CN102464801B - 一种阳离子聚合物及其制备方法和用途 - Google Patents
一种阳离子聚合物及其制备方法和用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用作非病毒型基因载体的新型阳离子聚合物及其制备方法和用途。本发明的阳离子聚合物具有下列式I的结构。本发明的阳离子聚合物是由炔基化单体和叠氮化单体(叠氮化一缩二乙二醇单体和叠氮化含二硫键的单体)通过一价铜离子催化的炔基-叠氮环加成反应聚合生成带有1,2,3-三唑基团结构和二硫键结构的阳离子聚合物。本发明的聚合物中含有三唑和酰胺毗邻的结构,与核酸有特异结合能力,可提高基因输送过程的稳定性;结构中含有的二硫键具有还原响应性,在细胞内可发生降解,可进一步提高转染效率、降低毒性,因此,用该聚合物制备的基因非病毒载体具有生物相容性高、毒性低、转染效率高等特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种新型阳离子聚合物及其制备方法和用途,还涉及由该新型阳离子聚合物与核酸构成的纳米复合物及其制备方法和用途。
背景技术
基因治疗是指将正常基因或有治疗作用的基因通过一定的方式导入靶细胞以纠正基因缺陷或发挥治疗作用,确切地说,它是遗传信息相关的特异性核酸序列的转移,是一项综合性高难度的生物技术。因此,基因治疗的关键问题就是寻找高效、低毒的基因载体。迄今研究开发的基因载体主要有病毒载体和非病毒载体两大类,其中,病毒载体,如各种逆转录病毒、腺病毒、疱疹病毒、腺相关病毒等,虽然转染效率高,但存在着对外源基因的容纳量少(约4.5-30kbp)、稳定性差、免疫原性高、毒性大、靶向特异性差等诸多缺点;而非病毒载体由于容易大规模制备、成本低、对外源基因无大小限制、具有低免疫原性和相对安全等优点已经越来越受到国内外学者的高度重视,并被建议替代病毒载体而成为基因载体研究的主要方向。
在非病毒载体研究中,阳离子聚合物基因输送系统已成为基因非病毒载体设计开发的主要方向,例如,对多聚赖氨酸(PLL)、聚乙烯亚胺(PEI)、聚酰胺-胺型树枝状高分子、聚二甲氨基甲基丙烯酸乙酯、壳聚糖和聚阳离子环糊精等。遗憾的是,迄今为止研究发现的阳离子聚合物基因输送载体的转染效率都不理想或转染效率较高但由于体内不降解导致毒性太大。因此,寻找新型的高效、低毒的基因非病毒载体已成为基因治疗研究领域最为迫切并具挑战性的课题之一。
带有高正电荷密度的阳离子聚合物可有效压缩DNA形成稳定的纳米复合物,使DNA能被细胞有效摄取并保护DNA在输送过程中免受酶的降解。但高电荷密度的聚合物,特别是不可降解的聚合物,会对细胞造成极大的毒性。此外,当纳米复合物进入细胞后,DNA必须要从复合物中有效解离才能发挥作用,因此过紧的压缩DNA会导致DNA无法从复合物中解离而使转染失败。因此,如何克服聚合物的毒性和转染效率之间以及细胞外DNA的强压缩效果和细胞内DNA的有效解离之间的双重矛盾已成为阳离子非病毒基因输送过程中的难题。
二硫键即S-S键,是由蛋白质的两个半胱氨酸之间配对形成的一种共价键。在细胞中,二硫键可被谷胱甘肽降解。因此,利用细胞内外谷胱甘肽(GSH)浓度差高达三个数量级且谷胱甘肽可降解二硫键的特性,可将二硫键引入到阳离子聚合物内部合成还原响应性的聚合物,该聚合物可在细胞外有效压缩DNA成足够小的纳米复合物利于细胞摄取,并保持DNA在输送过程中稳定。当纳米复合物通过内吞机制进入细胞后,在细胞内高GSH作用下,二硫键断裂,DNA可有效从复合物中解离。此外,在聚合物中引入二硫键可提高聚合物的降解性,进一步降低聚合物的毒性。
最近几年,产生了一种新的聚合物合成方法,即Huisgen环加成反应或“Click”反应。Click反应就是将末端带有炔基和叠氮基团的单体通过高选择性环合耦联后形成带有三唑环结构的聚合物,其最早是由Sharpless于2001年提出的。此后,Click反应就被广泛用于合成各种材料。有大量研究表明,杂环和酰胺毗邻的结构能与核酸特异性地稳定结合在一起。因此,利用三唑和酰胺键毗邻的结构可特异性结合DNA以及二硫键的还原响应性,通过合理的结构设计,通过Click反应可合成出既带有三唑和酰胺毗邻的结构又带有二硫键的结构的聚合物,这样,既能提高纳米复合物的胞外稳定性和增强DNA的胞内解离效果,又能增加聚合物降解性、降低聚合物毒性。
发明内容
基于上述研究背景,本发明人以一缩二乙二醇、三乙烯四胺和3,3’-二硫代二丙酸为原料,通过Click反应合成一种具有全新结构的阳离子聚合物。此聚合物含有的仲胺基团带有正电荷,能有效压缩核酸,同时能在酸性条件下接受H+,具有类似PEI的“质子海绵”效应;而且该聚合物中含有醚氧基结构,这就使该聚合物具有一定的亲水性和柔软性,具有类似PEG的性质,能在一定程度上分散聚合物的正电荷,阻止阳离子聚合物/核酸纳米复合物的聚集,减少聚合物对细胞的刺激性;该聚合物中含有的三唑和酰胺键毗邻的结构与DNA有很强的结合能力,可阻止纳米复合物聚集,提高纳米粒在输送过程中的稳定性;并且该聚合物中含有二硫键可提高DNA在胞内的解离效率,提高基因转染效率,此外,二硫键可在胞内降解,大大提高了聚合物的降解性,降低聚合物的毒性。
因此,本发明的目的在于提供一种高效低毒的用作非病毒型基因载体的新型还原响应性阳离子聚合物及其制备方法和用途。本发明的另一目的在于提供使用该阳离子聚合物制备的阳离子聚合物/核酸纳米复合物及其制备方法和用途。
本发明提供了一种用作非病毒型基因载体的阳离子聚合物,所述阳离子聚合物具有式I所示的结构:
式I中,m和n为聚合物的重复单元的个数。
所述阳离子聚合物的重均分子量为5,000~50,000道尔顿。
所述阳离子聚合物可为聚(叠氮基一缩二乙二醇-炔基三乙烯四胺)和聚(二叠氮丙胺二缩二硫代二丙酸-炔基三乙烯四胺)的Click嵌段共聚物。
本发明的阳离子聚合物是由含有保护基并在末端含有炔基基团的单体和末端含有叠氮基团的单体通过一价铜离子催化的炔基-叠氮环加成反应(“Click”反应)聚合并同时脱去保护基生成带有1,2,3-三唑基团结构的阳离子聚合物。
本发明提供的阳离子聚合物的合成方法如下:
步骤1:含有保护基的炔基化单体(末端含有炔基基团的单体)的合成
所述含有保护基的炔基化单体可以通过将丙炔酸与含有保护基的三乙烯四胺反应而合成,反应式如下:
反应式中,x为2;R为氨基保护基。反应步骤如下:
步骤a:使三乙烯四胺和三氟乙酸乙酯反应,先冰浴搅拌,待反应液温度升至室温后继续搅拌,得到末端的两个伯胺被三氟乙酰基保护的化合物;
步骤b:使上述末端的两个伯胺被三氟乙酰基保护的化合物与氨基保护试剂(优选为二碳酸二叔丁酯Boc2O)反应,用三乙胺(TEA)催化,得到仲胺被保护基(优选为Boc)保护的化合物;
步骤c:使上述仲胺被保护基保护的化合物在含有K2CO3的甲醇/水体系中回流后脱除三氟乙酰基,得到末端两个伯胺未被保护而仲胺被保护基保护的化合物;
步骤d:使末端两个伯胺未被保护而仲胺被保护基保护的化合物与丙炔酸反应,得到含有保护基的炔基化单体。
步骤2:叠氮化一缩二乙二醇单体(末端含有叠氮基团的单体)的合成
所述叠氮化一缩二乙二醇单体可以通过将一缩二乙二醇(即,二乙二醇)末端叠氮化而合成,反应式如下:
反应步骤具体如下:
步骤e:将一缩二乙二醇与对甲苯磺酰氯反应,以三乙胺(TEA)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)为催化剂,得到对甲苯磺酰基取代的一缩二乙二醇;
步骤f:将对甲苯磺酰基取代的一缩二乙二醇与叠氮钠反应,得到叠氮化一缩二乙二醇。
步骤3:叠氮化含二硫键的单体(末端含有叠氮基团结构中含二硫键的单体)的合成
所述叠氮化含二硫键的单体可以通过将3,3’-二硫代二丙酸和叠氮丙胺反应而合成,反应式如下:
步骤g:将氯化丙胺与叠氮钠反应,得到叠氮丙胺;
步骤h:将3,3’-二硫代二丙酸和叠氮丙胺反应,得到叠氮化含二硫键的单体。
步骤4:聚合物的合成
所述聚合物可以是通过将上述炔基化单体和上述叠氮化单体(叠氮化一缩二乙二醇单体和叠氮化含二硫键的单体)通过Click聚合反应聚合并同时脱去保护基得到的含有三唑基团的聚合物,反应式如下:
上式中,m和n为聚合物的重复单元的个数;x为2;R为氨基保护基。反应步骤如下:
将炔基化单体和叠氮化单体(叠氮化一缩二乙二醇单体和叠氮化含二硫键的单体)按等摩尔当量(炔基化单体和总的叠氮化单体为等摩尔当量)(例如0.1~2摩尔/升)在无水CuSO4和维生素C钠盐催化下,进行Click聚合反应(例如2~48小时),其中叠氮化一缩二乙二醇单体和叠氮化含二硫键的单体的摩尔比为9∶1,所得聚合物在二氯甲烷(DCM)/三氟乙酸(TFA)中脱除保护基,然后通过透析除杂,得到产物。
更具体地,
所述炔基化单体的制备如下:
步骤a:将三乙烯四胺溶于DCM中,加入三氟乙酸乙酯,冰浴下搅拌,待反应液温度升至室温后继续搅拌;
步骤b:向上述反应液中加入二碳酸二叔丁酯(Boc2O),加入催化剂三乙胺(TEA),室温搅拌使反应过夜;依次用饱和NaHCO3和饱和食盐水洗涤,无水Na2SO4干燥;浓缩后用DCM/正己烷体系重结晶;
步骤c:将上述结晶在含有K2CO3的甲醇/水体系中回流后,旋干甲醇,剩余物用DCM萃取;合并有机相,用无水Na2SO4干燥,旋干;
步骤d:将二环己基碳二亚胺(DCC)溶于DCM中,冰浴冷却,在N2保护下逐滴加入溶于DCM的丙炔酸溶液,冰浴下反应;然后逐滴加入由步骤c所得的产物的DCM溶液,冰浴反应后再室温反应;过滤除去白色沉淀物,浓缩溶剂,硅胶柱层析分离,以氯仿/甲醇进行梯度洗脱,得到所述炔基化单体。
所述叠氮化一缩二乙二醇单体的制备如下:
步骤e:将一缩二乙二醇溶于DCM中,冰浴冷却;按次序加入对甲苯磺酰氯、TEA和4-二甲氨基吡啶(DMAP),冰浴下搅拌,然后升至室温后继续搅拌;反应液依次用饱和NaHCO3和饱和食盐水洗涤,无水Na2SO4干燥;浓缩后用DCM/正己烷体系重结晶;
步骤f:将步骤e中重结晶产物溶于丙酮中,加入叠氮钠,回流;浓缩溶剂,硅胶柱层析分离,以石油醚/乙酸乙酯进行洗脱,得到叠氮化一缩二乙二醇单体。
所述叠氮化含二硫键的单体的制备如下:
步骤g:将氯化丙胺和叠氮钠溶于水中,80℃下反应15h,浓缩溶剂,冰浴冷却,加入氢氧化钠中和,用乙醚萃取,合并有机相,无水K2CO3干燥;浓缩后得到叠氮丙胺;
步骤h:将3,3’-二硫代二丙酸溶于水中,加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS),反应2h后加入叠氮丙胺,继续常温反应24h。反应液用乙酸乙酯萃取,合并有机相,无水Na2SO4干燥,浓缩后,硅胶柱层析分离,以氯仿/甲醇进行洗脱,得到叠氮化含二硫键的单体。
所述聚合物的制备如下:
将炔基化单体和叠氮化单体(叠氮化一缩二乙二醇单体和叠氮化含二硫键的单体的摩尔比为9∶1)按等摩尔当量溶于叔丁醇中,将无水CuSO4溶于水中,混合两溶液,放入塞有胶塞的小圆底烧瓶中,充N2保护,放入50℃油浴中,边搅拌边逐滴加入溶于水中的维生素C钠盐,50℃恒温反应过夜;旋转蒸发除去叔丁醇和少部分水后,粘稠物沉于反应瓶底;吸走上层水溶液后,旋干;加入DCM/三氟乙酸,常温反应后旋干;粘稠物用水复溶,用NaOH调节pH值呈碱性后装入透析袋中,用0.01M HCl透析后用纯水透析,冻干,得到聚合物。
本发明所述的聚合反应是由CuSO4和维生素C钠盐生成一价铜离子作为催化剂催化的。
本发明提供的聚合物是由炔基化单体和两种叠氮化单体通过Click聚合反应合成得到。
本发明所述的聚合物是含有二硫键且具有还原响应性的阳离子聚合物。
对于本发明合成的用作非病毒型基因载体的阳离子聚合物,聚合物的重均分子量为5,000~50,000道尔顿。通过控制聚合反应的单体投料量、聚合反应时间以及聚合反应温度,可以控制聚合物的分子量。
本发明的阳离子聚合物用于与核酸自组装形成纳米复合物。所述核酸可以是含有编码遗传标记的质粒DNA序列,所述遗传标记可为绿色荧光蛋白基因。
此外,本发明还提供了一种高效低毒的由所述阳离子聚合物和核酸组成的阳离子聚合物/核酸纳米复合物及其制备方法。该方法包括:将本发明的阳离子聚合物和质粒DNA分别用去离子水溶解,混合,室温静置,所述阳离子聚合物和质粒DNA通过静电自组装成纳米复合物。具体步骤为:将本发明的阳离子聚合物用去离子水溶解,配成0.1~10毫克/毫升的溶液;将质粒DNA用去离子水溶解,配成0.1~0.2毫克/毫升的溶液;将阳离子聚合物与DNA按体积比1∶1在涡旋混合仪上混合30秒,室温静置0.5~1小时,阳离子聚合物和质粒DNA通过静电自组装成纳米复合物。
本发明的阳离子聚合物/核酸纳米复合物可用于将核酸递送到细胞中。
使用本发明的阳离子聚合物/核酸的纳米复合物体外转染细胞的方法步骤为:用制备好的纳米复合物转染人乳腺癌细胞MCF-7或人乳腺癌耐阿霉素(ADR)细胞MCF-7/ADR,将细胞培养48小时后,用流式细胞仪测定,与阴性对照组相比,若有阳性荧光表达细胞,即为转染成功。
本发明通过凝胶阻滞实验验证了载体(本发明的阳离子聚合物)对质粒DNA的包载效果以及纳米复合物的还原响应性。
本发明通过粒度测定法验证了载体(本发明的阳离子聚合物)对质粒DNA的包载效果以及纳米复合物的还原响应性。
本发明测试了载体的细胞毒性。用MTT法测定载体的细胞毒性。
本发明所合成的新型阳离子聚合物,含有的仲胺基团带有正电荷,能有效压缩核酸,同时能在酸性条件下接受H+,具有类似PEI的“质子海绵”效应;而且该聚合物中含有醚氧基结构,这就使该聚合物具有一定的亲水性和柔软性,具有类似PEG的性质,能在一定程度上分散聚合物的正电荷,阻止阳离子聚合物/核酸纳米复合物的聚集,减少聚合物对细胞的刺激性;该聚合物中含有的三唑和酰胺键毗邻的结构与DNA有很强的结合能力,可阻止纳米复合物聚集,提高纳米粒在输送过程的稳定性;并且该聚合物中含有二硫键可提高DNA在胞内的解离效率,提高基因转染效率,此外,二硫键可在胞内降解,大大提高了聚合物的降解性,降低聚合物的毒性。
附图说明
图1为单体b和聚合物A1b的1H NMR图;
图2为本发明实施例6中凝胶阻滞实验电泳图片;
图3为本发明实施例7中细胞毒性实验结果示意图;以及
图4为本发明实施例8中体外转染实验结果示意图。
具体实施方式
下面,将通过实施例对本发明进行进一步说明,但本发明并不局限于这些实施例,在本发明权利要求所阐明的范围内,可对本发明进行各种改变或等同替换。
实施例1含有Boc的炔基化三乙烯四胺单体(编号A)的合成
将三乙烯四胺(1.46g,10mmol)溶于DCM(50mL)溶液中,冰浴冷却后,将三氟乙酸乙酯(2.95g,21mmol)逐滴加入其中,冰浴下搅拌1h。待反应液温度升至室温后再搅拌1h后,逐滴加入溶在适量DCM中的Boc2O(5.68g,26mmol)溶液和TEA(2.63g,26mmol)溶液,室温搅拌使反应过夜。依次用饱和NaHCO3和饱和食盐水洗涤,无水Na2SO4干燥。浓缩后用DCM/正己烷体系重结晶。
将上述重结晶物(2.00g)在含有K2CO3(1.80g)的甲醇/水(体积比20∶1)体系中回流4h后,旋干甲醇,剩余物用DCM萃取(3×100mL)。合并有机相,用无水Na2SO4干燥,旋干得粘稠物。
将DCC(1.25g,6mmol)溶于DCM(100mL)中,冰浴冷却,在N2保护下逐滴加入溶于DCM(10mL)的丙炔酸(0.38g,5.4mmol)溶液,冰浴下反应2h。然后逐滴加入上述粘稠物(0.83g,2.4mmol)的DCM溶液,冰浴反应2h后再室温反应24h。过滤除去白色沉淀物,浓缩溶剂,柱层析分离,以氯仿/甲醇(体积比50∶1和25∶1)进行梯度洗脱,得单体A(1H NMR(CDCl3):8.14(bs,2H),3.22-3.48(m,8H),2.75(s,2H),1.49(s,18H))。单体A的结构式如下:
实施例2叠氮化一缩二乙二醇单体(编号1)的合成
将一缩二乙二醇(2.12g,20mmol)溶于DCM(250mL)中,冰浴冷却。按次序加入对甲苯磺酰氯(7.62g,42mmol)、TEA(4.25g,42mmol)和4-二甲氨基吡啶DMAP(0.12g,0.1mmol),冰浴下搅拌1h,后室温搅拌12h。反应液依次用饱和NaHCO3(2×300mL)和饱和食盐水(300mL)洗涤,无水Na2SO4干燥。浓缩后用DCM/正己烷体系重结晶。将重结晶物(4.1g,10mmol)溶于丙酮中,加入叠氮钠(1.9g,30mmol),回流48h。浓缩溶剂,硅胶柱层析分离,以石油醚/乙酸乙酯(体积比2∶1)进行洗脱,得单体1(1HNMR(DMSO-d6):2.87(s,4H),2.70(s,4H))。单体1的结构式如下:
实施例3叠氮化含二硫键的单体(编号b)的合成
将氯化丙胺(1.30g,10mmol)溶于水中,加入叠氮钠(1.95g,30mmol),80℃下反应15h。减压除去大部分水后,反应液用冰浴冷却后,加入氢氧化钠(4g)中和盐酸。水溶液用乙醚萃取并用乙醚洗涤(3×100mL),合并有机相,用无水K2CO3干燥;浓缩后得到叠氮丙胺;
将3,3’-二硫代二丙酸(2.10g,10mmol)溶于水中(100mL),分别加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC,4.34g,22mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS,2.53g,22mmol),反应2h后加入叠氮丙胺(2.20g,22mmol),继续常温反应24h。反应液用乙酸乙酯萃取,合并有机相,用无水Na2SO4干燥。浓缩溶剂,硅胶柱层析分离,以氯仿/甲醇(体积比25∶1)进行洗脱,得到叠氮化含二硫键的单体(b)(1H NMR(CD3OD):8.19(bs,2H),3.36(t,J=5.2Hz,4H),3.25(t,J=6.0Hz,4H),2.94(t,J=7.2Hz,4H),2.59(t,J=6.8Hz,4H),1.78-1.72(m,4H).)。其1H NMR如图1(A)所示。单体b的结构式如下:
实施例4聚合物(编号为A1b)的合成
具体合成方法为:将单体A(0.45g,1mmol)和单体1(0.13g,0.9mmol)和单体b(0.04g,0.1mmol)溶于叔丁醇(1mL)中,将无水CuSO4(0.032g,0.2mmol)溶于水中(0.5mL),混合两溶液,放入塞有胶塞的小圆底烧瓶中,充N2保护,放入50℃油浴中,边搅拌边用一细针筒逐滴加入溶于水(0.5mL)中的维生素C钠盐(0.079g,0.4mmol)溶液,50℃恒温反应24h。旋转蒸发除去叔丁醇和少部分水后,粘稠物沉于反应瓶底。吸走上层水溶液后,旋干。加入DCM/TFA(体积比1∶1)10mL,常温反应3h后旋干。粘稠物用水复溶,用NaOH调节pH值呈碱性后装入透析袋中(截流分子量Mw7000),用0.01M HCl透析24h后用纯水透析3天,冻干。得到产物A1b。其1H NMR如图1(B)所示。由图可知,单体b中的二硫键已经被成功引入到聚合物内部。聚合物A1b的结构式如下:
聚合物的重均分子量随着聚合反应时间延长而增加,也随着单体投料量增加而增加。
实施例5由实施例4制备的阳离子聚合物和DNA组成的纳米复合物(A1bNs)的制备
将实施例4制备的阳离子聚合物用去离子水溶解,配成0.1~10毫克/毫升的溶液;将质粒DNA(为含有绿色荧光蛋白基因的质粒DNA,质粒编号为pEGFP-N1 vector,GenBank Accession#U55762)用去离子水溶解,得到浓度为0.2毫克/毫升的DNA溶液;将阳离子聚合物与质粒DNA按体积比1∶1在涡旋混合仪上混合30秒,室温静置0.5~1小时,阳离子聚合物和质粒DNA通过静电自组装成纳米复合物。
实施例6凝胶阻滞实验
按实施例5的方法,制得一系列不同N/P比(N为聚合物A1b中仲胺氮原子数,P为DNA中磷原子数)的聚合物和质粒DNA的纳米复合物。分别取每种配比的样品20微升,用10微升纯质粒作参照,1%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙啶染色,经凝胶成像系统(UVP公司Bioimaging Systems)拍摄。结果如图2(A)所示。
为确定聚合物的还原响应性,取新制备的不同N/P比的纳米复合物180微升,加入20微升25毫摩尔/升的二硫苏糖醇(DTT)溶液,室温孵育30min后,取样品20微升于1%琼脂糖凝胶中上样,电泳观察DNA迁移情况。
图2中、(A)和(B)分别为聚合物与质粒DNA形成的纳米复合物未经DTT作用和经DTT作用后的凝胶电泳图。各图中,第一电泳道为纯质粒对照,第二到第八道分别为聚合物与质粒DNA的N/P比为1,2,4,8,16,32,64。从图2(A)中可以看出,聚合物可以很好地压缩DNA,在N/P为2时即可完全阻滞DNA的迁移。在图2(B)中,可见游离DNA条带,这说明纳米复合物经DTT作用后,由于DTT可将聚合物中的二硫键降解,因此聚合物无法压缩DNA,DNA从纳米复合物中释放。
实施例7细胞毒性实验
以人乳腺癌细胞系MCF-7细胞和人乳腺癌耐阿霉素(ADR)细胞MCF-7/ADR细胞为测试细胞系(细胞购自美国标准生物品收藏中心(ATCC))。
细胞培养方法:取出液氮中冻存的细胞,在37℃的温水中解冻,将细胞悬液移入15mL离心管中,加5mL DMEM完全培养液,轻轻吹打均匀,置于离心机中,3000rpm离心5min,弃去上清液,加入2mL DMEM完全培养液,轻轻吹打均匀,将细胞悬液加入培养皿中,补加6mL DMEM完全培养液,将培养皿置于5%CO2、37℃培养箱中培养。
纳米复合物制备方法:参照实施例5的方法,制备N/P为32的聚合物/DNA的纳米复合物。
细胞毒性实验:将MCF-7或MCF-7/ADR细胞以2×104个细胞/孔的密度接种到96孔培养板中,培养24h后,更换培养液为新鲜血清培养液,并加入N/P比为32的含不同浓度的聚合物的纳米复合物,不加纳米复合物的孔设为空白对照,以w/w 3∶1制备PEI与/DNA形成的纳米复合物(PEINs),作为阳性对照(其中,PEI浓度为25μg/mL)。孵育24h后,吸弃孔中溶液,用PBS洗涤3遍,加入新鲜培养液180μL,同时每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL),继续在37℃、5%CO2(相对湿度90%)培养箱中培养4h后,终止培养,小心吸弃上清液,每孔加入150μL DMSO,避光振荡10min使结晶物充分溶解。以酶标仪检测570nm处的吸收度(A),按照以下公式计算:细胞存活率%=(试验组平均A值/空白对照组平均A值)×100%。
纳米复合物的细胞毒性结果如图3所示。从图3中可以看出,聚合物对细胞毒性很小,在100μg/mL浓度下,细胞存活率依然能高达80%左右。而用PEI/DNA纳米复合物的细胞毒性很大,在PEI浓度为仅25μg/mL下,几乎无细胞存活。
实施例8体外转染实验
以人乳腺癌细胞系MCF-7细胞和人乳腺癌耐阿霉素(ADR)细胞MCF-7/ADR细胞为测试细胞系(细胞购自美国标准生物品收藏中心(ATCC))。
细胞培养方法:取出液氮中冻存的细胞,在37℃的温水中解冻,将细胞悬液移入15mL离心管中,加5mL DMEM完全培养液,轻轻吹打均匀,置于离心机中,3000rpm离心5min,弃去上清液,加入2mL DMEM完全培养液,轻轻吹打均匀,将细胞悬液加入培养皿中,补加6mL DMEM完全培养液,将培养皿置于5%CO2、37℃培养箱中培养。
纳米复合物制备方法:参照实施例5的方法,制备N/P为8、16、32和64的四种聚合物/DNA的纳米复合物。
转染方法:将细胞以1×105个细胞/孔的密度接种到24孔培养板中,置于5%CO2、37℃培养箱中。培养24h后,更换新鲜完全培养基,分别加入纳米复合物,孵育24h后,吸弃孔中溶液,加入新鲜完全培养基,继续培养24h。以w/w 3∶1的PEI/DNA纳米复合物(PEINs)作为阳性对照,在无血清条件下培养2h后换新鲜完全培养基。培养结束后,用流式细胞仪(BectonDickinsion,USA)测定转染效率。
不同N/P的纳米复合物在两个细胞株中的细胞转染结果如图4所示。从图4中可以看出,聚合物/DNA纳米复合物能有效转染MCF-7和MCF-7/ADR两个细胞株。
综上所述,本发明的Click聚合物合成方便,与DNA形成纳米复合物后具有胞外稳定、胞内还原响应释放DNA的特性,用该聚合物制备的基因非病毒载体具有生物相容性高、毒性低、转染效率高等特点。
Claims (13)
2.根据权利要求1所述的阳离子聚合物,其中,所述阳离子聚合物为聚(叠氮基一缩二乙二醇-炔基三乙烯四胺)和聚(二叠氮丙胺二缩二硫代二丙酸-炔基三乙烯四胺)的Click嵌段共聚物。
3.权利要求1所述的阳离子聚合物的制备方法,该方法包括以下步骤:
步骤1:含有保护基的炔基化单体的合成
其中,x为2,R为氨基保护基,
所述含有保护基的炔基化单体是通过将丙炔酸与含有保护基的三乙烯四胺进行反应而合成;
步骤2:叠氮化一缩二乙二醇单体的合成
所述叠氮化一缩二乙二醇单体是通过将一缩二乙二醇末端叠氮化而合成;
步骤3:叠氮化含二硫键的单体的合成
所述叠氮化含二硫键的单体是通过将3,3’-二硫代二丙酸和叠氮丙胺反应而生成;
步骤4:聚合物的合成
其中,m和n为聚合物的重复单元的个数;x为2,R为氨基保护基;
所述聚合物是通过将上述含有保护基的炔基化单体和上述叠氮化单体通过一价铜催化的炔基—叠氮环加成反应聚合并同时脱去保护基生成带有1,2,3-三唑基团和二硫键基团结构的阳离子聚合物;所述阳离子聚合物的重均分子量为5,000~50,000道尔顿。
4.根据权利要求3所述的方法,其中,所述炔基化单体的合成具体包括以下步骤:
其中,x为2,R为氨基保护基,
步骤a:使三乙烯四胺和三氟乙酸乙酯反应,先冰浴搅拌,待反应液温度升至室温后继续搅拌,得到末端的两个伯胺被三氟乙酰基保护的化合物;
步骤b:使上述末端的两个伯胺被三氟乙酰基保护的化合物与氨基保护试剂反应,用三乙胺催化,得到仲胺被保护基保护的化合物;
步骤c:使上述仲胺被保护基保护的化合物在含有K2CO3的甲醇/水体系中回流后脱除三氟乙酰基,得到末端两个伯胺未被保护而仲胺被保护基保护的化合物;
步骤d:使末端两个伯胺未被保护而仲胺被保护基保护的化合物与丙炔酸反应,得到炔基化的含有保护基的三乙烯四胺。
7.根据权利要求3所述的方法,其中,所述聚合物的合成具体包括以下步骤:
其中,m和n为聚合物的重复单元的个数;x为2;R为氨基保护基,
将炔基化单体和叠氮化单体按等摩尔当量在无水CuSO4和维生素C钠盐催化下,进行Click聚合反应,其中叠氮化一缩二乙二醇单体和叠氮化含二硫键单体的摩尔比为9:1,所得聚合物在二氯甲烷/三氟乙酸中脱除保护基,然后通过透析除杂,得到产物。
8.权利要求1所述的阳离子聚合物用于非病毒型基因载体的用途。
9.一种由权利要求1所述的阳离子聚合物和核酸构成的纳米复合物。
10.根据权利要求9所述的纳米复合物,其中,所述核酸为含有编码遗传标记的质粒DNA序列,所述遗传标记为绿色荧光蛋白基因。
11.根据权利要求9所述的纳米复合物,其具有还原响应性。
12.权利要求9所述的纳米复合物的制备方法,该方法包括:将权利要求1所述的阳离子聚合物和质粒DNA分别用去离子水溶解,混合,室温静置,阳离子聚合物和质粒DNA通过静电自组装成纳米复合物。
13.权利要求9所述的纳米复合物用于将核酸递送到细胞中的用途。
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