KR101497668B1 - 전신 순환을 위한 짧은 간섭 rna 유전자 전달체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 siRNA 전달 및 이의 체내 전신 순환(systemic circulation)의 효율이 개선된 유전자 전달체에 대한 발명으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 R9(arginine) 펩타이드를 기반으로 하는, 전신 순환용 siRNA 유전자 전달 시스템에 대한 발명이다.

Description

전신 순환을 위한 짧은 간섭 RNA 유전자 전달체{A siRNA gene Delivery System for Systemic Circulation}
본 발명은 siRNA 전달 및 이의 체내 전신 순환(systemic circulation)의 효율이 개선된 유전자 전달체에 대한 발명으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 R9(arginine) 펩타이드를 기반으로 하는, 전신 순환용 siRNA 유전자 전달 시스템에 대한 발명이다.
통상적인 단백질 치료의 대용으로서 다양한 유전자 치료 기법이 발달되어 왔으나, 이에는 여전히 해결되어야 할 중요한 과제들이 존재한다. 유전자 치료의 주요한 과제 중 하나는 최소 세포독성을 가지고 원형질막(동물세포) 및 핵막을 통한 효율적인 유전자 유입(influx)을 달성하는 것이다.
유전자 치료 시스템은 크게 바이러스성 벡터-매개 시스템 및 비바이러스성 벡터-매개 시스템으로 분류될 수 있다. 레트로바이러스(retrovirus) 또는 아데노바이러스(adenovirus) 등을 이용하여 만든 바이러스성 벡터는 세포 내로의 높은 형질 주입 (트랜스펙션(transfection)) 효율을 갖는다는 장점이 있으나, in vivo 에서 면역원성의 문제 및 유전자 재조합과 같은 내재적 문제점 등을 갖는다. 이러한 바이러스성 벡터의 안정성 문제를 극복하기 위하여, 다양한 중합체성 유전자 전달 시스템이 전통적인 바이러스성 벡터-기재 유전자 전달 방법에 대한 대안으로서 발달되어 왔다. 그러나, 중합체성 벡터는 엔도좀 탈출(endosomal escape) 및 핵 편재화(nuclear localization)와 같은 세포내 트래피킹(trafficking) 장벽을 갖는다는 문제점이 있다.
합성 펩타이드에 기초한 유전자 전달 시스템은, 낮은 pH 에서 엔도좀 막 내에서의 누출을 야기시킴으로써 DNA 를 응축시키고, 또한 엔도좀 탈출을 촉진하므로 중합체성 유전자 전달 시스템과 관련된 상기 문제점들을 극복할 수 있다.
이러한 이유로, 다양한 합성 펩타이드가 in vitro 에서 여러 세포주에서의 유전자 전달을 촉진하는 것으로 개발되어 왔다. 그러나, 이 역시 in vivo 적용에 있어서 독성 및 혈청 불안정성 등의 문제점이 존재한다. 특히, 이와 관련하여 짧은 양이온성 펩타이드를 이용한 벡터에 대한 연구가 진행되고 있으나, 이 경우 세포외 공간에서 핵산이 불안정하다는 문제점이 있으며, 또한 핵산과의 복합체의 안정성 및 유전자 발현의 수준 등이 불충분하다는 문제점이 존재한다.
그 중에서도, RNAi 핵산 전달의 경우는, 핵산과의 복합체의 안정성이 낮아 합성 펩타이드로의 전달이 어려웠는 바, 종래 지질이나 리포솜 등을 이용하여 이루어졌고, 효과적인 체내 전신순환이 어려운 단점이 있었다.
이에 본 발명자들은 펩타이드를 이용한 유전자 전달 시스템을 연구하던 중, 특히, 한쪽 말단 또는 양쪽 말단에 Cys가 결합되어 있는 R9 구조의 벡터를 페길레이션(PEGylation)시킴으로써 siRNA의 체내 전달 효율을 현저히 향상시킬 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 주요 목적은 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 R9(arginine) 펩타이드를 함유하는 siRNA 전달체 및 전신 투여에 의해 이를 체내로 전달하는 방법를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 R9(arginine) 펩타이드; 및 목적 siRNA를 함유하는 복합체를 제공하는 데 있다.
상기 과제를 해결하기 위하여,
본 발명은 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 R9(arginine) 펩타이드를 함유하는, 전신 순환용 siRNA 전달체(PEG-R9)를 제공한다.
또한, 본 발명은 폴리에틸렌글리콜(PEG), R9(arginine) 펩타이드 및 목적 질환 치료용 siRNA 유전자를 함유하는 전신 순환용 복합체(PEG-R9-siRNA); 및 이를 함유하는 전신 순환용 약학적 조성물을 제공한다.
특히, 상기 R9(arginine) 펩타이드는 한쪽 말단 또는 양쪽 말단에 Cys가 결합되어 있는 것을 특징으로 하고, 바람직하게는 Cys-(D-R9)-Cys 또는 Gly-(D-R9)-Cys 구조를 가진다. 가장 바람직하게는 Cys-(D-R9)-Cys 구조를 이룬다.
이 때, 상기 Cys의 아민기(-NH2)에 의해 PEG가 펩타이드 한쪽 말단 또는 양쪽 말단에 결합되어 있는 구조를 지닌다.
그리고, 폴리에틸렌글리콜(PEG)은 500 달톤의 분자량을 가지는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 전신 순환용 복합체는 200nm 이하의 직경의 나노 크기를 가짐으로써 siRNA 전달체로써 작은 크기를 가지는 장점이 있고, 6:1 ~ 15:1의 전하비율(+/-)을 가짐으로써 우수한 트랜스펙션 효율을 가진다. 이때, 12:1의 전하비율(+/-)을 가지는 경우 트랜스펙션 효율이 가장 우수하다.
상기 복합체는 목적하는 질환의 치료를 위한 siRNA의 체내 순환시간을 증가시킴으로써, 뛰어난 치료 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 실시에에서는 암 치료 유전자 siRNA로서 siVEGF를 사용하였다.
이처럼, 본 발명의 PEG-R9-siRNA는 높은 트랜스펙션 효율, 낮은 세포독성, 높은 목적 유전자 발현 효율을 가지는, 체내 전신 순환이 효과적인 siRNA 전달 시스템으로 사용될 수 있다.
본 발명의 PEG-R9는 특히 siRNA의 전신 투여에 의한 체내 전달 효율을 현저히 높이는 siRNA 전달 시스템의 기반이 될 수 있다. 다양한 단백질 전달 도메인 종류 중에서도 특히 본 발명의 한쪽 말단 또는 양쪽 말단에 Cys가 결합되어 있는 R9 구조체의 말단을 페길레이션(PEGylation) 시킴으로써 siRNA의 체내(systemic) 전달 효율을 현저히 향상시킬 수 있으므로, 효과적인 전신 투여용 siRNA 유전자 전달 시스템으로 매우 유용하다.
도 1은 본 발명의 폴리에틸렌글리콜(PEG)과 올리고 아르기닌(R9)의 접합체를 이용한 핵산 전달체 모식도이다.
도 2는 PEG-R9의 접합체 형성 확인 및 이의 안정성 확인 결과이다.
도 3은 PEG-R9-siVEGF 복합체(polyplexes) 형성 후 크기 및 제타 포텐셜 측정 결과이다.
도 4는 PEG-R9에서 C-(D-R9)-C의 구조를 가지는데 이는 다른 구조의 D-R9과 트랜스팩션의 효율을 비교한 결과이다.
도 5는 최적의 PEG 분자량을 찾기 위해 PEG500과 PEG1000을 이용하여 루시퍼라제 분석 결과이다.
도 6은 세포내 유전자 전달 효율에 대한 루시페라제 분석(a) 및 세포 독성에 대한 MTT 분석 결과(b)이다.
도 7은 cys-R9-cys, PEG-R9, PEG-cys-R9-cys의 각 경우를 이용한 전달체에 있어서의 크기 및 제타 포텐셜 분석 결과이다.
도 8은 PEG-cys-R9-cys, PEG-TAT, PEG-cys-TAT-cys의 각 경우를 이용한 전달체에 있어서의 크기 및 제타 포텐셜 분석 결과이다.
도 9는 PEG-R9-siVEGF 복합체(polyplexes) 투여에 따른 암세포의 성장 속도를 비교한 그래프이다.
도 10은 암을 이식한 누드마우스에서 투여 10일 후 암세포 성장 억제를 관찰한 사진이다.
본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.
"유전자"는 단백질 코딩 또는 전사시에 또는 다른 유전자 발현의 조절시에 기능적 역할을 갖는 임의의 핵산 서열 또는 그의 일부를 의미한다. 유전자는 기능적 단백질을 코딩하는 모든 핵산 또는 단백질을 코딩 또는 발현하는 핵산의 일부만으로 이루어질 수 있다. 핵산 서열은 엑손, 인트론, 개시 또는 종료 영역, 프로모터 서열, 다른 조절 서열 또는 유전자에 인접한 특유한 서열 내에 유전자 이상을 포함할 수 있다.
"폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"라는 용어는 리보뉴클레오티드 뿐만 아니라 디옥시리보뉴클레오티드 등 온갖 길이의 뉴클레오티드 중합체를 의미한다.
"핵산"은 임의의 DNA 또는 RNA, 예를 들어, 조직 샘플에 존재하는 염색체, 미토콘드리아, 바이러스 및/또는 세균 핵산을 포함하는 의미이다. 이중가닥 핵산 분자의 하나 또는 두개 모두의 가닥을 포함하고, 무손상 핵산 분자의 임의의 단편 또는 일부를 포함한다. 본 발명에서 전달코자 하는 대표적인 핵산은 siRNA이다.
"벡터(vector)"라는 용어는 다른 핵산을 그것이 연관된 곳으로 운반할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. "발현벡터(expression vector)"라는 용어는 벡터에 의해 운반된 각각의 재조합 유전자에 의해 암호화된 단백질을 합성할 수 있는 플라스미드, 코스미드(cosmid) 또는 파지(phage)를 포함한다. 바람직한 벡터는 연관된 핵산의 자가복제와 발현이 가능한 것이다.
"트랜스펙션(transfection)"은 배양동물 세포에 핵산(DNA, RNA 등)을 직접 도입하여 세포 내에서 유전형질을 발현시키는 방법을 의미한다.도입한 핵산은 목적으로 하는 유전자를 플라스미드 등의 매개체에 넣어 도입하는 것이 일반적인 방법이다. 도입한 유전자가 세포에서 안정화된 경우는 염색체에 끼어들어간 경우가 많았다. 핵산을 도입한 세포를 형질도입체라고 한다. 형질도입 효율이 매우 낮기 때문에 효율을 높이기 위해서 여러 가지 방법을 개발되었다. 그 중에서도 인산칼슘공침법, DEAE-텍스트란처리법. 전기천공법, 재분포법(리포솜이라는 인공막과 DNA복합체를 만들게 하는 세포와 융합시키는 방법) 등이 있다.
"제타 포텐셜(zeta potential)"이란 대전된 입자표면에 붙어 있는 불가동수분과 입자로부터 쉽게 떨어져 나갈 수 있는 가동수분의 확산 이중층에서의 양전하 밀도차이에서 유래되는 전기역학적인 전위차를 의미한다. 세포표면과 주변 배양액 사이의 전기적 전위차 또는 제타전위로 나타내기도 한다.
"전하 비율"은 유전자 전달체로서 기능하고 있는 복합체에 있어서, 음전하를 지닌 DNA가 정전기적 인력을 통해 양전하의 담체 또는 캐리어(carrier)와 결합함에 있어서 사용된 각 전하량의 비율을 의미한다. 복합체가 만들어진 후 전체적인 전하가 양전하일 때 전달효율이 좋은데, 이는 세포막이 음전하를 띠고 있기 때문이다.
"아미노산" 및 "아미노산 잔기"는 천연 아미노산, 비천연 아미노산, 및 변형된 아미노산을 의미한다. 달리 언급되지 않는 한, 아미노산에 대한 모든 언급은, 일반적으로 또는 명칭에 따라 특이적으로, D 및 L 입체이성질체(구조가 이같은 입체이성질체 형태를 허용하는 경우) 양쪽 모두에 대한 언급을 포함한다. 천연 아미노산에는 알라닌 (Ala), 아르기닌 (Arg), 아스파라긴 (Asn), 아스파르트산 (Asp), 시스테인 (Cys), 글루타민 (Gln), 글루탐산 (Glu), 글리신 (Gly), 히스티딘 (His), 이소류신 (Ile), 류신 (Leu), 라이신 (Lys), 메티오닌 (Met), 페닐알라닌 (Phe), 프롤린 (Pro), 세린 (Ser), 트레오닌 (Thr), 트립토판 (Trp), 타이로신 (Tyr) 및 발린(Val)이 포함된다. 본 발명에서는 아르기닌(Arg)의 D 이성질체를 사용하는 것이 바람직하다.
"유전자 발현"이란 용어는 일반적으로 생물학적 활성이 있는 폴리펩티드가 DNA 서열로부터 생성되고 세포에서 생물학적 활성을 나타내는 세포 과정을 의미한다. 그런 의미로, 유전자 발현은 전사 및 해독 과정을 포함할 뿐만 아니라, 유전자 또는 유전자 산물의 생물학적 활성에 영향을 끼칠 수 있는 전사후 및 해독후 과정을 포함한다. 상기 과정들은 RNA 합성, 가공 및 수송뿐만 아니라, 폴립펩티드 합성, 수송 및 폴리펩티드의 해독후 변형을 포함한다.
"루시페라제(luciferase)"는 루시페린의 산화를 촉진하여 화학에너지를 빛에너지로 전환시켜 광을 발산하게하는 효소로, 생체 내에서 연속적, 실시간적으로 발현을 측정하고, 목적의 물질들에 대한 효과를 검증할 수 있게 하는 리포터 유전자(reporter gene) 기능을 한다. 반딧불이(firefly; 개똥벌레) 또는 딱정벌레(glow-worm)와 같은 곤충체로부터 직접 수득하거나 이러한 효소를 암호화하는 재조합 DNA 절편을 포함하는 미생물로부터의 발현에 의해 수득할 수 있다.
"담체 또는 캐리어(carrier)"는, 생물체 내에 있는 활성물질이 다른물질과 결합하여 존재하는 경우, 또는 세포막을 통한 물질의 이동인 운반체수송을 담당하는 고분자 물질을 총칭한다. 담체의 예로는 비제한적으로 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산과 같은 완충제, 아스코르브산과 같은 항산화제, 저분자량 폴리펩티드(약 10 잔기 미만), 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질, 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 폴리머, 글리신 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산, 단당류, 이당류 및 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물, EDTA와 같은 킬레이트화제, 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당알코올, 나트륨과 같은 염-형성 반대이온(salt-forming counterion), 및/또는 TWEEN®, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 PLURONICS®같은 무이온 계면활성제를 포함한다.
"치료"는 임상 결과를 포함하여 이로운 또는 원하는 결과를 수득하기 위한 접근법이다. 질환, 장애 또는 병태의 "치료" 또는 "완화"는, 장애를 치료하지 않는 것과 비교하여,병태, 장애 또는 질환 상태의 정도 및/또는 바람직하지 않은 임상 징후가 적어지고/적어지거나 경시적인 진행 추이가 느려지거나 길어지는 것을 의미한다. 본 발명의 목적을 위하여, 이롭거나 바람직한 임상 결과는, 검출가능 또는 검출불능 여부와 상관없이, 1가지 이상의 증상의 경감 또는 개선, 질환 정도의 축소, 질환의 안정화된(즉, 악화되지 않는) 상태, 질환 진행의 지연 또는 감속, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 진정 (부분적 또는 전체적)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. "치료"는 치료를 받지 않은 경우에 예상되는 생존과 비교하여 생존을 연장시키는 것을 또한 의미할 수 있다. 또한, 치료는 1회 용량의 투여에 의해 발생할 필요가 없고, 일련의 용량의 투여 시에 종종 발생한다. 따라서, 치료상 유효량, 완화에 충분한 양, 또는 질환, 장애 또는 병태의 치료에 충분한 양이 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다.
"질환(disorder)"이라는 용어는 본 발명의 유전자도입 동물 모델을 사용하여 동정되는 분자를 이용하여 치료하는 것으로부터 이익을 얻을 수 있는 어떤 상태이다. 이것은 포유류를 의문의 질환에 걸리기 쉽게 하는 병리학적 조건들을 포함한 만성과 급성 질환들 또는 질병들을 포함한다. 본 명세서에서 다루어질 질병들의 예들은, 이에 제한되는 것은 아니나, 암 등이다.
"치료상 유효량"은 치료될 장애의 증상의 경감이 포함되는, 연구원, 수의사, 의사 또는 기타 임상의학자에 의해 추구되는 조직, 시스템, 대상 또는 인간에서의 생물학적 또는 의학적 응답을 도출할 조성물 내의 활성 화합물의 양을 의미한다.
"유전자 치료(gene therapy)"는 돌연변이를 일으킨 유전자를 정정하여 유전병을 치료하거나, 유전자 혹은 RNAi를 이용하여 단백질 발현을 조절하여 질병을 치료하는 것을 말한다. 즉 환자의 세포에 외부에서 정상유전자를 이식하여 그 세포의 표현형을 변화시킴으로써 병을 치료하는 방법이다.
"약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 핵산(nucleic acid)의 세포 내 전달(transfection)에 관한 것으로, 특히, 전신투여에 의한 siRNA의 체내(systemic) 전달 효율을 높이기 위한 전달체 및 방법에 관한 것이다.
본 발명은 일 관점에서 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 폴리(올리고-아르기닌), 특히 R9(arginine) 펩타이드를 포함하는, 전신순환용 비바이러스성 siRNA 유전자 전달체 또는 벡터; 및 이의 이용 방법에 관한 것이다.
비바이러스성 유전자 전달 벡터는 바이러스를 이용하지 않고 유전자를 세포내로 운반하는 캐리어를 총칭하는 의미로서, 유전자를 구성하는 핵산이 음전하를 띠는 성질을 이용하여 양이온상의 양이온 부위와 핵산상의 음이온 부위의 전기적 상호작용을 이용하여 핵산을 코팅하는 형태의 벡터가 대표적인 예이다.
본 발명의 폴리(올리고-아르기닌)은 폴리(올리고-L-아르기닌)과 폴리(올리고-D-아르기닌)을 포함하며, 그 중에서도 폴리(올리고-D-아르기닌)인 것이 가장 바람직하다. 고분자량 폴리(올리고-D-아르기닌)은 DNA 의 응축을 효과적으로 촉진하여 안정한 복합체 및 DNA 의 세포 내로의 내재화를 형성하고, 내재화 후에는 복합체가 이황화결합의 환원에 의하여 엔도좀으로부터 세포질 공간으로 탈출하게 된다.
본 발명의 환원성 폴리(올리고-D-아르기닌)은 이황화물로 가교된 말단 시스테인을 포함하는 양이온성 올리고머로 구성된 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 시스테인은 인접하는 다른 시스테인 분자와 이황화 가교(cross-linking)를 형성하는 설프하이드릴기를 함유하는 유일한 아미노산으로서, 이황화물로 가교된 말단 시스테인 이외의 단백질 전달 도메인(PTD) 부분은 임의의 양이온성 펩타이드가 될 수 있다.
더욱, 바람직하게는 본 발명의 환원성 폴리(올리고-D-아르기닌)은 한쪽 말단 또는 양쪽 말단에 Cys가 결합되어 있는 것을 특징으로 한다. 가장 바람직하게는 양쪽 말단에 Cys가 결합되어 있는 형태가 좋다. 예를 들어, Cys-(D-R9)-Cys 또는 Gly-(D-R9)-Cys 반복 단위로 구성될 수 있다. 이러한 환원성 폴리(올리고-D-아르기닌)은 Cys-(D-R9)-Cys 또는 Gly-(D-R9)-Cys 반복 단위의 말단 시스테인-티올기의 DMSO 산화 과정에 의하여 제조될 수 있으며, 환원시약으로써 Cys-(D-R)9-Cys 로 단편화될 수 있다.
즉, 본 발명의 환원성 폴리(올리고-아르기닌)은 9개의 아르기닌(R9)으로 구성된, 한쪽 말단 또는 양쪽 말단에 Cys가 결합되어 있는 구조, 바람직하게는 Cys-(D-R9)-Cys 또는 Gly-(D-R9)-Cys 구조, 가장 바람직하게는 Cys-(D-R9)-Cys를 가지는 것을 특징으로 한다. 이처럼 Cys가 양쪽 말단에 위치함으로써 올리고 펩토플렉스(펩타이드 복합체, peptoplex)의 효과적인 응축 및 이에 따른 복합체의 중성 전하 특성을 보유할 수 있게 되는 것이다.
본 발명의 유전자 전달체는 전신순환(systemic circulation)을 위해, 한쪽 말단 또는 양쪽 말단에 Cys가 결합되어 있는 R9(arginine) 구조체에 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 결합시키는 것을 특징으로 한다.
이러한 구성을 가지는 본 발명의 전달체에 대해서 본 발명 명세서에서는 "PEG-R9"의 약어로 기재하기도 한다. 즉, 본 발명에서 PEG-R9는 한쪽 말단 또는 양쪽 말단에 Cys가 결합되어 있는 R9(arginine)의 하나 이상의 말단에 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 결합시킨 구조체를 일컫는다. 단, 비교예에서 Cys의 결합효과를 알아보기 위한 실험에서는 Cys를 별도로 표기하였다.
단백질의 페길레이션(PEGylation)은 전달 유전자의 전신순환 효율 향상을 위해 사용한 방법으로, 단백질의 4가지 반응기(functional group)를 통하여 주로 접합반응이 일어나는데, 이들을 각각 카프복실 페길레이션(Carboxyl PEGylation), 아민 페길레이션(Amine PEGylation), N-말단 페길레이션(N-terminal PEGylation), 티올 페길레이션(Thiol PEGylation)이라고 한다.
본 발명에서는 한쪽 말단 또는 양쪽 말단에 Cys가 결합되어 있는 R9 펩타이드 구조, 예를 들어, Cys-(D-R9)-Cys 또는 Gly-(D-R9)-Cys 펩티드 구조를 기반으로 하고 있고, Cys의 아민 페길레이션(Amine PEGylation)을 사용하였다.
한편, 본 발명의 PEG-R9 벡터는 핵산의 체내 전달에 효율적이다. 그 중에서도 siRNA의 효율적인 체내 전달에 매우 바람직하다.
RNA 간섭(RNAi)은 이중 나선의 짧은 간섭 RNA(siRNA)에 의해 대상 유전자의 발현을 특이적으로 하향 조절시키는 것을 포함하는 자연적인 기작으로서, 이러한 RNAi를 매개하는 RNAi 시약의 타입에 대한 예로, siRNA(짧은 간섭 RNA) 또는 miRNA (마이크로RNA) 또는 소형 헤어핀 RNA (shRNA)를 들 수 있고, 본 발명은 이 중에서도 특히, siRNA(짧은 간섭 RNA)의 체내 전달에 바람직하다.
종래 체내 siRNA 전달에 사용된 리포솜은, 전신순환을 목적으로 하는 다른 입자형 약물전달체의 경우와 마찬가지로 혈중 단백질의 흡착으로 인해 간이나 비장에 많이 존재하는 대식세포의 식작용(phagocytosis)에 의해 순환계에서 소실되거나, 혈중 순환과정 중 리포솜으로부터 약물이 유출되는 문제점을 가지고 있었다. 특히, 대식세포의 식작용은 리포솜 표면에 옵소닌 단백질(opsonic protein)의 흡착을 통해 발생하기 때문에 이러한 문제점을 해결하는 기술로서 인지질의 말단에 PEG(poly[ethylene glycol])을 결합시킨 인지질-PEG유도체를 리포솜의 구성성분으로 사용하거나, 제조된 리포솜의 표면을 PEG 또는 다당류 등으로 코팅함으로써 옵소닌 단백질의 흡착을 억제할 수 있는 리포솜이 개발되었다.
그러나 이러한 인지질-PEG유도체를 리포솜의 구성성분으로 사용하는 경우에 리포솜의 자체 안정성이 떨어지는 문제점이 있으며 트랜스팩션 효율이 낮고, 독성을 나타내기 때문에 생체 내 투여를 위한 in vivo 적용이 어려웠다. 그리고, 투여 후 대부분이 간으로 가게 되어 간 대비 종양에 대한 분포도가 낮은 문제점 또한 존재하였다.
이에 반해, 본 발명의 PEG-R9의 구조체, 가장 바람직하게는 PEG-Cys-R9-Cys 구성은 상기와 같은 문제점 없이 siRNA의 전신 순환(systemic circulation)에 매우 효과적이다.
본 발명은 다른 관점에서, 폴리에틸렌글리콜(PEG); R9(arginine) 펩타이드; 및 siRNA로 구성되는, 전신 순환용 siRNA 전달용 복합체; 및 이를 포함하는 목적 질환 치료용 조성물에 관한 것으로, 상기 유전자 전달체에 목적 유전자 siRNA가 결합된 구성에 관한 것이다. 이 때, R9 펩타이드는 한쪽 말단 또는 양쪽 말단에 Cys가 결합되어 있는 것이 바람직하다.
본 발명의 복합체가 전달하는 유전자 siRNA로는, 목적하는 치료를 위한 바람직한 임의의 siRNA를 삽입할 수 있고, 이들은 자연에 존재하거나 합성될 수 있으며, 크기에 있어서 올리고뉴클레오티드에서 크로모좀까지 다양한 크기로 존재할 수 있다. 이들 유전자는 인간, 동물, 식물, 박테리아, 바이러스 등으로부터 기원된다. 이들은 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 획득될 수 있다.
또한 상기 복합체는 목적하는 질환, 예를 들의 암의 치료 유전자 발현조절인자, 예를 들면 전사프로모터, 인헨서, 사일렌서, 오퍼레이터, 터미네이터, 어테뉴에이터 및 기타 발현조절인자 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로서, 폴리에틸렌글리콜(PEG); R9(arginine) 펩타이드; 및 목적하는 질환 치료용 siRNA로 구성되는 siRNA 전달용 복합체를 포함하는 목적 질환 치료용 조성물을 제공할 수 있다.
일부 구현예에서, siRNA는 핵산 벡터 (일반적으로 재조합 벡터 또는 발현 벡터로 언급되기도 함) 내로 삽입된 전사 단위로부터 발현된다. 벡터를 사용하여 siRNA를 암호화하는 핵산 분자를 세포 내로 전달하여 특이 유전자를 표적화할 수 있다.
이 외에도, 적합한 다수의 방법이 본 기술분야에서 공지되어 있다. 일반적으로, 표적 유전자를 발현하는 세포에 형질감염시키는데,형질감염을 위해서는 예를 들어, 일렉트로포레이션 (electroporation), 형질감염을 위한 헬퍼로서 양이온성 리피드 또는 양이온성 폴리머의 사용과 같은 다양한 방법이 사용될 수 있다. 그 후, 세포를 표적 유전자의 발현을 가능하게 하는 적합한 조건 하에서 배양한다. 이어서 표적 유전자의 발현을 예를 들어, RT-PCR 또는 리포터 유전자의 양의 측정과 같은 적합한 기술을 사용하여 측정한다. 기본적으로, 어떤 종류의 세포라도 형질감염전환을 위해서 사용될 수 있지만, 바람직한 구체예에서 세포는 진핵세포, 바람직하게는 동물 세포, 더욱 바람직하게는 포유동물 세포, 가장 바람직하게는 인간 세포이다.
본 발명의 일 실시예에서는 siRNA로서 항암용 siVEGF를 이용하였다.
VEGF(혈관내피성장인자)는 갑상선암, 유방암, 전립선암, 대장암, 자궁경부암 등 대부분의 암(종양) 세포에서 과발현되는 인자로써, 암의 발생, 재발, 전이 등과 밀접하게 관련되어 있다. 그러므로, siVEGF를 효율적으로 암세포에 전달할 수 있는 본 발명의 PEG-R9 전달체를 항암 용도로 유용하게 사용할 수 있을 것이다.
본 발명에 따른 복합체 또는 조성물의 치료적 유효량은 공지의 투여 경로에 의하여 제공될 수 있다. 본 발명에 따른 구현예는 PEG-R9-siVEGF를 암세포 내로 형질감염시킬 수 있도록 적용된다.
본 발명의 조성물은 이에 제한되지 않으나 유전자 물질을 표적 세포 내로 형질감염시키기 위한 상기한 수단들 중 임의의 것을 포함 또는 이용할 수 있다. 상기 siRNA이 암세포 내로 방출될 수 있도록 양이온성 양친매성 물질을 추가로 포함할 수도 있다.
그리고, 본 발명의 핵산 분자 및 촉진제는 통상적인 약학 합성 기법에 따라 제조되는 약학 조성물로 제형화 될 수도 있다.
조성물은 활성 제제 또는 활성 제제의 약학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다. 상기 조성물은 동시적, 또는 연속적으로 투여될 수 있다. 이들 조성물은 하나의 활성 물질 이외에, 당업계에 잘 알려진 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 버퍼, 안정화제 또는 다른 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질들은 비독성이어야 하며 활성 성분의 효능을 방해해서는 안된다.
담체는 투여를 위해 바람직한 제제 형태, 예를 들어, 국소형, 정맥내, 경구, 뇌막, 신경상막 또는 비경구인지에 따라 다양한 형태를 취할 수 있다. 일반적으로 충진제, 확장제, 결합제, 습윤제(wetting agent), 붕해제(disintegrating agent), 계면 활성제와 같은 희석제, 부형제와 혼합함으로써 경구 또는 비경구 투여용으로 제조할 수 있다.
상기 복합체 및 복합체를 포함하는 조성물의 투여에 효과적인 투여량 및 계획은 경험적으로 결정할 수 있고, 당업자가 적절하게 결정할 수 있다. 단일 또는 다중 투여량을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, siRNA의 체내 전신 순환을 위한 PEG-R9 기반의 전달체 및 복합체는 다음과 같은 장점을 가진다.
(1) 본 발명의 "PEG-R9"은 siRNA와 접합체 형성이 잘 되고 이의 보호 효과가 우수하다.
본 발명의 PEG-R9의 트랜스펙션 효율은 6:1의 전하 비율 이상에서 PEG-R9과 유전자 siRNA의 응축이 잘 일어나기 때문에, 6:1 ~ 15:1의 전하비율(+/-), 더욱 바람직하게는 9:1 ~ 15:1의 전하비율(+/-)을 가지는 것이 좋다. 특히, 일 구체예에서 본 발명의 전달체는 전하비율 12:1에서 가장 높은 유전자 트랜스펙션 효율을 보였다.
본 발명에서 상기 전하비율이란, 유전자(핵산)의 구성성분 중 인산(phosphate)이 음전하를 띠고 있고 전달체의 구성성분 중 아르기닌이 양전하를 띠고 있는데 유전자가 가지고 있는 음전하를 1로 기준으로 삼은 다음 반응시킬 전달체의 양을 6배 ~ 15배 높여서 유전자와 반응시키는 비율을 의미한다. 즉, 6:1 ~15:1의 전하비율을 가지는 것은 목적 유전자보다 전달체의 양을 6배~15배로 크게 구성하는 것을 말한다.
이는 세포막이 음전하를 띠고 있기 때문에, 유전자 전달 복합체가 전체적으로 양전하를 띠고 있을 때, 전달효율이 우수하기 때문이다. 복합체가 음전하를 띠는 경우는 세포막을 쉽게 통과하지 못하는 반면 양전하를 띠는 경우는 전하대 전하 반응으로 쉽게 세포막을 통과할 수 있는 것이다. 또한, 전하량은 세포막 투과능에 영향을 끼치는데, 전하량이 높을수록 세포막을 통과할 수 있는 능력도 커지게 된다.
한편, 통상적으로 사용되고 있는 양이온 담체 PEI와 비교하여 본 발명의 PEG-R9는 훨씬 높은 유전자 발현 효율을 가진다. 즉, PEG-R9에 의해 더욱 효과적인 siRNA 응축 능력을 나타내었고, 적정 전하 비율에서 혈청에서 DNA 가 분해(degradation)되지 않도록 보호하였다.
(2) 본 발명의 "PEG-R9"은 siRNA와 결합하여 나노 사이즈 크기의 복합체를 형성하고 양(positive)의 제타 포텐셜 값을 가진다.
PEG-R9은 siRNA와 결합하는 경우, 정전기적 상호작용에 의해 보다 효과적으로 DNA를 농축한다. 본 발명의 R9 양 말단에 Cys 구조를 포함하는 경우, 중성 조건에서 양성 전하를 나타내어 효과적으로 복합체를 나노크기 사이즈로 농축할 수 있고(약 200 nm 이하), 전하 비율 약 5 이상의 양(positive)의 제타 포텐셜을 가질 수 있는 것이다.
앞서 설명한 바와 같이, 복합체가 음전하를 띠는 경우는 같은 음전하를 가지는 세포막을 쉽게 통과하지 못하는 반면 양전하를 띠는 경우는 전하대 전하 반응으로 쉽게 세포막을 통과할 수 있으므로, 본 발명의 양(positive)의 제타 포텐셜 값을 가지는 특성은 유전자 전달효율이 우수함을 시사한다.
특히, 본 발명의 실시예를 통해 PEG를 결합하지 않았을 때보다 PEG를 결합한 복합체의 입자 크기가 더 작다는 점; 및 R9의 양쪽 말단에 시스테인(cyctein, Cys)을 결합시킨 경우 입자의 크기가 더 작고 균일하다는 점을 확인하였다. 즉, 본 발명의 가장 바람직한 형태는 R9 올리고펩타이드 양 말단에 시스테인이 결합되어 있고, 나아가 이에 PEG를 결합시킨 구성인 것이다.
(3) 본 발명의 “PEG-R9”은 세포 내 siRNA 전달효율 및 발현율이 우수하고, 세포독성이 없다..
다른 유전자 전달체인 TAT보다 본 발명의 R9에 Cys 및 PEG를 결합한 경우가 siRNA 전달 효율이 더욱 높음을 확인하였고(도 8), 루시페라제 DNA를 이용하여 세포 내 발현율도 높음을 확인하였다(도 6).
또한, 통상의 고분자 양이온 담체 PEI 등과 비교하여, 본 발명의 PEG-R9는 생체 내에서 이용할 수 있을 정도로 세포 독성이 낮다. 본 발명의 일 실시예에서는 PEG-R9은 독성의 PEI와 비교하여 95% 이상의 세포 생존능을 보였다(도 6).
(4) 본 발명의 “PEG-R9’은 siRNA의 체내 순환시간을 증가시킴으로써, 뛰어난 항암효과를 나타낸다.
본 발명의 실시예에서 PEG-R9과 siRNA 접합체를 누드 마우스에 정맥 주사하여 관찰한 결과, 유의하게 암세포 성장이 억제됨을 확인하였다.
요컨대, 본 발명의 PEG-R9 및 PEG-R9-siRNA는 높은 트랜스펙션 효율, 낮은 세포독성, 높은 목적 유전자 발현 효율을 가지는, 체내 전신 순환이 효과적인 siRNA 전달 시스템으로 사용될 수 있다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다
실시예 1: PEG -R9- siRNA 복합체 형성
폴리에틸렌글리콜과 올리고 아르기닌의 접합체를 이용한 핵산 전달체 모식도를 도 1에 도시하였다.
Cys-(D-R9)-Cys 구조에서 Cys의 아민기(-NH2)에 N-Hydroxysuccinimide (NHS) ester PEG (분자량 500, Thermo Fisher Scientific Inc. Rockford, IL USA)이 결합되는 구조를 지닌다. pH 7 ~ 8 정도의 약간 염기성인 조건에서 펩타이드와 NHS ester PEG를 반응비 1 : 1로 반응시키면 펩타이드 결합이 일어난다.
siVEGF (5-AUGUGAAUGCAGACCAAAGAA dTdT-3)는 바이오니아로부터 구입하고, 펩타이드 (PEG-Cys-(D-R9)-Cys)는 애니젠으로부터 합성주문하였다.
50 pmol siVEGF, 탈이온수 및 PEG-R9 (전하비율: 6, 9)를 20분 동안 상온에서 배양하여 올리고 펩토플렉스(oligo-peptoplexe)를 제작하였다. 배양시킨 후, 2% 아가로즈 젤(agarose gel)에 100V로 20분 동안 전기영동 시킨다. 또한, siVEGF와 PEG-R9을 배양시킨 후, 마우스 혈청을 부피비 90%로 첨가하여 안정성 테스트를 24시간까지 실시하였다. 헤파린을 첨가하여 PEG-R9과 siVEGF를 분리하여 siVEGF의 밴드가 유지되는지 확인하였다.
그 결과, 도 2에 도시한 바와 같이, PEG-R9 형태에서도 핵산과의 접합체 형성이 잘되며, 혈청에 대해 핵산의 보호 효과가 우수함을 확인할 할 수 있었다.
실시예 2 : PEG -R9- siRNA 복합체 크기 및 제타 포텐셜
PEG-R9/siVEGF 올리고-펩토플렉스(복합체)의 제타 포텐셜 및 평균 직경을 DLS(dynamic light scattering)을 이용하여 측정하였다.
5 μg siVEGF , 탈이온수 및 PEG-R9 (전하비율: 6, 9, 12, 15)를 30분동안 상온에서 배양하여 올리고 펩토플렉스(oligo-peptoplexe)를 제작하였다. 상기 올리고 펩토플렉스의 평균 직경 및 표면 제타 포텐셜을 Zetasizer-Nano ZS (Malvern Instruments, UK) 구비 DLS를 사용하여 측정하였다
그 결과 도 3에 나타낸 바와 같이, 전하 비율 6 이상에서 제타 포텐셜은 양(positive)의 값을 나타냈고, 전하 비율 6 이상에서 평균 직경은 200nm 미만이었다. 전하 비율 12에서 평균 직경이 가장 작게 나타났다(100nm).
실시예 3: PEG -R9의 세포내 전달( 트랜스펙션 ) 효율 평가
PEG-R9에 사용한 R9은 C-(D-R9)-C의 구조로 PEG와 결합되어 있다. C-(D-R9)-C의 구조가 최적인지 확인을 하기 위하여 다음의 군을 비교하였다. G-(D-R9)-G, G-(D-R9)-C, C-(D-R9)-G, C-(D-R9)-C의 전달체와 루시페라아제(Luciferase) DNA의 복합체를 형성하여 세포에 트랜스팩션 효율을 평가하였다. 본 실시에서 사용한 복합체는 전하비율 1:5 형성하여 진행하였다.
그 결과는 도 4에 도시하였다.
이중 C-(D-R9)-G와 C-(D-R9)-C 구조에서 트랜스팩션 효율이 높게 나타났으며, 이 중 C-(D-R9)-C를 선택하여 효율을 평가하였다.
실시예 4: PEG -R9의 세포내 전달( 트랜스펙션 ) 효율 평가
Flow cytometry (FACS)를 이용하여 PEG-R9/FITC-siVEGF의 세포내 투과율을 평가하였다. FITC-siVEGF는 바이오니아로부터 구입하였다.
우선, Squamous Cell Carcinoma (SCC7) 세포를 ATCC로부터 구입하여 분화를 유도하였다. SCC7 세포를 RPMI 1640, 10% FBS, 1% 페니실린 및 스트렙토마이신 보충된 완전 배지에서 37℃, 5% CO2 대기 하 배양하였다. 세포들을 일주일에 3회 계대 배양하였다.
수득한 SCC7 세포를 12 웰 플레이트에 1 × 105 으로 씨딩하였다. 세포들을 씨딩한지 24시간 후에, FITC-siVEGF 100 pmol과 PEG-R9(전하비율: 8, 15, 23)으로 복합체를 형성하고 트랜스펙션하였다. PEI 복합체를 전하 비율 8에서 대조군으로 사용하였다. 배양 4시간 후, 세포들을 PBS로 세척하고 트립신 처리하여 수득하고 1.5 ml 마이크로 튜브로 옮긴 후 1,300 rpm에서 3분 동안 원심분리하였다. FACS(Fluorescence Activated Cell Sorter) 버퍼로 세척한 뒤, FACS로 측정하였다.
그 결과, 이하 표에 기재한 바와 같이, PEG-R9/FITC-siVEGF가 양성 대조군인 PEI/FITC-siVEGF 만큼 세포내 전달효율이 높은 것을 확인할 수 있었다.
Figure 112013047166642-pat00001
실시예 5: PEG -R9의 발현 효율 및 독성 평가
루시퍼라아제 분석 키트로 루시퍼라아제 유전자 발현을 측정하였고, MTT 분석으로 세포 생존능 분석을 수행하였다.
루시퍼라아제 분석 키트를 Promega(USA)로부터 구입하고, DC 단백질 분석 키트 및 소혈청 알부민 스탠다드를 Bio-Rad Laboratories(USA)로부터 구입하였다. SCC7 세포를 24 웰 플레이트에 2 × 104 으로 씨딩하였다. 씨딩한지 24시간 후에, 세포들을 플라스미드 루시퍼라아제 4 μg과 전하비율 12의 R9 및 PEG-R9 복합체를 트랜스펙션하였다.
PEI 복합체를 전하비율 8에서 대조군으로 사용하였다. 배양 48시간 후, 세포들을 PBS로 세척하고 150 μl의 1x cell 용해 버퍼 시약을 20분 동안 처리하였다. 세포 용해물을 긁어내어 수득하고 1.5 ml 마이크로 튜브로 옮긴 후 13,000 rpm에서 3분 동안 원심분리하였다. 세포 용해물의 형광도(luminescence)를 20초 이ㅌ네그레이션(integration)으로 96-웰 플레이트 광도계(Berthold Detection Systems, Germany)로 측정하고 세포 단백질의 mg 당 RLU(relative luminescence units)값으로 표현하였다.
소혈청 알부민 스탠다드를 사용하는 DC 단백질 분석키트로 단백질을 결정하였다. 위의 방법을 통하여 PEG500 및 PEG1000의 비교하였고, 최적의 PEG를 선정하였다.
그 결과를 도 5에 도시하였다. 세포내 도입 효율을 평가한 결과 PEG 500이 PEG 1000과 비교하여 더 우수한 유전자 전달 효능을 보였는 바, PEG 500을 본 발명의 실험에 사용하였다.
한편, 세포 생존능을 MTT [3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide] 분석법으로 측정하였다.
SCC7 세포들을 24 웰 플레이트에서 배양시키고, 규정된 전하비율에서 R9, PEG-R9 및 PEI 복합체로 처리하였다. 트랜스펙션 48시간 후, 50 μl MTT 시약 및 500 μl 배지를 각 웰에 첨가하고 3시간 동안 37℃에서 배양하였다. 상기 배양 배지들을 제거하고 500 μl 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 각 웰에 첨가하고 상온에서 20분 동안 배양하였다. 흡광도를 570nm에서 측정하였다.
그 결과를 도 6에 도시하였다.
세포내 유전자 전달 효율을 Luciferase assay를 통하여 확인한 결과 PEG-R9은 유전자를 세포내로 잘 전달하여 발현하는 것으로 나타났고, 또한 세포독성이 타 유전자 전달체 (ex. PEI) 와 비교하여 매우 낮음을 알 수 있었다.
비교예 1 : siRNA 전달을 위한 최적의 전달체 확인
또한, siVEGF 및 다양한 종류의 전달체를 접합한 후, 이의 크기 및 제타 포텐셜 분석을 통해 siRNA 전달을 위한 최적의 전달체를 찾고자 하였다.
cys-R9-cys, PEG-R9, PEG-cys-R9-cys의 각 경우; 및 PEG-cys-R9-cys, PEG-TAT, PEG-cys-TAT-cys,를전달체군 및 로 사용하여 비교하였다.
그 결과를 도 7 및 도 8에 도시하였다.
우선, PEG를 결합하지 않았을 때보다 PEG를 결합한 전달체의 입자 크기가 더 작았으며, R9의 말단에 시스테인이 없을 경우에는 입자의 크기가 오히려 다소 커지는 것을 확인하였다(도 7). 이를 통해,R9의 양 말단에 시스테인이 결합되어 있고, 나아가 PEG를 결합하는 경우 siRNA와 결합률이 가장 향상됨을 알 수 있었다.
또한, TAT을 사용하여 R9과 유전자 결합 능력을 비교 평가한 결과, TAT보다 R9에 PEG를 결합하였을 때가 siRNA 전달을 위한 최적의 전달체임을 알 수 있었다(도 8)
이처럼, 상기 실험을 통해, 본 발명의 R9의 말단에 시스테인(cyctein) 및 PEG가 접합되어 있는 경우에 siRNA와의 결합이 가장 효율적이고, 나노입자의 크기도 균일함을 알 수 있었다.
실시예 6: PEG - R9 - siVEGF 의 항암 효능
7주령 누드마우스의 뒷다리 쪽에 SCC7 세포를 2 × 106 으로 주입하여 암 모델을 유도하였다. 종양의 부피가 100mm3 이상이 되면 치료를 시작하였다. siVEGF 10 μg과 규정된 전하비율에서의 PEG-R9, R9 및 PEI 복합체를 tail vein으로 일주일에 세 번 2주 동안 투여하였다. 각 군별 누드마우스의 수는 5마리였다.
그 결과, 도 9 및 도 10에 나타난 바와 같이, 누드마우스에 암을 이식하고 tail vein으로 siVEGF 복합체를 투여하였을 때, PEG-R9/siVEGF 투여군에서 다른 군과 비교하여 종양의 성장 속도가 느린 것을 확인함으로써 항암 효과를 증명하였다.

Claims (14)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 폴리에틸렌글리콜(PEG); R9(arginine) 펩타이드; 및 siRNA로 구성되고, 6:1 ~ 15:1의 전하비율(+/-)을 가지는 것을 특징으로 하는 전신 순환용 siRNA 전달용 복합체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 R9(arginine) 펩타이드는 한쪽 말단 또는 양쪽 말단에 Cys가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 복합체
  6. 제5항에 있어서, 상기 R9(arginine) 펩타이드는 Cys-(D-R9)-Cys 또는 Gly-(D-R9)-Cys 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 복합체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 R9(arginine) 펩타이드는 Cys-(D-R9)-Cys 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 복합체.
  8. 제4항에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜(PEG)은 분자량 500 달톤의 PEG 500인 것을 특징으로 하는 복합체
  9. 제4항에 있어서, 상기 복합체는 100-200 ㎚의 직경을 가지는 것을 특징으로 하는 복합체.
  10. 삭제
  11. 제4항에 있어서, 상기 복합체는 12:1의 전하비율(+/-)을 가지는 것을 특징으로 하는 복합체.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
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