CN103588749A - 一种新型甲基丙烯酰胺单体及其pH敏感聚阳离子基因载体的制备方法和应用 - Google Patents

一种新型甲基丙烯酰胺单体及其pH敏感聚阳离子基因载体的制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种新型甲基丙烯酰胺单体及其pH敏感聚阳离子基因载体的合成方法及其基因传递应用，属于聚合物载体和缓控释材料技术领域。该聚阳离子载体携带正电荷，能够与DNA有效复合形成纳米粒子，细胞毒性小，在微酸性环境中降解，可促使复合物从内涵体逃逸，提高体内或体外基因转染效率，是一种新型的pH敏感聚阳离子基因载体，在基因治疗领域将具有良好的应用前景。

Description

一种新型甲基丙烯酰胺单体及其pH敏感聚阳离子基因载体的制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种侧链含原酸酯基团的新型酸敏感聚合物的合成方法及其基因传递，属于聚合物载体与缓控释材料技术领域。
背景技术
近年来，现代医学与分子生物学迅速发展，基因治疗作为治疗疾病的新手段，成为目前最具潜力的生物疗法之一。用于基因治疗的载体主要有两类：病毒载体和非病毒载体。病毒载体转染效率高，对大多细胞都有靶向作用，已得到广泛应用；然而，由于其自身免疫原性、可能存在的致癌性、制备复杂、费用较高等缺点限制了其应用。与病毒载体相比，非病毒载体具有诸多优势：低毒性、低免疫原性、目的基因容量较大、制备简单、可用于大规模生产等，受到越来越多的研究者们的重视。其中，聚阳离子基因载体因其独特的优势成为研究的热点。
目前用于基因载体的阳离子聚合物有多肽类：聚赖氨酸（PLL）、聚谷氨酸及其衍生物；多聚胺类：聚乙烯亚胺（PEI）、聚丙烯亚胺树状物（PPI）；聚甲基丙烯酸类：聚酰胺-胺型树状物（PAMAM）、聚甲基丙烯酸乙酯-2-（二甲胺）（pDMAEM）；阳离子聚磷酸酯（PPE）；聚乙烯吡啶盐；脱乙酰壳聚糖、明胶等。但是这些聚合物基因转染效率相对较低，PEI25KDa是目前基因转染效率最高的聚阳离子基因载体，然而其毒性较大，不能被生物降解以及在体内的滞留时间较长。
在基因治疗中，具治疗作用的DNA片段必须定位于细胞核才能发挥其治疗作用，因此，基因载体在到达作用部位的过程中，需克服细胞膜屏障、内涵体逃逸以及进入细胞核等传递障碍。内涵体pH约为5，肿瘤细胞微环境呈弱酸性，因此，许多pH敏感或酸敏感的基因载体期望利用此pH特征促进内涵体逃逸，提高基因转染效率。目前，pH敏感的基因载体有β-氨酯、缩醛、缩酮、乙烯基醚、原酸酯等，相比较而言，原酸酯基元在微酸性条件下降解速率可控。
发明内容
本发明的目的是提供一种简单、经济、高效的制备聚阳离子基因载体及复合物的合成方法，并应用于基因传递领域。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种新型甲基丙烯酰胺单体，所述的新单体是N-（（2-（2-二甲基氨基）乙氧基）-[1，3]-二噁烷-4-亚甲基）甲基丙烯酰胺，其结构如化学式Ⅰ所示：
Figure BDA0000404580140000021
一种新型甲基丙烯酰胺单体的制备方法，包括以下步骤：氮气保护下，将甲基丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯、4-氨基甲基-2-N,N-二甲基氨基乙氧基-[1,3]-二噁烷及有机溶剂混合均匀，其投料摩尔比为（0.8-2.0）:1：（1-1000），在0-25℃下反应24-48小时，粗产物经硅胶柱层析分离得到纯化合物甲基丙烯酰胺原酸酯单体：N-((2-(2-二甲基氨基)乙氧基)-[1,3]-二噁烷-4-亚甲基)甲基丙烯酰胺。
一种新型甲基丙烯酰胺单体的制备方法，所述的有机溶剂为乙腈、丙酮、N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、二氧六环、苯、甲苯、对二甲苯中的一种或者混配体系。
一种新型甲基丙烯酰胺单体制备的侧链含原酸酯基元的阳离子聚合物，其结构如化学式Ⅱ所示：
Figure BDA0000404580140000022
n表示数值20-120。
一种所述的新型甲基丙烯酰胺单体制备的侧链含原酸酯基元的阳离子聚合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：将甲基丙烯酸原酸酯类单体（化学式Ⅰ）、引发剂及N，N-二甲基甲酰胺准确称量放入干燥洁净的玻璃聚合管中，其投料摩尔比为（20-200）:1：（1:1000），通氮气脱氧28-31分钟后封管，然后聚合管被放入60-80℃的油浴中聚合，4-24小时反应终止，待体系冷却至室温后，将反应物溶解于N，N-二甲基甲酰胺，在透析袋中24-72小时，然后冷冻干燥48小时，得到白色絮状物质，即目标聚合物。
一种新型甲基丙烯酰胺单体制备的侧链含原酸酯基元的阳离子聚合物的制备方法，其特征在于：所述的引发剂是2，2-偶氮二异丁氰。
一种新型甲基丙烯酰胺单体制备的侧链含原酸酯基元的阳离子聚合物的制备方法，其特征在于：透析袋的截留分子量为3500。
一种新型甲基丙烯酰胺单体制备的侧链含原酸酯基元的阳离子聚合物在基因传递中的应用，其特征在于，侧链含原酸酯基团的阳离子聚合物（化学式II）在转染中作为基因传递载体，所述的质粒DNA（基因）为pEGFP。
本发明的优点是：
1.合成的单体及聚合物具有良好的水溶性。
2.合成的单体含有酸敏感型基团——原酸酯键，由其进一步反应得到的聚合物与DNA作用所得复合物能够从偏酸性环境的内涵体中逃逸出来，可能会实现基因转染效率方面的突破。
3.合成的聚合物含具有缓冲能力的三级氨基，具有“质子海绵作用”，促进内涵体逃逸，提高基因转染效率。
附图说明
图1是实施例1所制备的N-（（2-（2-二甲基氨基）乙氧基）-[1，3]-二噁烷-4-亚甲基）甲基丙烯酰胺单体的1H-NMR及13C-NMR谱图。
图2是实施例4所制备聚合物的1H-NMR谱图。
图3是实施例2-4所制备聚合物的GPC谱图（Waters1512；流动相为DMF；PEG为标样；进样量100μl；流速1ml/min；温度为50℃）。
图4是实施例5所制备的复合物的琼脂糖凝胶电泳图。
图5是实施例5所制备的复合物与DNaseⅠ作用后的琼脂糖凝胶电泳图。
图6是DNA和肝素竞争作用于聚合物的琼脂糖凝胶电泳图。
图7是DNA和EB竞争作用于聚合物的N/P比与相对荧光强度的关系图。
图8是实施例5所制备的复合物的N/P比与粒径和电势的关系图。
图9是实施例8所制备的复合物于不同pH条件下孵育一定时间后的琼脂糖凝胶电泳图。
图10是实施例2所制备的聚合物于不同pH条件下孵育一定时间的降解情况结果。
图11是实施例3所制备的聚合物于不同pH条件下孵育一定时间的降解情况结果。
图12是实施例4所制备的聚合物于不同pH条件下孵育一定时间的降解情况结果。
图13是实施例2-4所制备的聚合物与人肾上皮细胞（293细胞）共培养24h的细胞毒性结果。
图14是实施例2-4所制备的聚合物与非洲绿猴肾成纤维细胞（COS-7）共培养24h的细胞毒性结果。
图15是实施例2-4所制备的聚合物介导绿色荧光蛋白质粒（pEGFP-N1）与人肾上皮细胞（293细胞）体外转染24h后的荧光倒置显微镜下拍照结果。
图16实施例2-4所制备的聚合物介导绿色荧光蛋白质粒（pEGFP-N1）与人肾上皮细胞（COS-7细胞）体外转染24h后的荧光倒置显微镜下拍照结果。
图17是实施例2-4所制备的聚合物介导绿色荧光蛋白质粒（pEGFP-N1）对人肾上皮细胞（293细胞）的体外转染结果。
图18是实施例2-4所制备的聚合物介导绿色荧光蛋白质粒（pEGFP-N1）对非洲绿猴肾成纤维细胞（COS-7）的体外转染结果。
具体实施方式
实施例1
N-（（2-（2-二甲基氨基）乙氧基）-[1，3]-二噁烷-4-亚甲基）甲基丙烯酰胺的制备
氮气氛下，向250毫升二口瓶中加入1.83g（9.99mmol）甲基丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯及25毫升乙腈，搅拌溶解后，再加入2.00g（10.51mmol）4-氨基甲基-2-N，N-二甲基氨基乙氧基-[1，3]-二噁烷、50毫升乙腈及1.06g（10.51mmol）三乙胺，室温避光搅拌反应24小时后，粗产物硅胶柱层析分离（淋洗液：丙酮/二氯甲烷，体积比为1：19，含少量三乙胺）得到淡黄色油状产物1.56g，产率是50%。1H NMR（400MHz，CDCl3）：δ（ppm）1.98（s，3H，C-CH3），2.24-2.27（d，6H，CH3-N-CH3），2.50-2.54（q，2H，N-CH2），3.38-3.59（m，2H，NH-CH2），3.60-3.72（m，2H，N-CH2-CH2），3.78-4.18（m，2H，O-CH2-CH），4.39-4.51（m，1H，O-CH-CH2），5.34-5.74（q，2H，C=CH2），5.82-5.89（d，1H，CH-O-CH2），6.12-7.22（b，1H，NH）。13C NMR（CDCl3，δppm）：18.62，40.68，41.34，45.63，58.56，62.33，62.89，65.21，66.02，74.34，75.41，76.83，77.15，77.47，115.20，115.84，119.33，119.82，139.71，140.14，168.73，169.39。ESI-MS Calcd for（C12H22N2O4），258.3；found m/z，259.1（M+H+），281.1（M+Na+）。
实施例2
将0.50g（1.94mmol）N-（（2-（2-二甲基氨基）乙氧基）-[1，3]-二噁烷-4-亚甲基）甲基丙烯酰胺、6.4mg（0.039mmol）2，2-偶氮二异丁氰准确称量放入干燥洁净的玻璃聚合管中，最后加入5毫升N，N-二甲基氨基和少量三乙胺。聚合物通氮气连续鼓泡脱气30分钟后封管，随后聚合反应管被放入70℃油浴中加热聚合，反应18小时后，待体系冷却至室温后，将反应混合物用少量N-二甲基氨基稀释，在截留分子量为3500的透析袋中48小时，然后冷冻干燥48小时，得到白色絮状物质，即目标聚合物P1，该聚合物的性质见表1。
实施例3
将0.50g（1.94mmol）N-（（2-（2-二甲基氨基）乙氧基）-[1，3]-二噁烷-4-亚甲基）甲基丙烯酰胺、3.18mg（0.0194mmol）2，2-偶氮二异丁氰及0.20g（1.94mmol）三乙胺准确称量放入干燥洁净的玻璃聚合管中，最后加入2毫升N，N-二甲基氨基。聚合物通氮气连续鼓泡脱气30分钟后封管，随后聚合反应管被放入70℃油浴中加热聚合，反应24小时后，待体系冷却至室温后，将反应混合物用少量N-二甲基氨基稀释，在截留分子量为3500的透析袋中72小时，然后冷冻干燥48小时，得到白色絮状物质，即目标聚合物P2，该聚合物的性质见表1。
实施例4
将0.50g（1.94mmol）N-（（2-（2-二甲基氨基）乙氧基）-[1，3]-二噁烷-4-亚甲基）甲基丙烯酰胺、1.59mg（0.00968mmol）2，2-偶氮二异丁氰及0.20g（1.94mmol）三乙胺准确称量放入干燥洁净的玻璃聚合管中，最后加入2毫升N，N-二甲基氨基。聚合物通氮气连续鼓泡脱气30分钟后封管，随后聚合反应管被放入70℃油浴中加热聚合，反应24小时后，待体系冷却至室温后，将反应混合物用少量N-二甲基氨基稀释，在截留分子量为3500的透析袋中72小时，然后冷冻干燥48小时，得到白色絮状物质，即目标聚合物P3，该聚合物的性质见表1。
表1
实施例5
Polycations/DNA复合物的制备
配制不同浓度的聚合物溶液；按照一定的N/P，将一定溶度的聚合物溶液50μl加入到等体积的质粒DNA溶液（0.1μg/μl）中，涡旋振荡10s，室温复合30min，得到polycations/DNA复合物。
实施例6
聚阳离子压缩DNA能力的考察通过下述步骤实现：
1）琼脂糖凝胶电泳实验
按照实施例5中描述的方法制备polycations/DNA复合物，每个样品中质粒DNA的量为5μg。分别取10μl不同复合比，一定复合时间的polycations/DNA复合物与2μl6×Loading buffer混合均匀，再取5μl质粒DNA溶液与1μl6×Loading buffer混合均匀，将样品小心加入已制备的1%琼脂糖凝胶中，在1×TAE缓冲溶液中进行电泳实验。电压为100V，常温电泳40min，关闭电源，将凝胶置于EB染液（其浓度为0.5μg/ml）中染色10min，然后在紫外灯下观察DNA条带，由凝胶成像系统记录结果（图4）。
2）DNaseⅠ降解实验
取1μl DNaseⅠ（稀释800倍）及10μl buffer溶液分别加入到90μl不同N/P比的polycations/DNA复合物中，摇匀，室温下静置10min，然后分别取10μl体系溶液与2μl6×Loading Buffer混合均匀，将样品小心加入已制备的1%琼脂糖凝胶中，在1×TAE缓冲溶液中进行电泳实验。电压为100V，常温电泳40min，关闭电源，将凝胶置于EB染液（其浓度为0.5μg/ml）中染色10min，然后在紫外灯下观察DNA条带，由凝胶成像系统记录结果（图5）。
3）肝素置换实验
制备N/P=8的polycations/DNA复合物（PEI、P1、P2、P3），其中DNA含量为5μg。复合30min后，在样品中加入10μl0-0.05IU/μl的肝素溶液，涡旋10s后静置30min，通过琼脂糖凝胶电泳实验观察释放出的DNA条带，通过凝胶电泳成像仪记录实验结果（图6）。
4）EB排阻实验
按照实施例5中描述的方法制备不同N/P（1:8-16:1）的polycations/DNA复合物，每个样品中质粒DNA的量为10μg。分别取不同N/P的polycations/DNA复合物200μl于96孔板中，分别设立三个平行组；每孔加1μl EB溶液（1%），轻轻振荡后，测定其相对荧光强度（激发波长Ex：520nm，发射波长Em：620nm），以DNA与EB混合后的荧光强度作为100%（图7）。
从实验结果可以看出，聚合物P1、P2、P3都能够有效地与DNA复合，且在N/P为1时可以完全复合，与PEI相比具有更好的压缩DNA的能力。
实施例7
复合物粒径和电势的测量
复合物粒径和电势通过马尔文粒度仪（Malvern Zetasizer Nano ZS）测量。按照实施例5中描述的方法制备不同N/P（1:8-16:1）的polycations/DNA复合物，每个样品中质粒DNA的量为5μg。测量之前用HEPES（20mM，pH=7.4）将复合物稀释10倍，使其终体积为1ml。
从图8可以看出，复合物随着N/P的不同，平均粒径在100～320nm之间变化；PDI在0.20-0.50。N/P为1:1时，三种复合物的粒径稳定在220～310nm之间，随着N/P的增加或降低，复合物的粒径均不同程度的降低。在N/P为1:1时，复合物的电位在0附近，此时，聚合物与DNA完全复合，随着N/P的增加，复合物的电位稳定在31.45±7.12mV范围内。
实施例8
复合物稳定性测定
制备N/P=8:1的polycations/DNA的复合物，复合物体积为100μl，其中DNA含量为5μg。向复合物中分别加入100μl不同pH（pH=7.4，6，5，4）的缓冲液，于不同时间点用凝胶电泳实验检测DNA条带的释放，并通过凝胶电泳成像仪记录实验结果（图9）。
实施例9
聚合物稳定性测定
将聚合物P1、P2、P3分别溶解于不同pH的氘代缓冲液（100mM，pH=7.4，6，5，4）中，使聚合物溶液浓度为5mg/ml，通过核磁共振仪（Bruker Advance-400）于不同时间点检测其1H-NMR，观察聚合物的降解情况，并以化学位移5.86处的原酸酯峰“a”为特征峰，化学位移8.30和8.10处分别为原酸酯降解产物甲酯质子峰“b”、甲酸质子峰“c”（图10、11、12）。
实施例10
聚合物的细胞（293细胞）毒性评价
293细胞（10000个/孔）接种于96孔板中，在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养24h，细胞融合度为60-80%。将PEI25KDa、P1-P3聚合物溶液加入上述已经接种、培养293细胞的96孔板中，继续培养24h。每孔加MTT溶液（5mg/ml；用PBS配制，pH=7.4；用0.22μm的微孔滤膜过滤，避光）20μl，4h后吸去培养液，每孔加入150μl DMSO，将96孔板置于振荡器上振荡10min，使结晶物甲臜充分溶解，在酶标仪上，于570nm测定OD值。按一下公式计算细胞存活率：细胞存活率=（ODsample–ODblank)/(ODuntreated cells–ODblank)×100%。从图13可以看出，实验组（聚合物P1-P3）293细胞的存活率相比于对照组（PEI25KDa）明显增大，证明聚合物P1-P3相比PEI细胞毒性小，具有更好的安全性。
实施例11
聚合物的细胞（COS-7细胞）毒性评价
COS-7细胞（10000个/孔）接种于96孔板中，在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养24h，细胞融合度为60-80%。将PEI25KDa、P1-P3聚合物溶液加入上述已经接种、培养COS-7细胞的96孔板中，继续培养24h。每孔加MTT溶液（5mg/ml；用PBS配制，pH=7.4；用0.22μm的微孔滤膜过滤，避光）20μl，4h后吸去培养液，每孔加入150μl DMSO，将96孔板置于振荡器上振荡10min，使结晶物甲臜充分溶解，在酶标仪上，于570nm测定OD值。按一下公式计算细胞存活率：细胞存活率=（ODsample–ODblank)/(ODuntreated cells–ODblank)×100%。从图14可以看出，实验组（聚合物P1-P3）COS-7细胞的存活率相比于对照组（PEI25KDa）明显增大，证明聚合物P1-P3相比PEI细胞毒性小，具有更好的安全性。
实施例12
聚合物介导绿色荧光蛋白质粒（pEGFP-N1）对人肾上皮细胞（293细胞）的体外转染
（1）293细胞的培养
将293细胞置于含有体积分数为10％胎牛血清（FBS）的DMEM培养液中，于37℃、5％CO2及饱和湿度的培养箱中连续培养。
（2）体外转染
转染前24h，取对数生长期的293细胞，用0.25％胰蛋白酶消化后，用含有10％FBS的DMEM培养液吹打成均匀的单细胞悬液，按每孔50000个细胞接种到12孔培养板中，每孔体积为1ml。将培养板放入CO2培养箱中，在37℃、5％CO2及饱和湿度条件下，培养24小时，使细胞融合度达到80%-90%。转染时，弃去细胞正常培养基，用PBS润洗两遍，换上1ml无血清培养基；每孔加入实施例5制备的复合物50μl，PEI25KDa与绿色荧光蛋白质粒的复合物作为对照，用荧光素酶质粒（pGL-3）与各聚合物的复合物排除细胞自身荧光。细胞与复合物共培养4h后，更换培养板中的培养基为含10%FBS的DMEM完全培养基，继续培养20h。
（3）体外转染观测与检测
取出培养板，将其置于荧光倒置显微镜下观察转染效果，并拍照记录，见图15；然后用流式细胞仪测定转染效率，见图17；说明聚合物在N/P为16时转染效率最高，可以作为基因载体在体外细胞内实现转染。
实施例13
聚合物介导绿色荧光蛋白质粒（pEGFP-N1）对非洲绿猴肾成纤维细胞（COS-7）的体外转染
（1）COS-7细胞的培养
将COS-7细胞置于含有体积分数为10％胎牛血清（FBS）的DMEM培养液中，于37℃、5％CO2及饱和湿度的培养箱中连续培养。
（2）体外转染
转染前24h，取对数生长期的COS-7细胞，用0.25％胰蛋白酶消化后，用含有10％FBS的DMEM培养液吹打成均匀的单细胞悬液，按每孔50000个细胞接种到12孔培养板中，每孔体积为1ml。将培养板放入CO2培养箱中，在37℃、5％CO2及饱和湿度条件下，培养24小时，使细胞融合度达到80%-90%。转染时，弃去细胞正常培养基，用PBS润洗两遍，换上1ml无血清培养基；每孔加入实施例5制备的复合物50μl，PEI25KDa与绿色荧光蛋白质粒的复合物作为对照，用荧光素酶质粒（pGL-3）与各聚合物的复合物排除细胞自身荧光。细胞与复合物共培养4h后，更换培养板中的培养基为含10%FBS的DMEM完全培养基，继续培养20h。
（3）体外转染观测与检测
取出培养板，将其置于荧光倒置显微镜下观察转染效果，并拍照记录，见图16；然后用流式细胞仪测定转染效率，见图18；说明聚合物在N/P为16时转染效率最高，可以作为基因载体在体外细胞内实现转染。

Claims (8)

1.一种新型甲基丙烯酰胺单体，其特征在于所述的新单体是N-（（2-（2-二甲基氨基）乙氧基）-[1，3]-二噁烷-4-亚甲基）甲基丙烯酰胺，其结构如化学式Ⅰ所示： 
。
2.一种如权利要求1所述的新型甲基丙烯酰胺单体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：氮气保护下，将甲基丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯、4-氨基甲基-2-N,N-二甲基氨基乙氧基-[1,3]-二噁烷及有机溶剂混合均匀，其投料摩尔比为（0.8-2.0）:1：（1-1000），在0-25℃下反应24-48小时，粗产物经硅胶柱层析分离得到纯化合物甲基丙烯酰胺原酸酯单体：N-((2-(2-二甲基氨基)乙氧基)-[1,3]-二噁烷-4-亚甲基)甲基丙烯酰胺。 
3.根据权利要求2所述的一种新型甲基丙烯酰胺单体的制备方法，其特征在于：所述的有机溶剂为乙腈、丙酮、N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、二氧六环、苯、甲苯、对二甲苯中的一种或者混配体系。 
4.一种由权利要求1所述的新型甲基丙烯酰胺单体制备的侧链含原酸酯基元的阳离子聚合物，其结构如化学式Ⅱ所示： 
Figure FDA0000404580130000012
n表示数值20-120。 
5.一种如权利要求4所述的由权利要求1所述的新型甲基丙烯酰胺单体制 备的侧链含原酸酯基元的阳离子聚合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：将甲基丙烯酸原酸酯类单体（化学式Ⅰ）、引发剂及N，N-二甲基甲酰胺准确称量放入干燥洁净的玻璃聚合管中，其投料摩尔比为（20-200）:1：（1:1000），通氮气脱氧28-31分钟后封管，然后聚合管被放入60-80℃的油浴中聚合，4-24小时反应终止，待体系冷却至室温后，将反应物溶解于N，N-二甲基甲酰胺，在透析袋中24-72小时，然后冷冻干燥48小时，得到白色絮状物质，即目标聚合物。 
6.根据权利要求5所述的由权利要求1所述的一种新型甲基丙烯酰胺单体制备的侧链含原酸酯基元的阳离子聚合物的制备方法，其特征在于：所述的引发剂是2，2-偶氮二异丁氰。 
7.根据权利要求5所述的由权利要求1所述的一种新型甲基丙烯酰胺单体制备的侧链含原酸酯基元的阳离子聚合物的制备方法，其特征在于：透析袋的截留分子量为3500。 
8.根据权利要求4-7所述的由权利要求1所述的一种新型甲基丙烯酰胺单体制备的侧链含原酸酯基元的阳离子聚合物在基因传递中的应用，其特征在于，侧链含原酸酯基团的阳离子聚合物（化学式II）在转染中作为基因传递载体，所述的质粒DNA（基因）为pEGFP。 
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