JP2003519199A - 遺伝子治療のための新規なコロイド合成ベクター - Google Patents

遺伝子治療のための新規なコロイド合成ベクター

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JP2003519199A JP2001549690A JP2001549690A JP2003519199A JP 2003519199 A JP2003519199 A JP 2003519199A JP 2001549690 A JP2001549690 A JP 2001549690A JP 2001549690 A JP2001549690 A JP 2001549690A JP 2003519199 A JP2003519199 A JP 2003519199A
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ジンピン ヤン
ヨルグ フレイ
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ヤロスラブ シュタネック
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Abstract

(57)【要約】 化学的に規定された試薬類を含む遺伝子治療用非天然ベクターが提供され、前記ベクターはセルフアセンブリし、かつ、前記ベクターは、（１）核酸を含むコア複合体および（２）少なくとも１種の複合体形成剤を含み、前記ベクターはフソーゲン性活性を有している。前記ベクターは適宜、細胞膜類との融合および核取り込みを可能とする試薬類を含有することができる。前記ベクターは、また、前記コア複合体に固定された外部シェルを含むことができ、それによって、前記外部シェルは前記複合体を安定化させ、それを望ましくない相互作用から保護し、核酸の標的組織または細胞への運搬を増大させる。外部シェルは適宜切断可能であり、すなわち、それは、標的細胞または組織に入ったとたん にベクターから離脱するように設計できる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の背景 発明の分野 本発明は、エクスビボの、局所的な、および全身性の核酸送達のための組成物
および方法を提供する。
【０００２】 関連分野の記載 遺伝子治療の成功のための重要な要件は、非標的組織への実質的な分布を伴わ
ずに標的組織および細胞型に目的の治療的な核酸を送達する能力である。多様な
合成分子、すなわち、ベクターが、核酸を細胞に送達するそれらの能力について
試験されてきた。合成ベクターに対する従来のアプローチは、カチオン脂質また
はカチオンポリマーベースの系の使用に集中する傾向があった。例えば、Ｂａｒ
ｒｏｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：３１５−３２３（１９９８）；Ｇ
ａｏら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０（１９９５）；Ｚｅｌｐｈａｔ
ｉら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ４１：９９（１９９６））
、またはカチオンポリマー（Ｂｏｕｓｓｉｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：７２９７（１９９５））；Ｇｏｕｌａら、Ｇｅｎ
ｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：１２９１（１９９５））；Ｃｈｅｍｉｎら、Ｊ Ｖｉ
ｒａｌ Ｈｅｐａｔ ５：３６９（１９９５））；Ｋｗｏｈら、Ｂｉｏｃｈｉｍ
．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １４４４：１７１（１９９９）；Ｗａｎｇｎｅｒ
，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ５３：１５５（１９９８）；お
よびＰｌａｎｋら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．１０：３１９（１９９９））
。 カチオン脂質またはカチオンポリマーとの、タンパク質をコードするプラスミ
ドＤＮＡの複合体（それぞれ、リポプレックスおよびポリプレックスといわれる
）は、細胞をトランスフェクトして、通常、複合体における正味の電荷が正（１
よりも大きい電荷比（＋／−））である場合に最も効果的なタンパク質発現を与
える。同様に、タンパク質をコードするｍＲＮＡについての特異的な配列を伴っ
て、類似のまたは同一の薬剤とともに複合体化されたアンチセンスまたはリボザ
イムオリゴヌクレオチドは、培養中の細胞に送達され得、通常、複合体における
正味の電荷が正である場合、特定のタンパク質の最も効果的な阻害を与える。開
発された核酸についてのいくつかの他の調製物としては、ＦＧＦ２タンパク質の
ような標的化リガンドとポリリジンのようなポリカチオンとの結合体、内部捕獲
された水相中に核酸をカプセル化するリポソーム、いわゆるＨＶＪ−リポソーム
のような核酸を捕獲するリポソームに融合された包膜ウイルス、および核酸が乳
濁液または微粒子の非水相へ隔絶される多様な乳濁液調製物が挙げられる。多様
な調製物にもかかわらず、大部分の場合において、核酸は、複合体形成またはカ
プセル化法によってコロイド複合体に結合される。多くの努力が、所望される薬
理学的利益を獲得する目的のために、プラスミド、オリゴヌクレオチド、および
核酸の他の形態に送達ベクターを提供し得る組成物を調製するためになされたが
、今日までにこれらの調製物はなお、インビボ安定性、標的組織および細胞につ
いての特異性、ならびに標的組織および細胞において核酸活性の十分なレベルを
提供する能力を欠損する。これらのコロイド複合体が内部移行される機構は理解
されていないが、複合体中の正味の電荷に依存することが考えられ、および複合
体の正の表面電荷および細胞の負の表面電荷が、複合体の細胞取り込み、および
生物学的な系との多くの他の相互作用において主要な役割を果たすことが推定さ
れる。 リポプレックスおよびポリプレックスの主要な不利益は、広範に多様な細胞と
非特異的に相互作用するそれらの傾向であり、いくつかの所望されない影響に寄
与する。さらに、複合体は、負に荷電されたタンパク質および血清中の他の成分
と静電的に相互作用し得、複合体の表面修飾または不安定化、および他の好まし
くない影響または細胞相互作用に導く。
【０００３】 従来の複合体でのさらなる問題は、コロイド安定性のそれらの欠損である。こ
の不安定性は、特に中性の電荷比にてまたはその近くで、大きな粒子への複合体
の凝集を導き、そして長期間の保存を困難にする。多くのアプローチが、この問
題を克服するために試みられた。例えば、最も簡単なアプローチの１つは、ポリ
（エチレングリコール）（ＰＥＧ）のような立体ポリマーでの表面修飾による。
（Ｓｃａｒｉａら、１９９９、６月９〜１３日にＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ
．で開催されたＰｒｏｇｒａｍ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅ
ｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｍｅｅｔｈｉｎｇ、ｐ２２１ａ、要約
番号８７８、Ｍｅｙｅｒら、１９９８、Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２７３、１
５６２１−１５６２７；Ｃｈｏｉら、１９９８、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ
．９，７０８−７１８；Ｃｈｏｉら、１９９８、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒ
ｅｌｅａｓｅ ５４,３９−４８；Ｋｗｏｈら、１９９９、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １４４４、１７１−１９０；Ｖｉｎｏｇｒａｄｏｖら
、１９９８、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ ９：８０５−１２；Ｚｅｌｐｈａ
ｔｉら、１９９８、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５、１２７２−１２８２；Ｐｈｉｌｌ
ｉｐｓ、１９９７、１９９７年６月２３〜２４日に、Ａｎｎａｐｏｌｉｓ、Ｍａ
ｒｙｌａｎｄにて開催されたＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ
Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｍｅｅｔｉｎｇ；およびＷｏｏｄｌｅら、１９
９２、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．６１、９０２−１０；Ｅ．Ｓｃｈａｃｈｔら、ＷＯ
９８１９７１０）。複合体の表面上の立体コーティングが、コロイド安定性を増
強し得る。 このような立体コーティングはまた、標的および非標的組織および細胞ならび
に血清成分との相互作用、標的組織および細胞の場合の所望されない効果を最小
にする。ＰＥＧでのリポプレックスおよびポリプレックスの修飾（ＰＥＧ化）は
、しかし、複合体の生物学的活性に対して有意な有害な影響を有する。細胞表面
への非特異的なおよび所望されない結合を阻害する所望される効果に加えて、立
体表面の使用は、標的組織および細胞への結合を有害に影響し得る。さらに、こ
れは、一旦標的細胞への結合が生じると、ＤＮＡ送達プロセスにおけるその後の
工程を有害に影響し得る。例えば、ＰＥＧ化は、複合体のＤＮＡ成分によってコ
ードされるタンパク質の発現の全体のレベルを不十分にすることを導く（Ｓｃａ
ｒｉａおよびＰｈｉｌｉｐｓ、前出）。 Ｓｃｈａｃｈｔら（ＷＯ９８１９７１０）は、特に有利な構築方法は、カチオ
ンポリマー分子と核酸複合体との第１の工程、続いて親水性ポリマーブロックも
しくは１つ以上の標的化分子および/または他の生体活性分子にカチオンポリマ
ー分子が共有結合される第２の工程の、段階的な構築を包含することを述べた。
自己アセンブリされた親水性ポリマーコーティングは、Ａ-Ｂ型直鎖状ブロック
コポリマーを使用して構築され、そしてこのようなコーティングは安定化を提供
し得るが、このように形成された複合体はしばしば、なお極めて迅速に不安定化
される。従って、Ｓｃｈａｃｈｔは、親水性ポリマーおよび標的化部分または他
の生体活性分子が、既存のコロイド、すなわち、粒子に共有結合的に付着される
複合体のアセンブリについての２段階の手順を記載する。さらに、親水性ポリマ
ーの共有結合的付着は、多価の共有結合的付着を使用し、それによって架橋が複
合体の表面コーティング中で生じる。このような複合体は、多くの制限を有する
。重要なことに、この種の構築は明らかに、所望される活性および所望されない
活性の両方を含むそれらの活性において有意な差異を有する多くの異なる化学構
造を生じる。さらに、生成される各構造の量の制御は、不可能でないにしても困
難である。重要なことに、第１の親水性ポリマー結合事象は、カップリング反応
のさらなる出現を減少する基本の立体コートを形成し、それによってプロセスは
自己制限する。自己制限カップリングが許容するよりも大きな量の表面結合ポリ
マーが必要とされる場合、得られるコートは不十分である。さらに、結合体が既
存の粒子の表面上で形成される場合、化学種が形成されることに関した、カップ
リング反応全体の完全な制御は、不可能でないにしても、非常に困難である。な
おさらなる困難は、所望されない反応または核酸成分への結合から保護するとい
う必要性であるが、これは容易には満たされない。２段階法で調製された複合体
でのなお他の困難は、コア複合体が正の表面電荷で調製されるという要件である
。 最後に、複合体が、標的組織および細胞に首尾よく到達する場合、これは標的
組織および細胞膜と効果的に結合し得、そしてその活性が行使され得る細胞内成
分に核酸成分を効果的に送達し得なくてはならない。従来の複合体は、これらの
工程を不十分にのみ行う傾向があり、非能率的なおよび/または不十分なレベル
の遺伝子発現に導く。 それゆえ、改善された標的特異性およびインビボ安定性を有し、および化学的
に規定された種から構成されるが比較的均質である遺伝子送達ベクターが非常に
所望される。特に、安定な遺伝子送達ベクターが、増強された標的特異性、イン
ビボおよびコロイド安定性、ならびに増強された標的特異性を提供する改善され
た外部立体層を有することが所望される。さらに、ベクターが、遺伝子発現のよ
うな増強された核酸治療的活性を許容する、改善された細胞入場、および細胞内
輸送を実証することが所望される。
【０００４】 発明の要旨 それゆえ、本発明の目的は、化学的に規定された薬剤から構成される遺伝子治
療のための天然に存在しないベクターを提供することであり、ここでベクターは
自己アセンブリし、およびここでベクターは（１）核酸を含むコア複合体および
（２）少なくとも１つの複合体形成剤を含み、ここでベクターがフソーゲン性活
性（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ：融合誘導活性）を有する。ベクタ
ーは必要に応じて、細胞膜との融合および核取り込みを許容する薬剤を含み得る
。ベクターはまた、コア複合体に固着される外殻部分を含み得、それによって外
殻は複合体を安定化し、これを所望されない相互作用およから保護し、そして標
的組織または細胞への核酸の送達を増強する。外殻は必要に応じて分断可能であ
り、すなわち、外殻は、これが標的細胞または組織への入場の際にベクターから
解離されるように設計され得る。 本発明のさらなる目的は、これらのベクター、ベクターを含む薬学的組成物を
作製する方法、ならびに患者を処置するためにベクターおよび薬学定組成物を使
用する方法を提供することである。 これらの目的に従って、（１）核酸および少なくとも１つの複合体形成剤を含
有するコア複合体を含む内殻を含む天然に存在しない遺伝子治療ベクターが提供
され、ここでベクターはフソーゲン性活性を有する。ベクターはさらに、フソー
ゲン性部分を含み得る。フソーゲン性部分は、コア複合体に固着される殻を含み
得るか、またはフソーゲン性部分はコア複合体中に直接的に取り込まれ得る。 別の実施態様において、ベクターは、ベクターを安定化し、タンパク質および
細胞への非特異的な結合を減少する外殻部分を含む。外殻部分は、親水性ポリマ
ーを含み得る。 別の実施態様において、ベクターはフソーゲン性部分を含む。外殻部分はフソ
ーゲン性部分に固着され得るか、またはコア複合体に固着され得る。 なお別の実施態様において、ベクターは少なくとも２つの外殻剤の混合物を含
み得る。外殻剤はそれぞれ、タンパク質および細胞への非特異的な結合を減少す
る親水性ポリマーを含み得、およびここでポリマーは実質的に異なる大きさを有
する。 なお別の実施態様において、ベクターは標的組織および細胞集団へのベクター
の結合を増強する標的化部分を含み得る。標的化部分は、外殻部分中に含まれ得
る。
【０００５】 なお別の実施態様において、複合体形成剤は、脂質、ポリマー、およびスペル
ミンアナログ複合体からなる群より選択される。複合体形成剤は、図２.１およ
び２．２において示される脂質からなる群より選択される脂質であり得る。特に
、複合体を形成する脂質薬剤は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジ
ルエタノールアミン（ＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（
ＤＯＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、コレステロール
、および他のステロール、Ｎ-１-(２,３-ジオレオイルオキシ)プロピル-Ｎ，Ｎ
，Ｎ，-トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）、１、２-ビス(オレオ
イルオキシ)-３-（トリメチルアンモニア）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、ホスファ
チジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、約１４
〜２２炭素原子を含む２つの必要に応じて不飽和化される炭化水素鎖を含む糖脂
質、スフィンゴミエリン、スフィンゴシン、セラミド、テルペン、コレステロー
ルヘミスクシネート、コレステロールスルフェート、ジアシルグリセロール、１
、２-ジオレオイル-３-ジメチルアンモニウムプロパンジオール（ＤＯＤＡＰ）、
ジオクタデシルジメチルアンモニウムブロミド（ＤＯＤＡＢ）、ジオクタデシル
ジメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＤＡＣ）、ジオクタデシルアミドグリシ
ルスペルミン（ＤＯＧＳ）、１,３-ジオレオイルオキシ-２-(６-カルボキシスペ
ルミル)プロピルアミド（ＤＯＳＰＥＲ）、２,３-ジオレイルオキシ-Ｎ-[２-(ス
ペルミンカルボキサミド)エチル]-Ｎ，Ｎ-ジメチル-１-プロパンアミニウムトリ
フルオロアセテート（ＤＯＳＰＡまたはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ７）、ヘキ
サデシルトリメチル-アンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ），ジメチル-ジオクタデ
シルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、１，２-ジミリスチルオキシプロピル-
３-ジメチル-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、ジパルミ
トイルホスファチジルエタノールアミルスペルミン（ＤＰＰＥＳ）、ジオクチル
アミングリシン-スペルミン（Ｃ８Ｇｌｙ-Ｓｐｅｒ）、ジヘキサデシルアミン-
スペルミン（Ｃ１８-２-Ｓｐｅｒ）、アミノコレステロール-スペルミン（Ｓｐ
ｅｒ-Ｃｈｏｌ）、１-[２-(９(Ｚ)-オクタデセノイルオキシ)エチル]-２-(８(Ｚ
)-ヘプタデセニル)-３-(２-ヒドロキシエチル)イミダゾリニウムクロライド（Ｄ
ＯＴＩＭ）、ジミリストイル-３-トリメチルアンモニウム-プロパン（ＤＭＴＡ
Ｐ）、１．２-ジミリストイル-ｓｎ-グリセロ-３-エチルホスファチジルコリン
（ＥＤＭＰＣまたはＤＭＥＰＣ）、リジルホスファチジルエタノールアミン（Ｌ
ｙｓ-ＰＥ）、コレストリル-４-アミノプロピオネート（ＡＥ-Ｃｈｏｌ）、スペ
ルマジンコレストリルカルバメート（Ｇｅｎｚｙｍｅ-６７）、２-（ジパルミト
ル-１，２-プロパンジオール）-４-メチルイミダゾール（ＤＰＩｍ）、２-（ジ
オレオイル-１、２-プロパンジオール）-４-メチルイミダゾール（ＤＯＩｍ）、
２-(コレストリル-１-プロピルアミンカルバメート)イミダゾール（ＣｈＩｍ）
、Ｎ-(４-ピリジル)-ジパルミトイル-１、２-プロパンジオール-３-アミン（ＤＰ
ＡＰｙ）、３β-[Ｎ’-（Ｎ’，Ｎ’-ジメチルアミノエタン）カルバモイル]コ
レステロール（ＤＣ-Ｃｈｏｌ）、３β-[Ｎ-(Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’-トリメチルアミ
ノエタン)カルバモイル]コレステロール（ＴＣ-ＣＨＯＬ-γ-ｄ３）、１、２-ジ
オレオイル-ｓｎ-グリセロ-３-スクシネート、１、２-ジオレオイル-ｓｎ-グリセ
ロ-３-スクシニル-２-ヒドロキセチルジスルフィドオルニチン結合体（ＤＯＧＳ
ＤＳＯ）、１,２-ジオレオイル-ｓｎ-グリセロ-３-スクシニル-２-ヒドロキセチ
ルヘキシルオルニチン結合体（ＤＯＧＳＨＤＯ）、Ｎ,ＮＩ，ＮＩＩ，ＮＩＩＩ-
テトラメチル-Ｎ,ＮＩ，ＮＩＩ，ＮＩＩＩ-テトラパルミチオールスペルミン（
ＴＭ-ＴＰＳ）、３-テトラデシルアミノ-Ｎ-ｔｅｒｔ−ブチル-Ｎ’-テトラデシ
ルプロピオンアミジン（ベクタミジンまたはｄｉＣ１４-アミジン）、Ｎ-[３-[
２-(１,３-ジオレオキシルオキシ)プロポキシ-カルボニル]プロピル-Ｎ，Ｎ，Ｎ
-トリメチルアンモニウムヨウ化物（ＹＫＳ-２２０）、およびＯ，Ｏ’-ジテト
ラデカノイル-Ｎ-(αトリメチルアンモニオアセチル)ジエタンオラミンクロライ
ド（ＤＣ-６〜１４）。
【０００６】 複合体形成剤はまた、以下の式Ｉの化合物および薬学的に受容される塩かあら
構成され得
【０００７】
【化８】
【０００８】 ここで、ｍは３または４であり； Ｙは、基-(ＣＨ２)ｎ-、ここでｎは３または４である、を意味するか、または
基-(ＣＨ２)ｎ-、ここでｎは５〜１６の整数である、を意味するか、またはまた
、Ｒ２が基-(ＣＨ２)３-ＮＲ４Ｒ５およびｍが３である場合、基-ＣＨ２-ＣＨ＝
ＣＨ-ＣＨ２-を意味し； Ｒ２は水素もしくは低級アルキルであるか、またはまた、ｍが３である場合、
基-(ＣＨ２)３-ＮＲ４Ｒ５を意味し得； Ｒ３は水素もしくｒはアルキルであるか、またはまた、Ｒ２が基-(ＣＨ２)３-
ＮＲ４Ｒ５およびｍが３である場合、基-ＣＨ２-ＣＨ(-Ｘ’)-ＯＨを意味し得； ＸおよびＸ’は互いに独立して、水素またはアルキルを示し； ラジカルＲ，Ｒ１、Ｒ４、およびＲ５は互いに独立して、水素または低級アル
キルであるが；但しｍが３でありおよびＹが基-(ＣＨ２)３-を意味する場合、ラ
ジカルＲ，Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＸは全てが共に水素およびメチルを意味し
得ない。
【０００９】 さらなる実施態様において、複合体形成剤は、少なくとも２つの複合体形成剤
の混合物を含む。 なお別の実施態様において、複合体形成剤は、細胞結合、生物学的な膜誘導、
エンドソーム破壊、および核標的化からなる群より選択される１つ以上のさらな
る活性を保持する。 他の実施態様において、核酸は、組換えプラスミド、複製不全プラスミド、ミ
ニプラスミド、組換えウイルスゲノム、直鎖状核酸フラグメント、アンチセンス
薬剤、直鎖状ポリヌクレオチド、環状ポリヌクレオチド、リボザイム、細胞プロ
モーター、およびウイルスゲノムからなる群より選択される。 コア複合体はまたさらに、核結合および／または取り込みを増強する核酸標的
化部分を含む。核標的化部分は、核局在化シグナルペプチド、核膜輸送ペプチド
、およびステロイド受容体結合部分からなる群より選択され得る。核標的化部分
はコア複合体中の核酸に固着され得る。 なおさらなる実施態様において、フソーゲン性部分は、ウイルスペプチド、両
親媒性ペプチド、フソーゲン性ポリマー、フソーゲン性ポリマー-脂質結合体か
らなる群より選択される少なくとも１つの部分を含む。フソーゲン性部分は、Ｍ
ＬＶｅｎｖペプチド、ＨＡｅｎｖペプチド、ウイルス包膜タンパク質エクトドメ
イン、ウイルス包膜タンパク質膜近位ドメインの膜不安定化ペプチド、ウイルス
融合タンパク質の疎水性ドメインペプチドセグメント、およびペプチドを含有す
る両親媒性領域からなる群より選択され、ここでペプチドを含有する両親媒性領
域は、メリトチン（ｍｅｌｉｔｔｉｎ）、マガイニン、Ｈ．インフルエンザ赤血
球凝集素（ＨＡ）タンパク質からの融合セグメント、ＨＩＶ１ ｇｐ４１の細胞
質尾部からのＨＩＶセグメントＩ、およびウイルス包膜膜タンパク質からの両親
媒性セグメントからなる群より選択される。
【００１０】 なおさらなる実施態様において、複合体形成剤は、以下の構造を有するポリマ
ーであり：
【００１１】
【化９】
【００１２】 ここでＲ１およびＲ３は独立して、炭化水素、またはアミン、グアニジニウム
、もしくはイミダゾール部分で置換された炭化水素であり、ここでＲ１およびＲ
３は同一であるかまたは異なり得；ならびに Ｒ２は低級アルキル基である。複合体形成剤はまた、以下の構造を有するポリ
マーであり得：
【００１３】
【化１０】
【００１４】 ここでＲ１およびＲ３は独立して、炭化水素、またはアミン、グアニジニウム
、もしくはイミダゾール部分で置換された炭化水素であり、ここでＲ１およびＲ
３は同一であるかまたは異なり得；ならびに Ｒ２およびＲ４は独立して低級アルキル基である。
【００１５】 別の実施態様において、フソーゲン性部分は以下の構造を有するポリマーであ
り；
【００１６】
【化１１】
【００１７】 ここでＲ１は、炭化水素、またはアミン、グアニジニウム、もしくはイミダゾ
ール部分で置換された炭化水素であり； Ｒ２は低級アルキル基であり；および Ｒ３は、炭化水素、またはカルボキシル、ヒドロキシル、スルフェート、また
はホスフェート部分で置換された炭化水素である。フソーゲン性部分はまた、以
下の構造を有するポリマーであり得：
【００１８】
【化１２】
【００１９】 ここでＲ１は、炭化水素、またはアミン、グアニジニウム、もしくはイミダゾ
ール部分で置換された炭化水素であり； Ｒ２およびＲ４は独立して低級アルキル基であり、ならびにＲ３は炭化水素、
またはカルボキシル、ヒドロキシル、スルフェート、またはホスフェート部分で
置換された炭化水素である。フソーゲン性部分はまた、膜界面活性剤ポリマー−
脂質結合体であり得る。界面活性剤−脂質結合体は、Ｔｈｅｓｉｔ（商標）、Ｂ
ｒｉｊ５８（商標）、Ｂｒｉｊ７８（商標）、Ｔｗｅｅｎ８０（商標）、Ｔｗｅ
ｅｎ２０（商標）、Ｃ１２Ｅ８、Ｃ１４Ｅ８、Ｃ１６Ｅ８（ＣｎＥｎ＝炭化水素
ポリ(エチレングリコール)エーテル、ここでＣは炭素長Ｎの炭化水素、およびＥ
は重合化Ｎの程度のポリ(エチレングリコール)を示す）、Ｃｈｏｌ-ＰＥＧ９０
０、ポリオキサゾリンまたはＰＥＧについて置換された他の親水性ポリマーを含
むアナログ、ならびに炭化水素について置換された炭化フッ素を有するアナログ
からなる群より選択され得る。
【００２０】 なお別の実施態様において、内殻は、化学的還元またはスルフヒドリル処置に
よって分解可能である共有結合を介して外殻部分に固着される。内殻は、ｐＨ６
．５以下で分解可能である共有結合を介して、外殻部分に固着され得る。共有結
合は、以下からなる群より選択され得る
【００２１】
【化１３】
【００２２】 別の実施態様において外殻は保護性のポリマー結合体を含み、ここでポリマー
は極性および非極性溶媒の両方において可溶性を示す。保護性の立体ポリマー結
合体におけるポリマーは、ＰＥＧ、ポリアセタルポリマー、ポリオキサゾリン、
末端基結合を伴うポリオキサゾリンポリマーブロック、ハイブリダイズされたデ
キストランポリアセタルポリマー、ポリオキサゾリン、ポリエチレングリコール
、ポリビニルピロリドン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリメタクリルアミド
、ポリエチルオキサゾリン、ポリメチルオキサゾリン、ポリジメチルアクリルア
ミド、ポリビニルメチルエーテル、ポリヒドロキシプロピルメタクリレート、ポ
リヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタクリルミ
ド、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ポリヒドロキシエチルオキサゾリン、
ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、およびポリアスパルタミド、およびポリ
ビニルアルコールからなる群より選択され得る。
【００２３】 なおさらなる実施態様において、ベクターは、受容体リガンド、抗体または抗
体フラグメント、標的化ペプチド、標的化炭化水素分子、またはレクチンからな
る群より選択される標的化エレメントを含む。標的化エレメントは、血管内皮脂
肪増殖因子、ＦＧＦ２、ソマトスタチン、およびソマトスタチンアナログ、トラ
ンスフェリン、メラノトロピン、ＡｐｏＥ，およびＡｐｏＥペプチド、フォンビ
ルブランド因子、およびフォンビルブランド因子ペプチド；アデノウイルス線維
タンパク質、およびアデノイ線維タンパク質ペプチド；ＰＤ１およびＰＤ１ペプ
チド、ＥＧＦおよびＥＧＦペプチド、ＲＧＤペプチド、葉酸、ピリドキシル、お
よびシアリル-Ｌｅｗｉｓ×、および化学アナログからなる群より選択され得る
。
【００２４】 本発明の別の目的に従って、以下の式Ｉを有する化合物；およびそれらの薬学
的に受容される塩が提供される：
【００２５】
【化１４】
【００２６】 ここでｍは３または４であり；Ｙは、基-(ＣＨ２)ｎ-、ここでｎは３または４
である、を意味するか、またはまた基-(ＣＨ２)ｎ-、ここでｎは５〜１６の整数
である、を意味し得るか、またはまた、Ｒ２が基-(ＣＨ２)３-ＮＲ４Ｒ５および
ｍが３である場合、基-ＣＨ２-ＣＨ＝ＣＨ-ＣＨ２-を意味し得；Ｒ２は水素また
は低級アルキルであるか、またはまた、ｍが３である場合、基-(ＣＨ２)３-ＮＲ ４ Ｒ５を意味し得；Ｒ３は水素またはアルキルであるか、またはまた、Ｒ２が基
-(ＣＨ２)３-ＮＲ４Ｒ５およびｍが３である場合、基-ＣＨ２-ＣＨ(-Ｘ’)-ＯＨ
を意味し得；ＸおよびＸ’は互いに独立して、水素またはアルキルを示し；ラジ
カルＲ，Ｒ１、Ｒ４、およびＲ５は互いに独立して、水素または低級アルキルで
あるが；但しｍが３でありおよびＹが基-(ＣＨ２)３-を意味する場合、ラジカル
Ｒ，Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＸは全てが共に水素およびメチルを意味し得ない
。
【００２７】 本発明の別の局面において、薬学的に受容される希釈剤または賦形剤とともに
、上記のベクターを含む薬学的組成物が提供される。 本発明の別の局面に従って、上記のタイプの自己アセンブリするコア複合体を
形成するための方法が提供され、ここで方法は、核酸の溶液の流動およびコア複
合体形成化部部の溶液の流動を立体ミキサー中に与える工程を包含し、ここで流
動はいくつかの異なる点で交わる内部および外部のらせん流動中に分割されて乱
流を引き起こし、そしてそれによって混合を促進し、物理化学的なアセンブリ相
互作用を生じる。 本発明のなお別の局面に従って、患者において疾患を処置する方法が提供され
、治療学的に有効な量の上記のようなベクターを患者に投与する工程を包含する
。 本発明のなお別の局面に従って、内殻を含む、天然に存在しない遺伝子治療ベ
クターが提供され、（１）核酸および少なくとも１つの複合体形成剤を含むコア
複合体；（２）核標的化部分；（３）フソーゲン性部分；ならびに（４）（ｉ）
ベクターを安定化し、そしてタンパク質および細胞への非特異的な結合を減少す
る親水性ポリマー、および（ｉｉ）組織および細胞を標的化するための結合を提
供する標的化部分を含む外殻を含み、ここで外殻は外殻が分断されることを可能
にする切断可能な結合を介して連結される。 本発明の別の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明白になる。
しかし、詳細な説明および特定の実施態様は、本発明の好ましい実施態様を示す
が、本発明の精神および範囲内の種々の変化および改変がこの詳細な説明から当
業者に明らかになるので、説明のためのみに与えられる。
【００２８】 発明の詳細な説明 治療学的核酸の送達についての改善された組成物および方法が提供される。改
善された複合体は、１）内部遺伝子コア複合体および２）内部遺伝子コア複合体
に固着される外殻部分を含有する、安定な遺伝子送達ベクターを含む。外殻部分
は、改善された核酸の送達、標的特異性、インビボでの生物学的安定性、および
コロイドのまたは物理的な安定性を提供する。遺伝子コア複合体は「ペイロード
」核酸部分、少なくとも１つのコア複合体形成剤を含み、および有利には、細胞
入場、核標的化、ならびに標的細胞および組織への入場後の核酸部分の核入場を
容易にするさらなる機能的単位を含む。コア複合体は、核酸が主に「大量の水」
がない区分中に局在化される複合体である。従って、コア複合体は、核酸の比較
的薄い溶液を捕獲し、ここでは核酸が内側の周りを「浮遊」する、リポソームの
ような組成物とは区別される。コア複合体は、核酸を水和する多くの水分子を含
むが、リポソームにおいて見出されるような大きな「捕獲される」容量ではない
。 遺伝子コア複合体は、コア複合体の必須の部分としてフソーゲン性部分を含み
得るか、またはフソーゲン性部分はベクターの別々の層または殻を含み得る。こ
の後者の実施態様において、フソーゲン性部分はコア複合体に固着され、ここで
は固着は、共有結合、静電、疎水性、またはこのような力の組み合わせである切
断を含む。コア複合体とフソーゲン性層との間の固着化結合の性質は、一旦ベク
ターが標的細胞の細胞質に入ると核酸から分離され得、それによってペイロード
核酸の生物学的活性が増強されるようである。同様にコア複合体形成剤は、核酸
分子が放出され、そして遊離し、その核またはそれがその所望される活性を示す
細胞の他の画分において生物学的活性を行使する。 核酸部分ペイロードは、１つ以上のＤＮＡまたはＲＮＡ分子または化学的アナ
ログを含む。１つの実施態様において、この部分は、治療学的なペプチド、ポリ
ペプチド、またはタンパク質をコードする。ペイロードはまた、標的組織および
細胞において内因性遺伝子の発現を、直接的にまたは間接的に阻害し得る。例え
ば、ペイロードは治療学的なＲＮＡ分子もしくはアンチセンスＲＮＡ分子をコー
ドするＤＮＡ分子であり得るか、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボ
ザイム、遺伝子発現を阻害する２本鎖ＲＮＡ、２本鎖ＲＮＡ/ＤＮＡハイブリッ
ド、ウイルスゲノム、または核酸の他の形態であり得る。 標的組織および細胞への入場後に核酸の核標的化を容易にする機能的な単位は
有利には、核局在化シグナルである。しかし当業者は、標的組織および細胞の核
へのコア複合体の送達を増強する他の部分が使用され得ることを認識する。例え
ば、機能的な単位はまた、ウイルスコアペプチド、ポリペプチド、もしくは核送
達を増強するタンパク質であり得るか、または核局在化シグナル（ＮＬＳ）とし
てもまた知られる核膜輸送ペプチド、またはステロイドもしくはステロイドアナ
ログ部分であり得る（Ｃｅｐｐｉら、６月９〜１３日に、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ
Ｄ．Ｃ．にて開催されたＰｒｏｇｒａｍ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｍｅｅｔｈｉｎｇ、ｐ２１
７ａ、要約番号８６０（１９９９）を参照のこと）。
【００２９】 １つの実施態様において、遺伝子送達ベクターは、複合体に改変された表面特
性を提供する非特異的な相互作用を排除する立体障壁外部層または殻を有し、そ
れによって従来のベクター系で有意な問題を引き起こす。立体層はまた、宿主へ
の投与の際にベクターに対する宿主免疫応答を抑制する利点を有する。有利には
、外部層は、標的組織および細胞への付着および入場の前にのみ複合体を保護す
る。１つの実施態様において、外部層は次いで脱離され、ペイロード核酸の至適
な生物学的活性を許容する。この目的を達成するために、複合体の表面上の立体
コーティングが提供され、これは血清成分と、非標的組織および細胞との相互作
用を最小にする。コーティングは、立体コーティングが細胞性相互作用が有益で
ある点にて複合体から脱離または切断される様な様式で、コア複合体に固着され
る。例えば、１つのこのような点は、標的組織および細胞への複合体の付着後で
あるが、細胞質へのコア複合体の放出の前に生じ得る。別のこのような点は、標
的組織の細胞外空間内である。なお別のこのような点は、予め決定された時間の
後である。なお別のこのような点は、外部シグナルまたは熱もしくは超音波エネ
ルギーのような力に曝露される標的細胞内である。細胞入場後の事象の配列は、
ペイロードの送達が、立体層によって妨害またはそうでなければ阻害されること
を確実にする。別の実施態様において、立体層は、これが非特異的な相互作用を
阻害するが、標的組織および細胞への結合、細胞入場、およびアンカーの切断を
伴わない核酸の機能的な送達を許容するように設計および固着される。 外側層は有利には、ベクターと、標的組織および細胞との間の相互作用の親和
性を増強する標的化部分を含む。標的化部分は、標的化部分の存在が、非標的組
織および細胞に比較して、標的組織および細胞の表面で結合されるベクターの増
加を提供する場合に、標的細胞集団についてのベクターの親和性を増強すると言
われる。標的化部分の例は、タンパク質、ペプチド、レクチン（炭水化物）、お
よび小分子リガンドを包含するが、これらに制限されず、ここで標的化部分のそ
れぞれは、受容体分子のような、細胞上の相補的な分子または構造に結合する。
【００３０】 本発明の特定の特徴は以下に詳細に記載される。 ペイロード核酸部分 本発明のベクターは、治療学的または診断的価値がある本質的に任意の核酸を
送達するために使用され得る。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、３重形成化オリゴヌク
レオチドまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）のような核酸ホモログであり得るか、ま
たはこれらの組み合わせであり得る。適切な核酸は、組換えプラスミド、複製不
全プラスミド、細菌の配列を欠損するミニプラスミド、組換えウイルスゲノム、
治療学的ペプチドまたはタンパク質をコードする直鎖状核酸フラグメント、ハイ
ブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ２重鎖、２重鎖ＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡまたは化学
的アナログ、アンチセンスＲＮＡまたは化学的アナログ、アンチセンスＲＮＡま
たはリボザイムとして転写される直鎖状ポリヌクレオチド、リボザイム、および
ウイルスゲノムを包含するが、これらに制限されない。本明細書において以後使
用されるように、用語「治療学的タンパク質」は、他で示されない限り、ペプチ
ド、ポリペプチド、およびタンパク質を包含する。 核酸が宿主細胞のゲノムに部位特異的に取り込まれることが所望される場合、
治療学的タンパク質をコードする核酸配列は、宿主ゲノム中の配列に相同である
配列のストレッチに近接され得る。これらの配列は、相同組換えのプロセスによ
って宿主ゲノムへの取り込みを容易にする。相同組換えを達成するにおける使用
のためのベクターは当該分野において公知である。核酸が、宿主ゲノムにこの部
位特異的な様式において取り込まれる場合、核酸の発現は内因性発現制御系の機
能的な制御下にあり得る。しかし、よりあり得ることに、核酸発現を駆動する外
因性制御エレメントを提供することが必要である。有利なことに、制御エレメン
トは細胞得意的であり、それによって核酸発現の細胞時的な性質が増強されるが
、これは必須ではない。プロモーターおよびエンハンサー配列（細胞特異定およ
び非特異的の両方）のような適切な発現制御エレメントは、当該分野において周
知である。例えば、Ｇａｚｉｔら、Ｃａｎ．Ｒｅｓ．５９、３１００−３１０６
（１９９１）、Ｗａｌｔｏｎら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１８（３Ａ）
：１３５７−６０（１９９８）；Ｃｌａｒｙら、Ｓｕｒｇ-Ｏｎｃｏｌ-Ｃｌｉｎ
-Ｎ-Ａｍ、７：５６５−７４（１９９８）、Ｒｏｓｓｉら／Ｃｕｒｒ-Ｏｐｉｎ-
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：４５１−６（１９９８）、Ｍｉｌｌｅｒら、Ｈｕｍ
−Ｇｅｎｅ−Ｔｈｅｒ．８：８０３（１９９７）；Ｃｌａｃｋｓｏｎ、Ｃｕｒｒ
．Ｏｐｉｎ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１：２１０−２１８（１９９７）を参照のこ
と。適切なプロモーターは、ＥＦ−１ａ、ＣＭＶ、ＲＳＶ、およびＳＶ４０ラー
ジＴ抗原プロモーターのような構成的プロモーター、アルブミン、肺界面活性タ
ンパク質、組織特異的増殖因子受容体のような組織特異的プロモーター、α胎児
タンパク質腫瘍特異的プロモーター、腫瘍特異的タンパク質、炎症カスケードタ
ンパク質、壊死応答タンパク質のような病理学的組織特異的プロモーター、テト
ラサイクリン活性化プロモーターおよびステロイド受容体活性化プロモーターの
ような調節されたプロモーター、または操作されたプロモーター、ならびに骨格
または基質付着領域（ＳＡＲまたはＭＡＲ）のようなクロマチンエレメント、ヌ
クレオソームエレメント、インスレーター、およびエンハンサーを包含するが、
これらに制限されない。 本発明における使用のための適切な発現プラスミドおよびミニプラスミドは当
該分野において周知である（Ｐｒａｚｅｒｅｓら、Ｔｒｅｎｄｓ-Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ．１７：１６９（１９９９）；Ｋｏｗａｋｃｚｙｋら、Ｃｅｌｌ−Ｍｏ
ｌ−Ｌｉｆｅ−Ｓｃｉ．５５：７５１（１９９９）；Ｍａｈｆｏｕｄｉ、Ｇｅｎ
ｅ Ｔｈｅｒ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２：４３１（１９９８）。プラスミドは必要
に応じてプロモーターエレメント、イントロン配列、およびポリアデニル化シグ
ナル配列と結合されたオープンリーディング配列を含み得る。核酸部分がプラス
ミドである場合、これは有利には、細菌において複製を許容する核酸エレメント
を欠損する。従って、例えば、プラスミドは細菌の複製起点を欠損する。最も有
利には、プラスミドは細菌起源の配列が比較的ない。このようなプラスミドを調
製するための方法は当該分野において周知である（Ｐｒａｚｅｒｅｓ、前出）。
【００３１】 核酸がウイルス起源である場合、適切なウイルス部分は、組換えアデノウイル
スゲノムＤＮＡ（末端タンパク質を伴うかまたは伴わない）、および例えば、Ｍ
ＬＶまたはＨＩＶ ｅｎｖ粒子に由来するレトロウイルスコアを包含するが、こ
れらに制限されない。細胞質発現および複製のために組換えαウイルスＲＮＡが
また使用され得る。他のウイルスゲノムは、ヘルペスウイルス、ＳＶ−４０、ワ
クシニアウイルス、およびアデノ随伴ウイルスを包含する。プラスミドＤＮＡま
たはウイルスゲノムをコードするＰＣＲ作製されたＤＮＡがまた使用され得る。
核酸の他のウイルス供給源が使用され得る。 核酸が合成起源である場合、適切な部分は、ＰＣＲフラグメントＤＮＡ、末端
基の化学修飾または結合を伴うＤＮＡ、アンチセンスおよびリボザイムオリゴヌ
クレオチド、直鎖状ＲＮＡ、直鎖状ＲＮＡ-ＤＮＡハイブリッドを包含するがこ
れらに制限されない。合成核酸または核酸アナログの他の供給源がまた使用され
得る。
【００３２】 複合体形成剤 本発明における使用のために適切な複合体形成剤は、核酸コア複合体のアセン
ブリを許容する様式においてコア核酸と会合し得なくてはならない。複合体形成
剤は、例えば、脂質、合成ポリマー、天然のポリマー、半合成ポリマー、脂質の
混合物、ポリマーの混合物、脂質およびポリマーの組み合わせ、またはスペルミ
ンアナログ複合体であり得るが、当業者は他の薬剤が使用され得ることを認識す
る。複合体形成剤は好ましくは、調製のために示される条件下で複合体の形成を
可能にするのに充分な、ならびに保存の間および投与後に示される条件下で複合
体を維持するのに十分であるが、標的細胞の細胞質または核における条件下で複
合体を維持するのに不十分な親和性を有する。複合体形成剤の共通の例は、カチ
オン脂質およびポリマーを含み、これは適切な混合条件下でのコア核酸部分との
自発的な複合体化を許容するが、中性および負に荷電された脂質およびポリマー
が使用され得る。他の例は、組み合わせの脂質およびポリマーを包含し、ここで
はいくつかは天然でカチオンであり、組み合わせのその他は天然において中性ま
たはアニオンであり、それによって、あわせて所望の安定性のバランスを伴う複
合体が獲得される。なお別の例において、非静電相互作用を有するが、なお所望
される安定性のバランスを伴って複合体を形成することが可能である脂質および
ポリマーが使用され得る。例えば、所望される安定性のバランスは核酸塩基と、
３重オリゴヌクレオチドまたは「ペプチド核酸」結合のような骨格部分との相互
作用を介して達成され得る。なおさらなる例において、結合された脂質およびポ
リマーは単独で、および組み合わせて使用され得る。
【００３３】 本発明における使用のために適切なカチオン脂質は、例えば、本明細書中にそ
れらの全体が参考として援用される、米国第５，８５４，２２４号および同第５
，８７７，２２０号において記載される。適切な脂質は典型的に少なくとも１つ
の疎水性部分および１つの親水性部分を含む。他の適切な脂質は、ベシクル形成
化またはベシクル適合性脂質、例えばリン脂質、糖脂質、ステロール、または脂
肪酸を包含する。このクラスにおいて含まれるのは、ホスファチジルコリン（Ｐ
Ｃ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、
ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）の
ようなリン脂質、およびスフィンゴミエリン（ＳＭ）のような糖脂質を包含し、
ここではこれらの化合物は典型的に、特徴的に約１４〜２２の間の炭素原子長で
ある２つの必要に応じて不飽和化される炭化水素鎖を含み、および不飽和の炭素
-炭素結合を含み得る。好ましい疎水性部分の１つのクラスは、炭化水素鎖およ
びステロールを包含する。疎水性部部の他のクラスは、スフィンゴシン、セラミ
ド、ならびにファルネソール、リモネン、フィトール、スクアラン、およびレチ
ノールのようなテルペン（ポリ−イソプレン）を包含する。本発明に適切な脂質
の特定の例は、アニオンの、中性の、または双性イオンの脂質、例えば、ホスフ
ァチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（Ｄ
ＯＰＥ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、コレステロールヘミスクシネート（Ｃ
ＨＥＭＳ）、コレステロールスルフェート、およびジアシルグリセロールを包含
する。カチオン脂質の特定の例は、Ｎ-１-(２,３-ジオレオイルオキシ)プロピル
-Ｎ，Ｎ，Ｎ，-トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）、１、２-ビス
(オレオイルオキシ)-３-（トリメチルアンモニア）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、１
、２-ジオレオイル-３-ジメチルアンモニウムプロパンジオール（ＤＯＤＡＰ）、
ジオクタデシルジメチルアンモニウムブロミド（ＤＯＤＡＢ）、ジオクタデシル
ジメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＤＡＣ）、ジオクタデシルアミドグリシ
ルスペルミン（ＤＯＧＳ）、１,３-ジオレオイルオキシ-２-(６-カルボキシスペ
ミル)プロピルアミド（ＤＯＳＰＥＲ）、２,３-ジオレイルオキシ-Ｎ-[２-(スペ
ルミンカルボキシアミド)エチル]-Ｎ，Ｎ-ジメチル-１-プロパンアミニウムトリ
フルオロアセテート（ＤＯＳＰＡまたはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ７）、ヘキ
サデシルトリメチル-アンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ），ジメチル-ジオクタデ
シルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、１，２-ジミリスチルオキシプロピル-
３-ジメチル-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、ジパルミ
トイルホスファチジルエタノールアミルスペルミン（ＤＰＰＥＳ）、ジオクチル
アミングリシン-スペルミン（Ｃ８Ｇｌｙ-Ｓｐｅｒ）、ジヘキサデシルアミン-
スペルミン（Ｃ１８-２-Ｓｐｅｒ）、アミノコレステロール-スペルミン（Ｓｐ
ｅｒ-Ｃｈｏｌ）、１-[２-(９(Ｚ)-オクタデセノイルオキシ)エチル]-２-(８(Ｚ
)-ヘプタデセニル)-３-(２-ヒドロキシエチル)イミダゾリニウムクロライド（Ｄ
ＯＴＩＭ）、ジミリストイル-３-トリメチルアンモニウム-プロパン（ＤＭＴＡ
Ｐ）、１、２-ジミリストイル-ｓｎ-グリセロ-３-エチルホスファチジルコリン（
ＥＤＭＰＣまたはＤＭＥＰＣ）、リジルホスファチジルエタノールアミン（Ｌｙ
ｓ-ＰＥ）、コレストリル-４-アミノプロピオネート（ＡＥ-Ｃｈｏｌ）、スペル
マジンコレストリルカルバメート（Ｇｅｎｚｙｍｅ-６７）、２-（ジパルミトル
-１，２-プロパンジオール）-４-メチルイミダゾール（ＤＰＩｍ）、２-（ジオ
レオイル-１、２-プロパンジオール）-４-メチルイミダゾール（ＤＯＩｍ）、２-
(コレストリル-１-プロピルアミンカルバメート)イミダゾール（ＣｈＩｍ）、Ｎ
-(４-ピリジル)-ジパルミトイル-１、２-プロパンジオール-３-アミン（ＤＰＡＰ
ｙ）、３β-[Ｎ’-（Ｎ’，Ｎ’-ジメチルアミノエタン）カルバモイル]コレス
テロール（ＤＣ-Ｃｈｏｌ）、３β-[Ｎ-(Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’-トリメチルアミノエ
タン)カルバモイル]コレステロール（ＴＣ-ＣＨＯＬ-γ-ｄ３）、ＤＯＴＭＡお
よびＤＯＰＥの１：１混合物（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ７）、１、２-ジオレオイル
-ｓｎ-グリセロ-３-スクシネート、１、２-ジオレオイル-ｓｎ-グリセロ-３-スク
シニル-２-ヒドロキセチルジスルフィドオルニチン結合体（ＤＯＧＳＤＳＯ）、
および１,２-ジオレオイル-ｓｎ-グリセロ-３-スクシニル-２-ヒドロキセチルヘ
キシルオルニチン結合体（ＤＯＧＳＨＤＯ）、Ｎ,ＮＩ，ＮＩＩ，ＮＩＩＩ-テト
ラメチル-Ｎ,ＮＩ，ＮＩＩ，ＮＩＩＩ-テトラパルミチオールスペルミン（ＴＭ-
ＴＰＳ）、３-テトラデシルアミノ-Ｎ-ｔｅｒｔ−ブチル-Ｎ’-テトラデシルプ
ロピオンアミジン（ベクタミジンまたはｄｉＣ１４-アミジン）、Ｎ-[３-[２-(
１,３-ジオレオキシルオキシ)プロポキシ-カルボニル]プロピル-Ｎ，Ｎ，Ｎ-ト
リメチルアンモニウムヨウ化物（ＹＫＳ-２２０）、およびＯ，Ｏ’-ジテトラデ
カノイル-Ｎ-(αトリメチルアンモニオアセチル)ジエタンオラミンクロライド（
ＤＣ-６〜１４）である（Ｌａｓｉｃ、遺伝子送達におけるリポソーム、１９９
７、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ ＦＬ．，Ｔａｎｇら、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２４２：１４１（１９９８）Ｏ
ｂｉｋａら、Ｂｉｏｌ−Ｐｈａｒｍ−Ｂｕｌｌ．２２：１８７（１９９９）を参
照のこと。
【００３４】 中性脂質とカチオン脂質との混合物が使用され得ること、カチオン脂質と中性
の脂質との混合物は３：１重量／重量ＤＯＳＰＡ：ＤＯＰＥ（Ｌｉｐｏｆｅｃｔ
ａｍｉｎｅ７）、１：１重量／重量ＤＯＴＭＡ：ＤＯＰＥ（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉ
ｎ７）、１：１モル／モルＤＭＲＩＥ：Ｃｈｏｌ（ＤＭＲＩＥ-ＣＴＭ）、１：
１．５モル／モルＴＭ-ＴＰＳ：ＤＯＰＥ（ＣｅｌｌｆｅｃｔｉｎＴＭ）、１：
２．５重量／重量ＤＤＡＢ：ＤＯＰＥ（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＣＥ７）、１：１重
量／重量ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ、および多くのそれらに対する改変体を含むこと
に留意のこと。 また、このようなカチオン脂質試薬、および疎水性部分を欠損する他のカチオ
ン試薬は、核酸が、トリグリセリドおよび／またはステロールで形成された油、
脂肪酸およびリゾリン脂質のような両親媒性の安定化剤と組み合わせた、油で形
成された乳濁液、微小乳濁液、立方相脂質を含む、低い極性の環境に取り込まれ
る様式において核酸に結合され得ることに留意のこと。１つの特定の実施態様は
、トリグリセリド、およびホスファチジルコリン：リゾホスファチジルコリン（
２：１または粒径を制御するために必要とされるような他の比率）と組み合わせ
て、ＤＯＧＳのような多価カチオン脂質を利用する。 このような組成物は、固着が、オクチルデシル（Ｃ１８）およびより長い炭化
水素、フィタノイル炭化水素のような大きな疎水性部分（非常に低い水可溶性を
有する）、または複数の部分、または他のこのような部分の添加を介して生じる
コア粒子を形成するために使用され得る。別の特定の実施態様は、炭化水素-フ
ッ化炭素「ダウエル」（Ｃ１６Ｆ１７Ｈ１７）、フッ化炭素「油」（例えば、Ｃ １６ Ｆ３４）、およびホスファチジルコリン：-リゾホスファチジルコリン（２
：１または粒径を制御するために必要とされるような他の比率）と組み合わせて
ＤＯＧＳのような多価カチオン脂質を利用する。このような組成物は、コア粒子
を形成するために使用され得、ここでは固着はフッ化炭素またはフッ化炭素「油
」に挿入し得る炭化水素-フッ化炭素セグメントの添加による。
【００３５】 多くの他のカチオン脂質は、コア複合体を形成するのに適切であり、および以
下の特許または特許出願において記載される：米国特許第５，２６４，６１８号
、米国特許第５，３３４，７６１号、米国特許第５，４５９，１２７号、米国特
許第５，７０５，６９３号、米国特許第５，７７７，１５３号、米国特許第５，
８３０，４３０号、米国特許第５，８７７，２２０号、米国特許第５，９５８，
９０１号、米国特許第５，９８０，９３５号、ＷＯ０９６４０７２５、ＷＯ０９
６４０７２６、ＷＯ０９６４０９６３、ＷＯ０９７０３９３９、ＷＯ０９７３１
９３４、ＷＯ０９８３４６４８、ＷＯ９８５６４２３、ＷＯ０９９３４８３５。
例えば、米国特許第５，８７７，２２０号、米国特許第５，９５８，９０１号、
ＷＯ９６／４０７２５、ＷＯ９６／４０７２６、およびＷＯ９７／０３９３９の
特許または特許出願によって記載される１４個の薬剤は、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉ
ｏｓｃｉｅｎｃｅｓ［正式には、ＪＢＬ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｓｕｂｓｉｄ
ｉａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｒａ Ｉｎｃ．］（Ｓａｎ Ｌｏｕｉｓ Ｏｂｉｓｂｏ
、ＣＡ）から入手可能であり、およびそれらの構造は、図２．１−２．２におい
て示される。疎水性部分は、ステロール（コレステロール）から、２つまたは４
つの炭化水素鎖の１７または１８炭素長におよぶ。正に荷電された部分（親水性
頭基）は非常に変化するが、一般にイオン化可能な窒素（アミン）を含む。各分
子における正電荷の数は１〜１３まで変化し、分子量は６５０〜４２１２まで変
化する。
【００３６】 有利には、任意の補助成分を伴わないか、またはコレステロールもしくは親水
性ポリマー部分を含む界面活性剤のような補助成分を含むかのいずれかで、コア
複合体はＧＣ−０３０またはＧＣ−０３４を用いて調製され得る。あるいは、Ｇ
Ｃ−０２９、ＧＣ−０３９、ＧＣ−０１６、ＧＣ−０３８が、単独で、またはＣ
ｈｏｌもしくは界面活性剤のような成分との混合物としてのいずれかで使用され
得る。多数の他の脂質構造は、米国特許第５，８７７，２２０号、米国特許第５
，９５８，９０１号、ＷＯ９６/４０７２５、ＷＯ９６/４０７２６、およびＷＯ
９７/０３９３９において記載され、ならびに本発明において使用され得る。最
も大きな有用性を有する特定の脂質は４種類のアッセイ：Ｉ）小さな、コロイド
安定性の粒子に核酸を形成する能力、２）組織培養における細胞中のエンドソー
ムへの核酸の内部移行を増強する能力、３）組織培養における細胞中の核酸の細
胞質放出を増強する能力、および４）局所的または全身的に投与される場合のイ
ンビボ組織によるプラスミド発現を誘発する能力を使用して同定され得る。
【００３７】 適切なカチオン化合物はさらに、以下の一般式Ｉを有する置換されたアミノエ
タノールおよびそれらの塩を包含する：
【００３８】
【化１５】
【００３９】 ここでｍは３または４であり；Ｙは、基-(ＣＨ２)ｎ-、ここでｎは３または４
である、を意味するか、または基-(ＣＨ２)ｎ-、ここでｎは５〜１６の整数であ
る、を意味し得るか、またはまた、Ｒ２が基-(ＣＨ２)３-ＮＲ４Ｒ５およびｍが
３である場合、基-ＣＨ２-ＣＨ＝ＣＨ-ＣＨ２-を意味し得；Ｒ２は水素または低
級アルキルであるか、またはまた、ｍが３である場合、-(ＣＨ２)３-ＮＲ４Ｒ５ を意味し得；Ｒ３は水素または低級アルキルであるか、またはまた、Ｒ２が基-(
ＣＨ２)３-ＮＲ４Ｒ５およびｍが３である場合、基-ＣＨ２-ＣＨ(-Ｘ’)-ＯＨを
意味し得；ＸおよびＸ’は互いに独立して、水素またはアルキルを示し；ラジカ
ルＲ，Ｒ１、Ｒ４、およびＲ５は互いに独立して、水素または低級アルキルであ
るが；但しｍが３でありおよびＹが基-(ＣＨ２)ｎ-を意味する場合、ラジカルＲ
，Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＸは全てが共に水素およびメチルを意味し得ない。
【００４０】 本明細書において以前および以後に使用される一般的な用語は、本出願の情況
において以下の意味を有する： 接頭辞「低級」は、７個以下の、特に３個以下の炭素原子を有するラジカルを
示す。 低級アルキルは、例えば、ｎ-プロピル、イソプロピル、ｎ-ブチル、イソブチ
ル、ｓｅｃ．-ブチル、ｔｅｒｔ．-ブチル、ｎ-ペンチル、ネオペンチル、ｎ-ヘ
キシル、またはｎ-ヘプチルである。１つの実施態様において、低級アルキルは
好ましくはエチル、および特にメチルである。別の実施態様において、低級アル
キルは炭化水素部分のフッ化水素アナログである。なお別の実施態様において、
低級アルキルはフッ化炭素および炭化水素部分の組み合わせである。 アルキルは、例えば、Ｃ１〜Ｃ３０-アルキル、好ましくはＣ１〜Ｃ１６-アル
キルである；アルキルは好ましくは直鎖状アルキルであるが、また分岐され得、
および例えば、上述で規定されるような低級アルキル、ｎ-オクチル、ｎ-ノニル
、ｎ-デシル、ｎ-ドデシル、ｎ-テトラデシル、ｎ-ヘキサデシル、または２，７
-ジメチルオクチルである。別の実施態様において、アルキルは炭化水素部分の
フッ化炭素アナログである。なお別の実施態様において、アルキルは、フッ化炭
素および炭化水素の組み合わせである。 ハロゲンは、例えば、フッ素、ヨウ素、特に臭素、および特に塩素を意味する
。
【００４１】 本発明に従う化合物の塩は、主に薬学的に受容される、非毒性の塩である。例
えば、３または４個のいずれかの塩基性中心を含む式Ｉの化合物は、塩化水素酸
およびヨウ化水素酸のような無機酸とともに、硫酸またはリン酸とともに、また
は適切な無機カルボン酸またはスルホン酸（例えば、酢酸、トリフルオロ酢酸、
フマル酸、オキサロ酸、メタンスルホン酸、またはｐ-トルエンスルホン酸）と
ともに、または例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸のような酸性アミノ
酸とともに、酸付加塩を形成し得る。式Ｉの化合物と関連される場合、用語「塩
」は単塩および多塩の両方を包含する。 単離および精製のために、薬学的に適切でない塩、例えば、ピクリン酸塩また
は過塩素酸塩がまた使用され得る。治療学的使用のために、薬学的に受容される
塩のみが使用され得、およびこの理由のためにこれらが好ましい。 構造的データに依存して、本発明の化合物は、異性体混合物の形態においｔ、
または純粋な異性体として存在し得る。
【００４２】 式Ｉの化合物は既知の方法で生成されてよく、たとえば、 （ａ） 式ＩＩの化合物
【００４３】
【化１６】
【００４４】 式中、ｍ、Ｙ、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、式Ｉについて定義されたとおりで
あり、アミノ基−ＮＲＲ１、−ＮＲ２Ｒ３および任意にラジカルＲ２＝−（ＣＨ ２ ）３、−ＮＲ４Ｒ５における−ＮＲ４Ｒ５は、適当な保護基により任意に保護
される］は、式IIIの化合物
【００４５】
【化１７】
【００４６】 式中、Ｘは式Ｉについて定義されたとおりであり、必要であればアミノ保護基
は再び切断される］と反応させられるか、または （ｂ） ｍは３であり、Ｒ２は基−（ＣＨ２）３−ＮＲ４Ｒ５であり、さらに
Ｒ３は基−ＣＨ２−ＣＨ（−Ｘ´）−ＯＨである、式Ｉの化合物を生成するべく
、式ＩＶの化合物
【００４７】
【化１８】
【００４８】 式中、Ｙ、Ｒ、Ｒ１、Ｒ４、およびＲ５は式Ｉについて定義されたとおりであ
り、アミノ基−ＮＲＲ１および−ＮＲ４Ｒ５は任意に適当な基により保護されて
いる］が、Ｘが式Ｉについて定義されたとおりであり、かつ必要であれば該アミ
ノ酸の保護基が再び切断される、式IIIの化合物と反応させられるか、または （ｃ） Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３が水素を意味しており、Ｙは基−（ＣＨ ２ ）ｎ−であり、ｎは３または４である、式Ｉの化合物を生成するべく、式Ｖの
化合物
【００４９】
【化１９】
【００５０】 式中、ｍおよびＸは式Ｉについて定義されたとおりであり、ｎは３または４で
ある、が還元されるか、または （ｄ） ｍが３であり、Ｒ２が基−（ＣＨ２）３−ＮＨ２を意味しており、かつ
ＲおよびＲ１が水素を意味している式Ｉの化合物を生成するべく、式ＶＩの化合
物
【００５１】
【化２０】
【００５２】 ［式中、Ｘ、Ｙ、およびＲ３は式Ｉについて定義されたとおりである］が還元さ
れ；およびまたは、所望であれば、得られた式Ｉの化合物は式Ｉの別の化合物に
変えられてよく、および／または、所望であれば、得られた塩は遊離の化合物か
または別の塩に変えられてよく、および／または、所望であれば、塩形成特性を
もつ得られた遊離の式Ｉの化合物は塩に変えられてよく、および／または、式Ｉ
の得られた異性体化合物の混合物は、個々の異性体に分離されてよい。
【００５３】 次に続く工程ａ）〜ｄ）の詳細な説明においては、記号ｍ、ｎ、Ｘ、Ｘ´、Ｙ
、Ｒ、およびＲ１〜Ｒ５は、他に断らない限り式Ｉについて与えられた意味をも
つ。 工程（ａ）： アミノ基−ＮＲＲ１、−ＮＲ２Ｒ３、および任意に−ＮＲ４Ｒ ５ は、好ましくは保護基により保護される。保護基が作用する方法は、たとえば
アミノ保護基では、それらの導入およびそれらの切断はそれ自体周知であり、た
とえば、Ｊ． Ｆ．Ｗ． ＭｃＯｍｉｅ、“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ
ｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”プレナム・プレス（Ｐｒｅｎ
ｕｍ Ｐｒｅｓｓ）、ロンドンおよびニューヨーク、１９７３、およびＴ．Ｗ．
Ｇｒｅｅｎ、“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”、ウィリー（Ｗｉｌｅｙ）、ニューヨーク、１９８４に
記述されている。スペルミン、スペルミジン、その他などのポリアミンに特に適
したアミノ保護基は、Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ， Ｒｅｓ． １９ ： １０５（１
９８６）およびＺ． Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ ４１ｂ， １２２（１９８６）
に記述されている。 好ましい１価のアミノ保護基は、エステル基、たとえば低級アルキルエステル
および特にｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）か、またはフェニル低級アルキル
エステル、たとえばベンジルオキシカルボニル（カルボベンゾキシ、Ｃｂｚ）か
、またはアシルラジカル、たとえば、特にアセチル、クロロアセチル、またはト
リフルオロアセチルといったアルカノイルまたはハロゲン低級アルカノイルか、
またはスルホニルラジカル、たとえばメチルスルホニル、フェニルスルホニル、
またはトルエン−４−スルホニルである。好ましい２価のアミノ保護基は、ビス
アシルラジカル、たとえばフタル酸（フタロイル）のそれであり、窒素原子とと
もに、保護された形状のフタルイミド基となる。 アミノ酸保護基の切断は、たとえば加水分解的に、おそらくは酸性の媒質、た
とえば塩酸中で、あるいはアルカリ性の方法、たとえば水酸化ナトリウム溶液中
で、あるいはまた水素化により起ってもよい。 ｔ−ブトキシカルボニルはアミノ保護基として特に好ましく、たとえば、遊離
のアミンを、２−（ｔ−ブトキシカルボニルオキシイミノ）−２−（フェニルア
セトニトリル［ｔ−ブチル−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（−フェニエル）−Ｃ
Ｎ］またはジ−（ｔ−ブチル）−ジカルボネートと反応させることにより導入さ
れてよい。ｔ−ブトキシカルボニルの切断は、たとえば酸性の媒質中で、特にシ
ュウ酸またはシュウ酸2水和物、塩酸、またはトルエン−４−スルホン酸、また
はトルエン−４−スルホン酸１水和物と反応することにより果たされる。 同様にアミノ保護基として好ましいのはベンジルオキシカルボニルであり、遊
離アミンをクロロギ酸ベンジルエステルと反応させることにより導入されてよい
。ベンジルオキシカルボニルの切断は、好ましくは水素化、たとえば活性炭上の
パラジウムの存在中で果たされる。 アミノ保護基としてまた好ましいのはトルエン−４−スルホニルであり、遊離
アミンをトルエン−４−スルホクロリドと、任意にトリエチルアミンなどの補助
塩基を使用して反応させることにより導入されてよい。トルエン−４−スルホニ
ルの切断は、好ましくは、酸性媒質中で、たとえば、濃硫酸または、氷酢酸中の
３０％臭化水素酸、およびフェノールを用いるか、またはアルカリ性の条件下で
、たとえばＬｉＡlＨ４を用いて果たされる。 末端の最初のアミノ酸に対する保護基としてまた好ましいのはフタロイルであ
り、好ましくはＮ−エトキシカルボニルフタルイミドとの反応により導入される
。この保護基の切断は、たとえばヒドラジンとの反応により生じる。 式ＩＩおよびＩＩＩの出発化合物は周知であり、あるいは既知の化合物のため
の類似した方法において生成されてよい。式ＩＩの問題の化合物は、特に、遊離
型または保護された形状で存在しているスペルミジン、ホモスペルミジン、ノル
スペルミジン、デオキシスペルミン、またはＮ，Ｎ´−ビス（３−アミノプロピ
ル）−α，ω−アルキレンジアミン［たとえばＪ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ７
， ７１０（１９６４）参照］、およびそれらの誘導体である。 Ｘがアルキルを意味している式IIIの化合は、ラセミまたは光学活性型で存在
してよい。もしそれらが、工程（ａ）［または（ｂ）］の反応において、純粋な
鏡像異性体として使用されるなら、対応する式Ｉの光学活性化合物が得られる。
同様に、式ＶＩＩまたはＶＩＩＩ［以下の工程（ｃ）および（ｄ）参照］の化合
物と反応した場合、式ＶまたはＶＩの光学活性化合物が得られる。 工程（ａ）の反応は、溶媒の存在下に起きてよく、または溶媒なしでもよい。
【００５４】 工程（ｂ）： 工程（ｂ）は工程（ａ）と一致するが、ここでは基−ＣＨ２−
ＣＨ（−Ｘまたは−Ｘ´）−ＯＨが式IVの出発化合物へ二重に導入されるとい違
いがある。ここではまた、アミノ基−ＮＲＲ１および−ＮＲ４Ｒ５は、好ましく
は保護基により保護される。 式IVの出発物質は周知であるか、または既知の化合のための類似した方法で生
成されてよい。式IVの問題の化合物は、特に、遊離型または保護された形状で存
在している、スペルミン、デヒドロスペルミン、またはＮ，Ｎ´−ビス（３−ア
ミノプロピル）−α，ω−アルキレンジアミン、およびそれらの誘導体である。
【００５５】 工程（ｃ）： 工程（ｃ）による還元は、適当な触媒、たとえばラネーニッケ
ルの存在下に、たとえば水素を用いてもたらされてよい。さらに、還元はＬｉＡ
ｌ４ＮａＢＨ４などの、複合金属水素化物を用いて行なわれてもよい。式Ｖの化
合物の還元のための一つの好ましい系は、エタノールとアンモニア、またはエタ
ノールと水酸化ナトリウムの存在下での、Ｈ２／ラネーニッケルである。 式Ｖの出発化合物は、たとえば式VII ＮＣ−（ＣＨ２）ｍ−１−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−１−ＣＮ （ＶＩＩ） の化合物を、式ＩＩＩの化合物と反応させることにより取得されてよい。 式ＶＩＩの化合物はまた、たとえば、アンモニアを、式 Ｈａｌ−（ＣＨ２）２または３−ＣＮ（Ｈａｌ＝ハロゲン） の化合物と反応させることにより取得可能である［Ｃ．Ａ． ６３， ２６４２
ｂ（１９６３）またはＪ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． １５， ６５（１９７２）
参照］。式ＶＩＩの非対称化合物は、たとえば、Ｃ．Ａ． ６３， ２６４２ｂ
（１９６３）により、ＮＣ−（ＣＨ２）３−ＮＨ２を アクリロニトリルと反応
させることにより得られてよい。
【００５６】 工程（ｄ）： 工程（ｄ）による還元は、工程（ｃ）のそれと同じ方法で行な
われる。（ｃ）におけると同様の還元剤が使用される。 式ＶＩの出発化合物は、たとえば、式ＶＩＩ
【００５７】
【化２１】
【００５８】 の化合物を、式ＩＩＩの化合物と反応させることにより取得されてよい。 式ＶＩＩＩの化合物は、たとえば、ジアミンＨ２Ｎ−Ｙ−ＮＨＲ３をアクリロ
ニトリルと反応させることにより、引き続き取得可能である。 式Ｉの化合物は、既知の方法で式Ｉの他の化合物に変えられてよい。たとえば
、Ｒ、Ｒ１、およびＲ２とＲ３（またはＲ４とＲ５）が水素を意味している式Ｉ
の化合物は、炭素上のパラジウムの存在下に、たとえば水素を用いた還元性の条
件下に、アルデヒドまたはケトン、たとえばホルムアルデヒドと反応さることに
より、低級アルキル化されてよく、それにより、たとえば、Ｒ、Ｒ１、およびＲ ２ とＲ３（またはＲ４とＲ５）が低級アルキルを意味している式Ｉの化合物が得
られる。さらに、たとえば、ｍが３であり、Ｒ３が水素を意味し、Ｒ２が基−（
ＣＨ２）３−ＮＲ４Ｒ５であり、さらにアミノ基−ＮＲＲ１および−ＮＲ４Ｒ５ が保護基により保護されている、式Ｉの化合物は、アルキル化剤、たとえばハロ
ゲン化アルキルまたはジアルキル硫酸塩と反応させることにより、Ｒ３がアルキ
ルを意味する式Ｉの類似化合物を形成するべく反応されてよい。 塩形成特性を有しており、この方法により取得される式Ｉの遊離の化合物は、
既知の方法でそれらの塩に変えられてよい。式Ｉの遊離の化合物は塩基性の基を
含んでいるため、それらは酸を用いて処理することにより、それらの酸付加塩に
変えられてよい。 遊離した形状および塩の形状の式Ｉの化合の間には密接な関係があるため、前
文および下文において、遊離の化合物またはそれらの塩はまたそれゆえ、対応す
る塩または遊離の化合物も意味することが理解される。 該化合物は、それらの塩を含めて、それらの水和物の形状で得られてもよく、
あるいはそれらの結晶は、たとえば結晶化に用いられた溶媒を含んでもよい。 本発明により得られる異性体の混合物は、既知の方法で、たとえば、光学的に
純粋な塩形成試薬を用いて塩を形成すること、およびそのようにして得られるジ
アステレオ異性体混合物を、たとえば分別結晶により分離することにより、個々
の異性体に分離されることが可能である。 上記の反応は、大気圧下または密閉容器内において、任意に加圧下および／ま
たは不活性大気、たとえば、窒素雰囲気下において、低下されたか、正常か、ま
たは高められた温度、たとえば、約−７０℃〜１９０℃、好ましくは−２０℃〜
１５０℃の温度範囲内において、たとえば、使用された溶媒の沸点において、反
応のタイプおよび／または反応成分に依存して、好ましくは用いられた試薬に対
し不活性であり、かつそれらを溶解する溶媒または希釈剤の不在、または標準的
には存在下に、触媒、濃縮剤、または中和剤の存在又は不在下に、既知の反応に
より行なわれてよい。
【００５９】 いくつかの例においては、置換されたアミノエタノールは一つの疎水体により
結合された二つの極性頭部をもち（図３）、バイヘッド・リピド（bihead lipid
）と呼ばれる。二つの親水性頭部はどちらの側においても水溶性の溶液に面する
ことができるため、これらの化合物は、ワンヘッド（ｏｎｅ ｈｅａｄ）基をも
つ脂質により形成される二重層のかわりに、水中では単層を形成することが可能
である（図３）。 置換されたアミノエタノールのもう一つの態様においては、前文に記述された
もの以外のバイヘッド・リピドの形状が用いられることが可能であり、置換され
たアミノエタノールは、一つが正で他方が負または中性といったように、静電気
的に異なって帯電した極性頭部を有しており、正味の過剰な陽イオンによる電荷
により、核酸との錯形成においてコア複合体を形成するべく用いられることが可
能であるが、形成された該複合体は中性または陰性の表面荷電を有する。かかる
極性の異なるバイヘッド・リピドは、正の頭部を用いてＤＮＡと結合することが
でき、負または中性の頭部を外側にし、したがって好ましい負または中性の表面
荷電をもつ単層のコートを、ＤＮＡの周りに形成することが可能である。さらに
、負または中性の頭部は、ベクターの他の成分を固定させるための好ましい成分
を提供する。このことは図（Ｆｉｇｕｒｅ）３．１〜３．４に図式的に示されて
いる。 二つの頭部は、第１級アミンとイミダゾールのように実質的に異なるｐＫをも
つ、同じかまたは異なる帯電状態、または形状をもつことが可能である。異なる
帯電状態をもつバイヘッド・リピドの標品は、独特の性質をもつ。一つの正の頭
部と、負または中性の他方をもつバイヘッド・リピドは、正の頭部の核酸への結
合を可能にし、負または中性の頭部が、水溶性の溶液に面している該複合体の外
表面を形成するようにする（図３）。核酸を複合体形成の鋳型として用いれば、
正の頭部が結合して、その周囲に単層を形成し、結果として負または中性の表面
をもつ単層のリポソーム／核酸複合体を生じる。かかるバイヘッド・リピドはプ
ラスミドＤＮＡ、他の核酸、または負に帯電した物質を高度に被包することが可
能であり、負または中性の表面荷電を生じ、毒性をもたらすような有害な生物学
的相互作用を避けるようにする。 バイヘッド・リピドは、異なる性質をもつ各々の頭部基を生じるべく、他の方
法で修飾されることが可能である。たとえば、一つの頭部は立体ポリマーと、タ
ーゲティングリガンドと、フソーゲン性成分と、または遠位端における立体ポリ
マーとターゲティングリガンドといった成分の組合せと結合されることが可能で
ある。（図３）。 第３の種類のバイヘッド・リピドは、双方とも負または中性の頭部をもつ。こ
れらは、薬物動態および生体内分布の調節のための物質の周囲に、リポソームお
よびエマルジョンが用いられるのと非常によく似た有用な脂質の単層を形成する
。 適当な陽イオン成分はまた、スペルミン類似体も含む。スペルミン類似体を用
いて形成されたコア複合体は、好ましくは膜崩壊剤を含む。もう一つの態様にお
いては、スペルミン類似体を用いて形成されたコア複合体は、該コア複合体に対
し負の表面荷電を運ぶための陰イオン剤を含む。
【００６０】 本発明における使用に適したポリマーは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、お
よび都合のよいことには直線、ポリリジン、ポリアミドアミンであるＰＥＩ（Ｐ
ＡＭＡＭデンドリマーポリマーズ、米国特許第５，６６１，０２５号）、直鎖ポ
リアミドアミン（Ｈｉｌｌら、Ｌｉｎｅａｒ ｐｏｌｙ（ａｍｉｄｏａｍｉｎｅ
）ｓ： ｐｈｙｓｉｘｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔ
ｈ ＤＮＡ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｖｅｃｔ
ｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕ
ｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ｆｒｏｍ Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ １９９９ ｍｅｅｔ
ｉｎｇ）の中で、 １９９９、２７頁）、硫酸プロタミン、ポリブリン、キトサ
ン（Ｌｅｏｎｇら、Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １９９８年４
月；５３（１ − ３） ： １８３ − ９３） 、ポリメタクリレート、ポ
リアミン（米国特許第５，８８０，１６１号）およびスペルミン類似体（米国特
許第５，７８３，１７８号）、ポリメタクリレートおよびその、ポリ［２−（ジ
エチルアミノ）エチルメタクリレート］（ＰＤＥＡＭＡ）などの誘導体（Ａｓａ
ｙａｍａら、Ｐｒｏｃ． Ｉｎｔ． Ｓｙｍｐ． Ｃｏｎｔｒｏｌ． Ｒｅｌ．
Ｂｉｏａｃｔ． Ｍａｔｅｒ． ２６， ＃６２３６（１９９９）およびＣｈ
ｅｒｎｇら、Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍ ４７ （３） ：
２１５ − ２４（１９９９））およびポリ（２−（ジメチルアミノ）エチルメ
タクリレート）（ＰＥＭＡＥＭＡ）（ｖａｎ ｄｅ Ｗｅｔｅｒｉｎｇら、Ｊ
Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ５３ ： １４５ − ５３（１９９
８）） 、ポリ（オルガノ）フォスファゼン（米国特許第５，９１４，２３１号
）を含んでおり、これらはことごとく参考文献により本文に取入れられている。
該複合体に使用されてよい他のポリマーは、ポリリシン（ポリ（Ｌ）、ポリ（Ｄ
））、およびポリ（Ｄ／Ｌ））、「ＧＡＬＡ」および「ＫＡＬＡ」ペプチドとい
った両親媒性アミノ酸配列を含んでいる合成ペプチド（Ｗｙｍａｎ ＴＢ， Ｎ
ｉｃｏｌ Ｆ， Ｚｅｌｐｈａｔｉ Ｏ， Ｓｃａｒｉａ ＰＶ， Ｐｌａｎｋ
Ｃ， Ｓｚｏｋａ ＦＣ Ｊｒ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９７，
３６ ： ３００８ − ３０１７ ； Ｓｕｂｂａｒａｏ ＮＫ， Ｐａｒｅ
ｎｔｅ ＲＡ， Ｓｚｏｋａ ＦＣ Ｊｒ， Ｎａｄａｓｄｉ Ｌ， Ｐｏｎｇ
ｒａｃｚ Ｋ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８７ ２６ ： ２９６４
− ２９７２）、およびＤアミノ酸、およびペプトイドなどの化学的類似体、イ
ミダゾール含有ポリマー、および核酸と結合しかつ濃縮する完全合成ポリマーを
含めた、非天然アミノ酸を含む形状を含む。かかる性質を示すポリマーの分析は
、ＤＳＬ（動的光散乱）および電子顕微鏡などの物理学的測定を用いての、プラ
スミドＤＮＡの小粒子への凝縮の測定を含む。
【００６１】 本発明において有用なコア形成試薬用の他の試薬は、一般構造：
【００６２】
【化２２】
【００６３】 式中、Ｒ１およびＲ３は独立して炭化水素か、またはアミン、グアニジニウム
、またはイミダゾール成分で置換された炭化水素であり、Ｒ２は低級アルキル基
である］か、または一般構造：
【００６４】
【化２３】
【００６５】 式中、Ｒ１およびＲ３は独立して炭化水素か、アミン、グアニジニウム、また
はイミダゾール成分で置換された炭化水素であり、Ｒ２およびＲ４は独立して低
級アルキル基である］をもつポリマーを含む。 本発明において有用なコア形成試薬用のさらなる試薬は、カチオンおよびアニ
オン基の混合物をもつものを含み、ある例では、過剰の負の荷電をもち、形成さ
れた複合体が正味の負の荷電をもつようにする。かかる試薬の実例は、一般構造
：
【００６６】
【化２４】
【００６７】 式中、Ｒ１は炭化水素かまたは、アミン、グアニジニウム、またはイミダゾー
ル成分で置換された炭化水素であり、Ｒ２は低級アルキル基であり、Ｒ３は炭化
水素か、またはカルボキシ、ヒドロキシ、硫酸塩、またはリン酸塩成分で置換さ
れた炭化水素である］か、または構造：
【００６８】
【化２５】
【００６９】 式中、Ｒ１は炭化水素かまたは、アミン、グアニジニウム、またはイミダゾー
ル成分で置換された炭化水素であり、Ｒ２およびＲ４は独立して低級アルキル基
であり、Ｒ３は炭化水素か、またはカルボキシ、ヒドロキシ、硫酸塩、またはリ
ン酸塩成分で置換された炭化水素である］をもつ試薬である。
【００７０】 核ターゲティング成分（核標的化部分） 外来性の核酸成分の効率的な転写および結果として生じる発現に対する主な障
害は、該核酸がターゲット細胞の核へ侵入することの必要性である。都合のよい
ことに、該核酸ペイロード（有効搭載物、ｐａｙｌｏａｄ）の意図された生物活
性が核である場合には、本発明の核酸は「核をターゲットとする」ものであり、
すなわち、核膜を通した宿主細胞の核内への該核酸の侵入を促進する一つまたは
それより多い分子、核局在化シグナル「ＮＬＳ」を含む。かかる核ターゲティン
グは、核膜輸送ペプチドか、または核局在化シグナル（「ＮＬＳ」）ペプチドか
、または同様のＮＬＳ機能を提供する低分子をコア複合体内に取り入れることに
より成遂げられる。適当なペプチドは、たとえば、参考文献としてことごとく本
文に取入れられている、米国特許第５，７９５，５８７および５，６７０，３４
７号、および特許出願ＷＯ９８５８９５５に、またＡｒｏｎｓｏｈｎら、Ｊ．
Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ １： １６３（１９９７）； Ｚａｎｔａら、
Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６ ： ９１ −
９６（１９９９）；Ｃｉｏｌｉｎａら、Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｐｌａｓ
ｍｉｄ ＤＮＡ ｔｏ Ｉｍｐｏｒｔｉｎ ａｌｐｈａ ｂｙ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ
Ｓｉｇｎａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、 Ｖｅｃｔｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓ
ｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖ
ｅｒｙ （Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ｆｒｏｍ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ １９９９ ｍｅｅｔｉｎｇ ）の中で、１９９９
、２０頁；Ｓａｐｈｉｒｅら、Ｊ． Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ； ２７３ ： ２９
７６４（１９９９）に記述されている。核ターゲティングペプチドは、核局在化
シグナルペプチドか、または核膜輸送ペプチドでよく、天然アミノ酸か、または
Ｄアミノ酸およびペプトイドなどの化学的類似体を含めた非天然アミノ酸から成
ってもよい。ＮＬＳは、天然の配列かまたは逆向きの配列中にある、アミノ酸ま
たはそれらの類似体から成ってよい。もう一つの態様はステロイド受容体結合性
ＮＬＳ成分であり、細胞質から核への該受容体の輸送を活性化し、この輸送が該
受容体とともに核酸を核内へ運ぶ（Ceppi、上記）。 さらなる態様においては、ＮＬＳはコア複合体上に、核内への核酸の侵入が可
能な場所に該複合体が向けられるような方法で固定されている。 一つの態様においては、ＮＬＳ成分のベクターへの取り込みは、核酸との会合
を通しておこり、この会合は細胞質内において保持される。このことは、核酸と
の解離によるＮＬＳ機能の損失を最小限にし、高レベルの核酸が核にデリバリー
されることを保証する。さらに、一度核酸がデリバリーされたなら、核内では核
酸との会合が、該核酸の意図された生物活性を阻害することはない。 さらにもう一つの態様においては、核酸ペイロードの意図された生物活性のタ
ーゲットは細胞質か、またはリボソーム、ゴルジ体、または小胞体などの、細胞
質中のオルガネラである。この態様においては、局在化シグナルはコア複合体に
含まれるか、またはそれに固定されており、該核酸がその作用を及ぼす意図され
た場所へ、該核酸の方向を提供するようにする。
【００７１】 フソーゲン性（融合原性）成分（部分） フソーゲン性層は、ターゲット細胞の細胞膜へのベクターの融合を促進し、該
細胞内への核酸ペイロードの侵入を容易にする。前文に述べたように、フソーゲ
ン性成分は、直接コア複合体自身に取込まれてよく、あるいは該コア複合体に固
定されてもよい。一つの態様においては、フソーゲン性層は融合促進エレメント
を含む。かかるエレメントは、大きい分子または粒子の膜を貫通する動きを可能
にするか、または膜を破壊して該膜によって隔てられた水溶性の相が自由に混合
されるようにする方法で、細胞膜またはエンドソーム膜と相互作用する。適当な
フソーゲン性成分の実例は、膜界面活性剤ペプチド、たとえばインフルエンザウ
イルスのヘマグルチニン（ＨＡ）などのウイルス融合タンパク質か、またはＰＥ
およびリシンなどの毒物に由来するペプチドを含む。他の実例は、ＨＩＶのＴＡ
Ｔタンパク質およびアンテナペディアか、または数々の他の種に由来するものな
どの、細胞の転送を可能にする配列か、または、ポリ（エチルアクリル酸）（Ｌ
ａｃｋｅｙら、Ｐｒｏｃ． Ｉｎｔ． Ｓｙｍｐ． Ｃｏｎｔｒｏｌ． Ｒｅｌ
． Ｂｉｏａｃｔ． Ｍａｔｅｒ． １９９９， ２６， ＃６２４５）、Ｎ−
イソプロピルアクリルアミドメタクリル酸コポリマー（Ｍｅｙｅｒら、ＦＥＢＳ
Ｌｅｔｔ． ４２１ ： ６１（１９９９））、またはポリ（アミドアミン）
、（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら、 Ｐｒｏｃ． Ｉｎｔ． Ｓｙｍｐ． Ｃｏｎｔ
ｒｏｌ． Ｒｅｌ． Ｂｉｏａｃｔ． Ｍａｔｅｒ． １９９９， ２６， ＃
２５１）といったｐＨ感受性を示す合成ポリマー、およびターゲット細胞または
エンドソームに対する結合時に、水溶性の相へ放出される脂質物質を含む。適当
な膜界面活性ペプチドは、インフルエンザヘマグルチニン、またはモロニー白血
病ウイルス（「ＭｏＭｕＬＶ」またはＭＬＶ）エンベロープ（ｅｎｖ）タンパク
質か、または水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のＧ−タンパク質などのウイルス
のフソーゲン性ペプチドを含む。 都合のよいことに、ＭｏＭｕＬＶのｅｎｖタンパク質の膜近位の細胞質ドメイ
ンが使用されてよい。該ドメインは種々のウイルスにおいて保存されており、膜
誘導性α−ヘリックスを含む。 本発明のための適当なウイルスのフソーゲン性ペプチドは、ウイルスエンベロ
ープタンパク質のエクトドメイン由来の融合ペプチド、ウイルスエンベロープタ
ンパク質の膜近位ドメインの膜不安定位化ペプチド、いわゆるウイルス「融合」
タンパク質の疎水性ドメインペプチドセグメント、および両親媒性領域含有ペプ
チドを含む。適当な両親媒性領域含有ペプチドは、メリチン、マガイニン（ｍａ
ｇａｉｎｉｎ）、Ｈ．インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質からの
融合セグメント、ＨＩＶ１ｇｐ４１の細胞質尾部からのＨＩＶセグメントＩ、お
よびトリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）、ウマ伝染
性貧血（ＥＩＡ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、肝炎ウイルス、単純疱疹
ウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｈ、ヒトＲＳウイルス（ｈＲＳＶ）、メーゾン
ファイザーサルウイルス（ＭＰＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、パライ
ンフルエンザウイルス（ＰＩＮＦ）、脾臓壊死ウイルス（ＰＮＶ）、および水疱
性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）からのものを含めた、ウイルスｅｎｖ膜タンパク質
からの両親媒性セグメントを含む。他の適当なペプチドは、微生物および爬虫類
の細胞毒性ペプチドを含む。特異的なペプチド、または最大の有用性をもつ他の
分子は、４種類の分析法を用いて同定されることが可能である：１）細胞膜脂質
または細胞膜のフラグメントから構成されたリポソームを崩壊させ、水溶性マー
カーの漏出を誘導する能力、２）細胞膜脂質または細胞膜のフラグメントから構
成されたリポソームの融合を誘導する能力、３）組織培養における細胞に添加さ
れた粒子の細胞質放出を誘導する能力、および４）局所または全身に投与された
場合の、インビボの組織における、粒子によるプラスミド発現増強能力。 フソーゲン性成分はまた、ペプチドおよび合成ポリマーを含め、ポリマーから
構成されてもよい。一つの態様においては、ペプチドポリマーは、「ＧＡＬＡ」
および「ＫＡＬＡ」ペプチドといった両親媒性アミノ酸配列を含んでいる合成ペ
プチド（Ｗｙｍａｎ ＴＢ， Ｎｉｃｏｌ Ｆ， Ｚｅｌｐｈａｔｉ Ｏ， Ｓ
ｃａｒｉａ ＰＶ， Ｐｌａｎｋ Ｃ， Ｓｚｏｋａ ＦＣ Ｊｒ， Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９７， ３６ ： ３００８ − ３０１７ ； Ｓｕ
ｂｂａｒａｏ ＮＫ， Ｐａｒｅｎｔｅ ＲＡ， Ｓｚｏｋａ ＦＣ Ｊｒ，
Ｎａｄａｓｄｉ Ｌ， Ｐｏｎｇｒａｃｚ Ｋ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
１９８７ ２６ ： ２９６４ − ２９７２、またはＷｙｍａｎ 上記、Ｓｕ
ｂｂａｒａｏ 上記）から成る。他のペプチドは、Ｄアミノ酸および、ペプトイ
ド、イミダゾール含有ポリマーなどの化学的類似体を含めた、非天然のアミノ酸
を含む。適当なポリマーは、アミノまたはイミダゾール成分を、断続的なカルボ
ン酸の機能性部分とともに含んでいるポリマーを含み、架橋がｐＨ感受性である
場合の形状を含めて、内部または外部のいずれかに「塩橋」を形成する形状のも
のなどを含む。他のポリマーは、内部またはポリマー間にジスルフィド架橋をも
つものを含めて使用されることが可能であり、該ジスルフィド架橋がフゾジェニ
シティ（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）を阻害しており、架橋が組織内または細胞
内の区画の中で切断され、それらの所望の部位においてフソーゲン性特性が発現
されるようにすることができる。たとえば、正に帯電したフソーゲン性ポリマー
と弱い静電気的な相互作用を形成し、正の電荷を中和するポリマーは、二つの分
子間のジスルフィド架橋によりその場に固定されることが可能であり、これらの
ジスルフィドはエンドソーム内で切断され、二つの分子が解離して正の電荷とフ
ソーゲン性活性を放出するようにすることができた。このタイプのフソーゲン性
物質のもう一つの形状は、同一分子の異なるセグメント上に局在された二つの特
性をもち、該架橋は分子内にあって、その解離が分子の構造変化を生じる結果と
なる。フソーゲン性物質のこのタイプのさらにもう一つの形状は、ｐＨ感受性の
架橋をもつ。
【００７２】 他のポリマーは、アミノまたはイミダゾール成分を、断続的なカルボン酸の機
能性部分とともに含んでいるポリマーであって、架橋がｐＨ感受性である場合の
形状を含めて、内部または外部のいずれかに「塩橋」を形成する形状のものなど
が使用可能である。一つの態様においては、ポリマーは以下に示された化学構造
をもつ。
【００７３】
【化２６】
【００７４】 式中、Ｒ１は炭化水素かまたは、アミン、グアニジニウム、またはイミダゾー
ル成分で置換された炭化水素であり、Ｒ２は前文に定義されたように低級アルキ
ル基であり、Ｒ３は炭化水素か、またはカルボキシ、ヒドロキシ、硫酸塩、また
はリン酸塩成分で置換された炭化水素である。］ 一つの態様においては、ポリ
マーは、Ｒ１がアミンまたはグアニジニウムを含み、かつＲ３がカルボキシルを
含む場合には、ＸはおよそＹに等しいかまたはＹより大きく、あるいはＲ１がイ
ミダゾールを含み、Ｒ３がカルボキシルを含む場合には、ＸはＹより多い、とい
うように、過剰の正の電荷を帯びるべくデザインされている。別の態様において
は、ポリマーは過剰の負の電荷を帯びるべくデザインされており、したがって典
型的にはＹはXより多い。さらに別の態様においては、ポリマーは中性に近い正
味の電荷をもつべくデザインされており、Ｘ対Ｙの比は適宜に調節される。 もう一つの態様においては、ポリマーは以下に記述されるような化学構造をも
つ。
【００７５】
【化２７】
【００７６】 式中、Ｒ１は炭化水素かまたは、アミン、グアニジニウム、またはイミダゾー
ル成分で置換された炭化水素であり、Ｒ２およびＲ４は独立して低級アルキル基
であり、Ｒ３は炭化水素か、またはカルボキシ、ヒドロキシ、硫酸塩、またはリ
ン酸塩成分で置換された炭化水素である。］ 一つの態様においては、ポリマー
は、Ｒ１がアミンまたはグアニジニウムを含み、かつＲ３がカルボキシルを含む
場合には、ＸはおよそＹに等しいかまたはＹより大きく、あるいはＲ１がイミダ
ゾールを含み、Ｒ３がカルボキシルを含む場合には、ＸはＹより多い、というよ
うに、過剰の正の電荷を帯びるべくデザインされている。別の態様においては、
ポリマーは過剰の負の電荷を帯びるべくデザインされており、したがって典型的
にはＹはＸより多い。さらに別の態様においては、ポリマーは中性に近い正味の
電荷をもつべくデザインされており、Ｘ対Ｙの比は適宜に調節される。 フソーゲン性成分はまた、膜界面活性剤ポリマー−脂質結合体を含んでよい。
適当な結合体は、ＴｈｅｓｉｔＴＭ、Ｂｒｉｊ７８ＴＭ、Ｔｗｅｅｎ８０ＴＭ、
Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭ、Ｃ１２Ｅ８、Ｃ１４Ｅ８、Ｃ１６Ｅ８（ＣｎＥｎ＝炭化水
素（エチレングリコール）エーテル、式中Ｃは炭素長Ｎの炭化水素を表し、Ｅは
重合度Ｎのポリ（エチレングリコール）を表す）、Ｃｈｏｌ−ＰＥＧ９００、ポ
リオキシアゾリンまたはＰＥＧの代わりに置換された他の親水性ポリマーを含ん
でいる類似体、および炭化水素の代わりに置換されたフルオロカーボンをもつ類
似体を含む。都合のよいことに、ポリマーは生体分解性であるか、または充分に
分子量が小さく、代謝なしに排出されることが可能である。熟練者は、他のフソ
ーゲン性成分もまた、本発明の精神から離れることなく使用されてよいことを認
識するであろう。
【００７７】 コア複合体の集合 コア複合体は都合のよいことに、成分の混合が適当な条件下に起きた場合、自
己集合することが可能である。コア複合体の調製に適した条件は、一般に混合の
最後に電荷においてモル過剰に存在している荷電成分が、混合を通して過剰であ
ることができるようにする。たとえば、もし最終的な製剤が正味の負の荷電過剰
である場合には、カチオン物質はアニオン物質内へ、形成される複合体が決して
正味のカチオン物質の過剰をもたぬように混合される。コア複合体の調製に適し
たもう一つの条件は、スタティックミキサー内でのコア成分の混合を含む連続的
な混合を利用する。スタティックミキサーは、固定形装置に流入および通過する
二つまたはそれより多い液体の流れの中に、乱流と、好ましくは弱い剪断力の混
合とを発生し、結果として混合された液体が該装置を出ることになる。コア複合
体では、核酸が剪断に対して壊れやすい場合には、特に弱い剪断力が重要である
。具体的には、核酸とコア複合体形成成分（カチオン脂質）の水溶液が一緒にス
タティックミキサー（たとえば、アメリカン・サイエンティフィック・インスツ
ルメンツ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ
）、カリフォルニア州、リッチモンド、より入手可能）に注がれ、そこで流れは
内側と外側の螺旋状の流れに分けられ、それはいくつかの異なる点において相交
わり、乱流を生じ、それにより混合が促進される。市販のスタティックミキサー
の使用は、得られた結果が操作員に無関係であり、計量可能であり、再現性があ
り、かつ調節可能であることを保証する。そのようにして産生されたコア複合体
粒子は、均一、安定であり、かつ濾過滅菌されることが可能である。コア複合体
が核ターゲティング成分および／またはフソーゲン性成分を含むことが意図され
る場合には、これらの成分はスタティックミキサーに入っていく流れに直接添加
されてよく、コア複合体が形成されるにつれて自動的にそれに取り込まれるよう
にする。 成分の流れはミキサー内において相交わり、それによりＤＮＡとポリマーの剪
断および混合が誘導され、それによりＤＮＡとポリマーとの複合体から成る粒子
が形成される。結果として生じる製剤は、ナノメーターでの平均粒子サイズおよ
び動的光散乱による分布について、たとえばコールターＮ４プラス・サブミクロ
ン・パーティクル・サイザー（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｎ４ Ｐｌｕｓ Ｓｕｂｍｉｃ
ｒｏｎ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｅｒ）（コールター・コーポレーション、フ
ロリダ州、マイアミ） を用いて検査されてよい。平均粒子サイズおよび標準偏
差は、単峰形およびサイズ・ディストリビューション・プロセシング（ＳＤＰ）
、または「強度」法により測定されることが可能である。 上記の方法では、該粒子の製剤を通してレーザー光線が注がれる。動的光散乱
は、粒子のブラウン運動の結果として測定される。測定された動的光散乱は、次
に粒子サイズに関係づけられる。単峰形法では、サイズ分布はガウス曲線上に粒
子サイズを置くことにより測定される。ＳＤＰ法では、サイズ分布はＣＯＮＴＩ
Ｎと呼ばれるＦＯＲＴＲＡＮプログラムにより測定される。かかる方法もまた、
コールターＮ４プラス・サブミクロン・パーティクル・サイザー・レファランス
・マニュアル（１９９５年１１月）にさらに記述されている。 フソーゲン性成分が直接コア成分内に取込まれない場合には、典型的にはそれ
はコア複合体を取り巻いているか、または包んでいる殻として存在する。この状
況においては、フソーゲン性な殻は静電的にか、共有結合的にか、または疎水性
の相互作用により、あるいはかかる力の組合せにより、コア複合体に固定されて
いる。フソーゲン性成分が静電的に固定されている場合には、それは核酸か、ま
たは複合体形成物質のいずれか、または双方の帯電された基と、荷電−荷電相互
作用を通して相互作用する。多価の静電的相互作用は結合安定性を可能にするが
、ターゲット組織および細胞内における適切な放出にも適応する。一つの具体的
な形状は、カチオンペプチド配列に結合されたフソーゲン性ペプチド配列であり
、該カチオン配列は、該ペプチドがコア複合体へ、その形成の時点で取込まれる
か、またはその形成後に、負に帯電したコア複合体の表面に結合するかのいずれ
かを保証する。このタイプの成分およびその取込みの一つの実例は、実施例４６
に示されたＨ．インフルエンザＨＡタンパク質の融合ドメインからの、短い疎水
性アミノ酸配列に結合された１４個のリジン残基の線状の配列から成るペプチド
の封入である。他の実例は、ポリ［２−（ジエチルアミノ）エチルメタクリレー
ト］（ＰＤＥＡＭＡ）、またはＮ−イソプロピルアクリルアミドメタクリル酸コ
ポリマーなどのフソーゲン性セグメントポリマーと結合されたＰＥＩなどの合成
カチオンポリマーの使用を含む。 フソーゲン性な成分が疎水性相互作用により固定される場合には、それはコア
複合体と結合するセグメントまたは成分を含んでおり、その結合が水溶液との接
触を減少させ、それにより、固定された複合体のエネルギーを低下させるように
する。一つの態様においては、アンカーである疎水性相互作用は、フソーゲン性
成分の炭化水素成分と、コア複合体の炭化水素成分との間にある。疎水性固定を
利用している一つの具体的な形状は、フソーゲン性成分と結合されたジアシルリ
ピドであり、該リピド部分はカチオン脂質により形成されたコア複合体と強力に
相互作用する。もう一つの態様においては、アンカーである疎水性相互作用は、
フソーゲン性成分のフルオロカーボン成分と、コア複合体のフルオロカーボン成
分との間にある。適切な固定を可能にする他の形状の疎水性相互作用力か可能で
ある。 フソーゲン性成分がコア複合体に対し共有結合により結合されている場合には
、共有結合によるカップリングは：（１）複合体形成試薬に対し；（２）複合体
内にその形成の時点で取込まれることになる化合物に対し；（３）あらかじめ形
成された複合体の表面に対し；または（４）あらかじめ形成された複合体の表面
に結合する化合物に対して、起る。一つの態様においては、結合は好ましくは、
ターゲット組織または細胞内へのベクターの侵入に際して切断される。この切断
は、切断可能な結合を通してフソーゲン性層を固定することにより成遂げられて
よい。実例は：（１）シッフ塩基か、またはヒドラゾンまたはビニルエーテルと
いった、酸不安定性結合；（２）ジスルフィド結合などの、還元可能な結合；ま
たは（３）外側の立体層の付着に使用するための下記のリンカーの一つ、を含む
。酸不安定性リンカーは、ほとんどの機構による細胞性の取り込みに際してベク
ターが最初にそこへ輸送されることになる、ターゲットされた組織において、ま
たはエンドソーム構造などの細胞内区画において支配的な酸性の状況において切
断される。一つの態様においては、フソーゲン性層は疎水性の性質を有しており
、その中では水がほとんど排除される層を形成する。かかる層がコア複合体の上
に形成される場合には、それは複合体形成物質に加えて、付加などの多くの可能
な方法により生成されることが可能であり、該層は自己集合によるか、またはコ
ア複合体がいったん形成されてから、第２の段階における付加によって生じる。
一つの態様においては、実施例３８〜４３に例証したように、該層はコア複合体
と同時に形成される。もう一つの態様においては、該層は第２の混合の段階によ
り形成され、コア複合体は第１の混合段階において形成され、次いで該層は、次
に続く混合段階により、コア複合体と、既存の複合体上に該層を形成する試薬と
の間に添加される。 本発明の一つの態様においては、表面荷電が負であるかまたは中性であるコア
複合体が好ましい。この態様では、正に帯電したコア複合体による結合および取
込みを提供すると考えられている、カチオン複合体−アニオン細胞の静電結合機
構とは対照的に、外側の殻が、ターゲット組織および細胞の結合および取込み特
性を運んでいる。中性または負の表面荷電コア複合体の使用を可能にすることで
、多くの利益が実現されることが可能である。正の表面荷電ベクターコロイドと
の静電的相互作用の減少または排除は、非ターゲット組織および臓器における毒
性に対し、またターゲット組織および臓器における細胞毒性に対し、食作用によ
る浄化をもたらす非特異的な相互作用を減少または排除させることが可能である
。 本発明がいかなる特定の疾患または障害の治療にも限定されないことが理解さ
れるべきである。
【００７８】 治療用物質をコードしている核酸配列を含む粒子は、遺伝子治療による治療の
有効性の研究のための動物モデルの一部として、インビボにおいて動物に投与さ
れてよい。粒子は同一の種の異なる動物に対し、用量を変えて投与されてよく、
該粒子は該動物内の細胞をトランスフェクトすることができる。次に該動物は、
所望の治療用物質の発現について該動物内でインビボにおいて査定される。かか
る査定より得られるデータから、ヒトの患者に対して投与されるべき粒子の量が
決定されてよい。 もう一つの態様では、粒子はインビトロにおいて細胞をトランスフェクトする
べく用いられてもよい。今度は該細胞が、治療用物質をコードしている核酸配列
を含んでおり、治療用物質を発現するべく、および／または宿主において治療効
果を供給するべく、前文に記述されたような宿主に対し投与されてよい。トラン
スフェクトされてもよい細胞および投与の方法は、前文に記述されたものから選
ばれてよい。 本発明の粒子はまた、臓器の細胞をインビトロにおいてトランスフェクトする
べく用いられてもよい。今、治療用物質をコードしている核酸配列を含んでいる
臓器は、動物に移植されてよく、それにより、移植された臓器が該動物内におい
て該治療物質を発現し、および／または動物において治療効果を提供する。該動
物は、ヒトおよび非ヒト霊長類を含め、哺乳類であってよい。 本発明の粒子はまた、インビトロにおける細胞のトランスフェクションにも使
用されてよく、細胞の混合物を含んでいる細胞培養物に含まれる。インビトロに
おける細胞の形質導入に際し、該細胞は治療用物質またはタンパク質をインビト
ロにおいて産生する。該治療用物質またはタンパク質は、当業者に周知の手段に
より、細胞培養物から取得されてよい。 該粒子はまた、インビトロの細胞の遺伝子工学の機構を研究する目的で、イン
ビトロの細胞のトランスフェクションに用いられてもよい。
【００７９】 外殻成分（外部シェル部分） 非荷電の親水性ポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が、オリゴヌク
レオチド／カチオン脂質複合体のための立体的なバリアを提供することができる
ことは周知である（Ｍｅｙｅｒら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３ ：
１５６２１（１９９８）；Ｓｃａｒｉａ上記、Ｐｈｉｌｉｐｓ上記）。本発明
は、コア複合体に固定されるバリアを提供することにより、立体バリアの通常の
用途を改良する。バリアはまた任意に、ターゲット組織および細胞に対するベク
ターの結合を促進するターゲティング成分も含んでよく、またそれは細胞性の取
り込みに際し、ベクターが典型的には最初にそこへ輸送されることになるターゲ
ット組織においてかまたは細胞内区画において切断される付着により、任意に固
定されてよい。 コア複合体がフソーゲン性殻成分に固定されている態様においては、以下に記
述されるように、外側の立体層はコア複合体か、フソーゲン性殻か、または双方
に対して次々に固定される。フソーゲン性成分が直接コア複合体にとりこまれる
態様では、立体層はコア複合体に直接固定される。 外側の立体層は、好ましくは親水性、生体分解性のポリマーを含む。もし該ポ
リマーが生体分解性でない場合には、したがって比較的分子量の小さい（＜３０
キロダルトン）のポリマーが用いられる。該ポリマーもまた、極性および非極性
溶媒の双方において溶解性を示してよい。適当なポリマーは、この技術において
周知の（米国特許第５，６３１，０１８）、ＰＥＧ（様々な分子量の）、ポリビ
ニルピロリドン（ＰＶＰ）、およびポリビニルアルコール、ポリビニルメチルエ
ーテル、ポリヒドロキシプロピルメタクリレート、ポリヒドロキシプロピルメタ
クリルアミド、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ポリメタクリルアミド、ポ
リジメチルアクリルアミド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリメチルオキサゾ
リン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシエチルオキサゾリン、ポリヒド
ロキシプロピルオキサゾリン、またはポリアスパルタミドを含む。 他の適当なポリマーは、コロイド粒子の上に、ゼータ電位の減少（Ｗｏｏｄｌ
ｅら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．６１：９０２（１９９２））か、または他の同様な
検定法により測定される、少なくとも５ｎｍまたはそれより多い「厚さ」の立体
バリアを形成することができるものを含む。さらなる適当なポリマーは、枝分か
れをもつものを含む。一つの態様においては、グルコース成分のヒドロキシル官
能基が多数の立体ポリマーを結合するべく用いられ、その一つがコア複合体に固
定される。もう一つの態様では、リジンのアミン官能基が二つの立体ポリマーを
結合するべく用いられ、カルボキシル官能基が立体ポリマーリンカーと共に用い
られ、コア複合体上に結合する。
【００８０】 親水性のポリマー結合体としてＰＥＧが用いられる場合、ＰＥＧは好ましくは
約１，０００〜約５０，０００ダルトンの間の分子量をもつ。典型的には、ＰＥ
Ｇ鎖は約２，０００〜約２０，０００ダルトンの分子量をもつ。分子量の混合物
もまた使用されることが可能であり、大きいポリマーに最もよく見られる立体特
性、たとえば細胞相互作用の阻止を、小さいポリマーに最もよく見られるもの、
たとえば低分子タンパク質の相互作用の阻止と結びつけることについて、特別の
利点をもつことが可能である。カップリングに対し遠位の末端においてリガンド
なしに用いられる場合、ＰＥＧはその自由末端に非反応性のメトキシ基を含み、
反応性の化学基を通してリンキングセグメントヘ結合される。かかるリンキング
を調製する方法は、結合についての最近の教科書に要約されているようにこの技
術において周知である（Ｇｒｅｇ Ｔ． Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ， Ｂｉｃｏｎｊ
ｕｇａｔｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ 、アカデミック・プレス・インク、サンデ
ィエゴ、１９９６年 ）。 別のポリマーは、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリビニルピロリドン、ポリ
メタクリルアミド、ポリエチルオキサゾリン、ポリメチルオキサゾリン、ポリジ
メチルアクリルアミド、ポリビニルメチルエーテル、ポリヒドロキシプロピルメ
タクリレート、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリヒドロキシエチ
ルアクリレート、ポリヒドロキシエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピル
オキサゾリン、またはポリアスパルタミドを含むが、これに制限されない。ＰＥ
Ｇについて前文に記述されたように、カップリングに対し遠位の末端においてリ
ガンドなしに用いられる場合、これらの親水性ポリマーの各々は、好ましくはそ
の自由末端に非反応性の基か、またはヒドロキシルをもち、反応性の化学基を通
してリンキングセグメントヘ結合される。 固定は、静電性、共有結合性、または疎水性の相互作用のいずれかによるか、
またはかかる力の組合せにより供給される。外側の殻が静電的に固定される場合
には、それは核酸上か、または複合体形成物質上に局在する帯電した基と、ある
いは両者と、荷電−荷電相互作用を通して相互作用する。多価の静電相互作用の
存在は、結合の安定性を可能にするのみではなく、ターゲット組織または細胞内
での適切な放出にも適応する。外殻が疎水性相互作用により固定されている場合
には、それはコア複合体と結合するセグメントまたは成分を、その結合が水溶液
との接触を減じる方法で含んでおり、それにより固定された複合体のエネルギー
が減じられる。一つの態様においては、固定疎水性相互作用は外殻の炭化水素成
分と、コア複合体の炭化水素成との間にある。もう一つの態様では、固定疎水性
相互作用は外殻のフルオロカーボン成分と、コア複合体のフルオロカーボン成分
との間にある。適当な固定を可能にする他の形状の疎水性相互作用力が可能であ
る。一つの態様においては、かかる疎水性アンカーは、チトクロームｂ５などの
膜タンパク質からの配列（Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−
Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−
Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ）か、または膜にか
かっている配列を含んでいる、膜アンカードメインなどの、脂質二重層と結合お
よび介在するペプチド配列を含む。 外殻が共有結合によりコア複合体へ結合される場合には、複合体形成物質に対
して共有結合形のカップリングが供給されるか、または別法として該複合体内に
、その形成の時点で取込まれていく化合物に対する共有結合形のカップリングを
通してか、または別法としてあらかじめ形成された複合体の表面に対する共有結
合形のカップリングを通してか、または別法としてあらかじめ形成された複合体
の表面と結合する化合物に対する共有結合形のカップリングを通して供給される
。一つの態様においては、この結合は好ましくはターゲット組織または細胞内へ
のベクターの侵入に際して切断される。この切断は、シッフ塩基またはヒドラゾ
ン、ビニルエーテル、といった酸不安定性結合か、ジスルフィド結合などの、還
元可能な結合、または外側の立体層の付着に使用するための下記のリンカーの一
つなどの、切断可能な結合により外殻を固定することによって成就されてよい。
酸不安定性リンカーは、ほとんどの機構による細胞性の取り込みに際してベクタ
ーが最初にそこへ輸送されることになる、ターゲットされた組織において、また
はエンドソーム構造などの細胞内区画において支配的な酸性の状況において切断
される。一つの態様においては、フソーゲン性層は疎水性の性質を有しており、
その中では水がほとんど排除される層を形成する。かかる層がコア複合体の上に
形成される場合には、それは複合体形成物質に加えて、付加などの多くの可能な
方法により生成されることが可能であり、該層は自己集合によるか、またはコア
複合体がいったん形成されてから、第２の段階における付加によって生じる。 もう一つの態様においては、ポリマーはリガンドとともに用いられる。リガン
ドはターゲット組織または細胞への結合に備える分子から成り、核酸ペイロード
がその生物活性を及ぼすようにする。適当なリガンドは、タンパク質、ペプチド
、およびそれらの化学的類似体、炭水化物、および低分子を含む。一つの態様に
おいては、リガンドはコア複合体に対し、フソーゲン性成分の、または立体ポリ
マーの方法と類似した方法で付着される。もう一つの態様においては、リガンド
は、そのコア複合体へのカップリングに対して遠位の末端において、立体ポリマ
ーに付着される。リガンドの適当な付着は、安定な共有結合、切断可能な結合、
および所望の結合事象を生じることができるまでリガンドを保持する非共有形の
付着を含む。
【００８１】 ターゲティング成分（標的化部分） ターゲット組織または細胞へのベクターの結合を促進するためには、外殻層は
好都合なことに、ベクターの、ターゲット組織または細胞との高度に特異的な相
互作用を可能にする少なくとも一つのターゲティング成分を含むことができる。
さらに具体的には、一つの態様において、ベクターは、好ましくは外層に付着さ
れた、ターゲット組織または細胞の表面上の受容体分子に対するリガンド特異的
な結合に有効な、シールドされていないリガンドを含むことができる（Ｗｏｏｄ
ｌｅら、Ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｌｉｇａｎｄｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅ
ｔｉｎｇ ｌｏｎｇ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ、Ｌｏｎｇ
Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ： Ｏｌｄ ｄｒｕｇｓ，
ｎｅｗ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、ＷｏｏｄｌｅおよびＳｔｏｒｍ共編、の中
で（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， １９９８、２８７ − ２９５頁）。もう一つの態様
においては、ベクターは好ましくは外層内か、または定義された組織またはター
ゲット条件下に外層が失われる場合にはコア複合体の表面に付着された、シール
ドされたリガンドを含むことができる。ベクターは、ターゲットされる細胞のタ
イプに依存して、二つまたはそれより多いターゲティング成分を含んでもよい。
多数の（２個またはそれより多い）ターゲティング成分の使用は、細胞のターゲ
ティングにおいてさらなる選択性を提供することが可能であり、またターゲット
細胞に対するベクターの、より高い親和性および／または結合活性に貢献するこ
とができる。ベクターに一つより多いターゲティング成分が存在する場合には、
最適なターゲティング効率を提供するべく、該ターゲティング成分の相対的なモ
ル比が変えられてよい。この様式で細胞結合性および選択性を最適化するための
方法は、この技術において周知である。熟練者はまた、細胞選択性ならびに親和
性および結合の効率を測定するための検定法がこの技術において周知であり、タ
ーゲティングリガンドの性質および量を最適化するべく使用されることが可能で
あることも認識するであろう。 適当なリガンドは：内皮細胞ターゲティングのための血管内皮細胞増殖因子：
血管損傷および腫瘍ターゲティングのためのＦＧＦ２；腫瘍ターゲティングのた
めのソマトスタチンペプチド；腫瘍ターゲティングのためのトランスフェリン；
腫瘍ターゲティングのためのメラノトロピン（αＭＳＨ）ペプチド；ＬＤＬ受容
体ターゲティングのためのＡｐｏＥおよびペプチド；露出されたコラーゲンｄタ
ーゲティングのためのフォンビルブラント因子；コクサッキー−アデノウイルス
受容体（ＣＡＲ）発現細胞ターゲティングのためのアデノウイルス線維タンパク
質およびペプチド；ニューロピリン（Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ）１ターゲティング
のためのＰＤ１およびペプチド；ＥＧＦ受容体発現細胞ターゲティングのための
ＥＧＦおよびペプチド；およびインテグリン発現細胞ターゲティングのためのＲ
ＧＤペプチド、を含むがこれに制限されない。 他の実例は、（ｉ）葉酸、該組成物は細胞表面葉酸受容体をもつ腫瘍細胞の治
療が意図される、（i i）ピリドキシル、該組成物はウイルス感染されたＣＤ４
＋リンパ球の治療が意図される、または（iii）シアリル−ルイス０、該組成物
は炎症の領域の治療が意図される、を含む。他のペプチドリガンドはファージデ
ィスプレイ（Ｆ． Ｂａｒｔｏｌｉら、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉ
ｄｅ ｌｉｇａｎｄｓ ｆｏｒ ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｅｌｌ
ｓｕｒｆａｃｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、 Ｖｅｃｔｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ
Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌ
ｉｖｅｒｙ （Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ｆｒｏｍ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ １９９９ ｍｅｅｔｉｎｇ）の中で、１９９
９、４頁）および微生物ディスプレイ（Ｇｅｏｒｇｉｏｕら、Ｕｌｔｒａ−Ｈｉ
ｇｈ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ Ｌｉｂｒａｒｉｅ
ｓ Ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｏｎ ｔｈｅ Ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏ
ｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｂｙ ＦＡＣＳ、 Ｖｅｃｔｏ
ｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔ
ｉｃ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ｆｒｏｍ Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ １９９９ ｍｅｅｔ
ｉｎｇ）の中で、１９９９、３頁））などの方法を用いて同定されてよい。この
方法で同定されたリガンドは、本発明における使用に適している。 特別の態様においては、ターゲティングリガンドはソマトスタチンか、または
ソマトスタチン類似体であってよい。ソマトスタチンは配列ＡＧＣＬＮＦＦＷＫ
ＴＦＴＳＣをもち、システイン残基の間にジスルフィド架橋を含む。ソマトスタ
チン受容体に結合する多くのソマトスタチン類似体はこの技術において周知であ
り、本発明における使用に適している。たとえば、参考文献として本文にことご
とく取入れられている米国特許第５，７７６，８９４号参照のこと。本発明にお
いて有用な特別のソマトスタチン類似体は、一般式Ｆ＊ＣＹ−（ＤＷ）ＫＴＣＴ
［式中、ＤＷはＤ−トリプトファンであり、Ｆ＊はフェニルアラニ残基がＤ−ま
たはＬ−絶対配置のいずれかを有してよいことを示す］をもつ。ソマトスタチン
自身におけると同様、これらの化合物はシステイン残基間のジスルフィド結合の
ため、環状である。都合のよいことに、これらの類似体は、フェニルアラニン残
基の遊離のアミノ基において、たとえばリジン残基の鎖のようなポリカチオン成
分を用いて誘導されてよい。熟練者は、この技術において周知の他のソマトスタ
チン類似体が本発明において有利に使用されてよいことを認識するであろう。 さらに、「ＤＮＡシャフリング」などのターゲット組織および細胞に対し、強
く選択的な結合を誘発する新規なペプチド配列を創製するための方法が開発され
ており（Ｗ．Ｐ．Ｃ． Ｓｔｒｅｍｍｅｒ、Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｅｖｏｌｕｔｉ
ｏｎ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ Ｐａｔｈｗａｙｓ ｂｙ ＤＮＡ Ｓｈ
ｕｆｆｌｉｎｇ、 Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ｆｒｏｍ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ １９９９ ｍｅｅｔｉｎｇ）の中で、１
９９９、５頁）、このような新規な配列ペプチドは、本発明のための適切なリガ
ンドである。リガンドに関する他の化学的形状は本発明に適しており、多数の形
状で存在しかつ細胞により一般に用いられるリガンドである天然の炭水化物（Ｋ
ｒａｌｉｎｇら、Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈ． １５０ ： １３０７（１９９７
））、ならびに新規な化学種などであり、それらのあるものはＤ−アミノ酸およ
びペプチド模倣物であってよく、他はコンビナトリアルケミストリーなどのい薬
品化学技術を通して同定される（Ｐ．Ｄ． Ｋａｓｓｎｅｒら、Ｌｉｇａｎｄｓ
Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｖｉａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＬＩＶＥ ： Ｄｉｒｅｃｔ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｌｉｇａ
ｎｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、 Ｖｅ
ｃｔｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐ
ｅｕｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ｆｒｏｍ
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ １９９９ ｍ
ｅｅｔｉｎｇ）の中で、１９９９、８頁））。 ターゲティング層は、所望の組織および細胞特異な結合を提供し、コア複合体
の表面か、フソーゲン性層の表面か、または保護的な立体層の表面のいずれかに
おいて複合体の表面に露出されているリガンドから成る。リガンドはコロイドに
対し共有結合形で付着されており、それらの露出が組織ならびに細胞結合に適す
るようにする。固定は、複合体形成試薬に対する共有結合形のカップリングによ
るか、または別法として、該複合体内に、その形成の時点で取込まれていく化合
物に対する共有結合形のカップリングを通してか、または別法としてあらかじめ
形成された複合体の表面に対する共有結合形のカップリングを通してか、または
別法としてあらかじめ形成された複合体の表面と結合する化合物に対する共有結
合形のカップリングを通して供給される。 たとえば、ペプチドリガンドは、ポリオキサゾリンなどの立体ポリマーに対し
、共有結合形で結合されることが可能であり、それはその遠位末端において、直
鎖ＰＥＩなどのポリカチオンに対し、共有結合形で結合される。ＰＥＩは核酸ペ
イロードとともに層状のコロイド複合体を形成することが可能であり、表面上に
露出されたペプチドリガンドとともに立体ポリマーの表面殻を形成する。別法と
して、この同じペプチド結合体は、直鎖ＰＥＩなどのポリカチオンか、または水
溶液中のカチオン脂質に結合されることが可能であり、それは次いで、表面の立
体ポリマー殻上に露出されたリガンドをもつ層状のコロイド内に、核酸ペイロー
ドを濃縮するべく用いられる。 別法として、この同じペプチド結合体は、ポリカチオンまたはカチオン脂質に
より、少なくとも部分的に濃縮された核酸ペイロードの負に帯電した複合体と複
合体形成されることが可能であり、結果として表面の立体ポリマー殻上に露出さ
れたリガンドをもつ層状のコロイドを生じる。同様に、ペプチドリガンドは、そ
の遠位末端において脂質と共有結合形で結合されるポリオキサゾリンなどの立体
ポリマーに対し、共有結合により結合されることが可能であり、この結合体が上
記のように、ポリカチオンおよび／またはカチオン脂質および／または核酸ペイ
ロードを含んでいる中性または負のコロイドとともに用いられる。 外層上に存在するターゲティング分子の数は可変であり、リガンド−受容体相
互作用の結合活性、ターゲット組織および細胞表面上の受容体の相対的な存在度
、およびターゲット組織および細胞の相対的な存在度などの因子に依存する。し
かし、通常は、各々のベクターの表面上の２５〜１００個のターゲティング分子
が、細胞ターゲティングの適切な増強を提供する。 ターゲティング成分の存在は、ターゲット組織および細胞への結合について所
望の増強をもたらす。かかる結合についての適当な検定法はＥＬＩＳＡプレート
検定法、細胞培養発現検定法、または他の何らかの結合検定法でよい。結合につ
いての一つの実例は、実施例４８および図２５および２６に示されている。
【００８２】 外殻成分（外部シェル部分）の固定 前文に述べたように、外殻成分の外側の立体層は、内側のフソーゲン性層か、
またはコア複合体に、あるいは双方に固定される。この固定は静電性か、共有結
合性か、または疎水性相互作用のいずれかによるか、またはかかる力の組合せで
あってよい。外殻が静電的に固定される場合、それは核酸、または複合体形成物
質のいずれかの帯電された基か、または双方との、荷電−荷電相互作用を通して
相互作用する。多価の静電的相互作用の存在は、結合の安定性を可能にするが、
ターゲット組織および細胞における適切な放出にも適合している。外殻が疎水性
相互作用により固定される場合には、それはコア複合体と結合するセグメントま
たは成分を、その結合が水溶液との接触を減じる方法で含んでおり、それにより
固定された複合体のエネルギーが減じられる。 一つの態様においては、かかる疎水性アンカーは、チトクロームｂ５などの膜
タンパク質からの配列（Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａ
ｌａ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｍ
ｅｔ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ）か、または膜にかか
っている配列を含んでいる、膜アンカードメインなどの、脂質二重層と結合およ
び介在するペプチド配列を含む。一つの態様においては、アンカーである疎水性
相互作用は、外殻の炭化水素成分と、コア複合体の炭化水素成分との間にある。
もう一つの態様においては、アンカーである疎水性相互作用は、外殻のフルオロ
カーボン成分と、コア複合体のフルオロカーボン成分との間にある。適切な固定
を可能にする他の形状の疎水性相互作用力が可能である。 外殻がコア複合体に対し共有結合により結合されている場合には、共有結合に
よるカップリングは：（１）複合体形成試薬に対し；（２）複合体内にその形成
の時点で取込まれることになる化合物に対し；（３）あらかじめ形成された複合
体の表面に対し；または（４）あらかじめ形成された複合体の表面に結合する化
合物に対して起る。 外殻がフソーゲン性層に対し、共有結合により固定されている場合には、その
結合は安定であってよく、この態様においては、外層は細胞への侵入時にフソー
ゲン性層とともに脱捨てられることができる。安定な結合の一つの実例は、カル
バメート結合である。もう一つの態様では、ターゲット組織または細胞へのベク
ターの侵入に際し、該結合は好ましくは切断される。一つの態様においては、フ
ソーゲン性層は疎水性の性質を有しており、その中では水がほとんど排除される
層を形成する。かかる層がコア複合体の上に形成される場合には、それは複合体
形成物質に加えて、付加などの多くの可能な方法により生成されることが可能で
あり、該層は自己集合によるか、またはコア複合体がいったん形成されてから、
第２の段階における付加によって生じる。 外層がコア複合体に対し、直接固定される場合には、それは好ましくは、エン
ドソーム内で支配的な条件下に切断が可能である。この切断は、酸不安定性結合
またはジスルフィド結合などの還元可能な結合のような、切断可能な結合を通し
た外層の固定によって成就されてよい。酸不安定性リンカーは、ほとんどの機構
による細胞性の取り込みに際してベクターが典型的には最初にそこへ輸送される
、ターゲットされた組織において、またはエンドソーム構造などの細胞内区画に
おいて支配的な酸性の状況において切断される。適当な切断可能な結合はジスル
フィド結合、およびシッフ塩基またはヒドラゾン、ビニルエーテル、といった酸
不安定性結合を含む。たとえば、コア複合体は遊離のアミノ基を含んでよく、立
体層は垂下がったアルデヒド基を含んでもよい。コア複合体および立体層の成分
の混合は、コア複合体と立体層との間にシッフ塩基の形成を生じる結果となる。
別法として、たとえば、コア複合体および立体層の上に各々存在する遊離のスル
フヒドリル基の間にジスルフィド結合が形成されることが可能である。好ましい
態様においては、切断可能な結合層はpH感受性の共有結合を含む。さらに好まし
くは、該pH感受性共有結合は、
【００８３】
【化２８】
【００８４】 より成る群より選ばれる。
【００８５】 ベクターの投与法 ベクターは非経口的に、全身または局所注入経路により投与され、またエクス
ビボ（生体外）において投与されてもよい。
【００８６】 インビボおよびインビトロにおけるベクターの試験 本発明のベクターについてのインビトロの試験法は、この技術において周知で
ある。たとえば、それらは実施例３５および４４に記述されたような、培養にあ
る細胞および組織に対し、デリバリーを供給する能力について試験されるか、ま
たはそれらは実施例４０および４２に記述されたような、コロイド状および物理
化学的性質について検査されることが可能である。 本発明のベクターについてのインビボの試験法は、この技術において周知であ
る。たとえば、哺乳類における疾患の治療のためにベクターが使用される場合に
は、ベクターの有効性は該疾患の一つまたはそれより多い症候についての回復の
調査により決定される。好都合なことに、インボビボの有効性は、疾患の進行ま
たは程度の特徴を示す定義された臨床上のエンドポイントの測定を利用すること
ができる。
【００８７】 遺伝子デリバリーベクターは、もしそれがインビトロまたはインビボにおいて
核酸を細胞または組織内へ転移することができるなら、本発明の意味の範囲内に
おいて、インビトロまたはインビボにおける「フソーゲン性活性」を示している
。しかしながら、フソーゲン性活性はまた、ベクターによって転移される核酸の
測定に依存しない、この技術において周知の方法により評価されてもよい。たと
えば、Ｌａｃｋｅｙら、Ｐｒｏｃ． Ｉｎｔ． Ｓｙｍｐ． Ｃｏｎｔｒｏｌ．
Ｒｅｌ． Ｂｉｏａｃｔ． Ｍａｔｅｒ． １９９９，２６， ＃６２４５；
Ｍｅｙｅｒら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４２１ ： ６１（１９９９）およびＲ
ｉｃｈａｒｄｓｏｎら、 Ｐｒｏｃ． Ｉｎｔ． Ｓｙｍｐ． Ｃｏｎｔｒｏｌ
． Ｒｅｌ． Ｂｉｏａｃｔ． Ｍａｔｅｒ． １９９９，２６， ＃２５１に
おいて使用された方法は、本発明のベクターのフソーゲン性活性を査定するべく
使用されてよい。全般的な参考文献としては、当業者は、膜融合に関連した出版
物を熟慮するとき、Ｈ． ＨｉｌｄｅｒｓｏｎおよびＳ． Ｆｕｌｌｅｒ共編、
シリーズ編集者Ｊ． Ｒｏｂｉｎ Ｈａｒｒｉｓ、 Ｆｕｓｉｏｎ ｏｆ Ｂｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｒｏｂｌ
ｅｍｓ， Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４巻、Ｋ
ｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、ニュー
ヨーク、２０００を考えるであろう。この巻では、Ｈ． Ｋｕｂｉｓｔａ， Ｓ
． Ｓａｃｒｅ，およびＳ．Ｅ． Ｍｏｓｓ， Ａｎｎｅｘｉｎｓ ａｎｄ Ｍ
ｅｍｂｒａｎｅ Ｆｕｓｉｏｎ， ７３ − １３１頁；Ｐ． Ｃｏｌｌａｓお
よびＤ． Ｐｏｃｃｉａ， Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｆｕｓｉｏｎ Ｅｖｅｎｔｓ
ｄｕｒｉｎｇ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｅｎｖｅｌｏｐｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ， ２７
３ − ３０２頁；Ｙ． Ｇａｕｄｉｎ， Ｒｅｖｅｒｓｉｂｉｌｉｔｙ ｉｎ
Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ Ｃｈａｎｇ
ｅｓ ： Ｔｈｅ Ｉｎｔｒｉｇｕｉｎｇ Ｃａｓｅ ｏｆ Ｒｈａｂｄｏｖｉ
ｒｕｓ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｆｕｓｉｏｎ， ３７９ − ４
０８頁、に対し特に参照される。さらに、Ｐ． ＣｏｌｌａｓおよびＤ． Ｐｏ
ｃｃｉａ， Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ． １９９５年５月；１６９（１） ： １２３
− ３５およびＰ． Ｃｏｌｌａｓ およびＤ． Ｐｏｃｃｉａ， Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １９９８ ； ５３ ： ４１７ − ５２は
、フソーゲン性活性の測定を記述している。膜の融合をモニターするための共鳴
エネルギー転移の使用は、Ｐｅｃｈｅｕｒ ＥＩ， Ｍａｒｔｉｎ Ｉ， Ｒｕ
ｙｓｓｃｈａｅｒｔ ＪＭ， Ｂｉｅｎｖｅｎｕｅ Ａ， Ｈｏｅｋｓｔｒａ
Ｄ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７ ， ２３６１ − ２３７１ （１９
９８）およびＳｔｒｕｃｋ ＤＫ， Ｈｏｅｋｓｔｒａ Ｄ， Ｐａｇａｎｏ
ＲＥ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０， ４０９３ − ４０９９（１９８
１）にさらに記述されている。もし、本発明のベクターのフソーゲン性活性の査
定にＦＲＥＴ技術が使用される場合には、好ましくは測定された出力シグナルは
、非フソーゲン性な対照ベクターに比較して、少なくとも２倍まで、さらに好ま
しくは少なくとも３倍まで増大される。
【００８８】 遺伝子デリバリーベクターは、もし細胞とベクターとの接触が、結果として該
細胞または組織における転移された核酸の発現をインビトロまたはインビボで生
じれるなら、インビトロまたはインビボにおいて「生物活性」を示す。本発明の
ベクターについての、フソーゲン性なおよび／または生物学的活性の測定法は、
この技術において周知であり、下記の実施例においてさらに記述される。特に、
ベクターによりデリバリーされるマーカー遺伝子によってコードされた遺伝産物
の直接または間接的な同定に依存する方法は、本発明のベクターが生物活性を示
すか否かを評価するために適している。好ましくは、インビトロで本発明のベク
ターと接触した細胞の少なくとも５％がマーカー遺伝子を発現する。さらに好ま
しいのは、インビトロで本発明のベクターと接触した細胞の少なくとも２０％、
５０％、および８０％の発現率である。もし組織がインビトロまたはインビボに
おいて本発明のベクターで処理された場合には、前記組織の実質細胞の、好まし
くは少なくとも２０％、５０％、および８０％が該マーカー遺伝子を発現する。
検出可能な遺伝子産物をコードしているいかなる遺伝子も、適当な遺伝子マーカ
ーとしてし役立ってよい。適当な遺伝子マーカーの選択は、当業者の通常の能力
の範囲内にあると思われる。
【００８９】 本発明についての、これらのおよび他の特徴および利点は、説明の目的のみの
ために提供され、本発明の範囲を限定することを意図したものではない以下の実
施例により、さらに充分に認識されるであろう。 以下の実施例は本発明を説明する；温度は摂氏度で示される。以下の略字が使
用される： ＢＯＣ＝ｔ−ブトキシカルボニル； ＴＨＦ＝テトラヒドロフラン； ｈｅｘａｎｅ＝ｎ−ヘキサン； ｅｔｈｅｒ＝ジエチルエーテル。 命名法について：別々の窒素原子を番号づけする場合、末端アミノ基の窒素が
、末端炭素原子の置換基として扱われ、一方非末端の窒素原子はＣＨ２基のアザ
置換基として解釈され、それに応じて番号づけされる。したがって、たとえばス
ペルミンにおける４個の窒素原子は、Ｎ１、Ｎ４、Ｎ９、およびＮ１２と名づけ
られる：
【００９０】
【化２９】
【００９１】 （１，１２−ジアミノ−４，９−ジアザドデカン）
【００９２】 実施例１：Ｎ４〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−テトラデシル〕−スペルミジントリ
ヒドロクロリド 酢酸エチル５０ｍｌ中の塩化水素６ｇ（０.１６４６モル）溶液を撹拌しなが
ら室温で、酢酸エチル５０ｍｌ中のＮ１，Ｎ８−ジ−ＢＯＣ−Ｎ４−〔（２−ヒ
ドロキシ）−ｎ−テトラデシル〕−スペルミジン８.８ｇ（０.０１５８モル）溶
液に添加した。１.２５時間撹拌した後、反応混合物から沈降した結晶をろ過し
た。水中で吸湿性粗製生成物を溶解させ、ＡｍｂｅｒｌｉｔｅＸＡＤ１１８０吸
着性樹脂（水中）が投入されたカラム上でクロマトグラフィに付し、これにより
まず第１に水での溶離が発生し、その後、水とイソプロパノールの混合物（９：
１又は３：１）での溶離が起こる。該生成物を含有する画分を組合せ、水ジェッ
ト真空内で濃縮させ、高真空下で凍結乾燥させた。表題化合物を、含水率４.２
５％の凍結乾燥物として得た、Ｒｆ；０.２５の〔薄層クロマトグラフィプレー
トシリカゲル６０Ｆ２５４：溶剤：塩化メチレン／メタノール／３０％のアンモ
ニア水溶液〔１０：３.５：１）〕。
【００９３】 出発化合物は以下のように生成された： ａ） Ｎ１Ｎ８−ジ−ＢＯＣ−Ｎ４−〔(２−ヒドロキシ)−ｎ−テトラデシル− スペルミジン エタノール２００ｍｌ中のＮ１，Ｎ８−ジ−ＢＯＣ−スペルミジン１７.２７
ｇ（０.０５モル）溶液に対して１，２−酸化テトラデセン（８５％）を添加し
た。反応混合物を２時間還流下で加熱し、次にさらなる３.４４ｇ（０.０１３７
７モル）の１，２−酸化テトラデセンを添加した。還流下で１６.５時間加熱し
た後、蒸発により反応混合物を濃縮した。粒度０.０４〜０.０６３mmのシリカゲ
ル上のフラッシュクロマトグラフィにより油性粗製生成物の精製を実施した。塩
化メチレン／メタノール混合物（１９：１）で溶離した生成物含有画分を組合せ
、真空下端部での蒸発によって濃縮した。油の形で表題化合物を得た、Ｒｆ：０
.８０。〔溶剤：塩化メチレン／メタノール／３０％のアンモニア水溶液（４０
：１０：１）〕。
【００９４】 ｂ） Ｎ１，Ｎ８−ジ−ＢＯＣ−スペルミジン ＴＨＦ６３０ｍｌ中のスペルミジン６５,３４ｇ（０.４５モル）溶液に対して
２時間にわたり窒素雰囲気下で撹拌しながら０〜５°で滴下により、ＴＨＦ６３
０ｍｌ中の２−（ＢOC−オキシイミノ）−２−フェニルアセトニトリル２２１.
６７ｇ（０.９０モル）の溶液を添加した。反応混合物を室温で１６時間撹拌し
、次に、真空下で蒸発により濃縮し、エーテルと希塩酸（ｐＨ３）の間で油性残
留物を分割した。３０％の水酸化ナトリウム溶液（ｐＨ１０）を用いて、塩酸含
有相を塩基性にし、エーテルを用いて所望の生成物を抽出し、エーテル抽出物を
飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ真空下
での蒸発により濃縮した。エーテル−ヘキサンから残留物を再結晶化させた後、
表題化合物（融点８５〜８６°）を得た。母液を濃縮させることによって、表題
化合物の第２のバッチ（融点７８〜８２°）を得た。
【００９５】 実施例２：Ｎ４−〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−テトラデシル〕−スペルミジント
リオキサレート 水９０ｍｌ中のシュウ酸二水和物１０.１７ｇ（０.０８０６７モル）溶液を、
エタノール３０ｍｌ中のＮ１−Ｎ８−ジ−Ｂｏｃ−Ｎ４−〔（２−ヒドロキシ）
−ｎ−テトラデシル〕〕−スペルミジン１５ｇ（０.０２６８９モル）溶液（実
施例１ａ）に対し、撹拌しながら添加した。反応混合物を９０°で５時間撹拌し
、その後真空下で濃縮した。０°まで冷却した後、エタノールと混合させておい
た濃縮物から結晶形態で表題化合物が沈降した。融点１８０°（分解）。
【００９６】 実施例３：Ｎ５−〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−デシル〕−ホモスペルミジントリ
ヒドロクロリド． 酢酸エチル１０ｍｌ中Ｎ１，Ｎ９−ジ−ＢＯＣ−Ｎ５−〔（２−ヒドロキシ）
−ｎ−デシル〕−ホモスペルミジンの２.８９ｇ（０.００５６モル）溶液に対し
室温で撹拌しながら酢酸エチル１０ｍｌ中の１.２７ｇ（０.０３５モル）の塩化
水素を添加した。室温で２０分、０℃で２０分、撹拌を実施した。沈降生成物を
ろ過し、低温酢酸エチルで洗浄し、水中で溶解させ、Amberlite ＸＡＤ１１８０
吸着性樹脂が投入されたカラム上で水を用いてクロマトグラフィに付した。組合
わされた生成物含有画分の凍結乾燥後、４.５％の含水率で表題化合物を得た、
Ｒｆ：０.２８（溶剤は実施例１と同じ）。
【００９７】 出発化合物は、以下のように生成された：
【００９８】 ａ） Ｎ１，Ｎ９−ジ−ＢＯＣ−Ｎ５−〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−デシル〕− ホモスペルミジン エタノール５０ｍｌ中のＮ１−Ｎ９−ジ−ＢＯＣ−ホモスペルミジン５.０３
ｇ（０.０１４モル）溶液に対して２.６３ｇ（０.０１６８モル）の１，２−デ
セン酸化物を添加した。反応混合物を２２時間還流下で沸とうさせ、次に１，２
−デセン酸化物をさらに０.５２ｇ（０.００３３３モル）添加し、還流下で１８
時間加熱をし続け、その後真空下での蒸発により油性粗製生成物の精製を実施し
た。塩化メチレン及び、メタノール含有率が１％又は２.５％又は５％又は１０
％の塩化メチレン／メタノール混合物を用いて溶離を実施した。表題化合物は、
油の形で（Ｒｆ：０.３９）得られた。（（９：１）〕。
【００９９】 ｂ） Ｎ１，Ｎ９−ジ−ＢＯＣ−ホモスペルミジン 活性炭上のパラジウム１７ｇ（１０％Ｐｄ）を、メタノール１２００ｍｌと濃
塩酸３１.９ｍｌの混合物中の１６７.７ｇ（０.３７３モル）のＮ５−ベンジル
−Ｎ１，Ｎ９−ジ−ＢＯＣ−ホモスペルミジン（Bergerone et al., Synthesis
１９８２：６８９）溶液に対して添加し、水素取込みが終わるまで３０°で水素
添加を行なった。ろ過し乾燥するまでろ液を蒸発させた後、水２リットル中に結
晶質残留物（表題化合物の塩酸塩）を溶解させ、４Ｎの塩酸を添加することによ
って水溶液（ｐＨ４）をｐＨ３に調整した。生成物をエーテルで洗浄し、３％の
水酸化ナトリウム溶液を添加することによって水相のｐＨを１０に調整し、油加
生成物を各５００ｍｌずつの３つのエーテル分量で抽出した。組合されたエーテ
ル相を濃塩酸ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空下
で蒸発させた後、漸進的に結晶化する油の形（融点４２−４６°）で表題化合物
を得た。
【０１００】 実施例４：Ｎ５−〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−デシル〕−ホモスペルミジン−ト
リオキサレート 水３０ｍｌ中のシュウ酸二水和物４.５４ｇ（０.０３６モル）の溶液を、エタ
ノール３０ｍｌ中のＮ１，Ｎ９−ジ−ＢＯＣ−Ｎ５−〔（２−ヒドロキシ）−ｎ
−デシル〕−ホモスペルミジン６.１９ｇ（０.０１２モル）の溶液（実施例３ａ
）に対し撹拌しながら添加した。２３時間で還流下で反応混合物を加熱し、次に
真空下で蒸発により濃縮させた。粗製生成物の精製は、Amberlite XAD １１８０
吸着性樹脂上で実施例１に対し類似の要領で行なわれる〔溶離剤：Ｈ２Ｏ及びＨ ２ Ｏ／イソプロパノール（１９：１又は４：１）〕。凍結乾燥の後、表題化合物
を３.８％の含水量で得た、Ｒｆ：０.２８（溶剤は実施例１と同じ）。
【０１０１】 実施例５：Ｎ５−〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−ヘキサデシル〕−ホモスペルミジ
ン−トリ−（トルエン−４−スルホネート） ２１.４８ｇ（０.０３５８モル）のＮ１，Ｎ９−ジ−ＢＯＣ−Ｎ５−〔（２ヒ
ドロキシ）−ｎ−ヘキサデシル〕−ホモスペルミジンと２０.４３ｇ（０.１０７
４モル）のトルエン−４−スルホン酸−水和物の水１２０ｍｌ中の混合物を撹拌
しながら７０°で１１.５時間加熱し、その後、約３０ｍｌの体積まで濃縮した
。濃縮物の精製をAmberlite XAD １１８０吸着性樹脂上で実施例１と類似した形
で実施した〔溶離剤：Ｈ２ＯおよびＨ２O／イソプロパノール（４：１又は３：
２）〕。含水率２.８％の凍結乾燥物として表題化合物を得た、Ｒｆ：０.３２。
【０１０２】 出発化合物は、以下のように生成された：
【０１０３】 ａ） Ｎ１，Ｎ９−ジ−ＢＯＣ−Ｎ５−〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−ヘキサデシ ル〕−ホモスペルミジン エタノール１５０ｍｌ中のＮ１−Ｎ９−ジ−ＢＯＣ−ホモスペルミジン１３.
４８ｇ（０.０３７５モル）の溶液（実施例３ｂ）に対して１５.９１ｇ（０.０
５６２モル）の１，２−ヘキサデセン酸化物（８５％）を添加し、２０時間還流
下で反応混合物を沸とうさせ、次に真空下での蒸発により濃縮した。油性粗製生
成物の精製は、シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィにより行ない、ここ
で使用された溶離剤は酢酸エチル／ヘキサン混合物（１：３又は１：２又は１：
１）及び酢酸エチルであった。油の形で表題化合物を得た、Ｒｆ：０.４５（溶
剤は実施例３ａと同じ）。
【０１０４】 実施例６：Ｎ５−〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−ヘキシル〕−ホモスペルミジン−
トリオキサレート 水４０ｍｌ中のシュウ酸二水和物４.６ｇ（０.０３６５モル）溶液を、エタノ
ール２０ｍｌ中のＮ１，Ｎ９−ジ−ＢＯＣ−Ｎ５−〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−
ヘキシル〕−ホモスペルミジン５.６ｇ（０.０１２１８モル）の溶液に対して添
加し、４，５時間還流下で反応混合物を加熱し、次に真空下での蒸発により濃縮
した。得られた粗製生成物をメタノール中で溶解し、エーテルの滴下による添加
によって沈降させた。ろ過を実施し、表題化合物をエタノール／水から再結晶さ
せた。融点８５−９０°。
【０１０５】 出発化合物は、以下のように生成された。 ａ） Ｎ１，Ｎ９−ジ−ＢＯＣ−Ｎ５−〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−ヘキシル〕 −ホモスペルミジン エタノール４０ｍｌ中のＮ１−Ｎ９−ジ−ＢＯＣ−ホモスペルミジン４.３１ｇ
（０.０１２モル）の溶液（実施例３ｂ）に対して１.８０ｇ（０.０１８モル）
の１，２−ヘキセン酸化物を添加し、２２時間還流下で反応混合物を沸とうさせ
、次に真空下で蒸発により濃縮した。油性残留物を、塩化メチレン／メタノール
混合物（９９：１又は１９：１又は９：１）を用いてシリカゲル上のフラッシュ
クロマトグラフィによって精製した。油の形で表題化合物を得た、Ｒｆ：０.３
２（溶剤は実施例３ａと同じ）。
【０１０６】 実施例７：Ｎ５−〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−ブチル〕−ホモスペルミジン−ト
リ−（トルエン−４−スルホネート） 水３０ｍｌ中のＮ１，Ｎ９−ジ−ＢＯＣ−Ｎ５−〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−
ブチル〕−ホモスペルミジン６.３９ｇ（０.０１４８モル）及びトルエン−４−
スルホン酸−水和物８.４５ｇ（０.０４４４モル）の混合物を、撹拌しながら３
.５時間７５°で加熱し、次に冷却後、１Ｎの水酸化ナトリウム溶液でｐＨ６ま
で調整し、真空下で濃縮した。Amberlite XAD １１８０吸着性樹脂上で実施例１
と類似の要領で濃縮物の精製を実施した（溶離剤：水及び水／イソプロパノール
（９：１））。１.４％の含水率で凍結乾燥物として表題化合物を得た、Ｒｆ：
０.１４（溶剤は実施例１と同じ）。
【０１０７】 出発化合物は以下のように生成された：
【０１０８】 ａ） Ｎ１，Ｎ９−ジ−ＢＯＣ−Ｎ５−〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−ブチル〕− ホモスペルミジン エタノール５０ｍｌ中のＮ１，Ｎ９−ジ−ＢＯＣ−ホモスペルミジン５.３９
ｇ（０.０１５モル）の溶液（実施例３ｂ）に対し、１.５１ｇ（０.０２１モル
）の１，２−ブテン酸化物を添加した。５時間８０°で反応混合物を加熱し、次
にさらに０.３６ｇ（０.００５モル）の１，２−ブテン酸化物を添加し、８０°
で１５時間加熱を続け、真空下での蒸発により混合物を濃縮した。粗製生成物の
精製を、塩化メチレン／メタノール混合物（５０：１又は２０：１又は１０：１
）を用いてシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィにより実施した。油の形
で表題化合物を得た、Ｒｆ：０.２０（溶剤は実施例３ａと同じ）。
【０１０９】 実施例８：Ｎ５−〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−オクチル〕−ホモスペルミジント
リオキサレート エタノール１２ｍｌ中のＮ１，Ｎ９−ジ−ＢＯＣ−Ｎ５−〔（２−ヒドロキシ
）−ｎ−オクチル〕−ホモスペルミジン４.７ｇ（０.００９６３モル）の溶液に
対し撹拌しながら水３６ｍｌ中のシュウ酸二水和物３.６４ｇ（０.０２８９モル
）の溶液を追加し、反応混合物を４.５時間９０°で加熱し、その後真空下での
蒸発によって濃縮した。エタノールからの再結晶化の後、表題化合物を２.２％
の含水率、融点８３〜８５°で得た。
【０１１０】 出発化合物は以下の通りに生成された。 ａ） Ｎ１，Ｎ９−ジ−ＢＯＣ−Ｎ５−〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−オクチル〕 −ホモスペルミジン エタノール５０ｍｌ中のＮ１，Ｎ９−ジ−ＢＯＣ−ホモスペルミジン５.３９
ｇ（０.０１５モル）の溶液（実施例３ｂ）に対し、２.３１ｇ（０.０１８モル
）の１，２−オクテン酸化物を添加した。反応混合物を１５時間８０°で加熱し
、次にさらに０.３９ｇ（０.００３０４モル）の１，２−オクテン酸化物を添加
し、８時間８０°で加熱を続行し、混合物を真空下の蒸発により濃縮した。粗製
生成物の精製を実施例７ａと類似の要領で実施した。油の形で表題化合物を得た
、Ｒｆ：０.３５（溶剤は実施例３ａと同じ）。
【０１１１】 実施例９：Ｎ５−〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−ヘキサデシル−Ｎ１，Ｎ１，Ｎ９ ，Ｎ９−テトラメチル−ホモスペルミジン−トリ−（トルエン−４−スルホネー
ト） 水２０ｍｌ中のＮ５−〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−ヘキサデシル〕−ホモスペ
ルミジン−トリ−（トルエン−４−スルホネート）２.８３ｇ（０.００３モル）
の溶液（実施例５）に対して、活性炭上のパラジウム０.０７５ｇ（１０％Ｐｄ
）と水中のホルムアルデヒド３５％溶液１１.８ｍｌ（０.１５モル）を添加した
。水素取込みが終わるまで、室温で水素添加を行なった。ろ過を実施し、ろ液を
真空下での蒸発により濃縮し、残留物を２Ｎの水酸化ナトリウム溶液と酢酸エチ
ルの間で分割した。濃縮塩化ナトリウム水溶液を用いて洗浄し硫酸ナトリウム上
で乾燥させた有機相を、蒸発により濃縮し、残留物をメタノール内で溶解し、２
Ｎの塩酸を加えることでメタノール溶液のｐＨ値を３までを調整した。真空下で
の蒸発及びメタノール／エーテルからの残留物の再結晶化の後、表題化合物を得
た。融点２３６〜２３９°。
【０１１２】 実施例１０：Ｎ４−〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−デシル〕−Ｎ１，Ｎ１，Ｎ８，
Ｎ８−テトラメチル−スペルミジン−トリオキサレート 水中３５％のホルムアルデヒド溶液１１.８ｍｌ（０.１５モル）と１.６ｇ（
０.００２７４５モル）のＮ４−〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−デシル〕−スペル
ミジントリオキサレート（実施例２７）を実施例９と類似の形で反応させた。蒸
発による濃縮の後、残留物をアセトニトリルから結晶化させた。メタノール／ア
セトニトリルからの再結晶化の後、１.６９％の含水率、融点１１８−１２１°
で表題化合物を得た。
【０１１３】 実施例１１： Ｎ１，Ｎ４−ビス−（３−アミノプロピル）−Ｎ１，Ｎ４−ビス
〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−ヘキサデシル〕−１，４−ジアミノ−トランス−２
−ブテン−トリオキサレート ２.７ｇ（０.００３０６モル）のＮ１，Ｎ４−ビス〔３−ＢＯＣ−アミノプロ
ピル〕−Ｎ１，Ｎ４−ビス〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−ヘキサデシル〕−１，４
−ジアミノ−トランス−２−ブテン、１.１６ｇ〔０.００９２モル〕のシュウ酸
二水和物及び３０ｍｌの水の混合物を実施例１３と類似の要領で反応させた（反
応時間：１８時間）。水／アセトニトリルから２度目に再結晶化された表題化合
物は２.３％の水を含有し、融点６５°（分解）であった。
【０１１４】 出発化合物は以下の通りに生成された。
【０１１５】 ａ） Ｎ１，Ｎ４−ビス−〔３−ＢＯＣアミノプロピル〕−Ｎ１，Ｎ４−ビス〔 （２−ヒドロキシ）−ｎ−ヘキサデシル〕−１，４−ジアミノ−トランス−２− ブテン ２ｇ（０.００５モル）のＮ１，Ｎ４−ビス〔３−ＢＯＣ−アミノプロピル〕
−１，４−ジアミノ−トランス−２−ブテン、３.４５ｇ（０.０１２５モル）の
１，２−ヘキサデセン酸化物（８５％）及び４０ｍｌのエタノールの混合物を２
４時間還流下で沸とうさせその後真空下で蒸発により濃縮させた。塩化メチレン
／メタノール混合物（１００：１又は２５：１）を用いてシリカゲル上のフラッ
シュクロマトグラフィにより残留物を精製した後、油の形で表題化合物を得、こ
れは短時間の後に結晶形態へと固化した、融点８５〜８７°。
【０１１６】 ｂ） Ｎ１，Ｎ４−ビス（３−ＢＯＣ−アミノプロピル）−Ｎ１−ＢＯＣ−１， ４−ジアミノ−トランス−２−ブテン及びＮ１，Ｎ４−ビス〔３−ＢＯＣ−アミ ノプロピル〕−１，４−ジアミノ−トランス−２−ブテン ＴＨＦ１５０ｍｌ中の２−（ＢＯＣ−オキシイミノ）−２−フェニルアセトニ
トリル４６.１８ｇ（０.１８７５モル）の溶液を、撹拌しながら３時間にわたり
、又窒素雰囲気内で、ＴＨＦ１００ｍｌ中のＮ１，Ｎ４−ビス（３−アミノプロ
ピル）−１，４−ジアミノ−トランス−２−ブテン１５.０２ｇ（０.０７５モル
）の０〜５°まで冷却された溶液に対し滴下により添加した。反応混合物をさら
に３.５日間室温で撹拌し、次に真空下で蒸発により濃縮させ、塩化メチレン／
エタノール混合物（３９：１又は９：１）及び塩化メチレン／メタノール／３０
％アンモニア水溶液の混合物（９０：１０：０.２５又は１０：５：１）を用い
て、シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィによって残留物を分離した。か
くして油の形で第１の表題化合物（Ｒｆ：０.８７）、Ｎ１，Ｎ４−ビス〔３−
ＢＯＣ−アミノプロピル〕−Ｎ１−ＢＯＣ−１，４−ジアミノ−トランス−２−
ブテンを得（溶剤は実施例１ａと同じ）、同様に油の形で第２の表題化合物（Ｒ ｆ ：０.２６）Ｎ１，Ｎ４−ビス〔３−ＢＯＣ−アミノプロピル〕−１，４−ジ
アミノ−トランス−２−ブテンも得た（溶剤は実施例１ａと同じ）。
【０１１７】 実施例１２： Ｎ１，Ｎ４−ビス（３−アミノプロピル）−Ｎ１−〔（２−ヒド
ロキシ）−ｎ−ヘキサデシル〕−１，４−ジアミノ−トランス−２−ブテン−ト
リオキサレート 表題化合物を、実施例１１と類似の要領で、１.５８ｇ（０.００２１３モル）
のＮ１，Ｎ４−ビス〔３−ＢＯＣ−アミノプロピル〕−Ｎ１−ＢＯＣ−Ｎ４−〔
（２−ヒドロキシ）−ｎ−ヘキサデシル〕−１，４−ジアミノ−トランス−２−
ブテン、１.０７５ｇ（０.００８５３モル）のシュウ酸２水和物及び２０ｍｌの
水から得た。融点１８５°（分解）。
【０１１８】 出発化合物は以下の通りに生成された。 ａ） Ｎ１，Ｎ４−ビス−〔３′−ＢＯＣ−アミノプロピル〕−Ｎ１−ＢＯＣ− Ｎ４−〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−ヘキサデシル〕−１，４−ジアミノ−トラン ス−２−ブテン 表題化合物を、実施例１１ａと類似の要領で、２.５ｇ（０.００５モル）のＮ １ ，Ｎ４−ビス〔３−ＢＯＣ−アミノプロピル〕−Ｎ１−ＢＯＣ−１，４−ジア
ミノ−トランス−２−ブテン及び１.７７ｇ（０.００６２６モル）の１，２ヘキ
サデセン酸化物（８５％）から、油の形で得た、Ｒｆ：０.５９（溶剤は実施例
３ａと同じ）。
【０１１９】 実施例１３：Ｎ４−〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−ヘキサデシル〕−Ｎ９−オクチ
ル−スペルミントリオキサレート １６時間還流下で、１.０８ｇ（０.００１４３モル）のＮ１，Ｎ１２−ジ−Ｂ
ＯＣ−Ｎ４−〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−ヘキサデシル〕−Ｎ９−ｎ−オクチル
−スペルミン、０.７２１ｇ（０.００５７７モル）のシュウ酸二水和物及び２０
ｍｌの水の混合物を加熱し、その後アセトニトリルと混合した（わずかな濁り度
が発生するまで）。冷却時点で沈降した生成物をろ過し、アセトニトリルで洗浄
し、高い真空下で１００°で乾燥させた。得られた表題化合物は１.６％の水を
含有していた。融点１７０〜１８０°（分解）。
【０１２０】 出発化合物は以下の通りに生成された。 ａ） Ｎ１−Ｎ１２−ジ−ＢＯＣ−Ｎ４−〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−ヘキサデ シル〕−Ｎ９−ｎ−オクチル−スペルミン 還流下で１６時間、１.３ｇ（０.００２０２モル）のＮ，Ｎ１２−ジ−ＢＯＣ
−Ｎ４−〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−ヘキサデシル〕スペルミン、０.４４４ｇ
（０.００２３モル）の１−ブロムオクタン、１.１ｇ（０.００７９６モル）の
炭酸カリウム及び２０ｍｌのアセトニトリルの混合物を加熱した。反応混合物に
対して、さらに０.０８９ｇ（０.０００４６モル）の１−ブロムオクタンを添加
し、さらに６時間還流下で加熱を続行した。さらに０.０８９ｇ（０.０００４６
モル）の１−ブロムオクタンを添加し、１４時間還流下で加熱した後、反応混合
物を真空下の蒸発により濃縮した。塩化メチレン／メタノール混合物（５０：１
又は９：１）及び塩化メチレン／メタノール／３０％アンモニア混合物（９０：
１０：０.２５）を用いてシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィにより残
留物の精製を実施した。油の形で表題化合物を得た、Ｒｆ：０.２６〔溶剤：ト
ルエン／イソプロパノール／３０％のアンモニア水溶液（７０：２９：１）〕。
【０１２１】 ｂ） Ｎ１，Ｎ１２−ジ−ＢＯＣ−Ｎ４−〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−ヘキサデ シル〕−スペルミン−及びＮ１，Ｎ１２−ジ−ＢＯＣ−Ｎ４，Ｎ９−ビス−〔（ ２−ヒドロキシ）−ｎ−ヘキサデシル〕−スペルミン エタノール４０ｍｌ中のＮ１，Ｎ１２−ジ−ＢＯＣ−スペルミン３.９８ｇ（
０.００９８９モル）の溶液に対し３.２１ｇ（０.０１１３６モル）の１，２−
ヘキサデセン酸化物（８５％）を添加し、反応混合物を還流下で２０時間沸とう
させ、次に真空下での蒸発により濃縮した。塩化メチレン／メタノール混合物（
１００：１又は９：１）を用いたシリカゲル上での粗製混合物のクロマトグラフ
ィ時点で、まず最初にＮ１，Ｎ１２−ジ−ＢＯＣ−Ｎ４，Ｎ９−ビス〔（２−ヒ
ドロキシ）ｎ−ヘキサデシル〕−スペルミンが溶離し（Ｒｆ；０.３１）（溶剤
は実施例３ａと同じ）、次に塩化メチレン／メタノール／３０％アンモニア混合
物（９０：１０：０.２５又は４０：１０：０.５）を用いて、Ｎ１，Ｎ１２−ジ
−ＢＯＣ−Ｎ４−〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−ヘキサデシル〕−スペルミンが溶
離する、Ｒｆ：０.０７（溶剤は実施例１３ａと同じ）。
【０１２２】 ｃ） Ｎ１，Ｎ９，Ｎ１２−トリ−ＢＯＣ−スペルミン及びＮ１，Ｎ１２−ジ− ＢＯＣ−スペルミン ５０ｇ（０.２４７１モル）のスペルミンを撹拌しながら窒素雰囲気下で３０
０ｍｌのＴＨＦ中で溶解させ、次に０〜５°で、ＴＨＦ５００ｍｌ中の２−（Ｂ
ＯＣ−オキシイミノ）−２−フェニルアセトニトリル１３４ｇ（０.５４４モル
）の溶液を、１時間にわたり滴下により添加した。室温でさらに１６時間反応混
合物を撹拌し、次に真空下で蒸気により濃縮した。塩化メチレン／メタノール混
合物（９７.５：２.５又は９：１）及び塩化メチレン／メタノール／３０％アン
モニア水溶液の混合物（９０：１０：０.５又は２０：１０：１）を用いてシリ
カゲル上のフラッシュクロマトグラフィにより反応混合物を分離した時点で、以
下のものが得られた：油性Ｎ１，Ｎ９，Ｎ１２−トリ−ＢＯＣ−スペルミン〔J.
Org. Chem. ５０，５７３５（１９８５）、Ｒｆ：０.７８（溶剤は実施例１ａ
と同じ）、わずかに不純なＮ１，Ｎ１２−ジ−ＢＯＣ−スペルミン，融点８６−
８８°及び純粋なＮ１，Ｎ１２−ジ−ＢＯＣ−スペルミン、融点９１−９２°。
【０１２３】 ｄ） Ｎ１，Ｎ１２−ジ−ＢＯＣ−スペルミンは以下の要領でも生成可能である
：すなわち、メタノール２００ｍｌ中にＮ１，Ｎ４，Ｎ９，Ｎ１２−テトラキス
（ベンジルオキシカルボニル）−Ｎ１，Ｎ１２−ジ−ＢＯＣ−スペルミン１８.
４ｇ（０.０１９６モル）を溶解させた。活性炭上のパラジウム１.８ｇ（１０％
Ｐｄ）を添加した後、水素取込みが終わるまで水素添加を実施した。溶液をろ過
し、真空下で蒸発によりろ液を濃縮した。漸進的に結晶形態に変化した油性の表
題化合物（Ｒｆ：０.０９）（溶剤は実施例１ａと同じ）は、実施例１３Ｃに従
って得られたＮ１，Ｎ１２−ジ−ＢＯＣ−スペルミンと同一であった。
【０１２４】 ｅ） Ｎ１，Ｎ４，Ｎ１２−テトラキス（ベンジルオキシカルボニル）−Ｎ１， Ｎ１２−ジ−ＢＯＣ−スペルミン ０.５７ｇ（０.００４６６モル）の４−ジメチルアミノピリジン及びアセトニ
トリル２５ｍｌ中のジ−（第３ブチル）−ジカーボネート１１.２４ｇ（０.０５
１５モル）溶液を、アセトニトリル４０ｍｌ中のＮ１、Ｎ４，Ｎ９，Ｎ１２−テ
トラキス（ベンジルオキシカルボニル）−スペルミジン１７.３ｇ（０.０２３４
モル）溶液に対し、撹拌しながら添加した。反応混合物を１８時間室温で撹拌し
、その後蒸発により濃縮し、ヘキサン／酢酸エチル混合物（４：１又は３：１又
は２：１又は１：１）を用いてシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィによ
り残留物を精製した。油の形で表題化合物を得た。Ｒｆ：０.３８〔溶剤：酢酸
エチル／ヘキサン（１：１）〕。
【０１２５】 ｆ） Ｎ１，Ｎ４，Ｎ９，Ｎ１２−テトラキス（ベンジルオキシカルボニル）− スペルミン 水２００ｍｌ中の炭酸ナトリウム３９.７５ｇ（０.３７５モル）とスペルミン
１０.１２ｇ（０.０５モル）の充分撹拌した溶液に対し、１時間にわたり室温で
８２.８２ｍｌ（０.２５モル）のクロロ蟻酸ベンジルエステム（トルエン中５０
％）を滴下にて添加した。反応混合物を４時間撹拌し、ろ過し、有機相を分離し
た。この相を水及び濃縮塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾
燥させ、真空下での蒸発により濃縮した。酢酸エチル／ヘキサン混合物（１：３
又は１：２又は１：１）を用いてシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィに
よって残留物の精製を実施した。油の形で表題化合物を得た、Ｒｆ：０.３７〔
溶剤：酢酸エチル／ヘキサン２：１）〕。
【０１２６】 実施例１４：Ｎ５−（２−ヒドロキシエチル）−ホモスペルミジントリオキサレ
ート ２.６ｇ（０.００６４４モル）のＮ１，Ｎ９−ジ−ＢＯＣ−Ｎ５−（２−ヒド
ロキシエチル）−ホモスペルミジン及び２.４３５ｇ（０.０１９３モル）のシュ
ウ酸二水和物から、実施例８と類似の要領で表題化合物を得た。融点１２７−１
３０°。
【０１２７】 出発化合物は以下の通りに生成された。 ａ） Ｎ１−Ｎ９−ジ−ＢＯＣ−Ｎ５−（２−ヒドロキシエチル）−ホモスペル ミジン ３.２ｇ（０.０７２６モル）のエチレン酸化物を、約２０分にわたりメタノー
ル２５ｍｌ中のＮ１，Ｎ９−ジ−ＢＯＣ−ホモスペルミジン７.１９ｇ（０.０２
モル）の５°まで冷却された溶液中に通した。反応混合物を室温で２１時間撹拌
し、その後真空下での蒸発により濃縮させた。残留物の精製は、塩化メチレン／
メタノール混合物（３０：１又は１０：１又は５：１）を用いてシリカゲル上の
フラッシュクロマトグラフィによって実施した。油の形で表題化合物を得た（Ｒ ｆ ：０.０９）（溶剤は実施例３ａと同じ）。
【０１２８】 実施例１５： Ｎ４，Ｎ９−ビス〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−オクチル〕−スペ
ルミントリオキサレート エタノール５ｍｌ中のＮ１，Ｎ１２−ジ−ＢＯＣ−Ｎ４，Ｎ９−ビス〔（２−
ヒドロキシ）−ｎ−オクチル〕−スペルミン１.６５ｇ（０.０００２５モル）の
溶液に対し、１０ｍｌの水中の１.２６ｇ（０.０１モル）のシュウ酸二水和物を
添加した。反応混合物を９０°で９時間撹拌し、次に真空下での蒸発により濃縮
し、残留物をメタノール／エーテルから結晶させた。得られた表題化合物は、１
２６〜１２９°で溶解した。
【０１２９】 出発化合物は以下の通りに生成された。 ａ） Ｎ１，Ｎ１２−ジ−ＢＯＣ−Ｎ４，Ｎ９−ビス〔（２−ヒドロキシ）−ｎ −オクチル〕−スペルミン １.０１ｇ（０.００２５モル）のＮ１，Ｎ１２−ジ−ＢＯＣ−スペルミン，０
.９６ｇ（０.００７５モル）の１，２−オクテン酸化物及び１５ｍｌのエタノー
ルの混合物を８５°で２１時間撹拌し、その後、真空下での蒸留により濃縮した
。塩化メチレン／メタノール混合物（１９：１又は９：１）を用いたシリカゲル
上のフラッシュクロマトグラフィにより、残留物の精製を実施した。油の形で表
題化合物を得た（Ｒｆ：０.２３）（溶剤は実施例３ａと同じ）。
【０１３０】 実施例１６： Ｎ４，Ｎ９−ビス〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−デシル〕−スペル
ミントリオキサレート エタノール１０ｍｌ中のＮ１，Ｎ１２−ジ−ＢＯＣ−Ｎ４，Ｎ９−ビス〔（２
−ヒドロキシ）−ｎ−デシル〕−スペルミン５.３ｇ（０.００７４１モル）の溶
液に対し、水１０ｍｌ中のシュウ酸二水和物３.７３ｇ（０.２９６モル）を添加
した。反応混合物を９０°で９時間撹拌し、次に蒸発により濃縮し、残留物をメ
タノール／エーテルから結晶させた。得られた表題化合物は、１７５〜１７７°
で溶解した。
【０１３１】 出発化合物は以下の通りに生成された。 ａ） Ｎ１，Ｎ１２−ジ−ＢＯＣ−Ｎ４，Ｎ９−ビス〔（２−ヒドロキシ）−ｎ −デシル〕−スペルミン ３.２２ｇ（０.００８モル）のＮ１，Ｎ１２−ジ−ＢＯＣ−スペルミン，３.
７５ｇ（０.０２４モル）の１，２−デセン酸化物及び３２ｍｌのエタノールの
混合物を８０°で１９時間撹拌し、その後、真空下での蒸留により濃縮した。塩
化メチレン及び塩化メチレン／メタノール（５０：１又は１９：１又は９：１）
を用いたシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィにより、残留物の精製を実
施した。油の形で表題化合物を得た、Ｒｆ：０.２５（溶剤は実施例３ａと同じ
）。
【０１３２】 実施例１７： Ｎ４，Ｎ９−ビス〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−ドデシル〕−スペ
ルミン−テトラオキサレート 表題化合物は、実施例１５と類似の要領で、ただし反応を１０時間維持して、
１.７ｇ（０.００２２モル）のＮ１，Ｎ１２−ジ−ＢＯＣ−Ｎ４，Ｎ９−ビス〔
（２−ヒドロキシ）−ｎ−ドデシル〕−スペルミン及び１.１１ｇ（０.００８８
モル）のシュウ酸二水和物から得られた。融点１８７°（分解）
【０１３３】 出発化合物は以下の通りに生成された。 ａ） Ｎ１，Ｎ１２−ジ−ＢＯＣ−Ｎ４，Ｎ９−ビス〔（２−ヒドロキシ）−ｎ −ドデシル〕−スペルミン 実施例１５ａに類似した要領で１，２−ドデセン酸化物１.３８ｇ（０.００７
５モル）とＮ１，Ｎ１２−ジ−ＢＯＣ−スペルミン１.０１ｇ（０.００２５モル
）を反応させた（反応持続時間：２２時間）。シリカゲル上のフラッシュクロマ
トグラフィによって精製された表題化合物は（溶離剤：塩化メチレン／メタノー
ル（９９：１又は１９：１）〕油の形で得られた。Ｒｆ：０.２７（溶剤は実施
例３ａと同じ）
【０１３４】 実施例１８： Ｎ４，Ｎ９−ビス〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−テトラデシル〕−
スペルミンテトラオキサレート 実施例１５と類似の要領で、ただし反応を１１．５時間維持して、１.８２ｇ
（０.００２２モル）のＮ１，Ｎ１２−ジ−ＢＯＣ−Ｎ４，Ｎ９−ビス〔（２−
ヒドロキシ）−ｎ−テトラデシル〕−スペルミンと１.１１ｇ（０.００８８モル
）のシュウ酸二水和物を反応させた。メタノール／水からの結晶化の後、表題化
合物１７０°で分解した。
【０１３５】 出発化合物は以下の通りに生成された。 ａ） Ｎ１，Ｎ１２−ジ−ＢＯＣ−Ｎ４，Ｎ９−ビス〔（２−ヒドロキシ）−ｎ −テトラデシル〕−スペルミン 実施例１５ａに類似した要領で１，２−テトラデセン酸化物（８５％）１.８
７４ｇ（０.００７５モル）とＮ１，Ｎ１２−ジ−ＢＯＣ−スペルミン１.０１ｇ
（０.００２５モル）を反応させた（反応持続時間：１８.５時間）。シリカゲル
上のフラッシュクロマトグラフィによって精製された表題化合物は（溶離剤：塩
化メチレン／メタノール（９９：１又は４９：１又は１９：１又は９：１））油
の形で得られた、」Ｒｆ：０.２７（溶剤は実施例３ａと同じ）
【０１３６】 実施例１９： Ｎ４，Ｎ９−ビス〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−ヘキサデシル〕ス
ペルミンテトラオキサレート ３.５３ｇ（０.００４モル）のＮ１，Ｎ１２−ジ−ＢＯＣ−Ｎ４，Ｎ９−ビス
〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−ヘキサデシル〕−スペルミン、３.０４ｇ（０.０１
６モル）のトルエン−４−スルホン酸一水和物及び２０ｍｌの水の混合物を７０
°で１９時間撹拌し、その後真空下での蒸発により濃縮し、残留物は、２Ｎの水
酸化ナトリウム溶液とクロロホルムの間で分割した。濃縮塩化ナトリウムで有機
相を洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、真空下での蒸発により濃縮した後、粗
製Ｎ４，Ｎ９−ビス〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−ヘキサデシル〕−スペルミンを
得、これを３２ｍｌのエタノール中で溶解させ、撹拌しながら３２ｍｌのエタノ
ール中のシュウ酸二水和物２.０ｇ（０.０１６モル）溶液と混合し、こうして、
表題化合物が結晶形態で沈降した。エタノールで洗浄し、高真空下で乾燥させた
結晶化物は分解下で１４０°で溶解した。
【０１３７】 出発化合物は以下の通りに生成された。 ａ） Ｎ１，Ｎ１２−ジ−ＢＯＣ−Ｎ４，Ｎ９−ビス〔（２−ヒドロキシ）−ｎ −ヘキサデシル−スペルミン〕 実施例１５ａと類似の要領で２.０２ｇ（０.００５モル）のＮ１，Ｎ１２−ジ
−ＢＯＣ−スペルミン及び４.２４ｇ（０.０１５モル）の１，２−ヘキサデセン
酸化物（８５％）を反応させた（反応時間：８時間）。酢酸エチル／ヘキサン混
合物（１：３又は１：２又は１：１）を用いて、酢酸エチルを用いて、及び酢酸
エチル／メタノール混合物（１９：１）を用いて、シリカゲル上のフラッシュク
ロマトグラフィにより精製された表題化合物は、油の形で得られた、Ｒｆ：０.
３１（溶剤は実施例３ａと同じ）。
【０１３８】 実施例２０： Ｎ４−〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−ヘキサデシル〕−スペルミン
−テトラ（トルエン−４−スルホネート） 実施例５と類似の要領で、５.９４ｇ（０.００８モル）のＮ１，Ｎ９，Ｎ１２ −トリ−ＢＯＣ−Ｎ４−〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−ヘキサデシル〕−スペルミ
ン，６.０９ｇ（０.０３２モル）のトルエン−４−スルホン酸一水和物及び３５
ｍｌの水の混合物を反応させた（反応時間：２５時間）。水及び水／イソプロパ
ノール混合物（９：１又は４：１又は３：２）を用いたＡｍｂｅｒｌｉｔｅＸＡ
Ｄ１１８０吸着性樹脂上での精製の後、２.２４％の含水量をもつ凍結乾燥物と
して表題化合物が得られた、Ｒｆ：０.０７（溶剤は実施例１と同じ）。
【０１３９】 出発化合物は以下の通りに生成された。
【０１４０】 ａ） Ｎ１，Ｎ９，Ｎ１２−トリ−ＢＯＣ−Ｎ４−〔（２−ヒドロキシ）−ｎ− ヘキサデシル〕−スペルミン Ｎ４−〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−デシル〕−ス
ペルミンテトラオキサレート 実施例１５ａと類似の要領で５.０２ｇ（０.０１モル）のＮ１，Ｎ９，Ｎ１２ −トリ−ＢＯＣ−スペルミン及び４.２４ｇ（０.０１５モル）の１，２−ヘキサ
デセン酸化物（８５％）を反応させた（反応時間：１０.５時間）。酢酸エチル
／ヘキサン混合物（１：３又は１：１）を用いて及び酢酸エチルを用いてシリカ
ゲル上のフラッシュクロマトグラフィにより精製された表題化合物は、油の形で
得られた、Ｒｆ：０.５２（溶剤は実施例３ａと同じ）。
【０１４１】 実施例１５と類似の要領で４.０５ｇ（０.００６１５モル）のＮ１，Ｎ９，Ｎ １２ −トリ−ＢＯＣ−Ｎ４−〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−デシル〕−スペルミン
，３.１ｇ（０.０２４６モル）のシュウ酸２水和物、８ｍｌのエタノール及び８
ｍｌの水の混合物を反応させた（反応時間：１２.５時間）。エタノール／エー
テルからの結晶化の後、表題化合物は１３５〜１５５°で分解した。
【０１４２】 出発化合物は以下の通りに生成された。 ａ） Ｎ１，Ｎ９，Ｎ１２−トリ−ＢＯＣ−Ｎ４−〔（２−ヒドロキシ）−ｎ− デシル〕−スペルミン ４.０２ｇ（０.００８モル）のＮ１，Ｎ９，Ｎ１２−トリ−ＢＯＣ−スペルミ
ン，１.８７５ｇ（０.０１２モル）の１，２−デセン酸化物及び４０ｍｌのエタ
ノールの混合物を２０時間８０°で撹拌し、その後真空下での蒸発により濃縮し
た。塩化メチレン及び塩化メチレン／メタノール混合物（５０：１又は１９：１
又は９：１）を用いてシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィにより残留物
を精製した後、油の形で表題化合物を得た、Ｒｆ：０.４０（溶剤は実施例３ａ
と同じ）。
【０１４３】 実施例２２： Ｎ４〔（Ｒ）−（２−ヒドロキシ）−ｎ−ヘキサデシル〕−スペ
ルミンテトラオキサレート 実施例１３と類似の要領で、５.６ｇ（０.００７５４モル）のＮ１，Ｎ９，Ｎ １２ −トリ−ＢＯＣ−Ｎ４−〔（Ｒ）−（２−ヒドロキシ）−ｎ−ヘキサデシル
〕−スペルミン，３.８（０.０３０１６モル）のシュウ酸二水和物、及び５０ｍ
ｌの水の混合物を反応させた（反応時間：１８時間）。得られた表題化合物は２
００〜２０５°で分解する、〔α〕Ｄ ２０＝−７.４±１.７°（Ｃ＝Ｈ２Ｏ中０
.５％）。
【０１４４】 出発化合物は以下の通りに生成された。 ａ） Ｎ１，Ｎ９，Ｎ１２−トリ−ＢＯＣ−Ｎ４−〔（Ｒ）（２−ヒドロキシ） −ｎ−ヘキサデシル〕−スペルミン ７.０４ｇ（０.０１４モル）のＮ１，Ｎ９，Ｎ１２−トリ−ＢＯＣ−スペルミ
ン，４.０６ｇ（０.０１６９モル）の（Ｒ）−１，２−ヘキサデセン酸化物（日
鉱金属（株）） 及び３０ｍｌのエタノールの混合物を１５時間８０°で撹拌し
、その後真空下での蒸発により濃縮した。塩化メチレン及び塩化メチレン／メタ
ノール混合物（１９：１）を用いてシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィ
により残留物を精製した後、油の形で表題化合物を得た、Ｒｆ：０.５２（溶剤
は実施例３ａと同じ）。
【０１４５】 実施例２３： Ｎ４−（２−ヒドロキシエチル）−スペルミジントリオキサレー
ト ２.７３ｇ（０.００７モル）のＮ１、Ｎ８−ジ−ＢＯＣ−Ｎ４−（２−ヒドロ
キシエチル）−スペルミジン，２.６５ｇ（０.０２１モル）のシュウ酸二水和物
、１０ｍのエタノール及び３０ｍｌの水を９０°で４.５時間撹拌した。なお温
かい反応混合物をエタノールと共に（わずかな濁り度が発生するまで）混合し、
次に０°まで冷却し、かくして、表題化合物は結果として結晶形態となった。融
点１５３〜１５６°（分解）。
【０１４６】 出発化合物は以下の通りに生成された。 ａ） Ｎ１，Ｎ８−ジ−ＢＯＣ−Ｎ４−（２−ヒドロキシエチル）−スペルミジ ン 塩化メチレン／メタノール混合物（１９：１又は９：１又は４：１）を用いて
シリカゲル上で粗製生成物を精製した後、６.９１ｇ（０.０２モル）のＮ１，Ｎ ３ −ジ−ＢＯＣ−スペルミジン及び３.２ｇ（０.０７２６モル）のエチレン酸化
物から、実施例１４ａと類似の形で油の形で表題化合物を得た、Ｒｆ：０.７６
（溶剤は実施例１ａと同じ）。
【０１４７】 実施例２４： Ｎ４−（２−ヒドロキシ）−ｎ−ヘキサデシル〕−スペルミジン
−トリ（トルエン−４−スルホネート） ６.２１ｇ（０.０１０６モル）のＮ１，Ｎ８−ジ−ＢＯＣ−Ｎ４−〔（２−ヒ
ドロキシ）−ｎ−ヘキサデシル〕−スペルミジン，６.０５ｇ（０.０３１８モル
）のトルエン−４−スルホン酸一水和物及び３０ｍｌの水の混合物を、７５℃で
２時間撹拌した。Amberlite XAD １１８０吸着性樹脂上でのクロマトグラフィに
より反応混合物の精製〔溶離剤：水及び水／イソプロパノール（４：１又は３：
２）〕及びその後の生成物含有画分の凍結乾燥の後、表題化合物を、２.２％の
含水率をもつ凍結乾燥物として得た、Ｒｆ：０.２６（溶剤は実施例１と同じ）
。
【０１４８】 出発化合物は以下の通りに生成された。 ａ） Ｎ１，Ｎ８−ジ−ＢＯＣ−Ｎ４−〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−ヘキサデシ ル〕−スペルミジン エタノール１００ｍｌ中のＮ１，Ｎ８−ジ−ＢＯＣ−スペルミジン８.６４ｇ（
０.０２５モル）の溶液に対し、１０.６１ｇ（０.０３７５モル）の１，２−ヘ
キサデセン酸化物（８５％）を添加した。１５時間環流下で反応混合物を沸とう
させ、さらに１.７ｇ（０.００６モル）の１，２−ヘキサデセン酸化物を添加し
、混合物をさらに７時間環流下で沸とうさせ、次に真空下での蒸発により濃縮し
た。粗製生成物の精製は、酢酸エチル／ヘキサン混合物（１：２又は１：１）を
用いて及び酢酸エチルを用いて、シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィに
よって実施した。表題化合物は油の形で得られた、Ｒｆ：０.８５（溶剤は実施
例１ａと同じ）。
【０１４９】 実施例２５： Ｎ４−〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−ヘキサデシル〕−ノルスペル
ミジン−トリ（トルエン−４−スルホネート） 表題化合物は、５.７２ｇ（０.０１モル）のＮ１−Ｎ７−ジ−ＢＯＣ−Ｎ４−
〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−ヘキサデシル〕−ノルスペルミジン及び５.７１ｇ
（０.０３モル）のトルエン−４−スルホン酸−水和物から、実施例２４と類似
の要領で、１.４％の含水率をもつ凍結乾燥物として得られた、Ｒｆ：０.２４（
溶離剤は実施例１と同じ）。
【０１５０】 出発化合物は以下の通りに生成された。 ａ） Ｎ１−Ｎ７−ジ−ＢＯＣ−Ｎ４−〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−ヘキサデシ ル〕−ノルスペルミジン エタノール７５ｍｌ中のＮ１，Ｎ７−ジ−ＢＯＣ−ノルスペルミジン６.４ｇ
（０.０１９３モル）の溶液（Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｙｎｔｈｅｓ
ｉｓ １９８２：４０４）に対して、６.５６ｇ（０.０２３２モル）の１，２−
ヘキサデセン酸化物（８５％）を添加し、反応混合物を再び２２時間還流下で沸
とうさせ、その後、実施例２４ａと類似の要領で作業を進めた。表題化合物は油
の形で得られた、Ｒｆ：０.７９（溶剤は実施例１ａと同じ）。
【０１５１】 実施例２６： Ｎ４−〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−デシル〕−ノルスペルミジン
トリオキサレート 表題化合物は、３.２ｇ（０.００６５６モル）のＮ１−Ｎ７−ジ−ＢＯＣ−Ｎ ４ −〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−デシル〕−ノルスペルミジン、２.４８ｇ（０.
０１９７モル）のシュウ酸二水和物及び２５ｍｌの水から、実施例１３と類似の
要領で得られた。融点１７４〜１７９°（分解）。
【０１５２】 出発化合物は以下の通りに生成された。
【０１５３】 ａ） Ｎ１，Ｎ７−ジ−ＢＯＣ−Ｎ４−〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−デシル〕− ノルスペルミジン 表題化合物は、２.４９ｇ（０.００７５モル）のＮ１，Ｎ７−ジ−ＢＯＣ−ノ
ルスペルミジン、１.４７ｇ（０.００９４モル）の１，２−デセン酸化物及び２
５ｍｌのエタノールから、実施例２２ａと類似の要領で、油の形で得た。短時間
の後、化合物は結晶形態に固化した。融点５２〜５４°。
【０１５４】 実施例２７： Ｎ４−〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−デシル〕−スペルミジン−ト
リオキサレート ３.１９ｇ（０.００６３６モル）のＮ１，Ｎ８−ジ−ＢＯＣ−Ｎ４−〔（２−
ヒドロキシ）−ｎ−デシル〕−スペルミジン，２.４０５ｇ（０.０１９０８モル
）のシュウ酸二水和物及び２５ｍｌの水の混合物を１５時間還流下で沸とうさせ
、その後真空下で蒸発により濃縮した。アセトンから残留物を結晶化した後、１
.９％の含水量で表題化合物を得た。融点１７０〜１７３°（分解）。
【０１５５】 出発化合物は以下の通りに生成された。 ａ） Ｎ１，Ｎ８−ジ−ＢＯＣ−Ｎ４−〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−デシル〕− スペルミジン ２.５９ｇ（０.００７５モル）のＮ１，Ｎ８−ジ−ＢＯＣ−スペルミジン、１
.４７ｇ（０.００９４モル）の１，２−デセン酸化物及び２５ｍｌのエタノール
から、実施例２２ａと類似の要領で、油の形で表題化合物を得た、Ｒｆ：０.５
０（溶剤は実施例３ａと同じ）。
【０１５６】 実施例２８： Ｎ４，Ｎ９−ビス〔（Ｓ）−（２−ヒドロキシ）−ｎ−デシル〕
−スペルミンテトラオキサレート ２.７２ｇ（０.００３８モル）のＮ１，Ｎ１２−ジ−ＢＯＣ−Ｎ４，Ｎ９−ビ
ス〔（Ｓ）（２−ヒドロキシ）−ｎ−デシル〕−スペルミン、１．９１６ｇ（０
.０１５２モル）のシュウ酸二水和物及び３０ｍｌの水の混合物を、１５時間還
流下で沸とうさせた。なお熱い間に（そしてわずかな濁り度が発生するまで）反
応混合物に対しアセトンを添加し、その後、混合物をゆっくりと０°まで冷却し
、かくして結晶形態で表題化合物が沈降した。ろ過の後、結晶化物をアセトンで
洗浄し、高真空下で乾燥させて、表題化合物を得た。融点１７５〜１７７°（分
解）、〔α〕Ｄ ２０＝＋１３.１°±０.７°（Ｃ＝１.４７％，Ｈ２Ｏ）。
【０１５７】 出発化合物は以下の通りに生成された。 ａ） Ｎ１，Ｎ１２−ジ−ＢＯＣ−Ｎ４，Ｎ９−ビス〔（Ｓ）−（２−ヒドロキ シ）−ｎ−デシル〕−スペルミン ２.０１３ｇ（０.００５モル）のＮ１，Ｎ１２−ジ−ＢＯＣ−スペルミン、２
.３４ｇ（０.０１５モル）の（Ｓ）−１，２−デセン酸化物及び２０ｍｌのエタ
ノールの混合物を１５時間還流下で沸とうさせ、その後真空下での蒸発により濃
縮した。塩化メチレン／メタノール混合物（９９：１又は４９：１又は１９：１
又は９：１）を用いてシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィにより残留物
を精製した後、表題化合物を油の形で得た、Ｒｆ：０.２５（溶剤は実施例３ａ
と同じ）。〔α〕Ｄ ２０＝＋５２.８４（Ｃ＝１.５５２％，ヘキサン）。
【０１５８】 実施例２９： Ｎ４，Ｎ９−ビス〔（Ｒ）−（２−ヒドロキシ）−ｎ−デシル〕
−スペルミンテトラオキサレート ２.７２ｇ（０.００３８モル）のＮ１−Ｎ２−ジ−ＢＯＣ−Ｎ４，Ｎ９−ビス
〔（Ｒ）（２−ヒドロキシ）−ｎ−デシル〕−スペルミン及び１.９１６ｇ（０.
０１５２モル）のシュウ酸二水和物から、実施例２８と類似の要領で表題化合物
を得た。融点１７５〜１７７°（分解）。〔α〕Ｄ ２０＝−１４.１°±０.７°
（Ｃ＝１.４３％，Ｈ２Ｏ）。
【０１５９】 出発化合物は以下の通りに生成された。
【０１６０】 ａ） Ｎ１，Ｎ１２−ジ−ＢＯＣ−Ｎ４，Ｎ１２−ビス〔（Ｒ）−（２−ヒドロ キシ）−ｎ−デシル〕−スペルミン ２.０１３ｇ（０.００５モル）のＮ１，Ｎ１２−ジ−ＢＯＣ−スペルミン及び
２.３４ｇ（０.０１５モル）の（Ｒ）−１，２−デセン酸化物から、実施例２８
ａと類似の要領で油の形で表題化合物を得た、Ｒｆ：０.２５（溶剤は実施例３
ａと同じ）。〔α〕Ｄ ２０＝−５２.８４°（Ｃ＝１.２６８％，ヘキサン）。
【０１６１】 実施例３０： Ｎ１，Ｎ８−ビス（３−アミノプロピル）−Ｎ１−〔（２−ヒド
ロキシ）−ｎ−ヘキサデシル〕−１，８−ジアミノ−オクタンテトラオキサレー
ト 実施例１３と類似の要領で、ただし２０時間という反応時間で、２.８４ｇ（
０.００３５５モル）のＮ１，Ｎ８−ビス（３−ＢＯＣ−アミノプロピル）−Ｎ
１−ＢＯＣ−Ｎ８−〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−ヘキサデシル〕−１，８−ジア
ミノ−オクタン、１.７９ｇ（０.０１４２モル）のシュウ酸二水和物及び３０ｍ
ｌの水から表題化合物を得た。融点１６５〜１７０°（分解）。
【０１６２】 出発化合物は以下の通りに生成された。 ａ） Ｎ１，Ｎ８−ビス（３−ＢＯＣ−アミノプロピル）−Ｎ１−ＢＯＣ−Ｎ８ −〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−ヘキサデシル〕−１，８−ジアミノ−オクタン 実施例２１ａと類似の要領で（反応時間１６時間）、４.８ｇ（０.００８５９
モル）のＮ１，Ｎ８−ビス（３−ＢＯＣ−アミノプロピル）−Ｎ１−ＢＯＣ−１
，８−ジアミノ−オクタン及びエタノール３０ｍｌ中の１，２ヘキサデセン酸化
物（８５％）２.９１ｇ（０.０１０３モル）を反応させた。塩化メチレン／メタ
ノール混合物（２０：１）を用いてシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィ
により精製された表題化合物が、油の形で得られた、Ｒｆ：０.６０（溶剤は実
施例３ａと同じ）。
【０１６３】 ｂ）Ｎ１，Ｎ８−ビス（３−ＢＯＣ−アミノプロピル）−Ｎ１−ＢＯＣ−１，８ −ジアミノ−オクタン及びＮ１，Ｎ８−ビス（３−ＢＯＣ−アミノプロピル）− １，８−ジアミノ−オクタン ＴＨＦ１２０ｍｌ中の２−（ＢＯＣ−オキシイミノ）−２−フェニルアセトニ
トリル３６.９４ｇ（０.１５モル）の溶液を、撹拌しながら１.５時間にわたり
、又窒素雰囲気下で、ＴＨＦ１００ｍｌ中のＮ１，Ｎ８−ビス（３−アミノプロ
ピル）−１，８−ジアミノ−オクタン１５.５１ｇ（０.０６モル）〔Pestic.Sci
, ４８５−４９０（１９７３）参照〕の０〜５°まで冷却された溶液に対し滴下
により添加した。反応混合物をさらに１６日間室温で撹拌し、次に真空下で蒸発
により濃縮させ、塩化メチレン／メタノール混合物（１００：１又は５０：１又
は２０：１又は１０：１）及び塩化メチレン／メタノール／３０％アンモニア水
溶液の混合物（９０：１５：０.５又は４０：１０：１）を用いて、シリカゲル
上のクロマトグラフィによって残留物を分離した。かくして以下のものが得られ
た。すなわち油の形の第１の表題化合物，Ｎ１，Ｎ８−ビス（３−ＢＯＣ−アミ
ノプロピル）−Ｎ１−ＢＯＣ−１，８−ジアミノ−オクタン、Ｒｆ：０.８１（
溶剤は実施例１ａと同じ）ならびに第２の表題化合物，Ｎ１，Ｎ８−ビス（３−
ＢＯＣ−アミノプロピル）−１，８−ジアミノ−オクタン、融点６７〜７０°、
Ｒｆ：０.２６（溶剤は実施例１ａと同じ）。
【０１６４】 実施例３１： Ｎ１，Ｎ８−ビス（３−アミノプロピル）−Ｎ１−〔（Ｒ）−（
２−ヒドロキシ）−ｎ−ヘキサデシル〕−１，８−ジアミノ−オクタンテトラオ
キサレート 実施例１３と類似の要領で、ただし反応を２１時間維持しながら、３.７１ｇ
（０.００４６４モル）のＮ，Ｎ８−ビス（３−ＢＯＣ−アミノプロピル）−Ｎ
１−ＢＯＣ−Ｎ８−〔（Ｒ）−（２−ヒドロキシ）−ｎ−ヘキサデシル〕−１，
８−ジアミノ−オクタン、２.３４ｇ（０.０１８５６モル）のシュウ酸二水和物
及び３５ｍｌの水から表題化合物を得た。融点１６５〜１７０°（分解）。〔α
〕Ｄ ２０＝−７.２°±１.６°（Ｃ＝０.５％，Ｈ２Ｏ）。
【０１６５】 出発化合物は以下の通りに生成された。 ａ） Ｎ１，Ｎ８−ビス（３−ＢＯＣ−アミノプロピル）−Ｎ１−ＢＯＣ−Ｎ８ −〔（Ｒ）−（２−ヒドロキシ）−ｎ−ヘキサデシル〕−１，８−ジアミノ−オ クタン 実施例３０ａと類似の要領で、５ｇ（０.００８９５モル）のＮ１，Ｎ８−ビ
ス（３−ＢＯＣ−アミノプロピル）−Ｎ１−ＢＯＣ−１，８−ジアミノ−オクタ
ン（実施例３０ｂ），２.５８ｇ（０.０１０７３モル）の（Ｒ）−１，２−ヘキ
サデセン酸化物及び３０ｍｌのエタノールから、油の形で表題化合物を得た、Ｒ ｆ ：０.６０（溶剤は実施例３ａと同じ）。
【０１６６】 実施例３２： Ｎ１，Ｎ１２−ビス（３−アミノプロピル）−Ｎ１，Ｎ１２−ビ
ス〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−ヘキサデシル〕−１，１２−ジアミノ−ドデカン
テトラオキサレート 実施例１３と類似の要領で、ただし反応を４０時間維持しながら、１.３ｇ（
０.００１３０５モル）のＮ１，Ｎ１２−ビス（３−ＢＯＣ−アミノプロピル）
−Ｎ１，Ｎ１２−ビス〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−ヘキサデシル〕−１，１２−
ジアミノ−ドデカン、０.６６ｇ（０.００５２３モル）のシュウ酸二水和物及び
２０ｍｌの水から表題化合物を得た。融点１１５−１１８°。
【０１６７】 出発化合物は以下の通りに生成された。 ａ） Ｎ１，Ｎ１２−ビス〔３−ＢＯＣ−アミノプロピル〕−Ｎ１，Ｎ１２−ビ ス〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−ヘキサデシル〕−１，１２−ジアミノ−ドデカン １.１ｇ（０.００２１３７モル）のＮ１，Ｎ１２−ビス〔３−ＢＯＣ−アミノ
プロピル〕−１，１２−ジアミノ−ドデカン及びエタノール２５ｍｌ中の１，２
−ヘキサデセン酸化物（８５％）１.４５ｇ（０.００５１３モル）を実施例１５
ａと類似の要領で反応させた（反応時間：１８時間）。塩化メチレン／メタノー
ル混合物（５０：１又は２５：１又は１０：１）を用いてシリカゲル上のフラッ
シュクロマトグラフィにより精製した表題化合物を油の形で得た、Ｒｆ；０.９
１（溶剤は実施例１ａと同じ）。
【０１６８】 ｂ） Ｎ１，Ｎ１２−ビス（３−ＢＯＣ−アミノプロピル）−Ｎ１−ＢＯＣ−１ ，１２−ジアミノ−ドデカン及びＮ１，Ｎ１２−ビス（３−ＢＯＣ−アミノプロ ピル）−１，１２−ジアミノ−ドデカン ３６.１ｍｌ（０.１９５モル）のナトリウムメチラートの５.４モルメタノー
ル溶液を、室温で撹拌しながらかつ窒素雰囲気下でＴＨＦ１３０ｍｌ中の１，１
２−ビス（３−アミノプロピル）−１，１２−ジアミノ−ドデカン−テトラヒド
ロクロリド〔J. Med. Chem.７．７１０（１９６４）〕２３.９ｇ（０.０５１９
モル）の懸濁液に添加した。２０分間撹拌した後、反応混合物を０°まで冷却し
、１時間にわたり、ＴＨＦ１３０ｍｌ中の２−（ＢＯＣ−オキシイミノ）−２−
フェニルアセトニトリル３８.３９ｇ（０.１５５９モル）の溶液と混合させた。
室温で１５時間撹拌を続行し、溶液をろ過し、ろ液を真空下での蒸発により濃縮
した。塩化メチレン／メタノール混合物（５０：１又は２５：１又は１６：１又
は１０：１）及び塩化メチレン／メタノール／３０％アンモニア水溶液の混合物
（９０：１０：０.５ 又は ９０：１５：０.５ 又は ４０：１０：１）の混合物
を用いて、シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィにより残留物を分離した
。かくして以下のものが得られた： すなわち、油の形での第１の表題化合物，
Ｎ１，Ｎ１２−ビス（３−ＢＯＣ−アミノプロピル）−Ｎ１−ＢＯＣ−１，１２
−ジアミノ−ドデカン、Ｒｆ：０.８５（溶剤は実施例１ａと同じ）、ならびに
第２の表題化合物，Ｎ１，Ｎ１２−ビス（３−ＢＯＣ−アミノプロピル）−１，
１２−ジアミノ−ドデカン、融点７７〜８０°、Ｒｆ：０.４８（溶剤は実施例
１ａと同じ）。
【０１６９】 実施例３３：Ｎ１，Ｎ４−ビス（３−アミノプロピル）−Ｎ１，Ｎ４−ビス〔（
２−ヒドロキシ）−ｎ−デシル〕−１，４−ジアミノ−トランス−２−ブテン−
トリオキサレート １.６５ｇ（０.００２３１４モル）のＮ１，Ｎ４−ビス（３−ＢＯＣ−アミノ
プロピル）−Ｎ１，Ｎ４−ビス〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−デシル〕−１，４−
ジアミノ−トランス−２−ブテン、０.８７５ｇ（０.００６９４モル）のシュウ
酸二水和物及び１５ｍｌの水の混合物を１６時間還流下で沸とうさせ、次に真空
下での蒸発により濃縮した。メタノールからの残留物の結晶化の後、３.５％の
含水率、融点１６３−１６５°（分解）で表題化合物を得た。
【０１７０】 出発化合物は以下の通りに生成された。 ａ） Ｎ１，Ｎ４−ビス（３−ＢＯＣ−アミノプロピル）−Ｎ１，Ｎ４−ビス〔 （２−ヒドロキシ）−ｎ−デシル〕−１，４−ジアミノ−トランス−２−ブテン クロマトグラフィのためには塩化メチレン及び塩化メチレン／メタノール混合
物（１９：１）を用いて、２ｇ（０.００５モル）のＮ１−Ｎ４−ビス（３−Ｂ
ＯＣ−アミノプロピル）−１，４−ジアミノ−トランス−２−ブテン（実施例１
１ｂ），２.３４ｇ（０.０１５モル）の１，２−デセン酸化物及び２０ｍｌのエ
タノールから、実施例１１ａと類似の要領で油の形で表題化合物を得た（反応時
間：１５時間。Ｒｆ：０.４９（溶剤は実施例３ａと同じ）。
【０１７１】 実施例３４： Ｎ１，Ｎ１２−ビス（３−アミノプロピル）−Ｎ１，Ｎ１２−ビ
ス〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−テトラデシル〕−１，１２−ジアミノ−ドデカン
テトラオキサレート ２０ｍｌのアセトニトリル中の０.４５ｇ（０.００３５７モル）のシュウ酸二
水和物溶液を、撹拌しながら、メタノール２０ｍｌ中のＮ１，Ｎ１２−ビス（３
−アミノプロピル）−Ｎ１，Ｎ１２−ビス〔（２−ヒドロキシ）−ｎ−テトラデ
シル〕−１，１２−ジアミノ−ドデカン０.６６ｇ（０.０００８９３モル）の溶
液に対して添加した。混合物を０°に冷却し、ろ過し、アセトニトリルで残留物
を洗浄し、高真空下で乾燥した。かくして表題化合物を得た。融点８７〜８９°
。
【０１７２】 出発化合物は以下の通りに生成された。 ａ） Ｎ１，Ｎ１２−ビス（３−アミノプロピル）−Ｎ１，Ｎ１２−ビス〔（２ −ヒドロキシ）−ｎ−テトラデシル〕−１，１２−ジアミノ−ドデカン エタノール中の１１％のアンモニア溶液１０ｍｌ中に、０.８１ｇ（０.００１
１モル）のＮ１−Ｎ１２−ビス（２−シアノエチル）−Ｎ１，Ｎ１２−ビス〔（
２−ヒドロキシ）−ｎ−テトラデシル〕−１，１２−ジアミノ−ドデカンを溶解
させ、０.４ｇのRaneyニッケルと混合し、水素取込みが終わるまで、水素添加し
た。ろ過し、真空下での蒸発によりろ液を濃縮し、塩化メチレン／メタノール混
合物（４０：１又は１０：１）及び塩化メチレン／メタノール／３０％アンモニ
ア水溶液の混合物（９０：１０：０.５又は４０：１０：１.５）を用いてシリカ
ゲル上のフラッシュクロマトグラフィにより残留物を精製した後、油の形で表題
化合物を得た、Ｒｆ：０.３４（溶剤は実施例１ａと同じ）、これは漸進的に結
晶質形態に固化した。
【０１７３】 ｂ） Ｎ１，Ｎ１２−ビス（２−シアノエチル）−Ｎ１，Ｎ１２−ビス〔（２− ヒドロキシ）−ｎ−テトラデシル〕−１，１２−ジアミノ−ドデカン １１.９９ｇ（０.０４８モル）の１，２−テトラデセン酸化物（８５％）をエ
タノール６０ｍｌ中のＮ１，Ｎ１２−ビス（２−シアノエチル）−１，１２−ジ
アミノ−ドデカン６.１３ｇ（０.０２モル）の溶液〔Ｊ．Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．
７，７１０（１９６４）〕に添加した。４０時間還流下で反応混合物を加熱し
、さらに２.５４ｇ（０.０１０１６モル）のテトラデセン酸化物（８５％）を添
加し、さらに６時間還流下で反応混合物を沸とうさせ、次に真空下での蒸発によ
り濃縮した。粗製生成物の精製は、塩化メチレン及び塩化メチレン／メタノール
混合物（４０：１又は２０：１）を用いて、シリカゲル上のフラッシュクロマト
グラフィにより行なった。真空下での蒸発により生成物含有画分を濃縮し、アセ
トニトリルから残留物を結晶化させた後、表題化合物を得た。融点３７〜３８°
【０１７４】 実施例３５： 置換されたアミノエタノールでのプラスミド核酸のコア複合体の
調製及びその生物活性 核酸のコア複合体の調製は、長鎖炭化水素（脂肪族）置換基を伴う又は伴わない
置換−アミノエタノールを用いて実施することができる。
【０１７５】 長鎖炭化水素（脂肪族）置換基が欠如した置換アミノエタノールは、水中コロ
イド分散の形にプラスミドＤＮＡを圧縮するために使用された。調製されたコロ
イド分散のサイズ及びゼータ電位は、添加されたカチオン（アミン）対アニオン
（ＤＮＡリン酸塩）について異なる投入比で決定されており、表１及び図４に示
されている。調製されたコロイド分散は、本発明に適したコア複合体へのＤＮＡ
の圧縮を可能にする。
【０１７６】 長鎖炭化水素（脂肪族）置換基を伴う置換アミノエタノールは同様に、プラス
ミドＤＮＡを水中コロイド分散に圧縮するためにも使用された。場合によっては
これらの複合体は単独で、細胞培養中での又は動物に投与された場合の遺伝子送
達を提供するのに充分である。この効果については、以下の結果の中で例示され
ている（表２及び３）
【０１７７】
【表１】
【０１７８】 長鎖炭化水素（脂肪族）置換基を伴う置換アミノエタノールの遺伝子送達能力
は、培養された細胞のトランスフェクションによって、そしてその後in vivoで
静脈内注射によって研究された（表２及び３）。置換アミノエタノールは、バイ
ヘッド脂質と名付けられた１つの疎水性物質と連結された２つの親水性極性ヘッ
ドを有する。バイヘッド脂質は、単層膜を形成するものとして提唱されている。
【０１７９】 置換アミノエタノール（カチオン化合物）は実施例１〜３４に記述されている
通りに調製された。その遺伝子送達能力は、標準的方法を用いて静脈内注射によ
り、in vivoで調製された（表１及び２）。マウスに対し尾静脈注射を介して、
調製物を投与し、５時間後に遺伝子発現を決定した。１３〜１５ｇの雌のＣＤ−
１マウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｉｎｃ．から購入した。指示された重
量比として、４０マイクログラムｐＣＩＬｕｃがＧＣ脂質又はＧＣ脂質：ｃｈｏ
１分散と複合体を形成した。５時間後に、マウスを屠殺し、器官を収集した。器
官を０．５ｍｌの溶解緩衝液中で均質化し、２０μｌの上清をルシフェラーゼ検
定のために使用した。ルシフェラーゼ活性 (Luciferase activity) を４匹のマ
ウスの相対発光量（ＲＬＵ）の平均として表わした。脂質は単独で、又はコレス
テロールと組合わされた状態で用いられ、一定範囲の重量及び投入比で標準手順
によりルシフェラーゼリポータ遺伝子プラスミドと複合体を形成した。ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏスクリーンのためには、４０μｇのｐＣＩＬｕｓを、製剤と複合体形成
させ、マウスの体内に注入した。
【０１８０】 構造と遺伝子送達機能の関係も同様に研究した。脂肪酸鎖の数及び長さは、そ
の遺伝子送達能力に影響を及ぼすことがわかった。脂質がわずか１つの鎖しかも
たなかった場合、トランスフェクション活性は、酸の鎖の長さとは無関係に観察
されなかった。２つの鎖の長さがＣ１４よりも短かかった場合、トランスフェク
ション活性は同じく観察されなかった。脂質が１つの短鎖（＜Ｃ１４）と１つの
長鎖（＞Ｃ１４）を有していた場合、これは遺伝子を送達しなかった。しかしな
がら、Ｃ１４及びＣ１６といったようなさらに長い鎖を伴う場合、脂質は、ｉｎ
ｖｉｔｒｏのみならずｉｎ ｖｉｖｏでもトランスフェクション活性を示した
。ｉｎ ｖｉｔｒｏ トランスフェクション活性は、リポフェクタミン（Lipofe
ctamine）７といったような市販の脂質調製物よりも高いものでさえあった。
【０１８１】 親水性極性ヘッド内の２つのアンモニウム基の間の炭素鎖の長さがＣ４からＣ
１２に増大した場合、水中の脂質の立体配座は、１ヘッドをもつ標準的な脂質か
ら分子の各端部に２つのヘッドを伴う形へと変化する可能性がある。従って、か
かる脂質は本書ではバイヘッド脂質と呼ばれ、これは、図３に示されている。
【０１８２】 図３，４に示された化学構造である置換アミノエタノール ＣＧＰ４４０１５
及びＣＧＰ４７２０４は、水中で分散して、直径１〜２０mm前後のきわめて小さ
い均質なミセルを形成する。これらは、プラスミドＤＮＡに結合してＤＮＡに対
するカチオン化合物の投入比に応じた粒度をもつコア複合体を形成する。この点
において、これらは、図４に異なる化合物と共に例示されているような核酸と共
に小さく比較的均質で安定した複合体を提供する置換アミノエタノールクラスの
化合物を代表している。投入比が１を超える場合、粒子は、１００ｎｍ未満の直
径をもち均質である。それらのトランスフェクション活性は、４に至るまで増加
する投入比に伴って増大する。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの最適な投入比は４である。
トランスフェクション活性は、投入比のさらなる増大に伴って減少した。ｉｎ
ｖｉｖｏ トランスフェクション活性及び投入比の関係は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで
のものと類似していたが、最適な投入比は４〜１０である（表１及び２）。全体
として、同じ投入ヘッド基をもつ化合物は、プラスミドＤＮＡとの優れた複合体
形成及びｉｎ ｖｉｔｒｏならびにｉｎ ｖｉｖｏの両方での遺伝子送達を示し
た。
【０１８３】 置換アミノエタノールはここでは、１つの疎水性物質によって連結された２つ
の親水性極性ヘッドを有すると思われ（図３），バイヘッド脂質と呼ばれる。い
ずれかの側にある２つの親水性ヘッドが１つの水溶液と面する可能性があること
から、これらの化合物は、１つのヘッド基をもつ脂質によって形成される２層の
代りに水中で単層を形成し得る（図３.１）。
【０１８４】 これらの結果は、優れた遺伝子移行能力を示す。好ましい脂質の中でも、ＣＧ
Ｐ４４０１５Ａ及びＣＧＰ４７２０４Ａは、in vivoでの発現を示すコア複合体
を形成する。ＣＧＰ４４０１５及びＣＧＰ４７２０４は、両方のヘッドで同じ正
の投入をもつ。
【０１８５】 バイヘッド脂質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでもｉｎ ｖｉｖｏでも高い遺伝子移行
能力を示す。
【０１８６】
【表２】
【０１８７】
【表３】
【０１８８】
【表４】
【０１８９】 実施例３６： プラスミド核酸とカチオン脂質のコア複合体の調製 カチオン脂質ＧＣ−００１，ＧＣ−００３，ＧＣ−０１６，ＧＣ−０２１，Ｇ
Ｃ−０２５，ＧＣ−０２６，ＧＣ−０２９，ＧＣ−０３０，ＧＣ−０３３，ＧＣ
−０３４，ＧＣ−０３５，ＧＣ−３８，ＧＣ−０３９及びＧＣ−０７１は、Ｐｒ
ｏｍｅｇａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓａｎ Ｌｕｉｓ Ｏｂｉｓｐｏ，
ＣＡ〔旧ＪＢＬ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｉｎｃ／Ｇｅｎｔａ〕から購入した
。その他の材料及び方法は、実施例３５に記述した通りに行なった。選択された
器官内のルシフェラーゼ発現の測定については、表３にまとめられている。
【０１９０】 全ての化合物をｉｎ ｖｉｖｏ活性について評価した。２つの非常に重要な因
子、すなわち、コレステロールを伴う又は伴わない製剤形態及びカチオン脂質対
ＤＮＡの比について検討した。コレステロールは、１：１の脂質：コレステロー
ル比でテストした。ＣＤ−１マウスの体内に静脈内注射した４０μｇ用量のカチ
オン脂質と又は脂質：コレステロール（１：１モル比）複合体形成したｐＣＩＬ
ｕｃで、研究を実施し、次に５時間後に異なる器官内でのルシフェラーゼ活性を
決定した。最初の評価には、２及び１０という重量比（ＧＣ脂質対ＤＮＡ）で１
４ＧＣ脂質全てが含まれていた。これは、４回の別々の実験により実施された。
標準対照として、毎回カチオンリポゾームＤＯＴＡＰ：コレステロールを使用し
た。結果は表４に示されている。多くのＧＣ脂質製剤が、脾臓及び肝臓において
２０μｌのリゼイトにつき２０００ＲＬＵ以上のルシフェラーゼ活性を示した。
【０１９１】 最初の実験よりも広い重量比で、脂質ＧＣ−０３０，ＧＣ−０３４及びＧＣ−
０２９で測定を繰返した。トランスフェクション手順は、表３に示された結果に
ついてのものと同じであった。ルシフェラーゼ活性は、４匹のマウスの相対発光
量（ＲＬＵ）の平均として表わされている。ＷＲは、ＧＣ脂質対ＤＮＡの重量比
を意味する。結果は、Table５に示されている。トランスフェクション活性は、
１器官あたりのルシフェラーゼ活性ＲＬＵで表わされた。ＧＣ−０３０は、重量
比２０で高いトランスフェクション活性を示した。トランスフェクション活性は
、重量比の増大（ＧＣ脂質対ＤＮＡ）と共に増大した。コレステロールの内含に
より、検査対象の異なる器官内の遺伝子発現の生体内分布が変化する可能性があ
る。例えば、ＧＣ−０３０は単独で、脾臓内の高いルシフェラーゼ活性を結果と
してもたらし、ＧＣ−０３０：コレステロールは、肺における高いルシフェラー
ゼ活性を結果としてもたらした。しかしながら、コレステロールのこの機能はＧ
Ｃ−０３４では見られなかった。ＧＣ−０３０は、重量比２０で脾臓内で高いル
シフェラーゼ活性、実際にはＤＯＴＡＰ：コレステロール標準のものよりも３６
倍高い活性を示した。同様にして、ＧＣ−０３０：コレステロールは、肺の中で
、ＤＯＴＡＰ：コレステロールのものより約５倍高い肺の中の高いルシフェラー
ゼ活性を示した。これらの結果は、ＧＣ脂質が、遺伝子送達ベクターのための優
れたコア複合体を形成することを示している。
【０１９２】
【表５】
【０１９３】
【表６】
【０１９４】
【表７】
【０１９５】 実施例３７： 線形ＰＥＩの調製 ２２ｋＤａのＭＷをもつ線形ＰＥＩを、ポリアミンに対する酸加水分解によっ
てポリエチルオキサゾリン重合体（ＰＥＯＺ）から調製した。ＰＥＯＺは、Ｚａ
ｌｉｐｓｋｙ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ；８５：１３３−１
３７（１９９６）により以前に報告された手順と基本的に同じ手順に従ってメチ
ルトシレートと５００当量の２−エチル−２−オキサゾリンを用いた重合によっ
て調製した。２−メチル−２−オキサゾリンはアセトニトリル中でＭＷ１６２０
０で沈降したため、その代りに２−エチル−２−オキサゾリンを用いる必要があ
った。同様に、より高い反応時間も必要であった。
【０１９６】 ＭＷ４９５００ｋＤａのポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）の調製 使用に先立ち加熱する一方で真空下で乾燥されたねじ込み口金付き管の中で重
合反応を実施した。管に、ＫＯＨ上で精製したばかりの５.０５ｍｌの２−エチ
ル−２−オキサゾリンと５ｍｌの乾燥アセトニトリルを投入した。乾燥アセトニ
トリル １０.５５ｍｌ中で４９１mgの精製したばかりのメチルトシレートを溶解
し、単量体の入った管にこの溶液を０.４ｍｌ移した。この移送の後、管をアル
ゴンでパージし、密封し、１１２時間８０℃で油浴内で撹拌しながら放置した。
室温で冷却した後、２ｍｌのＫＯＨメタノール溶液（０.５Ｍ）を、重合混合物
に添加しそれに続いて、５時間２５℃で撹拌した。０.２ｍｌの氷酢酸を添加し
、混合物を固体になるまで濃縮し、５０ｍｌの水中で再度溶解させ、３５００分
子量カットオフスペクトル／Ｐｏｒ透析膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ， Ｌｏｓ Ａｎ
ｇｅｌｅｓ， ＣＡ）内に入れた。透析は、５０ｍＭのＮａＣｌ（１×４Ｌ）及
び水（３×４Ｌ）に対するものであった。透析バッグの中味を凍結乾燥させ、さ
らに真空下で乾燥させ１４.５１ｇの白色固体（９１％）を得た。質量スペクト
ル分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）は、ｍ/ｚ ４５０００−６５０００でクラスタを
示し、５２.３９５（予想値ｍ／ｚ ４９,５００に集中していた。 １ＨＮＭＲ（４００ ＭＨｚＣＤＣＬ３）δ１.１１−１.１２（ｍ，ＣＨ３Ｃ
Ｈ２Ｃ＝Ｏ），２.３１−２.４１（ｍ，ＣＨ３ＣＨ２Ｃ＝Ｏ），３.４６（ｍ，
ＣＨ２Ｎ） １３ＣＮＭＲ（１００ ＭＨｚＣＤＣＬ３）δ９.２（ｂｓ，ＣＨ３ＣＨ２Ｃ＝
Ｏ），２５.８２（ｓ，ＣＨ３ＣＨ２Ｃ＝Ｏ），４３.５４−４７.２７（ｍ，Ｃ
Ｈ２Ｎ），１７３.７９−１７４.４０（ｍ，Ｃ＝Ｏ）
【０１９７】 ＭＷ２２ｋＤａの線形ポリエチレンイミンの調製 ねじ込み口金付き管の中で酸加水分解を行なった。管に、ＭＷ４９,５００ｋ
Ｄａのポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）０.１ｇ及び３.３Ｍの塩酸水溶液
１０ｍｌを投入した。溶液を脱ガスし、アルゴンでパージし、密封し、６５時間
油浴中で撹拌しながら放置した。より高い酸濃度は、１００℃での加水分解中沈
降を導いた。冷却後、混合物を、固体になるまで濃縮し、水中で溶解させ、再び
固体になるまで濃縮した。１ｍｌの水中で再度溶解させ、２.５ＭのＮａＯＨ水
を添加することによってｐＨを１２〜１３に調整した。線形ポリエチレンイミン
の沈降物を遠心分離により収集し、さらに水（２×１ｍｌ）で洗浄して４３mgの
白色固体（１００％）を得た。１ＨＮＭＲ（３６０ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ２.
７３（ｂｒ，ＣＨ２Ｎ）
【０１９８】 実施例３８ ５０μｇ／ｍｌの濃度のサケ精子ＤＮＡ及びポリエチレンイミン流を、５０μ
ｌのカートリッジ３本を縦列式で含むＨＰＬＣ静止ミキサー内に供給した。粒子
の各調製物の作製において、同じ流量で各々の流れがミキサーに供給され、かか
る流量は、カートリッジを通って流されるＤＮＡ及び重合体の結果として得られ
た組合せ流として維持された。流量は２５０μｌ／分〜５０００μｌ／分であっ
た。一定の与えられた流量で作られた各調製物についての粒度は、Table６に示
されている。
【０１９９】
【表８】
【０２００】 実施例３９ 縦列式の３本の１５０ｍｌ入りカートリッジを収納するＨＰＬＣミキサー内に
ＤＮＡ及びポリエチレンイミン流が供給され、流量が５００μｌ／分から７００
μｌ／分まで変動したという点を除いて、実施例３８の手順をくり返した。一定
の与えられた流量で作られた各調製物についての粒度は、Table７に示されてい
る。
【０２０１】
【表９】
【０２０２】 実施例３８及び３９の結果は、混合カートリッジのサイズを変更し流量を変更
することによって粒度を調整できるということを示している。かくして、所望の
サイズ及び均質性をもつ粒子を提供する条件を選択することができる。
【０２０３】 実施例４０ ＤＮＡと重合体の混合の後にＤＮＡ及び重合体に対し変動する濃度の塩化ナト
リウムを添加するという点を除き、実施例３８の手順をくり返した。一定の与え
られた塩濃度で作られた各調製物についての平均粒度は、Table８に示されてい
る。
【０２０４】
【表１０】
【０２０５】 以上の結果は、塩を添加することにより粒度を制御できること及びかかる粒子
のサイズが均等にとどまることを示している。
【０２０６】 実施例４１ ＤＮＡ濃度が１００μｇ／ｍｌであり流量が５００μｌ／分から４０００μｌ
／分まで変動したという点を除いて、実施例３８の手順をくり返した。一定の与
えられた流量で作られた各調製物について粒度は、Table９に示されている。
【０２０７】
【表１１】
【０２０８】 以上の結果は、実施例３８の結果と比べたとき、ＤＮＡの濃度を変更すること
で粒度を変更できるということを示している。
【０２０９】 実施例４２ ミキサーが２５０μｌ入りカートリッジを一個収納していたこと及び、ポリエ
チレンイミン流との混合に先立ちＤＮＡ流に対し０．２５重量％の量でＴｗｅｅ
ｎ８０洗浄剤がＤＮＡ流に添加され、ＤＮＡ及びＴｗｅｅｎ８０流について流量
が２１０μｌ／分／８４００μｌ／分まで変動させられたという点を除いて、実
施例３８の手順をくり返した。ＤＮＡ及びＴｗｅｅｎ８０流及び重合体流が当初
ミキサー内に供給させられた時点で、ＤＮＡ及びＴｗｅｅｎ８０流の流量は、重
合体流のものの１．４倍であった。ＤＮＡ及びＴｗｅｅｎ８０及び重合体の組合
せ流がカートリッジを通って走行した時点で、組合せ流の流量は、ＤＮＡとＴｗ
ｅｅｎ８０流及び重合体流の初期流量の平均であった。例えば、ＤＮＡ及びＴｗ
ｅｅｎ８０流が、４９００μｌ／分の初期流量を有し、重合体流が３５００μｌ
／分の流量を有していた場合、カートリッジを通る組合せ流の流量は４,２００
μｌ／分であった。
【０２１０】 一定の与えられた流量で作られた各調製物についての粒度は、Table１０に示
されている。
【０２１１】
【表１２】
【０２１２】 ＊ＤＮＡ及びＴｗｅｅｎ８０流れの初期流量 上述の調製物には、一般に約１０ｎｍ〜約２０ｎｍのサイズをもつミセルが含ま
れている。これらのミセルのサイズは、以上に示された平均粒度の決定に考慮さ
れた。かかるミセルは、Ｔｗｅｅｎ８０洗浄剤から形成され、その使用又は保管
に先立ち調製物から限外ろ過により除去することができた。
【０２１３】 かくして、もう１つの実験では、ＤＮＡ／Ｔｗｅｅｎ流の初期流量が４９００
μｌ／分で、重合体流の初期流量が３５００μｌ／分であり、ＤＮＡ濃度が２０
．８μｇ／ｍｌである上述のとおりに調製された粒子及びミセルの調製物は、以
下の平均粒度及び粒度分布を有していた。
【０２１４】 単一モード平均 (Unimoal mean) − ４２.６ｎｍ 標準偏差、単一モード (Std. dev. Unimodal) − １９.６ 標準偏差、％ (% std. Dev.) − ４６ ＳＤＰ平均 (SDP mean) − ７５.５ 標準偏差 (Std. Dev.) ＳＤＰ − ３２.６ 標準偏差 ％ − ４３
【０２１５】 この調製物を、０．２μフィルタを通してろ過しその後、等尺性構造をもつ３
００μｌ／分の流量でのＡｍｉｃｏｎポリスルホン（分子量５００Ｋｄａ）膜を
通した限外ろ過に付した（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｂ
ｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ）。ミセルの除去を提供する濃縮とろ過の後、調製物は、
４５０μｇ／ｍｌのＤＮＡ濃度を有していた。調製物を７日間保管し、平均粒度
及び粒度分布を、保管開始時点、１２時間後、２日目、３日目、７日目、１６日
目及び４３日目に測定した。粒度はTable１１に示されている
【０２１６】
【表１３】
【０２１７】 以上の結果は、この例に記述された手順に従って生成された粒子の調節物が、
粒度が基本的に一定であるという点で経時的に安定した状態にとどまるというこ
とを示している。
【０２１８】 実施例４３ ＤＮＡ及びＴｗｅｅｎ８０及びポリエチレンイミンが５０μｌのカートリッジ
内に流され、その後ミキサー内に収納された２つの１５０μｌ入りカートリッジ
内に流され、ＤＮＡ及びＴｗｅｅｎ８０流の初期流量が２５０μｌ／分から３５
００μｌ／分まで変動させられたという点を除いて、実施例４２の手順をくり返
した。一定の与えられた流量で作られた各調製物についての粒度はTable１２に
示されている。
【０２１９】
【表１４】
【０２２０】 ＊重合体流の１．４倍の流量を有する、ＤＮＡとＴｗｅｅｎ８０流の初期流量 以上の表から、均質な調製物を提供する最も望ましい条件を選択した。これら
の条件を応用して３つの独立したバッチを生成した。 次に、上述の手順を１５００μｌ／分の初期流量で２回くり返した。１５００
μｌ／分の流量でのもとの実験（実験３８）及びくり返した実験（実験３９及び
４０）の結果が、Table３１に示されている。
【０２２１】
【表１５】
【０２２２】 以上の結果は、一定の流量で重合体対ＤＮＡの一定の投入比で連続的にＤＮＡ
と重合体の水溶液を混合すると、一貫した形でＤＮＡと重合体の粒子の均質な調
製物が得られ、ここで各調製物には、類似した平均粒度をもつ粒子が含まれてい
るという点で、該方法が再現性あるものであることを示している。かくして、本
発明の方法は、作業者とは無関係である。手作業での混合及びピペット混合とい
ったようなその他の方法は、作業者の技能に依存している。
【０２２３】 各流れが２０ｍｌずつミキサーを通って供給されるような形でかかる手順がスケ
ールアップされたという点を除いて、１５００μｌ／分の流量で上述の手順をく
り返した。単一モード平均及び強度平均によって決定されるような平均粒度は、
以下のとおりであった。
【０２２４】 単一モード平均 ８８．３ｎm 標準偏差 単一モード ３８．２ 標準偏差 ％ ４３ ＳＤＰ平均 １１７ｎｍ 標準偏差 ＳＤＰ ３７．３ 標準偏差％ ３２
【０２２５】 次に、濃縮とろ過の後、調製物は２５０μｇ／μｌのＤＮＡ濃度を有していた
という点を除いて、実施例４２に記述された通りに、この調製物を、０.２μフ
ィルタを通してろ過し、それに続いて３００μｌ／分の流量でAmiconポリスルホ
ン（分子量５００Ｋｄａ）膜を通した限外ろ過により濃縮した。単一モード平均
及び強度平均によって決定された平均粒度は、以下のとおりであった。
【０２２６】 単一モード平均 １０２．９ｎｍ 標準偏差 単一モード ３７．６ 標準偏差 ％ ３７ ＳＤＰ平均 １１５．５ｎｍ 標準偏差 ＳＤＰ ２３．９ 標準偏差％ ２１
【０２２７】 再びこの調製物を、０.２μフィルタを通してろ過し、それに続いて３００μ
ｌ／分の流量でAmiconポリスルホン（分子量５００Ｋｄａ）膜を用いて濃縮し、
その後調製物は、８７０μｇ／μｌのＤＮＡ濃度を有していた。単一モード及び
強度平均によって決定された平均粒度は以下のとおりであった：
【０２２８】 単一モード平均 １０８．６ｎｍ 標準偏差 単一モード ３７．６ 標準偏差％ ３５ ＳＤＰ平均 １１７．５ｎｍ 標準偏差 ＳＤＰ ２５．２ 標準偏差％ ２１
【０２２９】 かくして、上述の結果は、粒子調製物の限外ろ過が、ＤＮＡ及び重合体粒子の
均質な分散を提供することを示している。さらに、かかる均質な粒子を調製する
能力はバッチサイズとは無関係である。
【０２３０】 実施例４４： 線形ＰＥＩとのコア複合体の調製及びその生物活性 臭化エチジウム置換検定によって決定されるように、１００ｍＭのアミンの最
終濃度を得るため、線形ＰＥＩを脱イオン水中に溶解させた。この検定では、１
ｍｍｏｌのＤＮＡリン酸塩を完全に中和させるのに必要とされるＰＥＩアミンの
量として１ｍｍｏｌが定義される。プラスミドＤＮＡ（ｐＣＩＩｕｃ）の２．７
２ｍｇ／ｍｌの原液から２２１μｌを１１０μｌの４５．４６％のグルコース溶
液及び５９７μｌの水と組合わせた。７２μｌのＰＥＩ溶液を混合物に添加し、
２０秒間徹底的に渦流に付し、４：１＋／−比をもつ複合体を調製した。尾静脈
を介してＣＤ−１マウスにこの複合体を２００マイクロリットル注射した。５匹
の動物から成るグループは同じ用量を受けた。５時間後マウスを安楽死させ、そ
の器官を収獲し、摩砕し、溶解させ、前述のとおりルシフェラーゼ発現について
検定した。
【０２３１】 結果は図５に示されている。これらの結果は、複合体がｉｎ ｖｉｖｏでの遺
伝子移行を提供するための活性を呈するもののこの活性は層状化されたコロイド
ベクターのその他の特長を付加することでいくつかの治療的応用分野のために改
善できるものである、ということを示している。
【０２３２】 実施例４５：コア被覆複合体類カチオン性脂質およびＰＥＧ系フソーゲン界面活
性剤類およびＰＥＧ系立体界面活性剤類の調製とそれらの生物活性 カチオン性脂質分散液の調製： 界面活性剤類を含む処方の脂質類全てをシクロヘキサンのような有機溶媒に溶
解させ、所望の比率で混合し、その後乾燥するまで凍結乾燥させた。たとえば、
ＤＯＴＡＰ４５ｍｇおよびコレステロール２５ｍｇまたはＧＣ−０３０ １０ｍ
ｇおよびコレステロール４．７４ｍｇを、それぞれ、ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌおよ
びＧＣ−０３０：Ｃｈｏｌのために用いた。二回蒸留水を前記脂質ケーキに添加
し、最終濃度１０ｍｇ／ｍｌのカチオン性脂質を得（コレステロールは中性脂質
であり、脂質分散液濃度計算のために考慮されず、あるいは、その後のＤＮＡと
の電荷比のために考慮されない）、７０℃で１時間水和させた。前記脂質分散液
を１００ｎｍ孔の炭酸膜（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社）を通し
て押し出すかまたは室温で１分間ボルテックスした。 リポプレックス類の調製： ｐＣＩＬｕｃ ４０μｇを１０％グルコース １００μｌに溶解させ、蒸留水
１００μｌに溶解させた種々の量の脂質類分散液と手で混合した。グルコースの
最終濃度は、５％である。ＤＮＡ溶液をこの脂質溶液に添加することによって、
混合した。この混合物中におけるＤＮＡに対する脂質類の電荷比は、本文に示し
た。ＤＮＡ／脂質複合体溶液類２００μｌをマウス尾静脈に注入した。各群は、
マウス３−５匹であった。５時間後、マウスを屠殺した。脾臓、肝臓、腎臓、心
臓および肺を切除し、２ｍｌの遠心管（Ｂｉｏ １０１から購入）に入れた。溶
解緩衝液０．５ｍｌを添加後、Ｆａｓｐｒｅｐ ＦＰ１２０（Ｂｉｏ１０１から
購入）中で４０秒間、臓器を振とうすることによって粉砕した。ホモジネートを
デスクトップ遠心器で５分間、１４０００ｒｐｍで遠心分離した。上清２０μｌ
をルシフェラーゼアッセイに使用した。ルシフェラーゼ活性は、Ｐｒｏｍｅｇａ
のルシフェラーゼアッセイシステムキットを用いることによって求めた。 インビボトランスフェクション： インビボ研究は、マウスまたは新生児ラット（３−１０日齢）の尾静脈からＤ
ＮＡ／脂質複合体溶液類を注入することによって実施した。各群は動物５匹とし
た。５乃至８時間後、血液を心穿刺によって採取し、前記動物を屠殺し、他の臓
器（例 肺 (luing)、肝臓 (liver)、脾臓 (spleen)、腎臓 (kideny)、心臓 (he
art)）を外科的に切除した。血清試料は、凝集血を遠心することによって調製し
た。臓器試料は、溶解緩衝液１ｍｌを添加しＢｉｏ１０１ Ｆａｓｐｒｅｐ Ｆ
Ｐ１２０で４０秒間ホモジナイズすることによって、調製した。前記ホモジネー
トは直接レポータジーン活性をアッセイするか、またはミクロ遠心管で１０分間
、１４０００ｒｐｍで遠心分離し、上清をタンパク質活性アッセイのために使用
した。 結果を図７に示した。それらは、前記コア複合体類がインビボジーントランス
ファーを付与する活性を表すことを示しており、無添加ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌに
よって得られた結果であり、前記活性がフソーゲン性添加物によって増大できる
ことを示しており、Ｂｒｉｊ，ＴｈｅｓｉｔおよびＴｗｅｅｎ添加によって得ら
れた結果であり、かつ、前記活性が立体的被覆性添加物の添加によって阻害でき
ることを示しており、Ｃｈｏｌ−ＰＥＧ５０００によって得られた結果である。
【０２３３】 実施例４６：フソーゲンペプチドによる被覆コア複合体類の調製とそれらの生物
活性 材料類： 全てのペプチド類は、市販ペプチド合成会社（Ｇｅｎｅｍｅｄ Ｓｙｎｔｈｅ
ｓｉｓ社、南サンフランシスコ、ＣＡ）から少なくとも８５％の純度を有するも
のを入手した。ペプチドＫ１４は、アミノ酸配列ＫＫＫ ＫＫＫ ＫＫＫ ＫＫ
Ｋ ＫＫを有している。ペプチドＫ１４Ｆｕｓｏは、インフルエンザヘマグルチ
ニン由来フソーゲン性ペプチドを有しており、そのアミノ酸配列は、ＧＬＦ Ｇ
ＡＩ ＥＧＦ ＩＥＮ ＧＷＥ ＧＷＩ ＤＧＷ ＹＧＣ ＫＣＫ ＫＫＫ Ｋ
ＫＫ ＫＫＫ ＫＫＫ Ｋを有している。リポフェクタミンおよびリポフェクチ
ンは、ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）から購入した。 方法： トランスフェクション： ＢＬ−６細胞を１日前に１００００細胞／ウェルで９６穴プレートの各ウェル
に接種した。ｐＣＩｌｕｃ２ ＤＮＡ０．５μｇおよび記載した種々の量のペプ
チド（μｇ）またはリポフェクチン性リポフェクチング試薬（μｌ）を別々に、
無血清培地５０μｌに添加した。その後、前記ペプチドまたはリポフェクチング
試薬含有培地を、ＤＮＡ含有培地に添加した。前記混合物を室温で３０分間イン
キュベーションし、その後、前記細胞に添加した。３時間インキュベーション後
、前記トランスフェクション溶液を除去し、培地を血清含有培地に交換した。 ルシフェラーゼ活性は、Ｐｒｏｍｅｇａ製ルシフェラーゼアッセイキットによ
りトランスフェクション２４時間後、指示された操作に従って測定した。 結果を図８に示した。それらは、前記コア複合体類がインビボジーントランス
ファーを付与する活性を示し、それが、コアによって変化することを示している
。Ｋ１４および前記２種の市販脂質試薬類によって得られた結果は、前記２種の
脂質類によって形成されたコアがＫ１４によって形成されたコアよりも実質的に
高い発現を示すことを示している。前記結果は、また、Ｋ１４によって形成され
たコアの活性がフソーゲン性ペプチド配列を添加することによって増大すること
を示しており、発現の実質的増加をもたらし、前記２種の脂質類による発現に匹
敵する。このように、層化コロイドのいくつかの特性が示された。
【０２３４】 実施例４７：ヒドラゾン連結の調製と酸性ｐＨ誘発切断（合成、切断アッセイ方
法類、結果類） １−アセチル−２−パラメトキシフェニルヒドラゾンの調製 酢酸ヒドラジド０．１０８ｇのメタノール０．２ｍｌ溶液を攪拌し、それに対
して、アニスアルデヒド０．３３ｍｌをゆっくりと添加した。添加後、反応物を
さらに４８時間攪拌した。反応混合物０．１ｍｌを取り出し、水０．４ｍｌに対
して添加した。その後、アリコット０．０８５ｍｌをＣ８逆相ｈｐｌｃ（Ｖｙｄ
ａｃ ３００Ａ、１０μ、２５０ｍｍｍ´ １０ｍｍ）を用いて、０．０２５Ｍリン酸ナトリウム水溶液ｐＨ７．５を溶媒Ａ
としてかつメタノールを溶媒Ｂとして用いて、精製した。１ｍｌ／分のフローお
よび３５分間におよぶ５５％−９５％勾配の溶媒Ｂを用いた。生成物１−アセチ
ル−２−パラメトキシフェニルヒドアゾンを、１５分時点で勾配中に溶出したピ
ークから採取し、白色固体０．０２０ｇを得た。 １Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）は、比１：１．６９でａｎ
ｔｉ−およびｓｙｎ−幾何異性体類という２個の生成物異性体類の存在を示した
。 主な異性体：δ ２．１７（ｓ，ＣＨ３Ｃ＝Ｏ）、３．７９（ｓ，ＣＨ３Ｏ）
、６．９８（ｄ，Ｊ＝８．８，Ａｒ）、７．５９（ｄ，Ｊ＝８．６，Ａｒ）、７
．９２（ｓ，ＡｒＣＨ＝Ｎ）、１１．１０５（ｓ，ＮＨＡｃ） マイナー異性体：δ １．９２（ｓ，ＣＨ３Ｃ＝Ｏ）、３．７９５（ｓ，ＣＨ ３ Ｏ）、６．９９（ｄ，Ｊ＝８．８，Ａｒ）、７．６１（ｄ，Ｊ＝８．４，Ａｒ
）、８．０８（ｓ，ＡｒＣＨ＝Ｎ）、１１．２２（ｓ，ＮＨＡｃ） 酸加水分解研究のため、１−アセチル−２−パラメトキシフェニルヒドラゾン
のａｎｔｉ−／ｓｙｎ混合物０．３５ｍｇを、１０％メタノール含有０．０５Ｍ
クエン酸ナトリウム／リン酸カリウム、ｐＨ５ ２ｍｌ中に溶解させた。前記混
合物をＮａＯＨを用いてｐＨ５に迅速に調節し、反応物を３７０℃に保持した。
０．１ｍｌを経時的に採取し、０．２５Ｍ リン酸カリウム、ｐＨ７．５ ０．
３ｍｌを添加し、ｐＨを７．５に増加させた。溶媒Ａを０．０２５Ｍリン酸ナト
リウム水溶液、ｐＨ７．５および溶媒Ｂをメタノールとして、Ｃ８逆相ｈｐｌｃ
（Ｖｙｄａｃ ３００Ａ、１０μ、２５０ｍｍ´ １０ｍｍ）に注入した。１ｍｌ／分のフローおよび３５分間にわたる５５％−９
５％勾配の溶媒Ｂを用いた。加水分解速度は、４−メトキシベンズアルデヒドお
よび１−アセチル−２−パラメトキシフェニルヒドラゾンピーク類のピーク面積
によって求めた。 上記酸加水分解研究は、ｐＨ５．５および６．１の緩衝液を用いて同様に行っ
た。 結果を図９に示した。それらは、ヒドラゾン連結が酸性ｐＨによって加水分解
できることおよび切断速度が前記連結の化学構造に依存することを示している。
このように、酸性条件暴露によって物理的状態をベクターが変化させるという層
化コロイドベクターのいくつの特徴を示した。酸性条件による変化の用途として
は、立体保護層の喪失とフソーゲン性活性の誘発が挙げられる。
【０２３５】 実施例４８：リガンドペプチド被覆コア複合体類の調製とそれらの生物活性 Ｋ１４−ＲＧＤおよびＫ１４−ＳＳＴの合成 ペプチドリガンド結合物類を含む複合体類の調製とリガンド媒介細胞結合およ
び取り込み 材料類： 少なくとも純度９０％のアミノ酸配列ＫＫＫ ＫＫＫ ＫＫＫ ＫＫＫ ＫＫ
Ｓ ＣＲＧ ＤＣを含むＫ１４ＲＧＤペプチドは、Ａｌｐｈａ Ｄｉａｇｎｏｓ
ｔｉｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ，ＴＸ）で合成
された。ペプチドＫ１４ＳＭＴは、アミノ酸配列ＫＫＫ ＫＫＫ ＫＫＫ ＫＫ
Ｋ ＫＫＡ ｄ−ＦＣＹ ｄ−ＷＫＴ ＣＴを含有し、ペプチドＫ１４ＭＳＴは
、アミノ酸配列ＫＫＫ ＫＫＫ ＫＫＫ ＫＫＫ ＫＫＡ ＴＤＣ ＲＧＥ Ｃ
Ｆを含有する。ＳＭＴおよびＭＳＴペプチド類の両者ともに、Ｇｅｎｅｍｅｄ
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｉｎｃ．（ＣＡ，南サンフランシスコ）が合成し、酸化し
、環状ペプチドを製造した。前記ペプチドは、前記製造業者が純度９０％に精製
していた。ＣＨＯ（Ｓｓｔ＋）細胞株を、Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ
（Ｄｒ．Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ Ｒａｕｌｆ）から入手した。この細胞株は、ヒト
ソマトスタチンレセプターＳｓｔ２を安定に発現させるために選択した。 方法： ＨＵＶＥＣ細胞２００００個を９６穴プレートの各ウェルに接種し、トランス
フェクションに先立ち１２時間培養した。０または２μｇのＫ１４ＲＧＤペプチ
ドを、０．１μｌから４μｌの記載した量のリポフェクチンと無血清培地５０μ
ｌ中で１５分間、混合した。前記混合物を、０．５μｇのｐＣＩｌｕｃ２ ＤＮ
Ａ含有無血清培地５０μｌに添加した。このポリ−リポプレックスを３０分間イ
ンキュベーションした後、前記細胞に添加した。トランスフェクション溶液を３
時間後除去し、血清含有培地を前記細胞に添加した。 １００００個のＣＨＯ（Ｓｓｔ２）細胞を、０．４ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８とと
もに血清含有培地中で１２時間培養した後、９６穴プレートの各ウェルにトラン
スフェクションした。前記培地を、トランスフェクション前に無血清培地に交換
した。ペプチドは、１μｇから１０μｇ／ウェルの記載量で前記細胞に添加し、
３０分間インキュベーションし、その後、同一培地に０．５μｇのｐＣＩｌｕｃ
２を添加し、前記細胞をトランスフェクションさせた。４μｌのリポフェクチン
は、対照として使用した。 ２４時間時点で、ルシフェラーゼ活性をＰｒｏｍｅｇａのルシフェラーゼアッ
セイキットによって指示操作に従い測定した。 結果： 結果を図２５および２６に示した。図２５は、リポフェクチンコア複合体類に
対してペプチドリガンド（Ｋ１４ＲＧＤ）を添加することによる発現増大を示し
た。図２６は、ポリリシンコア複合体類にペプチドリガンド（ソマトスタチンす
なわちＳＭＴ）を添加することによる発現増大を示したが、それは、変異ソマト
スタチン配列（ＭＳＴ）を使用したときには観察されない。これらの図は、前記
コア複合体類がある程度活性を示すこともあるが、にもかかわらず、前記コアの
活性は標的化リガンドを添加することによって改善でき、発現が実質的に増大す
ることになったことを示している。このように、層化コロイドベクターのいくつ
かの特徴を示した。
【０２３６】 実施例４９：核酸連結ＮＬＳ部分の調製 核酸にＮＬＳ部分をカップリングするためにいくつか手段を使用でき、その一
部を図１０Ａに示したが、それらには、核酸に対する直接結合および核酸を配列
特異的にまたは配列とは独立して結合する別の物質を介しての間接結合を含む。
ＮＬＳを核酸に連結するためのこれらの手段に必要な物質類は、トリプレックス
オリゴペプチド、ＰＮＡ−ペプチド、ＰＣＲ断片、プラスミドＤＮＡ、制限酵素
断片類、クオドラプレックスのようなキャッピング剤類、およびＰＥＧおよびポ
リオキサゾリンのようなスペーサー類の合成を含む。 ＤＮＡに結合したＰＮＡ−ＮＬＳペプチド： ｐＣＩｌｕｓ由来コード領域を含む線状ＤＮＡ断片を調製し、ＰＣＲによって
増幅させた。前記反応のプライマー類は、前記線状断片が配列ＡＡＡＧＡＧＧＧ
およびＧＡＧＡＧＧＡＡをそれぞれその５‘および３’末端上に含有するように
設計した。ペプチド核酸（ＰＮＡ）配列類、Ｘ−Ｏ−Ｏ−ＴＴＴＣＴＣＣＣ−Ｏ
−Ｏ−Ｏ−ＣＣＣＴＣＴＴＴおよびＹ−Ｏ−Ｏ−ＴＴＣＣＴＣＴＣ−Ｏ−Ｏ−Ｏ
ＣＴＣＴＣＣＴＴは、固相合成によってＲｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（
Ｈｕｎｓｔｖｉｌｌｅ，ＡＬ）において合成した。ここで、ＣおよびＴは、シト
シンおよびチミンＰＮＡアナログ類であり、Ｏは、８−アミノ−３．６−ジオキ
サオクタン酸リンカーである。Ｘは、ＳＶ４０ ラージＴアンチゲンＮＬＳ配列
ＰＫＫＫＲＫＶＥＤＰＹを示しており、一方、Ｙは、ローダミンである。前記２
種の化合物類はＨＰＬＣによって精製し、マススペクトロスコピーによって分析
した。 前記２個のＰＮＡ分子類は、図１０Ａに示したように、線状ＤＮＡ断片類の相
補性５‘および３’末端類とともに“クランプ”を形成するように、設計した。
ＤＮＡ−ＰＮＡ複合体は、２０倍モル過剰の２種のＰＮＡ分子類を前記線状ＤＮ
Ａと混合することおよび３７℃で１時間インキュベーションすることによって、
形成させた。前記複合体をその後、未結合物質からＣｅｎｔｒｉｃｏｎ セパレ
ータ（ＭＷＣＯ＝１０，０００Ｄ）で分離し、１％アガロースゲル電気泳動およ
びＵＶ照射によりローダミンラベルを発光させることによって可視できるように
した。前記ゲルをその後、エチジウムブロマイド中でインキュベーションし、Ｕ
Ｖ照射を行った。前記ローダミンおよびＤＮＡバンド類は重なって観察され、そ
れらが強く関連していることを示していた。前記物質をその後ＰＥＩと先に述べ
たように複合化し、培養ＳＭ１およびＨＵＶＥＣ細胞を種々の量でトランスフェ
クションさせるために用いた。前記細胞類を溶解させ、ルシフェラーゼ発現を先
に述べた方法によって２４時間後評価した。 トランスフェクション結果は、ＰＮＡ−ＮＬＳ含有線状ＤＮＡ断片が、試験し
た両細胞型をトランスフェクションさせる点において極めて効率的であることを
明確に示している（図１０Ｂ）。最大用量においてＰＮＡ−ＮＬＳ結合ＤＮＡと
対照断片で得られる発現レベルに有意差はないが、用量を２００から５０ｎｇに
低下させるに伴い、ＮＬＳ含有ＤＮＡは、細胞をより効率的にトランスフェクシ
ョンした。この構築体は、その高いトランスフェクション効率を全範囲にわたり
試験両細胞型において保持し、一方、対照断片はかろうじてバックグランドレベ
ルを上回る程度に低下していた。最大用量において核取り込み機構が飽和し従っ
て前記２種の構築体間で有意差がないのであろうというのがひとつの説明である
。用量を低下させると、ＮＬＳ含有ＤＮＡ断片は核中により積極的に移動し、し
たがって、その高レベルのトランスフェクションを保持できる。 しかし、ＰＮＡ−ＮＬＳを欠いているこの構築体が遊離の無保護末端を有して
おりエクソヌクレアーゼ分解を受け得ることに注目することは重要である。この
構築体のため、細胞内部におけるＤＮＡ分解は、有意ＤＮＡ分画が利用できない
とき、特に低用量において観察された低トランスフェクションレベルのひとつの
理由として除外することはできない。
【０２３７】 線状ＤＮＡ−ＮＬＳペプチド結合物の合成： 手段： 得られる線状ＤＮＡが一端に結合部位を有しエクソヌクレアーゼから保護する
構造に折りたたまれる配列を有するように、ＰＣＲ増幅によってプラスミドＤＮ
Ａから線状ＤＮＡ断片を合成する。 ５’ ＸＣＡＴ ＧＧＣ ＴＣＧ ＡＣＡ ＧＡＴ ＣＴＴ ＣＡＡ ＴＡ
３’（ＦＢ１）（Ｘ：アミンのＣ６リンカー） ５’ Ｘ１Ｘ２Ｘ３ ＴＧＧ ＧＴＴ ＴＴＧ ＧＧＴ ＴＴＴ ＧＧＧ Ｔ
ＴＴ ＴＧＧ ＧＴＴ ＴＧＧ ＡＴＣ ＣＧＣ ＴＧＴ ＧＧＡ ＡＴＧ Ｔ
Ｇ ３’（ＰＢ）（Ｘ１：アクリジン、Ｘ２，Ｘ３：Ｃ９リンカー） ＰＣＲプロトコール：ＰＣＲ増幅は、標準プロトコールを用いて実施した。 反応混合物は、下記の試薬類を有していた： １．ＰＣＲマスターミックス ５０μｌ ２．無菌蒸留水 ３２μｌ ３．プライマー１（１００ｎｇ／μｌ） ８μｌ ４．プライマー２（１００ｎｇ／μｌ） ８μｌ ５．テンプレート（１ｎｇ／μｌ、１０６コピー） ２μｌ ＰＣＲマスターミックスは、ＰＣＲ緩衝液１Ｘ，Ｂｒｉｊ３５中ＴａｑＰｏｌｙ
ｍ ２．５Ｕ、０．００５％（ｖ／ｖ）ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ、ｄＴＴ
を各０．２ｍＭ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ
ＭｇＣｌ２を含有する。 ＰＣＲ条件： １．９４℃ １分 ２．９４℃（変性） １分 ３． ６０℃（アニーリング） １分 ４． ７２℃（伸長） １分 ２−４の段階は、３８回繰り返す。 ５． ７２℃ ２時間
【０２３８】 ＰＥＧ２０００を介したＤＮＡへのＮＬＳペプチドの結合： アミノ酸配列ＰＫＫ ＫＲＫ ＶＥＤ ＰＹＣを有するＮＬＳペプチドはＧｅ
ｎｅｍｅｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ社から入手し、Ｆｍｏｃ化学を用いる固相法に
よって合成した。前記ペプチドは、逆相ＨＰＬＣを用いて＞９０％純度まで精製
した。前記ペプチドは、ＤＮＡとの反応前に２０ｍＭ ＤＴＴによって処理した
。ＤＴＴ処理ペプチドは、０．１％酢酸を溶媒として用いて遊離ＤＴＴを除去す
るため、Ｇ２５ゲルろ過カラムで精製した。ペプチドは、ＰＥＧ結合ＤＮＡと反
応させるまで０．１％酢酸中に保存した。 ＰＣＲ増幅によって得られた線状ＰＣＲ ＤＮＡは、５０，０００ＭＷＣＯ透
析チューブを４℃で用いて、５０ｍＭ ＮａＣｌ含有１０ｍＭ ＨＥＰＥＳに対
して広範囲にわたって透析し、精製した。ＰＣＲ ＤＮＡ３００μｇは、１．５
Ｍ ＮａＣｌ含有１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５ ２ｍｌ中に溶解させた。
Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓから入手しＤＭＳＯ（ジメチルスルホ
キシド）０．１ｍｌ中に溶解させたＮ−ハイドロキシスクシンイミドＰＥＧビニ
ルスルホン（ＮＨＳ−ＰＥＧ２０００−ＶＳ）１．５ｍｇをＤＮＡに添加し、４
℃で６時間攪拌した。反応混合物を５０，０００ＭＷＣＯ透析チューブに移し、
未反応ＰＥＧ誘導体を除去するため、１Ｍ ＮａＣｌ含有１０ｍＭ ＨＰＥＳに
対して４℃で透析し、その間、緩衝液を頻繁に交換した。 前記ＤＮＡ溶液中の塩濃度は、２Ｍに増加させた。１０ｍＭ ＨＥＰＥＳに溶
解させたＮＬＳペプチド１ｍｇをＤＮＡ溶液に添加し、希釈したＮａＯＨを用い
て前記溶液のｐＨを８．０に調整した。反応混合物を攪拌しながら１６時間４℃
に保持した。反応混合物を、２Ｍついで１ＭのＮａＣｌ含有１０ｍＭ ＨＥＰＥ
Ｓに対して広範囲に透析した。試料を、１Ｍ ＮａＣｌ含有１０ｍＭ ＨＥＰＥ
Ｓに保存した。
【０２３９】 実施例５０：ＰＥＩ−ＰＥＧ結合物の合成、およびＰＥＩ／ＤＮＡ複合体類の大
きさおよび安定性に及ぼすＰＥＧ化の効果 材料および方法 ＰＥＩ（２５ｋＤ）は、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ
（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から入手し、メトキシポリ（エチレングリコール
）−ニトロフェニルカーボネート（ＭＷ５０００）は、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ
Ｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ ＡＬ）から入手した。ＰＥＩ溶液濃
度は、下記の一級アミン含量のためＴＮＢＳアッセイを用いて求めた。ＤＮＡ濃
度は、２６０ｎｍにおける１３，２００ｍｏｌ−１ｃｍ−１のモル吸光係数／塩
基対（１ＯＤ＝５０μｇ ＤＮＡ）を用いて分光測定法によって求めた。コロイ
ド状処方の粒子径は、クールタ（Ｃｏｕｌｔｅｒ）Ｎ４粒子計によって角度９０
°で光分散測定によって求めた。自動相関関数は、粒子単一集団を想定した一元
分析によってまたは製造業者提供ソフトウェアを用いて複数集団を想定したＳＤ
Ｐ分析を用いて、分析した。 ＴＮＢＳアッセイ： 試薬類：ＴＮＢＳ：水、グリシンＨＣｌまたは他のすべての一級アミン標準中
１０ｍＭ：Ｈ２Ｏ，炭酸ナトリウムまたは炭酸水素ナトリウム緩衝液ｐＨ９．０
中１０ｍＭ。 ＊ＴＮＢＳは、メタノール中溶液として購入できる（５％ Ｗ／Ｖ）。 操作： 下記のごとく、一級アミン（グリシンＨＣｌがこの目的のため使用できる）中
、５μＭから０．１ｍＭの濃度範囲において標準溶液セットを調製する。１００
ｍＭ緩衝液中０．１ｍＭ グリシンＨＣｌを３００μｌ調製する。この試料を段
階的に希釈して試料をいくつか調製する。（例 上記試料２００μｌを緩衝液１
００μｌに添加して、６６．６６μＭ濃度に試料を調製し、上記試料２００μｌ
を緩衝液１００μｌに移し、４４．４４μＭ試料を得るなど。調製後最終試料か
ら２００μｌを除去し、全試料が同一容量すなわち１００μｌになるようにする
）。同一試料中で二重または三重に濃度未知の一級アミン試料１００μｌを調製
する。この試料の濃度は、標準曲線の範囲内におさまるようにする。各試料にＴ
ＮＢＳ１００μｌを添加し、ボルテックスする。室温で３０分間インキュベーシ
ョンし、４２０ｎｍにおける吸光度を読み取る。各試料の吸光度からブランクの
吸光度を減じる（すなわち、緩衝液１００μｌで希釈した１０μｌのＴＮＢＳ）
。４２０ｎｍにおける吸光度に対してグリシン濃度により標準曲線を作成する。
傾きおよびこのプロットが軸と交わる点および試料吸光度から、一級アミン類の
濃度を計算できる。 ＰＥＧ５０００とＰＥＩとの結合： ＰＥＩ １０ｍｇを１００ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９に溶解させ、メトキシ
−ＰＥＧ５０００−ニトロフェニルカーボネート ６１ｍｇ（ＰＥＩ残渣の５％
を修飾するのに十分）を添加し、４℃で１６時間反応させた。この反応混合物を
その後、１０，０００ＭＷカットオフを有する透析バッグを用いて２５０ｍＭ
ＮａＣｌついで水で広範囲に透析した。ＰＥＧ３５０のＰＥＩ結合物の合成は、
ＰＥＧ５０００について記載したのと類似の操作を用いて、Ｆｌｕｋａ、Ｍｉｌ
ｗａｕｋｅｅ，ＷＩから入手したＰＥＧ３５０のニトロフェニルカーボネートを
用いて実施した。ＰＥＧ結合の程度は、複合体の重量および一級アミンの濃度を
用いて、推定した。 固定（アンカーされた）ＤＮＡ／ＰＥＩ−ＰＥＧ複合体の形成： 種々のモル濃度のＰＥＧを含有するＤＮＡ／ＰＥＩ−ＰＥＧ複合体類は、等容
量のＤＮＡとＰＥＩ／ＰＥＩ−ＰＥＧ混合物を手で混合し、その後、３０乃至６
０秒間ボルテックスすることによって、調製した。 細胞結合：共焦顕微鏡 ＰＥＩ／ＤＮＡ複合体類の細胞取り込みに及ぼすＰＥＧの効果は、蛍光顕微鏡
によって評価した。Ｏｒｉｇｏｓ Ｅｔｃ．，Ｗｉｌｓｏｎｖｉｌｌｅ，Ｏｒｅ
ｇｏｎから入手した３‘−ローダミン標識ホスホロチオアートオリゴヌクレオチ
ド（５’−ＡＡＧ ＧＡＡ ＧＧＡ ＡＧＧ−３‘−ローダミン）を蛍光マーカ
ーとして用いた。標識オリゴヌクレオチドをＰＥＩまたはＰＥＩ−ＰＥＧと４：
１（＋／−）電荷比で複合し、６穴プレート中で顕微鏡カバースリップ上に増殖
させたＨＵＶＥＣ細胞類とともに３時間、無血清培地中でインキュベーションし
た。３時間インキュベーションした後細胞を無血清培地で洗浄し、さらに２０時
間増殖培地の存在下で増殖させた。これらの細胞をその後ＰＢＳで洗浄し、４％
パラホルムアルデヒドで１５分間固定し、ウェル中にＰＢＳを含有するハンギン
グドロップ顕微鏡スライド上に載せ、細胞をウェルに面するようにかつＰＢＳと
接触させた。スライドを共焦レーザースキャニングで観察した。ＰＥＩ １０ｍ
ｇを１００ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９中に溶解させ、メトキシ−ＰＥＦ５００
０−ニトロフェニルカーボネート６１ｍｇ（ＰＥＩ残渣の５％を修飾するのに十
分）を添加し、４℃で１６時間反応させた。この反応混合物をその後、１０，０
００ＭＷカットオフの透析バッグを用いて２５０ｍＭ ＮａＣｌついで水で広範
囲に透析した。ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ７５０およびＰＥＧ３５０のＰＥＩ結合
物の合成は、ＰＥＧ５０００について記載したのと類似の操作を用いて、Ｆｌｕ
ｋａから入手した各ＰＥＧ類のニトロフェニルカーボネート類を用いて実施した
。ＰＥＧ結合の程度は、複合体の重量および一級アミンの濃度を比較し、推定し
た。 ＤＮＡ／ＰＥＩ−ＰＥＧ複合体の形成： ６０倍の油浸対物レンズを用いる顕微鏡（ＭＲＣ１０００、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）
。ローダミン励起および発光のための光学フィルター類とともにＡｒ／Ｋｒレー
ザー光源を、蛍光イメージを得るために用いた。 生物活性：トランスフェクション ＰＥＩおよびＰＥＩ−ＰＥＧ複合体類のトランスフェクション効率は、ＣＭＶ
プロモータ制御ルシフェラーゼレポータジーン含有プラスミドＤＮＡ ｐＣＩ−
Ｌｕｃを用いて調べた。細胞（ＢＬ６）は、９６穴プレート中に２００００細胞
／ウェルで播種し、８０−９０％コンフルエンシーになるまで増殖させた。それ
らをその後ＰＥＩまたは電荷比５（＋／−）および０．５μｇＤＮＡ／ウェルの
ＤＮＡ用量で調製したＰＥＩ−ＰＥＧ／ＤＮＡ複合体類とともに３時間、無血清
培地中３７℃でインキュベーションした。細胞をさらに２０時間増殖培地中で増
殖させ、その後、ルシフェラーゼ活性をアッセイした。相対光単位によるルシフ
ェラーゼ活性は、市販のキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてアッセイし、９６穴
フォーマットを用いてルミノメータで読み取った。
【０２４０】 結果 コロイド安定性 図１１は、種々の電荷比で調製したＰＥＩ／ＤＮＡの粒子径分布に及ぼすＰＥ
Ｇ結合（ＰＥＧ化）の効果を示している。ＰＥＧ化しないと、ＰＥＩ／ＤＮＡ複
合体類は、電荷比に依存する径分布を有している。正味負荷電では、形成された
粒子は極めて小さかった（約１００ｎｍ）。ほとんど中性の電荷比では、ＰＥＩ
／ＤＮＡ複合体類が、大粒子に形成されるか凝集した。電荷比が正味正に増加す
ると、粒子径は小さくなり、おそらくそれは、会合を低下させる表面電荷反発に
よるのであろう。 ＰＥＧ化ＰＥＩによりＤＮＡ複合体類は小さくなり、その大きさは比較的高濃
度のＤＮＡにおいてもかつ特殊な混合技術を用いないでも電荷比に無関係となる
。これらの実験のため、ＤＮＡをＰＥＧ化ＰＥＩと複合体とし、ＰＥＩアミン残
基の約５％をＰＥＧ５０００と結合させた。この結果、これらの粒子表面にＰＥ
Ｇが存在することになり、電荷中性複合体類についてさえも会合現象を効果的に
低減させた。いかなる理論に拘束されることもなく、これらの効果が複合体表面
に立体バリアを付与するＰＥＧに起因すると考えられる。 ＰＥＩ／ＤＮＡ複合体類は何時間および何日にもわたり大粒子に凝集する傾向
があることが公知である。この不安定性は、従来の複合体類の望ましくない性質
である。図１２は、数日間にわたるコロイド安定性が、電荷比１：１で調製した
ＰＥＧ−ＰＥＩ／ＤＮＡ複合体によるＰＥＩのＰＥＧ化によって達成できること
を示している。数日間の間でさえも、平均粒子径は小さいままであった。これら
のデータは、ＰＥＧ化により遺伝子治療適用においてこれらのコロイド処方の使
用で成果をあげるために必要な長期安定性が得られることを示している。要約す
ると、少量のＰＥＧ（５％）によるＰＥＩ誘導体化により、小粒子の形成が促進
され、かつ前記複合体に実質的安定性が付与される。 血清の効果 最大正荷電ＤＮＡ複合体は血清存在下において細胞をトランスフェクションさ
せるそれらの能力を失うことが広く公知となっている。この不活性化は、非荷電
血清との相互作用を伴い、これら粒子類の凝集および／または前記複合体の脱安
定化につながる。ＰＥＧのＤＮＡ複合体への固定を用いて、この問題を解決でき
る。図１３は、ＰＥＩ／ＤＮＡおよびＰＥＩ−ＰＥＧ／ＤＮＡ複合体類の粒子径
分布に及ぼす血清の効果を示している。 血清とインキュベーションすると、従来の正荷電ＰＥＩ／ＤＮＡ複合体類は実
質的に凝集し、そのことは、約１００ｎｍから５００ｎｍ（０モル％ＰＥＧ）を
超える平均粒子径分布における増加として検証できる。このことは、凝集を媒介
するこれらの複合体類の表面上における血清タンパク質類の結合によるのかもし
れない。ＰＥＧ５０００ ＰＥＧ化ＰＥＩを含有する固定複合体類により、凝集
防止が１モル％を超えるレベルで出現した。この効果は、３モル％で飽和するよ
うであった。この効果は、前記ポリマーの分子量に依存している。ＰＥＧ３５０
は、試験した最大モル％にいたってさえも血清媒介凝集防止に有効ではなく、こ
のことは、図１３ｂに示した。いかなる理論に拘束されることもなく、このポリ
マーの長さが余りに短すぎタンパク質結合に対していかなる有意な立体バリアも
提供できないか、あるいは、前記ポリマーが表面被覆を形成しなかったのかもし
れない。 固定複合体の構造は、粒子表面における吸着タンパク質シェル上に至る伸長ポ
リマー鎖として可視化することもできるであろうが、これは、粒子−粒子会合に
対する立体バリアを付与する（図１４Ａ）。したがって、タンパク質吸着は低下
するか、未変化のまま進むか、あるいは増加さえするのかもしれないが、余剰タ
ンパク質は凝集に対するバリア形成を補助するか、または、表面上で増加した特
定タンパク質類が有益であるのかもしれない。 これらのデータは、ＰＥＧのような親水性ポリマーは、ＰＥＩおよびＤＮＡに
よって形成されたカチオン性粒子類のコロイドおよび生物性質に影響を及ぼすこ
とを示す。立体的ＰＥＧコーティングは、明らかに、ＰＥＩへの共有結合を介し
てＤＮＡ複合体にＰＥＧが固定されたとき、ＰＥＩ／ＤＮＡ複合体類の表面上に
形成された。このコーティングは、粒子径分布の低下、コロイド安定性増大、血
清安定性増大をもたらし、それらの全てが遺伝子運搬系に所望の性質である。 生物活性 ＰＥＩ／ＤＮＡ複合体類の生物活性は、前記複合体の電荷比（＋／−）に依存
することが公知である。正味正の電荷比において、ＰＥＩ／ＤＮＡ複合体類は、
いかなるレセプターの媒介相互作用がなくても単に静電気的相互作用を介して細
胞表面に結合できる。低電荷比（＋／−＜１）において、前記複合体が正味負荷
電で細胞表面との静電気的結合が最小であると予測される場合、これらの複合体
類の細胞トランスフェクションは、極めて非効率である。高電荷比（＋／−＞１
）において、前記複合体が正味正荷電である場合、負荷電細胞表面との静電気的
相互作用は、結合およびエンドサイトーシスまたは類似の機構によるその後の細
胞内取り込みに十分であろう。 前記粒子表面上でのＰＥＧコーティングは、複合体類の相互作用を修飾できる
。表面ＰＥＧの効果は、静電気的相互作用を低下させかつ立体的バリアを作るこ
とである。インビトロトランスフェクションのため、細胞への結合低下により取
り込みが低下するかまたは消滅し、発現を阻害する。インビボ全身適用のため、
タンパク質および細胞相互作用低下は血液循環時間を増加させ、非特異的相互作
用を最小とし、それによって、複合体の標的組織に到達する確率を増大させる。 図２０は、０から５モル％のＰＥＧ化ＰＥＩの範囲にわたりかつ異なる分子量
のＰＥＧにより、電荷比５におけるＰＥＩ／ＤＮＡ複合体類のインビトロトラン
スフェクション効率に及ぼすＰＥＧ化の効果を示している。活性は、レポータ遺
伝子ルシフェラーゼのプラスミド発現として測定する。ＰＥＩ／ＤＮＡ複合体類
は、この電荷比において、高ルシフェラーゼ発現によって示されるように十分に
合理的に前記細胞類のトランスフェクションを行った。前記複合体中におけるＰ
ＥＧ存在は、ＰＥＧの分子量およびモル％に高依存性の発現阻害を示す。この阻
害は、複合体の結合および／またはその後の細胞内プロセッシング阻害に起因す
る。２０００に等しいかまたはそれ以上のＰＥＧ分子量は、前記複合体中ＰＥＧ
モル％が増加するに伴い、発現低下を示す。分子量２０００のＰＥＧの効果は、
３モル％で飽和するようであり、一方、分子量５０００のＰＥＧの効果は、４モ
ル％で飽和する。５％までのＰＥＧ３５０またはＰＥＧ７５０は、複合体活性に
有意な効果を有していないようである。 上記に述べたようなＰＥＧコーティングの存在は、いくつかの経路で複合体生
物活性に影響を及ぼすことができる。正荷電粒子上の前記ポリマー被覆体は、基
本的に表面電荷をマスキングするように作用し、それによって、静電気相互作用
によって媒介される結合を低下させることができる。それはまた、表面上で立体
バリアとして作用でき、結合プロセスを妨害する。また、立体ポリマー類がエン
ドソームエスケープメカニズムに効果を有している可能性がある。小分子量（短
鎖長）ポリマー類は、５モル％まで全く効果を有していないようである。これら
の小ポリマー類が十分でないマスキングを付与するようである。しかし、前記ス
クリーニングまたは立体バリア、またはその両者は不適切であるかどうかは公知
でない。したがって、ＰＥＧが複合体活性を修飾するメカニズムを理解すること
が重要である。
【０２４１】 実施例５１：ＰＥＩ／ＤＮＡ複合体上での脱落可能ＰＥＧ被覆体の調製 ＤＮＡ複合体に及ぼすその安定化効果に加えて、固定保護層の存在は、ＤＮＡ
運搬プロセスにおけるその後の段階に影響を及ぼすことができる。特に、立体層
の存在はエンドゾームからの複合体エスケープにとって悪影響があるかもしれな
いが、これは、複合体とエンドゾーム膜の緊密相互作用を要するプロセスである
。あらゆる起こり得る問題を克服するためのひとつの方法は、化学的または酵素
的操作を用いて複合体から固定立体被覆体を切断する方法類を提供することであ
る。 この例は、粒子表面上の脱落可能被覆体がＰＥＧをＰＥＩに結合させるための
切断可能ジスルフィド結合を用いて作成できることを示している。実施例４４は
、立体ＰＥＧコーティングがＰＥＩ／ＤＮＡ複合体類表面上に形成でき、前記処
方のためにコロイド安定性改善を付与する。この例は、立体被覆体がたとえば還
元条件下で切断できることを示している。 材料および方法 ＰＥＩ（２５ｋＤ）は、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ
から入手し、メトキシポリ（エチレングリコール）−ニトロフェニルカーボネー
ト（ＭＷ５０００）およびメルカプトポリエチレングリコール５０００モノメチ
ルエーテルは、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ ＰｏｌｙｍｅｒｓおよびＦｌｕｋａから
それぞれ入手した。コロイド粒子上の表面電荷は、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｒｐｏ
ｒａｔｉｏｎのＤｅｌｓａ ４４０ＳＸを用いて、これらの粒子の電気泳動移動
度を測定し、それから求めた。他の実験条件は、実施例１に記載したとおりであ
った。 ＰＥＩのＰＥＧ５０００との結合： ＰＥＩ １０ｍｇを１００ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９に溶解させ、メトキシ
−ＰＥＧ５０００−ニトロフェニルカーボネート６１ｍｇを添加し、４℃で１６
時間反応させた。この反応混合物をその後、２５０ｍＭ ＮａＣｌ続いて水に対
して、１０、０００ ＭＷＣＯ透析バッグを用いて広範囲に透析した。ＰＥＧ量
は、乾燥試料の一級アミン濃度および重量から推定した。 ＰＥＧに対してジスルフィド結合で連結させたＰＥＩ（ＰＥＩ−ｓｓ−ＰＥＧ
）は、下記の操作で合成した。ＰＥＩ ２０ｍｇをＤＭＳＯ ２５０μｌに溶解
させた。ＳＰＤＰ ８ｍｇをこの溶液に添加し、４℃で１６時間反応させ、その
間、反応混合物はゲル状になった。１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ｐＨ８．０ ２ｍＬに
溶解させたメルカプトポリエチレングリコール５０００モノメチルエーテル１０
０ｍｇを上記溶液に添加し、２日間反応させ、その間、前記ゲルを溶解させた。
試料は、１０，０００ＭＷカットオフの透析カートリッジを用いて水に対して３
日間広範囲に透析し、水は頻繁に交換した。結合百分率は異なる２種の方法を用
いて推定したが、それらの方法では、（ｉ）ＰＥＧ量は乾燥試料の一級アミン濃
度および重量から推定するか、または、（ｉｉ）前記結合体をＤＴＴで処理した
。ＤＴＴを１０，０００ＭＷカットオフの透析膜を用いて透析によって除去した
後、スルフフィドリルに対する一級アミン比を、ＴＮＢＳ（ＲＤＳ＃）およびＥ
ｌｌｍａｎのアッセイを用いて、求めた。前記２種の操作は、極めて類似の値を
示した。 ＤＮＡ／ＰＥＩ−ＰＥＧ複合体の形成： 種々のモル濃度のＰＥＧを含有するＤＮＡ／ＰＥＩ−ＰＥＧ複合体類は、等量
のＤＮＡおよびＰＥＩ／ＰＥＩ−ＰＥＧ混合物を手で混合した後３０乃至６０秒
間ボルテックスすることによって、調製した。 細胞結合：共焦顕微鏡検査 ＰＥＩ／ＤＮＡ複合体類の細胞取り込みに及ぼすＰＥＧの効果は、蛍光顕微鏡
検査によって評価した。Ｏｌｉｇｏｓ Ｅｔｃ．、Ｗｉｌｓｏｎｖｉｌｌｅ，Ｏ
ｒｅｇｏｎから入手した３‘−ローダミン標識ホスホロチオアートオリゴヌクレ
オチド（５’−ＡＡＧ ＧＡＡ ＧＧＡ ＡＧＧ−３‘−ローダミン）は、蛍光
マーカーとして使用した。標識したオリゴヌクレオチドは、４：１（＋／−）電
荷比でＰＥＩまたはＰＥＩ−ＰＥＧと複合し、６穴プレートにおいて顕微鏡カバ
ースリップ上で増殖させたＨＵＶＥＳ細胞類と無血清培地で３時間、インキュベ
ーションした。３時間インキュベーションした後、細胞を無血清培地で洗浄し、
さらに２０時間増殖培地存在下で増殖させた。その後これらの細胞類をＰＢＳで
洗浄し、４％パラホルムアルデヒドによって１５分間固定し、前記ウェル中でＰ
ＢＳ含有ハンギングドロップ顕微鏡スライド上にのせ、細胞はウェルに面してＰ
ＢＳと接触させるようにした。前記スライド類は、６０倍の油浸対物レンズを用
いるレーザースキャニング共焦マイクロスコープ（ＭＲＣ１０２４、Ｂｉｏ−Ｒ
ａｄ）で観察した。ローダミン励起および発光のための光学フィルター類ととも
にＡｒ／Ｋｒレーザー光源を蛍光イメージを得るために用いた。 生物活性：トランスフェクション ＰＥＩおよびＰＥＩ−ＰＥＧ複合体類のトランスフェクション効率は、ＣＭＶ
プロモータ制御ルシフェラーゼレポータ遺伝子含有プラスミドＤＮＡ ｐＣＩ−
Ｌｕｃを用いて研究した。細胞類（ＢＬ６）は、９６穴プレート中で２０，００
０細胞類／ウェルで接種し、８０−９０％コンフルエンシーになるまで増殖させ
た。その後、それらはＰＥＩまたは電荷比５（＋／−）でＤＮＡ ０．５μｇ／
ウェルのＤＮＡ用量で調製したＰＥＩ−ＰＥＧ／ＤＮＡ複合体類と無血清培地中
、３７℃で３時間インキュベーションした。これらの細胞類は、さらに２０時間
、増殖培地中で増殖させた。細胞を溶解させ、ルシフェラーゼ活性を、９６穴フ
ォーマットを用いるルミノメータで市販のキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓ
ｏｎ，ＷＩ）を用いてアッセイした（相対光単位で測定）。
【０２４２】 結果 実施例４４は、ＰＥＩに対してのＰＥＧ固定によって、ＰＥＩ／ＤＮＡ複合体
に対して長期コロイド安定性を付与しかつ小粒子類製造に寄与することを示して
いる。また、それは、ＰＥＧのような立体保護層が前記複合体中に存在すること
が血清タンパク質類ならびに細胞表面との非特異的相互作用を低下させることを
示している。下記に述べた結果は、切断可能立体層を用いてＰＥＩ／ＤＮＡ複合
体類の物理化学的および生物性質に及ぼす効果を示している。図１６は、ＰＥＩ
／ＤＮＡ複合体の粒子径を示しているが、このＰＥＩは、ジスルフィド結合を介
してＰＥＧにその残基の１１％が結合している。これらの複合体類は、電荷比（
＋／−）１で調製されており、この場合、従来の粒子の大きさは非常に大きい（
実施例４４および図１１）。極めて径が大きいことに比較して、前記複合体は比
較的小さく平均径が１５０ｎｍであるとわかった。ＰＥＩ−ｓｓ−ＰＥＧはＤＮ
Ａ混合前に１０ｍＭ ＤＴＴで予備処理し、形成された粒子類は極めて大きく数
分内に溶液から沈殿した。これらのデータは、固定立体表面（ＰＥＧ）の安定化
効果ならびにＰＥＧジスルフィドリンカーの還元による切断が表面ＰＥＧおよび
その安定化効果を排除することを示している。 粒子凝集に影響を及ぼし非特異的相互作用を低下させる固定立体バリアのため
、それは粒子表面に付与されなければならない。ＰＥＧ化ＰＥＩをＤＮＡと混合
し粒子類を形成させるとき、ＰＥＧ分子類の一部は前記複合体の疎水性コア内部
にトラップできるが、化学的または酵素的切断を受けることができないであろう
。しかし、ＰＥＧは親水性ポリマーであるので、その大部分が表面にあると予測
できる。この表面ポリマーの切断は、粒子性質に有意な影響を及ぼすことができ
る。正荷電粒子表面に立体ポリマーを有する結果のひとつとして、表面電荷をマ
スキングすることが挙げられる。Ｚｅｔａ電位測定を用いて、表面におけるポリ
マー層存在を追跡できる。このような層は有効表面電荷を低下させ、低下度は、
ポリマー長に依存するであろう。 図１７は、ＰＥＩおよびサケ精子ＤＮＡと電荷比３（＋／−）で複合させたＰ
ＥＩ−ｓｓ−ＰＥＧ５０００のＺｅｔａ電位を示している。この電荷比における
ＰＥＩ／ＤＮＡは、約２４ｍＶの正のｚｅｔａ電位を有している。同一電荷比で
ＰＥＩ−ｓｓ−ＰＥＧと複合させたＤＮＡは、はるかに低いＺｅｔａ電位（１２
ｍＶ）を有しており、それは、ＰＥＧによる表面電荷の遮蔽を示している。この
複合体は、（ＰＥＩ上の総アミン類に対して）５ｍｏｌ％ＰＥＧを含有していた
。このｚｅｔａ電位は、５ｍｏｌ％ＰＥＧを含有するＰＥＩ／ＤＮＡ複合体につ
いて得られたものと非常に類似しており、ＰＥＧは、ＰＥＩに対して安定結合に
よって連結されていた。この複合体を１０ｍＭ ＤＴＴで処理し、Ｚｅｔａ電位
増加（２１ｍＶ）を結果的に得たが、表面から固定立体ＰＥＧ層が除去されたこ
とを示している。ＤＮＡと複合化する前のＰＥＩ−ｓｓ−ＰＥＧのＤＴＴによる
処理は、ＰＥＩ／ＤＮＡ複合体のそれ（２２ｍＶ）に類似した値を示した。これ
らの結果は、複合体表面におけるＰＥＧ存在を明確に示しており、また、ジスル
フィド結合に結合した時の還元条件下におけるその切断可能性を示している。 コロイド安定性 下記に示した結果は、切断可能アンカーの存在がＰＥＧ化複合体類のコロイド
安定性に悪影響を及ぼさなかったことを示している。 図１８は、電荷比１で調製したＰＥＩ−ｓｓ−ＰＥＧ／ＤＮＡの長期安定性を
示している。この処方の平均粒子径分布は、長期にわたり一定のままであった。
これは、実施例４４におけるＰＥＩ−ＰＥＧ／ＤＮＡについて得られた結果と一
致している。複合体表面からジスルフィド結合ＰＥＧを除去する効果を調べるた
め、１０ｍＭ ＤＴＴを試料に添加した。平均粒子径は、８８ｎｍから１０４ｎ
ｍに増加しており、時間がたってもほとんど未変化のままであった。 生物活性 ＰＥＩ／ＤＮＡについて、複合体結合リガンド類が全くない状態において、Ｄ
ＮＡトラフィッキングプロセスにおける初期細胞結合段階は、静電気的相互作用
によって媒介される。複合体表面上における立体バリア（ＰＥＧ）存在は、少な
くとも２種の明確な方法でその物理的性質に影響を及ぼす。１）ポリマー被覆体
は物理的に細胞表面との相互作用をブロックする、および２）それは、表面電荷
をマスキングし、その結果、静電気的相互作用により媒介された結合が低下する
。したがって、立体被覆体は、非特異的相互作用を阻害するために利用できる。
たとえば、ＰＥＩ／ＤＮＡ複合体のＰＥＧ化によって立体表面を利用することは
、望ましくない生物活性阻害のために使用できる。このことは、毒性につながる
非特異的相互作用を制御する方法を提供するので、重要である。 蛍光標識を用いる共焦イメージングは、このような活性阻害の可能な理由が細
胞に対する結合消失であることを示している。結合活性は、細胞または組織に特
異的なリガンド類を立体ポリマーの遠位端に結合するかまたは化学的または酵素
的トリガーによって複合体表面の立体ポリマーを切断することによって、回復す
ることができる。この後者の方法は、切断可能ジスルフィド結合を介してＰＥＧ
をＰＥＩに結合することによって、達成できる。 図１９は、前記複合体中種々のモル％ＰＥＧにおいて、ＰＥＩ−ｓｓ−ＰＥＧ
／ＤＮＡおよびＰＥＩ−ＰＥＧ／ＤＮＡの生物活性を示している。正電荷比のＰ
ＥＩ／ＤＮＡは、ＢＬ−６細胞を効率的にトランスフェクションした。ＰＥＩ−
ＰＥＧ／ＤＮＡ複合体でトランスフェクションされた細胞類は、前記複合体中の
ＰＥＧ量を増加させ、前記活性を有意に低下させた。活性は、＞３ｍｏｌ％ＰＥ
Ｇを含有する複合体から必然的に消失した。この場合、ＰＥＧは、安定結合を介
してＰＥＩに結合された。しかし、ＰＥＩ−ｓｓ−ＰＥＧ／ＤＮＡにトランスフ
ェックションされた細胞類は、５ｍｏｌ％ＰＥＧになっても高活性を示した。こ
れらの粒子類は、結合したＰＥＧによって付与される立体コーティングにもかか
わらず、それらの活性を保持していた。安定または不安定結合を介して連結した
複合体の表面上にＰＥＧが存在することは、細胞結合および取り込みに対して阻
害性であると予測される。しかし、ＰＥＩ−ｓｓ−ＰＥＧ／ＤＮＡ中のジスルフ
ィド結合を介して連結したＰＥＧは、インキュベーション中またはＤＮＡトラフ
ィッキングプロセスにおける後の段階において切断除去される。 ＰＥＩまたはＰＥＩ−ｓｓ−ＰＥＧにより複合化した蛍光標識オリゴヌクレオ
チドとともにインキュベーションしたＨＵＶＥＣ細胞類の共焦イメージは、細胞
内部に大量の蛍光があることから示唆されるように、ＰＥＩ／オリゴヌクレオチ
ド複合体が極めて効率的に取り込まれることを示した。対照的に、ＰＥＩ−ｓｓ
−ＰＥＧ／オリゴヌクレオチド複合体とインキュベーションした細胞類は、かな
り低い内部蛍光を示した。結合および取り込みは、ＰＥＩ−ＰＥＧ／オリゴヌク
レオチド複合体の場合に観察されたように、極めて低下していた。
【０２４３】 実施例５２：ＰＥＩ−ＰＭＯＺ結合体の合成と表面性質およびトランスフェクシ
ョン活性に及ぼす結合の効果 材料および方法 ４−ニトロフェノール、ビス（４−ニトロフェニル）カーボネート、トリエチ
ルアミン、ジシクロヘキシルカルボジイミド、無水アセトニトリルおよび無水ジ
クロロメタンは、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓｅ，ＭＯ）から購入した。 ＰＭＯＺおよびＰＥＯＺの合成 末端にプロピオン酸を有するポリ（２−メチル−２−オキサゾリン）（ＰＭＯ
Ｚ−プロピオン酸）および末端メチル基を有するポリ（２−エチル−２−オキサ
ゾリン）（ＰＥＯＺ）は、Ｓ．Ｚａｌｉｐｋｓｙら（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．
８５：１３３（１９９６））によって記載されたようにして調製した。ゲルろ過
クロマトグラフィ（ＧＰＣ）は、連続的に配置したＧ−３０００ＰＷおよびＧ−
２５００ＰＷカラム（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）類を装着しかつ水中ＰＥＧ標準で校正
したＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ １１００ ＨＰＬＣを用いて測定した。 Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、Ｄ２Ｏ中３６０ＭＨｚで測定した（Ｓｐｅｃｔｒａ
ｌ Ｄａｔａ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｍｐａｉｇｎ，ＩＬ）。 ＰＭＯＺ活性化−ＰＭＯＺ−プロピオン酸の４−ニトロフェニルエステルの調
製 ＰＭＯＺ−プロピオン酸（ＭＷ：９１００，プロピオン酸末端基０．１２９ｍ
ｍｏｌ）を、無水アセトニトリル１０ｍｌ中で２回、共佛乾燥させた。前記ポリ
マーをその後３ｍｌの無水ジクロロメタンおよび４−ニトロフェノール（２．８
７ｍｍｏｌ）に溶解させ、添加した。この混合物を０℃に冷却し、２ｍｌの無水
ジクロロメタン中ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣＩ）２．６２ｍｍｏ
ｌを添加した。３０分後、混合物を室温まで加温し、１６時間インキュベーショ
ンした。反応混合物をその後攪拌しながら、無水ジエチルエーテル３００ｍｌに
滴下した。上清を捨て、沈殿物を無水アセトニトリル中に溶解させ、ジエチルエ
ーテル中での沈殿を３回繰り返し、白色粉末としてＰＭＯＺ−プロピオン酸（０
．５４５ｇ）の４−ニトロフェニルエステルを得た。 ＰＥＯＺの活性化−ＰＥＯＺの４−ニトロフェニルカーボネートの調製 ＰＥＯＺ（分子量８８５０、水酸基末端０．１ｍｍｏｌ）およびトリエチルア
ミン（０．２５ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリル１０ｍｌに溶解させた。無水ア
セトニトリル１０ｍｌ中ビス（４−ニトロフェニル）カーボネート（２．５ｍｍ
ｏｌ）を攪拌しながら、温度を０℃に保持しつつ添加した。その後、この混合物
を室温まで加温し、反応を２０時間継続させた。その後、この反応混合物を濃縮
し、無水アセトニトリル５ｍｌ中に再溶解させ、ジエチルエーテル５００ｍｌお
よびジクロロメタン１０ｍｌの無水混合物に攪拌しながら滴下した。上清を除去
し、沈殿物をアセトニトリル５ｍｌ中に溶解させ、エチルアセテート−ジクロロ
メタンで再び再沈殿させた。ＰＥＯＺ（０．５９ｇ）の４−ニトロフェニルカー
ボネートの採取沈殿物は、白色固体であった。シリカゲルプレート上でのＴＬＣ
試験（溶液：エチルアセテート）は、ビス（４−ニトロフェニル）カーボネート
が存在していないことを示していた。 ＰＥＩとＰＭＯＺの結合 ＰＥＩ ４３ｍｇを０．１Ｍ重炭酸緩衝液、ｐＨ９．０に溶解させた。活性化
ＰＭＯＺ ０．５４５ｍｇを添加し、室温で一晩反応させた。反応後、濃塩酸を
添加しｐＨを５まで低下させた。放出されたニトロフェノールは、５回のクロロ
ホルム処理で抽出した。簡単に述べると、反応混合物を分離漏斗中でクロロホル
ム１００ｍｌと混合し、激しく振とう放置し、２層に分離させた。このニトロフ
ェノールはクロロホルム層に優先的に保持され、それを除去し、新しいクロロホ
ルムを添加し、このプロセスを繰り返した。その後、物質を乾燥させ、脱イオン
水１０ｍｌに再溶解させ、緩衝液を２回交換しながらＮａＣｌ １５０ｍＭで透
析し、４回交換しながら脱イオン水で２日間にわたり透析した。産物をその後凍
結乾燥し、ＰＭＯＺ量およびアミン含量をＮＭＲで求めた。 ＰＥＯＺとＰＥＩの結合。 ＰＥＩ ３２．０３５ｍｇを０．１Ｍホウ酸緩衝液、ｐＨ８．０ ５ｍｌに溶
解させた。活性化ＰＥＯＺ ５９０ｍｇをアセトニトリル４ｍｌ中に溶解させ、
攪拌しながらＰＥＩ溶液に添加した。５分後沈殿物を観察し、それは、ホウ酸緩
衝液１５ｍｌ添加により消失した。反応混合物を室温で一晩反応させた。反応後
物質をロータリエバポレータ（ｒｏｔｏｖａｐｏｒａｔｏｒ）中で乾燥させ、ア
セトニトリルを全て除去した。その後濃酢酸を添加し、ｐＨ５に低下させた。放
出されたニトロフェニールは、上記のようにしてクロロホルムによって抽出した
。この後、酢酸エチルによってさらに抽出し、残留しているニトロフェノールの
ほとんどを除去した。前記物質をその後乾燥させ、脱イオン水１０ｍｌ中に再溶
解させ、０．１Ｍ酢酸を２回交換して透析し、その後、４回交換しながら脱イオ
ン水に対して透析させた。前記生成物をその後凍結乾燥し、ＰＥＯＺ量およびア
ミン含量はＮＭＲによって求めた。 固定ＤＮＡ／ＰＥＩ−ＰＭＯＺ複合体類の形成 複合体類は、先に述べたようにして形成させた。 生物活性：トランスフェクション 生物活性は、実施例４５に記載のようにしてＢＬ−細胞中で測定した。 結果 表面性質およびコロイド安定性 図２２は、前記複合体の表面性質に及ぼすＰＭＯＺの効果を示している。前記
複合体類は４：１の電荷比で処方し、ｚｅｔａ電位は、１０ｍＭ生理食塩水中で
測定した。ＰＭＯＺが全く存在しないと、前記粒子類は＋３０ｍＶのｚｅｔａ電
位によって示されるように、高正電荷表面を示す。前記複合体中にちょうど１．
６％のＰＭＯＺ量があると、ｚｅｔａ電位は６．４６ｍＶに低下する。３．２％
まで量を増加させると、さらに５．３５ｍＶまで低下する結果となる。これらの
データは、セルフアセンブリプロセスにおいて、親水性ＰＭＯＺ分子類は疎水性
内部よりもむしろ前記複合体表面に存在することを好み、それによって、立体バ
リアとして作用し、表面によって提供されるみかけの電荷を低下させることを示
している。この親水性および非荷電表面は、タンパク質類のような大型血清成分
類との相互作用を低下させると考えることができる。このような現象が実際に図
２３に示したように観察され、０から３．２％（０．８ずつの段階で）の種々の
量のＰＭＯＺにより調製した４：１電荷比複合体類について、３７℃で１０％Ｆ
ＢＳ含有ＰＢＳ中で２時間インキュベーションする前後においてその粒子径を調
べた。血清中前記複合体類の安定性（それらの大きさを保持する能力によって測
定したところ）は、複合体中に存在するＰＭＯＺ量に直接比例していた。このこ
とは、前記複合体類が血清中で安定であることを示唆しており、これは、特定組
織に対する標的化のための重要成分である。 非特異的トランスフェクションのブロッキング 図２４は、上記複合体類を用いて得られた培養ＢＬ−６細胞のトランスフェク
ションの結果を示している。複合体中に存在するＰＭＯＺ量とその細胞トランス
フェクション能力には明らかな関係がある。表面ＰＭＯＺ量を増加させると、こ
れらの細胞中におけるルシフェラーゼ発現レベルが低下した。上記にも述べたよ
うに、ＰＭＯＺ存在は、立体的および静電気的バリアとして作用することによっ
て、細胞表面との前記複合体類の非特異的相互作用を妨害する。この相互作用低
下は、核酸の細胞中への取り込みを低下させ、低トランスフェクションレベルが
結果として生じた。このことは、リガンドをＰＭＯＺの遠位端に結合させること
により、いかなる標的にも選択的な複合体設計が可能となる。この設計では、至
適数のリガンド分子類が、粒子表面からはるかに離れた立体ポリマーに付加でき
、標的レセプターとの効率的相互作用が可能となる。
【０２４４】 実施例５３ リガンド標的化、層化コロイド複合体類の外部立体コーティングに
よる調製 ＰＥＩ−ＰＥＧ−ＲＤＧの調製： 合成および精製： 配列ＡＣＲ ＧＤＭ ＦＧＣ Ａを有しＣｙｓ側鎖で環状となり＞９０％まで
逆相ＨＰＬＣ（Ｃ１８カラム）で精製したＲＧＤペプチドは、Ｇｅｎｅｍｅｄ
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｓ．Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏから入手した。ＲＧＤペ
プチド１６．８ｍを１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ８．０中に溶解させた
。この溶液に対して、ＶＳ−ＰＥＧ３４００−ＮＨＳ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ
Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）４１ｍｇを乾燥ＤＭＳＯ（１００μｌ）に溶解させたものを
、ゆっくりと攪拌しながらシリンジポンプを用いて添加した。この反応混合物を
、室温でさらに７時間攪拌を続けた。ｐＨ８．０に調整したＰＥＩ溶液５ｍｇを
上記反応混合物に添加した。反応混合物のｐＨを９．５に増加させ、室温で４時
間攪拌放置した。反応終点で、反応混合物を凍結乾燥させた。 試料を１５０ｍＭ ＮａＣｌ含有５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０に再溶解さ
せ、５ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび１５０ｍＭ ＮａＣｌ含有緩衝液を用いて、Ｇ−
５０ゲルろ過カラムを通過させた。ボイドボリューム分画は、２５，０００ＭＷ
ＣＯの透析チューブ系を用いて１５０ｍＭ ＮａＣｌ含有５ｍＭ ＨＥＰＥＳに
対して広範囲に透析した。３５００ＭＷＣＯのバッグを用いて水に対して透析す
ることによって、その後試料を脱塩した。 ペプチド結合の推定： 結合体中ペプチド量は、Ｃｙｓ側鎖からのスルフフィドリル濃度を推定するこ
とによって求めた。前記結合物少量を２０ｍＭ ＤＴＴによって処理し、ペプチ
ドジスルフィド結合を還元した。その後過剰のＤＴＴを除くため、この試料を２
５０００ＭＷＣＯ透析チューブを用いて１ｍＭ ＥＤＴＡ含有０．１Ｍ酢酸に対
して透析した。広範囲に透析した後、スルフフィドリル濃度を、Ｅｌｌｍｅｎ試
薬を用いて求め、ＰＥＩによるアミン濃度は、一級アミン類用ＴＮＢＳアッセイ
を用いて求めた。これらのアッセイに基づき、ＰＥＩに対するペプチド結合は、
１０％であると推定した。 ＤＮＡ結合： ＤＮＡと複合体を形成するＰＥＩ−ＰＥＧ−ＲＧＤ２Ｃの能力を、ゲル電気泳
動実験によって検証した。電荷比１またはそれ以上で形成した複合体類はゲル中
へ移動できなかったが、複合体結合によるＤＮＡの完全電荷中和を示唆している
。 粒子径およびＺｅｔａ電位： ＤＮＡ／ポリカチオン複合体類の取り込みを促進するため、ＤＮＡは、細胞類
がエンドサイトーシスを行うことができる小粒子類に凝縮される必要がある。Ｐ
ＥＩ−ＰＥＧ−ＲＧＤ２ＣのＤＮＡを小粒子に凝縮する能力は、粒子径測定によ
って調べた。下記の表１４は、種々の電荷比のＤＮＡ／ＰＥＩ−ＰＥＧ−ＲＧＤ
２Ｃの粒子径を示している。Table１４はまた、種々の電解費のＤＮＡ／ＰＥＩ
−ＰＥＧ−ＲＧＤ２Ｃ複合体類のｚｅｔａ電位値を示している。Ｚｅｔａ電位は
、これらの電荷比において低いまま留まり、複合体の表面電荷をマスキングする
立体被覆体の形成を示している。 電荷比 (Charge)、 粒子径 (Particle size)（ｎＭ）、標準偏差 (Std. Deviaio
n) 、Ｚｅｔａ電位 Zeta potential)
【０２４５】
【表１６】
【０２４６】 細胞結合および取り込み： 核酸類を細胞に運搬するＰＥＩ−ＰＥＧ−ＲＧＤ２Ｃの能力を、蛍光標識オリ
ゴヌクレオチドを用いて共焦顕微鏡法を用いて調べた。共焦顕微鏡法実験は、先
に述べたようにして実施した（実施例５１）。図２８は、電荷比６においてＨＥ
ＬＡ細胞中ＰＥＧ結合ＰＥＩ遠位端に対するペプチドリガンド（ＲＧＤ）の添加
によるＰＥＩ複合Ｒｈ標識オリゴヌクレオチド類の細胞取り込み増加を示した。
この図は、ＰＥＩまたはＰＥＩ−ＰＥＧ−ＲＧＤ２ＣによるＨｅｌａおよびＨＵ
ＶＣ細胞への蛍光標識オリゴヌクレオチドの運搬を示している。インテグリンレ
セプターを有するＨｅｌａ細胞において、ＰＥＩ単独の場合に比較して、ＰＥＩ
−ＰＥＧ−ＲＧＤ２Ｃによって運搬が媒介されたとき、取り込まれたオリゴヌク
レオチド量に顕著な増加が見られる。分布パターンも同様に非常に異なっていた
。ＰＥＩによると、小胞体コンパートメントにおいて細胞質中にオリゴヌクレオ
チドが分布し、一方、ＰＥＩ−ＰＥＧ−ＲＧＤ２Ｃによると、オリゴヌクレオチ
ドの大半は、核内に局在する。
【０２４７】 実施例５４ 脱落可能な外部立体コーティングによるリガンド標的、層化コロイ
ド複合体類の調製 一端においてポリエチルオキサゾリン（ＰＥＯＺ）に対しておよび他端におい
てペプチドリガンド（ＲＧＤ）に対して制限されたジスルフィドにより結合させ
た線状ＰＥＩの合成を図２７に示した。図２７Ａに示したように、ＰＥＩ−ＳＳ
−ＰＥＯＺ−ＲＧＤの調製は、エチルヨードアセテートによる２−エチル−２−
オキサゾリンモノマーの重合化およびその後のメタノール性ＫＯＨ加水分解によ
りメチレンカルボキシル化ＰＥＯＺ中間体Ｉを得る。１−アミノ−２−メチル−
２−プロパン［２−ピリジルジチオール］によるカルボキシル化基の濃縮と、末
端水酸基の無水グルタル酸による誘導体化および生成したカルボキシル化末端の
ＲＧＤペプチドのＮ−末端アミンの濃縮によって、２−ピリジル保護ＳＳ−ＰＥ
ＯＺ−ＲＧＤ中間体ＩＶを得る。２５当量のジチオスレイトール、ｐＨ５により
８時間還元すると、チオールＨＳ−ＰＥＯＺ−ＲＧＤ Ｖが生成し、それは、２
−ピリジルジチオプロピオン酸誘導体化線状ポリエチレンイミンと反応でき、Ｐ
ＥＩ−ＳＳ−ＰＥＯＺ−ＲＧＤが得られる。この最終段階を、２−ピリジルジチ
オプロピオン酸誘導体化線状ポリエチレンイミンを２５当量のジチオスレイトー
ル、ｐＨ５によって８時間還元することおよびその後線状ポリエチレンイミン上
に生成したチオール類を２−ピリジル保護ＳＳ−ＰＥＯＺ−ＲＧＤ中間体ＩＶと
反応させることによって修飾でき、同一の最終産物ＰＥＩ−ＳＳ−ＰＥＯＺ−Ｒ
ＧＤを得ることができる。
【０２４８】 メチレンカルボキシル化ＰＥＯＺ中間体（Ｉ、図２７Ａ）の調製 重合化反応を、使用に先立ち加熱し真空中で乾燥したねじ栓付き試験管で実施
した。試験管に、ＫＯＨで蒸留したばかりの２−エチル−２−オキサゾリン４ｍ
ｌおよび乾燥アセトニトリル４ｍｌを入れた。蒸留したばかりのエチルヨードア
セテート０．８５ｇを乾燥アセトニトリル８ｍｌ中に溶解させ、この溶液０．８
０ｍｌを前記モノマーを含有する試験管に移した。この移しかえの後、試験管に
アルゴンをパージし、密封し、８０℃の油浴中で４５時間攪拌した。室温まで冷
却した後、ＫＯＨ（０．５Ｍ）のメタノール溶液２ｍｌを重合混合物に入れ、２
５℃で４時間攪拌した。氷酢酸０．１５ｍｌを添加し、混合物を固体になるまで
濃縮し、水５０ｍｌに再溶解させ、３５００分子量カットオフのＳｐｅｃｔｒａ
ｌ／Ｐｏｒ透析膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ，Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）に入れ
た。透析は、１００ｍＭ ＮａＣｌ（１×３．５Ｌ）および水（３×３．５Ｌ）
に対して行った。透析バッグの中身を凍結乾燥し、さらに真空中で乾燥させ、白
色固体３．８４ｇを得た（９８％）。 １Ｈ ＮＭＲ（３６０ ＭＨｚ Ｄ２Ｏ）ｄ ０．８７−０．９４（ｍ，ＣＨ
３ＣＨ２Ｃ＝Ｏ）、２．１３−２．２７（ｍ，ＣＨ３ＣＨ２Ｃ＝Ｏ）、３．３７
−３．４６（ｍ，ＣＨ２Ｎ） 試料は、約ｍ／ｚ８，０００と１３，０００の間で中心がおよそｍ／ｚ１０，
３３１（予測ｍ／ｚ １０，０７５）の弱く広い分布のおそらく偽分子状イオン
類であることを示す陽イオンＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルを付与した。
【０２４９】 １−アミド−２−メチル−２−プロパン［２−ピリジルジチオ］−メチレンカ
ルボキシル化ＰＥＯＺ中間体（ＩＩ，図２７Ａ）の調製： メチレンカルボキシル化ＰＥＯＺ中間体（Ｉ、図２７）２ｇを水１００ｍｌに
溶解させ、そのｐＨは、ＨＣｌ水溶液で６に調節した。この溶液を固体になるま
で真空中で濃縮し、その後、乾燥ジクロロメタン６ｍｌに溶解させた。１−ハイ
ドロキシベンゾトリアゾール１水和物０．２７３ｇ、ジシクロヘキジルカルボジ
イミド０．２０８ｇおよび１−アミノ−２−メチル−２−プロパン［２−ピリジ
ルジチオ］０．２５３ｇを添加し、４８時間攪拌した。反応混合物をろ過し、そ
の濾液をジエチルエーテル１Ｌに攪拌しながら滴下した。デカントした後、沈殿
物をジクロロメタン５ｍｌ中に溶解させ、再度、攪拌しながらジエチルエーテル
１Ｌに滴下した。デカントした後、沈殿物を水５０ｍｌ中に溶解させ、３５００
分子量カットオフのＳｐｅｃｔｒａｌ／Ｐｏｒ透析膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ，Ｌｏ
ｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）に入れた。透析は、１００ｍＭ ＮａＣｌ（１×３
．５Ｌ）および水（２×３．５Ｌ）に対して行った。透析バッグの中身を凍結乾
燥し、さらに真空中で乾燥させ、白色固体１．７７ｇを得た（８６％）。 生成した固体は、Ｃ１８逆相ｈｐｌｃ（Ｊｕｐｉｔｅｒ ３００Ａ、１０μ、
２５０ｍｍ×１０ｍｍ）を用いて、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液を溶媒Ａと
してアセトニトリルを溶媒Ｂとして用いて、精製した。フロー速度は５ｍｌ／分
であり、３０％から４５％の溶媒Ｂの勾配を用いて、４５分間行った。生成物１
−アミド−２−メチル−２−プロパン［２−ピリジルジチオ］−メチレンカルボ
キシル化ＰＥＯＺ中間体（ＩＩ，図２７Ａ）を、前記勾配中に２０分時点で溶出
したピークから採取し、白色固体０．８８ｇを得た（４３％）。１ Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ Ｄ２Ｏ）δ０．８７−０．９４（複数トリプレッ
ト類、Ｊ＝７．２，ＣＨ３ＣＨ２Ｃ＝Ｏ）、１．１６（ｂｓ，［ＣＨ３］２Ｃ）
、２．１３−２．２８（複数クワルテット類、Ｊ＝７．３，ＣＨ３ＣＨ２＝Ｏ）
、３．３７−３．４６（ｍ，ＣＨ２ＮおよびＣＨ２ＯＨ）、３．９２（ｂｓ，Ｎ
ＣＨ２Ｃ＝Ｏ）、７．６７（ｂｄｄ，Ｊ１／２＋Ｊ２／２＝６．８，４−Ｈピリ
ジル）、８．１６（ｂｄ、Ｊ＝８．３，２−Ｈピリジル）、８．２７（ｂｄｄ，
Ｊ１＝Ｊ２＝８．１３、３−Ｈピリジル）、８．５１（ｂｄ，Ｊ＝５．９，５−
Ｈ，５−Ｈピリジル）
【０２５０】 １−アミド−２−メチル−２−プロパン［２−ピリジルジチオ］−メチレンカル
ボキシル化ＰＥＯＺ−Ｏ−グルタルモノエステル一酸中間体（ＩＩＩ，図２７Ａ
）の調製 １−アミド−２−メチル−２−プロパン［２−ピリジルジチオ］メチレンカル
ボキシル化ＰＥＯＺ中間体（ＩＩ、図２７Ａ）０．０５ｇを１ｍｌの乾燥アセト
ニトリルおよび乾燥トルエン２ｍｌ中に溶解させた。溶液を固体になるまで濃縮
した。無水グルタル酸０．０１４ｇの０．５ｍｌの乾燥アセトニトリル溶液を添
加後、乾燥ピリジン０．０２５ｍｌを添加した。攪拌混合物を８０℃の油浴に２
４時間入れた。冷却後、混合物を固体になるまで真空中で濃縮させ、０．２Ｍ酢
酸ナトリウム水溶液、ｐＨ６．５に再溶解させ、ＳｅｐｈａｄｅｘＴＭ Ｇ−２
５ファイン（カラム直径１．６ｃｍおよび高さ６５ｃｍ）に載せた。生成物は、
水を用いて前記ゲルカラムから溶出させ、第１分画に集め、白色固体０．０４ｇ
を得た（８０％）。１ Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ ＣＤ３ＯＤ）δ１．０７−１．１２（複数トリプ
レット類、Ｊ＝７．３，ＣＨ３ＣＨ２Ｃ＝Ｏ）、１．３１（ｂｓ，［ＣＨ３］２ Ｃ）、１．８５−１．８９（ｍ，ＯＣ＝ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ）、２．
１８−２．２５（ｍ，ＯＣ＝ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ）、２．３６−２．
４７（複数クワルテット類、Ｊ＝７．３，ＣＨ３ＣＨ２＝Ｏ）、３．３５−３．
５７（ｍ，ＣＨ２ＮおよびＣＨ２ＯＨ）、４．０９（ｂｓ，ＮＣＨ２Ｃ＝Ｏ）、
４．２３−４．２６（ｍ，ＣＨ２ＯＣ＝Ｏ）、７．２１−７．２３（ｍ，４−Ｈ
ピリジル）、７．２１−７．２３（ｍ，２−Ｈおよび３−Ｈピリジル）、８．４
２（ｍ，５−Ｈピリジル）
【０２５１】 １−アミド−２−メチル−２−プロパン［２−ピリジルジチオ］−メチレンカル
ボキシル化ＰＥＯＺ−Ｏ−グルタルモノエステルペプチジルＲＧＤ中間体（ＩＶ
，図２７Ａ）の調製 １−アミド−２−メチル−２−プロパン［２−ピリジルジチオ］メチレンカル
ボキシル化ＰＥＯＺ−Ｏ−グルタルモノエステル一酸中間体（ＩＩＩ、図２７Ａ
）０．０３ｇを０．２５ｍｌの乾燥クロロホルム中に溶解させ、Ｈ−ハイドロキ
シスクシンイミド０．００２ｇおよびジシクロヘキシルカルボジイミド０．００
３ｇで処理する。この溶液を２５℃で４８時間攪拌し、その後、ろ過する。採取
した濾液を乾燥ジエチルエーテル１００ｍｌを攪拌したものに滴下する。デカン
トした後、沈殿物を乾燥アセトニトリル０．５ｍｌ中に溶解させ、ビス環状ＧＡ
ＣＤＣＲＧＤＣＷＣＧカルボキシル末端アミドペプチド（Ｇｅｎｍｅｄ Ｓｙｎ
ｔｈｅｓｉｓ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）０．００８ｇに添加
する。１−メチルイミダゾール０．００３ｇを添加し、反応物を２５℃で４８時
間攪拌する。０．１Ｍ 酢酸ナトリウム水溶液、ｐＨ６．５ ３ｍｌを添加し、
３５００分子量カットオフのＳｐｅｃｔｒａｌ／Ｐｏｒ透析膜（Ｓｐｅｃｔｒｕ
ｍ，Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）に入れる。透析は、１００ｍＭ ＮａＣｌ
（２×３．５Ｌ）および水（３×３．５Ｌ）に対して行う。透析バッグの中身を
凍結乾燥し、さらに真空中で乾燥させ、１−アミド−２−メチル−２−プロパン
［２−ピリジルジチオ］メチレンカルボキシル化ＰＥＯＺ−Ｏ−グルタルモノエ
ステルペプチジルＲＧＤ中間体（ＩＶ，図２７Ａ）を得る。
【０２５２】 １−アミド−２−メチル−２−プロパンチオールメチレンカルボキシル化ＰＥＯ
Ｚ−Ｏ−グルタルモノエステルペプチジルＲＧＤ中間体（Ｖ，図２７Ａ）の調製 １−アミド−２−メチル−２−プロパン［２−ピリジルジチオ］メチレンカル
ボキシル化ＰＥＯＺ−Ｏ−グルタルモノエステルペプチジルＲＧＤ中間体（ＩＶ
、図２７Ａ）０．０２ｇを、５ｍＭ ＥＤＴＡ含有０．２Ｍ酢酸ナトリウム水溶
液、ｐＨ５ ０．５ｍ１中に溶解させる。前記溶液に対して窒素をパージし、ジ
チオスレイトール０．００８ｇを添加する。８時間攪拌放置し、その後、Ｓｅｐ
ｈａｄｅｘＴＭ Ｇ−２５ファイン（カラム直径１．６ｃｍおよび高さ６５ｃｍ
）に載せる。生成物は、０．１０Ｍ 酢酸水溶液を用いて前記ゲルカラムから溶
出させ、第１分画に集め、１−アミド−２−メチル−２−プロパンチオールメチ
レンカルボキシル化ＰＥＯＺ−Ｏ−グルタルモノエステルペプチジルＲＧＤ中間
体（Ｖ，図２７Ａ）を得る。
【０２５３】 ２−ピリジルジチオプロピオン酸誘導体化線状ポリエチレンイミン（ＶＩ、図２
７Ａ）の調製 Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ ＩＬから入手したＮ−スクシンイミジル−
３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）０．０１３ｇの乾燥メタ
ノール０．５ｍｌ溶液を、分子量２２ｋＤａの遊離塩基線状ポリエチレンイミン
０．０２２ｇの乾燥メタノール０．２５ｍｌ溶液に添加する。この反応物を暗所
で１６時間攪拌する。０．５Ｍ 酢酸ナトリウム水溶液、ｐＨ６．５ １０ｍｌ
を添加し、生成した混合物を、３５００分子量カットオフのＳｐｅｃｔｒａｌ／
Ｐｏｒ透析膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ，Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）に入れる。
透析は、０．５Ｍ ＮａＣｌ（２×２Ｌ）および水（３×２Ｌ）に対して行う。
透析バッグの中身を凍結乾燥し、さらに真空中で乾燥させ、２−ピリジルジチオ
プロピオン酸誘導体化線状ポリエチレンイミン（ＶＩ、図２７Ａ）を得た。
【０２５４】 １−アミド−２−メチル−２−プロパンジチオ（ポリエチレンイミン）メチレン
カルボキシル化ＰＥＯＺ−Ｏ−グルタルモノエステルペプチジルＲＧＤ中間体（
ＶＩＩ、図２７Ａ）の調製 ２−ピリジルジチオプロピオン酸誘導体化線状ポリエチレンイミン（ＶＩ，図
２７Ａ）０．０１ｇを、０．１Ｍ塩化ナトリウムおよび２５ｍＭ ＥＤＴＡを含
有する０．２Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５ ０．１ｍｌ中に溶解させる。
この溶液を窒素でパージする。０．１Ｍ塩化ナトリウムおよび２５ｍＭ ＥＤＴ
Ａ含有０．２Ｍ酢酸ナトリウム ０．５ｍｌ中１−アミド−２−メチル−２−プ
ロパンチオールメチレンカルボキシル化ＰＥＯＺ−Ｏ−グルタルモノエステルペ
プチジルＲＧＤ中間体（Ｖ，図２７Ａ）の溶液を次に添加する。この反応混合物
を８時間攪拌する。カップリング度は、放出されたピリジン−２−チオンの３４
３ｎｍにおける吸光度を測定することによって、求めることができる。３４３ｎ
ｍにおけるモル吸光係数は、８．０８´ １０３Ｍ−３ｃｍ−１である。反応は、メルカプトエタノール０．０１ｇを添加
することによって、終結させる。さらに攪拌を継続し、ピリジン−２−チオン全
てが放出されるまで行う。０．５Ｍ 酢酸ナトリウム、ｐＨ４ １０ｍｌを添加
し、生成した混合物を、２５、０００分子量カットオフのＳｐｅｃｔｒａｌ／Ｐ
ｏｒ透析膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ，Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）に入れる。透
析は、０．５Ｍ ＮａＣｌ（２×２Ｌ）および水（３×２Ｌ）に対して行う。透
析バッグの中身を凍結乾燥し、さらに真空中で乾燥させ、１−アミド−２−メチ
ル−２−プロパンジチオ（ポリエチレンイミン）メチレンカルボキシル化ＰＥＯ
Ｚ−Ｏ−グルタルモノエステルペプチジルＲＧＤ中間体（ＶＩＩ、図２７Ａ）を
得る。 ＰＥＩ−ＳＳ−ＰＥＯＺ−ＲＧＤおよびＰＥＩ−ＳＳ−ＰＥＯＺを異なる比率
で混合し、異なるモル濃度のリガンド含有分子を得た。これらの混合物をその後
、上記のようなプラスミドＤＮＡ（ｐＣＩＬｕｓ）と配合し、４：１電荷比の複
合体類を産生させた。この複合体類を１０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ溶
液に希釈し、ＤＥＬＳＡ４４０（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｒｐ．，Ｍｉａｍｉ，Ｆ
Ｌ）中ｚｅｔａ電位を用いて、“表面被覆体”の厚さを推定した。ＨＵＶＥＣ細
胞をその後トランスフェクションし、ルシフェラーゼ活性は、トランスフェクシ
ョン２４時間、４８時間および７２時間後アッセイし、至適リガンド量と発現動
態における差（もしあれば）を求めた。実験のコントロールは、標的被覆体を有
していない正荷電複合体類であった。リガンド特異性は、遊離リガンドに対して
レセプター陰性の細胞中で競合アッセイで試験した。これらの複合体類は、尾静
脈を介してＣＤ−１マウスに注入し、種々の臓器および血管を単離しルシフェラ
ーゼ発現を調べ、対照処方に対しての差を調べた。
【０２５５】 実施例５５ ヒト滑膜細胞への遺伝子運搬とヒト滑膜細胞による発現 本発明で述べたカチオン性脂質類、特にＣＧＰ４４０１５Ａは、ＧＦＰまたは
ルシフェラーゼ発現のいずれかをコードするプラスミドＤＮＡと複合させる。前
記複合体類は、アニオン荷電プラスミドに対して異なる比のカチオン性荷電脂質
類により調製する。このように調製した前記複合体類を、培養したＲＡ１１９１
単離ヒト滑膜細胞にある範囲の用量で投与する。インキュベーション時間後細胞
を洗浄し、新鮮培地に細胞を保持する。２４時間後、ＧＦＰ発現をフローサイト
メトリおよび蛍光顕微鏡法によって細胞についてアッセイする。結果Table15お
よび図２９に要約する。これらの結果は、新規コロイド性ベクター類がヒト滑膜
細胞への運搬とその中での高レベル発現を付与することを示している。高効率は
、トランスフェクションした細胞が高百分率であることとタンパク質発現が高レ
ベルであることの両者である。タンパク質発現をもたらすベクターの機能は、電
荷比および用量を調整することによって最適化される。
【０２５６】
【表１７】
【０２５７】 滑膜細胞は、リウマチ性関節炎の病理に関与していると考えられている（たと
えば、Ｐａｐ Ｔ，Ｇａｙ ＲＥ、Ｇａｙ Ｓ．２０００，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ
Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ ２０００ Ｍａｙ；１２（３）：２０５−１０；Ｈａｉ
ｄｉ Ｚｈａｎｇ， Ｙｉｐｉｎｇ Ｙａｎｇ、Ｊｅｎｎｉｆｅｒ，Ｌ．Ｈｏｒ
ｔｏｎ，Ｅｌｅｎａ Ｂ．Ｓａｍｏｉｌｏｚａ，Ｔｈｏｍａｓ Ａ．，Ｊｕｄｇ
ｅ，Ｌａｕｒｅｎｃｅ Ａ．Ｔｕｒｋａ，Ｊａｍｅｓ Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ， ａ
ｎｄ Ｙｏｕｈａｉ Ｃｈｅｎ．１９９７．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｖｏ
ｌｕｍｅ １０、Ｎｕｍｂｅｒ ８、Ｏｃｔｏｂｅｒ １９５１−１９５７；Ｙ
ａｏ Ｑ，Ｇｌｏｒｉｏｓｏ ＪＣ、Ｅｖａｎｓ ＣＨ，Ｒｏｂｂｉｎｓ ＰＤ
ら、２０００．Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ２０００ Ｍａｙ−Ｊｕｎ；２（３）：
２１０−９；Ｅｖａｎｓ ＣＨ，Ｒｅｄｉｓｋｅ ＪＪ，Ａｂｒａｍｓｏｎ Ｓ
Ｂ，Ｒｏｂｂｉｎｓ ＰＤ．１９９９．Ｆｉｒｓｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ
ｌ ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ａｒｔ
ｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ（第一回国際関節
炎および関連疾患遺伝子治療会議）．Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ，２−３
Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９８． Ｍｏｌ Ｍｅｄ Ｔｏｄａｙ Ａｐｒ；５（
４）：１４８−５１；Ｎｉｔａ Ｉ，Ｇｈｉｖｉｚｚａｎｉ ＳＣ、Ｇａｌｅａ
−Ｌａｕｒｉ Ｊ，Ｂａｎｄａｒａ Ｇ，Ｇｅｏｒｇｅｓｃｕ ＨＩ、Ｒｏｂｂ
ｉｎｓ ＰＤ，Ｅｖａｎｓ ＣＨ．１９９６．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ
Ｍａｙ；３９（５）：８２０−８；Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ ＧＳ，Ｙｅｏ Ｍ，
Ｚｖａｉｆｌｅｒ ＮＪ．１９９５．Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１９９５
Ｓｅｐ；９６（３）：１６３１−８）。このように、本発明の好適な態様におい
て、滑膜細胞は、遺伝子治療によるリウマチ性関節炎治療の標的である。したが
って、本発明は、遺伝子治療によってリウマチ性関節炎を治療する方法に関し、
本発明の治療用遺伝子を含むベクターを有効量で患者に投与することおよび前記
治療用遺伝子が優先的に滑膜細胞に運搬されることを特徴とする。効率は、１種
以上の本疾患症状の改善を調べることによって求めることができる。インビボ効
率として、リウマチ性関節炎の進展または程度に特徴的な定義された臨床終点の
測定値を用いることができることは、有益である。投与される抽出物用量は、患
者年齢、体重、および性別および治療する状態の重篤度に依存している。このよ
うな投与は、全身投与によるかまたはリウマチ性関節炎に罹患している組織また
は腔への前記ベクター類の直接投与によることができる。前記ベクター類はまた
、許容可能な薬剤担体と関連させ投与することもできる。適切な薬剤担体の選択
は、当業者に明らかに自明であると見なされる。
【０２５８】 実施例５６．ＲＧＤペプチドを有するコロイドベクター−ヒト滑膜細胞への遺伝
子運搬とヒト滑膜細胞による発現 表面露出リガンド類によるさらなる改良が研究から得られ、それによって、Ｒ
ＧＤペプチドを前記の新規コロイドベクターに取り込ませる。ＲＧＤペプチドを
有する複合体類または有さない複合体類は異なる電荷比で調製し、実施例５５に
記載のようなＲＡ１９１１細胞のトランスフェクションについて試験する。結果
を図３０に示す。結果は、リガンド添加によるカチオン性表面電荷に対する遺伝
子発現の依存性を低下させることを示している。電荷比０．４において、この電
荷比コロイドベクターがＲＧＤリガンドを含有しているとき表面荷電は複合体中
過剰の陰性電荷に由来しているが、前記ベクターは、リガンドがないときと同様
に活性のままであり、正の荷電を付与する電荷比を有している。同様の結果は、
本発明にしたがって得られたＰＥＧ修飾ポリカチオン剤類に結合させたＲＧＤペ
プチドリガンドにより調製した新規コロイド類を用いても得られる。コロイド調
製物をＲＧＡペプチドリガンドありおよびなしで調製するとき、発現は、前記リ
ガンドの存在に依存している。
【０２５９】 本発明は、上記代表的態様を参考にして広く開示しかつ例示してきた。当業者
は、その精神および範囲から逸脱することなく、種々の改変が本発明について行
うことができることを理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、核酸および少なくとも１つの複合体形成剤、ならびに必要に応じて、
細胞膜との融合および核取り込みを提供する薬剤を含むコア複合体、ならびに（
２）切断可能なセグメントを必要に応じて備えたコア複合体に固着される必要に
応じた外殻、ならびに（３）コア複合体または外殻のいずれかに固着される必要
に応じた曝露されたリガンドを含む（構造Ｅ）、天然に存在しないベクターの模
式図を示す。
【図２Ａ】 図２．１は、カチオン脂質の化学構造を示す。
【図２Ｂ】 図２．２は、カチオン脂質の化学構造を示す。
【図３Ａ】 図３．１は、置換されたアミノエタノールおよび核酸によって形成される構造
の模式図を示す。
【図３Ｂ】 図３．２は、置換されたアミノエタノールおよび核酸によって形成される構造
の模式図を示す。
【図３Ｃ】 図３．３は、置換されたアミノエタノールおよび核酸によって形成される構造
の模式図を示す。
【図３Ｄ】 図３．４は、置換されたアミノエタノールおよび核酸によって形成される構造
の模式図を示す。
【図４】 図４は、置換されたアミノエタノールおよび核酸によって形成される複合体の
小粒径分布および均質性を示す。
【図５】 図５は、市販のカチオン脂質から形成された、置換されたアミノエタノールか
ら形成された、および市販の（ＥｘＧｅｎ）または合成された（Ｌｐ５００）直
鎖状ＰＥ１カチオンポリマーから形成された、コア複合体のマウスへの静脈内投
与後のインビボ組織のトランスフェクションから得られるルシフェラーゼの発現
を示す。
【図６】 図６は、市販のカチオン脂質から形成されるコア複合体のマウスへの静脈内投
与後のインビボ組織のトランスフェクションから得られるＧＭ-ＣＳＦ発現を示
す。
【図７】 図７は、フソーゲン性界面活性剤（２０００ダルトン未満の低分子量を有する
親水性ＰＥＧポリマーを含む）または立体界面活性剤（２０００ダルトンに等し
いかまたはこれよりも大きい高分子量を有する親水性ＰＥＧを含む）の包含によ
って形成される殻を備えた、市販のカチオン脂質から形成されるコア複合体のマ
ウスへの静脈内投与後のインビボ組織のトランスフェクションから得られるルシ
フェラーゼ発現を示す。
【図８】 図８は、ポリリジンコア複合体への、ＨＡタンパク質に由来するフソーゲン性
ペプチド（Ｋ１４−Ｆｕｓｏ）の添加による増加された発現を示す。
【図９】 図９は、酸性ｐＨでのヒドラジン結合の切断を示す。
【図１０Ａ】 図１０Ａは、ペイロード核酸へのＮＬＳの取り込みのためのいくつかの方法の
模式図を示す。
【図１０Ｂ】 図１０Ｂは、直鎖状ＤＮＡ単独に対して、これに結合されるＰＮＡ結合化ＮＬ
Ｓを有する直鎖状ＤＮＡによる増加された発現を示す。
【図１１】 図１１は、ＰＥＩ/ＤＮＡおよびＰＥＩ-ＰＥＧ５０００／ＤＮＡ複合体の電荷
比に対する粒径分布の依存性を示す。エラーバーは粒径分布の標準偏差を示す。
ＤＮＡ（サケ精子）濃度：１００μｇ／ｍｌ；複合体中のＭｏｌ％ＰＥＧ：５．
０
【図１２】 図１２は、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ；電荷比１（+/-）、複合体中
の５Ｍｏｌ％ＰＥＧ：５．０を含有するＰＥＩ-ＰＥＧ５０００／ＤＮＡの粒径
安定性を示す。エラーバーは粒径分布の標準偏差を示す。
【図１３】 図１３は、血清の存在下でのＰＥＩ／ＤＮＡ複合体の凝集に対するＰＥＧの効
果を示す。１０％血清とのインキュベーション前および後のＰＥＩまたは種々の
ｍｏｌ％ ＰＥＧを含むＰＥＩ-ＰＥＧ/ＤＮＡ複合体の粒径。３７℃で３０分間
血清とともにインキュベートされたサンプルは、粒径を測定する前に１，０００
，０００ＭＷカットオフを備える透析バックに対して徹底的に透析された。エラ
ーバーは、分布の標準偏差である。
【図１４】 図１４は、正に荷電されたＰＥＩ／ＤＮＡ複合体のタンパク質媒介性の凝集に
対する、異なる分子量のＰＥＧの効果の模式的な表示を示す。
【図１５Ａ】 図１５Ａは、マウスにおける固着されたＰＥＧまたはポリオキサゾリンポリマ
ーを伴うＩ１２５−ＤＮＡ複合体の長期間の血液クリアランスを示す。
【図１５Ｂ】 図１５Ｂは、マウスにおける固着されたＰＥＧまたはポリオキサゾリンポリマ
ー伴うＩ１２５−ＤＮＡ複合体の減少された肺取り込みを示す。
【図１６】 図１６は、ＰＥＩ-ｓｓ-ＰＥＧ５０００／ＤＮＡ複合体の粒径を示す。バー１
は、１：１の電荷比で２５０μｇ/ｍｌ ＤＮＡ（サケ精子）とＰＥＩ-ｓｓ-Ｐ
ＥＧ５０００（１１モル％のＰＥＧを含有するＰＥＩ-ｓｓ-ＰＥＧ５０００）と
を複合体化することによって作製された粒子の平均の大きさを示す。バー２は、
複合体化の前にＰＥＩ-ｓｓ-ＰＥＧ５０００が１０ｍＭ ＤＴＴで処理された以
外は同じ方法において調製されたサンプルを示す。
【図１７】 図１７は、３（＋／−）の電荷比でサケ精子ＤＮＡと複合体化されたＰＥＩ-
ｓｓ-ＰＥＧ５０００のζポテンシャルを示す。
【図１８】 図１８は、２５０μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含有する切断可能なＰＥＩ-ｓ
ｓ-ＰＥＧ５０００／ＤＮＡ複合体；電荷比１（＋／−）、複合体中のＰＥＧの
モル％：１０．０：の粒径安定性を示す。エラーバーは、粒径分布の標準偏差を
示す。
【図１９】 図１９は、ＰＥＩ／ＤＮＡ、ならびにＰＥＩ/ＰＥＧ、およびＰＥＩ-ｓｓ−Ｐ
ＥＧ／ＤＮＡ複合体のルシフェラーゼ活性を示す。細胞（ＢＬ６）は、血清非含
有培地中で３時間、５の電荷比にてＰＥＩ、ＰＥＩ/ＰＥＧ、およびＰＥＩ-ｓｓ
−ＰＥＧとともに複合体化された、０．５μｇ／ウェル（９６ウェルプレート中
）のプラスミドＤＮＡでトランスフェクトされた。ルシフェラーゼ活性は、トラ
ンスフェクション後２４時間、アッセイされた。
【図２０】 図２０は、ＰＥＩ／ＤＮＡ、ならびにＰＥＩ／ＰＥＧ／ＤＮＡ複合体のルシフ
ェラーゼ活性を示す。細胞（ＢＬ６）は、５の電荷比で、ＰＥＩまたはＰＥＩ-
ＰＥＧと複合体化された、０．５μｇ／ウェル（９６ウェルプレート中の）のプ
ラスミドＤＮＡでトランスフェクトされた。ルシフェラーゼ活性は、トランスフ
ェクション後２４時間、アッセイされた。
【図２１】 図２１は、複合体の表面特性に対するＰＥＧの効果を示す。
【図２２】 図２２は、複合体の表面特性に対するＰＭＯＺの効果を示す。複合体は、４：
１の電荷比で処方され、そしてζポテンシャルが１０ｍＭ生理食塩水中で測定さ
れた。
【図２３】 図２３は、血清安定性に対するＰＭＯＺの効果を示す（４：１の電荷比の複合
体が、０〜３．２％（０．８段階で）の種々の量のＰＭＯＺを用いて調製され、
そして３７．０℃での１０％ＦＢＳを含有するＰＢＳ中での２時間のインキュベ
ーションの前および後に、粒径について調査された）。
【図２４】 図２４は、ＰＥＩコア複合体による発現に対するＰＭＯＺの効果を示す。
【図２５】 図２５は、リポフェクチンコア複合体へのペプチドリガンド（Ｋ１４ＲＧＤ）
の添加による、増加された発現を示す。
【図２６】 図２６は、コア複合体へのペプチドリガンド（ＳＭＴまたはソマトスタチン）
の添加による増加された発現を示す。
【図２７Ａ】 図２７Ａは、一方の末端で隠されたジスルフィドで、ポリエチルオキサゾリン
（ＰＥＯＺ）に、および他方の末端でペプチドリガンド、ＲＧＤに結合される直
鎖状ＰＥＩの合成を示す。
【図２７Ｂ】 図２７Ｂは、一方の末端で隠されたジスルフィドで、ポリエチルオキサゾリン
（ＰＥＯＺ）に、および他方の末端でペプチドリガンド、ＳＭＴに結合される直
鎖状ＰＥＩの合成を示す。
【図２８】 図２８は、電荷比６にてＨＥＬＡ細胞においてＰＥＧ結合されたＰＥＩの遠位
末端へのペプチドリガンド（ＲＧＤ）の添加による、ＰＥＩと複合体化されたＲ
ｈ-オリゴヌクレオチドの増加された細胞性取り込みを示す。
【図２９】 新規なコロイドベクターによるＲＡ１１９１細胞送達およびルシフェラーゼプ
ラスミドの発現に対する、用量および電荷比依存性。ルシフェラーゼ発現レベル
（ｐｇ／２０，０００細胞）は、０．１、０．２、０．４、０．６、および０．
８μｇ／２０．０００細胞のＤＮＡ用量にて、電荷比４、６、および８に対して
示される。
【図３０】 新規なコロイドベクターによるＲＡ１１９１細胞送達およびルシフェラーゼプ
ラスミドの発現に対する、用量および電荷比依存性。ルシフェラーゼ発現レベル
（ｐｇ／２０，０００細胞）は、電荷比０．４、１、２、４、および８に対して
示される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 38/27 Ａ６１Ｋ 47/14 39/395 47/18 47/14 47/22 47/18 47/24 47/22 47/28 47/24 47/30 47/28 47/34 47/30 47/42 47/34 47/44 47/42 47/46 47/44 Ａ６１Ｐ 43/00 １０５ 47/46 Ａ６１Ｋ 37/02 Ａ６１Ｐ 43/00 １０５ 37/36 // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 スカリア プスパラムピル アメリカ合衆国 メリーランド州 20886 モントゴメリー・ビレッジ スワロー・ ポイント・ウェイ 9602 (72)発明者 スブラマニアン カス アメリカ合衆国 ニュージャージー州 08817 エジソン ハナ・ロード 7105 (72)発明者 ティツマス リチャード アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 01921 ボックスフォード パートリッ ジ・レーン 12 (72)発明者 ヤン ジンピン アメリカ合衆国 メリーランド州 20878 ノース・ポトマック レディング・リッ ジ・ドライブ 28 (72)発明者 フレイ ヨルグ スイス連邦共和国 ホルシュタイン 4434 ボイヒュリング 36 (72)発明者 メット ヘルムート ドイツ連邦共和国 ノイエンベルグ 79395 フライブルグシュトラッセ 21 (72)発明者 シュタネック ヤロスラブ スイス連邦共和国 アルレシャイム 4144 ハングシュトラッセ ９ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA01 CA11 CA20 GA11 HA17 4C076 AA19 AA95 CC26 DD19A DD46A DD47A DD48A DD49A DD50A DD51A DD60A DD63A DD69A DD70A EE23A EE25A EE31A EE56A FF63 4C084 AA02 AA03 AA13 BA44 DB52 MA02 MA05 MA24 NA03 NA10 NA13 ZB211 ZB212 4C085 AA21 EE03 EE07 4C086 AA01 AA02 CB09 EA16 MA02 MA03 MA04 MA05 MA24 NA03 NA10 NA13 ZB21

Claims (45)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （１）核酸を含むコア複合体および（２）少なくとも１種の複合
    体形成剤、を含む内部シェルを含む非天然遺伝子治療ベクター。
  2. 【請求項２】 さらにフソーゲン性部分を含む請求項１記載のベクター。
  3. 【請求項３】 前記フソーゲン性部分が前記コア複合体に固定したシェルを含む
    請求項２記載のベクター。
  4. 【請求項４】 前記フソーゲン性部分が前記コア複合体中に直接取り込まれる請
    求項２記載のベクター。
  5. 【請求項５】 前記ベクターを安定化させかつタンパク質類および細胞類への非
    特異的結合を低下させる外部シェル部分をさらに含む請求項１記載のベクター。
  6. 【請求項６】 前記外部シェル部分が親水性ポリマーを含む請求項５記載のベク
    ター。
  7. 【請求項７】 フソーゲン性部分をさらに含む請求項５記載のベクター。
  8. 【請求項８】 前記外部シェル部分が前記フソーゲン性部分に固定されている請
    求項７記載のベクター。
  9. 【請求項９】 前記外部シェル部分が前記コア複合体に固定されている請求項７
    記載のベクター。
  10. 【請求項１０】 少なくとも２個の外部シェル試薬類の混合物を含む請求項５記
    載のベクター。
  11. 【請求項１１】 前記外部シェル試薬類のそれぞれが、タンパク質類および細胞
    類に対する非特異的結合を低下させる親水性ポリマーを含み、かつ、前記ポリマ
    ー類が実質的に異なる大きさを有する請求項１０記載のベクター。
  12. 【請求項１２】 前記ベクターの標的組織および細胞集団に対する結合を増大さ
    せる標的化部分をさらに含む請求項１記載のベクター。
  13. 【請求項１３】 前記外部シェルが、前記ベクターの標的組織および細胞集団に
    対する結合を増大させる標的化部分をさらに含む請求項５記載のベクター。
  14. 【請求項１４】 前記複合体形成試薬が、脂質、ポリマーおよびスペルミンアナ
    ログ複合体から構成される群から選択される請求項１記載のベクター。
  15. 【請求項１５】 前記複合体形成試薬が、Ｆｉｇｕｒｅ２．１およびＦｉｇｕｒ
    ｅ２．２に示した脂質類から構成される群から選択された脂質である請求項１記
    載のベクター。
  16. 【請求項１６】 前記複合体形成脂質試薬が、ホルファチジルコリン（ＰＣ）、
    ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルエタノ
    ールアミン（ＤＯＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、コ
    レステロールおよび他のステロール類、Ｎ−１−（２，３−ジオレオイルオキシ
    ）プロピル−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、１
    ，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニア）プロパン（Ｄ
    ＯＴＡＰ）、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジル
    イノシトール、２種の適宜不飽和化され約１４−２２個の炭素原子類を含む炭化
    水素鎖類を含む糖脂質類、スフィンゴミエリン、スフィンゴシン、セラミド、テ
    ルペン類、コレステロールヘミスクシネート、硫酸コレステロール、ジアシルグ
    リセロール、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパンジオー
    ル（ＤＯＤＡＰ）、ジオクタデシルジメチルアンモニウムブロミド（ＤＯＤＡＢ
    ）、ジオクタデシルジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、ジオクタデ
    シルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、１，３−ジオレオイルオキシ−２
    −（６−カルボキシスペルミル）プロピルアミド（ＤＯＳＰＥＲ）、２，３−ジ
    オレオイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ
    −ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロ酢酸（ＤＯＳＰＡまたはリポ
    フェクタミン７）、ヘキサデシルトリメチル−アンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ
    ）、ジメチル−ジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、１，２−ジ
    ミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ハイドロキシエチルアンモニウムブ
    ロミド（ＤＭＲＩＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミルスペル
    ミン（ＤＰＰＥＳ）、ジオクチルアミングリシン−スペルミン（Ｃ８Ｇｌｙ−Ｓ
    ｐｅｒ）、ジヘキサデシルアミン−スペルミン（Ｃ１８−２−Ｓｐｅｒ）、アミ
    ノコレステロール−スペルミン（Ｓｐｅｒ−Ｃｈｏｌ）、１−［２−（９（Ｚ）
    −オクタデセノイルオキシ）エチル］−２−（８（Ｚ）−ヘプタデセニル）−３
    −（２−ハイドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）、ジミ
    リストイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＭＴＡＰ）、１，２−
    ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスファチジルコリン（ＥＤＭＰ
    ＣまたはＤＭＥＰＣ）、リシルホスファチジルエタノールアミン（Ｌｙｓ−ＰＥ
    ）、コレストリル−４−アミノプロピオナート（ＡＥ−Ｃｈｏｌ）、スペルマジ
    ンコレストリルカルバメート（Ｇｅｎｚｙｍｅ−６７）、２−（ジパルミトイル
    −１，２−プロパンジオール）−４−メチルイミダゾール（ＤＰＩｍ）、２−（
    ジオレオイル−１、２−プロパンジオール）−４−メチルイミダゾール（ＤＯＩ
    ｍ）、２−（コレストリル−１−プロピルアミンカルバメート）イミダゾール（
    ＣｈＩｍ）、Ｎ−（４−ピリジル）−ジパルミトイル−１，２−プロパンジオー
    ル−３−アミン（ＤＰＡＰｙ）、３ベータ−［Ｎ−（Ｎ‘，Ｎ’−ジメチルアミ
    ノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、３ベータ−［Ｎ
    −（Ｎ‘，Ｎ’、Ｎ‘−トリメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロー
    ル（ＴＣ−ＣＨＯＬ−ガンマ−ｄ３）、１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−
    ３−スクシネート、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−スクシニル−
    ２−ハイドロキシエチルジスルフィドオルニチン結合物（ＤＯＧＳＤＳＯ）、１
    ，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−スクシニル−２−ハイドロキシエチ
    ルヘキシルオルニチン結合物（ＤＯＧＳＨＤＯ）、Ｎ，ＮＩ，ＮＩＩ，ＮＩＩＩ −テトラメチル−Ｎ，ＮＩ，ＮＩＩ，ＮＩＩＩ−テトラパルミトイルスペルミン
    （ＴＭ−ＴＰＳ）、３−テトラデシルアミノ−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｎ’−テ
    トラデシルプロピオンアミジン（ベクタミジンまたはジＣ１４−アミジン）、Ｎ
    −［３−［２−（１，３−ジオレオイルオキシ）プロポキシ−カルボニル］プロ
    ピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムアイオダイド（ＹＫＳ−２２０）
    、およびＯ，Ｏ‘−ジテトラデカノイル−Ｎ−（アルファ−トリメチルアンモニ
    オアセチル）ジエタノールアミンクロリド（ＤＣ−６−１４）から構成される群
    から選択される請求項１５記載のベクター。
  17. 【請求項１７】 前記複合体形成試薬が式Ｉ 【化１】 （式中、ｍは、３または４であり； Ｙは、ｎが３または４である基−（ＣＨ２）ｎ−を意味するか、または、ｎが５
    から１６までの整数である基−（ＣＨ２）ｎ−を意味することができ、または、
    Ｒ２が−（ＣＨ２）３−ＮＲ４Ｒ５でありかつｍが３であるならば、基−ＣＨ２ −ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−を意味することができ； Ｒ２は、水素または低級アルキルであるか、または、ｍが３であるならば基−（
    ＣＨ２）３−ＮＲ４Ｒ５を意味することができ； Ｒ３は、水素またはアルキルであるか、または、もしＲ２が基−（ＣＨ２）３−
    ＮＲ４Ｒ５でありｍが３であるならば、基−ＣＨ２−ＣＨ（−Ｘ‘）−ＯＨを意
    味することができ； ＸおよびＸ‘は互いに独立して、水素またはアルキルを意味し； ラジカル類Ｒ，Ｒ１，Ｒ２，Ｒ４およびＲ５は互いに独立して水素または低級ア
    ルキルであり、ただし、ここで、前記ラジカル類Ｒ，Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＸ
    は、もしｍが３でありＹが基−（ＣＨ２）３−を意味するならば、同時に水素ま
    たはメチルを意味することができない） の化合物、およびそれらの薬学的に許容できる塩類である請求項１４記載のベク
    ター。
  18. 【請求項１８】 前記複合体形成試薬が少なくとも２種の複合体形成試薬類の混
    合物を含む請求項１４記載のベクター。
  19. 【請求項１９】 前記複合体形成試薬が、細胞結合、生体膜融合、エンドゾーム
    破壊および核標的化から構成される群から選択される１種以上の付加的活性を有
    している請求項１記載のベクター。
  20. 【請求項２０】 前記核酸が、組み換えプラスミド、複製欠失プラスミド、ミニ
    プラスミド、組み換えウイルスゲノム、線状核酸断片、アンチセンス試薬、線状
    ポリヌクレオチド、環状ポリヌクレオチド、リボザイム、細胞性プロモータ、お
    よびウイルスゲノムから構成される群から選択される請求項１記載のベクター。
  21. 【請求項２１】 前記コア複合体がさらに、核結合および／または取り込みを増
    大させる核標的化部分を含む請求項１記載のベクター。
  22. 【請求項２２】 前記核標的化部分が、核局在シグナルペプチド、核膜トランス
    ポートペプチドおよびステロイドレセプター結合部分から構成される群から選択
    される請求項２１記載のベクター。
  23. 【請求項２３】 前記核標的化部分が前記コア複合体中核酸に固定されている請
    求項２１記載のベクター。
  24. 【請求項２４】 前記フソーゲン性部分が、ウイルスペプチド、両親媒性ペプチ
    ド、フソーゲン性ポリマー、フソーゲン性ポリマー−脂質結合物、生分解性フソ
    ーゲン性ポリマー、および生分解性フソーゲン性ポリマー−脂質結合物から構成
    される群から選択された少なくとも１種の部分を含む請求項２記載のベクター。
  25. 【請求項２５】 前記フソーゲン部分が、ＭＬＶ ｅｎｖペプチド、ＨＡ ｅｎ
    ｖペプチド、ウイルス性エンベロープタンパク質エクトドメイン、ウイルスエン
    ベロープタンパク質膜−近位ドメインの膜脱安定化ペプチド、ウイルス融合タン
    パク質の疎水性ドメインペプチドセグメント、および両親媒性領域含有ペプチド
    から構成される群から選択されたウイルスペプチドであり、前記両親媒性領域含
    有ペプチドが、メリチン、マガイニン類、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａ（インフルエ
    ンザ）ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質由来融合セグメント類、ＨＩＶ １
    ｇｐ４１の細胞質テイル由来ＨＩＶセグメント、およびウイルスｅｎｖ膜タンパ
    ク質類由来両親媒性セグメント類から構成される群から選択される請求項２４記
    載のベクター。
  26. 【請求項２６】 前記複合体形成試薬が、式： 【化２】 （式中、Ｒ１およびＲ３は、それぞれ独立して、炭化水素またはアミン、グア
    ニジニウム、またはイミダゾール部分で置換された炭化水素であり、ここで、Ｒ
    １およびＲ３は、同一であるかまたは異なっており；および Ｒ２は低級アルキル基である） の構造を有するポリマーである請求項１記載のベクター。
  27. 【請求項２７】 前記複合体形成試薬が、式： 【化３】 （式中、Ｒ１およびＲ３は、それぞれ独立して、炭化水素またはアミン、グア
    ニジニウム、またはイミダゾール部分で置換された炭化水素であり、ここで、Ｒ
    １およびＲ３は、同一であるかまたは異なっており；および Ｒ２およびＲ４はそれぞれ独立して、低級アルキル基類である） の構造を有するポリマーである請求項１記載のベクター。
  28. 【請求項２８】 前記フソーゲン性部分が、式： 【化４】 （式中、Ｒ１は、炭化水素またはアミン、グアニジニウム、またはイミダゾー
    ル部分で置換された炭化水素であり； Ｒ２は低級アルキル基であり；および Ｒ３は、炭化水素またはカルボキシル、ハイドロキシル、サルフェートまたはホ
    スフェート部分で置換された炭化水素である） の構造を有するポリマーである請求項２記載のベクター。
  29. 【請求項２９】 前記フソーゲン性部分が、式： 【化５】 （式中、Ｒ１は、炭化水素またはアミン、グアニジニウム、またはイミダゾー
    ル部分で置換された炭化水素であり； Ｒ２およびＲ４はそれぞれ独立して低級アルキル基であり、およびＲ３は、炭化
    水素またはカルボキシル、ハイドロキシル、サルフェートまたはホスフェート部
    分で置換された炭化水素である） の構造を有するポリマーである請求項２記載のベクター。
  30. 【請求項３０】 前記フソーゲン性部分が、膜界面活性剤ポリマー−脂質結合物
    である請求項２記載のベクター。
  31. 【請求項３１】 前記膜界面活性剤ポリマー−脂質結合物が、ＴｈｅｓｉｔＴＭ ，Ｂｒｉｊ５８ＴＭ，Ｂｒｉｊ７８ＴＭ、Ｔｗｅｅｎ８０ＴＭ、Ｔｗｅｅｎ２０ ＴＭ 、Ｃ１２Ｅ８，Ｃ１４Ｅ８，Ｃ１６Ｅ８（ＣｎＥｎ＝炭化水素ポリ（エチレ
    ングリコール）エーテルであり、ここで、Ｃは、炭素長Ｎの炭化水素を示し、Ｅ
    は、重合度Ｎのポリ（エチレングリコール）を示す），Ｃｈｏｌ−ＰＥＧ９００
    ，ＰＥＧを置換しているポリオキサゾリンまたは他の親水性ポリマー類を含むア
    ナログ類、および炭化水素を置換しているフルオロカーボン類を有するアナログ
    類から構成される群から選択される請求項３０記載のベクター。
  32. 【請求項３２】 前記内部シェルが、化学還元またはスルフフィドリル処理によ
    って分解可能な共有結合を介して前記外部シェル部分に固定されている請求項５
    記載のベクター。
  33. 【請求項３３】 前記内部シェルが、ｐＨ６．５またはそれ以下で分解可能な共
    有結合を介して前記外部シェル部分に固定されている請求項３２記載のベクター
    。
  34. 【請求項３４】 前記共有結合が 【化６】 から構成される群から選択される請求項３３記載のベクター。
  35. 【請求項３５】 前記外部シェルが保護ポリマー結合物を含み、前記ポリマーが
    極性および非極性の両溶媒中で可溶性を示す請求項５記載のベクター。
  36. 【請求項３６】 前記外部シェルが保護立体ポリマー結合を含み、前記ポリマー
    が、ＰＥＧ，ポリアセタールポリマー、ポリオキサゾリン、末端結合を有するポ
    リオキサゾリンポリマーブロック、加水分解デキストランポリアセタールポリマ
    ー、ポリオキサゾリン、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリ
    乳酸、ポリグリコール酸、ポリメタクリルアミド、ポリエチルオキサゾリン、ポ
    リメチルオキサゾリン、ポリジメチルアクリルアミド、ポリビニルメチルエーテ
    ル、ポリハイドロキシプロピルメタクリレート、ポリハイドロキシプロピルメタ
    クリルアミド、ポリハイドロキシエチルアクリレート、ポリハイドロキシエチル
    オキサゾリン、ポリハイドロキシプロピルオキサゾリンおよびポリアスパルタミ
    ドおよびポリビニルアルコールから構成される群から選択される請求項５記載の
    ベクター。
  37. 【請求項３７】 前記標的化要素が、レセプターリガンド、抗体または抗体フラ
    グメント、標的ペプチド、標的炭水化物分子またはレクチンである請求項１３記
    載のベクター。
  38. 【請求項３８】 前記標的化要素は、血管内皮細胞増殖因子、ＦＧＦ２、ソマト
    スタチンおよびソマトスタチンアナログ類、トランスフェリン、メラノトロピン
    、ＡｐｏＥおよびＡｐｏＥペプチド類、ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄの因子お
    よびｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄの因子ペプチド類；アデノウイルス線維タン
    パク質およびアデノウイルス線維タンパク質ペプチド類；ＰＤ１およびＰＤ１ペ
    プチド類、ＥＧＦおよびＥＧＦペプチド類、ＲＧＤペプチド類、葉酸、ピリドキ
    サールおよびシアリル−ルイス（Ｌｅｗｉｓ＊）および化学アナログ類から構成
    される群から選択される請求項３７記載のベクター。
  39. 【請求項３９】 式Ｉ 【化７】 （式中、ｍは、３または４であり； Ｙは、ｎが３または４である基−（ＣＨ２）ｎ−を意味するか、または、ｎが５
    から１６までの整数である基−（ＣＨ２）ｎ−を意味することができ、または、
    Ｒ２が−（ＣＨ２）３−ＮＲ４Ｒ５でありかつｍが３であるならば、基−ＣＨ２ −ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−を意味することができ； Ｒ２は、水素または低級アルキルであるか、または、ｍが３であるならば基−（
    ＣＨ２）３−ＮＲ４Ｒ５を意味することができ； Ｒ３は、水素またはアルキルであるか、または、もしＲ２が基−（ＣＨ２）３−
    ＮＲ４Ｒ５でありｍが３であるならば、基−ＣＨ２−ＣＨ（−Ｘ‘）−ＯＨを意
    味することができ； ＸおよびＸ‘は互いに独立して、水素またはアルキルを意味し；および ラジカル類Ｒ，Ｒ１，Ｒ４およびＲ５は互いに独立して水素または低級アルキル
    であり、ただし、ここで、前記ラジカル類Ｒ，Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＸは、も
    しｍが３でありＹが基−（ＣＨ２）３−を意味するならば、同時に水素またはメ
    チルを意味することができない） の化合物、およびそれらの薬学的に許容できる塩類。
  40. 【請求項４０】 薬学的に許容できる希釈剤または賦形剤とともに請求項１記載
    のベクターを含む薬剤組成物。
  41. 【請求項４１】 核酸溶液流れおよびコア複合体形成部溶液流れをスタチックミ
    キサーに供給する段階を含み、前記流れ類は、いくつかの異なる点で交差する内
    部および外部ヘリカル流に分割され乱流を起こし、それによって混合を促進し、
    その結果、物理化学的アセンブリ相互作用が起こる請求項１記載のセルフアセン
    ブリするコア複合体の形成方法。
  42. 【請求項４２】 患者に対して治療上有効量の請求項１記載のベクターを投与す
    ることを含む前記患者における疾患を治療する方法。
  43. 【請求項４３】 （１）核酸を含むコア複合体および少なくとも１種の複合体形
    成剤；（２）核標的化部分；（３）フソーゲン性部分；および（４）（ｉ）前記
    ベクターを安定化させタンパク質類および細胞類に対する非特異的結合を低下さ
    せる親水性ポリマーおよび（ｉｉ）組織および細胞を標的化するための結合を提
    供する標的化部分を含む外部シェルを含む、内部シェルを含む非天然遺伝子治療
    用ベクターで、前記外部シェルが、外部シェルを脱落させることができる切断可
    能結合を介して結合されている前記ベクター。
  44. 【請求項４４】 前記ベクターが生物活性を示す請求項１記載のベクター。
  45. 【請求項４５】 前記ベクターがフソーゲン性活性を示す請求項１記載のベクタ
    ー。
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