CN106432647A - 基于叔氨基的pH响应嵌段聚合物及其混合胶束与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药用高分子材料技术领域，特别涉及基于叔氨基的pH响应嵌段聚合物及其制备方法和基于其得到的混合胶束系统与应用。本发明的基于叔氨基的pH响应嵌段聚合物，包括一种三嵌段聚合物和两种两嵌段聚合物中的至少一种，结构如下所示；mPEG‑b‑PDEAEMA‑b‑PMMA：n＝100～130，x＝10～20，y＝15～25；PDEAEMA‑b‑PMMA：x＝35～45，y＝20～30；PPEGMA‑b‑PDEAEMA：

Description

基于叔氨基的pH响应嵌段聚合物及其混合胶束与应用
技术领域
本发明属于生物医药用高分子材料技术领域，特别涉及基于叔氨基的pH响应嵌段聚合物及其制备方法和基于其得到的混合胶束系统与应用。
背景技术
癌症或恶性肿瘤是由于细胞生长增殖控制机制失常而引起的疾病。世界卫生组织指出，目前在全球每年癌症夺去700多万人的生命，而且这一数字还将增加，到2030年将可能超过1310万。在我国每年因癌症死亡病例达到270万之多，是仅次于心血管疾病的“第二号杀手”。目前，化疗法是临床上治疗癌症最常用的手段。但是由于癌症细胞的异质性、多耐药性和抗癌药物本身存在的水溶性差、生物分布不均匀和易发生副作用等缺陷，降低了化疗法的疗效。
为了提高癌症治疗的疗效，近年来，一些新型的药物载体被广泛研究，如聚合物胶束。许多两亲性的多嵌段共聚物、接枝共聚物、超支化共聚物和非线型共聚物等通过自组装构建结构有序的胶束，用作抗癌药物载体。聚合物胶束作为一种新型抗癌药物载体，具有很多优点。比如，能增溶疏水性抗癌药物，避免被网状内皮系统(RES)吞噬，利用高通透性和滞留效应实现被动靶向，降低抗癌药物对正常组织的毒副作用。
通常，高分子聚合物胶束是由单一的聚合物组装形成，往往为了赋予胶束更多的功能性，复杂的合成方法和步骤被用于合成多嵌段聚合物。直接使用多种嵌段结构简单的、易于合成的聚合物制备多功能性混合胶束是一种较有前景的方法。首先，通过合成简单的嵌段聚合物或者直接购买工业产品制备混合胶束，在赋予胶束更多的功能性的同时，简化了制备工艺流程；其次，可通过调节各嵌段共聚物的比例，这种简单的方法改善混合胶束的稳定性、大小、形貌、载药能力和响应性等；再者，可以通过便捷的化学方法对胶束表面进行修饰，如接枝一些功能性分子叶酸、荧光素和染料等赋予胶束主动靶向功能和自发荧光功能。
聚甲基丙烯酸N,N-二乙氨基乙酯(PDEAEMA)是一种阳离子聚碱类聚合物，pKb为6.9，其侧链的叔氨基可以在酸性条件下发生质子化作用变为可溶嵌段，而在中性或碱性条件下去质子化表现为疏水性，从而响应肿瘤组织的弱酸性条件。而且含有叔氨基的聚合物胶束载体在中性条件下表观带正电，有利于聚合物胶束穿透细胞膜，改善细胞内吞效果。
Yang[Acta biomaterialia,9(2013):7679-7690]合成了4/6均臂星型聚合物，其臂为三嵌段的PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA，该聚合物形成的纳米胶束用于包载疏水性的抗癌药物阿霉素(DOX)。载药胶束具有较低的临界胶束浓度和灵敏的pH敏感性能。在pH7.4下药物释放缓慢，当pH值下降到5.0时，药物的释放速率有了明显的加快，且通过细胞毒性实验证明了材料基本无毒。郎美东等[Journal of colloid and interface science,364(2011):92-99]使用星型嵌段共聚物S(PCL-b-PDEAEMA)和线型的mPEG-b-PCL制备了一种混合胶束，考察了不同聚合物质量比对混合胶束粒径的影响，随着mPEG-b-PCL的增加，粒径逐渐减小，同时研究了其对吲哚美辛的包载和体外释放性能。韩国的李斗成等[Bioconjugatechemistry,21(2010):208-213]使用线型AP-b-PEG-b-PLA和线型的mPEG-b-PAE制备了一种混合胶束，用于抗癌药物阿霉素(DOX)的包载和缓控释，比较了混合胶束与单组分mPEG-b-PAE胶束的性能，研究混合胶束和单组分胶束的体外和体内释放行为和毒性。
专利申请CN201510191330.8公布一种pH响应聚合物混合胶束及其应用。专利申请CN200910024899.X公布了一种采用ATRP方法合成嵌段聚合物的方法，嵌段的长度易于调控，反应的机理成熟，各种反应条件温和可行。专利申请CN20131014153.1和CN201510191330.8均公布了包载疏水性抗癌药物靶向聚合物胶束的制备方法，由于肿瘤组织环境和正常组织环境pH值的差异，实现药物的定点控制释放。
目前，从现有研究报道来看，不同亲疏水嵌段组分比例的混合胶束的稳定性、其对疏水药物的包载能力、体外释放性能和体外细胞毒性均有待研究，需要进一步对比讨论。
发明内容
为了探讨胶束中亲疏水组分对胶束的稳定性，药物包载量和体外释放性能的影响，克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供基于叔氨基的pH响应嵌段聚合物，包括一种三嵌段聚合物mPEG-b-PDEAEMA-b-PMMA和两种两嵌段聚合物PDEAEMA-b-PMMA和PPEGMA-b-PDEAEMA中的至少一种。
本发明另一目的在于提供上述基于叔氨基的pH响应嵌段聚合物的制备方法。
本发明方法采用酰溴化反应，以2-溴异丁酰溴为溴化试剂，与大分子聚乙二醇单甲醚进行酰溴化反应，制备大分子引发剂(mPEG-Br)；再采用电子转移活化再生原子转移自由基聚合法(ARGET ATRP)，以溴化聚乙二醇单甲醚(mPEG-Br)为大分子引发剂，依次引发单体甲基丙烯酸N,N-二乙氨基乙酯(DEAEMA)及甲基丙烯酸甲酯(MMA)得到pH响应三嵌段聚合物mPEG-b-PDEAEMA-b-PMMA(聚乙二醇单甲醚-b-聚甲基丙烯酸N,N-二乙氨基乙酯-b-聚甲基丙烯酸甲酯)。采用电子转移活化再生原子转移自由基聚合法(ARGET ATRP)，以2-溴异丁酸乙酯(EBriB)为小分子引发剂，依次引发单体甲基丙烯酸N,N-二乙氨基乙酯(DEAEMA)及甲基丙烯酸甲酯(MMA)得到pH响应两嵌段聚合物PDEAEMA-b-PMMA(聚甲基丙烯酸N,N-二乙氨基乙酯-b-聚甲基丙烯酸甲酯)。采用电子转移活化再生原子转移自由基聚合法(ARGETATRP)，以2-溴异丁酸乙酯(EBriB)为小分子引发剂，依次引发单体甲基丙烯酸N,N-二乙氨基乙酯(DEAEMA)及聚甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯(PEGMA)得到pH响应两嵌段聚合物PPEGMA-b-PDEAEMA(聚甲基丙烯酸N,N-二乙氨基乙酯-b-聚甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯)。
本发明的再一目的在于提供基于上述叔氨基的pH响应嵌段聚合物的混合胶束系统，该混合胶束系统由三嵌段聚合物mPEG-b-PDEAEMA-b-PMMA，以及两种两嵌段聚合物PDEAEMA-b-PMMA和PPEGMA-b-PDEAEMA中的至少一种溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，然后在水溶液中自组装得到。
本发明的再一目的在于提供上述混合胶束系统在生物医药领域中的应用，特别适用于制备包载疏水性抗癌药物。
本发明基于叔氨基的pH响应嵌段聚合物的混合胶束系统，各个聚合物组分中均含有pH响应官能团叔氨基，保障改变聚合物比例的同时，尽量维持其pH响应性能，保障其对于疏水性抗癌药物的输送效率。采用透析法制备含有疏水内核，pH响应中间层和亲水外壳的纳米级聚合物胶束，实现对疏水抗癌药物的包载。在弱酸性的肿瘤部位，胶束系统中的pH响应官能团叔氨基发生质子化作用，胶束结构膨胀或者解体，从而实现被包载药物的智能响应控制释放。
本发明的目的通过下述方案实现：
基于叔氨基的pH响应嵌段聚合物，包括一种三嵌段聚合物mPEG-b-PDEAEMA-b-PMMA和两种两嵌段聚合物PDEAEMA-b-PMMA和PPEGMA-b-PDEAEMA中的至少一种；
一种三嵌段聚合物mPEG-b-PDEAEMA-b-PMMA，具有下式所示结构：
其中n＝100～130，x＝10～20，y＝15～25；
一种两嵌段聚合物PDEAEMA-b-PMMA，具有下式所示结构：
其中x＝35～45，y＝20～30；
一种两嵌段聚合物PPEGMA-b-PDEAEMA，具有下式所示结构：
其中x＝8～12，y＝20～30，z＝6～10。
本发明的基于叔氨基的pH响应嵌段聚合物，包括一种三嵌段聚合物mPEG-b-PDEAEMA-b-PMMA和两种两嵌段聚合物PDEAEMA-b-PMMA和PPEGMA-b-PDEAEMA中的至少一种；
其中，所述三嵌段聚合物mPEG-b-PDEAEMA-b-PMMA的数均分子量为9335～11771g/mol；
所述两嵌段聚合物PDEAEMA-b-PMMA的数均分子量为6276～7936g/mol；
所述两嵌段聚合物PPEGMA-b-PDEAEMA的数均分子量为5276～9231g/mol。
本发明提供了一种上述基于叔氨基的pH响应嵌段聚合物的制备方法，各反应物的量以摩尔份数计：
(1)三嵌段聚合物mPEG-b-PDEAEMA-b-PMMA的制备方法，包括以下具体步骤：
1)制备大分子引发剂：将1.54～1.74份催化剂、1～2份聚乙二醇单甲醚(mPEG)溶于溶剂中，再加入2～4份缚酸剂搅拌均匀，逐滴加入1.5～3份溴化剂，室温下反应，得到大分子引发剂(mPEG-Br)；
2)制备pH响应三嵌段聚合物：将0.8～1.2份步骤1)制备得到的大分子引发剂(mPEG-Br)、15～25份单体甲基丙烯酸N,N-二乙氨基乙酯(DEAEMA)、0.08～0.12份催化剂、0.8～1.2份配体1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺(HMTETA)溶于溶剂中，再加入0.8～1.2份还原剂，加热反应后，再加入10～20份单体甲基丙烯酸甲酯(MMA)，恒温反应，得到pH响应三嵌段聚合物mPEG-b-PDEAEMA-b-PMMA。
步骤1)中所述的室温反应时间优选为12～36h。
步骤1)中所述的溴化剂优选在1h内滴加完，更优选在冰水浴中滴加。
步骤1)中所述的溶剂优选为二氯甲烷。
步骤1)中所述的催化剂优选为4-二甲氨基吡啶(DMAP)。
步骤1)中所述的缚酸剂可为本领域常用的任意缚酸剂，优选为三乙胺(TEA)。
步骤1)中所述的溴化剂可为本领域常用的任意溴化剂，优选为2-溴异丁酰溴(BMPB)。
步骤2)中所述的催化剂优选为CuBr2。
步骤2)中所述的还原剂优选为Sn(Oct)2。
步骤2)中所述的加热反应的条件优选为加热至60～90℃，反应5～10h。所述的恒温反应的时间优选为5～10h。
步骤2)中所述的溶剂优选为甲苯。
优选地，步骤1)中反应完成后，分别使用5wt％NaHSO4、Na2SO4、去离子水萃取反应液3次，得到纯化后的大分子引发剂。更优选萃取完后在无水硫酸镁中干燥过夜后过滤，旋转蒸发除去滤液中的大部分溶剂，再用10倍体积冷乙醚溶液沉淀，离心，并用冷乙醚洗涤三次，然后真空干燥。将干燥后的样品溶解在无水乙醇中，过夜重结晶，再真空干燥后即得产物mPEG-Br大分子引发剂白色固体。
优选地，步骤2)所述恒温反应完成后，将反应体系冷却、纯化、干燥，得到纯化后的产物。所述的纯化是指将反应产物溶解于四氢呋喃后，过中性氧化铝层析柱，四氢呋喃洗脱，除去催化剂，再将洗脱液旋蒸浓缩，滴入10倍体积的0℃正己烷进行沉淀，过滤得到纯化后产物。
优选地，上述反应均优选在惰性气体氛围、无水条件下进行。
(2)两嵌段聚合物PDEAEMA-b-PMMA的制备方法，包括以下具体步骤：
将0.8～1.2份小分子引发剂、20～30份单体甲基丙烯酸N,N-二乙氨基乙酯(DEAEMA)、0.08～0.12份催化剂、0.8～1.2份配体1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺(HMTETA)溶于溶剂中，再加入0.8～1.2份还原剂，加热反应后，再加入35～45份单体甲基丙烯酸甲酯(MMA)，恒温反应，得到pH响应两嵌段聚合物PDEAEMA-b-PMMA；
所述的小分子引发剂优选为EBriB。
所述的催化剂优选为CuBr2。
所述的还原剂优选为Sn(Oct)2。
所述的加热反应的条件优选为加热至60～90℃，反应5～10h。所述的恒温反应的时间优选为5～10h。
所述的溶剂优选为甲苯。
优选地，所述恒温反应完成后，将反应体系冷却、纯化、干燥，得到纯化后的产物。所述的纯化是指将反应产物溶解于四氢呋喃后，过中性氧化铝层析柱，四氢呋喃洗脱，除去催化剂，再将洗脱液旋蒸浓缩，滴入10倍体积的0℃正己烷进行沉淀，过滤得到纯化后产物。
优选地，上述反应均优选在惰性气体氛围、无水条件下进行。
(3)两嵌段聚合物PPEGMA-b-PDEAEMA的制备方法，包括以下具体步骤：
将0.8～1.2份小分子引发剂、20～30份单体甲基丙烯酸N,N-二乙氨基乙酯(DEAEMA)、0.08～0.12份催化剂、0.8～1.2份配体1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺(HMTETA)溶于溶剂中，再加入0.8～1.2份还原剂，加热反应后，再加入8～12份单体甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯(PEGMA)，恒温反应，得到pH响应两嵌段聚合物PPEGMA-b-PDEAEMA；
所述的小分子引发剂优选为EBriB。
所述的催化剂优选为CuBr2。
所述的还原剂优选为Sn(Oct)2。
所述的加热反应的条件优选为加热至60～90℃，反应5～10h。所述的恒温反应的时间优选为5～10h。
所述的溶剂优选为甲苯。
优选地，所述恒温反应完成后，将反应体系冷却、纯化、干燥，得到纯化后的产物。所述的纯化指将反应产物溶解于四氢呋喃后，过中性氧化铝层析柱，四氢呋喃洗脱，除去催化剂，再将洗脱液旋蒸浓缩，滴入10倍体积的0℃正己烷进行沉淀，过滤得到纯化后产物。
优选地，上述反应均优选在惰性气体氛围、无水条件下进行。
本发明还提供一种基于上述基于叔氨基的pH响应嵌段聚合物的混合胶束系统，该混合胶束系统由三嵌段聚合物mPEG-b-PDEAEMA-b-PMMA，以及两种两嵌段聚合物PDEAEMA-b-PMMA和PPEGMA-b-PDEAEMA中的至少一种溶于有机溶剂中，然后在水溶液中自组装得到。
在其中一个实施例中，本发明的基于上述叔氨基的pH响应嵌段聚合物的混合胶束系统，由三嵌段聚合物mPEG-b-PDEAEMA-b-PMMA和两嵌段聚合物PDEAEMA-b-PMMA混合后溶解于有机溶剂中，在水溶液中自组装得到。
在其中一个实施例中，上述两种共聚物的质量比为1:1。
在其中一个实施例中，本发明的基于上述叔氨基的pH响应嵌段聚合物的混合胶束系统，由三嵌段聚合物mPEG-b-PDEAEMA-b-PMMA和两嵌段聚合物PPEGMA-b-PDEAEMA混合后溶解于有机溶剂中，在水溶液中自组装得到。
在其中一个实施例中，上述两种共聚物的质量比为1:1。
所述的有机溶剂优选为二甲基亚砜或二甲基甲酰胺。
本发明还提供上述混合胶束系统在生物医药领域中的应用，如疏水性药物的包载中，特别适用于制备包载疏水性抗癌药物。具体包括以下步骤：将基于上述叔氨基的pH响应嵌段聚合物溶于有机溶剂中得到混合胶束系统；将疏水性药物溶于相同的有机溶剂中，再与上述胶束系统混合，搅拌，透析，过滤，干燥，得到包载疏水性药物胶束系统。
所述的搅拌优选为4～6h。
所述的透析优选用去离子水透析48h，更优选地，透析过程中的前12h每2h换一次水，12～24h每4h时换一次水，24～48h每6h换一次水。
所述的疏水性药物是指在1L水中溶解度小于或者等于1g的药物。
所述的有机溶剂优选为二甲基亚砜或二甲基甲酰胺中。
本发明制备得到的包载疏水性药物胶束系统可控制包载的药物，在正常组织(pH7.4)下，胶束结构保持紧凑完好，胶束中所包载药物缓慢释放；在肿瘤细胞弱酸性条件(pH5～6)下，胶束中的叔氨基发生质子化作用，胶束发生解离，从而实现被包载药物的快速可控释放。这种pH响应嵌段聚合物结构的混合胶束可以有效的调控载药胶束的稳定性和药物包载量，提高治疗效率，可广泛应用于医药领域中。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
(1)本发明设计、合成得到三嵌段聚合物和两嵌段聚合物，可以通过聚合物中的PDEAEMA嵌段侧链的叔氨基响应环境pH的变化，实现聚合物载药胶束对所包载药物的控制释放，避免药物在达到病灶前大量突释，减少药物对正常组织的毒副作用。
(2)本发明聚合物形成的胶束可调节胶束中聚合物的比例，提高其对药物的包载能力和在体内血液循环过程中的稳定性。根据应用环境的不同，可调节胶束中的聚合物的比例，选择包载不同的药物并实现其可控释放。
(3)本发通过简易的方法制备简单结构的聚合物，减少聚合物合成过程中有机溶剂的使用量，降低以其制备的混合胶束对人体的毒副作用。
附图说明
图1为实施例1中的mPEG-Br的GPC洗脱曲线，流动相为四氢呋喃。
图2为实施例1中的mPEG-Br的1H NMR谱，溶剂为氘代氯仿。
图3为实施例2、3和4合成的聚合物的GPC洗脱曲线，流动相为四氢呋喃。
图4为实施例2、3和4中的合成的聚合物的1H NMR谱，溶剂为氘代氯仿。
图5为实施例5中的混合胶束的临界胶束浓度测试曲线。
图6为实施例6中的混合胶束的电位滴定曲线。
图7为实施例7中的混合胶束的粒径、zeta电位与pH的关系。
图8为实施例8中的混合胶束的透射电镜图。
图9为实施例9中的混合胶束的体外释放曲线。
图10为实施例10中混合胶束的体外细胞毒性。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例使用的试剂均可从商业渠道获得。
实施例1：大分子引发剂mPEG-Br的合成
合成反应式如下：
大分子引发剂mPEG-Br的合成：于250mL圆底反应瓶中装入磁力搅拌子，用反口橡皮塞封口，抽真空-通氩气三次，放置在冰水中。将0.15g(1.232mmol)DMAP(上海共价化学)和0.7mL(5.0mmol)TEA溶解于10mL二氯甲烷中，将溶液通过注射器加入到反应瓶中。将4g(0.8mmol)mPEG(Sigma-Aldrich)溶解在40mL二氯甲烷中，通过注射器将mPEG溶液注入反应瓶中。用注射器向反应瓶中逐滴滴加0.4mL(1.60mmol)BMPB(J&K，百灵威)，在1h内加完，保持0℃下反应2h，撤掉冰浴，继续在室温下反应24h。反应完成后分别用5wt％NaHSO4、Na2SO4萃取3次，然后再用蒸馏水洗涤3次，置于无水硫酸镁中干燥过夜。通过旋转蒸发除去大部分的溶剂，再将浓缩液缓慢滴入10倍体积的冷乙醚中沉淀，离心，离心得到的固体在35℃、35mbar下真空干燥48h得到mPEG-Br白色固体。利用GPC测定其分子量，并进行核磁分析，见图1和图2。产率为75％，Mn＝5204，Mw/Mn＝1.13。
实施例2：三嵌段聚合物mPEG-b-PDEAEMA-b-PMMA的合成
于50mL干燥茄形瓶中装入磁力搅拌子、26.8mg(0.12mmol)溴化铜和5.2g(1mmol)大分子引发剂mPEG-Br，用反口橡皮塞封口，抽真空-通氩气三次，依次用注射器注入将甲苯20mL、单体DEAEMA(4.02mL，20mmol)(J&K，百灵威)、配体HMTETA(0.31ml，1.2mmol)(J&K，百灵威)加入瓶中，搅拌10min使催化剂配合物形成。随后将0.486g(1.2mmol)还原剂Sn(Oct)2溶于2mL甲苯并加入反应瓶中。然后将反应瓶转移到60℃反应7h后，加入1.6mL(15mmol)单体MMA(J&K，百灵威)，继续反应12h。将反应液冷却至室温，加入50mL THF并搅拌使其溶解，然后用中性氧化铝柱子过滤除去催化剂CuBr2(以THF作洗脱剂)。得到的洗脱液浓缩后缓慢加入到十倍量(体积比)的冷正己烷中沉淀。沉淀产物在35℃、35mbar下真空干燥48h。利用GPC测定其分子量，并进行核磁分析，见图3和图4。产率为95％，Mn＝10151，Mw/Mn＝1.18。
合成反应式如下：
实施例3：三嵌段聚合物mPEG-b-PDEAEMA-b-PMMA的合成
于50mL干燥茄形瓶中装入磁力搅拌子、26.8mg(0.12mmol)溴化铜和6.24g(1.2mmol)大分子引发剂mPEG-Br，用反口橡皮塞封口，抽真空-通氩气三次，依次用注射器注入将甲苯20mL、单体DEAEMA(5.02mL，25mmol)(J&K，百灵威)、配体HMTETA(0.31ml，1.2mmol)(J&K，百灵威)加入瓶中，搅拌10min使催化剂配合物形成。随后将0.486g(1.2mmol)还原剂Sn(Oct)2溶于2mL甲苯并加入反应瓶中。然后将反应瓶转移到60℃反应7h后，加入2.13mL(20mmol)单体MMA(J&K，百灵威)，继续反应12h。将反应液冷却至室温，加入50mL THF并搅拌使其溶解，然后用中性氧化铝柱子过滤除去催化剂CuBr2(以THF作洗脱剂)。得到的洗脱液浓缩后缓慢加入到十倍量(体积比)的冷正己烷中沉淀。沉淀产物在35℃、35mbar下真空干燥48h。利用GPC测定其分子量，并进行核磁分析。产率为95％，Mn＝11171，Mw/Mn＝1.25。
实施例4：两嵌段聚合物PDEAEMA-b-PMMA的合成
合成反应式如下：
于50mL干燥茄形瓶中装入磁力搅拌子、26.8mg(0.12mmol)溴化铜和165μL(1mmol)大分子引发剂EBriB，用反口橡皮塞封口，抽真空-通氩气三次，依次用注射器注入将甲苯20mL、单体DEAEMA(5.02mL，25mmol)(J&K，百灵威)、配体HMTETA(0.31ml，1.2mmol)(J&K，百灵威)加入瓶中，搅拌10min使催化剂配合物形成。随后将0.486g(1.2mmol)还原剂Sn(Oct)2溶于2mL甲苯并加入反应瓶中。然后将反应瓶转移到60℃反应7h后，加入4.27mL(40mmol)单体MMA(J&K，百灵威)，继续反应12h。将反应液冷却至室温，加入50mL THF并搅拌使其溶解，然后用中性氧化铝柱子过滤除去催化剂CuBr2(以THF作洗脱剂)。得到的洗脱液浓缩后缓慢加入到十倍量(体积比)的冷正己烷中沉淀。沉淀产物在35℃、35mbar下真空干燥48h。利用GPC测定其分子量，并进行核磁分析，见图3和图4。产率为90％，Mn＝6835，Mw/Mn＝1.28。
实施例5：两嵌段聚合物PDEAEMA-b-PMMA的合成
于50mL干燥茄形瓶中装入磁力搅拌子、26.8mg(0.12mmol)溴化铜和198μL(1.2mmol)大分子引发剂EBriB，用反口橡皮塞封口，抽真空-通氩气三次，依次用注射器注入将甲苯20mL、单体DEAEMA(6.03mL，30mmol)(J&K，百灵威)、配体HMTETA(0.31ml，1.2mmol)(J&K，百灵威)加入瓶中，搅拌10min使催化剂配合物形成。随后将0.486g(1.2mmol)还原剂Sn(Oct)2溶于2mL甲苯并加入反应瓶中。然后将反应瓶转移到60℃反应7h后，加入4.8mL(45mmol)单体MMA(J&K，百灵威)，继续反应12h。将反应液冷却至室温，加入50mL THF并搅拌使其溶解，然后用中性氧化铝柱子过滤除去催化剂CuBr2(以THF作洗脱剂)。得到的洗脱液浓缩后缓慢加入到十倍量(体积比)的冷正己烷中沉淀。沉淀产物在35℃、35mbar下真空干燥48h。利用GPC测定其分子量，并进行核磁分析。产率为90％，Mn＝7936，Mw/Mn＝1.26。
实施例6：两嵌段聚合物PPEGMA-b-PDEAEMA的合成
合成反应式如下：
于50mL干燥茄形瓶中装入磁力搅拌子、26.8mg(0.12mmol)溴化铜和165μL(1mmol)大分子引发剂EBriB，用反口橡皮塞封口，抽真空-通氩气三次，依次用注射器注入将甲苯20mL、单体DEAEMA(6.03mL，30mmol)(J&K，百灵威)、配体HMTETA(0.31ml，1.2mmol)(J&K，百灵威)加入瓶中，搅拌10min使催化剂配合物形成。随后将0.486g(1.2mmol)还原剂Sn(Oct)2溶于2mL甲苯并加入反应瓶中。然后将反应瓶转移到60℃反应7h后，加入5.28mL(12mmol)单体PEGMA(J&K，百灵威)，继续反应12h。将反应液冷却至室温，加入50mL THF并搅拌使其溶解，然后用中性氧化铝柱子过滤除去催化剂CuBr2(以THF作洗脱剂)。得到的洗脱液浓缩后缓慢加入到十倍量(体积比)的冷正己烷中沉淀。沉淀产物在35℃、35mbar下真空干燥48h。利用GPC测定其分子量，并进行核磁分析，见图3和图4。产率为92％，Mn＝9231，Mw/Mn＝1.36。
实施例7：两嵌段聚合物PPEGMA-b-PDEAEMA的合成
于50mL干燥茄形瓶中装入磁力搅拌子、26.8mg(0.12mmol)溴化铜和165μL(1mmol)大分子引发剂EBriB，用反口橡皮塞封口，抽真空-通氩气三次，依次用注射器注入将甲苯20mL、单体DEAEMA(5.02mL，25mmol)(J&K，百灵威)、配体HMTETA(0.31ml，1.2mmol)(J&K，百灵威)加入瓶中，搅拌10min使催化剂配合物形成。随后将0.486g(1.2mmol)还原剂Sn(Oct)2溶于2mL甲苯并加入反应瓶中。然后将反应瓶转移到60℃反应7h后，加入4.4mL(10mmol)单体PEGMA(J&K，百灵威)，继续反应12h。将反应液冷却至室温，加入50mL THF并搅拌使其溶解，然后用中性氧化铝柱子过滤除去催化剂CuBr2(以THF作洗脱剂)。得到的洗脱液浓缩后缓慢加入到十倍量(体积比)的冷正己烷中沉淀。沉淀产物在35℃、35mbar下真空干燥48h。利用GPC测定其分子量，并进行核磁分析。产率为92％，Mn＝7263，Mw/Mn＝1.33。
实施例8：测定混合胶束的CMC值
利用荧光探针法测试实施例2产物分别与实施例4产物PDEAEMA-b-PMMA(混合胶束A)和实施例6产物PPEGMA-b-PDEAEMA (混合胶束B)混合的胶束的临界胶束浓度。
(1)芘溶液的配置：用丙酮溶解芘，配置浓度为12×10-5M的芘溶液。
(2)样品溶液的配置：称取mPEG-b-PDEAEMA-b-PMMA与PDEAEMA-b-PMMA各4mg，混合后溶于10mL丙酮中将溶液加入到80mL去离子水中，搅拌24h以挥发掉丙酮，得到浓度为0.1mg/mL的聚合物母液，稀释成一系列浓度(浓度范围为0.0001～0.1mg/mL；称取mPEG-b-PDEAEMA-b-PMMA与PPEGMA-b-PDEAEMA各4mg，混合后溶于10mL丙酮中将溶液加入到80mL去离子水中，搅拌24h以挥发掉丙酮，得到浓度为0.1mg/mL的聚合物母液，稀释成一系列浓度(浓度范围为0.0001～0.1mg/mL。取20支10mL容量瓶，分别加入0.1mL步骤(1)配置的芘溶液，然后分别加入上述不同浓度的共聚物溶液定容，摇匀，得到样品溶液。样品溶液中芘的浓度为12×10-7M。
(3)荧光光谱测试：以373nm为发射波长，在300～350nm扫描样品溶液的荧光激发光谱。取波长为338nm和336nm的强度比值(I338/I336)对聚合物浓度对数作图，如图5所示，曲线突变点所对应的横坐标即为lg(CMC)。测得混合胶束A和混合胶束B的临界胶束浓度分别为1.95mg/L和4.11mg/L。
实施例9：电位滴定法测定混合胶束的pKb区间
将实施例2制备的产物分别与实施例4和6的产物按照质量比1:1的比例混合30mg并充分溶解于30mL去离子水中，通过加入少许HCl溶液(0.1M)和超声的方法使聚合物溶解为浓度1mg/mL的聚合物溶液。用NaOH或HCl溶液(0.1M)调节胶束溶液的pH值约为3，搅拌平衡一段时间至pH稳定，选用NaOH(0.1M)作为滴定液，往聚合物溶液中逐滴加入，读取各pH值，如图6所示。聚合物溶液的pKb区间为6.5～7.4。
实施例10：混合胶束系统的pH响应自组装行为
将实施例2制备的产物分别与实施例4和6的产物按照质量比1:1的比例混合充分溶解于20mL丙酮中，在快速搅拌下快速加入到50mL去离子水中，室温下搅拌24h以挥发掉丙酮，制备最终浓度为0.1mg/mL的混合聚合物胶束溶液A和B。用NaOH或HCl溶液(0.1M)调节胶束溶液的pH值，搅拌平衡一段时间至pH稳定，读取此时的pH值。同时采用DLS测试不同pH值下胶束的粒径和zeta电位。由图7(a)可知，当pH>8时，PDEAEMA嵌段完全去质子化，分子链收缩并与PMMA共同组成胶束内核，使得胶束的结构非常紧密且基本保持稳定，因而改变pH对粒径的变化较小，只有小幅度的增大，且增大的主要原因可能是由于聚合物胶束的聚集。随着pH逐渐从7降至4，PDEAEMA的侧链叔氨基逐渐质子化，胶束内核亲水性增强，PDEAEMA伸展到溶液相中，胶束发生溶胀；另一方面，质子化的PDEAEMA链带较强的正电荷，分子链段间的静电排斥作用也会促进胶束的溶胀过程，因而胶束的粒径出现显著的增大。pH继续降低至小于4，粒径出现轻微的下降，表明由于PDEAEMA嵌段完全质子化，聚合物链间极强的静电排斥作用引起胶束聚集数的减少，甚至导致胶束结构的轻微解离。且从图中可以看出，混合胶束A和混合胶束B表现出相同的变化趋势。从整体上看，混合胶束A的粒径略大于混合胶束B的粒径，主要原因是由于混合胶束A中PMMA嵌段的长度大于混合胶束B中的PMMA嵌段长度，进而导致的胶束内核略大，所以粒径略大。由图7(b)可知，zeta电位表现出与粒径几乎相同的变化趋势。随着pH逐渐降低，由于DEAEMA逐渐发生质子化，并最终完全变为亲水状态，zeta电位从接近负电荷逐渐升高到强正电荷，当pH<4时会有略微的下降。当pH>8时，相较于粒径由于聚集而变大，zeta电位仍然表现出继续下降的趋势。pH对混合胶束A和混合胶束B的zeta电位的影响，表现出一致的趋势。
实施例11：混合载药胶束系统形貌表征
制备单组分载药胶束和混合载药胶束，并表征形貌。采用透析法制备载药胶束。准确称取15mg阿霉素(DOX)溶于20mL DMSO中，加入2倍摩尔量的TEA 20μL，搅拌过夜。同时称取30mg实施例2产物分别与实施例4和6产物按照1:1比例的混合物溶于20mL DMSO中。将两者混合室温下搅拌4～6h，然后用去离子水透析48h(前12h每2h换一次水，12～24h每4h换一次水，24～48h每6h换一次水)，再用0.45μm过滤头过滤，冷冻干燥，得到DOX载药单组分胶束和混合载药胶束粉末。采用TEM观察其形貌为球形，如图8所示。
实施例12：混合载药胶束的体外释放性能测试
基于叔氨基的pH响应嵌段聚合物混合载药胶束的体外释放性能采用药物溶出仪和紫外测定。具体步骤如下：分别精确称取5mg DOX混合载药胶束(实施例11中制备)分散在5mL缓冲液(pH 7.4、pH 6.5、pH 5.0)中，然后置于透析袋中，转入45mL相同pH值的缓冲液中置于药物溶出仪在37℃，110rpm转速下进行体外释放，定时取4mL袋外的缓冲液进行分析，并加入4mL新鲜缓冲液。用紫外分光光度法测定不同时间释放液中DOX浓度，绘制其体外释放曲线。
由图9可知，在正常生理条件(pH 7.4)下，由于胶束结构比较紧凑，12h混合胶束和单组分胶束均只释放10％左右的DOX，随后释放速率基本不变，96h的累积DOX释放量少于25％。表明载药胶束中的药物很好的被保护，减少DOX在血液循环条件下的释放，降低DOX对正常组织的毒性。在肿瘤细胞外间隙的微酸性(pH 6.5)条件下，PDEAEMA的侧链叔氨基发生部分质子化，部分胶束发生溶胀，这种略松散的胶束结构不会导致DOX急剧释放，因而DOX的释放速率仅有一定程度的加快。在酸性更强(pH 5.0)的肿瘤细胞内环境，几乎所有的PDEAEMA侧链叔氨基都发生了质子化，胶束内核的疏水性急剧下降，PDEAEMA链段间的静电排斥作用急剧增大，引起胶束溶胀程度的显著提高，甚至于部分胶束发生解离，因而DOX的释放速率明显加快。
实施例13：混合载药胶束和空白胶束的体外细胞毒性评价
评价基于叔氨基的pH响应嵌段聚合物混合载药胶束和空白胶束(实施例11中制备)体外细胞毒性。取96孔平底组织培养板，将四周孔板中分别加入200μL细胞培养基(DMEM)作为空白组。中间60个孔中每孔以1×104细胞/ 孔(200μL)的细胞浓度接种HepG2细胞(购于ATCC，USA)，其中第2列作为对照，将96孔板放置到37℃，饱和湿度，5％CO2培养箱中培养24h。随后将游离阿霉素、冻干的空白或载药胶束用细胞培养介质稀释成不同的聚合物浓度(空白胶束1～400mg/L)或药物浓度(游离阿霉素或载阿霉素胶束，0.1～20mg/L)。在移走96孔板中从第2列到第11列所有孔中的细胞培养介质后，在第2列中加入新鲜的培养介质，作为对照。从第3列到第10列，向所有的孔中分别加入200μL的样品溶液，每个浓度的样品加入到6个孔中进行重复。
在经过24h或者48h的培养后，吸走所有含有细胞的孔中的上清液，加入200μL的PBS润洗细胞，然后吸走PBS。从第2列到第11列，分别向每个孔中加入20μL的MTT溶液和180μL的培养介质，然后将96孔板放置于培养箱中培养4h。随后吸走未还原的MTT溶液和培养介质。每个孔用200μL的PBS洗一遍，并吸走PBS。向每个孔中加入200μL的DMSO溶解MTT结晶。整个96孔板放在37℃摇床中振荡10min，然后利用酶标仪测定490nm处每个孔的吸光度，进而计算细胞存活率。
从图10(a)中可知，空白胶束对HepG2细胞没有明显的毒性作用。随着胶束浓度的增加，毒性略有增加，但是在最高浓度(400mg/L)下，HepG2细胞在经过48h培养后的细胞存活率仍超过85％，表明两种聚合物胶束均具有良好的生物相容性，毒性很低。由图10(b)和(c)可知，无论是经过24h还是48h，游离阿霉素的抗癌活性均优于混合聚合物胶束，因为阿霉素由聚合物胶束中释放出来是一个持续的过程，而游离的阿霉素则可以快速的作用于癌细胞，而且根据体外释放数据曲线可知，即使是48h，游离阿霉素仍然不能完全从聚合物胶束中释放出来。混合胶束体A和混合胶束B具有类似的电荷负载量，因此细胞摄取作用效率基本相当，但是由于混合胶束A含有较少的亲水基团包裹在聚合物胶束的外层，因而在24h的时候可以明显的看到混合胶束A的细胞存活率低于混合胶束B，。但是在48h时候基本没有太大差距，是由于在48h的时候，两种混合胶束体系中的大部分阿霉素均已经释放，因而细胞的存活率很接近。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.基于叔氨基的pH响应嵌段聚合物，其特征在于包括一种三嵌段聚合物mPEG-b-PDEAEMA-b-PMMA和两种两嵌段聚合物PDEAEMA-b-PMMA和PPEGMA-b-PDEAEMA中的至少一种；
一种三嵌段聚合物mPEG-b-PDEAEMA-b-PMMA，具有下式所示结构：
其中n＝100～130，x＝10～20，y＝15～25；
一种两嵌段聚合物PDEAEMA-b-PMMA，具有下式所示结构：
其中x＝35～45，y＝20～30；
一种两嵌段聚合物PPEGMA-b-PDEAEMA，具有下式所示结构：
其中x＝8～12，y＝20～30，z＝6～10。
2.根据权利要求1所述的基于叔氨基的pH响应嵌段聚合物，其特征在于：所述三嵌段聚合物mPEG-b-PDEAEMA-b-PMMA的数均分子量为9335～11771g/mol；
所述两嵌段聚合物PDEAEMA-b-PMMA的数均分子量为6276～7936g/mol；
所述两嵌段聚合物PPEGMA-b-PDEAEMA的数均分子量为5276～9231g/mol。
3.一种权利要求1～2任一项所述的基于叔氨基的pH响应嵌段聚合物的制备方法，其特征在于：各反应物的量以摩尔份数计，
(1)三嵌段聚合物mPEG-b-PDEAEMA-b-PMMA的制备方法，包括以下具体步骤：
1)制备大分子引发剂：将1.54～1.74份催化剂、1～2份聚乙二醇单甲醚溶于溶剂中，再加入2～4份缚酸剂搅拌均匀，逐滴加入1.5～3份溴化剂，室温下反应，得到大分子引发剂；
2)制备pH响应三嵌段聚合物：将0.8～1.2份步骤1)制备得到的大分子引发剂、15～25份单体甲基丙烯酸N,N-二乙氨基乙酯、0.08～0.12份催化剂、0.8～1.2份配体1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺溶于溶剂中，再加入0.8～1.2份还原剂，加热反应后，再加入10～20份单体甲基丙烯酸甲酯，恒温反应，得到pH响应三嵌段聚合物mPEG-b-PDEAEMA-b-PMMA；
(2)两嵌段聚合物PDEAEMA-b-PMMA的制备方法，包括以下具体步骤：
将0.8～1.2份小分子引发剂、20～30份单体甲基丙烯酸N,N-二乙氨基乙酯、0.08～0.12份催化剂、0.8～1.2份配体1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺溶于溶剂中，再加入0.8～1.2份还原剂，加热反应后，再加入35～45份单体甲基丙烯酸甲酯，恒温反应，得到pH响应两嵌段聚合物PDEAEMA-b-PMMA；
(3)两嵌段聚合物PPEGMA-b-PDEAEMA的制备方法，包括以下具体步骤：
将0.8～1.2份小分子引发剂、20～30份单体甲基丙烯酸N,N-二乙氨基乙酯、0.08～0.12份催化剂、0.8～1.2份配体1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺溶于溶剂中，再加入0.8～1.2份还原剂，加热反应后，再加入8～12份单体甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯，恒温反应，得到pH响应两嵌段聚合物PPEGMA-b-PDEAEMA。
4.根据权利要求3所述的基于叔氨基的pH响应嵌段聚合物的制备方法，其特征在于：(1)三嵌段聚合物mPEG-b-PDEAEMA-b-PMMA的制备方法中，步骤1)中所述的室温反应时间为12～36h；所述的催化剂为4-二甲氨基吡啶；所述的缚酸剂为三乙胺；所述的溴化剂为2-溴异丁酰溴；步骤2)中所述的催化剂为CuBr2；所述的还原剂为Sn(Oct)2；所述的加热反应的条件为加热至60～90℃，反应5～10h；所述的恒温反应的时间为5～10h。
5.根据权利要求3所述的基于叔氨基的pH响应嵌段聚合物的制备方法，其特征在于：(2)两嵌段聚合物PDEAEMA-b-PMMA的制备方法中，所述的小分子引发剂为EBriB；所述的催化剂为CuBr2；所述的还原剂为Sn(Oct)2；所述的加热反应的条件为加热至60～90℃，反应5～10h；所述的恒温反应的时间为5～10h。
6.根据权利要求3所述的基于叔氨基的pH响应嵌段聚合物的制备方法，其特征在于：(3)两嵌段聚合物PPEGMA-b-PDEAEMA的制备方法中，所述的小分子引发剂为EBriB；所述的催化剂为CuBr2；所述的还原剂为Sn(Oct)2；所述的加热反应的条件为加热至60～90℃，反应5～10h；所述的恒温反应的时间为5～10h。
7.一种基于权利要求1～2任一项所述的基于叔氨基的pH响应嵌段聚合物的混合胶束系统，其特征在于由所述三嵌段聚合物mPEG-b-PDEAEMA-b-PMMA，以及两种两嵌段聚合物PDEAEMA-b-PMMA和PPEGMA-b-PDEAEMA中的至少一种溶于有机溶剂中，然后在水溶液中自组装得到。
8.根据权利要求7所述的混合胶束系统，其特征在于：
由所述三嵌段聚合物mPEG-b-PDEAEMA-b-PMMA和两嵌段聚合物PDEAEMA-b-PMMA混合后溶解于有机溶剂中，在水溶液中自组装得到；所述两种共聚物的质量比为1:1；
或者由所述三嵌段聚合物mPEG-b-PDEAEMA-b-PMMA和两嵌段聚合物PPEGMA-b-PDEAEMA混合后溶解于有机溶剂中，在水溶液中自组装得到；所述两种共聚物的质量比为1:1。
9.权利要求7～8任一项所述的混合胶束系统在生物医药领域中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于具体包括以下步骤：将权利要求1～2任一项所述的基于叔氨基的pH响应嵌段聚合物溶于有机溶剂中得到混合胶束系统；将疏水性药物溶于相同的有机溶剂中，再与上述胶束系统混合，搅拌，透析，过滤，干燥，得到包载疏水性药物胶束系统。
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