JP2001323059A - ポリペプチド誘導体および核酸運搬体 - Google Patents

ポリペプチド誘導体および核酸運搬体

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JP2001323059A JP2000146829A JP2000146829A JP2001323059A JP 2001323059 A JP2001323059 A JP 2001323059A JP 2000146829 A JP2000146829 A JP 2000146829A JP 2000146829 A JP2000146829 A JP 2000146829A JP 2001323059 A JP2001323059 A JP 2001323059A
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Masaru Nakanishi
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圭司 米村
Naoya Omori
直哉 大森
Takashi Yasukochi
崇 安河内
Masanao Oya
正尚 大屋
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 遺伝子治療に用いる、安全に効率よく薬物遺
伝子を導入可能にする非ウイルス性核酸運搬体を提供す
る。 【解決手段】 式（１）で表わされるポリペプチド誘導
体またはその薬学的に許容される塩が臓器特異性を示す
核酸運搬体として開示される。 【化１】

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、細胞内に薬物遺伝
子を導入するための核酸運搬体に関する。より詳しく
は、本発明は、ポリジアミノ酪酸を含んでもよいポリペ
プチドの少なくとも２つの側鎖（遊離）アミノ基を細胞
認識性基で修飾したポリペプチド誘導体およびその核酸
運搬体としての用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】レトロウイルス介在遺伝子導入は、遺伝
子治療の最も有効な手段として用いられているが、ウイ
ルスベクターには感染反応および免疫反応の問題が懸念
される。さらに、ウイルスベクターの大量調製は、困難
で時間を要し、特殊な設備が必要でもある。これらの理
由から、従来ウイルスベクターに代わる合成キャリアの
研究が行われてきた。一例として、ポリジアミノ酪酸を
薬物遺伝子の運搬体に使用する試みが、特表昭５５−５
０００５３号公報、ＥＰ０７７５７５１、ＥＰ０８３４
５７２によって開示されている。特表昭５５−５０００
５３号公報の開示では、ポリジアミノ酪酸が薬物遺伝子
を保持する手段として共有結合を使用している。しかし
ながら、この場合、細胞内に取り込まれた際に、運搬体
であるポリジアミノ酪酸から薬物遺伝子の遊離（分離）
が必要であり、好ましくない。また、ＥＰ０７７５７５
１およびＥＰ０８３４５７２においては、オリゴジアミ
ノ酪酸を使用しているが、オリゴジアミノ酪酸を修飾す
る生理活性物質（細胞認識因子等）はその末端にのみ共
役されており、該生理活性物質のもたらす効果は低いた
め、「ヘルパーリピド」と呼ばれるリン脂質等の補助剤
がさらに必要となってくる。また、分岐したオリゴジア
ミノ酪酸の末端を生理活性物質で修飾した場合、アニオ
ン性の薬物遺伝子が電気的な結合をすることを妨げるた
め正電荷が表面上に出ず、細胞への取り込みは低いもの
になる。
【０００３】さらに、上記に例示した合成キャリア以外
に、ポリリジンを運搬体として用いた研究がなされてい
る（J. Controlled Release, vol.53, 1998, p301-31
0）。しかしながら、ポリリジンを運搬体にした複合体
は、濃度の増加と共に沈殿を生じやすく、実際の遺伝子
治療に対しては使用が困難である。特に、静脈内へ沈殿
を生じるような粒子を含む薬液を投与することは、血管
の塞栓や血栓等を引き起こす原因となり、また、局所的
に投与される場合でも、注射針の詰まりの問題や、標的
細胞に対して治療をするために必要な量の遺伝子を導入
できない等の問題がある。
【０００４】このような状況から、現在、生体内に安全
に、効率的に導入でき、しかも薬物遺伝子の効果を充分
に発揮できる非ウイルス性の薬物遺伝子の運搬体（以
下、核酸運搬体という）、およびそれを用いる遺伝子治
療用組成物の研究開発が強く望まれている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、細胞に薬物
遺伝子である核酸等を効率良く、安全に導入するための
核酸運搬体を提供することを目的とする。特に、ウイル
スベクターに劣らない遺伝子導入の効率を実現し、かつ
血管の塞栓等の副作用をもたらさない合成キャリアを提
供することが本発明の目的である。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
解決のため鋭意研究に努めた結果、薬物遺伝子を運搬す
るための核酸運搬体として、ポリジアミノ酪酸を含んで
もよいポリペプチドの少なくとも２つの側鎖（遊離）ア
ミノ基を細胞認識性基で修飾したポリペプチド誘導体を
用いると、前記薬物遺伝子を細胞内に効率良く、安全に
導入できることを見いだし、本発明を完成した。
【０００７】さらに、前記ポリペプチド誘導体を製造す
る過程で、ジアミノ酪酸の４位アミノ基をカルボベンゾ
キシ基で選択的に保護する段階での反応系をｐＨ８〜１
１の範囲内に保ち、［ｐ−（ベンジルオキシカルボニ
ル）フェニル］ジメチルスルホニウム・メチル硫酸塩
（Ｚ−ＤＳＰ）と反応させることにより、収率よくかつ
純度の高いジアミノ酪酸保護体が得られることを見いだ
し、本発明を完成した。
【０００８】すなわち、本発明は、式（１）で表される
ポリペプチド誘導体またはその薬学的に許容される塩を
提供する。
【０００９】
【化1】
【００１０】（式中、Ｒ1は、単糖、オリゴ糖、多糖、
ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、抗体および
細胞特異的なリガンドからなる群より選ばれる一員から
誘導されるか、或いは置換されていてもよいＣ1〜Ｃ20
アルキル基、置換されていてもよいＣ1〜Ｃ20アルケニ
ル基、置換されていてもよいＣ7〜Ｃ45アリール基、置
換されていてもよいＣ7〜Ｃ45アルキルアリール基、置
換されていてもよいＣ7〜Ｃ 45アルケニルアリール基お
よび置換されていてもよいアミノ基からなる群より選ば
れ（該置換基はいずれも単糖、オリゴ糖、多糖、ペプチ
ド、オリゴペプチド、ポリペプチド、抗体および細胞特
異的なリガンドからなる群より選ばれる一員からの基で
あってもよい）；ｐは １〜５の整数を表し；ｍは２以
上の整数を表し、ｎは２以上の整数を表し、但し、ｍ＋
ｎは３００以下の整数を表わす。）前記ポリペプチド誘
導体またはその薬学的に許容される塩において、好まし
くはＲ1が式Ｒ2−Ｌ−で表される基であり、式中、Ｌ
は、カルボニル、チオカルボニル、イミンまたはメチレ
ンから選ばれるリンカー（これはさらに１つ以上のメチ
レン基を含んでもよい）であり、Ｒ2は、前記で定義さ
れたＲ1基の残余の部分である。
【００１１】特に好ましくは、Ｌがイミンを含むリンカ
ー（これはさらに１つ以上のメチレン基を含んでもよ
い）であり、従ってＲ1が式（２）で表される基（式
中、Ｘは０または２０以下の自然数である）であり、そ
のとき前記ポリペプチド誘導体またはその薬学的に許容
される塩は式（３）で表される。
【００１２】
【化２】
【００１３】
【化３】
【００１４】さらに好ましくは、式（３）においてｐが
２であり、従って前記ポリペプチド誘導体またはその薬
学的に許容される塩は式（４）で表される。
【００１５】
【化４】
【００１６】上記好適なポリペプチド誘導体またはその
薬学的に許容される塩において、Ｒ 2が単糖、オリゴ
糖、多糖、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、
抗体および細胞特異的なリガンドからなる群より選ばれ
る一員から誘導される基であることが特に好ましい。
【００１７】前記ポリペプチド誘導体またはその薬学的
に許容される塩において、さらに好ましくはＲ2が単
糖、オリゴ糖、または多糖から選ばれる一員から誘導さ
れるチオグリコシル基、Ｏ-グリコシル基またはＮ-グリ
コシル基である。
【００１８】本発明によれば、特に好ましい個別のポリ
ペプチド誘導体またはその薬学的に許容される塩は式
（５）で表される。
【００１９】
【化５】
【００２０】また、本発明は、式（１）で表されるポリ
ペプチド誘導体またはその薬学的に許容される塩を含ん
で成ることを特徴とする核酸運搬体を提供する。
【００２１】さらに、本発明は、前記いずれかの核酸運
搬体と、薬物遺伝子とを含む遺伝子治療用組成物を提供
する。
【００２２】また、本発明の１つの側面では、ＤＬ−
２，４−ジアミノ酪酸の４位アミノ基をカルボベンゾキ
シ基で選択的に保護する方法において、ＤＬ−２，４−
ジアミノ酪酸またはその酸付加塩を［ｐ−（ベンジルオ
キシカルボニル）フェニル］ジメチルスルホニウム・メ
チル硫酸塩と反応不活性溶媒中、ｐＨ８〜１１で反応さ
せることを特徴とする前記方法が提供される。
【００２３】
【発明の実施の形態】本発明は、薬物遺伝子を運搬する
ための核酸運搬体として有用な、ポリジアミノ酸を含ん
でもよいポリペプチド誘導体であつて、その少なくとも
２つの側鎖（遊離）アミノ基を細胞認識性基で修飾した
ポリペプチド誘導体に関する。
【００２４】本発明のポリペプチド誘導体は、式（１）
で表されるポリペプチド誘導体またはその薬学的に許容
される塩である。以下、ポリペプチド誘導体とその薬学
的に許容される塩とを区別して記載する必要のないと
き、両者のいずれか一方または両方を「本発明のポリペ
プチド誘導体」という用語で表わす。
【００２５】
【化1】
【００２６】式（１）中、Ｒ1は、単糖、オリゴ糖、多
糖、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、抗体お
よび細胞特異的なリガンドからなる群より選ばれる一員
から誘導されるか、或いは置換されていてもよいＣ1〜
Ｃ20アルキル基、置換されていてもよいＣ1〜Ｃ20アル
ケニル基、置換されていてもよいＣ7〜Ｃ45アリール
基、置換されていてもよいＣ7〜Ｃ45アルキルアリール
基、置換されていてもよいＣ7〜Ｃ45アルケニルアリー
ル基および置換されていてもよいアミノ基からなる群よ
り選ばれ（該置換基はいずれも単糖、オリゴ糖、多糖、
ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、抗体および
細胞特異的なリガンドからなる群より選ばれる一員から
の基であってもよい）；ｐは１〜５の整数を表し；ｍは
２以上の整数を表し，そしてｎは２以上の整数を表す、
但し、ｍ＋ｎは３００以下の整数を表わす。
【００２７】本明細書で使用する「アルキル基」とは、
上で定義された炭素数を有し、直鎖、枝分かれ鎖、環式
鎖、またはそれらの組み合わせを含む飽和脂肪族の基を
意味する。
【００２８】また、本明細書で使用する「アルケニル
基」とは、上で定義された炭素数を有し、直鎖、枝分か
れ鎖、環式鎖、またはそれらの組み合わせを含む不飽和
脂肪族の基を意味する。
【００２９】本明細書で使用する「アリール基」とは、
上で定義された炭素数を有し、１〜４個の置換基で置換
されていてもよい芳香環を意味する。ここで、該置換基
はＣ 1〜Ｃ6アルキル、Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ、Ｃ1〜Ｃ6ア
ルキルアミノ、ヒドロキシル、シアノ、ハロゲン、メル
カプト、ニトロ、カルボキシル、ホオルミル、チオアル
コキシ等であるが、これらには限定されない。
【００３０】本明細書で使用する「アルキルアリール
基」および「アルケニルアリール基」とは、上で定義さ
れたアルキル基およびアルケニル基であって、それぞれ
１〜３個のアリール基に結合されているものを意味す
る。このアリール部分は、上記アリール基と同様に、１
〜４個の置換基で置換されていてもよい。
【００３１】以上の「アルキル基」、「アルケニル
基」、「アリール基」、「アルキルアリール基」、「ア
ルケニルアリール基」のいずれもは、後述するリンカー
（Ｌ）に対応する置換基を構造の一部として随意に含ん
でいてもよい。
【００３２】本明細書で使用する「薬学的に許容される
塩」とは、式（１）のポリペプチド誘導体の遊離のアミ
ノ基（すなわち、バックボーンのヘプチド結合に利用さ
れていない）、またはイミノ基が下記に例示する有機酸
または無機酸と形成した塩類であり、前記ポリペプチド
誘導体自体の生物学的有用性（すなわち、核酸運搬体と
して）を保持し、生物学的、生理学的に無毒で、人体に
投与しても望ましくない副作用を呈さない塩類を意味す
る。したがって、そのような薬学的に許容できる塩であ
れば特に限定はないが、好ましくはホウ酸、塩酸、硫
酸、硝酸、ホウ酸、リン酸等の無機酸からの塩、および
酢酸、プロピオン酸、クエン酸、乳酸、シュウ酸、コハ
ク酸、酒石酸、マロン酸、フマル酸、リンゴ酸等の有機
酸からの塩が挙げられる。このような薬学的に許容でき
る塩は、本発明のポリペプチド誘導体類から標準的な方
法よって、容易に調製できる。
【００３３】式（１）のポリペプチド誘導体は、同式か
ら明らかなように、１つのアミノ基がＲ1基でブロック
された、ポリジアミノ酪酸を含んでもよい構造体Ａと遊
離のアミノ基を有するポリジアミノ酪酸からなる構造体
位Ｂとから構成される（式（６））。さらに、前記ポリ
ペプチド誘導体は、構造体単位ＡおよびＢの任意の割合
からなり、構造体ＡおよびＢのそれぞれが上記の薬学的
に許容される塩の形で存在してもよい。また、ポリペプ
チド誘導体は、単一の分子量のものであってもよいし、
分子量分布を持つ集合体であってもよい。
【００３４】
【化６】
【００３５】前記構造体Ａおよび構造体Ｂは、各々が光
学異性体であるＤ体およびＬ体として存在可能である
が、本発明のポリペプチド誘導体は、Ｄ体若しくはＬ
体、またはそれらの任意に混ざったポリペプチドであ
る。
【００３６】式（１）中のｐは１〜２０の整数である
が、好ましくは２である。この場合、構造体Ａもジアミ
ノ酪酸（以下、ＤＢＡとも略記する）のポリマーが基本
単位となり、式（１）のポリペプチド誘導体は、ポリジ
アミノ酪酸（以下、ｐＤＢＡとも略記する）を含むこと
になる。
【００３７】本発明のポリペプチド誘導体の残基数と
は、式（１）中のｍ+ｎを意味する。ここで、ｍは２以
上の整数を表し、ｎは２以上の整数を表す。好ましい残
基数は、少なくとも２０残基以上である。さらに好まし
くは少なくとも２５残基以上であり、最も好ましくは３
０残基以上である。また本発明のポリペプチド誘導体の
残基数（ｍ+ｎ）は３００以下であり、好ましい残基数
は、２８０残基以下が好ましい。またより好ましくは２
５０残基以下である。残基数があまり多い場合は、ポリ
ペプチド誘導体の合成が困難となり、また取り扱いが不
便となる。また、あまり残基数が少ないと核酸運搬体と
して使用するときに性能が不十分になる。さらにｍの好
ましい値は３以上であり、より好ましくは４以上であ
る。
【００３８】上で定義されたＲ1は、遊離のアミノ基を
封入する基であり、単糖、オリゴ糖、多糖、ペプチド、
オリゴペプチド、ポリペプチド、抗体および細胞特異的
なリガンドからなる群より選ばれる一員から誘導される
か、或いは置換されていてもよいＣ1〜Ｃ20アルキル
基、置換されていてもよいＣ1〜Ｃ20アルケニル基、置
換されていてもよいＣ7〜Ｃ45アリール基、置換されて
いてもよいＣ7〜Ｃ45アラルキルアリール基、置換され
ていてもよいＣ7〜Ｃ45アルケニルアリール基および置
換されていてもよいアミノ基からなる群より選ばれる基
である。
【００３９】本発明に係るこのようなＲ1基は、主に２
つの特徴を有する。その1つは細胞認識作用であり、こ
れによってＲ1基は、標的細胞の構成要素（特に細胞表
面にある抗原、受容体等）を認識する。すなわち、Ｒ1
基の導入は、本発明のポリペプチド誘導体に細胞認識部
位を付与する。従って、本発明のポリペプチド誘導体を
核酸運搬体として用いると、治療遺伝子を標的細胞に効
率よく、送達（デリバリー）できることになる。細胞認
識作用を有する分子としては、天然の因子、或いは合成
化合物の様々な種類が知られている。本発明では、これ
ら公知の分子から誘導される基をＲ1基として好適に利
用できる。好ましくは、単糖、オリゴ糖、多糖、ペプチ
ド、オリゴペプチド、ポリペプチド、抗体、細胞特異的
なリガンド等である。以下のものに限定はされないが、
具体的な物質を例示すると、ガラクトース、マンノー
ス、グルコース、フルクトース、ラクトース、デキスト
ラン、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ、ＲＧＤ、トランスフェリ
ン、ＬＤＬ（低比重リポ蛋白）、アシアロオロソムコイ
ド等である。
【００４０】Ｒ1基の他の1つの特徴は、本発明のポリペ
プチド誘導体にカチオン性を付与するか、または該Ｒ1
基以外の部分のカチオン性に貢献するということであ
る。これは、通常負に帯電している核酸等の薬物遺伝子
と静電的に相互作用し、後者を組成物に取り込むのに必
要である。この目的のために、Ｒ1基は、必要ならば適
当な置換基を備えることができる。代表的な置換基とし
て、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルアミノ
基、アミノ基、イミノ基、グアニジノ基、ヒドラジノ基
等が挙げられる。
【００４１】本発明の好ましい側面では、Ｒ1が式Ｒ2−
Ｌ−で表わされる。ここで、Ｌは、遊離のアミノ基に結
合するリンカーである。Ｒ2は、前記Ｒ1基に潜在するリ
ンカー部分を除く、残余の部分である。適当なリンカー
としては、カルボニル、チオカルボニル、イミンおよび
メチレンが挙げられるが、これらには限定されない。
尚、リンカーは、前記の他に、１つ以上のメチレン基を
含んでもよい。
【００４２】前記リンカーの特に好適な例は、イミンを
含む。この場合、Ｒ1は式（２）で表される。
【００４３】
【化２】
【００４４】式中、Ｘは０または２０以下の自然数であ
る。
【００４５】さらに、本発明のポリペプチド誘導体は式
（３）で表される。
【００４６】
【化３】
【００４７】Ｌがイミンを含む式（３）の好適な本発明
のポリペプチド誘導体群のなかで、特に好適な一群のポ
リペプチド誘導体は、式中、ｐが２である化合物であ
り、式（４）で表わされる。
【００４８】
【化４】
【００４９】さらに好適な一群のポリペプチド誘導体
は、Ｒ2が単糖、オリゴ糖、または多糖から選ばれる一
員から誘導される基である、チオグリコシル基、Ｏ-グ
リコシル基またはＮ-グリコシル基である化合物であ
る。
【００５０】本発明の１つの実施の形態である、特に好
適な個別のポリペプチド誘導体は、式（５）で表わされ
る。
【００５１】
【化５】
【００５２】（ポリペプチド誘導体の合成方法）式
（１）のポリペプチド誘導体は、当業者に公知である幾
つかの反応を組み合せて、合成することができる。本発
明で用いた方法は、式（６）に示す構造体ＡおよびＢの
合成、並びに合成した各構造体からのペプチド結合の形
成からなり、具体的には以下の工程を含む。
【００５３】
【化６】
【００５４】工程１. 構造体Ａに対応する固相合成用
のＦｍｏｃアミノ酸（オリゴ／ポリペプチド）の合成 工程２. 構造体Ｂに対応する固相合成用のＦｍｏｃア
ミノ酸（オリゴ／ポリペプチド）の合成 工程3. 工程１．２.で合成したＦｍｏｃアミノ酸（オ
リゴ／ポリペプチド）を用いるペプチド固相合成（連結
反応） 各工程の詳細を以下に記載する。
【００５５】工程１ （１−１）側鎖にアミノ基を有するモノマー（ポリマ
ー）の溶液をアルカリ金属の水酸化物や炭酸塩などの塩
基で処理して、そのｐＨを調整し、適当な脱離基(ハロ
ゲン、スルホナート、フェノキシドおよびそれらの誘導
体)で活性化された保護化用試薬Ｒ−Ｘ(Ｒ：Ｚ，Ｂｏ
ｃ，Ｔｒｏｃ，Ｚ（Ｃｌ）等、Ｘ:脱離基)を反応させて
側鎖アミノ基に保護基を導入する。この場合、ポリマー
を調製するのに用いる出発モノマーとしては、ジアミノ
酪酸、リシン、オルニチン、ジアミノプロピオン酸が好
ましく使用される。保護基の導入されたモノマー（ポリ
マー）は、一般に沈殿として得られる。この沈殿の洗浄
には水および水と任意に混合する、揮発性の有機溶媒、
或いはジエチルエーテルや酢酸エチルを用いることがで
きる。 （１−２）１−１で調製した化合物を水および水と任意
に混合する有機溶媒に溶解して、アルカリ金属の水酸化
物や炭酸塩などの塩基で処理し、そのｐＨを調整し、9-
フルオレニルメチルクロロホルメートやＮ-(9-フルオレ
ニルメトキシカルボニルオキシ)スクシンイミド等のＦ
ｍｏｃ化剤を加えて反応させる。得られた沈澱を水およ
び水と任意に混合する、揮発性の有機溶媒、或いはジエ
チルエーテルや酢酸エチルを用いて洗浄し、乾燥する。 （１−３）１−２で得た化合物の側鎖アミノ基の保護基
を適当な方法で除去した後に、グリコシルハライド、側
鎖に保護されたペプチドを有するアルキルハライド等を
反応させることによって側鎖アミノ基を上記のＲ1基で
ブロックしたＦｍｏｃアミノ酸（オリゴ／ポリペプチ
ド）誘導体を合成する。
【００５６】工程2 （２−１）側鎖に遊離アミノ基を有するジアミノ酪酸の
溶液をアルカリ金属の水酸化物や炭酸塩などの塩基で処
理し、そのｐＨを調整し、適当な脱離基 (ハロゲン、ス
ルホナート、フェノキシドやそれらの誘導体) で活性化
された保護化用試薬Ｒ−Ｘ(Ｒ−Ｘ(Ｒ：Ｚ，Ｂｏｃ，Ｔ
ｒｏｃ，Ｚ（Ｃｌ）等、Ｘ:脱離基)を反応させて側鎖ア
ミノ基に保護基を導入する。保護基の導入されたＤＢＡ
は一般に沈殿として得られる。この沈殿の洗浄には水お
よび水と任意に混合する、揮発性の有機溶媒或いはジエ
チルエーテルや酢酸エチルを用いることができる。 （２−２）２−１で調製した保護されたＤＢＡを水およ
び水と任意に混合する有機溶媒に溶解して、アルカリ金
属の水酸化物や炭酸塩などの塩基で処理し、そのｐＨを
調整し、9-フルオレニルメチルクロロホルメートやＮ-
(9-フルオレニルメトキシカルボニルオキシ)スクシンイ
ミド等のＦｍｏｃ化剤を加えて反応させる。得られた沈
澱を水および水と任意に混じり、揮発性の有機溶媒、或
いはジエチルエーテルや酢酸エチルを用いて洗浄し、乾
燥する。
【００５７】工程3 （３−１）工程1および2で調製したペプチド合成用Fmoc
アミノ酸（オリゴ／ポリペプチド）およびFmocＤＢＡと
Wang樹脂を用いてＦｍｏｃ法に従って保護ポリペプチド
を固相合成する。次に適当な方法で脱樹脂、脱保護基化
することによって本発明のポリペプチド誘導体が得られ
る。詳細な実験条件については、実験化学講座, 第４
版, vol 22, p295-306を参照。
【００５８】本発明で実施される上記合成方法の変法
（以下、本発明に係る合成法という）について、詳しく
説明するために、式（４）のポリペプチド誘導体につい
て、その合成の具体例を示す。
【００５９】式（４）のポリペプチド誘導体（ポリジア
ミノ酪酸誘導体）の合成には、ジアミノ酪酸の側鎖アミ
ノ基（４位）を適当な保護基で保護し、かつアミノ酸部
分をトリホスゲンで酸無水物としてから縮重合のモノマ
ーとして使用することが好ましい。また、このモノマー
を用いることで、縮重合反応は適当な開始剤を用いるこ
とが可能となり、好ましい数のモノマー数を導入するこ
とも可能となる。
【００６０】ポリジアミノ酪酸の合成方法は、次の3つ
の工程を含む。第１の工程はＤＢＡの４位のアミノ基を
選択的に保護するステップ、第２の工程は選択的に保護
されたＤＢＡ（Ｒ）からジアミノ酪酸カルボキシ無水物
（以下、ＮＣＡと略記する）ステップ、第３の工程はＮ
ＣＡからｐＤＢＡを合成するステップである。ここで、
ＤＢＡ（Ｒ）のＲは、ＤＢＡの4位アミノ基に導入され
た保護基を意味する。
【００６１】まず、ジアミノ酪酸の側鎖（４位）アミノ
基の選択的保護が必要であり、その方法としては従来、
銅錯体法（実験化学講座 22巻 日本化学会編 p239）
および直接的保護法（実験化学講座 22巻 日本化学会
編 p238）が知られている。銅錯体法は、重金属である
銅を使用し、ステップ数が多いために工業的に有利な反
応経路ではなく、直接的保護法がより簡便である。しか
しながら、後者の方法を用いてジアミノ酪酸の側鎖アミ
ノ基を選択的に保護したという報告はいままでになかっ
た。
【００６２】そこで、本発明に係る合成法の第１の工程
では、ＤＢＡの溶液をアルカリ金属の水酸化物や炭酸塩
などの塩基で処理し、そのｐＨを調整し、適当な脱離基
(ハロゲン、スルホナート、フェノキシドやそれらの誘
導体) で活性化された保護化用試薬Ｒ−Ｘ(Ｒ：Ｚ，Ｂ
ｏｃ，Ｔｒｏｃ，Ｚ（Ｃｌ）等、Ｘ:脱離基)を反応させ
てＤＢＡに保護基を導入する。この反応系のｐＨは、好
ましくは８〜１１であり、さらに好ましくは８．５〜１
０．５であり、最も好ましくは９．２〜９．８である。
保護基の導入されたＤＢＡ（Ｒ）は、上記のように常法
に従って、後処理する。このように直接的保護法を用い
て、保護反応を特定のｐＨ範囲内で実施し、ＤＢＡのア
ミノ基を選択的に保護することは、当業者に知られてい
なかった。従って、前記の選択的アミノ基の保護方法
は、本発明の１側面を構成する。
【００６３】第２の工程でＤＢＡ（Ｒ）を適当な溶媒に
懸濁させてホスゲン、ホスゲンダイマー、またはトリホ
スゲンを反応させることによってＮＣＡを得る。使用さ
れる溶媒は、生成物であるＮＣＡの溶解度が高く、かつ
ＮＣＡと反応しないものが適しており、具体的にはＴＨ
Ｆ、アセトニトリル、酢酸エチル、ジクロロメタン等で
ある。生成したＮＣＡの結晶化には、ジエチルエーテ
ル、ジイソプロピルエーテル、ヘキサン、トルエン等の
ＮＣＡと反応せず、吸湿性の少ない溶媒が適している。
【００６４】第３の工程でＮＣＡを適当な溶媒に溶解さ
せ、適当な開始剤を作用させることによって重合体を得
る。使用される溶媒は、溶解度に関してＮＣＡに対して
は高く、生成物である重合体に関しては低い、さらにＮ
ＣＡや重合体と反応しないものが適しており、具体的に
はＴＨＦ、 アセトニトリル、酢酸エチル、ジクロロメ
タン等である。また、開始剤としてアミン類、アルコー
ル類、アルコキシドなどが使用可能であるが、アルキル
アミン類、特にブチルアミンが好ましい。重合体は沈殿
として得られ、その洗浄にはアセトニトリル、ジエチル
エーテル、ヘキサン、エタノール、メタノール等の重合
体を溶かさない、反応不活性な溶媒が用いられる。得ら
れた重合体からの前記保護基の除去は、保護基の性質に
合わせて適当な方法を用いることができる。脱保護基化
後の脱塩、低分子量不純物の除去には透析、限外濾過等
常法を用いることができる。
【００６５】式（４）のポリペプチド誘導体の合成は、
上記のようにして得られたポリジアミノ酪酸の２つ以上
の遊離４位アミノ基を修飾基（式中、Ｒ2−（ＣＨ2）X
−（Ｃ＝ＮＨ）−に相当）で修飾することによって、達
成される。これは、まずｐＤＢＡに導入したい修飾基を
その親物質（化合物）から誘導し、該アミノ基と反応す
るように活性化する。活性化の方法は、修飾基の性質に
よって異なるが、当業者に公知の方法から適宜選択でき
る。続いて、修飾基の活性化された形態とポリジアミノ
酪酸の４位アミノ基をカップリング反応させると、目的
とする修飾化されたポリペプチド誘導体が得られる。
【００６６】本発明の特に好適な１つの実施の形態に従
うと、すでにニトリル基の導入された糖やペプチド、タ
ンパク質等の親物質に適当なアルコール中で金属アルコ
キシドを作用させることによってアルコキシイミノ基へ
と変換させ、前記活性化を行う。ここで、アルコキシド
に使用する金属はアルカリ金属が好ましく、特にナトリ
ウムが好ましい。また、アルコール溶媒は、低級アルコ
ールが好ましく、特にメタノール、エタノールが好まし
い。
【００６７】次いで、活性化されたアルコキシイミノ基
をポリジアミノ酪酸の４位アミノ基と塩基性条件（ｐＨ
８〜１１）で反応させると該４位アミノ基が組織認識部
位となる修飾基で修飾された式（４）のポリペプチド誘
導体が生成する。カップリング反応に用いる緩衝液は、
前記ｐＨで緩衝能を有し、アミン成分を含まないものを
用いる。特に、ホウ酸緩衝液が好ましい。カップリング
反応終了後、最終生成物であるポリペプチド誘導体の脱
塩、低分子不純物の除去は、上記のとおり透析若しくは
限外濾過によって行うことができる。
【００６８】このようにして得られる、本発明のポリペ
プチド誘導体は、後述のように核酸運搬体として、薬物
遺伝子を運搬するのに有用である。ガラクトースで修飾
されたポリジアミノ酪酸（式（５）の化合物）を実例と
して、以上説明してきた本発明のポリペプチド誘導体の
合成の全工程を図１に示す。各工程の詳細については、
実施例に記載する。
【００６９】（核酸運搬体の検出）本発明のポリペプチ
ド誘導体を含んでなる核酸運搬体の構造は、既に説明し
たようなポリペプチド誘導体の構造的特徴を有するもの
である。従って、かかる構造上の特徴に基づいて本発明
の核酸運搬体を検出することが可能となる。また、本発
明の核酸運搬体自体、若しくはそれを含む遺伝子治療用
組成物が、種々の使用形態で使用されている場合におい
ても、適当な前処理を施すことにより、同様に本発明の
核酸運搬体を検出することが可能となる。そのために当
業者が、必要な前処理を選択することは容易である。
【００７０】検出方法についても特に制限はなく、種々
の通常公知のポリペプチド分析方法（J．Controlled Re
lease 54,39−48，1998）を用いることが可能である。
具体的には、ペプチドのアミノ酸分析方法によるジアミ
ノ酪酸等の定性および定量分析、種々の液体クロマトグ
ラフを用いた分子量測定による残基数の決定、質量分
析、または化学的な定性分析方法が使用可能である。
【００７１】（遺伝子治療用組成物、薬物遺伝子）本発
明に係る遺伝子治療用組成物は、本発明の核酸運搬体
と、薬物遺伝子とを少なくとも含むものである。ここで
薬物遺伝子とは、以下で説明する種々の核酸またはヌク
レオチド誘導体を意味する。
【００７２】核酸運搬体と薬物遺伝子は、様々な比で複
合体を形成し、遺伝子治療用組成物として調製できる
が、薬物遺伝子／核酸運搬体（重量（w）／重量（w））
が、2／1から1／50の範囲であれば治療効果を得ること
ができ、さらに好ましくは、薬物遺伝子／核酸運船体
（w／w）が、1／1から1／30の範囲で混合されることに
よりさらに有効な効果を得ることができる。薬物遺伝子
／核酸運搬体（w／w）の比が、1／50以上であると、薬
物遺伝子との複合体に関与しない遊離した核酸運搬体の
量が増え好ましくなく、一方、2／1以下では、導入され
るべき細胞の細胞表面との親和性が低下することによる
薬物遺伝子導入効率の低下が起こるため好ましくない。
【００７３】既に述べたように本発明の核酸運搬体は、
正の電荷を持ち得ることから、主に負の電荷を有する薬
物遺伝子（例えば核酸）を静電的結合により保持するこ
とが可能である。従って、目的の細胞若しくは細胞内に
運ばれた後に、該薬物遺伝子を効果的に遊離し、薬物遺
伝子を発現させることが可能となる。このような作用
は、薬物遺伝子／核酸運搬体のチャージ比を適宜選択す
ることで制御することが可能となる。本発明において
は、例えば1／1から1／40の範囲とすることにより、よ
り高い効果が得られる。チャージ比が1／1以下では、細
胞表面との親和性が低下することによる薬物遺伝子導入
効率の低下が起こり、一方、1／40以上では薬物遺伝子
との複合体に関与しない遊離した核酸運搬体の量が増え
好ましくない。
【００７４】本発明の核酸運搬体によって細胞内に導入
され得る薬物遺伝子である核酸またはヌクレオチド誘導
体の種類、分子量、形状、コードされる遺伝子の配列等
には特に制限はない。具体的には核酸の分子量は、２０
塩基程度のオリゴヌクレオチドから数十キロ塩基のコス
ミド遺伝子まで特に制限はない。核酸の形状は、1重鎖
遺伝子、2重鎖遺伝子、3重鎮形成遺伝子、ＤＮＡ、ＲＮ
Ａ、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラ型遺伝子、ホスホロチオエー
ト型遺伝子、直鎖状遺伝子、環状遺伝子等制限なく用い
ることができる。コードされる遺伝子の配列は薬物遺伝
子のほか、薬物遺伝子を転写するためのプロモーターや
エンハンサー、ポリＡシグナル、遺伝子が導入された細
胞の標識および／または選別のためのマーカー遺伝子、
細胞のゲノムＤＮＡ配列内に効率良く遺伝子を挿入する
ためのウイルス由来の遺伝子配列、薬物として作用する
物質を細胞外に分泌および／または細胞内の局所に滞留
させるためのシグナル配列等、いかなる配列でも用いる
ことが可能である。
【００７５】薬物遺伝子は疾患に対応する遺伝子、即
ち、疾患に対して拮抗的に作用する遺伝子や疾患におけ
る欠如を補足する遺伝子が用いられる。例えば、炎症性
疾患に対しては、ＳＯＤ、抗炎症性のサイトカイン類、
細胞接着因子に拮抗的に作用するペプチドをコードする
遺伝子、酵素欠損症に対しては正常な酵素をコードする
遺伝子、受容体欠損症に対しては正常な受容体をコード
する遺伝子、ウイルス感染症に対してはウイルス感染細
胞を殺傷するためのチミジンキナーゼ、ジフテリアトキ
シン等の毒素をコードする遺伝子やウイルスの複製等を
阻害するアンチセンス、トリプルヘリックス、リボザイ
ム、デコイ、トランスドミナントミュータント等をコー
ドする遺伝子、癌に対しては癌細胞を殺傷するためのチ
ミジンキナーゼ、ジフテリアトキシン等の毒素をコード
する遺伝子や癌遺伝子を不活性化するためのアンチセン
ス、リボザイム、トリプルヘリックス等をコードする遺
伝子や、癌細胞を正常化するためのp53等の癌抑制遺伝
子、抗癌剤に対する多剤耐性に関与する遺伝子を不活性
化するためのアンチセンス、トリプルヘリックス、リボ
ザイム等をコードする遺伝子、家族性高コレステロール
血症に対してはＬＤＬレセプターをコードする遺伝子等
が挙げられる。
【００７６】さらに、薬物遺伝子に用いられる発現カセ
ットは、標的細胞内で遺伝子を発現させることができる
ものであれば、特に制限されることなく何でも用いるこ
とができる。当業者はそのような発現カセットを容易に
選択することができる。好ましくは、動物由来の細胞内
で遺伝子発現が可能な発現カセットであり、より好まし
くは、哺乳類由来の細胞内で遺伝子発現が可能な発現カ
セットであり、特に好ましくは、ヒト由来の細胞内で遺
伝子発現が可能な発現カセットである。発現カセットに
用いられる遺伝子プロモーターは、例えばアデノウイル
ス、サイトメガロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、シ
ミアンウイルス40、ラウス肉腫ウイルス、単純ヘルペス
ウイルス、マウス白血病ウイルス、シンビスウイルス、
センダイウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイル
ス、C型肝炎ウイルス、バピローマウイルス、ヒトＴ細
胞白血病ウイルス、インフルエンザウイルス、日本脳炎
ウイルス、JCウイルス、バルボウイルスB19、ポリオウ
イルス等のウイルス由来のプロモーター、アルブミンや
熱ショック蛋白等の哺乳類由来のプロモーター、CAGプ
ロモーター等のキメラ型プロモーター等を含む。
【００７７】薬物遺伝子によってコードされた薬物を細
胞外に分泌および／または細胞内の局所に滞留させるた
めのシグナル配列としては、細胞外への分泌を補助する
インターロイキン2由来のシグナルペプチド（駒田富佐
夫、日本薬学会第115年会講演要旨集4，12，1995）や核
局在化を促進するアデノウイルスE1a由来のペプチド、
ポリオーマウイルスラージＴ抗原由来のペプチド、SV40
ラージＴ抗原由来のペプチド、ヌクレオプラスミン由来
のペプチド、HTLV1p24転写後調節蛋白質由来のペプチド
（Kalderon, D. , et a1., Cell，39，499, 1984）等を
用いることができる。
【００７８】本発明に係る遺伝子治療用組成物は、たと
えば上記に示すような治療用にデザインされた薬物遺伝
子と核酸運搬体を混合することで調製される。より具体
的に言えば、核酸運搬体と治療用にデザインされた薬物
遺伝子を各々、水、生理食塩水、等張化した緩衝液等の
適当な溶媒に溶解した後、混和し10分から30分放置する
ことで調製することができる。このとき、用いられる薬
物遺伝子を構成する核酸等と核酸運搬体の比は、限定さ
れるわけではないが、該核酸1μｇに対して約0．5〜50
μg、好ましくは1〜30μgの核酸運搬体を使用する。
【００７９】（遺伝子治療用組成物の使用方法）本発明
に係る遺伝子治療用組成物は、まず患者から標的細胞を
体外に取り出し、薬物遺伝子を導入した後に再びその細
胞を患者の体内に戻すという自家移植による遺伝子治療
（ex vivo遺伝子治療）に使用可能である。また、薬物
遺伝子を直接患者に投与する遺伝子治療（in vivo遺伝
子治療）にも使用可能である、また、遺伝子治療の方法
として、異常（原因）遺伝子をそのままにして、新しい
（正常）遺伝子を付け加える方法（Augmentation Gene
Therapy）と、異常遺伝子を正常遺伝子で置き換える方
法（Replacement Gene Therapy）に大別できるが、本発
明の核酸運搬体はどちらにも使用可能である。
【００８０】本発明に係る遺伝子治療用組成物の生体へ
の投与の方法については、特に制限はない。例えば非経
口的投与、例えば注射投与することにより好ましく実施
できる。組成物中には薬学的に許容できる種々の添加剤
を添加できる。
【００８１】本発明に係る遺伝子治療用組成物の用量
は、その使用方法、使用目的等により異なり、当業者は
容易に適宜選択、最適化することが可能である。例え
ば、注射投与して用いる場合には、1日量約0.1μg／kg
〜1000mg／kgを投与するのが好ましく、より好ましく
は、1日量約1μg／kg〜100 mg／kgである。
【００８２】本発明の核酸運搬体は、治療遺伝子との複
合体形成の際、沈殿生成を生じない。従って、血管に直
接遺伝子治療用組成物を投与しても血栓を起こす危険性
はなく、効率的に精度良く薬物遺伝子を導入することが
可能となる。
【００８３】以下、実施例を挙げて本発明をより具体的
に説明するが、本発明はこれらの例によって制限される
ものではない。
【００８４】
【実施例】以下の実施例に記載する化合物番号は、図１
の反応式中で、各化合物に付与された番号に該当する。
【００８５】（実施例1）4-N-カルボベンゾキシ-DL-ジ
アミノ酪酸（4-N-carbobenzoxy-DL-2,4-diaminobutyric
acid）（3）の合成。 DL-2,4-ジアミノ酪酸2塩酸塩（DL-2,4-diminobutyric a
cid dihydrochloride） （1）30g（シグマ社製）を水200mlに溶解し、これに水
酸化ナトリウム12.6gを水250mlに溶解したものを加えた
後、氷冷しながら［ｐ−（ベンジルオキシカルボニル）
フェニル］ジメチルスルホニウム・メチル硫酸塩（Z-DS
P）（2）（三新化学工業社製）101ｇを撹拌下、約20分
かけて加えた。この間8Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を加
えることによってpHを9.4〜9.7に保ち、その後２時間氷
冷しながら撹拌を続けて生成物として沈澱を得た。得ら
れた生成物をろ過し、水およびエタノールで洗浄した後
に乾燥し、28ｇ（収率：71％）の表記化合物（3）を得
た。
【００８６】（比較例1）4-N-カルボベンゾキシ-DL-ジ
アミノ酪酸（4-N-carbobenzoxy-DL-2,4-diaminobutyric
acid）（3）の合成。 DL-2,4-ジアミノ酪酸2塩酸塩（DL-2,4-ciminobutyric a
cid dihydrochloride） （1）30g（シグマ社製）を水200mlに溶解し、これに水
酸化ナトリウム12.6gを水250mlに溶解したものを加えた
後、氷冷しながらZ-DSP（2）（三新化学工業社製）101
ｇを撹拌下、約20分かけて加えた。この間8Ｍ水酸化ナ
トリウム水溶液を加えることによってpHを11.1〜11.5に
保ち、その後２時間氷冷しながら撹拌を続けて生成物と
して沈澱を得た。得られた生成物をろ過し、水およびエ
タノールで洗浄した後に乾燥し、15ｇ（収率：38％）の
表記化合物（3）を得た。
【００８７】（実施例2） １．4-N-カルボベンゾキシ-DL-ジアミノ酪酸NCA（4-N-c
arbobenzoxy-DL-2,4-diaminobutyric acid N-carboxy-a
nhydride（4）の合成。実施例1で得られた化合物（3）
（12g）をテトラヒドロフラン（THF）400mlに溶解し、
そこにトリホスゲン（Triphosgene，bis（tricholorome
thyl）cabonate，東京化成社製）5.2gを100mlのTHFに溶
解したものを加え、さらに40℃で60分撹拌した。減圧で
溶媒を除去し、得られた粗生成物にヘキサンを加え冷却
して、上澄のヘキサン層をデカントで除いた後に、さら
に減圧下溶媒を完全に留去した。得られた残渣に酢酸エ
チルを加えて溶解した後に、ヘキサンを加えてオイル様
の不溶物を生じさせて冷却した。上澄みをデカントして
除いた後に、さらに減圧下、十分に溶媒を除いた。得ら
れた粗生成物にジエチルエーテルを加えて溶解し、不溶
物をろ過して除いた。得られたろ液を減圧濃縮して液量
を200mlとすると無色の結晶が析出した。これにさらに
ヘキサンを加えた後に冷却し、析出した結晶を濾別して
減圧下、乾燥したところ7.5g（収率：57％）の表記化合
物(4)が得られた ２．ポリ-4-N-カルボベンゾキシ-DL-ジアミノ酪酸（Po1
y（4-N-carbobenzoxy-DL-2,4-diminobutyoric acid）
（５）の合成。4-N-カルボベンゾキシ-DL-ジアミノ酪酸
NCA（４）の1g（3.6mmol）をアセトニトリル19mlに溶解
した。開始剤としてブチルアミン（n-BuNH2）4.38mg
（0.06mmol）を加え、30℃で307時間静置した。得られ
たポリマーをろ過し、アセトニトリル、およびジエチル
エーテルで洗浄した後、減圧で乾燥して表記化合物
（５）0.77g（重合率91％）を得た。 ３．ポリ-DL-ジアミノ酪酸（Po1y（DL-2,4-diaminobuty
ric acid）（６）の酢酸塩の合成。ポリ-4-N-カルボベ
ンゾキシ-DL-ジアミノ酪酸（5）の0.5gをトリフルオロ
酢酸2mlに溶解し、これに25％臭化水素・酢酸溶液2mlを
加え振り混ぜた。静置した後に生成した沈澱をジエチル
エーテルによって二度洗浄（エーテルはデカントで除
去）し、得られた沈殿物を減圧で十分乾固した。得られ
た固体に酢酸ナトリウムと水を加えて得た混合液を、分
子量1,000以下除去の透析チューブを用いて流水で透析
を行った後、30,000rpmで2時間遠心し、不溶物を除去し
た。得られた溶液を凍結乾燥し、ポリ-DL-ジアミノ酪酸
（6）酢酸塩を0.34g（収率91％）得た。
【００８８】（実施例３）カップリング反応（pDBA酢酸
塩から） シアノメチル-1-チオ-β-D-ガラクトピラノシド（7）
（シグマ社製）23.5 mgを0.01Mナトリウムメトキシドメ
タノール溶液4mlを加えて25℃で24時間静置した。その
後、減圧下で溶媒を除去して、ポリ-DL-ジアミノ酪酸
（6）酢酸塩40mgを四ホウ酸緩衝液8ml（50mM,pH 9.5）
に溶かしたものを加えて３時間静置した。反応液を分画
分子量1,000の透析膜を用いて流水で透析を行った後、3
0,000 rpm で２時間遠心して不溶物を除去した。得られ
た溶液を凍結乾燥し、側鎖ガラクトース修飾ポリ-DL-ジ
アミノ酪酸（9）を31.2mg得た。糖修飾率はアントロン
硫酸法で測定すると11%であった。
【００８９】（実施例４）カップリング反応（pDBA臭化
物から） ポリ-DL-ジアミノ酪酸（Po1y（DL-2,4-diaminobutyric
acid）(6)の臭化物の合成。実施例２−２で得られたポ
リ4-N-カルボベンゾキシ-DL-ジアミノ酪酸（5）の90.0m
gをトリフルオロ酢酸0.5mlに溶解し、これに25％臭化水
素・酢酸溶液0.5mlを加え振り混ぜた。静置した後に生成
した沈澱をジエチルエーテルによって二度洗浄（エーテ
ルはデカントで除去）し、得られた沈殿物を減圧で十分
乾固した。得られた固体を水に溶解し、分子量1,000以
下除去の透析チューブを用いて流水で透析を行った後、
30,000rpmで2時間遠心し、不溶物を除去した。得られた
溶液を凍結乾燥し、ポリ-DL-ジアミノ酪酸（6）臭化物
を73.1mg（収率99％）得た。
【００９０】シアノメチル-1-チオ-β-D-ガラクトピラ
ノシド（7）（シグマ社製）16.6 mgを0.01Mナトリウム
メトキシドメタノール溶液2mlを加えて25℃で24時間静
置した。その後、減圧下に溶媒を除去して、ポリ-DL-ジ
アミノ酪酸（6）臭化物25.5mgを四ホウ酸緩衝液4ml（50
mM,pH 9.5）に溶かしたものを加えて３時間静置した。
反応液を分画分子量1,000の透析膜を用いて流水で透析
を行った後、30,000 rpmで二時間遠心して不溶物を除去
した。得られた溶液を凍結乾燥し、側鎖ガラクトース修
飾ポリ-DL-ジアミノ酪酸（9）を14.9mg得た。糖修飾率
はアントロン硫酸法で測定すると9.7%であった。
【００９１】（実施例５）HepG2細胞への遺伝子導入 １．プラスミド／pDBA複合体の調製 ルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミド［約5.25
kb。予めルシフェラーゼ遺伝子を挿入してあるピッカジ
ーンコントロールベクター（東洋インキ社製）、以下プ
ラスミドAと略記する］の溶液と、実施例２〜４で調製
したpDBAおよび側鎖ガラクトース修飾ポリジアミノ酪酸
誘導体（Gal-pDBA）の溶液をそれぞれ所望濃度の2倍濃
度で調製した。投与約30分前にプラスミド溶液を撹拌し
ながら核酸運搬体溶液を徐々に滴下してプラスミド／pD
BA複合体溶液を調製した。溶媒はPBSを使用した。具体
的には25μg／mlのプラスミド溶液を調製し、プラスミ
ド濃度が12.5μg／mlであるプラスミド／pDBA複合体溶
液を遺伝子導入用検体とした。 ２．プラスミド／pDBA複合体溶液を用いるHepG2細胞へ
の遺伝子導入および検定試験前日に12穴のマルチウェル
プレート（コースター社製）の1ウェルあたり1×105個
播種したHepG2細胞に、10％ウシ胎仔血清（三光純薬
製）存在下でプラスミド／pDBA複合体溶液を加え（プラ
スミドの終濃度は12.5μg／ml）し、37℃で4時間インキ
ュベートした。新鮮な培養液に交換し、さらに48時間イ
ンキュベートした。PBSで2回洗浄後、細胞溶解剤（東洋
インキ製）を加え、凍結融解を1度行った。細胞溶解液
を回収して遠心分離（12,000rpm×10min）し、上清中の
ルシフェラーゼ活性をルシフェラーゼアッセイシステム
（東洋インキ製）を使用してルミノメーター（Lumit LB
9501；Berthold社製）で測定した。また、遠心上清の蛋
白質濃度はプロテインアッセイキット（Bio-Rad社製）
を使い、マイクロプレートリーダー（Rainbow Themo；T
ecan製）で測定した。
【００９２】なお、プラスミドAとpDBAとの重量比（プ
ラスミド／pDBA）は、1/3〜1/7（w／w）の複合体溶液を
調製して試験に用いた。
【００９３】発現したルシフェラーゼの活性測定結果を
図２に示す。これらの測定結果から明らかなように、Ga
l-pDBAは、無修飾のpDBAと比較して、高いルシフェラー
ゼの活性を示した。従って、本発明により糖でpDBAを修
飾すると、ルシフェラーゼの発現が顕著に上昇すること
が確認された。
【００９４】（実施例６）pDBA複合体を用いるマウスヘ
の遺伝子導入 １．プラスミド／pDBA複合体の調製 プラスミドAの溶液とpDBA溶液を各所望濃度の2倍濃度で
調製した。投与約30分前にプラスミド溶液を攪拌しなが
らpDBA溶液を徐々に滴下してプラスミド／pDBA複合体溶
液を調製した。溶媒にはPBS培地を使用した。具体的に
は50μg／mlのプラスミド溶液を調製し、プラスミド濃
度が25μg／mlであるプラスミド／pDBA複合体溶液を投
与用検体とした。実施例２〜４で得られたpDBAおよびGa
l-pDBAとプラスミドAとを、プラスミド／pDBAの重量比
が1／3〜1/9（w／w）となるようにプラスミド／pDBA複
合体溶液を調製し、Balb／Cマウスに尾静脈投与した。
マウス1匹あたりのプラスミドA投与量は、12.5μg／0．
5mlであった。投与2日後、肝臓で見られるルシフェラー
ゼ活性を測定することによりこの組織への遺伝子導入を
測定した。得られた結果を図３（プラスミド／pDBAの重
量比が1／3のデーター）に示す。投与2日後には肝臓に
おいてGal-pDBAを核酸運搬体として使用した群ではpDBA
を核酸運搬体として使用した群と比較すると、約２．５
倍高いルシフェラーゼ活性が測定された。この結果は、
実施例の核酸運搬体を用いて全身に投与した場合、特に
肝臓へ遺伝子を導入することが可能であることを示す。
【００９５】
【発明の効果】本発明に従えば、ジアミノ酪酸の４位の
アミノ基をカルボベンゾキシ基で選択的に保護する反応
において、反応系のｐＨを調製することにより、該反応
の収率を向上させ、かつ生成物の純度を高めることがで
きる。従って、短時間、高収率で純度の高いカルボベン
ゾキシＤＢＡの合成が可能となる。
【００９６】また、本発明の核酸運搬体は、種々の薬物
遺伝子と複合体を形成し、種々の手段により前記遺伝子
を細胞に効率的に導入可能とし、該細胞内で前記遺伝子
の高い遺伝子発現を可能とする。
【００９７】これまで非ウイルスベクターを用いて薬物
遺伝子を全身に投与することで、特定の臓器または組織
に効率よく導入することが難しかったが、本発明の核酸
運搬体を用いると肝臓への遺伝子導入を高めることで
き、集中的に肝臓の治療を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のポリペプチド誘導体の一例である側鎖
ガラクトース修飾ポリジアミノ酪酸の合成経路の一つを
示す反応図である。
【図２】本発明に従い、HepG２細胞に遺伝子導入した結
果、発現したルシフェラーゼの活性測定結果を示すグラ
フである。
【図３】本発明に従い、マウスに遺伝子導入した結果、
発現したルシフェラーゼの活性測定結果を示すグラフで
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 米村 圭司 茨城県つくば市観音台１丁目25番11号 久 光製薬株式会社筑波研究所内 (72)発明者 大森 直哉 茨城県つくば市観音台１丁目25番11号 久 光製薬株式会社筑波研究所内 (72)発明者 安河内 崇 茨城県つくば市観音台１丁目25番11号 久 光製薬株式会社筑波研究所内 (72)発明者 大屋 正尚 茨城県つくば市観音台１丁目25番11号 久 光製薬株式会社筑波研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 BA08 CA02 DA02 EA04 GA11 GA18 HA17 4C076 AA12 BB11 CC26 EE41A FF34 FF63 4H045 AA10 AA30 EA20 FA32 FA41 FA58 4J001 DA01 DB04 EA13 EA33 EA34 FA06 FB01 FC01 GA13 JA20 JB31 JC01

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 式（１）で表されるポリペプチド誘導体
    またはその薬学的に許容される塩。 【化１】 （式中、Ｒ1は、単糖、オリゴ糖、多糖、ペプチド、オ
    リゴペプチド、ポリペプチド、抗体および細胞特異的な
    リガンドからなる群より選ばれる一員から誘導される
    か、或いは置換されていてもよいＣ1〜Ｃ20アルキル
    基、置換されていてもよいＣ1〜Ｃ20アルケニル基、置
    換されていてもよいＣ7〜Ｃ45アリール基、置換されて
    いてもよいＣ7〜Ｃ45アルキルアリール基、置換されて
    いてもよいＣ7〜Ｃ 45アルケニルアリール基および置換
    されていてもよいアミノ基からなる群より選ばれ（該置
    換基はいずれも単糖、オリゴ糖、多糖、ペプチド、オリ
    ゴペプチド、ポリペプチド、抗体および細胞特異的なリ
    ガンドからなる群より選ばれる一員からの基であっても
    よい）；ｐは１〜５の整数を表し；ｍは２以上の整数を
    表し，そしてｎは２以上の整数を表す、但し、ｍ＋ｎは
    ３００以下の整数を表わす。）
  2. 【請求項２】 Ｒ1が式Ｒ2−Ｌ−で表される基であり、
    式中、Ｌは、カルボニル、チオカルボニル、イミンまた
    はメチレンから選ばれるリンカー（これはさらに１つ以
    上のメチレン基を含んでもよい）であり、Ｒ2は、前記
    で定義されたＲ1基の残余の部分であることを特徴とす
    る、請求項１に記載のポリペプチド誘導体またはその薬
    学的に許容される塩。
  3. 【請求項３】 Ｌがイミンを含むリンカー（これはさら
    に１つ以上のメチレン基を含んでもよい）であり、従っ
    てＲ1が式（２）で表される基（式中、Ｘは０または２
    ０以下の自然数である）であり、式（３）で表されるこ
    とを特徴とする、請求項２に記載のポリペプチド誘導体
    またはその薬学的に許容される塩。 【化２】 【化３】
  4. 【請求項４】 ｐが２であり、従って式（４）で表され
    ることを特徴とする、請求項３に記載のポリペプチド誘
    導体またはその薬学的に許容される塩。 【化４】
  5. 【請求項５】 Ｒ2が単糖、オリゴ糖、多糖、ペプチ
    ド、オリゴペプチド、ポリペプチド、抗体および細胞特
    異的なリガンドからなる群より選ばれる一員から誘導さ
    れる基であることを特徴とする、請求項３または４に記
    載のポリペプチド誘導体またはその薬学的に許容される
    塩。、
  6. 【請求項６】 Ｒ2が単糖、オリゴ糖、または多糖から
    選ばれる一員から誘導されるチオグリコシル基、Ｏ-グ
    リコシル基、またはＮ-グリコシル基であることを特徴
    とする請求項５に記載のポリペプチド誘導体またはその
    薬学的に許容される塩。
  7. 【請求項７】 式（５）で表されることを特徴とする、
    請求項６に記載のポリペプチド誘導体またはその薬学的
    に許容される塩。 【化５】
  8. 【請求項８】 請求項１に記載のポリペプチド誘導体ま
    たはその薬学的に許容される塩を含んで成ることを特徴
    とする核酸運搬体。
  9. 【請求項９】 ＤＬ−２，４−ジアミノ酪酸の４位アミ
    ノ基をカルボベンゾキシ基で選択的に保護する方法にお
    いて、ＤＬ−２，４−ジアミノ酪酸またはその酸付加塩
    を［ｐ−（ベンジルオキシカルボニル）フェニル］ジメ
    チルスルホニウム・メチル硫酸塩と反応不活性溶媒中、
    ｐＨ８〜１１で反応させることを特徴とする前記方法
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