KR100825519B1 - 키토산 기재 고분자 접합체 및 그 제조방법 - Google Patents

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오유경
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Abstract

본 발명은 특정 목적의 핵산 의약의 세포내 전달을 위하여 양이온성 고분자 키토산을 주형으로 한 폴리아민고분자와의 접합체 및 그 제조방법에 관한 것으로, 상세하게는 고분자 및 저분자 키토산(Chitosan) 및 폴리아르기닌(Poly-L-Arginine) 등의 폴리아민이 공유결합으로 연결된 키토산-폴리아민 2중 접합체, 이에 추가적으로 폴리에틸렌글리콜(Polyethyleneglycol, PEG)이 첨가된 키토산-폴리아민-폴리에틸렌글리콜 3중 접합체, 이들의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 키토산 기재 고분자 접합체들은 플라스미드 데옥시리보핵산, 작은 간섭 리보핵산 등 음전하를 띤 핵산소재 의약과 하전도에 의한 접합체를 형성하여, 목적하는 핵산 의약들을 세포 내로 수송하는 효율을 높일 수 있을 뿐 아니라 세포 독성을 감소시킴으로써 핵산 소재 의약들을 생체 또는 세포 내로 투여하는 효율적인 전달체로서 유용하게 사용 가능할 것이다.
키토산 기재 고분자 접합체, 핵산의약 전달, 작은 간섭 리보핵산

Description

키토산 기재 고분자 접합체 및 그 제조방법{A CHITOSAN BASED POLYMER CONJUGATE AND A METHOD FOR PRODUCING THE SAME}
도 1은 키토산-폴리아르기닌 접합체의 1H NMR 결과를 나타낸 것이고,
도 2는 프탈릭산으로 반응기가 보호된 프탈로일 키토산의 1H NMR 결과이며,
도 3는 5`-mPEG2K-프탈로일-키토산 접합체의 1H NMR 결과이고,
도 4는 프탈릭산의 디프로텍팅(deprotecting) 후의 5`-mPEG2K-키토산 접합체의 1H NMR 결과이며,
도 5는 5`-mPEG2K-키토산-폴리아르기닌 접합체의 1H NMR 결과이다.
도 6은 키토산, 폴리아르기닌, 키토산-폴리아르기닌과 작은간섭 리보핵산 복합체의 전기영동상의 특징을 나타내는 것이고,
도 7은 각종 양이온성 고분자 전달체들의 간암세포주(hepa 1-6)로의 리보핵산 전달 효율을 형광표지 리보핵산을 이용하여 형광현미경으로 비교 평가한 것이고,
도 8은 각종 양이온성 고분자 전달체들의 점막 상피 세포주 (VK2 cell)로의 작은 간섭 리보핵산 전달 효율을 형광표지 리보핵산을 이용하여 형광현미경으로 비 교 평가한 것이고,
도 9는 키토산 고분자 접합체의 작은 간섭 리보핵산 세포 전달 효율을 세포내 표적 단백질의 발현 간섭 효능을 지표로 하여 평가한 것이고,
도 10은 키토산 고분자 접합체와 작은 간섭 리보핵산 복합체의 간암 세포주 (Hepa 1-6 cell) 에서의 세포 독성을 평가한 것이고,
도 11은 키토산 고분자 접합체와 작은 간섭 리보핵산 복합체의 상피 세포주 (VK2 cell) 에서의 세포 독성을 평가한 것이며,
도 12는 키토산 고분자 접합체와 복합체 형태로 투여된 작은 간섭 리보핵산의 혈중 체류성을 다른 양이온성 고분자 전달체를 사용하여 투여한 경우와 비교 평가한 것이다.
본 발명은 작은 간섭 리보핵산(small interfering RNA), 플라스미드 디옥시리보핵산 (DNA)등 핵산 소재 의약(gene medicine)의 생체 투여 및 세포내 전달을 위한 키토산 접합체 및 그 제조방법에 관한 것으로, 상세하게는 다양한 분자량의 키토산(chitosan)을 주형으로 하여 폴리아르기닌(poly-L-arginine)과 결합시킨 이중 접합체, 또는 이들 접합체에 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol, PEG)이 추가된 삼중 접합체 및 그 제조방법에 관한 것이다.
일반적으로 핵산 소재 의약(gene medicine)들은 그 구조적 특징으로 인하여 음이온을 띠고 있으며, 따라서 양전하를 보유한 폴리에틸렌이민, 폴리라이신 등의 양이온성 고분자들이나 양전하 지질을 사용한 인지질 나노입자들이, 작은 간섭 리보핵산이나 플라스미드 디옥시리보핵산의 음이온성 하전과 복합체(complex)를 형성하여 생체내로 전달하는 전달체로서 연구되어 왔다.
양이온성 인지질 나노입자의 경우, 인지질 조성에 양전하를 띄는 지질을 일정 비율로 혼합하여 양이온성 리포솜(cationic liposome)과 같은 입자를 제조하고 이 입자를 유전자와 혼합하여 양전하 인지질 입자 및 유전자의 접합체를 세포주에 처리하여 유전자의 발현을 증강시키는 방법이 공개된 바 있다(미국특허 US 5,858,784호, 미국특허 US 20060008910A1). 양이온성 고분자의 경우, DEAE 덱스트란, 라이신 아미노산이 반복되는 구조의 폴리라이신, 에틸렌이민이 반복되는 구조의 폴리에틸렌이민, 폴리아미도아민 (polyamidoamine) (미국특허 제6,020,457호), 폴리아민에스테르(poly-amino-ester) (미국특허 US 20040071654A1), 생분해성 양이온 공중합체(미국특허 US 20060093674A1) 등이 유전자의 수송체로 연구되어 왔다.
합성 고분자를 이용한 유전자 전달 방법은 렌티바이러스, 아데노 바이러스 또는 레트로바이러스 벡터 등을 사용한 바이러스성 유전자 수송체에 비하여 제조방법이 간편하고, 전달하려는 유전자의 크기 제한을 받지 않으며, 바이러스 벡터의 표면 단백질의 면역원성으로 의해 유발되는 반복투여시의 면역부작용이 적으며, 바이러스 자체가 소유하는 유전자에 의한 체내 안전성 문제가 제기되지 않으며, 제조 비용 및 공정 단계에 있어서도 상업적으로 매우 유리한 장점이 있다. 그러나 이들 양이온성 고분자를 이용한 수송체는 세포 표면의 수용체를 통하여 세포 내부로 효과적으로 수송되는 바이러스성 수송체에 비하여 체내 세포 내로의 수송 효율이 낮으며, 세포 내로의 유전자 전달과정에서 유발될 수 있는 세포에 대한 독성 등에 문제점이 지적되어 왔다(J. Control . Release (2006) 114, 100-109). 또한 생체 내에서 복합체를 형성하여 전달된 유전자의 혈중 반감기를 크게 연장시키지 못하는 단점이 있다(Gene Ther . (2001) 8, 1857-1592).
양이온성 고분자 중 키토산은 다른 고분자들에 비하여 경제성이 높아 산업적 이용성이 높고, 생체 내 적합성이 우수한 장점이 있으나 유전자 전달체로서 연구들이 수행된 바 있으나 키토산의 용해도 문제, 세포 내로의 낮은 전달효율 등이 당분야에서 해결해야할 문제점으로 남아있다. 키토산의 용해도, 세포내 투과도 등을 개선하기 위하여 키토산에 폴리에틸렌글리콜을 결합시킨 고분자 접합체가 점막 투여용 유전자 전달체로 알려진 바 있다(미국특허 6,730,742, 2004년). 그러나, 단순한 폴리에틸렌 글리콜의 첨가만으로는 세포 내로의 핵산 의약 전달을 현저히 증가시키는데 제한이 있었다.
따라서, 본 발명자는 키토산 소재로 핵산 의약을 생체 내로 전달하는 효율 및 혈중 안정성을 증강시키기 위하여 예의 노력한 결과 키토산에 양이온성 고분자인 폴리아민을 결합시킨 2중 접합체 또는 이들 접합체에 생체적합성 고분자인 폴리에틸렌 글리콜이 추가된 3중 접합체를 사용하는 경우 세포 독성이 감소하며, 핵산 의약의 세포내 전달 효율이나 생체 내 혈중 체류를 현저히 증강시킬 수 있는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 세포들에서 독성을 감소시키고 세포 내로 목적하는 작은 간섭 리보핵산이나 플라스미드 데옥시리보핵산 등 핵산소재 의약의 세포 및 체내 전달효능을 증강시킬 뿐만 아니라 세포 독성이 감소된, 키토산 및 폴리아민이 공유결합으로 연결된 키토산소재 고분자 접합체 또는 이들 접합체에 추가적으로 폴리에틸렌 글리콜이 연결된 키토산 기재 양이온성 고분자 접합체를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 키토산 기재 양이온성 고분자 접합체를 포함하는 핵산 소재 의약의 생체 내 또는 세포 내 전달용 수송체 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 키토산 기재 양이온성 고분자 접합체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 키토산 기재 양이온성 고분자 접합체를 사용하여 핵산 소재 의약의 혈중 체류를 증강시키기 위한 전달체로서 사용하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로서 키토산 및 폴리아민이 공유결합으로 연결된 키토산 기재 고분자 접합체를 제공한다.
키토산은 폴리-[1,4]-β-D-글루코사민의 통상적으로 사용되는 명칭이며 무척 추의 갑각류를 비롯하여 곤충류의 외피성분, 균류의 세포벽 등에 많이 존재하는 천연고분자인 키틴을 고농도의 알칼리로 처리함으로써 N-탈아세틸화하여 제조되는 염기성 다당류이다. 본 발명에서 사용되는 키토산은 키틴으로부터 화학적으로 유도되거나 진균류의 세포벽, 곤충의 껍질 및 특히 갑각류로부터 유도되는 등 널리 입수가능한 소재로부터 저렴하게 유도될 수 있으며, 또한 시판품으로도 구입가능하다.
본 발명에서 사용되는 키토산은 다양한 분자량을 가진 키토산이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 5,000 내지 2,000,000의 분자량을 가진다. 본 발명의 구체적인 일 실시예로서, 본 발명자는 저분자량(Low molecular weight)-키토산(LMW-키토산; fw 50000~150000, Fluka, 스위스), 중간분자량-키토산(MMW-키토산; Aldrich, 190,000-310,000) 및 고분자량-키토산(HMW-키토산; Aldrich, 310,000-375,000, 또는 평균분자량 600,000 Fluka, 스위스)를 사용하여 본 발명의 키토산 소재 양이온성 고분자를 제조하였다.
본 발명에서 사용되는 폴리아민으로는 분자 내에 2 이상의 아미노기를 갖는 것이라면 어떠한 것이라도 상관없으며, 당해 기술분야에 널리 알려진 방법에 의해 제조하거나 시판품을 사용할 수 있다. 구체적인 양태로서, 본 발명에서 사용되는 폴리아민은 양전하를 띄는 성질을 지니며, 바람직하게는 양전하를 띄는 폴리아미노산, 더욱 바람직하게는 폴리아르기닌, 폴리히스티딘 또는 폴리라이신이다.
또한, 본 발명에서 사용되는 폴리아민은 500 내지 300,000의 분자량을 가지며, 상기 사용되는 폴리아민의 분자량은 폴리아민의 종류 등에 따라 달라질 수 있 다.
구체적인 일 실시예로서, 본 발명자는 분자량 15000 내지 70000 또는 70000 이상의 폴리-L-아르기닌(시그마, 미국), 분자량 5000의 폴리-L-히스티딘(시그마, 미국) 또는 분자량 9200의 폴리-L-라이신(시그마, 미국)을 사용하여 본 발명의 접합체를 제조하였다.
키토산과 폴리아민의 결합 반응 시, 키토산:폴리아민 반응 몰 비의 범위는 1:1 내지 1:10, 바람직하게는 1:1 내지 1:2 이다. 또한 키토산, 폴리아민, 폴리에틸렌글리콜 결합 반응에서의 키토산과 폴리에틸렌글리콜 반응 몰 % 비의 범위는 1:1 내지 1:50이며 바람직하게는 1:5 내지 1:25 이다.
바람직한 일 양태로서, 본 발명의 키토산 소재 양이온성 고분자 접합체에는 추가적으로 폴리에틸렌글리콜이 결합될 수 있다(즉, 키토산, 폴리아민 및 폴리에틸렌글리콜 3중 접합체).
본 발명에서 사용되는 폴리에틸렌글리콜은 키토산과 결합하기 위해 활성화되어야 한다. 폴리에틸렌글리콜과 같은 생체적합성 고분자의 활성화는 생체적합성 고분자의 말단기중 하나를 반응성 작용기(group) 또는 잔기(moiety)로 전환시켜 달성한다. 이러한 전환에 의한 생성물을 "활성화된 생체적합성 고분자"라고 한다. 예를 들면, 폴리(알킬렌옥사이드)를 약물에 결합시키기 위해 하이드록실 말단기중 하나를 카보네이트와 같은 반응성 작용기로 전환시킬 수 있으며 이에 따라 얻어진 생성물은 활성화된 폴리(알킬렌 옥사이드)가 된다.
여러 용매에 쉽게 용해될 수 있고 실질적으로 비항원성을 나타내는 고분자 쇄로서의 폴리에틸렌글리콜의 수 평균 분자량은 약 300 달톤 내지 약 100,000 달톤이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 약 1,000 달톤 내지 약 20,000 달톤이다. 본 발명의 폴리에틸렌글리콜은 이차 또는 삼차 분지화 하기 위해 가지달린 것일 수 있다. 또한, 이작용성 및 헤테로-이작용성 활성 폴리에틸렌글리콜의 에스테르가 사용될 수 있다.
또한, 바람직한 일 양태로서 본 발명에서 사용되는 폴리에틸렌글리콜은 키토산의 아미노기 또는 하이드록시기와 결합할 수 있다. 본 발명에서 상기 폴리에틸렌글리콜을 키토산의 특정 기능기에 결합시키기 위해, 키토산의 아미노기 또는 하이드록시기를 예를 들어 프탈릭 무수물과 같은 보호 물질로 보호한 후 폴리에틸렌글리콜을 결합시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 바람직한 일 양태로서, 본 발명의 접합체가 표적 장기에 더욱 특이적으로 도달할 수 있도록 본 발명의 키토산 기재 양이온성 고분자 접합체에는 추가적으로 당 성분(sugar moiety)이 수식될 수 있다. 수식될 수 있는 당 성분으로는 만노즈, 갈락토즈 및 글루코즈 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다. 구체적인 일 실시예로서, 본 발명자는 폴리에틸렌글리콜에 만노즈(mannose)를 결합시킨 키토산 소재 양이온성 고분자를 제조하였다.
본 발명의 또 다른 바람직한 일 양태로서, 본 발명의 키토산 기재 양이온성 고분자 접합체는 추가적으로 생체 또는 세포 내로 투여하여 전달하고자 하는 하나 이상의 핵산 소재 의약과 복합체를 형성할 수 있다. 바람직하게는 상기 핵산 소재 의약은 플라스미드 유전자 또는 작은 간섭 RNA 이다. 구체적인 일 실시예로서, 본 발명자는 쥐의 서바이빈(survivin) 유전자의 단백질 발현을 저해하는 서바이빈 특이적인 작은 간섭 리보핵산 서열을 키토산-폴리아르기닌 및 폴리에틸렌글리콜-키토산-폴리아르기닌 접합체와 복합체를 형성하게 하였으며, 이를 세포 내로 전달시킨 경우 높은 세포 내 전달 효율을 나타낼 뿐만 아니라, 세포 독성도 현저히 감소시킴으로써 다양한 세포들을 대상으로 목적하는 작은 간섭 리보핵산 유전자를 효과적으로 세포 내로 수송하고 발현시켰다.
따라서, 본 발명의 키토산 기재 고분자 접합체들은 플라스미드 유전자 또는 작은 간섭 RNA 등과 같은 음전하를 띄는 핵산 소재 의약과 하전도에 의한 접합체를 형성하여 목적하는 핵산 의약들을 세포 내로 수송하는 효율을 높일 수 있을 뿐 아니라 세포 독성을 감소시킴으로써 핵산 소재 의약들을 생체 또는 세포 내로 투여하는 경우 전달체로서 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 키토산 기재 양이온성 고분자를 포함하는, 핵산 소재 의약의 생체 내 또는 세포 내 전달용 수송체 조성물 또는 핵산 소재 의약의 혈중 체류 증가용 수송체 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 본 발명의 키토산 기재 양이온성 고분자 접합체 및 추가적으로 생체 또는 세포 내로 투여하여 전달하고자 하는 하나 이상의 핵산 소재 의 약을 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 핵산 소재 의약은 플라스미드 유전자 또는 작은 간섭 RNA 이다.
본 발명에서 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물의 투여경로는 약물이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장 내 투여 등이 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 본 발명의 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구투여시에는 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화 할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다. 본 발명의 조성물은 생체 내 지속성 및 역가가 우수하므로, 본 발명의 약제학적 제제의 투여 횟수 및 빈도를 현저하게 감소시킬 수 있다. 바람직한 일 양태로서 본 발명의 조성물은 siRNA룰 생체 내로 단위 체중 그람당 0.1-500 pmole의 용량 범위로 전신 또는 국소 투여하는데 사용할 수 있으며, 플라스미드 유전자를 단위 그람당 0.1-1000 마이크로그램(microgram)의 용량 범위로 전신 또는 국소 투여하는데 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 키토산 기재 고분자 접합체를 제조하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 제조방법은 키토산 및 폴리아민을 혼합하여 결합시키는 단계를 포함한다. 바람직하게, 상기 결합은 혼합물을 교반하는 단계를 포함하여 이루어질 수 있다. 키토산 및 폴리아민을 용이하게 혼합 및 결합시키기 위해 적절한 용매를 사용하여 이들을 용해시킬 수도 있으며, 그러한 용매는 키토산 및 폴리아민을 용해시킬 수 있는 성질을 가지는 것이라면 제한이 없다. 상기 용매는 당업자가 그 용도에 따라 적절히 선택할 수 있다. 또한 교반 등을 통해 양 물질을 용이하게 혼합 및 결합하게 할 수도 있다.
또한, 본 발명에서는 키토산과 폴리아민을 용이하게 결합시키기 위하여, 키토산 또는 폴리아민의 말단기중의 카르복실 그룹을 커플링화 시키는 제제를 사용할 수 있다. 이러한 시약의 예로는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노-프로필)카보디이미드(EDAC), 1,3-디이소프로필카르보디이미드(DIC), 디사이클로헥실 카르보디이미드(DCC) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노 프로필)-카르보디이미드(EDC) 등을 포함한다. 바람직한 카르복실기의 커플링화제는 EDAC이다.
바람직하게는, 상기 카르복실기 커플링화제와 함께 활성반응 보조제를 사용할 수 있다. 상기 활성반응보조제의 바람직한 예로는 N-히드록시석신이미드(NHS), 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt), 3,4-디히드로-3-히드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진(HOOBt), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt), N-히드록시설포석신이미드(Sulfo-NHS) 등이 있으나 이에 제한되지는 않는다.
카르복실기 커플링화제와 활성반응보조제의 첨가량은 이들의 활성도, 농도 등 여러 요인들에 의해 결정될 수 있다. 구체적인 일 실시예로서, 본 발명자는 HCl 용액에 키토산을 용해시킨 후 완충용액으로 원하는 농도로 키토산 용액을 희석한 후, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노-프로필)카보디이미드(EDAC), N-하이드록시설포석신이미드(Sulfo-NHS) 및 폴리아민을 혼합하여 24시간 교반하여 반응시켰다.
바람직한 하나의 양태로서, 본 발명의 제조방법은 추가적으로 폴리에틸렌글리콜을 키토산에 결합시키는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명에서 결합되는 폴리에틸렌글리콜은 상기 키토산 기재 양이온성 고분자 접합체와 같이 키토산과 결합하기 위해 활성화되어야 한다. 폴리에틸렌글리콜과 같은 생체적합성 고분자의 활성화는 생체적합성 고분자의 말단기중 하나를 반응성 작용기(group) 또는 잔기(moiety)로 전환시켜 달성한다. 폴리에틸렌글리콜은 키토산과 폴리아민의 결합 전에 먼저 키토산과 결합될 수도 있으며, 키토산과 폴리아민의 결합 후에 결합될 수도 있다.
바람직한 또 다른 하나의 양태로서, 본 발명의 제조방법은 추가적으로 생산된 키토산 기재 양이온성 고분자에 당 성분을 추가적으로 수식하는 단계를 포함할 수 있다.
또 다른 바람직한 하나의 양태로서, 본 발명의 제조방법은 상기와 같이 생산된 키토산 소재 양이온성 고분자에 추가적으로 생체 내 또는 세포 내 투여를 원하는 핵산 소재 의약과 복합체를 형성시키는 단계를 추가적으로 포함한다. 복합체를 형성시키고자 하는 핵산 소재 의약은 시판품을 구입하거나 당해 기술 분야에서 널 리 알려진 방법에 의해 제조 가능하다. 더욱 바람직하게는 상기 핵산 소재 의약은 작은 간섭 RNA 또는 플라스미드 유전자이다. 복합체를 형성시키는 방법은 당업자가 당해 기술 분야에서 널리 알려진 방법에 의해 가능하며, 본 발명의 키토산 소재 양이온성 고분자와 핵산 소재 의약은 각각 다른 전하를 띄고 있으므로 교반 등의 간단한 처리에 의해 복합체를 형성할 수 있다.
구체적인 일 실시예로서 본 발명자는 쥐의 서바이빈 유전자의 단백질 발현을 저해하는 서바이빈 특이적인 작은 간섭 RNA 서열을 siRNA 가닥 디자인 프로그램을 이용하여 결정하여 주문제작하였고, 이러한 작은 간섭 리보핵산을 키토산-폴리아르기닌 또는 키토산-폴리아르기닌-폴리에틸렌글리콜 용액과 혼합한 다음 37℃에서 30분간 방치하여 복합체를 형성시켰다.
본 발명에 따른 제조방법들의 각 반응단계에서의 생성물은 당업계에 공지된 통상의 방법에 의하여 반응계로부터 분리 및/또는 정제될 수 있다. 분리 및 정제방법의 예로는, 증류(대기압하 증류 및 감압증류를 포함), 재결정, 칼럼크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 겔 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 박층 크로마토그래피, 상 분리, 용매 추출, 투석, 세척 등을 들 수 있다. 정제는 각 반응 단계마다 또는 일련의 반응단계들 이후에 수행할 수 있다.
본 발명의 제조방법에 의해 생산된 키토산 기재 양이온성 고분자 중합체는 상기에서 알 수 있는 바와 같이 유전자 또는 작은 간섭 RNA 등과 같은 음전하를 띄 는 핵산 소재 의약들을 세포 내로 수송하는 효율을 높일 수 있고 세포 독성을 감소시킴으로써 핵산 소재 의약들을 생체 또는 세포 내로 투여하는 경우 전달체로서 유용하게 사용될 수 있다. 뿐만 아니라 생체내의 혈중 체류성을 현저히 증강시킬 수 있다.
따라서, 또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 키토산 기재 양이온성 고분자 접합체를 사용하여 핵산 소재 의약의 혈중 체류를 증강시키기 위한 전달체로서 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명의 접합체를 이와 같은 전달체로서 사용하기 위해, 본 발명의 접합체를 단독 또는 약제학적으로 허용가능한 담체 등이 포함된 조성물의 형태로 투여할 수 있으며, 그 투여 방법 및 투여량은 상기 본 발명의 조성물에서 설명한 것과 동일하다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
비교예 1. 키토산- 폴리에틸렌글리콜 접합체 제조
LMW(저분자량, low molecular weight-키토산 (fw 50000~150000))을 0.1M HCl 용액에 20 mg/ml 농도로 용해시킨 후 PBS pH7.4 완충용액으로 2 mg/ml 농도로 희석한다.
상기에서 준비한 키토산 용액 5 ml(fw 50000~150000, 10 mg, 6.2X10-5 mol of pyranose units)과 mPEG5k-SC(mPEG5k-석시닐 카르보네이트, fw 5000, 24.84 mg, 4.96X10-6 mol, 8 mol%, IDB, 한국)을 혼합한 후 실온에서 24시간 동안 교반 반응한다. 이 혼합물을 원심분리용 여과기(centrifugal filter, MWCO 30k)를 사용하여 정제한 후 동결 건조하여 mPEG5k-LMW-키토산접합체를(DP 8 mol% ; DP : the degree of PEGylation) 제조한다.
비교예 2. 폴리아르기닌 -폴리에틸렌 글리콜 접합체 제조
20mM Tris pH 8.0 완충용액 2 ml에 폴리-L-아르기닌(PLR; fw 15000~70000, 10 mg, 2.85 X10-7 mol, 시그마, 미국) 과 mPEG5k-SC (fw 5000, 7.14 mg, 1.42X10-6 mol) 을 혼합한 후 실온에서 2시간 동안 교반 반응한다. 이 혼합물을 원심분리용 여과기(centrifugal filter, MWCO 30k)를 사용하여 정제한 후 동결 건조하여 PEG-폴리-L-아르기닌 접합체를 제조한다.
1. 키토산- 폴리아민 고분자 2중 접합체의 제조방법
실시예1 ) LMW -키토산- 폴리 -L-아르기닌( fw 15000 ~ 70000)접합체 제조
1-1. Low molecular weight 키토산(LMW-키토산; fw 50000~150000, Fluka, 스위스⇒)을 0.1M HCl 용액에 20mg/ml 농도로 용해시킨 후 50mM MES pH4.0 완충용 액으로 2 mg/ml 농도로 희석한다.
1-2. 실시예 1-1에서 준비된 키토산 용액 1 ml(fw 50000~150000, 2 mg, 1.24X10-5 mol of pyranose units)에 폴리-L-아르기닌(PLR; fw 15000~70000, 0.7 mg, 0.2X10-7 mol, 시그마, 미국), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노-프로필)카보디이미드(EDAC fw 191.7, 383.4 ug, 0.2X10-5 mol), N-하이드록시설포석신이미드(Sulfo-NHS; fw 217.14, 434.28 ug, 0.2X10-5 mol)을 혼합하여 실온에서 24시간 동안 교반 반응한다. 이 혼합물을 원심분리용 여과기(centrifugal filter, MWCO 30k, 사토리어스, 독일)를 사용하여 정제한 후 동결 건조하여 LMW-키토산-폴리-L-아르기닌(fw 15000~70000) 접합체를 제조한다.
1-3. 실시예 1-1에서 준비된 키토산 용액 1 ml(fw 50000~150000, 2 mg, 1.24X10-5 mol of pyranose units)에 PLR (fw 15000~70000, 1.4 mg, 0.4X10-7 mol), EDAC (fw 191.7, 766.8 ug , 0.4X10-5 mol , Sulfo-NHS (fw 217.14, 869 ug , 0.4X10-5 mol)을 혼합하여 실온에서 24시간 동안 교반 반응한다. 이 혼합물을 원심분리용 여과기(centrifugal filter, MWCO 30k)를 사용하여 정제한 후 동결 건조하여 LMW-키토산-폴리-L-아르기닌(fw 15000~70000) 접합제를 제조한다 .
1-4. 실시예 1-1에서 준비된 키토산 용액 1 ml(fw 50000~150000, 2 mg, 1.24X10-5 mol of pyranose units)에 PLR (fw 15000~70000, 3.5 mg, 1X10-7 mol), EDAC (fw 191.7, 1.917 mg , 1X10-5 mol) , Sulfo-NHS (fw 217.14, 2.17 mg , 1X10-5 mol)을 혼합하여 실온에서 24시간 동안 교반 반응한다. 이 혼합물을 원심분리용 여과기(centrifugal filter, MWCO 30k)를 사용하여 정제한 후 동결 건조하여 LMW-키토산-폴리-L-아르기닌(fw 15000~70000) 접합제를 제조한다
실시예2 ) LMW -키토산- 폴리 -L-아르기닌( fw > 70000) 접합체 제조
2-1. PLR (fw 15000 ~70000) 대신 PLR (fw > 70000, 1.4 mg, 0.2X10-7 mol, 시그마, 미국)을 사용하여 실시예 1-2와 동일한 방법으로 LMW-키토산-폴리-L-아르기닌(fw > 70000)접합체를 제조한다.
2-2. PLR(fw 15000 ~70000) 대신 PLR(fw > 70000, 2.8 mg, 0.4X10-7 mol)을 사용하여 실시예 1-3과 동일한 방법으로 LMW-키토산-폴리-L-아르기닌(fw > 70000) 접합체를 제조한다.
2-3. PLR(fw 15000 ~70000) 대신 PLR(fw > 70000, 7 mg, 1X10-7 mol)을 사용 하여 실시예 1-4와 동일한 방법으로 LMW-키토산-폴리-L-아르기닌(fw > 70000) 접합체를 제조한다.
실시예3 ) LMW -키토산- 폴리 -L-히스티딘( fw 5000) 접합체 제조
3-1. PLR(fw 15000~70000) 대신 폴리-L-히스티딘(PLH; fw 5000, 0.1 mg, 0.2X10-7 mol, 시그마, 미국)을 사용하여 실시예1-2와 동일한 방법으로 LMW-키토산-폴리-L-히스티딘(fw 5000) 접합체를 제조한다.
3-2. PLR(fw 15000~70000) 대신 PLH(fw 5000, 0.2 mg, 0.4X10-7 mol)을 사용하여 실시예1-3과 동일한 방법으로 LMW-키토산-폴리-L-히스티딘(fw 5000) 접합체를 제조한다.
3-3. PLR(fw 15000~70000) 대신 PLH(fw 5000, 0.5 mg, 1X10-7 mol)을 사용하여 실시예1-4와 동일한 방법으로 LMW-키토산-폴리-L-히스티딘(fw 5000) 접합체를 제조한다.
실시예4 ) LMW -키토산- 폴리 -L-라이신( fw 9200) 접합체 제조
4-1. PLR(fw 15000~70000) 대신 폴리-L-라이신(PLK; fw 9200, 0.184 mg, 0.2X10-7 mol, 시그마, 미국)을 사용하여 실시예 1-2와 동일한 방법으로 LMW-키토산-폴리-L-라이신(fw 9200) 접합체를 제조한다.
4-2. PLR(fw 15000~70000) 대신 PLK(fw 9200, 0.368mg, 0.4X10-7 mol)을 사용하여 실시예1-3과 동일한 방법으로 LMW-키토산-폴리-L-라이신(fw 9200) 접합체를 제조한다.
4-3. PLR(fw 15000~70000) 대신 PLK(fw 9200, 0.92 mg, 1X10-7 mol)을 사용하여 실시예 1-4와 동일한 방법으로 LMW-키토산-폴리-L-라이신(fw 9200) 접합체를 제조한다.
실시예5 ) MMW -키토산- 폴리 -L-아르기닌( fw 15000 ~ 70000) 접합체 제조
5-1. Medium molecular weight-키토산(MMW-키토산, 알드리치, 미국)을 사용하여 실시예 1-1과 동일한 방법으로 키토산 용액을 준비한다.
5-2. 실시예 5-1에서 준비된 키토산 용액 1 ml(2 mg, 1.24X10-5 mol of pyranose units)을 사용하여 실시예 1-2와 동일한 방법으로 MMW-키토산- 폴리-L-아르기닌 (fw 15000~70000) 접합체를 제조한다.
5-3. 실시예5-1에서 준비된 키토산 용액 1 ml(2 mg, 1.24X10-5 mol of pyranose units)을 사용하여 실시예 1-3과 동일한 방법으로 MMW-키토산- 폴리-L-아르기닌 (fw 15000 ~ 70000) 접합체를 제조한다.
5-4. 실시예 5-1에서 준비된 키토산 용액 1 ml(2 mg, 1.24X10-5 mol of pyranose units)을 사용하여 실시예 1-4와 동일한 방법으로 MMW-키토산-폴리-L-아르기닌(fw 15000 ~ 70000) 접합체를 제조한다.
실시예 6) MMW -키토산- 폴리 -L-아르기닌( fw > 70000) 접합체 제조
6-1. 실시예 5-1에서 준비한 키토산 용액 1 ml( 2 mg, 1.24X10-5 mol of pyranose units)과 PLR(fw > 70000, 1.4 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 1-2와 동일한 방법으로 MMW-키토산- 폴리-L-아르기닌 (fw > 70000) 접합체를 제조한 다.
6-2 실시예 5-1에서 준비한 키토산 용액 1 ml( 2 mg, 1.24X10-5 mol of pyranose units)과 PLR(fw >70000, 2.8 mg, 0.4X10-7 mol)을 사용하여 실시예 1-3과 동일한 방법으로 MMW-키토산- 폴리-L-아르기닌 (fw > 70000) 접합체를 제조한다.
6-3. 실시예 5-1에서 준비한 키토산 용액 1 ml( 2 mg, 1.24X10-5 mol of pyranose units)과 PLR(fw >70000, 7 mg, 1X10-7 mol)을 사용하여 실시예 1-4와 동일한 방법으로 MMW-키토산- 폴리-L-아르기닌(fw > 70000) 접합체를 제조한다.
실시예7 ) MMW -키토산- 폴리 -L-히스티딘( fw 5000) 접합체 제조
7-1. 실시예 5-1에서 준비한 키토산 용액 1 ml( 2 mg, 1.24X10-5 mol of pyranose units)과 PLH(fw 5000, 0.1 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 1-2와 동일한 방법으로 MMW-키토산-폴리-L-히스티딘(fw 5000) 접합체를 제조한다.
7-2. 실시예 5-1에서 준비한 키토산 용액 1 ml( 2 mg, 1.24X10-5 mol of pyranose units)과 PLH(fw 5000, 0.2 mg, 0.4X10-7 mol)을 사용하여 실시예 1-3과 동일한 방법으로 MMW-키토산-폴리-L-히스티딘(fw 5000) 접합체를 제조한다.
7-3. 실시예 5-1에서 준비한 키토산 용액 1 ml( 2 mg, 1.24X10-5 mol of pyranose units)과 PLH(fw 5000, 0.5 mg, 1X10-7 mol)을 사용하여 실시예1-4와 동일한 방법으로 MMW-키토산-폴리-L-히스티딘(fw 5000) 접합체를 제조한다.
실시예 8) MMW -키토산- 폴리 -L-라이신( fw 9200) 접합체 제조
8-1. 실시예 5-1에서 준비한 키토산 용액 1 ml( 2 mg, 1.24X10-5 mol of pyranose units)과 PLK(fw 9200, 0.184 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 1-2와 동일한 방법으로 MMW-키토산-폴리-L-라이신(fw 9200) 접합체를 제조한다.
8-2. 실시예 5-1에서 준비한 키토산 용액 1 ml( 2 mg, 1.24X10-5 mol of pyranose units)과 PLK(fw 9200, 0.368 mg, 0.4X10-7 mol)을 사용하여 실시예 1-3과 동일한 방법으로 MMW-키토산-폴리-L-라이신(fw 9200) 접합체를 제조한다.
8-3. 실시예 5-1에서 준비한 키토산 용액 1 ml( 2 mg, 1.24X10-5 mol of pyranose units)과 PLK(fw 9200, 0.92 mg, 1X10-7 mol)을 사용하여 실시예 1-4와 동일한 방법으로 MMW-키토산-폴리-L-라이신(fw 9200) 접합체를 제조한다.
실시예 9) HMW -키토산- 폴리 -L-아르기닌( fw 15000 ~ 70000) 접합체 제조
9-1. High molecular weight-키토산(HMW-키토산; fw ~600000, Fluka, 스위스)을 사용하여 실시예 1-1과 동일한 방법으로 키토산 용액을 준비한다.
9-2. 실시예 9-1에서 준비된 키토산 용액 1 ml(fw ~600000, 2 mg, 1.24X10-5 mol of pyranose units)을 사용하여 실시예 1-2와 동일한 방법으로 HMW-키토산- 폴리-L-아르기닌 (fw 15000~70000) 접합체를 제조한다.
9-3. 실시예 9-1에서 준비된 키토산 용액 1 ml(fw ~600000, 2 mg, 1.24X10-5 mol of pyranose units)을 사용하여 실시예 1-3과 동일한 방법으로 HMW-키토산- 폴 리-L-아르기닌 (fw 15000~70000) 접합체를 제조한다.
9-4. 실시예 9-1에서 준비된 키토산 용액 1 ml(fw ~600000, 2 mg, 1.24X10-5 mol of pyranose units)을 사용하여 실시예 1-4와 동일한 방법으로 HMW-키토산- 폴리-L-아르기닌 (fw 15000~70000) 접합체를 제조한다.
실시예 10) HMW -키토산- 폴리 -L-아르기닌( fw > 70000) 접합체 제조
10-1. 실시예 9-1에서 준비한 키토산 용액 1ml(fw ~600000, 2 mg, 1.24X10-5 mol of pyranose units)과 PLR(fw >70000, 1.4 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 1-2와 동일한 방법으로 HMW-키토산- 폴리-L-아르기닌 (fw > 70000) 접합체를 제조한다.
10-2. 실시예 9-1에서 준비한 키토산 용액 1 ml(fw ~600000, 2 mg, 1.24X10-5 mol of pyranose units)과 PLR(fw >70000, 2.8 mg, 0.4X10-7 mol) 을 사용하여 실시예 1-3과 동일한 방법으로 HMW-키토산- 폴리-L-아르기닌 (fw > 70000) 접합체를 제조한다
10-3. 실시예 9-1에서 준비한 키토산 용액 용액 1 ml(fw ~600000, 2 mg, 1.24X10-5 mol of pyranose units)과 PLR(fw >70000, 7 mg, 1X10-7 mol)을 사용하여 실시예 1-4와 동일한 방법으로 HMW-키토산-폴리-L-아르기닌 (fw > 70000) 접합체를 제조한다
실시예 11) HMW -키토산- 폴리 -L-히스티딘( fw 5000) 접합체 제조
11-1. 실시예 9-1에서 준비한 키토산 용액 1 ml(fw ~600000, 2 mg, 1.24X10-5 mol of pyranose units)과 PLH(fw 5000, 0.1mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 1-2와 동일한 방법으로 HMW-키토산-폴리-L-히스티딘(fw 5000) 접합체를 제조한다.
11-2. 실시예 9-1에서 준비한 키토산 용액 1 ml(fw ~600000, 2 mg, 1.24X10-5 mol of pyranose units)과 PLH(fw 5000, 0.2mg, 0.4X10-7 mol)을 사용하여 실시예 1-3과 동일한 방법으로 HMW-키토산-폴리-L-히스티딘(fw 5000) 접합체를 제조한다.
11-3. 실시예 9-1에서 준비한 키토산 용액 1 ml(fw ~600000, 2 mg, 1.24X10-5 mol of pyranose units)과 PLH(fw 5000, 0.5mg, 1X10-7 mol)을 사용하여 실시예 1-4와 동일한 방법으로 HMW-키토산-폴리-L-히스티딘(fw 5000) 접합체를 제조한다.
실시예 12) HMW -키토산- 폴리 -L-라이신( fw 9200) 접합체 제조
12-1. 실시예 9-1에서 준비한 키토산 용액 1 ml(fw ~600000, 2 mg, 1.24X10-5 mol of pyranose units)과 PLK(fw 9200, 0.184 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 1-2와 동일한 방법으로 HMW-키토산-폴리-L-라이신(fw 9200) 접합체를 제조한다.
12-2. 실시예 9-1에서 준비한 키토산 용액 1 ml(fw ~600000, 2 mg, 1.24X10-5 mol of pyranose units)과 PLK(fw 9200, 0.368 mg, 0.4X10-7 mol)을 사용하여 실시예 1-3과 동일한 방법으로 HMW-키토산-폴리-L-라이신(fw 9200) 접합체를 제조한다.
12-3. 실시예 9-1에서 준비한 키토산 용액 1 ml(fw ~600000, 2 mg, 1.24X10-5 mol of pyranose units)과 PLK(fw 9200, 0.92 mg, 1X10-7 mol)을 사용하 여 실시예 1-4와 동일한 방법으로 HMW-키토산-폴리-L-라이신(fw 9200) 접합체를 제조한다.
2. 폴리에텔렌 글리콜-키토산-폴리아르기닌 3중 접합체의 제조방법
실시예13 ) mPEG2k - LMW -키토산- 폴리 -L-아르기닌 ( fw 15000 ~ 70000) 접합체 제조
13-1. LMW-키토산 (fw 50000~150000)을 0.1M HCl 용액에 20 mg/ml 농도로 용해시킨 후 PBS pH7.4 완충용액으로 2 mg/ml 농도로 희석한다.
13-2. 10% mPEG2k -LMW-키토산- 폴리-L-아르기닌 (fw 15000 ~ 70000) 접합체
실시예 13-1에서 준비한 키토산 용액 10 ml(fw 50000~150000, 20 mg, 1.24X10-4 mol of pyranose units)과 mPEG2k-SG (mPEG2k-석시미딜 글루타레이트, fw 2000, 24.8 mg , 1.24X10-5 mol, 10 mol%, IDB, 한국)을 혼합한 후 실온에서 24시간 동안 교반 반응한다. 이 혼합물을 원심분리용 여과기(centrifugal filter, MWCO 30k)를 사용하여 정제한 후 동결 건조하여 mPEG2k-LMW-키토산(fw 50000~150000) 접합체(DP 10 mol% ; DP : the degree of PEGylation)를 제조한다. 제조된 mPEG2k-LMW-키토산(fw 50000~150000) 접합체 2 mg을 1 ml 의 50 mM MES pH4.0 완충용액에 녹인 후 (fw 15000~70000, PLR 0.7 mg, 0.2X10-7 mol), EDAC(fw 191.7, 383.4 ug, 0.2X10-5 mol) , Sulfo-NHS (fw 217.14, 434.28 ug , 0.2X10-5 mol)을 혼합하여 실온에서 24시간 동안 교반 반응한다. 이 혼합물을 원심분리용 여과기(centrifugal filter, MWCO 30k)를 사용하여 정제한 후 동결 건조하여 mPEG2k-LMW- 키토산- 폴리-L-아르기닌 (fw 15000 ~ 70000) 접합체(DP 10 mol%)를 제조한다.
13-3. 15% mPEG2k -LMW-키토산- 폴리-L-아르기닌 (fw 15000 ~ 70000) 접합체
실시예 13-1에서 준비한 키토산 용액 10 ml(fw 50000~150000, 20 mg, 1.24X10-4 mol of pyranose units)과 mPEG2k-SG ( fw 2000, 37.26 mg , 1.863X10-5 mol, 15 mol%)을 혼합한 후 실온에서 24시간 동안 교반 반응한다. 이 혼합물을 원심분리용 여과기(centrifugal filter, MWCO 30k)를 사용하여 정제한 후 동결 건조하여 mPEG2k -LMW-키토산(fw 50000~150000) 접합체(DP 15 mol%)를 제조한다. 제조된 mPEG2k-LMW-키토산(fw 50000~150000) 접합체 2 mg을 1 ml 의 50 mM MES pH4.0 완충용액에 녹인 후 PLR (fw 15000~70000, 0.7 mg, 0.2X10-7mol), EDAC (fw 191.7, 383.4 ug, 0.2X10-5 mol), Sulfo-NHS (fw 217.14, 434.28 ug , 0.2X10-5 mol)을 혼합하여 실온에서 24시간 동안 교반 반응한다. 이 혼합물을 원심분리용 여과 기(centrifugal filter, MWCO 30k)를 사용하여 정제한 후 동결 건조하여 mPEG2k-LMW- 키토산- 폴리-L-아르기닌 (fw 15000 ~ 70000) 접합체(DP 15 mol%)를 제조한다.
실시예 14) mPEG2k - LMW -키토산-PLR( fw > 70000) 접합체 제조
14-1. 10% mPEG2k -LMW-키토산- 폴리-L-아르기닌 (fw > 70000) 접합체
PLR(fw 15000~70000) 대신 PLR(fw > 70000, 1.4 mg, 0.2X10-7mol)을 사용하여 실시예 13-2와 동일한 방법으로 mPEG2k -LMW-키토산- 폴리-L-아르기닌 (fw > 70000) 접합체(DP 10 mol%)를 제조한다.
14-2. 15% mPEG2k -LMW-키토산- 폴리-L-아르기닌 (fw > 70000) 접합체
PLR(fw 15000~70000) 대신 PLR(fw > 70000, 1.4 mg, 0.2X10-7mol)을 사용하여 실시예 13-3과 동일한 방법으로 mPEG2k-LMW-키토산-PLR(fw > 70000) 접합체(DP 15 mol%)를 제조한다.
실시예15 ) mPEG2k - LMW -키토산- 폴리 -L-히스티딘 ( fw 5000) 접합체 제조
15-1. 10% mPEG2k-LMW-키토산-폴리-L-히스티딘(fw 5000) 접합체
PLR(fw 15000~70000)대신 PLH(fw 5000, 0.1 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 13-2와 동일한 방법으로 mPEG2k -LMW-키토산- 폴리-L-히스티딘 (fw 5000) 접합체(DP 10 mol%)를 제조한다.
15-2. 15% mPEG2k-LMW-키토산-폴리-L-히스티딘(fw 5000) 접합체
PLR(fw 15000~70000)대신 PLH(fw 5000, 0.1 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 13-3과 동일한 방법으로 mPEG2k -LMW-키토산- 폴리-L-히스티딘 (fw 5000) 접합체(DP 15mol%)를 제조한다.
실시예16 ) mPEG2k - LMW -키토산- 폴리 -L-라이신( fw 9200) 접합체 제조
16-1. 10% mPEG2k-LMW-키토산-폴리-L-라이신(fw 9200) 접합체
PLR(fw 15000~70000)대신 PLK(fw 9200, 0.184 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 13-2와 동일한 방법으로 mPEG2k -LMW-키토산- 폴리-L-라이신(fw 9200) 접합체(DP 10 mol%)를 제조한다.
16-2. 15% mPEG2k-LMW-키토산-폴리-L-라이신(fw 9200) 접합체
PLR(fw 15000~70000)대신 PLK(fw 9200, 0.184 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 13-3과 동일한 방법으로 mPEG2k -LMW-키토산- 폴리-L-라이신(fw 9200) 접합체(DP 15 mol%)를 제조한다.
실시예17 ) mPEG2k - MMW -키토산- 폴리 -L-아르기닌 ( fw 15000 ~ 70000)
17-1. MMW-키토산을 사용하여 실시예 13-1과 동일한 방법으로 키토산 용액을 준비한다.
17-2. 10% mPEG2k -MMW-키토산- 폴리-L-아르기닌 (fw 15000~70000) 접합체
17-1에서 준비한 키토산 용액 10 ml(20 mg, 1.24X10-4 mol of pyranose units)을 사용하여 실시예 13-2와 동일한 방법으로 mPEG2k-MMW- 키토산- 폴리-L-아르기닌 (fw 15000 ~ 70000) 접합체.(DP 10 mol%)를 제조한다
17-3. 15% mPEG2k -MMW-키토산- 폴리-L-아르기닌 (fw 15000~70000) 접합체
17-1에서 준비한 키토산 용액 10 ml(20 mg, 1.24X10-4 mol of pyranose units)을 사용하여 실시예 13-3과 동일한 방법으로 mPEG2k -MMW-키토산- 폴리-L-아 르기닌 (fw 15000 ~ 70000) 접합체(DP 15 mol%)를 제조한다.
실시예 18) mPEG2k - MMW -키토산- 폴리 -L-아르기닌 ( fw > 70000) 접합체 제조
18-1. 10% mPEG2k -MMW-키토산- 폴리-L-아르기닌 (fw > 70000) 접합체 제조
실시예 17-1에서 준비한 키토산 용액 10 ml(20 mg, 1.24X10-4 mol of pyranose units)과 PLR(fw > 70000, 1.4 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 13-2와 동일한 방법으로 mPEG2k-MMW-키토산-PLR(fw >70000) 접합체(DP 10 mol%)를 제조한다.
18-2. 15% mPEG2k -MMW-키토산- 폴리-L-아르기닌 (fw > 70000) 접합체 제조
실시예 17-1에서 준비한 키토산 용액 10 ml(20 mg, 1.24X10-4 mol of pyranose units)과 PLR(fw >70000, 1.4 mg, 0.2X10-7mol)을 사용하여 실시예 13-3과 동일한 방법으로 mPEG2k-MMW-키토산- 폴리-L-아르기닌 (fw >70000) 접합체(DP 15 mol%)를 제조한다.
실시예19 ) mPEG2k - MMW - 키토산 - 폴리 -L-히스티딘( fw 5000) 접합체 제조
19-1. 10% mPEG2k-MMW- 키토산 -폴리-L-히스티딘(fw 5000) 접합체
실시예 17-1에서 준비한 키토산 용액 10 ml(20 mg, 1.24X10-4 mol of pyranose units)과 PLH(fw 5000, 0.1 mg, 0.2X10-7mol)을 사용하여 실시예 13-2과 동일한 방법으로 mPEG2k-MMW-키토산- 폴리-L-히스티딘(fw 5000) 접합체(DP 10 mol%)를 제조한다.
19-2. 15% mPEG2k-MMW- 키토산 -폴리-L-히스티딘(fw 5000) 접합체
실시예 17-1에서 준비한 키토산 용액 10 ml(20 mg, 1.24X10-4 mol of pyranose units) 과 PLH(fw 5000, 0.1 mg, 0.2X10-7mol)을 사용하여 실시예 13-3과 동일한 방법으로 mPEG2k-MMW-키토산-폴리-L-히스티딘(fw 5000) 접합체(DP 15 mol%)를 제조한다.
실시예20 ) mPEG2k - MMW - 키토산 - 폴리 -L-라이신( fw 9200) 접합체 제조
20-1. 10% mPEG2k-MMW- 키토산 -폴리-L-라이신(fw 9200) 접합체
실시예 17-1에서 준비한 키토산 용액 10 ml(20 mg, 1.24X10-4 mol of pyranose units) 과 PLK(fw 5000, 0.184 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 13-2와 동일한 방법으로 mPEG2k-MMW-키토산- 폴리-L-라이신(fw 9200) 접합체(DP 10 mol%)를 제조한다.
20-2. 15% mPEG2k-MMW- 키토산 -폴리-L-라이신(fw 9200) 접합체
실시예 17-1에서 준비한 키토산 용액 10 ml(20 mg, 1.24X10-4 mol of pyranose units)과 PLK(fw 5000, 0.184 mg, 0.2X10-7mol)을 사용하여 실시예 13-3과 동일한 방법으로 mPEG2k-MMW-키토산- 폴리-L-라이신(fw 9200) 접합체(DP 15 mol%)를 제조한다.
실시예21 ) mPEG2k - HMW -키토산- 폴리 -L-아르기닌 ( fw 15000 ~ 70000) 접합체 제조
21-1. HMW-키토산(fw ~600000)을 사용하여 실시예 13-1과 동일한 방법으로 키토산 용액을 준비한다
21-2. 10% mPEG2k-HMW-키토산- 폴리-L-아르기닌 (fw 15000 ~ 70000) 접합체
실시예 21-1에서 준비한 키토산 용액 10 ml (20 mg, 1.24X10-4 mol of pyranose units)을 사용하여 실시예 13-2와 동일한 방법으로 mPEG2k-HMW-키토산-폴리-L-아르기닌 (fw 15000 ~ 70000) 접합체(DP 10 mol%)를 제조 한다.
21-3. 15% mPEG2k-HMW-키토산- 폴리-L-아르기닌 (fw 15000 ~ 70000) 접합체
실시예 21-1에서 준비한 키토산 용액 10 ml (20 mg, 1.24X10-4 mol of pyranose units)을 사용하여 실시예 13-3과 동일한 방법으로 mPEG2k-HMW-키토산- 폴리-L-아르기닌 (fw 15000 ~ 70000) 접합체(DP 15 mol%)를 제조 한다.
실시예22 ) mPEG2k - HMW -키토산- 폴리 -L-아르기닌 ( fw > 70000) 접합체 제조
22-1. 10% mPEG2k-HMW-키토산-폴리-L-아르기닌 (fw > 70000) 접합체
실시예 21-1에서 준비한 키토산 용액 10 ml(20 mg, 1.24X10-4 mol of pyranose units)과 PLR(fw > 70000, 1.4 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 13-2와 동일한 방법으로 mPEG2k-HMW-키토산- 폴리-L-아르기닌 (fw >70000) 접합체(DP 10 mol%)를 제조한다.
22-2. 15% mPEG2k-HMW-키토산-폴리-L-아르기닌 (fw > 70000) 접합체
실시예 21-1에서 준비한 키토산 용액 10 ml(20 mg, 1.24X10-4 mol of pyranose units)과 PLR(fw > 70000, 1.4 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 13-3과 동일한 방법으로 mPEG2k-HMW-키토산- 폴리-L-아르기닌 (fw >70000) 접합체를 제조한다.
실시예23 ) mPEG2k - HMW -키토산- 폴리 -L-히스티딘( fw 5000) 접합체 제조
23-1. 10% mPEG2k-HMW-키토산-폴리-L-히스티딘(fw 5000) 접합체 제조
실시예 21-1에서 준비한 키토산 용액 10 ml(20 mg, 1.24X10-4 mol of pyranose units)과 PLH(fw 5000, 0.1 mg, 0.2X10-7mol)을 사용하여 실시예 13-2과 동일한 방법으로 mPEG2k-HMW-키토산- 폴리-L-히스티딘(fw 5000) 접합체(DP 10 mol%)를 제조한다.
23-2. 15% mPEG2k-HMW- 키토산 -폴리-L-히스티딘(fw 5000) 접합체
실시예 21-1에서 준비한 키토산 용액10 ml(20 mg, 1.24X10-4 mol of pyranose units)과 PLH(fw 5000, 0.1 mg, 0.2X10-7mol)을 사용하여 실시예 13-3과 동일한 방법으로 mPEG2k-HMW-키토산- 폴리-L-히스티딘(fw 5000) 접합체(DP 15 mol%)를 제조한다.
실시예24 ) mPEG2k - HMW - 키토산폴리 -L-라이신( fw 9200) 접합체 제조
24-1. 10% mPEG2k-HMW- 키토산 -폴리-L-라이신(fw 9200) 접합체
실시예 21-1에서 준비한 키토산 용액 10 ml(20 mg, 1.24X10-4 mol of pyranose units)과 PLK(fw 5000, 0.184 mg, 0.2X10-7mol)을 사용하여 실시예 13-2과 동일한 방법으로 mPEG2k-HMW-키토산- 폴리-L-라이신(fw 9200) 접합체(DP 10 mol%)를 제조 한다.
24-2. 15% mPEG2k-HMW- 키토산 -폴리-L-라이신(fw 9200) 접합체
실시예 21-1에서 준비한 키토산 용액 10ml(20 mg, 1.24X10-4 mol of pyranose units)과 PLK(fw 5000, 0.184 mg, 0.2X10-7mol)을 사용하여 실시예 13-3과 동일한 방법으로 mPEG2k-HMW-키토산- 폴리-L-라이신(fw 9200) 접합체(DP 15 mol%)를 제조한다.
실시예25 ) mPEG5k - LMW - 키토산- 폴리 -L-아르기닌 ( fw 15000 ~ 70000) 접합체 제조
25-1. 5% mPEG5k-LMW- 키토산- 폴리-L-아르기닌 (fw 15000 ~ 70000) 접합체
실시예 13-1에서 준비한 키토산 용액 10 ml(fw 50000~150000, 20 mg, 1.24X10-4 mol of pyranose units)과 mPEG5k-SC (fw 5000, 31.05 mg , 6.21X10-6 mol, 5 mol%, IDB, 한국)을 혼합한 후 실온에서 24시간 동안 교반 반응한다. 이 혼합물을 원심분리용 여과기(centrifugal filter, MWCO 30k)를 사용하여 정제한 후 동결 건조하여 mPEG5k -LMW-키토산(fw 50000~150000) 접합체(DP 5 mol%)를 제조한다. 제조된 mPEG5k-LMW-키토산(fw 50000~150000) 접합체 2 mg을 1 ml 의 50 mM MES pH4.0 완충용액에 녹인 후 PLR (fw 15000~70000, 0.7 mg, 0.2X10-7 mol), EDAC (fw 191.7, 386.4 ug , 0.2X10-5 mol), Sulfo-NHS (fw 217.14, 434.28 ug, 0.2X10-5 mol)를 혼합하여 실온에서 24시간 동안 교반 반응한다. 이 혼합물을 원심분리용 여과기(centrifugal filter, MWCO 30k)를 사용하여 정제한 후 동결 건조하여 mPEG5k-LMW-키토산- 폴리-L-아르기닌(fw 15000 ~ 70000) 접합체(DP 5 mol%)를 제조한다.
25-2. 15% mPEG5k-LMW- 키토산- 폴리-L-아르기닌 (fw 15000 ~ 70000) 접합체
실시예 13-1에서 준비한 키토산 용액 10 ml( fw 50000~150000, 20 mg, 1.24X10-4 mol of pyranose units)과 mPEG5k-SC ( fw 5000, 46.58 mg, 9.316X10-6 mol, 15 mol%) 를 혼합한 후 실온에서 24시간 동안 교반 반응한다. 이 혼합물을 원심분리용 여과기(centrifugal filter, MWCO 30k)를 사용하여 정제한 후 동결 건조하여 mPEG5k -LMW-키토산(fw 50000~150000) 접합체(DP 15 mol%)를 제조한다. 제조된 mPEG5k-LMW-키토산(fw 50000~150000) 접합체 2 mg을 1 ml 의 50 mM MES pH4.0 완충용액에 녹인 후 PLR (fw 15000~70000, 0.7 mg, 0.2X10-7 mol), EDAC(fw 191.7, 386.4 ug, 0.2X10-5 mol), Sulfo-NHS (fw 217.14, 434.28 ug. 0.4X10-5 mol)을 혼합하여 실온에서 24시간 동안 교반 반응한다. 이 혼합물을 원심분리용 여과기(centrifugal filter, MWCO 30k)를 사용하여 정제한 후 동결 건조하여 mPEG5k-LMW-키토산- 폴리-L-아르기닌 (fw 15000 ~ 70000) 접합체(DP 15 mol%)를 제조한다.
실시예26 ) mPEG5k - LMW -키토산 -PLR( fw > 70000) 접합체 제조
26-1. 5% mPEG5k-LMW-키토산 -PLR(fw > 70000) 접합체
PLR(fw 15000~70000)대신 PLR(fw >70000, 1.4 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 25-1과 동일한 방법으로 mPEG5k-LMW- 키토산- 폴리-L-아르기닌 (fw > 70000) 접합체(DP 5 mol%)를 제조한다.
26-2. 15% mPEG5k-LMW-키토산 -PLR(fw > 70000) 접합체
PLR(fw 15000~70000)대신 PLR(fw >70000, 1.4 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 25-2와 동일한 방법으로 mPEG5k-LMW- 키토산- 폴리-L-아르기닌 (fw > 70000) 접합체(DP 15 mol%)를 제조한다
실시예27 ) mPEG5k - LMW -키토산- 폴리 -L-히스티딘( fw 5000) 접합체 제조
27-1. 5% mPEG5k-LMW-키토산-폴리-L-히스티딘(fw 5000) 접합체
PLR(fw 15000~70000)대신 PLH(fw 5000, 0.1 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 25-1과 동일한 방법으로 mPEG5k -LMW-키토산- 폴리-L-히스티딘 (fw 5000) 접합체(DP 5 mol%)를 제조한다.
15-2. 15% mPEG5k-LMW-키토산-폴리-L-히스티딘(fw 5000) 접합체
PLR(fw 15000~70000)대신 PLH(fw 5000, 0.1 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 25-2와 동일한 방법으로 mPEG5k -LMW-키토산- 폴리-L-히스티딘 (fw 5000) 접합체(DP 15mol%)를 제조한다.
실시예28 ) mPEG5k - LMW -키토산- 폴리 -L-라이신( fw 9200) 접합체 제조
28-1. 5% mPEG5k-LMW-키토산-폴리-L-라이신(fw 9200) 접합체
PLR(fw 15000~70000)대신 PLK(fw 9200, 0.184 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 25-1과 동일한 방법으로 mPEG5k -LMW-키토산- 폴리-L-라이신(fw 9200) 접합체(DP 5 mol%)를 제조한다.
28-2. 15% mPEG5k-LMW-키토산-폴리-L-라이신(fw 9200) 접합체
PLR(fw 15000~70000)대신 PLK(fw 9200, 0.184 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 25-2와 동일한 방법으로 mPEG5k-LMW-키토산- 폴리-L-라이신(fw 9200) 접합체(DP 15 mol%)를 제조한다.
실시예29 ) mPEG5k - MMW -키토산- 폴리 -L-아르기닌 ( fw 15000 ~ 70000) 접합체 제조
29-1. 5% mPEG5k-MMW-키토산-폴리-L-아르기닌 (fw 15000 ~ 70000) 접합체
실시예 17-1에서 준비한 키토산 용액 10 ml(20 mg, 1.24X10-4 mol of pyranose units)을 사용하여 실시예 25-1과 동일한 방법으로 mPEG5k-MMW-키토산- 폴리-L-아르기닌 (fw 15000 ~ 70000) 접합체(DP 5 mol%)를 제조한다.
29-2. 15% mPEG5k-MMW-키토산-폴리-L-아르기닌 (fw 15000 ~ 70000) 접합체
실시예 17-1에서 준비한 키토산 용액 10 ml(20 mg, 1.24X10-4 mol of pyranose units)을 사용하여 실시예 25-2와 동일한 방법으로 mPEG5k-MMW-키토산- 폴리-L-아르기닌 (fw 15000 ~ 70000) 접합체(DP 15 mol%)를 제조한다.
실시예30 ) mPEG5k - MMW -키토산- 폴리 -L-아르기닌 ( fw > 70000) 접합체 제조
30-1. 5% mPEG5k-MMW-키토산- 폴리-L-아르기닌 (fw > 70000) 접합체
실시예 17-1에서 준비한 키토산 용액 10 ml(20 mg, 1.24X10-4 mol of pyranose units)과 PLR(fw >70000, 1.4 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 25-1과 동일한 방법으로 mPEG5k-MMW-키토산- 폴리-L-아르기닌 (fw > 70000) 접합체(DP 5 mol%)를 제조한다.
30-2. 15% mPEG5k-MMW-키토산- 폴리-L-아르기닌 (fw > 70000) 접합체
실시예 17-1에서 준비한 키토산 용액 10 ml(20 mg, 1.24X10-4 mol of pyranose units)과 PLR(fw>70000, 1.4 mg, 0.2X10-7 mol) 을 사용하여 실시예 25-2 와 동일한 방법으로 mPEG5k-MMW-키토산- 폴리-L-아르기닌 (fw >70000) 접합체(DP 15 mol%)를 제조한다.
실시예31 ) mPEG5k - MMW -키토산- 폴리 -L-히스티딘 ( fw 5000) 접합체 제조
31-1. 5% mPEG5k-MMW-키토산-폴리-L-히스티딘 (fw 5000) 접합체
실시예 17-1에서 준비된 키토산 용액 10 ml(20 mg, 1.24X10-4 mol of pyranose units)과 PLH(fw 5000, 0.1mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 25-1과 동일한 방법으로 mPEG5k-MMW-키토산-폴리-L-히스티딘 (fw 5000) 접합체 (DP 5 mol%)를 제조한다.
31-2. 15% mPEG5k-MMW-키토산-폴리-L-히스티딘 (fw 5000) 접합체
실시예 17-1에서 준비된 키토산 용액 10 ml(20 mg, 1.24X10-4 mol of pyranose units)과 PLH(fw 5000, 0.1 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 25-2와 동일한 방법으로 mPEG5k-MMW-키토산-폴리-L-히스티딘 (fw 5000) 접합체 (DP 15 mol%)를 제조한다.
실시예33 ) mPEG5k - MMW -키토산- 폴리 -L-라이신 ( fw 9200) 접합체 제조
33-1. 5% mPEG5k-MMW-키토산-폴리-L-라이신 (fw 9200) 접합체
실시예 17-1에서 준비된 키토산 용액 10 ml(20 mg, 1.24X10-4 mol of pyranose units)과 PLK(fw 9200, 0.184 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 25-1과 동일한 방법으로 mPEG5k-MMW-키토산-폴리-L-라이신 (fw 9200) 접합체 (DP 5 mol%)를 제조한다.
33-2. 15% mPEG5k-MMW-키토산-폴리-L-라이신 (fw 9200) 접합체
실시예 17-1에서 준비된 키토산 용액 10 ml(20 mg, 1.24X10-4 mol of pyranose units)과 PLK(fw 9200, 0.184 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 25-2와 동일한 방법으로 mPEG5k-MMW-키토산-폴리-L-라이신 (fw 9200) 접합체 (DP 15 mol%)를 제조한다.
실시예33 ) mPEG5k - HMW -키토산- 폴리 -L-아르기닌 ( fw 15000 ~ 70000) 접합체 제조
33-1. 5% mPEG5k-HMW-키토산- 폴리-L-아르기닌 (fw 15000 ~ 70000) 접합체
실시예 21-1에서 준비한 키토산 용액 10 ml(20 mg, 1.24X10-4 mol of pyranose units)을 사용하여 실시예 25-1과 동일한 방법으로 mPEG5k-HMW-키토산-폴리-L-아르기닌 (fw 15000 ~ 70000) 접합체(DP 5 mol%)를 제조한다.
33-2. 15% mPEG5k-HMW-키토산- 폴리-L-아르기닌 (fw 15000 ~ 70000) 접합체
실시예 21-1에서 준비한 키토산 용액 10 ml(20 mg, 1.24X10-4 mol of pyranose units)을 사용하여 실시예 25-2와 동일한 방법으로 mPEG5k-HMW-키토산- 폴리-L-아르기닌 (fw 15000 ~ 70000) 접합체(DP 15 mol%)를 제조한다.
실시예34 ) mPEG5k - HMW -키토산-PLR( fw > 70000)접합체 제조
34-1. 5% mPEG5k-HMW-키토산-PLR(fw > 70000)접합체
실시예 21-1에서 준비한 키토산 용액 10 ml(20 mg, 1.24X10-4 mol of pyranose units)과 PLR(fw>70000, 1.4 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 25-1과 동일한 방법으로 mPEG5k-HMW-키토산- 폴리-L-아르기닌 (fw > 70000) 접합체(DP 5 mol%)를 제조한다.
34-2. 15% mPEG5k-HMW-키토산-PLR(fw > 70000)접합체
실시예 21-1에서 준비한 키토산 용액 10 ml(20 mg, 1.24X10-4 mol of pyranose units)과 PLR(fw >70000, 1.4 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 25-2와 동일한 방법으로 mPEG5k-HMW-키토산- 폴리-L-아르기닌 (fw (fw >70000) 접합체(DP 15 mol%)를 제조 한다.
실시예35 ) mPEG5k - HMW -키토산- 폴리 -L-히스티딘 ( fw 5000)접합체 제조
35-1. 5% mPEG5k-HMW-키토산-폴리-L-히스티딘 (fw 5000)접합체
실시예 21-1에서 준비한 키토산 용액 10 ml(20 mg, 1.24X10-4 mol of pyranose units)과 PLH(fw 5000, 0.1 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 25-1과 동일한 방법으로 mPEG5k-HMW-키토산-폴리-L-히스티딘 (fw 5000) 접합체(DP 5 mol%)를 제조한다.
35-2. 15% mPEG5k-HMW-키토산-폴리-L-히스티딘 (fw 5000)접합체
실시예 21-1에서 준비한 키토산 용액 10 ml(20 mg, 1.24X10-4 mol of pyranose units)과 PLH(fw 5000, 0.1 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 25-2와 동일한 방법으로 mPEG5k-HMW-키토산-폴리-L-히스티딘 (fw 5000) 접합체(DP 15 mol%)를 제조한다.
실시예36 ) mPEG5k - HMW -키토산- 폴리 -L-라이신 ( fw 9200) 접합체 제조
36-1. 5% mPEG5k-HMW-키토산-폴리-L-라이신 (fw 9200) 접합체
실시예 21-1에서 준비한 키토산 용액 10 ml(20 mg, 1.24X10-4 mol of pyranose units)과PLK(fw 9200, 0.184 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 25-1과 동일한 방법으로 mPEG5k-HMW-키토산-폴리-L-라이신 (fw 9200) 접합체(DP 5 mol%)를 제조한다.
36-2. 15% mPEG5k-HMW-키토산-폴리-L-라이신 (fw 9200) 접합체
실시예 21-1에서 준비한 키토산 용액 10 ml(20 mg, 1.24X10-4 mol of pyranose units)과 PLK(fw 9200, 0.184 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 25-2 와 동일한 방법으로 mPEG5k-HMW-키토산-폴리-L-라이신 (fw 9200) 접합체(DP 15 mol%)를 제조한다.
실시예37 ) 5'- mPEG2k - LMW - 키토산 - 폴리 -L-아르기닌 ( fw 15000 ~ 70000) 접합체 제조
37-1. mPEG2K-COCH(CH3)Cl 제조
mPEG2K-OH(0.5 g, 0.25 mmol), 4-디메틸아미노피린딘(DMAP; 91.6 mg, 0.75 mmol), 트리에틸아민(TEA; 0.070 ml, 0.5 mmol)를 12 ml의 디클로로메탄(DCM)에 녹인 용액을 0 ℃, 질소가스 하에서 2-클로로프로피오닐 클로라이드(2-chloropropionyl chloride; 0.12 ml, 1.25 mmol)를 3 ml의 DCM에 녹인 용액을 천천히 가한 다음 반응 온도를 0 ℃에서 실온으로 올리고, 24시간 동안 교반한다. TLC로 반응과정 확인 후 반응 혼합물을 감압농축 하여 디에틸에테르(diethyl ether)에 부어 침전시켜 여과 정제하고, 에탄올(ethanol)에 녹여 재결정을 시키고 여과 정제한다. 이 화합물의 구조 확인은 500 MHz 1H-NMR로 확인하였다.
37-2. Phthaloyl LMW Chitosan(phth-LMW-chitosan) 제조
LMW-키토산(LMW-Chitosan Fluka, 500 mg, 3.1 mmol), 프탈릭 무수물(Phthalic anhydride 1.38 g, 9.32 mmol)을 10 ml의 디메틸포름아미드(DMF)에 녹인 용액을 질소가스 하에서 130 ℃정도 가열하여 7 시간 동안 교반한다. 반응물을 실온으로 냉각하고 얼음물에 부어 침전물을 물로 씻어주며 여과한다. 얻은 고형물은 속시렛 추출(soxhlet extraction)을 통해 ethanol로 씻어 준다. 얻은 고형물은 50 ℃에서 진공 건조 시켜 chitosan의 아민기를 보호한 phth-LMW-chitosan을 얻었다.
37-3. 15 mol% PEGylation된 5`-mPEG2K-LMW-chitosan 제조
실시예 37-2에서 제조한 phth-LMW-chitosan(70 mg, 0.24 mmol)을 1 ml의 피리딘(Pyridine)에 녹인 용액에 실시예 37-1에서 합성한 mPEG2K-COCH(CH3)Cl (72.2 mg, 36.1 μmol)를 2 ml의 DMF에 용액을 가하고, 질소가스 하에서 100 ℃정도로 가열하여 24시간 동안 교반한다. 이 반응물을 실온으로 냉각하고 에탄올에 부어 침전 시키고, 에탄올과 에테르로 씻어주며 여과하여 키토산 5`C의 하이드록시기에 PEG를 접합시킨 고형물 5`-mPEG2K-키토산(phth)를 진공 건조 시킨다. 이 화합물 5`-mPEG2K-키토산(phth) 50 mg을 10 ml의 하이드라진 수화물(hydrazine monohydrate(H2NNH2·H2O))에 녹인 용액을 질소가스 하에서 130 ℃에서 환류 시키며 24시간 동안 교반한다. 이 반응물을 실온으로 냉각시키고, 침전물을 정제하여 10 ml의 0.1 M NaOH(aq)에 혼합하여 실온에서 16시간 동안 교반한다. 이 혼합물의 pH를 50 mM HCl(aq)로 10정도로 낮추고 투석시키고, 진공 건조하여 화합물 5`-mPEG2K-LMW-키토산를 얻는다. 이 화합물은 500 MHz 1H-NMR로 확인 하였다.
37-4. 10 mol% PEGylation된 5`-mPEG2K-LMW-chitosan 제조
mPEG2K-COCH(CH3)Cl (48.1 mg, 24.0 μmol)를 사용하여 실시예 37-3과 같은 방법으로 제조하였다.
37-5. 15% 5'-mPEG2k-LMW- 키토산 - 폴리-L-아르기닌 (fw 15000 ~ 70000)
실시예 37-3에서 제조한 5`-mPEG2K-LMW-키토산 2 mg을 50 mM MES pH4.0 완충용액 1 ml 에 녹인 후 PLR( fw 15000 ~ 70000, 0.7mg, 0.2X10-7 mol), EDAC(fw 191.7, 383.4 ug, 0.2X10-5 mol) , Sulfo-NHS (fw 217.14, 434.28 ug , 0.2X10-5 mol)을 혼합하여 실온에서 24시간 동안 교반 반응한다. 이 혼합물을 원심분리용 여과기(centrifugal filter, MWCO 30k)를 사용하여 정제한 후 동결 건조하여 5‘-mPEG2k-LMW- 키토산- 폴리-L-아르기닌 (fw 15000 ~ 70000) 접합체를 제조한다.
37-6 10% 5'-mPEG2k-LMW- 키토산 - 폴리-L-아르기닌 (fw 15000 ~ 70000)
실시예 37-4에서 제조한 5`-mPEG2K-LMW-키토산 2mg을 50 mM MES pH4.0 완충용액 1 ml 에 녹인 후 PLR( fw 15000 ~ 70000, 0.7 mg, 0.2X10-7 mol), EDAC(fw 191.7, 383.4 ug, 0.2X10-5 mol) , Sulfo-NHS (fw 217.14, 434.28 ug , 0.2X10-5 mol) 을 혼합하여 실온에서 24 시간 동안 교반 반응한다. 이 혼합물을 원심분리용 여과기(centrifugal filter, MWCO 30k)를 사용하여 정제한 후 동결 건조하여 5‘-mPEG2k-LMW- 키토산- 폴리-L-아르기닌 (fw 15000 ~ 70000) 접합체를 제조한다.
실시예38 ) 5'- mPEG2k - LMW - 키토산 - 폴리 -L-아르기닌 ( fw > 70000) 접합체 제조
38-1. 15% 5'-mPEG2k-LMW- 키토산 - 폴리-L-아르기닌 (fw > 70000)
PLR(fw 15000~150000) 대신 PLR(fw > 70000, 1.4 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 37-5와 동일한 방법으로 5'-mPEG2k-LMW- 키토산 - 폴리-L-아르기닌 (fw > 70000) 접합체를 제조한다.
38-2. 10% 5'-mPEG2k-LMW- 키토산 - 폴리-L-아르기닌 (fw > 70000)
PLR(fw 15000~150000) 대신 PLR(fw > 70000, 1.4 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 37-6과 동일한 방법으로 5'-mPEG2k-LMW- 키토산 - 폴리-L-아르기닌 (fw > 70000) 접합체를 제조한다.
실시예39 ) 5'- mPEG2k - LMW - 키토산 - 폴리 -L-히스티딘 ( fw 5000) 접합체 제조
39-1. 15% 5'-mPEG2k-LMW- 키토산 - 폴리-L-히스티딘 (fw 5000) 접합체
PLR(fw 15000~150000) 대신 PLH(fw 5000, 0.1 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 37-5와 동일한 방법으로 5'-mPEG2k-LMW- 키토산 - 폴리-L-히스티딘 (fw 5000) 접합체를 제조한다.
39-2. 10% 5'-mPEG2k-LMW- 키토산 - 폴리-L-히스티딘 (fw 5000) 접합체
PLR(fw 15000~150000) 대신 PLH(fw 5000, 0.1 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 37-6과 동일한 방법으로 5'-mPEG2k-LMW- 키토산 - 폴리-L-히스티딘 (fw 5000) 접합체를 제조한다.
실시예40 ) 5'- mPEG2k - LMW - 키토산 - 폴리 -L-라이신 ( fw 9200) 접합체 제조
40-1. 15% 5'-mPEG2k-LMW- 키토산 - 폴리-L-라이신 (fw 9200) 접합체 제조
PLR(fw 15000~150000) 대신 PLK(fw 9200, 0.184 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 37-5와 동일한 방법으로 5'-mPEG2k-LMW- 키토산 - 폴리-L-라이신 (fw 9200) 접합체를 제조한다.
40-2. 10% 5'-mPEG2k-LMW- 키토산 - 폴리-L-라이신 (fw 9200) 접합체 제조
PLR(fw 15000~150000) 대신 PLK(fw 9200, 0.184 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 37-6과 동일한 방법으로 5'-mPEG2k-LMW- 키토산 - 폴리-L-라이신 (fw 9200) 접합체를 제조한다.
실시예41 ) 5'- mPEG2k - MMW - 키토산 - 폴리 -L-아르기닌 ( fw 15000 ~ 70000)
41-1. Phth-MMW-키토산 제조
MMW-키토산(Aldrich)사용 하여 실시예 37-2와 같은 방법으로 제조하였다.
41-2. 15 mol% 페길화된 5`-mPEG2K-MMW-키토산 제조
phth-MMW-키토산을 사용하여 실시예 37-3과 같은 방법으로 제조하였다.
41-3. 10 mol% 페길화된 5`-mPEG2K-MMW-키토산 제조
phth-MMW-키토산을 사용하여 실시예 37-4과 같은 방법으로 제조하였다.
41-4. 15% 5'-mPEG2k-MMW- 키토산 - 폴리-L-아르기닌 (fw 15000 ~ 70000)
실시예 41-2에서 제조한 5`-mPEG2K-MMW-키토산 2 mg을 사용하여 실시예 37-5와 동일한 방법으로 5'-mPEG2k-MMW- 키토산 - 폴리-L-아르기닌 (fw 15000 ~ 70000) 접합체를 제조한다.
41-5. 10% 5'-mPEG2k-MMW- 키토산 - 폴리-L-아르기닌 (fw 15000 ~ 70000)
실시예 41-3에서 제조한 5`-mPEG2K-MMW-키토산 2 mg 을 사용하여 실시예 37- 6과 동일한 방법으로 5'-mPEG2k-MMW- 키토산 - 폴리-L-아르기닌 (fw 15000 ~ 70000) 접합체를 제조한다.
실시예42 ) 5'- mPEG2k - MMW - 키토산 - 폴리 -L-아르기닌 ( fw > 70000) 접합체 제조
42-1. 15% 5'-mPEG2k-MMW- 키토산 - 폴리-L-아르기닌 (fw > 70000)
실시예 41-2에서 제조한 5`-mPEG2K-MMW-키토산 2mg과 PLR(fw >70000, 1.4 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 37-5와 동일한 방법으로 5'-mPEG2k-MMW- 키토산 - 폴리-L-아르기닌 (fw > 70000) 접합체를 제조하였다.
42-2. 10% 5'-mPEG2k-MMW- 키토산 - 폴리-L-아르기닌 (fw > 70000)
실시예 41-3에서 제조한 5`-mPEG2K-MMW-키토산 2mg과 PLR(fw >70000, 1.4 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 37-6과 동일한 방법으로 5'-mPEG2k-MMW- 키토산 - 폴리-L-아르기닌 (fw > 70000) 접합체를 제조하였다.
실시예43 ) 5'- mPEG2k - MMW - 키토산 - 폴리 -L-히스티딘 ( fw 5000) 접합체 제조
43-1. 15% 5'-mPEG2k-MMW- 키토산 - 폴리-L-히스티딘 (fw 5000)
실시예 41-2에서 제조한 5`-mPEG2K-MMW-키토산 2 mg과 PLH(fw 5000, 0.1 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 37-5와 동일한 방법으로 5'-mPEG2k-MMW- 키토산 - 폴리-L-히스티딘 (fw 5000) 접합체를 제조하였다.
43-2. 10% 5'-mPEG2k-MMW- 키토산 - 폴리-L-히스티딘 (fw 5000)
실시예 41-3에서 제조한 5`-mPEG2K-MMW-키토산 2mg과 PLH(fw 5000, 0.1 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 37-6과 동일한 방법으로 5'-mPEG2k-MMW- 키토산 - 폴리-L-히스티딘 (fw 5000) 접합체를 제조하였다.
실시예44 ) 5'- mPEG2k - MMW - 키토산 - 폴리 -L-라이신 ( fw 9200) 접합체 제조
44-1. 15% 5'-mPEG2k-MMW- 키토산 - 폴리-L-라이신 (fw 9200) 접합체
실시예 41-2에서 제조한 5`-mPEG2K-MMW-키토산 2 mg과 PLK(fw 9200, 0.184 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 37-5와 동일한 방법으로 5'-mPEG2k-MMW- 키토산 - 폴리-L-라이신 (fw 9200) 접합체를 제조하였다.
44-2. 10% 5'-mPEG2k-MMW- 키토산 - 폴리-L-라이신 (fw 9200) 접합체
실시예 41-3에서 제조한 5`-mPEG2K-MMW-키토산 2 mg과 PLK(fw 9200, 0.184 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 37-6과 동일한 방법으로 5'-mPEG2k-MMW- 키토산 - 폴리-L-라이신 (fw 9200) 접합체를 제조하였다.
실시예45 ) 5'- mPEG2k - HMW - 키토산 - 폴리 -L-아르기닌 ( fw 15000 ~ 70000) 접합체 제조
45-1. Phth-HMW-키토산 제조
HMW-키토산(Fluka)을 사용하여 실시예 37-2와 같은 방법으로 제조하였다.
45-2. 15 mol% PEGylation된 5`-mPEG2K-HMW-키토산 제조
phth-HMW-키토산을 사용하여 실시예 37-3과 같은 방법으로 제조하였다.
45-3. 10 mol% PEGylation된 5`-mPEG2K-HMW-키토산 제조
phth-HMW-키토산을 사용하여 실시예 37-4과 같은 방법으로 제조하였다.
45-4. 15% 5'-mPEG2k-HMW- 키토산 - 폴리-L-아르기닌 (fw 15000 ~ 70000) 접합체
실시예 45-2에서 제조한 5`-mPEG2K-HMW-키토산 2 mg을 사용하여 실시예 37-5와 동일한 방법으로 5'-mPEG2k-HMW- 키토산 - 폴리-L-아르기닌 (fw 15000 ~ 70000) 접합체를 제조한다.
45-5. 10% 5'-mPEG2k-HMW- 키토산 - 폴리-L-아르기닌 (fw 15000 ~ 70000) 접합체
실시예 45-3에서 제조한 5`-mPEG2K-HMW-키토산 2 mg을 사용하여 실시예 37-6과 동일한 방법으로 5'-mPEG2k-HMW- 키토산 - 폴리-L-아르기닌 (fw 15000 ~ 70000) 접합체를 제조한다.
실시예46 ) 5'- mPEG2k - HMW - 키토산 - 폴리 -L-아르기닌 ( fw > 70000) 접합체 제조
46-1. 15% 5'-mPEG2k-HMW- 키토산 - 폴리-L-아르기닌 (fw > 70000)
실시예 45-2에서 제조한 5`-mPEG2K-HMW-키토산 2 mg과 PLR(fw >70000, 1.4 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 37-5와 동일한 방법으로 5'-mPEG2k-HMW- 키토산 - 폴리-L-아르기닌 (fw > 70000) 접합체를 제조하였다.
46-2. 10% 5'-mPEG2k-HMW- 키토산 - 폴리-L-아르기닌 (fw > 70000)
실시예 45-3에서 제조한 5`-mPEG2K-HMW-키토산 2 mg과 PLR(fw >70000, 1.4 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 37-6과 동일한 방법으로 5'-mPEG2k-HMW- 키토산 - 폴리-L-아르기닌 (fw > 70000) 접합체를 제조하였다.
실시예47 ) 5'- mPEG2k - HMW - 키토산 - 폴리 -L-히스티딘 ( fw 5000) 접합체 제조
47-1. 15% 5'-mPEG2k-HMW- 키토산 - 폴리-L-히스티딘 (fw 5000) 접합체
실시예 45-2에서 제조한 5`-mPEG2K-HMW-키토산 2mg과 PLH(fw 5000, 0.1 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 37-5와 동일한 방법으로 5'-mPEG2k-HMW- 키토산 - 폴리-L-히스티딘 (fw 5000) 접합체를 제조하였다.
47-2. 10% 5'-mPEG2k-HMW- 키토산 - 폴리-L-히스티딘 (fw 5000) 접합체
실시예 45-3에서 제조한 5`-mPEG2K-HMW-키토산 2 mg과 PLH(fw 5000, 0.1 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 37-6과 동일한 방법으로 5'-mPEG2k-HMW- 키토산 - 폴리-L-히스티딘(fw 5000) 접합체를 제조하였다.
실시예48 ) 5'- mPEG2k - HMW - 키토산 - 폴리 -L-라이신 ( fw 9200) 접합체 제조
48-1. 15% 5'-mPEG2k-HMW- 키토산 - 폴리-L-라이신 (fw 9200) 접합체 제조
실시예 45-2에서 제조한 5`-mPEG2K-HMW-키토산 2 mg과 PLK(fw 9200, 0.184 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 37-5와 동일한 방법으로 5'-mPEG2k-HMW- 키토산 - 폴리-L-라이신 (fw 9200) 접합체를 제조하였다.
48-2. 10% 5'-mPEG2k-HMW- 키토산 - 폴리-L-라이신 (fw 9200) 접합체 제조
실시예 45-3에서 제조한 5`-mPEG2K-HMW-키토산 2 mg과 PLK(fw 9200, 0.184 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 37-6과 동일한 방법으로 5'-mPEG2k-HMW- 키토산 - 폴리-L-라이신 (fw 9200) 접합체를 제조하였다.
실시예49 ) 5'- mPEG5k - LMW - 키토산 - 폴리 -L-아르기닌 ( fw 1500 ~ 70000)
49-1. mPEG5K-COCH(CH3)Cl 제조
mPEG2K-OH(1.0 g, 0.2 mmol), 4-디메틸아미노피린딘(DMAP; 73.3 mg, 0.18 mmol), 트리에틸아민(TEA; 0.056 ml, 0.4 mmol)과 2-클로로프로피오닐 클로라이드(2-chloropropionyl chloride; 0.097 ml, 1.0 mmol) 사용하여 실시예 37-1과 같은 방법으로 제조하였다.
49-2. 15 mol% PEGylation된 5`-mPEG5K-LMW-chitosan 제조
실시예 49-1에서 제조한 mPEG5K-COCH(CH3)Cl(180 mg, 36.1 μmol)과 실시예 37-2에서 제조한 키토산을 사용하여 실시예 37-3과 같은 방법으로 제조하였다.
49-3. 10 mol% PEGylation된 5`-mPEG5K-LMW-chitosan 제조
실시예 49-1에서 제조한 mPEG5K-COCH(CH3)Cl(120 mg, 24.0 μmol)과 실시예 37-2에서 제조한 키토산을 사용하여 실시예 37-4와 같은 방법으로 제조하였다.
49-4. 15% 5'-mPEG5k-LMW- 키토산 - 폴리-L-아르기닌 (fw 15000 ~ 70000)
실시예 49-2에서 제조한 5`-mPEG5K-LMW-키토산 2 mg을 50 mM MES pH4.0 완충용액 1 ml 에 녹인 후 PLR( fw 15000 ~ 70000, 0.7mg, 0.2X10-7 mol), EDAC(fw 191.7, 383.4 ug, 0.2X10-5 mol) , Sulfo-NHS (fw 217.14, 434.28 ug , 0.2X10-5 mol)을 혼합하여 실온에서 24시간 동안 교반 반응한다. 이 혼합물을 원심분리용 여과기(centrifugal filter, MWCO 30k)를 사용하여 정제한 후 동결 건조하여 5‘-mPEG2k-LMW- 키토산- 폴리-L-아르기닌 (fw 15000 ~ 70000) 접합체를 제조한다.
49-5. 10% 5'-mPEG5k-LMW- 키토산 - 폴리-L-아르기닌 (fw 15000 ~ 70000)
실시예 49-3에서 제조한 5`-mPEG5K-LMW-키토산 2 mg을 50 mM MES pH4.0 완충용액 1 ml 에 녹인 후 PLR( fw 15000 ~ 70000, 0.7 mg, 0.2X10-7 mol), EDAC(fw 191.7, 383.4 ug, 0.2X10-5 mol) , Sulfo-NHS (fw 217.14, 434.28 ug , 0.2X10-5 mol)을 혼합하여 실온에서 24시간 동안 교반 반응한다. 이 혼합물을 원심분리용 여과기(centrifugal filter, MWCO 30k)를 사용하여 정제한 후 동결 건조하여 5‘-mPEG2k-LMW- 키토산- 폴리-L-아르기닌 (fw 15000 ~ 70000) 접합체를 제조한다.
실시예50 ) 5'- mPEG5k - LMW - 키토산 - 폴리 -L-아르기닌 ( fw > 70000) 접합체 제조
50-1. 15% 5'-mPEG5k-LMW- 키토산 - 폴리-L-아르기닌 (fw > 70000)
PLR(fw 15000~150000) 대신 PLR(fw > 70000, 1.4 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 49-4와 동일한 방법으로 5'-mPEG5k-LMW- 키토산 - 폴리-L-아르기닌 (fw > 70000) 접합체를 제조한다.
50-2. 10% 5'-mPEG5k-LMW- 키토산 - 폴리-L-아르기닌 (fw > 70000)
PLR(fw 15000~150000) 대신 PLR(fw > 70000, 1.4 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 49-5와 동일한 방법으로 5'-mPEG5k-LMW- 키토산 - 폴리-L-아르기닌 (fw > 70000) 접합체를 제조한다.
실시예51 )5'- mPEG5k - LMW - 키토산 - 폴리 -L-히스티딘 ( fw 5000) 접합체 제조
51-1. 15% 5'-mPEG5k-LMW- 키토산 - 폴리-L-히스티딘 (fw 5000) 접합체
PLR(fw 15000~150000) 대신 PLH(fw 5000, 0.1 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 49-4와 동일한 방법으로 5'-mPEG5k-LMW- 키토산 - 폴리-L-히스티딘 (fw 5000) 접합체를 제조한다.
51-2. 10% 5'-mPEG5k-LMW- 키토산 - 폴리-L-히스티딘 (fw 5000) 접합체
PLR(fw 15000~150000) 대신 PLH(fw 5000, 0.1 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 49-5와 동일한 방법으로 5'-mPEG5k-LMW- 키토산 - 폴리-L-히스티딘 (fw 5000) 접합체를 제조한다.
실시예52 ) 5'- mPEG5k - LMW - 키토산 - 폴리 -L-라이신 ( fw 9200) 접합체 제조
52-1. 15% 5'-mPEG5k-LMW- 키토산 - 폴리-L-라이신 (fw 9200) 접합체
PLR(fw 15000~150000) 대신 PLK(fw 9200, 0.184 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 49-4와 동일한 방법으로 5'-mPEG5k-LMW- 키토산 - 폴리-L-라이신 (fw 9200) 접합체를 제조한다.
52-2. 10% 5'-mPEG5k-LMW- 키토산 - 폴리-L-라이신 (fw 9200) 접합체 제조
PLR(fw 15000~150000) 대신 PLK(fw 9200, 0.184 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 49-5와 동일한 방법으로 5'-mPEG5k-LMW- 키토산 - 폴리-L-라이신 (fw 9200) 접합체를 제조한다.
실시예53 ) 5'- mPEG5k - MMW - 키토산 - 폴리 -L-아르기닌 ( fw 1500 ~ 70000) 접합체 제조
53-1. 15 mol% PEGylation된 5`-mPEG5K-MMW-키토산 제조
실시예 49-1에서 제조한 mPEG5K-COCH(CH3)Cl과 실시예 41-1에서 제조한 키토산을 사용하여 실시예 49-2와 같은 방법으로 제조하였다.
53-2. 10 mol% PEGylation된 5`-mPEG5K-MMW-키토산 제조
실시예 49-1에서 제조한 mPEG5K-COCH(CH3)Cl과 실시예 41-1에서 제조한 키토산을 사용하여 실시예 49-3과 같은 방법으로 제조하였다.
53-3. 15% 5'-mPEG5k-MMW- 키토산 - 폴리-L-아르기닌 (fw 15000 ~ 70000)
실시예 53-1에서 제조한 5`-mPEG5K-MMW-키토산 2 mg을 사용하여 실시예 49-4와 동일한 방법으로 5'-mPEG5k-MMW- 키토산 - 폴리-L-아르기닌 (fw 15000 ~ 70000) 접합체를 제조한다.
53-4. 10% 5'-mPEG5k-MMW- 키토산 - 폴리-L-아르기닌 (fw 15000 ~ 70000)
실시예 53-2에서 제조한 5`-mPEG5K-MMW-chitosan 2 mg을 사용하여 실시예 49-5와 동일한 방법으로 5'-mPEG5k-MMW- 키토산 - 폴리-L-아르기닌 (fw 15000 ~ 70000) 접합체를 제조한다.
실시예54 ) 5'- mPEG5k - MMW - 키토산 - 폴리 -L-아르기닌 ( fw > 70000)
54-1. 15% 5'-mPEG5k-MMW- 키토산 - 폴리-L-아르기닌 (fw > 70000)
실시예 53-1에서 제조한 5`-mPEG5K-MMW-chitosan 2 mg과 PLR(fw >70000, 1.4 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 49-4와 동일한 방법으로 5'-mPEG5k-MMW- 키토산 - 폴리-L-아르기닌 (fw > 70000) 접합체를 제조하였다.
54-2. 10% 5'-mPEG5k-MMW- 키토산 - 폴리-L-아르기닌 (fw > 70000)
실시예 53-2에서 제조한 5`-mPEG5K-MMW-chitosan 2 mg과 PLR(fw >70000, 1.4 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 49-5와 동일한 방법으로 5'-mPEG5k-MMW- 키토산 - 폴리-L-아르기닌 (fw > 70000) 접합체를 제조하였다.
실시예55 ) 5'- mPEG5k - MMW - 키토산 - 폴리 -L-히스티딘 ( fw 5000) 접합체 제조
55-1. 15% 5'-mPEG5k-MMW- 키토산 - 폴리-L-히스티딘 (fw 5000)
실시예 53-1에서 제조한 5`-mPEG5K-MMW-chitosan 2 mg과 PLH(fw 5000, 0.1 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 49-4와 동일한 방법으로 5'-mPEG5k-MMW- 키토산 - 폴리-L-히스티딘 (fw 5000) 접합체를 제조하였다.
55-2. 10% 5'-mPEG5k-MMW- 키토산 - 폴리-L-히스티딘 (fw 5000)
실시예 53-2에서 제조한 5`-mPEG5K-MMW-chitosan 2 mg과 PLH(fw 5000, 0.1 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 49-5와 동일한 방법으로 5'-mPEG5k-MMW- 키토산 - 폴리-L-히스티딘 (fw 5000) 접합체를 제조하였다.
실시예56 ) 5'- mPEG5k - MMW - 키토산 - 폴리 -L-라이신 ( fw 9200) 접합체 제조
56-1. 15% 5'-mPEG5k-MMW- 키토산 - 폴리-L-라이신 (fw 9200) 접합체
실시예 53-1에서 제조한 5`-mPEG5K-MMW-chitosan 2 mg과 PLK(fw 9200, 0.184 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예49-4와 동일한 방법으로 5'-mPEG5k-MMW- 키토산 - 폴리-L-라이신 (fw 9200) 접합체를 제조하였다.
56-2. 10% 5'-mPEG5k-MMW- 키토산 - 폴리-L-라이신 (fw 9200) 접합체
실시예 53-2에서 제조한 5`-mPEG5K-MMW-chitosan 2 mg과 PLK(fw 9200, 0.184 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 49-5와 동일한 방법으로 5'-mPEG5k-MMW- 키토산 - 폴리-L-라이신 (fw 9200) 접합체를 제조하였다.
실시예57 ) 5'- mPEG5k - HMW - 키토산 - 폴리 -L-아르기닌 ( fw 1500 ~ 70000)
57-1. 15 mol% PEGylation된 5`-mPEG5K-HMW-chitosan 제조
실시예 49-1에서 제조한 mPEG5K-COCH(CH3)Cl과 실시예 45-1에서 제조한 키토산을 사용하여 실시예 49-2와 같은 방법으로 제조하였다.
57-2. 10 mol% PEGylation된 5`-mPEG5K-HMW-chitosan 제조
실시예 49-1에서 제조한 mPEG5K-COCH(CH3)Cl과 실시예 45-1에서 제조한 키토산을 사용하여 실시예 49-3과 같은 방법으로 제조하였다.
57-3. 15% 5'-mPEG5k-HMW- 키토산 - 폴리-L-아르기닌 (fw 15000 ~ 70000) 접합체
실시예 57-1에서 제조한 5`-mPEG5K-HMW-chitosan 2 mg을 사용하여 실시예 49-4와 동일한 방법으로 5'-mPEG5k-HMW- 키토산 - 폴리-L-아르기닌 (fw 15000 ~ 70000) 접합체를 제조한다.
57-4. 10% 5'-mPEG5k-HMW- 키토산 - 폴리-L-아르기닌 (fw 15000 ~ 70000) 접합체
실시예 57-2에서 제조한 5`-mPEG5K-HMW-chitosan 2 mg을 사용하여 실시예 49-5와 동일한 방법으로 5'-mPEG5k-HMW- 키토산 - 폴리-L-아르기닌 (fw 15000 ~ 70000) 접합체를 제조한다.
실시예58 ) 5'- mPEG5k - HMW - 키토산 - 폴리 -L-아르기닌 ( fw > 70000)
58-1. 15% 5'-mPEG5k-HMW- 키토산 - 폴리-L-아르기닌 (fw > 70000)
실시예 57-1에서 제조한 5`-mPEG5K-HMW-chitosan 2 mg과 PLR(fw >70000, 1.4 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 49-4와 동일한 방법으로 5'-mPEG5k-HMW- 키토산 - 폴리-L-아르기닌 (fw > 70000) 접합체를 제조하였다.
58-2. 10% 5'-mPEG5k-HMW- 키토산 - 폴리-L-아르기닌 (fw > 70000)
실시예 57-2에서 제조한 5`-mPEG5K-HMW-chitosan 2 mg과 PLR(fw >70000, 1.4 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 49-5와 동일한 방법으로 5'-mPEG5k-HMW- 키토산 - 폴리-L-아르기닌 (fw > 70000) 접합체를 제조하였다.
실시예59 ) 5'- mPEG5k - HMW - 키토산 - 폴리 -L-히스티딘 ( fw 5000) 접합체 제조
59-1. 15% 5'-mPEG5k-HMW- 키토산 - 폴리-L-히스티딘 (fw 5000) 접합체
실시예 57-1에서 제조한 5`-mPEG5K-HMW-chitosan 2 mg과 PLH(fw 5000, 0.1 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예49-4와 동일한 방법으로 5'-mPEG5k-HMW- 키토 산 - 폴리-L-히스티딘 (fw 5000) 접합체를 제조하였다.
59-2. 10% 5'-mPEG5k-HMW- 키토산 - 폴리-L-히스티딘 (fw 5000) 접합체
실시예 57-2에서 제조한 5`-mPEG5K-HMW-chitosan 2 mg 과 PLH(fw 5000, 0.1 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 49-5와 동일한 방법으로 5'-mPEG5k-HMW- 키토산 - 폴리-L-히스티딘 (fw 5000) 접합체를 제조하였다.
실시예60 ) 5'- mPEG5k - HMW - 키토산 - 폴리 -L-라이신 ( fw 9200) 접합체 제조
60-1. 15% 5'-mPEG5k-HMW- 키토산 - 폴리-L-라이신 (fw 9200) 접합체
실시예 57-1에서 제조한 5`-mPEG5K-HMW-chitosan 2 mg과 PLK(fw 9200, 0.184 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 49-4와 동일한 방법으로 5'-mPEG5k-HMW- 키토산 - 폴리-L-라이신 (fw 9200) 접합체를 제조하였다.
60-2. 10% 5'-mPEG5k-HMW- 키토산 - 폴리-L-라이신 (fw 9200) 접합체
실시예 57-2에서 제조한 5`-mPEG5K-HMW-chitosan 2 mg과 PLK(fw 9200, 0.184 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 49-5와 동일한 방법으로 5'-mPEG5k-HMW- 키토산 - 폴리-L-라이신 (fw 9200) 접합체를 제조하였다.
실시예61 ) Man - PEG2k - LMW -키토산- 폴리 -L-아르기닌( fw 15000-70000) 접합체 제조
61-1. Man-PEG2K-NHS 제조
PEG2K-diamine(0.5 g, 25 μmol)을 25 ml의 DCM에 녹이고 0 ℃에서 Fmoc-OSu(12.6 mg, 37.5 μmol)를 첨가하고 TLC로 확인하여 PEG-diamine이 소모될 때까지 교반한다. 감압증류 장치로 DCM을 제거한다. 소량의 DCM을 사용하여 녹이고 ether에 침전시켜 정제하여 (Fmoc)2-PEG를 포함하는 Fmoc-PEG-NH2을 얻는다. 이 PEG-화합물 Fmoc-PEG-NH2은 TLC로 반응 모니터링 하였다. 제조한 Fmoc-PEG-NH2(0.46 g, 23 μmol)을 23 ml의 DCM에 녹이고 숙시닉 무수물(succinic anhydride; 23.0 mg, 230 μmol)과 피리딘(22.3 μl, 276 μmol)을 넣고 질소가스 하에서 40-60 ℃ 정도에서 환류 시키며 밤새 교반한다. 실온으로 낮추고 DCM으로 추출하고 포화된 NH4Cl(aq)로 씻어준다. DCM층은 MgSO4로 수분을 제거하고 감압증류 장치로 DCM을 제거한다. 소량의 DCM에녹여 과량의 ether에 부어 침전시켜 정제하여 반응에 관여하지 않고 남은 (Fmoc)2-PEG를 포함하는 Fmoc-PEG-COOH를 얻는다. 화합물 Fmoc-PEG-COOH은 TLC로 반응 모니터링하고 D2O에 녹여 500 MHz1H NMR으로 확인하였다. 이 화합물 Fmoc-PEG-COOH (0.45 g, 22.5 μmol)을 50% 피페리딘/DMF에 녹이고 1.5 시간 정도 교반하여 Fmoc deprotection 반응을 한다. 과량의 에테르에 부어 침전시키고 에테르(ether)로 충분히 씻으며 여과하고 정제하여 PEG-diamine을 포함하는 H2N-PEG-COOH을 얻는다. 얻은 화합물 H2N-PEG-COOH(0.4 g, 20 μmol)와 만노즈(mannose; 10.8 mg, 60 μmol), 이미다졸(imidazole; 8.2 mg, 120 μmol)을 2 ml의 N-메틸 피롤리돈(NMP)에 녹이고 60 ℃정도로 가열하여 20 hr정도 교반한다. 실온으로 낮추고 DCM으로 추출하고 포화된 NH4Cl(aq)로 씻어준다. DCM층은 MgSO4로 수분을 제거하고 감압증류 장치로 DCM을 제거한다. 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제하고 DCM/MeOH/NH4OH로 PEG를 회수한 후 감압증류 장치로 용매를 제거한다. 소량의 DCM에 녹여 과량의 에테르에 부어 침전시켜 정제하여 (Man)2-PEG를 포함하는 Man-PEG-COOH를 얻는다. 만노즈의 확인은 Man-PEG-NHS 화합물로 NMR에서 확인하였다.
화합물 Man-PEG-COOH(125 mg, 6.25 μmol)와 NHS(7.2 mg, 62.5 μmol)를 1.5 ml의 DCM에 녹인 용액에 질소가스 하에0 ℃이하에서 DCC(12.9 mg, 62.5 μmol)를 0.3 ml의 DCM에 녹인 용액을 drop으로 1시간 정도에 걸쳐 가하고 저온 유지하여 10-12시간 동안 교반한다. 여과하여 생성된 고형물(urea 류)을 제거하고 ether로 침전 정제한다. EA(에틸아세테이트)로 재결정시켜 정제하여 Man-PEG-NHS를 얻는다. 화합물 Man-PEG-NHS의 만노즈 확인은 D2O에 녹이고 NHS는 CDCl3에 녹여 500 MHz1H NMR으로 확인하였다.
61-2. 15% Man-PEG2k-LMW-키토산-폴리-L-아르기닌(fw 15000-70000) 접합체
실시예 13-1에서 준비한 키토산 용액 10 ml(fw 50000~150000, 20 mg, 1.24X10-4 mol of pyranose units)과 실시예 61-1에서 제조한 Man-PEG2K-NHS ( fw 2000, 37.26 mg , 1.863X10-5 mol, 15 mol%)을 혼합한 후 실온에서 24시간 동안 교반 반응한다. 이 혼합물을 원심분리용 여과기(centrifugal filter, MWCO 30k)를 사용하여 정제한 후 동결 건조하여 Man-PEG2K-LMW-키토산(fw 50000~150000) 접합체(DP 15 mol%)를 제조한다. 제조된 Man-PEG2K-LMW-키토산(fw 50000~150000) 접합체 2 mg을 1ml 의 50 mM MES pH4.0 완충용액에 녹인 후 PLR (fw 15000~70000, 0.7 mg, 0.2X10-7mol), EDAC (fw 191.7, 383.4 ug, 0.2X10-5 mol), Sulfo-NHS (fw 217.14, 434.28 ug , 0.2X10-5 mol)을 혼합하여 실온에서 24시간 동안 교반 반응한다. 이 혼합물을 원심분리용 여과기(centrifugal filter, MWCO 30k)를 사용하여 정제한 후 동결 건조하여 Man-PEG2k-LMW-키토산-폴리-L-아르기닌(fw 15000-70000) 접합체(DP 15 mol%)를 제조한다.
실시예 62) 15% Man - PEG2k - LMW -키토산- 폴리 -L-아르기닌( fw > 70000) 접합체 제조
PLR(fw 15000~70000) 대신 PLR(fw > 70000, 1.4 mg, 0.2X10-7mol) 을 사용하 여 실시예 61-2와 동일한 방법으로 Man-PEG2k-LMW-키토산-폴리-L-아르기닌(fw > 70000) 접합체(DP 15 mol%)를 제조한다.
실시예63 ) 15% Man - PEG2k - MMW -키토산- 폴리 -L-아르기닌 ( fw 15000 ~ 70000)
17-1에서 준비한 키토산 용액10 ml(20 mg, 1.24X10-4 mol of pyranose units) 을 사용하여 실시예 61-2와 동일한 방법으로 Man-PEG2k -MMW-키토산- 폴리-L-아르기닌 (fw 15000 ~ 70000) 접합체를 제조한다.
실시예 64) 15% Man - PEG2k - MMW -키토산- 폴리 -L-아르기닌 ( fw > 70000) 접합체 제조
실시예 17-1에서 준비한 키토산 용액 10 ml(20 mg, 1.24X10-4 mol of pyranose units) 과 PLR(fw >70000, 1.4 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 61-2와 동일한 방법으로 Man-PEG2k-MMW-키토산- 폴리-L-아르기닌 (fw >70000) 접합체(DP 15 mol%)를 제조한다.
실시예 65) 15% Man - PEG2k - HMW -키토산- 폴리 -L-아르기닌 ( fw 15000 ~ 70000) 접합체 제조
실시예 21-1에서 준비한 키토산 용액 10 ml (20 mg, 1.24X10-4 mol of pyranose units)을 사용하여 실시예 61-2와 동일한 방법으로 Man-PEG2k-HMW-키토산- 폴리-L-아르기닌 (fw 15000 ~ 70000) 접합체(DP 15 mol%)를 제조한다.
실시예66 ) 15% Man - PEG2k - HMW -키토산- 폴리 -L-아르기닌 ( fw > 70000) 접합체 제조
실시예 21-1에서 준비한 키토산 용액 10 ml(20 mg, 1.24X10-4 mol of pyranose units)과 PLR(fw > 70000, 1.4 mg, 0.2X10-7 mol)을 사용하여 실시예 61-2와 동일한 방법으로 Man-PEG2k-HMW-키토산- 폴리-L-아르기닌 (fw >70000) 접합체를 제조한다.
실시예 67) 키토산 소재 접합체와 작은간섭 리보핵산의 복합체 ( complex ) 제조
67-1. 양이온성 고분자 전달체와 작은간섭 리보핵산의 복합체 제조
쥐(Mus musculus)의 서바이빈 (survivin, mouse 유래, NCBI accession number NM_001168) 유전자의 단백질 발현을 저해하는 서바이빈 특이적인 작은간섭 리보핵산 서열은 siRNA 가닥 디자인 프로그램을 이용하여 결정하였으며, 삼천리제약(서울, 한국)으로부터 주문 제작하였다. 양이온성 고분자 전달체는 키토산 (Sigma, 미국), 폴리아르기닌 (Sigma, 미국), 비교예 1, 2 및 상기 실시예에 기재된 키토산-폴리아르기닌 및 키토산-폴리아르기닌-폴리에틸렌 글리콜을 모두 수용액 상태로 제조하여 사용하였다.
67-2. 작은간섭 리보핵산과 양이온성 고분자의 복합체 형성 확인 평가
작은 간섭 리보핵산과 양이온성 고분자의 복합체를 제조하기 위해 키토산, 폴리아르기닌, 비교예 1, 비교예 2, 실시예 6-2에서 제조된 키토산-폴리아르기닌 또는 실시예 45-5에서 제조된 키토산-폴리아르기닌-폴리에틸렌 글리콜용액과 서바이빈에 대한 작은간섭 리보핵산을 다양한 비율로 가하고 혼합한 다음 37℃에서 30분간 방치시킨 후 아가로즈 젤에 전기영동하여 복합체의 형성을 확인하였다.
본 실험 수행결과, 도 6에서 나타나듯이 키토산-폴리아르기닌 (실시예 6-2)의 양이 증가할수록 복합체를 형성한 서바이빈 작은간섭 리보핵산의 양이 증가하여 복합체를 형성하지 않은 상태로 존재하여 전기영동시 이동성을 나타내는 작은간섭 리보핵산의 양이 감소하는 결과를 확인할 수 있었다. 또한, 키토산-폴리아르기닌-폴리에틸렌 글리콜 (실시예 45-4)의 양이 증가할수록 복합체를 형성한 서바이빈 작은간섭 리보핵산의 양이 증가하여 복합체를 형성하지 않아 전기영동 상에서 이동성 을 나타내는 작은간섭 리보핵산의 양이 감소하는 결과를 확인할 수 있었다.
실시예 68) 형광표지 리보핵산물질을 이용한 키토산 고분자 접합체의 세포내 전달 효율 평가
형광인자로 표지된 리보핵산 (Flu-dsRNA, Invitrogen, 미국)과 키토산, 키토산과 폴리에틸렌 글리콜 접합체(비교예 1), 폴리아르기닌, 폴리아르기닌과 폴리에틸렌 글리콜의 2중 접합체 (비교예 2), 키토산과 폴리아르기닌의 2중 접합체 (실시예 2-3), 키토산과 폴리아르기닌 및 폴리에틸렌 글리콜의 3중 접합체(실시예 14-1)를 각각 혼합한 다음 37℃에서 30분간 방치시킨 후 간암세포주인 Hepa 1-6 세포주 (American Tissue Culture Collection, 미국) (도 7 참조)와 상피세포주인 VK2 세포주 (American Tissue Culture Collection, 미국) (도 8 참조)에 각각 처리하고 24시간이 경과된 다음 형광현미경 하에서 세포내로 전달된 형광표지 리보핵산의 양을 비교하였다. 도 7에서 나타나듯이 키토산 자체를 전달체로 사용한 경우나 키토산과 폴리에틸렌 글리콜만의 2중 접합체 (비교예 1)의 경우 세포내 전달 효율이 비교군들 중 가장 낮았으며, 폴리아르기닌만을 처리한 경우 키토산만을 사용한 경우 보다는 세포내 전달 효율이 높았으나 키토산과 폴리아르기닌이 접합체를 형성한 경우 (실시예 2-3) 세포내 전달 효율이 증가되었다. 또한 키토산과 폴리아르기닌 및 폴리에틸렌글리콜 3중 접합체 (실시예 14-1)은 폴리아르기닌과 폴리에틸렌 글리콜만의 2중 접합체 (비교예 2)에 비교할 때 는 세포내 전달 효율 면에서 높은 효율을 나타내었다. 도 7과 다른 세포주를 대상으로 전달 효율을 평가한 도 8의 경우에도 실시예 2-2 및 실시예 17-2는 키토산, 폴리아르기닌 및 비교예 1, 2에 비하여 높은 전달 효율을 나타내었다.
실시예 69) 키토산 고분자 접합체의 작은 간섭 리보핵산 세포 내 전달 효율 평가: 표적 단백질의 발현 저하도에 의한 세포 내 전달도 평가
실시예 68에서 형광 표지 리보핵산을 사용하여 여러 가지 비교군중 키토산-폴리아르기닌, 키토산-폴리아르기닌-폴리에틸렌 글리콜 접합체가 세포내 전달 정도가 높은 것으로 평가되었으나, 이에 추가적으로 세포내로 전달된 작은간섭 리보핵산 물질이 세포내에서 소기의 생물학적 기능을 달성하는지를 특정 작은 간섭 리보핵산이 세포내에서 표적 단백질의 발현을 저하시키는 지의 여부로 평가하였다.
세포내 전달 대상으로는 서바이빈 단백질에 특이적인 작은 간섭 리보핵산을 사용하였고, 세포주로는 간암 세포주인 Hepa 1-6 세포를 사용하였다. 전달체로서는 키토산, 키토산과 폴리에틸렌 글리콜 접합체 (비교예 1), 폴리 아르기닌, 폴리아르기닌과 폴리에틸렌 글리콜 접합체 (비교예 2), 키토산과 폴리아르기닌의 2중 접합체 (실시예 5-3), 키토산과 폴리아르기닌 및 폴리에틸렌 글리콜의 3중 접합체 (실시예 42-2)를 각각 사용하였다.
간암 세포주인 Hepa 1-6 세포는 DMEM (Dulbecco's modified eagles medium)에 우혈청이 10 % 첨가된 배지를 제조하여 배양하였다. Hepa 1-6 세포주에 양이온성 고분자 키토산 유도체와 siRNA의 복합체를 제조하여 가하고 24시간동안 배양한 후 수세하고 트리졸(TRIzolTM, 인비트로젠사 (Invitrogen), 미국)을 사용하여 세포내에서 전사 유전자 (mRNA)를 분리 정제한 다음 서바이빈에 대한 전사 유전자 (mRNA)의 발현 감소율을 서바이빈에 대한 특정 프라이머 및 비교유전자인 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)에 대한 프라이머를 이용하여 역전사연쇄효소중합반응 (RT-PCR)을 통해 정량적으로 확인하였다.
역전사연쇄효소중합반응 (RT-PCR)은 먼저 1 ug의 분리정제된 RNA를 바이오니아사에서 구입한 RT-PreMix에 첨가하여 상보적 DNA 가닥 (cDNA)을 제조하였으며, 상기와 같이 제조된 cDNA 중 일부 (100 ng)를 10 pmole의 센스(sense) 및 안티센스 (antisense) 프라이머를 각각 1 ul 씩, 택 폴리머라아제(Taq Polymerase) (5 U/ul, 바이오니아사, 한국) 0.1 ul, dNTPs, 10X 반응 완충액을 혼합하여 연쇄중합반응을 수행하였다. 역전사중합효소 연쇄반응(RT-PCR)의 산물은 1% 아가로즈 젤 상에서 전기영동한 다음 연쇄반응 산물의 밴드 밀도 (gel density)를 이미지 분석기를 사용하여 정량화 하여 비교 평가하였다.
도 9에서 나타나듯이 키토산이나 키토산과 폴리에틸렌 글리콜 접합체 (비교예 1), 및 폴리아르기닌과 폴리에틸렌 글리콜 접합체 (비교예 2)의 경우 서바이빈 전사 유전자의 발현을 억제하는 기능이 거의 없었으며, 폴리아르기닌만을 처리한 경우 키토산만을 사용한 경우 보다는 전사 유전자 발현 억제 기능이 어느 정도 증강되었으나 키토산과 폴리아르기닌의 접합체 (실시예 5-3)를 형성한 경우나 키토 산과 폴리아르기닌 및 폴리에틸렌글리콜 3중 접합체(실시예 42-2)의 경우 다른 대조군들 보다 전사 유전자 발현 억제 기능이 현저히 증가되었다.
실시예 70) 종양 세포주에서의 세포 독성 평가
작은간섭 리보핵산과 유전자를 포함하는 양이온성 고분자 키토산 유도체로 이루어진 복합체의 세포 독성에 관한 평가를 하기 위하여 하기와 같은 과정으로 실험을 수행하였다. Hepa 1-6 간암세포주와 VK2 상피세포주를 대상으로 양이온성 고분자 키토산 유도체와 siRNA 유전자의 복합체를 제조하고 세포 독성을 평가하였다.
독성 평가 방법으로는 3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) 시약을 이용한 방법을 사용하였다. 세포를 한 웰 (well) 당 1× 105 세포가 되도록 분주 (seeding)하고 배양한 후 양이온성 고분자 키토산 유도체 (각각 15 ug)와 siRNA (100 pmole) 유전자의 복합체, 또는 siRNA 유전자 자체의 형태로 각각 첨가하였다. 복합체를 처리하고 24시간 경과 후 각각의 MTT 용액을 배지의 10 %가 되도록 가하고, 4시간 더 배양 한 다음 상층액을 제거하고 0.04 N 염산 이소프로판올 용액을 첨가한 후에 엘라이져 리더 (ELISA reader, Tecan사, 미국)를 이용하여 590 nm에서 그 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 작은간섭 리보핵산을 처리하지 않은 세포가 사용되었으며 세포의 생존률 (cell viability)은 하기와 같은 수학식으로 계산되었다.
세포의 생존률 (%) = (실험군의 OD /대조군의 OD)× 100
도 10에서 나타나듯이 키토산-폴리아르기닌 (실시예 1-4)이나 키토산-폴리에틸렌 글리콜 (실시예 41-5)처리군의 경우 증강된 세포내 전달 효율에도 불구하고 다른 양이온성 전달체들에 비하여 세포 독성이 크지 않은 것을 알 수 있다. 또한 도 11에서도 키토산-폴리아르기닌 (실시예 1-2, 1-3)이나 키토산-폴리에틸렌 글리콜 (실시예 14-1, 18-1)처리군의 경우 기존의 상업적으로 상용화되어 사용되는 리포펙타민 처리군에 비하여 세포 독성이 감소된 것을 알 수 있다.
실시예 71) 동물모델에서 키토산 고분자 접합체에 의한 작은간섭 리보핵산의 혈중 체류성 평가
실험용 마우스 (ICR mice)를 대상으로 이중가닥의 5’방향 뉴클레오타이드의 5번째 탄소에 연결된 인산화그룹에 각각 바이오틴 (biotin)과 디나이트로페놀(dinitrophenol, DNP)을 결합시킨 siRNA와 수송체로서 키토산-폴리에틸렌 글리콜 (비교예 1), 폴리아르기닌-폴리에틸렌 글리콜 (비교예 2), 키토산-폴리아르기닌의 접합체 (실시예 2-1)을 각각 사용하여 복합체(complex)를 형성시킨 후 꼬리 정맥으로 정맥주사 하고 일정시간 후에 혈액을 취하여 면역활성측정법에 의해 siRNA를 정량하였다. 자세한 실험 과정으로는 비교예 1, 비교예2, 실시예 2-1의 고분자와 작은 간섭 리보핵산을 20분간 상온에서 결합시키고, 대조군으로 아무것도 처리하지 않고 혈액만 취한 그룹과 키토산 유도체를 사용하지 않고 작은 간섭 리보핵산 만을 인슐린 주사기를 이용하여 주사한 그룹을 이용하였다. 30초, 2분, 5분에 쥐의 꼬리로부터 혈액을 취하여 헤파린을 첨가한 후, 스트렙타비딘 (streptavidin)이 코팅된 플레이트에 넣은 후 37℃에서 1시간 반응시켰다. 플레이트를 3회 수세한 다음 1차 항체(monoclonal mouse anti-DNP IgE; Sigma, Saint Louis, MO, USA)를 5000대 1로 희석하여 100μl 처리하고 37℃에서 1시간 방치하였다. 디에틸 피로카보네이트 및 0.1% 트윈 20을 함유한 인산완충액으로 세 차례 수세한 후, 2차 항체(goat anti-mouse IgE conjugate HRP; Serotec, Oxford, UK)를 1000대 1로 희석하여 100μl 넣고 37℃에서 1시간 방치한 다음, 디에틸 피로카보네이트 및 0.1% 트윈 20을 함유한 인산완충액로 수세하고 horseradish peroxidase 효소 기질인 3,3',5,5'-tetramethyl benzidine (Turbo TMBTM, Pierce, Rockford, USA)용액 100μl를 넣고 15분 동안 발색시킨 후, 동일 양의 1N H2SO4 100μl를 넣고 반응을 중지시켰다. 도면 12에서 보는 바와 같이 키토산과 폴리아르기닌 접합체 (실시예 2-1)과 복합체 형태로 의해 생체 내로 주입된 작은간섭 리보핵산은 복합체를 형성하지 않고 투여된 작은 간섭 리보핵산이나 키토산과 폴리에틸렌 글리콜 접합체 (비교예 1), 폴리아르기닌과 폴리에틸렌 글리콜 접합체 (비교예 2)를 수송체로 사용한 경우에 비하여 혈중 농도가 높은 상태로 지속되는 것이 관찰되었다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 키토산 소재 양이온성 고분자 접합체는 작은 간섭 리보핵산(siRNA) 등의 핵산 소재 의약물질과 하전에 의한 복합체 (complex)를 형성하여 세포 내로 이들 핵산 소재 물질들을 효율적으로 전달할 뿐만 아니라 세포 독성도 현저히 감소시킴으로써 다양한 세포들을 대상으로 목적하는 작은 간섭 리보핵산 유전자를 효과적으로 세포 내로 수송하고 발현시키는데 유용하게 사용될 수 있다. 또한 본 발명의 키토산 소재 양이온성 고분자 접합체는 생체 내에서 핵산의약의 체류시간을 증가시키는데 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (19)

  1. 키토산의 아민기에 공유결합된 폴리아민을 포함하는 키토산 기재 양이온성 고분자 접합체.
  2. 제1항에 있어서, 키토산에 공유결합된 폴리에틸렌글리콜을 더 포함하는 키토산 기재 양이온성 고분자 접합체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 폴리아민이 폴리아르기닌, 폴리히스티딘 또는 폴리라이신인 키토산 기재 양이온성 고분자 접합체.
  4. 제2항에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜이 키토산의 아민기 또는 하이드록시기에 결합되는 키토산 기재 양이온성 고분자 접합체.
  5. 제2항에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜이 당 성분(sugar moiety)에 의해 수식된 것인 키토산 기재 양이온성 고분자 접합체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 키토산 기재 양이온성 고분자 접합체 및 핵산 소재 의약을 포함하는 핵산 소재 의약의 생체 내 또는 세포 내 전달용 수송체 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 핵산 소재 의약은 작은 간섭 RNA 또는 플라스미드 유전자인 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 세포는 점막부위 또는 점막 조직을 구성하는 세포인 조성물.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 키토산 기재 양이온성 고분자 접합체 및 핵산 소재 의약을 포함하는 핵산 소재 의약의 혈중 체류 증가용 수송체 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 핵산 소재 의약은 작은 간섭 RNA 또는 플라스미드 유전자인 조성물.
  11. 수용액 내 카르복실기 커플링화제의 존재 하에 키토산 및 폴리아민을 혼합 및 교반하는 단계를 포함하는 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 키토산 기재 양이온성 고분자 접합체의 제조방법.
  12. 제11항에 있어서, 키토산 : 폴리아민의 몰비가 1:1 내지 1:10으로 결합되는 키토산 기재 양이온성 고분자 접합체의 제조방법.
  13. 제11항에 있어서, 키토산과 폴리아민의 혼합 전에 활성화된 폴리에틸렌글리콜을 키토산과 혼합 및 교반하거나, 또는 키토산과 폴리아민의 혼합 및 교반 후 생성된 키토산-폴리아민 공유결합 접합체에 활성화된 폴리에틸렌글리콜을 혼합 및 교반하는 단계를 더 포함하는 키토산 기재 양이온성 고분자 접합체의 제조방법.
  14. 제13항에 있어서, 키토산 : 폴리에틸렌글리콜의 몰비가 1:1 내지 1:50으로 결합되는 키토산 기재 양이온성 고분자 접합체의 제조방법.
  15. 제11항에 있어서, 상기 폴리아민은 폴리아르기닌, 폴리히스티딘 또는 폴리라이신인 키토산 기재 양이온성 고분자 접합체의 제조방법.
  16. 제13항에 있어서, 상기 활성화된 폴리에틸렌글리콜은 당 성분(sugar moiety)에 의해 수식된 것인 키토산 기재 양이온성 고분자 접합체의 제조방법.
  17. (1) 카르복실기 커플링화제의 존재 하에 키토산 및 폴리아민을 혼합 및 교반하여 키토산의 아민기에 폴리아민이 공유결합된 키토산 기재 양이온성 고분자접합체를 생산하는 단계; 및
    (2) 단계 (1)에서 생산된 키토산 기재 양이온성 고분자접합체를 핵산 소재 의약과 혼합하는 단계를 포함하는, 핵산소재 의약의 생체 내 또는 세포내 전달용 수송체 조성물의 제조방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 키토산 기재 양이온성 고분자접합체가 키토산에 공유결합된 폴리에틸렌글리콜을 더 포함하는 것으로서, 상기 제조 방법은 상기 단계 (1)에서 키토산과 폴리아민의 혼합 전에 활성화된 폴리에틸렌글리콜을 키토산과 혼합 및 교반하거나, 또는 키토산과 폴리아민의 혼합 및 교반 후 생성된 키토산-폴리아민 공유결합 접합체에 활성화된 폴리에틸렌글리콜을 혼합 및 교반하는 단계를 더 포함하여 제조되는 것인 핵산소재 의약의 생체 내 또는 세포내 전달용 수송체 조성물의 제조방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 핵산 소재 의약은 작은 간섭 RNA 또는 플라스미드 유전자인 핵산소재 의약의 생체 내 또는 세포내 전달용 수송체 조성물의 제조방법.
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