CN106065047B - 一种肝靶向阳离子聚合物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种肝靶向阳离子聚合物及其制备方法与应用。肝靶向阳离子聚合物，由BUCT‑PGEA侧链无规则地连接于普鲁兰主链上构成。本发明还涉及肝靶向阳离子聚合物的制备方法与应用。本发明首次公开了利用制备的PuPGEA共运载MEG3和P53基因所形成的纳米复合物在HepG2和SMMC7721细胞中显示出比载有单独的pcDNA‑MEG3和pcDNA‑P53的复合物更高的抗癌活性，证明MEG3和P53的共传递对体外HCC细胞的生长有附加效应。

Description

一种肝靶向阳离子聚合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种肝靶向阳离子聚合物及其制备方法与应用，特别涉及一种肝靶向阳离子聚合物(基因载体)和肝靶向纳米复合物的制备方法与应用，属于生物医药技术领域。
背景技术
肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一种高死亡率的原发性肝癌。在全球范围最常见的10种恶性肿瘤中，它位于第2位。大量的致病因素被证明可以引起这种恶性肿瘤，例如：感染乙型肝炎病毒(HBV)或者丙型肝炎病毒(HCV)；食用被黄曲霉素B污染的食物和酒精滥用。但是，被上述致病因素影响的个体中，仅有部分会患上肝细胞癌，表明还有遗传的因素参与了肝细胞癌的形成。在这些遗传因素中，长链非编码RNA(lncRNAs)在癌症生物学方面扮演非常重要的角色，在癌症的治疗方面表现出很大的潜力。lncRNAs是一个家族，它的大小从几百核苷酸对到成千上万核苷酸对。很多lncRNAs包括(MEG3)被证实参与了肝细胞癌的发生和发展。大量的证据表明MEG3充当一个肿瘤抑制子，和正常组织比起来在癌组织中低表达或不表达，这些反常表达是由于MEG3(maternal expressed gene3)基因是一类印记基因，其转录缺失可能诱导多种肿瘤的发生发展。MEG3也可以调节P53靶基因的表达，和P53相互作用来抑制肿瘤细胞的增殖。
作为基因传递载体中的一个重要类型，非病毒聚阳离子基因载体，比如聚乙烯亚胺(PEI)，聚赖氨酸，聚酰胺胺树桩分子和pH敏感材料，被广泛地研究。研究显示乙醇胺(EA)修饰的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(命名为BUCT-PGEA)具有优良的转染能力，因为BUCT-PGEA具有温和的仲胺基团和丰富的羟基。尽管聚阳离子在宿主免疫原性，灵活性和合成方面比病毒基因载体更优越，但是它们在体内的毒性，转染效率和靶向性能仍然需要改善。不同的天然多糖，比如β-环糊精(β-CD)，葡聚糖，壳聚糖，羟丙基纤维素和普鲁兰，已经被引入到阳离子基因载体中。在这些多糖中，普鲁兰具有肝靶向的特性，而且不会引起毒性，免疫原性或者致癌性。含普鲁兰的阳离子聚合物已经显示出有效地介导肝细胞中的基因传递的性能。
如何获得具有高的传递pcDNA-MEG3和pcDNA-P53效率的材料，成为目前的研究热点。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一种肝靶向阳离子聚合物及其制备方法与应用。
本发明技术方案如下：
一种肝靶向阳离子聚合物，由BUCT-PGEA侧链无规则地连接于普鲁兰主链上构成，结构式如下所示：
根据本发明优选的，所述肝靶向阳离子聚合物结构式中，m为4～6，n为87～91，x为10～30。
由普鲁兰主链和BUCT-PGEA侧链构成的PuPGEA主要是通过结合原子转移自由基聚合(ATRP)(基于合成的PuBr大分子引发剂)和后续的开环反应而合成出来的，具体的技术方案如下：
上述肝靶向阳离子聚合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)将4-二甲氨基吡啶(DMAP)与普鲁兰多糖(Pullulan)按质量比(0.024～0.073)：1的比例混合后，溶于无水二甲基甲酰胺(DMF)，普鲁兰多糖与无水二甲基甲酰胺的质量体积比为(0.08～0.12)：1，单位g/ml，冰浴搅拌条件下，加入溶液A，普鲁兰多糖与溶液A的质量体积比为(2.70～8.10)：1，单位g/ml，常温反应20～28h，经透析，干燥，制得溴代异丁基功能化的普鲁兰(PuBr)；
所述溶液A由2-溴代异丁酰溴(BIBB)与无水二甲基甲酰胺(DMF)按体积比(0.1～0.3)：1的比例混合制得；
(2)将步骤(1)制得的溴代异丁基功能化的普鲁兰(PuBr)与无水二甲基亚砜(DMSO)按质量体积比(0.03～0.05)：1的比例混合，单位g/ml，制得混合液B，将甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)、溴化亚铜(CuBr)与2,2’-联吡啶(Bipy)按摩尔比(80～120)：1：3的比例加入到上述混合液B中，甲基丙烯酸缩水甘油酯与无水二甲基亚砜的体积比为(0.3～0.5)：1，除氧后常温反应5～30分钟后，加入35～45倍体积的甲醇，固液分离，取沉淀，干燥，制得数均分子量分别为20～54kDa的普鲁兰-g-聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PuPGMA)；
(3)将步骤(2)制得的普鲁兰-g-聚甲基丙烯酸缩水甘油酯溶解于无水二甲基亚砜中，普鲁兰-g-聚甲基丙烯酸缩水甘油酯与无水二甲基亚砜的质量体积比为(0.01～0.04)：1，单位g/ml，然后加入10倍以上体积的乙醇胺(EA)，在45～55℃条件下反应10～16小时或者在75～85℃条件下反应0.4～0.8小时，经透析，干燥，制得数均分子量为22～71kDa的肝靶向阳离子聚合物PuPGEA。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，除氧后常温反应时间为10分钟，制得的肝靶向阳离子聚合物PuPGEA的数均分子量为36kDa。将数均分子量为36kDa的肝靶向阳离子聚合物PuPGEA命名为PuPGEA1。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，除氧后常温反应时间为20分钟，制得的肝靶向阳离子聚合物PuPGEA的数均分子量为56kDa。将数均分子量为56kDa的肝靶向阳离子聚合物PuPGEA命名为PuPGEA2。
上述肝靶向阳离子聚合物PuPGEA在制备传递pcDNA-MEG3的纳米复合药物中的应用。
根据本发明优选的，所述应用，肝靶向阳离子聚合物PuPGEA与pcDNA-MEG3的纳米复合药物中，N/P比为5～20。
上述纳米复合药物的制备方法，步骤如下：
将由无菌去离子水配制成氮浓度为8～12mM的肝靶向阳离子聚合物PuPGEA溶液，然后与pcDNA-MEG3溶液按体积比1:(0.8～1.2)的比例混合，在22～28℃下培养20～40分钟，制得纳米复合药物PuPGEA/MEG3。
上述肝靶向阳离子聚合物PuPGEA在制备传递pcDNA-P53的纳米复合药物中的应用。
根据本发明优选的，所述应用，肝靶向阳离子聚合物PuPGEA与pcDNA-P53的纳米复合药物中，N/P比为5～20。
上述纳米复合药物的制备方法，步骤如下：
将由无菌去离子水配制成氮浓度为8～12mM的肝靶向阳离子聚合物PuPGEA溶液，然后与pcDNA-P53溶液按体积比1:(0.8～1.2)的比例混合，在22～28℃下培养20～40分钟，制得纳米复合药物PuPGEA/P53。
上述肝靶向阳离子聚合物PuPGEA在制备传递pcDNA-MEG3和pcDNA-P53的纳米复合药物中的应用。
根据本发明优选的，所述应用，肝靶向阳离子聚合物PuPGEA在pcDNA-MEG3和pcDNA-P53的纳米复合药物中，N/P比为5～20。
上述纳米复合药物的制备方法，步骤如下：
将由无菌去离子水配制的氮浓度为8～12mM的肝靶向阳离子聚合物PuPGEA溶液与pcDNA-MEG3和pcDNA-P53的混合溶液按体积比1:(0.8～1.2)的比例混合，pcDNA-MEG3和pcDNA-P53的质量比为2:(0.8～1.2)，在22～28℃下培养20～40分钟，制得纳米复合药物PuPGEA/(MEG3+P53)。
根据本发明优选的，所述pcDNA-MEG3和pcDNA-P53的质量比为2:1。
有益效果
1、本发明利用制备的PuPGEA运载pcDNA-MEG3，pcDNA-P53或pcDNA-MEG3+P53，形成的纳米复合物可以有效地抑制HCC细胞的增殖；
2、本发明首次公开了利用制备的PuPGEA共运载MEG3和P53基因所形成的纳米复合物在HepG2和SMMC7721细胞中显示出比载有单独的pcDNA-MEG3和pcDNA-P53的复合物更高的抗癌活性，证明MEG3和P53的共传递对体外HCC细胞的生长有附加效应；通过研究发现，用MEG3和P53基因的共转染在HCC细胞中刺激了更多的P53蛋白的表达，lncRNA MEG3的表达的提高能够通过RNA-蛋白的相互作用作用于P53蛋白，增强P53的稳定性，并活化P53介导的转录活性和P53的靶向基因的表达。
附图说明
图1、用PuPGEA或者Lipo2000介导的MEG3和P53在肝癌细胞HepG2中不同氮磷比下的相对表达量柱状图；
A、MEG3的相对表达量柱状图；
B、P53的相对表达量柱状图；
图2、PuPGEA2/pc3.0、PuPGEA2/P53、PuPGEA2/MEG3和PuPGEA2/(MEG3+P53)纳米复合物影响HepG2细胞的增殖的计数折线图；
图3、PuPGEA2/pc3.0、PuPGEA2/P53、PuPGEA2/MEG3和PuPGEA2/(MEG3+P53)纳米复合物影响HepG2细胞的迁移的特征图；
图4、PuPGEA2/pc3.0、PuPGEA2/P53、PuPGEA2/MEG3和PuPGEA2/(MEG3+P53)纳米复合物影响HepG2细胞的侵袭的特征图；
图5、通过尾静脉注射PuPGEA2/P53和PuPGEA2/(MEG3+P53)的纳米复合物后，P53在小鼠的肝、脾、肾和心脏中的相对表达量柱状图；
图6、转染PuPGEA2/(MEG3+P53)的小鼠肿瘤体积明显小于转染PuPGEA2/pc3.0，证明PuPGEA2/(MEG3+P53)纳米复合物具有极高的转染效率和明确的体内抑癌效果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
实施例1肝靶向阳离子聚合物PuPGEA和肝靶向纳米复合物的制备
肝靶向阳离子聚合物的制备方法，步骤如下：
(1)将普鲁兰多糖(Pullulan，3g)和4-二甲氨基吡啶(DMAP，0.15g)完全地溶于无水二甲基甲酰胺(DMF，30mL)之后，在冰浴和搅拌的条件下加入2-溴代异丁酰溴(BIBB，0.148mL)的DMF(0.6mL)溶液。然后将体系转移到常温下反应24小时，再通过透析和冻干得到作为聚合的引发剂的溴代异丁基功能化的普鲁兰(PuBr)。
(2)将80mg的PuBr投入到无水二甲基亚砜(DMSO，2mL)中，将甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA，0.8mL)、溴化亚铜(CuBr)和2,2’-联吡啶(Bipy)以100:1:3的摩尔比加入到上述DMSO中，通过鼓泡的方式通入氮气20分钟后密封，再在常温下反应10分钟，再用40倍体积的甲醇将DMSO中的聚合物沉淀出来，并在真空下抽干，制得数均分子量约30kDa的普鲁兰-g-聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PuPGMA)；
(3)将250mg步骤(2)制得的普鲁兰-g-聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PuPGMA)溶解于DMSO(16mL)中，再加入10倍体积的乙醇胺(EA)，在80℃下反应0.7小时，然后透析和冻干，制得数均分子量约36kDa的肝靶向阳离子聚合物PuPGEA，命名为PuPGEA1。
各阶段的产物的化学结构通过核磁共振氢谱(1H NMR)来分析。1H NMR的谱图是使用Bruker公司产的ARX 400MHz分光仪测得的，其中PuPGMA的溶剂是DMSO-d6，PuBr,和PuPGEA的溶剂是D2O。
结果显示终产物肝靶向阳离子聚合物PuPGEA具有普鲁兰多糖、PGMA和EA的特征峰，表明成功制得肝靶向阳离子聚合物PuPGEA，结构式如下所示：
式中：m为3～4，n为89～94，x为14～18。
肝靶向阳离子聚合物PuPGEA与pcDNA-MEG3的纳米复合药物的制备方法，步骤如下：
将由无菌去离子水配制成氮浓度为10mM的肝靶向阳离子聚合物PuPGEA溶液，然后与pcDNA-MEG3溶液按体积比1:1的比例混合，在25℃下培养30分钟，制得纳米复合药物PuPGEA/MEG3，N/P比为10。
肝靶向阳离子聚合物PuPGEA与pcDNA-P53的纳米复合药物的制备方法，步骤如下：
将由无菌去离子水配制成氮浓度为10mM的肝靶向阳离子聚合物PuPGEA溶液，然后与pcDNA-P53溶液按体积比1:1的比例混合，在25℃下培养30分钟，制得纳米复合药物PuPGEA/P53，N/P比为10。
肝靶向阳离子聚合物PuPGEA与pcDNA-MEG3和pcDNA-P53的纳米复合药物的制备方法，步骤如下：
将由无菌去离子水配制的氮浓度为10mM的肝靶向阳离子聚合物PuPGEA溶液与pcDNA-MEG3和pcDNA-P53的混合溶液按体积比1:1的比例混合，pcDNA-MEG3和pcDNA-P53的质量比为2:1，在25℃下培养30分钟，制得纳米复合药物PuPGEA/(MEG3+P53)，N/P比为10。
实施例2肝靶向阳离子聚合物PuPGEA和肝靶向纳米复合物的制备
肝靶向阳离子聚合物的制备方法，步骤如下：
(1)将普鲁兰多糖(Pullulan，2g)和4-二甲氨基吡啶(DMAP，0.438g)完全地溶于无水二甲基甲酰胺(DMF，20mL)之后，在冰浴和搅拌的条件下加入2-溴代异丁酰溴(BIBB，0.19mL)的DMF(1.0mL)溶液。然后将体系转移到常温下反应24小时，再通过透析和冻干得到作为聚合的引发剂的溴代异丁基功能化的普鲁兰(PuBr)。
(2)将30mg的PuBr投入到无水二甲基亚砜(DMSO，1mL)中，将甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA，0.5mL)、溴化亚铜(CuBr)和2,2’-联吡啶(Bipy)以80:1:3的摩尔比加入到上述DMSO中，通过鼓泡的方式通入氮气20分钟后密封，再在常温下反应20分钟，再用40倍体积的甲醇将DMSO中的聚合物沉淀出来，并在真空下抽干，制得数均分子量约54kDa的普鲁兰-g-聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PuPGMA)；
(3)将200mg步骤(2)制得的普鲁兰-g-聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PuPGMA)溶解于DMSO(20mL)中，再加入10倍体积的乙醇胺(EA)，在50℃下反应13小时，然后透析和冻干，制得数均分子量约56kDa的肝靶向阳离子聚合物PuPGEA，命名为PuPGEA2。
检测方法同实施例1，结果显示终产物肝靶向阳离子聚合物PuPGEA具有普鲁兰多糖、PGMA和EA的特征峰，表明成功制得肝靶向阳离子聚合物PuPGEA，结构式如下所示：
m为5～7，n为87～91，x为30～34。
实施例3肝靶向阳离子聚合物PuPGEA和肝靶向纳米复合物的制备
肝靶向阳离子聚合物的制备方法，步骤如下：
(1)将普鲁兰多糖(Pullulan，4g)和4-二甲氨基吡啶(DMAP，576mg)完全地溶于无水二甲基甲酰胺(DMF，40mL)之后，在冰浴和搅拌的条件下加入2-溴代异丁酰溴(BIBB，0.54mL)的DMF(5mL)溶液。然后将体系转移到常温下反应24小时，再通过透析和冻干得到作为聚合的引发剂的溴代异丁基功能化的普鲁兰(PuBr)。
(2)将0.1g的PuBr投入到无水二甲基亚砜(DMSO，3mL)中，将甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA，0.9mL)、溴化亚铜(CuBr)和2,2’-联吡啶(Bipy)以120:1:3的摩尔比加入到上述DMSO中，通过鼓泡的方式通入氮气20分钟后密封，再在常温下反应5分钟，再用40倍体积的甲醇将DMSO中的聚合物沉淀出来，并在真空下抽干，制得数均分子量约20kDa的普鲁兰-g-聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PuPGMA)；
(3)将240mg步骤(2)制得的普鲁兰-g-聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PuPGMA)溶解于DMSO(6mL)中，再加入10倍体积的乙醇胺(EA)，在80℃下反应0.6小时，然后透析和冻干，制得数均分子量约22kDa的肝靶向阳离子聚合物PuPGEA
检测方法同实施例1，结果显示终产物肝靶向阳离子聚合物PuPGEA具有普鲁兰多糖、PGMA和EA的特征峰，表明成功制得肝靶向阳离子聚合物PuPGEA，结构式如下所示：
式中：m为7～9，n为83～92，x为4～6。
实施例4PuPGEA/MEG3和PuPGEA/P53纳米复合物的转染效率的试验
转染试验：在转染试验中，将每孔1×105个HepG2细胞铺到12孔板中，培养12小时。以脂质体2000与基因的复合物(Lipo2000/MEG3和Lipo2000/P53)作为阳性对照，以实施例1制得的PuPGEA/MEG3和PuPGEA/P53纳米复合物作为转染材料进行细胞转染，用荧光定量PCR检测MEG3和P53的信使RNA的表达水平，结果如图1所示。
图1中的相关结果显示，本发明实施例1制得的PuPGEA1和实施例2制得的PuPGEA2所介导的MEG3和P53的相对表达量都比Lipo2000介导的基因转染效率高，表明PuPGEA1和PuPGEA2的转染效率均优于Lipo2000。
实施例5PuPGEA2/MEG3、PuPGEA2/P53和PuPGEA2/(MEG3+P53)纳米复合物抑制细胞增殖的试验
细胞增殖试验：将每孔1×105个HepG2细胞铺到12孔板中培养12小时，然后加入PuPGEA2/pc3.0、实施例1制得的PuPGEA2/MEG3、实施例1制得的PuPGEA2/P53或PuPGEA2/(MEG3+P53)纳米复合物与细胞共同培养。分别在转染24小时、48小时和72小时后用胰酶消化细胞，并用台盼蓝染色后计数，结果如图2所示。
图2中的相关结果显示，与阴性对照PuPGEA2/pc3.0复合物相比，本发明实施例1制得的PuPGEA2/MEG3、PuPGEA2/P53和PuPGEA2/(MEG3+P53)纳米复合物抑制了HepG2细胞的增殖，且PuPGEA2/(MEG3+P53)纳米复合物的抑制效果最好。
实施例6PuPGEA2/MEG3、PuPGEA2/P53和PuPGEA2/(MEG3+P53)纳米复合物抑制HepG2细胞的迁移的试验
划痕修复试验：将每孔1×105个HepG2细胞铺到12孔板中，用PuPGEA2/pc3.0、实施例1制得的PuPGEA2/MEG3、实施例1制得的PuPGEA2/P53或PuPGEA2/(MEG3+P53)纳米复合物转染细胞，在37℃，5％二氧化碳培养箱中培养。在细胞接近愈合的时候用枪头比着直尺，尽可能笔直地划痕，在0、12、24、48和72小时后拍照，结果如图3所示。
图3中的相关结果显示，与阴性对照PuPGEA2/pc3.0复合物相比，本发明实施例1制得的PuPGEA2/MEG3、PuPGEA/P53和PuPGEA2/(MEG3+P53)纳米复合物抑制了HepG2细胞的迁移，其中PuPGEA2/(MEG3+P53)纳米复合物的抑制效果最明显。
实施例7PuPGEA2/MEG3、PuPGEA2/P53和PuPGEA2/(MEG3+P53)纳米复合物抑制HepG2细胞的侵袭的试验
人工基底膜侵袭试验：膜上均匀铺100微升/孔的人工基底膜胶(Matrigel，Biosciences Clontech公司)在37℃，5％二氧化碳培养箱中培养。在上室中加入200微升含0.2％血清的无双抗培养基(1×104个细胞)，在下室中加入650微升含10％血清的培养基。48小时后，将transwell小室中的培养基吸出，用PBS洗两遍，接着在小室中加入3.7％甲醛用于固定细胞，再用PBS洗两次；加入甲醇1mL，通透细胞20min，加入结晶紫进行染色，用棉签小心地将小室擦干净，风干并拍照，结果如图4所示。
图4中的相关结果显示，与阴性对照PuPGEA2/pc3.0复合物相比，本发明实施例1制得的PuPGEA2/MEG3、PuPGEA/P53和PuPGEA2/(MEG3+P53)纳米复合物抑制了HepG2细胞的侵袭，其中PuPGEA2/(MEG3+P53)纳米复合物的抑制效果最明显。
实施例8PuPGEA2/pc3.0、PuPGEA2/MEG3和PuPGEA2/P53纳米复合物在小鼠的主要器官中的分布的试验
纳米复合物在器官中的分布试验：为了评价PuPGEA2/MEG3纳米复合物在活体主要器官中的积累，我们选用9只BALB/c近交系雌性小鼠并随机分为3组。通过尾静脉注射的方法，给每只老鼠注射100微升的包含30微克的pc3.0、P53质粒的纳米复合物溶液。48小时后，将小鼠的肝、肾、脾和心脏取出，迅速冷冻至液氮中。提取RNA，通过荧光定量PCR评价不同器官中P53的相对表达水平，结果如图5所示。
图5中的相关结果显示，肝脏中的P53的表达远高于脾、肾和心脏，证明本发明实施例1制得的PuPGEA2纳米复合物具有肝靶向性。
实施例9PuPGEA2/pc3.0和PuPGEA2/(MEG3+P53)纳米复合物抑制裸鼠成瘤
活体肝细胞癌移植实验：为了评价PuPGEA2介导的MEG3和P53基因的转染效率，我们确定了以HepG2细胞来建立的肝细胞癌动物模型。将1×108个HepG2细胞接种到6周龄裸鼠的腋下，待肝细胞动物模型建立后，在肿瘤上注射PuPGEA/pc3.0或PuPGEA/(MEG3+P53)质粒，每天量肿瘤的体积直至对照的均值达到1×103立方毫米。
图6中的相关结果显示，转染PuPGEA2/(MEG3+P53)的小鼠肿瘤体积明显小于转染PuPGEA2/3.0，证明本发明实施例1制得的PuPGEA2/(MEG3+P53)纳米复合物具有极高的转染效率和明确的体内抑癌效果。

Claims (1)

1.肝靶向阳离子聚合物PuPGEA在制备传递pcDNA-MEG3和/或pcDNA-P53的纳米复合药物中的应用，其特征在于，所述肝靶向阳离子聚合物，由BUCT-PGEA侧链无规则地连接于普鲁兰主链上构成，结构式如下所示：
式中：m为3～4，n为89～94，x为14～18；
肝靶向阳离子聚合物的制备方法，步骤如下：
（1）将普鲁兰多糖3 g和4-二甲氨基吡啶0.15 g完全地溶于无水二甲基甲酰胺30 mL之后，在冰浴和搅拌的条件下加入2-溴代异丁酰溴0.148 mL的无水二甲基甲酰胺 0.6 mL溶液；然后将体系转移到常温下反应24小时，再通过透析和冻干得到作为聚合的引发剂的溴代异丁基功能化的普鲁兰；
（2）将80 mg的溴代异丁基功能化的普鲁兰投入到无水二甲基亚砜2 mL中，将甲基丙烯酸缩水甘油酯0.8 mL、溴化亚铜和2,2’-联吡啶以100:1:3的摩尔比加入到上述无水二甲基亚砜中，通过鼓泡的方式通入氮气20分钟后密封，再在常温下反应10分钟，再用40倍体积的甲醇将无水二甲基亚砜中的聚合物沉淀出来，并在真空下抽干，制得数均分子量约30 kDa的普鲁兰-g-聚甲基丙烯酸缩水甘油酯；
（3）将250 mg步骤（2）制得的普鲁兰-g-聚甲基丙烯酸缩水甘油酯溶解于无水二甲基亚砜16 mL中，再加入10倍体积的乙醇胺，在80℃下反应0.7小时，然后透析和冻干，制得数均分子量约36 kDa的肝靶向阳离子聚合物PuPGEA；
肝靶向阳离子聚合物PuPGEA与pcDNA-MEG3的纳米复合药物的制备方法，步骤如下：
将由无菌去离子水配制成氮浓度为10 mM的肝靶向阳离子聚合物PuPGEA溶液，然后与pcDNA-MEG3溶液按体积比1:1的比例混合，在25℃下培养30分钟，制得纳米复合药物PuPGEA/MEG3，N/P比为10；
肝靶向阳离子聚合物PuPGEA与pcDNA-P53的纳米复合药物的制备方法，步骤如下：
将由无菌去离子水配制成氮浓度为10mM的肝靶向阳离子聚合物PuPGEA溶液，然后与pcDNA-P53溶液按体积比1:1的比例混合，在25℃下培养30分钟，制得纳米复合药物PuPGEA/P53，N/P比为10；
肝靶向阳离子聚合物PuPGEA与pcDNA-MEG3和pcDNA-P53的纳米复合药物的制备方法，步骤如下：
将由无菌去离子水配制的氮浓度为10mM的肝靶向阳离子聚合物PuPGEA溶液与pcDNA-MEG3和pcDNA-P53的混合溶液按体积比1:1的比例混合，pcDNA-MEG3和pcDNA-P53的质量比为2:1，在25℃下培养30分钟，制得纳米复合药物PuPGEA/ (MEG3+P53)，N/P比为10。
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