CN113683780B - 具有穿膜活性和细胞核定位功能的抗血清、低细胞毒性的聚氨基酸类基因递送载体材料 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医用高分子材料技术领域，公开了一类具有穿膜活性和细胞核定位功能的抗血清、低细胞毒性的聚氨基酸类基因递送载体材料及其制备方法与应用。本发明的聚氨基酸类基因递送载体材料具有如附图1所示结构，其侧链具有不同取代度的胍基阳离子和低聚乙二醇，能有效地与基因形成纳米复合物颗粒，还能有效地降低载体的细胞毒性并提升纳米颗粒的血清稳定性，可向靶细胞内传递外源基因，转染效率好；当本发明载体递送基因时，载体的穿膜活性可将基因直接穿透细胞膜而进入细胞质，核定位功能又能使其携带的基因从细胞质直接进入细胞核，有效避免纳米颗粒的溶酶体陷阱，特别适合外源基因的细胞质和细胞核的靶向递送。

Description

具有穿膜活性和细胞核定位功能的抗血清、低细胞毒性的聚 氨基酸类基因递送载体材料
技术领域
本发明属于生物医用高分子材料技术领域，特别涉及一类具有穿膜活性和细胞核定位功能的抗血清、低细胞毒性的聚氨基酸类基因递送载体材料及其制备方法与应用。
背景技术
根据美国食品和药品监督局(FDA)的定义，基因治疗是指通过转入或整合到宿主基因组中的遗传物质经过转录或翻译调节细胞功能，以达到治疗疾病的目的。全世界正在开展的基因治疗临床试验中，60％以上为恶性肿瘤，其余为单基因遗传性疾病、心血管疾病、感染疾病、自身免疫性疾病等。不管针对哪种疾病，基因疗法都需要将外源基因通过载体递送的方法，将其传递到目标组织的靶细胞中才能发挥功效。然而，核酸类药物在体内循环时不稳定，易被血液中的核酸酶降解；同时，核酸分子易被血液循环系统的巨噬细胞清除；此外，若无载体保护，带负电荷的裸基因也无法透过细胞膜屏障。因此，缺乏安全、高效的基因递送载体仍然是基因治疗领域中亟待解决的难题。
基因递送载体主要分为两类：病毒载体和非病毒载体。病毒载体可能激发严重的免疫原性反应，对核酸的负载效率也低，这极大地限制了其在基因递送领域的应用。相比之下，非病毒基因递送载体则具有免疫原性反应低、载药量大及易规模化生产等优势。生理条件下基因带负电荷，故而要求非病毒载体带正电荷，如此它们就能通过静电吸引而聚集成纳米复合物颗粒。当基因被包裹入纳米复合物后，避免了其被核酸酶降解的可能，因此最终达到保护基因之目的。当载体/基因纳米复合物到达靶细胞时，通常以内吞的方式被细胞所摄取。然而，大部分类型的纳米复合物被细胞摄取后，都会被困在溶酶体中而无法逃脱，并最终被核酸酶所降解，这个现象称为纳米颗粒的“溶酶体陷阱”。溶酶体陷阱的存在是导致非病毒载体的基因转染效率低下的一个重要原因。
目前，克服载体/基因纳米复合物溶酶体陷阱的主要方式是使用细胞穿膜肽(CPPs)或含有CPPs链段的高分子共聚物作为载体材料。CPPs可以诱导细胞膜产生临时孔洞，纳米颗粒借助这些孔洞直接携带基因进入细胞质，整个过程不需要经过溶酶体，因此基因的递送效率获得显著提升。虽然利用CPPs的膜活性可以避免溶酶体陷阱，但是CPPs的分子链较短，负载基因的效率较低；不仅如此，目前尚无法一次性、大批量地制备低成本的CPPs。总之，CPPs的这些缺陷严重制约了其在基因靶向递送领域的应用。
按所用的基因类型分类，基因疗法主要包括pDNA、mRNA、siRNA等疗法，pDNA疗法需要将pDNA直接递送至细胞核而发挥作用，但核膜屏障会阻碍pDNA/载体纳米复合物的进入；mRNA疗法需要将外源mRAN递送至细胞质，因此需要克服溶酶体屏障。传统观点认为，siRNA疗法只需要将siRNA递送至细胞质，然而近年来最新的研究结果表明，siRNA也可以在细胞核内发挥沉默致病基因的功能。因此，这就需要开发能够直接将基因递送至细胞质和细胞核的新型载体，需要同时克服溶酶体屏障和细胞核屏障。目前克服细胞核屏障的一个重要方式是在载体结构上引入核定位信号肽(NLSPs)，所得到的功能化载体可将基因直接携带入细胞核；然而NLSPs也是短肽，它们不能够通过细胞膜，而且也无法从溶酶体中逃逸，因此不适合用作基因递送载体。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一类具有穿膜活性和细胞核定位功能的抗血清、低细胞毒性的聚氨基酸类基因递送载体材料。本发明的载体材料为侧链胍基化的聚氨基酸类阳离子基因递送载体，具有较长的分子链，且长度可调控，克服了CPPs对基因负载效率不足的问题；还能模拟CPPs的穿膜活性，将基因直接递送至细胞质，避免了纳米颗粒的溶酶体陷阱，从而提高转染效率；更为重要的是，本发明的载体材料在装载基因形成纳米复合物后，可通过直接穿膜的方式进入细胞，甚至直接将基因携带入细胞核，具备“核定位”功能。
本发明载体材料为聚氨基酸类高分子材料，侧链同时含胍基和低聚乙二醇，聚氨基酸链段可有效地与siRNA、miRNA、mRNA、pDNA等核酸分子形成聚电解质纳米复合物颗粒，向靶细胞内传递外源治疗性基因，转染效率好，且抗血清能力佳、细胞毒性低，仅与脂质体2000相当。最重要的是，当侧链胍基含量较高时，相应的阳离子聚氨基酸/基因纳米复合物通过细胞膜时还可以发挥穿膜作用，直接将核酸运送进细胞质，之后进一步发挥核定位功能，将核酸快速地运送至细胞核，实现基因的高效率递送。
本发明另一目的在于提供一种上述具有穿膜活性和细胞核定位功能的抗血清、低细胞毒性的聚氨基酸类基因递送载体材料的制备方法。
本发明再一目的在于提供上述具有穿膜活性和细胞核定位功能的抗血清、低细胞毒性的聚氨基酸类基因递送载体材料在基因递送领域的应用。本发明的聚氨基酸类基因递送载体材料既能模拟CPPs的细胞膜活性，又能模拟NLSPs的“核定位”功能；用作基因递送载体时，能同时避免CPPs和NLSPs的缺点，实现对基因的高效递送。
本发明的目的通过下述方案实现：
一类具有穿膜活性和细胞核定位功能的抗血清、低细胞毒性的聚氨基酸类基因递送载体材料，其具有如下式(1)-式(6)所示结构之一：
环形聚氨基酸：
Figure BDA0003263424810000031
Figure BDA0003263424810000041
Figure BDA0003263424810000042
其中，m和n分别表示侧链含胍基和低聚乙二醇的聚氨基酸中的结构单元数，1≤m≤300，0≤n≤300，10≤m+n≤600。
R1、R2相同或不同的分别取自：
Figure BDA0003263424810000043
CH3-或CH3CH2-；
R3：
Figure BDA0003263424810000044
R4：
Figure BDA0003263424810000045
Figure BDA0003263424810000046
且，如结构式所示，侧链低聚乙二醇的聚合度为2-30。
式(1)、式(2)、式(3)、式(4)所示结构为环状聚氨基酸；式(5)和式(6)所示结构为线形聚氨基酸。
本发明的具有穿膜活性和细胞核定位功能的抗血清、低细胞毒性的聚氨基酸类基因递送载体材料，其侧链具有不同取代度的胍基阳离子和低聚乙二醇，其中，胍基的取代度为[m/(m+n)]×100％，其值为0-100％，优选为50-100％；低聚乙二醇的取代度为[n/(m+n)]×100％，其值为0-50％，优选为0-30％。
本发明还提供一种上述聚氨基酸类基因递送载体材料的制备方法，包括以下步骤：(1)合成谷氨酸在γ-位的酯化产物；(2)制备步骤(1)酯化产物对应的N-羧基环内酸酐单体；(3)N-羧基环内酸酐(NCAs)单体开环聚合制备聚氨基酸；(4)通过光点击反应制备侧链同时含伯胺基团和低聚乙二醇的聚氨基酸；(5)将侧链胺基转化成胍基，得到聚氨基酸类基因递送载体。
具体地，上述制备方法包括以下步骤：
(1)使α,ω-烯醇、α,ω-炔醇、含α,ω-烯醇端基的低聚乙二醇、或含α,ω-炔醇端基的低聚乙二醇与谷氨酸的γ-位羧基发生酯化反应，合成端基为C＝C或C≡C键的谷氨酸酯；
(2)所得谷氨酸酯和三光气发生闭环反应，生成N-羧基环内酸酐单体；
(3)利用咪唑鎓碳酸氢盐类卡宾试剂、或端基为伯氨基的小分子胺类化合物，或端基为伯氨基的聚乙二醇单甲醚大分子为引发剂，引发N-羧基环内酸酐单体快速聚合，生成环形或线形、且侧链含C＝C或C≡C端基的聚氨基酸、或聚乙二醇-聚氨基酸嵌段共聚物；
进一步的，当利用咪唑鎓碳酸氢盐类卡宾试剂引发聚合反应时，控制单体浓度和聚合时间可以得到环上含/不含引发剂残基的环形聚合物；
(4)利用“巯基-烯”或“巯基-炔”光化学改性技术，在光引发剂存在下将半胱胺盐酸盐和链端为巯基的短链聚乙二醇单甲醚接枝到聚氨基酸的侧链，得到侧链端同时含伯胺基团和低聚乙二醇的聚氨基酸；
(5)在碱存在下，利用胍基化试剂与伯胺之间的取代反应，将侧链氨基转化成胍基。
本发明制备方法中，步骤(1)和(2)的反应过程可如式(一)所示：
Figure BDA0003263424810000061
步骤(1)中，所述的酯化反应可在20-80℃下进行，优选20-30℃；反应时间可为0.5-96h，优选60-84h。
所用谷氨酸和α,ω-烯醇或α,ω-炔醇、含α,ω-烯醇端基的低聚乙二醇、或含α,ω-炔醇端基的低聚乙二醇的摩尔比为1:4-1:8，优选为1:5-1:7。
所用的谷氨酸可以是L-谷氨酸、D-谷氨酸或D,L-谷氨酸。
所述的α,ω-烯醇含3-6个碳原子，优选包括烯丙醇、3-丁烯-1-醇、4-戊烯-1-醇、5-己烯-1-醇、乙二醇单烯丙基醚、二乙二醇单烯丙基醚、低聚乙二醇单烯丙基醚中的至少一种。
所述的α,ω-炔醇优选包括炔丙醇、乙二醇单炔丙基醚、二乙二醇单炔丙基醚、低聚乙二醇单炔丙基醚中的至少一种。
所述的酯化反应可采用强酸作为催化剂，所用的强酸可为浓硫酸、对甲苯磺酸、浓盐酸、氢溴酸、四氟硼酸等。上述酯化反应结束后，可用三乙胺、二异丙基乙胺、吡啶、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钠、碳酸钾等有机或无机弱碱中和酸性催化剂和氨基酸，将出现的沉淀物过滤后用异丙醇/水混合溶剂重结晶；所用的弱碱与谷氨酸的摩尔比为1:3-1:8，优选为1:4-1:5。
步骤(2)中，所述的闭环反应的具体步骤可包括，将步骤(1)合成的谷氨酸酯用溶剂悬浮，加热至40-90℃回流，然后添加三光气进行反应。
所述的闭环反应可采用四氢呋喃或乙酸乙酯为溶剂；当使用乙酸乙酯为溶剂时，温度优选为80-90℃，当采用四氢呋喃为溶剂时，温度优选为40-60℃。所述闭环反应的时间为0.5-6h，当使用THF为溶剂时，优选0.5-1.5h，当使用乙酸乙酯为溶剂时，优选5-6h。
所述三光气与谷氨酸酯的摩尔比为3:1-3.5:1，优选为3:1。
反应结束后，可采用冷的蒸馏水、0.5wt％的碳酸氢钠水溶液和氯化钠水溶液中的至少一种进行萃取，有机相用干燥剂干燥后，减压除去溶剂得到纯化后的单体，直接用于下一步的聚合反应。
本发明制备方法中，步骤(3)的反应过程如下式(二)所示：
Figure BDA0003263424810000071
线形聚氨基酸：
Figure BDA0003263424810000072
步骤(3)中，所述的聚合反应采用本领域常规方法及条件，常采用无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂，反应温度可为0-40℃，优选为25-35℃。
聚合反应具备活性聚合的特征，聚氨基酸的分子量可通过单体及引发剂的摩尔比控制，单体/引发剂的摩尔比可为10:1-600:1，优选为70:1-90:1。
聚合反应结束后，反应溶液可利用甲醇、乙醚或水沉淀出聚合物。
进一步的，当合成环形的产物时，采用咪唑鎓碳酸氢盐类卡宾试剂为引发剂；当合成线形的产物时，采用端基为伯胺的小分子或大分子化合物为引发剂。
所述的卡宾试剂可以包括1,3-二异丙基咪唑鎓碳酸氢盐、1,3-二环己基咪唑鎓碳酸氢盐、1,3-二环戊基咪唑鎓碳酸氢盐、1,3-二(2,4,6-三甲基苯基)咪唑鎓碳酸氢盐、1-甲基-3-乙基-咪唑鎓碳酸氢盐、1-甲基-3-异丙基咪唑鎓碳酸氢盐中的一种。
所述端基为伯胺的引发剂可以是包括含有2-11个碳原子的脂肪伯胺、苄胺、呋喃甲胺、聚合度为1-300的甲氧基聚乙二醇胺中的一种。
进一步的，当采用端基为伯胺的引发剂时，反应体系中，单体的浓度可为40-250g/L，优选为40-80g/L，反应的时间常为1-120h，优选为60-84h。
进一步的，当利用咪唑鎓碳酸氢盐类卡宾试剂引发聚合反应时，可通过调节单体浓度和聚合时间得到链端含/不含引发剂残基的环形聚合物；
其余条件不变，反应中，当单体的浓度为40-250g/L，优选为40-80g/L时，可制备得到环上含引发剂残基的环形聚氨基酸，反应的时间可为1-120h，优选为1-24h；当降低单体浓度和聚合时间，可反应得到环上不含引发剂残基的环形聚氨基酸，单体浓度可为1.0-10g/L，优选为1.0-8.0g/L，反应时间可为0-30min，优选为0-20min。
本发明制备方法中，步骤(4)的反应过程如式(三)所示。
步骤(4)中，所述的接枝反应为温和、高效的“巯基-炔”或“巯基-烯”(Thiol-Ene和Thiol-Yne)光化学点击反应。
所述半胱胺盐酸盐或链端为巯基的短链聚乙二醇单甲醚中的巯基(-SH)与聚氨基酸侧链的C＝C键或C≡C键的摩尔比可为1:1-1:8；其中，-SH与C＝C键的摩尔比优选为1:2；-SH与C≡C键的摩尔比优选为1:4。
接枝反应的温度可为0-90℃，优选为20-30℃。
接枝反应可在N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、N-甲基吡咯烷酮等强极性溶剂中进行。
进一步的，优选将聚合物完全溶于溶剂后，加入光引发剂，在紫外光照射下发生反应。
所用光引发剂的量为不包括溶剂在内的所有反应物总质量的0-5％，优选为5％。
Figure BDA0003263424810000091
所述光引发剂可为裂解型光引发剂，例如安息香双甲醚(Irgacure 651)、1-羟环己基苯酮(Irgacure 184)、2-羟基-2-甲基苯丙酮(Darocur1173)和2-羟基-4’-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(Irgacure 2959)等其中的一种。所述紫外光的光源可为中、高亚汞灯，手电筒式LED伍德氏灯、LED紫外固化灯、LED紫外点光源等。所述紫外光辐照的时间可为5-180min，优选50-70min；紫外光强度可为0.1-500mW/cm2，优选为10-30mW/cm2。所述反应体系中，光照结束后将混合溶液透析1-3天，冻干后得到侧链完全氨基化的聚氨基酸。
本发明制备方法中，步骤(5)的反应过程如下式(四)所示。
步骤(5)中，无论是环形结构聚氨基酸还是线形结构聚氨基酸，其侧链胍基化的方法都相同。
所述的胍基化试剂可为1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐等常规试剂。
具体可为在碱性条件下，利用侧链的氨基与胍基化试剂(如：1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐)的取代反应完成其胍基化改性；通过控制胍基化试剂与氨基的摩尔比得到胍基含量不一的聚氨基酸，侧链胍基的取代度为0-100％，优选为50-100％；侧链低聚乙二醇的取代度为0-50％，优选为0-30％。
所述反应可采用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、N-甲基吡咯烷酮和1,3-二甲基-2-咪唑啉酮等为反应溶剂。
所述反应的溶液为碱性，可通过加入碱调节，加入的碱可以是N,N-二异丙基乙胺、三乙胺、N-甲基吗啉、碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾等其中的一种。
所用胍基化试剂、氨基和碱的摩尔比可为(0-4)：1：(1-10)，优选为(0-1)：1：(1-2)。
所述反应的温度可为0-60℃，优选20-40℃；反应时间可为0-48h，优选20-30h。
反应结束，将反应混合物在蒸馏水中透析除去溶剂和杂质，透析时水溶液的pH为3-7，优选5-6；透析时间24-120h，优选72h；透析结束，冻干得到目标产物。
本发明制备方法操作简单，通过本发明方法可低成本、大批量地制备得到转染效率高、细胞毒性低、血清抵抗力好的非病毒类基因递送载体，应用于在基因递送领域，在肿瘤和其它多种疾病的基因治疗方面有广阔的应用前景。
Figure BDA0003263424810000111
本发明还提供基于本发明载体材料的基因/载体纳米复合物颗粒，可通过以下方法制备得到：将目标基因与本发明载体材料分别溶于水中，将两种水溶液混合，充分震荡，静置得到基因/载体纳米复合物颗粒。
所述混合的体系中，目标基因的浓度可为0-100nMol/L，优选为10-30nMol/L；载体材料的用量可根据侧链质子化的氮原子(N)的个数与目标基因的核苷酸单元中所含的磷原子(P)的个数比来确定，即N/P比，其值可为0-200:1，优选为0-50:1。
所述充分震荡可通过采用漩涡振荡器振荡30s；所述静置在室温下进行即可；所述静置的时间可为30min。
上述形成的复合物颗粒是目标基因与载体材料依靠静电引力的作用自组装形成的。所形成的纳米颗粒的粒径约为10-300nm，优选30-100nm；表面电位约为0-50mV，优选为5-20mV。
本发明的具有穿膜活性和细胞核定位功能的抗血清、低细胞毒性的聚氨基酸类基因递送载体材料，可用做非病毒基因递送载体材料应用于基因递送领域，可用于高效递送siRNA、mRNA、pDNA和miRNA等基因。其侧链具有不同取代度的胍基阳离子和低聚乙二醇，能有效地与siRNA、mRNA、pDNA和miRNA等基因形成纳米复合物颗粒，可向靶细胞内传递外源基因，转染效率好；其基因递送效率比目前流行的PEI载体和脂质体载体高，无血清条件下，本发明的胍基化载体对siRNA的体外转染效率是Lipofectamine2000的2倍、是PEI的1.1倍；且细胞毒性显著低于上述两者，且抗血清能力远高于这两种载体。
当本发明载体递送基因时，载体的穿膜活性可帮助基因直接穿透细胞膜而进入细胞质，核定位功能又能使其携带的大部分基因从细胞质直接进入细胞核，可以有效地避免纳米颗粒的溶酶体陷阱，特别适合外源基因的细胞质和细胞核的靶向递送。因此，本发明载体既拥有穿膜活性和细胞核定位功能，又拥有抗血清能力佳和细胞毒性低的优势，从而实现外源性基因的安全、高效率靶向递送。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单的介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
附图1为本发明聚氨基酸类基因递送载体材料结构示意图。
附图2为实施例1中的产物cPALG的1H NMR图。
附图3为实施例2中的产物cPALGgAET的1H NMR图。
附图4为实施例3中的产物CPG100的1H NMR图。
附图5为实施例4中的CPG90/siRNA纳米复合物颗粒的琼脂糖凝胶电泳照片。
附图6为实施例6中的有/无血清条件下CPG100、CPG90、lipo2000和PEI向HeLa-Luc细胞中递送siRNA的转染效率图。
附图7为实施例7中的CPG100、CPG90分别在4℃和37℃下向HeLa-Luc细胞中递送siRNA的转染效率图。
附图8为实施例6中的CPG90向HeLa-Luc细胞内递送siRNA-cy3的激光共聚焦显微镜照片。
附图9为实施例7中的CPG100、CPG90、PEI和lipofectamine2000的细胞毒性图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下列实施例中涉及的物料若无特殊说明均可从商业渠道获得。所述方法若无特别说明均为常规方法。各组分用量以重量份、摩尔份、体积份计，g、mol、L。
本发明提供一类具有穿膜活性和细胞核定位功能的抗血清、低细胞毒性的聚氨基酸类基因递送载体材料，其具有附图1所示结构，其中，m和n分别表示侧链含胍基和低聚乙二醇的聚氨基酸中的结构单元数，1≤m≤300，0≤n≤300，10≤m+n≤600。
R1、R2相同或不同的分别取自：
Figure BDA0003263424810000141
CH3-或CH3CH2-；
R3：
Figure BDA0003263424810000142
R4：
Figure BDA0003263424810000143
Figure BDA0003263424810000144
且，如结构式所示，侧链低聚乙二醇的聚合度为2-30。
式(1)、式(2)、式(3)、式(4)所示结构为环状聚氨基酸；式(5)和式(6)所示结构为线形聚氨基酸。
本发明的具有穿膜活性和细胞核定位功能的抗血清、低细胞毒性的聚氨基酸类基因递送载体材料，其侧链具有不同取代度的胍基阳离子和低聚乙二醇，其中，胍基的取代度为[m/(m+n)]×100％，其值为0-100％，优选为50-100％；低聚乙二醇的取代度为[n/(m+n)]×100％，其值为0-50％，优选为0-30％。
本发明还提供一种上述聚氨基酸类基因递送载体材料的制备方法，包括以下步骤：(1)合成谷氨酸在γ-位的酯化产物；(2)制备步骤(1)酯化产物对应的N-羧基环内酸酐单体；(3)N-羧基环内酸酐(NCAs)单体开环聚合制备聚氨基酸；(4)通过光点击反应制备侧链同时含伯胺基团和低聚乙二醇的聚氨基酸；(5)将侧链胺基转化成胍基，得到聚氨基酸类基因递送载体。
具体地，上述制备方法包括以下步骤：
(1)使α,ω-烯醇、α,ω-炔醇、含α,ω-烯醇端基的低聚乙二醇、或含α,ω-炔醇端基的低聚乙二醇与谷氨酸的γ-位羧基发生酯化反应，合成端基为C＝C或C≡C键的谷氨酸酯；
(2)所得谷氨酸酯和三光气发生闭环反应，生成N-羧基环内酸酐单体；
(3)利用咪唑鎓碳酸氢盐类卡宾试剂、或端基为伯氨基的小分子胺类化合物，或端基为伯氨基的聚乙二醇单甲醚大分子为引发剂，引发N-羧基环内酸酐单体快速聚合，生成环形或线形、且侧链含C＝C或C≡C端基的聚氨基酸、或聚乙二醇-聚氨基酸嵌段共聚物；
进一步的，当利用咪唑鎓碳酸氢盐类卡宾试剂引发聚合反应时，控制单体浓度和聚合时间可以得到环上含/不含引发剂残基的环形聚合物；
一实施方式中，所用的引发剂为咪唑鎓碳酸氢盐类卡宾试剂(如1,3-二异丙基咪唑鎓碳酸氢盐)，聚合得到环形的聚氨基酸；另一实施方式中，所用的引发剂为端基为伯氨基的小分子胺类化合物(如正己胺)，聚合得到线型聚氨基酸；再一实施方式中，可采用端基为伯氨基的聚乙二醇单甲醚大分子为引发剂，合成得到聚乙二醇和聚氨基酸的二嵌段共聚物。
(4)利用“巯基-烯”或“巯基-炔”光化学改性技术，在光引发剂存在下将半胱胺盐酸盐和链端为巯基的短链聚乙二醇单甲醚接枝到聚氨基酸的侧链，得到侧链端同时含伯胺基团和低聚乙二醇的聚氨基酸；
(5)在碱存在下，利用胍基化试剂与伯胺之间的取代反应，将侧链氨基转化成胍基。
具体实施例如下所示：
实施例1：环形cPALG和线性LPALG的合成
称取L-谷氨酸34摩尔份和丙烯醇153摩尔份，混合均匀于烧瓶中，冰浴条件下缓慢滴加41摩尔份浓硫酸，30min内滴加完毕。冷却1h后，撤去冰浴升温至室温，继续反应48h。反应结束后向体系中加入足量三乙胺中和，再加入足量丙酮搅拌，过滤得到沉淀。沉淀物在真空干燥箱内室温干燥过夜，粗产物用异丙醇/水重结晶，过滤后用足量冷丙酮洗涤，真空干燥。产物γ-烯丙基-L-谷氨酸酯为白色片状结晶，产率47％。
将10摩尔份γ-烯丙基-L-谷氨酸酯悬浮于30体积份无水THF中，升温至50℃，此时向反应体系中加入3.3摩尔份三光气，同时通入氮气，溶液立刻变澄清，继续反应1-1.5h。待冷却后将反应溶液倒入100体积份正己烷中，-20℃过夜。倾出上层有机溶液，下层油状物用50体积份乙酸乙酯溶解，用50体积份质量分数为0.5％的碳酸氢钠冷溶液萃取一次、50体积份冷水萃取一次，整个过程温度不得高于5℃，并避免剧烈摇晃。分出有机相，无水硫酸镁干燥过夜，旋蒸除去溶剂后立刻用于下一步聚合，产物为油状单体(单体A)，产率40％。
(1)环形聚(γ-烯丙基-L-谷氨酸酯)(cPALG)：
Figure BDA0003263424810000161
在手套箱中，室温条件下，将2.5摩尔份上述单体A用107体积份无水DMF溶解装于反应瓶中；根据所要求的分子量，称取6.0质量份1,3-二异丙基咪唑鎓碳酸氢盐直接加入到上述溶液，反应60min后将聚合物溶液慢慢滴加到无水乙醚或甲醇中沉淀出聚合物。过滤后50℃下真空干燥，得到蜡状的环形聚(γ-烯丙基-L-谷氨酸酯)(cPALG)，产率84％，用高效凝胶渗透色谱测得其平均分子量为14700g/mol，也即聚合度为87；其1H NMR图见附图2。
(2)线型聚氨基酸LPALG，以正己胺引发剂为例：
Figure BDA0003263424810000162
在手套箱中，室温条件下，将2.5摩尔份上述单体A用6体积份无水DMF溶解装于反应瓶中；根据所要求的分子量，称取3.2质量份的正己胺溶于2体积份无水DMF中，用注射器将此引发剂溶液快速打入反应瓶中，反应24小时。结束后将聚合物溶液慢慢滴加到无水乙醚或甲醇中沉淀出聚合物。过滤后50℃下真空干燥，得到蜡状的线形聚(γ-烯丙基-L-谷氨酸酯)(LPALG)，产率87％，用高效凝胶渗透色谱测得其平均分子量为12000g/mol，也即聚合度为72。
(3)R1≠R2的环形cPALG的合成
在手套箱中，室温条件下，将2.5摩尔份上述单体A用6体积份无水DMF溶解装于反应瓶中；根据所要求的分子量，称取5.2质量份的1-甲基-3-异丙基咪唑鎓碳酸氢盐溶于2体积份无水DMF中，用注射器将此引发剂溶液快速打入反应瓶中，反应2小时。结束后将聚合物溶液慢慢滴加到无水乙醚或甲醇中沉淀出聚合物。过滤后50℃下真空干燥，得到蜡状的环形聚(γ-烯丙基-L-谷氨酸酯)(cPALG)，产率76％，用高效凝胶渗透色谱测得其平均分子量为16000g/mol，也即聚合度约为95。
(4)聚乙二醇-聚氨基酸线型二嵌段共聚物(mPEG5k-b-PALG)的合成
在手套箱中，室温条件下，将2.5摩尔份上述单体A用6体积份无水DMF溶解装于反应瓶中；根据所要求的分子量，称取250质量份的甲氧基聚乙二醇胺(mPEG5k-NH2，数均分子量5000g/moL)为大分子引发剂溶于2体积份无水DMF中，将此引发剂溶液快速打入反应瓶中，反应72小时。结束后将聚合物溶液慢慢滴加到无水乙醚或甲醇中沉淀出聚合物。过滤后50℃下真空干燥，得到蜡状的线型二嵌段共聚物(mPEG5k-b-PALG)，产率91％，用高效凝胶渗透色谱测得其平均分子量为12100g/mol，也即PALG链端的聚合度约为42。
(5)侧链含低聚乙二醇链段的环形cPALG的合成
称取L-谷氨酸34摩尔份和二乙二醇烯丙基醚153摩尔份，混合均匀于烧瓶中，冰浴条件下缓慢滴加41摩尔份浓硫酸，30min内滴加完毕。冷却1h后，撤去冰浴升温至室温，继续反应72h。反应结束后向体系中加入足量三乙胺中和，再加入足量乙醚搅拌，离心过滤出沉淀。沉淀物在真空干燥箱内室温干燥过夜，产物为粘稠液体，产率20％。
将10摩尔份上述合成的谷氨酸酯悬浮于30体积份无水THF中，升温至50℃，此时向反应体系中加入3.3摩尔份三光气，同时通入氮气，溶液立刻变澄清，继续反应1-1.5h。待冷却后将反应溶液倒入100体积份正己烷中，-20℃过夜。倾出上层有机溶液，下层油状物用50体积份乙酸乙酯溶解，用50体积份质量分数为0.5％的碳酸氢钠冷溶液萃取一次、50体积份冷水萃取一次，整个过程温度不得高于5℃，并避免剧烈摇晃。分出有机相，无水硫酸镁干燥过夜，旋蒸除去溶剂后立刻用于下一步聚合，产物为油状单体(单体B)，产率34％。
在手套箱中，室温条件下，将2.5摩尔份上述所合成的单体B用6体积份无水DMF溶解装于反应瓶中；根据所要求的分子量，称取21.5质量份的1,3-二异丙基咪唑鎓碳酸氢盐溶于2体积份无水DMF中，用注射器将此引发剂溶液快速打入反应瓶中，反应12小时。结束后将聚合物溶液慢慢滴加到无水乙醚中沉淀出聚合物。过滤后50℃下真空干燥，得到相应的蜡状的环形cPALG，产率76％，用高效凝胶渗透色谱测得其平均分子量为5900g/mol，也即聚合度为23。
(6)环上无引发剂残基的环形cPALG的合成
在手套箱中，室温条件下将2.5摩尔份的单体A用107体积份的无水DMF溶解装于反应瓶中；根据所要求的分子量，称取6.0质量份的1,3-二异丙基咪唑鎓碳酸氢盐直接添加入上述溶液，继续反应20分钟。结束后将聚合物溶液慢慢滴加到无水乙醚或甲醇中沉淀出聚合物。过滤后50℃下真空干燥，得到蜡状的不含引发剂残基的环形聚(γ-烯丙基-L-谷氨酸酯)(cPALG-2)，产率86％。用高效凝胶渗透色谱测得其平均分子量为11500g/mol，也即聚合度为68。
实施例2：cPALGgAET的合成
称取含0.59摩尔份C＝C键的实施例1所制备的环形cPALG溶于3体积份DMF，搅拌使其彻底溶解，再加入含1.18摩尔份-SH键的巯基乙胺盐酸盐；再称取安息香双甲醚(Irgacure 651)12.3质量份加入到反应溶液中，在紫外手电筒照射下反应(λmax＝365nm，强度为3-5mW·cm-2)室温反应120min。反应结束后，将所得反应溶液装入透析袋(1000Mw)透析两天。冷冻干燥得近白色固体，命名为cPALGgAET，产率92％，1H NMR见附图3，结构式如下所示：
Figure BDA0003263424810000191
实施例3：胍基化cPALG的合成
Figure BDA0003263424810000192
以侧链胍基取代度为100％的聚氨基酸(命名为CPG100)为例阐述：取含2摩尔份-NH2的cPALGgAET，溶于4体积份的DMF；加入4摩尔份的1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐；取8摩尔份N,N-二异丙基乙胺滴加入反应溶液中，在30℃下继续反应24h。反应结束以后将反应液装入截留分子量为3500的透析袋透析，调节透析液pH为4-5，透析24h。冷冻干燥得棕黄色固体，产率为70％。用1H NMR测定胍基的取代度为100％，因此命名为CPG100，其1HNMR见附图4。
实施例4：侧链同时胍基化和低聚乙二醇改性聚氨基酸的合成
Figure BDA0003263424810000201
(1)以侧链胍基取代度为90％、低聚乙二醇取代度为10％的聚氨基酸(根据其胍基取代度命名为CPG90)为例阐述：
称取含0.59摩尔份C＝C键的实施例1所制备的环形cPALG溶于3体积份DMF，搅拌使其彻底溶解，再加入10.6质量份的巯基三甘醇甲醚；再称取6质量份安息香双甲醚(Irgacure 651)加入到反应溶液中，在紫外手电筒照射下(λmax＝365nm，强度为3-5mW·cm-2)室温反应1h。此时补加6质量份的光引发剂，再加入含1.06摩尔份-SH键的巯基乙胺盐酸盐继续光照反应3h；反应结束后将所得反应溶液装入透析袋(1000Mw)透析两天。冷冻干燥得近浅黄色固体，产率92％。用1H NMR测得其胍基取代度为90％，即侧链三乙二醇取代度为10％，根据胍基取代度将其命名为CPG90。
(2)侧链胍基取代度为70％、低聚乙二醇取代度为30％的聚氨基酸(根据其胍基取代度命名为CPG70)为例阐述：
称取含0.59摩尔份C＝C键的实施例1所制备的环形cPALG溶于3体积份DMF，搅拌使其彻底溶解，再加入31.9质量份的巯基三甘醇甲醚；再称取6质量份安息香双甲醚(Irgacure 651)加入到反应溶液中，在紫外手电筒照射下(λmax＝365nm，强度为3-5mW·cm-2)室温反应1h。此时补加6质量份的光引发剂，再加入含0.83摩尔份-SH键的巯基乙胺盐酸盐继续光照反应2h；反应结束后将所得反应溶液装入透析袋(1000Mw)透析两天。冷冻干燥得近浅黄色固体，产率85％。
实施例5：CPG90/siRNA纳米颗粒的制备
将实施例4中得到的CPG90溶解于去离子水中，配成浓度为1.0μg/μL的聚氨基酸母液一；将siRNA溶于去离子水配成浓度为20μMol/L的母液二。按照一定的氮磷比，分别将适量体积的母液一和2.5μL的母液二混合，得到N/P分别为0.5、1、2和5的样品，漩涡振荡器振荡30s以混合均匀，最后取适量的去离子水将混合液稀释至总体积为20μL，室温下静置孵育30min以使CPG100和基因完全复合。将CPG90/siRNA纳米复合物溶液以溴化乙锭为染色剂、在100V条件下电泳(1％琼脂糖)30min后，用凝胶成像系统观察并拍照，结果见附图5。由图可知，当N/P大于或等于1.0时，载体/基因可以形成稳定的纳米颗粒，基因被包在纳米颗粒的内部。
实施例6：CPG100、CPG90、lipo2000和PEI向HeLa-Luc细胞核内递送siRNA的效率
以稳定表达荧光素酶的HeLa细胞(HeLa-Luc)为模型靶细胞，以沉默荧光素酶表达的siRNA(siGL4)为模型基因。将HeLa-luc细胞以每孔15000个细胞的浓度种于24孔板。24h后当融合率达到50％时吸出原培养液。按照实施例5所述方法配制N/P比为20:1的siGL4/载体纳米颗粒溶液，用无血清的opti-MEM稀释纳米颗粒后加入孔板中，37℃条件下孵育，最终siGL4的浓度保持为30nMol/L。为了对比血清的影响，相同条件下向培养基中加入胎牛血清进行孵育，保证血清的体积浓度为10％/孔；5h后吸出培养液，用冷的PBS洗3次，每孔加100μL的细胞裂解液，在摇床上摇晃30min，离心。然后分别取20μL上清液测总蛋白含量和荧光素酶表达量。Lipofectamine2000按照制造商说明书所确定的最佳转染条件来配制纳米颗粒，然后同法执行转染实验；在PEI的安全浓度范围内，PEI的转染效率随着N/P的增加而增大；当N/P比为7，安全浓度范围内PEI的转染效率最高，所以用此时PEI的转染效率与其它载体的转染效率进行对比。荧光素酶表达量按如下计算公式测定：
均一化化荧光素酶表达百分含量(％)＝((样品组荧光强度/样品组总蛋白浓度)/(空白组荧光量/空白组总蛋白含量))×100％
使用BCA kit试剂盒测定细胞内总蛋白表达量；荧光素酶的发光强度使用化学发光仪或多功能酶标仪测定，其中空白组为同等培养条件下不加载体、si-GL4及其纳米复合物的HeLa-Luc细胞，最终四种载体的转染效率如附图6所示。其中荧光素酶的表达水平越低，表明siRNA的基因沉默效率越高，则载体对siRNA的递送效率越好。
由图可见，无血清条件下CPG100对siRNA的递送效率约是PEI的1.1倍，是Lipofectamine2000的2.1倍；CPG90对siRNA的递送效率约是PEI的1.25倍，是Lipofectamine2000的2.3倍。无血清条件下的递送效率数据表明，侧链胍基化/低聚乙二醇改性能够促使载体具有优异的转染效率。
有血清条件下，CPG100和Lipofectamine2000对siRNA的递送效率很弱，基本不具备转染能力；但CPG90对siRNA的递送效率约是PEI的2.7倍；这表明同时将侧链进行胍基化和低聚乙二醇改性有利于保证载体具有优异的转染效率，增强载体的抗血清能力。
实施例7：CPG100和CPG90在4℃和37℃下向HeLa-Luc细胞中递送siRNA
通常，细胞对纳米颗粒的摄取需要消耗能量；因此在培养温度较低时，细胞对纳米颗粒的摄取能力将会被抑制，但低温对具有穿膜活性的载体以及载体/基因纳米复合物的细胞摄取能力的影响较小。因此在其它培养条件一致的情况下，通过比较测定在37℃和4℃条件下细胞对纳米颗粒的摄取水平或目标蛋白表达水平，即可判断载体和基因/载体纳米复合物是否具有穿膜活性。
设定载体/siGL4的氮磷比为10:1，siGL4的浓度为100nMol/L。纳米颗粒的制备及细胞转染实验步骤见实施例5和实施例6所述，这里仅改变纳米颗粒的孵育温度为37或4℃，其它步骤基本一致。在37℃或4℃下，载体/siGL4的转染效率见附图7。由图可知，在4℃条件下递送siRNA时，CPG100和CPG90对siRNA的递送效率仍超过50％，这说明低温不能有效地抑制细胞对载体/siRNA纳米复合物颗粒的摄取，说明本发明载体具有穿膜活性。
实施例8：观察CPG90/siRNA的细胞核定位功能
使用红色荧光染料Cy3标记的siRNA为模型基因(siRNA-Cy3)。设定CPG90/siRNA的N/P比为10:1。在共聚焦小培养皿上将含有60nMol/L siRNA的CPG90/siRNA-cy3纳米复合物于37℃和HeLa细胞共同孵育5h，同时使用绿色荧光染料Lysotracker Green对细胞的溶酶进行染色，使用蓝色荧光染料Hoechst对细胞核进行染色。孵育结束后用PBS缓冲溶液将细胞洗涤3次，然后于激光共聚焦显微镜下观察纳米颗粒在细胞内的亚细胞器分布情况，最终得到的共聚焦显微镜照片见附图8。由图可知，细胞核呈现明显的粉紫色，表明绝大部分siRNA被直接递送入细胞核；极少量溶酶体呈现橘黄色，说明极少量的siRNA位于溶酶体；极少量的细胞质呈现Cy3的红色，说明极少量的siRNA位于细胞质。上述结果说明本发明载体具有很好的核定位功能。
实施例9：CPG100、CPG90、lipo2000和PEI的细胞毒性评估
将HeLa细胞种于96孔板，37℃，5％CO2下加入含10％胎牛血清、1％的盘尼西林的DMEM培养基培养，细胞密度为90000个/mL。当融合率达到70-80％时，吸出96孔板内的培养基，将载体按照不同的浓度梯度给药，每孔加入200μL的载体，用无血清DMEM培养基继续培养24h。吸出旧液，再向每孔加入20μL的MTT，3h后用酶标仪测定在570nm处的OD值，平行测定五次。同时以Lipofectamine2000和PEI为对照组，其结果见附图9。由图可知，CPG100的细胞毒性和Lipofectamine2000相当，但都低于PEI；CPG90的细胞毒性远低于其它三种载体，这说明本发明侧链同时胍基化和低聚乙二醇改性的载体具有显著降低的细胞毒性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一类具有穿膜活性和细胞核定位功能的抗血清、低细胞毒性的聚氨基酸类基因递送载体材料，其特征在于具有如下式(1)-式(6)所示结构之一：
环形聚氨基酸：
Figure FDA0003665110440000011
Figure FDA0003665110440000012
其中，m和n分别表示侧链含胍基和低聚乙二醇的聚氨基酸中的结构单元数，1≤m≤300，0≤n≤300，10≤m+n≤600；侧链同时含胍基和低聚乙二醇；
其中，胍基的取代度为[m/(m+n)]×100％，其值为0-100％；低聚乙二醇的取代度为[n/(m+n)]×100％，其值为0-50％；
R1、R2相同或不同的分别取自：
Figure FDA0003665110440000021
CH3-或CH3CH2-；
R3：
Figure FDA0003665110440000022
R4：
Figure FDA0003665110440000023
Figure FDA0003665110440000024
2.一种具有穿膜活性和细胞核定位功能的抗血清、低细胞毒性的聚氨基酸类基因递送载体材料的制备方法，其特征在于具体包括以下步骤：
(1)使α,ω-烯醇、α,ω-炔醇、含α,ω-烯醇端基的低聚乙二醇、或含α,ω-炔醇端基的低聚乙二醇与谷氨酸的γ-位羧基发生酯化反应，合成端基为C＝C或C≡C键的谷氨酸酯；
(2)所得谷氨酸酯和三光气发生闭环反应，生成N-羧基环内酸酐单体；
(3)利用咪唑鎓碳酸氢盐类卡宾试剂、或端基为伯氨基的小分子胺类化合物，或端基为伯氨基的聚乙二醇单甲醚大分子为引发剂，引发N-羧基环内酸酐单体快速聚合，生成环形或线形、且侧链含C＝C或C≡C端基的聚氨基酸、或聚乙二醇-聚氨基酸嵌段共聚物；
(4)利用“巯基-烯”或“巯基-炔”光化学改性技术，在光引发剂存在下将半胱胺盐酸盐和链端为巯基的短链聚乙二醇单甲醚接枝到聚氨基酸的侧链，得到侧链端同时含伯胺基团和低聚乙二醇的聚氨基酸；
(5)在碱存在下，利用胍基化试剂与伯胺之间的取代反应，将侧链氨基转化成胍基。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的酯化反应在20-80℃下进行，酯化反应的反应时间为0.5-96h；所用谷氨酸和α,ω-烯醇或α,ω-炔醇、含α,ω-烯醇端基的低聚乙二醇、或含α,ω-炔醇端基的低聚乙二醇的摩尔比为1:4-1:8；所用的谷氨酸为L-谷氨酸、D-谷氨酸或D,L-谷氨酸；所述的α,ω-烯醇含3-6个碳原子，包括烯丙醇、3-丁烯-1-醇、4-戊烯-1-醇、5-己烯-1-醇、乙二醇单烯丙基醚、二乙二醇单烯丙基醚、低聚乙二醇单烯丙基醚中的至少一种；所述的α,ω-炔醇包括炔丙醇、乙二醇单炔丙基醚、二乙二醇单炔丙基醚、低聚乙二醇单炔丙基醚中的至少一种；步骤(2)中，所述的闭环反应的具体步骤包括，将步骤(1)合成的谷氨酸酯用溶剂悬浮，加热至40-90℃回流，然后添加三光气进行反应；所述三光气与谷氨酸酯的摩尔比为3:1-3.5:1。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述的卡宾试剂包括1,3-二异丙基咪唑鎓碳酸氢盐、1,3-二环己基咪唑鎓碳酸氢盐、1,3-二环戊基咪唑鎓碳酸氢盐、1,3-二(2,4,6-三甲基苯基)咪唑鎓碳酸氢盐、1-甲基-3-乙基-咪唑鎓碳酸氢盐、1-甲基-3-异丙基咪唑鎓碳酸氢盐中的一种；所述端基为伯胺的引发剂包括含有2-11个碳原子的脂肪伯胺、苄胺、呋喃甲胺、聚合度为1-300的甲氧基聚乙二醇胺中的一种；当利用咪唑鎓碳酸氢盐类卡宾试剂引发聚合反应时，控制单体浓度和聚合时间得到环上含/不含引发剂残基的环形聚合物。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，所述半胱胺盐酸盐或链端为巯基的短链聚乙二醇单甲醚中的巯基与聚氨基酸侧链的C＝C键或C≡C键的摩尔比为1:1-1:8；接枝反应的温度为0-90℃；步骤(5)中，通过控制胍基化试剂与侧链的氨基的摩尔比得到胍基含量不一的聚氨基酸，胍基化试剂、氨基和碱的摩尔比为(0-4)：1：(1-10)；反应温度为0-60℃；反应时间为0-48h。
6.一种基于权利要求1所述的具有穿膜活性和细胞核定位功能的抗血清、低细胞毒性的聚氨基酸类基因递送载体材料的基因/载体纳米复合物颗粒，其特征在于通过以下方法制备得到：将目标基因与权利要求1所述的载体材料分别溶于水中，将两种水溶液混合，充分震荡，静置得到基因/载体纳米复合物颗粒。
7.权利要求1所述的具有穿膜活性和细胞核定位功能的抗血清、低细胞毒性的聚氨基酸类基因递送载体材料在基因递送领域的应用。
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