM 중 50 ㎎/㎖의 폴리비닐 알코올.
용액 6: 70 mM 포스페이트 완충액, pH 8.
이러한 lot를 이중으로 제조한 후, 세척 후에 조합시켰다. 일차(W1/O) 에멀젼을 먼저 용액 1 내지 4를 혼합시켜 생성시켰다. 용액 1(0.2 ㎖), 용액 2(0.50 ㎖), 용액 3(0.25㎖) 및 용액 4(0.25㎖)를 작은 유리 압력 튜브 내에서 조합시키고, Branson Digital Sonifier 250을 이용하여 40초 동안 50% 진폭에서 음파처리하였다. 이후, 용액 5(2.0 ㎖)를 일차 에멀젼에 첨가하고, 볼텍싱시켜 미정제 분산액을 생성시킨 후, Branson Digital Sonifier 250을 이용하여 60초 동안 30% 진폭에서 음파처리하여 이차(W1/O/W2) 에멀젼을 형성시켰다. 이차 에멀젼을 용액 6(30 ㎖)을 함유하는 개방된 50 ㎖ 비커에 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 교반시켜 디클로로메탄을 증발시키고, 나노운반체를 현탁액 중에 형성시켰다. 나노운반체 현탁액을 원심분리 튜브로 옮기고, 45분 동안 21,000 rcf에서 회전시키고, 상층액을 제거하고, 포스페이트 완충 염수 중에 펠렛을 재현탁시킴으로써 현탁된 나노운반체의 일부를 세척하였다. 이러한 세척 절차를 반복한 후, 펠렛을 PBS 1X에 재현탁시켜, 중합체를 기준으로 10 ㎎/㎖의 공칭 농도를 갖는 나노운반체 현탁액을 수득하였다. 현탁액을 사용때까지 -20C에 동결 저장하였다.
표 11: 나노운반체 특성규명
Figure pct00012
실시예 10: 합성 나노운반체 조성물은 높은 항체 역가 및 강한 항원-특이적 CTL 활성을 발생시킨다.
R848 및 OVA를 전달하는 합성 나노운반체는 중심(비장) OVA-특이적 CTL 반응을 발생시키고, 또한 강한(또는 보다 강한) OVA-특이적 체액성 반응을 발생시키는데 있어서 높은 용량의 PS-CpG + 6x 더 높은 용량의 자유 OVA로 구성되는 양성 비교측정기 대조군으로서 성공적이었다.
나노운반체 제조물 또는 대조군을 이용하여 s.c. 주사한 지 4 내지 5일 후, 유출 림프절(LN)을 분리시키고, 콜라게나제로 처리하고, 균질화시키고, 세척하고, 4 내지 5일 동안 10-100 units/㎖의 IL-2와 함께 인큐베이션하였다. 이후, 생성된 세포 집단을 계수하고, 세포독성 검정에서 효과기 세포로서 사용하였다. SIINFEKL(SEQ ID NO:1) 펩티드 또는 EG.7-OVA 세포(난알부민으로 안정적으로 트랜스펙션됨)로 펄싱된 동계 EL-4 세포를 표적으로 제공하였고, 온전한 EL-4 세포를 백그라운드 대조군으로 제공하였다. 다양한 효과기:표적 비에서의 세포독성을 제조업체의 권고에 따라 CytoTox-ONE™ Homogenuous Membrane Integrity Assay(Promega, Madison, WI)를 이용하여 24시간(37℃)에 걸쳐 측정하였다.
표 12
Figure pct00013
실시예 11: NC-OVA + NC-R848 혼합물의 단일 주사 후 나노운반체-캡슐화된 항원에 대한 체액성 및 세포 면역 반응의 발생 측정
재료 - Lot #9
3:1의 락티드 대 글리콜리드 비의 PLGA로부터 제조되고, 8.5% w/w의 컨쥬게이션된 레시퀴모드 함량을 갖는 약 7,800 Da의 PLGA-R848(S-205), 폴리-D/L-락티드-코-글리콜리드, 4-아미노-2-(에톡시메틸)-α,α-디메틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-에탄올아미드를 Princeton Global Synthesis(300 George Patterson Drive #206, Bristol, PA 19007)에서 맞춤 제조하였다. 0.19 dL/g의 고유 점도를 갖는 PLA를 SurModics Pharmaceuticals(756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211. Product Code 100 DL 2A)로부터 구입하였다. 약 5,000 Da의 메틸 에테르 말단화된 PEG 블록 및 약 28,000 Da의 PLA 블록을 갖는 PLA-PEG-OMe 블록 공중합체를 SurModics Pharmaceuticals(Product Code 100 DL mPEG 5000 5CE)로부터 구입하였다. EMPROVE® Polyvinyl Alcohol 4-88, USP(85 내지 89% 가수분해됨, 3.4 내지 4.6 mPa.s의 점도)를 EMD Chemicals Inc.(480 South Democrat Road Gibbstown, NJ 08027)로부터 구입하였다. 포스페이트-완충 염수 1X(PBS 1X). Mediatech Inc.(9345 Discovery Blvd. Manassas, VA 20109). 제품 코드 21-040-CV.
방법 - Lot #9
용액을 하기와 같이 제조하였다:
용액 1: PLGA-R848, PLA, 및 PLA-PEG-OMe 분말을 2:1:1 중량 비로 칭량한 후, 혼합된 중합체를 디클로로메탄에 용해시켜 1 ㎖ 당 100 ㎎의 전체 중합체 농도를 달성시켜 PLGA-R848을 제조하였다.
용액 2: 100mM 포스페이트 완충액, pH 8 중 35 ㎎/㎖의 폴리비닐 알코올.
용액 1 및 2를 혼합한 후, 미세 에멀젼 전 거친 에멀젼을 생성시킴으로써 O/W 에멀젼을 생성시켰다. 용액 1(2 ㎖)을 18G 에멀젼화 바늘을 통한 10회 통과를 이용하여 용액 2(8 ㎖)와 함께 거칠게 에멀젼화시켰다. 프라이밍되고 얼음물로 냉각된 고압 균질화기(Microfluidics LV1)에 거친 에멀젼을 로딩하고, 5000 psi에서 3회 통과를 수행함으로써 미세 에멀젼을 제조하였다. 미세 O/W 에멀젼을 1X PBS(60 ㎖)를 함유하는 개방된 100 ㎖ 비커에 첨가하고, 2시간 초과 동안 실온에서 교반시켜 디클로로메탄을 증발시키고, 나노운반체를 현탁액 중에 형성시켰다. 나노운반체 현탁액을 원심분리 튜브로 옮기고, 35분 동안 75,600 rcf에서 회전시키고, 상층액을 제거하고, 포스페이트 완충 염수 중에 펠렛을 재현탁시킴으로써 현탁된 나노운반체의 일부를 세척하였다. 이러한 세척 절차를 반복한 후, 펠렛을 PBS 1X에 재현탁시켜, 중합체를 기준으로 10 ㎎/㎖의 공칭 농도를 갖는 나노운반체 현탁액을 수득하였다. 나노운반체 제형화 공정을 1x 또는 2x의 동일 규모로 또 다른 3회로 반복하였다. 4개의 현탁액을 조합시킨 후, 0.22 마이크론 PES 주사기 필터를 통해 여과시킨 후, 사용때까지 -20C에 동결 저장하였다.
재료 - Lot #10
3:1의 락티드 대 글리콜리드 비의 PLGA로부터 제조되고, 8.5% w/w의 컨쥬게이션된 레시퀴모드 함량을 갖는 약 7,800 Da의 PLGA-R848(S-205), 폴리-D/L-락티드-코-글리콜리드, 4-아미노-2-(에톡시메틸)-α,α-디메틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-에탄올아미드를 Princeton Global Synthesis(300 George Patterson Drive #206, Bristol, PA 19007)에서 맞춤 제조하였다. 0.19 dL/g의 고유 점도를 갖는 PLA를 SurModics Pharmaceuticals(756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211. Product Code 100 DL 2A)로부터 구입하였다. 약 5,000 Da의 메틸 에테르 말단화된 PEG 블록 및 약 28,000 Da의 PLA 블록을 갖는 PLA-PEG-OMe 블록 공중합체를 SurModics Pharmaceuticals(Product Code 100 DL mPEG 5000 5CE)로부터 구입하였다. EMPROVE® Polyvinyl Alcohol 4-88, USP(85 내지 89% 가수분해됨, 3.4 내지 4.6 mPa.s의 점도)를 EMD Chemicals Inc.(480 South Democrat Road Gibbstown, NJ 08027)로부터 구입하였다. 포스페이트-완충 염수 1X(PBS 1X). Mediatech Inc.(9345 Discovery Blvd. Manassas, VA 20109). 제품 코드 21-040-CV.
방법 - Lot #10
용액을 하기와 같이 제조하였다:
용액 1: 화학 흄 후드 내에서 1 ㎖의 디클로로메탄 당 100 ㎎의 PLGA-R848을 용해시켜 PLGA-R848을 제조하였다.
용액 2: 화학 흄 후드 내에서 1 ㎖의 디클로로메탄 당 100 ㎎의 PLA를 용해시켜 PLA를 제조하였다.
용액 3: 화학 흄 후드 내에서 1 ㎖의 디클로로메탄 당 100 ㎎의 PLA-PEG-OMe를 용해시켜 PLA-PEG-OMe를 제조하였다.
용액 4: 100mM 포스페이트 완충액, pH 8 중 50 ㎎/㎖의 폴리비닐 알코올.
용액 1 내지 4를 혼합한 후, 미세 에멀젼 전 거친 에멀젼을 생성시킴으로써 일차(O/W) 에멀젼을 생성시켰다. 용액 1(1 ㎖), 용액 2(0.5 ㎖), 및 용액 3(0.5㎖)을 먼저 조합시킨 후, 2분 동안 50 ㎖ 비커 내에서 350 rpm에서 함께 교반하고 반복 피펫팅(pipetting)함으로써 용액 4(8 ㎖)와 함께 거칠게 에멀젼화시켰다. 프라이밍된 고압 균질화기(Microfluidics LV1)에 거친 에멀젼을 로딩하고, 5000 psi에서 3회 통과를 수행함으로써 미세 에멀젼을 제조하였다. 미세 O/W 에멀젼을 1X PBS(30 ㎖)를 함유하는 개방된 50 ㎖ 비커에 첨가하고, 2시간 초과 동안 실온에서 교반시켜 디클로로메탄을 증발시키고, 나노운반체를 현탁액 중에 형성시켰다. 나노운반체 현탁액을 원심분리 튜브로 옮기고, 35분 동안 75,600 rcf에서 회전시키고, 상층액을 제거하고, 포스페이트 완충 염수 중에 펠렛을 재현탁시킴으로써 현탁된 나노운반체의 일부를 세척하였다. 이러한 세척 절차를 반복한 후, 펠렛을 PBS 1X에 재현탁시켜, 중합체를 기준으로 10 ㎎/㎖의 공칭 농도를 갖는 나노운반체 현탁액을 수득하였다. 이후, 나노운반체 현탁액을 0.22 마이크론 PES 주사기 필터를 통해 여과시킨 후, 사용때까지 -20C에 동결 저장하였다.
재료 - Lot #11
난알부민 단백질을 Worthington Biochemical Corporation(730 Vassar Avenue, Lakewood, NJ 08701. Product Code LS003054)으로부터 구입하였다. 75% 락티드 및 25% 글리콜리드 함량 및 0.24 dL/g의 고유 점도를 갖는 PLGA를 SurModics Pharmaceuticals(756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211. Product Code 7525 DLG 2.5A)로부터 구입하였다. 0.2 dL/g의 고유 점도를 갖는 PLA를 SurModics Pharmaceuticals(Product Code 100 DL 2A)로부터 구입하였다. 약 5,000 Da의 메틸 에테르 말단화된 PEG 블록 및 약 21,000 Da의 PLA 블록을 갖는 PLA-PEG-OMe 블록 공중합체를 합성하였다. EMPROVE® Polyvinyl Alcohol 4-88, USP(85 내지 89% 가수분해됨, 3.4 내지 4.6 mPa.s의 점도)를 EMD Chemicals Inc.(480 South Democrat Road Gibbstown, NJ 08027)로부터 구입하였다. 포스페이트-완충 염수 1X(PBS 1X). Mediatech Inc.(9345 Discovery Blvd. Manassas, VA 20109). 제품 코드 21-040-CV.
방법 - Lot #11
용액을 하기와 같이 제조하였다:
용액 1: 50 ㎎/㎖의 난알부민 단백질을 실온에서 PBS 1X 중에서 제조하였다.
용액 2: PLGA, PLA, 및 PLA-PEG-OMe를 2:1:1 중량 비로 칭량하고, 화학 흄 후드 내에서 디클로로메탄 중에 용해시켜 1 ㎖ 당 100 ㎎의 최종 전체 중합체 농도를 달성시켰다.
용액 3: 100mM 포스페이트 완충액, pH 8 중 50 ㎎/㎖의 폴리비닐 알코올.
용액 4: 70 mM 포스페이트 완충액, pH 8.
용액 1 및 2를 혼합하여 일차(W1/O) 에멀젼을 먼저 생성시켰다. 용액 1(66 ㎖) 및 용액 2(264 ㎖)를 조합시키고, 1L 비커 중에서 오버헤드(overhead) 혼합기를 이용하여 거친 에멀젼으로 형성시켰다. 거친 에멀젼을 맞춤-제조된 온도-조절된 균질화 용기로 옮기고, 고-전단 로터 고정자를 이용하여 균질화시켰다. 이후, 일차 에멀젼의 ½을 330 ㎖의 용액 3을 함유하는 비커로 옮기고, 오버헤드 혼합기로 혼합시킴으로써 거친 이차(W1/O/W2) 에멀젼을 형성시켰다. 이후, 거친 이차 에멀젼을 맞춤 균질화 용기로 복귀시키고, 고전단을 이용하여 미세 에멀젼으로 균질화시켰다. 이후, 이차 에멀젼을 용액 4(3.2 L)를 함유하는 퍼징된 6L 용기에 첨가하고, 실온에서 밤새 진탕시켜, 증발시키고 나노운반체를 현탁액 중에 형성시켰다. 나노운반체 현탁액을 원심분리 튜브로 옮기고, 35분 동안 75,600 rcf에서 회전시키고, 상층액을 제거하고, 포스페이트 완충 염수 중에 펠렛을 재현탁시킴으로써 현탁된 나노운반체의 일부(30 ㎖ 각각)를 세척하였다. 이러한 세척 절차를 반복한 후, 펠렛을 PBS 1X에 재현탁시켜, 목표 나노운반체 농도를 달성시켰다. 이러한 현탁액을 여과시키고, 사용때까지 -20C에 동결 저장하였다.
C57BL/6 암컷 마우스(2-3/그룹)를 4.3 ㎍의 R848 및 6.2 ㎍의 OVA(각각의 마우스 당)를 함유하는 100 ㎍의 NC-OVA 및 100 ㎍의 NC-R848의 혼합물에 의해 1회 면역화시켰다. 나노운반체 접종 4, 7, 10 및 14일 후, 마우스를 채혈하고, 이들의 OVA에 대한 항체(IgG) 역가를 ELISA에 의해 결정하였다. 추가로, 동일 시점에, OVA의 우세 CTL 에피토프를 나타내는 펩티드(SIINFEKL(SEQ ID NO:1))에 의해 펄싱되고, CSFE에 의해 차별적으로 라벨링된 동계 비장세포를 마우스에 주사(i.v.)하였다. 다음날, 면역화된 마우스로부터의 비장세포를 취하여, FACS에 의해 분석하고, PBS-주사된(나이브) 동물에서의 기본 세포독성 수준과 비교하여 각각의 동물에서의 특정 세포독성을 결정하였다(%=100x[1-RRnaive/RRimm]).
NC-OVA + NC-R848을 이용한 단일 면역화는 세포 및 체액성 면역 반응의 신속한 유도를 발생시켰으며, 세포 면역 반응은 주사 4일 후만큼 초기에 검출되고, 이후 7일에서의 피크와 함께 적어도 10일 동안 지속되었으며, 체액성 면역 반응은 주사 7일 후에 검출되고, 접종 10일 후에 유의한 수준에 도달하였다.
실시예 12: CpG 및 OVA를 전달하는 합성 나노운반체
재료 - Lot #12
소듐 반대이온을 갖는 뉴클레오티드 서열 5'-TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT-3'(SEQ ID NO:2)를 갖는 포스포디에스테르 백본을 갖는 PO-1826 DNA 올리고뉴클레오티드를 Oligo Factory(120 Jeffrey Avenue, Holliston, MA 01746)로부터 구입하였다. 54% 락티드 및 46% 글리콜리드 함량 및 0.24 dL/g의 고유 점도를 갖는 PLGA를 SurModics Pharmaceuticals(756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211. Product Code 5050 DLG 2.5A)로부터 구입하였다. 약 2,000 Da의 메틸 에테르 말단화된 PEG 블록 및 약 88,000 Da의 75% 락티드/25% 글리콜리드 PLGA 블록을 갖는 PLGA-PEG-OMe 블록 공중합체를 SurModics Pharmaceuticals(Product Code 7525 DLG PEG 2000 7E-P)로부터 구입하였다. EMPROVE® Polyvinyl Alcohol 4-88, USP(85 내지 89% 가수분해됨, 3.4 내지 4.6 mPa.s의 점도)를 EMD Chemicals Inc.(480 South Democrat Road Gibbstown, NJ 08027)로부터 구입하였다. 포스페이트-완충 염수 1X(PBS 1X). Mediatech Inc.(9345 Discovery Blvd. Manassas, VA 20109). 제품 코드 21-040-CV.
방법 - Lot #12
용액을 하기와 같이 제조하였다:
용액 1: 1 ㎖ 엔도톡신-비함유 물 당 250 ㎎ Na 콜레이트를 함유하는 1 ㎖의 수용액 당 40 ㎎을 용해시킴으로써 PO-1826을 제조하였다.
용액 2: 화학 흄 후드 내에서 1 ㎖의 디클로로메탄 당 100 ㎎의 PLA를 용해시켜 PLGA를 제조하였다.
용액 3: 화학 흄 후드 내에서 1 ㎖의 디클로로메탄 당 100 ㎎의 PLGA-PEG-OMe를 용해시켜 PLGA-PEG-OMe를 제조하였다.
용액 4: 100mM 포스페이트 완충액, pH 8 중 50 ㎎/㎖의 폴리비닐 알코올.
용액 5: 70 mM 포스페이트 완충액, pH 8.
용액 1 내지 3을 혼합시키고, 미세 에멀젼 이전에 거친 에멀젼을 생성시킴으로써 일차(W/O) 에멀젼을 생성시켰다. 용액 1(0.2 ㎖), 용액 2(0.5 ㎖), 및 용액 3(0.5㎖)을 작은 유리 압력 튜브 내에서 조합시키고, 반복 피펫팅에 의해 거칠게 에멀젼화시키고, Branson Digital Sonifier 250을 이용하여 얼음 배쓰 상에서 40초 동안 50% 진폭에서 음파처리하였다. 이후, 일차 에멀젼에 용액 4(3.0 ㎖)를 첨가하고, 볼텍싱시켜 미정제 분산액을 생성시킨 후, Branson Digital Sonifier 250을 이용하여 얼음 배쓰 상에서 60초 동안 30% 진폭에서 음파처리하여 이차(W1/O/W2) 에멀젼을 형성시켰다. 미세 W1/O/W2 에멀젼을 70 mM 포스페이트 완충액(30 ㎖)을 함유하는 개방된 50 ㎖ 비커에 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 교반시켜 디클로로메탄을 증발시키고, 나노운반체를 현탁액 중에 형성시켰다. 나노운반체 현탁액을 원심분리 튜브로 옮기고, 90분 동안 21,000 rcf에서 회전시키고, 상층액을 제거하고, 포스페이트 완충 염수 중에 펠렛을 재현탁시킴으로써 현탁된 나노운반체의 일부를 세척하였다. 이러한 세척 절차를 반복한 후, 펠렛을 PBS 1X에 재현탁시켜, 중합체를 기준으로 10 ㎎/㎖의 공칭 농도를 갖는 나노운반체 현탁액을 수득하였다. 이후, 나노운반체 현탁액을 0.22 마이크론 PES 주사기 필터를 통해 여과시키고, 농도가 결정될때까지 냉동 저장한 후, 농도를 조정하고, 사용때까지 -20C에 동결 저장하였다.
재료 - Lot #13
난알부민 단백질을 Worthington Biochemical Corporation(730 Vassar Avenue, Lakewood, NJ 08701. Product Code LS003054)으로부터 구입하였다. 75% 락티드 및 25% 글리콜리드 함량 및 0.2 dL/g의 고유 점도를 갖는 PLGA를 SurModics Pharmaceuticals(756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211. Product Code 7525 DLG 2A)로부터 구입하였다. 약 5,000 Da의 메틸 에테르 말단화된 PEG 블록 및 1H-NMR에 의해 약 21,000 Da(21kDa의 Mn)의 PLA 블록을 갖는 PLA-PEG-OMe 블록 공중합체를 합성하였다. EMPROVE® Polyvinyl Alcohol 4-88, USP(85 내지 89% 가수분해됨, 3.4 내지 4.6 mPa.s의 점도)를 EMD Chemicals Inc.(480 South Democrat Road Gibbstown, NJ 08027)로부터 구입하였다. 포스페이트-완충 염수 1X(PBS 1X). Mediatech Inc.(9345 Discovery Blvd. Manassas, VA 20109). 제품 코드 21-040-CV.
방법 - Lot #13
용액을 하기와 같이 제조하였다:
용액 1: 50 ㎎/㎖의 난알부민 단백질을 실온에서 PBS 1X 중에서 제조하였다.
용액 2: 화학 흄 후드 내에서 1 ㎖의 디클로로메탄 당 100 ㎎의 PLGA를 용해시켜 PLGA를 제조하였다.
용액 3: 화학 흄 후드 내에서 1 ㎖의 디클로로메탄 당 100 ㎎의 PLA-PEG-OMe를 용해시켜 PLA-PEG-OMe를 제조하였다.
용액 4: 100mM 포스페이트 완충액, pH 8 중 50 ㎎/㎖의 폴리비닐 알코올.
용액 5: 70 mM 포스페이트 완충액, pH 8.
용액 1 내지 3을 혼합하여 일차(W1/O) 에멀젼을 먼저 생성시켰다. 용액 1(0.2 ㎖), 용액 2(0.75 ㎖), 및 용액 3(0.25㎖)을 작은 유리 압력 튜브 내에서 조합시키고, Branson Digital Sonifier 250을 이용하여 얼음 배쓰 상에서 40초 동안 50% 진폭에서 음파처리하였다. 이후, 일차 에멀젼에 용액 4(3.0 ㎖)를 첨가하고, 볼텍싱시켜 미정제 분산액을 생성시킨 후, Branson Digital Sonifier 250을 이용하여 얼음 배쓰 상에서 60초 동안 30% 진폭에서 음파처리하여 이차(W1/O/W2) 에멀젼을 형성시켰다. 이차 에멀젼을 용액 5(30 ㎖)를 함유하는 개방된 50 ㎖ 비커에 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 교반시켜 디클로로메탄을 증발시키고, 나노운반체를 현탁액 중에 형성시켰다. 나노운반체 현탁액을 원심분리 튜브로 옮기고, 130분 동안 21,000 rcf에서 회전시키고, 상층액을 제거하고, 포스페이트 완충 염수 중에 펠렛을 재현탁시킴으로써 현탁된 나노운반체의 일부를 세척하였다. 이러한 세척 절차를 반복한 후, 펠렛을 PBS 1X에 재현탁시켜, 중합체를 기준으로 10 ㎎/㎖의 공칭 농도를 갖는 나노운반체 현탁액을 수득하였다. 현탁액을 사용때까지 -20C에 동결 저장하였다.
재료 - Lot #14
난알부민 단백질을 Worthington Biochemical Corporation(730 Vassar Avenue, Lakewood, NJ 08701. Product Code LS003054)으로부터 구입하였다. 76% 락티드 및 24% 글리콜리드 함량 및 0.69 dL/g의 고유 점도를 갖는 PLGA를 SurModics Pharmaceuticals(756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211. Product Code 7525 DLG 7A)로부터 구입하였다. 0.22 dL/g의 고유 점도를 갖는 PLA를 SurModics Pharmaceuticals(Product Code 100 DL 2A)로부터 구입하였다. 약 5,000 Da의 메틸 에테르 말단화된 PEG 블록 및 약 21,000 Da의 PLA 블록을 갖는 PLA-PEG-OMe 블록 공중합체를 합성하였다. EMPROVE® Polyvinyl Alcohol 4-88, USP(85 내지 89% 가수분해됨, 3.4 내지 4.6 mPa.s의 점도)를 EMD Chemicals Inc.(480 South Democrat Road Gibbstown, NJ 08027)로부터 구입하였다. 포스페이트-완충 염수 1X(PBS 1X)를 Mediatech Inc.(9345 Discovery Blvd. Manassas, VA 20109. Product Code 21-040-CV)로부터 구입하였다.
방법 - Lot #14
용액을 하기와 같이 제조하였다:
용액 1: 50 ㎎/㎖의 난알부민 단백질을 실온에서 PBS 1X 중에서 제조하였다.
용액 2: 화학 흄 후드 내에서 1 ㎖의 디클로로메탄 당 100 ㎎의 PLGA를 용해시켜 PLGA를 제조하였다.
용액 3: 화학 흄 후드 내에서 1 ㎖의 디클로로메탄 당 100 ㎎의 PLGA를 용해시켜 PLA를 제조하였다.
용액 4: 화학 흄 후드 내에서 1 ㎖의 디클로로메탄 당 100 ㎎의 PLA-PEG-OMe를 용해시켜 PLA-PEG-OMe를 제조하였다.
용액 5: 100mM 포스페이트 완충액, pH 8 중 50 ㎎/㎖의 폴리비닐 알코올.
용액 6: 70 mM 포스페이트 완충액, pH 8.
용액 1 내지 4를 혼합하여 일차(W1/O) 에멀젼을 먼저 생성시켰다. 용액 1(0.2 ㎖), 용액 2(0.5 ㎖), 용액 3(0.25㎖) 및 용액 4(0.25㎖)를 작은 유리 압력 튜브 내에서 조합시키고, Branson Digital Sonifier 250을 이용하여 얼음 배쓰 상에서 40초 동안 50% 진폭에서 음파처리하였다. 이후, 일차 에멀젼에 용액 5(3.0 ㎖)를 첨가하고, 볼텍싱시켜 미정제 분산액을 생성시킨 후, Branson Digital Sonifier 250을 이용하여 얼음 배쓰 상에서 60초 동안 30% 진폭에서 음파처리하여 이차(W1/O/W2) 에멀젼을 형성시켰다. 이차 에멀젼을 용액 6(30 ㎖)를 함유하는 개방된 50 ㎖ 비커에 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 교반시켜 디클로로메탄을 증발시키고, 나노운반체를 현탁액 중에 형성시켰다. 나노운반체 현탁액을 원심분리 튜브로 옮기고, 45분 동안 25,600 rcf에서 회전시키고, 상층액을 제거하고, 포스페이트 완충 염수 중에 펠렛을 재현탁시킴으로써 현탁된 나노운반체의 일부를 세척하였다. 이러한 세척 절차를 반복한 후, 펠렛을 PBS 1X에 재현탁시켜, 중합체를 기준으로 10 ㎎/㎖의 공칭 농도를 갖는 나노운반체 현탁액을 수득하였다. 현탁액을 사용때까지 -20C에 동결 저장하였다.
재료 - Lot #15
소듐 반대이온을 갖는 뉴클레오티드 서열 5'-TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT-3' (SEQ ID NO:2)를 갖는 포스포디에스테르 백본을 갖는 PO-1826 DNA 올리고뉴클레오티드를 Oligo Factory(120 Jeffrey Avenue, Holliston, MA 01746)로부터 구입하였다. 54% 락티드 및 46% 글리콜리드 함량 및 0.24 dL/g의 고유 점도를 갖는 PLGA를 SurModics Pharmaceuticals(756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211. Product Code 5050 DLG 2.5A)로부터 구입하였다. 약 5,000 Da의 메틸 에테르 말단화된 PEG 블록 및 약 21,000 Da의 PLA 블록을 갖는 PLA-PEG-OMe 블록 공중합체를 합성하였다. EMPROVE® Polyvinyl Alcohol 4-88, USP(85 내지 89% 가수분해됨, 3.4 내지 4.6 mPa.s의 점도)를 EMD Chemicals Inc.(480 South Democrat Road Gibbstown, NJ 08027)로부터 구입하였다. Na 콜레이트를 Sigma Aldrich LLC.(3050 Spruce St. St. Louis, MO 6310. Product Code C6445-100G)로부터 구입하였다. 포스페이트-완충 염수 1X(PBS 1X)를 Mediatech Inc.(9345 Discovery Blvd. Manassas, VA 20109. Product Code 21-040-CV)로부터 구입하였다.
방법 - Lot #15
용액을 하기와 같이 제조하였다:
용액 1: 1 ㎖ 엔도톡신-비함유 물 당 150 ㎎ KCl을 함유하는 1 ㎖의 수용액 당 40 ㎎을 용해시킴으로써 PO-1826을 제조하였다.
용액 2: 실온에서 1 ㎖ 1X PBS 당 200 ㎎의 건조 분말을 용해시킴으로써 Na 콜레이트를 제조하였다.
용액 3: 화학 흄 후드 내에서 1 ㎖의 디클로로메탄 당 100 ㎎의 PLGA를 용해시켜 PLGA를 제조하였다.
용액 4: 화학 흄 후드 내에서 1 ㎖의 디클로로메탄 당 100 ㎎의 PLGA-PEG-OMe를 용해시켜 PLGA-PEG-OMe를 제조하였다.
용액 5: 100mM 포스페이트 완충액, pH 8 중 50 ㎎/㎖의 폴리비닐 알코올.
용액 6: 70 mM 포스페이트 완충액, pH 8.
용액 1 내지 4를 혼합시키고, 미세 에멀젼 전에 거친 에멀젼을 생성시킴으로써 일차(W/O) 에멀젼을 생성시켰다. 용액 1(0.25 ㎖), 용액 2(0.25 ㎖), 용액 3(0.5 ㎖), 및 용액 4(0.5 ㎖)를 작은 유리 압력 튜브 내에서 조합시키고, 반복 피펫팅에 의해 거칠게 에멀젼화시키고, Branson Digital Sonifier 250을 이용하여 얼음 배쓰 상에서 40초 동안 50% 진폭에서 음파처리하였다. 이후, 일차 에멀젼에 용액 5(3.0 ㎖)를 첨가하고, 볼텍싱시켜 거친 분산액을 생성시킨 후, Branson Digital Sonifier 250을 이용하여 얼음 배쓰 상에서 60초 동안 30% 진폭에서 음파처리하여 이차(W1/O/W2) 에멀젼을 형성시켰다. 미세 W1/O/W2 에멀젼을 70 mM 포스페이트 완충액(30 ㎖)을 함유하는 개방된 50 ㎖ 비커에 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 교반시켜 디클로로메탄을 증발시키고, 나노운반체를 현탁액 중에 형성시켰다. 나노운반체 현탁액을 원심분리 튜브로 옮기고, 90분 동안 21,000 rcf에서 회전시키고, 상층액을 제거하고, 포스페이트 완충 염수 중에 펠렛을 재현탁시킴으로써 현탁된 나노운반체의 일부를 세척하였다. 이러한 세척 절차를 반복한 후, 펠렛을 PBS 1X에 재현탁시켜, 중합체를 기준으로 10 ㎎/㎖의 공칭 농도를 갖는 나노운반체 현탁액을 수득하였다. 이후, 나노운반체 현탁액을 농도가 결정될 때까지 냉동 보관하고, 이후 농도를 조정하고, 사용때까지 -20C에 동결 저장하였다.
재료 - Lot #16
소듐 반대이온을 갖는 뉴클레오티드 서열 5'-TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT-3'(SEQ ID NO:2)를 갖는 포스포디에스테르 백본을 갖는 PO-1826 DNA 올리고뉴클레오티드를 Oligo Factory(120 Jeffrey Avenue, Holliston, MA 01746)로부터 구입하였다. 54% 락티드 및 46% 글리콜리드 함량 및 0.24 dL/g의 고유 점도를 갖는 PLGA를 SurModics Pharmaceuticals(756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211. Product Code 5050 DLG 2.5A)로부터 구입하였다. 약 5,000 Da의 메틸 에테르 말단화된 PEG 블록 및 약 21,000 Da의 PLA 블록을 갖는 PLA-PEG-OMe 블록 공중합체를 합성하였다. EMPROVE® Polyvinyl Alcohol 4-88, USP(85 내지 89% 가수분해됨, 3.4 내지 4.6 mPa.s의 점도)를 EMD Chemicals Inc.(480 South Democrat Road Gibbstown, NJ 08027)로부터 구입하였다. 포스페이트-완충 염수 1X(PBS 1X)를 Mediatech Inc.(9345 Discovery Blvd. Manassas, VA 20109. Product Code 21-040-CV)로부터 구입하였다.
방법 - Lot #16
용액을 하기와 같이 제조하였다:
용액 1: 1 ㎖ 엔도톡신-비함유 물 당 150 ㎎ KCl을 함유하는 1 ㎖의 수용액 당 40 ㎎을 용해시킴으로써 PO-1826을 제조하였다.
용액 2: 100mM 포스페이트 완충액, pH 8 중 100 ㎎/㎖의 폴리비닐 알코올.
용액 3: 화학 흄 후드 내에서 1 ㎖의 디클로로메탄 당 100 ㎎의 PLGA를 용해시켜 PLGA를 제조하였다.
용액 4: 화학 흄 후드 내에서 1 ㎖의 디클로로메탄 당 100 ㎎의 PLGA-PEG-OMe를 용해시켜 PLGA-PEG-OMe를 제조하였다.
용액 5: 100mM 포스페이트 완충액, pH 8 중 100 ㎎/㎖의 폴리비닐 알코올.
용액 6: 70 mM 포스페이트 완충액, pH 8.
용액 1 내지 4를 혼합시키고, 미세 에멀젼 전에 거친 에멀젼을 생성시킴으로써 일차(W/O) 에멀젼을 생성시켰다. 용액 1(0.25 ㎖), 용액 2(0.25 ㎖), 용액 3(0.5 ㎖), 및 용액 4(0.5㎖)를 작은 유리 압력 튜브 내에서 조합시키고, 반복 피펫팅에 의해 거칠게 에멀젼화시키고, Branson Digital Sonifier 250을 이용하여 얼음 배쓰 상에서 40초 동안 50% 진폭에서 음파처리하였다. 이후, 일차 에멀젼에 용액 5(3.0 ㎖)를 첨가하고, 볼텍싱시켜 거친 분산액을 생성시킨 후, Branson Digital Sonifier 250을 이용하여 얼음 배쓰 상에서 60초 동안 30% 진폭에서 음파처리하여 이차(W1/O/W2) 에멀젼을 형성시켰다. 미세 W1/O/W2 에멀젼을 70 mM 포스페이트 완충액(30 ㎖)을 함유하는 개방된 50 ㎖ 비커에 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 교반시켜 디클로로메탄을 증발시키고, 나노운반체를 현탁액 중에 형성시켰다. 나노운반체 현탁액을 원심분리 튜브로 옮기고, 90분 동안 21,000 rcf에서 회전시키고, 상층액을 제거하고, 포스페이트 완충 염수 중에 펠렛을 재현탁시킴으로써 현탁된 나노운반체의 일부를 세척하였다. 이러한 세척 절차를 반복한 후, 펠렛을 PBS 1X에 재현탁시켜, 중합체를 기준으로 10 ㎎/㎖의 공칭 농도를 갖는 나노운반체 현탁액을 수득하였다. 이후, 나노운반체 현탁액을 농도가 결정될 때까지 냉동 보관하고, 이후 농도를 조정하고, 사용때까지 -20C에 동결 저장하였다.
CpG 및 OVA를 전달하는 합성 나노운반체는 신속한 항체 유도 능력에 있어서 자유 고-용량 CpG 및 OVA(둘 모두 5x 더 높은 용량으로 사용되는 자유 CpG 및 자유 OVA)보다 우수하였고, 국소 및 전신 항원-특이적 CTL의 유도에서 동일한 고용량의 자유 CpG 및 자유 OVA 만큼 성공적이거나 우수하였다.
3마리의 동물의 그룹(C57BL/6 마우스, 암컷)을 5배 과량의 자유 CpG 및 OVA를 이용한 면역화와 동시에 나노운반체-통합된 CpG(ODN 1826) 및 OVA의 3개의 조합에 의해 면역화(프라임-부스트, 0일 및 10일;뒷다리, s.c.)시켰다. NC-CpG의 3개의 상이한 제형을 NC-OVA의 동일 제형과 함께 사용하였다(세부사항에 대해 표 13 참조). 두번째 면역화 4일 후, 동물을 희생시키고, 이들의 혈청, 유출(오금) 리프절(LN) 및 비장을 취하였다. 면역화된 마우스로부터의 혈청을 난알부민에 대한 항체 역가를 결정하는데 사용하였고, 이는 시험 혈청의 연속 희석액을 이용한 표준 ELISA로 측정하였다. 비오티닐화된 염소 항-마우스 Ig를 검출 항체로 사용하였다(BD Biosciences, San Diego, CA). EC50을 적정 곡선을 기초로 하여 결정하였다. NC-OVA와 조합된 모든 NC-CpG 제형은 자유 CpG 및 OVA의 5배 높은 용량보다 OVA에 대해 30배 초과의 더 높은 초기 항체 반응을 유도하였다.
동시에, OVA-특이적 CTL의 유도를 FACS 분석을 통해 유출 LN(국소) 또는 비장(전신)에서 생체외(시험관내 확장 없음)에서 평가하였다. 간단히, 둘 모두의 조직을 콜라게나제로 처리하고, 균질화시키고, 세척하고, 트립판 배제(Countess, Invitrogen, CA, USA)를 이용하여 세포를 계수하고, 표면 CD 8(T 세포 마커), CD 19(B 세포 마커) 및 MHC 클래스-I-제한된 면역우세 OVA-유래 펩티드 SIINFEKL(SEQ ID NO:1)에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 인지할 수 있는 형광 염료와 결합된 항체 또는 MHC 클래스 I-제한 펜타머로 라벨링시켰다. 이후, OVA-특이적 CTL의 주요 종을 나타내는 것으로 간주된, CD8 발현을 나타내고(CD8+), CD19 발현을 나타내지 않으며(CD19-), MHC 클래스 I-복합체화된 SIINFEKL(SEQ ID NO:1)에 결합(SIINFEKL+(SEQ ID NO:1))된 세포를 이용한 FACS에 의해 차별적 세포 집단을 분석하였다. 사용된 NC-CpG 제형 중 적어도 하나는 NC-OVA와 결합되는 경우 자유 CpG 및 OVA의 5배 높은 양보다 단기 CTL을 국소적 및 전신적으로 생성시키는 동등하거나 보다 높은 능력을 갖는다. 요점은, 나노운반체-통합된 난알부민 항원에 대한 국소 또는 전신 CTL 반응의 유도에 있어서 다양한 NC-CpG 제형이 특히 이로웠다.
또한, 면역화된 동물로부터의 정제된 비장세포를 또한 OVA-특이적 CD8+ 세포의 우선적 확장을 발생시켜야 하는 미토마이신-처리된 EG.7-OVA 세포(난알부민으로 안정적으로 트랜스펙션된 동계 세포)로 자극시킴으로써 시험관내에서 확장(100 u/㎖ IL-2)시켰다. 시험관내 접종 11일에, 확장된 배양물을 상기 기재된 바와 같이 라벨링시키고, FACS에 의해 분석하였다. 시험된 모든 NC-CpG 제형은 5x 용량의 자유 CpG 및 OVA에 의해 유도된 것보다 높은 확장 잠재성으로 Ag-특이적 CTL의 유도를 발생시켰다. 요점은, 생체외 분석되고, 시험관내 확장되는 경우, 하나의 CpG 제형(NC-CpG)은 CTL 확장에 대해 특별히 강한 잠재성을 가졌고, 또 다른 제형(NC-CpG)은 자유 고-용량 CpG 및 OVA에 의한 전신 CTL 유도 수준을 초과하였다.
표 13. 나노운반체-통합된 CpG 및 OVA 대 자유 CpG 및 OVA에 의해 유도된 체액성 및 세포 면역 반응의 시험을 위한 실험 설계.
Figure pct00014
SEQUENCE LISTING <110> Selecta Biosciences, Inc. Altreuter, David O'Neil, Conlin Ilyinskii, Petr <120> Synthetic Nanocarriers that Generate Humoral and Cytotoxic T Lymphocyte (CTL) Immune Responses <130> S1681.70029 <140> <141> 2012-07-27 <150> 61/513,496 <151> 2011-07-29 <150> 61/513,526 <151> 2011-07-29 <150> 61/513,527 <151> 2011-07-29 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 1 Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu 1 5 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 2 Thr Cys Cys Ala Thr Gly Ala Cys Gly Thr Thr Cys Cys Thr Gly Ala 1 5 10 15 Cys Gly Thr Thr 20

Claims (52)

  1. 제1 단백질에 대한 체액성 및 세포독성 T 림프구(CTL) 면역 반응을 필요로 하는 피검체를 확인하는 단계, 및
    제1 단백질에 결합된 합성 나노운반체의 집단을 포함하는 조성물을 피검체에 투여하는 단계를 포함하는 방법으로서,
    상기 제1 단백질이 적어도 하나의 체액성 에피토프 및 동일 에피토프가 아닌 적어도 하나의 MHC 클래스 I-제한 에피토프를 포함하고, 상기 합성 나노운반체의 집단이 사포닌-콜레스테롤 애쥬번트를 포함하지 않고, 상기 합성 나노운반체의 집단의 동적광산란을 이용하여 수득된 입자 크기 분포의 평균은 최대 치수가 20 nm 내지 250 nm인 방법.
  2. 제1 단백질에 결합된 합성 나노운반체의 집단을 포함하는 조성물을 피검체에 투여하는 단계를 포함하는 방법으로서,
    상기 제1 단백질이 적어도 하나의 체액성 에피토프 및 동일 에피토프가 아닌 적어도 하나의 MHC 클래스 I-제한 에피토프를 포함하고, 상기 합성 나노운반체의 집단이 사포닌-콜레스테롤 애쥬번트를 포함하지 않고, 상기 합성 나노운반체의 집단의 동적광산란을 이용하여 수득된 입자 크기 분포의 평균은 최대 치수가 20 nm 내지 250 nm이고, 상기 조성물이 예방접종 요법에 따라 투여되는 방법.
  3. 제1 단백질에 결합된 합성 나노운반체의 집단을 포함하는 조성물을 피검체에 투여하는 단계를 포함하는 방법으로서,
    상기 제1 단백질이 적어도 하나의 체액성 에피토프 및 동일 에피토프가 아닌 적어도 하나의 MHC 클래스 I-제한 에피토프를 포함하고, 상기 합성 나노운반체의 집단이 사포닌-콜레스테롤 애쥬번트를 포함하지 않고, 상기 합성 나노운반체의 집단의 동적광산란을 이용하여 수득된 입자 크기 분포의 평균은 최대 치수가 20 nm 내지 250 nm이고, 상기 조성물이 하나 이상의 시험 피검체에서 제1 단백질에 특이적인 체액성 및 CTL 면역 반응을 발생시키는 것으로 이전에 밝혀진 프로토콜에 따라 투여되는 방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 방법이 제1 단백질에 대한 체액성 및 세포독성 T 림프구(CTL) 면역 반응을 필요로 하는 피검체를 확인하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  5. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 조성물이 예방접종 요법에 따라 투여되는 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물이 하나 이상의 시험 피검체에서 제1 단백질에 특이적인 체액성 및 CTL 면역 반응을 발생시키는 것으로 이전에 밝혀진 프로토콜에 따라 투여되는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 제1 단백질에 대한 체액성 및 CTL 면역 반응을 발생시키는 유효량으로 투여되는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 하나 이상의 애쥬번트를 추가로 포함하는 방법.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 하나 이상의 애쥬번트를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 하나 이상의 애쥬번트가 패턴 인식 수용체의 자극제 또는 효능제, 무기염, 명반(alum), 장내세균(Enterobacteria)의 모노포스포릴 지질(MPL) A와 조합된 명반, MPL®(AS04), AS15, 사포닌(saponin), QS-21, Quil-A, ISCOM, ISCOMATRIX™, MF59™, Montanide® ISA 51, Montanide® ISA 720, AS02, 리포솜 및 리포솜 제형, AS01, 합성되거나 특이적으로 제조된 미세입자 및 미세운반체, N. 고노레아(N. gonorrheae) 또는 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis)의 박테리아-유래 외막 소포, 키토산 입자, 데포-형성 작용제(depot-forming agent), Pluronic® 블록 공중합체, 특별히 변형되거나 제조된 펩티드, 뮤라밀 디펩티드, 아미노알킬 글루코사미니드 4-포스페이트, RC529, 박테리아 톡소이드, 독소 단편, Toll-유사 수용체 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9의 효능제 및/또는 이들의 조합물; 아데닌 유도체; 면역자극성 DNA; 면역자극성 RNA; 이미다조퀴놀린 아민, 이미다조피리딘 아민, 6,7-융합된 사이클로알킬이미다조피리딘 아민, 1,2-브릿징된 이미다조퀴놀린 아민; 이미퀴모드(imiquimod); 레시퀴모드(resiquimod); DC 표면 분자 CD40에 대한 효능제; 타입 I 인터페론; 폴리 I:C; 박테리아 지질다당류(LPS); VSV-G; HMGB-1; 플라젤린(flagellin) 또는 이의 일부 또는 유도체; CpG를 포함하는 면역자극성 DNA 분자; 괴사 세포로부터 방출된 전염증성 자극; 요산염 결정; 보체 연쇄반응의 활성화된 성분; 면역 복합체의 활성화된 성분; 보체 수용체 효능제; 사이토카인; 또는 사이토카인 수용체 효능제를 포함하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 하나 이상의 애쥬번트가 Toll-유사 수용체 2, 3, 4, 7, 8 또는 9의 효능제를 포함하는 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 하나 이상의 애쥬번트가 이미다조퀴놀린 또는 옥소아데닌을 포함하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 이미다조퀴놀린이 레시퀴모드 또는 이미퀴모드를 포함하는 방법.
  14. 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 애쥬번트가 합성 나노운반체의 집단의 합성 나노운반체에 결합되는 방법.
  15. 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 합성 나노운반체의 또 다른 집단을 투여하는 것을 추가로 포함하거나, 상기 방법이 합성 나노운반체의 또 다른 집단을 투여하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 하나 이상의 애쥬번트가 합성 나노운반체의 다른 집단의 합성 나노운반체에 결합되는 방법.
  16. 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 애쥬번트가 합성 나노운반체에 결합되지 않는 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 하나 이상의 추가 항원을 추가로 포함하는 방법.
  18. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 하나 이상의 추가 항원을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가 항원이 제2 단백질을 포함하는 방법.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가 항원이 체액성 에피토프 및/또는 MHC 클래스 I-제한 에피토프를 포함하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가 항원이 체액성 에피토프 및 MHC 클래스 I-제한 에피토프를 포함하는 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가 항원이 적어도 하나의 체액성 에피토프 및 동일 에피토프가 아닌 적어도 하나의 MHC 클래스 I-제한 에피토프를 포함하는 방법.
  23. 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가 항원이 합성 나노운반체에 결합되는 방법.
  24. 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 합성 나노운반체의 또 다른 집단을 투여하는 것을 추가로 포함하거나 상기 방법이 합성 나노운반체의 또 다른 집단을 투여하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 하나 이상의 추가 항원이 합성 나노운반체의 다른 집단의 합성 나노운반체에 결합되는 방법.
  25. 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가 항원이 합성 나노운반체에 결합되지 않는 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 합성 나노운반체 및/또는 다른 합성 나노운반체가 중합체 나노입자, 금속 나노입자, 덴드리머(dendrimer), 벅키볼(buckyball), 나노와이어(nanowire), 바이러스-유사 입자 또는 펩티드 또는 단백질 입자를 포함하는 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 합성 나노운반체 및/또는 다른 합성 나노운반체가 하나 이상의 중합체를 포함하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 하나 이상의 중합체가 폴리에스테르, 폴리아미노산, 폴리카보네이트, 폴리아세탈, 폴리케탈, 다당류, 폴리에틸옥사졸린 또는 폴리에틸렌이민을 포함하는 방법.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 하나 이상의 중합체가 폴리에스테르를 포함하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 폴리에스테르가 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 폴리(락틱-코-글리콜산) 또는 폴리카프로락톤을 포함하는 방법.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 폴리에스테르가 폴리에테르에 결합되는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 폴리에테르가 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 단백질 및/또는 하나 이상의 추가 항원이 암, 감염 또는 감염성 질병, 비-자가면역 또는 퇴행성 질병, HIV, 말라리아, 리슈만편모충증, 인간 필로바이러스, 토가바이러스, 알파바이러스, 아레나바이러스, 버냐바이러스, 플라비바이러스, 인간 유두종바이러스, 인간 인플루엔자 A 바이러스, B형 간염 또는 C형 간염과 관련된 항원인 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피검체가 암, 감염 또는 감염성 질병 또는 비-자가면역 또는 퇴행성 질병을 갖거나, 상기 질병들을 가질 위험이 있는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 피검체가 HIV, 말라리아, 리슈만편모충증, 인간 필로바이러스 감염, 토가바이러스 감염, 알파바이러스 감염, 아레나바이러스 감염, 버냐바이러스 감염, 플라비바이러스 감염, 인간 유두종바이러스 감염, 인간 인플루엔자 A 바이러스 감염, B형 간염 감염 또는 C형 간염 감염을 갖거나, 상기 질병들을 가질 위험이 있는 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발생되는 체액성 및 CTL 면역 반응이 임상적으로 효과적인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 체액성 및 CTL 면역 반응이 피검체에서 암, 감염 또는 감염성 질병 또는 비-자가면역 또는 퇴행성 질병을 치료하거나 예방하는데 효과적인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 체액성 및 CTL 면역 반응이 HIV, 말라리아, 리슈만편모충증, 인간 필로바이러스 감염, 토가바이러스 감염, 알파바이러스 감염, 아레나바이러스 감염, 버냐바이러스 감염, 플라비바이러스 감염, 인간 유두종바이러스 감염, 인간 인플루엔자 A 바이러스 감염, B형 간염 감염 또는 C형 간염 감염을 치료하거나 예방하는데 효과적인 방법.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 약학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함하는 방법.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 멸균 조성물인 방법.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 동결건조된 형태로부터 재구성되는 방법.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 투여 형태인 방법.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 백신인 방법.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 정맥내, 경구, 피하, 폐, 비내, 피내, 경점막, 점막내 또는 근내 투여에 의해 투여되는 방법.
  45. 치료 또는 예방에 사용하기 위한 제1 단백질에 결합된 합성 나노운반체의 집단을 포함하는 조성물로서, 상기 제1 단백질이 적어도 하나의 체액성 에피토프 및 동일 에피토프가 아닌 적어도 하나의 MHC 클래스 I-제한 에피토프를 포함하고, 상기 합성 나노운반체의 집단이 사포닌-콜레스테롤 애쥬번트를 포함하지 않고, 상기 합성 나노운반체의 집단의 동적광산란을 이용하여 수득된 입자 크기 분포의 평균은 최대 치수가 20 nm 내지 250 nm인 조성물.
  46. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 정의된 방법에 사용하기 위한 제1 단백질에 결합된 합성 나노운반체의 집단을 포함하는 조성물로서, 상기 제1 단백질이 적어도 하나의 체액성 에피토프 및 동일 에피토프가 아닌 적어도 하나의 MHC 클래스 I-제한 에피토프를 포함하고, 상기 합성 나노운반체의 집단이 사포닌-콜레스테롤 애쥬번트를 포함하지 않고, 상기 합성 나노운반체의 집단의 동적광산란을 이용하여 수득된 입자 크기 분포의 평균은 최대 치수가 20 nm 내지 250 nm인 조성물.
  47. 예방접종에서 사용하기 위한 제1 단백질에 결합된 합성 나노운반체의 집단을 포함하는 조성물로서, 상기 제1 단백질이 적어도 하나의 체액성 에피토프 및 동일 에피토프가 아닌 적어도 하나의 MHC 클래스 I-제한 에피토프를 포함하고, 상기 합성 나노운반체의 집단이 사포닌-콜레스테롤 애쥬번트를 포함하지 않고, 상기 합성 나노운반체의 집단의 동적광산란을 이용하여 수득된 입자 크기 분포의 평균은 최대 치수가 20 nm 내지 250 nm인 조성물.
  48. 피검체에서 제1 단백질에 대한 체액성 및 CTL 면역 반응을 발생시키는데 사용하기 위한 제1 단백질에 결합된 합성 나노운반체의 집단을 포함하는 조성물로서, 상기 제1 단백질이 적어도 하나의 체액성 에피토프 및 동일 에피토프가 아닌 적어도 하나의 MHC 클래스 I-제한 에피토프를 포함하고, 상기 합성 나노운반체의 집단이 사포닌-콜레스테롤 애쥬번트를 포함하지 않고, 상기 합성 나노운반체의 집단의 동적광산란을 이용하여 수득된 입자 크기 분포의 평균은 최대 치수가 20 nm 내지 250 nm인 조성물.
  49. 암, 감염 또는 감염성 질병, 비-자가면역 또는 퇴행성 질병, HIV, 말라리아, 리슈만편모충증, 인간 필로바이러스 감염, 토가바이러스 감염, 알파바이러스 감염, 아레나바이러스 감염, 버냐바이러스 감염, 플라비바이러스 감염, 인간 유두종바이러스 감염, 인간 인플루엔자 A 바이러스 감염, B형 간염 감염 또는 C형 간염 감염의 치료 또는 예방 방법에 사용하기 위한 제1 단백질에 결합된 합성 나노운반체의 집단을 포함하는 조성물로서, 상기 제1 단백질이 적어도 하나의 체액성 에피토프 및 동일 에피토프가 아닌 적어도 하나의 MHC 클래스 I-제한 에피토프를 포함하고, 상기 합성 나노운반체의 집단이 사포닌-콜레스테롤 애쥬번트를 포함하지 않고, 상기 합성 나노운반체의 집단의 동적광산란을 이용하여 수득된 입자 크기 분포의 평균은 최대 치수가 20 nm 내지 250 nm인 조성물.
  50. 정맥내, 경구, 피하, 폐, 비내, 피내, 점막내, 경점막 또는 근내 투여에 의한 투여를 포함하는 치료 또는 예방 방법에 사용하기 위한 제1 단백질에 결합된 합성 나노운반체의 집단을 포함하는 조성물로서, 상기 제1 단백질이 적어도 하나의 체액성 에피토프 및 동일 에피토프가 아닌 적어도 하나의 MHC 클래스 I-제한 에피토프를 포함하고, 상기 합성 나노운반체의 집단이 사포닌-콜레스테롤 애쥬번트를 포함하지 않고, 상기 합성 나노운반체의 집단의 동적광산란을 이용하여 수득된 입자 크기 분포의 평균은 최대 치수가 20 nm 내지 250 nm인 조성물.
  51. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 정의된 방법에서 사용하기 위한 약제, 예를 들어, 백신의 제조를 위한 제1 단백질에 결합된 합성 나노운반체의 집단을 포함하는 조성물의 용도로서, 상기 제1 단백질이 적어도 하나의 체액성 에피토프 및 동일 에피토프가 아닌 적어도 하나의 MHC 클래스 I-제한 에피토프를 포함하고, 상기 합성 나노운반체의 집단이 사포닌-콜레스테롤 애쥬번트를 포함하지 않고, 상기 합성 나노운반체의 집단의 동적광산란을 이용하여 수득된 입자 크기 분포의 평균은 최대 치수가 20 nm 내지 250 nm인 용도.
  52. 조성물이 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은, 제45항 내지 제50항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같이 사용하기 위한 조성물 또는 제51항의 용도.
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