CN105906815B - 微环境双重响应壳聚糖基因载体及其制备方法和应用 - Google Patents

微环境双重响应壳聚糖基因载体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种微环境双重响应壳聚糖基因载体及其制备方法和应用，该方法从壳聚糖低聚寡糖出发，合成了含酰腙键和二硫键的大分子壳聚糖(SRCS)。采用共价接枝方法对SRCS进行聚乙烯亚胺和聚乙二醇接枝，得到氧化还原微环境和酸微环境双重响应聚合物SRCS‑g‑PEI‑g‑PEG。本发明所制备的SRCS‑g‑PEI‑g‑PEG聚合物具有对微环境双重响应控制释放基因的性能。本发明还提供该方法获得的SRCS‑g‑PEI‑g‑PEG聚合物作为基因载体在基因转染中的应用，表现出良好的生物相容性和高的基因转染效率，是基因转染的优良载体，具有广阔的应用前景。

Description

微环境双重响应壳聚糖基因载体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种微环境双重响应壳聚糖基因载体，具体地说，涉及一种酰腙键和二硫键交联壳聚糖接枝聚乙烯亚胺和聚乙二醇的聚合物及其制备方法和应用，属于基因治疗领域新型高效非病毒基因载体的制备方法与技术。
背景技术
基因治疗通过将外源基因导入到靶细胞核内以修复导致疾病的缺陷基因或者抑制导致疾病的有害基因，从而使机体恢复正常功能，达到治疗疾病的目的【1.中国发明专利，公开号CN 102140171A，发明名称为：用作非病毒基因载体材料的谷胱甘肽修饰壳聚糖共聚物及其制备和应用】。基因治疗技术为常规医疗手段难以治愈的疾病提供了新的治疗方法。分子生物学的发展和人类基因库的建立推动了基因治疗的临床应用，使其不仅在治疗遗传性先天疾病和恶性肿瘤等领域发挥优势，并且越来越广泛的应用于各种普遍性疾病的治疗。基因治疗的关键在于开发安全、高效的基因递送载体。
壳聚糖，作为唯一一种天然阳离子碱性多糖，具有良好的生物降解性、生物相容性、低细胞毒性等优点，其所携带的氨基阳离子能够复合DNA形成纳米微球，正成为非病毒基因载体的热门研究内容之一。壳聚糖对DNA的保护压缩能力与其分子量密切相关。大分子壳聚糖可以很好的保护和压缩DNA，但进入细胞后难以释放DNA，而低分子量壳聚糖却因不能很好的保护DNA使DNA在进入细胞之前即被降解。因而设计即能在细胞外环境中很好地保护DNA、又能使DNA在细胞内环境中快速释放的壳聚糖基非病毒基因载体，对壳聚糖基基因载体的研究具有十分重要的意义。
人体病变部位(如肿瘤)的细胞外和细胞内存在明显的氧化还原环境差异，细胞外倾向于氧化性环境，以保持细胞膜蛋白等二硫键的稳定性，而细胞内则是过度表达的高浓度谷胱甘肽形成的还原性环境【2.Chem Soc Rev,2013,42(17):7289-325.Functionalblock copolymer assemblies responsive to tumor and intracellularmicroenvironments for site-specific drug delivery and enhanced imagingperformance】。载体和基因的复合物进入细胞后，会经历不同pH值梯度的细胞内环境，从生理pH值条件到早期内涵体(pH＝5.5-6.2)、再到晚期内涵体和溶酶体(pH＝5.0-5.5)。因此可以利用病变部位细胞内外环境的氧化还原物质和酸性物质浓度的梯度差异，设计具有环境刺激响应性能的壳聚糖基因载体，巧妙解决载体压缩与释放DNA的矛盾，实现对基因的控制释放，提高载体的基因转运效率。
采用环境敏感的化学键对小分子聚合物进行交联，得到大分子聚合物，是解决上述问题的有效途径之一【3.Biomacromolecules,2015,16(4):1390-1400.ReversiblyCross-Linked Polyplexes Enable Cancer-Targeted Gene Delivery via Self-Promoted DNA Release and Self-Diminished Toxicity】。从目前文献的调研结果看，尚未有任何报道是以酸和还原敏感化学键交联壳聚糖，合成酸和还原环境响应大分子交联壳聚糖，再进行聚乙烯亚胺(PEI)和聚乙二醇(PEG)接枝，构建具有具有“质子海绵效应”和长循环稳定性、还原环境和酸性环境双重响应控释基因的壳聚糖基非病毒基因载体。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服现有壳聚糖基因载体的缺陷，提供一种新型酰腙键和二硫键交联壳聚糖接枝PEI和PEG聚合物及其制备方法。
本发明的第一个目的在于提供一种新型含酰腙键和二硫键交联壳聚糖(SRCS)，其具有式(Ⅰ)结构：
其中，R1、R2独立地为C1～6的亚烷基或C2～6的亚烯基或含1～3个苯环的亚芳基。
优选地，R1、R2独立地为-CH2-或-C2H4-或-C6H4-。
所述SRCS通过以下技术方案实现：
将高碘酸盐和壳聚糖低聚寡糖分别溶于pH＝4-6的醋酸-醋酸盐缓冲溶液中，超声脱气，氮气气氛下0-4℃搅拌反应10-30h；加入乙二醇终止反应，反应液经透析、冷冻干燥，制备醛基壳聚糖；
将醛基壳聚糖分散到醇溶液中，加入摩尔当量为醛基壳聚糖重复单元0.1-2倍的二硫代二酰肼化合物，再加入适量冰醋酸，在惰性气体保护下，20-100℃的反应温度下搅拌回流2-80h，去离子水透析后，冷冻干燥，得到酰腙交联壳聚糖。
进一步地，所述壳聚糖低聚寡糖的重均分子量为500-10000Da，脱乙酰度为65-95％。
进一步地，所述二硫代二酰肼化合物为二硫代双乙酰肼、二硫代双丙酰肼或二硫代双苯酰肼中的一种，用量为醛基壳聚糖重复单元摩尔当量的0.1-2倍，优选为0.2-1倍，反应条件为20-100℃回流2-80h，优选为50-80℃回流12-72h。
本发明另一个目的还在于提供一种微环境双重响应壳聚糖接枝聚乙烯亚胺和聚乙二醇(SRCS-g-PEI-g-PEG)，其具有式(Ⅱ)结构：
其中，R1、R2独立地为C1～6的亚烷基或C2～6的亚烯基或含1～3个苯环的亚芳
基；L1为酰脲键或者氨基甲酸酯键；L2为酰脲键。
优选地，R1、R2独立地为-CH2-或-C2H4-或-C6H4-。
所述SRCS-g-PEI-g-PEG通过以下技术方案实现：含酰腙键和二硫键的大分子壳聚糖与聚乙烯亚胺和聚乙二醇的进行接枝共聚反应，得到SRCS-g-PEI-g-PEG聚合物。
将制备的含酰腙键和二硫键的大分子壳聚糖加入离子液体中，充分搅拌溶解后加入与壳聚糖氨基葡萄糖单元等摩尔量的CDI，N2气保护下搅拌反应充分并加入mPEG和PEI，反应混合物在去离子水中透析，冷冻干燥得到SRCS-g-PEI-g-PEG聚合物。优选地，mPEG与SRCS质量比为：(0.1～1):1，更优选(0.2～0.7):1；PEI与SRCS质量比为：(0.1～1):1，更优选(0.1～0.6):1。
本发明所用离子液体优选咪唑类离子液体，但不限于咪唑类离子液体(比如1-丁基-3-甲基咪唑醋酸盐离子液体)或者离子液体反应介质(如氨基酸盐酸盐离子液体)；更优选采用羰基二咪唑等偶联试剂对SRCS进行聚乙烯亚胺和聚乙二醇接枝，但本发明不限于偶联试剂共价接枝，还可以使用本领域常用的其他接枝方法，如在反应体系中加入引发剂甲基苯磺酸甲酯和2-乙基-2-噁唑啉，经开环聚合后，以氢氧化钾/甲醇溶液闭环，进行PEI接枝或者向体系中加入盐酸和氮丙啶聚合，进行PEI接枝。
本发明同时请求保护上述微环境双重响应壳聚糖基因载体在基因转染中的应用。
本发明通过含酰腙键和二硫键的化合物对壳聚糖低聚寡糖进行交联，得到以酸和还原敏感大分子壳聚糖SRCS，再对SRCS进行聚乙烯亚胺和聚乙二醇接枝，得到微环境双重响应聚合物基因载体SRCS-g-PEI-g-PEG，巧妙解决基因转运过程中细胞内外基因压缩与释放的矛盾，有效提高基因转运，是基因转运的优良载体。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1.本发明从低分子壳聚糖低聚寡糖出发，制备了二硫键和酰腙键交联大分子壳聚糖SRCS，具有在酸环境和氧化还原环境中响应断裂的环境敏感性能。
2.本发明对所获得的SRCS聚合物进行聚乙烯亚胺和聚乙二醇接枝，得到SRCS-g-PEI-g-PEG聚合物基因载体，协同SRCS的微环境双重响应性能、PEI的质子海绵效应和PEG的血液循环稳定性。
3.SRCS-g-PEI-g-PEG聚合物表现出良好的生物相容性和高的基因转染效率，是基因转染的优良载体，基因载体在细胞外能够有效压缩基因，在细胞内对胞内微环境进行响应，释放基因，有效解决基因压缩与释放的矛盾，基因转运效率高、细胞毒性低，在基因治疗领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为实施例1所制备的SRCS和SRCS-g-PEI-g-PEG聚合物的FTIR谱图；
图2为实施例1所制备的SRCS和SRCS-g-PEI-g-PEG聚合物的1HNMR谱图；
图3为实施例1所制备的SRCS和SRCS-g-PEI-g-PEG聚合物的13C-CP/MAS NMR谱图；
图4为实施例1所制备的SRCS-g-PEI-g-PEG与DNA形成的稳定的复合物在酸和还原环境中响应释放DNA的能力考查结果；其中，0泳道为DNA标记,1泳道为DNA,图4-a的2-12泳道pH值分别为7.4,7.0,6.5,6.0,5.5,5.0,4.5,4.0,3.5,3.0,2.5；图4-b的2-12泳道分别含10μg/μL DTT为0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10μL；
图5为本发明实施例9制备的SRCS和SRCS-g-PEI-g-PEG聚合物的基因转染效率；其中，PEI25表示PEI分子量为25kDa；PEI1.8表示PEI分子量为1.8kDa；
图6为本发明实施例9制备的SRCS和SRCS-g-PEI-g-PEG聚合物的MTT细胞毒性。
具体实施方式
下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例和附图仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均可从化学药品店购买得到的。
实施例1
低分子量壳聚糖(CSO)0.8554g，溶于50mL的NaAc/HAc(pH＝4.5)的缓冲溶液中，超声30min，使其溶解。高碘酸钠0.1093g，溶于50mL的NaAc/HAc(pH＝4.5)的缓冲溶液中，超声30min。以上两种溶液分别置于冰浴，并通入高纯氮气脱气30min，将两种溶液混合，在0-4℃下搅拌反应26h，加入10mL乙二醇中止反应。反应液转移到透析袋(MWCO＝3000Da)中，在NaAc/HAc缓冲溶液中透析24h，再经去离子水透析48h，冻干，得到醛基壳聚糖。称取醛基壳聚糖0.16g，3,3'-二硫代二(丙酸肼)0.10g，冰醋酸三滴，无水乙醇30mL，氮气保护，68℃下搅拌回流42h，真空旋转蒸发去除溶剂，残余物加去离子水转移到透析袋中，去离子水中透析48h，冻干。产物经1HNMR、13C-CP/MAS NMR、FTIR、UV、GPC表征进行结构确认，SRCS中二硫键的含量采用紫外可见吸光度法通过Ellman试剂法测定，氧化得到的醛基壳聚糖的醛基含量通过盐酸羟胺反滴定的方法确定。
将制备的SRCS加入[BMIM]Ac离子液体中，80℃油浴N2气保护下充分搅拌溶解，加入与壳聚糖氨基葡萄糖单元等摩尔量的CDI，N2气保护下80℃搅拌反应2h，再加入0.3mol壳聚糖氨基葡萄糖单元的mPEG-NH2，N2气保护下80℃反应2h，最后加入0.45mol壳聚糖氨基葡萄糖单元的PEI，N2气保护下80℃搅拌反应2h。在反应液中加入适量去离子水，将反应液混合物转移至透析袋中(MWCO＝8000-14000Da)，去离子水中透析3天，冷冻干燥，得到SRCS-g-PEI-g-PEG聚合物。
实施例2
将制备的SRCS加入[BMIM]Cl离子液体中，80℃油浴N2气保护下充分搅拌溶解，加入与壳聚糖氨基葡萄糖单元等摩尔量的CDI，N2气保护下80℃搅拌反应2h，再加入0.3mol壳聚糖氨基葡萄糖单元的mPEG-NH2，N2气保护下80℃反应2h，最后加入0.45mol壳聚糖氨基葡萄糖单元的PEI，N2气保护下80℃搅拌反应2h。在反应液中加入适量去离子水，将反应液混合物转移至透析袋中(MWCO＝8000-14000Da)，去离子水中透析3天，冷冻干燥，得到SRCS-g-PEI-g-PEG聚合物。
实施例3
将制备的SRCS加入DMF中，40℃N2气保护下充分搅拌使均匀分散，加入与壳聚糖氨基葡萄糖单元等摩尔量的CDI，N2气保护下40℃搅拌反应12h，再加入0.3mol壳聚糖氨基葡萄糖单元的mPEG-NH2，N2气保护下40℃反应12h，最后加入0.45mol壳聚糖氨基葡萄糖单元的PEI，N2气保护下40℃搅拌反应12h。在反应液中加入适量去离子水，将反应液混合物转移至透析袋中(MWCO＝8000-14000Da)，去离子水中透析3天，冷冻干燥，得到SRCS-g-PEI-g-PEG聚合物。
实施例4
将制备的SRCS加入[BMIM]Ac离子液体中，80℃油浴N2气保护下充分搅拌溶解，加入与壳聚糖氨基葡萄糖单元等摩尔量的CDI，N2气保护下80℃搅拌反应2h，再加入0.3mol壳聚糖氨基葡萄糖单元的mPEG-OH，N2气保护下80℃反应2h，最后加入0.45mol壳聚糖氨基葡萄糖单元的PEI，N2气保护下80℃搅拌反应2h。在反应液中加入适量去离子水，将反应液混合物转移至透析袋中(MWCO＝8000-14000Da)，去离子水中透析3天，冷冻干燥，得到SRCS-g-PEI-g-PEG聚合物。
实施例5
将制备的SRCS加入[BMIM]Ac离子液体中，80℃油浴N2气保护下充分搅拌溶解，加入与壳聚糖氨基葡萄糖单元等摩尔量的CDI，N2气保护下80℃搅拌反应2h，再加入0.3mol壳聚糖氨基葡萄糖单元的mPEG-NH2，N2气保护下80℃反应2h，加入0.1mol对甲基苯磺酸甲酯引发剂和壳聚糖氨基葡萄糖单元0.6倍摩尔量的2-乙基-2-噁唑啉，经开环聚合后，以氢氧化钾/甲醇溶液闭环，进行PEI接枝，反应结束后，在反应液中加入适量去离子水，将反应液混合物转移至透析袋中(MWCO＝8000-14000Da)，去离子水中透析3天，冷冻干燥，得到SRCS-g-PEI-g-PEG聚合物。
实施例6
将制备的SRCS加入[BMIM]Ac离子液体中，80℃油浴N2气保护下充分搅拌溶解，加入与壳聚糖氨基葡萄糖单元等摩尔量的CDI，N2气保护下80℃搅拌反应2h，再加入0.3mol壳聚糖氨基葡萄糖单元的mPEG-OH，N2气保护下80℃反应2h，加入对甲基苯磺酸甲酯引发剂和0.6倍壳聚糖氨基葡萄糖单元摩尔量的2-乙基-2-噁唑啉，经开环聚合后，以氢氧化钾/甲醇溶液闭环，进行PEI接枝，反应结束后，在反应液中加入适量去离子水，将反应液混合物转移至透析袋中(MWCO＝8000-14000Da)，去离子水中透析3天，冷冻干燥，得到SRCS-g-PEI-g-PEG聚合物。
实施例7
将制备的SRCS加入[BMIM]Ac离子液体中，80℃油浴N2气保护下充分搅拌溶解，加入与壳聚糖氨基葡萄糖单元等摩尔量的CDI，N2气保护下80℃搅拌反应2h，再加入0.3mol壳聚糖氨基葡萄糖单元的mPEG-NH2，N2气保护下80℃反应2h，加入壳聚糖氨基葡萄糖单元0.1倍摩尔量的盐酸，再滴加壳聚糖氨基葡萄糖单元5倍摩尔量氮丙啶聚合，进行PEI接枝，反应结束后，在反应液中加入适量去离子水，将反应液混合物转移至透析袋中(MWCO＝8000-14000Da)，去离子水中透析3天，冷冻干燥，得到SRCS-g-PEI-g-PEG聚合物。
实施例8
将制备的SRCS加入[BMIM]Ac离子液体中，80℃油浴N2气保护下充分搅拌溶解，加入与壳聚糖氨基葡萄糖单元等摩尔量的CDI，N2气保护下80℃搅拌反应2h，再加入0.3mol壳聚糖氨基葡萄糖单元的mPEG-OH，N2气保护下80℃反应2h，加入壳聚糖氨基葡萄糖单元0.1倍摩尔量的盐酸，再滴加壳聚糖氨基葡萄糖单元5倍摩尔量氮丙啶聚合，进行PEI接枝，反应结束后，在反应液中加入适量去离子水，将反应液混合物转移至透析袋中(MWCO＝8000-14000Da)，去离子水中透析3天，冷冻干燥，得到SRCS-g-PEI-g-PEG聚合物。
实施例9
将制备的SRCS加入[BMIM]Ac离子液体中，80℃油浴N2气保护下充分搅拌溶解，加入与壳聚糖氨基葡萄糖单元等摩尔量的CDI，N2气保护下80℃搅拌反应2h，再加入0.3mol壳聚糖氨基葡萄糖单元的mPEG-NH2，N2气保护下80℃反应2h，最后加入0.3mol壳聚糖氨基葡萄糖单元的PEI，N2气保护下80℃搅拌反应2h。在反应液中加入适量去离子水，将反应液混合物转移至透析袋中(MWCO＝8000-14000Da)，去离子水中透析3天，冷冻干燥，得到SRCS-g-PEI-g-PEG聚合物。
实施例10
将制备的SRCS加入[BMIM]Ac离子液体中，80℃油浴N2气保护下充分搅拌溶解，加入与壳聚糖氨基葡萄糖单元等摩尔量的CDI，N2气保护下80℃搅拌反应2h，再加入0.6mol壳聚糖氨基葡萄糖单元的mPEG-NH2，N2气保护下80℃反应2h，最后加入0.3mol壳聚糖氨基葡萄糖单元的PEI，N2气保护下80℃搅拌反应2h。在反应液中加入适量去离子水，将反应液混合物转移至透析袋中(MWCO＝8000-14000Da)，去离子水中透析3天，冷冻干燥，得到SRCS-g-PEI-g-PEG聚合物。
实施例11
将制备的SRCS加入[BMIM]Cl离子液体中，80℃油浴N2气保护下充分搅拌溶解，加入与壳聚糖氨基葡萄糖单元等摩尔量的CDI，N2气保护下80℃搅拌反应2h，再加入0.3mol壳聚糖氨基葡萄糖单元的mPEG-NH2，N2气保护下80℃反应2h，最后加入0.3mol壳聚糖氨基葡萄糖单元的PEI，N2气保护下80℃搅拌反应2h。在反应液中加入适量去离子水，将反应液混合物转移至透析袋中(MWCO＝8000-14000Da)，去离子水中透析3天，冷冻干燥，得到SRCS-g-PEI-g-PEG聚合物。
实施例12
将制备的SRCS加入[BMIM]Cl离子液体中，80℃油浴N2气保护下充分搅拌溶解，加入与壳聚糖氨基葡萄糖单元等摩尔量的CDI，N2气保护下80℃搅拌反应2h，再加入0.6mol壳聚糖氨基葡萄糖单元的mPEG-NH2，N2气保护下80℃反应2h，最后加入0.3mol壳聚糖氨基葡萄糖单元的PEI，N2气保护下80℃搅拌反应2h。在反应液中加入适量去离子水，将反应液混合物转移至透析袋中(MWCO＝8000-14000Da)，去离子水中透析3天，冷冻干燥，得到SRCS-g-PEI-g-PEG聚合物。
实施例13
将制备的SRCS加入DMF中，40℃N2气保护下充分搅拌使均匀分散，加入与壳聚糖氨基葡萄糖单元等摩尔量的CDI，N2气保护下40℃搅拌反应12h，再加入0.3mol壳聚糖氨基葡萄糖单元的mPEG-NH2，N2气保护下40℃反应12h，最后加入0.3mol壳聚糖氨基葡萄糖单元的PEI，N2气保护下40℃搅拌反应12h。在反应液中加入适量去离子水，将反应液混合物转移至透析袋中(MWCO＝8000-14000Da)，去离子水中透析3天，冷冻干燥，得到SRCS-g-PEI-g-PEG聚合物。
实施例14
将制备的SRCS加入[BMIM]Ac离子液体中，80℃油浴N2气保护下充分搅拌溶解，加入与壳聚糖氨基葡萄糖单元等摩尔量的CDI，N2气保护下80℃搅拌反应2h，再加入0.3mol壳聚糖氨基葡萄糖单元的mPEG-OH，N2气保护下80℃反应2h，最后加入0.3mol壳聚糖氨基葡萄糖单元的PEI，N2气保护下80℃搅拌反应2h。在反应液中加入适量去离子水，将反应液混合物转移至透析袋中(MWCO＝8000-14000Da)，去离子水中透析3天，冷冻干燥，得到SRCS-g-PEI-g-PEG聚合物。
实施例15
将制备的SRCS加入[BMIM]Ac离子液体中，80℃油浴N2气保护下充分搅拌溶解，加入与壳聚糖氨基葡萄糖单元等摩尔量的CDI，N2气保护下80℃搅拌反应2h，再加入0.6mol壳聚糖氨基葡萄糖单元的mPEG-OH，N2气保护下80℃反应2h，最后加入0.3mol壳聚糖氨基葡萄糖单元的PEI，N2气保护下80℃搅拌反应2h。在反应液中加入适量去离子水，将反应液混合物转移至透析袋中(MWCO＝8000-14000Da)，去离子水中透析3天，冷冻干燥，得到SRCS-g-PEI-g-PEG聚合物。
实施例16
将制备的SRCS加入[BMIM]Ac离子液体中，80℃油浴N2气保护下充分搅拌溶解，加入与壳聚糖氨基葡萄糖单元等摩尔量的CDI，N2气保护下80℃搅拌反应2h，再加入0.3mol壳聚糖氨基葡萄糖单元的mPEG-NH2，N2气保护下80℃反应2h，加入0.1mol对甲基苯磺酸甲酯引发剂和壳聚糖氨基葡萄糖单元0.3倍摩尔量的2-乙基-2-噁唑啉，经开环聚合后，以氢氧化钾/甲醇溶液闭环，进行PEI接枝，反应结束后，在反应液中加入适量去离子水，将反应液混合物转移至透析袋中(MWCO＝8000-14000Da)，去离子水中透析3天，冷冻干燥，得到SRCS-g-PEI-g-PEG聚合物。
实施例17
将制备的SRCS加入[BMIM]Ac离子液体中，80℃油浴N2气保护下充分搅拌溶解，加入与壳聚糖氨基葡萄糖单元等摩尔量的CDI，N2气保护下80℃搅拌反应2h，再加入0.6mol壳聚糖氨基葡萄糖单元的mPEG-NH2，N2气保护下80℃反应2h，加入0.1mol对甲基苯磺酸甲酯引发剂和壳聚糖氨基葡萄糖单元0.6倍摩尔量的2-乙基-2-噁唑啉，经开环聚合后，以氢氧化钾/甲醇溶液闭环，进行PEI接枝，反应结束后，在反应液中加入适量去离子水，将反应液混合物转移至透析袋中(MWCO＝8000-14000Da)，去离子水中透析3天，冷冻干燥，得到SRCS-g-PEI-g-PEG聚合物。
实施例18
将制备的SRCS加入[BMIM]Ac离子液体中，80℃油浴N2气保护下充分搅拌溶解，加入与壳聚糖氨基葡萄糖单元等摩尔量的CDI，N2气保护下80℃搅拌反应2h，再加入0.6mol壳聚糖氨基葡萄糖单元的mPEG-NH2，N2气保护下80℃反应2h，加入0.1mol对甲基苯磺酸甲酯引发剂和壳聚糖氨基葡萄糖单元0.3倍摩尔量的2-乙基-2-噁唑啉，经开环聚合后，以氢氧化钾/甲醇溶液闭环，进行PEI接枝，反应结束后，在反应液中加入适量去离子水，将反应液混合物转移至透析袋中(MWCO＝8000-14000Da)，去离子水中透析3天，冷冻干燥，得到SRCS-g-PEI-g-PEG聚合物。
实施例19
将制备的SRCS加入[BMIM]Ac离子液体中，80℃油浴N2气保护下充分搅拌溶解，加入与壳聚糖氨基葡萄糖单元等摩尔量的CDI，N2气保护下80℃搅拌反应2h，再加入0.3mol壳聚糖氨基葡萄糖单元的mPEG-NH2，N2气保护下80℃反应2h，加入壳聚糖氨基葡萄糖单元0.1倍摩尔量的盐酸，再滴加壳聚糖氨基葡萄糖单元3倍摩尔量氮丙啶聚合，进行PEI接枝，反应结束后，在反应液中加入适量去离子水，将反应液混合物转移至透析袋中(MWCO＝8000-14000Da)，去离子水中透析3天，冷冻干燥，得到SRCS-g-PEI-g-PEG聚合物。
实施例20
将制备的SRCS加入[BMIM]Ac离子液体中，80℃油浴N2气保护下充分搅拌溶解，加入与壳聚糖氨基葡萄糖单元等摩尔量的CDI，N2气保护下80℃搅拌反应2h，再加入0.3mol壳聚糖氨基葡萄糖单元的mPEG-NH2，N2气保护下80℃反应2h，加入壳聚糖氨基葡萄糖单元0.1倍摩尔量的盐酸，再滴加壳聚糖氨基葡萄糖单元1倍摩尔量氮丙啶聚合，进行PEI接枝，反应结束后，在反应液中加入适量去离子水，将反应液混合物转移至透析袋中(MWCO＝8000-14000Da)，去离子水中透析3天，冷冻干燥，得到SRCS-g-PEI-g-PEG聚合物。
SRCS-g-PEI-g-PEG/DNA复合物的环境响应性能测定
采用琼脂糖凝胶电泳考察SRCS-g-PEI-g-PEG/DNA复合物在酸环境中响应释放DNA的性能：以pH值从7.4到4.0变化的PBS缓冲溶液，新鲜制备SRCS-g-PEI-g-PEG/DNA复合物，孵育1h后，加入Loading Buffer进行电泳。考察复合物还原环境中响应释放DNA的性能：新鲜制备SRCS-g-PEI-g-PEG/DNA复合物，加入不同浓度的DTT，孵育1h后加入Loading Buffer进行电泳测试。
SRCS-g-PEI-g-PEG聚合物基因转运效率的测定
采用pGL3质粒为报告基因，对SRCS-g-PEI-g-PEG聚合物载体的基因转运性能进行评价，10％血清条件下的基因转运和无血清条件下的基因转运作对比，所用细胞为人非小细胞肺癌细胞A549细胞系。将培养好的细胞铺板，在培养箱中培养至细胞融合度达到80％后，进行基因转运，转运时，将完全培养基吸去，用PBS洗涤两次，血清条件下转运时，加入400μL含10％血清的培养基和不同N/P比(质量比)的SRCS-g-PEI-g-PEG/DNA复合物(每孔含1μg DNA)，培养18h后，吸出培养基，换上新鲜的含10％血清的培养基继续培养32h后，进行检测，无血清条件下的转运仅仅在转运时，将加入的400μL含10％血清的培养基替换为无血清培养基，与不同N/P比(质量比)的SRCS-g-PEI-g-PEG/DNA复合物(每孔含1μg DNA)孵育5h后，再将无血清培养基换成完全培养基，继续培养45h进行检测。按照荧光素酶试剂盒所提供的说明书在BioTek Synergy2多功能酶标仪上检测光子的强度，用BCA检测出总蛋白的浓度，从而将结果统一标准化成RLU/mg蛋白(每毫克蛋白所对应的相对光子数)。
SRCS-g-PEI-g-PEG聚合物的细胞毒性
载体的细胞毒性采用MTT法进行评价。在96孔细胞培养板上种植细胞，平行3孔，每孔种植5×104个细胞，在37℃，5％CO2细胞培养箱中培养至细胞融合度达到85％以上。移去培养基，用PBS洗2次后，加入新鲜培养基和待测载体，培养24h后，每孔加入20μL 5mg/mL的MTT溶液，37℃继续培养4h，移去培养基，终止培养。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原MTT生成甲臢，每孔加入150μL DMSO使溶解，在37℃继续孵育30min。在多功能酶标仪(Sunrise Tecan)上测定570nm波长各孔的吸收值，检测前震动96孔板自动混匀600s，并采用无细胞的培养基对酶标仪调零。细胞存活率按公式1.1计算：
细胞存活率(％)＝A570SMP/A570CTL×100 (1.1)
其中A570SMP为加入待测载体或复合物的细胞孔板的吸光值，A570CTL为只含培养基的细胞孔板的吸光值。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.含酰腙键和二硫键的大分子壳聚糖，其特征在于，具有式(Ⅰ)结构：
其中，R1、R2独立地为C1～6的亚烷基或C2～6的亚烯基或含1～3个苯环的亚芳基。
2.根据权利要求1所述含酰腙键和二硫键的大分子壳聚糖，其特征在于，R1、R2独立地为-CH2-或-C2H4-或-C6H4-。
3.一种如权利要求1所述含酰腙键和二硫键的大分子壳聚糖的制备方法，其特征在于，采用高碘酸盐、壳聚糖低聚寡糖在醋酸-醋酸盐缓冲溶液中，0-4℃搅拌反应10-30h，再加入乙二醇终止反应，反应液经透析、冷冻干燥，制备醛基壳聚糖，再将醛基壳聚糖分散到醇溶液中，加入二硫代二酰肼化合物，再加入适量冰醋酸，在惰性气体保护下，20-100℃的反应温度下搅拌回流2-80h，去离子水透析后，冷冻干燥，得到酰腙键和二硫键交联壳聚糖。
4.根据权利要求3所述含酰腙键和二硫键的大分子壳聚糖的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖低聚寡糖的重均分子量为500-10000Da，脱乙酰度为65-95％。
5.根据权利要求3所述含酰腙键和二硫键的大分子壳聚糖的制备方法，其特征在于，所述二硫代二酰肼化合物为二硫代双乙酰肼、二硫代双丙酰肼或二硫代双苯酰肼中的一种。
6.根据权利要求3所述含酰腙键和二硫键的大分子壳聚糖的制备方法，其特征在于，二硫代二酰肼化合物用量为醛基壳聚糖重复单元摩尔当量的0.1-2倍，反应条件为20-100℃回流2-80h。
7.微环境双重响应壳聚糖基因载体，其特征在于，具有式(Ⅱ)结构：
其中，R1、R2独立地为C1～6的亚烷基或C2～6的亚烯基或含1～3个苯环的亚芳基；L1为酰脲键或者氨基甲酸酯键；L2为酰脲键。
8.根据权利要求7所述的微环境双重响应壳聚糖基因载体，其特征在于，
R1、R2独立地为-CH2-或-C2H4-或-C6H4-。
9.一种如权利要求7所述的微环境双重响应壳聚糖基因载体的制备方法，其特征在于，含酰腙键和二硫键的大分子壳聚糖与聚乙烯亚胺和聚乙二醇进行接枝共聚反应，得到SRCS-g-PEI-g-PEG聚合物。
10.根据权利要求9所述的微环境双重响应壳聚糖基因载体的 制备方法，其特征在于，将制备的含酰腙键和二硫键的大分子壳聚糖加入离子液体中，充分搅拌溶解后加入与壳聚糖氨基葡萄糖单元等摩尔量的CDI，N2气保护下搅拌反应加入mPEG和PEI，反应混合物在去离子水中透析，冷冻干燥得到SRCS-g-PEI-g-PEG聚合物。
11.权利要求7所述的微环境双重响应壳聚糖基因载体在基因转染中的应用。
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