CN102140171A - 用作非病毒基因载体材料的谷胱甘肽修饰壳聚糖共聚物及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

用作非病毒基因载体材料的谷胱甘肽修饰壳聚糖共聚物及其制备和应用，本发明属于基因治疗及新材料领域。所述共聚物的制备步骤如下：1)合成烯丙基修饰的壳聚糖衍生物；2)RAFT合成不同分子量的刷状PEG聚合物链；3)利用自由基偶联法将刷状PEG接枝到壳聚糖骨架上；4)利用EDC/NHS活化法将谷胱甘肽连接到刷状PEG链端。制得谷胱甘肽修饰壳聚糖共聚物载体材料。本发明技术所得到的谷胱甘肽修饰壳聚糖共聚物作为非病毒基因载体，可显著提高与DNA形成的复合纳米粒子的细胞内吞作用，同时改善了进入细胞后DNA从复合物粒子中释放机制，进而得到高转染效率的非病毒载体材料。

Description

用作非病毒基因载体材料的谷胱甘肽修饰壳聚糖共聚物及其制备和应用

技术领域

本发明属于基因治疗及新材料领域，具体涉及一种以谷胱甘肽改性壳聚糖为基础的非病毒基因载体的制备方法。

背景技术

在各种人类疾病的治疗过程中，基因治疗引起了越来越多的关注。基因治疗是一种利用分子生物学方法将目的基因导入患者体内，使之表达目的基因产物，从而使疾病得到治疗的技术。载体问题一直是基因治疗研究领域的核心技术之一，基因治疗的关键技术是基因传递载体的选择。基因载体通常分为病毒载体和非病毒载体.在多数情况下，病毒载体的转染效率高，但存在毒性、免疫原性及基因转染的靶向性等问题，限制了其在临床治疗中的应用；非病毒载体虽然没有毒性问题，但是不利的生物分布以及低效的胞内运转，导致活性基因转染率低.因此提高非病毒基因载体的转染率成是当前研究的热点。

壳聚糖作为一种天然存在的、亲水性阳离子、可生物降解多糖，具有无毒、良好的生物相容性、低免疫排斥反应等一系列特殊的化学和生物特性，在非病毒基因载体方面有很大的优势。但是单一的聚阳离子片段在生物体内易发生聚集被原生质体清除，改进方法是在壳聚糖上接枝分散性和生物相容性都很好的聚乙二醇片段，不仅增加了其水溶性，更重要的是增加其分散性和循环时间。谷胱甘肽是一种广泛存在于生物体内的功能性三肽，将其引入壳聚糖体系，可以利用谷胱甘肽上的巯基与细胞膜作用，增强聚合物的细胞膜透过性，同时，巯基在共聚物中与DNA形成复合物中可发生交联作用而有利于其在转运过程中的稳定以及进入细胞内后DNA的释放，达到提高转染效率的目的。

发明内容

本发明旨在提供一种制备谷胱甘肽改性壳聚糖共聚物，具有低毒性、高转染效率的非病毒基因载体的方法。

本发明用作非病毒基因载体材料的谷胱甘肽修饰壳聚糖共聚物，主要由烯丙基化壳聚糖、亲水性的刷状聚乙二醇大分子链以及谷胱甘肽组成，其结构示意如图1所示。

所述的壳聚糖分子量为3-100千道尔顿，脱乙酰度不低于90％。

所述的亲水性的刷状聚乙二醇大分子链是由聚乙二醇分子量为200-10000的(甲基)丙烯酸酯单体(MPEG)通过可控自由基聚合成分子量为3-100千道尔顿含有端羧基的刷状亲水活性大分子链。

所述的刷状亲水活性大分子链是以4，4’-偶氮4-氰基戊酸(ACVA)为引发剂以及4-氰基戊酸-二硫代苯酯为链转移剂(CPADB)制得。

所述的谷胱甘肽是指还原态的谷胱甘肽。

所述的用作非病毒基因载体材料的谷胱甘肽修饰壳聚糖共聚物的方法，包括如下步骤：

1)壳聚糖经烯丙基化得烯丙基化壳聚糖衍生物。

2)以RAFT可控自由基聚合制得活性亲水性聚合物PMPEG。

3)利用自由基偶联法制备PMPEG接枝壳聚糖共聚物，CS-PMPEG。

4)谷胱甘肽经用EDC和NHS活化法连接到PMPEG接枝壳聚糖共聚物的PMPEG链端，得谷胱甘肽接枝共聚物，CS-PMPEG-GSH。

所述的用作非病毒基因载体材料的谷胱甘肽修饰壳聚糖共聚物的应用方法，用作非病毒基因载体材料。

用作非病毒基因载体材料所进行的共聚物(CS-PMPEG-GSH)的细胞转染方法，其步骤为：

1)CS-PMPEG-GSH/DNA复合物的制备：将聚合物溶于乙酸钠溶液中，配制成CS-PMPEG-GSH溶液，然后将配置好的经绿色荧光蛋白标记的DNA溶液，等体积加入到聚合物溶液，混合后，室温静置30分钟，然后静置得到CS-PMPEG-GSH/DNA复合物溶液；

2)体外细胞转染实验：

将NIH3T3细胞在培养板上培育，然后加入谷胱甘肽接枝壳聚糖共聚物CS-PMPEG-GSH/DNA复合物，培育完成后，用流式细胞仪定量测定转染效率。

所述的DNA是质粒DNA。

本发明的制备谷胱甘肽改性壳聚糖共聚物非病毒基因载体的方法，其步骤如下：

1)烯丙基壳聚糖的制备。

2)亲水性刷状聚乙二醇活性聚合物(PMPEG)的制备。

3)刷状聚乙二醇聚合物接枝壳聚糖的制备。

4)谷胱甘肽接枝壳聚糖共聚物(CS-PMPEG-GSH)的制备。

本发明谷胱甘肽接枝壳聚糖共聚物(CS-PMPEG-GSH)的细胞转染方法步骤为：

1)CS-PMPEG-GSH/pDNA复合物的制备。

2)NIH3T3细胞转染。

本发明的主要优点：

壳聚糖作为一种天然阳离子、可生物降解多糖，具有无毒、良好的生物相容性、低免疫排斥反应等一系列特殊的化学和生物特性，是非病毒基因载体临床应用较理想的候选材料，但不经改性的壳聚糖用作基因载体时转染效率较低，距离临床应用仍较远。本发明的方法通过引入具有刷状结构的亲水聚乙二醇链作为间隔臂将谷胱甘肽接枝到壳聚糖骨架上，既得到了对质粒DNA具有良好保护作用、稳定性高的复合纳米粒子，同时又改善了复合粒子与细胞膜表面的结合作用以及质粒DNA在细胞之内从复合粒子中解离的效率，从而使复合粒子对NIH3T3细胞的转染效率较未改性壳聚糖大幅提高，有望达到临床应用水平，同时经本发明方法改性的聚合物较未改性壳聚糖在细胞毒性方面也大幅下降。

附图说明

图1谷胱甘肽接枝壳聚糖共聚物的结构示意图。

图2体外转染流式细胞仪结果。

图3凝胶阻滞实验电泳图。

图4耐DNase实验电泳图。

图5改性材料细胞摄取能力实验结果。

图6质粒DNA从复合纳米粒中释放行为实验电泳图。

图7细胞毒性实验结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明方案作进一步说明，但此说明并不限制本发明的范围。

实施例1：

1)称取10.0g壳聚糖溶于去离子水中，后加入适量氢氧化钠和硼氢化钠，溶解均匀，然后，在40℃下加入10ml烯丙基溴，升温到60℃搅拌下反应3小时，之后，用乙酸中和，产物经乙醇中反复沉淀提取后，真空干燥至恒重，得烯丙基壳聚糖。

2)称取2.104g聚乙二醇甲基丙烯酸酯大单体(MPEG)，5.6mgACVA和27.9mgCPADB溶解于甲醇中，然后，经三次液氮冷冻-抽空-解冻循环脱空气后，在60℃下反应24小时。然后，用冰水终止反应，经在冷乙醚中反复沉淀及真空干燥得粘稠的活性聚合物PMPEG。

3)称取0.2g的步骤1)所得烯丙基壳聚糖，以及0.25g步骤2)所得的PMPEG和引发剂ACVA溶于二甲基甲酰胺(DMF)中，在氮气保护下70℃反应12小时，将反应混合物用去离子水透析3天，后冷冻及真空干燥得产物，CS-PMPEG。

4)取0.28g接枝共聚物CS-PMPEG溶于1％的乙酸溶液中，加入过量1-乙基-3-(-三甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合物，搅拌数小时后，将过量的EDC和NHS透析掉，然后加入GSH，在室温下搅拌反应24小时，之后，去离子水透析、冻干得共聚物CS-PMPEG-GSH。

实施例2：

共聚物(CS-PMPEG-GSH)的细胞转染步骤为：

1)CS-PMPEG-GSH/pDNA复合物的制备：

将聚合物溶于pH5.5的乙酸钠溶液中，配制成CS-PMPEG-GSH溶液，然后将配置好的浓度为0.5μg/μL的经绿色荧光蛋白标记的质粒DNA溶液，等体积加入到聚合物溶液，每种复合物加2.5μg pDNA，混合后，室温静置30分钟，然后静置得到CS-PMPEG-GSH/pDNA复合物溶液。

2)体外细胞转染实验：

将NIH3T3细胞以每孔1×10⁵的细胞数种入24孔培养板上培育24小时，然后用含有谷胱甘肽接枝壳聚糖共聚物CS-PMPEG-GSH/pDNA复合物的新介质替换，继续培育48小时，用流式细胞仪定量测定转染效率。结果如图2所示。

图2表明，经谷胱甘肽改性的壳聚糖共聚物pDNA复合物在相同N/P时对NIH3T3细胞的转染效率显著提高。

实施例3：凝胶阻滞实验：

首先用浓度为1％的琼脂糖溶化后制备电泳凝胶，然后不同N/P比的CS-PMPEG-GSH/pDNA复合物溶液，其中每个样品含pDNA0.066μg，最后在恒压100V下电泳30min，电泳结束后把胶板放到EB溶液中进行染色，完全浸泡30min，在紫外灯下观察pDNA谱带情况。结果如图3所示。

图3不同N/P比琼脂凝胶电泳图，(a)壳聚糖/pDNA；(b)共聚物CS-PMPEG/pDNA和(c)接枝共聚物CS-PMPEG-GSH/pDNA。可见谷胱甘肽接枝壳聚糖共聚物在N/P比4以上即可对pDNA良好包裹。

实施例4：核酸酶抗性实验：

首先制备一系列N/P比的CS-PMPEG-GSH/pDNA复合物溶液，每个样品含pDNA0.066μg，然后每个样品中加入2μL 0.066 Unit/μL DNase I，37℃水浴中培养30min后加入5μL 80mM EDTA终止酶反应，最后用凝胶电泳的方法检测pDNA被降解的情况。结果如图4所示。

图4第一泳带为裸pDNA；第二泳带为裸pDNA+DNase 1；第三泳带至第七泳带为不同N/P比CS-PMPEG-GSH/pDNA+DNase 1的情形。表明改性后的壳聚糖共聚物具有明显保护pDNA免受DNase降解作用的能力。

实施例5：改性材料细胞摄取能力实验

为了检测材料对细胞摄取率的影响，首先将CS-PMPEG-GSH用FITC标记，成为FTIC-CS-PMPEG-GSH，然后做成FTIC-CS-PMPEG-GSH/pDNA复合物进行NIH3T3细胞转染实验，转染时间为4个小时，为了排除pEGFP荧光的影响，以CS-PMPEG-GSH/pDNA作为对照进行相同条件的细胞转染，转染4个小时后，收集细胞用流式细胞仪定量测定FITC发光效率。结果如图5所示。

图5可见未经FITC标记的材料与pDNA所形成的复合物在细胞培养4小时后均未见明显荧光强度，表明此时还没有完成转染过程，而经FITC标记的复合物粒子的荧光完全是由于粒子内吞进入细胞后材料的荧光贡献，从而从荧光强度可以判断不同材料所形成质粒的内吞程度，该结果说明经改性共聚物CS-PMPEG-GSH要显著优于未改性壳聚糖。

实施例6：质粒DNA从复合纳米粒中释放实验

质粒DNA的释放实验是在CS-PMPEG-GSH/pDNA复合物中加入10mMGSH进行的，并且在37℃作用不同的时间，1小时，4小时，8小时，分别用凝胶电泳检测DNA的释放情况。结果如图6所示。

图6可见，环境中的谷胱甘肽对未经谷胱甘肽改性的壳聚糖与pDNA复合物的pDNA释放行为无影响，而经谷胱甘肽改性的壳聚糖共聚物与pDNA复合物，CS-PMPEG-GSH/pDNA，对环境中的谷胱甘肽很敏感，表明pDNA在此环境下更容易从复合物中释放。

实施例7：细胞毒性试验：

将NIH3T3细胞以0.8×105/孔的密度加入96孔培养板中，培养24h，80％以上的细胞汇合后，加入聚合物溶液，使其最终浓度为5μg/mL到200μg/mL，每个浓度设3个复孔，培养48h后，吸去培养液，每孔加入100ul MTT溶液(最终浓度为0.5mg/ml)，继续培养4h，每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪OD570nm处测量各孔的吸光值，同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的聚合物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。结果如图7所示。

图7表明，经改性后的共聚物的细胞毒性比未改性的壳聚糖显著降低。

Claims (9)

1.一种用作非病毒基因载体材料的谷胱甘肽修饰壳聚糖共聚物，其特征是，该共聚物主要由烯丙基化壳聚糖、亲水性的刷状聚乙二醇大分子链以及谷胱甘肽组成，其结构示意如图1所示。

2.如权利要求1所述的用作非病毒基因载体材料的谷胱甘肽修饰壳聚糖共聚物，其特征是，所述的壳聚糖分子量为3-100千道尔顿，脱乙酰度不低于90％。

3.如权利要求1所述的用作非病毒基因载体材料的谷胱甘肽修饰壳聚糖共聚物，其特征是，所述的亲水性的刷状聚乙二醇大分子链是由聚乙二醇分子量为200-10000的(甲基)丙烯酸酯单体MPEG通过可控自由基聚合成分子量为3-100千道尔顿含有端羧基的刷状亲水活性大分子链。

4.如权利要求3所述的用作非病毒基因载体材料的谷胱甘肽修饰壳聚糖共聚物，其特征是，所述的刷状亲水活性大分子链是以4，4’-偶氮4-氰基戊酸ACVA为引发剂以及4-氰基戊酸-二硫代苯酯为链转移剂CPADB制得。

5.如权利要求1所述的用作非病毒基因载体材料的谷胱甘肽修饰壳聚糖共聚物，其特征是，所述的谷胱甘肽是指还原态的谷胱甘肽。

6.一种制备权利要求1所述的用作非病毒基因载体材料的谷胱甘肽修饰壳聚糖共聚物的方法，其特征是，包括如下步骤：

1)壳聚糖经烯丙基化得烯丙基化壳聚糖衍生物；

2)以RAFT可控自由基聚合制得活性亲水性聚合物PMPEG；

3)利用自由基偶联法制备PMPEG接枝壳聚糖共聚物，CS-PMPEG；

4)谷胱甘肽经用EDC和NHS活化法连接到PMPEG接枝壳聚糖共聚物的PMPEG链端，得谷胱甘肽接枝共聚物，CS-PMPEG-GSH。

7.一种权利要求1所述的用作非病毒基因载体材料的谷胱甘肽修饰壳聚糖共聚物的应用方法，其特征是，用作非病毒基因载体材料。

8.如权利要求7所述的用作非病毒基因载体材料的谷胱甘肽修饰壳聚糖共聚物的应用方法，其特征是，用作非病毒基因载体材料所进行的共聚物CS-PMPEG-GSH的细胞转染方法，其步骤为：

1)CS-PMPEG-GSH/DNA复合物的制备：将聚合物溶于乙酸钠溶液中，配制成CS-PMPEG-GSH溶液，然后将配置好的经绿色荧光蛋白标记的DNA溶液，等体积加入到聚合物溶液，混合后，室温静置30分钟，然后静置得到CS-PMPEG-GSH/DNA复合物溶液；

2)体外细胞转染实验：

将NIH3T3细胞在培养板上培育，然后加入谷胱甘肽接枝壳聚糖共聚物CS-PMPEG-GSH/DNA复合物，培育完成后，用流式细胞仪定量测定转染效率。

9.如权利要求8所述的用作非病毒基因载体材料的谷胱甘肽修饰壳聚糖共聚物的应用方法，其特征是，所述的DNA是质粒DNA。

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